Copyright by $ta

ODCZYNY SEROLOGICZNE I ETODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ STOSOWANE W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ Odczyny serologiczne stosowane w diagnostyce wirusologicznej s oparte na reakcji antygenu z przeciwciaem swoicie przeciwko niemu skierowanym. Odczyny te wykorzystuje si do wykrywania: Antygenw obecnych w pobranym materiale klinicznym (tzw. szybkie lub bezporednie metody diagnostyczne) Antygenw po namnoeniu wirusa we wraliwych komrkach (w hodowli komrkowej zarodku kurzym, zwierztach laboratoryjnych) Przeciwcia obecnych w surowicy chorego bdcych nastpstwem reakcji immunologicznej na toczce si zakaenie W zalenoci od celu, w jakim stosujemy odczyn serologiczny, gdy poszukujemy obecnoci antygenu posugujemy si surowicami wzorcowymi o znanej specyficznoci lub gdy chcemy okreli miano przeciwcia wzorcowymi antygenami Okrelajc poziom przeciwcia w surowicy chorego , mona ustali rozpoznanie na podstawie wykazania: Co najmniej 4-krotnego przyrostu miana w 2 prbkach surowicy pobranych w odstpie 2-3 tygodni (najlepiej w okresie ostrym choroby i rekonwalescencji) lub Obecnoci swoistych przeciwcia klasy IgM Najczciej stosowane odczyny: Odczyn neutralizacji (ONt) Odczyn immunoenzymatyczny (ELISA) Odczyn immunofluorescencyjny (OIF) Odczyn wizania dopeniacza (OWD) Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA) Odczyn radioimmunologiczny (RIA) Odczyn aglutynacji czstek opaszczonych wirusem Odczyn hemolizy radialnej Metoda immunodyfuzji Metoda immunoblotu (Western blot, WB)

Odczyn neutralizacji (ONt) To najczulszy i najbardziej swoisty odczyn stosowany zarwno do wykrywania wirusw obecnych w badanym materiale, jak i przeciwcia w surowicy chorego Niedogodnoci ONt jest pracochonno i stosunkowo d ugi czas oczekiwania na wynik ONt znajduje gwnie zastosowanie w diagnostyce enterowirusw Istot odczynu jest zobojtnienie wirusa przez swoiste przeciwciaa, co objawia si utrat jego waciwoci zakanych. o Reakcj zobojtniania przeprowadza si w probwce wobec staej dawki wirusa (gdy okrelamy poziom przeciwcia) lub wobec surowicy odpornociowej o znanym mianie (gdy typujemy nieznany wirus) Wynik reakcji zobojtnienia jest niewidoczny i mona go oceni dopiero po wprowadzeniu reagentw do ukadu indykatorowego Mieszanin wirusa i surowicy zakaa si wraliwy obiekt biologiczny, jakim moe by zwierz dowiadczalne, zarodek kurzy lub hodowla komrkowa. Brak objaww zakaenia jest wynikiem dodatnim. Dla waciwej interpretacji wyniku konieczne jest przeprowadzenie niezbdnych kontroli. Warto miana przeciwcia neutralizujcych okrela takie najwysze rozcieczenie surowicy pacjenta, ktre zobojtnia waciwoci patogenne uytego wirusa w danym systemie biologicznym.

Odczyn immunoenzymatyczny (EIA, ELISA) Pozwala na jakociow i ilociow ocen obecnoci szukanego antygenu lub przeciwciaa, ktry wie si ze zwizanym, (faza staa) przeciwstawnym reagentem. W wyniku reakcji cay kompleks antygenu z przeciwciaem jest unieruchomiony, w zwizku z czym nie ulega wymyciu w procesie odpukiwania nadmiaru niezwizanych reagentw i mona go wykaza po dodaniu kolejnego przeciwciaa poczonego z enzymem (najczciej jest to peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna). Pod wpywem enzymu nastpie zmiana zabarwienia dodanego w kolejnym etapie reakcji substratu, np. aminoetylokarbozolu lub dwuaminobenzydyny. Powstae zabarwienie jest proporcjonalne do iloci powstaych kompleksw antygen-przeciwciao. Wynik reakcji moe by oceniany wizualnie lub -1-

 Copyright by $ta

spektrofotometrycznie. Stosujc enzymatycznie znakowane przeciwciaa swoiste dla poszczeglnych klas immunoglobulin, mona wykrywa obecno przeciwciaa klasy IgG,M,A. Odmian metod immunoenzymatycznych stosowan do wykrywania antygenw w utrwalonych skrawkach histologicznych lub preparatach komrkowych, z wykorzystaniem przeciwcia znakowanych peroksydaz lub fosfataz jest metoda PAP i APAAP. W tych odczynach poszukiwany produkt reakcji antygenu z przeciwciaem mostkuje si za porednictwem dodatkowej antyglobuliny (surowicy wicej) z kompleksem zawierajcym przeciwciao-enzym. Utworzenie takiego kilkuwarstwowego kompleksu w reakcji wieloetapowej wpywa na znaczne zwikszenie czuoci tych metod. Wynik reakcji odczytywany jest pod mikroskopom (powikszenie 100-400x) Zalet metod immunoenzymatycznych jest bezpieczestwo i szybko wykonania odczynu, prostota odczytu i interpretacji wyniku oraz moliwo penej automatyzacji. Odczyny te s szeroko stosowane w diagnostyce, np. zakae wirusami hepatotropowymi, wirusami z rodziny Herpesviridae
W celu wykrycia przeciwcia naley opaszczy faz sta antygenem (1), przeciwko ktremu skierowane s poszukiwane przeciwciaa. W przypadku zastosowa diagnostycznych dostpne s zwykle gotowe, opaszczone antygenem pytki. Na tak przygotowane podoe nanosi si surowic pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji pytk si przepukuje. Jeeli przeciwciaa skierowane przeciwko antygenowi znajdoway si w surowicy, zwi si one z antygenem na pytce (2). Za pomoc drugiego przeciwciaa lub innego wyznakowanego ligandu (ktre wi e si z jakim innym epitopem) mona nie tylko wykry przeciwciaa, ale nawet okreli ich klas (4, 5), co moe dostarczy dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecno tylko przeciwcia IgM wiadczy o tym, e chory przechodzi pierwsze w yciu zakaenie danym drobnoustrojem, za obecno IgG wiadczy o kolejnym zakaeniu). To drugie przeciwciao lub inny enzym przeksztaca dodatkowo bezbarwny lub niefluoryzuj cy substrat w barwny lub fluoryzuj cy produkt. A intensywno kolory lub fluorescencji jest nastpnie mierzona dla kadej prby i stanowi podstaw obliczenia iloci obcego w niej Ag.

Odczyn immunofluorescencyjny (OIF) W przypadku wykrywania antygenw wirusowych stosuje si przeciwciaa wzorcowe skoniugowane z barwikami fluorescencyjnymi, np. izotiocyjanianem fluoresceiny lub rodaminy (surowice znakowane). Reakcje przeprowadza si na utrwalonych rozmazach z materiaw klinicznych lub preparatach histologicznych. W miejscu ekspresji antygenu wirusa na powierzchni komrki nastpuje reakcja serologiczna, polegajca na utworzeniu kompleksu przeciwciao-antygen. Niezwizane przeciwciaa spukuje si, a wynik reakcji odczytuje si w mikroskopie fluorescencyjnym. Do wykrywania przeciwcia obecnych w surowicy pacjenta stosuje si poredni OIF. Jako antygenu uywa si hodowle komrkowe zakaone laboratoryjnym szczepem danego wirusa. Kompleks antygenprzeciwciao uwidacznia si za porednictwem dodatkowej, znakowanej immunoglobuliny zawierajcej przeciwciaa swoiste dla ludzkiej globuliny uzyskane w toku immunizacji zwierzt. Powszechnie stosuje si zarwno bezporedni i poredni OIF. Znalaz on, midzy innymi zastosowanie w tzw. szybkich metodach diagnostycznych, w rozpoznawaniu zakae drg oddechowych.

Odczyn radioimmunologiczny (RIA) W metodzie tej jako znacznika uywa si pierwiastka promieniotwrczego Wykrycie poszukiwanego skadnika odbywa si za pomoc pomiaru promieniowania izotopu zwizanego z jedn ze skadowych reakcji antygen-przeciwciao. Mona dokonywa pomiaru radioaktywnoci powstaego kompleksu lub supernatantu, po oddzieleniu tego kompleksu. Najczciej stosowanym izotopem znacznikowym jest 125J. Metoda RIA cechuje bardzo wysoka czuo; Ich ograniczeniem jest konieczno wyposaenia laboratorium w odpowiedni sprzt oraz zapewnienie bezpieczestwa pracy. Odczyn RIA do niedawna stosowany by w diagnostyce zakae wywoanych wirusem zapalenia w troby typu B

Odczyn wizania dopeniacza (OWD) Istot odczynu jest wizanie dopeniacza (pochodzcego z surowicy winki morskiej) przez swoisty kompleks antygen-przeciwciao (I faza reakcji). To czy zosta on zwizany stwierdza si w II fazie reakcji przez dodanie do ukadu uczulonych krwinek baranich, to jest krwinek opaszczonych swoistymi dla nich przeciwciaami (amboceptor hemolityczny). Ulegaj one hemolizie tylko wtedy, gdy dopeniacz nie zosta zwizany w I fazie reakcji. Brak hemolizy oznacza wynik dodatni, gdy wskazuje, e w I fazie reakcji powsta kompleks antygenprzeciwciao, ktry zwiza cakowicie dopeniacz OWD znalaz zastosowanie gwnie do okrelania miana swoistych przeciwcia , np. dla wirusa herpes simplex, cytomegalii. -2-

 Copyright by $ta

Odczyn zahamowania hemaglutynacji (OZHA) Odczyn ten mona stosowa w diagnostyce wirusw, ktre posiadaj zdolno hemaglutynacji, tj. aglutynowania krwinek czerwonych rnych gatunkw zwierzt lub ludzkich 0Rh(-)(np. ortomyksowirusy, paramyksowirusy, wirus ryczki),. Jeeli w badanej surowicy znajduj si przeciwciaa dla okrelonej hemaglutyniny wirusowej, to po dodaniu wirusa , a nastpnie odpowiednich krwinek czerwonych nie dochodzi do ich aglutynowania. Za miano surowicy przyjmuje si to najwiksze rozcieczenie, w ktrym wystpuje zahamowanie hemaglutynacji. Poniewa wiele surowic ludzkich i zwierzcych zawiera nieswoiste czynniki hamuj ce aglutynacj erytrocytw, co moe powodowa faszywie dodatnie wyniki, przed uyciem surowic do OZHA konieczne jest zniszczenie lub usunicie tych inhibitorw. o W tym celu stosuje si wiele metod, np. ogrzewanie, traktowanie przesczem hodowli bulionowej przecinkowca cholery (RDE), adsorpcj kaolinem.

Odczyn aglutynacji czstek opaszczonych wirusem Antygen wirusowy zostaje zaadsorbowany na powierzchni nonika, np. lateksu, bentonitu, erytrocytw (mwimy wwczas o hemaglutynacji poredniej). Nastpnie dodaje si surowic zawieraj c przeciwciaa, ktre reaguj z tym opaszczonym na noniku antygenem nastpuje wytrcenie czstek nonika i ich zlepianie (aglutynacja) Metoda ta znalaza zastosowanie gwnie w tzw. szybkich testach diagnostycznych w wykrywaniu np. rotawirusw w kale pacjenta

Odczyn hemolizy radialnej Jest odczynem wykorzystuj cym waciwoci hemolityczne dopeniacza 1. 2. 3. 4. 5. 6. Antygen wirusowy opaszcza si na powierzchni erytrocytw. Erytrocyty z opaszczonym antygenem wirusowym miesza si nastpnie z pynn, podgrzan agaroz i rozlewa do pytek Petriego Po zakrzepniciu wycina si w agarozie doki, do ktrych wlewa si badane surowice. W czasie kilkugodzinnej inkubacji nastpuje dyfuzja przeciwcia (z badanej surowicy w tych dokach) i ich poczenie z antygenami znajdujcymi si na erytrocytach (w agarozie) Na powierzchni pytek nanosi si wtedy roztwr dopeniacza, ktry powoduje liz tych krwinek, na ktrych powsta kompleks antygen-przeciwciao. Wielko strefy hemolizy wok dokw odpowiada iloci obecnych w surowicy swoistych przeciwcia.

Metoda immunodyfuzji W tej metodzie, w rodowisku elu agarowego, nastpuje w drwka naprzeciw siebie antygenu i przeciwciaa. W miejscu ich zetknicia powstaje linia precypitacji, ktrej natenie jest wykadnikiem stenia reaguj cych skadnikw. Metoda ta jest przydatna gwnie do wykrywania rozpuszczalnych antygenw wirusowych o Stosowana bya np. w diagnostyce wirusowego zapalenia w troby typu B, obecnie wyparta przez metody immunoenzymatyczne

Metoda immunoblotu, Western blot (WB) Metoda ta umoliwia jednoczasowe wykrycie w surowicy pacjenta obecnoci przeciwcia reagujcych z rnymi bia kami danego wirusa 1. 2. 3. 4. 5. 6. Namnoon i oczyszczon zawiesin wirusa poddaje si trawieniu, uzyskane w ten sposb biaka wirusowe rozdziela si elektroforetycznie w elu poliakrylamidowym, zgodnie z ich mas czsteczkow . Pasma poszczeglnych biaek s przenoszone (blotting) na bon nitrocelulozow , z ktr silnie si wi Po wypukaniu i wysuszeniu bon tnie si na paski uywane do odczynu waciwego, Na pasek nanosi si badan surowic po okresie inkubacji swoiste przeciwciaa wi si z odpowiednimi biakami wirusowymi -3-

 Copyright by $ta

7. 8.

Po odpukaniu niezwizanych fragmentw dodaje si przeciwciaa skierowane przeciwko ludzkiej immunoglobulinie wyznakowane enzymem. Dodany w kolejnym etapie substrat barwi te prki, na ktrych zasza reakcja antygen-przeciwciao. Odczyn ten jest obecnie stosowany jako test potwierdzajcy w diagnostyce zakae HIV

W diagnostyce wirusologicznej coraz czciej stosuje si metody biologii molekularnej umoliwiajce wykrywanie genomu wirusowego. Metody te wymagaj znajomoci sekwencji poszczeglnych nukleotydw w wirusowym DNA lub RNA. Bardzo wysoka czuo tych technik moe by przyczyn uzyskiwania faszywie dodatnich wynik, std konieczno zachowani odpowiedniego reimu postpowania i ostronej interpretacji wynikw

Metoda hybrydyzacji Wykorzystuje zjawisko komplementarnoci zasad purynowych i pirymidynowych. 1. 2. W pierwszym etapie reakcji nastpuje denaturacja kwasu nukleinowego (pod wpywem temperatury, rzadziej dziaania chemicznego) do pojedynczej nici. Dodana sonda genetyczna (fragment oligonukleotydw o znanej sekwencji, charakterystycznej dla poszukiwanego wirusa) czy si (hybrydyzuje) w miejscach, gdzie sekwencja nukleotydw jest komplementarna do obecnej w badanej prbce. a. W zalenoci od znacznika, z ktrym poczona jest sonda genetyczna (barwnik fluorescencyjny, enzym, biako, radioizotop) stosujemy rne sposoby detekcji reakcji hybrydyzacji. W praktyce stosujemy odmiany: o Hybrydyzacja in situ w tej samej odmianie reakcj hybrydyzacji przeprowadza si na utrwalonym skrawku tkanki lub rozmazie komrkowym. Metoda ta umoliwia zlokalizowanie poszukiwanych sekwencji wirusowych wewntrz zakaonej komrki o Hybrydyzacja typu Southern blot DNA wyizolowany z badanej prbki poddaje si dziaaniu enzymw restrykcyjnych, ktre tn ni kwasu nukleinowego na krtsze fragmenty oligonukleotydw. Fragmenty te rozdziela si elektroforetycznie, Nastpnie, po utrwaleniu, przenosi si na filtr nitrocelulozowy, na ktrym przeprowadza si hybrydyzacj z sond genetyczn. Porwnanie prkw uzyskanych z materiau klinicznego i wirusa prototypowego umoliwia dokadne okrelenie typu wyizolowanego wirusa i umoliwia dochodzenie epidemiologiczne hybrydyzacja typu Northern blot w przypadku gdy rozdzia dotyczy fragmentw RNA

Polimerazowa reakcja acuchowa, PCR Umoliwia w warunkach in vitro, w cigu kilku godzin, zwielokrotnienie pojedynczej kopii fragmentu wirusowego DNA miliony razy, do takich iloci, ktre jestemy w stanie wykry dostpnymi nam metodami 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Reakcj przeprowadza si w termocyklerze, aparacie charakteryzujcym si moliwoci szybkich zmian temperatury Prbk badanego materiau poddaje si dziaaniu wysokiej temperatury (>90C) w celu uzyskania pojedynczej nici DNA (denaturacja). Po ochodzeniu do 50-60C dodaje si primery (startery o budowie oligonukleotydowej), przyczajce si w sposb swoisty, na zasadzie komplementarno ci, do dwch fragmentw przeciwlegych nici DNA. Do mieszaniny reakcyjnej, odpowiednio zbuforowanej dodajemy take termostabiln polimeraz DNA oraz nukleotydy konieczne do syntezy DNA. W temperaturze 70-75C w obecnoci polimerazy nastpuje dobudowywanie komplementarne nici DNA, zapocztkowane w miejscach przyczenia si primerw. Jest to pierwszy cykl reakcji PCR Nastpnie temperatur podnosi si, aby denaturowa nowo powstae nici DNA. Reakcj przyczania primerw i polimeryzacji powtarza si automatycznie, zazwyczaj 30-40-krotnie.

-4-

 Copyright by $ta

8. 9.

Powielanie kopii DNA lecych midzy zastosowanymi primerami jest moliwe tylko wwczas, gdy nastpio poczenie primerw z homologiczn sekwencj w poszukiwanym kwasie nukleinowym. Otrzymane DNA rozdziela si w elu poliaktylamidowym lub agarozowym i uwidacznia w wietle UV przez dodanie bromku etydyny. O swoistoci przeprowadzonej reakcji PCR mona przekona si, wykonujc, hybrydyzacj otrzymanego produktu z sond rozpoznajc zwielokrotnione fragmenty kwasu nukleinowego. W przypadku wykrywania wirusw zawierajcych RNA w pierwszym etapie reakcji musi nastpi przepisanie informacji genetycznej na ni DNA przy uyciu odwrotnej transkryptazy (metoda RT PCR)

a.

-5-