Copyright by $ta

D i a g n o s t y k a

g r u l i c y

Wyduone, paeczkowate, proste lub lekko wygite bakterie Prtki to drobnoustroje wolno rosnce, tlenowe, o niezwykej budowie ciany komrkowej o Lipidy stanowi 40% masy ciany komrkowej, poza tym znajduj si w niej wielocukry, nukleoproteidy i frakcje biakowej Znaczna oporno na dziaanie kwasw (unikalna budowa ciany prtka, a dokadniej obecno w ich cianie kwasu mykolowego) Z trudnoci barwi si metod Grama Wi kszo prtkw to saprofity wystpujce w glebie i wodzie oraz jako staa flora ludzi i zwierzt Choroby wywoane przez prtki nazywa si mykobakteriozami o o Mycobacterium leprae czynnik etiologiczny trdu (zakaenie przez kontakt bezporedni) MTC (Mycobacterium Tuberculosis Complex) Wywouj grulic; prtki genetycznie blisko spokrewnione: M. tuberculosis prtek grulicy ludzkiej M. bovis M. bovis BCG M. africanum MOTT prtki niegrulicze = prtki atypowe (Mycobacterium other than tuberculosis)

Zakaenie prtkiem grulicy moe by zlokalizowane w kadym narzdzie, ale najczciej narzdem tym jest: o P uca o Opucna o Wzy chonne o Koci i stawy o Ukad moczowo-pciowy o Opony mzgowo-rdzeniowe Objawy: o Osabienie o Utrata masy ciaa o Stany podgorczkowe o Kaszel utrzymujcy si powyej 3 tygodni Najczstsz postaci grulicy jest posta pucna Prtki mog rwnie wywoywa grulic jelit, skry, w zw chonnych, koci czy opon mzgowordzeniowych rdem zakaenia jest osoba prtkujca lub chore zwierz o Prtki grulicy dostaj si do organizmu zwykle przez drogi oddechowe w czasie wdechu. Ich nonikiem s kropelki plwociny, luzu lub liny, wydzielane przez prtkujcego chorego o Poza plwocin zakane mog by take na przykad wydzieliny z ran i przetok powstajce niekiedy w przebiegu grulicy kostno-stawowej, zmiany wystpujce w grulicy skry, mocz chorych na grulic ukadu moczowo-pciowego. o Poza drog wziewn zakaenie nastpuje rwnie drog pokarmow (mleko) oraz przez skr w wyniku zakucia ig lub skaleczenia skaonymi instrumentami medycznymi. Rozpoznanie grulicy o Rozpoznanie grulicy opiera si o objawy kliniczne (kaszel, krwioplucie, popo udniowa gorczka, nocne poty, spadek masy ciaa, ze samopoczucie) i badanie radiologiczne (zwapnienia lub zmiany jamiste), potwierdzone badaniem mikrobiologicznym lub badaniem molekularnym. Pobieranie materiau Materia do badania grulicy: o Najczciej plwocina poranna (10-15 ml, kilka razy (3-5) w cigu kolejnych dni, odkrztuszanie do jaowego pojemnika, szybki transport lub przechowywanie w temp. 4 C) o Materiay od chorych nie odkrztuszaj cych: popuczyny pcherzykowo-oskrzelowe (BAL bronchoalveolar lavage), 5-10 ml aspirat oskrzelowy (przez bronchoskopi) 5-10 ml wymaz krtaniowy (z materiau na szczoteczce lub wymazwce - hodowle na podou pynnym) -1-

 Copyright by $ta

wysik opucnowy

Rzadziej popuczyny odkowe (od chorych nieprzytomnych lub maych dzieci) pyn mzgowo-rdzeniowy pyn stawowy bioptaty tkanek (szpik, w zy chonne, nerki, w troba, koci, skra) ropa, mocz i inne

Materiay kliniczne z ukadu oddechowego (a take rop, mocz i inne, ktre mog zawiera towarzyszc flor drobnoustrojw), poddaje si dekontaminacji, poniewa powolny kilkutygodniowy wzrost prtkw mgby zosta zag uszony przez inne bakterie lub grzyby (metody: wodorotlenek sodu, kwas szczawiowy, kwas siarkowy i in.). Nastpnie materia jest homogenizowany (w celu uwolnienia prtkw z ziarniny gruliczej, luzu, ropy, elementw tkanek) i zagszczany przez wirowanie.)

Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testw morfologiczno-biochemicznych Plwocina o objtoci 10-20 ml ma by pobrana do jaowego naczynia, powinna by odksztuszona rano i pochodzi gboko z puc pobrany materia przenosi si do pytki Petriego wyszukanie ropnych lub podbarwionych krwi grudek, dekontaminacja i homogenizacja przeniesienie ich ez na szkieko podstawowe przykrycie drugim szkiekiem i rozcieranie uzyskuje si 2 preparaty wyschnicie i utrwalenie w pomieniu palnika o Obecnie rutynowo stosowan metod w laboratoriach jest metoda fluorescencyjna (auramina, rodamina, oran akrydyny) prtki wiec Dawniej jedyn metod barwienia prtkw bya metoda Ziehl-Neelsena prtki na kolor czerwony, to na niebieski W preparacie przeglda si co najmniej 100-200 pl widzenia, ocenia si ilociowo (to pomaga lekarzowi oceni postpy w leczeniu), np.: 1-2 prtki w 200 polach widzenia wynik w tpliwy (do powtrzenia) 1-9 w 100 polach widzenia skpe prtkowanie 1-9 w 10 polach widzenia obfite prtkowanie Powyej 9 w kadym polu widzenia bardzo obfite prtkowanie

Hodowla prtkw o Dekontaminacja o Homogenizacja prtkw eby usun pozosta flor i zagci o Rutynowo stosowane podoe to podoe Lowensteina-Jensena (masa jajowa + r-r zieleni malachitowej) innym stosowanym podoem staym jest podoe agarowe Middlebrooka M. tuberculosis suche, szorstkie, uniesione, tobeowe kolonie o nierwnej powierzchni M. bovis mae, bezbarwne, piramidoksztatne kolonie Identyfikacja o Tempo wzrostu o Zdolno do wytwarzania barwnika o Cechami pozwalajcymi na odrnienie M. tuberculosis od pozostaych prtkw s: wytwarzanie czynnika sznurowego i produkcja niacyny Inne, nowe, przyspieszone systemy hodowli prtkw kwasoodpornych: o Izotopowy pautomatyczny system do hodowania, rnicowania i oznaczania wraliwoci na leki Do podoa dodawany kwas palmitynowy znakowany w glem C14 prtki, rosn zuywaj kwas palmitynowy i wydzielaj CO2 znakowany C14 odczyt na podstawie przyrostu radioaktywnoci CO2 Wzrost na poywkach Middelbroka odczyt wizualny P ynny system hodowli z odczynnikami fluorescencyjnymi = system MIGIT Nieizotopowy, w peni skomputeryzowany system hodowli prtkw na podoach pynnych odczyt na podstawie przyrostu CO2 System hodowli prtkw na poywce pynnej Kirchnera z dodatkiem surowicy oraz soli tetrazolowych

o o o

-2-

 Copyright by $ta

Metody chromatograficzne Sk ad ilociowy i jakociowy kwasw mykolowych jest charakterystyczny dla poszczeglnych gatunkw prtkw analiza chromatograficzna kwasw tuszczowych wyizolowanych ze ciany komrkowej

Metody genetyczne Hybrydyzacja kwasw nukleinowych PCR amplifikacja in vitro wybranych odcinkw genomu Badanie lekowraliwoci W przypadku prtkw bada si ich wraliwo w stosunku do: PAS, INH, etambutolu, rifampicyny, streptomycyny. Wyej wymienione tuberkulostatyki inkorporuje si bezporednio do podoa

T e c h n i k a
Sposb barwienia

b a r w i e n i a

m e t o d

G r a m a :

na odtuszczone szkieko podstawowe nanie bakterie i po ewentualnym dodaniu pynu fizjologicznego wykona rozmaz 2. szkieko z rozmazem pozostawi do cakowitego wyschni cia, po czym preparat utrwali przez trzykrotne przesunicie nad pomieniem palnika 3. utrwalony preparat zalewa nad rynienk roztworem fioletu krystalicznego 4. odczeka 60 sekund 5. tryskawk delikatnie zmy barwnik 6. zala preparat jodyn lub pynem Lugola 7. odczeka 30 sekund 8. ostronie odbarwi cao w etanolu przez ok. 10-20 sekund 9. spuka preparat wod 10. dobarwi innym barwnikiem, np. safranin czy fuksyn zasadow przez ok. 30 sekund 11. dobrze spuka preparat wod i ogl da pod mikroskopem

1.

Mechanizm barwienia Komrki bakteryjne, zarwno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiaj si fioletem krystalicznym. Dodanie pynu Lugola powoduje, e fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworz si stosunkowo due kompleksy zoone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komrek maj zabarwienie granatowe. P ukanie w alkoholu powoduje, e w komrkach Gram-dodatnich nastpuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych cianach komrkowych, majcych wygld wielu (ok. 50) naoonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mog ulec wypukaniu, co w przypadku 1-2 warstw u bakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkod i alkohol wietnie wypukuje barwnik. Po zakoczonym pukaniu komrki Gram-dodatnie s granatowe, za Gram-ujemne bezbarwne. Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komrki Gram-ujemne, nie zmieniaj c barwy komrek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama W efekcie wyej przedstawionych dziaa i opisanego mechanizmu komrki efekty mog by trojakie: bakterie barwi si na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, okrelamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +) bakterie barwi si w kolorze czerwonym, okrelamy jako Gram-ujemne lub (Gram -) bakterie nie barwi si w ogle metod Grama

-3-