P. 1
R.murray, granner P.mayes, V.rodwell - Biochemia Harpera

R.murray, granner P.mayes, V.rodwell - Biochemia Harpera

4.71

|Views: 12,584|Likes:
Wydawca: mmm13
biochemia harpera, biochemia, harper
biochemia harpera, biochemia, harper

More info:

Published by: mmm13 on Feb 05, 2009
Prawo autorskie:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF or read online from Scribd
See more
See less

10/20/2015

BIOCHEMIA HARPERA

a LANGE medical book

Harper's

Biochemistry
Twenty-second Edition
Robert K. Murray, MD, PhD Professor of Biochemistry Universtty of Toronto Daryl K. Granner, MD Professor and Chairman Department of Moiecuiar Physiology and Biophysics Professor of Medicine Vanderbitt University Nashville, Tennessee Peter A. Mayes, PhD, DSc Reader in Biochemistry Royał Veterinary College University of London Victor W. Rodwell, PhD Professor of Biochemistry Purdue University West Lafayette, Indiana

Prentice-Hall International Inc.

Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell

BIOCHEMIA HARPERA
Wydanie III Redaktor naukowy tłumaczenia Franciszek Kokot

IHhl. Medyczna CM ID

1816004318

Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL
50LAT

Copyright for the Polish Edition by ydawnictwo Lekarskie PZWL J994, 1995

Z oryginału angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22
Copyright © 1990 by Appleton Lange Ali Rights Reserved i rozdz. 60, 64 z oryginału angielskiego Harper's Btochemistry ed. 23 Copyright © 1993 by Appleton Lange Alt Rights Reserved

pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tłumaczyli
Doc. med. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 12—19) Prof. dr hab. MIECZYSŁAW CHORĄśY (rozdz. 35—42) Prof. dr hab. MARIAN DRÓśDś (rozdz. 57, 58) Prof. dr hab. ZOFIA KILAŃSKA (rozdz. 2—5) Prof. dr hab. LEOKADIA KŁYSZEJKO-STEFANOWICZ (rozdz. 1, 6, 32, 33) Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (rozdz. 44—56, 60, 62 i przedmowa) Prof. dr hab, WANDA MAŁGORZATA KRAJEWSKĄ (rozdz. 7, 10, l i , 34) Prof. dr hab. EUGENIUSZ KUCHARZ (rozdz. 63) Prof, dr hab. BOHDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 59) Prof. dr hab. ANNA LIPIŃSKA (rozdz. 8, 9, 30, 31) Prof. dr hab. JERZY VETULANI (rozdz. 64) Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 43, 61) Prof. dr hab. MARIUSZ ZYDOWO (rozdz. 20—29) Projekt okładki i strony tytułowej Anna Dluiewaka Redaktorzy Krystyna Chąjęcka, Renata Piotrowska-Siemdzka Redaktor techniczny Joanna Głodowska Korektorzy Zespół

1SBN 83-200-1798-X
Wydawnictwo Uliatskie PZWL Warszawa ]»5 Wydanie Iii Cieszyńska Drukarnia Wydawnicza ul. Pokoju I, 43-400 Cieszyn Zam. nr 2543/K-94

PRZEDMOWA / 5

Przedmowa do wydania polskiego
Do rąk Czytelnika oddajemy tłumaczenie 22. wydania „Biochemii Harpera". W trakcie tłumaczenia ukazało się wydanie 23. tej ksiąŜki, wzbogacone o kitka nowych rozdziałów w stosunku do wydania 22. Dlatego teŜ, chcąc dostarczyć Czytelnikom moŜliwie aktualnej wiedzy, postanowiono włączyć do wydania 22. dwa nowe rozdziały z wydania 23. („Erytrocyty i leukocyty" oraz „PodłoŜe biochemiczne niektórych chorób neuropsychiatrycznych"), uwzględniając stan wiedzy z końca 1992 r. Jako redaktor naukowy, odpowiedzialny za obecne polskie wydanie ksiąŜki, kieruję wyrazy głębokiego szacunku i podziękowania do wszystkich Współtłumaczy za trud włoŜony w tłumaczenie poszczególnych rozdziałów. Pragnę podkreślić, Ŝe tłumaczenie ksiąŜki natrafiało na duŜe trudności w zakresie mianownictwa biochemicznego, często nie ustabilizowanego nie tylko w skali naszego kraju, lecz takŜe międzynarodowej. ToteŜ sądzę, Ŝe wartość merytoryczna, a nie nomenklaturowa, będzie głównym kryterium oceny ksiąŜki przez Czytelników. Pragnę wyrazić nadzieję, Ŝe i obecne wydanie „Biochemii Harpera" nie tylko spełni wymagania „starych" Czytelników tej ksiąŜki, lecz takŜe przysporzy jej wielu nowych Czytelników i przyjaciół.

Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot

PRZEDMOWA / 7

Przedmowa
„Biochemia Harpera" dostarcza zwięzłej, choć dostatecznie szerokiej, wiedzy dotyczącej podstaw biochemii i biologii molekularnej. Zawiera ona liczne przykłady na to, Ŝe wiedza biochemiczna jest niezbędna do zrozumienia mechanizmów podtrzymujących zdrowie oraz przyczyn i racjonalnego leczenia licznych chorób, jakimi są szczególnie zainteresowani lekarze i inni pracownicy opieki zdrowotnej. Zmiany dokonane w wydaniu 22. Dwa cele przyświecały autorom przygotowującym obecne wydanie: 1) przedstawienie moŜliwie najnowszej wiedzy biochemicznej, potrzebnej przy studiowaniu medycyny oraz 2) dostarczenie studentom medycyny i innych nauk dotyczących zdrowia ksiąŜki interesującej i lubianej przez uŜytkownika. Odzwierciedleniem tego jest układ i treść nowego wydania. • Wszystkie rozdziały zostały przeredagowane z uwzględnieniem waŜnych postępów wiedzy biochemicznej. • We wstępie większości rozdziałów zasygnali zowano główne problemy będące ich treścią. • Zredukowano szczegółowe omawianie drugorzędowych szlaków metabolicznych. • Liczne ryciny zmodyfikowano w celu po prawienia ich czytelności. • Włączono nowe rozdziały dotyczące „Wody i pH", „Witamin rozpuszczalnych w wo dzie", „Witamin rozpuszczalnych w tłusz czach", „Utleniania kwasów tłuszczowych i ketogenezy", „śywienia" i „Przemiany ksenobiotyków". • W ostatnim rozdziale, który jest równieŜ nowy, znajduje się zwięzłe omówienie bio chemicznych aspektów przyczyn i mechaniz mów chorób. Na podstawie historii choroby 8 chorych zilustrowano uŜyteczność wiedzy biochemicznej dla medycyny. Przedstawione przypadki dotyczą głównych klas przyczyn chorobowych. Rozdział ten, wraz z suple mentem omawiającym testy laboratoryjne, stanowią pomost wypełniający dotychczaso wą lukę dzielącą biochemię od kliniki. Układ ksiąŜki Tekst składa się z 3 rozdziałów wprowadzających i 6 głównych działów. Dział 1 jest poświęcony białkom i enzymom, będącym końmi roboczymi organizmu. PoniewaŜ większość reakcji zachodzących w komórkach ludzkich ma charakter enzymatyczny, jest istotne zapoznanie się z właściwościami enzymów przed omawianiem innych problemów. W dziale II przedstawiono a) róŜne reakcje komórkowe, w których zachodzi utylizacja lub wytwarzanie nośników energetycznych oraz b) szlaki syntezy i rozkładu węglowodanów i lipidów. Ponadto przedstawiono funkcję poszczególnych związków naleŜących do wymienionych klas cząsteczek. W dziale III omówiono poszczególne aminokwasy i ich losy oraz przemiany tych związków przebiegające ze zuŜytkowaniem lub wytwarzaniem energii. W dziale IV przedstawiono strukturę i funkcję kwasów nukleinowych oraz szlak DNA-tRNA->białka. W tej części opisano równieŜ zasady technologii rekombinacji DNA, tj. zagadnienie o niezwykłych implikacjach w dyscyplinach biomedycznych. Treścią działu V są hormony i ich kluczowa rola w komunikacji międzykomórkowej i regulacji poszczególnych szlaków metabolicznych. Po to, aby hormony mogły zadziałać na komórkę, muszą mieć kontakt z błonami komórkowymi. Nic więc dziwnego, Ŝe początek tego działu jest poświęcony strukturze i funkcjom błon. Dział VI składa się z 7 specjalnych rozdziałów, w tym nowego rozdziału omawiającego przemianę ksenobiotyków i biochemiczne aspekty niektórych chorób. W suplemencie podano zwięzłą interpretację wyników badań laboratoryjnych i główne ich implikacje diagnostyczne.

8 / PRZEDMOWA

Podziękowanie Autorzy pragną wyrazić podziękowanie Panu Aleksandrowi Kugushewowi; wiele zmian dokonanych w tym wydaniu nie mogłoby być zrealizowanych bez Jego stałego zainteresowania, rady, „popychania sprawy" i zachęcania. Nasza wdzięczność naleŜy się równieŜ naszym zawodowym Kolegom i Przyjaciołom z całego świata za przekazane sugestie, mające na celu poprawienie ksiąŜki. Zachęcamy ich, aby w dalszym ciągu wykazali zainteresowanie ksiąŜką i nie szczędzili wysiłku w jej ulepszaniu. Za szczególnie cenne uwaŜamy opinie wyraŜone przez studentów.

Autorzy czują się szczególnie usatysfakcjonoszeroką akceptacją i poparciem ksiąŜki w ca ^ m świecie. Przedruki licznych wydań opublikowanych w języku angielskim ukazały sie w Japonii, Libanie, na Tajwanie, Filipinach oraz w Korei. Ponadto ksiąŜkę przetłumaczono na j ązy ^ włoski, hiszpański, francuski, portugalski, japoński, polski, niemiecki, serbsko-chorwacki i grecki,
wam

, ■

_ RKM _ DKG _ PAM _ VWR

SPIS TREŚCI / 9

Spis treści
1. Biochemia i medycyna — Robert K. Murray ........................................................... 2. Biomolekuły i metody biochemiczne — Robert K. Murray .................................... 3. Woda i pH — Victor W. Rodwell .............................................................................. 11 16 26

Część I. Budowa oraz funkcje białek i enzymów 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

...................................

35 35 49 59 70 82 94 110 118

Aminokwasy — Victor W. Rodwell ........................................................................... Peptydy — Victor W. Rodwell ................................................................................. Białka: struktura i właściwości — Victor W. Rodwell ............................................ Białka; mioglobina i hemoglobina — Vtctor W. Rodwell ...................................... Enzymy: właściwości ogólne — Victor W. Rodwell .............................................. Enzymy: kinetyka — Victor W. Rodwell ................................................................... Enzymy: mechanizmy działania — Victor W. Rodwell ............................................ Enzymy: regulacja aktywacji — Victor W. Rodwell ..............................................

C z ę ś ć I I . B io e n e r g e t y k a i m e t a b o l i z m w ę g l o w o d a n ó w o r a z l i p i d ó w 12. Bioenergetyka — Peter A. Mayes ........................................................................... 13. Utlenianie biologiczne — Peter A. Mayes ................................................................ 14._ Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące — Peter A. Mayes ............................................................................ 15. Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes .............................. 16. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym — Peter A. Mayes ............................................ 17. Zarys przemian pośrednich — Peter A. Mayes ........................................................ 18. Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA— Peter A. Mayes ............... y 19. Glikoliza i utlenianie pirogronianu —Peter A. Mayes ........................................... 20. Metabolizm glikogenu — Peter A. Mayes ................................................................ v 21. Glukoneogeneza i kontrola stęŜenia glukozy we krwi — Peter A. Mayes ............ 22. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz — Peter A. Mayes 23. Biosynteza kwasów tłuszczowych — Peter A. Mayes ............................................. 24. Utlenianie kwasów tłuszczowych: ketogeneza — Peter A. Mayes ........................ 25. Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów — Peter A. Mayes ............................................................................................................................ 26. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów — Peter A. Mayes ............................. 27. Transport i magazynowanie lipidów — Peter A. Mayes ......................................... 28. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu — Peter A. Mayes ........................... 29. Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek — Peter A. Mayes .................................................................................................. Część III. Metabolizm białek i aminokwasów .........................................

131 131 139 147 161 173 188 198 207 217 226 239 251 260 274 284 294 314 329 337 337 344 357

30. Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w poŜywieniu — Victor W. Rodwell ......................................................................... 31. Katabolizm białek i azotu aminokwasów — Victor W. Rodwell ........................... 32. Katabolizm szkieletów węglowych aminokwasów — Victor W. Rodwell .............

10 / SPIS TREŚCI 33. Przemiana aminokwasów w wyspecjalizowane produkty — Victor W. Rodwell . 34. Porfiryny i barwniki Ŝółciowe — Robert K. Murray ............................................... Część IV. Budowa, czynność i replikacja makrocząsteczek informacyjnych ................................................................... 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. Nukleotydy — Victor W. Rodweil ........................................................................... Metabolizm nukleotydów purynowych i pi rym idy nowych — Victor W. RoJwell . Struktura i funkcja kwasów nukleinowych — Dary! K. Granner .......................... Organizacja i replika DNA — Dary/ K. Granner ........................................................ Synteza, przekształcenie i metabolizm RNA — Dary/ K. Granner ........................ Synteza białek i kod genetyczny — Dary/ K. Granner ............................................ Regulacja ekspresji genu — Dary/ K. Granner ........................................................ Technologia rekombinacji DNA — Dary/ K. Granner ............................................ 385 398

415 415 425 443 456 476 491 508 529

Część V. Biochemia zewnątrzkomórkowej i wewnątrzkomórkowej komunikacji ........................................................... 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. Błony: struktura, organizacja i funkcja — Dary/ K. Granner .................................... Charakterystyka układów hormonalnych — Dary I K. Granner ............................. Działanie hormonów — Dary! K. Granner ................................................................ Przysadka mózgowa i hormony podwzgórza — Dary/ K. Granner ......................... Hormony tarczycy — Dary/ K. Granner .................................................................. Hormony regulujące przemianę wapniową — Dary/ K. Granner ........................... Hormony kory nadnerczy — Dary/ K. Granner ........................................................ Hormony rdzenia nadnerczy — Dary! K. Granner .................................................. Hormony gonadalne — Dary I K. Granner ................................................................ Hormony trzustki i Ŝołądkowo-jelitowe — Dary/ K. Granner .................................

549 549 573 584 599 612 619 629 645 652 671

C z ę ś ć V I . Z a g a d n i e n i a w y b r a n e ............................................................................ 53. 54. 55. 56. 57. 58. Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie — Peter A. Mayes . . . Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tłuszczach — Peter A. Mayes . . śywienie — Peter A. Mayes ...................................................................................... Trawienie i wchłanianie — Peter A. Mayes ............................................................. Glikoproteiny i proteoglikany — Robert K. Murray ............................................... Białka osocza, immunoglobitliny i czynniki krzepnięcia — Elizabeth J. Harfenist Robert K. Murray ............................................................. 59. Białka kurczliwe i strukturalne — Victor W. Rodwell, Robert K. Murray, Frederick W. Keetey ................................................................... 60. Metabolizm ksenobiotyków — Robert K. Murray ................................................. 61. Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe — Robert K. Murray .................................... 62. Biochemia a choroby — Robert K. Murray ............................................................. 63. Erytrocyty i leukocyty — Robert K. Murray .............................................................. 64. PodłoŜe biochemiczne niektórych schorzeń neuropsychiatrycznych — Robert K. Murray ................................................................................................... Dodatek ............................................................................................................................... Skróty spotykane w biochemii ......................................................................................... Skorowidz ......................................................................................................................... '.

693 693 710 721 734 749 770 794 817 824 842 865 887 910 930 935

Biochemia i medycyna
Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE Biochemia jest to nauka zajmująca się róŜnorodnymi molekułami i związanymi z nimi reakcjami chemicznymi, które zachodzą w Ŝywych komórkach i organizmach. KaŜda informacja wykraczająca poza skrajnie powierzchowną wiedzę o Ŝyciu — we wszystkich jego zróŜnicowanych przejawach — wymaga poznania biochemii. Co więcej, studenci medycyny, zdobywając solidną porcję wiedzy z zakresu biochemii, będą w stanie skonfrontować zarówno w praktyce, jak i w pracy badawczej 2 podstawowe problemy wszystkich nauk medycznych: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia to chemia Ŝycia Biochemię moŜna, bardziej konwencjonalnie, zdefiniować jako naukę dotyczącą chemicznych podstaw Ŝycia (gr. bios — Ŝycie). Komórka jest strukturalną jednostką organizmu Ŝywego. RozwaŜenie tej koncepcji prowadzi do funkcjonalnej definicji biochemii, jako nauki zajmującej się chemicznymi składnikami Ŝywych komórek oraz reakcjami i procesami, którym one ulegają. Zgodnie z nią biochemia obejmuje przepastne obszary biologii komórki i całość biologii molekularnej. Zadaniem biochemii jest opisanie i wyjaśnienie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych zachodzących w Ŝywych komórkach Głównym celem biochemii jest dogłębne poznanie na poziomie molekularnym wszystkich procesów chemicznych związanych z Ŝyciem komórki. Aby wypełnić to zadanie, biochemicy

usiłują wyizolować liczne molekuły znajdujące się w komórkach, określić ich strukturę i zanalizować, jak funkcjonują. Przykładem takich działań są próby zrozumienia molekularnych podstaw skurczu — procesu związanego przede wszystkim, ale nie wyłącznie, z komórkami mięśniowymi, co wymaga oczyszczenia wielu cząsteczek zarówno prostych, jak i złoŜonych, a następnie poddania ich szczegółowym badaniom strukturalno-funkcjonalnym. Dzięki tym wysiłkom ustalono niektóre cechy molekularnych podstaw skurczu mięśni. Kolejnym zadaniem biochemii jest usiłowanie docieczenia, jak powstało Ŝycie. Wiedza na ten fascynujący temat pozostaje nadal w powijakach. Zasięg biochemii jest tak niezmierzony, jak samo Ŝycie. Gdziekolwiek to Ŝycie się pojawia, tam zachodzą procesy chemiczne. Biochemicy badają je w mikroorganizmach, roślinach, owadach, rybach, ptakach, u niŜszych i wyŜszych ssaków oraz u ludzi. Studenci nauk biomedycznych będą zainteresowani zwłaszcza biochemią 2 ostatnich grup. NaleŜy jednak docenić równieŜ biochemię mniej skomplikowanych form Ŝycia, często bezpośrednio związaną z biochemią człowieka. Ma przykład współczesne teorie regulacji aktywności genów i enzymów u ludzi emanują z pionierskich badań dotyczących droŜdŜy piekarskich i bakterii. Dziedzina rekombinacji DNA wyłoniła się z doświadczeń na bakteriach i ich wirusach. Szybkość namnaŜania się (multyplikacji) i łatwość wyekstrahowania ich materiału genetycznego czynią je odpowiednimi dla genetycznych analiz i manipulacji. Wiedza zdobyta z badania genów wirusów odpowiedzialnych za niektóre typy raka u zwierząt (wirusowych onkogenów) zapewniła gruntowny wgląd, w jaki sposób komórki ludzkie stają się nowotworów ymi.

12 / ROZDZIAŁ 1

Znajomość biochemii jest istotna dla wszystkich nauk przyrodniczych, z medycyną włącznie Biochemia kwasów nukleinowych leŜy w sercu genetyki; z kolei zastosowanie metod genetycznych staio się kluczowe do wyjaśnienia wielu dziedzin biochemii. Fizjologia, badająca funkcjonowanie organizmu, niemal kompletnie pokrywa się z biochemią. Immunologia posługuje się licznymi technikami biochemicznymi, a wiele podejść immunologicznych znalazło S2erokie zastosowanie w biochemii. Farmakologia i farmacja opierają się na rzetelnej znajomości biochemii i fizjologii, zwłaszcza Ŝe większość leków jest metabolizowana w reakcjach katalizowanych enzymatycznie, a skomplikowane interakcje pomiędzy lekami najlepiej zrozumieć za pomocą biochemii. Trucizny oddziałują na reakcje i procesy biochemiczne i to jest domeną toksykologii. Biochemiczne podejście znajduje coraz więcej zastosowania w badaniu podstawowych aspektów patologii (nauki o chorobach), np. stany zapalne, uszkodzenia komórek 1 nowotwory. Wiehi przedstawicieli mikrobiolo gii, zoologii i botaniki posługuje się niemal wyłącznie metodami biochemicznymi. Te po wiązania nie są zaskoczeniem, poniewaŜ Ŝycie, jak wiadomo, polega na reakcjach i procesach biochemicznych. Istotnie, dawne bariery mię dzy naukami przyrodniczymi padają, a bio chemia coraz bardziej staje się ich wspólnym językiem. Wzajemne oddziaływanie między biochemią a medycyną pobudza stały postęp w obu tych dziedzinach Jak wspomniano na początku tego rozdziału, 2 główne problemy pracowników nauk medycz nych, a zwłaszcza lekarzy, to: 1) zrozumienie, jak zachować zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorób i ich skuteczne leczenie. Biochemia zapisała się na trwałe w obu tych fundamentalnych zagadnieniach medycyny. Faktycznie wzajemne oddziaływanie biochemii i medycyny to tak, jak szeroka dwukierunkowa ulica. Analizy biochemiczne wyjaśniły wiele aspektów z dziedziny zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie róŜnych przejawów zdrowia i choroby otwiera coraz to nowe obszary przed biochemią. Wzajemna współpraca medycyny i biochemii ma waŜne implikacje filozoficzne dla tej pierwszej. Jak długo postępowanie lekarskie będzie mocno zakorzenione w gruntownej znajomości

biochemii oraz innych pokrewnych nauk podstawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, Ŝywienia), tak długo medycyna praktyczna będzie miała racjonalną podstawę do zastosowania coraz to nowych osiągnięć wiedzy. Kontrastuje to jaskrawo z kultem niekonwencjonalnej medycyny, która często opiera się na niczym więcej niŜ na micie, poboŜnych Ŝyczeniach i braku bazy intelektualnej. PRAWIDŁOWE PROCESY BIOCHEMICZNE SĄ PODSTAWĄ ZDROWIA Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) definiuje zdrowie jako stan w pełni dobrego samopoczucia fizycznego, umysłowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub zniedołęŜnienia. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie moŜe być rozwaŜane jako sytuacja, » której wszystkie z wielu tysięcy reakcji wewnątrz- i zewnątrz komórkowych, zachodzących w organizmie, przebiegają z szybkością adekwatną do jego maksymalnego przetrwania w stanie fizjologicznym. Badania biochemików znajdują oddźwięk w odŜywianiu i medycynie prewencyjnej Głównym warunkiem zachowania zdrowia jest pobieranie w poŜywieniu optymalnej ilości związków chemicznych; głównymi z nich są witaminy, niektóre aminokwasy, pewne kwasy tłuszczowe, róŜne substancje mineralne i woda. Wiele zagadnień z biochemii oraz Ŝywienia dotyczy badania róŜnych aspektów tych właśnie związków chemicznych, wobec czego współdziałanie obu wymienionych dyscyplin jest bardzo ścisłe. Ponadto, ze względu na dąŜenie do obniŜenia rosnących kosztów opieki lekarskiej, najprawdopodobniej większy nacisk zostanie połoŜony na systematyczne działania w celu zachowania zdrowia i zapobiegania chorobom, tj. na medycynę prewencyjną. Zatem podejście Ŝywieniowe do przeciwdziałania np. miaŜdŜycy tętnic i nowotworom prawdopodobnie uzyska rosnące poparcie. Zrozumienie znaczenia odŜywiania zaleŜy jednak w rozległym zakresie od znajomości biochemii.

BIOCHEMIA i MEDYCYNA / 13

KaŜda choroba ma biochemiczne uzasadnienie Wszystkie choroby są manifestacją zaburzeń w cząsteczkach, reakcjach chemicznych i procesach. Główne czynniki odpowiedzialne za powstawanie chorób u ludzi i zwierząt są wymienione w tab. l-l. Wszystkie one mogą wpłynąć na jedną lub więcej zmian chorobotwórczych w reakcjach chemicznych lub molekułach organizmu.

Tabela 1 -1. Główne przyczyny chorób, wpływające na róŜnorodne mechanizmy biochemiczne w komórce lub organizmie* 1. Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, eks tremalne temperatury, nagle zmiany ciśnienia atmosferycznego, promieniowanie, szok elekt ryczny 2. Czynniki chemiczna i leki: pewne związki toksyczne, środki terapeutyczne itp. 3. Czynniki biologiczne: wirusy, riketsje, bak terie, grzyby, wyŜsze formy pasoŜytów 4. Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie poje mności tlenowej krwi, zatrucie enzymów ok sydacyjnych 5. Genetyczna: wrodzone, molekularne 6. Reakcje immunologiczne: anafilaksja. cho roba autoimmunologiczna 7. Zaburzania w odŜywianiu: niedobory i nad miary 8. Zachwiania równowagi wewnątrzwydzielniczej: niedobory i nadmiary hormonów * Zaadaptowano za zgodą z: Robbins SL, Cotram RS, KumarV: The Pathologic Bas/s of D/sease, wyd. 3, Saunders, 1984.

Badania biochemiczne pomagają w diagnozie, prognozie i leczeniu Istnieje bogata dokumentacja potwierdzająca zastosowanie biochemii w zapobieganiu chorobom, diagnozie i leczeniu chorób. Wiele dowodów na to moŜna znaleźć w kolejnych rozdziałach tej ksiąŜki. JednakŜe na tym etapie, w celu zilustrowania ogromu przedmiotu i zainteresowania nim Czytelnika, wydaje się niezbędne podanie 7 krótkich przykładów. 1. Człowiek musi pobrać pewną liczbę złoŜonych cząsteczek organicznych, zwanych witaminami, aby utrzymać zdrowie. Witaminy są,

ogólnie rzecz biorąc, zamieniane w organizmie na bardziej kompleksowe cząsteczki (koenzymy), które odgrywają kluczową rolę w wielu reakcjach komórkowych. Brak którejś z witamin w poŜywieniu znajduje oddźwięk w spowodowanej tym faktem chorobie, takiej jak gnilec lub krzywica (wynikłej odpowiednio z niedoboru witaminy C lub D). Wyjaśnienie kluczowej roli witamin, lub teŜ ich aktywnych biologicznie pochodnych w komórkach zwierzęcych i ludzkich jest głównym wspólnym problemem biochemików i dietetyków od przełomu naszego stulecia. Gdy tylko ustalono, Ŝe dana choroba jest wywoływana brakiem jakiejś witaminy, wówczas stało się racjonalne jej leczenie podawaniem brakującej witaminy. 2. Fakt, iŜ wiele roślin- afrykańskich jest pozbawionych jednego lub kilku istotnych, czyli niezbędnych, aminokwasów, które muszą być dostarczone z zewnątrz w celu utrzymania zdro wia, pomógł wytłumaczyć wyniszczające nie doŜywienie białkowo-energetyczne (kwashiorkor), będące chorobą tych, dta których owe rośliny stanowią główne źródło białka. Leczenie niedoboru istotnych aminokwasów jest tu roz sądną konsekwencją, ale, niestety, nie zawsze moŜliwą do przeprowadzenia. Polega ono na zapewnieniu wywaŜonej diety, zawierającej od powiednie ilości wszystkich niezbędnych ami nokwasów. 3. Grenlandzcy Eskimosi (ang. Inuit) spoŜy wają duŜe ilości oleju rybnego bogatego w nie które wiełoRienasycone kwasy tłuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids; skrót — PUFA). Badania wykazały, Ŝe odznaczają się oni małym stęŜeniem cholesterolu w osoczu i rzadką za chorowalnością na miaŜdŜycę tętnic. Te obser wacje wywołały Ŝywe zainteresowanie moŜliwo ścią stosowania PUFA w celu zmniejszenia stęŜenia cholesterolu. Zarówno choroby wywołane brakiem witamin, jak i te spowodowane niedoborem istotnych aminokwasów, to przykłady zaburzeń odŜywiania (p. tab. 1-1). MiaŜdŜyca tętnic moŜe być uwaŜana za przykład zaburzenia spowodowanego nieprawidłowym odŜywianiem, ale wiąŜą się z nią takŜe inne, np. genetyczne, czynniki. 4. Stan znany jako fenyloketonuria (ang. phenylketonuria; skrót — PKU) nie leczony prowadzi do cięŜkich zaburzeń umysłowych juŜ w dzieciństwie. Podstawa biochemiczna PKU jest znana od ponad 30. lat. Jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie (tab. 1-1), spowo-

14 / ROZDZIALI dowane brakiem lub małą aktywnością enzymu, który przekształca fenyloalaninę w tyrozynę. W konsekwencji niedoboru enzymu, fenyloalanina i niektóre jej metabolity, takie jak fenyloketony, gromadzą się w tkankach i niszczą rozwijający się ośrodkowy układ nerwowy. Odkąd udowodniono naturę biochemicznego zaburzenia w PKU, kolejnym logicznym krokiem stało się leczenie dzieci z fenyloketonurią dietą o małej zawartości fenyloalaniny. Gdy tylko masowe testy biochemiczne na rozpoznanie PKU zaraz po urodzeniu okazały się moŜliwe do przeprowadzenia, wówczas stało się realne skuteczne leczenie tej wady metabolicznej. 5. Mukowiscydoza (łac. fibrosis cystica) jest to znana choroba gruczołów wydzielania ze wnętrznego i gruczołów potowych, uwarunko wana genetycznie (p. tab. 1-1), Charakteryzuje ją nienaturalnie lepka wydzielina, która zatyka przewody wydzielnicze trzustki i oskrzeliki. Chorzy na mukowiscydozę mają takŜe zwięk szone ilości chlorków w pocie. Ofiary tej choro by często umierają w młodym wieku na zakaŜe nie płuc. Bardzo niedawno (1989 r.) wyizolowa no i zsekwencjonowano gen związany z tą chorobą. Prawidłowy gen koduje łańcuch 1480 aminokwasów białka transbłonowego, które wydaje się być kanałem dla chlorków lub, prawdopodobnie, jakimś regulatorem takiego kanału. Nieprawidłowością u prawie 70% cho rych na mukowiscydozę wydaje się być delecja 3 nukleotydów w DNA, co powoduje brak w tym transmembranowym białku aminokwasu w pozycji 508, tj. reszty fenyloalaniny. W ja ki sposób ta delecja uszkadza czynność owego transbłonowego białka i powoduje gęs ty śluz, czeka Jeszcze na opracowanie. To waŜne zadanie powinno Ułatwić odnalezie nie nośników genu fibrosis cystica i spowo dować racj onalniej sze leczenie niŜ obecne. Prawdopodobnie moŜliwe byłoby przygoto wanie leku, który korygowałby zaburzenie w białku transbłonowym, a takŜe nie jest wy kluczone, Ŝe moŜna by wprowadzać prawid łowy gen do komórek płuc w wyniku leczenia genetycznego. 6. Analiza mechanizmu działania toksyny bakteryjnej, powodującej cholerę, dostarczyła waŜnego czynnika do zrozumienia przyczyny klinicznych objawów tej choroby (obfita bie gunka, utrata elektrolitów i wody z organizmu). 7. Odkrycie, iŜ komary przenoszące zarodźce (plazmodia) powodujące zimnicę są w stanie wytworzyć w sobie barierę ochronną o podłoŜu biochemicznym na działanie środków owadobójczych, ma waŜne implikacje w próbach wyeliminowania tej choroby. Ten przykład i poprzednie reprezentują choroby powodowane przez czynniki biologiczne (p, tab. 1-1), Wiele analiz biochemicznych naświetla mechanizmy chorób, które z kolei inspirują badania w określonych działach biochemii Wstępne obserwacje, poczynione w początkach naszego stulecia przez angielskiego lekarza Archibalda Garroda na małej grupie wrodzonych wad metabolicznych, wzbudziły poszukiwanie biochemicznych przyczyn tego stanu. Badania dotyczące genezy przyczyn choroby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako hipercholesterolemia rodzinna, będącej przyczyną zaawansowanej miaŜdŜycy tętnic w młodym wieku, umoŜliwiły radykalny postęp w dziedzinie receptorów komórkowych i mechanizmów przyswajania cholesterolu przez komórki. Prace z zakresu onkogenów w komórkach rakowych zwróciły uwagę na mechanizmy molekularne związane z kontrolowaniem prawidłowego wzrostu komórkowego. Te i wiele innych przykładów ilustruje, jak obserwacje poczynione w klinice mogą otworzyć szerokie obszary funkcjonowania komórek dla badań biochemicznych. TA KSIĄśKA POMOśE POWIĄZAĆ WIEDZĘ Z ZAKRESU BIOCHEMII Z PROBLEMAMI KLINICZNYMI Końcowy rozdział podsumowuje wiele koncepcji, pojawiających się w tekście, dotyczących powiązania biochemii z patologią. Przykładami są tutaj takŜe mechanizmy biochemiczne działające w poszczególnych chorobach, które powoduje kaŜda z 8 przyczyn wymienionych w tab. 1-1. W suplemencie omówiono równieŜ podstawowe rozwaŜania stosowane podczas interpretacji wyników biochemicznych testów laboratoryjnych wykonywanych rutynowo w praktyce klinicznej. Głównym celem tych starań jest pomoc i zachęta dla Czytelnika, aby umiał przetransponować wiedzę z zakresu biochemii w swoją działalność kliniczną. Wykorzystanie badań biochemicznych w odniesieniu do chorób moŜna podsumować w 5 punktach.

BIOCHEMIA I MEDYCYNA / 16

Takie badania mogą: 1) odkryć przyczyny choroby, 2) zaproponować racjonalne i skuteczne jej leczenie, 3) umoŜliwić masowe testy do wczesnej diag nozy, 4) ułatwić monitorowanie postępów choroby, 5) ułatwić ocenę skutku leczniczego.

Suplement do tej ksiąŜki opisuje najwaŜniejsze rutynowe biochemiczne testy diagnostyczne, uŜywane do wykrywania chorób (tzn. do celów określonych w pkt. 3, 4 i 5). PosłuŜy on za poŜyteczne źródło informacji przy omawianiu biochemicznej diagnostyki chorób (np. zawału serca, ostrego zapalenia trzustki).

2

Biomolekuły i metody biochemiczne
Robert K. Murray, MD, PhD

WPROWADZENIE
Celem niniejszego rozdziału jest przedstawienie 5 zagadnień istotnych dla zrozumienia biochemii oraz wskazania głównych kierunków pomagających w przyswojeniu wiedzy niniejszego podręcznika. Omówiono więc zwięźle kolejno: 1. Skład chemiczny organizmu i podstawowe klasy cząsteczek w nim występujących. 2. Budowę struktur komórkowych i sposobu ich wydzielania. 3. Wagę rozwiązań doświadczalnych i właś ciwego dobom metod stosowanych w biochemii. 4. Główne osiągnięcia w biochemii oraz 5. Słabo rozwinięte działy biochemii dotyczą ce m.in. rozwoju, róŜnicowania, funkcji mózgu, nowotworów i innych chorób człowieka. Wobec powyŜszego być moŜe staną się one dla niektórych Czytelników motorem przyszłego ich udziału w badaniach nad tymi problemami.

rolę w licznych procesach biologicznych i znajduje się w centrum wielu aktualnie prowadzonych badań. Pierwiastki wyszczególnione w kolumnie 3. tab. 2-1 pełnią róŜnorakie funkcje. Większość z nich spotyka się w codziennej praktyce lekarskiej u chorych z zaburzeniami równowagi elektrolitowej (K.+, Na + , Cl" i Mga+), niedokrwist ością spowodowaną niedoborem Ŝelaza (Fe2+) lub chorobami tarczycy (I").
Tabela 2-1. PrzybliŜony skład chemiczny organizmu ludzkiego (w przeliczeniu na suchą masę)* Pierwiastek Procent Pierwiastek Procent Węgiel Tlen Wodór Azot Wapń Fosfor
50 20 10 8,5 4 2,5

Potas Siarka Sód Chlor Magnez śelazo Mangan
Jod

1

0,8 0,4
0,4 0,1

0,01 0.001 0,00006

ORGANIZM LUDZKI SKŁADA SIĘ Z KILKU PIERWIASTKÓW, KTÓRE TWORZĄ RÓśNE CZĄSTECZKI Główne pierwiastki to: węgiel (C), wodór <H), tten (O) i azot (N)
Skład chemiczny organizmu ludzkiego został poznany, a podstawowe jego składniki przedstawiono w tab. 2-1. Węgiel, tlen, wodór i azot stanowią główne składniki większości biomolekuł. Fosfor jest składnikiem kwasów nukleinowych i innych związków, a w fprmie zjonizowanej jest równieŜ szeroko rozprzestrzeniony w organizmie człowieka. Wapń odgrywa kluczową

* Cytowane za zgodą z: West ES, Todd WR: Textbook of Biochemistry, 3 wyd., Macmillan, 1961.

Główne biopołinrtery to DNA, RNA, białka, polisacharydy i złoŜone lipidy
Jak przedstawiono w tab. 2-2, główne zespoły biocząsteczek w komórkach i tkankach wyŜszych zwierząt (włączając człowieka) to: DNA, RNA, białka, polisacharydy i lipidy. Te złoŜone cząsteczki są zbudowane z prostych cząsteczek, które takŜe wymieniono w tab. 2-2. Cegiełki

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 17

budulcowe DNA i RNA (ogólnie znane jako kwasy nukleinowe) to odpowiednio deoksyrybonukleotydy i rybonukleotydy, natomiast bu-

dujące białka to aminokwasy. Polisacharydy są zbudowane z prostych węglowodanów: w przypadku gfikogenu (głównego polisacharydu występującego w tkankach ludzkich) cegiełką budulcową jest glukoza. Kwasy tłuszczowe mogą

być uwaŜane za jednostki budulcowe lipidów, chociaŜ lipidy nie są polimerami kwasów tłuszczowych. DNA, RNA, białka i polisacharydy zalicza się do hiopolimerów, poniewaŜ składają się z powtarzających się cegiełek budulcowych (monomerów). Te złoŜone cząsteczki stanowią istotne „tworzywo Ŝycia". Większość przedstawionego tekstu będzie wiec związana z opisem róŜnych biochemicznych właściwości tych biopolimerów i monomerów. Takie same złoŜone cząsteczki znaleziono równieŜ wśród niŜszych organizmów, chociaŜ cegiełki budulcowe w niektórych przypadkach mogą się róŜnić od tych przedstawionych w tab. 2-2, np. bakterie nie mają glikogenu i triacylogliceroli, ale mają one inne poiisacharydy i lipidy.

Białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne stanowią główne komponenty organizmu ludzkiego Skład chemiczny organizmu ludzkiego przedstawiono w tab. 2-3. Główne jego komponenty to: białka, tłuszcze, węglowodany, woda i składniki mineralne. Woda stanowi główny składnik, choć jej ilość waha się w szerokim zakresie wśród róŜnych tkanek. Polarny charakter i zdolność tworzenia wiązań wodorowych czynią wodę idealnym rozpuszczalnikiem w organizmie. Szczegółowe znaczenie właściwości wody zostanie przedstawione w rozdz. 3.
Tabela 2-3. Prawidłowy skład chemiczny człowieka o masie ciała 65 kg* Kilogramy Białka
Tłuszcze 11

Procent 17,0 13,8
1,5

9
1 40 4

Węglowodany Woda** Składniki mineralne

61,6
6,1

Tabela 2-2. Główne złoŜone biomolekuły organiczne komórek i tkanek. Kwasy nukleinowe, białka i polisacharydy są biopolimerami zbudowanymi z poniŜej przedstawionych jednostek budulcowych. Lipidów ogólnie nie zalicza się do biopolimerów i nie wszystkie lipidy zawierają kwasy tłuszczowe jako jednostki budulcowe Blomolekula Jednostka budulcowa
DNA RNA Deoksyry bonu kleotyd Rybonukleotyd Aminokwasy

* Cytowane za zgodą z: Davidson SD, Passmore R, Brock JF: Human Nutrition and Dietetics, wyd. 5, Churchill Livingstone, 1973. ** Zawartość wody moŜe róŜnić się między róŜnymi tkankami, występując w małej ilości (22,5%) w kościach bezszpikowych, Zawartość procentowa wody wykazuje tendencje zmniejszania, gdy zwiększa się odsetek lipidów w organizmie.

Podstawowe funkcje Materiał genetyczny Matryca w biosyntezie białek RóŜnorodność pełnionych funkcji w komórkach (np, enzymy, elementy kurczliwe) Krótkotrwałe magazynowanie energii w postaci glukozy RóŜnorodne, np. składniki błon komórkowych, długotrwałe magazynowanie energii w postaci triacylogliceroli

KOMÓRKA PODSTAWOWĄ JEDNOSTKĄ śYCIA W XIX w. w badaniach Schleidena i Schwanna oraz innych pionierów, takich jak Virchow uznano komórkę za podstawową jednostkę aktywności biologicznej. JednakŜe dopiero bezpośrednio po II wojnie światowej 3 wydarzenia zapoczątkowały okres nierównomiernego rozwoju w biochemii i biologii komórki. Były to: 1) zwiększająca się dostępność mikroskopu elektronowego, 2) wprowadzenie metod pozwalających rozbijać komórki, w warunkach względnie

Białko

Polisacharydy (glikogen) Lipidy

Glukoza

Kwasy tłuszczowe

łagodnych, zapewniających ich funkcje, oraz 3) zwiększająca się dostępność wysokoobrotowej
ultra wirówki z chłodzeniem, zapewniającej wy-

tworzenie siły odśrodkowej wystarczającej do

2

Biochemia

18 / ROZDZIAŁ 2

rozdzielenia rozbitych komórek, bez ich przegrzewania. Zastosowanie mikroskopu elektronowego ujawniło wiele nie znanych wcześniej lub słabo widocznych składników komórkowych, których rozbicie i ultrawirowanie pozwoliło na ich wydzielenie i analizę in vitro, Hepatocyt szczura — modelowa komórka eukariotyczna Schemat strukturalny komórki wątroby {hepatocytu) szczura przedstawiono na ryc. 2-1. Hepatocyt jest prawdopodobnie najczęściej badaną komórką ze wszystkich komÓTek pod względem biochemicznym, częściowo z powodu łatwej jej dostępności w stosunkowo duŜych ilościach odpowiednich do frakcjonowania i badania róŜnorodności jej funkcji. Hepatocyt zawiera główne organelle występujące w komórkach eukariotycznych (tab. 2-4). Są to: jądro komórkowe, mitochondria, siateczka śródplazmatyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego, lizosomy, peroksysomy, błona komórkowa i niektóre elementy cyt o szkieletu. Do rozbicia komórek i wydzielania organelli i wewnątrzkomórkowych cząsteczek stosuje się techniki fizyczne W celu zbadania funkcji dowolnej organelli naleŜy, w pierwszej kolejności, wydzielić ją we względnie czystej formie, wolnej od większych zanieczyszczeń innymi elementami strukturalnymi komórki. Utarty sposób, który pozwala to osiągnąć, nazywa się frakcjonowaniem subkomórkowym i ogólnie wymaga 3 operacji, tj. ekstrakcji, homogenizacji i wirowania. Większość pionierskich badań w tym zakresie wykonano wykorzystując wątrobę szczura. Ekstrakcja. Pierwszy etap w kierunku izolowania określonej organelli (czy cząsteczek) stanowi jej ekstrakcja z komórek, w których się znajduje. W większości organelle i biomolekuły są nietrwałe i tracą biologiczną aktywność; muszą więc być ekslrahowane w warunkach łagodnych (np. stosowanie roztworów wodnych i pozbawionych ekstremalnych wartości pH, ciśnienia osmotycznego i wysokich temperatur). Rzeczywiście, większość metod izolowania organelli wykorzystuje temp. 0 — 4°C (tj. w chłodni lub utrzymywanie badanego materiału w pojemnikach z lodem). Znaczna utrata aktywności moŜe mieć miejsce w temperaturze pokojowej, częściowo wskutek działania róŜnych enzymów trawiennych (proteaz, mikleaz, itd.), uwolnionych podczas rozbijania komó-

3 i steczka Srńdplazmatyczna

Cytozol
Rybosom

Aparat Golgiego

Błona
cytoplazmatyczna Lizosom

Ryc. 2-1. Schemat komórki wątroby szczura z jej głównymi organellami.

rek. Ogólnie stosowany roztwór do ekstrakcji organelli komórkowych zawiera 0,25 mol/l sacharozy (izotonicznej), doprowadzonej do pH 7,4 za pomocą 0,05 mol/l buforu Tris (trishydroksymetyloaminometan) — kwas solny i jony K+ i Mg2+ o stęŜeniu zbliŜonym do wartości fizjologicznych; ten roztwór jest nazywany umownie STKM. Nie wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji są tak łagodne jak STKM; np. rozpuszczalniki organiczne wykorzystywane do ekstrakcji lipidów i kwasów nukleinowych. Homogenizacja. Aby wyekstrahować organelle (lub biocząsteczkę) z komórek, najpierw naleŜy rozbić komórki w łagodnych warunkach. Narządy (np. wątroba, nerka, mózg) i zawarte w nich komórki mogą być rozbite w sposób standardowy przez homogenizację, podczas której napędzany ręcznie lub mechani-

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 19 Tabeła 2-4. Główne organelle wewnątrzkomórkowe i ich czynnością W zestawieniu podano tylko podstawowe funkcje związane z kaŜdą z tych struktur. W wielu przypadkach w organellach moŜe przebiegać kilka szlaków metabolicznych, procesów czy reakcji Organella lub frakcja* Znacznik (Marker) Jądro komórkowe Mitochondrium Rybosom* Siateczka śródpiazmatyczna DNA Dehydrogenaza bursztynianowa DuŜa zawartość RNA GI u kozo - 6 - fosfataza

Główne czynności
Miejsce chromosomów Miejsce syntezy RNA zaleŜnej od DNA (transkrypcja) Cykl kwasu cytrynowego, oksydacyjna fosforyiacja Miejsce biosyntezy białek (translacja mRNA w biatka) Rybosomy związane z błonami są głównym miejscem biosyntezy białek Biosynteza róŜnych lipidów Utlenianie wielu ksenobiotyków (cytochrom P-450) Miejsce licznych hydrolaz (enzymów katalizujących reakcje degradacyjne) Transport cząsteczek do i z komórek Wewnątrzkomórkowa adhezja i wymiana Wewnątrzkomórkowy rozdział białek Reakcje glikozylacji Reakcje powstawania siarczanów Degradacja niektórych kwasów tłuszczowych Wytwarzanie i degradacja nadtlenku wodoru Mikrof i lamenty, mikrotubule; filamenty pośrednie Enzymy glikoltzy, syntezy kwasów tłuszczowych

Uzosom Błona cytoplazmatyczna Aparat Golgiego

Fosfataza kwaśna Na+/K + -ATPaza, 5'-nukleotydaza Galaktozylotransferaza Katalaza Oksydaza moczanowa Brak swoistych znaczników** Dehydrogenaza mlecza nowa

Peroksysom Cytoszkielet* Cytozol*

* Orga nel la sta nowi wewnątrzkomórkową substrukturę otoczoną btoną i wydzieloną pr zez wirowanie przy duŜej sile odśrodkowej. W związku z powyŜszym rybosomy, cytoszkielet i cytozol nie są organellami. Zamieszczono je w tabeli ze względu na ich izolowanie przez wirowanie róŜnicowe. Mogą być rozpatrywane jako struktury wewnątrzkomórkowe lub frakcje. Organeile izolowane w toku pojedynczego cyklu wirowania róŜnicowego nie są czyste. W celu uzyskania czystych frakcji jest wymagane wielokrotne powtórzenie cyklu oczyszczania, ** Frakcje cytokszkieletowe mogą być ocenione za pomocą mikroskopii elektronowej lub przez analizę elektroforetyczną charakterystycznych dla nich białek.

cznie ttok obraca się w szklanej probówces odpowiednich rozmiarów, zawierającej pocięte kawałki narządu we właściwym środowisku, takim jak STKM. Kontrolowane obroty tłoka powodują cięcie i rozbijanie komórek, uwalniając ich składniki do roztworu sacharozy. Otrzymana zawiesina, zawierająca wiele nie naruszonych organelli, nazywa się homogenałem. Wirowanie. Frakcjonowanie składników homogenatu przez wirowanie róŜnicowe jest techniką o kluczowym znaczeniu w biochemii, W klasycznej metodzie stosuje się serię 3 odwirowań przy stopniowo zwiększających się szybkościach (ryc. 2-2), z których kaŜde dostar-

cza osadu i supernatantu. Supernatant na kaŜdym etapie poddaje się odwirowaniu. Takie postępowanie pozwala otrzymać 3-krotnie osad, nazywany odpowiednio frakcją jądrową, mitochondrialną i mikrosomalną. śadna z tak uzyskanych frakcji nie reprezentuje w pełni czystych organelli. JednakŜe, na podstawie badań w mikroskopie elektronowym oraz analizy aktywności odpowiednich enzymów — znaczników (ang, markerów) i składników chemicznych (np. DNA i RNA), stwierdzono, Ŝe głównymi elementami opisywanych 3 frakcji są odpowiednio: jądra komórkowe, mitochondria i mikrosomy. Znacznikowy enzym lub składnik chemiczny jest jednym z parametrów prawie

20 / ROZDZIAŁ 2

, Supernatant (1)

Supernatan t (2)

Supernatant (31

600 g • \i
■:-::-i

15,000 g
x 5 min

x 10 min.
,Homogenat

105,000 g x 60 min

.

p
Frakcja Jądrowa Frakcja mllochondfialna , Frakcja ml kro BO ma tna

Ryc. 2-2. Schemat rozdziału frakcji wewnątrzkomórkowych za pomocą wirowania róŜnicowego. Zhomogenizowaną tkankę (np. wątrobę) początkowo poddaje się wirowaniu przy małej sile odśrodkowej, która dostarcza frakcji jądrowej {zawierającej jądra komórkowe i nienaruszone komórki) oraz supernatantu (1). Supernatant (1) dekantujesię i poddaje wirowaniu przy średniej sile odśrodkowej, które prowadzi do otrzymania frakcji mitochondrialnej {zawierającej mitochondria, lizosomy i peroksysomy) i supernatantu (2). Supernatant ten poddaje się dekantacji oraz wirowaniu przy duŜej sile odśrodkowej. Osad z tego wirowania stanowi frakcję mikrosomainą (zawierającą mieszaninę wolnych rybosomów oraz gładką i szorstką siateczkę śród plaŜ maty czną) i końcowy, klarowny płyn — supernatant {3). Ten ostatni odpowiada cytozolowi, czyli sokowi komórkowemu. RóŜne modyfikacje tego podstawowego schematu wirowania róŜnicowego umoŜliwiają izolację kaŜdej organelli komórkowej we względnie czystym stanie.

wyłącznego występowania w określonej organelli, np. fosfataza kwaśna — w lizosomach, DNA — w jądrze komórkowym (tab. 2-4). W ten sposób znacznik moŜe stanowić wskaźnik obecności lub braku w poszczególnej frakcji organelli, w których on występuje. Frakcja mikrosomalna (mikrosomy) zawiera głównie mieszaninę gładkiej i szorstkiej (siateczka śródplazmatyczna z połączonymi z nią rybosomami) siateczki śródplazmatycznej oraz wolnych rybosomów. Zawartość ostatniego supernatantu odpowiada rozpuszczalnej frakcji cytopiazmy (cytozoł). Modyfikacja tej podstawowej metody wirowania róŜnicowego przez stosowanie odmiennych środowisk do homogenizacji tkanek, róŜnych technik wirowania (np. ciągły lub skokowy gradient stęŜenia sacharozy) pozwala wydzielić lepiej lub gorzej oczyszczone postacie wszystkich organelli komórkowych przedstawionych na ryc. 2-1 i wymienionych w tab. 2-4. Opisany powyŜej schemat frakcjonowania moŜe znaleźć zastosowanie, w ogólnym zarysie, do większości narządów i komórek. Jednak frakcjonowanie komórek tym sposrobem musi być ocenione przez analizę w mikroskopie elektronowym w celu standaryzacji metody. Nie naleŜy

przeceniać znaczenia badań frakcjonowania struktur komórkowych w rozwoju biochemii i biologii komórki. Stanowi ono jedno z waŜniejszych rozwiązań doświadczalnych (patrz niŜej) i głównie dzięki jego wykorzystaniu wyjaśniono funkcje organelli, przedstawionych w tab. 2-4. Informacje o funkcjach poszczególnych organelli, przedstawione w tej tabeli, stanowią główne osiągnięcia badań biochemicznych (patrz niŜej). Rozwiązanie doświadczalne obejmuje 3 etapy Rozwiązanie doświadczalne stosowane w biochemii obejmuje 3 główne etapy: 1) izolowanie biomolekul i organelli (p. powyŜej: Wirowanie), 2) określenie struktury biomolekuł oraz 3) analizy, z wykorzystaniem róŜnych preparatów, funkcji i metabolizmu biomolekuł (tj. syntezy i degradacji). Izolowanie biomolekuł Wyjaśnienie funkcji biomolekuł, podobnie jak w przypadku organelli, wymaga przede wszystkim wydzielenia ich w czystej postaci. W tabeli 2-5 przedstawiono główne metody

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 21

wykorzystywane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. W tym podrozdziale nie podano szczegółów metodycznych, niektóre z nich zostaną krótko opisane w róŜnych miejscach tego podręcznika. Połączenie kilku metod jest prawie zawsze nieodzowne w oczyszczaniu biomolekuł do stanu jednorodności (wolnych od zanieczyszczeń innymi biomolekułami). NaleŜy podkreślić, Ŝe postępy biochemii są uwarunkowane rozwojem nowych metod analizy, oczyszczania i badania struktury. Na przykład biochemię lipidów zrewolucjonizowało wprowadzenie chromatografii ciecz owo-gazowej i chromatografii cienkowarstwowej. Analiza błon biologicznych i wielu białek przysparzała ogromnych trudności, aŜ do chwili wprowadzenia elektroforezy w Ŝelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE). Wprowadzenie detergentu — siarczanu dodecylu sodu (SDS) — pozwala „rozpuścić" wiele białek do analizy elektroforetycznej, które przedtem uchodziły

raczej za nierozpuszczalne. Rozwój metod sekwencjonowama i klonowania DNA dokonał przewrotu w badaniach kwasów nukleinowych i biologii w ogóle. Określanie struktury biomolekuł Kiedy biocząsteczki zostaną oczyszczone, wtedy naleŜy określić ich strukturę. Pozwoli to na szczegółowe znalezienie zaleŜności między ich budową a Funkcją. Główne metody, wykorzystywane w analizie budowy biomolekuł, przedstawiono w tab. 2-6. Są one znane Czytelnikowi, który ma pewien zakres wiedzy z chemii organicznej. Znana swoistość niektórych enzymów czyni je bardzo uŜytecznymi narzędziami w wyjaśnieniu właściwości strukturalnych pewnych biomolekuł. Udoskonalenia w ich rozdzielaniu dokonano dzięki postępowi teoretycznemu i technologicznemu, w wyniku wprowadzenia spektrometrii masowej i spektroskopii jądrowego rezonansu magnetycznego (NMR), które stały się metodami z wyboru do oznaczania budowy. Na przykład budowa bardzo złoŜonych łańcuchów węglowodanowych, wykryta w niektórych biomolekulach, takich jak glikoproteiny, obecnie często moŜe być wyjaśniona dzięki spektroskopii wysokorozdzielczej NMR. Najbardziej wnikliwej informacji o budowie biomolekui dostarcza dyfrakcja promieniami X i krystalografia. Zastosowanie ich było przełomem w wyjaśnieniu szczegółów budowy róŜnych białek i enzymów oraz natury podwójnego heliksuDNA.
Tabela 2-6. Główne metody stosowane w określeniu struktur biomolekuł Analiza elementarna Spektrofotometria w świetle nadfioletowym i widzialnym Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego Zastosowanie kwasowej lub zasadowej hydrolizy do degradacji btomolekufy w badaniu jej podstawowych składników Zastosowanie enzymów swoiście degradujących biomolekuły (np. proteazy, nukleazy, glikozydazy) Spektrometria masowa L Metody swoistego sekwencjonowania {np. białek, kwasów nukleinowych) Krystalografia rentgenowska

Tabela 2-5. Główne metody stosowane do rozdziału i oczyszczania biomolekuł. Większość z nich jest uŜyteczna do analizy składników obecnych w ekstraktach komórkowych i innym materiale biologicznym. Połączenie kilku technik pozwala oczyścić większość biomolekuł. Zaleca się Czytelnikowi podręczniki przedstawiające szczegółowe opracowania metod wykorzystywanych w badaniach biochemicznych Frakcjonowanie za pomocą soli (np. wytrącanie siarczanem amonu) Chromatografia Bibułowa Jonowymienna (wymieniacze anionowe i kationowe) Powinowactwa Cienkowarstwowa Cieczowogazowa Cieczowa wysokociśnieniowa Filtracja Ŝelowa E le k t roto r e za Bibułowa Wysokonapięciowa Na agarozie Na octanie celulozy W Ŝelu skrobiowym W Ŝelu poliakryloamidowym W Ŝelu poliakryloamidowym zawierającym SDS U Itra w i rowan i e

22 / ROZDZIAŁ 2

Analiza czynności i metabolizmu biomolekuł Początkowe badania biochemiczne człowieka i zwierząt wykonywano na poziomie „całego organizmu". Przykładem były badania oddychania i śledzenie losu trawionych związków. Wkrótce stało się jasne, Ŝe cały organizm jest zbyt złoŜonym obiektem, aby moŜna było uzyskać ostateczne odpowiedzi na wiek postawionych pytań. Rozpoczęto zatem rozwijać prostsze postępowania in vitro, które usuwały wiele

komplikacji powstających w doświadczeniach na całym organizmie. W tabeli 2-7 podsumowano róŜne typy postępowania preparatywnego, dostępne obecnie w badaniach procesów biochemicznych; większość danych przedstawionych w tym podręczniku otrzymano przez ich zastosowanie. Wykaz metod przedstawiono w zmniejszającym się porządku stopnia ich złoŜoności. Zarówno wykorzystanie badań na poziomie całego organizmu, jak i inne metody postępowania mają swoje ograniczenia. Przy-

Tabela 2-7. Kolejność postępowania w badaniu procesów biochemicznych Poziom badań (metoda) Organizm zwierzęcy Uwagi Badania mogą obejmować: 1) usunięcie narządu (np. hepatektomia) 2) zmiany w diecie (np. głodzenie) 3) podawanie leków (np. fenobarbital) 4) podawanie toksyn (np. tetrachlorek węgla) 5) wykorzystanie zwierząt z określoną chorobą {np. cukrzyca) 6) stosowanie wyrafinowanych technik, jak spektroskopia NMR i to mografia emisji pozytronowej Badania na tym poziomie są często fizjologiczne, ale ich interpretacja moŜe być utrudniona przez wpływ na narządy układu krąŜenia i układu nerwowego Szczególnie uŜyteczne narządy: wątroba, serce i nerka. Takie podejście pozwala badać narząd poza wpływem innych narządów lub układu nerwowego. Zastosowanie perfuzji zapewnia, Ŝe czynności narządu są podtrzymywane przez kilka godzin Często uŜywa się skrawków wątroby. Skrawki narządu, odizolowane od innych wpływów; preparaty takie wykazują jednakŜe tendencję do degradacji w ciągu niewielu godzin, częściowo, z powodu niedostatecznego odŜywienia 1. Szczególnie przydatne dla komórek krwi, które moŜna stosunkowo łatwo oczyścić 2. Stosowanie komórek w kulturach tkankowych jest niezbędne w wielu dziedzinach biologii 1. Zapewnia preparatykę w układach bezkomórkowych 2. MoŜliwość dodawania lub usuwania określonych składników (np, przez dializę) i analiza ich wpływu 3. MoŜliwość frakcjonowania przez wirowanie indywidualnych orga nelli komórkowych Szeroko stosowane w badaniach czynności mitochondriów, siateczki śródplazmatycznej, rybosomów, itp. Szeroko wykorzystywane, np. w badaniach czynności podstruktur mitochondriów Istotna część analizy reakcji chemicznych lub szlaków metabolicznych Izolowanie sklonowanych genów jest istotne dla badań ich budowy i regulacji, moŜe stanowić podstawę w określaniu sekwencji aminokwasowych kodowanych przez nie enzymów lub białek

Wyizolowany, perfundowany narząd Skrawki tkankowe

Komórki

Homogenat

Wydzielone organelte komórkowe Pod Struktury organelli komórkowych Izolowanie i charakterystyka metabolitów i enzymów Klonowanie genów kodujących enzymy i białka

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 23

czyną fałszywych wyników (artefaktów) doświadczeń in ntro moŜe być np. homogenizacja komórek, uwalniająca enzymy, które mogą częściowo trawić składniki komórkowe.

STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZŁOśONE I WIELOPOZIOMOWE
Niniejsza ksiąŜka w większości będzie dotyczyła złoŜonych procesów biochemicznych (np. biosyntezy białka, skurczu mięśnia), łącznie ze szlakami metabolicznymi. Szlak metaboliczny stanowi serie reakcji odpowiedzialnych za biosyntezę bardziej złoŜonego związku, zbudowanego z jednego lub wielu prostych związków, czy za degradację związku do jego końcowych produktów. O istnieniu złoŜonego procesu biochemicznego moŜna wnioskować na podstawie obserwacji poczynionych na poziomie całego organizmu, np. obserwując człowieka moŜna stwierdzić, Ŝe mięśnie szkieletowe się kurczą. Wiemy, Ŝe glukoza słuŜy jako źródło energii dla

ludzi i innych organizmów zwierzęcych, a zatem moŜna wnioskować, Ŝe musi ona być degradowana (metaboiizowana) w organizmie w celu uzyskania energii. JednakŜe, aby zrozumieć w pełni przebieg tego procesu w komórkach ludzkich, a wiedza nasza o tym jest wciąŜ niekompletna, naleŜy przeprowadzić analizy na róŜnych poziomach. Na rycinie 2-3 przedstawiono schematycznie róŜne typy obserwacji i analiz, które są nieodzowne w celu zrozumienia procesów biochemicznych, takich jak rozkład glukozy w celu uzyskania energii (proces znany jako gjikoli/a). Schemat ten stosuje się do podstawowego poziomu wszystkich głównych procesów biochemicznych omawianych w niniejszej ksiąŜce i przedstawienia ogólnej strategii w ich wyjaśnianiu. Powinien on się przypominać wtedy, kiedy kaŜdy z opisywanych głównych procesów biochemicznych (np. glikoliza, utlenianie kwasów tłuszczowych) będzie rozpatrywany, chociaŜ nie zawsze punkt wyszczególniony na rycinie będzie z nim związany. Wiele waŜnych punktów, przedstawionych w tabeli 2-7 i na ryc. 2-3, zasługuje na dyskusję.

Wnioskowania o obecności procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego na poziomie całego organizmu zwierzęcego Badanie mechanizmów jago kontroli in vtvo Badanie wpływu swoistych chorób (np. wrodzone bloki metaboliczne, nowotwór itp,) na Jego przebieg

ł

Umiejscowienie procesu w Jednym (lub więcej) narząd z ie(ach) Umiejscowienie procesu w Jednej (lub więcej) organem czy frakcji komórkowej Przedstawienie reakcji zaangaŜowanych w jego przebieg

t

Oczyszczanie uczestniczących w nim Indywidualnych substratOw, produktów, enzymów, koenzymów I innych składników

Badanie mechanizmów Jego kontroli In vttro Ustalenie mechanizmów reakcji zaangaŜowanych w Jego przebieg Ftekonstytucja przebiegu procesu (szlaku)

t t

ł
Badanie procesu na poziomie genu za pomocą rekombinacji DNA Ryc. 2-3. Schemat ogólnego postępowania w analizie procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Wyszczególnione etapy nie muszą być stosowane dokładnie w wymienionej kolejności. Wykorzystanie ich prowadzi zwykle do wyjaśnienia szczegółów procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Schemat ten znajduje zastosowanie we wszystkich głównych szlakach metabolicznych przedstawionych w następnych rozdziałach niniejszej ksiąŜki.

24 / ROZDZIAŁ 2

1. Aby. zrozumieć proces biochemiczny na poziomie molekularnym, pomimo moŜliwości pojawienia się artefaktów, nieodzowne jest wyizolowanie i identyfikacja kaŜdego z jego składników w czystej postaci. Liczne przykłady tego będą spotykane później. 2. Istotna jest takŜe moŜliwość rekonstytucji procesu w warunkach in vitro przez systematyczną jego odbudowe z indywidualnych składników. JeŜeli po rekonstytucji z jego składników proces nie przebiega, oznacza to, Ŝe pewien krytyczny składnik został utracony i nie został wprowadzony do układu. 3. Ostatnie zdobycze technologiczne (np. spektroskopia NMR i tomografia emisji pozytronowej; ang. PET scanning) pozwalają wykrywać pewne biomolckuły na poziomie narządu i rejestrować zmiany ich ilości w czasie. Takie rozwiązania wskazują, Ŝe staje się moŜliwe wykonywanie wyrafinowanych analiz wielu procesów biochemicznych na poziomie in vivo. 4. JeŜeli wyniki badań uzyskiwanych na róŜnych poziomach pokrywają się, to ma się prawo wnioskować, Ŝe został poczyniony rzeczywisty postęp w zrozumieniu procesu biochemicznego. Jeśli pojawią się duŜe rozbieŜności przy zastosowaniu róŜnych rozwiązań doświadczalnych, to ich przyczyny muszą być badane aŜ do uzyskania racjonalnego wyjaśnienia. 5. Przedstawione sposoby preparatywne i poziomy analiz mogą być wykorzystane w badaniu róŜnic biochemicznych u zwierząt ze zmienionym stanem metabolicznym {np. głodzenie, karmienie) lub swoistymi chorobami (np. cukrzyca, rak). 6. Większość przedstawionych metod i rozwiązań moŜna wykorzystać w badaniach prawidłowych i zmienionych chorobowo komórek lub tkanek człowieka. JednakŜe naleŜy uwzględnić warunki (czas) pobierania takiego materiału i szczególnie brać pod uwagę względy etyczne prowadzenia doświadczeń z materiałem ludzkim. Zastosowanie radioaktywnych i cięŜkich izotopów przyczyniło się do wyjaśnienia procesów biochemicznych Wprowadzenie izotopów do badań w biochemii w latach 30. naszego wieku stanowiło punkt zwrotny, zatem ich zastosowania zasługują na specjalną wzmiankę. Przed ich uŜyciem bardzo trudno było „naznaczyć" biomolekuły, aby moŜna było łatwo śledzić ich los „metaboliczny". Pionierskie doświadczenia, zwłaszcza Schoenheimera i wsp., wprowadzające niektóre izotopy trwałe (np. 2D, l5N), połączone z ich detekcją na drodze spektrometrii

masowej, znalazły zastosowanie w rozwiązywaniu wielu problemów biochemicznych. Na przykład pewne zsyntetyzowane aminokwasy, cukry i kwasy tłuszczowe, zawierające odpowiednie trwałe izotopy, podaje się zwierzętom lub in vitro w toku preparatyki, aby śledzić ich los metaboliczny (np. okres połowicznego rozpadu, przemianę w inne biomolekuły). Związki znakowane trwałymi izotopami wykorzystano do poznania wielu aspektów metabolizmu białek, węglowodanów i lipidów. Z tych doświadczeń wynika jasno, Ŝe metabolizm jest bardzo aktywnym procesem, a większość związków w komórce jest stale syntetyzowana i degradowana, choć z odmienną szybkością. Te odkrycia, zdaniem Schoenheimera, zwróciły uwagę na „dynamiczny charakter metabolizmu".
Tabela 2-8. Główne izotopy stosowane w badaniach biochemicznych Izotopy trwale
2

Izotopy
promieni ot wó rcze "C M Ca 1 3 1 1

D"N

Późniejsze wprowadzenie izotopów radioaktywnych oraz przyrządów umoŜliwiających pomiar ich aktywności było takŜe niezmiernie waŜne. W tabeli 2-8 przedstawiono główne trwałe i radioaktywne izotopy wykorzystywane w układach biologicznych. Zastosowanie zarówno izotopów trwałych, jak i radioaktywnych jest fundamentalne dla rozwoju kaŜdego działu biochemii. Badania za ich pomocą złoŜonych i prostych biomolekuł zarówno in vivo, jak i in vitro budzą zaufanie. Ogromny postęp, poczyniony ostatnio w sekwencjonowaniu kwasów nukleinowych, a takŜe w oznaczaniu substancji występujących w-układach biologicznych w niezwykle małych ilościach stosując metody radioimmunologiczne, opiera się na wykorzystaniu izotopów.

BIOMOLEKUŁY I METODY BIOCHEMICZNE / 25

BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGIĘ KOMÓRKI I MEDYCYNĘ
PoniŜej dokonano podsumowania głównych osiągnięć w dziedzinie biochemii, zwłaszcza w odniesieniu do biochemii człowieka. Obejmują one: • Ustalenie pełnego składu chemicznego komó rek, tkanek i organizmu oraz wydzielenie i określenie budowy podstawowych związ ków w nich występujących. • Dostarczenie informacji, przynajmniej na ogólnym poziomie, o funkcjach wielu pro stych, a takŜe głównych złoŜonych biomolekuł (opisanych w dalszych rozdziałach ksiąŜ ki), W centrum zainteresowania pozostaje DNA, materiał genetyczny, z którego infor macja jest przenoszona na 1 z typów RNA (informacyjny RNA, czyli mRNA), który z kolei dyktuje kolejność (sekwencje) amino kwasów w białkach. Przepływ informacji z DNA moŜe być zapisany następująco: DNA-> RNA-+ białko. • Wydzielenie głównych organelli komórek zwierzęcych i ustalenie ich podstawowych funkcji. • Stwierdzenie, Ŝe prawie wszystkie reakcje przebiegające w komórkach katalizują en zymy; oczyszczono i zbadano wiele enzymów oraz przedstawiono obszernie właściwości i mechanizmy ich działania. • Przedstawienie szlaków metabolicznych syn tezy i degradacji głównych prostych i złoŜo nych biomolekuł. Szlak syntezy danego związ ku w zasadzie róŜni się od szlaku jego de gradacji. • Wyjaśnienie licznych aspektów regulacji me tabolizmu. • Przedstawienie, w szerokim zakresie, w jaki sposób komórki zachowują i wykorzystują energię. • Wyjaśnienie wielu aspektów budowy i funkcji róŜnych błon występujących w komórkach, których głównymi składnikami są białka i li pidy. • Przedstawienie, w ogólnym zarysie, sposobu działania głównych hormonów • Wykrycie biochemicznych podstaw wielu
chorób.

POZOSTAŁO WIELE DO ZBADANIA
Zdając-sobie sprawę, jak wiele zgromadzono wiadomości biochemicznych, naleŜy ocenić, jak niewiele jeszcze wiadomo w wielu działach tej nauki. Dwa istotne problemy, wymagające wyjaśnienia, dotyczą ustalenia biochemicznych podstaw rozwoju i róŜnicowania oraz funkcji mózgu. ChociaŜ obecnie dobrze poznano naturę chemiczną materiału genetycznego, prawie nic nie wiadomo o mechanizmach, które włączają i wyłączają geny w czasie rozwoju. Zrozumienie regulacji genów stanowi klucz do poznania, jak róŜnicują się komórki i jak zmieniają się w komórki nowotworowe. Wiedza o podziale komórkowym i wzroście komórek prawidłowych i nowotworowych oraz o ich regulacji jest bardzo skąpa. Rzeczywiście nic nie wiadomo na temat biochemicznych podstaw złoŜonych zjawisk ncuronalnych, takich jak świadomość i pamięć. Bardzo ograniczona jest równieŜ nasza wiedza 0 mechanizmach wydzielania komórkowego. Pomimo pewnego postępu, molekularne pod stawy większości głównych chorób genetycznych nie są wyjaśnione, ale wiele nadziei niesie tech nologia rekombinacji DNA, zwiastując zauwa Ŝalny rozwój w tej dziedzinie w ciągu kilku najbliŜszych lat. Ludzki genom moŜe być zsekwencjonowany w następnym stuleciu lub wcześniej. Wiadomości uzyskane przez tak ogromny wysiłek będą potęŜnym wyzwaniem dla biologii człowieka 1 medycyny.

PIŚMIENNICTWO
Freifelder D: Physicał Biochemistry: Appiicalions to Biochemistry and Molecułar Biology. Fceeman, 1982. Fruton JS: Mołecuks and Life; Historical Essays on the Interplay of Ckemistry and Biology. Wiley-Interscience, 1972, Weinberg RA: The molecules of life. Sci Am (Oct) 1985; 253: 48. [Entire issue is of interest.]

3
WPROWADZENIE
Biochemia dotyczy w większości właściwości i reakcji chemicznych związków organicznych. Często jednak się zapomina, Ŝe w komórkach Ŝywych większość reakcji chemicznych przebiega w środowisku wodnym. Woda jest czynnym składnikiem w wielu reakcjach biochemicznych i jest waŜnym czynnikiem determinującym właściwości makrocząsteczek, takich jak białka. Woda dysocjuje do jonów OH~ i H+. Termin pH stosuje się do określenia stęŜenia jonów wodorowych w komórkach oraz płynach ustrojowych i stanowi kluczowe pojęcie w biochemii i medycynie. Grupy funkcyjne (aminowe, karboksylowe itd.) biomolekuł dysocjują przy określonej wartości pH, a wiele ich właściwości biologicznych i fizycznych zaleŜy od tej dysocjacji.

Woda i pH
Vicłor W. Rodwelł, PhD

Regulacja równowagi wodnej jest złoŜona i za-

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Wiadomo, Ŝe dla zdrowia nieodzowna jest
stałość środowiska wewnętrznego organizmu,

ieŜy przede wszystkim od podwzgórza, kontrolującego pragnienie, hormonu antydiuretycznego (ADH) i czynności nerek. Stany niedoboru wody i nadmiaru wody ustrojowej są powszechne. W wielu przypadkach towarzyszy im niedobór lub nadmiar jonów sodowych. Przyczynami niedoboru wody mogą być: 1) zmniejszone jej pobieranie (np. podczas śpiączki) lub 2) nadmierne jej wydalanie (np. utrata z moczem w cukrzycy, przy silnych potach przez skórę, w ostrej biegunce u dzieci, w przebiegu chslery). Nadmiar wody ustrojowej powodują: 1) zwiększone pobieranie (np. przy nadmiernym podawaniu płynów doŜylnie) bądź 2) zmniejszone jej wydalanie (np. w ostrej niewydolności nerek). U osób zdrowych pH płynu pozakomórkowego utrzymuje się w granicach 7,35—7,45. Bufor wodorowęglanowy (HCOf/H2CO3) odgrywa szczególnie waŜną rolę w tym względzie. Kiedy pH osiąga wartość poniŜej 7,35, wtedy dochodzi do stanu określanego jako kwasica, jeŜeli zaś pH przekroczy wartość 7,45
występuje zasado wica. Zaburzenia równowagi kwasowo-zasadowej moŜna zwykle

utrzymywana we względnie wąskich granicach. Dotyczy to ogólnego rozmieszczenia wody, a takŜe utrzymywania pH i stęŜenia róŜnych elektrolitów, np. Na+, K+, Ca2+, Mg2+ i fosforanów w organizmie. Ogólna zawartość wody w organizmie męŜczyzny waha się w granicach 55—65% masy ciała; mniejsza wartość odnosi się do osób otyłych. Dane dla kobiet są mniejsze, średnio o ok. 10%. Dwie trzecie wody
organizmu stanowi płyn wewnątrzkomórkowy

(ang. intraceliular fluid; skrót — ICF), zaś pozostałą część reprezentuje płyn pozakomórkowy (ang. extracellular fluid; skrót — ECF). Około 25% ECF występuje' w osoczu.

rozpoznać oznaczając pH krwi tętniczej, pCO 2 oraz ogólną zawartość COj we krwi Ŝylnej, znając poprzednio wymienione wartości, stęŜenie HCOf. Istnieją liczne przyczyny kwasicy (ketoacydoza cukrzycowa, kwasica mleczanowa itp.) i zasadowicy (wymioty kwaśną treścią Ŝołądkową, działanie niektórych leków moczopędnych itp.). Znajomość patogenezy zaburzeń równowagi wodnej i równowagi kwasowo-zasadowej jest podstawą właściwej diagnozy i ich leczenia. Wymaga to zatem poznania tych właściwości wody, które umoŜliwiają jej odegranie kluczowej roli w biochemii.

WODA I pH / 27

Cząsteczka wody wykazuje budowę tetraedryczną Cząsteczka wody ma postać nieregularnego czworościanu (tetraedr) z atomem tlenu w jego środku (ryc. 3-1). Dwa wiązania z wodorem są skierowane w 2 rogi czworościanu, podczas gdy 2 pozostałe rogi są zajęte przez niesparowane elektrony na zhybrydyzowanych orbitalach 2sp3. Kąt pomiędzy 2 atomami wodoru a tlenem (105°) jest nieco mniejszy niŜ kąt tetraedryczny (109,5c), co przyczynia się do utworzenia nieznacznie skośnego czworościanu.
Ryc. 3-2. Tetraedryczna struktura amoniaku.

STRUKTURA TETRAEDRYCZNA I DIPOLARNY CHARAKTER WODY UŁATWIAJĄ REAKCJE W stanie ciekłym woda jest stabilizowana przez wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, które tworzą strukturę wielkocząsteczkową przypominającą strukturę lodu Cząsteczki wody, z powodu dwubiegunowego charakteru, tworzą uporządkowane układy (przypominające płatki śniegu). JednakŜe uporządkowanie takie, jak w cząsteczce wody, nie ogranicza się do lodu. Woda w stanie ciekłym wykazuje strukturę wielkocząsteczkową, która jest ściśle równoległa do rozkładu geometrycznego cząsteczek wody w lodzie. Zdolność cząsteczek wody do łączenia się ze sobą zarówno w stanie ciekłym, jak i stałym wynika z dipolarncgo charakteru wody. Pozostaje ona w stanie ciekłym z powodu przemijającego charakteru jej kompleksów wielkocząsteczkowych (okresu półtrwania asocjacji — dysocjacji cząsteczek wody — ok. 1 as). W stanie stałym kaŜda cząsteczka wody asocjuje z 4 innymi cząsteczkami wody. W stanie ciekłym liczba asocjujących cząsteczek jest nieco mniejsza (ok. 3,5) i w tym stanie woda swoją budową wielkocząsteczkową, z wyjątkiem przemijającej natury wewnątrzcząsteczkowych interakcji, przypomina lód w znacznie większym stopniu niŜ moŜna było początkowo przypuszczać. Dipolarny charakter cząsteczek wody sprzyja ich wzajemnemu łączeniu się w uporządkowanym, precyzyjnym szyku, wynikającym z wewnętrznej geometrii cząsteczki wody (ryc. 3-3).

Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody

Nierównomierne rozmieszczenie ładunku w cząsteczce wody przyczynia się do utworzenia dipolu (cząsteczki biegunowej) Lekko pochyla struktura czworościanu wody jest przyczyną nierównomiernego rozmieszczenia w niej ładunku. Przeciwległa do 2 atomów wodoru strona tlenu jest stosunkowo bogata w elektrony, natomiast druga strona, zawierająca względnie odsłonięte jądra wodoru, tworzy obszar o ładunku miejscowo dodatnim. Pojęcie „dipol" oznacza taką cząsteczkę, jak woda, w której ładunek elektryczny (elektrony) jest rozmieszczony nierównomiernie. Amoniak, podobnie jak woda, jest tetraedryczną cząsteczką dipolową W cząsteczce amoniaku kąty między wiązaniami atomów wodoru (107°) są zbliŜone do kąta tetraedrycznego nawet bardziej niŜ w wodzie {ryc. 3-2). Wiele związków organicznych budujących komórki jest dipolami, np. alkohole, fosfolipidy, aminokwasy i kwasy nukleinowe.

28 / ROZDZIAŁ 3

V ł
Ryc. 3-3. Strona Iswa: Asocjacja 2 dipoiarnych cząsteczek wody. Linia kropkowana przedstawia wiązanie wodorowe Strona prawa: Asocjacja cząsteczki wody (środkowej) z 4 innymi cząsteczkami wody za pomocą wiązań wodorowych. Struktura ta H ,, jest typowa dla lodu i w mniejszym stopniu dla wody w stanie ciekłym.

V

wodorowe narzucają uporządkowanie struktury nie tylko wodzie, lecz takŜe innym cząsteczkom dipolowym, tak odmiennym od wody, jak alkohole, DNA i białka. Tworzenie wiązań wodorowych między przedstawicielami cząsteczek waŜnych fizjologicznie związków przedstawia ryc. 3-4. Powstawanie ich nie ogranicza się do cząsteczek wody. Atomy wodoru, połączone z atomami azotu, mogą uczestniczyć takŜe w wiązaniach wodorowych. Problem ten będzie rozpatrywany w dalszej części ksiąŜki w związku z omawianiem trójwymiarowej struktury białek oraz reguł łączenia się (parowania) zasad azotowych w DNA,

Oddziaływanie elektrostatyczne między jądrem wodoru jednej cząsteczki wody a wolną parą elektronów drugiej nazywa się wiązaniem wodorowym. W porównaniu do wiązań kowalencyjnych, wiązania wodorowe są raczej słabe. Rozerwanie wiązania wodorowego w wodzie (w stanie ciekłym) wymaga ok. 18,8 kJ/mol (4,5 kca!/mol), tj. ok. 4% energii wymaganej do rozerwania wiązania O—H w wodzie (461 kJ/mol=llO kcal/mol).

Cząsteczki wody wykazują niewielką, ale fizjologicznie waŜną, tendencję do dysocjacji, tj. tworzenia małych ilości jonów OH- i H
Cząsteczki wody wykazują ograniczoną tendencję do dysocjacji (jonizowania) na jony H + iOH": H2O ~ H+ + OH" PoniewaŜ jony są w ciągłym ruchu, twcTrząc cząsteczki wody i dysocjując, trudno określić, czy pojedynczy atom wodoru Jub tlenu występuje jako jon, czy jako część cząsteczki wody. W danym momencie moŜe być jonem, a w następnym częścią cząsteczki. Jonów oraz cząsteczek wody nie rozpatruje się pojedynczo. Wiedząc, Ŝe 1 g wody zawiera 3,46 x 1022 cząsteczek, jonizację wody moŜna opisać statystycznie. NaleŜy znać prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu lub części cząsteczki wody. W przypadku gdy prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01 oznacza to, Ŝe atom wodoru ma 1 szansę na 100 bycia jonem, a 99 szans na sto — istnienia w cząsteczce wody. Faktyczne prawdopodobieństwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi ok. 0,0000000018, tj. 1,8 x 10~9. Zatem jest on prawie w całości częścią cząsteczki wody. Wynika z tego, ze w czystej wodzie na kaŜdy jon wodorowy i hydroksylowy przypada 1,8 x 109, tj, 1,8 mld cząsteczek wody. Jony wodorowe i hydroksylowe mają jednak znaczny wpływ na właściwości wody. Tendencję wody do dysocjacji wyraŜa się następująco:
[H2O]

Słabe wiązania wodorowe odgrywają istotną rolę w biochemii, włączając stabilizacje struktury białek i kwasów nukleinowych
Wiązania wodorowe, które są słabe, lecz mogą powstawać w duŜych ilościach, odgrywają istotną rolę w biochemii. Liczne wiązania

CH3 — CHj—

CHj — CH

Ryc. 3-4. Powstawanie wiązań wodorowych między cząsteczkami etanolu i wody, między 2 cząsteczkami etanolu oraz między tlenem grupy karbonylowej peptydu i wodorem grupy aminowej sąsiadującego peptydu.

WODA I pH / 29

W nawiasach przedstawiono stęŜenia molowe jonów wodorowych, hydroksylowych i niezdysocjowanych cząsteczek wody*, a K nazwano stalą dysocjacji. Aby obliczyć stalą dysocjacji dla wody, natęŜy przypomnieć, Ŝe 1 mol ma masę 18 g. Jeden litr (1) (1000 g) wody zawiera zatem 1000:18 = 55,56 mol. StęŜenie molowe czystej wody wynosi więc 55,56 mol. PoniewaŜ prawdopodobieństwo występowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 x 10~9, stęŜenie molowe jonu H + (lub jonów OH~) w wodzie oblicza się, mnoŜąc prawdopodobieństwo 1,8 x 10~* przez stęŜenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik= 1,0 x 10"7 mol/l. Teraz moŜna wyliczyć wartość K dla wody:
K
[H+] [ O H ] [107] [107]

kiego (37°C) stęŜenie H+ w wodzie jest nieco większe niŜ 10~7 mol/l. W ramach ustalonych granic wpływu temperatury, wartość Kw =
10~1'1 (mol/1)2 dla wszystkich roztworów

wodnych, nawet dla tych, które zawierają kwasy lub zasady. W dalszej części rozdziału stalą ta będzie wykorzystywana do obliczenia wartości pH roztworów kwaśnych i zasadowych.

pH JEST UJEMNYM LOGARYTMEM STĘśENIA JONÓW WODOROWYCH, A ŚCIŚLEJ AKTYWNOŚCI JONÓW WODOROWYCH
Termin pH wprowadził w 1909 r. Sórensen, definiując pH jako ujemny logarytm stęŜenia jonów wodorowych: pH = -log[H ] Definicja ta, aczkolwiek niezbyt ścisła*, jest na ogół wystarczająca do celów biochemicznych. Aby obliczyć pH roztworu naleŜy: 1) oznaczyć stęŜenie jonów wodorowych (H+), 2) obliczyć logarytm dziesiętny (H+), 3) pH jest ujemną wartością znalezioną w punkcie (2). Na przykład w przypadku czystej wody w temp. 25°C:
+

[HZO]

[55,56]

14

= 1,8 x

= 0,018 x 10 1O"1S mol/l

DuŜe stęŜenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianom przez dysocjację. Stąd wygodnie jest rozpatrywać wodę jako zasadniczo niezdysocjowaną (stalą). Stała ta moŜe być włączona w stałą dysocjacji K, jako nowa stała Kw, zwana iloczynem jonowym wody. Stosunek między Kw a K przedstawiono poniŜej:
K [OH 1,8 x 10[HZO]
16
16

mol/l

pH = -log[H*] = -logiO

-[-7]= 7,0

K w = (K) [H t O] = [H+] [ O H ] =

- 1,8 x10

mol/l) (55,56 mol/l) =
14

= 1,00 x 10"

(mol/l)

1

Stałą K wyraŜa się w molach na litr, zaś Kw — w mol2 na litr2. Z nazwy wynika, Ŝe iloczyn jonowy Kw jest liczbowo równy iloczynowi stęŜeń molowych jonów H + i OH ~:
Kw = [H+] [ O H ]

W temperaturze 25°C Kw = (10~7)2 m 10~14 (mol/f)2. Natomiast w temperaturach poniŜej 25°C wartość Kw jest większa, zaś powyŜej 25°C mniejsza niŜ 10~14. W temperaturze ciała ludz-

Małe wartości pH odpowiadają duŜym stęŜeniom jonów H+, a duŜe — małym stęŜeniom H+ Kwasy określa się dawcami protonów, a zasady biorcami protonów. WyróŜnia się mocne kwasy (np. HC1, H2SO4) całkowicie zdysocjowane, nawet w mocnych roztworach kwaśnych (niskie pH), oraz słabe kwasy, częściowo tylko dysocjujące w roztworach kwaśnych. Podobnie moŜna wyróŜnić mocne zasady (np. KOH, NaOH) i słabe zasady (np. Ca(OH)2>. Tylko mocne zasady dysocjują przy małych wartościach pH. Większość związków organicznych w komórkach to słabe kwasy. Wyjątek stanowią ufosforylowane związki pośrednie, które zawierają

Ściśle mówiąc, wyraŜenia w nawiasach reprezen- * scisie mówiąc, wyraŜenia w nawiasacn reprczen- ------------------------------------------------------------------------------tują raczej aktywność molową niŜ stęŜenie molowe. * pH= — log (aktywności H + )

30 / ROZDZIAŁ 3

silnie kwasową grupę pierwszorzędowego kwasu fosforowego. PoniŜsze przykłady ilustrują sposób obliczania pH roztworów kwaśnych i zasadowych: Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stęŜenie jonu wodorowego wynosi 3,2 xlO"4 mol/l?

StęŜenie (mol/1)
(a) (b)

Molowość KOH 2,0xicr 2 2,0 2 [0H-] 2 KOH xl O" 7 [OH-j z wody 1,0x10" 2 Całość [0H-] 2,00001 x10~

2,0x10" e 2,0x10~ 7 1,0x10" 6 2,1 x10"

6

= -log (3,2x10"*) 4 = -log (3,2) -logCIO" )

=-0,5+4 = 3,5 Przykład. Jakie jest pH roztworu, w którym stęŜenie j o nu hyd ro ksylo wego wyno si 4,0 x 10"4 mol/l? Aby rozwiązać to zadanie, naleŜy określić ilościowo wartość pOH, które jest równe —log [OH~]; wartość tę moŜna wyprowadzić z definicji K: [OH-] = 10" zatem
log [H ] + log [ O H ] = log 10" lub pH + pOH = 14
+

W momencie podjęcia decyzji o znaczeniu udziału wody, pH moŜna wyliczyć jak powyŜej. , W przedstawionych przykładach przyjęto załoŜenie, Ŝe mocna zasada KOH jest w pełni zdysocjowana, a stęŜenie molowe jonów OH~ równa się stęŜeniu molowemu KOH. ZałoŜenie to jest słuszne dla względnie rozcieńczonych roztworów mocnych zasad i kwasów lecz nie dotyczy słabych zasad i kwasów. Ze względu na fakt, Ŝe te słabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjują w roztworach, naleŜy przed obliczeniem całkowitego [H+] (lub całkowitego [OH~]) oraz obliczeniem pH, obliczyć stęŜenie H+ (lub stęŜenia OH~) z danego stęŜenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystując stałą dysocjacji. Biomolekuły zawierają grupy funkcyjne czynne o istotnym znaczeniu fizjologicznym, które zachowują się jak słabe kwasy Wiele związków organicznych Ŝywych komórek ma grupy funkcyjne, typowe dla słabych kwasów lub zasad. Jedna lub więcej grup funkcyjnych — głównie grupy karboksylowe, aminowe lub utworzone w wyniku drugorzędowej dysocjacji fosforanowej estrów fosforanowych — występują we wszystkich białkach i kwasach nukleinowych, większości koenzymów oraz metabolitów pośrednich. Aby zrozumieć wpływ wewnątrzkomórkowego pH na budowę i aktywność biochemiczną tych związków, naleŜy poznać sposób dysocjacji (równowagi protono-

14

A następnie:
[ O H ] = 4,0 x 1 0 * pOH = -log [ O H ] = -log (4,0 x 10 1og(10" ) =
4 4

) = -log (4,0) -

-0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz

pH = 14 - pOH = 14 - 3,4 = 10,6

Przykład. Jakie jest pH roztworu (a) 2,0xl0" ! mol/l KOH, (b) 2,0 x 10"* mol/l KOH? W roztworach tych jony OH~ pochodzą z 2 źródeł: KOH i wody. PoniewaŜ pH określa całkowite stęŜenie jonów [H+] (pOH — całkowite [OH ]) naleŜy obydwa źródła brać pod uwagę. W pierwszym przypadku udział wody w całkowitej puli [OH~] jest nieistotny, czego nie moŜna powiedzieć w drugim przypadku.

Tabela 3-1. Przykłady słabych kwasów i sprzęŜonych z nimi zasad Kwas CH3COOH CH3NH3
OH

SprzęŜona zasada CH3COOCH3NH2
O"

H+N

NH

N

NH

WODA I pH / 31

wej) grup funkcyjnych słabo kwaśnych i słabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i klinicznych rozdział i identyfikacja tych związków opiera się na znajomości przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych. Protonowa forma kwasu (HA lub RNH+) odnosi się do kwasu, zaś nieprotonowa (A~ lub RNH2} — do sprzęŜonej z nim zasady (tab. 3-1). Podobnie moŜna opisać zasadę (np. A~ lub RNH2) i sprzęŜony z nią kwas (np. HA lub RNH+) (lac. conitmgere — połączyć razem). Względną moc słabych kwasów i zasad wyraŜa sie ilościowo przez ich stale dysocjacji, które obrazują ich tendencje do jonizacji. PoniŜej podano wyraŜenia stałej dysocjacji (K.) dla 2 przedstawicieli słabych kwasów: i R—NH+
R—COOH ++ R—COO + IR-COO R-NH *+ R—NH2 K = [R—MH2] [H [RNHj] ] [H + ] H [R—COOH]

Z powyŜszych równań, odnoszących K do [H+] i do stęŜenia niezdysocjowanego kwasu i sprzęŜonej z nim zasady, wynika, Ŝe gdy
IR—COO] = R—COOH

lub gdy
[R—NHZ] = [R— NHj]

to wtedy
K = [H+]

MoŜna to wyrazić słowami: gdy rodzaj jonów
zasocjowanych (protonowych) i zdysocjowanych (sprzęŜone zasady) występuje w równych stęŜeniach, wówczas przewaŜające stęŜenie jonów wodorowych [H+] jest równe liczbowo stałej dysocjacji K.

Jeśli obliczy się logarytmy powyŜszego równania i obie strony pomnoŜy się przez — I, to K [H+] -log[H

PoniewaŜ wartości liczbowe K dla słabych kwasów są ujemnymi liczbami wykładniczymi, wygodniej jest wyraŜać K jako pK, gdzie:
p K = -l o g K

Z definicji —log K opisuje się jako pK, zaś — log [H+] jako pH. W związku z tym moŜna ostatnie równanie zapisać
pK = pH

tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w którym
Tabela 3-2. Stałe dysocjacji i wartości pK dla przedstawicieli kwasów karboksylowych Kwas Octowy Gluta rowy Cytrynowy (1-rz.) (2-rz,) (1-rz.) (2-rz.) (3-rz.) K 1,76x10 4,58 x10" 8,40x10"
5 5

stęŜenia postaci protonowej i niepro tonowej są

pK 4,75 4,34 5,41 3,08 4,74 5,40

równe. Wartość pK kwasu moŜna oznaczyć doświadczalnie przez dodanie 0,5 równowaŜnika* zasady na równowaŜnik kwasu. Powstałe w ten sposób końcowe pH będzie odpowiadać pK kwasu. Charakter słabych kwasów i buforów, które są roztworami słabych kwasów i ich soli opisuje równanie Hendersona-Hasselbalcha Wartość pH roztworu zawierającego słaby kwas jest zaleŜna od stałej dysocjacji tego kwasu, jak przedstawiono powyŜej dla słabo kwaśnej wody. ZaleŜność tę opisuje, w przystęp-

3,89x10" 6
4

1,80x10"E 4,00x10" 6

NaleŜy odnotować, Ŝe pK odnosi się do K tak, jak pH do stęŜenia H + . W tabeli 3-2 przedstawiono wartości K i pK dla kwasu mono-, di- i trikarboksylowego. NaleŜy podkreślić, Ŝe grupy mocniejszych kwasów mają mniejsze wartości pK.

* Według układu SI pojęcie równowaŜnika chemicznego nie jest uŜywane, jednak w tym tłumaczeniu określenie to świadomie utrzymujemy {przyp. red. nauk. tłum.).

32 / ROZDZIAŁ 3

nej formie, równanie Hendersona-Hasselbalcha, wyprowadzone poniŜej. Słaby kwas HA dysocjuje w następujący sposób: HA~ H + +A" Stała dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi: " [HA] Po pomnoŜeniu na krzyŜ:
[H+] [ A ] = K[HA]

Zatem w przypadku zobojętnienia w połowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1

pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10
pH = pK +■ log-

pK + (-1)

1,0 -

Po podzieleniu obu stron przez [A~]
i
1 0

0,8

Po zlogarytmowaniu obu stron:

o
■o

■og[H+]
[HA]

I%

l i
1*08

[A ] log K + log Po pomnoŜeniu przez — 1
- f c » g [ H+ ] = -l o g K - l og [HA ]

i

ojpK -3 pK -2 pK -1 pK 0 pK +1 pK +2 pK +3

Po podstawieniu zamiast —log H+ i —log K odpowiednio pH i pK otrzymuje się
[HA] pH = pK - log
[A]

łtyc. 3-5. Typowa krzywa miareczkowania wykreślona na podstawie wyników obliczeń z równania Hendersona-Hasselbalcha.

Z kolei usuwa się znak minus, odwracając ostatni człon równania:
pH = pK 4 log [HA]

Jeśli równanie zastosuje się dla róŜnych stos u n kó w [ A- ] /[ H A] w za kr e s ie 1 0 M0 " 3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartości pH. to otrzymany wynik opisuje krzywą miareczkowania słabego kwasu (ryc, 3-5).

Ta ostatnia forma równania, opisywana jako równanie Hendersona-Hasselbalcha, słuŜy do wyliczania równowagi protonowej, np.: 1. Kiedy kwas jest zobojętniony dokładnie w połowie, tj. A~ =[HA]. W tych warunkach pH = pK + tog [A] [HA] pK +- log— =pK + 0

Roztwory słabych kwasów i ich soli buforują pH w przypadku dodania lub usuwania protonów
Roztwory słabych kwasów i sprzęŜonyct z nimi zasad (lub słabych zasad i sprzęŜonycl z nimi kwasów) wykazują zjawisko buforowa
nia, tj. zdolności utrzymywania pH. Wartość pt roztworu buforowego po dodaniu mocnego kwasi lub mocnej zasady nie zmienia się bardziej niŜ p< dodaniu takiej samej objętości wody. Zjawisk*

WODA I pH / 33

buforowania moŜna najlepiej zilustrować poprzez miareczkowanie słabego kwasu lub zasady wykorzystując pH-metr. W innym rozwiązaniu moŜna obliczyć przesunięcie pH, które ma miejsce w przypadku dodania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawionym przykładzie, zbuforowany roztwór (mieszanina słabego kwasu i sprzęŜonej z nim zasady, pK = 5,0) wykazuje początkowo w jednej z 4 wartości pH. MoŜna obliczyć przesuniecie pH, które wystąpi, jeśli zostanie dodany 0,1 mmol/1 K.OH na kaŜdy milirównowaŜnik kwasu w roztworze (o stęŜeniu 1 mmol).
Początkowe pH 5,00 [" ] początkowe 0,50 0,50 1,00 Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje 0,60 0,40 [A f/[HA]końcowe Kortcowe pH 1,50 49,0 0,602 5,60 0,23 0,80 0,90 0,20 0,10 0,02 4,00 9,00 0,95 5,95 0,35 0,98 0,30 2.33 5,37 0,70 0,20 4,00 5,60 0,80 0,12 7,33

f 1,0-

5,86 0,88

2

3

4

5

6

7

8

Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA.

Punkt {) wskazuje pK o wartości 5,0.

0,176 5,18

1,69 6,69 0,83

ipH

0,18

Zmiana pH, wywołana przez dodanie 1 mmol jonów OH~ róŜni się znacznie w zaleŜności od pH. Przy wartościach pH zbliŜonych do wartości pK, roztwory buforowe utrzymują skuteczniej pH, co określa się ich efektem buforującym. Roztwory słabych
kwasów i sprzęŜonych z nimi zasad są najskuteczniejszymi układami buforowymi w zakresie pH równym pK + 2,0 jednostki pH.

Ładunek ułamkowy —0,5 nie oznacza, Ŝe pojedyncza cząsteczka jest obdarzona ładunkiem ułamkowym, lecz wyraŜa statystyczne prawdopodobieństwo, Ŝe ma ona ładunek —0,5. Przyjęcie ładunku elektrycznego makrocząsteczek jako funkcji pH stwarza podstawę dla wielu uŜytecznych technik rozdziału, włączając eiektroforetyczny rozdział aminokwasów, białek osocza i nieprawidłowych hemogJobin. W komórkach Ŝywych bufory fosforanowy i wodorowęglanowy, oprócz białczanowych, stanowią podstawowe bufory.

PIŚMIENNICTWO
Segel IM: 1968. Biochemical Calcuiations. Wiley,

Oznacza to, Ŝe aby zbuforować roztwór w pH X, moŜna wykorzystać słaby kwas lub zasadę, których pH nie róŜni się od pH X więcej niŜ o 2 jednostki pH. Na rycinie 3-6 przedstawiono ładunek eJektryczny 1 cząsteczki kwasu jako funkcję pH.

3 — Biochemia

CZĘŚĆ I Budowa oraz funkcje białek i enzymów Aminokwasy
Victor W. Rodweli, PhD

4

genne) muszą być dostarczane w poŜywieniu, poniewaŜ nasz organizm nie moŜe ich synśywe komórki wytwarzają makrocząsteczki tetyzować w ilościach niezbędnych do pod(białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), które trzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdrosłuŜą jako składniki strukturalne, katalizatory, wia (dorośli). Metabolizm aminokwasów przyhormony, receptory lub magazyny informacji czynia się do powstania wielu biomedycznie genetycznej. Te makrocząsteczki są biopolime- waŜnych związków. Na przykład dekarboksylarami, utworzonymi z jednostek monomerycz- cja pewnych aminokwasów prowadzi do ponych lub cegiełek budulcowych. Jednostkami wstania amin, wśród których cześć pełni waŜne monomerycznymi w kwasach nukleinowych są funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-anukleotydy, w złoŜonych polisacharydach — po- minomasłowy [GABA]). Liczne choroby są chodne cukrowe, a w białkach — L-a-amino- spowodowane nieprawidłowościami transportu kwasy. aminokwasów do komórek. W pewnych warunChociaŜ białka mogą takŜe zawierać poza kach moŜe dojść do pojawienia się w moczu aminokwasami, dodatkowe substancje (np. znacznej ilości jednego lub wielu aminokwasów hem, cukrowce, tłuszcze), ich trójwymiarową — takie stany określa się jako aminoacydurie. strukturę i właściwości biologiczne warunkuje w głównej mierze rodzaj aminokwasów, kolejność, w jakiej łączą się ze sobą w łańcuchu WSZYSTKIE AMINOKWASY polipeptydowym oraz ich przestrzenne ułoŜenie,, ZAWIERAJĄ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE względem siebie. Aminokwasy pełnią dodatkowe funkcje Aminokwasy zawierają 2 grupy funkcyjne, tj. w komórkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektóre biologicznie waŜne substancje, które aminową i karboksylową. W a-aminokwasach obie te grupy połączone są z tym samym (a) wywodzą się z aminokwasów.
H

WPROWADZENIE

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niektóre aminokwasy wydają się być zaangaŜowane w przenoszeniu impulsów w układzie nerwowym, czego przykładem są glicyna i kwas Ryc. 4-1. glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo- kwasu.

\a
R-C-NHj I

COOH

OH

Dwie formy przedstawienia j.-amino-

36 / ROZDZIAŁ 4

atomem węgla (ryc. 4-1). ChociaŜ w przyrodzie występuje ok. 300 aminokwasów, tylko 20 z nich występuje w białkach (tab. 4-3). Całkowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-aminokwasów. NaleŜy podkreślić, Ŝe białka wszystkich form Ŝycia — roślin, zwierząt, drobnoustrojów — zawierają te same 20 aminokwasów. Przyczyną tego jest uniwersalność kodu genetycznego, co stanie się oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia później (p. rozdz. 30). W skład niektórych białek wchodzą pochodne aminokwasów, utworzone po ich włączeniu w cząsteczkę białka (p. lab. 6-4). Z wyjątkiem glicyny, dla której R (R — łańcuch boczny aminokwasu) stanowi atom wodoru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki związane z atomem węgla et-aminokwasów są róŜne. Tetrąędryczne. ułoŜenie 4 róŜnych podstawników wokół atomu węgla a (tzw. węgiel asymetryczny) nadaje aminokwasom właściwość op.tyczna. (zdolnośćTjio_ _skręcania . płaszczyzny światła spolaryzowanego). ChociaŜ pewne aminokwasy występujące w białkach są prawoskrętne, a niektóre lewoskrętne, w pH 7,0 wszystkie mają bezwzględną konfigurację porównywalną z konfiguracją aldehydu L-glicerynowego, stąd opisuje się je jako L-a-aminokwasy.

jedna naładowana, a druga obojętna, występują w równowadze protonowej:
R—COOH « R—COO" + H+ H
+

Ogólne reakcje chemiczne aminokwasów moŜna przewidzieć znając właściwości grup funkcyjnych Grupy funkcyjne aminokwasów — karboksylowa i aminowa — wykazują typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikację, acyla-

RÓWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASÓW W zaleŜności od pH otaczającego środowiska aminokwas moŜe mieć ładunek dodatni, ujemny lub nie mieć Ŝadnego ładunku Aminokwasy zawierają co najmniej 2 zjonizo wanc, słab o k waś ne gr up y: — COOH i —NHt- W roztworze obie formy tych grup.

W równowadze tej R—COOH i R—NH^ reprezentują związki protonowe lub kwaśne, natomiast R—COO~ i R—NH2 — zasady sprzęŜone (protonobiorców) z odpowiednimi kwasami. ChociaŜ zarówno R—COOH jak i R NH; są słabymi kwasami, R—COOH jest znacznie silniejszym kwasem niŜ R—NH r W pH osocza krwi czy przestrzeni śródkomórkowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy karboksylowe istnieją prawie całkowicie jako jony karboksyjowe — R—COO~. Przy tych wartościach pH większość grup aminowych występuje w f o r m i e z a s o c j o wa n e j ( p r o t o n o we j ) — R—NH3. Ze względu na przewaŜającą postać zjonizowaną aminokwasów we krwi i większości tkanek, naleŜy przedstawić ich budowę tak, jak na ryc. 4-2A. NaleŜy pamiętać, Ŝe struktura B (ryc. 4-2) nie moŜe istnieć w Ŝadnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w którym cofa się jonizacja grupy karboksylowej, znacznie słabsza kwaśna grupa aminowa będzie występować takŜe w formie protonowej. PrzybliŜone wartości pKa dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynoszą odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszącym 2 jednostki poniŜej wartości pKa, kwas w ok. 99% ma formę protonową. JeŜeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odłącza się znacznie wcześniej niŜ z grupy R—NH 3 • W kaŜdym wystarczająco wysokim pH do utworzenia przewagi grupy aminowej R—NH2 musi być równieŜ obecny jon karboksylowy (R—COO~). JednakŜe w wielu reakcjach, poza równaniami równowagi protonowej, stosuje się wzory aminokwasów w formie B.
+

NH, 0-

NHj

II O 8

* Hydroliza = rozerwanie wiązania kowalencyjnego przy udziale cząsteczki wody.

Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego aminokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjologicznego (A). Postać B (niezjonizowana) nie występuje w Ŝadnym pH, ale jest często' uŜywana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwasów.

AMINOKWASY / 37 Tabela 4-1. Słabo kwaśne grupy aminokwasów występujących w białkach SprzęŜony kwas a-Karboksylowa Nie a-kar boksy Iowa (asparaginian, glutaminian) R—COOH R—COOH SprzęŜona zasada R—COO" R—COO"
f 1--------- R

PrzybliŜona wartość pK

2.1 ±0,5
4,0 + 0,3

Imidazolowa (histydyna) ^-Aminowa s-Aminowa (lizyna) Fenolowa OH (tyrozyna) R-NH + R-NH^

r v
R—NH2 R—NHa

6,0

9,8 ±1,0 10,5 10,1

Guanidynowa (arginina)

1 11+R—N—
C—NH2

H NH2

H NH j II R—N— C—NH2

12,5

Sulf hydry Iowa (cystein3)

R—SH

R - S-

8,3

Względną moc słabych kwasów wyraŜają wartości pK, Względną moc słabych kwasów wyraŜa się przez ich stale dysocjacji Ka lub przez ich pK — ujemny logarytm ze stałej dysocjacji:

Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy którym nie jest on obdarzony Ŝadnym ładunkiem i nie porusza się w polu elektrycznym Strukturę aminokwasu alifatycznego, takiego jak alanina, w pH odpowiadającym punktowi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3.

W tabeli 4-1 przedstawiono wartości pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasów spotykanych w białkach. Całkowity ładunek (algebraiczna suma wszystkich dodatnio i ujemnie naładowanych grup) aminokwasu zaleŜy od pH lub stęŜenia protonów otaczającego środowiska. MoŜliwość zmiany ładunku aminokwasów i ich pochodnych, przez umiejętne sterowanie pH, ułatwia fizyczny rozdział aminokwasów, peptydów i białek.

NrV

Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. ChociaŜ jon obojnaczy alaniny ma grupy obdarzone ładunkiem elektrycznym, nie wędruje w polu elektrycznym.

♦ Dla wygody zapis Ka lub pKtt będzie stosowany, w przypadku aminokwasu z tylko dwiema lecz opuszczony później w przypisach dotyczących grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma symboli. niejasności w wyliczeniu pl. PoniewaŜ wartość

38 / ROZDZIAŁ 4

W mocnym kwasie (pH ponlŜeji); całkowity ladunek= + l

O B pH ok. 3; całkowity ładunek = o pH ok. 6 - ft całkowity ładunek = -1 D W mocno) zasadzie (pH powyŜej 11); całkowity ładunek = -2

Ryc. 4-4. Równowagi protonowe kwasu asparaginowego.

pK, (R—COOH) = 2,35 natomiast pK 2 (R—NH*) = 9,69, to punkt izoelektryczny (pl) alaniny wynosi:

2,35+9,69
Pl

= 6,02

Wyliczenie wartości pl dla aminokwasu z dodatkowymi grupami zjonizowanymi, poza tymi związanymi z węglem ot, jest bardziej skomplikowane. Na rycinie 4-4 przedstawiono róŜne formy jonowe kwasu asparaginowego. Jakie będzie zatem pH odpowiadające punktowi izoelektrycznemu dla tego aminokwasu? W poszukiwaniu pl dla kwasu asparaginowego trzeba napisać wszystkie moŜliwe formy jonowe tego związku w kolejności, w której pojawiają się w roztworach — od silnie kwaśnych, poprzez obojętne do zasadowych (porównaj przykład kwasu asparaginowego na ryc. 4-4). Następnie naleŜy rozpoznać formę izojonową, jon obojnaezy lub obojętny (jak na ryc. 4-4B). Punkt izoelektryczny (pl) jest to pH w środku pomiędzy wartościami pK po obydwu stronach form izojonowych. W omawianym przykładzie:
2,09+ 3,86 Pl = 2,98

Wartość pl dla lizyny wynosi 9,7; dla argininy 10,8. Czytelnik powinien umieć określić pl dla histydyny. Określenie wartości pK po kaŜdej stronie jonu obojnaczego przez sprawdzenie form naładowanych, nie ogranicza się do aminokwasów. MoŜna ją stosować do obliczania ładunku cząsteczki z kaŜdą liczbą grup dysocjujących. MoŜliwość wykonywania takich obliczeń okazuje się bardzo przydatna w laboratorium klinicznym, gdyŜ pozwala przewidzieć ruchliwość elektroforetyczną związków w polu elektrycznym i dobrać właściwe bufory do ich rozdziału. Na przykład, w buforze o pH 7,0 moŜna rozdzielić 2 typy cząsteczek: z pl 6,0 i 8,0, poniewaŜ cząsteczka z pI = 6,0 będzie mieć większy całkowity ujemny ładunek przy pH 7,0 niŜ cząsteczka z pI = 8,0. Podobne rozwaŜania stosują się do rozdziałów na złoŜach jonowych zarówno dodatnio, jak i ujemnie naładowanych polimerów (np. DEAE-celuloza, Ŝywica Dowex 1), Rozpuszczalność i temperatura topnienia aminokwasów odzwierciedlają ich charakter jonowy Obecność elektrycznie naładowanych grup większości aminokwasów przyczynia się do ich rozpuszczalności. W formie jonowej rozpuszczają się one łatwo w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol, ale nie rozpuszczają się w rozpuszczalnikach niepolarnych, jak: benzen, heksan i eter. Wysoka temperatura topnienia (punkty topnienia powyŜej 200DC) odzwierciedla ilość energii potrzebnej do pokonania sił jonowych stabilizujących strukturę sieci kryształów.

Takie rozwiązanie jest równieŜ stosowane do obliczania wartości pl aminokwasów z innymi, dodatkowymi grupami dysocjującymi, np. lizyny lub histydyny. Po napisaniu wszystkich moŜliwych form elektrycznie naładowanych aminokwasów zasadowych — lizyny i argininy — naleŜy zapisać, Ŝe:
pK2+ pK3 P ' = --------- « -------

AMINOKWASY / 33 Tabela 4-2. Podział L-at-aminokwasów występujących w białkach na podstawie względnej polarności ich grup R. W grupie niepolarnej jest mała bądź nie ma wcale róŜnicy w ładunku elektrycznym między regionami, podczas gdy w grupie polarnej róŜnica ta jest względnie duŜa Aminokwasy
niepolarne

PODZIAŁ AMINOKWASÓW WYSTĘPUJĄCYCH W BIAŁKACH NA PODSTAWIE WZGLĘDNEJ POLARNOŚCI ICH GRUP R
Aminokwasy występujące w białkach moŜna podzielić na 2 duŜe grupy na podstawie poiarności grup R. przyłączonych do atomu węgla a. W celu ułatwienia przedstawiania niezwykle długich sekwencji amin o kwasowych niektórych białek, praktykuje się stosowanie jednoliterowych symboli aminokwasów (tab. 4-3). Aminokwasy w stanie wolnym lub związanym (nie będące składnikami białek) odgrywają waŜną rolę w procesach przemiany materii (tab. 4-4 i 4-5). Na przykład ornityna, cytrulina i kwas argininobursztynowy uczestniczą w biosyntezie mocznika, katanie naturalnym występuje ponad 20 D-aminokwasów. NaleŜą do nich Dalanina i kwas D-glutami nowy ścian komórkowych niektórych bakterii oraz róŜne D-aminokwasy wchodzące w skład antybiotyków.

Aminokwasy polarne Arginina Asparagina Kwas asparaginowy Cysteina Kwas glutaminowy Glutamina Glicyna Histydyna Lizy na Sery na Treonina Tyrozyna

Alanina Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloa Janina Prolina Tryptolan Walina

Tabela 4-3. L-s-aminokwasy występujące w białkach* Nazwa Symbol Wzór strukturalny

Aminokwasy z. alifatycznymi łańcuchami bocznymi
H—CH™COCT

Glicyna

Gly [G]

Alanina

Ala [A]

CH3

Walina

Vaf [V]

,CH—CH—COO"

t

Leucyna

Leu [L]

H,C

X

Izoleucyna

Ile [1]

7>

CH—CB—CGO"

40 / ROZDZSAŁ 4

cd. tab. 4-3 Nazwa Symbol Wzór strukturalny

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym grupy hydroksylowe (OH)
Sery na

Ser [S]

CH^CH^rC&O.---.Li ^łJLJf-

Treonina

Thr[T]

CH,-CH—OH—COCT

OH *NHj

Tyrozyna

Tyr [Y]

patrz niŜej

Aminokwasy z łańcuchem bocznym zawierającym atomy siarki
Cysterna* Cys [C]

SH fl^ CH;—
CH3-CH—COO" CH SH
;C

Metionina

Met [M]

H

3

H COO
rwij -^

O^~Cn3

Aminokwasy z łańcuchem Kwas asparaginowy

bocznym zawierającym grupy kwaśne lub ich amidy Asp[D]

"OOC—C Hs —CH—COO"
t 1L 1 M

flfTJ

.$.

Asparagina

Asn [N]

HjN-C-CH, -C H —COO" 0 ^H,

Kwas glutaminowy

Glu ! El

"OOC—C H 2—C H3 —CH—COO"

Glutamina

Gin [Q]

H,N—C—CH 2—C H2 ~CH—COO-

Aminokwasy z łańcuchem
H—N—CH2—CH,—CH? —CH—COO"

bocznym zawierającym grupy zasadowe

I
Arginina
NH,

Arg
r

+

NH5

Lizy na

H s - CH, —CH, —C H S - CM—

[R]

COO" H3
+

NH,

Histydyna j Lys [K]

I

C H,—GH—COO*

AMINOKWASY / 41 cd. tab. 4-3 Nazwa Symbol Wzór strukturalny

Aminokwasy zawierające pierścień aromatyczny -Histydyna Fenyioaianina His [H] Phe {F] patrz wyŜej \ — / >—CHj—CH^COO"

Tyrozyna

Tyr[Yl

Tryptofan

Trp[W]
H

pCH;—CH—cocr

Immokwasy Ptoiina Pro [P]

i------------1

*. Z wyjątkiem hydroksyl i zyny (Hyl) thydroksyproliny (Hyp), które są włączane w wiązania peptydowe jako lizyna i proiina, a następnie hydroksylowane, swoiste tRNA istnieją dla wszystkich aminokwasów przedstawionych w tej t3be/i. Ich włączanie w białka pozostaje pod bezpośrednią kontrolą genetyczną. ** Cystyna składa się z 2 reszt cystetn połączonych wiązaniem disiarczkowym: I
"OOC—CH—CHZ —S—S—CH2—CH—COO" NH +

Tabela 4-4. Przykłady oc-aminokwasów nie występujących w białkach, ale spełniających istotną rolę w metabolizmie ssaków Nazwa po tuczna i systematyczna Homocysteina (kwas 2amino--4-merkaptoma słowy) Kwas cysteinosulfinowy {kwas 2-amtno-3-sulfinopropionowy) Homoseryna (kwas 2-amino-4-hydroksymasłowy) Wzór strukturalny w pH obojętnym
CH 2 — CH ? —CH—COCf SH
ł

Znaczenie Związek pośredni w biosyntezie metiortiny Związek pośredni w katabotizmie cysteiny Związek pośredni w metabolizmie treoniny, asparaginianu i metioniny

NH 3

H2—CH—COO" CH2—C

so t^

CHS—CHS

42 / ROZDZIAŁ 4

cd. tab. 4-4 Nazwa potoczna i systematyczna
Ornityna (kwas 2,5-diaminoamylowy)

Wzór strukturalny w pH obojętnym
C H2—CH2—CH2—bi—COO"

Znaczenie

Cytrulina (kwas2-amtno-5-ureidoamylowy)

I
NH,

Związek pośredni w biosyntezie mocznika

Kwas argininobursztynowy

■NH CH2~™CHj11 "CHj

JW.

HN—C—NH"COO—CH2—C—COO*

Dopa {3,4-dihydroksyfenyloalanina)

3—T

V—CH,

Prekursor meianiny

HO

3-Monojodotyrozyna

HO

CH,—

Prekursor hormonów tarczycy

I

3,5 - D i j od oty r ozy n a

HO

-CH,

3,5,3'-Trijodotyronina (T 3) .

jw.

Tyroksyna (3,5,3',5'-tetrajodotyronina; T4}

HO

CH,

jw.

AMINOKWASY / 43 Tabela 4-5. Przykłady nie a-aminokwasów waŜnych dla metabolizmu ssaków Nazwa potoczna i systematyczna B-alanina (kwas 3-aminoproprionowy) Tauryna {kwas 2-amtnoerytosu)fonowy) Kwas y-aminomasłowy (GA8A) (kwas 4-aminomasłowy)
Kwas fi-aminuizumasłowy H 3 N+—CH 2 —CH—COO"

Wzór strukturalny
CH2—CH2—COO" [ + NH3 CH2—CH2—SO3"
11

Znaczenie Składnik koenzymu A i witaminy
pantoteiny

Występuje w Ŝółci w połączeniu z kwasami Ŝółciowymi NeuroprzekaŜnik powstający z glutaminianu w tkance mózgowej

On2—v*r12—^rl2—UUU

(kwas 2-metylo-3-aminopropionowy)

ĆH3

Końcowy produkt katabolizmu pirymidyny, występujący w moczu niektórych osób

WŁAŚCIWOŚCI POSZCZEGÓLNYCH AMINOKWASÓW ZALEZĄ ÓD ICH GRUP R PRZY ATOMIE WĘGLA a Glicyna, najmniejszy aminokwas, moŜe „dopasować się" łatwo w obszary trójwymiarowej struktury białek, niedostępne dla innych aminokwasów i występuje w obszarach, w których łańcuchy peptydowe ulegają silnemu zwinięciu. Alifatyczne grupy R jłaniny, waliny, leucyny jjzoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenyloajaniny, tyrozyny i tryptofanu są hydrofobowe i ta właściwość ma waŜne znaczenie w uporządkowaniu cząsteczek wody w białkach, w bezpośrednim sąsiedztwie tych grup. Te aminokwasy są charakterystyczne przede wszystkim dla wnętrza łańcuchów białek cytozolowych. Naładowane grupy R aminokwasów zasadowych odgrywają kluczową rolę w utrzymywaniu swoistej konformacji białka przez tworzenie wiązań typu soli. Przerwanie i odtworzenie wiązań typu soli towarzyszy utlenowaniu i odtlenowaniu hemoglobiny {p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naładowanymi grupami R uczestniczą w układach „przekazywania ładunku" (ang, „charge relay"). które przesyłają ładunki na znaczne odległości podczas katalizy enzymatycznej. Histydyna ponadto pełni wyjątkową i waŜną funkcję w katalizie enzymatycznej, gdyŜ wartość pK jej formy protonowej układu imidazolowego dopuszcza w pH 7,0 działanie jej jako katalizatora zasadowego lub kwasowego.

Pierwszorzędowa grupa alkoholowa seryny i pierwszo rzędowa grupa tioalkoholowa (—SH) cysteiny są doskonałymi czynnikami nukleofilowymi, których funkcja jest waŜna dla katalizy. Z kolei drugorzędowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofiiowym, aczkolwiek nie jest znany jej udział w katalizie. Dodatkowo, poza katalityczną rolą grupy —OH w przypadku seryny i tyrozyny, odgrywa ona rolę w regulacji aktywności niektórych enzymów, których aktywność katalityczna zaleŜy od stanu ufosforylowania reszt serylowych lub tyrozylowych.

L" I |3H
1-

5

6-1 Tryptofan

<H
u

I
<3 Fenyioalanlna

"- 1 1 r ^
240 260 DłusjoSć fali [nm|

1 ---------------- r
280

Ryc. 4-5. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny

i fenyloalaniny.

___

44 / ROZDZIAŁ 4

Aminokwasy nie absorbują światła widzialnego (tj. są one bezbarwne) i, z wyjątkiem aminokwasów aromatycznych: tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absorbują światła nadfioletowego o długości powyŜej 240 nm. Jak przedstawiono na ryc. 4-5 większość światła nadfioletowego o długości fali powyŜej 240 nm, absorbowanego przez białko, pochłania zawarty w nim tryptofan. Ryc. 4-7. Fluorescamma.

REAKCJA Z NINHYDRYNĄ LUB FLUORESCAMINĄ SŁUśY DO WYKRYWANIA AMINOKWASÓW
Ninhydryna (ryc. 4-6). Powoduje oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów, w wyniku czego powstają CO Z , NH 3 i atdehyd uboŜszy o jeden atom węgla w porównaniu z macierzystym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, tworząc niebieski kompleks, który absorbuje światło o długości 570 nm. NatęŜenie barwy niebieskiej powstałego kompleksu stanowi podstawę
ilościowej metody oznaczania aminokwasów, za

RÓśNORODNOŚĆ TECHNIK ROZDZIAŁU AMINOKWASÓW Chromatografia
We wszystkich rodzajach chromatografii cząsteczki rozdzielają się między fazę stacjonarną a ruchomą (tab. 4-6). Rozdział zaleŜy od względnej tendencji cząsteczek mieszaniny do ich silniejszego wiązania się z jedną z tych faz. ChociaŜ

przedstawione techniki rozdziału dotyczą głównie aminokwasów, ich zastosowanie nie ogranicza się tylko do tych cząsteczek.
Tabela 4-6. Relacje zachodzące między fazami w chromatografii TYP chromatografii Chromatografia podziałowa na stałych sorbentach; filtracja Ŝelowa Chromatografia jonowymienna Chromatografia podziałowa między cienką warstwą ciekłego złoŜa i przepływającym gazem Faza stacjonarna Ciekła Stała Ciekła Faza ruchoma Ciekła Ciekła Gazowa

pomocą której moŜna wykryć mikrogramowe ilości aminokwasów. Aminy, inne niŜ a-aminokwasy, takŜe reagują z ninhydryna, tworząc barwny niebieski kompleks, ale bez tworzenia CO2. Powstawanie CO? wskazuje zatem na obecność a-aminokwasów. Peptydy i NH$ reagują takŜe z ninhydryna, lecz znacznie wolniej niŜ a-aminokwasy. Pro lina i 4-hydroksyprolina tworzą z ninhydryna kompleks o barwie Ŝółtej.

Ryc. 4-6. Ninhydryna.

Chromatografia bibułowa
Chromatografia bibułowa, pomimo wypierania jej przez bardziej wyrafinowane metody, wciąŜ znajduje zastosowanie w rozdziałach aminokwasów. Próbki aminokwasów nanosi się na pasek bibuły, w określonym punkcie, w odległości 5 cm od jego końca. Następnie pasek zawiesza się w szczelnym naczyniu (komorze) zawierającym rozpuszczalnik (ryc, 4-8).

Fluorescamina (ryc. 4-7). Jest czulszym związkiem, za pomocą którego moŜna wykryć nanogramowe ilości aminokwasów. Podobnie jak ninhydryna, fluorescamina tworzy kompleks z aminami innymi niŜ a-aminokwasy.

AMINOKW ASY / 45

TnT
Kierunek wędrówki Pasek rozpuszczalnika iblbutyj 1 Naczynia 2 rozpuszczalnikiem

Ryc. 4-8. Chromatografia bibułowa zstępująca (przekrój komory).

Rozpuszczalniki stosowane do rozdzielania aminokwasów są mieszaninami wody, alkoholi, kwasów lub zasad. Bardziej polarne składniki rozpuszczalnika wiąŜą się z celulozą i stanowią fazę stacjonarną, zaś mniej polarne składniki — fazę ruchomą. Tak jest w klasycznej chromatografii podziałowej. W chromatografii podziałowej w odwróconej fazie polarności fazy ruchomej i stacjonarnej są odwrócone (np. przez

Kierunek wędrówki rozpuszczalnika Lys Asp •

*

_ Start

Glv Thr

1
1

Cys His Arg Ser Glu

Pro
Val

i i
#

Tvr
Met

Trp Phe Leu

Ryc. 4-9. identyfikacja aminokwasów występują cych w białkach. Po rozdziale mieszaniny amino kwasów techniką chromatografii bibułowej zstępu jącej w układzie n- butanol -kwas octowy-woda plamy aminokwasów wywołano za pomocą ninhydryny. _______________________________

pierwotne zanurzenie bibuły w roztworze silikonu). Chromatografię podziałową w odwróconej fazie stosuje się do rozdziału niepolarnych peptydów lub lipidów, niepolarnych związków, takich jak niektóre aminokwasy. WyróŜnia się 2 typy technik stosowanych do rozwijania chromato gram u; chromatografię wstępującą i zstępującą, tj. odpowiednio gdy rozpuszczalnik wędruje przez bibułę z naniesioną próbą w górę lub w dół. Kiedy rozpuszczalnik zbliŜy się prawie do końca bibuły, wtedy wyjmuje się ją, suszy i przeprowadza reakcję identyfikacji badanych związków (w przypadku aminokwasów przeprowadza się reakcję z 0,5% roztworem ninhydryny w acetonie, po czym ogrzewa przez kilka minut w temp. 90—110°C. Aminokwasy z duŜymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) wędrują dalej niŜ te z krótszymi niepolarnymi łańcuchami bocznymi (Pro, Ala, Gly) lub z polarnymi łańcuchami bocznymi (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (p. ryc. 4-9). Odzwierciedla to większą względną rozpuszczalność cząsteczek polarnych w hydrofilowej fazie stacjonarnej, zaś cząsteczek niepolarnych w rozpuszczalnikach organicznych. W grupie cząsteczek niepolarnych (Gly. Ala, Val, Leu) zwiększeniu długości niepolarnego łańcucha bocznego towarzyszy zwiększenie ruchliwości tych cząsteczek. Stosunek odległości przebytej przez aminokwas do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika, mierzonych od miejsca naniesienia mieszaniny aminokwasów, opisuje się jako wartość Rf tego aminokwasu (względną ruchliwość). Wartości Rf dla danego aminokwasu zmieniają się w zaleŜności od warunków doświadczalnych, np. od stosowanego rozpuszczalnika. ChociaŜ moŜliwa jest próbna identyfikacja aminokwasu za pomocą samej wartości Rf, bardziej wskazane jest rozdzielenie chromatograficzne nieznanej mieszaniny aminokwasów równocześnie ze znanymi aminokwasami wzorcowymi. Wobec tego ruchliwość moŜe być porównana do ruchliwości wzorców (np. jako RAia raczej niŜ jako Rf). Ruchliwości, przedstawione jako względne wobec standardowych, róŜnią się mniej niŜ wartości Rf z kolejnych doświadczeń. Zawartość aminokwasów moŜna oznaczyć ilościowo, wycinając kaŜdą plamę i eluując odpowiednim rozpuszczalnikiem, a następnie przeprowadzając analizę kolorymetryczną (z ninhydryną). W innym rozwiązaniu bibułę

46 / ROZDZIAŁ 4

spryskuje się ninhydryną, a natęŜenie barwy wyeluowanych plam mierzy się w fotometrze z zapisem natęŜenia światła przepuszczanego lub odbitego. W innej technice — chromatografii bibułowej dwuwymiarowej, próbkę nanosi się w jednym rogu kwadratowego arkusza bibuły i rozdziela w odpowiednio dobranej mieszaninie rozpuszczalników. Po wysuszeniu i usunięciu rozpuszczalnika arkusz obraca się o 90°C i rozdziela w innej mieszaninie rozpuszczalników (ryc. 410).

— ATLC), nie przypomina chromatografii bibułowej i opiera się na innych zasadach. W tej technice rozpuszczalnik (który nie musi być dwuskładnikowy lub bardziej złoŜony) eluuje składniki próby z zaadsorbowanych miejsc na aktywowanym sorbencie, takim jak praŜony Ŝel krzemionkowy. Metoda ATLC znajduje zastosowanie do rozdziału związków niepolarnych, takich jak lipidy, i stąd nie jest przydatna dla części aminokwasów i większości peptydów. Chromatografia jonowymienna Całkowita analiza reszt aminokwasowych po hydrolizie łańcucha peptydowego wymaga na
ogół automatycznej chromatografii jonowymien-

Butanol-kwas octowy-woda (4:1:5).

Ryc. 4-10. Dwuwymiarowa chromatografia aminokwasów (przerysowano, nieznacznie zmodyfikowano z: Levy A. J. i Chung D.: Two-dimensional chi-omatographyof aminoacidsonbuffered papers. Aria!. Chem. 1953; Copyright ©1953 by American Chemical Society; zamieszczono za zgodą).

nej. Pełen rozdział, identyfikacja i oznaczenie ilościowe hydrolizatu białkowego nie trwa dłuŜej niŜ 3 h. W metodzie Moore'a i Steina stosuje się kolumny (krótką i długą) zawierające formę Na+ sulfonowanej Ŝywicy polistyrenowej. Kiedy kwaśny hydrolizat w pH 2,0 zostanie naniesiony na kolumny, aminokwasy wiąŜą się z jonem Na+ wymieniacza kationowego. Następnie kolumny eluuje się cytrynianem sodu w zaprogramowanych warunkach pH i temperatury. Krótką kolumnę eluuje się jednym buforem, zaś długą — dwoma, W eluatach z kolumn wywołuje się reakcję z odczynnikiem ninhydrynowym, a odczyty natęŜenia barwy przeprowadza się w kolorymetrze przepływowym. Dane są rejestrowane na katodowej lampie obrazowej ze sprzęŜonym komputerowym odczytem integracji powierzchni pól rozdzielonych aminokwasów (ryc. 4-11).

Chromatografia cienkowarstwowa WyróŜnia się 2 odrębne klasy chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin-layer chromatography; skrót — TLC). Pierwsza — chromatografia cienkowarstwowa podziałowa (ang. partition thin-layer chromatography: skrót — PTLC), w pełni przypomina chromatografię bibułową podziałową. W metodzie PTLC wykorzystuje się te same układy rozpuszczalników i sposoby identyfikacji badanych związków, co w chromatografii bibułowej. Natomiast bibułę zastępuje płytka pokryta cienką warstwą sproszkowanej celulozy lub innego względnie obojętnego złoŜa. MoŜliwy jest równieŜ wariant PTLC w odwróconej fazie. Z kolei druga klasa — adsorpcyjna TLC (adsorption thin-layer chromatography; skrót

570 nm

Ryc. 4-11A

AMINOKWASY / 47 55 ° C

570 nm -pH 3,25-pH 4,25C. 4-11. Automatyczna analiza kwaśnego hydrolizatu białkowego na kolumnach Dowex 50 Moore'a iSteina (w temp. 55° A; Do rozdziału aminokwasów zasadowych uŜyto krótkiej kolumny (5,0x0,9 cm), C). stosując elucję roztworem o pH 5,28; potrzebny czas = 60 min. B: Do rozdziału aminokwasów obojętnych i kwaśnych uŜyto dłuŜszej kolumny (55 x 0,9 cm), stosując elucje najpierw buforem o pH 3,25, a potem buforem o pH 4,25. Norleucynę uŜyto jako substancję wzorcową {tzw. wzorzec wewnętrzny). Aminokwasy zasadowe pozostają związane na kolumnie; potrzebny czas =180 min. Eluowane próbki reagują z odczynnikiem ninhydrynowym, a pomiar ich gęstości optycznej jest dokonywany przy długości fal światła 570 nm i 440 nm. Przy 440 nm wykrywa się jedynie prolinę i hydroksyprolinę. Oś rzędnych — gęstość optyczna w skali logarytmicznej: oś odciętych — czas w min (reprodukowano za zgodą: Prof. ET. Mert, Pardue University).

Elektroforeza wysokonapięciowa
Elektroforeza wysokonapięciowa (ang. high-voltage electrophoresis; skrót — HVE) rozdzielająca aminokwasy, polipeptydy i inne amfolity (cząsteczki, których ładunek całkowity zaleŜy od pH otaczającego środowiska) w polu prądu stałego ma wiele zastosowań w biochemii. W analizie aminokwasów najczęściej uŜywanymi nośnikami są arkusze bibuły albo cienkowarstwowe płytki powleczone sproszkowaną celulozą. W rozdziałach wielkocząsteczkowych polipeptydów i białek uŜywa się usieciowanego Ŝelu poliakryloamidowego. W analizie oligomerów nukleotydowych wykorzystuje się głównie 2 złoŜa — agarozę i Ŝel poliakryloamidowy. Rozdział amfolitów, umieszczonych w polu elektrycznym o napięciu 2000—5000 V w ciągu 0,5—2 h, zaleŜy od ich ładunku elektrycznego i masy cząsteczkowej, W przypadku cząsteczek obdarzonych jednakowym ładunkiem elektrycznym, szybciej będą wędrować cząsteczki o mniejszej masie. Ładunek elektryczny jest jednak waŜniejszym czynnikiem w określeniu stopnia osiągniętego rozdziału. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie aminokwasów, małocząsteczkowych polipeptydów,

niektórych białek, nukleotydów i fosfocukrów. Próbki nanosi się na nośnik zwilŜony buforem o odpowiednim pH i łączy się ten nośnik ze zbiornikami buforu za pomocą bibułowych łączników, a cały układ z bibułą moŜna przykryć płytą szklaną lub zanurzyć w chłodziwie węglowodorowym. Po podłączeniu prądu cząsteczki obdarzone ładunkiem dodatnim wędrują w roztworze o wybranym pH w kierunku katody, a cząsteczki z ładunkiem ujemnym — w kierunku anody. W celu zidentyfikowania rozdzielonej próby elektroforegram wybarwia się odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, peptydy), bromkiem etydyny i ogląda w świetle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wybór pH „narzucają" wartości pK grup zjonizowanych cząsteczek w mieszaninie.

NAJWAśNIEJSZĄ REAKCJĄ AMINOKWASÓW JEST TWORZENIE WIĄZANIA PEPTYDOWEGO
W zasadzie tworzeniu wiązania peptydowego towarzyszy odłączenie 1 mola wody, powstającego z grupy a-aminowej jednego aminokwasu

48 / ROZDZIAŁ 4 — NH

Alanina

OH + H
O Walina

hydrolizy wiązania peptydowego. Aby przeprowadzić biosyntezę wiązania peptydowego między dwoma aminokwasami, najpierw musi ulec aktywacji grupa karboksylowa. Chemicznie grupę karboksylowa moŜna przekształcić w chlorek kwasowy. W przyrodzie, aktywację zapoczątkowuje kondensacja z ATP (p. rozdz. 30).

HSO

PIŚMIENNICTWO
Barrett GC: Chemistry and Biochemistry ofthe Amino Acids. Chapman & Hal], 1985. Davies JS: Amino Acids and Peptides. Chapman & Hali. 1985. Gehrke CW, Kuo KCT, Zumwalt RW, Kenneth CT: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. 3 vols. CRC Press, 1987. Hancock WS: Handbook ofHPLCfor the Separation of Amino Acids, Peptides. and Proteins. 2vols. CRC Press, 1984. Hugli TE: Techniaues in Protein Chemistry. Academic Press, 1989. Rattenbury JM: Amino Acid Analysis. Halstead Press, 1981.

CHpeptyd; alanyiowaltna (Ala-Val) Ryc. 4-12. Aminokwasy połączone wiązaniem peptydowym (obszar zaciemniony).

i grupy oc-karboksylowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-12). Reakcja ta nie przebiega jednak tak, jak przedstawiono na tej rycinie, gdyŜ stała równowagi reakcji jest przesunięta w kierunku

Peptydy
Victor W. Rodweli, PhD

5
PEPTYDY TWORZĄ SIĘ Z L- K AMINOKWASÓW POŁĄCZONYCH WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI Na rycinie 5-1 przedstawiono tripeptyd utworzony z reszt aminokwasowych alaniny, cysteiny i waliny. NaleŜy odnotować, Ŝe tripeptyd składa się z 3 reszt aminokwasów ych. ale nie zawiera 3 wiązań peptydowych. Umownie strukturę peptydu zapisuje się rozpoczynając od lewej strony N-końcową resztą aminokwasów ą (z wolną grupą a-aminową), a kończąc po prawej stronie C-końcową resztą aminokwasową (z wolną grupą a-karboksylową). Przedstawiony peptyd ma jedną wolną grupę a-aminową oraz 1 wolną grupę a-karboksylową. JednakŜe w niektórych pepiydach końcowe grupy aminowe lub karboksylowe mogą być podstawione (np. N-formyloamina lub amid grupy karboksylowej) i w ten sposób nie są wolne.

WPROWADZENIE Po połączeniu grup aminowych i karboksylowych aminokwasów z utworzeniem wiązań peptydowych, składowe ami no kwasowe określa się resztami aminokwasowymi. Peptyd składa się z dwóch lufo więcej reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi. Peptydy zawierające więcej niŜ 10 reszt aminokwasowych nazywa się polipeptydarni, ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Peptydy są związkami budzącymi szerokie zainteresowanie, szczególnie w endokrynologii. Wiele hormonów jest peptydami i mogą być podawane chorym w celu korygowania ich niedoborów (np. wstrzyknięcia insuliny chorym na cukrzycę). Pewne antybiotyki są peptydami (np. walinomycyna i gramicydyna A), a nieliczne z nich substancjami przeciwnowotworowymi (np. bleomycyna). Szybka synteza chemiczna i technologia rekombinacji DNA ułatwiły produkcję znacznych ilości hormonów peptydowych. Wiele z nich występuje w organizmie w stosunkowo małych stęŜeniach, co utrudnia moŜliwość ich wydzielenia w ilościach wystarczających do leczenia. Ta sama technologia pozwala syntetyzować inne peptydy, dostępne z naturalnych źródeł w niezwykle małych ilościach (np. niektóre peptydy i białka wirusowe), wykorzystywane do produkcji szczepionek.

Alanyb-

cysteinylo-

walina

Ryc. 5-1. Wzór strukturalny tripeptydu {wiązania peptydowe zaciemniono).

Prosta metoda przedstawiania wzorów strukturalnych peptydów Aby w prosty sposóbzapisać wzór strukturalny peptydu, w pierwszej kolejności rysuje się jego „szkielet" z połączonych grup oc-NHU
4 — Biochemia

50 / ROZDZIAŁ 5

i a-COOH oraz atomów węgla a. Następnie wpisuje się w odpowiednie miejsca łańcucha atomy węgla a (patrz niŜej). NaleŜy więc: 1. Narysować szkielet (zyg-zag) i dodać N-końcową grupę aminokwasową:

G!u-A!a-Lys-Gly-Tyr-Ala E A K G Y A
Ryc. 5-2. Przykład zapisu jednoliterowymi i trójI(terowymi symbolami reszt aminokwasowych przedstawiający pierwszorzędową strukturę heksapeptydu, zawierającego, jako N-końcowy aminokwas, kwas glutaminowy (Glu, E) oraz jako Ckońcowy — alaninę {Ala, A).

2. Dopisać atomy węgla a, grupy a-karboksylowe i a-aminowe:

COO+

Glu-Lys-(A!a,Gly,Tyr)-His-Ala
Ryc. 5-3. Przykład heptapeptydu, zawierającego fragment o niepewnej strukturze pierwszorzędowej (w nawiasie).

H3N

3. Dopisać właściwe grupy R i atomy wodoru a do atomów węgla a: SH 0 H CH,

H

II V H \ H
O H
CH, CH,

00

Zapis struktury pierwszorzędowej za pomocą trójliterowych symboli, połączonych kreskami reprezentującymi wiązania peptydowe, jest zrozumiały i jednoznaczny. Kreski zwykle pomija się w zapisie sekwencji peptydów przy uŜyciu symboli jednoliterowych. W przypadku niepewności w ustaleniu kolejności fragmentu polipeptydowego, wątpliwą sekwencję reszt aminokwasowych umieszcza się w nawiasie i oddziela przecinkami (ryc. 5-3). Zmiana w pierwszorzędowej strukturze peptydu moŜe zmieniać jego aktywność biologiczną Podstawienie pojedynczego aminokwasu przez inny, w liniowej sekwencji polipeptydu o 100 lub więcej resztach aminokwasowych, moŜe zmniejszyć lub znieść jego aktywność biologiczną oraz powodować potencjalnie powaŜne następstwa (np. niedokrwistość sierpowata). Wiele dziedzicznych wad metabolicznych wynika ze zmiany pojedynczego aminokwasu w określonym białku. Wprowadzenie nowych metod badania struktury białek i DNA przyczyniło się do poszerzenia wiedzy o biochemicznych podstawach wielu dziedzicznych chorób metabolicznych. Peptydy są potielektrolitami, których ładunek zaleŜy od pH otaczającego środowiska Wiązanie peptydowe (amidowe) nie ma ładunku w Ŝadnym waŜnym fizjologicznie pH. Powstawaniu peptydów z aminokwasów w pH

Kolejność aminokwasów określa strukturę pierwszorzędową peptydu Pierwszorzędową strukturę peptydu określa
liczba, budowa chemiczna i kolejność (sekwen-

Symboli trój- i jednoliterowych uŜywa się w zapisie aminokwasów w peptydach PoniewaŜ polipeptydy (białka) mogą zawierać 100 i więcej reszt aminokwasowych, w celu przedstawienia ich struktury pierwszorzędowej (ryc. 5-2) stosuje się symbole albo trój- albo jednoliterowe (tab. 4-3, kolumna 2).

PEPTYDY / 51

7,4 towarzyszy utrata jednego ładunku dodatniego i ujemnego przy utworzeniu jednego wiązania peptydowego. JednakŜe peptydy są cząsteczkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym w pH fizjologicznym dzięki ładunkom ich grup C- i N-końcowych oraz grup funkcyjnych występujących w polarnych resztach aminokwasowych przyłączonych do atomów węgla a (p. tab. 4-1). Liczba moŜliwych konformacji peptydu jest wymuszona siłami niekowalencyjnymi Polipeptydy mogą wykazywać róŜną konformację (ułoŜenie przestrzenne), jednak w roztworze przewaŜa tendencja do niewielkich zmian konformacyjnych. Konformację peptydów utrwalają takie czynniki, jak zawada przestrzenna, oddziaływania kulombowskie, wiązania wodorowe i hydrofobowe (p. rozdz. 6). Tak jak w przypadku białek, do fizjologicznej aktywności polipeptydów jest nieodzowna specyficzna konformacja. WIELE MAŁO CZĄSTECZKOWYCH PEPTYDÓW WYKAZUJE AKTYWNOŚĆ FIZJOLOGICZNĄ Komórki zwierząt, roślin i bakterii zawierają róŜnorodne małocząs tęcz k owe polipeptydy (3—100 reszt aminokwasowych) o istotnej aktywności fizjologicznej. Niektóre z nich, łącznie z większością polipeptydowych hormonów ssaków, zawierają tylko wiązania peptydowe, utworzone między grupami a-aminowymi i 7-karboksylowymi, 20 L-a-arninokwasów występujących w białkach. JednakŜe w polipeptydach mogą równieŜ występować dodatkowe, ,,niebiałkowe" aminokwasy, lub teŜ pochodne aminokwasów budujących białka. Krótki polipeptyd — bradykinina, czy.anik zj32ui£^szaJ3«y.jłapica.e.inięśni^ła<ikicfe — uwalnia się ze swoistych białek osocza przez proteoliŜę.
Arg-Pro-Pro-Giy-Phe-Ser Pro-Phe Arg Bradykinirta

0 N I H

SH CH2
CHj I
CHj H-C-NHS

coo-

cooRyc. 5-4. Giutation (y-glutamylocysteinyloglicyna).

zym — reduktaza glutationowa — uczestniczą w powstawaniu prawidłowych wiązań disiarczkowych w wielu białkach i hormonach polipeptydowych (p. rozdz. 6). Antybiotyki jolipeptydowe. Są wytwarzane przez grzyby i zawierają zarówno D- jak ...LLcaminokwasy, a takŜe aminokwasy nie występujące w białkach. Zalicza się do nich np. tyrocydynę i gramicydynę S, cykliczne polipeptydy zawierające D-fenyłoalaninę oraz niebiałkowy aminokwas — ornitynę. NaleŜy podkreślić, Ŝe wymienione polipeptydy nie są syntetyzowane na ry boso mach. Hormon tyreotropowy (TRH). W tym wariancie peptydowym N-końcowy kwas glutaminowy- ulega, cyklizacji do kwasu piro glutamino we.gOjjiatomiast N-końcowa grupa karboksylowa jjroliny występuje jako amid (ryc. 5-5).

Ryc. 5-5. (TRH).

Piroglutamylohistydyloprolinoamid

Glutation (ryc, 5-4). Jest nietypowym tripeptydem, w którym N-końcowy kwas glutaminowy wiąŜe się z cysteiną wiązaniem nie-ot-peptydylowym. Jest związkiem niezbędnym do działania niektórych enzymów. Glutation i en-

W niektórych przypadkach polipeptydy ssaków w swojej cząsteczce mogą zawierać więcej niŜ 1 fizjologicznie czynny peptyd, np, (3-lipotropina. Ten hormon przysadki pobudza uwalnianie kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. W strukturze pierwszorzędowej pMipotropiny występują fragmenty łańcucha wspólne dla innych hormonów peptydowych o odrębnych właściwościach fizjologicznych (ryc. 5-6). Długi polipeptyd jest prekursorem krótszych polipeptydów.

52 / ROZDZIAŁ 5
GL T S O R L R N G D S P N A G A N O G E G P N A L E H S L !_■»

« D L V » A E K

K OrETSXPlTrftYMl €Y HTFYRYW G / S YPYP YKYDl K

R

...-

0-Endorflna y-Endorfina a-Endorflna Enkefallna metloninowa Byc. 5-6. Pierwszorzędowa struktura fMipotropiny. Reszty 41-58 reprezentują hormon pobudzający melanocyty (p-MSH). Reszty 61—91 zawierają sekwencje odpowiadające wskazanym endorfinom.

ZŁOśONĄ MIESZANINĘ PEPTYDÓW MOśNA ROZDZIELIĆ PODCZAS ELEKTROFOREZY LUB CHROMATOGRAFII Chromatografia i elektroforeza wysokonapięciowa (HVE) Techniki, które jako podstawę rozdziału wykorzystują ładunek elektryczny, znajdują zastosowanie zarówno w badaniach polipeptydów, jak i aminokwasów (p. rozdz. 4). Wartość pK. C-końcowej grupy karboksylowej polipeptydu jest większa niŜ grupy a-karboksylowej odpowiedniego aminokwasu (oznacza to, Ŝe grupa karboksylowa peptydu jest słabszym kwasem). Odwrotnie, N-końcowa grupa aminowa polipeptydu jest silniejszym kwasem (ma mniejszą wartość pK) niŜ grupa aminowa aminokwasu, od którego on pochodzi (tab. 5-1).

Filtracja Ŝelowa W metodzie automatycznego sekwencjonowania wykorzystuje się niewielką liczbę peptydów o długości 30—100 reszt aminokwasowych. JednakŜe wiek wielkocząsteczkowych polipeptydów moŜe być nierozpuszczalnych, z powodu odsłonięcia w procesie dcnaturacji uprzednio niedostępnych reszt hydrofobowych. Nierozpuszczalnośc polipeptydów moŜna pokonać przez ich rozpuszczenie w moczniku, alkoholach, kwasach organicznych lub zasadach, ale czynniki te ograniczają stosowanie technik chromatografii jonowymiennej w ich oczyszczaniu. Okazuje się, Ŝe filtrację Ŝelową duŜych hydrofobowych peptydów moŜna przeprowadzić, uŜywając roztworów kwasu mrówkowego lub octowego w duŜych stęŜeniach (1—4 mol/1). Wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa w fazie odwróconej Skuteczną techniką tv oczyszczaniu wielkocząsteczkowych, niepolarnych peptydów jest wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography; skrót — HPLC) na niepolamych nośnikach, z wykorzystaniem polarnych rozpuszczalników. Na rycinie 5-7 przedstawiono 'rozdział bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny płodowej za pomocą tej techniki. Połączenie

Tabela 5-1. Wartości pK glicyny i peptydów glicynowych

9.60 8,17 7,91

Gly Gly-Gly GlyGty-Gly

PEPTYDY / 53

o

sie lub solami srebra, natomiast polinukleolydów — bromkiem etydyny. Popularną odmianą elektroforezy jest PAGE w warunkach denaturujących. Białka przed elektroforeza, poddaje się gotowaniu w odpowiednim buforze, a następnie rozdziela w obecności czynników denaturujących — mocznika lub siarczanu dodecylu sodu (SDS). Ujemny ładunek cząsteczek \ CH1 - (CH,), L - SO3") pokrywa białka w stosunku 1 cząsteczka SDS na 2 wiązania pcptydowe. ["o „obładowanie" białek ładunkami czyni je silnie ujemnymi (anionami). Późniejszy rozdział białek jest oparty na wielkości ich masy cząsteczkowej. Metoda SDS-PAGE jest szeroko stosowana do określania masy cząsteczkowej białek przez porównanie ich ruchliwości elektroforetycznej z ruchliwością białek wzorcowych o znanej masie cząsteczkowej.

Ryc. 5-7. Profil elucyjny rozdziału bromocyjanowych fragmentów ludzkiej globiny pfodowej, uzyskanej metodą HPLC w odwróconej fazie. Przedstawiono oznaczenia dowolnie numerowanych fragmentów OL i 7 łańcuchów (reprodukowano dzięki uprzejmości: J.D. Pearson i wsp.r Deparrment of Biochemistry, Pardue Ur>iversity).

PIERWSZY ETAP W OKREŚLANIU STRUKTURY PIERWSZORZĘDOWEJ PEPTYDU TO POZNANIE JEGO SKŁADU AMIN0KWASOWEG0
W analizie struktury peptydów najpierw przeprowadza się hydrolizę wiązań peptydowych łączących aminokwasy. PoniewaŜ wiązania te są trwałe w roztworach o obojętnym pH, przeprowadza się hydrolizę kwaśną lub zasadową. Kataliza enzymatyczna jest stosunkowo mało przydatna do przeprowadzenia pełnej hydrolizy wiązań peptydowych. KaŜdy typ hydrolizy białek przebiega z utratą pewnych reszt aminokwasowych. Metodą z wyboru jest hydroliza w zatopionych, odpowietrzonych probówkach w 6 mol/l roztworze HC1 w temp. HO^C. Podczas takiej hydrolizy wszystkie reszty tryptofanu i cysteiny oraz większość reszt cystynowych ulegają zniszczeniu. W obecności jonów metali dochodzi do częściowej utraty metioniny i tyrozyny. Glutamina i asparagina ulegają deamidacji do kwasów: glutaminowego i asparaginowego. Odzysk seryny i treoniny jest niepełny, a ilość tych aminokwasów zmniejsza się w miarę przedłuŜania czasu hydrolizy. Niektóre wiązania między resztami aminokwasów obojętnych (Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Iłe-Val) ulegają rozbiciu tylko w ok. 50% po 20 h hydrolizy. Zwykle przeprowadza się hydrolizę próbek (w powtórzeniach) przez 24, 48, 72 i 96 h, ekstrapolując potem zawartość seryny i treoniny do czasu zerowego. Zawartość waliny i izoieucyny oznacza się po 96 h hydrolizy. Amino-

filtracji Ŝelowej i HPLC w odwróconej fazie stosuje się do oczyszczania złoŜonych mieszanin peptydów, otrzymanych w wyniku częściowego trawienia białek.

Wysokonapięciowa elektroforeza (HVE) na sitach molekularnych
Sączenie molekularne, w połączeniu z rozdziałem związków i wykorzystujące ładunek, ułatwia ich rozdział. Oprócz skrobi i agarozy, najczęściej uŜywanym nośnikiem jest usiedowany polimer akryloamidu (CH2 = CHCONH,,).
Podczas elektroforezy w Ŝelu poliakryloamido-

wym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis; skrót — PAGE) roztwór białka nanosi się na spolimeryzowany akryloamid, w odpowiednim buforze, uformowany w postaci płytki lub w ru■rkach. Czynnikiem sieciującym złoŜe poliakryloamidu moŜe być 2—10% roztwór metyłeno-tó-akryloamidu (CH2 = CONH)? - CH2 lub podobne związki sieciujące. Rozdział naniesionych prób, w odpowiednim buforze, dokonuje się pod wpływem prądu elektrycznego. Identyfikację poiipeptydów po rozdziale elektro foretycznym przeprowadza się za pomocą barwienia Ŝeli błękitem brylantowym Coomas-

5* / ROZDZIAŁ 5

kwasy dikarboksylowe i ich amidy oznacza się razem i przedstawia łącznie jako „Glx" i „Asx". Cysteina i cystyna przechodzą w trwałą w środowisku kwaśnym pochodną (np. kwas cysternowy) przed hydrolizą. Hydroliza zasadowa, w czasie której ulegają zniszczeniu seryna, treonina, arginina i cysteina, a wszystkie aminokwasy ulegają racemizacji, jest stosowana do oznaczania tryptofanu. Po hydrolizie prób ich skład aminokwasowy moŜe być oznaczony podczas automatycznej chromatografii jonowymiennej (p. ryc. 4-11) lub HPLC. Sekwencjonowanie pierwszego białka przeprowadził Fred Sanger, za pomocą odczynnika mającego od tej pory jego nazwisko Minęło juŜ ponad 30 lat od określenia przez Sangera pełnej sekwencji aminokwasowej hormonu polipeptydowego — insuliny. W metodzie Sangera najpierw rozdzielono insulinę na 2 łańcuchy polipeptydowe A i B, po czym poddano swoistemu trawieniu enzymatycznemu do krótkich peptydów, zawierających odcinki sekwencji zachodzących. Następnie zastosowano związek — i-fluoro-2,4-dinitrobenzen (ryc. 5-8), tworzący pochodne tylko
Ryc. 5-8. Reakcja aminokwasu z 1 -fluoro-2,4--N-CH -COOH

CH-COOH dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera). Odczynniki nazwano od nazwiska laureata nagrody Nobla (1958), biochemika Fryderyka Sangera, który zastnsowal go w celu oznaczenia pierwszorzędowej struktury insuliny. Odczynnik ilościowo aryluje wszystkie wolne grupy aminowe, dając intensywnie Ŝółto zabarwione 2,4-dinitrofenyloaminokwasy. Pochodne te łatwo się oznacza ilościowo za pomocą spektrototometru. Oprócz reszt N-końcowych, fluorod(nitrobenzen reaguje takŜe 'z grupami; e-aminową lizyny, imidazolową histydyny, hydroksyl ową tyrozyny i grupą SH cysteiny. PoniewaŜ grupa dinitrofenylowa nie jesi usuwana podczas kwaśnej hydrolizy, stosuje sieją do analizy N-końcowego aminokwasu polipeptydów.

z N-końcowymi resztami aminokwasowymi peptydów, które po hydrolizie usuwano i identyfikowano. Porównanie sekwencji zachodzących pozwoliło Sartgerowi jednoznacznie wydedukować sekwencje obydwu łańcuchów insuliny. Pomimo Ŝe metoda Sangera jest wciąŜ stosowana, 2 inne techniki zrewolucjonizowały oznaczanie struktury pierwszorzędowej polipeptydów (białek). Pierwsza z nich, wprowadzona w 1967 r., to metoda automatycznego usuwania i identyfikowania N-końcowych reszt aminokwasowych peptydów, jako ich pochodnych fenylotiohydantoinowych (degradacja Edmana). Druga — wprowadzona niezaleŜnie przez Sangera oraz Maxama i Gilberta — polega na szybkim sekwencjonowaniu DNA genów kodujących poszukiwane białko. Obecnie optymalną strategią jest stosowanie obydwu równocześnie. Technika automatycznej degradacji Edmana, choć szybsza w analizie sekwencji peptydów od metod Sangera, napotyka trudności i dostarcza wolniej wyników niŜ metoda sekwencjonowania DNA. Technika sekwencjo no wania DNA nie dostarcza jednak nieomylnych, jednoznacznych wyników dotyczących pierwszorzędowej struktury białek. NajpowaŜniejsze trudności w sekwencjonowaniu genów eukariotycznych są związane z obecnością w ich obrębie intronów — sekwencji nukleotydowych nie ulegających ekspresji w dojrzałym białku. Pomimo to, główna przewaga tej metody polega na stosunkowo łatwej detekcji i sekwencjonowaniu regionów prekursorowych cząsteczek, które mogą „umknąć" wykryciu w technice degradacji Edmana (wskutek dojrzewania przed jego wydzieleniem). Metody sekwencjonowania DNA i degradacji Edmana naleŜy traktować jako uzupełniające się. Zrewolucjonizowały one i daleko posunęły naszą wiedzę o pierwszorzędowej strukturze białek. Oznaczanie pierwszorzędowej struktury polipeptydów za pomocą techniki automatycznej degradacji Edmana Ze względu na fakt, Ŝe wiele białek składa się z więcej niŜ jednego łańcucha polipeptydowego, połączonych wiązaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki disiarczkowe, pierwszy etap stanowi dysocjacja i rozdzielenie indywidualnych łańcuchów poiipeptydowych. Czynniki denaturujące (mocznik, chlorowodorek guanidyny) rozbijają wiązania wodorowe i dysocjują niekowalencyjnie połączone polipeptydy,

PEPTYDY / 55

a czynniki utleniające i redukujące rozrywają mostki disiarczkowe (ryc. 5-9). Następnie peptydy rozdziela się metodami chromatograficznymi. Wielkocząsteczkowe polipeptydy muszą ulec rozszczepieniu do peptydów o długości nadającej się do automatycznego sekwencjonowania Aparaty słuŜące do automatycznego sekwencjonowania (sekwentatory) analizują skutecznie polipeptydy o długości 20—60 reszt aminokwasowych. Ten fakt wpływa na wybór techniki rozcinania polipeptydów oraz oczyszczania otrzymanych fragmentów. Zmierza się więc do uzyskania niewielkiej liczby dłuŜszych fragmentów (o długości 30—100 reszt aminokwasowych). Korzystne jest zatem bardzo swoiste i pełne rozszczepienie łańcucha polipeptydowego w określonych miejscach. Takie wymagania spełnia rozszczepienie za pomocą bromocyjanu (CNBr), trypsyny lub o-jodozobenzenu. CNBr. Reszty cysteiny są najpierw modyfikowane przez kwas jodooctowy. CNBr rozcina
Ryc, 5-9. Rozszczepienie łańcuchów poiipepty-

=O

wówczas łańcuch polipeptydowy (w większości ilościowo) tylko w miejscach występowania reszt metioninowych, po ich stronie karboksylowej. PoniewaŜ metionina występuje rzadko w polipeptydach, takie rozszczepienie powoduje powstawanie fragmentów peptyd owych o właściwej długości. Trypsyna. Trypsyna nacina łańcuchy pohpeptydowe po karboksylowej stronie reszt lizyny i argininy. Jeśli reszty lizyny najpierw przeprowadzi się w pochodne za pomocą bezwodnika kwasu cytrakonowego (reakcja odwracalna), w celu zmiany ładunku reszt hzynowych z dodatniego na ujemny, to trypsyna rozszczepia tylko reszty argininowe. Wykorzystanie pochodnych reszt argininowych jest mało uŜyteczne z powodu stosunkowo duŜego „nadmiaru" reszt hzynowych w białkach. JednakŜe jest przydatne do kolejnego rozszczepiania CNBr fragmentów. o- Jodozobenzen. Związek len rozszczepia swoiście i ilościowo miejsca względnie rzadko występujących reszt: Trp-X. Nie wymaga wcześniejszej osłony innych reszt aminokwasowych. Hydroksyloamina. Hydroksyloamina rozrywa względnie rzadko wiązania: Asn-Gly, chociaŜ nie w sposób ilościowy. Proteaza V8. Enzym ze Staphylococcus aureus rozcina peptyd przy resztach Glu-X, z wyraźną wybiórczością w stosunku do reszty X o charakterze hydrofobowym. Wiązanie Glu-Lys nie ulega rozszczepieniu przez tę proteazę. Ta reakcja jest wykorzystywana do kolejnej degradacji CNBr fragmentów.

Łagodna kwaśna hydroliza. W toku
takiej hydrolizy ulega rozerwaniu rzadko spotykane wiązanie Asp-Pro. 2 lub 3 procesy trawienia pierwotnego polipeptydu, przy resztach Met, Trp, Arg i Asn-Gly, połączone z odpowiednio nadtrawionymi powstałymi fragmentami, zazwyczaj pozwalają określić pełną sekwencję polipeptydu. Oprócz wyjątkowych trudności w oczyszczaniu fragmentów peptydowych, oznaczenie pierwszorzędowej struktury polipeptydu moŜna wykonać, dysponując zaledwie kilkoma jego mikromolami. Mieszanina peptydów, otrzymana z rozszczepienia polipeptydu, musi być rozdzielona do homogennych peptydów przed ich sek we ncjo no wan i em Oczyszczanie fragmentów peptydowych przeprowadza się głównie przez ich filtrację

O =

dowych połączonych wiązaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomocą czynników utleniających (kwas nadmrówkowy, strona lewa) bądź redukujących (2-merkaptoetanol; strona prawa) prowadzące do utworzenia 2 peptydów — odpowiednio z resztą kwasu cysteinowego lub resztą cysteiny Iową.

56 / ROZDZIAŁ 5

Ŝelową w kwasie octowym lub mrówkowym, wykorzystując technikę HPLC w odwróconej fazie (ryc. 5-7), albo w toku chromatografii jonowymiennej na fosfocelulozie lub na złoŜu sulfofenyło-Sephadex w roztworach kwasu ortofosforowego. Sekwencjonowanie z zastosowaniem odczynnika i reakcji Edmana Automatyczna analiza sekwencji aminokwasów wykorzystuje fenyloizotiocyjanian (odczynnik Edmana) i reakcje, w wyniku których usuwana jest N-końcowa grupa aminowa peptydu, jako pochodna fenylotiohydantoinowa (reakcja Edmana, ryc. 5-10). Metoda tzw. degradacji Edmana polega na kolejnym odłączaniu reszt am i no kwasowych od aminowego końca peptydu. Główną część reaktora stanowi obracające się naczynie szklane, zapewniające przebieg reakcji na ścianie naczynia w postaci cienkiej warstwy. To ułatwia ekstrakcję i kolejne usuwanie rozpuszczalników. W pełni zautomatyzowanym aparacie moŜna zsekwencjonować do 30—40 reszt aminokwasowych w 1 ciągu operacyjnym (w wyjątkowych przypadkach do 60 lub nawet 80 reszt). Aparat jest zaprogramowany do wykonywania kolejnych degradacji reszt aminokwasowych od N-końca polipeptydu. Po usunięciu pierwszego N-końcowego aminokwasu, wydzieleniu i identyfikacji powstaje następna w kolejności N-końcowa pochodna Edmana, itd. (ryc. 5-10). Pochodne fenylotiohydantoinowe rozdziela się techniką HPLC i identyfikuje na podstawie ich kolejności i miejsca elucji. Wnioskowanie o pełnej strukturze pier wszo rzędowej po I i peptydu wymaga sekwencjonowania nakładających się peptydów W przypadku oznaczenia sekwencji reszt aminokwasowych wszystkich uzyskanych CNBr peptydów wciąŜ nie znana jest informacja, dotycząca kolejności ułoŜenia tych peptydów w łańcuchu białkowym. W celu uzyskania jednoznacznych danych o pierwszorzędowej strukturze białka, naleŜy otrzymać i zsekwencjonować dodatkowe CNBr peptydy, których N-i i C-końcowe reszty nakładają się. Te
NH3

R'
Fsnylolzotlocyjanlan (odczynnik Edrnana) I peptyd Fenylotiohydantnina I peptyd krótszą o jedną resztę aminokwasową

Ryc. 5-10. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza

R' O Kwas fenylotlohydanloinowy

resztę aminokwasową (lub N-końcową resztę poliH+, nitrometan

dodatkowe peptydy otrzymuje się technikami, które rozrywają białko w miejscach innych niŜ reszta metioninowa (np. przez trawienie chymotrypsyną). Jednoznaczne określenie struktury pierwszo rzędowej, przez porównanie sekwencji

peptydu) do fenylotiohydantoiny. Fenyloizotiocyjanian reaguje z grupami aminowymi aminokwasów i peptydów, co prowadzi do powstania kwasów fenylotiohydantoinowych, które po dodaniu kwasu, w rozpuszczalnikach niehydroksytowych, cyklizują do pochodnych fenylotiohydantoinowych. Reakcję tę wykorzystuje się głównie w celu identyfikacji N-końcowych reszt peptydu w metodzie automatycznego sekwencjonowania polipeptydów.

PEPTYDY / 57

peptydowych, przypomina sposób analogiczny do budowy układanki (ryc. 5-11). W celu umiejscowienia wiązań disiarczkowych peptydy. z kontrolnych oraz zredukowanych lub utlenionych białek, rozdziela się metodą dwuwymiarowej chromatografii lub elektroforezy i chromatografii (tzw. finger-printing). Identyfikacja za pomocą ninhydryny ujawnia w produkcie trawienia białka kontrolnego 2 mniejsze peptydy, zaś w białku, na które działano wymienionymi powyŜej czynnikami, 1 nowy peptyd. Mając informację dotyczącą sekwencji tych peptydow, moŜna wyznaczyć w nich połoŜenie wiązań disiarczkowych.
Paptyd X Paptyd Z Peptyd Y

1
C —końcowy fragment peptydu X N —końcowy fragmenl peptyd u Y

Ryc. 5-11. Nakładające się sekwencje peptydu Z stosuje się w celu stwierdzenia, Ŝe peptydy X i Y występują w pierwotnym białku w kolejności X-*Y, a nie Y-»Z.

N

C

SYNTEZA PEPTYDOW METODAMI AUTOMATYCZNYMI
Rycina 5-12 ilustruje procedurę syntezy dipeptydu A -B za pomocą automatycznej, stałofazowej techniki Merrifielda, podsumowującej wszystkie reakcje wymagane do zsyntetyzowania peptydu o dowolnej długości. Te etapy syntezy obejmują: 1. Zablokowanie N-końcowego aminokwasu A (otwarty prostokąt) i aminokwasu B (zaciemniony prostokąt) za pomocą grupy /-butylooksykarbonylowej (t-BOC) (■):
O II (CH3)—C—O—C—

Ryc. 5-12. Schematyczne przedstawienie syntezy powstającego dipeptydu za pomocą techniki wprowadznnej przez IWerrifielda. Wyjaśnienie symboli znajdzie Czytelnik w towarzyszącym tekście.

2. Aktywację grupy karboksylowej (-BOC-aminokwas B za pomocą dicykloheksylokarboimidu(DCC) (A):
N C = N-C H
6 (

co prowadzi do utworzenia pochodnych /-BOC-aminokwas A i /-BOC-aminokwas B.

3. Reakcje grupy karboksylowej aminokwa su A (który staje się C-końcową resztą peptydu) z zaktywowaną, nierozpuszczalny Ŝywicą poli styrenową ($). 4. Usunięcie grup blokujących z połączeń f-BOC-aminokwas A, za pomocą kwasu trifluorooctowego w temperaturze pokojowej (TFA, FjC—COOH). Uwaga. W praktyce etapy 3 i 4 moŜna pominąć, gdyŜ Ŝywica z danym Ŝ-BOC-aminokwasem, połączone wiązaniem estrowym z fe-

58 / ROZDZIAŁ 5

nyloacetamidometylowym (PAM) „łącznikiem" zakotwiczonym w Ŝywicy polistyrenowej, są dostępne w sprzedaŜy. 5. Kondensacje zaktywowanej grupy karboksylowej połączenia t-BOC-aminokwas B z wolną grupą aminową unieruchomionego ami nokwasu A. 6. Usunięcie blokującej grupy f-BOC za po mocą TFA (p. etap 4). 7. Uwolnienie dipeptydu A—B od cząste czek Ŝywicy przez działanie fluorowodoru (HF) w dichlorometanie w temp, — 2°C, Pierwsze osiągnięcia techniki Merrifielda dotyczyły syntezy łańcucha A (21 reszt) i łańcucha B (30 reszt) insuliny w ciągu 11 dni oraz enzymu — rybonukkazy trzustkowej z wydajnością 18%. Kolejne jej udoskonalenia skróciły czas syntezy wiązania peptydowego do ok. 1 h i znacznie zwiększyły wydajność. Technika Merrifielda otworzyła nowe nadzieje nie tylko w badaniach de novo syntezy białek o określonej strukturze pierwszorzędowej, lecz takŜe w immunologii, do produkcji szczepionek i hormonów polipeptydowych i być moŜe takŜe w leczeniu wybranych wrodzonych wad metabolicznych.

PIŚMIENNICTWO Allen G: Sequencing of Proteins and Peptides. North Holland, 1981. Bhwon AS: Protein/Peptide Sequence Analysis: Current Methodologies. CRC Press, 1988.

Cantor CR, Schimmel PR: Biophyskal Chemistry, Part I: The Conformation of Macromolecules. Freeman, 1980. Dayhoff M {editor): Atlas of Protein Seąuence and Structure. Vol 5. National Biomedicai Research Foundation, Washington, DC. Doolittle RF: Ol" uris and orfs: a Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Seąuences. University Science Books. 1987. Hewick RM, Hunkapiiler MW. Hood LE, Dryer WJ: A gasliquid solid phase peplide and protein sequenator. J Biol Chem 1981; 256: 7990. Hunkapiiler MW, Hood LE: Protein sequence analysis: automated microseąuencing. Science 1983; 219: 650. LipmanDJ, PearsonWR: Similar amino acid seąuences: chance or common ancestry?/Mo/Bw/19Sl; 16:9. Mahoney WC, Smith PK, Hermodson MA: Fragmentation of proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mechanism and identification of o-iodosobenzoic acid as a reactive contaminant that modifies tyrosyl residues. Biochemistry 1981; 20: 443; Methods Enzymol. Vols. 47; 48, 49, 91 (published continuously). Meriifield RB: Solid phase synthesis. Science 1986; 232: 341. Pearson JD et al: Reversed-phase supports fó"r thc resolution of iarge denatured protein fragments. / Chromatogr 1981; 207: 325. Regnier FE. Gooding K.M: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980; 103: 1. Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Ulility of the gasphase sequencer for both liąuid- and solid*phase degradation of proteins and peptides at Iow picomole levels. Anal Biochem 1984; 140: 553.

Białka: struktura i właściwości
Victor W. Rodweli, PhD

6
BIAŁKA SĄ KLASYFIKOWANE W RÓśNE SPOSOBY W CELU ZILUSTROWANIA RÓśNORODNYCH WŁAŚCIWOŚCI ICH FUNKCJI STRUKTURALNYCH Ze względu na brak uniwersalnego, wszechstronnie zadowalającego systemu klasyfikacji białek, powszechnie stosuje się kilka wzajemnie przeciwstawnych sposobów ich podziału. Wszystkie one mają raczej ograniczoną wartość jako pomoc w zrozumieniu wielu kluczowych właściwości białek. Utrzymywanie się w uŜyciu tych klasyfikacji i terminów — zwłaszcza w laboratoriach klinicznych — zmusza do krótkiej refleksji. PoniŜej zostaną przedstawione podstawowe cechy systemów klasyfikacji, opartych na rozpuszczalności białek, ich kształcie, funkcji, właściwościach fizycznych oraz trójwymiarowej strukturze. Klasyfikacja na podstawie rozpuszczalności System klasyfikacji białek oparty na ich rozpuszczalności i rozwinięty w latach 1907—1908 jest nadal stosowany w zawęŜonym stopniu, zwłaszcza w biochemii klinicznej (tab. 6-1). Rozgraniczenia między klasami nie są przekonywające. Wyraźne rozróŜnienie, np. miedzy albuminami i globulinami, nie moŜe być przeprowadzone jedynie na podstawie ich rozpuszczalności w wodzie lub roztworach soli. Klasyfikacja na podstawie kształtu Dwie obszerne klasy białek mogą być wyodrębnione za pomocą ich stosunku osiowego (długości do szerokości). Białka globularnc, dla których wartość tego stosunku jest mniejsza od 10 i na ogół nie przekracza 3—4, mają łańcuchy polipeptydowe ściśle pofałdowane i zwinięte.

WPROWADZENIE Białka to wielkocząsteczkowe polipeptydy. Granica oddzielająca duŜe polipeptydy od małych białek przebiega zazwyczaj między masami cząsteczkowymi 8000 — 10 000. Białka proste są zbudowane tylko z aminokwasów. Białka złoŜoee^awierąją dodatkowe związki nieaminokwasowe, takie jak hern, pochodne witamin, lipidy lub węglowodany. Ten rozdział dotyczy białek prostych. W innych rozdziałach zostaną omówione typowe białka złoŜone, jak hemowe, glikoproteiny i lipoproteiny, a takŜe właściwości białek prostych o szczególnie odrębnej strukturze, takich jak kolagen i białka kurczliwe. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Białka odgrywają wiodącą rolę w czynności i budowie komórki. W celach diagnostycznych szeroko stosuje się analizę niektórych białek i enzymów krwi. Dobrym przykładem jest oznaczenie elektroforetyczne stosunku zawartości albumin do globulin osocza, które stanowi integralną część rozpracowania diagnostycznego w chorobach wątroby. Analiza lipoprotein oraz immunoglobulin osocza, za pomocą elektroforezy oraz innych metod, jest powszechnie stosowana w diagnostyce odpowiednio swoistych typów hiperlipoproteinemii i zaburzeń odporności. Prawidłowy ludzki mocz zwykle jest wolny od białek, a więc stwierdzenie znaczącej proteinurii stanowi zazwyczaj waŜny sygnał chorób nerek, takich jak róŜne postacie ich stanów zapalnych.

60 / ROZDZIAŁ 6 Tabela 6-1. Klasyfikacja białek oparta na ich rozpuszczalności Albuminy Rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. śadnych szczególnych aminokwasów Słabo rozpuszczalne w wodzie, ale dobrze w roztworach soli. śadnych szczególnych aminokwasów

Klasyfikacja na podstawie czynności
Zgodnie z ich funkcjami biologicznymi, białka mogą być sklasyfikowane np. jako strukturalne, katalityczne lub transportowe (tab. 62). Białka katalityczne (enzymy), stanowiące większość tych związków, są ujmowane w klasy według typu reakcji, którą katalizują.

Globuliny

Rozpuszczalne w 70 80% etanolu, ale nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolutnym. Wzbogacone w arginine Histony Rozpuszczalne w roztworach soli (i kwasów nieorganicznych*) Nierozpuszczalne w wodzie ani w Skleroprotetny roztworach soli. Wzbogacone w Gly, Aia, Pro * Przyp. tłum.

Prolaminy

Klasyfikacja na podstawie właściwości fizycznych
Dla białek budzących zainteresowanie medyczne, wyspecjalizowane systemy klasyfikacji pozwalają rozróŜnić ściśle spokrewnione białka. W powszechnym uŜyciu są np. 2 układy nazewnictwa lipoprotein osocza, a 3. jest rozwaŜany. Pierwszy z nich wyodrębnia ot]-, ot2-, P- i Y-lipoproteiny na podstawie ich ruchliwości elektroforetycznej w środowisku o pH 8,6. Lipoproteiny są takŜe klasyfikowane pod względem ich zachowania się podczas sedymentacji jako: chylomikrony, VLDL, LDL, HDL i VHDL. Ponadto 6 obszernych klas lipoprotein osocza moŜe być rozpoznanych w zaleŜności od występowania w nich apoprotein A, B, C, D, E lub F, które z kolei róŜnicuje się za pomocą kryteriów immunologicznych.

NaleŜą do nich m.in. insulina, albuminy i globuliny osocza oraz wiele enzymów. Białka włókienkowe, dla których wartości stosunków osiowych są większe niŜ 10, zawierają odcinki łańcuchów polipeptydowych zwiniętych śrubowo lub w heliks i połączone krzyŜowo wiązaniami kowalencyjnymi lub wodorowymi. Przykładami białek włókienkowych są: kerą.tyna, miozyna, kolagen i włóknik.

Klasyfikacja na podstawie struktury trój wy m ia ro wej
Białka mogą być zróŜnicowane na podstawie występującej w nich struktury czwartorzędowej lub jej braku (patrz niŜej). Ponadto podobieństwa w strukturze, wykryte głównie przez krystalografię promieniami X, dostarczają cennej podstawy do klasyfikacji białek. Na przykład białka łączące się z nukleotydami mają w strukturze trzeciorzędowej wspólną „domenę wiąŜącą nukleotyd" i mogą być ewolucyjnie spokrewnione. W miarę rozszyfrowywania dalszych struktur krystalicznych moŜliwe będzie rozpoznanie i ustalenie dodatkowych wspólnych domen.

Tabela 6-2. Główne funkcje biafek Funkcja Katalityczna Strukturalna Ochronna Regulatorowa Białka (przykłady) Enzymy Kolagen, elastynar keratyny Włóknik, immunogiobuliny, interferon Kalmoduiina

Regulacja genowa Histony, białka represorowe Regulacja Insulina hormonalna Skurcz Transport Aktyna, miozyna Albumina (bilirubina, kwasy tłuszczowe itp.), hemoglobina (tlen)Jipoproieiny (róŜne lipidy), transferyna (Ŝelazo)

PIERWSZORZĘDOWA STRUKTURA BIAŁEK WYWODZI SIĘ Z KOWALENCYJNEGO POŁĄCZENIA L-a-AMINOKWASÓW WIĄZANIAMI PEPTYDOWYMI
Wprawdzie wiodącą rolę wiązań peptydowych w białkach wydedukowano dawno temu, na podstawie wielorakich faktów, to jednak najbardziej przekonywającym dowodem nie-

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 61

zbędności jedynie tych wiązań stalą się pełna synteza chemiczna insuliny i rybonukleazy, wyłącznie w wyniku połączenia aminokwasów za pomocą wiązań amidowych. Wiązanie łączące atomy węgla grupy karbonyiowej i azotu w wiązaniu peptydowym ma częściowo charakter wiązania podwójnego ChociaŜ peptydy zapisuje się z pojedynczym wiązaniem łączącym atomy a-karboksylu i a-azotu, wiązanie węgiel—azot w rzeczywistości ma częściowo charakter wiązania podwójnego (ryc. 6-!). Nie ma tu Ŝadnego swobodnego
O O
H

obrotu wokół wiązania łączącego atomy C i N, a wszystkie 4 atomy' przedstawione na ryc. 6-1, leŜą w tej samej płaszczyźnie (tj. są koplanarne). Przeciwnie, rozległa swobodna rotacja zachodzi wokół pozostałych wiązań szkieletu polipeptydowego. Te koncepcje są przedstawione na ryc. 6-2, gdzie wiązania obdarzone swobodnym obrotem są okółkowane strzałkami, a współpłaszczyznowe (koplanarne) atomy znajdują się w obszarach zacienionych. Ta półsztywność ma waŜne konsekwencje w uporządkowaniu struktury białek powyŜej poziomu pierwszego rzędu. W uzupełnieniu do wiązań peptydowych, które tworzą „szkielet" łańcucha polipeptydowego, dodatkowe wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne przyczyniają się do stabilności polipeptydów. Mostki disiarczkowe uformowane przez reszty cysterny tworzą kowalencyjne wiązania w obrębie oraz pomiędzy polipeptydatni niektórych białek Wiązanie disiarczkowe, utworzone między 2 resztami cysteiny, łączy 2 części łańcucha polipeptydowego za pomocą reszty cystyny. Wiązanie cystynowe jest oporne na warunki powodujące denaturację białka. Kwas nadmrówkowy (utleniający wiązanie S-S) lub fS-merkaptoetanol (redukujący mostki S-S z utworzeniem 2 reszt cysteiny) rozdziela łańcuchy polipeptydowe połączone wiązaniami disiarczkowymi bez wpływu na ich strukturę pierwszorzędową (ryc. 5-9). NIEKOWALENCYJNE WIĄZANIA RÓWNIEś STABILIZUJĄ CZĄSTECZKĘ BIAŁKA

C H H

Ryc. 6-1. Stabilizacja rezonansowa wiązania peptydowego nadaje mu częściowo charakter wiązania podwójnego i stąd sztywność połączenia C-N.

Ryc. 6-2. Wymiary calkowiciewyciągniętegotańcucha polipeptydowego. 4 atomy w zacienionych obszarach są wspó! płaszczyzn owe (kop la na me) i tworzą wiązanie peptydowe. Niezacienionymi są: atom węgla a, atom wodoru a i grupa a-R danego aminokwasu. Swobodna rotacja zachodzi wokół wiązań łączących węgiel a z azotem a i węglem cc-karbonylowym (białe strzałki). Rozciągnięty łańcuch poiipeptydowy stanowi więc strukturę pół23 sztywną, w której / atomów jego szkieletu jest utrzymywanych w stałych wzajemnych powiązaniach płaszczyznowych. Odległość pomiędzy sąsiednimi atomami węgla (/wynosi 0,36 nm. Podano równieŜ odległości międzyatomowe i kąty pomiędzy wiązaniami, które nie są równowaŜne. (Przerysowano i reprodukowano za zgodą z: L Pauiing, L. P. Corey, H. R. Branson: Proc. Nałl. Acad. Sci. USA 1951:37:205).

Trzy główne typy wiązań niekowalencyjnych szczególnie się przyczyniają do utrwalenia struktur białkowych. Wielokrotne wiązania wodorowe stabilizują ogólną strukturę białek Wiązania wodorowe. utworzone pomiędzy: resztami w łańcuchach bocznych peptydowo związanych aminokwusówj-iłtomami wodoru i tlenu w samych wiązaniach peptydowych oraz między resztami polarnymi na powierzchni białek i cząsteczkami wody, odgrywają waŜną rolę w utrzymaniu struktury białek powyŜej pierwszego rzędu (p. niŜej: heliks a i struktura P).

62 / ROZDZIAŁ 6

Interakcje hydrofobowe przyczyniają się do stabilizacji wnętrza cząsteczek białkowych Niepolarne łańcuchy boczne aminokwasów obojętnych w białkach dąŜą do zasocjowania. Powiązanie nie jest stechiometryczne, wobec tego nie istnieje prawdziwe wiązanie. Tyra niemniej ich duŜa liczba powoduje, Ŝe te oddziaływania odgrywają znaczącą rolę w utrzymaniu struktury białek. Elektrostatyczne oddziaływania wiąŜą reszty powierzchniowe w białkach Wiązania typu soli, czyli elektrostatyczne, tworzą się albo między przeciwstawnie naładowanymi grupami w łańcuchach bocznych amino k wasó w, alb o po międ zy r eszta mi Ni C-końcowymi a innymi ugrupowaniami o przeciwnym ładunku. Na przykład w pH fizjologicznym s-aminowa grupa lizyny dźwiga ładunek netto + 1, zaś nie-a-karboksyl asparaginianu i glutamianu — czysty ładunek — 1. Mogą więc one nawzajem oddziaływać elektrostatycznie, stabilizując cząsteczki białka. Związki denaturujące białka rozrywają w nich wiązania niekowafencyjne, powodując utratę aktywności biologicznej Denaturacja białka za pomocą takich odczynników, jak: mocznik, siarczan dodecylu sodu (SDS), umiarkowane stęŜenie jonów H4 lub OH~ rozrywa wiązania wodorowe, hydrofobowe i elektrostatyczne, z wyjątkiem wiązań kowalencyjnych: peptydowych lub disiarczkowych. HELIKS a JEST JEDNYM Z MOTYWÓW STRUKTURALNYCH UTRZYMUJĄCYCH UPORZĄDKOWANE KONFORMACJE W BIAŁKACH Odkrycie, Ŝe łańcuchy polipeptydowe charakteryzują się bardzo uporządkowanymi konformacjami, utrzymywanymi przez wiązania wodorowe, stało się głównym postępem pojęciowym. Wprawdzie istnienie tych bardzo uporządkowanych struktur zostało potwierdzone przez krystalografię rentgenowską, jednak było ono najpierw zaproponowane w wyniku rozwaŜań teoretycznych.

Dane rentgenograficzne wykazały obecność powtarzających się jednostek o długości 0,5—0,55 nm wzdłuŜ długiej osi a-keratyn włosa i wełny. Niestety, Ŝaden wymiar rozciągniętego łańcucha poiipeptydowego nie wynosił 0,5— 0,55 nm (ryc. 6-2). Tę oczywistą anomalię rozstrzygnęli Pauling i Corey, którzy zaproponowali ukształtowanie łańcucha polipeptydowego a-keratyny w formie a-heliksu (ryc. 6-3). W strukturze tej grupy R wystają na zewnątrz od centrum heliksu (ryc. 6-4). Na jedenjJsok śruby (zwój a-heliksu) przyj>adajL&reszt aminokwasowych, a odległość "przebyta przez jeden skręt (inaczej: odległość między
Ryc. 6-3. Przedstawienie helikalnej konfiguracji

Skok 0,54 nm (3.6 reszt)

głównego łańcucha polipeptydowego wokół osi a-heiiksu.

BiAŁKA: STRUKTURA i WŁAŚCIWOŚCI / 63

0,5 r Ryc. 6-4. Przekrój poprzeczny heltksu a. Łańcuchy boczne (R) wystają na zewnątrz heiiksu. Promienie van der Waalsa są większe niŜ wykazano na rycinie, stąd wewnątrz heiiksu prawie nie ma wolnej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Stryer L; Biochemistry, wyd.2, Freeman, 1981, Copyright© 1981 by W. H. Freeman and Co).

zwojami*) wynosi 0,54 nm. Odstęp przypadający na Jedną resztę aminokwasem A wzdłuŜ osi ctheliksu wynosi 0,15 nm. Właściwości a-helik-su są następujące: 1. Strukturę cc-heliksu stabilizują miedzyaminokwasowe wiązania wodorowe. KaŜde z nich jest utworzone przez atom H połączony z azotem jednego ugrupowania peptydowego (NH) i znajdujący się między silnie elektroujemnymi atomami (układami*), tj. wymienionym azotem peptydowym oraz tlenem grupy karbonylowej (ĆO) 4. z kolei reszty aminokwasowej w strukturze pierwszorzędowej. 2. KaŜde wiązanie peptydowe uczestniczy w wytworzeniu wiązania wodorowego, co za pewnia maksymalną stabilność. 3. Wszystkie atomy azotu peptydowego i tle nu karbonylowego reszt aminokwas owych w łańcuchu głównym są zaangaŜowane w wiąza nia wodorowe, co znacznie zmniejsza hulrofilowy (zwiększając hydrofobowy) charakter regionu a-helikalnego. 4. Heliks ot formuje się spontanicznie, ponie waŜ — przy najmniejszym zuŜyciu energii — stanowi najbardziej stabilną konformację łańcucha polipeptydowego. * Przyp. tłum.

Ryc. 6-5. Wiązania wodorowe (kropki} uformowane między atomami H i O stabilizują polipeptyd w konformacji a-heltkalnej. (Przedrukowano za zgodą z; Haggis G. H. i wsp. tntroduetion to Motecular Biology. Witey, 1964).

Tabela 6-3. Wpływ róŜnycfi reszt aminokwasowych na formowanie heiiksu a

Heliks a
stabilizują (utrwalają)
Ala Asn Cys Gin His Leu Met Phe Trp Tyr Val

destabilizują
Arg Asp Glu Gly Lys Ile Ser Thr

kończą (przerywają)
Pro Hyp

64 / ROZDZIAŁ 6

5. Prawozwojowy heliks występujący w biał kach jest znacznie bardziej trwały niŜ lewoskrętny, gdy resztami są L-aminokwasy. 6. Resztami destabilizującymi heliks są: pro.liną_(w której atom N jest częścią sztywnego pierścienia, co uniemoŜliwia rotację wokół wią zania N C) oraz aminokwasy z naładowanymi elektrycznie lub masywnymi grupami R, które elektrostatycznie lub fizycznie przeszkadzają w uformowaniu heliksu (tab. 6-3).

RÓWNOLEGŁE I PRZE CiW RÓWNO LEGŁE POFAŁDOWANE ŁAŃCUCHY STANOWIĄ DRUGI TYP ROZPOZNAWALNIE UPORZĄDKOWANEJ STRUKTURY
Pauling i Corey zaproponowali równieŜ drugie uporządkowanie struktury białka, tj^jtruktury p, czyli pofałdowanej kartki (inaczej: pofałdowanego łańcucha, pofałdowanego lub „splisowanego" arkusza*) (ang. f3-pleated sheet; p — poniewaŜ to była druga struktura po opisanym najpierw a-heliksie). W heliksie J. łańcuch polipeptydowy jest zwarty, natomiast w_. strukturze p (inaczej: fałdowej, „harmonijkowej" lub „dywanowej"*) pozostaje on niemal całkowicie rozciągnięty (ryc. 6-6). Struktura P noslnazwę przeciwrównoległej, gdy sąsiadujące łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach (N-koniec jednego łańcucha do C-końca drugiego) (ryc. 6-6); luedy łańcuchy podąŜają w tym samym kierunku jest ona nazywana równoległą (nie wykazano). W wielu białkach występują współbieŜne i przeciwbieŜne regiony struktury p. MoŜe ją formować 2—5 przylegających łańcuchów polipeptydowych. Na rycinie 6-7 przedstawiono region rybonukleazy, w której 3 odcinki łańcucha polipeptydowego tworzą strukturę p. Heliks a jest stabilizowany mostkami wodorowymi między wiązaniami peptydowymi, oddzielonymi od siebie 4 resztami w sensie struktury pierwszorzędowej, podczas gdy strukturę fS utrwalają wiązania wodorowe między segmentami peptydowymi oddalonymi od siebie w sensie struktury pierwszorzędowej (ryc. 6-7).
Ryc. 6-6. W przeciwrównoległej fałdowej strukturze p sąsiednie łańcuchy polipeptydowe biegną w przeciwnych kierunkach. Wiązania wodorowe między grupami NH i CO sąsiednich łańcuchów stabilizują tę strukturę. Łańcuchy boczne (R) aminokwasów znajdują się powyŜej i poniŜej płaszczyzny kartki. O atomy węgla; © atomy azotu; O atomy wodoru. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgodą z: Siryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, Copyright © 1981 by W. H. Freeman and Co.).

ZAKRĘTY p UMOśLIWIAJĄ POLIPEPTYDOM PRZYJMOWANIE KSZTAŁTÓW GLOBULARNYCH
Polipeptydy z reguły formują zbite masy globularne, muszą więc istnieć moŜliwości zmiany kierunku łańcucha polipeptydowego. Jednym z nich jest utworzenie ciasnej pętli zakrętu P (inaczej: skrętu p, zwrotu p1 lub zwrotu typu spinki do włosów*), w której tlen grupy karbonylowej jednej reszty łączy sie wiązaniem wodorowym z wodorem amidowym aminokwasu oddalonego o 3 reszty do przodu. Często w zakrętach p występują prolina i glicyna. Część struktury przestrzennej (geometrii) zakrętu p jest ukształtowana w prolinie, która bardziej niŜ inne aminokwasy podlega konfor* Przyp. tłum.

Przyp. tłum.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 65

ASPEKTY STRUKTURY BIAŁEK ROZWAśA SIĘ POD KĄTEM 4 POZIOMÓW UPORZĄDKOWANIA Struktura pierwszorzędowa Strukturę pierwszego rzędu stanowi, jak w przypadku peptydów, kolejność aminokwasów w łańcuchu lub łańcuchach polipeptydowych oraz umiejscowienie wiązań disiarczkowych, jeŜeli one w tych łańcuchach występują. Struktura drugorzędowa Struktury drugiego rzędu, czyli przestrzenne współzaleŜności między aminokwasami zwartymi w pierwszorzędowym strukturalnym zakresie, mogą być regularne (np. heliks a, struktura f>) lub przejawiać niewiele tej regularności (np. przypadkowy zwój). Struktura trzeciorzędowa Ogólne rozmieszczenie i wzajemne powiązanie roŜnych regionów lub domen oraz poszczególnych reszt amin o kwas owych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym stanowi trzeciorzędową strukturę białka. Wprawdzie rozgraniczenie pomiędzy strukturą drugo- i trzeciorzędową nie jest wyraźne, struktura trzeciorzędowa wyraŜa wzajemne przestrzenne usytuowanie reszt aminokwasowych, które — generalnie — są daleko od siebie w- sensie budowy pierwszego rzędu. Struktura czwartorzędowa Białka wykazują strukturę czwartego rzędu,
jeŜeli składają się z 2 lub więcej łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami innymi

Ryc. 6-7. Cząsteczka rybonukleazy trzustki wołu jest zbudowana z pojedynczego łańcucha 124 reszt połączonego poprzecznie w 4 miejscach za pomocą wiązań disiarczkowych. Region a-heliksu ujęto w kropkowany owal, a region struktury fałdowej zacienione Pozostałe części cząsteczki występują giównie w postaci przypadkowego zwoju. Centrum aktywne enzymu znajduje się w miejscu związania jonu fosforanowego (PO^~). (Zaadoptowano z: Kartha G., Bello J.r Harker D.: Tertiary structure of nbonuclease. Naturę 1967; 213:862) Białko zostato w całości z syntetyzowane chemicznie.

macyjnym ograniczeniom. Dla kontrastu mała grupa R. pozwala glicynie działać jako giętki „zawias" między regionami polipeptydu, którego ugrupowania R sprzyjałyby inaczej bardziej rozciągniętej konformacji. REGIONY BIAŁEK, KTÓRE NIE SĄ UFORMOWANE W HELIKSY, STRUKTURY p LUB ZAKRĘTY % WYSTĘPUJĄ WTZW. KONFORMACJI „PRZYPADKOWEGO" (NIEPLANOWANEGO) ZWOJU Znaczne części cząsteczki białkowej mogą występować w konformacji przypadkowego (nieplanowanego) zwoju (ang. random-coil; kłębek statystyczny) (ryc. 6-7), Termin „przypadkowy" jest niefortunny, poniewaŜ moŜe bardziej implikować mniejsze biologiczne znaczenie niŜ regionów o duŜej powtarzalności. Dla funkcji biologicznej regiony przypadkowego zwoju są równie waŜne, jak heliks a lub konformacja p.
5 — Biochemia

niŜ kowalencyjne (tj. niepeptydowymi lub disiarczkowymi*). Siłami stabilizującymi te agregaty są wiązania wodorowe i elektrostatyczne (typu soli) utworzone miedzy resztami aminokwasowymi na powierzchniach łańcuchów polipeptydowych. Takie białka noszą nazwę oltgomerów, a pojedyncze łańcuchy polipeptydowe je

* Cząsteczka białka nie dająca się, przynajmniej potencjalnie, rozdzielić na podjednostki (związane wiązaniami mekowalencyjnymi) nie ma struktury czwartorzędowej. Przykładami białek bez struktury czwartorzędowej są: rybonukleaza (1 łańcuch) i chymotrypsyna (3 łańcuchy). Przyp. tłum. zaczerpnięty z: Morawiecki A. (red.): Nowe polskie słownictwo biochemiczne. PWN, 1983, s. 113.

66 / ROZDZIAŁ 6 tworzące określa się jako protomery, monomery lub podjednostki.

Wiele białek oligomerycznych zawiera 2 lub 4 protomery, nosząc odpowiednio nazwy dimerów lub tetramerów. Oligomery zbudowane z więcej niŜ 4 protomerów są równieŜ rozpowszechnione, zwłaszcza wśród enzymów regulatorowych (przykładem — karbamoilotransferaza asparaginianowa). Białka oligomeryczne odgrywają szczególną role w regulacji wewnątrzkomórkowej, poniewaŜ protomery mogą przyjmować względem siebie róŜne ułoŜenia przestrzenne, co powoduje zmiany we właściwościach oligomeru. Niektóre białka tworzą kompleksy wielkocząsteczkowe Asocjację róŜnorodnych białek czynnościowych, z których kaŜde ma 4 poziomy struktury, w wielofunkcjonalne makromolekularne kompleksy spotyka się w transporcie elektronów, biosyntezie kwasów tłuszczowych i metabolizmie pirogronianu. DRUGORZĘDOWĄ I TRZECIORZĘDOWĄ STRUKTURĘ BIAŁEK WYZNACZA SEKWENCJA AMINOKWASÓW W ŁAŃCUCHU POLIPEPTYDOWYM Skoro tylko utworzy się łańcuch polipeptydowy, grupy R aminokwasów kierują swoistym zwijaniem się poszczególnych jego regionów (struktura drugo rzędowa), jak równieŜ zasocjowaniem tych regionów (struktura trzeciorzędowa). Dowodzi tego klasyczne doświadczenie. Zadziałanie na rybonukleazę łagodnym związkiem redukującym (P-merkaptoetanolem) i czynnikiem denaturującym (mocznikiem lub guanidyną; p. niŜej) inaktywuje ją tak, Ŝe przyjmuje konformację przypadkowego zwoju. Powolne usunięcie czynnika denaturującego i łagodne ponowne utlenienie, w celu rekonstrukcji wiązań S—S, prowadzi do niemal kompletnego odtworzenia aktywności enzymatycznej. Nie
jest więc niezbędne postulowanie niezaleŜnej genetycznej kontroli uporządkowania struktury białka powyŜej poziomu pierwszego, poniewaŜ budowa pierwszorzędowa wyznacza drugorzędową, trzeciorzędową oraz (kiedy jest obecna) czwartorzędową strukturę (tj. konformację) cząs-

która jest term o dynamicznie najbardziej stabilna w danym otoczeniu, np. w hydrofilowym w przeciwieństwie do hydrofobowego. Struktura białka moŜe być modyfikowana podczas po trans! acyjnego dojrzewania, takiego jak konwersja prcproenzyirm w postać katalitycznie aktywną lub usunięcie peptydowego „lidera" (peptydu sygnałowego), który przeprowadza poprzez błonę białka przeznaczone „na eksport'7. Stosunkowo słabe oddziaływania odpowiedzialne za utrzymanie drugo-, trzecio- i czwartorzędowej struktury białek ulegają łatwo rozerwaniu, powodując utratę ich aktywności biologicznej Naruszenie rodzimej struktury nosi nazwę denaturacji. Fizycznie denaturacja moŜe być rozpatrywana jako zaburzenia konformacji łańcucha polipeptydowego, nie wpływające aa jego strukturę pierwszorzędowa. Dla protomeru proces ten moŜe być przedstawiony tak, jak na ryc. 6-8. Dla białka oligomerycznego denaturacja moŜe obejmować rozdysocjowanie protomerów, czemu towarzyszą zmiany wich konformacji.

Enzym aktywny (natywny) Dsnaturacja Enzym nieaktywny (z denaturowany) Ryc. 6-8. Zobrazowanie denaturacji protomeru.

teczki białkowej. Rodzimą konformacją białka, takiego jak rybonukleaza, wydaje się być ta,

Biologiczną aktywność niszczą mocne kwasy lub zasady, wysoka temperatura, detergenty jonowe (amfipatyczne), związki chaotropowe (mocznik, guanidyną), cięŜkie metale (Ag, Pb, Hg) lub rozpuszczalniki organiczne. Zdenaturowane białka są na ogół gorzej rozpuszczalne i ulegają wytrąceniu. Znajduje to zastosowanie w laboratorium klinicznym. Do krwi lub surowicy, w której oznacza się zawartość małych cząsteczek (np. glukozy, kwasu moczowego, leków), generalnie najpierw dodaje się kwasu trichlorooctowego, fo sforo wolframowego lub fosforomolindenowcgo w celu strącenia białek.

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 67

Po usunięciu ich, przez wirowanie, analizuje się wolny od białek supernatant.
WraŜliwość większości enzymów na ogrzewanie, kwasy oraz proteazy, stanowi podstawę wstępnego badania, stwierdzającego czy daną

Tabela6-5. Zmodyfikowane nie-a-funkcyjne grupy w białkach* Grupy modyfikowane —OH PO3H2 Ser Thr Tyr Mto-et-N N- metylowa N dimetylowa N-trimetylowa Arg His Lys
Lys

reakcję katalizuje enzym. Ekstrakt komórek, obdarzony aktywnością enzymatyczną, który traci tę właściwość w wyniku zagotowania, zakwaszenia i ponownego zobojętnienia lub zadziałania proteazą, zapewne zawiera jakiś enzym w charakterze katalizatora. Często na denaturację jakiegoś enzymu wpływa obecność jego substratu. Pojawienie się zmiany konformacyjnej podczas związania substratu dowodzi, Ŝe nowa konformacja moŜe być trwalsza lub mniej trwała niŜ poprzednia.

Arg Lys

PIERWSZORZĘDOWE STRUKTURY BIAŁEK SĄ OZNACZANE METODAMI STOSOWANYMI DO SEKWENCJONOWANIA PEPTYDOW
Z białek złoŜonych usuwa się najpierw grupy prostetyczne (np. hem), a wiązanie disiarczkowe utlenia się w celu uzyskania liniowych polipeptydów (p. ryc. 5-9). Techniki stosowane do
Tabela 6-4. Modyfikacja grup a-COOH i a-NH 2 w białkach* Grupy modyfikowane a-COOH
Amidowa N-formylowa N-ace tyłowa Ala Asp Gly Met Gly Met
N -metylowa

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins. Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 by the American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów tej pracy.

sekwencjonowania tych polipeptydów przedstawiono w rozdz. 5. Wprawdzie większość białek 2awiera tylko aminokwasy wymienione w tab, 4-3, pochodne tych reszt równieŜ występują w niektórych białkach (tab. 6-4 i 6-5). Jakkolwiek omówienie metod uŜywanych do zidentyfikowania owych pochodnych aminokwasowych nie wchodzi w zakres tego rozdziału, jednak ich obecność moŜe komplikować określenie struktury pierwszorzedowej.

Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura białek jest analizowana za pomocą krystalografii rentgenowskiej
Techniki poprzednio stosowane, pozwalające wnioskować o występowaniu w białkach struktur helikalnych (np. optyczna dyspersja rotacyjna, wymiana protonów trytu) zostały wyparte przez rentgenowską analizę krystalograficzną. Promienie X są kierowane na kryształ białka oraz na jedną z jego pochodnych, zawierającą dodatkowo jon cięŜkiego metalu. Promienie ulegają rozproszeniu w sposób zaleŜny od gęstości elektronów w róŜnych częściach cząsteczki białkowej. Obrazy zbioru plamek dyfrakcyjnych, uzyskane na błonie fotograficznej (po jej wywołaniu), są tłumaczone na tzw. mapy rozkładu gęstości elektronowej, które po ułoŜeniu jednej na drugiej pozwalają krystalografowi skonstruować wiarogodny model danego białka. Krystalografia rentgen o graficzna, chociaŜ czasochłonna, kosztowna i wymagająca specjalistycznego przeszkolenia, ujawniła szcze-

Asp Glu Gly His Met Phe Pro

Ala Asp Gly Met

Ser Thr Tyr

Ser Thr

Val

Val

* Według R. Uy, F. Wold: Posttranslational covalent modification of proteins, Science 1977; 198:890. Copyright © 1977 American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziału za zezwoleniem autorów cytowanej pracy.

68 / ROZDZIAŁ 6

gólowe i precyzyjne obrazy z usytuowaniem wszystkich aminokwasów w wielu białkach. Nie moŜna nie docenić jej ogromnego wkładu do naszego dzisiejszego pojmowania struktury białek. Wyłoniona technika zobrazowania magnetycznego rezonansu (ang. magnetic resonance imaging; skrót — MRI) została ostatnio wykorzystana do zanalizowania trójwymiarowej struktury małego białka. Technika MRI wydaje się mieć szansę zastosowania do większych białek. Metody fizyczne stosowane do zbadania czwartorzędowej struktury białek Badanie czwartorzędowej struktury białka oligomerycznego obejmuje określenie liczby i rodzaju obecnych w nich protomerów, ich połoŜenia względem siebie oraz łączących je oddziaływań. Zakładając, Ŝe oJigomery nie ulegają denaturacji podczas procedury stosowanej do oznaczenia masy cząsteczkowej, wiele metod moŜe dostarczyć o niej danych. Te same techniki mogą być wykorzystane do określenia masy cząsteczkowej protomeru po wcześniejszym zdenaturowaniu oligomeru. Ultrawirowanie, filtracja Ŝelowa i elektroforeza w Ŝelu pozwalają oznaczyć masę cząsteczkową białek oi izomerycznych Rozwinięta przez Svedberga technika ultrawirowania mierzy szybkość sedymentacji* w polu siły odśrodkowej ok. 105 x g. W ostatnich latach istnieje tendencja, aby zastąpić ją mniej złoŜonymi metodami. W pokrewnej technice, tj. ultrawirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy, nawarstwia się

białka wzorcowe i badane na gradient stęŜeń roztworów sacharozy (5—20%), przygotowany w probówce plastikowej. Po ultrawirowaniu przy 10 5 x g przez kilkanaście godzin (np. w ciągu nocy) przekłuwa się mały otworek w dnie probówki, zbiera jej zawartość w postaci kropel w serii kolejnych małych probówek i oblicza ruchliwości na podstawie względnego połoŜenia białek w gradiencie. Masę cząsteczkową białka globu larnego moŜna określić z jego ruchliwości w sicie molekularnym Kolumny z Ŝelu Sephadex lub podobne matryce, mające „pory" o wiadomym rozmiarze kalibruje się, stosując białka o znanej masie cząsteczkowej. Poszukiwaną masę cząsteczkową nieznanego białka oblicza się z porównania jego objętości elucyjnej z objętościami elucyjnymi białek wzorcowych. MoŜna popełnić duŜe błędy, jeŜeli cząsteczka białka jest bardzo asymetryczna albo oddziałuje silnie ze związkami, z których zostały wyprodukowane molekularne sita. Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym (PAGE) to jeszcze jedna metoda oznaczania masy cząsteczkowej Białka wzorcowe rozdziela się elektroforetycznie w 5—15% Ŝelach poliakrylamidowych o zmiennej porowatości, wybarwia się je na obecność białek, generalnie błękitem Coomassie lub tzw. srebrem, i masę cząsteczkową oznacza względem ruchliwości elektroibretycznej wzorców. Najbardziej powszechne zastosowanie tej techniki, PAGE-SDS, pozwala oznaczyć masę cząsteczkową protomeru w wyniku wcześniejszego zdenaturowania oligomeru (np. przez zagotowanie w roztworze detergentu w obecności p-merkaptoetanolu) i rozdzielenie w Ŝelach zawierających detergent jonowy — siarczan dodecylu sodu (SDS). KOMPLEKSY BIAŁKOWE MOGĄ BYĆ UWIDOCZNIONE PRZEZ ELEKTRONOWĄ MIKROFOTOGRAFIĘ Uzyskane w mikroskopie elektronowym powiększenia rozmiarów średnicy nawef 100000 razy pozwalają uwidocznić białka o bardzo duŜej masie cząsteczkowej, takie jak cząstki

* Matematycznym wyrazem tej szybkości jest tzw. stała sedymentacji S20, tj. szybkość opadania warstwy roztworu białka pod działaniem jednostki siły odśrodkowej, wyraŜona w jednostkach układu cgs, sprowadzona do gęstości i lepkości wody w temp. 20°C. Dla większości białek wartości liczbowe stałej sedymentacji wahają się w granicach l,510~ 13 — 2010~"; dla cząsteczki białka o kształcie kulistym jednostka stałej sedymentacji (1I0""13) odpowiada masie cząsteczkowej ok. 16 000. (Przyp. tłum. zaczerpnięty z: SkarŜytiski B.: Chemia fizjologiczna, t. I, PWRiL, 3956, s. 85).

BIAŁKA: STRUKTURA I WŁAŚCIWOŚCI / 69 Tabela 6-6. Czwartorzędowe struktury wybranych enzymów* Enzym (oligomer) Aminotransferaza asparaginianowa serca kury Syn ta za kwasów tłuszczowych wątroby goiębia Fruktozobisfosfataza wątroby królika Aminotransferaza ornitynowa wątroby szczura Karboksylaza propionylo-CoA serca świni LDH serca, wątroby lub mięśni wołu ATPaza mitocriondrrów serca wołu Syntetaza glutaminowa Escherichia coli Karboksylaza acetylo-CoA wątroby kury Liczba protomerów 22 2" 2** 44 4** 10 12 2** 10** Masa cząsteczkowa protomeru 50 000 230 000 29 000 37 000 33 000 175 000 35 000 26 0O0 48 500 4 100 000 409 000

* Zaadaptowano z: Klotz I. M., Langerman N. R., Darnall D. W.: Cłuaternary structure of enzymes, Annu Rev Biochem 1970; 39:25. ** Niezidentyfikowane podjednostek.

wirusów, kompleksy enzymatyczne i białka oligomeryczne. W tabeli 6-6 podano przykłady liczby oraz mas cząsteczkowych protomerów stanowiących czwartorzędowe struktury wybranych enzymów.

PIŚMIENNICTWO
Advances in Protein Chemistry. Academic Press, 1944 to datę, [Annual publicalion.] Celis JE. Bravo R: Two-dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. Methoiłs and Applications. Academic Press, 1984. Chothia C. Principles that determine the structure of proteins. Annu Rev Biochem 1984; 53:537. Dunn MJ: Gel Electrophoresis of Proteins. Wright,
1986.

Franks F: Characterization of Proteins. Wright, 1986 One AD, Braun W, Wuthrich K. Studies by l H NMR and distanoe geometry of the solution conformation of the a-amylase inhibitor tendamistat. / Mol Biol 1986; 189:377. Lennarz WJ (editor): The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycarrs. Plenum Press, 1980. L'Italien JJ: Proteins: Structure and Function. Plenum Press, 1987. Rosę CD, Geselowitz AR, Lesser GJ, Lee RM, Zehfus MH. Hydrophobiciiy of amino acid residues in globular proteins. Science 1985; 229:834, Schlessinger DH: Macromolecular Seąuencing and Analysis: Selected Methods and Applications. AR Liss, 1988. Schott H: Affinity Chrotnatography. Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. Marcel Dekker, 1984. Wittmann-Liebold B, Solnikow J, Erdmann VA: Advancetl Methods in Protein Microseąuence Analysis. Springer Verlag, 1986.

7
WPROWADZENIE
W rozdziale tym omówiono zaleŜność struktury i funkcji na przykładzie mioglobiny i hemoglobiny, białek nie tylko bardzo istotnych fizjologicznie, lecz takŜe obrazujących, w jaki sposób struktura białek decyduje o ich funkcji biologicznej.

Białka: mioglobina i hemoglobina
Victor W. Rodwell, PhD

ZDOLNOŚĆ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY DO MAGAZYNOWANIA I TRANSPORTU TLENU WIĄśE SIĘ Z OBECNOŚCIĄ PROSTETYCZNEJ GRUPY HEMOWEJ I JONU śELAZAWEGO
Grupą proste ty czną mioglobiny i hemoglobiny jest hem, cykliczny tetrapirol nadający tym białkom zabarwienie czerwone. W tetrapirolu 4 pierścienie pirolowe są połączone mostkami tt-metinowytni, tworząc płaski układ cykliczny (ryc. 7-1). Podstawniki w pozycjach P pierścieni

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Białka hemowe biorą udział w transporcie i magazynowaniu tlenu, transporcie elektronów oraz fotosyntezie. Badania mioglobiny i hemoglobiny ujawniły istnienie cech struktury wspólnych dla wielu białek, jak równieŜ istnienie zaleŜności między strukturą a funkcją. Ponadto umoŜliwiły one poznanie molekularnych podstaw chorób genetycznych, takich jak niedokrwistośc sierpowata (wynik zmienionych właściwości powierzchniowych podjednostki p hemoglobiny) i taJasemie (przewlekłe dziedziczne choroby hemolityczne, charakteryzujące się upośledzeniem syntezy hemoglobiny). Badania wykazały, Ŝe cyjanek i tlenek węgla stanowią śmiertelne zagroŜenie, poniewaŜ uniemoŜliwiają fizjologiczną funkcję odpowiednio oksydazjŁ cytocJLrpmowei-J^hemoglobiny, a stabilizacja struktury czwartorzędowefnieutJenowanej hemoglobiny przez 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) stanowi podstawę mechanizmów choroby górskiej i adaptacji do duŜych wysokości.

n

Ryc. 7-1. Pirol. Węgle a fączą się za pomocą mostków metinowych tworrac cykliczny tetrapirol. Przy węglach p występują podstawniki charakterystyczne dta swoistych tetrapiroli, np. hemu.

pirolowych określają rodzaj pochodnej tetrapirolu. W hemie w pozycjach p znajdują się grupy metylowe (M), winylowe (V) i pfbpionianpwe (P) ułoŜone w następującej kolejności: M, V, M, V, M, P, P, M (ryc. 7-2). W centrum tego układu znajduje się atom Ŝelaza w formie jonu Ŝelazawego (Fe2+), Innymi białkami, w których grupą prostetyczną jest tetrapirol zasocjowany z jonem metalu są cytochromy (Fe2+ i Fei+), katalaza, 2,3-dioksygenaza tryptofanowa oraz chlorofil (Mg2+). Funkcja biologiczna cyto-

BIAŁKA: MJOGLOBtNA f HEMOGLOBINA / 71

Ryc. 7-2. Hem. Pierścienie pirolowe, węgle mostków metinowych i atom Ŝelaza Fe'4 + leŜą praktycznie w jednej płaszczyźnie. Piąte i szóste wiązanie

nu, wewnątrz cząsteczki mioglobiny znajdują się wyłącznie aminokwasy niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met). Mioglobina, pierwsze białko, którego strukturę rozszyfrowano rentgenograficznie, jest bogata w ot-heliks Mioglobina jest silnie upakowaną, w przybliŜeniu kulistą cząsteczką o wymiarach 4,5x3,5 x2,5 nm(ryc. 7-3). Niemniej jednak jej

koordynacyjne Fe 2+ są usytuowane prostopadle, znajdując się nad i pod płaszczyzną hemu. Na uwagę zasługuje rodzaj podstawników przy węglach P pierścieni piroiowych, centralnie połoŜony atom zela2a oraz polarne łańcuchy boczne, które są zwrócone na zewnątrz cząsteczki mioglobiny.

chromów wynika z utlenienia i redukcji atomu Ŝelaza. W przeciwieństwie, w przypadku mioglobiny i hemoglobiny utlenienie Fe2+ wiąŜe się z utrat -A przez te białka ich aktywności biologicznej.

Utlenowana mioglobina mięśni stanowi rezerwę tlenu
Fnnk^pt iTiinplrthiTiy jftst ma^Tynnwfinie t1f»-

nu w mięśniach. W warunkach niedoboru tlenu (np. w przypadku intensywnych ćwiczeń fizycznych) tlen utlenowanej miogiobiny jest wykorzystywany w mitochondriach mięśni do syntezy ATP na drodze fosfcrylacji oksydacyjnej. Poza dwoma wyjątkami reszty polarne znajdują się na zewnątrz, a niepolarne wewnątrz cząsteczki mioglobiny Mioglobina jest to pojedynczy łańcuch polipęptydowy o masie cząsteczkowej 17 000 zbudowany zejj_5J)reszt aminokwasowych rozmieszczonych w "cKaraktery styczny dla białek globularnych sposób. Zewnętrzna cześć cząsteczki białka jest polarna, a wnętrze — niepolarne. Reszty aminokwasowe, zawierające zarówno grupę polarną, jak i niepolarną (np. Thr, Trp i Tyr), są skierowane swoją niepolarną częścią do wnętrza częsteczki. Poza 2 resztami histydynowymi, biorącymi udział w wiązaniu tle-

Ryc. 7-3. Model mioglobiny opracowany na podstawie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wyłącznie węgle s, (Reprodukcja za zgodą z: Dickerson R. E.r w: The Proteins, wyd. 2, t. 2, Neurath H, [red], Academic Press, 1964).

struktura jest nieregularna i wykazuje brak symetrii. Okojo 75% ^"^nyfia wy^t^ry^\yfgarnie R prąwnslfi-^tiiyrh a-heiiksów o długości 7—20 aminokwasów. Licząc od N-końca odcinki helikalne oznacza się kolejnymi literami od A do H, natomiast fragmenty między helikalne literami 2 odcinków helikalnych, które one łączą. Poszczególne aminokwasy określa się za pomocą litery oznaczającej hełiks, w którym dana reszta występuje, oraz liczby wskazującej jej pozycję od końca N w tym heliksie. Na przykład „His F8" odpowiada 8, reszcie w heliksie F zidentyfikowanej jako histydyna. Odległe w rozumieniu struktury pierwszorzędowej reszty aminokwasowe (np. w róŜnych heliksach) ze względu na ułoŜenie przestrzenne łańcucha polipeptydowego mogą znajdować się blisko

72 / ROZDZIAŁ 7

siebie, jak na przykład histydyna F8 (proksymalna) i histydyna E7 (dystalna) {ryc. 7-3). Drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura mioglobiny w roztworze ściśle odpowiada strukturze mioglobiny krystalicznej. Wykazują one identyczne widma absorpcji, obie wiąŜą tlen. a zawartość cc-heliksów w strukturze mioglobiny w roztworze (oznaczona za pomocą dyspersji skręcalności optycznej i dichroizmu kołowego) jest porównywalna z zawartością ujawniony przez analizę rentgenograficzną.

His praksymalna (F8)

Pierwszorzędowa struktura a po mioglobiny zapewnia prawidłowe upakowanie białka w obecności hetnu
Przekształceniu mioglobiny w pozbawioną hemu apomioglobine, wskutek obniŜenia pH do 3,5, towarzyszy zmniejszenie zawartości struktury a-helikalnej, a w obecności mocznika całkowity jej zanik. Usunięcie mocznika poprzez dializę i dodanie hemu przywraca całkowicie strukturę helikalną, a w obecności Fe2+ aktywność biologiczną (wiązanie tlenu). Wskazuje to, Ŝe informacja zawarta w strukturze pierwszorzędowej apomioglobiny jest odpowiedzialna za swoiste upakowanie białka w obecności hemu. Stwierdzenie, Ŝe struktura pierwszorzędowa białka determinuje jego strukturę drugo- i trzeciorzędową okazało się być uniwersalne. Histydyny F8 i E7 odgrywają unikatową rolę w wiązaniu tlenu przez mioglobinę W mioglobinie grupa hemowa znajduje się w zagłębieniu między heliksem E i F (ryc. 7-3). Polarne, propionianowe łańcuchy boczne hemu są skierowane na zewnątrz cząsteczki mioglobiny, a jego pozostała część znajduje się we wnętrzu białka, gdzie, z wyjątkiem His_F_8 j.His Ę7, otaczają go reszty niępolarne. Atom Ŝelaza piąj^mwiąza niemkoordvnacvjnvm wiąŜesie z pierścieniem imidazoTowym His F8 określanej mianem histydyny proksymalnej (ryc. 7-4). Po drugiej stronie płaszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje się His E7, określaną mianem histydyny dystalnej, która jednak nie zajmuje szóstej pozycji koordynacyjnej Ŝelaza (ryc. 7-4). Atom Ŝelaza umiejscowiony nieco poza płaszczyzną hemu przesuwa się w jej kierunku po związaniu tlenu W mioglobinie pozbawionej tlenu atom Ŝelaza jest wysunięty o ok. 0,03 nm (0,3 A) poza płaszczyznę hemu w kierunku His F8. W przy-

His dystalna (B7)

Ryc. 7-4. Wiązanie tlenu z Ŝelazem hemowym podczas reakcji utlenowania. W reakcji tej istotną rolę odgrywają pierścienie imidazolowe 2 reszt histydynowych globiny, łączące się z Ŝelazem he mowym. (Reprodukcja za zgodą z: Harper H. A. i wsp., Physiologische Chemie, Springer-Verlarg, 1975). ________________________________

padku utlenowanej mioglobiny, w którejjjm, zajmuje szósta, pozycje koordynacyjną, Ŝelazo jeśT~ wy sunięte poza płaszczyznę hemu tylko ook. 0,01 nm(0,l A). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy więc ruch atomu Ŝelaza, a w konsekwencji His F8 i reszt kowalencyjnie połączonych z His F8, w stronę płaszczyzny grupy prostetycznej. Skutkiem tego zjawiska jest zmiana konformacji części białka. Apomioglobina zmniejsza powinowactwo Ŝelaza hemowego do tlenku węgla W utlenowanej mioglobinie wiązanie między atomem tlenu i Fei+ jest prostopadłe~db płaszczyzny nemu. Drugi atom tlenUj w stosunku do płaszczyzny hemu, jest przyłączony natomiast pod kątem 121 stopni z dala od histydyny dystalnej (ryc. 7-5). Około 25 000 razy silniej niŜ tlen do wyizolowanego hemu wiąŜe się tlenek węgla (CO). ChociaŜ CO znajduje się w atmosferze w ii oś-

BIAŁKA: MLOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 73 O III O c

I

I

KRZYWE DYSOCJACJI TLENOWEJ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY OBRAZUJĄ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE
Mioglobina jest białkiem magazynującym, a nie"transportującym"tlen.llość_przyłączonego do mioglobiny tlenu (wyraŜona w „procentach nasycenia") zakŜv od jego stęŜenia (wyraŜonego jako pO2, czyli stęŜenie cząstkowe tlenu) w nąjbliŜszyjn_gtoczeniu Ŝelaza hemowe^o. ZaleŜność międzypbi i ilością związanego tlenu obrazują graficznie krzywe dysocjacji tlenowej.
Dla mioglobiny krzywa dysocjacji tlenowej w. warunkach izotermicznych ma kształt hiperboli

Ryc. 7-5. Preferowane kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu Ŝelaza w hemie.

ciach śladowych, a podczas prawidłowego katabótizmu hemu powstają jedynie niewielkie jego ilości, nasuwa się pytanie, jak to się dzieje, Ŝe O2, a nie CO zajmuje szóste miejsce koordynacyjne w Ŝelazie hemu mioglobiny. Przyczyną jest przestrzenna zawada, jaką stanowi otoczenie "Fiemu w mioglobinie. Preferowane ułoŜenie CO przyłączonego do Ŝelaza hemowego jest dla wszystkich 3 atomów (Fe, C. O) prostopadłe w stosunku do płaszczyzny hemu (ryc. 7-5). Podczas gdy taka orientacja jest moŜliwa w^przypadku wyizolowanego hemu, w mioglobinie histydy na dystalna stanowi przestrzenną

(ryc. 7-7). W naczyniach włosowatych płuc,
Ryc. 7-7. Krzywa dysocjacji tlenowej mioglobi

zawadę dla wiązania CO pod tym kątem (ryc. 7-6). Powoduje to, Ŝe CO wiąŜe się w mniej korzystriejTcbnfiguracji, co zmniejsza siłę wiązania hem-CO o ponad 2 rzędy wielkości, do wartości ok. 200 razy przewyŜszającej wiązanie hem-O2. Pomimo tego w warunkach fizjologicznych niewieika część mioglobiny (ok. 1%) występuje w formie karboksymioglobiny.

ny. Na uwagę zasługuje zaleŜność stopnia utlenowanra i ciśnienia cząstkowego tlenu w płucach (100 mm Hg), tkankach (20 mm Hg) i pracujących mięśniach (5 mm Hg). _____________

Ryc. 7-6. Kąty wiązania tlenu i tlenku węgla do atomu Ŝelaza hemu w mioglobinie, Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenną zawadę dla wiązania CO pod preferowanym w stosunku do płaszczyzny hemu kalem (180° ),

w których pOj wynosi 100 mm Hg, mioglobina mogłaby skutecznie wiązać tlen. PoniewaŜ jednak wartość pO2 w Ŝyłach i mięśniach wynosi odpowiednio 40 i 20 mrn_Hgj a mioglobina nie oddaje znacznej części związanego tlenu nawet przy ciśnieniu 20 mm Hg nie moŜe ona słuŜyć jako przenośnik tlenu z płuc do tkanek. Dopiero w warunkach niedoboru tlenu, towarzyszącego duŜej aktywności fizycznej, kiedy pO, w mięśniach spada do 5 mm Hg, mioglobina uwalnia związany tlen, który w mitochondriach mięśni jest wykorzystywany do biosyntezy ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej.

74 / ROZDZIAŁ 7

HEMOGLOBINA TRANSPORTUJE TLEN, DWUTLENEK WĘGLA I PROTONY MIĘDZY PŁUCAMI I TKANKAMI Hemoglobina, zawarta w erytrocytach kręgowców, spełnia dwie główne funkcje biologiczne; 1) przenosi O2 z płuc do tkanek i 2) przenosi CO2 i protony z tkanek do phic w celu wydalenia. Mimo Ŝe biochemia porównawcza hemoglobin kręgowców jest bardzo interesująca, przedmiotem dalszych rozwaŜań są hemoglobiny ludzkie. KONSEKWENCJĄ CZWARTORZĘDOWEJ STRUKTURY HEMOGLOBINY SĄ JEJ WŁAŚCIWOŚCI ALLOSTERYCZNE Właściwości poszczególnych hemoglobin są prawidłowością wynikającą z ich struktury czwartorzędowej (jak równieŜ drugo- i trzeciorzędowej). Czwartorzędowa struktura hemoglobiny jest odpowiedzialna za nowe, dodatkowe w stosunku do mioglobiny, właściwości, które warunkują jej unikatową funkcję biologiczną i pozwalają na jej precyzyjną regulację. Właściwości allosteryczne (gr. allos — inna, steros — przestrzeń) hemoglobiny stanowią ponadto model do zrozumienia innych białek allosterycznych. W przeciwieństwie do mioglobiny, hemogtobina jest tetramerem Hemoglobina w odróŜnieniu od jednołańcuchowej mioglobiny nie mającej struktury czwartorzędowej, jest tetramerem składającym się z 2 par identycznych łańcuchów polipeptydowych, czyli podjednostek (określanych jako a, p, 7,8, S itd.). Podobne pod względem długości polipeptydy a (14l) reszt aminokwas owych) i P (146 jeszt aminokwasowych) hemoglobiny A (HftA) są kodowane przez róŜne geny i mają odmienną strukturę pierwszorzedową. W przeciwieństwie, łańcuchy p, y i 5 hemoglobin ludzkich charakteryzuje duŜa konserwatywność ich sekwencji. Najczęściej występujące hemoglobiny mają następujący skład tetrameru: HbA j (podstawowa hemoglobina prawidłowa u ludzi dorosłych) = ąj^, ^^(hemoglobina płodowa) = a2Y2, HBS ^hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) = <x2S2, HbA2 (hemoglobina prawidłowa u ludzi doros-

łych stanowiąca ok. 2,5%* Hb całkowitej) = Mioglobina i podjednostki P hemoglobiny mają praktycznie identyczną strukturę drugorzędową 1 trzeciorzędową Pomimo róŜnic w rodzaju i liczbie aminokwasów, mioglobina i łańcuchy polipeptydowe P HbA wykazują praktycznie identyczną strukturę drugorzędową i trzeciorzędową. To ścisłe podobieństwo, dotyczące równieŜ umiejscowienia hem u i odcinków helikalnych, jest przynajmniej w części wynikiem substytucji aminokwasów o podobnych właściwościach i równoznacznych pozycjach w strukturze pierwszorzędowej mioglobiny i podjednostki P HbA. Nawet występowanie 7 a nie 8 odcinków helikalnych w łańcuchu P nie zmienia zasadniczego podobieństwa strukturalnego tych polipeptydów. Podobnie jak w przypadku mioglobiny, zarówno podjednostki ot, jak i p HbA charakteryzuje obecność hydrofobowych reszt aminokwasowych wewnątrz cząsteczki (z wyjątkiem 2 reszt His w kaŜdej podjednostce), a hydrofilowych na zewnątrz cząsteczki. Uttenowaniu hemoglobiny towarzyszy wsunięcie Ŝelaza w płaszczyznę hemu oraz zmiana konformacji sprzęŜonej apoproteiny wywołana przemieszczeniem histydyny proksymalnej Tetramcryczna hemoglobina wiąŜe 4 cząsteczkftlenu (hem kaŜdej podjednostki wiąŜe jedną cząsteczkę tlenu), a jej krzywa dysocjacji tlenowej ma kształt sigmoidalny (ryc. 7-8). Przyłączenie O2 przez jeden z hemów ułatwia wiązanie kolejnych O2 przez pozostałe grupy hemowe. To kooperatywne wiązanie tlenu z hemoglobiną jest właściwością pozwalającą na wiązanie maksymalnej ilości O2 w płucach i uwalnianie maksymalnej ilości O3 w tkankach (ryc. 7-8). Miarą powinowactwa hemoglobiny do tlenu jest wielkość Pso, odpowiadająca ciśnieniu cząstkowemu tlenu, przy którym występuje 50% nasycenia Oa Wartość P;o jest róŜna dla róŜnych organizmów, przy czym jest ona zawsze większa od wartości pO2 w tkankach badanych organiz* Przyp. tłum.

BIAŁKA; MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 75
20 140 40 60 80 100 120 Ciśnienie cząstkowe tlenu (mm Hg) Utlenowana krew __ opuszczająca płuca

Ryc.
Odtlenowana krew powracająca z tkanek

7-8.

Hemoglobina

1,1
Krzywedysociacjitlenowej hemoglobiny i mioglobiny. Ciśnienie cząstkowe tlenu w krwi tętniczej wynosi ok. 100 mm Hg; wkrwiŜylnej—40 mm Hg; w naczyniach włosowatych — 20 mm Hg; minimum niezbędne dla funkcji cytochromów — 5 mm Hg. Połączenie łańcuchów polipeptydowych w strukturę tetrameryczną (hemoglobina) pozwala na zwiększenie, w porównaniu z pojedynczymi łańcuchami, wydajności dostarczania tlenu. (Zmodyfikowana i reprodukowane za zgodą z: StanburyJ, B,,Wyngaarden J. B., Fredrickson D.S. [red.], The Metabolic Bas/s of Inherited Disease, wyd.4, McGraw-Hill, 1978). Ryc. 7-9. Wiązania poprzeczne międ2y podjednostkarni oraz w obrębie podjednostek nieutlenowanej hemoglobiny. Podczas utlenowania te niekowalencyjne, elektrostatyczne wiązania zostają rozerwane, {Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry. wyd. 2, Freeman, 1981). ________________________________

go-, trzecio- i czwartorzędowej strukturze białka. Jedna para podjednostek a/P obraca się w stosunku do drugiej pary a/&\ w wyniku czego następuje zbliŜenie podjednostek tetramem i zwiększenie powinowactwa hemów do tlenu (ryc, 7-10 i 7-11).

mów, czego dobrym przykładem jest ludzka hemoglobina płodowa (HbF). Wartość P50 dla HbA = 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF = 2(1 mm Hg. Ta róŜnica w powinowactwie Hbl i HbA do tlenu umoŜliwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrębie łoŜyska. Po porodzie HbF przestaje właściwie spełniać swoją funkcję poniewaŜ jej duŜe powinowactwo do O2 utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach. Najwcześniej w rozwoju osobniczym człowieka są syntetyzowane łańcuchy £ i e. Pod koniec pierwszego trymestru ciąŜy łańcuch £ zastępuje podjednostka et, a łańcuch e — podjednostka7. Hemoglobina F, pojawiająca się więc w tym okresie Ŝycia płodowego, jest zbudowana według wzoru d2 y . Podjednostka % której synteza rozpoczyna się w trzecim trymestrze ciąŜy, całkowicie zastępuje łańcuch y dopiero kilka tygodni po porodzie. Utlenowamu hemoglobiny towarzyszą zmiany konformacji białka PrzyJaszernu O2 towarzyszy rozerwanie wiązań poprzecznych pomiędzy końcami karboksylowymi wszystkich 4 podjednostek hemoglobiny (ryc. 7-9), co powoduje zmiany w dru-

cc, S 1 i/

\\
/
s

V '
1 / 1

i. \

/ 6 15°
Postać R

■~~____________ -■

Postać T

Rvc. 7-10. W czasie przejścia postaci T w postać R hemoglobiny jedna para podjednostek (a2/f>2) obraca się o 15° w stosunku do drugiej pary (a 1/fl]). PoniewaŜ oś obrotu jest niewspółśrodkowa, para at2/P2 przesuwa się równieŜ nieco w kierunku osi. Na diagramie para a,/^ utrzymująca się w stałej pozycji jest niezaciemniona, a para a2/P: dokonująca obrotu i przesunięcia jest zaciemniona.

Czwartorzędową strukturę częściowo utlenowanej hemoglobiny określa się jak o stanT(ang. taut — napręŜony), a całkowicie utlenowanej hemoglobiny (HbOj) jako stan R (ang. relaxed

76 / ROZDZIAŁ 7

— rozluźniony) (ryc. 7-12). Symbole R i T są równieŜ uŜywane w celu określenia czwartorzędowej struktury enzymów allosterycznych, gdzie forma T wykazuje mniejsze powinowactwo do stibstratu. Utlenowanie hemoglobiny prowadzi do zmian konformacyjnych w bezpośrednim otoczeniu grupy hemowej Podczas utlenowania hemoglobiny atomy Ŝelaza (Mace ok. 0,06 nm poza płaszczyzną hemów w nieutlenowanej hemoglobinie) wsuwają się w płaszczyznę hemów, pociągając za sobą histydynę proksymalną (F8) i połączone z nią reszty aminokwasowe (ryc. 7-13).
TyrC7|«)

Pod jednostka /)t

Odtlenowanie (posiać T)

Podjednostka a. AspG1(94!

Ryc. 7-11. Zmiany oddziaływań w obrębie ot,/p, podczas utlenowania. Przesunięcie zazębiających się obszarów powoduje zmianę miejsc oddziały wań i „przełączanie" jednych wiązań wodorowych na inne. Pozostałe wiązania mają charakter niepolarny. (Reprodukcja za zgodą z: Perutz M. F.: Molecular pathology of human hemoglobin: stereochemical interpretation of abnormal oxygen affinities, Naturę 1971; 232:408). ___________________

Podjednostka f)2

Utlenowani e (postać R)

Postać T

Postać R

Ryc. 7-12. Przejście postaci T w postać R zwiększa prawdopodobieństwo utlenowania kaŜdego z 4 hemów. Przekształcenie to nie następuje z chwilą przyłączenia określonej liczby cząsteczek tlenu, lecz dokonuje się wraz z utlenowaniem kolejnych hemów. Stopniowe przyłączanie tlenu powoduje pękanie (linie cienkie) i osłabianie (linie węŜykowate) wiązań poprzecznych łączących podjednostki w postaci T. Przejście między tymi dwoma postaciami pozostaje pod wpływem róŜnych czynników, takich jak: protony, dwutlenek węgla, chlorki, BPG. Im większe stęŜenie tych czynników, tym więcej tlenu musi zostać związane, aby zapoczątkować przekształcenie. Schemat nie zawiera całkowicie utłenowanej cząsteczki w postaci T oraz całkowicie nieutlenowanej cząsteczki w postaci R, poniewaŜ są one zbyt nietrw'ałe, aby istnieć w znaczącej liczbie. (Zmodyfikowana i przerysowana za zgodą z: Perutz M. F,: Hemoglobin structure and respiratory transport, Sci. Am. [Dec], 1978; 239:92), ___________

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 77
Hlslydyna FB HeliKs F

Odpychania ' przestrzenne I Płaszczyzna nam u

przed szkodliwym wpływem zwiększenia kwasowości krwi, pełni m.in. hemoglobina._QJL-, łączeniu 4 cząsteczek tlenu z hemoglobiny towarzyszy wiązanie 2 protonów. W płucach natomiast zachodzi zjawisko odwrotne, tj. przyłączenie tlenu do hemoglobiny powoduje uwolnienie protonów. Uwolnione-prolony łączą się z wodorowęglanem, tworząc kwas węglowy, który pod wpływem dehydratazy węglanowej przekształca się w CO2, usuwany w procesie oddychania. Stad wiązanie tlenu zwiększa wydychanie CO2. To odwracalne zjawisko nosf nazwę efektu Bohra (ryc. 7-l5)7EfekTBohTa jest właściwością

Wydychania Tkanki 2H C O , "

Cykl

Ryc. 7-13. Podczas utlenowania atom Ŝelaza wsuwa się w płaszczyznę hemu. Razem z atomem źeiaza przemieszcza się histydyna F8 i związane z nią reszty aminokwasowe. (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2. Freeman, 1981).

(Buforujące działania — ------------hemoglobiny) Płuca

40

JD.2H

kwasów

Po uwolnieniu tlenu w tkankach hemoglobina transportuje dwutlenek węgla i protony do płuc
Oprócz transportu tlenu z płuc do tkanek, hemoglobina bierze udział w przenoszeniu COj z tkanek do płuc, skąd jest on usuwany podczas oddychania. Bezpośrednio po odłączeniu tlenu, cząsteczka hemoglobinjL.^dąiŁ_CQs_ w ilości stanowiącej~oJć7l5% CO2 transportowanego . Ponadto z chwilą za"SBsorbtyw"ania

trlkarboksylowych (Krebsa) Ryc. 7-15. Efekt Bohra. Powstający w tkankach dwutlenek węgla laczy się z wodą, tworząc kwas węglowy, który dysocjuje do protonu i jonu wodorowęglanowego. Nieutlenowana hemoglobina wiąŜe protony i transportuje je do płuc. W płucach, w wyniku przyłączania tlenu, następuje uwalnianie protonów, które łącząc się z jonem wodorowęglanowym tworzą kwas węglowy, przekształcany przez dehydrataze węglanową do dwutlenku węgla usuwanego w procesie oddychania.

pj
COj przez Ićrew dehydrataza węglanowa erytrocytów katalizuje utworzenie kwasu węgiowego, który dysocjuje do wodorowęglanu i protonu na skutek przesunięcia równowagi reakcji w kierunku dysocjacji (ryc. 7-14). Funkcję układu buforowego, zabezpieczającego organizm

charakterystyczną dla tetramerycznej hemoglobiny, 7al1?iB[l ffl jnterakcji hem-hem, czyli HCO.-+ H+ kooperatywności wiązania tlenu. Efektu Bohra nie obserwuje się w przypadku mioglobiny.

co,+
Ryc. 7-14. Tworzenie kwasu węglowego pod wpływem dehydratazy węglanowej i jego dysocjacja do jonu wodorowęglanowego i protonu.

78 / ROZDZIAŁ 7

Rozerwanie wiązań poprzecznych podczas przyłączania tlenu do hemoglobiny w postaci T dostarcza protonów odpowiedzialnych za efekt Bohra Protonv_odpowiedzialne za elekt Bohra powstają w wyniku rozerwania \\ i a&łjl „poprzecznych podczas przyłączania tlenu do postaci T, Sa one głównie uwalniane z atomów N pierścieni imidazolowych C-końcowych reszt histydyny łańcuchów P HC3 (146). Uwolnione pmtnny pye kształcą ją wodorowęglan w kwaś" węglo wy, usuwany pkn m, w naczyniacF )

z 1,3-bisfosfoglicerynianu, będącego metabolitem pośrednim glikolizy. BPG wiąŜe się z hemoglobiną w stosunku 1 cząsteczka BPG na tetrameryczną cząsteczkę hemoglobiny, a miejscem wiązania jest przestrzeń między 4 podjednostkami, znajdująca się w centrum cząsteczki hemoglobiny. Rozmiar tej wnęki jest odpowiedni dla BPG tylko w przypadku postaci T, tj. wtedy, kiedy przestrzeń między heliksami H łańcuchów p jest wystarczająco duŜa. BPG przyłącza się za pomocą wiązań poprzecznych, twofzą-ćycn się pomiędzy atomami tlenu BPG i dodatnio naładowanymi resztami Val NA1 (grupy aminowe N-koricowe), Lys EF6 oraz His H21 łańcuchów p (ryc. 7-17). BPG stabilizuje

węglowy, usuway p włosowatych pęcherzyków nłucnych fryc. 7-15). Natomiast podczas odłączania tlenu tworzenie wiązań poprzeczaych, pjaslaci T hemoglobiny wymaga przyłączenia protonów do reszt HC3 łańcuchów p. oiwnrrer protonów w tkankach ułatwia więc tworzenie wiązań poprzecznych na skjJteYprotonacji końcowych/reszt Hisw podjednostkach p. Odtworzenie wiązań poprzecznych sprzyja wiec uwalnianiu łferm z, ufleno'wanej (postajLKLJiamo.globiny. Uogólniając, /większenic stęŜeniajworpntm; powoduje odjaczenSjttnu.JJOticS^gdy zwiększenie stęŜenia tlenu powoduje odłączenie protonów. ZaleŜność tęorjrazuje przesunięcie krzywej dysocjacji tlenu na prawo w wyniku zwiększenia zawartości jonów wodorowych (protonów). W centralnej wnęce cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny 2,3bisfosfoglicery niań (BPG) tworzy wiązanie poprzeczne, stabilizujące strukturę T W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiększa się zawartość 2,3-bisfosfogIicerynianu (BPG) (ryc. 7-16). Związek ten tworzy się

Ryc. 7-17. Sposób wiązania 2,3-bisfosfogltcerynianu z nieutlenowaną hemoglobiną człowieka. BPG oddziałuje z 3 dodatnio naładowanymi grupami kaŜdego z łańcuchów fi. (Reprodukcja za zgodą z: Arnone A,: X-ray diffraction siudy of binding 2,3-diphosphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Naturę 1972; 237:146).

oop
\\

o
Ryc. 7-16. (BPG). Struktura 2,3-bisfosfoglicerynianu

więc postać T lub nieutlenowaną postać hemoglobiny przez tworzenie wiązań poprzecznych w obrębie łańcuchów p oraz dostarcza dodatkowe wiązania poprzeczne, które muszą ulec zerwaniu przy przechodzeniu postaci T w postać R. Wiązanie BPG z hemoglobiną płodową jest znacznie słabsze niŜ z hemoglobiną Judzi dorosłych, poniewaŜ zamiast His resztą H2T w łańcuchu y hemoglobiny płodowej jest seryna, która nie tworzy wiązań poprzecznych z BPG.

BIAŁKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 79

BPG ma więc mniejszy wpływ na stabilizację formy T w przypadku hemoglobiny płodowej, co powoduje jej większe w porównaniu z hemoglobiną ludzi dorosłych, powinowactwo do tlenu. Przejście postaci T w postać R hemoglobiny i odwrotnie jest wyzwalane przez ruch Ŝelaza do wewnątrz i na zewnątrz płaszczyzny układu porfirynowego. Przejście to jest uruchamiane przez czynniki oddziałujące przestrzennie i elektrostatycznie przy nakładzie energii ok. 12 560 J/mol (3000 cal/mol). Niewielka zmiana pozycji Fe2+ w stosunku do płaszczyzny układu porfirynowego indukuje więc znaczne zmiany w konformacji hemoglobiny, wpływając decydująco na jej funkcje biologiczną w odpowiedzi na sygnały środowiska. ZIDENTYFIKOWANO KILKASET MUTANTÓW HEMOGLOBINY WWIĘKSZOŚCI NIE OBJAWIAJĄCYCH ZABURZEŃ FUNKCJI Mutacje genów kodujących łańcuchy ot lub P mogą wpływać na biologiczną funkcje hemoglobin. PoniŜej opisano kilka, spośród kilkuset znanych (w większości łagodnych), mutantów hemoglobin Judzkich o zmienionej funkcji biologicznej, Stan, w którym w wyniku mutacji następuje zaburzenie funkcji biologicznej hemoglobiny określa się mianem hemoglobino-

wactwa do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). W hemoglobinie Sj^ęsztŁ Dostarczanie wskutek tego zbyt małej ilości l tlenu do tkanek powoduje hipoksje, która prowadzi do policytemii (zwiększenie liczby erytrocytów). gl j^ęs glutaminowego w pozycji 6 łańcucha {> jest zastąpiona resztą waliny Hemoglobina S powstaje w wyniku zastąpieuiśLCjju A2 (ó)p\ tj, reszty 6 w łańcuchu (3 przez ^al. Reszta A2 (Glu lub Val) znajduje się na powierzchni cząsteczki, odpowiadając za jej kontakty z wodą. Zastąpienie polarnego kwasu glutaminowego niepolarną waliną powoduje powstanie na powierzchni łańcucha P „lepkich miejsc". „Lepkie miejsca" występują zarówno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej postaci hemoglobiny S; nie ma ich n^ b T glojbinic: AJJ koTei na powierzchni hemoglobiny nieutlenowanej występują miejsca komplementarne do „lepkich miejsc". Są one niedostępne w hemoglobinie utlenowanej (ryc. 7-18). IMieutlenowana hemoglobina S moŜe tworzyć włókna, które zniekształcają erytrocyty „Lepkie miejsca" nieutlenowanej hemoglobinySmogą łączyć się z miejscami komplementarnymi innej cząsteczki nieutlenowanej hemoglobiny. Oddziaływania te powodują polimeryzację nieutlenowanej hemoglobiny S, w wyniku czego powstają długie, wytrącające się agregaty zniekształcające erytrocyty (erytrocyty przybierają kształt sierpowaty), odpowiedzialne za ich liŜę i inne objawy kliniczne. Utrzymanie hemoglobiny S w postaci utlenowanej lub zmniejszenie do minimum jej stęŜenia w postaci nieutlenowanej zapobiegałoby tworzeniu się polimerów, a tym samym sierpowatości krwinek. Jest bowiem wiadomo, Ŝe polimeryzacji ulega postać T hemoglobiny S. Interesujący, chociaŜ nie do zastosowania terapeutycznego, jest fakt, Ŝe forma Ŝelazowa hemoglobiny S (methemoglobina S) nie tworzy polimerów. Podobnie bowiem jak w przypadku methemoglobiny A, jon Ŝelazowy pozostaje w płaszczyźnie układu porfirynowego, stabilizując strukturę R hemoglobiny. ChociaŜ nieutlenowana hemoglobina A zawiera miejsca komplementarne do „lepkich miejsc" występujących w utlenowanej i nieutlenowanej hemoglobinie S, to jej przyłączenie do hemoglobiny S uniemoŜliwia dalsze wydhiŜanie polimerów na skutek braku na jej

pata.
W hemoglobinach typu M proksymalna lub dystalna reszta histydyny w podjednostkach ot lub ji jest zastąpiona resztą tyrozyny Zastąpienie proksymalnej lub dystalnej histydyny resztą tyrozyny przyczynia się do stabilizacji Ŝelaza hemowego w formie Fe3+, na skutek tworzenia przez niego trwałego połączenia z anionem fenolanowym Tyr. Obecność hemu w formie Ŝelazowej nie wiąŜącej 02 powoduje met hemoglobinemię. W przypadku wariantów hemoglobin M dotyczących łańcuchów a obserwuje się przesunięcie równowagi przejścia R-T w kierunku formy T, zmniejszenie powniowaćTwa do tlemi i zniesienie efektu BohraTNatomiast w przypadku wariantów dotyczących łańcuchów P efekt Bohra jest zachowany, poniewaŜ nie ulega zakłóceniu przejście R-T. Mutacje, które sprzyjają tworzeniu się postaci R charakteryzują się zwiększeniem powino-

80 / ROZDZIAŁ 7
Utleń owa na A Nieutlenowana A U tlen owa na S Nieutlenowana S

a. a

e

Nieutlenowana A Nieutlenowana S

l l l l

Ryc. 7-18. Schemat przedstawiający „lepkie miejsca" (A) w hemoglobinie S i ich „receptory" wnieutlenowanej hemoglobinie A i S. Komplementarność oddziałujących powierzchni powoduje faczenie się n te utleń owa n ej hemoglobiny S w polimery. WydłuŜanie polimerów przerywa nieuttenowana hemoglobina A nie zawierająca „iepkich miejsc". (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgodą z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981).

powierzchni „iepkich miejsc" sprzyjających dalszemu wiązaniu (ryc. 7-18). Przyłączenie nieutlenowanej hemoglobiny A do hemoglobiny S zarówno w formie R, jak i T stanowi barierę do dalszej polimeryzacji.

W,_wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S tworzą się włókna o helikalnej strukturze, w których kaŜda cząsteczka hemoglobiny oddziałuje z 4 przylegającymi cząsteczkami (ryc. 7-19). Włókna te deformują erytrocyty tak, Ŝe przybierają ońlTEsŜtałt sieTpowaty (ryc. 720). Krwinki te wykazują zwiększoną podatność do hemolizy w czasie przechodzenia przez zatoki śledzionowe. Talasernie są niedokrwistościamj charakteryzującymi się upośledzeniem syntezy łańcuchów cc lub p hemoglobiny W talasemiach zmniejsza się synteza łańcuchów a (a-talasemie) lub łańcuchów p (fi-talasemie) hemoglobiny. Wywołuje to często groźną w skutkach niedokrwistość. Wyniki badań ostatnich lat wniosły duŜy wkład do naszej wiedzy o molekularnych mechanizmach odpowiedzialnych za talasernie.

6,2 nm

RyC-7-19, Proponowana helikaIna struktura włókna utworzonego w wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S, (Reprodukcja za zgodą z: Maugh T. II: A new understanding of sickle celi emerges. Science 1981; 211:265, Copyright © 1981 by the American Associatiort for the Advancement of Science).

BIAŁKA: MI0GL0B1NA I HEMOGLOBINA / 81

Ryc. 7-20. Obraz erytrocytu prawidłowego (A) oraz sierpowatego (B)w skaningowym mikroskopie elektronowym. Obserwowane róŜnice strukturalne są wynikiem zmiany w obrębie łańcuchów (i będącej skutkiem mutacji punktowej w DNA. Zamiana T na A powoduje, Ŝe w łańcuchu {J zamiast kwasu glutaminowego znajduje się walina.

PIŚMIENNICTWO
Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin: Molecular, Genetic, and Ciinical Aspects, Saunders, 1986. Dickerson RE, Geis I: Hemoglobin. Benjamin/Cummjngs, 1983. Embury SH: The ciinical pathology of sickle-ceil disease. Anmt Rcv Med 1986;37:36[. Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, Gholson MA, Golbus M, Arnheim N, Erlich HA: Rapid prenatal diagnosis of sickle celi anemia by a new method of DNA analysis. New Engl J Med 1987;316:ó56. Fermi G, Perutz MF, Shaanan B, Fourme R: The crystal structure of hunian deoxyhemoglobin at 1.74 angstrom resolution. J Mol Biol I984;175: 159.

Friedman JM: Structure, dynamics, and reactivity in hemoglobin. Science 1985;228:1273. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, MuBis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N: Enzymatic amplification of beta-globin genomic: seąuences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science, 1985;230:1350. Schacter L, Wartti JA, Gordon EM, Prasad A, Klein BL: Altered araount and activity of superoxide dismutase in sickle celi anemia. FASEB J 198S;2:237. Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG: The hemoglobinopathies. In The Metabolk Basis of InheritedDisease, 6th Ed. Serwer CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill, p. 2281, 1989.

6 — Biochemia

8

Enzymy: właściwości ogólne
Victor W. Rodwell, PhD

WPROWADZENIE
Katalizatory przyspieszają reakcje chemiczne. Podczas reakcji ulegają one zmianom fizycznym, ale po ich zakończeniu powracają do stanu pierwotnego. ChociaŜ są znane przypadki katalizy przez cząsteczki RNA, prawie wszystkie enzymy są katalizatorami białkowymi. Większość reakcji biochemicznych zachodziłaby bardzo wolno, gdyby nie były one katalizowane przez enzymy. W przeciwieństwie do katalizatorów niebiałkowych (H+, OH , jony metali), kaŜdy enzym katalizuje niewielką liczbę reakcji, często tylko jedną. Enzymy są więc swoistymi katalizatorami danych reakcji. W zasadzie wszystkie reakcje biochemiczne są katalizowane przez enzymy.

SYSTEM MIĘDZYNARODOWEJ UNII BIOCHEMICZNEJ (IUB) KLASYFIKUJE ENZYMY WEDŁUG TYPU I MECHANIZMU REAKCJI
Początkowo nazwy enzymów tworzono przez dodanie końcówki -aza do nazwy substratów, na które one działają. Enzymy, które hydrolizują skrobię (gr.: amyłori) nazywano amylazami, rozkładające tłuszcze (gr.: lipos) lipazami, a~nydrolizujące białka -—. proteinazarrjUóźniei enzymom, które katalizują podobne reakcje, dawano nazwy wskazujące na typ katalizowanej reakcji chemicznej. Określano je jako dehydrogenązyjOksydazY^dekąrbok^ylazy, acylazy itd". System nomenklaturowy podany przez Międzynarodową Unię Biochemiczną (IUB), mimo Ŝe jest złoŜony, jest niedwuznaczny. Jego podstawową zasadą jest to, Ŝe nazewnictwo i klasyfikacja enzymów na podstawie typu reakcji chemicznej i mechanizmu reakcji moŜe integrować informację z róŜnych obszarów metabolizmu. Główne zasady systemu IUB są następujące: 1. Reakcje i katalizujące je enzymy tworzą 6 klas, a kaŜda z nich ma 4—13 podklas. 2. Nazwa enzymu składa się z 2 części. Pierwsza, zakończona na -aza, wskazuje na typ katalizowanej reakcji, druga — określa substrat lub substraty. 3. Dodatkowa informacja, jeśli jest potrzebna do wyjaśnienia reakcji, moŜe być podana w na wiasach; np. enzym katalizujący reakcję L-jabłczan + NAD+ = pirogronian -I- COj-l+ NADH + H + oznacza się 1.1,1.37 L-jabłczan: NAD+ oksydoreduktaza (dekarboksylująca).

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Enzymy czynią moŜliwym Ŝycie na Ziemi i stąd łączą wiele dziedzin nauk biomedycznych. Pewne choroby (wrodzone wady metabolizmu) są spowodowane genetycznie uwarunkowanymi nieprawidłowościami w syntezie enzymów. Gdy komórki są uszkodzone (np. przez ograniczenie dopływu krwi lub przez zapalenie), wówczas pewne enzymy przechodzą do osocza. Pomiar aktywności takich enzymów w osoczu staje sie integralną częścią diagnozowania waŜnych zaburzeń (np. zawał serca). Enzymologia diagnostyczna jest dziedziną medycyny obejmującą wykorzystanie enzymów w diagnostyce. Enzymy mogą być równieŜ uŜyte w leczeniu.

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 83

4. KaŜdy enzym ma numer kodu (EC), który charakteryzuje typ reakcji, czyli klasę (pierwszy człon), podklasę (drugi człon) i pod-podklasę (trzeci człon). Czwarty człon wskazuje na nazwę określonego enzymu. EC 2.7.1.1 oznacza więc klasę 2 (transferaza), podklasę 7 (przenoszenie fosforanu), pod-podklasę 1 (alkohol jako akceptor fosforanu). Ostatnia cyfra wskazuje heksokinazę, czyli 6-fosfotransferaza ATP: D-heksoza, enzym katalizujący przeniesienie fosforanu z ATP na grupę hydroksylową przy 6 węglu glukozy.

r
H,C

o
L-Mleczan

O Plrogronlan

NAD*

NADH* + H+

Ryc. 8-1. Działanie NAD+ jako kosubstratu w reakcji o ksy do red u kej i.

WIELE ENZYMÓW DO AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ WYMAGA KOENZYMU

Wiele enzymów wymaga swoistej, termostabilnej, małocząsteczkowej molekuły organicznej zwanej koenzymem, Holoenzym (pełen układ katalityczny) składa się z apoenzymu (część białkowa) i przyłączonego koenzymu. Koenzym moŜe przyłączać się do apoenzymu kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Termin „grupa prostetyczna" oznacza kowalencyjnie przyłączony koenzym. Reakcje, które wymagają koenzymów, obejmują reakcje oksydacyjno-redukcyjne, reakcje przenoszenia grup i izomeryzacji oraz reakcje prowadzące do tworzenia wiązań kowalencyjnych (IUB, klasy I, 2, 5 i 6). Reakcje lityczne, łącznie z reakcjami hydrolitycznymi katalizowanymi przez enzymy trawienne, nie wymagają koenzymów.

cującego beztlenowo do przemiany pirogronianu w mleczan tkwi nie w samym pirogronianie lub mleczanie. Reakcja słuŜy głównie do utlenienia NADH do NAD+. Bez NAD+ glikoliza nie moŜe dalej przebiegać i ustaje beztlenowa synteza ATP (a tym samym praca). W warunkach beztlenowych redukcja pirogronianu do mleczanu słuŜy do ponownego utlenienia NADH i umoŜliwia biosyntezę ATP. Inne reakcje mogą spełniać równie dobrze taką samą funkcję. Na przykład w bakteriach lub droŜdŜach, rosnących w warunkach beztlenowych, metabolity pochodzące z pirogronianu słuŜą jako utleniacze dla NADH, przy czym same się redukują (tab. 8-1).
Tabela 8-1. Mechanizmy beztlenowej regeneracji NAD+

Utleniacz
Piróg ronian

Produkt zredukowany
Mleczan

Form a Ŝycia Mięśnie, bakterie fermentacji mlekowej

KOENZYM MOśE BYĆ ROZPATRYWANY JAKO DRUGI SUBSTRAT
Koenzym moŜe być rozpatrywany jako drugi substrat, tj. kosubstrat, z 2 powodów. Po pierwsze, chemiczne zmiany w koenzymie dokładnie równowaŜą zmiany zachodzące w substracie. Na przykład w reakcjach oksydacyjno-redukcyjnych, gdy 1 cząsteczka substratu utlenia się, wówczas 1 cząsteczka koenzymu ulega redukcji (ryc. 8-1). Podobnie w reakcjach transaminacji fosforan pirydoksalu działa jako drugi substrat w 2 kolejnych reakcjach oraz jako przenośnik w przekazywaniu grupy aminowej na róŜne aketokwasy. Drugim powodem podkreślenia roli koenzymu jest to, Ŝe reakcja zjego udziałem moŜe mieć większe podstawowe znaczenie fizjologiczne. Na przykład zdolność mięśnia pra-

Aldehyd octowy Alkohol etylowy DroŜdŜe Fosfodihydroksyaceton Fruktoza a-Glicerofosfo- Escherichia coli ran Mannitol Bakterie fermentacji pseudomlekowej

Koenzymy działają jako czynniki przenoszące określone grupy funkcyjne

Biochemiczne reakcje przenoszenia grup typu:
D-G+A=A-G+D

w których funkcyjna grupa G jest przenoszona z cząsteczki donora D —G na cząsteczkę akceptora A, zazwyczaj wykorzystują koenzym albo

84 / ROZDZIAŁ 8

jako ostateczny akceptor (np. w reakcjach odwodorowania), albo jako pośredni przenośnik grup (np. reakcje transaminacji). Schemat ilustruje drugą koncepcje: A—G D—G CoE
Ct

nami d. fiamina. ryboflawina i kwas pantotenowy

Mimo Ŝe sugeruje to tworzenie 1 kompleksu CoE—G w ciągu całej reakcji, w grę moŜe wchodzić w danej reakcji tworzenie kilku pośrednich CoE—G kompleksów (np. transaminacja). Gdy przenoszona grupą jest wodór, wówczas przyjęto przedstawiać tylko lewą stronę — „polowę reakcji":
D—H XCoE CoE—H D

są waŜnymi składnikami koenzymów reakcji biologicznego utleniania i redukcji, a kwas foliowy i koenzymy kobamidowe biorą udział w przemianach reszt jednowęgl owych. Wiele koenzymów zawiera adeninę, rybozę, fosforan i są one pochodnymi monofosforanu adenozyny (AMP). Przykłady obejmują NAD + i NADP+ (ryc. 8-2).

To, Ŝe reakcja ta przedstawia tylko szczególny przypadek ogólnego transferu grupy H ilustrują reakcje zachodzące w nienaruszonych komórkach (tab. 8-1). MoŜna je zapisać następująco: CoE A— H D—H

Koenzymy mogą być klasyfikowane zaleŜnie od grupy, przeniesienie której one ułatwiają Na podstawie powyŜszej koncepcji moŜna sklasyfikować koenzymy następująco: Koenzymy przenoszące inne grupy niŜ H Fosforany cukrów CoASH Pirofosforan tiaminy Fosforan pirydoksalu Koenzymy folia nowe Biotyna Koenzymy kobamidowe (B1;) Kwas liponowy Koenzymy przenoszące H NAD+, NADP+ FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Wiele koenzymów jest pochodnymi witamin B i monofosforanu adenozyny Witaminy grupy B tworzą część struktury wielu koenzymów. Witaminy grupy B: nikoty-

NHj + + +

Ryc. 8-2. NAD(P) . W NAD , R = H; w NADP , R="OPO1".

Skoro substraty łączą się z enzymami w 3 punktach, enzymy działają jako stereoswoiste katalizatory Większość substratów tworzy z enzymami co najmniej 3 wiązania. Takie „3-punktowe dolą* czenie" moŜe nadawać cząsteczce, skądinąd symetrycznej, asymetrię. Na rycinie 8-3 przedstawiono cząsteczkę substratu w postaci atomu węgla z 3 róŜnymi grupami, które mogą się przyłączyć w 3 punktach do miejsca enzymu. JeŜeli miejsce na enzymie jest dostępne tylko z jednej strony i mogą ze sobą reagować tylko atomy i miejsca komplementarne (uzasadnione przypuszczenia dla istotnych enzymów), cząsteczka substratu moŜe się przyłączyć do enzymu tylko w jeden sposób. Reakcja moŜe ograniczać się do atomów związanych w miejscach 1 i 2,

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 86

Większość enzymów wykazuje absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części swoistych substratów Z wyjątkiem epimeraz (racemaz), które katalizują wewnętrzne przekształcenie izomerów
optycznych, ogólnie enzymy wykazują absolutną swoistość optyczną dla przynajmniej części cząs-

Miejsce enzym etyczne Ryc. 8-3. Schemat trzypunktowego przyłączenia się substratu do płaskiego miejsca aktywnego enzymu.

teczki substratu. Dlatego enzymy glikolizy i bezpośredniej przemiany tlenowej katalizują przekształcenie fosfocukrów szeregu D-, a nie L. Z kilkoma wyjątkami (np. oksydaza D-aminokwasu nerki), większość enzymów ssaków działa na L-izomery aminokwasów.
Swoistość optyczna enzymów moŜe rozciągać się na część lub całość cząsteczki substratu.

nawet jeśli atomy 1 i 3 są takie same. Jeśli wyobrazimy sobie obrót cząsteczki substratu w przestrzeni, to widać, Ŝe istnieje tylko jedno połoŜenie substratu, w którym moŜe on łączyć się z 3 punktami miejsca planarnego enzymu. W wyniku tego atomy 1 i 3, chociaŜ identyczne, po połączeniu substratu z enzymem stają się róŜne. Zmiana chemiczna moŜe obejmować atom 1, ale nie atom 3 i odwrotnie. To moŜe wyjaśnić, dlaczego katalizowana przez enzym redukcja optycznie nieaktywnej cząsteczki pirogronianu prowadzi do L-, a nie D, L-mleczaffu. WIĘKSZOŚĆ ENZYMÓW KATALIZUJE ALBO SWOISTĄ REAKCJĘ, ALBO, W PEWNYCH PRZYPADKACH, SWOISTY TYP REAKCJI
Zdolność enzymu do katalizowania tylko 1 swoistej reakcji i zasadniczo Ŝadnej innej, być moŜe jest jego najwaŜniejszą właściwością.

Glikozydazy są przykładem obu tych przypadków. Te enzymy, które katalizują hydrolizę wiązań glikozydowych między cukrami a alkoholami, są wysoce swoiste dla części cukrowej i dla typu wiązania (a lub P), ale są stosunkowo nieswoiste dla aglikonu (część alkoholowa). Enzymy wykazują swoistość wyŜszego rzędu dla typu reakcji, które one katalizują Enzymy lityczne działają na określone ugrupowania chemiczne, np. glikozydazy na glikozydy, pepsyna i trypsyna na wiązania peptydowe, a esterazy na estry. Ten fakt tłumaczy moŜliwości rozkładu znacznej ilości róŜnych substratów peptydowych przez nieliczne tylko enzymy trawienne. Wiele proteaz katalizuje równieŜ hydrolizę estrów. ChociaŜ ten rodzaj reakcji ma ograniczone znaczenie fizjologiczne, uŜycie estrów, jako substratów syntetycznych znacznie się przyczyniło do poznania mechanizmu działania proteaz. Pewne enzymy lityczne wykazują większą swoistość. Chymotrypsyna hydrolizuje wiązania peptydowe, w których grupa karboksylowa pochodzi od aminokwasów aromatycznych: fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu. Karboksypeptydazy usuwają po 1 aminokwasie od końca karboksylowego, a aminopeptydazy — od końca aminowego łańcucha polipeptydowego. ChociaŜ niektóre oksydoreduktazy wykorzystują albo NAD+ lub NADP+ jako akceptor elektronu, większość z nich uŜywa przede wszystkim jednego lub drugiego. Mówiąc ogólnie,
oksydoreduktazy biorące udział w procesach biosyntezy u ssaków (np. synteza kwasu tłuszczowego lub sterolu) wykorzystują jako substan-

Szybkość procesów metabolicznych moŜe być zatem regulowana przez zmiany w katalitycznej sprawności odpowiednich enzymów, Niemniej większość enzymów katalizuje ten sam typ reakcji (przenoszenie fosforanu, utlenianie i redukcja, itp.) dla kilku strukturalnie pokrewnych substratów. Reakcje z pokrewnymi substratami zachodzą wówczas, gdy substraty te występują w duŜym stęŜeniu. To, czy w Ŝywych organizmach będą zachodziły wszystkie z moŜliwych reakcji, zaleŜy od względnych stęŜeń alternatywnych substratów w komórce i od względnego powinowactwa enzymu do tych substratów.

86 / ROZDZIAŁ 8 cję redukującą NADPH, natomiast oksydoreduktazy działające w procesach degradacji (np. glikoliza, utlenianie kwasu tłuszczowego) wykorzystują NAD+ jako substancje utlenia-

1. 0
0. 8

A
i

KATALITYCZNA AKTYWNOŚĆ ENZYMU JEST WYBIÓRCZĄ I CZUŁĄ PRÓBĄ DO ICH DETEKCJI Mała zawartość enzymów w komórkach komplikuje pomiar ich ilości w wyciągach tkankowych lub w płynach ustrojowych. Szczęśliwie aktywność katalityczna enzymu stanowi czułą i swoistą próbę do ich pomiaru. Aby zmierzyć ilość enzymu w próbce ekstraktu tkankowego lub innego płynu biologicznego, oznacza się szybkość reakcji katalizowanej przez enzym obecny w próbce. W odpowiednich warunkach oznaczana szybkość
reakcji jest proporcjonalna do ilości obecnego

I s

0. 6 0. 4 0. 2

1 \

NADH / \

V
200
i

\____

NAD

1

400

,

250

300 350 Długość fali (nm)

enzymu. PoniewaŜ trudne jest określenie ilości cząsteczek lub masy obecnego enzymu, wyniki są wyraŜone w jednostkach enzymatycz-

Ryc. 8-4. Widma absorpcji NAD ' i NADH Gęstość dotyczy roztworu o stęŜeniu 44 mg/l w kuwecie 1 cm. NADP+ i NAOPH mają widma analogiczne odpowiednio do widm NAD i NADH

nych. Względne ilości enzymu w róŜnych ekstraktach mogą być wówczas porównywane. Jednostki enzymu wyraŜa się w mikromolach (umol; 10 6 mol), nanomolach (nmol; 10~9 mol) lub pikomolacb. (pmol; 10 1Z mol) reagującego substratu Jub wytwarzanego produktu na minutę. Dehydrogenazy zaleŜne od NAD' mogą być analizowane przez pomiar zmiany absorbancji przy 340 nm, + spowodowanej i nterkon wersją NAD i NADH W reakcjach z udziałem NAD+ lub NADP+ (dehydrogenazy) wykorzystuje się właściwość absorbowania światła o długości fali 340 nm przez NADH lub NADPH (ale nie NAD + lub NADP+) (ryc. 8-4). Gdy NADH jest utleniany do NAD+ (lub odwrotnie) zmienia się gęstość optyczna (OD) przy 340 nm. W określonych warunkach szybkość zmiany w OD zaleŜy bezpośrednio od aktywności enzymu (ryc. 8-5). Krzywą kalibracyjną (ryc. 8-6) wykreśla się, oznaczając zmiany OD względem ilości dodanego enzymu (ryc. 8-5). Ilość enzymu obecnego w nieznanym roztworze moŜna obliczyć znając szybkość zmian w OD przy 340 nm.

0,90 2,0 t,0 Minuty Ryc. 8-5. Oznaczenie 0,85 -

0,80 L dehydrogenazy zaleŜnej od NADH i NADPH. Obserwuje się wielkość zmiany OD (gęstości optycznej) przy 340 nm na skutek przejścia koenzymu zredukowanego w koenzym utleniony. Do kuwety są dodawane: utleniony substrai (S), zredukowany koenzym (NADH) i bufor. Następnie przepuszcza się światło o długości 340 nm. Początkowo OD jest duŜa, poniewaŜ NADH {lub NADPH) absorbuje światło, przy 340 nm. Po dodaniu 0,025 — 0,2 ml standardowego roztworu enzymu OD się zmniejsza.

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 87
0.20

0,10 r

determinują określoną metodę obliczeń. Często dogodnie jest połączyć produkt reakcji z dehydrogenaza, dla której ten produkt jest substratem (ryc. 8-7). CZYSTE ENZYMY SĄ KONIECZNE DO ZROZUMIENIA ICH STRUKTURY, FUNKCJI, MECHANIZMU REAKCJI I REGULACJI ICH AKTYWNOŚCI Wiedza o reakcjach i chemicznych związkach pośrednich w szlakach metabolicznych i mechanizmach regulacyjnych, które działają na poziomie katalizy, pochodzi w duŜym stopniu z badań oczyszczonych enzymów. Wiarygodna informacja dotycząca kinetyki, k o fakt o rów, miejsc aktywnych, struktury i mechanizmu działania takŜe wymaga bardzo oczyszczonych enzymów. Efektywny przepis oczyszczania enzymu, z dobrą wydajnością na kaŜdym etapie, zwiększa swoistą aktywność enzymu W tabeli 8-2 przedstawiono przebieg typowego oczyszczania enzymu wątroby, z dobrą wydajnością i 490-krotnym oczyszczaniem całkowitym. NaleŜy zwrócić uwagę, jak oblicza się swoistą aktywność i odzysk początkowej aktywności. Celem jest osiągnięcie maksymalnej swoistej aktywności (jednostki enzymu na miligram białka) z moŜliwie najlepszym odzyskiem początkowej aktywności. Oczyszczanie enzymu polega na wyizolowaniu swoistego enzymu z surowego ekstraktu komórkowego, zawierającego wiele innych komponentów. Małe cząsteczki moŜna usunąć przez dializę lub filtrację Ŝelową, kwasy nukleinowe przez strącanie antybiotykiem, np. streptomycyną, itd. Największym problemem jest wydzielanie poŜądanego enzymu z tysięcy chemicznie i fizycznie podobnych białek. Klasyczne metody oczyszczania enzymów obejmują strącanie wybiórcze, chromatografię jonowymienną i filtrację Ŝelową UŜyteczne, klasyczne techniki oczyszczania obejmują strącanie solami o róŜnych stęŜeniach (głównie siarczanem amonu i siarczanem sodu) lub rozpuszczalnikami (aceton lub etanol), róŜnicową denaturację cieplną iub w wyniku zmian pH,1 róŜnicowe wirowanie, filtrację Ŝelową i ele-

0,05 0,10 0,15 Roztwór enzymu (ml)

Ryc. 8-6. Krzywa kalibracyjna do analizy enzymatycznej. Nachylenia prostych z ryc. 8-5 są wykreślone względem ilości enzymu.

Ilościowa analiza wielu enzymów moŜe być uproszczona, sprzęgając reakcje przez nie katalizowane z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę zaleŜną od NAD W powyŜszym przykładzie, aby określić aktywność enzymu, oznaczano szybkość tworzenia produktu (NADH). Enzymy inne niŜ dehydrogenazy mogą być takŜe badane przez pomiar szybkości pojawiania się produktu (lub, rzadziej, szybkości zanikania substratu). Fizykochemiczne właściwości produktu lub substratu
Glukoza

[HEKSOKINAZA I
*ADP, Mi Glu kozo- 6fosforan , NADP* DEHYDROGENAZA GLUKO2O-6.FOSFORANOWA NADPH + H 6-Fosfool ukonolakton
ł

Ryc. 8-7. Oznaczanie aktywności heksokinazy metodą „sprzęŜoną". Reakcja jest sprzęŜona z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową. Dehydrogenaza g I u kozo - 6 - f osf ora nowa, glukoza, ATP, Mg2"* i NADP+ są dodawane w nadmiarze. Ilość obecnej heksokinazy determinuje szybkość całej sprzęŜonej reakcji i przede wszystkim szybkość tworzenia NADPH, która moŜe być mierzona przy 340 nm.

88 / ROZDZIAŁ 8 Tabela 8-2, Schemat typowego oczyszczania enzymu Całkowita Frakcja enzymu Surowy homogenat wątroby Supernatant 100 000xff Osad — 40—50% {NH4)2SO4 Osad — 20—35% aceton Kolumna DEAE, frakcja 80—110 Osad — 43—48% (NH4)2SO4 Pierwsze kryształy Rekrystalizacja Białko całkowite (nig) 10 000 8 000 1 500 250 29 20 12 10 Aktywność Całkowity odzysk (%) (100) 98 90 60 58 52 50 49

aktywność
(pU) 100 000 98 000 90 000 60 000 58 000 52 000 50 000 49 000

właściwa
(pU/mg) 10 12,2 60 240 2 000 2 600 4 160 4 900

ktroforezę. Niezwykle skuteczną do wydajnego i szybkiego oczyszczenia enzymów okazała się selektywna adsorpcja i elucja białek z anionowego jonitu celulozowego— dietyloaminoetylo (DEAE) celulozy i kationowego jonitu — karboksymetylocelulozy (CMC). Szeroko stosowany jest rozdział białek na sitach molekularnych, takich jak Sephadex, które rozdzielają białka na podstawie ich wielkości. Metody te są względnie nieselektywne (z wyjątkiem przypadków stosowania kombinacji kilku takich metod), poniewaŜ nie rozdzielają one pojedynczego białka od wszystkich innych białek. Jest to lepiej osiągane za pomocą chromatografii powinowactwa. Techniki chromatografii powinowactwa wykorzystują unieruchomione Ugandy, które reagują ze swoistymi regionami enzymu Uderzającą cechą chromatografii powinowactwa jest jej zdolność do wybiórczego usuwania jednego określonego białka lub, najwyŜej, małej liczby poszczególnych białek z ich mieszaniny. Technika wykorzystuje unieruchomiony ligand swoiście reagujący z enzymem, który zamierzamy oczyścić. Gdy mieszanina białek jest poddana działaniu tego unieruchomionego ligandu, wówczas białkami, które przyłączą się, są te, które silnie z nim reagują. NiepoŜądane białko wypływa z kolumny i jest odrzucane. Badane białko jest wówczas eluowane z unieruchomionego ligandu. na ogół za pomocą duŜych stęŜeń soli lub przeprowadzając ligand w postać rozpuszczalną. Oczyszczania, dokonane za pomocą techniki chromatografii powinowactwa, są imponujące, często przewyŜszają to, co jest moŜliwe przez sukcesywne stosowanie wielu

technik klasycznych. Preferowanymi Ugandami są substraty lub pochodne koenzymów kowaJencyjnie przyłączone do nośnika, takiego jak Sephadex. Przyłączenie moŜe być bezpośrednie lub przez molekularny łącznik, zawierający 3—8 atomów węgla. JeŜeli sposób przyłączenia ligandu uniemoŜliwia jego zdolność do interakcji z enzymem, to mogą pojawić się trudności, których moŜna uniknąć, uŜywając cząsteczek łącznikowych. UŜycie hydrofobowego „Mnkera" moŜe jednak komplikować rozdział przez wprowadzenie elementu chromatografii hydrofobowej (p. poniŜej). Przykłady udanej chromatografii powinowactwa obejmują oczyszczanie wielu róŜnych dehydrogenaz na nośniku z NAD+. ChociaŜ wiele dehydrogenaz moŜe się przyłączać i eluować wspólnie, gdy kolumnę poddaje się działaniu rozpuszczonego NAD+, to kolejne uŜycie kolumn, raczej z substratem (niŜ koenzymem) lub elucja kolumny za pomocą usuwającej mieszaniny trójskładnikowej (ang. abortive ternary mixture) w wielu przypadkach umoŜliwia uzyskanie czystego enzymu. Chromatografia z barwnikiem jako ligandem i chromatografia hydrofobowa wykorzystują zasady analogiczne do zasad chromatografii powinowactwa Chromatografia z barwnikiem jako ligandem na nośnikach, takich jak błękit, zieleń lub czerwień Sepharose i chromatografia z ligandem hydrofobowym na nośniku, takim jak oktyi- lub fenyl-Sepharose są technikami ściśle spokrewnionymi z chromatografią powinowactwa. Pierwsza wykorzystuje jako unieruchomiony ligand barwnik organiczny, który słuŜy jako analog substratu, koenzymu lub allosterycznego efektora. Elucja jest przeprowadzona za

ENZYMY-. WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 89

pomocą gradientu stęŜenia soli. W chromatografii z ligandem hydrofobowym, alkilowy lub arylowy węglowodór jest przyłączony do nośnika, takiego jak Sephadex. Zatrzymywanie białek na nośniku obejmuje hydrofobowe interakcje między łańcuchem alkilowym a regionami hydrofobowymi białka. Białka są nanoszone w roztworach, które zawierają duŜe stęŜenia soH (np. (NH4)2SO4) i są eluowane przy zmniejszającym się gradiencie stęŜenia tej samej soli.
Elektroforeza w Ŝelu połiakryłoamidowym wykrywa zanieczyszczenia w preparatach enzymów

Umiejscowienie poszczególnego enzymu w tkance lub komórce, w stosunkowo nie zmienionym stanie, jest często dokonywane za pomocą metod histochemicznych (histoenzymologia). Na cienkie (2—10 um) zamroŜone skrawki tkanki działa się substratem dla odpowiedniego enzymu. W miejscu, w którym znajduje się enzym, powstaje produkt reakcji przez niego katalizowanej. JeŜeli produkt jest barwny i nierozpuszczalny, to pozostaje on w miejscu powstania i umiejscawia enzym. Histoenzymologia daje obraz względnie fizjologicznego rozmieszczenia enzymów.
IZOENZYMY SĄ FIZYCZNIE ODMIENNYMI FORMAMI TEJ SAMEJ AKTYWNOŚCI KATALITYCZNEJ

Homogenność białka jest najlepiej oceniana przez elektroforezę w Ŝelu połiakryłoamidowym (PAGE) przeprowadzoną w róŜnych warunkach. JeŜeii nałoŜona jest dostateczna ilość próbki, jednowymiarowa PAGE natywnego białka ujawni większe i mniejsze zanieczyszczenia białkowe. W dwuwymiarowej (O'Farrell) PAGE w pierwszym wymiarze, który zawiera mocznik i gradient pH utrzymywany przez polimeryzowane amfolity, zdenaturowane białka rozdzielają sie na zasadzie ich wartości pl przez zrównowaŜenie ich w polu elektrycznym. W drugim wymiarze białka, po zadziałaniu na nie SDS, rozdzielają sie na zasadzie wielkości mas cząsteczkowych ich protomerów (jeŜeli występują).
0 WEWNĄTRZKOMÓRKOWYM ROZMIESZCZENIU ENZYMÓW WNIOSKUJE SIĘ NA PODSTAWIE TECHNIK HISTOCHEMICZNYCH, A TAKśE PRZEZ IZOLOWANIE 1 BADANIE ORGANELLI SUBKOMORKOWYCH

W obrębie komórki bardzo waŜne jest przestrzenne rozmieszczenie i przedziałowość (kompartmentacja) enzymów, substratów i kofaktorów. Na przykład w komórkach wątroby enzymy glikolizy są umiejscowione w cytoplazmie, podczas gdy enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach. Umiejscowienie enzymów w subkomórkowych organellach moŜe być badane po frakcjonowaniu homogenatu komórkowego za pomocą wirowania z duŜą szybkością. Badana jest wówczas zawartość enzymu w kaŜdej frakcji.

ChociaŜ takie terminy, jak „dehydrogenaza jabłczanowa" lub „glukozo-6-fosfataza" wydają się opisywać pojedynczą jednostkę katalityczną, to obejmują one wszystkie białka, które katalizują odpowiednio utlenianie ja błczanu do szczawiooctanu lub hydrolizę glukozo-6-fosforanu do glukozy i Pr JeŜeli np. techniki oczyszczania enzymów były zastosowane dla dehydrogenazy jabłczanowej z róŜnych źródeł (np. wątroba szczura i Escherichia coli), stało się oczywiste, Ŝe chociaŜ dehydrogenaza jabłczanowa wątroby szczura i E. coli katalizuje tę samą reakcje, ich właściwości fizyczne i chemiczne wykazują znaczne róŜnice. Fizycznie odmienne formy o tej samej aktywności katalitycznej mogą takŜe występować w róŜnych tkankach tego samego organizmu, w róŜnych typach komórek, w subkomórkowych kompartmentach lub w organizmie prokariotycznym, takim jak E. coli. To odkrycie wynika z zastosowania metod rozdziału elektroforetycznego do oddzielenia elektroforetycznie odmiennych postaci określonej aktywności enzymatycznej. Wprawdzie określenie „izozym" (izoenzym) obejmuje wszystkie powyŜsze przykłady fizycznie róŜnych postaci o danej aktywności katalitycznej, w praktyce jednak, a zwłaszcza w medycynie klinicznej, „izozym" ma bardziej ograniczony sens, określając mianowicie fizycznie odmienne i rozdzielające się postacie danego enzymu, występujące w róŜnych typach komórek lub kompartmentach subkomórkowych człowieka. Izoenzymy są powszechne w surowicy i tkankach wszystkich kręgowców, owadów,

90 / ROZDZiAŁ 8

roślin i organizmów jednokomórkowych. Zarówno rodzaj, jak i liczba enzymów jest w równym stopniu róŜna. Znane są izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fosfataz, transfosforylaz i enzymów proteolitycznych. RóŜne tkanki mogą zawierać róŜne izoenzymy, a te izoenzymy mogą się róŜnić w ich powinowactwie do substratu. MoŜliwość rozdzielenia i identyfikacji izoenzymów ma znaczenie diagnostyczne Medyczne zainteresowanie izoenzymami było stymulowane odkryciem, Ŝe surowica człowieka zawiera kilka izoenzymów rlehydrngenazy mleczaiiowej, 1 ze ich względne proporcje zmieniają się znacznie w pewnych stanach chorobowych. Następnie opisano, jako wynik choroby, wiele dodatkowych przykładów zmian w proporcjach izoenzymów. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej surowicy mogą być ujawnione przez poddanie próbki surowicy elektroforezie, zazwyczaj w pH 8,6, uŜywając jako nośnika skrobi, agaru lub Ŝelu poliakryloamidowego. W tym pH izoenzymy mają róŜne ładunki elektryczne i wędrują do 5 odmiennych obszarów elektroforegramu. Zdolność izoenzymów do katalizowania redukcji barwników bezbarwnych do nierozpuszczalnej postaci barwnej wykorzystuje się w celu ich umiejscowienia. W typowym zestawie odczynników do wykrycia izoenzymu dehydrogenazy znajduje się: 1. Zredukowany substrat (np. mleczan). 2. Koenzym (NAD+). 3. Barwnik utleniony (np. sól tetrazolowa błękitu nitrowego [NBT]). 4. Związek pośrednio przenoszący elektrony miedzy NADH a barwnikiem (np. metosiarczan fenazyny [PMS]). 5. Bufor; w razie potrzeby jony aktywujące. Dehydrogenaza mleczan owa katalizuję przeniesienie 2 elektronów f 1 H+ z mleczanu na NAD+ (ryc. 8-8). Reakcja przebiega z dającą się zmierzyć szybkością tylko w obecności dehydrogenazy mleczanowej. Po spryskaniu eiektroforegramu mieszaniną odczynników testowych i inkubacji w temp. 37°C, reakcje przenoszenia elektronów zajdą tylko w tych miejscach, w których znajduje się dehydrogenaza mleczanowa (ryc. 8-9). Względne nasilenie barwy prąŜków moŜna ocenić ilościowo za pomocą fotometru skaningowego (ryc. 8-10). Izoenzym o największym ładunku ujemnym określono jako Ir

Zredukowany NBT (niebieski formazan) DEHYDflOGENAZA MLECZANOWA H,C

O L-Mleezan

' -----------------------* V

O Plrngronlan

NAD+

NADH+ + H+

Ryc. 8-8. Reakcja dehydrogenazy L-mleczanowej.

Ryc. 8-9. Wykorzystanie reakcji sprzęŜonych do
Mleczan SH S Pirogronian

NAD*

NADH + H*

Zredukowany PMS

Utleniony PMS

Utleniony NBT (bezbarwny)

oznaczania aktywności dehydrogenazy mleczanowej na elektroferogramie.

Izoenzymy są produktami ekspresji ściśle spokrewnionych genów Enzymy oligomeryczne z róŜnymi protomerami mogą występować w kilku postaciach. Często jedna tkanka wytwarza głównie jeden protomer, a inna — drugi protomer. JeŜeli protomery mogą się łączyć w róŜny sposób, aby utworzyć aktywny enzym (np. tetramer), tworzą się izoenzymy o tej aktywności enzymatycznej. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej róŜnią się między sobą na poziomie struktury czwartorzędowej. Oligomeryczna cząsteczka dehydrogenazy mleczanowej (m.cz. 130000) składa się z 4 protomerów 2 typów — H i M (mcz. ok. 34000). Tylko cząsteczka tetrameryczna ma aktywność katalityczną. JeŜeli uporządkowanie jest bez znaczenia, to te protomery mogą się ze sobą łączyć w następujących 5 kombinacjach: HHHH HtłHM

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 91

Norma

Wątroba

I

f
Ryc. 8-10.Prawidłowy i patologiczny wykres izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej w surowicy ludzkiej, izoenzymy LDH rozdzielono na octanie celulozy w pH 8,6 i barwiono na obecność enzymu. Wykres fotometru pokazuje względną zawartość izoenzymów. Wykres A — surowica chorego z zawałem mięśnia sercowego; B — prawidłowa surowica; C — surowica chorego z chorobą wątroby, (Za zgodą Dr Me!virta Blacka, Mr Hugha Millera, St Luke's Hospital, San Francisco), _____________

HHMM HM MM MMMM

na przez odmienne loci genetyczne, które ulegają odmiennej ekspresji w róŜnych tkankach, np. w sercu i mięśniach szkieletowych.

W. celu wyjaśnienia związku miedzy izoenzymami dehydrogenazy mleczanowej, Market wykorzystał znane warunki do rozbicia i ponownego utworzenia struktury czwartorzędowej. Rozszczepienie i rekonstrukcja dehydrogenazy mleczanowej I^ub dehydrogenazy mleczanowej I, nie spowodowały utworzenia się Ŝadnych nowych izoenzymów. Wynika to z faktu, Ŝe składają się one z 1 typu protomeru. Gdy tym samym zabiegom poddano mieszaninę dehydrogenazy Ij i dehydrogenazy mleczanowej I5, wówczas otrzymywano dehydrogenazę mleczanową I2, 13 i I+. Stwierdzone proporcje izoenzymów wskazywałyby na następujący skład podjednostek:
Dehydrogenaza mlecza nowa Izoenzym Podjednostki HHHH HHHM HHMM
H (vi (VI lvi
JVIIVI In lvi

Synteza podjednostek H i M jest kontrolowa-

ILOŚCIOWA ANALIZA PEWNYCH ENZYMÓW OSOCZA MA ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE
Pewne enzymy, proenzymy i ich substraty znajdują się stale we krwi krąŜącej zupełnie
zdrowych ludzi, pełniąc określone funkcje fizjo-

logiczne. Do takich enzymów osocza naleŜy m.in. lipaza lipo proteinowa, pseudochołinesteraza, proenzymy krzepnięcia krwi i fibrynolizy. Na ogół są one syntetyzowane w wątrobie, ale występują we krwi w takich samych lub większych stęŜeniach niŜ w tkankach.
Niefunkcjonalne enzymy osocza, jak sama

nazwa wskazuje, nie pełnią Ŝadnej znanej funkcji fizjologicznej we krwi. Ich substraty często nie występują w osoczu, a same enzymy występują we krwi osób zdrowych w ilościach do miliona razy mniejszych niŜ w tkankach. Występowanie ich w osoczu, w ilościach powyŜej wartości prawidłowych, sugeruje zwiększenie szybkości destrukcji określonych tkanek. Pomiar stęŜenia tych niefunkcjonalnych enzymów osocza moŜe dostarczać lekarzowi cennych informacji przy ustalaniu rozpoznania i rokowaniu. W grupie niefunkcjonalnych enzymów osocza znajdują się enzymy występujące w wydzielinach gruczołów wydzielania zewnętrznego i „prawdziwe" enzymy wewnątrzkomórkowe.

92 / ROZDZIAŁ 8

Enzymy wydzielania zewnętrznego — amylaza trzustkowa, lipaza, fosfataza alkaliczna Ŝółci i fosfataza kwaśna gruczołu krokowego — dyfundują do osocza. Prawdziwe enzymy wewnątrzkomórkowe w warunkach fizjologicznych nie występują w układzie krąŜenia. Małe stęŜenie niefunkcjonalnych enzymów osocza wynika z fizjologicznego rozpadu komórek Małe ilości niefunkcjonalnych enzymów stwierdzane w osoczu pochodzą z rozpadu erytrocytów, leukocytów i innych komórek zachodzącego nawet w warunkach fizjologicznych. Przy szybkim obumieraniu komórek uwalniające się z nich enzymy dostają się do krwi. ChociaŜ ogólnie uwaŜa się, Ŝe zwiększone stęŜenie tych enzymów w osoczu świadczy o martwicy komórek, intensywne ćwiczenia fizyczne równieŜ powodują uwalnianie znacznej ilości enzymów mięśni. StęŜenia niefunkcjonalnych enzymów osocza od wielu lat są wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Praktykujący lekarze długo wykorzystywali ilościowe określenie stęŜenia pewnych niefunkcjonalnych enzymów osocza. Tę wartościową diagnostycznie i prognostycznie informację w większości przypadków otrzymuje się za pomocą całkowicie zautomatyzowanego wyposaŜenia. W tabeli 8-3 podano listę głównych enzymów wykorzystywanych w dziedzinie diagnostyki enzymatycznej. Dalsze szczegóły wykorzystania tych enzymów są podane w suplemencie, obejmując omówienie waŜnych pojęć — czułości i swoistości testów diagnostycznych. ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE DOSTARCZAJĄ NOWEJ METODY W DIAGNOSTYCE CHORÓB GENETYCZNYCH Ogromny postęp w rozpoznawaniu chorób genetycznych dokonał się od wprowadzenia technologii rekombinacji DNA. ChociaŜ od dawna wiedziano, Ŝe wszystkie choroby molekularne są konsekwencją zmienionego DNA, to techniki bezpośredniego badania sekwencji DNA stały się dostępne od niedawna. Rozwój badań hybrydyzacjj fragmentów DNA wskazał drogę do technik o dostatecznej czułości do prenatalnego zbadania zaburzeń dziedzicznych

Tabela 8-3. Główne enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Wiele enzymów nie jest swoistych dla podanych chorób; szczegóły dotyczące warunków, w których enzymy te wykazują zmienną aktywność, podano w suplemencie
Enzym osocza

Główna wykorzystanie diagnostyczne Zawał serca Wirusowe zapalenie wątroby

Aminotransferazy Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT lub S60T) Aminotransferaza alaninowa (AIAT lub SGPT) Amylaza Cerutoplazmina

Ostre zapalenie trzustki Zwyrodnienie wątrobowo- soczewko watę {choroba Wilsona) Fosfokinaza kreatynowa Choroby mięśni i zawał serca Transpeptydaza y-gluta- RóŜne choroby wątroby mylowa Dehydrogenaza mlecza- Zawał serca nowa (izoenzymy) Lipaza Ostre zapalenie trzustki Fosfataza kwaśna Fosfataza alkaliczna {izoenzymy) Rak gruczołu krokowego z przerzutami RóŜne choroby kości, choroby wątroby z utrudnionym odpływem Ŝółci

przez mapowanie DNA, pochodzącego z komórek płodowych w płynie owodniowym, za pomocą enzymu restrykcyjnego. Zasadniczo badania DNA mogą być zastosowane w diagnostyce większości chorób genetycznych. Na przykład do prenatalnego wykrycia talasemii (charakteryzującej się wadą w syntezie podjednostek hemoglobiny; p. rozdz. 7), badaniem wykonanym z uŜyciem części genu dla normalnej podjednostki hemoglobiny moŜna wykryć skrócenie lub brak fragmentu restrykcyjnego, wynikające z delecji w tym genie, jakie ma miejsce w pewnych a-talasemiach i pewnych rzadkich typach |3- i p,5-talasemiach. Alternatywnie, moŜna wykonać badanie z uŜyciem syntetycznego cDNA, który hybrydyzuje z sekwencją fl-globiny, zawierającą nonsensowną mutację obecną w pewnych p-talasemiach, ale

ENZYMY: WŁAŚCIWOŚCI OGÓLNE / 93

nie z normalnym genem fi-globiny. Nieobecność osoezowego inhibitora proteazy o^-antytrypsyny jest związana z rozedmą płuc i marskościa. wątroby. Obecność nieaktywnej c^-antytrypsyny wykryto sondą wykrywającą nieaktywny allel, który zawiera punktową mutacje w genie o^-antytrypsyny. Metoda hybrydyzacji moŜe takŜe być uŜyta do wykrycia zmian genetycznych prowadzących do utraty miejsc działania dla endonukleazy restrykcyjnej (p. rozdz, 38). Na przykład mutacja punktowa kodonu dla Glu (GAG) na kodon Val (GTG), charakterystyczna dla niedokrwistości sierpowatej, moŜe być wykryta w genie (ł-globiny, uzyskanym z komórek pochodzących tylko z 10 ml płynu owodniowego, za pomocą endonukleazy restrykcyjnej Mst II lub Sau I. BADANIE PRODUKTÓW TRAWIENIA ENZYMAMI RESTRYKCYJNYMI MOśE UJAWNIĆ HOMOLOGICZNE GENY Z RÓśNYMI SEKWENCJAMI ZASAD Badania DNA mogą być takŜe wykorzystywane do wykrycia sekwencji ściśle sprzęŜonych "z genem, ale nie umiejscowionych w obrębie interesującego genu. Badania takie moŜna rozszerzyć o określenie swoistych chromosomowo zmian (róŜnice w sekwencji między homologicznymi chromosomami). Przez trawienie DNA endonukleazami restrykcyjnymi uzyskuje się róŜne mapy restrykcyjne (wykresy fragmentów DNA) z homologicznych genów, które zawierają jednak róŜne sekwencje zasad. Zjawisko to określa się jako polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restrietion fragment length polymorphism; skrót — RFLP). W przypadku choroby genetycznej sprzęŜonej z polimorfizmem długości fragmentów restrykcyjnych, nosiciel jej będzie miał 1 chromosom z prawidłowym genem i 1 z genem wadliwym. Gdy fragmenty restrykcyjne poddaje się rozdziałowi, wówczas wykrywa się 2 pasma hyb-iydyzacji (odmienne od pojedynczego pasma,

jeŜeli oba geny są identyczne). Potomek, który odziedziczył chromosom kodujący chorobę wykazuje wprawdzie tylko pojedyncze pasmo hybrydyzacji, ale róŜniące się od pasma produkowanego przez prawidłowe chromosomy. Zjawisko RFLP wykorzystuje się do wykrycia cechy niedokrwistości sierpowatej (związanej z Hpa I RFLP) i p-talasemii (związanej z Hind III i Bam HI RFLP). Metodę opartą na RFLP rozwinięto do wykrycia dziecięcej fenyloketonurii (p. rozdz. 32). Skoro RFLP nie powoduje choroby, lecz jest spowodowany zmianami chroinosomaJnymi, umiejscowionymi blisko wadliwego genu, badanie to nie jest niezawodne. RFLP jest punktem wyjścia do badań zmierzających do identyfikacji genu odpowiedzialnego za sprzęŜone z nim choroby. Ten sposób podejścia wykorzystano juŜ w badaniach skriningowych zjawisk mutacyjnych uczestniczących w powstawaniu retinobiastoma i choroby Huntingtona. Następne przykłady wykorzystania enzymów restrykcyjnych w diagnostyce p. rozdz. 36. PIŚMIENNICTWO
Methods in Enzymohgy. Over 130 volumes, 1955—present. Advances in Enzymohgy. Issued annually. Boyer PD, Lardy H, Myrbach K (editor): The Enzymes, 3rd ed. 7 vols. Academic Press, 1970-1973. Bergmeyer HH, Bergmeyer J, Grass M: Methods of EnivmkAnalysis. Vol. XI, Antigens and Antibodies. VCH Publishers, 1986. Fersht A: Enzyme Structure and Mechanizm. 2nd ed. Freeman, 1985. Freifelder D: Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Moleadar Biology. Freeman, 1982. Kaiser T, Lawrence DS, Rokita SZ: The chemical modification of enzyme specificity. Ann Rev Biochem 1985;54:597. Naąui A: Where are the asymptotes of Michaelis-Menten? Trends Biochem Sci 1986; 1J:64. Scopes R: Protein Purifwation: Principles and Practke. Springer-Verlag, 1982. Tijssen P: Practice and Theory of Enzyme fmmunoassays. Elsevier, 1985.

9
WPROWADZENIE
W tym rozdziale zostanie omówiony charakter chemiczny katalizy przeprowadzonej przez enzymy oraz charakter interakcji enzym-substrat odpowiedzialny za swoistość reakcji tych biologicznych katalizatorów.

Enzymy: kinetyka
Victor W. Rodwell, PhD

TWORZENIE I ZANIK STANÓW PRZEJŚCIOWYCH W CAŁKOWITEJ REAKCJI WIĄśE SIĘ Z DYSKRETNYMI ZMIANAMI W WOLNEJ ENERGII
W reakcji zastąpienia grupa Y zastępuje pozostającą grupę X:
V + R - XY - R + X

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Rozpatrując główne czynniki, tj. stęŜenie enzymu i substratu. temperaturę, pH i inhibitory, które wpływają na aktywność enzymu, 3 ostatnie są szczególnie interesujące w badaniach klinicznych. PoniewaŜ aktywność enzymów zwiększa się wraz ze wzrostem temperatury, szybkość procesów metabolicznych znacznie się zwiększa podczas gorączki. JeŜeli gorączka jest długotrwała, rezultaty mogą być fatalne, częściowo z powodu wyczerpania metabolicznego. ObniŜenie temperatury ciała (hipotermia), a w konsekwencji zmniejszenie aktywności większości enzymów, okazuje się uŜyteczne wówczas, gdy zachodzi potrzeba redukcji całkowitego metabolizmu (np. podczas operacji na otwartym sercu lub transportu narządów przeznaczonych do transplantacji). Zasadniczą regułą biologiczną jest homeostaza, tj. utrzymywanie wewnętrznego środowiska ciała bardzo zbliŜone do jego normalnych warunków. Stosunkowo małe zmiany pH mogą wpływać na aktywność wiciu enzymów lub białek. Większość leków działa przez wpływ na reakcje katalizowane przez enzymy. Wiele leków przypomina naturalne substraty i działa jako inhibitory kompetycyjne aktywności enzymatycznej. Lepsze zrozumienie farmakologii i toksykologii zaleŜy od prawdziwej znajomości zasad hamowania działania enzymów.

Ta reakcja przebiega w 2 reakcjach połówkowych: 1) tworzenie stanu przejściowego, w którym Y i X są przyłączone do R, i 2) zanik stanu przejściowego i utworzenie
Y-R + X

Y+R-X produktów:

R...... Stan przejściowy

Jak we wszystkich reakcjach chemicznych, zmiany w wolnej energii są związane z kaŜdą połówką reakcji. AGp definiuje się jako zmianę w wolnej energii związaną z tworzeniem stanu przejściowego, a AGD jako zmianę w wolnej energii związaną z zanikiem stanu przejściowego do utworzenia produktów:

m

[V- R] [Y] [Y -R -X]

gdzie zmiana w wolnej energii dla całej reakcji — AG jest sumą zmian wolnej energii w obu reakcjach połówkowych: AG= AG + AG
F "

Tak jak dla kaŜdego równania z dwoma członami, nie jest tu moŜliwe wywnioskowanie

ENZYMY: KINETYKA / 95

znaku lub wielkości ani AGF, ani AGD przez zbadanie algebraicznego znaku i wielkości AG. Nie ma wiec moŜliwości prostego wnioskowania na podstawie zmian wolnej energii AG dla całej reakcji o zmianach wolnej energii związanych z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych. Skoro kataliza jest ściśle związana z AG> i AGD, to pociąga za sobą to, Ŝe termodynamika całkowitej reakcji (AG) nie moŜe nam powiedzieć nic o drodze przebiegającej reakcji {tj. jej mechanizmie). Jest to zadanie kinetyki. Profile reakcji ilustrują zmiany wolnej energii związane z tworzeniem i zanikiem stanów przejściowych Profile reakcji na ryc. 9-1 i 9-2 ilustrują zaleŜności między AG, AGp i AG D NaleŜy
Wielkość wolnej energii
r

Reakcje katalizowane enzymatycznie obejmują stany przejściowe przy niŜszym poziomie energii niŜ reakcje niekatalizowane Na rycinie 9-3 przedstawiono profile reakcji 2 róŜnych stanów przejściowych w tej samej reakcji całkowitej. W obu przypadkach, wielWielkoSfi wolnej energii ■x]'
[V ■ - ■ R ■ ■ ■ Xl

AGF

Y Ryc.

+ R-X

9-3. Profil reakcji dla tworzenia 2 róŜnych sta n ów pr ze jśc i owyc h [Y- R - X ] a i [Y--R - X] b i towarzysząca im wolna energia tworzenia, AGp iAG£

y---R

AGF Y + R- X AGo<0

A6<0

Y-R + X
Ryc. 9-1. Profil reakcji dla reakcji zastąpienia z ujemną całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG

Wielkość we In ej enerflil AGD AGF>0 AG>0 Y + R-X

Ryc. 9-2. Profil reakcji dla reakcji zastąpienia z dodatnią całkowitą zmianą w wolnej energii, tj. AG>0.

kość wolnej energii tworzenia stanu przejściowego reprezentuje barierę energetyczną dla cafej reakcji. Bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R-"X]b, jest niŜsza niŜ bariera energetyczna dla reakcji, która przebiega przez stan przejściowy [Y — R— X]a- Katalizatory zmieniają wielkość wolnej energii stanu przejściowego. W powyŜszym przykładzie [Y —R — X]a przedstawia stan przejściowy dla niekatalizowanej reakcji, natomiast [Y •■• R ■*■ X]b przedstawia stan przejściowy dla reakcji katalizowanej. Wszystkie katalizatory, łącznie z enzymami, zmniejszają wolną energię tworzenia stanu przejściowego AGp. Następnie naleŜy zauwaŜyć, Ŝe skoro kataliza nie ma Ŝadnego wpływu na AG, zmiana w wolnej energii dla reakcji całkowitej jest niezaleŜna od katalizy. Skoro stała równowagi dla reakcji chemicznej jest funkcją standardowej zmiany wolnej energii dla reakcji:
AG°= -RTIn K eq

zwrócić uwagę, Ŝe podczas gdy na ryc. 9-1 AG jest ujemna (AG<0), a na ryc. 9-2 AG jest dodatnia (AG > 0), w obu przypadkach AGFjest dodatnia (AG t > 0) i AG D jest ujemna (AGD<0). Dlatego, jak stwierdzono powyŜej, ze znaku i wielkości AG nie moŜna wnioskować o znaku i wielkości ani AGF ani AGD. -

to powoduje to, Ŝe enzymy i inne katalizatory nie mają Ŝadnego wpływu na stałą równowagi reakcji.

96 / ROZDZIAŁ 9

ABY REAGOWAĆ, CZĄSTECZKI MUSZĄ SIĘ ZBLIśYĆ DO SIEBIE NA ODLEGŁOŚĆ TWORZONEGO WIĄZANIA Z WYSTARCZAJĄCĄ ENERGIĄ, ABY PRZEKROCZYĆ BARIERY ENERGETYCZNE MIĘDZY STANAMI PRZEJŚCIOWYMI Teoria kinetyczna lub teoria zderzeń dla reakcji chemicznych zawiera 2 kluczowe pojęcia: 1. Aby ze sobą reagować, cząsteczki muszą się zderzać (tj. być jedna obok drugiej w obrębie odległości tworzonego wiązania). 2. W zderzeniu kończącym się reakcją, reagu jące cząsteczki muszą mieć wystarczającą ilość ener gii, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. Czynniki, które zwiększają częstość zderzeń i energię kinetyczną zwiększają szybkość reakcji JeŜeli cząsteczki mają wystarczającą energię aby reagować, to wszystkie czynniki, które zwiększają częstość zderzeń między cząsteczkami, będą zwiększały szybkość reakcji. Natomiast czynniki, które zmniejszają albo częstość zderzeń, albo energię kinetyczną, będą zmniejszały szybkość reakcji. JeŜeli te same cząsteczki w populacji mają niewystarczającą energię aby reagować, to podwyŜszenie temperatury, która zwiększa energię kinetyczną, będzie zwiększało szybkość reakcji. Te koncepcje przedstawiono
Bariera energetyczna

poniewaŜ większość ma niewystarczającą energię kinetyczną do przekroczenia bariery energetycznej reakcji. W znacznie wyŜszej temperaturze (i większej energii kinetycznej) reakcja będzie zachodziła duŜo szybciej. To, Ŝe reakcja zachodzi świadczy o tym, Ŝe jest to reakcja samorzutna (AG<0). W niŜszej temperaturze reakcja przebiega samorzutnie, ale wolno; w wyŜszej temperaturze — samorzutnie i szybko. Zadaniem enzymów jest spowodowanie, aby w warunkach panujących w Ŝywych komórkach reakcje samorzutne zachodziły szybko. Wiele reakcji chemicznych waŜnych biologicznie obejmuje tworzenie lub rozpad wiązań kowalencyjnych W reakcji przeniesienia grupy: D-G + A^A-G+D grupa G jest przenoszona z donora D—G na akceptor A. Całkowita reakcja obejmuje zarówno rozbicie wiązania D—G, jak i tworzenie nowego wiązania A—G. Katalizowane enzymatycznie reakcje przeniesienia grupy mogą być przedstawione następująco: D-G AEnz Enz-G G D To uwydatnia 3 A główne cechy katalizowanych enzymatycznie reakcji przenoszenia grup: 1. KaŜda połowa reakcji zawiera zarówno rozbicie, jak i tworzenie wiązania kowalencyj nego. 2. Enzym reaguje zarówno z D—G, jak A. 3. Podczas gdy w całkowitej reakcji enzym działa katalitycznie (tzn. jest wymagany tylko w śladowych ilościach i moŜe być odzyskiwany w postaci nie zmienionej, gdy reakcja jest za kończona), dla kaŜdej polowy reakcji enzym jest stechiometrycznym substratem (tzn. jest on wymagany w stosunku molowym z innymi substratami równymi:!). MoŜna rozwaŜyć wiele dodatkowych reakcji biochemicznych, w których D, A lub oba mogą być nieobecne. Na przykład reakcje izomeryzacji (takie, jak przekształcenie glukozo-6-fosforanu i glukozo-1-fosforanu) mogą być przedstawione jako reakcje, w których zarówno D, jak i A są nieobecne: S ^T Enz

Energia kinetyczna Hyc. 9-4. Bariera energetyczna dla reakcji chemicznych.

na ryc. 9-4. W przypadku A Ŝadna, w B część i w C wszystkie cząsteczki mają wystarczającą energię kinetyczną, aby przekroczyć barierę energetyczną reakcji. W nieobecności katalizy enzymatycznej wieJe reakcji chemicznych zachodzi bardzo wolno w temperaturze Ŝywej komójki. Jednak, nawet w tej temperaturze, cząsteczki są w ruchu i podlegają zderzeniom. Nie reagują one szybko,

ENZYMY: KINETYKA / 97

KILKA REAKCJI CZĄSTKOWYCH 1 KOMPLEKSY ENZYM-SUBSTRAT UCZESTNICZĄ W REAKCJACH KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE PowyŜsze prezentacje nie podkreślają jeszcze innej kluczowej cechy reakcji katalizowanych
enzymatycznie udziału w całkowitej reakcji 2 lub więcej pośrednich form kompleksu EnzS i późniejszego udziału zespołu kolejnych reakcji

połówkowych. Prezentacją reakcji przeniesienia grupy, która podkreśla te cechy, moŜe być
Enz AG

Enz-G
D-G

Mała wartość Kd przedstawia zatem ścisły kompleks R-C. ' Jedną waŜną konsekwencją jest to, Ŝe gdy substrat przyłączy się do katalizatora, wówczas zwiększa się stęŜenie substratu w określonym obszarze roztworu wyraźnie powyŜej jego stęŜenia w wolnym roztworze. Dlatego nie ma się dłuŜej do czynienia z homogennym, ale heterogennym roztworem chemicznym. JeŜeli katalizator dla dwucząsteczkowej (dwusubstratowej) reakcji przyłącza oba substraty, stęŜenie miejscowe kaŜdego z nich jest zwiększone o czynnik, który zaleŜy od indywidualnego powinowactwa (wartość Kj) do katalizatora. JeŜeli szybkość całkowitej reakcji dwucząsteczkowej A+ B -* A-B jest, jak zostanie przedstawione poniŜej, proporcjonalna do stęŜeń obu A i B, przyłączenie
obu A i B przez katalizator moŜe powodować ogromne (kilka tysięcy razy) zwiększenie całkowitej szybkości reakcji.

Enz-G** Enz-G

w której Enz-G, Enz-G* i Enz-G** reprezentują kolejne kompleksy EnzS w reakcji całkowitej. Przyłączanie substratów do enzymu zwiększa ich stęŜenie miejscowe i sprowadza je na odległość tworzenia wiązania Aby kaŜda z powyŜszych reakcji zaszła, wszystkie substraty muszą zbliŜyć się do siebie na odległość tworzenia wiązania (lub rozerwania wiązania). Dla homogennego roztworu chemicznego w nieobecności katalizatorów stęŜenia reagujących cząsteczek w roztworze są stałe. Ten warunek nie jest dłuŜej zachowany po wprowadzeniu katalizatora. Katalizator musi mieć powierzchniowe domeny, które przyłączają reagujące cząsteczki. Mimo Ŝe to przyłączenie jest procesem odwracalnym, całkowita stała równowagi dla reakcji przyłączania silniej uprzywilejowuje przyłączenie niŜ wolne formy reagujących cząsteczek. Jakościowo moŜna przedstawić to następująco: Substrat + Katalizator -± Kompleks su b st rat - kata ł izato r Ilościowo moŜna wyrazić ścisłość asocjacji miedzy substratem R a katalizatorem C w formie stałej dysocjacji Kd dla kompleksu R-C lub stałej równowagi dla reakcji: +c
[CJ

Obszar enzymu związany z przyłączeniem substratu i katalizą jest nazywany „miejscem aktywnym" Kluczową właściwością enzymów jest ich zdolność do przyłączenia jednego lub (coraz częściej) obu substratów w reakcji bimolekularnej z towarzyszącym miejscowym zwiększeniem stęŜenia substratu i wynikającej z tego miejscowej szybkości reakcji. Enzymy są zarówno niezwykle czynnymi, jak i bardzo wybiórczymi katalizatorami. Aby zrozumieć te charakterystyczne właściwości enzymów, naleŜy wprowadzić pojecie „miejsca aktywnego" lub „katalitycznego"*. Ogromna wielkość białek, w stosunku do substratów, prowadzi do koncepcji, Ŝe ograniczony obszar enzymu, „miejsce aktywne", jest związany z katalizą. Początkowo było intrygujące, dlaczego enzymy są tak ogromne, gdy tylko część ich struktury okazuje się być konieczna do przyłączenia substratu i katalizy. Dzisiaj wiadomo, Ŝe z substratem reaguje duŜo większa część cząsteczki białka niŜ to poprzednio przypuszczano. Gdy zwiększa się zapotrze♦ Podczas gdy wiele tekstów zrównuje aktywne i katalityczne miejsca enzymów, w enzymach znajdują się inne „aktywne" miejsca związane raczej z regulacją aktywności enzymu niŜ z pośrednią enzytnologią procesu katalitycznego per se. UŜyto zatem terminu „miejsce katalityczne" aby uniknąć dwuznaczności.

[R-C]
7 — Biochemia

98 / ROZDZIAŁ 9

bowanie na miejsca allosteryczne równej wielkości, wówczas wielkość enzymów nie powinna być dłuŜej niespodzianką. Wiele właściwości enzymów moŜe być zrozumiałych na podstawie sztywnego modelu „zamka i klucza" miejsca aktywnego Model miejsca katalitycznego, zaproponowany przez Emila Fischera, przedstawiał interakcję między substrałem a enzymem na zasadzie analogii „zamka i klucza". Ten model „zamka i klucza" lub sztywny model matrycowy (ryc. 9-5) jest ciągle uŜyteczny w celu zrozumienia pewnych właściwości enzymów, np. uporządkowanego przyłączenia 2 lub więcej substratów (ryc. 9-6) lub krzywej kinetyki prostego nasycenia substratem.

aminokwasowych lub innych grup enzymu we właściwym połoŜeniu przestrzennym do związania substratu, katalizy lub obu zjawisk łącznie. W przykładzie z ryc. 9-7 zarówno grupy hydrofobowe (zakreskowane) jak i grupy naładowane elektrycznie (zakropkowane) są zaangaŜowane w przyłączeniu substratu. W katalizie

Ryc. 9-7. Dwuwymiarowe przedstawienie indukowanego dopasowania się przez zmianę konformacyjną w strukturze białka. NaleŜy zwrócić uwagę na odpowiednie pozycje kluczowych reszt aminokwasowych przed przyłączeniem i po przyłączeniu substratu.

Ryc. 9-5. Przedstawienie tworzenia kompleksu EnzS zgodnie z matrycową hipotezą Fischera.

Ryc. 9-6. Przedstawienie kolejnej adsorpcji koenzymu (CoE) i 2 substratów (S, i Ss) do enzymu według hipotezy matrycowej. Zakłada się, Ŝe koenzym ma grupę niezbędną do przyłączenia pierwszego substratu (S,), który z kolei ułatwia przyłączenie S:

W modelu „indukowanego dopasowania się" miejsca katalitycznego, substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie, która „tworzy" miejsce katalityczne Niefortunna cechą modelu Fischera jest załoŜenie sztywności miejsca katalitycznego. Bardziej uniwersalnym modelem jest model „indukowanego dopasowania się" Koshlanda. Ten model miał znaczne potwierdzenie doświadczalne. W modelu Fischera załoŜono, Ŝe miejsce katalityczne jest z góry ukształtowane w taki sposób, Ŝe pasuje do substratu. W modelu indukowanego dopasowania się substrat indukuje konformacyjną zmianę w enzymie. Zmiana ta dotyczy ustawienia reszt

bierze udział reszta fosfoseryny (—P) i grupa —SH reszty cysterny. Inne reszty, nie biorąte udziału w Ŝadnym procesie, są reprezentowane przez reszty Lys i Met. W nieobecności substratu i;rupy katalityczne i wiąŜące substrat są od siebie oddalone na odległość kilku wiązań. ZbliŜenie się -ubstratu wywołuje zmianę konformacyjną w biał k u enzymatycznym, ustawiając w odpowiedni sposób grupy uczestniczące w wiązaniu substratu i katalizie. W tym samym czasie zmienia się równieŜ przestrzenne ustawienie innych obszarów — Lys i Met są teraz blisko siebie (ryc. 9-7). Analogi substratów mogą powodować pewne, ale nie wszystkie, zmiany właściwej konformacji (ryc. 9-8). Po przyłączeniu właściwego substratu A wszystkie grupy (przedstawione jako zaciemnione kółka) ustawiają się we właściwym połoŜeniu. Przyłączenie analogu EnzS substratu, który jest

Eni + S B

Ryc. 9-8. Przedstawienie zmian konformacyjnych w białku enzymatycznym po przyłączeniu substratu (A) i nieaktywnych analogów substratu (B, C) {według Koshlanda).

ENZYMY; KINETYKA / 99

zbyt „gruby" (ryc. 9-8B) lub zbyt „chudy" (ryc, 9-8C) indukuje nieprawidłowe ustawienie grup. Ostatnią cechą enzymu jest miejsce pokazane jako małe nacięcie z prawej strony. MoŜna sobie wyobrazić przyłączenie się w tym miejscu cząsteczki regulatorowej i „ściąganie w dół" jednego z ramion polipeptydowych wrazz grupą katalityczną. W takim przypadku moŜe zachodzić przyłączenie substratu, ale nie kataliza. Jak to ilustruje model indukowanego dopasowania się, reszty aminokwasów, które znajdują się w miejscu katalitycznym, mogą być oddalone od siebie w strukturze pierwszorzędowej, ale przestrzennie zbliŜone w strukturze trzeciorzędowej. Katalityczne miejsca Itzozymu, rybonukieazy i wielu innych enzymów znajdują się w bruzdach powierzchni enzymu Lizozym występujący we łzach, śluzie nosowym, plwocinie, tkankach, soku Ŝołądkowym, mleku i białku jaja, katalizuje hydrolizę wiązań P-1,4 kwasu N-acetyloneuraminowego w proteoglikanach i glukozoaminoghk ariach. Jego działanie polega na niszczeniu ścian komórkowych wielu bakterii Gram-dodatnich, przedostających się z powietrza do łez i śluzu nosowego. Lizozym jest zbudowany z jednego łańcucha polipeptydowego, składającego się ze 129 reszt aminokwasowych. PoniewaŜ nie ma koenzymu ani jonu metalu, kataliza, swoistość i trójwymiarowa struktura są określone wyłącznie przez te reszty aminokwasowe. W cząsteczce lizozymu są małe obszary struktury harmonijA) Asp 1011 Trp 62 Trp63
I \

kowej, a-heliksu i szerokie obszary struktury nie uporządkowanej! Cząsteczka ma przebiegającą przez środek bruzdę, w której znajduje się miejsce katalityczne, z 6. „podmiejscami" (ang. subsites) (ryc. 9-9), które przyłącza róŜne substraty lub inhibitory. Reszty aminokwasowe odpowiedzialne za rozbicie wiązania leŜą między miejscami D i E, blisko grup karboksylowych Asp 52, Glu 35. Glu 35 przekazuje protony wiązaniu acetalowemu substratu, podczas gdy ujemnie naładowany Asp 52 stabilizuje powstający jon karboniowy. Katalityczne miejsce rybonukieazy leŜy w obrębie bruzdy podobnej do bruzdy lizozymu, w poprzek której leŜą 2 reszty aminokwasowe — His 12 i His 119. JuŜ wcześniejsze badania chemiczne wskazywały na obecność tych 2 aminokwasów w miejscu katalitycznym enzymu. Obie reszty aminokwasowe znajdują się blisko miejsca wiąŜącego kwas urydylowy (ryc. 9-10).

411

Grupa fosforanowa

Ryc. 9-10. Struktura rybonukieazy określona za pomocą dyfrakcji promieni X. Liczby odpowiadają swoistym resztom aminokwasowym (p. teŜ ryc. 67).

(§) Ser 100 Ala 107 f) Argt14

Asp 52 [ Glu 35 Ala 110 Ser 36

Ryc. 9-9. Schematyczne przedstawienie miejsca katalitycznego w okolicy bruzdy lizozymu. Punkty A—F przedstawiają reszty glikozydowe heksasacharydu. Pewne reszty aminokwasowe, lezące w okolicy bruzdy, są podane wraz z ich numerami w sekwencji lizozymu (według Koshlanda),_____

Wspólny motyw struktury pierwszorzędowej występuje w miejscach katalitycznych licznych enzymów hydrolitycznych Struktury pierwszorzędowe miejsc katalitycznych enzymów hydrolitycznych wykazują wiele podobieństw (tab. 9-1). MoŜe to oznaczać, Ŝe liczba mechanizmów, według których zachodzi rozrywanie wiązań w układach biologicznych, jest stosunkowo mała. W świetle tych podobieństw nie jest zaskakujące to, Ŝe sekwencje aminokwasów blisko miejsc katalitycznych tego samego enzymu, z róŜnych gatunków, wykazują nawet jeszcze większe podobieństwo.

100 / ROZDZIAŁ 9 Tabela 9-1. Sekwencje aminokwasów i sąsiedztwie miejsc katalitycznych kilku proteaz wołu . w stawiono regiony miejsca 30 stronie reszty serylowej (S) i histydylowej (H)* Przedkatalitycznego Sekwencja aminokwasów Enzym Sekwencja aminokwasów wokół seryny wokół histydyny ® (§ Trypsyna DSC Q D G

D
G

G PVV C

s GK
K KN Q KN

V V S A A ® C Y K V V T A A ® G G V V V T A A ® C G V

SG TT TT

Chymotrypsyna A S S C

M G Q (• G D >) =)

G P LV
G

Chymotrypsyna B S S C M G D Trombina

G P F V M K SP V L T A A @ C LL Y P G * Reprodukowano za zgodą z: Dayhoff MO (red.) Atlas Sekwencji Białek i Struktury, t. 5, Narodowa Fundacja Badań Biomedycznych, 1972.

G D A C E G Q Q >) D

c PLV c

W OGRANICZONYM ZAKRESIE TEMPERATUR SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE ZWIĘKSZA SIĘ WRAZ ZE WZROSTEM TEMPERATURY Ma rycinie 9-11 przedstawiono wpływ temperatury na typową reakcję katalizowaną enzymatycznie. Szybkość reakcji początkowo się
Optimum temperatury

Niemniej nie jest to podstawowy parametr, poniewaŜ optymalna temperatura zaleŜy od czasu trwania próby uŜytej do jej określenia, tj. im dłuŜej enzym jest utrzymywany w temperaturze, w której jego struktura jest mało stabilna^ tym bardziej prawdopodobne jest to, Ŝe będzie zdenaturowany.
Współczynnik temperatury lub Q1B jest to

czynnik, o który się zwiększa szybkość procesu biologicznego przy wzroście temperatury 0 10°C. Szybkość wielu procesów biologicz nych, np. szybkość skurczów izolowanego ser ca, w przybliŜeniu podwaja się wraz ze wzros tem temperatury o 10°C {QI0 =2). Dla większości enzymów optymalne temperatury są takie same lub wyŜsze od tych, jakie występują w miejscu ich działania, tj. w komórkach. Na przykład enzymy mikroorganizmów przystosowanych do wzrostu w naturalnych gorących źródłach mogą wykazywać optymalną temperaturę blisko temperatury wrzącej wody, pH WPŁYWA NA AKTYWNOŚĆ ENZYMU PRZEZ ZMIANĘ ŁADUNKU GRUPZJON1ZOWANYCH ENZYMU 1 CZĘSTO TAKśE SUBSTRATU Gdy aktywność enzymu zmierzy się w kilku wartościach pH, obserwuje się wówczas, Ŝe optymalna aktywność mieści się na ogói między wartościami pH 5,0—9,0, niemniej kilka enzymów, np. pepsyna, jest aktywnych przy wartościach pH wyraźnie wykraczających poza ten zakres. Kształt krzywych wyraŜających zaleŜność aktywności od pH określają następujące czynniki: 1. Denaturacja enzymu przy małych i duŜych wartościach pH.

Temperatura (° C) Ryc. 9-11. Wpływ temperatury da szybkość hipotetycznej reakcji katalizowanej enzymatycznie.

zwiększa, wraz ze wzrostem temperatury, z powodu zwiększenia energii kinetycznej reagujących cząsteczek. Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barierę energetyczną do rozerwania słabych wiązań wodorowych i hydrofobowych, które utrzymują ich strukturę drugo- i trzeciorzędową. W tej temperaturze denaturacji dominuje towarzysząca strąceniu strata aktywności katalitycznej enzymu. Dlatego enzymy wykazują optymalną temperaturę.

ENZYMY: KINETYKA / 101 2. Zmiany w ładunku enzymu i (lub) sub-

stratów. W przypadku enzymu pH moŜe wrjłyr wać na J*ego aktyvjnaś£j^!^x3rirlar\c fltrnktuj; fub^przez zmianę ładunku reszty aminokwasowej, biorącej udział w przyłączaniu substratu lubwkata]izie. Aby to zilustrować, naleŜy wziąć pod uwagę ujemnie naładowany enzym (Enz~) reagujący z dodatnio naładowanym substratem (SH+):
SH*
Enz >EnzSH

aktywności, W zaleŜności od ostrości tych zmian aktywność moŜe iub nie moŜe być przywrócona, gdy enzym powróci do swojego optymalnego pH.

JEśELI SUBSTRATY SĄ OBECNE W PRAWIE RÓWNO MOLOWYCH PROPORCJACH,SZYBKOŚĆ REAKCJI JEST PROPORCJONALNA DO STĘśENIA WSZYSTKICH SUBSTRATÓW
W duŜych stęŜeniach substratów zarówno liczba cząsteczek mających dostateczną energię, aby reagować, jak i częstość ich zderzeń są duŜe. Ten stan utrzymuje się niezaleŜnie od tego, czy wszystkie cząsteczki, czy tylko ich część ma wystarczającą energię, aby reagować. Biorąc pod uwagę reakcję, w której uczestniczą 2 róŜne cząsteczki A i B: A+B-* AB podwojenie stęŜenia albo A albo B podwoi szybkość reakcji. Podwojenie stęŜenia zarówno A, jak i B zwiększy prawdopodobieństwo zderzenia 4-krotnie. Szybkość reakcji zwiększy się zatem 4-krotnie. Szybkość reakcji jest proporcjonalna do stęŜeń cząstek reagujących. Nawiasy pH kwadratowewysokie uŜyto do oznaczenia stęŜeń ([ ]) molowych*; a oznacza „proporcjonalny do". Określenie szybkości jest następujące: Szybkość a [cząsteczki reagujące] lub Szybkość a [A] [B] W przypadku gdy wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość x [A] [B][B] lub Szybkość? [A] [BY Dla przypadku ogólnego, gdy n cząsteczek A reaguje z m cząsteczkami B nA+mB-AnBm wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość oc [A]n[B]m
* Ściślej mówiąc, powinny być uŜyte raczej aktywności molowe niŜ stęŜenia molowe.

Przy niskim pH Enz~ dąŜy do przyłączenia protonów i traci swój EnzH ładunek ujemny:
Enz +

Przy wysokim pH SH + jonizuje i traci swój ładunek dodatni: SH+-S+ H
+

PoniewaŜ, z definicji, jedynymi formami, które będą wchodzić w interakcje są SH+ i Enz , krańcowe wartości pH będą zmniejszały skuteczne stęŜenie Enz~ i SH+, zmniejszając w ten sposób szybkość reakcji fryc. 9-12). Tylko na
100 Enz" Niskie

Ryc. 9-12. pH na aktywność

Wpływ enzymu.

obszarze zakreskowanym na krzyŜ zarówno Enz, jak i S są we właściwym stanie jonowym i największe stęŜenie Enz i S są odpowiednio naładowane w punkcie X. Enzymy- mogą takie podlegać zmianom w konfqrmacjj_na skutek zmian pH. Grupy mające ładunek, dystalne w stosunku do regionu, w którym przyłącza się substrat, mogą być niezbędne do utrzymania aktywnej struktury trzecio- i czwartorzędowej. JeŜeli zmieni się ładunek elektryczny tych grup, białko moŜe się rozluźnić, stać się bardziej zbite lub dysocjować na podjednostki —wszystko to powoduje stratę

102 / ROZDZIAŁ 9 STAŁA RÓWNOWAGI JEST STOSUNKIEM STAŁYCH SZYBKOŚCI REAKCJI PRZEBIEGAJĄCEJ DO PRZODU I REAKCJI ODWROTNEJ PoniewaŜ wszystkie reakcje chemiczne są odwracalne, dla reakcji odwrotnej, gdzie AnBra tworzy n cząsteczek A i m cząsteczek B An^n, - nA+mB odpowiednim wyraŜeniem szybkości jest: Szybkość a [AnBm] Odwracalność wyraŜa się podwójnymi strzałkami;
nA + mB ^± A„Bm 4. Stałą równowagi moŜna wyrazić liczbowo, jeśli są znane stęŜenia A, B i \„BW w stanie równowagi.

Standardową zmianę wolnej energii (AG ) dla danej reakcji moŜna obliczyć ze stałej równowagi Związek stałej równowagi z AG" jest następujący:
ZiG^-RTInK^,

R jest stałą gazową i T — temperaturą bezwzględną. PoniewaŜ są one znane, znajomość
wartości liczbowej K^ umoŜliwia wyliczenie war-

To wyraŜenie czyta się: ,,n cząsteczek A i m cząsteczek B jest w równowadze z AnBm". Symbol a „proporcjonalny do" moŜna zastąpić znakiem równości, wstawiając stalą proporcjonalności k, charakterystyczną dla danej reakcji. Dla przypadku ogólnego
nA + mB j± AnBm

tości AG°. JeŜeli stała równowagi jest większa od 1, reakcja jest spontaniczna, tj. przewaŜa reakcja zachodząca zgodnie z zapisem (od strony lewej do prawej). JeŜeli jest ona mniejsza od 1, to kierunek przebiegu reakcji jest przeciwny, tzn. jest bardziej prawdopodobne, Ŝe reakcja będzie przebiegała od strony prawej do lewej. JednakŜe naleŜy zauwaŜyć, Ŝe chociaŜ stała
równowagi reakcji wskazuje kierunek, w którym reakcja zachodzi samorzutnie, to nie wskazuje,

wyraŜeniami szybkości dla reakcji przebiegającej w prawo (szybkośćj) i reakcji w lewo (szybkość_,) są: m Szybkość,= k1[A]"[B] i Szybkość, = k_,rAnBm] Gdy szybkości reakcji przebiegającej w prawo i odwrotnie są równe, mówi sie, Ŝe system jest w stanie równowagi, tj.
Szybkość^ Szybkość.,

czy będzie ona przebiegać szybko, tj. nie mówi
ona nic o wielkości bariery energetycznej dla

reakcji (czyli o AGF; patrz powyŜej). To wypływa z faktu, Ŝe K^ określa AG", która —• co wykazano uprzednio — dotyczy tylko stanu początkowego i końcowego. Szybkość reakcji
zaleŜy od wielkości bariery energetycznej, a nie od wartości AG".

Wiele czynników wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy działa
przez zmianę miejscowego stęŜenia substratu.

wtedy

k1[A] [B] =k_1[AnBm]
o

n

m

[A]"[B] Stosunek kj do k , nazwano stalą równowagi, K^,. NaleŜy zapamiętać następujące waŜne właściwości układu w stanie równowagi: 1. Stała równowagi jest stosunkiem stałych szybkości reakcji ki/k_t. 2, W stanie równowagi szybkości reakcji (nie stałe szybkości reakcji) w obie strony są równe.
3. Równowaga jest stanem dynamicznym.

Enzymy nie wpływają na stałe równowagi reakcji, które katalizują Enzym jest związkiem reagującym, który łączy się z substratem, tworząc kompleks enzym—substrat — EnzS, który rozkłada się, tworząc produkt P i wolny enzym. W najprostszej formie moŜe to być przedstawione następująco k. Enz+ S ^ Podczas gdy wyraŜenia określające szybkość dla reakcji zachodzącej w prawo, odwrotnej i reakcji ogólnej zawierają składnik [Enz], Enz+ S ^ Enz+ P ■ •M Szybkość = k-, [Enz] [S]

ChociaŜ w stanie równowagi nie zachodzi Ŝadna zmiana netto w stęŜeniu cząsteczek substratu i produktu, A i B nieustannie przechodzą w A„Bm i odwrotnie.

ENZYMY: KINETYKA / 103 Szybko4ć_i= k., [Enz] [PJ
V

to w wyraŜeniu dla całkowitej stałej równowagi [Enz] znosi się.
K

------- '

c~

TL

J 2 .

= k, _ [En»] [P] = [P] •*" IM [Enz] [S] [S]

StęŜenie enzymu nie ma zatem Ŝadnego wpływu

na stałą równowagi. Mówiąc inaczej, skoro enzymy wpływają na szybkość reakcji, a nie na stałą szybkości, nie mogą one wpływać na K.^, która jest stosunkiem starych szybkości. K^
reakcji jest taka sama bez względu na ta, czy równowaga jest osiągana w wyniku (lub bez) katalizy enzymatycznej (naleŜy sobie przypom-

-/f . r!
/A!

•V
Ti

. . .

I

I

1

Ryc. 9-13. Wpływ stęŜenia substratu na szybkość reakcji katalizowanej enzymatycznie.

nieć AG"). Enzymy zmieniają drogę reakcji, ale nie wpływają na początkowe i końcowe równowaŜne stęŜenia substratów i produktów, czynników, które determinują K^i AG°. SZYBKOŚĆ POCZĄTKOWA REAKCJI KATALIZOWANEJ PRZEZ ENZYM JEST WPROST PROPORCJONALNA DO STĘśENIA ENZYMU Szybkość początkowa reakcji jest to szybkość mierzona przed utworzeniem dostatecznej ilości produktu, pozwalającej na zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybkość początkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna do stęŜenia enzymu. NaleŜy jednak zanotować, Ŝe to stwierdzenie odnosi się tylko do szybkości początkowej. W WIELU SYTUACJACH OZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM STĘśENIE SUBSTRATU WPŁYWA NA SZYBKOŚĆ REAKCJI KATALIZOWANEJ ENZYMATYCZNIE Reakcje enzymatyczne są tak rozpatrywane, jeŜeli mają 1 substrat i 1 produkt. Mimo Ŝe istnieje taki przypadek dla pewnych reakcji katalizowanych enzymatycznie, większość reakcji enzymatycznych ma 2 lub więcej substratów i produktów. Uwaga ta jednak nie uniewaŜnia omówienia. JeŜeli zwiększa się stęŜenie substratu [S], a wszystkie inne warunki pozostają nie zmienione, to mierzona szybkość początkowa V; (szyb-

maksymalnej — Ym^ i nie przekracza jej (ryc. 9-13). Szybkość reakcji zwiększa się wraz ze zwiększeniem stęŜenia substratu, aŜ do momentu, gdy enzym jest „nasycony"' substratem. Mierzona szybkość początkowa osiąga wartość maksymalną i nie ma na nią wpływu dalsze zwiększanie stęŜenia substratu, poniewaŜ substrat występuje w duŜym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu. Na przykład, jeŜeli enzym o masie cząsteczkowej 100 000 działa na substrat o masie cząsteczkowej 100 i oba związki występują w stęŜeniu 1 mg/ml, to 1000 mol. substratu przypada na kaŜdy mol enzymu. Bardziej realistyczne są niŜej podane proporcje wagowe enzymu do substratu:
[Enz]=0r1 ng/ml=1(T mol [S]= 0,1 mg/ml=10~ mol
3 9

co daje 106 mol więcej substratu w stosunku do enzymu. Nawet jeŜeli [S] zmniejszy się 100-krotnie, substrat jest w dalszym ciągu w 10000-krotnym molowym nadmiarze w stosunku do enzymu. Sytuacje w punktach A, B i C 7. ryc. 9-13 są przedstawione na ryc. 9-14. W punktach A i B tylko część enzymu łączy się z substratem, jakkolwiek jest duŜo więcej cząsteczek substratu niŜ enzymu. Dzieje się tak dlatego, Ŝe stała równowagi dla reakcji Enz+S ^ EnzS (tworzenie kompleksu EnzS) nie jest nieograniczenie
duŜa. W punkcie A lub B zwiększenie lub zmniejszenie [S] będzie zwiększać lut) zmniejszać ilość enzymu związanego z S, jako EnzS, i vf będzie zatem zaleŜeć od |S|.

kość mierzona wtedy, kiedy przereagowało bardzo mało substratu) zwiększa się do wartości

W punkcie C zasadniczo wszystkie cząsteczki enzymu łączą się z substratem tak, Ŝe dalsze zwiększenie [S], chociaŜ zwiększa częstość zde-

104 / ROZDZIAŁ 9

ćT*

.Q

w

Być. 9-14. Przedstawienie enzymu przy maiym (A), duŜym (C)i przy stęŜeniu substratu równym Km (B). Punkty A, B i C odpowiadają punktom z ryc. 9-13. ■ _________________

rŜeń między Enz i S, nie moŜe spowodować zwiększenia szybkości reakcji, skoro nie ma wolnych cząsteczek enzymu, które mogłyby reagować. Przypadek B opisuje sytuację o duŜym znaczeniu teoretycznym, w której dokładnie połowa cząsteczek enzymu jest „wysycona" substratem. Szybkość równa się połowie szybkości maksymalnej (Vmaks/2), która mogłaby być osiągnięta przy danym stęŜeniu enzymu. Równanie Michaelisa-Menten obrazuje wpływ stęŜenia substratu na szybkość wielu reakcji katalizowanych enzymatycznie
StęŜenie substratu, które powoduje osiągniecie potowy szybkości maksymalnej, określane wartością Km lub stalą Michaelisa, moŜna oznaczyć doświadczalnie przez graficzne przedstawienie Vj jako funkcji [S] (ryc. 9-13). Km ma wymiary

1. Gdy [S] jest znacznie mniejsze od Km (punkt

A na ryc. 9-13 i 9-14). Dodanie [S] do K™ w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego wartość, tak Ŝe wyraŜenie [S] moŜna w mianowniku pominąć. PoniewaŜ W^^. i Km są stałe, moŜna zastąpić ich stosunek nową stałą, K:
v.

. [S]

[S]'
Vj

^

[S]~K[S]

(~ oznacza „prawie równa się").
Innymi słowy, jeŜeli stęŜenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, które jest wymagane do uzyskania połowy szybkości maksymalnej (wartość Kra), to szybkość początkowa vt zaleŜy od stęŜenia substratu [S|. 2. Gdy |S| jest znacznie większe od Km (punkt

stęŜenia molowego. Gdy [S] jest prawie równe Km, wówczas V; bardzo reaguje na zmiany [S] i enzym działa z dokładnie połową szybkości maksymalnej. W rzeczywistości wiele enzymów ma wartości K.m zbliŜone do fizjologicznego stęŜenia ich substratów. Równanie Michaelisa-Menten
Vl

C na ryc. 9-13 i ryc. 9-14). Dodanie K„ do [S] w mianowniku zmienia wartość mianownika bardzo niewiele, tak Ŝe wyraŜenie Km moŜna w mianowniku pominąć:
"maha.

Km+[S]

[S]

V.nak..[S] Km + [S]

Oznacza to, Ŝe jeŜeli stęŜenie substratu [Sj znacznie przewyŜsza wartość K„, to szybkość początkowa Vj jest szybkością maksymalną,
'ntaks.'

opisuje zachowanie się wielu enzymów przy zmieniającym się stęŜeniu substratu. Na podstawie równania Michaelisa-Menten zaleŜność początkowej szybkości reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Kra moŜna przedstawić następująco:

3. Gdy ISJ = *Cm (punkt B na ryc. 9-13 i ryc. 914),

' Km+ [S]

2[S]

ENZYMY: KINETYKA / 105

Oznacza to, Ŝe jeŜeli stęŜenie substratu jest równe wartości Krai to szybkość początkowa \-, równa się połowie szybkości maksymalnej. To takŜe wskazuje, jak oznaczyć Km, a mianowicie trzeba określić doświadczalnie stęŜenie substratu, przy którym początkowa szybkość stanowi połowę szybkości maksymalnej. Aby określić wartość Km i Vmaks. równanie Michaeiisa-Menten jest tak przekształcane, aby wykres stanowiła linia prosta PoniewaŜ dla wielu enzymów krzywa nasycenia nie pozwala na łatwe określenie Vm!lk5 (i stąd Kw), kiedy V; jest wykreślone względem [S], wygodniej jest przekształcić równanie Michaelisa-Menten tak, aby uprościć wyznaczenie Km i Ymats.- Równanie Michaeiisa-Menten moŜna odwrócić i przekształcić następująco:
Vmakl. [S]
V| =

nych odwrotności, tj. odwrotność ¥|(1/Vj) jest wykreślona względem odwrotności [S] (1/[SJ). Z wykresu podwójnych odwrotności lub wykresu Lineweavera-Burka moŜna określić Km (ryc. 915), wykorzystując albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y, albo odcinek na ujemnej

C. 9-15. Podwójna odwrotność albo wykres Lineweavera-Burka zaie2ności 1/v względem 1/[S] wykorzystywany do określenia Km i y^k,,,.

po odwróceniu [SJ
[S]

po przekształceniu:
1 Km 1 [S] Vraak.. [S]

po uproszczeniu:
Km
vi VmakB,

1
■ + ■

1
Vmaks. Jest

[S]

to równanie linii prostej
y =a ■x+b

gdzie:
y= — z aś x =
[S]

części osi x. Skoro [S] jest wyraŜone w stęŜeniu molowym, wymiarem Km jest stęŜenie molowe lub liczba mol na litr. Szybkość V; moŜna wyrazić w dowolnych jednostkach, poniewaŜ Kra nie zaleŜy od [EnzJ. Technika podwójnych odwrotności wymaga stosunkowo niewielu punktów dla określenia Km i jest metodą najczęściej uŜywaną do wyznaczenia K„,. Doświadczalnie wykorzystanie równania Linę weavera-Burka do wyznaczenia Km moŜe spowodować nieuzasadnione połoŜenie nacisku na dane otrzymane przy małych stęŜeniach substratu. Dzieje się tak wówczas, gdy stęŜenia substratu, wybrane do badania, róŜnią się stałą przyrostu. Ta niedogodność moŜe być ominięta przez selekcjonowanie odwrotności stęŜeń substratów, które róŜnią sie stałą przyrostu. Innym podejściem do doświadczalnego wyznaczenia Km i Vmaks jest podejście Eadie i Hofstee. Równanie Michaeiisa-Menten moŜe być przekształcone:

JeŜeli y lub l/v, jest wykreślony jako funkcja x lub l/[S], to b jest równe l/VmakSi na osi y, a kąt nachylenia a jest równy K.aJVaiaks.- Ujemny odcinek na osi x moŜna określić przez przyjęcie y = 0. Wtedy
x = - — = Km

Taki wykres jest nazwany wykresem podwój-

Aby wyznaczyć Km i Y,,^. wykreśla się Vj/[S] (oś y) wobec \, (oś x). Miejsce przecięcia osi y wyznacza wówczas Vmaks /Km, a miejsce przecięcia osi x Vmaks.. Nachylenie jest - 1/Km. Zarówno podejście Linweavera-Burka i Eadie-Hofstee są uŜyteczne w wybranych przypadkach, natomiast dokładne wyznaczenie K m i Vm!,ks. wymaga opracowania statystycznego.

106 / ROZDZIAŁ 9

Wartości K,,,, oprócz ich uŜyteczności w interpretacji mechanizmów reakcji katalizowanych enzymatycznie, mają duŜe znaczenie praktyczne. Przy stęŜeniu substratu 100-krotnie przewyŜszającym K m, enzym będzie działał w zasadzie z maksymalną szybkością i dlatego maksymalna szybkość (Vmiks) będzie odzwierciedlała ilość obecnego aktywnego enzymu. Taka sytuacja jest ogólnie poŜądana w badaniach enzymów. Wartość Km wskazuje, ile substratu natęŜy uŜyć w celu pomiaru VMkŁ. Technika podwójnych odwrotności znajduje takŜe szerokie zastosowanie w ocenie inhibitorów enzymów.
W szczególnych przypadkach Km moŜe być zbliŜona do stałej przyłączania

wtedy
k*

W tych warunkach 1/Kro = 1/K^ = powinowactwo. JeŜeli k2 + k_t ^ k_! to 1/K.m zbyt nisko oceni powinowactwo
RÓWNANIE HILLA PRZEDSTAWIA WPŁYW STĘśENIA SUBSTRATU NA ENZYMY ALLOSTERYCZNE

Powinowactwo enzymu do substratu jest równe odwrotności stałej dysocjacji—Kd kompleksu enzym-substrat (EnzŚ).
■_

Enz + S ;===* EnzS k-.

Pewne enzymy i inne białka przyłączające ligandy, takie jak hemoglobina, nie działają zgodnie z klasyczną kinetyką nasycenia Michaelisa-Menten. JeŜeli [S] wykreśli się względem Vj, to krzywa nasycenia jest sigmoidalna (ryc. 916). Ogólnie wskazuje to na kooperatywne

Mniejsza tendencja substratu i enzymu do dysocjacji wskazuje na większe powinowactwo enzymu do substratu. Wartość Km enzymu dla jego substratu moŜe równieŜ słuŜyć do pomiaru jego Kd. Jednak, aby to było prawdziwe, załoŜenie dokonane w przekształceniu wyraŜenia Michaelisa-Menten musi być słuszne. Przekształcenie zakłada, Ŝe pierwszy etap reakcji katalizowanej enzymatycznie
Enz + S~±EnzS k-i

jest szybki i zawsze w równowadze. Innymi słowy, szybkość dysocjacji EnzS do Enz + S musi być duŜo większa od szybkości dysocjacji enzym + produkt;
k2 Enz S k-2 ' Enz + P

0

[S]

8

Ryc. 9-16. Sigmoidalna kinetyka nasycenia.

W wyraŜeniu Michaelisa-Menten [S], które daje Vj = Vmik!./2 wynosi

Ale kiedy

-i >>

przyłączenie substratu do licznych miejsc. Przyłączenie w jednym miejscu wpływa na przyłączenie w innych miejscach, jak opisano w rozdz. 7 dla hemoglobiny. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu substratem, omówione powyŜej metody graficznej oceny stęŜenia substratu, które powoduje osiągnięcie połowy szybkości maksymalnej, są nie wartościowe (brak linii prostych). Aby ocenić sigmoidalna kinetykę nasycenia, moŜna wykorzystać graficzne przedstawienie równania Hilla, równania, które pierwotnie wyprowadzono, aby opisać kooperatywne

ENZYMY: KINETYKA / 107

przyłączenie O2 do hemoglobiny. Opisane w formie linii prostej równanie Hilla jest następujące:
log = nlog [S] - log k'
V;

RÓśNICA MIĘDZY KOM PETYCYJNYMI I NIEKOMPETYCYJNYMI INHIBITORAMI ENZYMÓW POLEGA NA TYM, CZY ZWIĘKSZAJĄCE SIĘ STĘśENIE SUBSTRATU USUWA HAMOWANIE
ChociaŜ rozróŜnia się inhibitory aktywności enzymatycznej w zaleŜności od tego, czy hamowanie ustępuje lub nie w wyniku zwiększenia stęŜenia substratu, to jednak wiele inhibitorów nie wykazuje idealnych właściwości czysto kompetycyjnego i niekompetycyjnego hamowania omawianego poniŜej. Innym sposobem klasyfikacji inhibitorów jest podział według ich miejsca działania. Miektóre z nich wiąŜą się z enzymem w tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne); inne wiąŜą się w innym miejscu (miejsce allosteryczne) z dala od miejsca katalitycznego.

gdzie k' jest stalą złoŜoną. Z równania wynika, Ŝe kiedy [S] jest małe w porównaniu z k', to szybkość reakcji zwiększa się jako n-ta potęga [S]. Na rycinie 9-17 przedstawiono wykres Hilla
Log [S]

I Nachylenie ■ n

-3

Inhibitory kompetycyjne wykazują ścisłe podobieństwo strukturalne do substratu
Klasyczne hamowanie kompetycyjne zachodzi w miejscu wiązania substratu (katalitycznym). Chemiczna struktura inhibitora, analoga substratu (I), ogólnie przypomina strukturę substratu (S). Łączy się on zatem odwracalnie z enzymem, tworząc kompleks enzym-inhibitor (Enzl), a nie kompleks EnzS. Gdy jest obecny zarówno substrat, jak i ten typ inhibitora, wówczas współzawodniczą one ze sobą o te same miejsca wiązania na powierzchni enzymu. Najlepiej zbadanym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para: malonian (I) i bursztynian (S) w stosunku do dehydrogenazy bursztynianowej. Dehydrogenaza bursztynianowa katalizuje tworzenie fumaranu przez usunięcie po jednym atomie wodoru z kaŜdego atomu ot-węgla bursztynianu (ryc. 9-18).

Ryc. S-17. Graficzna ocena równania Hilla w celu oznaczenia stęŜenia substratu, przy którym szybkość, osiąga potowe szybkości maksymalnej. Stosowana wówczas, gdy kinetyka nasycenia substratem jest sigmoidalna.

danych kinetycznych dla enzymu z kinetyką wiązania kooperatywnego. Wykres Vj/VmaiŁ—vj względem log [S] daje linię prostą o nachyleniu = n, gdzie n jest parametrem empirycznym, którego wartość zaleŜy od liczby miejsc wiąŜących substrat oraz liczby i typu interakcji między tymi miejscami. Kiedy n = 1, miejsca wiązania działają niezaleŜnie jedno od drugiego. JeŜeli n > 1, to miejsca są kooperatywne i przy większej wartości n kooperatywność jest silniejsza i wtedy bardziej „sigmoidalne" są kinetyki nasycenia. JeŜeli n<l, mówi się, Ŝe miejsca wykazują negatywną kooperatywność. W p o ł o wi e s z yb k o ś c i m a k s y m a l n e j (vi = Vmai[S./2), Vi/(Variu.—Vf)=l, a więc log Vj/(Vmak5 —Vi)=Q, A zatem aby oznaczyć S5,. (stęŜenie substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej), naleŜy wykreślić linię prostopadłą do osi x z punktu, w którym log Vj/(¥m»b.-vś)=O-

H H-CCOO-

-2H

H-C-COO
■-OOC-C-H

OOC-Ć-H
IH

DEHYDROGENAZA BURSZTYNIANOWA Bursztyn lan

Fu maran

Ryc. 9-18. Reakcja dehydrogenazy bursztynianowej.

108 / ROZDZIAŁ 9

Malonian ("OOC-CH 2 -COO") moŜe łączyć się z dehydrogenazą, tworząc kompleks EnzI. Maionian nie moŜe ulec odwodorowaniu, gdyŜ nie ma Ŝadnego sposobu, aby usunąć nawet jeden atom H z pojedynczego atomu węgla a bez utworzenia pięcio wartościowe go atomu węgla. Jedyną reakcją, której moŜe podlegać kompleks EnzI jest rozpad z powrotem na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji odwracalnej
EnzI tEnz + I

stała równowagi
K= =

wynosi [I]
[EnzIJ

Ryc. 9-19. Wykres Linevueavera-Burka klasycznego kompetycyjnego hamowania. NaleŜy zauwaŜyć całkowite zwolnienie hamowania przy duŜym [S] (małe.1/[S]). y odpowiada 1/V mats, to świadczy o tym, Ŝe przy nieograniczenie duŜym stęŜeniu S (1/|S] = O), Vj jest taka sama, jak w nieobecności inhibitora.

Działanie inhibitorów kompetycyjnych moŜna zrozumieć w formie następujących reakcji:
■ Enzl (nieaktywny) » Enz + P 'EnzS (aktywny) -> Enz+ p

Enz

Jednak odcinek na osi x (który odpowiada Km) zmienia się wraz ze stęŜeniem inhibitora i staje się większą liczbą {— 1/Kra jest mniejszy niŜ — 1/K^,) w obecności inhibitora. W ten sposób
inhibitor kotnpetycyjny zwiększa Km (Kń) sub-

Szybkość tworzenia produktu, to co jest głównie mierzone, zaleŜy wyłącznie od stęŜenia EnzS. ZałóŜmy, Ŝe I przyłącza się do enzymu bardzo silnie (Ks = mała liczba). W takiej sytuacji jest mało wolnego enzymu (Enz) dostępnego do połączenia się z S, aby utworzyć EnzS i ewentualnie Enz+P. Szybkość reakcji (tworzenie P) będzie bardzo mała. Z analogicznych powodów równe stęŜenie słabiej wiązanego inhibitora (Kj = większa liczba) nie zmniejszy tak znacznie szybkości katalizowanej reakcji. Przypuśćmy, Ŝe przy stałym stęŜeniu I doda się więcej S. Zwiększy to prawdopodobieństwo, Ŝe Enz będzie raczej łączył się z S niŜ z I. Wzrośnie stosunek EnzS do EnzI, a takŜe szybkość reakcji. Przy dostatecznie duŜym stęŜeniu S, stęŜenie Enzl powinno być znikomo małe. JeŜeli tak jest, to szybkość katalizowanej reakcji będzie taka sama, jak w nieobecności I (ryc. 9-19). Efektywność róŜnych inhibitorów kompetycyjnych jest oceniona przez wykres podwójnych odwrotności 1/v ; względem 1/[S] Rycina 9-19 przedstawia typowy przykład hamowania kompetycyjnego pokazany graficznie w formie wykresu Lineweavera-Burka. Przy stałym stęŜeniu inhibitora mierzono szybkość reakcji (v,) przy róŜnych stęŜeniach S. Linie przeprowadzone przez punkty doświadczalne zbiegają się przy osi y. PoniewaŜ odcinek na osi

stratu. PoniewaŜ Km jest stęŜeniem substratu, w którym stęŜenie wolnego enzymu jest równe stęŜeniu enzymu występującego jako EnzS, spora ilość wolnego enzymu moŜe się łączyć z inhibitorem. W przypadku prostego hamowania kompetycyjnego miejsce przecięcia na osi x daje się przedstawić

Km moŜe być oznaczone w nieobecności I, a K; określa się wykorzystując powyŜsze równanie. JeŜeli liczba moli dodanego I jest duŜo większa niŜ liczba moli obecnego enzymu, to stęŜenie I moŜna przyjąć jako stęŜenie (znane) dodanego inhibitora. Wartości Ks dla serii inhibitorów (kompetycyjnych) będących analogami substratów wykazują, które z nich są najbardziej
efektywne. Przy małych stęŜeniach największy stopień zahamowania będą powodowały inhibitory o najmniejszych wartościach Kj.

Wiele skutecznych klinicznie leków działa jako inhibitory kompetycyjne waŜnych enzymów w komórkach mikroorganizmów i zwierząt.

ENZYMY: KINETYKA / 109

Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają Vmaki.' ale nie wpływają na Km Jak sama nazwa wskazuje, w tym przypadku nie ma konkurencji między S i I. Inhibitor zazwyczaj nie wykazuje Ŝadnego albo małe podobieństwo do S i moŜna przyjąć, Ŝe wiąŜe się z inną domeną enzymu. Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszają szybkość maksymalną, osiągalną przy danej ilości enzymu (zmniejszają Vraaka), ale zazwyczaj nie wpływają na

Km. PoniewaŜ I i S mogą łączyć się w róŜnych miejscach, jest moŜliwe tworzenie zarówno kompleksów Enzl, jak i EnzIS. PoniewaŜ EnzIS moŜe się rozpaść, tworząc produkt z mniejszą szybkością niŜ EnzS, reakcja moŜe być spowolniona, ale nie zatrzymana. Mogą zachodzić następujące reakcje EnzIS -> Enz +P konkurencyjne:
±1

jony metali cięŜkich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniające itd. PoniewaŜ te inhibitory nie wykazują strukturalnego podobieństwa do substratu, zwiększenie stęŜenia substratu na ogół nie zmniejsza tego hamowania. Obecność jednego lub więcej substratów lub produktów moŜe chronić enzym przed inaktywacją. Omawiana powyŜej analiza kinetyczna moŜe być niewystarczająca do odróŜnienia przedstawionych trucizn od odwracalnych inhibitorów niekompetycyjnych. W kaŜdym razie odwracalne niekompetycyjne hamowanie zdarza się rzadko. Niestety nie jest to zawsze uchwycone, poniewaŜ zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne hamowanie niekompetycyjne wykazuje podobną kinetykę. AKTYWNOŚĆ KLUCZOWYCH ENZYMÓW MOśE BYĆ REGULOWANA PRZEZ POZYTYWNE I NEGATYWNE CZĄSTECZKI MODULATOROWE Małe cząsteczkowe modulatory, które zmniejszają aktywność katalityczną, są określane jako modulatory negatywne, a te, które zwiększają aktywność, są nazywane modulatorami pozytywnymi. To zagadnienie jest omawiane w następnych rozdziałach.

±1
Enz

JeŜeli S ma takie samo powinowactwo zarówno do Enz, jak i do Enzl (I nie wpływa na powinowactwo Enz do S), to otrzymuje się wyniki przedstawione na ryc. 9-20 w formie wykresu zaleŜności l/vj względem 1/ [S] w obecności i nieobecności inhibitora. (Zakłada się, Ŝe po przyłączeniu I nie ma Ŝadnych waŜnych zmian w konformacji miejsca aktywnego).

PIŚMIENNICTWO
Bender ML, Bergeron RJ, Komiyama M: The Bioorganić Chemistry of Enzymatic CataJysia. Wiley-[nierscience, 1984. Cabral F, Barlow SB; Mechanisms by which mammalian cells aequire resistance to drugs that affect microLubule assembly. FASEB J 1988;3:1593. CechTR: RNA as anenzyme. Sci Amer 1986;255:64. Dugas H, Penny C: Bioorganic Chemistry: A Chemicat ApproachtoEnzyme Action. Springer-Verlag, 1981. Fersbt AR, Leatherbarrow RJ, Wells TNC: Binding energy a.nd catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. Trendu Biochetn Sci 1986;11:321. Freeman RB, Hawkins HC (editors): Tne Enzymology of PosttransiatiOrial ModiftcatiOn ofProteins, Academic Press, 1985. Segel IH: Emyme Kinetks. Wiley, 1975. Walsh CT: Suicide substrates, mechanism-based enzyme inactivators; recent dcvelopments. Amiu Rev Biochem 1984;53:493. Patrz takŜe piśmiennictwo w rozdz. 7.

■*

0

_L
(Sl Ryc. 9-20. Wykres Lineweavera-Burka odwracalnego nie kom petycyjnego hamowania.

Wiele „trucizn" działa jako nieodwracalne, ni ekom petycyjne inhibitory aktywności enzymatycznej Aktywność enzymatyczną redukują działające na enzymy „trucizny", np. jodoacetamid,

10
Yictor W, Rodwell, PhD

Enzymy: mechanizmy działania

WPROWADZENIE
W rozdziale tym, w celu zilustrowania zasad reakcji enzymatycznych, przedstawiono w szczegółach reakcję katalizowaną przez enzym proteolityczny chymotrypsynę.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Przedmiotem badań mechanizmów działania enzymów są zmiany molekularne towarzyszące przekształceniu substratu w produkt. Rokują one wielką nadzieję na właściwy sposób postępowania podczas leczenia, jak równieŜ opracowywania leków. Wyniki anaiizy rentgenograficznej struktury białek, w połączeniu z danymi odnośnie do mechanizmów katalizy enzymatycznej, juŜ obecnie umoŜliwiają opracowywanie ieków hamujących swoiste enzymy, takie jak reduktaza HMG-CoA, która reguluje biosyntezę cholesterolu. Badania te sugerują równieŜ sposób wykorzystania technik rekombinacji DNA oraz ukierunkowanej mutagenezy w celu zmodyfikowania swoistości i (lub) aktywności katalitycznej enzymu. Techniki te zapewnię ułatwią wprowadzenie enzymów o Ŝądanych właściwościach.

Tyr, Trp) lub z aminokwasów z duŜą grupą niepolarną R (Met). Podobnie jak wiele innych proteaz, chymotrypsyna katalizuje hydrolizę niektórych estrów. ChociaŜ zdolność chymotrypsyny do katalizowania hydrolizy estrów nie jest istotna z fizjologicznego punktu widzenia, umoŜliwia ona badania mechanizmu katalizy enzymatycznej. Zmiany molekularne zachodzące podczas katalizy określane są mianem „intermediary enzymology". Syntetycznym substratem, pozwalającym na kolorymetryczną analizę aktywności chymotrypsyny, jest octan />-nitrofenylu (ryc. 10-1).

Ryc. 10-1. Octan p-mtrofenylu

W wyniku hydrolizy octanu p-nitroienylu uwalnia się/f-nitrofenol, który w środowisku zasadowym przekształca się w Ŝółty anion^-nitrofenolanowy.

MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY ILUSTRUJE OGÓLNE CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ
Chymotrypsyna katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupa karboksylowa pochodzi z aminokwasów aromatycznych (Phe,

KINETYKA REAKCJI „STOP-FLOW" UJAWNIŁA MECHANIZM DZIAŁANIA CHYMOTRYPSYNY
Kinetykę reakcji hydrolizy octanu /J-nitrofenylu moŜna badać za pomocą aparatu „stop-tiow". W doświadczeniach „stop-flow" ilość enzymu odpowiada ilości substratu (w przy-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 111

bliŜeniu równomolowe ilości enzymu i substratu), a oznaczenie dotyczy zdarzeń zachodzących w pierwszych kilku milisekundach po zmieszaniu enzymu i substratu. Aparat „stop-flow" jest wyposaŜony w 2 strzykawki: jedna przeznaczona na chymotrypsynę, a draga na octan />-nitrofenylu. Natychmiastowe zmieszanie enzymu i substratu następuje za pomocą urządzenia mechanicznego, które szybko i równocześnie usuwa zawartość obu strzykawek do jednej, wąskiej probówki. Probówka przesuwa się przez spektrofotometr i wartość absorbancji, jako funkcja czasu, ukazuje się na ekranie oscyloskopowym. Uwalnianie anionu p-nitrof enolanowego ma charakter dwufazowy Uwalnianie anionu /j-nitrofenolanowego przebiega w 2 wyraźnych fazach (ryc. 10-2): 1)

w kategoriach kolejnych etapów katalizy przedstawionych na ryc. 10-3, Wolny etap reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odpowiada hydrolizie kompleksu chymotrypsyna-octan (CTAc) Z chwilą związania chymotrypsyny w kompleks CT-Ac dalsze uwalnianie anionu p-nitrofenolanowego zaleŜy od regeneracji wolnej chymotrypsyny w wyniku hydrolizy tego kompleksu (ryc. 10-3). Faza szybka uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego (ryc. 10-2) odpowiada przekształceniu całej dostępnej chymotrypsyny w kompleks CT-Ac, z równoczesnym uwolnieniem anionu/>-nitrofenolanowego. Następujące po niej dalsze odszczepianie anionu p-nilTO fenol ano wego (PNP) jest uzaleŜnione od wolnego odzyskiwania chymotrypsyny z kompleksu CT-Ac. Uwolniona chymotrypsyna ponownie reaguje z PNP, tworząc kompleks CT-Ac i anion /j-nitrofeno łanowy. Szybkość reakcji w fazie szybkiej (tj. liczba moli uwolnionego anionu jc-nitrofen o łanowego) jest wprost proporcjonalna do liczby moli chymotrypsyny w momencie rozpoczęcia reakcji. Kluczową rolę w reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę odgrywa seryna 195 W kompleksie CT-Ac grupa acylowa jest połączona z bardzo reaktywną resztą seryny, znajdującą się w pozycji 195 chymotrypsyny. Dowodem szczególnej roli i duŜej reaktywności Ser 195 (w porównaniu z pozostałymi 27 resztami serynowymi chymotrypsyny) jest jej reakcja z diizopropylofluorofosforanem (DIPF) (ryc. 10-4). Przyłączenie DIPF do Ser 195 powoduje inaktywację chymotrypsyny. Analogicznie inaktywacji przez DIPF ulega wiele innych proteaz określanych mianem proteaz sery nowych.

Faza stacjonarna

i

i
Czas (ms)

Ryc. 10-2. Kinetyka uwalniania anionu p-nitrofenolanowego w wyniku hydrolizy octanu /)-nitrofenytu katalizowanej przez chymotrypsynę. Ilość „uwolnionego fenolu" wyliczono na podstawie absorbancji.

w fazie szybkiego uwalniania i 2) następującej po niej fazie wolniejszego uwalniania dalszych anionów />-nitrofen olano wy ch. Dwufazowy charakter uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego jest w pełni zrozumiały
Fenol

Ac

CT + PNP
Szybko

CT-PNP

■J t Szybko

*■ CT-Ac

-^-------- ^ -

CT

Wolne

Ryc. 10-3. Pośrednie etapy hydrolizy octanu p-nitrofenylu katalizowanej przez chymotrypsynę, CT — chymotrypsyna, PNP — octan p-nitrofenyfu; CT-PNP — kompleks: chymotrypsyna-octan p-nitrofenylu; CT-Ac—kompleks: chymotrypsyna-octan (acetylochymotrypsyna);feno!-anionp-nitrofenolanowy: Ac~ — anion octanowy. Tworzenie kompleksów CT-PNP i CT-Ac w stosunku do hydrolizy kompleksu CT-Ac przebiega s^ybko. __________________________________

112 / ROZDZIAŁ 10

V ? Enz-CHjOH +F-P-O ?

y

» Enz—CH, — O— P»=O

P

°
czna sekwencja zdarzeń ma miejsce podczas hydrolizy fizjologicznych substratów chymotrypsyny, takich jak peptydy. WIELE PROTEAZ WYDZIELA SIĘ W POSTACI NIEAKTYWNYCH PROENZYMÓW, CZYLI ZYMOGENÓW Wiele białek jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorów określanych jako probiałka. W przypadku gdy białka te są enzymami ich probiałka nazywane są proenzymatni lub zymogenami. Przekształcenie probiałek w aktywne białka następuje w wyniku jednolub kilkustopniowej swoistej proteolizy. Białkami syntetyzowanymi w formie probiałek są np. insulina (probiałko=proinsulina), enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna (odpowiednie probiałka = pepsynogen, trypsynogen, chymotrypsynogen), czynniki krzepnięcia krwi i fibrynoiizy (p. rozdz. 58) oraz biatko tkanki łącznej — kolagen (probiałko = prokolagen). Przekształcenie proch ymotry psy ny (pro-CT), 245-aminokwasowego polipeptydu, w aktywną a-chymotrypsynę przebiega przez formę pośrednią znaną jako chymotrypsyna U (7C-CT) {ryc. 10-6). W chymotrypsynie a łańcuchy A, B i C (ryc. 10-6) są połączone ze sobą 2 mostkami disiarczkowymi (ryc. 10-7). Proenzymy umoŜliwiają szybkie uruchomienie aktywnych form w momencie zapotrzebowania fizjologicznego Jaka jest przyczyna syntezy niektórych białek w formie nieaktywnej? Podczas gdy jedne białka są wykorzystywane w organizmie stale, inne (np. enzymy krzepnięcia krwi i fibrynoiizy) tyiko czasami, ale wówczas enzymy te są po-

Ryc. 10-4. Reakcja pierwszorzędowej grupy hydroksylowej Ser 195 chymotrypsyny z diizopropylofluorofosforanem (DIPF). __________________________________________________________

W reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę 3 aminokwasy tworzą system przekazywania ładunku W reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsynę szczególną role odgrywają 3 reszty aminokwasowe, które, mimo Ŝe zajmują odległe w stosunku do siebie miejsca w sensie struktury pierwszorzędowej, znajdują się w pozycjach pozwalających na tworzenie między nimi wiązań w sensie struktury trzeciorzędowej. Są to Asp 102, His 57 i Ser 195. Podczas gdy większość naładowanych reszt aminokwasowych jest umiejscowiona na zewnątrz cząsteczki, 3 oddziałujące ze sobą reszty są ukryte w niepolarnym wnętrzu cząsteczki, tworząc układ: Asp 102 — His 57 — Ser 195. Aminokwasem, który ulega acylacji podczas reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę, jest Ser 195. ZbliŜenie anionu octanowego (pochodzącego z octanu /)-nitrofeny)u) do tlenu grupy OH* Ser 195 wyzwala reakcję przeniesienia protonu z Ser 195 poprzez His 57 na Asp 102 (ryc. 10-5), — C — O"--"H-N^N---H — O— Ser
u:. ic
1

Sub- (tj. AG")

— C—O—H- •N

9

N—H

O-Ser

U _0A
Ryc. 10-5. Przeniesienie protonu w chymotrypsynie podczasacylacji Ser 195 przezsubstrat (Sub').

Podczas deacylacji intermediatu acylo-Ser 195 (enzym) protony przekazywane są w przeciwnym kierunku. Przypuszcza się, Ŝe analogi* Przyp. tłum.

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 113
1 13 146 149
245

Pro-CT

13/^415 16_

146 /

f 149

245

»CT

13

16

146

149

245

e

tt-CT

Ryo. 10-6. Przekształcenie prochymotrypsyny (pro-CT) w chymotrypsynę n (it-CT) i w pełni aktywną enzymatycznie chymotrypsynę ot (ct-CT).______

S ----S

Ryc. 10-7. Wewnątrzłańcuchowe i rniędzyłańcuchowe wiązania disiarczkowe w chymotrypsynie a («-CT). _______________________________________________________________________________

trzebne natychmiast. Pewne procesy fizjologiczne, takie jak trawienie, są sporadyczne, przy czym często regularne i moŜliwe do przewidzenia (chociaŜ nie jest to regułą u ludzi prymitywnych). Inne natomiast, jak krzepnięcie krwi i fibrynoliza, zachodzą tylko w przypadku zadziałania określonych czynników fizjologicznych lub patologicznych, przy czym do zachowania hemostazy muszą one być skoordynowane w czasie. Ponadto synteza proteaz w formie nieaktywnych prekursorów zabezpiecza tkanki, w których są one wytwarzane (np. trzustkę) przed samotrawieniem. (Samotrawienie moŜe zachodzić w przypadku zapalenia trzustki). Synteza de novo niezbędnych w danym momencie białek, przy załoŜeniu, Ŝe byłaby dostępna odpowiednia pula aminokwasów, mogłaby przebiegać niewystarczająco szybko w stosunku do potrzeb organizmu indukowanych czynnikami chorobotwórczymi, np. utratą krwi. RównieŜ sam proces wydzielania mógłby być zbyt wolny w stosunku do potrzeb.

Aktywacja prochymotrypsyny polega na swoistej proteolizie Przekształcenie probiałek w fizjologicznie czynne białka przebiega według następujących zasad: 1. Przekształcenie polega na swoistej proteo lizie, która moŜe dotyczyć hydrolizy tylko poje dynczego wiązania. 2. Produkty proteolizy mogą zostać rozdzie lone lub pozostać razem w ostatecznym białku. 3. Proces moŜe (lub nie) prowadzić do znacz nej zmiany masy cząsteczkowej. 4. Podstawową konsekwencją swoistej pro teolizy jest nowa konformacja. 5. Jeśli probiałko jest enzymem, to zmiana konformacji powoduje powstawanie miejsca katalitycznego. W przypadku proenzymów wy biórcza proteoliza moŜe być rozpatrywana jako proces, który uruchamia zmiany konformacyjne „tworzące" miejsce katalityczne. Wybiórcza proteoliza prochymotrypsyny (chymotrypsynogenu) umoŜliwia zbliŜenie 3 reszt aminokwasowych tworzących system przekazywania ładunku. W chymotrypsynie a His 57 i Asp 102 znajdują się w łańcuchu B, a Ser 195 — w łańcuchu C (ryc. 10-6).

8 — Biochemia

114 / ROZDZIAŁ 10

WIĄZANIE SUBSTRATU PRZEZ SWOISTE ENZYMY ODBYWA SIĘ W SPOSÓB PRZYPADKOWY LUB UPORZĄDKOWANY
Większość enzymów katalizuje reakcje między 2 lub więcej substratami, dostarczając 1 lub więcej produktów. Pewne enzymy wymagają obecności wszystkich substratów równocześnie, inne natomiast wiąŜą najpierw jeden substrat, a następnie katalizują jego reakcję z drugim substratem. Sposób w jaki enzymy wiąŜą substraty moŜe być przypadkowy lub uporządkowany (ryc. 10-8).

Wiele reakcji, wymagających udziału koenzymów, przebiega za pomocą mechanizmu określanego jako „ping-pong" (enzym występuje na przemian w formie E i Ex) (ryc. 10-9 i 10-10). ChociaŜ pewne koenzymy są często rozpatrywane jako drugi substrat, inne (np. fosforan pirydoksalu) są związane z enzymem kowalencyjnie lub niekowalencyjnie tak silnie, Ŝe ich dysocjacja praktycznie nie występuje (np. difosforan tiaminy). W tych przypadkach kompleks enzym-koenzym jest rozpatrywany jako enzym.

RESZTY AMINOKWASOWE W MIEJSCU KATALITYCZNYM MOGĄ FUNKCJONOWAĆ JAKO KATALIZATORY KWASOWO-ZASADOWE
Z chwilą związania substratu w miejscu katalitycznym naładowane (lub zdolne do naładowania) grupy funkcyjne łańcuchów bocznych aminokwasów, znajdujących się w bliskim otoczeniu, mogą brać udział w katalizie, działając na zasadzie katalizatorów kwasowych lub zasadowych. Istnieją 2 odrębne rodzaje katalizy enzymatycznej kwasowo-zasadowej: ogólna i swoista. Reakcje, których szybkość zmienia się wraz ze zmianą stęŜenia jonów H+ lub H3O+, a jest niezaleŜna od stęŜenia innych kwasów lub zasad znajdujących się w roztworze, uwaŜa się za
podporządkowane swoistej katalizie kwasowej
P EA-E'P 'P * >E'

C. 10-8. Przypadkowe i uporządkowane przyłączanie substratów A i B i oddysocjowywanie produktów P i Q od enzymu E.

Ryc. 10-9. Ogólny mechanizm „ping-pong" kata lizy enzymatycznej_______________

lub zasadowej. Natomiast reakcje, których szybkość jest uzaleŜniona od wszystkich kwasów (donorów protonów) lub zasad (akceptorów protonów) obecnych w roztworze uwaŜa się za podporządkowane ogólnej katalizie kwasowej lub zasadowej.

E-CHO

E-CH,NH,

CHO Glu

Glu

E-CHO

Ryc. 10-10. Mechanizm „ping-pong" w reakcji transaminacjt. ECHO i E-CH2NH2 reprezentują odpowiednio kompleksy enzym-fosforan pirydoksalu i enzym-fosforan pirydoksaminy. (Ala—alanina; Pyr — pirogronian; KG — a-ketoglutaran; Glu — glutaminian). ___

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 115

Ogólną i swoistą katalizę kwasowozasadową pozwala odróŜnić pomiar szybkości reakcji w buforach o róŜnych wartościach pH i stęŜenia JeŜeli przy stałym stęŜeniu buforu szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą pH roztworu, to reakcję określa się jako swoiście katalizowaną przez zasadę (jeŜeli pH jest powyŜej 7) lub swoiście katalizowaną przez kwas (jeŜeli pH jest poniŜej 7). JeŜeli natomiast przy stałym pH szybkość reakcji zmienia się wraz ze zmianą stęŜenia buforu, to reakcję określa się jako ogólną katalizę zasadową (w przypadku, gdy pH jest powyŜej 7) lub ogólną katalizę kwasową (w przypadku, gdy pH jest poniŜej 7). Przykładem swoistej katalizy kwasowej moŜe być przekształcenie substratu (S) w produkt (P). Przybiega ono w 2 etapach — etapie szybkiego, odwracalnego transferu protonu:
S+

S + Imidazol

H -* SH + Imidazol

+

+

przebiega wolno, determinując szybkość reakcji. Na uwagę zasługuje fakt, Ŝe wraz ze zmianą mechanizmu katalizy kwasowej ze swoistego na ogólny następuje odwrócenie etapów szybkiego i wolnego. Matematyczne przedstawienie szybkości reakcji ogólnie katalizowanej przez kwas jest często bardzo skomplikowane. WIĄZANIE SUBSTRATU I KATALIZĘ MOGĄ UMOśLIWIAĆ JONY METALU Ponad 25% wszystkich enzymów zawiera silnie związany jon metalu, który jest niezbędny do ich aktywności. Funkcje jonów metali w katalizie enzymatycznej bada się za pomocą analizy rentgenograficznej, spektroskopii MRI (magnetic resonance imaging) oraz ESR (electron spin resonance). Wyniki tych badań, w połączeniu ze znajomością tworzenia i rozpadu kompleksów metali i reakcji w obrębie sfer koordynacyjnych jonów metali, pozwalają na określenie funkcji jonów metali w reakcjach katalizowanych przez enzymy. Metsuoenzymy zawierają określoną liczbę funkcyjnych jonów metalu, które nie są usuwane podczas oczyszczania enzymu. Enzymy aktywowane przez metale wiąŜą natomiast metal słabiej, jednak jest on niezbędny do ich funkcji katalitycznej. Powinowactwo określonego enzymu do jonu metalu jest więc podstawą rozróŜnienia między metaloenzymami i enzymami aktywowanymi przez metale. Mechanizmy działania jonów metali zarówno w przypadku metaloenzymów, jak i enzymów aktywowanych przez metale są podobne. W katalizie enzymatycznej funkcjonują trójskładnikowe kompleksy zawierające metal W wyniku połączenia miejsca aktywnego enzymu (Enz), jonu metalu (M) i substratu (S) w stosunku 1:1:1 tworzą się trójskładnikowe kompleksy. MoŜliwe są 4 sposoby połączeń między tymi składnikami:
M—Enz—S Enz—S—M Kompleks z mostKompleks z mostkiem kiem utworzonym utworzonym przez przez enzym substrat

oraz następującym po nim wolniejszym i dlatego determinującym szybkość reakcji, etapie zamiany zawierającego proton substratu w produkt:
SH + H,O-*P+ H 3 0
+ +

Zwiększenie stęŜenia jonu hydronowego <H3O+) powoduje zwiększenie szybkości reakcji na skutek zwiększenia stęŜenia SH+, czyli substratu dla etapu określającego szybkość reakcji. WyraŜając matematycznie: dfP] + Szybkość = —' = k[SH ] dt gdzie: P = stęŜenie produktu, t = czas, k = swoista stała szybkości i [SH+] = stęŜenie kwasu sprzęŜonego w substracie. PoniewaŜ stęŜenie SH+ zaleŜy od stęŜenia S i stęŜenia H3O+ szybkość reakcji swoiście katalizowanej przez kwas wyraŜa się ogólnie jako
^ = k'[S] [H30 ] dt
+

Rozpatrzmy sytuację, w której oprócz opisanej powyŜej swoistej katalizy kwasowej, w buforze, np. imidazolowym, zachodzi równieŜ kataliza poprzez jon imidazolowy. Imidazol, będąc słabym kwasem (pKa ok. 7), jest słabym protonodawcą i powoduje, Ŝe etap

M

116 / ROZDZIAŁ 10

Enz—M—S Kompleks z mostkiem Cykliczny kompleks utworzonym przez z mostkiem utworzonym przez metal metal

UwaŜa się, Ŝe w reakcjach fo sfo transferu funkcja jonów metali polega na aktywacji atomów fosforu i tworzeniu polifosforanowoadeninowych kompleksów o charakterystycznej konformacji w aktywnych układach czteroskładnikowych.
Kompleksy z mostkiem utworzonym przez metal:

W przypadku enzymów aktywowanych przez metale mogą się tworzyć kompleksy wszystkich 4 typów. Metaloenzymy nie tworzą natomiast kompleksu typu EnzSM, poniewaŜ silnie związany z enzymem metal stanowi juŜ kompleks EnzM. Wyniki badań pozwalają obecnie na następujące uogólnienia: 1. Większość, ale nie wszystkie, kinaz (fosfotransferaza: ATP) tworzy kompleksy z most kiem przez substrat typu Enz—nukleotyd—M. 2. Fosfotransferazy działające na pirogronian lub fosfoenolopirogronian, enzymy katali zujące inne reakcje fosfoenolopirogronian u oraz karboksylazy tworzą kompleksy z most kiem poprzez metal. 3. Dany enzym moŜe tworzyć róŜne typy kompleksów w zaleŜności od substratu.
Kompleksy z mostkiem utworzonym przez enzym (MEnzS)

Enz—M—S lub Enz

W kompleksach tego typu metale odgrywają przypuszczalnie ro]ę strukturalną utrzymując aktywną konformację (np. syntetaza glutaminowa) lub tworząc mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa). W kinazie pirogronianowej jon metalu, oprócz funkcji strukturalnej, aktywuje ponadto jeden substrat (ATP), który utrzymuje w określonej pozycji.

Wyniki badań krystalograficznych i analizy sekwencji aminokwasów wykazały, Ŝe resztą wiąŜącą metal w aktywnym miejscu wielu białek jest His (rip. karboksypeptydaza A, cytochrom c, rubredoksyna. metmioglobina i methemoglobina; p. rozdz. 7), W dwuskładnikowych kompleksach EnzM etapem ograniczającym szybkość wiązania jest często odłączenie wody ze sfery koordynacyjnej jonu metalu. Dla wielu peptydaz aktywacja jonami metalu jest powoJnym, trwającym wiele godzin procesem, prowadzącym do utworzenia aktywnej konfcrrmacji dwuskładnikowego kompleksu. Wiązanie metalu:
Szybko Enz— M<Hit0).-ll+nrljt0

Przekształcenie w aktywną strukturalnie formę (Enz*):

Kinaza pirogronianowa ----- ATP Kreatyna Kompleksy z mostkiem utworzonym przez substrat (EnzSM)

Powstawanie trójskładnikowego kompleksu w przypadku mctalocnzymów polega na przyłączeniu substratu (S) do dwuskładnikowego kompleksu EnzM;
Enz—M+S Enz—M—S lub Jony metałi odgrywają róŜnorodne funkcje w katalizie
z^

Utworzenie trójskładnikowych kompleksów enzymu, metalu i substratu w przypadku trifosforanów nukleozydów przypisuje się wyparciu przez ATP wody ze sfery koordynacyjnej metalu:
ATP
S

+ M(HaO)£ ^ATP—M(HaO)|- + 3HaO

+

a następnie związanie z enzymem; ATP— MfH^O)!"+ Enz^Enz—ATP—WHHjO);-

Jony metali mogą brać udział w kaŜdym z 4 znanych mechanizmów zwiększenia szybkości reakcji chemicznej przez enzymy: 1) ogólnej katalizie kwasowo-zasad owej, 2) katalizie kowalencyjnej, 3) zbliŜeniu reagujących związków oraz 4) indukcji zmian strukturalnych w enzymie lub substracie. Oprócz Ŝelaza, funkcjonującego w hemoproteinach, najczęściej zwią-

ENZYMY: MECHANIZMY DZIAŁANIA / 117

zanymi z katalizą enzymatyczną są Mg-2"1", Mn2"1", Ga2*, chociaŜ w przypadku niektórych enzymów mogą to być równieŜ jony innych metali (np, K+). Jony metali, podobnie jak protony, spełniając funkcję kwasów Lewisa (związków elektrofilowych) mogą. uczestniczyć w tworzeniu pary elektronów wiązania sigma. MoŜna je równieŜ
Funkcja jonu metalu Enzym Tabela 10-1. Wybrane przykłady funkcji jonów metaii w mechani2mie działania enzymów* Amoniako-liaza histydynowa Maskowanie grupy nukleofilowej

Kinazy, liazy, dekarbok- Aktywacja grupy eleksylaza pirogronianowa trof iłowej Dehydrataza węglanowa Aktywacja grupy nukleofilowej Enzymy kobamidowe Metal pełni funkcję nukleoftlu Karboksylaza pirogronia- Usunięcie elektronu TT nowa, karboksypeptydaza, dehydrogenaza alkoholowa Niehemowe białka zaOddawanie etektronu % wierające Ŝelazo Kinaza pirogronianowa, Gromadzenie i ustawiakarboksylaza pirogronia- nie ligandów nowa, kinaza adenylanowa Fosf otrą nsf eraza, izome- Zmiany konformacji raza ksylozowa, hemoproteiny

rozpatrywać jako^.superkwasy", poniewaŜ występują w środowisku obojętnym, mają ładunek dodatni powyŜej 1 i mogą tworzyć wiązania pi. Ponadto (w przeciwieństwie do protonów) mogą słuŜyć jako trójwymiarowa matryca do ustawienia grup zasadowych enzymu lub substratu w określonej pozycji. Jony metali, będąc akceptorami elektronów przez wiązania sigma lub pi, mogą aktywować grupy elektrofilowe oraz nukleofilowe (ogólna kataliza kwasowo-zasadowa). Oddając elektrony jony metali mogą z kolei aktywować grupy nukleofilowe lub same funkcjonować jako nukleofile. Poprzez sferę koordynacyjną metale mogą powodować zbliŜenie enzymu i substratu lub w wyniku połączeń chelatowych zmiany konformacyjne w enzymie czy substracie. Ponadto jony metalu mogą „maskować" grupy nukleofilowe zapobiegając w ten sposób reakcji ubocznej, która przebiegałaby prawdopodobnie w ich nieobecności. Wreszcie jony metali poprzez sferę koordynacyjną mogą funkcjonować jako trójwymiarowa matryca utrzymująca reagujące grupy w określonej orientacji przestrzennej, co ma decydujące znaczenie w stereochemicznej kontroli przebiegu katalizowanej przez enzym reakcji (tab. 10-1).

PIŚMIENNICTWO
Fersht A: Enzyme Structure and Meckanism, 2nd ed. Freeman, 1985. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymotogy oj'Past-translationalModification ojProteins, Academic Press, 1985. Purith DL (editor): Enzyme kinetics and mechanisms. Parts A and B in: Methods in Enzymołogy. Vol 63, 1979; Vol 64; 1980. Academic Press. Patrz takŜe piśmiennictwo w rozdz, 7 i 8

* Zaadaptowane z: Mildvan AS, Metals in enzyme catalysis, t. 2, str. 456, w The Enzymes, Boyer PD, Lardy H, Myrback K (red.), Academic Press, 1970.

11
WPROWADZENIE
W rozdziale tym, na podstawie wybranych przykładów, przedstawiono udział enzymów w regulacji procesów metabolicznych. Przykłady ilustrujące odmienne mechanizmy regulacji metabolizmu zaprezentowano w innych rozdziałach tego podręcznika.

Enzymy: regulacja aktywności
Victor W. Rodweii, PhD

Indukcja enzymów stanowi biochemiczną pod-

stawę interakcji leków, a więc sytuacji, w której podanie jednego leku powoduje znaczne zwiększenie metabolizmu innego leku.

REGULACJA METABOLIZMU ZAPEWNIA HOMEOSTAZĘ
Wysunięta przez Claude Bernarda pod koniec XIX w. koncepcja homeostatycznej regulacji środowiska wewnętrznego podkreślała zdolność zwierząt do utrzymania stałości środowiska wewnątrzkomórkowego, mimo zmian zachodzących w środowisku zewnętrznym. ChociaŜ koncepcja ta wyprzedzała współczesną enzymologię, sugerowała ona, Ŝe zmiany środowiska zarówno wewnętrznego, jak i zewnętrznego wpływają na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy. Komórka lub organizm, reagujące w sposób niewystarczający lub nieprawidłowy na bodźce wewnętrzne lub zewnętrzne, mogą być określone jako chore. Wiedza o czynnikach wpływających na szybkość reakcji katalizowanych przez enzymy ma szczególne znaczenie zarówno w zrozumieniu mechanizmów homeostazy w komórkach prawidłowych, jak i poznaniu molekularnych podstaw chorób.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Mechanizmy, za pomocą których komórki i organizmy regulują i koordynują ogólny metabolizm, są przedmiotem zainteresowania badaczy w wielu dziedzinach nauk biomedycznych dotyczących tak róŜnych problemów, jak; nowotwory, choroby serca, starzenie, fizjologia drobnoustrojów, róŜnicowanie, przeobraŜenie, działanie hormonów czy działanie leków. We wszystkich tych przypadkach wykazano istnienie zarówno prawidłowej, jak i nieprawidłowej regulacji enzymatycznej. Nieprawidłowości w regulacji aktywności enzymów (brak indukcji lub represji) stwierdza się np. w wielu komórkach nowotworowych. Potwierdza to ogólnie przyjęte załoŜenie, Ŝe zaburzenia mechanizmów kontrolujących ekspresje genów leŜą u podstaw procesu nowo tworzenia. Niektóre wirusy onkogenne zawierają gen kodujący tyrozyno-swoistą kinaze białek. Ekspresja tego genu w komórkach gospodarza prowadzi do nie mającej miejsca w warunkach prawidłowych fosforylacji wielu białek i enzymów, powodując znaczne zmiany fenotypowe. UwaŜa się, Ŝe zmiany tego typu są główną przyczyną transformacji nowotworowej wywoływanej przez pewne wirusy onkogenne. Innym znamiennym przykładem regulacji enzymatycznej jest działanie leków.

Przepływ metabolitów jest z reguły jednokierunkowy
Wszystkie reakcje chemiczne, łącznie z reakcjami katalizowanymi przez enzymy, są do pewnego stopnia odwracalne*. W komórkach Ŝy* Reakcje łatwo odwracalne charakteryzuje mała wartość liczbowa AG. Reakcje o duŜej wartości ujemnej AG, do jakich naleŜy większość przemian biochemicznych, moŜna określić jako nieodwracalne.

ENZYMY; REGULACJA AKTYWNOŚCI / 119

wych jednak reakcje odwracalne zasadniczo nie zachodzą, poniewaŜ produkty jednej reakcji są natychmiast usuwane na skutek włączania ich w następne reakcje katalizowane przez inne enzymy. Przepływ metabolitów w Ŝywej komórce przypomina przepływ wody w instalacji wodociągowej. ChociaŜ woda moŜe płynąć w dowolnym kierunku, w praktyce jej przepływ jest jednokierunkowy. Podobnie przepływ metabolitów w Ŝywych komórkach jest takŜe w znacznym stopniu jednokierunkowy. Stan równowagi, nietypowy dla Ŝycia, komórka osiąga dopiero w chwili śmierci. Jednokierunkowy przepływ metabolitów w Ŝywej komórce pozwala na zachowanie stałości środowiska wewnętrznego (ryc. 11-1). W pełni wykształconej

sorów makrocząsteczek, transport, wydzielanie lub wchłanianie musi ulegać zmianom pod wpływem nawet niewielkich zmian w środowisku komórki, narządu lub całego organizmu. Procesy te muszą być skoordynowane i reagować zarówno na krótkotrwałe zmiany w środowisku zewnętrznym (np. dodanie lub usuniecie składnika pokarmowego), jak równieŜ wydarzenia okresowo zachodzące wewnątrz komórki (np. replikacja DNA). Brak złoŜonych systemów kontroli hormonalnej i nerwowej, a takŜe stosunkowa łatwość prowadzenia badań na poziomie genomu powoduje, Ŝe obecnie najlepiej poznane są szczegóły molekularnych podstaw regulacji u bakterii. ChociaŜ jest oczywiste, Ŝe pozornie podobne zjawiska u bakterii i ssaków znacznie się róŜnią, regulacja procesów metabolicznych u bakterii stanowi podstawę do zrozumienia tej regulacji u człowieka. AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW REGULUJĄ 3 PODSTAWOWE MECHANIZMY Ogólnie mówiąc, na przepływ węgla przez jakąkolwiek reakcję katalizowaną przez enzym mają wpływ: 1) zmiany bezwzględnej ilości obecnego enzymu, 2) zmiany wielkości puli reagujących związków, innych niŜ enzym oraz 3) zmiany sprawności katalitycznej enzymu. Wszystkie te moŜliwości są wykorzystywane przez większość form Ŝycia. Szybkość syntezy i degradacji determinuje ilość enzymu Bezwzględna ilość danego enzymu jest wypadkową szybkości jego syntezy (ks), oraz szybkości jego degradacji (k^) (ryc. 11-2). Ilość enzymu w komórce moŜe się zwiększyć w wyniku zwiększenia szybkości jego biosyntezy (zwiększenie wartości ks), zmniejszenia szybkości jego degradacji (zmniejszenie wartości kdes) lub obu procesów równocześnie. Podobnie zmniejszenie ilości enzymu moŜe być wynikiem zmniejszenia wartości ks, zwiększenia wartości k^g lub obu
Enzym

Ryc. 11-1. Schemat homeostazy komórkowej.

komórce średnie stęŜenie metabolitów pozostaje względnie stałe w duŜych przedziałach czasowych*. Zdolność przystosowawczą Ŝywej komórki najlepiej ilustrują jedynie niewielkie zmiany i przesunięcia, za pomocą których organizm zachowuje stałość środowiska wewnętrznego pomimo duŜych róŜnic w pobieraniu pokarmu, wody i soli mineralnych, wykonywaniu pracy, czy temperaturze zewnętrznej. Szybkość reakcji odzwierciedla zmieniające się potrzeby fizjologiczne Aby procesy Ŝyciowe przebiegały w uporządkowany sposób, przepływ metabolitów przez szlaki anaboliczne i kataboliczne musi podlegać regulacji, a szybkość reakcji chemicznych niezbędnych w danym momencie musi odpowiadać potrzebom organizmu ze względu na jego otoczenie. Przebieg wszystkich procesów, takich jak wytwarzanie ATP, biosynteza prekur* Zdarzają się jednak krótkotrwałe zmiany w stęŜeniach metabolitów i enzymów mające ogromne znaczenie fizjologiczne.

k, f

) k„.fl

Aminokwasy Ryc. 11-2. Ilość enzymu jest wypadkową jego syntezy i degradacji.

120 / ROZDZIAŁ 11

wartości równocześnie. We wszystkich formach Ŝycia biosynteza enzymu (białka) z aminokwasów i degradacja enzymu (białka) do aminokwasów są odmiennymi procesami, katalizowanymi przez zupełnie róŜne zestawy enzymów. Dzięki temu regulacja biosyntezy i degradacji enzymu moŜe przebiegać niezaleŜnie.

nikowego, reduktaza HMG-CoA i cytochrom P-450.

Synteza enzymów moŜe ulegać represji pod wpływem ostatecznego produktu
Obecność w środowisku reakcyjnym syntetyzowanego metabolitu moŜe powodować represję dalszej jego syntezy. Małe cząsteczki, takie jak puryny czy aminokwasy, działając na zasadzie korepresorów mogą więc blokować syntezę enzymów biorących udział w ich własnej biosyntezie. Na przykład u Salmonella typhimuriurn w obecności egzogennej histydyny (His) następuje represja syntezy wszystkich enzymów biosyntezy histydyny, a po dodaniu do poŜywki leucyny represji ulega synteza 3 enzymów typowych jedynie dla biosyntezy Leu. Po usunięciu lub wyczerpaniu w podłoŜu konkretnego związku pośredniego dla danej biosyntezy zachodzi proces odwrotny, określony jako derepresja. PowyŜsze przykłady ilustrują charakterystyczną dla szlaków biosyntezy u bakterii represję na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego za pomocą produktu. Zjawiskiem pokrewnym jest represja za pomocą katabolitu. Polega ona na represji syntezy enzymów biorących udział w katabolizmie pod wpływem związków pośrednich, powstających w reakcjach kata bo licznych kataiizowanych przez te enzymy. Zjawisko to po raz pierwszy zaobserwowano w hodowlach E. coli rosnących na poŜywkach zawierających inne (X) niŜ glukoza źródło węgla. Nazwano je „efektem glukozy", dodanie bowiem do podłoŜa glukozy powodowało represję syntezy enzymów związanych z katabolizmem związku X. Z chwilą, kiedy stwierdzono, Ŝe utlenianie składników poŜywienia innych niŜ glukoza wywołuje podobne efekty, wprowadzono termin represji za pomocą katabolitu. Związkiem pośredniczącym w represji katabolicznej jest cAMP. Molekularne mechanizmy indukcji, represji i derepresji przedstawiono w rozdz. 41.

Synteza enzymów moŜe być uruchamiana w odpowiedzi na pewne
indu który

Reakcją komórek na obecność swoistych małocząsteczkowych induktorów jest synteza swoistych enzymów. Na przykład Escherichia coli hodowana na poŜywce zawierającej glukozę nie fermentuje laktozy na skutek braku pgalaktozydazyhyrolizującej laktozę do galaktozy i glukozy. Dodanie do podłoŜa laktozy lub innych p-ga lak to Ŝydów indukuje P-galaktozydazę, dzięki czemu w hodowli moŜe zachodzić fermentacja laktozy. ChociaŜ na ogół induktorami są substraty indukowanych enzymów, mogą być nimi równieŜ związki strukturalnie przypominające substraty, nie będące jednak substratami. Określa się je mianem induktorów gratisowych. Odwrotnie, pewne związki, mimo Ŝe są substratami, nie muszą być induktorami. Często jeden związek indukuje kilka enzymów danego szlaku metabolicznego (np. laktoza indukuje zarówno permeazę p-g a laktozy do wą, jak i P-galaktozydaze). Enzymy, których stęŜenie w komórce jest niezaleŜne od dodanego induktora określa się jako konstytutywne. Ten sam enzym, w zaleŜności od szczepu bakteryjnego, moŜe mieć charakter konstytutywny, ulegać indukcji lub być w ogóle nieobecny. Komórki, w których dany enzym \ub inne białko ulega indukcji, zwykle zawierają bardzo małą, ale dającą się zmierzyć, podstawową ilość tego białka nawet w nieobecności induktora. WraŜliwość komórek na induktory jest uwarunkowana genetycznie. Dlatego teŜ określenia „konstytutywny" czy „ulegający indukcji'1 mają charakter względny, podobnie jak „ciepły" i „zimny", i oznaczają jedynie krańcowe moŜliwości reakcji komórki w obecności induktora. Indukcja enzymów jest zjawiskiem występującym równieŜ u eukariontów. U zwierząt enzymami ulegającymi indukcji są np. 2,3-dioksygenaza tryptofanowa, dehydrataza treoninowa, aminotransferaza tyrozyna :a-ketoglutaran, p-D-fruktofuranozydaza, enzymy cyklu mocz-

WE WSZYSTKICH FORMACH śYCIA ZACHODZI OBRÓT METABOLICZNY BIAŁEK
Procesy syntezy enzymu i jego degradacji określa się mianem obrotu metabolicznego. Obrót metaboliczny białek stwierdzono jako właściwość cechującą wszystkie komórki ssaków na długo zanim zaobserwowano występowanie tego zjawiska u bakterii. O istnieniu przemiany

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 121

białek (enzymów) u ludzi wywnioskowano z doświadczeń dotyczących odŜywiania się człowieka przeszło 100 lat temu. Klasyczne juŜ badania Schoenheimera, prowadzone tuŜ przed II wojną światową i w czasie jej trwania, niezbicie dowiodły, Ŝe w czasie Ŝycia człowieka zachodzi ciągła przemiana białek komórkowych. Mierząc szybkość wbudowywania znakowanych' ;N-aminokwasów do białek oraz szybkość ich ubytku z białek, Schoenheimer wykazał, Ŝe w organizmie białka są w stanie „dynamicznej równowagi". Koncepcja ta obejmuje równieŜ inne składniki organizmu, łącznie z lipidami i kwasami nukleinowymi. Degradacja swoistych enzymów jest regulowana Szczegóły degradacji białek ssaków w wyniku proteoiizy zaleŜnej od ATP i ubikwityny oraz niezaleŜnej od ATP przedstawiono w rozdz. 31. WraŜliwość enzymów na proteolityczną degradację jest uzaleŜniona od ich konformacji. Obecność lub brak czynników zmieniających konformację białka, takich jak substraty, koenzymy lub jony metali, wpływa więc na podatność enzymów na proteolizę. StęŜenie substratów, koenzymów i prawdopodobnie jonów w komórce moŜe w ten sposób warunkować szybkość degradacji swoistych enzymów. Koncepcję tę ilustrują dwa enzymy: arginaza i 2,3-dioksygenaza tryptofanowa (pirolaza tryptofanowa).

Regulacja stęŜenia arginazy w wątrobie obejmuje zmianę wartości kj lub kdcg. Zwiększenie stęŜenia arginazy w wątrobie po spoŜyciu pokarmu bogatego w białko jest wynikiem zwiększonej syntezy tego enzymu. Zwiększenie natomiast stęŜenia arginazy w wątrobie zwierząt głodzonych jest skutkiem zmniejszonej degradacji tego enzymu, podczas gdy wartość ks pozostaje nie zmieniona. W przypadku drugiego enzymu zwiększenie stęŜenia 2.3-dioksygenazy tryptofanowej u ssaków obserwuje się po wstrzyknięciu glikokortykoidów lub spoŜyciu tryptofanu. Stwierdzono, Ŝe hormony powodują zwiększenie syntezy tego enzymu (zwiększenie ks), Trp natomiast nie wpływa na wartość IŁ,, ale zmniejsza wartość k^g w wyniku zmniejszenia podatności enzymu na proteolizę. Zwiększenie stęŜenia arginazy w wątrobie, w wyniku zwiększonego spoŜycia azotu w diecie bogatobia&owej (p. rozdz. 31) przypomina indukcję za pomocą substratu u bakterii. Jednak w przypadku 2,3-dioksygenazy tryptofanowej, nawet jeśli tryptofan moŜe działać jako induktor u bakterii (zmienia kj, to u ssaków wpływa on wyłącznie na proces degradacji enzymu (zmniejsza kdpg). Na stęŜenie enzymu w tiankach ssaków mają znaczny wpływ zmiany fizjologiczne, hormonalne lub pokarmowe (tab. 11 -1), ale wiedza o molekularnych podstawach tych zmian jest nadal fragmentaryczna.

Tabela 11-1. Adaptacja wybranych enzymów wątroby szczura do zmian w środowisku*

Enzym Metabolizm aminokwasów
Arginaza

<h>

Bodziec

Zmiana

aktywności

100—120 Głodzenie lub glikokortykosteroidy
Zamiana diety z bogatobiarkowej na matobiałkową

+22 + 100 + 20

Dehydrataza sery nowa Amoniako-liaza histydynowa

20 60

Glukagon lub aminokwasy egzogenne Zmiana diety z maiobiałkowej na bogatobiałkowa

Metabolizm węglowodanów
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

15

Hormony tarczycy lub dieta bogatowęglowodanowa poprzedzona głodzeniem Hormony tarczycy Glukoza

+ 10

Dehydrogenaza glicerolo-a-fosforanowa Fruktozobisfosfataza (Fruktozo-1,6-bisfosfataza)

100

+ 10 + 10

122 / ROZDZIAŁU cd. tab. 11-1 Enzym Metabolizm lipidów Enzym rozszczepiający cytrynian
ti/2

W

Bodziec

Zmiana aktywności

Dieta bogatowęglowodanowa i małottuszczowa poprzedzona głodzeniem Głodzenie Dieta beztłuszczowa poprzedzona głodzeniem 2—3

+30

Syntetaza kwasów tłuszczowych

-1 0

Reduktaza HMG-CoA

Głodzenie lub dieta zawierająca 5% -10 ± 5 cholesterolu Zmiany dobowe + 2do10 Insulina lub hormony tarczycy

+30

Metabolizm puryn i pjrymidyn

Oksydaza ksantynowa Karbamoilotransferaza asparaginianowa Dihydroorotaza
60 12

Dieta bogatobiatkowa Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego Dieta zawierająca 1% kwasu orotowego

-10

+2 +3

* Dane poza dotyczącymi reduktazy HMG-CoA z: Schimke RT, Doyle D: Control of enzyme levels in animał tissues, Annu, Rev, Biochem. 1970; 39:929.

Glikokortykosteroidy powodują zwiększenie stęŜenia aminotransferazy tyrozynowej przez pobudzenie jej syntezy. Stwierdzenie to było pierwszym dowodem istnienia hormonalnej regulacji biosyntezy enzymów u ssaków. Insulina i glukagon — pomijając ich wzajemne antagonistyczne działanie fizjologiczne — niezaleŜnie od siebie zwiększają 4—5-krotnie wartość k s . W działaniu glukagonu pośredniczy prawdopodobnie cAMP, który w hodowlach tkankowych wątroby szczura wywołuje podobne do hormonu skutki.

AKTYWNOŚĆ KATALITYCZNA ENZYMÓW MOśE BYĆ REGULOWANA W ROśNY SPOSÓB
Zmiana aktywności enzymu moŜe być wynikiem zmiany bezwzględnej ilości enzymu lub obecny enzym moŜe stać się bardziej lub mniej skutecznym katalizatorem. Zmiany aktywności
katalitycznej enzymu, zachodzące bez zmiany jego ilości, określa się jako „wpływ na sprawność katalityczną enzymu".

Regulacja poprzez syntezę niektórych enzymów w formie nieaktywnych prekursorów
Regulacja aktywności enzymatycznej moŜe polegać na biosyntezie enzymu w formie nieaktywnego proenzymu. Przekształcenie proenzy,mu w formę aktywną katalitycznie jest wynikiem ograniczonej proteolizy, procesu któremu towarzyszą zmiany konformacyjne odsłaniające lub „tworzące" miejsce katalityczne (p. rozdz. 9). Synteza enzymów w formie nieaktywnych prekursorów jest zjawiskiem charakterystycznym dla enzymów trawiennych oraz czynników krzepnięcia krwi i fibrynolizy (p. rozdz. 58).

KOMPARTMENTACJA ENZYMÓW UŁATWIA REGULACJĘ METABOLIZMU
Znaczenie kompartmentacji procesów metabolicznych w komórkach eukariotycznych, łącznie z komórkami ssaków, jakkolwiek bardzo waŜne, nie moŜe być przeceniane. Umiejscowienie swoistych procesów metabolicznych w cytozolu lub organellach komórkowych umoŜliwia ich niezaleŜną regulację, Kompartmentacja procesów metabolicznych, charakterystyczna dla wyŜszych form Ŝycia, daje więc moŜliwość bardzo finezyjnej regulacji metabolizmu. Jed-

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 123

nocześnie stwarza jednak problem przemieszczania metabolitów przez błony oddzielające poszczególne struktury subkomorkowe. Przenikanie przez te bariery jest moŜliwe dzięki istnieniu mechanizmów zapewniających przemiesz-

stępnych dla danego enzymu. Jednak nawet

czanie w wyniku przekształcania metabolitów w formy przepuszczalne dla błon. Po przejściu przez Honę metabolity są ponownie przekształcane w postać pierwotną. W konsekwencji wymaga to występowania tej samej aktywności katalitycznej w 2 formach, np. cytozolowej 1 mitochondrialnej. Fizyczne rozdzielenie tych 2 form enzymu ułatwia ich niezaleŜną regulację. W rozdziale 18 przedstawiono udział mechaniz mów umoŜliwiających przenikanie przez błony w zachowaniu równowagi puli metabolicznej związków pośrednich cyklu kwasu cytrynowe go i innych związków amfibolicznych.

ENZYMY KATALIZUJĄCE CIĄGI REAKCJI METABOLICZNYCH MOGĄ TWORZYĆ WIELKOCZĄSTECZKOWE KOMPLEKSY
Organizacja enzymów katalizujących kolejne reakcje szlaku metabolicznego w wielkocząsteczkowe kompleksy koordynuje działanie enzymów i przepływ metabolitów. Istnienie układów wieloenzymowych zwiększa dostępność związków pośrednich dla enzymów danego szlaku przemian, umoŜliwia bowiem przenoszenie produktów między enzymami bez uprzedniego ustalenia ich równowagi z pulami metabolicznymi. Pozwala to na bardziej precyzyjną kontrolę metabolizmu niŜ miałoby to miejsce w przypadku enzymów nie pozostających w kompleksie. Ponadto zmiany konformacyjne jednego ze składników kompleksu przez interakcje białko-białko mogą być przekazywane innym składnikom tego kompleksu, powodując w ten sposób wzmocnienie skutków regulacji.

pomiar stęŜenia metabolitu w organellach komórkowych nie odzwierciedla faktycznego stanu rzeczy m.in. wskutek znacznej bliskości wytwarzania i usuwania danego związku. Ponadto istnieją często duŜe róŜnice pomiędzy całkowitym stęŜeniem metabolitu a stęŜeniem metabolitu wolnego, tj. dostępnego dla enzymu. Na przykład, mimo Ŝe całkowite stęŜenie 2,3-bisfosfoglicerynianu w erytrocytach jest bardzo duŜe, to stęŜenie wolnego bisfosfoglicery-nianu jest porównywalne z innymi tkankami. Podobnie dostępność wielu innych metabolitów ulega znacznemu zmniejszeniu w obecności wiąŜących je białek. Jednym z podstawowych załoŜeń teorii kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten jest to, Ŝe ogólne stęŜenie substratu odpowiada stęŜeniu dostępnego substratu. ZałoŜenie to moŜe się jednak nie sprawdzać w warunkach in vivo, gdzie stęŜenie wolnych substratów często jest tego samego rzędu wielkości co stęŜenie enzymów. Regulatorową rolę mogą spełniać równieŜ jony metali zaangaŜowane w strukturę i funkcję ponad XJĄ wszystkich znanych enzymów (p. rozdz. 10), a szczególnie w przypadku reakcji, w których substratem jest ATP. Największą aktywność obserwuje się zazwyczaj wówczas, gdy w kompleksie ATP-jon metalu stosunek ATP do metalu wynosi ok. 1. Nadmiar metalu lub ATP ma wpływ hamujący. PoniewaŜ difosforany i trifosforany nukleozydów tworzą trwale kompleksy z jonami metali dwuwartościowych, wydaje się, Ŝe wewnątrzkomórkowe stęŜenie nukleotydów moŜe regulować wewnątrzkomórkowe stęŜenie wolnych jonów metali, a tym samym aktywność pewnych enzymów.

AKTYWNOŚĆ OKREŚLONYCH ENZYMÓW REGULUJĄ EFEKTORY ALLOSTERYCZNE
Aktywność katalityczna pewnych kluczowych w danym szlaku metabolicznym enzymów — enzymów regulatorowych — jest modulowana za pomocą ma łocząs teczko wych efektorów allosterycznych, które na ogół nie wykazują podobieństwa do substratów lub koenzymów danego enzymu. Hamowanie aktywności enzymu szlaku biosyntezy przez końcowy produkt tego szlaku nosi nazwę hamowania
przez sprzęŜenie zwrotne. W biosyntezie

STĘśENIE SUBSTRATÓW, KOENZYMÓW, KATIONÓW MOśE REGULOWAĆ AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW
Średnie wewnątrzkomórkowe stęŜenie substratu, koenzymu lub jonu metalu moŜe nie stanowić właściwej podstawy do oceny aktywności enzymu in vivo. Niezbędna jest w tym celu
znajomość stęŜeń metabolitów bezpośrednio do-

124 / ROZDZIAŁ 11

związku D ze związku A, katalizowanej przez enzymy Enz1; Enz2 i Enz3
Enz,
B

Enza Enz,

duŜe stęŜenie związku D z reguły hamuje przemianę A w B. Nie zachodzi tu proste „cofanie się" związków pośrednich, ale związek D wiąŜe się z Enzl5 hamując jego aktywność. Związek D działa więc jako ujemny efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny Enz,. W ten sposób hamowanie Enz! przez D na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego reguluje ostatecznie syntezę związku D. Związek D łączy się zwykle z miejscem allosterycznym, oddalonym od miejsca katalitycznego enzymu. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne moŜe mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne najczęściej jest spotykane w przypadku szlaków biosyntezy. Często inhibitorem zwrotnym jest ostatnia mała cząsteczka przed utworzeniem związku wielkocząsteczkowego (np. aminokwasy w szlaku biosyntezy białek, nukleotydy w szlaku biosyntezy kwasów nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzęŜenie zwrotne dotyczy najwcześniejszego, funkcjonalnie nieodwracalnego* etapu charakterystycznego wyłącznie dla danego szlaku biosyntezy; najlepiej poznanym przykładem jest hamowanie karbamoilotransferazy asparaginianowej przez CTP (p. rozdz. 36). Często szlak biosyntezy jest rozgałęziony, tzn. metabolity początkowe są wykorzystywane do biosyntezy 2 lub więcej metabolitów końcowych. Hamowanie na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego w rozgałęzionym szlaku biosyntezy (np. biosyntezy aminokwasów, puryn lub pirymidyn) przedstawia ryc. 11-3. Związki S^ S2 iS3 są prekursorami wszystkich 4 produktów końcowych (A, B, C i D) natomiast związek S4 jest prekursorem produktów B i C, a związek S; prekursorem wyłącznie produktu D. Przekształcenia: S, ----- A , -

Ryc. 11-3. Hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne w rozgałęzionym szlaku biosyntezy. S-\ — S5 są związkami pośrednimi w biosyntezie ostatecznych produktów A — D. Strzałki proste oznaczają enzymy katalizujące określone przemiany. Strzałki wygięte wskazują hipotetyczne miejsca hamowania przez swoiste produkty końcowe w wyniku sprzęŜenia zwrotnego.

stanowią więc liniowe ciągi reakcji, które jak moŜna się spodziewać, są hamowane na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego przez ich produkty końcowe. Konkretnym przykładem tego zjawiska jest biosynteza nukleotydów (p. rozdz. 36). RóŜnorodne mechanizmy hamowania przez sprzęŜenie zwrotne regulują rozgałęzione szlaki metaboliczne ~ RóŜnorodność mechanizmów hamowania przez sprzęŜenie zwrotne w rozgałęzionych szlakach metabolicznych stanowi dodatkowy poziom regulacji (ryc. 11-4). Na przykład, jeśli produkt B występuje w nadmiarze, to zmniejsza sie zapotrzebowanie na związek S2. Zdolność produktu B do zmniejszenia syntezy S2 jest więc korzystna z biologicznego punktu widzenia. Jeśli jednak nadmiar związku B hamuje tę część szlaku, która dotyczy nie tylko jego własnej

► C

S3

D

* Reakcją przebiegającą praktycznie w jednym kierunku {wznaczeniu termodynamicznym) jest reakcja o duŜej wartości ujemnej AG.

Ryc. 11-4. Regulacja rozgałęzionego szlaku biosyntezy w wyniku hamowania przez sprzęŜenie zwrotne. Dodatkowe, w porównaniu ze schematem przedstawionym na ryc. 11-3, strzałki wygięte, oznaczone liniami ciągłymi, wskazują-róŜnorodno&ć mechanizmów hamowania przez sprzęŜenie zwrotne.

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 125

biosyntezy, ale jest wspólna dla biosyntezy związków A, C czy D, to nadmiar związku B potencjalnie mógłby wstrzymać syntezę wszystkich 4 produktów. Istnieją jednak mechanizmy, które zapobiegają takiemu niepoŜądanemu efektowi. W kumulatywnym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne hamujący wpływ 2 lub więcej produktów końcowych na I enzym regulatorowy jest sumą skutków wywoływanych przez kaŜdy z tych produktów niezaleŜnie. W zgodnym lub wielo wartościowym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne całkowite zahamowanie ma miejsce tylko wtedy, kiedy jednocześnie 2 lub więcej produktów końcowych jest obecnych w nadmiarze. W kooperatywnym hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne I końcowy produkt występujący w nadmiarze hamuje enzym regulatorowy, ale w obecności 2 lub więcej produktów końcowych stopień hamowania znacznie przewyŜsza sumaryczny efekt kumulatywnego hamowania przez sprzęŜenie zwrotne. Najlepiej poznanym enzymem atlosterycznym jest karbamoiłotransferaza asparaginia nowa Karbamoiłotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwszą reakcję w szlaku biosyntezy pirymidyn {ryc. 11-5). Enzym ten jest hamowany na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego przez trifosforan cytydyny (CTP). W obecności związków rtęci ATCaza staje się niewraŜliwa na CTP, ale zachowuje pełną aktywność syntezy karbamoiioasparaginianu. Sugeruje to, iŜ CTP wiąŜe się z enzymem w innym miejscu (allosterycznym) niŜ kaŜdy z substratów. Cząsteczka ATCazy składa się z 2 podjednostek katalitycznych i 3 lub 4 podjednostek regulatorowych. KaŜda podjednostka katalityczna zawiera 4 miejsca wiązania asparaginianu (substratu), a kaŜda jednostka regulatorowa co najmniej 2 miejsca wiązania CTP (regulatora). Otrzymanie mutantów pozbawionych prawidłowej kontroli zwrotnej przez CTP, a z nich rewertantów z prawidłowymi właściwościami pozwoliło wykazać, Ŝe oba rodzaje podjednostek podlegają niezaleŜnej kontroli genetycznej. Miejsca allosteryczne i katalityczne są przestrzennie odmienne Około 1963 r. Monod zwrócił uwagę na brak strukturalnego podobieństwa pomiędzy inhibi-

-o-c. I ♦ i
C00

■*ii

0 CH,

•" v ~

M

KARBAMOILOTRANSFERAZA ASPARAGIN1AN0WA
I

o u o-c
*CH,

Kar b ama i I o as p a r ag i n i an

Ryc. 11-5. Reakcja katalizowana przez karbamoilotra nsferazę asparag in ianową.

torem zwrotnym a substratem dla enzymu, którego aktywność podlega regulacji. Skoro efektory nie są izosteryczne, ale allosteryczne („zajmują inną przestrzeń") z substratem zaproponował on, Ŝe enzymy, których aktywność jest regulowana przez efektory allosteryczne (np. inhibitory zwrotne) wiąŜą efektor w miejscu fizycznie odmiennym od miejsca katalitycznego, tj. w miejscu allosterycznym. Enzymy, których aktywność miejsca katalitycznego moŜe być regulowana przez efektory allosteryczne znajdujące się w miejscu atlosterycznym określa się jako enzymy allosteryczne. Istnienie fizycznie odrębnych miejsc allosterycznych w cząsteczce enzymu potwierdzają m.in. następujące fakty: 1. Modyfikacje enzymów za pomocą technik chemicznych lub fizycznych często prowadzą do utraty ich wraŜliwości na efektory allosteryczne. nie zmieniając jednocześnie ich aktywności katalitycznej. Wybiórczą denaturacje miejsc allosterycznych moŜna spowodować działając związkami rtęci, mocznikiem, promieniowaniem X, enzymami proteolitycznymi, roztworami o skrajnych wartościach siły jonowej lub pH, przechowywaniem w temp. 0—5°C, zamraŜaniem lub ogrzewaniem.

126 / ROZDZIAŁ 11

2. Efektory ałlosteryczne, w odróŜnieniu od substratów, często zabezpieczają miejsce katali tyczne przed denaturacją. Wydaje się mało prawdopodobne, aby związanie efektora z miej scem katalitycznym zapobiegało denaturacji, podczas gdy związanie substratu nie. Sugeruje to istnienie drugiego miejsca allosterycznego w innej części cząsteczki enzymu. 3. Enzymy pewnych mutantów komórek ba kteryjnych i ssaków wykazują zmienione właś ciwości regulatorowe, mimo identycznych 2 ty pem dzikim (z którego mutant powstał) właś ciwości katalitycznych. Miejsca ałlosteryczne i katalityczne są zatem odmienne genetycznie. 4. Badania dotyczące wiązania substratów i efektorów aU o sferycznych wykazały, Ŝe wiąŜą się one niezaleŜnie od siebie. 5. W niektórych przypadkach miejsce ałlo steryczne i miejsce katalityczne są umiejscowio ne w odrębnych podjednostkach. Enzymy allosteryczne charakteryzuje sigmoidalny przebieg krzywej kinetyki wiązania substratu Na rycinie 11 -6 przedstawiono zaleŜność szybkości reakcji katalizowanej przez typowy enzym allosteryczny od stęŜenia substratu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego. W nieobecności inhibitora allosterycznego krzywa nasycenia substratem ma kształt hiperboli, podczas gdy w jego obecności ma kształt

sigmoidamy; przy duŜych stęŜeniach substratu krzywa sigmoidalna moŜe się łączyć z krzywą hiperbo liczną. Analogiczną zaleŜność obserwuje się w przypadku krzywych nasycenia O2 dla mioglobiny i hemoglobiny (p. rozdz, 7). Na podstawie analizy kinetyki reakcji wykazano, Ŝe hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne moŜe mieć charakter kompetycyjny, niekompetycyjny, częściowo kompetycyjny lub inny. Jeśli przy duŜych stęŜeniach S aktywność enzymu w obecności i nieobecności inhibitora allosterycznego jest porównywalna, to kinetycznie reakcja odpowiada hamowaniu kompetycyjnemu. Sigmoidalny, a nie hiperboliczny, przebieg krzywej nasycenia substratem uniemoŜliwia jednak w przypadku hamowania allosterycznego określenie charakterystycznych wielkości za pomocą metody stosowanej w przypadku hamowania kompetycyjnego w miejscu katalitycznym, tj. graficznego przedstawienia danych jako liniowej funkcji odwrotności stęŜenia substratu i szybkości reakcji. Przyczyną jest fakt, Ŝe inhibitory ałlosteryczne wiąŜą się w innym miejscu {allosterycznym} niŜ analog substratu. Sigmoidalny charakter krzywej zaleŜności v od S w obecności inhibitorów allosterycznych odzwierciedla zjawisko kooperatywności. Przy małych stęŜeniach S aktywność w obecności inhibitora, w porównaniu z aktywnością w jego nieobecności, jest mała. Jednak, w miarę zwiększania się stęŜenia S, hamowanie się zmniejsza. Wskazuje to na istnienie 2 lub więcej wzajemnie na siebie oddziałujących miejsc wiązania substratu. Obecność cząsteczki substratu w jednym miejscu katalitycznym ułatwia wiązanie drugiej cząsteczki substratu w drugim miejscu. Zjawisko kooperatywności wiązania substratu przedstawiono w rozdz. 7 dotyczącym hemoglobiny. Sigmoidalny przebieg krzywej nasycenia O% jest wynikiem kooperatywnego oddziaływania między miejscami wiąŜącymi O2 umiejscowionymi w róŜnych podjednostkach. W wyniku oddziaływań allosterycznych zmienia się wartość Km lub Vmaka. Odnoszenie określeń „kompetycyjny" lub „niekompetycyjny" z substratem do kinetyki hamowania allosterycznego moŜe wprowadzać w błąd. Słuszniejszym wydaje się podział enzymów podlegających regulacji na 2 grupy, tj. enzymy serii K i enzymy serii V. W-przypadku enzymów allosterycznych serii K kinetyka nasycenia substratem jest kompetycyjna w sensie

Ryc. 11 -6. Sigmoidalna krzywa wiązania substratu w obecności inhibitora allosterycznego.

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚĆ! / 127

zwiększenia wartości Km (zmniejszenie powinowactwa dp substratu) i braku wpływu na wartość Vmaks. Natomiast w przypadku enzymów allosterycznych serii V efektor allosteryczny zmniejsza wartość Vmai£s. (zmniejszenie sprawności katalitycznej) bez widocznego wpływu na wartość Km. Zmiany wartości Km i Vmai;S. wynikają prawdopodobnie ze zmian konformacyj-nych w miejscu katalitycznym wywołanych związaniem efektora all o sferycznego w miejscu allosterycznym. Dla enzymów allosterycznych serii K skutkiem zmian konformacyjnych moŜe być osłabienie wiązań pomiędzy substratem a resztami amin okwa sowy mi w miejscu wiąŜącym substrat. Odpowiednio dla enzymów allosterycznych serii V pierwotnym skutkiem moŜe być zmiana orientacji przestrzennej reszt katalitycznych, prowadząca do zmniejszenia wartości Vmaks.- Zmiany konformacyjne mogą mieć równieŜ pośredni wpływ na wartości K_m i Vma)(S, Kooperatywne wiązanie substratu ma istotne znaczenie fizjologiczne Fizjologiczne następstwa kooperatywnego wiązania substratu są analogiczne jak w przypadku efektów kooperatywnego wiązania O2 przez hemoglobinę. Przy małym stęŜeniu substratu efektor allosteryczny jest skutecznym inhibitorem. Jego oddziaływanie regulatorowe jest więc najbardziej efektywne w warunkach największego zapotrzebowania, tj. kiedy wewnątrzkomórkowe stęŜenie substratu jest małe. Wraz ze zwiększeniem dostępności substratu ścisła regulacja staje się mniej konieczna. W miarę zwiększania stęŜenia substratu stopień hamowania maleje i w rezultacie powstaje więcej produktu. Podobnie jak w przypadku hemoglobiny, sigmoidalna krzywa nasycenia substratem świadczy o tym, Ŝe względnie małe zmiany stęŜenia substratu powodują duŜe zmiany aktywności. W ten sposób poprzez małe zmiany stęŜenia substratu jest osiągana czuła kontrola aktywności katalitycznej enzymu. Ponadto, analogicznie do zróŜnicowania krzywych nasycenia O2 hemoglobin odmiennych gatunków, sigmoidalne krzywe nasycenia enzymów regulatorowych, pochodzących z róŜnych źródeł, mogą być przesunięte w lewo lub w prawo w zaleŜności od istniejącego in vivo stęŜenia substratu.

REGULACJA NA ZASADZIE SPRZĘśENIA ZWROTNEGO NIE JEST SYNONIMEM HAMOWANIA PRZEZ SPRZĘśENIE ZWROTNE Zarówno w komórkach ssaków, jak i bakterii produkty końcowe, działając na zasadzie „sprzęŜenia zwrotnego", kontrolują swoją syntezę. W wielu przypadkach mechanizm tego zjawiska polega na hamowaniu enzymu katalizującego początkowe etapy biosyntezy. NaleŜy jednak odróŜnić regulację na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego, stanowiącą jedynie określenie fenomenologiczne, od hamowania przez sprzęŜenie zwrotne stanowiącego mechanizm regulacji wielu enzymów bakterii i ssaków. Na przykład cholesterol zawarty w diecie ogranicza syntezę cholesterolu z octanu w tkankach ssaków. Ta regulacja na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego nie polega jednak na hamowaniu przez sprzęŜenie zwrotne enzymu katalizującego pierwsze etapy biosyntezy cholesterolu, ale cholesterol lub jego metabolit powoduje zmniejszenie ekspresji genu kodującego reduktazę HMG-CoA. Cholesterol bezpośrednio nie ma natomiast Ŝadnego wpływu na aktywność reduktazy HMG-CoA. REGULACJA KLUCZOWYCH ENZYMÓW SSAKÓW MOśE POLEGAĆ NA ICH ODWRACALNYCH MODYFIKACJACH KOWALENCYJNYCH Aktywność katalityczna enzymów moŜe być regulowana za pomocą odwracalnych modyfikacji, polegających na przyłączaniu grup fosforanowych (głównie u ssaków) lub nukleotydów (głównie u bakterii). Enzymy ulegające modyfikacjom wpływającym na ich aktywność są określane jako enzymy o wewnątrzcząsteczkowej zmienności (ang. interconvertible enzymes) (ryc. 11-7). Enzymy te występują w 2 formach róŜniących się sprawnością katalityczną. W zaleŜności od rodzaju enzymu formą o większej aktywności katalitycznej moŜe być postać ufosforylowana lub defosforylowana (tab. 11-2). Enzymy mogą mieć wiele miejsc fosfory lacji Fosforylacji ulega swoista reszta Ser lub rzadziej Tyr, z utworzeniem odpowiednio Ofosfoserynowej lub O-fosfo tyrozyn owej po-

128 / ROZDZIAŁ 11 P-Enz NMP-Enz Ryc. 11-7. ATP ADP

Enz-Ser>O-PO,
Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej. Strona lewa: fosforylacja. Strona prawa: nukleotydylacja. W przypadku obu procesów trifosforanem nukleozydu (NTP) jest zazwyczaj ATP, Tabela 11-2. Wybrane przykłady enzymów ssaków, których aktywność katalityczną warunkuje fosforylacja-defosforylacja. E — forma defosforylowana, EP — forma ufosforylowana Enzym Aktywność mała duŜa Ka r bo ks y I aza a cety I o - Co A Syntaza glikogenowa Dehydrogenaza pirogronianowa Reduktaza HMG-CoA Fosforylaza glikogenowa Liaza cytrynianowa Kinaza fosforylazy b Kinaza reduktazy HMG-CoA

:

Ryc. 11-8. Regulacja aktywności enzymu w wyniku modyfikacji kowalencyjnej, polegającej na fosforylacji i defosiorylacjt reszty Ser.

EP E EP E EP E EP E E EP E EP E EP E EP

fosfataz, chociaŜ ich aktywność jest równieŜ regulowana. Aktywność zarówno kinaz, jak i fosfataz białek jest kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy, przy czym szczegółowy mechanizm tej regulacji nie jest w wielu przypadkach poznany. Regulacja przez fosforylację i dafosforylację zuŜywa ATP Reakcje przedstawione na ryc. 11-8 przypominają wzajemne przekształcenia glukozy i glukozo-6-fosforanu oraz fruktozo-6-fosforanu i fruktozo-l,6-bisfosforanu (p. rozdz. 19). W wyniku fosforylacji, a następnie defosforylacji 1 mola substratu (enzymu lub cukru) hydrolizie ulcg;i 1 mol ATP. Sugeruje to, Ŝe aktywność kinaz (katalizujących reakcje 1 i 3) i fosfataz (katalizujących reakcje 2 i 4) jest wzajemnie regulowana, bowiem w przeciwnym razie powodowałyby one niekontrolowaną hydrolizę ATP.
1. 2. Glukoza + ATP -+ ADP + Giukozo-6-P H,O + Glukozo-6-P -* P\ + Glukoza HaO + ATP -» ADP + P;

chodnej. Mimo Ŝe enzymy mogą zawierać wiele reszt Ser lub Tyr, fosforylacja ma charakter wybiórczy i dotyczy tylko niektórych z nich. Przypuszczalnie reszty te nie wchodzą w skład miejsca katalitycznego, przynajmniej w sensie struktury pierwszorzędowej, ale stanowią następny przykład miejsca allosterycznego. Białkami przekształcającymi są kinazy i fosfatazy białek Fosforylację i defosforylację katalizują odpowiednio kinazy i fosfatazy białek (białka przekształcające — ang. converter proteins), które w pewnych szczególnych przypadkach same mogą ulegać tym modyfikacjom kowalencyjnym (ryc. 11-8, tab. 11-2). Istnieją więc kinazy kinaz białek i fosfatazy kinaz białek katalizujące wewnątrzcząsteczkowe zmiany enzymów odpowiedzialnych za fosforylację innych enzymów. Mniej są" natomiast przekonujące dowody o fosforylacji i defosforyjacji

Netto: 3. 4.

Enz-Sar-OH + ATP — ADP + Enz-Ser-O-P HaO + Enz-Ser-O-P -» P, + Enz Ser-OH HaO + ATP -> ADP + Pf

Netto:

Modyfikacje kowalencyjne, podobnie jak hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne, regulują przepływ metabolitów Regulacja aktywności enzymów, w wyniku fosforylacji i defosforylacji wykazuje analogie z regulacją na zasadzie hamowania przez sprzę-

ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOŚCI / 129

Ŝenię zwrotne. Oba mechanizmy regulują przepływ metabolitów w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne, nie wywołując zmian w ekspresji genów, obejmując enzymy początkowych etapów szlaków metabolicznych (często biosyntez) oraz działając poprzez zmiany w miejscu allosterycznym, a nie katalitycznym. Jednak hamowanie przez sprzęŜenie zwrotne dotyczy pojedynczego białka i nie podlega regulacji hormonalnej i nerwowej. Przeciwnie regulacja aktywności enzymów ssaków w wyniku fosforylacji i defosforylacji obejmuje wiele białek oraz ATP lub inne trifosforany nukleozydów, a takŜe jest bezpośrednio kontrolowana przez układ hormonalny i nerwowy.

PIŚMIENNICTWO
Crabtree B, Newsholme EA: A systematic approach to describing and analyzing metabolic control systems. Trends Biochem Sci 1987;12:4. Kacser H, Porteus JW: Control of meta boli sm: What Nestler EJ, Greengard P: Protein phosphorylation in the brain. Naturę l983;305:583. Soderling TR; Role of hormones and protein phosphorylation in metabolit regulation. Fed Proc I982;41;2615. Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. MeGraw-Hill, 1989. Weber G (editor): Advances in Emyme Regulatiots. Pergamon Press, 1963—1990.

9 — Biochem in

CZĘSC Bioenergetyka i metabolizm węglowodanów oraz lipidów Bioenergetyka
Peter A. Mayes, PhD, DSc

12
ENERGIA SWOBODNA JEST ENERGIĄ UśYTECZNĄ UKŁADU Zmiana energii swobodnej (AG) jest tą częścią zmiany energii całkowitej układu, która jest wykorzystywana do wykonania pracy, tzn. jest ona energią uŜyteczną, znaną w układach chemicznych jako potencjał chemiczny. Podstawowe prswa termodynamiki dotyczą równieŜ układów biologicznych Pierwsza zasada termodynamiki podaje, Ŝe energia całkowita układu i jego otoczenia jest stała. Jest to równieŜ prawo zachowania energii. Głosi ono, Ŝe w układzie zamkniętym Ŝadna zmiana nie powoduje straty bądź zysku energii. JednakŜe w obrębie tego układu zamkniętego, energia moŜne być przekazywana z jednej części układu do drugiej lub moŜe być przekształcona w inną formę energii. Na przykład w układzie biologicznym energia chemiczna moŜe być przekształcona w energię cieplną, elektryczną, mechaniczną lub energię promieniowania. Druga zasada termodynamiki podaje, Ŝe jeśli proces zachodzi samorzutnie, to musi się zwiększać entropia całkowita układu. Entropia jest miarą nieuporządkowania (bezładu molekularnego) układu. Przybiera ona wartości maksymalne z chwilą osiągnięcia przez układ równowagi. W warunkach stałej temperatury i ciśnienia zaleŜność między zmianą energii swobodnej (AG) układu reagującego a zmianą entropii

WPROWADZENIE Bioenergetyka, czyli termodynamika biochemiczna, zajmuje się badaniem zmian energetycznych towarzyszących reakcjom biochemicznym. Dostarcza ona podstawowych reguł wyjaśniających, dlaczego niektóre reakcje mogą zajść, a inne nie mogą. Układy niebiologiczne mogą wykorzystywać energię cieplną do wykonywania pracy. Natomiast układy biologiczne są zasadniczo izotermiczne i uŜywają energię chemiczną do napędzania procesów Ŝyciowych. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Do prawidłowego przebiegu procesów Ŝyciowych jest wymagane odpowiednie „paliwo" dostarczające energii. Znajomość sposobu, w jaki organizm czerpie energie z poŜywienia, jest podstawą zrozumienia prawidłowego odŜywiania i metabolizmu. JeŜeli dostępne rezerwy energetyczne ulegną wyczerpaniu, to dochodzi do śmierci głodowej. Pewne formy wadliwego odŜywiania są związane z brakiem równowagi energetycznej (marazm). Szybkość uwalniania energii, mierzona szybkością metabolizmu, jest regulowana przez hormony tarczycy, której niedoczynność wywołuje chorobę. Wynikiem magazynowania nadmiaru energii jest otyłość, jedna z najbardziej powszechnych chorób społeczeństw zachodnich.

132 / ROZDZIAŁ 12

(AS) ujmuje następujące równanie, które łączy 2 zasady termodynamiki:
AG = AH - TAS

czenie lub sprzęŜenie z reakcjami oksydacyjnymi. W najprostszej formie ten typ sprzęŜenia moŜna przedstawić tak, jak na ryc. 12-1. ,M 3

gdzie AH oznacza zmianę entalpii (ciepło), a T oznacza temperaturę bezwzględną. W warunkach reakcji biochemicznych, poniewaŜ AH równa się w przybliŜeniu całkowitej zmianie energii wewnętrznej (AE) reakcji, powyŜszą zaleŜność moŜna wyrazić następująco: AG = AE - TAS JeŜeli AG ma znak ujemny, to reakcja zachodzi samorzutnie z utratą energii swobodnej, tzn. jest egzoergiczna. Jeśli wartość AG jest duŜa, to reakcja zachodzi właściwie aŜ do końca i jest zasadniczo nieodwracalna. JeŜeli AG ma wartość dodatnią, to reakcja zachodzi tylko wówczas, gdy energia swobodna moŜe być pobrana z zewnątrz, tzn. reakcja jest endoergiczna. Jeśli wartość AG jest duŜa, to układ jest trwały i charakteryzuje się brakiem lub tylko niewielką skłonnością do reagowania. JeŜeli AG równa się zeru, układ jest w stanie równowagi i nie zachodzą Ŝadne zmiany. Gdy reagenty znajdują się w stęŜeniach 1,0 mol/l, AGC oznacza standardową zmianę energii swobodnej. Dla reakcji biochemicznych jako warunki standardowe przyjęto umownie pH 7,0. Standardową zmianę energii swobodnej w tych standardowych warunkach (tzn. w pH 7,0) oznacza się jako AG0' Standardową zmianę energii swobodnej moŜna obliczyć, znając stałą równowagi K'eq
AG°' = -2,303 RT logK'eq

4
b
Ciepło

fi
Ryc. 12-1.

SprzęŜenie reakcji egzoergicznej z en doergiczna. ________

gdzie R jest stałą gazową, a T oznacza temperaturę bezwzględną (p. str. 95), NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w zaleŜności od stęŜeń róŜnych reagentów wartość AG moŜe być większa lub mniejsza od wartości AG"'. NaleŜy podkreślić, Ŝe w układach reakcji biochemicznych enzym tylko przyspiesza dojście do stanu równowagi i nigdy nie zmienia końcowych stęŜeń reagentów w stanie równowagi. PROCESY ENDOERGICZNE PRZEBIEGAJĄ W SPRZĘśENIU Z PROCESAMI EGZOERGICZNYMI Procesy Ŝyciowe, np. reakcje syntez, skurcz mięśniowy, przewodnictwo nerwowe i aktywny transport, czerpią energię przez chemiczne połą-

Przemiana metabolitu A w metabolit B zachodzi z uwolnieniem energii swobodnej. Przemiana ta jest sprzęŜona z inną reakcją, która wymaga energii swobodnej do przekształcania metabolitu C w metabolit D. PoniewaŜ część energii uwalnianej w reakcji degradacji jest przekazywana reakcji syntezy w innej postaci niŜ ciepło, nie naleŜy w przypadku tych reakcji uŜywać terminów chemicznych: reakcja egzotermiczna i reakcja endotermiczna. Zamiast nich uŜywa się określeń egzoergiczna lub endoergiczna, aby wskazać, Ŝe procesom towarzyszy odpowiednio strata lub zysk energii swobodnej, niezaleŜnie od formy energii biorącej udział w tych procesach. W praktyce, procesy endoergiczne nie mogą zachodzić samodzielnie, lecz musza być składnikiem sprzęŜonego układu egzoergiczno-endoergicznego, w którym wypadkowa zmiana netto jest egzoergiczna. Reakcje egzoergiczne określa się mianem katabolizm (degradacja lub utlenienie cząsteczek „paliwa"), natomiast reakcja syntez, w wyniku których powstają cząsteczki, określa się jako anabolizm. Wszystkie procesy kataboliczne i anaboliczne nazywa się ogólnie metabolizmem. Jeśli reakcja przedstawiona na ryc. 12-1 przebiega z lewa na prawo, to całemu procesowi musi towarzyszyć utrata energii swobodnej w postaci ciepła. Jeden z moŜliwych mecha-

BIOENERGETYKA / 133

nizmów sprzęŜenia mógłby polegać na uczestnictwie w obu reakcjach wspólnego koniecznego związku pośredniego (I),
A+C
I

B+D

W ten sposób są sprzęŜone niektóre reakcje egzoergiczne i endoergiczne w układach biologicznych. NaleŜy uświadomić sobie, Ŝe ten typ układu ma wbudowany mechanizm biologicznej kontroli szybkości procesów oksydacyjnych, poniewaŜ istnienie wspólnego koniecznego związku pośredniego powoduje, Ŝe szybkość zuŜycia produktu szlaku syntezy (D) warunkuje z kolei, przez jego działanie masowe, szybkość, z jaką ulega utlenieniu A. Istotnie, te wzajemne powiązania stanowią podstawę koncepcji kontroli oddechowej, procesu który zabezpiecza organizm przed spalaniem poza kontrolą. Rozwinięciem koncepcji sprzęŜeniowej są reakcje odwodornienia, sprzęŜone za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego z reakcjami uwodornienia (ryc. 12-2).
AH, BH;

Alternatywną metodą sprzęgania procesów egEoergicznych z' procesami endoergicznymi jest synteza związku bogatoenergetycznego w reakcji egzoergicznej i włączenie tego nowego związku w reakcję endoergiczną. Tym sposobem następuje przeniesienie energii swobodnej z procesu egzoergicznego do endoergicznego (ryc 12-3). Na rycinie 12-3 — © jest związkiem bogatoenergetycznym, a © jest odpowiadającym mu związkiem małoenergetycznym. Zaletą biologiczną tego mechanizmu jest to, Ŝe ®, w przeciwieństwie do I w poprzednim układzie, nie musi być strukturalną pochodną A, B, C lub D. W ten sposób związek ® moŜe shiŜyć jako przekaźnik energii pochodzącej z wielu reakcji egzoergicznych na równie duŜą liczbę reakcji lub procesów endoergicznych, jak to przedstawiono na ryc. J2-4.
PracMy
endoMglczne Syntezy

Rnkcja
«gioergiezne
Skurcz mięśni

B Przenośnik Przenośni k-H Transport aktywny

A

Ryc. 12-2. SprzęŜenie reakcji odwodornienia i uwodornienia za pośrednictwem przenośnika międzyenzymowego. Ryc. 12-3. Przeniesienie energii swobodnej z reak cji egzoergicznej do endoergicznej za pośrednict

Ryc. 12-4. Przekazanie energii endoergicznym procesom biologicznym przy udziale „uniwersalnego" pośrednika bogatoenergetycznego.

W Ŝywych komórkach najwaŜniejszym boga toenergetycznym związkiem pośrednim hib związkiem przenośnikowym (oznaczonym ~ ©) jest trifosfoadenozyna (ATP). FOSFORANY BOGATOEN ERG ETYCZNE ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W PRZEJMOWANIU I PRZENOSZENIU ENERGII
B

wem bogatoen erg etycznego metabolitu pośred niego. ___________________________

Wszystkie organizmy, w celu podtrzymania procesów Ŝyciowych, mus74 pobierać energię swobodną ze swojego środowiska. Organizmy

134 / ROZDZIAŁ 12

a u to troficzne sprzęgają swój metabolizm z pewnymi procesami egzoergicznymi zachodzącymi w ich otoczeniu, np. rośliny zielone wykorzystują energię słoneczną, a niektóre bakterie autotroficzne wykorzystują reakcję Fe2+
--------------------------------------------------------------------------------------

> Fe3+. Natomiast organizmy heterntroficzne uzyskują energię swobodną przez sprzęŜenie ich metabolizmu z degradacją złoŜonych cząsteczek organicznych występujących w ich środowiskach. We wszystkich tych procesach ATP odgrywa kluczową rolę w przenoszeniu energii swobodnej z procesów egzoergicznych na procesy endoergiczne {ryc. 12-3 i 12-4). ATP jest wyspecjalizowanym nukleotydem zawierającym adeninę, ryboze i 3 grupy fosforanowe (ryc. 12-5). W komórce ATP uczestniczy w reakcjach w postaci kompleksu z Mg2+ (ryc. 12-6).

od dostarczenia energii pochodzącej z procesów utleniań przebiegających w mięśniach. Rola tych związków w bioenergetyce była wyraźnie niedoceniana, aŜ do czasu gdy Lipmann wprowadził pojęcie „fosforanów bogatoenergetycznych" i „fosforanowych wiązań bogatoenergetycznych". Pośrednia wartość energii swobodnej hydrolizy ATP, w porównaniu z innymi fosforanami organicznymi, ma istotne znaczenie bioenergetyczne Standardową energię swobodną hydrolizy niektórych biochemicznie waŜnych fosforanów przedstawiono w tab. 12-1. Na podstawie daTabela 12-1. Standardowa energia swobodna hydrolizy niektórych biochemicznie waŜnych fosł+ foranów organicznych AG" Fosforan organiczny kj/mof kcal/mol -14 ,8 -12,3 -11,8 -10,3 - 7,3 - 6,6 6,6 5,0 3,8 3,4 3,3 2,2

0i

O-P-O-P-O-P-O-CHS

o-

° ° °

u

»

n

kw
HO OH

l

O

Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-Bisfosfogliceryntan (do 3-fosfoglicerynian) Fosfokreatyna ATP ---------- ► ADP + Pf

-61,9 -51,4 -49,3 -43,1 -30,5 -27,6 -27,6 -20,9 -15,9 -14,2 -13,8 - 9,2

Ryc. 12-5. Adenozynotrifosforan (ATP).

ADP-----------» AMP + P, Pirofosforan Glukozo-1 -fosforan Fruktozo-6-f osf ora rt
AMP

o~ o-

o~

Glukozo-6-fosforan Glicerolo-3-fosforan

-0-P-O-P-O-P-O- Adenozyna M II II 0 0 0 Ryc. 12-6. Magnezowy kompleks ATP. {Podobnie wygląda kompleks Mg-ADP).

* Pi —fosforan nieorganiczny. + Wartości dla ATP i większości pozostałych związków na podstawie Krebsa i Kornberga (1957).

Znaczenie fosforanów w metabolizmie pośrednim stało się jasne wraz z poznaniem chemicznych szczegółów glikolizy oraz roli ATP, difosfoadenozyny (ADP) i fosforanu nieorganicznego (Pj) w tym procesie (p. str. 213). Przyjęto, Ŝe ATP jest pośrednikiem w przenoszeniu rodników fosforanowych w procesie fosforylacji. Rolę ATP w energetyce biochemicznej sugerowały dane doświadczeń, wskazujących, Ŝe podczas skurczu mięśniowego' rozpada się ATP j fosfokreatyna, a ich ponowna synteza zaleŜy

nych AG°' hydrolizy (oznaczanej w temp. 37°C) moŜna ocenić porównawczo skłonność kaŜdej z grup fosforanowych do przejścia na odpowiedni akceptor. Jak widać z tabeli, wartość — 30,5 kJ/mol dla hydrolizy końcowego fosforanu ATP dzieli wymienione związki na 2 grupy. Jedną grupę stanowią fosforany małoenergetyczne, reprezentowane przez estry fosforanowe uczestniczące w glikohzie, dla których wartość AG°' hydrolizy jest mniejsza niŜ dla ATP, natomiast w drugiej grupie, określanej mianem

BIOENERGETYKA / 135

fosforany bogatoenergetyczne, wartość jest większa niŜ dla ATP. Składniki tej ostatniej grupy, obejmującej ATP i ADP, są zwykle bezwodnikami (np. fosforan-1 w 1,3 -bis fosfo glicery nianie), enolofosforanami (np. fosfoenolopirogroniań) lub fosfoguanidynami (np. fosfokreatyna, fosfoarginina). Środkowa pozycja ATP pozwala mu odgrywać istotną rolę w przenoszeniu energii. Inne biologicznie waŜne „związki bogatoenergetyczne" to estry tioiowe zawierające koenzym A (np. acetylo-CoA), białko przenoszące reszty acylowe kwasów tłuszczowych (ang. acyl carrier protein; ACP), estry aminokwasów uczestniczące w syntezie białek, S-adenozylometionina (aktywny metyl), UDP-Glc (urydynodifosfoghikoza) i PRPP (5-fosforybozylo-l-pirofosforan).
Fosforany bogatoenergetyczne oznacza się symbolem ~ ©

powodu, niektórzy preferują określenie potencja! przenoszenia grupy zamiast wiązanie bogatoenergetyczne. ATP więc zawiera 2 bogatoenergetyczne grupy fosforanowe, a ADP zawiera 1; natomiast fosforan w AMP (adenozynomonofosforanie) jest typu małoenergetycznego, poniewaŜ jest połączony zwykłym wiązaniem estrowym (ryc, 12-7).
FOSFORANY BOGATOENERGETYCZNE DZIAŁAJĄ JAKO OBIEGOWA MONETA ENERGETYCZNA KOMÓRKI

W celu zaznaczenia obecności bogatoenergetycznej grupy fosforanowej, Lipmann wprowadził symbol ~®, oznaczający bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe. Symbol ten wskazuje, Ŝe dołączona do tego wiązania grupa, po przeniesieniu na odpowiedni akceptor, przekaŜe większą ilość energii swobodnej. Z tego
lub Adenozyno

r
Ad en oz yn o- 0 -P M O -

Adenozynotrlfostoran (ATP)

o0

o-

Adeno,2yno - 0 - P - ©/—P II """"T

o-

0

lub Adenozyno- (&)—(?) Adenozynodltosforan (ADP)

0
Adenozyno -O - P - 0 ~ lub Adenozyno — (ji) Adenozynomonofosforan (AMP)

h

Ryc. 12-7. Struktura ATP, ADP i AMP ukazująca połoŜenie i liczbę fosforanów bogato en erg etycznych (~).

Dzięki swemu połoŜeniu, pośrodku listy standardowych energii swobodnych hydrolizy (tab. 12-1), ATP moŜe być donorem fosforanu bogatoenergetycznego dla związków znajdujących się w tabeli poniŜej ATP. Z tego samego powodu, w obecności odpowiednich enzymów, ADP moŜe być akceptorem fosforanu bogatoenergetycznego od związków znajdujących się w tabeli powyŜej ATP; w reakcji tej powstaje ATP. W istocie, cykl ATP/ADP łączy procesy generujące ~© z procesami zuŜywającymi ~® (ryc. 12-8). W ten sposób ATP jest stale zuŜywany 1 odtwarzany. Zasadniczym źródłem MS są 3 procesy uczestniczące w wychwytywaniu energii, czyli zachowaniu energii: 1. Foforylacja oksydacyjna. Jest to ilościowo największe źródło ~ ® w organizmach tlenowych. Energia swobodna, napędzająca ten proces, pochodzi z utlenian w mitochondriainym łańcuchu oddechowym (p. str. 153). 2. Glikoli/a. W wyniku przemiany do mleczanu z 1 mola glukozy uzyskuje się netto 2 ~©, tworzone w 2 reakcjach katalizowanych odpowiednio przez kinazę fosfogliceryniartową i kinazę pirogronianową (p. ryc. 19-2). 3. Cykl kwasu cytrynowego. Bezpośrednio w cyklu po wstaje jeden ~ ®, na etapie katalizowanym przez syntetazę sukcynylo-CoA (p. ryc. 18-3). Inna grupa związków, fosfageny, stanowi zapasową formę fosforanów boga to energetycznych. NaleŜy do niej fosfokreatyna, występująca w mięśniach kręgowców i w mózgu, oraz fosfoarginina występująca w mięśniach bezkręgowców. W warunkach fizjologicznych fosfageny pozwalają utrzymać stęŜenie ATP w mięśniach w sytuacji, gdy ATP jest szybko zuŜywany, słuŜąc jako źródło energii do skurczu mięśniowego. Odwrotnie, w sytuacji gdy ATP jest pod dostatkiem, zwiększa się stęŜenie fosfage-

136 / ROZDZIAŁ 12
Fosfo1,3-B isfosfog 11 ceryn i a n anolopirogronian Fosforylacja oksydacyjna Sukcynyto -CoA

ga toenergetyczny z mitochondriów do sarkolemy i działa jako bufor bogatoenergetyczny. Ten bufor moŜe mieć waŜne znaczenie w mięśniu sercowym, odgrywając rolę natychmiastowej osłony przed skutkami zawału. Gdy ATP działa jako donor fosforanu z utworzeniem związku charakteryzującego się niniejszą energią swobodną hydrolizy (tab. 12-1), grupa fosforanowa przekształca się zawsze w grupę małoenergetyczną, np.
KINAZA G LICE ROLO W A

Glicerol +Adenozyno-? Glicerolo-n + Adenozyno-® ~®

Inne fosfory I acje, aktywacje i procesy endoerglczne

Gl I ce ra to-3-f osf □ ran Gl ukozo-6fosforan Glukoza-1,6blsfosforan Ryc. 12-8. Rola cyklu ATP/ADP w przenoszeniu ■fosforanu bogatoenergetycznego. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe — © nie występuje w stanie wolnym, ale w takiej postaci jest przenoszony we wskazanych reakcjach.

ATP pozwala sprząc reakcje tertnodynamicznie niekorzystne z reakcjami termodynamicznie korzystnymi Na rycinie 12-1 oraz 12-3 przedstawiono szczegółowo energetykę reakcji sprzęŜonych. Tego rodzaju reakcją jest pierwsza reakcja ciągu glikoli tycznego (p. ryc. 19-2), fosforylacji glukozy do giukozo-6-fosforanu. Jest ona bardzo endoergiczna i nie moŜe przebiegać samodzielnie w warunkach fizjologicznych.
1. Glukoza+ P ^Glukozo-6-fosforan +

(AG°'=+13,8kJ/mol) Aby reakcja mogła zajść, musi zostać sprzęŜona z inną reakcją, która jest bardziej egzoergiczna niŜ fosforylacja glukozy endoergiczna. Taką reakcją jest hydroliza końcowego wiązania fosforanowego w ATP,
2. ATP

nów słuŜących jako zapas fosforanów bogatoenergetycznych (ryc. 12-9). W mięśniach „czółenko fosfokreatynowe" transportuje fosforan bo-

(AG°'= -30,5 kJ/mol) Gdy (1) i (2) są sprzęŜone w reakcji katalizowanej przez heksokinazę, fosforylacja glukozy przebiega bc/. trudu w bardzo tgzoergicznej reakcji, która w warunkach fizjologicznych jest daleka od równowagi i z tego powodu praktycznie nieodwracalna.
MEKSOKINAZA

KINAZA 1 KREATYNOWA
C

t

H3CN CH, COOH Fosfokreatyna

C=MH-«*-

*T
ADP ATP

CHi

= -12,6 kJ/mol)

COOH

Kfeatyna

Ryc. 12-9. Przenoszenie fosforanu bogatoenergetycznego z fosfokreatyny ń'a ADP i z ATP na kreatynę, „Czółenko fosfokreatynowe".

Glukoza + ATP

---------- ► Gliikozo-6-fosforan+ADP <AG° '= 16,7 kJ/mol)

BIOENERGETYKA / 137

Wiele reakcji „aktywacji" zachodzi w ten sposób. Kinaza adenylanowa umoŜliwia wzajemną przemianę nukleotydów adenino wych Kinaza adenylanowa (miokinaza) jest enzymem występującym w większości komórek. Katalizuje ona przemianę ATP i AMP w ADP:
KINAZA ADENYLANOWA

Kombinacja pąwyŜszych reakcji umoŜliwia obieg fosforanu i przemianę wzajemną nukleotydów adeninowych (ryc. 12-10).
PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

ATP +■ AMP «-

-> 2 ADP

Reakcja ta spełnia 3 zadania: 1. UmoŜliwia wykorzystanie fosforanu bogatoenergetycznego w ADP do syntezy ATP. 2. UmoŜliwia refosforylację AMP, powstałe go z ATP w róŜnych reakcjach aktywacji. 3. UmoŜliwia zwiększenie stęŜenia AMP wraz ze zmniejszeniem się stęŜenia ATP. AMP działa jako sygnał metaboliczny (allosteryczny) do zwiększenia szybkości reakcji katabolicznych, które z koiei prowadzą do tworzenia większych ilości ATP (p. str. 246). Gdy ATP uczestniczy w reakcjach z utworzeniem AMP, wówczas powstaje pirofosforan nieorganiczny (PPi) Następuje to np. w reakcji aktywacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych:
SYNTETAZA ACYLO-CoA

Ryc. 12-10. Cykle fosforanowe i przemiana wzajemna nukieotydów adeninowych.

RównieŜ inne trifosfonukleozydy uczestniczą w przenoszeniu fosforanu bogatoene rgety cz n eg o Przy udziale kinazy difosfonukleozydowej z odpowiednich difosforanów mogą być syntetyzowane trifosfonukleozydy podobne do ATP, ale zawierające inną zasadę niŜ adenina, np.

ATP + HS—CoA + R—COOH AIWP + PP,+ R—CO—SCoA

KINAZA DIFOSFONUKLEOZYDOWA

Reakcji towarzyszy utrata energii swobodnej w postaci ciepła, co gwarantuje przebieg reakcji aktywacji w prawo. Jest ona dodatkowo wspomagana przez hydrohtyczne rozszczepienie PPj (AG°r = — 27,6 kJ/mol), katalizowane przez pirofosfatazę nieorganiczną. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w wyniku reakcji aktywacji, zachodzącej z utworzeniem pirofosforanu, dochodzi do utraty 2~©, a nie l~®, jak w przypadku reakcji z utworzeniem ADP i Pj.
PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA

ATP+UDP ADP+UTP
(u r yd y n ot r if osfo ra n)

ATP+GDP ADP-rGTP
(guanuzynotrifosforan)

ATP+CDP

—<■ ADP+CTP (cytydynotrifosforan)

i + HzO

2P,

Wszystkie te trifosforany uczestniczą w reakcjach fosforylaeji zachodzących w komórce. Podobnie kinazy monofosfonukleozydowe, swoista dla nukleozydów purynowych i swoiste dla nuk]eozydów pirymidynowych, katalizują reak-

138 / ROZDZIAŁ 12

cje tworzenia disfosfonukleozydów z odpowiednich monofosforanów:
SWOISTA KINAZA MONOFOSFO NUKLEOZYDOWA

PIŚMIENNICTWO
Ernsier L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Harold FM; The Vitat Force: A Study of Bioenergetics. Freeman, 1986. Klotz IM: Introduclion to Biomolecular Energetics. Academic Press, 1986, Krebs HA, Kornberg HL: Energy Transformatwns in Living Matter. Springer, 1957. Lehninger AL: Bioenergetics: The Molecułar Basis of BiologicaJ Energy Transformatwns, 2nd ed, Benjamin, 1971.

ATP + Nukleozydo-J < ADP+ Nukleozydo-© ~©

Wynika z tego, Ŝe kinaza adenylanowa jest wyspecjalizowaną kinazą monoiosforanową.

Utleniania biologiczne
Peter A. Mayes, PhD, DSc

13

WPROWADZENIE
Chemicznie utlenianie definiuje się jako proces usuwania elektronów, natomiast redukcję jako proces przyłączania elektronów; ilustruje to reakcja utlenienia jonu Ŝelazawego w jon Ŝelazowy:

ZMIANY ENERGII SWOBODNEJ W UKŁADACH OKSYDACYJNO-REDUKCYJNYCH MOGĄ BYĆ WYRAśONE JAKO POTENCJAŁ RED.-OKS.
W reakcjach obejmujących utlenianie i redukcję wymiana energii swobodnej jest proporcjonalna do skłonności związków reagujących do oddawania lub pobierania elektronów. Stąd teŜ, oprócz wyraŜania zmian energii swobodnej jako AG°' (p. rozdz. 12), moŜliwe jest analogiczne wyraŜenie ich liczbowo jako potencjał oksydoredukcyjny lub red.-oks. układu (Eo')_ Zazwyczaj porównuje się potencjał oksydoredukcyjny układu (Eo) z potencjałem elektrody wodorowej, którego wartość w pH 0 określa się jako 0,0 woltów. Jednak w przypadku układów biologicznych przyjęło się wyraŜanie potencjału oksydoredukcyjnego (Eo'} w pH 7,0, w którym to pH potencjał elektrody wodorowej równa się -0,42 V. W tabeli 13-1 podano potencjały
Tabela 13-1. Niektóre potencjały oksydoredukcyjne o specjalnym znaczeniu w układach oksydoredukcyjnych ssaków Układ Bursztynian/cc-ketogluiaran H + /H2 NAD+/NADH Liponian/dihydroliponian Acetoocta n/J3- hydroksymaślan Piróg ronian/mleczan Szczawiooctan/jabłczan Flawoproteina -stary Ŝółty enzym; ult./zred. fumaran/bursztynian 3+ 2+ Cytochrom b; Fe /Fe Ubichinon/ubichinol 3+ 2+ Cytochrom c; Fe /Fe 3+ 2+ Cytochrom a; Fe /Fe Tlen/woda EO'[V1 -0,67 -0,42 -0,32 -0,29 -0,27 -0,19 -0,17 -0,12 + 0,03 + 0,08 + 0,10 + 0,22 + 0,29 + 0,82

J -+

e~ (elektron) Fe
3+

Wynika z tego, Ŝe utlenieniu zawsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. Ta reguła utleniania — redukcji obowiązuje równieŜ w układach biologicznych i jest zasadniczym pojęciem pozwalającym zrozumieć istotę utleniań biologicznych. NaleŜy podkreślić fakt, Ŝe wiele utleniań biologicznych moŜe zachodzić bez udziału tlenu cząsteczkowego np. procesy odwodorowania.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
ChociaŜ pewne bakterie (beztlenowce) Ŝyją w nieobecności tlenu, Ŝycie wyŜszych gatunków zwierząt jest bezwzględnie zaleŜne od obecności tlenu. Głównym procesem zuŜywającym tlen jest oddychanie tkankowe, które moŜna określić jako proces kontrolowanej reakcji wodoru z (Jenem i tworzenia wody, w którym komórka uzyskuje energię w postaci ATP. Poza tym tlen cząsteczkowy jest wbudowywany do róŜnych substratów przez enzymy określane mianem oksygenaz; wiele leków, chemicznych zanieczyszczeń środowiska i chemicznych karcynogenów (ksenobiotyków) jest meta boi izowanych przy udziale tej klasy enzymów, określanych jako system cytochromu P-450. Podawanie tlenu chorym z niewydolnością oddechową lub krąŜeniową moŜe uratować im Ŝycie, a sporadyczne podawanie tlenu pod wysokim ciśnieniem (hiperbaria) ma równieŜ zastosowanie kliniczne, aczkolwiek moŜe to prowadzić do wystąpienia toksycznych działań tlenu.

140 / ROZDZIAŁ 13

oksy do redukcyjne niektórych biologicznych układów oksydoredukcyjnych, szczególnie interesujących w biochemii ssaków. Na podstawie przedstawionych w tabeli wartości potencjałów oksy do redukcyjnych moŜna przewidzieć kierunek przepływu elektronów z jednej pary oksyd o redukcyjnej na drugą. ENZYMY UCZESTNICZĄCE W UTLENIANIU I REDUKCJI OKREŚLA SIĘ MIANEM OKSYDOREDUKTAZ Oksydoreduktazy podzielono na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. OKSYDAZY UśYWAJĄ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORU Oksydazy katalizują oderwanie wodoru z substratu w reakcji, w której tlen jest biorcą wodoru*. Produktem reakcji jest woda lub nadtlenek wodoru (ryc. 13-1).

końcowy akceptor — tlen. Oksydaza traci aktywność w obecności tlenku węgla, cyjanku lub siarkowodoru. Enzym ten równieŜ nazywano cytochromem a3. Początkowo przypuszczano, Ŝe cytochrom a i cytochrom a3 są związkami niezaleŜnymi, gdyŜ kaŜdy z nich ma inne widmo i róŜne właściwości w odniesieniu do działania tlenku węgla i cyjanku. W późniejszych badaniach wykazano, Ŝe te 2 cytochromy występują w tym samym białku, a kompleks jest znany jako cytochrom aa3. Zawiera on 2 cząsteczki hemu, z których kaŜda ma atom Fe występujący podczas utleniania i redukcji w formie Fe3+ lub Fe2+. Kompleks zawiera równieŜ 2 atomy Cu, kaŜdy z nich związany z jednostką hemową. Fcnolaza (tyrozynaza, oksydaza polifenolowa, oksydaza katecholowa) jest zawierającym miedź enzymem o szerokiej swoistości substratowej. Katalizuje ona przemianę monofenoli lub o-difenoli w 0-chinony. RównieŜ inne enzymy zawierają miedź. Niektóre oksydazy są flawoproteinami Enzymy flawo protein owe zawierają mononukleotyd flawinowy (FMN) lub dinukleotydflawinoadeninowy (FAD) jako grupy prostetyczne. FMN i FAD są wytwarzane w organizmie z witaminy — ryboflawiny (p. rozdz. 53). FMN i FAD są zwykle mocno — ale nie kowalencyjnie — związane z odpowiednim apoenzymem. Enzymy flawoproteinowe, określane mianem meltdoflawoprotein, zawierają jeden lub więcej metali, które są niezbędne do działania enzymu. Do tej grupy oksydaz zalicza się min. oksydazę L-aminokwasową, współdziałający z FMN enzym występujący w nerkach. Enzym ten katalizuje deaminację oksydacyjną naturalnie występujących L-aminokwasów. Szeroko rozpowszechniona jest oksydaza ksantynowa, której aktywność wykryto w mleku, jelicie cienkim, nerce i wątrobie. Zawiera ona molibden i odgrywa waŜną rolę w przemianie zasad purynowych w kwas moczowy (p. str. 425). Ma ona szczególne znaczenie w wątrobie i nerkach ptaków, które wydalają kwas moczowy jako główny azotowy produkt końcowy metabolizmu nie tylko puryn, iecz takŜe katabolizmu białek i aminokwasów. Dehydrogenaza aldehydowa jest enzymem związanym z FAD, występującym wwątrobie ssaków. Jest to tnetaloflawoproteina zawierająca molibden i Ŝelazo niehemowe, a działa na aldehydy i substraty N-heterocykliczne.

Ryc. 13-1. Utlenianie metabolitów katalizowane przez oksydazę (A) tworzącą wodę, (B) tworzącą H2O3.

Niektóre oksydazy zawierają miedź Oksydaza cytochromowa jest hemoproteiną szeroko rozpowszechnioną w wielu tkankach roślinnych i zwierzęcych. Jest ona końcowym przenośnikiem elektronów w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym, a zatem jest odpowiedzialna za reakcję, w której elektrony pochodzące z utleniania cząsteczek substratów przez dehydrogenazy są przenoszone na ich * Czasami nazwa „oksydaza" jest uŜywana jako ogólne określenie wszystkich enzymów, które katalizują reakcje wymagające udziału tlenu cząsteczkowego-

UTLENIANIA BIOLOGICZNE / 141 Przenośnik (Uli)
(Utl) Przenośnik(Zred) DEHYDROGENAZA SPECYFICZNA DLA A DEHYDflOGENAZA SPECYFICZNA DLft

8H,
(Zred) B (Utl)

Ryc. 13-2. Utlenianie metabolitów katalizowane przez dehydrogenazy, zachodzące bez udziału łań cucha oddechowego, ________

Interesująca, ze względu na zastosowanie w oznaczaniu stęŜenia glukozy, jest oksydaza glukozowa, FAD-zaJeŜny enzym otrzymywany z grzybów. Mechanizm reakcji oksydoredukcyjnych, katalizowanych przez te enzymy, jest złoŜony. JednakŜe są dowody na to, Ŝe redukcja pierścienia izoalloksazynowego zachodzi w 2 etapach przez pośredni związek semichinonowy (wolny rodnik) (ryc. 13-3). DEHYDROGENAZY NIE MOGĄ UśYWAĆ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORÓW Ta klasa obejmuje duŜą liczbę enzymów. Spełniają one 2 zasadnicze funkcje: a. Przenoszą wodory z jednego substratu na

drugi w sprzęŜonej reakcji oksydoredukcyjnej (ryc. 13-2). Te deriydrogenazy są swoiste względem ich substratów, ale często uŜywają tego samego koenzymu lub przenośnika wodorów co inne dehydrogenazy. PoniewaŜ reakcje są odwracaine, właściwości te pozwalają swobodnie przenosić równowaŜniki redukujące wewnątrz komórki. Ten typ reakcji, w której jeden subslrat utlenia się kosztem drugiego, jest uŜyteczny zwłaszcza w nieobecności tlenu umoŜliwia bowiem przebieg procesów oksydacyjnych, b. Jako składniki łańcucha oddechowego transportującego elektrony z substratu na tlen (ryc. 13-4). Niektóre dehydrogenazy są zaleŜne od koenzymów nikotynoamidowych Ta kategoria enzymów obejmuje liczną grupę dehydrogenaz, których koenzymem jest dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy (NAD+) lub fosforan dioukleotydu nikotynoamido-adeninowego (NADP+). Niektóre dehydrogenazy mogą uŜywać zarówno NAD+, jak i NADP+NAD+ i NADP+ są wytwarzane w organizmie 2 witaminy —• niacyny (p. ryc. 53-4). Koenzymy te ulegają redukcji przez swoisty substrat dehydrogenazy i reoksydacji przez właściwy akceptor elektronów (ryc. 13-5). Mogą one swobodnie i odwracalnie dysocjować od odpowiednich apoenzymów. Na ogół NAD-zaleŜne dehydrogenazy katalizują reakcje oksydoredukeji w oksydacyjnych

Ryc. 13-3. Redukcja pierścienia izoalloksazynowego w nukleotydach Ilawinowych.

[DEHYDROGENAŹA]

| DEHYPROGENAZAl Przenośnik

j PEHYDROSENAZAI Przenośnik-H,

[OKSYDAZA I Przenośnik

AH 3 (Utl) Przenośnik 2 (Utl)
y\przenośnlK-H,

A

lUtt)

1 (Zred)

(Zred) ostatecznie przez oksydazę w łańcuchu Ryc. 13-4. Utlenianie metabolitu przez dehydrogenazy oddechowym.

142 / ROZDZIAŁ 13

DEHYDFIOGENAZ A SWOISTA DLA A N

CONHj
Postać A

R

DEHYDROGENAZA SWOISTA DLA B

NAD+ + Ryc. 13-5. Mechanizm utleniania i redukcji koenzymów nikotynoamidowych. Nikotynoamid jest redukowany stereospecyficznie w pozycji 4 przez substrat AH2. Jeden z atomów wodoru zostaje oderwany od substratu jako anion wodorkowy H" (jądro wodoru z 2 elektronami) i przeniesiony na atom węgla w pozycji 4 nikotynoamidu, gdzie moŜe zostać przyłączony w połoŜeniu A lub B w zaleŜności od swoistości dehydrogenazy katalizującej tę reakcję. Drugi atom wodoru z pary wodorów oderwanych od substratu pozostaje w środowisku wolny jako kation wodorowy.

szlakach metabolizmu, np. w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego i mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. Z kolei NADP-zaleŜne dehydrogenazy są charakterystyczne dla syntez redukcyjnych, np. pozamitochondrialnej syntezy kwasów tłuszczowych i syntezy steroidów, NADP jest równieŜ koenzymem dehydrogenaz cyklu pentozofosforanowego. Niektóre dehydrogenazy zaleŜne od koenzymu nikotynoamidowego zawierają cynk, np. dehydrogenaza alkoholowa z wątroby i dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa z mięśni szkieletowych; jony cynku nie uczestniczą w reakcji oksydoredukcji. Niektóre dehydrogenazy są zaleŜne od ryboflawiny Grupy {lawinowe związane z tymi dehydrogenazami są podobne do FMN i FAD występujących w oksydazach. Zasadniczo są one ściślej związane ze swoimi apoenzymami niŜ koenzymy nikotynoamidowe. Większość dehydrogenaz ryboflawi nowych bierze udział w przenoszeniu elektronów w (lub dn) łańcuchu oddechowym. Dehydrogenaza NADH jest członem

bursztynianowa, dehydrogenaza acylo-CoA i mitochondrialna dehydrogenaza glicerolo-3-fosfo-

ranowa przenoszą równowaŜniki redukcyjne bezpośrednio z substratu na łańcuch oddechowy (p. ryc. 14-3). Inną rolą dehydrogenaz zaleŜnych od flawin jest udział w odwodorowaniu (przez dehydrogenazę dihydroliponianową) zredukowanego liponianu, związku pośredniego w dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu (p. ryc. 14-3). W tym szczególnym przypadku, z powodu niskiego potencjału o ksy do redukcyjnego, flawoproteina (FAD) działa jako przenośnik wodorów ze zredukowanego liponianu na NAD (p. ryc. 195). Flawoproteina przenosząca elektrony jest

pośredniczącym przenośnikiem elektronów między dehydrogenaza acylo-CoA a łańcuchem oddechowym (p. ryc. 14-3). Niektóre cytochromy mogą być traktowane jako dehydrogenazy Z wyjątkiem oksydazy cytochromowej (opisanej wcześniej), cytochromy są klasyfikowane jako dehydrogenazy. Ich identyfikację i badanie ułatwia właściwość występowania w stanie zredukowanym charakterystycznych pasm absorpcyjnych, które zanikają po utlenieniu cząsteczki. W łańcuchu oddechowym cytochromy
funkcjonują jako przenośniki elektronów między

łańcucha oddechowego działającym jako przenośnik elektronów między MADH a składnikami bardziej elektrododatnimi (p. ryc. 14-2). Inne dehydrogenazy, takie jak dehydrogenaza

UTLENIANIA BtOLOGiCZNE / 143

flawoproteinami a oksydazą cytochromową (p. ryc. 14-3-). Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi Ŝelazo, w których atom Ŝelaza podczas oksydoredukcji występuje naprzemiennie w postaci Fe3+ lub w postaci Fe2+. W łańcuchu oddechowym występuje kilka róŜnych cytochromów, mianowicie cytochromy b, Ci, c, a i a3 (oksydazą cytochromową). Spośród nich tylko cytochrom c jest rozpuszczalny w wodzie. Cytochromy występują równieŜ poza łańcuchem oddechowym, np. w siateczce endoplazmatycznej {cytochromy P-450 i b5).

go glutationu rozkład H2O2 i nadtlenków lipidów, zapobiegając w ten sposób utlenieniu lipidów błonowych i hemoglobiny przez nadtlenki (p. str. 233).

Katalaza uŜywa nadtlenku wodoru zarówno jako donora, jak i akceptora elektronów
Katalaza jest hemoproteiną zawierającą 4 grupy hemowe. Wykazuje ona aktywność peroksydazową oraz dodatkowo moŜe katalizować reakcję, w której jedna cząsteczka H3O2 jest substratem oddającym elektrony, a druga cząsteczka H2Oi jest utleniaczem, czyli akceptorem elektronów. W warunkach in vivo katalaza wykazuje zwykle aktywność peroksydazową.
KATALAZA

PEROKSYDAZY UśYWAJĄ NADTLENKU WODORU LUB NADTLENKÓW ORGANICZNYCH JAKO SUBSTRATÓW
Do tej kategorii zalicza się 2 typy enzymów: klasyczne peroksydazy i katalazę. Oba typy występują zarówno u zwierząt, jak i u roślin, Peroksydazy chronią organizm przed szkodliwymi nadtlenkami. Nagromadzenie się nadtlenków moŜe prowadzić do tworzenia wolnych rodników, co z kolei moŜe być przyczyną uszkodzenia błon itp. i jednym z czynników prowadzących do miaŜdŜycy i nowotworów (p. rozdz. 16).-

2 H2O2 2 H2O + O2

Peroksydazy redukują nadtlenki, uŜywając wielu róŜnych związków jako akceptorów elektronów
Aczkolwiek pierwotnie sądzono, Ŝe są enzymami roślinnymi, peroksydazy znajdują się w mleku, w leukocytach, płytkach krwi i innych tkankach metabolizujących eikozanoidy (p. str. 290). Grupą prostetyczną peroksydaz jest protonem, który przeciwnie niŜ w większości hemoprotein jest luźno związany z apoproteiną. W reakcji katalizowanej przez peroksydaze. nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem róŜnych związków, np. askorbinianu, chinonów i cytochromu c, które działają jako biorcy elektronów. Reakcja katalizowana przez peroksydaze jest złoŜona, ale jej ogólny zapis moŜna przedstawić następująco:
JPEROKSYDAZA

Występowanie katalazy stwierdzono we krwi, szpiku kostnym, błonach śluzowych, nerkach i wątrobie. Przyjmuje się, Ŝe rozkłada ona nadtlenek wodoru tworzony w reakcjach oksydaz. W wątrobie oraz wielu innych tkankach wykazano w komórkach obecność peroksysomów, które charakteryzują się duŜą aktywnością oksydaz i katalazy. Ten fakt sugeruje, Ŝe zgrupowanie enzymów wytwarzających H2O2 z enzymem rozkładającym nadtlenek wodoru jest biologicznie korzystne (ryc. 13-6). Poza

AH 2

A

- H2O5 I KATALAZA 2H;O

Ryc. 13-6. Rola katalazy w procesie rozkładu nadtlenku wodoru.

H2O2 2 H2O + A

W erytrocytach i innych tkankach, peroksydaza glutationu, zawierająca selen jako grupę prostetyczną, katalizuje w obecności zredukowane-

enzymami peroksysomalnymi, wytwarzającymi nadtlenek wodoru, źródłem H2O2 mogą być reakcje katalizowane przez mitochondrialny i mikrosomalny układ transportujący elektrony oraz oksydazę ksantynową.

144 / ROZDZIAŁ 13

OKSYGENAZY KATALIZUJĄ BEZPOŚREDNIE PRZENIESIENIE I PRZYŁĄCZENIE TLENU 00 CZĄSTECZKI SUBSTRATU Oksygenazy uczestniczą raczej w syntezie lub degradacji wielu róŜnych typów metabolitów, a nie w procesach dostarczających komórce energii. Enzymy tej grupy katalizują reakcje przyłączenia tlenu do cząsteczki substratu. Reakcja przebiega dwuetapowo: 1) wbudowanie tlenu do centrum katalitycznego enzymu i 2) reakcja redukcji lub przeniesienia związanego z enzymem tlenu do substratu. Oksygenazy moŜna podzielić na 2 podgrupy. Dioksygenazy (transferazy tlenu, prawdziwe oksygenazy) przyłączają do substratu oba atomy tlenu Podstawowa reakcja przebiega następująco: A + 02
AO2

Mikrosomalne systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują hydroksylację wielu leków Monooksygenazy te występują w mikrosomach wątroby razem z cytochromem P-450 i cytochromem b 5 . Zarówno NADH, jak i NADPH dostarczają równowaŜników redu kujących do redukcji tych cytochromów (ryc. 13-7), które z kolei są utleniane przez substraty w wieloetapowym procesie enzymatycznym określanym mianem cyklu hydroksylacyjnego (ryc. 13-8). "
IHYDHOKSYLAZA [

Lek-H O2+ 2Fe + ZH (P-4S0) (P-450)

z+

Do tej podgrupy naleŜą enzymy zawierające Ŝelazo, np. dioksygenaza homogentyzynowa (oksydaza, p. str. 369) i dioksygenaza 3-hydroksyantrani łanowa (oksydaza, p. str. 376) z wątroby oraz enzymy wykorzystujące hem, np. dioksygenaza L-trj ptofanowa (pirolaza tryptofanowa, p. str. 376) z wątroby. Monooksygenazy (oksydazy o mieszanej funkcji, hydroksylazy) wbudowują do substratu tylko 1 atom tlenu Drugi atom tlenu ulega redukcji do wody, co wymaga udziału dodatkowego donora elektronów lub kosubstratu
A— H + O2 + ZH2 A—OH + H 2 O + Z

Wśród leków metaboiizowanych przez ten układ enzymatyczny znajdują się: benzopiren, aminopiryna, anilina, morfina i benzofetamina. Wiele leków, np. fenobarbital, moŜe wywoły- ■ wać indukcję syntezy enzymów mikrosomalnych i cytochromu P-450. Mitochondrialne układy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują reakcje hydroksylacji steroidów Te układy enzymatyczne występują w tkankach steroidogenicznych, takich jak kora nadnerczy, jądra, jajniki, łoŜysko. Biorą one udział w biosyntezie hormonów sterośdowych z cholesterolu (hydroksylacja na C22 i C20 w procesie odszczepiania łańcucha bocznego oraz w pozycji l i p i 18). Nerkowe systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizują la- i 24-hydroksylacje 25-hydroksychotekalcyferolu, a układ wątrobowy katalizuje hydroksylację w pozycji 26 w procesie biosyntezy kwasów Ŝółciowych.

CN"
NADH
Amlnooksydaza Itp. Flawoproleina

Flawroprotelna,

■A

Cyt b»-ł*- Desaturaza EfearolioCoA 9 Cvt P-450-^ Hydroksylacja

NADPHf-*
. Feroksydacja lipidów Oksygenaza hem u

Ryc. 13-7. Mikrosomalnyjańcuch przenoszący elektrony. Zaznaczono miejsce hamowania przez cyjanek (CN>.

UTLENIANIA BIOLOGICZNE / 145 SubstratA-H

| REDUKTAZA NADPH-CylP^t50 NADP
+

P-450-A-H I

^

-

A-OH
■ P-450-A-H

Ryc 13-8. Mikrosomalny cykl hydroksylacyjny. Przedstawiony układ jest typowy dla hydroksylaz steroidowych kory nadnerczy. Mikrosomalny system hydroksylacyjny w wątrobie nie wymaga udziału białka Ŝelazosiarkowego (Fe^). Zaznaczono miejsce hamowania przez tlenek węgla (CO).
Wewnętrzna błona mitochondriaina Strona^ wewnętrzna Jabłczan Strona zewnętrzna lzocytrynlan

umiejscowione na wewnętrznej powierzchni mitochondrialnej błony wewnętrznej: swoistą względem NADP flawoproteine mającą FAD, białko Fe2S2 (adrenodoksynę) i cytochrom P450 (ryc. 13-9).

Ryc. 13-9. Mitochondnalny układ monooksygenaza-cytochrom PFe2S2białko

450.
Hydroksysteroid

WOLNY RODNIK PONADTLENKOWY MOśE BYĆ ODPOWIEDZIALNY ZA TOKSYCZNOŚĆ TLENU
Tlen jest substancją potencjalnie toksyczną. Jego toksyczność wiązano dotychczas z tworzeniem H2O:- Ostatnio jednak, uwzględniając łatwość, z jaką tlen w tkankach ulega redukcji do wolnego anionorodnika ponadtlenkowego {C>2~') i występowanie u organizmów tlenowych (ale nie u beztlenowców bezwzględnych) dysmutazy ponadtlenkowej, przypuszcza się, Ŝe toksyczność tlenu wynika z przemiany jego w ponadtlenek. Dotychczas brak jednak bezpośrednich dowodów toksyczności ponadtienku. Ponadtlenek powstaje wówczas, gdy zredukowane flawiny, znajdujące się np. w oksydazie ksantynowej, ulegają jednoetektronowej reoksydacji przez tlen cząsteczkowy. Ponadtlenek powstaje równieŜ z tlenu cząsteczkowego podczas jednoetektronowych utieniań zachodzących w łańcuchu oddechowym:

Ŝelazosiar-kowe (adrenodoksyna). PoniewaŜ NADP{H) nie moŜe przejść przez bfonę mitochondrialna, źródła równowaŜników redukujących są ograniczone do takich substratów, jak jabłczan i izocytrynian, które mogą być utleniane przez wewnątrzmitochondriat-ne dehydrogenazy współdziałające z NADP.

W korze nadnerczy zawartość mitochondrjlalnego cytochromu P-450 jest 6-krotnie większa od ilości cytochromów łańcucha oddechowego. Układ monooksygenazy zawiera 3 składniki

II) — Bicthcmia

146 / ROZDZIAŁ 13

Enzym-H2 + O2 --------- * Enzym-H + O2~ + H+ Ponadtlenek moŜe redukować cytochrom c będący w formie utlenionej: Cytc<Fe +>
3

rodników, takich jak O2~" i ograniczają toksyczność tlenu (p. rozdz. 54). PODSUMOWANIE 1. W układach biologicznych, tak jak w che micznych, utlenieniu (utracie elektronów) za wsze towarzyszy redukcja biorcy elektronów. 2. Oksydoreduktazy dzieli się na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. 3. Oksydazy i dehydrogenazy spełniają róŜne funkcje w metabolizmie, ale obie klasy en zymów odgrywają zasadniczą rolę w oddycha niu. 4. Peroksydazy chronią organizm przed uszkodzeniem przez woine rodniki, a oksygenazy pośredniczą w hydroksylacji leków. PIŚMIENNICTWO
Bonnett R: Oxygen activation and tetrapyrroles. Essays Biochem 1981;17:1. Ernster L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Fleisher S, Packer L (editors); Biologica) oxidations, mierosomal, cytochrome P-450, and other hemoprotein systems. In: Methods in Enzymology. Vol 52. Biomembranes, part C. Academic Press, 1978. Friedovich I: Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 1975;44:147. Nicholls DG: Cytochromes and Celi Respiration. Carolina Biological Supply Company, N. Carolina, 1984. Salemme FR: Structure and function of cytochromes c. Annu Rev Biockem 1977;46:299. Tolbert NE: Metabolic pathways in perosisomes and g]yoxysomes. Annu Rev Biochem 1981;5©:133. Tyler DD, Sutton CM: Respiratory enzyme systems in mitochondrial membranes. Page 33 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Biltar EE (editor). Wiley, 1984. White RE, Coon MJ: Oxygen activation by cytochrorae P-450. Annu Rev Biochem 1980;49:315.

Cytc(F« )

2+

lub moŜe być usuwany przez swoisty enzym — dysmutazę ponadtlenkową.
DYSMUTAZA PONADTLENKOWĄ
2"

+2H +

H2O2 + O2

W tej reakcji ponadtlenek działa zarówno jako utleniacz, jak i reduktor. Chemiczne działanie ponadtlenku w tkankach wzmacnia się w wyniku reakcji łańcuchowej wolnych rodników. Przypuszcza się, ŜeO2~' związany z cytochromem P-450, jest związkiem pośrednim w reakcji aktywacji tlenu w procesie hydroksylacji (ryc. 13-8). Wydaje się, Ŝe funkcja dysmutazy ponadtienkowej polega na ochronie organizmów tlenowych przed cytotoksycznym działaniem ponadtlenku. Enzym występuje w wielu róŜnych kompartmentach komórkowych. Enzym cytoplazmatyczny składa się z 2 podjednostek zawierających po jednym jonie Cu2+ i Zn3+, podczas gdy enzym mitochondrialny zawiera Mn2+ podobnie jak enzym bakteryjny. Fakt ten potwierdza hipotezę, Ŝe mitochondria rozwinęły się z Procaryota, które weszły w symbiozę z Protoeucaryota. Dysmutaza występuje we wszystkich głównych tkankach tlenowych. Aczkolwiek przeniesienie zwierząt do atmosfery składającej się w 100% z tlenu powoduje adaptacyjne zwiększenie ilości enzymu, zwłaszcza w płucach, to jednak przedłuŜony pobyt w tej atmosferze prowadzi do uszkodzenia płuc i śmierci. Przeciwutleniacze, np. a-tokoferol (witamina E), działają równieŜ jako wychwytywacze wolnych

*

Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujące
Peter A. Mayes, PhD, DSc

14

WPROWADZENIE
Mitochondrion określa się mianem „sifowni" komórki, poniewaŜ wewnątrz tej organelli zachodzi wychwytywanie większości energii pochodzącej z utleniań tkankowych. Mitochondrialny proces wytwarzania bogatoenergetycznego związku (ATP), sprzęŜony z oddychaniem, określa się mianem fosforylacji oksydacyjnej.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Fosforylacja oksydacyjna umoŜliwia organizmom tlenowym związać znacznie większą część dostępnej energii swobodnej substratów oddechowych w porównaniu z organizmami beztlenowymi. Przebieg tego procesu wyjaśnia teoria chemiosmotyczna. Niektóre leki (np. amobarbital) i trucizny (np. cyjanek, tlenek węgla) hamują iaricuch oddechowy i wtórnie fosforylację oksydacyjną, zwykle z fatalnymi następstwami. Obecnie znamy wiele wad dziedzicznych, dotyczących składników mitochondrialnego łańcucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej. Wady te ujawniają się w postaci iniupatii, encefalopalii, a często i kwasicy mleczanowej.

węglowodanów jest dostępna w obrębie mitochondriów w postaci równowaŜników redukujących ( —H lub elektrony). Mitochondria zawierają zespół katalizatorów, nazwany łańcuchem oddechowym. Zbiera on i przenosi równowaŜniki redukujące, kierując je do ich końcowej reakcji z tlenem, w której powstaje woda. Mitochondria zawierają równieŜ układ enzymatyczny gromadzący uwalnianą energię swobodną w postaci bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego. Poza tym zawierają one układy enzymatyczne warunkujące wytwarzanie większości równowaŜników redukujących zbieranych przez łańcuch oddechowy. Są to enzymy P-oksydacji i cyklu kwasu cytrynowego. Ten ostatni układ jest końcowym szlakiem metabolicznym wspólnym dla utleniania wszystkich głównych składników pokarmowych. Powiązania te przedstawiono na ryc. 14-1.

SKŁADNIKI ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO SĄ UPORZĄDKOWANE W KOLEJNOŚCI WZRASTAJĄCYCH POTENCJAŁÓW RED. OKS.
Zasadnicze składniki łańcucha oddechowego przedstawiono na ryc. 14-2. Wodory lub elektrony przepływają stopniowo przez łańcuch oddechowy — od składników bardziej elektroujemnych do bardziej elektrododarniego tlenu. Rozpiętość red.-oks. układu od NAD+/NADH do O2/2H2O wynosi 1,1 V (p. tab. 13-1). Główny łańcuch oddechowy w mitochondriach katalizuje ciąg reakcji, przebiegających od dehydrogenaz, współdziałających z NAD, przez

ŁAŃCUCH ODDECHOWY ZBIERA I UTLENIA RÓWNOWAśNIKI REDUKUJĄCE
Cała uŜyteczna energia, uwalniana podczas utleniania kwasów tłuszczowych i aminokwasów, oraz niemal cała energia z utleniania

148 / ROZDZIAŁ 14 POKARM I Kwasy tłuszczowe Ttuszcze—.® Glicerol Węgło- -g woda my—* g p- Oksydacja ATP

. Glukoza itp

1

. Aminokwasy

Łańcuch oddechowy I ADP Białka — i-

Pozamitochondrialne źródła równowaŜników redukujących Ryc. 14-1. Rola mitochondrialnego łańcucha oddechowego w przekształcaniu energii chemicznej poŜywienia w ATP. Utlenianiu większości składników pokarmu towarzyszy wytwarzanie równowaŜników redukujących (2H), które są zbierane przez łartcuch oddechowy w cełu ich utlenienia i sprzęŜonego z tym wytwarzania ATP. Cytochromy

-^l^Substral Y H+ Ryc. 14-2. Przenoszenie równowaŜników redukujących w łańcuchu oddechowym. Pro I i na 3-Hyd ro k sy acyl o-Co A 3-Hyd roksymaślan Glutami niań Jabtczan Izocytrynian Bursztynian Cholina
Fp (FAD) FeS

H+

2H+

2H

Acyło-CoA
\.. -Cyt ■Cytc Cu

Glice ro lo-3-f osf o ran

Sarkozyna Dl metyl og li cyna

Ryc. 14-3. Składniki mitochondrialnego łańcucha oddechowego. FeS uczestniczy w transporcie elektronów, zbierając je z flawoproteiny lub cytochromu b: Cyt — cytochrom, ETF — flawoproteina przenosząca elektrony, FeS — białko Ŝe I a zos i arko we, Fp — flawoproteina, Q — ubichinon.

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 149

OH Forma całkowicie utleniona. oŜyli chfnonowa Forma samlchlronowa (wolny radnik} Forma zredukowana, czyli chinolowa (hydrochincn)

Ryc. 14-4. Struktura ubichinonu (Q), n — liczba jednostek izoprenoidowych; waha się ona w granicach 6—10, tj. Q6-io-

flawoproteiny i cytochromy do tlenu cząsteczkowego, Nie wszystkie substraty są związane z łańcuchem oddechowym przez dehydrogenazy współdziałające z NAD; niektóre ze względu na ich bardziej dodatnie potencjały red.-oks. (np. fumaran/bursztynian; P- tab. 13-1) wiąŜą się bezpośrednio z dehydrogenazami będącymi fiawoproteinami, które z kolei są związane z cytochromami łańcucha oddechowego (ryc. 14-3). Poza wspomnianymi przenośnikami w łańcuchu oddechowym znajduje się dodatkowy przenośnik łączący flawoproteiny z cytochromcm b, białkiem o najniŜszym potencjale oksydo/edukcyjnym w Łańcuchu cytochromowym. Ten dodatkowy przenośnik, który nazwano ubichinonem lub CoQ (koenzymem Q; p.

flawoproteinami) i 7. cytochromem b. Zarówno siarka, jak i Ŝelazo uczestniczą w jednoelektronowym mechanizmie oksyd o redukcyjnym (ryc. 14-5).

Pr—Cvl-S

ryc. 14-4), występuje w mitochondriach w warunkach tlenowych w utlenionej formie chinonowej, a w warunkach beztlenowych w zredukowanej formie chinolowej, Ubichinon jest składnikiem lipidów mitochondrialnych, zawierających przede wszystkim fosfolipidy, tworzące część struktury błony mitochondrialnej. Struktura koenzymu Q jest bardzo podobna do budowy witamin K i E; podobna jest równieŜ do plastochinonu znajdującego się w chloroplastach. Wszystkie te związki charakteryzują się poliizoprenoidowym fańcuchem bocznym. W mitochondriach koenzym Q występuje w znacznym stechiometrycznym nadmiarze względem pozostałych członów łańcucha oddechowego. Ten fakt sugeruje, Ŝe jest on ruchomy m_ elementem łańcucha oddechowego i Ŝe zbiera on równowaŜniki redukujące z bardziej nieruchomych kompleksów flawoproteinowych i przenosi je na cytochromy. Innym składnikiem, występującym równieŜ w preparatach łańcucha oddechowego jest bial-c (Fe:S; Ŝelazo niehemowe). J l i i (metało-

Ryc, 14-5. Kompleks białka Ŝelazosiarkowego (^6484).®— siarka nietrwała w środowisku kwaśnym, Pr — apoprotein3, Cys — reszta cysteinowa. Niektóre białka Ŝeiazosiarkowe zawierają 2 atomy Ŝelaza i 2 atomy siarki

Na rycinie 14-3 przedstawiono, zgodnie z współczesnymi poglądami, sekwencję zasadniczych składników łańcucha oddechowego. N a elektroujemnym końcu łańcucha dehydrogeńazy katalizują przeniesienie elektronów z substratów na NAD łańcucha. Sposoby tego przenoszenia mogą być dosyć róŜne, a-Ketokwasy — pirogronian i a-ketoglutaran — mają własne kompleksy dehydrogenaz, zawierające liponian 1 FAD, które pośredniczą w przenoszeniu elektronów na NAD łańcucha oddechowego. Inne dehydrogenazy, np. dehydrogenaza h( + )-3-hydroksyacylo-CoA, D(—)-3-hydroksymaśIanowa,

150 / ROZDZIAŁU prolinowa, glutami ni a nowa, jabtczanowa lub izocytrynianowa, przenoszą elektrony bezpośrednio na NAD łańcucha oddechowego. Zredukowany NAD łańcucha oddechowego jest z kolei utleniany przez dehydrogenazę NADH, która jest metalofloawoproteiną. Enzym ten zawiera Fe:S i FMN i jest ściśle związany z łańcuchem oddechowym. Przenosi on równowaŜniki redukujące na koenzym Q. Koenzym Q stanowi w łańcuchu oddechowym równieŜ punkt zbiorczy dla równowaŜników redukujących, pochodzących z innych substratów, które przez flawoproteinowe dehydrogenazy kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym. Takimi substratami są bursztynian, cholina, giiceróló:5-Fósibran;~sarkozyna, dimetyloglicyna i acylo-CoA (ryc. 14-3). W dehydrogenazach tych substratów część flawinową stanowi FAD. Elekt£o^y_zCoQ przepływają następnie przez. y h H y ^ 7 y T y e n cząsteczkowy. Cytochromy są ułoŜone zgodnie ze wzrastającym potencjałem oksydoredukcyjnym. Znajdujący się na końcu łańcucha cytochrom aa3(oksydaza cytochromowa) odpowiada za ostateczne połączenie równowaŜników redukujących z tlenem cząsteczkowym. Enzym _ten_zawięra miedź, składnik wielu oksydaz. Oksydaza cytochromowa ma bardzo duŜe powinowactwo do tlenu, co pozwala na funkcjonowanie łańcucha oddechowego z maksymalną szybkością, aŜ do momentu, w którym tkanka zostanie całkowicie pozbawiona tlenu. PoniewaŜ jest to reakcja nieodwracalna (jedyna w łańcuchu), nadaje ona kierunek przemieszczania się równowaŜników redukujących w łańcuchu oddechowym i do sprzęŜonego z nim wytwarzania ATP. Organizacja strukturalna łańcucha oddechowego była przedmiotem wielu hipotez. Istotnym odkryciem było stwierdzenie niemal starych stosunków molowych miedzy składnikami łańcucha oddechowego. Funkcjonalnie i strukturalnie składniki łańcucha oddechowego są zgrupowane w wewnętrznej błonie mitochondrialnej w 4
lipidowo-białkowc kompleksy łańcucha od-

dechowego. PowyŜsze dane wskazują, Ŝe przenośniki mają w błonach określoną orientację przestrzenną. Cytochrom c jest jedynym rozpuszczalnym cytochromem i tak jak koenzym Q wydaje się być bardzo ruchomym składnikiem łańcucha oddechowego łączącym nieruchome kompleksy (ryc, 14-6).

Malonian Kompleks II Bursztynian Karboksyna TTFA BAL Antymycyna Kompleks II! I yt b, FeS. Cyt c,

&&

H;S CO* CN * ,'x Kompleks IV I Cyt a Cyt

NADH Związki rozprzęgające Plerycydyna A Amobarbltal ^ _ 1 _ ^ R o t e n o n Oligomyoyna" i J ' O ^\
AD P + P ,

I

Związki rozprzęgające O ligo mycy na

ATP

ADP + P,

Miejsce sprzęgająca 1

ATP Mtejsce sprzęgające 2

ADP + P,

ATP

Miejsce sprzęgające 3

Ryc. 14-6. Proponowane miejsca hamowania (0) tańcucha oddechowego prze* niektóre leki, substancje chemiczne i antybiotyki. Zaznaczono „miejsca sprzęgające", które tworząc gradient protonowy wspierają fosforylację. BAL (dimerkaprol); TTFA jest czynnikiem chelatującym Fe, Kompteks I — oksydo/eduktaza NADH : ubichinon; kompleks tl •— oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon; kompleks III —oksydoreduktaza ubichinot: utleniony cytochrom c; kompleks IV — oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen. Inne skróty jak na ryc. 14-3, ____________________________ ____________

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 151

ŁAŃCUCH ODDECHOWY UMOśLIWIA ZMAGAZYNOWANIE ZNACZNEJ CZĘŚCI ENERGII CHEMICZNEJ UTLENIAM BIOLOGICZNYCH
ADP jest cząsteczką, która wiąŜe w postaci bogatoenergetycznych fosforanów część energii

KONTROLA ODDYCHANIA W MITOCHONDRIACH ZABEZPIECZA STAŁE DOSTARCZANIE ATP
Szybkość oddychania mitochondriów moŜe być kontrolowana przez stęŜenie ADP. Dzieje się tak, poniewaŜ utlenianie i fosforyłacja są ze sobą ściśle sprzęŜone, tzn. utlenianie w łańcuchu oddechowym nie moŜe zachodzić bez towarzyszącej fosforylacji ADP. Chance i Williams podali 5 czynników, które mogą kontrolować szybkość oddychania w mitochondriach {tab. 14-1).
Tabela 14-1. Stany kontroli oddechowej Czynniki ograniczające szybkość oddychania Sta 1 n Sta 2 n Sta 3 n Sta 4 n Sta 5 n Brak ADP i substratu Brak tylko substratu Aktywność samego łańcucha oddechowego, gdy wszystkie substraty i ADP są obecne w stęŜeniach wysycających Brak tytko ADP Brak tylko tlenu

swobodnej uwalnianej w procesach katabolicznych. Powstający ATP moŜe z kolei przekazać tę energię swobodną procesom wymagającym energii. Stąd teŜ ATP bywa nazywany „monetą obiegową" komórki (p. ryc. 12-8). Wjęakcjach glikolizy powstają 2 bogatoenergęticznejrugy fosforanowe, co jest równowaŜne ok. 61 kJ/moI glukozy (p. tab. 19-1). Wynika z.tęgo^Ŝe ilość energii wychwytywanej w procesie glikolizy, w reakcjach fosforylacji substratowej, jest mata, jako Ŝe 1 mol glukozy,"ulegając całkowitemu spaieniu dostarcza ok. 2780 kJ. Reakcje cyklu kwasu cytrynowego, końcowego szlaku całkowitego uflemania"glukozy, obejmują 1 .^tap fosforylacii — przekształcenie y sukcynylo-CoA w bursztyniajŁ_co pozwala wytworzyć następne 2 boga to energetyczne wiąza"hia__fosforaiiowe na moTglukozy, Wszystkie wspomniane powyŜej fosfbrylacje zachodzą na po4pjnje_jybstratu. Wyniki badań prowadzonych na nie naruszonych oddychających mitochondriach wykazują, Ŝe utlenieniu substratów J ^ A D k ^ h ^ i " ) ń h oddechowy towarzyszy wbudowanie 3 mol fosforanu nieorganicznego w 3 mol ADP i powstanie w ten sposób 3 mol ATP na kaŜde ]j2 mol zuŜytego O2, tzn. stosuneTt P:O = 3 (ryc. 14-6). JeŜeli natomiast substrat ulega utlenieniu przy udziale dehydrogenazy flawinowej, powstaje tylko 2 mol ATP, a stosunek P:O = 2. Reakcje te są znane jako fosforyiacje oksydacyjne (fosforylacjc na poziomie łańcucha oddechowego). Uwzględniając reakcje odwodorowania w szlaku katabolicznym glukozy zarówno w glikolizie, jak i w cyklu kwasu cytrynowego oraz fosforyiacje substratowe moŜna obliczyć, Ŝe niemal 42% energii swobodnej, pochodzącej ze spalenia glukozy, zostaje związane w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. Jest oczywiste, ze to łańcuch oddechowy odpowiada za znaczną część puli tworzonego ATP.

Zasadniczo większość komórek w okresie spoczynkowym znajduje się w stanie metabolicznym 4, w którym szybkość oddychania zaleŜy od dostępności ADP. W czasie wykonywania pracy następuje przemiana" ATP w ADP, co powoduje zwiększenie szybkości oddychania, a to z kolei prowadzi do uzupełnienia zapasu ATP (ryc. 14-7). NaleŜy dodać, Ŝe w pewnych warunkach szybkość funkcjonowania łańcucha oddechowego moŜe zaleŜeć równieŜ od stęŜenia fosforanu nieorganicznego. Gdy szybkość oddychania się zwiększa (np. podczas pracy), metabolizm komórki zbliŜa się do stanu 3 lnb stanu 5, wówczas łańcuch oddechowy albo osiąga stan wysycenia, albo pO2 zmniejsza się poniŜej Km dla cytochromu ay Niewykluczone, Ŝe sprawność przenośnika ADP/ATP, który ułatwia wejście cytoplazmatycznego ADP do wnętrza mitochondrionu, moŜe być czynnikiem ograniczającym szybkość fosforylacji oksydacyjnej. Proces utleniań biologicznych, w których energia swobodna, powstała w wyniku utleniania składników pokarmowych, staje się dostępna i moŜe być związana, przebiega stopniowo,

152 / ROZDZIAŁ 14

Ciepto

Procesy zuŜywające energię SUBSTHAT

T

\

Ryc. 14-7. Rota ADP w kontroli oddechowej.

wydajnie (40—45%) i podlega kontroli — a nie wybuchowo, nieskutecznie i w sposób niekontrolowany. Pozostała energia swobodna, która nie została związana w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, uwalnia się w postaci ciepła. Nie znaczy to, Ŝe jest „stracona", gdyŜ dzięki temu układ oddechowy, jako całość, jest dość egzoergiczny, aby być w stanie nierównowagi, co pozwala na ciągły jednokierunkowy przepływ elektronów i stałe zaopatrywanie komórki w ATP. U zwierząt stałocieplnych zapewnia to utrzymanie odpowiedniej temperatury ciała.

WIELE ZNANYCH TRUCIZN TO INHIBITORY ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO
Wiele informacji dotyczących łańcucha oddechowego uzyskano po zastosowaniu związków, których przypuszczalne miejsce działania przedstawiono na ryc. 14-6. Do celów opisowych związki te moŜna podzielić na inhibitory łańcucha oddechowego, inhibitory fosforylacji oksydacyjnej i związki rozprzęgające fosforylację oksydacyjną. Inhibitory, które hamują oddychanie przez blokowanie łańcucha oddechowego, działają w 3 miejscach. W miejscu pierwszym działają,. barbiturany (np. amobarbital), antybiotyk pierycydyna A oraz jad rybi — rotenon. Inhibitory te hamują utlenianie substratów.Hofe kontaktują się bezpośrednio z łańcuchem oddechowym przez NAD-zaJeŜne dehydrogenazy, jak np. 3hydroksymaślan.

Dimerkaprol i antymycyna AJiamują łańcuch oddechowy między cytochromem.b a cytochromem c. Klasyczne trucizny, jak H2S, tlenek węgla i cyjanki hamują oksydazę cytócEfomową. Karboksyna i TTFA swoiście hamują przeniesienie równowaŜników redukujących z dehydrogenazy bursztynianowej na koenzym (^ natomiast malonian jest inhibitorem kompetycyjnym dehydrogenazy bursztynianowej. Antybiotyk oUgomycyna całkowicie hamuje utlenianie i fosforylację w nie uszkodzonych mitochondriach. JednakŜe, w obecności .związku rozprzęgającego — di nitrofenolu — zachodzi utlenia,nie_hez. towarzyszącej fosforylacji, co wskazuje, Ŝe oligomycyna nie działa bezpośrednio" na łańcuch oddechowy, lecz na etapie fosforylacji (p. ryc. 14-8). Atraktylozyd hamuje fosforylację oksydacyjną, "która zaleŜy od transportu nukleotydów adeninowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Przyjmuje się, Ŝe hamuje on przenośnik nukleotydów adeninowych, odpowiedzialny za transport ADP do wnętrza, a ATP na zewnątrz mitochondrionu (p. ryc. 14-16). Działanie związków rozprzedających polega na „odłączeniu" procesu utleniania w łańcuchu oddechowym od fosforylacji. Wskutek tego oddychanie przebiega w sposób niekontrolowany, poniewaŜ stęŜenie ADP lub P, nie ogranicza juŜ szybkości oddychania. Najczęściej stosowanym związkiem rozprzęgającym jest 2,4-dinitrofenol, ale takŜe inne związki działają w podobny sposób, np. dinitrokrezol, pentachlorofenol i CCCP (m-chlorokarbonyiocyjanidofenylohydrazon). Ten ostatni jest ok. 100-krotnie aktywniejszy od dinitrofenolu.

:
FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 153
ADP Stan 4

A"

ADP f

i \ i >

i Stan 3

\
\

(v
\Stan4
Związek razprzegąjący

d B " c

i
S 5
i

Ollgomycyna ^1 i | Związek 1 \i rozprzęgający \

Teoria chemiosmotyczna postuluje, Ŝe utlenianie przenośników w łańcuchu oddechowym prowadzi do tworzenia jonów wodorowych, które są wyrzucane na zewnątrz sprzęgającej błony mitochondriałnej. RóŜnica potencjałów elektrochemicznych, wynikająca z asymetrycznego rozmieszczenia jonów wodorowych (protonów, H+), jest zuŜywana następnie do napędzania mechanizmu odpowiedzialnego za tworzenie ATP (ryc 14-9). Łańcuch oddechowy jest pompą protonową Według Mitchella, pierwotnym etapem procesu fosforylacji oksydacyjnej jest przemieszczenie protonów (H +)1n£|^wjiait4£z>iblony sprzęgającej (tzn. wewnętrznej hłoriy mitochondriałnej) napędzane przez utleniania w łańcuchu oddechowym. KaŜdy z kompleksów łańcucha oddechowego I, III i IV (p. ryc. 14-6} działa jako pompa protonowa. Postulował on równieŜ, Ŝe błona jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonów, a zwłaszcza dla protonów, które gromadzą się na zewnątrz błony, wytwarzając transmembranową róŜnice potencjału elektrochemicznego (AU,H+). Na tę róŜnicę składa się potencjał chemiczny (róŜnica pH) oraz potencjał elektryczny. RóŜnica potencjału elektrochemicznego jes^zuŜywana-przez błonową syntazę ATP (syntaza ATP, transportująca H+), która w obecności ADP i Pj wytwarza ATP (ryc. 14-9). Nie ma tu więc bogatoenergetycznego pośrednika wspólnego dla utleniania i fosforylacji, jak to sugerowano w hipotezie sprzęŜenia chemicznego. Według pierwotnej wersji teorii łańcuch oddechowy jest tak ułoŜony w błonie, Ŝe tworzy 3 pętle utłeniająco-redukcyjne (o/r). Na rycinie 14-10 przedstawiono schematycznie pojedynczą pętlę zawierającą przenośnik wodoru i przenośnik elektronów. JednakŜe ten wymóg trudno było pogodzić w pełni ze znanymi składnikami błonowych kompleksów łańcucha oddechowego, np. kompleks IV nie zawiera przenośnika wodoru. Co więcej, nie jest znana dokładna liczba protonów pompowanych przez kaŜdy kompleks, przypadająca na kaŜdy transportowany elektron. Na rycinie 14-11 przedstawiono cykl Q, wyjaśniający moŜliwy mechanizm pompowania protonów przez kompleks III. Powierzchnię błony wewnętrznej pokrywają Jednostki fosforylujące" odpowiedzialne za biosyntezę ATP (ryc. 14-12). KaŜda z nich składa się z wielu róŜnych białek. Hydrofilowy

3 Minuty Ryc. 14-8. Kontrola oddechowa w mitochondriach. Doświadczenie A: na wykresie przedstawiono szybkość zuŜycia tlenu w stanie 4, która ulega przyspieszeniu po dodaniu ADP. Gdy cały egzogenny ADP zostanie ufosforylowany do ATP, wówczas szybkość oddychania maleje do wartości w stanie 4. Dodanie związku rozprzedającego, np. dinitrofenolu, uniezaleŜnia oddychanie od fosforylacji. W doświadczeniu B: dodanie oNgomycyny hamuje fosforylację dodanego uprzednio ADP i w związku z tym obserwujemy hamowanie oddychania. Dodanie z kolei związku rozprzedającego zwiększa szybkość zuŜycia tlenu, poniewaŜ uniezaleŜnia oddychanie od fosforylacji.

TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA WYJAŚNIA MECHANIZM SPRZĘśENIA UTLENIANIA Z FOSFORYLACJA
W ciągu ubiegłych lat przedstawiono wiele hipotez dotyczących sprzęŜenia utleniania z fosforylacją. MoŜna je podzielić na 2 zasadnicze grupy. Hipotezy sprzęŜenia chemicznego postulowały bezpośrednie sprzęŜenie chemiczne na wszystkich etapach procesu, tak, jak ma to miejsce w reakcjach tworzących ATP w glikolizie. JednakŜe hipotezy te odrzucono, poniewaŜ nie udało się nigdy wyizolować bogatoenergetycznych pośredników, które miały łączyć utlenianie z fosfory lacją. Według innych hipotez energia pochodząca z utleniania jest przechowywana w stanach konformacyjnych cząsteczek. Zmiana konformacji miała prowadzić do tworzenia bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych.

154 / ROZDZIAŁ 14

O lig o mycy na

Błona sprzęgająca Ubtahfnon

Cytochrom c

Byc. 14-9. ZałoŜenia teorii

NA

chemiosmotycznej ZEWNĄTRZ dotyczącej fosforytacji + oksydacyjnej. F1( Fo, czynniki białkowe warunkujące fosforylację Syntaza ATP, transportująca H (FiFo), działa jako wtórna pompa protonowa. Pierwotna pompa protonowa funkcjonuje w wyniku sprzęŜenia utleniania z przemieszczeniem protonów z wewnętrznej na zewnętrzną powierzchnię błony. To + przemieszczenie H prowadzą kompleksy łańcucha oddechowego I, III i IV, z których kaŜdy działa jako + pompa protonowa. Związki rozprzęgające, takie jak di nitrofenol, powodują „przeciek" H przez błonę, skutkiem czego jest zanik elektrochemicznego gradientu protonów. Oligomycyna swoiście blokuje + transport H przez Fo.
NA ZEWNĄTRZ BŁONA SPRZĘGAJĄCA WEWNĄTRZ

Ryc. 14-10. Pętla oksydoredukcyjna (o/r) przemieszczająca protony (teoria criemiosmotyczna).

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 155
WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA

CYTOZOL (NA ZEWNĄTRZ)

Ryc. 14-11. Pompujący protony cykl koenzymu Q. QH* jest zakotwiczony po obu stronach btony przez przyłączenie się do białka wiąŜącego Q, natomiast CIH2 i Q są ruchome. Cytochromy zaznaczono odpowiednio jako b, c-|.

Jednostki fosforylujące

B : U8Ł0NA - j ZEWNĘTRZNA f BŁONA*--*] WEWNĘTRZNA

rinr

Działanie ultradźwiękami

BŁONA ZEWNĘTRZNA

Cząstki submitochondrialne powstałe z fragmentów błony wewnętrznej Ryc. 14-12. Budowa błon mitochondrialnych. Cząstki submitochondrialne są „przenicowane", tzn, mają odwróconą orientację błony, a więc i odwrócony błonowy gradient protonów. Na ich powierzchni zewnętrznej znajdują się Fi. Taki preparat pozwala prowadzić badania zamkniętych systemów błonowych. *
■■-

* I
Jt3>/

156 / ROZDZIAŁ 14
Pj ADP
+

ATP Pj + ADP

Ryc. 14-13. Syntaza ATP, transportująca H (Mitchell).

kompleks tych białek określa się mianem Fj (czynnik sprzęgający I; ang. factor 1); wystaje on w kierunku małriks i wy|fa7il]jei aktywność _syntązyATP (ryc. t4-9).JEtje5tpołąc2.ony przez tzw. szyjkę (ang. stalk) z—błonowym f hydrofobowym) kompleksem-biaŁŁ-owym. Tkanym FD (czynnik sprzęgający wiąŜący oligomycyne), który prawdopodobnie zajmuje całą szerokość błony (ryc. 14-9). Protony przechodzą przez kompleks Fo— F, (syntazę. ATP, transportują£&Ji+), co umoŜliwia syntezę ATP z ADP i Pj. Ciekawe, Ŝe podobne jednostki fosforylujące znaleziono na wewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej bakterii i na zewnętrznej powierzchni błony tylakoidowej chloropiastów. Charakterystyczne, Ŝe błonowy gradient protonów skierowany jest w mitochondriach i bakteriach z zewnątrz do wewnątrz, ale w odwrotnym kierunku w chloroplastach. Mechanizm sprzęŜenia przemieszczania protonów z anizotropowym (wektorowym) układem syntezy ATP nie jest wyjaśniony. Jeden 7. modeli proponowanych przez Mitchella jest przedstawiony na ryc. 14-13. Para protonów atakuje jeden z tlenów P,, tworząc wodę i aktywny Pj, który natychmiast reaguje z ADP, tworząc ATP. Wyniki innych badań wskazują, Ŝe bezpośrednia reakcja syntezy ATP nie jest głównym etapem wymagającym dostarczenia energii — jest nim raczej etap uwalniania ATP z centrum aktywnego syntazy. Niewykluczone, Ŝe wymaga to konformacyjnych zmian cząsteczki Dane doświadczalne potwierdzają teorię chemiosmotyczną 1. Dodanie protonów (kwasu) do środowiska inkubacyjnego zawierającego mitochondria prowadzi do wytwarzania ATP.

2. Fosforylacja oksydacyjna nie zachodzi w układach rozpuszczalnych, w których nie ma moŜliwości występowania wektorowej syntazy ATP, Aby fosforylacja oksydacyjna mogła za chodzić, w układzie inkubacyjnym muszą być zamknięte pęcherzyki błonowe (ryc. 14-9). 3. Składniki łańcucha oddechowego są uło Ŝone w błonie w sposób asymetryczny (poprze czna asymetria), co jest zgodne z wymaganiami teorii chemiosmotycznej. Teoria chemiosmotyczną wyjaśnia zjawisko kontroli oddechowej Powstała wskutek przemieszczania protonów róŜnica potencjałów elektrochemicznych po obu stronach błony hamuje dalsze przenoszenie ~ równowaŜników redukujących przez łańcuch oddechowy dopóty, dopóki nie zostanie ona rozładowana w wyniku wstecznego transportu protonów przez błonę przy udziale wektorowej syntazy ATP. To z kolei zaleŜy od dostępności ADP i Pi. Tłumaczy działanie związków rozprzęgających Te związki (np. dinitrofenol) są amfipatyczne (p. str. 190) i zwiększają przepuszczalność błony mitochondrialnej d!a protonów (ryc. 14-9), zmniejszając w ten sposób potencjał elektrochemiczny i „zwierając" syntazę ATP. Dlatego teŜ w ich obecności utlenianie moŜe przebiegać bez fosforylacji. Tłumaczy istnienie mitochondrialnych układów transportujących na zasadzie wymiany przeciwprądowej Te układy transportujące są konsekwencją wymogu, Ŝe aby utrzymać gradient elektro-

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 157

chemiczny błona sprzęgająca musi być nieprzepuszczalna dla protonów i innych jonów (patrz poniŜej). WZGLĘDNA NIEPRZEPUSZCZALNOŚC WEWNĘTRZNEJ BŁONY MITOCHONDRIAŁNEJ NARZUCA POTRZEBĘ OBECNOŚCI PRZENOŚNIKÓW Systemy transportu wymiennego znajdują się w błonie i katalizują wymianę przeciwprądową anionów z OH~ oraz kationów z H + . KaŜdy z tych systemów jest niezbędny do zachowania równowagi elektrycznej i osmotycznej podczas pobierania i uwalniania zjonizowanych metabolitów. Roz m i eszczen ie c ha rakterystycz nych enzymów, tzw. znacznikowych, w przedziałach rozdzielonych błonami mitochondrialnymi Mitochondria mają błonę zewnętrzną przepuszczalną dla większości metabolitów, błonę wewnętrzną, która jest wybiórczo przepuszczalna i pofałdowana w tzw. grzebienie, oraz macierz .wewnątrz mitochondrionu (ryc. 14-12). Działając na mitochondrion digitoniną moŜna usunąć z niego błonę zewnętrzną, której enzymami znacznikowymi są monoaminooksydaza, syntetaza acyio-CoA, acylotransferaza glicerolo fosforanowa, acylotransferaza lizofosfatydowa i ibsfolipaza A2, W przestrzeni międzybłonowej znajduje się kinaza adenylanowa oraz

kinaza kreatynowa. W Wonie wewnętrznej jest nagromadzony fosfolipid — kardiolipina. W macierzy mitochondriainej znajdują się rozpuszczalne enzymy cyklu kwasu cytrynowego i enzymy P-oksydacji kwasów tłuszczowych. Oba procesy wymagają udziału układów transportujących metabolity oraz nukleotydy przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Dehydrogenaza bursztynianowa znajduje się na wewnętrznej powierzchni mitochondriainej błony wewnętrznej, gdzie przenosi równowaŜniki redukujące bezpośrednio na ubichinon łańcucha oddechowego, z pominięciem kompleksu I łańcucha oddechowego. Na powierzchni matryksowej wewnętrznej błony mitochondriainej znajduje się równieŜ dehydrogenaza 3-hydroksymaślanowa. Na zewnętrznej powierzchni błony wewnętrznej zlokalizowana jest dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa, co pozwala
jej uczestniczyć w „mostku" glicerolofosforanowym (układ wahadłowy glicerolofosfuran-dihydroksyaceton, ryc. 14-14).

Utlenianie pozamitochondrialnego NADH odbywa się za pośrednictwem „mostków" substratowych Wewnętrzna błona mitochondrialna nie jest przepuszczalna dla NADH, który jest stale wytwarzany w cytozolu w reakcji szlaku glikolityczncgo, katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (p. ryc. \9-2).JedńakŜe w warunkach tlenowych pozamitochondrialny NADH nie gromadzi się i ulega przypuszczalnie utlenieniu w mitochondrialnym łańcuchu oddechowym. RozwaŜano kilka mechanizmów, według których ten proces mógłby

CYTOZOL

WEWNĘTRZNA BŁONA MłTOCHONDRIALNA

NAD

GI icerolo-3-fosfo ra n DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA Dlhydroksyacetono fosforan "*■

GI icerolo-3-f osf oran DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA ■Dlhydroksyacetonofosforan

FAD

FADH2

t
Łańcuch oddechowy

Ryc. 14-14. Mostek glicerolofosf ora nowy {układ wahadłowy glicerolo-3-fosforan : dihydroksyacetonofosforan) transportujący równowaŜniki redukujące z cytozolu do mitochondrionu. PoniewaŜ mitochond rialna dehydrogenaza giicerolo-3-fosforanowa znajduje się na zewnętrznej powierzchni btony wewnętrz nej, układ ten nie wymaga transportu substratów przez błonę.________________________________

158 / ROZDZIAŁ 14 CYTOZOL NAD
ł

BŁONA

MITOCHONDRION ^J a b ł c za n Szczawiooctan
DEHYDROG
NAD*

Jabłczan,
OEHYDROG

Glutaminian
AMINOTHANSFERAZA

NADH + H+

Szczawiooc

a-KG

a-KG

AMIN0TRANS

Glutaminian

Asp

Asp

Ryc. 14-15. Mostek jabłczanowo-asparaginianowy (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przenoszący równowaŜniki redukujące z cytozolu do mttochondrionu. 1 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 2 — przenośnik glutaminianowo-asparaginianowy (przenoszący z glutaminianem proton, symport).

przebiegać. Jednym z nich jest przenoszenie równowaŜników redukujących przez błonę mitochondriałną za pośrednictwem par substratów sprzęŜonych odpowiednimi dehydrogenazami. Niezbędnym warunkiem przebiegu tego procesu jest obecność swoistej dehydrogenazy po obu stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej. Na rycinie 14-14 przedstawiono mechanizm przenoszenia przy uŜyciu „mostka" glicerolofosforano wego. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w związku z tym procesem zostaną wytworzone tylko 2, a nie 3 mol ATP na atom zuŜytego tlenu, poniewaŜ enzym mitochondrialny jest flawoproteiną związaną z łańcuchem oddechowym bez udziału NAD. U niektórych gatunków aktywność FAD-zaleŜnego enzymu (mitochondrialnego) zmniejsza się po tyreoidektomii i zwiększa po podaniu tyroksyny. ChociaŜ obecność tego układu wahadłowego wykazano w mięśniach skrzydłowych owada i w mięśniu białym i moŜe on mieć znaczenie w wątrobie, to w innych tkankach (np. w mięśniu sercowym) stwierdza się niedobór mitochondrialnej dehydrogenazy glicerolo-3-fosforanowej. Przeto uwaŜa się, Ŝe bardziej uniwersalny jest układ transportujący wykorzystujący jabłczan i dehydrogenazy jabłczanowe, cytoplazmatyczną i mitochondrialną. Ten „mostek" (układ wahadłowy jabłczan : asparaginian) przedstawiono na ryc. 14-15, ZłoŜoność tego układu wynika z nie-

przepuszczalności wewnętrznej błony mitochondrialnej dla szczawiooctanu. Szczawiooctan, kosztem glutaminianu, musi najpierw ulec transaminacji do asparaginianu, z którego po jego przejściu przez błonę mitochondrialną zostanie w cytozolu odtworzony szczawiooctan. Transport jonów w mitochondriach jest procesem wymagającym dostarczenia energii Aktywnie oddychające mitochondnaj wjctórych zachodzi fosforylacja oksydacyjna, utrzymują lub gromadzą kationy, takie jak K+,Na+, Ca2 + i Mg2 + oraz P*. RozprzęŜenie fosforylacji oksydacyjnej za pomocą dinitrofenolu prowadzi do ucieczki jonów z mitochondrionu, ale pobieranie jonów ze środowiska nie jest hamowane przez oligomycynę, co sugeruje, Ŝe energia konieczna do procesu transportu nie pochodzi z bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego, powstającego podczas fosforylacji ADP. Przyjmuje się, Ŝe wymianę kationów napędza pierwotna pompa protonowa. Układy transportujące zabezpieczają równowagę elektryczną i osmotyczną po obydwu stronach błony mitochondrialnej (p. ryc. 14-16) Wewnętrzna błona mitochondrialną swobodnie przepuszcza elektrycznie obojętne małe

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 159
Wewnętrzna błona WEWNĄTRZ mltochondrlalna N-

NA ZEWNĄTRZ Ety)orraieimłd

OH" H3PO4" N-Etyloma!eJmld i Hyd r o teycyn am on lan Pirogronian"

Jabtazan1" _Jabłczan'Cytrynian*-+ H
ł

Jablczarr et-Ketoglutaran1" .
ADP 3" ■

ków lub układów transportujących, ułatwiających ich transport przez błonę. Okazuje się, Ŝe aniony monokarboksylowe przenikają przez błonę łatwiej ze względu na mniejszy stopień dysocjacji tych kwasów. UwaŜa się, Ŝe niezdysocjowany i dobrze rozpuszczalny w lipidach kwas jest tym rodzajem cząsteczki, która przechodzi przez błonę lipidową. Transport anionów dikarboksylowych i trikarboksylowych jest ściśle związany z przenoszeniem fosforanu nieorganicznego. Ten ostatni łatwo przechodzi przez błonę jako jon HZPO~, wymieniając się z OH". Pobranie jabłczanu przez przenośnik anionów dikarboksylowych wymaga na wymianę fosforanu nieorganicznego po przeciwnej stronie błony. Pobranie cytrynianu, izocytrynianu, lub ds-akonitanu przez transporter anionów trikarboksylowych wymaga na wymianę jabłczanu. Transport acketoglutaranu równieŜ zachodzi na zasadzie wymiany z jabłczanem. Dzięki uŜyciu mechanizmów wymiany przeciwp radowej (antyport) zostaje więc zachowana równowaga osmotyczna. Transport cytrynianu przez wewnętrzną błonę mitochondrialną zaleŜy nie tylko od przenoszenia jabłczanu, lecz takŜe od transportu fosWewnętrzna ^„a mliocriondrialna F 1

■ATP*
Atraktylozyd i

NA ZEWNĄTRZ

WEWNĄTRZ

Byc. 14-16. Układy przenośnikowe w błonie mitochondrialnej, 1 ~ przenośnik fosforanowy, 2 — sprzęŜony transport (symport) pirogronianu, 3 — przenośnik anionów dikarboksylowych, 4 — przenośnik anionów trikarboksylowych, 5 — przenośnik a-ketoglutaranowy, 6 — przenośnik nukleotydów adeninowych, Zaznaczono miejsca hamowania (0) przez N-etylomaleimid, hydroksycynarnonian i atraktylozyd, W błonie znajdują się równieŜ (nie pokazano) przenośniki: glutaminianowo-asparaginianowy (ryc. 14-15), glutaminowy, ornttynowy i karrtitynowy (ryc. 24-1).

} t
ATP""

_J
"l

j

cząsteczki, takie jak tlen, woda, CO2 i NH3, oraz kwasy monokarboksylowe, takie jak 3-hydroksymasłowy, acetooctowy i octowy. Długołańcuchowe kwasy tłuszczowe są przenoszone do mitochondriów jako pochodne karnityny (p. ryc. 24-1), a specjalny przenośnik w wewnętrznej bionie rnitochondrialnej umoŜliwia sprzęŜony transport pirogronianu z H+ {kotransport, symport), co jest równoznaczne ze zuŜyciem transmembranowego gradientu protonów. Aniony dikarboksylowe i trikarboksylowe oraz aminokwasy wymagają swoistych przenośni-

0 ) Ryc. 14-17. Współdziałanie przenośnika fosforanowego (1) z przenośnikiem nukleotydów adeninowych (2) podczas syntezy ATP. Przedstawiony + sprzęŜony transport (symport) H /Pj jest odpowiednikiem przeć i wtrans portu (antyport) Pj/OH~ (ryc. 14-16). Na kaŜdą zsyntetyzowaną w mitochondriach i uwalnianą cząsteczkę ATP, mitochondrion pobiera 3 protony. Natomiast pobiera tylko 2 protony, jeŜeli zsyntetyzowana cząsteczka ATP zostanie zuŜyta wewnątrz mttochondrionu.

160 / ROZDZIAŁ 14

forami nieorganicznego. Przenośnik nukleotydów adeninowych umoŜliwia wymianę ATP z ADP, ale nie z AMP. Pozwala on wyjść cząsteczce ATP z mitochondrionu do pozamitochondrialnych miejsc zuŜywających energię oraz zapewnia powrót ADP do wnętrza mitochondrionu, gdzie słuŜy do syntezy ATP (ryc. 14-17), Na+ moŜe wymieniać się z H + , zuŜywając gradient protonów. UwaŜa się, Ŝe aktywny transport Ca 2h do mitochondriów zachodzi z przemieszczeniem I ładunku (uniport). prawdopodobnie na zasadzie antyportu CaJ + /H+, Uwalnianie wapnia z mitochondriów jest ułatwione przez wymianę z Na+. Jonofory umoŜliwiają swoistym kationom transport przez błonę Jonofory uzyskały taką nazwę ze względu na ich zdolność do kompleksowania swoistych kationów i ułatwiania ich transportu przez błony biologiczne. Ta właściwość jonoforów wynika z ich lipofilowego charakteru, który umoŜliwia penetrację błon lipidowych, takich jak błona mitochondrialna. Za przykład moŜe posłuŜyć walinomycyna umoŜliwiająca przechodzenie K+ przez błonę mitochondriainą. w następstwie czego dochodzi do rozładowania potencjału błonowego między środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym mitochondrionu. Nigerycyna równieŜ działa jako jonofor dla K+, ale na zasadzie wymiany z H + . Prowadzi to do zniesienia transmembranowego gradientu pH. W obecności walinomycyny i nigerycyny, zostaje wyeliminowany zarówno potencjał błonowy, jak i gradient pH i stąd całkowite hamowanie fosforylacji. Klasyczne związki rozprzęgające, takie jak dinitrofenol, są w rzeczywistości jonoforami protonowymi. Transhydrogenaza transportująca H* wytwarza wewnątrzmitochondrialny NADPH Znajdująca się w wewnętrznej błonie mitochondrialnej energetycznie zaleŜna transhydrogenaza katalizuje przeniesienie H+ z wewnątrzmitochondrialnego NADH na NADP, tworząc NADPH, który jest sprzęŜony z przemieszczeniem protonów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza mitochondrionu. Wydaje się, Ŝe

enzym działa jako energetycznie zaleŜny bufor red.-oks. i jako źródło NADPH dla enzymów wewnątrzmitochondrialnych, takich jak dehydrogenaza glutaminianowa i hydroksylazy uczestniczące w syntezie steroidów. Niedoczynność łańcucha oddecho wego

jest przyczyną choroby
Niedobory lub brak większości oksydoreduktaz łańcucha oddechowego są przyczyną śmiertelnej miopatii tnitochondrialnej niemowląt i dysfunkcji nerek. MELAS (miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mkczanowa i udar) jest dziedzicznym zespołem chorobowym, wynikającym z niedoboru oksydoreduktazy NADH; ubichinon {kompleks 1) lub oksydazy cytochromowej. Opisano wiek chorób spowodowanych niedoborem któregoś z enzymów mitochondrialnych (Scholte). PIŚMIENNICTWO
Boyer PD: The unusual enzymology of ATP synthase. Biochemistry 1987;26:8503. Cross RL: The mechanism and regulation oT ATP synthesis by FrATPases. Annu Rev Biochem 1981;50:<581. Hatefi Y: The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu Rev Biochem 1985;54:1015. Hinkle PC, McCarty RE: How cells make ATP. Sci Am (March) 197K;238:104. Mitchcll P: BCeilin's respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 1979;206:1148. Nicholls DG: Bioenergetics: An introduetion to the Chemiosmotic Theory. Academic Press, 1982. Prince RC: Tbe proton pump of cytochrome oxidase. TIBS 1988;13:159. Schohe HR, et al: Defects in oxidative phosphorylation. Biochemical iiwestigations in skeletal muscle and expression of the lesion in other cells. / Inher Metab Dis 1987;I0, Suppl 1:81. Tyler DD: The mitochondrial ATP synthase. Page 117 in: Membranę Structure and Function, Vol. 5. Bittar EE (editor). Wiicy, 1984. Tyler DD, Sutton CM: Mitochondrial transporting systems. Page 181 in: Membranę Structure and Function. Vol 5. Bittar EE (editor). Wiley, 1984.

Węglowodany o znaczeniu fizjologicznym
Peter A. Mayes, PhD, DSc

15

WPROWADZENIE
Węglowodany są szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Odgrywają one rolę zarówno strukturalną, jak i metaboliczną. W roślinach glukoza jest syntetyzowana z dwutlenku węgla i wody w procesie fotosyntezy i przechowywana jako skrobia lub ulega przekształceniu w błonnik szkieletu roślinnego. Zwierzęta mogą syntetyzować niektóre węglowodany, wykorzystując do tego celu tłuszcz i białka, ale większa część węglowodanów zwierzęcych jest pochodzenia roślinnego.

WĘGLOWODANY SĄ ALDEHYDOWYMI LUB KETONOWYMI POCHODNYMI ALKOHOLI WIELOHYDROKSYLOWYCH
Węglowodany klasyfikuje się następująco:

Monosacharydy są to węglowodany, które nie ulegają hydrolizie do form
prostszych. Na podstawie liczby atomów węgla moŜna je podzielić na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy i hcptozy; oraz na aldozy i ketozy zaleŜnie od obecności grupy aldehydowej lub ketonowej. Przykładami są:
Aldoza
Triozy (C3H6O3)

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Znajomość struktury i właściwości węglowodanów fizjologicznie waŜnych jest niezbędna do zrozumienia ich roli w ekonomii organizmu ssaków. Glukoza jest najwaŜniejszym węglowodanem, poniewaŜ większość węglowodanów zawartych w pokarmach wchłania się do krwiobiegu jako glukoza lub jest przekształcana w nią w wątrobie, a w organizmie z glukozy mogą powstać wszystkie inne cukry. Glukoza jest istotnym źródłem energii w tkankach, ssaków (z wyjątkiem przeŜuwaczy) i uniwersalnym „paiiwem" dla płodu. Jest ona przekształcana w inne cukry odgrywające swoiste role, np. glikogen jako spichlerz; ryboza w kwasach nukleinowych; galaktoza w laktozie mleka, w pewnych lipidach złoŜonych oraz w połączeniu z białkami w glikoproteinach i proteoglikanach. Do chorób związanych z zaburzeniami węglowodanów zalicza się cukrzycę, galaktozemic, zaburzenia spichrzania glikogenu i nietolerancję mleka.
Tetrozy Pentozy (CBH10Os) Heksozy (C6H12O0)

Ketoz Dihyd roglicerynowy Erytroza Ryboza Glukoza ksyaceton Erytruloza Rybuloza Fruktoza

a (C.H.OJ Aldehyd

Disacharydy to węglowodany, które podczas hydrolizy rozpadają się na 2 cząsteczki takich samych lub róŜnych monosacharydów. Przykładami są sacharoza, laktoza i maltoza. Oligosacharydy to cząsteczki, które podczas hydrolizy rozpadają się na 3—6 jednostek monosacharydowych. Przykładem moŜe być maltotrioza*.

Polisacharydy w wyniku hydrolizy rozkładają się na ponad 6 cząsteczek
monosacharydów. Przykładami polisacharydów, które mogą być liniowe lub rozgałęzio* NaleŜy podkreślić, Ŝe nie jest to trioza, ale trisacharyd zbudowany z 3 reszt a-glukozy.

II — Biochemia

162 / ROZDZIAŁ 15

ne, są skrobie i dekstryny. Niekiedy określa się je jako heksozany lub pentozany, w zaleŜności od rodzaju monosacharydów otrzymywanych w wyniku hydrolizy.
GLUKOZA JEST GŁÓWNYM MONOSACHARYDEM Struktura glukozy moŜe być przedstawiona 3 sposobami

frakcji promieni rentgenowskich ustalono, Ŝe ten sześcioczłonowy pierścień zawierający 1 atom tlenu, w rzeczywistości istnieje w formie krzesełkowej (ryc. 15-1C).
Cukry występują w formie róŜnych rodzajów izomerów

ChociaŜ wzór strukturalny w formie prostego łańcucha (aldoheksoza, ryc. 15-1 A) pozwala zrozumieć niektóre właściwości glukozy, to strukturą uprzywilejowaną termo dynamicznie i warunkującą jej pozostałe właściwości chemiczne jest forma cykliczna. W większości przypadków wzór strukturalny glukozy moŜe być przedstawiony jako płaski pierścień narysowany perspektywicznie, jak zaproponował Haworth (ryc. 15-1B). Na podstawie analizy dy0
II -H ■c H— -OH 2 C
11

Związki o takim samym wzorze strukturalnym, ale róŜnej konfiguracji przestrzennej są znane jako stereoizomery. Warunkiem powstania izomerów przestrzennych są asymetryczne atomy węgla (atomy węgla połączone z 4 róŜnymi atomami lub grupami). Liczba moŜliwych izomerów danego związku zaleŜy od liczby asymetrycznych atomów węgla (n) i równa się 2n. Glukoza, z 4 asymetrycznymi atomami węgla, ma 16 izomerów. WaŜniejsze rodzaje izomerów glukozy są następujące:

1. Izomery konf iguracyjne D i L. Określenie izomerujako formy D lub jej lustrzanego odbicia jako formy L jest uwarunkowane przestrzennym podobieństwem do macierzystego związku rodziny węglowodanów, trójwęglowego cukru — aldehydu glicerynowego (gliceroza jest nazwą nie wskazaną). Formy L i D tego cukru, wraz z odpowiadającymi im izomerami glukozy, przedstawiono na ryc. 15-2. Ustawie-

H- -OH «C

e

i

CH,OH

<C —H I 'CHjOH
Aldehyd L-pllcerynowy

C—H I H-C —OH CHjOH
Aldehyd D-gtfoeryrtowy (D-G!loeroza)

J

C-H OH

'C-H t HOI H- CI HO—
I *C —H I 'CHsOH
S

C —H I H- C —OH ( HO—C —H i H-C

«C -H

Ć
—OH H-C I

m

CH,OH
a-D-Glutoza L-Glukoza D- Glukoza

Ryc. 15-1. a-D-Glukoza. A — forma łańcuchowa, B — wzór rzutowy Hawortha, C — konformacja krzesełkowa.

Ryc. 15-2. D- i L-lzomery aldehydu glicerynowego i glukozy.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 163 nie grup — H i -OH wokół atomu węgla (tj. 5 atomu, węgla w glukozie) przylegającego do końcowego węgla pierwszorzędowego alkoholu warunkuje przynaleŜność cukru do szeregu D lub

L. JeŜeli grupa — OH przy tym atomie węgla (atomie odniesienia) znajduje się po stronie prawej (jak przedstawiono na ryc. 15-2), to cukier naleŜy do szeregu D; jeśli grupa — OH znajduje się po stronie lewej, to cukier naleŜy do szeregu L. Większość monosacharydów występujących u ssaków ma konfigurację D, a enzymy warunkujące ich metabolizm są swoiste dla tej konfiguracji. Obecność asymetrycznych atomów węgla nadaje równieŜ cząsteczce aktywność optyczną. Gdy strumień światła spolaryzowanego przechodzi przez roztwór izomeru optycznego, wówczas płaszczyzna polaryzacji przechodzącego światła spolaryzowanego moŜe zostać skręcona w prawo, prawoskrętność (+), lub w lewo, lewoskrętność (—). Związek moŜe być oznaczony D(—), D( + ), L( —) lub L(-t-), co wskazuje na jego pokrewieństwo strukturalne 2 aldehydem Dlub L-gliceryn owym, oraz wskazuje, Ŝe wykazuje on niekoniecznie ten sam kierunek skręca lności optycznej co aldehyd, np. naturalnie występującą formą fruktozy jest D(—) izomer. Mieszanina równych ilości izomerów D i L nie wykazuje Ŝadnej aktywności optycznej, gdyŜ aktywności kaŜdego z izomerów wzajemnie się znoszą. Mieszaninę taką nazywamy racemiczną lub DL-mieszaniną. Związki otrzymywane syntetycznie są z konieczności racemiczne, poniewaŜ kaŜdy z izomerów powstaje z taką samą łatwością. 2. Piranozowe i furanozowe formy pierścieniowe. Podstawą terminologii jest fakt, Ŝe trwale struktury pierścieniowe mono sacharydów są podobne do struktury pierście nia piranu lub furanu (ryc. 15-3). Ketozy mogą równieŜ występować w formach pierścienio wych (np. D-fruktofuranoza lub D-fruktopiranoza) (ryc. 15-4). W przypadku znajdującej się w roztworze glukozy, ponad 99% jej cząsteczek znajduje się w postaci piranozowej; a więc mniej niŜ 1% znajduje się w postaci furanozowej. 3. a i p Ano mery. Struktura pierścieniowa aldozy jest półacetalem, poniewaŜ została utwo rzona w wyniku reakcji grupy aldehydowej z grupą alkoholową (ryc. 15-5). Podobnie pierś cieniowa struktura ketozy jest półketalem. Kry staliczna glukoza jest a-D-glukopiranozą. W roztworze zachowuje się struktura cykliczna, ale pierwszy atom węgla (karbonylowy) staje się

Plran

Fu ran

HOCH

HOCHj I
HCOH

H

OH ■i- D- GI u kołu ranoza

n-OGIukopIranoza

Ryc. 15-3. Postacie pira noŜowa i furanozowa glukozy.

OH

H

a-D-FruktopIranoza

OH

H a - D-

Fru ktof u r an oza

Ryc. 15-4. Postacie pira noŜowa i furanozowa fruktozy.

asymetryczny (anomeryczny atom węgla). Wyni-

kiem tego jest powstanie mieszaniny zawierającej a-glukopiranozę (36%) i P-glukopiranozę (63%) oraz śladowe ilości oc i P anomerów glukofuranozy (1%). Ustalaniu się równowagi w tym układzie towarzyszy zmiana skręcalności optycznej (mutarotacja), w miarę otwierania się

164 / ROZDZIAŁ 15 HOCH
HO\OH

HOCH,
H/H

\
HO\OH

\OH /
H/H
OH

H

OH

W
H

«r-D-Glukoplranoza (fl-anomer)

/f-OGIukopIranoza (0-anomer) Acykliczna forma aldehydowa

Ryc. 15-S. cc- i DMechanizm

p-stereoizomery glukopiranozy. mutarotacji.

pierścienia pó lace tal owego i jego odtwarzania, wraz ze zmianami połoŜenia grup — H i — OH przy pierwszym atomie węgfa. Pośrednikiem w tym procesie jest przypuszczalnie uwodniona

prostolańcuchowa cząsteczka acykliczna, aczkolwiek analiza polarograficzna wykazała, Ŝe najwyŜej 0,0025% glukozy istnieje w formie acyklicznej. Rotacja optyczna obserwowana w roztworach glukozy jest prawoskretna; z tego powodu w praktyce klinicznej często uŜywa się nazwy dekstroza zamiast glukoza. 4. Epimery. Izomery róŜniące się konfigu racją — OH i — H przy atomach węgla 2, 3 lub 4 glukozy nazywamy epimerami. NajwaŜniej szymi biologicznie epimerami glukozy są mannoza i galaktoza, utworzone przez epimeryzację odpowiednio przy węglu 2 i 4 (ryc. 15-6). 5. Izomery konstytucyjne — aldoza, ketoza. Fruktoza ma ten sam wzór cząstecz kowy co glukoza, lecz róŜni się wzorem struk turalnym. Przy drugim atomie węgla cząsteczki fruktozy znajduje się potencjalna grupa ketono wa (ryc. 15-7), natomiast glukoza zawiera po tencjalną grupę aldehydową w pozycji 1 (ryc. 15-8). Wiele monosacharydów to związki fizjologicznie waŜne Pochodne trioz powstają w wyniku metabolicznej degradacji glukozy w ciągu glikolitycz-

HOCH, H OH a-

HOCH

D-Galaktoza Ryc. 15-6. Epirneryzacja glukozy H H aD-Mann ola

CH,OH CHiOH I HO —C — H H - C - OH i CH,OH D-(Jsyluloza CHjOH

CH3OH i

c=o
HO—C—H

c=o

i

ć=o
I H-C — OH H-C -OH CH,OH D-Rybuloza

C=OI HO— C— H H—C —OH H —C—OH CH,OH

CH,OH I

C=O CH,OH Dihydroksyaceton

H—C —OH I H—C —OH I H—C —OH CHiOH

D-Fruktoza

D-Sedoheptuloza

Ryc. 15-7. Przykłady ketoz o znaczeniu fizjologicznym.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU RZJ O LOGICZNYM / 165

CHO
H-C-OH
CH,OH
Aldehyd D-gllcarynowy

"

CHO

*

CHO H-C-OH H-C-OH CHiOH D-Erytroza CHO

HO-Ć-H H-C-OH
CHjOH D-Treoza CHO

ł

CHO n

CHO

ł

HO-Ć-H HO-Ć-H
j

H-Ć -OH
LJA /* LJ

n v^ w

H -C -OH ĆH3OH
D-LIksoza CHO

H-C -OH CH.OH D-Ksyloza

HO-Ć-H H-Ć-OH H-Ć -OH
CHiOH D-Arablnoza

H-Ć -OH H-Ć -OH
H-C -OH CHjOH D-Ryboia

r
HO-C-H

1
H-Ć-OH

H-C-OH
HO-Ć-H

HO-C-H

HO-Ć-H

HO-Ć-H
H-C-OH

H-Ć-OH
H-C-OH
CH,OH D-Mannoza

H-Ć-OH
H-Ć-OH
CH,OH D -Glukoza

ĆH,OH
O-Galakloza

Ryc. 15-8. WspółzaleŜności strukturalne szeregu D. D-Treoza nie ma znaczenia fizjologicznego. aldoz Szereg utworzono przez teoretyczne dodawanie jednostki CH2O do grupy -CHO cukru.

nym. Pochodne trioz, tetroz, pentoz i 7-wcglowego cukru (sedoheptulozy) powstają w procesie degradacji glukozy w cyklu pentozofosforanowym. Pentozy są istotnym składnikiem nukleotydów, kwasów nukleinowych i wielu koenzymów (tab. 15-1). 2 heksoz najwaŜniejsze fizjologicznie są; glukoza, galaktoza, fruktoza i mannoza (tab. 15-2). Na rycinie 15-8 przedstawiono strukturę znaczących biochemicznie aldoz, a ryc. 15-7 budowę 5 waŜnych w metabolizmie ketoz. WaŜną rolę odgrywają kwasy karboksylowe pochodne glukozy, takie jak D-glukuronian (uczestniczący w tworzeniu gtukuronidów i występujący jako składnik glikozaminoglikanów) i jego pochodne metaboliczne, L-iduronian (skiadnik glikozaminoglikanów) (ryc, 15-9) i L-gulonian (metabolit szlaku kwasu uronowego; p. ryc. 22-1).

coo-

OH

OH

Ryc. 15-9. a-D-Glukuroman (z lewej) 1 p-L-iduronian (z prawej).

Cukry tworzą glikozydy, reagując z innymi związkami lub między sobą Glikozydy są to związki powstające w wyniku kondensacji między grupą hydroksylową, znajdującą się na anomerycznym atomie węgla monosacharydu lub reszty monosacharydowej, a drugim związkiem, którym moŜe — lecz nie

166 / ROZDZIAŁ 15 Tabela 15-1. Pentozy Cukier D-Ryboza mające znaczenie fizjologiczne
Występowanie Znaczenie biochemiczne Znaczenie kliniczne

Kwasy nukleinowe

Składnik strukturalny kwasów nukleinowych i koenzymów, np. ATP, NAD, NADP, flawoprotein. Metabolit pośredni w cyklu pentozofosforarrowym Związek pośredni w cyklu pentozofosforan owym Składnik glikoprotein

D-Rybuloza D-Arabinoza

Powstaje w procesach metabolicznych Guma arabska Gumy śliwkowa i czereśniowa Gumy drzewne proteoglikany, glikozaminoglikany Mięsień sercowy

D-Ksyloza

Składnik głikoprotein

D-Liksoza

Składnik liksoflawiny izolowanej z mięśnia sercowego człowieka <wasu uronowego Pojawia się w moczu w pentozurii wrodzonej

L-Ksyluloza

Związek pośredni szlaku

Tabela 15-2. Heksozy Cukier D-Glukoza

mające znaczenie fizjologiczne
Źródło Znaczenie biochemiczne Znaczenie kliniczne

Soki owocowe. Hydrolizat skrobi, sacharozy, maltozy i laktozy Soki owocowe. Miód. Hydrolizat sacharozy i inuliny (z bulw karczochów) Hydrolizat laktozy

„Cukier" organizmu. Przenoszony przez krew. pobierany i wykorzystywany przez tkanki W wątrobie i jelitach przekształca się w glukozę i tak zuŜywa ją organizm W wątrobie ulega przekształceniu w glukozę i jest metabolizowana. Syntetyzowana w gruczole sutkowym tworzy laktozę mleka. Składnik glikolipidów i glikoprotein Składnik wielu glikoprotein

D- Fruktoza

D-Galaktoza

Pojawia się w moczu (giukozuria) w wyniku zwiększenia stęŜenia glukozy we krwi (hiperglikemia) w cukrzycy Dziedziczna nietolerancja fruktozy jest przyczyną akumulacji fruktozy i hipoglikemit Zaburzenia jej metabolizmu prowadzą do galak-

tozemii i zaćmy

D-Mannoza

Hydrolizat gum i martnozanów roślinnych

musi (w przypadku aglikonu — być inny monosacharyd. JeŜeli drugą grupa jest hydroksyl, to
wiązanie O-gliknzydowe jest połączeniem aceta-

lowym, poniewaŜ jest ono wynikiem reakcji

między półacetalową grupą hydroksylową a inną grupą — OH. JeŜeli częścią hemiacetalową jest glukoza, to utworzony związek jest glukozydem; jeśli galak-

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 167

HO/CH.OH

OH

H

OH

OH

Ryc, 15-10. Streptomycyna (z lewej) i ouabaina (z prawej).

toza — galaktozydent, itd. JeŜeli drugą grupą jest amina, powstaje wiązanie N-glikozydowe, np. między adeniną a rybozą w takich nukleotydach, jak ATP (p. ryc. 12-5). Glikozydy są składnikami wielu leków i przypraw korzennych oraz tkanek zwierzęcych. Aglikonem moŜe być metanol, glicerol, steroł, fenol lub zasada, np. adenina. Wszystkie glikozydy, waŜne w medycynie ze względu na ich działanie na mięsień sercowy (glikozydy nasercowe), zawierają, jako składnik aglikonowy, steroidy. NaleŜą tu pochodne naparstnicy i strofantusa, takie jak ouabaina będąca inhibitorem Na+/K+-ATPazy błon komórkowych. GUkozydami są niektóre antybiotyki, np. streptomycyna (ryc. 15-10). Deoksycukrom brak atomu tlenu W deoksycukrach grupę hydroksylową przyłączoną do pierścienia zastąpił atom wodoru. Deoksycukry otrzymuje się w wyniku hydrolizy pewnych biologicznie waŜnych związków. Przykładem jest deoksyryboza (ryc. 15-11) występująca w kwasach nukleinowych (DNA).

Deoksycukrem jest równieŜ L-fukoza (p. ryc. 15-17), składnik glikoprotein, oraz 2-deoksyglukoza, znany inhibitor metabolizmu glukozy. Aminocukry (heksozoaminy) są składnikami glikoprotein, gangliozydów i glikozaminoglikanów Przykładami aminocukrów występujących w przyrodzie są D-glukozamina (ryc. 15-12), D-galaktozamina i D-mannozamina. Glukozamina jest składnikiem kwasu hialuronowego. Galaktozamina (chondrozamina) jest składnikiem chondroityny (p. rozdz. 54),
HOCH

Ryc. 15-12. Giukozamina (2-amino-D-glukopiranoza) (anomer a). Galaktozamina jest 2-amino-D-galaktopiranozą. Zarówno giukozamina, jak i ga laktozamina występują jako N-acetylowe pochod ne w większości węglowodanów złoŜonych, np. w glikoproteinach. ____________

OH

H

Ryc. 15-11. 2- Deoksy- D-rybofuranoza (anomer ji),

Niektóre antybiotyki (erytromycyna, karbomycyna) zawierają w swojej cząsteczce aminocukry. UwaŜa się, Ŝe aktywność lecznicza związana jest z obecnością aminocukrów w cząsteczkach tych antybiotyków.

168 / ROZDZIAŁ 15

NAJWAśNIEJSZYMI DISACHARYDAMI SĄ MALTOZA. SACHAROZA I LAKTOZA
Disacharydy są cukrami złoŜonymi z 2 reszt monosacharydowych połączonych wiązaniem glikozydowym (ryc. 15-13). Nazwę chemiczną

disacharydów tworzy się na podstawie ich monocukrowych składników. WaŜnymi fizjologicznie disacharydami są maltoza, sacharoza, laktoza i trehaloza {tab. 15-3). W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje mieszanina zwana „cukrem inwertowanym", gdyŜ powstająca w czasie hydrolizy silnie lewoskręt-

Maltoza

Trehaloza

A --- \
iOH 1 H OH

—o—'
H OH

0-a-0-Glukoplranozylo-(1ł4)-a-D-giukopiranoza H OH H

0-a-OGIukoplranozyto-(1-ł1)-«-[>-g!ukoplranozyd

Celobioza

HOCH2

HO

H

OH

OH

H

H

OH

OH

O-/t-D-Fru ktof u ra n ozylo-(2 -• 1 )-a - D-g I u to p I ran ozyd

Laktoza

H

OH

H

OH

O-0-D-GaJal<taptranozylo-(1-.4)-£-D-gfukopiranoza

Ryc. 15-13. Struktura typowych disacharydów. Przedrostek a i p odnosi się do konfiguracji przy anomerycznym atomie węgla(*). JeŜeli węgiel anomeryczny drugiej reszty uczestniczy w tworzeniu wiązania glikozydowego, to ta|ją resztę glikozydową nazywa stę furanozydem lub piranozydem. W odróŜnieniu od większości innych cukrów, cukier nie mający wolnej potencjalnej grupy aldehydowej lub ketonowej na węglu anomerycznym nie wykazuje właściwości redukujących.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 169 Tabela 15-3. Disacharydy Cukier Maltoza Laktoza Źródło Produkt trawienia amylazą lub hydrolizy skrobi. Kiełkujące ziarna zbóŜ i słód Mleko MoŜe pojawiać się w moczu podczas ciąŜy. Przy niedoborze laktazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia Przy niedoborze sacharazy, zaburzenie wchłaniania prowadzi do biegunki i wzdęcia Znaczenie kliniczne

Sacharoza

Cukier trzcinowy i z buraków cukrowych. Sorgo, ananasy, marchew Grzyby i droŜdŜe. Główny cukier hemolimfy owadów.

Trehaloza

na fruktoza powoduje zmianę (inwersję) skręcał no ści optycznej pierwotnie prawoskrętnej sacharozy.

POLISACHARYDY PEŁNIĄ FUNKCJE ZAPASOWE I STRUKTURALNE
Do polisacharydów zalicza się następujące waŜne fizjologicznie węglowodany: Skrobia. Ma budowę łańcucha a-glikozydoweg"b. Takie związki, rozpadające się w trakcie hydrolizy tylko na cząsteczki glukozy, są homopolimerami zwanymi glukoza na mi tub glukanatni. Skrobia jest najwaŜniejszym źródłem węglowodanów w poŜywieniu i znajduje się w kaszach, ziemniakach, roślinach strączkowych i innych warzywach. Dwoma głównymi skład-

nikami skrobi s ą: amylo z a (15 20%),two rŜąca nierozgałęzioną strukturę helikoidalną (ryc. 15-14), oraz amylopektyna (80—85%), tworząca łańcuchy rozgałęzione. W tej ostatniej do łańcucha głównego są przyłączone wiązaniem 1 -+ó łańcuchy boczne; jedno odgałęzienie przypada na 24—-30 reszt glukozowych połączonych wiązaniami l-*4. Glikogen (ryc. 15-15). Jest zapasowym polisacharydem organizmów zwierzęcych. Często nazywa się go skrobią zwierzęcą. Ma strukturę bardziej rozgałęzioną niŜ amylopektyna, bowiem jedno odgałęzienie przyłączone do łańcucha głównego wiązaniem a(l -»-6)-glikozydowym przypada na 10—18 reszt a-D-glukopiranozowych połączonych wiązaniami a(l-»4)-glikozydowymi, Inulina. Jest polisacharydem występującym

Ryc. 15-14. Struktura skrobi. A — amyloza o strukturze spiralnego zwoju, B — amylopektyna z rozgałęzieniami przyłączonymi wiązaniami 1 -»6. ____

170 / ROZDZIAŁ 15

REGION ZEWNĘTRZNY

Ryc. 15-15. Cząsteczka glikogenu. A — struktura ogólna, B — powiększona struktura w punkcie rozgałęzienia. Liczby w A oznaczają kolejne etapy wzrostu cząsteczki. R — pierwotna reszta glukozy zawierająca, jako jedyna w cząsteczce glikogenu, redukującą grupę przy Cv Rozgałęzienia są bardziej róŜnorodne niŜ to przedstawiono na tej rycinie: wartość stosunku wiązań 1 -* 4 do wiązań 1 -* 6 waha się w granicach 10—18.

w bulwach i korzeniach dalii, karczochów i mniszka lekarskiego. Ulega ona hydrolizie do fruktozy, jest więc fruktozanem. Ten cukier zapasowy, w odróŜnieniu od skrobi ziemniaków, jest łatwo rozpuszczalny w ciepłej wodzie i bywa uŜywany w badaniach fizjologicznych do określenia szybkości filtracji w kłębuszkach nerkowych. Dekstryny. Są substancjami powstającymi podczas częściowej hydrolizy skrobi. Pierwszymi produktami trawienia skrobi, tworzonymi w wyniku skracania łańcuchów bocznych amylopektyny, są dekstryny graniczne. Błonnik (celuloza). Jest głównym składnikiem podporowym u roślin. Nie rozpuszcza się w po-

pularnych rozpuszczalnikach. Tworzy, zbudowane z jednostek p-D-glukopiranozowych, połączonych wiązaniami P(l-ł4), długie, proste łańcuchy wzmocnione krzyŜowymi wiązaniami wodorowymi. Błonnik nie jest trawiony w przewodzie pokarmowym wielu ssaków, w tym człowieka, z powodu braku hydrolazy działającej na wiązania p. Jest waŜnym składnikiem „objętościowym" poŜywienia. W Ŝołądku przeŜuwaczy i innych trawoŜernych występują mikroorganizmy zdolne rozbić wiązanie p, co pozwala wykorzystać bionnik jako znaczące źródło energetyczne. Chiryna. Jest waŜnym polisacharydem strukturalnym u bezkręgowców. Znajduje się ona np.

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM I 171
C hity na

HOCH2

HOCH, H

HN*CO«CH3 N-Acetyloglukozamina

H

HN»CO*CH3

N-Acełylogiu Kozami na

Kwas hiahironowy

w pancerzach skorupiaków i owadów. Strukturalnie chityna składa się z jednostek N-acetylo-D-glukozaminy, połączonych wiązaniami P(l-*4)-glikozydowymi (ryc. 15-16). Glikozamiaogliksny (mukopohsacharydy). Składają się z łańcuchów węglowodanów złoŜonych, charakteryzujących się zawartością aminocukrów i kwasów uronowych. Po przyłączeniu tych łańcuchów cukrowych do cząsteczki białka powstaje składnik zwany proteoglikanem. Razem z elastyną i kolagenem, elementami strukturalnymi takich tkanek, jak kość, tworzą substancję podstawową, czyli kitową. Znaczna liczba grup — OH i ładunków ujemnych, które przez odpychanie utrzymują w cząsteczce łańcuchy węglowodanowe osobno, powoduje, Ŝe glikozaminoglikany mają właściwość zatrzymywania znacznej ilości wody oraz pęcznienia i dzięki temu zdolność do nadawania właściwości amortyzujących lub poślizgowych innym strukturom. Przykładem są kwas hiałuronowy,
siarczan chondroityny i heparyna (ryc. 15-16),

HOCH, COO" H OH Kwas /(-g luku ran owy N-

Acatylogukozamlna
4-Siarczan chondroltyny

omówienie szczegółowo w rozdz. 57, Glikoproteiny (mukoproteiny). Występują w róŜnych płynach i tkankach, w tym w błonach komórkowych (p. rozdz. 43 i 57). Są to białka złoŜone zawierające w róŜnych ilościach węglowodany, przyłączone jako krótkie lub długie (do 15 jednostek) rozgałęzione lub nierozgałęzione łańcuchy. Łańcuchy takie nazywa się zwykle łańcuchami oligosacharydowymi. Składniki cukrowe obejmują:
Heksozy Mannoza (Man) HOCH, H HNCOCH3 Acetyloheksozaminy N-Acetyloglukozarnina (GIcNAc) Galaktoza (Gal) N-Acetylogalaktozarriina (GaiNAc)

(Uwaga: występuje równieŜ 6-siarczan)

Pentozy Arabinoza (Ara) Ksyloza (Xyi) H OH Metylopentozy Kwas 0L-Fukoza (Fuc; p. ryc, 15-17) glukuronowy Siarczan Nacatylogalaktozaminy
Heparyna

Kwasy sjałowe Pochodne N-acylowe kwasu neuraminowego, np. kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. ryc. 15-18), główny kwas sjalowy.

H/H

\H

Hy

"O.

H Suttonowana giukozamina Sulfonowany kwas Iduronowy

Dojrzale glikoproteiny, oprócz kolagenu, nie zawierają glukozy i w przeciwieństwie do gliko/aminoglikanów i proteogiikanow nie zawierają kwasów uronowych. Kwasy sjalowe. Są N- lub O-acylowymi pochodnymi kwasu neuraminowego (ryc. 15-18). Kwas neuraminowyH 9-węglowym cukrem, jest OSĄ1 NH«SO3~

Ryc. 15-16. Struktura niektórych polisacharydów złoŜonych.

172 / ROZDZIAŁ 15

JtrsO\H

W
OH H

HO/0

Ryc. 15-17. (i-L Fukoza (6-deoksy-p-L-galaktoza).

Ac —NH

COCT

stanowią węglowodany, które znajdują się w glikoproteinach i gliko lipid ach. Ich obecność na zewnętrznej powierzchni błony plazmatycznej (glikokaliks) wykazano przy uŜyciu lektyn roślinnych, aglutynin białkowych, które wiąŜą się swoiście z pewnymi resztami glikozylowymi, np. kimkanawalina A jest swoista w stosunku do reszt a-glukozy 1 owych i a-mannozylowych. Glikoforyna. Jest główną integralną glikoproteiną błony ludzkich erytrocytów. Zbudowana ze 130 reszt aminoacylowych tkwi w błonie lipidowej tak, Ŝe zarówno z zewnętrznej, jak i z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) powierzchni błony wystają wolne części polipeptydowe. Łańcuchy sacharydowe są przyłączone tylko do części N-końcowej, znajdującej się na zewnątrz powierzchni zewnętrznej błony (p. rozdz, 43). PIŚMIENNICTWO
Advances in Carbohydrate Chemistry. Academic Press, 1945—current. Collins PM (editor); Carbokydrates. Chapman & Hali, 1987. Ferrier RJ, Collins PM; Monosaccharide Chemistry. Penguin Books, 1972. Hughes RC: The comple* carbohydrates of mammalian celi surfaces and their biological roles. Essays Biochem 1975;11:1. Lindahl U, Hook M: Glycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules. Annu Rev Biochem 1978;47:385. Pigman WW, Horton D (editors): The Carbohydrates. Vols — 1A and 1B. Academic Press, 1972. Rees DA: Poiysaccharide Shapes. Wiley, 1977. Sharon N: Carbohydrates. Sci Am 1980;245:90

OH

H

Ryc. 15-18. Struktura kwasu N-acetyloneuraminowego (kwasu sjalowego). Ac = CH3-CO-.

którego strukturę moŜna wyprowadzić, tączac mannozaminę (epimer glukozaminy) z pirogronianem. Kwasy sjalowe są składnikami zarówno glikoprotein jak i gangliozydów. WĘGLOWODANY ZNAJDUJĄ SIĘ W BŁONACH KOMÓRKOWYCH Lipidową strukturę błon komórkowych opisano w rozdz. 16 i 43. Analiza składników błon komórkowych ssaków wykazuje, Ŝe ok. 5%

Lipidy o znaczeniu fizjologicznym
Peter A. Mayes, PhD, DSc

16
LIPIDY DZIELI SIĘ NA PROSTE I ZŁOśONE
Zmodyfikowana klasyfikacja lipidów wg Bloora jest następująca: A. Lipidy proste: estry kwasów tłuszczowych z róŜnymi alkoholami. 1. Thiszcze właściwe — estry kwasów tłu szczowych z glicerolem. Tłuszcze występujące w stanie płynnym nazywa się olejami. 2. Woski — estry kwasów tłuszczowych z długołańcuchowymi alkoholami monohydroksylowymi. B. Lipidy złoŜone: estry kwasów tłuszczowych zawierające, oprócz alkoholu i kwasów tłu szczowych, jeszcze grupy dodatkowe. 1. Fosfolipidy — lipidy zawierające oprócz kwasów tłuszczowych i glicerolu, resztę kwasu fosforowego. Często zawierają one zasadę azo tową i inne podstawniki. a. Glieerofosfolipidy — alkoholem jest glicerol. b. Sfingofosfolipidy — alkoholem jest sfingozyna. 2. Glikolipidy (glikosfingolipidy) — lipidy za wierające kwas tłuszczowy, sfingozynę i wę glowodany, 3. Inne lipidy złoŜone — takie lipidy, jak sulfolipidy i aminolipidy. W tej grupie moŜna umieścić równieŜ lipoproteiny. C. Prckursory i pochodne lipidów: nakŜą tu kwasy tłuszczowe, glicerol, steroidy, alkohole inne niŜ gHcerol i sterole, aldehydy tłuszczowe, związki ketonowe (p, rozdz. 24), węglowodory, witaminy rozpuszczalne w tłuszczach i hor mony. Ze względu na brak ładunku w cząsteczkach, acylogiicerole (glicerydy), cholesterol i estry cholesterolu określa się mianem lipidów obojętnych.

WPROWADZENIE
Lipidy są heterogenną grupą związków rzeczywiście lub potencjalnie pokrewnych kwasom tłuszczowym. Mają one wspólną cechę, którą jest t) względna nierozpu szcza Iność w wodzie oraz 2) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak eter, chloroform i benzen. Do lipidów zalicza się wiec thiszcze, oleje, woski i związki pokrewne. Lipidy są waŜnymi składnikami pokarmów nie tylko ze względu na ich duŜą wartość energetyczną, lecz takŜe dlatego, Ŝe w tłuszczach zawartych w naturalnych pokarmach znajdują się -witaminy rozpuszczalne w tłuszczach oraz niezbędne (tzw. egzogenne) kwasy tłuszczowe.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
W organizmie tłuszcze słuŜą jako wydajne źródło energii zarówno bezpośrednio, jak i potencjalnie, gdy odłoŜone są w tkance tłuszczowej. Tłuszcze tkanki podskórnej i gromadzące się wokół pewnych narządów słuŜą jako izolator termiczny, a lipidy niepolarne jako izolatory elektryczne pozwalające na szybkie rozprzestrzenianie się fal depolaryzacyjnych wzdłuŜ mielinowych włókien nerwowych. Zawartość tłuszczów jest wyjątkowo duŜa w tkance nerwowej. Połączenia tłuszczu z białkiem (lipoproteiny) stanowią waŜne składniki komórkowe występujące zarówno w błonie komórkowej, jak i w mitochondriach, a takŜe słuŜą jako środki transportu lipidów w osoczu krwi. Znajomość biochemii lipidów jest konieczna do zrozumienia wielu bieŜących zagadnień biomedycznych, np. otyłości, miaŜdŜycy oraz roli róŜnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zarówno w Ŝywieniu, jak i w zdrowiu.

174 / ROZDZIAŁ 16

KWASY TŁUSZCZOWE SĄ ALIFATYCZNYMI KWASAMI KARBOKSYLOWYMI Kwasy tłuszczowe występują głównie w formie zestryfikowanej w naturalnych tłuszczach i olejach, ale w surowicy krwi występują i są transportowane w formie niezestryfikowanej jako wolne kwasy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach naturalnych są zwykle pochodnymi nierozgałęzionych łańcuchów węglowodorowych i zawierają parzystą liczbę atomów węgla, poniewaŜ są syntetyzowane z jednostek dwuwęglowych. Ich łańcuch moŜe być nasycony (brak wiązań podwójnych) lub nienasycony (z jednym, lub więcej, wiązaniem podwójnym). Nazwy kwasów tłuszczowych wyprowadza się od odpowiednich węglowodorów Według najczęściej uŜywanej nomenklatury nazwę systematyczną kwasu tłuszczowego tworzy się od nazwy węglowodoru o tej samej liczbie atomów węgla przez dodanie końcówki -owy do nazwy węglowodoru (nomenklatura genewska). Tym sposobem nazwa kwasu nasyconego kończy się na -anowy np. oktanowy, a kwasu nienasyconego z wiązaniami podwójnymi na -enowy, np. oktadekenowy (kwas oleinowy). Numerację atomów węgla rozpoczyna się od węgla grupy karboksylowej (węgiel nr 1). Atom węgla przylegający do węgla karboksylowego (nr 2) jest równieŜ znany jako węgiel a. Atom węgla nr 3 jest węglem p, a atom węgla w grupie metylowej znajdującej się na dystalnym końcu łańcucha nazywa się węglem w lub n-atomem węgla. W uŜyciu jest kilka sposobów wskazywania liczby i połoŜenia wiązań podwójnych; np. A9 oznacza wiązanie podwójne między atomami węgla 9 i 10 kwasu tłuszczowego; to9 wskazuje wiązanie podwójne przy węglu 9, licząc od atomu węgla co. Na ryc. 16-1 przedstawiono powszechnie uŜywane sposoby wskazywania liczby atomów węgla, liczby i połoŜenia wiązań podwójnych w cząsteczce kwasu tłuszczowego. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są wprowadzane tylko miedzy istniejącym wiązaniem podwójnym (np. (o9, ro6 lub ca3) a węglem karboksylowym, wynikiem czego są 3 serie kwasów tłuszczowych, znane odpowiednio jako rodzina o>9, 006 i co3.

CH3(CH2),CH = CH(CHj)7COOH lub a>9,C18:1 lub n-9, 18:1 CH3CH2CH,CH2CH£H2CHJCH2CH = CH(CH2)7COOH
n 17 10 9 1

Ryc. 16-1. Kwas oleinowy, n-9 (n minus 9).

Nasycone kwasy tłuszczowe nie zawierają wiązań podwójnych Nasycone kwasy tłuszczowe moŜna traktować jako pochodne kwasu octowego, pierwszego przedstawiciela szeregu. W tabeli 16-1 przedstawiono przykłady kwasów tego szeregu. Inne długołańcuchowe kwasy tłuszczowe z tego szeregu występują przewaŜnie w woskach. Wyodrębniono równieŜ kilka kwasów tłuszczowych o łańcuchu rozgałęzionym zarówno z materiału roślinnego, jak i zwierzęcego. Nienasycone kwasy tłuszczowe zawierają jedno lub więcej wiązań podwójnych (p. tab. 16-2) Kwasy te moŜna podzielić na podgrupy ze względu na ich stopień nienasycenia. A. Kwasy jednonienasycone (monoetenoidy, kwasy monoetenowe) zawierające jedno wiąza nie podwójne. B. Kwasy wielonienasycone (polienoidy, kwa sy polienowe) zawierające więcej wiązań po dwójnych. C. Eikozanoidy. Grupa związków, pochod nych ikoza-(20-C) polienowych kwasów tłusz czowych, obejmująca prostanoidy i leukotrieny (LT). Do prostanoidów zalicza się prostaglandyny (PG), prostacykliny (PGI) i tromboksany (TX). Terminu „prostaglandyny" uŜywa się często nieściśle jako określenia ogólnego obej mującego wszystkie prostanoidy. Prostagiandyny. Odkryto pierwotnie w nasieniu, ale obecnie wiadomo, Ŝe występują praktycznie we wszystkich tkankach ssaków, działając jako miejscowe hormony lokalne; wykazują one istotne aktywności fizjologiczne i farmakologiczne. In vivo są one syntetyzowane z 20-C wielonienasyconych (ikozanowych) kwasów tłuszczowych (np. kwasu arachidonowego). Pierwszy etap biosyntezy polega na cyklizacji środkowej części łańcucha i utworzeniu pierś-

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 175 Tabela 16-1. Nasycone Nazwa zwyczajowa kwasu Mrówkowy* Octowy Propionowy Masłowy Walerianowy Kapronowy Kaprylowy (oktanowy) Kaprynowy (dekanowy) Laury no wy Mirystynowy Palmitynowy Stearynowy Arachidowy (ikozanowy) Behenowy Lig npc ery nowy kwasy tłuszczowe Liczba atomów węgla
1

Uczestniczy w metabolizmie reszt Ci (mrówczanu) Główny produkt końcowy fermentacji węglowodanów u przeŜuwaczyKońcowy produkt fermentacji węglowodanów u przeŜuwa+ czy Wpewnych tłuszczach w mafych ilościach (zwłaszcza w maśle). > Końcowy produkt fermentacji węglowodanów u 1 przeŜuwaczy " ^W wielu tłuszczach (łącznie z masłem) w małych > ilościach, zwłaszcza w tłuszczach roślinnych Spermacet, cynamon, nasiona palmy, olej kokosowy, owoc wawrzynu Gałka muszkatołowa, nasiona palmy, olej kokosowy, mirt 1 Powszechnie występujące we wszystkich tłuszczach zwie-f rzęcych i roślinnych Olej arachidowy Nasiona Cerebrozydy, olej arachidowy

2 3
4 56

a
10
12 14

16 18
20 22 24

* Tylko kwas mrówkowy, bez pochodnych alkilowych. + RównieŜ w okręŜnicy człowieka.

coo-

Ryc. 16-2. Prostaglandyna E2 (PGE2). Byc. 16-3. Tromboksan A2 (TXA2).

COCr

cienia cyklopentanowego (ryc. 16-2). Pokrewny szereg związków, tj. tromboksaiiy wykryte w płytkach krwi, ma pierścień cyklopentanowy przerwany atomem tlenu (pierścień oksanowy) (ryc. 16-3), Trzy róŜne ikozanowe kwasy tłuszczowe dają początek 3 grupom eikozanoidów z charakterystyczną liczbą wiązań podwójnych w łańcuchach bocznych, np. PGj, PG2, PG> Zmiany dotyczące podstawników przyłączonych do pierścieni są przyczyną istnienia róŜnych typów podstawienia oznakowanych A, B itd. w kaŜdym szeregu prostaglandyn i tromboksanó w. Typ „E" prostagland yn (jak w PGE2) ma grupę ketonową w pozycji 9, natomiast typ „F" ma grupę hydroksylową w tej pozycji. Lcukotrkny są trzecią grupą pochodnych eikozanoidów powstających raczej przez szlak lipooksygenazy niŜ przez cyklizację łańcucha kwasu tłuszczowego (ryc. 16-4). Leu-

176 / ROZDZIAŁ 16 Tabela 16-2. Nienasycone kwasy tłuszczowe występujące w pokarmach i mające znaczenie fizjologiczne Liczba atomów C oraz liczba i pozycja wiązań podwójnych

Szereg

Nazw a zw yczajowa

Na zw a systematyczna

W ystępowanie

Kwas y monoenowe (z 1 podwójn ym wiązaniem) 16:1; 9 18:1; 9 w7 w9 Palmitooleinowy Oleinowy cis - 9 - H eksa de ke n o w y cis - 9 - 0 kta d eke n owy Niemal we wszystkich tłuszczach Prawdopodobnie najbardziej rozpowszechniony kwas tłuszczowy w tłuszczach naturalnych Tłuszcze przeŜuwaczy i utwardzane Oleje rzepakowy i gorczyczny W cerebrozydach

18:1; 9 22:1;13 24:1;15

w9
u9 w9

Ela i dyn owy Erukowy Nerwonowy

frans- 9 • 0 ktadeken o wy c/s-13-Dokozenowy c«-15-Tetrakozenowy

Kwasy drenowe (z 2 podwójnymi wiązaniami) 18:2; 9, 12 cis,cis-B,12-Oktadekadienowy Oleje: kukurydziany, arachidowy, bawełniany, sojowy i wiele innych roślinrfych

Kwasy trienowe (z 3 podwójnymi wiązaniami) 18:3; 6, 9, 12 Y-Linolenowy 6,9,12-Oktadekatrienowy Niektóre rośliny, np. olej z wiesiołka. Niewielkie ilaści w tłuszczach zwierzęcych

18:3; 9, 12, 15

et-Linolenowy

9,12,15-Oktadekatrienowy Często występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju lnianym

Kwasy tetraenowe {z 4 podwójnymi wiązaniami)

20:4; 5, 8, 11, 14

Arachidonowy 5,8,11,14- Ikozatetraenonowy

Występuje z kwasem linolowym, zwłaszcza w oleju arachidowym; istotny składnik fosfolipidów zwierzęcych

Kwasy pentaenowe (z 5 podwójnymi wiązaniami)

20:5; 5, 8, 11, 14, 17
22:5; 7, 10, 13, 16, 19

Timnodonowy Klupanodono-

5,8,11,14,17-lkozapentaenowy 7,10,13,16,19-Dokozapentaenowy

Istotny składnik olejów rybich, np. tranu dorszowego Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

Kwasy heksaenowe {z 6 podwójnymi wiązaniami) 22:6; 4, 7, 10, 13, 16, 19 Cerwonowy 4,7,10,13,19-Dokozaheksaenowy Oleje rybie, fosfolipidy w mózgu

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 177

COO"

Postać trans (kwas eialdynowy)

Ryc. 16-4. Leukotnen A4 (LTA4).

kotrieny izolowane z leukocytów charakteryzują się obecnością 3 sprzęŜonych wiązań podwójnych. Większość naturalnie występujących nienasyconych kwasów tłuszczowych ma podwójne wiązanie cis Łańcuchy węglowe nasyconych kwasów tłuszczowych po rozciągnięciu w niskich temperaturach przyjmują konformację typu zygzak. W wyŜszych temperaturach niektóre wiązania ulegają rotacji, powodując skrócenie łańcucha, co wyjaśnia, dlaczego błony biologiczne stają się cieńsze wraz ze wzrostem temperatury. Typ izomerii geometrycznego, w jakim występują nienasycone kwasy tłuszczowe, zaleŜy od ustawienia atomów lub grup wokół osi wiązania podwójnego. Jeśli łańcuchy węglowe znajdują się po tej samej stronie wiązania, to wiązanie ma konfigurację cis, jak w kwasie oleinowym; jeśli po przeciwnych stronach — trans, jak w kwasie elaidynowym, sztucznym izomerze kwasu oleinowego (ryc. 16-5). Prawie wszystkie występujące w przyrodzie nienasycone długołańcuchowe kwasy tłuszczowe mają konfiguracje cis; łańcuchy węglowodorowe cząsteczek są „zgięte" w miejscu podwójnego wiązania o 120°. Kwas oleinowy ma więc kształt litery L, natomiast kwas elaidynowy mając podwójne wiązanie trans, pozostaje „prosty". Zwiększenie liczby wiązań podwójnych cis w kwasach tłuszczowych pozwala na róŜnorodność konfiguracji przestrzennych cząsteczki, np. kwas arachidonowy, z 4 wiązaniami podwójnymi cis, moŜe mieć kształt „supła" lub litery „U", To moŜe mieć istotne znaczenie dla molekularnego upakowania w błonie i dla ułoŜenia przestrzennego kwasów tłuszczowych w bardziej złoŜonych cząsteczkach, takich jak fosfolipidy. Obecność wiązań podwójnych trans będzie zmieniać te przestrzenne współzaleŜności. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans występują w pewnych pokarmach. Większość z nich powstaje jako produkt uboczny podczas wysycania kwasów

coo-

coo-

Ryc. 16-5. Izomery geometryczne kwasu tłusz9 czowego A ,18:1 (kwasy oleinowy i elaidynowy).

tłuszczowych w procesie uwodornienia, czyli „utwardzania" naturalnych olejów w zakładach produkujących margarynę. Dodatkowa niewielka część kwasów tłuszczowych trans pochodzi ze spoŜywanych tłuszczów przeŜuwaczy, u których powstają one w źwaczu w wyniku działania mikroorganizmów. Zarówno fizyczne, jak i fizjologiczne właściwości kwasów tłuszczowych są warunkowane długością i stopniem nienasycenia ich łańcucha Temperatura topnienia kwasów tłuszczo12 — Biochemia

wych o parzystej liczbie węgli wzrasta wraz z długością łańcucha i obniŜa się zgodnie z jego nienasyceniem. Triacyłoglicerol, zawierający tylko nasycone kwasy tłuszczowe o 12 atomach węgla lub dłuŜsze, występuje w stanie stałym w temperaturze ciała, natomiast jeŜeli wszystkie 3 reszty kwasów tłuszczowych są 18:2 jest w stanie płynnym do temperatury poniŜej 0°C.
O

O1 1

[I

R»-C-O-CH *CH, -

O u

O - C - R , Ryc. 16-6. Trtacyloglicerol.

'CH 3 -O-C-R,

178 / ROZDZIAŁ 16

W rzeczywistości naturalne acyloglicerole zawierają mieszaninę kwasów tłuszczowych dobraną zgodnie z funkcją lipidu. Lipidy błon, które muszą być płynne w zakresie temperatur środowiska, są bardziej nienasycone niŜ lipidy zapasowe. Lipidy tkanek naraŜonych na schłodzenie, np. u zwierząt podczas snu zimowego lub w kończynach zwierząt, są w wyŜszym stopniu nienasycone. Pewne alkohole i aldehydy występują w naturalnych lipidach Alkohole. Do alkoholi występujących w cząsteczkach lipidów naleŜy glicerol, cholesterol i występujące zwykle w woskach wyŜsze alkohole (np. alkohol cetylowy, Cj6H33OH) oraz dolichol, alkohol poliizoprenoidowy (p. ryc. 16-27).

O 'CH2 -O-C-C,7H» C„H l t -C-O-'ĆH 0 >CHa -0-C — C„H3S Ryc. 16-7. 1,3-Distearynopalmityna.

C„H„-C-O-iCH O a CH,-O-C-C„H 1 , Ryc. 16-8. 1,2-Distearynopalmityna.

Aldehydy tłuszczowe. Kwasy tłuszczowe
mogą zostać zredukowane do aldehydów tłuszczowych. Związki te znaleziono w tłuszczach naturalnych w formie wolnej lub związanej. TRIACYLOGLICEROLE (TRIGLICERYDY)* TO GŁÓWNA FORMA ZAPASOWA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Triacyloglicerole są estrami alkoholu — glicerolu z kwasami tłuszczowymi. W naturalnie występujących tłuszczach procent cząsteczek triacyloglicerolu, w których glicerol jest zestryfikowany 3 takimi samymi kwasami, jest bardzo mały. Niemal wszystkie one są acyloglicerolami mieszanymi. Gdyby wszystkie 3 kwasy tłuszczowe oznaczone na ryc. 16-6 jako R, były kwasami stearynowymi, tłuszcz nazywałby się tristearyną, poniewaŜ składałby się z glicerolu zestryfikowanego 3 resztami kwasu stearynowego. Na rycinach 16-7 i 16-8 przedstawiono przykłady acylogliceroli mieszanych. Atomy węgla 1 i 3 w cząsteczce glicerolu nie są identyczne Aby jednoznacznie ponumerować atomy węgla glicerolu, stosuje się system -sn- (stereochemiczne numerowanie), np. 1,2-distearoilo--3palmitoilo-OT-glicerol (przedstawiony,wzorem projekcyjnym równieŜ na ryc. 16-9). Nale-

i II HjC-O-C-R,
i

O Rs-COI

i i

H'Ć-0-C-R-,

Ryc. 16-9. Triacylo-s/ł-glicerol.

* Monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy zgodnie z obecną standardową terminologią Międzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) oraz Międzynarodowej Unii Biochemicznej (IUB) określa się odpowiednio jako "monoacyioglicerole, diacyloglicerole i triacyloglicerole.

Ŝy podkreślić, Ŝe węgle 1 i 3 cząsteczki glicerolu nie są identyczne, jeŜeli ogląda się trójwymiarowy model cząsteczki. Enzymy bez trudu rozpoznają je i są prawie zawsze swoiste względem jednego lub drugiego węgla, np. glicerol jest zawsze fosforylowany przez glicerokinazę na sn-i dając glicerolo-3-fosforan, a nigdy glicerolo-l-fosforan. W tkankach znaleziono równieŜ częściowe acyloglicerole, tzn. mono- lub diacyloglicerole, w których glicerol jest zestryfikowany 1 lub 2 kwasami tłuszczowymi. Mają one szczególne znaczenie w syntezie i hydrolizie triacylogliceroli.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 179

FOSFOLIPIDY SĄ GŁÓWNYM SKŁADNIKIEM LłPIDOWYM BŁON Do grupy fósfolipidów zalicza się: 1) kwas fosfatydowy i fosfatydyloglicerol, 2) fosfatydylocholinę, 3) fosfatydyloetanoloaminę, 4) fosfatydyloinozytol, 5) fosfatydyloserynę, 6) lizofosf o lipidy, 7) plazmalogeny i 8) sfingomieliny. Wszystkie te związki są fosf o glicerydami, oprócz sfingomidin, których cząsteczki nie zawierają glicerolu. Mogą one być traktowane jako pochodne kwasu fosfatydowego (ryc. 16-10), w którym fosforan jest zestryfikowany z grupą -OH odpowiedniego alkoholu.

Fosfatydylocholiny (lecytyny) występują w błonach komórkowych Fosfatydylocholiny są to fosf o glicerydy zawierające cholinę (ryc. 16-12). Są one przewaŜającymi ilościowo lipidami błon komórkowych O
1 "

O
3

CH;.-O-C-R, CH2-O-P-OTCH£-CH2~N~CH3
*^H ^^
x

c \-\ ■

Cholina Ryc. 16-12. 3-Fosfatydylocholina.

o
II O CHi-O-C-R, II 1 R 2 -C-O-CH I li CH2-O-P~O I Ryc. 16-10. Kwas fosfatydowy

Kwas fosfatydowy jest kluczowym związkiem pośrednim w syntezie triacylogliceroli oraz fosf o glicerydów, ale w tkankach występuje w niewielkich ilościach. Kardiolipina jest istotnym lipidem błon mitochondrialnych Kwas fosfatydowy jest prekursorem fosfatydyloglicerolu, który z kolei w mitochondriach ulega przekształceniu w kardiolipinę (ryc. 16-11).

i stanowią duŜą część zasobów choliny w organizmie, Cholina odgrywa waŜną rolę w przewodnictwie nerwowym oraz jako zapas labilnych grup metylowych. Dipalmitoilolecytyna jest bardzo aktywnym związkiem powierzchniowo czynnym (surfaktant), zmniejszającym napięcie powierzchniowe pomiędzy fazą tkanki płucnej i fazą gazów oddechowych i zapobiegającym sklejaniu się wewnętrznych powierzchni płuc. Brak surfaktantu w płucach wcześniaków jest przyczyną zespołu błon szklistych, którego zasadniczym objawem jest zespól niewydolności oddechowej. Większość fosfolipidów ma nasycony rodnik acylowy w połoŜeniu Cls a rodnik nienasycony w połoŜeniu C2 glicerolu. Fosfatydyloetanoloamina (kefaiina) Kefaliny róŜnią sic od fosfatydylocholiny tylko tym, Ŝe zamiast choliny zawierają etanoloaminę (ryc. 16-13).

■■■ii

i ■
f

CH2— O-P—O—CH2 O I<4Ś u i u H-C-OH O O H-C-O-C-Ra

Fosfatydyloglicerol Bisfosfatydyloglicerol (kardiolipina) Ryc. 16-11. Kardiolipina (bisfosfatydyloglicerol}.

180 / ROZDZIAŁ 16

Etanoloamina Ryc. 16-13. 3-Fosfatydytoetanoloamina

Lizofosfolipidy są związkami pośrednimi w metabolizmie fosfoglicerydów Są to fosfoacyloglicerole zawierające w swojej cząsteczce tylko jedną resztę acylową, np. lizolecytyna, uczestnicząca w metabolizmie i przekształcaniu fosfolipidów (ryc. 16-16).
0 IICH2-O-C-R CH2-O-P-S-CH3-CHi-N-ĆHa | ^ Cholina Ryc. 16-16. Lizolecytyna.

Fosfatydyloinozytol jest prekursorem wtórnych przekaźników Występuje tu stereoizomer ino2ytolu, mioinozytol (ryc. 16-14). Fosfatydyloinozytoto-4,5-bis-

fosforan jest waŜnym składnikiem fosfolipidów błon komórkowych. Po pobudzeniu komórki przez właściwy hormon jest hydrolizowany do diacyloglicerolu i inozytolo-tris-fosforanu. z których kaŜdy działa jako wewnątrzkomórkowy sygnał, czyli drugi posłaniec (p. str. 594).

O CH,—O—C—Rt ii I 2 R 2 -C-O- CH Ryc. 16-14. 3-Fosfatydyloinozytol.

1

Fosfatydyloseryna W większości tkanek występuje fosfatydyloseryna, która zamiast etanoloaminy ma serynę (ryc. 16-15). Wyizolowano równieŜ fosfolipidy zawierające treoninę.
OO CH2-O-C-R, ,1 !t .-. Ł:- I ■III : C H 2-O-P- O-C H2-C H-C OO" O 'CHi-O-C-R,
i

Plazmalogeny występują w mózgu i mięśniach Związki te stanowią co najmniej 10% fosfolipidów mózgu i mięśni. Strukturalnie plazmalogeny przypominają fosfatydyloetanolpaminc. ale przy C, zamiast wiązania estrowego, występującego w większości acylogliceroli, mają wiązanie eterowe. Zazwyczaj rodnikiem alkilowym jest nienasycony alkohol (ryc. 16-17). W niektórych przypadkach etanoloamina moŜe być zastąpiona choliną, seryną lub inozytolem.

Rj-C-O-CH
3
V .____________

{

CH2-O-P-i
O'

Kwas plazmenowy

Etanoloamina

Ryc. 16-17. Plazmalogen (plazmenyloelanoloamina).

( Seryna Ryc. 16-15. 3-Fosfatydyloseryna^ _____

Sfingomieliny równieŜ występują w układzie nerwowym Sfingomieliny wykryto w duŜych ilościach w mózgu i tkance nerwowej. W wyniku hydrolizy sfingomielin otrzymuje się kwas tłuszczowy, kwas fosforowy, cholinę i złoŜony amirioalkohol — sfingozynę (ryc. 16-18), W lipidach tych nie występuje glicerol. Amidowe połączenie sfingo-

R J - C - O - CH

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 181 Ceramid Sfingozyna

?

H

H
ĆH;

CH 3 - (CH s ),s-CH=CH-CH-CH-N-

Kwas tłuszczowy Ó Kwas fosforowy

Cholina Ryc. 16-18. Sfingomielina.

zyny z kwasem tłuszczowym nazywa się ceramidem; struktura tego typu występuje równieŜ w glikolipidach (p, poniŜej). GLIKOLIPIDY (GLIKOSFINGOLIPIDY) SĄ ISTOTNYM SKŁADNIKIEM TKANKI NERWOWEJ I BŁON KOMÓRKOWYCH Glikolipidy są szeroko rozpowszechnione w kaŜdej tkance organizmu, zwłaszcza w tkance nerwjowej takiej jak mózg. Znajdują się głównie w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, z której wystają ich. łańcuchy oligosacharydowe, tworząc sacharydy powierzchni komórki. Głównymi glikolipidami zwierzęcymi są glikosfingolipidy. Zawierają one ceramid i jedną lub więcej cząsteczek cukru. Dwoma najprostszymi glikolipidami są gaiaktozyloceramid i glukozyloceramid. Galaktozyloceramid jest główSfingazyna A

nym gJikosfingolipidem mózgu i innych tkanek nerwowych, ale we względnie małych ilościach występuje on wszędzie. Zawiera sporo charakterystycznych Ci4 kwasów tłuszczowych. Galaktozyłoceramid (ryc. 16-19) moŜe zostać przekształcony w sulfogalaktozyloceramid (klasyczny sulfoglikozylosfingolipid; dawniej sulfatyd), który występuje obficie w mielinie. Glukozyloceramid jest przewaŜającym prostym glikosflngolipidem tkanek pozanerwowych, aJe w małych ilościach znajduje się równieŜ w mózgu. Bardziej złoŜonymi glikosfmgolipidami są gangliozydy, pochodne glukozyloceramidu. Gangliozyd jest glikosfingolipidem zawierającym dodatkowo jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. rozdz. 15) jest zasadniczym kwasem sjalowym występującym w tkankach ludzkich. Gangliozydy występują w duŜych stęŜeniach równieŜ w tkance nerwowej. Wydaje się, Ŝe pełnią one funkcje receptorowe i inne. Najprostszym gang-

___

OH O I H II
3—(CH2)12-CH=

CH-CH-CH—N—C- CH(OH) Kwas tłuszczowy, np. kwas cerebronowy

GalaWoza

O-CH,

H

OH

Ryc. 16-19. Struktura gaiaktozyloceramidu (galaktocerebrozyd, R = H) i sulfogalaktozyloceramidu (dawniej sulfatyd, R = SO|~).

182 / ROZDZiAŁ 16

liozydem występującym w tkankach jest GM3-Zawiera on ceramid, 1 cząsteczkę glukozy, 1 cząsteczkę galaktozy i 1 cząsteczkę NeuAc. W uŜytym tu skrótowym zapisie gangliozydu: G oznacza gangliozyd, M = monosjalo, a cyfra arabska wskazuje kolejność lokowania się na chromatogramach cienkowarstwowych. Na rycinie 16-20 przedstawiono strukturę GM], bar- Rvc. 16-21. Szkielet (rdzeń) steroidowy. dziej złoŜonego gangliozydu będącego pochodną GM3. G M| jest związkiem dosyć interesująCaramid-Glukoza-Galaklcwa -N-Acetylo- GalaMoza (Acy<ogalaktozamlna NeuAc sflngozyna) lub

Cer-GIc-Gal-GalNAc-Gal I NeuAc Ryc. 16-20. Gangliozyd GM1, monosjaloganglio/yd.

Ŝe zaznaczono inaczej; tzn. nie jest to pierścień benzenowy. We wzorze zaznacza się wszystkie wiązania podwójne. Boczne grupy metylowe przedstawia się w postaci wiązań pojedynczych nie połączonych na dalszym końcu (metyl). Występują one typowo w pozycji 10 i 13 (tworząc 18 i 19 atom węgla), W pozycji 17 występuje zwykle łańcuch boczny (jak w cząsteczce cholesterolu). JeŜeli związek zawiera 1 lub więcej grup hydroksylowych, a Ŝadnej grupy karbonylowej lub karboksylowej, jest sterolem i jego nazwa ma końcówkę — ol. Ze względu na asymetrię cząsteczki steroidu moŜliwe jest istnienie wielu stereoizomerów KaŜdy z pierścieni sześciowęglowych rdzenia steroidowego moŜe istnieć w trójwymiarowej konformacji krzesełkowej lub lódeczkowej (ryc. 16-22).

cym biologicznie, jako Ŝe jest on znanym receptorem dla toksyny cholery w jelicie cienkim. Inne gangliozydy mogą zawierać w swojej cząsteczce od jednej do 5 reszt sjalowych, tworzących odpowiednio di-, trisjalogangliozydy itd. STEROIDY PEŁNIĄ WIELE WAśNYCH FUNKCJI FIZJOLOGICZNYCH Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej znanym steroidem ze względu na jego udział w rozwoju miaidiycy. Odgrywa on bardzo waŜną rolę biochemiczną, poniewaŜ jest prekursorem wielu równie waŜnych steroidów, takich jak kwasy Ŝółciowe, hormony kory nadnerczy, hormony płciowe, witaminy D, glikozydy nasercowe, sitosterole w świecie roślin i niektóre alkaloidy. Wszystkie steroidy mają podobny rdzeń cykliczny, przypominający fenantren (pierścienie A, B i C), do którego jest dołączony pierścień cyklopentanu (D). Atomy węgla w rdzeniu steroidowym są numerowane tak, jak pokazano na ryc. 16-21. Przy rozpatrywaniu wzorów strukturalnych steroidów naleŜy zwrócić uwagę, Ŝe prosty pierścień heksagonalny oznacza całkowicie nasycony pierścień 6-węglowy ze wszystkimi wartościowościami wy sycony mi wodorem, chyba

Konformacja, Krzesełkowa"

Konformaoja .(Maczkowa" Ryc. 16-22. Konformacje stereo izomerów.

W steroidach naturalnych wszystkie pierścienie występują właściwie w formie krzesełkowej, która jest bardziej stabilną konformacją. Poszczególne pierścienie mogą znajdować się względem siebie w konformacji cis lub trans (ryc. 16-23).

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 183

Byc. 16-23. Siereochemta steroidów: (A) konfiguracja trans między wszystkimi sąsiadującymi pierścieniami; (B) konfiguracja cis między pierścieniami A i B.

W naturalnych steroidach sposób połączenia pierścieni A i B moŜe być cis lub trans, natomiast między B i C jest trans, a połączenie CjD jest trans, z wyjątkiem glikozydów nasercowych i jadów wydzielanych przez ropuchy. Wiązania utrzymujące podstawniki nad płaszczyzną pierścieni przedstawia się linią ciągłą (p1), natomiast wiązania łączące grupy znajdujące się pod płaszczyzną pierścieni linią przerywaną (a). W steroidzie "5a, pierścień A przyjmuje zawsze konformację trans względem pierścienia B, natomiast w steroidzie 5P — zawsze cis. Grupy metylowe, przyłączone do atomów węgla Ci0 i Cu, są niezmiennie w konfiguracji p. Cholesterol jest istotnym składnikiem wielu tkanek Cholesterol jest szeroko rozpowszechniony we wszystkich komórkach organizmu, a zwłaszcza w tkance nerwowej. Jest jednym z waŜniejszych składników błon plazmatycznych i lipoprotein surowicy krwi. Występuje zwykle w połączeniu z kwasami tłuszczowymi jako ester cholesterolu. Jest w tłuszczach zwierzęcych, lecz nie ma go w tłuszczach roślinnych. 3-Hydroksy-5,6-cholesten (ryc. 16-24) to nazwa systematyczna cholesterolu. Ergosterol jest prekursorem witaminy D Ergosterol występuje w roślinach i droŜdŜach i jest waŜnym prekursorem witaminy D (ryc. 16-25). Naświetlanie promieniami nadfioletowymi powoduje otwarcie pierścienia B (p. ryc. 54-6) w wyniku czego związek nabywa właściwości przeciwkrzywiczych.

Ryc. 16-24. Cholesterol.

HORyc. 16-25. Ergosterol

Koprosterol znajduje się w kale Koprosterol (koprostanol) powstaje w jelicie w wyniku bakteryjnej redukcji podwójnego wiązania Cs—C6 cholesterolu i jest wydalany w kale. Prekursorem poliprenoidów i cholesterolu jest ten sam związek Poliprenoidy, chociaŜ nie są steroidami, są im pokrewne (p. ryc. 28-3), poniewaŜ są syntetyzowane, podobnie jak cholesterol (ryc. 16-26),

184 / ROZDZIAŁ 16 C3 H I -CH=CCH=CHRyc. 16-26. Jednostka izoprenowa.

PEROKSYDACJA LIPIDÓW JEST ŹRÓDŁEM WOLNYCH RODNIKÓW IN VIVO
Peroksydacja (autooksydacja) lipidów naraŜonych na działanie tlenu jest przyczyną nie tylko psucia się Ŝywności (jełczenie), lecz takŜe uszkodzenia tkanek in vivo, które z kolei moŜe być przyczyną odczynów zapalnych, nowotworów, miaŜdŜycy, starzenia się itp. Szkodliwe działania są inicjowane przez wolne rodniki (ROO*, RO*, OH*) powstające podczas tworzenia nadtlenków kwasów tłuszczowych, zawierających wiązania podwójne oddzielone grupą metylenową, a więc takie jak te, które znajdują się w naturalnych wielo nienasyconych kwasach tłuszczowych (ryc. 16-28). Peroksydacja lipidów jest procesem lawinowym, zapewniającym ciągłą dostawę wolnych rodników, które inicjują następne reakcje peroksydacji. Pełny proces moŜe być zapisany następująco:
1. Inicjacja peroksydacji lipidów. Wytwarzanie R' z prekursora. ROOH + metal<«>+

z 5-wcglowej jednostki izoprenowej. NaleŜy do nich ubichinon (p.str. 149), składnik mitochondrialnego łańcucha oddechowego, oraz długołańcuchowy alkohol dolichol (ryc. 16-27), który

,OH

Ryc. 16-27. Dolichol — alkohol C95,

uczestniczy w syntezie glikoprotein, przenosząc reszty oligosacharydowe na reszty asparaginy łańcucha poiipeptyd owego (p. rozdz. 57). Grupa roślinnych izoprenoidów obejmuje kauczuk, kamforę, rozpuszczalne w tłuszczach witaminy A, D, E i K oraz P-karoten (prowitaminę A).

X'+ RH-R* +XH
Rozprzestrzenianie peroksydacji lipidów:

ROO'+ RH-ROOH+ R\ ttd.

H

H

+RH H Endonad tlenek WodoronadUenek ROOH Aldehyd malonowy

Ryc. 16-28. Peroksydacja tipidów. Reakcje inicjuje światło lub jony metali. Aldehyd matonowy powstaje tylko z kwasów tłuszczowych mających 3 lub więcej wiązań podwójnych. Miarą peroksydacji lipidów jest ilość powstającego aldehydu malonowego oraz etanu lub pentanu powstających odpowiednio z 2 końcowych węgli kwasów u3-tłuszcz owych lub z końcowych 5-węgli kwasów a>6-tłuszczowych.

LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 185 3. Zakończenie: ROCT+ ROO°->ROOR+ O, ROCT+ R' .ROOR R*+ R'^RR

■——

PoniewaŜ molekularnym prekursorem dla inicjacji procesu jest zazwyczaj wodoronadtlenek ROOH, peroksydacja lipidów jest rozgałęzionym procesem łańcuchowym z potencjalnymi skutkami niszczycielskimi. W celu kontroli i ograniczenia peroksydacji lipidów zarówno ludzie, jak i natura uŜywają związków przeciwutleniających. Propyiogalusan, butylowany hydroksyanizol (BHA) i butylowany hydroksytoluen (BHT) są przeciwutleniaczami uŜyDetektor wanymi jako dodatki (środki konserwujące) do Gaz Ŝywności. Naturalnie występującymi przeciwutleniaczami są witamina E (tokoferol), która jest rozpuszczalna w lipidach, oraz moczan i witamina C, które są rozpuszczalne w wodzie. pKaroten wykazuje właściwości przeciwutleniacza przy małym pOz. Przeciwutleniacze dzielą się na 2 klasy: 1) przeciwutleniacze zapobiegające, które zmniejszają szybkość inicjacji peroksydacji i 2) przeciwutleniacze przerywające proces lawinowy, które utrudniają rozprzestrzenianie peroksydacji. Przeciwutleniacze zapobiegające obejmują katalazę i inne peroksydazy, które reagują PróbKa z ROOH, oraz związki chelatujące jony metali, Rajestrator kreślący takie jak DTPA (dietylenotriaminopentaoctan) i EDTA (etylenodiaminotetraoctan). Przeciwutleniacze przerywające rozprzestrzenianie pe- Ryc. 16-29. Schemat chromatografu gazowo-roksydacji są często fenolami lub aminami cieczowego. Po prawej stronie ryciny przedstaaromatycznymi. In vivo głównymi przeciwut- wiono chromatogram rozdziału cHugołańcuchowych kwasów tłuszczowych (jako estrów metyloleniaczami przerywającymi rozprzestrzenianie wych). są: dysmutaza ponadtlenkowa (p, str. 146), która działa w fazie wodnej, wychwytując wolne Chromatografia gazowo-cieczowa polega na rodniki ponadtknkowe (Oi*), być moŜe moczan oraz witamina E, która działa w fazie fizycznym rozdziale ruchomej fazy gazowej przez adsorpcję na fazie stacjonarnej, zawierajątipidowej, wychwytując rodniki ROO*. Peroksydacja jest katalizowana in vivo rów- cej obojętne ciało stałe, takie jak Ŝel krzemionnieŜ przez związki hemowe i przez lipooksygena- kowy lub obojętne ziarna glinki ogniotrwałej zy znajdujące się w płytkach krwi i leukocytach, pokrytej nielotną cieczą (np. smarem lub olejem silikonowym). W praktyce szklaną lub metaloitp. wą kolumnę napełnia się nieczynnym ciałem stałym, a mieszaninę metylowych estrów kwasów tłuszczowych odparowuje się na jednym DO ROZDZIAŁU I IDENTYFIKACJI końcu kolumny, która na całej swej długości nia LIPIDÓW W MATERIALE BIOLOGICZNYM UśYWA SIĘ METOD temp. 170—225°C(ryc. 16-29). Stale przepływający strumień gazu obojętnego, np, argon lub CHROMATOGRAFICZNYCH hel, powoduje przesuwanie się lotnych estrów Obecnie metody chromatograficzne coraz wewnątrz kolumny. Podobnie jak w przypadku częściej wypierają z uŜycia starsze metody rozinnych rodzajów chromatografu, rozdział parujących estrów kwasów tłuszczowych zaleŜy od róŜnic powinowactwa składników mieszaniny

dzieiania i identyfikacji lipidów oparte na klasycznych procedurach chemicznych, takich jak krystalizacja, destylacja i ekstrakcja rozpuszczalnikiem. Szczególnie uŜyteczna do rozdziału róŜnych klas lipidów jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC), a do rozdziału poszczególnych kwasów tłuszczowych — chromatografia gazowo-cieczowa (GLC; ryc. 16-29). Przed uŜyciem tych technik lipidy ekstrahuje się z tkanek nieodwodnionych układem rozpuszczalników, opartym zwykle na mieszaninie chloroformu z metanolem (2:1).

186 / ROZDZIAŁ 16

gazowej do fazy stacjonarnej. Ga2y silniej przyciągane przez fazę stacjonarną wolniej przesuwają się w kolumnie i dlatego znajdą się na końcu kolumny później od gazów przyciąganych stosunkowo słabiej. Poszczególne estry kwasów tłuszczowych, wydostające się z kolumny, wykrywa się metodami fizycznymi lub chemicznymi i zapisuje automatycznie w postaci pików ukazujących się w róŜnym czasie w zaleŜności od siły, z jaką poszczególne estry kwasów tłuszczowych są zatrzymywane przez fazę stacjonarną (ryc. 16-29). Powierzchnia pod kaŜdym pikiem jest proporcjonalna do stęŜenia poszczególnego składnika mieszaniny. Identyfikację kaŜdego składnika przeprowadza się przez porównanie z wzorcowym chiomatogramem standardowej mieszaniny o znanym składzie. Na drodze strumienia gazu moŜna umieścić, oprócz detektora masy, równieŜ detektor mierzący radioaktywność. W ten sposób moŜna zmierzyć swoistą radioaktywność kaŜdego wydzielonego składnika. Zaletą chromatografii gazówo-cieczowej jest jej niezwykła czułość, która pozwala uŜywać bardzo małych ilości mieszaniny do rozdziału, a takŜe to, Ŝe kolumny chromatograficzne mogą być uŜywane wielokrotnie. Za pomocą tej techniki wykazano w tłuszczach naturalnych obecność wielu dotychczas niewykrytych róŜnych kwasów tłuszczowych.
Chromatografię cienko warstwową (TLC)

Estry cholesterolu

Czoło rozpuszczalnika

Trlacylogllcerole

m
ii
5P

Kwasy HUSZCZOWB (wolne)

Cholesterol 1,3DlacyloQllcwole 1,2DlacyloBH08role Monoacytogjlcerole Fosfo lipidy

Miejsce naniesienia

Ryc. 16-30. Rozdział głównych klas lipidów przy uŜyciu chromatografii cienkowarstwowej. Właściwym układem rozpuszczalników dla powyŜszego rozdziału była mieszanina heksan : eter etylowy : kwas mrówkowy w stosunku objętościowym 80:20:2.

AMFIPATYCZNE LIPIDY SAMOORIENTUJĄ SIĘ NA GRANICY OLEJ : WODA Tworzą one błony, micele, liposomy i emulsje Lipidy są na ogół nierozpuszczalne w wodzie, gdyŜ przewaŜają w ich cząsteczkach grupy niepolarne (węglowodory). JednakŜe kwasy tłuszczowe, fosfolipidy, sfingolipidy, kwasy Ŝółciowe i, w mniejszym stopniu, cholesterol zawierają grupy polarne. Dlatego część cząsteczki jest hydrofobowa, czyli nierozpuszczalna w wodzie, a inna część jest hydrnfilowa, czyli rozpuszczalna w wodzie. Tego rodzaju cząsteczki określa się jako amtlpatyczne (ryc. 16-31). Ustawiają się one na granicy faz woda: olej w ten sposób, Ŝe
ich grupy polarne znajdują się w fazie wodnej, a niepolarne w fazie olejowej. UwaŜa się, Ŝe

przeprowadza się na płytkach szklanych pokrytych cienką warstwą adsorbentu, zwykle Ŝelu krzemionkowego. Po osuszeniu adsorbentu, płytki ogrzewa się w cieplarce w standardowej temperaturze przez standardowy czas. Po oziębieniu na „aktywowaną" płytkę nakrapia się mieszaninę lipidów rozpuszczonych we właściwym rozpuszczalniku. Po odparowaniu rozpuszczalnika brzeg płytki, najbliŜszy miejsca naniesienia próbki, zanurza się w odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalników i pozostawia w zamkniętym naczyniu do czasu, aŜ czoło rozpuszczalnika znajdzie się blisko górnego brzegu płytki. Płytkę osusza się i miejsce rozdzielonych substancji ustala się przez „zwęglenie" (spryskując powierzchnię płytki kwasem siarkowym, a następnie ogrzewając) lub przez fiuorescencję (z dichlorofluoresceiną), albo po reakcji z parami jodu (ryc. 16-30).

podstawową strukturą błon biologicznych jest podwójna warstwa takich polarnych lipidów (p. rozdz. 42). Lipidy polarne znajdujące się w środowisku wodnym w stęŜeniu krytycznym tworzą micele. Przyłączanie się soli kwasów Ŝółciowych do miceli i liposomń w i tworzenie miceli mieszanych z produktami trawienia tłuszczu

LIPIDY O ZNACZENiU FIZJOLOGICZNYM / 187
LIPID AMFIPATYCZNY A

Grupy polarne, czyli hydrofitowa
Grupy nie polarna, czyli hydrofobowe

Faza wodna

Faza wodna

OOOOOO
L1POSOM (JEDNOWARSTWOWY) .Olej*, czyli laza E

Faza wodna

uouuoo
Faza wodna PODWÓJNA WAHSTWA LIPIDOWA EMULSJA OLEJU W WOOZIE D

Faza nie po I ar na

Fala wodna

Przedzi ał wodny

Podwójna warstwa llpldowa

LiPOSOM (WIELOWARSTWOWY)

Ryc. 16-31. Powstawanie błon lipidowych, miceli, emulsji i liposomów z lipidów amftpatycznych, np. fosfolipidów. ____________________________________

ułatwia wchłanianie lipidów z jelita. Liposomy moŜna otrzymać działając ultradźwiękami na amfipatyczne lipidy w środowisku wodnym. Liposomy są utworzone z podwójnej warstwy lipidowej, otaczającej część środowiska wodnego. Potencjalnie, zwłaszcza gdy połączy się je ze swoistymi tkankowo przeciwciałami, mogą być one uŜyteczne klinicznie jako przenośniki leków w krwiobiegu, trafiając do odpowiednich narządów. Emulsje są cząstkami duŜo większymi, powstającymi zwykle z lipidów niepolarnych znajdujących się w środowisku wodnym. Są one stabilizowane przez środki emulgujące, takie jak lipidy polarne (np. lecytyna), które tworzą warstwę powierzchniową oddzielającą główną masę fazy niepolarnej od fazy wodnej (ryc. 16-31).

PIŚMIENNICTWO
Christie WW: LipidAnalysis. 2nd ed. Pergamon Press, 1982. Cotgreave 1A et al: Host biochemical defence mechanisms against prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1988;28:189. Frankel EN: Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Próg Lipid Res 1985;23:197. Gunscone FD, Harwood JL, Padley FB: The Lipid Handbook. Chapraan & Hali, 1986. Gurr AI, James AT: Lipid Biochemistry: An Introduclion. 3rd ed. Wiiey, 1980. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phospholipids, Elsevier, 1982. Johnson AR, Davenport JB: Biochemistry and Methodołogy of Lipids. Wiley, 1971. Vance DE, Vance JE {editors}: Biochemistry of Lipids and Membranes. Benjamin/Cummings, 1985.

17
WPROWADZENIE
Losy składników diety po strawieniu i absorpcji składają się na przemiany pośrednie. Stanowią więc one szeroką dziedzinę, która usiłuje nie tylko opisać szlaki metaboliczne indywidualnych cząsteczek, lecz takŜe próbuje zrozumieć współzaleŜności między nimi oraz mechanizmy, które regulują przepływ metabolitów przez te szlaki. Szlaki metaboliczne dzieli się na 3 kategorie (ryc. 17-1): 1. Szlaki anaboliczne prowadzące syntezy związków tworzących strukturę ciała i warsztat metaboliczny. Takim szlakiem

Zarys przemian pośrednich
Peter A. Mayes, PhD, DSc

jest synteza białek. Energia swobodna, napędzająca te procesy, pochodzi z drugiej kategorii szlaków. 2. Szlaki kataboliczne dotyczą procesów oksydacyjnych, które uwalniają energię swobodną zwykle w postaci fosforanu bogatoenergetycznego lub równowaŜników redukujących, np. łańcuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna. 3. Szlaki amfiboliczne mają więcej niŜ jedną funkcję i biegną na „skrzyŜowaniu dróg" metabolicznych, działając jako łączniki między ciągami anabolicznymi i katabo licznym, np. cykl kwasu cytrynowego.

Białka,
węglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe Itp.

Cząsteczki Trawienie pokarmu

Cząsteczki prostsze

Wchłanianie

Szlaki amfl bo Heine

Inne procesy endoerglczne

Ryc. 17-1.3 główne kategorie szlaków meta bo licznych. Szlaki kataboliczne uwalniają energię swobodną w formie równowaŜników redukujących (2H) lub fosforanu bogBioenergetycznego (~ P). ta warunkuje przebieg szlaków a na bo licznych. Szlaki amfiboliczne jako łączniki między szlakami 2 pozostałych kategorii.

Energia działają

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 189

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Znajomość metabolizmu zdrowego zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do pełnego zrozumienia wielu stanów chorobowych. Prawidłowa przemiana obejmuje zmiany metabolizmu i jego adaptację w okresach głodzenia, wysiłku, ciąŜy i laktacji. Zaburzenia metabolizmu mogą być wynikiem np. niedoborów Ŝywieniowych, braku enzymu lub nieprawidłowego wydzielania hormonu. WaŜnym przykładem choroby,

wynikającej z nieprawidłowego metabolizmu (choroby metaboliczne), jest cukrzyca.

PODSTAWOWE SZLAKI METABOLICZNE PRZETWARZAJĄ GŁÓWNE PRODUKTY TRAWIENIA
Podstawowy typ metabolizmu w tkankach jest warunkowany rodzajem diety. Ssaki, takie jak człowiek, muszą przetwarzać wchłaniane w przewodzie pokarmowym produkty trawie-

Pokarmy

Glukoza

Glikogen 3CO,

Gl u kozotosfora Cykl pentnzof osf oran owy

s
(3

-------- ' Acytoglteerol Trlozofosforany Mleczan

^ -------»- Rybozofosforan

Kwasy tłuszczowe Cholesterol

Plrogronian.

Ryc. 17-2. Ogólny schemat metabolizmu węglowodanów i jego główne produkty końcowe.

190 / ROZDZIAŁ 17
Trlacyloglicerol (tłuszcz) Steroidy Cholesterol Cti oieslerologeneza Ketogeneza Pokarmy

Związki ketonowe

Ryc. 17-3. Ogólny schemat metabolizmu kwasów tłuszczowych i jego główne produkty końcowe. Związki ketonowe to acetooctan, 3-hydroksymaślan aceton

Białka pokarmów

Białka tkankowe

Aminokwasy TFWNSAMINACJA

I

Nisbialkowe pochodne azotowe

2CO,

Ryc. 17-4. Ogólny schemat przemiany aminokwasów i jej główne produkty końcowe.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 191

nia pokarmów — węglowodanów, lipidów i białek. Głównie są to (odpowiednio): glukoza, kwasy tłuszczowe z glicerolem oraz aminokwasy. U przeŜuwaczy (i w mniejszym stopniu u innych trawoŜernych) błonnik diety ulega trawieniu przez symbiotyczne mikroorganizmy do niŜszych kwasów tłuszczowych (octowego, propionowego, masłowego), a tkanki tych zwierząt są przygotowane metabolicznie do zuŜycia niŜszych kwasów tłuszczowych jako zasadniczych substratów. Wszystkie produkty trawienia są przetwarzane we właściwych szlakach metabolicznych do wspólnego produktu — acetylo-CoA, który ulega następnie całkowitemu utlenieniu w cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc. 14-1 oraz 17-2, 17-3 i 17-4). Metabolizm węglowodanów dotyczy głównie glukozy (p. ryc. 17-2) Glukoza jest metabolizowana we wszystkich komórkach ssaków w procesie glikolizy do pirogronianu i mleczanu. Aby wejść do tego szlaku glukoza musi ulec fosforylacji. Glikoliza moŜe przebiegać w nieobecności tlenu (anaerobowo), ale końcowym produktem jest wtedy tylko mleczan. Tkanki, które mogą zuŜywać tlen (aerobowe), są zdolne do metabolizowania pirogronianu do acetylo-CoA, który z kolei moŜe 'wejść do cyklu kwasu cytrynowego, ulegając całkowitemu utlenieniu do CO3 i H2O z uwolnieniem znacznej ilości energii swobodnej, wykorzystanej do syntezy ATP w procesie zwanym fosforylacją oksydacyjną (p. ryc. 18-2). Glukoza jest więc główną cząsteczką energetyczną wielu tkanek. Uczestniczy ona (i pewne jej metabolity) równieŜ w innych procesach, a mianowicie: i. W przemianie do jej zapasowego polimeru — glikogenu, zwłaszcza w mięśniach szkieletowych i w wątrobie. 2. W cyklu pentozofosforano wy III, który bierze początek od metabolitu pośredniego glikolizy. Cykl jest dostawcą równowaŜników redukujących (2H) do biosyntezy np. kwasów tłuszczowych — oraz jest źródłem rybozy koniecznej w procesach syntez nukleotydów i kwasów nukleinowych. 3. Fosfotriozy uczestniczą w tworzeniu glicerolowej części acylogliceroli (tłuszczu). 4. Pirogronian i metabolity pośrednie cyklu kwasu cytrynowego dostarczają szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów, a acetylo-CoA jest jednostką budującą długołaricuchowe kwasy tłuszczowe i cholesterol będący z kolei prekursorem wszystkich steroidów syntetyzowanych w organizmie.

Metabolizm lipidów dotyczy głównie kwasów tłuszczowych i cholesterolu (p,ryc.17-3) Źródłem dlugołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest albo synteza de novo z acetylo-CoA pochodzącego z przemiany węglowodanów, albo lipidy z pokarmów. W tkankach kwasy tłuszczowe mogą zostać utlenione do acetylo-CoA (fi-oksydacja) lub ulec estryfikacji do acylogliceroli, które w postaci triacylogliceroli (tłuszcz) stanowią główną rezerwę energetyczną organizmu, Acetylo-CoA, wytwarzany w procesie jł-oksydacji, ma kilka waŜnych przeznaczeń: 1. Tak jak w przypadku acetylo-CoA po chodzącego z przemiany węglowodanów, ulega
całkowitemu utlenieniu do CO2 i H2O w cyklu

kwasu cytrynowego. Kwasy tłuszczowe są bar dzo wydajnym tkankowym źródłem energetycz nym, dostarczając znacznych ilości energii zaró wno w procesie p-oksydacji, jak i w cyklu kwasu cytrynowego. 2. Są one źródłem atomów węgla dla chole sterolu i innych steroidów. 3. W wątrobie jest z nich wytwarzany acetooctan, macierzysty związek ketonowy*. Zwią zki ketonowe rozpuszczalne w wodzie są alter natywnym paliwem tkankowym, które w pew nych warunkach (np. w głodzeniu) staje się waŜnym źródłem energii. Metabolizm większości aminokwasów wymaga transaminacji (p. ryc. 17-4) Aminokwasy są konieczne do biosyntezy białka. Niektóre z nich muszą być obowiązkowo doprowadzone z poŜywieniem (aminokwasy niezbędne lub egzogenne), poniewaŜ tkanki są niezdolne do ich syntezy. Pozostałe, czyli aminokwasy endogenne, są równieŜ dostarczane z pokarmem, ale mogą być takŜe wytwarzane w organizmie z węglowych związków pośrednich w procesie transaminacji, wykorzystującym azot aminowy z występujących w nadmiarze innych aminokwasów. Po deaminacji aminokwasów nadmiar azotu aminowego jest usuwany jako

* Jako związki ketonowe naleŜy rozumieć nie tylko związki zawierające grupę ketonową (acetooctan, aceton), lecz takŜe P-hydroksymaślan. W tyrn sensie określenie „związki ketonowe" pokrywa się z treścią określenia angielskiego „ketonc bodies" — ciała ketonowe (przyp, wyd.).

192 / ROZDZIAŁ 17

mocznik. Szkielety węglowe powstające w wyniku transaminacji są: 1) utleniane do COi w cyklu kwasu cytrynowego, 2) wykorzystane do syntezy glukozy (glukoneogeneza) lub 3) ulegają przemianie w związki ketonowe. Poza niezbędnym udziałem w syntezie białka, aminokwasy są równieŜ prekursorami wielu innych waŜnych związków, np. puryn, pirymidyn i hormonów, takich jak adrenalina lub tyroksyna. Szlaki metaboliczne mogą być badane na róŜnych poziomach organizacji Dotąd patrzyliśmy na metabolizm zachodzący w całym organizmie. Umiejscowienie szlaków metabolicznych i ich integrację ustala się za pomocą badań na niŜszych poziomach organizacji, a mianowicie: 1. Na poziomie tkanki i narządu — określa się rodzaj substratów wchodzących i metabolitów opuszczających tkanki lub narządy i podaje ogólny opis ich przemian. 2. Na poziomie subkomórkowym — kaŜda struktura subkomórkowa (np. mitochondrium) lub kompartment komórki (np. cytozol) pełni swoiste funkcje biochemiczne.

które tworzą część subkomórkowego zestawu szlaków metabolicznych. KrąŜenie krwi integruje metabolizm na poziomie tkanki i narządu Aminokwasy powstające w procesie trawienia białek pokarmowych oraz glukoza powstająca w wyniku trawienia węglowodanów są wchłaniane z jelita do krwi Ŝyły wrotnej wątroby. To gwarantuje, Ŝe zarówno te metabolity jak i inne rozpuszczalne w wodzie produkty trawienia są początkowo kierowane do wątroby (ryc. 17-5). Podstawową funkcją metaboliczną wątroby jest regulowanie stęŜenia większości metabolitów we krwi, zwłaszcza glukozy i aminokwasów. W przypadku glukozy odbywa się to przez wychwytywanie nadmiaru glukozy i przekształcanie jej w glikogen (gUkogenogeneza) lub w tłuszcz (lipogencza). Pomiędzy posiłkami, w celu uzupełnienia stęŜenia glukozy we krwi, wątroba uwalniają ze zmagazynowanego glikogenu (glikogenoliza) lub, wraz z nerką, przekształca metabolity niecukrowe, takie jak mleczan, glicerol i aminokwasy, w glukozę (glukoneogeneza). Utrzymanie właściwego stęŜenia

anina itn. '#. ■ \'.''. ^

fosforan o^yk.-j ^SllkoW/// Sllkogen

5

S^

JELITO CIENKIE

Ryc. 17-S. Transport i los głównych substratów i metabolitów węglowodanowych i amtnofcwasowych. Uwaga: w mięśniu wolna glukoza występuje w niewielkich stęŜeniach, poniewaŜ po wniknięciu do komórki ulega natychmiast fosforylacji. ____ ___

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 193

glukozy we krwi jest konieczne ze względu na pewne tkanki (np. mózg lub erytrocyty), dla których jest ona obligatoryjnym źródłem energii. Do zadań wątroby naleŜy równieŜ syntetyzowanie głównych białek osocza krwi (np. albuminy) oraz deaminatja aminokwasów będących w nadmiarze, i związane z tym tworzenie mocznika. Ten ostatni jest transportowany z krwią do nerek i wydalany. Mięśnie szkieletowe uŜywają glukozy jako paliwa, wytwarzając z niej mleczan i CO2. Magazynują glikogen z przeznaczeniem na źródło energii do skurczu mięśnia oraz syntetyzują białka mięśniowe z aminokwasów osocza. Mięśnie stanowią ok. 50% masy ciała, przeto reprezentują znaczny zapas białek, który moŜe być wykorzystany do zaopatrzenia osocza w aminokwasy, zwłaszcza przy niedoborach pokarmowych. Z lipidów (ryc. 17-6) po strawieniu powstają monoacyloglicerole i kwasy tłuszczowe. W komórkach jelitowych zachodzi resynteza lipidów, które po połączeniu z białkiem są wydzielane w formie lipoprotein, znanych jako ehylomikrony, początkowo do układu chłonnego, a na-

stępnie do krwiobiegu. Wszystkie rozpuszczalne w lipidach hydrofobowe produkty trawienia (np. cholesterol), wchodzą w skład lipoprotein, co ułatwia ich transportowanie miedzy tkankami w środowisku wodnym — osoczu. Triacyloglicerol chylomikronów, w odróŜnieniu od glukozy i aminokwasów, nie jest wychwytywany przez wątrobę. Jest on metabolizowany przez tkanki pozawątrobowe przy udziale Kpazy lipoproteinowej, która hydrolizuje triacyloglicerol, uwalniając kwasy tłuszczowe, które są następnie wbudowywane do lipidów tkankowych lub utleniane jako źródło energii. Innym waŜnym źródłem długołańcuchowych kwasów tłuszczowych jest synteza (lipogeneza) z węglowodanów, głównie w tkance tłuszczowej i w wątrobie. Triacyloglicerol tkanki tłuszczowej stanowi zasadniczą rezerwę energetyczną w organizmie. W następstwie jego hydrolizy (lipolizy) kwasy tłuszczowe są uwalniane do krwiobiegu jako woine kwasy tłuszczowe. Są one wychwytywane przez większość tkanek (ale nie przez mózg i erytrocyty) i estryfikowane do acylogliceroli lub utleniane, jako główne źródło energetyczne do CO2 i H^O. W wątrobie zachodzą 2 szlaki
JELITO CIENKIE

Ryc. 17-8. Transport i losy głównych substratów i metabolitów liptdowych: WKT — wolne kwasy

Glukoza

Kwasy ^tłuszczowe

MG — monoacyloglicerol, — lipoproteiny o bardzo malej gęstości.
13 — Biochemia

TG

tłuszczowe, LPL — lipaza lipoproteinowa, — triacyloglicerol, VLDL ____________

194 / ROZDZIAŁ 17

o dodatkowym znaczeniu: 1. NadwyŜka triacyloglicerolu, będąca zarówno wynikiem lipogenezy, jak i podaŜy wolnych kwasów tłuszczowych, jest wydzielana do krwiobiegu w postaci
Kpoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL: ang.

very Iow density lipoprotein). Ten triacyloglicerol ulega przemianom podobnym do tych z chylomikronów. 2. Częściowe utlenianie wolnych kwasów thiszczowych pozwala wytwarzać związki ketonowe (ketogeneza). Związki ketonowe są transportowane do tkanek pozawąlrobowych, gdzie są wykorzystywane jako inne waŜne źródło energii.

Na poziomie subkomórkowym: gltkoliza przebiega w cytozolu, a cykl kwasu cytrynowego w mitochondriach Główne funkcje biochemiczne składników subkomórkowych i organelli komórki przedstawiono w tab. 2-4. JednakŜe, większość komórek jest podporządkowana wyspecjalizowanym funkcjom róŜnych tkanek i zmierza do uwydatnienia pewnych szlaków metabolicznych i ograniczenia innych. Rycina 17-7 ilustruje zasadnicze szlaki metaboliczne, ze specjalnym uwzględnieniem umiejscowienia we-

CYTOZOL Gtikogen , Białko
AA

/

J^ybosom

Cykl per loŜof ostoranowy

/ .:-.Siateczka.\śród p I azm a tyczn a /

Glicerofosforan \ G ii cero I

Triacytogliceral

Kwasy tłuszczowa

Ryc. 17-7. Wewnątrzkomórkowe umiejscowienie i integracja gjównych szlaków metabolicznych w
Fosfoenolopirogronian Meczan

\ wątrobowej komórce miąŜszowej. AA -> przemiana jednego więcej aminokwasów

T
Pirogronian

— lub

Szczawiooctan

Acetyio-CoA

Fumaran

AA

Cytrynian

Sukcynylo-CoA

a-Ketoglutaran

AA

M1TOCHONDRIUM

egzogennych, AA *+ — przemiana jednego lub więcej aminokwasów endogennych.

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 19S

wnątrzkomórkowego oraz ich integrację w wątrobowej komórce miąŜszowej. Wyraźnie widoczna jest centralna rola mitochondrium. Jest on siedliskiem krzyŜujących się torów metabolicznych węglowodanów, lipidów i aminokwasów. Mieszczą się w nim m.in. enzymy cyklu kwasu cytrynowego, łańcucha oddechowego z syntazą ATP, P-oksydacji kwasów tłuszczowych i ketogenezy. Dodatkowo jest on punktem zbiorczym dla powstających podczas transaminacji szkieletów węglowych aminokwasów przekazywanych następnie do procesu syntezy aminokwasów endogennych. W cytozolu zachodzą: glikohza, cykl pentozo fosforan owy i synteza kwasów tłuszczowych. NaleŜy podkreślić, Ŝe w glukoneogenezie nawet substancje, które są wytwarzane w cytozolu, takie jak mleczan i pirogroniatt, muszą wejść do mitochondrium, aby ulec przemianie w szcza wio octan, nim zostaną przekształcone w glukozę. Błony siateczki śródplazmatycznej zawierają układ enzymatyczny katalizujący biosyntezę acylogliceroli. Rybosomy z kolei są miejscem syntezy białka. NaleŜy zdać sobie sprawę, Ŝe transport metabolitów o róŜnej wielkości, ładunku i rozpuszczalności przez błony oddzielające struktury subkemórkowe wymaga złoŜonych mechanizmów. Niektóre z nich przedstawiono przy opisie błony mitochondrialnej (p. rozdz. 14), a pozostałe w następnych rozdziałach. PRZEPŁYW METABOLITÓW W SZLAKACH METABOLICZNYCH MUSI BYĆ REGULOWANY W SPOSÓB ZHARMONIZOWANY Regulacja całkowitego przepływu metabolitów przez szlak metaboliczny sprowadza się często do kontroli tylko jednej lub prawdopodobnie dwóch kluczowych reakcji ciągu, katalizowanych przez „enzymy regulatorowe". NajwaŜniejsze w kontroli całkowitej szybkości szlaku metabolicznego są czynniki fizykochemiczne kontrolujące szybkość reakcji enzymatycznej, np. stęŜenie substratu (p. rozdz. 10). Natomiast temperatura i pH, czynniki, które mogą wpływać na aktywność enzymatyczną, mają niewielkie znaczenie regulacyjne u kręgowców stałocieplnych ze względu na stałą wartość tych parametrów. (Jednak naleŜy zwrócić uwagę na zmiany pH w przewodzie pokarmowym i ich wpływ na trawienie [p. rozdz. 56]).

Reakcje, które zachodzą w stanie nierównowagi nadają kierunek szlakom metabolicznym i są potencjalnymi punktami ich kontroli W reakcji zachodzącej w stanie równowagi szybkości reakcji w obydwu kierunkach są jednakowe i dlatego nie obserwuje się Ŝadnego przepływu w jakimkolwiek kierunku. Wiele reakcji w szlakach metabolicznych jest „reakcjami równowagi":
A «—► B «—* C <—. D

In vivo, w warunkach stanu stacjonarnego (ang. steady state), prawdopodobnie przepływ netto będzie zachodził ze strony lewej na prawą w przypadku ciągłego dostarczania A i ciągłego usuwania D. Taki szlak mógłby funkcjonować, ale kontrola przepływu przez regulację aktywności enzymu nie byłaby tu celowa, gdyŜ zwiększenie aktywności słuŜyłoby tylko do przyspieszenia osiągnięcia stanu równowagi. Zazwyczaj w szlaku metabolicznym jedna albo więcej reakcji zawsze jest w stanie nierównowagi. W reakcjach tych stęŜenia reagentów są dalekie od stanu równowagi, W wyniku dąŜenia do osiągnięcia stanu równowagi powstają duŜe straty energii swobodnej, wydzielanej w postaci ciepła, która nie moŜe być ponownie wykorzystana. Powoduje to, Ŝe tego typu reakcja jest zasadniczo nieodwracalna, np.: Ciepło
Reakcja nierównowagi

Taki szlak ma kierunek i zachodzi w nim przepływ metabolitów, ale przy braku kontroli szlak wyczerpuje się sam. Enzymy katalizujące reakcje w warunkach nierównowagi występują zwykle w mniejszych stęŜeniach i podlegają innym mechanizmom kontroli. Przypomina to otwieranie i zamykanie jednokierunkowego" wentyla, stwarzając moŜliwość kontroli przepływu netto. Reakcją powodującą przepływ jest ta pierwsza reakcja w ciągu, która jest wysycona substratem MoŜna ją zidentyfikować jako reakcję nierównowagi, w której K^ enzymu jest znacznie mniejsza od fizjologicznego stęŜenia substratu. Przykładem takiej reakcji powodującej przepływ jest pierwsza reakcja w glikolizie katalizowana przez heksokinaze (p. ryc. 19-2).

196 / ROZDZIAŁ 17

MECHANIZMY ALLOSTERYCZNY I HORMONALNY MAJĄ DUśE ZNACZENIE W METABOLICZNEJ KONTROLI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Na rycinie 17-8 przedstawiono hipotetyczny szlak metaboliczny A, B, C, D, w którym reakcje A <-> B i C «-» D zachodzą w stanie równowagi, a B -* C jest reakcją „nierównowagi". Przepływ w tym szlaku moŜe być regulowany przez dostępność substratu A, a zaleŜy od dostarczania go z krwi, co z kolei zaleŜy od spoŜycia odpowiedniego pokarmu lub od pewnych kluczowych reakcji, które wytwarzają i uwalniają substraty do krwi. Przykładem tego są 2 reakcje powodujące przepływ — jedna katalizowana przez fosforylazę w wątrobie (p. ryc. 20-1), która dostarcza giukozę do krwi, oraz druga, katalizowana przez lipazę wraŜliwą na hormony (p. ryc. 27-8), która dostarcza

wolne kwasy tłuszczowe. To zaleŜy równieŜ od zdolności substratu A do przenikania przez błonę komórkową. Przepływ moŜe być równieŜ warunkowany przez sprawność usuwania końcowego produktu D i dostępność kosubstratu lub kofaktorów oznaczonych na rycinie jako Xi Y. Enzymy katalizujące reakcje nierównowagi są często białkami allosterycznymi podiegającymi kontroli przez efektory ailosteryczne szybko działające przez sprzęŜenie zwrotne (ang. feed-back) albo przez sprzęŜenie ku przodowi (ang. feed-forward) (p. rozdz. 10). Często końcowy produkt szlaku biosyntezy hamuje aktywność enzymu katalizującego pierwszą reakcję tego szlaku, np. dlugołańcuchowe kwasy tłuszczowe hamują karboksylazę acetylo-CoA. Inne mechanizmy kontroli zaleŜą od działania hormonów reagujących na potrzeby całego organizmu. Są znane róŜne mechanizmy działania hormonów (p. rozdz. 44). Jednym z nich jest kowalenNieaktywny enzym,

Ca* /kalmodulinaBtona komórkowa

+

0
Aktywny

©

(Y) •cAMP

[Enzym,]

Inhibicja ailosteryezna przez ujemne

Aktywacja ailosteryezna sprzęŜenie zwrotne przez dodatnie sprzęŜenie ku przodowi Ryb osom a I na biosynteza nowego białka enzymatycznego lub ©

Jądrowa biosynteza

Indukcja mHNA Represja

Ryc. 17-8. Mechanizmy kontroli reakcji enzymatycznych. Liczby w kółkach wskazują moŜliwe miejsca działania hormonów. CD—zmiany przepuszczalności błony, © — przemiana postaci nieaktywnej w postać aktywną enzymu, ® — zmiana szybkości translacji mRNA na poziomie rybosomu, © — indukcja biosyntezy mRNA. © — represja biosyntezy mRNA. ____________________________________

ZARYS PRZEMIAN POŚREDNICH / 197
cyjna modyfikacja enzymu przez fosforylację lub defosforylację jego cząsteczki. Jest ona szybka

i często zachodzi za pośrednictwem drugiego posłańca — cAMP, który z kolei powoduje przekształcenie enzymu nieaktywnego w enzym aktywny. To przekształcenie jest przeprowadzane albo przez kinazę białek cAMP-zaleŜną, która fosforyzuje enzym, lub przez swoistą fosfatazę, która defosforyluje enzym. Aktywną formą enzymu moŜe być albo jego cząsteczka ufosforylowana, jak w enzymach szlaku degradacji (np. fosforylaza a), albo cząsteczka defosforylowana, jak w enzymach procesów syntez (np. glikogenowa syntaza a). Niektóre enzymy regulatorowe mogą być fosforylowane bez pośrednictwa cAMP i zaleŜnej od cAMP kinazy białek. Te enzymy reagują na inne sygnały metaboliczne, takie jak stosunek [ATP]/[ADP] (np. dehydrogenaza pirogronianowa; ryc. 19-6) lub kinaza białek kontrolowana przez Ca2+/kalmodulinę (np. kinaza fosforylazy; p. ryc. 20-6). Synteza enzymów kontrolujących szybkość szlaku moŜe być regulowana hormonalnie. PoniewaŜ dotyczy to syntezy nowego białka, nie

jest to zmiana szybka, Jęcz jest częstą reakcją na zmianę odŜywiania. Hormony mogą działać jako induktory lub represory syntezy mRNA w jądrze komórkowym lub jako stymulatory translacji w procesie syntezy białka na poziomie rybosomów (p. rozdz. 41 i 44). Znamienną cechą, która ułatwia kontrolę metabolizmu, jest to, Ŝe szlak degradacji substratu nie jest prostym odwróceniem syntezy. Zwykie w grę wchodzą 2 całkowicie oddzielne ciągi, z których kaŜdy podlega oddzielnej regulacji, np. synteza i rozpad glikogenu (ryc. 20-1).

PIŚMIENNICTWO
Cohen P: Control ofEnzyme Actinty, 2nd ed. Chapman & Hal), 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Newsholme EA, Crabtree B: Flus-generating and regulatory steps in metabolic control. Trends Bio-

hm

Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism,
WiJey, 1973.

18
WPROWADZENIE

Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA
Peter A. Mayes, PhD, DSc

Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa, cykl kwasów trikarboksylowych) jest ciągiem reakcji zachodzących w mitochondriach, w wyniku których reszty acetylowe ulegają katabolizmowi z uwolnieniem równowaŜników wodoro wych. Utlenieniu tych ostatnich towarzyszy uwolnienie przewaŜającej części energii swobo dnej zawartej w spalanych substratach. Reszty acetylowe występują w formie acetylo-CoA (CH3-CO-S-CoA, aktywny octan), estru koen zymu A. Jednym ze składników CoA jest wita mina ... kwas pantotenowy.

kowanych nieprawidłowości enzymów cyklu; tego typu nieprawidłowości są przypuszczalnie nie do pogodzenia z prawidłowym rozwojem organizmu. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO DOSTARCZA SUBSTRATU DLA ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO Istotą cyklu jest połączenie czas teczki *acetylo-CoĄ z 4-węglowym dikarboksylowym kwasem szczawiooctowym; czego wynikiem jest
powstanie 6-węglowego kwasu trikarboksy(owe-

go — cytrynianu. Następuje po tym ciąg reakcji, w czasie których odłączają się 2 cząsteczki CO2 i odtwarza się szczawiooctan (ryc. 18-1). Szczawiooctan spełnia tu właściwie funkcję katalitycz-

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zasadnicza rola cyklu kwasu cytrynowego polega na działaniu jako wspólny szlak końcowy utleniania węglowodanów, lipidów i białek. Wynika to z faktu, Ŝe glukoza, kwasy tłuszczowe oraz niektóre aminokwasy są tnetabolizowane .do acetylo-CoA lub związków po.Średnich cyklu. Cykl odgrywa równieŜ istotną rolę w jlukoneogenezie, tran sam i nacji, deaminacji T lipogenezie. ChociaŜ niektóre z tych procesów zachodzą w wielu tkankach, to jedynym narządem, w którym wszystkie te procesy zachodzą w znaczącym stopniu, jest wątroba. StącfteŜ uwidaczniają się głębokie następstwa wówczas, gdy np. znaczna liczba komórek wątrobowych jest uszkodzonych lub zastąpionych tkanką łączną, jak ma to miejsce w ostrym
zapaleniu lub marskości wątroby. Pośrednim

ną, poniewaŜ tylko niewielkie jego ilości są konieczne do ułatwienia przemiany znacznej liczby jednostek acetylowych w CO2.
AoatykJ-CoA Co-A

Szczawiooctan

Cytrynian (CJ

dowodem, świadczącym o Ŝyciowym znaczeniu cyklu kwasu cytrynowego, jest fakt, Ŝe u ludzi odkryto bardzo niewiele genetycznie uwarun-

Ryc. 18-1. Cykl kwasu cytrynowego. Katalityczna rola szczawiooctanu.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 199

Cykl kwasu cytrynowego jest integralni} częścią procesu, w wyniku którego przewaŜająca cześć energii swobodnej, uwalnianej podczas utleniania węglowodanów, lipidów i aminokwasów, staje się dostępna. W wyniku działania w cyklu swoistych dehydrogenaz podczas utleniania acetylo-CoA powstają równowaŜniki re-

dukujące w postaci wodpru lub elektron ów^Ta . równowaŜniki redukujące wchodzą patem do łańcucha oddechowego, gdzie w procesie fpsforylacji oksydacyjnej są wytwarzane duŜe ilości ATP <ryc. 18-2; p. równieŜ rozdz. 14). Ten aerobowy proces wymaga tlenu, jako ostatecznego utleniacza równowaŜników redukujących.

Bursztynlan

NAD

2H

Sukcynylo-CoA lCA

Fosforylacja ' oksydacyjna

Łańcuch i ---- ? txl<techowy Anaarobloza (htpoksja, anoksja) Węglowodany Flawoproteina Cytoctirom Fosforan bogat o energetyczny Ryc. 18-2. Cykl kwasu cytrynowego: główny szlak katabolizmu acetylo-CoA w organizmach aerobowych. Acetylg-CoA, produkt katabolizmu węglowodanów, białek i lipidów, wchodzi do cyklu.wraz z H2O, ulegając utlenieniu do ĆOZ z jednoczesnym uwolnieniem równowaŜników redukujących (2H). Późniejsze utlenienie 2H w łańcuchu oddechowym jest sprzęŜone z fosforylacją AD P do ATP. KaŜdy obrót cyklu generuje 11 ~ ® pnez fosfory I a cjf oksydacyjną oraz 1.— ® przez fosforylację substratową (konwer sję sukcynylo-CoA do bursztynianu)J ____________________________________________________________________________________________ Białka Lipidy

200 / ROZDZIAŁ 18

e

Stąd teŜ brak (anoksja) lub częściowy niedobór (hipoksja) O2 jest przyczyną całkowitej lub częściowej inhibicji cyklu. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego znajdują sic~w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej, albo przyłączone do wewnętrznej powierzchni wewnętrznej błony mitochondrialnej, co ułatwia przenoszenie równowaŜników redukujących na.odpowiednie enzymy łańcucha oddechowego, umiejscowionego równieŜ w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. REAKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UWALNIAJĄ RÓWNOWAśNIKI REDUKUJĄCE I CO a (p. ryc. 18-3) Enzym kondensujący — syntaza cy trynianowa — katalizuje inicjującą cykl kondensację acelylo-CoA ze szczaswfloctąnem* i powstanie cytrynianu przez utworzenie" wiązania wę-gielwęgiel między atomem węgla grupy metylowej acety]o-CoA a atomem węgla grupy karbonylowej szczawiooctanu. Po reakcji kondensacji, w której powstaje cytrylo-CoA, następuje jiyjlroliza wiązania tioestrowego CoA połączona ze znaczną utratą energii swobodnej w postaci ciepła, co zapewnia przebieg reakcji do końca.
Acetylo-CoA+Szczawiooctan+H.,0 -> -> Cytrynian+ Co-A

Reakcja jest wraŜliwa na fluorooctan, który w formie fluoroacetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem, tworząc fluorocytryman. Ten ostatni hamuje akonitazę, powodując akumulację cytrynianu. Wyniki doświadczeń z uŜyciem związków pośrednich znakowanych węglem lłC wskazują, Ŝe akonitaza reaguje z cytrynianem w sposób asymetryczny. Enzym zawsze działa na tę część cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawiooctanu. Fakt ten był zaskakujący, poniewaŜ kwas cytrynowy wydawał się być związkiem symetrycznym. Okazało się (gdy cząsteczkę rozpatruje się w 3 wymiarach), Ŝe 2 grupy — CH2COOH nie są przestrzennie identyczne w odniesieniu do grup —OH i —COOH. Następstwa asymetrycznego działania akonitazy moŜna ocenić, śledząc losy znakowanego acetylo-CoA w cyklu kwasu cytrynowego przedstawionego na ryc. 18-3. MoŜJiwe, Ŝe CŁs-akonitan nie jest koniecznym związkiem pośrednim miedzy cytrynianem a izocytrynianem, lecz w rzeczywistości stanowi boczne odgałęzienie głównego szlaku. Izocytrynian przy udziale dehydrogenazy izocytrynianowej ulega odwodornieniu i powstaje szczawiobursztyńian. Znane są 3 róŜne dehydrogenazy izocy tryniano we. Jedna, swoista względem NAD", znajduje się tylko w chondriach. Pozostałe 2 enzymy są swoiste względem NADP+, jeden z nich znajduje się ?
(Irilgi W rytmniii. TTtWia-

nie izocytrynianu związane z łańcuchem odCytrynian ulega przekształceniu w izocyi- dechowym odbywa się niemaJ wyłącznie przy rynian pr2ez enzym akonitazę (hydrataza akoni- udziale enzymu zaleŜnego od NAD+. tanowa), która zawiera Ŝelazo, jakujop Fe2 + , + w formie białka Ŝclazo-siarkowegofFeiSJT^rŜe^ Izocytrynian + NAD .—> *—* miana ta zachodzi w 2 etapach :_dehydratacji do Szczawiobursztyńian <—► (związany z enzymem) i—>txds-akonitanu pozostającego w^pbłączeniu Ŝ en~ + Ketoglutaran + COa+ NADH + H zymem i ponownej rehydratacji do izocytrynianu.

7i Cytrynian

Cw-akonitan - — jf fzocytryniarc

związany z enzymemj

* Z okólnika nr 200 Komitetu Wydawców Biochcmical Joumals Recommendations (]975): „Zgodnie ze standardową konwencją biochemiczną końcówka -an (np. palmitynian) oznacza dowolną mieszaninę wolnego kwasu i jego form(y) zjonizowanych(ej) (w zaleŜności od pH), w której nie wyszczególnia się kationów". Tę samą konwencję przyjęto w tej ksiąŜce dla wszystkich kwasów karboksy1 owych.

ksylacji do a-ketoglutaranu w reakcji kąjaj^owąnej takŜe przez dehydrogenazę izocytrynianową. WaŜnym składnikiem tej reakcji jest Mnz+ (lub Mg?.jt)j Wydaje się, Ŝe.s_zczawk>bursztynian pozostaje związany z enzymem jako związek pośredni w ogólnej reakcji. Towstały a-ketogtutaran ulega dekarbo ksylacji oksydacyjnej w sposób analogiczny do dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronianu (p. ryc. 19-5) — oba substraty są a-ketokwasami.
:-Ketoglutaran + NAD* + Co-A -» -* + Sukcynylo-CoA + COa + NADH + H

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 201

JABŁ.CZANOWA
CH 3 ~ COCT NADH + HłSzczawlooctanHJ°

HO—C-COO" CH5-COCT Cytrynian JAKONITAZA]

Fluorocytrynian C—COO JJH-COCT Cis-a. koni tan t

DEHYDROG BURSZTYNIANOWA

HO-CH-COO izocytrynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA1

O-C-S-CoA Sukcynylo-CoA
K-

r

p
OC aSzczawicbursztynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA

DEHYDROGENAZY

KETOGLUTARANO

Ketoglutaran

DEHYDROGENAZA OWA | Ryc. 18-3. Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa). Utlenianie NADH i FADH2 w łańcuchu oddechowym umoŜliwia syntezę ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, W celu łatwiejszego śledzenia losów acetylo-CoA w cyklu, atomy węgla rodnika acetylowego oznakowano na węglu karboksyiowym {uŜywając znaku [*]) i na węglu metylowym {uŜywając znaku [ •] ) W jednym obrocie zostają uwolnione 2 atomy węgla w postaci CO2, W pierwszym obrocie cyklu le uwolnione atomy nie pochodzą zacetyio-CoA, który bezpośrednio wszedt do cyklu, ale z lej części cząsteczki cytrynianu, która pochodzi ze szczawtooctanu. JednakŜe, po pierwszym pełnym obrocie cyklu, odtworzony szczawiooctan jest juŜ znakowany, stąd teŜ w następnym obrocie cyklu uwolnieniu ulega znakowany CO^. PoniewaŜ bursztynian jest związkiem symetrycznym, a dehydrogenaza bursztyn ianowa nie rozróŜnia 2 grup karboksylowych, na tym etapie dochodzi do „przypadkowości" znakowania, w wyniku czego wszystkie 4 atomy węgla szczawiooctan u okazują się być znakowane po jednym obrocie cyklu. W wyniku glukoneogenezy część węgl i znakowanego szcza wtooctanu moŜe się zna leźć w glukozie i glikogenie (p. ryc 21 -1). Stereochemiczne aspekty cyklu kwasu cytrynowego omówił Grevrl(e (1968). Na rycinie zaznaczono miejsca hamowania (O) przez fluorocytrynian, malonian i arsenin.

202 / ROZDZIAŁ 18

Reakcja katalizowana przez kompleks dehydrogenazy a-ketoglu tara nowej £akŜe__»;^ma-ga obecności identycznych kofaktorów, tj. difosfotiaminy, Ijponianu, NAD+, FAD i "CoA. "Wj ej_wy ni kupo wstaj e sukcynylo-CoA, tioester zawierający wiązanie bogatoenergetyczne. Równowaga tej reakcji jest tak znacznie przesunięta na korzyść tworzenia sukcynylo-CoA, Ŝe naleŜy ją uwaŜać za fizjologicznie jednokierunkową. Tak jak w przypadku utleniania pirogronianu (p, str. 214), reakcję tę hamuje arsenin, powodując nagromadzenie się su.bstratu, ot-ke^ toglutarann. W następnym etapie cyklu sukcynylo-CoA jpstaje przekształcony w bursztyniań pr7«z enzym tiokinazę bursztyn Janową (syntetazę sukcynylo-CoA).

Pierwszą reakcję odwodoraiejH^J^^izuje dehydrogeriaza burszry niannwa. która jest związana_ z wewnętrzną.jowierzchnia:,wawl^4ee&eT
Błony mitn^nnHpalinpj w nńrń?r\ipr\h\ nńj^

zostałych enzymów cyklu, które znajdują się Śt to jedyna reakcja odwodor-y kwasu cytrynowego, w której następuje bezpośrednie przeniesienie wodoru z substratu na flawoproteinę bez udziału NAD + Enzym zawiera FAD i białko Ŝelazo siarkowe (Fe:S). Wynikiem odwodornienia jest powstanie fumaranu. Dane uzyskane z doświadczeń z izotopami wykazały, Ŝe enzym jest stereospecyficzny względem atomów wodoru w połoŜeniu trans na węglach metylenowych bursztynianu. Dodanie malonianu. lub szczawiooctanu hamuje kompetycyjnie dehydrogenazę bursztymanową, powodując nagromadzenie się bursztynianu. Sukcynylo-CoA + Pj + GDP <—• Fumaraza (hydrataza fumaranowa) katalizuje «—» Bursztynian + GTP + CoA reakcję przyłączenia cząsteczki wody do fumaReakcja ta wymaga GDP lub IDP, które ranu, dając jabłezan. w obecności fosforanów nieorganicznych zoFumaran + HaO <—> L-Jabłezan stają przekształcone odpowiednio w GTP lub TYP. W cyklu kwasu cytrynowego jest to jedyny Oprócz swoistości dla L-izomeru jabłezanu, przypadek powstawania bogatoenergetyczncgo fumaraza katalizuje przyłączenie j:jem£ató.w_ mazania fosforanowego na poziomie substratu. wody do podwójnego wiązania fumaranu Występuje on dlatego, Ŝe uwolnienie energii w konfiguracji trans. Jabłezan ulega przekształswbbodnejw reakcji dekarboksylacji oksyda- ceniu przez dehydrogenazę jablczanową w szczacyjnej a-ketoglutaranu jest wystarczające do wlooctan w reakcji wymagającej obecności dodatkowego utworzenia wiązania bogatoener- NAD+. getycznego, oprócz wytwarzania NADH (równowaŜnik 3~®). Przy udziale kioaz^^lifos^ L-Jabłczan + NAD+ Szczawiooctan + + fonukleozydowej (p. str. [37) z GTP lub ITP + NADH + H moŜe powstawać ATP,. m>.:
GTP + ADP GDP+ ATP

W tkankach po za wątrobowych reakcją alternatywną, katalizowaną przez transferazę CoA sukcynylo-CoA: acetooctan (tioforaze), jest przemiana sukcynylo-CoA w bursztynian sprzęŜona z przekształceniem acetooctanu w acetoacetylo-CoA (p, str. 268). W wątrobie stwierdza się równieŜ aktywność deacylazy, która powoduje nieznaczną hydrolizę sukcynylo-CoA do bursztynianu i CoA. 35Ldalszych_przemianach bursztynian ulega odwodornicniu, po którym następuje przyłączenie cząsteczki wody oraz jeszcze jedno odwodornienie prowadzące do odtworzenia szczawiooctanu.
Bursztynian + FAD <-^> Fumaran + FADH2

Aczkolwiek równowaga tej reakcji jest znacznie przesuniętajv_stron^ jabłezanu, zachodzi ona jednak w kierunku szczawi o octanu, poniewaŜ związek ten, wraz z drugim produktem reakcji (NADH), jest ciągle usuwany w następnych reakcjach. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego, z wyjątkiem dehydrogena^a-TteTo^tutara^no^eji bTJrsZtyaianowcj*,występują równieŜ poza mitochondriarniT ŁhociaŜ katalizują one podobne reakcje, niektóre z enzymów, np. dehydrogenaza jabłezanowa, nie muszą być w rzeczywistości tymi samymi białkami, co enzymy mitochondrialne o tej samej nazwie.

* Powinna być równieŜ wymieniona syntaza cytrynianowa (przyp.

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 203

KAśDY OBRÓT CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UMOśLIW IA SYNTEZĘ 12 CZĄSTECZEK ATP W_jvyniku utleniań katalizowanych przez dehydrogenazy cyklu kwasu cytrynowego, zos t a j ą w y t wo r z o n e 3 c z ą s t e c z k i N A D H i 1 F.4DH2 na kaŜdą cząsteczkę acetylo-CoA TĆataboIiźówaną w jednym obrocie cyklu. Te równowaŜniki redukujące są przenoszone do łańcucha oddechowego w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (ryc. 18-2). Podczas wędrówki w łańcuchu, równowaŜniki redukujące z NADH generują 3 boga t o e ne rgety czn e wiązania fos-" foranowe powstające w procesie fostorylaćji oksydacyjnej wskutek fosforylacjf AD? do ATP (p. rozdz. 14). Natomiast FADH, daje tylko 2 bo^tgenerąerycznejffi^zataTT&sfera nowe, gdyŜ przenosi swą siłę redukcyjną na CoQ, omijając w ten sposób pierwsze miejsce fosforylacji oksydacyjnej w łańcuchu oddechowym (p. ryc. 14-6). JDalsze bogatoenc rgety czne wiązanie fosforanowe.-powstaje na poziomie samego cyklu (tj. na poziomie subs trat u) podczas przemiany sukcynylo-CoA w bursztynian. Prz^-kaŜdym obrocie cyklu powstaje więc 12 cząsteczek ATP {tab. 18-1)!

NIEKTÓRE WITAMINY ODGRYWAJĄ KLUCZOWĄ ROLĘ W CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO Cztery rozpuszczalne witaminy kompleksu B maJ4 określone rok w funkcjonowaniu cyklu kwasu cytrynowego. Są to: I) ryboflawina w formie dinukleotydu flawinoadeninowego_(jFĄD), kofaktor w kompleksie dehydrotzcnazy «-ketoglutarano..weji w dehydrogenazic burszty-nta nowej, 2) niacjTia w formie dinukleotydu nikotyaoa ni i do u dt ni nowego (NAD), koenzym dla 3 dehydrogenaz cyklu: dehydrogenazy i/oe>tryniunowej, kompleksu dehydrugenazy .r-ktitoglutaranowej i dehydrogenazy jaWczanowej, 3) tiamina (witamina B,), jak£ difosfo tiamina, koenzym procesu dekar boksy lacjiw" reakcji dehydrogenazy ot-ketoglutaranowej, 4) kwas pantotenowy, jako C2ęść koenzymu A, kofaktor związany z „aktywnymi" resztami kwasów karboksylowych, takich jak acetylo-CoA i sukcynylo-CoA. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO ODGRYWA WĘZŁOWĄ ROLĘ METABOLICZNĄ Niektóre szlaki metaboliczne kończą się na związku pośrednim cyklu kwasu cytrynowego, a inne szlaki wywodzą się z tego cyklu. Dotyczy to takich procesów, jak: glukoneogcneza^ transaminacja, deaminacja i synteza kwasów,.tłuszczowych. Jak widać cykl kwasu cytrynowego odgrywa role zarówno w procesach oksydacyjnych, jak i w procesach syntez, a zatem jest amilbolicztiy. PoniŜej przedstawiono podsumowanie tej dwoistej roli cyklu. Cykl kwasu cytrynowego ma udział w giukoneogenezie, tran sam i nacji i deaminacji Wszystkie waŜniejsze metabolity ryWlu, od „Cytrynianu do szczawiooctanu, są potencjalnie g! ukogennc. gdyŜ mogą zwiększyć wytwarzanie glukozy w wątrobie lub nerce, narządach zawie rających pełny zestaw enzymów niezbędnych do przeprowadzenia glukoneogenezy (p. str. 226). Kluczowym enzymem, umoŜliwiającym przejś cie z cyklu do głównego szlaku glukoneogenezy, jest kar boksy kiiiiizii fosfoenolopirogr omanowa, katalizująca reakcję dekarboksylacji szczawic:octanu do fosfoenolopirogronianu z GTP jajko źródłem fosforanu bogatoenergetycznego (ryc. T8-4). ' -

Tabela 18-1. Wytwarzanie ATP przez cykl kwasu cytrynowego __________ —- -----------------Enzym katalizujący reakcję Dehydrogenaza izocytrynianowa Kompleks dehydrogenazy 3-ketoglutaranowej Tiokinaza bursztyn janowa Dehydrogenaza bursztynianowa Sposób wytwarzania ~P Utlenianie NADH włańcuchu oddechowym Utlenianie MADH wtańcuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenianie FADH2 w łańcuchu oddechowym Utlenianie NADH w łańcuchu oddechowym Zysk Liczba utworzonych cząsteczek ATP

3

3

1

2

Dehydrogenaza ablczanowa

3 12

204 / ROZDZIAŁ 18
Hlstydyna Prollna Hydroksyprollna Seryna Cysta! na Trsonlna Gtloyna Mleczan

)\
KARBOKSYLAZA FOSFOENO LOPIHOGRONIANOWA Fosfeanolo-

&

,JV f

Tryptofan.

Pirogronian KARBOKSYLAZA PIHOGHONIANOWA

plrogrnnlanln "^

Tyrozyna
Fenyloalanina

Glutamina f Arglnln. J

Ryc. 18-4. Uczestnictwo cyklu kwasu cytrynowego w transaminacji i glukoneogenezie. Grubsze strzałki wskazują główny szfak glukoneogenezy. Szczawiooctan ł GTP-» -» Fosfoenoloptrogronian + CO3+ GDP W reakcjach katalizowanych przez truns a mi-

Wprowadzenie do cyklu następuje jako wynik kilku róŜnych reakcji. Jedną z najwaŜniejszych jest tworzenie szczawi o octanu w reakcji karboksylacji pirogronianu katalizowanej przez
karboksylazę pirogronianową. ATP + COa + HaO + Pirogronian ■ -» Szcza wiooctan + ADP + P|

na/y (aminotransferazy) wytwarza się; pirogronian z alaniny, szczawiooctan z asparaginianu oraz a-ketoglutaran z glutaminianu. PoniewaŜ reakcje te są odwracalne, cykl słuŜy równieŜ jako źródło szkieletów węglowych do syntezy aminokwasów endogennych, np.:
Asparaginian + Pirogronian *—> Szczawiooctan + Alanina Glutaminian + Pirogronian<—»a-Ket oglu taran + Alanina

Reakcję tę uwaŜa się za waŜną w utrzymaniu odpowiedniego stęŜenia szczawiooctanu dla reakcji kondensacji z acetylo-CoA. JeŜeli nagromadza się acetylo-CoA, to działa on jako allosteryczny aktywator kaiboksylazy pirogronianowej, zapewniając w ten sposób dopływ szczawiooctanu. Mleczan, waŜny substrat glukoneogenezy, wchodzi dó^ cykl u w^wyniku przemiany w pirogronian i szczawiooctan.

Inne aminokwasy wspierają glukoneogeneze, poniewaŜ cały ich szkielet węglowy lub jego cześć po deaminacji lub transaminacji zasila cykl kwasu cytrynowego. Przykładami s$ ąląnina, cysteina^glicyjia, hydroksyprolina, seryoa, treońma i^yptofaiir któie ulegaią" prze-

CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 205
^rmnina htetyrlyna "

"glutamina i prolina. które"poprzez glutaminian przechodzą w a-ketoglu\ąran; izołeucyna, metionina i walina, które tworzą sukcynylo-CoA; tyt6fcyjia"T"ienyIoai an i n"a. z którjcE powstaje fumaran (p. ryc. 18-4). Substancje tworzące pirogronian mogą ulec całkowitemu utlenieniu dp^CO^jeśli ulegną przekształceniu w acetylo-CoA przez kompleks dehydrogenazy pirogronianowej, lub teŜ mogą trafić do glukoneogenezy przez karboksylację do szczawi o octanu. " Szczególne znaczenie dla przeŜuwaczy ma przemiana propionianu, będącego głównym produktem glikogennym fermentacji węglowodanów w Ŝwaczu przeŜuwaczy, w sukcynylo-CoA poprzez metyloma)onylo-CoA (p. ryc, 21-2). Cykl kwasu cytrynowego uczestniczy w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc. 18-5) Acetylo-CoA, utworzony z pirogronianu w wyniku działania kompleksu dehydrogenazy piróg ronią nowej, stanowi podstawowy element do syntezy długo łańcuch owych kwasów tłuszczowych u nieprzeŜuwaczy. (U przeŜuwaczy acetylo-CoA powstaje bezpośrednio z octanu).

PoniewaŜ dehydrogenaza pirogronian owa jest enzymem mitochóndrialnym, a enzymy katalizujące syntezę kwasów tłuszczowych znajdują się poza mitochondriami. acetylo-CoA musi zostać przetransportowany przez nieprzepuszczalną dla niego błonę mitochondrialną. Dokonuje się to przez utworzenie z acetylo-CoA cytrynianu w cyklu kwasu cytrynowego, następnie przetransportowanie cytrynianu z mitochondrium i w końcu utworzenie acetylo-CoA w cytozolu przez rozszczepienie cytrynianu w reakcji katalizowanej przez enzym Uazę ATP: cytrynianową.
Cytrynian + ATP + CoA-» Acetylo-CoA + Szczawiooctan + ADP+ P.

Regulacja cyklu kwasu cytrynowego zaleŜy głównie od podaŜy utlenionych kofaktorów Bez wątpienia w większości tkanek, w których zasadnicza funkcja cyklu kwasu cytrynowego polega na dostarczeniu energii, „kontrola oddechowa" przez łańcuch oddechowy T fosforylację oksydacyjną jest nadrzędnym elementem regulacji aktywności cyklu kwasu cytrynowego. Aktywność cyklu jest więc bezpośrednio
Siczawlodan

Glukoza i

- Pirogronian

LIA2A ATP: CYTHYNIANOWA Cytryn łan

Ryc. 18-5. Udział cyklu kwasu
DEHYDROGENAZA PIROGRO NIANOWA

cytrynowego w procesie syntezy kwasów tłuszczowych z glukozy {p. teŜ ryc. 23-5).
Saczawioocian Cykl kwasu cytrynowego

CO,
BŁONA MITOCHONDRIALNĄ

Kwasy tłuszczowe

Acetylo-CoA

206 / ROZDZIAŁ 18

zaleŜna od podaŜy utlenionych kofatetorów dehydrogenaz (np. NAD), ta z kolei, ze względu na sprzęŜenie utleniania z fosforylacją, zaleŜy od dostępności ADP, a w końcu takŜe od szybkości zuŜywania ATP. Szybkość wykonywanej pracy, w wyniku której zuŜywa się ATP, warunkuje zatem zarówno szybkość oddychania, jak i aktywność cyklu kwasu cytrynowego pod warunkiem, Ŝe tlen jest dostępny. Poza tą ogólną lub zgrubną kontrolą, właściwości niektórych enzymów cyklu sugerują, źe regulacja moŜe mieć miejsce na poziomie samego cyklu. W tkance, takiej jak mózg, która jest zaleŜna w znacznym stopniu od węglowodanów dostarczających acetylo-CoA, kontrola cyklu kwasu cytrynowego moŜe zachodzić na etapie dehydrogenazy pirogronianowej. W samym cyklu niektóre enzymy wykazują wraŜliwość na stan energetyczny wyraŜony stosunkiem [ATP]/[ADP] i [NADH]/[N AD+]. I tak syntaza eytrynianowa jest hamowana allosterycznie przez ATP i długołaricuchowe acylo-CoA. Allosteryczna aktywacja przez ADP mitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynianowej zaleŜnej od NAD jest znoszona przez ATP i NADH. Kompleks dehydrogenazy tx-ketoglutaranowej wydaje się być pod analogiczną kontrolą, jak dehydrogenaza pirogronianowa. Dehydrogenaza bursztynianowa jest hamowana przez szczawiooctan, a dostępność szcza wi o octanu,

kontrolowana przez dehydrogenazę jabłezanową,.zalęŜy.od stosunku [NADH]/[NAD], PoniewaŜ wartość Km syntazy cytrynianowej dla szczawiooctanu jest tego samego rzędu, co jego stęŜenie wewnatrzmitochondrialne, to wydaje się, Ŝe stęŜenie szczawiooctanu moŜe odgrywać pewną rolę w regulacji szybkości powstawania cytrynianu. Jak na razie nie rozstrzygnięto, który z powyŜej wymienionych mechanizmów funkcjonuje w warunkach in vivo.

PIŚMIENNICTWO
Baldwin JE, Krebs HA: The cvolution of metabolic cydes. Naturę 1981;291:381. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Academic Press, 1971. Goodwin TW (editor): The Metabolic Rołes of Citrate. Academic Press, 1968. Greville G"D: Vol 1, p 297, in: Carbohydrate MetaboHsm and hs Disorders. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors). Academic Press, 1968. Kay J, Weitzman PDJ (editors): Kreb's Citric Acid Cyde - Half a Century and Still Turning. Biochemical Society of London, 1987. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde: Control and Compartmentalion. Dekker, J969. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde. Vol 13 in: Methods in Enzymology. Academic Press, 1969. Srere PA: The enzymology of the formation and breakdown of citrate. Adv Enzymol I975;43:57.

Glikoliza i utlenianie piróg ronianu
Peter A, Mayes, PhD, DSc

19

WPROWADZENIE
Wszystkie tkanki wymagają pewnej minimalnej podaŜy glukozy, ale dla niektórych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów) jest to wymóg zasadniczy. GlikolizaJesL^ównym szlakiem r ^ ? T h i k i h ■Komórkach. Jest to wyjątkowy szlak, poniewaŜ moŜe on przebiegać zarówno w warunkach tlenojłjchjaerobowych), jak i beztlenowych (anaerobowych).

cykl kwasu cytrynowego. Znaczy to, Ŝe wytwarzanie pirogronianu przewyŜsza zdolność jego metabolizowania. W rezultacie prowadzi to do nadmiernego wytwarzania mleczanu i miejscowego zakwaszenia środowiska w guzie, a to z kolei moŜe mieć następstwa w terapii pewnych typów nowotworów. Kwasica mleczanów u moŜe wynikać z wielu przyczyn, włącznie z niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej.

GLIKOLIZA MOśE PRZEBIEGAĆ W WARUNKACH BEZTLENOWYCH ZNACZENIE BIOMED/CZNE
Glikoliza jest nie tylko podstawową drogą metabolizmu glukozy prowadzącą do wytwa rzania acetylo-CoA i utleniania w-cyklu-kwasu cjffynowcgo. lecz takŜe stanowi główny szlak, metabolizmu fruktozy i galaktozy i y g pokarmowego. Jej zasadnicze znaczenie biomedyczne wynika z faktu, Ŝe glikoliza moŜe dostarczać _&!£■ w BWobecnoścDtoua^cqrpo,T. zwala mięśniom szkieletowym funkcjonować sprawnie przy niedostatecznych procesach aerobowych i co pozwala tkankom z duŜą aktywnością glikolityczną przetrwać epizod Beztlenowy. Odwrotnie, mięsień sercowy, przystosowany do warunków tlenowych, charakteryzuje się względnie mała aktywnością glikolityczną i słabą zdolnością przetrwania w warunJtach niedotlenienia. Znamy niewielką liczbę chorób, w których stwierdzono brak aktywności enzymów glikolizy (np. kinazy pirogronianowej); zasadniczym ich objawem jest niedokrwistość hemolityczna. W szybko rosnących komórkach nowotworowych, glikoliza przebiega ze znacznie większą szybkością niŜ wymaga tego JuŜ we wczesnym okresie badań nad glikolizą zauwaŜono, Ŝe proces fermentacji w droŜdŜach jest podobny do rozpadu glikogenu w mięśniu. Stwierdzono, Ŝe gdy mięsień kurczy się w środowisku beztlenowym, tzn. takim, z którego usunięto tlen, znika glikogen, a pojawia się mleczan jako główny produkt końcowy. Gdy tlen jest dostępny, czyli istnieją ponownie warunki tlenowe, pojawia.-sje.glikjo.gen, natomiast mleczan .znika. JeŜeli jednak skurcz następuje w warunkach tlenowych, to mleczan się nie gromadzi, a głównym produktem glikolizy jest pirogronian; ten ostatni nie akumuluje się, poniewaŜ jest utleniany dalej do CO2 i wody (ryc. 19-1). Na podstawie tych obserwacji przyjęto rozdział metabolizmu węglowodanów na fazę tlenową i beztlenową. Jednak tego typu zróŜnicowanie jest arbitralne, gdyŜ reakcje w procesie glikolizy, przebiegające zarówno w obecności, jak i przy braku tlenu, są takie same z wyjątkiem ich intensywności oraz produktów końcowych. Je: Ŝeli.tlęnjest dostęnny-tyJko^r-zez-króiki-okres, to jest. ograniczona peoksydacja NADH powstałego w czasie glikolizy. W tych warunkach

208 / ROZDZIAŁ 19 Gllkogen

Glukoza + 2 AOP + 2 Pf -* -» 2 L(+)-Ml«aan + 2 ATP + 2 H3O Wszystkie_ enzymy- ■ szlaku -glikojitycznego (ryc. 19-2) znajdują się w pozamitochondrialnej rozpuszczalnej frakcji komórkowej.jK.c^tozplu. Katalizują one reakcje zachodzące podczas przemiany glukozy do pirogronianu i mleczanu następująco: Glukoza wchodzi do szlaku glikołitycznego przez fosforylację do glukozo-6-fosforanu: Za- chodzi to przy udziale enzymu heksokinazy, a w hepatocytach przy udziale glukokinazy, k*torej aktywność jest indukowana i modyfikowana w wyniku zmian odŜywiania. Jak»-dawca P fnsfhranp pnrr^frny jggf AT J* jak W Wielu reakcjach związanych z fosforylacją, regguje-on w formie kompleksu Mg^ATP. \f reakcji zuŜywa sie 1 bogatoenergetyczne wiązanie fosforanowe ATP i powstaje ADP._Reakgji tej towarzyszy znaczna strata energii swobodnej w postaci ciepła i dlatego w warunkach fizjologicznych moŜe być ona traktowana jako reakcja nieodwracalna. Heksokirta7M jp&t .hamawana w SpOsób izosteryczny przez produkt reakcji glultpzo-6-fosforan. Glukoza + ATP-—* -» Glukozo-6-fosforan + ADP

Ryc. 19-1. Uproszczony schemat glikolizy. Q — zablokowane w warunkach beztlenowych lub przy braku mitochondriów, np. w erytrocytach.

NADH jest utleniany w reakcji redukcji pirogronianu do rn]eczanu,7a_tak utworzony_NAD_.. umoŜliwia dalszy przebieg glikolizy (ryc, 19-1), W ten sposób glikoliza moŜe zachodzić w warunkach beztlenowych, lecz ma to swoją cenę — dochodzi do ograniczenia ilości energii uwalnianej na mol utlenianej glukozy. W konsekwencji, aby wytworzyć tę samą ilość energii, więcej glukozy musi ulec glikolizie w warunkach beztlenowych niŜ w warunkach tlenowych.

CIĄG REAKCJI W GLIKOLIZIE TO GŁÓWMY SZLAK ZUśYCIA GLUKOZY
Ogólne równanie glikolizy do mleczanu jest następujące:

r wy stepująca we wszystkich komórkach, z wyjątkiem komórek parenchymalnych wątroby, ma duŜe powinowactwo (mata wartość Km) do jej substratu, tj, glukozy. Jej rola polega na zapewnieniu dostarczenia gluko■ZXjjo_ tkanek. Nawet przy małych stęŜeniach glukozy we krwi, przez fosforylację wszystkich jej cząsteczek wnikających do komórki, jest moŜliwe utrzymywanie duŜego gradientu stęŜenia glukozy między krwią a środowiskiem wewnątrzkomórkowym. Heksokinaza działa zarówno na a, jak i p anomer glukozy i moŜe równieŜ katalizować fosforylację innych heksoz, jednak ze znacznie mniejszą szybkością niŜ fosforylację glukozy. Funkcia ęlukokinazy iest usuwanie glukozy Z krwi po spoŜyciu posiłków. W przeciwieństwie

Ryć. 19-2. Szlak glikolizy. ® ------- PO3 , P, — H0P0| , 9 — hamowanie. * Atomy węgla 1 — 3 fruktozobisfosforanu tworzą hydroksyacetonofosforan, natomiast węgle 4 — 6 tworzą giicera)dehydo-3-fosforan. Przedrostek bis- (jak w fruktozobisiosforanie) wskazuje, Ŝe grupy fosforanowe są odseparowane, natomiast określerile difosforan, np. w difosforanie adenozyny, wskazuje Ŝe są bezpośrednio ze sobą połączone.

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 209
Gtifcogen Glukozo-

1-fosforan

[ HEKSOKINAZA ]
| GLUKOKINAZA j

CHjL Q

_ c
Hy

J—- 0

Mg'

+

12OMEHA2A FOSFOHEKSOZOWA

CHa-O-©
^OH

HO\?
H
Glukoza

H

H

y0H
ATP
;ł-

OH
V FOSFOFRUKTOKINAZA

OH it-D- ATP

H 0H ADP ■-D-G lu kozo-6-f osf oran

cooH-C-OH i
CH,-OMUTA2A

OH

H D-

D-F r u kicz o -1.6-b i sf o sf o ran FOSFOGUCERYNIANOWA

Jod oo otan

CHjOH Dlhyd roksy aoeto nofoslo r FrukJczo-6-łosforan

FOSFOGLICERYNIANOWA

ALDEHYDO-3-FOSFORANOWA

coo—-5 3-Fos1oglioeryniari

2-Fnsfogllcerynian ADP 1,3-Blsfostogl icery n lan

___

ERAZA
g , __

, | \

H-Ć-O-® ĆH,OH
Fluorek

-H;O I ENOLAZA

Mltochondrlalny y: o£ łańcuch

cooĆ-0-®

3ATP 3ADP + P.

II

CH,
KINA2A PtROGRONIANOWĄ Fosfoenolo piróg ron lan Utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego

-A D P Mg1 ATP Samorzutnie NADH+H^ NAD +

cooi

cooĆ-OH -CH,
(Enol) Plrogfonian

CH3 (Keton) Plrogronlan

0EHYDH0G6NAZA MLECZANOWA

U
cooHO-C-H

Ryc. 19-2
14 Biochemia

Ć

210 / ROZDZIAŁ 19

do heksokinazy ma ona duŜą wartość Km dła glukozy i działa optymalnie przy stęŜeniu glukozy we krwi wynoszącym powyŜej 5 mmol/1 (p. ryc. 21-5). Jest swoista względem fliulfozy Glukoz o-6-fosforan jest waŜnym związkiem łączącym wiele szlaków metabolicznych (glikoliza, glukoneogeneza, cykl pentozofosforanowy, glikogcneza i glikogenoliza). W glikolizie jest ona przekształcana w fruktozo-6-fosforan przez izomeryzację aldozowo-ketozową przy udziale izomerazy fosfoheksozowej. Przemianie tej ulegaJyIkjDjąjm£nier_glukozó-6-fos...D-Głukozo-6-fosforan <—» *—> a>D-Fruktozo-6-fosforan

Następny etap glikolizy to utlenienie gliceraldehydo-^Tosforanu do J^^BisfbsfogUcer^ nianu. Dzięki aktywności izomerazy TosTotriozowej równieŜ dihydroksyacetonofosforan^ przechodząc uprzednio w gliceraldehydo-3-fosforan, jest utleniany do 1,3-bisfosfoglicerynianu,
D-Gliceraldehydo-3-fosforan + NAD * + + + Pj.—.1,3-bisfosfoglicerynian +NADH + H

Po tej reakcji następuje druga fosforylacja z udziałem ATP, katalizowana przez enzym fosfofruktokinazę (fosfofruktokinazc-1), tworząca fruktozo-l,6-bisibsforan. Fosfofruklokinazajest zarówno enzymem allosterycznym, jak i indukowanym, którego aktywność odgrywa główną rolę w regulacji szybkości glikolizy. Reakcja katalizowana przez fosfofruktokinazę e być uwaŜana za nieodwracalną w warunkach fizjoJogicznych.
D-Fruktozo-6-fosforan + ATP > ■ D - F ruktozo-1,6-bisf osforan

Fruktozo-l,6-bisfosforan jest rozszczepiany przcz aldolazę (aldolazę fruktozo-1,6-bisf o sforanową) na 2 fosfotriozy, glicfiraldehydo-3-fosforan i dihydroksyacetonofosforan.
D-Fruktozo-1,6-bisfosforan «—► <-^>Gliceraldehydo-3 -fosforan + + Dihydroksyacetonof osforan

Stwierdzono występowanie kilku róŜnych aldolaz; wszystkie zawierają 4 podjednostki. W większości tkanek występuje aldolazą A, natomiast w wątrobie i nerce występuje dodatkowo aldolaza B. ChociaŜ fruktozofosforany występują w komórce głównie w formie furanozowej, to z izomerazą fosfoheksozową, fosfofruktokinazą i aldolaza wiąŜą się w formie łańcuchowej. Gliceraldehydo-3-fosforan oraz dihydroksyacetonofosforan przekształcają się jeden w drugi pod wpływem enzymu izomerazy fosfotriozowej.
D -Gliceraldehydo-3-f osforan *—► «—► Dihydroksyacetonofosforan

Kn^ym warunkujący utlenianie—dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa —jest zaleŜny od NAD. Strukturalnie składa się on z 4 identycznych polipeptydów (monomerów) tworzących tetramer. KaŜdy polipeptyd zawiera 4 grupy -SH, znajdujące się w resztach cysteiny łańcucha polipeptydowego. Jedna z grup -SH znajduje się w centrum katalitycznym enzymu. Początkowo substrat łączy się z tą resztą SH, tworząc tiohemiacetal, który w wyniku utlenienia ulega przekształceniu w bogatoenergetyczny tioester; wodór oderwany w czasie tego utleniania jest przenoszony na NAD związany z enzymem. Wytworzony NADH nie jest tak mocno związany z enzymem jak NAD. Dlatego teŜ NADH moŜe być łatwo zastępowany przez następną cząsteczkę NAD, W końcu w reakcji fosforolizy, przy udziale nieorganicznego fosforanu (P;), tworzy się" 1,3bisfosfoglicerynian i wolny enzym z odtworzoną grupą -SH (ryc. 19-3). Energia uwalniana w czasie utleniania zostaje zatrzymana najpierw w formie bogatoenergetycznego wiązania siarczkowego, a po jego fosforolizie w formie bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego w pozycji 1 1,3-bisfosfogIicerynianu. Ten_„ bogatoenergetyc2ny fosforan znajdzie się następnie w ATP w wyniku katalizowanej przez kinaze fosfoglicerynianową reakcji zachodzącej w obecności ADP i tworzącej J-fosfoglicery-nian.
1,3-bisfosfoglicerynian-)- ADP «—» <—• 3-fosfoglicerynian+ ATP

PoniewaŜ z cząsteczki glukozy podlegającej glikolizie powstają 2 cząsteczki fosfotrioz, na tym etapie wytwarzają się równieŜ 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę glukozy; jest to przykład fosforylacji „na poziomie substratu" (fosforylacja substratowa). W przypadku obecności arseniami, współzawodniczy on w powyŜszych reakcjach z fosforanem nieorganicznym (Pj), tworząc 1-arse-

GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 211

H-C-0 H-C-OH
i

NAD+) S-Enz H-C-O H H-C-O H CHrO-(PKompleks enzym -substrat HS-Enz

CH-O-(P) G! fceraldehyd o-3-fosf □ ra n

nzym

o-®
H - C -O H CH,-O-(P) 1,3-Blsfostoglloerynlan

Utlenianie sabstratu przez związany NAtT

Intefmedlat bogatoeneroełyczny

Hyc-. 19-3. Mechanizm utleniania gliceraldefiydo-3fosforanu. Em ~~ dehydrogenaza gliceraldehydo-3--fosforanu. jest hamowany przez jodooctan wiąŜący się z grupą -SH, W ten sposób jodooctan moŜe hamować glikolizę.

Enzym

no-3-fosfoglicerynian, który spontanicznie hydrolizuje, dając 3-fosfoglicerynian i ciepło, bez tworzenia ATP. Jest to waŜny przykład zdolności arsenianu do rozprzęgania utleniania i fosforylacji. Powstający w powyŜszych reakcjach 3-jpsfogliceryhian jest przekształcany w 2-fosfoglicerynian przez enzym mutaze fosfoglicerynianową. Prawdopodobnie 2,3-bisfosfoglicerynian (dawniej określany jako difosfoglicerynian, DPG) jest związkiem pośrednim w tej reakcji.
3-Fosfoglicerynian *—f2-Fosfoglr cery niań

hamowana przez fluorki; ta właściwość moŜe być wykorzystana w sytuacji, gdy zachodzi potrzeba zahamowania glikolizy, np. w próbce krwi w celu oznaczenia w niej stęŜenia glukozy. Aktywność enzymu zaleŜy od obecności Mg2 + lub Mn2+.
2-Fosfoglicerynian «-» *-* Fosfoenolopirogronian + H2O

Następny etap glikolizy jest katalizowany przez enolazę, którą powoduje odłączenie wod^,_pr_zernieszczenie energii wewnątrz cząsteczki, przejście fosforanu w pozycji 2 w stan bogatoenergetyczny i w rezultacie tego utworzenie fosfoenolopirogronianu. Enoląza, jest

Następnie fosforan bogatoenergetyczny jest przenoszony z fosfoenolopirogronianu na ADP przez enzym kinazę pirogronianową, tworzący na tym etapie 2 cząsteczki ATP na cząsteczkę utlenianej glukozy. Utworzony w tej reakcji enolopirogronian przekształca się spontanicznie w formę ketonową pirogronianu. Jest to kolejna reakcja, której towarzyszy znaczna utrata energii swobodnej w postaci ciepła i musi być ona traktowana jako fizjologicznie nieodwracalna.

212 / ROZDZIAŁ 19 Fosfoenolopirogronian + ADP -* -» Pirogronian + ATP

Teraz stan red.-oks. tkanki jest czynnikiem decydującym, który z 2 moŜliwych szlaków metabolicznych zajdzie. JeŜeli przewaŜają waranki beztlenowe, to uniemoŜliwiona jest reoksydacja NADH w łańcuchu oddcdumym-pczez przeniesienie równowaŜników redukujących na tlen. Pirogrojiiaji ulega redukcji przez NADH rjrprpiwyfiTpi w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanów ą. Opisano izozymy tego "enzymu i ich znaczenie kliniczne (p. str. 82). Pirogronian + NADH + H ~ <-.L(+)-Mleczan + NAD*
+

ca_regulacji glikolizy. Komórki, mające róŜne systemy~enzyriiatyczne, pozwalające na alternatywny przebieg nieodwracalnych reakcji katalizowanych przez wyŜej wymienione enzymy, mają moŜliwość dokonywania w szlaku glikolitycznym przesunięcia metabolitów w kierunku syntezy (glukoneogenezy). Te reakcje oraz regulacja glikolizy i regulacja glukoneogenezy są przedstawione w rozdz. 21. W glikolizie zachodzącej w erytrocytach reakcja kinazy fosfog li cery nia nowej moŜe być ominięta W erytrocytach wie\u gatunków ssaków dochodzi do ominięcia reakcji katalizowanej przez kinazę fosfoglicerynianowa. W tym przypadku energia swobodna wiązania bogatoenergetyczi. nego 1,3-bisfosfoglicerynianu zostaje rozproszona w postaci ciepła (ryc. 19-4). Dodatkowy

Reoksydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu, przez odtworzenie NAD+ potrzebnego w następnym cyklu reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową, umoŜliwia przebieg glikolizy w nie------- Glukoza obecności tlenu. Tkanki funkcjonujące w warunH-C-GH kach niedotlenienia wytwarzają więc mleczan (ryc. 19-2). Dotyczy to zwłaszcza mięśni szkieletowych, gdyŜ szybkość wykonywanej przez mięGl fceraldehyd o-3-fosforan śnie pracy nie jest ograniczona przez ich stan NAD* oksygenacji. Nadmierne ilości utworzonego mleczanu moŜna stwierdzić w tkankach oraz we DEHYDROGENAZA GLICERALDEHYOO-3-FOSFORANIOWA krwi i w moczu. W _ervtrocvtach ^ikgjizajjiawet w warunkach tlenowych, kończy się zawsze 'NADH + H* utworzeniem mleczanu, z powodu braku w tych komórkach mitochondriów, które zawieraj4 system enzymatyczny utleniający pirogronian. MUTAZA Jedynie w erytrocytach ssaków ok^90% cał- H-C-OH BISFOSFO kowitego zapotrzebowania energetycznego pokrywa glikolizaJ_Coza mięśniem szkieletowym i erytrocytami, tkankami, które równieŜ czerpią energię głównie z glikolizy i wytwarzają mle- 1.3-BtefoBfoglicerynlan czan, są: mózg, jelito, rdzeń nerki, siatkówka 1 skóra. Wątroba, nerki i serce zwykle pobierają ADP, KINAZA mleczan i utleniają go, ale w warunkach niedoFOSFOGLICEHYNIANOWA tlenienia narządy te mogą wytwarzać mleczan. Glikoliza jest regulowana na 3 etapach obejmujących reakcje „nieodwracalne" ChociaŜ większość reakcji glikoli ty cznych jest odwracalna, to jednak 3 z nich są wyraźnie egzoergiczne i z tego powodu muszą być uwaŜane za rgakcj£jftzjologicznie nieodwracalne. Są to reakcje katalizowane przez heksokinazę (i glukokinazę),"ibsfofruktokinazę 'i kinazę pirogronianowa,. Reakcje te stanowią zasadnicze miejs-

J

Gl I cer o I o-2,3-b I sf osf o ra n

COO" H-COH CH2-O(F
3-Fosfogllcerynlan

FOSFATAZA 2^-BISFOSFOGUCERYN1AN0WA Pfrogronlan

Ryc. 19-4. Szlak 2,3- bisfosfoglicerynianowy w erytrocytach.

GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 213

enzym, imitasa ■faisfosfpglieerynianowa, katalizuje przekształcenie 1.3-bisfosfoglJccryniami w 2.3 - b i stos fbgl u: e ry ni an. Ten ostatni u lega przemianii: do .i-loslosilicciynianu prze/ fosfatazę ~TfośiSgBcerynianową, której aktywność wykazuje cząsteczka mutazy bisfosfoglicerynianowej. W związku z utratą bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego proces glikoiizy, przebiegający z udziałem tych reakcji, nie daje zysku energetycznego w postaci ATP. JednakŜe moŜe to być korzystne dla erytrocytów, poniewaŜ pozwala na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP. Poza tym 2,3-bisfosfoglicerynian, występujący w komórce w duŜym stęŜeniu, łączy się 7. hemoglobiną, powodując zmniejszenie jej powinowactwa do tlenu i przesuniecie krzywej dysocjacji oksyhemoglobiny w prawo. W_,Jten sposób w erytrocytach ułatwia on uwalnianie tlenu z oksj hemoglobiny (p. rozdz. 7). UTLENIANIE PIROGRONIANU DO ACETYLO-CoA JEST NIEODWRACALNYM PROCESEM ŁĄCZĄCYM GLIKOLIZĘ Z CYKLEM KWASU CYTRYNOWEGO AUy.piiogroniaajnógł wejść do cyklu kwasu cytrynowego, musi najpierw zostać przetransportowany do wnętrza mitochondrium przez przenośnik pirogronianowy, który umoŜliwia przejście pirogronianu przez wewnętrzną Honę mitochondrialną. W tym procesie transportowi cząsteczki pirogronianu towarzyszy transport 1 protonu (kotransport). Tego typu mechanizm transportu określa się mianem symportu (p. ryc. 14-15). Wewnątrz mitochondrium pirogrogjfrn
do acetylo-

ten ostatni zostanie ponownie utleniony przez flawoprofeinę, w obecności dehydrogęnazy dihydroliponianowej, cykl reakcji jest" zakończony! Ostatecznie zredukowana flawoproteina jest utleniana-pfzezr.:NAD, który z kolei przenosi równowaŜniki redukujące do łańcucha oddechowego.
Pirogronian + NAD + CoA -• + -» Acetylo-CoA + NADH + H + COa
+

Kompleks_dshydrogenazy pirogronianowej składa się z szeregu łańcuchów polipeptydowych. kaŜdego z 3 składowych enzymów, ułoŜonych w regularny układ przestrzenny. Ruchy kaŜdego z enzymów są ograniczone, a metabolity pośrednie nie dysocjują swobodnie, lecz pozostają przyłączone do enzymów. Taka organizacja kompleksu enzymatycznego, w którym substraty są przekazywane z jednego enzymu na następny, powoduje zwiększenie szybkości reakcji i uniemoŜliwia przebieg reakcji ubocznych, a w konsekwencji zwiększa wydajność ogólną procesu. NaleŜy zaznaczyć, Ŝe system dehydrogenazy pirogronianowej jest wystarczająco elektroujemny względem łańcucha oddechowego, aby generować zarówno zredukowany koenzym (NADH), jak i dodatkowo bogatoenergetyczne wiązanie tioestrowe w acetylo-CoA. Dehydrogenaza pirogronianowa jest regulowana przez hamowanie produktami końcowymi oraz przez modyfikacje kowalencyjne pehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana przez produkty jej reakcji, acetylo-CoA oraz NADH (ryc. 19-6). Jest ona równieŜ regulowana przez ATP-zaleŜną fosforylację, katalizowaną przez kinazę, co prowadzi do zmniejszenia aktywności oraz przez defosforylację przy udziale fosfatazy, co z kolei prowadzi do zwiększenia aktywności dehydrogenazy. Kinaza ulega aktywacji przy zwiększeniu wartości stosunków facetyIo-CoAj/XCoA], [NADHJ/tNAD1-] lub [ATP]/[ADP] Dęhydrogenaza pirogronianowa — a zatem i glikoli/a — jest więc hamowana nie tylko przez potencjał bogatoenergetyczny, lecz takŜe w warunkach, gdy zachodzi utlenianie kwasów tłuszczowych, w czasie którego zwiększają się wartości wyŜej wymienionych stosunków,.. W- -głodzeniu dochodzi do zmniejszenia ilości aktywnej formy enzymu, a po podaniu insuliny obserwuje się

;CpA. Reakcja ta jest katalizowana przez kilka róŜnych enzymów, działających kolejno w kompleksie wieloenzymatycznym. Enzymy te określa_sic-zbk>rowo mianem kompleksu dehydrogenazy pirogr omanowej, który jest analogiczny do kompleksu dehydrogenazy a-ketoglutaranowej w cyklu kwasu cytrynowego (p. str. 199). Pirjagnjniarijyilega.4ekarboksylacji do hydroksyetyłowej pochodnej pierścienia tiazolowego difosfoLićtmmy związanej z enzymem, która reaguje z kolei z utlenionym lipoamidem, tworząc acetylolipoamid (ryc. 19-5). W obecności acetylotransfcrazy dihydroliponianowcj acetylolipoamid reaguje z koenzymem A., tworząc acetylo-CoA i zredukowany lipoamid. Gdy

214 / ROZDZIAŁ 19
Dltosfotlamlna w formie karbanionu

S

C=Ć-CH,-CH,- O-®-®

C H -{ C H S ) 4 -C O O -

DEHYDROGENAZA PlROGFIONIANOWA

Oifosforiydroksyetylotiamina DEHYDflOGENAZA P1R0GR0NIAN0WA

Związek pośredni

DEHYDFIDGENAZA PIROGRONIANOWA

Utleniony lipoamid

ACETYLOTRANSFERAZ O A II CKHYDHOLIPONWNOWA CnA-S-C-CHj Aeetylo-CoA.

O II S -C —
CH 3 Aoetytolipoamld

Zredukowany lipoamid

[4

DEHYDROGENAZA DIHYDflOLIPONIANOWA NAD*

NADH

Ryc. 19-5. A. Dekarboksylacja oksydacyjna pirogronianu przez kompleks dehydrogertazy pirogronianowej, B, Kwas liponowy. Kwas li porto wy jest połączony wiązaniem amidowym z resztą lizyny acetylotransferazy będącej składnikiem kompleksu enzymatycznego. _____________________________________________________

zwiększoną aktywność w tkance (ale me w wątrobie).

iwej

Zahamowanie utleniania pirogronianu prowadzi do kwasicy mleczanowej Arsenin i jony rtęciowe, kompleksując grupę — §H kwasu liponowego, hamują dehydrogenazę pirogronianową i, tak jak niedobór tiaminy w diecie, powodują nagromadzenie się pirogronianu. NiedoŜywieni alkoholicy mają 7wykte niedobór darniny i jeŜeli poda się im glukozę, to dochodzi do szybkiego nagromadzania się

pirogronianu i kwasicy mleczanowej, często śmiertelnej. Kwasica mleczanowa, zwłaszcza po obciąŜeniu glukozą, jest jednym z objawów u osób z dziedzicznym niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej. Opisano wady genetyczne dotyczące niemal kaŜdego z enzymów metabolizujacych węglowodany; kaŜda z nich jest związana z odpowiednią chorobą u ludzi. Dziedziczny niedobór aldolazy A oraz niedobór kinazy pirogroniano wej w erytrocytach wywołuje niedokrwistość hemolityczną.

GUK0L1ZA I UTLENIANIE PiROGRONIANU / 215
Piróg ronian

B

Piróg ronlan ATP

PDH -a-(Aktywny DEFOSFOEN2YM)

PDHb (nieaktywny FOSFO ENZYM)

Insulina (w tkance tłuszczowej)
NAD ł GcA H,0

Ryc. 19-6. Regulacja dehydrogenazy piróg roni a nowej (PDH). Strzałki faliste dotyczą efektów allo-sterycznych. A — regulacja przez hamowanie produktami końcowymi, B — regulacja przez wzajemną przemianę postaci aktywnej i nieaktywnej enzymu.

Utlenienie cząsteczki glukozy dostarcza 38 mol ATP w warunkach tlenowych i tylko 2 mol ATP w nieobecności tlenu Gdy 1 cząsteczkę glukozy spali się w kalorymetrze do CO2 i wody, uwolni się ok. 2780 kJ ciepła. Gdy utlenianie zachodzi w tkankach, wówczas część tej energii nie jest rozpraszana bezpośrednio w postaci ciepła, lecz zostaje „zachowana" w postaci bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych. KaŜdej _ cząsteczce glukozy utlenionej do CO2 i wody to~warzyszy ^wytworzenie—3fr-vBSg.l-.ATP.—:Zakładając, Ŝe kaŜde wiązanie bogatoenergetyczne odpowiada

30,5 kJ, to energia magazynowana w postaci ATP, przypadająca na cząsteczkę utleniojieL glukozy, wynosi 1159 kJ, czyli stanowi ok. 41,7% całkowitej energii spalania. Większość ATP tworzy się podczas fosforylacji oksydacyjnej wwyniku reoksydacji zredukowanych koenzymów w łańcuchu oddechowym. Pozostały ATP jesMvytwarzany przez fosforvfaj|j^ substratową (p^oŜ3Ŝ~T^rr-W-ta^e^T^ :TpTzed^ stawiono reakcje warunkujące wytwarzanie bogatoenergetycznego fosforanu podczas utleniania glukozy i zysk energetyczny w warunkach tlenowych oraz beztlenowych.

216 / ROZDZIAŁ 19 Tabela 19-1. Wytwarzanie bogatoenergetycznych wiązań fosfo ran owych podczas kata boi iz mu glukozy Reakcja, którą Sposób Liczba ~ (J) Szlak katalizuje: wytwarzania tworzonych na przemian mol glukozy Giikoliza Dehydrogenaza gliceraldehydo- Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym -3-fosforanowa Kinaza fosfoglicerynianowa Fosforylacja substratowa Kinaza pirogronianowa Fosforylacja substratowa
6

2 2 10

ZuŜycie ATP w reakcjach katalizowanych przez heksokinazę i fosfofruktokinazę Zysk

-2 8

Dekarboksylacja Kompleks dehydrogenazy oksydacyjna pirogronianowej Dehydrogenaza izocytrynianowa Dehydrogenaza a-ketogiutaranowa Tiokinaza bursztyntanowa Detiydrogenaza bursztynianowa Dehydrogenaza jabłczanowa

Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w tańcuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenienie 2 FADH2 w łańcuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w łańcuchu oddechowym Zysk

6 6 6 2 4 6 30 38

Cykl kwasu cytrynowego

Ogólny bilans w warunkach tlenowych Ogólny bitans w warunkach beztlenowych

2

' Przyjęto, Ŝe NADH powstający w glikolizie przekazuje wodory do wnętrza mitochondriów przy udziale mostka jabłczanowego (p. ryc. 14-15). Przy uŜyciu mostka fosfoglicerynianowego powstałyby tylko 2 ~ © na mol NADH, stąd całkowity zysk wyniósłby 36 zamiast 38. W kalkulacji pominięto niewielką stratę + ATP (ok, 1 mol ATP) wynikającą z transportu do wnętrza mitochondriów H z pirogronianem oraz ł podobnego transportu H w działającym mostku jabłczanowym

PIŚMIENNICTWO Boitcux A, Hess B: Design of glycolysśs. Phil Trans

R Soc LonOm 3 imO93i5.
Blass JP: Disorders of pyriwate metabolism. Neurology 1979;29:280. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vols 5—9. Academic Prcss, 1972. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Mewholism and Its Disorders. 2 vols. Acadcmic Press, 1968.

Greenberg DM {editor): MetaboHc Patkways, 3rd ed, Vol. 1. Academic Press, 1967. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Scriver CR (editor); MetaboHc Basis of Inherited Disease. McGraw HjU, óth ed. 1989. Sols A: Multimodulation of enzymeactivity. Curr Top Celt Reg 1981;19:77. Veneziale CM (editor): The Regulatwn ofCarbohydrate Formation and Utiiizaiion in Mammals. University Park Press, 1981.

Metabolizm glikogenu
Peter A. Mayes, PhD, DSc

20

WPROWADZENIE Glikogen jest główną formą magazynowania węglowodanów u zwierząt i jest odpowiednikiem skrobi u roślin. Występuje głównie w wątrobie (do 6%) i w mięśniach, gdzie rzadko przekracza 1%. Jednak mięśnie, z powodu duŜej masy, zawierają 3—4-krotnie większy zapas glikogenu niŜ wątroba (tab. 20-1). Glikogen, podobnie jak skrobia, jest rozgałęzionym polimerem ot-glukozy (p. ryc. 15-15).
Tabela 20-1. Magazynowanie węglowodanów u przeciętnego dorosłego człowieka (70 kg) w stanie postabsorpcyjnym Glikogen wątroby Glikogen 4,0% = 72 g' 0,7% = 245 g* mięśni Glukoza 0,1% = 10 g" pozakomórkowa

kogenu i odkładaniem nieprawidłowych postaci glikogenu, co prowadzi do osłabienia mięśni, a nawet zgonu. GLIKOGEN WYSTĘPUJE GŁÓWNIE W MIĘŚNIACH I W WĄTROBIE W szlaku biosyntezy glikogenu bierze udział specjalny aktywny nukleotyd glukozy (p. ryc. 20-1) ' Glukoza jest fosibrylowana do glukozo-6-fosforanu w reakcji, która jest równieŜ pierwszą reakcją szlaku glikolizy z glukozy. Ta reakcja jest katalizowana przez beksokinazę w mięśniu i przez glukakinaze w wątrobie. Glukozo-6-fosforan jest zmieniany w glukozo-1-fosforan w reakcji katalizowanej prze2 fosfoglukomutazę. Sam enzym jest fosforylowany w przebiegu reakcji, a grupa fosforanowa bierze udział w reakcji odwracalnej, w której związkiem pośrednim jest glukozo-l,6-bisfosforan.
Enz-P + Glukozo-6 fosforan <-t ♦* Enz + Glukozo-1,6-bisfosforan «■» *+ Enz-P + Glukozo-1-fosforan Następnie glukozo-1-fosforan reaguje z ury.dynotriibsforanem (UTP), aby utworzyć urydyaodifosfoglukozę (UDPGic)* {ryc. 20-2).

327 g
Masa wątroby 1800 g Masa mięśni 35 kg Całkowita objętość 10 I

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glikogen mięśni jest łatwo dostępnym źródłem jednostek heksozowych do glikolizy w samym mięśniu. Glikogen wątroby głównie magazynuje i eksportuje jednostki heksozowe w celu utrzymania fizjologicznego stęŜenia glukozy we krwi, zwłaszcza między posiłkami. Po 12—18 h głodzenia wątroba staje się niemal zupełnie pozbawiona glikogenu, podczas gdy glikogenu w mięśniach znacznie ubywa tylko po długotrwałym intensywnym wysiłku. Choroby spichrzania glikogenu są to dziedziczne zaburzenia, charakteryzujące się wadliwą mobilizacją gli-

* Są równieŜ znane i inne związki będące nukleozydodifosfopochodnymi cukrów, up. UDPGal. Ponadto ten sam cukier moŜe być połączony z róŜnymi nukleotydami, np. glukoza moŜe być przyłączona do urydyny Gak to pokazano powyŜej), aie takŜe do nukleotyd u guanozy nowego, tymidy nowego, adenozyno w ego lub cytydynowego.

218 / ROZDZIAŁ 20
(jednostki Gllkogen (jednostki glukozylowe 1 -*i i 1 -*6)

SYNTAZA Enzym rozgałęziający GUKOGENOWA Insulina

I
glukozylowe 1-UDP . Prlmer ^ gllkogenu ATP U rydyno d ifosf ag I u ko za (UDPGIc) KINAZA K

Q

_cAMP ------- ~—*Ą
Glukagon Adrenalina

ł


©
FOSFORYLAZA TRANSFERAZA G L ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY L J KANOWA Wolna glukoza z enzymu odgałęziającego Do gltkollzy I szlaku pentozofosforan ADP oweg o MgI+ USLUKOKINAZA

GI u k oz o-1 ATP FOSFOGL UKOMUTA GI u kozo6-łostoran H,0 GLUKOZO-6-FOSFATAZA

NUKLEOZYDODH * -

FOSFORANOWA

ADP

14
Glukoza

Ryc. 20-1. Szlak glikogenogenezy i glikogenolizy w wątrobie. 2 bogatoenergetyczne fosiorany są zuŜywane przy wbudowaniu 1 mola glukozy w glikogen. © — pobudzenie, © — hamowanie. Insulina zmniejsza stęŜenie cAMP jedynie wówczas, gdy było ono uprzednio zwiększone działaniem glukagonu lub adrenaliny, tzn. jest antagonistą ich działania. Glukagon działa na mięsień sercowy, ale nie na mięśnie szkieletowe. "Transferaza glukanowa i enzym odgałęziający wydają się być 2, oddzielnymi aktywnościami tego samego enzymu.

.CHjOH

H/ł—OH IY3H HZ II II HO^rfO-P-O— P-O-CH
T^^ I H OH O" i O"

Reakcja pomiędzy glukozo-1-fosforanem i urydynotrifosforanem jest katalizowana przez Uracyl enzym pirofosforylazę UDFGlc.
UTP + Glukozo-1-fosforan « UDPGIc + PP.

Następująca potem hydroliza nieorganicznego pirofosforanu pod wpływem nieorganicznej Ryboza pirofosfatazy przesuwa reakcję na prawą stronę równania.
Ryc. 20-2. Urydynodifosfoglukoza {UDPGIc).
T

Glukoza Dlfosforan Urydyna

METABOLIZM GLIKOGENU / 219

Działaniem enzymu syntazy glikogenowej, C, aktywnej, glukozy UDPGlc tworzy wiązanie glikozydowe z C4 końcowej reszty glukozowej glikogenu, uwalniając urydyn od i fosforan (UDP). Aby zainicjować tę reakcję, musi być obecna istniejąca juŜ wcześniej cząsteczka glikogenu, czyli primer. Sam primer (wymawiaj prajmer) glikogenu moŜe być utworzony na szkielecie białkowym, co moŜe być procesem podobnym do syntezy innych glikoprotein (p. rozdz. 57).
UDPGlc + (C6)„ -* UDP + (C6)n+1 Glikogen Glikogen

w cząsteczce całkowita liczba miejsc zdolnych do reagowania, przyspieszając zarówno glikogenogenezę, jak i glikogenolizę. Działanie enzymu rozgałęziającego badano na Ŝywym organizmie zwierzęcym, podając glukozę znakowaną i4C, a następnie badając glikogen wątroby w odpowiednich odstępach czasu (ryc, 20-3).

GLIKOGENOLIZA NIE JEST ODWRÓCENIEM GLIKOGENOGENEZY, LECZ JEST ODRĘBNYM SZLAKIEM REAKCJI W szlaku degradacji jest zawarty mechanizm odgałęziania (p. ryc. 20-1) Etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy jest reakcja katalizowana przez fosforytazę.
(Ce ) n + Pj -* (Ce ) n-, + Glukozo-1-fosforan Glikogen Glikogen

Częścią mechanizmu rozgałęziania jest odłączenie istniejących juŜ łańcuchów glikogenu Dodawanie reszty glukozy do istniejącego juŜ łańcucha glikogenowego, czyli primera, nastęP.ujej!3._ nieredukującym zewnętrznym końcu cząsteczki tak, Ŝe „gałęzie" „drzewa" glikogenu wydłuŜają sie wraz z sukcesywnym po wsta waniem wiązań I ->4 fryc. 20-3), Gdy łańcuch zostanie przedłuŜony do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas inny enzym, enzym rozgałęziający (amylo [l-+4i->[l->6]-łransglukozydaza) przenosi część łańcucha I ->4 (długości co najmniej 6 reszt glukozowych) na sąsiedni łańcuch, tworząc wiązanie l-*-6 i ustanawiając w ten sposób punkt rozgałęzienia w cząsteczce. Rozgałęzienia wzrastają poprzez dalsze dodawanie jednostek l-»4 glukozylowych i dalsze rozgałęzienia. Wraz ze zwiększeniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się

Ten enzym jest swoisty dla fosfor o litycznego rozkładu (fosforolizy) wiązań od-+4 w glikogenie z wytworzeniem glukozo-1-fosforanu. Z najbardziej zewnętrznych łańcuchów cząsteczki glikogenu są usuwane reszty glukozylowe, aŜ do pozostania ok. 4 reszt glukozy po kaŜdej stroaie rozgałęzienia l-*6 (ryc. 20-4). Inny enzym (a-[l->4]->a-[l -*4]-transferaza glukanowa) przenosi jednostkę trisacharydową z jednego rozgałęzienia na inne, odsłaniając punkty rozgałęzienia 1-+6. Hydroli ty czne rozbicie wiązań l->6 wymaga działania swoistego enzymu

o_o Wiązanie giukazydowe 1 -»4 o Reszty glukozy nie znakowane Oło Wiązania glukozydowe 1-*6 • Fteszty glukozy znakowane WC

Ryc. 20-3. Biosynteza glikogenu. Mechanizm rozgałęziania został wyjaśniony przez dodawanie gfukozy znakowanej 14C.

220 / ROZDZIAŁ 20
FOSFORYLAZA TRANSFEHAZ A GLUKANOWA

ENZYM ODGAŁĘZIAJĄCY

Q_Q r

ł Reszty glukozy połączone wiązaniami (jtukozydowyml Reszty glukozy połączone
wiązaniami glukozydawyml 1 -»6

Wiele kowalencyjnych modyfikacji jest spowodowanych działaniem cAMP (3', 5'-cykliczny kwas adenylowy; cykliczny AMP) (p. ryc. 20-5 i str. 594). cAMP jest wewnątrzkomórkowym pośrednikiem" albo drugim posłańcem, przez który działa wiele hormonów. Tworzy się on z ATP pod wpływem enzymu cyklazy adenylanowej, występującej na wewnętrznej powierzchni błony komórkowej. Cyklaza adenylanowa jest aktywowana takimi hormonami, jak adrenalina i noradrenalina, działającymi przez receptory P-ad ren ergi czne w błonie komórkowej, a ponadto w wątrobie glukagonem działającym przez niezaleŜny receptor glukagonu. Fosfodiesteraza rozkłada cAMP i to właśnie aktywność tego enzymu utrzymuje normalnie małe stęŜenie cAMP. Wykazywano, Ŝe insulina zwiększa aktywność tego enzymu w wątrobie, zmniejszając w ten sposób stęŜenie cAMP.
NH,

Ryc. 20-4. Etapy glikogenolizy.

odgałęziającego (amy)o-[1 -►ńj-glukozydazy). Po usunięciu rozgałęzienia moŜe postępować dalsze działanie fosforylazy. Wspólne działanie fosforylazy i wspomnianych innych enzymów prowadzi do całkowitego rozkładu glikogenu. Reakcja katalizowana przez fosfoglukomutazę jest odwracalna, wobec czego z glukozo-1-fosforanu moŜe być wytwarzany glukozo-6-fosforau, W wątrobie i w Derce (ale nie w mięśniach) "cTIzym' glukozo-6-fosfataza, który usuwa fosforan z glukozo-6-fosforanu, umoŜliwiając powstającej gJukozie dyfundowanic z komórki do krwi. Jest to końcowy etap glikogenolizy wątrobowej, która odzwierciedla się zwiększeniem stęŜenia glukozy we krwi. CYKLICZNY AMP INTEGRUJE REGULACJĘ GLIKOGENOLIZY I GLIKOGENOGENEZY Główne enzymy kontrolujące metabolizm glikogenu, tj. fosforylaza glikogenowa i syntaza glikogenowa, są regulowane przez złoŜoną serię reakcji, wśród których są zarówno mechanizmy allosteryczne (p. str. 123) jak i modyfikacje kowalencyjne, polegające na odwracalnej fosforylacji i defosforylacji enzymatycznego białka (p. str. 127).

" W
■CHj

I

II

;H

-O-P»O

/S \ \H H/
■■■■
J ^>.

■ i ■— n

rtu

OH

Ryc. 20-5. Kwas3',5'-adenylowy (cykliczny AMP, cAMP). ____________ _________________

Fosforylaza wątroby róŜni się od fosforylazy mięsni

W wątrobig fosforylaza istnieje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Aktywna fosforylaza (fosforytaza a) ma jedną z grup hydroksylowych seryny ufosforylowaną przez wytworzone wiązanie estrowe. Działaniem swoistej fosfatazy (fbsfataza-1 białek), enzym ten zostaje unieczynniony, przez przekształcenie go w fosforylazę b, w reakcji polegającej na hydrolitycznym usunięciu fosforanu z reszty seryny. Reaktywacja wymaga refosforylacji z udziałem ATP i swoistego enzymu kinazy fosforylazy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 221

Mięśniowa fosforylaza jest immunologicznie i genetycznie odmienna od wątrobowej. Jest dimerem, a kaŜdy monomer zawiera 1 mol fosforanu pirydoksalu. Występuje w..2 postaciach, jako fostoryla/a a, która jest ufosforylowana i aktywna zarówno w obecności, jak 1 nieobecności AMP (jej allosterycznego mody fikatora), oraz fosforylaza b, która jest zdefosforylowana i aktywna jedynie w obecności AMP, co ma miejsce w czasie wysiłku, kiedy stęŜenie AMP się zwiększa. Fosforylaza a jest normalną fizjologicznie aktywną formą enzy mu. Aktywacja mięśniowej fosforylazy odbywa się z udziałem cAMP Fosforylaza w mięśniu jest aktywowana przez adrenalinę (ryc. 20-6)! JednakŜe nie jest to .działanie bezpośrednie, lecz przez eAMP. Zwiększenie stęŜenia cAMP aktywuje cAMP-zaleŜną kinazę białek, enzym o raczej szerokiej swoistości. Ta kinaza katalizuje fosforylację, z udziałem ATP, nieaktywnej kinazy b fosforylazy do aktywnej kinazy a fosforylazy, która z koJei przez kolejną fosforylacje aktywuje fosforyiazę b do fosfory Jazy a. Nieaktywna cAMP-zaleŜna kinaza białek ma 2 pary podjednostek. kaŜda para składa się z podjednostki regulacyjnej (R), która wiąŜe 2 mol cAMP, oraz podjednostki katalitycz nej (C), która ma miejsce aktywne. Połącze nie z cAMP powoduje dysocjację komplek su R 2 C 2 , uwalniając aktywne monomery C (p. str. 596). B,Ca + 4cAMP »2C + 2{R~cAMPt) Nieaktywny Aktywny enzym enzym Ca synchronizuje aktywację fosforylazy ze skurczem mięśnia Glikogenoiiza wjnigśniu^ zwiększa się kilkasetkrotnie bezpośrednio po rozpoczęciu skurczu mięśnia. Przyczynia się do tego szybka aktywacja kinazy fosforylazy przez CaJ~., ten sam sygnał, który inicjuje skurcz. Mięśniowa kinaza fosforylazy ma 4 typy podjednostek: ot, (J, y i 5, w strukturze, którą moŜna, przedstawić jako (apy§)4. Podjednostki a i p mają reszty seryny, które są fosforylowane wskutek działania cAMP-zaleŜnej kinazy białek. Podjednostka p wiąŜe 4 Ca2+ i jest identyczna z białkiem wiąŜącym Ca2+ — kalmoduliną (p. str. 595). Związanie Ca2ł aktywuje katalityczne miejsce
2

podjednostki y jedynie wówczas, gdy cząsteczka znajduje się w zdefo'sforylowanej konfiguracji b. JednakŜe ufosforylowana postać a jest w pełni aktywna w obecności Ca2 + . Jest waŜne, źe kalmoduiina jest podobna w swojej strukturze do TpC, białka wiąŜącego Ca2+ w mięśniach. Dodatkowa cząsteczka kalmoduliny lub TpC moŜe oddziaływać z kinaza fosforylazy, powodując dalszą aktywację. Aktywacja skurczu mięśnia i glikogenolizy jest więc dokonywana przez to samo białko wiąŜące Ca2+, zapewniając w ten sposób synchronizację tych procesów. Glikogenoiiza w wątrobie moŜe być niezaleŜna od cAMP Pomimo, Ŝe głównym działaniem glukagonu w wątrobie jest powodowanie powstawania cAMP i aktywacja fosforylazy, badania wykazały, Ŝe receptory a, są głównymi pośrednikami pobudzenia glikogenolizy przez aminy katecholowe. Bierze w tym udział niezaleŜna od cAMP mobilizacja Ca3+ z mitochondriów do cytozolu, w następstwie czego następuje pobudzenie wraŜliwej na CV + kalniotfullnę kinazy fostorylary. NiezaleŜną od cAMP glikogenolizę wywołują równieŜ wazopresyna, oksytocyna i angiotensyna II, działające przez wapń albo przez fosfatydyloinozytolobisfosforan, Inaktywacja fosforylazy następuje pod wpływem fosfatazy-1 białek Zarówno fosforylaza a, jak i kinaza a fosforylazy są defosforylowane i inaktywowane przez fosfatazę-1 białek. Fosfataza-ł białek jest hamowana przez białko zwane inhibitorem-1 które jest aktywne jedynie wówczas, gdy zostanie ufosforylowane działaniem cAMP-zaleŜnej kinazy białek, W ten sposób cAMP kontroluje zarówno aktywację, jak i inaktywację fosforylazy (ryc. 20-6). Aktywność syntazy glikogenowej i fosforyłazy są regulowane wspólnie (p. ryc. 20-7) Podobnie jak fosforylaza, syntaza glikogenowa występuje w stanie ufosforylowanym i nie ufosforylowanym. JednakŜe, odmiennie niŜ w przypadku fosforylazy, aktywną formą jest zdefosforylowany enzym (syntaza a glikogenowa), który moŜe być zinaktywowany do syntazy b glikogenowej przez fosforylacje 7 reszt seryny wskutek działania co najmniej 6 róŜnych kinaz białek. Wszystkie 7 miejsc fosforylacji znajduje się na kaŜdej z 4 identycznych podjednostek

Ryc. ZO-6. Kontrola fosforylazy w mięśniu (n = liczba reszt glukozy). Ciąg reakcji ułoŜonych jako kaskada pozwala na zwielokrotnienie (wzmocnienie) sygnału hormonal nego na kaŜdym etapie, _________
Adrenalina /t-recepior

B
73

O N

©
Nieaktywna cyklazaadenylanowa Aktywna cyklaza adenytanowa G!lkogen|rg

+
|F05FOOIESTERAZA I ATP Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA ODcAMP cAMP ----------------------------------------------*■ 5'-AMP G!lkogen(B+11

Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OOeAMP FOSFOHYLAZA a (aktywna) KALMODULINOWY SKŁADNIK KINAZY FOSFORYLAZY

lnhlbttor-1 (nieaktywny)

ATP-

KINAZA b FOSFORYLAZY (nieaktywna)

KINAZA a FOSFORYLAZY (aktywna)

FOSFATAZA-1 BIAŁEK

ADP
FOSFATAZA-1 BIAŁEK lnhlbltor-1 ufoeforylowany (aktywny)

FOSFORYLAZA b (nieaktywna)

Glukozo-1 -fosforan

METABOLIZM GLIKOGENU / 223 Adrenalina
/(-receptor Nieaktywna eyklaza ---------adenylanowa Aktywna eyklaza adenylanowa

O
F05F0DIESTERAZA ATP ATP cAMP SYNTAZA b GLIKOGENOWA (nieaktywna) •- 5' A MP SYNTAZAa GLIKOGENOWA (aktywna) KINAZA FOSFATAZA FOSFORYLAZY BIAŁEK

0

Ca

J

Nieaktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNAkozo-6-fosforan Glu OD CAMP lnhlbltor-1 nieaktywny)

Aktywna KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OD cAMP

Gllkogenln] + UDPG

KINAZA BIAŁEK ZALEśNA OD KALMODULINY ADP

FOSFATAZA-1 BIAŁEK

lnhlbltor-1 u fosfory Iow any (aktywny)

Ryc. 20-7. Kontrola syntazy glikogenowej w mięśniu (n = liczba reszt glukozy). Ciąg reakcji ułoŜony w kaskadę powoduje wzmocnienie na kaŜdym etapie, pozwalając na to, Ŝe zaledwie nanomolowe ilości hormonu powodują znaczne zmiany stęŜenia glikogenu, GSK — kinaza -3, -4 i -5 syntazy glikogenowej, węŜykowate strzałki — aktywacja allosteryczna.

enzymu. Dwie spośród wspomnianych kinaz białek są zaleŜne od Ca2 + ,/kalmoduliny (jedna z nich to kinaza fosforyiazy). Inna z kinaz to cAMP-zaleŜna kinaza białek, która pozwala na
to, aby działanie hormonalne wywierane za pośrednictwem cAMP powodowało hamowanie syntezy glikogenu, zsynchronizowane z aktywa-

cją glikogenolizy. Pozostałe kinazy są znane jako kinaza-3, kinaza-4 i kinaza-5 syntazy glikogenowej. Glu kozo - 6-fo sfora n jest allosterycznym aktywatorem syntazy b glikogenowej, powodującym zmniejszenie Km dla UDP-glukozy i pozwalającym na syntezę glikogenu pod wpływem u fos fory Iow a nego enzymu. Glikogen wywiera

takŜe hamujące działanie na tworzenie siebie samego, a insulina takŜe pobudza wytwarzanie glikogenu w mięśniu przez sprzyjanie defosforylacji i wobec tego aktywacji syntazy b glikogenowej. Defosforylacja syntazy b glikogenowej zwykle odbywa się podczas działania fosfatazy-1 białek, która pozostaje pod kontrolą cAMP-zaleŜnej kinazy białek (ryc. 20-7).

224 / ROZDZIAŁ 20

REGULACJA METABOLIZMU GLfKOGENU JEST EFEKTYWNA DZIĘKI RÓWNOWADZE MIĘDZY AKTYWNOŚCIAMI SYNTAZY GLfKOGENOWEJ I FOSFORYLAZY (p. ryc. 20-8)
Syntaza glikogenowa i fosforyiaza są zarówno pod kontrolą substratów (przez allosterię), jak i pod kontrolą hormonalną. Nie tylko fosforylaza jest aktywowana przez zwiększenie stęŜenia cAMP (przez kinazę fosforyiazy), ale w tym samym czasie syntaza glikogenowa jest zamieniana w postać nieaktywną; obydwa skutki osiąga się za pośrednictwem cAMP-zaFOSFODIESfTERAZA

leŜnej kinazy białek. Wobec tego zahamowanie glikogenolizy wzmaga efektywną glikogenogeneze, natomiast zahamowanie glikogenogenezy zwiększa netto glikogenolizę. Istotne dla regulacji metabolizmu glikogenu jest stwierdzenie, Ŝe defosforylacja fosfory]azy a, kinazy fosforyiazy i syntazy b glikogenowej dokonuje się wskutek działania 1 enzymu o szerokiej swoistości — fosfatazy-1 białek. Z kolei fosfataza-1 biatek jest hamowana przez cAMP-zaleŜną kinazę białek poprzez inhibitor-1 (ryc, 20-8). Wobec tego synchronicznie moŜe zostać przerwana glikogenoliza, a wzmoŜona glikogenogeneza i odwrotnie, poniewaŜ kluczem do regulacji obydwóch tych procesów jest aktywność cAMP-zaleŜnej

Adrenalina (wątroba.

■*» cAMP

-*- 5-AMP

lnhlbllor-1

KINAZABWLEK ZALEśNA OD OAMP

Glukoza (wątroba)

Inhibitor 1
ufosiorylowany

Byc. 20-8. Skoordynowana kontrola glikogenotizy i glikogenogenezy przez kinazy biatek zaleŜne od cAMP. Reakcje, które prowadzą do gtikogenolizy, w rezultacie zwiększenia stęŜenia cAMP/zaznaczono grubymi strzałkami, a te, które są hamowane, zaznaczono przerywanymi strzałkami. Dzieje się odwrotnie, gdy stęŜenie cAMP zmniejsza się w wyniku aktywności f osf od testera zy, co prowadzi do glikogenogenezy.

METABOLIZM GLIKOGENU / 225

kinazy białek. Zarówno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenu mogą być odwracalnie fosforyiowane w więcej niŜ 1 miejscu przez odrębne kinazy i fosfatazy. Te wtórne fosforylacje modyfikuj;} wraŜliwość pierwotnych miejsc fosforylacji na fosforylację i defosforylaeję. Jest to znane jako wielomiejscowa fosfory lacja, Głównym czynnikiem, który kontroluje metabolizm glikogenu w wątrobie, jest stęŜenie fosforyłazy a Ten enzym jest nie tylko etapem ograniczającym szybkość glikogenolizy, lecz takŜe jest inhibitorem aktywności fosfatazy-1 białek, przez co kontroluje syntezę glikogenu (ryc. 20-8). Inaktywacja fosforylazy zachodzi jako wynik all o sferycznego hamowania przez glukozę wówczas, gdy jej stęŜenie zwiększa się po posiłku. Aktywacja jest powodowana pr2ez 5'AMP jako reakcja na wyczerpanie się ATP. Podanie insuliny powoduje niezwłoczną inaktywację fosforylazy z następującą aktywacją syntazyglikogenowej. Do osiągnięcia tych działań insuliny niezbędna jest obecność glukozy. Enzymy rozgałęziający i odgałęziający nie są regulowane. CHOROBY SPICHRZANIA GLIKOGENU SĄ DZIEDZICZNE Termin „choroba spichrzania glikogenu" jest ogólną nazwą uŜywaną do opisania grupy zaburzeń dziedzicznych, charakteryzujących się odkładaniem nieprawidłowego rodzaju lub nieprawidłowych ilości glikogenu w tkankach. W typie 1 glikogenozy (choroba von Cierkego) zarówno kpjnórkj wątroby, jak i komórki kanalików krętych nerki są^ w charakterystyczny sposób przeładowane glikogenem. JednakŜe te magazyny glikogenu me są dostępne, co uwidacznia się występowaniem hjgoglikemii i brakiem uwalniania glukozy pod wpływem takich bodźców, jak adrenalina lub glukagon. U chorych tych obserwuje się takŜe ketozę i hiperlip.emiL.co jest charakterystyczne~aTa"Ófgai)izmu pozbawionego węglowodanów. W wątrobie, nerce i w ścianie jelit aktywność glukozo-6-fosfatazy jest skrajnie mała lub w ogóle jej nie ma. Typ II (choroba Pompego) jest zgubny i charakteryzuje się niedoborem lizosomalncj a-l-»4i l-*6-glukozydazy {kwaśnej maltazy), której
15 — Biochemia

funkcją jest degradowanie glikogenu nagromadzającego się w Uziomach. Typ 11.1 (graniczna dekstrynoza; choroba Forbesa albo Coriega) charakteryzuje się brakiem enzymu odgałęziającego, co powoduje nagromadzanie charakterystycznego rozgałęzionego polisacharydu. Tj_pJV (amylopektynoza: choroba Andersena) wynika z nieobecności enzymu rozgałęzi ającego^czego rezultatem jest to, Ŝe gromadzi się polisacharyd mający niewiele punktów rozgałęzienia. Zgon następuje zwykle w pierwszym roku Ŝycia z powodu niedomogi serca lub wątroby. Brak mięśniowej fosforylazy (miofosforylazy) jest przyczyną glikogenozy typu V (glikogenoza z niedoboru miofosforylazy; zespół McArdle'a). Chorzy wykazują zwykle znacznie zmniejszoną tolerancję na wysiłek. ChociaŜ ich mięśnie szkieletowe wykazują nienormalnie duŜą zawartość glikogenu (2,5—4,1%), w krwi tych chorych po wysiłku wykrywa się tylko w niewielkim stęŜeniu mleczan lub teŜ całkowicie go brak. Wśród chorób spichrzenia glikogenu opisano takŜe niedobór fosforyiazy w wątrobie (typ VI; choroba Hersa), niedobór fosfofruktokinazy w mięśniach i w erytrocytach (typ VII; choroba TaruPego) oraz glikogenozę, w której występuje niedobór wątrobowej kinazy fosforylazy (typ VIII). Donoszono równieŜ o niedoborach kinazy adenylanowej i cAMP-zaleŜnej kinazy białek.

PIŚMIENNICTWO
Cohen P: Conirol ofEnzyme Acthity, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Cohen P: Thc role of protein phoaphorylation in the hormonal control of enzyme activity. Eur J Biochem 1985; 151:439. Exton JH: Molecular mechanisms involved in a-adrenergic responses. Mol Cel! Endocrinoi 1981; 23:233. Geddes R: Glycogcn: A metabolic viewpoint. Bioscience Rep 1986;6:415. Hers HO: The control of glycogen metabolism in the liver. Annu Rev Biochem 1976;45:167. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, !98i. Siriver CR et al (editor): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. McGraw-Hill, 1989. Sperlmg t), de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. Karger, 1978.

21
WPROWADZENIE

Glukoneogeneza i kontrola stęŜenia glukozy we krwi
Peter A. Mayes, PhD, DSc

W procesie glukoneogenezy_ uczestniczą wszystkie "mechanizmy ~i s~zlaki odpowiedzialne za przekształcenie związków nie węglowo danowych.w glukozę lub glikogen,_Gtówny_mi_s_ubstratami dla glukoneogeMeŜy są glikogenne aninokwasy, mleczan, glicerolj (istotny u przeŜuwaczy) propionian. Głównymi tkankami. w których odbywJTśię ten proces, są wątroba ingJŁjgdyŜ one właśnie zawierają pełen zestaw niezbędnych do tego enzymów. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glukoneogeneza zaspokaja zapotrzebowanie organizmu na glukozę wówczas, gdy. węglowodany nie są dostępne w wystarczającej ilości z dostarczanych pokarmów. Ciągłe dostarczanie glukozy jest niezbędne jako źródło energii, zwłaszcza dla układu nerwowego i dla erytrocytów. PoniŜej pewnego krytycznego stęŜenia glukozy we krwi występuje zaburzenie czynności mózgu, które w warunkach cięŜkiej hipoglikemii moŜe prowadzić do śpiączki i zgonu. Glukoza jest takŜe potrzebna w tkance tłuszczowej jako źródło glicerolu glicerydów i prawdopodobnie odgrywa rolę w utrzymaniu odpowiedniego stęŜenia związków pośrednich cyklu cytrynianowego w wielu tkankach. Wiadomo, Ŝe nawet w warunkach, w których tłuszcze mogą pokrywać większość zapotrzebowania energetycznego organizmu, zawsze istnieje pewne podstawowe zapotrzebowanie na glukozę. W dodatku glukoza jest jedynym źródlem.snergii dla mięśnia szkieletowego w warunkach beztlenowych. Jest_ prekursorem cukru mleka_

( ą X i y X ^ J l ^ J ^ ę i pobierana przez płód. EodfiS!^ glukoneogenezy są takŜe usuwane z krwi produkty metabolizmu innych tkanek, np. mleczan wytwarzany przez mięśnie i erytrocyty oraz glkerol, który jest stale wytwarzany przez tkankę tłuszczową. Propionian. główny glikogenny kwas tłuszczowy, wytwarzany podczas trawienia węglowodanów przez przeŜuwacze, jest najwaŜniejszym, substratem glukoneogenezy u tych gatunków. GLUKONEOGENEZA OBEJMUJE REAKCJE GLIKOLIZY, CYKLU CYTRYNIANOWEGO ORAZ NIEKTÓRE REAKCJE SPECJALNE (p. ryc. 21-1) Bariery termodynamiczne zapobiegają prostemu odwróceniu glikolizy Krebs zwracał uwagę na to, Ŝe bariery energetyczne nie pozwalają na proste odwrócenie glikolizy: 1) pomiędzy pirogronianiem a fosfoenolopirogronianem, 2) pomiędzy fruktozo-1,6-bisfosforanem a fruktozo-6-fosforanem. 3} pomiędzy glukozo-6-fosforanem a glukozą: oraz 4) pomiędzy glukozo-1-fosforanem a glikogenem. Wszystkie te reakcje nie są w stanie równowagi, uwalnla}ą~cl:uŜą ilość energii w postaci ciepła i wobec tego są fizjologicznie nieodwracalne. Są one omijane poprzez specjalne reakcje.

Pirogronian i fosfoenolopirogronian.
W mitochondriach znajduje się enzym karboksylaza pirogronianowa, który w obecności ATP, jednej z witamin B — biotyny. — oiaz^COi,. przekształca pirogronian w szczawiooctan. Funkcją biotyny jest związanie CO3 na enzymie

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 227

przed przyłączeniem go_do pirogronianu. Drugi :iuj m karLoi^^4ft»z»fo^enolopirogroriiano wa, katalizuje przekształcenkjzczawiogctan.u. do rosibepolopirogroiuanu. W tej reakcji jest niezbedjLy.bogato-energetyczny fosforan w postaci GTP lub-ITP. a uwalnia.si? GO.. Wobec tego, za pomocą tvch 2 enzymów i dehydrogenazy mleczanowej, mliyTan moŜt- hyć ^ ^ p goięrjia^kury i królika W-wa karboksykinaza fosfoeri ol ii)ii rtwwMua.no.wa jest enzymem mi loch ond Halnym i fosfoenolopirogronian jest transportowany do cytozolu w celu przekształcenia go w fruktozo- 1,6-bisfosforan przez odwrócenie glikolizy. U szczura i u myszy len cnzvm jest w cvlo7ohi. a 1 e.. szcza wi noc ran nie dyCuadiĄ]e]a^twQ.iLJJiaQdig.ndriów, Dostępne są natomiast alternatywne środki do osiągnięcia tego samego skutku końcowego; polegają one na przekształceniu szcza wio octan u w związki, które mogą łatwo dyfundować z mitochondriów, i późniejszej rekonwersji do szczawiooctanu w pozamitochondrialnej części komórki. Takim związkiem jest jabłezan, którego tworzenie ze szczawiooctanu w mi loch on dri ach i rekonwersja do szczawiooctanu w pozamitochondrialnym kompartmencie przebiega z udziałem dehydrogenazy jabłezanowej. W_w^trobje_człoi i i i k ^ morskiejj_wołu_teiL enzym jest chojidrjaroi -i Qtazolem. Fruktozo-6-fosforan i fruktozo-1,6-bisfosforan. P£zekszUiceni£_iruklozo-l,ć-bisfosibraiiu ..do. fruktozo-ń-fosforanu konieczrie_ dq_osiagnięcia odwrócenia ^likolizy^ jest katalizowane przez swoisty enzym fruktozJir.lU6-bisfosfąt^S. Jest to kluczowy enzym takŜe z innego punktu widzenia, poniewaŜ jego obecność warunkuje _.to, czy dana tkanka jest /dolna do biosyntezy glikogenu nie tylko z pirogromanu, lecz takŜe z fosfotrioz. Enzym len \vy stępuje, w. wątrobie i w iiertctch, wykazano jego występowanie takŜe w mięśniu szkieletowy ni. U w;iŜa się, ze nie występuje on w mięśniu .serc.uw^KLLW mięśniu"gładkim. Glukozo-6-fosforan i glukoza. jYz_e r k_sztaicenie—gJukjOZOj^fosforanu _w__jgl_ukozę jest _ katalizowane przez inna .aiwrintTi fncfalsizę glukozo-6-fosfatazc. Występuje ona hi i \« nerkąf h ale nie ma jej w mięśniu i w tkance tłuszczowej. Obecność jej podwala tkance na_oddawaiiie„glukQzy do krwi.
Glukozo-1 -fosforan i glikogen. Roz-

talizowany przez fosforylaze. Biosynteza glikogenu odbywa się całkiem odmiennym szlaJdem, przez utworzenie urydynodifosfoglukozy i z udziałem syntazy glikogenowej (p. ryc: 20-1). Te kluczowe enzymy pozwalają na to, Ŝe odwrócenie glikolizy odgrywa zasadniczy rolę w glukoneogenezie. ZaleŜności między gluko..neagenezą a flakiem glik o litycznym przedstawiono na ryc. 21-1. Aminokwasy glikogenne po transaminacji lub dcaminacji tworzą albo pirogronian. albo stają się członami cyklu kwasu cytrynowego. Wobec tego powyŜej opisane reakcje są odpowiedzialne za przekształcenie w glukozę lub glikogen zarówno aminokwasów glikogennych, jak i mleczanu. Wiadomo, Ŝe mle-_ cjąn przekształca się w pirogronian i wnika do mitochondriów przed przekształceniem do szczawiooctanu i ewentualnym przekształceniem w glukozę. Propitmian jest głównym źródłem glukozy u przeŜuwaczy i wchodzi do głównego szlaku glukoneogenezy przez cykl kwasu cytrynowego po przekształceniu w sukcynylo-CoA. _Pxapio-niań jest najpierw aktywowany z udziałem ATP i CoA przez odpowiednią syntetazę acylo-CoA. Propionylo-CoA, produkt tej reakcji, uczestniczy w reakcji wiązania -CQ^ katalizowanej przez karboksylazę propionylo-CoA, czego wynikiem jest wytworzenie D^jnelyljQnia=..... lonyb-CoA (ryc. 21-2). Ta reakcja jest analogiczna do reakcji wiązania CO2 do acetylo-CoA przez karboksylazę acetylo-CoA (p. rozdz. 23), w której powstaje pochodna malonylowa, co wymaga udziału jednej z witamin — biotyn^ — jako koenzymu. D-Metylomalonylo-CoA musi być zamieniony w jego stereoizomer L-metylomalonylo-CoA przez racemaze mety-lomalonylo-CoA, zanim nastąpi ostateczna izomeryzacja do sukcynylo-CoA. katalizowana przez izomerazę metylomalonylo-Co A, wymagającą witaminy B12 jako koenzymu. Wynikiem niedoboru witaminy B12 u ludzi i zwierząt jest wydalanie duŜych ilości metylomalonianu (acy-duria metylomalonowa). ChociaŜ przemiana do bursztynianu jest głównym szlakiem metabolicznym propionianu, to jednak moŜe on zapoczątkowywać, w tkance tłuszczowej i gruczole sutkowym, wytwarzanie kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla. Kwasy tłuszczowe C, 5 i C 17 znajdują się w tłuszczach, zwłaszcza u przeŜuwaczy. Glicerol jest produktem metabolizmu tkanki tłuszczowej i tylko te tkanki, które mają enzym

228 / ROZDZIAŁ 21
Glukoza
oiu i««oo- ^ s ^_ j
Aop

J!gLUKOZt>6-f OSFATAZA |j H2O

ATP JGLUKOKINAZAl | HEKSOKIKAZA]

-fosforan

J?

t
Glikogen AMP FHUKTOZO-1,6B(SFOSFATAZA FruktozoH|,6-blsfosforan"

rp
AMP

e

T
Gliceroloaldshyd o3- fo sf o ran

A
ADP

\e \

fFOSFOFRUKTOKINAZA

Fruktozo- „_^ ___ CAMP - 2.6-btefosforan (glukagon)

FruWozo-^6-blsfosforan ! cAMP (glukagon)
e

1,3-BtetosfogH(»rynlan

P-dihydroksyacetor; DEKYDHOGENA2A KADH GLICEROLO-.FOSFORANOWA

ATP 3Foefogllcerynlan GI!cerolo-3-fosforan KINAZA

ATP

A

2-Fo8fogllo«ynlen cAMP (glukagon; ■ Fosfoenoloplrogronian |0
Q

/ Alanina

. GDP + CO, Plrogronlan— NADH L Mleczan

Kwasy tłuszczowa Cytrynian

KARBOKSYU\ZA PtROGRONIANOWA

Cykl kwaau cylrynowago akstoglutaran

-ADP

f

/

GLUKONEOGENEZA i KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 229 Hyc. 21 -1. Główne szlaki i regulacja glukoneogenezy i glikolizy w wątrobie. Punkty wejścia giikogennych aminokwasów po ich transaminacji są zaznaczone znaczkami s—* (p. teŜ ryc. 18-7). Kluczowe enzymy glukoneogenezy są obwiedzione podwójną ramką. ATP niezbędny do glukoneogenezy powstaje w procesie utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym. Propionian ma ilościowe znaczenie jedynie u przeŜuwaczy. WęŜykowatymi strzałkami zaznaczono efekty allosteryczne, a strzałkami z przerywaną linią — kowalencyjną modyfikację przez odwracalną fosforylację. DuŜe stęŜenia alaniny działają jak „sygnał do glukoneogenezy" przez zahamowanie glikolizy na etapie kinazy pirogronianowej. KARBOKSYLAZA I CH3 CoA»SH PROPIONYLOCoA ' H-C-COO" CO-S-Co A D-Mstytomaionylo-CoA RACEMAZA METYLOMALONYLO-CoA IZOMEHAZA coo- METYLOMALONYLO-CoA intermedlaty cyklu kwasu cytrynowego

CH,

ĆHj

"**

Koenzym B„ CO-S-CoA
L-Metyfomalonylo-CoA

^OOC-Ć-H CO- S- C oA
Sukcynylo-CoA

Ryc. 21-2. Metabolizm propionianu.

aktywujący go, kinazę glicerolową, mogą go zjiŜjttfeewać. Enzym ...tflii, wyTtiagaja6Ł-..AIT, znajduje się poza innymi tkankami takŜe w wątrobie i w nerce. Kinaza Hiceroinwa, ^trilizi^ie, zamianę glicerolu w glicerolo-3-ibsfonia. Łączy się to z etapem triozofosforanów szlaku glikolitycznego, gdyŜ gjicerolo^fosioran moŜe.hyi utleniony __djŁ__dih^droksyacetonofosforan\] przez NAD+ w obecności dehydrogenazy glicerolo-Ś^^^nUffief Wątroba i nerka są zdolne do zamiapy ąliceralii w -glukozc krwi dzięki y ^ y y ^ _ z y ^ i y _ zymów^jkolizy i swoistych enzymów, szlaku glukoneogenezy, fruktozo-ł,6-bisfosfatazy i glukozo-6-fosfatazy (ryc. 21-1).

stęŜeń substratów we krwi, spowodowane zmianami ich dostępności z pokarmów, mogą zmieniać szybkość wydzielania hormonów, które z kolei wpływają na przebieg szlaków metabolicznych, zmieniając często aktywność kluczowych enzymów w taki sposób, Ŝe dąŜą one do skompensowania pierwotnych zmian w dostępności substratu. MoŜna zidentyfikować 3 typy mechanizmów odpowiedzialnych za regulację aktywności enzymów uczestniczących w metabolizmie węglowodanów, a wymienionych w tab. 21-1: 1) zmiany szybkości syntezy enzymu, 2) kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosforylację oraz 3) efekty allosteryczne.

GLIKOLiZA I GLUKONEOGENEZA DZIELĄ TEN SAM SZLAK. MUSZĄ BYĆ WOBEC TEGO WZAJEMNIE KONTROLOWANE
Zmiany w dostępności substratów są albo bezpośrednio, albo pośrednio odpowiedzialne za większość zmian w metabolizmie. Wahania

Indukcja i represja kluczowych enzymów nie jest szybka, ale zachodzi w ciągu kilku godzin
W tabeli 21-1 wymieniono niektóre z tych lepiej udokumentowanych zmian aktywności enzymów, co do których wiadomo, Ŝe zachodzą w róŜnych warunkach metabolicznych. Informacja w tej tabeli odnosi się głównie do wątroby. Enzymy tutaj zaangaŜowane katalizują reak-

230 / ROZDZIAŁ 21 Tabela 21-1. Enzymy regulacyjne adaptacyjne u szczura (głównie w wątrobie)

Aktywność przy karmieniu węglowodanami głodzeniu i w cukrzycy

Induktor

Rep resor

Aktywator

Inhibitor

Enzymy glikogenogenezy, glikolizy utleniania pirogron i anu Układ syntazy glikogenowej Heksokinaza Glukokinaza Fosfofruktokinaza-1

t

1

Insulina

Insulina

Glukagon (cAMP), fosforylaza, glikogen *Glukozo-6-fosforan 'Cytrynian (kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe), *ATP, glukagon (cAMP) ATP, alanina, glukagon (cAMP), adrenalina Acetylo-CoA, NADH, ATP (kwasy tłuszczowe. ciała ketonowe)

t T

1 I

Insulina Insulina

Glukagon (cAMP) *AMP, "fruktozo-6-fosforan, *Pj *fruktozo-2,6-bisfosforan Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan CoA, NAD, insulina', ADP, pirogron ian

Kinaza pirogronianowa Dehydrogenaza pirogron Janowa

t I

1 I

Insulina, fruktoza

Enzymy glukoneogenezy
Karboksylaza pirogron i a nowa Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa Fruktozo-1,6-bisfosfataza

I 1 I

T I I

Giukokortykoidy, Insulina glukag on, adrenalina {cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, glukagon, adrenalina (cAMP) Insulina

*Acetylo-CoA

*ADP

Glukagon?

Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan, *AMP, fruktozo-2,6-bisfosforan

Glukozo-6-fosfataza

1

T

Enzymy szlaku pentozofosforanowego i lipogenezy
Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa „Enzym jabłczanowy"

T I I

1 I i

Insulina

Insulina

Insulina

_________________ GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 231
cd. tab. 21 -1 Aktywność przy karmieniu węglowa danami ATP-liaza cytrynianowa Karboksylaza acetylo-CoA Syntaza kwasu tłuszczowego głodzeniu i w cukrzycy Induktor Rep resor Aktywator Inhibitor

T t T

1 I I

Insulina Insulina? * Cytrynian, insulina ADP Długotań cuch owy acylo-CoA, cAMP, glukagon

Insulina?

Ali o sferyczny " W tkance tłuszczowej, ale nie w wątrobie

cje^nie będące w sianie równowagi i moŜna je uwaŜać raczej za fizjologicznie przebiegające :,w jedną stronę" niŜ osiągające stan równowagi. Często wymienione w niej procesy są wzmocnione, poniewaŜ aktywność enzymów katalizujących zmiany w odwrotnym kierunku ulega równoczesnym zmianom (ryc. 21-1). Jest waŜne, aby kluczowe enzymy zaangaŜowane w odpowiedni szlak metaboliczny ulegały w sposób skoordynowany aktywacji lub hamowaniu. W tabeli 21-1 pokazano, Ŝe tak jest rzeczywiście. Wszystkie enzymy uczestniczące w zuŜywaniu glukozy (tj. enzymy glikolizy i lipogenezy) stają się bardziej aktywne wówczas, gdy występuje obfitość glukozy, natomiast w tych warunkach enzymy odpowiedzialne za wytwarzanie glukozy podczas glukoneogenezy wykazują małą aktywność. Wydzielanie insuliny, które jest wraŜliwe na stęŜenie glukozy we krwi, wzmaga biosyntezę enzymów odpowiedzialnych za glikolizę. Podobnie wydzielanie insuliny przeciwdziała pobudzaniu enzym ów; odpowiedzialnych za glukoneogeneze, a zachodzącej jako efekt działania glikokortykosteroidów i cAMP powstającego pod wpływem glukagoiiu. Wszystkim tym działaniom, które mogą być wyjaśnione indukcją lub represją enzymów, moŜna zapobiec działaniem czynników blokujących biosyntezę białka, takich jak puromycyna i etionina. Wykazano, Ŝe jest regulowany mRNA tych enzymów i Ŝe zachodzi modulacja ekspresji ich genów.

Obydwie dchydrogenazy cyklu pentozofosforanowego mogą być zaliczone do enzymów adaptacyjnych, gdyŜ ich aktywność zwiększa się u dobrze odŜywionych zwierząt oraz po podaniu insuliny zwierzęciu z cukrzycą. Aktywność tych enzymów jest mała w cukrzycy i w okresie głodzenia. Podobnie zachowują się „enzym jabłczanowy" i ATP-zaleŜna liaza cytrynianowa, co wskazuje na to, Ŝe te 2 enzymy są raczej zaangaŜowane w lip o genezę niŜ w glukoneogenezę. Kowalencyjna modyfikacja przez odwracalną fosfory iację zachodzi szybko Glukagon, a_3'.imii£jszj:tn,stopniu adrenalina, hamują glikoli/ę, natomiast pobudzają glukoneogenezę w wątrobie przez zwiększenie stęŜenia cAMP, który z kolei aktywuje cAMP-zaleŜną Klnazę białek, doprowadzając do foslbrylacji i inaktywacji kinazy pirogronianowej. Obydwa te hormony wpływają równieŜ na stęŜenie fruktozo-2,6-bisf o sfor an u i w^obec tego na glikolizę i gluk one o genezę w sposób wyjaśniony poniŜej. Aliosteryczna modyfikacja jest równieŜ szybka Znane są przykłady z metabolizmu węglowodanów, ilustrujące allosteryczną regulację enzymu. W procesie glukoneogenezy synteza szczawiooetanu z wodorowęglanu i pirogroniahu, Aktora jest katalizowana przez karboksylazę

232 / ROZDZIAŁ 21

pirogi omanowy, wymaga obecności acetyl o-Co A jako aktywatora allosterycznego. Dodanie acetyl o-Co A powoduje zmianę czwartorzędowej struktury białka, zmniejszając wartość Km dla wodorowęglanu. To działanie ma waŜne następstwa dla samoregulacji przemian pośrednich: gdy powstaje acetylo-CoA z pirogronianu, przez aktywację karboksylazy pirogronianowej, zapewnia on niejako automatycznie dostarczanie szczawiooctanu i wobec tego moŜliwość swojego dalszego utleniania w cyklu kwasu cytrynowego. Aktywacja karboksylazy pirogronianowej i równoczesne hamowanie dehydrogenazy pirogronianowej przez acety-loCoA, powstający z utjeniania kwasów tłuszczowych, pomaga wyjaśnić oszczędzające działanie utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie pirogronianu w wątrobie i pobudzenie glukoneogenezy wątrobowej. Odwrotny stosunek między aktywnością dehydrogenazy pirogronianowej a karboksylazy pirogronianowej zarówno w wątrobie, jak i w nerce zmienia metaboliczne losy pirogronianu wówczas, gdy tkanka przechodzi z utleniania węglowodanów podczas glikolizy na gl ukoneogenezę. Taka zmiana ma miejsce przy przechodzeniu stanu poresorpcyjnego w stan głodu (ryc. 21-1). Zasadniczą rolą utleniania kwasów tłuszczowych w pobudzaniu glukoneogenezy jest dostarczanie ATP, potrzebnego w reakcjach karboksylazy pirogronianowej i kar boksy kinazy fosfoenolopirogronianowej. Innym enzymem, który podlega kontroli na zasadzie hamowania zwrotnego, jestJfosjMruk-. tokinaza (fosfofrukrokinaza-1). Zajmuje ona kluczową pozycję w regulacji glikolizy. Fosfofruktokinaza-1 jest hamowana przez cytrynian i przez ATP, natomiast jest aktywowana przez AMP. AMP działa jak wskaźnik stanu energetycznego komórki. Obecność kinazy adenylanowej w wątrobie i w wielu innych tkankach pozwala na szybkie osiągnięcie równowagi reakcji: 2ADP ATP + AMP Kiedy ATP jest zuŜywany w procesach wymagających energii, czego rezultatem jest powstawanie ADP, wtedy zwiększa się [AMP]. PoniewaŜ w stanic równowagi [ATP] moŜe być 50-krotnie większe od [AMP], małe cząstkowe zmniejszenie [ATP] spowoduje wielokrotne zwiększenie [AMP]. DuŜa zmiana w [AMP] jest zatem wyrazem tego, Ŝe działa ona jako wzmacniacz malej zmiany w [ATP]. Ten mechanizm

pozwala na to, Ŝe aktywność fosfofruktokinazy-1 jest bardzo czuła nawet na małe zmiany w stanie energetycznym komórki i Ŝe kontroluje ona ilość węglowodanów ulegających giikolizie przed wejściem do cyklu kwasu cytrynowego. Zwiększenie stęŜenia AMP moŜe być równieŜ wyjaśnieniem, dlaczego glikoliza zostaje pobudzona w czasie niedotlenienia, gdy [ATP] maleje. Równocześnie AMP aktywuje fosforylazę, wzmagając glikogenolizę. Inhibicja fosfofruktokinazy-1 przez cytrynian i ATP mogłaby być jeszcze jednym wyjaśnieniem oszczędzającego działania utleniania kwasów tłuszczowych na utlenianie glukozy, a takŜe wyjaśnieniem efektu Pasteura; ten ostatni jest zjawiskiem hamowania beztlenowego (anaerobowego) metabolizowania glukozy przez jej aerobowe utlenianie (w cyklu kwasu cytrynowego). Konsekwencją zahamowania aktywności fosfofruktokinazy-1 jest nagromadzenie glukozo-6-fosforanu, który z kolei hamuje dalsze pobieranie glukozy w tkankach po za wątrobowych przez allosteryczne hamowanie heksoldnazy.

Fruktozo-2,6-bisfosforan odgrywa wyjątkową rolę w regulacji glikolizy i glukoneogenezy
Najbardziej skutecznym pozytywnym efektom cemall o sferycznym fosfofruktokinazy-1, a inhibitorem fruktozo-1,6-bis fosfatazy w wątrobie, jest fmktozo-2,6-bisfosforan. śnosj^onjha; mowanie fosfolruktokinazy-l przez ATP i powoduje zwiększenie powinowactwa do fruktozo-6-fosforanu. Powoduje trjzo-jjć-Jbisfosfatazy przez zwiększenie wartości K„, dla fruktozo-l,6-bisfosforanu. Jego stęŜenie jest zarówno pod kontrolą substratową (allosteryczną), jak i hormonalną (modyfikacja kowalencyjna) (ryc. 21-3). Fruktozo-2,6-bisfosforan powstaje przez fosforylację fruktozo-6-fo sforami działaniem ?5sfofruktokinazj-2, Zo^samo białko enzymatyczne jest odpowiedzialne równieŜ za jego rozpad, poniewaŜ ma takŜe aktywność fruktozo-lłó-bisfosfatazy. Ten bifunkcyjny enzym jest pod allosteryczną kontrolą fruktozo-6-fósTo7anu7Tćtóregó" zwiększone stęŜenie występująre~przx;pbfitości glukozy, a więc w stanie poposiłkowym pobudza kinazę oraz hamuje fosfatazę. JeŜeli natomiast występuje niedobór glukozy, glukagon pobudza wytwarzanie cAMP, aktywując cAMP-zaleŜną kinazę białek, która z kolei inaktywuje fosfofruktokinazę-2 oraz aktywuje fruktozo-2,6-bisibsfatazę przez fosforylację.

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 233 Glukoza I Glikogan

Ŝe to, Ŝe gobudzeoie glikogenoUzj; glukagonem w_wątrobie prowadzi raczei do uwalniania glukozy niŜ do wzmoŜonej gtikolizy.

Cykle substratowe (daremne) pozwalają na subtelne dostrajanie
KINAZA BIAŁEK ZALEśNA 00 cAMP

W wielu punktach kontrolnych glikolizy i metabolizmu glikogenu są zawarte cykle fosforylacji i defosforylacji, np. glukokinaza/glukozo-6-fosfataza; fosfofruktokinaza- l/fruktozo-1,6-bisfosfataza; kinaza pirogronianowa/karboksylaza pirogronianowa/karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa. Gdyby były one pozostawione bez kontroli, wówczas stanowiłyby ilościowo pokaźne cykle daremne, których rezultatem końcowym byłaby jedynie hydroliza ATP. To, Ŝe tak się nie dzieje na wielką skalę, zabezpieczają róŜne mechanizmy kontrolne, dzięki którym jedno ramię cyklu jest hamowane wówczas, gdy przeciwne ulegają pobudzeniu zgodnie z potrzebami tkanki i całego organizmu. JednakŜe w pewnych przypadkach moŜe istnieć korzyść z tego, Ŝe cykl przebiega swobodnie. Na przykład w cyklu foslbfruktokina-zal/fruktozo-1.6-bisfosfataza, zachodzi wzmocnienie efektu allosterycznego modyfikatora fruktozo-2,6-bisfosforan u, powodując większy przepływ metabolitów w którymkolwiek kierunku, niŜ miałoby to miejsce bez udziału cyklu substratowego. To „subtelne dostrajanie" kontroli metabolicznej zachodzi jedynie kosztem utraty pewnej ilości ATP.

Fr u Ktoz o-6-f □ sio ran Glukagon Fru ktozo-1,6-bisf osforan Piróg ronlan Ryc. 21-3. Kontrola gtikolizy i glukoneogenezy w wątrobie przez fnjktozo-2,6-bisfosforan ibifunk-Gy^hy enzym PFK-2/F-2,6-Pazę <6-fosfofrukto-2-kinazę/fruktozo-2,6-bisfosfatazę). PFK — fosfofruktokinaza (S-fosfofrukto-1-kinaza), F-1,6-Paza — fru ktozo-1,6- bisfosfataza. Strzałki węŜykowate oznaczają efekty allosteryczne.

STĘśENIE GLUKOZY KRWI JEST PRECYZYJNIE REGULOWANE W WĄSKICH GRANICACH
W stanie poabsorpcyjnym stęŜenie glukozy u ludzi i u wielu ssaków waha się w granicach 4,5- 5,5 mmoi/L Pa.spoŜyc|uposiłku3!ęglmja> Hanowego moŜe się ono zwiększać do 6,5—7,2 jńmoj/L-W czasie głodzenia stęŜenie glukozy zmniejsza się do"ok, JT-PT,? mmol/l. StęŜenie glukozy we krwi ptaków jest znacznie większe (14,0 mmol/l), a u przeŜuwaczy znacznie mniejsze (2,2 u owiec a 3,3 mmol/l u bydła). Te normalnie mniejsze stęŜenia wydają się być związane z faktem, Ŝe u przeŜuwaczy właściwie wszystkie węglowodany pokarmu fermentują do niŜszych (lotnych) kwasów tłuszczowych, które w duŜej mierze zastępują glukozę jako główne metaboliczne źródło energii tkanek w okresie między posiłkami. Gwałtowne zmniej-

Przy nadmiar/i- glukozy zwiększa sig więc stęŜenie fniktozu-2.(t-hisfostoriinu, pobudzając gUkolize przez aktywację fosfofruktokinazy-1 oraz hamowanie fniktoziMj6-bisfosfatazy. W warunkach niedoboru-^glukozy gkjkoneogeneza jest pobudzana przez zmniejszenie stęŜenia fruktozo-2,6-bisfosforan u, który inaktywujc fosfolr.uktoJunazę-1 oraz znosi hamowanie fruktozo-1.6-bisfostatazy. Ten mechanizm zapewnia tak-

234 / ROZDZIAŁ 21

szenie stęŜenia giukozyjwęjawgowoduje drgawki, podobnie~jak™przy przedawkowaniu insuliny, ze względu na bezpośrednie uzaleŜnienie mózgu od dostawy glukozy. JednakŜe znacznie mniejsze stęŜenia glukozy mogą być dobrze tolerowane pod warunkiem, Ŝe pozwoli się na stopniową adaptację; np. szczury zaadaptowane do diety boga to tłuszcz owej zachowują się zupełnie normalnie przy tak małym stęŜeniu glukozy we krwi, jak 1,1 mmol/1. GLUKOZA KRWI POCHODZI Z POKARMÓW, GLUKONEOGENEZY I GLIKOGENOLIZY

Glukoza węglowodanów w spoŜytych pokarmach. Większość węglowodanów po Łtrawie-niu pokarmów~tó glukoza, galąktoza 1 fruktoza. Są one transportowane do wątroby przez Ŝyłę wrotną. G a laktoza i fruktoza są łatwo przekształcane w wątrobie w glukozę (p. rozdz. 22). Glukoza pochodząca z róŜnych związków glukogennych, które ulegają glukoneogenezie (ryc. 18-7 i 21-1). Są to związki 2 kategorii: 1) ulegające bezpośredniemu prze kształceniu w glukozę bez znaczącej recyklizacji, np. niektóre aminokwasy i propionian i 2) związki będące produktami częściowego meta bolizmu glukozy w niektórych tkankach, które po dostaniu się do wątroby i nerek są prze kształcane w glukozę. 1 tak mleczan, powstały z glukozy w mięśniach i erytrocytach, jest transportowany do wątroby i nerek, gdzie jest przekształcany w glukozę. W ten sposób ta ostatnia dostając się do krwi staje się ponownie dostępna dla tkanek do utleniania. Ten proces jest znany jako cykl Cori lub cykl kwasu mle kowego (ryc. 21-4). GUcerol do syntezy triacylogliceroli tkanki tłuszczowej pochodzi z glu kozy krwi. Acyloglicerole tkanki tłuszczowej ciągle ulegają hydrolizie, wytwarzając gjicerol, który nie moŜe być zuŜytkowany przez tkankę tłuszczową i wobec tego dyfunduje do krwi. Jest on ponownie przekształcany w glukozę przez mechanizmy glukoneogenezy w wątrobie i w nerce (ryc. 21-1). Istnieje zatem ciągły cykl, w którym glukoza jest transportowana z wątroby i nerek do tkanki tłuszczowej, a glicerol powraca z tkanki tłuszczowej do wymie nionych narządów, aby ulec resyntezie do glu kozy. Wśród aminokwasów transportowanych

z mięśni do wątroby w czasie głodzenia _p_rgewaŜa alanina! DopfowacTzifoTo do postulowania istnienia cyklu glukozowo-alaninowego. przedstawionego na ryc. 21-4, w wyniku którego glukoza z wątroby przepływa do mięśni L utworzeniem tam pirogronianu ulegającego transaminacji do alaniny. Alanina jest następnie transportowana do wątroby, aby w procesie glukoneogenezy przekształcić się ponownie w glukozę. W ten sposób dokonuje się transport azotu aminowego z mięśni do wątroby oraz wolnej energii z wątroby do mięśni. Energia potrzebna do wątrobowej syntezy glukozy z pirogronianu pochodzi z utleniania kwasów tłuszczowych. Glukoza powstająca z glikogenu, wątroby podczas glikogenolizy, (p. rozdz. 20). Metaboliczne i hormonalne mechanizmy kontroli stęŜenia glukozy we krwi Utrzymywanie stałego stęŜenia glukozy we krwi jest jednym z najbardziej precyzyjnie regulowanych mechanizmów homeostatycznych i to takim, w którym odgrywa rolę zarówno wątroba, jak i tkanki pozawątrobowe, a takŜe wiele hormonów. Przez komórki wątrobowe wydaje się swobodnie przenikać glukoza, podczas gdy komórki tkanek poza wątrobowych są dla niej stosunkowo nieprzenikalne. Wynikiem tego jest, Ŝe przechodzenie przez błony komórkowe jest etapem ograniczającym szybkość pobierania glukozy przez tkanki pozawątrobowe. Po wniknięciu do komórki glukoza jest szybko fosforylowana działaniem heksokinazy. Jest prawdopodobne, Ŝe na pobieranie glukozy przez wątrobę i jej oddawanie z wątroby do krwi bardziej bezpośredni wpływ wywierają aktywności niektórych enzymów i stęŜenia kluczowych związków pośrednich. StęŜenie glukozy we krwi jest jednak waŜnym czynnikiem kontrolującym szybkość pobierania glukozy zarówno przez wątrobę, jak i przez tkanki pozawątrobowe,

Glukokinaza jest waŜnym regulatorem stęŜenia glukozy we krwi po posiłku.
NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe heksokinaza jest hamowana działaniem glukozo-6-fosforanu. Ten ostatni metabolit moŜe więc wywierać pewne hamowanie zwrotne na pobieranie glukozy przez tkanki pozawątrobowe zaleŜne od fosfory! o warna glukozy działaniem heksokinazy. Wątroba nie podlega takiemu ograniczeniu, poniewaŜ glukoki nic jest wraŜliwa na działanie gmkozo-6-

Pirogronian .* .i^—i--!-—..«•■>•—--»•»■——ii-»»'.«"i*'

Ryc. 21-4. Cykl kwasu mlekowego (Cori) i cykl ala ni nowo- glukozowy.

236 / ROZDZIAŁ 21 .100 Heksokinaza

50 o o GlukoKinaza

0

5

10 15 Glukoza krwi, mmoi/1

20

25

Ryc. 21-5. Zmiany aktywności fosforylującej glukozę heksokinazy i glukokinazy w zaleŜności od zwiększającego się stęŜenia glukozy we krwi. Km heksokinazy dla glukozy wynosi 0,05 mmol/i, a Km glukokinazy 10 mmol/l.

-fosforanu. Glukokinaza, która ma większą wartość Km (mniejsze powinowactwo) dla glukozy niŜ heksokinaza, zwiększa swoją aktywność wraz ze zwiększeniem stęŜenia glukozy w przedziale fizjologicznych stęŜeń tego związku (ryc. 21-5) i wydaje się w swoisty sposób sprzyjać pobieraniu glukozy do wątroby, w przypadku jej duŜego stęŜenia występującego w Ŝyle wrotnej po posiłku węglowodanowym. Brak glukokinazy u przeŜuwaczy, u których niewiele glukozy przechodzi z jelita do krąŜenia wrotnego, wydaje się potwierdzać tę funkcję tego enzymu. Przy prawidłowym stęŜeniu glukozy w krąŜącej krwi (4,5—5,5 mmol/l), wątroba wydaje się być producentem glukozy. JeŜeli jednak stęŜenie gJukozy się zwiększa, to wydalanie glukozy przez wątrobę ustaje, a przy duŜym stęŜeniu pobiera ona glukozę z krwi. Ustalono, Ŝe u szczura szybkość oddawania glukozy przez wątrobę staje się równa szybkości pobierania przy stęŜeniu w Ŝyle wrotnej wątroby równym 8,3 mmol/l.

Insulina odgrywa centralną rolę w regulacji stęŜenia glukozy we krwi. Poza
bezpośrednim wpływem hiperglikemii na pobieranie glukozy zarówno przez wątrobę, jak i tkanki obwodowe, zasadniczą rolę w regulacji stęŜenia gJukozy we krwi odgrywa hormon insulina. Wytwarzają ją komórki B wysp trzustkowych, a wydziela się do krwi wskutek bezpośredniej reakcji na hiperglikemię. Jej stęŜenie we krwi zmienia się równolegle ze stęŜeniem

glukozy, a szybkim skutkiem jej podania jest hipoglikemia. Do substancji pobudzających wydzielanie insuliny naleŜą takŜe aminokwasy, wolne kwasy tłuszczowe, ciała ketonowe, glukagon, sekretyna oraz lek tolbutamid. Adrenalina i noradrenalina blokują uwalnianie insuliny. Insulina pobudza natychmiast pobieranie glukozy przez takie tkanki, jak tkanka tłuszczowa i mięśniowa. To działanie jest spowodowane wzmoŜonym transportem przezbłonowym glukozy uwarunkowanym przeniesieniem transportera insulinowego z wnętrza komórki do błony plazmatycznej. Insulina nie ma natomiast bezpośredniego wpływu na penetrację glukozy do komórek wątrobowych. To stwierdzenie jest zgodne z faktem, Ŝe szybkość metabolizmu glukozy w komórkach wątrobowych nie jest ograniczana ich przenikalnością. JednakŜe insulina wpływa pośrednio na pobieranie glukozy przez wątrobę, działając na enzymy kontrolujące glikolizę i glikogenogenezę. Glukagon jest hormonem wytwarzanym przez komórki A wysp trzustkowych. Jego wydzielanie jest pobudzane przez hipoglikemie. Gdy dostanie się do wątroby (przez Ŝyłę wrotną), pobudza glikogenolizę przez aktywację fosforylazy. Większość endogennego giukagonu jest usuwana z krąŜenia przez wątrobę. Odmiennie niŜ adrenalina, glukagon nie ma wpływu na fosforylazę mięśni. Glukagon wzmaga równieŜ glukoneogenezę z aminokwasów i mleczanu. Zarówno glikogenoliza wątrobowa, jak i glukoneogeneza uczestniczą w hiperglikemizującym działaniu glukagonu, którego działania są przeciwne do insuliny. Przedni płat przysadki mózgowej wydziela hormony, które zwiększają stęŜenie glukozy krwi, a więc działają antagonistycznie w stosunku do insuliny. Są to: hormon wzrostu, kortykortofina (ACTH) i zapewne inne czynniki „diabetogenne". Wydzielanie hormonu wzrostu pobudza hipoglikemia. Hormon wzrostu zmniejsza pobieranie glukozy przez niektóre tkanki, np. przez mięśnie. Niektóre z tych działań mogą być nie bezpośrednie, wiadomo bowiem, Ŝe hormon wzrostu mobilizuje z tkanki tłuszczowej wolne kwasy tłuszczowe, które same zmniejszają zuŜycie glukozy. Długotrwałe podawanie hormonu wzrostu prowadzi do cukrzycy. Hormon wzrostu wywołując hiperghkemię, pobudza wydzielanie insuliny, powodując czasami wyczerpanie komórek B (i w konsekwencji cukrzycę).

GLUKONEOGENEZA I KONTROLA STĘśENIA GLUKOZY WE KRWI / 237

Glikokortykosteroidy (11-oksosteroidy) są wydzielane przez korę nadnerczy i są istotne dla metabolizmu węglowodanów. Podanie tych steroidów pobudza glukoneogenezę. Zwiększenie glukoneogenezy jest wynikiem zwiększonego katabolizmu białek w tkankach, zwiększonego pobierania aminokwasów przez wątrobę i zwiększonej aktywności amino tran sfe raz i innych enzymów wątrobowych związanych z glukoneogenezą. Ponadto glikokortykosteroidy hamują zuŜycie glukozy w tkankach pozawątrobowych, działają więc anłagonistycznie w stosunku do insuliny. Adrenalinę wydziela rdzeń nadnerczy* pod wpływem bodźców stresogennych (strach, podniecenie, krwotok, hipoglikemia, hipoksja itd.). Pobudza ona glikogenoiizę w wątrobie i mięśniu wskutek pobudzenia fosforylazy. Brak glukozo-6-fosfatazy w mięśniach sprawia, Ŝe glikogenoliza wiąŜe się z powstawaniem mleczanu, podczas gdy w wątrobie głównym jej produktem jest glukoza, co jest przyczyną zwiększenia stęŜenia glukozy we krwi. Hormony tarczycy powinny być równieŜ rozpatrywane jako wpływające na stęŜenie glukozy we krwi. Istnieją dane doświadczalne przemawiające za tym, Ŝe tyroksyna ma działanie diabetogenne, a usunięcie tarczycy przeciwdziała rozwojowi cukrzycy. ZauwaŜono równieŜ całkowity brak glikogenu w wątrobach zwierząt z tyreotoksykozą. U chorych z nadczynnością tarczycy stęŜenie glukozy we krwi na czczo jest zwiększone, natomiast jest zmniejszone u chorych z niedoczynnością tego narządu. NaleŜy jednak dodać, Ŝe u chorych z nadczynnością tarczycy utylizacja glukozy przez tkanki jest normalna lub zwiększona, natomiast u chorych z hipotyreozą jest zmniejszona. Chorzy z niedoczynnością tarczycy są znacznie bardziej wraŜliwi na hipoglikemiczne działanie insuliny niŜ osoby zdrowe lub chorzy z hipertyreozą. Glukozuria występuje wówczas, gdy jest przekroczony próg nerkowy dla glukozy Kiedy stęŜenie giukozy we krwi zwiększa się do stosunkowo duŜego, wtedy równieŜ nerka działa regulująco na glikemię. Glukoza jest wciąŜ przesączana w kłębuszkach nerkowych, ale normalnie powraca w całości do krwi, ulegając wchłanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Wchłanianie zwrotne glukozy wbrew gradientowi stęŜeń jest energochłonne i wymaga obecności ATP w komórkach kanali-

kowych. Zdolnoić kanalików nerkowych do wchłaniania zwrotnego glukozy jest ograniczona do ok. 350 mg/min. Gdy stęŜenie glukozy we krwi jest zwiększone, ilość przesączanej w kłębuszkach nerkowych glukozy przekracza pojemność resorpcyjną kanalików nerkowych w stosunku do glukozy i wówczas stwierdza się obecność glukozy w moczu, czyli glukozurię. U osób zdrowych glukozuria pojawia się wtedy, kiedy stęŜenie glukozy we krwi Ŝylnej jest większe niŜ 9,5—10mmol/l. To stęŜenie jest nazywane progiem nerkowym dla glukozy. Glukozurię moŜna wywołać u zwierząt doświadczalnych floryzyną, która hamuje układ reabsorbujący w kanaliku. To zjawisko jest znane jako glukozuria nerkowa. Glukozuria pochodzenia nerkowego moŜe być wynikiem wrodzonych wad kanalikowych, moŜe teŜ być nabyta jako wynik procesów chorobowych. Stwierdzenie glukozurii jest często objawem cukrzycy (diabetes mellitus). Niedobór fruktozo-1,6-bisfosfatazy powoduje laktacydozę i hipogtikemię Blokowanie glukoneogenezy przez niedobór tego enzymu nie pozwala na przekształcanie w wątrobie mleczanu i innych substratów glukogennych w glukozę. Ten stan moŜe być kontrolowany przez karmienie pokarmami o duŜej zawartości węglowodanów. MOśNA SIĘ PRZEKONAĆ O ZDOLNOŚCI ORGANIZMU DO ZUśYWANIA GLUKOZY, OZNACZAJĄC JEGO TOLERANCJĘ NA GLUKOZĘ Wskaźnikiem tolerancji glukozy jest przebieg krzywej stęŜenia glukozy we krwi po podaniu określonej ilości glukozy (ryc. 21-6). Diabetes mellitus (cukrzyca, moczówka słodka) charakteryzuje się zmniejszoną tolerancją na glukozę spowodowaną niedostatecznym wydzielaniem insuliny (cukrzyca typu 1 albo cukrzyca insulinozaleŜna; ang.: insulin-dependent diabetes mellitus. IDDM). Charakteryzuje się ona zwiększonym stęŜeniem giukozy we krwi (hipergiikemia) oraz glukozuria (cukromoczem), a mogą jej towarzyszyć zmiany metabolizmu tłuszczu. Tolerancja glukozy jest zmniejszona nie tylko w cukrzycy typu I, lecz takŜe w stanach uszkodzenia wątroby oraz w niektórych zakaŜeniach, w cukrzycy typu II (cukrzycy niezaleŜnej

238 / ROZDZIAŁ 21

moŜe równieŜ wystąpić w nadczynności przysadki lub kory nadnerczy ze względu na antagonizm hormonów tych gruczołów wydzielania wewnętrznego w stosunku do działania insuliny.
Insulina zwiększa tolerancję glukozy. Wstrzy-

knięcie insuliny zmniejsza zawartość glukozy we krwi i powoduje zwiększenie jej zuŜywania oraz magazynowania w formie glikogenu w wątrobie i w mięśniach. Nadmiar insuliny moŜe spowodować cięŜką hipnglikemię, prowadzącą do drgawek, a nawet do śmierci, jeŜeli nie poda się szybko glukozy. Zwiększoną tolerancję glukozy obserwuje się w niedoczynności przysadki i kory nadnerczy, co moŜna przypisać zmniejszeniu normalnego antagonistycznego działania kortyzolu w stosunku do insuliny, wskutek czego dochodzi do względnego jej nadmiaru.
1 Czas (h) 2

PIŚMIENNICTWO
Krebs HA: Gluconeogenesis. Proc R Soc London (Biol) 1964;159:545. Ncwsholme EA, Chaliss RAJ, Crabtrcc B: Substratc cycles: Thcir role in improving sensitivity in mctabolic control. Trmds Biochem Sci 1984;9:277, Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism. Wiley, 1973. Pagliara AS et al: Hepatic fruL-tose1,6-Diphosphatase deficiency, a cause of laciic acidosis and hypoglycemia in infaticy. ■/ Ciin Invest 1972;51:2l 15. Pilkis SJ, El-Maghrabi MR, Claus TH: Hormonal rcgulation of licpaiic gluconeogenesis and glycolysis. Anrtu Rev Biochem 1988;57:755. Watford M: What is the metabolic fate of dietary glucosc? Trends Biochem Sci 1988;13:329.

Ryc. 21-6. Test tolerancji glukozy. Krzywe stęŜenia glukozy we krwi osoby zdrowej i u chorego na cukrzycę po doustnym podaniu 50 g glukozy. ZauwaŜ początkowe duŜe zwiększenie stęŜenia glukozy u chorego na cukrzycę. Kryterium normalności jest powrót stęŜenia glukozy do początkowej wartości w ciągu 2 h.

od insuliny; ang.: non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM), której towarzyszy zwykle otyłość i zwiększone stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych po podaniu niektórych leków oraz niekiedy równieŜ w miaŜdŜycy. Cukrzyca

Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz
Peter A. Mayes, PhD, DSc

22

WPROWADZENIE Szlak pentojofosforanowy aie generuje ATP, ale spełnia '2 główne tuli keje: l)j&#miuza NADJffl dk takich redukujących syntez, jak Biosynteza kwasów tłuszczowych i steroidów oraz 2) dostarcza rybozy do biosyntezy nuklcotydówTkwifsow riukieinowych. Glukoza, fruktoza i galaktoza są ilościowo najwaŜniejszymi heksozami wchłanianymi z pfzewodu pokarmowego. Pochodzą one odpowiednio ze skrobi, sacharozy i laktozy zawartych w poŜywieniu. Specjalne szlaki metaboliczne rozwinęły się, zwłaszcza w wątrobie, do przemiany fruktozy i galaktozy w glukozę. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niedobory pewnych enzymów szlaku pentozofosforanowego są główną przyczyną hemoiizy erytrocytów, występującej w jednym z typów niedokrwistości hemolitycznej Głównym zaangaŜowanym w tym enzymem jest dehydrogenaza glukozo6-fosfora nowa. AŜ u 100 min ludzi na świecie moŜna wykazać genetycznie uwarunkowane małe stęŜenie tego enzymu. Głównymi szlakami metabolicznymi zuŜywanja glukozy są glikoliza i szlak pentozofosforano"włl~- ilościowo mniej znaczące, ale bardzo waŜne dla wydalania obcych organizmowi związków (ksenobiotyków) w postaci glukuronidów jest wytwarzanie kwasu glukuronowego z glukozy w szlaku kwasów uronowych. Zaburzenia tego szlaku są przyczyną samoistnej pentozurii. Całkowity brak jednego z enzymów tego szlaku

u wszystkich naczelnych sprawia, Ŝe kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbędnym składnikiem pokarmu dla ludzi, ale nie dla większości ssaków. Niedobory enzymów metabolizmu fruktozy .i galaktozy prowadzą do takich chorób metabolicznych, jak samoistna fruktozuria i galaktozemia Fruktoza bywa uŜywana w Ŝywieniu pozajelitowym, ale w duŜym stęŜeniu moŜe ona powodować uszczuplenie puli nukleotydów adeninowych w wątrobie i martwicę wątroby. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY WYTWARZA NADPH ORAZ RYBOZĘ Szlak pentozofosforanowy (spięcie heksozomo no fos fora nowe) jest alternatywną drogą utleniania glukozy. Jest to proces wielocykliczny, w którym z 3 cząsteczek glukozo-6-fosforanu powstają 3 cząsteczki CO2 i 3 reszty 5węglowe. Te ostatnie zostają tak przetworzone, Ŝe regenerują się z nich 2 cząsteczki glukozo--6fosforanu i wytwarza się 1 cząsteczka związku pośredniego glikolizy — gliceraldehydo-3-foslbranu. PoniewaŜ z 2 cząsteczek giiceraldehydo-3-fosforanu moŜe regenerować glukozo-6- fosforan, w szlaku pentozofosfora nowym moŜe zachodzić całkowite utlenienie glukozy.
3(Glukozo-6-fosforan) + 6 NADP -» -> 3 COa + 2 (Glukozo-6-fosforan) + - Gliceraidehydo 3-fosforan + 6 NADPH + + + 6H
+

240 / ROZDZIAŁ 22

KOLEJNE REAKCJE SZLAKU PENTOZOFOSFORANOWEGO ZACHODZĄ W CYTOZOLU Enzymy^szlaku pentozofosforanowego, podobnie jak TglikoTizy, znajdują się w cytozolu. Utlenianie, tak jak w glikolizie, odbywa się przez oSwodorowanie, jednakŜęjw przypadku szlaku

pentozofo sfora nowego akceptorem wodoru jest NAPD, a nie NAD. Sekwencję reakcji szlaku moŜna podzielić na
2 etapy: oksydacyjny i nieoksydacyjny. W pierw-

szym glukozo-6-fosforan ulega odwodorowanhi i dekafboksylacji, przechodząc w pentoze — rybulozo.-5-fosforan. W drugim etapie rybulozo-5-fosforan ulega przekształceniu z powroHjO V lub Ca" HYDROLAZA GLUKONOLAKTONOWA osi o g lukonolakton

NADP NADPH+H^ HO-C-H

f

HO-C-H 6- f

H-ĆDEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA

OH I HO-Ć-H
C-OH I

4

COO" H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH
6-Fosfogtukonlan — NADP1

Q H-

H-i ---- 1
CHj-O-l
^D-G lu kozo-6-fosfo ran

DEHYDROGENAZA 6FOSFOGLUKDNIANOWA

Mg 1 ; Mn ! ; lub Ca**

NADPH + H+
CHOH
1 1 KETOIZOMERAZA RYBOZO-S-FOSFOflANOWA

CH,OH
i

H-C-OH
I

c=o
CH, -O -(P ) Rybulozo-5-fosforan

C-OH H-C-OH H-C-OH i
C H , - 0 - ( F Forma enotlowa
i

H-CH-C-OH i

C=O H-C-OH H-Ć-OH

3-Kato-B-f *CH2OH i 3-EPIMERAZA HYBUL020-5-F0SF0RAN0WA

oafogl u ko n la n

HO-C-H H^ t^1^ (JM > H-C CHj-ORybozo^Si-ftwfora n

H-C-

O -T - H H^C-OH
K syl u I o zO-5-f osf o r an

Ć

OH H-C-OH
Sadoheptu loŜo -7-f osto ra n

H- C-OH

K

"CH2-O~®
lcaraldehydo-3-tosfo ra n

Gl

PRPP Ryc. 22-1. Szlak pentozofosforanowy.
P ------ POf,

PRPP — 5-fosforybozylo-i-pirofosforan.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 241

"CH.OH HOJC-H

-f

H-"Ć-OH
Sliceraldehyda•3-1o«toran

•CHjOH O C H

H-Ć-OH ~*____ H-Ć-OH H-Ć-OH H-C = O H-ĆCH,-O-® Sadoheplulozo- OH H-Ć-OH

|THANSALDOLAZA|

T

H-^t-OH
H-iC-OH
ł

CH,0H

7-fosforan

*CHaOH

CH, -O-(P)
Etyt roz o-4-1o sto r an

FruktoiD-6-iosforan

4

ć

HO-C-H H-Ć-OH

CH,-O-<g)
Ksyiuiozo-5-fostoran

| TRAN8KET0LAZA Tlamlrw- ®j Mg' ł

H-C=O
H-C-OH

Ryc. 22-1 cd. Szlak pentozofosforanowy,

CH,-O-®
SilcerakJBhydo-3-fosłofan

ćo
HO-C-H H-C-OH H-Ć-OH
FruKtozo-S-losforan

tem_dp5!ukozQ-i-ibsforanu w całej serii reakcji, głównie z udziałem 2 enzymów; transkętotazy UransaMolazy (ryc. 22-1). Etap oksydacyjny wytwarza NADPH Odwodorowanie glukozo-6-fo sforanu do 6fosfoglukonianu zachodzi przez utworzenie 6fosfoglukonolaktonu katalizowane przez dehydrogentizę glukQzo-6-fo$foranową, enzym zaleŜny od NADP. Hydrolizę 6-fosibglukonolaktonu katalizuje hydrolaza glukonol a klonowa Drugi etap oksydacyjny jest katalizowany przez dehydrogenazę 6-fosfoglokonianową, która potrzebuje NADP+ jako akceptora wodoru. Dalej następuje dekarboksyjacja_z_ wy tworzeniem kelopentozy — rybuiozo-5-ibsforanu. Reakcja zachodzi prawdopodobnie w 2 etapach przez związek pośredni 3-keto-6-fosfoglukonian. Etap nieoksydacyjny wytwarza

prekursory rybozy
Rybulozo-5-fosforan jest substratem dla 2 róŜnych enzymów, 3-Epimeraza ryhulozo-5-fosforanowa zmienia konfiguracje wokół C3, twol<> Biochemia

rząc epimer ksylulozo-5-fosforan będący ketopentozą, Ketoizomeraza rybozo-5-fosforanowa zamienia rybulozo-5-fosforan.w odpowiednią aldopentoze, rybozo-5-fosforan. Transketolaza przenosi jednostkę 2-węglową zawierającą węgle 1. i .2 ketozy na aldehydowy węgiel cukru — aldozy. Powoduje ona .zatem zamianę cukcu ketozj w aldozę uboŜszą-o-2-atomy węgla, a równocześnie zamienia cukier aldozę w ketozę bogatszą o 2 atomy węgla. Reakcja wymaga udziału jednej z witamin B — darniny — jako koenzymu w postaci difosforanu tiaminy, a takŜe jonów Mg2:. Przenoszona jednostka 2-weglowa jest prawdopodobnie glikolaldehydem związanym do difosforanu tiaminy, tzn. jest „aktywnym glikolaldehydem". Transketolaza katalizuje więc przeniesienie opisanej jednostici"2*węglowej z ksylulozo-5-fosforanu na ryb ozo-5-fosforan, tworząc 7-węgiową ketozę sedoheptulozo-7-fosforan oraz aldozę gliceraldehydo-3-fosforan. Te 2 produkty wchodzą następnie w inną reakcję, znanąjakotransaldolacja. Transaldolaza umoŜliwia przeniesienie jednostki 3-węglowej „ak-

242 / ROZDZIAŁ 22
GI ukozo-6-fosf o ran -N AD P* DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA Gl ufco zo-6-fosforan NADP* Glukozo-6-fosforan NADP
ł

- NADPH

*■ NADPH e-Fosfoflukonian NADP*

>■ NADPH + H* 6-Fosfoglukonian NADP*

6-Fosfogukonlan - NADP* DEHYDROGENAZA 6-FOSFOGLLJKON1ANOWA »
1i ^ CO2

NADPH + H

+

NADPH+ H*
k

^"

NADPH

COj

Ryb u lozo-5-tostoran C, |3-EPIMERA2A~|

Rybulozo-S-fosfcran

* CO, Rybulozb-5-taatoran

KETOIZOMERAZA Rybozo-5-f osf o ra n

| 3-EPIMERA2AJ

Ksylulozo-5-fosforan

Ksytu lozo-S-tosf o ran C TRANSKETOLAZA

Gllcef aldehyd o-3-fosforan Ci 1 TRANSALDOLAZA

f

Sedoheptulazo-7-fosforan C,

f
Fruktozo-6-fosloran C« Erytrozo-4-tosforan TFIANSKETOLAZA Gl I ce r aldehyd o-3-f o sfa ra n Fru ktoz o-6-f osfo ran IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

ALDOLAZA IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

IZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA

, Fruklozo-1,6-btefosforanu FHLTKTOZO-1,6-BISFOSFATAZA /j Fruktozo-6-fosforanu IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA

GI ukozo-6-fostoran

Gl ukozo-6-fosforan

Vj Glut<ozo-6-fofiforanu

Ryc. 22-2. Schemat przebiegu szlaku pentozof osforan owego i jego połączeń ze szlakiem glikolizy.

SZLAK PEIMTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 243

tywnegodihydroksyacetonu" (węgli l-3)_zketo- dehydrogenazy ghitaminianowej, albo zreduzy, którą1 jest sedoheptulozo-7-fosforan, na al- kowanego glutationu w erytrocytach. Jest pradozę gliceraldehvdo-3-fosforan. aby_utworzyć wdopodobne, Ŝe obecność aktywnej lipogenezy ketozę — fruktozo-6-fosforan i 4-węglową al- albo układu zuŜywającego NADPH pobudza rozkład. glukozy w szlaku pentozofosforanodozę — ery trozo-4-fosforan. Następnie zachodzi dalsza reakcja, znów wym. ZuŜywanie NADPH dostarcza bowiem z udziałem transketolazy, w której ksylulozo-5- NADP, którego stęŜenie jest normalnie bardzo mafe ze względu na nierównowagowy charakter Ti JFuŜy jako da_w_c_a „aktywnego gli pierwszych reakcji szlaku. RównieŜ synteza kolaldehydu". W tym przypadku utworzony uprzednio eryfrozo-4-fosforan jest akcpptnjeay ■ dehydrogenaz glukozo-6-fosforanowej i 6-fosProduktami wymienionej reakcji są fruktozo-6-- foglukonianowej moŜe być indukowana przez insulinę wydzielaną w warunkach związanych fosforan i gIiccraldehydo-_3-fosforan. ze „stanem sytości" (tab. 21-1). Aby glukoza u legia_ całkowitemu utlenieniu do CO, w szlaku pentozofosforanowym, nie- h i Ryboza moŜe być syntetyzowana j bJ ™ tkance enzymów przek sz t nic aj ą c y e h gl i ce ra I dc h y d o - 3 - fo s f oran w g lu - we wszystkich tkankach SzJak pentozo fosforan o wy dostarcza ryhozy j^zo-6-fosforan..Są to enzymy szlaku giikolizy, dz^aja^e.\£o£LwŁQinyjn kierunku, i dodatkowo do syntezy nukleotydów i kwasów nukleinoenzym glukoneogenezy frtiktozo-l,6-bisfosfata- wych (ryc. 22-1). Źródłem jes.t rybozo-5-fas^ foran. który reaguje z ATP, tworząc PRPP Ł-A. Schemat tego szlaku przedstawiono na rye. uŜywany w biosyntezie nukleotydów (p. str. 427). Tkanka mięśniowa ma bardzo niewielkie ilości dehydrogenaz glukozo-6-fo sfora nowej 2 najwaŜniejsze szlaki katabolizmu i 6-fosfoglukonianowej. Mięsień szkieletowy, glukozy mają niewiele ze sobą podobnie jak większość innych tkanek, jest wspólnego jednak zdoiny do syntetyzowania rybozo-5-fosChociaŜ niektóre metabolity są wspólne, np. foranu na potrzeby syntezy nukleotydów. Odglukozo-6-fosforan, to jednak szlak pectozobywa się to przez odwrócenie nie oksydacyjnego i etapu szlaku pentozofo sfora nowego z uŜyciem ^xJ£liJq "DTI^jerue następuje w pierwszych reakcjach fruktozo-6-fosforanu. Oznacza to, Ŝe nie jest Z udziałcin~RKDP. a nieNAD. a CO3, który konieczny kompletny funkcjonujący szlak penw ogóle nicjeśt produktem giikolizy, jest chara- tozofosforano wy, aby tkanka mogła syntetyzokterystycznym pr^ukteatszłafea=--pentozofos- wać fosforany rybozy. Ryboza nie jest znaczącym składnikiem krąfofahowego. ATP nie powstaje w szlaku pentozofos fora nowym, podczas gdy jego generacja Ŝącej krwi. Wobec tego tkanka musi sama jest zasadniczą funkcją giikolizy. Fosforany zaspokajać zapotrzebowanie na ten waŜny prerybozy powstają w szlaku pentozo fosforano- kursor nukleotydów. wym, ale me w glikolizie. RównowaŜniki redukujące są wytwarzane w tych tkankach, które są wyspecjalizowane w syntezach redukujących Oznaczenia aktywności szlaku pentozofosforanowego w róŜnych tkankach wskazują na jego znaczenie metaboliczne. Jest on aktywny w wątrobie, tkance tłuszczowej, korze nadnerczy, w tarczycy, erytrocytach, jądrze i w gruczole sutkowym w okresie laktacji. Brak jest jego _le sutkowym po_ga okresem wn"^ występuje w mięśniu szkielet o wy rn. Wszystkie tkanki, w których ten szlak"jest aktywny, zuŜywają NADPH do syntez redukujących, np. do syntezy kwasów tłuszczowych, steroidów, aminokwasów szlakiem SZLAK PENTOZOF0SF0RAN0WY WSPOMAGA PEROKSYDAZĘ GLUTATIONOW Ą W OCHRONIE ERYTROCYTÓW PRZED HEMOLIZĄ Szlak pentozofosforanowy w erytrocytach dostarcza NADPH do redukcji utlenionego glutationu (G-S-S-G) do glutationu zredukowanego (2G-SH). Redukcja ta jest katalizowana przez reduktazę gluta tionową. enzym będący flawoproteiną zawierającą FAD. Z kolei zredukowany glutation usuwa H 2 O 2 z erytrocytu w reakcji katalizowanej przez peroksydazę gtutationową, enzym zawierający pierwiastek śladowy selen.

244 / ROZDZIAŁ 22 G-S-S-G + NADPH + H —. 2G-SH + NADP+
REDUKTAZA OLUTATIONOWA FAD
+

2G-SH +

G-S-S-G + 2H,0
PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA SELEN

Ta reakcja jest waŜna, poniewaŜ nagromadzenie H2O2 moŜe skrócić czas Ŝycia erytrocytów, zwiększając szybkość utlenienia hemoglobiny do methemoglobiny. W niektórych populacjach występuje mutacja charakteryzująca się niedoborem dehydrogenazy di!ki>/i>-6-fosforanowej, czego konsekwencją są zaburzenia w wytwarzaniu NADPH. To zaburzenie charakteryzuje się hemolizą erytrocytów wówczas, gdy osobnik z tą wadą jest naraŜona na działanie takich utleniaczy, jak lek przeciwzimniczy — prymachina, kwas acetylosalicylowy lub sulfonamidy, albo spoŜywa pewien gatunek fasoli (Viciafaba — fawizm). Peroksydaza glutationowa jest naturalnym przeciwutleniaczem znajdującym się w wielu tkankach. Oprócz H3O2, działa ona równieŜ na nadtlenki organiczne. Razem z witaminą E jest częścią układu ochronnego przeciw peroksydacji lipidów (p, str. 185). Donoszono o związku między występowaniem niektórych nowotworów a małym stęŜeniem selenu we krwi i (lub) małą aktywnością peroksydazy glutationowej. Oznaczanie aktywności transketolazy we krwi odzwierciedla stopień niedoboru tiaminy. Jedynym stanem, w którym aktywność tego enzymu jest zwiększona jest niedokrwistość złośliwa.

GLUKURONIAN, PREKURSOR PROTEOGLIKANÓW I SPRZĘGNIĘTYCH GLUKURONIDÓW, JEST PRODUKTEM SZLAKU KWASU URONOWEGO Poza opisanymi wyŜej głównymi szlakami metabolizmu glukozo-6-fosforanu istnieje szlak,- w którym -glukoza, jest przemieniana w kwas glukuronowy, kwas askorbinowy i pentozy, nazywany szlakiem kwasu uranowego. Jest on takŜe alternatywnym szlakiem utleniania glukozy, ale, podobnie jak szlak pentozofosforanowy, nie prowadzi do wytwarzania ATP.

W szlaku-kwasu.JirQn.owJego„.glu;kuronian pQWStaje-z,_glukQzy w wyniku reakcji pokazanych na ryc. 22-3. Glukozo-6-fosforan jest przekształcany w glukozo-1-fosforan, który następnie reaguje z urydynotrifosforanem (UTP), tworząc aktywny nukleotyd — urydynodifosloglukozę (UDPGlcK Ta ostatnia reakcja jest katalizowana przez enzym urydylilotransferazę glukozo-1-fosforanowa (polifosfory!azę UT3F' glukozową). Wszystkie etapy, aŜ do tego miejsca, są identyczne z tymi, które uprzednio opisano jako szlak glikogenogenezy w wątrobie. UDPGlc jest utleniana w dwuetapowym procesie do glukuronianu. Produktem utleniania, które jest katalizowane przez dehydrogenazę UPPglukozową, jest UDP-glukuronian. UDP-gliikuroman jest „aktywną" formą glukuntnianu w reakcji whudowywania glukuronianu w proteoglikany lub dla reakcji, w których glukuronian jest sprzęgany z takimi substratami, jak hormony steroidowe, niektóre leki lub bilirubina (p. ryc. 34-13). W NADPH-zaleŜnej reakcji glukuronian jest redukowany do L-gulonianu {ryc. 22-3). Ten ostatni związek jest bezpośrednim prekursorem askorninianu u zwierząt zdolnych do syntetyzowania tej witaminy. U człowieka i innych naczelnych, jak równieŜ u świnki morskiej, kwas askorbinowy nie moŜe być syntetyzowany ze względu na brak enzymu oksydazy [-oulonolaktonowej. Gulonian jest utleniany do 3-keto-L-gulonianu, który jest dekarboksylowany do pentozy — L-ksylulozy. Związkiem pośrednim szlaku pentozofosforanowego jest D-ksyluloza. W reakcjach przedstawionych na ryc. 22-3 z ketogulonianu powstaje natomiast L-izomer ksylulozy. W celu połączenia tych 2 szlaków niezbędne jest przekształcenie L-ksylulozy do jej izomeru D. Zachodzi ono w wyniku NADPH-zaleŜnej redukcji do ksylitolu, który jest następnie utleniany w reakcji NAD-zaleŜnej do D-ksylulozy, Ten ostatni związek, po przekształceniu do D-ksylulozo-5-fosforanu jest dalej metabolizowany w szlaku pentozofosforanowym. Przerwanie ciągłości szlaku kwasu uranowego jest powodowane wadami enzymatycznymi i przez niektóre leki W samoistnej pentozurii, rzadkiej chorobie dziedzicznej, pojawiają się w moczu, znaczne ilości L-ksylulozy. Obecnie się uwaŜa, Ŝe przyczyną tego jest brak u chorych z pentozurią enzymu niezbędnego do przeprowadzenia redu-

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 245
3-Keto-L-gulonian

PKOFOSFO HYDRO LAZA UDPGIc

Urydyn od ifosf og iu koza (UOPGlc)

Urydynodlfosfoglukuronian

O

c-o-

9
c-oHO-Ć-H HO-C-H H-C-OH HO-Ć-H
•CHjOH C-Gulonlan C02 BLOK U CZŁOWIEKA i

c=o
H-C-OH HO-Ć-H
L-Kiylulon

HO-C-H Ć=0 H-C-OH HO-Ć-H *CH;OH

Szczawian Glikolan L-GulonolaMon 4 BLOK U NACZELNYCH ^~ Aldehyd gllkolowy I SWWW MORSKIEJ BLOK D- Ksyl u loŜo -1 -f osf o ran W PENTOZURI! 2-Keto-L-gulonoiakton

+

t

t

*CH2OH NADP HO-C-H
+

•CHjOH NADPH + H+ C=O HO-Ć H-Ć-OH HEDUKTAZA 0ĆHsOH ATp KSYLULOZOWA AOP ' D-Ksylu lozo-5-fosfo ran

I

O [2H]

J>

HO-Ć-H D-Ksyjuloza

C

H-C- OH ĆH,OH KsyMol

HO-C H-Ć H O - C - H

•ĆH,OH

J_

L-Askorbinlan

0=Ć 0=Ć HĆ HOĆ-H
L-Dehyd roaekor bl nlan

Szła

ntozofwfo

Rye. 22-3. Szlak kwasu uranowego. * — losy węgla 1 glukozy, © ------ P03

kcji L-ksylulozy do ksylitolu. Pozajelitowe podanie ksylitoJu moŜe prowadzić do oksalozy, łącznie z odkładaniem się złogów szczawianu wapnia w mózgu i w nerkach. Wynika to z przekształcenia D-ksylulozy do szczawianu, przez kolejne tworzenie ksylulozo-1-fosforanu, aldehydu glikolowego i glikolanu. RóŜne leki wzmagają szybkość wchodzenia glukozy do szlaku kwasu uronowego, np. podanie barbitalu lub chlorobutanolu szczurom powoduje znaczne zwiększenie przekształcania glukozy do glukuronianu, L-gulonianu i askor-

binianu. Donoszono, Ŝe aminofenazon i fenazon zwiększają wydalanie L-ksylulozy u osób z pentozurią.

SPOśYCIE DUśYCH ILOŚCI FRUKTOZY MA GŁĘBOKIE KONSEKWENCJE METABOLICZNE
SpoŜycie pokarmów o duŜej zawartości sacharozy jest przyczyną duŜego napływu fruktozy (i glukozy) do Ŝyły wrotnej i wątroby.

246 / ROZDZIAŁ 22
Gllkogen ATP

Gtu kozo-6-fosf □ ran

i
tZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA GLUKOZO-6DEHYDROGENAZA

Ffuktozo-6-fosforan

FflUKTOZO-1,6BISFOSFATAZA

FOSFOFRUKTOKINAZA BLOK PRZY SAMOISTNEJ FRUKTOZURII

Fru ktozo-1 ,&- blstosf c ran

Fruttozo-I-fosforan BLOK PRZY DZIEDZICZNEJ NIETOLERANCJI FRUKTOZY [ALDOLAZA B| Fosto dłhyd roKsyacełon

t

[ALDOLAZA A | 1ALDOLAZA"B1

IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA

Gllcer a H ehyd o-3-fosforan

ATP

D-Oileeraldenyd

| TRIOZOKINAśA]
2-Fosfagllcerynlan

Plrogronlan Ryc. 22-4. Metabolizm fruktozy, Aldolaza A znajduje się we wszystkich tkankach, z wyjątkiem wątroby, w której występuje jedynie aldotaza B.

Fruktoza znacznie szybciej niŜ glukoza ulega

glikolizie w wątrobie. Jest to spowodowane tym, Ŝe omija ona etap metabolizmu glukozy katalizowany przez fosfofniktokinazę. Na tym etapie zachodzi bowiem kontrola metaboliczna szybkości katabolizmu glukozy. Pozwala to na pobudzenie przez fruktozę szlaków metabolicznych w wątrobie, prowadzących do wzmoŜonej syntezy kwasów tłuszczowych, estryfikacji kwasów tłuszczowych i wydzielania VLDL oraz do

zwiększenia stęŜenia triacylogliceroli w surowicy krwi. Nadmiar glukozy^dostający się do krwiobiegu, pobudza wydzielanie insuliny, co wzmaga wszystkie w. procesy. Fruktoza moŜe być fosforylowana do fruktozo -6-fo sfora mi. Proces ten jest katalizowany przez ten sam enzym - heksokjnazę, który katalizuje fosforylaqe glukozy (lub mannozy) {p. ryc. 22-4), JednakŜe powinowactwo tego enzymu do fruktozy jest bardzo małe w porów-

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 247

naniu z powinowactwem do glukozy. Dlatego wydaje się mało prawdopodobne, aby to była główna droga zuŜytkowania fruktozy. Inny enzym,^fi]!^ctokinaza^wystcpujący_w wąJrobae_katalizuje przeniesienieTósfbranu z ATP na fruktozę, ale z wytworzeniem fruktozo-1-fhsŁiraiiu. Jego występowanie wykazano równieŜ w nerkachi \y jelitach. Enzym ten nie fosforyluje glukozy. W odróŜnieniu od glukokinazy, na jego aktywność nie wpływa głodzenie ani insulina, co moŜe tłumaczyć, dlaczego fruktoza znika z normalną szybkością z krwi chorych na cukrzycę. K.™ tego enzymu pochodzącego z wątroby dla fruktozy jest bardzo mała, co wskazuje na duŜe powinowactwo enzymu do substratu. Wydaje się, Ŝe to jest wjainie_głó.wria dr-Oga-Jhsfbrjdficji fruktozy. Samoistna fruktozuria_jęst wynikiem braku fruktokinazy watro bovffij.. Fruktozo-1-fosforan jest rozkładany do aldeTryduD-glicerynowego i dihyBrbksyącstonofmforanujyjgalccu^lfFital^riwaripj p^e? aldolazc B, enzym znajdujący się w wątrobie. Ten enzjQL_.. atakuje równieŜ fruktozo-1,6-bisfoslbran. Jego brak jest przyczyną wrodzonej nietolerancji fruktozy. Aldehyd D-gliceryno-: ■ / Y?.kuj.e moŜliwość wejścia do sekwencji reakcji szlaku gl'^gljzj{ dzięki innemu enzymo-wi obecnemu w wątrobie, triokinazie, która katalizuje jego fosforylację do gliccraldehydo-3-foslbranu. Dwie fosfotriozy: dihydroksyacetonolosforan i gliceraldehydo-3-fosforan mogą być katabolizowane w szlaku glikolitycznym albo mogą łączyć się ze sobą pod wpływem aldolazy i być przetworzone w glukozę. To ostatnie jest losem większości fruktozy metabolizowanej w wątrobie. Jedną L konsekwencji wrodzonej nietolerancji fruktozy i innej choroby spowodowanej niedoborem fruktozo-l,6-bisfosfatazy jest indukowana fniVtr>7iiJjiipnpljl<,piiiia, pnmmuy.występowania duŜych zapasów glikogenu.-5^apewne nagromadzanie się fruktozo-1-fosforanu i fruktózo-l,6-bisfosforanu hamuje aktywność fosforylazy wątrobowej przez mechanizmy allosteryczne. JeŜeli zwierzęciu doświadczalnemu usunąć jelito i wątrobę, to przemiana wstrzykniętej fruktozy w glukozę nie zachodzi i zwierzę popada w hipoglikemię, jeśli nie podać mu glukozy. JednakŜe stwierdzono, Ŝe ludzka nerka moŜe przekształcać fruktozę do glukozy i mleczanu. U ludzi, ale nie u szczurów, znaczna ilość fruktozy pochodząca z rozpadu spoŜytej sacha-

rozy jest przemieniana w jelicie do glukozy, zanim dostanie się do krąŜenia wrotnego. Wolna fruktoza znajduje się w płynie nasiennym i jest wydzielana w nader duŜych ilościach do płodowego krąŜenia zwierząt kopytnych 1wielorybów, u których gromadzi się w płynach owodniowym i omoczniowym.
Fruktoza i sorbitol uczestniczą w patogenezie zaćmy cukrzycowej

Zarówno fruktoza jak i sorbitol znajdują się w ludzkiej soczewce, w której ich stęŜenie zwiększa się w cukrzycy, i mogą one mieć udział w patogenezie zaćmy cukrzycowej. Szlak sorbitolowy (poliolowy), którego nie ma w wątrobie, jest odpowiedzialny za powstawanie &«ktozy z glukozy (ryc. 22-4). U chorych na cukrzycę jego aktywność się zwiększa, w miarę zwiększania stęŜenia glukozy we krwi, w tkankach, które nie są wraŜliwe na insulinę, tj. w soczewce, nerwach obwodowych i kłębuszkach nerkowych. Glukoza jest redukowana do sorbitolu, przez reduktazę aldozową z udziałem NADPH. Następnie sorbitol jest utleniany do fruktozy przez dehydrogenazę sorbitolową (dehydrogenazę L-iditolową, zwaną takŜe poliolową), w obecności NAD. Sorbitol nie przenika łatwo przez błony komórkowe i dlatego gromadzi się w tkankach, powodując ich uszkodzenie w mechanizmie osmotycznym. Równocześnie zmniejsza się stęŜenie mioinozytolu. U szczurów 2cukrzycą moŜna zapobiec nagromadzaniu się sorbitolu w tkankach, niedoborowi mioinozy tolu i powstawaniu zaćmy cukrzycowej, stosu jąc inhibitor reduktazy aldozowej. Reduktaza aldozową znajduje się w łoŜysku owiec i jest odpowiedzialna za wydzielanie sorbitolu do krwi płodowej. Dehydrogenaza sorbitolowa w wątrobie oraz w wątrobie płodu jest odpowiedzialna za przemianę sorbitolu do fruktozy. Ten szlak jest równieŜ odpowiedzialny 2a występowanie fruktozy w płynie nasiennym. Po doŜylnym podaniu sorbitolu jest on raczej przekształcany do fruktozy niŜ do glukozy. Po doustnym podaniu sorbitolu znaczna jego część nie wchłania się i ulega w jelicie grubym fermentacji pod wpływem bakterii do takich produktów, jak octan i H2. Bóle brzucha spowodowane nietolerancją sorbitolu mogą być wywołane „wolnymi od cukru" środkami słodzącymi zawierającymi sorbitol.

248 / ROZDZIAŁ 22

GALAKTOZA JEST POTRZEBNA DO SYNTEZY LAKTOZY, GLIKOLIPIDÓW, PROTEOGLIKANOW I GLIKOPROTEIN
Galaktoza powstaje w jelitach w następstwie hydrolizy disaćnarydu — lalctozy, tj. cukru zawartego w mleku. W wątrobie jest ona łatwo przemieniana w glukozę. Zdolność wątroby do dokonania takiej przemiany moŜe być miernikiem sprawności czynności wątroby i jest podstawą testu tolerancji galaktozy. Szlak przemiany galaktozy w glukozę przedstawiono na ryc. 22-5. W reakcji 1 galaktoza jest fosforylowana przez galaktoklnazę z uŜyciem ATP jako dawcy fosforanu. Produkt tej reakcji galaktozo-1-fosforan reaguje z urydynodifosfoglukozą (UDPGlc), tworząc urydynodtfosfogalaktozę
Galaktoza

(UDPGal) i glukozo-1-fosforan. W reakcji tej (reakcja 2), katalizowanej przez urydylilotransferazc galaktozo-1 -fosforanową, galaktoza jest przenoszona na miejsce glukozy zawartej, w UDPGlc. Przemiana galaktozy w glukozę (reakcja 3) jest katalizowana przez epimerazę. Jej produktem jest UDPGlc. Epimeryzacja prawdopodobnie odbywa się przez utlenienie i redukcję na C4, z udziałem NAD jako koenzymu. W końcu (reakcja 4) glukoza jest uwalniana jako glukozo-1-fosforan prawdopodobnie po inkorporacji do glikogenu i następującej potem fo sforo lizie. Reakcja 3 jest swobodnie odwracalna. W ten sposób glukoza moŜe być przemieniana w galaktozę, tak Ŝe obecność gotowej galaktozy nie jest niezbędna w pokarmach. Galaktoza jest potrzebna w organizmie nie tylko przy tworzeniu laktozy, lecz takŜe jako

ATP Mg'* ADP-* Gal aktozo-1 fosforan Glukozo-1 -fosforan UDPGlc
URYDYLOTRANSFERAZA UDPGal 1-FOSFOGAtAKTOZOWA 4EPIMEHA2A IMYDYNODIFOSFOGALAKTOZOWA

Ni

GALAKTOKINAZA|(2J

UDP

5)
NAD'

Ł

Laktoza

LAKTOZY Glukoza

] FOSFORYLAZA ]

UDPGlc
PBOFOSFOHYLAZA UDPGlc

UTP
Gllkogen
ATP HEKSOKINAZAI lub ADP I

Glukoza

GluKOZO-

6LUK0KINAZA

Ryc. 22-5. Szlak przemiany galaktozy w glukozę oraz syntezy laktozy.

SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 249
■y. Gllkogen _

c Gl u kozo-1 -fosforan #*
w

i

ATP

ADP

i

Glukoza ^* "^- Glukozo-6-tostoran

Gllkollza Fruktozo-d-fosforan — Glutamina Plrogrontan

Cykl kwasu cytrynowego

COŹ+HŹO

ATP

ADP

IAMINOTHANSFERAZA] ■ Glutamin lan
FOSFOGLUKOMUTAZA Glukozoamino-1-fosforan

UTP
j PJ Glukozoamlna * I

^M^Ę

Glukozoamlna
Acetylo-CoA

e
Glukozoamino-6- ■* fosforan Acetylo-CoA

ATP

ADP

r+Acetylo- k. N-Acetyio- -glukozoamłno-glukozoamlna 6-fosfaran
EPIMERAZA ] N-Acstylomannozcamino-5-fosioran Fosfoenotoplrogronian ■

glukazoamlno-■1 -fosforan UTP

Gllkozam! nogi łkany (np, heparyna)

UDP— N-acaty log a! a Kl ozoami n a

Gllkozam Inogtlkany (kwas hiaiuronowy, gllkoprotelny)

NAO+ I EPIMERAZA I
9-Fosforan kwasu UDPN-aoetylcrieuraminowego -N-aoatylogalaWozoamina
- UJsmny

e
Kwas slalowy, gangliozydy, gllkoprotalny GtlkozoamlnogJlkany fchonaroltyny), gllkoprotalny

(inhlbujacy) afekt allosteryezny

Ryc. 22-6. Zestawienie wzajemnych powiązań w metabolizmie aminocukrów. * Analogiczna do UDPGIc. Inne nukleotydy purynowe lub pirymidynowe mogą być podobnie związane z aminocukrami. Przykładami są tymidynodifosfo{TDP)-glukozoamina oraz TDP-N-acetyloglukozoamina. ____________________

składnik glikolipidów (cerebrozydów), proteoglikanów i glikoprotein. Przy syntezie latriozy w gruczole sutkowym, glukoza ^jest przemieniana w UDPGal pod wpływem opisanych powyŜej enzymów. UDPGal łączy się z glukozą tworząc laktozę. Proces ten jest katalizowany przez syntazę laktozową.

Niedobory enzymatyczne szlaku galaktozowego są przyczyną galaktozemii Niezdolność do metabolizowania galaktozy występuje w galaktozemiach, które mogą być powodowane wrodzoną wadą kaŜdego z enzymów zaznaczonych na ryc. 25-5 cyframi 1, 2, 3, chociaŜ niedobór urydylilotransferazy (2) jest

250 / ROZDZIAŁ 22

najlepiej poznany. Gal a ktoza której stęŜenie we krwi się zwiększa, jest w oku redukowana przez reduktaze aldozową do odpowiedniego poliolu (galaktytolu). Gromadzenie się galaktytolu w rogówce jest przyczyną występowania zaćmy. W przypadku wady ury dylil o tran sfe razy ogóiny stan chorego jesi cięŜki, poniewaŜ nagromadza się galaktozo-1 -fosforan, co pozbawia wątrobę zapasów nieorganicznego fosforanu. Końcowym skutkiem tej wady jest niedoczynność wątroby i zaburzenia umysłowe. Przy wrodzonym niedoborze urydylilotransferazy galaktozo-1-fosforanowej, dotyczącym zarówno wątroby, jak i erytrocytów (reakcja 2), epimeraza (reakcja 3) jest obecna w dostatecznej ilości, tak Ŝe chorzy z tą postacią galaktozemii mogą tworzyć UDPGal z glukozy. Wyjaśnia to, dlaczego u dotkniętych tą wadą dzieci jest moŜliwy normalny wzrost i rozwój, pomimo stosowania diety wolnej od galaktozy w celu zwalczania objawów choroby. Opisano kilka wad genetycznych, które polegają raczej na zmniejszonej ilości transferazy niŜ na jej całkowitym braku. PoniewaŜ enzym normalnie występuje w nadmiarze, zmniejszenie jego aktywności do 50% lub nawet mniejszej nie powoduje klinicznych objawów choroby, która pojawia się jedynie u homozygot. U niektórych chorych niedobór epimerazy dotyczy jedynie erytrocytów, a nie wątroby lub innych tkanek. W tych stanach choroba przebiega bezobjawowo. Glukoza jest prekursorem wszystkich aminocukrów (heksozoamin) (p. ryc. 22-6) Aminocukry są waŜnymi składnikami glikoprntein (p. rozdz. 57), niektórych glikosfingolipidów (np. gangliozydów) (p. rozdz. 16) oraz glukozoaminoglikanów (p. rozdz. 57). Głównymi aminocukrami są glukrwoamina, gnlaklozuamina i mannozoamina (wszystkie są heksozoammami) oraz związek 9-węglowy - kwas sjalowy. Głównym kwasem sjalowym znajdywanym w tkankach człowieka jest kwas N-acetyloneu-

raminowy (NeuAc). Zestawienie relacji po między aminocukrami przedstawiono na ryc. 22-6. NajwaŜniejsze są następujące fakty: 1. Glukozoamina jest głównym ammocukrem. Po wstaje ona jako glukozoam ino- 6 -fosforan z fruktozo-6-fosforanu przy uŜyciu glutaminy jako dawcy grupy aminowej. 2. Aminocukry występują głównie w formie N-acetylowanej. Dawcą grupy acetylowej jest acetylo-CoA. 3. N-Acetylomannozoammo-6-fosforan powstaje przez epimeryzację ghikozoam ino -6 -fosforan u. 4. NeuAc powstaje przez kondensację mannozoamino-6-fosforanu z fosfoenolopirogronianem. S. Galaktozoamina powstaje przez epi meryzację UDP-N-acetyloglukozoaminy (UDPGlcNAc) do UDP-N-acetylogalaktozoaminy (UDPGałNAc). 6, Nukleotydosacharydy są wykorzystywane do biosyntezy glikoprotein i innych złoŜonych związków. WaŜnymi nukleotydami zawierającymi aminocukry są: UDPGlcNAc, UDPGalNAc oraz CMP-NeuAc. PIŚMIENNICTWO
Huijing F: Textbook ermrs>: Galaetose metabolism and galactosemia. Trends Biochem Sei James HMeLal: Models forthemetabolicproduction of oxalate from xylitol in humans. Aust. J Exp Biol MedSci 1982;60:!17. Ka.dor PF: The role of aldose reductase in the development of diabetic complications. Med Res Rev 1988;8:325. Macdonald I, Vrana A {editors}: Metabolk Effects of Dietary Carbohydrates. Karger, 1986. Randle PJ, Steiner DF, Whclan WJ (editors): Carbohydrate Metabolizm and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Sperling O, de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. K_arger, 1978. Various authora: In: The Metabolic Basis oflnheńted Dhease, 6th ed. Serwer CR et al (editors). McGraw-Hill. 19S9. Wood T: The Pentose Phosphate Palhwaw Aeademit; Press; 1985.

Biosynteza kwasów tłuszczowych
Peter A. Mayes, PhD, DSc

23

WPROWADZENIE Podobnie jak przy innych procesach degradacji i syntezy (np. przy glikogenolizie i glikogenogenezie), do niedawna uwaŜano, Ŝe synteza kwasów tłuszczowych (iipogeneza) jest po prostu odwróceniem ich utleniania. Jednak obecnie wydaje się, Ŝe mitochondrialny układ syntezy kwasów tłuszczowych, zawierający pewne modyfikacje szlaku P-oksydacji, jest odpowiedzialny jedynie za przedłuŜanie (elongację) istniejących juŜ kwasów tłuszczowych o średniej długości łańcucha. Natomiast zupełnie odmienny i bardzo aktywny układ pozamitochondrialny jest odpowiedzialny za kompletną syntezę palmitynianu z acetylo-CoA. Aktywny uktad elongacji łańcucha występuje równieŜ w siateczce śródplazmatycznej wątroby. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Istnieje ogromna róŜnorodność między gatunkami zarówno co do rozmieszczenia szlaku lipogenetycznego w róŜnych tkankach, jak i głównych substratów do syntezy kwasów tłuszczowych. V szczura, gatunku, który dostarczył najwięcej wiadomości o lipogenezie. szlak ten jest obficie reprezentowany w tkance tłuszczowej i w wątrobie, podczas gdy u człowieka tkanka tłuszczowa nie jest istotnym miejscem lipogenezy, a wątroba ma stosunkowo małą aktywność. U ptaków Iipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona szczególnie istotna w tworzeniu jaj. U większości ssaków pierwotnym substratem do lipogenezy jest glukoza, ale u przeŜuwaczy rolę tę przejmuje octan, który jest głównym związkiem o znaczeniu

energetycznym wytwarzanym zpoŜywienia. PoniewaŜ u człowieka szlak lipogenezy moŜe mieć ograniczone znaczenie, nie jest zaskakujące, Ŝe nie donoszono dotychczas o istotnych chorobach z nim związanych. JednakŜe róŜnorodna jego aktywność u poszczególnych osobników moŜe być w istotny sposób znacząca dla istoty i rozmiarów otyłości. GŁÓWNY SZLAK SYNTEZY KWASÓW TŁUSZCZOWYCH DE NOVO (LIPOGENEZY) WYSTĘPUJE W CYTOZOLU Ten układ występuje w wielu tkankach, łącznie z wątrobą, nerkami, mózgiem, gruczołem sutkowym i tkanką tłuszczową. Do jego funkcjonowania są potrzebne takie kofaktory, jak NADPH, ATP, Mn2 + , biotyna, i HCO7 (jako źródło CO2). Bezpośrednim substratem jest acetylo-CoA, a końcowym produktem jest wolny palmitynian. Te cechy odróŜniają znacząco lipogeneze od p-oksydacji. Wytworzenie malonylo-CoA jest początkowym i kontrolującym etapem w syntezie kwasów tłuszczowych Wodorowęglan, jako źródło CO2, jest potrzebny w początkowej reakcji do karboksylacji acetylo-CoA do malonylo-CoA w obecności ATP i karboksylazy acetylo-CoA. Biotyna, będąca jedną z witamin, jest niezbędna do działania karboksylazy acetylo-CoA (ryc. 23-1). Enzym ten ma zmienną liczbę identycznych podjednostek, w kaŜdej są zawarte: biotyna, karboksylaza biotyny, białko nośnikowe karboksybiotyny, transkarboksylaza, jak równieŜ al-

252 / ROZDZIAŁ 23 CH 3 - CO -S -Co A Aoetyio-CoA Enz-biotyna-COOEnz-btotyna ■» - -O O C - CH 2 - CO -S - Co A Malotiyla-CoA

/£♦■ ADP+Pi ATP+HCO," + Era-Wotyna Ryc. 23-1. Biosynteza
malonylo-CoA. Enz — karboksytaza acetylo-CoA.

losteryczne miejsce regulatorowe. Jest to wiec białko wieloenzymowe. Reakcja zachodzi w 2 etapach: 1) karboksylacja biotyny (z udziałem ATP, p. ryc. 53-13) oraz 2) przeniesienie karboksylu na acetylo-CoA z wytworzeniem malonylo-CoA. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest polipeptydem zawierającym 6 enzymów Wydają się istnieć 2 typy układu syntazy kwasu tłuszczowego znajdującego się w rozpuszczalnej części komórki, U bakterii, roślin i niŜszych form poszczególne enzymy układu są oddzielne, a reszty acylowe występują w połączeniu z białkiem nazywanym białkiem przenoszącym acyl (ACP, ang.: Acyl Carrier Protein). JednakŜe u droŜdŜy, ssaków i ptaków układ syntazy jest kompleksem wieloenzymowym, którego nie moŜna rozdzielić bez utraty aktywności, a ACP jest częścią tego kompleksu. ACP zarówno bakterii, jak i kompleksu wieloenzymowego zawiera witaminę — kwas pantotenowy w postaci 4'-fosfopanteteiny (p. ryc. 53-6). W układzie tym ACP przejmuje rolę CoA. Połączenie wszystkich enzymów określonego szlaku metabolicznego w jedną funkcjonalną jednostkę wieloenzymową sprawia, Ŝe taki szlak jest bardzo wydajny i wolny od interferencji ze strony innych współzawodniczących o substraty procesów, przez co osiąga się, bez konieczności wytwarzania barier przepuszczalności, kompartmentację procesu w komórce. Inną zakta istnienia pojedynczego polipeptydu wieloenzymowego jest to. Ŝe wszystkie enzymy kompleksu są syntetyzowane w sposób skoordynowany. Kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jest dimerem (ryc. 23-2). U ssaków obydwa monomery są identyczne, kaŜdy z nich stanowi godny

uwagi pojedynczy polipeptyd, zawierający wszystkie 6 enzymów syntazy kwasu tłuszczowego oraz ACP z grupą — SH 4-fosfopanteteiny. W bezpośrednim sąsiedztwie tej grupy znajduje się inna grupa tiolowa reszty cysteiny, połączonej z syntazą 3-ketoacylową (enzymem kondensującym) drugiego monomeru (ryc. 23-2). PoniewaŜ obydwie grupy sulfhydrylowe uczestniczą w aktywności syntazy, jedynie cały dimer jest aktywny. Na początku inicjująca cząsteczka acetylo-CoA łączy się z grupą — SH cysteiny, co jest katalizowane przez transacylazę acetylową (ryc. 23-3). Malonylo-CoA łączy się z sąsiadującą grupą — SH 4'-fosfopanteteiny naleŜącej do ACP drugiego monomeru, co jest katalizowane przez transacylazę malonylową i wytwarza się aeetylo-(acylo)-malonyloenzym. Niedawne prace wykazały, Ŝe najprawdopodobniej transacylaza acetylową i transacyłaza malonyiowa jest tym samym enzymem (jak to pokazano na ryc. 23-2 i 23-3). Grupa acetylową atakuje grupę metylenową reszty malonylowej w reakcji katalizowanej przez syntazę 3-ketoacylu i uwalnia COa, tworząc 3-ketoacyloenzym (acetoacetyloenzym). To uwalnia grupę — SH cysteiny, związaną dotychczas przez grupę acetylową. Dekarboksylacja pozwala na zajście reakcji do końca dzięki temu, Ŝe działa jako siła pociągająca całą sekwencję reakcji. Powstała grupa 3-ketoacylowa zostaje zredukowana, odwodniona i ponownie zredukowana, aby utworzyć odpowiedni nasycony acyto-S-enzym. Te reakcje są analogiczne do tych, które zachodzą w p-oksydacji, z wyjątkiem tego, Ŝe 3-hydroksykwas jest izomerem D(—) a nie L( +), oraz Ŝe NADPH słuŜy jako dawca wodoru, a nie NADH w obu redukcjach. Nowa cząsteczka malonylo-CoA łączy się z grupą — SH 4'-fosfopanteteiny, wypierając nasyconą resztę acylową na wolną grupę —SH cysteiny. Ta sekwencja reakcji

Podział funkcjonalny

Podział

4'-F osfop a ntetaln a SH

SH 4'-F(»topani8telna

podjednostek

w o

1
5
>

I
Ryc. 23-2. Wieloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego. Kompleks jest dimerem o 2 identycznych monomerach polipeptydowych, 1 i 2, kaŜdy składający się z 6 oddzielnych aktywności enzymatycznych i białka przenoszącego acy I (ang.: AcylCarrier Protein—ACP). Cys-SH —grupa sulf hydry Iowa cysteiny. Grupa -SH 4'-fosfopanteteiny jednego monomeru jest w bliskim sąsiedztwie grupy -SH cysteinylowej reszty syntazy ketoacylowej drugiego monomeru, co sugeruje ułoŜenie „głowa do ogona" obu monomerów w stosunku do siebie. Szczegółowe ułoŜenie sekwencji enzymów w kaŜdym z monomerów jest hipotetyczne (na podstawie danych Tsukamoto). ChociaŜ kaŜdy z monomerów zawiera wszystkie cząstkowe aktywności ciągu reakcji, rzeczywista funkcjonalna jednostka składa się z połowy monomeru współdziałającej z komplementarną polową drugiego monomeru. Wobec tego 2 łańcuchy acylowe są wytwarzane równocześnie.

I
c < n
IM W W

Acetylo-CoA Pan — SH HS-c HS -P a n Wisloenzymowy kompleks syntazy kwasu tłuszczowego Matonyio-CoA Przeniesienie C„ z

CoA (Cj albo cn)

- C l ) - Cys — S~C — O1 3

Aoyto (aoetylo Jmalonylo-enzym

*co.
Cys - SH

SYNTAZA 3KETOACYLOWA

O -( a }-Pan— S ~ C — CH2 — C — CH3 3- Kato acylc-enzy m (aceto acetyio-enzy m) NADPH + H+ REDUKTAZA 3KETOACYLOWA NADP+

s-SH
O OH I CH,

-T2_)-Pan-S~C-CH2-CHD(-)-3-HydroksyacyloB nzym HYDRATAZA Dehydrogenaza izooytrynlanowa

W

i-SH -(2)- Pan -S ~ C - CH = CH - CH,
NADPH t H+ NADP + ^~ H,0 Tloesleraza SH "(T>Cy S J — ^ -

2,3-Nlenasycony acytoenzym REDUKTAZA ENOILOWA

V
Po 7-Krotnym cyklicznym praejtclu przez eta^

-( 2 }-Pan-S ~C—CH2 —CHa—CH3 Acyloenzym

PalmKynlan

Ryc. 23-3. Biosynteza kwasów tłuszczowych o dtugim łańcuchu. Szczegóły wskazują, jak dodawanie reszty malonylowej powoduje, Ŝe łańcuch acylowy wydłuŜa się skokowo po 2 atomy węgla Ćys — reszta cysteiny, pan — 4'-fosfopanteteina. Szczegóły budowy dimeru syntazy kwasu tłuszczowego przedstawiono na ryc. 23-2. (J) i (2) przedstawiają poszczególne monomery syntazy kwasu tłuszczowego. 2 łańcuchy acyiowe są syntetyzowane równocześnie na 1 dłmerze przy uŜyciu kaŜdej pary grup SH Cys/pan.

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 255
AcyloglicerolB Estry cholesterolu

ATP + CoA

AMP + PP:
Estryfikacja

Palmltynlan. SYNTETAZA ACYLO-CoA

Paimltollo-CoA Elongacja łańcucha, desaturacja Acylo-CoA

Ryc. 23-4. Los palmitynianu po jego biosyntezie

powtarza się jeszcze 6 razy, za kaŜdym razem włącza się nowa reszta malonylowa, aŜ do powstania ló-węglowego (palmityłowego) rodnika. Jest on uwalniany z kompleksu enzymatycznego działaniem 6. enzymu znajdującego się w kompleksie, tioesterazy (deacylazy). Wolny palmitynian musi zostać zaktywowany do acylo-CoAzanim będzie mógł wejść do jakiegokolwiek innego szlaku metabolicznego. Zazwyczaj jego losem jest estryfikacja do acylogliceroli (ryc. 23-4). W gruczole sutkowym istnieje oddzielna tioesteraza swoista dla reszt acylowych C8, C10 lub C12, które następnie znajdują się w tłuszczu mleka. W gruczole sutkowym przeŜuwaczy ten enzym jest częścią kompleksu syntazy kwasu tłuszczowego. Wydają się istnieć 2 centra aktywności w jednym dimerycznym kompleksie, które działają niezaleŜnie, tworząc równocześnie 2 cząsteczki palmitynianu. PoniŜej przedstawiono sumarycznie równanie całkowitej syntezy palmitynianu z acetylo-CoA i malonylo-CoA:
CH,CO-S-CoA + 7HOOC-CH 3 C0-S-CoA t + 14NADPH + 14H+ -> ^CHatCHJ^COOH + 7CO 3 + 6H 2 O + + SCoA-SH + 14NADP
1

tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla. Występują one zwłaszcza u przeŜuwaczy, u których propionian powstaje pod wpływem działania mikroorganizmów w Ŝwaczu. Głównym źródłem równowaŜników redukujących (NADPH) jest szlak pentozofosforanowy NADPH jest zaangaŜowany, jako koenzym, w redukcję zarówno 3-ketoacylopochodnych, jak i acylowych pochodnych 2,3-nienasyconych. Oksydacyjne reakcje szlaku pentozofosforanowego (p. str. 240) są głównym źródłem wodorów niezbędnych do redukcyjnej syntezy kwasów tłuszczowych. Jest znamienne, Ŝe tkanki, które wykazują aktywny szlak pentozofosforanowy, są takŜe tkankami wyspecjalizowanymi w aktywnej lipogenezie; są to wątroba, tkanka tłuszczowa i gruczoł sutkowy w okresie laktacji. Co więcej, obydwa szlaki metaboliczne znajdują się w pozamitochondrialnej przestrzeni komórki, lak Ŝe nie istnieją błony, ani inne bariery do przenoszenia NADPH/NADP od jednego szlaku do drugiego. Innymi źródłami NADPH jest reakcja, która przekształca jabłczan w pirogronian, katalizowana przez „enzym jabłczanowy" (dehydrogenaza jabłczanowa dekarboksylująca) (ryc. 23-5) oraz pozamitochondrialna reakcja dehydrogenazy izocytrynianowej (prawdopodobnie nie jest to istotne źródło). Acetylo-CoA jest głównym budulcem kwasów tłuszczowych Jest on wytwarzany z węglowodanów przez utlenianie pirogronianu wewnątrz mitochondriów. JednakŜe acetylo-CoA nie przenika swobodnie do kompartmentu pozamitochondrialnego, zasadniczego miejsca syntezy kwasów tłuszczowych. Aktywność pozamitochondrial-

Z acetylo-CoA, uŜytego jako cząsteczka inicjująca, tworzą się atomy węgla 15 i 16 palmitynianu. Dodawanie wszystkich następnych jednostek dwuwęglowych odbywa się przez uprzednie tworzenie malonylo-CoA. Jako cząsteczka inicjująca w wątrobie i gruczole sutkowym ssaków moŜe działać butyrylo-CoA. JeŜeli propionylo-CoA działa jako cząsteczka inicjująca, powstają dlugołańcuchowe kwasy

256 / ROZDZIAŁ 23

Glukoza

Glukozo-6fosforan

Fruktozo6-fosforan

Glloeraldeh yd o-3DEHYDROGENAZA 3-FOSFOGUCEHALDEHYDOWA

Cytrynian WEWNĘTRZN A BŁONA MITOCHON DRIALNA Piróg rc n ian. -:' ; ' - ' ' Strona zewnętrzna A DEHYDR0G6MAZA S PtROGHONIANOWA^ OEHYDROGENAZA IZOCYTRYNtANOWA

Cykl kwasu

;y-Vj rsrtmntan

mmmmK

Paimltynla

n

Ryc. 23-5. Dostarczanie acetyl o-Co A i NADPH dla lipogenezy. PP — sztak pentozofosforanowy: T— przenośnik trikarboksylanów, K —- przenośnik a-ketoglutaranu.

nej liazy ATP-cytrynianowej, podobnie jak i „enzymu jabłczanowego", zwiększa się w stanie dobrego odŜywienia, zachowując się równolegle do aktywności układu syntetyzującego kwasy tłuszczowe (tab. 21-1). Obecnie uwaŜa się, Ŝe zuŜywanie pirogronianu do lipogenezy odbywa się przez cytrynian. Ten szlak obejmuje

glikolizę, po której następuje oksydacyjna dekarboksylacja do acetylo-CoA wewnątrz mitochondrium i następnie kondensacja ze szczawiooctanem do cytrynianu, jako część szlaku kwasu cytrynowego. Potem następuje tramslokacja cytrynianu do kompartmcntu pozamitochondrialnego, gdzie, w obecności CoA i ATP,

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 257

ulega on rozszczepieniu do acetylo-CoA i szczawiooctanu, co jest katalizowane przez liazę ATP-cytrynianową. Ten aeetylo-CoA jest wówczas dostępny do tworzenia malonylo-CoA i syntezy palmitynianu (ryc. 23-5). Szczawiooctan moŜe tworzyć jablczan pod wpływem działania NADH-zaleŜnej dehydrogenazy jabłczanowej, po czym następuje wytwarzanie NADPH pod wpływem enzymu jabłczanowego. Ten NADPH z kolei staje się dostępny do lipogenezy. Ten szlak jest sposobem przeniesienia równowaŜników redukujących z pozamitochondrialnego NADH na NADP. Inną alternatywą dla jablczanu jest jego przetransportowanie do mitochondrium, gdzie moŜe on przejść ponownie w szczawiooctan. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe przenośnik cytrynianu (trikarboksylanów) ■•' błonie mitochondrialnej wymaga jabłczanu do wymiany z cytrynianem (p. ryc. 14-16). U przeŜuwaczy niemal nie ma liazy ATP-cytrynianowej ani enzymu jabłczanowego, prawdopodobnie dlatego, Ŝe u tych gatunków octan (pochodzący z Ŝwacza) jest głównym źródłem acetylo-CoA. PoniewaŜ octan jest pozamitochondrialnie aktywowany do acetylo-CoA, nie ma potrzeby, aby wnikał on do mitochondriów i tworzył cytrynian przed inkorporacją w długołańcuchowe kwasy tłuszczowe. U tych gatunków, ze względu na brak enzymu jabłczanowego, znacznie większe znaczenie ma wytwarzanie NADPH działaniem pozamitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynia nowej. Elongacja łańcucha kwasów tłuszczowych zachodzi w siateczce śródplazmatycznej Ten szlak (elongacyjny układ mikrosomainy) przekształca acylo-Co A-pochodne kwasów tłuszczowych w pochodne acylowe, mające o 2 atomy węgla więcej, przy uŜyciu malonylo-CoA jako dawcy acetylu oraz NADPH jako czynnika redukującego. Związkami pośrednimi w tym procesie są tioestry CoA. Grupy acylowe, które mogą działać jako cząsteczki inicjujące, obejmują serię nasyconych kwasów tłuszczowych od Clo wzwyŜ, jak równieŜ nienasycone kwasy thiszczowe. Głodzenie w znacznej mierze znosi elongację łańcucha. Eiongacja stearylo-CoA w mózgu przyspiesza się w okresie mielinizacji, aby dostarczyć kwasów tłuszczowych C22 i C24, które występują w sfingolipidach (ryc. 23-6).

0 l + •CH1-»C -S-CoA I 'COOH
Malonylo-CoA

Acylo-CoA

SYNTAZA 3-KETOACYLO-CoA

Co A*SH+ ł CO,

R -CH, -O C I -'ICHI -*C - S - CoA 3Koioaoylo-CoA

■NAOPH + REDUKTAZA 3KETOACYLO-CoA

H

O

R-tHj-^H-fCHjJC - S-CoA 3-HydroksyacyloXoA

HYDRATAZA

^CH-Jfi - S-CoA 2,3-N<enasycony ac/lo^CoA NADPH + H + REDUKTAZA 2,3-NSENASYCONYCH ACYLO-CoA NADP*

:-JCH,-?<!!~S-CoA Acylo-CoA

Ryc. 23-6. Mikrosomalny układ elongacji łańcucha {elongaza).

258 / ROZDZIAŁ 23

STAN ODśYWIENIA REGULUJE LIPOGENEZĘ Wiele zwierząt, łącznie z człowiekiem, przyjmuje pokarm jako oddzielone czasem posiłki i dlatego magazynuje wiele energii pochodzącej z poŜywienia, aby móc ją uŜytkować między posiłkami. Proces lipogenezy dotyczy przekształcenia glukozy i takich związków pośrednich, jak pirogronian, mleczan i acetylo-CoA w tłuszcz, co stanowi anaboliczną fazę tego cyklu. Stan odŜywienia organizmu i tkanki jest głównym czynnikiem kontrolującym szybkość lipogenezy. I tak szybkość ta jest duŜa u dobrze odŜywionego zwierzęcia, którego dieta zawiera duŜo węglowodanów. Zmniejsza się w warunkach ograniczonego dostarczania energetycznego pokarmu, pokarmu boga to tłuszczowego, lub gdy istnieje niedobór insuliny, jak to jest w cukrzycy. Warunki te są związane ze zwiększonym stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Regulacja mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej jest opisana w rozdz. 27. Istnieje odwrotna zaleŜność miedzy wątrobową lipogenezą a stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy (ryc. 23-7). Największe zahamowanie lipogenezy występuje w zakresie zmian stęŜeń wolnych kwasów tłuszczowych o 0,3—0,8 jamot/ml osocza. StęŜenia te w osoczu krwi zmieniają się o podany zakres podczas przejścia ze stanu sytości w stan 2,0 3,0 głodzenia.
0.5 1J0 WKTw surowicy (fimol/ml)

Tłuszcze zawarte w poŜywieniu powodują takŜe zmniejszenie lipogenezy w wątrobie. JeŜeli ich zawartość w poŜywieniu przekracza 10%, to nie ma przekształcania węglowodanów poŜywienia w tłuszcze. Lipogenezą jest większa wówczas, gdy sacharoza zastąpi glukozę w pokarmie, poniewaŜ fruktoza omija etap kontrolny glikoiizy, jakim jest fosforruktokinaza i zalewa szlak lipogenezy (p. ryc. 22-4). LIPOGENEZĄ JEST REGULOWANA POPRZEZ MECHANIZMY KRÓTKOTERMINOWE I DŁUGOTERMINOWE Synteza długołańcuchowa kwasów tłuszczowych w trybie krótkotrwałym jest kontrolowana przez allosteryczne i kowalencyjne modyfikacje enzymów, a w dłuŜszym czasie przez zmiany szybkości syntezy i degradacji odpowiednich enzymów. StęŜenie cytrynianu i acylo-CoA reguluje karboksylazę acetylo-CaA Reakcja ograniczająca szybkość szlaku lipogenezy znajduje się na etapie karboksylazy acetyio-CoA. Ta karboksylaza jest aktywowana przez cytrynian, którego stęŜenie się zwiększa w stanie dobrego odŜywienia i który jest wskaźnikiem obfitego dostarczania acetylo-CoA. JednakŜe jest ona hamowana działaniem cząsteczek acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, co jest przykładem hamowania zwrotnego przez końcowy produkt ca^go ciągu reakcji. Wobec tego, jeŜeli nagromadza się acylo-CoA, poniewaŜ nie jest on dostatecznie szybko estryfikowany, automatycznie zmniejsza się synteza nowych kwasów tłuszczowych. Podobnie, gdy acylo-CoA nagromadza się w wyniku wzmoŜonej lipolizy lub dopływu wolnych kwasów tłuszczowych do tkanki, wówczas równieŜ następuje zahamowanie syntezy nowych cząsteczek kwasu tłuszczowego. Acylo-CoA moŜe równieŜ hamować transporter trikarboksy łanów i wobec lego zapobiegać wychodzeniu cytrynianu z mitochondriów do cytozolu. Dehydrogenaza piróg ronią nowa jest takŜe regulowana przez acylo--CoA Istnieje odwrotna zaleŜność między stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych, a proporcją aktywnej postaci dehydrogenazy pirogro-

Ryc. 23-7. Bezpośrednia inhibicja wątrobowej lipogenezy przez wolne kwasy tłuszczowe. Lipo-genezę oceniano oznaczając 3 wbudowywanie trytu H2O do wolnych kwasów tłuszczowych w perfun-dowanej wątrobie. WKT —, wolne kwasy tłuszczowe. (Doświadczenia z laboratorium autora wspólnie z D.L. Toppingiem).

BIOSYNTEZA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH / 259

nianowej do nieaktywnej, co reguluje dostępność ace.tylo-CoA dla lipogenezy. Acylo-CoA powoduje zahamowanie aktywności dehydrogenazy pirogronianowej przez hamowanie wymiennego transportera ATP-ADP wewnętrznej błony mitochondrialnej, co prowadzi do zwiększenia wewnątrzmitochondrialnego stosunku [ATP] / jADP] i w konsekwencji do przekształcenia aktywnej postaci dehydrogenazy pirogronianowej w nieaktywną (p. ryc. 24-4). Ponadto utlenianie acylo-CoA, spowodowane zwiększonym stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych, moŜe powodować zwiększenie stosunku [acetylo-CoA] / [CoA] oraz [NADH] / [NAD+] w mitochondriach hamując w ten sposób dehydrogenazę pirogronianową. Hormony regulują równieŜ lipogenezę Insulina pobudza lipogenezę za pomocą kilku mechanizmów. Wzmaga transport glukozy do komórki (np. w tkance tłuszczowej) i przez to zwiększa dostępność zarówno pirogronianu do syntezy kwasów tłuszczowych, jak i glicerolo-3-fosforanu do estryfikacji kwasów tłuszczowych. Insulina zmienia nieaktywną postać dehydrogenazy pirogronianowej w aktywną, ale czyni to w tkance tłuszczowej, a nie w wątrobie. Ponadto karboksylaza acetyl o-Co A jest enzymem, który moŜe być regulowany przez odwracalną fosforylację. Insulina aktywuje karboksylazę acetylo-CoA, zapewne przez aktywację fosfatazy białek. TakŜe insulina, przez jej zdolność zmniejszania stęŜenia cAMP w komórce, hamuje lipolizę i przez to zmniejsza stęŜenie acylo-CoA o długim łańcuchu węglowym, będącego inhibitorem lipogenezy. Za pomocą tego samego mechanizmu insulina staje się antagonistą działania glukagonu i adrenaliny, które hamują karboksylazę acetylo-CoA, a więc i lipogenezę, dzięki zwiększeniu stęŜenia cAMP i umoŜliwieniu cAMP-zaleŜnej kinazie białek unieczynnienie enzymu przez fosforylację. Ostatnio opisano AMP-zaleŜną kinazę Watek, która wykrywa stan małej energii w komórce, wykazując wraŜliwość na zwiększone stęŜenie AMP. Ta nowa kinaza takŜe inaktywuje

przez fosforyiacj^ karboksyiaze acetylo-CoA. Ponadto aminy katecholowe hamują ten enzym przez receptory a-adrenergiczne i kinazę białek zaleŜną od Ca2+/kalmoduliny. U przeŜuwaczy octan, a nie glukoza, jest materiałem wyjściowym do lipogenezy. Następstwem tego jest to, Ŝe u tych zwierząt wiele mechanizmów regulacyjnych z udziałem mitochondriów nie ma zastosowania. Zarówno kompleks syntazy kwasu tłuszczowego jak i karboksylaza acetylo-CoA są ezymami adaptacyjnymi Adaptują się one do fizjologicznych potrzeb organizmu przez zwiększenie ich całkowitej ilości w stanie sytości, a zmniejszenie w głodzie, karmieniu tłuszczem i w cukrzycy. Insulina jest waŜnym hormonem powodującym indukcję biosyntezy enzymu, a przeciwdziała temu glukagon. Musi upłynąć kilka dni, aby te działania uwidoczniły się i wzmagały bezpośredni i natychmiastowy efekt wolnych kwasów tłuszczowych oraz takich hormonów, jak insulina i glukagon.

PIŚMIENNICTWO
Goodridge AG: Fatty acid synthesis in eukaryotes. Page 143 in: Biochemistry ojLipids andMembranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Goodridge AG: Dietary regulalion of gene expression: Enzymes involved in carbohydrate and lipid metabolism. Annu Rev Nuir 1987; 7:157. Hardie DG, Carling D, Sim ATR: The AMP-activated protein kinase: a multisubsiratę regulator of lipid metabolism. Trends Biochem Sci 1989; 14; 20. Singh N, Wakil SJ, Stoops JK: On the question of half-or full-site reactivity of animal fatty acid synthetase. J Biol Chem 1984; 259:3605. Tsukamoto Y et al: The architecture of the fatty acid synłhetasecotccia. JBkAChem 1983; 258:15312. Wakil SJ, Stoops JK, Joshi VC: Fatty acid synthesis and its regulation, Annu Rev Biochem 1983; 52:537.

24
WPROWADZENIE

Utlenianie kwasów tłuszczowych: Ketogeneza
Peter A. Mayes, PhD, DSc

Kwasy tłuszczowe są utleniane zarówno do acetylo-CoA, jak i są syntetyzowane z acetylo-CoA. Jakkolwiek materiał wyjściowy jednego procesu jest identyczny z produktem drugiego procesu, a chemiczne etapy pośrednie zaangaŜowane w obydwa procesy są porównywalne, to jednak utlenianie kwasów tłuszczowych nie jest zwyczajnym odwróceniem ich biosyntezy, lecz zupełnie odmiennym procesem, zachodzącym w innym kompartmencie komórki. Oddzielenie utleniania kwasów tłuszczowych od ich biosyntezy umoŜliwia indywidualną kontrolę kaŜdego z tych procesów i ich integrację z potrzebami tkanki. Utlenianie kwasów tłuszczowych zachodzi w mitochondriach. W kaŜdym jego etapie uczestniczy pochodna acylo-CoA i kaŜdy etap jest katalizowany przez oddzielny enzym. Koenzymami tego procesu są NAD i FAD. W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych powstaje ATP. W odróŜnieniu od utleniania, biosynteza kwasów tłuszczowych (lipogeneza) odbywa się w cytozolu. Uczestniczą w niej acylowe pochodne związane z wieloenzymowym kompleksem, NADP jako koenzym, i jest potrzebny ATP oraz jon wodorowęglanowy. Utlenianie kwasów tłuszczowych jest procesem aerobowym, wymagającym obecności tlenu.

powstawania ciał ketonowych* w wątrobie (ketoza). Ciała ketonowe są kwasami. JeŜeli są wytwarzane w nadmiarze przez długi czas, jak to ma miejsce w cukrzycy, to mogą być przyczyną kwasicy ketonowej (ketoacidosis), która nie leczona moŜe być zgubna w skutkach. PoniewaŜ glukoneogeneza jest zaleŜna od utleniania kwasów tłuszczowych, kaŜde zmniejszenie ich utleniania prowadzi do hipoglikemii. Taka sytuacja ma miejsce w róŜnych stanach niedoboru karnityny lub enzymów istotnych w utlenianiu kwasów tłuszczowych (np. palmitoilotransferazy karnitynowej), albo pfzy zahamowaniu utleniania kwasów tłuszczowych spowodowanym truciznami (np. hipoglicyną).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ZACHODZI W MITOCHONDRIACH Kwasy tłuszczowe są transportowane we krwi jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT, FFA)
Określenie „wolne kwasy tłuszczowe" (ang. free fatty acids) odnosi się do kwasów tłuszczowych, które występują w stanie niezestryfikowanym. Alternatywnymi skrótami są UFA (ang.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
WzmoŜone utlenianie kwasów tłuszczowych jest charakterystyczne dla stanu głodzenia i cukrzycy (diabetes mellitits/. Jest ono przyczyną

*W języku polskim określenie „ciała ketonowe" (ketone bodies) było wielokrotnie przedmiotem krytyki. Zastąpiono je określeniem „związki ketonowe", mając na myśli 3 substancje, tj. aceton, acetooctan i p-bydroksymaślan. Określenie „ciała ketonowe" pozostawiono na wyraźne Ŝyczenie Tłumacza (przyp. red. i wyd.).

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 261

unesterified fatty acids) lub NEFA (ang. non-estenfię.d fatty acids). W osoczu WKT o dłuŜszym łańcuchu węglowym są związane z albuminą, zaś w komórkach z białkiem wiąŜącym kwasy tłuszczowe albo z białkiem Z. W rzeczywistości kwasy te nigdy nie występują w stanie „wolnym1'. Kwasy tłuszczowe o krótszym łańcuchu są lepiej rozpuszczalne w wodzie i występują w postaci niezjonizowanych kwasów lub anionów kwasu tłuszczowego. Kwasy tłuszczowe muszą być aktywowane, aby mogły być metabolizowane Podobnie jak to ma miejsce z przemianą glukozy, kwasy tłuszczowe muszą najpierw w reakcji z udziałem ATP zostać zamienione w aktywny metabolit, aby mogły reagować z enzymami odpowiedzialnymi za ich dalszy metabolizm. W całym szlaku całkowitej degradacji kwasów tłuszczowych jest to jedyny etap, który wymaga energii zawartej w ATP. W obecności ATP i koenzymu A, enzym — syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) — katalizuje przemianę kwasu tłuszczowego, tj. wolnego kwasu tłuszczowego w „aktywny kwas tłuszczowy'*, czyli w acylo-CoA. Reakcja ta jest związana z wydatkiem 1 bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego.
SYNTETAZA ACYLO-CoA

Kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu przenikają przez wewnętrzną błonę mitochondrialną jedynie w połączeniu z karnityną Karnityna (p- hy droksy-y-trimety loaminomaślan), (CH 3 ) 3 N+-CH 2 -CH(OH)-CH 2 -— COO~, jest szeroko rozpowszechniona, a szczególnie obficie występuje w mięśniach. Jest syntetyzowana z iizyny i metioniny w wątrobie i nerkach. Aktywacja niŜszych kwasów tłuszczowych i ich utlenianie moŜe zachodzić w mitochondriach niezaleŜnie od karnityny. W odróŜnieniu od krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych WKT o długim łańcuchu nie wnikają do mitocbondriów i nie są utleniane bez uprzedniego przekształcenia w acylo karnityny.
Acylo-CoA + Karnityna --------------------------►
PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

> Acylo karnityna + CoA

Kwas tłuszczowy + ATP + Co A ---------------» - Acylo-CoA + PP, + AMP

Obecność pir o fosfatazy nieorganicznej sprawia, Ŝe aktywacja przebiega do końca dzięki ułatwieniu utraty dodatkowego bogatoenergetycznego wiązania fosforanowego pirofosforanu. W rzeczywistości w czasie aktywacji kaŜdej cząsteczki kwasu tłuszczowego są wiec wydatkowane 2 bogatoenergetyczne wiązania fosforanowe.
PPi + HaO
PIR0FOSFATA2A NIEORGANICZNA

Enzym, palmitoilotransferaza karnitynowa 1, znajdujący się po wewnętrznej stronie zewnętrznej błony mitochondrialnej, katalizuje przekształcenie długołańcuchowych acylo-CoA w acylokarnitynę, która przenika do mitochondriów, przez co kwasy tłuszczowe stają się dostępne dla enzymów szlaku p-oksydacji. Translokaza karnitynoacylokarnitynowa działa jako błonowy wymienny przenośnik karnityny. Transport acy lokami ty ny do wnętrza mitochondriów jest sprzęŜony z przeniesieniem 1 cząsteczki karnityny na zewnątrz. W mitochondrium acylokarnityna reaguje z CoA, w wyniku czego powstają acylo-CoA i wolna karnityna uwalniane do macierzy mitochondriainej. Reakcja ta jest katalizowana przez palm i to i to transfer a «■ ka mity nową II, związaną z wewnętrzną powierzchnią wewnętrznej błony mitochondrialnej (ryc. 24-1). W mitochondriaeh występuje jeszcze inny enzym, acetylotransferaza karnitynowa, katalizujący przenoszenie grup acy 1 owych o krótkim łańcuchu węglowym między CoA a kamityną. Funkcja tego enzymu jest niejasna. Jest moŜliwe, Ŝe ułatwia on transport grup acetyl owych przez błonę mitochondrialną.
Acetylo-CoA + Karnityna
ACETYLOTRANSFERAZA KARNITYMOWA

Syntetazy acylo-CoA występują w siateczce śródplazmatycznej, w obrębie mitochondriów i na zewnętrznej błonie mitochondrialnej. Opisano kilka syntetaz acylo-CoA. KaŜda z nich jest swoista wobec kwasów tłuszczowych o określonej długości łańcucha.

Acetylokarnttyna +■ CoA

262 / ROZDZIAŁ 24
Strona FFA zewnętrzna SYNTETAZA ACYLO-Co/ł CoA

ZEWNĘTRZNA ■-tM
BŁONA l.>'£i;.'>j

MITOCHONDFNALNA
■ . . ■ ■ . . : . . :

Acytokarnltyna PALMITOILORANSFERAZA KARNffYNOWAf RANSLOKAZA, WEWNĘTRZNA KARNITYNA-> i ł B Ł O N A , ^. ACYLOMITOCHONDRIALNA RNITYN Strona wewnętrzna Karnityna Acylo-CoA PALMITO1LOTRANSFERAZA RNITY-A l l

p-Oksydacja kwasów tłuszczowych polega na kolejnym odczepianiu r uwalnianiu acetyło-CoA W p-oksydacji (ryc. 24-2) odczepiane są od cząsteczek acylo-CoA, począwszy od końca karbonylowego, reszty dwuwęglowe. Łańcuch jest rozrywany pomiędzy atomami węgla a (2) 1 p (3) i stąd nazwa ^-oksydacja. Powstające jednostki dwuwęglowe to cząsteczki acetylo-CoA; tak wiec z palmitoilo-CoA tworzy się S cząsteczek acetylo-CoA. W cyklicznej sekwencji reakcji są wytwarzane NADH i FADH 2 Kilka enzymów, znanych pod zbiorczą nazwą „oksydaza kwasów thiszczowych", znajduje się w macierzy mitochondrialnej w pobliŜu łańcucha oddechowego (który jest umiejscowiony w wewnętrznej Honie mitochondrialnej). Katalizują one utlenianie acyio-CoA do acetylo-CoA, co wiąŜe się z fosforylacją ADP do ATP (ryc. 24-3). Po wniknięciu reszty acylowej przez wewnętrzną błonę mitochondrialną za pośrednictwem uktadu transportującego karnitynę i po odtworzeniu acyio-CoA, następuje oderwanie 2 atomów wodoru od atomów węgla 2 (a) i 3 (p), katalizowane przez dehydrogenazę acylo-CoA. W wyniku tej reakcji powstaje A2-tranj-enoilo-CoA. Koenzymem tej dehydrogenazy jest flawoproteina zawierająca FAD jako grupę pro-

A cv I o kar nity na

0-OksydtcJa Ryc. 24-1. Rola karnityny w transporcie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Oługołańcuchowy acylo-CoA nie moŜe przenikać przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, ale produkt jego metabolizmu, acylokarnityna, ma tę zdolność.

CO-S-CoA
Acetylo-CoA Kolejne usuwanie jednostek dwuwęglowych

co-s-coA+a

8 CH3-CO-S-CoA Acetylo-CoA Ryc. 24-2. Ogólny schemat [i-oksydscji kwasów tłuszczowych.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 263 Kwas tłuszczowy CoA-SH SYNTETAZA ACYLO-CoA Aoyto-Co* (Aktywny Kwas tłuszczowy) ATP ^ł* AMP-ł- PP, i. 0

R^CHr *CHrC - S -CoA i (zewnętrzna) strona cytoplazmatyczna

WEWNĘTRZNA BLDNAMITOCHONDHIALNA

TRANSPOHTER KARNITYNOWY (wewnętrzna) strona mltochoncfrlatna S-CoA

'CH DEHYDBOGENAZA] ACYLO-OoA

j -C -

(Flawoprotaina) 2~(P; -»-H,0 Łańcuch Q oddechowy

A'-S»n*Enolło-CoA

R-S CH = H -C -S -

CoA

HYDRATAZA A"ENOILO-CnA

H,0

-CoA

RJCH-JCH

?H ł

3

-C-

S -C o A

DEHYDROGENAZA L( + )-^KYDROKSYACYLO-CoA «:« »Xatoacylo-CoA R -3 CoA-SH 2CO, Łańcuch oddechowy

3-©
H,0

(4)

3-KETOACYLOTIOLAZA TIOLAZA

Ryc. 24-3. [J-Oksydacja kwasów tłuszczowych. Długołańcuchowy acylo-CoA przechodzi cyklicznie przez reakcje 2-5, a w kaŜdym cyklu jest odczepiany acetylo-CoA działaniem tiolazy (reakcja 5). Gdy pozostanie reszia acyiowa o długości jedynie 4 atomów węgla, wówczas w reakcji 5 wytwarzają się 2 cząsteczki acetylo-CoA

264 / ROZDZIAŁ 24

stetyczną. Reoksydacja tej grupy prostetycznej przez łańcuch oddechowy wymaga pośrednictwa innej fiawoproteiny nazwanej flawoproteiną przenoszącą elektrony. Wysyccnic podwójnego wiązania i wytworzenie 3-hydroksyacylo-CoA odbywa się przez przyłączenie cząsteczki wody, co katalizowane jest przez enzym hydratazę A2-enoilo-CoA. Pochodna 3-hydroksylowa ulega dalszemu odwodorowaniu na węglu 3 pod wpływem dehydrogenazy L(+)-3-hydroksyacylo-CoA, W wyniku tej reakcji powstaje odpowiedni 3-ketoacylo-CoA. W reakcji tej MAD, a nie FAD jest koenzymem uczestniczącym w odwodorowaniu. W końcu 3-ketoacylo-CoA jest rozrywany w pozycji 2,3 przez tiolazę (3-ketoacylotiolazę aibo poprą wnie: acetyl o trans ferazę acetylo-CoA), katalizującą tiolityczne rozerwanie wiązania z udziałem drugiej cząsteczki CoA. Produktami tej reakcji są acetylo-CoA i acylo-CoA zawierający o 2 atomy węgla mniej niŜ pierwotna cząsteczka acy-loCoA, która uległa utlenieniu. Utworzony w reakcji rozszczepienia acylo-CoA ponownie wchodzi w szlak oksydacyjny rozpoczynający się reakcją 2 (ryc. 24-3), W ten sposób długi łańcuch kwasu tłuszczowego moŜe zostać całkowicie rozłoŜony na acetylo-CoA (jednostki C2), PoniewaŜ acetylo-CoA moŜe być utleniony do CO2 i wody w cyklu kwasu cytrynowego (który takŜe jest umiejscowiony w mitochondriach), kwasy tłuszczowe mogą ulegać całkowitemu utlenieniu.

prowadzi do syntezy 5 bogatoenergetycznych wiązań fosforanowych (p. rozdz. 14) na kaŜdą z pierwszych 7 cząsteczek acetylo-CoA utworzonych przez P-oksydację palmitynianu ( 7 x 5 = 35), W sumie wytwarza się 8 mol acetylo-CoA, z których kaŜdy moŜe dostarczyć 12 wiązań o duŜej energii przez utlenienie w cyklu cytrynianowym. Ogółem powstaje więc 8 x 1 2 = 96 wiązań bogatoenergetycznych pochodzących z utlenienia cząsteczek acetylo-CoA utworzonych w wyniku rozpadu palmitynianu. Po odjęciu 2 wiązań bogatoenergetycznych na początkową aktywację kwasu tłuszczowego zysk netto wynosi 129 wiązań bogatoenergetycznych na mol utlenionego palmitynianu albo 129 x 30,5 = 3935 kJ. Swobodna energia spalania kwasu palmitynowego wynosi 9791 kJ/mol, wobec czego w omawianym procesie przetworzeniu na energię zawartą w bogatoenergetycznych wiązaniach fosforanowych ulega ok. 40% całkowitej energii spalania kwasu tłuszczowego.

Kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu są utleniane w peroksysomach
W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana forma p-oksydacji. Produktami jej są acetylo-CoA i K2O2 (H2O2 powstaje na etapie działania dehydrogenazy związanej z flawoproteiną). Ten szlak nie jest bezpośrednio powiązany z fosforylacją i wytwarzaniem ATP, ale pomaga utlenić kwasy tłuszczowe o bardzo długim łańcuchu (np. C20) C22). Jest on indukowany przez spoŜycie pokarmów o duŜej zawartości tłuszczu, a takŜe przez leki o działaniu hipolipemicznym, np. klofibrat. Enzymy zawarte w peroksysomach nie atakują kwasów tłuszczowych o krótszym łańcuchu. Sekwencja P-oksydacji kończy się na oktanoilo-CoA. Grupy oktanoilowe i acetylowe są usuwane z peroksysomów w postaci oktanoiloi acctylokamityny, a następnie sa utleniane w mitochondriach.

W wyniku utleniania kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgła powstaje cząsteczka propionylo-CoA
Kwasy tłuszczowe o nieparzystej liczbie atomów węgla są utleniane w szlaku p-oksydacji z wytwarzaniem acetylo-CoA, aŜ do pozostania trójwęglowej reszty propionylo-CoA. Ten związek jest przekształcany do sukcynylo-CoA, metabolitu będącego związkiem pośrednim cyklu cytrynianowego (p. teŜ ryc. 21-2). Wobec tego reszta propionylowa z kwasów tłuszczowych o nieparzystej liczbie atomów węgla jest jedynym fragmentem kwasów tłuszczowych, który jest glukogenny.

ot- i (o-OKSYDACJA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH SĄ WYSPECJALIZOWANYMI SZLAKAMI
Ilościowo p-oksydacja w mitochondriach jest najwaŜniejszym szlakiem utleniania kwasów tłuszczowych. JednakŜe w mózgu wykryto oc-oksydację, tj. proces usuwania po 1 atomie węgla od karbonylowego końca cząsteczki. Ten

Utlenianie kwasów tłuszczowych powoduje powstanie wielu cząsteczek ATP
Transport elektronów w łańcuchu oddechowym ze zredukowanych fiawoproteiny i NAD

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 265

proces nie wymaga przekształcenia kwasów tłuszczowych w pochodną Co A i nie wiąŜe się z wytwarzaniem bogatoenergetycznych fosforanów. tó-Oksydacja jest normalnie szlakiem o bardzo niewielkim znaczeniu. Uczestniczą w niej układy hydroksylujące zawierające cytochrom P-450 siateczki śródpiazmatycznej. Grupa — CH3 jest przekształcana w grupę — CHjOH, a następnie utleniana do — COOH i w ten sposób powstaje kwas dikarboksylowy. Jest on utleniany przez B-oksydacje zwykle do kwasów adypinowego (C6) i suberynowego (C8), które są wydalane z moczem.

WADLIWE UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH JEST PRZYCZYNĄ CHORÓB METABOLICZNYCH
Niedobór karnityny moŜe występować zwłaszcza u noworodków, a szczególnie u wcześniaków. MoŜe on być spowodowany niedostateczną biosyntezą karnityny albo jej utratą przez nerki. Utratę moŜe takŜe spowodować hemodializa lub acyduria spowodowana kwasami organicznymi. Karnityna jest wówczas wydalana po sprzęgnięciu z kwasami organicznymi. W wymienionych stanach zachodzi potrzeba uzupełnienia karnityny, podobna do potrzeby uzupełnienia niedoborów witaminowych w pokarmach. Objawami niedoboru karnityny są: okresowa hipoghkemia, spowodowana zmniejszoną glukoneogenezą (uwarunkowaną zmniejszonym utlenianiem kwasów tłuszczowych), upośledzona ketogeneza w obecności zwiększonego stęŜenia WK.T w osoczu, osłabienie mięśni oraz spichrzanie Jipidów w tkankach miąŜszowych. Leczenie polega na doustnym podawaniu karnityny. Objawy niedoboru karnityny są podobne do zespołu Reye'a, w którym stęŜenie karnityny jest prawidłowe. Przyczyna zespołu Reye'a jest nieznana. Niedobór wątrobowej palmitoilotransferazy karnitynowej jest przyczyną hipoglikemii i małego stęŜenia związków ketonowych w osoczu, podczas gdy niedobór mięśniowej palmitoilotransferazy karnitynowej charakteryzuje się nieprawidłowym utlenianiem kwasów tłuszczowych, co powoduje napadów o występujące osłabienie mięśni i mioglobinurię. Mechanizm działania hipoglikemizującego pochodnych sulfonyl o mocznika (gliburyd i tolbutamid) poJega min. na zmniejszeniu utleniania kwasów tłusz-

czowych uwarunkowanym hamowaniem palmitoilotransferazy karnitynowej. Jamajska choroba wymiotna jest spowodowana spoŜywaniem niedojrzałych owoców drzewa akee, zawierających toksynę hipoglicyn, która inaktywując dehydrogenazę acylo-CoA hamuje P-oksydację i powoduje hipoglikemię. Acyduria dik ar boksytów a charakteryzuje się wydalaniem &>-dikarboksylowych kwasów 0 długości łańcucha Ce do C,o i hipoglikemią. Jest ona spowodowana brakiem mitochondrialnej dehydrogenazy acylo-CoA swoistej dla substratów o średniej długości łańcucha. Brak tego enzymu upośledza p-oksydację, ale wzmaga (o-oksydację kwasów tłuszczowych o długim 1 średnim łańcuchu, które są następnie skracane podczas P-oksydacji do kwasów dikarboksyiowych o średniej długości łańcucha i są wydalane z moczem. Choroba Rei suma jest rzadkim zaburzeniem neurologicznym spowodowanym nagromadzaniem się kwasu fitanowego, powstałego z fitolu, składnika chlorofilu występującego w pokarmach roślinnych. Kwas fitanowy zawiera grupę metylową przy węglu 3, która blokuje p-oksydację. U osób zdrowych początkowa a-oksydacja usuwa grupę metylową. Osoby z chorobą Refsuma mają dziedziczną wadę cc-oksydacji, która jest przyczyną nagromadzania się kwasu fitanowego w tkankach. Zespół Zellwegera {mózgo wo-wątrobo wo-nerkowy) występuje u osób z rzadko stwierdzanym wrodzonym brakiem peroksysomów we wszystkich tkankach. Gromadzą się u nich kwasy polienowe C26—C33w tkance mózgowej, gdyŜ nie ma w tej wadzie zdolności do utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu w peroksysomach.

UTLENIANIE NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH ODBYWA SIĘ W ZMODYFIKOWANYM SZLAKU 8- OKSYDACJI
Nienasycone kwasy tłuszczowe związane estrowo z CoA są degradowane przez enzymy uczestniczące normalnie w p-oksydacji, aŜ do etapu powstania A3-cn-acylo-CoA albo A4-cis-acylo-CoA, zaleŜnie od pozycji podwójnego wiązania (ryc. 24-4). Pierwszy z tych związków jest izomeryzowany (izomeraza A3-m -+ A2-trałts-euoilo-CoA) do odpowiedniego etapu A2-trans-enoUo-CoA p-oksydacji, aby następnie

266 / ROZDZIAŁ 24 cis cis Ryc. 24-4. Kolejność reakcji zachodzących podczas utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych, np. kwasu finolowego. Kwasy tłuszczowe i A -cis lub kwasy tłuszczowe tworzące A*-as-enoilo-CoA, wchodzą do szlaku w pokazanym miejscu.

:-sLinolalto-CoA 3 cykle /J-oksydacji

3-Acetylo-CoA cis cis

tf-cts-Cć-cis-O l«n o Ilo-Co A IZOMERAZA A'-cfc (albo

as

A1- trans~ó?-cts-D leno Ilo-Co A [etap /J-oksydaejl odpowiadający AMrans-enoilc-CoAi 1 cykl ^-oksydacji Acetylo-CoA
cs

ulec hydratacji i dalszemu utlenieniu. KaŜdy A*-c«-acylo-CoA pozostający w tym szlaku, czego przykładem jest przemiana kwasu linolenowego (ryc. 24-4), albo wchodzący w szlak na tym etapie (3-oksydacji jest przekształcany do A2-(fanj-A+-c/.c-dienoilo-CoA przez dehydrogenazę acylo-CoA, Ten związek pośredni jest przekształcany do A3-/rans-enoilo-CoA pod wpływem redukta/y A2-trans-A4-cis-dienoilo-CoA — enzymu zaleŜnego od NADP. Izomeraza A3-c/5-*A;:-ffa«5-enoilo-CoA atakuje równieŜ podwójne wiązanie óP-trcms, powodując powstanie A2-mzns-enoilo-CoA, związku pośredniego P-oksydacji. Mikrosomalna peroksydacja wielonienasyconych kwasów tłuszczowych jest zaleŜna od NADPH NADPH-zaleŜna peroksydacja nienasyconych kwasów thaszczowych jest katalizowana przez enzymy mikrosomalne. Przeciwutleniacze BHT (butylowany hydroksytoluen) i a-tokoferol (witamina E) hamują mikrosomalna peroksydację lipidów. KETOGENEZA ZACHODZI WÓWCZAS, GDY NATĘśENIE UTLENIANIA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH W WĄTROBIE JEST DUśE W pewnych warunkach metabolicznych, związanych z duŜym natęŜeniem utleniania kwasów tłuszczowych, wątroba wytwarza znaczne ilości acetooctanu i D(-)-3-hydroksymaślanii (P-hydroksymaślanu). Acetooctan ulega ciągłej samoistnej dekarboksylacji, dając aceton. Te 3 substancje są znane pod wspólną nazwą ciała ketonowe (nazywane takŜe związkami acetonowymi, lub niewłaściwie „ketonami"*) (ryc. 24-5). Acetooctan i 3-hydroksymaś-

'

C-S-CoA O A*//a/7*A4-rfs-Dl8nollo-CoA ^ H + +NA0PH-O
DEHYDflOGENAZA ACYLO-CoA . Ał-c/s-Enollo-CoA RE DUKTAZA

*

C-S-CoA

A^frans-Enollo-CoA IZOMERAZA Ał-c/9{albo A*-irans-ENOILOCoA

O // C-S-CoA

•J
4 cykle ^-oksydacji
4-Aoe(ylo-CoA

* Termin „ketony" nie powinien byc uŜywany, poniewaŜ 3-hydroksymaśIan nie jest ketonem, a we krwi jest wiele ketonów, które nie są związkami (ciałami) ketonowymi, np. pirogronian, fruktoza.

UTLENIANiE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 267

O II CH,-C-CH,-

COO"

Acetooctan

DEHYDHOGENAZA D(-}3-HYDROKSYMAS ŁANOWA NAD H + H NAD
ł

CH,-CHCH,COCT DMaHydroksyinaślan Ryc. 24-S. Wzajemne zaleŜności ciał ketonowych. Dehydrogenaza D(-)-3-hydroksymaślanowa jest enzymem mitochondrialnym.

lan są wzajemnie w siebie przekształcane działaniem mitochondrialnego enzymu dehydrogenazy D(-)-3-hydroksymaślanowej. Równowaga tej reakcji jest kontrolowana mitochondrialnym

stosunkiem [NAD+] do [NADH], tj. stanem red.-oks. Stosunek [3-hydroksymaślan]; [acetooctan] w krwi waha się w granicach 1:1—10:1. StęŜenie całkowite ciał ketonowych we krwi dobrze odŜywionych ssaków normalnie nie przekracza 0,2 mmol/L Jest ono nieco większe u przeŜuwaczy dzięki tworzeniu 3-hydroksymaślanu z kwasu masłowego (produktu fermentacji w Ŝwaczu) w ścianie Ŝwacza. U człowieka utrata ciał ketonowych z moczem wynosi zwykle mniej niŜ 1 mg/24 h. Stany zwiększonego stęŜenia ciał ketonowych we krwi określa się jako ketonemię (hiperketonemię), zaś zwiększone ich wydalanie z moczem jako ketouuric. Oba te stany określa się jako ketozę. Kwasy acetooctowy i 3-hydroksymasłowy są umiarkowanie mocnymi kwasami i są zbuforowane, gdy występują we krwi lub w tkankach. JednakŜe w stanach zwiększonego wydalania nadmiaru obu tych związków dochodzi do utraty kationu buforującego (pomimo zwiększonego wytwarzania amoniaku w nerce). W konsekwencji dochodzi do stopniowego wyczerpania rezerwy alkalicznej i do rozwoju kwasicy ketonowej. Wystąpienie kwasicy ketonowej moŜe być fatalne w skutkach u chorych z niewyrównaną cukrzycą.

2COi

2CO,

Ryc. 24-6. Powstanie, zuŜywanie i wydalanie ciał ketonowych. Główny szlak jest zaznaczony ciągłymi strzałkami

268 / ROZDZIAŁ 24

Najprostsza postać ketozy występuje przy głodzeniu, kiedy dochodzi do wyczerpania się zapasów węglowodanowych i do zwiększenia stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych. KaŜdy inny stan, w którym występuje ketoza, nie róŜni się jakościowo od tego modelu metabolicznego, ale ilościowo moŜe być tak nasilony, Ŝe jest przyczyną stanów chorobowych obserwowanych np. w cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciąŜowym u owiec i ketozie u mlecznych krów. Postacie ketozy pozbawione znaczenia chorobowego stwierdza się u osób Ŝywionych dietą o duŜej zawartości tłuszczu oraz po wykonaniu cięŜkiego wysiłku u niektórych osób będących na czczo. In vivo wątroba wydaje się być jedynym narządem u nieprzeŜuwaczy wydzielającym znaczne ilości ciał ketonowych do krwi. Pozawątrobowe tkanki zuŜywają ciała ketonowe jako substraty energetyczne. Pozawątrobowe źródła ciał ketonowych, występujące u przeŜuwaczy w okresie sytości nie mają znaczącego udziału w powstawaniu ketozy u tych gatunków. Wypływ ciał ketonowych z wątroby do tkanek pozawątrobowyeh jest wynikiem aktywnego mechanizmu enzymatycznego pobudzającego wytwarzanie ciał ketonowych w wątrobie oraz małej aktywności w tym narządzie enzymów odpowiedzialnych za ich zuŜytkowanie. Odwrotna sytuacja ma miejsce w tkankach pozawątrobowych (ryc. 24-6). 3-Hvdroksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA) jest związkiem pośrednim na szlaku ketogenezy w wątrobie Enzymy odpowiedzialne za powstawanie ciał ketonowych są związane głównie z mitochondriami. Pierwotnie sądzono, Ŝe tylko 1 cząsteczka acetooctanu moŜe powstać z końcowych 4 węgli kwasu tłuszczowego podczas jego utleniania. Później, aby wyjaśnić powstawanie większych niŜ równowaŜne ilości acetooctanu z I cząsteczki kwasu tłuszczowego o długim iańcuchu, jak i moŜliwość tworzenia ciał ketonowych 2 kwasu octowego, zaproponowano, Ŝe jednostki C2 powstające w p-oksydacji mogą ze sobą kondensować, tworząc acetooctan. Taki proces moŜe być wynikiem odwrócenia reakcji katalizowanej przez tiolazę, w której 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Acetoacetylo-CoA, który jest związkiem wyjściowym do ketogenezy, mógłby więc powstać albo bezpośrednio pod-

czas p-oksydacji, albo jako wynik kondensacji acetylo-CoA (ryc. 24-7). Zaproponowano JLszlalagowstawania acetooctapH ? fgetff"^^lo-CoA.?terwszv"z'nicn"ma bvć prosta deacyla■cjąTDrugrszlak (ryc. 24-8) obejmuje kondensację acetoacetylo-CoA z jeszcze 1 cząsteczką acetylo-CoA i wytworzenie HMG-CoA. Reakcję tę katalizuje syntaza 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA. Obecność w mitochondriach innego enzymu, liazy 3-hydroksy-3-metyloghtfarylo-CoA, umoŜliwia odczepienie acetylo-CoA od HMG-CoA z pozostawieniem wolnego acetooctanu. Atomy węgla odczepione jako cząsteczka acetylo-CoA pochodzą z pierwotnej cząsteczki acetoacetylo-CoA (ryc. 24-8). Obydwa te enzymy muszą być w ntitochondriach, aby zachodziła ketogeneza. Ma to miejsce jedynie w wątrobie i w nabłonku Ŝwacza. Obecnie przewaŜa opinia, Ŝe szlak HMG-CoA jest główną drogą tworzenia ciał ketonowych. ChociaŜ podczas głodu występuje znaczne zwiększenie aktywności liazy HMG-CoA, dane doświadczalne nie sugerują, aby byl to enzym ograniczający szybkość ketogenezy. Acetooctan jest przetwarzany do D(-)-3-hydroksymaślanu przez dehydrogenazę D(-)-3-hydroksymaślanową, która występuje w mitochondriach wielu tkanek, łącznie z wątrobą. D(-)-3-Hydroksymaślan jest ilościowo dominującym ciałem ketonowym występującym we krwi 1 w moczu w ketozie. Ciała ketonowe są wykorzystywane jako materiał energetyczny przez tkanki pozawątrobowe ChociaŜ wątroba jest wyposaŜona w aktywny mechanizm enzymatyczny potrzebny do wytwarzania acetooctanu z acetoacetylo-CoA, to raz powstały acetooctan nie moŜe być w zasadzie w wątrobie ponownie reaktywowany. W cytozolu komórek wątrobowych zachodzi znacznie mniej aktywny proces biosyntezy cholesterolu, dla którego acetoacetylo-Co A jest prekursorem. Wszystko to sprawia, Ŝe w wątrobie przewaŜa powstawanie acetooctanu nad jego utylizacją. W tkankach pozawątrob owych zachodzą 2 reakcje, w których acetooctan jest aktywowa ny do acetoacetylo-Co A. W jednej z nich uczest niczy sukcynylo-CoA i enzym transfera/a bursz tyny ło-CoA-acetoacetylo-Co A. Enzym ten kata lizuje przeniesienie CoA z sukcynylo-CoA na acetooctan z wytworzeniem acetoacetylo-Co A i wolnego bursztynianu.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 269

CH3COCHaCOO Acetooctan CH3COCH3CO-S-CoA ITRANSFCRAZACOAI

CHaC0O" I CH a CO-S-CoA Sukcvnylo-CoA

CHaCOO" i CHaCOO" Bursztynian Acetoa cetylo -CoA

Druga reakcja polega na aktywacji acetooctanu przez ATP w obecności CoA, katalizowana jest przez syntctazę acetoacetjlo-CoA,
SYNTETAZA ACETOACETYLO-CoA

CH 3COCH ICOO"+ ATP+ CoA- SH Acetooctan - CH3COCHJCOSCoA+AMP+ A ceto a c et y I o - C o A

D(-)-3-HydroksymaśIan moŜe być bezpośrednio aktywowany w tkankach pozawątrobowych przez odpowiednią syntetazę; jednakŜe przemiana do acetooctanu z udziałem dehydrogenazy D(-)- 3 -hydro ksym a sianowej i NAD+, z następującą potem aktywacją do acetoacetylo-CoA, jest waŜniejszą drogą dalszej przemiany hydroksymaślanu. Acetoacetylo-CoA powstały w tych reakcjach jest rozszczepiany do acetylo-CoA działaniem tiolazy i utleniany w cyklu kwasu cytrynowego, jak to przedstawiono na ryc. 24-7. Ciała ketonowe są utleniane w tkankach pozawątrobowych proporcjonalnie do ich stęŜenia we krwi. Są one utleniane preferencyjnie przed glukozą i WKT. Kiedy stęŜenie ciał ketonowych we krwi zwiększa się, zwiększa się ich utlenianie, aŜ do stęŜenia ok. 12 mmol/l, w którym wysycają one układy utleniające. Gdy to nastąpi, znaczna ilość pobieranego przez zwierzę tlenu moŜe być zuŜywana do utleniania ciał ketonowych.

FFA ATP-v CoA AMP+ PPt
SYNTETAZA ACYLO-CoA Ettryflkacja Tfiacylogilcaro l fosioiipld

Acyto-CoA
^-Oksydacja •[AMrtylo-CoA).

|DEACYLAZA|

"7T"
H,0
SYNTAZA HMG-CoA

CoA

ITPLAZAI \ Pula aeetylo-CoA

H,O\ * Acetylo-CoA

3-HydrDk£y-3me!yloglutar^o-CoA (HMG-CoA) LIAZA HMG-CoA

I kwasu! cytrynowego

DEHYDROGENAZA D (-)3-HYDROKEYWASLANOWA

2CO,

D(-)3My0roksyfna4ian

Rve. 24-7. Szlak ketogenezy w wątrobie. WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HMG — 3-hydroksy-3-metylogiuiaryl.

270 / ROZDZIAŁ 24 O O
HjO
3 -*C-S

CHJ-C-CHJ-C-S -CoA Acetoacetylo-CoA

—CoA Awtylo-CoA

V_______
SYNTAZA HMG-CoA

CH,- C - CHi —C-S-CoA "Ć H , -* C O O 3-Hyd ro ksy-3-m styl og! u ta rył o-CoA

OH I

O li

LSAZA HMG-CoA

H.-C-S — <

i
CH 3 - C Acełooctan CH 3 -C~S —CoA Acetylo-CoA Byc. 24-8. Powstawanie acetooctanu przez pośrednie wytwarzanie HMG-CoA.

Większość danych doświadczalnych przemawia za tym, Ŝe kctonemia jest powodowana raczej nadmiernym wytwarzaniem ciał ketono-

KETOGENEZA JEST REGULOWANA NA 3 KLUCZOWYCH ETAPACH 1. Pierwsze miejsce kontroli ketogenezy znaj duje się w tkance tłuszczowej. Retoza nie wy stąpi in vivo, jeŜeli nie ma równoczesnego zwięk szenia stęŜenia krąŜących wolnych kwasów tłu szczowych, które pochodzą z lipolizy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej. Kwasy tłusz czowe są prekursorami ciał ketonowych w wąt robie. Wątroba zarówno w fazie sytości, jak i w czasie głodzenia ma zdolność wychwytywa nia ok. 30% lub więcej kwasów tłuszczowych z krwi docierającej do tego narządu. Przy duŜych stęŜeniach wolnych kwasów tłuszczo wych we krwi ich napływ do wątroby jest znaczny. Wobec tego dla kontroli ketogenezy znacząca jest rola czynników regulujących mobi lizację wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej (ryc. 24-9). 2. Losy wychwytywanych przez wątrobę wo lnych kwasów tłuszczowych mogą być dwojakie po wstępnej ich aktywacji do acylo-CoA. Mogą one zostać zestryfikowane, głównie do triacylo-

wych w wątrobie niŜ upośledzonym ich zuŜywaniem przez tkanki pozawątrobowe. Wyniki doświadczeń na szczurach z usuniętą trzustką przemawiają jednak za tym, Ŝe w cięŜkiej cukrzycy ketoza moŜe być pogłębiana zmniejszeniem katabolizowama ciał ketonowych. Przy umiarkowanej ketonemii utrata ciał ketonowych z moczem stanowi zaledwie niewielki procent całkowitego ich wytwarzania i utylizacji. PoniewaŜ ciała ketonowe zachowują się w nerkach podobnie jak związki „progowe" (w rzeczywistości nie istnieje prawdziwy próg nerkowy dla tych metabolitów), przy czym poszczególne gatunki i poszczególni osobnicy wykazują znaczne róŜnice indywidualne; cięŜkość ketozy naleŜy oceniać na podstawie nasilenia ketonemii, a nie ketonurii. Podczas gdy utlenianie acetooctanu i D(-)-3-hydroksymaślanu w tkankach pozawątrobowych przebiega nader sprawnie, utlenianie acetonu in vivo jest raczej trudne.

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 271

gliceroli i fosfolipidów, lub teŜ ulegają fi-oksydacji do CO, względnie do związków ketonowych. Wydolność estryfikacji, jako czynnika przeciwketogennego, zaleŜy od dostępności w wątrobie prekursorów glicerolo-3-fosforanu. Jednak w głodzonych perfundowanych wątrobach dostępność glicerolo-3-fosforanu nie jest czynnikiem ograniczającym estryfikację WKT. Nie rozstrzygnięto ostatecznie, czy ta dostępność w wątrobie jest w ogóle czynnikiem ograniczającym szybkość estryfikacji. Nie ma równieŜ pewnych informacji, czy aktywność in vivo enzymów uczestniczących w estryfikacji jest czynnikiem ograniczającym szybkość tego procesu. Wydaje się, Ŝe nim nie jest, gdyŜ nie zdarza się spichrzanie w wątrobie ani wolnych kwasów tłuszczowych, ani związków pośrednich na drodze ich estryfikacji (p. ryc. 26-1). UŜywając perfundowanej wątroby wykazano, Ŝe narząd ten. pochodzący od dobrze kar-

Trlacyloglioerol

TKANKA TŁUSZCZOWA

©
WKT

Llpoliza

KREW

WKT

Cykl kwasu cytrynowego Ketogeneza CO, Ciała ketonowe

Ryc. Z4-9. Regulacja ketogenezy. 1-3— 3-węzłowe etapv szlaku metabolizmu wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), które dete/minują wielkość ketogenezy. _______ ___________

mionyeh szczurów, estryfikuje znacznie więcej kwasów tłuszczowych znakowanych 14C niŜ wątroba szczurów głodzonych, w której nie zestryfikowany nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych jest utleniany do 14CO;, lub 14C-ciał ketonowych. Te wyniki tych badań moŜna wyjaśnić tym, Ŝe aktywność palmitoilotransferazy I kamity nowej, umiejscowionej w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, reguluje wnikanie grup acylowych o długim łańcuchu do wnętrza mitochondriów przed ich fi-oksyda-cją (p. ryc. 24-1). Aktywność tego enzymu jest mała w stanie sytości, gdy utlenianie kwasów tłuszczowych jest małe, natomiast duŜa przy głodzeniu, kiedy zwiększa się utlenianie kwasów tłuszczowych. Malonylo-CoA, początkowy metabolit w biosyntezie kwasów tłuszczowych (p. ryc, 23-1), którego stęŜenie zwiększa się w stanie sytości, jest inhibitorem wymienionej pataitoilotransferazy, przez co ustaje p-oksydacja. W warunkach sytości zachodzi więc aktywna lipogeneza i jest duŜe stęŜenie malonylo-CoA, hamującego palmitoilotransferazę I (ryc. 24-10). Wolne kwasy tłuszczowe, wnikające do wątroby przy ich małym stęŜeniu w osoczu, są niemal w całości estryfikowane do acyl o gliceroli i wydalane z wątroby do krwi w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL), Na początku głodzenia, kiedy stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu się zwiększa, zahamowana zostaje karboksylaza acetylo-CoA i stęŜenie malonylo-CoA się zmniejsza. W następstwie tego procesu odblokowaniu ulega palmiloilotransferaza kani i ty nowa, co pozwala na zwiększenie utleniania acyl o-Co A. Te zdarzenia nasilają się w stanach głodzenia, kiedy zmniejsza się stosunek [insulina] / [glukagon], przez co zwiększa się lipoliza w tkance tłuszczowej, natomiast zahamowaniu ulega karboksylaza acetylo-CoA w wątrobie (p. ryc. 2410). 3. Acetylo-CoA, powstały w procesie P-oksydacji, jest utleniany w cyklu kwasu cytrynowego albo wchodzi w szlak ketogenezy wytwarzający ciała ketonowe. Gdy stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy się zwiększa, wówczas proporcjonalnie więcej kwasów tłuszczowych jest przekształcanych w ciała ketonowe, a mniej jest utlenianych w cyklu cytrynianowym do CO7. Proporcja acetylo-CoA, napływającego do szlaku ketogenezy i szlaku utleniania do CO2, jest tak regulowana, Ŝe całkowita energia swobodna zgromadzona w postaci ATP w wyniku utleniania kwasów

27 2 / ROZDZIAŁ 24

WKT
KREW

VLDL

Węglowodany —»• Acetyto-CoA

WKF ł ^ , , Acylo-CoA Estryłlkacja --------------------

WĄTROBA

Acytagllcerole

KARBOKSYLAZA ACETYLD-CoA Insulina Cylosol Glukagon Matonylo-CoA ______ PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYNOWA I .Acylo-CoA [ 0-Oksydacja

O.

Milochondrlum Aootylo-CoA —

Ketoganeza

Ciała ketonowe Ryc. 24-10. Regulacja utleniania dtugołańcuchowych kwasów tłuszczowych w wątrobie. WKT —wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteiny o bardzo malej gęstości. Dodatnie (©) i ujemne (©) efekty regulacyjne są przedstawione przerywanymi liniami, a przepływ substratów iiniami ciągłymi. __________

tłuszczowych pozostaje stalą. Całkowitemu utlenieniu 1 mol palmil ynianu towarzyszy wytwarzanie netto 129 mol ATP, gdy proces ten zachodzi poprzez ft-oksydację i wytworzenie CO^ w cyklu kwasu cytrynowego (p. wyŜej). JeŜeli końcowym produktem przemiany palmitynianu jest acetooctan ilość powstałego ATP wynosi tylko 33 moi. Ilość powstającego ATP zmniejsza się nawet do 21 mol, gdy produktem końcowym jest 3-hydroksymaśtan. Ketogeneza moŜe więc być uwaŜana za mechanizm, który umoŜliwia wątrobie utlenienie zwiększających się ilości kwasów thiszczowych w układzie skojarzonych oksydacyj-

nych fosforylacji, bez zwiększenia całkowitego wydatku energetycznego. Wysuwano kilka innych hipotez w celu wyjaśnienia przełączania utleniania kwasów tłuszczowych ze szlaku prowadzącego do CO2 na szlak ketogenezy. Teoretycznie zmniejszenie stęŜenia szczawi o octanu, zwłaszcza w mitochondriach, mogłoby zmniejszać zdolność cyklu kwasu cytrynowego do metaboltzowania acetylo-CoA. Takie zmniejszenie moŜe się zdarzać wtedy, kiedy dochodzi do zwiększenia stosunku [NADH] / [NAD+], spowodowanego intensywniejszą p-oksydacją. Krebs sugerował,

UTLENIANIE KWASÓW TŁUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 273

Ŝe wzmoŜona glukoneogeneza, na szlaku której występuje takŜe szczawiooctan, jest przyczyną zmniejszenia stęŜenia tego związku, co moŜe być powodem cięŜkich postaci ketozy występującej w cukrzycy, a takŜe ketozy u bydła. JednakŜe Utter i Keech wykazali, Ŝe karboksylaza pirogronianowa, katalizująca przemianę pirogronianu w szczawiooctan, jest aktywowana przez acetylo-CoA. Wynika stad, Ŝe w razie występowania znacznych ilości acetyl o-Co A są niezbędne dostatecznie duŜe ilości szczawiooctanu w celu zainicjowania reakcji kondensacji, rozpoczynającej cykl kwasu cytrynowego.

PIŚMIENNICTWO
Boyer Pd (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vol 16 of Lipid Enzymology. Academic Press, 1983,

Debeer LJ, Mannaerts GP: The mitochondrial and peroxisomal pathways of fatty acid oxidation in rat liver. Diabete Metab (Paris) 1983;9;134. Mayes PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339, McGarry JD, Foster DW: Regulation ofhepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Pandę SV, Parvin R: Page 143 in: Carnitine Biosynthesis, Metabolium. and Functions, Frenkel RA, McGarry JD (editors). Academic Prcss, 1980. Schulz H: Oxidation of fatty acids. Page 116 in: Biochemistry ofLipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 19S5. Various authors: In: Tke Metabolit- Basia of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et ul (editors). McGraw-Hill, 1989. Vianey-LiaudCetal: Theinborn errorsofmitochondriai fatty acid osidation. / Inher Metab Dis 1987;1O: Suppl 1:159.

1S — Biochemia

25

Metabolizm nienasyconych kwasów tłuszczowych i eikozanoidów
Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE
W porównaniu z roślinami tkanki zwierzęce mają ograniczoną zdolność desaturacji kwasów tłuszczowych. Stwarza to konieczność przyjmowania w pokarmie pewnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych głównie pochodzenia roślinnego. Te egzogenne kwasy tłuszczowe umoŜliwiają powstawanie ikozanowych (C20) kwasów tłuszczowych, z których pochodzą związki znane jako eikozanoidy. NaleŜą do nich prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny.

adenylanowej, np. 1) w regulacji agregacji płytek krwi oraz 2) w hamowaniu działania hormonu antydiuretycznego w nerkach. Leukotrieny mają właściwości kurczenia mięśni gładkich, a takŜe właściwości chemotaktyczne, co sugeruje, Ŝe mogą one odgrywać waŜną rolę w reakcjach alergicznych i zapalnych. Mieszaninę leukotrienów zidentyfikowano jako wolno reagującą substancję anafilaksji (SRS-A). Przez zmianę proporcji róŜnych wielo nienasyconych kwasów tłuszczowych w diecie jest moŜliwe wpływanie na typ syntetyzowanych eikozanoidów. Wskazuje to na moŜliwość wpływania na przebieg choroby przez zmiany składu diety.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych w tłuszczu wyznacza jego temperaturę topnienia, a więc i jego płynność. Fosfolipidy błony komórkowej równieŜ zawierają nienasycone kwasy tłuszczowe istotne do utrzymania odpowiedniej płynności błony. DuŜy stosunek stęŜenia wielo nie nasyconych kwasów tłuszczowych do nasyconych (stosunek P:S) w pokarmach jest waŜnym czynnikiem do zmniejszenia stęŜenia cholesterolu w surowicy krwi za pomocą diety i uwaŜa się, Ŝe działa korzystnie w zapobieganiu chorobie niedokrwiennej serca. Prostaglandyny i tromboksany są miejscowymi hormonami, które w miarę potrzeby są szybko syntetyzowane i działają blisko miejsca swojej syntezy, Niesteroidowe Leki przeciwzapalne, takie jak kwas acetylosalicylowy, działają na zasadzie hamowania syntezy prostaglandyn. Prostaglandyny odgrywają fizjologiczną rolę głównie jako modulatory aktywności cyklazy

NIEKTÓRE WfELONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE NIE MOGĄ BYĆ SYNTETYZOWANE PRZEZ SSAKI I SĄ NIEZBĘDNYMI SKŁADNIKAMI POKARMU
Niektóre długołańcuchowe nienasycone kwasy tłuszczowe, mające znaczenie metaboliczne u ssaków, przedstawiono na ryc. 25-1. (Przegląd nazewnictwa kwasów tłuszczowych omówiono w rozdz. 16). Inne C20 kwasy polienowe, kwasy C22 i C2A moŜna równieŜ znaleźć w tkankach. Mogą one powstawać z kwasów olejowego, linolowego i a-linolenowego przez elongację łańcucha. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe wszystkie podwójne wiązania w naturalnie występujących kwasach tłuszczowych mają konfigurację cis. Kwasy palmitoolejowy i olejowy nie naleŜą do kwasów egzogennych, poniewaŜ tkanki są

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 275

/WWVW\ COOH
16 9 Kwas palmltoolejowy (a> 7, 16:1 A") Kwas olejowy (w 9,18:1, A")

AAAAAAA/
*Kwas llnolawy {as 6, 18:2,

/WWWWNA
18 15 12 9 'Kwas «-llno(enowy (a» 3, 18:3, £*■*«)
20

rych wiadomo, Ŝe są niezbędnymi składnikami poŜywienia dla wielu gatunków zwierząt, łącznie z człowiekiem i muszą być dostarczane z pokar mem; nazywa się je przeto egzogennymi kwasa mi tłuszczowymi. Kwas linolowy nie jest syn tetyzowany u człowieka i dlatego musi być COOH dostarczany w gotowej postaci w poŜywieniu. Kwas arachidonowy moŜe być jednakŜe wy twarzany z kwasu linolowego u większości ssaków (p. ryc. 25-4). U zwierząt podwójne wiązanie moŜe być wprowadzane do pozycji A4, COOH A5, A6 i A9 (licząc od końca karboksylowego; p. rozdz. 16), ale nigdy poza pozycję A9. Odmien nie jest u roślin, które są zdolne do wprowadza nia nowych podwójnych wiązań w pozycje As, A9, A12 i A15 i wobec tego mogą syntetyzować egzogenne (niezbędne w pokarmie zwierzęcym) COOH kwasy tłuszczowe.
Stearoito-CoA + Enzym COOH

'Kwas arachidonowy (co 6, 20:4,

THANSFERAZA ACYLOWA 'COO

CoA-SH

H Kwas elkozapenlaenowy (m 3, 20:5, A**"'

1t1T

)

Stearollo-Enzym

Byc. 25-1. Budowa niektórych nienasyconych kwasów tłuszczowych. ChociaŜ atomy węgla są numerowane konwencjonalnie, tzn. od węgla karboksylowego, liczby poprzedzone grecką literą at (np. to7 w kwasie palmitoolejowym) oznaczają pozycje liczoną od odwrotnego końca {końcowej grupy metylowej) cząsteczki. Informacja zawarta w nawiasach wskazuje, Ŝe np. kwas a-linolenowy ma podwójne wiązania począwszy od C3, licząc od końca metylowego, ma 18 atomów węgla i 3 podwójne wiązania oraz Ŝe te podwójne wiązania są umiejscowione przy 9,12 i 15 atomie węgla, licząc od końca karboksylowego. Znak * oznacza, Ŝe dany związek jest „egzogennym kwasem tłuszczowym".

HYDROKSYUKZA Cytbs * . NAD
+

Hyd roksyslearoilo-Enzym

HYDRATAZA

Olallo-Enzym

zdolne do wprowadzania podwójnego wiązania w pozycji A9 do odpowiedniego nasyconego kwasu tłuszczowego. Doświadczenia ze znakowanym kwasem palmitynowym wykazały, Ŝe znacznik łatwo pojawia się w kwasie palmitootejowym i olejowym, ale nie ma go w kwasach linolowym, ot-linolenowym ani arachidonowym. Są one jedynymi kwasami tłuszczowymi, o któ-

TRANSFEHAZA ACYLOWA

Oleilo-CoA + Enzym Ryc

25-2. Uktad

mikrosomalnej A -desaturazy.

9

• 276 / ROZDZIAŁ 25

MONONIENASYCONE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ SYNTETYZOWANE PRZEZ UKŁAD A9-DESATURAZY
UwaŜa się Ŝe wiek tkanek, łącznie z wątrobą, ma zdolność tworzenia mono nienasyconych kwasów tłuszczowych z odpowiednich kwasów nasyconych. Pierwsze podwójne wiązanie jest wprowadzane do nasyconego kwasu tłuszczowego niemal zawsze w pozycji A9. Układ enzymatyczny — A9-desaturaza — (ryc. 25-2) w siateczce śródplazmatycznej katalizuje przekształcenie palmitoilo-CoA w palmitooleilo-CoA albo stearoilo-CoA w oleilo-CoA. Do reakcji jest niezbędny tlen oraz NADH albo NADPH. Enzymy uczestniczące w tej reakcji wydają się być typowymi enzymami układu monooksygenazy zawierającego cytochrom b; (hydroksylaza).

W SYNTEZIE WIELONIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH UCZESTNICZĄ UKŁADY ENZYMATYCZNE DESATURAZY 1 ELONGAZY
Dodatkowe wiązania podwójne, wprowadzane do istniejących juŜ niononienasyconych kwasów tłuszczowych, zawsze (z wyjątkiem bakterii) są od siebie przedzielone grupą metylenową. U zwierząt dodatkowe wiązania podwójne są zawsze wprowadzane między istniejące podwójne wiązanie a grupę karhoksyIową, ale u roślin mogą być wprowadzane między istniejące wiązanie podwójne i węgiel to (koniec metylowy). PoniewaŜ zwierzęta mają A9-desaturazę, są one zdolne do kompletnej syntezy rodziny a>9 (kwasu olejowego) nienasyconych kwasów tłuszczowych przez kombinację elongacji i desatu-

ELONGAZA

| A'-DESATURAZA

A'-DESATURAZA

Rodzlna

Kwas olejowy 18:1 A'-DE5ATURAZA

■ 20:2

20i3 -----------^ 22:3

22:4

18:2.
ELONGAZA \

20:1
ELONGAZA

'
18:3

22:1

B_0NGAZA

Ai
24:1

Spichrza nie przy niedoborze kwasów tłuszczowych egzogennych

Rodzina

Kwas lin o Iowy 18:2------ -.—

-20:3

-20:4

22:5

ELONGAZA

20:2

/e

Kwas a-llnolenowy Rodzina
(D 3

18:3 --------------------------1

18:4

20:4

20:5

-*- 22:5 •

22:6

Ryc. 25-3. Biosynteza wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodzin u9, w6 oraz co3. KaŜdy z etapów jest katalizowany przez mikrosomalne układy elongacji albo desaturacji. Ilość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych »9 staje się znacząca jedynie wówczas, gdy kwasy linolowy i ot-linolenowy zostają wyłączone z diety. Dzieje się tak dlatego, Ŝe kaŜda z przedstawionych serii współzawodniczy o te same układy enzymatyczne, a powinowactwa zmniejszają się począwszy od mZ aŜ do <»>9. © —■ hamowanie.

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 277

Llnolelto-CoA (A^-oktadefcadfenolto-CoA) Oj + NADH + H + ,

y-Lfnoteno(to-CoA(4**"-aktadekatrlenollo-CoA)

(Malonyto-CoA, NADPH)

C-S — CoA Arachldonollo-CoA (A""'1*-«lkozatetraenollo-CoA)

Ryc. 25-4. Przemiana kwasu linolowego do arachidonowego. U kotów nie zachodzi ta przemiana, gdyŜ 6 nie mają one A -desaturazy i muszą wobec tego otrzymywać arachidonian z pokarmem. ____________

racji łańcucha (ryc. 25-3). PoniewaŜ jednak nie są one zdolne do syntetyzowania ani kwasu linolowego ((06), ani a-linolenowego (co3), gdyŜ nie mają potrzebnych do tego odpowiednich desaturaz, te kwasy muszą być dostarczone w pokarmach, aby mogła zachodzić synteza innych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych rodziny w6 i o>3. Linolenian moŜe być przemieniony w arachidonian (ryc. 25-4). W szlaku tym dochodzi najpierw do odwodorowania estru kwasu linolowego z CoA i utworzenia Y-linolenianu, po czym następuje dodanie jednostki dwuwęglowej przez przyłączenie malonylo-CoA

w mikrosomalnym układzie elongacyjnym (p. str. 257). W wyniku tych reakcji powstaje ikozatrienian (dihomo-y-linolenian), który przez dalsze odwodorowanie tworzy arachidonian. Układ odwodorowujący jest podobny do tego, który opisano powyŜej dla nasyconych kwasów tłuszczowych. Z powyŜszego wynika,
Ŝe przy dostatecznej podaŜy kwasu liściowego kwas arachidonowy przestaje być kwasem egzogennym.

Aktywność układu desaturacji i eiongacji jest znacznie zmniejszona w stanie głodzenia i przy braku insuliny.

278 / ROZDZIAŁ 25

OBJAWY NIEDOBORU WYSTĘPUJĄ WÓWCZAS, GDY BRAK JEST W POKARMACH EGZOGENNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (EFA) W 1928 r. Evans i Burr zauwaŜyli, Ŝe szczury karmione oczyszczoną dietą bezlipidową, do której dodano witaminę A i D, wykazują zmniejszone tempo wzrostu i upośledzoną reprodukcję. Późniejsze prace wykazały, Ŝe ten zespół niedoboru moŜna wyleczyć przez dodanie do diety kwasów linolowego, a-linolenowego i arachid ono wego. Dalsze objawy zespołu niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych to łuszcząca się skóra, martwica ogona i uszkodzenie układu moczowego, ale choroba nie jest śmiertelna. Leczące ten zespół kwasy tłuszczowe występują w duŜym stęŜeniu w róŜnych olejach roślinnych (p. str. 175), a w niewielkich tylko ilościach w produktach zwierzęcych. Funkcje egzogennych kwasów tłuszczowych wydają się być róŜnorodne, chociaŜ niezbyt dobrze określone, z wyjątkiem znaczenia, jakie mają w tworzeniu prostaglandyn i leukotrienów. Egzogenne kwasy tłuszczowe występują w strukturalnych lipidach komórki i mają znaczenie w utrzymaniu strukturalnej integralności błon mitochondrialnych. Kwas arachidonowy występuje w błonach komórkowych i stanowi 5—15% wszystkich kwasów tłuszczowych w fosfolipidach. Kwas dokozaheksaenowy (DHA: a>3,20:6), który jest syntetyzowany z kwasu a-linolenowego lub otrzymywany bezpośrednio z tłuszczu ryb, występuje w duŜych stęŜeniach w siatkówce, korze mózgu, w jądrach i w spermie. DHA jest przede wszystkim potrzebny do rozwoju mózgu i jest dostarczany poprzez łoŜysko i z mlekiem. Aby spełnić wiele funkcji strukturalnych egzogenne kwasy tłuszczowe występują w fosfolipidach głównie w pozycji 2. W niedoborze egzogennych kwasów tłuszczowych endogenne polienowe kwasy tłuszczowe z rodziny 0)9 zastępują egzogenne kwasy w fosfolipidach w innych złoŜonych lipidach i w błonach. Takim polienowym kwasem tłuszczowym jest kwas Ai'811ikozatrienowy (ryc. 25-3). Oceny stopnia niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych moŜna dokonać, oznaczając stosunek stęŜenia trienów do tetraenów (arachidonianu) w osoczu. U ludzi spoŜywających pokarmy pozbawione egzogennych kwasów tłuszczowych zauwaŜono zmiany skórne oraz upośledzenie transportu

lipidów. Objawów takich nie stwierdzono u dorosłych pozostających na zwykłej diecie. Jednak u dzieci otrzymujących poŜywienie ubogie w tłuszcze obserwowano zmiany skórne, które ustępowały po podaniu linolenianu. Niedobory dające się przypisać brakowi egzogennych kwasów tłuszczowych, łącznie z kwasem a-linolenowym mogą wystąpić takŜe u chorych Ŝywionych przez dłuŜszy czas doŜylnie płynami z małą zawartością egzogennych kwasów tłuszczowych. Temu niedoborowi moŜna zapobiec przez podawanie egzogennych kwasów tłuszczowych w ilości 1—2% całkowitego zapotrzebowania energetycznego. Kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans mogą konkurować z kwasami tłuszczowymi cis Śladowe ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans powstają w tłuszczach przeŜuwaczy, gdzie występują dzięki działaniu mikroorganizmów znajdujących się w Ŝwaczu. Obecność duŜych ilości trans nienasyconych kwasów tłuszczowych w częściowo uwodorowanych olejach roślinnych (np. wmargarynie) nasuwa wątpliwości odnośnie do bezpieczeństwa ich stosowania jako dodatków pokarmowych. Skutki długotrwałego ich spoŜywania przez ludzi są trudne do ocenienia, chociaŜ juŜ od wielu lat są one składnikami poŜywienia człowieka. W czasie autopsji w tkankach człowieka stwierdza się do 15% nienasyconych kwasów tłuszczowych o konfiguracji trans. Dotychczas nie opisano powaŜnych ujemnych skutków ich występowania. Są one metabolizowane raczej w sposób bardziej podobny do nasyconych kwasów tłuszczowych niŜ do cis nienasyconych. MoŜe to być spowodowane ich podobną prostolań cuch ową konformacją (p. rozdz. 16). Wielonienasycone kwasy tłuszczowe o konfiguracji trans nie mają działania egzogennych kwasów tłuszczowych. Mogą one antagonizować metabolizm tych ostatnich, pogłębiając niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych. Nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych występujący w niektórych chorobach Poza niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i zmianami w proporcji zawartości poszczególnych wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, spowodowanym długotrwałym wadliwym odŜywianiem, nieprawidłowy metabolizm egzogennych kwasów tłuszczowych

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 279

stwierdzono u chorych z torbielowatym włóknieniem trzustki, w acrodermatitis enteropathtca, zespole wątrób owo-nerkowym, zespole Sjógrena-Larssona, wieloukładowym zwyrodnieniu nerwów, chorobie Crohna, marskości wątroby, alkoholizmie oraz zespole Reye'a. DuŜe stęŜenie polienowych kwasów tłuszczowych o bardzo długim łańcuchu węglowym stwierdzono w mózgu chorych z zespołem Zellwegera (p. str. 265). SpoŜywanie pokarmów o duŜym stosunku P;S (wielonienasycone : nasycone kwasy tłuszczowe) zmniejsza stęŜenie cholesterolu surowicy, zwłaszcza cholesterolu LDL. Jest to korzystne z punktu widzenia relacji zachodzącej między stęŜeniem cholesterolu w surowicy a chorobą niedokrwienną serca.

Arachidonian, zwykle pochodzący z pozycji 2 fosfatydylodiacylogliceroli błon plazmatycznych w wyniku działania fosfolipazy A2 (p. ryc. 26-5), jest substratem do syntezy PG2, TXj oraz LT4. Szlaki ich metabolizmu są róŜne. Biosynteza PG i TX2 (prostanoidów) współzawodniczy 0 substrat, tj. arachidonian, z syntezą serii LT4. Te 2 szlaki są znane jako szlaki cyklooksygenazy 1 lipooksygenazy (ryc. 25-5). Istnieją 3 grupy eikozanoidów (kaŜda zawierająca PG, TX i LT) syntetyzowane odpowiednio z 3 egzogennych kwasów tłuszczowych:
linolanu, arachidonianu i a-Hnolenianu (ryc. 25-6).

EIKOZANOIDY POWSTAJĄ Z C3O-WIEL0NIENASYC0NYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH
Arachidonian i niektóre inne C10 kwasy tłuszczowe, z wiązaniami podwójnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi, są źródłem powstawania eikozanoidów, fizjologicznie i farma kologicznie czynnych związków znanych jako prostaglandyny (PG), tromboksany (TX) i leukotrieny (LT) (p. rozdz. 16).

SZLAK CYKLOOKSYGENAZY JEST ODPOWIEDZIALNY ZA BIOSYNTEZĘ PROSTANOIDÓW
Biosynteza prostanoidów (ryc. 25-7), podczas której dochodzi do zuŜycia 2 cząsteczek O2, jest katalizowana przez syntazę endoperoksydu prostaglandyny, wykazującą 2 oddzielne aktywności enzymatyczne, cyklooksygenazy i peroksydazy. Produkt szlaku cyklooksygenazy, endoperoksyd (PGH), jest przemieniany do prostagJandyn D, E i F, a takŜe do tromboksanu (TXA2) i prostacykliny (PGI2). KaŜdy rodzaj komórki
RóŜne bodźce, np. anglotensyna II, twadyktntna. adrenalina,

FoEtolipId błonowy

irombina
FOSFOLIPAZA A,

KortykoBteroltJy przeciwzapalne Arachidonian UPOKSYGENA2A

Leukotrieny

Prostaglandyny i tromboksany

Kwas acetylosalicylowy

Indomstacyna

Ryc. 25-5, Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyn i tromboksanów szlakiem cyklooksygenazy oraz do leukotrienów szlakiem I i po k sygenazy. Na rycinie pokazano, dlaczego steroidy, które hamują całkowite wytwarzanie eikozanoidów, są lepszymi czynnikami przeciwzapalnymi niŜ kwas acetylosalicylowy i podobne do niego leki, które hamują tylko szlak cyklooksygenazy. UwaŜa się, Ŝe steroidy przeciwzapalne hamują fosfolipazę Az przez to, Ŝe indukują inhibitorowe białko lipokortynę.

280 / ROZDZIAŁ 26
Pokarm

Llinolan

I-2H
y-Unolenian

Pros!anofdy;

:

J+2C
COOH
8,11,14Eikozatrienoart (d th omo-y-l in ols n ian)

POD, PGE,

LTD,
GRUPA3 Prostanoidy;

.
Ei kc zatet raanoan

PG D, PGE,

|+2C Oktadekatettaenaan -2H

-COOH

. _-----

PG13

3

TXAj, Leukatrieny 5 8, 11, 14, 17-Elkozape nlaen o a n

T-2H
ot-Linolenian

©

LTCS

Dieta

Ry - 25-6. 3 grupy eikozanoidów i ich biosyntetyczne pochodzenie. PG — prostaglandyna, PGI — prostacykltna, TX — tromboksan, LT — leukotrien, 1 —szlak cyklooksygenazy, 2—szlak Itpotcsygenazy Indeks we frakcji dolnej oznacza całkowitą liczbę podwójnych wiązań w cząsteczce i serię, do której ten związek naleŜy.

c

wytwarza tylko 1 typ prostanoidu. Kwas acetylosalicylowy hamuje cyklooksygenazę i podobnie działa indometacyna. Aktywność egzogennych kwasów tłuszczowych jest skorelowana z wytwarzaniem prostagłandyn Jakkolwiek istnieje znaczna korelacja między aktywnością poszczególnych egzogennych kwasów tłuszczowych a ich zdolnością do przekształcania się w prostaglandyny nie wydaje się, aby egzogenne kwasy tłuszczowe wywierały wszystkie swoje fizjologiczne efekty przez biosyntezę prostagłandyn. Rola egzogennych

kwasów tłuszczowych w powstawaniu błon nie ma związku z tworzeniem prostagłandyn. Pod wpływem prostagłandyn nie dochodzi do cofania się objawów niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych zaś zespół niedoboru egzogennych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany dhigo trwałym hamowaniem syntezy prostagłandyn. Cyklooksygenaza jest „enzymem samobójczym" „Wyłączenie" syntezy prostagłandyn zachodzi częściowo dzięki godnej uwadze właściwości cyklooksygenazy, mianowicie enzym ten wyka-

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDÓW / 281
COOH

Ryc. Przemiana
9 Kwas acetylosalicylowy Indomalacyna

26-7. kwasu

arachidonowego do prostaglandyrt i tromboksanów serii 2.
STNTETAZA PROSTACYKLINOWA COOH

SYNTETAZA TROMBOKSANOWA

COOH

PG — prosta-glandyna, TX — tromboksan, PGI — prostacyklina, HHT — hydroksyheptadekatrienoan. * Obydwie te aktywności są związane z jednym enzymem — syntazą endoperoksydów prostaglandyn owych. Podobne przemiany zachodzą z prostaglandynami i tromboksanami serii 1 i 3.

zuje 2dolność katalizowania samozagłady, czyli jest ona „enzymem samobójczym". Inaktywacja raz powstałych prostaglandyn jest szybka. Przyczyną tego jest prawdopodobnie obecność w większości tkanek ssaków dehydrogenazy 15hydroksyprostag landy nowej. Wykazano, Ŝe

zablokowanie tego enzymu sulfasalazyną lub indometacyną moŜe przedłuŜyć biologiczny okres póltrwania prostaglandyn w organizmie. Prostanoidy są substancjami o duŜej aktywności biologicznej Tromboksany są syntetyzowane w płytkach krwi. Przy uwolnieniu powodują skurcz naczyń i agregację płytek. Prostacykliny (PGI2) są wytwarzane przez ściany naczyń krwionośnych i są silnymi inhibitorami agregacji płytek.

Tromboksany i prostacykliny są więc antagonistami. Niewielką zapadalność na choroby serca, występowanie zmniejszonej agregacji płytek i przedłuŜonego czasu krzepnięcia u grenlandzkich Eskimosów przypisuje się duŜemu spoŜyciu olejów rybnych zawierających kwas tłuszczowy 20:5 w3 (EPA albo kwas ikozapentaenowy), który jest wyjściowym związkiem do syntezy serii 3 prostaglandyn (PG3) oraz tromboksanu TX3 (ryc. 25-6). PG3 i TX3 hamują uwalnianie arachidonianu z fostblipidów i tworzenie PG2 oraz TX2. PGI3 ma takie samo silne działanie przedwagregacyjne płytek krwi jak PGI2, natomiast TXA3 jest słabszym czynnikiem agregującym płytki krwi niŜ TXA2. W rezultacie przewaŜa więc działanie hamujące agregację płytek krwi. Ponadto w osoczu Eskimo-

282 / ROZDZIAŁ 25 COOH
Gtlcyna

Kwas glutaminowy ' ---------* — + - J ^ ^ COOH

EJ

fl

OH
Leukotrlen C, COOH

COOH
OH
NH,1

Leukotrlen E,

A
o s
Leukotrion D, Glleyna

Cystelna

Ryc. 25-8. Przemiana kwasu arachidonowego do feukotrienó w serii 4 szlakiem lipoksygen azy HPETE — hydroperok syeikozatetra enoan, HETE — hydroksyeikozatetraen oan. Niektóre podobne prze miany zachodzą z leukotrien ami serii 3 i 5. 1 — Peroksydaz a, 2 — epoksydohydrol aza leukotrienu A,, 3 — Stransferaza glutationow a; 4 — yglutamylotrans feraza, 5 — dipeptydaz a cysteinyłoglicy nowa.

____

METABOLIZM NIENASYCONYCH KWAS0W TŁUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDOW / 283

sów stwierdza się małe stęŜenia cholesterolu, triacylogliceroli, LDL i VLDL, natomiast zwiększone stęŜenie lipoprotein o duŜej gęstości (HDL). Taki profil stęŜeń wymienionych lipidów zdaje się przeciwdziałać powstawaniu miaŜdŜycy naczyń i występowaniu zawałów serca. Zaledwie 1 ng/m] niektórych prostaglandyn powoduje skurcz mięśni gładkich u zwierząt. Potencjalnymi wskazaniami do stosowania prostaglandyn m.in. są: zapobieganie zapłodnieniu, sprowokowanie porodu przy ciąŜy donoszonej, przerwanie ciąŜy, złagodzenie bólu u chorych z chorobą wrzodową Ŝołądka, łagodzenie procesów zapalnych, ciśnienia tętniczego krwi, dychawicy oskrzelowej oraz obrzęków błony śluzowej nosa. Prostaglandyny zwiększają stęŜenie cAMP w: płytkach krwi, tarczycy, ciałku Ŝóhym, kościach płodowych, w przysadce gruczołowej i w płucach, natomiast zmniejszają go w komórkach kanalików nerkowych i w tkance tłuszczowej.

pujące potem odczepienie glutaminianu i glicyny powoduje kolejno powstanie leukotrienu D4 i leukotrienu E4.

Leukotrieny są silnymi regulatorami wielu procesów chorobowych
Wolno reagująca substancja anafilaksji (SRS-A) jest mieszaniną leukotrienów C4, D4 i E4. Ta mieszanina Jeukotrienów jest 100-1000-krotnie silniejszym czynnikiem kurczącym mięśnie oskrzeli niŜ histamina lub niektóre prostaglandyny. Te leukotrieny, razem z leukotrienem B4, zwiększają przepuszczalność naczyń krwionośnych oraz wywołują chemotaksję i aktywację leukocytów. Wydaje się, Ŝe związki te są więc waŜnymi regulatorami wielu procesów chorobowych przebiegających ze stanami zapalnymi oraz uczestniczą w reakcjach nadwraŜliwości bezpośredniej, takich jak dychawica oskrzelowa. Leukotrieny są aktywne w stosunku do naczyń, zaś 5-lipoksygenazę wykazano w ścianie naczyń tętniczych.

PIŚMIENNICTWO LEUKOTRIENYSĄ SYNTETYZOWANE W SZLAKU LIPOKSYGENAZY
Lenkotrieny są rodziną skoniugowanych trienów powstających z kwasów ikozanowych w szlaku lipoksygenazy w leukocytach, komórkach mastocytoma, płytkach krwi i w makrofagach, jako reakcja zarówno na bodźce immunologiczne, jak i nieimmunologiczne. Trzy róŜne lipoksygenazy (dioksygenazy) katalizują przyłączanie tlenu do atomu węgla w pozycjach 5, 12 i 15 kwasu arachidonowego, powodując powstanie hydroperoksydów (HPETE). Jedynie 5-lipoksygenaza bierze udział w powstawaniu leukotrienów. Najpierw powstaje leukotrien A4, który jest metabolizowany albo do leukotrienu B4, albo do leukotrienu C4 (ryc. 25-8). Leukotrien C4 powstaje przez połączenie z glutationem wiązaniem tioeterowym. NastęHammarstróm S: Leukotrienes. Annu Rev Biochem 1983;52:355. Holman RT: Controi of polyunsaturated acids in tissue lipids. J Am Coli Nutr 1986;5:183. Kinsella JE: Food components with potential therapeutic benefits: The n-3 polyunsaturated fatty acids of fish oils. Food Technology 1986;40:89. Lagarde M, Gualde N, Rigaud M: Metabolicinteractions between eicosanoids in blood and vascular cells. Biochem J 1989;257:313. Moncada S (editor): Prostacyclin, thromboxane and leukotrienes. Br Med Buli I989;39:2O9. Neuringer M, Anderson GJ, Connor WE; The essentiality of a-3 fatty acids for the devdopment and function of the retina and brain. Annu Rev Nutr 1988;8:517. Piper P: Formation and actions of leukotrienes. PhyswlRev 1984;64:744. Smith WL, Borgeat P: The eicosanoids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985.

OC £*"

Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidów
Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE
Acyloglicerole stanowią większość lipidów organizmu. Triacyloglicerole są głównymi lipidami tłuszczu zapasowego organizmu i zawartego w pokarmach. W dodatku acyloglicerole, zwłaszcza fosfolipidy, są głównym składnikiem błon plazmatycznych i innych błon Ŝywych organizmów. Fosfolipidy biorą takŜe udział w metabolizmie wielu lipidów. Glikosfingolipidy, które zawierają reszty sfingozyny i cukru, jak równieŜ kwasów tłuszczowych, stanowią 5—10% lipidów błon plazmatycznych.

(RDS) u noworodków. Fosfolipidy inozytolowe są prekursorami wtórnych przekaźników działania hormonu, a czynnik aktywujący płytki

krwi jest alkilofosfolipidem, Glikosfmgolipi-dy, występujące w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej z ich oligosacharydowymi łańcuchami wystającymi na zewnątrz, tworzą cześć glikokaliksu powierzchni komórki. UwaŜa się, Ŝe są one waŜne: 1) w komunikowaniu się komórek i kontakcie międzykomórkowym, 2) jako receptory dla toksyn bakteryjnych (np. toksyny, która powoduje cholerę) oraz 3) jako substancje grupowe krwi ABO. Opisano ok. 12
glikolipidowych chorób spichrzeniowych (np.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Rola triacyloglicerolu w transporcie i spichrzaniu lipidów oraz w patogenezie róŜnych chorób, takich jak otyłość, cukrzyca i hiperlipoproteinemie, jest szczegółowo opisana w dalszych rozdziałach. Fosfoglicerole, fosfosfingolipidy i glikosfingolipidy są amfipatycznymi lipidami i dlatego są idealnie dopasowane do tego, aby spełniać funkcję głównych składników lipidowych błon plazmatycznych. Niektóre fosfolipidy spełniają specjalne funkcje, np. dipa1 m i t o i 1 o 1 ecy t y n a (dipa 1 mi toi lof o sf at y d y loch oli na) jest głównym składnikiem surfaktantu płucnego, którego brak u wcześniaków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej

choroba Gauchera, choroba Tay-Sachsa); są one spowodowane niedoborem glikolipidowych hydrolaz normalnie występujących w lizosomach.

KATABOLIZM ACYLOGLICEROLI NIE JEST ODWRÓCENIEM ICH BIOSYNTEZY Katabolizm triacy logliceroli zaczyna się od hydrolizy
Triacyloglicerole muszą zostać zhydrolizowane przez odpowiednią lipaze do ich skład* ników, tj. kwasów tłuszczowych i glicerolu zanim nastąpi dalszy ich katabolizm. Taka hydroliza (lipoliza) zachodzi głównie w tkance

Byc. 26-1. Biosynteza triac^loglicerolu i fosfolipidów. 1 — szlak monoacyloglicerolowy, 2 — szlak glicerolofosf ora nowy, 3 — szlak dihydroksyacetonofosforanowy. Diacy logi icerołotransferazy fosfoetanoloaminowej nie ma w wątrobie.

AOP

NAD*

HjC-OH I HOC-H H,C-OH Gllcero!
I

KINAZA GUCEROLOWA

DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3FOSFORANOWA HO-C-H -■ -3-tosforan HZC-OAcylo-CoA (głownie HjC-OH nasycony) ACYLOTRANSFERAZAI © GLICEROLO--afOSFORANOWA ~* CoA O HjCO-C-R,-*HO-CH
O II

- Ghfcc iiz.a H,C--O-© Di hydro ksyaoet ono-fosforan Acylo-CoA (zwykle nienasycony) ACYLOTRANSFERAZA

® DIHYDROKSYACETONOFOSFORANOWA
NADPH ». H"*

** CoA

n,—c—o— c— H O HjC-OH 2- U D n oa cy I og I łce ro!

©
Acylo-CaA ACYLOTRAMSFI MpNOACYLOGLICE- i S OLOWA (w jelicie) ■ C hol Ina (otanoloamina)

H,C-O-® 1-AcvlogllGero]ot-Acylod I hyd rpksy--acetonofosfofan ff (lizofosfatydan) ^Acylo-CoA (flłdwnle nlenasyoony) ACYLOTRANSFEflAZA 1-ACYLOGLICEROLO-3-FOSFORANOWA Lipidy eterowe ~^CoA
O-C-R, fii-C~O-c-H O It HjC-

®

REDUKTA2A 1-ACYLODIHYDROKSYACETONO -FOSFORANOWA

HjC-O-C-H, C=O

II

I

_ H,C-O-® —
CTP

O 1,2-DI acyl ogl ioe r o I o1 o sf o ra n FOSFOHYOROLAZA (fosfatydan, kwasFOSFATY0AN0WA fosfatydowy)

Fosfocholma i to sto e t an o lo a m i n a ■

CYTYDYLOTRANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA
PP,

CDP-crrallna (CDP-etanoloamlna) DlACYLOGLICEROLCh TRANSFERAZAF0SFOCHOLIN0WA CYTYDYLOTRANSF6RAZA l_CTPHjC-O-C-R, Hj-C-O-C-H O HSC-O-® Chollna (elan o loa mina) Fosfatvdv1ocriolina FOSFATYOANOWA_ _

-PP,
ACYLOTRANSFERAZA H?c-o-c-n, DIACYLOGLICEROLOWA
Rj-C-O-C-H

Kardioliplna (NOZYTOLOTRANSF ERAZA CDPDIACYLOGLICEHOL OWA
ADP

O

■ M;C-O-®-© ATP O Cytydyna M P CD P-d lacv!og llcoro I—

HjC-O-C>— Inozytol

R,

-S-

-<H;C-O-C-R,

Hj-C-O-C-H
O

................

O

l
Rj-C-O-C-H

n,-c-o-c-H o HjC-o-@-lnoz/tol-® Fo sfalyclylol nozytolo-4-fosforan

H;C — O-C— R

O

H;C-O-

Trlacylogltoerot inozytot Fostatydylolnozylol (foafatytMoetan oloaml na) Fosfalydyloelanoloamlna Foafatydyloseryna Etan oi oa ml na [KINAZA | Seryna
ADP ■*' •

H;C-O-Ć-R, R,-C-O-C-H o H,c-o-@-inozytol®

Fosfatydyło In oŜyto lo-4,5- blsfosfor an

286 / ROZDZIAŁ 26

tłuszczowej. Uwolnione w wyniku lipolizy wolne kwasy tłuszczowe dostają się do osocza, gdzie występują w postaci związanej z albuminą. Następnie wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki i utleniane lub ponownie estryfikowane. Wiele tkanek (łącznie z wątrobą, sercem, nerkami, mięśniami szkieletowymi, płucami, gonadami męskimi, mózgiem i tkanką tłuszczową) ma zdolność utleniania kwasów tłuszczowych o długim łańcuchu węglowym, chociaŜ mózg niezbyt łatwo pobiera je z krwi. ZuŜytkowanie glicerolu zaleŜy od tego, czy dana tkanka ma konieczny do tego aktywujący enzym kinazę glkerolową (ryc. 26-1). Enzym ten wykazano w znacznych ilościach w wątrobie, nerkach, jelitach, brunatnej tkance tłuszczowej i w gruczole sutkowym w okresie laktacji.

KWAS FOSFATYDOWY JEST WSPÓLNYM PREKURSOREM BIOSYNTEZY TRIACYLOGLICEROLI I FOSFOGLICEROLI
ChociaŜ reakcję hydrolizy triacyloglicerolj z udziałem lipazy moŜna odwrócić w warunkach laboratoryjnych, nie jest to jednak mechanizm, przez który acyloglicerole są syntetyzowane w tkankach. Zarówno kwasy tłuszczowe, jak i glicerol muszą zostać zaktywowane przez ATP zanim będą mogły być wbudowane do acylogliceroli. Kinaza glicerolowa katalizuje aktywację glicerolu do sn-glicerolo-3-fosforanu. JeŜeli tego enzymu nie ma lub jego aktywność jest mała, jak to ma miejsce w mięśniach lub w tkance tłuszczowej, większość glicerolo-3-fosforanu musi pochodzić ze związku pośredniego glikolizy — dihydroksyacetonofosforantt, który przekształca się w glicerolo-3-fosforan przez redukcję z NADH, katalizowaną przez dehydrogenazę gliceroIo-3-fosforanową (ryc, 26-1).

fatydanowej fosfatydan jest przekształcany do 1,2-diacyloglicerolu. W błonie śluzowej jelita istnieje szlak monoacyloglicerolowy, w którym monoacyloglicerol jest przekształcany do 1,2diacyloglicerolu pod wpływem acylotransferazy mo no ac>log lice rolo w ej. Następna cząsteczka acylo-CoA wchodzi w reakcję z diacyloglicerolem, tworząc triacyloglicerol. Reakcja ta jest katalizowana przez acylotransferazę diacyloglicerolową. Większość aktywności tych enzymów jest umiejscowiona w siateczce śródplazmatycznej komórek, chociaŜ niektóre z nich znajdują się w mitochondriach, np. acylotransferaza glicerolo-3-fosforanowa. Aktywność fosfohydrolazy fosfatydanowej występuje głównie we frakcji supernatantu pozbawionej struktur subkomórkowych, ale pewne jej ilości są związane z błonami. Dihydroksyacetonofosforan moŜe być acylowany i przemieniany do lizofosfatydanu po redukcji przez NADPH. Ilościowe znaczenie tego szlaku przemiany jest kontrowersyjne. Ten szlak wydaje się być bardziej istotny w peroksysomach, gdzie uczestniczy w syntezie lipidów eterowych.

Biosynteza fosfogliceroli. Te fosfoiipidy są syntetyzowane albo z fosfatydanu, np. fosfatydyJoinozytol, albo z 1,2-diacyloglicerolu, np. fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina. W syntezie fosfatydyloinozytolu, cytydynotrifosforan (CTP), bogatoenergetyczny fosforan wytwarzany z udziałem ATP (p, str. 137) reaguje z fosfatydanem, tworząc cyłydynodifosfodiacyloglicerol (CDP-diacyloglicerol). Ostatecznie ten związek reaguje z inozytolem w reakcji katalizowanej przez CDP-diacylogliceroiotransferazę inozytolową, tworząc fosfatydyioinozytol (ryc. 26-1). Przez kolejne fosforylacje fosfatydyloinozytol jest przekształcany najpierw do fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, a następnie do fosfatydyloinozyto!o-4,5-bisfosforanu. Ten ostatni jest rozkładany do diacyloglicerolu i inozytolotrisfosforanu po zadziałaniu na komórkę hormonu, który zwiększa stęŜenie Ca2+, np. wazopresyny. Te 2 produkty odgrywają rolę drugiego przekaźnika w działaniu hormonu. W biosyntezie fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy (lecytyn i kefalin) cholina lub etanoloamina muszą najpierw zostać przekształcone w „aktywną choiinę" lub „aktywną etanoioaminę". Jest to proces 2-etapowy, w którym zachodzi najpierw reakcja z ATP, z wytworzeniem odpowiednich monofosforanowych pochodnych, a następnie reakcja z CTP

Biosynteza triacylogliceroli. Kwasy
tłuszczowe są aktywowane do acylo-CoA pod wpływem enzymu syntetazy acylo-CoA z udziałem ATP i CoA (p. str. 261). 2 cząsteczki acylo-CoA wiąŜą się z glicerolo-3-fosforanem, tworząc fosfatydan (l,2-diacyloglicerolo-3-fosforan). Reakcja ta przebiega w 2 etapach przez lizofosfatydan i jest katalizowana najpierw przez acylołransferazę gIicerolo-3-fosforanową, a następnie przez acylotransferazę l-acyloglicerolo-3-fosforanową (acylotransferazę lizofosfatydanową). Pod wpływem fosfohydrolazy fos-

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPIDÓW / 287

z wytworzeniem cytydynodifosfocholiny (CDP-choliny), lub cytydynodifosfoetanoloaminy (CDP-etanoloaminy). W takiej postaci cholina lub etanoloamina reagują z 1,2-diacylogiicerolera w ten sposób, Ŝe ufosforylowana zasada (fosfbchoiina albo fosfoetanoloamina) jest przenoszona na 1,2-diacy logi ice roi z wytworzeniem albo fosfatydylocholiny, albo fosfatydyloetanoloaminy. Cytydylotransferaza wydaje się być regulacyjnym enzymem szlaku biosyntezy fosfatydylocholiny. Fosfatydyloseryna powstaje z fosfatydylo-etanolaminy w bezpośredniej reakcji z seryną. Fosfatydyloseryna moŜe odtwarzać fosfatydyloetanoloaminę przez dekarboksylację, W wątrobie występuje alternatywna droga umoŜliwiająca bezpośrednią przemianę fosfatydyloetanoloaminy w fosfatydylocholinę przez kolejne metylacje reszty etanoioaminowej przy uŜyciu S-adenozylometioniny jako dawcy grup metylowych. Z kolei grupa metylowa w metioninie moŜe pochodzić z metylo-H+-fołianu (p. ryc. 53-15). Pomimo tych moŜliwych szlaków wytwarzania choliny. jest ona uwaŜana za egzogenny składnik poŜywienia dla wielu gatunków ssaków, chociaŜ nie ustalono tego dla człowieka. Fosfolipidem występującym w mitochondriachjest kardiolipina (difosfatydyloglicerol, p. str. 179). Powstaje ona z fosfatydyloglicerolu, który jest syntetyzowany z CDP-diacyloglicerolu (ryc. 26-1} oraz glicerolo-3-fosforanu według schematu przedstawionego na ryc. 26-2.

Surfaktant płucny. Jest wydzieliną powierzchniowo aktywną, złoŜoną głównie z lipidu z niewielką ilością białka i węglowodanów. Zapobiega ona zapadaniu się pęcherzyków płucnych. Aktywność surfaktantu jest przypisywana głównie obecności fosfolipidu — dipalmitoilofosfatydylocholinie, który jest syntetyzowany krótko przed porodem u donoszonego dziecka. Niedobór surfaktantu w płucach wielu niedonoszonych noworodków jest przyczyną zespołu niewydolności oddechowej (RDS). Podawanie naturalnego lub sztucznego surfaktantu ma korzystne działanie terapeutyczne.

Biosynteza eterowych fosfolipidów glicerolowych oraz plazmalogenów.
Plazmalogenowy diacyloglicerol jest to taki związek, w którym w pozycji 1 (lub 2) glicerolu znajduje się reszta alkenylowa, zawierająca wiązanie aldehydogenne eteru winylowego (CHj - O - CH = CH - R). Prekursorem części glicerolowej jest dihydroksyacetonofosforan (ryc. 26-3), który reaguje z acylo-CoA, tworząc 1-acylodihydroksyacetonofosforan. Następnie zachodzi reakcja wymiany między grupą acylową i alkoholem o długim łańcuchu węglowym z wytworzeniem 1 -alkilodihydroksyacetonofosforanu (mającego wiązanie eterowe). Związek ten w obecności NADPH jest przemieniany w l-alkiloglicerolo-3-fosforan. Po następnej acylacji, w pozycji 2, utworzony l-alkilo-2-acyloglicerolo-3-fosforan (analogiczny do fosfatydanu z ryc. 26-1), jest hydrolizowany z wytworzeniem pochodnej glicerolu pozbawionej reszty fosforanowej. Plazmaiogeny powstają przez desaturację odpowiednich pochodnych z fosfoetanoloamina (ryc. 26-3). Znaczną część fosfolipidów w mitochondriach stanowią plazmaiogeny. Czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) jest syntetyzowany z odpowiedniej pochodnej fosfocholinowej, a zidentyfikowano go jako l-alkilo-2-acetylo-i7j-glicerolo-3-fosfocholinę. Jest on wytwarzany przez wiele komórek krwi oraz inne tkanki. Powoduje on agregację płytek krwi w tak małych stęŜeniach, jak 10"11 mol/l. Ma on takŜe właściwości hipotensyjne i wrzodotwórcze. Fosfolipazy pozwalają na degradację oraz przemodelowanie glicerolofosfolipidów Degradacja wielu złoŜonych cząsteczek w tkankach przebiega do całkowitego ich rozłoŜenia, np. białka są rozkładane do aminokwasów. Wobec tego moŜna określić czas ob-

CDP-dlacylogltoeral

Ryc. 26-2. Biosynteza kardioiipiny.

CMP CMP Kardiolrpma sn-Gllcerolo-

HiCOH

Acylo-CoA

H 3 C-O-C-R,

ml A
DihydrokByaeetonofosforan

_I ;YLÓI I

R,-(CH ; I,-OH H

NADPH-fH4 NAOP + H^C-O-ICH^R, |RH>UKTAZA|

ACYLO

~
HOOC-R,

SFEHA2AI H,C~O-(p)
1-Acytodl hydro ksyaoetonofosforan

i -Al ki I o g I icero lo-3-f osf o ra n r aceton ofoaforati TRANSFERA2, lfRj-C-O-CH 1-Alki!o-2-acy!ogl(cerolo-a-insfoetafwłDamlna CMP k. CDP-etanoloamlna l O H;CO II H^C-O Acyto-CoA ACYLO-

\

J

-

i - i

Ł1ACVLC>GLICEROLO -C-O -C -H TRANSFERAZA I HjC-OH IP0SF0HYDR0LA2AI FOSFOETANOLO1-Alkilo-2-acy1oglicerol HjC-0-® 1 - Alkilo-2-acy AM1NOWA -CDP-chollna DiACYLOGLICEHOLOTFIANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA

R,

I

log lloeroło-3-tosfof an
CMP

NADPH, O*

Alktlodiacylogllcerole

[DESATURAZA I
O CO HUC-OHiC-O-CH-CH-ft, O H^-O-ICH^-R,
R) COOH

;

V
HjC-G-ICHA-R! HO-C-H
I FOSF0L1PA2A |

1 -Alkarylo-E-aeylogllcorolo- 3-f osf oatanoloamlna, plaŜ mato gen

Cholina 1-Alkilo-2-acylog!icerolo3-fosfocholina

Cholina
i-Aikilo-2-iizoglioerolow 3-fosfcchalina

Acetylo-CoA
O HjC — O-

ACYLOTRANSFERAZA | II i H^-C-O-C-H

Ryc. ?6-3. Biosynteza lipidów eterowych, plazmalogenów i ciynrrika aktywującego płytki {PAF). W szlaku syntezy PAF rfe novo acetylo-CoA jest wbudowywany w etapie*, unikając ostatnich 2 etapów pokazanych tutaj.

Cholina
1 -A Ikllo -2-acety lo g I icef o I a-3-iosf oc hol i na PAF

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPiDÓW / 289

o
O
II

HjC-O-C-fi,
I

FOSFOLIPAZA A,J

ij -C-O-C-H HjC-O-(P)-Cf)ollna Fosfatydyloohollna H,0
jFOSFOLIFAZAA; | Acylo-CoA

—0-- C FÓSFOLIPAśAD I — R, R 3 —C--O-C -H
O

HjC-0 + P -+ O —I O
FD3FOLIPAZA A,

ZASADA AZOTOWA

H,C-O-C-R 1 HOOH H3 C-O-®CHolina
Lizofosfatydylocholina (> iz o lecytyna) H,0 ILIZOFOSFOLIPAZA

| FOSFOLIPAZA C | Ryc. 26-5. Miejsca hydfolitycznego działania fos-

folipaz na substrat fosfolipidowy.

R, -COOH H2C-OH HO-C-H
l

Gl ioery lofosfocho lina HYDROLAZA GUCERYLOFOSFOCHOLtNOWA

HO-C-H
I icero I o-3-f o sio ran

+ Chollna

HjC-O-® src-G
R yc. 26- 4. Metab oli zm l ustći t yu yl i j Ui oiii i y (l u ^yt y

ny).

rot u (turnover time) dla takich cząsteczek. ChociaŜ fosfolipidy są aktywnie degradowane, kaŜda cześć składowa ich cząsteczki ulega obrotowi (rozpadowi i re syn tezie) z odmienną szybkością, np. czas obrotu grupy fosforanowej jest inny niŜ czas obrotu grupy 1-acylowej, Jest to spowodowane obecnością enzymów, które umoŜliwiają częściową degradację z następującą zaraz po niej resyntezą (ryc. 26-4). Fosfolipaza Aj katalizuje hydrolizę wiązania estrowego w pozycji 2 gl icero lofosfolipid ów z wytworzeniem wolnego kwasu tłuszczowego i lizofosfolipidu, który moŜe zostać ponownie acylowany przez acylo-CoA w obecności acylotransferazy.
19 — Biochemia

Alternatywnie lizofosfolipid (np. lizolecytyna) moŜe być atakowana przez lizofosfoiipazę (fosfolipazę A^, która usuwa pozostałą grupę 1 -acylową, pozostawiając glicerol połączony losfodiestrowo z odpowiednią zasadą. Ten ostatni związek moŜe być rozkładany przez odpowiednią hydrolazę z uwolnieniem glicero-Io-3-fosforanu i zasady. Fosfolipaza Aj działa na wiązanie estrowe w pozycji 1 fosfolipidów (ryc. 26-5). Fosfolipaza C atakuje wiązanie estrowe w pozycji 3, uwalniając 1,2diacylo-glicerol i ufosforylowaną zasadę. Jest to jedna z głównych toksyn wytwarzanych przez bakterie. Fosfolipaza D jest enzymem opisywanym głównie u roślin, a katalizującym odhydrolizo-wanie zasady azotowej od fosfolipidów. Lizo lecytyna moŜe powstawać alternatywną drogą, z udziałem acylotransferazy lecytyna: : cholesterol (LCAT), Ten enzym, występujący w osoczu, a syntetyzowany w wątrobie, katalizuje przeniesienie 1 reszty kwasu tłuszczowego z pozycji 2 lecytyny na cholesterol z wytworzeniem estru cholesterolowego. Enzym ten ma być odpowiedzialny za duŜą ilość estru cholesterolowego zawartego w li po proteinach osocza. Następstwa niedoboru LCAT są dyskutowane na str. 321
A C E T Y LO T B A N S F E R A Z A L ECYT YNA— CHO L EST ERO L

Lecytyna + cholesterol Lizolecytyna + Ester cholesterolowy

Nasycone kwasy tłuszczowe o długim łańcuchu występują przewaŜnie w pozycji 1 fosfolipidów, podczas gdy wielo nienasycone kwasy (np, prekursory prostaglandyn) są wbudowa-

290 / ROZDZIAŁ 26

ne raczej w pozycji 2. Wbudowywanie kwasów tłuszczowych do lecytyny odbywa się przez kompletną syntezę fosfolipidu, przez transacylacje między estrami cholesterolu i lizolecytyną i przez bezpośrednią acylacje lizolecytyny z udziałem acylo-CoA. Wobec tego moŜliwa jest ciągła wymiana kwasów tłuszczowych, zwłaszcza gdy chodzi o wprowadzanie egzogennych kwasów tłuszczowych do cząsteczek fosfolipidów. WSZYSTKIE SFINGOLIPIDY POWSTAJĄ Z CERAMIDU Aminoalkohol sfingozyna (ryc, 26-6) jest syntetyzowany w siateczce śródplazrnatycznej. Po zaktywowaniu, polegającym na połączeniu z foNH3+ CH 3-<CH Palmltollo-CoA

sforanem pirydoksalu, aminokwas seryna łączy sie z palmitoilo-CoA, tworząc po odłączeniu CQ2 3-ketosfinganine. Sama sfingozyna powstaje po etapie redukcji, o którym wiadomo Ŝe uczestniczy w nim NADPH jako dawca wodorów. Potem następuje etap oksydacyjny, analogiczny do etapu P-oksydacji z udziałem dehydrogenazy acylo-CoA, w którym uczestniczy enzym będący flawoproteiną. Ceramid (N-acylosfingozyna) powstaje pr2ez połączenie acylo-CoA i sfingozyny (ryc. 26-7).
Sflngomlellna Acylogllcerol Fosfatydylochnilna

Sflngozyna

-- ^

Ceramid

, -»■ SfingomWIna

Acyfo-CoA

CoA

CDP- CMP -oholfna

Ryc. 26-7. Biosynteza ceramidu i sfingomieliny.

CoA • SH

Grupą acylową często jest reszta długołańcuchowego kwasu nasyconego lub monoenowego. Sfingomieliny są fosfolipidami (p. str. 181) powstającymi w wyniku reakcji ceramidu z CDP-choliną albo z fosfatydylocholiną; pierwsza reakcja jest analogiczna z tą, jaka zachodzi podczas biosyntezy fosiatydy locho liny (ryc. 26-1).
3-Ketosiinganina ■NADPH+H

REDUKTAZA 3KETOSRNGANINOWA NADP +

I I OH NHa + Dlhydrosflngozyrta REDUKTAZA SFINGANINOWA \

I I OH NH3 + Sflngozyna Ryc. 26-6. Biosynteza sfingoz/ny. Fp-flawoproteina.

Glikosfingolipidy są połączeniem ceramidu z jedną lub wieloma resztami cukrowymi W wielu glikosfingolipidach, zwłaszcza w mózgu, jest charakterystyczne występowanie kwasów tłuszczowych C24 (kwasów lignocery-n owego, cerę brono we go i nerwonowego). Kwas lignocerynowy(C23H47COOH) jest w całości syntetyzowany z acetylo-CoA. Kwas cerębronowy jest 2-hydroksypochodną kwasu lignocerynowego i jest z niego syntetyzowany. Kwas nerwonowy (C;3H4;COOH) jest mononienasyconym kwasem i powstaje przez elongację kwasu olejowego. Najprostszymi glikosfingolipidami (cerebrozydami) są galaktozyloceramid (GalCer) i glukozyloceramid (GlcCer). GalCer jest głównym lipidem mieliny, podczas gdy GlcCer jest głównym glikosfingolipidem tkanek pozanerwowych oraz prekursorem większości bardziej

METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOUPiDÓW / 291
UDPGIc [EPIMERAZA| Acyl-CoA CoA Sfngozyna ^> * », UDPGal UDP PAPS f Galaktozyloceramld ( Sulfogalaklozyloceramid Cerami d —^-*- (cerebrazyd) ------------- ^-*(aurtaNdl
(sulfatyd)

Ryc. 26-8. Biosynteza galaktozyloceramidu i jego siarczanowej pochodnej, PAPS — „aktywny siarczan' fosfoadenozyno-B-tosfosiarczan.
Acylo-CaA CoA

UOPGIc
Ceramtd

UDP

UDPGal Glukozylaceramid (Cer-Glc)

UDP

Stingozyna

L

CerGIcGal

Prosty gangilozyd (mon QS ialogan g I! ozyd) Cer-GIcGal-GalNAc-Gal --------- Ne!,Ac
(GMI)

CMP-NeuAc

CM P

UDP

'— UDPGal

UDP

UDP-N-acBtylogalaktazoamina

WyŜsze ganfllbzydy
[disialo-1 trisialogangllozydy)

Cer-GIc-Gal-GalNAc

I

NeuAc

Cer-GIc-Gal I NeuAc

Ryc. 26-9. Biosynteza gangliozydów. NeuAc — kwas N-acetyloneuraminowy

złoŜonych glikosfingolipidów. Epimeraza urydynodifosfogalaktozowa (ryc. 26-8) katalizuje epimeryzację glukozy do galaktozy, przekształcając urydynodifosfoglukozę (UDPGIc) w urydynodifosfogalaktozę (UDPGal). W mózgu reakcja przebiega podobnie do przedstawionej na ryc. 22-5 dla wątroby i gruczołu sutkowego. Galaktozyloceramid powstaje w wyniku reakcji między ceramidem i UDPGal. Sulfagalaktozyloteramid jest rezultatem dalszej reakcji z 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanem (PAPS; „aktywny siarczan"). PAPS uczestniczy takŜe

w biosyntezie innych suliblipidów, tj. sulfo(galakto)głicerololipidów i estrów siarczanowych steroidów, Gangliozydy są syntetyzowane z ceramidu przez stopniowe przyłączanie zaktywowanych cukrów (np. UDPGIc i UDPGal) oraz kwasu sjalowego, którym zwykle jest kwas N-atetylone u mm i na wy (ryc. 26-9). MoŜe powstawać wiele gangliozydów o coraz większej masie cząsteczkowej. Większość enzymów przenoszących cukry z nukleotydocukrów (glikozylotransferazy) jest umiejscowiona w aparacie Golgiego.

292 / ROZDZIAŁ 26

Glikosfingolipidy są składnikami zewnętrznej warstwy błony plazmatycznej i są waŜnymi strukturami uczestniczącymi w kontakcie międzykomórkowym i komunikowaniu się komórek. Niektóre z nich są antygenami, np. antygen Forssmana i antygeny układu grupowego krwi ABO, Podobne łańcuchy oligosacharydowe występują w glikoproteinadi błon komórkowych. Niektóre gangliozydy funkcjonują jako receptory toksyn bakteryjnych (np. toksyny cholery, która następnie aktywuje cyklazę adenylanową).
Tabela 26-1. Zestawienie sfingolipidoz
Choroba Fukozydoza Niedobór enzymu oc-Fukozydaza

FOSFOLIP1DY I SFINGOLIPIDY UCZESTNICZĄ W PATOGENEZIE STWARDNIENIA ROZSIANEGO I LIPIDOZ
Pewne choroby charakteryzują się występowaniem nieprawidłowych ilości wspomnianych powyŜej lipidów w tkankach, często w tkance nerwowej. Choroby te moŜna podzielić na 3 grupy: 1) prawdziwe choroby demielinizacyjne, 2) sfmgoiipidozy oraz 3) leu kody strofie. W stwardnieniu rozsianym, które jest chorobą

Nagromadzający się lipid Cer-GIc-Gal-GalNAc-GaljFuc Izoantygen H Cer-Glc-Gal(NeuAc)-GalNAc|Gal GM1-Gangliozyd Cer-Glc-Gal(NeuAc)jGalr\!Ac GM2Gangliozyd Cer-GIc-Gal-GalJGalNAc Globozyd plus G^2 gangliozyd Cer-GIc-GalJGal Globotriaozylocefamid

Objawy kliniczne Zwyrodnienie mózgu, przykurczę mięśniowe, gruba skóra Niedorozwój umysłowy, powiększenie wątroby, zniekształcenia kośćca Niedorozwój umysłowy, ślepota, osłabienie mięśni Takie same, jak w chorobie Tay-Sachsa, ale postępujące znacznie szybciej Wykwity skórne, niedoczynność nerek (pefne objawy tylko u osobników męskich, gen recesywny związany z chromosomem X) Postępujące uszkodzenie mózgu, powiększenie wątroby i Śledziony Niedorozwój umysłowy, a u dorosłych zaburzenia psychiczne, demielinizacja Niedorozwój umysłowy, prawie zupełny brak mieliny Powiększona wątroba i śledziona, ubytki osteolityczne kości długich. U dzieci niedorozwój umysłowy Powiększona wątroba i śledziona, niedorozwój umysłowy; zgon we wczesnym okresie Ŝycia Chrypka, zapalenie skóry, zniekształcenie kośćca, niedorozwój umysfowy, zgon we wczesnym okresie Ŝycia

Uogólniona gang- Gurf)-galaktozydaliozydoza Choroba Tay-Sach- Hekso2oaminidaza A sa Odmiana choroby Heksozoaminidaza Tay-Sachsa albo A i B choroba Sandhoffa Choroba Fabry'ego u-Galaktozydaza

Lipid oia laktozydoceramidowa Leukodystrofia metach romatyczn a

Laktozydaza cerami- Cer-Glc|Gal dowa (f}-galaktozy- Laktozydoceramid daza) Ary losu Ifataza A Cer-GaljOSOj 3Sulfogalaktozyloceramid Ce^Gal Galaktozyioceramid CeriGlic Glukozy loceramid

Choroba Krabbego p-Galaktozydaza

Choroba Gauchera

p-Glukozydaza

Choroba Miemanna-Picka

Sfingomielinaza

CerjP-cholina Sfingomielina

Choroba F3fbera

Ceramidaza

AcyljSfingozyna Cera m id

NeuAc — kwas N-acetyloneu/aminowy, Cer — ceramid; Glc — glukoza, Gal — galaktoza, Fuc — fukoza. Wiązania oznaczone j są miejscami reakcji katalizowanej przez enzym, którego niedobór występuje

METABOLIZM ACYLOGL1CEROLI I SFINGOLIPIDOW / 293

demielinizacyjną, stwierdza się utratę z substancji białej zarówno fosfolipidów (zwłaszcza plazmalogenu etanoloaminowego), jak i sfmgolipidów. Wynikiem tego jest zbliŜenie składu chemicznego substancji białej mózgu do składu substancji szarej. W substancji białej u takich chorych moŜna stwierdzić obecność estrów cholesterolu, chociaŜ normalnie ich tam nie ma, a w płynie mózgów o- rdzeniowym występuje zwiększone stęŜenie fosfolipidów. Sfingoiipidozy są grupą chorób dziedzicznych, często ujawniających się juŜ w dzieciństwie. Choroby te zalicza się do duŜej grupy zaburzeń lizosomalnych. Choroby charakteryzujące się spichrzaniem lipidów mają kilka stałych cech: 1. W róŜnych tkankach stwierdza się spichrzanie złoŜonych lipidów, w których skład wchodzi wspólny składnik —■ ceramid. 2. Szybkość syntezy spichrzanego lipidu jest porównywalna do szybkości u zdrowych osób. 3. Enzymatycznym defektem
jest niedobór swoistego hydrolityczneg© enzymu lizosomalnego, niezbędnego do rozkładania na-

u nienarodzonego płodu. Zestawienie najwaŜniejszych lipidoz przedstawiono w tab. 26-1.
Skutkiem licznych postaci niedoboru sulfataz

jest spichrzanie w tkankach sulfogalaktoceramidu, estrów siarczanowych steroidów i proteoglikanów. Jest to spowodowane złoŜonym niedoborem arylosulfataz A, B i C oraz sulfatazy steroidowej.

PIŚMIENNICTWO
Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rded. Vol 16: Lipid Enzymoiogy. Academic Press, 1983. Brady RO: Sphingolipidoses. Annu Rev Biochem 1978;47:Ó87. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phosphoiipids. Bfeevier, 1982. Snyder F: Biochemistry of plateletactivating factor. PSEBM 1989; 190:125. Various authors: In: The Metaboik Basis oflnherited Disease, óth ed. Scriver CR et al (editors). McOraw-Hill, 1989. Various authors: Metabolism of triacylglycerols; phospholipid metabolism; ether-linked glyrerolipids; sphingolipids. In: Biochemisiry of Lipids and Hormones. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummiugs, 1985. VanGolde LMG. Batenburg JJ, Robertson B; The pulmonary surfaelant system: biochemical aspects and functional significance. Physiol Rev 1988;68:374. Watts RWE, Gibbs DA: Lysosomal Storage Diseases: Biochemical and Clinical Aspects. Taylor & Francis, London, 1986.

gromadzanego lipidu. 4. Stopień niedoboru aktywności enzymu, warunkującego spichrzanie lipidu, jest podobny we wszystkich tkankach chorego z ttj. wadą. Na podstawie tej jednakowej aktywności opracowano metody rozpoznawania, -dzięki którym stało się moŜliwe równieŜ wykrycie heterozygotycznych osób z tymi nieprawidłowościami genetycznymi, odpowiedzialnymi za przenoszenie choroby, a takŜe wykazanie występowania dystrofii sfmgolipidowej

Transport i magazynowanie lipidów
Peter A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Tłuszcze wchłonięte z pokarmów i lipidy syntetyzowane przez wątrobę i tkankę tłuszczową muszą być transportowane między róŜnymi tkankami i narządami, aby mogły być zuŜytkowane i magazynowane. PoniewaŜ lipidy są nierozpuszczalne w wodzie, powstaje problem, jak je transportować w środowisku wodnym, jakim jest osocze krwi. Zosta! on rozwiązany dzięki asocjacji niepoiarnych lipidów (triacylogliceroli i estrów cholesterolu) z amfipatycznymi lipidami (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z białkami, przez co powstają mieszające się z wodą lipoproteiny. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE U zwierząt wszystkoŜernych, takich jak człowiek, spoŜywających posiłki przedzielone okresami postu, nadmiar energii zostaje zmagazynowany w fazie anabolicznej procesu karmienia, po której następuje okres negatywnej równowagi energetycznej, w czasie którego organizm czerpie potrzebną mu energię ze swoich zapasów węglowodanowych i tłuszczowych. Lipoproteiny pośredniczą między tymi cyklami, transportując lipidy z jelita (w postaci chylomikronów) i z wątroby (w postaci lipoprotein o bardzo małej gęstości — VLDL) do większości tkanek, gdzie są utleniane, lub do tkanki tłuszczowej, gdzie są magazynowane. Z tkanki tłuszczowej tłuszcz jest mobilizowany jako wolne kwasy tłuszczowe (WKT), które, dostając się do krwi, łączą się z albuminami surowicy. Nieprawidłowości przemiany lipidów mogą być spowodowane zaburzeniami syntezy lub utyli-

zacji lipoprotein i mogą powodować róŜne hipolipoproteinemie lub hiperlipoproteinemie. Najbardziej powszechna z nich występuje u chorych na cukrzycę (diabetes melłitus), u których niedobór insuliny jest przyczyną nadmiernej mobilizacji WKT oraz zmniejszonego zuŜytkowywania chylomikronów i VLDL, prowadzących do powstawania hipertriacyloglicerolemii. Większość innych stanów patologicznych dotyczących zaburzeń transportu lipidów jest uwarunkowana dziedzicznymi wadami syntezy części apoproteinowej lipoprotein, kluczowych enzymów ich przemiany lub receptorów lipoprotein. Niektóre z tych wad powodują hipercholesterolemic i przedwczesną miaŜdŜycę (atherosclerosis). Nadmierne spichrzanie tłuszczów jest cechą otyłości, której jedna z postaci jest spowodowana wadliwą termogenezą indukowaną dietą w brunatnej tkance tłuszczowej. LIPIDY SĄ TRANSPORTOWANE W OSOCZU JAKO LIPOPROTEINY Zidentyfikowano 4 główne grupy lipoprotein Przez wyekstrahowanie lipidów osocza odpowiednim rozpuszczalnikiem tłuszczowym i po rozdziale wyciągu na poszczególne klasy lipidów moŜna wykazać w nim obecność triacylogikeroli, fosfolipidów, cholesterolu i estrów cholesterolu oraz niewielkie ilości niezestryfikowanych, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych (wolnych kwasów tłuszczowych), które stanowią mniej niŜ 5% całkowitej ilości kwasów tłuszczowych występujących w osoczu. Ta frakcja wolnych kwasów tłuszczowych (WKT; ang. Free Fatty Acids — FFA) jest najbardziej aktyw-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 295 Tabela 27-1. Lipidy osocza krwi u człowieka Lipid Triacyloglicerol + Całkowite fosfolipidy Całkowity cholesterol Wolny cholesterol (nie-zegtryf i kowany} Wolne kwasy tłuszczowe (niezestryfikowane)
1,6 3,1 5,2 1,4 0,4
Gęstość _ Miejsce , starlu Chylomlkrony

mmol/l Średnio zakres 0,9-2,0 1,8-5,8 2,8-8,3 0,7-2,7 0,2-0,6
ł

<0,96 1,006-1,063 iLDL) < 1.006 (VLDL) 1,063-1,21 (HDL)

^Lipoproteiny Pre-/Hipoprotalny a-LIpoprotelny

Ryc. 27-1. Elektroforetyczny rozdział lipoprotein

Z catej ilości kwasów tłuszczowych 45% znajduje się w triacyloglicerolach, 35% w fosioiipidach, 15% występuje jako estry cholesterolu, a mniej niŜ 5% to wolne kwasy tłuszczowe * Waha się w zaleŜności od stanu odŜywienia Oznaczone jako fosfor lipidowy
+

ną metabolicznie frakcją lipidów osocza. StęŜenie głównych klas lipidów osocza krwi przedstawiono w tab. 27-1. Czysty tłuszcz ma gęstość właściwą mniejszą od wody. Wobec tego obserwuje się malejącą gęstCść w miarę zwiększania proporcji lipidu do białka w lipoproteinach (tab. 27-2). Tę cechę fizyczną wykorzystano do rozdziału lipoprotein osocza metodą ultra wirowani a. Szybkość, z jaką kaŜda lipoproleina wznosi się przez roztwór NaCl (gęstość właściwa 1,063) moŜe być wyraŜona w jednostkach flotacji Svedberga (Sf). Jedna jednostka Sf jest równa 10-11 cm/s/ /dyna/g w temp. 26°C, Skład róŜnych frakcji lipoproteinowych otrzymanych metodą wirowania przedstawiono w tab. 27-2. Z tabeli tej wynika, Ŝe róŜne klasy chemiczne lipidów występują w większości frakcji lipoproteinowych w róŜnych ilościach. PoniewaŜ frakcje lipoproteinowe o określonych gęstościach spełniają określone funkcje fizjologiczne, sama analiza chemiczna lipidów osocza (z wyjątkiem WKT), dostarcza tylko niewielu informacji o ich znaczeniu w patofizjologii. Poza zastosowaniem technik polegających na wykorzystaniu róŜnic gęstości, lipoproteiny moŜna rozdzielić na podstawie ich właściwości elektroforę ty cznych na a-, 0- oraz pre-P-li po proteiny (ryc. 27-1) i moŜna je zidentyfikować dokładniej za pomocą immunoelektrofore-

Poza WKT zidentyfikowano 4 główce grupy lipoprotein o waŜnym znaczeniu fizjologicznym oraz diagnostycznym. Są to: 1) chylomikrony, powstające z wchłanianych w jelicie triacylogliceroli, 2) lipoproteiny o bardzo małej gęstości (VLDL lub pre-P-lipoproteiny), pochodzące z wątroby i spełniające funkcję eksportera triacylogliceroli z tego narządu, 3) lipoproteiny 0małej gęstości (LDL lub P-lipoproteiny), będą ce przedstawicielem końcowych produktów katabolizmu VLDL oraz 4) lipoproteiny o duŜej gęstości (HDL lub a-lipoproteiny), biorące udział w metabolizmie VLDL i chylomi kranów, a takŜe w przemianie cholesterolu. Triacylo glicerol jest głównym lipidem chyJomikronów 1VLDL, podczas gdy cholesterol i fosfolipidy są dominującymi składnikami lipidowymi odpo wiednio LDL i HDL (tab. 27-2). Amfipatyczne lipidy są istotnymi składnikami lipoprotein Typowa iipoproteina — taka jak chyloinikron lub VLDL — składa się z rdzenia lipidowego, zawierającego głównie triacyloglicerole i estry cholesterolu, otoczonego pojedynczą warstwą powierzchniową złoŜoną z cząsteczek amfipatycznyeh fosfolipidów i cholesterolu. Te cząsteczki są tak ułoŜone, Ŝe ich grupy polarne są skierowane na zewnątrz, do środowiska wodnego, tak jak w błonie komórkowej (p. str. 187), Białkowe części lipoprotein są znane jako a po lipoproteiny lub apoproteiny Stanowią one ok. 60% masy niektórych HDL, a zaledwie 1% masy chyl orni kro nów. Niektóre apolipoproteiny są ściśle zintegrowane z częścią lipidową, tak

Tabela 27-2. Skład lipoprotein osocza u człowieka Źródło Frakcja Średnica [nm] Gęstość
S

.

Skład Białko [%] CałkowiProcent całkowitych lipidów te lipidy [%] Triacy- Fosfoli Estry Choleste Wolne loglice- pidy choleste rol kwasy rol (wolny) rolu tłuszczowe 98-99 90-93 89 79 67 43 1 88 56 29 13 16 13 0 46 0 8 20 26 28 43 3 15 34 48 31 29 0 18 9 10 10 60 11 6 100

Chylomikrony Lipopfoteiny o bardzo małej gęstości (VLDL) Lipoprotetny o pośredniej gęstości (IDL) Lipoproteiny o małej gęstości (LDL) Lipoproteiny o duŜej gęstości HDLj HDL3 WKT— albumina

Jelito Wątroba i jelitu VLDL i chylomikrony VLDL Wątroba i jelito. VLDL? Chylomikrony? Tkanka tłuszczowa

90-1000 30-90 25-30 20-25 10-20 7,5-10

< 0r95 0.951,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,125 1,125-1,210 > 1,2810

> 400 20-400 12-20 2-

1-2 7-10 1 1 2 33 1 57 99

1

12

WKT — wolne kwasy tłuszczowe. VHDL (ang.; very high density lipoproteins) jest niewielką frakcją o gęstości 1,21 -1,25,

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 297 Obwodowa apolipo protein a (np, Apo-C}
Jednowarstwowa błona zbudowana głównie

Wolny
cholesterol

Fosfotlpld z

Trlacylogllcerol lipidów amflpatycznych

c- 27-2. Uogólniona

budowa lipoproteiny osocza. NaleŜy
'Rdzeft złoŜony ' głć wni e z nie polarnych lipidów

zauwaŜyć podobieństwa Integralna s apoll z bfoną plazmatycz-ną. Niedawne badania wskazują, Ŝe po proteina "V,, {np. niewielkie ilości estrów cholesterolu i apo-B) triacyloglicerolu znajdują się w powierzchniowej warstwie, a małe ilości wolnego cholesterolu występują w warstwie rdzeniowej.

Ŝe nie moŜna ich usunąć z cząstek lipoproteinowych, podczas gdy inne mogą być swobodnie przenoszone do innych lipoprotem (ryc. 27-2), Skład apolipoprotein jest charakterystyczny dla danej lipoproteiny W kaŜdej lipoproteinie występuje 1 lub więcej apolipoprotein (białek lub polipeptydów). Według nomenklatury ABC główną apolipoproteinę HDL (ot-lipoproteiny) określa się jako apolipoproteinę A. Główną apolipoproteina. LDL (P~hpoproteiny) jest apolipopro_tęinajgv. która znajduje się równieŜ w VLDL i w chylomikronach. JednakŜe apo B chylomikronów (B-48) jest mniejsza niŜ apo B pochodząca z LDL lub VLDL (B-100). B-48 jest syntetyzowana w jelicie, natomiast B-100 w wątrobie (u szczura wątroba wydaje się syntetyzować 2arówno B-48, jak i B-100). Apo B-100 jest zapewne najdłuŜszym łańcuchem ze znanych pojedynczych łańcuchów polipeptydowych, złoŜonym z 4536 reszt aminokwasowych. Apo B-48 (mająca wielkość 48% apo B-100) jest syntetyzowana na tym samym mRNA, co apo B-100. Zapewne w jelicie kodon stop, którego nie ma w odpowiednim DNA genomu, jest wprowadzany do RN A w procesie

posttranskrypcyjnej jego obróbki w taki sposób, Ŝe translacja zatrzymuje się na reszcie aminokwasu 2153. Apolipoproteiny C-I, C-II i C-HI są małymi polipeptydami swobodnie dającymi się przenosić między róŜnymi lipoproteinami (tab. 27-3). Węglowodany stanowią ok. 5% masy apo-B i zawierają mannozę, galaktozę, fukozę, glukozę, glukozoaminę oraz kwas sjalowy. Niektóre lipoproteiny są więc takŜe glikoproteinami. W lipoproteinach osocza znaleziono równieŜ inne apolipoproteiny. Jedną z nich jest bogata w argininę apolipoproteina E wyizolowana z VLDL i HDL. Zawiera ona argininę w ilości aŜ 10% wszystkich aminokwasów i stanowi 5—10% wszystkich apolipoprotein VLDL u zdrowych osób. Nadmierne jej ilości stwierdza się u chorych z hiperlipoproteinemia. typu III o szerokim paśmie PVLDL. Apolipoproteiny spełniają róŜne funkcje: 1) są kofaktorami enzymów, np. C-Il jest kofaktorem Jipazy lipoproteinowej, AA acylotransferazy lecytynaxholesterol, 2) mogą działać jako białka przenoszące lipid y, np. apo D w HDL, 3) działają jako Ugandy w interakcjach z receptorami lipoprotein w tkankach, np. apo B-100 i apo E w interakcji z receptorami LDL, apo E z receptorami remnantów, a apo A-I z receptorami HDL,

298 / ROZDZIAŁ 27 Tabela 27-3. Apolipoproteiny lipoprotein osocza człowieka Apo 1 i pop rotei na A-l A-ll

Li po proteina
HDL, chylomikrony HDL, chylomikrony

Masa cząsteczkowa {Da) 28000 17000

Dodatkowe uwagi
Aktywator acylotransferazy lecytyna: cholesterol (LCAT) Zbudowana z 2 identycznych monomerów połączonych mostkiem disiarczkowym. inhibitor LCAT? Syntetyzowana w wątrobie. Ligand dla receptora LDL Syntetyzowana w jelicie MoŜliwe, Ŝe aktywator LCAT Aktywator poza wątrobowej lipazy lipo proteinowej Wiele postaci pohmorficznych zaleŜnie od zawartości kwasów sjalowych MoŜliwe, ze identyczna z białkiem przenoszącym estry cholesterolu Obecna w nadmiarze w (5-VLDL u chorych z hiperlipoproteinemią typu III. Jest to jedyna apolipoproteina znajdująca się w HDL c u zwierząt z hipercholesterolemią wywołaną dietą Ligand dla receptora remnantów chylomikronów w wątrobie i dla receptora LDL

B-100 B-48 Cl C-ll

LDL, VLDL. IDL Chylomikrony, chyiomikrony resztkowe VLDL, HDL VLDL, HDL, chylomikrony VLDL, HDL, chylomikrony Subfrakcja HDL

550000 260000 7 600 8 800 8750 20000 34 000

c-m
D

E (bogata w argmi- VLDL, HDL, chylomikrony, chylomikrony resztkowe ne)

WOLNE KWASY TŁUSZCZOWE SĄ BARDZO SZYBKO METABOLIZOWANE Wolne kwasy tłuszczowe (WK.T, FFA, niezestryfikowane kwasy tłuszczowe) osocza pochodzą z lipolizy triacylogliceroii w tkance tłuszczowej albo powstają w wyniku działania lipazy lipoproteinowej w czasie wychwytywania triacylogliceroli osocza prze2 tkanki. W surowicy
występują one w połączeniu z albuminą w stęŜe-

niach wahających się miedzy 0,1—2 u.mol/ml osocza. Są to głównie długołańcuchowe kwasy tłuszczowe znajdowane w tkance tłuszczowej (np. palmitynowy, stearynowy, olejowy, palmitoolejowy, hnolowy i inne wielonienasycone kwasy tłuszczowe) oraz w niewielkich ilościach róŜne inne długołań cuch owe kwasy tłuszczowe. Opisano miejsca wiąŜące dla kwasów tłuszczowych na albuminie mające róŜne powinowactwo. W warunkach sytoścL notuje się małe stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Zwiększa się ono do ok. 0,5 jimol/ml

w fazie poposiłkowej i do 0,7 ^mol/ml i 0,8 u.mol/ml w stanie całkowitego głodu. W niewyrównanej cukrzycy stęŜenie ich moŜe się zwiększyć do 2 ^mol/ml. StęŜenie WKT zmniejsza się tuŜ po jedzeniu i zwiększa się przed następnym posiłkiem. U takich zwierząt jak przeŜuwacze, odŜywiających się w sposób ciągły i u których zachodzi nieprzerwany napływ składników pokarmowych 7 jelita do krwi, stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu jest małe. Szybkość usuwania wolnych kwasów tłuszczowych z krwi jest wyjątkowo duŜa. Część WKT pobranych przez tkanki jest utleniana i pokrywa w głodzie 25—50% zapotrzebowania energetycznego organizmu. Pozostała część pobranych WKT jest estryfikowana. Iloraz oddechowy (RQ), oznaczony w okresie głodu, wskazuje na to, Ŝe spalaniu ulega znacznie więcej tłuszczów niŜ to wynika z ilości utlenionych wolnych kwasów tłuszczowych. Na t£ róŜnicę składa się utlenianie estrów lipidowych pochodzących z krąŜącej krwi lub obecnych w tkankach. Ostatnie ma szczególnie znaczenie w mieś-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 299

niach szkieletowych i w sercu, gdzie mogą występować w dość znacznych ilościach zapasy lipidu w komórkach mięśniowych.
Obrót (ang. turnover) wolnych kwasów tłuszczowych jest wprost proporcjonalny do stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych. Oznacza to, Ŝe

do roli albumin surowicy w pozakomórkowym transporcie długolańcuchowych kwasów tłuszczowych. TRIACYLOGLICEROLE SĄ TRANSPORTOWANE Z JELITA W CHYLOMI KROWACH, A Z WĄTROBY W LIPOPROTEINACH O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI Jak sama nazwa wskazuje, chylomikrony znajdują się w chłonce, czyli limfie (łac: chyluś). Powstają one jedynie w układzie odprowadzającym chlonke z jelita. Są odpowiedzialne za transport wszystkich lipidów zawartych w pokarmach do układu krąŜenia. W chłonce stwierdza się równieŜ mniejsze cząstki lipoproleinowe o nieco większej gęstości, wykazujące fizykochemiczną charakterystykę cząstek VLDL. Skład chemiczny tych mniejszych cząstek przypomina raczej chylomikrony niŜ VLDL, wskazując na to, Ŝe powinno się je uwaŜać raczej za

szybkość wytwarzania wolnych kwasów tłuszczowych w tkance tłuszczowej jest czynnikiem kontrolującym stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu, co z kolei determinuje pobieranie wolnych kwasów tłuszczowych przez inne tkanki. Stan odŜywienia nie wydaje się mieć wielkiego wpływu na frakcje wolnych kwasów tłuszczowych pobieranych przez tkanki, wpływa natomiast na proporcje ilości kwasów tłuszczowych utlenianych w stosunku do estryfikowanych. W stanie głodzenia więcej kwasów tłuszczowych się utlenia niŜ w stanie sytości, W cytozolu komórek większości tkanek stwierdzono obecność białka wiąŜącego kwasy tłuszczowe, czyli białka Z. UwaŜa się, Ŝe rola tego białka w wewnątrzkomórkowym transporcie wolnych kwasów tłuszczowych jest podobna

Światło jelita

Kanalik Ŝółciowy Komórka śrńdblonka

E Włosowate naczynie Krwionośne Naczynie llmfatyczne prowadzące do przewodu piersiowego Światło zatoki Ŝylnej

Ryc. 27-3. Tworzenie i wydzielanie (A) chyiomtkronów przez komórki jelita oraz (B) lipoprotein o bardzo małej gęstości przez komórkę wątrobową. RER — szorstka siateczka śródpiazmatyczna, SER — gładka siateczka śródplazmatyczna, G — aparat Golgiego, N —jądro, C — chylomikrony, VLDL— lipoproteiny o bardzo małej gęstości, E —śródbłonek, SD — przestrzeń okotozatokowa {Dissego) zawierająca osocze krwi. Rycina jest schematycznym przedstawieniem zdarzeń, które moŜna zobaczyć w mikroskopie elektronowym. __________________________________________________________________

300 / ROZDZIAŁ 27

małe chylomikrony niŜ za VLDL. Ich wytwarzanie odbywa się nawet w okresie głodzenia, a ich lipidy pochodzą głównie z Ŝółci i z wydzieliny ścian jelita. Ilość wytwarzanych chylomikronów o normalnej wielkości zwiększa się z ilością triacylogliceroli wchłoniętych ze światła jelita. Większość VLDL osocza jest pochodzenia wątrobowego. Są one przenośnikami triacylogliceroli z wątroby do tkanek poza wątrobowych. Istnieje wiele podobieństw w mechanizmie wytwarzania chylomikronów przez komórki jelita i VLDL przez hepatocyty wątroby (ryc. 27-3). Apoiipoproteina B jest syntetyzowana przez rybosomy w szorstkiej siateczce śródplazmatycznej i wbudowywana do lipoprotein w gładkiej siateczce śródplazmatycznej, która jest głównym miejscem syntezy triacylogliceroli. Następnie lipoproteiny przechodzą przez aparat Golgiego. gdzie — jak się sądzi — do lipoproteiny przyłączane są reszty cukrowcowe. Chylomikrony albo VLDL są uwalniane z komórki jelita lub wątroby przez fuzję pęcherzyka wydzielniczego z błoną komórkową (zjawisko to określa się jako odwrotną pinocytozę). ChyTGidłety. Receptor remnantów ohylomikronu (Apo-E) Chyjo mikron świeŜo utworzony

lomikrony przechodzą do przestrzeni między komórkami jelitowymi, skąd dostają się do układu limfatycznegojelita. VLDL są wydzielane przez komórki miąŜszu wątrobowego do przestrzeni okolozatokowej (Dissego), skąd dostają się do zatok wątrobowych, przenikając przez okienka śródbłonka naczyń. Podobieństwa pomiędzy tymi dwoma procesami i mechanizmami anatomicznymi są uderzające, gdyŜ — pomijając gruczoł sutkowy — jelito i wątroba są jedynymi tkankami, z których są wydzielane lipidy w postaci lipoprotein. Niezdolność cząstek lipidowych o rozmiarach chylomikronów i VLDL do przechodzenia przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych, bez uprzedniej hydrolizy, jest prawdopodobnie przyczyną, dla której tłuszcze pokarmowe dostają się do krąŜenia poprzez układ limfatyczny (ductus thoracicus), a nie przez układ Ŝyły wrotnej. ChociaŜ zarówno chylomikrony, jak i VLDL izolowane z krwi zawierają apoli po proteiny C i E, lipoproteiny te i.n statu nascendi zawierają ich bardzo niewiele albo wcale. Wydaje się więc, Ŝe do chylomikronów i VLDL syntetyzowanych de novo przyłączanie polipeptydów apo C r apo
Glloerol

Romnant chytomlkronu

JELFTO CIENKIE

27-4.
TKANKI POZAWĄTFIOBOWE ILIFAZA LIPOPHOTEINOWAl -Kwasy tłuszczowe

Metaboliczne chylomikronów. A — apolipoproteina A, B-48 — apoiipoproteina B-48, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL — lipoproteina o duŜej gęstości, TG — triacylo-giicerol, C — cholesterol i estry cholesterolu, P — fosfolipid. Przedstawiono tytko ilościowo dominujące lipidy. losy

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 301
świeŜo wytworzona VLDL

Receptor LDL Apo-B-1QO Apo-E Kwasy tłuszczowe Cholesterol WĄTHOBA Receptor LDL

"KANKI POZAWĄTHOBOWE

. Kwasy ~ tłuszczowe

I w tkankach pozawąlrobowych (np. w limfocytach, fibro toastach) drogą endocytozy

IDL Jremnant VLDL) Gllcerol TKANKI POZAWĄTROBOWE

Rvc. Z7-5. Metaboliczne losy lipoprotein o bardzo małej gęstości (VLDL) i biosynteza lipoprotein o małej gęstości (LDL). A — apolipoproteina A, B-100 — apolipoproteina B-100, © — apolipoproteina C, E — apolipoproteina E, HDL— lipoproteina o duŜej gęstości, TG —triacyloglicerol, IDL — lipoproteina o pośredniej gęstości, C — cholesterol i estry cholesterolu, P — fosfolipid. Pokazano jedynie lipidy przewaŜające ilościowo.

E z HDL zachodzi dopiero wówczas, gdy chylomikrony i VLDL znajdują się w układzie krąŜenia (ryc. 27-4 i 27-5). Bardziej szczegółowy opis czynników kontrolujących wątrobowe wydzielanie VLDL podano niŜej. Apo B jest istotna w tworzeniu chylomikronów i VLDL. W a beta li pop rotę ine mii (rzadkiej chorobie) apo B nie jest syntetyzowana; hpoproteiny zawierające tę apolipo proteinę nie są wytwarzane, przez co dochodzi do spichrzania lipidów w jelitach i w wątrobie. KATABOLIZM CHYLOMIKRONOW I LIPOPROTEIN O BARDZO MAŁEJ GĘSTOŚCI JEST SZYBKIM PROCESEM Oczyszczanie krwi z chylomikronów, oznaczane znikaniem znakowanych chylomikronów z krąŜenia, jest szybkie. Biologiczny okres półtrwania tych cząstek jest rzędu minut u ma-

łych zwierząt (np. u szczura) i nieco dłuŜszy u większych zwierząt (np. u człowieka), u których i tak wynosi mniej niŜ 1 h. Większe cząstki są szybciej katabolizowane niŜ małe. JeŜeli podać doŜylnie chylomikrony ze znakowanymi kwasami tłuszczowymi triacyloglicerolu, to ok. 80% znakowanych kwasów stwierdza się w tkance tłuszczowej, sercu i mięśniach, a ok. 20% w wątrobie. PoniewaŜ doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, Ŝe wątroba nie metabolizuje w istotnym stopniu chylomikronów ani

VLDL, obecność znakowanych kwasów w wątrobie jest zapewne zjawiskiem wtórnym i pochodzi z przemiany tych lipoprotein w tkankach pozawątrobowych. Triacyloglicerol chylomikronów i VLDL jest hydrolizowany przez lipazę lipoproteinową Istnieje znamienna korelacja między zdolnością tkanek do wbudowywania kwasów tłuszczowych z triacylogliceroli lipoprotein a aktyw-

302 / ROZDZIAŁ 27

nością enzymu lipa/y lipoproteinowej. Ten enzym ic:iL umiejscowiony na ścianach włosowatych naczyń krwionośnych zakotwiczony proteoglikanowym łańcuchem siarczanu heparanu. Jego obecność wykazano w wyciągach z serca, tkanki tłuszczowej, śledziony, płuc, rdzenia nerki, aorty, przepony oraz gruczołu sutkowego w okresie Laktacji. Prawidłowa krew nie zawiera znaczących ilości tego enzymu, jednak po wstrzyknięciu heparyny lipaza li po protein owa zostaje uwolniona do krwiobiegu z jej zakotwiczenia siarczanem heparanu. Procesowi temu towarzyszy klarowanie iipemicznego osocza. Lipaza jest równieŜ uwalniana z wątroby po podaniu duŜych ilości heparyny (lipaza wątrobowa uwalniana heparyną), ale ten enzym ma właściwości odmienne od lipazy lipoprotcinowej i nie reaguje łatwo z chyl om ikro na mi. Do aktywności lipazy lipoproteinowej są potrzebne, jako kofaktory, fosjfolipidy oraz apolipoproteina C-II. Apo C-II ma swoiste miejsce wiązania fosfolipidu, przez które jest ona związana z lipoproteiną. A zatem chylomikrony i VLDL dostarczają enzymowi potrzebnemu do przemiany tych lipoprotein zarówno kofaktorów, jak i substratu. Hydroliza zachodzi wówczas gdy lipoproteiny są przyłączone do enzymu na powierzchni śródblonków. Triacyloglicerol jest hydrolizowany stopniowo poprzez diacy loglicerol do monoacylogiicerolu, który w końcu jest hydrolizowany do glicerolu i wolnego kwasu tłuszczowego. Niewielka ilość uwolnionych kwasów tłuszczowych wraca do krwiobiegu, gdzie jest wiązana z albuminą, ale znaczna większość z nich jest transportowana do tkanki (ryc. 27-4 i 27-5). Lipaza lipoproteinowa serca ma małą wartość Km dla triacyloglicerolu, podczas gdy Km tego enzymu w tkance tłuszczowej jest 10-krotnie większa. Gdy stęŜenie triacylogliceroli osocza zmniejsza się przy przejściu ze stanu sytości w stan głodu, wówczas sercowy enzym pozostaje nadal wysycony substratem, natomiast wysycenie enzymu w tkance tłuszczowej zmniejsza się, co sprawia, Ŝe następuje intensywniejsze pobieranie kwasów tłuszczowych przez serce niŜ przez tkankę tłuszczową. Podobne odwrócenie kierunku pobierania kwasów tłuszczowych następuje podczas laktacji, w czasie której zmniejsza się aktywność lipazy lipoproteinowej w tkance tłuszczowej, a zwiększa się w gruczole sutkowym, pozwalając na pobieranie długołańcuch owych kwasów tłuszczowych, z triacylogliceroli lipoprotein potrzebnych do syntezy tłuszczu mleka.

W tkance tłuszczowej insulina zwiększa syntezę lipazy lipoproteinowej w adypocytach i jej przemieszczanie do powierzchni luminarnej śródbłonka naczyń włosowatych. Działanie lipazy lipoproteinowej powoduje powstawanie resztkowych lipoprotein (remnantów) Wynikiem działania lipazy lipoproteinowej jest utrata z chylomikronów ok. 90% triacylogliceroli i utrata apo C (która powraca do HDL), ale nie apo E, która pozostaje połączona z powstałymi cząstkami, określonymi jako retnnanty chylomikronów lub chylomikrony resztkowe (od angielskiego „remnant" - pozostałość, resztka). Te cząstki mają średnicę o połowę mniejszą niŜ pierwotne chylomikrony. Na skutek utraty triacylogliceroli są one bogatsze w cholesterol i estry cholesterolu (ryc. 27-4). Podobne zmiany zachodzą w VLDL, które zamieniają się w remnanty VLDL, określane jako IDL (od angielskiej nazwy intermediate-density lipoproteins, czyli lipoproteiny o pośredniej gęstości) (ryc. 27-5). Wątroba jest odpowiedzialna za wychwytywanie remnantów lipoprotein Remnanty chylomikronów są wychwytywane przez wątrobę, a zawarte w nich estry cholesterolu i triacyloglicerole są hydrolizowane i meiabolizowane. Wychwytywanie to wydaje się odbywać za pośrednictwem receptora swoistego dla apo E {ryc. 27-4), Badania z uŜyciem VLDL zawierających znakowaną apo B-100 wykazały, Ŝe VLDL są prekursorami IDL oraz LDL. Tylko 1 cząsteczka apo B-100 występuje w kaŜdej z wymienionych lipoprotein i ta cząsteczka pozostaje nie zmieniona w czasie przekształcania lipoprotein. KaŜda cząstka LDL pochodzi więc od pojedynczej cząstki VLDL (ryc. 27-5). IDL są przekształcane jedną z 2 moŜliwych dróg. Mogą one być wychwytywane bezpośrednio przez wątrobę za pośrednictwem receptorów LDL (wiąŜących apo B-100 i apo E), lub teŜ mogą być przekształcane w LDL. U szczura większość apo B z VLDL pojawia się w wątrobie, a tylko niewielki procent w LDL. MoŜe to być spowodowane faktem, Ŝe u szczura część cząstek VLDL zawiera apo B-48 zamiast apo B-100. JeŜeli wątrobowy receptor dla apo E wyklucza wychwytywanie cząstek zawierających apo B100, ale me cząstek zawierających apo B-48,

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 303

to jest to wytłumaczeniem większego usuwania przez wątrobę szczura I DL i mniejszego wytwarzania LDL u szczurów.

znajdujących się w osoczu chorych z niedoborem enzymu acyibtransferazy lecytyna : chole-

LDL SĄ METABOLIZOWANE ZA POŚREDNICTWEM RECEPTORA LDL
Jak to opisano wyŜej, większość LDL powstaje 2 VLDL; istnieją jednak dowody na to, Ŝe pewna ich iJość jest wytwarzana bezpośrednio przez wątrobę. Okres połowicznego znikania z krwi apoproteiny B-100, występującej w LDL, wynosi ok. 2,5 dnia. Badania w hodowli fibroblastów, limfocytów i komórek mięśni gładkich tętnic, a takŜe wątroby wykazały istnięnje_swQisiy_ch miejsc wiąŜących, czyli receptorów LDL, tzw. receptorów B-100 E. Receptor ten tale nazwano, poniewaŜ jest on swoisty dla apo B-100, ale nie dla apo B-48, a w pewnych warunkach wiąŜe lipoproteiny bogate w apo E. W apo B-48 brakuje domeny znajdującej się przy karboksylowym końcu apo B-100, która zawiera ligand dla receptora LDL.
W rodzinnej hipercholesterolemii występuje wa-

sterol (LCAT) oraz w osoczu chorych na Ŝółtaczkę zastoinowij. LCAT oraz jej aktywator — apolipoproteina A-1 wiąŜą się z tym tworem dyskoidalnym. Katalizowana przez LCAT reakcja zamienia fosfolipid i wolny cholesterol znajdujące się na powierzchni HDL w estry cholesterolu i łizolecytynę. Niepołarne estry cholesterolu przemieszczają się do hydrofobowego wnętrza struktury bilamelarnej, a lizolecytyna zostaje przeniesiona na albuminę osocza. Reakcja postępuje dalej i wytwarza niepolarny rdzeń, który rozpycha podwójną błonę cząstek aŜ do ukształtowania się sferycznego pseudomicelarnego HDL, pokrytego błoną złoŜoną z polarnych lipidów i apolipoprotein. Zestryfikowany cholesterol moŜe być przenoszony z HDL do lipoprotein o mniejszej gęstości, np. do chylomikronów, VLDL i LDL, za pośrednictwem białka przenoszącego estry cholesterolu

da tych receptorów. Około 50% LDL ulega degradacji w tkankach pozawątrobowych, a pozostałe 50% w wątrobie. Istnieje dodatnia korelacji między występowaniem miaŜdŜycy naczyń wieńcowych a stęŜeniem LDL w osoczu. Dalsza dyskusja na temat regulacji receptora LDL p. str. 319.

HDL UCZESTNICZĄ ZARÓWNO W METABOLIZMIE TRIACYLOGLICEROLU, JAK I CHOLESTEROLU
HDL są syntetyzowane i wydzielane zarówno w wątrobie, jak i w jelicie (ryc. 27-6). JednakŜe HDL nowo wytworzone (świeŜo wydzielone) w jelitach nie zawierają apolipoproteiny C ani E, a jedynie apolipoproteinę A. Apo C i apo E są więc syntetyzowane w wątrobie i przenoszone do jelitowych HDL wówczas, gdy te ostatnie
znajdą się w osoczu. Główną funkcją HDL jest działanie jako składowisko dla a po li po protein C i E, które są potrzebne w metabolizmie chylomikronów i VLDL (p, ryc. 27-4 i 27-5).

(apo D), które jest jeszcze jednym składnikiem HDL. Białko przenoszące estry cholesterolu umoŜliwia więc transport estrów cholesterolu HDL do wątroby poprzez resztkowe chylomikrony i VLDL albo przez wychwytywanie LDL w wątrobie. Układ LCAT uczestniczy więc w usunięciu nadmiaru niezestryfikowanego cholesterolu z lipoprotein i z tkanek. Wątroba, a moŜliwe Ŝe i jelita, wydają się być miejscem końcowej degradacji apolipoprotein HDL. Nie jest jasne, czy w tym procesie uczestniczy swoisty receptor dla HDL, czy dla apo A. Zaproponowano istnienie cyklu HDL, odpowiedzialnego za transport cholesterolu z tkanek do wątroby (szczegóły są przedstawione na ryc. 27-6). To wyjaśnia, dlaczego stęŜenie HDLj
w osoczu zmienia się odwrotnie proporcjonalnie do stęŜenia chylomikronów i VLDL, a wprost proporcjonalnie do aktywności lipazy lipoproteinowej. StęŜenia HDL (HDL2) są odwrotnie proporcjonalne do częstości występowania miaŜdŜycy naczyń wieńcowych być moŜe dlatego, Ŝe

Nowo wytworzone HDL składają się z dyskoidalnych podwójnych błon fosfolipidowych zawierających apolipoproteinę i wolny cholesterol. Te lipoproteiny są podobne do cz4Stek

odzwierciedlają one wydajność usuwania cholesterolu z tkanek. HDL,; znajdują się we krwi zwierząt, u których występuje indukowana dietą hipercholesterolemia. Ta lipoproteina jest szczególnie bogata w cholesterol, a jej jedyną apolipoproteina jest apo E. Jest ona wychwytywana przez wątrobę poprzez receptor remnantów wiąŜący apo E oraz poprzez receptory LDL. To właśnie dlatego te ostatnie bywają czasem oznaczane jako receptory wiąŜące apo B-100 E. Płytki miaŜdŜycowe mają komórki,

304 / ROZDZIAŁ 27

Clttci
I Kwasy Ŝółciowe

Dyskoldatna nowe postacie HDL

Dwu warstwa fosiollpidowa

Ryc.

27-6. Metabolizm lipoprotein o duŜej gęstości (HDL). HRHL — lipaza uwalnialna przez heparynę, LCAT— acylotransferaza lecytyna : cholesterol, LPL — lipaza tipoproteinowa, C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, PL
Chylomlkron y VLDL

— fosfolipid, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, A-l — apolipoproteina A-l. Na rycinie przedstawiono rolę 3 enzymów HRHL, LCAT i LPL w postuiowanym cyklu HDL, słuŜącym do transportowania cholesterolu z tkanek do wątroby HDL2, HDL3 — p. tab. 27-2. Poza triacyloglicerolem, HRHL hydrofizuje fosfolipidy na powierzchni HDL2, uwalniając cholesterol, który jest wykorzystywany przez wątrobę. Równocześnie powstają mniejsze cząstki o większej gęstości. Aktywność HRHL zwiększa się pod wpływem aridrogenów, a maleje pod wpływem estrogenów, co moŜe być przyczyną większego stęŜenia HDL2w osoczu kobiet.

które wychwyciły tyle cholesterolu, Ŝe zmieniły się w przeładowane estrami cholesterolu komórki piankowate. Większość tych komórek pochodzi z makrofagów, które pochłonęły nieprawidłowe, bogate w cholesterol lipoprote-

iny, takie jak chemicznie zmodyfikowane LDL lub p-VLDL(p. str. 319). Makrofagi wydzielają zarówno cholesterol (przekazując go odpowiedniemu biorcy, takiemu jak HDL), jak i apo E. Ta apolipoproteina E, po odpowiednim przetwo-

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 305

rŜeniu w obecności LCAT, moŜe być źródłem bogatej w cholesterol HDLC. HDLC mogłaby więc być waŜnym ogniwem w przemieszczaniu cholesterolu z tkanek do wątroby („odwrócony transport cholesterolu").
Wszystkie lipoproteiny osocza są. wzajemnie ze sobą powiązanymi ogniwami jednego lub kilku cykli metabolicznych, a wszystkie razem są odpowiedzialne za złoŜony proces transportu lipidów w osoczu.

WĄTROBA ODGRYWA GŁÓWNĄ ROLĘ W TRANSPORCIE I METABOLIZMIE LIPIDÓW
Uprzednio sądzono Ŝe większość przemian lipidów odbywa się w wątrobie. Odkrycie, Ŝe większość tkanek ma zdolność całkowitego utleniania kwasów tłuszczowych oraz nagromadzona z czasem ilość informacji o tym, Ŝe tkanka tłuszczowa jest nadzwyczaj aktywnym metabolicznie narządem, zmusiły do zmodyfikowania tego poglądu o dominującej roli wątroby. JednakŜe koncepcja, przypisująca wątrobie bardzo waŜną i jedyną w swoim rodzaju rolę w przemianie lipidów, pozostaje nadal obowiązująca. Wątroba sprawuje następujące bardzo waŜne funkcje w przemianie lipidów: 1) ułatwia trawienie i wchłanianie lipidów z przewodu pokarmowego, dlatego Ŝe wytwarza Ŝółć zawierającą cholesterol i sole kwasów Ŝółciowych syntetyzowane w wątrobie (p. str. 345), 2) wątroba ma aktywne układy enzymatyczne niezbędne do syntetyzowania i utleniania kwasów tłuszczowych (p. rozdz. 23 i 24), syntetyzowania triacylogliceroli, foslblipidów (p. rozdz. 26) i cholesterolu (rozdz. 27), 3) syntetyzuje lipoproteiny osocza (opisane w tym rozdziale), 4) przekształca kwasy tłuszczowe w ciała ketonowe (ketogeneza) (p. rozdz. 24), 5) odgrywa integrującą rolę w przemianie lipoprotein osocza (patrz ten rozdział).

czowe uŜyte do syntezy wątrobowych triacylogliceroli pochodzą z 2 moŜliwych źródeł: 1) z syntezy w wątrobie z acetylo-CoA pochodzącego z węglowodanów oraz 2) z kwasów tłuszczowych wychwytywanych z krąŜenia. Pierwsze źródło dominuje w stanie sytości, gdy synteza kwasów tłuszczowych zachodzi intensywnie, a stęŜenie kwasów tłuszczowych wkraŜącej krwi jest małe. PoniewaŜ normalnie w tych warunkach triacyloglicerole nie gromadzą się w wątrobie, naleŜy sądzić, Ŝe są przez nią wydalane w postaci VLDL z taką samą szybkością, z jaką są syntetyzowane. Natomiast w czasie głodzenia, podczas spoŜywania pokarmów bogatych w tłuszcze lub w cukrzycy stęŜenie krąŜących wolnych kwasów tłuszczowych jest zwiększone i więcej kwasów jest wychwytywanych przez wątrobę. W tych warunkach lipogeneza jest zahamowana i wolne kwasy tłuszczowe są głównym źródłem kwasów tłuszczowych zawartych w triacyloglicerolach wątroby oraz VLDL. Mechanizmy enzymatyczne uczestniczące w syntezie triacylogliceroli i fosfolipidów opisano na slr. 286. Czynnikami, które powodują zarówno zwiększenie syntezy triacyloglicerolu, jak i wydzielania VLDL w wątrobie, są: 1) stan sytości, a nie głodzenia, 2) karmienie pokarmami o duŜej zawartości węglowodanów (zwłaszcza, gdy zawierają one sacharozę lub fruktozę), prowadzące do znacznej lipogenezy i estryfikacji kwasów tłuszczowych, 3) duŜe stęŜenie krąŜących we krwi wolnych kwasów tłuszczowych, 4) spoŜywanie etanolu oraz 5) duŜe stęŜenie insuliny, a małe stęŜenie glukagonu, co wzmaga syntezę i estryfikację wolnych kwasów tłuszczowych, a hamuje ich utlenianie.

Brak równowagi między wytwarzaniem triacylogliceroli a ich wydzielaniem jest przyczyną stłuszczenia wątroby (ryc. 27-7)
Z rozmaitych powodów lipidy, głównie jako triacyloglicerole, mogą sie nagromadzić w wątrobie. Znaczne ich spichrzenie jest uwaŜane za stan chorobowy. Gdy nagromadzanie się lipidów ma charakter przewlekły, dochodzi do rozwoju zmian włóknistych, przechodzących w marskość (cirrhosis) i upośledzających czynność wątroby. WyróŜnia się 2 główne typy stłuszczenia wątroby: 1. Pierwszy typ jest związany ze zwiększonym
stęŜeniem wolnych kwasów tłuszczowych osocza,

Istnieje zaleŜność między wydzielaniem VLDL przez wątrobę a składem spoŜytych pokarmów
PowyŜej opisano procesy komórkowe uczestniczące w tworzeniu i wydzielaniu VLDL (str. 322). Wątrobowe triacyloglicerole są bezpośrednimi prekursorami triacylogliceroli zawartych w VLDL osocza krwi (ryc. 27-7). Biosynteza triacylogliceroli stanowi bezpośredni bodziec do tworzenia i wydzielania VLDL: Kwasy tłusz20 — Biochemia

spowodowanym mobilizacją tłuszczów z tkanki

306 / ROZDZIAŁ 27 VLDL
Apo-C KREW ŚwiaŜo wytworzona VLDL Kwas orotowy Reszty glikozylowe Gładka siateczka śródplazmatyczna

HDL
' Apo-E*

J
A po-A Apo-C Apo-E
Tatra chlorek węgla Puromycyna l n ^ < Etlonlna Syntez a i f§ blatka

Apo-B-100 ■ Apo-C Apo-E

\ f
Poiirybosomy

ou
Szorstka siateczka śródplazmatyczna

OD
świeŜy taft cuch policeptydowy

Karmienie cholesterolem niedobór EFA

Niedobór ofiollny 1,2-Dlaoylogllcerol CDP-chollna Fosfochollna . Chollna

Etanol Acyto-CoA

_». Utlenianie

WKT

Llpogeneza z węglowodanów

Ryc. 27-7. Synteza lipoprotein o bardzo malej gęstości (VLDL) oraz prawdopodobne miejsca działania czynników powodujących spichrzanie triacylogliceroii i stłuszczenie wątroby EFA — egzogenne kwasy tłuszczowe, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, HDL — iipoproteiny o duŜej gęstości, ApoA — apolipoproteina A, ApoB — apolipoproteina B, ApoC — apolipoproteina C, ApoE — apolipoproteina E. Zaznaczone szlaki są podstawą dla zdarzeń przedstawionych na ryc. 27-3 B.

tłuszczowej albo z hydrolizą triacylogliceroli lipoprotein lub chylomikronów przez Iipa2ę lipoproteinową tkanek poza wątrobowych. Zwiększone ilości wolnych kwasów tłuszczowych osocza są wychwytywane przez wątrobę i estryfikowane. Wytwarzanie lipoprotein nie

nadąŜa za napływem wolnych kwasów tłuszczowych, co jest przyczyną nagromadzania się triacylogliceroli i stłuszczenia wątroby. Ilość triacyloglicerohi w wątrobie znacznie się zwiększa podczas głodzenia oraz spoŜywania
pokarmów o duŜej zawartości tłuszczów.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 307

W wielu stanach (np. w głodzeniu) jest zaburzona zdolność wydzielania VLDL przez hepatocyty. MoŜe to być spowodowane małym stęŜeniem insuliny i upośledzoną syntezą białka. W niewyrównanej cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciąŜowym u owiec i w ketozie bydła nacieczenie tłuszczami moŜe być tak znaczne, Ŝe powoduje widoczną bladość lub tłuszczowaty wygląd i powiększenie wątroby. 2. Drugi typ stluszczenia wątroby jest zwykle spowodowany metabolicznym blokiem wytwarzania lipoprotein osocza, co pozwala na nagromadzenie się tnacylogliceroli w wątrobie. Teoretycznie to upośledzenie moŜe być spowodowane a) zablokowaniem syntezy apohpoprotein, b} zablokowaniem tworzenia iipoprotein z lipidu i apolipoproteiny, c) niedoborem w dostarczaniu fosfolipidów, które są w lipoproteinach lub d) niewydolnością samego mechanizmu wydzielania. Typem stłuszczenia wątroby, który byt przedmiotem licznych badań u szczura, jest stłuszczenie wywoływane niedoborem choliny i dlatego związek ten bywa nazywany czynnikiem lipotropowym. PoniewaŜ do syntezy choliny są potrzebne labilne grupy metylowe, których dawcą jest metionina w procesie transmetylacji (p. rozdz. 32 i 33), niedobór choliny w rzeczywistości jest spowodowany niedostatkiem grup metylowych tego typu, jaki zawiera metionina. Sugerowano kilka róŜnych mechanizmów, które mogłyby wyjaśnić rolę choliny jako czynnika lipotropowego, m.jn. taki, Ŝe brak choliny powoduje niedobór fosfolipidów niezbędnych do syntezy lipoprotein. Antybiotyk puromycyna hamuje biosyntezę białka i powoduje stłuszczenie wątroby oraz znaczne zmniejszenie stęŜenia VLDL u szczurów. Innymi związkami o podobnym działaniu są: elionina {kwas cc-amino-y-merkaptoetylomasłowy). tetrachlorek węgla, chloroform, fosfor, ołów i arsen. Cholina nie chroni organizmu przed toksycznym działaniem tych czynników, ale wydaje się przyspieszać proces zdrowienia. Jest bardzo prawdopodobne, Ŝe tetrachlorek węgla wpływa równieŜ na sam mechanizm wydzielania lub na łączenie się lipidu z apolipoproteiną. Działanie tetrachlorku węgla nie jest bezpośrednie, ale zaleŜy od przekształcenia jego cząsteczki. Prawdopodobnie polega ono m.in. na tworzeniu wolnych rodników, które uszkadzają lipidy błon siateczki śródplazmatycznej, tworząc nadtlenki lipidowe. Uzupełnienie diety witaminą Ejest czynnikiem ochronnym przeciw

peroksydacji lipidów indukowanej tetrachlorkiem węgla. UwaŜa się Ŝe działanie etioniny polega na zmniejszeniu dostępności ATP. Wynika to z tego, Ŝe etionina, zastępując metioninę w S-adenozylometiomnie, wiąŜe pewną część dostępnej puli adenylanów i zapobiega tworzeniu się ATP. Kwas orotowy takŜe powoduje stłuszczenie wątroby. W tym przypadku VLDL gromadzi sie w aparacie Golgiego. Dlatego uwaŜa się, Ŝe kwas orotowy zaburza glikozylację lipoprotein i hamuje ich uwalnianie, co jest przyczyną znacznego zmniejszenia się w osoczu stęŜenia lipoprotein zawierających apo B. Niedobór witaminy E nasila martwicę wątroby występującą w przebiegu jej stłuszczenia wywołanego brakiem chohny. Podanie witaminy E lub selenu ma ochronne działanie przeciw peroksydacji lipidów. Tłuszczowe nacieczenie wątroby moŜe być spowodowane — poza niedoborem białka — takŜe niedoborem egzogennych kwasów tłuszczowych i witamin (np. kwasu hnolowego, pirydoksyny i kwasu pantotenowego). UwaŜa się Ŝe niedobór egzogennych kwasów tłuszczowych upośledza syntezę fosfolipidów. To sprawia, Ŝe takie substancje, jak cholesterol, które współzawodniczą o niezbędne dla estryfikacji egzogenne kwasy tłuszczowe, mogą takŜe powodować stłuszczenie wątroby. Etanol takŜe powoduje stłuszczenie wątroby Alkoholizm powoduje spichrzenie thiszczów w wątrobie, hiperlipemię i ewentualnie marskość wątroby {cirrhosis hepatis). Dokładny mechanizm długotrwałego działania etanolu jest wciąŜ niepewny. Nie jest jasne, czy w procesie spichrzania thiszczów jakąś rolę odgrywa dodatkowa mobilizacja wolnych kwasów tłuszczowych, chociaŜ wielokrotnie wykazano, Ŝe pojedyncza toksyczna dawka etanolu, podana szczurowi, powoduje zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. JednakŜe spoŜywanie etanolu przez dłuŜszy okres powoduje spichrzenie kwasów tłuszczowych, w wątrobie, które raczej pochodzą z endogennej syntezy niŜ z mobilizacji z tkanki tłuszczowej. Po spoŜyciu alkoholu nie stwierdza się upośledzenia syntezy białka w wątrobie. Istnieją przekonujące dowody na to, Ŝe utlenianie etanolu w wątrobie wzmaga syntezę triacylogliceroli i hamuje utlenianie kwasów tłuszczowych oraz zmniejsza aktywność cyklu cytrynianowego. Zmniejszenie aktywności tego cyklu jest spowodowane utlenianiem etanolu przez

308 / ROZDZIAŁ 27

dehydrogenazę alkoholową, co prowadzi do nadmiernego wytwarzania NADH.
DEHYDROGENAZA ALKOHOLOWA

TKANKA TŁUSZCZOWA JEST GŁÓWNYM MAGAZYNEM TRIACYLOGLICEROLI W ORGANIZMIE Zapasy triacylogliceroli w tkance tłuszczowej ulegają ciągle lipolizie (hydrolizie) i reestryfikacji (ryc. 27-8). Te 2 procesy nie są prostym odwróceniem tej samej reakcji. Przebiegają one całkowicie odmiennymi szlakami zawierającymi inne pośrednie związki i inne enzymy. Wiele czynników Ŝywieniowych, metabolicznych i hormonalnych, które regulują przemianę tkanki tłuszczowej działa albo na proces estryfikacji, albo na lipolizę. Wypadkową tych 2 procesów jest wielkość puli wolnych kwasów, tłuszczowych w tkance tłuszczowej. Pula ta determinuje stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych krąŜących w osoczu. PoniewaŜ stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych ma bardzo duŜy wpływ na metabolizm innych tkanek, zwłaszcza wątroby i mięśni, czynniki działające w tkance tłuszczowej i regulujące wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych, wywierają wpływ sięgający daleko poza samą tkankę tłuszczową. Dostępność glicerolo-3-fosforanu reguluje estryfikację. Lipoliza jest kontrolowana przez lipazę wraŜliwą na hormony W tkance tłuszczowej triacylogltcerol jest syntetyzowany z acylo-CoA i glicerolo-3-fosforanu według mechanizmu przedstawionego na ryc. 26-1. PoniewaŜ w tkance tłuszczowej aktywność enzymu kinazy glicerolowej jest mała, glicero! nie moŜe być wykorzystany w znaczniejszym stopniu do estryfikacji z acylo-CoA. Dlatego pod względem dostarczania glicerolo-3-fosforanu tkanka tłuszczowa jest zaleŜna od glikoiizy i od dostępności glukozy. Triacyloglicerol jest hydrolizowany pod wpływem lipazy wraŜliwej na hormony. Produktami tej reakcji są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. Lipaza ta jest odmienna od lipazy lipoproteinowej, która katalizuje hydrolizę triacylogliceroli zawartych w iipoproteinach przed ich wychwytem przez tkanki pozawątrobowe (p. str. 302). GJicerol, nie mogąc być wykorzystany przez tkankę tłuszczową, przenika do osocza krwi, skąd jest wychwytywany i zuŜytkowywany prze2 takie narządy, jak wątroba i nerka, które mają aktywną kinazę giicerolową. Wolne kwasy tłuszczowe powstające w procesie lipolizy mogą być ponownie przekształcone w tkań-

CH,-CH*-OH Etanol -.--------- , CHj- CHO + NADH + H Aldehyd octowy

+

Powstający w tej reakcji NADH współzawodniczy z równowaŜnikami redukcyjnymi pochodzącymi z utleniania innych substratów o łańcuch oddechowy, hamując w ten sposób utlenianie tych substratów. Zwiększenie stosunku [NADH]/[NAD+] powoduje przesunięcie w lewo równowagi jablczan ^ szcza wio octan, co moŜe zmniejszyć aktywność cyklu cytrynianowego. Sumarycznym skutkiem zahamowania utleniania kwasów tłuszczowych jest wzmoŜenie estryfikacji kwasów tłuszczowych do triacylogliceroli, co wydaje się być przyczyną stłuszczenia wątroby. W wyniku utleniania etanolu powstaje najpierw aldehyd octowy, który jest utleniany w mitochondriach do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydowej. Innymi skutkami spoŜywania etanolu moŜe być m.in. zwiększona lipogeneza i zwiększona synteza cholesterolu z acetylo-CoA. Zwiększony stosunek [NADH]/[NAD+] powoduje takŜe zwiększenie stosunku [mleczan]/[pirogronian], czego wynikiem jest hiperlaktacydemia, która z kolei jest przyczyną 2mniejszenia zdolności nerek do wydalania kwasu moczowego. Upośledzenie wydalania kwasu moczowego jest prawdopodobnie przyczyną pogorszenia się dny moczanowej po wypiciu alkoholu. ChociaŜ główna droga przemiany etanolu przebiega szlakiem dehydrogenazy alkoholowej, pewna jego ilość jest metabolizowana przez układ mikrosomalny zaleŜny od cytochromu P-450, w którym uczestniczą takŜe NADPH i O2. Aktywność tego układu zwiększa się w przewlekłym alkoholizmie i moŜe być przyczyną zwiększenia metabolicznego usuwania etanolu z krwi w tych warunkach, na co wskazują zwiększone stęŜenia aldehydu octowego i octanu.
CH 3 -CH a 0H + NADPH + H Etanol 2HaO -* CH,-CHO Aldehyd octowy

TRANSPORT I MAGAZYNOWANfE LIPIDÓW / 309

Glukoza

G lice roi

Ryc. 27-8. Metabolizm tkanki tłuszczowej. Upaza wraŜliwa na hormony jest aktywowana przez ACTH, TSH, glukagon, adrenalinę, noradrenalinę i wazopresyne, zaś hamowana przez insulinę, prostag landy nę E, i kwas nikotynowy. Szczegóły powstawania glicerolo-3-fosforanu z produktów pośrednich glikolizy przedstawiono na ryc. 26-1. PPP — szlak pentozofosforanowy, TG — triacyloglicerol, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

ce tłuszczowej w acylo-CoA działaniem sycitetazy acylo-CoA i mogą być reestryfikowane z glicerolo-3-fosforanem, tworząc triacyloglicerol. W tkance tłuszczowej istnieje zatem ciągły cykl lipolizy i reestryfikacji. Gdy szybkość reeslryfikacji nie jest dostatecznie duŜa, aby zrównowaŜyć szybkość lipolizy, wówczas dochodzi do nagromadzenia wolnych kwasów tłuszczowych, które przenikają do osocza, gdzie wiąŜą się z albuminą i sa. przyczyną zwiększenia

stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Są one najwaŜniejszym źródłem energetycznym dla wielu tkanek. Zwiększony metabolizm glukozy zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Przy zwiększeniu zuŜycia glukozy przez tkankę tłuszczową zmniejsza się wypływ z niej wolnych kwasów tłuszczowych. Pomimo tego

310 / ROZDZIAŁ 27

utrzymuje się uwalnianie glicerolu. Sugeruje to, Ŝe hamujący wpływ glukozy na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych nie jest spowodowany zmniejszeniem lipolizy. UwaŜa się, Ŝe jest to spowodowane dostawą glicero-lo-3fosforanu, który nasila procesy estryfikacji wolnych kwasów tłuszczowych po ich uprzednim przekształceniu w acylo-CoA. Glukoza w tkance tłuszczowej moŜe wchodzić w wiele szlaków metabolicznych, łącznie z utlenianiem do CO2 poprzez cykl cytrynianowy, z utlenianiem poprzez szlak pentozofosforanowy, przekształceniem w długołańcuchowe kwasy thiszezowe oraz wytworzeniem acyloglicerolu poprzez glicerolo-3-fbsforan. Gdy zuŜycie glukozy jest duŜe. wówczas większa część pobranej glukozy jest utleniana do CO2 i przetwarzana w kwasy thiszczowe. JeŜeli jednak całkowite zuŜycie glukozy się zmniejsza, większość jej jest przekształcana w glicerolo-3-fosforan, wykorzystywany do estryfikacji z acylo-CoA. Proces ten pomaga-zminimaiizować wypływ wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej. Wolne kwasy tłuszczowe są wychwytywane przez tkanki w wyniku aktywności lipazy lipoprotei nowej W tkance tłuszczowej istnieje więcej niŜ 1 pula wolnych kwasów tłuszczowych. Wykazano, Ŝe pula wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 27-8, pula 1) powstająca w wyniku lipolizy triacylogliceroli, jest tą samą pulą, która dostarcza kwasów tłuszczowych do estryfikacji. Jest to takŜe ta sama pula, z której wolne kwasy tłuszczowe są uwalniane do osocza. JednakŜe kwasy tłuszczowe pobierane z osocza w wyniku działania lipazy lipoproteinowej na triacyloglicerole chylomikronów lub VLDL nie mieszają się z pulą 1, zanim nie zostaną wbudowane w triacyloglicerole, lecz przechodzą przez bardzo małą pulę 2, o bardzo duŜej liczbie obrotów (krótkim okresie półtrwania). HORMONY REGULUJĄ MOBILIZACJĘ TŁUSZCZÓW Insulina zmniejsza uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych Na szybkość uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej działa wiele hormonów, które wpływają^albo na szybkość estryfikacji, albo na szybkość lipolizy. Insulina hamuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczo-

wych z tkanki tłuszczowej, czego następstwem jest zmniejszenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu. Wzmaga ona lipogenezę i syntezę acyloglicerolu oraz nasila utlenianie glukozy do CO2 w szlaku pentozofosforanowym. Te działania insuliny są zaleŜne od obecności glukozy. W duŜej mierze mogą one być wyjaśnione pobudzającym wpływem insuliny na pobieranie glukozy przez komórki tkanki tłuszczowej. To działanie insuliny polega na spowodowaniu przemieszczania przenośników glukozy z aparatu Golgiego do błony plazmatycznej. Wykazano równieŜ, Ŝe insulina wzmaga aktywność dehydrogenazy pirogronianowej, karhoksylazy acetylo-CoA oraz acylotransferazy glicerolo-3-fosforanowej, wzmacniając przez to skutki wynikające ze wzmoŜonego pobierania glukozy, zwiększające wytwarzanie kwasów tłuszczowych i acylogliceroli. Wiadomo, Ŝe wymienione powyŜej 3 enzymy są regulowane w sposób skoordynowany przez modyfikacje kowalencyjne, tj. przez mechanizm fosforylacji i defosforylacji. Zasadniczym działaniem insuliny w tkance tłuszczowej jest hamowanie aktywności lipazy wraŜliwej na hormony. W wyniku tego działania zmniejsza się uwalnianie nie tylko wolnych kwasów tłuszczowych, lecz takŜe glicerolu. Tkanka tłuszczowa jest znacznie bardziej wraŜliwa na działanie insuliny niŜ wiele innych tkanek, co wskazuje na tkankę tłuszczową jako główne miejsce działania insuliny In vivoDuŜa liczba hormonów ma zdolność pobudzania lipolizy W odróŜnieniu od insuliny, inne hormony przyspieszają uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej i zwiększają stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych w osoczu dzięki temu, Ŝe zwiększają szybkość hydrolizy spichrzanych triacylogliceroli (ryc. 27-9). Wśród tych hormonów znajdują sie m.in. adrenalina, noradrenalina, glukagon, kortykotrofina (ACTH), <x- oraz p-melanotrofina (MSH), tyreotrofina (TSH), hormon wzrostu (GH) i wazopresyna. Wiele z nich aktywuje lipazę wraŜliwa, na hormony. W celu osiągnięcia optymalnego skutku w wielu 2 tych procesów lipolizy jest potrzebna obecność glikokortykoidów i hormonów tarczycy. Same te hormony nie wzmagają w znaczny sposób lipolizy, ale działają ułatwiająco lub permisywnie w stosunku do innych lipolitycznych czynników wewnątrzwydziel niczych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 311

Adrenalina, nnradrenalina

/ ACTH, \ I TSH, ) Nglukagon'

insulina, proatag landy na E„ Kwas nikotynowy ATP

WKT + diacylaglicerol

Blokery ■'© \ 0adrenergiczns j^ Hormony--^) \© tarczycy \
CYKUAZA G.TPADENYLANOWA

WKT + monoacylogllcerol

--—WKT-*-'

l"acylog licerolawa b wraŜliwa na hormony
ATP WKT + glicerol

Hormon WZf08tu

Metyloksantyrty (np. kofeina} ..©_ FOSFODIESTEFIAZA

inhibitory"' ,-"'"*! syntezy ,'' białka / Adenozyna

')&

,-

eJ

cAMP-zaleŜna kJnaza białek cAMP ADP
x

■Llpaza triacyloglicero Iowa a wraŜliwa na hormony (aktywna)

Fosfataza lipazy THIACYLO GLICEROL
'Inhibitory

Insulina
Llpaza dlacylogllcerolowa monoacylogHeerolowa

Hormon tarczycy

5'AMP ^ Glukokortykoldy

biosynt ezy

białka

Ryc. 27-9. Kontrola lipolizy w tkance tłuszczowej, TSH — tyreotropina, WKT — wolne kwasy tłuszczowe. ZauwaŜ kaskadową sekwencję reakcji zmierzającą do zwielokrotnienia na kaŜdym etapie. Bodziec lipolityczny jest „wyłączony" przez: 1) usunięcie hormonu pobudzającego, 2) działanie fosfatazy lipazy, 3) hamowanie lipazy i cyklazy adenylanowej działaniem duŜych stęŜeń WKT, 4} hamowanie cyklazy adenylanowej dziafaniem adenozyny oraz 5) usunięcie cAMP w reakcji katalizowanej przez fosfod ieste raŜę, ACTH, TSH i glukagon raczej nie mogą aktywować cyklazy adenytanowej in i/ivo, gdyŜ niezbędne do tego stęŜenia hormonu//? vitro są znacznie większe niŜ znajdywane w krąŜeniu Pozytywne (©) i negatywne (G) skutki regulacyjne są zaznaczone przerywanymi liniami, a przepływ substratów ciągłymi liniami.

Te hormony, które szybko pobudzają lipolizę, np. aminy katecholowe, czynią to pobudzając aktywność cyklazy adenylanowej, enzymu, który przemienia ATP w cAMP. Ten mechanizm jest analogiczny do tego, który jest odpowiedzialny za hormonalne pobudzenie glikogenolizy (p. rozdz. 20). cAMP, pobudzając cAMP-zaleŜną kina/ę białek, przekształca nieaktywną, wraŜliwą na hormon, lipazę triacyloglicerolową w aktywną lipazę. Lipoliza jest w duŜej mierze kontrolowana przez ilość cAMP znajdującego się w tkance. Wobec tego procesy, które rozkładają lub chronią przed rozkładem cAMP, mają wpływ na lipolizę. cAMP jest rozkładany do 5'-AMP przez enzym fosfodiesterazę cykli-

cznego 3',5'-nukleotydu. Ten enzym jest hamowany przez metyloksantyny, takie jak kofeina i reoillina. Wiadomo, Ŝe picie kawy zawierającej kofeinę powoduje zwiększenie WKT w osoczu człowieka. Insulina działa antago ni stycznie w stosunku do hormonów Iipolityc2nych. Obecnie się uwaŜa, Ŝe lipolka moŜe być bardziej wraŜliwa na stęŜenie insuliny niŜ proces zuŜywania glukozy i estryfikacja kwasów tłuszczowych. Przeciwlipolityczne działania insuliny, kwasu nikotynowego i prostaglandyny E, mogą być spowodowane hamowaniem syntezy cAMP w miejscu działania cykJazy adenyJanowej. Insulina pobudza takŜe fosfodiesterazę. MoŜliwe mecha-

312 / ROZDZIAŁ 27

niŜmy działania hormonów tarczycy na lipazę polegają na zwiększeniu stęŜenia cAMP, uwarunkowanym ułatwionym przenikaniem bodźca z miejsca na receptorze, umiejscowionego po zewnętrznej stronie błony komórkowej, do miejsca cykJazy adenylanowej umiejscowionej po wewnętrznej stronie błony, a takŜe na hamowaniu aktywności fosfodiesterazy. Pobudzający wpływ hormonu wzrostu na lipolizę jest powolny. ZaleŜy on od syntezy białek uczestniczących w wytwarzaniu cAMP. Glikokortykosteroidy pobudzają lipoiizę poprzez syntezę de now białka lipazy w sposób niezaleŜny od cAMP, co moŜe być hamowane przez insulinę. Te fakty pomagają wyjaśnić rolę przysadki mózgowej i kory nadnerczy w pobudzaniu mobilizacji tłuszczów. Współczulny układ nerwowy, wskutek uwalniania noradrenaliny w tkance tłuszczowej, odgrywa główną rolę w mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych, działając tonizująco na ten proces nawet przy braku wzmoŜonej aktywności nerwowej. Wobec tego wzmoŜoną lipolizę, spowodowaną wieloma czynnikami opisanymi powyŜej, moŜna zredukować lub nawet całkowicie zahamować przez odnerwienie tkanki tłuszczowej, przez blokadę zwojów współczulnych heksametonium lub przez zuboŜenie zapasów noradrenaliny rezerpiną. U RÓśNYCH BADANYCH GATUNKÓW WYKSZTAŁCIŁY SIĘ ROZMAITE MECHANIZMY SŁUśĄCE SUBTELNEJ KONTROLI METABOLIZMU TKANKI TŁUSZCZOWEJ Tkanka tłuszczowa człowieka nie wydaje się być waŜnym miejscem lipogenezy. Wskazuje na to obserwacja, Ŝe nie ma znaczącego wbudowywania znaczników do długołańcuchowych kwasów tłuszczowych ze znakowanej glukozy lub pirogronianu. Ponadto ATP-zaleŜna liaza cytrynianowa, kluczowy enzym lipogenezy, wydaje się być nieobecna w tkance tłuszczowej, a w wątrobie wykazuje bardzo małą aktywność. Inne enzymy, np. dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa i enzym jabłezanowy, których aktywność u szczura ulega adaptacyjnym zmianom zaleŜnym od zwiększającej się intensywności lipogenezy, nie ulegają podobnym zmianom w tkance tłuszczowej człowieka. W związku z tym sugerowano, Ŝe u człowieka istnieje

„zespół nadmiaru węglowodanów", spowodowany wyjątkowym ograniczeniem zdolności organizmu do usuwania nadmiaru węglowodanów przez lipogenezę. U ptaków lipogeneza jest ograniczona do wątroby, gdzie jest ona bardzo istotna, poniewaŜ dostarcza lipidów potrzebnych do tworzenia jaj pobudzonego przez estrogeny. Ludzka tkanka tłuszczowa nie jest wraŜliwa na działanie większości hormonów lipolitycznych, poza aminami katecholowymi. Dalszymi ciekawostkami są: brak reakcji lipolitycznej na działanie adrenaliny u królika, świnki morskiej, świni i kurczęcia, bardzo znaczne działanie lipolityczne glukagonu u ptaków, przy braku przeciwlipolitycznego działania insuliny oraz brak syntezy acylogliceroiu i glicerolu z glukozy u gołębia. Biorąc pod uwagę głębokie zaburzenie metabolizmu występujące w cukrzycy (które jest spowodowane głównie zwiększonym uwalnianiem wolnych kwasów tłuszczowych z ich magazynów) oraz fakt, Ŝe podanie insuliny w duŜej mierze poprawia le zaburzenia, naleŜy wysnuć
wniosek, Ŝe insulina odgrywa pierwszoplanową rolę w regulacji metabolizmu tkanki tłuszczowej.

BRUNATNA TKANKA TŁUSZCZOWA POBUDZA TERMOGENEZĘ Brunatna tkanka tłuszczowa uczestniczy w metabolizmie szczególnie wówczas, gdy jest konieczne wytwarzanie ciepła. Ten fakt tłumaczy, Ŝe ta tkanka jest bardzo aktywna metabolicznie u niektórych gatunków zwierząt w okresie budzenia się ze snu zimowego, u zwierząt naraŜonych na zimno (termogeneza bezdrŜeniowa) oraz przy wytwarzaniu ciepła, u noworodków. ChociaŜ nie jest to pierwszoplanowa tkanka u ludzi, ostatnio wykazano, Ŝe jest aktywna u osób zdrowych, u których wydaje się ona
odpowiadać za „termogenezę indukowaną przez

dietę". Ten fakt tłumaczy, dlaczego niektóre osoby mogą Jeść i nie być otyłymi". Godne uwagi jest to, Ŝe ilość brunatnej tkanki tłuszczowej jest mniejsza lub w ogóle brak jej u ludzi otyłych. Brunatną tkankę tłuszczową charakteryzuje dobrze rozwinięte ukrwienie, duŜa zawartość mitochondriów i cytochromów, ale mała aktywność syntazy ATP. Metabolicznie przewaŜa utlenianie zarówno glukozy, jak i kwasów tłuszczowych.

TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDÓW / 313
STRONA ZEWNĘTRZNA WEWNĘTRZNA BŁONA MITOCHONDRIALNA STRONA WEWNĘTRZNA

Noradrenallna

9

\

I

F

°

KffN
ATP

cAMP

f I ------------------------------ 1 i.

,

Hl

Noradrenalina, uwalniana z zakończeń nerwów współczułnycli, jest waŜna do wzmoŜenia lipolizy w brunatnej tkance tłuszczowej. Utlenianie i fosforylacja nie są skojarzone w brunatnej tkance tłuszczowej, czego wyrazem jest brak wpływu dinitrofenolu na zuŜycie tlenu i brak kontroli oddechowej wywieranej przez ADP. Fosforylacje, które zachodzą, mają miejsce na poziomie substratu, np. w reakcji katalizowanej przez tiokinazę bursztynianową
oraz w glikolizie. W procesie utleniania wytwarza się więc duŜo ciepła, a tytko niewiele energii swobodnej jest wiązane w postaci ATP. W katego-

Ciepło

Laficuch oddechowy Trfaoyfo.

WKT
Tarmogsnlna Acyio-CoA -*-j RównowaŜniki

redukcyjne

riach teorii chemiosmotycznej dzieje się tak, Ŝe gradient stęŜeń protonów, istniejący normalnie po obydwóch stronach wewnętrznej błony mJtochondrialnej skojarzonych mitochondriów, w brunatnej tkance tłuszczowej ulega ciągłej dyssypacji działaniem ciepłotwórczego białka termogeniny, którego mechanizm działania polega na tworzeniu drogi swobodnego przenikania protonów przez błonę. Wyjaśniałoby to pozorny brak efektu związków rozkojarzajacych (ryc. 27-10).
PIŚMIENNICTWO Borensztajn J (edilor): Lipoprotein Lipase. Eveuer Publishers, Chicago, 1987. Brewer HB, et al: Apolipoproteins and lipoproteins in human plasma: An overview. Clin Chem 1988;34:B4. Brown Ms, Goldsten JL: Lipoprotein metabolisra in the macrophage: Implication for cholesterol deposition in atherosclerosis. Amtu Rev Biochem 1983;52:223. Eisenberg S: High densiiy lipoprotein metabolism. J Lipid Res 1984;25:1017. Fielding CJ, Fielding PE: Metabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemiitry of&ptds and Membmnes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Himms-Hagen J: Brown adipose tissue metabolism and thermogenesis. Ann Rev Nutr I985;5:69. Liber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injor>- to liver and other tissues. New Eng JMed 1988:319:1639. Sparks JD, Sparks CE: Apolipoprotein B and lipoprotein metabolisra, Ath Lipid Res 19S5;21:t.

C iepło
JMuKeotydy purynowe

Transporter karnltynowy

^Oksydacja

Ryc. 27-10. Termogeneza w brunatnej tkance tłuszczowej. Aktywność łańcucha oddechowego wytwarza ciepło, prowadząc równocześnie translokację protonów (p. str. 151). Gdy te protony wracają do kompartmentu wewnątrzmitochondrialnego za pośrednictwem termogeniny, następuje rozproszenie ciepła, zamiast wytwarzania ATP, które zachodzi wówczas, gdy protony powracają za pośrednictwem F^syntazy ATP. JeŜeli brunatna tkanka tłuszczowa ł nie jest pobudzana, to przejście H przez termogeninę jest zahamowane przez nukleotydy purynowe. Pod wpływem noradrenaliny ta inhibicja zostaje zniesiona, gdyŜ są wytwarzane wolne kwasy tłuszczowe (WKT) i acylo-CoA. ZauwaŜ podwójną rolę acylo-CoA, z jednej strony ułatwiają działanie termogeniny, z drugiej zaś dostarczają równowaŜników redukujących dla łańcucha oddechowego. Zaznaczone są pozytywne (©) i negatywne (0) skutki regulacyjne.

28

Synteza, transport i wydalanie cholesterolu
Pater A. Mayes, PhD, DSc

WPROWADZENIE Cholesterol występuje w tkankach oraz w lipoproteinach osocza jako wolny cholesterol albo w połączeniu z kwasami tłuszczowymi o długim łańcuchu węglowym jako estry cholesterolu. Jest on syntetyzowany w wielu tkankach z acetyl o-Co A i ostatecznie wydalany z organizmu z Ŝółcią jako cholesterol lub sole kwasów Ŝółciowych. Cholesterol jest prekursorem wszystkich innych steroidów w organizmie, takich jak: korty kos teroidy, hormony płciowe, kwasy Ŝółciowe i witamina D. Jest typowym produktem metabolizmu zwierzęcego, a więc znajduje się w pokarmach pochodzenia zwierzęcego, takich jak: Ŝółtko jaja, mięso, wątroba i mózg. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Cholesterol jest amfipatycznym lipidem i jako taki jest istotnym strukturalnym składnikiem błon oraz zewnętrznej warstwy Hpoprotein osocza. Ponadto lipoproteiny transportują wolny cholesterol w krąŜącej krwi, gdzie wymienia się on, na zasadzie równowagi, z cholesterolem innych lipoprotein i błon. Cholesterol zestryfikowany jest postacią zapasową cholesterolu znajdującego się w większości tkanek. Jest on transportowany jako „cargo" w rdzeniu Iipoprotein osocza .fCDD jest pośrednikiem w pr^Ł noszeniu cholesterolu i estrów cholesterol u do wielu Tkanek. Wolnycholesterol jest usuwany z tkanek przez fHDJ^ i transportowany do wątroby, gdzie jest przekształcany w kwasy Ŝółciowe. Cholesterol jest głównym składnikiem kamieni Ŝółciowych. JednakŜe najwaŜniej-

sza jego rola w procesach patologicznych polega na uczestniczeniu w powstawaniu miaŜdŜycy {(itherosderosis) Ŝyciowo waŜnych tętnic, stając się przyczyną chorób naczyń mózgowych, tętnic wieńcowych i naczyń obwodowych. Nasilenie miaŜdŜycy naczyń wieńcowych wykazuje dodatnią korelację ze stosunkiem stęŜenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL. CHOLESTEROL POCHODZI MNIEJ WIĘCEJ W TEJ SAMEJ ILOŚCI Z POKARMÓW CO I Z BIOSYNTEZY Około połowa cholesterolu organizmu człowieka pochodzi z syntezy (ok. 500 mg/24 h), pozostała zaś ilość jest dostarczana z pokarmem. Około 50% syntetyzowanego cholesterolu pochodzi z wątroby, 15% z jelit, zaś znaczna część pozostałej ilości syntetyzowanego w organizmie cholesterolu pochodzi ze skóry. Praktycznie wszystkie tkanki zawierające komórki jądrzaste są zdolne do syntetyzowania cholesterolu. Za syntezę jest odpowiedzialna zarówno frakcja mikrosomalna (siateczka śródplazmatyczna), jak i frakcja cytozolowa komórki. Źródłem wszystkich atomów węgla cholesterolu jest acetylo-CoA Biosynteza cholesterolu moŜe być podzielona na 5 etapów. 1. Najpierw następuje synteza mewalonianu, 6węglowego związku powstającego z acetylo-CoA (ryc. 28-1). 2. Następnie dochodzi do wytworzenia jednostki izoprenoidowej z mewalonianu przez utratę COZ (ryc. 28-2). 3. 6 jedno-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 315

C H 3 -C -S -C o A 2-Acatylo-CoA | TIOLAZA | CoA-SH
CH3
ot *

O
CM

Ć - CH ; - C~ S- Co A 0 Acetoacełylo-CoA

o
ĆH3-° £!-S-CoA
Acetylo-CaA SYNTAZA KMG-CoA

CH, C o A . S H O l

,

o

zolowy — tiola/a. W wątrobie acetoacetylo-CoA moŜe powstawać alternatywnie w taki sposób, Ŝe acetooctan wytworzony w szlaku ketogenezy wewnątrz mitochondrium (p. rozdz. 24) dyfunduje do cytozolu. gdzie moŜe być aktywowany do acetoacetylo-CoA działaniem syntazy acetoacetylo-CoA. Reakcja ta wymaga obecności ATP i CoA. W wyniku kondensacji acetoacetylo-CoA z kolejną cząsteczką aceiylo-CoA (reakcje te katalizuje syntaza HMG-CoA) powstaje HMG-CoA. HMG-CoA jest przekształcany w mewalonian w 2-etapowej redukcji z udziałem NADPH i mikrosomalnego enzymu reduktazy HMG-CoA. Reakcja ta jest uwaŜana za etap ograniczający szybkość szlaku biosyntezy cholesterolu (ryc. 28-1).

O

Ol

*

:-! |

- OO C-CH; - C-CHj - C - S -Co A I OH 3-Hydrofoy-3-metylaglutaryto-CaA (HMG-CoAJ
IREDLKTAZA HMG-CoA Cholesterol Mewastaryna Lowastafyrra
c •

Etap 2. Z mewalonianu powstają aktywne jednostki izoprertoidowe. Mewalonian jest fosforylowany przez ATP z wytworzeniem kilku aktywnych ufosforylowanych związków pośrednich (ryc. 28-2). Przez dekarboksylację powstaje aktywna jednostka izoprenoidowa — izopentenylopiro fosforan. Etap 3. 6 jednostek izoprenoidowych tworzy skwalen. W tym etapie dochodzi do kondensacji 3 cząsteczek izopentenylopirofosforanu z powstaniem pirofosforanu famezylu. Odbywa się to wskutek izomeryzacji izopentenylopirofosforanu, w czasie której dochodzi do przesunięcia wiązania podwójnego i wytworzenia pirofosforanu dimetyloalilu. Z kolei następuje kondensacja z inną cząsteczką izopentenylopiro fosforanu i wytworzenie 10-węglowego związku pośredniego, pirofosforanu geranylu (ryc, 28-2). W wyniku dalszej kondensacji z izopentenylopirofosforanem powstaje pirofosforan farnezylu. 2 cząsteczki pirofosforanu farnezylu kondensują przy końcu piro fosforanowym. W tej reakcji najpierw odszczepia się 1 pirofosforan i powstaje pirofosforan preskwalenu, po czym następuje redukcja z udziałem NADPH i oderwanie pozostałej reszty piro fosforanowej. Produktem tych reakcji jest skwalen. MoŜe istnieć alternatywny szlak zwany „spięciem trans-metyloglutakonylanowym". W tym szlaku jest eliminowana znaczna część (5% w wątrobie w stanie sytości, a do 33% w wątrobie w stanie głodzenia) pirofosforanu dimetyloalilu, który wraca do HMG-CoA przez (rans-3-metyloglutakonylo-CoA. Ten szlak moŜe mieć znaczący wpływ regulacyjny na sumaryczną szybkość syntezy cholesterolu.

2NADPH+2H1 0 ^ 2 NA DP +

+ C0 A . S H OCH^

-OOC-CH 2 - C - C H . - C H ^ O H I OH
Mewalonlan

Ryc. 28-1. Biosynteza mewalonianu. HMG — reszta 3-hydroksy-3-metyloglutarylowa. Reduktaza HMG-CoAjest hamowana przez cholesterol i metabolity grzybów, mewastatynę (Compactin) i lowastatyne (Mevinolin), które działają kompetycyjnie w stosunku do HMG-CoA.

stek izoprenoidowych kondensuje tworząc produkt pośredni — skwalen. 4, Skwalen cyklizuje i powstaje macierzysty steroid — lanosterol. 5. Z lanosterolu powstaje cholesterol w wyniku kilku dalszych reakcji związanych z utratą 3 grup metylowych (ryc. 28-3).

Etap 1. Z acetylo-CoA powstaje HMG-CoA i mewalonian Szlak prowadzący przez HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA) przebiega według tej samej sekwencji reakcji, jaka została opisana w rozdz. 24 przy syntezie ciał ketonowych w mitochondriach. PoniewaŜ synteza cholesterolu jest procesem pozamitochondrialnym, te 2 szlaki przebiegają oddzielnie. Na początku 2 cząsteczki acetylo-CoA kondensują tworząc acetoacetylo-CoA. Reakcję te katalizuje enzym cyto-

316 / ROZDZIAŁ 28 CH3 OH
ATP ADP CH, OH

-ooc

\r
CH 5 CH : Mewalonian

CH,
OH

^L_-OOC C KINAZA CH, O MEWALONIANOWA CH2 5-Fosforan mewalonianu ATP KINAZA FOSFOMEWALONIANOWA

\if \ / \

-C PJ

ADP
CH3 ADP CH3

OH

ATP

CH, CH; O-®-® 3-Fosto-5-plrofosłoran rnawalonlanu ~ COj+Pj HMG-CoA
CH3 I ^ ___ C / CH, 'Izopentenylo-IRNA OS-PRENYLOTRANSFERAZA DEKARBOKSYLAZ A PIROFOSFOMEWA-

AA
H5 CH2 5Plrofosforan mewalonlanu

Spięcie trans-matyloglutakonłanowa ^

'

^ / \
Pirofostoran 3,3-dimetyloallilu

°

°

IZOMEflAZA IZOPENTENYLODtFOSFORANOWA

Piralosforan Izopentenylu

___ JL
CH3

_

CH3

CH3 Hem a

CH

CH, CH Pirofosforan geranylu

CIS-PRENYLOTRANSFERAZA Łańcuch boczny __ ubichlnonu ^—

»Skwalen

Ryc. 28-2. Biosynteza skwa len u, ubichinonu idoMcholu, HMG — reszta 3hydroksy-3meiylo'gluiarylowa: x— cytokinina. Reszta farnezylowa jest obecna w hemie a oksydazy cyto chrom owej. Węgiel zaznaczony * staje się C,, lub C12 w skwatenie. Syntetaza skwalenowa jest enzymem mikrosomainym; wszystkie inne enzymy zaznaczone na schemacie są rozpuszczalnymi białkami cytozolowymi. _________

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 317

CH,
O • ul • O

CH 3 -°C~S-CoAAcetylc-CoA

" OOC -CH!-C -CH3 -CH20H l
OH Mewalontan


CHa~C

=

ol

*

a ^"1

CH — CH;— Jednoalka

ca

H,0

izoprenoldowa

Daamosterol (24-ae hyd r oe ho I astero i)

CH,

*aH "^
H2C

^=c"'

LANOSTEROLOCYKLAZ A O KSY DOSKWALENOW A

HO

Cholesterol

Ryc. 28-3. Biosynteza cholesterolu. Ponumerowane pozycje oznaczają numery atomów węgla pierścienia steroidowego. 'Odnosi się do znakowania skwalenu na ryc. 28-2.

Etap 4. Skwaien jest przekształcany
w tanosterol. Skwaien ma budowę przypominającą pierścień steroidowy (ryc. 28-3). Przed zamknięciem pierścienia skwaien jest przekształcany w 2,3-tlenek. Reakcję tę, zachodzącą w siateczce śród plazma ty cznej, katalizuje oksydaza o mieszanej funkcji zwana epoksydazij

skwalenową, W trakcie cykiizacji, katalizowanej przez lanosterolocyklazę 2,3-oksydoskwatenową, grupa metylowa przy C14 zostaje przeniesiona do C]3, a grupa metylowa z C8 na CM.

Etap 5. Lanosterol jest przekształcany do cholesterolu. W tym ostatnim etapie (ryc, 28-3) przejście lanosterolu w cholesterol

318 / ROZDZIAŁ 28

zachodzi w błonach siateczki śródplazmatycznej i obejmuje zmiany w pierścieniu steroidowym oraz w łańcuchu bocznym. Grupa metylowa przy C,4 zostaje utleniona do CO2 i powstaje 14-demetyloianosteroI. Podobnie 2 grupy metylowe przy C4 zostają usunięte, czego wynikiem jest zymosterol. Z zymosterolu tworzy się przez przesunięcie podwójnego wiązania z pozycji pomiędzy Cg i C9 do pozycji pomiędzy C3 a C7, A7>24-cholestadienol. Na tym etapie powstaje, przez dalsze przesunięcie podwójnego wiązania w pierścieniu B do pozycji między C; a Cfi —jak w cholesterolu — des most er o I W końcu, po redukcji podwójnego wiązania w łańcuchu bocznym, powstaje cholesterol. Reakcja ta moŜe zachodzić na kaŜdym etapie biosyntezy cholesterolu. Dokładna kolejność, w jakiej rzeczywiście zachodzą opisane powyŜej etapy, nie jest znana z pewnością. Jest prawdopodobne, Ŝe związki pośrednie od skwalenu do cholesterolu są związane ze swoistym białkiem nośnikowym, znanym jako białko przenoszące skwalen i steroJe. To białko wiąŜe sterole i inne nierozpuszczalne lipidy, umoŜliwiając im wchodzenie w reakcje w wodnej fazie komórki. Ponadto jest prawdopodobne, Ŝe cholesterol, właśnie w formie związanej ze specjalnym białkiem nośnikowym, jest przekształcany w hormony steroidowe i w kwasy Ŝółciowe, a takŜe uczestniczy w tworzeniu błon i lipoprotein. Pirofosforan farnezylu jest związkiem wyjściowym do wytwarzania innych waŜnych związków izoprenoidowych Pirofosforan farnezylu jest kluczowym związkiem, od którego rozgałęziają się szlaki syntezy innych poliizoprenoidów, dolicholu i ubichinonu. Alkohol poliizoprenylowy — dolichol (p. str. 184 i str. 756) powstaje przez dalsze dołączanie, maksymalnie 16 reszt, izopentenylopiro fosforanu, natomiast łańcuch boczny ubichinonu (p. str. 149) przez dołączenie dalszych 3—7 takich jednostek. SYNTEZA CHOLESTEROLU JEST REGULOWANA IMA ETAPIE REDUKTAZY HMG-CoA Synteza cholesterolu jest regulowana blisko początku szlaku na etapie reduktazy HMG-CoA. U_. .głodzonych zwierząt stwierdza się znaczne zmniejszenie aktywności reduktazy

JJMG-CoA, co wyjaśnia fakt zmniejszania syntezy cholesterolu w czasie głodzenia. Istnieje mechanizm sprzęŜenia zwrotnego, dzięki któremu rcduklazŁt IIMG-CoA w wątrobie jest hamowana przez cholesterol — główny produkt szlaku. PoniewaŜ nie udało się wykazać bezpośredniego hamowania enzymu przez cholesterol, wydaje się moŜliwe, Ŝe cholesterol (albo jego metabolit, np. sterol z wprowadzonym dodatkowo tlenem) działa albo przez represję syntezy nowego białka reduktazy, albo przez indukcję syntezy enzymów rozkładających istniejącą reduktazę. Syntezą cholesterolu jest równieŜ hamowana przez cholesterol zawarty w LDL, wychwytywany przez receptory LDL (receptory apo-B-100, E). Istnieją okołodobowe wahania dotyczące zarówno szybkości syntezy cholesterolu, jak i aktywności reduktazy HMG-CoA. Wpływ cholesterolu na aktywność reduktazy moŜe jednak wystąpić szybciej, niŜ to moŜna by wyjaśnić zmianami szybkości syntezy białka. Podanie insuliny lub hormonu tarczycy z wieksza~a~k~tywność reduktazy HMCŁCoA, podczas gdy glukagon i gluko korty kos teroidy ją zmniejszają. HMG-CoA występuje zarówno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Te postacie mogą odwracalnie w siebie przechodzić działaniem mechanizmów fosforylacji — defosforylacji. Niektóre z tych mechanizmów mogą być zaleŜne od cAMP i przez to wraŜliwe na glukagon, a moŜliwe, Ŝe i na insulinę (ryc. 28-4). Wpływ zmiennych ilości cholesterolu spoŜytych w pokarmach na endogenne wytwarzanie cholesterolu badano u szczurów. Przy podaŜy jedynie 0,05% cholesterolu w diecie, 70-80% cholesterolu zawartego w wątrobie, jelicie cienkim i nadnerczach pochodziło z biosyntezy w organizmie, natomiast gdy stęŜenie cholesterolu w poŜywieniu zwiększono do 2% jego endogenne wytwarzanie było mniejsze Wydaje się, Ŝe jest hamowana jedynie wątrobowa synteza cholesterolu. Doświadczenia z perfundowaną wątrobą wykazały, Ŝe bogate w cholesterol resztkowe chylomikrony wychwytywane przez wątrobę (p. str. 303) hamują syntezę sterol i. Próby zmniejszenia stęŜenia cholesterolu w osoczu u ludzi przez zmniejszenie podaŜy cholesterolu w pokarmach dają zmienne wyniki. Na ogół zmniejszenie ilości cholesterolu w diecie o 100 mg powoduje zmniejszenie jego stęŜenia w surowicy o ok. 0,13 mmcrt/1.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 319

AT P
KINAZA KINAZY REDUKTAZY

KINAZA REDUKTAZY (nieaktywna)

FOSFATAZY BIAŁEK

— Insulina ?

ADP
KINAZA HEDUKTAZY (aktywna)

e
H,0
ADP Glukagon I

ATP, HMG-CoA


Cholesterol

J
e

REDUKTAZ A HMGCoA (aktywna)

FOSFATAZY BIAŁEK

BEDUKTAZA HMG-CoA (nieaktywna)

Utosforylowany f inhlbltor-1 "* cAMP

Oksy ster ole

Synteza

Ryc. 28-4. MoŜliwe mechanizmy regulacji syntezy cholesterolu przez reduktazę HMG-CoA. Insulina odgrywa dominującą rotę w porównaniu z glukagonem.

WIELE CZYNNIKÓW WPŁYWA NA RÓWNOWAGĘ CHOLESTEROLU W TKANKACH Na poziomie tkanki rozwaŜa się następujące procesy jako stanowiące o równowadze cholesterolu komórkowego {ryc. 28-5). Zwiększenie stęŜenia cholesterolu w komórkach moŜe być spowodowane: 1) pobieraniem przez receptory, np. za pośrednictwem receptora LDL, lipoprotein zawierających cholesterol, 2) pobieraniem przez komórkę lipoprotein zawierających cholesterol bez pośrednictwa receptorów, 3) wychwytywaniem przez błonę komórkową wolnego cholesterolu z lipoprotein bogatych w cholesterol, 4) syntezą cholesterolu oraz 5) hydrolizą estrów cholesterolu przez
enzym esteraze cholesterolową.

wem cholesterolu z błon komórkowych do lipoprotein o małym potencjale cholesterolowym, zwłaszcza do HDLj albo do cząstek HDL świeŜo syntetyzowanych de novo (proces ten jest pobudzany przez LCAT-acylotransferazę lecytyna: cholesterol), 2) estryfikacją cholesterolu przez ACAT (acylotransferazę acylo-CoA:cholesterol) oraz 3) zuŜywaniem cholesterolu do syntezy innych steroidów, takich jak hormony lub kwasy Ŝółciowe w wątrobie. Receptor LDL jest intensywnie regulowany Receptory LDL (apo B-100, E) znajdują się na powierzchni komórek we wgłębieniach, które są pokryte od strony cytozolowej błony komórkowej białkiem zwanym klatryną. Receptor jest glikoproteiną przezbłonową, a jej miejsce wiąŜące apo B-100 jest umiejscowione na N-koricu wystającym na zewnątrz komórki.

Zmniejszenie zawartości cholesterolu w komórkach moŜe być spowodowane: 1) wypły-

320 / ROZDZIAŁ 28
BŁONA KOMÓRKOWA

Ftewptcty U3L (Apo-B-100, E) w opfaszczortym zagłębieniu

LDL

HDL Ryc. 28-5. Czynniki wpływające na równowagę cholesterolu na poziomie komórki. C — cholesterol, CE — estry cholesterolu, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT — acytotransferaza lecytyna : cholesterol, A-l — apolipoproteina A-l, LDL — lipoproteina o małej gęstości, VLDL — lipoproteina o bardzo małej gęstości.

Receptor reaguje z ligandem LDL, tj. apo-B-100. Cząstka LDL w całości jest wchłaniana przez endocytozę. Jest ona następnie rozkładana w Jizosomach, który to rozkład obejmuje zarówno hydrolizę apoproteiny, jak i estrów cholesterolu. Cholesterol jest następnie przemieszczany do cytozolu komórki. Receptory nie są rozkładane, lecz wracają na powierzchnię komórki. Ten napływ cholesterolu do komórki hamuje aktywność reduktazy HMG-CoA i syntezę cholesterolu oraz pobudza aktywność ACAT. Wydaje się, Ŝe liczba receptorów LDL na powierzchni komórki jest regulowana zgodnie z zapotrzebowaniem komórki na cholesterol niezbędny do budowy błon i syntezy hormonów steroidowych. Napływ cholesterolu do komórki zmniejsza więc liczbę receptorów LDL — zjawisko nazywane po angielsku „down reguiation" (ryc. 28-5).

Receptor apo B-100, E jest receptorem LDL o „duŜym powinowactwie" i moŜe być wysycony w większości zaistniałych warunków. Poza tym wydają się istnieć receptory LDL o „małym powinowactwie", jak równieŜ szlak wnikania cholesterolu do komórki za pomocą mechanizmu niereceptorowego, określany jako „szlak oczyszczający" („scavenger pathway"), który nie jest regulowany.

TRANSPORT CHOLESTEROLU MIĘDZY TKANKAMI ODBYWA SIĘ ZA POŚREDNICTWEM LIPOPROTEIN OSOCZA (p. ryc. 28-6)
U ludzi stęŜenie całkowitego 'Cholesterolu w osoczu wynosi ok. 5,2 mmo[/l; zwiększa się ono z wiekiem, wykazując duŜą zmienność

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 321

osobniczą. Większość cholesterolu znajduje się w osoczu w posUici ^estryfikowanej. Cholesterol jest transportowany i]ni<!i w lipoproteinach osocza, a ^ W warunkach, w których dominująca, lipoproteiną osocza jest VLDL, większa ilość cholesterolu przypada na K Trakcję. Cholesterol spoŜyty wraz z pokarmami dopiero po kilku dniach miesza sie (osiąga równowagę) z cholesterolem osocza, a po-

trzeba kilku tygodni, aby osiągnął stan równowagi z cholesterolem tkanek. Obrót cholesterolu w wątrobie jest stosunkowo szybki w porównaniu z biologicznym okresem półtrwania cholesterolu w całym organizmie człowieka, który wynosi kilka tygodni. Wolny cholesterol w osoczu i w wątrobie osiąga stan równowagi w ciągu godzin. Estry cholesterolu zawarte w poŜywieniu są hydrolizowane do wolnego cholesterolu, który

KRĄśENIE JELIT OWO-WĄTROBOWE ZYLA WROTNA WĄTROBY PoŜywlente (0,5 g/24 h) C

?
JELITO

t

i

C Kwasy (0,5 g/24 h) Ŝółciowo (0^ g/Z4 h) Kat

Hyc. 28-6. Transport cholesterolu między tkankami u ludzi, C — wolny cholesterol, CE — estry cholesterolu, VLDL — lipoproteiną o bardzo malej gęstości, I DL— lipoproteiną o pośredniej gęstości, LDL — lipoproteiną o malej gęstości, HDL — lipoproteiną o dueej gęstości, ACAT — acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT ...acy I otrą n sfera za lecytyna : cholesterol, A-l — apotipoproteina A-l, D — apolipoproteina D, LPL — lipaza lipoproteinowa. ____________
Biochemia

322 / ROZDZIAŁ 28

miesza się z wolnym cholesterolem z poŜywienia i cholesterolem Ŝółci, zanim wchłonie się z jelita razem z innymi lipidami. Następnie miesza sie z cholesterolem syntetyzowanym w jelitach i zostaje wbudowany do chylornikronów. Z wchłoniętego w jelitach cholesterolu 80—90% zostaje zestryfikowane z dhigołańc uch owymi kwasami tłuszczowymi w błonie śluzowej jelit. Sterole roślinne (sitosterole) słabo wchłaniają się w przewodzie pokarmowym. Gdy chylomikrony reagują z lipazą lipoprofeinową i powstają resztkowe chylomikrohy, wówczas następuje utrata jedynie ok. 5% estrów cholesterolu. Reszta jest wychwytywana przez wątrobę, gdy resztkowe chyloralkrony reagują- iieceptorem -flEŚLJL—i_ hydrolizowana do wolnego cholesterolu, VLDL powstałe w watro biejr^nśpg rtiuą cholesterol rtn osonzn If-rlna'lc7e u 1iiH?i jpst to głównie wolny cholesterol, gdyŜ aktywność ACAT w wątrobie jest mała. Lstry cholesterolu zawarte w VLDL pochodzą głównie z działania LCAT w osoczu. Większość cholesterolu zawartego w VLDL pozostaje w resztkowych VLD L. które są wychwytywane przez wątrobę albo przetwarzane do LDL. Te ostatnie z kolei wiąŜą się z receptorami LDL wątroby i tkanek po/awątrobowych. LCAT jest odpowiedzialna za powstawanie większości estrów cholesterolu osocza U ludzi aktywność LCAT osocza jest odpowiedzialna praktycznie za obecność wszystkich estrów cholesterolu w osoczu. (Tak nie jest u innych gatunków, takich jak szczur, w którego wątrobie jest znaczna aktywność ACAT, pozwalająca na znaczny eksport estrów cholesterolu w VLDL syntetyzowanych de novo). Aktywność LCAT jest związana z typem HDL zawierającym apo A-L Gdy cholesterol zawarty w HDL zostaje zestryfikowany, wytwarza się gradient stęŜenia wciągający wolny cholesterol z tkanek i z innych lipoprotein do cząstek HDL (ryc. 28-6). W wyniku tych procesów gęstość właściwa HDL się zmniejsza, tworząc tzw. HDL,, o której się sadzi „..Ŝe dostarcza cFolesterolu do wątroby__(ryc- 28-6). HDL spełnia więc waŜną funkcję w odwróconym transporcie cholesterolu, tj. procesie, przez który cholesterol tkanek jest przemieszczany do wątroby.

Białko przenoszące estry cholesterolu ułatwia przenoszenie estrów cholesterolu między lipoproteinami To białko, znajdywane w osoczu ludzi, lecz nie u szczurów, jest takŜe związane HDL i wydaje się być identyczne z apo D. Ułatwia ono przenoszenie estrów cholesterolu z HDL do VLDL, LDL, a w mniejszym stopniu do chylomikronów w wymianie za triacyloghcerol. Znosi ono w ten sposób hamowanie w obrębie HDL aktywności LCAT produktem reakcji katalizowanej przez ten enzym. U ludzi duŜa ilość estrów cholesterolu, utworzonych działaniem LCAT w HDL, trafia do wątroby poprzez resztkowe VLDL (IDL) albo LDL (p. ryc. 28-6). CHOLESTEROL, PRZEZNACZONY DO WYDALENIA Z ORGANIZMU, MUSI WEJŚĆ DO WĄTROBY I BYĆ WYDALONY Z śÓŁCIĄ ALBO JAKO CHOLESTEROL, ALBO JAKO KWASY śÓŁCIOWE (ICH SOLE) W ciągu jednego dnia z organizmu wydala się ok. 1 g cholesterolu. Prawie połowa, po przekształceniu w kwasy Ŝółciowe, wydala się z kałem. Pozostała ilość jest wydalana w postaci obojętnych steroidów. Znaczna część cholesterolu wydalana z Ŝółcią ponownie wchłania się w jelitach. UwaŜa się, Ŝe przynajmniej pewna ilość cholesterolu, który jest prekursorem steroli występujących w kale, pochodzi z błony śluzowej jelita. Koprostanol jest głównym sterolem w kale. Jest on wytwarzany z cholesterolu w dolnych odcinkach jelita pod wpływem działania miejscowej flory bakteryjnej. DuŜa część wydalanych z Ŝółcią soli kwasów Ŝółciowych jest reabsorbowana do krąŜenia wrotnego, a następnie wychwytywana przez wątrobę i ponownie wydalana z Ŝółcią. Zjawisko to jest znane jako krąŜenie jelito wo-wątro bo we. Sole_kw_asów Ŝółciowych lub ich pochodne, które nie zostały wchłonięte w jelitach, są wydalane z kałem. Sole kwasów Ŝółciowych ulegają przemianom pod wpływem bakterii jelitowych, tworząc wtórne kwasy Ŝółciowe. Kwasy Ŝółciowe są wytwarzane z cholesterolu Pierwotne kwasy Ŝółciowe są „syntetyzowane w wątrobie z cholesterolu w kilku etapach pośrednich. Kwas cholowy jest kwasem Ŝółcio-

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 323

NADPH + H

ł

NADP*

Cholesterol Kwas gllkocholowy

}7gHYDROKS Witamina C

e
|12i-HYDROKSY-| I LA7A

OH
7cc- Hyd ro Ksyc h o I estero I

śółciowe

,I+
Oj

NADPH + H 2 CoA-SH

+

Kwas taurocholowy (pbrwotny kwas iótelowy) Kwas lauroi glikochenodeoksycholowy (pierwotne kwasy ióteiowe} Oekonrugscja 7odehycfrokaylacja

Cholollo-CoA

j^N^N, COOH

rrj
Kwas deoksycholowy (wlórny kwas Ŝófolowy) (pierwotny kwas Ŝółciowy) Dekonlugacja -------------------» 7«-de hyd ro ksylacja HO

j-^Y]

COO

Kwas lltocholowy (wtOrny kwas śółciowy)

Rye. 28-7. Biosynteza i degradacja kwasów Ŝółciowych. 'Katalizowane przez enzymy bakteryjne.

wym występującym w Ŝółci w największej ilości. Zarówno kwas cholowy, jak i chenodeoksycholowy powstają ze wspólnego prekursora, który sam pochodzi z cholesterolu (ryc. 28-7). 7a-Hydroksylacja cholesterolu jest pierwszą reakcją w szlaku biosyntezy kwasów Ŝółciowych i to właśnie ta reakcja jest etapem ograniczającym nasilenie całego szlaku. Reakcja ta jest

katalizowana przez 7<x-hydroksylazc, która jest enzymem mikrosomalnym. Wymaga ona udziału tlenu, NADPH i cytochromu P-450. Enzym ten wydaje się być typową monooksygenazą, podobnie jak i enzymy dalszych etapów hydroksylacyjnych. Niedobór witaminy C zaburza tworzenie kwasów Ŝółciowych na etapie 7ot-hydroksyłacji, prowadzi do spichrzania choie-

324 / ROZDZIAŁ 28

sterolu i miaŜdŜycy naczyń u świnek morskich chorych na gnilec. Szlak biosyntezy kwasów Ŝółciowych rozgałęzia się we wczesnych stadiach i jedna droga prowadzi do kwasu cholowego, charakteryzującego się obecnością dodatkowej grupy a-OH w pozycji 12, druga zaś do kwasu chenodeoksycholowego. Poza tą róŜnicą, w obydwóch szlakach zachodzą podobne reakcje hydroksylacji i skracania łańcucha bocznego (ryc. 28-7), tak Ŝe powstają typowe struktury kwasów Ŝółcio wyc h z gr up a mi a - O H w p o z ycj a c h 3 i 7 i z całkowicie wysyconym pierścieniem steroid owym. Kwasy Ŝółciowe przechodzą do Ŝółci jako połączenia z glicyną lub z tauryną. UwaŜa się, Ŝe nowo syntetyzowane kwasy Ŝółciowe w komórce wątrobowej występują jako tioestry CoA, tj, jako choloilo-CoA albo chenodeoksycholoilo-CoA (ryc. 28-7). Pochodne CoA powstają przy udziale enzymu aktywującego występującego w mikrosomach wątroby. Inny enzym katalizuje połączenie odpowiednich pochodnych CoA z glicyną lub z tauryną, tworząc kwasy glikocholowy lub glikochenodeoksycholowy oraz taurocholowy lub taurochenodeoksycholowy. Są to tzw. pierwotne kwasy Ŝółciowe. U ludzi stosunek glicyny do tauryny w tych połączeniach wynosi normalnie 3:1. PoniewaŜ Ŝółć zawiera znaczne ilości jonów sodowych i potasowych, a jej pH jest zasadowe, naleŜy przyjąć, Ŝe kwasy Ŝółciowe i ich połączenia występują w postaci soli, diatego niekiedy jest uŜywany termin „sole kwasów Ŝółciowych". Pewna część pierwotnych kwasów Ŝółciowych moŜe podlegać dalszym przemianom w jelicie, dzięki aktywności bakterii jelitowych. Te przemiany mogą obejmować od szczepienie przyłączonej uprzednio glicyny i tauryny oraz grupy 7a-OH. W ten sposób powstają wtórne kwasy Ŝółciowe, kwas deoksycholowy z kwasu cholowego i litocholowy z kwasu chenodeoksycholowego (ryc. 28-7). Prawie wszystkie kwasy Ŝółciowe powracają do wątroby w krąŜeniu jelito wo- wątrobowym ChociaŜ produkty trawienia tłuszczu, łącznie z cholesterolem, zostają wchłonięte w początkowych 100 cm jelita cienkiego, pierwotne i wtórne kwasy Ŝółciowe są wchłaniane wyłącznie w jelicie krętym. W krąŜeniu wrotnym wraca do wątroby ok. 98—99% kwasów Ŝółciowych wydzielonych do światła jelita. Zjawisko to jest

znane jako krąŜenie jelitowo-wątrobowe. JedriafcŜe kwas-łitochołowy, ze względu na jego nierozpuszczałność, nie wchłania się zwrotnie w znaczniejszych ilościach. Niewielka część soli kwasów Ŝółciowych, moŜe tak niewiele jak 500 mg/24 h, unika wchłaniania zwrotnego i jest eliminowana z kałem. Jakkolwiek jest to niewielka ilość, to jednak jest to główna droga eliminacji cholesterolu. KrąŜenie jelitowo-wątrobowe kwasów Ŝółciowych jest tak wydajne, Ŝe kaŜdego dnia stosunkowo mała pula kwasów Ŝółciowych (ok. 3—5 g) moŜe cyklicznie przejść przez jelito 6—10 razy z niewielką tylko ich utratą w kale, wynoszącą nie więcej niŜ 1—2% ilości, która przeszła przez krąŜenie jelitowo-wątrobowe. Jednak kaŜdego dnia taka
sama ilość kwasów Ŝółciowych, Jaka została utracona z kałem, jest syntetyzowana w wątrobie

z cholesterolu, tak Ŝe wielkość puli kwasów Ŝółciowych jest stała, nad czym czuwa układ kontrojny oparty na sprzęŜeniu zwrotnym. Synteza kwasów Ŝółciowych jest regulowana na etapie 7tx-hydroksylazy Głównym etapem ograniczającym szybkość biosyntezy kwasów Ŝółciowych jest reakcja katalizowana przez 7a-hydroksylaze, a w biosyn-

tezie cholesterolu jest to etap katalizowany przez reduktaze HMG-CoA (ryc. 28-1). Aktywności tych 2 enzymów często ulegają równoległym zmianom, co sprawia, Ŝe trudno stwierdzić, czy hamowanie syntezy kwasów Ŝółciowych ma miejsce pierwotnie na etapie działania reduktazy HMG-CoA, czy na etapie reakcji 7ot-hydroksylazy. Obydwa enzymy ulegają takim samym okołodobowym zmianom aktywności, jednak pobudzający wpływ karmienia cholesterolem na aktywność 7a-hydroksylazy wydaje się być raczej reakcją na samą aktywność enzymu niŜ wynikiem zwiększonej dostępności substratu. Kwasy Ŝółciowe z pewnością wywierają zwrotny wpływ hamujący na aktywność 7a-hydroksylazy, ale mechanizm tego hamowania nie wydaje się być bezpośrednim działaniem alłosterycznym. Pod tym względem powrót kwasów Ŝółciowych do wątroby, przez krąŜenie jelitowo-wątrobowe, stanowi waŜny czynnik kontroli, który, jeśli zostaje przerwany, prowadzi do aktywacji 7a-hydroksylazy. Niedawne badania wykazały, Ŝe 7a-hydroksylaza (jak równieŜ reduktaza HMG-CoA) moŜe być regulowana przez kowalencyjną fosforylację i defosforylację. W odróŜnieniu od reduktazy HMG-CoA, postać ufosforylowana 7cc-hydroksylazy jest bardziej aktywna.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 32S

Hipercholesterolemię moŜna leczyć przez przerwanie krąŜenia jelitowo- wątrobowego kwasów Ŝółciowych Znaczne zmniejszenie stęŜenia cholesterolu osocza moŜna osiągnąć za pomocą Ŝywicy cholestyraminy (Questran) lub chirurgicznie przez wyłączenie jelita krętego. Obydwa sposoby powodują zablokowanie wchłaniania zwrotnego kwasów Ŝółciowych. Wówczas, w wyniku zniesienia hamowania zwrotnego, wywieranego przez kwasy Ŝółciowe, przemiana cholesterolu w kwasy Ŝółciowe znacznie się zwiększa w dąŜeniu do utrzymania stałej puli kwasów Ŝółciowych. W następstwie tego zwiększa się liczba receptorów LDL w wątrobie, powodując wzmoŜone wychwytywanie LDL przez hepatocyty i w konsekwencji zmniejszenie stęŜenia cholesterolu w osoczu. StęŜenie cholesterolu w surowicy jest skorelowane z częstością występowania miaŜdŜycy tętnic i z chorobą niedokrwienną serca Spośród lipidów surowicy najczęściej wskazywano na cholesterol jako najbardziej zaangaŜowany w tę zaleŜność. JednakŜe i inne parametry, takie jak stęŜenie triacylogliceroli w surowicy, wykazują podobne koreiacjevChorzy 2 chorobą tętnic mogą mieć jedną z następujących nieprawidłowości: 1) zwiększone stęŜenia VLDL przy prawidłowych stęŜeniach LDL, 2) zwiększone stęŜenie LDL przy prawidłowych stęŜeniach VLDL, 3) zwiększenie stęŜeń obydwu frakcji lipoprotein. Występuje wównieŜ odwrotna zaleŜność między stęŜeniami HDL (HDL2) a chorobą niedokrwienną serca. Niektórzy badacze uwaŜają, Ŝe progn o stycznie najbardziej znaczący jest stosunek cholesterol LDL : HDL. Tę zaleŜność moŜna wyjaśnić, biorąc pod uwagę proponowane role frakcji LDL w transporcie cholesterolu do tkanek, a frakcji HDL, działającej jako czyściciel cholesterolu, w odwrotnym kierunku (w transporcie cholesterolu z tkanek do wątroby). MiaŜdŜyca naczyń charakteryzuje się odkładaniem cholesterolu i estrów cholesterolu z lipoprotein zawierających apo B-100, w tkance łącznej ścian naczyń tętniczych. Chorobom, w których występują długotrwałe zwiększenia stęŜenia VLDL, 1DL lub LDL we krwi (np. cukrzycy, nerczycy lipidowej, hipotyreozie i innych stanach przebiegających z hiperlipidemią), towarzyszy zwykle przedwczesna lub cięŜsza miaŜdŜyca.

Jak wykazują badania doświadczalne, podatność na rozwój miaŜdŜycy zaleŜy od gatunku zwierząt. Króliki, świnia, małpa i człowiek są gatunkami, u których miaŜdŜycę moŜna wywołać karmieniem cholesterolem. Szczur, pies i kot są pod tym względem odporne. Tyroidektomia lub podawanie leków pochodnych tiouracylu umoŜliwia wywołanie miaŜdŜycy u psa i szczura. Małe stęŜenie cholesterolu we krwi jest charakterystyczne dla nadczynności tarczycy. Zmiany w składzie diety odgrywają waŜną rolę w zmniejszaniu stęŜenia cholesterolu w surowicy Czynniki dziedziczne mają największy wpływ na stęŜenie cholesterolu we krwi. Z czynników środowiskowych i pokarmowych, które powodują zmniejszenie stęŜenia cholesterolu we krwi, najkorzystniejszym czynnikiem jest zastąpienie w diecie pewnej ilości nasyconych kwasów tłuszczowych wielontenasyconynii i mononienasyconymi kwasami tłuszczowymi. Naturalnie występujące oleje, które zawierają wielonienasycone kwasy tłuszczowe w duŜych ilościach, to olej słonecznikowy, z nasion bawełny, kukurydzy i soi, zaś olej z oliwek zawiera znaczne ilości mononienasyconych kwasów tłuszczowych. W odróŜnieniu od wymienionych olejów, masło, tłuszcz wołowy i olej kokosowy zawierają duŜe ilości nasyconych kwasów tłuszczowych. Sacharoza i fruktoza mają większy wpływ na zwiększenie stęŜenia lipidów we krwi, zwłaszcza triacylogliceroli, niŜ inne węglowodany. Przyczyna, dla której wielonienasycone kwasy tłuszczowe powodują zmniejszenie stęŜenia cholesterolu wciąŜ nie jest jasna. Wysunięto wiele hipotez w celu wyjaśnienia tego zjawiska, min, przypuszcza się, Ŝe pobudzają one wydalanie cholesterolu do jelita i pobudzają utlenianie choiesteroJu do kwasów Ŝółciowych. Jest całkiem moŜliwe, Ŝe estry cholesterolu z wielontenasyconymi kwasami tłuszczowymi są szybciej metabolizowane przez wątrobę i inne tkanki, co mogłoby zwiększać szybkość ich obrotu i wydalania. Inne dane świadczą o tym, Ŝe działanie to jest głównie spowodowane przemieszczaniem cholesterolu z osocza do tkanek, poniewaŜ wielonienasycone i mononienasycone kwasy tłuszczowe zwiększają liczbę receptorów LDL, przez co zwiększają szybkość katabolizmu LDL, natomiast nasycone kwasy tłuszczowe mają odwrotne działanie na liczbę receptorów LDL. Nasycone kwasy tłuszczowe powodują takŜe powstawanie mniejszych cząstek

326 / ROZDZIAŁ 28

VLDL, które zawierają stosunkowo więcej cholesterolu i są zuŜywane przez tkanki pozawątrobowe z mniejszą szybkością niŜ większe cząstki. Takie zmiany mogą sprzyjać aterogenezie. Styl Ŝycia wpływa na stęŜenie cholesterolu w surowicy Wśród innych czynników, o których się sądzi, Ŝe uczestniczą w powstawaniu choroby niedokrwiennej serca naleŜy wymienić nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, otyłość, brak ruchu i picie miękkiej wody, a nie twardej. Zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych osocza, pobudzające wydzielanie VLDL przez wątrobę do krwi, jest kolejnym czynnikiem zwiększającym stęŜenie triacylogliceroli i cholesterolu w osoczu. Czynnikami prowadzącymi do większych albo zmieniających się stęŜeń wolnych kwasów tłuszczowych są m.in. stres emocjonalny, nikotyna pochodząca z palenia papierosów, picie kawy i spoŜywanie kilku duŜych posiłków zamiast częstego przyjmowania małych ilości pokarmów. Kobiety w okresie premenopauzalnym wydają się być chronione przed wieloma tymi szkodliwymi czynnikami być moŜe dlatego, Ŝe mają one większe stęŜenie HDL niŜ męŜczyźni i kobiety w okresie pomenopauzalnym. Kiedy dieta zawodzi moŜna stosować leki hipolipemizujące, które zmniejszą stęŜenie cholesterolu w surowicy O wielu lekach wiadomo, Ŝe blokują tworzenie cholesterolu na róŜnych etapach szlaku jego biosyntezy. Wiele z tych leków ma działanie szkodliwe, ale pochodzące z grzybów inhibitory reduktazy HMG-CoA mewastattn i lowastatin zmniejszają stęŜenie cholesterolu LDL, powodując niewiele działań niepoŜądanych. Sitosterol jest czynnikiem zmniejszającym stęŜenie cholesterolu, działającym przez blokowanie wchłaniania cholesterolu z przewodu pokarmowego. śywice, takie jak kolestypol i cholestyramina (Questran), zapobiegają wchłanianiu soli kwasów Ŝółciowych, łącząc się z nimi, przez co zwiększają ich utratę z kałem. Hipolipemizujące działanie klofi bratu i gemfibrozylu polega m.in. na pobudzeniu utleniania napływających do wątroby wolnych kwasów tłuszczowych, a nie na ich estryfikacji, przez co zmniejsza się wydzielanie przez wątrobę VLDL zawierających triacyloglicerol i cholesterol. Ppnadto wymienione leki ułatwiają hydrolizę triacylogliceroli VLDL przez lipazę lipoproteinową. Probucol wydaje się

zwiększać katabolizm LDL w sposób niezaleŜny od receptorów. Kwas nikotynowy zmniejsza napływ do krwi i wątroby WKT, dzięki temu, Ŝe hamuje lipolizę w tkance tłuszczowej, a tym samym wytwarzanie VLDL w wątrobie. Pierwotne zaburzenia lipoprotein osocza (dyslipoproteinemie) są dziedziczne Pewna liczba osób ma wrodzone wady przemiany lipoprotein, prowadzące do stanu hipolipoproteinemii albo hiperlipoproteinemii. Wiele innych osób z takimi chorobami, jak cukrzyca, niedoczynność tarczycy i miaŜdŜyca, ma nieprawidłowe profile lipoprotein o we osocza, które są bardzo podobne do występujących w pierwotnych wrodzonych wadach przemiany lipoprotein. Praktycznie kaŜde z tych pierwotnych zaburzeń jest spowodowane wadą na którymś z etapów tworzenia, transportu albo rozkładania lipoprotein (p. ryc. 27-4, 28-5 i 28-6). Nie wszystkie te zaburzenia są szkodliwe. A. Hipolipoprotsinemie

1. Abetalipoproteinemia. Jest to readka
choroba wrodzona charakteryzująca się bra kiem (J-lipoprotein (LDL) w osoczu. Lipidy we krwi występują w bardzo małych stęŜeniach — zwłaszcza acyloglicerole, których praktycz nie nie ma, poniewaŜ nie są syntetyzowane chylomikrony ani VLDL. W tej wadzie dochodzi do spichrzania acyloglicerolu zarówno w ścia nach jelit, jak i w wątrobie. Abetalipoproteine mia jest spowodowana wadą syntezy apolipoproteiny B. 2. Rodzinna hipobetalipoproteinemia. W hipobetalipoproteinemii stęŜenie LDL wy nosi 10—50% stęŜenia prawidłowego, ale two rzenie chylomikronów zachodzi. NaleŜy więc sądzić, Ŝe apo-B jest istotna dla transportu triacylogliceroli. Większość osób z tą wadą jest klinicznie zdrowa i cieszy się długim Ŝyciem. 3. Rodzinny niedobór -/-lipoprotein (choroba wyspy Tangier). U osób homozygotycznych prawie nie ma w osoczu HDL, zaś w tkankach stwierdza się nagromadzenie estrów cholesterolu. Nie ma zaburzenia w tworzeniu chylomikronów, ani wydzielaniu VLDL przez wątrobę. Jednak w obrazie elektro foretycznym nie ma pre-pMipoprotein, ale zamiast tego stwie rdza się szerokie pasmo fi, zawierające endogen ny triacyloglicerol. Dzieje się tak dlatego, Ŝe prawidłowe pasmo pre-p zawiera inne apoJipoproteiny normalnie dostarczane przez HDL.

SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 327

U chorych występuje skłonność do rozwinięcia się hipertriacylogiicerolemii, spowodowanej brakiem apo-C-II, która normalnie aktywuje lipaze li po pro lei nową. B. Hiperlipoproteinemie

1. Rodzinny niedobór Hpazy lipoprotetnowej (typ < ) ■ Ten stan charakteryzuje się bardzo powolnym klirensem chylomikronów z krąŜenia, prowadzącym do nienormalnie du Ŝych stęŜeń chylomikronów w osoczu. MoŜe być takŜe zwiększone stęŜenie VLDL, nato miast zmniejszone LDL i HDL. Ten stan jest indukowany spoŜywaniem tłuszczów. MoŜna go skorygować przez zmniejszenie w diecie ilości tłuszczów, a zwiększenie ilości złoŜo nych węglowodanów. Pewna odmiana tej cho roby jest spowodowana niedoborem apo-C-II, potrzebnej jako kofaktor lipazy lipoproteinowej. 2. Rodzinna hipercholesterolemia (typ II) . Chorzy charakteryzują się hiperbetalipoproteinemią (LDL), która jest przyczyną zwiększonego stęŜenia całkowitego cholestero lu. MoŜe takŜe wystąpić tendencja do zwięk szenia stęŜenia VLDL (w typie Ilb). U chorych moŜe wystąpić nieco zwiększone stęŜenie triacyloglkerolu, chociaŜ osocze — w odróŜnieniu od innych typów hiperlipoproteinemii — pozostaje przejrzyste (klarowne). Powszechnym zjawis kiem jest odkładanie się lipidów w tkankach, np. w postaci Ŝółtaków (xanthoma) lub ognisk miaŜdŜycowych (atheroma). Typ II hiperlipo proteinemii moŜe takŜe powstać jako zjawisko wtórne u chorych z niedoczynnością tarczycy. Choroba jest spowodowana zmniejszonym kli rensem LDL z krąŜenia uwarunkowanym wad liwymi receptorami LDL. Wada ta jest związana ze zwiększeniem częstości występowania miaŜ dŜycy. W leczeniu moŜe być przydatne zmniej szenie podaŜy cholesterolu i nasyconych kwa sów tłuszczowych. Inną chorobą wywołującą hipercholesterolemię, ale spowodowaną inną przyczyną, jest choroba Wolmana (choroba spichrzania estrów cholesterolu). Jest ona spowo dowana niedoborem hydrolazy estrów chole sterolu w lizosomach takich komórek, jak fibroblasty, które normalnie metabolizują LDL. 3. Rodzinna hiperlipoproteinemia ty pu III (choroba szerokiego pasma p, choroba upośledzonego usuwania re mnantów, rodzinna dysbetaltpoproteinemia) Ten stan charakteryzuje się za równo zwiększeniem stęŜenia resztkowych chylomikronów, jak i remnantów VLDL; są to

lipoproteiny o gęstości mniejszej niŜ 1,019, a charakteryzujące się w elektroforogramie jako szerokie pasmo p (p-VLDL). Powodują one hipercholesterolemię i hipertriacyloglicerolemię. Występują Ŝóltaki (xanthoma) i miaŜdŜyca zarówno tętnic obwodowych, jak i tętnic wieńcowych. Zalecane jest leczenie, polegające na redukcji masy dała i stosowaniu diety zawierającej złoŜone węglowodany, nienasycone kwasy tłuszczowe oraz mało cholesterolu. Choroba jest spowodowana wadliwym metabolizmem remnantów w wątrobie, uwarunkowanym obecnością nieprawidłowych apo £, które zwykle występują w 3 izoformach: E2, E3 i E4. U chorych z typem III hiperlipoproteinemii występuje tylko forma E2t która nie reaguje z receptorem E. 4. Rodzinna hipertriacyloglioerolemia (typ IV). Ten stan charakteryzuje się duŜymi stęŜeniami endogennie wytwarzanych triacylogliceroli (VLDL). U chorych z tą wadą stęŜenie cholesterolu zwiększa się proporcjonalnie do hipertriacyloglicerolemii. Często występuje nie tolerancja glukozy. Zarówno LDL, jak HDL występują w stęŜeniach poniŜej normy. Ten pro fil lipoproteinowy często jest powiązany z wy stępowaniem choroby niedokrwiennej serca, insulinoniezaleŜnej cukrzycy typu II, otyłości oraz wielu innych stanów, łącznie z alkoholizmem oraz przyjmowaniem gestagenów. Leczenie pier wotnej hiperiipoproteinemii typu IV polega na redukcji masy ciała, zastąpieniu prostych węg lowodanów w diecie węglowodanami złoŜonymi, spoŜywaniu pokarmów zawierających nienasy cone tłuszcze i mało cholesterolu, a takŜe na stosowaniu leków hipolipemizujących. 5. Rodzinna hiperlipoproteinemm ty pu V. Profil lipoproteinowy osocza jest złoŜo ny, gdyŜ występuje zarówno zwiększone stęŜe nie chylomikronów, jak i VLDL, co powoduje zarówno hipertriacyloglicerolemię, jak i hiper cholesterolemię. StęŜenia LDL i HDL są małe. śółtaki są częste, ale występowanie miaŜdŜycy nie jest uderzająco częste. Tolerancja glukozy jest zmniejszona i często związana z występowa niem otyłości i cukrzycy. Przyczyna występowa nia tego stanu, który ma charakter rodzinny, nie jest jasna. Leczenie polega na redukcji masy ciała i stosowaniu w diecie niezbyt duŜej ilości węglowodanów i tłuszczów. Sugerowano, Ŝe dalszą przyczyną hiperlipoproteinemii jest nadmierne wytwarzanie apo B, co moŜe być przyczyną zwiększonego stęŜenia VLDL i LDL w osoczu.

328 / ROZDZIAŁ 28

6. Rodzinna hiperalfalipoproteinemia. Jest to rzadki stan związany ze zwiększonym stęŜeniem HDL, okazujący się być dobroczynny dla zdrowia.

PIŚMIENNICTWO
Bjórkhem I, Akerlund JE: Studies on the link between HMG-CoA reductase and cholesterol 7a-hydroxylase in rat liver, /. Lipid Res 1988;29:136. Brown MS, Goldstein JL: Lipoprotein metabolism in the macrophage: lmplications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Annu Rev Biochem 1983;52:223. Fears R, Sabinę JR (editors): Cholesterol 7tt.-Hydroxylase (7v.-Manooxygenase). CRC Press, 1986. Fielding CJ, Fielding PE: Mefabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummmgs, 1985. Kane JB, Havel RJ: Treatment of hypercholesterolemia. Annu Rev Med 1986;37:427. Mahley RW, Innerarity TL: Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis. Biockim Biophys Acta 1983;737:197. NIH Publication No 88-2925: Report of the Expert Panel on Detection, Evaltmtian and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. January, 1988. Rudney H, Sexton RC: Regulation of Cholesterol Biosynthesis, Annu Rev Nutr 1986;6:245.

C. Rodzinny niedobór acylotransf erazy lecytyna: cholesterol (LCAT). U osób
z tą wadą stęŜenie estrów cholesterolu i Hzolecytyny jest małe, natomiast cholesterolu i lecytyny zwiększone. Osocze często jest mętne. Nieprawidłowości występują takie w lipoproteinach. Jedna z frakcji HDL zawiera dyskowate struktury ułoŜone w stosy lub rulony, które są najwidoczniej świeŜo powstałymi HDL niezdolnymi do pobrania cholesterolu ze względu na nieobecność LCAT. Występuje takŜe nieprawidłowa subfrakcja LDL, lipoproteina X, skądinąd znajdywana jedynie u chorych z cholestazą. VLDL są takŜe nieprawidłowe, wędrujące w elektroforezie z p-lipoproteinami (|3-VLDL). Chorzy z chorobami miąŜszu wątrobowego takŜe wykazują zmniejszenie aktywności LCAT i nieprawidłowości w lipidach surowicy i lipoproteinach.

Integracja metabolizmu i dostarczanie substratów energetycznych do tkanek
Peter A. Mayes, PhD, DSc

29

WPROWADZENIE
Węglowodany i Hpidy spełniają wiele funkcji strukturalnych i metabolicznych. Największy wpływ tych związków na metabolizm i zdrowie polega jednak na tym, Ŝe są głównymi substratami energetycznymi zawartymi w pokarmach. Regulacja dopływu tego źródła energii i sposób, w jaki jest on zintegrowany z innymi tkankowymi substratami energetycznymi, są w centrum zainteresowania badaczy, poniewaŜ wkraczają one w wiele innych procesów metabolicznych i mają związek z chorobami metabolicznymi.

jako wynik zaburzeń równowagi metabolicznej spowodowanej intensywną laktacją {np. charakteryzującą się ketozą u bydła), albo jako wynik zwiększonego zapotrzebowania metabolicznego występującego podczas ciąŜy, a będącego np. przyczyną zatrucia ciąŜowego u owiec. Wszystkie te stany są patologicznymi postaciami zespołu głodzenia, występującego jako powikłanie wielu zespołów klinicznych przebiegających ze zmniejszonym łaknieniem.

NIE WSZYSTKIE Z GŁÓWNYCH SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH ULEGAJĄ WZAJEMNYM PRZEKSZTAŁCENIOM (p. ryc. 29-1)
Fakt, Ŝe zwierzęta mogą się stać otłuszczone, gdy karmi sieje dietą o przewadze węglowodanów, wskazuje na łatwość przekształcania węglowodanów w tłuszcze. JednakŜe, jak to juŜ wspomniano, u ludzi istnieją zapewne ograniczone moŜliwości przekształcania glukozy w kwasy tłuszczowe. Najbardziej znaczącą reakcją w tym względzie jest przemiana pirogronianu do acetylo-CoA, poniewaŜ właśnie acetylo-CoA jest materiałem wyjściowym do syntezy długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Odwrotny proces, tj. przemiana kwasów tłuszczowych w glukozę nie zachodzi, poniewaŜ
reakcja katalizowana przez dehydrogeaazę pirogroniaaową jest zasadniczo nieodwracalna, co

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
W stanie dodatniej równowagi energetycznej znaczna część energii pobranej z pokarmami jest magazynowana jako glikogen albo jako tłuszcze. Jednak w wielu tkankach, nawet w stanie sytości, kwasy tłuszczowe są utleniane preferencyjnie w stosunku do glukozy, co zaznacza się szczególnie w warunkach niedoboru energetycznego lub przy głodzeniu. Ma to na celu zaoszczędzenie glukozy dla tych tkanek (np. dla mózgu i erytrocytów), które potrzebują glukozy w kaŜdych warunkach. Mechanizmy regulacyjne, często za pośrednictwem hormonów, zapewniają więc dostawę źródła energii dla wszystkich tkanek i w kaŜdym czasie, począwszy od stanu sytości aŜ do stanu całkowitego głodu. Załamanie się tych mechanizmów zdarza się jako skutek nierównowagi hormonalnej (np. indukowanej niedoborem insuliny w cukrzycy),

zapobiega bezpośredniemu przekształcaniu acetylo-CoA w pirogronian. Ponadto nie moŜe zachodzić przekształcenie (sumarycznie) acetylo-CoA w szczawiooctan, nawet przez cykl

330 / ROZDZIAŁ 29
Węglowodany Tłuszcze Trlacylogiieeroi

(

GHkogen v Glukoza /

Seryna

Tryptolan Treonina \ Glioyna Fenyloalanlna Tyrozyna Leucyna^

Hydroksyprollna

Szczaw! ooclan Asparaglnlan Fanyloalanina

\

Cylrynlan Cykl kwasu cytrynowego

1
Tyrozyna Izoleucyna \
Proplony(o-CoA

-»- Fu maran

a-Katoglutaran Arginina ( Ornltyna Prollna Htstydyna \

t \t
Proplonlan I— Metlonlna

Sukcyny(o-CoA

Glutami Glutamlnlan

Wallna Węgle m1 -to3 kwasów tłuszczowych o nieparzystej kolbie atomów wf flta

1
Hydroksyprollna

Ryc. 29-1. I nterkon wersja głównych składników pokarmowych.

cytrynianowy, gdyŜ 1 cząsteczka szczawiooctanu jest niezbędna do kaŜdej reakcji kondensacji z acetylo-CoA, podczas gdy w cyklu regeneruje się tylko 1 cząsteczka szczawiooctanu. Z podobnych powodów nie moŜe zachodzić netto przekształcenie kwasów tłuszczowych o pa-

rzystej liczbie atomów węgla (które wytwarzają acetylo-CoA) w glukozę lub glikogen. jedynie końcowy trójwęglowy fragment kwasu tłuszczowego o nieparzystej liczbie atomów węgla jest glukogenny. Jest nim propionylo-CoA, powstający jako końcowy produkt p-oksydacji

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 331

tych kwasów. Jest jednak moŜliwe występowanie znakowanych atomów węgla kwasu tłuszczowego w glikogenie po przejściu przez cykl cytrynianowy. Dzieje się tak dlatego, Ŝe szczawiooctan jest związkiem pośrednim zarówno cyklu kwasu cytrynowego, jak i szlaku ghikoneogenezy. Glicerol, będący częścią triacyloglicerolu, moŜe brać udział w tworzeniu glukozy po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu. Wiele spośród szkieletów węglowych aminokwasów endogennych moŜe powstać z węglowodanów przez cykl kwasu cytrynowego i transaminację. Przez odwrócenie tych procesów z aminokwasów glikogennych powstają szkielety węglowe, które są albo metabolitami cyklu cytrynianowego, albo ich prekursorami. Są one zatem łatwo przekształcane drogą glukoneogenezy w glukozę i w glikogen. Aminokwasy ketogenne są przemieniane do acetooctanu, który jak i inne ciała ketonowe jest metabolizowany w tkankach pozawątrob owych, tworząc acetylo-CoA. Z tych samych powodów, dla których kwasy tłuszczowe nie mogą być przetwarzane w węglowodany, nie moŜe równieŜ zachodzić przemiana kwasów tłuszczowych do aminokwasów glikogennych. Nie jest równieŜ moŜliwe odwrócenie szlaku rozkładu aminokwasów ketogenhych i innych naleŜących do niezbędnych składników poŜywienia, tzw. aminokwasów egzogennych. Przemiana szkieletów węglowych aminokwasów glikogennych do kwasów tłuszczowych jest moŜliwa albo przez utworzenie pirogronianu i acetylo-CoA, albo przez odwrócenie pozamitochondrialnych reakcji cyklu cytrynianowego od a-ketoglutaranu do cytrynianu, a następnie zadziałanie ATP-zaleŜnej liazy cytrynianowej i wytworzenie acetylo-CoA (p. rozdz. 23), Jednak w większości warunków naturalnych, np. w okresie głodzenia, rozpadowi białek i aminokwasów towarzyszy rozpad tłuszczów. Sumarycznie więc przekształcanie aminokwasów w tłuszcze nie jest procesem ilościowo znaczącym, moŜe z wyjątkiem przypadków, w których zwierzęta są karmione dietą bogatą w białko.

EKONOMIA PRZEMIANY WĘGLOWODANÓW ł LIPIDÓW OBEJMUJE CAŁY ORGANIZM Glukoza jest metaboliczną koniecznością w kaŜdym stanie odŜywienia

Opisano uprzednio wiele szczegółów współzaleŜności między przemianą węglowodanów i tłuszczów w róŜnych tkankach, zwłaszcza łatwe przetwarzanie wielu substancji glukogennych w glukozę i w glikogen przez glukoneogcneze. Glukoneogeneza jest bardzo waŜna, poniewaŜ niektóre tkanki i typy komórek, łącznie z ośrodkowym układem nerwowym i erytrocytami, są znacznie bardziej zaleŜne od ciągłego dostarczania glukozy niŜ inne. Pewien minimalny dopływ glukozy do tkanek pozawątrobowych jest prawdopodobnie niezbędny do utrzymania odpowiednich stęŜeń szczawiooctanu, aby zachować integralność cyklu cytrynianowego. Ponadto glukoza wydaje się być głównym źródłem glicerolo-3-fosforanu w tych tlcankach, które są pozbawione aktywności kinazy glicerolowej. Istnieje zatem pewne minimalne i obligatoryjne utlenianie glukozy w kaŜdych warun-

kach. DuŜe ilości glukozy są takŜe niezbędne do odŜywiania płodu i do syntezy laktozy mleka. Pewne dodatkowe mechanizmy, poza glukoneogeneza, zapewniają dostarczanie glukozy w okresach jej niedoboru. Dzieje się to przez
oszczędzanie utleniania glukozy kosztem innych substratów. Preferencyjne zuŜywanie ciał ketonowych i wolnych kwasów tłuszczowych oszczędza glukozę w celu spełnienia przez nią jej istotnych funkcji

Ciała ketonowe i wolne kwasy tłuszczowe powodują oszczędniejsze utlenianie gJukozy w mięśniach, upośledzając: jej wnikanie do komórek, fosforylację do glukozo-6-fosforanu, reakcję katalizowaną przez fosfofruktokinazę i reakcję oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu. Utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych powoduje zwiększenie wewnątrzkomórkowego stęŜenia cytrynianu, który z kolei jest allosterycznym inhibitorem fosfofruktokinazy. Te i inne obserwacje, które wykazały, Ŝe w perfundowanym sercu acetooctan jest utleniany preferencyjnie w stosunku do wolnych kwasów tłuszczowych, uzasadniają wniosek, Ŝe w warunkach niedobo-

332 / ROZDZIAŁ 29

Acyio-CoA //TKANKĄ/ TŁUSZCZOWA

GHcerolo-3-fosforan

/POZAWATRCIBOWE'//' np. MIĘSIEŃ SESCOWY''

VLDL

związki ketonowe

WKT

łłttłłi

Glukoza

r

■ — «^ i

Acylo-CoA
>

Gllcerolon3-foeforan

2CO3

Glikogen Giukozo-6-fciHtoran Aminokwasy, mleczan

Ryc. 29-2. Metaboliczne zalftŜności między tkanką tłuszczową, wątrobą i tkankami poza wątrobowym i. Zakropkowane przestrzenie przedstawiają obszary działania lipazy lipoproteinowej ściany naczyń włosowatych, WKT — wolne kwasy tłuszczowe, VLDL — Iipoproteiny o bardzo malej gęstości.

INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH / 333

ru węglowodanów dostępne substraty energetyczne są utleniane w następującej kolejności preferencyjnej: 1) ciała ketonowe (i prawdopodobnie inne krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. octan), 2) wolne kwasy tłuszczowe oraz 3) glukoza. Nie oznacza to, Ŝe utlenianie określonego substratu energetycznego całkowicie wyklucza utlenianie jakiegokolwiek innego (ryc. 29-2). Te mechanizmy funkcjonują w sposób bardziej zaznaczony w tych tkankach, które mają znaczną wydolność tlenowej przemiany kwasów tłuszczowych, np. w sercu i we włóknach mięśniowych typu powolnego (czerwonego) niŜ w tkankach z małą wydolnością, np. we włóknach mięśniowych typu szybkiego (białego). Połączenie efektu woinych kwasów tłuszczowych (polegającego na oszczędzaniu zuŜywania glukozy przez serce i mięsień) oraz efektu zaoszczędzonej glukozy (hamowania mobilizacji wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej) nazwano cyklem glukoza-kwasy tłuszczowe.

W CZASIE GŁODZENIA NASTĘPUJE CIĄGŁE DOSTARCZANIE SUBSTRATÓW ENERGETYCZNYCH DLA TKANEK
U zwierząt karmionych dietą bogatą w węglowodany jest oszczędzane utlenianie kwasów tłuszczowych. Dzieje się tak dlatego, poniewaŜ jest hamowana lipoliza w tkance tłuszczowej pod wpływem duŜych stęŜeń glukozy i insuliny. Skutkiem tych procesów jest małe stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych (ryc. 29-3). Gdy zwierzę przechodzi ze stanu sytości do stanu głodzenia, wówczas dostępność glukozy z pokarmu się zmniejsza, przez co zostaje uruchomiony glikogen wątroby w celu utrzymania odpowiedniego stęŜenia glukozy we krwi. StęŜenie insuliny we krwi się zmniejsza, natomiast stęŜenie giukagonu się zwiększa. PoniewaŜ zuŜycie glukozy w tkance tłuszczowej zmniejsza się, a działanie insuliny hamujące lipolizę staje się mniejsze, następuje mobilizacja tłuszczów w postaci womych kwasów tłuszczowych i glicerolu. Wolne kwasy tłuszczowe są transportowane do tkanek, gdzie są utleniane ajbo estryfiko-

1

G utógon osacza

"x /' V
/\
i

__

ć-i ------•£

yf

c—--N

\\

\ •/J /

V
? ^-/
Glukoza Krwi

12-24 Godzfny gtodzertta

Ryc. 29-3. Względne zmiany parametrów metabolicznych po rozpoczęciu głodzenia.

334 / ROZDZIAŁ 29

wane. Glicerol, po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu, włącza się głównie w wątrobie i w nerkach w pulę węglowodanową. Podczas tej fazy przejściowej od stanu sytości do stanu całkowitego głodzenia, endogenne wytwarzanie glukozy nie nadąŜa za jej zuŜywaniem i utlenianiem, poniewaŜ zapasy glikogenu wątroby zostają wyczerpane. Odzwierciedleniem tych procesów jest zmniejszenie stęŜenia glukozy we krwi oraz mobilizacja tłuszczów, zachodząca z coraz to większą szybkością. Jednak juŜ po kilku godzinach stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych i glukozy stabilizują się na poziomie charakterystycznym dla stanu na czczo (odpowiednio 0,7— 0,8 inmol/1 oraz 3,3—3,9 mmol/1). NaleŜy załoŜyć, Ŝe w tym stadium w całym organizmie zwierzęcia nastąpiło zrównowaŜenie między dostawą glukozy, a zapotrzebowaniem tkanek na jej zuŜytkowanie i utlenianie. Stan taki osiąga się przez zwiększone utlenianie wolnych kwasów tłuszczowych i ciał ketonowych oraz ograniczenie utleniania glukozy do moŜliwego minimum. Ta subtelna równowaga zostaje zaburzona w stanach, w których zapotrzebowanie na glukozę jest zwiększone, lub gdy uŜytkowanie glukozy przez tkanki jest upośledzone. W takich przypadkach dochodzi do dalszej mobilizacji tłuszczów. Dostarczanie węglowodanów przez tkankę tłuszczową w postaci glicerolu jest waŜną funkcją, poniewaŜ jest to jedyne źródło węglowodanów, oprócz glukoneogenezy z białek, w głodującym organizmie dla tych procesów, które muszą zuŜytkowywać glukozę. U człowieka w długotrwałym głodzie zmniejsza się glukoneogeneza z białek wskutek zmniejszonego uwalniania aminokwasów, zwłaszcza alaniny z mięśni. Towarzyszy temu adaptacja mózgu do zastąpienia około polowy utlenianej glukozy utlenianiem ciał ketonowych. Ketoza jest metaboliczną adaptacją do głodzenia Pierwotną funkcją ketogenezy jest usuwanie z wątroby nadmiaru węgli kwasów tłuszczowych w postaci związków, które są łatwo utleniane przez tkanki pozawątrobowe zamiast glukozy. Ketoza jest rezultatem zmniejszonej dostępności węglowodanów. Zwiększenie ketogenezy powoduje (p. ryc. 24-9 i 24-10); 1. Nierównowaga między estryfikacją a lipolizą w tkance tłuszczowej, czego następstwem jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych do krąŜenia. Wolne kwasy tłuszczowe są głównym substratem do wytwarzania ciał ketonowych

w wątrobie. Oznacza to, Ŝe wszystkie czynniki metaboliczne i wewnątrzwydzielnicze, wpływające na uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej, wpływają równieŜ na ketogenezę. 2. Podczas wnikania wolnych kwasów tłuszczowych do wątroby równowaga między ich estryfikacją a utlenianiem zaleŜy od palmitoilotransferazy karnitynowej I, której aktywność jest pośrednio zwiększana przez zwiększenie stęŜenia wolnych kwasów tłuszczowych i zwiększenie stosunku [glukagon]: [insulina]. 3. Przy zwiększonym utlenianiu kwasów tłuszczowych większa ich ilość przetwarza się w ciała ketonowe, a mniej tworzy się CO2. Proces ten jest regulowany w taki sposób, Ŝe całkowite wytwarzanie ATP w wątrobie pozostaje stałe. Uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych z tkanki tłuszczowej w stanie głodu moŜe być kontrolowane przez sprzęŜenie zwrotne, polegające na tym, Ŝe ciała ketonowe i woine kwasy tłuszczowe bezpośrednio pobudzają trzustkę do wytwarzania insuliny. W większości przypadków uwalnia się nadmiar wolnych kwasów tłuszczowych w stesunku do zapotrzebowania na ich utlenianie, przez co znaczna ich część jest estryfikowana nawet w czasie głodzenia. PoniewaŜ wątroba wychwytuje i estryfikuje znaczną część kwasów tłuszczowych uwalniających się z tkanki tłuszczowej, moŜna powiedzieć, Ŝe ten narząd odgrywa istotną rolę regulacyjną w usuwaniu nadmiaru wolnych kwasów tłuszczowych z krąŜenia. Gdy podaŜ węglowodanów jest wystarczająca, wówczas większość napływających kwasów tłuszczowych jest estryfikowana w wątrobie i następnie eksportowana z wątroby jako VLDL, które są zuŜytkowywane przez inne tkanki. W przypadku nadmiernego napływu wolnych kwasów tłuszczowych wątroba dysponuje alternatywną drogą ich przemiany, tj. ketogenezą, która pozwala wątrobie kontynuować eksport większości napływających kwasów tłuszczowych w postaci łatwej do zuŜytkowania przez tkanki pozawątrobowe i to w kaŜdym stanie odŜywienia. Większość powyŜszych procesów przedstawiono na ryc. 29-2. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe istnieje cykl węglowodanowy, obejmujący uwalnianie glicerolu z tkanki tłuszczowej i jego przetworzenie w wątrobie do glukozy. Powstała w ten sposób glukoza wraca ponownie do tkanki tłuszczowej, zamykając cykl. Inny cykl, cykl Hpidowy, obejmuje uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych przez tkankę tłuszczową,

INTEGRACJA METABOLIZMU 1 DOSTARCZANIE SUBSTRATOW ENERGETYCZNYCH / 335

ich przetransportowanie do wątroby i estryfikację w tym narządzie oraz powrotny transport powstałych estrów do tkanki tłuszczowej w postaci VLDL. Patologiczna ketoza jest spowodowana zwielokrotnionym działaniem czynników powodujących ketozę głodową Ketoza występująca w głodzie i przy karmieniu tłuszczami jest stosunkowo łagodna, w porównaniu ze stanem spotykanym w niewyrównanej cukrzycy, zatruciu etaŜowym u owiec albo w ketuzie u bydła w okresie laktacji. Główną przyczyną tych stanów jest jeszcze znaczniejsza niedostępność węglowodanów dla tkanek niŜ w łagodnych stanach ketozy. W łagodniejszych postaciach cukrzycy, przy karmieniu tłuszczami i w przewlekłym głodzeniu, glikogen występuje w wątrobie w zmiennych ilościach, natomiast stęŜenie wolnych kwasów tłuszczowych jest mniejsze, co prawdopodobnie jest przyczyny mniej cięŜkiej ketozy występującej w tych stanach. W cukrzycy typu I brak (albo względny brak) insuliny prawdopodobnie wpływa na tkankę tłuszczową bardziej niŜ na jakąkolwiek inną tkankę, z powodu niezwykłej wraŜliwości tej tkanki na ten hormon. Skutkiem tego jest uwalnianie wolnych kwasów tłuszczowych w ilościach powodujących zwiększenie ich stęŜenia w osoczu krwi do wartości przekraczających 2-krotnie prawidłowe stęŜenie na czczo u osób zdrowych. Występuje równieŜ wiele zmian aktywności enzymów w wątrobie, nasilających glukoneogenezę i eksport glukozy do krwi pomimo występowania znacznej hiperglikemh. W ketozie przeŜuwaczy zachodzi intensywne pobieranie glukozy z krwi przez płody bliźniacze lub proces intensywnej laktacji (ryc. 29-2).W rezultacie rozwija się krańcowa hipoglikemia, połączona z niezwykle małą ilością glikogenu

w wątrobie. Ketoza powstająca w tych warunkach bywa bardzo cięŜka. W miarę rozwoju hipoglikemii zmniejsza się wydzielanie insuliny, przez co zmniejsza się nie tylko zuŜywanie glukozy, lecz równocześnie wzmaga się lipoliza w tkance tłuszczowej. Kobiety w ciąŜy często mają łagodną ketozę. W nie leczonej cukrzycy typu I zgon jest spowodowany powikłaniami kwasicy uwarunkowanej długotrwałą utratą zasad, niezbędnych do zobojętnienia kwaśnych związków ketonowych wydalanych z moczem (p. rozdz. 62. Przypadek 8: Cukrzyca przebiegająca z kwasicą ketonową). W zatruciu dąŜowym owiec zgon następuje szybko z powodu cięŜkiej hipoglikemii.

PIŚMIENNICTWO
Caprio S et al: Oxidative fuel metabolism during mild nypoglycemia: critical role free fatty acids. Am J Physiol 1989:256:E413. Cohen P: Comroi of Enzyme Activitv, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Knopp RH et al: Lipoprotein metabolism in pregnancy, fat transport to the ferus and the effects of diabetes. Biol Neonate 1986;5O:297. Maycs PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339. McGarry JD, Foster DW. Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body produetion. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Siess EA, KientschEngel Rl, Wieland OH: Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem J 1984;218:171. Zorzano A et al: Effects of starvation and exercise on concentrations of citrate, hexose phosphates and glycogen in skeletal muscle and heart; Evidence for selectivc operation of the ghicose-fatty acid cycle. Biochem J 1985;232:585.

CZĘSC Metabolizm białek aminokwasów

Biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczane w poŜywieniu
Victor W. Rodwell, PhD

30

WPROWADZENIE
Często mówi się o aminokwasach, które muszą być dostarczone w poŜywieniu, jako o „podstawowych" i „niezbędnych", i o aminokwasach niekoniecznie występujących w pokarTabela 30-1. Zapotrzebowanie na aminokwasy u człowieka Aminokwasy, które Aminokwasy, które muszą być dostarczo- nie muszą być dostarne w poŜywieniu czona w poŜywieniu Arginina* Alanina Histydyna* Asparagina Izoieucyna Asparaginian Leucyna Cysteina Lizy na Glutaminian Metionina Glutamina Fenyloalanina Glicyna Treonina Hydroksyprolina" Tryptofan Hydroksylizyna** Walina Prolina Seryna Tyrozyna 'Częściowo niezbędny w poŜywieniu. Syntetyzowany z niedostateczną szybkością, aby podtrzymać rozwój dzieci. "Niekonieczny do syntezy białka, ale tworzący się podczas zmian potranslacyjnych kolagenu.
22 - Biochemia

mie, jako o „nie podstawowych" i „nie niezbędnych" (tab. 30-1). ChociaŜ w sensie Ŝywienia terminy te są poprawne, zaciemniają one podstwową, biologiczną naturę wszystkich 20 aminokwasów. MoŜna udowodnić, Ŝe aminokwasy, których nie trzeba dostarczać w poŜywieniu są waŜniejsze dla komórki od tych, które muszą być dostarczone w poŜywieniu, skoro organizmy (np. człowiek) zatraciły zdolność syntezy ostatniej, ale nie pierwszej grupy. PoniewaŜ ksiąŜka ta kładzie nacisk na procesy metaboliczne tkanek ludzkich, będzie tu omówiona tylko biosynteza aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w poŜywieniu, a nie będziemy omawiać tych, które są biosyntetyzowane przez rośliny i mikroorganizmy, i muszą być dostarczone w poŜywieniu.

ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Znaczenie medyczne materiału zawartego w tym rozdziale wiąŜe się ze stanami niedoboru aminokwasów, które mogą wynikać z faktu, Ŝe konieczne w poŜywieniu aminokwasy nie występują w poŜywieniu lub występują w niedostatecznych ilościach. PoniewaŜ pewne zboŜa są stosunkowo ubogimi źródłami tryptofanu i lizyny, moŜe wystąpić stan dramatycznego niedo-

338 / ROZDZIAŁ 30

boru tych aminokwasów w regionach, w których poŜywienie opiera się na tych zboŜach i nie jest uzupełniane przez takie źródła białka, jak mleko, ryby i mięso. Kwashiorkor i wyniszczenie (ang. marasmus) są endemiczne w pewnych regionach Afryki Zachodniej. Kwashiorkor pojawia się wówczas, gdy dziecko po odjęciu od piersi matki przechodzi na dietę skrobiową ubogą w białko. W wyniszczeniu istnieje niedobór zarówno energetycznego poŜywienia, jak i swoistych aminokwasów. PODCZAS EWOLUCJI ZWIERZĘTA WYśSZE TRACĄ ZDOLNOŚĆ DO BIOSYNTEZY AMINOKWASÓW, KTÓRYCH TWORZENIE WYMAGA DŁUGIEGO CIĄGU REAKCJI Istnienie zapotrzebowania na poŜywienie sugeruje, Ŝe zaleŜność od dostarczania z zewnątrz potrzebnego związku pośredniego moŜe mieć większą wartość do utrzymania się przy Ŝyciu niŜ zdolność do jego biosyntezy. JeŜeli swoisty intermediat występuje w poŜywieniu, to organizm, który moŜe go syntetyzować, rozmnaŜając się przekazuje przyszłym pokoleniom informację genetyczną o ujemnej wartości tej zdolności dla przeŜycia. Zdolność ta dla preeŜy-

cia jest ujemna, a nie zerowa, poniewaŜ organizm zuŜywa ATP i środki pokarmowe na syntezę niepotrzebnego DNA. Liczba enzymów wymagana przez komórki prokariotyczne do biosyntezy aminokwasów niezbędnych w poŜywieniu jest ogromna w porównaniu z liczbą enzymów potrzebną do syntezy aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w poŜywieniu (tab. 30-2). To sugeruje, Ŝe poŜyteczne dla przeŜycia organizmu jest utrzymanie zdolności wytwarzania „łatwych" aminokwasów, natomiast strata zdolności do syntezy „aminokwasów trudnych". WIĘKSZOŚĆ AMINOKWASÓW, KTÓRE NIE MUSZĄ BYĆ DOSTARCZANE W POśYWIENIU, TWORZY SIĘ Z AMFIBOLICZNYCH ZWIĄZKÓW POŚREDNICH W KRÓTKICH SZLAKACH ANABOL1CZNYCH Z 12 aminokwasów, które nie muszą być dostarczone w pokarmie (tab. 30-1), 9 tworzy się z amfibolicznych związków pośrednich. Pozostałe 3 (Cys, Tyr, Hyl) tworzą się z aminokwasów, które muszą być w poŜywieniu. Dehydrogenaza glutaminianowa., syntetaza glutaminowa i transaminazy zajmują centralną pozycję w biosyntezie aminokwasów. Wynikiem ich wspólnego działania jest katalizowanie przekształcenia nieorganicznego jonu amonowego w organiczny azot a-aminowy róŜnych aminokwasów. Glutaminian. Redukcyjna aminacja a-ketoglutaranu jest katalizowana przez dehydrogenazę glutaminianową (ryc. NAD(P]30-1). W dodatku do
NAD(P)H + H

Tabela 30-2. Enzymy biorące uctzial w syntezie aminokwasów z amfibolicznych związków pośrednich Liczba enzymów potrzebna do syntezy
Aminokwasy, które nie Aminokwasy, które muszą być dostarczone muszą być dostarczone w poŜywieniu Arg1 His
Thr Met

w poŜywieniu Ala Asp Asn=

7 6 6

1
1 1

5 (4 wspólne)

Glu
Gin' Hyl3 Hyp4 Pro1 Ser Gly= Cys6 Tyr'_
4 ! 6

1
1
1

Lys 8 Ile 8 (6 wspólnych) Val 1 (7 wspólnych) Leu 3 (7 wspólnych) Phe 10 Trp 5 (8 wspólnych)
59

1 3 3 1

Ryc.

30-1.
NH, '■

2 1
17

a 7

z Glu. z Asp, z Lys. z Pro. z Ser. z Ser. plus S. z Phe.

1

2

3

Reakcja dehydrogenazy glutaminiano-wej. Redukcyjna aminacja aketoglutaranu przez NHl zachodzi kosztem NAD(P)H.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 339

NH+ O
NH. Mg-ATP Mg-ADP+P;

Ryc. 30-2. Reakcja syntetazy glutaminowej.

Asparagina. Synteza asparaginy z asparaginianu, katalizowana przez syntetazę asparaginowa (ryc. 30-4), przypomina syntezę glutaminy (ryc. 30-2). Tym niemniej enzym ssaków wykorzystuje jako źródło azotu raczej glutaminę niŜ jon amonowy; syntetaza asparaginowa u ssaków nie przyłącza nieorganicznego azotu, natomiast bakteryjna syntetaza asparaginowa wykorzystuje jon amonowy i wskutek tego przyłącza azot. Tak jak w przypadku innych, reakcji, w których tworzy się PPj: hydroliza PP; do P| przez pirofosfatazę zapewnia, Ŝe reakcja jest silnie uprzywilejowana energetycznie.
Mg-ATP

tworzenia L-glutaminianu z amfi bo licznego związku pośredniego a-ketoglutaranu, reakcja ta stanowi kluczowy, pierwszy etap w biosyntezie wielu dodatkowych aminokwasów. Glutamina. Biosynteza glutaminy z glutaminianu jest katalizowana przez syntetazę glutaminową (ryc. 30-2). Reakcja wykazuje zarówno podobieństwa, jak i róŜnice w porównaniu z reakcją katalizowaną przez dehydrogenazę glutaminianową. Obie reakcje wbudowują azot nieorganiczny -—jedna w grupę aminową, druga w wiązanie amidowe. Obie reakcje są połączone z reakcjami wysoce egzoergicznymi: w przypadku dehydrogenazy glutaminianowej z utlenieniem NAD(P)H, a w przypadku syntetazy glutaminowej — hydrolizą ATP.

NH,+
H,N

NH,+

O L-Asparaglnlan L-Asparagina

R —NH3+-

Mg-AMP + PP,

Ryc. 30-4. Reakcja syntetazy asparaginowej. NaleŜy zwrócić uwagę na podobieństwa i róŜnice w porównaniu z reakcją syntetazy glutaminowej (ryc. 30-2).

Alanina i asparaginian. L-alanina powstaje w wyniku transaminacji pirogronianu, natomiat w wyniku transaminacji szczawiooctanu tworzy się L-asparaginian (ryc. 30-3). Przeniesienie grupy a-aminowej glutami niań u na te amfiboliczne związki pośrednie ilustruje zdolność transaminaz do kierowania jonu amonowego, przez glutaminian, w oc-aminowy azot aminokwasów. Seryna. Seryna tworzy się ze związku pośredniego glikolizy — D-fosfoglicerynianu (ryc. 30-5). Grupa ot-hydroksylowa jest utleniana przez NAD+ do grupy ketonowej, a następnie podlega transaminacji, tworząc fosfoserynę. Ta jest wówczas defosforylowana, dając serynę. Głicyna. Synteza glicyny w tkankach ssaków jest prowadzona kilkoma drogami. Cytozol wątroby zawiera Lransaminazy glicynowe, które katalizują syntezę glicyny z glioksalanu i glutaminianu lub alaniny. W przeciwieństwie do większości reakcji transaminacji, ta silnie uprzywilejowuje syntezę glicyny. Dwoma dodatkowymi waŜnymi szlakami tworzenia glicyny u ssaków jest jej synteza z choliny (ryc. 30-6) i z seryny przez reakcję katalizowaną przez hydroksymetylotransferazę serynową (ryc. 30-7). Prolina. U ssaków i niektórych innych form Ŝycia prolina tworzy się z glutaminianu wskutek odwrócenia reakcji kataboiizmu proliny (ryc. 30-8).

Plrogronlan Q GlulubAsp ot-Ketoglutaran lubazczawiooctan

Ryc. 30-3. Tworzenie alaniny przez transami nację pirogronianu. Donorem grupy aminowej moŜe być glutaminian lub asparaginian. Innym produktem jest a-ketoglutaran lub szczaw i oo etan.

340 / ROZDZIAŁ 30

OKSYDAZA SARKO2YNOWA i

o
3- Fosf o- D-g! loory nlan L--NAD +

9
(P)-O o
DEHYDROGENAZA ALDEHYDU BETAINY Fosfo hyd ro teyplrog ron lan

NH,+

Fosfo-L-swyna

Ryc. 30-5. Biosynteza seryny. a-AA — a-aminokwasy, a-KA — a-ketokwasy.

OKSYDAZA DIMETYl.OGLlCYNOWA

Cysteina. Cysteina, której obecność w poŜywieniu nie jest konieczna, tworzy się z metioniny (koniecznej w poŜywieniu) i seryny (niekoniecznej w poŜywieniu). Metionina ulega najpierw przemianie w homocysteinę przez S-adenozylometionine i S-adenozylohomocysteinę (p. rozdz. 32). Przekształcenie homocysteiny i seryny w cysteinę i homoserynę przedstawiono na ryc. 30-9. Tyrozyna. Tyrozyna powstaje z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaninową (ryc. 30-10). Podczas gdy fenyloalanina jest aminokwasem niezbędnym w poŜywieniu, tyrozyna nim nie jest — dostarczone poŜywienie powinno zawierać odpowiednie ilości fenyloalaniny. Reakcja jest nieodwracalna, dlatego tyrozyna nie moŜe zastępo-

ICHjO) Formaldahyd i

NHJ
Silcyna

Ryc. 30-6. Powstawanie glicyny z cboliny.

wać w poŜywieniu fenyloalaniny. Kompleks hydroksylazy fenyloalaninowej jest oksygenazą o mieszanej funkcji, występuje w wątrobie ssaków, ale nie występuje w innych tkankach.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 341
MetytenoH^-follan
i

NH,*
NH +

!
Glteyna
Seryna

HO ]
+/

O
L-

Ryc. 30-7. Reakcja hydroksym etyl otrą nsf era zy serynowej. Reakcja jest łatwo odwracalna. H4-fo)ian — tetrahydrofolian.
O

L-GkJtamlnten

L-Glutam/lo-y-eemialoohyd L-Cysteina

Seryna L-Homowryna

A'-Pirolldyno-5-karboksyian

Ryc. 30-9. Przekształcenie homocysteiny i seryny w homoserynę i cysteine. NaleŜy zauwaŜyć, Ŝe podczas gdy siarka cysteirty pochodzi z transsuifu racji z metioniny, szkieletu węglowego dostarcza seryna.

O

L-Prollna Ryc. 30-8. Biosynteza proliny zglutaminianu przez odwrócenie reakcji katabolizmu proliny.

Reakcja polega na wbudowaniu jednego atomu tlenu w pozycjepara fenylo alaniny, podczas gdy drugi atom jest redukowany z utworzeniem wody (ryc. 30-10). Moc redukcyjną, zawartą

ostatecznie w NADPH, natychmiast dostarcza tctrahydrobiopteryna. przypominająca pterydyne kwasu foliowego. Hydroksyprolina. PoniewaŜ prolina słuŜy jako prekursor hydroksyproliny, prolina i hydroksyprolina naleŜą do rodziny glutaminianu. ChociaŜ w tkankach ssaków występuje zarówno 3-, jak i 4-hydroksyprolina, wszystkie podane niŜej fakty dotyczą tylko Ŝran.s-4-hyclroksyproliny, Hydroksyprolina, podobnie jak hydroksyli2yna, jest prawie wyłącznie związana z kolagenem, białkiem występującym w największej iloś-

342 / ROZDZIAŁ 30 NADP+ NADPH+H+

TetrahydroDmydrablopteryna biopteryna

L-Fanyloalanlna

L-Tyroiyna

H

0H

OH ÓH

Tatra hyd ro bi o ptery n a

Ryc. 30-10. Reakcja hydroksylazy fenyloalaninowej. Biorą udział 2 róŜne enzymy. Enzym II katalizuje redukcję dihydrobiopteryny przez NADPH i enzym I — redukcję O2 do H2O oraz fenyloalaniny do tyrozyny Reakcja ta wiąŜe się z zaburzeniami metabolizmu fenyloalaniny omawianymi w rozdz. 32.

i-Ketoglularan [ "OJ-Bursztyn la n

Ryc. 30-11. Reakcja hydroksylazy prolilowej. Substratem jest peptyd bogaty w prolinę. Podczas przebiegu reakcji tlen cząsteczkowy wbudowuje się zarówno do bursztynianu, jak i do proliny (wykaza13 no wykorzystując izotop tlenu O2).

W przeciwieństwie do grup hydroksylowych hydroksylizyny, które słuŜą jako miejsca przyłączenia reszt galaktozyd owych i glukozowych, grupy hydroksylowe hydroksyproliny kolagenu nie są podstawione. Wyjątkową cechą metabolizmu hydroksyproliny i hydroksylizyny jest to, Ŝe jeśli aminokwasy te pochodzą z białka przyjmowanego poŜywienia, to nie są włączane do kolagenu. Nie ma Ŝadnego tRNA zdolnego przyłączyć hydroksyprolinę i hydroksylizynę i wbudować je w wydłuŜający się łańcuch polipeptydowy. Prolina zawarta w pokarmie jest prekursorem hydroksyproliny kolagenu, natomiast lizyna — prekursorem hydroksylizyny kolagenu. Hydroksylacje proliny lub lizyny katalizuje hydroksylaza prolilowa lub hydroksylaza lizylowa, enzymy związane z frakcją mikrosomalną wielu tkanek (skóry, wątroby, płuc, serca, mięśni szkieletowych i zi a minujących ran). Enzymy te są hydroksylazami peptydowymi, poniewaŜ hydroksylacja zachodzi tylko po wbudowaniu proliny i lizyny do polipeptydu. Obie hydroksylazy są oksygenazami o mieszanej funkcji, które wymagają w dodatku do substratu obecności tlenu cząsteczkowego, askorbinianu, Fe2"1" i a-ketoglutaranu. Intensywniej badano hydroksylazę prolilowa, ak okazuje się, Ŝe hydroksylaza lizylowa jest bardzo podobna. Na kaŜdy mol hydroksylowanej proliny, 1 mol oc-ketoglutaranu ulega dekarboksylacji do bursztynianu. Podczas tego procesu 1 atom tlenu cząsteczkowego wbudowuje się w prolinę i 1 w bursztynian (rys. 30-11). Hydroksylizyna. 5-Hydroksylizyna (a,e-diamino-S-hydroksykapronian) występuje w kolagenie, ale nie występuje w większości innych białek ssaków, Hydroksylizyna kolagenu pochodzi bezpośrednio z lizyny, ale nie z hydroksylizyny poŜywienia. Zanim lizyna ulegnie hydroksylacji musi być wbudowana w peptyd. HydroksyJacje peptydu lizylowego katalizuje wówczas hydroksylaza lizylowa, oksydaza o mieszanej funkcji, analogiczna do hydroksylazy prolilowej (ryc. 30-11). 7-Ketokwasy 3 aminokwasów o rozgałęzionych łańcuchach bocznych mogą zastąpić w poŜywieniu człowieka odpowiadające im aminokwasy ChociaŜ leucyna, walina i izoleucyna są dla ludzi i innych wyŜszych zwierząt aminokwasami, które muszą być dostarczone w pokarmie, tkanki ssaków mają transaminazy, które od-

ci w tkankach ssaków. Kolagen zawiera ok. 1/3 glicyny, 1/3 proliny i hydroksyproliny. Hydroksyprolina, która stanowi wiele reszt aminokwasowych kolagenu, chroni potrójny heliks kolagenu przed trawieniem przez proteazy.

BIOSYNTEZA AMINOKWASÓW / 343

wracalnie katalizują wzajemne przemiany wszystkich 3 aminokwasów i odpowiadających im a-ketokwasów. Dlatego odpowiednie a-ketokwasy mogą zastępować w poŜywieniu odpowiadające im aminokwasy. Histydyna i arginina są uwaŜane jako aminokwasy częściowo niezbędne w poŜywieniu Arginina, aminokwas który musi być dostarczony w poŜywieniu dla rozwoju człowieka, moŜe być syntetyzowana przez szczury, ale w ilościach niewystarczających do prawidłowego wzrostu. Histydyna, podobnie jak arginina, nie jest całkowicie niezbędna w poŜywieniu. W nieobecności histydyny u dorosłych ludzi i-dorosłych szczurów była utrzymywana przez krótki okres równowaga azotowa. Rosnące zwierzę wymaga jednak w poŜywieniu histydyny. JeŜeli badania

byłyby prowadzone w dłuŜszych okresach, jest prawdopodobne, Ŝe ujawniłoby się zapotrzebowanie na histydynę równieŜ u dorosłego człowieka. PIŚMIENNICTWO
Cardinale GJ, Udenfriend S: Prolyl hydroxylase. Adv Eniymol 1974;41:245. Mercer LP, Dodds SJ, Smith DI: Dispensable, indispensable, and conditionally indispensable amin o acid ratios in the diet. Chapter 1 in Vol. 1 of; Adsorption and Utilization of Amino Acids. Friedman M (editor). CRC Press. 1989. Rosenberg LE. Serwer CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Disease. Bondy PK, Roscnberg LE (editors). Saunders, 1980. Tyler B: Regulation of the assimilation of nitrogen tompounds. Annu Rev Biochem 1978;47:1127.

31
WPROWADZENIE

Katabolizm białek i azotu aminokwasów
Victor W. Rodwełt, PhD

W tym rozdziale będzie omówiony sposób, w jaki azot jest usuwany z aminokwasów i przekształcany w mocznik oraz problemy medyczne pojawiające się wskutek zaburzeń tych reakcji. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Amoniak, pochodzący głównie z a-aminowego azotu aminokwasów, jest dla ludzi potencjalnie toksyczny. Mechanizmy, które powodują, Ŝe amoniak jest toksyczny, nie są całkowicie poznane. Człowiek usuwa amoniak przez przekształcenie go w nietoksyczny związek chemiczny — mocznik. Prawidłowy przebieg szlaku metabolicznego, który przekształca amoniak w mocznik — cykl mocznikowy —jest istotny do utrzymania zdrowia. W warunkach, w których funkcja wątroby jest powaŜnie zagroŜona, np. u chorych z zaawansowaną marskośdą wątroby (gdzie prawidłowe hepatocyty są zastąpione przez fibrobiasty i kolagen) lub ostrym zapaleniem wątroby — stęŜenie amoniaku we krwi się zwiększa, co w rezultacie powoduje objawy kliniczne. W przypadku nielicznych dzieci urodzonych z brakiem aktywności jednego z enzymów cyklu mocznikowego właściwe leczenie wymaga zrozumienia biochemii syntezy mocznika. WYMIANA BIAŁKA ZACHODZI WE WSZYSTKICH FORMACH śYCIA Białka Ŝywych komórek są stale odnawiane przez wymianę białka, nieprzerwany proces degradacji i następnie resyntezy z wolnych amino-

kwasów. Fizjologiczne znaczenie wymiany białka jest wykazane przez jej obecność we wszystkich formach Ŝycia, nawet u bakterii rosnących logarytmicznie w bogatym podłoŜu. ChociaŜ wymiana obejmuje zarówno syntezę, jak i degradację białek, rozdział ten omawia degradację białek i aminokwasów. Syntezę białek opisano w rozdz. 40. Klinicyści i dietetycy uŜywają swoistych terminów w celu scharakteryzowania róŜnych stanów bilansu azotowego Swoiste terminy opisują stan metabolizmu azotu u ludzi. Bilans azotowy dotyczy róŜnicy między całkowitym azotem spoŜytym a całkowitym azotem wydalonym. Przyjęcie więcej azotu niŜ wydalenie stanowi dodatni bilans azotowy, stan typowy dla rosnącego dziecka lub kobiety w ciąŜy. W równowadze azotowej, typowej dla dorosłego człowieka, ilość azotu spoŜytego odpowiada ilości azotu wydalonego w kale i moczu. Ujemny bilans azotowy, w którym ilość azotu wydalonego przewyŜsza ilość azotu spoŜytego, charakteryzuje pewnych chorych po operacjach, chorych z zaawansowanym rakiem i osoby, które przyjmują nied o stateczną ilość azotu (np. w kwashiorkor) lub dietę ubogobiałkową. KaŜdego dnia dorośli degradują 1—2% białka ich organizmu Wymiana 1—2% całkowitego białka ciała dziennie u zdrowego człowieka wynika głównie z degradacji białka mięśni. 75—80% uwolnionych aminokwasów jest wówczas ponownie wykorzystywanych do syntezy białka. Azot pozostałych jest katabolizowany do mocznika.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 345
Białko organizmu Ponowne wykorzystanie do syntezy nowego białka (15 - 2B g azotu dziennie) Aminokwasy

Degradacja białka (2 0 -3 5g azotu dziennie)

Kalabollzm (5 — 7 g azotu dziennie)

zynowej wynosi ok. 2 h, a tm reduktazy HMG-CoA moŜe wynosić tylko 30 min. Te wartości wyraźnie kontrastują z okresem połowicznego rozpadu powyŜej 100 h dJa aldolazy, dehydrogenazy mleczanowej i cytochromów. Domeny bogate w Pro, Ser, Asp i Glu, określane jako sekwencje PEST, występują w białkach z krótkim okresem połowicznego rozpadu. W reakcji na potrzeby fizjologiczne szybkość degradacji kluczowych enzymów regulatorowych moŜe być przyspieszona lub opóźniona, zmieniając stęŜenie enzymu i stąd podzielenie metabolitów między róŜne szlaki metaboliczne.

Ryc. 31 -1. ZaleŜności ilościowe zachodzące między obrotem białek i aminokwasów.

Aminokwasy przyjęte w nadmiarze w stosunku do potrzeb są degradowane, a nie przechowywane
Utrzymanie zdrowia typowego zachodniego dorosłego człowieka wymaga 30 — 60 g białka dziennie lub jego równowaŜników w postaci wolnych aminokwasów. Niemniej jakość białka (proporcja niezbędnych aminokwasów w poŜywieniu względem ich proporcji w syntetyzowanych białkach) ma szczególne znaczenie. Nadmiar aminokwasów nie jest magazynowany. Bez względu na ich pochodzenie, te które bezpośrednio nie zostały włączone do nowego białka są szybko degradowane. SpoŜycie nadmiaru aminokwasów nie słuŜy zatem Ŝadnemu poŜytecznemu celowi, który nie moŜe równie dobrze być spełniony i przy niŜszym nakładzie przez węglowodany i lipidy.

a szkielety węglowe do amfibolicznych związków pośrednich (ryc. 31-1). W społeczeństwie zachodnim ta dzienna strata wynosi do 30—40 g białka lub 5—7 g azotu.

Szybkość degradacji białka znacznie się róŜni między białkami oraz w róŜnych stanach fizjologicznych
Poszczególne białka są degradowane z róŜną szybkością. Średnia szybkość degradacji białka w danej komórce, tkance lub w całym organizmie odzwierciedla średnią wartość dJa róŜnych białek. Szybkość degradacji lub połowicznego rozpadu białek w odpowiednich tkankach odpowiada ich fizjologicznemu wymaganiu. Średnia szybkość degradacji moŜe być niezmiernie duŜa, gdy tkanka ulega powaŜnemu strukturalnemu przekształceniu (np. tkanka macicy podczas ciąŜy lub tkanka ogona kijanki podczas metamorfozy). Degradacja białek mięśni szkieletowych takŜe się zwiększa podczas ostrego głodzenia.

PROTEAZY I PEPTYDAZY DEGRADUJĄ BIAŁKA DO AMINOKWASÓW
Analogicznie do procesów zachodzących w przewodzie Ŝołądkowo-j elito wy m, proteolityczne trawienie endogennych białek w obrębie komórek wymaga proteaz i peptydaz. Wewnątrzkomórkowe proteazy hydrolizują wewnętrzne wiązania peptydowe białek, tworząc peptydy. Te peptydy są wtedy degradowane do wolnych aminokwasów przez peptydazy. Endopeptydazy przecinają wewnętrzne wiązania w peptydach, tworząc krótsze peptydy, Aminopeptydazy i karboksypeptydazy usuwają wówczas odpowiednio aminokwasy z N- i C-końców peptydów. Ostatecznymi produktami są wolne aminokwasy.

Okres połowicznego rozpadu białek waha się od 30 min do powyŜej 150 h
PoniewaŜ in vivo szybkość degradacji białka odpowiada kinetyce reakcji I-rzędu, wraŜliwość enzymu aa degradację jest wyraŜona przez jego okres połowicznego rozpadu — tt„. Jest to czas wymagany do zmniejszenia jego stęŜenia do 50% wartości początkowej. Okres połowicznego rozpadu enzymów wątroby waha się od mniej niŜ 40 min do powyŜej 150 h. Wiele kluczowych enzymów regulatorowych wykazuje krótki okres połowicznego rozpadu. Na przykład t,,2 oksygenazy tryptofanowej i transaminazy tyro-

346 / ROZDZIAŁ 31

Białka są degradowane na szlaku ATP-zaleŜnym i ATP-niezaleŜnym Wewnątrzkomórkowe białka komórek eukariotycznych są degradowane w 2 głównych szlakach. Pozakomórkowe, związane z błoną, i długo Ŝyjące białka wewnątrzkomórkowe są degradowane w organeliach komórkowch, nazwanych lizosomami, w procesach ATP-niezaleŜnych. Przeciwnie, degradacja nieprawidłowych i innych krótko Ŝyjących białek wymaga ATP i ubikwityny, i przebiega w cytozolu. Receptory asjaloglikoprotein hepatocytów przyłączają i internalizują glikoproteiny przeznaczone do degradacji Jakie czynniki „wyznaczają" białko do szybkiej degradacji? Dla białek w krąŜeniu (np. pewnych hormonów peptydowych) strata cząsteczki kwasu sjalowego, od końców nieredukujacych ich łańcuchów oligosacharydowych, sygnalizuje ich degradację. Te pozbawione kwasu sjalowego glikoproteiny są rozpoznawane przez asjaloglikoproteinowy receptor hepatocytów i internalizowane. Wówczas są one degradowane w lizosomach przez proteazy zwane katepsynami. Ubikwityna „wyznacza" wiele wewnątrzkomórkowych białek do degradacji Wiele wewnątrzkomórkowych białek jest „wyznaczanych" do degradacji przez ubikwitynę, małocząs teczko we (8,5 kD) białko występujące we wszystkich komórkach eukariotycznych. Pierwszorzędowa struktura ubikwityny jest bardzo konserwatywna. Tylko 3 z 76 reszt aminokwasowych róŜni ubikwitynę droŜdŜową od ludzkiej. Cząsteczki ubikwityny przyłączają

się do białka przeznaczonego do degradacji na drodze reakcji zaleŜnych od ubikwityny. Są one przyłączane w 3-etapowym procesie, kończącym się utworzeniem wiązania izopeptydowego między końcem karboksylowym ubikwityny i g-aminową grupą reszty iizyny w białku (ryc. 31-2). To czy białko zostanie zmodyfikowane przez ubikwitynę zaleŜy od rodzaju aminokwasu obecnego na jego N-końcu. Reakcja z ubikwityną jest opóźniana przez N-końcową resztę metioniny i seryny, a przyspieszana przez resztę kwasu asparaginowego i argininy. ZALEśNIE OD ICH NISZY EKOLOGICZNEJ, ZWIERZĘTA PRZEKSZTAŁCAJĄ AZOT W RÓśNE PRODUKTY KOŃCOWE Zwierzęta przekształcają azot z aminokwasów i innych źródeł w jeden z 3 produktów końcowych: amoniak, kwas moczowy lub mocznik. Który z produktów przewaŜa u róŜnych zwierząt, zaleŜy od dostępności wody w ich specyficznej niszy ekologicznej. Organizmy amonoteliczne, ryby kostnoszkieletowe, wydalają azot jako amoniak. Ich nisza wodna, zmuszająca do ciągłego usuwania wody, ułatwia stałe wydalanie bardzo toksycznego komponentu — amoniaku. Natomiast zwierzęta lądowe przekształcają azot albo w kwas moczowy (urykoteliczny tryb Ŝycia), albo w mocznik (organizmy ureoteliczne). Ptaki, które muszą zarówno zachowywać wodę, jak i utrzymywać małą masę ciała są urykoteliczne. Kwas moczowy, stosunkowo nierozpuszczalny produkt końcowy, jest wówczas wydalany jako półstałe guano. Zwierzęta lądowe, a takŜe człowiek, są ureoteliczne, przekształcające azot w dobrze rozpuszczalny nietoksyczny związek — mocznik. Nie-

o
1. O 2. O

o

UB—C—O" + E, -SH + ATP -»AMP + PP, + UB—C—S—E1

UB—C—S—E, + E, -SH -* E, -SH + UB-C—S—E,

O E O H 3. UB—C-^S—E2+ H2N—E— Białko 4 Ej -SH + UB—C—N-e— Białko c. 31-2. Reakcje cząstkowe w przyłączaniu ubikwityny (UB) do białka. 1. Terminalna grupa karboksylowa COOH ubikwityny tworzy wiązanie tioestrowe z grupą -SH enzymu E, w reakcji kierowanej przez przekształcenie ATP wAMPi PP,. 2. Reakcja wymiany tioestru przenosi zaktywowang ubikwitynę na enzym E;. 3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na e-aminowe grupy lizyny docelowego białka.

KATABOLIZM BIAŁEK I AZOTU AMINOKWASÓW / 347

zwykle mała toksyczność mocznika jest niejednokrotnie zaciemniona przez zwiększone stęŜenie mocznika we krwi osób z chorobami nerek. To zwiększone stęŜenie mocznika we krwi jest konsekwencją, ale nie przyczyną, chorób nerek. BIOSYNTEZA MOCZNIKA PRZEBIEGA W KILKU ETAPACH Ze względów dydaktycznych omówienie biosyntezy mocznika podzielono na 4 etapy: 1) transaminacja, 2) deaminacja oksydacyjna, 3) transport amoniaku i 4) reakcje cyklu mocznikowego. Rycina 31-3 wiąŜe te zagadnienia w całkowity katabolizm azotu aminokwasowego. ChociaŜ kaŜdy etap odgrywa takŜe rolę w biosyntezie aminokwasów, najpierw zostanie rozpatrzony z perspektywy ich katabolizmu.
a-Aminokwas i-Ketokwas

sydacyjną. Powstały węglowy „szkielet" jest wówczas degradowany w szlakach, które będą opisane w następnym rozdziale. W tym rozdziale omówiono los samego azotu. Fosforan pirydoksalu jest obecny w miejscu katalitycznym wszystkich transaminaz Fosforan pirydoksalu tworzy istotny część miejsca katalitycznego transaminaz i wielu innych enzymów, których subst