CINTICA DE FERMENTACIN Los microorganismos crecen en el espectro n variedad de entornos fsicos y qumicos, su crecimiento y otras actividades fisiolgicas en el tacto

de una respuesta he aqu su entorno fsico-qumico. Cintica de fermentacin se describe el crecimiento y formacin de producto por microorganismos - no slo el crecimiento celular activo, sino tambin a las actividades de descanso y la muerte de las clulas, ya que muchos productos de la fermentacin de arco inters comercial producido tras el crecimiento se ha detenido. En este captulo se limita cintica Lo en cultivo discontinuo. Cintica de crecimiento y formacin de producto en un cultivo continuo se considera en el captulo 7. MICROBIANA El crecimiento microbiano se caracteriza generalmente por el tiempo necesario para duplicar la masa celular o nmero de clulas. Tiempo de duplicacin de masa pueden diferir de tiempo de duplicacin celular debido a la masa de clulas puede aumentar sin un aumento en el nmero de clulas. Sin embargo, si en un entorno determinado el intervalo entre la masa celular o duplicaciones de nmeros es constante con el tiempo, el organismo est creciendo a un ritmo exponencial. Bajo tales condiciones, el crecimiento se describe por:

Donde: X = concentracin de clulas en g /L N = concentracin de clulas en clulas / L t = tiempo = tasa de crecimiento especfico en hr- 1 (en masa) tasa de crecimiento especfico (nmero) As, la ecuacin 1 describe el aumento en la masa de clulas con el tiempo y la Ecuacin 2 describe el aumento en el nmero de clulas con el tiempo. Bajo la mayora de circunstancias el crecimiento se mide por un aumento en la masa, por lo que se utilizar ft. El valor es la tasa de crecimiento volumtrico (productividad volumtrica) en g / l-hr Integracin de la ecuacin 1 nos da:

Si la tasa de crecimiento especfico es constante, la ecuacin 3 rendimientos

Ecuacin 4 se puede resolver para el caso en el que A - td, es decir, el tiempo de re requerido para X2 = 2X, y, a continuacin; ln 2 .693

De la ecuacin 4, se observa que la tasa de crecimiento especfico se obtiene de la pendiente de una grfica de ln A versus tiempo. Crecimiento Bacteriano Hay cuatro patrones generales de crecimiento microbiano, ejemplificados por bacterias, levaduras, mohos y virus. Las bacterias se dividen por fisin, como se ilustra en la Figura 6.1. Durante el ciclo de crecimiento de la clula duplica su masa y la cantidad de todos los constituyentes de la clula. Antes de la fisin, la pared celular y la membrana se sintetizan y la clula madre se divide en dos clulas hijas idnticas, cada una de las cuales crece exactamente como la clula original. Como consecuencia, generalmente no es posible asignar una edad a una bacteria, excepto en el contexto de una sola duplicacin. As, la referencia a un cultivo viejo o joven se refiere al tiempo de permanencia en un matraz o en un agitador y no a la edad de las clulas individuales. Una excepcin importante el concepto de edad se produce cuando un cambio ambiental excluye la necesidad de una enzima especfica en la clula y la enzima ya no se sintetiza junto con el crecimiento. A medida que la clula contina dividindose, la enzima existente puede llegar a ser exponencialmente diluido. Como una consecuencia, es posible especificar edad del cultivo con referencia al nivel de enzima en la clula. Tiempo de duplicacin para algunas bacterias se inform a ser tan rpido como 15-20 minutos en condiciones de crecimiento ptimas. Sin embargo, los 45-60 minutos es ms tpico. Figura 6,1 Ilustracin esquemtica de las formas tpicas de crecimiento de bacterias, levaduras y mohos. Crecimiento de levaduras Las levaduras pertenecen a los hongos y por lo general se dividen por gemacin. Las excepciones a esto incluyen levaduras que crecen por fisin o mediante la formacin de hifas. Budding, como se representa en la figura 6,1, implica la formacin de un brote en la clula madre. Este brote crece hasta que se aproxime al tamao de la madre, en cuyo punto la clula

hija separa. A diferencia de la divisin de las bacterias, es posible distinguir fsicamente entre la madre y la hija de clulas porque la clula madre retiene una cicatriz brote para cada clula hija producido. As, una poblacin en crecimiento de clulas de levadura tiene una distribucin de clulas edad en continuo cambio. Bajo ciertas condiciones de crecimiento de las yemas no se separan de la clula madre y cadenas largas, ramificadas de las clulas (pseudomicelios) formar. Bajo la levadura condiciones ptimas pueden dividir en tan poco como 45 minutos, sin embargo, 90 a 120 minutos es ms tpico. Crecimiento de moho Otro tipo de hongos son los moldes, que caractersticamente crecen por alargamiento de la cadena y la ramificacin como se ilustra en la figura 6,1. Procede el crecimiento de la punta del micelio (crecimiento apical) mediante la formacin de septos entre las clulas. Una vez que una clula se forma retiene su integridad y tiene una edad con respecto al resto de sus vecinos. Dependiendo del entorno fsico, el micelio puede ser largo y difuso, corto y muy ramificada, o una mezcla de los de los dos. Cuando se cultiva en una superficie, el micelio puede entrelazarse y formar esteras gruesas. Si bien en cultivo sumergido los micelios pueden existir como micelios difusa o puede formar grnulos con dimetros que van desde 0,1 hasta 10 mm. Las esteras y pellets son extremadamente importantes para el crecimiento de mohos ya que llicy tendr un efecto en el medio ambiente local fisicoqumica de la estera individual o sedimentar las clulas. Esto se ilustra en la Figura 6,2 por el perfil de la concentracin de nutrientes en un pellet. Puesto que las reacciones metablicas son dependientes de la concentracin de nutrientes, algunas clulas de pellets a menudo puede haber reducido o modificado de otros estertores de metabolismo. Es muy difcil para seguir el crecimiento con respecto al nmero de clulas en los moldes debido a que las clulas no se separan fcilmente. Por esta razn, el aumento de masa se utilizan para controlar el crecimiento. La distribucin de la edad y la morfologa de los moldes son ambos extremadamente importante para la cintica de los procesos de fermentacin. En algunos procesos slo las clulas viejas producir el producto, mientras que en otros procesos las clulas jvenes se requieren. Tpicamente, los moldes tienen ptimos limas duplicacin en masa de 4-8 horas, aunque algunos son reportados al doble en tan poco como 60-90 minutos. Actinomyces y Streptomyces son clases de organismos estrechamente relacionados con las bacterias que son extremadamente importantes industrialmente. Ambas clases tambin crecen como organismos micelos. 6.1.4 Virus Crecimiento Figura 6.2 Nutrientes y perfiles de producto de concentracin en una micelial pellet; si el producto se sintetiza en el centro de la pastilla del perfil se ver como (a), y si las clulas en el centro estn muertos o nutriente hambre, el perfil del producto puede aparecer como (b). Virus microbianos o fagos, no siguen los patrones normales de crecimiento. Requieren un organismo husped, que puede ser una bacteria, levadura, moho, o forma superior de la celda. Los virus son estructuralmente simple que consta de material gentico (ADN o ARN) incorporan normalmente en una vaina de protena. Ellos pueden existir como partculas de

virus individuales o se incorpora en el genoma de la clula husped. Para multiplicar, sin embargo, deben infectar una clula y utilizar las protenas de la clula y la sntesis de cido nucleico maquinaria para producir material viral nuevo. Como resultado de ello, un solo virus dentro de una clula puede ser replicado 50 a 300 veces antes de las rfagas de la clula y libera los virus recin formados. As, el crecimiento es exponencial / pero el exponente es mucho mayor que dos. crecimiento microbiano: una descripcin qumica El crecimiento puede ser considerado como una serie de reacciones qumicas que conducen a la sntesis de la masa celular. La frmula estequiomtrica generalizada de crecimiento puede ser escrito como; XXXXX donde A, B, D, P y Q son los moles de los compuestos respectivos, C0H6Oc es un generalizada de carbono-fuente de energa, y M es los moles de una unidad de clulas (Ca HpOy Nj). Por ejemplo una levadura tpica puede estar representada por C6H,, N03, por lo tanto la fraccin orgnica de la clula tiene un peso molecular de la unidad 145. Si la celda es 90% orgnico y 10% de ceniza, el peso de la frmula general de una celda unitaria es 145/0.9 = 161. De esta relacin estequiomtrica, se puede ver que la relacin de la masa celular formada por masa de sustrato consumido (M / / 1), se hace referencia como el rendimiento celular, depende de la eficiencia de la utilizacin de fuente de carbono para la incorporacin en la masa de clulas y para la combustin a dixido de carbono y agua para obtener energa para el crecimiento. Adems, a partir de este equilibrio es posible concebir una relacin entre el rendimiento de las clulas sobre el sustrato de carbono y la necesidad de oxgeno. Mateles (1971) deriva la siguiente expresin til para este propsito.

Figura 6.3 Oxgeno requisito versus rendimiento celular de los microorganismos cultivados en diferentes sustratos. Datos de la celda composicin son: O, 0,19; C, 0,53; N. 0,12; H, 0,07 para las bacterias y C 0 -47 'N. 0,075; O. 0,31; H, 0,065 para la levadura. Donde C, H y O son el nmero de tomos por molcula de sustrato y C, O ', N' y H 'son la fraccin de C, O, N y H en la clula, Y es el coeficiente de rendimiento celular (clula g / g de sustrato) para la fuente de carbono, y Mw es el peso molecular de la fuente de carbono. De esta expresin, es evidente que la demanda de oxgeno es inversamente proporcional a la produccin celular, que es una medida de la eficiencia de con-versin de la fuente de carbono a la masa de clulas. Esta relacin se muestra grficamente en la Figura 6,3 para el crecimiento en varios sustratos. 6.3 Mtodos para medir el crecimiento MICROBIANA Una amplia variedad de mtodos estn disponibles para medir el crecimiento microbiano, pero ningn procedimiento nico es aplicable en todas las situaciones. El mtodo de eleccin depende del objetivo de la medicin y en la utilidad de las tcnicas disponibles. En muchos

casos, especialmente las de fermentacin comercial, la media para el crecimiento y la formacin de productos son tan compleja (Solomons, 1969) que los mtodos directos para la estimacin del nmero de clulas mus no pueden usarse y son un medio para la evaluacin indirecta de mas celulares es NECESARIO (Calam, 1972). Sin embargo, no importa qu mtodo se usa, se requiere mucho cuidado en la interpretacin de los resultados. Xxxxxx no se escaneo bien Recuento viable. El nmero de clulas se mide frecuentemente por la concentracin de grmenes viables. Este mtodo emplea placas de Petri con agar que contiene un medio de crecimiento apropiado. El agar se propaga con muestras diluidas de los microorganismos de mantenimiento de cada muestra separada de su vecina. Estos cultivos de superficie se incuban durante 24 o ms horas hasta arco formado colonias discretas, cada uno derivado de una unidad formadora de colonias (CFU). Es importante distinguir entre un CFU de una sola clula. Si las clulas tienden a agregarse, forman cadenas, pseudomyeclia, o myeclia cierto, es difcil, o imposible, separar las unidades, y una UFC en realidad puede ser ms de una celda. Esta tcnica es muy til para las bacterias y la levadura y menos til para los moldes. Es necesario tener cuidado tambin con muchas levaduras, ya que pueden formar myeclia pseudomyeclia o verdadero cuando se cultivan bajo ciertas condiciones. Al realizar el recuento de viables, es necesario recordar que la viabilidad se define operacionalmente como la capacidad de crecer en un medio ambiente especfico. Por lo tanto, es necesario tener cuidado en la seleccin de un medio apropiado para el recuento de viables desde un mejor crecimiento de algunos medios de apoyo que otros. Esto es especialmente cierto cuando una poblacin contiene muriendo o mutando clulas. Slide Cultura. Una modificacin de la placa de recuento viable es la tcnica de deslizamiento de cultivo descrito en detalle por Postgate, et al. (1961). este procedimiento emplea un medio de agar gel colocado en un pequeo anillo montado sobre un micro diapositiva alcance. Clulas contado desde plaling sobre esta placa de cultivo en miniatura, la totalidad de la preparacin coloc en una incubadora. Despus de tres a cuatro veces de duplicacin, el portaobjetos se examinaron con un microscopio y el nmero total o microcolonias se divide por el nmero total de colonias de clulas que no se dividen ms para producir la fraccin de clulas viables. Este procedimiento tiene las mismas limitaciones que el recuento total en placa, pero es ms rpido que en slo unas pocas veces celulares duplicacin es necesario contar [vfore (3-4 horas en lugar de 24).

Coulter Counter. Un mtodo sofisticado para la determinacin de recuento total de clulas utiliza un contador Coulter (Gregg y ms enfermo, 1965). Un esquema de este dispositivo se muestra en la figura 6,4. Una muestra de cultivo diluido se coloca en el depsito de lquido que contiene un electrolito, y se aplica un vaco al tubo interior para tirar de un volumen predeterminado de lquido a travs del orificio pequeo. Un electricista cal potencial se aplica entre los electrodos, y como las clulas pasan a travs del orificio, la corriente aumenta la resistencia elctrica y legumbres en causas. Estos impulsos se cuentan entonces. Adems, la magnitud del cambio de resistencia es proporcional al tamao de las clulas, por lo que

mediante el uso de un analizador de altura de pulso, la distribucin de tamao de clula tambin puede ser medido. Una variedad de tamaos de orificio estn disponibles para el contador Coulter, y el tamao ms pequeo (30 / t) debe ser utilizado para las bacterias que son tpicamente 1-3 / t de dimetro. Este orificio se enchufa fcilmente por partculas de polvo o agregados de clulas. Las clulas ms grandes, tales como levaduras, protozoos o clulas de tejido se puede contar con ms xito con orificios grandes. No es sorprendente que la tcnica es difcil de usar con organismos en cadenas y es intil con organismos miceliales. \ Nephohmetry. Total de clulas o el nmero de partculas se puede determinar por nepholomelry. Esta tcnica emplea una fuente de luz en un ngulo recto a una clula fotoelctrica. A medida que la luz pasa a travs de la muestra lquida, la clula fotoelctrica mide la luz dispersada. Este procedimiento es til para la clula diluido y suspensiones de partculas.

6.3.2 Medicin de la masa celular: Mtodos directos Peso seco de la clula. El mtodo ms comn para medir la masa celular total es el de obtener el peso seco de clulas. Las muestras de caldo de cultivo entero se recoge, se centrifuga, se lava con tampn o agua, y luego se sec a 80 C durante 24 horas o a 110 C durante 8 horas. Para las clulas cultivadas en un medio libre de slidos, esta tcnica es aplicable en general. Sin embargo, si los slidos no celulares tales como carbonato de calcio, slidos de melazas, licor de maceracin de maz celulosa, o harina de soja estn presentes, no se eliminan en el lavado y en consecuencia contribuir al peso seco final. Cuando el carbonato de calcio es el nico material insoluble, es posible usar un lavado cido para disolver la sal y re moverlo de las clulas antes del secado. Incluso cuando los slidos no celulares estn presentes, si las clulas de peso es mucho mayor que las impurezas "peso, peso seco de clulas es todava til, aunque no es preciso. La turbidez. La densidad ptica o la turbidez de un caldo de cultivo es proporcional a la masa celular, este mtodo proporciona una forma sencilla, rpida y barata para estimar la masa de clulas en una base rutinaria. El cambio en la intensidad de la luz /, a travs de una distancia L est dada por: XXXXX donde e es el coeficiente de absorcin molar y C es la concentracin. Integracin de la ecuacin 8 rendimientos donde e 'es el coeficiente de extincin molar. Por lo tanto, un grfico de ln (/, / / 0) frente a la concentracin C dar lugar a una lnea recta con una pendiente-rL L se elige generalmente como CM. (/, / / 0) x 100 se define como T porcentaje de transmitancia y absorbancia es igual a log10 (L / T). Reordenando la ecuacin 8 para dar la absorbancia A. XXX

Por lo tanto, una grfica de absorbancia en coordenadas lineales frente a concentracin da una lnea recta. La turbidez de una suspensin de clulas se mide generalmente con luz a una longitud de onda entre 600-700 nm utilizando un espectrofotmetro o con luz a travs de un filtro rojo cuando se utiliza un colormetro. Es importante que no se salen del rango lineal del ensayo. La mayora de arco espectrofotmetros lineal hasta dos o ms unidades de absorbancia, una unidad de absorbancia es aproximadamente la mitad de un gramo de peso seco de clulas. KlettSummerson colormetros son lineales hasta aproximadamente 125 unidades klelt y tpicamente 250-300 unidades klelt es igual a un gramo de peso seco de clulas. Es importante cuando se utiliza como una medida de la turbidez de la masa de clulas para estar seguro de que los productos de fermentacin o de los componentes del medio no absorben la luz en la longitud de onda utilizada. Esta tcnica no es til si cantidades sustanciales de slidos no celulares estn en el medio. Cuando la turbidez se utiliza para las estimaciones de organismos filamentosos, a veces es necesario para homogeneizar la muestra en un mezclador Waring antes del anlisis.

6.3.3 Estimacin de la Masa Celular: Mtodos indirectos

Es evidente que la naturaleza del organismo y los componentes del medio afectan en gran medida la facilidad con que se puede medir la masa celular. En muchos casos, tales como el moho u otras fermentaciones micelio en el complejo de los medios de comunicacin los mtodos descritos son inaplicables y es necesario recurrir a mtodos indirectos para evaluar el crecimiento. La interpretacin de los mtodos indirectos para medir la masa celular se facilita por teniendo en cuenta el total stoichiom-tra para el crecimiento y formacin de producto, que puede estar escrita en una forma general: XXXX De esta ecuacin, es evidente que los mtodos para la medicin del consumo de nutrientes o la formacin de producto puede estar relacionada con el crecimiento microbiano. Componentes celulares. Un mtodo til para evaluar la concentracin de clulas es medir un componente macromolecular de clulas (por ejemplo, protena, ARN, ADN). Sin embargo, debido a que la proporcin de estos materiales en una clula puede cambiar con la cal, es necesario tener cuidado en la interpretacin de los resultados. Durante gruido exponencial con una tasa de crecimiento constante, la composicin de clulas es constante, como se muestra en la figura 6,5. Durante la primera parte y tarda de los cambios del ciclo de crecimiento de la composicin celular. El contenido de protena es bastante constante, mientras que el ARN vara dramticamente con la tasa de crecimiento. ADN, probablemente el ms constante, no se encuentra normalmente en los materiales no celulares aadidos como nutrientes. Anlisis de ADN es laboriosa (Burton, 1957), pero, en medios heterogneos complejos, donde la especificidad es necesaria para la medicin de la masa de clulas, es til. \

El anlisis del contenido de protena celular se merece una mencin. Los mtodos ms comunes son biuret (Stickland, 1951), Folin (Lowcry ct al., 1951), nitrgeno kjehdahl y anlisis total de aminocidos. Cada mtodo da un valor diferente para la protena celular ya que cada reaccin es diferente. Sin embargo: Figura 6,5 cintica de crecimiento celular y composicin macromolecular durante el curso de la fermentacin por lotes (Herbert, 1961). La reaccin de Biuret es muy til ya que principalmente mide enlaces peptdicos y hay poca o ninguna interferencia de otros componentes que contiene nitrgeno libras. Adems, es un procedimiento sencillo y rpido. anlisis elemental de las clulas tambin pueden ser empleados. La tcnica ms comn es el anlisis de nitrgeno total mediante el mtodo kjehdahl. Anlisis de carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y tambin es posible con un analizador elemental. El ltimo, sin embargo, requieren un equipo costoso y en todos los casos, es necesario separar las clulas de otros componentes del medio. Si la composicin elemental se determina que puede estar relacionado con el crecimiento a travs de la estequiometra presenta en la Ecuacin 6.

La captacin de nutrientes. Un enfoque alternativo para el anlisis celular es medir la eliminacin de un nutriente esencial del medio. Es deseable elegir un nutriente no susceptibles de ser utilizados para sintetizar un producto metablico. Fosfato, sulfato, o magnesio pueden ser candidatos probables. Cuando la masa de clulas es el producto principal, la fuente de energa de carbono u oxgeno son particularmente tiles para este propsito. Formacin de subproductos. Con frecuencia, los productos del crecimiento de clulas son tiles para la estimacin de crecimiento, adems de ser el principal objetivo de la fermentacin. Un producto comn, dixido de carbono, resultante de la oxidacin de la fuente de energa de carbono, se mide fcilmente con un analizador de gases infrarrojo, y puede estar relacionada estequiomtricamente para el crecimiento. Muchos arco fermentaciones anaerbicas caracteriza por la oxidacin incompleta de la fuente de energa de carbono y la acumulacin de productos tales como cido lctico o etanol. Es necesario tener cuidado, sin embargo, en estos productos en relacin con el crecimiento en que su formacin puede ser tanto el crecimiento y no crecimiento asociado. Un producto que es bastante general es el ion hidrgeno. Si in amonio se utiliza para la fuente de hidrgeno, a continuacin, por cada mol de amonio consumido,; i de iones hidrgeno se produce. Esta debe ser neutralizada para mantener constante pi I, y como consecuencia la cantidad de lcali aadido es proporcional al crecimiento. Si se utiliza nitrato de nitrgeno, se debe controlar la adicin de cido para la neutralizacin. Evolucin del calor. Un producto universal del crecimiento microbiano es el calor. Los microorganismos no violan las leyes de la termodinmica y el crecimiento pro-excede, el calor desprendido se. El calor de combustin de los microorganismos es bastante constante con un valor tpico de 5 kcal / g y la evolucin de calor depender de la eficiencia con la que se utiliza la fuente de energa de carbono. Este punto se discute en detalle ms adelante en este

captulo. Baste decir aqu que el calor es estequiomtricamente relacionados con el crecimiento y formacin de producto. Varios mtodos de medicin de calor existen, pero los ms adecuados para su uso con fermcnlors dos son un balance de energa en el agua de refrigeracin y la tcnica de calorimetra dinmica (Cooncy et al .. 1968). Cuando un balance de energa est escrito para una fermentacin, la siguiente ecuacin se obtiene: Xxxxx donde Q3 es la acumulacin neta de calor Q es el calor de la fermentacin 03f es el calor de la agitacin Ocvar es el calor de la evaporacin 0 ^. N es la cura sensible en la corriente de aire y Q Mr, es el sanar disipado al ambiente a travs de las paredes del fermentador. Qfen es generalmente mucho menos de ,. Y pueden despreciarse. Qcv3p pueden ser eliminados mediante el uso de aire saturado con agua a la temperatura de la fermentacin, o puede ser calculada a partir de la parte hmeda y seca temperaturas de bulbo de la entrada y salida de gas. GGC + Qiu "puede ser medida antes de la inoculacin del cultivo a diferentes valores de velocidad de agitacin y flujo de aire. Con la informacin dada aqu, el calor de la fermentacin puede ser medida continuamente. Calorimetra dinmica emplea el fermentador todo como un calormetro adiabtico. Para medir el calor de la fermentacin, el control de temperatura se apaga y la temperatura se dej subir por 0.5-1.0 C. La acumulacin de calor se calcula entonces a partir de la pendiente de la curva de temperatura-cal (TA / FA) y la capacidad trmica total del sistema Cp en kca / C como se muestra en la Ecuacin 14: Xx Un enfoque alternativo es medir la velocidad de flujo (w), entrada (;? "), Y la salida (Toul) temperaturas del agua de refrigeracin. Esto es difcil de hacer en fermentadores pequeos y es ms til cuando la relacin de superficie a volumen del recipiente es pequeo. El balance de energa en el agua de refrigeracin puede ser escrito: Xxx donde Cp es el calor especfico del larguero. Los valores tpicos para cada uno de los trminos de calor en un proceso de fermentacin se presentan en la Tabla 6,1. As temprano en el error fermentacin sustancial puede ocurrir, pero como la tasa de evolucin de calor aumenta el mtodo se vuelve cada vez ms til.

Tabla 6,1 magnitudes relativas de los trminos del balance de energa durante una fermentacin de Bacillus subtilis en melaza (de Cooney et al. 1968) Xx Embalado - Volumen Cell. Un mtodo frecuentemente utilizado para la estimacin de la masa de clulas en las plantas industriales es el volumen del concentrado de clulas. Esto se determina mediante centrifugacion una muestra de caldo completo bajo condiciones estndar de rotacin y de cal en un tubo cnico, graduado. El volumen ocupado por los slidos es entonces indicativa de la masa de clulas. Afortunadamente, existe poca variacin de la densidad de las clulas con el tiempo (tpicos gravedades especficas son 1.5 a 1.1). Este procedimiento es til cuando los slidos extraos estn presentes debido a que frecuentemente instalarse ms rpidamente que las clulas y su volumen se puede detectar visualmente y se resta del total. Viscosidad. Las mediciones de la viscosidad del caldo son tiles en muchas fermentaciones comerciales. Por ejemplo, con el crecimiento del micelio o polisacrido formacin hay aumentos sustanciales en la viscosidad del caldo en el curso de la fermentacin. Lamentablemente, estos caldos son por lo general no newtoniano en su comportamiento, y las determinaciones reales de viscosidad requieren la medicin de la tensin cortante en varias velocidades de corte. Sin embargo, la viscosidad aparente medido como una velocidad de cizallamiento fijo se puede utilizar para estimar celular o la concentracin de producto. Cuando la fuente de energa de carbono es un polmero tal como almidn o celulosa, la viscosidad del caldo de fermentacin bacteriana o por levaduras disminuye con el tiempo y es proporcional al crecimiento y la actividad de hidrlisis en el caldo de cultivo. Tambin se ha demostrado que la viscosidad se puede utilizar para los organismos unicelulares en la ausencia de formacin de polmero o utilizacin. La figura 6.6 muestra el efecto de la concentracin de levadura de la viscosidad del caldo completo. Viscosidad / tc est relacionada con la presin AP gota a travs de un canal delgado por la relacin la gravedad especfica, GC es la constante gravitacional, L es la longitud del canal, y Q es el caudal volumtrico de lquido. ATP Medicin. Trifosfato de adenosina (ATP) es un comn intermediario de energa qumica utilizada para el crecimiento y la biosntesis de vida organismos. Su presencia es exclusivo de las clulas y su concentracin por unidad de masa celular es aproximadamente constante para un organismo dado. Por lo tanto, el anlisis de ATP puede ser til para detectar las clulas vivas cualitativamente y cuantitativamente medir la cantidad presente de la masa de clulas. El mtodo utilizado para detectar ATP se basa en la reaccin catalizada por la luciferasa, luciferina en la que se oxida a expensas de oxgeno y ATP y un fotn de luz se evolucionado. Mediante la medicin de la emisin de luz total, la cantidad total de ATP puede medirse en presencia de luciferina y el exceso de oxgeno. Mtodos para la deteccin de la luz, por ejemplo, los fotmetros o contadores de centelleo, son muy sensibles y pueden detectar hasta 10 ~ 12 g de ATP por litro. El contenido de ATP de una clula bacteriana es de aproximadamente 1 mg de ATP / g de peso celular seco. As nmeros pequeos de clulas vivas se detectan fcilmente.

6.4 Cintica del crecimiento microbiano y formacin de producto Crecimiento, que se caracteriza por un aumento en la masa de clulas y / o nmero, slo se produce cuando ciertas condiciones qumicas y fsicas son satisfechas, tal como temperatura y pH aceptables, as como la disponibilidad de los nutrientes requeridos. La cintica de crecimiento y formacin de producto refleja la capacidad de la clula para responder al medio ambiente y aqu reside la lgica de un estudio de la cintica de crecimiento. Cintica del crecimiento celular Una curva de crecimiento lote tpico para un microorganismo que crece en un medio definido qumicamente se ilustra en la figura 6,7. Generalmente, el crecimiento se mide por la valoracin de la masa de clulas, y a menos que se especifique lo contrario este se supone que es el caso. Esta curva de crecimiento se ve que tiene tres fases: una fase de latencia, una fase de crecimiento exponencial, y una fase estacionaria. La fase de retardo sigue inoculacin del medio nutriente y es un periodo de adaptacin. Cuando un cultivo microbiano se desplaza de un medio a otro, es necesario reorganizar ambos constituyentes sus micro y macromolecular. Esto puede implicar la sntesis o la represin de las enzimas o componentes estructurales de la clula. Como consecuencia de ello, la fase de retardo puede ser muy corta o larga bastante. Durante esta fase la masa de clulas puede cambiar sin un cambio en el nmero de clulas. Tambin puede haber una fase de retardo aparente o pseudo cuando el inoculo es pequeo o tiene baja viabilidad, ya que el crecimiento slo puede ser registrada por encima del nivel de sensibilidad del mtodo de anlisis. Por ejemplo, si la poblacin celular inicial es de 105 clulas / ml y la turbidez se utiliza para medir el crecimiento, el crecimiento no ser perceptible hasta aproximadamente 107 clulas / ml estn presentes. Este es el punto de turbidez visible. Una vez que las alteraciones necesarias se han completado, las clulas se mueven en la fase de crecimiento. Esto es por lo general el crecimiento exponencial o registro, aunque algunas excepciones se presentan ms adelante. Figura 6.7 cintica de fermentacin por lotes que muestran las tres fases de crecimiento. La curva (a) representa la masa de clulas en ausencia de lisis, (b) la masa de clulas cuando se produce la lisis y es seguido por el crecimiento crptico, y (c) de clulas viables contar cuando se produce la lisis celular. La fase de registro se caracteriza por una lnea recta en una grfica semilogartmica de la ln X vs tiempo. Este es un periodo de crecimiento equilibrado viciado o estable durante el cual la tasa de crecimiento especfico / t es constante. A lo largo de la fermentacin la composicin qumica del caldo est cambiando desde el arco nutricnls se consume y productos metablicos se han fabricado. Como consecuencia, el medio ambiente no es constante en la pizarra. En un rango de concentracin de nutrientes, la tasa de crecimiento es independiente de la concentracin. Adems, durante la fase de registro, la composicin macromolecular de clulas permanece constante; esto se ve claramente en la Figura 6,5 mostrando composicin de clulas, el tamao y el crecimiento durante las tres fases de fermentacin por lotes. En algn momento, la tasa de crecimiento empieza a disminuir, ya sea a causa del agotamiento de un nutriente esencial, o porque se acumula un producto inhibitorio. Sin embargo, las clulas pasan por una transicin hasta que la tasa de crecimiento neto es cero.

Esta fase estacionaria se produce cuando las clulas han dejado de dividirse, o cuando las clulas viables se han alcanzado el equilibrio con las clulas muertas, es decir, con la tasa de muerte. Tras incubacin varias cosas tienden a suceder. A pesar de que el crecimiento neto se ha detenido, puede haber todava metabolismo y la acumulacin de productos en la clula o en el caldo. La masa total de clulas pueden permanecer constante [fig. 6,7 (a)], pero el nmero de clulas viables es probable que caiga [fig. 6,7 (c)]. Alternativamente, a medida que disminuye la viabilidad, la lisis celular puede producirse [fig. 6,7 (b)] y la masa celular se caiga. Esto conduce a la creacin de un medio complejo de productos de lisis, y un segundo periodo de crecimiento, llamado crecimiento crptico, puede seguir. Con frecuencia, no esenciales metabolitos secundarios estn formados por sistemas de enzimas no presentes anteriormente o funcionamiento en la clula. Tambin, como se muestra en la Figura 6,5, la composicin macromolecular de la clula es probable que cambie desde las demandas metablicas de la clula son diferentes que durante el crecimiento. Esas clulas capaces de esporulacin (por ejemplo, especies de Bacillus o Clostridia) pueden formar esporas en respuesta al entorno restrictivo. 6.4.2 Tasa de crecimiento frente a la concentracin de nutrientes Durante ms de una fermentacin de lote tpico de la tasa de crecimiento especfico es con constante e independiente de la concentracin variable de nutrientes. Sin embargo, la tasa de crecimiento, como una velocidad de reaccin qumica, es una funcin de la concentracin qumica con . Los qumicos en este caso son los nutrientes esenciales o sustratos para el crecimiento. La forma de la relacin entre la tasa de crecimiento y sub concentracin estrategias se observ por Monod (1949) es similar a la cintica de saturacin exhibidos por adsorcin monomolecular. Por lo tanto, un modelo (Fig. 6,8) similar a la de Langmuir monomolecular isoterma de adsorcin se aplic al crecimiento. Este modelo, el modelo de Monod, tiene la forma: XXXX donde U es la Umax tasa de crecimiento especfico es la tasa mxima de crecimiento especfico, S es la concentracin de sustrato, y Ks es una constante igual a la concentracin de sustrato cuando / t = 0.5/tniax. Los valores tpicos de Ks son bastante pequeas como se ve por los valores de la Tabla 6,2. Esto significa que / i ~ xxx cuando S> \ 0Ka y no es hasta que S <10 / C, que la tasa de crecimiento especfico se convierte en una funcin fuerte de la concentracin de sustrato. Debido a que el valor de Ks es baja, la tasa de crecimiento especfico durante la fase de registro es constante. La transicin de registro a la fase estacionaria es por lo general bastante rpida o brusca, ya que en el momento en el sustrato S residual es bajo, la alta concentracin de clulas rpidamente utiliza el sustrato restante. Por esta razn, es muy difcil de estimar valores de Ks en fermentaciones cultivo discontinuo. Es posible sin embargo, para emplear cintica de velocidad inicial donde los bajos niveles iniciales del sustrato y se emplean cuando la tasa de crecimiento inicial se mide

antes de la concentracin de sustrato cambia de manera significativa. Esto se debe hacer con recuentos de placas viables o algn otro mtodo muy sensible. El mtodo habitual para medir los valores de Ks es emplear continuo, la cultura como se discuti en el Captulo 7. El modelo de Monod se basa en observaciones empricas pero frecuentemente se racionaliz por analoga con Michaclis-Menton cintica enzimtica (Lchningcr, 1975) con la hiptesis de que una sola rale enzima limitante catalizada paso controla la tasa de crecimiento. Adems, algn significado fsico y biolgico se puede atribuir a las dos constantes Umax) es la tasa mxima de crecimiento especfico en un medio qumico determinado a la temperatura especificada y PLL, y Kx es inversamente proporcional a la afinidad del microorganismo por su sustrato. Muchos otros modelos han sido propuestos para la tasa de crecimiento se refieren a la concentracin de sustrato (vase Powell, 1967), pero el modelo de Monod se utiliza ms comnmente.

6.4.3 Crecimiento Celular y rendimientos de productos Crecimiento y formacin de producto por microorganismos son procesos de bioconversin en el que los nutrientes qumicos alimentados a la fermentacin se convierten a la masa celular y metabolitos. Cada una de estas conversiones pueden ser quantitized por un coeficiente de rendimiento expresado como la masa de clulas o de producto formado por unidad de masa de nutrientes consumidos, Yxts y YPIS para las clulas y de productos, respectivamente. As, el coeficiente de rendimiento representa la eficiencia de conversin. El significado de los rendimientos celulares y el producto pueden verse a partir del examen de la estequiometra para el crecimiento y formacin de producto: Xxxx El coeficiente de rendimiento celular en la fuente de energa de carbono se convierte en: XXX donde r es la fraccin de masa celular representada por ceniza (por ejemplo, r ~ 0.07-0.10). El rendimiento del producto de una manera similar se convierte en: XXX Tanto en las Ecuaciones 19 y 20, trminos IHE en parntesis los pesos moleculares de arco. La manera usual de los rendimientos de clculo es medir la masa de clulas o producto producido y el sustrato consumido durante un perodo de tiempo y calcular: XXX Los valores anteriores representan observados coeficientes de rendimiento. Es posible calcular los rendimientos tericos de la masa celular y los productos de los respectivos sustratos esenciales. Aunque mucha discusin todava se realiza en el sentido de los rendimientos tericos celulares, todava proporcionan una gua con la que disear experimentos y evaluar los resultados.

Hay dos mtodos comnmente utilizados para el clculo de los rendimientos tericos celulares en la fuente de carbono y energa, uno se basa en los electrones disponibles y el otro sobre el concepto de un rendimiento constante en el ATP (trifosfato de adenosina). El nmero de electrones disponibles se encuentran fcilmente multiplicando por cuatro moles de los 02 requeridos para oxidar completamente un compuesto de carbono orgnico en dixido de carbono y agua. Por ejemplo XXXXXX Por lo tanto, la glucosa tiene 24 electrones disponibles. Mayberry et al. (1967) encontraron que el rendimiento medio de la masa de clulas por electrn disponible es 3,14 0,11 independientemente de sustrato o un organismo, cuando se usa amonaco como fuente de nitrgeno. Bauchop y Elsdon (I960) originalmente propuesto el uso de un rendimiento de ATP> AT (, basado en la observacin de que muchos de los microorganismos se derivan del catabolismo de ATP con la misma eficiencia, como consecuencia de un valor de 10,5 g de clulas / mol de ATP producido ha sido utilizado como una constante para la estimacin de los rendimientos celulares tericas. Variacin del valor se ha observado y demostrado ser dependientes de las condiciones para el crecimiento y la demanda de mantenimiento celular (Siouthamer y Bettenhausser, 1973). Sin embargo, cuando algn conocimiento de la ruta catablica existe , este es un mtodo til para estimar el rendimiento celular. Variacin de valor de rango VATP 6 a 29. Estimacin de los rendimientos del producto requiere algn conocimiento de la estequiometra de la formacin de producto. En el caso de los productos directos catablicos de la glucosa, tales como etanol, la estequiometra es conocido: Xxxxx por lo tanto la conversin mxima es de 2 moles de etanol / mol de glucosa o glucosa 0,51 g / g. En la prctica, los rendimientos tericos no se puede lograr ya que parte del sustrato entra en la masa celular, pero con frecuencia se puede obtener cerca. Los rendimientos de 90 95% de la terica se puede conseguir fcilmente para la produccin de etanol. La estequiometra es ms complejo para productos tales como aminocidos y antibiticos y la evaluacin del rendimiento terico es ms difcil. Sin embargo, se puede resumir la secuencia de reacciones que conducen a la formacin de producto. Este enfoque se ilustra por Cooney y Acevedo (1977) para la sntesis de penicilina a partir de glucosa, amonaco y sulfato. Uso de la va postulado por Domain (1974) para la conversin: Xxxx donde el cido fenilactico se aade exgenamente, y conociendo las vas de cistena y valina, el rendimiento terico de la penicilina a partir de glucosa se calcul en II penicilina g / g de glucosa. Mientras que este rendimiento no tiene en cuenta el uso de la glucosa para la sntesis de la masa de clulas o de mantenimiento, documentos de proporcionar un punto de referencia para evaluar la eficiencia de la fermentacin.

6.4.4 Cintica de la utilizacin de los nutrientes y la formacin de producto En el principio de este captulo, el crecimiento fue descrito primero en trminos de una simple ecuacin de primer orden y luego tasa relacionada con la utilizacin del sustrato a travs de una relacin estequiomtrica. Formacin de producto metablico puede ser igualmente relacionada con el consumo de nutrientes. Adems, la formacin de producto no puede ocurrir sin la presencia de clulas. As, se espera que el crecimiento y formacin de producto estn estrechamente acoplado a la utilizacin de nutrientes y que, dependiendo de los controles de regulacin metablica, la formacin de producto se acoplar al crecimiento y / o la concentracin de la masa de clulas. Esto se ve en las siguientes ecuaciones de balance de materiales para el crecimiento, la utilizacin del sustrato, y la formacin de producto: Crecimiento. Xxxx Sustrato utilizacin. Xxx Estas ecuaciones son adecuados tanto para fermentaciones en estado estacionario y no estacionario rancios. Sin embargo, en el ltimo caso, su solucin explcita es difcil. Si no hay alimentacin de sustrato o la retirada de producto desde el proceso, entonces la ecuacin 24 para la utilizacin de la fuente de carbono y energa se convierte en: Xxx y se hace evidente que la fuente de carbono, que es generalmente el componente de medio ms costoso, entra en la sntesis de la masa de clulas y mantenimiento, as como la sntesis del producto. Reordenando esta ecuacin, donde qs es la tasa especfica de la utilizacin del sustrato, la interrelacin de crecimiento, el mantenimiento y la sntesis de producto se ve. Dos trminos que se presenta aqu, las tasas volumtricas y especficas. Las unidades son g / lhr para las tasas volumtricas y g / g de clulas en serie hr para la tasa especfica. El caudal volumtrico Q es dependiente de la concentracin de la masa de clulas y es de gran inters para el gerente de la planta de fermentacin ya que describe la tasa de producto de sntesis o de la demanda de materiales por unidad de capacidad fermentador. La tasa especfica q es independiente de la concentracin de la masa de clulas y describe la eficacia de las clulas en la sntesis del producto o la utilizacin del material. Tasa especfica es especialmente til para comparar los resultados entre las fermentaciones para evaluar cual es la ms efectiva. La relacin entre la cintica de crecimiento y formacin de producto depende de la funcin del producto en el metabolismo celular. Los dos patrones cinticos ms comunes son aquellos que describen la sntesis de productos durante el crecimiento y el crecimiento despus de haya cesado. Un tipo menos comn, se aplica al caso en que el crecimiento se produce inicialmente

sin la formacin de producto pero despus de algn periodo el producto comienza a aparecer, mientras que el crecimiento contina. Estos patrones cinticos se il'ustrated en la Figura 6.9. Figura 6,9 patrones cinticos de crecimiento y formacin de producto en fermentaciones en lote: (a) formacin de crecimiento asociada a producto. (b) mezclado - crecimiento asociada a la formacin de producto, y c) no crecimiento - formacin asociada producto. Productos sintetizados en una forma asociada a crecimiento son generalmente productos directos de una va catablica, tales como la fermentacin anaerbica de la glucosa a etanol. O que son producidos como metabolitos intermediarios normales tales como aminocidos o vitaminas. La tasa de produccin de metabolitos primarios relacionados directamente con el crecimiento viene dada por Xxxx donde YPLC es el gramo de producto por gramo de clulas. La tasa especfica de formacin de producto se puede definir como Xxxx junto con la tasa de crecimiento especfico t /, se representa en la figura 6.10 para ilustrar] a sus relaciones para el perfil cintico. Figure 6.10 Relationship of specific growth rate /i and specific product synthesis rate </,, for (a) growth-associated, (b) mixed-growth -associated. and (c) non growth-associated product fermentations. En algunas fermentaciones, el crecimiento y la formacin de producto son slo parcialmente;. Vinculado (mixto crecimiento asociado). Un ejemplo de esto es el cido lctico de fermentacin descrito por Lucdeking y Piret (1959). Se encontr que la tasa de formacin de producto fue descrito por: Xx , Despus de dividir por X: Xx As, hay un crecimiento y no crecimiento trmino-asociado. Este modelo tiene una utilidad general para cualquier crecimiento fermentacin mixta. Cuando el producto se asocia con el metabolismo de la energa como un calabolite de la fuente de carbono (PIRT, 1975), tambin se puede escribir: Xxx relacin formacin de producto y el consumo de fuente de carbono xxx

De esto se puede ver que A y B de la ecuacin 32 se relacionan con YP / S / YXIS y Vp / s / n, respectivamente. Productos no-crecimiento asociado estn histricamente llamados metabolitos secundarios ya que son producidos secundaria para el crecimiento. Mientras que todos los productos nocrecimiento asociados pueden ser llamados metabolitos secundarios, todos los metabolitos secundarios no son necesariamente no-crecimiento asociado. Por lo tanto, es importante definir metabolitos secundarios como productos de fermentacin no necesarias para el crecimiento del organismo. Ejemplos de productos que no incluyen el crecimiento asociado a la mayora de los antibiticos y toxinas microbianas. La tasa de produccin de estos materiales es difcil de relacionar con el crecimiento o porque la disociacin de crecimiento y formacin de producto. La tasa especfica de produccin, sin embargo, todava est dado por la Ecuacin 25 y tambin se representa en la figura 6,10. Esta tasa especfica es la forma ms til para expresar y comparar los datos debido a que el efecto de la concentracin celular se elimina. Adems, si las tasas de utilizacin de los nutrientes se expresan de la misma manera, es fcil para calcular los rendimientos de conversin. Por ejemplo, el rendimiento de producto de los yps fuente de carbono se calcula Crecimiento mixto, asociados no crecimiento-productos son algo ms difciles de describir analticamente, y los mdulos de frecuencia empricos se derivan para este propsito.

6,5 PRODUCTIVIDAD EN LOS PROCESOS DE FERMENTACION DE LOS LOTES

Productividad volumtrica se expresa como gramos de producto por litro por hora y es una medida del rendimiento global de un proceso. en un proceso por lotes es necesario para calcular la productividad durante el tiempo de procesamiento completo, que incluye no slo el tiempo de fermentacin, sino tambin el tiempo requerido para vaciar el fermentador de la ejecucin anterior, lavar el recipiente, y por lotes y esterilizar nuevo medio. Este intervalo de tiempo puede ser tan corto como seis horas en la fabricacin de levadura o tanto como 20 horas en la produccin de antibiticos. Una composicin tpica del ciclo de fermentacin total se muestra en la Figura 6,11. La productividad general est representada por la pendiente de una lnea desde el origen hasta el punto de terminacin de la fermentacin. La productividad mxima viene dada por una lnea similar a travs del origen, sino tangente a la curva de crecimiento, lo que ocurre en una clula o concentracin de producto menor que la mxima. Figura 6.11 La productividad en cultivo discontinuo: t,. r ". y son el cambio cultural, retardo y tiempos de retardo, respectivamente: Xxx El tiempo total para la fermentacin puede ser calculada a partir de la Ecuacin 37

donde Ft, t,, y f0 son el cambio de tendencia, retardo, y el retardo (por ejemplo, para la dosificacin medio y esterilizacin) limes muestra en la Figura 6,11, A'0 y A ', - son las concentraciones celulares iniciales y finales. Por lo tanto, la productividad total P viene dada por la Ecuacin 38 De esta ecuacin, es posible determinar los efectos de los cambios del proceso en la productividad global. Un tamao del inculo grande aumentar la A'0 y acortar el proceso. Disminuir el tiempo de respuesta o tiempo de retardo del mismo modo se acorta el ciclo, as como el uso de un cultivo en crecimiento activo de arranque para eliminar la fase de latencia. Si un ciclo de fermentacin es corto (por ejemplo, 18-48 hr), tal como por la levadura de panadera o la produccin de cido glutmico, los tiempos de respuesta son importantes para la productividad global. Por otro lado, con fermentaciones largas (por ejemplo, 150-200 hr), como en la produccin de antibiticos, una diferencia de unas pocas horas es de poca importancia. 6.6 EVOLUCIN DE CALOR DURANTE LA FERMENTACIN La evolucin de calor durante los procesos de fermentacin est estrechamente relacionada con la utilizacin de la fuente de carbono y energa. Cuando la fuente de carbono est siendo activamente incorporado en la masa de clulas a travs de crecimiento, tpicamente alrededor de 40-50% de la entalpa disponible se conserva en la biomasa, y el resto es emitido en forma de calor. Por otro lado, cuando la fuente de carbono est siendo metabolizada por el mantenimiento de clulas, todos de la entalpa asociada con la combustin se libera en forma de calor. Si un producto se est formando, a continuacin, el calor desprendido por unidad de fuente de carbono es metabolizado entre los dos extremos. As, la cantidad de calor est relacionado con la estequiometra para el crecimiento y formacin de producto, mientras que la tasa de evolucin de calor es proporcional a la cintica del proceso. El inters en la evolucin de calor se deriva de la necesidad de eliminar durante el proceso de fermentacin y de la utilidad de calor como un indicador de la actividad metablica. Durante el crecimiento activo cuando el requisito de mantenimiento es bajo, la evolucin de calor es directamente proporcional a la sntesis de la masa de clulas (vase la ecuacin 6). Como se seal en la seccin (6.2.2), esto proporciona un mtodo para la medicin de la masa de clulas en presencia de slidos no celulares sin requerir una muestra fermentador. Durante un perodo de poco o ningn crecimiento, tales como la fase estacionaria, cuando el mantenimiento de la actividad metablica es dominante, la evolucin curar se desacopla de crecimiento, pero todava es una medida de la fuente de carbono y energa que se cataboliza. Esto se muestra en la Figura 6,12, que es un grfico del calor total desprendido durante la fermentacin. La zona inferior representa la entalpa conserva en la masa celular y el rea sombreada es la entalpia liberada como calor durante la fase estacionaria. Estos resultados son para una fermentacin de Streptomyces novobiocina por nivalis (Mou y Cooney, l976). Desde el rea sombreada de la proporcin de mantenimiento puede ser calculado en 0,104 kcal / g de clulas - hr.

Figura 6.12 Evolucin de carne durante la fermentacin de Streptomyces nirem. El rea sombreada representa el calor desprendido por la cultura y el mantenimiento del rea libre es la entalpa conserva en la masa de clulas Figura 6,13 Correlacin de evolucin de calor con el consumo de oxgeno para una variedad de fermentaciones microbianas. El calor de combustin de la glucosa es 3,7 kcal / g, por lo que el trmino mantenimiento se convierte en 0,028 g de glucosa / g de clulas-hr, que es tpica de los valores obtenidos por otros trabajadores de mantenimiento (PIRT, 1975). xxxxxx Calor evolucin Qf (kcal / litro-hora) tambin se ha demostrado por Cooney et al. (1968) para ser relacionado con la tasa de consumo de oxgeno (Q0. (m moles / l h-)) a travs de la correlacin Xxxx Esta expresin es vlida en general y se muestra en la Figura 6,13 para una variedad de microorganismos que crecen en diferentes sustratos. 6.7 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN LA PRESENCIA DE FUENTES DE CARBONO Y MLTIPLES MEDIOS COMPLEJOS la curva de crecimiento se muestra en la Figura 6,7 es tpico del patrn para el cultivo de microorganismos en un medio definido con un nico carbono y fuente de energa. La velocidad a la que una clula crezca es muy dependiente de la naturaleza de esta fuente de carbono tal como se ilustra en la Tabla 6,3 para E. coli. en crecimiento por lotes en presencia de ms de una fuente de carbono y energa, por lo general slo uno de los sustratos de carbono se utiliza a la vez, un ejemplo comnmente citado es el crecimiento de microorganismos en un medio que contiene glucosa y lactosa. La cintica de crecimiento y la utilizacin del sustrato se muestran en la Figura 6,14. Este tipo de comportamiento con dos fases de crecimiento se llama crecimiento diauxic. La glucosa, la fuente de carbono ms fcilmente utilizada, se utiliza primero y ejerce la represin catablica en la utilizacin de lactosa. Si muchos sustratos de carbono estn disponibles en el medio, una serie de fases de crecimiento dar como resultado, cada uno con una tasa de crecimiento disminuye sucesivamente. En un medio complejo en el que no slo hay mltiples fuentes de carbono, sino tambin una amplia variedad de compuestos, tales como aminocidos, nucletidos, vitaminas y otros intermediarios metablicos, las clulas pasan a travs de muchas transiciones Figura 6,14 crecimiento por lotes en presencia de dos fuentes de carbono y energa (. S, y S,) showing.diauxic cintica. Figura 6.15 Cintica de crecimiento en medios complejos que muestran sucesivamente decrecientes tasas de crecimiento como el medio se agota de nutrientes.

durante el crecimiento. Cuando las clulas se cultivan en presencia de compuestos intermedios prefabricados, los sistemas de enzimas para la sntesis de estos compuestos no se realizan hasta que los compuestos se utilizan plenamente. Por lo tanto, a medida que avanza el crecimiento en medios complejos, la clula sucesivamente agota el medio de intermediarios tiles y por lo tanto necesita para sintetizar sistemas ms y ms enzima con el tiempo. As como los intermedios formados previamente y nutrientes ms fcilmente utilizados se agotan, la tasa de crecimiento disminuye. El resultado es la curva de crecimiento se muestra en la Figura 6,15 donde las clulas no parecen crecer exponencialmente. En realidad, la curva se compone de una serie de curvas exponenciales, tal como se muestra por las lneas discontinuas, cada una con una pendiente decreciente a medida que avanza el tiempo. Esta forma de la curva de crecimiento es bastante comn en las fermentaciones industriales que generalmente emplean medios complejos para el crecimiento y formacin de producto.

6,8 MICROBIANA CRECIMIENTO Y SU RELACIN CON EL MEDIO AMBIENTE La capacidad de un microorganismo para crecer y sintetizar productos en un ambiente dada est determinada por las caractersticas genticas del organismo. El desarrollo exitoso de los procesos de fermentacin es primero dependiente de la obtencin de buenas cepas mediante la seleccin y mutacin, y segundo en dilucidar el efecto de los parmetros ambientales en el crecimiento celular y la formacin de producto. El objetivo aqu es examinar algunas respuestas comunes de microorganismos y su medio ambiente. 6.8.1 Efecto de la Temperatura El crecimiento microbiano y la formacin de producto son el resultado de una compleja serie de reacciones qumicas. Al igual que todas las reacciones qumicas, que estn influenciados por la temperatura. El crecimiento puede ser descrito por: Xxxx donde a es la rale muerte especfica. As, la tasa observada growlh especfica (\ / X) TLX / (LT es un equilibrio de crecimiento y muerte. Listo microorganismos se cultivan cuando un ft y-J. Puede despreciarse. Sin embargo, ya que tanto U y una es probable que la temperatura sea dependiente de ambos sern considerados aqu. Tres curvas tpicas de temperatura de crecimiento cansan ilustra en la Figura 6.16. Estas curvas corresponden a crecimiento psicrfilo, mcsophilic, y termfilas. Aunque hay excepciones individuales, la mayora de los microorganismos slo crecer en un rango de temperatura de 20-30 C. Adems, la mayora de los microorganismos caer en uno de estos patrones. Aquellos con una temperatura de mxima tasa de crecimiento por debajo de 20 "C son psicrfilo, aquellos alrededor de 30-35 C son mesfilas, y aquellos por encima de 50 C arco termfilo. Las curvas son iguales en forma. Cuando la temperatura se incrementa hacia la temperatura ptima de crecimiento, la tasa de crecimiento se duplica en un rango de 10 C. Por encima de la temperatura ptima de crecimiento, tasa de crecimiento disminuye rpidamente al aumentar la temperatura. La razn de este patrn caracterstico se ve fcilmente por el

trazado de la tasa mxima de crecimiento especfico para cada temperatura en un grfico de Arrhenius (por ejemplo en Umax vs T-1. Donde T es el absoluto Figura 6,16 Crecimiento tpico versus las relaciones de temperatura para psicrfilos, mesfilos y termofilos. Figura 6,17 grfico de Arrhenius de crecimiento versus absolutos de temperatura aerogenes Enterobacter {lor-A -) y Candida utilis (-O-).

temperatura K) como se muestra en la Figura 6,17. La porcin decreciente de la curva (por encima de la temperatura ptima) es una consecuencia de una tasa de mortalidad creciente. Tanto el crecimiento y la muerte puede ser descrito por la relacin de Arrhenius: xxxx y xxxxx donde A y A 'son constantes, EA y " son las energas de activacin, R es la constante de los gases (R = 1,98 cal/mole- K) y T es la temperatura absoluta ( K). Energas tpicas de activacin para el crecimiento son 15-20 kcal / mol y para la muerte de 6070 Kcal / mol. As, la tasa de mortalidad es mucho ms sensible a la temperatura que es la tasa de crecimiento. El significado fsico de las energas de activacin no es obvio ya que no sabemos en qu cantidad molar se refieren. Sin embargo, la relacin de Arrhenius todava es extremadamente til como un medio de calcular los efectos de temperatura. La formacin de producto por microorganismos es tambin dependiente de la temperatura de una manera similar al crecimiento. Sin embargo, la temperatura ptima para el crecimiento y formacin de producto no son necesariamente los mismos y deben examinarse por separado. As pues, un compromiso puede ser necesario. Figura 6,18 rendimiento celular en metanol para un cultivo mixto de bacterias (tomado de Sncdecor y Cooney, 1974). La temperatura tambin puede afectar a otros aspectos importantes del crecimiento microbiano. En la produccin de biomasa o de protena unicelular, es esencial para lograr la conversin mxima del substrato a la masa celular. As, el coeficiente de rendimiento celular es una preocupacin primaria. Este coeficiente de rendimiento de la temperatura, se muestra en la Figura 6,18 para las bacterias que crecen en metanol. Por lo tanto, es la relacin temperatura-rendimiento que es probable que se determine la temperatura de operacin. La principal razn para la disminucin en el rendimiento celular aumento de la temperatura es el aumento de los requisitos de mantenimiento. El coeficiente de mantenimiento aumenta al aumentar la temperatura con 15-20 kcal / mol energa de activacin. Como consecuencia de ello, como la temperatura de crecimiento se incrementa, la utilizacin de la fuente de carbono y energa de mantenimiento aumenta.

La temperatura tambin afecta a los procesos controlados por difusin. difusin Molecular se caracteriza por una energa de activacin de aproximadamente 6 kcal / mol. De hecho, cuando el crecimiento o formacin de productos exhiben una dependencia de la tempera tura de menos de 10 kcal, no hay razn para sospechar limitaciones difusionales en el proceso. 6.8.2 Efectos del pH PH del medio, es un parmetro importante que afecta el crecimiento y formacin de producto. La mayora de los organismos funcionarn en un rango de pH de 3-4 unidades de pH. El pH para la mxima tasa de crecimiento con frecuencia cae sobre un -1 I] intervalo de pH unidad. Debido a que el pH es tan importante, que es controlado en la mayora de las fermentaciones ya sea por medio de un tampn o un sistema ph control. Si bien hay excepciones, algunas generalizaciones tiles pueden hacerse sobre la dependencia del crecimiento microbiano en el pH. Las bacterias crecen generalmente en el intervalo de pH 4-8. Las levaduras suelen preferir 3-6, 3-7, moldes y clulas eucariticas superiores 6.5-7.5. Como consecuencia, el pH se puede utilizar para seleccionar preferentemente para la levadura sobre las bacterias y, a veces para ayudar en el mantenimiento de un entorno con una susceptibilidad mnima a la contaminacin. Por ejemplo, una fermentacin de la levadura a pH 3 es poco probable que se contamine con bacterias. Durante la fermentacin el pH tiene una tendencia a cambiar por varias razones. Cuando el amonaco es la fuente de nitrgeno, el pH tiende a disminuir. Amoniaco en solucin (por debajo de pH 9) existe como NH4 +; el microorganismo se incorpora en la clula como R - NH3 +, donde R es un esqueleto de carbono. En el proceso, una + H permanece en el medio. Si el nitrato es la fuente de nitrgeno, a continuacin, los iones de hidrgeno se eliminan del medio para reducir la N03 a = R - NH3 + y el pH tiende a subir. Si los compuestos orgnicos de aminocidos se utilizan para el crecimiento y despus el pH se presta a subir como los compuestos son desaminados. Otra razn para los cambios de pH cuando se produce cidos orgnicos tales como cido lctico, cido actico, o cido pirvico se producen. Si la razn predominante para los cambios de pH se conoce, a continuacin, mediante la medicin de la adicin de cido o lcali para neutralizar el cambio, es posible obtener alguna informacin sobre el crecimiento y formacin de producto. 6.8.3 Efecto de la concentracin de nutrientes de alta

El efecto de la concentracin de nutrientes en el crecimiento celular se discuten en la Seccin 6.3.2 y el crecimiento fue demostrado que exhiben cintica de saturacin de tipo como la concentracin de nutrientes se increment. En muchos casos, cuando la concentracin de nutrientes se incrementa an ms, una regin de la inhibicin de sustrato se produce. Esto se ilustra en la Figura 6,19. Hay una variedad de razones para esta inhibicin. Para los nutrientes tales como la glucosa de la inhibicin no suele ocurrir hasta niveles de azcar muy altos (por ejemplo, mayor que 100-150 g / 1), pero por el momento la concentracin alcanza 350-500 g / 1, el crecimiento de la mayora de los organismos es imposible . La explicacin ms probable es una deshidratacin de las clulas en solucin concentrada tal. Slo los organismos osmoflicas

o osmotolerante puede crecer en estas soluciones. Un fenmeno similar ocurre con soluciones de sal alta, tales como los de arriba 40 g / 1 de NaCl, en la que slo los organismos halfilos puede crecer. Estos dos ejemplos son extremadamente importantes en la preservacin de algunos alimentos. Otras razones para la inhibicin de sustrato incluyen efectos txicos o inhibidores de los compuestos especficos de enzimas clave o componentes estructurales celulares. Muchos organismos son inhibidas por compuestos tales como fenol, formaldehdo, tolueno y metanol en concentraciones por encima de un g / 1. Sin embargo, estos materiales son fcilmente utilizados para el crecimiento por algunos organismos si la concentracin es suficientemente baja. en el captulo siguiente continuo cultura ser demostrado ser muy til para este propsito. Figura 6,19 Efecto de la inhibicin de sustrato sobre la tasa de crecimiento especfico. Lmites de referencia para algunos arco frecuentemente utilizado nutrientes: ion amonio, 5 g / 1; sales de fosfato, 10 g / 1; nitrato, 5 g / 1; etanol, 100 g / 1; glucosa, 100 g / 1. 6.8.4 Efecto de insoluble en agua Nutrientes Cuando los microorganismos se cultivan en insolubles en agua, los nutrientes esenciales para el crecimiento, el crecimiento puede llegar a ser limitada por la velocidad de difusin o la velocidad de disolucin de dicho nutriente. Esto ocurre comnmente, por ejemplo, cuando las clulas se cultivaron en condiciones aerbicas en matraces de agitacin o inamovible a altas concentraciones de clulas en un matraz de agitacin o fermentador. El oxgeno es un gas escasamente soluble en agua y, como consecuencia, es necesario para transferir continuamente oxgeno de las burbujas de aire o una superficie aire-lquido para el medio de cultivo. La dependencia de la tasa de crecimiento en la concentracin de oxgeno disuelto sigue una dependencia saturacin Monod-como tal que por debajo de un nivel crtico, el oxgeno disuelto una disminucin en los resultados de oxgeno disuelto en una disminucin en la tasa de crecimiento especfico. Para las bacterias y la levadura, los crticos disueltos rangos de nivel de oxgeno de 3-10% de saturacin de aire. El nivel crtico para el aceite de moldes por otro lado puede variar desde 10 hasta 50% de saturacin de aire o superior, dependiendo de la forma de crecimiento y el grado de formacin de sedimento. Una vez que se encuentran oxgeno disuelto cae por debajo del valor crtico, la dependencia del crecimiento de la transferencia de masa de oxgeno es descrito por las siguientes ecuaciones. La transferencia de oxgeno rale (OTR) est dado por: Xxx donde K es el coeficiente de transferencia de masa, u es el rea de transferencia de masa, y (' y C, son la presin parcial de oxgeno en equilibrio con la fase gas y en el lquido, respectivamente (g 0 :/ l-hr ). La tasa de consumo de oxgeno, Na, puede ser expresada en trminos de la concentracin celular y la tasa de crecimiento y el coeficiente de rendimiento de oxgeno

Xxxxx Igualando las ecuaciones 43 y 44 y la solucin para la tasa de crecimiento especfica da: Xxxx Recordando que xxxx De esta ecuacin se ve que el crecimiento de microorganismos en virtud de la limitacin de oxgeno es una funcin lineal de la fuerza motriz para la transferencia de oxgeno (C * - C,). Situaciones anlogas ocurrir con el crecimiento de las clulas en sustratos insolubles en agua, tales como celulosa y los hidrocarburos. Wang y Ochoa (1972) examin el crecimiento de Candida intermedia en hexadecano y se observaron los resultados mostrados en la Figura 6,20. El crecimiento celular fue inicialmente exponencial hasta que el rea superficial de las gotitas de hidrocarburos se satur con clulas. En este punto, la tasa de crecimiento se hizo lineal y, como se ve a partir de los datos, depende de la velocidad de agitacin, ya que este ltimo controla rea superficial disponible para la transferencia de masa. Durante la utilizacin de la celulosa, el crecimiento puede llegar a ser limitada por la velocidad de hidrlisis de la celulosa en azcares fermentables. Puesto que la hidrlisis es una reaccin en la superficie, una cintica lineal de crecimiento resultar si la demanda de azcar es mayor que el suministro de azcar o si el contacto entre la clula y la celulosa es necesario para la hidrlisis. . El crecimiento lineal tambin puede ocurrir cuando las clulas se recubren con un material capsular gruesa o cuando los grnulos de micelio se forman a travs de la cual los nutrientes tienen que difundirse (ver fig. 6.2). Muchos organismos se cultivan en medios con contenidos altos en carbohidratos formar cpsulas, especialmente los organismos que pertenecen a los gneros Streptococcus y gneros Mycobacterium. Adems, muchas fermentaciones industriales pueden formar pellets durante al menos una parte del proceso. Figura 6.20 Cintica de crecimiento showsng la transicin de crecimiento exponencial a lineal para Candida lipolytica creciente de n - alcanos en un fermentador se agita a diferentes velocidades de agitacin. 6.9 FORMULACIN DEL MEDIO El diseo de un medio nutriente para el crecimiento y formacin de producto es un paso clave en asegurar un experimento exitoso o ciclo de produccin. Los componentes qumicos del medio debe cumplir todos los requisitos elementales para la masa celular, y productos y debe suministrar energa apropiada para la sntesis y el mantenimiento. Tambin deben cumplir con los requisitos especficos de nutrientes tales como vitaminas y minerales traza. Esta seccin proporciona algunas reglas generales y una justificacin para el diseo de un medio de fermentacin. 6.9.1 Composicin de la clula

Como un primer paso en el diseo del medio, un examen de la composicin de clulas proporciona informacin importante. Usualmente, el anlisis detallado de la composicin elemental no est disponible, por lo que los valores utilizados estn concebidos como directrices para el diseo de medio. La composicin tpica elemental para una clula microbiana se muestra en la tabla 6.4. Cualquier medio para el crecimiento microbiano debe contener, como mnimo, estos elementos en las proporciones correctas. Excepto para el carbono, el oxgeno y el hidrgeno, la formulacin de medio nutriente se basa en la Tabla 6,4 de datos. Por ejemplo, si se desea sintetizar 30 g / 1 de la masa celular de la levadura utilizando sulfato de amonio como la fuente de azufre y nitrgeno, es necesario suministrar 12 g / l de (NH4) 2S04. Esto proporciona 2,4 g / 1 de nitrgeno y 3,0 g / 1 de azufre. Uno puede ver que haciendo coincidir las necesidades de nitrgeno, el azufre requisito se cumple en exceso. Clculos similares permiten a uno disear el medio mnimo que se muestra en la Tabla 6,5 para la sntesis de 30 g / 1 de biomasa de levadura. El oligoelemento requisitos son ms difciles de estimar con precisin, ya que se requieren en cantidades variables como cofactores bioqumicos y componentes estructurales. Sin embargo, como regla general, se puede comenzar con la adicin de los elementos traza se muestran en la Tabla 10 en 6,5 ~ 4-I0 ~ 5M concentracin de 30-3 g / 1 de clulas respectivamente. Es importante entender que algunos organismos pueden tener requisitos inusualmente alta para uno o ms elementos traza y una cierta modificacin de la solucin de sal de rastreo inicial puede ser requerido. 6.9.2 Requisitos bioqumica especfica Mientras que muchos microorganismos son capaces de crecer muy bien en simples sales minerales medios de comunicacin, hay muchos que requieren uno o ms compuestos bioqumicos especficos. Esto es debido a que algunos microorganismos son incapaces de sintetizar Tabla 6.5 Crecimiento medio diseado para apoyar la produccin de 30 g / litro de levadura en fuentes de carbono seleccionados todos sus componentes bioqumicos propios. Los requisitos ms frecuentes son las vitaminas y aminocidos. Las levaduras, por ejemplo, con frecuencia tienen requisitos para la biotina, tiamina y riboflavina. Algunos organismos son muy exigentes y requieren diez o veinte compuestos bioqumicos preformados. En general, el "requisito de vitaminas es pequeo y se aade tpicamente en cantidades de miligramos por litro.

6.9.3 Necesidades de Energa Aunque los microorganismos son capaces de convertir los productos qumicos bsicos en molculas complejas, no viola la segunda ley de la termodinmica en el proceso. La compleja serie de reacciones de sntesis realizadas en la clula requiere el gasto de energa. Esta energa procede, en la mayora de los casos, a partir de la oxidacin controlada de la reduccin de compuestos orgnicos. As, los compuestos de carbono se usan para producir energa para la

biosntesis, as como para cumplir con el requisito de la celda elemental de carbono. Esto se ha ilustrado mediante la Ecuacin 6: De esta relacin, se puede ver que la relacin de la masa celular formada por unidad de sustrato consumido (M / A) depender de la proporcin de sustrato utilizado para la energa (combustin a C02 y H20) y para la incorporacin directa en la masa de clulas. Desde un punto de vista bioqumico, la mayora se desprende calor durante la Etapas terminales de oxidacin donde conductoras de energa cofactores se usan para reducir el oxgeno a agua. En el proceso, generar trifosfato de adenosina (ATP), un compuesto rico en energa, para su uso en reacciones que requieren energa biosintticas. Adems de la biosntesis, la clula requiere energa para el mantenimiento de la estructura celular, el transporte activo de molculas, el establecimiento de gradientes de concentracin entre la clula y su entorno, y, en algunos casos, la movilidad celular. As, con el fin de satisfacer los requerimientos de la clula para el carbono y energa, se debe suministrar suficiente carbono para la biosntesis y para la generacin de energa. Ambos de estos se incluyen en el coeficiente de rendimiento celular, YXI5. La estimacin de los requisitos de fuente de carbono para el crecimiento celular son hechas por densidad dividiendo celda deseada con el rendimiento celular esperado. Por ejemplo, para obtener 30 g / 1 de las clulas a partir de metanol cuando el rendimiento es de 0,5 g de clulas / g de metanol, se necesita 60 g de metanol / l como se muestra en la Tabla 6,5. El nutriente nico que queda es el oxgeno. Como el oxgeno es un gas escasamente soluble J su suministro a una fermentacin es un problema especial de transferencia de masa. I o razn de esto, se discute en el captulo 10 "La aireacin y agitacin". Basta decir en este punto, sin embargo, que la demanda de oxgeno depender de la naturaleza de la fuente de carbono y la eficiencia de su utilizacin.