EXTRACCIN DE ADN OBJETIVOS Lograr la extraccin de ADN de una muestra vegetal.

. FUNDAMENTO TERICO Los cidos nucleicos estn siempre asociados con protenas, de all que una vez hecha la ruptura de las clulas se proceda a la desproteinizacin. Esta puede realizarse agitando suavemente la mezcla cido nucleico-proteina con una solucin de fenol y/o una mezcla de cloroformo-alcohol isoamlico a fin de precipitar las proteinas, la que se remueven por centrifugacin. Las proteinas pueden tambin disociarse de los cidos nucleicos con detergentes, cloruro de guanidina o altas concentraciones salinas, pueden tambin degradarse mediante proetasas, tal como la pronasa. Se obtiene as una mezcla de RNA y DNA que puede aislarse precipitando con etanol. El RNA se recupera de estos precipitados tratndolo con DNAsa pancretica para eliminar el DNA, y el DNA puede liberarse del RNA tratando el precipitado con RNasa. El DNA y RNA pueden tambin separase por ultracentrifugaciones. En todo este proceso y las maniulaciones subsecuentes, los cidos nucleidos deben protegerse de la accin degradativa de las nucleasas. Estas pueden inhibirse por agentes quelantes como el EDTA que secuestra los iones metlicos divalentes que son esenciales para la actividad de las nucleasas. Los cidos nucleicos son generalmente de ms fcil manipulacin que las protenas por carecer, en la mayora de los casos, de estructura terciaria, hacindolas ms tolerantes a condiciones extremas. Procedimiento Experimental Materiales y reactivos Vasos de precipitado de: 500, 250 y 100 ml; probeta de 100 ml, 2 pipetas de 10 ml, una propipeta, pisceta, gasa, hielo, pipeta pasteur, tubos de ensayo de 15 ml, tubos de ensayo para centrifuga 10 ml, gotero, gradilla, varilla de vidrio.

Bicarbonato de sodio, cloruro de sodio (sal de mesa), alcohol isoamilico o etanol, a bajas temperaturas, azul de metileno. Solucin Tampn: mantener en la nevera o en un bao de hielo triturado. 120 ml de agua, si es posible destilada (o mineral) 1.5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. 5 g de bicarbonato sdico. Muestra vegetal: tomate, pltano seda. Procedimiento: 1. Triturar la muestra con un poco de agua destilada en la licuadora accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos. As se rompern muchas clulas y otras quedarn expuestas a la accin del detergente. 2. Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampn fro y agitar vigorosamente durante al meno 2 minutos. 3. Separar despus los restos vegetales ms grandes de la suspensin molecular hacindolo pasar por un tamiz (gasa). centrifugar a baja velocidad 5 minutos y despus pipetear el sobrenadante. 4. Tomar 5 ml de la suspensin molecular a un tubo de ensayo y aadir 5 ml de alcohol isoamlico a 0 C. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo ste inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el tampn. Cuando el alcohol se agrega a la mezcla, los componentes, excepto el ADN, permanecen en la solucin mientras el ADN precipita en la capa de alcohol. 5. La solucin se deja reposar por 2 a 3 minutos sin mover. Es importante no batir el tubo de ensayo. Se puede observar el ADN blanco el cual precipita en la capa de alcohol. 6. Se introduce en la punta de una varilla estrecha hasta justo debajo de la separacin entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs poco a poco se irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con la cual el ADN quedar adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodn mojado.

Cuestionario 1. Cul es la funcin del cloruro de sodio, detergente, alcohol isoamlico? La sal evita la unin de las protenas al ADN. La sal permite que el ADN precipite en una solucin fra del alcohol y que las cadenas de ADN no se corten. El detergente contiene lauril sulfato de sodio, el cual limpia los trastes removiendo grasas y protenas. La funcin del alcohol isoamlico es de precipitar las protenas, las que se remueven por centrifugacin. 2. Cul es la funcin del detergente sobre la membrana celular? El detergente disuelve los lpidos (molculas grasas) y las protenas de la membrana celular, rompiendo las uniones que mantienen la integridad de la misma. De esta forma se libera el contenido celular. Luego, el detergente forma complejos con los lpidos y las protenas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtracin. As se libera el ADN.

LOS NMEROS

CUNTICOS DE UN ELEMENTO ES (4,1,0,-

1/2),CUANDO SE CONVIERTE EN ION LOS NMEROS LOS NMEROS CUNTICOS ES (4,1,1,-1/2) CUAL ES LA CARGA DEL ION.