SPRAWOZDANIA Z WICZE LABORATORYJNYCH

BIOCHEMIA
WYDZIA LEKARSKI I ROK
KATEDRA BIOCHEMII LEKARSKIEJ UJ CM KRAKW

Imi i nazwisko: .
Numer grupy:
TERMINY ZAJ LABORATORYJNYCH (dzie tygodnia i godzina): . OSOBY PROWADZCE: ..

SEMESTR ZIMOWY 2012/2013

WICZENIE I

BIAKA I
DATA:
I. Elektroforeza biaek surowicy krwi na pasku z octanu celulozy. 1. Przedstaw schemat rozdziau elektroforetycznego biaek surowicy krwi (docz uzyskany wynik przeprowadzonego rozdziau elektroforetycznego). Zaznacz pocztek wdrwki biaek, pooenie katody (-) i anody (+), kierunek migracji i pozycje poszczeglnych frakcji biaek surowicy krwi.

2. Wyjanij rol biologiczn tej frakcji biaek, ktra wystpuje w najwyszym steniu w analizowanej surowicy krwi.

II. Widma absorpcyjne pochodnych hemoglobiny.

1. Docz (lub narysuj) widmo absorpcyjne (450650 nm) kadej z badanych pochodnych
hemoglobiny. Wska maksima absorbancji (max). Oksyhemoglobina Deoksyhemoglobina

Methemoglobina

Cyjanmethemoglobina

2. Zaznacz stopie utlenienia jonu elaza w kadej z badanych pochodnych hemoglobiny. 3. Umie w tabeli wartoci dugoci fali, w zakresie widzialnym, przy ktrych obserwuje si
maksimum absorbancji kadej z pochodnych hemoglobiny.
Maksimum absorbancji (max) Stopie utlenienia jonu elaza

Pochodna hemoglobiny Oksyhemoglobina Deoksyhemoglobina Methemoglobina Cyjanmethemoglobina

4. Ktra z pochodnych hemoglobin jest wykorzystywana do oznaczenia cakowitego stenia hemoglobiny we krwi? Wyjanij, w jaki sposb otrzymuje si t pochodn i uzasadnij taki wybr.

III. Obliczanie wartoci pI dla biaek i peptydw z wykorzystaniem programu PTOOLS. 1. Na podstawie podanego skadu aminokwasw (tabela poniej) albuminy surowicy ludzkiej, oblicz jej pI (N- kocowym aminokwasem jest asparaginian, C-kocowy aminokwasem jest leucyna). Okrel adunek biaka w pH fizjologicznym (7.4). pI: . adunek w 7,4: .

2. Na podstawie uzyskanych krzywych miareczkowania 2 biaek (program PTOOLS) produktw trawienia trypsyn hemoglobiny A i hemoglobiny S: A: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys. S: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lyszasugeruj zakres pH odpowiedni dla elektroforetycznego rozdziau tych 2 biaek (HbA i HBS)

Uzasadnienie: Skad aminokwasowy albuminy ludzkiej

Aminokwas
Alanina Arginina Asparagina Asparaginian Cysteina Glicyna Glutaminian Glutamina Histydyna Izoleucyna Leucyna Lizyna Metionina Fenyloalanina Prolina Seryna Treonina Tryptofan Tyrozyna Walina

Kod trj- literowy

Ala Arg Asn Asp Cys Gly Glu Gln His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val

Zapis jednoliterowy
A R N D C G E Q H I L K M F P S T W Y V Cakowita ilo aminokwasw

Liczba reszt
62 24 17 36 35 12 62 20 16 8 61 59 6 31 24 24 28 1 18 41 585

LICZBA PUNKTW Test Wykonanie Suma pkt.

Data: Podpis asystenta:

WICZENIE II

KINETYKA ENZYMATYCZNA
DATA:
1. Oblicz stenie pocztkowe nadtlenku wodoru w kadej z mieszanin reakcyjnych.
TABELA I Prbka 1 2 3 4 5 0.02 M Gwajakol (cm ) 1 1 1 1 1
3

1 mM H2O2 (cm ) 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8

3

Bufor pH = 6.0 (cm ) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.2

3

Pocztkowe stenie H2O2 (mM)

2. Umie w Tabeli II uzyskane wartoci absorbancji produktu reakcji przy dugoci fali 470 nm. Oblicz stenie (c) tetragwajakolu (TG) w trakcie przebiegu reakcji w kadej z mieszanin. Prawo Lamberta- Beera: A=kcl gdzie: A absorbancja prbki mierzonej przy 470 nm, k = 26.6 cm-1 mM-1 (wspczynnik absorbancji dla tetragwajakolu przy 470 nm) l = 1 cm. Obliczone wartoci wpisz do Tabeli II. Tabela II. Stenie tetragwajakolu (TG) w trakcie przebiegu reakcji Pocztkowe stenie H2O2
czas [min]

...... mM H2O2
A470 TG (mM)

...... mM H2O2
A470 TG (mM)

...... mM H2O2
A470 TG (mM)

...... mM H2O2
A470 TG (mM)

...... mM H2O2
A470 TG (mM)

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

3. Narysuj, dla wybranej mieszaniny reakcyjnej, wykres zalenoci stenia tetragwajakolu od czasu trwania reakcji (krzywa kinetyczna). Docz wykres do sprawozdania. 4. Dla wybranego stenia pocztkowego H2O2 oblicz szybko pocztkow reakcji (v0) na podstawie wykrelonej krzywej kinetycznej reakcji. V0 = dla [H2O2] =

5. Za pomoc programu SIMFIT oblicz wartoci prdkoci pocztkowych reakcji dla kadej z mieszanin reakcyjnych. Uzyskane wartoci wpisz do Tabeli III. Tabela III. Prbka 1 2 3 4 5 6. Sporzd krzyw zalenoci prdkoci pocztkowej (v0) od stenia nadtlenku wodoru [H2O2] (v0 wzgldem [S]). Wykres docz do sprawozdania. 7. Oblicz wartoci 1/vo i 1/[H2O2] i wpisz do Tabeli IV. Tabela IV. Prbka 1 2 3 4 5 1/ [H2O2] (mM-1) 1/v0 (min mM-1) [H2O2 ] mM vo (mM min-1)

8. Sporzd wykres 1/vo od 1/[H2O2] (krzywa Lineawera-Burka). Docz wykres do sprawozdania. 9. Wyznacz wartoci Vmax [mM/min] i Km [mM]. Wyniki wpisz do Tabeli V. 10. Za pomoc programu SIMFIT oblicz wartoci Km i Vmax. Wyniki wpisz do Tabeli V. Porwnaj oba zestawy uzyskanych parametrw reakcji. Tabela V. Wartoci Km and Vmax dla reakcji katalizowanej peroksydaz Km (mM)
Z wykresu

Vmax (mM min-1)

1 1 versus vo [S ]

Z obliczenia SIMFIT 11. Oblicz warto kcat. Stenie peroksydazy jest rwne 1nM. kcat=

LICZBA PUNKTW Test Wykonanie Suma pkt.

Data: Podpis asystenta:

WICZENIE III

BIAKA II
DATA:
I. Wykonanie widma absorpcyjnego roztworu albuminy surowicy woowej BSA.

1. Docz (lub narysuj) widmo absorpcyjne (190-350nm) roztworu albuminy surowicy wolowej. 2. Wska maksima absorbancji (max). 3. Napisz wartoci dugoci fali, w zakresie pomiarowym, przy ktrych obserwuje si maksimum
absorbancji dla badanej prbki.

.. 4. Wyjanij jakie moe by praktyczne wykorzystanie oznaczania absorpcji promieniowania

elektromagnetycznego w zakresie UV w prbkach biologicznych.

5. Na podstawie wykonanego widma absorpcyjnego roztworu albuminy surowicy woowej BSA,

obliczy stenie dla badanej prbki.

Wspczynnik absorbancji przy 280 nm wynosi 0,667 (mg/mL)-1 x (cm)-1

II. Oznaczenie stenia biaka cakowitego w surowicy krwi.

1. Oblicz zawarto biaka w probwkach zawierajcych roztwr standardowy biaka.

Roztwr standardowy Surowica Numer probwki (25 mg/mL BSA*) (L) (L) 1 (kontrola) 2 3 4 5 6 7 (badana) 0 25 50 75 100 125 0 0 0 0 0 0 0 25 Woda (L) 250 225 200 175 150 125 225 Odczynnik Ilo biaka biuretowy w prbce (mL) (mg) 1 1 1 1 1 1 1 0 Absorbancja 540 nm 0

*BSA = albumina surowicy woowej

2. Narysuj, na papierze milimetrowym krzyw standardow: absorbancja przy 540nm (prbki 1-6) (rzdna) vs zawarto biaka w prbce (odcita). Docz wykres do sprawozdania. 3. Oblicz stenie biaka w surowicy krwi (prbka nr 7). Wynik przedstaw w nastpujcych jednostkach: mg/mL oraz % (g na 100mL surowicy).

Biako cakowite w surowicy (mg/mL) Biako cakowite w surowicy (%)

4. Porwnaj i skomentuj swoje wyniki z prawidowym steniem biaka w surowicy ludzkiej, ktre wynosi ................ , ... III. Rozdzia mieszaniny hemoglobiny i jonw chlorkowych na kolumnie SEPHADEX G-25 1. Przedstaw zasad dziaania sit molekularnych, stosowanych do rozdziau skadnikw mieszaniny biaek i soli. Przedyskutuj uzyskany wynik wykorzystujc podstawy stosowanej techniki i krtko omw jej praktyczne wykorzystanie.

2. Przedstaw obraz rozdziau mieszaniny hemoglobiny i jonw chlorkowych uzyskany za pomoc sczenia molekularnego.

0 brak 1 niskie 2 rednie 3 wysokie

czerwony kolor- stenie frakcji hemoglobiny i opalizujcy - osad AgCl

Objto eluatu (mL)

WNIOSKI: .. ..

LICZBA PUNKTW Test Wykonanie Suma pkt.

Data: Podpis asystenta: