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Jos Manuel Lozano Moreno jmlozanom@unal.edu.co jotalozano@gmail.com Departamento de Farmacia Oficina 106
Double stranded DNA Melt Single-stranded DNA DNA binds to filter Filter Incubate with labeled DNA Hybridized complemetary DNAs Wash away labeled DNA that did not hybridize to DNA bound to filter Perform autoradiography
Esther Lederberg, "Lysogenicity in Escherichia coli strain K-12, Microbial Genetics Bulletin, v.1, pp. 5-8 (Jan. 1950); seguido por "Lysogenicity in E. coli K-12", Genetics, v.36, p. 560 (1951) (abstract).
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) -Inmunoensayo enzimatico en fase slida-
= 570 nm H3PO4 1M
= 450 nm
EcoR1
ADN Genmico
Clonacin
Estudios de mutacin
muestra de paciente
Estudios Comparativos
Evolucin del genoma, clasificacin de cepas bacterianas
SNPs
Single nucleotide polymorphysms
PCR Cuantitativa
Identificacin de variacin en el nmero de copias
Secuenciacin
ARN/ ADNc
ADN Clonado
Insertos Pequeos Plsmidos Insertos Grandes BAC/ YAC
Estructura Gnica
Determinar el tamao de los intrones y determinar los lmites de las secuencias intrnicas y exnicas basados en el conocimiento del mRNA.
Ethidium Bromide
~20 kb
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) permite la separacin de molculas grandes de ADN
~20 kb 10 Mb
Separa molculas muy grandes de ADN Sonda especfica para cada cromosoma
SCUENCIACIN AUTOMATIZADA
Deteccin de los reordenamientos de los genes de las Igs por hibridizacin (Southern blot )
ADN de Ig en clulas (embrionarias) no comprometidas,clulas no linfoides
La Cromatografa es controlada por dos fenmenos: - Reparto - Transferencia de Masa Existen mtodos absolutos de anlisis: Potenciometra
Etimologa: CROMATOGRAFA del griego cromos: color; graphos: escribir El botnico ruso Mikhail Tswett hacia 1903 inici la cromatografa en papel
Definiciones
La cromatografa es un proceso fsico en el cual los componentes de una mezcla se distribuyen diferencialmente en dos fases: -Un lecho o FASE ESTACIONARIA -Un percolador o FASE MOVIL -La Fase Estacionaria puede estar conformada por materiales derivados de Slica gel o Almina. -Esta puede encontrarse por ejemplo un soporte de slica gel enlazado a otra molcula (Fase enlazada) -La Fase Mvil arrastra a las molculas del analito a travs de la fase estacionaria
En este proceso de resolucin de una sustancia en funcin de las fases mvil y estacionaria se llevan a cabo procesos de equilibrio y de intercambio de masa constituyendo platos tericos A mayor nmero de equilibrios mayor separacin y eficiencia del proceso Hay sustancias que no interactan con estas fases Las velocidades en este proceso dependen de la CONSTANTE DE INTERACCION o COEFICIENTE DE REPARTO (K)
Isoterma de Adsorcin
Cs
Cm
La separacin de los componentes de la muestra depender de la naturaleza de las Fases mvil y estacionaria as como de la sustancia misma y de otros factores como la temperatura
Clasificacin de la Cromatografa
Cromatografa de Gases
Fase estacionaria
Fase mvil
Fase estacionaria
Fase mvil
Slida (G-S)
Lquida (G-L)
Gas
Slida (L-S)
Lquida (L-L)
Lquido
Cromatografa Lquida
1. Cromatografa en papel
2. Cromatografa planar
TLC. MATERIALES: Placas de silica gel de 5 x 20 cm Cmara desarrolladora con tapa Gua para marcar la placa FM: Sistema de Solvente (n-butanol: cido actico: agua) (4:1:5) Muestras de aminocidos patrn (individuales) Mezcla de aminocidos experimental Horno Ninhidrina en atomizador (revelador) Pipeteador de 2 l, con puntas Lpiz Regla (cm)
TLC analtica
TLC preparativa
Cromatograma de la fraccin de inters eluida por la columna obtenida mediante una tcnica preparativa
Column chromatography
HPTLC
An In Vitro Evaluation of Human DNA Topoisomerase I Inhibition by Peganum harmala L. Seeds Extract and Its -Carboline Alkaloids
Armin Madadkar Sobhani, Sultan-Ahmad Ebrahimi, Massoud Mahmoudian1
Department of Pharmacology, Iran University of Medical Sciences, Tehran, Iran Received September 13, 2001, Revised January 22, 2002, Accepted March 8, 2002
Se cuantifica midiendo el rea bajo la curva de cada pico correspondiente a cada componente
Figure 1: Chromatogram of HPTLC analysis of P. harmala seeds extract. Peak No. 1: harmaline, Peak No. 3: quinidine sulfate (internal standard), Peak No. 4: harmine. Horizontal axis is distance in millimeter. Vertical axis is fluorescence intensity expressed in an arbitrary unit.
3. Cromatografa en Columna
-Abierta (presin atmosfrica) -Aplicando vaco -Aplicando presin: -Rpida (Flash Chromatography) -Baja presin: LPLC -Presin media: MPLC -Alta presin: HPLC
HPLC:
Fase Mvil
Columna
Detector
Registrador
Procesador de datos
HPLC
A = Reservorios de los eluentes B = Vlvulas de mezcla electromgneticas con la bomba de pistn doble del movimiento C = Vlvula de descarga D = Regulador de presin E = Mezclador F = Inyector RHEODYNE G = Columna H = Unidad de HPLC I = Detector Arreglo de diodos o espectrometro UV J = Computador-Interface K = PC L = Graficador o impresora
Mecanismos de separacin
. Adsorcin - desorcin . Reparto (particin) . Pares inicos: uso de contraiones . Intercambio inico: aninica y catinica . Exclusin o filtracin en gel . Seleccin quiral . Afinidad
Clasificacin de la Cromatografa Lquida segn la polaridad de la Fase Mvil Cromatografa de fases enlazadas
Fase Normal: Fase estacionaria enlazada por grupos -NH2, -CN, fenil y otras molculas pequeas La fase mvil es menos polar que la fase estacionaria
Fase Invertida o fase Reversa: Fases enlazadas grupos metil (Me), dimetil (DM), octil (C8), octadecil (C18) La fase mvil es m polar que la fase estacionaria
Cromatografa de Gases
Fase Mvil
Sitio de Inyeccin
Columna
Detector
Registrador o Integrador
Horno
Agilent Technologies
Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico
Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico
tr tr
Perfil cromatogrfico:
Cromatograma tpico
h/2
Terminologa
Fc: Flujo verdadero es el flujo o volumen de la fase mvil medida a la salida de la columna a la temperatura y presin de salida Fc = F x T1 T2 Temperatura de la columna Temperatura ambiente
Vr: Volumen de retencin, volumen de la fase mvil necesario para que un compuesto se resuelva Vr = tr x Fc Vm: Volumen muerto, volumen en el cual eluye el solvente o fase mvil Vm = tm x F Vr: Volumen de retencin corregido Vr = Vr - Vm
K: factor de capacidad, tiempo durante el cual cada compuesto es retenido K = tr / tm Normalmente entre 2 -10 : Factor de separacin o ndice de retencin relativa, describe la posicin relativa de un pico respecto a otro = tr(B) / tr(A) Si es igual a 1 entonces no hay separacin, esta debe ser mayor que 1 R: Resolucin, es la medida de la capacidad de separacin de dos picos. Es una medida de la eficiencia de la columna R = 2t / (Wb1 + Wb2) n: Nmero de platos tericos, indica el nmero de equilibrios o nmero de transferencias de masas n = 16 (tr / Wb)2, n = 5.54 (tr / Wb)2 H: Altura de platos tericos H=L/n (longitud de la columna)
(4 min) y tr1
(8 min) tr2
= tr2 / tr1 = 8 min/ 4 min =2 R = 2t / (Wb1 + Wb2) t Wb1 (3 min) Wb2 (4 min) R = 2 x (8 min 4 min) (3 min + 4 min) R = 1.14
tm
Velocidad de la carta = 0.5 cm / min R > 1.5 garantiza el 100% de separacin R = 1 indica separacin de un 90 %
Chiral Chromatography
Bibliografa - Weaver R. (McGraw-Hill, 2002). 2nd issue. Molecular Biology 2nd ed . Baltimore D, Lodish H and Darnell J. Biologia Celular. y Molecular. Labor SA. Primera edicion. New York. 1986 Skoog DA, West DM, Anlisis Instrumental, Interamericana, 2a Ed, Mexico, 1986 Willard HH, Merrit LL, Dean JA, Mtodos Instrumentales de Anlisis, Ed Iberoamericana, 7a Ed, FA Settle, 1991 Ewing GW, Mtodos Instrumentales de Anlisis, McGraw-Hill, 4a Ed, Mexico, 1978 Journal of Chromatography, pISSN: 0021-9673, Elsevier, 2008
Rojas JH, de Nigrinis S, Guas para Laboratorio de Anlisis Instrumental Farmacutico, Universidad Nacional de Colombia, Departamento de Farmacia