1. Zaliczenie w postaci eEgzaminu w trakcie sesji. 2. To tyle z ciekawostek.
Wykad I Czym jest biotechnologia? 9.10.2012 Historia i dziay nauk biotechnologicznych.
Rys historyczny
1. Biotechnologia jest dziedzin multidyscyplinarn. 2. Po II Wojnie wiatowej, przez rozwj biologii molekularnej, wykreowano nowy dzia nauk, jakim jest biotechnologia. 3. Dwie definicje biotechnologii: - Zastosowanie metod naukowych i inynieryjnych do obrbki materiaw czynnikami biologicznymi w celu pozyskania dbr i usug /OECD/ - Integracja nauk przyrodniczych i inynieryjnych w celu zastosowania organizmw komrek i ich czci oraz molekularnych analogw do pozyskania dbr i usug. /EFB/ 4. Biotechnologi dzielimy na klasyczn i nowoczesn. 5. 4 etapy powstawania biotechnologii w historii: - etap rzemielniczy (intuicyjny) produkty spoywcze, - etap uprzemysawiania kwasy organiczne, biomasa mikroorganizmw, rozpuszczalniki, - etap przemysowy farmaceutyki, preparaty enzymatyczne, - etap naukowy (trwa dzi). 6. Etap rzemielniczy - wytwarzanie chleba z zakwasu od 3 tys. p.n.e - wytwarzanie wina gronowego Asyria od 2 tys, p.n.e - wytwarzanie piwa od 300 p.n.e, Sumeria, Babilon, Egipt - produkcja octu XIVw., Francja + drewniane zbiorniki + procesy naukowe + naturalne szczepy + brak aparatury 7. Etap uprzemysawiania - 1857r. opis fermentacji alkoholowej (Pasteur) - 1880r. zastosowanie czystych kultur drody w piwowarstwie - 1881r. mikrobiologiczna produkcja kwasu mlekowego - 1894r. biologiczna oczyszczalnia ciekw - 1913r. - wytwarzanie acetony i butanolu (GB), glicerolu (Ger) - 1915r. produkcja drody piekarskich - 1923r. produkcja kwasu cytrynowego metod powierzchniow, z wykorzystaniem Aspergillus (metod opracowa Charles Pfizer) W tym etapie biotechnologia wykroczya poza przemys spoywczy. 8. Etap przemysowy 1929r. odkrycie penicyliny przez Alexandra Fleminga 1937r. odkrycie transformacji mikrobiologicznych przez Marmoliego i Vercellone 1941r. uruchomienie przemysowej produkcji penicyliny 1944r. odkrycie streptomycyny przez Schatza i Waksmana 1949r. produkcja kwasu octowego w hodowli wgbnej 1949r. mikrobiologiczna produkcja witaminy B 12
1953r. mikrobiologiczna produkcja dekstranu. 9. Etap naukowy + zastosowanie technik inynierii genetycznej do otrzymywania szczepw produkcyjnych, + biologiczne wytwarzanie skadnikw obcych dla danego mikroorganizmu, + sztuczne kreowanie przemian biologicznych, + komputeryzacja biotechnologii.
Kolory biotechnologii
10. Kolory podstawowe: Zielona biotechnologia = agrobiotechnologia wszystko, co jest zwizane z zarwno spoywcz, jak i niespoywcz czci rolnictwa (skupia si wycznie na rolinach). Czerwona = farmaceutyczna Biaa = przemysowa, z biokataliz Niebieska = biotechnologia wd Fioletowa = biotechnologia zwizane z etycznymi aspektami oraz prawem i legislacj. 11. Kolory dodatkowe: Zota = bioinf. + nanobiotech. ta = ywnoci Brzowa = zwizana z ekstremofilami Czarna = bioterroryzm
Procesy biotechnologiczne
12. Proces technologiczny zesp wszystkich czynnoci (procesw jednostkowych), ktre wystpuj po sobie w cile okrelonej kolejnoci, prowadzc do otrzymania cile okrelonego produktu bd efektu. W trakcie procesu technologicznego zachodz przemiany fizyczne, chemiczne i biochemiczne surowcw oraz materiaw, ktre umoliwiaj otrzymanie podanego produktu lub grupy produktw. 13. Proces biotechnologiczny proces technologiczny majcy na celu uzyskanie produktu z dziedziny biotechnologii. 14. Trzy cele procesu biotechnologicznego: a) nagromadzenie biomasy mikroorganizmw (produkcja BY, SCP) (BIOMASA) b) otrzymywanie odpowiedniego metabolitu (kwasy organiczne, enzymy, alkohole, antybiotyki). (METABOLIT) c) przemiana skadnika poywki, substratu biotransformacja. (BIOTRANSFORMACJA)
Pojcie fermentacji
15. Fermentacja w ujciu biochemicznym jest enzymatycznym procesem rozkadu zwizkw organicznych, w ktrym nie bierze udziau tlen. W przypadku oddychania tlenowego, w ostatnim etapie przemian nastpuje przekazanie elektronw na tlen. Fermentacja rni si tym, e akceptorem (biorc) jest nie tlen lecz jaki zwizek organiczny. Zawajc pojcie fermentacji mona powiedzie, e jest to beztlenowy rozkad cukrw przeprowadzany przez niektre bakterie czy grzyby (drode, plenie). 16. Fermentacja w biotechnologii - niektre procesy produkcji zwizkw organicznych z wykorzystaniem mikroorganizmw w biotechnologii okrelane s nazw fermentacja pomimo zachodzenia w warunkach tlenowych. Przykadem jest fermentacja octowa przebiegajca z dostpem tlenu.
Procesy biotechnologiczne c.d.
17. Schemat bioreaktora
Ryc.1.1 Schemat bioreaktora typu okresowego
18. Bioreaktor to inaczej bioreaktor. 19. Fermentacja tlenowa 1) Przygotowanie fermentora 2) Przygotowanie i kontrola osprztu fermentora 3) Przygotowanie podoa (poywki), inocculum, antypieniaczy 4) Sterylizacja sprztu, pomieszcze, powietrza 5) Wprowadzenie inocculum 6) Okresowe pobieranie prbek i ich kontrola 7) Fermentacja i kontrola parametrw procesu 8) Oprnienie fermentora 9) Wydzielenie, oczyszczenie i otrzymanie gotowego produktu 10) Unieszkodliwienie produktw ubocznych lub odpadowych powstajcych w wyniku procesu.
Problem powikszania skali procesu
20. Jeden z najwikszych problemw w realizacji procesu. Czsto uniemoliwia jego wykorzystanie na skal przemysow. 21. Przeniesienie procesu laboratoryjnego do przemysu musi by kadorazowo projektowane, opracowywane indywidualnie.
Mikroorganizmy w biotechnologii
22. Rne rodzaje mikroorganizmw i ich rde w biotechnologii: o izolowane ze rodowiska, o pozyskiwanie z kolekcji mikroorganizmw. naturalne, ulepszone genetycznie, prokariotyczne eukariotyczne. 23. Wybr mikroorganizmu dla danego procesu technologicznego uwzgldnia: charakterystyk odywiania mikroorganizmu optimum temperaturowe wzrost w aparaturze przemysowej stabilno cech drobnoustrojw oraz odporno na manipulacje genetyczne produkcyjno atwo wydzielania produktu z medium pofermentacyjnego brak toksycznych produktw metabolizmu.
Kolekcje mikroorganizmw i przechowalnictwo
24. Drobnoustroje, stanowice podstawowe ogniwo wszelkich procesw biotechnologicznych, powinny zapewnia wysok jako produktu i powtarzalno prowadzonych procesw. 25. Przechowywane szczepy powinny by preparatami aktywnymi, o staych cechach fizjologicznych i niezmienionej aktywnoci produkcyjnej. 26. Celem kolekcji jest zapewnienie referencyjnych szczepw bakteryjnych dla celw badawczych, porwnawczych edukacyjnych. 27. Zadania kolekcji: poszukiwanie nowych szczepw o przydatnych cechach, oraz ich ulepszanie z zastosowaniem metod klasycznych i inynierii genetycznej, klasyfikacja i identyfikacja drobnoustrojw badania nad doborem skutecznych metod przechowywania drobnoustrojw w warunkach laboratoryjnych. 28. Przykady kilku kolekcji (dwie najbardziej przydatne kolekcje, najbardziej rozbudowane): ATCC drode, bakterie, plenie (USA) DSMZ (Niemcy) /www.dsmz.de/ 29. Wszystkie kolekcje zrzeszone s w wiatowej Federacji Kultur (WFCC) z siedzib w Japonii. 30. Polskie kolekcje: PCM Polska Kolekcja Mikroorganizmw (Wrocaw) DMVB Pastwowa Kolekcja Szczepw Oddziau Weterynarii (Puawy) [nie trzeba pamita] 31. Pierwszym zdeponowanym szczepem przemysowym by Streptomyces aureofaciens producent tetracykliny (w bazie NRRL, w Stanach Zjednoczonych, 1949 rok) 32. Pierwszym krajem w ktrym wprowadzono ochron patentow na szczepy drobnoustrojw by Zwizek Socjalistycznych Republik Radzieckich (1979 rok). 33. W Polsce ochronie patentowej moe podlega proces technologiczny prowadzony z zastosowaniem danego szczepu, ale nie sam szczep!!! 34. Atrybuty dobrej kolekcji: # wykwalifikowana kadra naukowa, # katalog szczepw i usug, # metryczka szczepu. 35. Metryka szczepu zawiera: numer kolekcyjny, nazw gatunkow i synonimy szczepu, dat wprowadzenia do kolekcji, metod przechowywania, cechy morfologiczne, biochemiczne, waciwoci toksyczne i chorobotwrcze. 36. Przechowywanie szczepw powinno uwzgldnia: s czysto mikrobiologiczn, s maksymaln ywotno komrek (nawet przy bardzo maej przeywalnoci drobnoustrojw, wane jest aby pozostae przy yciu komrki charakteryzoway si cechami biotechnologicznymi na poziomie kultury wyjciowej), s stabilno cech fizjologicznych i genetycznych, w tym przede wszystkim produktywno metabolitw pierwszo- i drugorzdowych. 37. Stosowana metoda przechowalnicza powinna: c zapewni maksymaln przeywalno komrek, c zminimalizowa liczb komrek uszkodzonych, c przeciwdziaa spontanicznym mutacjom i selekcji komrek mniej przydatnych w procesie technologicznym, c ogranicza przypadkowe zanieczyszczenia innymi mikroorganizmami. 38. Kilka faktw dotyczcych przechowalnictwa: nie ma uniwersalnej metody przechowywania mikroorganizmw okresowe przesiewy mikroorganizmw na poywki stae lub pynne i przechowywanie tych hodowli w temperaturze pokojowej lub 4, skosy agarowe zalane jaow parafin metoda opracowana indywidualnie dla szczepw cennych
Doskonalenie szczepw mikroorganizmw
39. Polepszanie szczepw uwzgldnia: < zwikszanie wydajnoci wytwarzania okrelonego czynnika, (wysoce wydajne s np. szczepy Corynobacterium glutamicum, produkuj kwas glutaminowy) < zachowanie produkcyjnoci, < odporno na fagi, < problem pienienia, < odporno na skadniki mediw hodowlanych, < brak ubocznych produktw przemian. [Ma by tanio, szybko i bez problemu liczy si kasa ] 40. Trzy sposoby doskonalenia szczepw to mutacje, fuzja protoplastw i technologia rekombinacyjna DNA. 41. Mutacje gwna droga pozyskiwania nowych szczepw produkcyjnych w przemyle biotechnologicznym. 42. Fuzja protoplastw zblienie protoplastw, inicjacja fuzji (PEG) rekombinacja wewntrz- i midzygatunkowa, rekombinacja wicej ni dwch genotypw. 43. Technologia rekombinacji DNA polega na przenoszeniu genw z jednego organizmu do drugiego i otrzymywaniu tzw. klonw komrek, ktre s zdolne do syntezy nowego biaka. 44. Przykad hormonu zapewnionego drog rekombinacji: somatotropina (hormon wzrostu) jej niedobr powoduje u ludzi karowato, jest wytwarzana przez przysadk mzgow. Jest polipeptydem o 191 aminokwasach. 45. Jak otrzymano zrekombinowan somatotropin? Usunito sekwencj sygnaow HGH cDNA i wprowadzono sztuczny gen zoony z kodonu start, miejsca wizania rybosomw i miejsce promotorowe lac. E. coli produkuje 2mg/dm 3
46. Pierwszym rekombinowanym hormonem wzrosty (1985 rok) by lek o nazwie Protropin. 47. Inny hormon zapewniony przez rekombinacj u mikroorganizmw: insulina. Insulina jest odpowiedzialna za: spadek spalania tuszczw, syntez kwasw tuszczowych, transport jonw, wychwyt aminokwasw, itp. Insulina rekombinowana jest lekiem na cukrzyc, chorob cywilizacyjn, na ktr zachorowalno wzrasta. 48. Aktywna insulina s to dwa polipeptydy (A i B) poczone mostkami disiarczkowymi. Naleao omin fakt, e u E. coli nie ma aparatu enzymatycznego (jest ona przecie prokariontem). Insulina ma dwa acuchy. W tym celu powoano dwie linie komrkowe E. coli, osobno rozwijane. W efekcie powstaway biaka fuzyjne A i B, chemicznie je obcinano i czono, po czym powstaa aktywna insulina. 49. Pierwsz insulin by humulin, pierwszy lek (1982r.) wprowadzony drog inynierii genetycznej do lecznictwa. 50. BIOTON polska firma biotechnologiczna, ktra wprowadzia na rynek Gensulin (2000 rok) polski lek wyprodukowany przy zastosowaniu inynierii genetycznej, syntezowany przy uyciu drody (!). 51. Interferony: s rodkami antywirusowymi, zwalczaj zmiany nowotworowe, IFN-alfa: stosowany jako lek antywirusowy i przeciwnowotworowy, IFN-beta: przeciw stwardnieniu rozsianemu. 52. Pierwsze interferony: Roferon-A (IFN-alfa) i Intron-A (IFN-beta)
Wykad II Biotechnologia dla medycyny 16.10.2012
Wprowadzenie do wykadu
1. 2001r. rynek antybiotykw stosowanych w leczeniu ludzi wyceniano na 26 mld dolarw. 2. Antybiotyk substancja przeciwdrobnoustrojowa, produkowana przez mikroorganizmy lub uzyskiwana na drodze psyntetycznej bd syntetycznej; posiada naturalny wzorzec.
3. Zastosowanie antybiotykw: a) leczenie ludzi i zwierzt b) dodatek do pasz (gwnie w Ameryce, proceder jest szkodliwy) 4. Chemioterapeutyk substancja przeciwdrobnoustrojowa, uzyskiwana na drodze syntezy chemicznej; nie posiada naturalnego wzorca. 5. Podzia antybiotykw ze wzgldu na budow: -laktamy aminoglikozydy glikopeptydy fluorochinoliny oksazolidynony inne 6. Podzia antybiotykw ze wzgldu na dziaanie: bakteriobjcze bakteriostatyczne 7. Antybiotyki -laktamowe penicyliny (piercie - penicylina benzylowa (G) - penicylina fenoksymetylowa (V) Ryc.2.1 - wzr oglny penicylin Ryc.2.2 - wzr penicyliny G (penicyliny benzylowej) Zastosowanie antybiotykw: leczenie ludzi i zwierzt dodatek do pasz (gwnie w Ameryce, proceder jest szkodliwy) substancja przeciwdrobnoustrojowa, uzyskiwana na drodze syntezy chemicznej; nie posiada naturalnego wzorca. antybiotykw ze wzgldu na budow: Podzia antybiotykw ze wzgldu na dziaanie:
wzr oglny penicylin wzr penicyliny G (penicyliny benzylowej) substancja przeciwdrobnoustrojowa, uzyskiwana na drodze syntezy chemicznej; z prekursora: kwasu fenylooctowego z prekursora: kwasu fenoksyoctowego
Ryc.2.3 wzr penicyliny V (fenoksymetylopenicyliny) tienamycyna (odkryta u - obecno ukadu karbapenowego - podczas leczenia tym antybiotykiem dochodzi do zablokowania formimidowej dehydropeptydazy) - po zablokowaniu pochodnej, istnieje moliwo przechowywania jej w roztworach wodnych kwas klawulanowy (odkyryty u - powoduje inhibicj wzr penicyliny V (fenoksymetylopenicyliny)
tienamycyna (odkryta u Streptomyces cattleya) obecno ukadu karbapenowego (bez siarki) podczas leczenia tym antybiotykiem dochodzi do zablokowania formimidowej [lek Imipenem] (w kombinacji z cilastatyn, inhibitorem dehydropeptydazy) po zablokowaniu pochodnej, istnieje moliwo przechowywania jej w roztworach wodnych Ryc.2.4 wzr tienamycyny
kwas klawulanowy (odkyryty u Streptomyces clavuligerus) powoduje inhibicj -laktamaz: niekompetycyjn, nieodwracaln
Ryc.2.5 wzr kwasu klawulanowego
podczas leczenia tym antybiotykiem dochodzi do zablokowania pochodnej N- cilastatyn, inhibitorem po zablokowaniu pochodnej, istnieje moliwo przechowywania jej w roztworach
niekompetycyjn, nieodwracaln
kwasy oliwanowe = epitienamycyny [karbapenemy] ( - grupa porednia midzy tienamycynami a kwasem klawulanowym monobaktamy (nocardicyny) - monocykliczne - nasilniejsza z grupy jest nocardicyna A. cefamycyny (opisane w ppkt. 31 cefalosporyny - antybiotyki produkowane przez grzyby - zawieraj piercie dihydrotiazynowy - hamuj biosyntez ciany komrkowej na poziomie syntezy peptydoglikanu 8. Penicylina G pierwszy naturalny antybiotyk ziarenkowcw Gram +, wywiera dziaanie bakteriobjcze. wic nie moe by aplikowana doustnie. (Aktywo 1667 mg 9. Penicylina V podobne spektrum aktywnoci (1595 mg podawana doustnie. 10. Penicylina dziaa na transpeptydaz glikope peptydoglikanw) i blokuje ostatni etap syntezy peptydoglikanu. Penicylina czy si z transpeptydaz w jej centrum aktywnym prawidowo dziaajcego enzymu nie jest w stanie syntetyzowa ciany bakteryjnej. Prowadzi to do upoledzenia jej zdolnoci ycia w niekorzystnych warunkach rodowiska przepuszczalno ciany komrkowej. Takie uszkodzenie prowadzi po pewnym czasie do zwikszenia aktywnoci bakteryjnych enzymw autolitycznych, powodujcych 11. Proces biosyntezy penicylin: a) trofofaza namnoenie grzybni (30 24; bardzo szybkie namnaanie biomasy b) idiofaza waciwa faza produkcji; zasilanie produkcji substratami i s 12. Surowce produkcja penicylin: + rdo wgla + rdo azotu + potas, fosfor, siarka, cynk + suplementowanie solami wapnia + prekursor PAA 13. Namok kukurydziany produkt uboczny uzyskiwany w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera szerokie spektrum aminokwasw, witamin i soli mineralnych. Namo cennym surowcem w biotechnologii i czsto w przypadku problemw ze wzrostem szczepu dodatek e = epitienamycyny [karbapenemy] (odkyrte u Streptomyces olivaceus grupa porednia midzy tienamycynami a kwasem klawulanowym monobaktamy (nocardicyny) monocykliczne -laktamy produkowane przez szczepy z rodzaju nasilniejsza z grupy jest nocardicyna A. opisane w ppkt. 31) antybiotyki produkowane przez grzyby Cephalosporium zawieraj piercie dihydrotiazynowy hamuj biosyntez ciany komrkowej na poziomie syntezy peptydoglikanu Ryc.2.6 wzr oglny cefalosporyn
pierwszy naturalny antybiotyk -laktamowy, o bardzo dobrej aktywnoci wobec ziarenkowcw Gram +, wywiera dziaanie bakteriobjcze. Nie jest stabilna w roztworach wodnych, wic nie moe by aplikowana doustnie. (Aktywo 1667 mg -1 ) podobne spektrum aktywnoci (1595 mg -1 ), nieaktywna w stosunku do gronkowcw , transpeptydaz glikopeptydow (ktra zwykle katalizuje syntez sieciujcych peptydoglikanw) i blokuje ostatni etap syntezy peptydoglikanu. Penicylina czy si z transpeptydaz aktywnym i w ten sposb blokuje jej aktywno. Komrka bakteryjna pozbawiona prawidowo dziaajcego enzymu nie jest w stanie syntetyzowa ciany bakteryjnej. Prowadzi to do upoledzenia jej zdolnoci ycia w niekorzystnych warunkach rodowiska ciany komrkowej. Takie uszkodzenie prowadzi po pewnym czasie do zwikszenia aktywnoci bakteryjnych enzymw autolitycznych, powodujcych samozniszczenie bakterii Proces biosyntezy penicylin: namnoenie grzybni (30-40h), szybka asymilacja skadnikw podoa, temp. 27 ; bardzo szybkie namnaanie biomasy waciwa faza produkcji; zasilanie produkcji substratami i surowcami. produkcja penicylin: glukoza namok kukurydziany, octan potas, fosfor, siarka, cynk z mineraw suplementowanie solami wapnia prekursor PAA produkt uboczny uzyskiwany w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. Zawiera szerokie spektrum aminokwasw, witamin i soli mineralnych. Namok kukurydziany jest bardzo cennym surowcem w biotechnologii i czsto w przypadku problemw ze wzrostem szczepu dodatek Streptomyces olivaceus) grupa porednia midzy tienamycynami a kwasem klawulanowym my produkowane przez szczepy z rodzaju Nocardia hamuj biosyntez ciany komrkowej na poziomie syntezy peptydoglikanu
laktamowy, o bardzo dobrej aktywnoci wobec Nie jest stabilna w roztworach wodnych, ), nieaktywna w stosunku do gronkowcw , (ktra zwykle katalizuje syntez sieciujcych peptydoglikanw) i blokuje ostatni etap syntezy peptydoglikanu. Penicylina czy si z transpeptydaz i w ten sposb blokuje jej aktywno. Komrka bakteryjna pozbawiona prawidowo dziaajcego enzymu nie jest w stanie syntetyzowa ciany bakteryjnej. Prowadzi to do upoledzenia jej zdolnoci ycia w niekorzystnych warunkach rodowiska zwiksza si ciany komrkowej. Takie uszkodzenie prowadzi po pewnym czasie do zwikszenia samozniszczenie bakterii. szybka asymilacja skadnikw podoa, temp. 27- urowcami. produkt uboczny uzyskiwany w procesie ekstrakcji skrobi kukurydzianej. k kukurydziany jest bardzo cennym surowcem w biotechnologii i czsto w przypadku problemw ze wzrostem szczepu dodatek acylaza penicylinowa acylaza penicylinowa (znowu?) metody chemiczne hydroliza namoku kukurydzianego ratuje sytuacj. Stosowany jest w wikszoci technologii biosyntezy antybiotykw. 14. Etapy otrzymywania oczyszczonego antybiotyku liofilizowana kultura inoculum prefermentor
oczyszczanie filtrowanie fermentor produkcyjny 15. Wyodbrbnianie produktu i oczyszczanie: # oddzielenie grzybni od pynu filtracja # ekstrakcja rozpuszczalnikami w ukadzie ciecz-ciecz # chromatografia kolumnowa z uyciem wgla aktywnego # krystalizacja, suszenie i inne czynnoci prowadzce do otrzymania farmaceutyku. 16. Kiedy zaczto produkowa penicylin pod koniec II Wojny wiatowej w oparciu o Penicilium notatum, wydajno procesu nie przekraczaa 1 mg/dm3 Dzisiaj przy uyciu mutantw (np. Penicilium chrysogenium) otrzymuje si do 50mg/dm3. 17. Ampicylina, amoksycylina, piperacylina penicyliny semisyntetyczne (pierwsz dostpn na rynku bya ampicylina). 18. Penicyliny s degradowane przez -laktamazy na drodze hydrolizy piercienia lak tamowego.
Ryc.2.7 Dziaanie -laktamaz na penicyliny i ich pochodne 19. Inhibitory -laktamaz: kwas klawulanowy, sulbaktam, tazobaktam. We wsppracy z -laktamowymi antybiotykami s stosowane w leczeniu. Poczenie to rozszerza zakres dziaania pochodnych penicyliny na bakterie wytwarzajce -laktamazy, np. amoksycylina z kwasem klawulanowym, ampicylina z sulbaktamem, piperacylina z tazobaktamem. 20. Otrzymywanie penicylin semisyntetycznych istniej 4 metody: dwie chemiczne i dwie enzymatyczne. metoda I Penicylina G + H 2 O 6-APA + R-COOH Penicylina semisyntetyczna. metoda II penicylina G(lub V) diacylopenicylina 6-APA.
KTO POSIADA INFORMACJE NA TEMAT DWU POZOSTAYCH METOD PROSZONY JEST O ZGOSZENIE SI DO AUTORA NOTATKI.
21. Mieszanina racemiczna = mieszanina enancjomerw. 22. Acylaza penicylinowa enzym hydrolizujcy wizanie amidowe w penicylinach. Reakcja zachodzi w rodowisku obojtnym lub lekko alkalicznym. W rodowisku kwanym acylaza posiada zdolno katalizowania reakcji odwrotnej syntezy penicyliny lub innych amidw.
23. Acylaza penicylinowa enzym produkowany przez rne drobnoustroje hydrolizuje wizanie amidowe w penicylinie (rodowisko obojtne i alkaliczne) w rodowisku kwanym katalizuje reakcje syntez penicyliny lub inne amidy. w zalenoci od producenta enzym istnieje w formie rnych izoenzymw o rnych waciwociach i specyficznoci substratowej jeden producent moe wytwarza acylazy o rnych specyficznociach substratowych. 24. Podzia acylaz penicylinowych: < Typ I acylaza fenoksymetylopenicylinowa (PVA) c Dua rnorodno rna specyficzno substratowa. c Szybsze i wydajniejsze usuwanie grup acylowych z penicyliny fenoksymetylowej ni benzylowej c Producenci: grzyby z rodzaju Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mucor, Trichoderma, Botrytis i promieniowce. c Produkcja konstytutywna lub indukowana. c Waciwoci: dziaanie w pH 8-10 i temp. 28-50. c Czstsze wytwarzanie zewntrzkomrkowe ni wewntrzkomrkowe. < Typ 2 acylaza fenylometylopenicylinowa (PGA) c Efektywniejsza hydroliza penicyliny benzylowej ni innego typu. c Producenci: bakterie nalece do rznych rodzajw - Escherichia, Bacillus, Aerobacter, Proteus, Corynebacterium, Micrococcus (czciej gram ujemne). c Waciwoci: dziaanie w pH 7.5-8.5 i temp. 28-40. c Indukowana kwasem fenylooctowym. 25. Warunki wytwarzania acylazy na skal przemysow: - Podoe na bazie peptydw i peptonw - Dodatek atwo metabolizowanych wglowodanw hamowaby syntez - Zwikszenie wydajnoci przez indukowane acylazy kwasem fenylo- lub fenoksyoctowym - Temperatura 24-30 - Silne napowietrzanie - pH obojtne lub lekko alkaliczne - Maksymalna produkcja w logarytmicznej fazie wzrostu bakterii - Hodowla prowadzona przez 1-4 dni (jedynie w przypadku bakterii) 26. Warunki wytwarzania acylazy na skal przemysow preparaty: W produkcji stosowane s udoskonalone pod wzgldem genetycznym, wysokowydajne szczepy: Escherichia coli, Kluyvera citrophila, Pseudomonas melanoganum, Bacillus megaterium Preparaty enzymatyczne stanowi immobilizowane komrki drobnoustrojw lub czciej oczyszczony enzym. 27. Problem aplikacji enzymu do reakcji hydrolizy penicyliny G lub V: o w trakcie reakcji hydrolizy wizania amidowego powstaje kwas karboksylowy, ktry powoduje obnienie pH rodowiska. o w niskim pH enzym traci aktywno, wic rodowisko reakcji musi by neutralizowane, o w tym celu stosuje si dodatek wody amoniakalnej lub ugu sodowego. 28. Cefalosporyny (cz informacji powtrzona z 7. ppkt) - piercie dihydrotiazynowy - antybiotyki produkowane przez grzyby Cephalosporium, - hamuj biosyntez ciany komrkowej na poziomie syntezy peptydoglikanu, - 4 generacje, rnice si spektrum przeciwbakteryjnym, wraliwoci na - laktamazy oraz waciwosciami farmakokinetycznymi:
Pseudomonas putida I generacja ziarenkowce Gram +, tlenowe paeczki Gram IV generacja - ziarenkowce Gram +, tlenowe paeczki Gram 29. Proces przemysowego wytwarzania cefalosporyn semisyntetycznych. Hodowla okresowa z zasilaniem FBC (Feed Batch Culture).
Cefalosporyna C 7 ACA
Penicyliny cefalosporyny semisyntetyczne.
30. W lecznictwie stosuje si ponad 30 cefalosporyn semisyntetycznych. 31. Cefamycyny a) Producenci Actinomycetes (np. Nocardia lactamudrans, Streptomyces clavuligeris). b) Nie s chemicznymi pochodnymi penicylin ani cefalosporyn c) Aktywne wobec bakterii Gram -, d) odporne na beta-laktamazy.
Ryc.2.8 Wzr cefamycyny C
32. Semisyntetyczna cefamycyna przykad: cefoksytyna. Posiada grupy aktywne wobec Gram + i Gram - oraz odpowiadajce za trwao i za stabilno in vivo.
Ryc.2.9 Wzr cefotoksyny z opisaniem aktywnoci poszczeglnych jej grup Ryc.2.10 Rnice w budowie podstawowych szkieletw 33. Antybiotyki aminoglikozydowe producenci: promieniowce klasyfikacja na podstawie budowy jednostki pochodne streptaminy (np. streptomycyna) pochodne deoksystreptaminy (np. neomycyna, gentamycyna, kanamycyna), inne 34. Aktywno mikrobiologiczna aminoglikozydw: Bakterie Gram +, Gram Aktywne przeciw aureginosa, Staphylococcus aureus Nieaktywne wobec Wykazuj dziaanie bakteriobjcze.
Rnice w budowie podstawowych szkieletw grup antybiotykw
Antybiotyki aminoglikozydowe producenci: promieniowce klasyfikacja na podstawie budowy jednostki aminocyklitolu. pochodne streptaminy (np. streptomycyna) pochodne deoksystreptaminy (np. neomycyna, gentamycyna, kanamycyna), Ryc.2.11 Wzr gentamycyny
Aktywno mikrobiologiczna aminoglikozydw: +, Gram -, mycobacterie. Aktywne przeciw E. coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter enterococcus, Pseudomonas aureginosa, Staphylococcus aureus. Nieaktywne wobec Streptococcus, bakterii beztlenowych, grzybw, wirusw i pierwotniakw. Wykazuj dziaanie bakteriobjcze.
grup antybiotykw pochodne deoksystreptaminy (np. neomycyna, gentamycyna, kanamycyna),
E. coli, Klebsiella, Proteus, Enterobacter enterococcus, Pseudomonas , bakterii beztlenowych, grzybw, wirusw i pierwotniakw. 35. Dziaanie aminoglikozydw: Zakcenie biosyntezy biaka rybosom 70s. streptomycyna podjednostka 30S, wizanie fmtRNA z rybosomami (inicjacja biosyntezy biaka), bdne odczytanie mRNA. pochodne deoksystreptaminy dezorganizacja miejsca dekodowania, blokada splicingu autokatalitycznego gr. I intronw 36. Problem toksycznoci aminoglikozydw: + cikie: ototoksyczno przedsionkowa, suchowa; nefrotoksyczno; hamowanie przekanictwa nerwowo-miniowego. + agodne: gorczka polekowa, osutka. 37. Problem opornoci mikroorganizmw Oporno na antybiotyki aminoglikozydowe moe by spowodowana: zmianami w przepuszczalnoci bony komrkowej, mutacjami 30S, enzymami modyfikujcymi antybiotyki. 38. 4 drogi pozyskiwania/poszukiwania nowych drg syntezy aminoglikozydw: screening + inynieria genetyczna mutageneza modyfikacje chemiczne lub enzymatyczne synteza chemiczna 39. Streptomycyna s produkowana przez Streptomyces griseus s leczy si ni grulic, chorob wywoywan przez Mycobacterium tuberculosis 40. Proces wytwarzania streptomycyny: Streptomyces griseus DTH2 liofilizowane spory zmieszane z ziemi zostaj umieszczone na szalkach Petriego lub w butelkach Rouxa z agarem sojowym, inkubacja 2-3 tygodnie, 27;
Inoculum I etap kultury wegetatywne w 0,5 2,0l kolbach Erlenmayera z sojowym podoem A (48h, 26) II etap fermentor 5l, sojowe podoe B (26)
Proces waciwy Fermentor produkcyjny, podoe B, pH 7 6.5-7.5, 26, mieszanie i napowietrzanie (trofofaza, idiofaza). 41. Etapy procesu oczyszczania: (i przykadowe towarzyszce mu wielkoci) 1) Zawiesina pohodowlana 2) Filtracja lub odwirowanie przescz (50m 3 , 5,5g/l) + 50 m 3 H2O 3) chromatografia jonowymienna kolumna pianowa (1900 l) wypeniona Amberlitem IRC-50 (kationit) 4) wymywanie zwizku EDTA, woda nasycona CO 2 , 2,5N H 2 SO 4 wodny roztwr siarczanu streptomycyny 2700 l 90g/l 5) dekoloryzacja na wglu aktywnym 6) zagszczenie pod prni 7) suszenie 8) 275 kg siarczanu streptomycyny 98% czystoci. 42. Antybiotyki peptydowe (gramicydyna, polimyksyny, bacitracyna, glikopeptydy) np. Tyrotrycyna Bacillus brevis
+ Biaka syntezowane tradycyjnie rybosomalnie + Biaka syntezowane nie-rybosomalnie + Proces technologiczny otrzymywane na drodze fermentacji (towarzysz jej trudnoci!) 43. Przykady antybiotykw peptydowych: a) aktynomycyna hamuje syntez kwasw nukleinowych; antybiotyk silny(!) b) bestatyna i bleomycyna terapia przeciwnowotworowa c) bestatyna - aminopeptydazy d) bleomycyna hamowanie biosyntezy kwasw nukleinowych, biaek e) bacitracyna przeciwbakteryjny, ciana komrkowa f) cyklosporyny immunosytymulator, stosowany podczas transplantacji 44. Poszukiwane s nowe antybiotyki peptydowe przeciwko: < szczeglnie odpornym bakteriom Gram+ < odpornym na wszystko gronkowcom zocistym, < Enterococcus odpornym na wankomycyn, < Streptococcus odpornym na penicylin. 45. Przyszoci biotechnologii farmaceutycznej s: modyfikacje chemiczne antybiotykw peptydowych 1950 rok odkryto streptograminy, zwizki trudnorozpuszczalne, o duym potencjale modyfikacje chemiczne dalfopristin i qiunupristin rozpuszczalne w wodzie wykorzystanie moduowego charakteru nie-rybosomalnej biosyntezy biaka wykorzystanie znanych struktur jako matryc do syntezy chemicznej.
Wykad III Biotechnologia dla medycyny (c.d.) 23.10.2012
Antybiotyki cytotoksyczne
1. Antybiotyki cytotoksyczne Producenci: mikroorganizmy, roliny oraz ssacze kultury tkankowe. Problemy: trudnoci przy produkcji zwizkw cytotoksycznych, toksyczno w stosunku do biochemii podziaw komrkowych. Niskie stenie otrzymywane w procesie produkcyjnym. 2. Roztwr pofermentacyjny zawiera duo biaek. Trudno wydzieli je i oczyci. 3. Cytotoksyczne antybiotyki uywane s do detoksyfikacji ciekw. 4. Zachowanie bezpieczestwa przy produkcji lekw cytotoksycznych co jest wymagane? a) fermentory produkcyjne i pilotowe b) filtry HEPA (rodzaj bariery biologicznej) c) bariery biologiczne w procesie przemysowym (budynki, sprzt, zaoga) d) wykwalifikowani pracownicy e) odpowiednie postpowanie ze ciekami, odpadami, itp. 5. Przykady antybiotykw przeciwnowotworowych. Antracykliny (producent: Streptomyces) pochodne antrachinonu o charakterze glikozydowym. 6. Antracykliny odpowiadaj za: fosforylacj oksydatywn, dziaanie polimerazy DNA, enzymw naprawczych DNA, syntez metalotionein, topoizomerazy I i II oraz helikazy, a take produkcj wolnych rodnikw. 7. Przykady antracyklin: adriamycyna (inaczej: doksorubicyna dziaa na rne postaci nowotworw), daunomycyna (inaczej: daunorubicyna rwnie przeciwnowotworowa), epirubicyna (epidokosorubicyna).
48h, 28 8. Proces produkcji daunomycyny:
zaoenie skosu kultury w kolbach fermentory 170l (pilotowe)
67h, 28 waciwe fermentory 800l Uzyskuje si 60-70 mikrogramw na mililitr. 9. Proces produkcji adriamycyny:
zaoenie skosu homogenizacja, zawieszenie w sterylnej wodzie
fermentor produkcyjny fermentor pilotowy kolby (800l) Po 67-145h w 27 uzyskuje si ok. 5-15 mikrogramw na mililitr. 10. Antybiotyki nukleozydowe, w tym polioksyny: najsilniejsze czynniki cytotoksyczne. Aktywno: antybiotyczna, cytotoksyczna, immunosupresyjna. Producent: Nocardia lub Streptomyces. Trudnoci: bezbarwne i atwo rozpuszczalne w wodzie. Przykad: polioksyna B
Ryc.3.1 wzr polioksyny B
11. Enzymy cytotokszyczne, np. L-asparaginaza Producenci: niektre szczepy Escherichia coli, Herbinia herbicola. Podstawowy lek w terapii chorb limfoproliferacyjnych (np. ostra biaaczka limfoblastyczna). Zmutowane komrki biaaczkowe nie s zdolne do syntezy aspraraginy, podczas gdy zdrowe komrki wytwarzaj wasn asparagin. Tak wic zmutowane komrki zale od wolnej asparaginy cyrkulujcej w organizmie. Asparaginaza katalizuje rozkad L-asparaginy do kwasu asparaginowego i amoniaku, co likwiduje woln asparagin w organizmie. Produkcja jest droga i niskowydajna. 12. Leki od pomysu do apteki: 1) odkrycie substancji lekowej 2) projektowanie analogw 3) testy poczone z doskonaleniem leku. 13. Testy przedkliniczne obejmuj: toksykologi prby na zwierztach, farmakologi poznanie mechanizmu dziaania leku, zaproponowanie formy leku ustalenie, czy produkowa w postaci tabletek, kapsuek, etc. sprawdzenie trwaoci w jaki sposb lek zachowuje si w rnych tkankach, profil metabolizmu leku sprawdzenie dziaania pochodnej zawierajcej znakowany izotop, ktr monitoruje si pod ktem promieniotwrczoci, a take tego, jak si w lek wchania, itp. 14. Testy kliniczne: faza I ustalenie poziomu dawkowania leku i badania farmakokinetyczne faza II przydatno terapeutyczna leku oraz badania efektw ubocznych faza III badania statystyczne (ok. 3 lat) faza IV bezpieczestwo stosowania leku, rzadkie dziaania uboczne, interakcje z innymi lekami. 10 dni, 26-27 2 dni, 28 27h, 26-27 27h, 26-27
16. elazo bierze udzia w regulowaniu skadu komrki, oraz w jej metabolizmie; wystpuje w produktach metabolizmu oraz biakach i enzymach wymagajcych elaza. Niedobr elaza powoduje zastopowanie wzrostu, zmniejszenie intensywnoci syntezy kwasw nukleinowych, hamowanie sporulacji, zmiany morfologii komrki. 17. Poniewa dostpno Fe w rodowisku jest ograniczona, to mikroorganizmy musiay wyksztaci specjalne mechanizmy umoliwiajce pobieranie go ze rodowiska siderofory. 18. Przykady sideroforw: mykobaktyny, pseudobaktyny, enterobaktyna, ferichromy, agrobaktyna.
Ryc.3.2 biologiczny aspekt dziaania sideroforw.
19. Cechy sideroforw: + substancje niskoczsteczkowe (wzgldna masa czsteczkowa <1500) + rozpuszczalnie w wodzie + wi elazo z wysok swoistoci i powinowactwem (staa stabilnoci 10 30 ) + zwizki fenolowe lub hydroksamaty (te drugie wytwarzane przez grzyby) 20. Enterobaktyn wytwarzaj bakterie jelitowe, ferrichromy wytwarzane s przez grzyby. Inne przykady: Ferrioksoamina u promieniowcw, egzochelina u bakterii luzowych. 21. Drobnoustroje wytwarzaj siderofory zazwyczaj wtedy, gdy nika dostpno elaza ogranicza wzrost. Siderofory mog posiada aktywno antybiotyczn: sideromycyna, albomycyna, ferrimycyna. Produkcja przemysowa sideroforw jest trudna! 22. Siderofor produkowany na skal przemysow: deferoksyamina (Desferal) otrzymywany za porednictwem Streptomyces pilosus. 23. Cechy dobrego chelatora: atwo produkcji, efektywno, specyficzno, nietoksyczno. 24. Wykorzystanie sideroforw w medycynie: chelator (leczenie zatrucia elazem, leczenie hemochromatozy, usuwanie toksycznych metali z organizmu). Zastosowania niemedyczne: produkowane in-situ a nie fermentacyjnie w rolnictwie (Pseudomonas putida pseudobaktyna, a take hodowle hydroponiczne Rhizobium). 25. Hodowla hydroponiczna hodowla wodna, bez uycia ziemi.
26. Przykady sterydw, otrzymywanych na drodze biotransformacji: steran, cholesterol. Ryc.3.3 wzr steranu z numeracj wgli 27. Podstawowe surowce do produkcji lekw sterydowych: diosgenina, sitosterol.
Ryc.3.5 wzr diosgeniny Ryc.3.7 wzr stygmasterolu
28. Mikrobiologiczna konwersja steroli a) dehydrogenacj, b) epoksydacj, c) estryfikacj, Pochodne sterydowe Przykady sterydw, otrzymywanych na drodze biotransformacji: steran, cholesterol. wzr steranu z numeracj wgli Ryc.3.4 wzr cholesterolu owe surowce do produkcji lekw sterydowych: diosgenina, -sitosterol, stygmasterol, wzr diosgeniny Ryc.3.6 wzr wzr stygmasterolu Ryc.3.8 wzr Mikrobiologiczna konwersja steroli obejmuje:
Przykady sterydw, otrzymywanych na drodze biotransformacji: steran, cholesterol.
wzr cholesterolu sitosterol, stygmasterol, -
wzr -sitosterolu
wzr -sitosterolu d) izomeryzacj, e) hydroliz acetali, f) hydroliz estrw, g) hydroliz epoksydw, h) hydroksylacj, i) utlenianie alkoholi i ketonw, j) redukcj ketonw i podwjnych wiza. 29. Reakcje o znaczeniu przemysowym: hydroksylowanie pozycji 11 i 11; uywa si Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricaus, Aspergillus ochraceus. Produkty uboczne: 6-11-dihydroksyprogesteron; enzym indukowany jest obecnoci substratu (enzym ten naley do oksygenaz o funkcji mieszanej).
Ryc.3.9 Progesteron i 11-hydroksyprogesteron
hydroksylowanie pozycji 11. Uywane s Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana. Wiksza ilo produktw ubocznych (powstaych rwnie w wyniku dziaania enzymw, bdcych oksygenazami o funkcji mieszanej).
dehydrogenacja w pozycji 1, przy uyciu Arthrobacter simplex, Bacillus sphericus, Nocardia restricus, Septomyxa affinis, Fusarium solani. Prowadzi do powstania prednizolonu. Enzym i w tym wypadku indukowany obecnoci substratu.
Ryc.3.12 Wzr prednizolonu
hydroksylowanie w pozycja 16, przy uyciu Streptomyces argentelous. Powstaje triamcinolon (ma waciwoci przeciwzapalne).
modyfikacje acuchw bocznych. W celu ich uzyskania stosowane s: Nocardia, Streptomyces, Arthrobacter, Mycobacterium. Grupa ketonowa w pozycji C-17 oraz grupa COOH w pozycji C-20 mog by przez nie modyfikowane. Produkty o znaczeniu komercyjnym: kortyzon, hydrokortyzon, prednizon, prednizolon, testosteron, testolakton, triamcinolon, flokortolon.
Ryc 3.15. mechanizm hydroksylowania
Biotechnologia sztucznych komrek
30. Thomas Ming Swi Chang pionier w dziedzinie projektowania sztucznych komrek, gwny pomysodawca podjcia si tego tematu w toku rozwoju nauk biotechnologicznych. 31. Cechy komrek, ktre s na tyle istotne, by miay je naladowa sztuczne komrki: + zamknicie bon (osobne rodowisko reakcji w nich przebiegajcych: izolacja od otoczenia, z jednoczesn moliwoci interakcji ze rodowiskiem zewntrznym komrki), + duy stosunek powierzchni do objtoci, 32. Cechy komrek sztucznych: + pprzepuszczalna bona, + grubo 0,02m-1,8nm + mono zamykania w ich obrbie lekw, enzymw, mikroorganizmw, a take innych komrek. + produkcja substytutw krwi, a take sztucznych organw (wtoba, nerki) 33. W sztucznych komrkach zamyka si leki, enzymy i cae systemy enzymatyczne. W ten sposb wprowadza si do organizmu np. heksokinaz i kinaz pirogronianow. Tak rwnie doprowadza si do regeneracji ATP.
Ryc.3.16 Schemat fosforylacji glukozy
34. Inne enzymy zamykane w sztucznych komrkach: ureaza, dehydrogenaza glutaminianowa, dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu.
Ryc.3.17 Schemat powstawania pirogronianu z PEP.
Umoliwiane jest take zachodzenie reakcji, takich jak degradowanie mocznika do amoniaku i nastpnie do -ketoglutaranu. 35. Sztuczne komrki uzyskuje si na drodze emulsyfikacji, a nastpnie polimeryzacji midzyfazowej. Uywa si do tego celu silastiku, octanu celulozy, nylonu polietylenoiminowego i materiaw biodegradowalnych.
Human Genome Project
36. HGP rozpoczto w 1990 roku, aby bada ludzki genom; jego celem byo zsekwencjonowanie caego genomu ludzkiego w celu uzyskania wielu poytecznych informacji. 37. Craig Venter wystarczy miao mu 3 lata i 15 razy mniejsze nakady finansowe, aby zsekwencjonowa ca map genomw szybciej ni ludzie zrzeszeni w konsorcjum powstaym na potrzeby projektu HGP. Udao mu si w nieco duszym czasie. Rozpocz w 1998, zakoczy w 2002. Sta na czele firmy Celera Genomics. 38. Metody Ventera i projektu HGP byy rne: Venter stosowa strza na lepo, konsorcjum projektu HGP sekwencjonowao losowo. 39. Sekwencjonowanie ludzkiego genomu zostao ukoczone, ale jego interpretacja jest wyzwaniem przyszociowym dla nas, dzi yjcych i rozwijajcych nauki biotechnologiczne.
Genomika i inne dziay nauk pomocniczych
40. Genomika nauka zajmujca si poznaniem funkcji poszczeglnych elementw genomu (ang. functional genomics). 41. Proteomika badanie biaek danego organizmu i zrozumienie roli biaek kodowanych przez genomy (ang. functional proteomics). 42. Transkryptomika dziedzina nauk biologicznych, gwnie biologii molekularnej i genetyki, pokrewna proteomice, genomice i metabolomice. Zajmuje si badaniem RNA, z okreleniem miejsca i czasu aktywnoci genw poprzez badanie transkryptomu. 43. Metabolomika poznawanie cukrw, nukleotydw, aminokwasw, tuszczy i ich znaczeniu dla fenotypu; dziedzina nauki zajmujca si badaniem zestawu wszystkich metabolitw obecnych w organizmie, tkance czy komrce 44. Bioinformatyka - dyscyplina zajmujca si stosowaniem narzdzi matematycznych i informatycznych do rozwizywania problemw z nauk biologicznych.
Technologie rekombinowanego DNA
45. Technologie rekombinacyjne DNA - systemy do otrzymywania biaek z wykorzystaniem transgenicznych organizmw. 46. Systemy ekspresji genw: a) prokariotyczny (E. coli) b) eukariotyczny (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, hodowle komrek ssakw i owadw) 47. System bakulowirusa Bakulowirusy, z racji swojej specyficznoci wzgldem gospodarza, s uywane jako bro w walce z owadami oraz jako wektory w eksperymentach na owadach, zwizanych z inynieri genetyczn. Przykady owadw traktowanych bakulowirusami: ma kalifornijska, jedwabnik. 48. ywe bioreaktory wykorzystanie wyszych organizmw transgenicznych jako systemw ekspresji biaek heterologicznych (np. wykorzystanie gruczow mlecznych myszy, krlikw, owiec i kz; wydajno 1-40 g na litr mleka). 49. Systemy rolinne - inna ni u zwierzt glikozylacja - atwe skalowanie produkcji - brak niebezpieczestwa zakae typowymi patogenami zwierzt - otrzymywanie lekw biakowych, przeciwcia monoklonalnych i szczepionek Ciekawe moliwoci: + Szczepionka przeciwrakowa z tytoniu zakaonego rekombinowanym wirusem mozaiki tytoniowej. + Doustna szczepionka przeciw wirusowi HIV z transgenicznych pomidorw.
Szczepionki
50. Szczepionki preparaty biofarmaceutyczne chronice organizm przed czynnikami infekcyjnymi poprzez pobudzenie odpowiedzi ukadu odpornociowego. 51. Szczepionki klasyczne s zoone z umierconych lub osabionych patogenw; zaliczaj si do nich take szczepionki zoone (poliwalentne). 52. Szczepionki nowoczesne stanowi szczepionki podjednostkowe, syntetyczne szczepionki peptydowe oraz szczepionki DNA i RNA. 53. Wady szczepionek klasycznych: problemy z hodowl zarazkw chorobotwrczych w hodowlach in vitro cena hodowli komrkowych zarazki atemiowane mog przeksztaci si w patogenne mutanty nie mona stosowa klasycznych szczepionek przeciw chorobom niezakanym wydatki na zabezpieczenie pracownikw due koszty przechowywania i transportu preparatw. 54. Etapy procedury opracowywania nowej szczepionki mog trwa bardzo dugo, nawet 13,5 do 23 lat (rdo: tabela z wykadu, slajd szybko pominity na wykadzie). 55. Szczepionki podjednostkowe zawieraj tylko okrelone fragmenty patogenw. Zalety: a) niemoliwa jest replikacja w komrkach gospodarza, a dziki temu brak patogennoci, b) wzgldnie may koszt otrzymania, c) prosta technologia wytwarzania. Wady: a) neutralizujce antygeny trzeba najpierw wykry i izolowa na poziomie genetycznym, b) antygen w formie ostatecznej musi wykazywa waciw konformacj przestrzenn, c) potrzeba separacji antygenu aby szczepionka nie zostaa zanieczyszczona przez skadniki kultury komrkowej, d) obniona immunogenno. 56. Szczepionki peptydowe jest ni peptyd stanowicy kluczowy epitop antygenu. Istnieje konieczno czenia go z biakiem przenonikowym. Przykadem jest szczepionka weterynaryjna przeciwko FMDV (pryszczycy).
Wykad IV Biotechnologia w subie medycyny 30.10.2012
Szczepionki DNA
1. Szczepionka DNA konstrukt genetyczny, w ktrym znajduje si gen kodujcy biako, na ktrego odporno chcemy uzyska. 2. Mechanizmy dziaania szczepionek DNA:
plazmid DNA przyjmuj je dwa rodzaje komrek
miniowe prezentujce antygen
limfocyty B biako jdro
produkcja przeciwciaa odpowied humoralna
3. Antygeny mog by rozpoznane przez kompleksy MHC II. Takie poczenia mog by rozpoznane przez limfocyty Th (T, pomocnicze), ktre wspomagaj reakcj humoraln. 4. Humoralna odpowied odpornociowa jedna z gazi odpowiedzi odpornociowej. Okrelenie to powstao z obserwacji, e czynnik odpowiedzialny za rozpoznanie antygenu i wyzwolenie ataku na niego znajduje si w bezkomrkowym pynie (ac. humor - pyn), np. w osoczu krwi, czy pynie tkankowym. Za to zjawisko odpowiedzialne s przeciwciaa, ktre s produkowane przez limfocyty B, a ich podstawowym celem jest specyficzne przyczenie si do antygenu i tym samym "oznakowanie" celw dla ataku przez rne mechanizmy efektorowe (komrki erne, komrki K, dopeniacz) lub te przynajmniej neutralizacja patogenu przez zablokowanie istotnych dla jego funkcjonowania struktur. Pojcie "odpowied humoralna" jest o tyle mylce, e w rozpoznaniu antygenu, oraz w wyprodukowaniu adekwatnego dla niego przeciwciaa uczestniczy skomplikowany ukad rnych komrek (komrki prezentujce antygen, limfocyty Th, limfocyty B) poczonych ze sob zoon sieci zalenoci. 5. Odpowied odpornociowa komrkowa - to sztuczne okrelenie, w zasadzie o znaczeniu historycznym, ale dosy przydatne w opisie pewnych zjawisk, oznaczajce mechanizmy odpowiedzi odpornociowej, w ktrych gwn rol odgrywaj uczulone limfocyty T bezporednio znajdujce si w miejscu wstpowania antygenu i oddziaujce z komrkami efektorowymi (np. makrofagami rnych typw, granulocytami itp.), lub same biorce bezporedni udzia w likwidacji komrek nioscych antygen wobec ktrego jest wyzwolona reakcja limfocytu Tc. Pojcie odpowiedzi komrkowej zostao niegdy zdefiniowane jako przeciwiestwo odpowiedzi humoralnej, gdzie elementem rozpoznajcym antygen s przeciwciaa, w zwizku z tym reakcja moga by wyzwolona przez podanie bezkomrkowego pynu zawierajcego przeciwciaa, podczas gdy inne reakcje wymagay podania uczulonych wczeniej komrek. Jest to podzia sztuczny, gdy produkcja przeciwcia jest jednym z moliwych ramion odpowiedzi immunologicznej mediowanej przez te same mechanizmy co odpowied komrkowa, tylko zastosowana "bro" (przeciwciao) ma moliwo raenia na odlego.
wstrzyknicie do komrki translacja 6. Szczepionki DNA waciwoci: a) odporno na dziaanie temperatury b) brak infekcyjnoci lub infekcyjno niewielka c) aktywowanie obrony humoralnej i komrkowej d) niska immunogenno e) ryzyko chromosomalnej integracji plazmidowego DNA z genomem gospodarza i mutacji (nawet czasem tworzc onkogeny). Dotychczas sukcesem zakoczyy si eksperymenty ze szczepionkami przeciwko grulicy i malarii, prowadzone na myszach, a take ostatnio - na szympansach. 7. Szczepionki jadalne umieszczanie w rolinie zmodyfikowanego Agrobacterium tumefaciens w celu zmiany waciwoci teje roliny, po czym podanie jej do spoycia. 8. Zalety szczepionek jadalnych: a) atwy sposb aplikacji (samodzielnie) b) ekonomiczna produkcja i dystrybucja c) biaka terapeutyczne wolne od toksyn i patogenw zwierzcych d) mono magazynowania blisko miejsca zapotrzebowania e) stabilne temperaturowo, atwe przechowywanie f) moliwo dostarczenia zoonych antygenw. 9. Wady szczepionek jadalnych i ich ograniczenia: a) stao dawki w poszczeglnych generacjach roliny b) odpowiednio silna odpowied ukadu odpornociowego c) nieznana stabilno szczepionek w owocach d) wybr roliny jest trudny e) niektre warzywa musz by przetwarzane przed zjedzeniem 10. Polskim akcentem w tym wtku jest modyfikowana saata produkujca szczepionk przeciw zapaleniu wtroby typu B zostaa ona opracowana przez naukowcw z Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierownictwem prof. Legockiego. Jest to przykad roliny jako bioreaktora.
Terapia genowa
11. Terapia genowa jest to: - korekta defektu genetycznego przez wprowadzenie do komrek prawidowego genu - zmiana wasnoci komrek przez wprowadzenie obcego genu, - regulacja ekspresji nieprawidowego genu.
12. Rodzajami terapii genowej s terapie: germinalna (dotyczca gamet, podlegajca dziedziczeniu) i somatyczna (majca charakter zachowawczy, dotyczca komrek ciaa niebdcych komrkami rozrodczymi). cecha terapia germinalna terapia somatyczna typ komrek docelowych komrki rozrodcze (gamety), we wczesnym stadium zarodkowym komrki ciaa nie bdce gametami integracja z genomem komrek docelowych tak rzadko (przewanie brak) zmiana dziedziczna tak nie Terapii germinalnej uywa si rzadziej (problematyka etyczna). 13. Terapia genowa ex vivo polega na tym, e od pacjenta pobierane s komrki, ktre transfekuje si poza ustrojem, i zmienione wprowadza z powrotem do organizmu. 14. Terapia genowa in vivo w tej metodzie wstrzykuje si lub wstrzeliwuje spreparowane komrki, majce zniwelowanie wady w genomie; mona wprowadza lokalnie lub w stosunku do caego organizmu (przez krwioobieg). 15. Pacjentowi podaje si nagie DNA (plazmid), ale due jego iloci s degradowane po drodze. 16. Rodzaje wektorw wirusowych: adenowirusy, retrowirusy, pokswirusy, AAV (wirusy towarzyszce adenowirusom), HSV. 17. Zastosowanie terapii genowej (stan na rok 2008): nowotwory choroby infekcyjne wady zapisane w genach na chromosomach homologicznych choroby ukadu krenia 18. Strategia antysensownych nukleotydw konstrukty oligonukleotydowe komplementarne do mRNA kodujcego biako, ktrego ekspresj chcemy zahamowa. 19. Przeciwciaa monoklonalne (1975 rok - C. Milstein i G. Koehler otrzymali je poraz pierwszy) - s to przeciwciaa majce jednakow swoisto wzgldem danego antygenu i takie samo lub podobne powinowactwo. Otrzymywane s z jednego klonu limfocytw B. Komrka mieszacowa, hybrydoma (= komrka nowotworowa + komrki limfocytw B) niemiertelna, produkujca przeciwciaa (tak otrzymali Milstein i Koehler). 20. Swoisto przeciwcia monoklonalnych okrela limfocyt, z ktrego zostay spreparowane. 21. Przeciwciaa chimeryczne maj niewielki procent przeciwciaa ze zwierzcia, w ktrym je wyprodukowano. Cechuje je niska immunogenno. 22. Przeciwciaa humanizowane maj jeszcze wikszy procent ludzkich immunoglobulin 23. Cakowicie ludzkie przeciwciaa produkowane w zwierztach jako ywych bioreaktorach, po wyizolowaniu przeciwciaa z czowieka i zablokowaniu mechanizmw obronnych (przed czynnikiem ludzkim) u zwierzcia-bioreaktora. 24. Sposoby modyfikacji przeciwcia monoklonalnych: a) przeciwciao monoklonalne + toksyna b) przeciwciao monoklonalne + izotop c) przeciwciao monoklonalne + lek Dziki nim ogranicza si efekty uboczne chemioterapii, dziaajc na konkretne tkanki/komrki nowotworu. 25. Zastosowanie przeciwcia monoklonalnych: a) rodki diagnostyczne (in vivo i ex vivo) b) terapia nowotworw c) profilaktyka kardiologiczna d) immunoterapia. 26. Przeciwciaa monoklonalne jako rodki diagnostyczne s stosowane np. w scyntografii raka okrnicy i odbytnicy (za pomoc fragmentu przeciwciaa mysiego, CEA-Scan - 99m Te arcitumomab). 27. Terapia nowotworw: Panorex MoAb17-1A; pooperacyjne leczenie raka jelita grubego Herceptin Transtuzumab; leczenie raka piersi (przypadki z nadekspresj naskrkowego czynnika wzrostu). 28. Immunoterapia za pomoc przeciwcia monoklonalnych - przykady: przeciwciao chimeryczne (Orthoclone OKT3-muromonab-CD3), humanizowane (Basiliksimab-C) i cakowicie ludzkie (Daktizumab-3C).
Komrki macierzyste
29. Komrki macierzyste (ang. stem cell, komrki pnia) komrki majce zdolno do nieskoczonych podziaw (proliferacji), mogce si rnicowa w dowolny rodzaj komrek. Dopiero po dostaniu odpowiednich sygnaw zaczynaj si rnicowa. 30. Podzia komrek macierzystych ze wzgldu na zdolno do rnicowania: totipotentne (mog si rnicowa we wszystkie rodzaje komrek), pluripotentne (mog si rnicowa we wszystkie komrki, z wyjtkiem komrek oyska), multipotentne (takie, ktre ewoluuj w kilka rnych typw komrek, z reguy o podobnych waciwociach i pochodzeniu embrionalnym), unipotentne (prekursorowe, mogce rnicowa tylko do jednego typu komrek). 31. Podzia komrek macierzystych ze wzgldu na pochodzenie: embrionalne (ESC) wyprowadzone z komrek; mog by totipotentne, gdy pochodz z kilkukomrkowego embrionu, a pluripotentne kiedy pochodz z wza zarodkowego blastocysty somatyczne (dorose komrki macierzyste) komrki macierzyste, ktre znajduj si w tkankach dorosych organizmw; komrki te s multipotentne (jak np. komrki hepatopoetyczne) lub unipotentne (np. miniowe komrki satelitarne). 32. James Alexander Thomson czowiek, ktry zapocztkowa prace nad komrkami macierzystymi. 33. iPSC indukowane pluripotentne komrki macierzyste komrki modyfikowane wstecznie do momentu odzyskania pluripotencji, uzyskiwane z komrek somatycznych; s one reprogramowane do momentu, gdy mogy sta si kad inn komrk. Nie wywouj problemw etycznych. (Otrzymano w 2006 od myszy, w 2007 od ludzi). 34. stycze 2012 pojawienie si pierwszego leku z komrkami macierzystymi (dopucia Poudniowokoreaka Agencja ds. Lekw). 35. luty 2012 odkryto, e komrki raka piersi po poddaniu ich radioterapii przeksztaciy si w bardziej odporne i zoliwe komrki nowotworowe. 36. marzec 2012 podanie pacjentom po transplantacji nerki komrek macierzystych umoliwio nieprzyjmowanie przez nich lekw immunosupresywnych, ktre normalnie musieliby zaywa do koca ycia, obniajc odpowied odpornociow swojego organizmu.
Komrki macierzyste
37. Doping genetyczny wpywanie na organizm w celu jego ulepszenia (vide: poprawa wydolnoci, zmiana profilu metabolicznego, etc.) przez zmiany w jego genomie; niedozwolone w sporcie, szkodliwe zjawisko. 38. Rodzaje dopingu: farmakologiczny z uyciem lekw fizjologiczny transfuzje krwi genetyczny skutek uboczny terapii genowej zastosowanej w celu z ppkt. 37; zakada on: ingerencj w ekspresj genw wszczepienie obcych, zmodyfikowanych komrek podanie bakterii produkujcych hormony, celem zasiedlenia nimi organizmu 39. Doping genetyczny jest trudny do wykrycia szczeglnie w dwu wypadkach: a) terapia genowa mini zwiksza produkcj czynnika stymulujcego wzrost, hamuje podziay komrkowe b) terapia genowa krwi wzrost produkcji erytropoetyny, zwikszenie wytrzymaoci mini. W razie odnalezienia BDW MERYTORYCZNYCH w opracowaniu lub posiadania nielicznie wystpujcych tu MATERIAW BRAKUJCYCH, osoba chtna do uyczenia swoich zapiskw i/lub wiedzy jest proszona o zgoszenie si do autora notatki (!!!)