Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS DEPARTAMENTO DE PATOLOGA VETERINARIA CATEDRA DE MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA ASIGNATURA: MICROBIOLOGA LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL

CULTIVO DE MICROORGANISMOS: MEDIOS DE CULTIVO Y MTODOS DE SIEMBRA.

1.- OBJETIVOS DE LA PRCTICA a. Reconocer los medios de cultivos, materiales, instrumentos y tcnicas empleadas rutinariamente en los procedimientos de aislamiento primario e identificacin bacteriolgica de patgenos de inters veterinario. b. Conocer la clasificacin, preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios de cultivo. c. Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparacin del medio de cultivo en la prctica microbiolgica. d. Reconocer la necesidad de evitar la contaminacin tanto de los medios de cultivo como de los dems elementos utilizados en el laboratorio de microbiologa e. Adquirir conocimientos bsicos tericos y prcticos de la siembra y aislamiento de bacterias realizando sobre medios de cultivo los diferentes procedimientos de siembra por extensin, siembra por estra y agotamiento en placa, siembra en masa por placa vertida y siembra en medios de cultivo lquidos y slidos en tubos. 2.- ACTIVIDADES DEL INSTRUCTOR: a. Explicacin sobre medios de cultivo, mtodos de siembra y aplicaciones b. Demostracin de las tcnicas de preparacin, esterilizacin y distribucin de los medios de cultivo en placas de petri y tubos de ensayo, diferenciando, en estos ltimos las tcnicas para los medios lquidos y slidos. c. Demostracin de tcnicas de siembra por agotamiento en placa de agar, placa vertida, tubos de medios lquidos y slidos. 3.- ACTIVIDADES DE LOS ALUMNOS: a- Aplicando tcnicas aspticas, siembre el medio de cultivo lquido en tubo que se le suministra. Emplee el esquema de diseminacin del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37C. b- Aplicando tcnicas aspticas, siembre el medio de cultivo slido en tubo (medio con bisel) que se le suministra. Emplee el esquema de diseminacin del inoculo indicado. Marque el tubo, incube el tubo en estufa a 37C. 1

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

c- Aplicando tcnicas aspticas, siembre en la placa de agar nutritivo que se le suministra, por la tcnica de extensin, usando una esptula de Drygalsky esquemas de diseminacin del inoculo. Marque la placa, incube la placa en posicin invertida, en estufa a 37C. d- Aplicando tcnicas aspticas, siembre en la placa de agar nutritivo que se le suministra, por la tcnica de agotamiento, usando cualquiera de los esquemas de diseminacin del inoculo. Marque la placa, incube la placa en posicin invertida, en estufa a 37C. e- Aplicando tcnicas aspticas, y a partir de un tubo de una dilucin seriada de una muestra bacteriolgica, realice la siembra siguiendo la tcnica de siembra en masa por placa vertida. 4.- LOS MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGA Los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, de modo que podemos encontrarlos prcticamente en cualquier ambiente. Frecuentemente, se encuentran varias especies microbianas compartiendo un determinado ambiente; buenos ejemplos de complejas comunidades biticas lo constituyen el colon humano o animal, el rumen, las cavidades naturales del hombre y los animales, el suelo, etc. Las mezclas de microorganismos es frecuente en los materiales clnicos, sobre todo en los que proceden de regiones en las que existe una flora microbiana normal establecida como, por ejemplo, las muestras de lesiones en piel, exudados ticos, nasales, farngeos, uretrales, vaginales, heces, etc. Las bacterias se encuentran en el ambiente junto con otros microorganismos, razn por la cual es difcil aislarlas. A menudo nuestro inters es caracterizar una especie bacteriana, para lo cual debemos estar preparados para aislar, cultivar e identificar a la misma. Si bien el aislamiento es un paso crucial en este camino, comenzaremos examinando los medios de cultivo, ya que en estos ltimos se basan muchos de los principios del aislamiento. Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los 2

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

microorganismos. Es decir, es cualquier medio que proporcione substancias nutritivas que permitan el desarrollo y reproduccin de microorganismos. La diversidad metablica de los microorganismos es enorme, por ello, la variedad de medios de cultivo tambin lo es, no existiendo un medio de cultivo universal adecuado para todos ellos. El conocimiento de las necesidades nutritivas y fsicas de los microorganismos es fundamental para seleccionar un medio de cultivo adecuado. Los requisitos que debe reunir el cultivo de un microorganismo tienden a reproducir el ambiente natural en el que se desarrollan. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas). 5.- LA EVOLUCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina. 3

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agaragar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos. 6.- CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. a- disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles. 4

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. b- consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. c- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida y concentraciones elevadas de CO2 5-8%), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. d- condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

e- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. f- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. En general el rango ptimo de pH para la mayora de las bacterias oscila entre 6,6 y 7,8 con pH ptimo de 7,4. g- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. h- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave de Chamberland, el cual utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante. (15 libras de presin a 121C, durante 15 a 20 minutos) i.- Presin osmtica y fuerza inica Aunque en menor grado, a veces, puede ser necesario controlar las condiciones de salinidad y presin osmtica del medio de cultivo 7.- CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones adecuadas y con condiciones fsicas ptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos. Contienen una base mineral; fuente de carbono, nitrgeno y azufre; atmsfera adecuada y los factores de crecimiento necesarios. Ellos pueden clasificarse en funcin a: 7.1.- SEGN SU ORIGEN Los medios de cultivos pueden clasificarse en: a.- Naturales: 6

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Son aquellos que existen como tales en la naturaleza, por ejemplo, agua, suero, papa, huevos, leche, sangre, tierra, etc. b.- Artificiales: Estn compuestos de sustancias que son manipuladas por el hombre en el laboratorio. A los medios artificiales a su vez se los puede dividir en sintticos y complejos. Sinttico o qumicamente definido: Medio del cual se conoce exactamente su composicin qumica y las cantidades precisas de sus componentes; puede ser una simple solucin de sales con una fuente de carbono o puede contener muchos compuestos orgnicos. Medio no sinttico o complejo: es aquel del que se desconoce su composicin qumica exacta; se trata bsicamente de extractos de tejidos vegetales, animales o microbianos, cuya concentracin no se conoce con exactitud y que proveen todos los nutrientes necesarios, como por ejemplo el caldo nutritivo. 7.2.- ATENDIENDO A SU ESTADO FSICO O CONSISTENCIA: Lquidos: Semislidos: Se preparan agregando a un medio lquido sustancias solidificantes, tales como la gelatina y el agar; este ltimo es el ms usado por tratarse de un polisacrido complejo, formado por molculas de galactosa, que muy pocas bacterias son capaces de degradar. Los medios semislidos se preparan agregando 2,5 a 3 gramos de agar por litro y son ampliamente utilizados para estudiar motilidad bacteriana. Slidos: Se preparan agregando 13 a 15 gramos de agar por litro de medio 7.3.- ATENDIENDO A SU UTILIDAD PRCTICA: a.- Medios Bsicos Ordinarios o medios simples: En esta clase tenemos los medios como el caldo y el agar nutritivo, capaces de soportar el crecimiento de microorganismos que no ostentan requerimientos de cultivos especiales. Se utilizan con frecuencia para mantener cepas de laboratorio, como base para preparar medios ms ricos o complejos, para el sub-cultivo de microorganismos a partir de colonias aisladas, etc. b.- Medios Enriquecidos: Aunque muchas bacterias desarrollan bien en medios de cultivos simples u ordinarios, algunas tienen requerimientos especiales, no siempre bien conocidos, que no son cubiertos por los medios ordinarios y, por ello, no desarrollan en esos medios. Se recurre entonces al uso de los llamados 7

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

medios enriquecidos, que son bsicamente, medios de cultivo simples u ordinarios a los cuales se agrega sangre, suero, lquido asctico, extracto de levadura o cualquier otro producto biolgico, con el fin de aportar los factores de crecimiento requeridos por esos microorganismos llamados exigentes. Ejemplos de este tipo de medio son: el agar sangre, el agar chocolate, el caldo cerebro corazn ms suero, etc. Cuando se trata de medios lquidos no existe dificultad para agregar al medio estril las sustancias enriquecedoras necesarias, en las proporciones deseadas. Tratndose de medios de cultivo slido se requiere fundir el medio base a 100C, esperar a que su temperatura descienda a 46-50C, aproximadamente, y luego, aadir la sustancia enriquecedora estril, respetando rigurosas condiciones de asepsia. c.- Medios Selectivos: Son medios de cultivo que, por su composicin, permiten el desarrollo de determinado microorganismo e inhibe el crecimiento de otros. Ejemplos de estos medios de cultivo selectivo son: Medio de Chapman, utilizado en el aislamiento y caracterizacin de miembros del gnero Staphylococcus y especialmente de la especie patgena Staphylococcus aureus. El poder selectivo de este medio reside en su alta (7,5%) concentracin de cloruro de sodio, con relacin a la de los medios ordinarios (0,5%), lo cual impide el desarrollo de la mayora de las bacterias, pero permite el desarrollo de los Staphylococcus; de esa manera se facilita grandemente su aislamiento a partir de muestras poliinfectadas. Medio de Edwards, es un medio usado para aislamiento de miembros del gnero Streptococcus; este medio es, bsicamente, un agar sangre, pero contiene cristal violeta que impide el desarrollo de los microorganismos Gram negativos y sales de talio, que inhibe el desarrollo de ciertas bacterias Gram positivas como los Staphylococcus. Medio de MacConkey, es un medio que contiene sales biliares, lactosa, roo neutro y cristal violeta, adems de las sustancias usuales. Las sales biliares impiden el desarrollo de la mayora de las bacterias Gram positivas y el cristal violeta evita el desarrollo de ciertos grmenes Gram negativos. El medio es recomendable para el aislamiento de enterobacterias patgenas. La presencia de lactosa en el medio y del rojo neutro como indicador de pH, permiten adems una diferenciacin inicial entre bacterias fermentadoras de la lactosa (E. coli y otras bacterias coliformes) y no fermentadoras de la lactosa (Salmonella sp., Shigella sp.) d.- Medios Diferenciales: Son medios de cultivo diseados para estudiar caractersticas bioqumicas o enzimticas, que nos permiten la identificacin de las bacterias aisladas. 8

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Existen muchos medios de cultivo diferenciales de uso frecuente; p. ej. El medio Kliger, medio citratado de Simmon, caldo nitratado, medios hidrocarbonados, caldo urea, medios de Clark y Lubs MR-VP (para pruebas de Rojo Metilo y Voges-Proskauer), etc. e.- Medios Especiales: Se trata de medios desarrollados con una finalidad especfica, por ejemplo tenemos los medios de Lowestein-Jensen y Petragnani, diseados para el aislamiento de bacilo tuberculoso humano o bovino. f.- Medios de Enriquecimiento: La mayora de estos medios estn basados en el mismo principio sealado para los medios selectivos; sin embargo, los medios de enriquecimiento no siempre permiten el aislamiento del microorganismo investigado en un solo paso, Ejemplos de este tipo de medio son el Caldo Selenito, el Caldo Tetrationato para enriquecimiento de Salmonella sp., a partir de muestras de heces y el agua peptonada alcalina para Vibrio cholerae. En ocasiones, el enriquecimiento de un determinado microorganismo se logra por incorporacin de una determinada fuente de carbono usada preferentemente por el agente investigado, con lo cual se logra su multiplicacin rpida y prevalencia en la poblacin microbiana inoculada en el medio. g.- Medios de transporte: Se trata de medios diseados especialmente para el transporte de muestras clnicas. Generalmente, son medios qumicamente definidos, formulados para lograr que la poblacin microbiana presente en una muestra que sufra pocas modificaciones, durante perodos que varan dependiendo del medio de transporte. Estos medios se caracterizan por no aportar materiales nutritivos, por lo que no se produce multiplicacin microbiana, con lo cual la proporcin de bacterias presentes en la muestra no se altera. Adems, son medios tamponados, por lo que el pH se mantiene cercano a la neutralidad y, algunos, vienen incorporados con carbn, que absorbe sustancias txicas. Generalmente, son semislidos y de bajo potencial de xido reduccin, por lo que pueden usarse tambin en caso de sospecharse microorganismos anaerobios. Ejemplos de estos medios son el medio de Stuart, el medio de Cary y Blair y el medio de Amies. En el mercado existen medios de transporte como el Transcult y el Culturette.

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

8.- CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los elementos citados a continuacin, son los ms frecuentemente usados en la preparacin de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los nicos e incluso alguno de ellos puede estar ausente de la preparacin. a.- Agua destilada o desionizada. Libre de inhibidores del crecimiento. b.- Agar. El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacrido, al que acompaan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas. Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullicin (funde hacia los 98C) y al enfriarse forma un gel inodoro e inspido (se gelifica alrededor de los 42C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser slido a la temperatura de incubacin. Con la excepcin de algunos microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para preparar un medio slido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %. c.- Extractos. Para su preparacin, ciertos rganos o tejidos animales o vegetales (por ejemplo carne, hgado, semillas, etc.) son extrados con agua y calor, y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la confeccin de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrgeno y carbono. d.- Peptonas. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos nitrogenados y sales minerales que carecen de identidad qumica definida; se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales (soja, carne, gelatina, casena, etc.). Las peptonas son muy ricas en pptidos y aminocidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales. Proveen proteosas, peptonas, polipptidos y aminocidos. e.- Fluidos Corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguneo son frecuentemente aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos patgenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por tanto, ser obtenida en condiciones aspticas directamente de un animal sano. Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento, sino tambin con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. f.- Sistemas amortiguadores. Algunos componentes son incorporados al medio de cultivo para mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. 10

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Los microorganismos ms comunes son neutrfilos (el pH ptimo para su crecimiento est prximo a la neutralidad), y sales como fosfatos bisdicos o bipotsicos, o sustancias como las peptonas, previenen una desviacin del pH. g.- Indicadores de pH. Indicadores cido- base se aaden a menudo a los medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH. h.- Agentes reductores. Cistena, tioglicolato y otros son agentes reductores que se aaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. i.- Agentes selectivos. La adicin de determinadas sustancias al medio de cultivo puede convertirlo en selectivo (ver ms adelante, clasificacin de los medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, azida sdica, telurito potsico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada, actan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

9.- PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados, normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso re-hidratar. En general, la preparacin de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada, siguiendo las instrucciones del fabricante y luego esterilizarlo. En caso que el medio de cultivo debamos hacerlo nosotros, la preparacin de un medio de cultivo comienza por hacer un estudio de la frmula que constituye una receta que deber respetarse estrictamente. Primero se agrega agua destilada o desionizada a un recipiente, luego se van incorporando todos los ingredientes de la lista en el orden en el que se encuentran. Generalmente figura en primer trmino el compuesto que acta como tampn, como puede ser el PO4H2K, que adems provee fsforo y potasio. Es conveniente aadir todos los ingredientes en el orden indicado y disolverlos de a uno antes de agregar el siguiente. Al finalizar la preparacin y una vez que sta se enfre, se debe verificar que el pH sea el adecuado. En caso de ser necesario se ajusta con CO3Na2 (1N) o HCl (1N). 9.1.- EJEMPLOS DE PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 11

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

MATERIALES: - Erlenmeyer - Pipetas de 10 ml - Tubos de ensayo con sus tapones - Gradillas - Tiras de pH o pHmetro - Reactivos correspondientes a cada frmula - Balanza - Autoclave A.- CALDO NUTRITIVO (CALDO CARNE) Es el medio complejo ms comn para el cultivo de microorganismos. Frmula: Peptona.................... 5g Extracto de carne..... 3g Agua c.s.p................. 1000 ml pH............................... 7,2 Preparacin: 1) Colocar un volumen medido de agua destilada en un recipiente. 2) Disolver los ingredientes de a uno y por orden. 3) Llevar a ebullicin agitando peridicamente con una varilla de vidrio. 4) Completar el volumen hasta 1000 ml. 5) Dejar enfriar y medir pH. Si hace falta corregir con HONa 1M. 6) Colocar 10 ml del caldo en tubos de ensayo y volmenes apropiados en frascos. 7) Tapar, colocar capuchn de papel y esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm. B.- AGAR NUTRITIVO Frmula: Agar........................... 20 g Caldo nutritivo........ 1000 ml Preparacin: 1) Colocar 1000 ml de caldo en un recipiente. 2) Agregar el agar calentando a bao mara agitando hasta disolucin total. 3) Ajustar pH hasta 7,2. 4) Llevar 10 ml a tubos de ensayo. 5) Esterilizar.

12

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

La preparacin de agar nutritivo no requiere usar caldo estril, la esterilizacin se lleva a cabo una vez que se ha envasado el caldo agarizado. Para la preparacin de tubos con agar inclinado o en pico de flauta (slant), se colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan. Una vez fuera del autoclave, cuando estn an lquidos, se apoyan sobre la mesada con un cierto ngulo hasta que solidifiquen. Para la preparacin de tubos con agar para puncin, se colocan 5 ml del agar en los tubos de ensayo, se tapan y esterilizan En este caso, una vez que los tubos fueron retirados del autoclave se dejan solidificar en posicin vertical. Para la preparacin de capsulas de Petri con agar nutritivo se puede utilizar medio de cultivo recin esterilizado y todava lquido, o bien medio solidificado y fundido a ebullicin en Bao Mara. Se deja enfriar el agar hasta 45 C, luego se lo vuelca aspticamente en caja de Petri estril, teniendo la precaucin de flamear previamente la boca del tubo o recipiente a la llama del mechero. Se deja solidificar en posicin horizontal y posteriormente se invierten las placas para almacenarlas en nevera. 10.- SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO En la naturaleza los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos complejas. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los mismos que dependern del tipo de microorganismo y del perodo de tiempo de conservacin que se requiera. Para ello existen tcnicas de siembra, conservacin y mantenimiento de los cultivos microbianos. Una tcnica esencial en Microbiologa es la de obtencin de cultivos puros, a partir de los cuales podemos realizar estudios sobre las propiedades de los microorganismos. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismo. Para poder obtenerlo es necesario concurrir a las tcnicas conocidas como aislamiento. 10.1.- SIEMBRA Sembrar una bacteria es colocarla en un medio de cultivo, elegido de acuerdo a las exigencias vitales del microorganismo, lo que permite su desarrollo y multiplicacin, si se incuba en condiciones adecuadas y en un tiempo conveniente. Para ello una pequea porcin de cultivo o muestra, que se denomina inculo se transfiere al medio con precauciones especiales de asepsia a fin de evitar la introduccin de otros microorganismos ajenos al inculo. El conjunto de pasos a efectuar para lograr una siembra correcta, se conoce como tcnica asptica. La toma del inoculo es simple, pero se requiere tener en cuenta lo siguiente: 13

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

a. La siembra siempre debe realizarse al abrigo de las corrientes de aire (cerrar bien puertas y ventanas), con movimientos pausados, poco amplios, sin brusquedad y sin hablar. b. Coloque frente a usted el mechero y la preparacin o muestra que contiene los microorganismos, as como el resto del material necesario (portaobjetos, tubos, placas). Todo ello ha de ser alcanzado con facilidad y sin tropiezos. c. Se debe trabajar a una distancia no mayor de 15 cm. de la llama de un mechero. d. El asa o aguja de siembra se esteriliza por llameado directo (flamelo hasta que alcance un rojo incandescente) y antes de retirar el inculo debe facilitarse su enfriamiento, a fin de evitar el deterioro del material a sembrar (enfrelo en la proximidad de la llama unos 10 segundos). e. Una vez realizada la siembra se esteriliza nuevamente el asa o aguja a la llama del mechero antes de depositarla sobre la mesada de trabajo. b- Nunca debe depositarse un tapn sobre la mesada o gradilla, pues estos elementos estn cargados de microorganismos. c- Cuando est destapado, mantener el tubo en la forma ms horizontal posible para evitar que los microorganismos del ambiente, en su cada, tengan acceso al interior. a. Las bocas de los tubos de donde se toman los cultivos y la de aquellos a donde sern transferidos, deben pasarse ligeramente sobre la llama inmediatamente antes de que el asa o aguja sea introducida. Tambin se debe flamear la boca del tubo antes de taparlo. Este procedimiento fija al vidrio los microorganismos que pueden estar en dicha boca y tiende a crear corrientes hacia afuera (el aire tiende a salir), disminuyendo as el riesgo de contaminacin. b. Para retirar el inoculo o sembrar medios de cultivos en capsulas de Petri, coloque la placa invertida sobre la mesada de trabajo y levante la parte que contiene el medio de cultivo con los microorganismos. Llvela a la proximidad de la llama del mechero y tome el inoculo con el asa de siembra. Otro mtodo permitido consiste en retirar el inoculo o sembrar, levantando la tapa solo lo suficiente para permitir la introduccin del asa o aguja, para evitar que los microorganismos ambientales se depositen en la superficie del medio. c. Si la siembra se realiza con pipeta, sta debe estar convenientemente preparada y esterilizada hasta el momento de su empleo. Una vez utilizada se descarta introducindola en una solucin antisptica. d. Transfiera el inoculo a otro medio de cultivo estril, tomando las mismas precauciones en su manejo (flameando bocas de tubos, trabajando en la proximidad de la llama, etc.) La finalidad de una siembra puede ser la de realizar una transferencia o un aislamiento. La primera se efecta con cultivos puros (una sola especie bacteriana), ya sea con el objeto de renovar el medio de cultivo para perpetuar la especie, o bien 14

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

para conocer alguna de sus propiedades culturales o bioqumicas. El aislamiento, en cambio, se realiza a partir de un material que contiene una mezcla de especies bacterianas y su objeto es separarlas para obtener cultivos puros. 10.2.- TOMA DEL INCULO Si la muestra proviene de un medio lquido, el inoculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extremo del filamento del asa de siembra. Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (capsula de Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si la muestra se encuentra en la profundidad del agar (tubo con agar en pico de flauta), hunda el filamento dentro del medio hasta tomar una pequea porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo en el soporte necesario. 10.3.- TRANSFERENCIA La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos: a. Siembra de medio lquido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos. b. Siembra de medio slido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos. c. Siembra de medio slido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa o aguja y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en capsula de Petri, en superficie. d. Siembra de medio lquido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo, aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en capsula de Petri, ya sea en superficie o por homogenizacin. TCNICA DE TRANSFERENCIA EN TUBOS DE ENSAYO. TCNICA PARA MEDIO LQUIDO. Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma altura.

15

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y se los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de toda la superficie del cultivo. Con los dedos: pulgar e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma la pipeta estril o el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza. Se destapan los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguiente manera: el tapn del tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra) entre el dedo meique y la palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador (que contiene el medio de cultivo estril) entre el meique y el anular. Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inoculo; se siembra; se flamean nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando la procedencia de los tapones y se quema el asa. Como el inoculo procede de un medio lquido, antes de realizar la transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensin a los microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se agita el tubo sembrado para distribuir homogneamente el inoculo. Para realizar la agitacin se toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos ndice y pulgar y se golpea suavemente la base del mismo sobre el dedo ndice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos. TCNICAS PARA MEDIO SLIDO. Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en profundidad o en profundidad y superficie. a.- En superficie: Por estra: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo diluyendo el inoculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte, luego mover el ansa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio. Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una lnea de siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presin para que no se rompa el medio. b.- En profundidad:

16

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

Por puncin: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en forma vertical y la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inoculo rpidamente en el seno del medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio o excntricamente. c.- En profundidad y superficie: Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta. TCNICA DE TRANSFERENCIA EN CAJA DE PETRI. La siembra en capsula de Petri, puede hacerse: a.- En superficie. Por estra central: Se levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduccin del asa con la carga de microorganismos, inicindose la estra en el borde del medio ms alejado del operador y se la extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira sta 180 y se contina realizando otra estra de la misma manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa Por estra en cuadrantes: Se divide la caja en cuatro sectores y se siembra en estra cada uno de ellos, partiendo del borde de la caja hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el ms alejado del operador y el inoculo en cada caso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto (diferente especie) para cada cuadrante. Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se deposita sobre el medio slido contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del material a sembrar, que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula de DRIGALSKY. La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipiente para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %. Por diseminacin con hisopo: Se sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el exceso de lquido sobre la pared interior del tubo y se estran ambas mitades de la capsula de Petri, partiendo de los bordes hacia el

17

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

centro, luego se gira 90 y se estran nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45 y se estran ambas mitades. b.- Por homogeneizacin: Tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inoculo se introduce con el ansa o pipeta en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C en cantidad suficiente para cubrir la placa de Petri. Se homogeniza por rotacin y se vuelca en la placa previo flameado de la boca del tubo. Tcnica del agar volcado: Se deposita el inoculo con pipeta en el centro de la caja de Petri y luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a 45C. Se homogeneiza por rotacin para lo cual se le imprime a la caja movimientos circulares, en sentido horario y en sentido antihorario y movimientos rectilneos, horizontales y verticales.

Se debe tener en cuenta que de las cajas de Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar dicha operacin. Para tal fin es aconsejable preparar las placas con 24 hs. de anticipacin y dejarlas invertidas a temperatura ambiente. 10.4.- AISLAMIENTO El objeto es obtener cultivos en estado puro, operacin imprescindible y previa al estudio e identificacin de una especie bacteriana. Se pueden realizar aislamientos por mtodos generales y por mtodos especiales. MTODOS GENERALES DE AISLAMIENTO. Estos mtodos utilizan medios de cultivos slidos en caja de Petri. Por diluciones sucesivas: Se homogeniza la muestra y se carga el asa por nica vez. Luego se pasa el asa de un tubo a otro. Estos tubos contienen agar a 45 C. De esta manera el primer tubo contendr mayor concentracin de microorganismos que el ltimo. Luego se pasa el contenido de los tubos a las cajas de Petri y de all a los tubos con agar en pico de flauta. Por agotamiento en superficie en una sola caja: Es el mtodo ms utilizado. Se prepara una caja de Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad segn se indic anteriormente. 18

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

a. Se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. b. Se carga el asa con la muestra c. Se deposita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al borde, y se extiende en el mismo con estras prximas y paralelas. A continuacin se quema el asa y se deja enfriar. d. Se gira la caja 90 , se pasa el asa una vez sobre la ltima estra de la regin ya inoculada y se arrastra al sector (II) efectuando sobre l la siembra sin superponer las estras con las realizadas antes. e. Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estra el sector (III). f. Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estras con el material que se arrastra de (III), ms amplias y que terminan en el centro de la caja. Cualquiera sea el mtodo empleado, si se realiza correctamente, podrn obtenerse colonias aisladas. Estas pueden pertenecer a distintas especies bacterianas, las que generalmente se diferencian macroscpicamente.

En general cada colonia se considera formada a partir de una clula bacteriana, aunque esto no es del todo cierto pues puede darse el caso de que dos o ms clulas den origen a una colonia. Si todas pertenecen a una misma especie, la colonia resultante ser pura. Caso contrario, la finalidad del trabajo no se habr cumplido, no logrndose el aislamiento. MTODOS ESPECIALES DE AISLAMIENTO. Mtodos derivados de las propiedades de las bacterias: Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o por precipitacin de elementos del medio). Un ejemplo, es el aislamiento en el llamado agar- lactosa- verde- brillante- bilis, donde las bacterias coliformes dan colonias color rojo intenso en el centro con un halo rosado que destacan del fondo azul del medio. Mtodos biofsicos: Se basan en el empleo de condiciones fsicas determinadas que afectan a ciertos microorganismos y no a otros. a) Empleo de temperaturas disgensicas: La mayora de las bacterias desarrollan bien a 37C. Sin embargo hay especies que lo hacen hasta 40 C -42C y an ms, otras por debajo de 35 C. Estas caractersticas se pueden usar para la separacin de especies. b) Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de resistencia que toleran temperaturas que 19

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

resultan letales para las formas vegetativas. Este comportamiento se aprovecha para la separacin de las especies que tienen la capacidad de esporular. c) Movilidad del microorganismo: Las bacterias mviles desarrollan en gran parte de la superficie del medio, mientras que las inmviles lo hacen solo en el punto de siembra. Mtodos biolgicos: Estos mtodos utilizan la propiedad que tienen ciertos animales de laboratorio de ser receptivos a algunos microorganismos.

CARACTERSTICAS DE CULTIVO: OBSERVACIN, DESCRIPICIN E INTERPRETACIN DE LOS CULTIVOS

MORFOLOGA COLONIAL Y CARACTERSTICAS FENOTPICAS DE LOS MICROORGANISMOS

I. OBJETIVO 1. Definir la morfologa colonial de los microorganismos cultivados por sus caractersticas de tamao, forma, color, produccin de pigmento y de hemlisis mediante examen visual. 2. Describir los medios de cultivo rutinarios utilizados en el diagnostico microbiolgico de muestras clnicas. (Agar sangre, Agar McConkey y Agar manitol salado). 3. Describir las caractersticas de crecimiento de los microorganismos en Agar Sangre, Agar McConkey y Agar Manitol Salado). 4. Reconocer como separar una mezcla de microorganismos por la tcnica de siembra de dilucin por estra en placa de agar para obtener un cultivo axnico o puro.

II. INTRODUCCIN La evaluacin de las caractersticas macroscpicas de las colonias se lleva a cabo con el examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar.

20

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

La inspeccin de los cultivos se realiza sosteniendo la placa con una mano y observando la superficie del agar para comprobar la presencia de desarrollo bacteriano. Se debe estudiar con cuidado cada placa debido a que las bacterias aisladas inicialmente a partir de muestras, constituyen a menudo cultivos mixtos y puede haber una gran variedad de colonias de diversos tipos. Si se toma un asa bacteriolgica cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estras de sta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya diluyendo sobre la superficie (Fig. 12.1), llegar un momento en que las bacterias depositadas en la estra estn bien separadas unas de otras, reproducindose cada una en progresin geomtrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.). Dependiendo del tiempo de generacin, que vara segn la especie bacteriana, despus de cierto tiempo, cada una se habr multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeo promontorio constituido por clulas bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas. Las colonias puntiformes constituidas por bacterias de desarrollo lento, pueden pasar inadvertidas entre las de mayor tamao, principalmente si hay una tendencia a la dispersin del desarrollo por toda la superficie de la placa. Durante el examen las placas se deben inclinar en distintas direcciones con iluminacin brillante directa, de modo que la luz sea reflejada desde diversos ngulos. En algunos casos, se utiliza una lupa o un microscopio de diseccin para la mejor deteccin de colonias minsculas o inmaduras y as observar mejor sus caractersticas en el agar. Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color, consistencia etc., y pueden ser diferenciadas sobre estas bases. Cada colonia aislada est constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una sola clula y por tanto, un cultivo puro. Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas, fisiolgicas, etc., de una bacteria, se necesita que sta sea aislada en cultivo puro y el aislamiento en cpsula de Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una porcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza despus de la incubacin apropiada, mediante observacin al microscopio. III. MORFOLOGA COLONIAL

21

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella. La terminologa mencionada a continuacin sobre algunas de las caractersticas ms constantes de una colonia bacteriana es muy til: FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc. TAMAO: Estimar el dimetro en mm. SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc. SUPERFICIE (LUZ REFLEJADA): Brillante, mate, etc. ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc. BORDE O MARGEN: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, rizado, aserrado, etc. ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa. COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc. DENSIDAD: Transparente, opaca, translucida, etc. CONSISTENCIA: Dura, viscosa, butirosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, quebradiza, etc. Usar el asa bacteriolgica para determinar la consistencia.

22

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

23

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

IV. REACCIONES EN MEDIOS IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

DE

AGAR,

USADOS

EN

LA

1.- Hemlisis en agar sangre (se pueden distinguir tres tipos de hemlisis): Alfa: aclaramiento parcial de la sangre alrededor de las colonias, con coloracin verde del medio. Beta: zona de aclaramiento completa de la sangre alrededor de las colonias, debida a la lisis de los eritrocitos. Gamma: no hay cambio en el medio que rodea a la colonia, no hay lisis de los eritrocitos. Doble zona: halo de lisis completa inmediatamente alrededor de las colonias, con una segunda zona de hemlisis parcial ubicada en la periferia. 2. Produccin de pigmentos en medios de agar: Pigmentos hidrosolubles que colorean el medio. Piocianinas. Pigmentos fluorocrmicos (fluorescena). Pigmentos no difusibles, confinados a las colonias.

3.- Cambios en medios diferenciales: en los medios diferenciales se incluyen diversos colorantes, indicadores de pH y otros componentes, que actan como indicadores de las actividades enzimticas y ayudan a identificar las bacterias aisladas, por ejemplo, Agar McConkey y Manitol Sal Agar, 4.- Olor: Si bien son difciles de describir especficamente los olores producidos por accin de ciertas bacterias, tanto en medios slidos como lquidos, stos pueden ser tiles para la identificacin tentativa de los microorganismos, ejemplos: Pseudomonas spp. Zumo de uvas Proteus spp. Chocolate quemado Streptomyces spp. Stano enmohecido Clostridium spp. Ftido, nauseabundo Evaluando las caractersticas descritas de las colonias y la accin sobre los medios, se puede realizar una identificacin preliminar de las bacterias aisladas por cultivo primario. Dichas caractersticas son tiles en la seleccin de otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificacin de los aislamientos una vez obtenidos los cultivos puros o axnicos.

24

Cultivo de microorganismos: Medios de cultivo y mtodos de siembra

MEDIOS PARA AISLAMIENTO PRIMARIO Agar McConkey Es un medio diferencial utilizado para la deteccin, aislamiento y enumeracin de bacterias coliformes y patgenas intestinales en agua, productos lcteos y muestras biolgicas. Su accin diferencial radica en que las bacterias con la capacidad de fermentar la lactosa provocan un descenso de pH, junto con una absorcin del indicador de pH (colorante), surgiendo en la colonia el color rojo. Las colonias de bacterias que no fermentan la lactosa quedan incoloras. En cuanto a su composicin por litro observamos 17 g de pancretico digestivo de gelatina; 1.5 g de pancretico digestivo de casena, 1.5 de peptona de tejido animal; 10 g de lactosa; 1.5 g de sales biliares; 5 g de cloruro Sdico; 0.03 g de rojo Neutro; 0.001g de cristal Violeta; 13.5 g de agar; y un pH de 7.1 (+ - 0.2 a 25) Agar Nutritivo Es un medio con fines generales para la siembra y el crecimiento de la mayora de los microorganismos poco exigentes. Su composicin esta a base de 3 g de extracto de Carne de buey, 5 g de peptona trpsica de gelatina, 15 g de agar, y cloruro sdico, glucosa y agua destilada hasta 1000 ml Agar Manitol Sal Es un medio elegido para la deteccin de Staphylococcus patgenos en muestras de alimentos y muestras clnicas. En su composicin observamos extracto de carne de 1g, peptona trpsica de casena de 5g, peptona de carne de 5g, cloruro sdico de 75g, D-manitol de 15g, rojo fenol de 25g y agar de 15g. Agar Sangre Medio de cultivo con fines generales para una gran cantidad de microorganismos circunscribiendo los exigentes. Con el aadido de sangre, viene bien en el empleo de las reacciones hemolticas. Este medio est libre de azucares reductores. En su composicin por litro se le observa 15 g de digestivo pancretico, 5 g de peptona de soja, 5 de cloruro sdico y 15 g de agar

25