Wykad 12 Analiza toksykologiczna materiau biologicznego i prbek rodowiskowych Cele i zadania analizy toksykologicznej Wykrywanie , identyfikacja i oznaczanie ilociowe

e naturalnych i syntetycznych zwizkw chemicznych wykazujcych szkodliwy wpyw lub dziaanie toksyczne na organizm ywy Cel oglny - udzia w ochronie zdrowia czowieka i czystoci rodowiska - realizowany przez wczesne wykrywanie wystpowania szkodliwoci chemicznych, niebezpieczestwa powstawania zatru oraz wykrywania zatru ju zaistniaych Rodzaje bada w analizie toksykologicznej badanie jakociowe wykrywanie i identyfikacja (informuj o rodzaju szkodliwoci, naraenia lub zatrucia) badania ilociowe (pozwalaj na okrelenie stopnia skaenia, naraenia lub cikoci zatrucia) badanie ukierunkowane na okrelon substancje lub substancj z okrelonej grupy badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji

Dane, ktrych dostarcza analiza toksykologiczna pozwalaj na: - ustalenie przyczyny zatrucia (przyyciowe i po mierci) - ocen naraenia zawodowego na substancje toksyczne (przemys, rolnictwo) - ocen rodzaju i intensywnoci zanieczyszczenia i/lub potencjalnego zagroenia rodowiska przez zwizki chemiczne - ocen szkodliwoci zwizkw chemicznych i produktw je zawierajcych -----s wykorzystywane do celw medycznych, administracyjnych i prawnych - opracowanie metodyk, czsto indywidualnie dla konkretnego przypadku skaenia, naraenia lub zatrucia Kierunki analizy toksykologicznej Analiza toksykologiczna sdowa Analiza kliniczno-toksykologiczna - badanie materiau biologicznego do celw diagnostyki zatru - monitorowanie stenia trucizn w pynach ustrojowych w przebiegu leczenia zatru Analiza toksykologiczna rodowiskowa - kontrola zanieczyszczenia rodowiska oglnego (powietrze, woda, gleba, opady, cieki, flora, fauna, ywno) - oznaczanie w materiaach rodowiskowych stenia zanieczyszczajcych je zwizkw chemicznych oraz produktw ich degradacji lub biotransformacji rodowiskowej - kontrola chemizacji w rolnictwie: - oznaczanie pozostaoci pestycydw w rodowisku i podach rolnych - okrelenie dynamiki zanikania pestycydw w podach rolnych Analiza toksykologiczna przemysowa - ocena naraenia zawodowego na substancje toksyczne - kontrola zatru w przemyle monitoring rodowiska pracy (NDS, NDSCh, NDSP) oznaczanie ste substancji w powietrzu na stanowiskach pracy monitoring biologiczny celem okrelenia biologicznych skutkw naraenia Oznaczanie: - stenia substancji toksycznych i/lub metabolitw - produktw patologicznych powstaych w ustroju w wyniku dziaania substancji toksycznych (np. HbCO przy zatruciu CO, MetHb przy zwizkach methemoglobinotwrczych) - poziomw niektrych zwizkw endogennych lub aktywnoci enzymw (np. AchE przy insektycydach fosforoorganicznych i karbaminianowych, stenie ALA w moczu przy Pb) Analiza substancji toksycznych (wykrywanie, identyfikacja, oznaczanie) prowadzone:

dla celw badawczo naukowych, wypracowywania nowych metodyk stanowicych zabezpieczenie metodyczne toksykologii dowiadczalnej - jako badanie dowodw rzeczowych o leki o chemikalia uytkowane w przemyle, rolnictwie, gospodarstwie domowym o ywno i napoje o przedmioty rne (opakowania po chemikaliach, odzie, strzykawki, igy) Wykrywanie i kontrola - toksykomanii w tym narkomanii - dopingu w sporcie - kontrola u kierowcw lekw ograniczajcych sprawno psychofizyczn Specyfika analizy toksykologicznej Rnorodno prb do bada - zrnicowany materia - materia biologiczny rolinny, zwierzcy oraz ludzki - prbki rodowiskowe woda, powietrze, gleba, opady, roliny - przedmioty uytkowe ywno, leki, opakowania o rny stan skupienia prb (gazowe, cieke, stae) o rna budowa chemiczna substancji (zw. org. i nieorganiczne, naturalne i syntetyczne) o substancje o rnych waciwociach toksykodynamicznych o zwizki czyste oraz ich rne formy uytkowe (leki, pestycydy, chemikalia gospodarstwa domowego, przemysowe i rolnicze) Konieczno wykrywania, identyfikacji i oznaczania niewielkiej iloci substancji chemicznej w duej masie badanych prb Obecno w analizowanej prbie jednej lub kilku substancji toksycznych z tej samej lub rnych grup chemicznych Wystpowanie w analizowanej prbie obok substancji toksycznej produktw jej biotransformacji lub produktw rozkadu materiau biologicznego oraz produktw degradacji rodowiskowej substancje te mog interferowa w analizie. Leki oraz substancje czynne z uywek (kofeina, nikotyna) mog utrudnia analiz Ilo materiau jest czsto ograniczona (brak moliwoci powtrzenia oznacze) Czas na wykonanie moe by bardzo krtki (np. diagnostyka zatru ostrych) Konieczno odpowiedniego zabezpieczenia prb do bada na czas transportu (przed rozmylnym zniszczeniem lub zafaszowaniem oraz niezamierzon pomyk) i odpowiednio przechowywane Konieczno stosowania szka i odczynnikw o wysokiej czystoci (np. spektralnie czyste kwasy i wzorce metali do AAS, rozpuszczalniki do HPLC) Rodzaje materiau do bada Zatrucia ostre przyyciowe Mocz Krew krew pena, osocze, erytrocyty Zawarto odka odessana tre pokarmowa, popuczyny, wymiociny Zatrucie ostre miertelne Mocz z pcherza Krew Tkanki i narzdy wewntrzne pobrane na sekcji zwok - odek z zawartoci, jelito cienkie z zawartoci, okrnica z zawartoci - wtroba i woreczek ciowy - puca - nerki - serce - ledziona - koci - mzg - macica, pochwa - odbytnica, pcherz - wycinki skry Zatrucie przewleke oraz do celw monitoringu uzalenienia, naraenia zawodowego i rodowiskowego mocz krew

 wosy, paznokcie (np. As) slina (np. kotynina, kokaina, heroina, metadon, amfetamina) materiay dodatkowe resztki ywnoci leki opakowania czci garderoby rne przedmioty uytkowe powietrze w miejscu zatrucia (przy zatruciach inhalacyjnych) Zasady doboru materiau do bada Rodzaj materiau do bada zalezy od rodzeju rozwizywanego problemu (rodzaj naraenia, kierunku prowadzonych bada), stosowanych metod analitycznych badanie ukierunkowane materia, w ktrym substancja toksyczna wystpuje w najwyszym steniu w stanie niezmienionym oraz materia, w ktrym mona wykry metabolity substancji (potwierdzenie rozpoznania) badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji rnorodny materia pozwalajcy wykry substancje z rnych grup analitycznych do celu toksykologii przemysowej wg. obowizujcych norm i przepisw prawnych do celw toksykologii sdowej wg. obowizujcych zalece odnonie podziau materiau i dla badania analitycznego, sposobu i czasu jego przechowywania do kontrekspertyzy o waciwoci fizykochemiczne substancji toksycznej, skaenia o losy substancji toksycznej w organizmie lub zanieczyszczenia w rodowisku o materia biologiczny (ludzie zwierzta) - kinetyka wchaniania - zdolno kumulacji - kierunki i szybko biotransformacji o prby rodowiskowe - trwao i zdolno substancji do przemieszczania si w rodowisku - degradacja rodowiskowa pod wpywem warunkw atmosferycznych - biotransformacja rodowiskowa z udziaem bakterii, drody i grzybw Podzia materiau do bada Zasady podziau badania ukierunkowane zabezpieczenie prb do: - wykrycia objtej poszukiwaniem substancji lub grupy substancji - wykonanie oznaczenia ilociowego - powtrzenia prb badanie w kierunku poszukiwania nieznanej substancji (pena analiza toksykologiczna) zabezpieczenie materiau do: - poszukiwania substancji ze wszystkich grup analitycznych - wykonania oznaczenia ilociowego z oddzielnej porcji materiau - powtrzenia prb - kontrekspertyzy Tok postpowania w analizie toksykologicznej pobranie i przygotowanie prby do badania wykonanie prb wstpnych i testw skryningowych bezporednio w materiale biologicznym izolowanie wstpne (dla nielotnych trucizn organicznych) oczyszczanie, zagszczanie podzia na podgrupy wykrywanie grupowe (jest nie ma) i szczegowa identyfikacja oznaczanie ilociowe (najczciej z oddzielnej porcji materiau) ocena i interpretacja wynikw

Podzia analityczny trucizn na grupy trucizny lotne i gazowe nielotne trucizny organiczne (tzw. Trucizny ekstrakcyjne) trucizny metaliczne trucizny dializujce rne o indywidualnych metodach izolowania Metody analityczne w analizie toksykologicznej Chemiczne badania wstpne - organoleptyczne - makroskopowe i mikroskopowe - spawianie - w rurce do praenia - na wglu - na perle boroksowej - w pomieniu - pienienia identyfikacyjne reakcje barwne - z odczynnikiem specyficznym - z odczynnikami grupowymi

metody scriningowe - chemiczne i fizykochemiczne - biologiczne - botaniczne Aparaturowe metody spektralne - emisyjne - absorpcyjne (UV VIS, IR,AAS) metody chromatograficzne - TLC, HPLC, GC/MS Elektroforeza Fluorymetria NMR Neuronowa analiza aktywacyjna Polarografia Metody izotopowe Elektrochemiczne (elektrody jonoselektywne) Immunologiczne - EMIT (immunoenzymatyczne) - RIA (radioimmunologiczne) - FIA (waciwoci fluorescencyjne) - HI (oparta na aglutynacji) - FRAT (oparta na wolnych rodnikach) Analiza trucizn lotnych i gazowych Zwizki organiczne - alkohole - aldehydy - ketony - estry - wglowodory alifatyczne, aromatyczne, aminowe i nitrowe pochodne wglowodorw - kwasy organiczne (np. salicylowy, mrwkowy, octowy, benzoesowy )

- fenole i wielofenole - disiarczek wgla zwizki nieorganiczne - tlenek wgla - fosfor - cyjanki, elazo i elazicyjanki - lotne sole niektrych metali oraz fungicydy metaloorganiczne (np. Sn- organiczne, Hg organiczne)

Analiza trucizn lotnych i gazowych Metody izolacji destylacja z par wodn (np. fenol z moczu) metody oparte na zjawisku dyfuzji - odparowanie (izolacja etanol w metodzie Widmarka roztwr K2Cr2O7 w H2SO4) - mikrodyfuzja (cyjanki roztwr NaOH, chloroform - toluen) - technika head - space

Aeracja (wymywanie strumieniem gazu obojetnego np. izolacja CS2 z krwi) Metody identyfikacji i oznaczania Chromatografia gazowa (+ izolacja technik head - space ; detekcja spekrometria masowa) - metoda uniwersalna w badaniach skryningowych przy poszukiwaniu nieznanej substancji toksycznej oraz w badaniach ukierunkowanych metody spektralne metody miareczkowe (np. metoda widmarka) grupowe i specyficzne testy i reakcje chemiczne do celw jakociowych Nielotne trucizny organiczne nielotne zwizki organiczne izolowane przez ekstrakcj rozpuszczalnikami organicznymi (trucizny ekstrakcyjne) ok. 90% wszystkich potencjalnie szkodliwych zwizkw chemicznych leki pestycydy chemikalia przemysowe i stosowane w gospodarstwie domowym, kosmetyki, substancje dodawane do ywnoci - zwizki naturalne i syntetyczne - zwizki zasadowe, kwane, obojtne i amfoteryczne Analiza nielotnych trucizn organicznych Metody izolacji i oznaczania etap Materia I. -sekcyjny Izolowanie wstpne -ekshumacyjny -ywno (tusta) -tre odka (tusta) -krew pena -mocz patologiczny niektre formy lekw II. -z zatru przyyciowych Izolowanie waciwe -kwany wodny roztwr

Czynno -macerowanie kwanym pynem wodnoalkoholowym -oczyszczanie wyciagu

Efekt Kwany, wodny oczyszczony roztwr

- ekstrakcja rozpuszczalnikami

Wyizolowanie substancji toksycznej i podzia na

po izolacji wstpnej -niektre formy lekw

organicznymi

podgrupy

Metody ekstrakcji ciecz ciecz - ekstrakcja eterem dietylowym ze rodowiska kwanego (dla substancji kwanych i obojetnych) - ekstrakcja chloroformem ze rodowiska amoniakalnego (dla substancji zasadowych i amfoterycznych) ciecz ciao stae (SPE)

Metody oznaczania metody chromatograficzne - chromatografia cienkowarstwowa TLC - chromatografia cieczowa HPLC/MS - chromatografia gazowa GC/MS metody instrumentalne - spektrofotometria UV i VIS - spektrofluorymetria - immunologiczne metody chemiczne metody fizyczne metody biologiczne Analiza trucizn metalicznych - metale - metaloidy - pary metali - zwizki metaloorganiczne (fungicydy SN- Hg- organiczne, tri- i tetraetylek Pb) metody izolacji mineralizacja - na sucho - na mokro solubilizacja - trawienie Soluenem VI rzdowa sl amoniowa zmydla materia biologiczny w rodowisku alkalicznym - maceracja w 1M buforze TRIS trawienie enzymatyczne przy uyciu alkalicznej proteazy metody oznaczania spekrometria atomowo absorpcyjna AAS spektrofotometria pomieniowo emisyjna spektrografia polarografia (Pb, Zn, Cd) metody elektrochemiczne elektrody jonoselektywne neuronowa analiza aktywacyjna reakcje charakterystyczne dla poszczeglnych metali (z odczynnikiem kompleksujcym np. ditizon, ditiokarbaminian sodu)

Trucizny dializujce substancje rozpuszczalne w wodzie - kationy, aniony - kwasy i zasady (kwas siarkowy, azotowy, solny) - sole (szczawiany, chlorany, bromki, jodki) metody izolacji przechodzenie do wycigw wodnych dializa elektrodializa metody identyfikacji i oznaczania reakcje barwne i z odczynnikami osadowymi metody spektrofotometryczne metody elektrochemiczne Interpretacja wynikw bada Waciwa interpretacja wynikw konieczno uwzgldnienia - poziomw fizjologicznych (np. fenolu w moczu) - ste normalnych metali toksycznych (np. Pb, Cd) - dopuszczalnych ste biologicznych - ste terapeutycznych (leki) - ste toksycznych - ste miertelnych Kontrola jakoci oznacze zasady dobrej praktyki laboratoryjnej (DPL) walidacja metod analitycznych (wykazanie prawidowoci wyboru metody do celu, ktremu suy)