INSTITUTO TECNLOGICO DE TEPIC DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOQUIMICA

TITULO DEL TRABAJO: INMOVILIZACION DE ENZIMAS

MATERIA: Cintica qumica biolgica

INTEGRANTES DEL EQUIPO: Nez Espinoza Vctor Hugo Snchez Hernndez Alejandro Monsalvo Ziga Omar

GRUPO: 6 B

CARRERA: Ing. Bioqumica

PROFESOR: Aguilar Ramrez Salvador Yunior

Fecha de entrega: 07/ 05 / 2013

INTRODUCCIN A LOS MTODOS DE INMOVILIZACIN.

Desde la segunda mitad del siglo pasado, se han hecho numerosos esfuerzos dedicados al desarrollo de enzimas inmovilizadas insolubles para una variedad de aplicaciones. Es posible visualizar tres pasos en el desarrollo del biocatalizador inmovilizado. El primer paso, a principios del siglo 19, los microorganismos inmovilizados estaban siendo empleados industrialmente sobre una base emprica solamente. Las bases de las tecnologas actuales fueron desarrolladas en los 60s y hubo un gran incremento en las publicaciones sobre este tema. El segundo paso es que solo se usaron enzimas individuales inmovilizadas pero en los 70s se usaron sistemas ms complejos. Y el tercero sucedi del 1985 a 1995 usando la inmovilizacin de mltiples enzimas, incluyendo las reacciones de dos enzimas con la regeneracin de cofactor y clulas vivas han sido desarrolladas. La historia moderna de inmovilizacin de enzimas se data a la dcada de los 40s pero la gran mayora de los trabajos presentados fueron ignorados por los bioqumicos ya que se publicaron principalmente en revistas de otras disciplinas. Sin embargo cualquiera que sea la naturaleza de una enzima inmovilizada y sin importar como es preparada, cualquier enzima inmovilizada por definicin debe comprender dos funciones esenciales, esto es las funciones no catalticas que estn diseados para ayudar a la separacin y a las funciones catalticas que estn diseados para convertir en un tiempo y espacio deseado. El trmino de enzimas inmovilizadas se refiere a una enzima fsicamente confinada localizada en una cierta regin o espacio definido con la retencin de sus actividades catalticas y que pueden ser usados repetidamente y en forma continua. Aunque la ciencia de la inmovilizacin de enzimas se ha desarrollado como una consecuencia de su utilidad tcnica.

Una ventaja principal de la inmovilizacin de enzimas es que puede ser reusado ya que puede ser fcilmente separada de la solucin y ser fcilmente retenida en un reactor de flujo continuo. La utilizacin de enzimas inmovilizadas o no depender de una evaluacin econmica de las alternativas, donde se considerarn datos de cintica y estabilidad, costo, propiedades fisicoqumicas, eficiencia de inmovilizacin y carga del soporte. Las propiedades de las enzimas inmovilizadas estn gobernadas por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material del soporte. Las enzimas normalmente se inmovilizan a travs de algn tipo de interaccin entre sus residuos aminoacdicos y el soporte. Esto puede producir prdidas considerables de actividad, al comprometer los aminocidos en l, o vecinos del, sitio activo. La inmovilizacin de enzimas tiene sus pros y contras PROS CONTRAS

Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo Existencia de la resistencia a la cortante y a la contaminacin Fcil de desarrollar procesos continuos transferencia de masa Necesidad del proceso de inmovilizacin Rpidas tasas de reaccin Costos adicionales de reactivos para la inmovilizacin Fcil separacin de los productos Perdida de actividad durante la etapa de inmovilizacin Uso repetitivo del catalizador

Los mtodos ms comunes de inmovilizacin de enzimas: Heterogenizacin de enzimas solubles a travs del acoplamiento de un soporte

insoluble mediante: adsorcin o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en micro cpsulas. Las tcnicas de inmovilizacin de enzimas se clasifican bsicamente en dos mtodos: el fsico y el qumico, el fsico es la formacin de un enlace covalente dependiente y el qumico es la formacin de un enlace no covalente de enlace dependiente.

La seleccin de los mtodos de inmovilizacin debern estar basados en los requerimientos tcnicos especficos y en el marco global de su aplicacin comercial. Mtodos de Inmovilizacin Mtodos de enlace a soportes Enlace covalente Adsorcin fsica Fuerzas electrostticas

Entrecruzamiento Atrapamiento

Entre los mtodos qumicos est el enlace covalente que est clasificado como los que se unen a soportes, el cual, es el ms adecuado para usar en las enzimas, la formacin de estos enlaces se da entre una enzima y un soporte de los que puede haber gran variedad para este tipo de mtodo como: naturales y/o sintticos. Los enlaces covalentes solo afectan a grupos funcionales del enzima que no intervengan en el proceso cataltico. Las etapas por las que se lleva a cabo por medio de las siguientes etapas: Activacin del soporte (creacin de grupos funcionales adecuados para su unin con los del enzima): activacin por bromuro deciangeno, carbodiimida, complejos de diazonio seguida de recubrimiento superficial con grupos funcionales orgnicos adecuados. En este mtodo se puede presentar perdida de actividad debida a la participacin del centro activo del enzima en el enlace covalente o por algunos impedimentos estricos. Mediante la formacin de un enlace covalente se han inmovilizado enzimas sobre vidrio de poro controlado, colorantes, enzimas, anticuerpos e incluso bacterias y algas. Es importante tener en cuenta que los grupos funcionales del reactivo responsables de la reaccin analtica no deben estar involucrados en la reaccin de inmovilizacin. La inmovilizacin covalente puede modificar drsticamente las caractersticas fsicas y qumicas del reactivo, por ello es necesario caracterizar el reactivo inmovilizado.

Otro mtodo qumico es el entrecruzamiento con reactivos multifuncionales que se define como, Formacin de enlaces covalentes entre las molculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formando agregados entrecruzados tridimensionales. Y su metodologa se da por medio de Adicin de una cantidad apropiada de agente entrecruzante a una solucin de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formacin de enlaces covalentes mltiples. Los reactivos multifuncionales adems pueden ser usados para introducir grupos funcionales en polmeros insolubles en agua, que luego reaccionan covalentemente con enzimas solubles al agua. Puede usarse en combinacin con la adsorcin para prevenir prdida de catalizador. Y tiene la posibilidad de uso simultneo de varios enzimas. Tambin se pueden presentar inconvenientes como problemas difusionales que limiten el rendimiento, Prdida de enzima durante la preparacin. Problemas difusionales debidos a la membrana, Posible inactivacin de enzimas, sometidos a fuerzas de cizalla elevadas. En cuanto a los mtodos fsicos tenemos la: Adsorcin: en el que los biocatalizadores enlazan a los soportes por interacciones fsicas tales como interacciones hidrofbicas, fuerzas de van der Waals. Frecuentemente se usan soportes inorgnicos. Actualmente, estn disponibles varios materiales naturales que tienen fuertes capacidades de adsorcin. Es el mtodo ms sencillo para inmovilizar a las enzimas. Las enzimas pueden ser adsorbidos fsicamente en un adsorbente de superficie activa ponindose en contacto con una solucin acuosa de la enzima con un adsorbente. Los adsorbentes empleados comnmente son: alumina, carbonato de calcio, carbono, resinas de intercambio catinico, arcillas, celulosas, colgeno, coloide de litio, metal acondicionado, placas de vidrio, tierra de diatomeas e hidrixiapatita. Las ventajas tcnicas de la adsorcin son: El procedimiento de inmovilizacin es simple.

Es posible separar y purificar las enzimas mientras estn siendo inmovilizadas.

Las enzimas no se desactivan generalmente por adsorcin. La adsorcin es un proceso reversible.

Sin embargo, tambin tienen sus desventajas. La fuerza de unin es dbil. El estado de inmovilizacin es muy sensible al pH de la solucin, fuerza inica y la temperatura. La cantidad de enzimas cargado en una cantidad unitaria de apoyo es por lo general baja. El mtodo se basa en la adorcin fsica de las molculas de enzima en la superficie de una matriz slida, poniendo en contacto una solucin acuosa de enzima con el soporte.

El mtodo de atrapamiento inmovilizacin est basado en la localizacin de una enzima dentro de un enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal forma que previene la liberacin de protena mientras permite la penetracin de substrato. Las enzimas pueden ser atrapados dentro de reticulado polmeros mediante la formacin de una red altamente reticulado de polmero en la presencia de una

enzima. Este mtodo tiene una gran ventaja en el hecho de que no hay modificacin qumica de la enzima, por lo tanto, las propiedades intrnsecas de una enzima no se alteran. Sin embargo, la enzima puede desactivarse durante la formacin de gel. El polmero reticulado ms comnmente empleado es el sistema de gel de poliacrilamida. Esto ha sido utilizado para inmovilizar la alcohol deshidrogenasa, glucosa oxidasa, aminocido oxidasa, glucosa isomerasa, la ureasa, y muchas otras enzimas. La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz del gel o a la membrana. Mayoritariamente para clulas. Poco usado para enzimas (baja retencin). Inclusin del enzima en una matriz tridimensional, quedando atrapado. La matriz se forma en presencia del enzima. Se debe permitir la difusin de substrato/productos. Uso de polmeros sintticos o geles de origen natural.

Otro mtodo es la Microencapsulacin en el que las enzimas pueden ser inmovilizadas dentro de microcpsulas membrana semipermeable. Esto se puede hacer por la tcnica de polimerizacin interfacial. El disolvente orgnico que contiene un componente de co-polmero con un tensioactivo se agita en un recipiente y se introduce solucin de enzima acuosa. La membrana de polmero se forma en la interfase lquido-lquido mientras que la fase acuosa se dispersa en forma de pequeas gotas. Un ejemplo de este proceso es el sistema de poliamida

de nylon, en el que 1, 6-diaminohexano es la diamme soluble en agua y cloruro de 1,10-decanoil es el di-cido orgnico soluble en haluro. Procedimiento: - Formacin de emulsin en disolucin acuosa (lquido orgnico[monmero] + enzima). - Polimerizacin de la emulsin.

EFECTOS DE LA INMOVILIZACIN SOBRE LA ACTIVIDAD CATALITICA

Efectos sobre la estabilidad Efectos sobre la actividad 1. Efectos sobre el biocatalizador propiamente dicho 2. Restricciones estricas 3. Cambios conformacionales Efectos sobre el microambiente 1. Efectos de particin 2. Limitacin a la difusin: Internas y externas

Incremento en la estabilidad operacional: - Estabilizacin conformacional: uniones multi-puntuales enzima-soporte.

i.

Mayor rigidez estructura terciaria: resistencia a desactivacin trmica o qumica.

ii.

Combinacin inmovilizacin covalente multi-puntual + adicin reactivos bifuncionales

- Proteccin frente a proteasas: iii. Unin de proteasas a soporte elimina capacidad proteoltica

- Evita la agregacin intermolecular: iv. Molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio.

- Alteracin del micro-entorno: v. vi. vii. Disminucin concentracin oxgeno disuelto por incremento fuerza inica Efecto tamponador del soporte Hidrofilia del soporte

EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD: EFECTOS SOBRE EL BIOCATALIZADOR

1. Efectos conformacionales: modificaciones qumicas de la enzima durante la inmovilizacin, que influyen en su actividad cuando estn implicados aminocidos del centro activo o contribuyen al mantenimiento de la estructura terciaria Conducen a la prdida total de la actividad cataltica. Unin al soporte imposibilita el acceso del sustrato al centro activo Reaccin grupos reactivos del soporte con algn aminocido del centro activo o esencial para la actividad cataltica Cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva, Desnaturalizacin o desactivacin enzima por condiciones experimentales

2.- Efectos estricos: una parte de las molculas de enzima estn inmovilizadas en una posicin en relacin con la superficie del soporte tal que el centro activo est poco accesible al sustrato. Conducen a la prdida parcial de la actividad cataltica.

Efectos conformacionales y estricos que afectan a la molcula de enzima Efectos micro-ambientales de particin y difusin

EFECTOS SOBRE LA ACTIVIDAD: EFECTOS DEL MICROAMBIENTE

La enzima inmovilizada se mantiene en un medio fsico muy diferente al existente en el grueso de la solucin. Conducen a la prdida parcial de la actividad cataltica. Fenmenos de particin: Ocurren cuando las concentraciones de sustrato o de otros compuestos relacionados con la actividad son diferentes en la superficie del soporte y en el grueso de la solucin. Parmetros moleculares responsables de la particin: Tamao Interacciones electrostticas Interacciones hidrofbicas

Modificaciones ms importantes Diferencia de pH en la proximidad de la enzima inmovilizada Alteraciones en la afinidad por el sustrato

Coeficiente de particin P= Cs/Cb Cs = concentracin en la superficie del polmero Cb = concentracin en la solucin Fenmenos de particin Prediccin de la concentracin de protones en la superficie pH

[H+]s = concentracin de protones en la superficie de la matriz [H+]b = concentracin de protones en la solucin e = carga electrnica = potencial electrnico k = constante de Boltzmann T = temperatura absoluta pH = 0,43 e / kT Fenmenos de particin Alteraciones en la afinidad por sustrato provocan cambios en la Km de la enzima inmovilizada 1. Tamao del sustrato y de los poros del soporte 2. Naturaleza hidrofbica o hidroflica del sustrato y del soporte: sustratos hidroflicos son atrados por el soporte hidroflico provocando un aumento en la concentracin local de sustrato. 3. Distribucin de cargas del sustrato y del soporte de sustratos con (+) son atrados hacia soportes con (carga -) y como consecuencia tenemos un aumento en la concentracin local del sustrato Km decrece Km enzima inmovilizado= Km/P P: Coeficiente de particin (P= Cs/Cb) Cs = Concentracin en la superficie del polmero Cb = Concentracin en la solucin

LIMITACIONES DIFUSIONALES EN SISTEMAS DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

Como el nombre lo dice limitan la disponibilidad de sustrato para la reaccin. Adems de que conducen a la prdida parcial de la actividad cataltica. Los fenmenos de limitacin de la difusin. Se presentan en zonas de lquido no mezclado que rodean la partcula de enzima inmovilizada y las que ocupan el interior de dicha partcula. Usando la ley de Fick podemos explicar estos fenmenos la cual enuncia que:
Vd De S S r

Donde:
Vd= Velocidad de Difusin De= Coeficiente de Difusin S= Superficie de Difusin S= [s] exterior-[s]interior r= Distancia de Difusin

Para una reaccin enzimtica que sigue la cintica de Michaelis-Menten el factor de efectividad es:

APLICACIN DE LA TECNOLOGA DE INMOVILIZACIN

El uso de esta tecnologa en la enzima ATP asa la podemos encontrar en los procesos de transporte de electrones.

Se observa la inmovilizacin del complejo F1 sobre la bola. La estreptavidina protena que acopla la actina marcada con fluorescencia a la subunidad .

BIBLIOGRAFIAS Immobilization of Enzymes and Cells 2nd Edition, Jose M Guisan, Humana Press
http://www.wiley-vch.de/books/sample/3527312323_c01.pdf

Fundamentals of Biochemical Engineering, Rajiv Dutta, Ane Books India- Springer https://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rj a&ved=0CDQQFjAB&url=http%3A%2F%2Fiqtma.cps.unizar.es%2Findex.php%3F

option%3Dcom_docman%26Itemid%3D27%26task%3Ddocclick%26bid%3D1076 %26limitstart%3D0%26limit%3D15&ei=bieHUcvDJKfO0wGqpIHgDA&usg=AFQjC NEjKfDc2ckQkHgzkuz2SFgEYc6Bvg&sig2=tirV4LyusNkVjnX4eTA7hw Sensores pticos, Concepcin Prez Conde, Universitat de Valencia, Arts Grfiques Soler, 1996 Fisiologa humana: Un enfoque integrado, 4ed, Silverthorn, Editorial Medica Panamericana, 2008