RESPIRACIN EN MITOCONDRIA AISLADA INTRODUCCIN Los procesos fundamentales utilizados por los seres vivos para producir energa

son la gluclisis, la fosforilacin oxidativa y la fotofosforilacin. Estos procesos requieren de sistemas multienzimticos coordinados eficientemente, las clulas eucariontes llevan a cabo estos procesos en organelos especializados, en las mitocondrias ocurre la fosforilacin oxidativa y en los cloroplastos es donde ocurre la fotofosforilacin. Las clulas procariontes disponen de estos sistemas enzimticos integrados a la membrana plasmtica. La fosforilacin oxidativa y la fotofosforilacin estn conformadas en complejos enzimticos localizados en la membrana de la mitocondria y cloroplasto. En las membranas de mitocondrias y cloroplastos as como en la membrana plasmtica de los procariontes, se lleva a cabo el proceso de transduccin de energa, de manera que se acopla la energa derivada del transporte de electrones desde el NADH hasta el O2 en la respiracin y del H2O hasta el NADP+ en la fotosntesis, a la sntesis de trifosfato de adenosina (ATP). En el metabolismo de carbohidratos, como en el caso de la glucosa, la oxidacin se inicia en el citoplasma con la conversin de sta en dos molculas de cido pirvico, la energa liberada de esta reaccin es destinada a la fosforilacin de dos molculas de ADP generando dos de ATP. Los piruvatos contienen an suficiente energa para producir ms molculas de ATP, por lo cual, el piruvato es convertido en Acetil-CoA en la mitocondria, para ser oxidado posteriormente hasta CO2 y H2O (Alberts et al, 2006). En la matriz mitocondrial la Acetil-CoA, se condensa con una molcula de cuatro carbonos, el oxalacetato, para producir el cido ctrico de 6 carbonos, el cual sufre una serie de transformaciones donde se eliminan 2 carbonos en forma de CO2, hasta regenerar el oxalacetato que reinicia el ciclo llamado ciclo de los cidos tricarboxlicos o Ciclo de Krebs. Al final se generan 3 molculas de NADH y una de FADH2, los cuales donan sus electrones a los intermediarios de la cadena transportadora, que se encuentran incluidos en la membrana interna de la mitocondria (Hinkle y McCarty, 1978). Los transportadores de electrones estn organizados a favor de un gradiente de energa, de tal forma que los electrones pasan de un intermediario con ms energa a uno con menos energa. En tres pasos de la cadena, se libera suficiente energa para sintetizar una molcula de ATP, de manera que por cada molcula de NADH que dona su par electrnico, se producen tres molculas de ATP o dos molculas de ATP por cada FADH2. El flujo lineal de electrones en la cadena transportadora, produce un transporte de protones desde la matriz mitocondrial hacia fuera de la membrana mitocondrial, generando una diferencia de potencial electroqumico; el cual es utilizado como fuerza motriz para la sntesis de ATP en la ATP sintetasa, segn lo propuesto en la teora quimiosmtica de Mitchell (Voet y Voet, 2006). 28

El transporte electrnico puede ser evaluado mediante la cuantificacin del oxgeno consumido por clulas o mitocondrias aisladas, utilizando un mtodo polarogrfico. La figura 5.1 muestra un trazo experimental obtenido al registrar los datos del electrodo de oxgeno. Como se observa la velocidad de consumo de oxgeno por las mitocondrias es lenta hasta que se aade ADP, entonces el oxgeno se consume rpidamente hasta que todo el ADP ha sido fosforilado, y en este punto, la velocidad del consumo de oxgeno disminuye nuevamente. El consumo rpido de oxgeno en presencia de ADP fue denominado estado 3 por Chance y Williams y la etapa en la cual el ADP ha sido agotado, se ha llamado estado 4. La relacin de la velocidad de consumo del estado 3 sobre el estado 4 se denomina relacin de control respiratorio (RCR) y proporciona una medida de la integridad de las mitocondrias y su capacidad de acoplamiento. Una relacin de 1 ocurre en mitocondrias no acopladas, relaciones de 3 a 6 son habituales con el malato o el glutamato como substrato para mitocondrias de hgado de rata (Pon y Schon, 2007). La figura 5.1 tambin muestra como la Oligomicina inhibe el consumo de oxgeno, sin embargo, esto puede evitarse por la adicin de un desacoplante como el FCCP (Carbonil cianuro tricloro fenil hidrazona), entonces el consumo de oxgeno no es controlado y solo cesa cuando el sistema llega a ser anaerbico (Leister y Herrmann, 2007).

Figura 5.1. Resultados tpicos de la respiracin mitocondrial obtenidos con el electrodo de oxgeno. OBJETIVOS Registrar el consumo de oxgeno en una muestra de mitocondrias aisladas.

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Determinar los principales parmetros respiratorios.

Material 3 pipetas de 5 mL 10 tubos de vidrio de 10 mL 4 tubos de centrfuga (50 mL) 1 espectrofotmetro 1 centrfuga refrigerada 1 piseta con agua destilada 1 oxmetro.

Reactivos Medio de Reaccin * Cianuro de potasio (KCN) 1 mM ADP 24 mM Succinato 200 mM Reactivo de Bradford Albmina Srica de Bovino (BSA) 100 g/mL CCCP 500 M en etanol de 96o (carbonilcianuro m-clorofenilhidrazona).

* El medio de reaccin para mitocondrias aisladas de clulas animales es: sacarosa 250 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 5 mM, KCl 10 mM ajustado con Trizma a pH 7.2. * El medio de reaccin para mitocondrias aisladas de clulas vegetales es: manitol 0.3M, Cloruro de Potasio (KCl) 10mM, Fosfato Monobsico de Potasio (KH2PO4) 10 mM, Cloruro de Magnesio (MgCl2) 5 mM, pH 7.2 ajustado con KOH.

MTODO A) Calibracin del oxgrafo y registro de la actividad respiratoria. 1. Encienda el interruptor principal del equipo (Oxmetro YSI, INCORPORATED, modelo 5300). Agregue 1 mL de agua a la celda del oxgrafo que deber estar en agitacin. Espere 2 minutos para que la temperatura se estabilice a 30C.

2. Coloque la perilla (A) en posicin AIR. Espere a que marque 100%. Ajuste a 100% con la perilla de calibracin (B). Si no puede ajustarse a 100% es posible que la membrana del electrodo est rota o seca y deber cambiarla.

3. Revise y ajuste la concentracin de oxgeno agregando unos cuantos cristales de ditionita. La ditionita consume el oxgeno disuelto en el agua, lo cual debe coincidir con la lectura en el panel de control del oxmetro.

4. Retire de inmediato esta solucin, lave varias veces la celda con agua destilada. La ditionita causa corrosin en el electrodo de oxgeno.

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5. Encienda el graficador y ajstelo a las siguientes condiciones: Output 1 Volt, Chart Speed 1cm/min, Zero: perilla en posicin STBY.

6. Agregue 0.6 mL de medio de reaccin en la celda del oxgrafo.

Calibre el oxgrafo a 100% con la perilla (A) AIR y al mismo tiempo ajuste la plumilla del graficador en la escala mxima colocando la perilla Zero en posicin REC y recorriendo la plumilla con la perilla izquierda del mismo panel, de tal manera de que el valor del 100% de oxgeno del aire en el display del oxgrafo corresponda a la escala mxima del papel en el graficador (extremo superior izquierdo). Si el graficador tiene escalas de expansin, el valor seleccionado depender de la magnitud en la liberacin o consumo de O2 de la muestra. De igual manera, la velocidad de movimiento del papel depender de la rapidez en la liberacin o consumo de O2.
7.

8. Una vez ajustado el oxmetro realice el registro de consumo de oxigeno segn lo indicado en la figura 5.2, agregando 0.1 mL de la suspensin de mitocondrias y 0.3 mL de succinato 200 Mm en la cmara. Recuerde que para el clculo correcto de la P/O y RCR se necesita de dos estados 4, despus de la primera adicin del ADP. Es importante dejar una extensin buena de estos estados 4, esto con el fin de poder trazar correctamente la pendiente de donde se origina el clculo de la relacin RCR.

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Figura 5.2. Representacin de los registros de consumo de oxigeno durante la respiracin mitocondrial.

B) Cuantificacin de protena mitocondrial.

1. Prepare 7 tubos como se indica en lasiguiente tabla.

Reactivos (mL) Bradford BSA(100 g/mL) Agua Destilada Suspensin de mitocondrias

1 2.5 0 0.5 0

2 2.5 0.05 0.45 0

3 2.5 0.1 0.4 0

TUBO 4 2.5 0.15 0.35 0

5 2.5 0.2 0.3 0

6 2.5 0.25 0.25 0

7 2.5 0 0.5 0.01

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2. Mezcle perfectamente el contenido de los tubos y mida su absorbancia a 595 nm, utilizando el contenido del tubo 1 como blanco de reactivos.

3. Construya una curva patrn con los datos obtenidos (absorbancia vs concentracin), calcule la pendiente ms probable y utilice este dato para calcular la concentracin de la muestra problema de acuerdo con la absorbancia registrada.

4. Lave los tubos y la cubeta con etanol al 70% al terminar las mediciones y despus enjuguelos perfectamente con agua destilada.

C) Clculos de parmetros respiratorios. 1. Con el propsito de familiarizarse con los clculos respiratorios durante la sesin de laboratorio calcule los parmetros respiratorios que se le piden en la seccin de resultados en base al trazo experimental de la figura 5.3. Verifique sus clculos con el profesor. Si se efecta el registro en un graficador, el clculo de la pendiente en el consumo de oxgeno ser la medida de la velocidad. Las unidades en que debe expresarse el consumo de oxgeno debern ser nanomoles de Oxgeno/mg protena mitocondiral x hora. considerando que 1 mL de H2O a 30 oC contienen 230 nanomoles de oxgeno disueltos.
2.

En base a sus resultados calcule el "Control Respiratorio" (RCR) expresado en nmoles de O2 consumido/mg de protena mitocondrial X hora y calcule tambin la cantidad de ADP fosforilado a ATP en relacin a la cantidad de oxgeno consumido, o lo que se conoce como la "Relacin P/O", expresado en nmoles de ADP fosforilado / nanotomos O2 gastado.
3.

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Figura 5.3. Trazo experimental de la actividad respiratoria en mitocondrias de hgado de rata. BIBLIOGRAFA 35

Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff, Roberts y Walter. 2006. Introduccin a la Biologa Celular. 2 Ed. Editorial Mdica Panamericana. Espaa. Gonzlez Moreno S. y Pealosa Castro I. 2000. Biomolculas: Mtodos de anlisis. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Tlalnepantla, Estado de Mxico. Gonzlez Moreno S., Perales Vela, H., Salcedo Alvarez, M. 2010. Biologa Celular y Bioqumica. Proyectos experimentales acerca del metabolismo. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Profesionales Iztacala. Tlalnepantla, Estado de Mxico. Hinkle PC y McCarty RE. 1978. How cell make ATP. Scientific American. 238:104-123. Leister D and Herrmann JM. 2007. Mitochondria, practical protocols. Humana Press Inc. USA. Pon LA and Schon EA. 2007. Mitochondria. Elsevier. USA Voet D y Voet JG. 2006. Bioqumica. 3a ed. Editorial Mdica Panamericana. Argentina.

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