Biochemia Harpera PDF

BIOCHEMIA HARPERA
a LANGE medical book
Harper's
Biochemistry
Twenty-second Edition
Robert K. Murray, MD, PhD Professor of Biochemistry Universtty of Toronto Daryl K. Granner, MD Professor and Chairman Department of Moiecuiar Physiology and Biophysics Professor of Medicine Vanderbitt University Nashville, Tennessee Peter A. Mayes, PhD, DSc Reader in Biochemistry Roya Veterinary College University of London Victor W. Rodwell, PhD Professor of Biochemistry Purdue University West Lafayette, Indiana
Prentice-Hall International Inc.
Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell
BIOCHEMIA HARPERA
Wydanie III Redaktor naukowy tumaczenia Franciszek Kokot
IHhl. Medyczna CM ID
1816004318
Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL

50LAT
Copyright for the Polish Edition by ydawnictwo Lekarskie PZWL J994, 1995
Z oryginau angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22

Copyright 1990 by Appleton Lange Ali Rights Reserved i rozdz. 60, 64 z oryginau angielskiego Harper's Btochemistry ed. 23 Copyright 1993 by Appleton Lange Alt Rights Reserved
pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tumaczyli

Doc. med. ZENON ALEKSANDROWICZ (rozdz. 12 19) Prof. dr hab. MIECZYSAW CHORY (rozdz. 3542) Prof. dr hab. MARIAN DRD (rozdz. 57, 58) Prof. dr hab. ZOFIA KILASKA (rozdz. 2 5) Prof. dr hab. LEOKADIA KYSZEJKO -STEFANOWICZ (rozdz. 1, 6, 32, 33) Prof. dr hab. FRANCISZEK KOKOT (rozdz. 44 56, 60, 62 i przedmowa) Prof. dr hab, WANDA MAGORZATA KRAJEWSK (rozdz. 7, 10, l i , 34) Prof. dr hab. EUGENIUSZ KUCHARZ (rozdz. 63) Prof, dr hab. BOHDAN LEWARTOWSKI (rozdz. 59) Prof. dr hab. ANNA LIPISKA (rozdz. 8, 9, 30, 31) Prof. dr hab. JERZY VETULANI (rozdz. 64) Prof. dr hab. TADEUSZ WILCZOK (rozdz. 43, 61) Prof. dr hab. MARIUSZ ZYDOWO (rozdz. 20 29) Projekt okadki i strony tytuowej Anna Dluiewaka Redaktorzy Krystyna Chjcka, Renata Piotrowska -Siemdzka Redaktor techniczny Joanna Godowska Korektorzy Zesp
1SBN 83-200-1798-X
Wydawnictwo Uliatskie PZW L W arszawa ]5 Wydanie Iii Cieszyska Drukarnia Wydawnicza ul. Pokoju I, 43-400 Cieszyn Zam. nr 2543/K-94
PRZEDMOWA / 5
Przedmowa do wydania polskiego

Do rk Czytelnika oddajemy tumaczenie 22. wydania Biochemii Harpera". W trakcie tumaczenia ukazao si wydanie 23. tej ksiki, wzbogacone o kitka nowych rozdziaw w stosunku do wydania 22. Dlatego te, chcc dostarczy Czytelnikom moliwie aktualnej wiedzy, postanowiono wczy do wydania 22. dwa nowe rozdziay z wydania 23. (Erytrocyty i leukocyty" oraz Podoe biochemiczne niektrych chorb neuropsychiatrycznych"), uwzgldniajc stan wiedzy z koca 1992 r. Jako redaktor naukowy, odpowiedzialny za obecne polskie wydanie ksiki, kieruj wyrazy gbokiego szacunku i podzikowania do wszystkich Wsptumaczy za trud woony w tumaczenie poszczeglnych rozdziaw. Pragn podkreli, e tumaczenie ksiki natrafiao na due trudnoci w zakresie mianownictwa biochemicznego, czsto nie ustabilizowanego nie tylko w skali naszego kraju, lecz take midzynarodowej. Tote sdz, e warto merytoryczna, a nie nomenklaturowa, bdzie gwnym kryterium oceny ksiki przez Czytelnikw. Pragn wyrazi nadziej, e i obecne wydanie Biochemii Harpera" nie tylko speni wymagania starych" Czytelnikw tej ksiki, lecz take przysporzy jej wielu nowych Czytelnikw i przyjaci.
Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot
PRZEDMOWA / 7
Przedmowa
Biochemia Harpera" dostarcza zwizej, cho dostatecznie szerokiej, wiedzy dotyczcej podstaw biochemii i biologii molekularnej. Zawiera ona liczne przykady na to, e wiedza biochemiczna jest niezbdna do zrozumienia mechanizmw podtrzymujcych zdrowie oraz przyczyn i racjonalnego leczenia licznych chorb, jakimi s szczeglnie zainteresowani lekarze i inni pracownicy opieki zdrowotnej. Zmiany dokonane w wydaniu 22. Dwa cele przywiecay autorom przygotowujcym obecne wydanie: 1) przedstawienie moliwie najnowszej wiedzy biochemicznej, potrzebnej przy studiowaniu medycyny oraz 2) dostarczenie studentom medycyny i innych nauk dotyczcych zdrowia ksiki interesujcej i lubianej przez uytkownika. Odzwierciedleniem tego jest ukad i tre nowego wydania. Wszystkie rozdziay zostay przeredagowane z uwzgldnieniem wanych postpw wiedzy biochemicznej. We wstpie wikszoci rozdziaw zasygnali zowano gwne problemy bdce ich treci. Zredukowano szczegowe omawianie dru gorzdowych szlakw metabolicznych. Liczne ryciny zmodyfikowano w celu po prawienia ich czytelnoci. Wczono nowe rozdziay dotyczce Wody i pH", Witamin rozpusz czalnych w wo dzie", Witamin rozpuszczalnych w tusz czach", Utleniania kwasw tuszczowych i ketogenezy", ywienia" i Przemiany ksenobiotykw". W ostatnim rozdziale, ktry jest rwnie nowy, znajduje si zwize omwienie bio chemicznych aspektw przyczyn i mechaniz mw chorb. Na podstawie historii choroby 8 chorych zilustrowano uyteczno wiedzy biochemicznej dla medycyny. Przedstawione przypadki dotycz gwnych klas przyczyn chorobowych. Rozdzia ten, wraz z suple mentem omawiajcym testy laboratoryjne, stanowi pomost wypeniajcy dotychczaso w luk dzielc biochemi od kliniki. Ukad ksiki Tekst skada si z 3 rozdziaw wprowadzajcych i 6 gwnych dziaw. Dzia 1 jest powicony biakom i enzymom, bdcym komi roboczymi organizmu. Poniewa wikszo reakcji zachodzcych w komrkach ludzkich ma charakter enzymatyczny, jest istotne zapoznanie si z waciwociami enzymw przed omawianiem innych problemw. W dziale II przedstawiono a) rne reakcje komrkowe, w ktrych zachodzi utylizacja lub wytwarzanie nonikw energetycznych oraz b) szlaki syntezy i rozkadu wglowodanw i lipidw. Ponadto przedstawiono funkcj po szczeglnych zwizkw nalecych do wymienionych klas czsteczek. W dziale III omwiono poszczeglne aminokwasy i ich losy oraz przemiany tych zwizkw przebiegajce ze zuytkowaniem lub wytwarzaniem energii. W dziale IV przedstawiono struktur i funkcj kwasw nukleinowych oraz szlak DNA-tRNA->biaka. W tej czci opisano rwnie zasady technologii rekombinacji DNA, tj. zagadnienie o niezwykych implikacjach w dyscyplinach biomedycznych. Treci dziau V s hormony i ich kluczowa rola w komunikacji midzykomrkowej i regulacji poszczeglnych szlakw metabolicznych. Po to, aby hormony mogy zadziaa na komrk, musz mie kontakt z bonami komrkowymi. Nic wic dziwnego, e pocztek tego dziau jest powicony strukturze i funkcjom bon. Dzia VI skada si z 7 specjalnych roz dziaw, w tym nowego rozdziau omawiajcego przemian ksenobiotykw i biochemiczne aspekty niektrych chorb. W suplemencie podano zwiz interpretacj wynikw bada laboratoryjnych i gwne ich implikacje diagnostyczne.
8 / PRZEDMOWA
Podzikowanie Autorzy pragn wyrazi podzikowanie Panu Aleksandrowi Kugushewowi; wiele zmian dokonanych w tym wydaniu nie mogoby by zrealizowanych bez Jego staego zainteresowania, rady, popychania sprawy" i zachcania. Nasza wdziczno naley si rwnie na szym zawodowym Kolegom i Przyjacioom z caego wiata za przekazane sugestie, majce na celu poprawienie ksiki. Zachcamy ich, aby w dalszym cigu wykazali zainteresowanie ksik i nie szczdzili wysiku w jej ulepszaniu. Za szczeglnie cenne uwaamy opinie wyraone przez studentw.
Autorzy czuj si szczeglnie usatysfakcjonoszerok akceptacj i poparciem ksiki w ca ^ m wiecie. Przedruki licznych wyda opublikowanych w jzyku angielskim ukazay sie w Japonii, Libanie, na Tajwanie, Filipinach oraz w Korei. Ponadto ksik przetumaczono na jzy^ woski, hiszpaski, francuski, portu galski, japoski, polski, niemiecki, serbsko-chorwacki i grecki,
wam
_ RKM _ DKG _ PAM _ VWR
SPIS TRECI / 9
Spis treci
1. Biochemia i medycyna Robert K. Murray ........................................................... 2. Biomolekuy i metody biochemiczne Robert K. Murray .................................... 3. Woda i pH Victor W. Rodwell .............................................................................. Cz I. B ud o w a or az fu nk cj e bi a e k i enz y m w 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 11 16 26
...................................
35 35 49 59 70 82 94 110 118
Aminokw asy Victor W. Rodwell ........................................................................... Peptydy Victor W. Rodwell ................................................................................. Biaka: struktura i waciwoci Victor W. Rodwell ............................................ Biaka; mioglobina i hem oglobina Vtctor W. Rodwell ...................................... Enzym y: waciwoci oglne Victor W. Rodwell ............................................... Enzym y: kinetyka Victor W. Rodwell ................................................................... Enzymy: mechanizmy dziaania Victor W. Rodwell ............................................ Enzym y: regulacja aktyw acji Victor W. Rodwell ...............................................
C z I I. Bi o en erg e ty k a i m e t abol iz m w glo wo d an w o ra z li p i d w 12. Bioenergetyka Peter A. Mayes ........................................................................... 13. Utlenianie biologiczne Peter A. Mayes ................................................................ 14._ Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujce Peter A. Mayes ............................................................................ 15. Wglowodany o znaczeniu fizjologicznym Peter A. Mayes .............................. 16. Lipidy o znaczeniu fizjologicznym Peter A. Mayes ............................................ 17. Zarys przemian porednich Peter A. Mayes ........................................................ 18. Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA Peter A. Mayes ............... y 19. Glikoliza i utlenianie pirogronianu Peter A. Mayes ........................................... 20. Metabolizm glikogenu Peter A. Mayes ................................................................ v 21. Glukoneogeneza i kontrola stenia glukozy we krwi Peter A. Mayes ............ 22. Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz Peter A. Mayes 23. Biosynteza kwasw tuszczowych Peter A. Mayes ............................................. 24. Utlenianie kwasw tuszczowych: ketogeneza Peter A. Mayes ........................ 25. Metabolizm nienasyconych kwasw tuszczow ych i eikozanoidw Peter A. Mayes ............................................................................................................................. 26. Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidw Peter A. Mayes ............................. 27. Transport i magazynowanie lipidw Peter A. Mayes ......................................... 28. Synteza, transport i wydalanie cholesterolu Peter A. Mayes ........................... 29. Integracja metabolizmu i dostarczanie substratw energetycznych do tkanek Peter A. Mayes .................................................................................................. C z III . M e t a b oli z m bi a e k i a m i no k w a s w .........................................
131 131 139 147 161 173 188 198 207 217 226 239 251 260 274 284 294 314 329 337 337 344 357
30. Biosynteza aminokwasw, ktre nie musz by dostarczane w poywieniu Victor W. Rodwell ......................................................................... 31. Katabolizm biaek i azotu aminokw asw Victor W. Rodwell ........................... 32. Katabolizm szkieletw wglow ych aminokwasw Victor W. Rodwell .............
10 / SPIS TRECI 33. Przemiana aminokwasw w wyspecjalizowane produkty Victor W. Rodwell . 34. Porfiryny i barwniki ciow e Robert K. Murray ............................................... Cz IV. Budowa, czynno i replikacja makroczsteczek informacyjnych ................................................................... 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. Nukleotydy Victor W. Rodweil ............................................................................ Metabolizm nukleotydw purynowych i pi rym idy nowych Victor W. RoJwell . Struktura i funkcja kwasw nukleinow ych Dary! K. Granner .......................... Organizacja i replika DNA Dary/ K. Granner ........................................................ Synteza, przeksztacenie i metabolizm RNA Dary/ K. Granner ........................ Synteza biaek i kod genetyczny Dary/ K. Granner ............................................ Regulacja ekspresji genu Dary/ K. Granner ........................................................ Technologia rekombinacji DNA Dary/ K. Granner ............................................ 385 398
415 415 425 443 456 476 491 508 529
C z V. Bi o c h e mi a ze wn t rz k o m r k o we j i we wntrzko m rk o wej ko mu nikacji ........................................................... 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. Bony: struktura, organizacja i funkcja Dary/ K. Granner .................................... Charakterystyka ukadw hormonalnych Dary I K. Granner ............................. Dziaanie hormonw Dary! K. Granner ................................................................ Przysadka mzgowa i hormony podw zgrza Dary/ K. Granner ......................... Hormony tarczycy Dary/ K. Granner .................................................................. Hormony regulujce przemian wapniow Dary/ K. Granner ........................... Hormony kory nadnerczy Dary/ K. Granner ........................................................ Hormony rdzenia nadnerczy Dary! K. Granner .................................................. Hormony gonadalne Dary I K. Granner ................................................................ Hormony trzustki i o dkowo-jelitowe Dary/ K. Granner .................................
549 549 573 584 599 612 619 629 645 652 671
C z V I . Z a g a d n i e n i a w y b r a n e ............................................................................ Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie Peter A. Mayes . . . Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tuszczach Peter A. Mayes . . ywienie Peter A. Mayes ...................................................................................... Trawienie i wchanianie Peter A. Mayes ............................................................. Glikoproteiny i proteoglikany Robert K. Murray ............................................... Biaka osocza, immunoglobitliny i czynniki krzepnicia Elizabeth J. Harfenist Robert K. Murray ............................................................. 59. Biaka kurczliwe i strukturalne Victor W. Rodwell, Robert K. Murray, Frederick W. Keetey ................................................................... 60. Metabolizm ksenobiotykw Robert K. Murray ................................................. 61. Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe Robert K. Murray .................................... 62. Biochemia a choroby Robert K. Murray ............................................................. 63. Erytrocyty i leukocyty Robert K. Murray .............................................................. 64. Podoe biochemiczne niektrych schorze neuropsychiatrycznych Robert K. Murray ................................................................................................... Dodatek ................................................................................................................................ Skr ty spotykane w biochemii ......................................................................................... Skorowidz ......................................................................................................................... '. 53. 54. 55. 56. 57. 58.
693 693 710 721 734 749 770 794 817 824 842 865 887 910 930 935
Biochemia i medycyna
Robert K. Murray, MD, PhD
WPROWADZENIE Biochemia jest to nauka zajmujca si rnorodnymi molekuami i zwizanymi z nimi reakcjami chemicznymi, ktre zachodz w ywych komrkach i organizmach. Kada informacja wykraczajca poza skrajnie powierzchown wiedz o yciu we wszystkich jego zrnicowanych przejawach wymaga poznania biochemii. Co wicej, studenci medycyny, zdobywajc solidn porcj wiedzy z zakresu biochemii, bd w stanie skonfrontowa zarwno w praktyce, jak i w pracy badawczej 2 podstawowe problemy wszystkich nauk medycznych: 1) zrozumienie, jak zachowa zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorb i ich skuteczne leczenie. Biochemia to chemia ycia Biochemi mona, bardziej konwencjonalnie, zdefiniowa jako nauk dotyczc chemicznych podstaw ycia (gr. bios ycie). Komrka jest strukturaln jednostk organizmu ywego. Rozwaenie tej koncepcji prowadzi do funkcjonalnej definicji biochemii, jako nauki zajmujcej si chemicznymi skadnikami ywych komrek oraz reakcjami i procesami, ktrym one ulegaj. Zgodnie z ni biochemia obejmuje przepastne obszary biologii komrki i cao biologii molekularnej. Zadaniem biochemii jest opisanie i wyjanienie na poziomie molekularnym wszystkich procesw chemicznych zachodzcych w ywych komrkach Gwnym celem biochemii jest dogbne poznanie na poziomie molekularnym wszystkich procesw chemicznych zwizanych z yciem komrki. Aby wypeni to zadanie, biochemicy
usiuj wyizolowa liczne molekuy znajdujce si w komrkach, okreli ich struktur i zanalizowa, jak funkcjonuj. Przykadem takich dziaa s prby zrozumienia molekularnych podstaw skurczu procesu zwizanego przede wszystkim, ale nie wycznie, z komrkami miniowymi, co wymaga oczyszczenia wielu czsteczek zarwno prostych, jak i zoonych, a nastpnie poddania ich szczegowym badaniom strukturalno-funkcjonalnym. Dziki tym wysikom ustalono niektre cechy molekularnych podstaw skurczu mini. Kolejnym zadaniem biochemii jest usiowanie docieczenia, jak powstao ycie. Wiedza na ten fascynujcy temat pozostaje nadal w powi jakach. Zasig biochemii jest tak niezmierzony, jak samo ycie. Gdziekolwiek to ycie si pojawia, tam zachodz procesy chemiczne. Biochemicy badaj je w mikroorganizmach, rolinach, owadach, rybach, ptakach, u niszych i wyszych ssakw oraz u ludzi. Studenci nauk biomedycznych bd zainteresowani zwaszcza biochemi 2 ostatnich grup. Naley jednak doceni rwnie biochemi mniej skomplikowanych form ycia, czsto bezporednio zwizan z biochemi czowieka. Ma przykad wspczesne teorie regulacji aktywnoci genw i enzymw u ludzi emanuj z pionierskich bada dotyczcych drody piekarskich i bakterii. Dziedzina rekombinacji DNA wyonia si z dowiadcze na bakteriach i ich wirusach. Szybko namnaania si (multyplikacji) i atwo wyekstrahowania ich materiau genetycznego czyni je odpowiednimi dla genetycznych analiz i manipulacji. Wiedza zdobyta z badania genw wirusw od powiedzialnych za niektre typy raka u zwierzt (wirusowych onkogenw) zapewnia gruntowny wgld, w jaki sposb komrki ludzkie staj si nowotworw ymi.
12 / ROZDZIA 1
Znajomo biochemii jest istotna dla wszystkich nauk przyrodniczych, z medycyn wcznie Biochemia kwasw nukleinowych ley w sercu genetyki; z kolei zastosowanie metod genetycznych staio si kluczowe do wyjanienia wielu dziedzin biochemii. Fizjologia, badajca funkcjonowanie organizmu, niemal kompletnie pokrywa si z biochemi. Immunologia posuguje si licznymi technikami biochemicznymi, a wiele podej immunologicznych znalazo S2erokie zastosowanie w biochemii. Farmakologia i farmacja opieraj si na rzetelnej znajomoci biochemii i fizjologii, zwaszcza e wikszo lekw jest metabolizowana w reakcjach katalizowanych enzymatycznie, a skomplikowane interakcje pomidzy lekami najlepiej zrozumie za pomoc biochemii. Trucizny oddziauj na reakcje i procesy biochemiczne i to jest domen toksykologii. Biochemiczne podejcie znajduje coraz wicej zastosowania w badaniu podsta wowych aspektw patologii (nauki o chorobach), np. stany zapalne, uszkodzenia komrek 1 nowotwory. Wiehi przedstawicieli mikrobiolo gii, zoologii i botaniki posuguje si niemal wycznie metodami biochemicznymi. Te po wizania nie s zaskoczeniem, poniewa ycie, jak wiadomo, polega na reakcjach i procesach biochemicznych. Istotnie, dawne bariery mi dzy naukami przyrodniczymi padaj, a bio chemia coraz bardziej staje si ich wsplnym jzykiem. Wzajemne oddziaywanie midzy biochemi a medycyn pobudza stay postp w obu tych dziedzinach Jak wspomniano na pocztku tego rozdziau, 2 gwne problemy pracownikw nauk medycz nych, a zwaszcza lekarzy, to: 1) zrozumienie, jak zachowa zdrowie oraz 2) zrozumienie istoty chorb i ich skuteczne leczenie. Biochemia zapisaa si na trwae w obu tych fundamentalnych zagadnieniach medycyny. Faktycznie wzajemne oddziaywanie biochemii i medycyny to tak, jak szeroka dwukierunkowa ulica. Analizy biochemiczne wyjaniy wiele aspektw z dziedziny zdrowia oraz choroby i odwrotnie, badanie rnych przejaww zdro wia i choroby otwiera coraz to nowe obszary przed biochemi. Wzajemna wsppraca medycyny i biochemii ma wane implikacje filozoficzne dla tej pierwszej. Jak dugo postpowanie lekarskie bdzie mocno zakorzenione w gruntownej znajomoci
biochemii oraz innych pokrewnych nauk podstawowych (np. fizjologii, mikrobiologii, ywienia), tak dugo medycyna praktyczna bdzie miaa racjonaln podstaw do zastosowania coraz to nowych osigni wiedzy. Kontrastuje to jaskrawo z kultem niekonwencjonalnej medycyny, ktra czsto opiera si na niczym wicej ni na micie, pobonych yczeniach i braku bazy intelektualnej. PRAWIDOWE PROCESY BIOCHEMICZNE S PODSTAW ZDROWIA wiatowa Organizacja Zdrowia (WHO) definiuje zdrowie jako stan w peni dobrego samopoczucia fizycznego, umysowego i socjalnego, a nie tylko jako brak choroby lub zniedo-nienia. Z czysto biochemicznego punktu widzenia zdrowie moe by rozwaane jako sytuacja, ktrej wszystkie z wielu tysicy reakcji wewntrz- i zewntrz komrkowych, zachodzcych w organizmie, przebiegaj z szybkoci adekwatn do jego maksymalnego przetrwania w stanie fizjologicznym. Badania biochemikw znajduj oddwik w odywianiu i medycynie prewencyjnej G wnym warunkiem zachowania zdrowia jest pobieranie w poywieniu optymalnej iloci zwizkw chemicznych; gwnymi z nich s witaminy, niektre aminokwasy, pewne kwasy tuszczowe, rne substancje mineralne i woda. Wiele zagadnie z biochemii oraz ywienia dotyczy badania rnych aspektw tych wanie zwizkw chemicznych, wobec czego wspdziaanie obu wymienionych dyscyplin jest bardzo cise. Ponadto, ze wzgldu na denie do obnienia rosncych kosztw opieki lekarskiej, najprawdopodobniej wikszy nacisk zostanie pooony na systematyczne dziaania w celu zachowania zdrowia i zapobiegania chorobom, tj. na medycyn prewencyjn. Zatem podejcie ywieniowe do przeciwdziaania np. miadycy ttnic i nowotworom prawdopodobnie uzyska rosnce poparcie. Zrozumienie znaczenia odywiania zaley jednak w rozlegym zakresie od znajomoci biochemii.
BIOCHE MIA i M E DYCYNA / 13
Kada choroba ma biochemiczne uzasadnienie Wszystkie choroby s manifestacj zaburze w czsteczkach, reakcjach chemicznych i procesach. Gwne czynniki odpowiedzialne za powstawanie chorb u ludzi i zwierzt s wymienione w tab. l-l. Wszystkie one mog wpyn na jedn lub wicej zmian chorobotwrczych w reakcjach chemicznych lub molekuach organizmu.
Tabela 1 -1 . Gwne przyczyny chorb, wpywaj ce na rnorodne mechanizmy biochemiczne w ko mrce lub organizmie* 1. Czynniki fizyczne: urazy mechaniczne, eks tremalne temperatury, nagle zmiany cinienia atmosferycznego, promieniowanie, szok elekt ryczny 2. Czynn iki che m iczn a i leki: pe wne zwizki toksyczne, rodki terapeutyczne itp. 3. Czynniki biologiczne: wirusy, riketsje, bak terie, grzyby, wysze formy pasoytw 4. Brak tlenu: niedokrwienie, zmniejszenie poje mno ci tleno wej krwi, zatrucie enzymw o k sydacyjnych 5. Genetyczna: wrodzo ne, mo lekularne 6. Reakcje im munologiczne: anafilaksja. cho roba autoimmuno logiczna 7. Zaburzania w odyw ianiu: niedo bory i nad miary 8. Zachwiania rwnowagi wewntrzwy dzielniczej: niedobory i nadmiary hormo nw * Zaadaptowano za zgod z: Robbins SL, Cot-ram RS, KumarV: The Pathologic Bas/s of D/sease, wyd. 3, Saunders, 1984.
Badania biochemiczne pomagaj w diagnozie, prognozie i leczeniu Istnieje bogata dokumentacja potwierdzaj ca zastosowanie biochemii w zapobieganiu chorobom, diagnozie i leczeniu chorb. Wiele dowodw na to mona znale w kolejnych rozdziaach tej ksiki. Jednake na tym etapie, w celu zilustrowania ogromu przedmiotu i zainteresowania nim Czytelnika, wydaje si niezbdne podanie 7 krtkich przykadw. 1. Czowiek musi pobra pewn liczb zoonych czsteczek organicznych, zwanych witaminami, aby utrzyma zdrowie. Witaminy s,
oglnie rzecz biorc, zamieniane w organizmie na bardziej kompleksowe czsteczki (koenzymy), ktre odgrywaj kluczow rol w wielu reakcjach komrkowych. Brak ktrej z witamin w poywieniu znajduje oddwik w spowodowanej tym faktem chorobie, takiej jak gnilec lub krzywica (wynikej odpowiednio z niedoboru witaminy C lub D). Wyjanienie kluczowej roli witamin, lub te ich aktywnych biologicznie pochodnych w komrkach zwierzcych i ludzkich jest gwnym wsplnym problemem biochemikw i dietetykw od przeomu naszego stulecia. Gdy tylko ustalono, e dana choroba jest wywoywana brakiem jakiej witaminy, wwczas stao si racjonalne jej leczenie podawaniem brakujcej witaminy. 2. Fakt, i wiele rolin - afrykaskich jest pozbawionych jednego lub kilku istotnych, czyli niezbdnych, aminokwasw, ktre musz by dostarczone z zewntrz w celu utrzymania zdro wia, pomg wytumaczy wyniszczajce nie doywienie biakowo-energetyczne (kwashiorkor), bdce chorob tych, dta ktrych owe roliny stanowi gwne rdo biaka. Leczenie niedoboru istotnych aminokwasw jest tu roz sdn konsekwencj, ale, niestety, nie zawsze moliw do przeprowadzenia. Polega ono na zapewnieniu wywaonej diety, zawierajcej od powiednie iloci wszystkich niezbdnych ami nokwasw. 3. Grenlandzcy Eskimosi (ang. Inuit) spoy waj due iloci oleju rybnego bogatego w nie ktre wieoRienasycone kwasy tuszczowe (ang. polyunsaturated fatty acids; skrt PUFA). Badania wykazay, e odznaczaj si oni maym steniem cholesterolu w osoczu i rzadk za chorowalnoci na miadyc ttnic. Te obser wacje wywoay ywe zainteresowanie moliwo ci stosowania PUFA w celu zmniejszenia stenia cholesterolu. Zarwno choroby wywoane brakiem wita min, jak i te spowodowane niedoborem istotnych aminokwasw, to przykady zaburze odywiania (p. tab. 1-1). Miadyca ttnic moe by uwaana za przykad zaburzenia spowo dowanego nieprawidowym odywianiem, ale wi si z ni take inne, np. genetyczne, czynniki. 4. Stan znany jako fenyloketonuria (ang. phenylketonuria; skrt PKU) nie leczony prowadzi do cikich zaburze umysowych ju w dziecistwie. Podstawa biochemiczna PKU jest znana od ponad 30. lat. Jest to zaburzenie uwarunkowane genetycznie (tab. 1-1), spowo-
14 / ROZDZIALI dowane brakiem lub ma aktywnoci enzymu, ktry przeksztaca fenyloalanin w tyrozyn. W konsekwencji niedoboru enzymu, fenylo-alanina i niektre jej metabolity, takie jak fenyloketony, gromadz si w tkankach i niszcz rozwijajcy si orodkowy ukad nerwowy. Odkd udowodniono natur biochemicznego zaburzenia w PKU, kolejnym logicznym kro kiem stao si leczenie dzieci z fenyloketonu-ri diet o maej zawartoci fenyloalaniny. Gdy tylko masowe testy biochemiczne na rozpoznanie PKU zaraz po urodzeniu okazay si moliwe do przeprowadzenia, wwczas stao si realne skuteczne leczenie tej wady metabolicznej. 5. Mukowiscydoza (ac. fibrosis cystica) jest to znana choroba gruczow wydzielania ze wntrznego i gruczow potowych, uwarunko wana genetycznie (p. tab. 1-1), Charakteryzuje j nienaturalnie lepka wydzielina, ktra zatyka przewody wydzielnicze trzustki i oskrzeliki. Chorzy na mukowiscydoz maj take zwik szone iloci chlorkw w pocie. Ofiary tej choro by czsto umieraj w modym wieku na zakae nie puc. Bardzo niedawno (1989 r.) wyizolowa no i zsekwencjonowano gen zwizany z t chorob. Prawidowy gen koduje acuch 1480 aminokwasw biaka transbonowego, ktre wydaje si by kanaem dla chlorkw lub, prawdopodobnie, jakim regulatorem takiego kanau. Nieprawidowoci u prawie 70% cho rych na mukowiscydoz wydaje si by delecja 3 nukleotydw w DNA, co powoduje brak w tym transmembranowym biaku aminokwasu w pozycji 508, tj. reszty fenyloalaniny. W ja ki sposb ta delecja uszkadza czynno owego transbonowego biaka i powoduje gs ty luz, czeka Jeszcze na opracowanie. To wane zadanie powinno Uatwi odnalezie nie nonikw genu fibrosis cystica i spowo dowa racj onalniej sze leczenie ni obecne. Prawdopodobnie moliwe byoby przygoto wanie leku, ktry korygowaby zaburzenie w biaku transbonowym, a take nie jest wy kluczone, e mona by wprowadza prawid owy gen do komrek puc w wyniku leczenia genetycznego. 6. Analiza mechanizmu dziaania toksyny bakteryjnej, powodujcej choler, dostarczya wanego czynnika do zrozumienia przyczyny klinicznych objaw w tej choroby (obfita bie gunka, utrata elektrolitw i wody z organizmu). 7. Odkrycie, i komary przenoszce zarodce (plazmodia) powodujce zimnic s w stanie wytworzy w sobie barier ochronn o podou biochemicznym na dziaanie rodkw owado bjczych, ma wane implikacje w prbach wyeliminowania tej choroby. Ten przykad i po przednie reprezentuj choroby powodowane przez czynniki biologiczne (p, tab. 1-1), Wiele analiz biochemicznych nawietla mechanizmy chorb, ktre z kolei inspiruj badania w okrelonych dziaach biochemii Wstpne obserwacje, poczynione w pocztkach naszego stulecia przez angielskiego lekarza Archibalda Garroda na maej grupie wrodzonych wad metabolicznych, wzbudziy poszukiwanie biochemicznych przyczyn tego stanu. Badania dotyczce genezy przyczyn choroby uwarunkowanej genetycznie, znanej jako hiper-cholesterolemia rodzinna, bdcej przyczyn zaawansowanej miadycy ttnic w modym wieku, umoliwiy radykalny postp w dziedzinie receptorw komrkowych i mechanizmw przyswajania cholesterolu przez komrki. Prace z zakresu onkogenw w komrkach rakowych zwrciy uwag na mechanizmy molekularne zwizane z kontrolowaniem prawidowego wzrostu komrkowego. Te i wiele innych przykadw ilustruje, jak obserwacje poczynione w klinice mog otworzy szerokie obszary funkcjonowania komrek dla bada biochemicz nych. TA KSIKA POMOE POWIZA WIEDZ Z ZAKRESU BIOCHEMII Z PROBLEM AMI KLINICZNYMI Kocowy rozdzia podsumowuje wiele koncepcji, pojawiajcych si w tekcie, dotyczcych powizania biochemii z patologi. Przykadami s tutaj take mechanizmy biochemiczne dziaajce w poszczeglnych chorobach, ktre powoduje kada z 8 przyczyn wymienionych w tab. 1-1. W suplemencie omwiono rwnie podstawowe rozwaania stosowane podczas interpretacji wynikw biochemicznych testw laboratoryjnych wykonywanych rutynowo w praktyce klinicznej. Gwnym celem tych stara jest pomoc i zachta dla Czytelnika, aby umia przetransponowa wiedz z zakresu biochemii w swoj dziaalno kliniczn. Wykorzystanie bada biochemicznych w odniesieniu do chorb mona podsumowa w 5 punktach.
BIOCHEMIA I MEDYCYNA / 16
Takie badania mog: 1) odkry przyczyny choroby, 2) zaproponowa racjonalne i skuteczne jej leczenie, 3) umoliwi masowe testy do wczesnej diag nozy, 4) uatwi monitorowanie postpw choroby, 5) uatwi ocen skutku leczniczego.
Suplement do tej ksiki opisuje najwaniej sze rutynowe biochemiczne testy diagnostyczne, uywane do wykrywania chorb (tzn. do celw okrelonych w pkt. 3, 4 i 5). Posuy on za poyteczne rdo informacji przy omawianiu biochemicznej diagnostyki chorb (np. zawau serca, ostrego zapalenia trzustki).
Biomolekuy i metody biochemiczne

WPROWADZENIE
Celem niniejszego rozdziau jest przedstawienie 5 zagadnie istotnych dla zrozumienia biochemii oraz wskazania gwnych kierunkw pomagajcych w przyswojeniu wiedzy niniejszego podrcznika. Omwiono wic zwile kolejno: 1. Skad chemiczny organizmu i podstawowe klasy czsteczek w nim wystpujcych. 2. Budow struktur komrkowych i sposobu ich wydzielania. 3. Wag rozwiza dowiadczalnych i wa ciwego dobom metod stosowanych w biochemii. 4. Gwne osignicia w biochemii oraz 5. Sabo rozwinite dziay biochemii dotycz ce m.in. rozwoju, rnicowania, funkcji mzgu, nowotworw i innych chorb czowieka. Wobec powyszego by moe stan si one dla niektrych Czytelnikw motorem przyszego ich udziau w badaniach nad tymi pro blemami.
rol w licznych procesach biologicznych i znajduje si w centrum wielu aktualnie prowadzonych bada. Pierwiastki wyszczeglnione w kolumnie 3. tab. 2-1 peni rnorakie funkcje. Wikszo z nich spotyka si w codziennej praktyce lekarskiej u chorych z zaburzeniami rwnowagi elektrolitowej (K.+ , Na + , Cl" i Mga+), niedokrwist oci spowodowan niedoborem elaza (Fe2+) lub chorobami tarczycy (I").
Tabela 2-1. Przybliony skad chemiczny organizmu ludzkiego (w przeliczeniu na such mas)* Pierwiastek Procent Pierwiastek Procent Wgiel Tlen Wodr Azot Wap Fosfor
50 20 10 8,5 4 2,5
Potas Siarka Sd Chlor Magnez elazo Mangan

Jod
0,8 0,4
0,4 0,1
ORGANIZM LUDZKI SKADA SI Z KILKU PIERWIASTKW, KTRE TWORZ RNE CZSTECZKI Gwne pierwiastki to: wgiel (C), wodr <H), tten (O) i azot (N)
0,01 0.001 0,00006
* Cytowane za zgod z: West ES, Todd WR: Textbook of Biochemistry, 3 wyd., Macmillan, 1961.
Skad chemiczny organizmu ludzkiego zosta poznany, a podstawowe jego skadniki przedstawiono w tab. 2-1. Wgiel, tlen, wodr i azot stanowi gwne skadniki wikszoci biomole-ku. Fosfor jest skadnikiem kwasw nukleinowych i innych zwizkw, a w fprmie zjonizowa-nej jest rwnie szeroko rozprzestrzeniony w organizmie czowieka. Wap odgrywa kluczow
Gwne biopoinrtery to DNA, RNA, biaka, polisacharydy i zoone lipidy
Jak przedstawiono w tab. 2-2, gwne zespoy bioczsteczek w komrkach i tkankach wyszych zwierzt (wczajc czowieka) to: DNA, RNA, biaka, polisacharydy i lipidy. Te zoone czsteczki s zbudowane z prostych czsteczek, ktre take wymieniono w tab. 2 -2. Cegieki
BIOMOLEKUY I METODY BIOCHEMICZNE / 17
budulcowe DNA i RNA (oglnie znane jako kwasy nukleinowe) to odpowiednio deoksyry-bonukleotydy i rybonukleotydy, natomiast bu dujce biaka to aminokwasy. Polisacharydy s zbudowane z prostych wglowodanw: w przypadku gfikogenu (gwnego polisacharydu wystpujcego w tkankach ludzkich) cegiek bu dulcow jest glukoza. Kwasy tuszczowe mog by uwaane za jednostki budulcowe lipidw, chocia lipidy nie s polimerami kwasw tuszczowych. DNA, RNA, biaka i polisacharydy zalicza si do hiopolimerw, poniewa skadaj si z powtarzajcych si cegieek budulcowych (monomerw). Te zoone czsteczki stanowi istotne tworzywo ycia". Wikszo przedstawionego tekstu bdzie wiec zwizana z opisem rnych biochemicznych waciwoci tych biopolimerw i monomerw. Takie same zoone czsteczki znaleziono rwnie wrd niszych organizmw, chocia cegieki budulcowe w niektrych przypadkach mog si rni od tych przedstawionych w tab. 2-2, np. bakterie nie maj glikogenu i triacylogliceroli, ale maj one inne poiisacharydy i lipidy.
Tabela 2-2. Gwne zoone biomolekuy organi czne komrek i tkanek. Kwasy nukleinowe, biaka i polisacharydy s biopolimerami zbudowanymi z poniej przedstawionych jednostek budulco wych. Lipidw oglnie nie zalicza si do bio polimerw i nie wszystkie lipidy zawieraj kwasy tuszczowe jako jednostki budulcowe Blomolekula Jednostka budulcowa
DNA RNA Deoksyry bonu kleotyd Rybonukleotyd Aminokwasy
Biaka, tuszcze, wglowodany, woda i skadniki mineralne stanowi g wne komponenty organizmu ludzkiego Skad chemiczny organizmu ludzkiego przedstawiono w tab. 2-3. Gwne jego komponenty to: biaka, tuszcze, wglowodany, woda i skadniki mineralne. Woda stanowi gwny skadnik, cho jej ilo waha si w szerokim zakres ie wrd rnych tkanek. Polarny charakter i zdolno tworzenia wiza wodorowych czyni wod idealnym rozpuszczalnikiem w organizmie. Szczegowe znaczenie waciwoci wody zostanie przedstawione w rozdz. 3.
Tabela 2-3. Prawidowy skad chemiczny czowieka o masie ciaa 65 kg* Kilogramy Biaka
Tuszcze 11
Procent 17,0 13,8

1,5
9
1 40 4
Wglowodany Woda** Skadniki mineralne
61,6
6,1
* Cytowane za zgod z: Davidson SD, Pas-smore R, Brock JF: Human Nutrition and Dietetics, wyd. 5, Churchill Livingstone, 1973. ** Zawarto wody moe rni si midzy rnymi tkankami, wystpujc w maej iloci (22,5%) w kociach bezszpikowych, Zawarto procentowa wody wykazuje tendencje zmniejszania, gdy zwiksza si odsetek lipidw w organizmie.
Podstawowe funkcje Materia genetyczny Matryca w biosyntezie biaek Rnorodno penionych funkcji w komrkach (np, enzymy, elementy kurczliwe) Krtkotrwae magazynowanie energii w postaci glukozy Rnorodne, np. skadniki bon komrkowych, dugotrwae magazynowanie energii w postaci triacylogliceroli
KOMRKA PODSTAWOW JEDNOSTK YCIA W XIX w. w badaniach Schleidena i Schwan-na oraz innych pionierw, takich jak Virchow uznano komrk za podstawow jednostk aktywnoci biologicznej. Jednake dopiero bezporednio po II wojnie wiatowej 3 wydarzenia zapocztkoway okres nierwnomiernego roz woju w biochemii i biologii komrki. Byy to: 1) zwikszajca si dostpno mikroskopu elektronowego, 2)
wprowadzenie metod pozwalajcych rozbija komrki, w warunkach wzgldnie agodnych, ultra wirwki z chodzeniem, zapewniajcej wy-
Biako
Polisacharydy (glikogen) Lipidy
Glukoza
Kwasy tuszczowe
zapewniajcych ich funkcje, oraz 3) zwikszajca si dostpno wysokoobrotowej tworzenie siy odrodkowej wystarczajcej do
Biochemia
18 / ROZDZIA 2
rozdzielenia rozbitych komrek, bez ich przegrzewania. Zastosowanie mikroskopu elektronowego ujawnio wiele nie znanych wczeniej lub sabo widocznych skadnikw komrkowych, ktrych rozbicie i ultrawirowanie pozwolio na ich wydzielenie i analiz in vitro, Hepatocyt szczura modelowa komrka eukariotyczna Schemat strukturalny komrki wtroby {he-patocytu) szczura przedstawiono na ryc. 2-1. Hepatocyt jest prawdopodobnie najczciej badan komrk ze wszystkich komTek pod wzgldem biochemicznym, czciowo z powodu atwej jej dostpnoci w stosunkowo duych ilociach odpowiednich do frakcjonowania i badania rnorodnoci jej funkcji. Hepatocyt zawiera gwne organelle wystpujce w komrkach eukariotycznych (tab. 2-4). S to: jdro komrkowe, mitochondria, siateczka rdplaz-matyczna, wolne rybosomy, aparat Golgiego, lizosomy, peroksysomy, bona komrkowa i niektre elementy cyt o szkieletu. Do rozbicia komrek i wydzielania organelli i wewntrzkomrkowych czsteczek stosuje si techniki fizyczne W celu zbadania funkcji dowolnej organelli naley, w pierwszej kolejnoci, wydzieli j we wzgldnie czystej formie, wolnej od wikszych zanieczyszcze innymi elementami struktural nymi komrki. Utarty sposb, ktry pozwala to osign, nazywa si frakcjonowaniem subko-mrkowym i oglnie wymaga 3 operacji, tj. ekstrakcji, homogenizacji i wirowania. Wikszo pionierskich bada w tym zakresie wyko nano wykorzystujc wtrob szczura. Ekstrakcja. Pierwszy etap w kierunku izolowania okrelonej organelli (czy czsteczek) stanowi jej ekstrakcja z komrek, w ktrych si znajduje. W wikszoci organelle i biomolekuy s nietrwae i trac biologiczn aktywno; musz wic by ekslrahowane w warunkach agodnych (np. stosowanie roztworw wodnych i pozbawionych ekstremalnych wartoci pH, cinienia osmotycznego i wysokich temperatur). Rzeczywicie, wikszo metod izolowania organelli wykorzystuje temp. 0 4C (tj. w chodni lub utrzymywanie badanego materiau w pojemnikach z lodem). Znaczna utrata aktywnoci moe mie miejsce w temperaturze pokojowej, czciowo wskutek dziaania rnych enzymw trawiennych (proteaz, mikleaz, itd.), uwolnionych podczas rozbijania kom -
3 i steczka Srdplazmatyczna
Cytozol
Rybosom
Aparat Golgiego
Bona
cytoplazmatyczna Lizosom
Ryc. 2-1. Schemat komrki wtroby szczura z jej gwnymi organellami.
rek. Oglnie stosowany roztwr do ekstrakcji organelli komrkowych zawiera 0,25 mol/l sacharozy (izotonicznej), doprowadzonej do pH 7,4 za pomoc 0,05 mol/l buforu Tris (trishyd-roksymetyloaminometan) kwas solny i jony K+ i Mg2+ o steniu zblionym do wartoci fizjologicznych; ten roztwr jest nazywany umownie STKM. Nie wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji s tak agodne jak STKM; np. rozpuszczalniki organiczne wykorzystywane do ekstrakcji lipidw i kwasw nukleinowych. Homogenizacja. Aby wyekstr ahowa or ganelle (lub bioczsteczk) z komrek, najpierw naley rozbi komrki w agodnych warun kach. Narzdy (np. wtroba, nerka, mzg) i zawarte w nich komrki mog by rozbite w sposb standardowy przez homogenizacj, podczas ktrej napdzany rcznie lub mechani-
BIOMOLEK UY I METODY BIOCHEMICZNE / 19 Tabea 2 -4. Gwne organelle wewntrzko mrko we i ich czynnoci W zestawieniu podano tylko podstawowe funkcje zwizane z kad z tych struktur. W wielu przypadkach w organellach moe przebiega kilka szlakw metabolicznych, procesw czy reakcji Organella lub frakcja* Jdro komrko we Mitocho ndrium Rybosom* Siateczka rd -piazmatyczn a Uzosom Bona cytoplaz-matyczn a Aparat Golgiego
Znacznik (Marker)
DNA Dehydrogenaza bursztynianowa Dua zawarto RNA GI u kozo - 6 - fosfataza
Gwne czynnoci
Miejsce chromosomw Miejsce syntezy RNA zalenej od DNA (transkrypcja) Cykl kwasu cytrynowego, oksydacyjna fosforyiacja Miejsce biosyntezy biaek (translacja mRNA w biatka) Rybosomy zwizane z bo nami s g wnym miejscem biosyntezy biaek Biosynteza rnych lipidw Utlenianie wielu ksenobiotykw (cytochrom P -450) Miejsce licznych hydrolaz (enzymw katalizujcych rea kcje degradacyjne) Transport czsteczek do i z komrek Wewntrzkomrkowa adhezja i wymiana Wewntrzkomrkowy rozdzia biaek Reakcje glikozylacji Reakcje powstawania siarczanw Degradacja niektrych kwasw tuszczowych Wytwarzanie i degradacja nadtlenku wodoru Mikrof i lamenty, mikrotubule; filamenty porednie Enzymy glikoltzy, syntezy kwasw t uszczowych
Fosfataza kwana Na+/K + -ATPaza, 5'-nukleotydaza Galaktozylo-tr ansferaza Katalaza Oksydaza moczanowa Brak swoistych znacznikw** Dehydrogenaza mlecza nowa
Peroksysom Cytoszkielet* Cytozol*
* Orga nel la sta nowi wewntrzkomrkow substruktur otoczon bton i wydzielon pr zez wirowanie przy duej sile odrodkowej. W zwizku z powyszym rybosomy, cytoszkielet i cytozol nie s organellami. Zamieszczo no je w tabeli ze wzgl du na ich izolo wanie przez wiro wanie rnicowe. Mo g by rozpatrywane jako struktury wewntrzkomrkowe lub frakcje. Organeile izolowane w toku pojedynczego cyklu wirowania rnicowego nie s czyste. W celu uzyskania czystych frakcji jest wymagane wielokrotne powtrzenie cyklu oczyszczania, ** Frakcje cytokszkieletowe mog by ocenione za pomoc mikroskopii elektronowej lub przez analiz elektroforetyczn charakterystycznych dla nich biaek.
cznie ttok obraca si w szklanej probwces odpowiednich rozmiarw, zawierajcej pocite kawaki narzdu we waciwym rodowisku, takim jak STKM. Kontrolowane obroty toka powoduj cicie i rozbijanie komrek, uwalniajc ich skadniki do roztworu sacharozy. Otrzymana zawiesina, zawierajca wiele nie naruszonych organelli, nazywa si homogena-em. Wirowanie. Frakcjonowanie skadnikw homogenatu przez wirowanie rnicowe jest technik o kluczowym znaczeniu w biochemii, W klasycznej metodzie stosuje si seri 3 od-wirowa przy stopniowo zwikszajcych si szybkociach (ryc. 2-2), z ktrych kade dostar-
cza osadu i supernatantu. Supernatant na ka dym etapie poddaje si odwirowaniu. Takie postpowanie pozwala otrzyma 3 -krotnie osad, nazywany odpowiednio frakcj jdrow, mitochondrialn i mikrosomaln. adna z tak uzyskanych frakcji nie reprezentuje w peni czystych organelli. Jednake, na podstawie bada w mikroskopie elektronowym oraz analizy aktywnoci odpowiednich enzymw znacznikw (ang, markerw) i skadnikw chemicznych (np. DNA i RNA), stwierdzono, e gwnymi elementami opisywanych 3 frakcji s odpowiednio: jdra komrkowe, mitochondria i mikrosomy. Znacznikowy enzym lub skadnik chemiczny jest jednym z parametrw prawie
20 / ROZDZIA 2
, Supernatant (1)
Supernatan t ( 2)
Supernatant (31
600 g
:-:-: \i -i
15,000 g
x 5 min
x 10 min.
,Homogenat
105,000 g x 60 min
p
Frakcja Jdrowa Frakcja mllochondfialna , Frakcj a ml kro BO ma tna
Ryc. 2-2. Schemat rozdziau frakcji wewntrzkomrkowych za pomoc wirowania rnicowego. Zhomogenizowan tkank (np. wtrob) pocztkowo poddaje si wirowaniu przy maej sile odrodkowej, ktra dostarcza frakcji jdrowej {zawierajcej jdra komrkowe i nienaruszone komrki) oraz supernatantu (1). Supernatant (1) dekantujesi i poddaje wirowaniu przy redniej sile odrodkowej, ktre prowadzi do otrzymania frakcji mitochondrialnej {zawierajcej mitochondria, lizosomy i peroksysomy) i supernatantu (2). Supernatant ten poddaje si dekantacji oraz wirowaniu przy duej sile odrodkowej. Osad z tego wirowania stanowi frakcj mikrosomain (zawierajc mieszanin wolnych rybosomw oraz gadk i szorstk siateczk rd pla maty czn) i kocowy, klarowny pyn supernatant {3). Ten ostatni odpowiada cytozolowi, czyli sokowi komrkowemu. Rne modyfikacje tego podstawowego schematu wirowania rnicowego umoliwiaj izolacj kadej organelli komrkowej we wzgldnie czystym stanie.
wycznego wystpowania w okrelonej orga nelli, np. fosfataza kwana w lizosomach, DNA w jdrze komrkowym (tab. 2 -4). W ten sposb znacznik moe stanowi wskanik obecnoci lub braku w poszczeglnej frakcji organelli, w ktrych on wystpuje. Frakcja mikrosomalna (mikrosomy) zawiera gwnie mieszanin gadkiej i szorstkiej (siateczka rd-plazmatyczna z poczonymi z ni rybosomami) siateczki rdplazmatycznej oraz wolnych rybosomw. Zawarto ostatniego supernatantu odpowiada rozpuszczalnej frakcji cytopiazmy (cy-tozo). Modyfikacja tej podstawowej metody wirowania rnicowego przez stosowanie od miennych rodowisk do homogenizacji tkanek, rnych technik wirowania (np. cigy lub skokowy gradient stenia sacharozy) pozwala wydzieli lepiej lub gorzej oczyszczone postacie wszystkich organelli komrkowych przedsta wionych na ryc. 2-1 i wymienionych w tab. 2-4. Opisany powyej schemat frakcjonowania moe znale zastosowanie, w oglnym zarysie, do wikszoci narzdw i komrek. Jednak frakc jonowanie komrek tym sposrobem musi by ocenione przez analiz w mikroskopie elektronowym w celu standaryzacji metody. Nie naley
przecenia znaczenia bada frakcjonowania struktur komrkowych w rozwoju biochemii i biologii komrki. Stanowi ono jedno z waniejszych rozwiza dowiadczalnych (patrz niej) i gwnie dziki jego wykorzystaniu wyjaniono funkcje organelli, przedstawionych w tab. 2-4. Informacje o funkcjach poszczeglnych organelli, przedstawione w tej tabeli, stanowi gwne osignicia bada biochemicznych (patrz niej). Rozwizanie dowiadczalne obejmuje 3 etapy Rozwizanie dowiadczalne stosowane w biochemii obejmuje 3 gwne etapy: 1) izolowanie biomolekul i organelli (p. powyej: Wirowanie), 2) okrelenie struktury biomoleku oraz 3) analizy, z wykorzystaniem rnych preparatw, funkcji i metabolizmu biomoleku (tj. syntezy i degradacji). Izolowanie biomoleku Wyjanienie funkcji biomoleku, podobnie jak w przypadku organelli, wymaga przede wszystkim wydzielenia ich w czystej postaci. W tabeli 2-5 przedstawiono gwne metody
wykorzystywane do rozdziau i oczyszczania biomoleku. W tym podrozdziale nie podano szczegw metodycznych, niektre z nich zostan krtko opisane w rnych miejscach tego podrcznika. Poczenie kilku metod jest prawie zawsze nieodzowne w oczyszczaniu biomoleku do stanu jednorodnoci (wolnych od zanieczyszcze innymi biomolekuami). Naley podkreli, e postpy biochemii s uwarunkowane rozwojem nowych metod analizy, oczyszczania i badania struktury. Na przykad bio chemi lipidw zrewolucjonizowao wprowadzenie chromatografii ciecz owo-gazowej i chromatografii cienkowarstwowej. Analiza bon biologicznych i wielu biaek przysparzaa ogromnych trudnoci, a do chwili wprowadzenia elektroforezy w elu poliakryloamidowym zawierajcym SDS (SDS-PAGE). Wprowadzenie detergentu siarczanu dodecylu sodu (SDS) pozwala rozpuci" wiele biaek do analizy elektroforetycznej, ktre przedtem uchodziy
raczej za nierozpuszczalne. Rozwj metod sek-wencjonowama i klonowania DNA dokona przewrotu w badaniach kwasw nukleinowych i biologii w ogle. Okrelanie struktury biomoleku Kiedy bioczsteczki zostan oczyszczone, wtedy naley okreli ich struktur. Pozwoli to na szczegowe znalezienie zalenoci midzy ich budow a Funkcj. Gwne metody, wykorzystywane w analizie budowy biomoleku, przedstawiono w tab. 2-6. S one znane Czytelnikowi, ktry ma pewien zakres wiedzy z chemii organicznej. Znana swoisto niektrych en zymw czyni je bardzo uytecznymi narzdziami w wyjanieniu waciwoci strukturalnych pewnych biomoleku. Udoskonalenia w ich rozdzielaniu dokonano dziki postpowi teoretycznemu i technologicznemu, w wyniku wprowadzenia spektrometrii masowej i spektroskopii jdrowego rezonansu magnetycznego (NMR), ktre stay si metodami z wyboru do oznaczania budowy. Na przykad budowa bardzo zoonych acuchw wglowodanowych, wykryta w niektrych biomolekulach, takich jak gliko-proteiny, obecnie czsto moe by wyjaniona dziki spektroskopii wysokorozdzielczej NMR. Najbardziej wnikliwej informacji o budowie biomolekui dostarcza dyfrakcja promieniami X i krystalografia. Zastosowanie ich byo przeomem w wyjanieniu szczegw budowy rnych biaek i enzymw oraz natury podwjnego heliksuDNA.
Tabela 2-6. Gwne metody stosowane w okre leniu struktur biomoleku Analiza elementarna Spektrofotometria w wietle nadfioletowym i wi dzialnym Spektroskopia w podczerwieni, spektroskopia jdrowego rezonansu magnetycznego Zastosowanie kwasowej lub zasadowej hydrolizy do degradacji btomolekufy w badaniu jej podstawowych skadnikw Zastosowanie enzymw swoicie degradujcych biomolekuy (np. proteazy, nukleazy, glikozydazy) Spektrometria masowa L Metody swoistego sekwencjonowania {np. biaek, kwasw nukleinowych) Krystalografia rentgenowska
Tabela 2-5. Gwne metody stosowane do rozdziau i oczyszczania biomoleku. Wikszo z nich jest uyteczna do analizy skadnikw obecnych w ekstraktach komrkowych i innym materiale biologicznym. Poczenie kilku technik pozwala oczyci wikszo biomoleku. Zaleca si Czytelnikowi podrczniki przedstawiajce szczegowe opracowania metod wykorzystywanych w badaniach biochemicznych Frakcjonowanie za pomoc soli (np. wytrcanie siarczanem amonu) Chromatografia Bibuowa Jonowymienna (wymieniacze anionowe i kationowe) Powinowactwa Cienkowarstwowa Cieczowo-gazowa Cieczowa wysokocinieniowa Filtracja elowa E le k t roto r e za Bibuowa Wysokonapiciowa Na agarozie Na octanie celulozy W elu skrobiowym W elu poliakryloamidowym W elu poliakryloamidowym zawierajcym SDS U Itra w i rowan i e
22 / ROZDZIA 2
Analiza czynnoci i metabolizmu biomoleku Pocztkowe badania biochemiczne czowieka i zwierzt wykonywano na poziomie caego organizmu". Przykadem byy badania oddychania i ledzenie losu trawionych zwizkw. Wkrtce stao si jasne, e cay organizm jest zbyt zoonym obiektem, aby mona byo uzyska ostateczne odpowiedzi na wiek postawionych pyta. Rozpoczto zatem rozwija prostsze postpowania in vitro, ktre usuway wiele
komplikacji powstajcych w dowiadczeniach na caym organizmie. W tabeli 2-7 podsumowano rne typy postpowania preparatywnego, dostpne obecnie w badaniach procesw biochemicznych; wikszo danych przedstawionych w tym podrczniku otrzymano przez ich zastosowanie. Wykaz metod przedstawiono w zmniejszajcym si porzdku stopnia ich zoonoci. Zarwno wykorzystanie bada na poziomie caego organizmu, jak i inne metody postpowania maj swoje ograniczenia. Przy-
Tabela 2-7. Kolejno postpowania w badaniu procesw biochemicznych Poziom bada (metoda) Organizm zwierzcy Uwagi Badania mog obejmowa: 1) usunicie narzdu (np. hepatektomia) 2) zmiany w diecie (np. godzenie) 3) podawanie lekw (np. fenobarbital) 4) podawanie toksyn (np. tetrachlorek wgla) 5) wykorzystanie zwierzt z okrelon chorob {np. cukrzyca) 6) stosowanie wyrafinowanych technik, jak spektroskopia NMR i to mografia emisji pozytronowej Badania na tym poziomie s czsto fizjologiczne, ale ich interpretacja moe by utrudniona przez wpyw na narzdy ukadu krenia i ukadu nerwowego Szczeglnie uyteczne narzdy: wtroba, serce i nerka. Takie podejcie pozwala bada narzd poza wpywem innych narzdw lub ukadu nerwowego. Zastosowanie perfuzji zapewnia, e czynnoci narzdu s podtrzymywane przez kilka godzin Czsto uywa si skrawkw wtroby. Skrawki narzdu, odizolowane od innych wpyww; preparaty takie wykazuj jednake tendencj do degradacji w cigu niewielu godzin, czciowo, z powodu niedo statecznego odywienia 1. Szczeglnie przydatne dla komrek krwi, ktre mona stosunkowo atwo oczyci 2. Stosowanie komrek w kulturach tkankowych jest niezbdne w wielu dziedzinach biologii 1. Zapewnia preparatyk w ukadach bezkomrkowych 2. Moliwo dodawania lub usuwania okrelonych skadnikw (np, przez dializ) i analiza ich wpywu 3. Moliwo frakcjonowania przez wirowanie indywidualnych orga nelli komrkowych Szeroko stosowane w badaniach czynnoci mitochondriw, siateczki rdplazmatycznej, rybosomw, itp. Szeroko wykorzystywane, np. w badaniach czynnoci podstruktur mitochondriw Istotna cz analizy reakcji chemicznych lub szlakw metabolicznych Izolowanie sklonowanych genw jest istotne dla bada ich budowy i regulacji, moe stanowi podstaw w okrelaniu sekwencji amino-kwasowych kodowanych przez nie enzymw lub biaek
Wyizolowany, perfundowany narzd Skrawki tkankowe
Komrki
Homogenat
Wydzielone organelte komrkowe Pod Struktury organelli komrkowych Izolowanie i charakterystyka metabolitw i enzymw Klonowanie genw kodujcych enzymy i biaka
BIOM OLEK UY I MET ODY BIOCHEMICZNE / 23
czyn faszywych wynikw (artefaktw) dowiadcze in ntro moe by np. homogenizacja komrek, uwalniajca enzymy, ktre mog czciowo trawi skadniki komrkowe.
STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZOONE I WIELOPOZIOMOWE

Niniejsza ksika w wikszoci bdzie dotyczya zoonych procesw biochemicznych (np. biosyntezy biaka, skurczu minia), cznie ze szlakami metabolicznymi. Szlak metaboliczny stanowi serie reakcji odpowiedzialnych za biosyntez bardziej zoonego zwizku, zbudowanego z jednego lub wielu prostych zwizkw, czy za degradacj zwizku do jego kocowych produktw. O istnieniu zoonego procesu biochemicznego mona wnioskowa na podstawie obserwacji poczynionych na poziomie caego organizmu, np. obserwujc czowieka mona stwierdzi, e minie szkieletowe si kurcz. Wiemy, e glukoza suy jako rdo energii dla
ludzi i innych organizmw zwierzcych, a zatem mona wnioskowa, e musi ona by degradowana (metaboiizowana) w organizmie w celu uzyskania energii. Jednake, aby zrozumie w peni przebieg tego procesu w komrkach ludzkich, a wiedza nasza o tym jest wci niekompletna, naley przeprowadzi analizy na rnych poziomach. Na rycinie 2-3 przedstawiono schematycznie rne typy obserwacji i analiz, ktre s nieodzowne w celu zrozumie nia procesw biochemicznych, takich jak rozkad glukozy w celu uzyskania energii (proces znany jako gjikoli/a). Schemat ten stosuje si do podstawowego poziomu wszystkich gwnych procesw biochemicznych omawianych w niniejszej ksice i przedstawienia oglnej strategii w ich wyjanianiu. Powinien on si przypomina wtedy, kiedy kady z opisywanych gwnych procesw biochemicznych (np. glikoliza, utlenianie kwasw tuszczowych) bdzie rozpatrywany, chocia nie zawsze punkt wyszczeglniony na rycinie bdzie z nim zwizany. Wiele wanych punktw, przedstawionych w tabeli 2-7 i na ryc. 2-3, zasuguje na dyskusj.
Wnioskowania o obecnoci procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego na poziomie caego organizmu zwierzcego Badanie mechanizmw jago kontroli in vtvo Badanie wpywu swoistych chorb (np. wrodzone bloki metaboliczne, nowotwr itp,) na Jego przebieg
Umiejscowienie procesu w Jednym (lub wicej) narzd z ie(ach) Umiejscowienie procesu w Jednej (lub wicej) organem czy frakcji komrkowej Przedstawienie reakcji zaangaowanych w jego przebieg
Oczyszczanie uczestniczcych w nim Indywidualnych substratOw, produktw, enzymw, koenzymw I innych skadnikw Badanie mechanizmw Jego kontroli In vttro Ustalenie mechanizmw reakcji zaangaowanych w Jego przebieg Ftekonstytucja przebiegu procesu (szlaku)
t t
Badanie procesu na poziomie genu za pomoc rekombinacji DNA Ryc. 2- 3. Schemat oglnego postpowania w analizie procesu biochemicznego lub szlaku metaboliczne go. Wyszczeglnione etapy nie musz by stosowane dokadnie w wymienionej kolejnoci. Wykorzystani e ich prowadzi zwykle do wyjanienia szczegw procesu biochemicznego lub szlaku metabolicznego. Schemat ten znajduje zastosowanie we wszystkich gwnych szlakach metabolicznych przedstawionych w nastpnych rozdziaach niniejszej ksiki.
24 / ROZDZIA 2
1. Aby. zrozumie proces biochemiczny na poziomie molekularnym, pomimo moliwoci pojawienia si artefaktw, nieodzowne jest wyizolowanie i identyfikacja kadego z jego skadnikw w czystej postaci. Liczne przykady tego bd spotykane pniej. 2. Istotna jest take moliwo rekonstytucji procesu w warunkach in vitro przez systematyczn jego odbudowe z indywidualnych skadnikw. Jeeli po rekonstytucji z jego skadnikw proces nie przebiega, oznacza to, e pewien krytyczny skadnik zosta utracony i nie zosta wprowadzony do ukadu. 3. Ostatnie zdobycze technologiczne (np. spektroskopia NMR i tomografia emisji pozytrono-wej; ang. PET scanning) pozwalaj wykrywa pewne biomolckuy na poziomie narzdu i rejestrowa zmiany ich iloci w czasie. Takie rozwizania wskazuj, e staje si moliwe wykonywanie wyrafinowanych analiz wielu procesw biochemicznych na poziomie in vivo. 4. Jeeli wyniki bada uzyskiwanych na rnych poziomach pokrywaj si, to ma si prawo wnioskowa, e zosta poczyniony rzeczywisty postp w zrozumieniu procesu biochemicznego. Jeli pojawi si due rozbienoci przy zastosowaniu rnych rozwiza dowiadczal nych, to ich przyczyny musz by badane a do uzyskania racjonalnego wyjanienia. 5. Przed stawione sposoby preparatywne i poziomy analiz mog by wykorzystane w badaniu rnic biochemicznych u zwierzt ze zmienionym stanem metabolicznym {np. godzenie, karmienie) lub swoistymi chorobami (np. cukrzyca, rak). 6. Wikszo przedstawionych metod i rozwiza mona wykorzysta w badaniach prawidowych i zmienionych chorobowo komrek lub tkanek czowieka. Jednake naley uwzgldni warunki (czas) pobierania takiego materiau i szczeglnie bra pod uwag wzgldy etyczne prowadzenia dowiadcze z materiaem ludzkim. Zastosowanie radioaktywnych i cikich izotopw przyczynio si do wyjanienia procesw biochemicznych Wprowadzenie izotopw do bada w biochemii w latach 30. naszego wieku stanowio punkt zwrotny, zatem ich zastosowania zasuguj na specjaln wzmiank. Przed ich uyciem bardzo trudno byo naznaczy" biomole-kuy, aby mona byo atwo ledzi ich los metaboliczny". Pionierskie dowiadczenia, zwaszcza Schoenheimera i wsp., wprowadzajce niektre izotopy trwae (np. 2D, l5N), poczone z ich detekcj na drodze spektrometrii
masowej, znalazy zastosowanie w rozwizywaniu wielu problemw biochemicznych. Na przykad pewne zsyntetyzowane aminokwasy, cukry i kwasy tuszczowe, zawierajce odpowiednie trwae izotopy, podaje si zwierztom lub in vitro w toku preparatyki, aby ledzi ich los metaboliczny (np. okres poowicznego rozpadu, przemian w inne biomolekuy). Zwizki znakowane trwaymi izotopami wykorzystano do poznania wielu aspektw metabolizmu biaek, wglowodanw i lipidw. Z tych dowiadcze wynika jasno, e metabolizm jest bardzo aktywnym procesem, a wikszo zwizkw w komrce jest stale syntetyzowana i degradowana, cho z odmienn szybkoci. Te odkrycia, zdaniem Schoenheimera, zwrciy uwag na dynamiczny charakter metabolizmu".
Tabela 2-8. Gwne izotopy stosowane w badaniach biochemicznych Izotopy trwale
2
Izotopy
promieni ot w rcze "C M Ca 1 3 1 1
D"N
Pniejsze wprowadzenie izotopw radioaktywnych oraz przyrzdw umoliwiajcych pomiar ich aktywnoci byo take niezmiernie wane. W tabeli 2 -8 przedstawiono gwne trwae i radioaktywne izotopy wykorzystywane w ukadach biologicznych. Zastosowanie zarwno izotopw trwaych, jak i radioaktywnych jest fundamentalne dla rozwoju kadego dziau biochemii. Badania za ich pomoc zoonych i prostych biomoleku zarwno in vivo, jak i in vitro budz zaufanie. Ogromny postp, poczyniony ostatnio w sekwencjonowaniu kwasw nukleinowych, a take w oznaczaniu substancji wystpujcych w-ukadach biologicznych w niezwykle maych ilociach stosujc metody radio-immunologiczne, opiera si na wykorzystaniu izotopw.
BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGI KOMRKI I MEDYCYN

Poniej dokonano podsumowania gwnych osigni w dziedzinie biochemii, zwaszcza w odniesieniu do biochemii czowieka. Obejmuj one: Ustalenie penego skadu chemicznego kom rek, tkanek i organizmu oraz wydzielenie i okrelenie budowy podstawowych zwiz kw w nich wystpujcych. Dostarczenie informacji, przynajmniej na oglnym poziomie, o funkcjach wielu pro stych, a take gwnych zoonych biomoleku (opisanych w dalszych rozdziaach ksi ki), W centrum zainteresowania pozostaje DNA, materia genetyczny, z ktrego infor macja jest przenoszona na 1 z typw RNA (informacyjny RNA, czyli mRNA), ktry z kolei dyktuje kolejno (sekwencje) amino kwasw w biakach. Przepyw informacji z DNA moe by zapisany nastpujco: DNA-> RNA-+ biako. Wydzielenie gwnych organelli komrek zwierzcych i ustalenie ich podstawowych funkcji. Stwierdzenie, e prawie wszystkie reakcje przebiegajce w komrkach katalizuj en zymy; oczyszczono i zbadano wiele enzymw oraz przedstawiono obszernie waciwoci i mechanizmy ich dziaania. Przedstawienie szlakw metabolicznych syn tezy i degradacji gwnych prostych i zoo nych biomoleku. Szlak syntezy danego zwiz ku w zasadzie rni si od szlaku jego de gradacji. Wyjanienie licznych aspektw regulacji me tabolizmu. Przedstawienie, w szerokim zakresie, w jaki sposb komrki zachowuj i wykorzystuj energi. Wyjanienie wielu aspektw budowy i funkcji rnych bon wystpujcych w komrkach, ktrych gwnymi skadnikami s biaka i li pidy. Przedstawienie, w oglnym zarysie, sposobu dziaania gwnych hormonw Wykrycie biochemicznych podstaw wielu
chorb.
POZOSTAO WIELE DO ZBADANIA

Zdajc-sobie spraw, jak wiele zgromadzono wiadomoci biochemicznych, naley oceni, jak niewiele jeszcze wiadomo w wielu dziaach tej nauki. Dwa istotne problemy, wymagajce wyjanienia, dotycz ustalenia biochemicznych podstaw rozwoju i rnicowania oraz funkcji mzgu. Chocia obecnie dobrze poznano natur chemiczn materiau genetycznego, prawie nic nie wiadomo o mechanizmach, ktre wczaj i wyczaj geny w czasie rozwoju. Zrozumienie regulacji genw stanowi klucz do poznania, jak rnicuj si komrki i jak zmieniaj si w komrki nowotworowe. Wiedza o podziale komrkowym i wzrocie komrek prawidowych i nowotworowych oraz o ich regulacji jest bardzo skpa. Rzeczywicie nic nie wiadomo na temat biochemicznych podstaw zoonych zjawisk ncuronalnych, takich jak wiadomo i pami. Bardzo ograniczona jest rwnie nasza wiedza 0 mechanizmach wydzielania komrkowego. Pomimo pewnego postpu, molekularne pod stawy wikszoci gwnych chorb genetycznych nie s wyjanione, ale wiele nadziei niesie tech nologia rekombinacji DNA, zwiastujc zauwa alny rozwj w tej dziedzinie w cigu kilku najbliszych lat. Ludzki genom moe by zsekwencjonowany w nastpnym stuleciu lub wczeniej. Wiadomoci uzyskane przez tak ogromny wysiek bd potnym wyzwaniem dla biologii czowieka 1 medycyny.
PIMIENNICTWO
Freifelder D: Physica Biochemistry: Appiicalions to Biochemistry and Molecuar Biology. Fceeman, 1982. Fruton JS: Moecuks and Life; Historical Essays on the Interplay of Ckemistry and Biology. Wiley-Interscience, 1972, Weinberg RA: The molecules of life. Sci Am (Oct) 1985; 253: 48. [Entire issue is of interest.]
3
WPROWADZENIE
Biochemia dotyczy w wikszoci waciwoci i reakcji chemicznych zwizkw organicznych. Czsto jednak si zapomina, e w komrkach ywych wikszo reakcji chemicznych przebiega w rodowisku wodnym. Woda jest czynnym skadnikiem w wielu reakcjach biochemicznych i jest wanym czynnikiem determinujcym waciwoci makroczsteczek, takich jak biaka. Woda dysocjuje do jonw OH~ i H+. Termin pH stosuje si do okrelenia stenia jonw wodorowych w komrkach oraz pynach ustrojowych i stanowi kluczowe pojcie w biochemii i medycynie. Grupy funkcyjne (aminowe, kar-boksylowe itd.) biomoleku dysocjuj przy okrelonej wartoci pH, a wiele ich waciwoci biologicznych i fizycznych zaley od tej dyso-cjacji.
Woda i pH
Vicor W. Rodwel, PhD
Regulacja rwnowagi wodnej jest zoona i za-iey przede wszystkim od podwzgrza, kont -
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE
Wiadomo, e dla zdrowia nieodzowna jest utrzymywana we wzgldnie wskich granicach. Dotyczy to oglnego rozmieszczenia wody, a take utrzymywania pH i stenia rnych elektrolitw, np. Na+, K+, Ca2+, Mg2+ i fosforanw w organizmie. Oglna zawarto wody w organizmie mczyzny waha si w granicach 5565% masy ciaa; mniejsza warto odnosi si do osb otyych. Dane dla kobiet s mniej sze, rednio o ok. 10%. Dwie trzecie wody
organizmu stanowi pyn wewntrzkomrkowy stao rodowiska wewntrznego organizmu,
rolujcego pragnienie, hormonu antydiuretycz-nego (ADH) i czynnoci nerek. Stany niedoboru wody i nadmiaru wody ustrojowej s powszechne. W wielu przypadkach towarzyszy im niedobr lub nadmiar jonw sodowych. Przyczynami niedoboru wody mog by: 1) zmniejszone jej pobieranie (np. podczas piczki) lub 2) nad mierne jej wydalanie (np. utrata z moczem w cukrzycy, przy silnych potach przez skr, w ostrej biegunce u dzieci, w przebiegu chslery). Nadmiar wody ustrojowej powoduj: 1) zwikszone pobieranie (np. przy nadmiernym podawaniu pynw doylnie) bd 2) zmniejszone jej wydalanie (np. w ostrej niewydolnoci nerek). U osb zdrowych pH pynu pozakomrko-wego utrzymuje si w granicach 7,357,45. Bufor wodorowglanowy (HCOf/H2CO3) od grywa szczeglnie wan rol w tym wzgldzie. Kiedy pH osiga warto poniej 7,35, wtedy dochodzi do stanu okrelanego ja ko kwasica, jeeli za pH przekroczy warto 7,45 wystpuje zas ado
wica. Zaburze nia rwnowagi kwasowo-zasadowej mona zwykle rozpozna
(ang. intraceliular fluid; skrt ICF), za pozosta cz reprezentuje pyn pozakomr-kowy (ang. extracellular fluid; skrt ECF). Okoo 25% ECF wystpuje' w osoczu.
oznaczajc pH krwi ttni czej, pCO 2 oraz ogln zawarto COj we krwi ylnej, znajc poprzednio wymienione wartoci, stenie HCOf. Istniej liczne przyczyny kwasicy (ketoacydoza cukrzycowa, kwasica mleczanowa itp.) i zasadowicy (wymioty kwan treci odkow, dziaanie niektrych lekw moczopdnych itp.). Znajo mo patogenezy zaburze rwnowagi wodnej i rwnowagi kwasowo-zasadowej jest podstaw waciwej diagnozy i ich leczenia. Wymaga to zatem poznania tych waciwoci wody, ktre umoliwiaj jej odegranie kluczowej roli w biochemii.
WODA I pH / 27
Czsteczka wody wykazuje budow tetraedryczn Czsteczka wody ma posta nieregularnego czworocianu (tetraedr) z atomem tlenu w jego rodku (ryc. 3-1). Dwa wizania z wodorem s skierowane w 2 rogi czworocianu, podczas gdy 2 pozostae rogi s zajte przez niesparowane elektrony na zhybrydyzowanych orbitalach 2sp3. Kt pomidzy 2 atomami wodoru a tlenem (105) jest nieco mniejszy ni kt tetraed-ryczny (109,5c), co przyczynia si do utworzenia nieznacznie skonego czworocianu.
Ryc. 3-2. Tetraedryczna struktura amoniaku.
STRUKTURA TETRAEDRYCZNA I DIPOLARNY CHARAKTER WODY UATWIAJ REAKCJE W stanie ciekym woda jest stabilizowana przez wewntrzczsteczkowe wizania wodorowe, ktre tworz struktur wielkoczsteczkow przypominajc struktur lodu Czsteczki wody, z powodu dwubiegunowego charakteru, tworz uporzdkowane ukady (przypominajce patki niegu). Jednake uporzdkowanie takie, jak w czsteczce wody, nie ogranicza si do lodu. Woda w stanie ciekym wykazuje struktur wielkoczsteczkow, ktra jest cile rwnolega do rozkadu geometrycznego czsteczek wody w lodzie. Zdolno czsteczek wody do czenia si ze sob zarwno w stanie ciekym, jak i staym wynika z dipolar-ncgo charakteru wody. Pozostaje ona w stanie ciekym z powodu przemijajcego charakteru jej kompleksw wielkoczsteczkowych (okresu ptrwania asocjacji dysocjacji czsteczek wody ok. 1 as). W stanie staym kada czsteczka wody asocjuje z 4 innymi czsteczkami wody. W stanie ciekym liczba asocjuj-cych czsteczek jest nieco mniejsza (ok. 3,5) i w tym stanie woda swoj budow wielkoczsteczkow, z wyjtkiem przemijajcej natury wewntrzczsteczkowych interakcji, przypomina ld w znacznie wikszym stopniu ni mona byo pocztkowo przypuszcza. Dipolarny charakter czsteczek wody sprzyja ich wzajemnemu czeniu si w uporzdkowa nym, precyzyjnym szyku, wynikajcym z wewntrznej geometrii czsteczki wody (ryc. 3-3).
Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody
Nierwnomierne rozmieszczenie adunku w czsteczce wody przyczynia si do utworzenia dipolu (czsteczki biegunowej) Lekko pochyla struktura czworocianu wody jest przyczyn nierwnomiernego rozmieszczenia w niej adunku. Przeciwlega do 2 atomw wodoru strona tlenu jest stosunkowo bogata w elektrony, natomiast druga strona, zawierajca wzgldnie odsonite jdra wodoru, tworzy obszar o adunku miejscowo dodatnim. Pojcie dipol" oznacza tak czsteczk, jak woda, w ktrej adunek elektryczny (elektrony) jest rozmieszczony nierwnomiernie. Amoniak, podobnie jak woda, jest tetraedryczn czsteczk dipolow W czsteczce amoniaku kty midzy wizaniami atomw wodoru (107) s zblione do kta tetraedrycznego nawet bardziej ni w wodzie {ryc. 3-2). Wiele zwizkw organicznych budujcych komrki jest dipolami, np. alkohole, fos-folipidy, aminokwasy i kwasy nukleinowe.
28 / ROZDZIA 3
V
Ryc. 3-3. Strona Iswa: Asocjacja 2 dipoiarnych czsteczek wody. Linia kropkowana przedstawia wizanie wodorowe Strona prawa: Asocjacja czsteczki wody (rodkowej) z 4 innymi czsteczkami wody za pomoc wiza wodorowych. Struktura ta jest H ,, typowa dla lodu i w mniejszym stopniu dla wody w stanie ciekym.
wodorowe narzucaj uporzdkowanie struktury nie tylko wodzie, lecz take innym czsteczkom dipolowym, tak odmiennym od wody, jak alkohole, DNA i biaka. Tworzenie wiza wodorowych midzy przedstawicielami czsteczek wanych fizjologicznie zwizkw przedstawia ryc. 3-4. Powstawanie ich nie ogranicza si do czsteczek wody. Atomy wodoru, poczone z atomami azotu, mog uczestniczy take w wizaniach wodorowych. Problem ten bdzie rozpatrywany w dalszej czci ksiki w zwizku z omawianiem trjwymiarowej struktury biaek oraz regu czenia si (parowania) zasad azotowych w DNA,
Oddziaywanie elektrostatyczne midzy jdrem wodoru jednej czsteczki wody a woln par elektronw drugiej nazywa si wizaniem wodorowym. W porwnaniu do wiza kowalencyjnych, wizania wodorowe s raczej sabe. Rozerwanie wizania wodorowego w wodzie (w stanie ciekym) wymaga ok. 18,8 kJ/mol (4,5 kca!/mol), tj. ok. 4% energii wymaganej do rozerwania wizania O H w wodzie (461 kJ/mol=llO kcal/mol).
Czsteczki wody wykazuj niewielk, ale fizjologicznie wan, tendencj do dysocjacji, tj. tworzenia maych iloci jonw OH- i H
Czsteczki wody wykazuj ograniczon tendencj do dysocjacji (jonizowania) na jony H + i OH": H2 O ~ H+ + OH"
Wizania wodorowe, ktre s sabe, lecz mog powstawa w duych ilociach, odgrywaj istotn rol w biochemii. Liczne wizania
Sabe wizania wodorowe odgrywaj istotn rol w biochemii, wczajc stabilizacje struktury biaek i kwasw nukleinowych
CH3 CHj
CHj CH
Ryc. 3-4. Powstawanie wiza wodorowych midzy czsteczkami etanolu i wody, midzy 2 czsteczkami etanolu oraz midzy tlenem grupy kar-bonylowej peptydu i wodorem grupy aminowej ssiadujcego peptydu.
Poniewa jony s w cigym ruchu, twcTrzc czsteczki wody i dysocjujc, trudno okreli, czy pojedynczy atom wodoru Jub tlenu wystpuje jako jon, czy jako cz czsteczki wody. W danym momencie moe by jonem, a w nastpnym czci czsteczki. Jonw oraz czsteczek wody nie rozpatruje si pojedynczo. Wiedzc, e 1 g wody zawiera 3,46 x 1022 czsteczek, jonizacj wody mona opisa statystycznie. Naley zna prawdopodobiestwo wystpowania wodoru w formie jonu lub czci czsteczki wody. W przypadku gdy prawdopodobiestwo wystpowania wodoru w formie jonu wynosi 0,01 oznacza to, e atom wodoru ma 1 szans na 100 bycia jonem, a 99 szans na sto istnienia w czsteczce wody. Faktyczne prawdopodobiestwo znalezienia atomu wodoru w postaci jonu w czystej wodzie wynosi ok. 0,0000000018, tj. 1,8 x 10~9. Zatem jest on prawie w caoci czci czsteczki wody. Wynika z tego, ze w czystej wodzie na kady jon wodorowy i hydroksylowy przypada 1,8 x 109, tj, 1,8 mld czsteczek wody. Jony wodorowe i hydroksylowe maj jednak znaczny wpyw na waciwoci wody. Tendencj wody do dysocjacji wyraa si nastpujco:
[H2O]
WODA I pH / 29
W nawiasach przedstawiono stenia molowe jonw wodorowych, hydroksylowych i nie-zdysocjowanych czsteczek wody*, a K nazwano stal dysocjacji. Aby obliczy stal dysocjacji dla wody, naty przypomnie, e 1 mol ma mas 18 g. Jeden litr (1) (1000 g) wody zawiera zatem 1000:18 = 55,56 mol. Stenie molowe czystej wody wynosi wic 55,56 mol. Poniewa prawdopodobiestwo wystpowania wodoru w formie jonowej wynosi 1,8 x 10~9, stenie molowe jonu H+ (lub jonw OH~) w wodzie oblicza si, mnoc prawdopodobiestwo 1,8 x 10~* przez stenie molowe wody, tj. 55,56, co daje wynik= 1,0 x 10"7 mol/l. Teraz mona wyliczy warto K dla wody:
K
[H+] [ O H ] [10 ] [10 ]
7 7
kiego (37C) stenie H+ w wodzie jest nieco wiksze ni 10~7 mol/l. W ramach ustalonych granic wpywu temperatury, warto Kw = 10~1'1 (mol/1)2 dla wszystkich roztworw wodnych, nawet dla tych, ktre zawieraj kwasy lub zasady. W dalszej czci rozdziau stal ta bdzie wykorzystywana do obliczenia wartoci pH roztworw kwanych i zasadowych.
pH JEST UJEMNYM LOGARYTMEM STENIA JONW WODOROWYCH, A CILEJ AKTYWNOCI JONW WODOROWYCH
Termin pH wprowadzi w 1909 r. Srensen, definiujc pH jako ujemny logarytm stenia jonw wodorowych: pH = -log[H ] Definicja ta, aczkolwiek niezbyt cisa*, jest na og wystarczajca do celw biochemicznych. Aby obliczy pH roztworu naley: 1) oznaczy stenie jonw wodorowych (H+), 2) obliczy logarytm dziesitny (H+), 3) pH jest ujemn wartoci znalezion w punkcie (2). Na przykad w przypadku czystej wody w temp. 25C:
+
[HZO]
[55,56]
14
= 1,8 x
= 0,018 x 10 1O" 1S mol/l
Due stenie molowe wody (55,56) prawie nie ulega zmianom przez dysocjacj. Std wygodnie jest rozpatrywa wod jako zasadniczo niezdysocjowan (stal). Staa ta moe by wczona w sta dysocjacji K, jako nowa staa Kw, zwana iloczynem jonowym wody. Stosunek midzy Kw a K przedstawiono poniej: 16
K [OH 1,8 x 10[HZO]
16
mol/l
pH = -log[H*] = -logiO
-[-7]= 7,0
K w = (K) [H t O] = [H+] [ O H ] =
- 1 ,8x 10
mol/l) (55,56 mol/l) =

14
= 1,00 x 10"
(mol/l)
Sta K wyraa si w molach na litr, za Kw w mol2 na litr2. Z nazwy wynika, e iloczyn jonowy Kw jest liczbowo rwny iloczynowi ste molowych jonw H + i OH ~:
Kw = [H+] [ O H ]
W temperaturze 25C Kw = (10~7)2 m 10~14 (mol/f)2. Natomiast w temperaturach poniej 25C warto Kw jest wiksza, za powyej 25C mniejsza ni 10~14. W temperaturze ciaa ludz-
Mae wartoci pH odpowiadaj duym steniom jonw H+, a due maym steniom H+ Kwasy okrela si dawcami protonw, a zasady biorcami protonw. Wyrnia si mocne kwasy (np. HC1, H2SO4) cakowicie zdysocjo-wane, nawet w mocnych roztworach kwanych (niskie pH), oraz sabe kwasy, czciowo tylko dysocjujce w roztworach kwanych. Podobnie mona wyrni mocne zasady (np. KOH, NaOH) i sabe zasady (np. Ca(OH)2>. Tylko mocne zasady dysocjuj przy maych wartociach pH. Wikszo zwizkw organicznych w komrkach to sabe kwasy. Wyjtek stanowi ufos-forylowane zwizki porednie, ktre zawieraj
cile mwic, wyraenia w nawiasach reprezen - * scisie mwic, wyraenia w nawiasacn reprczen- ---------------------------------------------------------------------------------tuj raczej aktywno molow ni stenie molowe. * pH= log (aktywnoci H + )
30 / R OZDZIA 3
silnie kwasow grup pierwszorzdowego kwasu fosforowego. Ponisze przykady ilustruj sposb obliczania pH roztworw kwanych i zasadowych: Przykad. Jakie jest pH roztworu, w kt rym st eni e jonu wodo ro wego wynosi 3,2 xlO"4 mol/l?
Stenie (mol/1)
(a) (b)
Molowo KOH 2, 0 xic r 2 2,0 2 [0H-] 2 KOH xl O" 7 [OH-j z wody 1,0x10" 2 Cao [0H -] 2,00001 x10~
2,0x10" e 2,0x10~ 7 1,0x10" 6 2,1 x10"
= -l og ( 3, 2 x1 0" *) 4 = -log (3, 2) -log C IO" )
=-0 , 5 +4 = 3,5 Przykad. Jakie jest pH roztworu, w ktrym s ten ie jo nu h yd rok s yl o wego wyn osi 4,0 x 10"4 mol/l? Aby rozwiza to zadanie, naley okreli ilociowo warto pOH, ktre jest rwne log [OH~]; warto t mona wyprowadzi z definicji K: [OH-] = 10"14 zatem
log [H ] + log [ O H ] = log 10" lub pH + pOH = 14
+
W momencie podjcia decyzji o znaczeniu udziau wody, pH mona wyliczy jak powyej. , W przedstawionych przykadach przyjto za oenie, e mocna zasada KOH jest w peni zdysocjowana, a stenie molowe jonw OH~ rwna si steniu molowemu KOH. Zaoenie to jest suszne dla wzgldnie rozcieczonych roztworw mocnych zasad i kwasw lecz nie dotyczy sabych zasad i kwasw. Ze wzgldu na fakt, e te sabe elektrolity tylko w niewielkim stopniu dysocjuj w roztworach, naley przed obliczeniem cakowitego [H+] (lub cakowitego [OH~]) oraz obliczeniem pH, obliczy stenie H+ (lub stenia OH~) z danego stenia molowego kwasu (lub zasady), wykorzystujc sta dysocjacji. Biomolekuy zawieraj grupy funkcyjne czynne o istotnym znaczeniu fizjologicznym, ktre zachowuj si jak sabe kwasy Wiele zwizkw organicznych ywych komrek ma grupy funkcyjne, typowe dla sabych kwasw lub zasad. Jedna lub wicej grup funkcyjnych gwnie grupy karboksylowe, ami nowe lub utworzone w wyniku drugorzdowej dysocjacji fosforanowej estrw fosforanowych wystpuj we wszystkich biakach i kwasach nukleinowych, wikszoci koenzymw oraz metabolitw porednich. Aby zrozumie wpyw wewntrzkomrkowego pH na budow i ak tywno biochemiczn tych zwizkw, naley pozna sposb dysocjacji (rwnowagi protono-
A nastpnie:
[ O H ] = 4,0 x 1 0 * pOH = -log [ O H ] = -log (4,0 x 10 1og(10" ) =
4 4
) = -log (4,0) -
-0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz
pH = 14 - p O H = 14 - 3,4 = 10,6
Przykad. Jakie jest pH roztworu (a) 2,0xl0"! mol/l KOH, (b) 2,0 x 10"* mol/l KOH? W roztworach tych jony OH~ pochodz z 2 rde: KOH i wody. Poniewa pH okrela cakowite stenie jonw [H+ ] (pOH cakowite [OH ]) naley obydwa rda bra pod uwag. W pierwszym przypadku udzia wody w cakowitej puli [OH~] jest nieistotny, czego nie mona powiedzie w drugim przypadku.
Tabela 3-1. Przykady sabych kwasw i sprzonych z nimi zasad Kwas CH3COOH CH3NH3
OH
Sprzona zasada CH3COOCH3NH2

O"
H+N
NH
NH
WODA I pH / 31
wej) grup funkcyjnych sabo kwanych i sabo zasadowych. W laboratoriach badawczych i klinicznych rozdzia i identyfikacja tych zwizkw opiera si na znajomoci przebiegu dysocjacji ich grup funkcyjnych. Protonowa forma kwasu (HA lub RNH+) odnosi si do kwasu, za nieprotonowa (A~ lub RNH2} do sprzonej z nim zasady (tab. 3-1). Podobnie mona opisa zasad (np. A~ lub RNH2) i sprzony z ni kwas (np. HA lub RNH+) (lac. conitmgere poczy razem). Wzgldn moc sabych kwasw i zasad wyraa sie ilociowo przez ich stale dysocjacji, ktre obrazuj ich tendencje do jonizacji. Poniej podano wyraenia stae j dysocjacji (K.) dla 2 przedstawicieli sabych kwasw: i R NH+
R COOH ++ R COO + IR-C O O R-N H *+ R NH 2 K = [R MH2] [H [R-NHj] ] [H ] H
+
Z powyszych rwna, odnoszcych K do [H+ ] i do stenia niezdysocjowanego kwasu i sprzonej z nim zasady, wynika, e gdy
IR COO] = R COOH
lub gdy
[R NH Z] = [R NHj]
to wtedy
K = [H +]
Mona to wyrazi sowami: gdy rodzaj jonw

zasocjowanych (protonowych) i zdysocjowanych (sprzone zasady) wystpuje w rwnych ste niach, wwczas przewaajce stenie jonw wodorowych [H+ ] jest rwne liczbowo staej dysocjacji K.
[R COOH]
Jeli obliczy si logarytmy powyszego rwnania i obie strony pomnoy si przez I, to K [H+] -log[H
Poniewa wartoci liczbowe K dla sabych kwasw s ujemnymi liczbami wykadniczymi, wygodniej jest wyraa K jako pK, gdzie:
p K = -l o g K
logK Z definicji log K opisuje si jako pK, za log [H+] jako pH. W zwizku z tym mona ostatnie rwnanie zapisa
pK = pH
tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w ktrym

Tabela 3-2. Stae dysocjacji i wartoci pK dla przedstawicieli kwasw karboksylowych Kwas Octowy Gluta rowy Cytrynowy (1-rz.) (2-rz,) (1-rz.) (2-rz.) (3-rz.) K 1,76x10 4,58 x10" 8,40x10" 3,89x10" 6
4 5 5
stenia postaci protonowej i niepro tonowej s
pK 4,75 4,34 5,41 3,08 4,74 5,40
rwne. Warto pK kwasu mona oznaczy dowiadczalnie przez dodanie 0,5 rwnowanika* zasady na rwnowanik kwasu. Powstae w ten sposb kocowe pH bdzie odpowiada pK kwasu. Charakter sabych kwasw i buforw, ktre s roztworami sabych kwasw i ich soli opisuje rwnanie Hendersona--Hasselbalcha Warto pH roztworu zawierajcego saby kwas jest zalena od staej dysocjacji tego kwasu, jak przedstawiono powyej dla sabo kwanej wody. Zaleno t opisuje, w przystp* Wedug ukadu SI pojcie rwnowanika chemicznego nie jest uywane, jednak w tym tumaczeniu okrelenie to wiadomie utrzymujemy {przyp. red. nauk. tum.).
1,80x10" E 4,00x10" 6
Naley odnotowa, e pK odnosi si do K tak, jak pH do stenia H + . W tabeli 3-2 przedstawiono warto ci K i pK dla kwasu mono-, di- i trikarboksylowego. Naley podkreli, e grupy mocniejszych kwasw maj mniejsze wartoci pK.
32 / ROZDZIA 3
nej formie, rwnanie Hendersona-Hasselbal-cha, wyprowadzone poniej. Saby kwas HA dysocjuje w nastpujcy sposb: HA~ H + +A" Staa dysocjacji dla tej reakcji dysocjacji wynosi: " [HA] Po pomnoeniu na krzy:
[H+] [ A ] = K[HA]
Zatem w przypadku zobojtnienia w poowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1
pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10

pH = pK + lo g -
pK + (-1)
1,0 -
Po podzieleniu obu stron przez [A~]

i
1 0
0,8
Po zlogarytmowaniu obu stron:
og[H+]
[HA]
I%
l i
1*08
[A ] log K + log Po pomnoeniu przez 1

- f c g [ H+ ] = - l o gK - l o g [HA ] [A]
ojpK -2 pK -1 pK 0 pK +1 pK pK pK -3 +2 +3
Po podstawieniu zamiast log H+ i log K odpowiednio pH i pK otrzymuje si

[HA] pH = pK - log
[A]
tyc. 3-5. Typowa krzywa miareczkowania wykrelona na podstawie wynikw oblicze z rw nania Hendersona-Hasselbalcha.
Z kolei usuwa si znak minus, odwracajc ostatni czon rwnania:

pH = pK 4 log [HA]
Jeli rwnanie zastosuje si dla rnych stos u n k w [A -]/ [ HA] w zak res i e 1 0 M 0 " 3 i przedstawi na wykresie wyliczone wartoci pH. to otrzymany wynik opisuje krzyw miareczkowania sabego kwasu (ryc, 3 -5).
Ta ostatnia forma rwnania, opisywana jako rwnanie Hendersona-Hasselbalcha, suy do wyliczania rwnowagi protonowej, np.: 1. Kiedy kwas jest zobojtniony dokadnie w poowie, tj. A~ =[HA]. W tych warunkach pH = pK + tog [ A ] [HA] pK +- log =pK + 0
Roztwory sabych kwasw i ich soli buforuj pH w przypadku dodania lub usuwania protonw
Roztwory sabych kwasw i sprzonyct z nimi zasad (lub sabych zasad i sprzonycl z nimi kwasw) wykazuj zjawisko buforowa
nia, tj. zdolnoci utrzymywania pH. Warto pt roztworu buforowego po dodaniu mocnego kwasi lub mocnej zasady nie zmienia si bardziej ni p< dodaniu takiej samej objtoci wody. Zjawisk*
WODA I pH / 33
buforowania mona najlepiej zilustrowa poprzez miareczkowanie sabego kwasu lub zasady wykorzystujc pH-metr. W innym rozwiza niu mo na obliczy przesunicie pH, ktre ma miejsce w przypadku dodania kwasu lub zasady do zbuforowanego roztworu. W przedstawionym przykadzie, zbuforowany roztwr (mieszanina sabego kwasu i sprzonej z nim zasady, pK = 5,0) wykazuje pocztkowo w jednej z 4 wartoci pH. Mona obliczy przesuniecie pH, ktre wystpi, jeli zostanie dodany 0,1 mmol/1 K.OH na kady milirwnowanik kwasu w roztworze (o steniu 1 mmol).
Pocztkowe pH 5,00 [" ] pocztkowe 0,50 0,50 1,00 Dodanie 0,1 mmol KOH powoduje 0,60 0,40 [A f/[HA]kocowe 0 Kortcowe pH 0 1,50 0,176 5,18 0,02 4,00 0,602 5,60 0,23 9,00 0,95 5,95 0,35 49,0 1,69 6,69 0,83 0,1 0,2 0,80 0,90 0,98 0,30 2.33 0,20 4,00 5,37 0,70 0,12 7,33
f 1,0-
5,60 0,80
5,86 0,88
Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA.
Punkt {) wskazuje pK o wartoci 5,0.
ipH
0,18
Zmiana pH, wywoana przez dodanie 1 mmol jonw OH~ rni si znacznie w zalenoci od pH. Przy wartociach pH zblionych do wartoci pK, roztwory buforowe utrzymuj skuteczniej pH, co okrela si ich efektem buforujcym. Roztwory sabych
kwasw i sprzonych z nimi zasad s najskuteczniejszymi ukadami buforo wymi w zakresie pH rwnym pK + 2,0 jednostki pH.
adunek uamkowy 0,5 nie oznacza, e pojedyncza czsteczka jest obdarzona adunkiem uamkowym, lecz wyraa statystyczne prawdopodobiestwo, e ma ona adunek 0,5. Przyjcie adunku elektrycznego makroczsteczek jako funkcji pH stwarza podstaw dla wielu uytecznych technik rozdziau, wczajc eiektroforetyczny rozdzia aminokwasw, biaek osocza i nieprawidowych hemogJobin. W komrkach ywych bufory fosforanowy i wodorowglanowy, oprcz biaczanowych, stanowi podstawowe bufory.
PIMIENNICTWO
Segel IM: 1968. Biochemical Calcuiations. Wiley,
Oznacza to, e aby zbuforowa roztwr w pH X, mona wykorzysta saby kwas lub zasad, ktrych pH nie rni si od pH X wicej ni o 2 jednostki pH. Na rycinie 3-6 przedstawiono adunek eJekt-ryczny 1 czsteczki kwasu jako funkcj pH.
3 Biochemia
CZ I Budowa oraz funkcje biaek i enzymw Aminokwasy

Victor W. Rodweli, PhD
4
genne) musz by dostarczane w poywieniu, poniewa nasz organizm nie moe ich syntetyzowa w ilociach niezbdnych do podtrzymania wzrostu (dzieci) i utrzymania zdrowia (doroli). Metabolizm aminokwasw przyczynia si do powstania wielu biomedycznie wanych zwizkw. Na przykad dekarboksyla-cja pewnych aminokwas w prowadzi do powstania amin, wrd ktrych cze peni wane funkcje biologiczne (np. histamina i kwas 7-a-minomasowy [GABA]). Liczne choroby s spowodowane nieprawidowociami transportu aminokwasw do komrek. W pewnych warunkach moe doj do pojawienia si w moczu znacznej iloci jednego lub wielu aminokwasw takie stany okrela si jako aminoacydurie. WSZYSTKIE AMINOKWASY ZAWIERAJ PRZYNAJMNIEJ 2 GRUPY FUNKCYJNE Aminokwasy zawieraj 2 grupy funkcyjne, tj. aminow i karboksylow. W a -aminokwasach obie te grupy poczone s z tym samym (a)
H
WPROWADZENIE ywe komrki wytwarzaj makroczsteczki (biaka, kwasy nukleinowe, polisacharydy), ktre su jako skadniki strukturalne, katalizatory, hormony, receptory lub magazyny informacji genetycznej. Te makroczsteczki s biopolime-rami, utworzonymi z jednostek monomerycz-nych lub cegieek budulcowych. Jednostkami monomerycznymi w kwasach nukleinowych s nukleotydy, w zoonych polisacharydach pochodne cukrowe, a w biakach L-a-amino-kwasy. Chocia biaka mog take zawiera poza aminokwasami, dodatkowe substancje (np. hem, cukrowce, tuszcze), ich trjwymiarow struktur i waciwoci biologiczne warunkuje w gwnej mierze rodzaj aminokwasw, kolejno, w jakiej cz si ze sob w acuchu polipeptydowym oraz ich przestrzenne uoenie,, wzgldem siebie. Aminokwasy peni dodatkowe funkcje w komrkach. W tabeli 4-4 i 4-5 przedstawiono niektre biologicznie wane substancje, ktre wywodz si z aminokwasw.
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niektre aminokwasy wydaj si by zaan gaowane w przenoszeniu impulsw w ukadzie nerwowym, czego przykadem s glicyna i kwas Ryc. 4-1. glutaminowy. Aminokwasy podstawowe (egzo- kwasu.
\a
R-C-NHj I
COOH
OH
Dwie formy przedstawienia j.-amino-
36 / ROZDZIA 4
atomem wgla (ryc. 4-1). Chocia w przyrodzie wystpuje ok. 300 aminokwasw, tylko 20 z nich wystpuje w biakach (tab. 4-3). Ca kowita hydroliza* biatek dostarcza 20 L-a-ami-nokwasw. Naley podkreli, e biaka wszystkich form ycia rolin, zwierzt, drobnoustrojw zawieraj te same 20 aminokwasw. Przyczyn tego jest uniwersalno kodu genetycznego, co stanie si oczywiste dla Czytelnika w toku omawiania tego zagadnienia pniej (p. rozdz. 30). W skad niektrych biaek wchodz pochodne aminokwasw, utworzone po ich wczeniu w czsteczk biaka (p. lab. 6-4). Z wyjtkiem glicyny, dla ktrej R (R acuch boczny aminokwasu) stanowi atom wodoru (ryc. 4-1), wszystkie 4 podstawniki zwizane z atomem wgla et-aminokwasw s rne. Tetrdryczne. uoenie 4 rnych podstawnikw wok atomu wgla a (tzw. wgiel asymetryczny) nadaje aminokwasom waciwo op-.tyczna. (zdolnoTjio_ _skrcania . paszczyzny wiata spolaryzowanego). Chocia pewne aminokwasy wystpujce w biakach s prawo-skrtne, a niektre lewoskrtne, w pH 7,0 wszystkie maj bezwzgldn konfiguracj porwnywaln z konfiguracj aldehydu L-glicery-nowego, std opisuje si je jako L-a-amino-kwasy. Oglne reakcje chemiczne aminokwasw mona przewidzie znajc waciwoci grup funkcyjnych Grupy funkcyjne aminokwasw karbok-sylowa i aminowa wykazuj typowe dla nich reakcje, np. tworzenie soli, estryfikacj, acyla-
jedna naadowana, a druga obojtna, wystpuj w rwnowadze protonowej:

R COOH RCOO" + H+ H
+
W rwnowadze tej RCOOH i RNH^ reprezentuj zwizki protonowe lub kwane, natomiast RCOO~ i RNH2 zasady sprzone (protonobiorcw) z odpowiednimi kwasami . C h o c i a z a r wn o R C O O H j a k i R NH; s sabymi kwasami, RCOOH jest znacznie silniejszym kwasem ni R NH r W pH osocza krwi czy przestrzeni rdkomr-kowej (pH odpowiednio 7,4 i 7,1) grupy kar-boksylowe istniej prawie cakowicie jako jony karboksyjowe RCOO~. Przy tych wartociach pH wikszo grup aminowych wystpuje w fo r mi e z as o cj o wan ej (p ro t o n o wej ) RNH3. Ze wzgldu na przewaajc posta zjonizowan aminokwasw we krwi i wikszoci tkanek, naley przedstawi ich budow tak, jak na ryc. 4-2A. Naley pamita, e struktura B (ryc. 4-2) nie moe istnie w adnym pH. Przy dostatecznie niskim pH, w ktrym cofa si jonizacja grupy karboksylowej, znacznie sabsza kwana grupa aminowa bdzie wystpowa take w formie protonowej. Przyblione wartoci pKa dla grup a-karboksylowej i oc-aminowej wynosz odpowiednio 2 i 10 (tab. 4-1). Przy pH wynoszcym 2 jednostki poniej wartoci pKa, kwas w ok. 99% ma form protonow. Jeeli pH stopniowo wzrasta, to proton z grupy karboksylowej odcza si znacznie wczeniej ni z grupy RNH 3 W kadym wystarczajco wysokim pH do utworzenia przewagi grupy aminowej RNH2 musi by rwnie obecny jon karboksylowy (RCOO~). Jednake w wielu reakcjach, poza rwnaniami rwnowagi protonowej, stosuje si wzory aminokwasw w formie B.
+
RWNOWAGI PROTONOWE AMINOKWASW W zalenoci od pH otaczajcego rodowiska aminokwas moe mie adunek dodatni, ujemny lub nie mie adnego adunku Aminokwasy zawieraj co najmniej 2 zjoni-zo wan c, s ab o k wa n e grup y: COOH i NHt- W roztworze obie formy tych grup.
NH, 0NHj
II O 8
* Hydroliza = rozerwanie wizania kowalencyjnego przy udziale czsteczki wody.
Ryc. 4-2. Poprawna struktura ^jonizowanego aminokwasu w pH fizjologicznym lub blisko pH fizjologicznego (A). Posta B (niezjonizowana) nie wystpuje w adnym pH, ale jest czsto' uywana, dla wygody, przy omawianiu chemii aminokwasw.
AMINOKWASY / 37 Tabela 4-1. Sabo kwane grupy aminokwasw wystpujcych w biakac h Sprzony kwas a-Karboksylowa Nie a-kar boksy Iowa (aspara-ginian, glutaminian) RCOOH RCOOH Sprzona zasada R COO" R COO"
f 1 --------- R
Przybliona warto pK
2.1 0,5
4,0 + 0,3
Imidazolowa (histydyna) ^-Aminowa s-Aminowa (lizyna) Fenolowa OH (tyrozyna) R- N H + R-NH^
RNH2 RNHa
r v
6,0
9,8 1,0 10,5 10,1
Guanidynowa (arginina)
H NH2
RNCNH2
1 11+
H NH j II R N C NH 2
12,5
Sulf hydry Iowa (cystein3)
RSH
R-S-
8,3
Wzgldn moc sabych kwasw wyraaj wartoci pK, Wzgldn moc sabych kwasw wyraa si przez ich stale dysocjacji Ka lub przez ich pK ujemny logarytm ze staej dysocjacji:
Punkt izoelektryczny aminokwasu (pl) jest to takie pH, przy ktrym nie jest on obdarzony adnym adunkiem i nie porusza si w polu elektrycznym Struktur aminokwasu alifatycznego, takiego jak alanina, w pH odpowiadajcym punktowi izoelektrycznemu przedstawia ryc. 4-3.
W tabeli 4-1 przedstawiono wartoci pK dla grup funkcyjnych 20 aminokwasw spotykanych w biakach. Cakowity adunek (algebraiczna suma wszystkich dodatnio i ujemnie naadowanych grup) aminokwasu zaley od pH lub stenia protonw otaczajcego rodowiska. Moliwo zmiany adunku aminokwasw i ich pochodnych, przez umiejtne sterowanie pH, uatwia fizyczny rozdzia aminokwasw, peptydw i biaek.
NrV
Ryc. 4-3. Struktura postaci zjonizowanej lub jonu obojnaczego alaniny. Chocia jon obojnaczy alani ny ma grupy obdarzone adunkiem elektrycznym, nie wdruje w polu elektrycznym.
Dla wygody zapis Ka lub pKtt bdzie stosowany, w przypadku aminokwasu z tylko dwiema lecz opuszczony pniej w przypisach dotyczcych grupami zjonizowanymi (np. alanina) nie ma symboli. niejasnoci w wyliczeniu pl. Poniewa warto
38 / ROZDZIA 4
W mocnym kwasie (pH ponleji); cakowity ladunek= + l
O B pH ok. 3; cakowity adunek = o pH ok. 6 - ft cakowity adunek = -1 D W mocno) zasadzie (pH powyej 11); cakowity adunek = -2
Ryc. 4- 4. Rwno wagi protono we kwasu asparagino wego.
pK, (R COOH) = 2,35 nato miast p K 2 (RNH*) = 9,69, to punkt izoelektryczny (pl) alaniny wynosi:
2,35+9,69
Pl = 6,02
Wyliczenie wartoci pl dla aminokwasu z dodatkowymi grupami zjonizowanymi, poza tymi zwizanymi z wglem ot, jest bardziej skomplikowane. Na rycinie 4-4 przedstawiono rne formy jonowe kwasu asparaginowego. Jakie bdzie zatem pH odpowiadajce punktowi izo-elektrycznemu dla tego aminokwasu? W poszukiwaniu pl dla kwasu asparaginowego trzeba napisa wszystkie moliwe formy jonowe tego zwizku w kolejnoci, w ktrej pojawiaj si w roztworach od silnie kwanych, poprzez obojtne do zasadowych (porwnaj przykad kwasu asparaginowego na ryc. 4-4). Nastpnie naley rozpozna form izojonow, jon oboj-naezy lub obojtny (jak na ryc. 4-4B). Punkt izoelektryczny (pl) jest to pH w rodku pomidzy wartociami pK po obydwu stronach form izojonowych. W omawianym przykadzie:
2,09+ 3,86 Pl = 2,98
Warto pl dla lizyny wynosi 9,7; dla argininy 10,8. Czytelnik powinien umie okreli pl dla histydyny. Okrelenie wartoci pK po kadej stronie jonu obojnaczego przez sprawdzenie form naadowanych, nie ogranicza si do aminokwasw. Mona j stosowa do obliczania adunku czsteczki z kad liczb grup dysocjujcych. Moliwo wykonywania takich oblicze okazuje si bardzo przydatna w laboratorium klinicznym, gdy pozwala przewidzie ruchliwo elektro-foretyczn zwizkw w polu elektrycznym i dobra waciwe bufory do ich rozdziau. Na przykad, w buforze o pH 7,0 mona rozdzieli 2 typy czsteczek: z pl 6,0 i 8,0, poniewa czsteczka z pI = 6,0 bdzie mie wikszy cakowity ujemny adunek przy pH 7,0 ni czsteczka z pI = 8,0. Podobne rozwaania stosuj si do rozdziaw na zoach jonowych zarwno dodatnio, jak i ujemnie naadowanych polimerw (np. DEAE -celuloza, ywica Dowex 1), Rozpuszczalno i temperatura topnienia aminokwasw odzwierciedlaj ich charakter jonowy Obecno elektrycznie naadowanych grup wikszoci aminokwasw przyczynia si do ich rozpuszczalnoci. W formie jonowej rozpuszczaj si one atwo w rozpuszczalnikach polarnych, takich jak woda i etanol, ale nie rozpuszczaj si w rozpuszczalnikach niepolarnych, jak: benzen, heksan i eter. Wysoka temperatura topnienia (punkty topnienia powyej 200DC) odzwierciedla ilo energii potrzebnej do pokonania si jonowych stabilizujcych struktur sieci krysztaw.
Takie rozwizanie jest rwnie stosowane do obliczania wartoci pl aminokwasw z innymi, dodatkowymi grupami dysocjujcymi, np. lizy-ny lub histydyny. Po napisaniu wszystkich moliwych form elektrycznie naadowanych aminokwasw zasadowych lizyny i argininy naley zapisa, e:
pK 2 + pK 3 P ' = ---------- --------
AMINOKWASY / 33 Tabela 4-2. Podzia L-at-aminokwasw wystpu jcych w biakach na podstawie wzgldnej polar-noci ich grup R. W grupie niepolarnej jest maa bd nie ma wcale rnicy w adunku elektrycznym midzy regionami, podczas gdy w grupie polarnej rnica ta jest wzgldnie dua Aminokwasy
niepolarne
PODZIA AMINOKWASW WYSTPUJCYCH W BIAKACH NA PODSTAWIE WZGLDNEJ POLARNOCI ICH GRUP R

Aminokwasy wystpujce w biakach mona podzieli na 2 due grupy na podstawie poiar-noci grup R. przyczonych do atomu wgla a. W celu uatwienia przedstawiania niezwykle dugich sekwencji amin o kwasowych niektrych biaek, praktykuje si stosowanie jednolitero wych symboli aminokwasw (tab. 4-3). Aminokwasy w stanie wolnym lub zwizanym (nie bdce skadnikami biaek) odgrywaj wan rol w procesach przemiany materii (tab. 4-4 i 4-5). Na przykad ornityna, cytrulina i kwas argininobursztynowy uczestnicz w biosyntezie mocznika, katanie naturalnym wyst puje ponad 20 D-aminokwasw. Nale do nich D-alanina i kwas D-glutami nowy cian komrkowych niektrych bakterii oraz rne D-ami-nokwasy wchodzce w skad antybiotykw.
Aminokwasy polarne Arginina Asparagina Kwas asparaginowy Cysteina Kwas glutaminowy Glutamina Glicyna Histydyna Lizy na Sery na Treonina Tyrozyna
Alanina Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloa Janina Prolina Tryptolan Walina
Tabela 4-3. L-s- aminokwasy wystpujce w biakach* Nazwa Symbol Wzr strukturalny
Aminokwasy z. alifatycznymi acuchami bocznymi

HCHCOCT
Glicyna
Gly [G]
Alanina
Ala [A]
CH3
Walina
Vaf [V]
,CH CH COO"
Leucyna
Leu [L]
H,C
Izoleucyna
Ile [1]
7>
CHCB CGO"
40 / ROZDZSA 4
cd. tab. 4-3 Nazwa Symbol Wzr strukturalny
Aminokwasy z acuchem bocznym zawierajcym grupy hydroksylowe (OH)

Sery na
Ser [S]
CH^CH^rC&O.---.Li ^JLJf-
Treonina
Thr[T]
CH,-CH OH COCT
OH *NHj
Tyrozyna
Tyr [Y]
patrz niej
Aminokwasy z acuchem bocznym zawierajcym atomy siarki

Cysterna* Cys [C]
SH fl^
CH ; CH 3-CH COO" CH SH
;C
Metionina
Met [M]
H COO
rw ij -^
O^~ C n 3
Aminokwasy z acuchem bocznym zaw ierajcym grupy kwane lub ich amidy "OOCC Hs CHCOO" Kwas asparaginowy Asp[D]
t 1L 1 M
flfTJ
.$.
Asparagina
Asn [N]
H j N - C - CH , - C H C O O " 0 ^H,
Kwas glutamino wy
Glu ! El
"OOCC H 2C H3 CHCOO"
Glutamina
Gin [Q]
H,NCCH 2C H 2 ~CH COO-
Aminokwasy z acuchem
H N CH2 CH, CH? CH COO"
bocznym zawierajcym grupy zasadowe
I
Arginina
N H,
Arg
r
NH5
Lizy na
Hs -C H, C H, C H
[R]
S -C M C O O" +
H3 Histydyna j ________________________________________________________________________ I
C H, GHCOO*
Lys [K]
His | h|
AMINOKWASY / 41 cd. tab. 4-3 Nazwa Symbol Wzr strukturalny
Aminokwasy zawierajce piercie aromatyczny -Histydyna Fenyioaianina His [H] Phe {F] patrz wyej \ / >CHjCH^COO"
Tyrozyna
Tyr[Yl
Tryptofan
Trp[W]
H
pCH;CHcocr
Immokwasy Ptoiina Pro [P]
i ------------ 1
*. Z wyjtkiem hydroksyl i zyny (Hyl) thydroksyproliny (Hyp), ktre s wczane w wizania peptydowe jako lizyna i proiina, a nastpnie hydroksylowane, swoiste tRNA istniej dla wszystkich aminokwasw przedstawionych w tej t3be/i. Ich wczanie w biaka pozostaje pod bezporedni kontrol genetyczn. ** Cystyna skada si z 2 reszt cystetn poczonych wizaniem disiarczkowym:
I
"OOC CH CH Z S S CH 2 CH COO" NH +
Tabela 4-4. Przykady oc-aminokwasw nie wystpujcych w biakach, ale speniajcych istotn rol w metabolizmie ssakw Nazwa po tuczna i systematyczna Homocysteina (kwas 2-amino--4-merkaptoma sowy) Kwas cysteinosulfinowy {kwas 2-amtno-3-sulfi-nopropi onowy) Homoseryna (kwas 2-amino-4-hydroksymasowy) Wzr strukturalny w pH obojtnym
C H 2 C H ? C H C O Cf SH
Znaczenie Zwizek poredni w biosyntezie metiortiny Zwizek poredni w kata-botizmie cysteiny Zwizek poredni w metabolizmie treoniny, aspara-ginianu i metioniny
NH 3
H2CHCOO" CH2C
so t^
CHSCHS OH
42 / ROZDZIA 4
cd. tab. 4-4 Nazwa potoczna i systematyczna

Ornityna (kwas 2,5-diaminoamylo wy)
Wzr strukturalny w pH obojtnym

C H2CH2CH2biCOO"
Znaczenie
Cytrulina (kwas2-amtno-5-ureidoamylo wy)
I
NH,
Zwizek poredni w bio syntezie mocznika
Kwas argininobursztyno-wy
NH CH2~CHj11 "CHj
JW.
H N C N H"COOCH2C COO*
Dopa {3,4-dihydroksyfe-nyloalan ina)
3 T
VCH,
Prekursor meianiny
HO
HO
CH,
3-Mo nojodotyrozyna
I
Prekursor hormonw tar czycy
3,5 - D i j od oty r ozy n a
HO
-CH,
3,5,3'-Trijodotyronina (T3 ) .
jw.
Tyroksyna (3,5,3',5'-tetra-jodotyronin a; T4}
HO
CH,
jw.
AMINOKWASY / 43 Tabela 4-5. Przykady nie a-aminokwasw wanych dla metabolizmu ssakw Nazwa potoczna i systematyczna B-alanina (kwas 3-aminoproprionowy) Tauryna {kwas 2-amtnoerytosu)fonowy) Kwas y-aminomasowy (GA8A) (kwas 4-aminomasowy)
Kwas fi- aminuizumasowy H 3 N+ CH 2 CH COO"
Wzr strukturalny
CH2 CH 2 COO" [ + NH3 CH2 CH2 SO3"
11
Znaczenie Skadnik koenzymu A i witaminy

pantoteiny
Wystpuje w ci w poczeniu z kwasami ciowymi Neuroprzekanik powstajcy z glutaminianu w tkance mzgowej
On2 v*r1 2 ^rl2 UUU
(kwas 2-metylo-3-aminopropionowy)
H3
Kocowy produkt katabolizmu pirymidyny, wystpujcy w moczu niektrych osb
WACIWOCI POSZCZEGLNYCH AMINOKWASW ZALEZ D ICH GRUP R PRZY ATOMIE WGLA a Glicyna, najmniejszy aminokwas, moe dopasowa si" atwo w obszary trjwymiarowej struktury biaek, niedostpne dla innych aminokwasw i wystpuje w obszarach, w ktrych acuchy peptydowe ulegaj silnemu zwiniciu. Alifatyczne grupy R janiny, waliny, leucyny jjzoleucyny oraz aromatyczne grupy R fenylo-ajaniny, tyrozyny i tryptofanu s hydrofobowe i ta waciwo ma wane znaczenie w uporzdkowaniu czsteczek wody w biakach, w bezporednim ssiedztwie tych grup. Te aminokwasy s charakterystyczne przede wszystkim dla wntrza acuchw biaek cytozolowych. Naadowane grupy R aminokwasw zasadowych odgrywaj kluczow rol w utrzymywa niu swoistej konformacji biaka przez tworzenie wiza typu soli. Przerwanie i odtworzenie wiza typu soli towarzyszy utlenowaniu i od-tlenowaniu hemoglobiny {p. rozdz. 7). Ponadto aminokwasy z dodatnio lub ujemnie naadowanymi grupami R uczestnicz w ukadach przekazywania adunku" (ang, charge relay"). ktre przesyaj adunki na znaczne odlegoci podczas katalizy enzymatycznej. Histydyna ponadto peni wyjtkow i wan funkcj w katalizie enzymatycznej, gdy warto pK jej formy protonowej ukadu imidazolowego dopuszcza w pH 7,0 dziaanie jej jako katalizatora zasadowego lub kwasowego.
Pierwszorzdowa grupa alkoholowa seryny i pierwszo rzdowa grupa tioalkoholowa (SH) cysteiny s doskonaymi czynnikami nukleofi-lowymi, ktrych funkcja jest wana dla katalizy. Z kolei drugorzdowa grupa alkoholowa treoniny jest dobrym czynnikiem nukleofiio-wym, aczkolwiek nie jest znany jej udzia w katalizie. Dodatkowo, poza katalityczn rol gru py OH w przypadku seryny i tyrozyny, odgrywa ona rol w regulacji aktywnoci niektrych enzymw, ktrych aktywno katalityczna zaley od stanu ufosforylowania reszt serylowych lub tyrozylowych.
" L I |3H
1-
6-1 Tryptofan
<H
u
I
<3 Fenyioalanlna
" r -1 ^1 -------------------------- 1 -- r
240 260 DusjoS fali [nm| 280
Ryc. 4-5. Widma absorpcyjne tryptofanu, tyrozyny
i fenyloalaniny.
___
44 / ROZDZIA 4
Aminokwasy nie absorbuj wiata widzialnego (tj. s one bezbarwne) i, z wyjtkiem aminokwasw aromatycznych: tryptofanu, tyrozyny, fenyloalaniny i histydyny, nie absorbuj wiata nadfioletowego o dugoci powyej 240 nm. Jak przedstawiono na ryc. 4-5 wikszo wiata nadfioletowego o dugoci fali powyej 240 nm, absorbowanego przez biako, pochania zawarty w nim tryptofan. Ryc. 4-7. Fluorescamma.
REAKCJA Z NINHYDRYN LUB FLUORESCAMIN SUY DO WYKRYWANIA AMINOKWASW

Ninhydryna (ryc. 4-6). Powoduje oksydacyjn dekarboksylacj aminokwasw, w wyniku czego powstaj CO Z , NH 3 i atdehyd uboszy o jeden atom wgla w porwnaniu z macierzys tym aminokwasem. Zredukowana ninhydryna reaguje wtedy z uwolnionym amoniakiem, tworzc niebieski kompleks, ktry absorbuje wiato o dugoci 570 nm. Natenie barwy niebieskiej powstaego kompleksu stanowi podstaw
ilociowej metody oznaczania aminokwasw, za
RNORODNO TECHNIK ROZDZIAU AMINOKWASW Chromatografia

We wszystkich rodzajach chromatografii cz-
steczki rozdzielaj si midzy faz stacjonarn a ruchom (tab. 4-6). Rozdzia zaley od wzgldnej tendencji czsteczek mieszaniny do ich silniejszego wizania si z jedn z tych faz. Chocia
przedstawione techniki rozdziau dotycz gwnie aminokwasw, ich zastosowanie nie ogranicza si tylko do tych czsteczek.
Tabela 4-6. Relacje zachodzce midzy fazami w chromatografii T YP chromatografii Chromatografia podziaowa na staych sorbentach; filtracja elowa Chromatografia jonowymienna Chromatografia podziaowa midzy cienk warstw ciekego zoa i prze pywajcym gazem Faza stacjonarna Cieka Staa Cieka Faza ruchoma Cieka Cieka Gazowa
pomoc ktrej mona wykry mikrogramowe iloci aminokwasw. Aminy, inne ni a-amino-kwasy, take reaguj z ninhydryna, tworzc barwny niebieski kompleks, ale bez tworzenia CO2. Powstawanie CO? wskazuje zatem na obecno a-aminokwasw. Peptydy i NH$ reaguj take z ninhydryna, lecz znacznie wolniej ni a-aminokwasy. Pro lina i 4-hydroksyprolina tworz z ninhydryna kompleks o barwie tej.
Ryc. 4-6. Ninhydryna.
Fluorescamina (ryc. 4-7). Jest czulszym zwizkiem, za pomoc ktrego mona wykry nano-gramowe iloci aminokwas w. Podobnie jak ninhydryna, fluorescamina tworzy kompleks z aminami innymi ni a-aminokwasy.
Chromatografia bibuowa, pomimo wypierania jej przez bardziej wyrafinowane metody, wci znajduje zastosowanie w rozdziaach aminokwasw. Prbki aminokwasw nanosi si na pasek bibuy, w okrelonym punkcie, w odlegoci 5 cm od jego koca. Nastpnie pasek zawiesza si w szczelnym naczyniu (komorze) zawierajcym rozpuszczalnik (ryc, 4-8).
Chromatografia bibuowa
A M INOK WA S Y / 45
TnT
Kierunek wdrwki Pasek rozpuszczalnika iblbutyj 1 Naczynia 2 rozpuszczalnikiem
Ryc. 4- 8. Chro mato grafia bibuo wa zstpujca (przekrj komory).
Rozpuszczalniki stosowane do rozdzielania aminokwasw s mieszaninami wody, alkoholi, kwasw lub zasad. Bardziej polarne skadniki rozpuszczalnika wi si z celuloz i stanowi faz stacjonarn, za mniej polarne skadniki faz ruchom. Tak jest w klasycznej chromatografii podziaowej. W chromatografii podziaowej w odwrconej fazie polarnoci fazy ruchomej i stacjonarnej s odwrcone (np. przez
Kierunek wdrwki rozpuszczalnika Lys Asp
_ Start Cys
Glv Thr
1
1
His Arg Ser Glu Ala'
Pro
Val
i i
#
Tvr
Met
Trp Phe Leu
Ryc. 4-9. identyfikacja aminokwasw wystpuj cych w biakach. Po rozdziale mieszaniny amino kwasw technik chromatografii bibuowej zstpu jcej w ukadzie n- butanol -kwas octowy-woda plamy aminokwasw wywoano za pomoc ninhydryny. _______________________________
pierwotne zanurzenie bibuy w roztworze silikonu). Chromatografi podziaow w odwr conej fazie stosuje si do rozdziau niepolarnych peptydw lub lipidw, niepolarnych zwizkw, takich jak niektre aminokwasy. Wyrnia si 2 typy technik stosowanych do rozwijania chro-mato gram u; chromatografi wstpujc i zstpujc, tj. odpowiednio gdy rozpuszczalnik wdruje przez bibu z naniesion prb w gr lub w d. Kiedy rozpuszczalnik zbliy si prawie do koca bibuy, wtedy wyjmuje si j, suszy i przeprowadza reakcj identyfikacji badanych zwizkw (w przypadku aminokwasw przeprowadza si reakcj z 0,5% roztworem ninhydryny w acetonie, po czym ogrzewa przez kilka minut w temp. 90110C. Aminokwasy z duymi niepolarnymi acuchami bocznymi (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, Tyr) wdruj dalej ni te z krtszymi niepolarnymi acuchami bocznymi (Pro, Ala, Gly) lub z polarnymi acuchami bocznymi (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (p. ryc. 4-9). Odzwierciedla to wiksz wzgldn rozpuszczalno czsteczek polarnych w hydrofilowej fazie stacjonarnej, za czsteczek niepolarnych w rozpuszczal nikach organicznych. W grupie czsteczek niepolarnych (Gly. Ala, Val, Leu) zwikszeniu dugoci niepolarnego acucha bocznego to warzyszy zwikszenie ruchliwoci tych czsteczek. Stosunek odlegoci przebytej przez aminokwas do odlegoci przebytej przez czoo rozpuszczalnika, mierzonych od miejsca naniesienia mieszaniny aminokwasw, opisuje si jako warto Rf tego aminokwasu (wzgldn ruchliwo). Wartoci Rf dla danego aminokwasu zmieniaj si w zalenoci od warunkw dowiadczalnych, np. od stosowanego rozpuszczalnika. Chocia moliwa jest prbna identyfikacja aminokwasu za pomoc samej wartoci Rf, bardziej wskazane jest rozdzielenie chromatograficzne nieznanej mieszaniny aminokwasw rwnoczenie ze znanymi aminokwasami wzorcowymi. Wobec tego ruchliwo moe by porwnana do ruchliwoci wzorcw (np. jako RAia raczej ni jako Rf). Ruchliwoci, przedstawione jako wzgldne wobec standardowych, rni si mniej ni wartoci Rf z kolejnych dowiadcze. Zawarto aminokwasw mona oznaczy ilociowo, wycinajc kad plam i eluujc odpowiednim rozpuszczalnikiem, a nastpnie przeprowadzajc analiz kolorymetryczn (z ninhydryn). W innym rozwizaniu bibu
46 / ROZDZIA 4
spryskuje si ninhydryn, a natenie barwy wyeluowanych plam mierzy si w fotometrze z zapisem natenia wiata przepuszczanego lub odbitego. W innej technice chromatografii bibuowej dwuwymiarowej, prbk nanosi si w jednym rogu kwadratowego arkusza bibuy i rozdziela w odpowiednio dobranej mieszaninie rozpuszczalnikw. Po wysuszeniu i usuniciu rozpuszczalnika arkusz obraca si o 90C i rozdziela w innej mieszaninie rozpuszczalnikw (ryc. 4-10).
ATLC), nie przypomina chromatografii bibuowej i opiera si na innych zasadach. W tej technice rozpuszczalnik (ktry nie musi by dwuskadnikowy lub bardziej zoony) eluuje skadniki prby z zaadsorbowanych miejsc na aktywowanym sorbencie, takim jak praony el krzemionkowy. Metoda ATLC znajduje zastosowanie do rozdziau zwizkw niepolarnych, takich jak lipidy, i std nie jest przydatna dla czci aminokwasw i wikszoci peptydw. Chromatografia jonowymienna Cakowita analiza reszt aminokwasowych po hydrolizie acucha peptydowego wymaga na
og automatycznej chromatografii jonowymien-
Butanol-kwas octowy-woda (4:1:5).
Ryc. 4-10. Dwuwymiarowa chromatografia aminokwasw (przerysowano, nieznacznie zmodyfi kowano z: Levy A. J. i Chung D.: Two-dimensional chi-omatographyof aminoacidsonbuffered papers. Aria!. Chem. 1953; Copyright 1953 by American Chemical Society; zamieszczono za zgod).
nej. Peen rozdzia, identyfikacja i oznaczenie ilociowe hydrolizatu biakowego nie trwa duej ni 3 h. W metodzie Moore'a i Steina stosuje si kolumny (krtk i dug) zawierajce form Na+ sulfonowanej ywicy polistyrenowej. Kiedy kwany hydrolizat w pH 2,0 zostanie naniesiony na kolumny, aminokwasy wi si z jonem Na+ wymieniacza kationowego. Nastpnie kolumny eluuje si cytrynianem sodu w zaprogramowanych warunkach pH i temperatury. Krtk kolumn eluuje si jednym buforem, za dug dwoma, W eluatach z kolumn wywouje si reakcj z odczynnikiem ninhydrynowym, a odczyty natenia barwy przeprowadza si w kolorymetrze przepywowym. Dane s rejestrowane na katodowej lampie obrazowej ze sprzonym komputerowym odczytem integracji powierzchni pl rozdzielonych aminokwasw (ryc. 4-11).
Chromatografia cienkowarstwowa Wyrnia si 2 odrbne klasy chromatografii cienkowarstwowej (ang. thin-layer chromato-graphy; skrt TLC). Pierwsza chromato grafia cienkowarstwowa podziaowa (ang. par-tition thin-layer chro mato graph y: sk rt PTLC), w peni przypomina chromatografi bibuow podziaow. W metodzie PTLC wykorzystuje si te same ukady rozpuszczalnikw i sposoby identyfikacji badanych zwizkw, co w chromatografii bibuowej. Natomiast bibu zastpuje pytka pokryta cienk warstw sproszkowanej celulozy lub innego wzgldnie obojtnego zoa. Moliwy jest rwnie wariant PTLC w odwrconej fazie. Z kolei druga klasa adsorpcyjna TLC (adsorption thin-layer chromatography; skrt
570 nm
Ryc. 4-11A
AMINOKWASY / 47 55 C
570 nm -pH 3,25-pH 4,25C. 4-11. Automatyczna analiza kwanego hydrolizatu biakowego na kolumnach Dowex 50 Moore'a iSteina (w temp. 55C). A; Do rozdziau aminokwasw zasadowych uyto krtkiej kolumny (5,0x0,9 cm), stosujc elucj roztworem o pH 5,28; potrzebny czas = 60 min. B: Do rozdziau aminokwasw obojtnych i kwanych uyto duszej kolumny (55 x 0,9 cm), stosujc elucje najpierw buforem o pH 3,25, a potem buforem o pH 4,25. Norleucyn uyto jako substancj wzorcow {tzw. wzorzec wewntrzny). Aminokwasy zasadowe pozostaj zwizane na kolumnie; potrzebny czas =180 min. Eluowane prbki reaguj z odczynnikiem ninhydrynowym, a pomiar ich gstoci optycznej jest dokonywany przy dugoci fal wiata 570 nm i 440 nm. Przy 440 nm wykrywa si jedynie prolin i hydroksyprolin. O rzdnych gsto optyczna w skali logarytmicznej: o odcitych czas w min (reprodukowano za zgod: Prof. ET. Mert, Pardue University).
Elektroforeza wysokonapiciowa (ang. high--voltage electrophoresis; skrt HVE) rozdzielajca aminokwasy, polipeptydy i inne am-folity (czsteczki, ktrych adunek cakowity zaley od pH otaczajcego rodowiska) w polu prdu staego ma wiele zastosowa w biochemii. W analizie aminokwasw najczciej uywanymi nonikami s arkusze bibuy albo cienkowarstwowe pytki powleczone sproszkowan celuloz. W rozdziaach wielkoczsteczkowych polipeptydw i biaek uywa si usieciowanego elu poliakryloamidowego. W analizie oligo-merw nukleotydowych wykorzystuje si gwnie 2 zoa agaroz i el poliakryloamidowy. Rozdzia amfolitw, umieszczonych w polu elektrycznym o napiciu 20005000 V w cigu 0,52 h, zaley od ich adunku elektrycznego i masy czsteczkowej, W przypadku czsteczek obdarzonych jednakowym adunkiem elektrycznym, szybciej bd wdrowa czsteczki o mniejszej masie. adunek elektryczny jest jednak waniejszym czynnikiem w okreleniu stopnia osignitego rozdziau. Elektroforeza HVE znajduje zastosowanie w analizie aminokwasw, maoczsteczkowych polipeptydw,
Elektroforeza wysokonapiciowa
niektrych biaek, nukleotydw i fosfocukrw. Prbki nanosi si na nonik zwilony buforem o odpowiednim pH i czy si ten nonik ze zbiornikami buforu za pomoc bibuowych cznikw, a cay ukad z bibu mona przykry pyt szklan lub zanurzy w chodziwie wglowodorowym. Po podczeniu prdu czsteczki obdarzone adunkiem dodatnim wdruj w roztworze o wybranym pH w kierunku katody, a czsteczki z adunkiem ujemnym w kierunku anody. W celu zidentyfikowania rozdzielonej prby elektroforegram wybarwia si odczynnikiem ninhydrynowym (aminokwasy, peptydy), bromkiem etydyny i oglda w wietle lampy UV (oligomery nukleotydowe) itd. Wybr pH narzucaj" wartoci pK grup zjonizo-wanych czsteczek w mieszaninie.
NAJWANIEJSZ REAKCJ AMINOKWASW JEST TWORZENIE WIZANIA PEPTYDOWEGO

W zasadzie tworzeniu wizania peptydowego towarzyszy odczenie 1 mola wody, powstajcego z grupy a-aminowej jednego aminokwasu
48 / ROZDZIA 4 NH
Alanina
OH + H
O Walina
hydrolizy wizania peptydowego. Aby przeprowadzi biosyntez wizania peptydowego midzy dwoma aminokwasami, najpierw musi ulec aktywacji grupa karboksylowa. Chemicznie grup karboksylowa mona przeksztaci w chlorek kwasowy. W przyrodzie, aktywacj zapocztkowuje kondensacja z ATP (p. rozdz. 30).
HSO
PIMIENNICTWO
Barrett GC: Chemistry and Biochemistry ofthe Amino Acids. Chapman & Hal], 1985. Davies JS: Amino Acids and Peptides. Chapman & Hali. 1985. Gehrke CW, Kuo KCT, Zumwalt RW, Kenneth CT: Amino Acid Analysis by Gas Chromatography. 3 vols. CRC Press, 1987. Hancock WS: Handbook ofHPLCfor the Separation of Amino Acids, Peptides. and Proteins. 2vols. CRC Press, 1984. Hugli TE: Techniaues in Protein Chemistry. Academic Press, 1989. Rattenbury JM: Amino Acid Analysis. Halstead Press, 1981.
CHpeptyd; alanyiowaltna (Ala-Val) Ryc. 4-12. A mino kwasy po czo ne wizaniem peptydowym (obszar zaciemnio ny).
i grupy oc-karboksylowej drugiego aminokwasu (ryc. 4-12). Reakcja ta nie przebiega jednak tak, jak przedstawiono na tej rycinie, gdy staa rwnowagi reakcji jest przesunita w kierunku
Peptydy
5
PEPTYDY TWORZ SI Z L- K - AMINOKWASW POCZONYCH WIZANIAMI PEPT YDOWYMI Na rycinie 5-1 przedstawiono tripeptyd utworzony z reszt aminokwasowych alaniny, cys-teiny i waliny. Naley odnotowa, e tripeptyd skada si z 3 reszt aminokwasw ych. ale nie zawiera 3 wiza peptydowych. Umownie struktur peptydu zapisuje si rozpoczynajc od lewej strony N-kocow reszt aminokwasw (z woln grup a-aminow), a koczc po prawej stronie C-kocow reszt aminokwasow (z woln grup a-karboksylow). Przedstawiony pep tyd ma jedn woln grup a - aminow oraz 1 woln grup a-karboksylow. Jednake w niektrych pepiydach kocowe grupy a minowe lub karboksylowe mog by podstawione (np. N-formyloamina lub amid grupy karboksylo-wej) i w ten sposb nie s wolne.
WPROWADZENIE Po poczeniu grup aminowych i karbo-ksylowych aminokwasw z utworzeniem wiza peptydowych, skadowe ami no kwasowe okrela si resztami aminokwasowymi. Peptyd skada si z dwch lufo wicej reszt aminokwaso-wych poczonych wizaniami peptydowymi. Peptydy zawierajce wicej ni 10 reszt amino-kwasowych nazywa si polipeptydarni, ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Peptydy s zwizkami budzcymi szerokie zainteresowanie, szczeglnie w endokrynologii. Wiele hormonw jest peptydami i mog by podawane chorym w celu korygowania ich niedoborw (np. wstrzyknicia insuliny chorym na cukrzyc). Pewne antybiotyki s peptydami (np. walinomycyna i gramicydyna A), a nieliczne z nich substancjami przeciwnowotworowymi (np. bleomycyna). Szybka synteza chemiczna i technologia rekombinacji DNA uatwiy produkcj znacznych iloci hormonw peptydowych. Wiele z nich wystpuje w organizmie w stosunkowo maych steniach, co utrud nia moliwo ich wydzielenia w ilociach wystarczajcych do leczenia. Ta sama technolo gia pozwala syntetyzowa inne peptydy, dostpne z naturalnych rde w niezwykle maych ilociach (np. niektre peptydy i biaka wirusowe), wykorzystywane do produkcji szczepionek.
Alanyb-
cysteinylo-
walina
Ryc. 5-1. Wzr strukturalny tripeptydu {wizania peptydowe zaciemniono).
Prosta metoda przedstawiania wzorw strukturalnych peptydw Aby w prosty sposbzapisa wzr struktural ny peptydu, w pierwszej kolejnoci rysuje si jego szkielet" z poczonych grup oc-NHU
4 Biochemia
50 / ROZDZIA 5
i a-COOH oraz atomw wgla a. Nastpnie wpisuje si w odpowiednie miejsca acucha atomy wgla a (patrz niej). Naley wic: 1. Narysowa szkielet (zyg-zag) i doda N-kocow grup aminokwasow:
G!u-A!a-Lys-Gly-Tyr-Ala E A K G Y A
Ryc. 5-2. Przykad zapisu jednoliterowymi i trj-I(terowymi symbolami reszt aminokwasowych przedstawiajcy pierwszorzdow struktur heksa-peptydu, zawierajcego, jako N-kocowy aminokwas, kwas glutaminowy (Glu, E) oraz jako C-kocowy alanin {Ala, A).
2. Dopisa atomy wgla a, grupy a-karbok-sylowe i a-aminowe:

COO+
Glu-Lys-(A!a,Gly,Tyr)-His-Ala
Ryc. 5-3. Przykad heptapeptydu, zawierajcego fragment o niepewnej strukturze pierwszorzdowej (w nawiasie).
H3N
3. Dopisa waciwe grupy R i atomy wodoru a do atomw wgla a: SH 0

H
CH,
00
II V H \ H
O H
CH, CH,
Zapis struktury pierwszorzdowej za pomoc trjliterowych symboli, poczonych kreskami reprezentujcymi wizania peptydowe, jest zrozumiay i jednoznaczny. Kreski zwykle pomija si w zapisie sekwencji peptydw przy uyciu symboli jednoliterowych. W przypadku niepewnoci w ustaleniu kolejnoci fragmentu polipep-tydowego, wtpliw sekwencj reszt aminokwasowych umieszcza si w nawiasie i oddziela przecinkami (ryc. 5-3). Zmiana w pierwszorzdowej strukturze peptydu moe zmienia jego aktywno biologiczn Podstawienie pojedynczego aminokwasu przez inny, w liniowej sekwencji polipeptydu o 100 lub wicej resztach aminokwasowych, moe zmniejszy lub znie jego aktywno biologiczn oraz powodowa potencjalnie powane nastpstwa (np. niedokrwisto sierpo-wata). Wiele dziedzicznych wad metabolicznych wynika ze zmiany pojedynczego aminokwasu w okrelonym biaku. Wprowadzenie nowych metod badania struktury biaek i DNA przyczynio si do poszerzenia wiedzy o biochemicznych podstawach wielu dziedzicznych chorb metabolicznych. Peptydy s potielektrolitami, ktrych adunek zaley od pH otaczajcego rodowiska Wizanie peptydowe (amidowe) nie ma adunku w adnym wanym fizjologicznie pH. Powstawaniu peptydw z aminokwasw w pH
Kolejno aminokwasw okrela struktur pierwszorzdow peptydu Pierwszorzdow struktur peptydu okrela
liczba, budowa chemiczna i kolejno (sekwen -
Symboli trj- i jednoliterowych uywa si w zapisie aminokwasw w peptydach Poniewa polipeptydy (biaka) mog zawiera 100 i wicej reszt aminokwasowych, w celu przedstawienia ich struktury pierwszorzdowej (ryc. 5-2) stosuje si symbole albo trj - albo jednoliterowe (tab. 4-3, kolumna 2).
PEPTYDY / 51
7,4 towarzyszy utrata jednego adunku dodat niego i ujemnego przy utworzeniu jednego wizania peptydowego. Jednake peptydy s czsteczkami obdarzonymi adunkiem elektrycznym w pH fizjologicznym dziki adunkom ich grup C- i N-kocowych oraz grup funkcyjnych wystpujcych w polarnych resztach ami-nokwasowych przyczonych do atomw wgla a (p. tab. 4-1). Liczba moliwych konformacji peptydu jest wymuszona siami niekowalencyjnymi Polipeptydy mog wykazywa rn konformacj (uoenie przestrzenne), jednak w roztworze przewaa tendencja do niewielkich zmian konformacyjnych. Konformacj pepty-dw utrwalaj takie czynniki, jak zawada przestrzenna, oddziaywania kulombowskie, wizania wodorowe i hydrofobowe (p. rozdz. 6). Tak jak w przypadku biaek, do fizjologicznej aktywnoci polipeptydw jest nieodzowna specyficzna konformacja. WIELE MAO CZSTECZKOWYCH PEPTYDW WYKAZUJE AKTYWNO FIZJOLOGICZN Komrki zwierzt, rolin i bakterii zawieraj rnorodne maoczs t cz k owe polipeptydy (3100 reszt aminokwasowych) o istotnej aktywnoci fizjologicznej. Niektre z nich, cznie z wikszoci polipeptydowych hormonw ssakw, zawieraj tylko wizania peptydowe, utworzone midzy grupami a -aminowymi i 7-karboksylowymi, 20 L-a-arninokwasw wystpujcych w biakach. Jednake w polipep-tydach mog rwnie wystpowa dodatkowe, ,,niebiakowe" aminokwasy, lub te pochodne aminokwasw budujcych biaka. Krtki polipeptyd bradykinina, czy.anik zj32ui^szaJ3y.japica.e.ininiâ<ikicfe uwalnia si ze swoistych biaek osocza przez proteoli.
Arg-Pro-Pro-Giy-Phe-Ser Pro-Phe Arg Bradykinirta
0 N I H
SH CH2
CHj I
CHj H-C-NHS
coo-
cooRyc. 5-4. Giutation (y-glutamylocysteinyloglicy-na).
zym reduktaza glutationowa uczestnicz w powstawaniu prawidowych wiza disiarcz-kowych w wielu biakach i hormonach polipeptydowych (p. rozdz. 6). Antybiotyki jolipeptydowe. S wytwarzane przez grzyby i zawieraj zarwno D- jak ...LLcaminokwasy, a take aminokwasy nie wystpujce w biakach. Zalicza si do nich np. tyrocydyn i gramicydyn S, cykliczne polipeptydy zawierajce D-fenyoalanin oraz niebia-kowy aminokwas ornityn. Naley podkreli, e wymienione polipeptydy nie s syntetyzowane na ry boso mach. Hormon tyreotropowy (TRH). W tym wariancie peptydowym N-kocowy kwas glutaminowy- ulega, cyklizacji do kwasu piro glutamino we-.gOjjiatomiast N-kocowa grupa karboksylowa jjroliny wystpuje jako amid (ryc. 5-5).
Ryc. 5-5. (TRH).
Piroglutamylohistydyloprolinoamid
Glutation (ryc, 5-4). Jest nietypowym tripep-tydem, w ktrym N-kocowy kwas glutamino wy wie si z cystein wizaniem nie-ot-pep-tydylowym. Jest zwizkiem niezbdnym do dziaania niektrych enzymw. Glutation i en-
W niektrych przypadkach polipeptydy ssakw w swojej czsteczce mog zawiera wicej ni 1 fizjologicznie czynny peptyd, np, (3-lipo-tropina. Ten hormon przysadki pobudza uwal nianie kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej. W strukturze pierwszorzdowej pMipo-tropiny wystpuj fragmenty acucha wsplne dla innych hormonw peptydowych o odrbnych waciwociach fizjologicznych (ryc. 5-6). Dugi polipeptyd jest prekursorem krtszych polipeptydw.
52 / ROZDZIA 5
GL T S O R L R N G D S P N A G A N O G E G P N A L E H S L ! _
D L V A E K
K OrETSXPlTrftYMl Y HTFYRYW G / S YPYP YKYDl K
..-
0-Endorflna y-Endorfina a-Endorflna Enkefallna metloninowa Byc. 5- 6. Pierwszorzdo wa struktura fMipotropiny. Reszty 41 - 58 reprezentuj hormo n pobudzajcy melanocyty (p-MSH). Reszty 61 91 zawieraj sekwencje odpo wiadajce wskazany m endorfinom.
ZOON MIESZANIN PEPTYDW MONA ROZDZIELI PODCZAS ELEKTROFOREZY LUB CHROMAT OGRAFII Chromatografia i elektroforeza wysokonapiciowa (HVE) Techniki, ktre jako podstaw rozdziau wykorzystuj adunek elektryczny, znajduj zastosowanie zarwno w badaniach polipepty-dw, jak i aminokwasw (p. rozdz. 4). Warto pK. C-kocowej grupy karboksylowej polipeptydu jest wiksza ni grupy a-karboksylowej odpowiedniego aminokwasu (oznacza to, e grupa karboksylowa peptydu jest sabszym kwasem). Odwrotnie, N-kocowa grupa ami nowa polipeptydu jest silniejszym kwasem (ma mniejsz warto pK) ni grupa aminowa aminokwasu, od ktrego on pochodzi (tab. 5-1).
Filtracja elowa W metodzie automatycznego sekwencjono-wania wykorzystuje si niewielk liczb peptydw o dugoci 30100 reszt aminokwaso-wych. Jednake wiek wielkoczsteczkowych polipeptydw moe by nierozpuszczalnych, z powodu odsonicia w procesie dcnaturacji uprzednio niedostpnych reszt hydrofobowych. Nierozpuszczalnoc polipeptydw mona pokona przez ich rozpuszczenie w moczniku, alkoholach, kwasach organicznych lub zasadach, ale czynniki te ograniczaj stosowanie technik chromatografii jonowymiennej w ich oczyszczaniu. Okazuje si, e filtracj elow duych hydrofobowych peptydw mona przeprowadzi, uywajc roztworw kwasu mr wkowego lub octowego w duych steniach (14 mol/1). Wysokocinieniowa chromatografia cieczowa w fazie odwrconej Skuteczn technik tv oczyszczaniu wielkoczsteczkowych, niepolarnych peptydw jest wysokocinieniowa chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography; skrt HPLC) na niepolamych nonikach, z wykorzystaniem polarnych rozpuszczalnikw. Na rycinie 5-7 przedstawiono 'rozdzia bromocyjanowych fragmentw ludzkiej globi-ny podowej za pomoc tej techniki. Poczenie
Tabela 5-1. Wartoci pK glicyny i peptydw glicynowych
9.60 8,17 7,91
Gly Gly-Gly Gly-Gty-Gly
PEPTYDY / 53
sie lub solami srebra, natomiast polinukleo-lydw bromkiem etydyny. Popularn odmian elektroforezy jest PAGE w warunkach denaturujcych. Biaka przed elektroforeza, poddaje si gotowaniu w odpowiednim buforze, a nastpnie rozdziela w obecnoci czynnikw denaturujcych mocznika lub siarczanu do-decylu sodu (SDS). Ujemny adunek czsteczek \ CH1 - (CH,), L SO3") pokrywa biaka w stosunku 1 czsteczka SDS na 2 wizania pcptydowe. ["o obadowanie" biaek adunkami czyni je silnie ujemnymi (anionami). Pniejszy rozdzia biaek jest oparty na wielkoci ich masy czsteczkowej. Metoda SDS-PAGE jest szeroko stosowana do okrelania masy czsteczkowej biaek przez porwnanie ich ruchliwoci elekt-roforetycznej z ruchliwoci biaek wzorcowych o znanej masie czsteczkowej.
Ryc. 5-7. Profil elucyjny rozdziau bromocyjano-wych fragmentw ludzkiej globiny pfodowej, uzyskanej metod HPLC w odwrconej fazie. Przedstawiono oznaczenia dowolnie numerowanych fragmentw OL i 7 acuchw (reprodukowano dziki uprzejmoci: J.D. Pearson i wsp.r Deparrment of Biochemistry, Pardue Ur>iversity).
PIERWSZY ETAP W OKRELANIU STRUKTURY PIERWSZORZDOWEJ PEPTYDU TO POZNANIE JEGO SKADU AMIN0KWASOWEG0
W analizie struktury peptydw najpierw przeprowadza si hydroliz wiza peptydo-wych czcych aminokwasy. Poniewa wizania te s trwae w roztworach o obojtnym pH, przeprowadza si hydroliz kwan lub zasadow. Kataliza enzymatyczna jest stosunkowo mao przydatna do przeprowadzenia penej hydrolizy wiza peptydowych. Kady typ hydrolizy biaek przebiega z utrat pewnych reszt aminokwasowych. Metod z wyboru jest hydroliza w zatopionych, odpowietrzonych probwkach w 6 mol/l roztworze HC1 w temp. HO^C. Podczas takiej hydrolizy wszystkie reszty tryptofanu i cysteiny oraz wikszo reszt cystynowych ulegaj zniszczeniu. W obecnoci jonw metali dochodzi do czciowej utraty metioniny i tyrozyny. Glutamina i asparagina ulegaj deamidacji do kwasw: glutaminowego i asparaginowego. Odzysk seryny i treoniny jest niepeny, a ilo tych aminokwasw zmniejsza si w miar przeduania czasu hydrolizy. Niektre wizania midzy resztami aminokwasw obojtnych (Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ie-Val) ulegaj rozbiciu tylko w ok. 50% po 20 h hydrolizy. Zwykle przeprowadza si hydroliz prbek (w powtrzeniach) przez 24, 48, 72 i 96 h, ekstrapolujc potem zawarto seryny i treoni ny do czasu zerowego. Zawarto waliny i izo-ieucyny oznacza si po 96 h hydrolizy. Amino-
filtracji elowej i HPLC w odwrconej fazie stosuje si do oczyszczania zoonych mieszanin peptydw, otrzymanych w wyniku czciowego trawienia biaek.
Sczenie molekularne, w poczeniu z roz dziaem zwizkw i wykorzystujce adunek, uatwia ich rozdzia. Oprcz skrobi i agarozy, najczciej uywanym nonikiem jest usiedowa-ny polimer akryloamidu (CH2 = CHCONH,,). Podczas elektroforezy w elu poliakryloamido-wym (ang. polyacrylamide gel electrophoresis; skrt PAGE) roztwr biaka nanosi si na spolimeryzowany akryloamid, w odpowiednim buforze, uformowany w postaci pytki lub w ru-rkach. Czynnikiem sieciujcym zoe poliak-ryloamidu moe by 210% roztwr metye-no-t -akryloamidu (CH2 = CONH)? - CH2 lub podobne zwizki sieciujce. Rozdzia naniesionych prb, w odpowiednim buforze, doko nuje si pod wpywem prdu elektrycznego. Identyfikacj poiipeptydw po rozdziale elektro foretycznym przeprowadza si za pomoc barwienia eli bkitem brylantowym Coomas-
Wysokonapiciowa elektroforeza (HVE) na sitach molekularnych
5* / ROZDZIA 5
kwasy dikarboksylowe i ich amidy oznacza si razem i przedstawia cznie jako Glx" i Asx". Cysteina i cystyna przechodz w trwa w rodowisku kwanym pochodn (np. kwas cysternowy) przed hydroliz. Hydroliza zasadowa, w czasie ktrej ulegaj zniszczeniu seryna, treo-nina, arginina i cysteina, a wszystkie aminokwasy ulegaj racemizacji, jest stosowana do oznaczania tryptofanu. Po hydrolizie prb ich skad aminokwasowy moe by oznaczony podczas automatycznej chromatografii jonowymiennej (p. ryc. 4-11) lub HPLC. Sekwencjonowanie pierwszego biaka przeprowadzi Fred Sanger, za pomoc odczynnika majcego od tej pory jego nazwisko Mino ju ponad 30 lat od okrelenia przez Sangera penej sekwencji aminokwasowej hormonu polipeptydowego insuliny. W metodzie Sangera najpierw rozdzielono insulin na 2 acuchy polipeptydowe A i B, po czym poddano swoistemu trawieniu enzymatycznemu do krtkich peptydw, zawierajcych od cinki sekwencji zachodzcych. Nastpnie zastosowano zwizek i-fluoro-2,4-dinitroben-zen (ryc. 5-8), tworzcy pochodne tylko
-N-CH -CO OH
CH-COOH Ryc. 5-8. Reakcja aminokwasu z 1 -fluoro-2,4--dinitrobenzenem (odczynnikiem Sangera). Odczynniki nazwano od nazwiska laureata nagrody Nobla (1958), biochemika Fryderyka Sangera, ktry zastnsowal go w celu oznaczenia pierwszo-rzdowej struktury insuliny. Odczynnik ilociowo aryluje wszystkie wolne grupy aminowe, dajc intensywnie to zabarwione 2,4-dinitrofenyloa-minokwasy. Pochodne te atwo si oznacza ilociowo za pomoc spektrototometru. Oprcz reszt N-kocowych, fluorod(nitrobenzen reaguje take 'z grupami; e-aminow lizyny, imidazolow his-tydyny, hydroksyl ow tyrozyny i grup SH cysteiny. Poniewa grupa dinitrofenylowa nie jesi usuwana podczas kwanej hydrolizy, stosuje siej do analizy N-kocowego aminokwasu polipeptydw.
z N-kocowymi resztami aminokwasowymi peptydw, ktre po hydrolizie usuwano i identyfikowano. Porwnanie sekwencji zachodzcych pozwolio Sartgerowi jednoznacznie wyde-dukowa sekwencje obydwu acuchw insuliny. Pomimo e metoda Sangera jest wci stosowana, 2 inne techniki zrewolucjonizoway oznaczanie struktury pierwszorzdowej polipeptydw (biaek). Pierwsza z nich, wprowadzona w 1967 r., to metoda automatycznego usuwania i identyfikowania N-kocowych reszt aminokwa-sowych peptydw, jako ich pochodnych fenylotio-hydantoinowych (degradacja Edmana). Druga wprowadzona niezalenie przez Sangera oraz Maxama i Gilberta polega na szybkim sekwencjonowaniu DNA genw kodujcych poszukiwane biako. Obecnie optymaln strategi jest stosowanie obydwu rwnoczenie. Technika automatycznej degradacji Edmana, cho szybsza w analizie sekwencji peptydw od metod Sangera, napotyka trudnoci i dostarcza wolniej wynikw ni metoda sekwencjonowa-nia DNA. Technika sekwencjo no wania DNA nie dostarcza jednak nieomylnych, jednoznacznych wynikw dotyczcych pierwszorzdowej struktury biaek. Najpowaniejsze trudnoci w sekwencjonowaniu genw eukariotycznych s zwizane z obecnoci w ich obrbie in-tronw sekwencji nukleotydowych nie ulegajcych ekspresji w dojrzaym biaku. Pomimo to, gwna przewaga tej metody polega na stosunkowo atwej detekcji i sekwencjonowaniu regionw prekursorowych czsteczek, ktre mog umkn" wykryciu w technice degradacji Edmana (wskutek dojrzewania przed jego wydzieleniem). Metody sekwencjonowania DNA i degradacji Edmana naley traktowa jako uzupeniajce si. Zrewolucjonizoway one i daleko posuny nasz wiedz o pierwszorzdowej strukturze biaek. Oznaczanie pierwszorzdowej struktury polipeptydw za pomoc techniki automatycznej degradacji Edmana Ze wzgldu na fakt, e wiele biaek skada si z wicej ni jednego acucha polipeptydowego, poczonych wizaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki disiarczkowe, pierwszy etap stanowi dysocjacja i rozdzielenie indywidualnych acuchw poiipeptydowych. Czynniki denaturujce (mocznik, chlorowodorek guani-dyny) rozbijaj wizania wodorowe i dysoc-juj niekowalencyjnie poczone polipeptydy,
PEPTYDY / 55
a czynniki utleniajce i redukujce rozrywaj mostki disiarczkowe (ryc. 5-9). Nastpnie pep-tydy rozdziela si metodami chromatograficznymi. Wielkoczsteczkowe polipeptydy musz ulec rozszczepieniu do peptydw o dugoci nadajcej si do automatycznego sekwencjonowania Aparaty suce do automatycznego sekwencjonowania (sekwentatory) analizuj skutecznie polipeptydy o dugoci 2060 reszt amino-kwasowych. Ten fakt wpywa na wybr techniki rozcinania polipeptydw oraz oczyszczania otrzymanych fragmentw. Zmierza si wic do uzyskania niewielkiej liczby duszych fragmentw (o dugoci 30100 reszt aminokwaso-wych). Korzystne jest zatem bardzo swoiste i pene rozszczepienie acucha polipeptydowe-go w okrelonych miejscach. Takie wymagania spenia rozszczepienie za pomoc bromocyjanu (CNBr), trypsyny lub o-jodozobenzenu. CNBr. Reszty cysteiny s najpierw modyfikowane przez kwas jodooctowy. CNBr rozcina
Ryc, 5-9. Rozszczepienie acuchw
=O
wwczas acuch polipeptydowy (w wikszoci ilociowo) tylko w miejscach wystpowania reszt metioninowych, po ich stronie karbok-sylowej. Poniewa metionina wystpuje rzadko w polipeptydach, takie rozszczepienie powoduje powstawanie fragmentw peptyd owych o waciwej dugoci. Trypsyna. Trypsyna nacina acuchy poh-peptydowe po karboksylowej stronie reszt lizy-ny i argininy. Jeli reszty lizyny najpierw przeprowadzi si w pochodne za pomoc bezwodnika kwasu cytrakonowego (reakcja odwracal na), w celu zmiany adunku reszt hzynowych z dodatniego na ujemny, to trypsyna rozszczepia tylko reszty argininowe. Wykorzystanie pochodnych reszt argininowych jest mao uyteczne z powodu stosunkowo duego nad miaru" reszt hzynowych w biakach. Jednake jest przydatne do kolejnego rozszczepiania CNBr fragmentw. o- Jodozobenzen. Zwizek len rozszczepia swoicie i ilociowo miejsca wzgldnie rzadko wystpujcych reszt: Trp-X. Nie wymaga wczeniejszej osony innych reszt aminokwasowych. Hydroksyloamina. Hydroksyloamina rozrywa wzgldnie rzadko wizania: Asn-Gly, chocia nie w sposb ilociowy. Proteaza V8. Enzym ze Staphylococcus aureus rozcina peptyd przy resztach Glu-X, z wyran wybirczoci w stosunku do reszty X o charakterze hydrofobowym. Wizanie Glu--Lys nie ulega rozszczepieniu przez t proteaz. Ta reakcja jest wykorzystywana do kolejnej degradacji CNBr fragmentw.
agodna kwana hydroliza. W toku
O =
poiipepty-dowych poczonych wizaniami disiarczkowymi (pole zaciemnione) za pomoc czynnikw utleniajcych (kwas nadmrwkowy, strona lewa) bd redukujcych (2-merkaptoetanol; strona prawa) prowadzce do utworzenia 2 peptydw odpowiednio z reszt kwasu cysteinowego lub reszt cysteiny Iow.
takiej hydrolizy ulega rozerwaniu rzadko spotykane wizanie Asp-Pro. 2 lub 3 procesy trawienia pierwotnego polipeptydu, przy resztach Met, Trp, Arg i Asn-Gly, poczone z odpowiednio nadtrawionymi powstaymi fragmentami, zazwyczaj pozwalaj okreli pen sekwencj polipeptydu. Oprcz wyjtkowych trudnoci w oczyszczaniu fragmentw peptydo-wych, oznaczenie pierwszorzdowej struktury polipeptydu mona wykona, dysponujc zaledwie kilkoma jego mikromolami. Mieszanina peptydw, otrzymana z rozszczepienia polipeptydu, musi by rozdzielona do homogennych peptydw przed ich sek we ncjo no wan i em Oczyszczanie fragmentw peptydowych przeprowadza si gwnie przez ich filtracj
56 / ROZDZIA 5
elow w kwasie octowym lub mrwkowym, wykorzystujc technik HPLC w odwrconej fazie (ryc. 5-7), albo w toku chromatografii jonowymiennej na fosfocelulozie lub na zou sulfofenyo-Sephadex w roztworach kwasu ortofosforowego. Sekwencjonowanie z zastosowaniem odczynnika i reakcji Edmana Automatyczna analiza sekwencji aminokwasw wykorzystuje fenyloizotiocyjanian (odczynnik Edmana) i reakcje, w wyniku ktrych usuwana jest N-kocowa grupa aminowa pep-tydu, jako pochodna fenylotiohydantoinowa (reakcja Edmana, ryc. 5-10). Metoda tzw. degradacji Edmana polega na kolejnym odczaniu reszt am i no kwasowych od aminowego koca peptydu. Gwn cz reaktora stanowi obracajce si naczynie szklane, zapewniajce przebieg reakcji na cianie naczynia w postaci cienkiej warstwy. To uatwia ekstrakcj i kolejne usuwanie rozpuszczalnikw. W peni zautomatyzowanym aparacie mona zsekwencjono-wa do 3040 reszt aminokwasowych w 1 cigu operacyjnym (w wyjtkowych przypadkach do 60 lub nawet 80 reszt). Aparat jest zaprogramowany do wykonywania kolejnych degradacji reszt aminokwasowych od N-koca poli-peptydu. Po usuniciu pierwszego N-kocowe-go aminokwasu, wydzieleniu i identyfikacji powstaje nastpna w kolejnoci N-kocowa pochodna Edmana, itd. (ryc. 5-10). Pochodne fenylotiohydantoinowe rozdziela si technik HPLC i identyfikuje na podstawie ich kolejnoci i miejsca elucji. Wnioskowanie o penej strukturze pier wszo rzdowej po I i peptydu wymaga sekwencjonowania nakadajcych si peptydw W przypadku oznaczenia sekwencji reszt aminokwasowych wszystkich uzyskanych CNBr peptydw wci nie znana jest informacja, dotyczca kolejnoci uoenia tych peptydw w acuchu biakowym. W celu uzyskania jednoznacznych danych o pierwszorzdowej strukturze biaka, naley otrzyma i zsek-wencjonowa dodatkowe CNBr peptydy,
ktrych N-i i C-kocowe reszty nakadaj si. Te
NH3
R'
Fsnylolzotlocyjanlan (odczynnik Edrnana) I peptyd Fenylotiohydantnina I peptyd krtsz o jedn reszt aminokwasow
Ryc. 5-10. Fenyloizotiocyjanian przeprowadza
R'
reszt aminokwasow (lub N-kocow reszt

H, nitrometan
+
Kwas fenylotlohydanloinowy
dodatkowe peptydy otrzymuje si technikami, ktre rozrywaj biako w miejscach innych ni reszta metioninowa (np. przez trawienie chymo-trypsyn). Jednoznaczne okrelenie struktury pierwszo rzdowej, przez porwnanie sekwencji
poli-peptydu) do fenylotiohydantoiny. Fenyloizotiocy-janian reaguje z grupami aminowymi aminokwasw i peptydw, co prowadzi do powstania kwasw fenylotiohydantoinowych, ktre po dodaniu kwasu, w rozpuszczalnikach niehydroksytowych, cyklizuj do pochodnych fenylotiohydantoinowych. Reakcj t wykorzystuje si gwnie w celu identyfikacji N-kocowych reszt peptydu w metodzie automatycznego sekwencjonowania polipep-tydw.
PEPTYDY / 57
peptydowych, przypomina sposb analogiczny do budowy ukadanki (ryc. 5-11). W celu umiejscowienia wiza disiarczkowych peptydy. z kontrolnych oraz zredukowanych lub utlenionych biaek, rozdziela si metod dwuwymiarowej chromatografii lub elektroforezy i chromatografii (tzw. finger-printing). Identyfikacja za pomoc ninhydryny ujawnia w produkcie trawienia biaka kontrolnego 2 mniejsze peptydy, za w biaku, na ktre dziaano wymienionymi powyej czynnikami, 1 nowy peptyd. Majc informacj dotyczc sekwencji tych peptydow, mona wyznaczy w nich pooenie wiza disiarczkowych.
Paptyd X Paptyd Z Peptyd Y
1
C kocowy fragment peptydu X N kocowy fragmenl peptyd u Y
Ryc. 5-11. Nakadajce si sekwencje peptydu Z stosuje si w celu stwierdzenia, e peptydy X i Y wystpuj w pierwotnym biaku w kolejnoci X-*Y, a nie Y-Z.
SYNTEZA PEPTYDOW METODAMI AUTOMATYCZNYMI

Rycina 5-12 ilustruje procedur syntezy dipeptydu A -B za pomoc automatycznej, staofa-zowej techniki Merrifielda, podsumowujcej wszystkie reakcje wymagane do zsyntetyzowa-nia peptydu o dowolnej dugoci. Te etapy syntezy obejmuj: 1. Zablokowanie N-kocowego aminokwa su A (otwarty prostokt) i aminokwasu B (zaciemniony prostokt) za pomoc grupy /-buty-looksykarbonylowej (t-BOC) ( ):
O II (CH3)COC
Ryc. 5-12. Schematyczne przedstawienie syntezy powstajcego dipeptydu za pomoc techniki wprowadznnej przez IWerrifielda. Wyjanienie symboli znajdzie Czytelnik w towarzyszcym tekcie.
2. Aktywacj (-BOC--aminokwas
grupy karboksylowej B za pomoc dicykloheksylokar-boimid N u(DCC) (A):
C = N-C6H(
3. Reakcje grupy karboksylowej aminokwa su A (ktry staje si C-kocow reszt peptydu) z zaktywowan, nierozpuszczalny ywic poli styrenow ($). 4. Usunicie grup blokujcych z pocze f-BOC-aminokwas A, za pomoc kwasu tri fluorooctowego w temperaturze pokojowej (TFA, FjC COOH). Uwaga. W praktyce etapy 3 i 4 mona pomin, gdy ywica z danym -BOC-amino-kwasem, poczone wizaniem estrowym z fe-
co prowadzi do utworzenia pochodnych /-BOC-aminokwas A i /-BOC-aminokwas B.
58 / ROZDZIA 5
nyloacetamidometylowym (PAM) czni kiem" zakotwiczonym w ywicy polistyrenowej, s dostpne w sprzeday. 5. Kondensacje zaktywowanej grupy karboksylowej poczenia t -BOC-aminokwas B z woln grup aminow unieruchomionego ami nokwasu A. 6. Usunicie blokujcej grupy f-BOC za po moc TFA (p. etap 4). 7. Uwolnienie dipeptydu AB od czste czek ywicy przez dziaanie fluorowodoru (HF) w dichlorometanie w temp, 2C, Pierwsze osignicia techniki Merrifielda dotyczyy syntezy acucha A (21 reszt) i acucha B (30 reszt) insuliny w cigu 11 dni oraz enzymu rybonukkazy trzustkowej z wydajnoci 18%. Kolejne jej udoskonalenia skrciy czas syntezy wizania peptydowego do ok. 1 h i znacznie zwikszyy wydajno. Technika Merrifielda otworzya nowe nadzieje nie tylko w badaniach de novo syntezy biaek o okrelonej strukturze pierwszorzdowej, lecz take w immunologii, do produkcji szczepionek i hormonw polipeptydowych i by moe take w leczeniu wybranych wrodzonych wad metabolicznych.
PIMIENNICTWO Allen G: Sequencing of Proteins and Peptides. North Holland, 1981. Bhwon AS: Protein/Peptide Sequence Analysis: Current Methodologies. CRC Press, 1988.
Cantor CR, Schimmel PR: Biophyskal Chemistry, Part I: The Conformation of Macromolecules. Freeman, 1980. Dayhoff M {editor): Atlas of Protein Seuence and Structure. Vol 5. National Biomedicai Research Foundation, Washington, DC. Doolittle RF: Ol" uris and orfs: a Primer on How to Analyze Derived Amino Acid Seuences. Univer-sity Science Books. 1987. Hewick RM, Hunkapiiler MW. Hood LE, Dryer WJ: A gasliquid solid phase peplide and protein seque-nator. J Biol Chem 1981; 256: 7990. Hunkapiiler MW, Hood LE: Protein sequence analysis: automated microseuencing. Science 1983; 219: 650. LipmanDJ, PearsonWR: Similar amino acid seuen ces: chance or common ancestry?/Mo/Bw/19Sl; 16:9. Mahoney WC, Smith PK, Hermodson MA: Frag-mentation of proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mechanism and identification of o-iodo-sobenzoic acid as a reactive contaminant that modifies tyrosyl residues. Biochemistry 1981; 20: 443; Methods Enzymol. Vols. 47; 48, 49, 91 (published continuously). Meriifield RB: Solid phase synthesis. Science 1986; 232: 341. Pearson JD et al: Reversed-phase supports f"r thc resolution of iarge denatured protein fragments. / Chromatogr 1981; 207: 325. Regnier FE. Gooding K.M: High performance liquid chromatography of proteins. Anal Biochem 1980; 103: 1. Strickler JE, Hunkapiller MW, Wilson KJ: Ulility of the gasphase sequencer for both liuid - and solid-*phase degradation of proteins and peptides at Iow picomole levels. Anal Biochem 1984; 140: 553.
Biaka: struktura i waciwoci

6
BIAKA S K LASYFIKOWANE W RNE SPOSOBY W CELU ZILUSTROWANIA RNORODNYCH WACIWOCI ICH FUNKCJI STRUKTURALNYCH Ze wzgldu na brak uniwersalnego, wszech stronnie zadowalajcego systemu klasyfikacji biaek, powszechnie stosuje si kilka wzajemnie przeciwstawnych sposobw ich podziau. Wszystkie one maj raczej ograniczon warto jako pomoc w zrozumieniu wielu kluczowych waciwoci biaek. Utrzymywanie si w uyciu tych klasyfikacji i terminw zwaszcza w laboratoriach klinicznych zmusza do krtkiej refleksji. Poniej zostan przedstawione podstawowe cechy systemw klasyfikacji, opartych na rozpuszczalnoci biaek, ich ksztacie, funkcji, waciwociach fizycznych oraz trjwymiarowej strukturze. Klasyfikacja na podstawie rozpuszczalnoci System klasyfikacji biaek oparty na ich rozpuszczalnoci i rozwinity w latach 19071908 jest nadal stosowany w zawonym stopniu, zwaszcza w biochemii klinicznej (tab. 6-1). Rozgraniczenia midzy klasami nie s przekonywajce. Wyrane rozrnienie, np. miedzy albuminami i globulinami, nie moe by przeprowadzone jedynie na podstawie ich rozpuszczalnoci w wodzie lub roztworach soli. Klasyfikacja na podstawie ksztatu Dwie obszerne klasy biaek mog by wyodrbnione za pomoc ich stosunku osiowego (dugoci do szerokoci). Biaka globularnc, dla ktrych warto tego stosunku jest mniejsza od 10 i na og nie przekracza 34, maj acuchy polipeptydowe cile pofadowane i zwinite.
WPROWADZENIE Biaka to wielkoczsteczkowe polipeptydy. Granica oddzielajca due polipeptydy od maych biaek przebiega zazwyczaj midzy masami czsteczkowymi 8000 10 000. Biaka proste s zbudowane tylko z aminokwasw. Biaka zoo-eeâwierj dodatkowe zwizki nieamino-kwasowe, takie jak hern, pochodne witamin, lipidy lub wglowodany. Ten rozdzia dotyczy biaek prostych. W innych rozdziaach zostan omwione typowe biaka zoone, jak hemowe, glikoproteiny i lipoproteiny, a take waciwoci biaek prostych o szczeglnie odrbnej strukturze, takich jak kolagen i biaka kurczliwe. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Biaka odgrywaj wiodc rol w czynnoci i budowie komrki. W celach diagnostycznych szeroko stosuje si analiz niektrych biaek i enzymw krwi. Dobrym przykadem jest oznaczenie elektroforetyczne stosunku zawartoci albumin do globulin osocza, ktre stanowi integraln cz rozpracowania diagnostycznego w chorobach wtroby. Analiza lipoprotein oraz immunoglobulin osocza, za pomoc elektroforezy oraz innych metod, jest powszechnie stosowana w diagnostyce odpowiednio swoistych typw hiperlipoproteinemii i zaburze odpornoci. Prawidowy ludzki mocz zwykle jest wolny od biaek, a wic stwierdzenie znaczcej proteinurii stanowi zazwyczaj wany sygna chorb nerek, takich jak rne postacie ich stanw zapalnych.
60 / ROZDZIA 6 Tabela 6-1. Klasyfikacja biaek oparta na ich rozpuszczalnoci Albuminy Rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli. adnych szczeglnych aminokwasw Sabo rozpuszczalne w wodzie, ale dobrze w roztworach soli. adnych szczeglnych aminokwasw
Globuliny
Zgodnie z ich funkcjami biologicznymi, biaka mog by sklasyfikowane np. jako strukturalne, katalityczne lub transportowe (tab. 6-2). Biaka katalityczne (enzymy), stanowice wikszo tych zwizkw, s ujmowane w klasy wedug typu reakcji, ktr katalizuj.
Klasyfikacja na podstawie czynnoci
Rozpuszczalne w 70 80% etanolu, Prolaminy ale nierozpuszczalne w wodzie i etanolu absolutnym. Wzbogacone w arginine Rozpuszczalne w roztworach soli (i Histony kwasw nieorganicznych*) Nierozpuszczalne w wodzie ani w roztworach soli. Wzbogacone w Skleroprotetny Gly, Aia, Pro * Przyp. tum.
Nale do nich m.in. insulina, albuminy i globuliny osocza oraz wiele enzymw. Biaka w-kienkowe, dla ktrych wartoci stosunkw osiowych s wiksze ni 10, zawieraj odcinki acuchw polipeptydowych zwinitych rubowo lub w heliks i poczone krzyowo wizaniami kowalencyjnymi lub wodorowymi. Przykadami biaek wkienkowych s: ker.tyna, mio-zyna, kolagen i wknik.
Dla biaek budzcych zainteresowanie medyczne, wyspecjalizowane systemy klasyfikacji pozwalaj rozrni cile spokrewnione biaka. W powszechnym uyciu s np. 2 ukady nazewnictwa lipoprotein osocza, a 3. jest rozwaany. Pierwszy z nich wyodrbnia ot]-, ot2-, P- i Y-lipo-proteiny na podstawie ich ruchliwoci elektro-foretycznej w rodowisku o pH 8,6. Lipoprotei-ny s take klasyfikowane pod wzgldem ich zachowania si podczas sedymentacji jako: chy-lomikrony, VLDL, LDL, HDL i VHDL. Ponadto 6 obszernych klas lipoprotein osocza moe by rozpoznanych w zalenoci od wystpowania w nich apoprotein A, B, C, D, E lub F, ktre z kolei rnicuje si za pomoc kryteriw immunologicznych.
Klasyfikacja na podstawie waciwoci fizycznych
Klasyfikacja na podstawie struktury trj wy m ia ro wej
Tabela 6-2. Gwne funkcje biafek Funkcja Katalityczna Strukturalna Ochronna Regulatorowa Biaka (przykady) Enzymy Kolagen, elastynar keratyny Wknik, immunogiobuliny, interferon Kalmoduiina
Biaka mog by zrnicowane na podstawie wystpujcej w nich struktury czwartorzdowej lub jej braku (patrz niej). Ponadto podobiest wa w strukturze, wykryte gwnie przez krys talografi promieniami X, dostarczaj cennej podstawy do klasyfikacji biaek. Na przykad biaka czce si z nukleotydami maj w strukturze trzeciorzdowej wspln domen wic nukleotyd" i mog by ewolucyjnie spokrewnione. W miar rozszyfrowywania dalszych struktur krystalicznych moliwe bdzie rozpoznanie i ustalenie dodatkowych wsplnych domen.
Regulacja genowa Histony, biaka represorowe Regulacja Insulina hormonalna Skurcz Transport Aktyna, miozyna Albumina (bilirubina, kwasy tuszczowe itp.), hemoglobi na (tlen)Jipoproieiny (rne lipidy), transferyna (elazo)
PIERWSZORZDOWA STRUKTURA BIAEK WYWODZI SI Z KOWALENCYJNEGO POCZENIA L-a-AMINOKWASW WIZANIAMI PEPTYDOWYMI

Wprawdzie wiodc rol wiza peptydo-wych w biakach wydedukowano dawno temu, na podstawie wielorakich faktw, to jednak najbardziej p rzekonywajcym dowodem nie-
BIAKA: STRUKTURA I WACIWOCI / 61
zbdnoci jedynie tych wiza stal si pena synteza chemiczna insuliny i rybonukleazy, wycznie w wyniku poczenia aminokwasw za pomoc wiza amidowych. Wizanie czce atomy wgla grupy karbonyiowej i azotu w wizaniu peptydowym ma czciowo charakter wizania podwjnego Chocia peptydy zapisuje si z pojedynczym wizaniem czcym atomy a -karboksylu i a-a-zotu, wizanie wgielazot w rzeczywistoci ma czciowo charakter wizania podwjnego (ryc. 6-!). Nie ma tu adnego swobodnego
O O
H
obrotu wok wizania czcego atomy C i N, a wszystkie 4 atomy' przedstawione na ryc. 6-1, le w tej samej paszczynie (tj. s koplanarne). Przeciwnie, rozlega swobodna rotacja zachodzi wok pozostaych wiza szkieletu polipep-tydowego. Te koncepcje s przedstawione na ryc. 6-2, gdzie wizania obdarzone swobodnym obrotem s okkowane strzakami, a wsp-paszczyznowe (koplanarne) atomy znajduj si w obszarach zacienionych. Ta psztywno ma wane konsekwencje w uporzdkowaniu struktury biaek powyej poziomu pierwszego rzdu. W uzupenieniu do wiza peptydowych, ktre tworz szkielet" acucha polipeptydowego, dodatkowe wizania kowalencyjne i niekowa-lencyjne przyczyniaj si do stabilnoci polipep-tydw. Mostki disiarczkowe uformowane przez reszty cysterny tworz kowalencyjne wizania w obrbie oraz pomidzy polipeptydatni niektrych biaek Wizanie disiarczkowe, utworzone midzy 2 resztami cysteiny, czy 2 czci acucha polipeptydowego za pomoc reszty cystyny. Wizanie cystynowe jest oporne na warunki powodujce denaturacj biaka. Kwas nad-mrwkowy (utleniajcy wizanie S-S) lub fS-mer-kaptoetanol (redukujcy mostki S-S z utworzeniem 2 reszt cysteiny) rozdziela acuchy poli-peptydowe poczone wizaniami disiarczko-wymi bez wpywu na ich struktur pierwszo-rzdow (ryc. 5-9). NIEKOWALENCYJNE WIZANIA RWNIE STABILIZUJ CZSTECZK BIAKA
C H H
Ryc. 6-1. Stabilizacja rezonansowa wizania pe-ptydowego nadaje mu czciowo charakter wizania podwjnego i std sztywno poczenia C-N.
Ryc. 6-2. Wymiary calkowiciewycignitegota-cucha polipeptydowego. 4 atomy w zacienionych obszarach s wsp! paszczyzn owe (kop la na me) i tworz wizanie peptydowe. Niezacienionymi s: atom wgla a, atom wodoru a i grupa a-R danego aminokwasu. Swobodna rotacja zachodzi wok wiza czcych wgiel a z azotem a i wglem cc-karbonylowym (biae strzaki). Rozcignity acuch poiipeptydowy stanowi wic struktur p 23 sztywn, w ktrej / atomw jego szkieletu jest utrzymywanych w staych wzajemnych powizaniach paszczyznowych. Odlego pomidzy ssiednimi atomami wgla (/wynosi 0,36 nm. Podano rwnie odlegoci midzyatomowe i kty pomidzy wizaniami, ktre nie s rwnowane. (Przerysowano i reprodukowano za zgod z: L Pauiing, L. P. Corey, H. R. Branson: Proc. Nal. Acad. Sci. USA 1951:37:205).
Trzy gwne typy wiza niekowalencyjnych szczeglnie si przyczyniaj do utrwalenia struktur biakowych. Wielokrotne wizania wodorowe stabilizuj ogln struktur biaek Wizania wodorowe. utworzone pomidzy: resztami w acuchach bocznych peptydowo zwizanych aminokwuswj -itomami wodoru i tlenu w samych wizaniach peptydowych oraz midzy resztami polarnymi na powierzchni biaek i czsteczkami wody, odgrywaj wan rol w utrzymaniu struktury biaek powyej pierwszego rzdu (p. niej: heliks a i struktura P).
62 / ROZDZIA 6
Interakcje hydrofobowe przyczyniaj si do stabilizacji wntrza czsteczek biakowych Niepolarne acuchy boczne aminokwasw obojtnych w biakach d do zasocjowania. Powizanie nie jest stechiometryczne, wobec tego nie istnieje prawdziwe wizanie. Tyra niemniej ich dua liczba powoduje, e te oddziaywania odgrywaj znaczc rol w utrzymaniu struktury biaek. Elektrostatyczne oddziaywania wi reszty powierzchniowe w biakach Wizania typu soli, czyli elektrostatyczne, tworz si albo midzy przeciwstawnie naadowanymi grupami w acuchach bocznych ami n o k was w, al bo po mi d zy res zt ami N -i C- kocowymi a innymi ugrupowaniami o przeciwnym adunku. Na przykad w pH fizjologicznym s-aminowa grupa lizyny dwiga adunek netto + 1, za nie-a-karboksyl aspara-ginianu i glutamianu czysty adunek 1. Mog wic one nawzajem oddziaywa elektro-statycznie, stabilizujc czsteczki biaka. Zwizki denaturujce biaka rozrywaj w nich wizania niekowafencyjne, powodujc utrat aktywnoci biologicznej Denaturacja biaka za pomoc takich od czynnikw, jak: mocznik, siarczan dodecylu sodu (SDS), umiarkowane stenie jonw H4 lub OH~ rozrywa wizania wodorowe, hydrofobowe i elektrostatyczne, z wyjtkiem wiza kowalencyjnych: peptydowych lub disiarczko-wych. HELIKS a JEST JEDNYM Z MOTYWW STRUKTURALNYCH UTRZYMUJCYCH UPORZDKOWANE KONFORMACJE W BIAKACH Odkrycie, e acuchy polipeptydowe chara kteryzuj si bardzo uporzdkowanymi konformacjami, utrzymywanymi przez wizania wodorowe, stao si gwnym postpem pojciowym. Wprawdzie istnienie tych bardzo uporzdkowanych struktur zostao potwierdzone przez krystalografi rentgenowsk, jednak byo ono najpierw zaproponowane w wyniku rozwaa teoretycznych.
Dane rentgenograficzne wykazay obecno powtarzajcych si jednostek o dugoci 0,50,55 nm wzdu dugiej osi a-keratyn wosa i weny. Niestety, aden wymiar rozcignitego acucha poiipeptydowego nie wynosi 0,50,55 nm (ryc. 6-2). T oczywist anomali rozstrzygnli Pauling i Corey, ktrzy zaproponowali uksztatowanie acucha polipep-tydowego a-keratyny w formie a-heliksu (ryc. 6-3). W strukturze tej grupy R wystaj na zewntrz od centrum heliksu (ryc. 6 -4). Na jedenjJsok ruby (zwj a-heliksu) przyj>adajL&-reszt aminokwasowych, a odlego "przebyta przez jeden skrt (inaczej: odlego midzy
Skok 0,54 nm (3.6 reszt)
Ryc. 6-3. Przedstawienie helikalnej konfiguracji gwnego acucha polipeptydowego wok osi a-heiiksu.
BiAKA: STRUKTURA i WACIWOCI / 63
0,5 r Ryc. 6-4. Przekrj poprzeczny heltksu a. acuchy boczne (R) wystaj na zewntrz heiiksu. Promienie van der Waalsa s wiksze ni wykazano na rycinie, std wewntrz heiiksu prawie nie ma wol nej przestrzeni. (Nieznacznie zmodyfikowano i reprodukowano za zgod z: Stryer L; Biochemistry, wyd.2, Freeman, 1981, Copyright 1981 by W. H. Freeman and Co).
zwojami*) wynosi 0,54 nm. Odstp przypadajct-heliksu wynosi 0,15 nm. Waciwoci a-helik-su s nastpujce: 1. Struktur cc-heliksu stabilizuj miedzyaminokwasowe wizania wodorowe. Kade z nich jest utworzone przez atom H poczony z azotem jednego ugrupowania peptydowego (NH) i znajdujcy si midzy silnie elektroujemnymi atomami (uk adami*), tj. wymienionym azotem peptydowym oraz tlenem grupy karbonylowej (O) 4. z kolei reszty aminokwasowej w strukturze pierwszorzdowej. 2. Kade wizanie peptydowe uczestniczy w wytworzeniu wizania wodorowego, co za pewnia maksymaln stabilno. 3. Wszystkie atomy azotu peptydowego i tle nu karbonylowego reszt aminokwas owych w acuchu gwnym s zaangaowane w wiza nia wodorowe, co znacznie zmniejsza hulrofilowy (zwikszajc hydrofobowy) charakter regionu a-helikalnego. 4. Heliks ot formuje si spontanicznie, ponie wa przy najmniejszym zuyciu energii stanowi najbardziej stabiln konformacj acucha polipeptydowego. * Przyp. tum.
cy na Jedn reszt aminokwasem
A
wzdu osi
Ryc. 6-5. Wizania wodorowe (kropki} uformo wane midzy atomami H i O stabilizuj polipeptyd w konformacji a-heltkalnej. (Przedrukowano za zgod z; Haggis G. H. i wsp. tntroduetion to Motecular Biology. Witey, 1964). Tabela 6-3. Wpyw rnycfi reszt aminokwaso-wych na formowanie heiiksu a
Heliks a
stabilizuj (utrwalaj)
Ala Asn Cys Gin His Leu Met Phe Trp Tyr Val
destabilizuj
Arg Asp Glu Gly Lys Ile Ser Thr
kocz (przerywaj)
Pro Hyp
64 / ROZDZIA 6
5. Prawozwojowy heliks wystpujcy w bia kach jest znacznie bardziej trway ni lewoskrtny, gdy resztami s L-aminokwasy. 6. Resztami destabilizujcymi heliks s: pro.lin_(w ktrej atom N jest czci sztywnego piercienia, co uniemoliwia rotacj wok wi zania N C) oraz aminokwasy z naadowanymi elektrycznie lub masywnymi grupami R, ktre elektrostatycznie lub fizycznie przeszkadzaj w uformowaniu heliksu (tab. 6-3).
RWNOLEGE I PRZE CiW RWNO LEGE POFADOWANE ACUCHY STANOWI DRUGI TYP ROZPOZNAWALNIE UPORZDKOWANEJ STRUKTURY
Pauling i Corey zaproponowali rwnie drugie uporzdkowanie struktury biaka, tj^jtruk-tury p, czyli pofadowanej kartki (inaczej: pofadowanego acucha, pofadowanego lub spli-sowanego" arkusza*) (ang. f3-pleated sheet; p poniewa to bya druga struktura po opisanym najpierw a-heliksie). W heliksie J. acuch polipeptydowy jest zwarty, natomiast w_. strukturze p (inaczej: fadowej, harmonijkowej" lub dywanowej"*) pozostaje on niemal cakowicie rozcignity (ryc. 6 -6). Struktura P noslnazw przeciwrwnolegej, gdy ssiadujce acuchy polipeptydowe biegn w przeciwnych kierunkach (N-koniec jednego acucha do C-koca drugiego) (ryc. 6-6); luedy acuchy podaj w tym samym kierunku jest ona nazywana rwnoleg (nie wykazano). W wielu biakach wystpuj wspbiene i przeciwbiene regiony struktury p. Moe j formowa 25 przylegajcych acuchw poli-peptydowych. Na rycinie 6-7 przedstawiono region rybonukleazy, w ktrej 3 odcinki acucha polipeptydowego tworz struktur p. Heliks a jest stabilizowany mostkami wodorowymi midzy wizaniami peptydowymi, oddzielonymi od siebie 4 resztami w sensie struktury pierwszorzdowej, podczas gdy struktu r fS utrwalaj wizania wodorowe midzy segmentami peptydowymi oddalonymi od siebie w sensie struktury pierwszorzdowej (ryc. 6-7). Przyp. tum.
Ryc. 6-6. W przeciwrwnolegej fadowej strukturze p ssiednie acuchy polipeptydowe biegn w przeciwnych kierunkach. Wizania wodorowe midzy grupami NH i CO ssiednich acuchw stabilizuj t struktur. acuchy boczne (R) aminokwasw znajduj si powyej i poniej paszczyzny kartk i. O atomy wgla; atomy azotu; O atomy wodoru. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgod z: Siryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, Copyright 1981 by W. H. Freeman and Co.).
ZAKRTY p UMOLIWIAJ POLIPEPTYDOM PRZYJMOWANIE KSZTATW GLOBULARNYCH

Polipeptydy z reguy formuj zbite masy globularne, musz wic istnie moliwoci zmiany kierunku acucha polipeptydowego. Jednym z nich jest utworzenie ciasnej ptli zakrtu P (inaczej: skrtu p, zwrotu p1 lub zwrotu typu spinki do wosw*), w ktrej tlen grupy karbonylowej jednej reszty czy sie wizaniem wodorowym z wodorem amidowym aminokwasu oddalonego o 3 reszty do przodu. Czsto w zakrtach p wystpuj prolina i gli-cyna. Cz struktury przestrzennej (geometrii) zakrtu p jest uksztatowana w prolinie, ktra bardziej ni inne aminokwasy podlega konfor-
* Przyp. tum.
ASPEKTY STRUKTURY BIAEK ROZWAA SI POD KTEM 4 POZIOMW UPORZDKOWANIA Struktura pierwszorzdowa Struktur pierwszego rz du stanowi, jak w przypadku peptydw, kolejno aminokwasw w acuchu lub acuchach polipeptydo-wych oraz umiejscowienie wiza disiarczkowych, jeeli one w tych acuchach wystpuj. Struktura drugorzdowa Struktury drugiego rzdu, czyli przestrzenne wspzalenoci midzy aminokwasami zwartymi w pierwszorzdowym strukturalnym zakresie, mog by regularne (np. heliks a, struktura f>) lub przejawia niewiele tej regularnoci (np. przypadkowy zwj). Struktura trzeciorzdowa Oglne rozmieszczenie i wzajemne powizanie ronych regionw lub domen oraz poszczeglnych reszt amin o kwas owych w pojedynczym acuchu polipeptydowym stanowi trzeciorz dow struktur biaka. Wprawdzie rozgraniczenie pomidzy struktur drugo- i trzeciorzdow nie jest wyrane, struktura trzeciorzdowa wyraa wzajemne przestrzenne usytuowanie reszt aminokwasowych, ktre generalnie s daleko od siebie w- sensie budowy pierwszego rzdu. Struktura czwartorzdowa Biaka wykazuj struktur czwartego rzdu,
jeeli skadaj si z 2 lub wicej acuchw polipeptydowych poczonych wizaniami innymi
Ryc. 6-7. Czsteczka rybonukleazy trzustki wou jest zbudowana z pojedynczego acucha 124 reszt poczonego poprzecznie w 4 miejscach za pomoc wiza disiarczkowych. Region a -heliksu ujto w kropkowany owal, a region struktury fadowej zacienione Pozostae czci czsteczki wystpuj giwnie w postaci przypadkowego zwoju. Centrum aktywne enzymu znajduje si w miejscu zwizania jonu fosforanowego (PO^~). (Zaadoptowano z: Kartha G., Bello J.r Harker D.: Tertiary structure of nbonuclease. Natur 1967; 213:862) Biako zo-stato w caoci z syntetyzowane chemicznie.
macyjnym ograniczeniom. Dla kontrastu maa grupa R. pozwala glicynie dziaa jako gitki zawias" midzy regionami polipeptydu, ktrego ugrupowania R sprzyjayby inaczej bardziej rozcignitej konformacji. REGIONY BIAEK, KTRE NIE S UFORMOWANE W HELIKSY, STRUKTURY p LUB ZAKRTY % WYSTPUJ WTZW. KONFORMACJI PRZYPADKOWEGO" (NIEPLANOWANEGO) ZWOJU Znaczne czci czsteczki biakowej mog wystpowa w konformacji przypadkowego (nieplanowanego) zwoju (ang. random-coil; kbek statystyczny) (ryc. 6-7), Termin przypadkowy" jest niefortunny, poniewa moe bardziej implikowa mniejsze biologiczne znaczenie ni regionw o duej powtarzalnoci. Dla funkcji biologicznej regiony przypadkowego zwoju s rwnie wane, jak heliks a lub konformacja p.
5 Biochemia
ni kowalencyjne (tj. niepeptydowymi lub disiar-czkowymi*). Siami stabilizujcymi te agregaty s wizania wodorowe i elektrostatyczne (typu soli) utworzone miedzy resztami aminokwaso-wymi na powierzchniach acuchw polipeptydowych. Takie biaka nosz nazw oltgome-rw, a pojedyncze acuchy polipeptydowe je
* Czsteczka biaka nie dajca si, przynajm niej potencjalnie, rozdzieli na podjednostki (zwizane wizaniami mekowalencyjnymi) nie ma struktury czwartorzdowej. Przykadami biaek bez struktury czwartorzdowej s: rybonukleaza (1 acuch) i chy-motrypsyna (3 acuchy). Przyp. tum. zaczerpnity z: Morawiecki A. (red.): Nowe polskie sownictwo biochemiczne. PWN, 1983, s. 113.
66 / ROZDZIA 6 tworzce okrela si jako protomery, monomery lub podjednostki.
Wiele biaek oligomerycznych zawiera 2 lub 4 protomery, noszc odpowiednio nazwy di-merw lub tetramerw. Oligomery zbudowane z wicej ni 4 protomerw s rwnie rozpowszechnione, zwaszcza wrd enzymw regulatorowych (przykadem karbamoilotransfera-za asparaginianowa). Biaka oligomeryczne odgrywaj szczegln role w regulacji wewntrzkomrkowej, poniewa protomery mog przyjmowa wzgldem siebie rne uoenia przestrzenne, co powoduje zmiany we waciwo ciach oligomeru. Niektre biaka tworz kompleksy wielkoczsteczk owe Asocjacj rnorodnych biaek czynnociowych, z ktrych kade ma 4 poziomy struktury, w wielofunkcjonalne makromolekularne kompleksy spotyka si w transporcie elektronw, biosyntezie kwasw tuszczowych i metabolizmie pirogronianu. DRUGORZDOW I TR ZECIORZDOW STRUKTUR BIAEK WYZNACZA SEKWENCJA AMINOKWASW W ACUCHU POLIPEPTYDOWYM Skoro tylko utworzy si acuch polipep-tydowy, grupy R aminokwasw kieruj swoistym zwijaniem si poszczeglnych jego regionw (struktura drugo rzdowa), jak rwnie zasocjowaniem tych regionw (struktura trzeciorzdowa). Dowodzi tego klasyczne dowiadczenie. Zadziaanie na rybonukleaz agodnym zwizkiem redukujcym (P-merkaptoetanolem) i czynnikiem denaturujcym (mocznikiem lub guanidyn; p. niej) inaktywuje j tak, e przyjmuje konformacj przypadkowego zwoju. Powolne usunicie czynnika denaturujcego i agodne ponowne utlenienie, w celu rekonstrukcji wiza SS, prowadzi do niemal kompletnego odtworzenia aktywnoci enzymatycznej. Nie
jest wic niezbdne postulowanie niezalenej genetycznej kontroli uporzdkowania struktury biaka powyej poziomu pierwszego, poniewa budowa pierwszorzdowa wyznacza drugorzdo-w, trzeciorzdow oraz (kiedy jest obecna) czwartorzdow struktur (tj. konformacj) czsteczki biakowej. Rodzim
ktra jest term o dynamicznie najbardziej stabilna w danym otoczeniu, np. w hydrofilowym w przeciwiestwie do hydrofobowego. Struktura biaka moe by modyfikowana podczas po trans! acyjnego dojrzewania, takiego jak konwersja prcproenzyirm w posta katalitycznie aktywn lub usunicie peptydowego lidera" (peptydu sygnaowego), ktry przeprowadza poprzez bon biaka przeznaczone na eksport'7. Stosunkowo sabe oddziaywania odpowiedzialne za utrzymanie drugo-, trzecio- i czwartorzdowej struktury biaek ulegaj atwo rozerwaniu, powodujc utrat ich aktywnoci biologicznej Naruszenie rodzimej struktury nosi nazw denaturacji. Fizycznie denaturacja moe by rozpatrywana jako zaburzenia konformacji acucha polipeptydowego, nie wpywajce aa jego struktur pierwszorzdowa. Dla protomeru proces ten moe by przedstawiony tak, jak na ryc. 6-8. Dla biaka oligomerycznego denaturacja moe obejmowa rozdysocjowanie protomerw, czemu towarzysz zmiany wich konformacji.
Enzym aktywny (natywny) Dsnaturacja Enzym nieaktywny (z denaturowany) Ryc. 6-8. Zobrazowanie denaturacji protomeru.
konformacj biaka, takiego jak rybonukleaza, wydaje si by ta,
Biologiczn aktywno niszcz mocne kwasy lub zasady, wysoka temperatura, detergenty jonowe (amfipatyczne), zwizki chaotropowe (mocznik, guanidyn), cikie metale (Ag, Pb, Hg) lub rozpuszczalniki organiczne. Zdenatu-rowane biaka s na og gorzej rozpuszczalne i ulegaj wytrceniu. Znajduje to zastosowanie w laboratorium klinicznym. Do krwi lub suro wicy, w ktrej oznacza si zawarto maych czsteczek (np. glukozy, kwasu moczowego, lekw), generalnie najpierw dodaje si kwasu trichlorooctowego, fo sforo wolframowego lub fosforomolindenowcgo w celu strcenia biaek.
Po usuniciu ich, przez wirowanie, analizuje si wolny od biaek supernatant.

Wraliwo wikszoci enzymw na ogrzewanie, kwasy oraz proteazy, stanowi podstaw wstpnego badania, stwierdzajcego czy dan
Tabela6-5. Zmodyfikowane nie-a-funkcyjne grupy w biakach* Grupy mod yfi kowane OH PO3H2 Ser Thr Tyr N- metylowa Arg His Lys Mto-et-N N dimetylowa N-trimetylowa
Lys
reakcj katalizuje enzym. Ekstrakt komrek, obdarzony aktywnoci enzymatyczn, ktry traci t waciwo w wyniku zagotowania, zakwaszenia i ponownego zobojtnienia lub zadziaania proteaz, zapewne zawiera jaki enzym w charakterze katalizatora. Czsto na denaturacj jakiego enzymu wpywa obecno jego substratu. Pojawienie si zmiany konfor-macyjnej podczas zwizania substratu dowodzi, e nowa konformacja moe by trwalsza lub mniej trwaa ni poprzednia.
Arg Lys
PIERWSZORZDOWE STRUKTURY BIAEK S OZNACZANE METODAMI STOSOWANYMI DO SEKWENCJONOWANIA PEPTYDOW

Z biaek zoonych usuwa si najpierw grupy prostetyczne (np. hem), a wizanie disiarczkowe utlenia si w celu uzyskania liniowych polipep-tydw (p. ryc. 5 -9). Techniki stosowane do
Tabela 6-4. Modyfikacja grup a-COOH i a-NH2 w biakach* Grupy modyfikowane a-COOH
Amidowa N-formylowa N-ace tyowa Ala Asp Gly Met Gly Met
N -metylowa
* Wedug R. Uy, F. Wold: Posttranslational co-valent modification of proteins. Science 1977; 198:890. Copyright 1977 by the American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziau za zezwoleniem autorw tej pracy.
sekwencjonowania tych polipeptydw przedstawiono w rozdz. 5. Wprawdzie wikszo biaek 2awiera tylko aminokwasy wymienione w tab, 4-3, pochodne tych reszt rwnie wystpuj w niektrych biakach (tab. 6-4 i 6-5). Jakkolwiek omwienie metod uywanych do zidentyfikowania owych pochodnych amino-kwasowych nie wchodzi w zakres tego rozdziau, jednak ich obecno moe komplikowa okrelenie struktury pierwszorzedowej.
Asp Glu Gly His Met Phe Pro
Ala Asp Gly Met
Ser Thr Tyr
Ser Thr
Val
Val
* Wedug R. Uy, F. Wold: Posttranslational co-valent modification of proteins, Science 1977; 198:890. Copyright 1977 American Association for the Advancement of Science, w modyfikacji autora rozdziau za zezwoleniem autorw cyto wanej pracy.
Techniki poprzednio stosowane, pozwalajce wnioskowa o wystpowaniu w biakach struktur helikalnych (np. optyczna dyspersja rotacyjna, wymiana protonw trytu) zostay wyparte przez rentgenowsk analiz krystalograficzn. Promienie X s kierowane na kryszta biaka oraz na jedn z jego pochodnych, zawierajc dodatkowo jon cikiego metalu. Promienie ulegaj rozproszeniu w sposb zaleny od gstoci elektronw w rnych czciach czsteczki biakowej. Obrazy zbioru plamek dyfrakcyj nych, uzyskane na bonie fotograficznej (po jej wywoaniu), s tumaczone na tzw. mapy rozkadu gstoci elektronowej, ktre po uoeniu jednej na drugiej pozwalaj krystalografo wi skonstruowa wiarogodny model dane go biaka. Krystalografia rentgen o graficzna, chocia czasochonna, kosztowna i wymagajca specjalistycznego przeszkolenia, ujawnia szcze-
Drugorzdowa i trzeciorzdowa struktura biaek jest analizowana za pomoc krystalografii rentgenowskiej
68 / ROZDZIA 6
glowe i precyzyjne obrazy z usytuowaniem wszystkich aminokwasw w wielu bia kach. Nie mona nie doceni jej ogromnego wkadu do naszego dzisiejszego pojmowania struktury biaek. Wyoniona technika zobrazowania magnetycznego rezonansu (ang. magnetic resonance imaging; skrt MRI) zostaa ostatnio wykorzystana do zanalizowania trjwymiarowej struktury maego biaka. Technika MRI wydaje si mie szans zastosowania do wikszych biaek. Metody fizyczne stosowane do zbadania czwartorzdowej struktury biaek Badanie czwartorzdowej struktury biaka oligomerycznego obejmuje okrelenie liczby i rodzaju obecnych w nich protomerw, ich pooenia wzgldem siebie oraz czcych je oddziaywa. Zakadajc, e oJigomery nie ulegaj denatu-racji podczas procedury stosowanej do oznaczenia masy czsteczkowej, wiele metod moe dostarczy o niej danych. Te same techniki mog by wykorzystane do okrelenia masy czsteczkowej protomeru po wczeniejszym zdenaturowaniu oligomeru. Ultrawirowanie, filtracja elowa i elektroforeza w elu pozwalaj oznaczy mas czsteczkow biaek oi izomerycznych Rozwinita przez Svedberga technika ultra-wirowania mierzy szybko sedymentacji* w polu siy odrodkowej ok. 105 x g. W ostatnich latach istnieje tendencja, aby zastpi j mniej zoonymi metodami. W pokrewnej technice, tj. ultrawirowaniu w gradiencie gstoci sacharozy, nawarstwia si
biaka wzorcowe i badane na gradient ste roztworw sacharozy (520%), przygotowany w probwce plastikowej. Po ultrawirowaniu przy 10 5 x g przez kilkanacie godzin (np. w cigu nocy) przekuwa si may otworek w dnie probwki, zbiera jej zawarto w postaci kropel w serii kolejnych maych probwek i oblicza ruchliwoci na podstawie wzgldnego pooenia biaek w gradiencie. Mas czsteczkow biaka globu larnego mona okreli z jego ruchliwoci w sicie molekularnym Kolumny z elu Sephadex lub podobne mat ryce, majce pory" o wiadomym rozmiarze kalibruje si, stosujc biaka o znanej masie czsteczkowej. Poszukiwan mas czsteczkow nieznanego biaka oblicza si z porwnania jego objtoci elucyjnej z objtociami elucyj-nymi biaek wzorcowych. Mona popeni due bdy, jeeli czsteczka biaka jest bardzo asymetryczna albo oddziauje silnie ze zwizkami, z ktrych zostay wyprodukowane molekularne sita. Elektroforeza w elu poliakrylamidowym (PAGE) to jeszcze jedna metoda oznaczania masy czsteczkowej Biaka wzorcowe rozdziela si elektroforety-cznie w 515% ela ch poliakrylamidowych o zmiennej porowatoci, wybarwia si je na obecno biaek, generalnie bkitem Coomas-sie lub tzw. srebrem, i mas czsteczkow oznacza wzgldem ruchliwoci elektroibretycz-nej wzorcw. Najbardziej powszechne zastosowanie tej techniki, PAGE-SDS, pozwala oznaczy mas czsteczkow protomeru w wyniku wczeniejszego zdenaturowania oligomeru (np. przez zagotowanie w roztworze detergentu w obecnoci p-merkaptoetanolu) i rozdzielenie w elach zawierajcych detergent jonowy siarczan dodecylu sodu (SDS). KOMPLEKSY BIAKOWE MOG BY UWIDOCZNIONE PRZEZ ELEKTRONOW MIKROFOTOGRAFI Uzyskane w mikroskopie elektronowym powikszenia rozmiarw rednicy nawef 100000 razy pozwalaj uwidoczni biaka o bardzo duej masie czsteczkowej, takie jak czstki
* Matematycznym wyrazem tej szybkoci jest tzw. staa sedymentacji S20, tj. szybko opadania warstwy roztworu biaka pod dziaaniem jednostki siy od rodkowej, wyraona w jednostkach ukadu cgs, sprowadzona do gstoci i lepkoci wody w temp. 20C. Dla wikszoci biaek wartoci liczbowe staej sedymentacji wahaj si w granicach l,510~ 13 2010~"; dla czsteczki biaka o ksztacie kulistym jednostka staej sedymentacji (1I0""13) odpowiada masie czsteczkowej ok. 16 000. (Przyp. tum. zaczerpnity z: Skar-ytiski B.: Chemia fizjologiczna, t. I, PWRiL, 3956, s. 85).
BIAKA: STRUKTURA I WACIWOCI / 69 Tabela 6-6. Czwartorzdowe struktury wybranych enzymw* Enzym (oligomer) Aminotransferaza asparaginianowa serca kury Syn ta za kwasw tuszczowych wtroby goibia Fruktozobisfosfataza wtroby krlika Aminotransferaza ornitynowa wtroby szczura Karboksylaza propionylo-CoA serca wini LDH serca, wtroby lub mini wou ATPaza mitocriondrrw serca wou Syntetaza glutaminowa Escherichia coli Karboksylaza acetylo-CoA wtroby kury Liczba protomerw 22 2" 2** 44 4** 10 12 2** 10** Masa czsteczkowa protomeru 50 000 230 000 29 000 37 000 33 000 175 000 35 000 26 0O0 48 500 4 100 000 409 000
* Zaadaptowano z: Klotz I. M., Langerman N. R., Darnall D. W.: Cuaternary structure of enzymes, Annu Rev Biochem 1970; 39:25. ** Niezidentyfikowane podjednostek.
wirusw, kompleksy enzymatyczne i biaka oligomeryczne. W tabeli 6-6 podano przykady liczby oraz mas czsteczkowych protomerw stanowicych czwartorzdowe struktury wybranych enzymw.
PIMIENNICTWO
Advances in Protein Chemistry. Academic Press, 1944 to dat, [Annual publicalion.] Celis JE. Bravo R: Two-dimensional Gel Electrophoresis of Proteins. Methois and Applications. Academic Press, 1984. Chothia C. Principles that determine the structure of proteins. Annu Rev Biochem 1984; 53:537. Dunn MJ: Gel Electrophoresis of Proteins. Wright,
1986.
Franks F: Characterization of Proteins. Wright, 1986 One AD, Braun W, Wuthrich K. Studies by l H NMR and distanoe geometry of the solution conformation of the a-amylase inhibitor tendamistat. / Mol Biol 1986; 189:377. Lennarz WJ (editor): The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycarrs. Plenum Press, 1980. L'Italien JJ: Proteins: Structure and Function. Plenum Press, 1987. Ros CD, Geselowitz AR, Lesser GJ, Lee RM, Zehfus MH. Hydrophobiciiy of amino acid residues in globular proteins. Science 1985; 229:834, Schlessinger DH: Macromolecular Seuencing and Analysis: Selected Methods and Applications. AR Liss, 1988. Schott H: Affinity Chrotnatography. Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins. Marcel Dekker, 1984. Wittmann-Liebold B, Solnikow J, Erdmann VA: Advancetl Methods in Protein Microseuence Analysis. Springer Verlag, 1986.
7
WPROWADZENIE
W rozdziale tym omwiono zaleno struktury i funkcji na przykadzie mioglobiny i hemoglobiny, biaek nie tylko bardzo istotnych fizjologicznie, lecz take obrazujcych, w jaki sposb struktura biaek decyduje o ich funkcji biologicznej.
Biaka: mioglobina i hemoglobina

Victor W. Rodwell, PhD
ZDOLNO MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY DO MAGAZYNOWANIA I TRANSPORTU TLENU WIE SI Z OBECNOCI PROSTETYCZNEJ GRUPY HEMOWEJ I JONU ELAZAWEGO
Grup proste ty czn mioglobiny i hemoglobiny jest hem, cykliczny tetrapirol nadajcy tym biakom zabarwienie czerwone. W tetrapirolu 4 piercienie pirolowe s poczone mostkami tt-metinowytni, tworzc paski ukad cykliczny (ryc. 7-1). Podstawniki w pozycjach P piercieni
Biaka hemowe bior udzia w transporcie i magazynowaniu tlenu, transporcie elektronw oraz fotosyntezie. Badania mioglobiny i hemoglobiny ujawniy istnienie cech struktury wspl nych dla wielu biaek, jak rwnie istnienie zalenoci midzy struktur a funkcj. Ponadto umoliwiy one poznanie molekularnych podstaw chorb genetycznych, takich jak niedo-krwistoc sierpowata (wynik zmienionych waciwoci powierzchniowych podjednostki p hemoglobiny) i taJasemie (przewleke dziedziczne choroby hemolityczne, charakteryzujce si upoledzeniem syntezy hemoglobiny). Badania wykazay, e cyjanek i tlenek wgla stanowi miertelne zagroenie, poniewa uniemoliwiaj fizjologiczn funkcj odpowiednio oksydazj cytocJLrpmowei-J^hemoglobiny, a stabilizacja struktury czwartorzdowefnieutJenowanej hemoglobiny przez 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) stanowi podstaw mechanizmw choroby grskiej i adaptacji do duych wysokoci.
Ryc. 7-1. Pirol. Wgle a fcz si za pomoc mostkw metinowych tworrac cykliczny tetrapirol. Przy wglach p wystpuj podstawniki charakterystyczne dta swoistych tetrapiroli, np. hemu.
pirolowych okrelaj rodzaj pochodnej tetrapirolu. W hemie w pozycjach p znajduj si grupy metylowe (M), winylowe (V) i pfbpionianpwe (P) uoone w nastpujcej kolejnoci: M, V, M, V, M, P, P, M (ryc. 7-2). W centrum tego ukadu znajduje si atom elaza w formie jonu elazawego (Fe2+ ), Innymi biakami, w ktrych grup prostetyczn jest tetrapirol zasocjowany z jonem metalu s cytochromy (Fe2+ i Fei+), katalaza, 2,3-dioksygenaza tryptofanowa oraz chlorofil (Mg2+ ). Funkcja biologiczna cyto-
BIAKA: MJOGLOBtNA f HEMOGLOBINA / 71
Ryc. 7-2. Hem. Piercienie pirolowe, wgle most 4 + kw metinowych i atom elaza Fe' le praktycz nie w jednej paszczynie. Pite i szste wizanie
nu, wewntrz czsteczki mioglobiny znajduj si wycznie aminokwasy niepolarne (np. Leu, Val, Phe i Met). Mioglobina, pierwsze biako, ktrego struktur rozszyfrowano rentgenograficznie, jest bogata w ot-heliks Mioglobina jest silnie upakowan, w przyblieniu kulist czsteczk o wymiarach 4,5x3,5 x2,5 nm(ryc. 7-3). Niemniej jednak jej
koordynacyjne Fe 2+ s usytuowane prostopadle, znajdujc si nad i pod paszczyzn hemu. Na uwag zasuguje rodzaj podstawnikw przy wg lach P piercieni piroiowych, centralnie pooony atom zela2a oraz polarne acuchy boczne, ktre s zwrco ne na zewntrz czsteczki mioglobi ny.
chromw wynika z utlenienia i redukcji atomu elaza. W przeciwiestwie, w przypadku mioglobiny i hemoglobiny utlenienie Fe2+ wie si z utrat -A przez te biaka ich aktywnoci biologicz-nej.
Utlenowana mioglobina mini stanowi rezerw tlenu

Fnnk^pt iT iinplrthiTiy jftst ma^Tynnwfinie t1f-
nu w miniach. W warunkach niedoboru tlenu (np. w przypadku intensywnych wicze fizycznych) tlen utlenowanej miogiobiny jest wykorzystywany w mitochondriach mini do syntezy ATP na drodze fosfcrylacji oksydacyjnej. Poza dwoma wyjtkami reszty polarne znajduj si na zewntrz, a niepolarne wewntrz czsteczki mioglobiny Mioglobina jest to pojedynczy acuch poli-pptydowy o masie czsteczkowej 17 000 zbudowany zejj_5J)reszt aminokwasowych rozmieszczonych w "cKaraktery styczny dla biaek globularnych sposb. Zewntrzna cze czsteczki biaka jest polarna, a wntrze niepolarne. Reszty aminokwasowe, zawierajce zarwno grup polarn, jak i niepolarn (np. Thr, Trp i Tyr), s skierowane swoj niepolarn czci do wntrza czsteczki. Poza 2 resztami his-tydynowymi, biorcymi udzia w wizaniu tle-
Ryc. 7-3. Model mioglobiny opracowany na podstawie analizy rentgenograficznej. W modelu zaznaczono wycznie wgle s, (Reprodukcja za zgod z: Dickerson R. E.r w: The Proteins, wyd. 2, t. 2, Neurath H, [red], Academic Press, 1964).
struktura jest nieregularna i wykazuje brak symetrii. Okojo 75% ^"^nyfia wy^t^ry^\yfgarnie R prwnslfi -^tiiyrh a-heiiksw o dugoci 720 aminokwasw. Liczc od N-koca odcinki helikalne oznacza si kolejnymi literami od A do H, natomiast fragmenty midzy helikalne literami 2 odcinkw helikalnych, ktre one cz. Poszczeglne aminokwasy okrela si za pomoc litery oznaczajcej heiks, w ktrym dana reszta wystpuje, oraz liczby wskazujcej jej pozycj od koca N w tym heliksie. Na przykad His F8" odpowiada 8, reszcie w heli ksie F zidentyfikowanej jako histydyna. Odlege w rozumieniu struktury pierwszorzdowej reszty aminokwasowe (np. w rnych heliksach) ze wzgldu na uoenie przestrzenne acucha polipeptydowego mog znajdowa si blisko
72 / ROZDZIA 7
siebie, jak na przykad histydyna F8 (proksyma-lna) i histydyna E7 (dystalna) {ryc. 7-3). Drugorzdowa i trzeciorzdowa struktura mioglobiny w roztworze cile odpowiada strukturze mioglobiny krystalicznej. Wykazuj one identyczne widma absorpcji, obie wi tlen. a zawarto cc-heliksw w strukturze mioglobiny w roztworze (oznaczona za pomoc dyspersji skrcalnoci optycznej i dichroizmu koowego) jest porwnywalna z zawartoci ujawniony przez analiz rentgenograficzn.
His praksymalna (F8)
Pierwszorzdowa struktura a po mioglobiny zapewnia prawidowe upakowanie biaka w obecnoci hetnu
Przeksztaceniu mioglobiny w pozbawion hemu apomioglobine, wskutek obnienia pH do 3,5, towarzyszy zmniejszenie zawartoci struktury a-helikalnej, a w obecnoci mocznika cakowity jej zanik. Usunicie mocznika poprzez dializ i dodanie hemu przywraca cakowicie struktur helikaln, a w obecnoci Fe2+ aktywno biologiczn (wizanie tlenu). Wskazuje to, e informacja zawarta w strukturze pierwszo-rzdowej apomioglobiny jest odpowiedzialna za swoiste upakowanie biaka w obecnoci hemu. Stwierdzenie, e struktura pierwszorzdowa biaka determinuje jego struktur drugo- i trzeciorzdow okazao si by uniwersalne. Histydyny F8 i E7 odgrywaj unikatow rol w wizaniu tlenu przez mioglobin W mioglobinie grupa hemowa znajduje si w zagbieniu midzy heliksem E i F (ryc. 7-3). Polarne, propionianowe acuchy boczne hemu s skierowane na zewntrz czsteczki mioglobiny, a jego pozostaa cz znajduje si we wntrzu biaka, gdzie, z wyjtkiem His_F_8 j.His 7, otaczaj go reszty nipolarne. Atom el aza pij^mwiza niemkoordvnacvjnvm wi esie z piercieniem imidazoTowym His F8 okrelanej mianem histydyny proksymalnej (ryc. 7-4). Po drugiej stronie paszczyzny hemu w stosunku do His F8 znajduje si His E7, okrelan mianem histydyny dystalnej, ktra jednak nie zajmuje szstej pozycji koordynacyjnej elaza (ryc. 7-4). Atom elaza umiejscowiony nieco poza paszczyzn hemu przesuwa si w jej kierunku po zwizaniu tlenu W mioglobinie pozbawionej tlenu atom elaza jest wysunity o ok. 0,03 nm (0,3 A) poza paszczyzn hemu w kierunku His F8. W przy-
His dystalna (B7)
Ryc. 7-4. Wizanie tlenu z elazem hemowym podczas reakcji utlenowania. W reakcji tej istotn rol odgrywaj piercienie imidazolowe 2 reszt histydynowych globiny, czce si z elazem he mow ym. (Reprodukcja za zgod z: Harper H. A. i wsp., Physiologische Chemie, Springer-Verlarg, 1975). ________________________________
padku utlenowanej mioglobiny, w ktrejjjm, zajmuje szsta, pozycje koordynacyjn, elazo jeT~ wy sunite poza paszczyzn hemu tylko ook. 0,01 nm(0,l A). Utlenowaniu mioglobiny towarzyszy wic ruch atomu elaza, a w konsekwencji His F8 i reszt kowalencyjnie poczonych z His F8, w stron paszczyzny grupy pro-stetycznej. Skutkiem tego zjawiska jest zmiana konformacji czci biaka. Apomioglobina zmniejsza powinowactwo elaza hemowego do tlenku wgla W utlenowanej mioglobinie wizanie midzy atomem tlenu i Fei+ jest prostopade~db paszczyzny nemu. Drugi atom tlenUj w stosunku do paszczyzny hemu, jest przyczony natomiast pod ktem 121 stopni z dala od histydyny dystalnej (ryc. 7-5). Okoo 25 000 razy silniej ni tlen do wyizolowanego hemu wie si tlenek wgla (CO). Chocia CO znajduje si w atmosferze w ii o-
BIAKA: MLOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 73 O III O c
KRZYWE DYSOCJACJI TLENOWEJ MIOGLOBINY I HEMOGLOBINY OBRAZUJ ICH ODMIENNE FUNKCJE FIZJOLOGICZNE
Mioglobina jest biakiem magazynujcym, a nie"transportujcym"tlen.llo_przyczonego do mioglobiny tlenu (wyraona w proc entach nasycenia") zakv od jego stenia (wyraonego jako pO2 , czyli stenie czstkowe tlenu) w njbliszyjn_gtoczeniu elaza hemoweô. Zaleno midzypbi i iloci zwizanego tlenu obrazuj graficznie krzywe dysocjacji tlenowej.
Dla mioglobiny krzywa dysocjacji tlenowej w. warunkach izotermicznych ma ksztat hiperboli
Ryc. 7-5. Preferowane kty wizania tlenu i tlenku wgla do atomu elaza w hemie.
ciach ladowych, a podczas prawidowego kata-btizmu hemu powstaj jedynie niewielkie jego iloci, nasuwa si pytanie, jak to si dzieje, e O2, a nie CO zajmuje szste miejsce koordynacyjne w elazie hemu mioglobiny. Przyczyn jest przestrzenna zawada, jak stanowi otoczenie "Fiemu w mioglobinie. Preferowane uoenie CO przyczonego do elaza hemowego jest dla wszystkich 3 atomw (Fe, C. O) prostopade w stosunku do paszczyzny hemu (ryc. 7-5). Podczas gdy taka orientacja jest moliwa w^przypadku wyizolowanego hemu, w mio-globinie histydy na dystalna stanowi przestrzenn zawad dla wizania CO pod tym ktem (ryc. 7-6). Powoduje to, e CO wie si w mniej korzystriejTcbnfiguracji, co zmniejsza si wizania hem-CO o ponad 2 rzdy wielkoci, do wartoci ok. 200 razy przewyszajcej wizanie hem-O2. Pomimo tego w warunkach fizjologicznych niewieika cz mioglobiny (ok. 1%) wystpuje w formie karboksymioglobiny.
(ryc. 7-7). W naczyniach wosowatych puc,
Ryc. 7-7. Krzywa dysocjacji tlenowej mioglobi
ny. Na uwag zasuguje zaleno stopnia utlenowanra i cinienia czstkowego tlenu w pucach (100 mm Hg), tkankach (20 mm Hg) i pracujcych miniach (5 mm Hg). _____________
Ryc. 7-6. Kty wizania tlenu i tlenku wgla do atomu elaza hemu w mioglobinie, Histydyna dystalna E7 stanowi przestrzenn zawad dla wizania CO pod preferowanym w stosunku do paszczyzny hemu kalem (180),
w ktrych pOj wynosi 100 mm Hg, mioglobina mogaby skutecznie wiza tlen. Poniewa jednak warto pO2 w yach i miniach wynosi odpowiednio 40 i 20 mrn_Hgj a mioglobina nie oddaje znacznej czci zwizanego tlenu nawet przy cinieniu 20 mm Hg nie moe ona suy jako przenonik tlenu z puc do tkanek. Dopiero w warunkach niedoboru tlenu, towarzyszcego duej aktywnoci fizycznej, kiedy pO, w miniach spada do 5 mm Hg, mioglobina uwalnia zwizany tlen, ktry w mitochondriach mini jest wykorzystywany do biosyntezy ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej.
74 / ROZDZIA 7
HEMOGLOBINA TRANSPORTUJE TLEN, DWUTLENEK WGLA I PROT ONY MIDZY PUCAMI I TKANKAMI Hemoglobina, zawarta w erytrocytach krgowcw, spenia dwie gwne funkcje biologiczne; 1) przenosi O2 z puc do tkanek i 2) przenosi CO2 i protony z tkanek do phic w celu wydalenia. Mimo e biochemia porwnawcza hemoglobin krgowcw jest bardzo interesujca, przedmiotem dalszych rozwaa s hemoglobiny ludzkie. KONSEKWENCJ CZWARTORZDOWEJ STRUKTURY HEMOGLOBINY S JEJ WACIWOCI ALLOSTERYCZNE Waciwoci poszczeglnych hemoglobin s prawidowoci wynikajc z ich struktury czwartorzdowej (jak rwnie drugo - i trzeciorzdowej). Czwartorzdowa struktura he moglobiny jest odpowiedzialna za nowe, dodatkowe w stosunku do mioglobiny, waciwoci, ktre warunkuj jej unikatow funkcj biologiczn i pozwalaj na jej precyzyjn regulacj. Waciwoci allosteryczne (gr. allos inna, steros przestrze) hemoglobiny stanowi ponadto model do zrozumienia innych biaek allosterycznych. W przeciwiestwie do mioglobiny, hemogtobina jest tetramerem Hemoglobina w odrnieniu od jednoacu-chowej mioglobiny nie majcej struktury czwartorzdowej, jest tetramerem skadajcym si z 2 par identycznych acuchw polipeptydo-wych, czyli podjednostek (okrelanych jako a, p, 7,8, S itd.). Podobne pod wzgldem dugoci polipeptydy a (14l) reszt aminokwas owych) i P (146 jeszt aminokwasowych) hemoglobiny A (HftA) s kodowane przez rne geny i maj odmienn struktur pierwszorzedow. W przeciwiestwie, acuchy p, y i 5 hemoglobin ludzkich charakteryzuje dua konserwatyw-no ich sekwencji. Najczciej wystpujce hemoglobiny maj nastpujcy skad tetrame-ru: HbA j (podstawowa hemoglobina prawid owa u ludzi dorosych) = j^, ^^(hemo globina podowa) = a2Y2, HBS ^hemoglobina sierpowatych krwinek czerwonych) = <x2S2, HbA2 (hemoglobina prawidowa u ludzi doros-
ych stanowica ok. 2,5%* Hb cakowitej) = Mioglobina i podjednostki P hemoglobiny maj praktycznie identyczn struktur drugorzdow 1 trzeciorzdow Pomimo rnic w rodzaju i liczbie aminokwasw, mioglobina i acuchy polipeptydowe P HbA wykazuj praktycznie identyczn struktur drugorzdow i trzeciorzdow. To cise podobiestwo, dotyczce rwnie umiejscowienia hem u i odcinkw helikalnych, jest przynaj mniej w czci wynikiem substytucji aminokwasw o podobnych waciwociach i rwnoznacznych pozycjach w strukturze pierwszo-rzdowej mioglobiny i podjednostki P HbA. Nawet wystpowanie 7 a nie 8 odcinkw helikalnych w acuchu P nie zmienia zasadniczego podobiestwa strukturalnego tych polipepty-dw. Podobnie jak w przypadku mioglobiny, zarwno podjednostki ot, jak i p HbA charak teryzuje obecno hydrofobowych reszt aminokwasowych wewntrz czsteczki (z wyjtkiem 2 reszt His w kadej podjednostce), a hydro filowych na zewntrz czsteczki. Uttenowaniu hemoglobiny towarzyszy wsunicie elaza w paszczyzn hemu oraz zmiana konformacji sprzonej apoproteiny wywoana przemieszczeniem histydyny proksymalnej Tetramcryczna hemoglobina wie 4 czste-czkftlenu (hem kadej podjednostki wie jedn czsteczk tlenu), a jej krzywa dysocjacji tlenowej ma ksztat sigmoidalny (ryc. 7-8). Przyczenie O2 przez jeden z hemw uatwia wizanie kolejnych O2 przez pozostae grupy hemowe. To kooperatywne wizanie tlenu z hemoglobin jest waciwoci pozwalajc na wizanie maksymalnej iloci O2 w pucach i uwalnianie maksymalnej iloci O3 w tkankach (ryc. 7-8). Miar powinowactwa hemoglobiny do tlenu jest wielko Pso, odpowiadajca cinieniu czstkowemu tlenu, przy ktrym wystpuje 50% nasycenia O a Warto P;o jest rna dla rnych orga nizmw, przy czym jest ona zawsze wiksza od wartoci pO2 w tkankach badanych organiz* Przyp. tum.
BIAKA; MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 75

20 140 40 60 80 100 120 Cinienie czstkowe tlenu (mm Hg) Utlenowana krew _ opuszczajca puca
Ryc.
Odtlenowana krew powracajca z tkanek
7-8.
Hemoglobina
1,1
Krzywedysociacjitlenowej hemoglobiny i mioglobiny. Cinienie czstkowe tlenu w krwi ttniczej wynosi ok. 100 mm Hg; wkrwiylnej40 mm Hg; w naczyniach wosowatych 20 mm Hg; minimum niezbdne dla funkcji cytochromw 5 mm Hg. Poczenie acuchw polipeptydo-wych w struktur tetrameryczn (hemoglobina) pozwala na zwikszenie, w porwnaniu z pojedynczymi acuchami, wydajnoci dostarczania tlenu. (Zmodyfikowana i reprodukowane za zgod z: StanburyJ, B,,Wyngaarden J. B., Fredrickson D.S. [red.], The Metabolic Bas/s of Inherited Disease, wyd.4, McGraw-Hill, 1978). Ryc. 7-9. Wizania poprzeczne mid2y podjednostkarni oraz w obrbie podjednostek nieutleno wanej hemoglobiny. Podczas utlenowania te niekowalencyjne, elektrostatyczne wizania zostaj rozerwane, {Zmodyfikowana i reprodukowana za zgod z: Stryer L: Biochemistry. wyd. 2, Freeman, 1981). ________________________________
go-, trzecio- i czwartorzdowej strukturze biaka. Jedna para podjednostek a/P obraca si w stosunku do drugiej pary a/&\ w wyniku czego nastpuje zblienie podjednostek tetramem i zwikszenie powinowactwa hemw do tlenu (ryc, 7-10 i 7-11).
mw, czego dobrym przykadem jest ludzka hemoglobina podowa (HbF). Warto P50 dla HbA = 26 mm Hg, podczas gdy dla HbF = 2(1 mm Hg. Ta rnica w powinowactwie Hbl i HbA do tlenu umoliwia HbF pobieranie tlenu od HbA w obrbie oyska. Po porodzie HbF przestaje waciwie spenia swoj funkcj poniewa jej due powinowactwo do O2 utrudnia jego oddysocjowywanie w tkankach. Najwczeniej w rozwoju osobniczym czowieka s syntetyzowane acuchy i e. Pod koniec pierwszego trymestru ciy acuch zastpuje podjednostka et, a acuch e podjednostka7. Hemoglobina F, pojawiajca si wic w tym okresie ycia podowego, jest zbudowana wedug wzoru d 2 y . Podjednostka % ktrej synteza rozpoczyna si w trzecim trymestrze ciy, cakowicie zastpuje acuch y dopiero kilka tygodni po porodzie. Utlenowamu hemoglobiny towarzysz zmiany konformacji biaka PrzyJaszernu O2 towarzyszy rozerwanie wiza poprzecznych pomidzy kocami karbo-ksylowymi wszystkich 4 podjednostek hemoglobiny (ryc. 7-9), co powoduje zmiany w dru-
cc, S 1 i/
\\
/
8
V '
1 1
.i \
/ s
/ 6 15
Posta R
~~_______________ -
Posta T
Rvc. 7-10. W czasie przejcia postaci T w posta R hemoglobiny jedna para podjednostek (a2/f>2) obraca si o 15 w stosunku do drugiej pary (a1/fl]). Poniewa o obrotu jest niewsprodkowa, para at2/P2 przesuwa si rwnie nieco w kierunku osi. Na diagramie para a,/^ utrzymujca si w staej pozycji jest niezaciemniona, a para a2/P: dokonujca obrotu i przesunicia jest zaciemniona.
Czwartorzdow struktur czciowo utleno-wanej hemoglobiny okrela si jak o stanT(ang. taut naprony), a cakowicie utlenowanej hemoglobiny (HbOj) jako stan R (ang. relaxed
76 / ROZDZIA 7
rozluniony) (ryc. 7-12). Symbole R i T s rwnie uywane w celu okrelenia czwartorzdowej struktury enzymw allosterycznych, gdzie forma T wykazuje mniejsze powinowactwo do stibstratu. Utlenowanie hemoglobiny prowadzi do zmian konformacyjnych w bezporednim otoczeniu grupy hemowej Podczas utlenowania hemoglobiny atomy elaza (Mace ok. 0,06 nm poza paszczyzn hemw w nieutlenowanej hemoglobinie) wsuwaj si w paszczyzn hemw, pocigajc za sob histydyn proksymaln (F8) i poczone z ni reszty aminokwasowe (ryc. 7 -13).
TyrC7| )
Pod jednostka /)t
Odtlenowanie (posia T)
Podjednostka a. AspG1(94!
Ryc. 7-11. Zmiany oddziaywa w obrbie ot,/p, podczas utlenowania. Przesunicie zazbiajcych si obszarw powoduje zmian miejsc oddziay wa i przeczanie" jednych wiza wodorowych na inne. Pozostae wizania maj charakter niepolarny. (Reprodukcja za zgod z: Perutz M. F.: Molecular pathology of human hemoglobin: stereochemical interpretation of abnormal oxygen affinities, Natur 1971; 232:408). ___________________
Podjednostka f)2
Utlenowani e (posta R)
Posta T
Posta R
Ryc. 7-12. Przejcie postaci T w posta R zwiksza prawdopodobiestwo utlenowania kadego z 4 hemw. Przeksztacenie to nie nastpuje z chwil przyczenia okrelonej liczby czsteczek tlenu, lecz dokonuje si wraz z utlenowaniem kolejnych hemw. Stopniowe przyczanie tlenu powoduje pkanie (linie cienkie) i osabianie (linie wykowate) wiza poprzecznych czcych podjednostki w postaci T. Przejcie midzy tymi dwoma postaciami pozostaje pod wpywem rnych czynnikw, takich jak: protony, dwutlenek wgla, chlorki, BPG. Im wiksze stenie tych czynnikw, tym wicej tlenu musi zosta zwizane, aby zapocztkowa przeksztacenie. Schemat nie zawiera cakowicie utenowanej czsteczki w postaci T oraz cakowicie nieutlenowanej czsteczki w postaci R, poniewa s one zbyt nietrw'ae, aby istnie w znaczcej liczbie. (Zmodyfikowana i przerysowana za zgod z: Perutz M. F,: Hemoglobin structure and respiratory transport, Sci. Am. [Dec], 1978; 239:92), ___________
BIAKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 77

Hlslydyna FB HeliKs F
Odpychania ' przestrzenne I Paszczyzna nam u
przed szkodliwym wpywem zwikszenia kwasowoci krwi, peni m.in. hemoglobina._QJL-, czeniu 4 czsteczek tlenu z hemoglobiny towarzyszy wizanie 2 protonw. W pucach natomiast zachodzi zjawisko odwrotne, tj. przy czenie tlenu do hemoglobiny powoduje uwolnienie protonw. Uwolnione-prolony cz si z wodorowglanem, tworzc kwas wglowy, ktry pod wpywem dehydratazy wglanowej przeksztaca si w CO2, usuwany w procesie oddychania. Stad wizanie tlenu zwiksza wydychanie CO2. To odwracalne zjawisko nosf nazw efektu Bohra (ryc. 7-l5)7EfekTBohTa jest waciwoci
Wydychania Tkanki 2 HC O ,"
Cykl
Ryc. 7-13. Podczas utlenowania atom elaza wsuwa si w paszczyzn hemu. Razem z atomem eiaza przemieszcza si histydyna F8 i zwizane z ni reszty aminokwasowe. (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgod z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2. Freeman, 1981).
kwasw
(Buforujce dziaania ------------- hemoglobiny) Puca
40
JD.2H
Oprcz transportu tlenu z puc do tkanek, hemoglobina bierze udzia w przenoszeniu COj z tkanek do puc, skd jest on usuwany podczas oddychania. Bezporednio po odczeniu tlenu, czsteczka hemoglobinjL.^di_CQs_ w iloci stanowicej~oJ7l5% CO2 transportowanego . Ponadto z chwil za"SBsorbtyw"ania COj przez Irew dehydrataza wglanowa erytrocytw katalizuje utworzenie kwasu wgiowe-go, ktry dysocjuje do wodorowglanu i protonu na skutek przesunicia rwnowagi reakcji w kierunku dysocjacji (ryc. 7-14). Funkcj ukadu buforowego, zabezpieczajcego organizm
Po uwolnieniu tlenu w tkankach hemoglobina transportuje dwutlenek wgla i protony do puc
trlkarboksylowych (Krebsa) Ryc. 7-15. Efekt Bohra. Powstajcy w tkankach dwutlenek wgla laczy si z wod, tworzc kwas wglowy, ktry dysocjuje do protonu i jonu wodo rowglanowego. Nieutlenowana hemoglobina wie protony i transportuje je do puc. W pucach, w wyniku przyczania tlenu, nastpuje uwalnianie protonw, ktre czc si z jonem wodorowg-lanowym tworz kwas wglowy, przeksztacany przez dehydrataze wglanow do dwutlenku wgla usuwanego w procesie oddychania.
pj
charakterystyczn dla tetramerycznej hemo globiny, 7al1?iB[l ffl jnterakcji hem-hem, czyli HCO.-+ H+ kooperatywnoci wizania tlenu. Efektu Boh ra nie obserwuje si w przypadku mioglobi -ny.
co,+
Ryc. 7-14. Tworzenie kwasu wglowego pod wpywem dehydratazy wglanowej i jego dysocja-cja do jonu wodorowglanowego i protonu.
78 / ROZDZIA 7
Rozerwanie wiza poprzecznych podczas przyczania tlenu do hemoglobiny w postaci T dostarcza protonw odpowiedzialnych za efekt Bohra Protonv_odpowiedzialne za elekt Bohra powstaj w wyniku rozerwania \\ i a&jl poprzecznych podczas przyczania tlenu do postaci T, Sa one gwnie uwalniane z atomw N piercieni imidazolowych C-kocowych reszt his-tydyny acuchw P HC3 (146). Uwolnione pmtnny pye ksztac j wodorowglan w kwa" w glo wy, u su wan y p kn m, w n aczyni acF )
z 1,3-bisfosfoglicerynianu, bdcego metabolitem porednim glikolizy. BPG wie si z hemoglobin w stosunku 1 czsteczka BPG na tet-rameryczn czsteczk hemoglobiny, a miejscem wizania jest przestrze midzy 4 podjed-nostkami, znajdujca si w centrum czsteczki hemoglobiny. Rozmiar tej wnki jest odpowiedni dla BPG tylko w przypadku postaci T, tj. wtedy, kiedy przestrze midzy heliksami H acuchw p jest wystarczajco dua. BPG przycza si za pomoc wiza poprzecznych, twofz-ycn si pomidzy atomami tlenu BPG i dodatnio naadowanymi resztami Val NA1 (grupy aminowe N-koricowe), Lys EF6 oraz His H21 acuchw p (ryc. 7-17). BPG stabilizuje
w glowy, u su way p wosowatych pcherzykw nucnych fryc. 7-15). Natomiast podczas odczania tlenu tworzenie wiza poprzeczaych, pjaslaci T hemoglobiny wymaga przyczenia protonw do reszt HC3 acuchw p. oiwnrrer protonw w tkankach uatwia wic tworzenie wiza poprzecznych na skjJteYprotonacji kocowych/reszt Hisw pod-jednostkach p. Odtworzenie wiza poprzecznych sprzyja wiec uwalnianiu ferm z, ufleno'-wanej (postajLKLJiamo.globiny. Uoglniajc, /wikszenic steniajworpntm; powoduje odjacze-nSjttnu.JJOticS^gdy zwikszenie stenia tlenu powoduje odczenie protonw. Zaleno torj-razuje przesunicie krzywej dysocjacji tlenu na prawo w wyniku zwikszenia zawartoci jonw wodorowych (protonw). W centralnej wnce czsteczki nieutlenowanej hemoglobiny 2,3-bisfosfoglicery nia (BPG) tworzy wizanie poprzeczne, stabilizujce struktur T W warunkach niedoboru tlenu w tkankach zwiksza si zawarto 2,3-bisfosfogIicerynianu (BPG) (ryc. 7-16). Zwizek ten tworzy si
Ryc. 7-17. Sposb wizania 2,3-bisfosfogltcery-nianu z nieutlenowan hemoglobin czowieka. BPG oddziauje z 3 dodatnio naadowanymi grupami kadego z acuchw fi. (Reprodukcja za zgod z: Arnone A,: X-ray diffraction siudy of binding 2,3-diphosphoglycerate to human deoxyhemoglo-bin. Natur 1972; 237:146).
Struktura 2,3-bisfosfoglicerynianu
o-op
\\
Ryc. 7-16. (BPG).
wic posta T lub nieutlenowa n posta hemoglobiny przez tworzenie wiza poprzeczn ych w obrbie acuchw p oraz dostarcza dodatkowe wizania poprzeczne , ktre musz ulec zerwaniu przy przechodze niu postaci T w posta R. Wizani e BPG z hemoglobi n podow jest znacznie sabsze ni z hemoglobi n Judzi dorosych, poniewa zamiast His reszt H2T w acuchu y hemoglobi ny podowej jest seryna, ktra nie tworzy wiza poprzeczn ych z BPG.
BIAKA: MIOGLOBINA I HEMOGLOBINA / 79
BPG ma wic mniejszy wpyw na stabilizacj formy T w przypadku hemoglobiny podowej, co powoduje jej wiksze w porwnaniu z hemoglobin ludzi dorosych, powinowactwo do tlenu. Przejcie postaci T w posta R hemoglobiny i odwrotnie jest wyzwalane przez ruch elaza do wewntrz i na zewntrz paszczyzny ukadu por-firynowego. Przejcie to jest uruchamiane przez czynniki oddziaujce przestrzennie i elektro-statycznie przy nakadzie energii ok. 12 560 J/mol (3000 cal/mol). Niewielka zmiana pozycji Fe2+ w stosunku do paszczyzny ukadu po-rfirynowego indukuje wic znaczne zmiany w konformacji hemoglobiny, wpywajc decydujco na jej funkcje biologiczn w odpowiedzi na sygnay rodowiska. ZIDENTYFIKOWANO KILKASET MUTANTW HEMOGLOBINY WWIKSZOCI NIE OBJAWIAJCYCH ZABURZE FUNKCJI Mutacje genw kodujcych acuchy ot lub P mog wpywa na biologiczn funkcje hemoglobin. Poniej opisano kilka, spord kilkuset znanych (w wikszoci agodnych), mutantw hemoglobin Judzkich o zmienionej funkcji biologicznej, Stan, w ktrym w wyniku mutacji nastpuje zaburzenie funkcji biologicznej hemoglobiny okrela si mianem hemoglobino-pata. W hemoglobinach typu M proksymalna lub dystalna reszta histydyny w podjednostkach ot lub ji jest zastpiona reszt tyrozyny Zastpienie proksymalnej lub dystalnej histydyny reszt tyrozyny przyczynia si do stabilizacji elaza hemowego w formie Fe 3+, na skutek tworzenia przez niego trwaego poczenia z anionem fenolanowym Tyr. Obecno hemu w formie elazowej nie wicej 02 powoduje met hemoglobinemi. W przypadku wariantw hemoglobin M dotyczcych acuchw a obserwuje si przesunicie rwnowagi przejcia R-T w kierunku formy T, zmniejszenie powniowaTwa do tlemi i zniesienie efektu Boh-raTNatomiast w przypadku wariantw dotyczcych acuchw P efekt Bohra jest zachowany, poniewa nie ulega zakceniu przejcie R-T. Mutacje, ktre sprzyjaj tworzeniu si po staci R charakteryzuj si zwikszeniem powino-
wactwa do tlenu (np. hemoglobina Chesapeake). W hemoglobinie Sj^szt Dostarczanie wskutek tego zbyt maej iloci l do tkanek powoduje hipoksje, ktra pro tlenu wadzi do policytemii (zwikszenie liczby erytrocytw). gl j^s glutaminowego w pozycji 6 acucha {> jest zastpiona reszt waliny Hemoglobina S powstaje w wyniku zastpie-uiLCjju A2 ()p\ tj, reszty 6 w acuchu (3 przez âl. Reszta A2 (Glu lub Val) znajduje si na powierzchni czsteczki, odpowiadajc za jej kontakty z wod. Zastpienie polarnego kwasu glutaminowego niepolarn walin powoduje powstanie na powierzchni acucha P lepkich miejsc". Lepkie miejsca" wystpuj zarwno w utlenowanej, jak i nieutlenowanej postaci hemoglobiny S; nie ma ich n^
glojbinic: AJJ koTei na powierzchni hemoglobiny nieutlenowanej wystpuj miejsca komplementarne do lepkich miejsc". S one niedostpne w hemoglobinie utlenowanej (ryc. 7-18). IMieutlenowana hemoglobina S moe tworzy wkna, ktre znieksztacaj erytrocyty Lepkie miejsca" nieutlenowanej hemoglobinySmog czy si z miejscami komplementarnymi innej czsteczki nieutlenowanej hemoglobiny. Oddziaywania te powoduj polimeryzacj nieutlenowanej hemoglobiny S, w wyniku czego powstaj dugie, wytrcajce si agregaty znieksztacajce erytrocyty (erytrocyty przybieraj ksztat sierpowaty), odpowiedzialne za ich li i inne objawy kliniczne. Utrzymanie hemoglobiny S w postaci utlenowanej lub zmniejszenie do minimum jej stenia w postaci nie utlenowanej zapobiegaoby tworzeniu si polimerw, a tym samym sierpowatoci krwinek. Jest bowiem wiadomo, e polimeryzacji ulega posta T hemoglobiny S. Interesujcy, chocia nie do zastosowania terapeutycznego, jest fakt, e forma elazowa hemoglobiny S (methemoglobi-na S) nie tworzy polimerw. Podobnie bowiem jak w przypadku methemoglobiny A, jon elazowy pozostaje w paszczynie ukadu porfiryno-wego, stabilizujc struktur R hemoglobiny. Chocia nieutlenowana hemoglobina A zawiera miejsca komplementarne do lepkich miejsc" wystpujcych w utlenowanej i nieutlenowanej hemoglobinie S, to jej przyczenie do hemoglobiny S uniemoliwia dalsze wy-dhianie polimerw na skutek braku na jej
80 / ROZDZIA 7
Utle owa na A Nieutlenowana A U tlen owa na S Nieutlenowana S
a. a
Nieutlenowana A Nieutlenowana S
Ryc. 7-18. Schemat przedstawiajcy lepkie miejsca" (A) w hemoglobinie S i ich receptory" wnieutlenowanej hemoglobinie A i S. Komplementarno oddziaujcych powierzchni powoduje faczenie si n te utle owa n ej hemoglobiny S w polimery. Wyduanie polimerw przerywa nieuttenowana hemoglobina A nie zawierajca iepkich miejsc". (Zmodyfikowana i reprodukowana za zgod z: Stryer L: Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981).
powierzchni iepkich miejsc" sprzyjajcych dalszemu wizaniu (ryc. 7-18). Przyczenie nieu-tlenowanej hemoglobiny A do hemoglobiny
S zarwno w formie R, jak i T stanowi barier do dalszej polimeryzacji.
l l l l l l l l l l l
W,_wyniku agregacji nieutlenowanej hemoglobiny S tworz si wkna o helikalnej strukturze, w ktrych kada czsteczka hemoglobiny oddziauje z 4 przylegajcymi czsteczkami (ryc. 7-19). Wkna te deformuj erytrocyty tak, e przybieraj olTEstat sieTpowaty (ryc. 7-20). Krwinki te wykazuj zwikszon podatno do hemolizy w czasie przechodzenia przez zatoki ledzionowe. Talasernie s niedokrwistociamj charakteryzujcymi si upoledzeniem syntezy acuchw cc lub p hemoglobiny W talasemiach zmniejsza si synteza acuchw a (a-talasemie) lub acuchw p (fi-ta-lasemie) hemoglobiny. Wywouje to czsto gron w skutkach niedokrwisto. Wyniki bada ostatnich lat wniosy duy wkad do naszej wiedzy o molekularnych mechanizmach odpowiedzialnych za talasernie.
6,2 nm
RyC-7-19, Proponowana helikaIna struktura wkna utworzonego w wyniku agregacji nieutlenowa-nej hemoglobiny S, (Reprodukcja za zgod z: Maugh T. II: A new understanding of sickle celi emerges. Science 1981; 211:265, Copyright 1981 by the American Associatiort for the Advancement of Science).
BIAKA: MI0GL0B1NA I HEMOGLOBINA / 81
Ryc. 7-20. Obraz erytrocytu prawidowego (A) oraz sierpowatego (B)w skaningowym mikroskopie elektronowym. Obserwowane rnice strukturalne s wynikiem zmiany w obrbie acuchw (i bdcej skutkiem mutacji punktowej w DNA. Zamiana T na A powoduje, e w acuchu {J zamiast kwasu glutaminowego znajduje si walina.
PIMIENNICTWO
Bunn HF, Forget BG: Hemoglobin: Molecular, Gene-tic, and Ciinical Aspects, Saunders, 1986. Dickerson RE, Geis I: Hemoglobin. Benjamin/Cum-mjngs, 1983. Embury SH: The ciinical pathology of sickle-ceil disease. Anmt Rcv Med 1986;37:36[. Embury SH, Scharf SJ, Saiki RK, Gholson MA, Golbus M, Arnheim N, Erlich HA: Rapid prenatal diagnosis of sickle celi anemia by a new method of DNA analysis. New Engl J Med 1987;316:56. Fermi G, Perutz MF, Shaanan B, Fourme R: The crystal structure of hunian deoxyhemoglobin at 1.74 angstrom resolution. J Mol Biol I984;175: 159.
Friedman JM: Structure, dynamics, and reactivity in hemoglobin. Science 1985;228:1273. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, MuBis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N: Enzymatic amplification of beta-globin genomic: seuences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science, 1985;230:1350. Schacter L, Wartti JA, Gordon EM, Prasad A, Klein BL: Altered araount and activity of superoxide dismutase in sickle celi anemia. FASEB J 198S;2:237. Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG: The hemoglobinopathies. In The Metabolk Basis of InheritedDisease, 6th Ed. Serwer CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D (editors). McGraw-Hill, p. 2281, 1989.
6 Biochemia
Enzymy: waciwoci oglne

WPROWADZENIE
Katalizatory przyspieszaj reakcje chemiczne. Podczas reakcji ulegaj one zmianom fizycznym, ale po ich zakoczeniu powracaj do stanu pierwotnego. Chocia s znane przypadki katalizy przez czsteczki RNA, prawie wszystkie enzymy s katalizatorami biakowymi. Wikszo reakcji biochemicznych zachodziaby bardzo wolno, gdyby nie byy one katalizowane przez enzymy. W przeciwiestwie do katalizatorw niebia kowych (H+, OH , jony metali), kady enzym katalizuje niewielk liczb reakcji, czsto tylko jedn. Enzymy s wic swoistymi katalizatorami danych reakcji. W zasadzie wszystkie reakcje biochemiczne s katalizowane przez enzymy.
SYSTEM MIDZYNARODOWEJ UNII BIOCHEMICZNEJ (IUB) KLASYFIKUJE ENZYMY WEDUG TYPU I MECHANIZMU REAKCJI
Pocztkowo nazwy enzymw tworzono przez dodanie koc wki -aza do nazwy substratw, na ktre one dziaaj. Enzymy, ktre hydro-lizuj skrobi (gr.: amyori) nazywano amylaza-mi, rozkadajce tuszcze (gr.: lipos) lipazami, a~nydrolizujce biaka -. proteinazarrjUniei enzymom, ktre katalizuj podobne reakcje, dawano nazwy wskazujce na typ katalizowanej reakcji chemicznej. Okrelano je jako dehyd-rogenzyjOksydazY^dekrbok^ylazy, acylazy itd". System nomenklaturowy podany przez Midzynarodow Uni Biochemiczn (IUB), mimo e jest zoony, jest niedwuznaczny. Jego podstawow zasad jest to, e nazewnictwo i klasyfikacja enzymw na podstawie typu reakcji chemicznej i mechanizmu reakcji moe integrowa informacj z rnych obszarw metabolizmu. Gwne zasady systemu IUB s nastpujce: 1. Reakcje i katalizujce je enzymy tworz 6 klas, a kada z nich ma 413 podklas. 2. Nazwa enzymu skada si z 2 czci. Pierwsza, zakoczona na -aza, wskazuje na typ katalizowanej reakcji, druga okrela substrat lub substraty. 3. Dodatkowa informacja, jeli jest potrzebna do wyjanienia reakcji, moe by podana w na wiasach; np. enzym katalizujcy reakcj L-jabczan + NAD+ = pirogronian -I- COj-l+ NADH + H+ oznacza si 1.1,1.37 L-jab czan: NAD+ oksydoreduktaza (dekarboksylujca).
Enzymy czyni moliwym ycie na Ziemi i std cz wiele dziedzin nauk biomedycznych. Pewne choroby (wrodzone wady metabolizmu) s spowodowane genetycznie uwarunkowanymi nieprawidowociami w syntezie enzymw. Gdy komrki s uszkodzone (np. przez ograniczenie dopywu krwi lub przez zapalenie), wwczas pewne enzymy przechodz do osocza. Pomiar aktywnoci takich enzymw w osoczu staje sie integraln czci diagnozowania wanych zaburze (np. zawa serca). Enzymologia diagnostyczna jest dziedzin medycyny obejmujc wykorzystanie enzymw w diagnostyce. Enzymy mog by rwnie uyte w leczeniu.
ENZYMY: WACIWOCI OGLNE / 83
4. Kady enzym ma numer kodu (EC), ktry charakteryzuje typ reakcji, czyli klas (pierwszy czon), podklas (drugi czon) i pod-podklas (trzeci czon). Czwarty czon wskazuje na nazw okrelonego enzymu. EC 2.7.1.1 oznacza wic klas 2 (transferaza), podklas 7 (przenoszenie fosforanu), pod-podklas 1 (alkohol jako akceptor fosforanu). Ostatnia cyfra wskazuje heksoki-naz, czyli 6-fosfotransferaza ATP: D-heksoza, enzym katalizujcy przeniesienie fosforanu z ATP na grup hydroksylow przy 6 wglu glukozy.
WIELE ENZYMW DO AKTYWNOCI KATALITYCZNEJ WYMAGA KOENZYMU
r
H,C
o
L-Mlec zan
O Plrogronlan
NAD*
+
NADH* + H+
Ryc. 8- 1. Dziaanie NAD jako kosubstratu w reakcji o ksy do red u kej i.
Wiele enzym w wymaga swoistej, termosta-bilnej, maoczsteczkowej molekuy organicznej zwanej koenzymem, Holoenzym (peen ukad katalityczny) skada si z apoenzymu (cz biakowa) i przyczonego koenzymu. Koenzym moe przycza si do apoenzymu kowalencyjnie lub niekowalencyjnie. Termin grupa prostetyczna" oznacza kowalencyjnie przyczony koenzym. Reakcje, ktre wymagaj koenzymw, obejmuj reakcje oksydacyjno-redukcyjne, reakcje przenoszenia grup i izomeryzacji oraz reakcje prowadzce do tworzenia wiza kowalencyjnych (IUB, klasy I, 2, 5 i 6). Reakcje lityczne, cznie z reakcjami hydrolitycznymi katalizowanymi przez enzymy trawienne, nie wymagaj koenzymw.
cujcego beztlenowo do przemiany pirogronia-nu w mleczan tkwi nie w samym pirogronianie lub mleczanie. Reakcja suy gwnie do utlenienia NADH do NAD +. Bez NAD+ glikoliza nie moe dalej przebiega i ustaje beztlenowa synteza ATP (a tym samym praca). W warunkach beztlenowych redukcja pirogronianu do mleczanu suy do ponownego utlenienia NADH i umoliwia biosyntez ATP. Inne reakcje mog spenia rwnie dobrze tak sam funkcj. Na przykad w bakteriach lub drodach, rosncych w warunkach beztlenowych, metabolity pochodzce z pirogronianu su jako utleniacze dla NADH, przy czym same si redukuj (tab. 8-1).
T abela 8-1. Mechanizmy beztlenowej regeneracji NAD+
Utleniacz
Pirg ronian
Produkt zredukowany
Mleczan
Fo rma ycia Minie, bakte rie fermentacji mlekowej Drode
KOENZYM MOE BY ROZPATRYWANY JAKO DRUGI SUBSTRAT

Koenzym moe by rozpatrywany jako drugi substrat, tj. kosubstrat, z 2 powodw. Po pierwsze, chemiczne zmiany w koenzymie dokadnie rwnowa zmiany zachodzce w substracie. Na przykad w reakcjach oksydacyjno-redukcyjnych, gdy 1 czsteczka substratu utlenia si, wwczas 1 czsteczka koenzymu ulega redukcji (ryc. 8-1). Podobnie w reakcjach transaminacji fosforan pirydoksalu dziaa jako drugi substrat w 2 kolejnych reakcjach oraz jako przenonik w przekazywaniu grupy aminowej na rne a-ketokwasy. Drugim powodem podkrelenia roli koenzymu jest to, e reakcja zjego udziaem moe mie wiksze podstawowe znaczenie fizjologiczne. Na przykad zdolno minia pra -
Aldehyd octowy Alkohol etylowy
Fosfodihydrok-s a-Glicerofosfo- Escherichia coli ran yaceton Fruktoza Mannitol Bakterie fermentacji pseu-domleko wej
Koenzymy dziaaj jako czynniki przenoszce okrelone grupy funkcyjne
Biochemiczne reakcje przenoszenia grup typu:

D-G+A=A-G+ D
w ktrych funkcyjna grupa G jest przenoszona z czsteczki donora D G na czsteczk akceptora A, zazwyczaj wykorzystuj koenzym albo
84 / ROZDZIA 8
jako ostateczny akceptor (np. w reakcjach od-wodorowania), albo jako poredni przenonik grup (np. reakcje transaminacji). Schemat ilustruje drug koncepcje: AG DG CoE
Ct
nami d. fiamina. ryboflawina i kwas pantotenowy
Mimo e sugeruje to tworzenie 1 kompleksu CoEG w cigu caej reakcji, w gr moe wchodzi w danej reakcji tworzenie kilku porednich CoEG kompleksw (np. transami-nacja). Gdy przenoszona grup jest wodr, wwczas przyjto przedstawia tylko lew stron po-low reakcji":
DH D XCoE CoEH
s wanymi skadnikami koenzymw reakcji biologicznego utleniania i redukcji, a kwas foliowy i koenzymy kobamidowe bior udzia w przemianach reszt jednowgl owych. Wiele koenzymw zawiera adenin, ryboz, fosforan i s one pochodnymi monofosforanu adenozyny (AMP). Przykady obejmuj NAD + i NADP+ (ryc. 8-2).
To, e reakcja ta przedstawia tylko szczeglny przypadek oglnego transferu grupy H ilustruj reakcje zachodzce w nienaruszonych komrkach (tab. 8-1). Mona je zapisa nastpujco: CoE A H DH Koenzymy mog by klasyfikowane zalenie od grupy, przeniesienie ktrej one uatwiaj Na podstawie powyszej koncepcji mona sklasyfikowa koenzymy nastpujco: Koenzymy przenoszce inne grupy ni H Fosforany cukrw CoASH Pirofosforan tiaminy Fosforan pirydoksalu Koenzymy folia nowe Biotyna Koenzymy kobamidowe (B1;) Kwas liponowy Koenzymy przenoszce H NAD+, NADP+ FMN, FAD Kwas liponowy Koenzym Q Wiele koenzymw jest pochodnymi witamin B i monofosforanu adenozyny Witaminy grupy B tworz cz struktury wielu koenzym w. Witaminy grupy B: nikoty-
NHj + + +
Ryc. 8-2. NAD(P) . W NAD , R = H; w NADP , R="OPO1".
Skoro substraty cz si z enzymami w 3 punktach, enzymy dziaaj jako stereoswoiste katalizatory Wikszo substratw tworzy z enzymami co najmniej 3 wizania. Takie 3-punktowe dol* czenie" moe nadawa czsteczce, skdind symetrycznej, asymetri. Na rycinie 8-3 przedstawiono czsteczk substratu w postaci atomu wgla z 3 rnymi grupami, ktre mog si przyczy w 3 punktach do miejsca enzymu. Jeeli miejsce na enzymie jest dostpne tylko z jednej strony i mog ze sob reagowa tylko atomy i miejsca komplementarne (uzasadnione przypuszczenia dla istotnych enzymw), czsteczka substratu moe si przyczy do enzymu tylko w jeden sposb. Reakcja moe ogranicza si do atomw zwizanych w miejscach 1 i 2,
ENZY MY : WACIWOCI OGLNE / 86
Wikszo enzymw wykazuje absolutn swoisto optyczn dla przynajmniej czci swoistych substratw Z wyjtkiem epimeraz (racemaz), ktre katalizuj wewntrzne przeksztacenie izomerw
optycznych, oglnie enzymy wykazuj absolutn swoisto optyczn dla przynajmniej czci czs Miejsce enzym etyczne Ryc. 8- 3. Schemat trzypunktowego przyczenia si substratu do paskiego miejsca aktywnego en zymu.
teczki substratu. Dlatego enzymy glikolizy i bezporedniej przemiany tlenowej katalizuj przeksztacenie fosfocukrw szeregu D -, a nie L. Z kilkoma wyjtkami (np. oksyd aza D-amino-kwasu nerki), wikszo enzymw ssakw dziaa na L-izomery aminokwasw.
Swoisto optyczna enzymw moe rozciga si na cz lub cao czsteczki substratu.
nawet jeli atomy 1 i 3 s takie same. Jeli wyobrazimy sobie obrt czsteczki substratu w przestrzeni, to wida, e istnieje tylko jedno pooenie substratu, w ktrym moe on czy si z 3 punktami miejsca planarnego enzymu. W wyniku tego atomy 1 i 3, chocia identyczne, po poczeniu substratu z enzymem staj si rne. Zmiana chemiczna moe obejmowa atom 1, ale nie atom 3 i odwrotnie. To moe wyjani, dlaczego katalizowana przez enzym redukcja optycznie nieaktywnej czsteczki pirogronianu prowadzi do L-, a nie D, L-mle-czaffu. WIKSZO ENZYMW KAT ALIZUJE ALBO SWOIST REAKCJ, ALBO, W PEWNYCH PRZYPADKACH, SWOISTY TYP REAKCJI
Zdolno enzymu do katalizowania tylko 1 swoistej reakcji i zasadniczo adnej innej, by moe jest jego najwaniejsz waciwoci.
Glikozydazy s przykadem obu tych przypadkw. Te enzymy, ktre katalizuj hydroliz wiza glikozydowych midzy cukrami a al koholami, s wysoce swoiste dla czci cukrowej i dla typu wizania (a lub P), ale s stosunkowo nieswoiste dla aglikonu (cz alkoholowa). Enzymy wykazuj swoisto wyszego rzdu dla typu reakcji, ktre one katalizuj Enzymy lityczne dziaaj na okrelone ugrupowania chemiczne, np. glikozydazy na gliko-zydy, pepsyna i trypsyna na wizania pep-tydowe, a esterazy na estry. Ten fakt tumaczy moliwoci rozkadu znacznej iloci rnych substratw peptydowych przez nieliczne tylko enzymy trawienne. Wiele proteaz katalizuje rwnie hydroliz estrw. Chocia ten rodzaj reakcji ma ograniczone znaczenie fizjologiczne, uycie estrw, jako substratw syntetycznych znacznie si przyczynio do poznania mechanizmu d ziaania proteaz. Pewne enzymy lityczne wykazuj wiksz swoisto. Chymotrypsyna hydrolizuje wiza nia peptydowe, w ktrych grupa karboksylowa pochodzi od aminokwasw aromatycznych: fe-nyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu. Karbo-ksypeptydazy usuwaj po 1 aminokwasie od koca karboksylowego, a aminopeptydazy od koca aminowego acucha polipeptydo-wego. Chocia niektre oksydoreduktazy wykorzystuj albo NAD+ lub NADP+ jako akceptor elektronu, wikszo z nich uywa przede wszystkim jednego lub drugiego. Mwic oglnie,
oksydoreduktazy biorce udzia w procesach biosyntezy u ssakw (np. synteza kwasu tusz czowego lub sterolu) wykorzystuj jako substan -
Szybko procesw metabolicznych moe by zatem regulowana przez zmiany w katalitycznej sprawnoci odpowiednich enzymw, Niemniej wikszo enzymw katalizuje ten sam typ reakcji (przenoszenie fosforanu, utlenianie i redukcja, itp.) dla kilku strukturalnie pokrewnych substratw. Reakcje z pokrewnymi sub-stratami zachodz wwczas, gdy substraty te wystpuj w duym steniu. To, czy w ywych organizmach bd zachodziy wszystkie z moliwych reakcji, zaley od wzgldnych ste alternatywnych substratw w komrce i od wzgldnego powinowactwa enzymu do tych substratw.
86 / ROZDZIA 8 cj redukujc NADPH, natomiast oksydo-reduktazy dziaajce w procesach degradacji (np. glikoliza, utlenianie kwasu tuszczowego) wykorzystuj NAD+ jako substancje utlenia-
1. 0
0. 8
A
i
I
KATALITYCZNA AKTYWNO ENZYMU JEST WYBIRCZ I CZU PRB DO ICH DETEKCJI Maa zawarto enzymw w komrkach komplikuje pomiar ich iloci w wycigach tkankowych lub w pynach ustrojowych. Szczliwie aktywno katalityczna enzymu stanowi czu i swoist prb do ich pomiaru. Aby zmierzy ilo enzymu w prbce ekstraktu tkankowego lub innego pynu biologicznego, oznacza si szybko reakcji katalizowanej przez enzym obecny w prbce. W odpowiednich warunkach oznaczana szybko
reakcji jest proporcjonalna do iloci obecnego
0. 6 0. 4 0. 2
0
1 \
NADH / \
V
200
i
\ ____
NAD
400
250
300 350 Dugo fali (nm)
enzymu. Poniewa trudne jest okrelenie iloci czsteczek lub masy obecnego enzymu, wyniki s wyraone w jednostkach enzymatycznych. Wzgldne iloci enzymu w rnych ekstraktach mog by wwczas porwnywane. Jednostki enzymu wyraa si w mikromolach (umol; 10 6 mol), nanomolach (nmol; 10~9 mol) lub pikomolacb. (pmol; 10 1Z mol) reagujcego substratu Jub wytwarzanego produktu na minut. Dehydrogenazy zalene od NAD' mog by analizowane przez pomiar zmiany absorbancji przy 340 nm, spowodowanej i nterkon wersj NAD+ i NADH W reakcjach z udziaem NAD+ lub NADP+ (dehydrogenazy) wykorzystuje si waciwo absorbowania wiata o dugoci fali 340 nm przez NADH lub NADPH (ale nie NAD + lub NADP+) (ryc. 8-4). Gdy NADH jest utleniany do NAD+ (lub odwrotnie) zmienia si gsto optyczna (OD) przy 340 nm. W okrelonych warunkach szybko zmiany w OD zaley bezporednio od aktywnoci enzymu (ryc. 8-5). Krzyw kalibracyjn (ryc. 8-6) wykrela si, oznaczajc zmiany OD wzgldem iloci dodanego enzymu (ryc. 8-5). Ilo enzymu obecnego w nieznanym roztworze mona obliczy znajc szybko zmian w OD przy 340 nm.
Ryc. 8- 4. Widma absorpcji NA D ' i NADH Gs to dotyczy roztworu o steniu 44 mg/l w kuwe cie 1 cm. NADP + i NAOPH maj widma analogicz ne o dpo wiednio do widm NA D i NADH
0,90 2,0 t,0 Minuty Ryc. 8-5. Oznaczenie 0,85 -
0,80 L dehydrogenazy zalenej od NADH i NADPH. Obserwuje si wielko zmiany OD (gstoci optycznej) przy 340 nm na skutek przejcia koenzymu zredukowanego w koenzym utlenio ny. Do kuwety s dodawane: utlenio ny substrai (S), zredukowany koenzym (NADH) i bu for. Nastpnie przepuszcza si wiato o dugoci 340 nm. Pocztko wo OD jest dua, po niewa NA DH { lub NA DP H) abso rb uje wiat o , przy 340 nm. Po dodaniu 0,025 0,2 ml standardowego roztworu enzymu OD si zmnie jsza.

0.20
0 ,10 r
determinuj okrelon metod oblicze. Czsto dogodnie jest poczy produkt reakcji z dehydrogenaza, dla ktrej ten produkt jest substratem (ryc. 8-7). CZYSTE ENZYMY S KONIECZNE DO ZROZUMIENIA ICH STRUKTURY, FUNKCJI, MECHANIZMU REAKCJI I REGULACJI ICH AKTYWNOCI Wiedza o reakcjach i chemicznych zwizkach porednich w szlakach metabolicznych i mechanizmach regulacyjnych, ktre dziaaj na poziomie katalizy, pochodzi w duym stopniu z bada oczyszczonych enzymw. Wiarygodna informacja dotyczca kinetyki, k o fakt o rw, miejsc aktywnych, struktury i mechanizmu dziaania take wymaga bardzo oczyszczonych enzymw. Efektywny przepis oczyszczania enzymu, z dobr wydajnoci na kadym etapie, zwiksza swoist aktywno enzymu W tabeli 8-2 przedstawiono przebieg typowego oczyszczania enzymu wtroby, z dobr wydajnoci i 490-krotnym oczyszczaniem cakowitym. Naley zwrci uwag, jak oblicza si swoist aktywno i odzysk pocztkowej ak tywnoci. Celem jest osignicie maksymalnej swoistej aktywnoci (jednostki enzymu na mili gram biaka) z moliwie najlepszym odzyskiem pocztkowej aktywnoci. Oczyszczanie enzymu polega na wyizolowaniu swoistego enzymu z surowego ekstraktu komrkowego, zawierajcego wiele innych komponentw. Mae czsteczki mona usun przez dializ lub filtracj elow, kwasy nukleinowe przez strcanie antybiotykiem, np. streptomycyn, itd. Najwikszym problemem jest wydzielanie podanego enzymu z tysicy chemicznie i fizycznie podobnych biaek. Klasyczne metody oczyszczania enzymw obejmuj strcanie wybircze, chromatografi jonowymienn i filtracj elow Uyteczne, klasyczne techniki oczyszczania obejmuj strcanie solami o rnych steniach (gwnie siarczanem amonu i siarczanem sodu) lub rozpuszczalnikami (aceton lub etanol), rnicow denaturacj ciepln iub w wyniku zmian pH,1 rnicowe wirowanie, filtracj elow i ele-
0,05 0,10 0,15 Roztwr enzymu (ml)
Ryc. 8-6. Krzywa kalibracyjna do analizy enzymatycznej. Nachylenia prostych z ryc. 8-5 s wykre lone wzgldem iloci enzymu.
Ilociowa analiza wielu enzymw moe by uproszczona, sprzgajc reakcje przez nie katalizowane z reakcj katalizowan przez dehydrogenaz zalen od NAD W powyszym przykadzie, aby okreli aktywno enzymu, oznaczano szybko tworzenia produktu (NADH). Enzymy inne ni dehy-drogenazy mog by take badane przez pomiar szybkoci pojawiania si produktu (lub, rzadziej, szybkoci zanikania substratu). Fizyko chemiczne waciwoci produktu lub substratu
Glukoza
[HEKSOKINAZA I
*ADP, Mi Glu kozo6-fosforan , NADP* DEHYDROGENAZA GLUKO2O-6.FOSFORANOWA NAD P H + H 6-Fosfool ukonolakton
Ryc. 8- 7. Oznaczanie aktywnoci heksokinazy metod sprzon". Reakcja jest sprzona z reakcj katalizowan przez dehydrogenaz glukozo-6--fosforanow. Dehydrogenaza g I u kozo - 6 f osf ora -nowa, glukoza, ATP, Mg2 "* i NADP + s dodawane w nadmiarze. Ilo obecnej heksokinazy determinuje szybko caej sprzonej reakcji i przede wszystkim szybko tworzenia NADPH, ktra moe by mierzo na przy 340 nm.
88 / ROZDZIA 8 Tabela 8-2, Schemat typowego oczyszczania enzymu Cakowita Frakcja enzymu Surowy homogenat wtroby Supernatant 100 000xff Osad 4050% {NH4)2SO4 Osad 2035% aceton Kolumna DEAE, frakcja 80110 Osad 4348% (NH4)2SO4 Pierwsze krysztay Rekrystalizacja Biako cakowite (nig) 10 000 8 000 1 500 250 29 20 12 10 Aktywno Cakowity odzysk (%) (100) 98 90 60 58 52 50 49
aktywno
(pU) 100 000 98 000 90 000 60 000 58 000 52 000 50 000 49 000
waciwa
(pU/mg) 10 12,2 60 240 2 000 2 600 4 160 4 900
ktroforez. Niezwykle skuteczn do wydajnego i szybkiego oczyszczenia enzymw okazaa si selektywna adsorpcja i elucja biaek z anionowego jonitu celulozowego dietyloaminoetylo (DEAE) celulozy i kationowego jonitu kar-boksymetylocelulozy (CMC). Szeroko stosowany jest rozdzia biaek na sitach molekularnych, takich jak Sephadex, ktre rozdzielaj biaka na podstawie ich wielkoci. Metody te s wzgldnie nieselektywne (z wyjtkiem przypadkw stosowania kombinacji kilku takich metod), poniewa nie rozdzielaj one pojedyn czego biaka od wszystkich innych biaek. Jest to lepiej osigane za pomoc chromatografii powinowactwa. Techniki chromatografii powinowactwa wykorzystuj unieruchomione Ugandy, ktre reaguj ze swoistymi regionami enzymu Uderzajc cech chromatografii powinowactwa jest jej zdolno do wybirczego usuwania jednego okrelonego biaka lub, najwyej, maej liczby poszczeglnych biaek z ich mieszaniny. Technika wykorzystuje unieruchomiony ligand swoicie reagujcy z enzymem, ktry zamierzamy oczyci. Gdy mieszanina biaek jest poddana dziaaniu tego unieruchomionego ligandu, wwczas biakami, ktre przycz si, s te, ktre silnie z nim reaguj. Niepodane biako wypywa z kolumny i jest odrzucane. Badane biako jest wwczas eluowane z unieruchomionego ligandu. na og za pomoc duych ste soli lub przeprowadzajc ligand w posta rozpuszczaln. Oczyszczania, dokonane za pomoc techniki chromatografii powinowactwa, s imponujce, czsto przewyszaj to, co jest moliwe przez sukcesywne stosowanie wielu
technik klasycznych. Preferowanymi Ugandami s substraty lub pochodne koenzymw kowa-Jencyjnie przyczone do nonika, takiego jak Sephadex. Przyczenie moe by bezporednie lub przez molekularny czni k, zawierajcy 38 atomw wgla. Jeeli sposb przyczenia ligandu uniemoliwia jego zdolno do interakcji z enzymem, to mog pojawi si trudnoci, ktrych mona unikn, uywajc czsteczek cznikowych. Uycie hydrofobowego Mnke-ra" moe jednak komplikowa rozdzia przez wprowadzenie elementu chromatografii hydrofobowej (p. poniej). Przykady udanej chroma tografii powinowactwa obejmuj oczyszczanie wielu rn ych deh ydro genaz na noniku z NAD+. Chocia wiele dehydrogenaz moe si przycza i eluowa wsplnie, gdy kolumn poddaje si dziaaniu rozpuszczonego NAD +, to kolejne uycie kolumn, raczej z substratem (ni koenzymem) lub elucja kolumny za pomo c usuwajcej mieszaniny trjskadnikowej (ang. abortive ternary mixture) w wielu przypadkach umoliwia uzyskanie czystego enzymu. Chromatografia z barwnikiem jako ligandem i chromatografia hydrofobowa wykorzystuj zasady analogiczne do zasad chromatografii powinowactwa Chromatografia z barwnikiem jako ligandem na nonikach, takich jak bkit, ziele lub czerwie Sepharose i chromatografia z ligan dem hydrofobowym na noniku, takim jak oktyi- lub fenyl-Sepharose s technikami cile spokrewnionymi z chromatografi powinowactwa. Pierwsza wykorzystuje jako unieruchomiony ligand barwnik organiczny, ktry suy jako analog substratu, koenzymu lub allosterycz-nego efektora. Elucja jest przeprowadzona za
ENZYMY-. WACIWOCI OGLNE / 89
pomoc gradientu stenia soli. W chromato grafii z ligandem hydrofobowym, alkilowy lub arylowy wglowodr jest przyczony do nonika, takiego jak Sephadex. Zatrzymywanie biaek na noniku obejmuje hydrofobowe interakcje midzy acuchem alkilowym a regionami hydrofobowymi biaka. Biaka s nanoszone w roztworach, ktre zawieraj due stenia soH (np. (NH4)2SO4) i s eluowane przy zmniejszajcym si gradiencie stenia tej samej soli.
Elektroforeza w elu poiakryoamidowym wykrywa zanieczyszczenia w preparatach enzymw
Umiejscowienie poszczeglnego enzymu w tkance lub komrce, w stosunkowo nie zmienionym stanie, jest czsto dokonywane za pomoc metod histochemicznych (histoenzy-mologia). Na cienkie (210 um) zamroone skrawki tkanki dziaa si substratem dla odpowiedniego enzymu. W miejscu, w ktrym znajduje si enzym, powstaje produkt reakcji przez niego katalizowanej. Jeeli produkt jest barwny i nierozpuszczalny, to pozostaje on w miejscu powstania i umiejscawia enzym. Histoenzymologia daje obraz wzgldnie fizjologicznego rozmieszczenia enzymw.
IZOENZYMY S FIZYCZNIE ODMIE NNY MI FORMAMI TEJ SAMEJ AKTYWNOCI KATALITYCZNEJ
Homogenno biaka jest najlepiej oceniana przez elektroforez w elu poiakryoamido wym (PAGE) przeprowadzon w rnych wa runkach. Jeeii naoona jest dostateczna ilo prbki, jednowymiarowa PAGE natywnego biaka ujawni wiksze i mniejsze zanieczyszczenia biakowe. W dwuwymiarowej (O'Far-rell) PAGE w pierwszym wymiarze, ktry zawiera mocznik i gradient pH utrzymywany przez polimeryzowane amfolity, zdenaturowa-ne biaka rozdzielaj sie na zasadzie ich wartoci pl przez zrwnowaenie ich w polu elektrycznym. W drugim wymiarze biaka, po zadziaaniu na nie SDS, rozdzielaj sie na zasadzie wielkoci mas czsteczkowych ich protomerw (jeeli wystpuj).
0 WEWNTRZKOMRKOWYM ROZMIESZCZENIU ENZYMW WNIOSKUJE SI NA PODSTAWIE TECHNIK HISTOCHEMICZNYCH, A TAKE PRZEZ IZOLOWANIE 1 BADANIE ORGANELLI SUBKOMORKOWYCH
W obrbie komrki bardzo wane jest prze strzenne rozmieszczenie i przedziaowo (kom-partmentacja) enzymw, substratw i kofak-torw. Na przykad w komrkach wtroby enzymy glikolizy s umiejscowione w cytoplaz-mie, podczas gdy enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach. Umiejscowienie enzymw w subkomrkowych organellach mo e by badane po frakcjonowaniu homogenatu komrkowego za pomoc wirowania z du szybkoci. Badana jest wwczas zawarto enzymu w kadej frakcji.
Chocia takie terminy, jak dehydrogenaza jabczanowa" lub glukozo-6-fosfataza" wydaj si opisywa pojedyncz jednostk katalityczn, to obejmuj one wszystkie biaka, ktre katalizuj odpowiednio utlenianie ja bczanu do szczawiooctanu lub hydroliz glukozo-6-fosfo-ranu do glukozy i Pr Jeeli np. techniki oczyszczania enzymw byy zastosowane dla dehyd-rogenazy jabczanowej z rnych rde (np. wtroba szczura i Escherichia coli), stao si oczywiste, e chocia dehydrogenaza jabczanowa wtroby szczura i E. coli katalizuje t sam reakcje, ich waciwoci fizyczne i chemiczne wykazuj znaczne rnice. Fizycznie odmienne formy o tej samej aktywnoci katalitycznej mog take wystpowa w rnych tkankach tego samego organizmu, w rnych typach komrek, w subkomrkowych kompartmen -tach lub w organizmie prokariotycznym, takim jak E. coli. To odkrycie wynika z zastosowania metod rozdziau elektroforetycznego do oddzielenia elektroforetycznie odmiennych postaci okrelonej aktywnoci enzymatycznej. Wprawdzie okrelenie izozym" (izoenzym) obejmuje wszystkie powysze przykady fizycznie rnych postaci o danej aktywnoci katalitycznej, w praktyce jednak, a zwaszcza w medycynie klinicznej, izozym" ma bardziej ograniczony sens, okrelajc mianowicie fizycznie odmienne i rozdzielajce si postacie danego enzymu, wystpujce w rnych typach komrek lub kompartmentach subkomrkowych czo wieka. Izoenzymy s powszechne w surowicy i tkankach wszystkich krgowcw, owadw,
90 / ROZDZiA 8
rolin i organizmw jednokomrkowych. Zarwno rodzaj, jak i liczba enzymw jest w rwnym stopniu rna. Znane s izoenzymy szere gu dehydrogenaz, oksydaz, aminotransferaz, fosfataz, transfosforylaz i enzymw proteolitycznych. Rne tkanki mog zawiera rne izoenzymy, a te izoenzymy mog si rni w ich powinowactwie do substratu. Moliwo rozdzielenia i identyfikacji izoenzymw ma znaczenie diagnostyczne Medyczne zainteresowanie izoenzymami byo stymulowane odkryciem, e surowica czowieka zawiera kilka izoenzymw rlehydrngenazy mleczaiiowej, 1 ze ich wzgldne proporcje zmieniaj si znacznie w pewnych stanach chorobowych. Nastpnie opisano, jako wynik choroby, wiele dodatkowych przykadw zmian w proporcjach izoenzymw. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej surowicy mog by ujawnione przez poddanie prbki surowicy elektroforezie, zazwyczaj w pH 8,6, uywajc jako nonika skrobi, agaru lub elu poliakryloamidowego. W tym pH izoenzymy maj rne adunki elektryczne i wdruj do 5 odmiennych obszarw elektroforegramu. Zdolno izoenzymw do katalizowania redukcji barwnikw bezbarwnych do nierozpuszczalnej postaci barwnej wykorzystuje si w celu ich umiejscowienia. W typowym zestawie odczynnikw do wykrycia izoenzymu dehydrogenazy znajduje si: 1. Zredukowany substrat (np. mleczan). 2. Koenzym (NAD+). 3. Barwnik utleniony (np. sl tetrazolowa bkitu nitrowego [NBT]). 4. Zwizek porednio przenoszcy elektrony miedzy NADH a barwnikiem (np. metosiarczan fenazyny [PMS]). 5. Bufor; w razie potrzeby jony aktywujce. Dehydrogenaza mleczan owa katalizuj przeniesienie 2 elektronw f 1 H+ z mleczanu na NAD+ (ryc. 8-8). Reakcja przebiega z dajc si zmierzy szybkoci tylko w obecnoci dehydrogenazy mleczanowej. Po spryskaniu eiektro-foregramu mieszanin odczynnikw testowych i inkubacji w temp. 37C, reakcje przenoszenia elektronw zajd tylko w tych miejscach, w ktrych znajduje si dehydrogenaza mleczanowa (ryc. 8-9). Wzgldne nasilenie barwy prkw mona oceni ilociowo za pomoc fotometru skaningowego (ryc. 8-10). Izoenzym o najwikszym adunku ujemnym okrelono jako Ir
Zredukowany NBT (niebieski formazan) DEHYDflOGENAZA MLECZANOWA H,C
O L-Mleezan
' ------------------------ * V
O Plrngronlan
NAD
NADH + H
Ryc. 8-8. Reakcja dehydrogenazy L-mleczanow ej.
Ryc. 8-9. Wykorzystanie reakcji sprzonych do

Mleczan SH S Pirogronian
NAD*
NADH + H*
Zredukowany PMS
Utleniony PMS
Utleniony NBT (bezbarwny)
oznaczania aktywnoci dehydrogenazy mleczanowej na elektroferogramie.
Izoenzymy s produktami ekspresji cile spokrewnionych genw Enzymy oligomeryczne z rnymi protome-rami mog wystpowa w kilku postaciach. Czsto jedna tkanka wytwarza gwnie jeden protomer, a inna drugi protomer. Jeeli protomery mog si czy w rny sposb, aby utworzy aktywny enzym (np. tetramer), two rz si izoenzymy o tej aktywnoci enzymatycznej. Izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej rni si midzy sob na poziomie struktury czwartorzdowej. Oligomeryczna czsteczka dehydrogenazy mleczanowej (m.cz. 130000) s k a d a s i z 4 p r o t o me r w 2 t y p w H i M (mcz. ok. 34000). Tylko czsteczka tetrameryczna ma aktywno katalityczn. Jeeli uporzdkowanie jest bez znaczenia, to te protomery mog si ze sob czy w nastpujcych 5 kombinacjach: HHHH HtHM
Norma
W troba
Ryc. 8-10.Prawidowy i patologiczny wykres izoenzymw dehydrogenazy mleczanowej w surowicy ludzkiej, izoenzymy LDH rozdzielono na octanie celulozy w pH 8,6 i barwiono na obecno enzymu. Wykres fotometru pokazuje wzgldn zawarto izoenzymw. Wykres A surowica chorego z zawaem minia sercowego; B prawidowa surowica; C surowica chorego z chorob wtroby, (Za zgod Dr Me!virta Blacka, Mr Hugha Millera, St Luke's Hospital, San Francisco), _____________
HHMM HM MM MMMM
W. celu wyjanienia zwizku miedzy izoen-zymami dehydrogenazy mleczanowej, Market wykorzysta znane warunki do rozbicia i ponownego utworzenia struktury czwartorzdowej. Rozszczepienie i rekonstrukcja dehydrogenazy mleczanowej Iûb dehydrogenazy mleczanowej I, nie spowodoway utworzenia si adnych nowych izoenzymw. Wynika to z faktu, e skadaj si one z 1 typu protomeru. Gdy tym samym zabiegom poddano mieszanin dehydrogenazy Ij i dehydrogenazy mleczanowej I5, wwczas otrzymywano dehydrogenaz mlecza-now I2, 13 i I+. Stwierdzone proporcje izoenzymw wskazywayby na nastpujcy skad podjednostek:
Dehydrogenaza mlecza nowa Izoenzym Podjednostki HHHH HHHM HHMM
H (vi (VI lvi
JVIIVI In lvi
Synteza podjednostek H i M jest kontrolowana przez odmienne loci genetyczne, ktre ulegaj odmiennej ekspresji w rnych tkankach, np. w sercu i miniach szkieletowych.
ILOCIOWA ANALIZA PEWNYCH ENZYMW OSOCZA MA ZNACZENIE DIAGNOSTYCZNE

Pewne enzymy, proenzymy i ich substraty znajduj si stale we krwi krcej zupenie
zdrowych ludzi, penic okrelone funkcje fizjo -
logiczne. Do takich enzymw osocza naley m.in. lipaza lipo proteinowa, pseudochoineste-raza, proenzymy krzepnicia krwi i fibrynolizy. Na og s one syntetyzowane w wtrobie, ale wystpuj we krwi w takich samych lub wikszych steniach ni w tkankach. nazwa wskazuje, nie peni adnej znanej funkcji fizjologicznej we krwi. Ich substraty czsto nie wystpuj w osoczu, a same enzymy wystpuj we krwi osb zdrowych w ilociach do miliona razy mniejszych ni w tkankach. Wystpowanie ich w osoczu, w ilociach powyej wartoci prawidowych, sugeruje zwikszenie szybkoci destrukcji okrelonych tkanek. Pomiar stenia tych niefunkcjonalnych enzymw osocza moe dostarcza lekarzowi cennych informacji przy ustalaniu rozpoznania i rokowaniu. W grupie niefunkcjonalnych enzymw osocza znajduj si enzymy wystpujce w wydzielinach gruczow wydzielania zewntrznego i prawdziwe" enzymy wewntrzkomrkowe.
Niefunkcjonalne enzymy osocza, jak sama
92 / ROZDZIA 8
Enzymy wydzielania zewntrznego amylaza trzustkowa, lipaza, fosfataza alkaliczna ci i fosfataza kwana gruczou krokowego dy-funduj do osocza. Prawdziwe enzymy wewntrzkomrkowe w warunkach fizjologicznych nie wystpuj w ukadzie krenia. Mae stenie niefunkcjonalnych enzymw osocza wynika z fizjologicznego rozpadu komrek Mae iloci niefunkcjonalnych enzymw stwierdzane w osoczu pochodz z rozpadu erytrocytw, leukocytw i innych komrek zachodzcego nawet w warunkach fizjologicznych. Przy szybkim obumieraniu komrek uwalniajce si z nich enzymy dostaj si do krwi. Chocia oglnie uwaa si, e zwikszone stenie tych enzymw w osoczu wiadczy o martwicy komrek, intensywne wiczenia fizyczne rwnie powoduj uwalnianie znacznej iloci enzymw mini. Stenia niefunkcjonalnych enzymw osocza od wielu lat s wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Praktykujcy lekarze dugo wykorzystywali ilociowe okrelenie stenia pewnych niefunkcjonalnych enzymw osocza. T wartociow diagnostycznie i prognostycznie informacj w wikszoci przypadkw otrzymuje si za pomoc cakowicie zautomatyzowanego wyposaenia. W tabeli 8-3 podano list gwnych enzymw wykorzystywanych w dziedzinie diagnostyki enzymatycznej. Dalsze szczegy wykorzystania tych enzymw s podane w suplemencie, obejmujc omwienie wanych poj czuoci i swoistoci testw diagnostycznych. ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE DOSTARCZAJ NOWEJ METODY W DIAGNOSTYCE CHORB GENETYCZNYCH Ogromny postp w rozpoznawaniu chorb genetycznych dokona si od wprowadzenia technologii rekombinacji DNA. Chocia od dawna wiedziano, e wszystkie choroby molekularne s konsekwencj zmienionego DNA, to techniki bezporedniego badania sekwencji DNA stay si dostpne od niedawna. Rozwj bada hybrydyzacjj fragmentw DNA wskaza drog do technik o dostatecznej czuoci do prenatalnego zbadania zaburze dziedzicznych
Tabela 8-3. Gwne enzymy osocza wykorzystywane w diagnostyce klinicznej Wiele enzymw nie jest swoistych dla podanych chorb; szczegy dotyczce warunkw, w ktrych enzymy te wykazuj zmienn aktywno, podano w suplemencie
Enzym osocza
Gwna wykorzystanie diagnostyczne Zawa serca Wirusowe zapalenie wtroby
Aminotransferazy Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT lub S60T) Aminotransferaza alaninowa (AIAT lub SGPT) Amylaza Cerutoplazmina
Ostre zapalenie trzustki Zwyrodnienie wtrobowo- soczewko wat {choroba Wilsona) Fosfokinaza kreatynowa Choroby mini i zawa serca Transpeptydaza y-gluta- Rne choroby wtroby mylowa Dehydrogenaza mlecza- Zawa serca nowa (izoenzymy) Lipaza Ostre zapalenie trzustki Fosfataza kwana Fosfataza alkaliczna {izoenzymy) Rak gruczou krokowego z przerzutami Rne choroby koci, choroby wtroby z utrudnionym odpywem ci
przez mapowanie DNA, pochodzcego z komrek podowych w pynie owodniowym, za pomoc enzymu restrykcyjnego. Zasadniczo badania DNA mog by zastosowane w diagnostyce wikszoci chorb genetycznych. Na przykad do prenatalnego wykrycia talasemii (charakteryzujcej si wad w syntezie podjednostek hemoglobiny; p. rozdz. 7), badaniem wykonanym z uyciem czci genu dla normalnej podjednostki hemoglobiny mona wykry skrcenie lub brak fragmentu restrykcyjnego, wynikajce z delecji w tym genie, jakie ma miejsce w pewnych a-talasemiach i pewnych rzadkich typach |3- i p,5-talasemiach. Alternatywnie, mona wykona badanie z uyciem syntetycznego cDNA, ktry hybrydyzuje z sekwencj fl-globiny, zawierajc nonsensown mutacj obecn w pewnych p-talasemiach, ale
nie z normalnym genem fi-globiny. Nieobecno osoezowego inhibitora proteazy o^-anty-trypsyny jest zwizana z rozedm puc i mars-kocia. wtroby. Obecno nieaktywnej c^-anty-trypsyny wykryto sond wykrywajc nieaktywny allel, ktry zawiera punktow mutacje w genie o^-antytrypsyny. Metoda hybrydyzacji moe take by uyta do wykrycia zmian genetycznych prowadzcych do utraty miejsc dziaania dla endonuk-leazy restrykcyjnej (p. rozdz, 38). Na przykad mutacja punktowa kodonu dla Glu (GAG) na kodon Val (GTG), charakterystyczna dla nie-dokrwistoci sierpowatej, moe by wykryta w genie (-globiny, uzyskanym z komrek pochodzcych tylko z 10 ml pynu owodniowego, za pomoc endonukleazy restrykcyjnej Mst II lub Sau I. BADANIE PRODUKTW TRAWIENIA ENZYM AMI RESTRYKCYJNYM I MOE UJAWNI HOMOLOGICZNE GENY Z RNYMI SEKWENCJAMI ZASAD Badania DNA mog by take wykorzystywane do wykrycia sekwencji cile sprzonych "z genem, ale nie umiejscowionych w obrbie interesujcego genu. Badania takie mona rozszerzy o okrelenie swoistych chromosomo-wo zmian (rnice w sekwencji midzy homologicznymi chromosomami). Przez trawienie DNA endonukleazami restrykcyjnymi uzyskuje si rne mapy restrykcyjne (wykresy fragmen tw DNA) z homologicznych genw, ktre zawieraj jednak rne sekwencje zasad. Zjawisko to okrela si jako polimorfizm dugoci fragmentw restrykcyjnych (ang. restrietion fragment length polymorphism; skrt RFLP). W przypadku choroby genetycznej sprzonej z polimorfizmem dugoci fragmentw restrykcyjnych, nosiciel jej bdzie mia 1 chromosom z prawidowym genem i 1 z genem wadliwym. Gdy fragmenty restrykcyjne poddaje si rozdziaowi, wwczas wykrywa si 2 pasma hyb-i-ydyzacji (odmienne od pojedynczego pasma,
jeeli oba geny s identyczne). Potomek, ktry odziedziczy chromosom kodujcy chorob wykazuje wprawdzie tylko pojedyncze pasmo hybrydyzacji, ale rnice si od pasma produkowanego przez prawidowe chromosomy. Zjawisko RFLP wykorzystuje si do wykrycia cechy niedokrwistoci sierpowatej (zwizanej z Hpa I RFLP) i p-talasemii (zwizanej z Hind III i Bam HI RFLP). Metod opart na RFLP rozwinito do wykrycia dziecicej fenyloketo-nurii (p. rozdz. 32). Skoro RFLP nie powoduje choroby, lecz jest spowodowany zmianami chroinosomaJnymi, umiejscowionymi blisko wadliwego genu, badanie to nie jest niezawodne. RFLP jest punktem wyjcia do bada zmierzajcych do identyfikacji genu odpowiedzialnego za sprzone z nim choroby. Ten sposb podejcia wykorzystano ju w bada niach skriningowych zjawisk mutacyjnych uczestniczcych w powstawaniu retinobiastoma i choroby Huntingtona. Nastpne przykady wykorzystania enzymw restrykcyjnych w diagnostyce p. rozdz. 36. PIMIENNICTWO
Methods in Enzymohgy. Over 130 volumes, 1955present. Advances in Enzymohgy. Issued annually. Boyer PD, Lardy H, Myrbach K (editor): The Enzymes, 3rd ed. 7 vols. Academic Press, 1970-1973. Bergmeyer HH, Bergmeyer J, Grass M: Methods of EnivmkAnalysis. Vol. XI, Antigens and Antibodies. VCH Publishers, 1986. Fersht A: Enzyme Structure and Mechanizm. 2nd ed. Freeman, 1985. Freifelder D: Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry and Moleadar Biology. Freeman, 1982. Kaiser T, Lawrence DS, Rokita SZ: The chemical modification of enzyme specificity. Ann Rev Biochem 1985;54:597. Naui A: Where are the asymptotes of Michaelis-Menten? Trends Biochem Sci 1986; 1J:64. Scopes R: Protein Purifwation: Principles and Practke. Springer-Verlag, 1982. Tijssen P: Practice and Theory of Enzyme fmmunoassays. Elsevier, 1985.
9
WPROWADZENIE
W tym rozdziale zostanie omwiony charakter chemiczny katalizy przeprowadzonej przez enzymy oraz charakter interakcji enzym-sub-strat odpowiedzialny za swoisto reakcji tych biologicznych katalizatorw.
Enzymy: kinetyka
TWORZENIE I ZANIK STANW PRZEJCIOWYCH W CAKOWITEJ REAKCJI WIE SI Z DYSKRETNYMI ZMIANAMI W WOLNEJ ENERGII
W reakcji zastpienia grupa Y zastpuje pozostajc grup X:
V + R - XY - R + X
Rozpatrujc gwne czynniki, tj. stenie enzymu i substratu. temperatur, pH i inhibitory, ktre wpywaj na aktywno enzymu, 3 ostat nie s szczeglnie interesujce w badaniach klinicznych. Poniewa aktywno enzymw zwiksza si wraz ze wzrostem temperatury, szybko procesw metabolicznych znacznie si zwiksza podczas gorczki. Jeeli gorczka jest dugotrwaa, rezultaty mog by fatalne, czciowo z powodu wyczerpania metabolicznego. Obnienie temperatury ciaa (hipotermia), a w konsekwencji zmniejszenie aktywnoci wikszoci enzymw, okazuje si uyteczne wwczas, gdy zachodzi potrzeba redukcji cakowitego metabolizmu (np. podczas operacji na otwartym sercu lub transportu narzdw przeznaczonych do transplantacji). Zasadnicz regu biologiczn jest homeostaza, tj. utrzymywanie wewntrznego rodowiska ciaa bardzo zblione do jego normalnych warunkw. Stosunkowo mae zmiany pH mog wpywa na aktywno wiciu enzymw lub biaek. Wikszo lekw dziaa przez wpyw na reakcje katalizowane przez enzymy. Wiele lekw przypomina naturalne substraty i dziaa jako inhibitory kompetycyjne aktywnoci enzymatycznej. Lepsze zrozumienie farmakologii i toksykologii zaley od prawdziwej znajomoci zasad hamowania dziaania enzymw.
Ta reakcja przebiega w 2 reakcjach powkowych: 1) tworzenie stanu przejciowego, w ktrym Y i X s przyczone do R, i 2) zanik stanu przejciowego i utworzenie
Y-R + X
Y+R-X produktw:
.............................. R..........
Stan przejciowy
Jak we wszystkich reakcjach chemicznych, zmiany w wolnej energii s zwizane z kad powk reakcji. AGp definiuje si jako zmian w wolnej energii zwizan z tworzeniem stanu przejciowego, a AGD jako zmian w wolnej energii zwizan z zanikiem stanu przejciowego do utworzenia produktw:
[V- R] [Y] [Y -R -X]
gdzie zmiana w wolnej energii dla caej reakcji AG jest sum zmian wolnej energii w obu reakcjach powkowych: AG= AG + AG
F "
Tak jak dla kadego rwnania z dwoma czonami, nie jest tu moliwe wywnioskowanie
ENZYMY: KINETYKA / 95
znaku lub wielkoci ani AGF, ani AGD przez zbadanie algebraicznego znaku i wielkoci AG. Nie ma wiec moliwoci prostego wnioskowania na podstawie zmian wolnej energii AG dla caej reakcji o zmianach wolnej energii zwizanych z tworzeniem i zanikiem stanw przejciowych. Skoro kataliza jest cile zwizana z AG> i AGD, to pociga za sob to, e termodynamika cakowitej reakcji (AG) nie moe nam powiedzie nic o drodze przebiegajcej reakcji {tj. jej mechanizmie). Jest to zadanie kinetyki. Profile reakcji ilustruj zmiany wolnej energii zwizane z tworzeniem i zanikiem stanw przejciowych Profile reakcji na ryc. 9 -1 i 9-2 ilustruj zalenoci midzy AG, AGp i AGD Naley
Wielko wolnej energii
r
Reakcje katalizowane enzymatycznie obejmuj stany przejciowe przy niszym poziomie energii ni reakcje niekatalizowane Na rycinie 9-3 przedstawiono profile reakcji 2 rnych stanw przejciowych w tej samej reakcji cakowitej. W obu przypadkach, wiel WielkoSfi wolnej energii
[V - R Xl
x ]'
AGF
Y Ryc.
+ R-X
9- 3. Pr ofil r eakcji dl a t w or zeni a 2 rnych st a n w pr z ej ci o w y c h [ Y - R - X ] a i [ Y - - R - X ] b i towarzyszca im wolna ener gia twor zenia, AG p iAG
y---R
AGF Y + R -X AGo<0
A6<0
Y-R + X
Ryc. 9- 1. Profil reakcji dla reakcji zastpienia z ujemn cakowit zmian w wolnej energii, tj. AG
Wielko we In ej enerflil AGD A GF>0 AG>0 Y + R-X
Ryc. 9-2. Profil reakcji dla reakcji zastpienia z dodatni cakowit zmian w wolnej energii, tj. AG>0.
ko wolnej energii tworzenia stanu przejciowego reprezentuje barier energetyczn dla cafej reakcji. Bariera energetyczna dla reakcji, ktra przebiega przez stan przejciowy [Y R-"X]b, jest nisza ni bariera energetyczna dla reakcji, ktra przebiega przez stan przejciowy [Y R X]a- Katalizatory zmieniaj wielko wolnej energii stanu przejciowego. W powyszym przykadzie [Y R X]a przedstawia stan przejciowy dla niekatalizowanej reakcji, natomiast [Y R * X]b przedstawia stan przejciowy dla reakcji katalizowanej. Wszystkie katalizatory, cznie z enzymami, zmniejszaj woln energi tworzenia stanu przejciowego AGp. Nastpnie naley zauway, e skoro kataliza nie ma adnego wpywu na AG, zmiana w wolnej energii dla reakcji cakowitej jest niezalena od katalizy. Skoro staa rwnowagi dla reakcji chemicznej jest funkcj standardowej zmiany wolnej energii dla reakcji:
AG= -RTIn K eq
zwrci uwag, e podczas gdy na ryc. 9-1 AG jest ujemna (AG<0), a na ryc. 9-2 AG jest dodatnia (AG > 0), w obu przypadkach AGFjest dodatnia (AG t > 0) i AG D jest ujemna (AGD<0). Dlatego, jak stwierdzono powyej, ze znaku i wielkoci AG nie mona wnioskowa o znaku i wielkoci ani AGF ani AGD. -
to powoduje to, e enzymy i inne katalizatory nie maj adnego wpywu na sta rwnowagi reakcji.
96 / ROZDZIA 9
ABY REAGOWA, CZSTECZKI MUSZ SI ZBLIY DO SIEBIE NA ODLEGO TWORZONEGO WIZANIA Z WYST ARCZAJC ENERGI, ABY PRZEKROCZY BARIERY ENERGETYCZNE MIDZY ST ANAMI PRZEJCIOWYMI Teoria kinetyczna lub teoria zderze dla reakcji chemicznych zawiera 2 kluczowe pojcia: 1. Aby ze sob reagowa, czsteczki musz si zderza (tj. by jedna obok drugiej w obrbie odlegoci tworzonego wizania). 2. W zderzeniu koczcym si reakcj, reagu jce czsteczki musz mie wystarczajc ilo ener gii, aby przekroczy barier energetyczn reakcji. Czynniki, ktre zwikszaj czsto zderze i energi kinetyczn zwikszaj szybko reakcji Jeeli czsteczki maj wystarczajc energi aby reagowa, to wszystkie czynniki, ktre zwikszaj czsto zderze midzy czsteczkami, bd zwikszay szybko reakcji. Natomiast czynniki, ktre zmniejszaj albo czsto zderze, albo energi kinetyczn, bd zmniejszay szybko reakcji. Jeeli te same czsteczki w populacji maj niewystarczajc energi aby reagowa, to podwyszenie temperatury, ktra zwiksza energi kinetyczn, bdzie zwikszao szybko reakcji. Te koncepcje przedstawiono
Bariera energetyczna
poniewa wikszo ma niewystarczajc energi kinetyczn do przekroczenia bariery energetycznej reakcji. W znacznie wyszej temperaturze (i wikszej energii kinetycznej) reakcja bdzie zachodzia duo szybciej. To, e reakcja zachodzi wiadczy o tym, e jest to reakcja samorzutna (AG<0). W niszej temperaturze reakcja prze biega samorzutnie, ale wolno; w wyszej temperaturze samorzutnie i szybko. Zadaniem enzymw jest spowodowanie, aby w warunkach panujcych w ywych komrkach reakcje samorzutne zachodziy szybko. Wiele reakcji chemicznych wanych biologicznie obejmuje tworzenie lub rozpad wiza kowalencyjnych W reakcji przeniesienia grupy: D- G + AÂ- G+D grupa G jest przenoszona z donora D G na akceptor A. Cakowita reakcja obejmuje zarwno rozbicie wizania D G, jak i tworzenie nowego wizania A G. Katalizowane enzymatycznie reakcje przeniesienia grupy mog by przedstawione nastpujco: D-G AEnz Enz-G D G To uwydatnia 3 A gwne cechy katalizowa nych enzymatycznie reakcji przenoszenia grup: 1. Kada poowa reakcji zawiera zarwno rozbicie, jak i tworzenie wizania kowalencyj nego. 2. Enzym reaguje zarwno z D G, jak A. 3. Podczas gdy w cakowitej reakcji enzym dzia a katalitycznie (tzn. jest wymagany tylko w ladowych ilociach i moe by odzyskiwany w postaci nie zmienionej, gdy reakcja jest za koczona), dla kadej polowy reakcji enzym jest stechiometrycznym substratem (tzn. jest on wymagany w stosunku molowym z innymi substratami rwnymi:!). Mona rozway wiele dodatkowych reakcji biochemicznych, w ktrych D, A lub oba mog by nieobecne. Na przykad reakcje izomeryzacji (takie, jak przeksztacenie glukozo-6-fosforanu i glukozo-1-fosforanu) mog by przedstawione jako reakcje, w ktrych zarwno D, jak i A s nieobecne: S ^T Enz
Energia kinetyczna Hyc. 9-4. Bariera energetyczna dla reakcji che micznych.
na ryc. 9-4. W przypadku A adna, w B cz i w C wszystkie czsteczki maj wystarczajc energi kinetyczn, aby przekroczy barier energetyczn reakcji. W nieobecnoci katalizy enzymatycznej wieJe reakcji chemicznych zachodzi bardzo wolno w temperaturze ywej komjki. Jednak, nawet w tej temperaturze, czsteczki s w ruchu i podlegaj zderzeniom. Nie reaguj one szybko,
KILKA REAKCJI CZSTKOWYCH 1 KOMPLEKSY ENZYM -SUBSTRAT UCZESTNICZ W REAKCJACH KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE Powysze prezentacje nie podkrelaj jeszcze innej kluczowej cechy reakcji katalizowanych
enzymatycznie udziau w cakowitej reakcji 2 lub wicej porednich form kompleksu EnzS i pniejszego udziau zespou kolejnych reak cji
powkowych. Prezentacj reakcji przeniesienia grupy, ktra podkrela te cechy, moe by

Enz AG
Enz-G
D-G
Maa warto Kd przedstawia zatem cisy kompleks R-C. ' Jedn wan konsekwencj jest to, e gdy substrat przyczy si do katalizatora, wwczas zwiksza si stenie substratu w okrelonym obszarze roztworu wyranie powyej jego stenia w wolnym roztworze. Dlatego nie ma si duej do czynienia z homogennym, ale hetero-gennym roztworem chemicznym. Jeeli katalizator dla dwuczsteczkowej (dwu-substratowej) reakcji przycza oba substraty, stenie miejscowe kadego z nich jest zwikszone o czynnik, ktry zaley od indywidualnego powinowactwa (warto Kj) do katalizatora. Jeeli szybko cakowitej reakcji dwuczsteczkowej A+ B -* A-B jest, jak zostanie przedstawione poniej, proporcjonalna do ste obu A i B, przyczenie
obu A i B przez katalizator moe powodowa ogromne (kilka tysicy razy) zwikszenie ca kowitej szybkoci reakcji.
Enz-G** Enz-G
w ktrej Enz-G, Enz-G* i Enz-G** reprezentuj kolejne kompleksy EnzS w reakcji cakowitej. Przyczanie substratw do enzymu zwiksza ich stenie miejscowe i sprowadza je na odlego tworzenia wizania Aby kada z powyszych reakcji zasza, wszystkie substraty musz zbliy si do siebie na odlego tworzenia wizania (lub rozerwania wizania). Dla homogennego roztworu chemicznego w nieobecnoci katalizatorw stenia reagujcych czsteczek w roztworze s stae. Ten warunek nie jest duej zachowany po wprowadzeniu katalizatora. Katalizator musi mie powierzchniowe domeny, ktre przyczaj reagujce czsteczki. Mimo e to przyczenie jest procesem odwracalnym, cakowita staa rwnowagi dla reakcji przyczania silniej uprzywilejowuje przyczenie ni wolne formy reagujcych czsteczek. Jakociowo mona przedstawi to nastpujco: Substrat + Katalizator - Kompleks su b st rat - kata izato r Ilociowo mona wyrazi ciso asocjacji miedzy substratem R a katalizatorem C w formie staej dysocjacji Kd dla kompleksu R-C lub staej rwnowagi dla reakcji: +c
[CJ
Obszar enzymu zwizany z przyczeniem substratu i kataliz jest nazywany miejscem aktywnym" Kluczow waciwoci enzymw jest ich zdolno do przyczenia jednego lub (coraz czciej) obu substratw w reakcji bimolekularnej z towarzyszcym miejscowym zwikszeniem stenia substratu i wynikajcej z tego miejscowej szybkoci reakcji. Enzymy s zarwno niezwykle czynnymi, jak i bardzo wybirczymi katalizatorami. Aby zrozumie te charakterystyczne waciwoci enzymw, naley wprowadzi pojecie miejsca aktywnego" lub katalitycznego"*. Ogromna wielko biaek, w stosunku do substratw, prowadzi do koncepcji, e ograni czony obszar enzymu, miejsce aktywne", jest zwizany z kataliz. Pocztkowo byo intrygujce, dlaczego enzymy s tak ogromne, gdy tylko cz ich struktury okazuje si by konieczna do przyczenia substratu i katalizy. Dzi siaj wiadomo, e z substratem reaguje duo wiksza cz czsteczki biaka ni to poprzednio przypuszczano. Gdy zwiksza si zapotrze Podczas gdy wiele tekstw zrwnuje aktywne i katalityczne miejsca enzymw, w enzymach znajduj si inne aktywne" miejsca zwizane raczej z regulacj aktywnoci enzymu ni z poredni enzytnologi procesu katalitycznego per se. Uyto zatem terminu miejsce katalityczne" aby unikn dwuznacznoci.
[R-C]
7 Biochemi a
98 / ROZDZIA 9
bowanie na miejsca allosteryczne rwnej wielkoci, wwczas wielko enzymw nie powinna by duej niespodziank. Wiele waciwoci enzymw moe by zrozumiaych na podstawie sztywnego modelu zamka i klucza" miejsca aktywnego Model miejsca katalitycznego, zaproponowany przez Emila Fischera, przedstawia interakcj midzy substraem a enzymem na zasadzie analogii zamka i klucza". Ten model zamka i klucza" lub sztywny model matrycowy (ryc. 9-5) jest cigle uyteczny w celu zrozumienia pewnych waciwoci enzymw, np. uporzdkowanego przyczenia 2 lub wicej substratw (ryc. 9-6) lub krzywej kinetyki prostego nasycenia substratem.
aminokwasowych lub innych grup enzymu we waciwym pooeniu przestrzennym do zwizania substratu, katalizy lub obu zjawisk cznie. W przykadzie z ryc. 9-7 zarwno grupy hydrofobowe (zakreskowane) jak i grupy naadowane elektrycznie (zakropkowane) s zaangaowane w przyczeniu substratu. W katalizie
Ryc. 9-7. Dwuwymiarowe przedstawienie indukowanego dopasowania si przez zmian konformacyjn w strukturze biaka. Naley zwrci uwag na odpowiednie pozycje kluczowych reszt aminokwasowych przed przyczeniem i po przyczeniu substratu.
Ryc. 9-5. Przedstawienie tworzenia kompleksu EnzS zgodnie z matrycow hipotez Fischera.
Ryc. 9-6. Przedstawienie kolejnej adsorpcji koenzymu (CoE) i 2 substratw (S, i Ss) do enzymu wedug hipotezy matrycowej. Zakada si, e koenzym ma grup niezbdn do przyczenia pierwszego substratu (S,), ktry z kolei uatwia przyczenie S:
W modelu indukowanego dopasowania si" miejsca katalitycznego, substrat indukuje konformacyjn zmian w enzymie, ktra tworzy" miejsce katalityczne Niefortunna cech modelu Fischera jest zaoenie sztywnoci miejsca katalitycznego. Bardziej uniwersalnym modelem jest model indukowanego dopasowania si" Koshlanda. Ten model mia znaczne potwierdzenie dowiadczalne. W modelu Fischera zaoono, e miejsce katalityczne jest z gry uksztatowane w taki sposb, e pasuje do substratu. W modelu indukowanego dopasowania si substrat indukuje konformacyjn zmian w enzymie. Zmiana ta dotyczy ustawienia reszt
bierze udzia reszta fosfoseryny (P) i grupa SH reszty cysterny. Inne reszty, nie biorte udziau w adnym procesie, s reprezentowane przez reszty Lys i Met. W nieobecnoci substratu i;rupy katalityczne i wice substrat s od siebie oddalone na odlego kilku wiza. Zblienie si -ubstratu wywouje zmian konformacyjn w bia k u enzymatycznym, ustawiajc w odpowiedni sposb grupy uczestniczce w wizaniu substratu i katalizie. W tym samym czasie zmienia si rwnie przestrzenne ustawienie innych obszarw Lys i Met s teraz blisko siebie (ryc. 9-7). Analogi substratw mog powodowa pewne, ale nie wszystkie, zmiany waciwej konformacji (ryc. 9-8). Po przyczeniu waciwego substratu A wszystkie grupy (przedstawione jako zaciemnione kka) ustawiaj si we waciwym pooeniu. Przyczenie analogu EnzS substratu, ktry jest
Eni + S B
Ryc. 9-8. Przedstawienie zmian konformacyjnych w biaku enzymatycznym po przyczeniu substratu (A) i nieaktywnych analogw substratu (B, C) {wedug Koshlanda).
ENZYMY; KINETYKA / 99
zbyt gruby" (ryc. 9-8B) lub zbyt chudy" (ryc, 9-8C) indukuje nieprawidowe ustawienie grup. Ostatni cech enzymu jest miejsce pokazane jako mae nacicie z prawej strony. Mona sobie wyobrazi przyczenie si w tym miejscu czsteczki regulatorowej i ciganie w d" jednego z ramion polipeptydowych wrazz grup katalityczn. W takim przypadku moe zachodzi przyczenie substratu, ale nie kataliza. Jak to ilust ruje model indukowanego dopasowania si, reszty aminokwasw, ktre znajduj si w miejscu katalitycz nym, mog by oddalone od siebie w strukturze pierwszorzdowej, ale przestrzennie zblione w strukturze trzeciorzdowej. Katalityczne miejsca Itzozymu, rybonukieazy i wielu innych enzymw znajduj si w bruzdach powierzchni enzymu Lizozym wystpujcy we zach, luzie nosowym, plwocinie, tkankach, soku odkowym, mleku i biaku jaja, katalizuje hydroliz wiza P-1,4 kwasu N-acetyloneuraminowego w pro-teoglikanach i glukozoaminoghk ariach. Jego dziaanie polega na niszczeniu cian komrkowych wielu bakterii Gram-dodatnich, przedostajcych si z powietrza do ez i luzu nosowego. Lizozym jest zbudowany z jednego acucha polipeptydowego, skadajcego si ze 129 reszt aminokwasowych. Poniewa nie ma koenzymu ani jonu metalu, kataliza, swoisto i trjwymiarowa struktura s okrelone wycz nie przez te reszty aminokwasowe. W czsteczce lizozymu s mae obszary struktury harmonij 1
kowej, a-heliksu i szerokie obszary struktury nie uporzdkowanej! Czsteczka ma przebiegajc przez rodek bruzd, w ktrej znajduje si miejsce katalityczne, z 6. podmiejscami" (ang. subsites) (ryc. 9-9), ktre przycza rne sub-straty lub inhibitory. Reszty aminokwasowe odpowiedzialne za rozbicie wizania le midzy miejscami D i E, blisko grup karbok-sylowych Asp 52, Glu 35. Glu 35 przekazuje protony wizaniu acetalowemu substratu, podczas gdy ujemnie naadowany Asp 52 stabilizuje powstajcy jon karboniowy. Katalityczne miejsce rybonukieazy ley w obrbie bruzdy podobnej do bruzdy lizozymu, w poprzek ktrej le 2 reszty aminokwasowe His 12 i His 119. Ju wczeniejsze badania chemiczne wskazyway na obecno tych 2 aminokwasw w miejscu katalitycznym enzymu. Obie reszty aminokwasowe znajduj si blisko miejsca wicego kwas urydylowy (ryc. 9-10).
411
Grupa fosforanowa
A) Asp 101 Trp 62 T rp63

I \
Ryc. 9-10. Struktura rybonukieazy okrelona za pomoc dyfrakcji promieni X. Liczby odpowiadaj swoistym resztom aminokwasowym (p. te ryc. 6-7).
() Ser 100 Ala 107 f) A r g t1 4
Asp 52 [ Glu 35 Ala 110 Ser 36
Ryc. 9-9. Schematyczne przedstawienie miejsca katalitycznego w okolicy bruzdy lizozymu. Punkty AF przedstawiaj reszty glikozydowe heksasacharydu. Pewne reszty aminokwasowe, lezce w okolicy bruzdy, s podane wraz z ich numerami w sekwencji lizozymu (wedug Koshlanda), _____
Wsplny motyw struktury pierwszorzdowej wystpuje w miejscach katalitycznych licznych enzymw hydrolitycznych Struktury pierwszorzdowe miejsc katalitycznych enzymw hydrolitycznych wykazuj wiele podobiestw (tab. 9 -1). Moe to oznacza, e liczba mechanizmw, wedug ktrych zachodzi rozrywanie wiza w ukadach biologicznych, jest stosunkowo maa. W wietle tych podobiestw nie jest zaskakujce to, e sekwencje aminokwasw blisko miejsc katalitycznych tego samego enzymu, z rnych gatunkw, wykazuj nawet jeszcze wiksze podobiestwo.
100 / ROZDZIA 9 Tabela 9-1. Sekwencje aminokwasw w i ssiedztwie miejsc katalitycznych kilku proteaz wou . stawiono regiony miejsca katalitycznego 30 stronie reszty serylowej (S) i histydylowej (H)* PrzedEnzym Trypsyna Sekwencja aminokwasw wok seryny ( Sekwencja aminokwasw
wok histydyny
V V S A A C Y K V V T A A G G V V V T A A C G V
DSC Q D G
M G M G
Chymotrypsyna A S S C Chymotrypsyna B S S C Trombina
D G Q D ( >)
G
G PVV C
s GK
K KN Q KN
SG TT T T
G P LV
G
DQ
V L T A A @ C LL Y P D A C E G D Q >) G P F V M K S P G * Reprodukowano za zgod z: Dayhoff MO (red.) Atlas Sekwencji Biaek i Struktury, t. 5, Narodowa Fundacja Bada Biomedycznych, 1972.
=) G
c PL V c
W OGRANICZONYM ZAKRESIE TEMPERATUR SZYBKO REAKCJI KATALIZOWANYCH ENZYMATYCZNIE ZWIKSZA SI WRAZ ZE WZROSTEM TEMPERATURY Ma rycinie 9-11 przedstawiono wpyw temperatury na typow reakcj katalizowan en-zymatycznie. Szybko reakcji pocztkowo si
Optimum temperatury
Niemniej nie jest to podstawowy parametr, poniewa optymalna temperatura zaley od czasu trwania prby uytej do jej okrelenia, tj. im duej enzym jest utrzymywany w temperaturze, w ktrej jego struktura jest mao stabilna^ tym bardziej prawdopodobne jest to, e bdzie zdenaturowany. czynnik, o ktry si zwiksza szybko procesu biologicznego przy wzrocie temperatury 0 10C. Szybko wielu procesw biologicz nych, np. szybko skurczw izolowanego ser ca, w przyblieniu podwaja si wraz ze wzros tem temperatury o 10C {Q I0 =2). Dla wikszoci enzymw optymalne temperatury s takie same lub wysze od tych, jakie wystpuj w miejscu ich dziaania, tj. w komrkach. Na przykad enzymy mikroorganizmw przystosowanych do wzrostu w naturalnych gorcych rdach mog wykazywa optymaln temperatur blisko temperatury wrzcej wody, pH WPYWA NA AKTYWNO ENZYMU PRZEZ ZMIAN ADUNKU GRUPZJON1ZOWANYCH ENZYMU 1 CZSTO TAKE SUBSTRATU Gdy aktywno enzymu zmierzy si w kilku wartociach pH, obserwuje si wwczas, e optymalna aktywno mieci si na ogi midzy wartociami pH 5,09,0, niemniej kilka enzym w, np. pepsyna, jest aktywnych przy wartociach pH wyranie wykraczajcych poza ten zakres. Ksztat krzywych wyraajcych zaleno aktywnoci od pH okrelaj nastpujce czynniki: 1. Denaturacja enzymu przy maych i duych wartociach pH.
Wspczynnik temperatury lub Q 1B jest to
Temperatura (C) Ryc. 9-11. Wpyw temperatury da szybko hipo tetycznej reakcji katalizowanej enzymatycznie.
zwiksza, wraz ze wzrostem temperatury, z powodu zwikszenia energii kinetycznej reagujcych czsteczek. Ostatecznie energia kinetyczna enzymu przekracza jednak barier energetyczn do rozerwania sabych wiza wodorowych i hydrofobowych, ktre utrzymuj ich struktur drugo- i trzeciorzdow. W tej temperaturze denaturacji dominuje towarzyszca strceniu strata aktywnoci katalitycznej enzymu. Dlatego enzymy wykazuj optymaln temperatur.
ENZYMY: KINETYKA / 101 2. Zmiany w adunku enzymu i (lub) sub-stratw. W przypadku enzymu pH moe
wrjyr wa na J*ego aktyvjnaj^!^x3rirlar\c fltrnktuj; fub^przez zmian adunku reszty aminokwaso-wej, biorcej udzia w przyczaniu substratu lubwkata]izie. Aby to zilustrowa, naley wzi pod uwag ujemnie naadowany enzym (Enz~) reagujcy z dodatnio naadowanym substratem (SH+):
SH*
Enz >EnzSH
aktywnoci, W zalenoci od ostroci tych zmian aktywno moe iub nie moe by przywrcona, gdy enzym powrci do swojego optymalnego pH.
JEELI SUBSTRATY S OBECNE W PRAWIE RWNO MOLOWYCH PROPORCJACH,SZYBKO REAKCJI JEST PROPORCJONALNA DO STENIA WSZYSTKICH SUBSTRATW
W duych steniach substratw zarwno liczba czsteczek majcych dostateczn energi, aby reagowa, jak i czsto ich zderze s due. Ten stan utrzymuje si niezalenie od tego, czy wszystkie czsteczki, czy tylko ich cz ma wystarczajc energi, aby reagowa. Biorc pod uwag reakcj, w ktrej uczestnicz 2 rne czsteczki A i B: A+B-* AB podwojenie stenia albo A albo B podwoi szybko reakcji. Podwojenie stenia zarwno A, jak i B zwikszy prawdopodobiestwo zderzenia 4-krotnie. Szybko reakcji zwikszy si zatem 4-krotnie. Szybko reakcji jest proporcjonalna do ste czstek reagujcych. Nawiasy wysokie kwadratowepH ([ ]) uyto do oznaczenia ste molowych*; a oznacza proporcjonalny do". Okrelenie szybkoci jest nastpujce: Szybko a [czsteczki reagujce] lub Szybko a [A] [B] W przypadku gdy wyraeniem szybkoci jest: Szybko x [A] [B][B] lub Szybko? [A] [BY Dla przypadku oglnego, gdy n czsteczek A reaguje z m czsteczkami B nA+mB-An Bm wyraeniem szybkoci jest: Szybko oc [A]n[B]m
* cilej mwic, powinny by uyte raczej aktywnoci molowe ni stenia molowe.
Przy niskim pH Enz~ dy do przyczenia protonw i traci swj EnzH adunek ujemny:
Enz +
Przy wysokim pH SH+ jonizuje i traci swj adunek dodatni: SH+-S+ H

+
Poniewa, z definicji, jedynymi formami, ktre bd wchodzi w interakcje s SH+ i Enz , kracowe wartoci pH bd zmniejszay skuteczne stenie Enz~ i SH+, zmniejszajc w ten sposb szybko reakcji fryc. 9 -12). Tylko na
100 Enz" Niskie
Ryc. 9-12. pH na aktywno
Wpyw enzymu.
obszarze zakreskowanym na krzy zarwno Enz, jak i S s we waciwym stanie jonowym i najwiksze stenie Enz i S s odpowiednio naadowane w punkcie X. Enzymy- mog takie podlega zmianom w konfqrmacjj_na skutek zmian pH. Grupy majce adunek, dystalne w stosunku do regionu, w ktrym przycza si substrat, mog by niezbdne do utrzymania aktywnej struktury trzecio- i czwartorzdowej. Jeeli zmieni si adunek elektryczny tych grup, biako moe si rozluni, sta si bardziej zbite lub dysocjowa na podjednostki wszystko to powoduje strat
102 / ROZDZIA 9 STAA RWNOWAGI JEST STOSUNKIEM STAYCH SZYBKOCI REAKCJI PRZEBIEGAJCEJ DO PRZODU I REAKCJI ODWROTNEJ Poniewa wszystkie reakcje chemiczne s odwracalne, dla reakcji odwrotnej, gdzie AnBra tworzy n czsteczek A i m czsteczek B An^n, - nA+mB odpowiednim wyraeniem szybkoci jest: Szybko a [AnBm] Odwracalno wyraa si podwjnymi strzakami;
nA + mB ^ AB m 4. Sta rwnowagi mona wyrazi liczbowo, jeli s znane stenia A, B i \BW w stanie rwnowagi.
Standardow zmian wolnej energii (AG ) dla danej reakcji mona obliczy ze staej rwnowagi Zwizek staej rwnowagi z AG" jest nastpujcy:
ZiG^-RTInK^,
R jest sta gazow i T temperatur bezwzgldn. Poniewa s one znane, znajomo

wartoci liczbowej K^ umoliwia wyliczenie war-
To wyraenie czyta si: ,,n czsteczek A i m czsteczek B jest w rwnowadze z AnBm". Symbol a proporcjonalny do" mona zastpi znakiem rwnoci, wstawiajc stal proporcjonalnoci k, charakterystyczn dla danej reakcji. Dla przypadku oglnego
nA + mB j AnB m
toci AG. Jeeli staa rwnowagi jest wiksza od 1, reakcja jest spontaniczna, tj. przewaa reakcja zachodzca zgodnie z zapisem (od strony lewej do prawej). Jeeli jest ona mniejsza od 1, to kierunek przebiegu reakcji jest przeciwny, tzn. jest bardziej prawdopodobne, e reakcja bdzie przebiega a od strony prawej do lewej. Jednake naley zauway, e chocia staa
rwnowagi reakcji wskazuje kierunek, w ktrym reakcja zachodzi samorzutnie, to nie wskazuje,
wyraeniami szybkoci dla reakcji przebiegajcej w prawo (szybkoj) i reakcji w lewo (szyb-ko_,) s: Szybko,= k1[A]"[B]m i Szybko, = k_,rAnBm] Gdy szybkoci reakcji przebiegajcej w prawo i odwrotnie s rwne, mwi sie, e system jest w stanie rwnowagi, tj.
Szybko^ Szybko.,
czy bdzie ona przebiega szybko, tj. nie mwi

ona nic o wielkoci bariery energetycznej dla
reakcji (czyli o AGF; patrz powyej). To wypywa z faktu, e K^ okrela AG", ktra co wykazano uprzednio dotyczy tylko stanu pocztkowego i kocowego. Szybko reakcji
zaley od wielkoci bariery energetycznej, a nie od wartoci AG". przez zmian miejscowego stenia substratu.
Wiele czynnikw wpywajcych na szybko reakcji katalizowanych przez enzymy dziaa Enzymy nie wpywaj na stae rwnowagi reakcji, ktre katalizuj Enzym jest zwizkiem reagujcym, ktry czy si z substratem, tworzc kompl eks enzymsubstrat EnzS, ktry rozkada si, tworzc produkt P i wolny enzym. W najprost szej formie moe to by przedstawione na stpujco k. Enz+ S ^ Podczas gdy wyraenia okrelajce szybko dla reakcji zachodzcej w prawo, odwrotnej i reakcji oglnej zawieraj skadnik [Enz], Enz+ S ^ Enz+ P M Szybko = k-, [Enz] [S]
wtedy
k1[A]n[B]m=k_1[AnBm]
o
[A]"[B] Stosunek kj do k , nazwano stal rwnowagi, K^,. Naley zapamita nastpujce wane waciwoci ukadu w stanie rwnowagi: 1. Staa rwnowagi jest stosunkiem staych szybkoci reakcji ki/k_t. 2, W stanie rwnowagi szybkoci reakcji (nie stae szybkoci reakcji) w obie strony s rwne. Chocia w stanie rwnowagi nie zachodzi adna zmiana netto w steniu czsteczek substratu i produktu, A i B nieustannie przechodz w ABm i odwrotnie.
3. Rwnowaga jest stanem dynamicznym.
ENZYMY: KINETYKA / 103 Szybko4_i= k., [Enz] [PJ

V
to w wyraeniu dla cakowitej staej rwnowagi [Enz] znosi si.

K
------- '
c~
TL
J 2 .
IM
= k, _ [En] [P] = [P] *" [Enz] [S] [S]
Stenie enzymu nie ma zatem adnego wpywu
na sta rwnowagi. Mwic inaczej, skoro enzymy wpywaj na szybko reakcji, a nie na sta szybkoci, nie mog one wpywa na K.^, ktra jest stosunkiem starych szybkoci. K^
reakcji jest taka sama bez wzgldu na ta, czy rwnowaga jest osigana w wyniku (lub bez) katalizy enzymatycznej (naley sobie przypom -
-/f r! .
/A !
V
Ti
. . .
Ryc. 9-13. Wpyw stenia substratu na szybko reakcji katalizowanej enzymatycznie.
nie AG"). Enzymy zmieniaj drog reakcji, ale nie wpywaj na pocztkowe i kocowe rwnowane stenia substratw i produktw, czyn nikw, ktre determinuj Kî AG. SZYBKO POCZTKOWA REAKCJI KAT ALIZOWANEJ PRZEZ ENZYM JEST WPROST PROPORCJONALNA DO STENIA ENZYMU Szybko pocztkowa reakcji jest to szybko mierzona przed utworzeniem dostatecznej iloci produktu, pozwalajcej na zachodzenie reakcji odwrotnej. Szybko pocztkowa reakcji katalizowanej przez enzym jest zawsze proporcjonalna do stenia enzymu. Naley jednak zanotowa, e to stwierdzenie odnosi si tylko do szybkoci pocztkowej. W WIELU SYTUACJACH OZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM STENIE SUBSTRATU WPYWA NA SZYBKO REAKCJI KATALIZOWANEJ ENZYMATYCZNIE Reakcje enzymatyczne s tak rozpatrywane, jeeli maj 1 substrat i 1 produkt. Mimo e istnieje taki przypadek dla pewnych reakcji katalizowanych enzymatycznie, wikszo reakcji enzymatycznych ma 2 lub wicej substratw i produktw. Uwaga ta jednak nie uniewania omwienia. Jeeli zwiksza si stenie substratu [S], a wszystkie inne warunki pozostaj nie zmienione, to mierzona szybko pocztkowa V; (szyb-
maksymalnej Ym^ i nie przekracza jej (ryc. 9-13). Szybko reakcji zwiksza si wraz ze zwikszeniem stenia substratu, a do momentu, gdy enzym jest nasycony"' substratem. Mierzona szybko pocztkowa osiga warto maksymaln i nie ma na ni wpywu dalsze zwikszanie stenia substratu, poniewa substrat wystpuje w duym nadmiarze molowym w stosunku do enzymu. Na przykad, jeeli enzym o masie czsteczkowej 100 000 dziaa na substrat o masie czsteczkowej 100 i oba zwizki wystpuj w steniu 1 mg/ml, to 1000 mol. substratu przypada na kady mol enzymu. Bardziej realistyczne s niej podane proporcje wagowe enzymu do substratu:
[Enz]=0r1 ng/ml=1(T mol [S]= 0,1 mg/ml=10~ mol
3 9
co daje 106 mol wicej substratu w stosunku do enzymu. Nawet jeeli [S] zmniejszy si 100--krotnie, substrat jest w dalszym cigu w 10000--krotnym molowym nadmiarze w stosunku do enzymu. Sytuacje w punktach A, B i C 7. ryc. 9-13 s przedstawione na ryc. 9 -14. W punktach A i B tylko cz enzymu czy si z substratem, jakkolwiek jest duo wicej czsteczek substratu ni enzymu. Dzieje si tak dlatego, e staa rwnowagi dla reakcji Enz+S ^ EnzS (two rzenie kompleksu EnzS) nie jest nieograniczenie
dua. W punkcie A lub B zwikszenie lub zmniejszenie [S] bdzie zwiksza lut) zmniejsza ilo enzymu zwizanego z S, jako EnzS, i v f bdzie zatem zalee od |S|.
ko mierzona wtedy, kiedy przereagowao bardzo mao substratu) zwiksza si do wartoci
W punkcie C zasadniczo wszystkie czsteczki enzymu cz si z substratem tak, e dalsze zwikszenie [S], chocia zwiksza czsto zde-
104 / ROZDZIA 9
T*
.Q
By. 9-14. Przedstawienie enzymu przy maiym (A), duym (C)i przy steniu substratu rwnym Km (B). Punkty A, B i C odpowiadaj punktom z ryc. 9-13. _________________
re midzy Enz i S, nie moe spowodowa zwikszenia szybkoci reakcji, skoro nie ma wolnych czsteczek enzymu, ktre mogyby reagowa. Przypadek B opisuje sytuacj o duym znaczeniu teoretycznym, w ktrej dokadnie poowa czsteczek enzymu jest wysycona" sub-stratem. Szybko rwna si poowie szybkoci maksymalnej (Vmaks/2), ktra mogaby by osignita przy danym steniu enzymu. Rwnanie Michaelisa -Menten obrazuje wpyw stenia substratu na szybko wielu reakcji katalizowanych enzymatycznie
Stenie substratu, ktre powoduje osigniecie potowy szybkoci maksymalnej, okrelane war toci Km lub stal Michaelisa, mona oznaczy dowiadczalnie przez graficzne przedstawienie Vj jako funkcji [S] (ryc. 9-13). K m ma wymiary
A na ryc. 9-13 i 9-14). Dodanie [S] do K w mianowniku zmienia bardzo niewiele jego warto, tak e wyraenie [S] mona w mianowniku pomin. Poniewa W^^. i Km s stae, mona zastpi ich stosunek now sta, K:
v.
1. Gdy [S] jest znacznie mniejsze od K m (punkt
. [S]
[S]' Vj ^ [S]~K[S] (~ oznacza prawie rwna si").

Innymi sowy, jeeli stenie substratu jest znacznie mniejsze od tego, ktre jest wymagane do uzyskania poowy szybkoci maksymalnej (warto Kra), to szybko pocztkowa v t zaley od stenia substratu [S|. 2. Gdy |S| jest znacznie wiksze od K m (punkt C
stenia molowego. Gdy [S] jest prawie rwne Km, wwczas V; bardzo reaguje na zmiany [S] i enzym dziaa z dokadnie poow szybkoci maksymalnej. W rzeczywistoci wiele enzymw ma wartoci K.m zblione do fizjologicznego stenia ich substratw. Rwnanie Michaelisa-Menten
Vl
na ryc. 9-13 i ryc. 9-14). Dodanie K do [S] w mianowniku zmienia warto mianownika bardzo niewiele, tak e wyraenie Km mona w mianowniku pomin:
"maha.
Km+[S]
[S]
Oznacza to, e jeeli stenie substratu [Sj znacznie przewysza warto K, to szybko pocztkowa Vj jest szybkoci maksymaln,
'ntaks.'
V.nak..[S] Km + [S]
3. Gdy ISJ = *Cm (punkt B na ryc. 9-13 i ryc. 9-14),
opisuje zachowanie si wielu enzymw przy zmieniajcym si steniu substratu. Na podstawie rwnania Michaelisa-Menten zaleno pocztkowej szybkoci reakcji katalizowanej przez enzym od [S] i od Kra mona przedstawi nastpujco:
' K m+ [S]
2[S]
Oznacza to, e jeeli stenie substratu jest rwne wartoci Krai to szybko pocztkowa \-, rwna si poowie szybkoci maksymalnej. To take wskazuje, jak oznaczy Km, a mianowicie trzeba okreli dowiadczalnie stenie substratu, przy ktrym pocztkowa szybko stanowi poow szybkoci maksymalnej. Aby okreli warto Km i Vmaks. rwnanie Michaeiisa-Menten jest tak przeksztacane, aby wykres stanowia linia prosta Poniewa dla wielu enzymw krzywa nasycenia nie pozwala na atwe okrelenie Vm!lk5 (i std Kw), kiedy V; jest wykrelone wzgldem [S], wygodniej jest przeksztaci rwnanie Michaeli-sa-Menten tak, aby uproci wyznaczenie Km i Ymats.- Rwnanie Michaeiisa-Menten mona odwrci i przeksztaci nastpujco:
Vmakl. [S]
V| =
nych odwrotnoci, tj. odwrotno |(1/Vj) jest wykrelona wzgldem odwrotnoci [S] (1/[SJ). Z wykresu podwjnych odwrotnoci lub wykresu Lineweavera-Burka mona okreli Km (ryc. 9-15), wykorzystujc albo nachylenie krzywej i odcinek na osi y, albo odcinek na ujemnej
C. 9-15. Podwjna odwrotno albo wykres Lineweavera-Burka zaie2noci 1/v wzgldem 1/[S] wykorzystywany do okrelenia K m i y^k,,,.
po odwrceniu [SJ
[S]
po przeksztaceniu:
1 Km 1 [S] Vraak.. [S]
po uproszczeniu:
Km
vi VmakB,
1
[S]
Vmaks. Jest to
rwnanie linii prostej

y = a x+ b
gdzie:
y= za x =
[S]
czci osi x. Skoro [S] jest wyraone w steniu molowym, wymiarem Km jest stenie molowe lub liczba mol na litr. Szybko V; mona wyrazi w dowolnych jednostkach, poniewa K ra nie zaley od [EnzJ. Technika podwjnych odwrotnoci wymaga stosunkowo niewielu punktw dla okrelenia Km i jest metod najczciej uywan do wyznaczenia K,. Dowiadczalnie wykorzystanie rwnania Li n weavera-Burka do wyznaczenia Km moe spowodowa nieuzasadnione pooenie nacisku na dane otrzymane przy maych steniach substratu. Dzieje si tak wwczas, gdy stenia substratu, wybrane do badania, rni si sta przyrostu. Ta niedogodno moe by ominita przez selekcjonowanie odwrotnoci ste sub-stratw, ktre rni sie sta przyrostu. Innym podejciem do dowiadczalnego wyznaczenia Km i Vmaks jest podejcie Eadie i Hof-stee. Rwnanie Michaeiisa-Menten moe by przeksztacone:
Jeeli y lub l/v, jest wykrelony jako funkcja x lub l/[S], to b jest rwne l/VmakSi na osi y, a kt nachylenia a jest rwny K.aJVaiaks.- Ujemny odcinek na osi x mona okreli przez przyjcie y = 0. Wtedy
x = - = Km
Taki wykres jest nazwany wykresem podwj -
Aby wyznaczy Km i Y,,^. wykrela si Vj/[S] (o y) wobec \, (o x). Miejsce przecicia osi y wyznacza wwczas Vmaks /Km, a miejsce przecicia osi x Vmaks.. Nachylenie jest - 1/Km. Zarwno podejcie Linweavera-Burka i Ea-die-Hofstee s uyteczne w wybranych przypadkach, natomiast dokadne wyznaczenie Km i Vm!,ks. wymaga opracowania statystycznego.
106 / ROZDZIA 9
Wartoci K,,,, oprcz ich uytecznoci w interpretacji mechanizmw reakcji katalizowa nych enzymatycznie, maj due znaczenie praktyczne. Przy steniu substratu 100-krotnie przewyszajcym Km , enzym bdzie dziaa w zasadzie z maksymaln szybkoci i dlatego maksymalna szybko (Vmiks) bdzie odzwierciedlaa ilo obecnego aktywnego enzymu. Taka sytuacja jest oglnie podana w badaniach enzymw. Warto Km wskazuje, ile substratu naty uy w celu pomiaru VMk. Technika podwjnych odwrotnoci znajduje take szero kie zastosowanie w ocenie inhibitorw enzymw.
W szczeglnych przypadkach Km moe by zbliona do staej przyczania
wtedy
k*
W tych warunkach 1/Kro = 1/K^ = powinowactwo. Jeeli k2 + k_t ^ k_! to 1/K.m zbyt nisko oceni powinowactwo
RWNANIE HILLA PRZEDSTAWIA WPYW STENIA SUBSTRATU NA ENZYMY ALLOSTERYCZNE
Powinowactwo enzymu do substratu jest rwne odwrotnoci staej dysocjacjiKd kompleksu enzym-substrat (Enz).
_
Enz + S ;===* EnzS k-.
Pewne enzymy i inne biaka przyczajce ligandy, takie jak hemoglobina, nie dziaaj zgodnie z klasyczn kinetyk nasycenia Michaelisa-Menten. Jeeli [S] wykreli si wzgldem Vj, to krzywa nasycenia jest sigmoidalna (ryc. 9-16). Oglnie wskazuje to na kooperatywne
Mniejsza tendencja substratu i enzymu do dysocjacji wskazuje na wiksze powinowactwo enzymu do substratu. Warto Km enzymu dla jego substratu moe rwnie suy do pomiaru jego Kd. Jednak, aby to byo prawdziwe, zaoenie dokonane w przeksztaceniu wyraenia Michaelisa-Menten musi by suszne. Przeksztacenie zakada, e pierwszy etap reakcji katalizowanej enzymatycznie
Enz + S~EnzS k-i
jest szybki i zawsze w rwnowadze. Innymi sowy, szybko dysocjacji EnzS do Enz + S musi by duo wiksza od szybkoci dysocjacji enzym + produkt;
Enz S k2 k-2 ' Enz + P
[S]
Ryc. 9-16. Sigmoidalna kinetyka nasycenia.
W wyraeniu Michaelisa-Menten [S], ktre daje Vj = Vmik!./2 wynosi
Ale kiedy
-i >>
przyczenie substratu do licznych miejsc. Przyczenie w jednym miejscu wpywa na przyczenie w innych miejscach, jak opisano w rozdz. 7 dla hemoglobiny. W przypadku sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu substratem, omwione powyej metody graficznej oceny stenia substratu, ktre powoduje osignicie poowy szybkoci maksymalnej, s nie wartociowe (brak linii prostych). Aby oceni sigmoidalna kinetyk nasycenia, mona wykorzysta graficzne przedstawienie rwnania Hilla, rwnania, ktre pierwotnie wyprowadzono, aby opisa kooperatywne
przyczenie O2 do hemoglobiny. Opisane w formie linii prostej rwnanie Hilla jest nastpujce:
log = nlog [S] - log k'
V;
RNICA MIDZY KOM PETYCYJNYMI I NIEKOMPETYCYJNYMI INHIBITORAMI ENZYMW POLEGA NA TYM, CZY ZWIKSZAJCE SI STENIE SUBSTRATU USUWA HAMOWANIE
Chocia rozrnia si inhibitory aktywnoci enzymatycznej w zalenoci od tego, czy hamowanie ustpuje lub nie w wyniku zwikszenia stenia substratu, to jednak wiele inhibitorw nie wykazuje idealnych waciwoci czysto kom-petycyjnego i niekompetycyjnego hamowania omawianego poniej. Innym sposobem klasyfikacji inhibitorw jest podzia wedug ich miejsca dziaania. Miektre z nich wi si z en zymem w tym samym miejscu co substrat (miejsca katalityczne); inne wi si w innym miejscu (miejsce allosteryczne) z dala od miejsca katalitycznego.
gdzie k' jest stal zoon. Z rwnania wynika, e kiedy [S] jest mae w porwnaniu z k', to szybko reakcji zwiksza si jako n-ta potga [S]. Na rycinie 9-17 przedstawiono wykres Hilla
Log [S]
I Nachylenie n
-3
Inhibitory kompetycyjne wykazuj cise podobiestwo strukturalne do substratu

Klasyczne hamowanie kompetycyjne zachodzi w miejscu wizania substratu (katalitycznym). Chemiczna struktura inhibitora, analoga substratu (I), oglnie przypomina struktur substratu (S). czy si on zatem odwracalnie z enzymem, tworzc kompleks enzym-inhibitor (Enzl), a nie kompleks EnzS. Gdy jest obecny zarwno substrat, jak i ten typ inhibitora, wwczas wspzawodnicz one ze sob o te same miejsca wizania na powierzchni enzymu. Najlepiej zbadanym przypadkiem hamowania kompetycyjnego jest para: malonian (I) i bursz-tynian (S) w stosunku do dehydrogenazy bursz-tynianowej. Dehydrogenaza bursztynianowa katalizuje tworzenie fumaranu przez usunicie po jednym atomie wodoru z kadego atomu ot-wgla bursz-tynianu (ryc. 9-18).
Ryc. S-17. Graficzna ocena rwnania Hilla w celu oznaczenia stenia substratu, przy ktrym szybko, osiga potowe szybkoci maksymalnej. Stosowana wwczas, gdy kinetyka nasycenia substratem jest sigmoidalna.
danych kinetycznych dla enzymu z kinetyk wizania kooperatywnego. Wykres Vj/Vmaivj wzgldem log [S] daje lini prost o nachyleniu = n, gdzie n jest parametrem empirycznym, ktrego warto zaley od liczby miejsc wicych substrat oraz liczby i typu interakcji midzy tymi miejscami. Kiedy n = 1, miejsca wizania dziaaj niezalenie jedno od drugiego. Jeeli n > 1, to miejsca s kooperatywne i przy wikszej wartoci n kooperatywno jest silniejsza i wtedy bardziej sigmoidalne" s kinetyki nasycenia. Jeeli n<l, mwi si, e miejsca wykazuj negatywn kooperatywno. W p o o wi e s z yb k o ci mak s y mal n ej (vi = Vmai[S./2), Vi/(Variu.Vf)=l, a wic log Vj/(Vmak5 Vi)=Q, A zatem aby oznaczy S5,. (stenie substratu, przy ktrym szybko reakcji osiga poow szybkoci maksymalnej), naley wykreli lini prostopad do osi x z punktu, w ktrym log Vj/(m b.-v)=O-
H H-C-COO-
-2H
H-C-COO
-OOC-C-H
OOC--H
IH
DEHYDROGENAZA BURSZTYNIANOWA Bursztyn lan
Fu maran
Ryc. 9-18. R eakcj a dehydr ogenazy bur szt yni anowej.
108 / ROZDZIA 9
Malonian ("OOC-CH2 -COO") moe czy si z dehydrogenaz, tworzc kompleks EnzI. Maionian nie moe ulec odwodorowaniu, gdy nie ma adnego sposobu, aby usun nawet jeden atom H z pojedynczego atomu wgla a bez utworzenia picio wartociowe go atomu wgla. Jedyn reakcj, ktrej moe podlega kompleks EnzI jest rozpad z powrotem na wolny enzym i inhibitor. Dla reakcji odwracalnej
EnzI tEnz + I
staa rwnowagi
K= =
wynosi [I]
[EnzIJ
Ryc. 9-19. Wykres Linevueavera-Burka klasycznego kompetycyjnego hamowania. Naley zauway cakowite zwolnienie hamowania przy duym [S] (mae.1/[S]). y odpowiada 1/Vmats, to wiadczy o tym, e przy nieograniczenie duym steniu S (1/|S] = O), Vj jest taka sama, jak w nieobecnoci inhibitora.
Dziaanie inhibitorw kompetycyjnych mona zrozumie w formie nastpujcych reakcji:

Enzl (nieaktywny) Enz + P 'EnzS (aktywny) -> Enz+ p
Enz
Jednak odcinek na osi x (ktry odpowiada Km) zmienia si wraz ze steniem inhibitora i staje si wiksz liczb { 1/Kra jest mniejszy ni 1/K^,) w obecnoci inhibitora. W ten sposb
inhibitor kotnpetycyjny zwiksza sub-stratu. Poniewa Km jest
Szybko tworzenia produktu, to co jest gwnie mierzone, zaley wycznie od stenia EnzS. Zamy, e I przycza si do enzymu bardzo silnie (Ks = maa liczba). W takiej sytuacji jest mao wolnego enzymu (Enz) dostpnego do poczenia si z S, aby utworzy EnzS i ewentualnie Enz+P. Szybko reakcji (two rzenie P) bdzie bardzo maa. Z analogicznych powodw rwne stenie sabiej wizanego inhibitora (Kj = wiksza liczba) nie zmniejszy tak znacznie szybkoci katalizowanej reakcji. Przypumy, e przy staym steniu I doda si wicej S. Zwikszy to prawdopodobiestwo, e Enz bdzie raczej czy si z S ni z I. Wzronie stosunek EnzS do EnzI, a take szybko reakcji. Przy dostatecznie duym steniu S, stenie Enzl powinno by znikomo mae. Jeeli tak jest, to szybko katalizowanej reakcji bdzie taka sama, jak w nieobecnoci I (ryc. 9-19). Efektywno rnych inhibitorw kompetycyjnych jest oceniona przez wykres podwjnych odwrotnoci 1/v; wzgldem 1/[S] Rycina 9-19 przedstawia typowy przykad hamowania kompetycyjnego pokazany graficznie w formie wykresu Lineweavera-Burka. Przy staym steniu inhibitora mierzono szybko reakcji (v,) przy rnych steniach S. Linie przeprowadzone przez punkty dowiadczalne zbiegaj si przy osi y. Poniewa odcinek na osi
steniem substratu, w ktrym stenie wolnego enzymu jest rwne steniu enzymu wystpujcego jako EnzS, spora ilo wolnego enzymu moe si czy z inhibitorem. W przypadku prostego hamowania kompetycyjnego miejsce przecicia na osi x daje si przedstawi
Km
(K)
Km moe by oznaczone w nieobecnoci I, a K; okrela si wykorzystujc powysze rwnanie. Jeeli liczba moli dodanego I jest duo wiksza ni liczba moli obecnego enzymu, to stenie I mona przyj jako stenie (znane) dodanego inhibitora. Wartoci Ks dla serii inhibitorw (kompetycyjnych) bdcych analogami sub-stratw wykazuj, ktre z nich s najbardziej efektywne. Przy maych steniach
najwiksz y stopie zahamowania bd powodoway inhibitory o najmniejszych wartociach Kj.
Wiele skutecznych klinicznie lekw dziaa jako inhibitory kompetycyjne wanych enzymw w komrkach mikroorganizmw i zwierzt.
Odwracalne niekompetycyjne inhibitory zmniejszaj V ma ki.' ale nie wpywaj na K m Jak sama nazwa wskazuje, w tym przypadku nie ma konkurencji midzy S i I. Inhibitor zazwyczaj nie wykazuje adnego albo mae podobiestwo do S i mona przyj, e wie si z inn domen enzymu. Odwracalne niekom-petycyjne inhibitory zmniejszaj
szybko maksymaln, osigaln przy danej iloci enzymu (zmniejszaj Vraaka), ale zazwyczaj nie wpywaj na Km. Poniewa I i S mog czy
si w rnych miejscach, jest moliwe tworzenie zarwno kompleksw Enzl, jak i EnzIS. Poniewa EnzIS moe si rozpa, tworzc produkt z mniejsz szybkoci ni EnzS, reakcja moe by spowolniona, ale nie zatrzymana. Mog zachodzi nastpujce reakcje konkurencyjne:
1
jony metali cikich (Ag+, Hg2+), czynniki utleniajce itd. Poniewa te inhibitory nie wykazuj strukturalnego podobiestwa do substra-tu, zwikszenie stenia substratu na og nie zmniejsza tego hamowania. Obecno jednego lub wicej substratw lub produktw moe chroni enzym przed inaktywacj. Omawiana powyej analiza kinetyczna moe by niewystarczajca do odrnienia przedstawionych trucizn od odwracalnych inhibitorw niekom-petycyjnych. W kadym razie odwracalne nie-kompetycyjne hamowanie zdarza si rzadko. Niestety nie jest to zawsze uchwycone, poniewa zarwno odwracalne, jak i nieodwracalne hamowanie niekompetycyjne wykazuje podob n kinetyk. AKTYWNO KLUCZOWYCH ENZYMW MOE BY REGULOWANA PRZEZ POZYTYWNE I NEGATYWNE CZSTECZKI MODULATOROWE Mae czsteczkowe modulatory, ktre zmniejszaj aktywno katalityczn, s okrelane jako modulatory negatywne, a te, ktre zwikszaj aktywno, s nazywane modulatorami pozytywnymi. To zagadnienie jest omawiane w nastpnych rozdziaach.
EnzIS -> Enz +P
1
Enz
Jeeli S ma takie samo powinowactwo zarwno do Enz, jak i do Enzl (I nie wpywa na powinowactwo Enz do S), to otrzymuje si wyniki przedstawione na ryc. 9-20 w formie wykresu zalenoci l/vj wzgldem 1/ [S] w obecnoci i nieobecnoci inhibitora. (Zakada si, e po przyczeniu I nie ma adnych wanych zmian w konformacji miejsca aktywnego).
PIMIENNICTWO
Bender ML, Bergeron RJ, Komiyama M: The Bioorgani Chemistry of Enzymatic CataJysia. Wiley-[nierscience, 1984. Cabral F, Barlow SB; Mechanisms by which mammalian cells aequire resistance to drugs that affect microLubule assembly. FASEB J 1988;3:1593. CechTR: RNA as anenzyme. Sci Amer 1986;255:64. Dugas H, Penny C: Bioorganic Chemistry: A Chemicat ApproachtoEnzyme Action. Springer-Verlag, 1981. Fersbt AR, Leatherbarrow RJ, Wells TNC: Binding energy a.nd catalysis: a lesson from protein engineering of the tyrosyl-tRNA synthetase. Trendu Biochetn Sci 1986;11:321. Freeman RB, Hawkins HC (editors): Tne Enzymology of PosttransiatiOrial ModiftcatiOn ofProteins, Academic Press, 1985. Segel IH: Emyme Kinetks. Wiley, 1975. Walsh CT: Suicide substrates, mechanism-based enzyme inactivators; recent dcvelopments. Amiu Rev Biochem 1984;53:493. Patrz take pimiennictwo w rozdz. 7.
_L
(Sl Ryc. 9-20. Wykres Lineweavera-Burka odwracalnego nie kom petycyjnego hamowania.
Wiele trucizn" dziaa jako nieodwracalne, ni ekom petycyjne inhibitory aktywnoci enzymatycznej Aktywno enzymatyczn redukuj dziaajce na enzymy trucizny", np. jodoacetamid,
10
Yictor W, Rodwell, PhD
Enzymy: mechanizmy dziaania
WPROWADZENIE
W rozdziale tym, w celu zilustrowania zasad reakcji enzymatycznych, przedstawiono w szczegach reakcj katalizowan przez enzym proteolityczny chymotrypsyn.
Przedmiotem bada mechanizmw dziaania enzymw s zmiany molekularne towarzyszce przeksztaceniu substratu w produkt. Rokuj one wielk nadziej na waciwy sposb postpowania podczas leczenia, jak rwnie opracowywania lekw. Wyniki anaiizy rentgeno-graficznej struktury biaek, w poczeniu z danymi odnonie do mechanizmw katalizy enzymatycznej, ju obecnie umoliwiaj opracowywanie iekw hamujcych swoiste enzymy, takie jak reduktaza HMG-CoA, ktra reguluje biosyntez cholesterolu. Badania te sugeruj rwnie sposb wykorzystania technik rekombinacji DNA oraz ukierunkowanej mutagenezy w celu zmodyfikowania swoistoci i (lub) aktywnoci katalitycznej enzymu. Techniki te zapewni uatwi wprowadzenie enzymw o danych waciwociach.
Tyr, Trp) lub z aminokwasw z du grup niepolarn R (Met). Podobnie jak wiele innych proteaz, chymo-trypsyna katalizuje hydroliz niektrych estrw. Chocia zdolno chymotrypsyny do katalizowania hydrolizy estrw nie jest istotna z fizjologicznego punktu widzenia, umoliwia ona badania mechanizmu katalizy enzymatycznej. Zmiany molekularne zachodzce podczas katalizy okrelane s mianem intermediary en-zymology". Syntetycznym substratem, pozwalajcym na kolorymetryczn analiz aktywnoci chymotrypsyny, jest octan />-nitrofenylu (ryc. 10-1).
Ryc. 10-1. Octan p-mtrofenylu
W wyniku hydrolizy octanu p-nitroienylu uwalnia si/f-nitrofenol, ktry w rodowisku zasadowym przeksztaca si w ty anion^-nitrofeno-lanowy.
MECHANIZM DZIAANIA CHYMOTRYPSYNY ILUSTRUJE OGLNE CECHY KATALIZY ENZYMATYCZNEJ

Chymotrypsyna katalizuje hydroliz wiza peptydowych, w ktrych grupa karboksylowa pochodzi z aminokwasw aromatycznych (Phe,
KINETYKA REAKCJI STOP-FLOW" UJAWNIA MECHANIZM DZIAANIA CHYMOTRYPSYNY

Kinetyk reakcji hydrolizy octanu /J-nitrofe-nylu mona bada za pomoc aparatu stop --tiow". W dowiadczeniach stop-flow" ilo enzymu odpowiada iloci substratu (w przy-
ENZYMY: MECHANIZMY DZIAANIA / 111
blieniu rwnomolowe iloci enzymu i sub-stratu), a oznaczenie dotyczy zdarze zachodzcych w pierwszych kilku milisekundach po zmieszaniu enzymu i substratu. Aparat stop --flow" jest wyposaony w 2 strzykawki: jedna przeznaczona na chymotrypsyn, a draga na octan />-nitrofenylu. Natychmiastowe zmieszanie enzymu i substratu nastpuje za pomoc urzdzenia mechanicznego, ktre szybko i rwnoczenie usuwa zawarto obu strzykawek do jednej, wskiej probwki. Probwka przesuwa si przez spektrofotometr i warto absorbancji, jako funkcja czasu, ukazuje si na ekranie oscyloskopowym. Uwalnianie anionu p-nitrof enolanowego ma charakter dwufazowy Uwalnianie anionu /j-nitrofenolanowego przebiega w 2 wyranych fazach (ryc. 10-2): 1)
w kategoriach kolejnych etapw katalizy przedstawionych na ryc. 10-3, Wolny etap reakcji katalizowanej przez chymotrypsyn odpowiada hydrolizie kompleksu chymotrypsyna-octan (CT-Ac) Z chwil zwizania chymotrypsyny w kompleks CT-Ac dalsze uwalnianie anionu p-nit-rofenolanowego zaley od regeneracji wolnej chymotrypsyny w wyniku hydrolizy tego kompleksu (ryc. 10-3). Faza szybka uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego (ryc. 10-2) odpowiada przeksztaceniu caej dostpnej chymotrypsyny w kompleks CT-Ac, z rwnoczesnym uwolnieniem anionu/>-nitrofenolanowego. Nastpujce po niej dalsze odszczepianie anionu p-nilTO fenol ano wego (PNP) jest uzalenione od wolnego odzyskiwania chymotrypsyny z kompleksu CT-Ac. Uwolniona chymotrypsyna ponownie reaguje z PNP, tworzc kompleks CT--Ac i anion /j-nitrofeno anowy. Szybko reakcji w fazie szybkiej (tj. liczba moli uwolnionego anionu jc-nitrofen o anowego) jest wprost proporcjonalna do liczby moli chymotrypsyny w momencie rozpoczcia reakcji. Kluczow rol w reakcji katalizowanej przez chymotrypsyn odgrywa seryna 195 W kompleksie CT-Ac grupa acylowa jest poczona z bardzo reaktywn reszt seryny, znajdujc si w pozycji 195 chymotrypsyny. Dowodem szczeglnej roli i duej reaktywnoci Ser 195 (w porwnaniu z pozostaymi 27 resztami serynowymi chymotrypsyny) jest jej reakcja z diizopropylofluorofosforanem (DIPF) (ryc. 10-4). Przyczenie DIPF do Ser 195 powoduje inaktywacj chymotrypsyny. Analogicznie inaktywacji przez DIPF ulega wiele innych proteaz okrelanych mianem proteaz sery nowych.
Faza stacjonarna
i
Czas (ms)
Ryc. 10-2. Kinetyka uwalniania anionu p-nitro-fenolanowego w wyniku hydrolizy octanu /)-nitro-fenytu katalizowanej przez chymotrypsyn. Ilo uwolnionego fenolu" wyliczono na podstawie absorbancji.
w fazie szybkiego uwalniania i 2) nastpujcej po niej fazie wolniejszego uwalniania dalszych anionw />-nitrofen olano wy ch. Dwufazowy charakter uwalniania anionu /7-nitrofenolanowego jest w peni zrozumiay
Fenol
Ac
CT + PNP
Szybko
CT-PNP
J * C T -Ac -^ -------------------------------------- ^ t Szybko
CT
Wolne
Ryc. 10-3. Porednie etapy hydrolizy octanu p -nitrofenylu katalizowanej przez chymotrypsyn, CT chymotrypsyna, PNP octan p-nitrofenyfu; CT-PNP kompleks: chymotrypsyna-octan p-nitrofenylu; CT-Ackompleks: chymotrypsyna-octan (acetylochymotrypsyna);feno!-anionp-nitrofenolanowy: Ac~ anion octanowy. Tworzenie kompleksw CT-PNP i CT-Ac w stosunku do hydrolizy kompleksu CT-Ac przebiega s^ybko. __________________________________
112 / ROZDZIA 10
V ? Enz-CHjOH +F-P-O ?
EnzCH, O P=O
czna sekwencja zdarze ma miejsce podczas hydrolizy fizjologicznych substratw chymotrypsyny, takich jak peptydy. WIELE PROTEAZ WYDZIELA SI W POST ACI NIEAKTYWNYCH PROENZYMW, CZYLI ZYMOGENW Wiele biaek jest syntetyzowanych w postaci nieaktywnych prekursorw okrelanych jako probiaka. W przypadku gdy biaka te s enzymami ich probiaka nazywane s proenzyma-tni lub zymogenami. Przeksztacenie probiaek w aktywne biaka nastpuje w wyniku jedno -lub kilkustopniowej swoistej proteolizy. Biakami syntetyzowanymi w formie probiaek s np. insulina (probiako=proinsulina), enzymy trawienne: pepsyna, trypsyna i chymotrypsyna (odpowiednie probiaka = pepsynogen, trypsy-nogen, chymotrypsynogen), czynniki krzepnicia krwi i fibrynoiizy (p. rozdz. 58) oraz biatko tkanki cznej kolagen (probiako = prokola-gen). Przeksztacenie proch ymotry psy ny (pro--CT), 245-aminokwasowego polipeptydu, w aktywn a-chymotrypsyn przebiega przez form poredni znan jako chymotrypsyna U (7C-CT) {ryc. 10-6). W chymotrypsynie a acuchy A, B i C (ryc. 10-6) s poczone ze sob 2 mostkami disiarcz-kowymi (ryc. 10-7). Proenzymy umoliwiaj szybkie uruchomienie aktywnych form w momencie zapotrzebowania fizjologicznego Jaka jest przyczyna syntezy niektrych biaek w formie nieaktywnej? Podczas gdy jedne biaka s wykorzystywane w organizmie stale, inne (np. enzymy krzepnicia krwi i fibrynoiizy) tyiko czasami, ale wwczas enzymy te s po -
Ryc. 10-4. Reakcja pierwszorzdowej grupy hydroksylowej Ser 195 chymotrypsyny z diizopropylofluorofosforanem (DIPF).___________________________________________________________
W reakcji katalizowanej przez chymotrypsyn 3 aminokwasy tworz system przekazywania adunku W reakcji hydrolizy katalizowanej przez chymotrypsyn szczegln role odgrywaj 3 reszty aminokwasowe, ktre, mimo e zajmuj odlege w stosunku do siebie miejsca w sensie struktury pierwszorzdowej, znajduj si w pozycjach pozwalajcych na tworzenie midzy nimi wiza w sensie struktury trzeciorzdowej. S to Asp 102, His 57 i Ser 195. Podczas gdy wikszo naadowanych reszt aminokwasowych jest umiejscowiona na zewntrz czsteczki, 3 oddziaujce ze sob reszty s ukryte w niepo-larnym wntrzu czsteczki, tworzc ukad: Asp 102 His 57 Ser 195. Aminokwasem, ktry ulega acylacji podczas reakcji katalizowanej przez chymotrypsyn, jest Ser 195. Zblienie anionu octanowego (pochodzcego z octanu /)-nitrofeny)u) do tlenu grupy OH* Ser 195 wyzwala reakcj przeniesienia protonu z Ser 195 poprzez His 57 na Asp 102 (ryc. 10-5), C O"--"H-N^N---H O Ser
u: . ic
1
Sub- (tj. AG")
CO H- N
N H
O-Ser
U _0A
Ryc. 10-5. Przeniesienie protonu w chymotryp-synie podczasacylacji Ser 195 przezsubstrat (Sub').
Podczas deacylacji intermediatu acylo-Ser 195 (enzym) protony przekazywane s w przeciwnym kierunku. Przypuszcza si, e analogi* Przyp. tum.

1 13 146 149
245
Pro-CT
13/^415 16_
146 /
f 149
245
CT
13
16
146
149
245
tt-CT
Ryo. 10-6. Przeksztacenie prochymotrypsyny (pro - CT) w chymotrypsyn n (it- CT) i w peni aktywn enzymatycznie chymotrypsyn ot (ct -CT). ______
S ---- S
Ryc. 10-7. W ewntrzacucho we i rnidzyacucho we wizania disiarczko we w chymo trypsynie a ( -CT). __________________________________________________________________________________
trzebne natychmiast. Pewne procesy fizjologiczne, takie jak trawienie, s sporadyczne, przy czym czsto regularne i moliwe do przewidzenia (chocia nie jest to regu u ludzi prymitywnych). Inne natomiast, jak krzepnicie krwi i fibrynoliza, zachodz tylko w przypadku zadziaania okrelonych czynnikw fizjologicznych lub patologicznych, przy czym do zachowania hemostazy musz one by skoor dynowane w czasie. Ponadto synteza proteaz w formie nieaktywnych prekursorw zabezpiecza tkanki, w ktrych s one wytwarzane (np. trzustk) przed samotrawieniem. (Samotrawie-nie moe zachodzi w przypadku zapalenia trzustki). Synteza de novo niezbdnych w danym momencie biaek, przy zaoeniu, e byaby dostpna odpowiednia pula aminokwasw, mogaby przebiega niewystarczajco szybko w stosunku do potrzeb organizmu indukowanych czynnikami chorobotwrczymi, np. utrat krwi. Rwnie sam proces wydzielania mgby by zbyt wolny w stosunku do potrzeb.
Aktywacja prochymotrypsyny polega na swoistej proteolizie Przeksztacenie probiaek w fizjologicznie czynne biaka przebiega wedug nastpujcych zasad: 1. Przeksztacenie polega na swoistej proteo lizie, ktra moe dotyczy hydrolizy tylko poje dynczego wizania. 2. Produkty proteolizy mog zosta rozdzie lone lub pozosta razem w ostatecznym biaku. 3. Proces moe (lub nie) prowadzi do znacz nej zmiany masy czsteczkowej. 4. Podstawow konsekwencj swoistej pro teolizy jest nowa konformacja. 5. Jeli probiako jest enzymem, to zmiana konformacji powoduje powstawanie miejsca katalitycznego. W przypadku proenzymw wy bircza proteoliza moe by rozpatrywana jako proces, ktry uruchamia zmiany konformacyj ne tworzce" miejsce katalityczne. Wybircza proteoliza prochymotrypsyny (chymotrypsynogenu) umoliwia zblienie 3 reszt aminokwasowych tworzcych system przekazywania adunku. W chymotrypsynie a His 57 i Asp 102 znajduj si w acuchu B, a Ser 195 w acuchu C (ryc. 10-6).
8 Biochemia
114 / ROZDZIA 10
WIZANIE SUBSTRATU PRZEZ SWOISTE ENZYMY ODBYWA SI W SPOSB PRZYPADKOWY LUB UPORZDKOWANY
Wikszo enzymw katalizuje reakcje midzy 2 lub wicej substratami, dostarczajc 1 lub wicej produktw. Pewne enzymy wymagaj obecnoci wszystkich substratw rwnoczenie, inne natomiast wi najpierw jeden substrat, a nastpnie katalizuj jego reakcj z drugim substratem. Sposb w jaki enzymy wi sub-straty moe by przypadkowy lub
uporzdkowany (ryc. 10-8).
Wiele reakcji, wymagajcych udziau koenzymw, przebiega za pomoc mechanizmu okrelanego jako ping-pong" (enzym wyst puje na przemian w formie E i E x) (ryc. 10-9 i 10-10). Chocia pewne koenzymy s czsto rozpat rywane jako drugi substrat, inne (np. fosforan pirydoksalu) s zwizane z enzymem kowalen-cyjnie lub niekowalencyjnie tak silnie, e ich dysocjacja praktycznie nie wystpuje (np. difos-foran tiaminy). W tych przypadkach kompleks enzym-koenzym jest rozpatrywany jako enzym.
RESZTY AMINOKWASOWE W MIEJSCU KATALITYCZNYM MOG FUNKCJONOWA JAKO KATALIZATORY KWASOWO-ZASADOWE

Z chwil zwizania substratu w miejscu katalitycznym naadowane (lub zdolne do naado wania) grupy funkcyjne acuchw bocznych aminokwasw, znajdujcych si w bliskim otoczeniu, mog bra udzia w katalizie, dziaajc na zasadzie katalizatorw kwasowych lub zasadowych. Istniej 2 odrbne rodzaje katalizy enzymatycznej kwasowo-zasadowej: oglna i swoista. Reakcje, ktrych szybko zmienia si wraz ze zmian stenia jonw H+ lub H3O+, a jest niezalena od stenia innych kwasw lub zasad znajdujcych si w roztworze, uwaa si za
podporzdkowane swoistej katalizie kwasowej
P EA-E'P 'P * >E'
C. 10-8. Przypadkowe i uporzdkowane przyczanie substratw A i B i oddysocjowywanie pro duktw P i Q od enzymu E.
Ryc. 10-9. Oglny mechanizm ping-pong" kata lizy enzymatycznej _______________
lub zasadowej. Natomiast reakcje, ktrych szybko jest uzaleniona od wszystkich kwasw (donorw protonw) lub zasad (akceptorw protonw) obecnych w roztworze uwaa si za podporzdkowane oglnej katalizie kwasowej lub zasadowej.
E-CHO
E-CH,NH,
CHO Glu
Glu
E-CHO
Ryc. 10-10. Mechanizm ping-pong" w reakcji transaminacjt. ECHO i E-CH2NH2 reprezentuj odpowiednio kompleksy enzym-fosforan pirydoksalu i enzym-fosforan pirydoksaminy. (Alaalanina; Pyr pirogronian; KG a-ketoglutaran; Glu glutaminian). ___
Ogln i swoist kataliz kwasowo- zasadow pozwala odrni pomiar szybkoci reakcji w buforach o rnych wartociach pH i stenia Jeeli przy staym steniu buforu szybko reakcji zmienia si wraz ze zmian pH roztworu, to reakcj okrela si jako swoicie katalizowan przez zasad (jeeli pH jest powyej 7) lub swoicie katalizowan przez kwas (jeeli pH jest poniej 7). Jeeli natomiast przy staym pH szybko reakcji zmienia si wraz ze zmian stenia buforu, to reakcj okrela si jako ogln kataliz zasadow (w przypadku, gdy pH jest powyej 7) lub ogln kataliz kwasow (w przypadku, gdy pH jest poniej 7). Przykadem swoistej katalizy kwasowej moe by przeksztacenie substratu (S) w produkt (P). Przybiega ono w 2 etapach etapie szybkiego, odwracalnego transferu protonu:
S+
S + Imidazol
H+ -* SH+ + Imidazol
przebiega wolno, determinujc szybko reakcji. Na uwag zasuguje fakt, e wraz ze zmian mechanizmu katalizy kwasowej ze swoistego na oglny nastpuje odwrcenie etapw szybkiego i wolnego. Matematyczne przedstawienie szybkoci reakcji oglnie katalizowanej przez kwas jest czsto bardzo skomplikowane. WIZANIE SUBSTRATU I KAT ALIZ MOG UMOLIWIA JONY METALU Ponad 25% wszystkich enzymw zawiera silnie zwizany jon metalu, ktry jest niezbdny do ich aktywnoci. Funkcje jonw metali w katalizie enzymatycznej bada si za pomoc analizy rentgenograficznej, spektroskopii MRI (ma-gnetic resonance imaging) oraz ESR (electron spin resonance). Wyniki tych bada, w poczeniu ze znajomoci tworzenia i rozpadu kompleksw metali i reakcji w obrbie sfer koordynacyjnych jonw metali, pozwalaj na okrelenie funkcji jonw metali w reakcjach katalizowanych przez enzymy. Metsuoenzymy zawieraj okrelon liczb funkcyjnych jonw metalu, ktre nie s usuwane podczas oczyszczania enzymu. Enzymy aktywowane przez metale wi natomiast metal sabiej, jednak jest on niezbdny do ich funkcji katalitycznej. Powinowactwo okrelonego en zymu do jonu metalu jest wic podstaw rozrnienia midzy metaloenzymami i enzymami aktywowanymi przez metale. Mechanizmy dziaania jonw metali zarwno w przypadku metaloenzymw, jak i enzymw aktywowanych przez metale s podobne. W katalizie enzymatycznej funkcjonuj trjskadnikowe kompleksy zawierajce metal W wyniku poczenia miejsca aktywnego enzymu (Enz), jonu metalu (M) i substratu (S) w stosunku 1:1:1 tworz si trjskadnikowe kompleksy. Moliwe s 4 sposoby pocze midzy tymi skadnikami:
MEnzS EnzSM Kompleks z mostKompleks z mostkiem kiem utworzonym utworzonym przez przez enzym substrat
oraz nastpujcym po nim wolniejszym i dlatego determinujcym szybko reakcji, etapie zamiany zawierajcego proton substratu w produkt:
SH + H,O-*P+ H 30
+ +
Zwikszenie stenia jonu hydronowego <H3O+) powoduje zwikszenie szybkoci reakcji na skutek zwikszenia stenia SH+, czyli substratu dla etapu okrelajcego szybko reakcji. Wyraajc matematycznie: dfP] Szybko = ' = k[SH+] dt gdzie: P = stenie produktu, t = czas, k = swoista staa szybkoci i [SH+] = stenie kwasu sprzonego w substracie. Poniewa stenie SH+ zaley od stenia S i stenia H3O+ szybko reakcji swoicie katalizowanej przez kwas wyraa si oglnie jako
^ = k' [ S ] [ H 3 0 ] dt
+
Rozpatrzmy sytuacj, w ktrej oprcz opisanej powyej swoistej katalizy kwasowej, w buforze, np. imidazolowym, zachodzi rwnie kataliza poprzez jon imidazolowy. Imidazol, bdc sabym kwasem (pKa ok. 7), jest sabym proto-nodawc i powoduje, e etap
116 / ROZDZIA 10
EnzMS Kompleks z mostkiem Cykliczny kompleks utworzonym przez z mostkiem utworzonym przez metal metal
Uwaa si, e w reakcjach fo sfo transferu funkcja jonw metali polega na aktywacji atomw fosforu i tworzeniu polifosforanowoade-ninowych kompleksw o charakterystycznej konformacji w aktywnych ukadach czteroska-dnikowych.
Kompleksy z mostkiem utworzonym przez metal: EnzMS lub Enz
W przypadku enzym w aktywowanych przez metale mog si tworzy kompleksy wszystkich 4 typw. Metaloenzymy nie tworz natomiast kompleksu typu EnzSM, poniewa silnie zwizany z enzymem metal stanowi ju kompleks EnzM. Wyniki bada pozwalaj obecnie na nastpujce uoglnieni a: 1. Wikszo, ale nie wszystkie, kinaz (fosfotransferaza: ATP) tworzy kompleksy z most kiem przez substrat typu EnznukleotydM. 2. Fosfotransferazy dziaajce na pirogro nian lub fosfoenolopirogronian, enzymy katali zujce inne reakcje fosfoenolopirogronian u oraz karboksylazy tworz kompleksy z most kiem poprzez metal. 3. Dany enzym moe tworzy rne typy kompleksw w zalenoci od substratu.
Kompleksy z mostkiem utworzonym przez enzym (MEnzS)
W kompleksach tego typu metale odgrywaj przypuszczalnie ro] strukturaln utrzymujc aktywn konformacj (np. syntetaza glutami nowa) lub tworzc mostek z substratem (np. kinaza pirogronianowa). W kinazie pirogronia-nowej jon metalu, oprcz funkcji strukturalnej, aktywuje ponadto jeden substrat (ATP), ktry utrzymuje w okrelonej pozycji.
Wyniki bada krystalograficznych i analizy sekwencji aminokwasw wykazay, e reszt wic metal w aktywnym miejscu wielu biaek jest His (rip. karboksypeptydaza A, cytochrom c, rubredoksyna. metmioglobina i methemo-globina; p. rozdz. 7), W dwuskadnikowych kompleksach EnzM etapem ograniczajcym szybko wizania jest czsto odczenie wody ze sfery koordynacyjnej jonu metalu. Dla wielu peptydaz aktywacja jonami metalu jest powoJ-nym, trwajcym wiele godzin procesem, pro wadzcym do utworzenia aktywnej konfcrrma-cji dwuskadnikowego kompleksu. Wizanie metalu:
Szybko Enz M<Hit0).-ll+nrljt0
Przeksztacenie w aktywn strukturalnie form (Enz*):
Kinaza pirogronianowa ------ATP Kreatyna Kompleksy z mostkiem utworzonym przez substrat (EnzSM)
Powstawanie trjskadnikowego kompleksu w przypadku mctalocnzymw polega na przyczeniu substratu (S) do dwuskadnikowego kompleksu EnzM;
EnzM+S Enz MS lub Jony metai odgrywaj rnorodne funkcje w katalizie
z^
Utworzenie trjskadnikowych kompleksw enzymu, metalu i substratu w przypadku trifos-foranw nukleozydw przypisuje si wyparciu przez ATP wody ze sfery koordynacyjnej metalu:
ATP
S
+ M(H aO) ÂTP M(H aO)|- + 3HaO
a nastpnie zwizanie z enzymem; ATP MfHÔ)!"+ EnzÊnzATPWHHjO);-
Jony metali mog bra udzia w kadym z 4 znanych mechanizmw zwikszenia szybkoci reakcji chemicznej przez enzymy: 1) oglnej katalizie kwasowo-zasad owej, 2) katalizie kowalencyjnej, 3) zblieniu reagujcych zwizkw oraz 4) indukcji zmian strukturalnych w enzymie lub substracie. Oprcz elaza, funkcjonujcego w hemoproteinach, najczciej zwi-
zanymi z kataliz enzymatyczn s Mg-2"1", Mn2"1", Ga2*, chocia w przypadku niektrych enzymw mog to by rwnie jony innych metali (np, K+ ). Jony metali, podobnie jak protony, speniajc funkcj kwasw Lewisa (zwizkw elektrofilo-wych) mog. uczestniczy w tworzeniu pary elektronw wizania sigma. Mona je rwnie
Funkcja jonu metalu Enzym Tabela 10-1. Wybrane przykady funkcji jonw metaii w mechani2mie dziaania enzymw* Amoniako-liaza histy-dynowa Kinazy, liazy, dekarbok-sylaza pirogronianowa Maskowanie grupy nuk-leofilowej Aktywacja grupy elek-trof iowej
Aktywacja grupy Dehydrataza wglanowa nukleo-filowej Metal peni funkcj Enzymy kobamidowe nuk-leoftlu
Usunicie elektronu TT Karboksylaza pirogronianowa, karboksypeptyda-za, dehydrogenaza alko- Oddawanie etektronu % holowa Niehemowe biaka zaGromadzenie i ustawiawierajce elazo nie ligandw Kinaza pirogronianowa, karboksylaza pirogronianowa, kinaza Zmiany konformacji adenylano-wa Fosf otr nsf eraza, izome-raza ksylozowa, hemo-proteiny * Zaadaptowane z: Mildvan AS, Metals in en-zyme catalysis, t. 2, str. 456, w The Enzymes, Boyer PD, Lardy H, Myrback K (red.), Academic Press, 1970.
rozpatrywa jako^.superkwasy", poniewa wystpuj w rodowisku obojtnym, maj adunek dodatni powyej 1 i mog tworzy wizania pi. Ponadto (w przeciwiestwie do protonw) mog suy jako trjwymiarowa matryca do ustawienia grup zasadowych enzymu lub substratu w okrelonej pozycji. Jony metali, bdc akceptorami elektronw przez wizania sigma lub pi, mog aktywowa grupy elektrofilowe oraz nukleofilowe (oglna kataliza kwasowo-zasadowa). Oddajc elektrony jony metali mog z kolei aktywowa grupy nukleofilowe lub same funkcjonowa jako nuk-leofile. Poprzez sfer koordynacyjn metale mog powodowa zblienie enzymu i substratu lub w wyniku pocze chelatowych zmiany konformacyjne w enzymie czy substracie. Ponadto jony metalu mog maskowa" grupy nukleofilowe zapobiegajc w ten sposb reakcji ubocznej, ktra przebiegaaby prawdopodob nie w ich nieobecnoci. Wreszcie jony metali poprzez sfer koordynacyjn mog funkcjonowa jako trjwymiarowa matryca utrzymujca reagujce grupy w okrelonej orientacji prze strzennej, co ma decydujce znaczenie w stereo-chemicznej kontroli przebiegu katalizowanej przez enzym reakcji (tab. 10-1).
PIMIENNICTWO
Fersht A: Enzyme Structure and Meckanism, 2nd ed. Freeman, 1985. Freeman RB, Hawkins HC (editors): The Enzymotogy oj'Past-translationalModification ojProteins, Academic Press, 1985. Purith DL (editor): Enzyme kinetics and mechanisms. Parts A and B in: Methods in Enzymoogy. Vol 63, 1979; Vol 64; 1980. Academic Press. Patrz take pimiennictwo w rozdz, 7 i 8
11
WPROWADZENIE
W rozdziale tym, na podstawie wybranych przykadw, przedstawiono udzia enzymw w regulacji procesw metabolicznych. Przykady ilustrujce odmienne mechanizmy regulacji metabolizmu zaprezentowano w innych rozdziaach tego podrcznika.
Enzymy: regulacja aktywnoci

Victor W. Rodweii, PhD
Indukcja enzymw stanowi biochemiczn pod -
staw interakcji lekw, a wic sytuacji, w ktrej podanie jednego leku powoduje znaczne zwikszenie metabolizmu innego leku.
REGULACJA METABOLIZMU ZAPEWNIA HOMEOSTAZ

Wysunita przez Claude Bernarda pod ko niec XIX w. koncepcja homeostatycznej regulacji rodowiska wewntrznego podkrelaa zdol no zwierzt do utrzymania staoci rodowiska wewntrzkomrkowego, mimo zmian za chodzcych w rodowisku zewntrznym. Chocia koncepcja ta wyprzedzaa wspczesn en-zymologi, sugerowaa ona, e zmiany rodowiska zarwno wewntrznego, jak i zewntrznego wpywaj na szybko reakcji katalizowanych przez enzymy. Komrka lub organizm, reagujce w sposb niewystarczajcy lub nieprawid owy na bodce wewntrzne lub zewntrzne, mog by okrelone jako chore. Wiedza o czynnikach wpywajcych na szybko reakcji katalizowanych przez enzymy ma szczeglne znaczenie zarwno w zrozumieniu mechanizmw homeostazy w komrkach prawidowych, jak i poznaniu molekularnych podstaw chorb.
Mechanizmy, za pomoc ktrych komrki i organizmy reguluj i koordynuj oglny metabolizm, s przedmiotem zainteresowania badaczy w wielu dziedzinach nauk biomedycznych dotyczcych tak rnych problemw, jak; nowotwory, choroby serca, starzenie, fizjologia drobnoustrojw, rnicowanie, przeobraenie, dziaanie hormonw czy dziaanie lekw. We wszystkich tych przypadkach wykazano istnienie zarwno prawidowej, jak i nieprawidowej regulacji enzymatycznej. Nieprawidowoci w regulacji aktywnoci enzymw (brak indukcji lub represji) stwierdza si np. w wielu komrkach nowotworowych. Potwierdza to oglnie przyjte zaoenie, e zaburzenia mechanizmw kontrolujcych ekspresje genw le u podstaw procesu nowo tworzenia. Niektre wirusy on-kogenne zawieraj gen kodujcy tyrozyno-swo-ist kinaze biaek. Ekspresja tego genu w komrkach gospodarza prowadzi do nie majcej miejsca w warunkach prawidowych fosforyla-cji wielu biaek i enzymw, powodujc znaczne zmiany fenotypowe. Uwaa si, e zmiany tego typu s gwn przyczyn transformacji nowotworowej wywoywanej przez pewne wirusy onkogenne. Innym znamiennym przykadem regulacji enzymatycznej jest dziaanie lekw.
Przepyw metabolitw jest z reguy jednokierunkowy

Wszystkie reakcje chemiczne, cznie z reak cjami katalizowanymi przez enzymy, s do pew nego stopnia odwracalne*. W kom rkach y * Reakcje atwo odwracalne charakteryzuje maa warto liczbowa AG. Reakcje o duej wartoci ujemnej AG, do jakich naley wikszo przemian biochemicznych, mona okreli jako nieodwracalne.
ENZYMY; REGULACJA AKTYWNOCI / 119
wych jednak reakcje odwracalne zasadniczo nie zachodz, poniewa produkty jednej reakcji s natychmiast usuwane na skutek wczania ich w nastp ne reakcje katalizowane przez inne enzymy. Przepyw metabolitw w ywej komrce przypomina przepyw wody w instalacji wodocigowej. Chocia woda moe pyn w dowolnym kierunku, w praktyce jej przepyw jest jednokierunkowy. Podobnie przepyw metabolitw w ywych komrkach jest take w znacznym stopniu jednokierunkowy. Stan rwnowagi, nietypowy dla ycia, komrka osiga dopiero w chwili mierci. Jednokierunkowy przepyw metabolitw w ywej komrce pozwala na zachowanie staoci rodowiska wewntrznego (ryc. 11-1). W peni wyksztaconej
sorw makroczsteczek, transport, wydzielanie lub wchanianie musi ulega zmianom pod wpywem nawet niewielkich zmian w rodowisku komrki, narzdu lub caego organizmu. Procesy te musz by skoordynowane i reagowa zarwno na krtkotrwae zmiany w rodowisku zewntrznym (np. dodanie lub usuniecie skadnika pokarmowego), jak rwnie wydarzenia okresowo zachodzce wewntrz komrki (np. replikacja DNA). Brak zoonych systemw kontroli hormonalnej i nerwowej, a take stosunkowa atwo prowadzenia bada na poziomie genomu powoduje, e obecnie naj lepiej poznane s szczegy molekularnych podstaw regulacji u bakterii. Chocia jest oczywiste, e pozornie podobne zjawiska u bakterii i ssakw znacznie si rni, regulacja procesw metabolicznych u bakterii stanowi podstaw do zrozumienia tej regulacji u czowieka. AKTYWNO ENZYMW REGULUJ 3 PODST AWOWE MECHANIZM Y Oglnie mwic, na przepyw wgla przez jakkolwiek reakcj katalizowan przez enzym maj wpyw: 1) zmiany bezwzgldnej iloci obecnego enzymu, 2) zmiany wielkoci puli reagujcych zwizkw, innych ni enzym oraz 3) zmiany sprawnoci katalitycznej enzymu. Wszystkie te moliwoci s wykorzystywane przez wikszo form ycia. Szybko syntezy i degradacji determinuje ilo enzymu Bezwzgldna ilo danego enzymu jest wypadkow szybkoci jego syntezy (ks), oraz szybkoci jego degradacji (k^) (ryc. 11 -2). Ilo en zymu w komrce moe si zwikszy w wyniku zwikszenia szybkoci jego biosyntezy (zwikszenie wartoci ks), zmniejszenia szybkoci jego degradacji (zmniejszenie wartoci kdes) lub obu procesw rwnoczenie. Podobnie zmniejszenie iloci enzymu moe by wynikiem zmniejszenia wartoci ks , zwikszenia wartoci k^g lub obu
Enzym
Ryc. 11-1. Schemat homeostazy komrkowej.
komrce rednie stenie metabolitw pozos taje wzgldnie stae w duych przedziaach czasowych*. Zdolno przystosowawcz ywej komrki najlepiej ilustruj jedynie niewielkie zmiany i przesunicia, za pomoc ktrych organizm zachowuje stao rodowiska wewntrznego pomimo duych rnic w pobieraniu pokarmu, wody i soli mineralnych, wykonywaniu pracy, czy temperaturze zewntrznej. Szybko reakcji odzwierciedla zmieniajce si potrzeby fizjologiczne Aby procesy yciowe przebiegay w uporzdkowany sposb, przepyw metabolitw przez szlaki anaboliczne i kataboliczne musi podlega regulacji, a szybko reakcji chemicznych niezbdnych w danym momencie musi odpowiada potrzebom organizmu ze wzgldu na jego otoczenie. Przebieg wszystkich procesw, takich jak wytwarzanie ATP, biosynteza prekur* Zdarzaj si jednak krtkotrwae zmiany w steniach metabolitw i enzymw majce ogromne znaczenie fizjologiczne.
k, f
) k.fl
Aminokwasy Ryc. 11-2. Ilo enzymu jest wypadkow jego syntezy i degradacji.
120 / ROZDZIA 11
wartoci rwnoczenie. We wszystkich formach ycia biosynteza enzymu (biaka) z aminokwasw i degradacja enzymu (biaka) do aminokwasw s odmiennymi procesami, katalizowanymi przez zupenie rne zestawy enzymw. Dziki temu regulacja biosyntezy i degradacji enzymu moe przebiega niezalenie.
nikowego, reduktaza HMG-CoA i cytochrom P-450.
Synteza enzymw moe by uruchamiana w odpowiedzi na pewne

Reakcj komrek na obecno swoistych maoczsteczkowych induktorw jest synteza swoistych enzymw. Na przykad Escherichia coli hodowana na poywce zawierajcej glukoz nie fermentuje laktozy na skutek braku p-galaktozydazyhyrolizujcej laktoz do galak-tozy i glukozy. Dodanie do podoa laktozy lub innych p-ga lak to ydw indukuje P-galaktozy-daz, dziki czemu w hodowli moe zachodzi fermentacja laktozy. Chocia na og induktorami s substraty indukowanych enzymw, mog by nimi rwnie zwizki strukturalnie przypominajce substraty, nie bdce jednak substratami. Okrela si je mianem induktorw gratisowych. Odwrotnie, pewne zwizki, mimo e s substratami, nie musz by induktorami. Czsto jeden zwizek indukuje kilka enzymw danego szlaku meta bolicznego (np. laktoza indukuje zarwno per-meaz p-g a laktozy do w, jak i P-galaktozyda-ze). Enzymy, ktrych stenie w komrce jest niezalene od dodanego induktora okrela si jako konstytutywne. Ten sam enzym, w zalenoci od szczepu bakteryjnego, moe mie charakter konstytutywny, ulega indukcji lub by w ogle nieobecny. Komrki, w ktrych dany enzym \ub inne biako ulega indukcji, zwykle zawieraj bardzo ma, ale dajc si zmierzy, podstawow ilo tego biaka nawet w nieobecnoci induktora. Wraliwo komrek na in-duktory jest uwarunkowana genetycznie. Dlatego te okrelenia konstytutywny" czy ulegajcy indukcji'1 maj charakter wzgldny, podobnie jak ciepy" i zimny", i oznaczaj jedynie kracowe moliwoci reakcji komrki w obecno ci induktora. Indukcja enzymw jest zjawiskiem wystpujcym rwnie u eukariontw. U zwierzt enzymami ulegajcymi indukcji s np. 2,3-diok-sygenaza tryptofanowa, dehydrataza treonino-wa, aminotransferaza tyrozyna :a-ketoglutaran, p-D-fruktofuranozydaza, enzymy cyklu moczindu ktry
Obecno w rodowisku reakcyjnym syntetyzowanego metabolitu moe powodowa represj dalszej jego syntezy. Mae czsteczki, takie jak puryny czy aminokwasy, dziaajc na zasadzie korepresorw mog wic blokowa syntez enzymw biorcych udzia w ich wasnej biosyntezie. Na przykad u Salmonella typhimu-riurn w obecnoci egzogennej histydyny (His) nastpuje represja syntezy wszystkich enzymw biosyntezy histydyny, a po dodaniu do poywki leucyny represji ulega synteza 3 enzymw typowych jedynie dla biosyntezy Leu. Po usuniciu lub wyczerpaniu w podou konkretnego zwizku poredniego dla danej biosyntezy zachodzi proces odwrotny, okrelony jako derepresja. Powysze przykady ilustruj charakterystyczn dla szlakw biosyntezy u bakterii represj na zasadzie sprzenia zwrotnego za pomoc produktu. Zjawiskiem pokrewnym jest represja za pomoc katabolitu. Polega ona na represji syntezy enzymw biorcych udzia w kataboliz-mie pod wpywem zwizkw porednich, powstajcych w reakcjach kata bo licznych kataii-zowanych przez te enzymy. Zjawisko to po raz pierwszy zaobserwowano w hodowlach E. coli rosncych na poywkach zawierajcych inne (X) ni glukoza rdo wgla. Nazwano je efektem glukozy", dodanie bowiem do pod oa glukozy powodowao represj syntezy enzymw zwizanych z katabolizmem zwizku X. Z chwil, kiedy stwierdzono, e utlenianie skadnikw poywienia innych ni glukoza wywouje podobne efekty, wprowadzono termin represji za pomoc katabolitu. Zwizkiem poredniczcym w represji katabolicznej jest cAMP. Molekularne mechanizmy indukcji, represji i derepresji przedstawiono w rozdz. 41.
Synteza enzymw moe ulega represji pod wpywem ostatecznego produktu
WE WSZYSTKICH FORMACH YCIA ZACHODZI OBRT METABOLICZNY BIAEK

Procesy syntezy enzymu i jego degradacji okrela si mianem obrotu metabolicznego. Obrt metaboliczny biaek stwierdzono jako waciwo cechujc wszystkie komrki ssakw na dugo zanim zaobserwowano wystpowanie te go zjawiska u bakterii. O istnieniu przemiany
ENZYMY: REGULACJA AKT YWNOCI / 121
biaek (enzymw) u ludzi wywnioskowano z dowiadcze dotyczcych odywiania si czowieka przeszo 100 lat temu. Klasyczne ju badania Schoenheimera, prowadzone tu przed II wojn wiatow i w czasie jej trwania, niezbicie dowiody, e w czasie ycia czowieka zachodzi ciga przemiana biaek komrkowych. Mierzc szybko wbudowywania znakowanych' ; N-amino-kwasw do biaek oraz szybko ich ubytku z biaek, Schoenheimer wykaza, e w organizmie biaka s w stanie dynamicznej rwnowagi". Koncepcja ta obejmuje rwnie inne skadniki organizmu, cznie z lipidami i kwasami nukleinowymi. Degradacja swoistych enzymw jest regulowana Szczegy degradacji biaek ssakw w wyniku proteoiizy zalenej od ATP i ubikwityny oraz niezalenej od ATP przedstawiono w rozdz. 31. Wraliwo enzymw na proteolityczn degradacj jest uzaleniona od ich konformacji. Obecno lub brak czynnikw zmieniajcych konformacj biaka, takich jak substraty, koen zymy lub jony metali, wpywa wic na podatno enzymw na proteoliz. Stenie substra-tw, koenzymw i prawdopodobnie jonw w komrce moe w ten sposb warunkowa szybko degradacji swoistych enzymw. Koncepcj t ilustruj dwa enzymy: arginaza i 2,3-dioksyge-naza tryptofanowa (pirolaza tryptofanowa).
Regulacja stenia arginazy w wtrobie obej muje zmian wartoci kj lub kdcg. Zwikszenie stenia arginazy w wtrobie po spoyciu pokarmu bogatego w biako jest wynikiem zwikszonej syntezy tego enzymu. Zwikszenie natomiast stenia arginazy w wtrobie zwierzt godzonych jest skutkiem zmniejszonej degradacji tego enzymu, podczas gdy warto ks pozostaje nie zmieniona. W przypadku drugiego enzymu zwikszenie stenia 2.3-dioksygenazy tryptofanowej u ssakw obserwuje si po wstrzykniciu glikokortykoidw lub spoyciu tryp-tofanu. Stwierdzono, e hormony powoduj zwikszenie syntezy tego enzymu (zwikszenie ks), Trp natomiast nie wpywa na warto I,, ale zmniejsza warto k^g w wyniku zmniejszenia podatnoci enzymu na proteoliz. Zwikszenie stenia arginazy w wtrobie, w wyniku zwikszonego spoycia azotu w diecie bogato-bia&owej (p. rozdz. 31) przypomina indukcj za pomoc substratu u bakterii. Jednak w przypadku 2,3-dioksygenazy tryptofanowej, nawet jeli tryptofan moe dziaa jako induktor u bakterii (zmienia kj, to u ssakw wpywa on wycznie na proces degradacji enzymu (zmniejsza kdpg). Na stenie enzymu w tiankach ssakw maj znaczny wpyw zmiany fizjologiczne, hormonalne lub pokarmowe (tab. 11 -1), ale wiedza o molekularnych podstawach tych zmian jest nadal fragmentaryczna.
T abela 11-1. Adaptacja wybranych enzymw wtroby szczura do zmian w rodowisku*
Enzym Metabolizm aminokwasw

Arginaza
<h>
Bodziec
aktywnoci
Zmiana
100120 Godzenie lub glikokortykosteroidy

Zamiana diety z bogatobiarkowej na matobiakow
+2 -2 + 100 + 20
Dehydrataza sery nowa Amoniako-liaza histydynowa
20 60
Glukagon lub aminokwasy egzo genne Zmiana diety z maiobiakowej na bogatobiakowa
Metabolizm wglowodanw
Dehydrogenaza glukozo -6-fosforanowa
15
Dehydrogenaza glicerolo-a-fosfora-nowa Fruktozobisfosfataza (Fruktozo-1,6-bis-fosfataza)
100
Hormony tarczycy lub dieta bogato- wglowodano wa poprzedzo na go dzeniem Hormony tarczycy Glukoza
+ 10
+ 10 + 10
122 / ROZDZIAU cd. tab. 11-1 Enzym Metabolizm lipidw Enzym rozszczepiajcy cytrynian Syntetaza kwasw tuszczowych
ti/2
Bodziec
Zmiana aktywnoci
Dieta bogatowglowodanowa i ma-ottuszczowa poprzedzona godzeniem Godzenie Dieta beztuszczowa poprzedzona godzeniem 2 3 Godzenie lub dieta zawierajca 5% cholesterolu Zmiany dobowe Insulina lub hormony tarczycy
+30
-10 -10 5 + 2do10
Reduktaza HMG-CoA
+30
Metabolizm puryn i pjrymidyn
Oksydaza ksantynowa Karbamoilotransferaza asparaginianowa Dihydroorotaza

60 12
Dieta bogatobiatkowa Dieta zawierajca 1% kwasu oro-towego Dieta zawierajca 1% kwasu oro-towego
-10
+2 +3
* Dane poza dotyczcymi reduktazy HMG-CoA z: Schimke RT, Doyle D: Control of enzyme levels in anima tissues, Annu, Rev, Biochem. 1970; 39:929.
Glikokortykosteroidy powoduj zwikszenie stenia aminotransferazy tyrozynowej przez pobudzenie jej syntezy. Stwierdzenie to byo pierwszym dowodem istnienia hormonalnej regulacji biosyntezy enzymw u ssakw. Insulina i glukagon pomijajc ich wzajemne antagoni-styczne dziaanie fizjologiczne niezalenie od siebie zwikszaj 4 5-krotnie warto k s . W dziaaniu glukagonu poredniczy prawdopodobnie cAMP, ktry w hodowlach tkankowych wtroby szczura wywouje podobne do hormonu skutki.
AKTYWNO KATALITYCZNA ENZYMW MOE BY REGULOWANA W RONY SPOSB

Zmiana aktywnoci enzymu moe by wynikiem zmiany bezwzgldnej iloci enzymu lub obecny enzym moe sta si bardziej lub mniej skutecznym katalizatorem. Zmiany aktywnoci
katalitycznej enzymu, zachodzce bez zmiany jego iloci, okrela si jako wpyw na sprawno katalityczn enzymu".
Regulacja aktywnoci enzymatycznej moe polega na biosyntezie enzymu w formie nieaktywnego proenzymu. Przeksztacenie proenzy-,mu w form aktywn katalitycznie jest wynikiem ograniczonej proteolizy, procesu ktremu towarzysz zmiany konformacyjne odsaniajce lub tworz ce" miejsce katalityczne (p. rozdz. 9). Synteza enzymw w formie nieaktywnych prekursorw jest zjawiskiem charakterys tycznym dla enzymw trawiennych oraz czynnikw krzepnicia krwi i fibrynolizy (p. rozdz. 58).
Regulacja poprzez syntez niektrych enzymw w formie nieaktywnych prekursorw
KOMPARTMENTACJA ENZYMW UATWIA REGULACJ METABOLIZMU

Znaczenie kompartmentacji procesw metabolicznych w komrkach eukariotycznych, cznie z komrkami ssakw, jakkolwiek bardzo wane, nie moe by przeceniane. Umiejscowienie swoistych procesw metabolicznych w cyto-zolu lub organellach komrkowych umoliwia ich niezalen regulacj, Kompartmentacja procesw metabolicznych, charakterystyczna dla wyszych form ycia, daje wic moliwo bardzo finezyjnej regulacji metabolizmu. Jed-
ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOCI / 123
noczenie stwarza jednak problem przemieszczania metabolitw przez bony oddzielajce poszczeglne struktury subkomorkowe. Przenikanie przez te bariery jest moliwe dziki istnieniu mechanizmw zapewniajcych przemiesz-
czanie w wyniku przeksztacania metabolitw w formy przepuszczalne dla bon. Po przejciu przez Hon metabolity s ponownie przeksztacane w posta pierwotn. W konsekwencji wymaga to wystpowania tej samej aktywnoci katalitycznej w 2 formach, np. cytozolowej 1 mitochondrialnej. Fizyczne rozdzielenie tych 2 form enzymu uatwia ich niezalen regulacj. W rozdziale 18 przedstawiono udzia mechaniz mw umoliwiajcych przenikanie przez bony w zachowaniu rwnowagi puli metabolicznej zwizkw porednich cyklu kwasu cytrynowe go i innych zwizkw amfibolicznych.
ENZYMY KATALIZUJCE CIGI REAKCJI METABOLICZNYCH MOG TWORZY WIELKOCZSTECZKOWE KOMPLEKSY

Organizacja enzymw katalizujcych kolejne reakcje szlaku metabolicznego w wielkoczsteczkowe kompleksy koordynuje dziaanie enzymw i przepyw metabolitw. Istnienie ukadw wieloenzymowych zwiksza dostpno zwizkw porednich dla enzymw danego szlaku przemian, umoliwia bowiem przenoszenie produktw midzy enzymami bez uprzedniego ustalenia ich rwnowagi z pulami metabolicznymi. Pozwala to na bardziej precyzyjn kontrol metabolizmu ni miaoby to miejsce w przypadku enzymw nie pozostajcych w kompleksie. Ponadto zmiany konformacyjne jednego ze skadnikw kompleksu przez interakcje biako-biako mog by przekazywane innym skadnikom tego kompleksu, powodujc w ten sposb wzmocnienie skutkw regulacji.
pomiar stenia metabolitu w organellach komrkowych nie odzwierciedla faktycznego stanu rzeczy m.in. wskutek znacznej bliskoci wytwarzania i usuwania danego zwizku. Ponadto istniej czsto due rnice pomidzy cakowitym steniem metabolitu a steniem metabolitu wolnego, tj. dostpnego dla enzymu. Na przykad, mimo e cakowite stenie 2,3--bisfosfoglicerynianu w erytrocytach jest bardzo due, to stenie wolnego bisfosfoglicery-nianu jest porwnywalne z innymi tkankami. Podobnie dostpno wielu innych metabolitw ulega znacznemu zmniejszeniu w obecnoci wicych je biaek. Jednym z podstawowych zaoe teorii kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten jest to, e oglne stenie substratu odpowiada steniu dostpnego substratu. Zaoenie to moe si jednak nie sprawdza w warunkach in vivo, gdzie stenie wolnych substratw czsto jest tego samego rzdu wielkoci co stenie enzymw. Regulatorow rol mog spenia rwnie jony metali zaangaowane w struktur i funkcj ponad XJ wszystkich znanych enzymw (p. rozdz. 10), a szczeglnie w przypadku reakcji, w ktrych substratem jest ATP. Najwiksz aktywno obserwuje si zazwyczaj wwczas, gdy w kompleksie ATP-jon metalu stosunek ATP do metalu wynosi ok. 1. Nadmiar metalu lub ATP ma wpyw hamujcy. Poniewa difos-forany i trifosforany nukleozydw tworz trwale kompleksy z jonami metali dwuwartocio-wych, wydaje si, e wewntrzkomrkowe stenie nukleotydw moe regulowa wewntrzkomrkowe stenie wolnych jonw metali, a tym samym aktywno pewnych enzymw.
stpnych dla danego enzymu. Jednak nawet
STENIE SUBSTRATW, KOENZYMW, KATIONW MOE REGULOWA AKTYWNO ENZYMW

rednie wewntrzkomrkowe stenie sub-stratu, koenzymu lub jonu metalu moe nie stanowi waciwej podstawy do oceny aktywnoci enzymu in vivo. Niezbdna jest w tym celu
znajomo ste metabolitw bezporednio do -
AKTYWNO OKRELONYCH ENZYMW REGULUJ EFEKTORY ALLOSTERYCZNE

Aktywno katalityczna pewnych kluczowych w danym szlaku metabolicznym enzymw enzymw regulatorowych jest modulowana za pomoc ma oczs teczko wych efektorw allosterycznych, ktre na og nie wykazuj podobiestwa do substratw lub koenzymw danego enzymu. Hamowanie aktywno ci enzymu szlaku biosyntezy przez ko cowy produkt tego szlaku nosi nazw hamowania
przez sprzenie zwrotne. W biosyntezie
124 / ROZDZIA 11
zwizku D ze zwizku A, katalizowanej przez enzymy Enz1; Enz2 i Enz3

Enz,
B
Enza Enz,
due stenie zwizku D z reguy hamuje przemian A w B. Nie zachodzi tu proste cofanie si" zwizkw porednich, ale zwizek D wie si z Enzl5 hamujc jego aktywno. Zwizek D dziaa wic jako ujemny efektor allosteryczny lub inhibitor zwrotny Enz,. W ten sposb hamowanie Enz! przez D na zasadzie sprzenia zwrotnego reguluje ostatecznie syntez zwizku D. Zwizek D czy si zwykle z miejscem allosterycznym, oddalonym od miejsca katalitycznego enzymu. Hamowanie przez sprzenie zwrotne moe mie charakter kompetycyjny, niekompetycyj-ny, czciowo kompetycyjny lub inny. Hamo wanie przez sprzenie zwrotne najczciej jest spotykane w przypadku szlakw biosyntezy. Czsto inhibitorem zwrotnym jest ostatnia maa czsteczka przed utworzeniem zwizku wielkoczsteczkowego (np. aminokwasy w szlaku biosyntezy biaek, nukleotydy w szlaku biosyntezy kwasw nukleinowych). Zazwyczaj regulacja przez sprzenie zwrotne dotyczy najwczeniejszego, funkcjonalnie nieodwracalnego* etapu charakterystycznego wycznie dla danego szlaku biosyntezy; najlepiej poznanym przykadem jest hamowanie karbamoilotransferazy aspara-ginianowej przez CTP (p. rozdz. 36). Czsto szlak biosyntezy jest rozgaziony, tzn. metabolity pocztkowe s wykorzystywane do biosyntezy 2 lub wicej metabolitw kocowych. Hamowanie na zasadzie sprzenia zwrotnego w rozgazionym szlaku biosyntezy (np. biosyntezy aminokwasw, puryn lub piry-midyn) przedstawia ryc. 11-3. Zwizki S^ S2 iS3 s prekursorami wszystkich 4 produktw kocowych (A, B, C i D) natomiast zwizek S 4 jest prekursorem produktw B i C, a zwizek S ; prekursorem wycznie produktu D. Przekszta cenia: S, ------ A
C
Ryc. 11-3. Hamowanie przez sprzenie zwrotne w rozgazionym szlaku biosyntezy. S-\ S5 s zwizkami porednimi w biosyntezie ostatecznych produktw A D. Strzaki proste oznaczaj en zymy katalizujce okrelone przemiany. Strzaki wygite wskazuj hipotetyczne miejsca hamowa nia przez swoiste produkty kocowe w wyniku sprzenia zwrotnego.
stanowi wic liniowe cigi reakcji, ktre jak mona si spodziewa, s hamowane na zasa dzie sprzenia zwrotnego prze z ich produkty kocowe. Konkretnym przykadem tego zjawiska jest biosynteza nukleotydw (p. rozdz. 36). Rnorodne mechanizmy hamowania przez sprzenie zwrotne reguluj rozgazione szlaki metaboliczne ~ Rnorodno mechanizmw hamowania przez sprzenie zwrotne w rozgazionych szlakach metabolicznych stanowi dodatkowy poziom regulacji (ryc. 11-4). Na przykad, jeli produkt B wystpuje w nadmiarze, to zmniejsza sie zapotrzebowanie na zwizek S2. Zdolno produktu B do zmniejszenia syntezy S2 jest wic korzystna z biologicznego punktu widzenia. Jeli jednak nadmiar zwizku B hamuje t cz szlaku, ktra dotyczy nie tylko jego wasnej
, -
S3
* Reakcj przebiegajc praktycznie w jednym kierunku {wznaczeniu termodynamicznym) jest reakcja o duej wartoci ujemnej AG.
Ryc. 11-4. Regulacja rozgazionego szlaku bio syntezy w wyniku hamowania przez sprz enie zwrotne. Dodatkowe, w porwnaniu ze schematem przedstawionym na ryc. 11-3, strzaki wygite, oznaczone liniami cigymi, wskazuj-rnorod-no& mechanizmw hamowania przez sprzenie zwrotne.
ENZYMY: REGULACJA AKT YWNOCI / 125
biosyntezy, ale jest wsplna dla biosyntezy zwizkw A, C czy D, to nadmiar zwizku B potencjalnie mgby wstrzyma syntez wszystkich 4 produktw. Istniej jednak mechanizmy, ktre zapobiegaj takiemu niepodanemu efektowi. W kumulatywnym hamowaniu przez sprzenie zwrotne hamujcy wpyw 2 lub wicej produktw kocowych na I enzym regulatorowy jest sum skutkw wywoywanych przez kady z tych produktw niezalenie. W zgodnym lub wielo wartociowym hamowaniu przez sprzenie zwrotne cakowite zahamowanie ma miejsce tylko wtedy, kiedy jednoczenie 2 lub wicej produktw kocowych jest obecnych w nadmiarze. W kooperatywnym hamowaniu przez sprzenie zwrotne I kocowy produkt wystpujcy w nadmiarze hamuje enzym regulatorowy, ale w obecnoci 2 lub wicej produktw kocowych stopie hamowania znacznie przewysza sumaryczny efekt kumulatywnego hamowania przez sprzenie zwrotne. Najlepiej poznanym enzymem atlosterycznym jest karbamoiotrans feraza asparaginia nowa Karbamoiotransferaza asparaginianowa (ATCaza) katalizuje pierwsz reakcj w szlaku biosyntezy pirymidyn {ryc. 11-5). Enzym ten jest hamowany na zasadzie sprzenia zwrotnego przez trifosforan cytydyny (CTP). W obecnoci zwizkw rtci ATCaza staje si niewraliwa na CTP, ale zachowuje pen aktywno syntezy karbamoiioasparaginianu. Sugeruje to, i CTP wie si z enzymem w innym miejscu (allo-sterycznym) ni kady z substratw. Czsteczka ATCazy skada si z 2 podjednostek katalitycznych i 3 lub 4 podjednostek regulatorowych. Kada podjednostka katalityczna zawiera 4 miejsca wizania asparaginianu (substratu), a kada jednostka regulatorowa co najmniej 2 miejsca wizania CTP (regulatora). Otrzyma nie mutantw pozbawionych prawidowej kontroli zwrotnej przez CTP, a z nich rewertantw z prawidowymi waciwociami pozwolio wykaza, e oba rodzaje podjednostek podlegaj niezalenej kontroli genetycznej. Miejsca allosteryczne i katalityczne s przestrzennie odmienne Okoo 1963 r. Monod zwrci uwag na brak strukturalnego podobiestwa pomidzy inhibi -
*ii
0 CH,
-o-c.
I i
C00
"Mv ~
KARBAMOILOTRANSFERAZA ASPARAGIN1AN0WA
I
o u o-c
*CH,
Kar b ama i I o as p a r ag i n i an
Ryc. 11-5. Reakcja katalizowana przez karba-moilotra nsferaz asparag in ianow.
torem zwrotnym a substratem dla enzymu, ktrego aktywno podlega regulacji. Skoro efektory nie s izosteryczne, ale allosteryczne (zajmuj inn przestrze") z substratem za proponowa on, e enzymy, ktrych aktywno jest regulowana przez efektory allosteryczne (np. inhibitory zwrotne) wi efektor w miejscu fizycznie odmiennym od miejsca katalitycznego, tj. w miejscu allosterycznym. Enzymy, ktrych aktywno miejsca katalitycznego moe by regulowana przez efektory allosteryczne znajdujce si w miejscu atlosterycznym okrela si jako enzymy allosteryczne. Istnienie fizycznie odrbnych miejsc allosterycznych w czsteczce enzymu potwierdzaj m.in. nastpujce fakty: 1. Modyfikacje enzymw za pomoc technik chemicznych lub fizycznych czsto prowadz do utraty ich wraliwoci na efektory allosteryczne. nie zmieniajc jednoczenie ich aktywnoci katalitycznej. Wybircz denaturacje miejsc allosterycznych mona spowodowa dziaajc zwizkami rtci, mocznikiem, promieniowaniem X, enzymami proteolitycznymi, roztworami o skrajnych wartociach siy jonowej lub pH, przechowywaniem w temp. 05C, zamraaniem lub ogrzewaniem.
126 / ROZDZIA 11
2. Efektory alosteryczne, w odrnieniu od substratw, czsto zabezpieczaj miejsce katali tyczne przed denaturacj. Wydaje si mao prawdopodobne, aby zwizanie efektora z miej scem katalitycznym zapobiegao denaturacji, podczas gdy zwizanie substratu nie. Sugeruje to istnienie drugiego miejsca allosterycznego w innej czci czsteczki enzymu. 3. Enzymy pewnych mutantw komrek ba kteryjnych i ssakw wykazuj zmienione wa ciwoci regulatorowe, mimo identycznych 2 ty pem dzikim (z ktrego mutant powsta) wa ciwoci katalitycznych. Miejsca alosteryczne i katalityczne s zatem odmienne genetycznie. 4. Badania dotyczce wizania substratw i efektorw aU o sferycznych wykazay, e wi si one niezalenie od siebie. 5. W niektrych przypadkach miejsce alo steryczne i miejsce katalityczne s umiejscowio ne w odrbnych podjednostkach. Enzymy allosteryczne charakteryzuje sigmoidalny przebieg krzywej kinetyki wizania substratu Na rycinie 11 -6 przedstawiono zaleno szybkoci reakcji katalizowanej przez typowy en zym allosteryczny od stenia substratu w obecnoci i nieobecnoci inhibitora allosterycznego. W nieobecnoci inhibitora allosterycznego krzywa nasycenia substratem ma ksztat hiperboli, podczas gdy w jego obecnoci ma ksztat
sigmoidamy; przy duych steniach substratu krzywa sigmoidalna moe si czy z krzyw hiperbo liczn. Analogiczn zaleno obserwuje si w przypadku krzywych nasycenia O2 dla mioglobiny i hemoglobiny (p. rozdz, 7). Na podstawie analizy kinetyki reakcji wykazano, e hamowanie przez sprzenie zwrotne moe mie charakter kompetycyjny, niekom-petycyjny, czciowo kompetycyjny lub inny. Jeli przy duych steniach S aktywno enzymu w obecnoci i nieobecnoci inhibitora allosterycznego jest porwnywalna, to kinety-cznie reakcja odpowiada hamowaniu kompety-cyjnemu. Sigmoidalny, a nie hiperboliczny, przebieg krzywej nasycenia substratem uniemoliwia jednak w przypadku hamowania allosterycznego okrelenie charakterystycznych wielkoci za pomoc metody stosowanej w przypadku hamowania kompetycyjnego w miejscu katalitycznym, tj. graficznego przedstawienia danych jako liniowej funkcji odwrotnoci stenia substratu i szybkoci reakcji. Przyczyn jest fakt, e inhibitory alosteryczne wi si w innym miejscu {allosterycznym} ni analog substratu. Sigmoidalny charakter krzywej zalenoci v od S w obecnoci inhibitorw allosterycznych odzwierciedla zjawisko kooperatywnoci. Przy maych steniach S aktywno w obecnoci inhibitora, w porwnaniu z aktywnoci w jego nieobecnoci, jest maa. Jednak, w miar zwikszania si stenia S, hamowanie si zmniejsza. Wskazuje to na istnienie 2 lub wicej wzajemnie na siebie oddziaujcych miejsc wizania substratu. Obecno czsteczki substratu w jednym miejscu katalitycznym uatwia wizanie drugiej czsteczki substratu w drugim miejscu. Zjawisko kooperatywnoci wizania substratu przed stawiono w rozdz. 7 dotyczcym hemoglobiny. Sigmoidalny przebieg krzywej nasycenia O% jest wynikiem kooperatywnego oddziaywania midzy miejscami wicymi O2 umiejscowionymi w rnych podjednostkach. W wyniku oddziaywa allosterycznych zmienia si warto Km lub Vmaka. Odnoszenie okrele kompetycyjny" lub niekompetycyjny" z substratem do kinetyki hamowania allosterycznego moe wprowadza w bd. Suszniejszym wydaje si podzia enzymw podlegajcych regulacji na 2 grupy, tj. enzymy serii K i enzymy serii V. W-przypadku enzymw allosterycznych serii K kinetyka nasycenia substratem jest kompetycyjna w sensie
Ryc. 11 -6. Sigmoidalna krzywa wizania substratu w obecnoci inhibitora allosterycznego.
ENZY MY: RE GULACJA AKT YWNO! / 127
zwikszenia wartoci Km (zmniejszenie powinowactwa dp substratu) i braku wpywu na war to Vmaks. Natomiast w przypadku enzymw allosterycznych serii V efektor allosteryczny zmniejsza warto Vmais. (zmniejszenie sprawnoci katalitycznej) bez widocznego wpywu na warto Km. Zmiany wartoci Km i Vmai;S. wynikaj prawdopodobnie ze zmian konformacyj-nych w miejscu katalitycznym wywoanych zwizaniem efektora all o sferycznego w miejscu allosterycznym. Dla enzymw allosterycznych serii K skutkiem zmian konformacyjnych moe by osabienie wiza pomidzy substratem a resztami amin okwa sowy mi w miejscu wicym substrat. Odpowiednio dla enzymw allosterycznych serii V pierwotnym skutkiem moe by zmiana orientacji przestrzennej reszt katalitycznych, prowadzca do zmniejszenia wartoci Vmaks.- Zmiany konformacyjne mog mie rwnie poredni wpyw na wartoci K_m i Vma)(S, Kooperatywne wizanie substratu ma istotne znaczenie fizjologiczne Fizjologiczne nastpstwa kooperatywnego wizania substratu s analogiczne jak w przypadku efektw kooperatywnego wizania O2 przez hemoglobin. Przy maym steniu substratu efektor allosteryczny jest skutecznym inhibitorem. Jego oddziaywanie regulatoro we jest wic najbardziej efektywne w warunkach najwikszego zapotrzebowania, tj. kiedy wewntrzkomrkowe stenie substratu jest mae. Wraz ze zwikszeniem dostpnoci substratu cisa regulacja staje si mniej konieczna. W miar zwikszania stenia substratu stopie hamowania maleje i w rezultacie powstaje wicej produktu. Podobnie jak w przypadku hemoglobiny, sigmoidalna krzywa nasycenia substratem wiadczy o tym, e wzgldnie mae zmiany stenia substratu powoduj due zmiany aktywnoci. W ten sposb poprzez mae zmiany stenia substratu jest osigana czua kontrola aktywnoci katalitycznej enzymu. Ponadto, analogicznie do zrnicowania krzy wych nasycenia O2 hemoglobin odmiennych gatunkw, sigmoidalne krzywe nasycenia enzymw regulatorowych, pochodzcych z rnych rde, mog by przesunite w lewo lub w prawo w zalenoci od istniejcego in vivo stenia substratu.
REGULACJA NA ZASADZIE SPRZENIA ZWROTNEGO NIE JEST SYNONIMEM HAM OWANIA PRZEZ SPRZENIE ZWROTNE Zarwno w komrkach ssakw, jak i bakterii produkty kocowe, dziaajc na zasadzie sprzenia zwrotnego", kontroluj swoj syntez. W wielu przypadkach mechanizm tego zjawiska polega na hamowaniu enzymu katalizujcego pocztkowe etapy biosyntezy. Naley jednak odrni regulacj na zasadzie sprzenia zwrotnego, stanowic jedynie okrelenie feno-menologiczne, od hamowania przez sprzenie zwrotne stanowicego mechanizm regulacji wielu enzymw bakterii i ssakw. Na przykad cholesterol zawarty w diecie ogranicza syntez cholesterolu z octanu w tkankach ssakw. Ta regulacja na zasadzie sprzenia zwrotnego nie polega jednak na hamowaniu przez sprzenie zwrotne enzymu katalizujcego pierwsze etapy biosyntezy cholesterolu, ale cholesterol lub jego metabolit powoduje zmniejszenie ekspresji genu kodujcego reduktaz HMG-CoA. Cholesterol bezporednio nie ma natomiast adnego wpywu na aktywno reduktazy HMG-CoA. REGULACJA KLUCZOWYCH ENZYMW SSAKW MOE POLEGA NA ICH ODWRACALNYCH MODYFIKACJACH KOWALENCYJNYCH Aktywno katalityczna enzymw moe by regulowana za pomoc odwracalnych modyfikacji, polegajcych na przyczaniu grup fosforanowych (gwnie u ssakw) lub nukleoty-dw (gwnie u bakterii). Enzymy ulegajce modyfikacjom wpywajcym na ich aktywno s okrelane jako enzymy o wewntrzczstecz-kowej zmiennoci (ang. interconvertible enzy-mes) (ryc. 11-7). Enzymy te wystpuj w 2 formach rnicych si sprawnoci katalityczn. W zalenoci od rodzaju enzymu form o wikszej aktywnoci katalitycznej moe by posta ufosforylowana lub defosforylowana (tab. 11-2). Enzymy mog mie wiele miejsc fosfory lacji Fosforylacji ulega swoista reszta Ser lub rzadziej Tyr, z utworzeniem odpowiednio O-fosfoserynowej lub O-fosfo tyrozyn owej po-
128 / ROZDZIA 11 P-Enz NMP-Enz Ryc. 11-7. ATP ADP
Enz-Ser>O-PO,
Regulacja aktywnoci enzymu w wyni ku modyfikacji kowalencyjnej. Stro na lewa: fos-forylacja. Strona prawa: nukleotydylacja. W przy padku obu procesw trifosforanem nukleozydu (NTP) jest zazwyczaj ATP, T abela 11-2. Wybrane przykady enzymw ssa kw, ktrych aktywno katalityczn warunkuje fosforylacja-defosforylacja. E forma defosforylo-wana, EP forma ufosforylowana E nzym Aktywno maa dua Ka r bo ks y I aza a cety I o - Co A Syntaza glikogenowa Dehydrogenaza pirogronianowa Reduktaza HMG-CoA Fosforylaza glikogenowa Liaza cytrynianowa Kinaza fosforylazy b Kinaza reduktazy HMG-CoA
Ryc. 11-8. Regulacja aktywnoci enzymu w wyni ku modyfikacji kowalencyjnej, polegajcej na fos forylacji i defosiorylacjt reszty Ser.
EP E EP E EP E EP E E EP E E E EP EP EP
fosfataz, chocia ich aktywno jest rwnie regulowana. Aktywno zarwno kinaz, jak i fosfataz biaek jest kontrolowana przez ukad hormonalny i nerwowy, przy czym szczegowy mechanizm tej regulacji nie jest w wielu przypadkach poznany. Regulacja przez fosforylacj i dafosforylacj zuywa ATP Reakcje przedstawione na ryc. 11-8 przypominaj wzajemne przeksztacenia glukozy i glukozo-6-fosforanu oraz fruktozo-6-fosforanu i fruktozo-l,6-bisfosforanu (p. rozdz. 19). W wyniku fosforylacji, a nastpnie defosforyla-cji 1 mola substratu (enzymu lub cukru) hydrolizie ulcg;i 1 mol ATP. Sugeruje to, e aktywno kinaz (katalizujcych reakcje 1 i 3) i fosfataz (katalizujcych reakcje 2 i 4) jest wzajemnie regulowana, bowiem w przeciwnym razie powodowayby one niekontrolowan hydroliz ATP.
1. 2. Glukoza + ATP -+ ADP + Giukozo-6-P H,O + Glukozo-6-P -* P\ + Glukoza HaO + ATP - ADP + P;
chodnej. Mimo e enzymy mog zawiera wiele reszt Ser lub Tyr, fosforylacja ma charakter wybirczy i dotyczy tylko niektrych z nich. Przypuszczalnie reszty te nie wchodz w skad miejsca katalitycznego, przynajmniej w sensie struktury pierwszorzdowej, ale stanowi nastpny przykad miejsca allosterycznego. Biakami przeksztacajcymi s kinazy i fosfatazy biaek Fosforylacj i defosforylacj katalizuj odpowiednio kinazy i fosfatazy biaek (biaka przeksztacajce ang. converter proteins), ktre w pewnych szczeglnych przypadkach same mog ulega tym modyfikacjom kowalencyjnym (ryc. 11-8, tab. 11-2). Istniej wic kinazy kinaz biaek i fosfatazy kinaz biaek katalizujce wewntrzczsteczkowe zmiany enzymw odpowiedzialnych za fosforylacj innych enzymw. Mniej s" natomiast przekonujce dowody o fosforylacji i defosforyjacji
Netto: 3. 4.
Enz-Sar-OH + ATP ADP + Enz-Ser-O-P H aO + Enz-Ser-O-P - P, + Enz Ser-OH HaO + ATP -> ADP + P f
Netto:
Modyfikacje kowalencyjne, podobnie jak hamowanie przez sprzenie zwrotne, reguluj przepyw metabolitw Regulacja aktywnoci enzymw, w wyniku fosforylacji i defosforylacji wykazuje analogie z regulacj na zasadzie hamowania przez sprz-
ENZYMY: REGULACJA AKTYWNOCI / 129
eni zwrotne. Oba mechanizmy reguluj przepyw metabolitw w odpowiedzi na sygnay fizjologiczne, nie wywoujc zmian w ekspresji genw, obejmujc enzymy pocztkowych eta pw szlakw metabolicznych (czsto biosyntez) oraz dziaajc poprzez zmiany w miejscu allo-sterycznym, a nie katalitycznym. Jednak hamo wanie przez sprzenie zwrotne dotyczy pojedynczego biaka i nie podlega regulacji hormonalnej i nerwowej. Przeciwnie regulacja aktywnoci enzymw ssakw w wyniku fosforyla-cji i defosforylacji obejmuje wiele biaek oraz ATP lub inne trifosforany nukleozydw, a take jest bezporednio kontrolowana przez ukad hormonalny i nerwowy.
PIMIENNICTWO
Crabtree B, Newsholme EA: A systematic approach to describing and analyzing metabolic control systems. Trends Biochem Sci 1987;12:4. Kacser H, Porteus JW: Control of meta boli sm: What Nestler EJ, Greengard P: Protein phosphorylation in the brain. Natur l983;305:583. Soderling TR; Role of hormones and protein phosphorylation in metabolit regulation. Fed Proc I982;41;2615. Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. MeGraw-Hill, 1989. Weber G (editor): Advances in Emyme Regulatiots. Pergamon Press, 19631990.
9 Biochem in
CZSC Bioenergetyka i metabolizm wglowodanw oraz lipidw Bioenergetyka

Peter A. Mayes, PhD, DSc
12
ENERGIA SWOBODNA JEST ENERGI UYTECZN UKADU Zmiana energii swobodnej (AG) jest t czci zmiany energii cakowitej ukadu, ktra jest wykorzystywana do wykonania pracy, tzn. jest ona energi uyteczn, znan w ukadach chemicznych jako potencja chemiczny. Podstawowe prswa termodynamiki dotycz rwnie ukadw biologicznych Pierwsza zasada termodynamiki podaje, e energia cakowita ukadu i jego otoczenia jest staa. Jest to rwnie prawo zachowania energii. Gosi ono, e w ukadzie zamknitym adna zmiana nie powoduje straty bd zysku energii. Jednake w obrbie tego ukadu zamknitego, energia mone by przekazywana z jednej czci ukadu do drugiej lub moe by przeksztacona w inn form energii. Na przykad w ukadzie biologicznym energia chemiczna moe by przeksztacona w energi ciepln, elektryczn, mechaniczn lub energi promieniowania. Druga zasada termodynamiki podaje, e jeli proces zachodzi samorzutnie, to musi si zwiksza entropia cakowita ukadu. Entropia jest miar nieuporzdkowania (bezadu molekularnego) ukadu. Przybiera ona wartoci maksymalne z chwil osignicia przez ukad rwnowagi. W warunkach staej temperatury i ci nienia zaleno midzy zmian energii swobodnej (AG) ukadu reagujcego a zmian entropii
WPROWADZENIE Bioenergetyka, czyli termodynamika biochemiczna, zajmuje si badaniem zmian energetycznych towarzyszcych reakcjom biochemicznym. Dostarcza ona podstawowych regu wyjaniajcych, dlaczego niektre reakcje mog zaj, a inne nie mog. Ukady niebiologiczne mog wykorzystywa energi ciepln do wykonywania pracy. Natomiast ukady biologiczne s zasadniczo izotermiczne i uywaj energi chemiczn do napdzania procesw yciowych. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Do prawidowego przebiegu procesw yciowych jest wymagane odpowiednie paliwo" dostarczajce energii. Znajomo sposobu, w jaki organizm czerpie energie z poywienia, jest podstaw zrozumienia prawidowego odywiania i metabolizmu. Jeeli dostpne rezerwy energetyczne ulegn wyczerpaniu, to dochodzi do mierci godowej. Pewne formy wadliwego odywiania s zwizane z brakiem rwnowagi energetycznej (marazm). Szybko uwalniania energii, mierzona szybkoci metabolizmu, jest regulowana przez hormony tarczycy, ktrej niedoczynno wywouje chorob. Wynikiem magazynowania nadmiaru energii jest otyo, jedna z najbardziej powszechnych chorb spoeczestw zachodnich.
132 / ROZDZIA 12
(AS) ujmuje nastpujce rwnanie, ktre czy 2 zasady termodynamiki:

AG = AH - TAS
gdzie AH oznacza zmian entalpii (ciepo), a T oznacza temperatur bezwzgldn. W warunkach reakcji biochemicznych, poniewa AH rwna si w przyblieniu cakowitej zmianie energii wewntrznej (AE) reakcji, powysz zaleno mona wyrazi nastpujco: AG = AE - TAS Jeeli AG ma znak ujemny, to reakcja zachodzi samorzutnie z utrat energii swobodnej, tzn. jest egzoergiczna. Jeli warto AG jest dua, to reakcja zachodzi waciwie a do koca i jest zasadniczo nieodwracalna. Jeeli AG ma warto dodatni, to reakcja zachodzi tylko wwczas, gdy energia swobodna moe by pobrana z zewntrz, tzn. reakcja jest endoergiczna. Jeli warto AG jest dua, to ukad jest trway i charakteryzuje si brakiem lub tylko niewielk skonnoci do reagowania. Jeeli AG rwna si zeru, ukad jest w stanie rwnowagi i nie zachodz adne zmiany. Gdy reagenty znajduj si w steniach 1,0 mol/l, AGC oznacza standardow zmian energii swobodnej. Dla reakcji biochemicznych jako warunki standardowe przyjto umownie pH 7,0. Standardow zmian energii swobodnej w tych standardowych warunkach (tzn. w pH 7,0) oznacza si jako AG0' Standardow zmian energii swobodnej mona obliczy, znajc sta rwnowagi K'eq
AG' = -2,303 RT logK'eq
czenie lub sprzenie z reakcjami oksydacyj nymi. W najprostszej formie ten typ sprzenia mona przedstawi tak, jak na ryc. 12-1. ,M 3
4
b
Ciepo
fi
Ryc. 12-1.
Sprzenie reakcji egzoergicznej z en doergiczna. ________
gdzie R jest sta gazow, a T oznacza temperatur bezwzgldn (p. str. 95), Naley zwrci uwag, e w zalenoci od ste rnych reagentw warto AG moe by wiksza lub mniejsza od wartoci AG"'. Naley podkreli, e w ukadach reakcji biochemicznych enzym tylko przyspiesza dojcie do stanu rwnowagi i nigdy nie zmienia kocowych ste reagentw w stanie rwnowagi. PROCESY ENDOERGICZNE PRZEBIEGAJ W SPRZENIU Z PROCESAMI EGZOERGICZNYMI Procesy yciowe, np. reakcje syntez, skurcz miniowy, przewodnictwo nerwowe i aktywny transport, czerpi energi przez chemiczne po-
Przemiana metabolitu A w metabolit B zachodzi z uwolnieniem energii swobodnej. Przemiana ta jest sprzona z inn reakcj, ktra wymaga energii swobodnej do przeksztacania metabolitu C w metabolit D. Poniewa cz energii uwalnianej w reakcji degradacji jest przekazywana reakcji syntezy w innej postaci ni ciepo, nie naley w przypadku tych reakcji uywa terminw chemicznych: reakcja egzotermiczna i reakcja endotermiczna. Zamiast nich uywa si okrele egzoergiczna lub endoergiczna, aby wskaza, e procesom towarzyszy odpowiednio strata lub zysk energii swobodnej, niezalenie od formy energii biorcej udzia w tych procesach. W praktyce, procesy endoer-giczne nie mog zachodzi samodzielnie, lecz musza by skadnikiem sprzonego ukadu egzoergiczno-endoergicznego, w ktrym wypadkowa zmiana netto jest egzoergiczna. Reakcje egzoergiczne okrela si mianem katabolizm (degradacja lub utlenienie czsteczek pali wa"), natomiast reakcja syntez, w wyniku ktrych powstaj czsteczki, okrela si jako ana-bolizm. Wszystkie procesy kataboliczne i ana-boliczne nazywa si oglnie metabolizmem. Jeli reakcja przedstawiona na ryc. 12-1 przebiega z lewa na prawo, to caemu procesowi musi towarzyszy utrata energii swobodnej w postaci ciepa. Jeden z moliwych mecha -
BIOENERGETYKA / 133
nizmw sprzenia mgby polega na uczestnictwie w obu reakcjach wsplnego koniecznego zwizku poredniego (I),
A+C
I
B+D
W ten sposb s sprzone niektre reakcje egzoergiczne i endoergiczne w ukadach biologicznych. Naley uwiadomi sobie, e ten typ ukadu ma wbudowany mechanizm biologicznej kontroli szybkoci procesw oksydacyj nych, poniewa istnienie wsplnego koniecznego zwizku poredniego powoduje, e szybko zuycia produktu szlaku syntezy (D) warunkuje z kolei, przez jego dziaanie masowe, szybko, z jak ulega utlenieniu A. Istotnie, te wzajemne powizania stanowi podstaw koncepcji kontroli oddechowej, procesu ktry zabezpiecza organizm przed spalaniem poza kontrol. Rozwiniciem koncepcji sprzeniowej s reakcje odwodornienia, sprzone za porednictwem przenonika midzyenzymowego z reakcjami uwodornienia (ryc. 12-2).
AH, BH;
Alternatywn metod sprzgania procesw egEoergicznych z' procesami endoergicznymi jest synteza zwizku bogatoenergetycznego w reakcji egzoergicznej i wczenie tego nowego zwizku w reakcj endoergiczn. Tym sposobem nastpuje przeniesienie energii swobodnej z procesu egzoergicznego do endoergicznego (ryc 12-3). Na rycinie 12-3 jest zwizkiem bogato-energetycznym, a jest odpowiadajcym mu zwizkiem maoenergetycznym. Zalet biologiczn tego mechanizmu jest to, e , w przeciwiestwie do I w poprzednim ukadzie, nie musi by strukturaln pochodn A, B, C lub D. W ten sposb zwizek moe shiy jako przekanik energii pochodzcej z wielu reakcji egzoergicznych na rwnie du liczb reakcji lub procesw endoergicznych, jak to przedstawiono na ryc. J2-4.
PracMy
endoMglczne Syntezy
Rnkcja
gioergiezne
Skurcz mini
B Przenonik Przenoni k-H
Ryc. 12-2. Sprzenie reakcji odwodornienia i uwodornienia za porednictwem przenonika midzyenzymowego. Ryc. 12-3. Przeniesienie energii swobodnej z reak cji egzoergicznej do endoergicznej za porednict
Transport aktywny
Ryc. 12-4. Przekazanie energii endoergicznym procesom biologicznym przy udziale uniwersal nego" porednika bogatoenergetycznego.
W ywych komrkach najwaniejszym bo ga toenergetycznym zwizkiem porednim hib zwizkiem przenonikowym (oznaczonym ~ ) jest trifosfoadenozyna (ATP). FOSFORANY BOGATOEN ERG ETYCZNE ODGRYWAJ KLUCZOW ROL W PRZEJMOWANIU I PRZENOSZENIU ENERGII
wem bogatoen erg etycznego metabolitu pored niego. ____________________________
B
Wszystkie organizmy, w celu podtrzymania procesw yciowych, mus74 pobiera energi swobodn ze swojego rodowiska. Organizmy
134 / ROZDZIA 12
a u to troficzne sprzgaj swj metabolizm z pewnymi procesami egzoergicznymi zachodzcymi w ich otoczeniu, np. roliny zielone wykorzystuj energi soneczn, a niektre bakterie autotroficzne wykorzystuj reakcj Fe2+
--------------------------------------------------------------------------------------
> Fe3+. Natomiast organizmy heterntroficzne uzyskuj energi swobodn przez sprze nie ich metabolizmu z degradacj zoonych czsteczek organicznych wystpujcych w ich rodowiskach. We wszystkich tych procesach ATP odgrywa kluczow rol w przenoszeniu energii swobodnej z procesw egzoergicz-nych na procesy endoergiczne {ryc. 12-3 i 12-4). ATP jest wyspecjalizowanym nukleotydem zawierajcym adenin, ryboze i 3 grupy fosforanowe (ryc. 12-5). W komrce ATP uczestniczy w reakcjach w postaci kompleksu z Mg2+ (ryc. 12-6).
od dostarczenia energii pochodzcej z procesw utlenia przebiegajcych w miniach. Rola tych zwizkw w bioenergetyce bya wyranie niedoceniana, a do czasu gdy Lipmann wpro wadzi pojcie fosforanw bogatoenergetycz-nych" i fosforanowych wiza bogatoener-getycznych". Porednia warto energii swobodnej hydrolizy ATP, w porwnaniu z innymi fosforanami organicznymi, ma istotne znaczenie bioenergetyczne Standardow energi swobodn hydrolizy niektrych biochemicznie wanych fosforanw przedstawiono w tab. 12-1. Na podstawie daTabela 12-1. Standardowa energia swobodna hydrolizy niektrych biochemicznie wanych fos+ foranw organicznych AG" Fosforan organiczny kj/mof kcal/mol -14,8 -12,3 -11,8 -10,3 - 7 ,3 - 6 ,6 6 ,6 5,0 3,8 3,4 3 ,3 2,2
0i
O-P-O-P-O-P-O-CHS
o-
kw
HO OH
Fosfoenolopirogronian Karbamoilofosforan 1,3-Bisfosfogliceryntan (do 3-fosfoglicerynian) Fosfokreatyna ATP ---------- ADP + Pf ADP ----------- AMP + P, Pirofosforan Glukozo-1 -fosforan Fruktozo-6-f osf ora rt
AMP
-61 ,9 -51,4 -49,3 -43,1 -30,5 -27 ,6 -27 ,6 -20,9 -15,9 -14 ,2 -13,8 - 9 ,2
Ryc. 12-5. Adenozynotrifosforan (ATP).
o~ o-
o~
Glukozo-6-fosforan Glicerolo-3-fosforan
-0-P -O -P- O -P- O- Ade nozyna M II II 0 0 0 Ryc. 12-6. Magnezowy kompleks ATP. {Podobnie wyglda kompleks Mg-ADP).
* Pi fosforan nieorganiczny. + Wartoci dla ATP i wikszoci pozostaych zwizkw na podstawie Krebsa i Kornberga (1957).
Znaczenie fosforanw w metabolizmie porednim stao si jasne wraz z poznaniem chemicznych szczegw glikolizy or az roli ATP, difosfoadenozyny (ADP) i fosforanu nieorganicznego (Pj) w tym procesie (p. str. 213). Przyjto, e ATP jest porednikiem w przenoszeniu rodnikw fosforanowych w procesie fosforylacji. Rol ATP w energetyce biochemicznej sugeroway dane dowiadcze, wskazujcych, e podczas skurczu miniowego' rozpada si ATP j fosfokreatyna, a ich ponowna synteza zaley
nych AG' hydrolizy (oznaczanej w temp. 37C) mona oceni porwnawczo skonno kadej z grup fosforanowych do przejcia na odpowiedni akceptor. Jak wida z tabeli, warto 30,5 kJ/mol dla hydrolizy kocowego fosforanu ATP dzieli wymienione zwizki na 2 grupy. Jedn grup stanowi fosforany maoenergetycz-ne, reprezentowane przez estry fosforanowe uczestniczce w glikohzie, dla ktrych warto AG' hydrolizy jest mniejsza ni dla ATP, natomiast w drugiej grupie, okrelanej mianem
BIOENERGETYKA / 135
fosforany bogatoenergetyczne, warto jest wiksza ni dla ATP. Skadniki tej ostatniej grupy, obejmujcej ATP i ADP, s zwykle bezwodnikami (np. fosforan-1 w 1,3 -bis fosfo glicery nianie), enolofosforanami (np. fosfoenolopirogro-nia) lub fosfoguanidynami (np. fosfokreatyna, fosfoarginina). rodkowa pozycja ATP pozwala mu odgrywa istotn rol w przenoszeniu energii. Inne biologicznie wane zwizki bogatoenergetyczne" to estry tioiowe zawierajce koenzym A (np. acetylo-CoA), biako przenoszce reszty acylowe kwasw tuszczowych (ang. acyl carrier protein; ACP), estry aminokwas w uczest niczce w syntezie biaek, S-adenozylometioni-na (aktywny metyl), UDP-Glc (urydynodifosfo-ghikoza) i PRPP (5-fosforybozylo-l-piro-fosforan).
Fosforany bogatoenergetyczne oznacza si symbolem ~
powodu, niektrzy preferuj okrelenie potencja! przenoszenia grupy zamiast wizanie bogatoenergetyczne. ATP wic zawiera 2 bogatoenergetyczne grupy fosforanowe, a ADP zawiera 1; natomiast fosforan w AMP (adenozynomono-fosforanie) jest typu maoenergetycznego, poniewa jest poczony zwykym wizaniem estrowym (ryc, 12-7).
FOSFORANY BOGATOENERGETYCZNE DZIAAJ JAKO OBIEGOWA MONETA ENERGETYCZNA KOMRKI
W celu zaznaczenia obecnoci bogatoener-getycznej grupy fosforanowej, Lipmann wpro wadzi symbol ~, oznaczajcy bogatoenergetyczne wizanie fosforanowe. Symbol ten wskazuje, e doczona do tego wizania grupa, po przeniesieniu na odpowiedni akceptor, przekae wiksz ilo energii swobodnej. Z tego
Ad e n o z y n o -
0PM O lub Adenozyno
-Adenozynotrlfostoran (ATP)
o0
o-
Adeno,2yno - 0 - P - /P II """"T
o-
lub Adenozyno- (&) (?) Adenozynodltosforan (ADP)
0
Adenozyno -O - P - 0 ~ lub Adenozyno (ji) Adenozynomonofosforan (AMP)
Ryc. 12-7. Struktura ATP, ADP i AMP ukazujca pooenie i liczb fosforanw bogato en erg etycznych (~).
Dziki swemu pooeniu, porodku listy standardowych energii swobodnych hydrolizy (tab. 12-1), ATP moe by donorem fosforanu boga-toenergetycznego dla zwizkw znajdujcych si w tabeli poniej ATP. Z tego samego powo du, w obecnoci odpowiednich enzymw, ADP moe by akceptorem fosforanu bogatoener-getycznego od zwizkw znajdujcych si w tabeli powyej ATP; w reakcji tej powstaje ATP. W istocie, cykl ATP/ADP czy procesy generujce ~ z procesami zuywajcymi ~ (ryc. 12-8). W ten sposb ATP jest stale zuywany 1odtwarzany. Zasadniczym rdem MS s 3 procesy uczestniczce w wychwytywaniu energii, czyli zachowaniu energii: 1. Foforylacja oksydacyjna. Jest to ilociowo najwiksze rdo ~ w organiz mach tlenowych. Energia swobodna, napdza jca ten proces, pochodzi z utlenian w mito-chondriainym acuchu oddechowym (p. str. 153). 2. Glikoli/a. W wyniku przemiany do mleczanu z 1 mola glukozy uzyskuje si netto 2 ~, tworzone w 2 reakcjach katalizowanych odpowiednio przez kinaz fosfogliceryniartow i kinaz pirogronianow (p. ryc. 19-2). 3. Cykl kwasu cytrynowego. Bezporednio w cyklu po wstaje jeden ~ , na etapie katalizowanym przez syntetaz sukcynylo-CoA (p. ryc. 18-3). Inna grupa zwizkw, fosfageny, stanowi zapasow form fosforanw boga to energetycznych. Naley do niej fosfokreatyna, wystpujca w miniach krgowcw i w mzgu, oraz fosfoarginina wystpujca w miniach bezkrgowcw. W warunkach fizjologicznych fosfageny pozwalaj utrzyma stenie ATP w miniach w sytuacji, gdy ATP jest szybko zuywany, suc jako rdo energii do skurczu miniowego. Odwrotnie, w sytuacji gdy ATP jest pod dostatkiem, zwiksza si stenie fosfage -
136 / ROZDZIA 12
Fosfo-anolopiro 1,3-B isfosfog 11 ceryn i a n gronian Fosforylacja oksydacyjna Sukcynyto -CoA
ga toenergetyczny z mitochondriw do sarkole-my i dziaa jako bufor bogatoenergetyczny. Ten bufor moe mie wane znaczenie w miniu sercowym, odgrywajc rol natychmiastowej osony przed skutkami zawau. Gd y ATP dzi aa jako do nor fos foranu z utworzeniem zwizku charakteryzujcego si niniejsz energi swobodn hydrolizy (tab. 12-1), grupa fosforanowa przeksztaca si zawsze w grup maoenergetyczn, np.
KINAZA G LICE ROLO W A
Glicerol +Adenozyno-? Glicerolo-n + Adenozyno- ~
Inne fosfory I acje, -aktywacje i procesy endoerglczne Gl I ce ra to-3-f osf
ran Gl ukozo-6-fosforan Glukoza-1,6blsfosforan Ryc. 12 -8. R ol a cykl u A TP/ A DP w pr zenoszeni u fosf oranu bogatoener getycznego. Naley zwrci uw ag, e nie wystpuje w stanie wolnym, ale w takiej post aci jest pr zenoszony w e w skazanych reakcjach.
ATP pozwala sprzc reakcje tertnodynamicznie niekorzystne z reakcjami termodynamicznie korzystnymi Na rycinie 12-1 oraz 12-3 przedstawiono szczegowo energetyk reakcji sprzonych. Tego rodzaju reakcj jest pierwsza reakcja cigu glikoli tycznego (p. ryc. 19-2), fosforylacji glukozy do giukozo-6-fosforanu. Jest ona bardzo endoergiczna i nie moe przebiega samodzielnie w warunkach fizjologicznych.
1. Glukoza+ P ^Glukozo-6-fosforan +
(AG'=+13,8kJ/mol) Aby reakcja moga zaj, musi zosta sprzona z inn reakcj, ktra jest bardziej egzoergiczna ni fosforylacja glukozy endoergiczna. Tak reakcj jest hydroliza kocowego wizania fosforanowego w ATP,
2. ATP
nw sucych jako zapas fosforanw bogato-energetycznych (ryc. 12-9). W miniach czenko fosfokreatynowe" transportuje fosforan boKINAZA 1 KREATYNOWA
C
(AG'= -30,5 kJ /mol) Gdy (1) i (2) s sprzone w reakcji katalizowanej przez heksokinaz, fosforylacja glukozy przebiega bc/. trudu w bardzo tgzoergicznej reakcji, ktra w warunkach fizjologicznych jest daleka od rwnowagi i z tego powodu praktycznie nieodwracalna.
MEKSOKINAZA
H3CN CH, COOH Fosfokreatyna
C=MH-* -
*T
ADP
ATP
COOH
CHi
= -12,6 kJ/mol)
Kfeatyna
Ryc. 12-9. Przenoszenie fosforanu bogatoenergetycznego z fosfokreatyny 'a ADP i z ATP na kreatyn, Czenko fosfokreatynowe".
Glukoza + ATP
----------- Gliikozo-6-fosforan+ADP <AG'= 16,7 kJ/mol)
BIOENERGETYKA / 137
Wiele reakcji aktywacji" zachodzi w ten spo sb. Kinaza adenylanowa umoliwia wzajemn przemian nukleotydw adenino wych Kinaza adenylanowa (miokinaza) jest enzymem wystpujcym w wikszoci kom rek. Katalizuje ona przemian ATP i AMP w ADP:
KINAZA ADENYLANOWA
Kombinacja pwyszych reakcji umoliwia obieg fosforanu i przemian wzajemn nukleotydw adeninowych (ryc. 12-10).
PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA
ATP + AMP -
-> 2 ADP
Reakcja ta spenia 3 zadania: 1. Umoliwia wykorzystanie fosforanu bogatoenergetycznego w ADP do syntezy ATP. 2. Umoliwia refosforylacj AMP, powstae go z ATP w rnych reakcjach aktywacji. 3. Umoliwia zwikszenie stenia AMP wraz ze zmniejszeniem si stenia ATP. AMP dziaa jako sygna metaboliczny (allosteryczny) do zwikszenia szybkoci reakcji katabolicz nych, ktre z koiei prowadz do tworzenia wikszych iloci ATP (p. str. 246). Gdy ATP uczestniczy w reakcjach z utworzeniem AMP, wwczas powstaje pirofosforan nieorganiczny (PPi) Nastpuje to np. w reakcji aktywacji du -goacuchowych kwasw tuszczowych:
SYNTETAZA ACYLO-CoA
Ryc. 12 -10. C ykl e f osf or anow e i przem i ana w zaj em na nuki eot ydw a deni now y ch.
Rwnie inne trifosfonukleozydy uczestnicz w przenoszeniu fosforanu bogatoene rgety cz n eg o Przy udziale kinazy difosfonukleozydowej z odpowiednich difosforanw mog by syntetyzowane trifosfonukleozydy podobne do ATP, ale zawierajce inn zasad ni adenina, np.
ATP + HS CoA + R COOH AIWP + PP,+ R CO SCoA
KINAZA DIFOSFONUKLEOZYDOWA
Reakcji towarzyszy utrata energii swobodnej w postaci ciepa, co gwarantuje przebieg reakcji aktywacji w prawo. Jest ona dodatkowo wspomagana przez hydrohtyczne rozszczepienie PPj (AGr = 27,6 kJ/mol), katalizowane przez pi-rofosfataz nieorganiczn. Naley zwrci uwag, e w wyniku reakcji aktywacji, zachodzcej z utworzeniem pirofosforanu, dochodzi do utraty 2~, a nie l~, jak w przypadku reakcji z utworzeniem ADP i Pj.
PIROFOSFATAZA NIEORGANICZNA
ATP+UDP ADP+UTP
(u r yd y n ot r if osfo ra n)
ATP+GDP ADP-rGTP
(guanuzynotrifosforan)
ATP+CDP ---------------------------------- <

ADP+CTP (cytydynotrifosforan)
i + HzO
2P,
Wszystkie te trifosforany uczestnicz w reakcjach fosforylaeji zachodzcych w komrce. Podobnie kinazy monofosfonukleozydowe, swoista dla nukleozydw purynowych i swoiste dla nuk]eozydw pirymidynowych, katalizuj reak-
138 / ROZDZIA 12
cje tworzenia disfosfonukleozydw z odpowiednich monofosforanw:

SWOISTA KINAZA MONOFOSFO NUKLEOZYDOWA
PIMIENNICTWO
Ernsier L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Harold FM; The Vitat Force: A Study of Bioenergetics. Freeman, 1986. Klotz IM: Introduclion to Biomolecular Energetics. Academic Press, 1986, Krebs HA, Kornberg HL: Energy Transformatwns in Living Matter. Springer, 1957. Lehninger AL: Bioenergetics: The Molecuar Basis of BiologicaJ Energy Transformatwns, 2nd ed, Ben-jamin, 1971.
ATP + Nukleozydo-J < ADP+ Nukleozydo- ~
Wynika z tego, e kinaza adenylanowa jest wyspecjalizowan kinaz monoiosforanow.
Utleniania biologiczne
13
WPROWADZENIE
Chemicznie utlenianie definiuje si jako proces usuwania elektronw, natomiast redukcj jako proces przyczania elektronw; ilustruje to reakcja utlenienia jonu elazawego w jon elazowy:
ZMIANY ENERGII SWOBODNEJ W UKADACH OKSYDACYJNO--REDUKCYJNYC H MOG BY WYRAONE JAKO POTENCJA RED.-OKS.
W reakcjach obejmujcych utlenianie i redukcj wymiana energii swobodnej jest proporcjonalna do skonnoci zwizkw reagujcych do oddawania lub pobierania elektronw. Std te, oprcz wyraania zmian energii swobodnej jako AG' (p. rozdz. 12), moliwe jest analogiczne wyraenie ich liczbowo jako potencja ok-sydoredukcyjny lub red.-oks. ukadu (Eo')_ Zazwyczaj porwnuje si potencja oksydoreduk-cyjny ukadu (Eo) z potencjaem elektrody wodorowej, ktrego warto w pH 0 okrela si jako 0,0 woltw. Jednak w przypadku ukadw biologicznych przyjo si wyraanie potencjau oksydoredukcyjnego (Eo'} w pH 7,0, w ktrym to pH potencja elektrody wodorowej rwna si -0,42 V. W tabeli 13 -1 podano potencjay
Tabela 13-1. Niektre potencjay oksydoredukcyj-ne o specjalnym znaczeniu w ukadach oksydore-dukcyjnych ssakw Ukad Bursztynian/cc-ketogluiaran H + /H2 NAD+/NADH Liponian/dihydroliponian Acetoocta n/J3- hydroksymalan Pirg ronian/mleczan Szczawiooctan/jabczan Flawoproteina -stary ty enzym; ult./zred. fumaran/bursztynian 3+ 2+ Cytochrom b; Fe /Fe Ubichinon/ubichinol 3+ 2+ Cytochrom c; Fe /Fe 3+ 2+ Cytochrom a; Fe /Fe Tlen/woda EO'[V1 -0,67 -0,42 -0,32 -0,29 -0,27 -0,19 -0,17 -0,12 + 0,03 + 0,08 + 0,10 + 0,22 + 0,29 + 0,82
J -+
e~ (elektron) Fe
3+
Wynika z tego, e utlenieniu zawsze towarzyszy redukcja biorcy elektronw. Ta regua utleniania redukcji obowizuje rwnie w ukadach biologicznych i jest zasadniczym pojciem pozwalajcym zrozumie istot utlenia biologicznych. Naley podkreli fakt, e wiele utlenia biologicznych moe zachodzi bez udziau tlenu czsteczkowego np. procesy odwodorowania.
Chocia pewne bakterie (beztlenowce) yj w nieobecnoci tlenu, ycie wyszych gatunkw zwierzt jest bezwzgldnie zalene od obecnoci tlenu. Gwnym procesem zuywajcym tlen jest oddychanie tkankowe, ktre mona okreli jako proces kontrolowanej reakcji wodoru z (Jenem i tworzenia wody, w ktrym komrka uzyskuje energi w postaci ATP. Poza tym tlen czsteczkowy jest wbudowywany do rnych substratw przez enzymy okrelane mianem oksygenaz; wiele lekw, chemicznych zanieczyszcze rodowiska i chemicznych karcynoge-nw (ksenobiotykw) jest meta boi izowanych przy udziale tej klasy enzymw, okrelanych jako system cytochromu P-450. Podawanie tlenu chorym z niewydolnoci oddechow lub kreniow moe uratowa im ycie, a sporadyczne podawanie tlenu pod wysoki m cinieniem (hi-perbaria) ma rwnie zastosowanie kliniczne, aczkolwiek moe to prowadzi do wystpienia toksycznych dziaa tlenu.
140 / ROZDZIA 13
oksy do redukcyjne niektrych biologicznych ukadw oksydoredukcyjnych, szczeglnie interesujcych w biochemii ssakw. Na podstawie przedstawionych w tabeli wartoci potencjaw oksy do redukcyjnych mona przewidzie kierunek przepywu elektronw z jednej pary ok-syd o redukcyjnej na drug. ENZYMY UCZESTNICZCE W UTLENIANIU I REDUKCJI OKRELA SI MIANEM OKSYDOREDUKTAZ Oksydoreduktazy podzielono na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i ok-sygenazy. OKSYDAZY UYWAJ TLENU JAKO AKCEPTORA WODORU Oksydazy katalizuj oderwanie wodoru z substratu w reakcji, w ktrej tlen jest biorc wodoru*. Produktem reakcji jest woda lub nadtlenek wodoru (ryc. 13-1).
kocowy akceptor tlen. Oksydaza traci aktywno w obecnoci tlenku wgla, cyjanku lub siarkowodoru. Enzym ten rwnie nazywano cytochromem a3. Pocztkowo przypuszczano, e cytochrom a i cytochrom a3 s zwizkami niezalenymi, gdy kady z nich ma inne widmo i rne waciwoci w odniesieniu do dziaania tlenku wgla i cyjanku. W pniejszych badaniach wykazano, e te 2 cytochromy wystpuj w tym samym biaku, a kompleks jest znany jako cytochrom aa3. Zawiera on 2 czsteczki hemu, z ktrych kada ma atom Fe wystpujcy podczas utleniania i redukcji w formie Fe3+ lub Fe2+. Kompleks zawiera rwnie 2 atomy Cu, kady z nich zwizany z jednostk hemow. Fcnolaza (tyrozynaza, oksydaza polifenolo-wa, oksydaza katecholowa) jest zawierajcym mied enzymem o szerokiej swoistoci substra-towej. Katalizuje ona przemian monofenoli lub o-difenoli w 0-chinony. Rwnie inne enzymy zawieraj mied. Niektre oksydazy s flawoproteinami Enzymy flawo protein owe zawieraj mononu-kleotyd flawinowy (FMN) lub dinukleotydflawi-noadeninowy (FAD) jako grupy prostetyczne. FMN i FAD s wytwarzane w organizmie z witaminy ryboflawiny (p. rozdz. 53). FMN i FAD s zwykle mocno ale nie kowalencyjnie zwizane z odpowiednim apo-enzymem. Enzymy flawoproteinowe, okrelane mianem meltdoflawoprotein, zawieraj jeden lub wicej metali, ktre s niezbdne do dziaania enzymu. Do tej grupy oksydaz zalicza si min. oksydaz L -aminokwasow, wspdziaajcy z FMN enzym wystpujcy w nerkach. Enzym ten katalizuje deaminacj oksydacyjn naturalnie wystpujcych L-aminokwasw. Szeroko rozpowszechniona jest oksydaza ksantynowa, ktrej aktywno wykryto w mleku, jelicie cienkim, nerce i wtrobie. Zawiera ona molibden i odgrywa wan rol w przemianie zasad purynowych w kwas moczowy (p. str. 425). Ma ona szczeglne znaczenie w wtrobie i nerkach ptakw, ktre wydalaj kwas moczowy jako gwny azotowy produkt kocowy metabolizmu nie tylko puryn, iecz take katabolizmu biaek i aminokwasw. Dehydrogenaza aldehydowa jest enzymem zwizanym z FAD, wystpujcym wwtrobie ssakw. Jest to tnetaloflawoproteina zawieraj ca molibden i elazo niehemowe, a dziaa na aldehydy i substraty N-heterocykliczne.
Ryc. 13-1. Utlenianie metabolitw katalizowane przez oksydaz (A) tworzc wod, (B) tworzc H2O3.
Niektre oksydazy zawieraj mied Oksydaza cytochromowa jest hemoprotein szeroko rozpowszechnion w wielu tkankach rolinnych i zwierzcych. Jest ona kocowym przenonikiem elektronw w mitochondrial-nym acuchu oddechowym, a zatem jest odpowiedzialna za reakcj, w ktrej elektrony pochodzce z utleniania czsteczek substratw przez dehydrogenazy s przenoszone na ich * Czasami nazwa oksydaza" jest uywana jako oglne okrelenie wszystkich enzymw, ktre katalizuj reakcje wymagajce udziau tlenu czsteczkowego-
UTLENIA NIA BIOLOGICZNE / 141 Przenonik (Uli)

(Utl) Przenonik -(Zr ed) DEHYDROGENAZA SPECYFICZNA DLA A DEHYDflOGENAZA SPECYFICZNA DLft
8H,
(Zred) B (Utl)
Ryc. 13-2. Utlenianie metabo litw katalizowane przez dehydrogenazy, zachodzce bez udziau a cucha oddechowego, ________
Interesujca, ze wzgldu na zastosowanie w oznaczaniu stenia glukozy, jest oksydaza glukozowa, FAD-zaJeny enzym otrzymywany z grzybw. Mechanizm reakcji oksydoredukcyjnych, katalizowanych przez te enzymy, jest zoony. Jednake s dowody na to, e redukcja piercienia izoalloksazynowego zachodzi w 2 etapach przez poredni zwizek semichinonowy (wolny rodnik) (ryc. 13-3). DEHYDROGENAZY NIE MOG UYWA TLENU JAKO AKCEPTORA WODORW Ta klasa obejmuje du liczb enzymw. Speniaj one 2 zasadnicze funkcje: a. Przenosz wodory z jednego substratu na
drugi w sprzonej reakcji oksydoredukcyjnej (ryc. 13-2). Te deriydrogenazy s swoiste wzgldem ich substratw, ale czsto uywaj tego samego koenzymu lub przenonika wodorw co inne dehydrogenazy. Poniewa reakcje s odwracaine, waciwoci te pozwalaj swobodnie przenosi rwnowaniki redukujce wewntrz komrki. Ten typ reakcji, w ktrej jeden subslrat utlenia si kosztem drugiego, jest uyteczny zwaszcza w nieobecnoci tlenu umoliwia bowiem przebieg procesw oksydacyjnych, b. Jako skadniki acucha oddechowego transportujcego elektrony z substratu na tlen (ryc. 13-4). Niektre dehydrogenazy s zalene od koenzymw nikotynoamidowych Ta kategoria enzymw obejmuje liczn grup dehydrogenaz, ktrych koenzymem jest dinuk-leotyd nikotynoamido-adeninowy (NAD+) lub fosforan dioukleotydu nikotynoamido-adeni-nowego (NADP+). Niektre dehydrogenazy mog uywa zarwno NAD+, jak i NADP+ -NAD+ i NADP + s wytwarzane w organizmie 2 witaminy niacyny (p. ryc. 53-4). Koenzymy te ulegaj redukcji przez swoisty substrat dehydrogenazy i reoksydacji przez waciwy akcep tor elektronw (ryc. 13-5). Mog one swobod nie i odwracalnie dysocjowa od odpowiednich apoenzymw. Na og NAD-zalene dehydrogenazy katalizuj reakcje oksydoredukeji w oksydacyjnych
Ryc. 13-3. Redukcja piercienia izoallo ksazyno wego w nukleotydach Ilawino wych.
[DEHYDROGENAA]
| DEHYPROGENAZAl Przenonik
j PEHYDROSENAZAI Prze no nik-H,
[OKSYDAZA I Przenonik
AH 3 (Utl) Przenonik 2 (Utl)

y\przenonlK-H,
lUtt)
1 (Zred)
(Zred) ostatecznie przez oksydaz w acuchu Ryc. 13-4. Utlenianie metabo litu przez dehydro genazy oddechowym.
142 / ROZDZIA 13
DEHYDFIOGENAZ A SWOISTA DLA A N
CONHj
Posta A
DEHYDROGENAZA SWOISTA DLA B
NAD+ + Ryc. 13-5. Mechanizm utleniania i redukcji koenzymw nikotynoamidowych. Nikotynoamid jest redukowany stereospecyficznie w pozycji 4 przez substrat AH2. Jeden z atomw wodoru zostaje oderwany od substratu jako anion wodorkowy H" (jdro wodoru z 2 elektronami) i przeniesiony na atom wgla w pozycji 4 nikotynoamidu, gdzie moe zosta przyczony w pooeniu A lub B w zalenoci od swoistoci dehydrogenazy katalizujcej t reakcj. Drugi atom wodoru z pary wodorw oderwanych od substratu pozostaje w rodowisku wolny jako kation wodorowy.
szlakach metabolizmu, np. w glikolizie, cyklu kwasu cytrynowego i mitochondrialnym acuchu oddechowym. Z kolei NADP-zalene dehydrogenazy s charakterystyczne dla syntez redukcyjnych, np. pozamitochondrialnej syntezy kwasw tuszczowych i syntezy steroidw, NADP jest rwnie koenzymem dehydrogenaz cyklu pentozofosforanowego. Niektre dehydrogenazy zalene od koenzymu nikotynoami-dowego zawieraj cynk, np. dehydrogenaza alkoholowa z wtroby i dehydrogenaza gliceral-dehydo-3-fosforanowa z mini szkieletowych; jony cynku nie uczestnicz w reakcji oksydore-dukcji. Niektre dehydrogenazy s zalene od ryboflawiny Grupy {lawinowe zwizane z tymi dehyd-rogenazami s podobne do FMN i FAD wystpujcych w oksydazach. Zasadniczo s one cilej zwizane ze swoimi apoenzymami ni koenzymy nikotynoamidowe. Wikszo dehy-drogenaz ryboflawi nowych bierze udzia w
przenoszeniu elektronw w (lub dn) acuchu oddechowym. Dehydrogenaza NADH jest czonem acucha oddechowego dziaajcym
bursztynianowa, dehydrogenaza acylo-CoA i mi-tochondrialna dehydrogenaza glicerolo-3-fosfo-ranowa przenosz
rwnowaniki redukcyjne bezporednio z substratu na a cuch oddechowy (p. ryc. 14-3). Inn rol dehydrogenaz zalenych od flawin jest udzia w odwodorowa-niu (przez dehydrogenaz dihydroliponianow) zredukowanego liponianu, zwizku poredniego w dekarboksylacji oksydacyjnej pirogronia-nu i a-ketoglutaranu (p. ryc. 14-3). W tym szczeglnym przypadku, z powodu niskiego potencjau o ksy do redukcyjnego, flawoproteina (FAD) dziaa jako przenonik wodorw ze zredukowanego liponianu na NAD (p. ryc. 19-5). Flawoproteina przenoszca elektrony jest poredniczcym przenonikiem elektronw midzy dehydrogenaza acylo-CoA a acuchem oddechowym (p. ryc. 14-3). Niektre cytochromy mog by traktowane jako dehydrogenazy Z wyjtkiem oksydazy cytochromowej (opi sanej wczeniej), cytochromy s klasyfikowane jako dehydrogenazy. Ich identyfikacj i badanie uatwia waciwo wystpowania w stanie zredukowanym charakterystycznych pasm absorpcyjnych, ktre zanikaj po utlenieniu czsteczki. W acuchu oddechowym cytochromy
funkcjonuj jako przenoniki elektronw midzy
jako przenonik elektronw midzy MADH a skad nikami bardziej elektrododatnimi (p. ryc. 14-2). Inne dehydrogenazy, takie jak dehydrogenaza
UTLENIANIA BtOLOGiCZNE / 143
flawoproteinami a oksydaz cytochromow (p. ryc. 14-3-). Cytochromy s hemoproteinami zawierajcymi elazo, w ktrych atom elaza podczas oksydoredukcji wystpuje naprzemiennie w postaci Fe3+ lub w postaci Fe2+. W acuchu oddechowym wystpuje kilka rnych cytochromw, mianowicie cytochromy b, Ci, c, a i a3 (oksydaz cytochromow). Spord nich tylko cytochrom c jest rozpuszczalny w wodzie. Cytochromy wystpuj rwnie poza acuchem oddechowym, np. w siateczce endoplaz-matycznej {cytochromy P-450 i b5).
go glutationu rozkad H2O2 i nadtlenkw lipi dw, zapobiegajc w ten sposb utlenieniu lipidw bonowych i hemoglobiny przez nadtlenki (p. str. 233).
PEROKSYDAZY UYWAJ NADTLENKU WODORU LUB NADTLENKW ORGANICZNYCH JAKO SUBSTRATW

Do tej kategorii zalicza si 2 typy enzymw: klasyczne peroksydazy i katalaz. Oba typy wystpuj zarwno u zwierzt, jak i u rolin, Peroksydazy chroni organizm przed szkodliwymi nadtlenkami. Nagromadzenie si nadtlenkw moe prowadzi do tworzenia wolnych rodnikw, co z kolei moe by przyczyn uszkodzenia bon itp. i jednym z czynnikw prowadzcych do miadycy i nowotworw (p. rozdz. 16).-
Katalaza jest hemoprotein zawierajc 4 grupy hemowe. Wykazuje ona aktywno peroksydazow oraz dodatkowo moe katalizowa reakcj, w ktrej jedna czsteczka H3O2 jest substratem oddajcym elektrony, a druga czsteczka H2Oi jest utleniaczem, czyli akceptorem elektronw. W warunkach in vivo katalaza wykazuje zwykle aktywno peroksydazow.
KATALAZA
Katalaza uywa nadtlenku wodoru zarwno jako donora, jak i akceptora elektronw
2 H2O2 2 H2O + O2
Peroksydazy redukuj nadtlenki, uywajc wielu rnych zwizkw jako akceptorw elektronw
Wystpowanie katalazy stwierdzono we krwi, szpiku kostnym, bonach luzowych, nerkach i wtrobie. Przyjmuje si, e rozkada ona nadtlenek wodoru tworzony w reakcjach oksy-daz. W wtrobie oraz wielu innych tkankach wykazano w komrkach obecno peroksyso-mw, ktre charakteryzuj si du aktywnoci oksydaz i katalazy. Ten fakt sugeruje, e zgrupowanie enzymw wytwarzajcych H2 O2 z enzymem rozkadajcym nadtlenek wodoru jest biologicznie korzystne (ryc. 13-6). Poza
Aczkolwiek pierwotnie sdzono, e s enzymami rolinnymi, peroksydazy znajduj si w mleku, w leukocytach, pytkach krwi i innych tkankach metabolizujcych eikozanoidy (p. str. 290). Grup prostetyczn peroksydaz jest protonem, ktry przeciwnie ni w wikszoci hemo-protein jest luno zwizany z apoprotein. W reakcji katalizowanej przez peroksydaze. nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem rnych zwizkw, np. askorbinianu, chinonw i cytochromu c, ktre dziaaj jako biorcy elektronw. Reakcja katalizowana przez peroksydaze jest zoona, ale jej oglny zapis mona przedstawi nastpujco:
JPEROKSYDAZA
AH 2
- H2O5 I KATALAZA 2H;O
Ryc. 13-6. Rola katalazy w procesie rozkadu nadtlenku wodoru.
H2O2 2 H2O + A
W erytrocytach i innych tkankach, peroksydaza glutationu, zawierajca selen jako grup prostetyczn, katalizuje w obecnoci zredukowane-
enzymami peroksysomalnymi, wytwarzajcymi nadtlenek wodoru, rdem H2O2 mog by reakcje katalizowane przez mitochondrialny i mikrosomalny ukad transportujcy elektrony oraz oksydaz ksantynow.
144 / ROZDZIA 13
OKSYGENAZY KATALIZUJ BEZPOREDNIE PRZENIESIENIE I PRZYCZENIE TLENU 00 CZSTECZKI SUBSTRATU Oksygenazy uczestnicz raczej w syntezie lub degradacji wielu rnych typw metabolitw, a nie w procesach dostarczajcych komrce energii. Enzymy tej grupy katalizuj reakcje przyczenia tlenu do czsteczki substratu. Reakcja przebiega dwuetapowo: 1) wbudowanie tlenu do centrum katalitycznego enzymu i 2) reakcja redukcji lub przeniesienia zwizanego z enzymem tlenu do substratu. Oksygenazy mona podzieli na 2 podgrupy. Dioksygenazy (transferazy tlenu, prawdziwe oksygenazy) przyczaj do substratu oba atomy tlenu Podstawowa reakcja przebiega nastpujco: A + 02
AO2
Mikrosomalne systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizuj hydroksylacj wielu lekw Monooksygenazy te wystpuj w mikrosomach wtroby razem z cytochromem P-450 i cytochromem b 5 . Zarwno NADH, jak i NADPH dostarczaj rwnowanikw redu kujcych do redukcji tych cytochromw (ryc. 13-7), ktre z kolei s utleniane przez substraty w wieloetapowym procesie enzymatycznym okrelanym mianem cyklu hydroksylacyjnego (ryc. 13-8). "
IHYDHOKSYLAZA [
Lek-H O2+ 2Fe + ZH (P-4S0) (P-450)
z+
Do tej podgrupy nale enzymy zawierajce elazo, np. dioksygenaza homogentyzynowa (ok-sydaza, p. str. 369) i dioksygenaza 3-hydroksy-antrani anowa (oksydaza, p. str. 376) z wtroby oraz enzymy wykorzystujce hem, np. dioksygenaza L-trj ptofanowa (pirolaza tryptofano-wa, p. str. 376) z wtroby. Monooksygenazy (oksydazy o mieszanej funkcji, hydroksylazy) wbudowuj do substratu tylko 1 atom tlenu Drugi atom tlenu ulega redukcji do wody, co wymaga udziau dodatkowego donora elektro nw lub kosubstratu
A H + O2 + ZH2 A OH + H 2 O + Z
Wrd lekw metaboiizowanych przez ten ukad enzymatyczny znajduj si: benzopiren, aminopiryna, anilina, morfina i benzofetamina. Wiele lekw, np. fenobarbital, moe wywoywa indukcj syntezy enzymw mikrosomal-nych i cytochromu P-450. Mitochondrialne ukady monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizuj reakcje hydroksylacji steroidw Te ukady enzymatyczne wystpuj w tkankach steroidogenicznych, takich jak kora nadnerczy, jdra, jajniki, oysko. Bior one udzia w biosyntezie hormonw sterodowych z cholesterolu (hydroksylacja na C22 i C20 w procesie odszczepiania acucha bocznego oraz w pozycji l i p i 18). Nerkowe systemy monooksygenaza-cytochrom P-450 katalizuj la- i 24-hydro-ksylacje 25-hydroksychotekalcyferolu, a ukad wtrobowy katalizuje hydroksylacj w pozycji 26 w procesie biosyntezy kwasw ciowych.
CN"
NADH
Amlnooksydaza Itp. Flawoproleina
Flawroprotelna,
Cyt b-*- Desaturaza Efearolio-CoA 9 Cvt P-450-^ Hydroksylacja
NADPHf-*
. Feroksydacja lipidw Oksygenaza hem u
Ryc. 13-7. Mikrosomalnyjacuch przenoszcy elektrony. Zaznaczono miejsce hamowania przez cyjanek (CN>.
UTLE NIA NIA BIOLOGICZNE / 145 SubstratA-H
| REDUKTAZA NADPH-CylP^t50 NA D P
+
P-450-A-H I
A-OH
P-450-A-H
Ryc 13-8. Mikrosomalny cykl hydroksylacyjny. Przedstawio ny ukad jest typowy dla hydroksylaz steroidowych kory nadnerczy. Mikrosomalny system hydroksylacyjny w wtrobie nie wymaga udziau biaka elazosiarko wego (Fe^). Zaznaczo no miejsce hamo wania przez tlene k wgla (CO).
Wewntrzna bona mitochondriaina Strona^ wewntrzna
Jabczan
Strona zewntrzna lzocytrynlan
umiejscowione na wewntrznej powierzchni mi-tochondrialnej bony wewntrznej: swoist wzgldem NADP flawoproteine majc FAD, biako Fe2S2 (adrenodoksyn) i cytochrom P-450 (ryc. 13-9).
Ryc. 13-9. Mitocho ndnalny ukad
WOLNY RODNIK PONADTLENKOWY MOE BY ODPOWIEDZIALNY ZA TOKSYCZNO TLENU

Hydroksysteroid
mo noo ksyge-naza-cytochrom P-450. Fe2S2 - biako elazosiarko we (adrenodo ksyna). Poniewa NADP{H) nie moe przej przez bfon mitochondrialna, rda rwno wanikw redukujcych s ograniczone do takich substratw, jak jabczan i izocytrynian, ktre mog by utleniane przez wewntrzmitochondriat-ne dehydrogenazy wspdziaajce z NADP.
W korze nadnerczy zawarto mitochondrjlal-nego cytochromu P-450 jest 6-krotnie wiksza od iloci cytochromw acucha oddechowego. Ukad monooksygenazy zawiera 3 skadniki
II) Bicthcmia
Tlen jest substancj potencjalnie toksyczn. Jego toksyczno wizano dotychczas z tworzeniem H2O:- Ostatnio jednak, uwzgldniajc atwo, z jak tlen w tkankach ulega redukcji do wolnego anionorodnika ponadtlenkowego {C>2~') i wystpowanie u organizmw tlenowych (ale nie u beztlenowcw bezwzgldnych) dys-mutazy ponadtlenkowej, przypuszcza si, e toksyczno tlenu wynika z przemiany jego w po-nadtlenek. Dotychczas brak jednak bezporednich dowodw toksycznoci ponadtienku. Ponadtlenek powstaje wwczas, gdy zredukowane flawiny, znajdujce si np. w oksydazie ksantynowej, ulegaj jednoetektronowej reok-sydacji przez tlen czsteczkowy. Ponadtlenek powstaje rwnie z tlenu czsteczkowego podczas jednoetektronowych utienia zachodzcych w acuchu oddechowym:
146 / ROZDZIA 13
Enzym-H2 + O2 --------- * Enzym-H + O2~ + H+ Ponadtlenek moe redukowa cytochrom c bdcy w formie utlenionej: Cytc<Fe3+> Cytc(F )
2+
rodnikw, takich jak O 2~" i ograniczaj toksyczno tlenu (p. rozdz. 54). PODSUMOWANIE 1. W ukadach biologicznych, tak jak w che micznych, utlenieniu (utracie elektronw) za wsze towarzyszy redukcja biorcy elektronw. 2. Oksydoreduktazy dzieli si na 4 grupy: oksydazy, dehydrogenazy, peroksydazy i oksygenazy. 3. Oksydazy i dehydrogenazy speniaj rne funkcje w metabolizmie, ale obie klasy en zymw odgrywaj zasadnicz rol w oddycha niu. 4. Peroksydazy chroni organizm przed uszkodzeniem przez woine rodniki, a oksygenazy porednicz w hydroksylacji lekw. PIMIENNICTWO
Bonnett R: Oxygen activation and tetrapyrroles. Essays Biochem 1981;17:1. Ernster L (editor): Bioenergetics. Elsevier, 1984. Fleisher S, Packer L (editors); Biologica) oxidations, mierosomal, cytochrome P-450, and other hemo-protein systems. In: Methods in Enzymology. Vol 52. Biomembranes, part C. Academic Press, 1978. Friedovich I: Superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 1975;44:147. Nicholls DG: Cytochromes and Celi Respiration. Carolina Biological Supply Company, N. Caro-lina, 1984. Salemme FR: Structure and function of cytochromes c. Annu Rev Biockem 1977;46:299. Tolbert NE: Metabolic pathways in perosisomes and g]yoxysomes. Annu Rev Biochem 1981;5:133. Tyler DD, Sutton CM: Respiratory enzyme systems in mitochondrial membranes. Page 33 in: Membran Structure and Function. Vol 5. Biltar EE (editor). Wiley, 1984. White RE, Coon MJ: Oxygen activation by cyto-chrorae P-450. Annu Rev Biochem 1980;49:315.
lub moe by usuwany przez swoisty enzym dysmutaz ponadtlenkow.

DYSM UTAZA PONADTLENKOW
2"
+2H +
H2O2 + O2
W tej reakcji ponadtlenek dziaa zarwno jako utleniacz, jak i reduktor. Chemiczne dziaanie ponadtlenku w tkankach wzmacnia si w wyniku reakcji acuchowej wolnych rodnikw. Przypuszcza si, eO2~' zwizany z cy-tochromem P-450, jest zwizkiem porednim w reakcji aktywacji tlenu w procesie hydro-ksylacji (ryc. 13-8). Wydaje si, e funkcja dysmutazy ponadtien-kowej polega na ochronie organizmw tleno wych przed cytotoksycznym dziaaniem ponadtlenku. Enzym wystpuje w wielu rnych kom-partmentach komrkowych. Enzym cytoplaz-matyczny skada si z 2 podjednostek zawierajcych po jednym jonie Cu2+ i Zn3+, podczas gdy enzym mitochondrialny zawiera Mn2+ podobnie jak enzym bakteryjny. Fakt ten potwierdza hipotez, e mitochondria rozwiny si z Proca-ryota, ktre weszy w symbioz z Protoeucaryo-ta. Dysmutaza wystpuje we wszystkich gwnych tkankach tlenowych. Aczkolwiek przeniesienie zwierzt do atmosfery skadajcej si w 100% z tlenu powoduje adaptacyjne zwikszenie iloci enzymu, zwaszcza w pucach, to jednak przeduony pobyt w tej atmosferze prowadzi do uszkodzenia puc i mierci. Prze-ciwutleniacze, np. a-tokoferol (witamina E), dziaaj rwnie jako wychwytywacze wolnych
Fosforylacja oksydacyjna i mitochondrialne systemy transportujce

14
WPROWADZENIE
Mitochondrion okrela si mianem sifowni" komrki, poniewa wewntrz tej organelli zachodzi wychwytywanie wikszoci energii pochodzcej z utlenia tkankowych. Mitochond-rialny proces wytwarzania bogatoenergetycz-nego zwizku (ATP), sprzony z oddychaniem, okrela si mianem fosforylacji oksydacyjnej.
Fosforylacja oksydacyjna umoliwia organizmom tlenowym zwiza znacznie wiksz cz dostpnej energii swobodnej substratw oddechowych w porwnaniu z organizmami beztlenowymi. Przebieg tego procesu wyjania teoria chemiosmotyczna. Niektre leki (np. amobarbital) i trucizny (np. cyjanek, tlenek wgla) hamuj iaricuch oddechowy i wtrnie fosforylacj oksydacyjn, zwykle z fatalnymi nastpstwami. Obecnie znamy wiele wad dziedzicznych, dotyczcych skadnikw mitochon-drialnego acucha oddechowego i fosforylacji oksydacyjnej. Wady te ujawniaj si w postaci iniupatii, encefalopalii, a czsto i kwasicy mle-czanowej.
wglowodanw jest dostpna w obrbie mito-chondriw w postaci rwnowanikw redukujcych ( H lub elektrony). Mitochondria zawieraj zesp katalizatorw, nazwany acu chem oddechowym. Zbiera on i przenosi rwnowaniki redukujce, kierujc je do ich kocowej reakcji z tlenem, w ktrej powstaje woda. Mitochondria zawieraj rwnie ukad enzymatyczny gromadzcy uwalnian energi swobodn w postaci bogatoenergetycznego wizania fosforanowego. Poza tym zawieraj one ukady enzymatyczne warunkujce wytwarzanie wikszoci rwnowanikw redukujcych zbiera nych przez acuch oddechowy. S to enzymy P-oksydacji i cyklu kwasu cytrynowego. Ten ostatni ukad jest kocowym szlakiem metabolicznym wsplnym dla utleniania wszystkich gwnych skadnikw pokarmowych. Powiza nia te przedstawiono na ryc. 14-1.
SKADNIKI ACUCHA ODDECHOWEGO S UPORZDKOWANE W KOLEJNOCI WZRASTAJCYCH POTENCJAW RED. OKS.

Zasadnicze skadniki acucha oddechowego przedstawiono na ryc. 14-2. Wodory lub elektrony przepywaj stopniowo przez acuch oddechowy od skadnikw bardziej elektroujem-nych do bardziej elektrododarniego tlenu. Rozpito red.-oks. ukadu od NAD+/NADH do O2/2H2O wynosi 1,1 V (p. tab. 13-1). Gwny acuch oddechowy w mitochond-riach katalizuje cig reakcji, przebiegajcych od dehydrogenaz, wspdziaajcych z NAD, przez
ACUCH ODDECHOWY ZBIERA I UTLENIA RWNOWANIKI REDUKUJCE

Caa uyteczna energia, uwalniana podczas utleniania kwasw tuszczowych i aminokwasw, oraz niemal caa energia z utleniania
148 / ROZDZIA 14 POKARM I
Kwasy tuszczowe Glicerol p- Oksydacja
Ttuszcze.
ATP
Wgo - -g woda my* g
. Glukoza itp
. Aminokwasy
acuch oddechowy I ADP Biaka i-
Pozamitochondrialne rda rwnowanikw redukujcych Ryc. 14-1. Rola mitocho ndrialnego acucha oddecho wego w przeksztacaniu energii chemicznej poywienia w ATP. Utlenianiu wikszoci skadnikw pokarmu towarzyszy wytwarzanie rwnowanikw redukujcych (2H), ktre s zbierane przez artcuch oddechowy w ceu ich utlenienia i sprzonego z tym wytwarzania ATP. Cytochromy
-^l^Substral Y H+ Ryc. 14-2. Przenoszenie rwno wanikw redukujcych w acuchu oddecho wym. Pro I i na 3-Hyd ro k sy acyl o-Co A 3-Hyd roksymalan Glutami nia Jabtczan Izocytrynian Bursztynian Cholina
Fp (FAD) FeS
H+
2H+
Acyo -CoA
\.. -Cyt Cytc Cu
Glice ro lo-3-f osf o ran
Sarkozyna Dl metyl og li cyna
Ryc. 14-3. S kadniki mitocho ndrialnego acucha oddecho wego. FeS uczestniczy w transporcie elektro nw, zbierajc je z flawoproteiny lub cytochromu b: Cyt cytochrom, ETF flawoproteina przenoszca elektrony, FeS biako e I a zos i arko we, Fp flawoproteina, Q ubichinon.
FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA / 149
OH Forma cakowicie utleniona. oyli chfnonowa Forma samlchlronowa (wolny radnik} Forma zredukowana, czyli chinolowa (hydrochincn)
Ryc. 14-4. Struktura ubichinonu (Q), n liczba jednostek izoprenoidowych; waha si ona w granicach 610, tj. Q6-io-
flawoproteiny i cytochromy do tlenu czsteczkowego, Nie wszystkie substraty s zwizane z acuchem oddechowym przez dehydrogena-zy wspdziaajce z NAD; niektre ze wzgldu na ich bardziej dodatnie potencjay red. -oks. (np. fumaran/bursztynian; P- tab. 13-1) wi si bezporednio z dehydrogenazami bdcymi fiawoproteinami, ktre z kolei s zwizane z cytochromami acucha oddechowego (ryc. 14-3). Poza wspomnianymi przenonikami w a cuchu oddechowym znajduje si dodatkowy przenonik czcy flawoproteiny z cytochro-mcm b, biakiem o najniszym potencjale ok-sydo/edukcyjnym w acuchu cytochromo-wym. Ten dodatkowy przenonik, ktry nazwano ubichinonem lub CoQ (koenzymem Q; p. ryc. 14-4), wystpuje w mitochondriach w warunkach tlenowych w utlenionej formie chino-nowej, a w warunkach beztlenowych w zredukowanej formie chinolowej, Ubichinon jest skadnikiem lipidw mitochondrialnych, zawierajcych przede wszystkim fosfolipidy, tworzce cz struktury bony mitochondrialnej. Struktura koenzymu Q jest bardzo podobna do budowy witamin K i E; podobna jest rwnie do plastochinonu znajdujcego si w chloroplas-tach. Wszystkie te zwizki charakteryzuj si poliizoprenoidowym facuchem bocznym. W mitochondriach koenzym Q wystpuje w znacznym stechiometrycznym nadmiarze wzgldem pozostaych czonw acucha oddechowego. Ten fakt sugeruje, e jest on ruchomy m_ elementem acucha oddechowego i e zbiera on rwnowaniki redukujce z bardziej nieruchomych kompleksw flawoproteinowych i przenosi je na cytochromy. Innym skadnikiem, wystpujcym rwnie w preparatach acucha oddechowego jest bial-c (Fe:S; elazo niehemowe). J l i i (metao-
flawoproteinami) i 7. cytochromem b. Zarwno siarka, jak i elazo uczestnicz w jednoelek-tronowym mechanizmie oksyd o redukcyjnym (ryc. 14-5).
PrCvl-S
Ryc, 14-5. Kompleks biaka elazosiarkowego (^6484). siarka nietrwaa w rodowisku kwanym, Pr apoprotein3, Cys reszta cysteinowa. Niektre biaka eiazosiarkowe zawieraj 2 atomy elaza i 2 atomy siarki
Na rycinie 14-3 przedstawiono, zgodnie z wspczesnymi pogldami, sekwencj zasadniczych skadnikw acucha oddechowego. N a elektroujemnym kocu acucha dehydrogea-zy katalizuj przeniesienie elektronw z sub-stratw na NAD acucha. Sposoby tego prze noszenia mog by dosy rne, a-Ketokwasy pirogronian i a-ketoglutaran maj wasne kompleksy dehydrogenaz, zawierajce liponian 1 FAD, ktre porednicz w przenoszeniu elektronw na NAD acucha oddechowego. Inne dehydrogenazy, np. dehydrogenaza h( + )-3-hy-droksyacylo-CoA, D()-3-hydroksymaIanowa,
150 / ROZDZIAU prolinowa, glutami ni a nowa, jabtczanowa lub izocytrynianowa, przenosz elektrony bezporednio na NAD acucha oddechowego. Zredukowany NAD acucha oddechowego jest z kolei utleniany przez dehydrogenaz NADH, ktra jest metalofloawoprotein. Enzym ten zawiera Fe:S i FMN i jest cile zwizany z acuchem oddechowym. Przenosi on rwnowaniki redukujce na koenzym Q. Koenzym Q stanowi w acuchu oddechowym rwnie punkt zbiorczy dla rwnowanikw redukujcych, pochodzcych z innych substra-tw, ktre przez flawoproteinowe dehydroge-nazy kontaktuj si bezporednio z acuchem oddechowym. Takimi substratami s burszty-nian, cholina, giicerl:5-Fsibran;~sarkozyna, dimetyloglicyna i acylo-CoA (ryc. 14-3). W de-hydrogenazach tych substratw cz flawino-w stanowi FAD. Elekto^y_zCoQ przepywaj nastpnie przez. y h H y ^ 7 y T y e n czsteczkowy. Cytochromy s uoone zgodnie ze wzrastajcym potencjaem oksydoredukcyjnym. Znajdujcy si na kocu acucha cytochrom aa3(ok-sydaza cytochromowa) odpowiada za ostateczne poczenie rwnowanikw redukujcych z tlenem czsteczkowym. Enzym _ten_zawira mied, skadnik wielu oksydaz. Oksydaza cytochromowa ma bardzo due powinowactwo do tlenu, co pozwala na funkcjonowanie acucha oddechowego z maksymaln szybkoci, a do momentu, w ktrym tkanka zostanie cakowicie pozbawiona tlenu. Poniewa jest to reakcja nieodwracalna (jedyna w acuchu), nadaje ona kierunek przemieszczania si rwnowanikw redukujcych w acuchu oddechowym i do sprzonego z nim wytwarzania ATP. Organi zacja strukturalna acucha oddechowego bya przedmiotem wielu hipotez. Istotnym odkryciem byo stwierdzenie niemal starych stosunkw molowych miedzy skadnikami acucha oddechowego. Funkcjonalnie i strukturalnie skadniki acucha oddechowego s zgrupowane w wewntrznej bonie mitochondrialnej w 4
lipidowo-biakowc
dechowego. Powysze dane wskazuj, e przenoniki maj w bonach okrelon orientacj przestrzenn. Cytochrom c jest jedynym rozpuszczalnym cytochromem i tak jak koenzym Q wydaje si by bardzo ruchomym skad nikiem acucha oddechowego czcym nieruchome kompleksy (ryc, 14-6).
kompleksy
acucha
od -
Malonian Kompleks II Bursztynian Karboksyna TTFA BAL Antymycyna Kompleks II! I yt b, FeS. Cyt c,
&&
H;S CO* CN * ,'x Kompleks IV I Cyt a Cyt
NADH Zwizki rozprzgajce Plerycydyna A Amobarbltal ^ _ 1 _ ^ R o t e no n Oligo myo yna" i J ' O ^\

AD P + P ,
Zwizki rozprzgajce O ligo mycy na
ATP
ADP + P,
Miejsce sprzgajca 1
ATP Mtejsce sprzgajce 2
ADP + P,
ATP
Miejsce sprzgajce 3
Ryc. 14- 6. Proponowane miejsca hamowania (0) tacucha oddechowego prze* niektre leki, substancje chemiczne i antybiotyki. Zaznaczono miejsca sprzgajce", ktre tworzc gradient protonowy wspieraj fosforylacj. BAL (dimerkaprol); TTFA jest czynnikiem chelatujcym Fe, Kompteks I oksydo/eduktaza NADH : ubichinon; kompleks tl oksydoreduktaza bursztynian : ubichinon; kompleks III oksydoreduktaza ubichinot: utleniony cytochrom c; kompleks IV oksydoreduktaza zredukowany cytochrom c: tlen. Inne skrty jak na ryc. 14 -3, ____________________________ _____________
ACUCH ODDECHOWY UMOLIWIA ZMAGAZYNOWANIE ZNACZNEJ CZCI ENERGII CHEMICZNEJ UTLENIAM BIOLOGICZNYCH
ADP jest czsteczk, ktra wie w postaci bogatoenergetycznych fosforanw cz energii
KONTROLA ODDYCHANIA W MITOCHONDRIACH ZABEZPIECZA STAE DOSTARCZANIE ATP

Szybko oddychania mitochondriw moe by kontrolowana przez stenie ADP. Dzieje si tak, poniewa utlenianie i fosforyacja s ze sob cile sprzone, tzn. utlenianie w acuchu oddechowym nie moe zachodzi bez towarzyszcej fosforylacji ADP. Chance i Williams podali 5 czynnikw, ktre mog kontrolowa szybko oddychania w mitochondriach {tab. 14-1).
Tabela 14-1. Stany kontroli oddechowej Czynniki ograniczajce szybko oddychania Sta 1 n Sta 2 n Sta 3 n Sta 4 n Sta 5 n Brak ADP i substratu Brak tylko substratu Aktywno samego acucha oddechowego, gdy wszystkie substraty i ADP s obecne w steniach wysycajcych Brak tytko ADP Brak tylko tlenu
swobodnej uwalnianej w procesach katabolicz-nych. Powstajcy ATP moe z kolei przekaza t energi swobodn procesom wymagajcym energii. Std te ATP bywa nazywany monet obiegow" komrki (p. ryc. 12-8). Wjakcjach glikolizy powstaj 2 bogatoener-gticznejrugy fosforanowe, co jest rwnowa-ne ok. 61 kJ/moI glukozy (p. tab. 19-1). Wynika z.tgoê ilo energii wychwytywanej w procesie glikolizy, w reakcjach fosforylacji substrato-wej, jest mata, jako e 1 mol glukozy,"ulegajc cakowitemu spaieniu dostarcza ok. 2780 kJ. Reakcje cyklu kwasu cytrynowego, kocowego szlaku cakowitego uflemania"glukozy, obejmuj 1 .^tap fosforylacii przeksztacenie y sukcynylo-CoA w bursztyniaj_co pozwala wytworzy nastpne 2 boga to energetyczne wiza-"hia__fosforaiiowe na moTglukozy, Wszystkie wspomniane powyej fosfbrylacje zachodz na po4pjnje_jybstratu. Wyniki bada prowadzonych na nie naruszonych oddychajcych mito-chondriach wykazuj, e utlenieniu substratw J ^ A D k ^ h ^ i " ) h oddechowy towarzyszy wbudowanie 3 mol fosforanu nieorganicznego w 3 mol ADP i powstanie w ten sposb 3 mol ATP na kade ] j2 mol zuytego O2, tzn. stosuneTt P:O = 3 (ryc. 14-6). Jeeli natomiast substrat ulega utlenieniu przy udziale dehydrogenazy flawinowej, powstaje tylko 2 mol ATP, a stosunek P:O = 2. Reakcje te s znane jako fosforyiacje oksydacyjne (fosforylacjc na poziomie acucha oddechowego). Uwzgldniajc reakcje odwodorowania w szlaku katabolicznym glukozy zarwno w gli-kolizie, jak i w cyklu kwasu cytrynowego oraz fosforyiacje substratowe mona obliczy, e niemal 42% energii swobodnej, pochodzcej ze spalenia glukozy, zostaje zwizane w postaci bogatoenergetycznych wiza fosforanowych. Jest oczywiste, ze to acuch oddechowy odpowiada za znaczn cz puli tworzonego ATP.
Zasadniczo wikszo komrek w okresie spoczynkowym znajduje si w stanie metabolicznym 4, w ktrym szybko oddychania zaley od dostpnoci ADP. W czasie wykonywania pracy nastpuje przemiana" ATP w ADP, co powoduje zwikszenie szybkoci oddychania, a to z kolei prowadzi do uzupenienia zapasu ATP (ryc. 14-7). Naley doda, e w pewnych warunkach szybko funkcjonowania acucha oddechowego moe zalee rwnie od stenia fosforanu nieorganicznego. Gdy szybko oddychania si zwiksza (np. podczas pracy), metabolizm komrki zblia si do stanu 3 lnb stanu 5, wwczas acuch oddechowy albo osiga stan wysycenia, albo pO2 zmniejsza si poniej Km dla cytochromu ay Niewykluczone, e sprawno przenonika ADP/ATP, ktry uatwia wejcie cytoplazmatycznego ADP do wntrza mitochondrionu, moe by czynnikiem ograniczajcym szybko fosforylacji oksydacyjnej. Proces utlenia biologicznych, w ktrych energia swobodna, powstaa w wyniku utleniania skadnikw pokarmowych, staje si dostpna i moe by zwizana, przebiega stopniowo,
152 / ROZDZIA 14
Ciepto
Procesy zuywajce energi SUBSTHAT
Ryc. 14-7. Rota ADP w kontroli oddechowej.
wydajnie (4045%) i podlega kontroli a nie wybuchowo, nieskutecznie i w sposb niekontrolowany. Pozostaa energia swobodna, ktra nie zostaa zwizana w formie bogatoenergety-cznego wizania fosforanowego, uwalnia si w postaci ciepa. Nie znaczy to, e jest stracona", gdy dziki temu ukad oddechowy, jako cao, jest do egzoergiczny, aby by w stanie nierwnowagi, co pozwala na cigy jednokierunkowy przepyw elektronw i stae zaopatrywanie komrki w ATP. U zwierzt staocieplnych zapewnia to utrzymanie odpowiedniej temperatury ciaa.
WIELE ZNANYCH TRUCIZN TO INHIBITORY ACUCHA ODDECHOWEGO

Wiele informacji dotyczcych acucha oddechowego uzyskano po zastosowaniu zwizkw, ktrych przypuszczalne miejsce dziaania przedstawiono na ryc. 14-6. Do celw opisowych zwizki te mona podzieli na inhibitory acucha oddechowego, inhibitory fosforylacji oksydacyjnej i zwizki rozprzgajce fosforyla-cj oksydacyjn. Inhibitory, ktre hamuj oddychanie przez blokowanie acucha oddechowego, dziaaj w 3 miejscach. W miejscu pierwszym dziaaj,. barbiturany (np. amobarbital), antybiotyk piery-cydyna A oraz jad rybi rotenon. Inhibitory te hamuj utlenianie substratw.Hofe kontaktuj si bezporednio z acuchem oddechowym przez NAD-zaJene dehydrogenazy, jak np. 3-hydroksymalan.
Dimerkaprol i antymycyna AJiamuj acuch oddechowy midzy cytochromem.b a cytochro-mem c. Klasyczne trucizny, jak H2S, tlenek wgla i cyjanki hamuj oksydaz cytcEfomo-w. Karboksyna i TTFA swoicie hamuj przeniesienie rwnowanikw redukujcych z dehydrogenazy bursztynianowej na koenzym (^ natomiast malonian jest inhibitorem kompety-cyjnym dehydrogenazy bursztynianowej. Antybiotyk oUgomycyna cakowicie hamuje utlenianie i fosforylacj w nie uszkodzonych mitochondriach. Jednake, w obecnoci .zwizku rozprzgajcego di nitrofenolu zachodzi utlenia,nie_hez. towarzyszcej fosforylacji, co wskazuje, e oligomycyna nie dziaa bezporednio" na acuch oddechowy, lecz na etapie fosforylacji (p. ryc. 14-8). Atraktylozyd hamuje fosforylacj oksydacyj n, "ktra zaley od transportu nukleotydw adeninowych przez wewntrzn bon mito-chondrialn. Przyjmuje si, e hamuje on przenonik nukleotydw adeninowych, odpowiedzialny za transport ADP do wntrza, a ATP na zewntrz mitochondrionu (p. ryc. 14-16). Dziaanie zwizkw rozprzedajcych polega na odczeniu" procesu utleniania w acuchu oddechowym od fosforylacji. Wskutek tego oddychanie przebiega w sposb niekontrolowany, poniewa stenie ADP lub P, nie ogranicza ju szybkoci oddychania. Najczciej stosowanym zwizkiem rozprzgajcym jest 2,4-dini-trofenol, ale take inne zwizki dziaaj w podobny sposb, np. dinitrokrezol, pentachlorofenol i CCCP (m-chlorokarbonyiocyjanidofenylohy-drazon). Ten ostatni jest ok. 100-krotnie aktywniejszy od dinitrofenolu.
:
ADP Stan 4
A"
d B " c
ADP f
i \ i >
i Stan 3
\
\
(v
\Stan4
Zwizek razprzegjcy
i S
5
i
Ollgomycyna ^1 i | Zwizek 1 \i rozprzgajcy \
Teoria chemiosmotyczna postuluje, e utlenianie przenonikw w acuchu oddechowym prowadzi do tworzenia jonw wodorowych, ktre s wyrzucane na zewntrz sprzgajcej bony mitochondrianej. Rnica potencjaw elektrochemicznych, wynikajca z asymetrycznego rozmieszczenia jonw wodorowych (protonw, H+), jest zuywana nastpnie do nap dzania mechanizmu odpowiedzialnego za tworzenie ATP (ryc 14-9). acuch oddechowy jest pomp protonow Wedug Mitchella, pierwotnym etapem pro cesu fosforylacji oksydacyjnej jest przemieszczenie protonw (H +)1n|^wjiait4z>iblony sprzgajcej (tzn. wewntrznej horiy mitochondrianej) n apdzane przez utleniania w acuchu oddechowym. Kady z kompleksw acucha oddechowego I, III i IV (p. ryc. 14-6} dziaa jako pompa protonowa. Postulowa on rwnie, e bona jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla jonw, a zwaszcza dla protonw, ktre gromadz si na zewntrz bony, wytwarzajc trans-membranow rnice potencjau elektrochemicznego (AU,H+). Na t rnic skada si potencja chemiczny (rnica pH) oraz potencja elektryczny. Rnica potencjau elektrochemicznego jes^zuywana-przez bonow syntaz ATP (syn-taza ATP, transportujca H+), ktra w obecnoci ADP i Pj wytwarza ATP (ryc. 14-9). Nie ma tu wic bogatoenergetycznego porednika wsplnego dla utleniania i fosforylacji, jak to sugerowano w hipotezie sprzenia chemicz nego. Wedug pierwotnej wersji teorii acuch oddechowy jest tak uoony w bonie, e tworzy 3 ptle uteniajco-redukcyjne (o/r). Na rycinie 14-10 przedstawiono schematycznie pojedyncz ptl zawierajc przenonik wodoru i przenonik elektronw. Jednake ten wymg trudno byo pogodzi w peni ze znanymi skadnikami bonowych kompleksw acucha oddechowego, np. kompleks IV nie zawiera przenonika wodoru. Co wicej, nie jest znana dokadna liczba protonw pompowanych przez kady kompleks, przypadajca na kady transporto wany elektron. Na rycinie 14-11 przedstawiono cykl Q, wyjaniajcy moliwy mechanizm pompowania protonw przez kompleks III. Powierzchni bony wewntrznej pokrywaj Jednostki fosforylujce" odpowiedzialne za biosyntez ATP (ryc. 14-12). Kada z nich skada si z wielu rnych biaek. Hydrofilowy
3 Minuty Ryc. 14-8. Kontrola oddechowa w mitochond-riach. Do wiadczenie A: na wykresie przedstawio no szybko zuycia tlenu w stanie 4, ktra ulega przyspieszeniu po dodaniu ADP. Gdy cay egzo genny ADP zostanie ufosforylowany do ATP, wwczas szybko oddychania maleje do wartoci w stanie 4. Dodanie zwizku rozprzedajcego, np. dinitrofenolu, uniezalenia oddychanie od fosfory lacji. W dowiadczeniu B: dodanie oNgomycyny hamuje fosforylacj dodanego uprzednio ADP i w zwizku z tym obserwujemy hamowanie oddychania. Dodanie z kolei zwizku rozprzedajcego zwiksza szybko zuycia tlenu, poniewa uniezalenia oddychanie od fosforylacji.
TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA WYJANIA MECHANIZM SPRZENIA UTLENIANIA Z FOSFORYLACJA

W cigu ubiegych lat przedstawiono wiele hipotez dotyczcych sprzenia utleniania z fos-forylacj. Mona je podzieli na 2 zasadnicze grupy. Hipotezy sprzenia chemicznego postuloway bezporednie sprzenie chemiczne na wszystkich etapach procesu, tak, jak ma to miejsce w reakcjach tworzcych ATP w glikoli-zie. Jednake hipotezy te odrzucono, poniewa nie udao si nigdy wyizolowa bogatoener-getycznych porednikw, ktre miay czy utlenianie z fosfory lacj. Wedug innych hipotez energia pochodzca z utleniania jest przechowywana w stanach konformacyjnych czsteczek. Zmiana konformacji miaa prowadzi do tworzenia bogato-energetycznych wiza fosforanowych.
154 / ROZDZIA 14
O lig o mycy na
Bona sprzgajca Ubtahfnon
Cytochrom c
Byc. 14-9. Zaoenia teorii
chemiosmotycznej ZEWNTRZ dotyczcej fosforytacji + oksydacyjnej. F1( Fo, czynniki biakowe warunkujce fosforylacj Syntaza ATP, transportujca H (FiFo), dziaa jako wtrna pompa protonowa. Pierwotna pompa protonowa funkcjonuje w wyniku sprzenia utleniania z przemieszczeniem protonw z wewntrznej na zewntrzn powierzchni bony. To + przemieszczenie H prowadz kompleksy acucha oddechowego I, III i IV, z ktrych kady dziaa jako + pompa protonowa. Zwizki rozprzgajce, takie jak di nitrofenol, powoduj przeciek" H przez bon, skutkiem czego jest zanik elektrochemicznego gradientu protonw. Oligomycyna swoicie blokuje + transport H przez Fo.
NA ZEWNTRZ BONA SPRZGAJCA WEWNTRZ
NA
Ryc. 14-10. Ptla oksydoredukcyjna (o/r) przemieszczajca protony (teoria criemiosmotyczna).

WEWNTRZNA BONA MITOCHONDRIALNA
CYTOZOL (NA ZEWNTRZ)
Ryc. 14-11. Pompujcy protony cykl koenzymu Q. QH* jest zakotwiczony po obu stronach btony przez przyczenie si do biaka wicego Q, natomiast CIH2 i Q s ruchome. Cytochromy zaznaczono odpowiednio jako b, c-|.
Jednostki fosforylujce
B : U80NA - j ZEWNTRZNA f BONA* --*] WEWNTRZNA
rinr
Dziaanie ultradwikami
BONA ZEWNTRZNA
Czstki submitochondrialne powstae z fragmentw bony wewntrznej Ryc. 14- 12. Budowa bon mitochondrialnych. Czstki submitochondrialne s przenicowane", tzn, maj odwrcon orientacj bony, a wic i odwrcony bonowy gradient protonw. Na ich powierzchni zewntrznej znajduj si Fi. Taki preparat pozwala prowadzi badania zamknitych systemw bonowych. *
-
* I
Jt3>/
156 / ROZDZIA 14
Pj ADP
+
ATP Pj + ADP
Ryc. 14-13. Syntaza ATP, transportujca H (Mitchell).
kompleks tych biaek okrela si mianem Fj (czynnik sprzgajcy I; ang. factor 1); wystaje on w kierunku mariks i wy|fa7il]jei aktywno _syntzyATP (ryc. t4-9).JEtje5tpoc2.ony przez tzw. szyjk (ang. stalk) zbonowym f hydrofobowym) kompleksem-bia-owym. Tkanym FD (czynnik sprzgajcy wicy oligomycyne), ktry prawdopodobnie zajmuje ca szeroko bony (ryc. 14-9). Protony przechodz przez kompleks Fo F, (syntaz. ATP, transportuj-&Ji+), co umoliwia syntez ATP z ADP i Pj. Ciekawe, e podobne jednostki fosforylujce znaleziono na wewntrznej powierzchni bony plazmatycznej bakterii i na zewntrznej powierzchni bony tylakoidowej chloropiastw. Charakterystyczne, e bonowy gradient protonw skierowany jest w mitochondriach i bakteriach z zewntrz do wewntrz, ale w odwrotnym kierunku w chloroplastach. Mechanizm sprzenia przemieszczania protonw z anizotropowym (wektorowym) uka dem syntezy ATP nie jest wyjaniony. Jeden 7. modeli proponowanych przez Mitchella jest przedstawiony na ryc. 14-13. Para protonw atakuje jeden z tlenw P,, tworzc wod i aktywny Pj, ktry natychmiast reaguje z ADP, t wo rzc ATP. Wyniki innych bada wskazuj, e bezporednia reakcja syntezy ATP nie jest gwnym etapem wymagajcym dostarczenia energii jest nim raczej etap uwalniania ATP z centrum aktywnego syntazy. Niewykluczone, e wymaga to konformacyjnych zmian czsteczki Dane dowiadczalne potwierdzaj teori chemiosmotyczn 1. Dodanie protonw (kwasu) do rodowis ka inkubacyjnego zawierajcego mitochondria prowadzi do wytwarzania ATP.
2. Fosforylacja oksydacyjna nie zachodzi w ukadach rozpuszczalnych, w ktrych nie ma moliwoci wystpowania wektorowej syntazy ATP, Aby fosforylacja oksydacyjna moga za chodzi, w ukadzie inkubacyjnym musz by zamknite pcherzyki bonowe (ryc. 14-9). 3. Skadniki acucha oddechowego s uo one w bonie w sposb asymetryczny (poprze czna asymetria), co jest zgodne z wymaganiami teorii chemiosmotycznej. Teoria chemiosmotyczn wyjania zjawisko kontroli oddechowej Powstaa wskutek przemieszczania protonw rnica potencjaw elektrochemicznych po obu stronach bony hamuje dalsze przenoszenie ~ rwnowanikw redukujcych przez acuch oddechowy dopty, dopki nie zostanie ona rozadowana w wyniku wstecznego transportu protonw przez bon przy udziale wektorowej syntazy ATP. To z kolei zaley od dostpnoci ADP i Pi. Tumaczy dziaanie zwizkw rozprzgajcych Te zwizki (np. dinitrofenol) s amfipatyczne (p. str. 190) i zwikszaj przepuszczalno bony mitochondrialnej d!a protonw (ryc. 14 -9), zmniejszajc w ten sposb potencja elektrochemiczny i zwierajc" syntaz ATP. Dlatego te w ich obecnoci utlenianie moe przebiega bez fosforylacji. Tumaczy istnienie mitochondrialnych ukadw transportujcych na zasadzie wymiany przeciwprdowej Te ukady transportujce s konsekwencj wymogu, e aby utrzyma gradient elekt ro-
chemiczny bona sprzgajca musi by nieprzepuszczalna dla protonw i innych jonw (patrz poniej). WZGLDNA NIEPRZEPUSZCZALNOC WEWNTRZNEJ BONY MIT OCHONDRIANEJ NARZUCA POTRZEB OBECNOCI PRZENONIKW Systemy transportu wymiennego znajduj si w bonie i katalizuj wymian przeciwprdow anionw z OH~ oraz kationw z H + . Kady z tych systemw jest niezbdny do zachowania rwnowagi elektrycznej i osmotycznej podczas pobierania i uwalniania zjonizowanych metabolitw. Roz m i eszczen ie c ha rakterystycz nych enzymw, tzw. znacznikowych, w przedziaach rozdzielonych bonami mitochondrialnymi Mitochondria maj bon zewntrzn przepuszczaln dla wikszoci metabolitw, bon wewntrzn, ktra jest wybirczo przepuszczalna i pofadowana w tzw. grzebienie, oraz macierz .wewntrz mitochondrionu (ryc. 14-12). Dziaajc na mitochondrion digitonin mona usun z niego bon zewntrzn, ktrej enzymami znacznikowymi s monoaminooksyda-za, syntetaza acyio-CoA, acylotransferaza glicerolo fosforanowa, acylotransferaza lizofosfa-tydowa i ibsfolipaza A2, W przestrzeni midzy-bonowej znajduje si kinaza adenylanowa oraz
kinaza kreatynowa. W Wonie wewntrznej jest nagromadzony fosfolipid kardiolipina. W macierzy mitochondriainej znajduj si rozpuszczalne enzymy cyklu kwasu cytrynowego i enzymy P-oksydacji kwasw tuszczowych. Oba procesy wymagaj udziau ukadw transportujcych metabolity oraz nukleotydy przez wewntrzn bon mitochondrialn. Dehydro-genaza bursztynianowa znajduje si na wewntrznej powierzchni mitochondriainej bony wewntrznej, gdzie przenosi rwnowaniki redukujce bezporednio na ubichinon acucha oddechowego, z pominiciem kompleksu I acucha oddechowego. Na powierzchni matryk-sowej wewntrznej bony mitochondriainej znajduje si rwnie dehydrogenaza 3-hydro-ksymalanowa. Na zewntrznej powierzchni bony wewntrznej zlokalizowana jest dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa, co pozwala jej uczestniczy w mostku"
glicerolofosforano-wym (ukad wahadowy glicerolofosfuran-dihyd-roksyaceton, ryc. 14-14).
Utlenianie pozamitochondrialnego NADH odbywa si za porednic twem mostkw" substratowych Wewntrzna bona mitochondrialna nie jest przepuszczalna dla NADH, ktry jest stale wytwarzany w cytozolu w reakcji szlaku glikoli-tyczncgo, katalizowanej przez dehydrogenaz gliceraldehydo-3-fosforanow (p. ryc. \9-2).Je-dake w warunkach tlenowych pozamitochon-drialny NADH nie gromadzi si i ulega przypuszczalnie utlenieniu w mitochondrialnym a cuchu oddechowym. Rozwaano kilka mechanizmw, wedug ktrych ten proces mgby
CYTOZOL
WEWNTRZNA BONA MTOCHONDRIALNA
NAD
GI icerolo-3-fosfo ra n DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA Dlhydroksyacetono fosforan "*
GI icerolo-3-f osf oran DEHYDROGENAZA GLICEROLO-3-FOSFORANOWA Dlhydroksyacetonofosforan
FAD
FADH2
acuch oddechowy Ryc. 14-14. Mostek glicerolofosf ora nowy {ukad wahadowy glicerolo -3-fosforan : dihydroksyacetonofosforan) transportujcy rwnowaniki redukujce z cytozolu do mitochondrionu. Poniewa mitochond rialna dehydrogenaza giicerolo-3-fosforanowa znajduje si na zewntrznej powierzchni btony wewntrz nej, ukad ten nie wymaga transportu substratw przez bon. ________________________________
158 / ROZDZIA 14 CYTOZOL NAD
BONA
MITOCHONDRION ^ Ja b c z a n Szczawiooctan
DEHYDROG ENA2A JABCZANO a-KG WA
NAD*
Jabczan,
OEHYDROG ENAZA JA8CZAN0 Szczawiooc WA tan
Glutaminian
AMINOTHANSFERAZA
NADH + +H
a-KG
AMIN0TRANS FERA2A
Glutaminian
Asp
Asp
Ryc. 14-15. Mostek jabczanowo-asparaginianowy (ukad wahadowy jabczan : asparaginian) przeno szcy rwnowaniki redukujce z cytozolu do mttochondrionu. 1 przenonik a-ketoglutaranowy, 2 przenonik glutaminianowo-asparaginianowy (przenoszcy z glutaminianem proton, symport).
przebiega. Jednym z nich jest przenoszenie rwnowanikw redukujcych przez bon mi-tochondrian za porednictwem par substra-tw sprzonych odpowiednimi dehydrogena-zami. Niezbdnym warunkiem przebiegu tego procesu jest obecno swoistej dehydrogenazy po obu stronach wewntrznej bony mitochond-rialnej. Na rycinie 14-14 przedstawiono mechanizm przenoszenia przy uyciu mostka" glice-rolofosforano wego. Naley zwrci uwag, e w zwizku z tym procesem zostan wytworzone tylko 2, a nie 3 mol ATP na atom zuytego tlenu, poniewa enzym mitochondrialny jest flawoprotein zwizan z acuchem oddechowym bez udziau NAD. U niektrych gatunkw aktywno FAD-zalenego enzymu (mitochon-drialnego) zmniejsza si po tyreoidektomii i zwiksza po podaniu tyroksyny. Chocia obecno tego ukadu wahadowego wykazano w miniach skrzydowych owada i w miniu biaym i moe on mie znaczenie w wtrobie, to w innych tkankach (np. w miniu sercowym) stwierdza si niedobr mitochondrialnej dehydrogenazy glicerolo-3-fosforanowej. Przeto uwaa si, e bardziej uniwersalny jest ukad transportujcy wykorzystujcy jabczan i dehydrogenazy jabczanowe, cytoplazmatyczn i mito-chondrialn. Ten mostek" (ukad wahadowy jabczan : asparaginian) przedstawiono na ryc. 14-15, Zoono tego ukadu wynika z nie -
przepuszczalnoci wewntrznej bony mitochondrialnej dla szczawiooctanu. Szczawiooctan, kosztem glutaminianu, musi najpierw ulec transaminacji do asparaginianu, z ktrego po jego przejciu przez bon mitochondrialn zostanie w cytozolu odtworzony szczawiooctan. Transport jonw w mitochondriach jest procesem wymagajcym dostarczenia energii Aktywnie oddychajce mitochondnaj wjct-rych zachodzi fosforylacja oksydacyjna, utrzymuj lub gromadz kationy, takie jak K+,Na+, Ca2 + i Mg2 + oraz P*. Rozprzenie fosforylacji oksydacyjnej za pomoc dinitrofenolu prowa dzi do ucieczki jonw z mitochondrionu, ale pobieranie jonw ze rodowiska nie jest hamo wane przez oligomycyn, co sugeruje, e energia konieczna do procesu transportu nie pochodzi z bogatoenergetycznego wizania fosforanowego, powstajcego podczas fosforylacji ADP. Przyjmuje si, e wymian kationw napdza pierwotna pompa protonowa. Ukady transportujce zabezpieczaj rwnowag elektryczn i osmotyczn po obydwu stronach bony mitochondrialnej (p. ryc. 14-16) Wewntrzna bona mitochondrialn swobodnie przepuszcza elektrycznie obojtne mae

Wewntrzna bona WEWNTRZ mltochondrlalna
NA ZEWNTRZ N-Ety)orraieimd
OH" H3PO4" N-Etyloma!eJmld i Hyd r o teycyn am on lan Pirogronian"
Jabtazan " _Jabczan' Cytrynian*-+ H
Jablczarr et-Ketoglutaran " .

ADP 3"
1
ATP*
Atraktylozyd i
kw lub ukadw transportujcych, uatwiajcych ich transport przez bon. Okazuje si, e aniony monokarboksylowe przenikaj przez bon atwiej ze wzgldu na mniejszy stopie dysocjacji tych kwasw. Uwaa si, e nie-zdysocjowany i dobrze rozpuszczalny w lipidach kwas jest tym rodzajem czsteczki, ktra przechodzi przez bon lipidow. Transport anionw dikarboksylowych i tri-karboksylowych jest cile zwizany z przenoszeniem fosforanu nieorganicznego. Ten ostatni atwo przechodzi przez bon jako jon HZPO~, wymieniajc si z OH". Pobranie jabczanu przez przenonik anionw dikarboksylowych wymaga na wymian fosforanu nieorganicznego po przeciwnej stronie bony. Pobranie cytrynianu, izocytrynianu, lub ds-akonitanu przez transporter anionw trikarboksylowych wymaga na wymian jabczanu. Transport ac-ketoglutaranu rwnie zachodzi na zasadzie wymiany z jabczanem. Dziki uyciu mechanizmw wymiany przeciwp radowej (antyport) zostaje wic zachowana rwnowaga osmotyczna. Transport cytrynianu przez wewntrzn bon mitochondrialn zaley nie tylko od przenoszenia jabczanu, lecz take od transp ortu fosNA ZEWNTRZ Wewntrzna â mliocriondrialna
F
Byc. 14-16. Ukady przenonikowe w bonie mi tochondrialnej, 1 ~ przenonik fosforanowy, 2 sprzony transport (symport) pirogro-nianu, 3 przenonik anionw dikarboksylo-wych, 4 przenonik anionw trikarboksylo-wych, 5 przenonik a-ketoglutaranowy, 6 przenonik nukleotydw adeninowych, Zaznaczono miejsca hamowania (0) przez N-etylomaleimid, hydroksycynarnonian i atraktylozyd, W bonie znajduj si rwnie (nie pokazano) przenoniki: gluta-minianowo-asparaginianowy (ryc. 14-15), glutaminowy, ornttynowy i karrtitynowy (ryc. 24-1).
WEWNTRZ
} t
ATP""
_J
"l
czsteczki, takie jak tlen, woda, CO 2 i NH3, oraz kwasy monokarboksylowe, takie jak 3-hy-droksymasowy, acetooctowy i octowy. Dugo-acuchowe kwasy tuszczowe s przenoszone do mitochondriw jako pochodne karnityny (p. ryc. 24-1), a specjalny przenonik w wewntrznej bionie rnitochondrialnej umoliwia sprzony transport pirogronianu z H+ {kotransport, symport), co jest rwnoznaczne ze zuyciem transmembranowego gradientu protonw. Aniony dikarboksylowe i trikarboksylowe oraz aminokwasy wymagaj swoistych przenoni -
0 ) Ryc. 14-17. Wspdziaanie przenonika fosforanowego (1) z przenonikiem nukleotydw adeni nowych (2) podczas syntezy ATP. Przedstawiony + sprzony transport (symport) H /Pj jest odpowiednikiem prze i wtrans portu (antyport) Pj/OH~ (ryc. 14-16). Na kad zsyntetyzowan w mito-chondriach i uwalnian czsteczk ATP, mitochon-drion pobiera 3 protony. Natomiast pobiera tylko 2 protony, jeeli zsyntetyzowana czsteczka ATP zostanie zuyta wewntrz mttochondrionu.
160 / ROZDZIA 14
forami nieorganicznego. Przenonik nukleoty-dw adeninowych umoliwia wymian ATP z ADP, ale nie z AMP. Pozwala on wyj czsteczce ATP z mitochondrionu do pozamito-chondrialnych miejsc zuywajcych energi oraz zapewnia powrt ADP do wntrza mito chondrionu, gdzie suy do syntezy ATP (ryc. 14-17), Na+ moe wymienia si z H + , zuywajc gradient protonw. Uwaa si, e aktywny transport Ca 2h do mitochondriw zachodzi z przemieszczeniem I adunku (uniport). prawdopodobnie na zasadzie antyportu CaJ + /H+ , Uwalnianie wapnia z mitochondriw jest uatwione przez wymian z Na+ . Jonofory umoliwiaj swoistym kationom transport przez bon Jonofory uzyskay tak nazw ze wzgldu na ich zdolno do kompleksowania swoistych kationw i uatwiania ich transportu przez bony biologiczne. Ta waciwo jonoforw wynika z ich lipofilowego charakteru, ktry umoliwia penetracj bon lipidowych, takich jak bona mitochondrialna. Za przykad moe posuy walinomycyna umoliwiajca przechodzenie K+ przez bon mitochondriain. w nastpstwie czego dochodzi do rozadowania potencjau bonowego midzy rodowiskiem zewntrznym i wewntrznym mitochondrionu. Nigerycyna rwnie dziaa jako jonofor dla K+, ale na zasadzie wymiany z H + . Prowadzi to do zniesienia transmembranowego gradientu pH. W obecnoci walinomycyny i nigerycyny, zostaje wyeliminowany zarwno potencja bonowy, jak i gradient pH i std cakowite hamowanie fosforylacji. Klasyczne zwizki rozprzgaj-ce, takie jak dinitrofenol, s w rzeczywistoci jonoforami protonowymi. Transhydrogenaza transportujca H* wytwarza wewntrzmitochondrialny NADPH Znajdujca si w wewntrznej bonie mito-chondrialnej energetycznie zalena transhydrogenaza katalizuje przeniesienie H+ z wewntrz-mitochondrialnego NADH na NADP, tworzc NADPH, ktry jest sprzony z przemieszczeniem protonw ze rodowiska zewntrznego do wntrza mitochondrionu. Wydaje si, e
enzym dziaa jako energetycznie zaleny bufor red.-oks. i jako rdo NADPH dla enzymw wewntrzmitochondrialnych, takich jak dehyd-rogenaza glutaminianowa i hydroksylazy uczestniczce w syntezie steroidw. Nied oczynno a cu ch a odd echo wego
jest przyczyn choroby
Niedobory lub brak wikszoci oksydore-duktaz acucha oddechowego s przyczyn miertelnej miopatii tnitochondrialnej niemowlt i dysfunkcji nerek. MELAS (miopatia mitochondrialna, encefalopatia, kwasica mkczano-wa i udar) jest dziedzicznym zespoem chorobowym, wynikajcym z niedoboru oksydoreduk-tazy NADH; ubichinon {kompleks 1) lub ok-sydazy cytochromowej. Opisano wiek chorb spowodowanych niedoborem ktrego z enzymw mitochondrialnych (Scholte). PIMIENNICTWO
Boyer PD: The unusual enzymology of ATP synthase. Biochemistry 1987;26:8503. Cross RL: The mechanism and regulation oT ATP synthesis by FrATPases. Annu Rev Biochem 1981;50:<581. Hatefi Y: The mitochondrial electron transport and oxidative phosphorylation system. Annu Rev Biochem 1985;54:1015. Hinkle PC, McCarty RE: How cells make ATP. Sci Am (March) 197K;238:104. Mitchcll P: BCeilin's respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences. Science 1979;206:1148. Nicholls DG: Bioenergetics: An introduetion to the Chemiosmotic Theory. Academic Press, 1982. Prince RC: Tbe proton pump of cytochrome oxidase. TIBS 1988;13:159. Schohe HR, et al: Defects in oxidative phosphorylation. Biochemical iiwestigations in skeletal muscle and expression of the lesion in other cells. / Inher Metab Dis 1987;I0, Suppl 1:81. Tyler DD: The mitochondrial ATP synthase. Page 117 in: Membran Structure and Function, Vol. 5. Bittar EE (editor). Wiicy, 1984. Tyler DD, Sutton CM: Mitochondrial transporting systems. Page 181 in: Membran Structure and Function. Vol 5. Bittar EE (editor). Wiley, 1984.
Wglowodany o znaczeniu fizjologicznym

15
WPROWADZENIE
Wglowodany s szeroko rozpowszechnione w wiecie rolinnym i zwierzcym. Odgrywaj one rol zarwno strukturaln, jak i metaboliczn. W rolinach glukoza jest syntetyzowana z dwutlenku wgla i wody w procesie fotosyntezy i przechowywana jako skrobia lub ulega przeksztaceniu w bonnik szkieletu rolinnego. Zwierzta mog syntetyzowa niektre wglowodany, wykorzystujc do tego celu tuszcz i biaka, ale wiksza cz wglowodanw zwierzcych jest pochodzenia rolinnego.
WGLOWODANY S ALDEHYDOWYMI LUB KETONOWYMI POCHODNYMI ALKOHOLI WIELOHYDROKSYLOWYCH

Wglowodany klasyfikuje si nastpujco:
Monosacharydy s to wglowodany, ktre nie ulegaj hydrolizie do form
prostszych. Na podstawie liczby atomw wgla mona je podzieli na triozy, tetrozy, pentozy, heksozy i hcptozy; oraz na aldozy i ketozy zalenie od obecnoci grupy aldehydowej lub ketonowej. Przykadami s:
Aldoza Aldehyd glicerynowy Tetrozy (C.H.OJ Erytroza Pentozy (CBH10Os) Ryboza Heksozy (C6H12O0) Glukoza
Triozy (C3H6O3)
Znajomo struktury i waciwoci wglowodanw fizjologicznie wanych jest niezbdna do zrozumienia ich roli w ekonomii organizmu ssakw. Glukoza jest najwaniejszym wglowodanem, poniewa wikszo wglowodanw zawartych w pokarmach wchania si do krwio-biegu jako glukoza lub jest przeksztacana w ni w wtrobie, a w organizmie z glukozy mog powsta wszystkie inne cukry. Glukoza jest istotnym rdem energii w tkankach, ssakw (z wyjtkiem przeuwaczy) i uniwersalnym paii-wem" dla podu. Jest ona przeksztacana w inne cukry odgrywajce swoiste role, np. glikogen jako spichlerz; ryboza w kwasach nukleinowych; galaktoza w laktozie mleka, w pewnych lipidach zoonych oraz w poczeniu z bia kami w glikoproteinach i proteoglikanach. Do chorb zwizanych z zaburzeniami wglowodanw zalicza si cukrzyc, galaktozemic, zaburzenia spichrzania glikogenu i nietolerancj mleka.
II Biochemia
Ketoza Dihydroksyaceton Erytruloza Rybuloza Fruktoza
Disacharydy to wglowodany, ktre podczas hydrolizy rozpadaj si na 2 czsteczki takich samych lub rnych monosacharydw. Przykadami s sacharoza, laktoza i maltoza. Oligosacharydy to czsteczki, ktre podczas hydrolizy rozpadaj si na 36 jednostek monosacharydowych. Przykadem moe by maltotrioza*.
Polisacharydy w wyniku hydrolizy rozkadaj si na ponad 6 czsteczek

monosacharydw. Przykadami polisacha rydw, ktre mog by liniowe lub rozgazio* Naley podkreli, e nie jest to trioza, ale trisacharyd zbudowany z 3 reszt a-glukozy.
162 / ROZ DZIA 15
ne, s skrobie i dekstryny. Niekiedy okrela si je jako heksozany lub pentozany, w zalenoci od rodzaju monosacharydw otrzymywanych w wyniku hydrolizy.
GLUKOZA JEST GWNYM MONOSACHARYDEM Struktura glukozy moe by przedstawiona 3 sposobami
frakcji promieni rentgenowskich ustalono, e ten szecioczonowy piercie zawierajcy 1 atom tlenu, w rzeczywistoci istnieje w formie krzesekowej (ryc. 15-1C).
Cukry wystpuj w formie rnych rodzajw izomerw
Chocia wzr strukturalny w formie prostego acucha (aldoheksoza, ryc. 15-1 A) pozwala zrozumie niektre waciwoci glukozy, to struktur uprzywilejowan termo dynamicznie i warunkujc jej pozostae waciwoci chemiczne jest forma cykliczna. W wikszoci przypadkw wzr strukturalny glukozy moe by przedstawiony jako paski piercie narysowa ny perspektywicznie, jak zaproponowa Ha-worth (ryc. 15-1B). Na podstawie analizy dy0
II -H c 2 H -OH C
11
Zwizki o takim samym wzorze struktural nym, ale rnej konfiguracji przestrzennej s znane jako stereoizomery. Warunkiem powstania izomerw przestrzennych s asymetryczne atomy wgla (atomy wgla poczone z 4 rnymi atomami lub grupami). Liczba moliwych izomerw danego zwizku zaley od liczby asymetrycznych atomw wgla (n) i rwna si 2n. Glukoza, z 4 asymetrycznymi atomami wgla, ma 16 izomerw. Waniejsze rodzaje izomerw glukozy s nastpujce: lenie izomerujako formy D lub jej lustrzanego odbicia jako formy L jest uwarunkowane przestrzennym podobiestwem do macierzystego zwizku rodziny wglowodanw, trjwglowe-go cukru aldehydu glicerynowego (gliceroza jest nazw nie wskazan). Formy L i D tego cukru, wraz z odpowiadajcymi im izomerami glukozy, przedstawiono na ryc. 15-2. Ustawie-
1. Izomery konf iguracyjne D i L. Okre-
H- -OH C
CH,OH
<C H I 'CHjOH
Aldehyd L-pllcerynowy
CH I H-C OH CHjOH
Aldehyd D-gtfoeryrtowy (D-G!loeroza)
'C-H t J HO- C-H I S H- C-OH I HO

C -H I *C H I 'CHsOH
C H I H-C OH ( HO C H i H-C
OH H-C I
CH,OH
a-D-Glutoza
Ryc. 15-1. a-D-Glukoza. A forma acucho wa, B wzr rzuto wy Hawortha, C ko nformacja krzesekowa.
L-G luko za D- Glukoza
Ryc. 15-2. D- i L-lzo mery aldehydu gliceryno we go i glukozy.
WGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 163 nie grup H i - OH wok atomu wgla (tj. 5 atomu, wgla w glukozie) przylegajcego do kocowego wgla pierwszorzdowego alkoholu warunkuje przynaleno cukru do szeregu D lub
L. Jeeli grupa OH przy tym atomie wgla (atomie odniesienia) znajduje si po stronie prawej (jak przedstawiono na ryc. 15-2), to cukier naley do szeregu D; jeli grupa OH znajduje si po stronie lewej, to cukier naley do szeregu L. Wikszo monosacharydw wystpujcych u ssakw ma konfiguracj D, a en zymy warunkujce ich metabolizm s swoiste dla tej konfiguracji. Obecno asymetrycznych atomw wgla nadaje rwnie czsteczce aktywno optyczn. Gdy strumie wiata spolaryzowanego przechodzi przez roztwr izomeru optycznego, wwczas paszczyzna polaryzacji przechodzcego wiata spolaryzowanego moe zosta skrcona w prawo, prawoskrtno (+), lub w lewo, lewoskrt-no (). Zwizek moe by oznaczony D(), D( + ), L( ) lub L(-t-), co wskazuje na jego pokrewiestwo strukturalne 2 aldehydem D-lub L-gliceryn owym, oraz wskazuje, e wykazuje on niekoniecznie ten sam kierunek skrca lno-ci optycznej co aldehyd, np. naturalnie wystpujc form fruktozy jest D() izomer. Mieszanina r wn ych iloci izo mer w D i L nie wykazuje adnej aktywnoci optycznej, gdy aktywnoci kadego z izomerw wzajemnie si znosz. Mieszanin tak nazywamy racemiczn lub DL-mieszanin. Zwizki otrzymywane syntetycznie s z koniecznoci racemi-czne, poniewa kady z izomerw powstaje z tak sam atwoci. 2. Piranozowe i furanozowe formy piercieniowe. Podstaw terminologii jest fakt, e trwale struktury piercieniowe mono sacharydw s podobne do struktury piercie nia piranu lub furanu (ryc. 15-3). Ketozy mog rwnie wystpowa w formach piercienio wych (np. D-fruktofuranoza lub D-fruktopiranoza) (ryc. 15-4). W przypadku znajdujcej si w roztworze glukozy, ponad 99% jej czsteczek znajduje si w postaci piranozowej; a wic mniej ni 1% znajduje si w postaci furanozowej. 3. a i p Ano mery. Struktura piercieniowa aldozy jest pacetalem, poniewa zostaa utwo rzona w wyniku reakcji grupy aldehydowej z grup alkoholow (ryc. 15-5). Podobnie pier cieniowa struktura ketozy jest pketalem. Kry staliczna glukoza jest a-D-glukopiranoz. W roztworze zachowuje si struktura cykliczna, ale pierwszy atom wgla (karbonylowy) staje si
Plran
Fu ran
HOCH
HOCHj I
HCOH
OH i- D- GI u kou ranoza
n-OGIukopIranoza
Ryc. 15-3. Postacie pira noowa i furanozowa glukozy.
OH
a-D-FruktopIranoza
OH
H a-
D-Fru ktof u r an oza
Ryc. 15-4. Postacie pira noowa i furanozowa fruktozy.
asymetryczny (anomeryczny atom wgla). Wyni-
kiem tego jest powstanie mieszaniny zawierajcej a-glukopiranoz (36%) i P-glukopira-noz (63%) oraz ladowe iloci oc i P anomerw glukofuranozy (1%). Ustalaniu si rwnowagi w tym ukadzie towarzyszy zmiana skrcalnoci optycznej (mutarotacja), w miar otwierania si
164 / ROZDZIA 15 HOCH

HO \O H
HOCH,
H/H
\
HO\OH
\OH /
H/H
OH
OH
W
H
r-D-Glukoplranoza (fl-ano mer)
/f-OGIukopIranoza (0-anomer) Acykliczna forma aldehydowa
Ryc. 15-S. cc- i Mechanizm
p-stereoizomery D-glukopiranozy. mutarotacji.
piercienia p lace tal owego i jego odtwarzania, wraz ze zmianami pooenia grup H i OH przy pierwszym atomie wgfa. Porednikiem w tym procesie jest przypuszczalnie uwodniona
prostolacuchowa czsteczka acykliczna, aczkolwiek analiza polarograficzna wykazaa, e najwyej 0,0025% glukozy istnieje w formie acyklicznej. Rotacja optyczna obserwowana w roztworach glukozy jest prawoskretna; z tego powodu w praktyce klinicznej czsto uywa si nazwy dekstroza zamiast glukoza. 4. Epimery. Izomery rnice si konfigu racj OH i H przy atomach wgla 2, 3 lub 4 glukozy nazywamy epimerami. Najwaniej szymi biologicznie epimerami glukozy s mannoza i galaktoza, utworzone przez epimeryzacj odpowiednio przy wglu 2 i 4 (ryc. 15-6). 5. Izomery konstytucyjne aldoza, ketoza. Fruktoza ma ten sam wzr czstecz kowy co glukoza, lecz rni si wzorem struk turalnym. Przy drugim atomie wgla czsteczki fruktozy znajduje si potencjalna grupa ketono wa (ryc. 15-7), natomiast glukoza zawiera po tencjaln grup aldehydow w pozycji 1 (ryc. 15-8). Wiele monosacharydw to zwizki fizjologicznie wane Pochodne trioz powstaj w wyniku metabolicznej degradacji glukozy w cigu gli kolitycz-
HOCH, H OH
HOCH
a- D - G al a kto z a R y c . 1 5 -6 . H E p ir ne r y z ac j a g l u ko z y a-D - M a n n o l a H
CH,OH CHiOH I HO C H H -C -OH i CH,OH D-(Jsyluloza CHjOH
CH3OH i
c=o
HOCH
c=o
=o
I H-C OH H-C -O H CH,OH D-Rybuloza
C = O I HO C H H C OH H C OH CH,OH
C H,O H I
C=O CH,OH Dihydroksyaceton
H C OH I HC OH I HC OH CHiOH
D-Fruktoza
D-Sedoheptuloza
Ryc. 15- 7. Przykady ketoz o znaczeniu fizjo logicznym.
WGLOWODANY O ZNACZENIU RZJ O LOGICZNYM / 165
CHO
H-C-OH
CH,OH
Aldehyd D-gllcarynowy
"
CHO
CHO H -C-OH H -C-OH CHiOH D-Erytroza CHO
HO--H H-C-OH
CHjOH D-Treoza CHO
HO--H HO--H
j
H- -OH
LJA /* LJ
n v^ w
H -C -OH H3OH
D-LIksoza CHO
H-C -OH CH.OH D-Ksyloza
HO--H H--OH H- -OH

CHiOH D-Arablnoza
CHO
H- -OH H- -OH
H-C - OH CHjOH D-Ryboia
CHO
r
HO-C-H CHO
1
H-CHO -OH
HO--H
H-C-OH
HO-C-H
HO--H
HO--H
H-C-OH
H--OH
H-C-OH
CH,OH D-Mannoza
H--OH
H--OH
CH,OH D -Glukoza
H,OH
O-Galakloza
Ryc. 15-8. Wspzalenoci strukturalne aldoz szeregu D. D-Treoza nie ma znaczenia fizjologicznego. Szereg utworzono przez teoretyczne dodawanie jednostki CH2O do grupy -CHO cukru.
nym. Pochodne trioz, tetroz, pentoz i 7-wcg-lowego cukru (sedoheptulozy) powstaj w procesie degradacji glukozy w cyklu pentozofos-foranowym. Pentozy s istotnym skadnikiem nukleotydw, kwasw nukleinowych i wielu koenzymw (tab. 15-1). 2 heksoz najwaniejsze fizjologicznie s; glukoza, galaktoza, fruktoza i mannoza (tab. 15-2). Na rycinie 15-8 przedstawiono struktur znaczcych biochemicznie aldoz, a ryc. 15-7 budow 5 wanych w metabolizmi e ketoz. Wan rol odgrywaj kwasy karboksylowe pochodne glukozy, takie jak D-glukuronian (uczestniczcy w tworzeniu gtukuronidw i wystpujcy jako skadnik glikozaminoglikanw) i jego pochodne metaboliczne, L-iduronian (skiadnik glikozaminoglikanw) (r yc, 15-9) i L-gulonian (metabolit szlaku kwasu uronowe-go; p. ryc. 22-1).
coo-
OH
OH
Ryc. 15-9. a-D-Glukuroman (z lewej) 1 p-L-iduronian (z prawej).
Cukry tworz glikozydy, reagujc z innymi zwizkami lub midzy sob Glikozydy s to zwizki powstajce w wyniku kondensacji midzy grup hydroksylow, znajdujc si na anomerycznym atomie wgla monosacharydu lub reszty monosacharydowej, a drugim zwizkiem, ktrym moe lecz nie
166 / ROZDZIA 15 Tabela 15-1. Pentozy majce znaczenie fizjologiczne Cukier D-Ryboza
Wystpowanie Znaczenie biochemiczne Znaczenie kliniczne
Kwasy nukleinowe
Skadnik strukturalny kwasw nukleinowych i koenzymw, np. ATP, NAD, NADP, flawoprote-in. Metabolit poredni w cyklu pentozofosfora-rrowym Zwizek poredni w cyklu pentozofosforan owym Skadnik glikoprotein Skadnik gikoprotein
D-Rybuloza D-Arabinoza
Powstaje w procesach metabolicznych Guma arabska Gumy liwkowa i czereniowa Gumy drzewne proteoglikany, glikozaminoglikany Misie sercowy Zwizek poredni szlaku
D-Ksyloza
D-Liksoza
Skadnik liksoflawiny izolowanej z minia sercowego czowieka <wasu uronowego Pojawia si w moczu w pentozurii wrodzonej
L-Ksyluloza
Tabela 15-2. Heksozy Cukier D-Glukoza
majce znaczenie fizjologiczne

rdo Znaczenie biochemiczne Znaczenie kliniczne
Soki owocowe. Hydrolizat skrobi, sacharozy, maltozy i laktozy Soki owocowe. Mid. Hydrolizat sacharozy i inuliny (z bulw karczochw) Hydrolizat laktozy
Cukier" organizmu. Przenoszony przez krew. pobierany i wykorzystywany przez tkanki W wtrobie i jelitach przeksztaca si w glukoz i tak zuywa j organizm W wtrobie ulega przeksztaceniu w glukoz i jest metabolizowana. Syntetyzowana w gruczole sutkowym tworzy laktoz mleka. Skadnik glikolipidw i glikopro tein Skadnik wielu glikoprotein
D- Fruktoza
D-Galaktoza
Pojawia si w moczu (giukozuria) w wyniku zwikszenia stenia glukozy we krwi (hiperglikemia) w cukrzycy Dziedziczna nietolerancja fruktozy jest przyczyn akumulacji fruktozy i hipoglikemit Zaburzenia jej metabolizmu prowadz do galak-
tozemii i zamy
D-Mannoza
Hydrolizat gum i martnozanw rolinnych
musi (w przypadku aglikonu by mono-sacharyd. Jeeli drug grupa hydroksyl, to wizanie O-gliknzydowe poczeniem aceta -lowym, poniewa jest wynikiem reakcji
inny jest ono

jest
midzy pacetalow grup hydroksylow a inn grup OH. Jeeli czci hemiacetalow jest glukoza, to utworzony zwizek jest glukozydem; jeli galak-
WGLOWODA NY O ZNA CZENIU FIZJOLOGICZNYM / 167
HO/CH.OH
OH
OH
OH
Ryc, 15-10. Streptomycyna (z lewej) i o uabaina (z prawej).
toza galaktozydent, itd. Jeeli drug grup jest amina, powstaje wizanie N-glikozydowe, np. midzy adenin a ryboz w takich nuk-leotydach, jak ATP (p. ryc. 12-5). Glikozydy s skadnikami wielu lekw i przypraw korzennych oraz tkanek zwierzcych. Aglikonem moe by metanol, glicerol, stero, fenol lub zasada, np. adenina. Wszystkie glikozydy, wane w medycynie ze wzgldu na ich dziaanie na misie sercowy (glikozydy naser-cowe), zawieraj, jako skadnik aglikonowy, steroidy. Nale tu pochodne naparstnicy i stro-fantusa, takie jak ouabaina bdca inhibitorem Na+/K+ -ATPazy bon komrkowych. GUko -zydami s niektre antybiotyki, np. streptomycyna (ryc. 15-10). Deoksycukrom brak atomu tlenu W deoksycukrach grup hydroksylow przyczon do piercienia zastpi atom wodoru. Deoksycukry otrzymuje si w wyniku hydrolizy pewnych biologicznie wanych zwizkw. Przykadem jest deoksyryboza (ryc. 15-11) wystpujca w kwasach nukleinowych (DNA).
Deoksycukrem jest rwnie L-fukoza (p. ryc. 15-17), skadnik glikoprotein, oraz 2-deoksy-glukoza, znany inhibitor metabolizmu glukozy. Aminocukry (heksozoaminy) s skadnikami glikoprotein, gangliozydw i glikozaminoglikanw Przykadami aminocukrw wystpujcych w przyrodzie s D-glukozamina (ryc. 15-12), D-galaktozamina i D-mannozamina. Glukoza-mina jest skadnikiem kwasu hialuronowego. Galaktozamina (chondrozamina) jest skadni kiem chondroityny (p. rozdz. 54),
HOCH
R yc. 15- 12. Gi ukozam i na ( 2- am i no-D - gl ukopir anoza) (anom er a). G alaktozamina jest 2-ami no- D- galaktopir anoz. Zar w no giukozamina, jak i ga lakt ozami na w yst puj j ako N - acet yl ow e pochod ne w w i kszo ci w gl ow o da nw z o on ych, np. w glikopr ot ei nach. ____________ OH H
Ryc. 15-11. 2- Deoksy- D-rybofuranoza (ano-mer ji),
Niektre antybiotyki (erytromycyna, karbo-mycyna) zawieraj w swojej czsteczce aminocukry. Uwaa si, e aktywno lecznicza zwizana jest z obecnoci aminocukrw w
czsteczkach tych antybiotykw.
168 / ROZDZIA 15
NAJWANIEJSZYMI DISACHARYDAMI S MALTOZA. SACHAROZA I LAKTOZA

Disacharydy s cukrami zoonymi z 2 reszt monosacharydowych poczonych wizaniem glikozydowym (ryc. 15-13). Nazw chemiczn
disacharydw tworzy si na podstawie ich mo-nocukrowych skadnikw. Wanymi fizjologicznie disacharydami s maltoza, sacharoza, laktoza i trehaloza {tab. 15-3). W wyniku hydrolizy sacharozy powstaje mieszanina zwana cukrem inwertowanym", gdy powstajca w czasie hydrolizy silnie lewoskrt-
Maltoza
Trehaloza
A---- \
iOH 1 H OH
o'
H OH
H 0-a-0-Glukoplranozylo-(1- 4)-a-D-giukopiranoza
OH
0-a-OGIukoplranozyto-(1- 1) - -[>-g!ukoplranozyd
Celobioza
HOCH2
HO
OH
OH
OH
OH
O-/t-D-Fru ktof u ra n ozylo-(2 - 1 )-a - D-g I u to p I ran ozyd
Laktoza
OH
OH
O-0-D-GaJal<taptranozylo-(1-.4)- -D-gfukopiranoza
Ryc. 15-13. Struktura typowych disacharydw. Przedrostek a i p odnosi si do konfiguracji przy anomerycznym atomie wgla(*). Jeeli wgiel anomeryczny drugiej reszty uczestniczy w tworzeniu wizania glikozydowego, to ta|j reszt glikozydow nazywa st furanozydem lub piranozydem. W odrnieniu od wikszoci innych cukrw, cukier nie majcy wolnej potencjalnej grupy aldehydowej lub ketonowej na wglu anomerycznym nie wykazuje waciwoci redukujcych.
WGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 169 Tabela 15-3. Disacharydy Cukier Maltoza Laktoza rdo Produkt trawienia amylaz lub hydrolizy skrobi. Kiekujce ziarna zb i sd Mleko Moe pojawia si w moczu podczas ciy. Przy niedoborze laktazy, zaburzenie wchaniania prowadzi do biegunki i wzdcia Przy niedoborze sacharazy, zaburzenie wchaniania prowadzi do biegunki i wzdcia Znaczenie kliniczne
Sacharoza
Cukier trzcinowy i z burakw cukro wych. Sorgo, ananasy, marchew Grzyby i drode. Gwny cukier hemo-limfy owadw.
Trehaloza
na fruktoza powoduje zmian (inwersj) skrca no ci optycznej pierwotnie prawoskrtnej sacharozy.
POLISACHARYDY PENI FUNKCJE ZAPASOWE I STRUKTURALNE

Do polisacharydw zalicza si nastpujce wane fizjologicznie wglowodany: Skrobia. Ma budow acucha a-glikozydo-weg"b. Takie zwizki, rozpadajce si w trakcie hydrolizy tylko na czsteczki glukozy, s homo-polimerami zwanymi glukoza na mi tub glukana-tni. Skrobia jest najwaniejszym rdem wglowodanw w poywieniu i znajduje si w kaszach, ziemniakach, rolinach strczkowych i innych warzywach. Dwoma gwnymi skad -
nikami skrobi s : amylo z a (15 20%),two rca nierozgazion struktur helikoidaln (ryc. 15--14), oraz amylopektyna (8085%), tworzca acuchy rozgazione. W tej ostatniej do acucha gwnego s przyczone wizaniem 1 -+ acuchy boczne; jedno odgazienie przypada na 24-30 reszt glukozowych poczonych wizaniami l-*4. Glikogen (ryc. 15-15). Jest zapasowym polisacharydem organizmw zwierzcych. Czsto nazywa si go skrobi zwierzc. Ma struktur bardziej rozgazion ni amylopektyna, bowiem jedno odgazienie przyczone do acucha gwnego wizaniem a(l --6)-glikozydo-wym przypada na 1018 reszt a-D-glukopi-ranozowych poczonych wizaniami a(l -4)--glikozydowymi, Inulina. Jest polisacharydem wystpujcym
Ryc. 15-14. Struktura skrobi. A amyloza o strukturze spiralnego zwoju, B amylopektyna z rozgazieniami przyczonymi wizaniami 1 -6. ____
170 / ROZDZIA 15
REGION ZEWNTRZNY
Ryc. 15-15. Czsteczka glikogenu. A struktura oglna, B powikszona struktura w punkcie rozgazienia. Liczby w A oznaczaj kolejne etapy wzrostu czsteczki. R pierwotna reszta glukozy zawierajca, jako jedyna w czsteczce glikogenu, redukujc grup przy Cv Rozgazienia s bardziej rnorodne ni to przedstawiono na tej rycinie: warto stosunku wiza 1 -* 4 do wiza 1 -* 6 waha si w granicach 1018.
w bulwach i korzeniach dalii, karczochw i mniszka lekarskiego. Ulega ona hydrolizie do fruktozy, jest wic fruktozanem. Ten cukier zapasowy, w odrnieniu od skrobi ziemniakw, jest atwo rozpuszczalny w ciepej wodzie i bywa uywany w badaniach fizjologicznych do okrelenia szybkoci filtracji w kbuszkach nerkowych. Dekstryny. S substancjami powstajcymi podczas czciowej hydrolizy skrobi. Pierwszymi produktami trawienia skrobi, tworzonymi w wyniku skracania acuchw bocznych amy-lopektyny, s dekstryny graniczne. Bonnik (celuloza). Jest gwnym skadnikiem podporowym u rolin. Nie rozpuszcza si w po-
pularnych rozpuszczalnikach. Tworzy, zbudowane z jednostek p-D-glukopiranozowych, poczonych wizaniami P(l -4), dugie, proste acuchy wzmocnione krzyowymi wizaniami wodorowymi. Bonnik nie jest trawiony w przewodzie pokarmowym wielu ssakw, w tym czowieka, z powodu braku hydrolazy dziaajcej na wizania p. Jest wanym skadnikiem objtociowym" poywienia. W odku przeuwaczy i innych trawoernych wystpuj mikroorganizmy zdolne rozbi wizanie p, co pozwala wykorzysta bionnik jako znaczce rdo energetyczne. Chiryna. Jest wanym polisacharydem strukturalnym u bezkrgowcw. Znajduje si ona np.
WGLOWODANY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM I 171

C hity na
HOCH2
HOCH, H
HN*COCH 3 N-Acetyloglukozamina
HNCO*CH 3
N-Aceylogiu Kozami na
Kwas hiahironowy
HOCH, COO" H OH Kwas /(-g luku ran owy
N-Acatylogukozamlna
4- Si ar czan chon dr olt yny
(Uwaga: wystpuje rwnie 6-siarczan) HOCH, H
w pancerzach skorupiakw i owadw. Struk turalnie chityna skada si z jednostek N-acety-lo-D-glukozaminy, poczonych wizaniami P(l-*4)-glikozydowymi (ryc. 15-16). Glikozamiaogliksny (mukopohsacharydy). Skadaj si z acuchw wglowodanw zoonych, charakteryzujcych si zawartoci ami-nocukrw i kwasw uronowych. Po przyczeniu tych acuchw cukrowych do czsteczki biaka powstaje skadnik zwany proteoglikanem. Razem z elastyn i kolagenem, elementami strukturalnymi takich tkanek, jak ko, tworz substancj podstawow, czyli kitow. Znaczna liczba grup OH i adunkw ujemnych, ktre przez odpychanie utrzymuj w czsteczce acuchy wglowodanowe osobno, powoduje, e glikozaminoglikany maj waciwo zatrzymywania znacznej iloci wody oraz pcznienia i dziki temu zdolno do nadawania waciwoci amortyzujcych lub polizgowych innym strukturom. Przykadem s kwas hiauronowy, siarczan chondroityny i heparyna (ryc. 15-16), omwienie szczegowo w rozdz. 57, Glikoproteiny (mukoproteiny). Wystpuj w rnych pynach i tkankach, w tym w bonach komrkowych (p. rozdz. 43 i 57). S to biaka zoone zawierajce w rnych ilociach wglowodany, przyczone jako krtkie lub dugie (do 15 jednostek) rozgazione lub nierozga-zione acuchy. acuchy takie nazywa si zwykle acuchami oligosacharydowymi. Skadniki cukrowe obejmuj:
Heksozy Mannoza (Man) A cetylo hekso zaminy N-Acetyloglukozarnina (GIcNAc) Galaktoza (Gal) N-Acetylogalaktozarriina (GaiNAc) Ksyloza (Xyi)
HN-COCH 3 H OH
Pentozy Arabinoza (Ara)
M etylo pento zy L-Fukoza (Fuc; p. ryc, 15-17) K wasy s jao we Pochodne N-acylowe kwasu neuraminowego, np. kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. ryc. 15-18), gwny kwas sjalowy.
Kwas 0-glukuronowy Siarczan N-acatylogalaktozaminy

Heparyna
H/H
\H
Hy
"O.
H Suttonowana giukozamina Sulfonowany kwas Iduronowy
Dojrzale glikoproteiny, oprcz kolagenu, nie zawieraj glukozy i w przeciwiestwie do gliko-/aminoglikanw i proteogiikanow nie zawieraj kwasw uronowych. Kwasy sjalowe. S N- lub O-acylowymi pochodnymi kwasu neuraminowego (ryc. 15-18). 1 NHSO3~ H OS Kwas neuraminowy jest 9wglowym cukrem,
Ryc. 15-16 . S tr ukt ur a ni ekt r ych poli sachar ydw zoonych.
172 / ROZDZIA 15
JtrsO\H
W
OH H
HO/0
R y c. 1 5 -17 . ( i - L Fukoza ( 6- deok sy - p- L- g al akt o- za).
Ac NH
COCT
stanowi wglowodany, ktre znajduj si w glikoproteinach i gliko lipid ach. Ich obecno na zewntrznej powierzchni bony plazmatycz-nej (glikokaliks) wykazano przy uyciu lektyn rolinnych, aglutynin biakowych, ktre wi si swoicie z pewnymi resztami glikozylowy-mi, np. kimkanawalina A jest swoista w stosunku do reszt a-glukozy 1 owych i a-mannozylo-wych. Glikoforyna. Jest gwn integraln gliko-protein bony ludzkich erytrocytw. Zbudowana ze 130 reszt aminoacylowych tkwi w bonie lipidowej tak, e zarwno z zewntrznej, jak i z wewntrznej (cytoplazmatycznej) powierz chni bony wystaj wolne czci polipeptydowe. acuchy sacharydowe s przyczone tylko do czci N-kocowej, znajdujcej si na zewntrz powierzchni zewntrznej bony (p. rozdz, 43). PIMIENNICTWO
Advances in Carbohydrate Chemistry. Academic Press, 1945current. Collins PM (editor); Carbokydrates. Chapman & Hali, 1987. Ferrier RJ, Collins PM; Monosaccharide Chemistry. Penguin Books, 1972. Hughes RC: The comple* carbohydrates of mammalian celi surfaces and their biological roles. Essays Biochem 1975;11:1. Lindahl U, Hook M: Glycosaminoglycans and their binding to biological macromolecules. Annu Rev Biochem 1978;47:385. Pigman WW, Horton D (editors): The Carbohydrates. Vols 1A and 1B. Academic Press, 1972. Rees DA: Poiysaccharide Shapes. Wiley, 1977. Sharon N: Carbohydrates. Sci Am 1980;245:90
OH
Ryc. 15-18. Struktura kwasu N-acetyloneurami-nowego (kwasu sjalowego). Ac = CH3-CO-.
ktrego struktur mona wyprowadzi, tczac mannozamin (epimer glukozaminy) z pirogro-nianem. Kwasy sjalowe s skadnikami zarwno glikoprotein jak i gangliozydw. WGLOWODANY ZNAJDUJ SI W BONACH KOMRKOWYCH Lipidow struktur bon komrkowych opisano w rozdz. 16 i 43. Analiza skadnikw bon komrkowych ssakw wykazuje, e ok. 5%
Lipidy o znaczeniu fizjologicznym

16
LIPIDY DZIELI SI NA PROSTE I ZOONE
Zmodyfikowana klasyfikacja lipidw wg Bloora jest nastpujca: A. Lipidy proste: estry kwasw tuszczowych z rnymi alkoholami. 1. Thiszcze waciwe estry kwasw tu szczowych z glicerolem. Tuszcze wystpujce w stanie pynnym nazywa si olejami. 2. Woski estry kwasw tuszczowych z dugoacuchowymi alkoholami monohydroksylowymi. B. Lipidy zoone: estry kwasw tuszczowych zawierajce, oprcz alkoholu i kwasw tu szczowych, jeszcze grupy dodatkowe. 1. Fosfolipidy lipidy zawierajce oprcz kwasw tuszczowych i glicerolu, reszt kwasu fosforowego. Czsto zawieraj one zasad azo tow i inne podstawniki. a. Glieerofosfolipidy alkoholem jest glicerol. b. Sfingofosfolipidy alkoholem jest sfingozyna. 2. Glikolipidy (glikosfingolipidy) lipidy za wierajce kwas tuszczowy, sfingozyn i w glowodany, 3. Inne lipidy zoone takie lipidy, jak sulfolipidy i aminolipidy. W tej grupie mona umieci rwnie lipoproteiny. C. Prckursory i pochodne lipidw: nak tu kwasy tuszczowe, glicerol, steroidy, alkohole inne ni gHcerol i sterole, aldehydy tuszczowe, zwizki ketonowe (p, rozdz. 24), wglowodory, witaminy rozpuszczalne w tuszczach i hor mony. Ze wzgldu na brak adunku w czsteczkach, acylogiicerole (glicerydy), cholesterol i estry cholesterolu okrela si mianem lipidw obojtnych.
WPROWADZENIE
Lipidy s heterogenn grup zwizkw rzeczywicie lub potencjalnie pokrewnych kwasom tuszczowym. Maj one wspln cech, ktr jest t) wzgldna nierozpu szcza Ino w wodzie oraz 2) rozpuszczalno w rozpuszczalnikach niepolarnych, takich jak eter, chloroform i benzen. Do lipidw zalicza si wiec thiszcze, oleje, woski i zwizki pokrewne. Lipidy s wanymi skadnikami pokarmw nie tylko ze wzgldu na ich du warto energetyczn, lecz take dlatego, e w tuszczach zawartych w naturalnych pokarmach znajduj si -witaminy rozpuszczalne w tuszczach oraz niezbdne (tzw. egzogenne) kwasy tuszczowe.
W organizmie tuszcze su jako wydajne rdo energii zarwno bezporednio, jak i potencjalnie, gdy odoone s w tkance tuszczowej. Tuszcze tkanki podskrnej i gromadzce si wok pewnych narzdw su jako izolator termiczny, a lipidy niepolarne jako izolatory elektryczne pozwalajce na szybkie rozprzestrzenianie si fal depolaryzacyjnych wzdu mie-linowych wkien nerwowych. Zawarto tuszczw jest wyjtkowo dua w tkance nerwowej. Poczenia tuszczu z biakiem (lipoproteiny) stanowi wane skadniki komrkowe wystpujce zarwno w bonie komrkowej, jak i w mito-chondriach, a take su jako rodki transportu lipidw w osoczu krwi. Znajomo biochemii lipidw jest konieczna do zrozumienia wielu biecych zagadnie biomedycznych, np. otyoci, miadycy oraz roli rnych wielonienasyco-nych kwasw tuszczowych zarwno w ywieniu, jak i w zdrowiu.
174 / ROZDZIA 16
KWASY TUSZCZOWE S ALIFAT YCZNYMI KWASAMI KARBOKSYLOWYMI Kwasy tuszczowe wystpuj gwnie w formie zestryfikowanej w naturalnych tuszczach i olejach, ale w surowicy krwi wystpuj i s transportowane w formie niezestryfikowanej jako wolne kwasy tuszczowe. Kwasy tuszczowe wystpujce w tuszczach naturalnych s zwykle pochodnymi nierozgazionych acuchw wglowodorowych i zawieraj parzyst liczb atomw wgla, poniewa s syntetyzowane z jednostek dwuwglowych. Ich acuch moe by nasycony (brak wiza podwjnych) lub nienasycony (z jednym, lub wicej, wizaniem podwjnym). Nazwy kwasw tuszczowych wyprowadza si od odpowiednich wglowodorw Wedug najczciej uywanej nomenklatury nazw systematyczn kwasu tuszczowego tworzy si od nazwy wglowodoru o tej samej liczbie atomw wgla przez dodanie kocwki -owy do nazwy wglowodoru (nomenklatura genewska). Tym sposobem nazwa kwasu nasyconego koczy si na -anowy np. oktanowy, a kwasu nienasyconego z wizaniami podwjnymi na -enowy, np. oktadekenowy (kwas oleinowy). Numeracj atomw wgla rozpoczyna si od wgla grupy karboksylowej (wgiel nr 1). Atom wgla przylegajcy do w gla karboksylowego (nr 2) jest rwnie znany jako wgiel a. Atom wgla nr 3 jest wglem p, a atom wgla w grupie metylowej znajdujcej si na dystalnym kocu acucha nazywa si wglem w lub n-atomem wgla. W uyciu jest kilka sposobw wskazywania liczby i pooenia wiza podwjnych; np. A9 oznacza wizanie podwjne midzy atomami wgla 9 i 10 kwasu tuszczowego; to9 wskazuje wizanie podwjne przy wglu 9, liczc od atomu wgla co. Na ryc. 16-1 przedstawiono powszechnie uywane sposoby wskazywania liczby atomw wgla, liczby i pooenia wiza podwjnych w czsteczce kwasu tuszczowego. U zwierzt dodatkowe wizania podwjne s wprowadzane tylko miedzy istniejcym wizaniem podwjnym (np. (o9, ro6 lub ca3) a wglem karboksylowym, wynikiem czego s 3 serie kwasw tuszczowych, znane odpowiednio jako rodzina o>9, 006 i co3.
CH3(CH2),CH = CH(CHj)7COOH lub a>9,C18:1 lub n-9, 18:1 CH3CH2CH,CH2CHH2CHJCH2CH = CH(CH2)7COOH

n 17 10 9 1
Ryc. 16-1. Kwas oleinowy, n-9 (n minus 9).
Nasycone kwasy tuszczowe nie zawieraj wiza podwjnych Nasycone kwasy tuszczowe mona traktowa jako pochodne kwasu octowego, pierwszego przedstawiciela szeregu. W tabeli 16-1 przedstawiono przykady kwasw tego szeregu. Inne dugoacuchowe kwasy tuszczowe z tego szeregu wystpuj przewanie w woskach. Wyodrbniono rwnie kilka kwasw tuszczowych o acuchu rozgazionym zarwno z materiau rolinnego, jak i zwierzcego. Nienasycone kwasy tuszczowe zawieraj jedno lub wicej wiza podwjnych (p. tab. 16 -2) Kwas y te mona podzieli na podgrupy ze wzgldu na ich stopie nienasycenia. A. Kwasy jednonienasycone (monoetenoidy, kwasy monoetenowe) zawierajce jedno wiza nie podwjne. B. Kwasy wielonienasycone (polienoidy, kwa sy polienowe) zawierajce wicej wiza po dwjnych. C. Eikozanoidy. Grupa zwizkw, pochod nych ikoza-(20-C) polienowych kwasw tusz czowych, obejmujca prostanoidy i leukotrieny (LT). Do prostanoidw zalicza si prostaglandyny (PG), prostacykliny (PGI) i tromboksany (TX). Terminu prostaglandyny" uywa si czsto niecile jako okrelenia oglnego obej mujcego wszystkie prostanoidy. Prostagiandyny. Odkryto pierwotnie w nasieniu, ale obecnie wiadomo, e wystpuj praktycznie we wszystkich tkankach ssakw, dziaajc jako miejscowe hormony lokalne; wykazuj one istotne aktywnoci fizjologiczne i farmakologiczne. In vivo s one syntetyzowane z 20-C wielonienasyconych (ikozanowych) kwasw tuszczowych (np. kwasu arachidonowego). Pierwszy etap biosyntezy polega na cyklizacji rodkowej czci acucha i utworzeniu pier-
LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 175 Tabela 16-1. Nasycone Nazwa zwyczajowa kwasu Mrwkowy* Octowy Propionowy Masowy Walerianowy Kapronowy Kaprylowy (oktanowy) Kaprynowy (dekanowy) Laury no wy Mirystynowy Palmitynowy Stearynowy Arachidowy (ikozanowy) Behenowy Lig npc ery nowy kwasy tuszczowe Liczba atomw wgla
1
Uczestniczy w metabolizmie reszt Ci (mrwczanu) Gwny produkt kocowy fermentacji wglowodanw u prze uwaczyKocowy produkt fermentacji wglowodanw u przeuwa + czy Wpewnych tuszczach w mafych ilociach (zwaszcza w male). > Kocowy produkt fermentacji wglowodanw u 1 przeu waczy " ^W wielu tuszczach (cznie z masem) w maych ilociach, > zwaszcza w tuszczach rolinnych Spermacet, cynamon, nasiona palmy, olej kokosowy, owoc wawrzynu Gaka muszkatoowa, nasiona palmy, olej kokosowy, mirt 1 Powszechnie wystpujce we wszystkich tuszczach zwie -f rzcych i rolinnych Olej arachidowy Nasiona Cerebrozydy, olej arachidowy
2 3
4 56
a
10
12 14
16 18
20 22 24
* Tylko kwas mrwkowy, bez pochodnych alkilowych. + Rwnie w okrnicy czowieka.
coo-
Ryc. 16-2. Prostaglandyna E2 (PGE2). Byc. 16-3. Tromboksan A2 (TXA2).
COCr
cienia cyklopentanowego (ryc. 16-2). Pokrewny szereg zwizk w, tj. tromboksaiiy wykryte w pytkach krwi, ma piercie cyklopentanowy przerwany atomem tlenu (piercie oksanowy) (ryc. 16-3), Trzy rne ikozanowe kwasy tuszczowe daj pocztek 3 grupom eikozanoidw z charakterystyczn liczb wiza podwjnych w acuchach bocznych, np. PGj, PG2, PG> Zmiany dotyczce podstawnikw przyczo nych do piercieni s przyczyn istnienia rnych typw podstawienia oznakowanych A, B itd. w kadym szeregu prostaglandyn i trom-bok san w. Typ E " p rost agl and yn (jak w PGE2) ma grup ketonow w pozycji 9, natomiast typ F" ma grup hydroksylow w tej pozycji. Lcukotrkny s trzeci grup pochodnych eikozanoidw powstajcych raczej przez szlak lipooksygenazy ni przez cyklizacj acucha kwasu tuszczowego (ryc. 16-4). Leu-
176 / ROZDZIA 16 Tabela 16-2. Nienasycone kwasy tuszczowe wystpujce w pokarmach i majce znaczenie fizjologiczne Liczba atomw C oraz liczba i pozycja w iza podw jnych
Szereg
Nazw a zw yczajow a
Nazw a systematyczna
Wyst pow anie
Kw asy mo noe now e (z 1 podw jnym w izan ie m) 16:1; 9 18:1; 9 w7 w9 Palmitooleinowy Oleino wy cis - 9 - H eksa de ke n o w y cis - 9 - 0 kta d eke n owy Niemal we wszystkich tuszczach Prawdopodobnie najbardziej rozpo wszechnio ny kwas tuszczowy w tusz czach naturalnych T us zc ze p rz e uwa cz y i utwardzane Oleje rzepakowy gorczycz-ny W cerebrozydach i
18:1; 9 22:1;1 3 24:1;1 5
w9
u9 w9
Ela i dyn owy Erukowy Nerwo no wy
frans- 9 0 ktadeken o wy c/s-13-Do kozeno wy c -15-Tetrakozeno wy
Kwasy drenowe (z 2 podwjnymi wizaniami) 18:2; 9, 12 cis,cis-B,12-Oktadekadienowy Oleje: kukurydziany, arachidowy, baweniany, sojowy i wiele innych rolinrfych
Kwasy trienowe (z 3 podwjnymi wizaniami) 18:3; 6, 9, 12 Y-Linolenowy 6,9,12-Oktadekatrienowy Niektre roliny, np. olej z wiesioka. Niewielkie ilaci w tuszczach zwierzcych
18:3; 9, 12, 15
et-Linolenowy
9,12,15-Oktadekatrienowy Czsto wystpuje z kwasem linolowym, zwaszcza w oleju lnianym
Kwasy tetraenowe {z 4 podwjnymi wizaniami)
20:4; 5, 8, 11, 14
Arachidonowy 5,8,11,14Ikozatetraeno-nowy
Wystpuje z kwasem lino-lowym, zwaszcza w oleju arachidowym; istotny skadnik fosfolipidw zwierzcych
Kwasy pentaenowe (z 5 podwjnymi wizaniami)
20:5; 5, 8, 11, 14, 17

22:5; 7, 10, 13, 16, 19
Timnodonowy Klupanodono-
5,8,11,14,17-lkozapentaenowy 7,10,13,16,19-Dokoza-p entaenowy
Istotny skadnik olejw rybich, np. tranu dorszowego Oleje rybie, fosfolipidy w mzgu
Kwasy heksaenowe {z 6 podwjnymi wizaniami) 22:6; 4, 7, 10, 13, 16, 19 Cerwonowy 4,7,10,13,19-Dokozaheksaenowy Oleje rybie, fosfolipidy w mzgu
LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 177
COO"
Posta trans (kwas eialdynowy)
Ryc. 16-4. Leukotnen A4 (LTA4).
kotrieny izolowane z leukocytw charakteryzuj si obecnoci 3 sprzonych wiza podwjnych. Wikszo naturalnie wystpujcych nienasyconych kwasw tuszczowych ma podwjne wizanie cis acuchy wglowe nasyconych kwasw tuszczowych po rozcigniciu w niskich temperaturach przyjmuj konformacj typu zygzak. W wyszych temperaturach niektre wizania ulegaj rotacji, powodujc skrcenie acucha, co wyjania, dlaczego bony biologiczne staj si ciesze wraz ze wzrostem temperatury. Typ izomerii geometrycznego, w jakim wystpuj nienasycone kwasy tuszczowe, zaley od ustawienia atomw lub grup wok osi wizania podwjnego. Jeli acuchy wglowe znajduj si po tej samej stronie wizania, to wizanie ma konfiguracj cis, jak w kwasie oleinowym; jeli po przeciwnych stronach trans, jak w kwasie elaidynowym, sztucznym izomerze kwasu oleinowego (ryc. 16-5). Prawie wszystkie wystpujce w przyrodzie nienasycone dugoacucho-we kwasy tuszczowe maj konfiguracje cis; acuchy wglowodorowe czsteczek s zgite" w miejscu podwjnego wizania o 120. Kwas oleinowy ma wic ksztat litery L, natomiast kwas elaidynowy majc podwjne wizanie trans, pozostaje prosty". Zwikszenie liczby wiza podwjnych cis w kwasach tuszczowych pozwala na rnorodno konfiguracji przestrzennych czsteczki, np. kwas arachido-nowy, z 4 wizaniami podwjnymi cis, moe mie ksztat supa" lub litery U", To moe mie istotne znaczenie dla molekularnego upakowania w bonie i dla uoenia przestrzennego kwasw tuszczowych w bardziej zoonych czsteczkach, takich jak fosfolipidy. Obecno wiza podwjnych trans bdzie zmienia te przestrzenne wspzalenoci. Kwasy tuszczowe o konfiguracji trans wystpuj w pewnych pokarmach. Wikszo z nich powstaje jako produkt uboczny podczas wysycania kwasw
coo-
coo-
Ryc. 16-5. 9 Izomery geometryczne kwasu tuszczowego A ,18:1 (kwasy oleinowy i elaidynowy).
tuszczowych w procesie uwodornienia, czyli utwardzania" naturalnych olejw w zakadach produkujcych margaryn. Dodatkowa niewielka cz kwasw tuszczowych trans pochodzi ze spoywanych tuszczw przeuwaczy, u ktrych powstaj one w waczu w wyniku dziaania mikroorganizmw. Zarwno fizyczne, jak i fizjologiczne waciwoci kwasw tuszczowych s warunkowane dugoci i stopniem nienasycenia ich acucha Temperatura topnienia kwasw tuszczo 12 Biochemia
wych o par zystej liczbie wgli wzrasta wraz z dugoci acucha i obnia si zgodnie z jego nienasyceniem. Triacyoglicerol, zawierajcy tylko nasycone kwasy tuszczowe o 12 atomach wgla lub dusze, wystpuje w stanie staym w temperaturze ciaa, natomiast jeeli wszystkie 3 reszty kwasw tuszczowych s 18:2 jest w stanie pynnym do temperatury poniej 0C.
O
[I
R -C-O-CH *CH,
O1 1
O u
- O - C - R , Ryc. 16-6. Trtacyloglicerol.
'CH 3 -O -C -R,
178 / ROZDZIA 16
W rzeczywistoci naturalne acyloglicerole zawieraj mieszanin kwasw tuszczowych dobran zgodnie z funkcj lipidu. Lipidy bon, ktre musz by pynne w zakresie temperatur rodowiska, s bardziej nienasycone ni lipidy zapasowe. Lipidy tkanek naraonych na schodzenie, np. u zwierzt podczas snu zimowego lub w koczynach zwierzt, s w wyszym stopniu nienasycone. Pewne alkohole i aldehydy wystpuj w naturalnych lipidach Alkohole. Do alkoholi wystpujcych w czsteczkach lipidw naley glicerol, cholesterol i wystpujce zwykle w woskach wysze alkohole (np. alkohol cetylowy, Cj6H33OH) oraz dolichol, alkohol poliizoprenoidowy (p. ryc. 16-27). mog zosta zredukowane do aldehydw tuszczowych. Zwizki te znaleziono w tuszczach naturalnych w formie wolnej lub zwizanej. TRIACYLOGLICEROLE (TRIGLICERYDY)* TO GWNA FORMA ZAPASOWA KWASW TUSZCZOWYCH Triacyloglicerole s estrami alkoholu gli-cerolu z kwasami tuszczowymi. W naturalnie wystpujcych tuszczach procent czsteczek triacyloglicerolu, w ktrych glicerol jest zestry-fikowany 3 takimi samymi kwasami, jest bardzo may. Niemal wszystkie one s acyloglicerolami mieszanymi. Gdyby wszystkie 3 kwasy tuszczowe oznaczone na ryc. 16-6 jako R, byy kwasami stearynowymi, tuszcz nazywaby si tristeary-n, poniewa skadaby si z glicerolu zestryfi-kowanego 3 resztami kwasu stearynowego. Na rycinach 16-7 i 16-8 przedstawiono przykady acylogliceroli mieszanych.
O 'CH 2 -O-C-C, 7H CH l t -C- O- 'H 0 >CHa -0-C CH3S Ryc. 16-7. 1,3-Distearynopalmityna.
CH -C-O-iCH O a CH,-O-C-CH 1, Ryc. 16-8. 1,2-Distearynopalmityna.
Aldehydy tuszczowe. Kwasy tuszczowe
Atomy wgla 1 i 3 w czsteczce glicerolu nie s identyczne Aby jednoznacznie ponumerowa atomy wgla glicerolu, stosuje si system -sn(stereoche-miczne numerowanie), np. 1,2-distearoilo--3-palmitoilo-OT-glicerol (przedstawiony,wzorem projekcyjnym rwnie na ryc. 16-9). Nale-
i II HjC-O-C-R,
O Rs-C-OI
i i
H'-0-C-R-,
Ryc. 16-9. Triacylo-s/-glicerol.
* Monoglicerydy, diglicerydy i triglicerydy zgodnie z obecn standardow terminologi Midzynaro dowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej (IUPAC) oraz Midzynarodowej Unii Biochemicznej (IUB) okrela si odpowiednio jako "monoacyioglicerole, diacyloglicerole i triacyloglicerole.
y podkreli, e wgle 1 i 3 czsteczki glicerolu nie s identyczne, jeeli oglda si trjwymiarowy model czsteczki. Enzymy bez trudu rozpoznaj je i s prawie zawsze swoiste wzgldem jednego lub drugiego wgla, np. glicerol jest zawsze fosforylowany przez glicerokinaz na sn-i dajc glicerolo-3-fosforan, a nigdy glicero-lo-l-fosforan. W tkankach znaleziono rwnie czciowe acyloglicerole, tzn. mono- lub diacyloglicerole, w ktrych glicerol jest zestryfik owany 1 lub 2 kwasami tuszczowymi. Maj one szczeglne znaczenie w syntezie i hydrolizie triacyloglice-roli.
FOSFOLIPIDY S GWNYM SKADNIKIEM LPIDOWYM BON Do grupy fsfolipidw zalicza si: 1) kwas fosfatydowy i fosfatydyloglicerol, 2) fosfatydy-locholin, 3) fosfatydyloetanoloamin, 4) fos-fatydyloinozytol, 5) fosfatydyloseryn, 6) lizo-fosf o lipidy, 7) plazmalogeny i 8) sfingomieliny. Wszystkie te zwizki s fosf o glicerydami, oprcz sfingomidin, ktrych czsteczki nie zawieraj glicerolu. Mog one by traktowane jako pochodne kwasu fosfatydowego (ryc. 16-10), w ktrym fosforan jest zestryfikowany z grup -OH odpowiedniego alkoholu.
Fosfatydylocholiny (lecytyny) wystpuj w bonach komrkowych Fosfatydylocholiny s to fosf o glicerydy zawierajce cholin (ryc. 16-12). S one przewaajcymi ilociowo lipidami bon komrkowych O
1 "
O
3
CH;.-O-C-R, CH2-O-P-OTCH-CH2~N~CH3
* ^ ^ ^ H
x
c \-\
Cholina Ryc. 16-12. 3-Fosfatydylocholina.
o
II O CHi-O-C-R, II 1 R 2-C-O-CH I li CH 2-O-P~O I Ryc. 16-10. Kwas fosfatydowy
Kwas fosfatydowy jest kluczowym zwizkiem porednim w syntezie triacylogliceroli oraz fosf o glicerydw, ale w tkankach wystpuje w niewielkich ilociach. Kardiolipina jest istotnym lipidem bon mitochondrialnych Kwas fosfatydowy jest prekursorem fosfaty-dyloglicerolu, ktry z kolei w mitochondriach ulega przeksztaceniu w kardiolipin (ryc. 16--11).
i stanowi du cz zasobw choliny w organizmie, Cholina odgrywa wan rol w przewodnictwie nerwowym oraz jako zapas labil-nych grup metylowych. Dipalmitoilolecytyna jest bardzo aktywnym zwizkiem powierzch niowo czynnym (surfaktant), zmniejszajcym napicie powierzchniowe pomidzy faz tkanki pucnej i faz gazw oddechowych i zapobiegajcym sklejaniu si wewntrznych powierzchni puc. Brak surfaktantu w pucach wczeniakw jest przyczyn zespou bon szklistych, ktrego zasadniczym objawem jest zespl niewydolnoci oddechowej. Wikszo fosfolipidw ma nasycony rodnik acylowy w pooeniu Cls a rodnik nienasycony w pooeniu C2 glicerolu. Fosfatydyloetanoloamina (kefaiina) Kefaliny rni sic od fosfatydylocholiny tylko tym, e zamiast choliny zawieraj etanolo-amin (ryc. 16-13).
ii CH2 O-POCH2 O
i
f
I<4
H-C-OH
O O H-C-O-C-Ra
Fosfatydyloglicerol Bisfosfatydyloglicerol (kardiolipina) Ryc. 16-11. Kardiolipina (bisfosfatydyloglicerol}.
180 / ROZDZIA 16
Etanoloamina Ryc. 16-13. 3-Fosfatydytoetanoloamina
Lizofosfolipidy s zwizkami porednimi w metabolizmie fosfoglicerydw S to fosfoacyloglicerole zawierajce w swojej czsteczce tylko jedn reszt acylow, np. lizole-cytyna, uczestniczca w metabolizmie i przeksztacaniu fosfolipidw (ryc. 16-16).
0 II CH2-O-C-R CH 2-O-P-S-CH3-CHi-N-H a | ^ Cholina Ryc. 16-16. Lizolecytyna.
Fosfatydyloinozytol jest prekursorem wtrnych przekanikw Wystpuje tu stereoizomer ino2ytolu, mioi-nozytol (ryc. 16-14). Fosfatydyloinozytoto-4,5-bis-fosforan jest wanym skadnikiem fosfolipidw bon komrkowych. Po pobudzeniu komr ki przez waciwy hormon jest hydrolizowany do diacyloglicerolu i inozytolo-tris-fosforanu. z ktrych kady dziaa jako wewntrzkomr kowy sygna, czyli drugi posaniec (p. str. 594).
O CH,OCRt ii I 2 R 2 - C-O- C H Ryc. 16-14. 3-Fosfatydyloinozytol.
Fosfatydyloseryna W wikszoci tkanek wystpuje fosfatydyloseryna, ktra zamiast etanoloaminy ma seryn (ryc. 16-15). Wyizolowano rwnie fosfolipidy zawierajce treonin.
OO CH 2-O-C-R, ,1 !t .-. : - I III : C H 2-O-P- O-C H2-C H-C OO" O 'CHi-O-C-R,
i
Plazmalogeny wystpuj w mzgu i miniach Zwizki te stanowi co najmniej 10% fosfolipidw mzgu i mini. Strukturalnie plazmalogeny przypominaj fosfatydyloetanolpami-nc. ale przy C, zamiast wizania estrowego, wystpujcego w wikszoci acylogliceroli, maj wizanie eterowe. Zazwyczaj rodnikiem alkilowym jest nienasycony alkohol (ryc. 16-17). W niektrych przypadkach etanoloamina moe by zastpiona cholin, seryn lub inozytolem.
Rj-C-O-CH
3
V . ___________
CH2-O-P-i
O'
Kwas plazmenowy Ryc. 16-17. Plazmalogen (plazmenyloelanolo-amina).
Etanoloamina
( Seryna Ryc. 16-15. 3-Fosfatydyloseryna^ _____
Sfingomieliny rwnie wystpuj w ukadzie nerwowym Sfingomieliny wykryto w duych ilociach w mzgu i tkance nerwowej. W wyniku hydrolizy sfingomielin otrzymuje si kwas tuszczowy, kwas fosforowy, cholin i zoony amirioalkohol sfingozyn (ryc. 16-18), W lipidach tych nie wystpuje glicerol. Amidowe poczenie sfingo-
RJ -C -O -CH 1
LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 181 Ceramid Sfingozyna
H
H; Kwas
C H 3 - ( C H s ), s - C H = C H - C H - C H - N -
tuszczowy Kwas fosforowy
Cholina Ryc. 16-18. Sfingomielina.
zyny z kwasem tuszczowym nazywa si cerami-dem; struktura tego typu wystpuje rwnie w glikolipidach (p, poniej). GLIKOLIPIDY (GLIKOSFINGOLIPIDY) S IST OTNYM SKADNIKIEM TKANKI NERWOWEJ I BON KOM RKOWYCH Glikolipidy s szeroko rozpowszechnione w kadej tkance organizmu, zwaszcza w tkance nerwjowej takiej jak mzg. Znajduj si gwnie w zewntrznej warstwie bony plazmatycznej, z ktrej wystaj ich. acuchy oligosacharydo-we, tworzc sacharydy powierzchni komrki. Gwnymi glikolipidami zwierzcymi s gli-kosfingolipidy. Zawieraj one ceramid i jedn lub wicej czsteczek cukru. Dwoma najprostszymi glikolipidami s gaiaktozyloceramid i glu-kozyloceramid. Galaktozyloceramid jest gwSfingazyna
nym gJikosfingolipidem mzgu i innych tkanek nerwowych, ale we wzgldnie maych ilociach wystpuje on wszdzie. Zawiera sporo charakterystycznych Ci4 kwasw tuszczowych. Gala-ktozyoceramid (ryc. 16-19) moe zosta przeksztacony w sulfogalaktozyloceramid (klasyczny sulfoglikozylosfingolipid; dawniej sulfatyd), ktry wystpuje obficie w mielinie. Glukozylo-ceramid jest przewaajcym prostym glikosfln-golipidem tkanek pozanerwowych, aJe w maych ilociach znajduje si rwnie w mzgu. Bardziej zoonymi glikosfmgolipidami s gan-gliozydy, pochodne glukozyloceramidu. Gang-liozyd jest glikosfingolipidem zawierajcym dodatkowo jedn lub wicej reszt kwasu sjalowego. Kwas N-acetyloneuraminowy (NeuAc; p. rozdz. 15) jest zasadniczym kwasem sjalowym wystpujcym w tkankach ludzkich. Ganglio-zydy wystpuj w duych steniach rwnie w tkance nerwowej. Wydaje si, e peni one funkcje receptorowe i inne. Najprostszym gang-
___ A
OH O I H
3 (C H 2 ) 1 2 -C H =
II
C H -C H -C H N C - C H (O H ) Kwas tuszczowy, np. kwas cerebronowy
GalaWoza
O-CH,
OH
Ryc. 16-19. Struktura gaiaktozyloceramidu (galaktocerebrozyd, R = H) i sulfogalaktozyloceramidu (dawniej sulfatyd, R = S O| ~).
182 / ROZDZiA 16
liozydem wystpujcym w tkankach jest GM3-Zawiera on ceramid, 1 czsteczk glukozy, 1 czsteczk galaktozy i 1 czsteczk NeuAc. W uytym tu skrtowym zapisie gangliozydu: G oznacza gangliozyd, M = monosjalo, a cyfra arabska wskazuje kolejno lokowania si na chromatogramach cienkowarstwowych. Na rycinie 16-20 przedstawiono struktur GM], bar- Rvc. 16-21. Szkielet (rdze) steroidowy. dziej zoonego gangliozydu bdcego pochodn GM3. G M| jest zwizkiem dosy interesujCaramid -Glukoza-G alaklc wa -N-Acetylo- G alaMo za (Acy<ogalaktozamlna NeuAc sflngozyna) lub
Cer-GIc-Gal-GalNAc-Gal I NeuAc Ryc. 16-20. Gangliozyd G M1, monosjaloganglio/yd.
cym biologicznie, jako e jest on znanym receptorem dla toksyny cholery w jelicie cienkim. Inne gangliozydy mog zawiera w swojej czsteczce od jednej do 5 reszt sjalowych, tworzcych odpowiednio di-, trisjalogangliozydy itd. STEROIDY PENI WIELE WANYCH FUNKCJI FIZJOLOGICZNYCH Cholesterol jest prawdopodobnie najbardziej znanym steroidem ze wzgldu na jego udzia w rozwoju miaidiycy. Odgrywa on bardzo wan rol biochemiczn, poniewa jest prekur sorem wielu rwnie wanych steroidw, takich jak kwasy ciowe, hormony kory nadnerczy, hormony pciowe, witaminy D, glikozydy naser-cowe, sitosterole w wiecie rolin i niektre alkaloidy. Wszystkie steroidy maj podobny rdze cykliczny, przypominajcy fenantren (piercienie A, B i C), do ktrego jest doczony piercie cyklopentanu (D). Atomy w gla w rdzeniu steroidowym s numerowane tak, jak pokazano na ryc. 16-21. Przy rozpatrywaniu wzorw strukturalnych steroidw naley zwrci uwag, e prosty piercie heksagonalny oznacza cakowicie nasycony piercie 6-wglowy ze wszystkimi wartociowociami wy sycony mi wodorem, chyba
e zaznaczono inaczej; tzn. nie jest to piercie benzenowy. We wzorze zaznacza si wszystkie wizania podwjne. Boczne grupy metylowe przedstawia si w postaci wiza pojedynczych nie poczonych na dalszym kocu (metyl). Wystpuj one typowo w pozycji 10 i 13 (tworzc 18 i 19 atom wgla), W pozycji 17 wystpuje zwykle acuch boczny (jak w czsteczce cholesterolu). Jeeli zwizek zawiera 1 lub wicej grup hydroksylowych, a adnej grupy karbony-lowej lub karboksylowej, jest sterolem i jego nazwa ma kocwk ol. Ze wzgldu na asymetri czsteczki steroidu moliwe jest istnienie wielu stereoizomerw Kady z piercieni szeciowglowych rdzenia steroidowego moe istnie w trjwymiarowej konformacji krzesekowej lub ldeczkowej (ryc. 16-22).
Konformacja, Krzesekowa"
Konformaoja .(Maczkowa" Ryc. 16-22. Konformacje stereo izomerw.
W steroidach naturalnych wszystkie piercienie wystpuj waciwie w formie krzesekowej, ktra jest bardziej stabiln konformacj. Poszczeglne piercienie mog znajdowa si wzgldem siebie w konformacji cis lub trans (ryc. 16-23).
Byc. 16-23. Siereochemta steroidw: (A) konfiguracja trans midzy wszystkimi ssiadujcymi pier cieniami; (B) konfiguracja cis midzy piercieniami A i B.
W naturalnych steroidach sposb poczenia piercieni A i B moe by cis lub trans, natomiast midzy B i C jest trans, a poczenie CjD jest trans, z wyjtkiem glikozydw nasercowych i jadw wydzielanych przez ropuchy. Wizania utrzymujce podstawniki nad paszczyzn piercieni przedstawia si lini cig (p1), natomiast wizania czce grupy znajdujce si pod paszczyzn piercieni lini przerywan (a). W steroidzie "5a, piercie A przyjmuje zawsze konformacj trans wzgldem piercienia B, natomiast w steroidzie 5P zawsze cis. Grupy metylowe, przyczone do atomw wgla Ci0 i Cu, s niezmiennie w konfiguracji p. Cholesterol jest istotnym skadnikiem wielu tkanek Cholesterol jest szeroko rozpowszechniony we wszystkich komrkach organizmu, a zwaszcza w tkance nerwowej. Jest jednym z waniejszych skadnikw bon plazmatycznych i lipo-protein surowicy krwi. Wystpuje zwykle w poczeniu z kwasami tuszczowymi jako ester cholesterolu. Jest w tuszczach zwierzcych, lecz nie ma go w tuszczach rolinnych. 3-Hydroksy--5,6-cholesten (ryc. 16-24) to nazwa systematyczna cholesterolu. Ergosterol jest prekursorem witaminy D Ergosterol wystpuje w rolinach i drodach i jest wanym prekursorem witaminy D (ryc. 16-25). Nawietlanie promieniami nadfioletowymi powoduje otwarcie piercienia B (p. ryc. 54-6) w wyniku czego zwizek nabywa waciwoci przeciwkrzywiczych.
Ryc. 16-24. Cholesterol.
HORyc. 16-25. Ergosterol
Koprosterol znajduje si w kale Koprosterol (koprostanol) powstaje w jelicie w wyniku bakteryjnej redukcji podwjnego wizania CsC6 cholesterolu i jest wydalany w kale. Prekursorem poliprenoidw i cholesterolu jest ten sam zwizek Poliprenoidy, chocia nie s steroidami, s im pokrewne (p. ryc. 28-3), poniewa s syntetyzowane, podobnie jak cholesterol (ryc. 16-26),
184 / ROZDZIA 16 C H 3 -CH=C-CH=CHRyc. 16-26. Jednostka izoprenowa.
z 5-wcglowej jednostki izoprenowej. Naley do nich ubichinon (p.str. 149), skadnik mitochon-drialnego acucha oddechowego, oraz dugo-acuchowy alkohol dolichol (ryc. 16-27), ktry
,OH
Peroksydacja (autooksydacja) lipidw nara onych na dziaanie tlenu jest przyczyn nie tylko psucia si ywnoci (jeczenie), lecz take uszkodzenia tkanek in vivo, ktre z kolei moe by przyczyn odczynw zapalnych, nowotworw, miadycy, starzenia si itp. Szkodliwe dziaania s inicjowane przez wolne rodniki (ROO*, RO*, OH*) powstajce podczas tworzenia nadtlenkw kwasw tuszczowych, zawierajcych wizania podwjne oddzielone grup metylenow, a wic takie jak te, ktre znajduj si w naturalnych wielo nienasyconych kwasach tuszczowych (ryc. 16-28). Peroksydacja lipidw jest procesem lawinowym, zapewniajcym cig dostaw wolnych rodnikw, ktre ini cjuj nastpne reakcje peroksydacji. Peny proces moe by zapisany nastpujco:
1. Inicjacja peroksydacji lipidw. Wytwarzanie R' z prekursora. ROOH + metal<>+
PEROKSYDACJA LIPIDW JEST RDEM WOLNYCH RODNIKW IN VIVO
Ryc. 16-27. Dolichol alkohol C95,
uczestniczy w syntezie glikoprotein, przenoszc reszty oligosacharydowe na reszty asparaginy acucha poiipeptyd owego (p. rozdz. 57). Grupa rolinnych izoprenoidw obejmuje kauczuk, kamfor, rozpuszczalne w tuszczach witaminy A, D, E i K oraz P-karoten (prowitamin A).
X'+ RH-R* +XH

Rozprzestrzenianie peroksydacji lipidw:
ROO'+ RH-ROOH+ R\ ttd.
+RH H Endonad tlenek WodoronadUenek ROOH Aldehyd malonowy
Ryc. 16-28. Peroksydacja tipidw. Reakcje inicjuje wiato lub jony metali. Aldehyd matonowy powstaje tylko z kwasw tuszczowych majcych 3 lub wicej wiza podwjnych. Miar peroksydacji lipidw jest ilo powstajcego aldehydu malonowego oraz etanu lub pentanu powstajcych odpowiednio z 2 ko cowych wgli kwasw u3-tuszcz owych lub z kocowych 5-wgli kwasw a>6-tuszczowych.
LIPIDY O ZNACZENIU FIZJOLOGICZNYM / 185 3. Zakoczenie: ROCT+ ROO->ROOR+ O, ROCT+ R' .ROOR R*+ R'^RR
Poniewa molekularnym prekursorem dla inicjacji procesu jest zazwyczaj wodoronad-tlenek ROOH, peroksydacja lipidw jest rozgazionym procesem acuchowym z poten cjalnymi skutkami niszczycielskimi. W celu kontroli i ograniczenia peroksydacji lipidw zarwno ludzie, jak i natura uywaj zwizkw przeciwutleniajcych. Propyiogalusan, butylo-wany hydroksyanizol (BHA) i butylowany hyd-roksytoluen (BHT) s przeciwutleniaczami uywanymi jako dodatki (rodki konserwujce) do ywnoci. Naturalnie wystpujcymi przeciwutleniaczami s witamina E (tokoferol), ktra jest rozpuszczalna w lipidach, oraz moczan i wita mina C, ktre s rozpuszczalne w wodzie. p-Karoten wykazuje waciwoci przeciwutle-niacza przy maym pOz. Przeciwutleniacze dziel si na 2 klasy: 1) przeciwutleniacze zapobiegajce, ktre zmniejszaj szybko inicjacji peroksydacji i 2) przeciwutleniacze przerywajce proces lawinowy, ktre utrudniaj rozprzestrzenianie peroksydacji. Przeciwutleniacze zapobiegajce obejmuj katalaz i inne peroksydazy, ktre reaguj z ROOH, oraz zwizki chelatujce jony metali, takie jak DTPA (dietylenotriaminopentaoctan) i EDTA (etylenodiaminotetraoctan). Przeciwutleniacze przerywajce rozprzestrzenianie peroksydacji s czsto fenolami lub aminami aromatycznymi. In vivo gwnymi przeciwutleniaczami przerywajcymi rozprzestrzenianie s: dysmutaza ponadtlenkowa (p, str. 146), ktra dziaa w fazie wodnej, wychwytujc wolne rodniki ponadtknkowe (Oi*), by moe mo czan oraz witamina E, ktra dziaa w fazie tipidowej, wychwytujc rodniki ROO*. Peroksydacja jest katalizowana in vivo rwnie przez zwizki hemowe i przez lipooksygena-zy znajdujce si w pytkach krwi i leukocytach, itp.
dzieiania i identyfikacji lipidw oparte na klasycznych procedurach chemicznych, takich jak krystalizacja, destylacja i ekstrakcja rozpuszczalnikiem. Szczeglnie uyteczna do rozdziau rnych klas lipidw jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC), a do rozdziau poszczeglnych kwasw tuszczowych chromatografia gazowo-cieczowa (GLC; ryc. 16-29). Przed uyciem tych technik lipidy ekstrahuje si z tkanek nieodwodnionych ukadem rozpuszczalnikw, opartym zwykle na mieszaninie chloroformu z metanolem (2:1).
Detektor
Gaz
PrbKa
Rajestrator krelcy Ryc. 16-29. Schemat chromatografu gazowo--cieczowego. Po prawej stronie ryciny przedstawiono chromatogram rozdziau cHugoacucho-wych kwasw tuszczowych (jako estrw metylowych).
DO ROZDZIAU I IDENTYFIKACJI LIPIDW W MATERIALE BIOLOGICZNYM UYWA SI METOD CHROMATOGRAFICZNYCH
Obecnie metody chromatograficzne coraz czciej wypieraj z uycia starsze metody roz-
Chromatografia gazowo-cieczowa polega na fizycznym rozdziale ruchomej fazy gazowej przez adsorpcj na fazie stacjonarnej, zawierajcej obojtne ciao stae, takie jak el krzemionkowy lub obojtne ziarna glinki ogniotrwaej pokrytej nielotn ciecz (np. smarem lub olejem silikonowym). W praktyce szklan lub metalow kolumn napenia si nieczynnym ciaem staym, a mieszanin metylowych estrw kwasw tuszczowych odparowuje si na jednym kocu kolumny, ktra na caej swej dugoci nia temp. 170225C(ryc. 16-29). Stale przepywajcy strumie gazu obojtnego, np, argon lub hel, powoduje przesuwanie si lotnych estrw wewntrz kolumny. Podobnie jak w przypadku innych rodzajw chromatografu, rozdzia parujcych estrw kwasw tuszczowych zaley od rnic powinowactwa skadnikw mieszaniny
186 / ROZDZIA 16
gazowej do fazy stacjonarnej. Ga2y silniej przycigane przez faz stacjonarn wolniej przesuwaj si w kolumnie i dlatego znajd si na kocu kolumny pniej od gazw przyciga nych stosunkowo sabiej. Poszczeglne estry kwasw tuszczowych, wydostajce si z kolumny, wykrywa si metodami fizycznymi lub chemicznymi i zapisuje automatycznie w postaci pikw ukazujcych si w rnym czasie w zalenoci od siy, z jak poszczeglne estry kwasw tuszczowych s zatrzymywane przez faz stacjonarn (ryc. 16-29). Powierzchnia pod ka dym pikiem jest proporcjonalna do stenia poszczeglnego skadnika mieszaniny. Identyfikacj kadego skadnika przeprowadza si przez porwnanie z wzorcowym chiomatogra-mem standardowej mieszaniny o znanym skadzie. Na drodze strumienia gazu mona umieci, oprcz detektora masy, rwnie detektor mierzcy radioaktywno. W ten sposb mona zmierzy swoist radioaktywno kadego wydzielonego skadnika. Zalet chromatografii gazwo-cieczowej jest jej niezwyka czuo, ktra pozwala uywa bardzo maych iloci mieszaniny do rozdziau, a take to, e kolumny chromatograficzne mog by uywane wielokrotnie. Za pomoc tej techniki wykazano w tuszczach naturalnych obecno wielu dotychczas niewykrytych rnych kwasw tuszczowych. przeprowadza si na pytkach szklanych pokrytych cienk warstw adsorbentu, zwykle elu krzemionkowego. Po osuszeniu adsorbentu, pytki ogrzewa si w cieplarce w standar dowej temperaturze przez standardowy czas. Po ozibieniu na aktywowan" pytk nakrapia si mieszanin lipidw rozpuszczonych we waciwym rozpuszczalniku. Po odparowaniu rozpuszczalnika brzeg pytki, najbliszy miejsca naniesienia prbki, zanurza si w odpowiedniej mieszaninie rozpuszczalnikw i pozostawia w zamknitym naczyniu do czasu, a czoo rozpuszczalnika znajdzie si blisko grnego brzegu pytki. Pytk osusza si i miejsce rozdzielonych substancji ustala si przez zwglenie" (spryskujc powierzchni pytki kwasem siarkowym, a nastpnie ogrzewajc) lub przez fiuorescencj (z dichlorofluorescein), albo po reakcji z parami jodu (ryc. 16-30).
Chromatografi cienko warstwow (TLC)
Estry cholesterolu
Czoo rozpuszczalnika
Trlacylogllcerole
m
ii
5P
Kwasy HUSZCZOWB (wolne)
Cholesterol 1,3-DlacyloQllcwole 1,2-DlacyloBH08role Monoacytogjlcerole Fosfo lipidy
Miejsce naniesienia
Ryc. 16-30. Rozdzia gwnych klas lipidw przy uyciu chromatografii cienkowarstwowej. Waciwym ukadem rozpuszczalnikw dla powyszego rozdziau bya mieszanina heksan : eter etylowy : kwas mrwkowy w stosunku objtociowym 80:20:2.
AMFIPAT YCZNE LIPIDY SAMOORIENTUJ SI NA GRANICY OLEJ : WODA Tworz one bony, micele, liposomy i emulsje Lipidy s na og nierozpuszczalne w wodzie, gdy przewaaj w ich czsteczkach grupy nie-polarne (wglowodory). Jednake kwasy tuszczowe, fosfolipidy, sfingolipidy, kwasy ciowe i, w mniejszym stopniu, cholesterol zawieraj grupy polarne. Dlatego cz czsteczki jest hydrofobowa, czyli nierozpuszczalna w wodzie, a inna cz jest hydrnfilowa, czyli rozpuszczalna w wodzie. Tego rodzaju czsteczki okrela si jako amtlpatyczne (ryc. 16-31). Ustawiaj si one na granicy faz woda: olej w ten sposb, e ich grupy polarne
znajduj si w fazie wodnej, a niepolarne w fazie olejowej. Uwaa si, e podstawow struktur
bon biologicznych jest podwjna warstwa takich polarnych lipidw (p. rozdz. 42). Lipidy polarne znajdujce si w rodowisku wodnym w steniu krytycznym tworz micele. Przyczanie si soli kwasw ciowych do miceli i liposom w i tworzenie miceli mieszanych z produktami trawienia tuszczu
LIPIDY O ZNA CZENiU FIZJOLOGICZNYM / 187

LIPID AMFIPATYCZNY A
Grupy polarne, czyli hydrofitowa

Grupy nie polarna, czyli hydrofobowe
Faza wodna
Faza wodna
OOOOOO
L1POSOM (JEDNOWARSTWOWY) .Olej*, czyli laza nlepoarna E
Faza wodna
uouuoo
Faza wodna PODWJNA WAHSTWA LIPIDOWA EMULSJA OLEJU W WOOZIE D
Faza nie po I ar na
Fala wodna
Przedzi a wodny
Podwjna warstwa llpldowa
LiPOSOM (WIELOWARSTWOWY)
Ryc . 16 -31 . P ow st aw ani e b on li pi dow ych, mi celi, em ul sji i li posom w z li pi dw am ft pat ycznych, np. fosf oli pi dw. _____________________________________
uatwia wchanianie lipidw z jelita. Liposomy mona otrzyma dziaajc ultradwikami na amfipatyczne lipidy w rodowisku wodnym. Liposomy s utworzone z podwjnej warstwy lipidowej, otaczajcej cz rodowiska wodnego. Potencjalnie, zwaszcza gdy poczy si je ze swoistymi tkankowo przeciwciaami, mog by one uyteczne klinicznie jako przenoniki lekw w krwiobiegu, trafiajc do odpowiednich narzdw. Emulsje s czstkami duo wikszymi, powstajcymi zwykle z lipidw niepolar-nych znajdujcych si w rodowisku wodnym. S one stabilizowane przez rodki emulgujce, takie jak lipidy polarne (np. lecytyna), ktre tworz warstw powierzchniow oddzielajc gwn mas fazy niepolarnej od fazy wodnej (ryc. 16-31).
PIMIENNICTWO
Christie WW: LipidAnalysis. 2nd ed. Pergamon Press, 1982. Cotgreave 1A et al: Host biochemical defence mechanisms against prooxidants. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1988;28:189. Frankel EN: Chemistry of free radical and singlet oxidation of lipids. Prg Lipid Res 1985;23:197. Gunscone FD, Harwood JL, Padley FB: The Lipid Handbook. Chapraan & Hali, 1986. Gurr AI, James AT: Lipid Biochemistry: An Introduclion. 3rd ed. Wiiey, 1980. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phospholipids, Elsevier, 1982. Johnson AR, Davenport JB: Biochemistry and Methodoogy of Lipids. Wiley, 1971. Vance DE, Vance JE {editors}: Biochemistry of Lipids and Membranes. Benjamin/Cummings, 1985.
17
WPROWADZENIE
Losy skadnikw diety po strawieniu i absorpcji skadaj si na przemiany porednie. Stanowi wic one szerok dziedzin, ktra usiuje nie tylko opisa szlaki metaboliczne indywidualnych czsteczek, lecz take prbuje zrozumie wspzalenoci midzy nimi oraz mechanizmy, ktre reguluj przepyw metabolitw przez te szlaki. Szlaki metaboliczne dzieli si na 3 kategorie (ryc. 17-1): 1. Szlaki anaboliczne prowadzce syntezy zwizkw tworzcych struktur ciaa i warsztat metaboliczny. Takim szlakiem
Zarys przemian porednich

jest synteza biaek. Energia swobodna, nap dzajca te procesy, pochodzi z drugiej kategorii szlakw. 2. Szlaki kataboliczne dotycz procesw oksydacyjnych, ktre uwalniaj energi swobodn zwykle w postaci fosforanu bogato-energetycznego lub rwnowanikw redukujcych, np. acuch oddechowy i fosforylacja oksydacyjna. 3. Szlaki amfiboliczne maj wicej ni jedn funkcj i biegn na skrzyowaniu drg" metabolicznych, dziaajc jako czniki midzy cigami anabolicznymi i katabo licznym, np. cykl kwasu cytrynowego.
Biaka,
wglowodany, lipidy, kwasy nukleinowe Itp.
Czsteczki Trawienie pokarmu
Czsteczki prostsze
Wchanianie
Szlaki amfl bo Heine
Inne procesy endoerglczne
Ryc. 17-1.3 gwne kategorie szlakw meta bo licznych. Szlaki kataboliczne uwalniaj energi swobodn w formie rwnowanikw redukujcych (2H) lub fosforanu bogBioenergetyczn ego (~ P). ta warunkuje przebieg szlakw a na bo licznych. Szlaki amfiboliczne jako czniki midzy szlakami 2 pozostaych kategorii.
Energia dziaaj
ZARYS PRZEMIAN POREDNICH / 189
Znajomo metabolizmu zdrowego zwierzcia jest warunkiem wstpnym do penego zrozumienia wielu stanw chorobowych. Prawidowa przemiana obejmuje zmiany metabolizmu i jego adaptacj w okresach godzenia, wysiku, ciy i laktacji. Zaburzenia metabolizmu mog by wynikiem np. niedoborw ywieniowych, braku enzymu lub nieprawidowego wydzielania hormonu. Wanym przykadem choroby,
wynikajcej z nieprawidowego metabolizmu (choroby metaboliczne), jest cukrzyca.
PODSTAWOWE SZLAKI METABOLICZNE PRZETWARZAJ GWNE PRODUKTY TRAWIENIA

Podstawowy typ metabolizmu w tkankach jest warunkowany rodzajem diety. Ssaki, takie jak czowiek, musz przetwarza wchaniane w przewodzie pokarmowym produkty trawie-
Pokarmy
Glukoza
Glikogen 3CO,
Gl u kozotosfora ny Cykl pentnzof osf oran owy
s
(3
-------- ' Acytoglteerol Trlozofosforany Mleczan
^ ------- - Rybozofosforan
Kwasy tuszczowe Cholesterol
Plrogronian.
Ryc. 17-2. Oglny schemat metabolizmu wglowodanw i jego gwne produkty kocowe.
190 / ROZDZIA 17
Trlacyloglicerol (tuszcz) Steroidy Cholesterol Cti oieslerologeneza Ketogeneza Pokarmy
Zwizki ketonowe
Ryc. 17-3. Oglny schemat metabo lizmu kwasw tuszczo wych i jego gwne pro dukty ko co we. Zwizki ketonowe to acetooctan, 3- hydroksymalan aceton
Biaka pokarmw
Biaka tkankowe
Aminokwasy TFWNSAMINACJA
Nisbialkowe pochodne azotowe
2CO,
Ryc. 17-4. Oglny schemat przemiany aminokwasw i jej gwne produkty ko co we.
nia pokarmw wglowodanw, lipidw i biaek. Gwnie s to (odpowiednio): glukoza, kwasy tuszczowe z glicerolem oraz aminokwasy. U przeuwaczy (i w mniejszym stopniu u innych trawoernych) bonnik diety ulega trawieniu przez symbiotyczne mikroorganizmy do niszych kwasw tuszczowych (octowego, propionowego, masowego), a tkanki tych zwierzt s przygotowane metabolicznie do zuycia niszych kwasw tuszczowych jako zasadniczych substratw. Wszystkie produkty trawie nia s przetwarzane we waciwych szlakach metabolicznych do wsplnego produktu ace-tylo-CoA, ktry ulega nastpnie cakowitemu utlenieniu w cyklu kwasu cytrynowego (p. ryc. 14-1 oraz 17-2, 17-3 i 17-4). Metabolizm wglowodanw dotyczy gwnie glukozy (p. ryc. 17-2) Glukoza jest metabolizowana we wszystkich komrkach ssakw w procesie glikolizy do pirogronianu i mleczanu. Aby wej do tego szlaku glukoza musi ulec fosforylacji. Glikoliza moe przebiega w nieobecnoci tlenu (anaero-bowo), ale kocowym produktem jest wtedy tylko mleczan. Tkanki, ktre mog zuywa tlen (aerobowe), s zdolne do metabolizowania pirogronianu do acetylo-CoA, ktry z kolei moe 'wej do cyklu kwasu cytrynowego, ulegajc cakowitemu utlenieniu do CO 3 i H2 O z uwolnieniem znacznej iloci energii swobodnej, wykorzystanej do syntezy ATP w procesie zwanym fosforylacj oksydacyjn (p. ryc. 18-2). Glukoza jest wic gwn czsteczk energetyczn wielu tkanek. Uczestniczy ona (i pewne jej metabolity) rwnie w innych procesach, a mianowicie: i. W przemianie do jej zapasowego polimeru glikogenu, zwaszcza w miniach szkieletowych i w wtrobie. 2. W cyklu pen-tozofosforano wy III, ktry bierze pocztek od metabolitu poredniego glikolizy. Cykl jest dostawc rwnowanikw redukujcych (2H) do biosyntezy np. kwasw tuszczowych oraz jest rdem rybozy koniecznej w procesach syntez nukleotydw i kwasw nukleinowych. 3. Fosfotriozy uczestnicz w tworzeniu glicerolo-wej czci acylogliceroli (tuszczu). 4. Pirogro-nian i metabolity porednie cyklu kwasu cytrynowego dostarczaj szkieletw wglowych do syntezy aminokwasw, a acetylo-CoA jest jednostk budujc dugoaricuchowe kwasy tuszczowe i cholesterol bdcy z kolei prekursorem wszystkich steroidw syntetyzowanych w organizmie.
Metabolizm lipidw dotyczy gwnie kwasw tuszczowych i cholesterolu (p,ryc.17-3) rdem dlugoacuchowych kwasw tuszczowych jest albo synteza de novo z acetylo-CoA pochodzcego z przemiany wglowodanw, albo lipidy z pokarmw. W tkankach kwasy tuszczowe mog zosta utlenione do acetylo--CoA (fi-oksydacja) lub ulec estryfikacji do acylogliceroli, ktre w postaci triacylogliceroli (tuszcz) stanowi gwn rezerw energetyczn organizmu, Acetylo-CoA, wytwarzany w procesie j-oksydacji, ma kilka wanych przeznacze: 1. Tak jak w przypadku acetylo-CoA po chodzcego z przemiany wglowodanw, ulega
ca kowitemu utlenieniu do CO2 i H2 O w cyklu
kwasu cytrynowego. Kwasy tuszczowe s bar dzo wydajnym tkankowym rdem energetycz nym, dostarczajc znacznych iloci energii zar wno w procesie p-oksydacji, jak i w cyklu kwasu cytrynowego. 2. S one rdem atomw wgla dla chole sterolu i innych steroidw. 3. W wtrobie jest z nich wytwarzany acetooctan, macierzysty zwizek ketonowy*. Zwi zki ketonowe rozpuszczalne w wodzie s alter natywnym paliwem tkankowym, ktre w pew nych warunkach (np. w godzeniu) staje si wanym rdem energii. Metabolizm wikszoci aminokwasw wymaga transaminacji (p. ryc. 17-4) Aminokwasy s konieczne do biosyntezy biaka. Niektre z nich musz by obowizko wo doprowadzone z poywieniem (aminokwasy niezbdne lub egzogenne), poniewa tkanki s niezdolne do ich syntezy. Pozostae, czyli aminokwasy endogenne, s rwnie dostarczane z pokarmem, ale mog by take wytwarzane w organizmie z wglowych zwizkw porednich w procesie transaminacji, wykorzystujcym azot aminowy z wystpujcych w nadmiarze innych aminokwasw. Po deaminacji aminokwasw nadmiar azotu aminowego jest usuwany jako
* Jako zwizki ketonowe naley rozumie nie tylko zwizki zawierajce grup ketonow (acetooctan, aceton), lecz take P-hydroksymalan. W tyrn sensie okrelenie zwizki ketonowe" pokrywa si z treci okrelenia angielskiego ketonc bodies" ciaa ketonowe (przyp, wyd.).
192 / ROZDZIA 17
mocznik. Szkielety wglowe powstajce w wyniku transaminacji s: 1) utleniane do COi w cyklu kwasu cytrynowego, 2) wykorzystane do syntezy glukozy (glukoneogeneza) lub 3) ulegaj przemianie w zwizki ketonowe. Poza niezbdnym udziaem w syntezie biaka, aminokwasy s rwnie prekursorami wielu innych wanych zwizkw, np. puryn, pirymi-dyn i hormonw, takich jak adrenalina lub tyroksyna. Szlaki metaboliczne mog by badane na rnych poziomach organizacji Dotd patrzylimy na metabolizm zachodzcy w caym organizmie. Umiejscowienie szlakw metabolicznych i ich integracj ustala si za pomoc bada na niszych poziomach organizacji, a mianowicie: 1. Na poziomie tkanki i narzdu okrela si rodzaj substratw wchodzcych i metabolitw opuszczajcych tkanki lub narzdy i podaje oglny opis ich przemian. 2. Na poziomie subkomrkowym kada struktura subkomrkowa (np. mito-chondrium) lub kompartment komrki (np. cytozol) peni swoiste funkcje biochemiczne.
ktre tworz cz subkomrkowego zestawu szlakw metabolicznych. Krenie krwi integruje metabolizm na poziomie tkanki i narzdu Aminokwasy powstajce w procesie trawienia biaek pokarmowych oraz glukoza powstajca w wyniku trawienia wglowodanw s wchaniane z jelita do krwi yy wrotnej wtroby. To gwarantuje, e zarwno te metabolity jak i inne rozpuszczalne w wodzie produkty trawienia s pocztkowo kierowane do wtroby (ryc. 17-5). Podstawow funkcj metaboliczn wtroby jest regulowanie stenia wikszoci metabolitw we krwi, zwaszcza glukozy i aminokwasw. W przypadku glukozy odbywa si to przez wychwytywanie nadmiaru glukozy i przeksztacanie jej w glikogen (gUkogenogeneza) lub w tuszcz (lipogencza). Pomidzy posikami, w celu uzupenienia stenia glukozy we krwi, wtroba uwalniaj ze zmagazynowanego gliko-genu (glikogenoliza) lub, wraz z nerk, przeksztaca metabolity niecukrowe, takie jak mleczan, glicerol i aminokwasy, w glukoz (glukoneogeneza). Utrzymanie waciwego stenia
anina itn. '#. \'.''. ^
fosforan o^yk.-j
Sllkogen ^Sll koW///
S^
JELITO CIENKIE
Ryc. 17-S. Transport i los gwnych substratw i metabolitw w glowodanowych i amtnofcwasowych. Uwaga: w miniu wolna glukoza wystpuje w niewielkich steniach, poniewa po wnikniciu do komrki ulega natychmiast fosforylacji. ____ ___
ZARYS PRZEMIA N P OREDNICH / 193
glukozy we krwi jest konieczne ze wzgldu na pewne tkanki (np. mzg lub erytrocyty), dla ktrych jest ona obligatoryjnym rdem ener gii. Do zada wtroby naley rwnie syntetyzowanie gwnych biaek osocza krwi (np. albuminy) oraz deaminatja aminokwasw bdcych w nadmiarze, i zwizane z tym tworzenie mocznika. Ten ostatni jest transportowany z krwi do nerek i wydalany. Minie szkieletowe uywaj glukozy jako paliwa, wytwarzajc z niej mleczan i CO2. Magazynuj glikogen z przeznaczeniem na rdo energii do skurczu minia oraz syntetyzuj biaka miniowe z aminokwasw osocza. Minie stanowi ok. 50% masy ciaa, przeto reprezentuj znaczny zapas biaek, ktry moe by wykorzystany do zaopatrzenia osocza w aminokwasy, zwaszcza przy niedoborach pokarmowych. Z lipidw (ryc. 17-6) po strawieniu powstaj monoacyloglicerole i kwasy tuszczowe. W komrkach jelitowych zachodzi resynteza lipidw, ktre po poczeniu z biakiem s wydzielane w formie lipoprotein, znanych jako ehylomik-rony, pocztkowo do ukadu chonnego, a na-
stpnie do krwiobiegu. Wszystkie rozpuszczalne w lipidach hydrofobowe produkty trawienia (np. cholesterol), wchodz w skad lipoprotein, co uatwia ich transportowanie miedzy tkankami w rodowisku wodnym osoczu. Triacy-loglicerol chylomikronw, w odrnieniu od glukozy i aminokwasw, nie jest wychwytywany przez wtrob. Jest on metabolizowany przez tkanki pozawtrobowe przy udziale Kpazy lipo-proteinowej, ktra hydrolizuje triacyloglicerol, uwalniajc kwasy tuszczowe, ktre s nastp nie wbudowywane do lipidw tkankowych lub utleniane jako rdo energii. Innym wanym rdem dugoacuchowych kwasw tuszczowych jest synteza (lipogeneza) z wglowodanw, gwnie w tkance tuszczowej i w wtrobie. Triacyloglicerol tkanki tuszczowej stanowi zasadnicz rezerw energetyczn w organizmie. W nastpstwie jego hydrolizy (lipolizy) kwasy tuszczowe s uwalniane do krwiobiegu jako woine kwasy tuszczowe. S one wychwytywane przez wikszo tkanek (ale nie przez mzg i erytrocyty) i estryfikowane do acylogliceroli lub utleniane, jako gwne rdo energetyczne do CO2 i HÔ. W wtrobie zachodz 2 szlaki
JELITO CIENKIE
Ryc. 17- 8. Transport i losy gwnych substratw i metabo litw liptdowych: WKT wo lne kwasy
Glukoza
Kwasy ^tuszczowe
MG mo no acyloglicero l, lipoproteiny o bardzo malej gstoci.

13 Biochemia
TG
tuszczo we, LP L lipaza lipo proteino wa, triacylo glicero l, V LDL ______________
194 / ROZDZIA 17
o dodatkowym znaczeniu: 1. Nadwyka triacy-loglicerolu, bdca zarwno wynikiem lipoge-nezy, jak i poday wolnych kwasw tuszczowych, jest wydzielana do krwiobiegu w postaci Kpoprotein o bardzo maej gstoci (VLDL: ang. very Iow density lipoprotein). Ten triacylo-glicerol ulega przemianom podobnym do tych z chylomikronw. 2. Czciowe utlenianie wolnych kwasw thiszczowych pozwala wytwarza zwizki ketonowe (ketogeneza). Zwizki ketonowe s transportowane do tkanek pozawl-robowych, gdzie s wykorzystywane jako inne wane rdo energii.
Na poziomie subkomrkowym: gltkoliza przebiega w cytozolu, a cykl kwasu cytrynowego w mitochondriach Gwne funkcje biochemiczne skadnikw subkomrkowych i organelli komrki przedstawiono w tab. 2-4. Jednake, wikszo komrek jest podporzdkowana wyspecjalizowanym funkcjom rnych tkanek i zmierza do uwydatnienia pewnych szlakw metabolicznych i ograniczenia innych. Rycina 17-7 ilustruje zasadnicze szlaki metaboliczne, ze specjalnym uwzgldnieniem umiejscowienia we-
CYTOZOL Gtikogen
AA
, Biako / J ^ybosom Cykl per loof ostoranowy / .:-.Siateczka.-\rd p I azm a tyczn a /
Glicerofosforan \ G ii cero I
Triacytogliceral
Kwasy tuszczowa
Ryc. 17-7. Wewntrzkomrkowe umiejscowienie i integracja gjwnych szlakw metabolicznych w

Fosfoenolopirogronian Meczan
\ wtrobowej komrce miszowej. AA -> przemiana jednego wicej aminokwasw
T
Pirogronian
lub
Szczawiooctan
Acetyio-CoA
Fumaran
AA
Cytrynian
Sukcynylo-CoA
a-Ketoglutaran
AA
egzogennych, AA *+ przemiana jednego lub wicej aminokwasw endogennych.
M1TOCHONDRIUM
ZARYS PRZEMIAN POREDNICH / 19S
wntrzkomrkowego oraz ich integracj w wtrobowej komrce miszowej. Wyranie widoczna jest centralna rola mito-chondrium. Jest on siedliskiem krzyujcych si torw metabolicznych wglowodanw, lipidw i aminokwasw. Mieszcz si w nim m.in. enzymy cyklu kwasu cytrynowego, acucha oddechowego z syntaz ATP, P-oksydacji kwasw tuszczowych i ketogenezy. Dodatkowo jest on punktem zbiorczym dla powstajcych pod czas transaminacji szkieletw wglowych ami nokwasw przekazywanych nastpnie do procesu syntezy aminokwasw endogennych. W cytozolu zachodz: glikohza, cykl pen-tozo fosforan owy i synteza kwasw tuszczowych. Naley podkreli, e w glukoneogenezie nawet substancje, ktre s wytwarzane w cytozolu, takie jak mleczan i pirogroniatt, musz wej do mitochondrium, aby ulec przemianie w szcza wio octan, nim zostan przeksztacone w glukoz. Bony siateczki rdplazmatycznej zawieraj ukad enzymatyczny katalizujcy biosyntez acylogliceroli. Rybosomy z kolei s miejscem syntezy biaka. Naley zda sobie spraw, e transport metabolitw o rnej wielkoci, adunku i rozpuszczalnoci przez bony oddzielajce struktury subkemrkowe wymaga zoonych mechanizmw. Niektre z nich przedstawiono przy opisie bony mitochondrialnej (p. rozdz. 14), a pozostae w nastpnych rozdziaach. PRZEPYW METABOLITW W SZLAKACH METABOLICZNYCH MUSI BY REGULOWANY W SPOSB ZHARMONIZOWANY Regulacja cakowitego przepywu metabolitw przez szlak metaboliczny sprowadza si czsto do kontroli tylko jednej lub prawdopo dobnie dwch kluczowych reakcji cigu, katalizowanych przez enzymy regulatorowe". Najwaniejsze w kontroli cakowitej szybkoci szlaku metabolicznego s czynniki fizykochemiczne kontrolujce szybko reakcji enzymatycznej, np. stenie substratu (p. rozdz. 10). Natomiast temperatura i pH, czynniki, ktre mog wpywa na aktywno enzymatyczn, maj niewielkie znaczenie regulacyjne u krgowcw staocieplnych ze wzgldu na sta warto tych parametrw. (Jednak naley zwrci uwag na zmiany pH w przewodzie pokarmowym i ich wpyw na trawienie [p. rozdz. 56]).
Reakcje, ktre zachodz w stanie nierwnowagi nadaj kierunek szlakom metabolicznym i s potencjalnymi punktami ich kontroli W reakcji zachodzcej w stanie rwnowagi szybkoci reakcji w obydwu kierunkach s jednakowe i dlatego nie obserwuje si adnego przepywu w jakimkolwiek kierunku. Wiele reakcji w szlakach metabolicznych jest reakcjami rwnowagi":
A B * C <. D
In vivo, w warunkach stanu stacjonarnego (ang. steady state), prawdopodobnie przepyw netto bdzie zachodzi ze strony lewej na praw w przypadku cigego dostarczania A i cigego usuwania D. Taki szlak mgby funkcjonowa, ale kontrola przepywu przez regulacj aktywnoci enzymu nie byaby tu celowa, gdy zwikszenie aktywnoci suyoby tylko do przyspieszenia osignicia stanu rwnowagi. Zazwyczaj w szlaku metabolicznym jedna albo wicej reakcji zawsze jest w stanie nierwnowagi. W reakcjach tych stenia reagentw s dalekie od stanu rwnowagi, W wyniku denia do osignicia stanu rwnowagi powstaj due straty energii swobodnej, wydzielanej w postaci ciepa, ktra nie moe by ponownie wykorzystana. Powoduje to, e tego typu reakcja jest zasadniczo nieodwracalna, np.: Ciepo
Reakcja nierwnowagi
Taki szlak ma kierunek i zachodzi w nim przepyw metabolitw, ale przy braku kontroli szlak wyczerpuje si sam. Enzymy katalizujce reakcje w warunkach nierwnowagi wystpuj zwykle w mniejszych steniach i podlegaj innym mechanizmom kontroli. Przypomina to otwieranie i zamykanie jednokierunkowego" wentyla, stwarzajc moliwo kontroli przepywu netto. Reakcj powodujc przepyw jest ta pierwsza reakcja w cigu, ktra jest wysycona substratem Mona j zidentyfikowa jako reakcj nierwnowagi, w ktrej K^ enzymu jest znacznie mniejsza od fizjologicznego stenia substratu. Przykadem takiej reakcji powodujcej prze pyw jest pierwsza reakcja w glikolizie katalizowana przez heksokinaze (p. ryc. 19-2).
196 / ROZDZIA 17
MECHANIZMY ALLOSTERYCZNY I HORMONALNY MAJ DUE ZNACZENIE W METABOLICZNEJ KONTROLI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH
Na rycinie 17-8 przedstawiono hipotetyczny szlak metaboliczny A, B, C, D, w ktrym reakcje A <-> B i C - D zachodz w stanie rwnowagi, a B -* C jest reakcj nierwnowagi". Przepyw w tym szlaku moe by regulowany przez dostpno substratu A, a zaley od dostarczania go z krwi, co z kolei zaley od spoycia odpowiedniego pokarmu lub od pewnych kluczowych reakcji, ktre wytwarzaj i uwalniaj substraty do krwi. Przykadem tego s 2 reakcje powodujce przepyw jedna katalizowana przez fosforylaz w wtrobie (p. ryc. 20-1), ktra dostarcza giukoz do krwi, oraz druga, katalizowana przez lipaz wraliw na hormony (p. ryc. 27-8), ktra dostarcza
wolne kwasy tuszczowe. To zaley rwnie od zdolnoci substratu A do przenikania przez bon komrkow. Przepyw moe by rwnie warunkowany przez sprawno usuwania ko cowego produktu D i dostpno kosubstratu lub kofaktorw oznaczonych na rycinie jako Xi Y. Enzymy katalizujce reakcje nierwnowagi s czsto biakami allosterycznymi podiegajcy-mi kontroli przez efektory ailosteryczne szybko dziaajce przez sprzenie zwrotne (ang. feed--back) albo przez sprzenie ku przodowi (ang. feed-forward) (p. rozdz. 10). Czsto kocowy produkt szlaku biosyntezy hamuje aktywno enzymu katalizujcego pierwsz reakcj tego szlaku, np. dlugoacuchowe kwasy tuszczowe hamuj karboksylaz acetylo-CoA. Inne mechanizmy kontroli zale od dziaania hormonw reagujcych na potrzeby caego organizmu. S znane rne mechanizmy dziaania hormonw (p. rozdz. 44). Jednym z nich jest kowalenNieaktywny enzym,
Ca* /kalmod ulina-Bt ona komrkowa
0
[Enzym,]
(Y) cAMP
Aktywny Inhibicja ailosteryezna przez ujemne
Aktywacja ailosteryezna sprzenie zwrotne przez dodatnie sprzenie ku przodowi Ryb osom a I na biosynteza nowego biaka enzymatycznego lub
Jdrowa biosynteza
Indukcja mHNA Represja
Ryc. 17-8. Mechanizmy kontroli reakcji enzymatycznych. Liczby w kkach wskazuj moliwe miejsca dziaania hormonw. CDzmiany przepuszczalnoci bony, przemiana postaci nieaktywnej w posta aktywn enzymu, zmiana szybkoci translacji mRNA na poziomie rybosomu, indukcja biosyntezy mRNA. represja biosyntezy mRNA. ____________________________________

cyjna modyfikacja enzymu przez fosforylacj lub defosforylacj jego czsteczki. Jest ona szybka i
czsto zachodzi za porednictwem drugiego posaca cAMP, ktry z kolei powoduje przeksztacenie enzymu nieaktywnego w enzym aktywny. To przeksztacenie jest przeprowadzane albo przez kinaz biaek cAMP -zalen, ktra fosforyzuje enzym, lub przez swoist fosfataz, ktra defosforyluje enzym. Aktywn form enzymu moe by albo jego czsteczka ufosforylowana, jak w enzymach szlaku degradacji (np. fosforylaza a), albo czsteczka defosforylowana, jak w enzymach procesw syntez (np. glikogenowa syntaza a). Niektre enzymy regulatorowe mog by fosforylowane bez porednictwa cAMP i zalenej od cAMP kinazy biaek. Te enzymy reaguj na inne sygna y metaboliczne, takie jak stosunek [ATP]/[ADP] (np. dehydrogenaza pirogro-nianowa; ryc. 19-6) lub kinaza biaek kontrolowana przez Ca2+/kalmodulin (np. kinaza fosforylazy; p. ryc. 20-6). Synteza enzymw kontrolujcych szybko szlaku moe by regulowana hormonalnie. Poniewa dotyczy to syntezy nowego biaka, nie
jest to zmiana szybka, Jcz jest czst reakcj na zmian odywiania. Hormony mog dziaa jako induktory lub represory syntezy mRNA w jdrze komrkowym lub jako stymulatory translacji w procesie syntezy biaka na poziomie rybosomw (p. rozdz. 41 i 44). Znamienn cech, ktra uatwia kontrol metabolizmu, jest to, e szlak degradacji sub-stratu nie jest prostym odwrceniem syntezy. Zwykie w gr wchodz 2 cakowicie oddzielne cigi, z ktrych kady podlega oddzielnej regulacji, np. synteza i rozpad glikogenu (ryc. 20-1).
PIMIENNICTWO
Cohen P: Control ofEnzyme Actinty, 2nd ed. Chapman & Hal), 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Newsholme EA, Crabtree B: Flus-generating and regulatory steps in metabolic control. Trends Bio-
hm
Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism,
WiJey, 1973.
18
WPROWADZENIE
Cykl kwasu cytrynowego. Katabolizm acetylo-CoA

Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa, cykl kwasw trikarboksylowych) jest cigiem reakcji zachodzcych w mitochondriach, w wyniku ktrych reszty acetylowe ulegaj katabolizmowi z uwolnieniem rwnowanikw wodoro wych. Utlenieniu tych ostatnich towarzyszy uwolnienie przewaajcej czci energii swobo dnej zawartej w spalanych substratach. Reszty acetylowe wystpuj w formie acetylo-CoA (CH3-CO-S-CoA, aktywny octan), estru koen zymu A. Jednym ze skadnikw CoA jest wita mina ... kwas pantotenowy.
kowanych nieprawidowoci enzymw cyklu; tego typu nieprawidowoci s przypuszczalnie nie do pogodzenia z prawidowym rozwojem organizmu. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO DOSTARCZA SUBSTRATU DLA ACUCHA ODDECHOWEGO Istot cyklu jest poczenie czas teczki *acety-lo-Co z 4-wglowym dikarboksylowym kwasem szczawiooctowym; czego wynikiem jest powstanie 6-wglowego kwasu trikarboksy(owe go cytrynianu. Nastpuje po tym cig reakcji, w czasie ktrych odczaj si 2 czsteczki CO2 i odtwarza si szczawiooctan (ryc. 18-1). Szcza-wiooctan spenia tu waciwie funkcj katalitycz n, poniewa tylko niewielkie jego iloci s konieczne do uatwienia przemiany znacznej liczby jednostek acetylowych w CO2.
AoatykJ-CoA Co-A
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zasadnicza rola cyklu kwasu cytrynowego polega na dziaaniu jako wsplny szlak kocowy utleniania wglowodanw, lipidw i biaek. Wynika to z faktu, e glukoza, kwasy tuszczowe oraz niektre aminokwasy s tneta-bolizowane .do acetylo-CoA lub zwizkw po-.rednich cyklu. Cykl odgrywa rwnie istotn rol w jlukoneogenezie, tran sam i nacji, deami-nacji T lipogenezie. Chocia niektre z tych procesw zachodz w wielu tkankach, to jedynym narzdem, w ktrym wszystkie te procesy zachodz w znaczcym stopniu, jest wtroba. Stcfte uwidaczniaj si gbokie nastpstwa wwczas, gdy np. znaczna liczba komrek wtrobowych jest uszkodzonych lub zastpionych tkank czn, jak ma to miejsce w ostrym zapaleniu lub marskoci wtroby. Porednim dowodem, wiadczcym o yciowym znaczeniu cyklu kwasu cytrynowego, jest fakt, e u ludzi odkryto bardzo niewiele genetycznie uwarun-
Szczawiooctan
Cytrynian (CJ
Ryc. 18-1. Cykl kwasu cytryno wego. Katalityczna rola szczawiooctanu.
CYK L KWASU CYTRYNOWE GO / 199
Cykl kwasu cytrynowego jest integralni} czci procesu, w wyniku ktrego przewaajca cze energii swobodnej, uwalnianej podczas utleniania wglowodanw, lipidw i aminokwasw, staje si dostpna. W wyniku dziaania w cyklu swoistych dehydrogenaz podczas utleniania acetylo-CoA powstaj rwnowaniki re-
dukujce w postaci wodpru lub elektron w^Ta . rwnowaniki redukujce wchodz patem do acucha oddechowego, gdzie w procesie fps-forylacji oksydacyjnej s wytwarzane due iloci ATP <ryc. 18-2; p. rwnie rozdz. 14). Ten aerobowy proces wymaga tlenu, jako ostatecznego utleniacza rwnowanikw redukujcych.
Bursztynlan
NAD
2H
Sukcynylo-CoA lCA
Fosforylacja ' oksydacyjna
acuch i ----- ? txl<techowy Anaarobloza (htpoksja, anoksja) Wglowodany Flawoproteina Cytoctirom Fosforan bogat o energetyczny Ryc. 18-2. Cykl kwasu cytryno wego: g wny szlak katabo lizmu acetylo -CoA w organizmach aero bo wych. A cetylg- CoA, produkt katabolizmu wglo wodanw, biaek i lipidw, wcho dzi do cyklu.wraz z H2 O, ulegajc utlenieniu do O Z z jednoczesnym uwolnieniem rwno wanikw redukujcych (2H). Pniejsze utlenienie 2H w acuchu oddechowym jest sprzone z fosforylacj AD P do ATP. Kady obrt cyklu generuje 11 ~ pnez fosfory I a cjf oksydacyjn oraz 1. przez fosforylacj substratow (konwer sj sukcynylo -CoA do bursztynianu) J_________________________________________________________________________________________ Biaka Lipidy
200 / ROZDZIA 18
Std te brak (anoksja) lub czciowy niedobr (hipoksja) O2 jest przyczyn cakowitej lub czciowej inhibicji cyklu. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego znajduj sic~w macierzy mitochondrialnej albo w formie wolnej, albo przyczone do wewntrznej powierzchni wewntrznej bony mitochondrialnej, co uatwia przenoszenie rwnowanikw redukujcych na.odpowiednie enzymy acucha oddechowego, umiejscowionego rwnie w wewntrznej bonie mitochondrialnej. REAKCJE CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UWALNIAJ RWNOWANIKI REDUKUJCE I COa (p. ryc. 18-3) Enzym kondensujcy syntaza cy trynianowa katalizuje inicjujc cykl kondensacj acely-lo-CoA ze szczaswfloctnem* i powstanie cyt rynianu przez utworzenie" wizania w-giel-wgiel midzy atomem wgla grupy metylowej acety]o-CoA a atomem wgla grupy kar-bonylowej szczawiooctanu. Po reakcji kondensacji, w ktrej powstaje cytrylo-CoA, nastpuje jiyjlroliza wizania tioestrowego CoA poczona ze znaczn utrat energii swobodnej w po staci ciepa, co zapewnia przebieg reakcji do koca.
Acetylo-CoA+Szczawiooctan+H.,0 -> -> Cytrynian+ Co-A
Reakcja jest wraliwa na fluorooctan, ktry w formie fluoroacetylo-CoA kondensuje ze szczawiooctanem, tworzc fluorocytryman. Ten ostatni hamuje akonitaz, powodujc akumu lacj cytrynianu. Wyniki dowiadcze z uyciem zwizkw porednich znakowanych wglem lC wskazuj, e akonitaza reaguje z cytrynianem w sposb asymetryczny. Enzym zawsze dziaa na t cz czsteczki cytrynianu, ktra pochodzi ze szczawiooctanu. Fakt ten by zaskakujcy, poniewa kwas cytrynowy wydawa si by zwizkiem symetrycznym. Okazao si (gdy czsteczk rozpatruje si w 3 wymiarach), e 2 grupy CH2COOH nie s przestrzennie identyczne w odniesieniu do grup OH i COOH. Nastpstwa asymetrycznego dziaania akonitazy mona oceni, ledzc losy znakowanego acety-lo-CoA w cyklu kwasu cytrynowego przedstawionego na ryc. 18-3. MoJiwe, e Cs-akoni-tan nie jest koniecznym zwizkiem porednim miedzy cytrynianem a izocytrynianem, lecz w rzeczywistoci stanowi boczne odgazienie gwnego szlaku. Izocytrynian przy udziale dehydrogenazy izo-cytrynianowej ulega odwodornieniu i powstaje szczawiobursztyian. Znane s 3 rne dehydrogenazy izocy tryniano we. Jedna, swoista wzgldem NAD", znajduje si tylko w chondriach. Pozostae 2 enzymy s swoiste wzgldem NADP+, jeden z nich znajduje si ?
(Irilgi W rytmniii. TTtWia-
Cytrynian ulega przeksztaceniu w nie izocytrynianu zwi zane z acuchem od izocyi-rynian pr2ez enzym akonitaz (hydrataza dechowym odbywa si niemaJ wycznie przy akoni-tanowa), ktra zawiera elazo, jakujop udziale enzymu zalenego od NAD+. + Fe2 , w formie biaka + clazo-siarkowegofFeiSJT^re^ miana ta Izocytrynian + NAD . > ** zachodzi w 2 etapach :_dehydratacji do Szczawiobursztyian < (zwizany z enzymem) ds-akonitanu pozostajcego w^pbczeniu en~ + i>tx-Ketoglutaran + COa+ NADH + H zymem i ponownej rehydratacji do izocytrynia-nu.
7i Cytrynian
Cw-akonitan - jf fzocytryniarc
zwizany z enzymemj
* Z oklnika nr 200 Komitetu Wydawcw Bio-chcmical Joumals Recommendations (]975): Zgodnie ze standardow konwencj biochemiczn kocwka -an (np. palmitynian) oznacza dowoln mieszanin wolnego kwasu i jego form(y) zjonizowa-nych(ej) (w zalenoci od pH), w ktrej nie wyszczeglnia si kationw". T sam konwencj przyjto w tej ksice dla wszystkich kwasw karboksy-1 owych.
ksylacji do a-ketoglutaranu w reakcji kjajô-wnej take przez dehydrogenaz izocytrynia-now. Wanym skadnikiem tej reakcji jest Mnz+ (lub Mg?.jt)j Wydaje si, e.s_zczawk>bur-sztynian pozostaje zwizany z enzymem jako zwizek poredni w oglnej reakcji. Towstay a-ketogtutaran ulega dekarbo ksylacji oksydacyjnej w sposb analogiczny do dekar-boksylacji oksydacyjnej pirogronianu (p. ryc. 19-5) oba substraty s a-ketokwasami.
:-Ketoglutaran + NAD* + Co-A - -* + Sukcynylo-CoA + COa + NADH + H
CYKL KWASU CYTRYNOWEGO / 201
JAB.CZANOWA
C H 3 ~ C O CT NADH H + H Szczawlooctan J
HO C-COO" CH5-COCT Cytrynian JAKONITAZA]
Fluorocytrynian CCOO JJH-COCT Cis-a. koni tan t
DEHYDROG BURSZTYNIANOWA
HO-CH-COO izocytrynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA1
O-C-S-CoA Sukcynylo-CoA
K-KETOGLUTARAN
p
Szczawicbursztynian DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA
DEHYDROGENAZY OC
OWEJ
a-Ketoglutaran
DEHYDROGENAZA OWA | Ryc. 18-3. Cykl kwasu cytrynowego (cykl Krebsa). Utlenianie NADH i FADH2 w acuchu oddechowym umoliwia syntez ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej, W celu atwiejszego ledzenia losw acetylo - CoA w cyklu, ato my wgla ro dnika acetylo wego oznako wano na wglu kar bo ksyio wym {uywajc znaku [*]) i na wglu metylo wym {uywajc znaku [ ] ) W jednym obrocie zostaj uwo lnio ne 2 atomy wgla w postaci CO2, W pierwszym obrocie cyklu le uwo lnio ne atomy nie po chodz zacetyio- CoA, ktry bezporednio wszedt do cyklu, ale z lej czci czsteczki cytrynianu, ktra pochodzi ze szczawtooctanu. Jednake, po pierwszym penym obrocie cyklu, odtworzony szczawiooctan jest ju znakowany, std te w nastpnym obrocie cyklu uwolnieniu ulega znakowany CO^. P oniewa bursztynian jest zwizkiem symetrycznym, a dehydrogenaza bursztyn ianowa nie rozrnia 2 grup karboksylowych, na tym etapie dochodzi do przypadkowoci" znakowania, w wyniku czego wszystkie 4 atomy wgla szczawiooctan u okazuj si by znakowane po jednym obrocie cyklu. W wyniku glukoneogenezy cz wgl i znakowanego szcza wtooctanu moe si zna le w glukozie i glikogenie (p. ryc 21 -1). Stereochemi- czne aspekty cyklu kwasu cytryno wego omwi Grevrl(e (1968). Na rycinie zaznaczo no miejsca hamowania (O) przez fluorocytrynian, malo nian i arsenin.
202 / ROZDZIA 18
Reakcja katalizowana przez kompleks dehyd-rogenazy a-ketoglu tara nowej ake__;^ma-ga obecnoci identycznych kofaktorw, tj. difos-fotiaminy, Ijponianu, NAD+, FAD i "CoA. "Wj ej_wy ni kupo wstaj e sukcynylo-CoA, tioester zawierajcy wizanie bogatoenergetyczne. Rwnowaga tej reakcji jest tak znacznie przesunita na korzy tworzenia sukcynylo-CoA, e naley j uwaa za fizjologicznie jednokierunkow. Tak jak w przypadku utleniania piro-gronianu (p, str. 214), reakcj t hamuje arsenin, powodujc nagromadzenie si su.bstratu, ot-ke^ toglutarann. W nastpnym etapie cyklu sukcynylo-CoA jpstaje przeksztacony w bursztynia pr7z enzym tiokinaz bursztyn Janow (syntetaz suk-cynylo-CoA).
Pierwsz reakcj odwodoraiejH^J^îzuje de-hydrogeriaza burszry niannwa. ktra jest zwiza-na_ z wewntrzn.jowierzchnia:,wawl^4ee&eT
Bony mitn^nnHpalinpj w nr?r \ipr\h\ n j^
zostaych enzymw cyklu, ktre znajduj si t t o j e d y n a r e a k c j a o d wo d o r - y kwasu cytrynowego, w ktrej nastpuje bezporednie przeniesienie wodoru z substratu na flawoprotein bez udziau NAD + Enzym zawiera FAD i biako elazo siarkowe (Fe:S). Wynikiem odwodornienia jest powstanie fumaranu. Dane uzyskane z dowiadcze z izotopami wykazay, e enzym jest stereo-specyficzny wzgldem atomw wodoru w pooeniu trans na wglach metylenowych bursz-tynianu. Dodanie malonianu. lub szczawiooc-tanu hamuje kompetycyjnie dehydrogenaz bur-sztymanow, powodujc Sukcynylo-CoA + Pj + GDP < Bursztynian + GTP + CoA nagromadzenie si bur-sztynianu. Fumaraza (hydrataza fumaranowa) katalizuje Reakcja ta wymaga GDP lub IDP, ktre w reakcj przyczenia czsteczki wody do fumaobecnoci fosforanw nieorganicznych zostaj ranu, dajc jabezan. przeksztacone odpowiednio w GTP lub TYP. W Fumaran + HaO <> L-Jabezan cyklu kwasu cytrynowego jest to jedyny przypadek powstawania bogatoenergetyczncgo Oprcz swoistoci dla L-izomeru jabezanu, mazania fosforanowego na poziomie substratu. fumaraza katalizuje przyczenie j:jemat.w_ Wystpuje on dlatego, e uwolnienie energii wody do podwjnego wizania fumaranu swbbodnejw reakcji dekarboksylacji oksyda- w konfiguracji trans. Jabezan ulega przeksztacyjnej a-ketoglutaranu jest wystarczajce do ceniu przez dehydrogenaz jablczanow w dodatkowego utworzenia wizania szcza-wlooctan w reakcji wymagajcej bogatoener-getycznego, oprcz wytwarzania obecnoci NAD+. NADH (rwnowanik 3~). Przy udziale kioaz^^lifos^ fonukleozydowej (p. str. [37) z L-Jabczan + NAD + Szczawiooctan + + NADH GTP lub ITP moe powstawa ATP,. m>.: +
+H GTP + ADP GDP+ ATP
W tkankach po za wtrobowych reakcj alternatywn, katalizowan przez transferaz CoA sukcynylo-CoA: acetooctan (tioforaze), jest przemiana sukcynylo-CoA w bursztynian sprzona z przeksztaceniem acetooctanu w acetoacetylo--CoA (p, str. 268). W wtrobie stwierdza si rwnie aktywno deacylazy, ktra powoduje nieznaczn hydroliz sukcynylo-CoA do bursz-tynianu i CoA. 35Ldalszych_przemianach bursztynian ulega odwodornicniu, po ktrym nastpuje przyczenie czsteczki wody oraz jeszcze jedno odwo-dornienie prowadzce do odtworzenia szcza-wiooctanu.
Bursztynian + FAD <-^> Fumaran + FADH2
Aczkolwiek rwnowaga tej reakcji jest znacznie przesunitajv_stron^ jabezanu, zachodzi ona jednak w kierunku szczawi o octanu, poniewa zwizek ten, wraz z drugim produktem reakcji (NADH), jest cigle usuwany w nastpnych reakcjach. Enzymy cyklu kwasu cytrynowego, z wyjtkiem dehydrogenaâ-TteTo^tutara^noêji bTJrsZ-tyaianowcj*,wystpuj rwnie poza mitochon-driarniT hocia katalizuj one podobne reak cje, niektre z enzymw, np. dehydrogenaza jabezanowa, nie musz by w rzeczywistoci tymi samymi biakami, co enzymy mitochond-rialne o tej samej nazwie. * Powinna by rwnie wymieniona syntaza cy-trynianowa (przyp.
KADY OBRT CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO UMOLIWIA SYNTEZ 12 CZSTECZEK ATP W_jvyniku utlenia katalizowanych przez dehydrogenazy cyklu kwasu cytrynowego, zos t aj wyt wo rzo n e 3 c zs t ec zk i NAD H i 1 F.4DH2 na kad czsteczk acetylo-CoA TataboIiwan w jednym obrocie cyklu. Te rwnowaniki redukujce s przenoszone do acucha oddechowego w wewntrznej bonie mitochondrialnej (ryc. 18-2). Podczas wdrwki w acuchu, rwnowaniki redukujce z NADH generuj 3 boga t o e ne rgety czn e wizania fos-" foranowe powstajce w procesie fostorylaji oksydacyjnej wskutek fosforylacjf AD? do ATP (p. rozdz. 14). Natomiast FADH, daje tylko 2 bo^tgenererycznej ffi^zataTT&sfera nowe, gdy przenosi sw si redukcyjn na CoQ, omijajc w ten sposb pierwsze miejsce fosforylacji oksydacyjnej w acuchu oddechowym (p. ryc. 14-6). JDalsze bogatoenc rgety czne wizanie fosforanowe.-powstaje na poziomie samego cyklu (tj. na poziomie subs trat u) podczas przemiany sukcynylo-CoA w bursztynian. Prz^-kadym obrocie cyklu powstaje wic 12 czsteczek ATP {tab. 18-1)!
NIEKTRE WITAMINY ODGRYWAJ KLUCZOW ROL W CYKLU KWASU CYTRYNOWEGO Cztery rozpuszczalne witaminy kompleksu B maJ4 okrelone rok w funkcjonowaniu cyklu kwasu cytrynowego. S to: I) ryboflawina w formie dinukleotydu flawinoadeninowego_(jFD), kofaktor w kompleksie dehydrotzcnazy -keto-glutarano..weji w dehydrogenazic burszty-nta nowej, 2) niacjTia w formie dinukleotydu nikotyao-a ni i do u dt ni nowego (NAD), koenzym dla 3 dehy-drogenaz cyklu: dehydrogenazy i/oe>tryniuno-wej, kompleksu dehydrugenazy .r-ktitoglutarano-wej i dehydrogenazy jaWczanowej, 3) tiamina (witamina B,), jak difosfo tiamina, koenzym procesu dekar boksy lacjiw" reakcji dehydrogenazy ot-ketoglutaranowej, 4) kwas pantotenowy, jako C2 koenzymu A, kofaktor zwizany z aktywnymi" resztami kwasw karboksylo-wych, takich jak acetylo-CoA i sukcynylo-CoA. CYKL KWASU CYTRYNOWEGO ODGRYWA WZOW ROL METABOLICZN Niektre szlaki metaboliczne kocz si na zwizku porednim cyklu kwasu cytrynowego, a inne szlaki wywodz si z tego cyklu. Dotyczy to takich procesw, jak: glukoneogcneza^ trans-aminacja, deaminacja i synteza kwasw,.tuszczowych. Jak wida cykl kwasu cytrynowego odgrywa role zarwno w procesach oksydacyjnych, jak i w procesach syntez, a zatem jest amilbolicztiy. Poniej przedstawiono podsumowanie tej dwoistej roli cyklu. Cykl kwasu cytrynowego ma udzia w giukoneogenezie, tran sam i nacji i deaminacji Wszystkie wani ejsze metabolity ryWlu, od Cytrynianu do szczawiooctanu, s potencjalnie g! ukogennc. gdy mog zwikszy wytwarzanie glukozy w wtrobie lub nerce, narzdach zawie rajcych peny zestaw enzymw niezbdnych do przeprowadzenia glukoneogenezy (p. str. 226). Kluczowym enzymem, umoliwiajcym przej cie z cyklu do gwnego szlaku glukoneogenezy, jest kar boksy kiiiiizii fosfoenolopirogr omanowa, katalizujca reakcj dekarboksylacji szczawic:octanu do fosfoenolopirogronianu z GTP jajko rdem fosforanu bogatoenergetycznego (ryc. T8-4). ' -
Tabela 18-1. Wytwarzanie ATP przez cykl kwasu cytrynowego __________ - -----------------Enzym katalizujcy reakcj Dehydrogenaza izocytrynianowa Kompleks dehydrogenazy 3-ketoglutaranowej Tiokinaza bursztyn janowa Dehydrogenaza bursztynianowa Sposb wytwarzania ~P Utlenianie NADH wacuchu oddechowym Utlenianie MADH wtacuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenianie FADH2 w acuchu oddechowym Utlenianie NADH w acuchu oddechowym Zysk Liczba utworzonych czsteczek ATP
Dehydrogenaza ablczanowa
3 12
204 / ROZDZIA 18
Hlstydyna Prollna Hydroksyprollna Seryna Cysta! na Trsonlna Gtloyna Mleczan
)\
KARBOKSYLAZA FOSFOENO LOPIHOGRONIANOWA Fosfeanolo-plro grnnlanln "^
&
,JV f
Tryptofan.
Pirogronian KARBOKSYLAZA PIHOGHONIANOWA
Tyrozyna
Fenyloalanina
Glutamina f Arglnln. J
Ryc. 18-4. Uczestnictwo cyklu kwasu cytrynowego w transaminacji i glukoneogenezie. Grubsze strzaki wskazuj gwny szfak glukoneogenezy. Szczawiooctan GTP - - Fosfoenoloptrogronian + CO 3+ GDP W reakcjach katalizowanych przez truns a mi-
Wprowadzenie do cyklu nastpuje jako wynik kilku rnych reakcji. Jedn z najwaniejszych jest tworzenie szczawi o octanu w reakcji kar-boksylacji pirogronianu katalizowanej przez karboksylaz pirogronianow.
ATP + COa + HaO + Pirogronian - Szcza wiooctan + ADP + P|
na/y (aminotransferazy) wytwarza si; pirogronian z alaniny, szczawiooctan z asparaginianu oraz a-ketoglutaran z glutaminianu. Poniewa reakcje te s odwracalne, cykl suy rwnie jako rdo szkieletw wglowych do syntezy aminokwasw endogennych, np.:
Asparaginian + Pirogronian *> Szczawiooctan + Alanina Glutaminian + Pirogronian<a-Ket oglu taran + Alanina
Reakcj t uwaa si za wan w utrzymaniu odpowiedniego stenia szczawiooctanu dla reakcji kondensacji z acetylo-CoA. Jeeli nagromadza si acetylo-CoA, to dziaa on jako allo-steryczny aktywator kaiboksylazy pirogronia-nowej, zapewniajc w ten sposb dopyw szcza-wiooctanu. Mleczan, wany substrat glukoneogenezy, wchodzi d^ cykl u w^wyniku przemiany w pirogronian i szczawiooctan.
Inne aminokwasy wspieraj glukoneogeneze, poniewa cay ich szkielet wglowy lub jego cze po deaminacji lub transaminacji zasila cykl kwasu cytrynowego. Przykadami s$ l-nina, cysteina^glicyjia, hydroksyprolina, sery-oa, treo ma i^yptofaiir ktie ulegai" prze-
"glutamina i prolina. ktre"poprzez glutaminian przechodz w a-ketoglu\ran; izoeucyna, me-tionina i walina, ktre tworz sukcynylo-CoA; tyt6fcyjia"T"ienyIoai an i n"a. z ktrjcE powstaje fumaran (p. ryc. 18-4). Substancje tworzce pirogronian mog ulec cakowitemu utlenieniu dp^CO^jeli ulegn przeksztaceniu w acetylo--CoA przez kompleks dehydrogenazy pirogro-nianowej, lub te mog trafi do glukoneogene-zy przez karboksylacj do szczawi o octanu. " Szczeglne znaczenie dla przeuwaczy ma przemiana propionianu, bdcego gwnym produktem glikogennym fermentacji wglowodanw w waczu przeuwaczy, w sukcynylo--CoA poprzez metyloma)onylo-CoA (p. ryc, 21-2). Cykl kwasu cytrynowego uczestniczy w biosyntezie kwasw tuszczowych (p. ryc. 18-5) Acetylo-CoA, utworzony z pirogronianu w wyniku dziaania kompleksu dehydrogenazy pirg roni nowej, stanowi podstawowy element do syntezy dugo acuch owych kwasw tuszczowych u nieprzeuwaczy. (U przeuwaczy acetylo-CoA powstaje bezporednio z octanu).
^rmnina
htetyrlyna "
Poniewa dehydrogenaza pirogronian owa jest enzymem mitochndrialnym, a enzymy katalizujce syntez kwasw tuszczowych znajduj si poza mitochondriami. acetylo -CoA musi zosta przetransportowany przez nieprzepusz czaln dla niego bon mitochondrialn. Dokonuje si to przez utworzenie z acetylo-CoA cytrynianu w cyklu kwasu cytrynowego, nastpnie przetransportowanie cytrynianu z mitochon-drium i w kocu utworzenie acetylo-CoA w cy-tozolu przez rozszczepienie cytrynianu w reakcji katalizowanej przez enzym Uaz ATP: cytrynia-now.
Cytrynian + ATP + CoA- Acetylo -CoA + Szczawiooctan + ADP+ P.
Regulacja cyklu kwasu cytrynowego zaley gwnie od poday utlenionych kofaktorw Bez wtpienia w wikszoci tkanek, w ktrych zasadnicza funkcja cyklu kwasu cytrynowego polega na dostarczeniu energii, kontrola oddechowa" przez acuch oddechowy T fos-forylacj oksydacyjn jest nadrzdnym elemen tem regulacji aktywnoci cyklu kwasu cytryno wego. Aktywno cyklu jest wic bezporednio
Siczawlodan
Glukoza i
- Pirogronian
LIA2A ATP: CYTHYNIANOWA Cytryn an
Ryc. 18-5. Udzia cyklu kwasu

DEHYDROGE-N AZA PIROGRO NIANOWA
cytrynowego w procesie syntezy kwasw tuszczowych z glukozy {p. te ryc. 23-5).

Saczawioocian Cykl kwasu cytrynowego
CO,
BONA MITOCHONDRIALN
Kwasy tuszczowe
Acetylo-CoA
206 / ROZDZIA 18
zalena od poday utlenionych kofatetorw dehydrogenaz (np. NAD), ta z kolei, ze wzgldu na sprzenie utleniania z fosforylacj, zaley od dostpnoci ADP, a w kocu take od szybkoci zuywania ATP. Szybko wykonywanej pracy, w wyniku ktrej zuywa si ATP, warunkuje zatem zarwno szybko oddycha nia, jak i aktywno cyklu kwasu cytrynowego pod warunkiem, e tlen jest dostpny. Poza t ogln lub zgrubn kontrol, waciwoci niektrych enzymw cyklu sugeruj, e regulacja moe mie miejsce na poziomie samego cyklu. W tkance, takiej jak mzg, ktra jest zalena w znacznym stopniu od wglowodanw dostarczajcych acetylo-CoA, kontrola cyklu kwasu cytrynowego moe zachodzi na etapie dehyd-rogenazy pirogronianowej. W samym cyklu niektre enzymy wykazuj wraliwo na stan energetyczny wyraony stosunkiem [ATP]/[ADP] i [NADH]/[N AD+]. I tak syntaza eytrynianowa jest hamowana allosterycznie przez ATP i dugoaricuchowe acylo-CoA. Al-losteryczna aktywacja przez ADP mitochond-rialnej dehydrogenazy izocytrynianowej zale nej od NAD jest znoszona przez ATP i NADH. Kompleks dehydrogenazy tx-ketoglutaranowej wydaje si by pod analogiczn kontrol, jak dehydrogenaza pirogronianowa. Dehydroge-naza bursztynianowa jest hamowana przez szczawiooctan, a dostpno szcza wi o octanu,
kontrolowana przez dehydrogenaz jabezano-w,.zaly.od stosunku [NADH]/[NAD], Poniewa warto Km syntazy cytrynianowej dla szczawiooctanu jest tego samego rzdu, co jego stenie wewnatrzmitochondrialne, to wydaje si, e stenie szczawiooctanu moe odgrywa pewn rol w regulacji szybkoci powstawania cytrynianu. Jak na razie nie rozstrzygnito, ktry z powyej wymienionych mechanizmw funkcjonuje w warunkach in vivo.
PIMIENNICTWO
Baldwin JE, Krebs HA: The cvolution of metabolic cydes. Natur 1981;291:381. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Academic Press, 1971. Goodwin TW (editor): The Metabolic Roes of Cit rate. Academic Press, 1968. Greville G"D: Vol 1, p 297, in: Carbohydrate MetaboHsm and hs Disorders. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors). Academic Press, 1968. Kay J, Weitzman PDJ (editors): Kreb's Citric Acid Cyde - Half a Century and Still Turning. Biochemical Society of London, 1987. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde: Control and Compartmentalion. Dekker, J969. Lowenstein JM (editor): Citric Acid Cyde. Vol 13 in: Methods in Enzymology. Academic Press, 1969. Srere PA: The enzymology of the formation and breakdown of citrate. Adv Enzymol I975;43:57.
Glikoliza i utlenianie pirg ronianu

Peter A, Mayes, PhD, DSc
19
WPROWADZENIE
Wszystkie tkanki wymagaj pewnej minimalnej poday glukozy, ale dla niektrych tkanek (np. dla mzgu i erytrocytw) jest to wymg zasadniczy. GlikolizaJesL^wnym szlakiem r ^ ? T h i k i h Komrkach. Jest to wyjtkowy szlak, poniewa moe on przebiega zarwno w warunkach tleno-jjchjaerobowych), jak i beztlenowych (anaero-bowych).
cykl kwasu cytrynowego. Znaczy to, e wytwarzanie pirogronianu przewysza zdolno jego metabolizowania. W rezultacie prowadzi to do nadmiernego wytwarzania mleczanu i miejscowego zakwaszenia rodowiska w guzie, a to z kolei moe mie nastpstwa w terapii pewnych typw nowotworw. Kwasica mleczanw u moe wynika z wielu przyczyn, wcznie z niedoborem dehydrogenazy pirogronianowej.
GLIKOLIZA MOE PRZEBIEGA W WARUNKACH BEZTLENOWYCH

Ju we wczesnym okresie bada nad glikoliz zauwaono, e proces fermentacji w drodach jest podobny do rozpadu glikogenu w miniu. Stwierdzono, e gdy misie kurczy si w rodowisku beztlenowym, tzn. takim, z ktrego usunito tlen, znika glikogen, a pojawia si mleczan jako gwny produkt kocowy. Gdy tlen jest dostpny, czyli istniej ponownie warunki tlenowe, pojawia.-sje.glikjo.gen, natomiast mleczan .znika. Jeeli jednak skurcz nastpuje w warunkach tlenowych, to mleczan si nie gromadzi, a gwnym produktem glikolizy jest pirogro-nian; ten ostatni nie akumuluje si, poniewa jest utleniany dalej do CO2 i wody (ryc. 19-1). Na podstawie tych obserwacji przyjto rozdzia metabolizmu wglowodanw na faz tlenow i beztlenow. Jednak tego typu zrnicowanie jest arbitralne, gdy reakcje w procesie glikolizy, przebiegajce zarwno w obecnoci, jak i przy braku tlenu, s takie same z wyjtkiem ich intensywnoci oraz produktw kocowych. Je: eli.tlnjest dostnny-tyJko^r-zez-kriki-okres, to jest. ograniczona peoksydacja NADH po wstaego w czasie glikolizy. W tych warunkach
ZNACZENIE BIOMED/CZNE
Glikoliza jest nie tylko podstawow drog metabolizmu glukozy prowadzc do wytwa rzania acetylo-CoA i utleniania w-cyklu-kwasu cjffynowcgo. lecz take stanowi gwny szlak, metabolizmu fruktozy i galaktozy i y g pokarmowego. Jej zasadnicze znaczenie biomedyczne wynika z faktu, e glikoliza moe dostarcza _&! w BWobecnocDtoua^cqrpo,T. zwala miniom szkieletowym funkcjonowa sprawnie przy niedostatecznych procesach aerobowych i co pozwala tkankom z du aktywnoci glikolityczn przetrwa epizod Beztlenowy. Odwrotnie, misie sercowy, przystosowany do warunkw tlenowych, charak teryzuje si wzgldnie maa aktywnoci glikoli tyczn i sab zdolnoci przetrwania w warun-Jtach niedotlenienia. Znamy niewielk liczb chorb, w ktrych stwierdzono brak aktywno ci enzymw glikolizy (np. kinazy pirogronia-nowej); zasadniczym ich objawem jest niedo-krwisto hemolityczna. W szybko rosncych komrkach nowotworowych, glikoliza przebiega ze znacznie wiksz szybkoci ni wymaga tego
208 / ROZDZIA 19 Gllkogen
Glukoza + 2 AOP + 2 Pf -* - 2 L(+)-Mlaan + 2 ATP + 2 H3O Wszystkie_ enzymy- szlaku -glikojitycznego (ryc. 19-2) znajduj si w pozamitochondrialnej rozpuszczalnej frakcji komrkowej.jK.c^tozplu. Katalizuj one reakcje zachodzce podczas przemiany glukozy do pirogronianu i mleczanu nastpujco: Glukoza wchodzi do szlaku glikoitycznego przez fosforylacj do glukozo-6-fosforanu: Za-chodzi to przy udziale enzymu heksokinazy, a w hepatocytach przy udziale glukokinazy, k*torej aktywno jest indukowana i modyfikowana w wyniku zmian odywiania. Jak-dawca P fnsfhranp pnrr^frny jggf AT J* jak W Wielu reakcjach zwizanych z fosforylacj, regguje-on w formie kompleksu MgÂTP. \f reakcji zuywa sie 1 bogatoenergetyczne wizanie fosforanowe ATP i powstaje ADP._Reakgji tej towarzyszy znaczna strata energii swobodnej w postaci ciepa i dlatego w warunkach fizjologicznych moe by ona traktowana jako reakcja nieodwracalna. Heksokirta7M jp&t .hamawana w SpOsb izosteryczny przez produkt reakcji glultpzo--6-fosforan. Glukoza + ATP- * - Glukozo-6-fosforan + ADP
Ryc. 19-1. Uproszczony schemat glikolizy. Q zablokowane w warunkach beztlenowych lub przy braku mitochondriw, np. w erytrocytach.
NADH jest utleniany w reakcji redukcji pirogronianu do rn]eczanu,7a_tak utworzony_NAD_.. umoliwia dalszy przebieg glikolizy (ryc, 19-1), W ten sposb glikoliza moe zachodzi w warunkach beztlenowych, lecz ma to swoj cen dochodzi do ograniczenia iloci energii uwalnianej na mol utlenianej glukozy. W konsekwencji, aby wytworzy t sam ilo energii, wicej glukozy musi ulec glikolizie w warunkach beztlenowych ni w warunkach tlenowych.
CIG REAKCJI W GLIKOLIZIE TO GWMY SZLAK ZUYCIA GLUKOZY

Oglne rwnanie glikolizy do mleczanu jest nastpujce:
r wy stepujca we wszystkich komrkach, z wyjtkiem komrek parenchymal-nych wtroby, ma due powinowactwo (mata warto Km) do jej substratu, tj, glukozy. Jej rola polega na zapewnieniu dostarczenia gluko-ZXjjo_ tkanek. Nawet przy maych steniach glukozy we krwi, przez fosforylacj wszystkich jej czsteczek wnikajcych do komrki, jest moliwe utrzymywanie duego gradientu stenia glukozy midzy krwi a rodowiskiem wewntrzkomrkowym. Heksokinaza dziaa za rwno na a, jak i p anomer glukozy i moe rwnie katalizowa fosforylacj innych hek-soz, jednak ze znacznie mniejsz szybkoci ni fosforylacj glukozy. Funkcia lukokinazy iest usuwanie glukozy Z krwi po spoyciu posikw. W przeciwiestwie
Ry. 19-2. Szlak glikolizy. ------- PO3 , P, H0P0| , 9 hamowanie. * Atomy wgla 1 3 fruktozobisfosforanu tworz hydroksyacetonofosforan, natomiast wgle 4 6 tworz giicera)dehydo-3--fosforan. Przedrostek bis- (jak w fruktozobisiosforanie) wskazuje, e grupy fosforanowe s odseparowane, natomiast okrelerile difosforan, np. w difosforanie adenozyny, wskazuje e s bezporednio ze sob poczone.
GLIK OUZA I UT LE NIA NIE P IROGRONIA NU / 209

Gtifcogen
Glukozo-1-fosforan
[ HEKSOKINAZA ]
| GLUKOKINAZA j
CHj L Q
_ c
Hy
J- 0
Mg'
12OMEHA2A FOSFOHEKSOZOWA
CHa-O-
ÔH
HO\?
H OH ATP
y0H
0H
OH
ATP
;-
it-D-Glukoza
ADP -D-G lu kozo-6-f osf oran
V FOSFOFRUKTOKINAZA
cooH-C-OH i
CH,-OMUTA2A
OH
D-F r u kicz o -1.6-b i sf o sf o ran FOSFOGUCERYNIANOWA
Jod oo otan
C HjO H Dlhyd roksy aoeto nofoslo r D-FrukJczo-6-osforan
FOSFOGLICERYNIANOWA
ALDEHYDO-3-FOSFORANOWA
coo2-Fnsfogllcerynian ADP 1,3-Blsfostogl icery n -5 3-Fos1oglioeryniari lan
____
E RA ZA
, | \
g, ___
H- -O- H,OH
Fluorek
-H;O I ENOLAZA
Mltochondrlalny y: o acuch
coo-0-
3ATP 3ADP + P-.
II
CH,
KINA2A PtROGRONIANOW Fosfoenolo pirg ron lan Utlenianie w cyklu kwasu cytrynowego
-ADP Mg1 ATP Samorzutnie NADH+H^ NAD +
c ooi
coo-OH -CH,
(Enol) Plrogfonian
CH3 (Keton) Plrogronlan
0EHYDH0G6NAZA MLECZANOWA
U
cooHO-C-H
Ryc. 19-2
14 Biochemia
210 / ROZDZIA 19
do heksokinazy ma ona du warto Km da glukozy i dziaa optymalnie przy steniu glukozy we krwi wynoszcym powyej 5 mmol/1 (p. ryc. 21-5). Jest swoista wzgldem fliulfozy Glukoz o-6-fosforan jest wanym zwizkiem czcym wiele szlakw metabolicznych (gli-koliza, glukoneogeneza, cykl pentozofosforanowy, glikogcneza i glikogenoliza). W glikoli-zie jest ona przeksztacana w fruktozo -6-fosforan przez izomeryzacj aldozowo-ketozow przy udziale izomerazy fosfoheksozowej. Przemianie tej ulegaJyIkjDjjmnier_glukoz-6-fos...D-Gukozo-6-fosforan < *> a>D-Fruktozo-6-fosforan
Nastpny etap glikolizy to utlenienie glicer-aldehydo-^Tosforanu do J^^BisfbsfogUcer^ nianu. Dziki aktywnoci izomerazy TosTotrio-zowej rwnie dihydroksyacetonofosforan^ przechodzc uprzednio w gliceraldehydo-3-fosforan, jest utleniany do 1,3-bisfosfoglicerynianu,
D-Gliceraldehydo-3-fosforan + NAD * + + + Pj..1,3-bisfosfoglicerynian +NADH + H
Po tej reakcji nastpuje druga fosforylacja z udziaem ATP, katalizowana przez enzym fosfofruktokinaz (fosfofruktokinazc-1), tworzca fruktozo -l,6-bisibsforan. Fosfofrukloki-nazajest zarwno enzymem allosterycznym, jak i indukowanym, ktrego aktywno odgrywa gwn rol w regulacji szybkoci glikolizy. Reakcja katalizowana przez fosfofruktokinaz e by uwaana za nieodwracaln w warun kach fizjoJogicznych.
D-Fruktozo-6-fosforan + ATP > D - F ruktozo-1,6-bisf osforan
Fruktozo-l,6-bisfosforan jest rozszczepiany przcz aldolaz (aldolaz fruktozo-1,6-bisf o sfo-ranow) na 2 fosfotriozy, glicfiraldehydo-3-fosforan i dihydroksyacetonofosforan.
D-Fruktozo-1,6-bisfosforan <-^>Gliceraldehydo-3 -fosforan + + Dihydroksyacetonof osforan
Stwierdzono wystpowanie kilku rnych al-dolaz; wszystkie zawieraj 4 podjednostki. W wikszoci tkanek wystpuje aldolaz A, natomiast w wtrobie i nerce wystpuje dodatkowo aldolaza B. Chocia fruktozofosforany wystpuj w komrce gwnie w formie furano-zowej, to z izomeraz fosfoheksozow, fosfo-fruktokinaz i aldolaza wi si w formie acuchowej. Gliceraldehydo-3-fosforan oraz dihydroksyacetonofosforan przeksztacaj si jeden w drugi pod wpywem enzymu izomerazy fosfotriozo-wej.
D -Gliceraldehydo-3-f osforan * Dihydroksyacetonofosforan
Kn^ym warunkujcy utlenianiedehydroge-naza gliceraldehydo-3-fosforanowa jest zaleny od NAD. Strukturalnie skada si on z 4 identycznych polipeptydw (monomerw) tworzcych tetramer. Kady polipeptyd zawiera 4 grupy -SH, znajdujce si w resztach cysteiny acucha polipeptydowego. Jedna z grup -SH znajduje si w centrum katalitycznym enzymu. Pocztkowo substrat czy si z t reszt -SH, tworzc tiohemiacetal, ktry w wyniku utlenienia ulega przeksztaceniu w bogato-energetyczny tioester; wodr oderwany w cza sie tego utleniania jest przenoszony na NAD zwizany z enzymem. Wytworzony NADH nie jest tak mocno zwizany z enzymem jak NAD. Dlatego te NADH moe by atwo zastpowany przez nastpn czsteczk NAD, W kocu w reakcji fosforolizy, przy udziale nieorganicznego fosforanu (P;), tworzy si" 1,3-bisfosfoglicerynian i wolny enzym z odtworzon grup -SH (ryc. 19-3). Energia uwalniana w czasie utleniania zostaje zatrzymana najpierw w formie bogatoenergetycznego wizania siarczkowego, a po jego fosforolizie w formie bogatoenergetycznego wizania fosforanowego w pozycji 1 1,3-bisfosfogIicerynianu. Ten_ bogatoenergetyc2ny fosforan znajdzie si nastpnie w ATP w wyniku katalizowanej przez kinaze fosfoglicerynianow reakcji zachodzcej w obecnoci ADP i tworzcej J-fosfoglicery-nian.
1,3-bisfosfoglicerynian-)- ADP < 3-fosfoglicerynian+ ATP
Poniewa z czsteczki glukozy podlegajcej glikolizie powstaj 2 czsteczki fosfotrioz, na tym etapie wytwarzaj si rwnie 2 czsteczki ATP na czsteczk glukozy; jest to przykad fosforylacji na poziomie substratu" (fosforylacja substratowa). W przypadku obecnoci arseniami, wsp zawodniczy on w powyszych reakcjach z fosforanem nieorganicznym (Pj), tworzc 1 -arse-
GLIKOUZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 211
H-C-0 H-C-OH
i
NAD+) S-Enz H-C -O H H-C -O H CHrO-(PKompleks enzym -substrat HS-Enz
CH-O-(P ) G! fceraldehyd o-3-fosf ra n
nzym
o-
H - C - OH CH,-O-(P) 1,3-Blsfostoglloerynlan
Utlenianie sabstratu przez zwizany NAtT
Intefmedlat bogatoeneroeyczny
Hyc-. 19-3. Mechanizm utleniania gliceraldefiydo-3-fosforanu. dehydrogenaza gliceraldehydo-3--fosforanu. jest hamowany przez jodooctan wicy si z grup -SH, W ten sposb jodooctan moe hamowa glikoliz.
Em
~~
Enzym
no-3-fosfoglicerynian, ktry spontanicznie hyd-rolizuje, dajc 3-fosfoglicerynian i ciepo, bez tworzenia ATP. Jest to wany przykad zdolnoci arsenianu do rozprzgania utleniania i fos-forylacji. Powstajcy w powyszych reakcjach 3-jps-fogliceryhian jest przeksztacany w 2-fosfo-glicerynian przez enzym mutaze fosfoglicerynia-now. Prawdopodobnie 2,3-bisfosfoglicerynian (dawniej okrelany jako difosfoglicerynian, DPG) jest zwizkiem porednim w tej reakcji.
3-Fosfoglicerynian *f2-Fosfoglr cery nia
hamowana przez fluorki; ta waciwo moe by wykorzystana w sytuacji, gdy zachodzi potrzeba zahamowania glikolizy, np. w prbce krwi w celu oznaczenia w niej stenia glukozy. Aktywno enzymu zaley od obecnoci Mg2 + lub Mn2+.
2-Fosfoglicerynian - *-* Fosfoenolopirogronian + H2O
Nastpny etap glikolizy jest katalizowany przez enolaz, ktr powoduje odczenie wo-d^,_pr_zernieszczenie energii wewntrz czsteczki, przejcie fosforanu w pozycji 2 w stan bogatoenergetyczny i w rezultacie tego utworzenie fosfoenolopirogronianu. Enolza, jest
Nastpnie fosforan bogatoenergetyczny jest przenoszony z fosfoenolopirogronianu na ADP przez enzym kinaz pirogronianow, tworzcy na tym etapie 2 czsteczki ATP na czsteczk utlenianej glukozy. Utworzony w tej reakcji enolopirogronian przeksztaca si spontanicznie w form ketonow pirogronianu. Jest to kolejna reakcja, ktrej towarzyszy znaczna utrata energii swobodnej w postaci ciepa i musi by ona traktowana jako fizjologicznie nieodwracalna.
212 / ROZDZIA 19 Fosfoenolopirogronian + ADP -* - Pirogronian + ATP
Teraz stan red.-oks. tkanki jest czynnikiem decydujcym, ktry z 2 moliwych szlakw metabolicznych zajdzie. Jeeli przewaaj wa-ranki beztlenowe, to uniemoliwiona jest reok-sydacja NADH w acuchu oddcdumym-pczez przeniesienie rwnowanikw redukujcych na tlen. Pirogrojiiaji ulega redukcji przez NADH rjrprpiwyfiTpi w reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz mleczanw . Opisano izozymy tego "enzymu i ich znaczenie kliniczne (p. str. 82). Pirogronian + NADH + H ~ <-.L(+)-Mleczan + NAD*
+
ca_regulacji glikolizy. Komrki, majce rne systemy~enzyriiatyczne, pozwalajce na alternatywny przebieg nieodwracalnych reakcji katalizowanych przez wyej wymienione enzymy, maj moliwo dokonywania w szlaku glikoli-tycznym przesunicia metabolitw w kierunku syntezy (glukoneogenezy). Te reakcje oraz regulacja glikolizy i regulacja glukoneogenezy s przedstawione w rozdz. 21. W glikolizie zachodzcej w erytrocytach reakcja kinazy fosfog li cery nia nowej moe by ominita W erytrocytach wie\u gatunkw ssakw dochodzi do ominicia reakcji katalizowanej przez kinaz fosfoglicerynianowa. W tym przypadku energia swobodna wizania bogatoenergetyczi. nego 1,3-bisfosfoglicerynianu zostaje rozproszona w postaci ciepa (ryc. 19 -4). Dodatkowy
Reoksydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu, przez odtworzenie NAD+ potrzebnego w nastpnym cyklu reakcji katalizowanej przez dehydrogenaz --------Glukoza gliceraldehydo-3-fosfora-now, umoliwia H-C-GH przebieg glikolizy w nie obecnoci tlenu. Tkanki funkcjonujce w warunkach niedotlenienia wytwarzaj wic mleczan (ryc. 19-2). Dotyczy to Gl fceraldehyd o-3-fosforan zwaszcza mini szkieletowych, gdy szybko NAD* wykonywanej przez minie pracy nie jest ograniczona przez ich stan oksygenacji. DEHYDROGENAZA GLICERALDEHYOO-3-FOSFORANIOWA Nadmierne iloci utworzonego mleczanu mona stwierdzi w tkankach oraz we krwi i w moczu. 'NADH + H* W _ervtrocvtach îkgjizajjiawet w warunkach tlenowych, koczy si zawsze utworzeniem mleczanu, z powodu braku w tych komrkach MUTAZA BISFOSFO mitochondriw, ktre zawieraj4 system H-C-OH GLICERYNIANOWA enzymatyczny utleniajcy pirogronian. Jedynie w erytrocytach ssakw ok^90% cakowitego zapotrzebowania energetycznego pokrywa glikolizaJ_Coza miniem szkieletowym i 1.3-BtefoBfoglicerynlan erytrocytami, tkankami, ktre rwnie czerpi energi gwnie z glikolizy i wytwarzaj mle- ADP, KINAZA czan, s: mzg, jelito, rdze nerki, siatkwka FOSFOGLICEHYNIANOWA 1 skra. Wtroba, nerki i serce zwykle pobieraj mleczan i utleniaj go, ale w warunkach niedoGl I cer o I o-2,3-b I sf osf o ra n tlenienia narzdy te mog wytwarza mleczan. COO" Glikoliza jest regulowana H- C- OH na 3 etapach obejmujcych reakcje FOSFATAZA CH2 -O-(F nieodwracalne" 2^-BISFOSFO-GUCERY Chocia wikszo reakcji glikoli ty cznych 3-Fosfogllcerynlan N1AN0WA jest odwracalna, to jednak 3 z nich s wyranie Pfrogronlan egzoergiczne i z tego powodu musz by uwaane za rgakcjjftzjologicznie nieodwracalne. S to Ryc. 19-4. Szlak 2,3- bisfosfoglicerynianowy w reakcje katalizowane przez heksokinaz (i erytrocytach. glu-kokinaz),"ibsfofruktokinaz 'i kinaz pirogro-nianowa,. Reakcje te stanowi zasadnicze miejs-
GLIKOLIZA I UTLENIANIE PIROGRONIANU / 213
enzym, imitasa faisfosfpglieerynianowa, katalizuje przeksztacenie 1.3 -bisfosfoglJccryniami w 2.3 - b i stos fbgl u: e ry ni an. Ten ostatni u lega prze-mianii: do .i-loslosilicciynianu prze/ fosfataz ~TfoiSgBcerynianow, ktrej aktywno wykazuje czsteczka mutazy bisfosfoglicerynia-nowej. W zwizku z utrat bogatoenergetycz-nego wizania fosforanowego proces glikoiizy, przebiegajcy z udziaem tych reakcji, nie daje zysku energetycznego w postaci ATP. Jednake moe to by korzystne dla erytrocytw, poniewa pozwala na przebieg glikolizy nawet w warunkach minimalnego zapotrzebowania na ATP. Poza tym 2,3-bisfosfoglicerynian, wystpujcy w komrce w duym steniu, czy si 7. hemoglobin, powodujc zmniejszenie jej powinowactwa do tlenu i przesuniecie krzywej dysocjacji oksyhemoglobiny w prawo. W_,Jten sposb w erytrocytach uatwia on uwalnianie tlenu z oksj hemoglobiny (p. rozdz. 7). UTLENIANIE PIROGRONIANU DO ACETYLO-CoA JEST NIEODWRACALNYM PROCESEM CZCYM GLIKOLIZ Z CYKLEM KWASU CYTRYNOWEGO AUy.piiogroniaajng wej do cyklu kwasu cytrynowego, musi najpierw zosta przetrans portowany do wntrza mitochondrium przez przenonik pirogronianowy, ktry umoliwia przejcie pirogronianu przez wewntrzn Hon mitochondrialn. W tym procesie transportowi czsteczki pirogronianu towarzyszy transport 1 protonu (kotransport). Tego typu mechanizm transportu okrela si mianem symportu (p. ryc. 14-15). Wewntrz mitochondrium pirogrogjfrn
do acetylo-
ten ostatni zostanie ponownie utleniony przez flawoprofein, w obecnoci dehydrognazy di-hydroliponianowej, cykl reakcji jest" zakoczony! Ostatecznie zredukowana flawopro-teina jest utleniana-pfzezr. :NAD, ktry z kolei przenosi rwnowaniki redukujce do acucha oddechowego.
Pirogronian + NAD + CoA - + - Acetylo-CoA + NADH + H + COa
+
Kompleks_dshydrogenazy pirogronianowej skada si z szeregu acuchw polipeptydo-wych. kadego z 3 skadowych enzymw, uoonych w regularny ukad przestrzenny. Ruchy kadego z enzymw s ograniczone, a metabolity porednie nie dysocjuj swobodnie, lecz pozostaj przyczone do enzymw. Taka organizacja kompleksu enzymatycznego, w ktrym substraty s przekazywane z jednego enzymu na nastpny, powoduje zwikszenie szybkoci reakcji i uniemoliwia przebieg reakcji ubocznych, a w konsekwencji zwiksza wydajno ogln procesu. Naley zaznaczy, e system dehydrogenazy pirogronianowej jest wystarczajco elektro-ujemny wzgldem acucha oddechowego, aby generowa zarwno zredukowany koenzym (NADH), jak i dodatkowo bogatoenergetyczne wizanie tioestrowe w acetylo-CoA. Dehydrogenaza pirogronianowa jest regulowana przez hamowanie produktami kocowymi oraz przez modyfikacje kowalencyjne pehydrogenaza pirogronianowa jest hamowana przez produkty jej reakcji, acetylo-CoA oraz NADH (ryc. 19-6). Jest ona rwnie regulowana przez ATP-zalen fosforylacj, katalizowan przez kinaz, co prowadzi do zmniejszenia aktywnoci oraz przez defosfory-lacj przy udziale fosfatazy, co z kolei prowadzi do zwikszenia aktywnoci dehydrogenazy. Kinaza ulega aktywacji przy zwikszeniu wartoci stosunkw facetyIo-CoAj/XCoA], [NADHJ/tNAD1-] lub [ATP]/[ADP] Dhydro-genaza pirogronianowa a zatem i glikoli/a jest wic hamowana nie tylko przez potencja bogatoenergetyczny, lecz take w warunkach, gdy zachodzi utlenianie kwasw tuszczowych, w czasie ktrego zwikszaj si wartoci wyej wymienionych stosunkw, .. W- -godzeniu dochodzi do zmniejszenia iloci aktywnej formy enzymu, a po podaniu insuliny obserwuje si
;CpA. Reakcja ta jest katalizowana przez kilka rnych enzymw, dziaajcych kolejno w kompleksie wieloenzymatycznym. Enzymy te okre-la_sic-zbk>rowo mianem kompleksu dehydrogenazy pirogr omanowej, ktry jest analogiczny do kompleksu dehydrogenazy a-ketoglutarano-wej w cyklu kwasu cytrynowego (p. str. 199). Pirjagnjniarijyilega.4ekarboksylacji do hydro-ksyetyowej pochodnej piercienia tiazolowego difosfoLitmmy zwizanej z enzymem, ktra reaguje z kolei z utlenionym lipoamidem, two rzc acetylolipoamid (ryc. 19-5). W obecnoci acetylotransfcrazy dihydroliponianowcj acetylolipoamid reaguje z koenzymem A., tworzc acetylo-CoA i zredukowany lipoamid. Gdy
214 / ROZDZIA 19
Dltosfotlamlna w formie karbanionu
C=-CH,-CH,- O--
C H -{C H S ) 4 -C O O -
DEHYDROGENAZA PlROGFIONIANOWA
Oifosforiydroksyetylotiamina DEHYDflOGENAZA P1R0GR0NIAN0WA
Zwizek poredni
DEHYDFIDGENAZA PIROGRONIANOWA
Utleniony lipoamid
ACETYLOTRANSFERAZ O A II CKHYDHOLIPONWNOWA CnA-S-C-CHj Aeetylo-CoA.
O II S -C
CH3 Aoetytolipoamld
Zredukowany lipoamid
[4
DEHYDROGENAZA DIHYDflOLIPONIANOWA NAD*
NADH
Ryc. 19-5. A. Dekar boksylacj a oksydacyj na pir ogr oni anu pr zez kom pl eks dehydr ogert azy pir ogr oniano wej, B, Kwas liponow y. Kwas li porto wy jest poczony wizaniem ami dow ym z reszt lizyny acetylotransfer azy bdcej skadniki em kom pleksu enzym atycznego. _______________________________________________________
zwikszon aktywno w tkance (ale me iwej w wtrobie). Zahamowanie utleniania pirogronianu prowadzi do kwasicy mleczanowej Arsenin i jony rtciowe, kompleksujc grup H kwasu liponowego, hamuj dehydroge-naz pirogronianow i, tak jak niedobr tiami-ny w diecie, powoduj nagromadzenie si pirogronianu. Niedoywieni alkoholicy maj 7wyk-te niedobr darniny i jeeli poda si im glukoz, to dochodzi do szybkiego nagromadzania si
pirogronianu i kwasicy mleczanowej, czsto miertelnej. Kwasica mleczanowa, zwaszcza po obcieniu glukoz, jest jednym z objaww u osb z dziedzicznym niedoborem dehydroge-nazy pirogronianowej. Opisano wady genetyczne dotyczce niemal kadego z enzymw meta-bolizujacych wglowodany; kada z nich jest zwizana z odpowiedni chorob u ludzi. Dziedziczny niedobr aldolazy A oraz niedobr kinazy pirogroniano wej w erytrocytach wywo uje niedokrwisto
hemolityczn.
GUK0L1ZA I UTLENIANIE PiROGRONIANU / 215

Pirg ronian
Pirg ronlan ATP
P D H-a -(Aktywny DEFOSFOEN2YM)
PDHb (nieaktywny FOSFO ENZYM)
Insulina (w tkance tuszczowej)

NAD
GcA H,0
Ryc. 19-6. Regulacja dehydrogenazy pirg ro ni a nowej (PDH). Strzaki faliste dotycz efektw allo -sterycznych. A regulacja przez hamowani e produktami kocowymi, B regulacja przez wzajemn przemian postaci aktywnej i nieaktywnej enzymu.
Utlenienie czsteczki glukozy dostarcza 38 mol ATP w warunkach tlenowych i tylko 2 mol ATP w nieobecnoci tlenu Gdy 1 czsteczk glukozy spali si w kalory-metrze do CO2 i wody, uwolni si ok. 2780 kJ ciepa. Gdy utlenianie zachodzi w tkankach, wwczas cz tej energii nie jest rozpraszana bezporednio w postaci ciepa, lecz zostaje zachowana" w postaci bogatoenergetycznych wiza fosforanowych. Kadej _ czsteczce glukozy utlenionej do CO2 i wody to~warzyszy ^wytworzenie3fr-vBSg.l-.ATP.:Zakadajc, e kade wizanie bogatoenergetyczne odpowiada
30,5 kJ, to energia magazynowana w postaci ATP, przypadajca na czsteczk utleniojieL glukozy, wynosi 1159 kJ, czyli stanowi ok. 41,7% cakowitej energii spalania. Wikszo ATP tworzy si podczas fosforylacji oksydacyj nej wwyniku reoksydacji zredukowanych koenzymw w acuchu oddechowym. Pozostay ATP jesMvytwarzany przez fosforvfaj|j^ sub-stratow (pô3~T^rr -W-taê^T^ : TpTzed^ stawiono reakcje warunkujce wytwarzanie bo-gatoenergetycznego fosforanu podczas utleniania glukozy i zysk energetyczny w warunkach tlenowych oraz beztlenowych.
216 / ROZDZIA 19 Tabela 19-1. Wytwarzanie bogatoenergetycznych wiza fosfo ran owych podczas kata boi iz mu glukozy Reakcja, ktr Sposb Liczba ~ (J) Szlak katalizuje: wytwarzania tworzonych na przemian mol glukozy Giikoliza Dehydrogenaza gliceraldehydo--3-fosforanowa Kinaza fosfoglicerynianowa Kinaza pirogronianowa Utlenienie 2 NADH w acuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Fosforylacja substratowa
6
2 2 10
Zuycie ATP w reakcjach katalizowanych przez heksokinaz i fosfofruktokinaz Zysk
-2 8
Dekarboksylacja Kompleks dehydrogenazy oksydacyjna pirogronianowej Dehydrogenaza izocytrynia-nowa Dehydrogenaza a-keto-giutaranowa Tiokinaza bursztyntanowa Detiydrogenaza bursztynia-nowa Dehydrogenaza jabczanowa
Utlenienie 2 NADH w acuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w acuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w tacuchu oddechowym Fosforylacja substratowa Utlenienie 2 FADH2 w acuchu oddechowym Utlenienie 2 NADH w acuchu oddechowym Zysk
6 6 6 2 4 6 30 38
Cykl kwasu cytrynowego
Oglny bilans w warunkach tlenowych Oglny bitans w warunkach beztlenowych
' Przyjto, e NADH powstajcy w glikolizie przekazuje wodory do wntrza mitochondriw przy udziale mostka jabczanowego (p. ryc. 14 -15). Przy uyciu mostka fosfoglicerynianowego powstayby tylko 2 ~ na mol NADH, std cakowity zysk wynisby 36 zamiast 38. W kalkulacji pominito niewielk strat + ATP (ok, 1 mol ATP) wynikajc z transportu do wntrza mitochondriw H z pirogronianem oraz podobnego transportu H w dziaajcym mostku jabczanowym
PIMIENNICTWO Boitcux A, Hess B: Design of glycolyss. Phil Trans
R Soc LonOm 3 imO93i5.

Blass JP: Disorders of pyriwate metabolism. Neurology 1979;29:280. Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vols 59. Academic Prcss, 1972. Dickens F, Randle PJ, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Mewholism and Its Disorders. 2 vols. Acadcmic Press, 1968.
Greenberg DM {editor): MetaboHc Patkways, 3rd ed, Vol. 1. Academic Press, 1967. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Scriver CR (editor); MetaboHc Basis of Inherited Disease. McGraw HjU, th ed. 1989. Sols A: Multimodulation of enzymeactivity. Curr Top Celt Reg 1981;19:77. Veneziale CM (editor): The Regulatwn ofCarbohydrate Formation and Utiiizaiion in Mammals. University Park Press, 1981.
Metabolizm glikogenu
20
WPROWADZENIE Glikogen jest gwn form magazynowania wglowodanw u zwierzt i jest odpowiednikiem skrobi u rolin. Wystpuje gwnie w wt robie (do 6%) i w miniach, gdzie rzadko przekracza 1%. Jednak minie, z powodu duej masy, zawieraj 34-krotnie wikszy zapas glikogenu ni wtroba (tab. 20-1). Glikogen, podobnie jak skrobia, jest rozgazionym polimerem ot-glukozy (p. ryc. 15-15).
Tabela 20-1. Magazynowanie wglowodanw u przecitnego dorosego czowieka (70 kg) w stanie postabsorpcyjnym Glikogen wtroby Glikogen mini Glukoza pozakomrkowa Masa wtroby 1800 g Masa mini 35 kg Cakowita objto 10 I 4,0% = 72 g' 0,7% = 245 g* 0,1% = 10 g"
kogenu i odkadaniem nieprawidowych postaci glikogenu, co prowadzi do osabienia mini, a nawet zgonu. GLIKOGEN WYSTPUJE GWNIE W MINIACH I W WT ROBIE W szlaku biosyntezy glikogenu bierze udzia specjalny aktywny nukleotyd glukozy (p. ryc. 20-1) ' Glukoza jest fosibrylowana do glukozo-6--fosforanu w reakcji, ktra jest rwnie pierwsz reakcj szlaku glikolizy z glukozy. Ta reakcja jest katalizowana przez beksokinaz w miniu i przez glukakinaze w wtrobie. Glukozo-6--fosforan jest zmieniany w glukozo-1-fosforan w reakcji katalizowanej prze2 fosfoglukomu-taz. Sam enzym jest fosforylowany w przebiegu reakcji, a grupa fosforanowa bierze udzia w reakcji odwracalnej, w ktrej zwizkiem porednim jest glukozo-l,6-bisfosforan.
Enz-P + Glukozo-6 fosforan <-t * Enz + Glukozo-1,6-bisfosforan *+ Enz-P + Glukozo-1-fosforan Nastpnie glukozo -1-fosforan reaguje z ury.-dynotriibsforanem (UTP), aby utworzy urydy-aodifosfoglukoz (UDPGic)* {ryc. 20-2).
327 g
ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glikogen mini jest atwo dostpnym rdem jednostek heksozowych do glikolizy w samym miniu. Glikogen wtroby gwnie magazynuje i eksportuje jednostki heksozowe w celu utrzymania fizjologicznego stenia glukozy we krwi, zwaszcza midzy posikami. Po 1218 h godzenia wtroba staje si niemal zupenie pozbawiona glikogenu, podczas gdy glikogenu w miniach znacznie ubywa tylko po dugotrwaym intensywnym wysiku. Choroby spich-rzania glikogenu s to dziedziczne zaburzenia, charakteryzujce si wadliw mobilizacj gli -
* S rwnie znane i inne zwizki bdce nuk-leozydodifosfopochodnymi cukrw, up. UDPGal. Ponadto ten sam cukier moe by poczony z rnymi nukleotydami, np. glukoza moe by przyczona do urydyny Gak to pokazano powyej), aie take do nukleotyd u guanozy nowego, tymidy nowego, adenozyno w ego lub cytydynowego.
218 / ROZDZIA 20
(jednostki Gllkogen (jednostki glukozylowe 1 -*i i 1 -*6)
SYNTAZA Enzym rozgaziajcy GUKOGENOWA Insulina glukozylowe 1-UDP . Prlmer ^ gllkogenu
_cAMP --------~*
Glukagon Adrenalina
i
I
FOSFORYLAZA TRANSFERAZA G L ENZYM ODGAZIAJCY L J KANOWA
ATP U rydyno d ifosf ag I u ko za (UDPGIc) KINAZA K
Wolna glukoza z enzymu odgaziajcego Do gltkollzy I szlaku pentozofosforan ADP oweg o Mg USLUKOKINAZA GI u k oz o-1 -f osf o ran FOSFOGL UKOMUTA ZA ATP
I+
NUKLEOZYDODH
GI u kozo-6-ost H,0 oran GLUKOZO-6-FOSFATAZA
-FOSFORANOWA
ADP
14
Glukoza
Ryc. 20-1. Szlak glikogenogenezy i glikogenolizy w wtrobie. 2 bogatoenergetyczne fosiorany s zuywane przy wbudowaniu 1 mola glukozy w glikogen. pobudzenie, hamowanie. Insulina zmniejsza stenie cAMP jedynie wwczas, gdy byo ono uprzednio zwikszone dziaaniem glukagonu lub adrenaliny, tzn. jest antagonist ich dziaania. Glukagon dziaa na misie sercowy, ale nie na minie szkieletowe. "Transferaza glukanowa i enzym odgaziajcy wydaj si by 2, oddzielnymi aktywnociami tego samego enzymu.
.C HjO H
H/OH IY3H HZ II II HO^rfO-P-O P-O-CH

T^^ I H OH O" i O"
Reakcja pomidzy glukozo -1-fosforanem i urydynotrifosforanem jest katalizowana przez Uracyl enzym pirofosforylaz UDFGlc.
UTP + Glukozo-1-fosforan UDPGIc + PP.
Nastpujca potem hydroliza nieorganiczne go pirofosforanu pod wpywem nieorganicznej Ryboza pirofosfatazy przesuwa reakcj na praw stron rwnania.
Ryc. 20-2. Urydynodifosfoglukoza {UDPGIc).
T
Glukoza
Dlfosforan
Urydyna
METABOLIZM GLIKOGENU / 219
Dziaaniem enzymu syntazy glikogenowej, C, aktywnej, glukozy UDPGlc tworzy wizanie glikozydowe z C4 kocowej reszty glukozowej glikogenu, uwalniajc urydyn od i fosforan (UDP). Aby zainicjowa t reakcj, musi by obecna istniejca ju wczeniej czsteczka glikogenu, czyli primer. Sam primer (wymawiaj prajmer) glikogenu moe by utworzony na szkielecie biakowym, co moe by procesem podobnym do syntezy innych glikoprotein (p. rozdz. 57).
UDPGlc + (C6) -* UDP + (C 6)n+1 Glikogen Glikogen
w czsteczce cakowita liczba miejsc zdolnych do reagowania, przyspieszajc zarwno gliko-genogenez, jak i glikogenoliz. Dziaanie enzymu rozgaziajcego badano na ywym organizmie zwierzcym, podajc glukoz znakowan i4C, a nastpnie badajc glikogen wtroby w odpowiednich odstpach czasu (ryc, 20-3).
GLIKOGENOLIZA NIE JEST ODWRCENIEM GLIKOGENOGENEZY, LECZ JEST ODRBNYM SZLAKIEM REAKCJI W szlaku degradacji jest zawarty mechanizm odgaziania (p. ryc. 20-1) Etapem ograniczajcym szybko glikogeno-lizy jest reakcja katalizowana przez fosforytaz.
(C e)n + Pj -* (C e)n-, + Glukozo-1-fosforan Glikogen Glikogen
Czci mechanizmu rozgaziania jest odczenie istniejcych ju acuchw glikogenu Dodawanie reszty glukozy do istniejcego ju acucha glikogenowego, czyli primera, nast-P.ujej!3._ nieredukujcym zewntrznym kocu czsteczki tak, e gazie" drzewa" glikogenu wyduaj sie wraz z sukcesywnym po wsta wa-niem wiza I ->4 fryc. 20-3), Gdy acuch zostanie przeduony do co najmniej 11 reszt glukozowych, wwczas inny enzym, enzym rozgaziajcy (amylo [l-+4i->[l->6]-ransglukozy-daza) przenosi cz acucha I ->4 (dugoci co najmniej 6 reszt glukozowych) na ssiedni acuch, tworzc wizanie l -*-6 i ustanawiajc w ten sposb punkt rozgazienia w czsteczce. Rozgazienia wzrastaj poprzez dalsze doda wanie jednostek l-4 glukozylowych i dalsze rozgazienia. Wraz ze zwikszeniem liczby nie-redukujcych reszt kocowych zwiksza si
Ten enzym jest swoisty dla fosfor o litycznego rozkadu (fosforolizy) wiza od-+4 w glikoge-nie z wytworzeniem glukozo-1-fosforanu. Z najbardziej zewntrznych acuchw czsteczki glikogenu s usuwane reszty glukozylowe, a do pozostania ok. 4 reszt glukozy po kadej stroaie rozgazienia l -*6 (ryc. 20-4). Inny enzym (a-[l->4]->a-[l -*4]-transferaza glukano-wa) przenosi jednostk trisacharydow z jed nego rozgazienia na inne, odsaniajc punkty rozgazienia 1-+6. Hydroli ty czne rozbicie wiza l->6 wymaga dziaania swoistego enzymu
o_o Wizanie giukazydowe 1 -4 o Reszty glukozy nie znakowane Oo Wizania glukozydowe 1-*6 Fteszty glukozy znakowane WC
Ryc. 20- 3. Biosynteza glikogenu. Mechanizm rozgaziania zosta wyja niony przez dodawanie gfukozy znakowanej 14C.
220 / ROZDZIA 20
FOSFORYLAZA TRANSFEHAZ A GLUKANOWA
ENZYM ODGAZIAJCY
Reszty glukozy poczone

Q_Q r wizaniami (jtukozydowyml
Reszty glukozy poczone

wizaniami glukozydawyml 1 -6
Wiele kowalencyjnych modyfikacji jest spowodowanych dziaaniem cAMP (3', 5'-cykliczny kwas adenylowy; cykliczny AMP) (p. ryc. 20-5 i str. 594). cAMP jest wewntrzkomrkowym porednikiem" albo drugim posacem, przez ktry dziaa wiele hormonw. Tworzy si on z ATP pod wpywem enzymu cyklazy adenyla-nowej, wystpujcej na wewntrznej powierzchni bony komrkowej. Cyklaza adenylanowa jest aktywowana takimi hormonami, jak adrenalina i noradrenalina, dziaajcymi przez receptory P-ad ren ergi czne w bonie komrkowej, a ponadto w wtrobie glukagonem dziaajcym przez niezaleny receptor glukagonu. Fosfodies-teraza rozkada cAMP i to wanie aktywno tego enzymu utrzymuje normalnie mae stenie cAMP. Wykazywano, e insulina zwiksza aktywno tego enzymu w wtrobie, zmniejszajc w ten sposb stenie cAMP.
NH,
Ryc. 20-4. Etapy glikogenolizy.
odgaziajcego (amy)o-[1 -j-glukozydazy). Po usuniciu rozgazienia moe postpowa dalsze dziaanie fosforylazy. Wsplne dziaanie fosforylazy i wspomnianych innych enzymw prowadzi do cakowitego rozkadu glikogenu. Reakcja katalizowana przez fosfoglukomutaz jest odwracalna, wobec czego z glukozo-1-fosforanu moe by wytwarzany glukozo-6-fos-forau, W wtrobie i w Derce (ale nie w miniach) "cTIzym' glukozo-6-fosfataza, ktry usuwa fosforan z glukozo-6-fosforanu, umoliwiajc powstajcej gJukozie dyfundowa-nic z komrki do krwi. Jest to kocowy etap glikogenolizy wtrobowej, ktra odzwierciedla si zwikszeniem stenia glukozy we krwi. CYKLICZNY AMP INTEGRUJE REGULACJ GLIKOGENOLIZY I GLIKOGENOGENEZY Gwne enzymy kontrolujce metabolizm glikogenu, tj. fosforylaza glikogenowa i syntaza glikogenowa, s regulowane przez zoon seri reakcji, wrd ktrych s zarwno mechanizmy allosteryczne (p. str. 123) jak i modyfikacje kowalencyjne, polegajce na odwracalnej fos-forylacji i defosforylacji enzymatycznego biaka (p. str. 127).
I
CHj
II
;H
" W
-O- PO /S \ \H H/
J ^>.
i n
rt u
OH
Ryc. 20-5. Kwas3',5'-adenylowy (cykliczny AMP, cAMP). ____________ _________________
W wtrobig fosforylaza istnieje zarwno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Aktywna fosforylaza (fosforytaza a) ma jedn z grup hydroksylowych seryny ufosforylowan przez wytworzone wizanie estrowe. Dziaaniem swoistej fosfatazy (fbsfataza-1 biaek), enzym ten zostaje unieczynniony, przez przeksztacenie go w fosforylaz b, w reakcji polegajcej na hydro-litycznym usuniciu fosforanu z reszty seryny. Reaktywacja wymaga refosforylacji z udziaem ATP i swoistego enzymu kinazy fosforylazy.
Fosforylaza wtroby rni si od fosforylazy misni
Miniowa fosforylaza jest immunologicznie i genetycznie odmienna od wtrobowej. Jest dimerem, a kady monomer zawiera 1 mol fosforanu pirydoksalu. Wystpuje w..2 postaciach, jako fostoryla/a a, ktra jest ufosforylo-wana i aktywna zarwno w obecnoci, jak 1 nieobecnoci AMP (jej allosterycznego mody fikatora), oraz fosforylaza b, ktra jest zdefos forylowana i aktywna jedynie w obecnoci AMP, co ma miejsce w czasie wysiku, kiedy stenie AMP si zwiksza. Fosforylaza a jest normaln fizjologicznie aktywn form enzy mu. Aktywacja miniowej fosforylazy odbywa si z udziaem cAMP Fosforylaza w miniu jest aktywowana przez adrenalin (ryc. 20 -6)! Jednake nie jest to .dziaanie bezporednie, lecz przez eAMP. Zwikszenie stenia cAMP aktywuje cAMP--zalen kinaz biaek, enzym o raczej szerokiej swoistoci. Ta kinaza katalizuje fosforylacj, z udziaem ATP, nieaktywnej kinazy b fosforylazy do aktywnej kinazy a fosforylazy, ktra z koJei przez kolejn fosforylacje aktywuje fosforyiaz b do fosfory Jazy a. Nieaktywna cAMP-zalena kinaza biaek ma 2 pary podjednostek. kada para skada si z podjednostki regulacyjnej (R), ktra wie 2 mol cAMP, oraz podjednostki katalitycz nej (C), ktra ma miejsce aktywne. Pocze nie z cAMP powoduje dysocjacj komplek su R 2 C 2, uwalniajc aktywne monomery C (p. str. 596). B,Ca + 4cAMP 2C + 2{R~cAMPt) Aktywny enzym Nieaktywny enzym Ca synchronizuje aktywacj fosforylazy ze skurczem minia Glikogenoiiza wjnigniu^ zwiksza si kil-kasetkrotnie bezporednio po rozpoczciu skurczu minia. Przyczynia si do tego szybka aktywacja kinazy fosforylazy przez CaJ~., ten sam sygna, ktry inicjuje skurcz. Miniowa kinaza fosforylazy ma 4 typy podjednostek: ot, (J, y i 5, w strukturze, ktr mona, przedstawi jako (apy)4. Podjednostki a i p maj reszty seryny, ktre s fosforylowane wskutek dziaania cAMP-zalenej kinazy biaek. Podjednostka p wie 4 Ca2+ i jest identyczna z biakiem wicym Ca2+ kalmodulin (p. str. 595). Zwizanie Ca2 aktywuje katalityczne miejsce
2
podjednostki y jedynie wwczas, gdy czsteczka znajduje si w zdefo'sforylowanej konfiguracji b. Jednake ufosforylowana posta a jest w peni aktywna w obecnoci Ca2 + . Jest wane, e kalmoduiina jest podobna w swojej strukturze do TpC, biaka wicego Ca2+ w miniach. Dodatkowa czsteczka kalmoduliny lub TpC moe oddziaywa z kinaza fosforylazy, powodujc dalsz aktywacj. Aktywacja skurczu minia i glikogenolizy jest wic dokonywana przez to samo biako wice Ca2+, zapewniajc w ten sposb synchronizacj tych procesw. Glikogenoiiza w wtrobie moe by niezalena od cAMP Pomimo, e gwnym dziaaniem glukagonu w wtrobie jest powodowanie powstawania cAMP i aktywacja fosforylazy, badania wykazay, e receptory a, s gwnymi porednikami pobudzenia glikogenolizy przez aminy katecho-lowe. Bierze w tym udzia niezalena od cAMP mobilizacja Ca 3+ z mitochondriw do cyto-zolu, w nastpstwie czego nastpuje pobudzenie wraliwej na CV + kalniotfulln kinazy fostory-lary. Niezalen od cAMP glikogenoliz wywouj rwnie wazopresyna, oksytocyna i angio-tensyna II, dziaajce przez wap albo przez fosfatydyloinozytolobisfosforan, Inaktywacja fosforylazy nastpuje pod wpywem fosfatazy -1 biaek Zarwno fosforylaza a, jak i kinaza a fos forylazy s defosforylowane i inaktywowane przez fosfataz-1 biaek. Fosfataza- biaek jest hamowana przez biako zwane inhibitorem-1 ktre jest aktywne jedynie wwczas, gdy zostanie ufosforylowane dziaaniem cAMP-zale-nej kinazy biaek, W ten sposb cAMP kontroluje zarwno aktywacj, jak i inaktywacj fosforylazy (ryc. 20-6). Aktywno syntazy glikogenowej i fosforyazy s regulowane wsplnie (p. ryc. 20-7) Podobnie jak fosforylaza, syntaza glikogeno-wa wystpuje w stanie ufosforylowanym i nie ufosforylowanym. Jednake, odmiennie ni w przypadku fosforylazy, aktywn form jest zdefosforylowany enzym (syntaza a glikogeno-wa), ktry moe by zinaktywowany do syntazy b glikogenowej przez fosforylacje 7 reszt seryny wskutek dziaania co najmniej 6 rnych kinaz biaek. Wszystkie 7 miejsc fosforylacji znajduje si na kadej z 4 identycznych podjednostek
Ryc. ZO-6. Kontrola fosforylazy w miniu (n = liczba reszt glukozy). Cig reakcji uoonych jako kaskada pozwala na zwielokrotnienie (wzmocnienie) sygnau hormonal nego na kadym etapie, _________
Adrenalina /t-recepior
B
73
O N
Nieaktywna cykl a za adenyl ano wa Aktywna cyklaza adenytanowa G!lkogen |rg
+
|F05F O O IE STE R AZ A ATP Ni eaktywna KINAZA BIAEK ZALENA ODcAMP I G!lkogen(B+11 cA MP ------------------------------------------------ * 5'-AMP
Aktywna KINAZA BIAEK ZALENA OO eA M P FOSFOHYLAZA a (aktywna) KALM ODULINOWY SKADNIK KINAZY FOSFORYLAZY
lnhlbttor-1 (nieaktywny)
ATP-
KINAZA b FOSFORYLAZY (nieaktywna)
KINAZA a FOSFORYLAZY (aktywna)
FOSFATAZA-1 BIAEK
ADP
FOSFATAZA-1 BIAEK lnhlbl tor-1 ufoeforyl owany (aktywny)
FOSFO RYLAZA b (nieaktywna)
Glukozo-1 -fosforan
METABOLIZM GLIK OGENU / 223 Adrenalina

/(-receptor Nieaktywna eyklaza ----------adenylanowa Aktywna eyklaza adenylanowa
O
F05F0DIESTERAZA ATP ATP cAMP SYNTAZA b GLIKOGENOWA (nieaktywna) - 5 ' A MP SYNTAZAa GLIKOGENOWA (aktywna) KINAZA FOSFATAZA FOSFORYLAZY BIAEK
Ca
Nieaktywna KINAZA BIAEK Glu kozo-6-fosforan ZALENA OD CAMP lnhlbltor-1 nieaktywny)
Aktywna KINAZA BIAEK ZALENA OD cAMP
Gllkogenln] + UDPG
KINAZA BIAEK ZALENA OD KALMODULINY ADP
FOSFATAZA-1 BIAEK
lnhlbltor-1 u fosfory Iow any (aktywny)
R yc. 20- 7. K ont r ol a synt azy gl i kogenow ej w m i ni u ( n = li czba r eszt gl ukozy) . C i g r eakcji u oony w kaskad pow oduj e wzm ocni enie na kadym et apie, pozw al aj c na t o, e zal edwie nanom olow e il oci horm onu pow oduj znaczne zmi any st eni a glikogenu, G SK kinaza -3, -4 i -5 synt azy glikogenow ej, wykow at e str za ki aktyw acja all ost er yczna.
enzymu. Dwie spord wspomnianych kinaz biaek s zalene od Ca2 + ,/kalmoduliny (jedna z nich to kinaza fosforyiazy). Inna z kinaz to cAMP-zalena kinaza biaek, ktra pozwala na
to, aby dzia anie hormonalne wywierane za porednictwem cAMP powodowao hamowanie syntezy glikogenu, zsynchronizowane z aktywa-
cj glikogenolizy. Pozostae kinazy s znane jako kinaza-3, kinaza-4 i kinaza-5 syntazy glikogenowej. Glu kozo - 6-fo sfora n jest allosterycznym aktywatorem syntazy b glikogenowej, powodujcym zmniejszenie Km dla UDP-glukozy i pozwalajcym na syntez glikogenu pod wpywem u fos fory Iow a nego enzymu. Glikogen wywiera
take hamujce dziaanie na tworzenie siebie samego, a insulina take pobudza wytwarzanie glikogenu w miniu przez sprzyjanie defos-forylacji i wobec tego aktywacji syntazy b glikogenowej. Defosforylacja syntazy b glikogeno wej zwykle odbywa si podczas dziaania fos fatazy-1 biaek, ktra pozostaje pod kontrol cAMP-zalenej kinazy biaek (ryc. 20-7).
224 / ROZDZIA 20
REGULACJA METABOLIZMU GLfKOGENU JEST EFEKTYWNA DZIKI RWNOWADZE MIDZY AKTYWNOCIAMI SYNTAZY GLfKOGENOWEJ I FOSFORYLAZY (p. ryc. 20-8)
Syntaza glikogenowa i fosforyiaza s zarwno pod kontrol substratw (przez allosteri), jak i pod kontrol hormonaln. Nie tylko fosforylaza jest aktywowana przez zwikszenie stenia cAMP (przez kinaz fosforyiazy), ale w tym samym czasie syntaza glikogenowa jest zamieniana w posta nieaktywn; obydwa skutki osiga si za porednictwem cAMP-za-
lenej kinazy biaek. Wobec tego zahamowanie glikogenolizy wzmaga efektywn glikogenoge-neze, natomiast zahamowanie glikogenogenezy zwiksza netto glikogenoliz. Istotne dla regulacji metabolizmu glikogenu jest stwierdzenie, e defosforylacja fosfory]azy a, kinazy fosforyiazy i syntazy b glikogenowej dokonuje si wskutek dziaania 1 enzymu o szerokiej swoistoci fosfatazy-1 biaek. Z kolei fosfataza-1 biatek jest hamowana przez cAMP-zalen kinaz biaek poprzez inhibitor-1 (ryc, 20-8). Wobec tego synchronicznie moe zosta przerwana glikoge-noliza, a wzmoona glikogenogeneza i odwrot nie, poniewa kluczem do regulacji obydwch tych procesw jest aktywno cAMP -zalenej
Adrenalina (wtroba.
FOSFODIESfTERAZA
* cAMP
-*- 5-AMP
lnhlbllor-1
KINAZABWLEK ZALENA OD OAMP
Glukoza (wtroba) Glukoza Mleczan (misie Inhibitor 1

ufosiorylowany
Byc. 20-8. S koordynowana ko ntrola glikogenotizy i glikogenogenezy przez kinazy biatek zalene o d cAMP. Reakcje, ktre prowadz do gtikogenolizy, w rezultacie zwikszenia stenia cAMP/zaznaczono grubymi strzakami, a te, ktre s hamowane, zaznaczono przerywanymi strzakami. Dzieje si odwrotnie, gdy stenie cAMP zmniejsza si w wyniku aktywnoci f osf od testera zy, co prowadzi do glikogenogenezy.
kinazy biaek. Zarwno kinaza fosforylazy, jak i syntaza glikogenu mog by odwracalnie fosforyiowane w wicej ni 1 miejscu przez odrbne kinazy i fosfatazy. Te wtrne fosfo-rylacje modyfikuj;} wraliwo pierwot nych miejsc fosforylacji na fosforylacj i defos-forylaej. Jest to znane jako wielomiejscowa fosfory lacja, Gwnym czynnikiem, ktry kontroluje metabolizm glikogenu w wtrobie, jest stenie fosforyazy a Ten enzym jest nie tylko etapem ograniczajcym szybko glikogenolizy, lecz take jest inhibitorem aktywnoci fosfatazy-1 biaek, przez co kontroluje syntez glikogenu (ryc. 20-8). Inaktywacja fosforylazy zachodzi jako wynik all o sferycznego hamowania przez glukoz wwczas, gdy jej stenie zwiksza si po posiku. Aktywacja jest powodowana pr2ez 5'-AMP jako reakcja na wyczerpanie si ATP. Podanie insuliny powoduje niezwoczn inak-tywacj fosforylazy z nastpujc aktywacj syntazyglikogenowej. Do osignicia tych dziaa insuliny niezbdna jest obecno glukozy. Enzymy rozgaziajcy i odgaziajcy nie s regulowane. CHOROBY SPICHRZANIA GLIKOGENU S DZIEDZICZNE Termin choroba spichrzania glikogenu" jest ogln nazw uywan do opisania grupy zaburze dziedzicznych, charakteryzujcych si odkadaniem nieprawidowego rodzaju lub nieprawidowych iloci glikogenu w tkankach. W typie 1 glikogenozy (choroba von Cierkego) zarwno kpjnrkj wtroby, jak i komrki kanalikw krtych nerki s^ w charakterystyczny sposb przeadowane glikogenem. Jednake te magazyny glikogenu me s dostpne, co uwidacznia si wystpowaniem hjgoglikemii i brakiem uwalniania glukozy pod wpywem takich bodcw, jak adrenalina lub glukagon. U chorych tych obserwuje si take ketoz i hiper-lip.emiL.co jest charakterystyczne~aTa"fgai)iz-mu pozbawionego wglowodanw. W wtro bie, nerce i w cianie jelit aktywno glukozo-6--fosfatazy jest skrajnie maa lub w ogle jej nie ma. Typ II (choroba Pompego) jest zgubny i charakteryzuje si niedoborem lizosomalncj a -l-4-i l-*6-glukozydazy {kwanej maltazy), ktrej
15 Biochemia
funkcj jest degradowanie glikogenu nagromadzajcego si w Uziomach. Typ 11.1 (graniczna dekstrynoza; choroba For-besa albo Coriega) charakte ryzuje si brakiem enzymu odgaziajcego, co powoduje nagromadzanie charakterystycznego rozgazionego polisacharydu. Tj_pJV (amylopektynoza: choroba Andersena) wynika z nieobecnoci enzymu rozgazi ajce-go^czego rezultatem jest to, e gromadzi si polisacharyd majcy niewiele punktw rozgazienia. Zgon nastpuje zwykle w pierwszym roku ycia z powodu niedomogi serca lub wtroby. Brak miniowej fosforylazy (miofosforyla-zy) jest przyczyn glikogenozy typu V (glikoge-noza z niedoboru miofosforylazy; zesp McArd-le'a). Chorzy wykazuj zwykle znacznie zmniejszon tolerancj na wysiek. Chocia ich minie szkieletowe wykazuj nienormalnie du zawarto glikogenu (2,54,1%), w krwi tych chorych po wysiku wykrywa si tylko w niewielkim steniu mleczan lub te cakowicie go brak. Wrd chorb spichrzenia glikogenu opisano take niedobr fosforyiazy w wtrobie (typ VI; choroba Hersa), niedobr fosfofruktokinazy w miniach i w erytrocytach (typ VII; choroba TaruPego) oraz glikogenoz, w ktrej wystpuje niedobr wtrobowej kinazy fosforylazy (typ VIII). Donoszono rwnie o niedoborach kinazy adenylanowej i cAMP-zalenej kinazy biaek.
PIMIENNICTWO
Cohen P: Conirol ofEnzyme Acthity, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Cohen P: Thc role of protein phoaphorylation in the hormonal control of enzyme activity. Eur J Biochem 1985; 151:439. Exton JH: Molecular mechanisms involved in a-adrenergic responses. Mol Cel! Endocrinoi 1981; 23:233. Geddes R: Glycogcn: A metabolic viewpoint. Bioscience Rep 1986;6:415. Hers HO: The control of glycogen metabolism in the liver. Annu Rev Biochem 1976;45:167. Randle PJ, Steiner DF, Whelan WJ (editors): Carbohydrate Metabolism and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, !98i. Siriver CR et al (editor): The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6th ed. McGraw-Hill, 1989. Sperlmg t), de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. Karger, 1978.
21
WPROWADZENIE
Glukoneogeneza i kontrola stenia glukozy we krwi

W procesie glukoneogenezy_ uczestnicz wszystkie "mechanizmy ~i s~zlaki odpowiedzialne za przeksztacenie zwizkw nie wglowo dano-wych.w glukoz lub glikogen,_Gtwny_mi_s_ub-stratami dla glukoneogeMey s glikogenne ani-nokwasy, mleczan, glicerolj (istotny u przeu waczy) propionian. G wnymi tkanka mi. w ktrych odbywJTi ten proces, s wtroba ingJjgdy one wanie zawieraj peen zestaw niezbdnych do tego enzymw. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Glukoneogeneza zaspokaja zapotrzebowanie organizmu na glukoz wwczas, gdy. wglowodany nie s dostpne w wystarczajcej iloci z dostarczanych pokarmw. Cige dostarcza nie glukozy jest niezbdne jako rdo energii, zwaszcza dla ukadu nerwowego i dla erytrocytw. Poniej pewnego krytycznego stenia glukozy we krwi wystpuje zaburzenie czynnoci mzgu, ktre w warunkach cikiej hipo-glikemii moe prowadzi do piczki i zgonu. Glukoza jest take potrzebna w tkance tuszczowej jako rdo glicerolu glicerydw i prawdopodobnie odgrywa rol w utrzymaniu odpowiedniego stenia zwizkw porednich cyklu cytrynianowego w wielu tkankach. Wiadomo, e nawet w warunkach, w ktrych tuszcze mog pokrywa wikszo zapotrzebowania energetycznego organizmu, zawsze istnieje pewne podstawowe zapotrzebowanie na glukoz. W dodatku glukoza jest jedynym rdlem.sner-gii dla minia szkieletowego w warunkach beztlenowych. Jest_ prekursorem cukru mleka_
( X i y X ^ J l ^ J ^ i pobierana przez pd. EodfiS!^ glukoneogenezy s take usuwane z krwi produkty metabolizmu innych tkanek, np. mleczan wytwarzany przez minie i erytrocyty oraz glkerol, ktry jest stale wytwarzany przez tkank tuszczow. Propionian. gwny glikogenny kwas tuszczowy, wytwarzany podczas trawienia wglowodanw przez przeuwacze, jest najwaniejszym, sub-stratem glukoneogenezy u tych gatunkw. GLUKONEOGENEZA OBEJMUJE REAKCJE GLIKOLIZY, CYKLU CYTRYNI ANOWEGO ORAZ NIEKTRE REAKCJE SPECJALNE (p. ryc. 21-1) Bariery termodynamiczne zapobiegaj prostemu odwrceniu glikolizy Krebs zwraca uwag na to, e bariery energetyczne nie pozwalaj na proste odwrcenie glikolizy: 1) pomidzy pirogronianiem a fos-foenolopirogronianem, 2) pomidzy fruktozo--1,6-bisfosforanem a fruktozo-6-fosforanem. 3} pomidzy glukozo-6-fosforanem a glukoz: oraz 4) pomidzy glukozo-1-fosforanem a glikoge-nem. Wszystkie te reakcje nie s w stanie rwnowagi, uwalnla}~cl:u ilo energii w postaci ciepa i wobec tego s fizjologicznie nieodwracalne. S one omijane poprzez specjalne reakcje. W mitochondriach znajduje si enzym karbok-sylaza pirogronianowa, ktry w obecnoci ATP, jednej z witamin B biotyny. oiaz^COi,. przeksztaca pirogronian w szczawiooctan. Funkcj biotyny jest zwizanie CO3 na enzymie
Pirogronian i fosfoenolopirogronian.
GLUKONE OGENE ZA I KONTROLA STENIA GLUKOZY WE K RWI / 227
przed przyczeniem go_do pirogronianu. Drugi :iuj m karLoi^^4ftzfoênolopirogroriiano wa, katalizuje przeksztacenkjzczawiogctan.u. do rosibepolopirogroiuanu. W tej reakcji jest niezbedjLy.bogato-energetyczny fosforan w postaci GTP lub-ITP. a uwalnia.si? GO.. Wobec tego, za pomoc tvch 2 enzymw i dehyd-rogenazy mleczanowej, mliyTan mothy ^ ^ p goi rjia^kury i krlika W-wa karboksykinaza fosfoeri ol ii)ii rtwwMua.no.wa jest enzymem mi loch ond Halnym i fosfoenolopirogro-nian jest transportowany do cytozolu w celu przeksztacenia go w fruktozo1,6-bisfosforan przez odwrcenie glikolizy. U szczura i u myszy len cnzvm jest w cvlo7ohi. a 1 e.. szcza wi noc ran nie dyCuadi]e]a^twQ.iLJJiaQdig.ndriw, Dostpne s natomiast alternatywne rodki do osignicia tego samego skutku kocowego; polegaj one na przeksztaceniu szcza wio octan u w zwizki, ktre mog atwo dyfundowa z mitochond-riw, i pniejszej rekonwersji do szczawiooc-tanu w pozamitochondrialnej czci komrki. Takim zwizkiem jest jabezan, ktrego tworzenie ze szczawiooctanu w mi loch on dri ach i rekonwersja do szczawiooctanu w pozamitochon-drialnym kompartmencie przebiega z udziaem dehydrogenazy jabezanowej. W_w^trobje_czo-i i i i k ^ morskiejj_wou_teiL enzym jest chojidrjaroi -i Qtazolem. Fruktozo-6-fosforan i fruktozo-1,6--bisfosforan. PzekszUiceni_iruklozo -l,-bisfosibraiiu ..do. fruktozo--fosforanu ko-nieczrie_ dq_osiagnicia odwrcenia ^likolizy^ jest katalizowane przez swoisty enzym fruk-tozJir.lU6-bisfosft^S. Jest to kluczowy enzym take z innego punktu widzenia, poniewa jego obecno warunkuje _.to, czy dana tkanka jest /dolna do biosyntezy glikogenu nie tylko z piro-gromanu, lecz take z fosfotrioz. Enzym len \vy stpuje, w. wtrobie i w iiertctch, wykazano jego wystpowanie take w miniu szkieletowy ni. U w;ia si, ze nie wystpuje on w miniu .serc.uw^KLLW miniu"gadkim. Glukozo-6-fosforan i glukoza. jYz_e r k_sztaiceniegJukjOZOj^fosforanu _w__jgl_ukoz jest _ katalizowane przez inna .aiwrintTi fnc-falsiz glukozo -6-fosfatazc. Wystpuje ona hi i \ nerkf h ale nie ma jej w miniu i w tkance tuszczowej. Obecno jej podwala tkance na_oddawaiiieglukQzy do krwi.
Glukozo-1 -fosforan i glikogen. Roz-
talizowany przez fosforylaze. Biosynteza gli-kogenu odbywa si cakiem odmiennym szla-Jdem, przez utworzenie urydynodifosfoglukozy i z udziaem syntazy glikogenowej (p. ryc: 20-1). Te kluczowe enzymy pozwalaj na to, e odwrcenie glikolizy odgrywa zasadniczy rol w glukoneogenezie. Zalenoci midzy gluko-..neagenez a flakiem glik o litycznym przedstawiono na ryc. 21-1. Aminokwasy glikogenne po transaminacji lub dcaminacji tworz albo piro-gronian. albo staj si czonami cyklu kwasu cytrynowego. Wobec tego powyej opisane reakcje s odpowiedzialne za przeksztacenie w glukoz lub glikogen zarwno aminokwasw gli-kogennych, jak i mleczanu. Wiadomo, e mle-_ cjn przeksztaca si w pirogronian i wnika do mitochondriw przed przeksztaceniem do szczawiooctanu i ewentualnym przeksztaceniem w glukoz. Propitmian jest gwnym rdem glukozy u przeuwaczy i wchodzi do gwnego szlaku glukoneogenezy przez cykl kwasu cytrynowego po przeksztaceniu w sukcynylo-CoA. _Pxapio-nia jest najpierw aktywowany z udziaem ATP i CoA przez odpowiedni syntetaz acylo-CoA. Propionylo-CoA, produkt tej reakcji, uczestniczy w reakcji wizania -CQ^ katalizowanej przez karboksylaz propionylo-CoA, czego wynikiem jest wytworzenie D^jnelyljQnia=..... lonyb-CoA (ryc. 21-2). Ta reakcja jest analogiczna do reakcji wizania CO2 do acetylo-CoA przez karboksylaz acetylo-CoA (p. rozdz. 23), w ktrej powstaje pochodna malonylowa, co wymaga udziau jednej z witamin biotyn^ jako koenzymu. D-Metylomalonylo-CoA musi by zamieniony w jego stereoizomer L-metylomalonylo-CoA przez racemaze mety-lomalonylo-CoA, zanim nastpi ostateczna izomeryzacja do sukcynylo-CoA. katalizowana przez izomeraz metylomalonylo-Co A, wymagajc witaminy B12 jako koenzymu. Wynikiem niedoboru witaminy B12 u ludzi i zwierzt jest wydalanie duych iloci metylomalonianu (acy-duria metylomalonowa). Chocia przemiana do bursztynianu jest gwnym szlakiem metabolicznym propionia-nu, to jednak moe on zapocztkowywa, w tkance tuszczowej i gruczole sutkowym, wytwarzanie kwasw tuszczowych o nieparzystej liczbie atomw wgla. Kwasy tuszczowe C, 5 i C 17 znajduj si w tuszczach, zwaszcza u przeuwaczy. Glicerol jest produktem metabolizmu tkanki tuszczowej i tylko te tkanki, ktre maj enzym
228 / ROZDZIA 21
Glukoza
J!gLUKOZt>6-f OSFATAZA |j H2O
ATP JGLUKOKINAZAl | HEKSOKIKAZA]
oi u i o - o - ^s
^_
Ao p
-fosforan
J?
t
Glikogen AMP
rp
AMP
FHUKTOZO-1,6B(SFOSFATAZA
A
ADP
\e \
fFOSFOFRUKTOKINAZA
Fruk tozo - _ ^ ___CAMP - 2.6-btefosforan (glukagon) FruWozo--^ 6-blsfosforan ! cAMP (glukagon)

e
FruktozoH|,6--bl sfosforan"
T
Gliceroloaldshyd o-3- fo sf o ran
P-dihydroksyacetor; DEKYDHOGENA2A KADH GLICEROLO-.-F OSFORANOWA
1,3-BtetosfogH(rynlan
GI!cerolo-3-fosforan KINAZA GLICEROLOW Al ATP
ATP 3-Foefogllcerynlan
2-Fo8foglloynlen cAMP (glukagon; Fosfoenoloplrogronian |0

Q
/ Alanina
. GDP + CO, Plrogronlan NADH L Mleczan
Kwasy tuszczowa Cytrynian
KARBOKSYU\ZA PtROGRONIANOWA
Cykl kwaau cylrynowago a-kstoglutaran
-ADP
GLUKONE OGENE ZA i KONTROLA ST ENIA GLUKOZY WE KRWI / 229 Hyc. 21 - 1. Gwne szlaki i regulacja glukoneogenezy i glikolizy w wtrobie. Punkty wejcia giikogennych aminokwasw po ich transaminacji s zaznaczone znaczkami s * (p. te ryc. 18 -7). Kluczowe enzymy gluko neo genezy s o bwiedzio ne po dwjn ramk. AT P niezbdny do gluko neo genezy po wstaje w procesie utleniania kwasw tuszczowych o dugim acuchu wglo wym. Propionian ma ilociowe znaczenie jedynie u przeuwaczy. Wykowatymi strzakami zaznaczono efekty allosteryczne, a strzakami z przerywan lini kowalencyjn modyfikacj przez odwracaln fosforylacj. Due stenia alaniny dziaaj jak sygna do glukoneogenezy" przez zahamo wanie glikolizy na etapie kinazy pirogronianowej. KARBOKSYLAZA I CH3 CoASH PROPIONYLO-CoA ' H- C -C O O " CO-S -CoA
D-Mstyto-m aionylo-CoA
RACEMAZA METYLOMALONYLO-CoA IZOMEHAZA coo- METYLOMALONYLO-CoA intermedlaty cyklu kwasu cytrynowego
CH,
Hj
"**
Koenzym B CO-S-CoA
L-Metyfomalonylo-CoA
ÔOC- -H CO-S-C o A
Sukcynylo-CoA
Ryc. 21-2. Metabolizm propio nianu.
aktywujcy go, kinaz glicerolow, mog go zjijttfeewa. Enzym ...tflii, wyTtiagaja6-..AIT, znajduje si poza innymi tkankami take w wtrobie i w nerce. Kinaza Hiceroinwa, ^triliziîe, zamian glicerolu w glicerolo-3-ibsfonia. czy si to z etapem triozofosforanw szlaku glikoli-tycznego, gdy gjicerolo^fo sioran moe.hyi utleniony __dj__dih^droksyacetonofosforan \] przez NAD+ w obecnoci dehydrogenazy glice-rolo-^^^nUffief Wtroba i nerka s zdolne do zamiapy licera lii w -glukozc krwi dziki y ^ y y ^ _ z y ^ i y _ zymw^jkolizy i swoistych enzym w, szlaku glukoneogenezy, fruktozo-,6 -bisfosfatazy i glukozo-6-fosfatazy (ryc. 21-1).
ste substratw we krwi, spowodowane zmianami ich dostpnoci z pokarmw, mog zmienia szybko wydzielania hormonw, ktre z kolei wpywaj na przebieg szlakw metabolicznych, zmieniajc czsto aktywno kluczowych enzymw w taki sposb, e d one do skompensowania pierwotnych zmian w dostpnoci substratu. Mona ziden tyfikowa 3 typy mechanizmw odpowiedzialnych za regulacj aktywnoci enzymw uczestniczcych w metabolizmie wglowodanw, a wymienionych w tab. 21-1: 1) zmiany szybkoci syntezy enzymu, 2) kowalencyjna modyfikacja przez odwracaln fosforylacj oraz 3) efekty allosteryczne.
Indukcja i represja kluczowych enzymw nie jest szybka, ale zachodzi w cigu kilku godzin
GLIKOLiZA I GLUKONEOGENEZA DZIEL TEN SAM SZLAK. MUSZ BY WOBEC TEGO WZAJEMNIE KONTROLOWANE
Zmiany w dostpnoci substratw s albo bezporednio, albo porednio odpowiedzialne za wikszo zmian w metabolizmie. Wahania
W tabeli 21-1 wymieniono niektre z tych lepiej udokumentowanych zmian aktywnoci enzymw, co do ktrych wiadomo, e zachodz w rnych warunkach metabolicznych. Informacja w tej tabeli odnosi si gwnie do wtroby. Enzymy tutaj zaangaowane katalizuj reak-
230 / ROZDZIA 21 Tabela 21-1. Enzymy regulacyjne adaptacyjne u szczura (gwnie w w t r obi e)
Aktywno przy karmieniu w glowodanami godze niu i w cukrzycy
Induktor
Rep resor
Aktywator
Inhibitor
Enzymy glikogenogenezy, glikolizy utleniania pirogron i anu Ukad syntazy glikogenowej Heksokinaza Glukokinaza Fosfofruktokinaza-1
Insulina
Insulina
Glukagon (cAMP), fosforylaza, glikogen *Glukozo-6-fosforan 'Cytrynian (kwasy tuszczowe, ciaa ketonowe), *ATP, glukagon (cAMP) ATP, alanina, glukagon (cAMP), adrenalina Acetylo-CoA, NADH, ATP (kwasy tuszczowe. cia a ketonowe)
t T
1 I
Insulina Insulina
Glukagon (cAMP) *AMP, "fruktozo-6-fosforan, *Pj *fruktozo-2,6-bisfosforan Glukagon (cAMP) *Fruktozo-1,6-bisfosforan CoA, NAD, insulina', ADP, pirogron ian
Kinaza pirogronianowa Dehydrogenaza pirogron Janowa
t I
1 I
Insulina, fruktoza
Enzymy glukoneogenezy
Karboksylaza pirogron i a nowa Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa Fruktozo-1,6-bisfosfataza
I 1 I
T I I
Giukokortykoidy, Insulina glukag on, adrenalina {cAMP) Giukokortykoidy, Insulina glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, glukagon, adrenalina (cAMP) Giukokortykoidy, glukagon, adrenalina (cAMP) Insulina
*Acetylo-CoA
*ADP
Glukagon?
Glukagon (cAMP)
*Fruktozo-1,6-bisfosforan, *AMP, fruktozo-2,6-bisfosforan
Glukozo-6-fosfataza
Insulina
Enzymy szlaku pentozofosforanowego i lipogenezy

Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa Dehydrogenaza 6-fosfoglukonianowa Enzym jabcza-nowy"
T I I
1 I i
Insulina
Insulina
Insulina
_________________ GLUKONE OGENE ZA I

cd. tab. 21 -1 Aktywno przy karmieniu wglowa danami ATP-liaza cytrynianowa Karboksylaza acetylo-CoA Syntaza kwasu tuszczowego godzeniu i w cukrzycy Induktor
KONTROLA STENIA GLUKOZY WE K RWI / 231
Rep resor
Aktyw ator
Inhibitor
T t T
1 I I
Insulina Insulina? * Cytrynian, insulina Insulina? ADP Dugota cuch owy acylo-CoA, cAMP, glukagon
Ali o sferyczny " W tkance tuszczowej, ale nie w wtrobie
cje^nie bdce w sianie rwnowagi i mona je uwaa raczej za fizjologicznie przebiegajce :,w jedn stron" ni osigajce stan rwnowagi. Czsto wymienione w niej procesy s wzmocnione, poniewa aktywno enzymw katalizujcych zmiany w odwrotnym kierunku ulega rwnoczesnym zmianom (ryc. 21-1). Jest wane, aby kluczowe enzymy zaangaowane w odpowiedni szlak metaboliczny ulegay w sposb skoordynowany aktywacji lub hamowaniu. W tabeli 21-1 pokazano, e tak jest rzeczywicie. Wszystkie enzymy uczestniczce w zuywaniu glukozy (tj. enzymy glikolizy i lipogenezy) staj si bardziej aktywne wwczas, gdy wystpuje obfito glukozy, natomiast w tych warunkach enzymy odpowiedzialne za wytwarzanie glukozy podczas glukoneogenezy wykazuj ma aktywno. Wydzielanie insuliny, ktre jest wraliwe na stenie glukozy we krwi, wzmaga biosyntez enzymw odpowiedzialnych za gli-koliz. Podobnie wydzielanie insuliny przeciwdziaa pobudzaniu enzym w; odpowiedzialnych za glukoneogeneze, a zachodzcej jako efekt dziaania glikokortykosteroidw i cAMP powstajcego pod wpywem glukagoiiu. Wszystkim tym dziaaniom, ktre mog by wyja nione indukcj lub represj enzymw, mona zapobiec dziaaniem czynnikw blokujcych biosyntez biaka, takich jak puromycyna i etio-nina. Wykazano, e jest regulowany mRNA tych enzymw i e zachodzi modulacja ekspresji ich genw.
Obydwie dchydrogenazy cyklu pentozofosforanowego mog by zaliczone do enzymw adaptacyjnych, gdy ich aktywno zwiksza si u dobrze odywionych zwierzt oraz po podaniu insuliny zwierzciu z cukrzyc. Aktywno tych enzymw jest maa w cukrzycy i w okresie godzenia. Podobnie zachowuj si enzym jab-czanowy" i ATP-zalena liaza cytrynianowa, co wskazuje na to, e te 2 enzymy s raczej zaangaowane w lip o genez ni w glukoneoge-nez. Kowalencyjna modyfikacja przez odwracaln fosfory iacj zachodzi szybko Glukagon, a_3'.imiijszj:tn,stopniu adrenalina, hamuj glikoli/, natomiast pobudzaj glukoneogenez w wtrobie przez zwikszenie stenia cAMP, ktry z kolei aktywuje cAMP -zalen Klnaz biaek, doprowadzajc do foslbrylacji i inaktywacji kinazy pirogronianowej. Obydwa te hormony wpywaj rwnie na stenie fruktozo-2,6-bisf o sfor an u i wôbec tego na glikoliz i gluk one o genez w sposb wyjaniony poniej. Aliosteryczna modyfikacja jest rwnie szybka Znane s przykady z metabolizmu wglowodanw, ilustrujce allosteryczn regulacj enzymu. W procesie glukoneogenezy synteza szczawiooetanu z wodorowglanu i pirogronia-hu, Aktora jest katalizowana przez karboksylaz
232 / ROZDZIA 21
pirogi omanowy, wymaga obecnoci acetyl o-Co A jako aktywatora allosterycznego. Dodanie acetyl o-Co A powoduje zmian czwartorzdowej struktury biaka, zmniejszajc warto Km dla wodorowglanu. To dziaanie ma wane nastpstwa dla samoregulacji przemian pored nich: gdy powstaje acetylo-CoA z pirogronianu, przez aktywacj karboksylazy pirogroniano-wej, zapewnia on niejako automatycznie dostarczanie szczawiooctanu i wobec tego moliwo swojego dalszego utleniania w cyklu kwasu cytrynowego. Aktywacja karboksylazy pirogronianowej i rwnoczesne hamowanie de-hydrogenazy pirogronianowej przez acety-lo-CoA, powstajcy z utjeniania kwasw tuszczowych, pomaga wyjani oszczdzajce dziaanie utleniania kwasw tuszczowych na utlenianie pirogronianu w wtrobie i pobudzenie glukoneogenezy wtrobowej. Odwrotny stosunek midzy aktywnoci dehydrogenazy pirogronianowej a karboksylazy pirogronianowej zarwno w wtrobie, jak i w nerce zmienia metaboliczne losy pirogronianu wwczas, gdy tkanka przechodzi z utleniania wglowodanw podczas glikolizy na gl ukoneogenez. Taka zmiana ma miejsce przy przechodzeniu stanu poresorpcyjnego w stan godu (ryc. 21-1). Zasadnicz rol utleniania kwasw tuszczowych w pobudzaniu glukoneogenezy jest dostarczanie ATP, potrzebnego w reakcjach karboksylazy pirogronianowej i kar boksy kinazy fosfo-enolopirogronianowej. Innym enzymem, ktry podlega kontroli na zasadzie hamowania zwrotnego, jestJfosjMruk-. tokinaza (fosfofrukrokinaza-1). Zajmuje ona kluczow pozycj w regulacji glikolizy. Fosfo-fruktokinaza-1 jest hamowana przez cytrynian i przez ATP, natomiast jest aktywowana przez AMP. AMP dziaa jak wskanik stanu energetycznego komrki. Obecno kinazy adenyla-nowej w wtrobie i w wielu innych tkankach pozwala na szybkie osignicie rwnowagi rea2ADP kcji: ATP + AMP Kiedy ATP jest zuywany w procesach wymagajcych energii, czego rezultatem jest powstawanie ADP, wtedy zwiksza si [AMP]. Poniewa w stanic rwnowagi [ATP] moe by 50-krotnie wiksze od [AMP], mae czstkowe zmniejszenie [ATP] spowoduje wielokrotne zwikszenie [AMP]. Dua zmiana w [AMP] jest zatem wyrazem tego, e dziaa ona jako wzmacniacz malej zmiany w [ATP]. Ten mechanizm
pozwala na to, e aktywno fosfofruktokinazy--1 jest bardzo czua nawet na mae zmiany w stanie energetycznym komrki i e kontroluje ona ilo wglowodanw ulegajcych giikolizie przed wejciem do cyklu kwasu cytrynowego. Zwikszenie stenia AMP moe by rwnie wyjanieniem, dlaczego glikoliza zostaje pobudzona w czasie niedotlenienia, gdy [ATP] maleje. Rwnoczenie AMP aktywuje fosforylaz, wzmagajc glikogenoliz. Inhibicja fosfofruk-tokinazy-1 przez cytrynian i ATP mogaby by jeszcze jednym wyjanieniem oszczdzajcego dziaania utleniania kwasw tuszczowych na utlenianie glukozy, a take wyjanieniem efektu Pasteura; ten ostatni jest zjawiskiem hamowania beztlenowego (anaerobowego) metabolizo-wania glukozy przez jej aerobowe utlenianie (w cyklu kwasu cytrynowego). Konsekwencj zahamowania aktywnoci fosfofruktokinazy-1 jest nagromadzenie glukozo-6-fosforanu, ktry z kolei hamuje dalsze pobieranie glukozy w tkankach po za wtrobowych przez allosterycz-ne hamowanie heksoldnazy.
Fruktozo-2,6-bisfosforan odgrywa wyjtkow rol w regulacji glikolizy i glukoneogenezy

Najbardziej skutecznym pozytywnym efektom cemall o sferycznym fosfofruktokinazy-1, a inhibitorem fruktozo-1,6-bis fosfatazy w wtro bie, jest fmktozo-2,6-bisfosforan. nosjônjha; mowanie fosfolruktokinazy-l przez ATP i powoduje zwikszenie powinowactwa do fruk-tozo-6-fosforanu. Powoduje trjzo-jj-Jbisfosfatazy przez zwikszenie wartoci K, dla fruktozo-l,6-bisfosforanu. Jego stenie jest zarwno pod kontrol substratow (allosteryczn), jak i hormonaln (modyfikacja kowalencyjna) (ryc. 21-3). Fruktozo-2,6-bisfosforan powstaje przez fos-forylacj fruktozo-6-fo sforami dziaaniem ?5s-fofruktokinazj-2, Zo^samo biako enzymatyczne jest odpowiedzialne rwnie za jego rozpad, poniewa ma take aktywno fruktozo-l-bis-fosfatazy. Ten bifunkcyjny enzym jest pod allosteryczn kontrol fruktozo-6-fsTo7anu7Tt-reg" zwikszone stenie wystpujre~przx;pb-fitoci glukozy, a wic w stanie poposikowym pobudza kinaz oraz hamuje fosfataz. Jeeli natomiast wystpuje niedobr glukozy, gluka-gon pobudza wytwarz anie cAMP, aktywujc cAMP-zalen kinaz biaek, ktra z kolei inaktywuje fosfofruktokinaz-2 oraz aktywuje fruktozo-2,6-bisibsfataz przez fosforylacj.
G LU K O N E O G E N E ZA I K O N TR O LA S T E N IA G LU K O ZY W E K R W I / 233 Glukoza I Glikogan
e to, e gobudzeoie glikogenoUzj; glukagonem w_wtrobie prowadzi raczei do uwalniania glukozy ni do wzmoonej gtikolizy.
Cykle substratowe (daremne) pozwalaj na subtelne dostrajanie

KINAZA BIAEK ZALENA 00 cAMP
Fr u Ktoz o-6-f sio ran Glukagon Fru ktozo-1,6-bisf osforan Pirg ronlan R yc. 21- 3. K ont r ol a gt i kol i zy i gl ukon eo ge n ezy w wtr obi e pr zez f nj kt ozo - 2, 6- bi sf osf or an ibif unk-- Gy^ hy enzym P FK- 2/ F- 2, 6- P az <6-f osf ofr ukt o- 2-- ki naz/fr ukt ozo - 2, 6- bisf osf at az) . PFK f osf o-f rukt oki naza (S -f osf ofr ukt o- 1- ki naza), F- 1, 6-P aza fru ktozo- 1, 6- bisf osf ataza. Strzaki wykow at e oznaczaj efekty allost eryczne.
W wielu punktach kontrolnych glikolizy i metabolizmu glikogenu s zawarte cykle fosforyla-cji i defosforylacji, np. glukokinaza/glukozo-6--fosfataza; fosfofruktokinazal/fruktozo-1,6--bisfosfataza; kinaza pirogronianowa/karbo-ksylaza pirogronianowa/karboksykinaza fosfo-enolopirogronianowa. Gdyby byy one pozostawione bez kontroli, wwczas stanowiyby ilociowo pokane cykle daremne, ktrych rezultatem kocowym byaby jedynie hydroliza ATP. To, e tak si nie dzieje na wielk skal, zabezpieczaj rne mechanizmy kontrolne, dziki ktrym jedno rami cyklu jest hamowane wwczas, gdy przeciwne ulegaj pobudzeniu zgodnie z potrzebami tkanki i caego organizmu. Jednake w pewnych przypadkach moe istnie korzy z tego, e cykl przebiega swobodnie. Na przykad w cyklu foslbfruktokina-za-l/fruktozo-1.6-bisfosfataza, zachodzi wzmocnienie efektu allosterycznego modyfikatora fru-ktozo-2,6-bisfosforan u, powodujc wikszy przepyw metabolitw w ktrymkolwiek kierunku, ni miaoby to miejsce bez udziau cyklu substratowego. To subtelne dostrajanie" kontroli metabolicznej zachodzi jedynie kosztem utraty pewnej iloci ATP.
STENIE GLUKOZY KRWI JEST PRECYZYJNIE REGULOWANE W WSKICH GRANICACH

W stanie poabsorpcyjnym stenie glukozy u ludzi i u wielu ssakw waha si w granicach 4,5 5,5 mmoi/L Pa.spoyc|uposiku3! glmja> Hanowego moe si ono zwiksza do 6,57,2 jmoj/L-W czasie godzenia stenie glukozy zmniejsza si do"ok, JT-PT,? mmol/l. Stenie glukozy we krwi ptakw jest znacznie wiksze (14,0 mmol/l), a u przeuwaczy znacznie mniejsze (2,2 u owiec a 3,3 mmol/l u byda). Te normalnie mniejsze stenia wydaj si by zwizane z faktem, e u przeuwaczy waciwie wszystkie wglowodany pokarmu fermentuj do niszych (lotnych) kwasw tuszczowych, ktre w duej mierze zastpuj glukoz jako gwne metaboliczne rdo energii tkanek w okresie midzy posikami. Gwatowne zmniej-
Przy nadmiar/i- glukozy zwiksza sig wic stenie fniktozu-2.(t-hisfostoriinu, pobudzajc gUko-lize przez aktywacj fosfofruktokinazy-1 oraz hamowanie fniktoziMj6-bisfosfatazy. W warunkach niedoboru-^glukozy gkjkoneogeneza jest pobudzana przez zmniejszenie stenia fruk-tozo-2,6-bisfosforan u, ktry inaktywujc fosfo-lr.uktoJunaz-1 oraz znosi hamowanie fruktozo--1.6-bisfostatazy. Ten mechanizm zapewnia tak-
234 / ROZDZIA 21
szenie stenia giukozyjwjawgowoduje drga wki, podobnie~jakprzy przedawkowaniu insuliny, ze wzgldu na bezporednie uzalenienie mzgu od dostawy glukozy. Jednake znacznie mniejsze stenia glukozy mog by dobrze tolerowane pod warunkiem, e pozwoli si na stopniow adaptacj; np. szczury zaadaptowa ne do diety boga to tuszcz owej zachowuj si zupenie normalnie przy tak maym steniu glukozy we krwi, jak 1,1 mmol/1. GLUKOZA KRWI POCHODZI Z POKARMW, GLUKONEOGENEZY I GLIKOGENOLIZY tych pokarmach. Wikszo wglowodanw po trawie-niu pokarmw~t glukoza, galktoza 1 fruktoza. S one transportowane do wtroby przez y wrotn. G a laktoza i fruktoza s atwo przeksztacane w wtrobie w glukoz (p. rozdz. 22). Glukoza pochodzca z rnych zwizkw glukogennych, ktre ulegaj glu-koneogenezie (ryc. 18-7 i 21-1). S to zwizki 2 kategorii: 1) ulegajce bezporedniemu prze ksztaceniu w glukoz bez znaczcej recyklizacji, np. niektre aminokwasy i propionian i 2) zwizki bdce produktami czciowego meta bolizmu glukozy w niektrych tkankach, ktre po dostaniu si do wtroby i nerek s prze ksztacane w glukoz. 1 tak mleczan, powstay z glukozy w miniach i erytrocytach, jest transportowany do wtroby i nerek, gdzie jest przeksztacany w glukoz. W ten sposb ta ostatnia dostajc si do krwi staje si ponownie dostpna dla tkanek do utleniania. Ten proces jest znany jako cykl Cori lub cykl kwasu mle kowego (ryc. 21-4). GUcerol do syntezy triacylogliceroli tkanki tuszczowej pochodzi z glu kozy krwi. Acyloglicerole tkanki tuszczowej cigle ulegaj hydrolizie, wytwarzajc gjicerol, ktry nie moe by zuytkowany przez tkank tuszczow i wobec tego dyfunduje do krwi. Jest on ponownie przeksztacany w glukoz przez mechanizmy glukoneogenezy w wtrobie i w nerce (ryc. 21-1). Istnieje zatem cigy cykl, w ktrym glukoza jest transportowana z wtroby i nerek do tkanki tuszczowej, a glicerol powraca z tkanki tuszczowej do wymie nionych narzdw, aby ulec resyntezie do glu kozy. Wrd aminokwasw transportowanych
Glukoza wglowodanw w spoy -
z mini do wtroby w czasie godzenia _p_rge-waa alanina! DopfowacTzifoTo do postulowania istnienia cyklu glukozowo-alaninowego. przedstawionego na ryc. 21-4, w wyniku ktrego glukoza z wtroby przepywa do mini L utworzeniem tam pirogronianu ulegajcego transaminacji do alaniny. Alanina jest nastpnie transportowana do wtroby, aby w procesie glukoneogenezy przeksztaci si ponownie w glukoz. W ten sposb dokonuje si transport azotu aminowego z mini do wtroby oraz wolnej energii z wtroby do mini. Energia potrzebna do wtrobowej syntezy glukozy z pirogronianu pochodzi z utleniania kwasw tuszczowych. Glukoza powstajca z glikogenu, wtroby podczas glikogenolizy, (p. rozdz. 20). Metaboliczne i hormonalne mechanizmy kontroli stenia glukozy we krwi Utrzymywanie staego stenia glukozy we krwi jest jednym z najbardziej precyzyjnie regulowanych mechanizmw homeostatycznych i to takim, w ktrym odgrywa rol zarwno wt roba, jak i tkanki pozawtrobowe, a take wiele hormonw. Przez komrki wtrobowe wydaje si swobodnie przenika glukoza, podczas gdy komrki tkanek poza wtrobowych s dla niej stosunkowo nieprzenikalne. Wynikiem tego jest, e przechodzenie przez bony komrkowe jest etapem ograniczajcym szybko pobierania glukozy przez tkanki pozawtrobowe. Po wnikniciu do komrki glukoza jest szybko fosforylo-wana dziaaniem heksokinazy. Jest prawdopodobne, e na pobieranie glukozy przez wtrob i jej oddawanie z wtroby do krwi bardziej bezporedni wpyw wywieraj aktywnoci niektrych enzymw i stenia kluczowych zwizkw porednich. Stenie glukozy we krwi jest jednak wanym czynnikiem kontrolujcym szybko pobierania glukozy zarwno przez wtrob, jak i przez tkanki pozawtrobowe,
Glukokinaza jest wanym regulato rem stenia glukozy we krwi po posi ku.
Naley zauway, e heksokinaza jest hamowana dziaaniem glukozo-6-fosforanu. Ten ostatni metabolit moe wic wywiera pewne hamowanie zwrotne na pobieranie glukozy przez tkanki pozawtrobowe zalene od fosfory! o warna glukozy dziaaniem heksokinazy. Wtroba nie podlega takiemu ograniczeniu, poniewa glukoki nic jest wraliwa na dziaanie gmkozo-6-
Pirogronian .* .i^ i--!- ..> -- -'." *'
ii
Ryc. 21-4. Cykl kwasu mlekowego (Cori) i cykl ala ni nowo- glukozowy.
236 / ROZDZIA 21 .100 Heksokinaza
50 o o GlukoKinaza
10 15 Glukoza krwi, mmoi/1
20
25
Ryc. 21-5. Zmiany aktywnoci fosforylujcej glukoz heksokinazy i glukokinazy w zalenoci od zwikszajcego si stenia glukozy we krwi. Km heksokinazy dla glukozy wynosi 0,05 mmol/i, a Km glukokinazy 10 mmol/l.
Insulina odgrywa centraln rol w regulacji stenia glukozy we krwi. Poza
-fosforanu. Glukokinaza, ktra ma wiksz warto Km (mniejsze powinowactwo) dla glukozy ni heksokinaza, zwiksza swoj aktywno wraz ze zwikszeniem stenia glukozy w przedziale fizjologicznych ste tego zwizku (ryc. 21-5) i wydaje si w swoisty sposb sprzyja pobieraniu glukozy do wtroby, w przypadku jej duego stenia wystpujcego w yle wrotnej po posiku wglowodanowym. Brak glukokinazy u przeuwaczy, u ktrych niewiele glukozy przechodzi z jelita do krenia wrotnego, wydaje si potwierdza t funkcj tego enzymu. Przy prawidowym steniu glukozy w krcej krwi (4,55,5 mmol/l), wtroba wydaje si by producentem glukozy. Jeeli jednak stenie gJukozy si zwiksza, to wydalanie glukozy przez wtrob ustaje, a przy duym steniu pobiera ona glukoz z krwi. Ustalono, e u szczura szybko oddawania glukozy przez wtrob staje si rwna szybkoci pobierania przy steniu w yle wrotnej wtroby rwnym 8,3 mmol/l.
bezporednim wpywem hiperglikemii na pobieranie glukozy zarwno przez wtrob, jak i tkanki obwodowe, zasadnicz rol w regulacji stenia gJukozy we krwi odgrywa hormon insulina. Wytwarzaj j komrki B wysp trzustkowych, a wydziela si do krwi wskutek bezporedniej reakcji na hiperglikemi. Jej stenie we krwi zmienia si rwnolegle ze steniem
glukozy, a szybkim skutkiem jej podania jest hipoglikemia. Do substancji pobudzajcych wydzielanie insuliny nale take aminokwasy, wolne kwasy tuszczowe, ciaa ketonowe, gluka-gon, sekretyna oraz lek tolbutamid. Adrenalina i noradrenalina blokuj uwalnianie insuliny. Insulina pobudza natychmiast pobieranie glukozy przez takie tkanki, jak tkanka tuszczowa i miniowa. To dziaanie jest spowodo wane wzmoonym transportem przezbono-wym glukozy uwarunkowanym przeniesieniem transportera insulinowego z wntrza komrki do bony plazmatycznej. Insulina nie ma natomiast bezporedniego wpywu na penetracj glukozy do komrek wtrobowych. To stwierdzenie jest zgodne z faktem, e szybko metabolizmu glukozy w komrkach wtro bowych nie jest ograniczana ich przenikalno-ci. Jednake insulina wpywa porednio na pobieranie glukozy przez wtrob, dziaajc na enzymy kontrolujce glikoliz i glikogeno-genez. Glukagon jest hormonem wytwarzanym przez kom rki A wysp trzustkowych. Jego wydzielanie jest pobudzane przez hipoglikemie. Gdy dostanie si do wtroby (przez y wrot-n), pobudza glikogenoliz przez aktywacj fosforylazy. Wikszo endogennego giukago-nu jest usuwana z krenia przez wtrob. Odmiennie ni adrenalina, glukagon nie ma wpywu na fosforylaz mini. Glukagon wzmaga rwnie glukoneogenez z aminokwasw i mleczanu. Zarwno glikogenoliza wtrobowa, jak i glukoneogeneza uczestnicz w hi-perglikemizujcym dziaaniu glukagonu, ktrego dziaania s przeciwne do insuliny. Przedni pat przysadki mzgowej wydziela hormony, ktre zwikszaj stenie glukozy krwi, a wic dziaaj antagonistycznie w stosunku do insuliny. S to: hormon wzrostu, kor-tykortofina (ACTH) i zapewne inne czynniki diabetogenne". Wydzielanie hormonu wzrostu pobudza hipoglikemia. Hormon wzrostu zmniejsza pobieranie glukozy przez niektre tkanki, np. przez minie. Niektre z tych dziaa mog by nie bezporednie, wiadomo bowiem, e hormon wzrostu mobilizuje z tkanki tuszczowej wolne kwasy tuszczowe, ktre same zmniejszaj zuycie glukozy. Dugotrwae podawanie hormonu wzrostu prowadzi do cukrzycy. Hormon wzrostu wywoujc hiperghke-mi, pobudza wydzielanie insuliny, powodujc czasami wyczerpanie komrek B (i w konsekwencji cukrzyc).
GLUKONE OGENE ZA I KONTROLA STENIA GLUKOZY WE K RWI / 237
Glikokortykosteroidy (11-oksosteroidy) s wydzielane przez kor nadnerczy i s istotne dla metabolizmu wglowodanw. Podanie tych steroidw pobudza glukoneogenez. Zwikszenie glukoneogenezy jest wynikiem zwikszonego katabolizmu biaek w tkankach, zwikszonego pobierania aminokwasw przez wtrob i zwikszonej aktywnoci amino tran sfe raz i innych enzymw wtrobowych zwizanych z gluko-neogenez. Ponadto glikokortykosteroidy ha muj zuycie glukozy w tkankach pozawtrobo-wych, dziaaj wic anagonistycznie w stosunku do insuliny. Adrenalin wydziela rdze nadnerczy* pod wpywem bodcw stresogennych (strach, podniecenie, krwotok, hipoglikemia, hipoksja itd.). Pobudza ona glikogenoiiz w wtrobie i miniu wskutek pobudzenia fosforylazy. Brak gluko-zo-6-fosfatazy w miniach sprawia, e glikoge-noliza wie si z powstawaniem mleczanu, podczas gdy w wtrobie gwnym jej produktem jest glukoza, co jest przyczyn zwikszenia stenia glukozy we krwi. Hormony tarczycy powinny by rwnie rozpatrywane jako wpywajce na stenie glukozy we krwi. Istniej dane dowiadczalne przemawiajce za tym, e tyroksyna ma dziaanie diabetogenne, a usunicie tarczycy przeciwdziaa rozwojowi cukrzycy. Zauwaono rwnie cakowity brak glikogenu w wtrobach zwierzt z tyreotoksykoz. U chorych z nadczynnoci tarczycy stenie glukozy we krwi na czczo jest zwikszone, natomiast jest zmniejszone u chorych z niedoczynnoci tego narzdu. Naley jednak doda, e u chorych z nadczynnoci tarczycy utylizacja glukozy przez tkanki jest normalna lub zwikszona, natomiast u chorych z hipotyreoz jest zmniejszona. Chorzy z niedo-czynnoci tarczycy s znacznie bardziej wraliwi na hipoglikemiczne dziaanie insuliny ni osoby zdrowe lub chorzy z hipertyreoz. Glukozuria wystpuje wwczas, gdy jest przekroczony prg nerkowy dla glukozy Kiedy stenie giukozy we krwi zwiksza si do stosunkowo duego, wtedy rwnie nerka dziaa regulujco na glikemi. Glukoza jest wci przesczana w kbuszkach nerkowych, ale normalnie powraca w caoci do krwi, ulegajc wchanianiu zwrotnemu w kanalikach nerkowych. Wchanianie zwrotne glukozy wbrew gradientowi ste jest energochonne i wymaga obecnoci ATP w komrkach kanali-
kowych. Zdolnoi kanalikw nerkowych do wchaniania zwrotnego glukozy jest ograniczona do ok. 350 mg/min. Gdy stenie glukozy we krwi jest zwikszone, ilo przesczanej w kbuszkach nerkowych glukozy przekracza pojemno resorpcyjn kanalikw nerkowych w stosunku do glukozy i wwczas stwierdza si obecno glukozy w moczu, czyli glukozuri. U osb zdrowych glukozuria pojawia si wtedy, kiedy stenie glukozy we krwi ylnej jest wiksze ni 9,510mmol/l. To stenie jest nazywane progiem nerkowym dla glukozy. Glukozuri mona wywoa u zwierzt dowiadczalnych floryzyn, ktra hamuje ukad reabsorbujcy w kanaliku. To zjawisko jest znane jako glukozuria nerkowa. Glukozuria pochodzenia nerkowego moe by wynikiem wrodzonych wad kanalikowych, moe te by nabyta jako wynik procesw chorobowych. Stwierdzenie glukozurii jest czsto objawem cukrzycy (diabetes mellitus). Niedobr fruktozo -1,6-bisfosfatazy powoduje laktacydoz i hipogtikemi Blokowanie glukoneogenezy przez niedobr tego enzymu nie pozwala na przeksztacanie w wtrobie mleczanu i innych substratw glu-kogennych w glukoz. Ten stan moe by kontrolowany przez karmienie pokarmami o duej zawartoci wglowodanw. MONA SI PRZEKONA O ZDOLNOCI ORGANIZMU DO ZUYWANIA GLUKOZY, OZNACZAJC JEGO TOLERANCJ NA GLUKOZ Wskanikiem tolerancji glukozy jest przebieg krzywej stenia glukozy we krwi po podaniu okrelonej iloci glukozy (ryc. 21-6). Diabetes mellitus (cukrzyca, moczwka sodka) charakteryzuje si zmniejszon tolerancj na glukoz spowodowan niedostatecznym wydzielaniem insuliny (cukrzyca typu 1 albo cukrzyca in-sulinozalena; ang.: insulin-dependent diabetes mellitus. IDDM). Charakteryzuje si ona zwikszonym steniem giukozy we krwi (hiper-giikemia) oraz glukozuria (cukromoczem), a mog jej towarzyszy zmiany metabolizmu tuszczu. Tolerancja glukozy jest zmniejszona nie tylko w cukrzycy typu I, lecz take w stanach uszkodzenia wtroby oraz w niektrych zakaeniach, w cukrzycy typu II (cukrzycy niezalenej
238 / ROZDZIA 21
moe rwnie wystpi w nadczynnoci przysadki lub kory nadnerczy ze wzgldu na antagonizm hormonw tych gruczow wydzielania wewntrznego w stosunku do dziaania insuliny. knicie insuliny zmniejsza zawarto glukozy we krwi i powoduje zwikszenie jej zuywania oraz magazynowania w formie glikogenu w wtrobie i w miniach. Nadmiar insuliny moe spowodowa cik hipnglikemi, prowadzc do drgawek, a nawet do mierci, jeeli nie poda si szybko glukozy. Zwikszon tolerancj glukozy obserwuje si w niedoczynnoci przysadki i kory nadnerczy, co mona przypisa zmniej szeniu normalnego antagonistycznego dziaania kortyzolu w stosunku do insuliny, wskutek czego dochodzi do wzgldnego jej nadmiaru.
1 Czas (h) 2
Insulina zwiksza tolerancj glukozy. Wstrzy-
PIMIENNICTWO
Krebs HA: Gluconeogenesis. Proc R Soc London (Biol) 1964;159:545. Ncwsholme EA, Chaliss RAJ, Crabtrcc B: Substratc cycles: Thcir role in improving sensitivity in mctabolic control. Trmds Biochem Sci 1984;9:277, Newsholme EA, Start C: Regulation in Metabolism. Wiley, 1973. Pagliara AS et al: Hepatic fruL-tose-1,6-Diphosphatase deficiency, a cause of laciic acidosis and hypoglycemia in infaticy. / Ciin Invest 1972;51:2l 15. Pilkis SJ, El-Maghrabi MR, Claus TH: Hormonal rcgulation of licpaiic gluconeogenesis and glycolysis. Anrtu Rev Biochem 1988;57:755. Watford M: What is the metabolic fate of dietary glucosc? Trends Biochem Sci 1988;13:329.
Ryc. 21-6. Test tolerancji glukozy. Krzywe stenia glukozy we krwi osoby zdrowej i u chorego na cukrzyc po doustnym podaniu 50 g glukozy. Zauwa pocztkowe due zwikszenie stenia glukozy u chorego na cukrzyc. Kryterium normalnoci jest powrt stenia glukozy do pocztkowej wartoci w cigu 2 h.
od insuliny; ang.: non-insulin-dependent diabe-tes mellitus, NIDDM), ktrej towarzyszy zwykle otyo i zwikszone stenie wolnych kwasw tuszczowych po podaniu niektrych lekw oraz niekiedy rwnie w miadycy. Cukrzyca
Szlak pentozofosforanowy oraz inne szlaki przemiany heksoz

22
WPROWADZENIE Szlak pentojofosforanowy aie generuje ATP, ale spenia '2 gwne tuli keje: l)j&#miuza NADJffl dk takich redukujcych syntez, jak Biosynteza kwasw tuszczowych i steroidw oraz 2) dostarcza rybozy do biosyntezy nuk-lcotydwTkwifsow riukieinowych. Glukoza, fruktoza i galaktoza s ilociowo najwaniejszymi heksozami wchanianymi z pfzewodu pokarmowego. Pochodz one odpowiednio ze skrobi, sacharozy i laktozy zawartych w poywieniu. Specjalne szlaki metaboliczne rozwiny si, zwaszcza w wtrobie, do przemiany fruktozy i galaktozy w glukoz. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Niedobory pewnych enzymw szlaku pen-tozofosforanowego s gwn przyczyn hemo-iizy erytrocytw, wystpujcej w jednym z typw niedokrwistoci hemolitycznej Gwnym zaangaowanym w tym enzymem jest dehyd-rogenaza glukozo6-fosfora nowa. A u 100 min ludzi na wiecie mona wykaza genetycznie uwarunkowane mae stenie tego enzymu. Gwnymi szlakami metabolicznymi zuywa-nja glukozy s glikoliza i szlak pentozofosfora-no"wl~ilociowo mniej znaczce, ale bardzo wane dla wydalania obcych organizmowi zwizkw (ksenobiotykw) w postaci glukuronidw jest wytwarzanie kwasu glukuronowego z glukozy w szlaku kwasw uronowych. Zaburzenia tego szlaku s przyczyn samoistnej pentozurii. Cakowity brak jednego z enzymw tego szlaku
u wszystkich naczelnych sprawia, e kwas askorbinowy (witamina C) jest niezbdnym skadnikiem pokarmu dla ludzi, ale nie dla wikszoci ssakw. Niedobory enzymw metabolizmu fruktozy .i galaktozy prowadz do takich chorb metabolicznych, jak samoistna fruktozuria i galaktozemia Fruktoza bywa uywana w ywieniu pozajelitowym, ale w duym steniu moe ona powodowa uszczuplenie puli nukleotydw adeninowych w wtrobie i martwic wtroby. SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY WYTWARZA NADPH ORAZ RYBOZ Szlak pentozofosforanowy (spicie heksozo-mo no fos fora nowe) jest alternatywn drog utleniania glukozy. Jest to proces wielocyklicz-ny, w ktrym z 3 czsteczek glukozo-6-fos-foranu powstaj 3 czsteczki CO2 i 3 reszty 5-wglowe. Te ostatnie zostaj tak przetworzo ne, e regeneruj si z nich 2 czsteczki glukozo--6-fosforanu i wytwarza si 1 czsteczka zwizku poredniego glikolizy gliceraldehydo-3--foslbranu. Poniewa z 2 czsteczek giiceral-dehydo-3-fosforanu moe regenerowa gluko-zo-6- fosforan, w szlaku pentozofosfora nowym moe zachodzi cakowite utlenienie glukozy.
3(Glukozo-6-fosforan) + 6 NADP - -> 3 COa + 2 (Glukozo-6-fosforan) + - Gliceraidehydo 3-fosforan + 6 NADPH + + + 6H
+
240 / ROZDZIA 22
KOLEJNE REAKCJE SZLAKU PENTOZOFOSFORANOWEGO ZACHODZ W CYTOZOLU Enzymy^szlaku pentozofosforanowego, podobnie jak TglikoTizy, znajduj si w cytozolu. Utlenianie, tak jak w glikolizie, odbywa si przez oSwodorowanie, jednakjw przypadku szlaku
pentozofo sfora nowego akceptorem wodoru jest NAPD, a nie NAD. Sekwencj reakcji szlaku mona podzieli na 2
etapy: oksydacyjny i nieoksydacyjny. W pierw-
szym glukozo-6-fosforan ulega odwodorowa-nhi i dekafboksylacji, przechodzc w pentoze rybulozo.-5-fosforan. W drugim etapie rybu-lozo-5-fosforan ulega przeksztaceniu z powroHjO V lub Ca" HYDROLAZA GL UK ONOLAKTON O WA osi o g lukonolakton
NADP HO-C-H
NADPH+H^
HO--H
H--OH I
Q DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6--F OSFORANOWA
HO-C-H 6- f
H-C-OH I
COO" H- C-O H HO- C- H H- C-O H H- C- O H

6-Fosfogtukonl an N A DP
1
H-i ---- 1
CHj- O-l
^D-G lu kozo-6-fosfo ran
DEHYDRO GENAZA 6-FOSFO GLUK D NIANO WA
Mg ; M n ; lub Ca**
NADPH + H+
CHOH
1 1 KETOIZOMERAZA RYBOZO-S--F OSFOflANOWA
CH,OH
i
H-C-OH
I
c=o
H-CH-C-OH
CH, - O -(P ) Rybulozo-5-fosforan
i
C-OH H-C-OH H-C-OH i

C H , - 0 - ( F Forma enotlowa
i
C=O H-C-OH H--OH
3-Kato-B-f *C H 2 O H 3-EPIMERAZA H YB U L 020 - 5-F 0S F0 R A N 0 W A

i
oafogl u ko n la n
HO-C-H H^ t^ ^ (JM > H-C C H j- O - Ryb

ozo^Si-ftwfora n
1
O -T-H H^C-OH
K syl u I o zO-5-f osf o r an
H-C-OH H-C-OH
Sadoheptu loo -7-f osto ra n
H- C-OH
"CH 2 -O~
lcaraldehydo-3-tosfo ra n
Gl
PRPP Ryc. 22-1. Szlak pentozofosforanowy.

P
------ POf, PRPP 5-fosforybozylo-i-pirofosforan.
SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 241
"CH.OH HOJC-H
-f
H-"-OH
Sliceraldehyda-
3-1otoran
CHjOH O C H
H--OH ~* ___ H--OH H--OH CH,-O-

Sadoheplulozo-7-fosforan
|THANSALDOLAZA|
H-C = O
H-^t-OH
H-iC-OH
*CHaOH
H--OH H--OH CH,

-O-(P)
Etyt roz o-4-1o sto r an
CH,0H
FruktoiD-6-iosforan
HO-C-H H--OH
CH,-O-<g)
Ksyiuiozo-5-fostoran
| TRAN8KET0LAZA Tlamlrw- j M g'
H-C=O
H-C-OH
Ryc. 22-1 cd. Szlak pentozofosforanowy,
CH,-O-
SilcerakJBhydo-3-fosofan
o
HO-C-H H-C-OH H--OH
FruKtozo-S-losforan
tem_dp5!ukozQ-i-ibsforanu w caej serii reakcji, gwnie z udziaem 2 enzymw; transktotazy UransaMolazy (ryc. 22-1). Etap oksydacyjny wytwarza NADPH Odwodorowanie glukozo-6-fo sforanu do 6-fosfoglukonianu zachodzi przez utworzenie 6-fosfoglukonolaktonu katalizowane przez de-hydrogentiz glukQzo-6-fo$foranow, enzym zaleny od NADP. Hydroliz 6-fosibglukonolak-tonu katalizuje hydrolaza glukonol a klonowa Drugi etap oksydacyjny jest katalizowany przez dehydrogenaz 6-fosfoglokonianow, ktra po-trzebuje NADP+ jako akceptora wodoru. Dalej nastpuje dekarboksyjacja_z_ wy tworzeniem ke-lopentozy rybuiozo-5-ibsforanu. Reakcja zachodzi prawdopodobnie w 2 etapach przez zwizek poredni 3-keto-6-fosfoglukonian. Etap nieoksydacyjny wytwarza
prekursory rybozy
Rybulozo-5-fosforan jest substratem dla 2 rnych enzymw, 3-Epimeraza ryhulozo-5-fos-foranowa zmienia konfiguracje wok C3, twol<> Biochemia
rzc epimer ksylulozo-5-fosforan bdcy keto-pentoz, Ketoizo meraza rybozo-5-fosfora-nowa zamienia rybulozo-5-fosforan.w odpowiedni aldopentoze, rybozo-5-fosforan. Transketolaza przenosi jednostk 2-wglow zawierajc wgle 1. i .2 ketozy na aldehydowy wgiel cukru aldozy. Powoduje ona .zatem zamian cukcu ketozj w aldoz ubosz-o-2-ato-my wgla, a rwnoczenie zamienia cukier aldoz w ketoz bogatsz o 2 atomy wgla. Reakcja wymaga udziau jednej z witamin B darniny jako koenzymu w postaci difosforanu tiaminy, a take jonw Mg2:. Przenoszona jednostka 2-weglowa jest prawdopodobnie glikolaldehydem zwizanym do difos foranu tiaminy, tzn. jest aktywnym glikolaldehydem". Transketolaza katalizuje wic przeniesienie opisanej jednostici"2*wglowej z ksylu-lozo-5-fosforanu na ryb ozo-5-fosforan, two rzc 7-wgiow ketoz sedoheptulozo-7-fosforan oraz aldoz gliceraldehydo-3-fosforan. Te 2 produkty wchodz nastpnie w inn reakcj, znanjakotransaldolacja. Transaldolaza umoliwia przeniesienie jednostki 3-wglowej ak-
242 / ROZDZIA 22
GI ukozo-6-fosf o ran -NA D P * DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6-FOSFORANOWA Gl ufco zo-6-fosforan NADP* Glukozo-6-fosforan NADP
- NADPH
* NADPH e-Fosfoflukonian NADP*
> NADPH + H* 6-Fosfoglukonian NADP*
6-Fosfogukonlan - NA DP * DEHYDROGENAZA 6-FOSFOGLLJKON1ANOWA

1i ^ C O2
NADPH + H
NADP H+ H*
k
^"
NADPH
C Oj
Ryb u lozo-5-tostoran C, |3-EPIMERA2A~|
Rybulozo-S-fosfcran
* CO, Rybulozb-5-taatoran
KETOIZOMERAZA
| 3-EPIMERA2AJ
Rybozo-5-f osf o ra n Ksytu lozo-S-tosf o ran C TRANSKETOLAZA
Ksylulozo-5-fosforan
Gllcef aldehyd o-3-fosforan Ci 1 TRANSALDOLAZA
Sedoheptulazo-7-fosforan C,
f
Fruktozo-6-fosloran C Erytrozo-4-tosforan TFIANSKETOLAZA Gl I ce r aldehyd o-3-f o sfa ra n Fru ktoz o-6-f osfo ran IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA
ALDOLAZA IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA
IZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA
, Fruklozo-1,6-btefosforanu FHLTKTOZO-1,6-BISFOSFATAZA /j Fruktozo-6-fosforanu IZOMEHAZA FOSFOHEKSOZOWA
GI ukozo-6-fostoran
Gl ukozo-6-fosforan
Vj Glut<ozo-6-fofiforanu
Ryc. 22-2. Schemat przebiegu szlaku pentozof osforan owego i jego pocze ze szlakiem glikolizy.
SZLAK PEIMTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 243
tywnegodihydroksyacetonu" (wgli l-3)_zketo-zy, ktr 1 jest sedoheptulozo-7-fosforan, na al-doz gliceraldehvdo-3-fosfora n. aby_utworzy ketoz fruktozo-6-fosforan i 4- wglow al - doz ery trozo-4-fosforan. Nastpnie zachodzi dals za reakcj a, znw z udziaem transketolazy, w ktrej ksylulozo-5-Ti JF uy jako da_w_c_a aktywnego gli kolaldehydu". W tym przypadku utworzony uprzednio eryfrozo-4-fosforan jest akcpptnjeay Produktami wymienionej reakcji s fruktozo-6--fosforan i gIiccraldehydo-_3-fosforan. Aby glukoza u legia_ cakowitemu utlenieniu do CO, w szlaku pentozofosforanowym, nie- h i j bJ t kance enzymw prze k sz t nic aj c y e h gl i ce ra I dc h y d o - 3 - fo s f oran w g lu -j^zo-6-fosf oran..S to enzymy szlaku giikolizy, dzâjaê.\ oLwQinyjn kierunku, i dodatkowo enzym glukoneogenezy frtiktozo-l,6-bisfosfata- -A . Schemat tego szlaku przedstawiono na rye. 2 najwaniejsze szlaki katabolizmu glukozy maj niewiele ze sob wsplnego Chocia niektre metabolity s wsplne, np. glukozo-6-fosforan, to jednak szlak pectozo^xJliJq "DTI^jerue nastpuje w pierwszych reakcjach Z udziacin~RKDP. a nieNAD. a CO3 , ktry w ogle nicjet produktem giikolizy, jest charakterystycznym prûkteatszafea=--pentozofos-fofahowego. ATP nie powstaje w szlaku pen-tozofos fora nowym, podczas gdy jego generacja jest zasadnicz funkcj giikolizy. Fosforany rybozy powstaj w szlaku pentozo fosforanowym, ale me w glikolizie. Rwnowaniki redukujce s wytwarzane w tych tkankach, ktre s wyspecjalizowane w syntezach redukujcych Oznaczenia aktywnoci szlaku pentozofos-foranowego w rnych tkankach wskazuj na jego znaczenie metaboliczne. Jest on aktywny w wtrobie, tkance tuszczowej, korze nadner czy, w tarczycy, erytrocytach, jdrze i w gruczole sutkowym w okresie laktacji. Bra k jest jego _le sutkowym po_ga okresem wn"^ wystpuje w miniu szkielet o wy rn. Wszystkie tkanki, w ktrych ten szlak"jest aktywny, zuywaj NADPH do syntez redukujcych, np. do syntezy kwasw tuszczowych, steroidw, aminokwasw szlakiem
dehydrogenazy ghitaminianowej, albo zredukowanego glutationu w erytrocytach. Jest prawdopodobne, e obecno aktywnej lipogenezy albo ukadu zuywajcego NADPH pobudza rozkad. glukozy w szlaku pentozofosforano-wym. Zuywanie NADPH dostarcza bowiem NADP, ktrego stenie jest normalnie bardzo mafe ze wzgldu na nierwnowagowy charakter pierwszych reakcji szlaku. Rwnie synteza dehydrogenaz glukozo-6-fosforanowej i 6-fos-foglukonianowej moe by indukowana przez insulin wydzielan w warunkach zwizanych ze stanem sytoci" (tab. 21 -1). Ryboza moe by syntetyzowana we wszystkich tkankach SzJak pentozo fosforan o wy dostarcza ryhozy do syntezy nukleotydw i kwasw nukleino wych (ryc. 22- 1). rdem jes.t rybozo -5-fas^ foran. ktry reaguje z ATP, tworzc PRPP uywany w biosyntezie nukleotydw (p. str. 427). Tkanka miniowa ma bardzo niewielkie iloci dehydrogenaz glukozo -6-fo sfora nowej i 6-fosfoglukonianowej. Misie szkieletowy, podobnie jak wikszo innych tkanek, jest jednak zdoiny do syntetyzowania rybozo-5-fos-foranu na potrzeby syntezy nukleotydw. Odbywa si to przez odwrcenie nie oksydacyjnego etapu szlaku pentozofo sfora nowego z uyciem fruktozo-6-fosforanu. Oznacza to, e nie jest konieczny kompletny funkcjonujcy szlak pen -tozofosforano wy, aby tkanka moga syntetyzowa fosforany rybozy. Ryboza nie jest znaczcym skadnikiem kr cej krwi. Wobec tego tkanka musi sama zaspokaja zapotrzebowanie na ten wany pre kursor nukleotydw. SZLAK PENT OZOF0SF0RAN0WY WSPOMAGA PEROKSYDAZ GLUTATIONOW W OCHRONIE ERYTROCYTW PRZED HEMOLIZ Szlak pentozofosforanowy w erytrocytach dostarcza NADPH do redukcji utlenionego glutationu (G-S-S-G) do glutationu zredukowanego (2G-SH). Redukcja ta jest katalizowa na przez reduktaz gluta tionow. enzym bdcy flawoprotein zawierajc FAD. Z kolei zredu kowany gl utation usuwa H 2 O 2 z erytrocytu w reakcji katalizowanej przez peroksydaz gtu-tationow, enzym zawierajcy pierwiastek ladowy selen.
244 / ROZDZIA 22 G-S-S-G + NADPH + H . 2G-SH + NADP+

REDUKTAZA OLUT ATIONOWA FAD
+
2G-SH +
G-S-S-G + 2H,0
PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA SELEN
Ta reakcja jest wana, poniewa nagromadze nie H2O2 moe skrci czas ycia erytrocytw, zwikszajc szybko utlenienia hemoglobiny do methemoglobiny. W niektrych populacjach wystpuje mutacja charakteryzujca si niedoborem dehydrogenazy di!ki>/i>-6-fosforanowej, czego konsekwencj s zaburzenia w wytwarzaniu NADPH. To zaburzenie charakteryzuje si hemoliz erytrocytw wwczas, gdy osobnik z t wad jest naraona na dziaanie takich utleniaczy, jak lek przeciwzimniczy pryma-china, kwas acetylosalicylowy lub sulfonamidy, albo spoywa pewien gatunek fasoli (Viciafaba fawizm). Peroksydaza glutationowa jest naturalnym przeciwutleniaczem znajdujcym si w wielu tkankach. Oprcz H3O2, dziaa ona rwnie na nadtlenki organiczne. Razem z witamin E jest czci ukadu ochronnego przeciw peroksyda-cji lipidw (p, str. 185). Donoszono o zwizku midzy wystpowaniem niektrych nowotwo rw a maym steniem selenu we krwi i (lub) ma aktywnoci peroksydazy glutationowej. Oznaczanie aktywnoci transketolazy we krwi odzwierciedla stopie niedoboru tiaminy. Jedynym stanem, w ktrym aktywno tego enzymu jest zwikszona jest niedokrwisto zoliwa.
GLUKURONIAN, PREKURSOR PROTEOGLIKANW I SPRZGNITYCH GLUKURONIDW, JEST PRODUKTEM SZLAKU KWASU URONOWEGO Poza opisanymi wyej gwnymi szlakami metabolizmu glukozo-6-fosforanu istnieje szlak,- w ktrym -glukoza, jest przemieniana w kwas glukuronowy, kwas askorbinowy i pen-tozy, nazywany szlakiem kwasu uranowego. Jest on take alternatywnym szlakiem utleniania glukozy, ale, podobnie jak szlak pentozofos-foranowy, nie prowadzi do wytwarzania ATP.
W szlaku-kwasu.JirQn.owJego.glu;kuronian pQWStaje-z,_glukQzy w wyniku reakcji pokazanych na ryc. 22-3. Glukozo-6-fosforan jest przeksztacany w glukozo-1-fosforan, ktry nastpnie reaguje z urydynotrifosforanem (UTP), tworzc aktywny nukleotyd urydynodifos-loglukoz (UDPGlcK Ta ostatnia reakcja jest katalizowana przez enzym urydylilotransferaz glukozo-1-fosforanowa (polifosfory!az UT3F' glukozow). Wszystkie etapy, a do tego miejsca, s identyczne z tymi, ktre uprzednio opisano jako szlak glikogenogenezy w wtrobie. UDPGlc jest utleniana w dwuetapowym procesie do glukuronianu. Produktem utleniania, ktre jest katalizowane przez dehydrogenaz UPPglukozow, jest UDP -glukuronian. UDP-gliikuroman jest aktywn" form glu-kuntnianu w reakcji whudowywania glukuronianu w proteoglikany lub dla reakcji, w ktrych glukuronian jest sprzgany z takimi sub-stratami, jak hormony steroidowe, niektre leki lub bilirubina (p. ryc. 34-13). W NADPH-zalenej reakcji glukuronian jest redukowany do L-gulonianu {ryc. 22-3). Ten ostatni zwizek jest bezporednim prekursorem askorninianu u zwierzt zdolnych do syntetyzowania tej witaminy. U czowieka i innych naczelnych, jak rwnie u winki morskiej, kwas askorbinowy nie moe by syntetyzowany ze wzgldu na brak enzymu oksydazy [-oulonolak-tonowej. Gulonian jest utleniany do 3-keto-L-gulonianu, ktry jest dekarboksylowany do pentozy L-ksylulozy. Zwizkiem porednim szlaku pentozofosforanowego jest D-ksyluloza. W reakcjach przedstawionych na ryc. 22-3 z ketogulo-nianu powstaje natomiast L-izomer ksylulozy. W celu poczenia tych 2 szlakw niezbdne jest przeksztacenie L-ksylulozy do jej izomeru D. Zachodzi ono w wyniku NADPH-zalenej redukcji do ksylitolu, ktry jest nastpnie utleniany w reakcji NAD-zalenej do D-ksylulozy, Ten ostatni zwizek, po przeksztaceniu do D-ksylu-lozo-5-fosforanu jest dalej metabolizowany w szlaku pentozofosforanowym. Przerwanie cigoci szlaku kwasu uranowego jest powodowane wadami enzymatycznymi i przez niektre leki W samoistnej pentozurii, rzadkiej chorobie dziedzicznej, pojawiaj si w moczu, znaczne iloci L-ksylulozy. Obecnie si uwaa, e przyczyn tego jest brak u chorych z pentozuri enzymu niezbdnego do przeprowadzenia redu-
SZLAK PENTOZOFOSFORANOWY ORAZ INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 245

3-Keto-L-gulonian
PKOFOSFO HYDRO LAZA UDPGIc
Urydyn od ifosf og iu koza (UOPGlc)
Urydynodlfosfoglukuronian
c-o-
9
c-oHO--H HO-C-H H-C-OH HO--H
CHjOH C-Gulonlan C02 BLOK U CZOWIEKA i
c=o
H-C-OH HO--H
L-Kiylulon
HO-C-H =0 H-C-OH HO--H *CH;OH
Szczawian Glikolan L-GulonolaMon 4 BLOK U NACZELNYCH ^~ Aldehyd gllkolowy I SWWW MORSKIEJ BLOK D- Ksyl u loo -1 -f osf o ran W PENTOZURI! 2-Keto-L-gulonoiakton
*CH2OH NADP HO-C-H

+
CHjOH NADPH + H+ C =O
O [2H]
J>
HO- -H D-Ksyjuloza
HO -
H- C- O H H,OH KsyMol
HO-C H-
H O - C - H H,OH L-Askorbinlan
HEDUKTAZA 0-KSYLULOZOWA
H- -O H HsOH ATp AOP ' D-Ksylu
J_
0= 0= H- HO--H
L-Dehyd roaekor bl nlan
lozo-5-fosfo ran
Sza
ntozofwfo
Rye. 22-3. Szlak kwasu uranowego. * losy wgla 1 glukozy, ------ P03
kcji L-ksylulozy do ksylitolu. Pozajelitowe podanie ksylitoJu moe prowadzi do oksalozy, cznie z odkadaniem si zogw szczawianu wapnia w mzgu i w nerkach. Wynika to z przeksztacenia D-ksylulozy do szczawianu, przez kolejne tworzenie ksylulozo-1-fosforanu, aldehydu glikolowego i glikolanu. Rne leki wzmagaj szybko wchodzenia glukozy do szlaku kwasu uronowego, np. podanie barbitalu lub chlorobutanolu szczurom powoduje znaczne zwikszenie przeksztacania glukozy do glukuronianu, L-gulonianu i askor-
binianu. Donoszono, e aminofenazon i fena-zon zwikszaj wydalanie L-ksylulozy u osb z pentozuri.
SPOYCIE DUYCH ILOCI FRUKTOZY MA GBOKIE KONSEKWENCJE METABOLICZNE

Spoycie pokarmw o duej zawartoci sacharozy jest przyczyn duego napywu fruktozy (i glukozy) do yy wrotnej i wtroby.
246 / ROZDZIA 22
Gllkogen ATP
Gtu kozo-6-fosf ran
i
tZOMERAZA FOSFOHEKSOZOWA GLUKOZO-6-FOSFATAZ A
DEHYDROGENAZA
Ffuktozo-6-fosforan -* ------------------------------------------------------------ - ----------- : ------------------------------ -, - - D-Fru ktoza
FflUKTOZO-1,6BISFOSFATAZA
FOSFOFRUKTOKINAZA BLOK PRZY SAMOISTNEJ FRUKTOZURII
Fru ktozo-1 ,&- blstosf c ran
Fruttozo-I-fosforan BLOK PRZY DZIEDZICZNEJ NIETOLERANCJI FRUKTOZY Fosto dhyd roKsyaceon [ALDOLAZA B|
[ALDOLAZA A | 1ALDOLAZA"B1
IZOMERAZA FOSFOTRIOZOWA
Gllcer a H ehyd o-3-fosforan
ATP
D-Oileeraldenyd
| TRIOZOKINAA]
2-Fosfagllcerynlan
Plrogronlan Ryc. 22-4. Metabolizm fruktozy, Aldolaza A znajduje si we wszystkich tkankach, z wyjtkiem wtroby, w ktrej wystpuje jedynie aldotaza B.
glikolizie w wtrobie. Jest to spowodowane tym, e omija ona etap metabolizmu glukozy katali zowany przez fosfofniktokinaz. Na tym etapie zachodzi bowiem kontrola metaboliczna szybkoci katabolizmu glukozy. Pozwala to na pobudzenie przez fruktoz szlakw metabolicznych w wtrobie, prowadzcych do wzmoonej syntezy kwasw tuszczowych, estryfikacji kwasw tuszczowych i wydzielania VLDL oraz do
Fruktoza znacznie szybciej ni glukoza ulega
zwikszenia stenia triacylogliceroli w surowicy krwi. Nadmiar glukozy^dostajcy si do krwiobiegu, pobudza wydzielanie insuliny, co wzmaga wszystkie w. procesy. Fruktoza moe by fosforylowana do fruk tozo -6-fo sfora mi. Proces ten jest katalizowany przez ten sam enzym - heksokjnaz, ktry katalizuje fosforylaqe glukozy (lub mannozy) {p. ryc. 22-4), Jednake powinowactwo tego enzymu do fruktozy jest bardzo mae w porw-
SZLAK PENTOZOFOS FORANOWY ORA Z INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 247
naniu z powinowactwem do glukozy. Dlatego wydaje si mao prawdopodobne, aby to bya gwna droga zuytkowania fr uktozy. Inny enzym,^fi]!^ctokinaza^wystcpujcy_w w-Jrobae_katalizuje przeniesienieTsfbranu z ATP na fruktoz, ale z wytworzeniem fruktozo-1--fhsiraiiu. Jego wystpowanie wykazano rwnie w nerkachi \y jelitach. Enzym ten nie fosforyluje glukozy. W odrnieniu od glukoki-nazy, na jego aktywno nie wpywa godzenie ani insulina, co moe tumaczy, dlaczego fruktoza znika z normaln szybkoci z krwi chorych na cukrzyc. K. tego enzymu pochodzcego z wtroby dla fruktozy jest bardzo maa, co wskazuje na due powinowactwo enzymu do substratu. Wydaje si, e to jest wjainie_g.wria dr-Oga-Jhsfbrjdficji fruktozy. Samoistna frukto-zuria_jst wynikiem braku fruktokinazy watro bovffij.. Fruktozo-1-fosforan jest rozkadany do al-deTryduD-glicerynowego i dihyBrbksycstono-fmforanujyjgalccu^lfFital^r iwaripj pê? aldola-zc B, enzym znajdujcy si w wtrobie. Ten enzjQL_.. atakuje rwnie fruktozo-1,6--bisfoslbran. Jego brak jest przyczyn wrodzonej nietolerancji fruktozy. Aldehyd D-gliceryno-: /Y?.kuj.e moliwo wejcia do sekwencji reakcji szlaku gl'^gljzj{ dziki innemu enzymo-wi obecnemu w wtrobie, triokinazie, ktra katalizuje jego fosforylacj do gliccraldehydo-3--foslbranu. Dwie fosfotriozy: dihydroksyaceto-nolosforan i gliceraldehydo-3-fosforan mog by katabolizowane w szlaku glikolitycznym albo mog czy si ze sob pod wpywem aldolazy i by przetworzone w glukoz. To ostatnie jest losem wikszoci fruktozy metabo-lizowanej w wtrobie. Jedn L konsekwencji wrodzonej nietolerancji fruktozy i innej choroby spowodowanej niedoborem fruktozo-l,6-bisfosfatazy jest indukowana fniVtr>7iiJjiipnpljl<,piiiia, pnmmuy.wy-stpowania duych zapasw glikogenu.-5âpewne nagromadzanie si fruktozo-1-fosforanu i fruktzo-l,6-bisfosforanu hamuje aktywno fosforylazy wtrobowej przez mechanizmy al-losteryczne. Jeeli zwierzciu dowiadczalnemu usun jelito i wtrob, to przemiana wstrzyknitej fruktozy w glukoz nie zachodzi i zwierz popada w hipoglikemi, jeli nie poda mu glukozy. Jednake stwierdzono, e ludzka nerka moe przeksztaca fruktoz do glukozy i mleczanu. U ludzi, ale nie u szczurw, znaczna ilo fruktozy pochodzca z rozpadu spoytej sacha-
rozy jest przemieniana w jelicie do glukozy, zanim dostanie si do krenia wrotnego. Wolna fruktoza znajduje si w pynie nasiennym i jest wydzielana w nader duych ilociach do podowego krenia zwierzt kopytnych 1wielorybw, u ktrych gromadzi si w pynach owodniowym i omoczniowym.
Fruktoza i sorb itol uczestnicz w patogenezie zamy cukrzycowej
Zarwno fruktoza jak i sorbitol znajduj si w ludzkiej soczewce, w ktrej ich stenie zwiksza si w cukrzycy, i mog one mie udzia w patogenezie zamy cukrzycowej. Szlak sor-bitolowy (poliolowy), ktrego nie ma w wt robie, jest odpowiedzialny za powstawanie &-ktozy z glukozy (ryc. 22-4). U chorych na cukrzyc jego aktywno si zwiksza, w miar zwikszania stenia glukozy we krwi, w tkankach, ktre nie s wraliwe na insulin, tj. w soczewce, nerwach obwodowych i kbusz-kach nerkowych. Glukoza jest redukowana do sorbitolu, przez reduktaz aldozow z udziaem NADPH. Nastpnie sorbitol jest utleniany do fruktozy przez dehydrogenaz sorbitolow (de-hydrogenaz L-iditolow, zwan take poliolo-w), w obecnoci NAD. Sorbitol nie przenika atwo przez bony komrkowe i dlatego gromadzi si w tkankach, powodujc ich uszkodzenie w mechanizmie osmotycznym. Rwnoczenie zmniejsza si stenie mioinozytolu. U szczurw 2cukrzyc mona zapobiec nagromadzaniu si sorbitolu w tkankach, niedoborowi mioinozy tolu i powstawaniu zamy cukrzycowej, stosu jc inhibitor reduktazy aldozowej. Reduktaza aldozow znajduje si w oysku owiec i jest odpowiedzialna za wydzielanie sorbitolu do krwi podowej. Dehydrogena za sorbitolowa w wtrobie oraz w wtrobie podu jest odpowiedzialna za przemian sorbitolu do fruktozy. Ten szlak jest rwnie odpowiedzialny 2a wystpowanie fruktozy w pynie nasiennym. Po doylnym podaniu sorbitolu jest on raczej przeksztacany do fruktozy ni do glukozy. Po doustnym podaniu sorbitolu znaczna jego cz nie wchania si i ulega w jelicie grubym fermentacji pod wpywem bakterii do takich produktw, jak octan i H2. Ble brzucha spowodowane nietolerancj sorbitolu mog by wywoane wolnymi od cukru" rodkami sodzcymi zawierajcymi sorbitol.
248 / ROZDZIA 22
GALAKTOZA JEST POTRZEBNA DO SYNTEZY LAKTOZY, GLIKOLIPIDW, PROTEOGLIKANOW I GLIKOPROTEIN

Galaktoza powstaje w jelitach w nastpstwie hydrolizy disanarydu lalctozy, tj. cukru zawartego w mleku. W wtrobie jest ona atwo przemieniana w glukoz. Zdolno wtroby do dokonania takiej przemiany moe by miernikiem sprawnoci czynnoci wtroby i jest podstaw testu tolerancji galaktozy. Szlak przemiany galaktozy w glukoz przedstawiono na ryc. 22-5. W reakcji 1 galaktoza jest fosforylowana przez galaktoklnaz z uyciem ATP jako dawcy fosforanu. Produkt tej reakcji galaktozo-1-fosforan reaguje z urydynodifosfoglukoz (UDPGlc), tworzc urydynodtfosfogalaktoz
(UDPGal) i glukozo-1-fosforan. W reakcji tej (reakcja 2), katalizowanej przez urydylilotrans-ferazc galaktozo-1 -fosforanow, galaktoza jest przenoszona na miejsce glukozy zawartej, w UDPGlc. Przemiana galaktozy w glukoz (reakcja 3) jest katalizowana przez epimeraz. Jej produktem jest UDPGlc. Epimeryzacja prawdopodobnie odbywa si przez utlenienie i redukcj na C4, z udziaem NAD jako koenzymu. W kocu (reakcja 4) glukoza jest uwalniana jako glukozo-1-fosforan prawdopodobnie po inkorporacji do glikogenu i nastpujcej potem fo sforo lizie. Reakcja 3 jest swobodnie odwracalna. W ten sposb glukoza moe by przemieniana w gala-ktoz, tak e obecno gotowej galaktozy nie jest niezbdna w pokarmach. Galaktoza jest potrzebna w organizmie nie tylko przy tworzeniu laktozy, lecz take jako
Galaktoza
ATP Mg'* ADP-* Gal aktozo-1 -fosforan Glukozo-1 -fosforan UDPGlc

URYDYLOTRANSFERAZA UDPGal 1-FOSFOGAtAKTOZOWA
Ni
GALAKTOKINAZA|(2J
5)
4-EPIMEHA2A IMYDYNODIFOSFOGALAKTOZOWA
NAD'
UDP Laktoza
LAKTOZY Glukoza
] FOSFORYLAZA ]
UDPGlc
PBOFOSFOHYLAZA UDPGlc
UTP
Gllkogen
ATP HEKSOKINAZAI lub ADP I FOSFOGL UKOMUTA GluKOZO-6 ZA -fostoran
Glukoza
6LUK0KINAZA
Ryc. 22-5. Szlak przemiany galaktozy w glukoz oraz syntezy laktozy.
SZLAK PENTOZOFOS FORANOWY ORA Z INNE SZLAKI PRZEMIANY HEKSOZ / 249

y. Gllkogen _
ATP
Gl u kozo-1 -fosforan ADP i
#*
Glukoza ^* "^- Glukozo-6-tostoran
Gllkollza Fruktozo-d-fosforan Glutamina Plrogrontan
Cykl kwasu cytrynowego
CO+HO
ATP
ADP
IAMINOTHANSFERAZA]
Glutamin lan FOSFOGLUKOMUTAZA Glukozoamino-1-fosforan
UTP
j PJ Glukozoamlna * I
^M^
Glukozoamlna
Acetylo-CoA
e
Glukozoamino-6- * -fosforan Acetylo-CoA
ATP
ADP
r+Acetylo-g k. N-Acetyiolukozoamlna -glukozoamno--6-fosfaran

EPIMERAZA ] N-Acstylo-man nozcamino-5-fosioran Fosfoenotoplrogronian
glukazoamlno- 1 -fosforan UTP
Gllkozam! nogi kany (np, heparyna)
UDP N-acaty log a! a Kl ozoami n a
Gllkozam Inogtlkany (kwas hiaiuronowy, gllkoprotelny)
NAO+ I EPIMERAZA I
9-Fosforan kwasu UDPN-aoetylcrieuraminowego -N-aoatylogalaWozoamina
- UJsmny
e
Kwas slalowy, gangliozydy, gllkoprotalny GtlkozoamlnogJlkany fchonaroltyny), gllkoprotalny
(inhlbujacy) afekt allosteryezny
Ryc. 22-6. Zestawienie wzajemnych powiza w metabolizmie aminocukrw. * Analogiczna do UDPGIc. Inne nukleotydy purynowe lub pirymidynowe mog by podobnie zwizane z aminocukrami. Przykadami s tymidynodifosfo{TDP)-glukozoamina oraz TDP-N-acetyloglukozoamina. ____________________
skadnik glikolipidw (cerebrozydw), proteo-glikanw i glikoprotein. Przy syntezie latriozy w gruczole sutkowym, glukoza ^jest przemieniana w UDPGal pod wpywem opisanych powyej enzymw. UDPGal czy si z glukoz tworzc laktoz. Proces ten jest katalizowany przez syntaz lak-tozow.
Niedobory enzymatyczne szlaku galaktozowego s przyczyn galaktozemii Niezdolno do metabolizowania galaktozy wystpuje w galaktozemiach, ktre mog by powodowane wrodzon wad kadego z enzymw zaznaczonych na ryc. 25-5 cyframi 1, 2, 3, chocia niedobr urydylilotransferazy (2) jest
250 / ROZDZIA 22
najlepiej poznany. Gal a ktoza ktrej stenie we krwi si zwiksza, jest w oku redukowana przez reduktaze aldozow do odpowiedniego poliolu (galaktytolu). Gromadzenie si galak-tytolu w rogwce jest przyczyn wystpowania zamy. W przypadku wady ury dylil o tran sfe razy oginy stan chorego jesi ciki, poniewa nagromadza si galaktozo -1 -fosforan, co po zbawia wtrob zapasw nieorganicznego fosforanu. Kocowym skutkiem tej wady jest niedoczynno wtroby i zaburzenia umysowe. Przy wrodzonym niedoborze urydylilotrans-ferazy galaktozo-1-fosforanowej, dotyczcym zarwno wtroby, jak i erytrocytw (reakcja 2), epimeraza (reakcja 3) jest obecna w dostatecznej iloci, tak e chorzy z t postaci galaktozemii mog tworzy UDPGal z glukozy. Wyjania to, dlaczego u dotknitych t wad dzieci jest moliwy normalny wzrost i rozwj, pomimo stosowania diety wolnej od galaktozy w celu zwalczania objaww choroby. Opisano kilka wad genetycznych, ktre polegaj raczej na zmniejszonej iloci transferazy ni na jej ca kowitym braku. Poniewa enzym normalnie wystpuje w nadmiarze, zmniejszenie jego aktywnoci do 50% lub nawet mniejszej nie powoduje klinicznych objaww choroby, ktra pojawia si jedynie u homozygot. U niektrych chorych niedobr epimerazy dotyczy jedynie erytrocytw, a nie wtroby lub innych t kanek. W tych stanach choroba przebiega bezobjawo-wo. Glukoza jest prekursorem wszystkich aminocukrw (heksozoamin) (p. ryc. 22-6) Aminocukry s wanymi skadnikami gliko-prntein (p. rozdz. 57), niektrych glikosfingolipi-dw (np. gangliozyd w) (p. rozdz. 16) oraz glukozoaminoglikanw (p. rozdz. 57). Gwnymi aminocukrami s glukrwoamina, gnlaklozu-amina i mannozoamina (wszystkie s heksozo-ammami) oraz zwizek 9-wglowy - kwas sjalo-wy. Gwnym kwasem sjalowym znajdywanym w tkankach czowieka jest kwas N-acetyloneu-
raminowy (NeuAc). Zestawienie relacji po midzy aminocukrami przedstawiono na ryc. 22-6. Najwaniejsze s nastpujce fakty: 1. Glukozoamina jest gwnym ammocukrem. Po wstaje ona jako glukozoam ino- 6 -fosforan z fruktozo-6-fosforanu przy uyciu glutaminy jako dawcy grupy aminowej. 2. Aminocukry wystpuj gwnie w formie N-acetylowanej. Dawc grupy acetylowej jest acetylo-CoA. 3. N-Acetylomannozoammo-6-fosforan powstaje przez epimeryzacj ghikozoam ino -6 -fosforan u. 4. NeuAc powstaje przez kondensacj mannozoamino-6-fosforanu z fosfoenolopirogronianem. S. Galaktozoamina powstaje przez epi meryzacj UDP-N-acetyloglukozoaminy (UDPGlcNAc) do UDP-N-acetylogalaktozoaminy (UDPGaNAc). 6, Nukleotydosacha rydy s wykorzystywane do biosyntezy glikoprotein i innych zoonych zwizkw. Wanymi nukleotydami zawierajcymi aminocukry s: UDPGlcNAc, UDPGalNAc oraz CMP -NeuAc. PIMIENNICTWO
Huijing F: Textbook ermrs>: Galaetose metabo-lism and galactosemia. Trends Biochem Sei James HMeLal: Models forthemetabolicproduction of oxalate from xylitol in humans. Aust. J Exp Biol MedSci 1982;60:!17. Ka.dor PF: The role of aldose reductase in the development of diabetic complications. Med Res Rev 1988;8:325. Macdonald I, Vrana A {editors}: Metabolk Effects of Dietary Carbohydrates. Karger, 1986. Randle PJ, Steiner DF, Whclan WJ (editors): Carbohydrate Metabolizm and Its Disorders. Vol 3. Academic Press, 1981. Sperling O, de Vries A (editors): Inborn Errors of Metabolism in Man. K_arger, 1978. Various authora: In: The Metabolic Basis oflnheted Dhease, 6th ed. Serwer CR et al (editors). McGraw-Hill. 19S9. Wood T: The Pentose Phosphate Palhwaw Aeademit; Press; 1985.
Biosynteza kwasw tuszczowych

23
WPROWADZENIE Podobnie jak przy innych procesach degradacji i syntezy (np. przy glikogenolizie i glikogeno-genezie), do niedawna uwaano, e synteza kwasw tuszczowych (iipogeneza) jest po prostu odwrceniem ich utleniania. Jednak obecnie wydaje si, e mitochondrialny ukad syntezy kwasw tuszczowych, zawierajcy pewne modyfikacje szlaku P-oksydacji, jest odpowiedzialny jedynie za przeduanie (elongacj) istniejcych ju kwasw tuszczowych o redniej dugoci acucha. Natomiast zupenie odmienny i bardzo aktywny ukad pozamitochondrialny jest odpowiedzialny za kompletn syntez pal-mitynianu z acetylo-CoA. Aktywny uktad elon-gacji acucha wystpuje rwnie w siateczce rdplazmatycznej wtroby. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Istnieje ogromna rnorodno midzy gatunkami zarwno co do rozmieszczenia szlaku lipogenetycznego w rnych tkankach, jak i gwnych substratw do syntezy kwasw tuszczowych. V szczura, gatunku, ktry dostarczy najwicej wiadomoci o lipogenezie. szlak ten jest obficie reprezentowany w tkance tuszczowej i w wtrobie, podczas gdy u czowieka tkanka tuszczowa nie jest istotnym miejscem lipogenezy, a wtroba ma stosunkowo ma aktywno. U ptakw Iipogeneza jest ograniczona do wtroby, gdzie jest ona szczeglnie istotna w tworzeniu jaj. U wikszoci ssakw pierwotnym substratem do lipogenezy jest glukoza, ale u przeuwaczy rol t przejmuje octan, ktry jest gwnym zwizkiem o znaczeniu
energetycznym wytwarzanym zpoywienia. Poniewa u czowieka szlak lipogenezy moe mie ograniczone znaczenie, nie jest zaskakujce, e nie donoszono dotychczas o istotnych chorobach z nim zwizanych. Jednake rnorodna jego aktywno u poszczeglnych osobnikw moe by w istotny sposb znaczca dla istoty i rozmiarw otyoci. GWNY SZLAK SYNTEZY KWASW TUSZCZOWYCH DE NOVO (LIPOGENEZY) WYSTPUJE W CYTOZOLU Ten ukad wystpuje w wielu tkankach, cznie z wtrob, nerkami, mzgiem, gruczoem sutkowym i tkank tuszczow. Do jego funkcjonowania s potrzebne takie kofaktory, jak NADPH, ATP, Mn2 + , biotyna, i HCO7 (jako rdo CO2). Bezporednim substratem jest acetylo-CoA, a kocowym produktem jest wolny palmitynian. Te cechy odrniaj znaczco lipogeneze od p-oksydacji. Wytworzenie malonylo-CoA jest pocztkowym i kontrolujcym etapem w syntezie kwasw tuszczowych Wodorowglan, jako rdo CO2, jest potrzebny w pocztkowej reakcji do karboksylacji acetylo-CoA do malonylo-CoA w obecnoci ATP i karboksylazy acetylo-CoA. Biotyna, bdca jedn z witamin, jest niezbdna do dziaania karboksylazy acetylo-CoA (ryc. 23-1). Enzym ten ma zmienn liczb identycznych pod-jednostek, w kadej s zawarte: biotyna, kar-boksylaza biotyny, biako nonikowe karbo-ksybiotyny, transkarboksylaza, jak rwnie al-
252 / ROZDZIA 23 CH 3 - C O-S - Co A Aoetyio-CoA Enz-biotyna-COOEnz-btotyna - -O OC - C H 2 - CO -S - C o A Malotiyla-CoA
/ ADP+Pi ATP+HCO," + Era-Wotyna Ryc. 23-1. Biosynteza

malo nylo-CoA. Enz karboksytaza acetylo -CoA.
losteryczne miejsce regulatorowe. Jest to wiec biako wieloenzymowe. Reakcja zachodzi w 2 etapach: 1) karboksylacja biotyny (z udziaem ATP, p. ryc. 53-13) oraz 2) przeniesienie karboksylu na acetylo-CoA z wytworzeniem malonylo-CoA. Kompleks syntazy kwasu tuszczowego jest polipeptydem zawierajcym 6 enzymw Wydaj si istnie 2 typy ukadu syntazy kwasu tuszczowego znajdujcego si w rozpuszczalnej czci komrki, U bakterii, rolin i niszych form poszczeglne enzymy ukadu s oddzielne, a reszty acylowe wystpuj w poczeniu z biakiem nazywanym biakiem przenoszcym acyl (ACP, ang.: Acyl Carrier Protein). Jednake u drody, ssakw i ptakw ukad syntazy jest kompleksem wieloenzymowym, ktrego nie mona rozdzieli bez utraty aktywnoci, a ACP jest czci tego kompleksu. ACP zarwno bakterii, jak i kompleksu wieloen-zymowego zawiera witamin kwas pantotenowy w postaci 4'-fosfopanteteiny (p. ryc. 53-6). W ukadzie tym ACP przejmuje rol CoA. Poczenie wszystkich enzymw okrelonego szlaku metabolicznego w jedn funkcjonaln jednostk wieloenzymow sprawia, e taki szlak jest bardzo wydajny i wolny od interferencji ze strony innych wspzawodniczcych o substra-ty procesw, przez co osiga si, bez koniecznoci wytwarzania barier przepuszczalnoci, kompartmentacj procesu w komrce. Inn zakta istnienia pojedynczego polipeptydu wie-loenzymowego jest to. e wszystkie enzymy kompleksu s syntetyzowane w sposb skoordynowany. Kompleks syntazy kwasu tuszczowego jest dimerem (ryc. 23-2). U ssakw obydwa monomery s identyczne, kady z nich stanowi godny
uwagi pojedynczy polipeptyd, zawierajcy wszystkie 6 enzymw syntazy kwasu tuszczowego oraz ACP z grup SH 4-fosfopan-teteiny. W bezporednim ssiedztwie tej grupy znajduje si inna grupa tiolowa reszty cysteiny, poczonej z syntaz 3-ketoacylow (enzymem kondensujcym) drugiego monomeru (ryc. 23--2). Poniewa obydwie grupy sulfhydrylowe uczestnicz w aktywnoci syntazy, jedynie cay dimer jest aktywny. Na pocztku inicjujca czsteczka acetylo--CoA czy si z grup SH cysteiny, co jest katalizowane przez transacylaz acetylow (ryc. 23-3). Malonylo-CoA czy si z ssiadujc grup SH 4'-fosfopanteteiny nalecej do ACP drugiego monomeru, co jest katalizowane przez transacylaz malonylow i wytwarza si aeetylo-(acylo)-malonyloenzym. Niedawne prace wykazay, e najprawdopodobniej transacy-laza acetylow i transacyaza malonyiowa jest tym samym enzymem (jak to pokazano na ryc. 23-2 i 23-3). Grupa acetylow atakuje grup metylenow reszty malonylowej w reakcji katalizowanej przez syntaz 3-ketoacylu i uwalnia COa, tworzc 3-ketoacyloenzym (acetoacetylo-enzym). To uwalnia grup SH cysteiny, zwizan dotychczas przez grup acetylow. Dekar-boksylacja pozwala na zajcie reakcji do koca dziki temu, e dziaa jako sia pocigajca ca sekwencj reakcji. Powstaa grupa 3-ketoacylo-wa zostaje zredukowana, odwodniona i ponownie zredukowana, aby utworzy odpowiedni nasycony acyto-S-enzym. Te reakcje s analogiczne do tych, ktre zachodz w p -oksydacji, z wyjtkiem tego, e 3-hydroksykwas jest izo-merem D() a nie L( +), oraz e NADPH suy jako dawca wodoru, a nie NADH w obu redukcjach. Nowa czsteczka malonylo-CoA czy si z grup SH 4'-fosfopanteteiny, wypierajc nasycon reszt acylow na woln grup SH cysteiny. Ta sekwencja reakcji
Podzia funkcjonalny
Podzia
4'-F osfop a ntetaln a SH
SH 4'-F(topani8telna
podjednostek
wo
1
5
>
I
Ryc. 23-2. Wieloenzymowy kompleks syntazy kwasu tuszczowego. Kompleks jest dimerem o 2 identycznych monomerach polipeptydowych, 1 i 2, kady skadajcy si z 6 oddzielnych aktywnoci enzymatycznych i biaka przenoszcego acy I (ang.: AcylCarrier ProteinACP). Cys-SH grupa sulf hydry Iowa cysteiny. Grupa -SH 4'-fosfopanteteiny jednego monomeru jest w bliskim ssiedztwie grupy -SH cysteinylowej reszty syntazy ketoacylowej drugiego monomeru, co sugeruje uoenie gowa do ogona" obu monomerw w stosunku do siebie. Szczegowe uoenie sekwencji enzymw w kady m z monomerw jest hipotetyczne (na podstawie danych Tsukamoto). Chocia kady z monomerw zawiera wszystkie czstkowe aktywnoci cigu reakcji, rzeczywista funkcjonalna jednostka skada si z poowy monomeru wspdziaajcej z komplementarn polow drugiego monomeru. W obec tego 2 acuchy acylowe s wytwarzane rwnoczenie.
I
c < n
IM W W
Acetylo-CoA Pan SH HS -c HS -P a n Wisloenzymowy kompleks syntazy kwasu tuszczowego Matonyio-CoA Przeniesienie C z
CoA (Cj albo c n)
- C l ) - C ys S~C O1 3
Aoyto (aoetylo Jmalonylo-enzym
*co.
Cys - SH
SYNTAZA 3-KETOACYLOWA
O -( a }-Pan S ~ C CH2 C CH3 3- Kato acylc-enzy m (aceto acetyio-enzy m) NADPH + H

+
REDUKTAZA 3-KETOACYLOWA NADP+
s-SH
O OH I CH,
-T2_)-Pan-S~C-CH 2-CHD(-)-3-HydroksyacyloB nzym HYDRATAZA Dehydrogenaza izooytrynlanowa
i-SH -(2)- P an -S ~ C - C H = C H - C H,
NADPH t H
+ +
2,3-Nlenasycony acytoenzym REDUKTAZA ENOILOWA
NADP ^~ H,0 Tloesleraza SH
"(T>Cy S J -^
V
Po 7-Krotnym cyklicznym praejtclu przez eta^
-( 2 }-Pan-S ~C CH2 CH a CH3 Acyloenzym
PalmKynlan
Ryc. 23-3. Biosynteza kwasw tuszczowych o dtugim acuchu. Szczegy wskazuj, jak dodawanie reszty malonylowej powoduje, e acuch acylowy wydua si skokowo po 2 atomy wgla ys reszta cysteiny, pan 4'-fosfopanteteina. Szczegy budowy dimeru syntazy kwasu tuszczowego przed stawiono na ryc. 23-2. (J) i (2) przedstawiaj poszczeglne monomery syntazy kwasu tuszczowego. 2 acuchy acyiowe s syntetyzowane rwnoczenie na 1 dmerze przy uyciu kadej pary grup SH Cys/pan.
BIOSYNTEZA KWASW TUSZCZOWYCH / 255

AcyloglicerolB Estry cholesterolu
AT P + CoA
AMP + PP:
Estryfikacja
Palmltynlan. SYNTETAZA ACYLO-CoA
Paimltollo-CoA Elongacja acucha, desaturacja Acylo-CoA
Ryc. 23-4. Los palmitynianu po jego biosyntezie
powtarza si jeszcze 6 razy, za kadym razem wcza si nowa reszta malonylowa, a do powstania l-wglowego (palmityowego) rodnika. Jest on uwalniany z kompleksu enzymatycznego dziaaniem 6. enzymu znajdujcego si w kompleksie, tioesterazy (deacylazy). Wolny palmitynian musi zosta zaktywowany do acy-lo-CoAzanim bdzie mg wej do jakiegokolwiek innego szlaku metabolicznego. Zazwyczaj jego losem jest estryfikacja do acylogliceroli (ryc. 23-4). W gruczole sutkowym istnieje oddzielna tioe-steraza swoista dla reszt acylowych C 8, C10 lub C12, ktre nastpnie znajduj si w tuszczu mleka. W gruczole sutkowym przeuwaczy ten enzym jest czci kompleksu syntazy kwasu tuszczowego. Wydaj si istnie 2 centra aktywnoci w jednym dimerycznym ko mpleksie, ktre dziaaj niezalenie, tworzc rwnoczenie 2 czsteczki palmitynianu. Poniej przedstawiono sumarycznie rwnanie cakowitej syntezy palmitynianu z acetylo-CoA i malonylo-CoA:
CH,CO-S-CoA + 7HOOC-CH 3C0-S-CoA t + 14NADPH + 14H+ -> ^CHatCHJ^COOH + 7CO 3 + 6H 2 O + + SCoA-SH + 14NADP
1
tuszczowe o nieparzystej liczbie atomw wgla. Wystpuj one zwaszcza u przeuwaczy, u ktrych propionian powstaje pod wpywem dziaania mikroorganizmw w waczu. Gwnym rdem rwnowanikw redukujcych (NADPH) jest szlak pentozofosforanowy NADPH jest zaangaowany, jako koenzym, w redukcj zarwno 3-ketoacylopochodnych, jak i acylowych pochodnych 2,3-nienasyconych. Oksydacyjne reakcje szlaku pentozofos-foranowego (p. str. 240) s gwnym rdem wodorw niezbdnych do redukcyjnej syntezy kwasw tuszczowych. Jest znamienne, e tkanki, ktre wykazuj aktywny szlak pentozofosforanowy, s take tkankami wyspecjalizowanymi w aktywnej lipogenezie; s to wtroba, tkanka tuszczowa i gruczo sutkowy w okresie laktacji. Co wicej, obydwa szlaki metaboliczne znajduj si w pozamitochondrialnej przestrzeni komrki, lak e nie istniej bony, ani inne bariery do przenoszenia NADPH/NADP od jednego szlaku do drugiego. Innymi rdami NADPH jest reakcja, ktra przeksztaca jab-czan w pirogronian, katalizowana przez enzym jabczanowy" (dehydrogenaza jabczanowa de-karboksylujca) (ryc. 23-5) oraz pozamitochon-drialna reakcja dehydrogenazy izocytrynianowej (prawdopodobnie nie jest to istotne rdo). Acetylo-CoA jest gwnym budulcem kwasw tuszczowych Jest on wytwarzany z wglowodanw przez utlenianie pirogroni anu wewntrz mitochond-riw. Jednake acetylo-CoA nie przenika swobodnie do kompartmentu pozamitochondrial-nego, zasadniczego miejsca syntezy kwasw tuszczowych. Aktywno pozamitochondrial-
Z acetylo-CoA, uytego jako czsteczka inicjujca, tworz si atomy wgla 15 i 16 palmitynianu. Dodawanie wszystkich nastpnych jednostek dwuwglowych odbywa si przez uprzednie tworzenie malonylo-CoA. Jako czsteczka inicjujca w wtrobie i gruczole sut kowym ssakw moe dziaa butyrylo-CoA. Jeeli propionylo -CoA dziaa jako czsteczka inicjujca, powstaj dlugoacuchowe kwasy
256 / ROZDZIA 23
Paimltynlan Glukoza
Ryc. 23-5.
Glukozo-6-
Dostarczanie fosforan acetyl o-Co A i NA DP H dla

Fruktozo-6 -fosforan
Glloeraldeh yd o-3-fosfora DEHYDROGENAZA n 3- FOSFOGUCEHALDEHYDOW A
Cytrynian WEWNTRZN A BONA MITOCHO NDRIALNA Pirg rc n : ian. - ' ; ;'-'' ; """:"'' Jiii Strona zewntrzna A D E HY D R 0G 6 M AZ A S Pt ROGHONI AN OW A^ OEHYDROGENAZA IZOCYTRYNtANOWA
mmmmK lipogenezy. PP mmm

a-ketoglutaranu.
Cykl kwasu cytrynowe go ;,
;y-Vj rsrtmntan
:
sztak pentozofosforano wy: T przenonik trikarboksylanw, K - przenonik
nej liazy ATP-cytrynianowej, podobnie jak i enzymu jabczanowego", zwiksza si w stanie dobrego odywienia, zachowujc si rwnolegle do aktywnoci ukadu syntetyzujcego kwasy tuszczowe (tab. 21-1). Obecnie uwaa si, e zuywanie pirogronianu do lipogenezy odbywa si przez cytrynian. Ten szlak obejmuje
glikoliz, po ktrej nastpuje oksydacyjna dekar-boksylacja do acetylo-CoA wewntrz mito-chondrium i nastpnie kondensacja ze szcza-wiooctanem do cytrynianu, jako cz szlaku kwasu cytrynowego. Potem nastpuje tramslo-kacja cytrynianu do kompartmcntu pozamito-chondrialnego, gdzie, w obecnoci CoA i ATP,
ulega on rozszczepieniu do acetylo-CoA i szcza-wiooctanu, co jest katalizowane przez liaz ATP-cytrynianow. Ten aeetylo-CoA jest wwczas do stpny do tworzenia malonylo-CoA i syntezy palmitynianu (ryc. 23-5). Szczawiooc-tan moe tworzy jablczan pod wpywem dziaania NADH-zalenej dehydrogenazy jabcza-nowej, po czym nastpuje wytwarzanie NADPH pod wpywem enzymu jabczanowe-go. Ten NADPH z kolei staje si dostpny do lipogenezy. Ten szlak jest sposobem przeniesienia rwnowanikw redukujcych z pozamito-chondrialnego NADH na NADP. Inn alternatyw dla jablczanu jest jego przetransportowanie do mitochondrium, gdzie moe on przej ponownie w szczawiooctan. Naley zwrci uwag, e przenonik cytrynianu (trikar-boksylanw) ' bonie mitochondrialnej wymaga jabczanu do wymiany z cytrynianem (p. ryc. 14-16). U przeuwaczy niemal nie ma liazy ATP--cytrynianowej ani enzymu jabczanowego, prawdopodobnie dlatego, e u tych gatunkw octan (pochodzcy z wacza) jest gwnym rdem acetylo-CoA. Poniewa octan jest pozamito-chondrialnie aktywowany do acetylo-CoA, nie ma potrzeby, aby wnika on do mitochondriw i tworzy cytrynian przed inkorporacj w dugo-acuchowe kwasy tuszczowe. U tych gatunkw, ze wzgldu na brak enzymu jabczanowego, znacznie wiksze znaczenie ma wytwarzanie NADPH dziaaniem pozamitochondrialnej dehydrogenazy izocytrynia nowej. Elongacja acucha kwasw tuszczowych za chodzi w siateczce rdplazmatycznej Ten szlak (elongacyjny ukad mikrosomainy) przeksztaca acylo-Co A-pochodne kwasw tuszczowych w pochodne acylowe, majce o 2 atomy wgla wicej, przy uyciu malonylo-CoA jako dawcy acetylu oraz NADPH jako czynnika redukujcego. Zwizkami porednimi w tym procesie s tioestry CoA. Grupy acylowe, ktre mog dziaa jako czsteczki inicjujce, obejmuj seri nasyconych kwasw tuszczowych od Clo wzwy, jak rwnie nienasycone kwasy thiszczowe. Godzenie w znacznej mierze znosi elongacj acucha. Eiongacja stearylo--CoA w mzgu przyspiesza si w okresie mieli-nizacji, aby dostarczy kwasw tuszczo wych C22 i C24, ktre wystpuj w sfingolipi-dach (ryc. 23-6).
0 l + CH1-C -S-CoA I 'COOH

Malonylo-CoA
Acylo-CoA
SYNTAZA 3-KETOACYLO-CoA
C oA * S H + C O ,
R -CH, - C -' CH I -*C - S - CoA 3-Koioaoylo-CoA
I I
NAOPH + REDUKTAZA 3-KETOACYLO-CoA
R-tHj-^H-fCHjJC - S-CoA 3-HydroksyacyloXoA
HYDRATAZA
^ C H - Jf i - S - C oA 2,3-N<enasycony ac/lo^CoA NADPH + H+ REDUKTAZA 2,3-NSENASYCONYCH ACYLO-CoA NADP*
: - JC H , - ? < ! ! ~ S - C oA Acylo-CoA
R yc . 23- 6. Mi kr osom al ny uk ad el ongacj i acu cha { elongaza).
258 / ROZDZIA 23
STAN ODYWIENIA REGULUJE LIPOGENEZ Wiele zwierzt, cznie z czowiekiem, przyjmuje pokarm jako oddzielone czasem posiki i dlatego magazynuje wiele energii pochodzcej z poywienia, aby mc j uytkowa midzy posikami. Proces lipogenezy dotyczy przeksztacenia glukozy i takich zwizkw porednich, jak pirogronian, mleczan i acetylo-CoA w tuszcz, co stanowi anaboliczn faz tego cyklu. Stan odywienia organizmu i tkanki jest gwnym czynnikiem kontrolujcym szybko lipogenezy. I tak szybko ta jest dua u dobrze odywionego zwierzcia, ktrego dieta zawiera duo wglowodanw. Zmniejsza si w warunkach ograniczonego dostarczania energetycznego pokarmu, pokarmu boga to tuszczowego, lub gdy istnieje niedobr insuliny, jak to jest w cukrzycy. Warunki te s zwizane ze zwikszonym steniem wolnych kwasw tuszczowych w osoczu. Regulacja mobilizacji wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej jest opisana w rozdz. 27. Istnieje odwrotna zaleno miedzy wtrobow lipogenez a steniem wolnych kwasw tuszczowych w surowicy (ryc. 23-7). Najwiksze zahamowanie lipogenezy wystpuje w zakresie zmian ste wolnych kwasw tuszczowych o 0,30,8 jamot/ml osocza. Stenia te w osoczu krwi zmieniaj si o podany zakres podczas przejcia ze stanu syto ci w stan 2,0 3,0 godzenia.
0.5 1J0 WKTw surowicy (fimol/ml)
Tuszcze zawarte w poywieniu powoduj take zmniejszenie lipogenezy w wtrobie. Jeeli ich zawarto w poywieniu przekracza 10%, to nie ma przeksztacania wglowodanw poywienia w tuszcze. Lipogenez jest wiksza wwczas, gdy sacharoza zastpi glukoz w pokarmie, poniewa fruktoza omija etap kontrolny gliko-iizy, jakim jest fosforruktokinaza i zalewa szlak lipogenezy (p. ryc. 22-4). LIPOGENEZ JEST REGULOWANA POPRZEZ MECHANIZMY KRTKOTERMINOWE I DUGOTERMINOWE Synteza dugoacuchowa kwasw tuszczowych w trybie krtkotrwaym jest kontrolowa na przez allosteryczne i kowalencyjne modyfikacje enzymw, a w duszym czasie przez zmiany szybkoci syntezy i degradacji odpowiednich enzymw. Stenie cytrynianu i acylo -CoA reguluje karboksylaz acetylo -CaA Reakcja ograniczajca szybko szlaku lipogenezy znajduje si na etapie karboksylazy acetyio-CoA. Ta karboksylaza jest aktywowana przez cytrynian, ktrego stenie si zwiksza w stanie dobrego odywienia i ktry jest wskanikiem obfitego dostarczania acetylo-CoA. Jednake jest ona hamowana dziaaniem czste czek acylo-CoA o dugim acuchu wglowym, co jest przykadem hamowania zwrotnego przez kocowy produkt ca^go cigu reakcji. Wobec tego, jeeli nagromadza si acylo-CoA, poniewa nie jest on dostatecznie szybko estryfikowany, automatycznie zmniejsza si synteza no wych kwasw tuszczowych. Podobnie, gdy acylo-CoA nagromadza si w wyniku wzmoonej lipolizy lub dopywu wolnych kwasw tuszczowych do tkanki, wwczas rwnie nastpuje zahamowanie syntezy nowych czsteczek kwasu tuszczowego. Acylo-CoA moe rwnie hamowa transporter trikarboksy anw i wobec lego zapobiega wychodzeniu cytrynianu z mi-tochondriw do cytozolu. Dehydrogenaza pirg roni nowa jest take regulowana przez acylo--CoA Istnieje odwrotna zaleno midzy steniem wolnych kwasw tuszczowych, a proporcj aktywnej postaci dehydrogenazy pirogro -
Ryc. 23-7. Bezporednia inhibicja wtrobowej lipogenezy przez wolne kwasy tuszczowe. Lipo-genez oceniano oznaczajc 3 wbudowywanie trytu H2O do wolnych kwasw tuszczowych w perfun-dowanej wtrobie. WKT , wolne kwasy tuszczowe. (Dowiadczenia z laboratorium autora wsplnie z D.L. Toppingiem).
nianowej do nieaktywnej, co reguluje dostp no ace.tylo-CoA dla lipogenezy. Acylo-CoA powoduje zahamowanie aktywnoci dehydro-genazy pirogronianowej przez hamowanie wymiennego transportera ATP-ADP wewntrznej bony mitochondrialnej, co prowadzi do zwik szenia wewntrzmitochondrialnego stosunku [ATP] / jADP] i w konsekwencji do przeksztacenia aktywnej postaci dehydrogenazy pirogronianowej w nieaktywn (p. ryc. 24-4). Ponadto utlenianie acylo-CoA, spowodowane zwikszonym steniem wolnych kwasw tuszczowych, moe powodowa zwikszenie stosunku [acety-lo-CoA] / [CoA] oraz [NADH] / [NAD+] w mi-tochondriach hamujc w ten sposb dehyd-rogenaz pirogronianow. Hormony reguluj rwnie lipogenez Insulina pobudza lipogenez za pomoc kilku mechanizmw. Wzmaga transport glukozy do komrki (np. w tkance tuszczowej) i przez to zwiksza dostpno zarwno pirogronianu do syntezy kwasw tuszczowych, jak i glicerolo-3--fosforanu do estryfikacji kwasw tuszczowych. Insulina zmienia nieaktywn posta dehydrogenazy pirogronianowej w aktywn, ale czyni to w tkance tuszczowej, a nie w wtrobie. Ponadto karboksylaza acetyl o-Co A jest enzymem, ktry moe by regulowany przez odwracaln fosforylacj. Insulina aktywuje kar-boksylaz acetylo-CoA, zapewne przez aktywacj fosfatazy biaek. Take insulina, przez jej zdolno zmniejszania stenia cAMP w komrce, hamuje lipoliz i przez to zmniejsza stenie acylo-CoA o dugim acuchu wglowym, bdcego inhibitorem lipogenezy. Za pomoc tego samego mechanizmu insulina staje si antagonist dziaania glukagonu i adrenaliny, ktre hamuj karboksylaz acetylo-CoA, a wic i lipogenez, dziki zwikszeniu stenia cAMP i umoliwieniu cAMP-zalenej kinazie biaek unieczynnienie enzymu przez fosforylacj. Ostatnio opisano AMP-zalen kinaz Watek, ktra wykrywa stan maej energii w komrce, wykazujc wraliwo na zwikszone stenie AMP. Ta nowa kinaza take inaktywuje
przez fosforyiacj^ karboksyiaze acetylo-CoA. Ponadto aminy katecholowe hamuj ten enzym przez receptory a-adrenergiczne i kinaz biaek zalen od Ca2+/kalmoduliny. U przeuwaczy octan, a nie glukoza, jest materiaem wyjciowym do lipogenezy. Nastpstwem tego jest to, e u tych zwierzt wiele mechanizmw regulacyjnych z udziaem mito-chondriw nie ma zastosowania. Zarwno kompleks syntazy kwasu tuszczowego jak i karboksylaza acetylo-CoA s ezymami adaptacyjnymi Adaptuj si one do fizjologicznych potrzeb organizmu przez zwikszenie ich cakowitej iloci w stanie sytoci, a zmniejszenie w godzie, karmieniu tuszczem i w cukrzycy. Insulina jest wanym hormonem powodujcym indukcj biosyntezy enzymu, a przeciwdziaa temu glu-kagon. Musi upyn kilka dni, aby te dziaania uwidoczniy si i wzmagay bezporedni i natychmiastowy efekt wolnych kwasw tuszczowych oraz takich hormonw, jak insulina i glu-kagon.
PIMIENNICTWO
Goodridge AG: Fatty acid synthesis in eukaryotes. Page 143 in: Biochemistry ojLipids andMembranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cum mings, 1985. Goodridge AG: Dietary regulalion of gene expression: Enzymes involved in carbohydrate and lipid metabolism. Annu Rev Nuir 1987; 7:157. Hardie DG, Carling D, Sim ATR: The AMP-activated protein kinase: a multisubsirat regulator of lipid metabolism. Trends Biochem Sci 1989; 14; 20. Singh N, Wakil SJ, Stoops JK: On the question of half-or full-site reactivity of animal fatty acid synthetase. J Biol Chem 1984; 259:3605. Tsukamoto Y et al: The architecture of the fatty acid synhetasecotccia. JBkAChem 1983; 258:15312. Wakil SJ, Stoops JK, Joshi VC: Fatty acid synthesis and its regulation, Annu Rev Biochem 1983; 52:537.
24
WPROWADZENIE
Utlenianie kwasw tuszczowych: Ketogeneza

Kwasy tuszczowe s utleniane zarwno do acetylo-CoA, jak i s syntetyzowane z acetylo--CoA. Jakkolwiek materia wyjciowy jednego procesu jest identyczny z produktem drugiego procesu, a chemiczne etapy porednie zaan gaowane w obydwa procesy s porwnywalne, to jednak utlenianie kwasw tuszczowych nie jest zwyczajnym odwrceniem ich biosyntezy, lecz zupenie odmiennym procesem, zachodzcym w innym kompartmencie komrki. Od dzielenie utleniania kwasw tuszczowych od ich biosyntezy umoliwia indywidualn kontrol kadego z tych procesw i ich integracj z potrzebami tkanki. Utlenianie kwasw tuszczowych zachodzi w mitochondriach. W kadym jego etapie uczestniczy pochodna acylo-CoA i kady etap jest katalizowany przez oddzielny enzym. Koenzymami tego procesu s NAD i FAD. W wyniku utleniania kwasw tuszczowych powstaje ATP. W odrnieniu od utleniania, biosynteza kwasw tuszczowych (lipogeneza) odbywa si w cytozolu. Uczestnicz w niej acylowe pochodne zwizane z wieloenzymowym kompleksem, NADP jako koenzym, i jest potrzebny ATP oraz jon wodorowglanowy. Utlenianie kwasw tuszczowych jest procesem aerobowym, wymagajcym obecnoci tlenu.
powstawania cia ketonowych* w wtrobie (ketoza). Ciaa ketonowe s kwasami. Jeeli s wytwarzane w nadmiarze przez dugi czas, jak to ma miejsce w cukrzycy, to mog by przyczyn kwasicy ketonowej (ketoacidosis), ktra nie leczona moe by zgubna w skutkach. Poniewa glukoneogeneza jest zalena od utleniania kwasw tuszczowych, kade zmniejszenie ich utleniania prowadzi do hipoglikemii. Taka sytuacja ma miejsce w rnych stanach niedoboru karnityny lub enzymw istotnych w utlenianiu kwasw tuszczowych (np. pal-mitoilotransferazy karnitynowej), albo pfzy zahamowaniu utleniania kwasw tuszczowych spowodowanym truciznami (np. hipoglicyn).
UTLENIANIE KWASW TUSZCZOWYCH ZACHODZI W MITOCHONDRIACH Kwasy tuszczowe s transportowane we krwi jako wolne kwasy tuszczowe (WKT, FFA)
Okrelenie wolne kwasy tuszczowe" (ang. free fatty acids) odnosi si do kwasw tuszczowych, ktre wystpuj w stanie niezestryfikowa-nym. Alternatywnymi skrtami s UFA (ang.
Wzmoone utlenianie kwasw tuszczowych jest charakterystyczne dla stanu godzenia i cukrzycy (diabetes mellitits/. Jest ono przyczyn
*W jzyku polskim okrelenie ciaa ketonowe" (ketone bodies) byo wielokrotnie przedmiotem kry tyki. Zastpiono je okreleniem zwizki ketonowe", majc na myli 3 substancje, tj. aceton, acetooctan i p-bydroksymalan. Okrelenie ciaa ketonowe" pozostawiono na wyrane yczenie Tumacza (przyp. red. i wyd.).
UTLENIANIE KWASW TUSZCZOWYCH: KETOGENEZA / 261
unesterified fatty acids) lub NEFA (ang. non--estenfi.d fatty acids). W osoczu WKT o du-szym acuchu wglowym s zwizane z albumin, za w komrkach z biakiem wicym kwasy tuszczowe albo z biakiem Z. W rzeczywistoci kwasy te nigdy nie wystpuj w stanie wolnym1'. Kwasy tuszczowe o krtszym acuchu s lepiej rozpuszczalne w wodzie i wystpuj w postaci niezjonizowanych kwasw lub anionw kwasu tuszczowego. Kwasy tuszczowe musz by aktywowane, aby mogy by metabolizowane Podobnie jak to ma miejsce z przemian glukozy, kwasy tuszczowe musz najpierw w reakcji z udziaem ATP zosta zamienione w aktywny metabolit, aby mogy reagowa z enzymami odpowiedzialnymi za ich dalszy metabolizm. W caym szlaku cakowitej degradacji kwasw tuszczowych jest to jedyny etap, ktry wymaga energii zawartej w ATP. W obecnoci ATP i koenzymu A, enzym syn-tetaza acylo-CoA (tiokinaza) katalizuje przemian kwasu tuszczowego, tj. wolnego kwasu tuszczowego w aktywny kwas tuszczowy'*, czyli w acylo-CoA. Reakcja ta jest zwizana z wydatkiem 1 bogatoenergetycznego wizania fosforanowego.
SYNTETAZA ACYLO-CoA
Kwasy tuszczowe o dugim acuchu przenikaj przez wewntrzn bon mi-toch ondrialn jedynie w poczeniu z karnityn Karnityna (phy droksy-y-trimety loamino-malan), (CH3 ) 3 N+-CH2 -CH(OH)-CH2 - COO~, jest szeroko rozpowszechniona, a szczeglnie obficie wystpuje w miniach. Jest syntetyzowana z iizyny i metioniny w wt robie i nerkach. Aktywacja niszych kwasw tuszczowych i ich utlenianie moe zachodzi w mitochondriach niezalenie od karnityny. W odrnieniu od krtkoacuchowych kwa sw tuszczowych WKT o dugim acuchu nie wnikaj do mitocbondriw i nie s utleniane bez uprzedniego przeksztacenia w acylo karnityny.
Acylo-CoA + Karnityna----------------------------
PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYMOWA
> Acylo karnityna + CoA
Kwas tuszczowy + ATP + Co A ---------------- - Acylo-CoA + PP, + AMP
Obecno pir o fosfatazy nieorganicznej sprawia, e aktywacja przebiega do koca dziki uatwieniu utraty dodatkowego bogatoenerge tycznego wizania fosforanowego pirofosfora-nu. W rzeczywistoci w czasie aktywacji kadej czsteczki kwasu tuszczowego s wiec wydatkowane 2 bogatoenergetyczne wizania fosforanowe.
PPi + HaO
PIR0FOSFAT A2A NIEORGANICZNA
Syntetazy acylo-CoA wystpuj w siateczce rdplazmatycznej, w obrbie mitochondriw i na zewntrznej bonie mitochondrialnej. Opisano kilka syntetaz acylo-CoA. Kada z nich jest swoista wobec kwasw tuszczowych o okrelonej dugoci acucha.
Enzym, palmitoilotransferaza karnitynowa 1, znajdujcy si po wewntrznej stronie zewntrznej bony mitochondrialnej, katalizuje przeksztacenie dugoacuchowych acylo -CoA w acylokarnityn, ktra przenika do mitochon-driw, przez co kwasy tuszczowe staj si dostpne dla enzymw szlaku p-oksydacji. Translokaza karnitynoacylokarnitynowa dziaa jako bonowy wymienny przenonik karnityny. Transport acy lokami ty ny do wntrza mito-chondriw jest sprzony z przeniesieniem 1 czsteczki karnityny na zewntrz. W mito-chondrium acylokarnityna reaguje z CoA, w wyniku czego powstaj acylo-CoA i wolna karnityna uwalniane do macierzy mitochond-riainej. Reakcja ta jest katalizowana przez pal-m i to i to transfer a ka mity now II, zwizan z wewntrzn powierzchni wewntrznej bony mitochondrialnej (ryc. 24-1). W mitochondriaeh wystpuje jeszcze inny enzym, acetylotransferaza karnitynowa, katalizujcy przenoszenie grup acy 1 owych o krtkim acuchu wglowym midzy CoA a kamityn. Funkcja tego enzymu jest niejasna. Jest mo liwe, e uatwia on transport grup acetyl owych przez bon mitochondrialn.
Acetylo-CoA + Karnityna
ACETYLOTRANSFERAZA KARNITYMOWA
Acetylokarnttyna + CoA
262 / ROZDZIA 24
CoA Strona FFA zewntrzna SYNTETAZA ACYLO-Co/ ZEWNTRZNA -tM
BONA l.>'i;.'>j
MITOCHONDFNALNA
. . . . : . . :
Acytokarnltyna PALMITOILORANSFERAZA KARNffYNOW Af RANSLOKAZA, WEWNTRZNA KARNITYNA->i B O NA , ^. A C YL O -RNIT MITOCHONDRIALNA YN PALMITO1LO-T RANSFERAZA RNITY-A l l
p-Oksydacja kwasw tuszczowych polega na kolejnym odczepianiu r uwalnianiu acetyo -CoA W p-oksydacji (ryc. 24-2) odczepiane s od czsteczek acylo-CoA, poczwszy od koca karbonylowego, reszty dwuwglowe. acuch jest rozrywany pomidzy atomami wgla a (2) 1 p (3) i std nazwa ^ -oksydacja. Powstajce jednostki dwuwglowe to czsteczki acetylo -CoA; tak wiec z palmitoilo-CoA tworzy si S czsteczek acetylo-CoA. W cyklicznej sekwencji reakcji s wytwarzane NADH i FADH 2 Kilka enzymw, znanych pod zbiorcz nazw oksydaza kwasw thiszczowych", znaj duje si w macierzy mitochondrialnej w pobliu acucha oddechowego (ktry jest umiejscowiony w wewntrznej Honie mitochondrialnej). Katalizuj one utlenianie acyio-CoA do acety-lo-CoA, co wie si z fosforylacj ADP do ATP (ryc. 24-3). Po wnikniciu reszty acylowej przez wewntrzn bon mitochondrialn za porednictwem uktadu transportujcego karnityn i po od tworzeniu acyio-CoA, nastpuje oderwanie 2 atomw wodoru od atomw wgla 2 (a) i 3 (p), katalizowane przez dehydrogenaz acylo-CoA. W wyniku tej reakcji powstaje A2-tranj-enoilo-CoA. Koenzymem tej dehydrogenazy jest flawoproteina zawierajca FAD jako grup pro -
Strona wewntrzna Karnityna
A cv I o kar nity na
Acylo-CoA
0-OksydtcJa Ryc. 24-1. Rola karnityny w transporcie dugo-acuchowych kwasw tuszczowych przez wewntrzn bon mitochondrialn. Ougoacucho-wy acylo-CoA nie moe przenika przez wewntrzn bon mitochondrialn, ale produkt jego metabolizmu, acylokarnityna, ma t zdolno.
CO-S-CoA
Acetylo-CoA Kolejne usuwanie jednostek dwuwglowych
co-s-coA+a
8 CH 3-CO-S-CoA Acetylo-CoA Ryc. 24-2. Oglny schemat [i-oksydscji kwasw tuszczowych.
U TLE N I A NI E K W A S W TU S ZC ZO W Y C H : K E TO G E N E ZA / 263 Kwas tuszczowy CoA-SH SYNTETAZA ACYLO-CoA Aoyto-Co* (Aktywny Kwas tuszczowy) ATP ^* AMP - - PP, i. 0
R^CHr *CHrC - S -CoA i (zewntrzna) strona cytoplazmatyczna
WEWNTRZNA BLDNAMITOCHONDHIALNA
TRANSPOHTER KARNITYNOWY (wewntrzna) strona mltochoncfrlatna S -C oA
'CH DEHYDBOGENAZA] ACYLO-OoA
j -C -
(Flawoprotaina) 2~(P; --H,0 acuch Q oddechowy
A'-Sn*Enolo-CoA
R- SCH = H-C-S-
CoA
HYDRATAZA A"ENOILO-CnA
H,0
-CoA
RJCH- CH
3
?H
J
-C-
S - C oA
DEHYDROGENAZA L( + )-^KYDROKSYACYLO-CoA : Xatoacylo -CoA R3
3-
acuch oddechowy H,0
(4)
3-KETOACYLOTIOLAZA TIOLAZA
CoA-SH 2CO,
Ryc. 24-3. [J- Oksydacja kwasw tuszczowych. Dugoa cuchowy acylo-CoA przechodzi cyklicznie przez reakcje 2-5, a w kadym cyklu jest odczepiany acetylo -CoA dziaaniem tiolazy (reakcja 5). Gdy pozostanie reszia acyiowa o dugoci jedynie 4 atomw wgla, wwczas w reakcji 5 wytwarzaj si 2 czsteczki acetylo-CoA
264 / ROZDZIA 24
stetyczn. Reoksydacja tej grupy prostetycz-nej przez acuch oddechowy wymaga porednictwa innej fiawoproteiny nazwanej flawo-protein przenoszc elektrony. Wysyccnic podwjnego wizania i wytworzenie 3-hydroksya-cylo-CoA odbywa si przez przyczenie czsteczki wody, co katalizowane jest przez enzym hydrataz A2-enoilo-CoA. Pochodna 3-hydro-ksylowa ulega dalszemu odwodorowaniu na wglu 3 pod wpywem dehydrogenazy L(+)-3--hydroksyacylo-CoA, W wyniku tej reakcji powstaje odpowiedni 3-ketoacylo-CoA. W reakcji tej MAD, a nie FAD jest koenzymem uczestniczcym w odwodorowaniu. W kocu 3-ketoa-cylo-CoA jest rozrywany w pozycji 2,3 przez tiolaz (3-ketoacylotiolaz aibo popr wnie: acetyl o trans feraz acetylo-CoA), katalizujc tio-lityczne rozerwanie wizania z udziaem drugiej czsteczki CoA. Produktami tej reakcji s acety-lo-CoA i acylo-CoA zawierajcy o 2 atomy wgla mniej ni pierwotna czsteczka acy-lo-CoA, ktra ulega utlenie niu. Utworzony w reakcji rozszczepienia acylo-CoA ponownie wchodzi w szlak oksydacyjny rozpoczynajcy si reakcj 2 (ryc. 24-3), W ten sposb dugi acuch kwasu tuszczowego moe zosta cakowicie rozoony na acetylo-CoA (jednostki C2), Poniewa acetylo-CoA moe by utleniony do CO2 i wody w cyklu kwasu cytrynowego (ktry take jest umiejscowiony w mitochond riach), kwasy tuszczowe mog ulega cakowitemu utlenieniu.
prowadzi do syntezy 5 bogatoenergetycznych wiza fosforanowych (p. rozdz. 14) na kad z pierwszych 7 czsteczek acetylo-CoA utworzonych przez P-oksydacj palmitynianu (7 x 5 = 35), W sumie wytwarza si 8 mol acety-lo-CoA, z ktrych kady moe dostarczy 12 wiza o duej energii przez utlenienie w cyklu cytrynianowym. Ogem powstaje wic 8 x 1 2 = 96 wiza bogatoenergetycznych pochodzcych z utlenienia czsteczek acetylo--CoA utworzonych w wyniku rozpadu palmitynianu. Po odjciu 2 wiza bogatoenergetycznych na pocztkow aktywacj kwasu tuszczowego zysk netto wynosi 129 wiza bogatoenergetycznych na mol utlenionego palmitynianu albo 129 x 30,5 = 3935 kJ. Swobodna energia spalania kwasu palmitynowego wynosi 9791 kJ/mol, wobec czego w omawianym procesie przetworzeniu na energi zawart w bogatoene rgetycznych wizaniach fosforanowych ulega ok. 40% cakowitej energii spalania kwasu tuszczowego.
Kwasy tuszczowe o bardzo dugim acuchu s utleniane w peroksysomach

W peroksysomach zachodzi zmodyfikowana forma p-oksydacji. Produktami jej s acetylo--CoA i K2O2 (H2O2 powstaje na etapie dziaania dehydrogenazy zwizanej z flawoprotein). Ten szlak nie jest bezporednio powizany z fos-forylacj i wytwarzaniem ATP, ale pomaga utleni kwasy tuszczowe o bardzo dugim acuchu (np. C20) C22). Jest on indukowany przez spoycie pokarmw o duej zawartoci tusz czu, a take przez leki o dziaaniu hipolipemicz-nym, np. klofibrat. Enzymy zawarte w peroksysomach nie atakuj kwasw tuszczowych o krtszym acuchu. Sekwencja P-oksydacji koczy si na oktanoilo--CoA. Grupy oktanoilowe i acetylowe s usuwane z peroksysomw w postaci oktanoilo-i acctylokamityny, a nastpnie sa utleniane w mitochondriach.
W wyniku utleniania kwasw tuszczowych o nieparzystej liczbie atomw wga powstaje czsteczka propionylo-CoA
Kwasy tuszczowe o nieparzystej liczbie atomw wgla s utleniane w szlaku p -oksydacji z wytwarzaniem acetylo-CoA, a do pozostania trjwglowej reszty propionylo-CoA. Ten zwizek jest przeksztacany do sukcynylo-CoA, metabolitu bdcego zwizkiem porednim cyklu cytrynianowego (p. te ryc. 21-2). Wobec tego reszta propionylowa z kwasw tuszczowych o nieparzystej liczbie atomw wgla jest jedynym fragmentem kwasw tuszczowych, ktry jest glukogenny.
ot- i (o-OKSYDACJA KWASW TUSZCZOWYCH S WYSPECJALIZOWANYMI SZLAKAMI

Ilociowo p-oksydacja w mitochondriach jest najwaniejszym szlakiem utleniania kwasw tuszczowych. Jednake w mzgu wykryto oc--oksydacj, tj. proces usuwania po 1 atomie wgla od karbonylowego koca czsteczki. Ten
Utlenianie kwasw tuszczowych powoduje powstanie wielu czsteczek ATP
Transport elektronw w acuchu oddecho wym ze zredukowanych fiawoproteiny i NAD
proces nie wymaga przeksztacenia kwasw tuszczowych w pochodn Co A i nie wie si z wytwarzaniem bogatoenergetycznych fosforanw. t-Oksydacja jest normalnie szlakiem o bardzo niewielkim znaczeniu. Uczestnicz w niej ukady hydroksylujce zawierajce cytochrom P-450 siateczk i rdpiazmatycznej. Grupa CH3 jest przeksztacana w grup CHjOH, a nastpnie utleniana do COOH i w ten sposb powstaje kwas dikarboksylowy. Jest on utleniany przez B-oksydacje zwykle do kwasw adypinowego (C6) i suberynowego (C8), ktre s wydalane z moczem.
WADLIWE UTLENIANIE KWASW TUSZCZOWYCH JEST PRZYCZYN CHORB METABOLICZNYCH

Niedobr karnityny moe wystpowa zwaszcza u noworodkw, a szczeglnie u wcze-niakw. Moe on by spowodowany niedostateczn biosyntez karnityny albo jej utrat przez nerki. Utrat moe take spowodowa hemodializa lub acyduria spowodowana kwasami organicznymi. Karnityna jest wwczas wydalana po sprzgniciu z kwasami organicz nymi. W wymienionych stanach zachodzi potrzeba uzupenienia karnityny, podobna do potrzeby uzupenienia niedoborw witamino wych w pokarmach. Objawami niedoboru kar nityny s: okresowa hipoghkemia, spowodowana zmniejszon glukoneogenez (uwarunkowan zmniejszonym utlenianiem kwasw tuszczowych), upoledzona ketogeneza w obecnoci zwikszonego stenia WK.T w osoczu, osabienie mini oraz spichrzanie Jipidw w tkankach miszowych. Leczenie polega na doustnym podawaniu karnityny. Objawy niedoboru karnityny s podobne do zespou Reye'a, w ktrym stenie karnityny jest prawidowe. Przyczyna zespou Reye'a jest nieznana. Niedobr wtrobowej palmitoilotransferazy karnitynowej jest przyczyn hipoglikemii i maego stenia zwizkw ketonowych w osoczu, podczas gdy niedobr miniowej palmitoilotransferazy karnitynowej charakteryzuje si nieprawidowym utlenianiem kwasw tuszczowych, co powoduje napadw o wystpujce osabienie mini i mioglobinuri. Mechanizm dziaania hipoglikemizujcego pochodnych sul-fonyl o mocznika (gliburyd i tolbutamid) poJega min. na zmniejszeniu utleniania kwasw tusz-
czowych uwarunkowanym hamowaniem pal-mitoilotransferazy karnitynowej. Jamajska choroba wymiotna jest spowodowana spoywaniem niedojrzaych owocw drzewa akee, zawierajcych toksyn hipoglicyn, ktra inaktywujc dehydrogenaz acylo-CoA hamuje P-oksydacj i powoduje hipoglikemi. Acyduria dik ar boksytw a charakteryzuje si wydalaniem &>-dikarboksylowych kwasw 0 dugoci acucha Ce do C,o i hipoglikemi. Jest ona spowodowana brakiem mitochondrialnej dehydrogenazy acylo-CoA swoistej dla substratw o redniej dugoci acucha. Brak tego enzymu upoledza p -oksydacj, ale wzmaga (o-oksydacj kwasw tuszczowych o dugim 1 rednim acuchu, ktre s nastpnie skracane podczas P-oksydacji do kwasw dikarboksyiowych o redniej dugoci acucha i s wydalane z moczem. Choroba Rei suma jest rzadkim zaburzeniem neurologicznym spowodowanym nagromadzaniem si kwasu fitanowego, powstaego z fitolu, skadnika chlorofilu wystpujcego w pokarmach rolinnych. Kwas fitanowy zawiera grup metylow przy wglu 3, ktra blokuje p-oksydacj. U osb zdrowych pocztkowa a-ok-sydacja usuwa grup metylow. Osoby z chorob Refsuma maj dziedziczn wad cc-oksyda-cji, ktra jest przyczyn nagromadzania si kwasu fitanowego w tkankach. Zesp Zellwegera {mzgo wo-wtrobo wo-ner-kowy) wystpuje u osb z rzadko stwierdzanym wrodzonym brakiem peroksysomw we wszystkich tkankach. Gromadz si u nich kwasy polienowe C26C33w tkance mzgowej, gdy nie ma w tej wadzie zdolnoci do utleniania kwasw tuszczowych o dugim acuchu w pe-roksysomach.
UTLENIANIE NIENASYCONYCH KWASW TUSZCZOWYCH ODBYWA SI W ZMODYFIKOWANYM SZLAKU 8- OKSYDACJI

Nienasycone kwasy tuszczowe zwizane es-trowo z CoA s degrado wane przez enzymy uczestniczce normalnie w p-oksydacji, a do etapu powstania A3-cn-acylo-CoA albo A4-cis--acylo-CoA, zalenie od pozycji podwjnego wizania (ryc. 24-4). Pierwszy z tych zwizkw jest izomeryzowany (izomeraza A3-m -+ A2--trats-euoilo-CoA) do odpowiedniego etapu A2--trans-enoUo-CoA p-oksydacji, aby nastpnie
266 / ROZDZIA 24 cis cis Ryc. 24-4. Kolejno reakcji zachodzcych podczas utleniania nienasyconych kwasw tuszczo wych, np. kwasu finolowego. Kwasy tuszczowe i A -cis lub kwasy tuszczowe tworzce A*-as-enoi-lo-CoA, wchodz do szlaku w pokazanym miejscu.
:-sLinolalto-CoA 3 cykle /J-oksydacji
3-Acetylo-CoA cis cis
tf-cts-C -cis-O ln o Ilo-Co A IZOMERAZA A'-cfc (albo
as
A - trans~?-cts-D leno Ilo-Co A [etap /J-oksydaejl odpowiadajcy AMrans-enoilc-CoAi 1 cykl ^-oksydacji Acetylo-CoA
cs
ulec hydratacji i dalszemu utlenieniu. Kady A*-c-acylo-CoA pozostajcy w tym szlaku, czego przykadem jest przemiana kwasu linole-nowego (ryc. 24-4), albo wchodzcy w szlak na tym etapie (3-oksydacji jest przeksztacany do A2-(fanj-A+-c/.c-dienoilo-CoA przez dehydro-genaz acylo-CoA, Ten zwizek poredni jest przeksztacany do A3 -/rans-enoilo-CoA pod wpywem redukta/y A2-trans-A4-cis-dienoilo--CoA enzymu zalenego od NADP. Izo -meraza A3-c/5-*A;:-ffa5-enoilo-CoA atakuje rwnie podwjne wizanie P-trcms, powodujc powstanie A2-mzns-enoilo-CoA, zwizku poredniego P-oksydacji. Mikrosomalna peroksydacja wielonienasyconych kwasw tuszczowych jest zalena od NADPH NADPH-zalena peroksydacja nienasyco nych kwasw thaszczowych jest katalizowana przez enzymy mikrosomalne. Przeciwutleniacze BHT (butylowany hydroksytoluen) i a-tokofe-rol (witamina E) hamuj mikrosomalna perok-sydacj lipidw. KETOGENEZA ZACHODZI WWCZAS, GDY NATENIE UTLENIANIA KWASW TUSZCZOWYCH W WTROBIE JEST DUE W pewnych warunkach metabolicznych, zwizanych z duym nateniem utleniania kwasw tuszczowych, wtroba wytwarza znaczne iloci acetooctanu i D(-)-3-hydroksyma-lanii (P-hydroksymalanu). Acetooctan ulega cigej samoistnej dekarboksylacji, dajc aceton. Te 3 substancje s znane pod wspln nazw ciaa ketonowe (nazywane take zwizkami acetonowymi, lub niewaciwie ketonami"*) (ryc. 24-5). Acetooctan i 3-hydroksyma* Termin ketony" nie powinien byc uywany, poniewa 3-hydroksymaIan nie jest ketonem, a we krwi jest wiele ketonw, ktre nie s zwizkami (ciaami) ketonowymi, np. pirogronian, fruktoza.
'
C-S- Co A O DEHYDflOGENAZA A*-//a/7*A4-rfs-Dl8nollo-CoA ^ ACYLO-CoA H +NA0P H -O

+
. A -c/s-Enollo-CoA RE DUKTAZA
C-S-CoA
A^frans-Enollo-CoA IZOMERAZA A -c/9-{albo A*-irans-ENOILO-CoA
O // C -S- CoA
J
4 cykle ^-oksydacji
4-Aoe(ylo-CoA
UTLENIANiE KWASW TUSZCZOWYCH: KETOGENE ZA / 267
O II
CH,-C-CH,-COO"
Acetooctan DEHYDHOGENAZA D(-}3-HYDROKSYMAS ANOWA NA D H + H NA D
CH,-CH-CH,-COCT DMa-Hydroksyinalan Ryc. 24- S. Wzajemne zalenoci cia ketonowych. Dehydrogenaza D(-)-3- hydro ksymalano wa jest enzymem mitochondrialnym.
lan s wzajemnie w siebie przeksztacane dziaaniem mitochondrialnego enzymu dehydrogena-zy D(-)-3-hydroksymalanowej. Rwnowaga tej reakcji jest kontrolowana mitochondrialnym
stosunkiem [NAD+] do [NADH], tj. stanem red.-oks. Stosunek [3-hydroksymalan]; [aceto-octan] w krwi waha si w granicach 1:110:1. Stenie cakowite cia ketonowych we krwi dobrze odywionych ssakw normalnie nie przekracza 0,2 mmol/L Jest ono nieco wiksze u przeuwaczy dziki tworzeniu 3-hydroksyma-lanu z kwasu masowego (produktu fermen tacji w waczu) w cianie wacza. U czowieka utrata cia ketonowych z moczem wynosi zwykle mniej ni 1 mg/24 h. Stany zwikszonego stenia cia ketonowych we krwi okrela si jako ketonemi (hiperketonemi), za zwik szone ich wydalanie z moczem jako ketouuric. Oba te stany okrela si jako ketoz. Kwasy acetooctowy i 3-hydroksymasowy s umiar kowanie mocnymi kwasami i s zbuforowane, gdy wystpuj we krwi lub w tkankach. Jednake w stanach zwikszonego wydalania nadmiaru obu tych zwizkw dochodzi do utraty kationu buforujcego (pomimo zwikszonego wytwarzania amoniaku w nerce). W konsekwencji dochodzi do stopniowego wyczerpania rezerwy alkalicznej i do rozwoju kwasicy ketonowej. Wystpienie kwasicy ketonowej moe by fatalne w skutkach u chorych z niewyrw-nan cukrzyc.
2COi
2CO,
Ryc. 24- 6. Powstanie, zuywanie i wydalanie cia ketono wych. Gwny szlak jest zaznaczony cigymi strzakami
268 / ROZDZIA 24
Najprostsza posta ketozy wystpuje przy godzeniu, kiedy dochodzi do wyczerpania si zapasw wglowodanowych i do zwikszenia stenia wolnych kwasw tuszczowych. Kady inny stan, w ktrym wystpuje ketoza, nie rni si jakociowo od tego modelu metabolicznego, ale ilociowo moe by tak nasilony, e jest przyczyn stanw chorobowych obserwowanych np. w cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciowym u owiec i ketozie u mlecznych krw. Postacie ketozy pozbawione znaczenia chorobowego stwierdza si u osb ywionych diet o duej zawartoci tuszczu oraz po wykonaniu cikiego wysiku u niektrych osb bdcych na czczo. In vivo wtroba wydaje si by jedynym narzdem u nieprzeuwaczy wydzielajcym znaczne iloci cia ketonowych do krwi. Poza-wtrobowe tkanki zuywaj ciaa ketonowe jako substraty energetyczne. Pozawtrobowe rda cia ketonowych, wystpujce u przeuwaczy w okresie sytoci nie maj znaczcego udziau w powstawaniu ketozy u tych gatun kw. Wypyw cia ketonowych z wtroby do tka nek pozawtrobowyeh jest wynikiem aktywnego mechanizmu enzymatycznego pobudzajcego wytwarzanie cia ketonowych w wtrobie oraz maej aktywnoci w tym narzdzie enzymw odpowiedzialnych za ich zuytkowanie. Odwrotna sytuacja ma miejsce w tkankach pozawtrobowych (ryc. 24 -6). 3-Hvdroksy-3-metyloglutarylo-CoA (HMG-CoA) jest zwizkiem porednim na szlaku ketogenezy w wtrobie Enzymy odpowiedzialne za powstawanie cia ketonowych s zwizane gwnie z mito-chondriami. Pierwotnie sdzono, e tylko 1 czsteczka acetooctanu moe powsta z kocowych 4 wgli kwasu tuszczowego podczas jego utleniania. Pniej, aby wyjani powstawanie wikszych ni rwnowane iloci acetooctanu z I czsteczki kwasu tuszczowego o dugim iacuchu, jak i moliwo tworzenia cia ketonowych 2 kwasu octowego, zaproponowano, e jednostki C2 powstajce w p-oksydacji mog ze sob kondensowa, tworzc acetooctan. Taki proces moe by wynikiem odwrcenia reakcji katalizowanej przez tiolaz, w ktrej 2 czsteczki acetylo-CoA kondensuj tworzc acetoacetylo-CoA. Acetoacetylo-CoA, ktry jest zwizkiem wyjciowym do ketogenezy, mgby wic powsta albo bezporednio pod-
czas p-oksydacji, albo jako wynik kondensacji acetylo-CoA (ryc. 24-7). Zaproponowano JLszlalagowstawania acetooctapH ? fgetff"^^-lo-CoA.?terwszv"z'nicn"ma bv prosta deacyla-cjTDrugrszlak (ryc. 24-8) obejmuje kondensacj acetoacetylo-CoA z jeszcze 1 czsteczk acetylo-CoA i wytworzenie HMG-CoA. Reak cj t katalizuje syntaza 3-hydroksy-3-metylo-glutarylo-CoA. Obecno w mitochondriach innego enzymu, liazy 3-hydroksy-3-metyloghtfa-rylo-CoA, umoliwia odczepienie acetylo-CoA od HMG-CoA z pozostawieniem wolnego acetooctanu. Atomy wgla odczepione jako czs teczka acetylo-CoA pochodz z pierwotnej czsteczki acetoacetylo-CoA (ryc. 24-8). Obydwa te enzymy musz by w ntitochondriach, aby zachodzia ketogeneza. Ma to miejsce jedynie w wtrobie i w nabonku wacza. Obecnie przewaa opinia, e szlak HMG--CoA jest gwn drog tworzenia cia ketonowych. Chocia podczas godu wystpuje znaczne zwikszenie aktywnoci liazy HMG-CoA, dane dowiadczalne nie sugeruj, aby byl to enzym ograniczajcy szybko ketogenezy. Acetooctan jest przetwarzany do D(-)-3-hyd-roksymalanu przez dehydrogenaz D(-)-3-hyd-roksymalanow, ktra wystpuje w mitochondriach wielu tkanek, cznie z wtrob. D(-)-3--Hydroksymalan jest ilociowo dominujcym ciaem ketonowym wystpujcym we krwi 1 w moczu w ketozie. Ciaa ketonowe s wykorzystywane jako materia energetyczny przez tkanki pozawtrobowe Chocia wtroba jest wyposaona w aktywny mechanizm enzymatyczny potrzebny do wytwarzania acetooctanu z acetoacetylo-CoA, to raz powstay acetooctan nie moe by w zasadzie w wtrobie ponownie reaktywowany. W cytozolu komrek wtrobowych zachodzi znacznie mniej aktywny proces biosyntezy cholesterolu, dla ktrego acetoacetylo-Co A jest prekursorem. Wszystko to sprawia, e w wt robie przewaa powstawanie acetooctanu nad jego utylizacj. W tkankach pozawtrob owych zachodz 2 reakcje, w ktrych acetooctan jest aktywowa ny do acetoacetylo-Co A. W jednej z nich uczest niczy sukcynylo-CoA i enzym transfera/a bursz tyny o-CoA-acetoacetylo-Co A. Enzym ten kata lizuje przeniesienie CoA z sukcynylo-CoA na acetooctan z wytworzeniem acetoacetylo-Co A i wolnego bursztynianu.
UTLENIANIE KWAS W TUS ZCZOWYCH: KETOGENE ZA / 269
CH3COCHaCOO Acetooctan CH 3COCH 3CO-S-CoA ITRANSFCRAZACOAI
CH aC0O" I CH aCO-S-CoA Sukcvnylo-CoA
CHaCOO" i CHaCOO" Bursztynian Acetoa cetylo -CoA
Druga reakcja polega na aktywacji acetooctanu przez ATP w obecnoci CoA, katalizowana jest przez syntctaz acetoacetjlo-CoA,
SYNTETAZA ACETOACETYLO-CoA
CH 3COCH ICOO"+ ATP+ CoA- SH Acetooctan - CH3C OCHJ COS CoA + A MP + A ceto a c et y I o - C o A
D(-)-3-HydroksymaIan moe by bezpo rednio aktywowany w tkankach pozawtro -bowych przez odpowiedni syntetaz; jednake przemiana do acetooctanu z udzia em dehydrogenazy D(-)- 3 -hydro ksym a sianowej i NAD+, z nastpujc potem aktywacj do acetoacetylo-CoA, jest waniejsz drog dalszej przemiany hydroksymalanu. Acetoacetylo--CoA powstay w tych reakcjach jest rozszczepiany do acetylo-CoA dziaaniem tiolazy i utleniany w cyklu kwasu cytrynowego, jak to przedstawiono na ryc. 24-7. Ciaa ketonowe s utleniane w tkankach pozawtrobowych proporcjonalnie do ich st enia we krwi. S one utleniane preferencyjnie przed glukoz i WKT. Kiedy stenie cia ketonowych we krwi zwiksza si, zwiksza si ich utlenianie, a do stenia ok. 12 mmol/l, w ktrym wysycaj one ukady utleniajce. Gdy to nastpi, znaczna ilo pobieranego przez zwierz tlenu moe by zuywana do utleniania cia ketonowych.
FFA A T P -v CoA AMP+ PPt

SYNTETAZA ACYLO-CoA Ettryflkacja Tfiacylogilcaro l fosioiipld
Acyto-CoA
^-Oksydacja [AMrtylo-CoA).
|DEACYLAZA |
"7T"
H,0
SYNTAZA HMG-CoA
CoA
ITPLAZAI \ Pula aeetylo-CoA
H,O\
3-HydrDky-3-me!ylog lu tar ô -C o A * (HM G-CoA) LIAZA HMG-CoA
Acetylo-CoA
I kwasu! cytrynowego
DEHYDROGENAZA D(-)3--HYDROKEYWASLAN OWA
2CO,
D(-)3My0roksyfna4ian
Rve. 24-7. Szlak ketogenezy w wtrobie. WKT wolne kwasy tuszczowe, HMG 3-hydroksy-3--metylogiuiaryl.
270 / ROZDZIA 24 O O
HjO
3 -* C-S
C H J-C -C H J-C -S -Co A Acetoacetylo-CoA
Co A Awtylo-CoA
V _______
SYNTAZA HMG-CoA
CH,- C - CHi C-S-CoA " H , -* C O O 3-Hyd ro ksy-3-m styl og! u ta ry o-CoA
OH I
O li
LSAZA HMG-CoA
H.-C-S <
i
CH 3 - C Aceooctan CH 3 -C~S Co A Acetylo-CoA Byc. 24- 8. Po wstawanie acetooctanu przez po rednie wytwarzanie HM G -CoA.
Wikszo danych dowiadczalnych przemawia za tym, e kctonemia jest powodowana raczej nadmiernym wytwarzaniem cia ketono-
KETOGENEZA JEST REGULOWANA NA 3 KLUCZOWYCH ETAPACH 1. Pierwsze miejsce kontroli ketogenezy znaj duje si w tkance tuszczowej. Retoza nie wy stpi in vivo, jeeli nie ma rwnoczesnego zwik szenia stenia krcych wolnych kwasw tu szczowych, ktre pochodz z lipolizy triacylo gliceroli w tkance tuszczowej. Kwasy tusz czowe s prekursorami cia ketonowych w wt robie. Wtroba zarwno w fazie sytoci, jak i w czasie godzenia ma zdolno wychwytywa nia ok. 30% lub wicej kwasw tuszczowych z krwi docierajcej do tego narzdu. Przy duych steniach wolnych kwasw tuszczo wych we krwi ich napyw do wtroby jest znaczny. Wobec tego dla kontroli ketogenezy znaczca jest rola czynnikw regulujcych mobi lizacj wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej (ryc. 24-9). 2. Losy wychwytywanych przez wtrob wo lnych kwasw tuszczowych mog by dwojakie po wstpnej ich aktywacji do acylo-CoA. Mog one zosta zestryfikowane, gwnie do triacylo-
wych w wtrobie ni upoledzonym ich zuywaniem przez tkanki pozawtrobowe. Wyniki dowiadcze na szczurach z usunit trzustk przemawiaj jednak za tym, e w cikiej cukrzycy ketoza moe by pogbiana zmniejszeniem katabolizowama cia ketonowych. Przy umiarkowanej ketonemii utrata cia ketonowych z moczem stanowi zaledwie niewielki procent cakowitego ich wytwarzania i utylizacji. Poniewa ciaa ketonowe zachowuj si w nerkach podobnie jak zwizki progowe" (w rzeczywistoci nie istnieje prawdziwy prg nerkowy dla tych metabolitw), przy czym poszczeglne gatunki i poszczeglni osobnicy wykazuj znaczne rnice indywidualne; ciko ketozy naley ocenia na podstawie nasilenia ketonemii, a nie ketonurii. Podczas gdy utlenianie acetooctanu i D(-)-3--hydroksymalanu w tkankach pozawtrobo -wych przebiega nader sprawnie, utlenianie acetonu in vivo jest raczej trudne.
gliceroli i fosfolipidw, lub te ulegaj fi-ok-sydacji do CO, wzgldnie do zwizkw ketonowych. Wydolno estryfikacji, jako czynnika przeciwketogennego, zaley od dostpnoci w wtrobie prekursorw glicerolo-3-fosforanu. Jednak w godzonych perfundowanych wtrobach dostpno glicerolo-3-fosforanu nie jest czynnikiem ograniczajcym estryfikacj WKT. Nie rozstrzygnito ostatecznie, czy ta dostpno w wtrobie jest w ogle czynnikiem ograniczajcym szybko estryfikacji. Nie ma rwnie pewnych informacji, czy aktywno in vivo enzymw uczestniczcych w estryfikacji jest czynnikiem ograniczajcym szybko tego procesu. Wydaje si, e nim nie jest, gdy nie zdarza si spichrzanie w wtrobie ani wolnych kwasw tuszczowych, ani zwizkw porednich na drodze ich estryfikacji (p. ryc. 26-1). Uywajc perfundowanej wtroby wykazano, e narzd ten. pochodzcy od dobrze kar-
Trlacyloglioerol
TKANKA TUSZCZOWA
WKT
Llpoliza
KREW
WKT
Cykl kwasu cytrynowego Ketogeneza CO, Cia a ket onowe
Ryc. Z4-9. Regulacja ketogenezy. 1-3 3-wzowe etapv szlaku metabolizmu wolnych kwasw tuszczowych (WKT), ktre dete/minuj wielko ketogenezy. _______ ___________
mionyeh szczurw, estryfikuje znacznie wicej kwasw tuszczowych znakowanych 14C ni wtroba szczurw godzonych, w ktrej nie zestryfikowany nadmiar wolnych kwasw tuszczowych jest utleniany do 14CO;, lub 14C--cia ketonowych. Te wyniki tych bada mona wyjani tym, e aktywno palmitoilo-transferazy I kamity nowej, umiejscowionej w zewntrznej bonie mitochondrialnej, reguluje wnikanie grup acylowych o dugim acuchu do wntrza mitochondriw przed ich fi-oksyda-cj (p. ryc. 24-1). Aktywno tego enzymu jest maa w stanie sytoci, gdy utlenianie kwasw tuszczowych jest mae, natomiast dua przy godzeniu, kiedy zwiksza si utlenianie kwasw tuszczowych. Malonylo-CoA, pocztkowy metabolit w biosyntezie kwasw tuszczowych (p. ryc, 23-1), ktrego stenie zwiksza si w stanie sytoci, jest inhibitorem wymienionej pataitoi-lotransferazy, przez co ustaje p-oksydacja. W warunkach sytoci zachodzi wic aktywna lipogeneza i jest due stenie malonylo-CoA, hamujcego palmitoilotransferaz I (ryc. 24--10). Wolne kwasy tuszczowe, wnikajce do wtroby przy ich maym steniu w osoczu, s niemal w caoci estryfikowane do acyl o gliceroli i wydalane z wtroby do krwi w postaci lipo-protein o bardzo maej gstoci (VLDL), Na pocztku godzenia, kiedy stenie wolnych kwasw tuszczowych w osoczu si zwiksza, zahamowana zostaje karboksylaza acetylo--CoA i stenie malonylo-CoA si zmniejsza. W nastpstwie tego procesu odblokowaniu ulega palmiloilotransferaza kani i ty nowa, co pozwala na zwikszenie utleniania acyl o-Co A. Te zdarzenia nasilaj si w stanach godzenia, kiedy zmniejsza si stosunek [insulina] / [gluka-gon], przez co zwiksza si lipoliza w tkance tuszczowej, natomiast zahamowaniu ulega karboksylaza acetylo-CoA w wtrobie (p. ryc. 24-10). 3. Acetylo-CoA, powstay w procesie P-ok-sydacji, jest utleniany w cyklu kwasu cytrynowego albo wchodzi w szlak ketogenezy wytwarzajcy ciaa ketonowe. Gdy stenie wol nych kwasw tuszczowych w surowicy si zwiksza, wwczas proporcjonalnie wicej kwasw tuszczowych jest przeksztacanych w ciaa ketonowe, a mniej jest utlenianych w cyklu cytrynianowym do CO7. Proporcja acetylo-CoA, napywajcego do szlaku ketogenezy i szlaku utleniania do CO2, jest tak regulowana, e ca kowita energia swobodna zgromadzona w postaci ATP w wyniku utleniania kwasw
2 7 2 / R O ZD Z I A 2 4
WKT
KREW
VLDL
Wglowodany Acetyto-CoA
WKF ^ , , A cyl o -C oA Estrylkacja ---------------------
WTROBA
Acytagllcerole
KARBOKSYLAZA ACETYLD-CoA Insulina Cylosol Glukagon Matonylo-CoA _______ PALMITOILOTRANSFERAZA KARNITYNOWA I .Acylo-CoA [ 0-Oksydacja
O.
Milochondrlum Aootylo-CoA
Ketoganeza
Ciaa ketonowe Ryc. 24-10. Regulacja utleniania dtugoacuchowych kwasw tuszczowych w wtrobie. WKT wolne kwasy tuszczo we, VLDL lipoproteiny o bardzo m alej gstoci. Dodatnie () i ujemne () efekty regulacyjne s przedstawione przerywanymi liniami, a przepyw substratw iiniami cigymi. ___________
tuszczowych pozostaje stal. Cakowitemu utlenieniu 1 mol palmil ynianu towarzyszy wytwarzanie netto 129 mol ATP, gdy proces ten zachodzi poprzez ft-oksydacj i wytworzenie CO^ w cyklu kwasu cytrynowego (p. wyej). Jeeli kocowym produktem przemiany palmitynianu jest acetooc-tan ilo powstaego ATP wynosi tylko 33 moi. Ilo powstajcego ATP zmniejsza si nawet do 21 mol, gdy produktem kocowym jest 3-hydro-ksymatan. Ketogeneza moe wic by uwaana za mechanizm, ktry umoliwia wtrobie utlenienie zwikszajcych si iloci kwasw thisz-czowych w ukadzie skojarzonych oksydacyj-
nych fosforylacji, bez zwikszenia cakowitego wydatku energetycznego. Wysuwano kilka innych hipotez w celu wyjanienia przeczania utleniania kwasw tuszczowych ze szlaku prowadzcego do CO2 na szlak ketogenezy. Teoretycznie zmniejszenie stenia szczawi o octanu, zwaszcza w mito-chondriach, mogoby zmniejsza zdolno cyklu kwasu cytrynowego do metaboltzowania acetylo-CoA. Takie zmniejszenie moe si zdarza wtedy, kiedy dochodzi do zwikszenia stosunku [NADH] / [NAD +], spowodowanego intensywniejsz p-oksydacj. Krebs sugerowa,
e wzmoona glukoneogeneza, na szlaku ktrej wystpuje take szczawiooctan, jest przyczyn zmniejszenia stenia tego zwizku, co moe by powodem cikich postaci ketozy wystpujcej w cukrzycy, a take ketozy u byda. Jednake Utter i Keech wykazali, e karbok-sylaza pirogronianowa, katalizujca przemian pirogronianu w szczawiooctan, jest aktywowana przez acetylo-CoA. Wynika stad, e w razie wystpowania znacznych iloci acetyl o-Co A s niezbdne dostatecznie due iloci szczawiooc-tanu w celu zainicjowania reakcji kondensacji, rozpoczynajcej cykl kwasu cytrynowego.
PIMIENNICTWO
Boyer Pd (editor): The Enzymes, 3rd ed. Vol 16 of Lipid Enzymology. Academic Press, 1983,
Debeer LJ, Mannaerts GP: The mitochondrial and peroxisomal pathways of fatty acid oxidation in rat liver. Diabete Metab (Paris) 1983;9;134. Mayes PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339, McGarry JD, Foster DW: Regulation ofhepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Pand SV, Parvin R: Page 143 in: Carnitine Biosynthesis, Metabolium. and Functions, Frenkel RA, McGarry JD (editors). Academic Prcss, 1980. Schulz H: Oxidation of fatty acids. Page 116 in: Biochemistry ofLipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 19S5. Various authors: In: Tke Metabolit- Basia of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et ul (editors). McGraw-Hill, 1989. Vianey-LiaudCetal: Theinborn errorsofmitochondriai fatty acid osidation. / I nher Metab Dis 1987;1O: Suppl 1:159.
1S Biochemia
25
Metabolizm nienasyconych kwasw tuszczowych i eikozanoidw

WPROWADZENIE
W porwnaniu z rolinami tkanki zwierzce maj ograniczon zdolno desaturacji kwasw tuszczowych. Stwarza to konieczno przyjmowania w pokarmie pewnych wielo nienasyconych kwasw tuszczowych gwnie pochodzenia rolinnego. Te egzogenne kwasy tuszczowe umoliwiaj powstawanie ikozanowych (C20) kwasw tuszczowych, z ktrych pochodz zwizki znane jako eikozanoidy. Nale do nich prostaglandyny, tromboksany i leukotrieny.
adenylanowej, np. 1) w regulacji agregacji pytek krwi oraz 2) w hamowaniu dziaania hormonu antydiuretycznego w nerkach. Leukotrieny maj waciwoci kurczenia mini gadkich, a take waciwoci chemotaktyczne, co sugeruje, e mog one odgrywa wan rol w reakcjach alergicznych i zapalnych. Mieszanin leukotrienw zidentyfikowano jako wolno reagujc substancj anafilaksji (SRS -A). Przez zmian proporcji rnych wielo nienasyconych kwasw tuszczowych w diecie jest moliwe wpywanie na typ syntetyzowanych eikozanoidw. Wskazuje to na moliwo wpywania na przebieg choroby przez zmiany skadu diety.
Zawarto nienasyconych kwasw tuszczowych w tuszczu wyznacza jego temperatur topnienia, a wic i jego pynno. Fosfolipidy bony komrkowej rwnie zawieraj nienasycone kwasy tuszczowe istotne do utrzymania odpowiedniej pynnoci bony. Duy stosunek stenia wielo nie nasyconych kwasw tuszczowych do nasyconych (stosunek P:S) w pokarmach jest wanym czynnikiem do zmniejszenia stenia cholesterolu w surowicy krwi za pomoc diety i uwaa si, e dziaa korzystnie w zapobieganiu chorobie niedokrwiennej serca. Prostaglandyny i tromboksany s miejscowymi hormonami, ktre w miar potrzeby s szybko syntetyzowane i dziaaj blisko miejsca swojej syntezy, Niesteroidowe Leki przeciwzapalne, takie jak kwas acetylosalicylowy, dziaaj na zasadzie hamowania syntezy prostaglandyn. Prostaglandyny odgrywaj fizjologiczn rol gwnie jako modulatory aktywnoci cyklazy
NIEKTRE WfELONIENASYCONE KWASY TUSZCZOWE NIE MOG BY SYNTETYZOWANE PRZEZ SSAKI I S NIEZBDNYMI SKADNIKAMI POKARMU
Niektre dugoacuchowe nienasycone kwasy tuszczowe, majce znaczenie metaboliczne u ssakw, przedstawiono na ryc. 25-1. (Przegld nazewnictwa kwasw tuszczowych omwiono w rozdz. 16). Inne C20 kwasy polienowe, kwasy C22 i C2A mona rwnie znale w tkankach. Mog one powstawa z kwasw olejowego, linolowego i a-linolenowego przez elongacj acucha. Naley zauway, e wszystkie podwjne wizania w naturalnie wystpujcych kwasach tuszczowych maj konfiguracj cis. Kwasy palmitoolejowy i olejowy nie nale do kwasw egzogennych, poniewa tkanki s
METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASW TUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDW / 275
/WWVW\ COOH
16 9 Kwas palmltoolejowy (a> 7, 16:1 A") Kwas olejowy (w 9,18:1, A")
AAAAAAA/
*Kwas llnolawy {as 6, 18:2,
/WWWWNA
18 15 12 9 'Kwas -llno(enowy (a 3, 18:3, **)
20
rych wiadomo, e s niezbdnymi skadnikami poywienia dla wielu gatunkw zwierzt, cznie z czowiekiem i musz by dostarczane z pokar mem; nazywa si je przeto egzogennymi kwasa mi tuszczowymi. Kwas linolowy nie jest syn tetyzowany u czowieka i dlatego musi by COOH dostarczany w gotowej postaci w poywieniu. Kwas arachidonowy moe by jednake wy twarzany z kwasu linolowego u wikszoci ssakw (p. ryc. 25-4). U zwierzt podwjne wizanie moe by wprowadzane do pozycji A4, COOH A5, A6 i A9 (liczc od koca karboksylowego; p. rozdz. 16), ale nigdy poza pozycj A9. Odmien nie jest u rolin, ktre s zdolne do wprowadza nia nowych podwjnych wiza w pozycje As, A9, A12 i A15 i wobec tego mog syntetyzowa egzogenne (niezbdne w pokarmie zwierzcym) COOH kwasy tuszczowe.
Stearoito-CoA + Enzym COO H
'Kwas arachidonowy (co 6, 20:4, THANSFERAZA ACYLOWA 'COO H Kwas elkozapenlaenowy (m 3, 20:5, A**"'
1t1T
Co A-S H
Stearollo-Enzym
Byc. 25-1. Budowa niektrych nienasyconych kwasw tuszczowych. Chocia atomy wgla s numerowane konwencjonalnie, tzn. od wgla karboksylowego, liczby poprzedzone greck liter at (np. to7 w kwasie palmitoolejowym) oznaczaj pozycje liczon od odwrotnego koca {kocowej grupy metylowej) czsteczki. Informacja zawarta w nawiasach wskazuje, e np. kwas a-linolenowy ma podwjne wizania poczwszy od C3, liczc od koca metylowego, ma 18 atomw wgla i 3 podwjne wizania oraz e te podwjne wizania s umiejscowione przy 9,12 i 15 atomie wgla, liczc od koca karboksylowego. Znak * oznacza, e dany zwizek jest egzogennym kwasem tuszczowym".
HYDROKSYUKZA Cytbs * . NAD

+
Hyd roksyslearoilo-Enzym
HYDRATAZA
Olallo-Enzym
zdolne do wprowadzania podwjnego wizania w pozycji A9 do odpowiedniego nasyconego kwasu tuszczowego. Dowiadczenia ze znakowanym kwasem palmitynowym wykazay, e znacznik atwo pojawia si w kwasie palmito-otejowym i olejowym, ale nie ma go w kwasach linolowym, ot-linolenowym ani arachidonowym. S one jedynymi kwasami tuszczowymi, o kt -
TRANSFEHAZA ACYLOWA
Oleilo-CoA + Enzym Ryc 25-2.
Uktad
mikrosomalnej A -desaturazy.
276 / ROZDZIA 25
MONONIENASYCONE KWASY TUSZCZOWE S SYNTETYZOWANE PRZEZ UKAD A9-DESATURAZY

Uwaa si e wiek tkanek, cznie z wtrob, ma zdolno tworzenia mono nienasyconych kwasw tuszczowych z odpowiednich kwasw nasyconych. Pierwsze podwjne wizanie jest wprowadzane do nasyconego kwasu tuszczowego niemal zawsze w pozycji A9. Ukad enzymatyczny A9 -desaturaza (ryc. 25-2) w siateczce rdplazmatycznej katalizuje przeksztacenie palmitoilo-CoA w palmitooleilo--CoA albo stearoilo-CoA w oleilo-CoA. Do reakcji jest niezbdny tlen oraz NADH albo NADPH. Enzymy uczestniczce w tej reakcji wydaj si by typowymi enzymami ukadu monooksygenazy zawierajcego cytochrom b; (hydroksylaza).
W SYNTEZIE WIELONIENASYCONYCH KWASW TUSZCZOWYCH UCZESTNICZ UKADY ENZYMATYCZNE DESATURAZY 1 ELONGAZY

Dodatkowe wizania podwjne, wprowadzane do istniejcych ju niononienasyconych kwasw tuszczowych, zawsze (z wyjtkiem bakterii) s od siebie przedzielone grup metylenow. U zwierzt dodatkowe wizania podwjne s zawsze wprowadzane midzy istniejce podwjne wizanie a grup karhoksyIow, ale u rolin mog by wprowadzane midzy istniejce wizanie podwjne i wgiel to (koniec metylowy). Poniewa zwierzta maj A9-desaturaz, s one zdolne do kompletnej syntezy rodziny a>9 (kwasu olejowego) nienasyconych kwasw tuszczowych przez kombinacj elongacji i desatu-
ELONGAZA
Rodzlna
Kwas olejowy 18:1 A'-DE5ATURAZA
| A'-DESATURAZA ELONGAZ A
A'-DESATURAZA
20:2
20i3 ---------- ^ 22:3
22:4
18:2.
ELONGAZA \
20:1
ELONGAZA
'
18:3
22:1
B_0NGAZA
Ai
24:1
Spichrza nie przy niedoborze kwasw tuszczowych egzogennych
Rodzina
Kwas lin o Iowy 18:2 --------.
-20:3
-20:4
22:5
ELONGAZA
20:2
/e
-*- 22:5
Kwas a-llnolenowy Rodzina

(D 3
18:3 ----------------------------1
18:4
20:4
20:5
22:6
Ryc. 25-3. Biosynteza wielo nienasyconych kwasw tuszczowych rodzin u9, w6 oraz co3. Kady z etapw jest katalizo wany przez mikrosomalne ukady elo ngacji albo desaturacji. Ilo wielo nienasyconych kwasw tuszczowych 9 staje si znaczca jedynie wwczas, gdy kwasy linolowy i ot -linolenowy zostaj wyczone z diety. Dzieje si tak dlatego, e kada z przedstawionych serii wspzawodniczy o te same ukady enzymatyczne, a powinowactwa zmniejszaj si poczwszy od mZ a do <>9. hamowanie.
METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDW / 277
Llnolelto-CoA (A^-oktadefcadfenolto-CoA) Oj + NA DH + H ,
+
y-Lfnoteno(to-CoA(4**"-aktadekatrlenollo-CoA)
(Malonyto-CoA, NADPH)
C-S CoA Arachldonollo-CoA (A""'1*-lkozatetraenollo-CoA)
Ryc. 25-4. Przemiana kwasu linolowego do arachidonowego. U kotw nie zachodzi ta przemiana, gdy 6 nie maj one A -desaturazy i musz wobec tego otrzymywa arachidonian z pokarmem. ____________
racji acucha (ryc. 25-3). Poniewa jednak nie s one zdolne do syntetyzowania ani kwasu linolowego ((06), ani a-linolenowego (co3), gdy nie maj potrzebnych do tego odpowiednich desaturaz, te kwasy musz by dostarczone w pokarmach, aby moga zachodzi synteza innych wielonienasyconych kwasw tuszczowych rodziny w6 i o>3. Linolenian moe by przemieniony w arachidonian (ryc. 25-4). W szlaku tym dochodzi najpierw do odwodorowania estru kwasu linolowego z CoA i utworzenia Y-linole-nianu, po czym nastpuje dodanie jednostki dwuwglowej przez przyczenie malonylo-CoA
w mikrosomalnym ukadzie elongacyjnym (p. str. 257). W wyniku tych reakcji powstaje ikozatrienian (dihomo-y-linolenian), ktry przez dalsze odwodorowanie tworzy arachidonian. Ukad odwodorowujcy jest podobny do tego, ktry opisano powyej dla nasyconych kwasw tuszczowych. Z powyszego wynika,
e przy dostatecznej poday kwasu licio wego kwas arachidonowy przestaje by kwasem egzogennym.
Aktywno ukadu desaturacji i eiongacji jest znacznie zmniejszona w stanie godzenia i przy braku insuliny.
278 / ROZDZIA 25
OBJAWY NIEDOBORU WYSTPUJ WWCZAS, GDY BRAK JEST W POKARMACH EGZOGENNYCH KWASW TUSZCZOWYCH (EFA) W 1928 r. Evans i Burr zauwayli, e szczury karmione oczyszczon diet bezlipidow, do ktrej dodano witamin A i D, wykazuj zmniejszone tempo wzrostu i upoledzon reprodukcj. Pniejsze prace wykazay, e ten zesp niedoboru mona wyleczy przez dodanie do diety kwasw linolowego, a-linolenowego i arachid ono wego. Dalsze objawy zespou niedoboru egzogennych kwasw tuszczowych to uszczca si skra, martwica ogona i uszkodzenie ukadu moczowego, ale choroba nie jest miertelna. Leczce ten zesp kwasy tuszczowe wystpuj w duym steniu w rnych olejach rolinnych (p. str. 175), a w niewielkich tylko ilociach w produktach zwierzcych. Funkcje egzogennych kwasw tuszczowych wydaj si by rnorodne, chocia niezbyt dobrze okrelone, z wyjtkiem znaczenia, jakie maj w tworzeniu prostaglandyn i leukotrie-nw. Egzogenne kwasy tuszczowe wystpuj w strukturalnych lipidach komrki i maj znaczenie w utrzymaniu strukturalnej integralnoci bon mitochondrialnych. Kwas arachidonowy wystpuje w bonach komrkowych i stanowi 515% wszystkich kwasw tuszczowych w fosfolipidach. Kwas dokozaheksaenowy (DHA: a>3,20:6), ktry jest syntetyzowany z kwasu a-linolenowego lub otrzymywany bezporednio z tuszczu ryb, wystpuje w duych steniach w siatkwce, korze mzgu, w jdrach i w spermie. DHA jest przede wszystkim potrzebny do rozwoju mzgu i jest dostarczany poprzez oysko i z mlekiem. Aby speni wiele funkcji strukturalnych egzogenne kwasy tuszczowe wystpuj w fos-folipidach gwnie w pozycji 2. W niedoborze egzogennych kwasw tuszczowych endogenne polienowe kwasy tuszczowe z rodziny 0)9 zastpuj egzogenne kwasy w fosfolipidach w innych zoonych lipidach i w bonach. Takim polienowym kwasem tuszczowym jest kwas Ai'811ikozatrienowy (ryc. 25-3). Oceny stopnia niedoboru egzogennych kwasw tuszczowych mona dokona, oznaczajc stosunek stenia trienw do tetraenw (arachidonianu) w oso czu. U ludzi spoywajcych pokarmy pozbawione egzogennych kwasw tuszczowych zauwaono zmiany skrne oraz upoledzenie transportu
lipidw. Objaww takich nie stwierdzono u dorosych pozostajcych na zwykej diecie. Jednak u dzieci otrzymujcych poywienie ubogie w tuszcze obserwowano zmiany skrne, ktre ustpoway po podaniu linolenianu. Niedobory dajce si przypisa brakowi egzogennych kwasw tuszczowych, cznie z kwasem a-linoleno-wym mog wystpi take u chorych ywionych przez duszy czas doylnie pynami z ma zawartoci egzogennych kwasw tuszczowych. Temu niedoborowi mona zapobiec przez podawanie egzogennych kwasw tuszczowych w iloci 12% cakowitego zapotrzebowania energetycznego. Kwasy tuszczowe o konfiguracji trans mog konkurowa z kwasami tuszczowymi cis ladowe iloci nienasyconych kwasw tuszczowych o konfiguracji trans powstaj w tuszczach przeuwaczy, gdzie wystpuj dziki dziaaniu mikroorganizmw znajdujcych si w waczu. Obecno duych iloci trans nienasyconych kwasw tuszczowych w czciowo uwodorowanych olejach rolinnych (np. wmar-garynie) nasuwa wtpliwoci odnonie do bezpieczestwa ich stosowania jako dodatkw pokarmowych. Skutki dugotrwaego ich spoywania przez ludzi s trudne do ocenienia, chocia ju od wielu lat s one skadnikami poywienia czowieka. W czasie autopsji w tkankach czowieka stwierdza si do 15% nienasyconych kwasw tuszczowych o konfiguracji trans. Dotychczas nie opisano powanych ujemnych skutkw ich wystpowania. S one metabolizowa-ne raczej w sposb bardziej podobny do nasyconych kwasw tuszczowych ni do cis nienasyconych. Moe to by spowodowane ich podobn prostola cuch ow konformacj (p. rozdz. 16). Wielonienasycone kwasy tuszczowe o konfiguracji trans nie maj dziaania egzogennych kwasw tuszczowych. Mog one antagonizowa metabolizm tych ostatnich, pogbiajc niedobr egzogennych kwasw tuszczowych. Nieprawidowy metabolizm egzogennych kwasw tuszczowych wystpujcy w niektrych chorobach Poza niedoborem egzogennych kwasw tuszczowych i zmianami w proporcji zawartoci poszczeglnych wielonienasyconych kwasw tuszczowych, spowodowanym dugotrwaym wadliwym odywianiem, nieprawidowy metabolizm egzogennych kwasw tuszczowych
METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASW TUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDW / 279
stwierdzono u chorych z torbielowatym wk-nieniem trzustki, w acrodermatitis enteropa-thtca, zespole wtrb owo-nerkowym, zespole Sjgrena-Larssona, wieloukadowym zwyrodnieniu nerww, chorobie Crohna, marskoci wtroby, alkoholizmie oraz zespole Reye'a. Due stenie polienowych kwasw tuszczowych o bardzo dugim acuchu wglowym stwierdzono w mzgu chorych z zespoem Ze-llwegera (p. str. 265). Spoywanie pokarmw o duym stosunku P;S (wielonienasycone : nasycone kwasy tuszczowe) zmniejsza stenie cholesterolu surowicy, zwaszcza cholesterolu LDL. Jest to korzystne z punktu widzenia relacji zachodzcej midzy steniem cholesterolu w surowicy a chorob niedokrwienn serca.
Arachidonian, zwykle pochodzcy z pozycji 2 fosfatydylodiacylogliceroli bon plazmatycz-nych w wyniku dziaania fosfolipazy A2 (p. ryc. 26-5), jest substratem do syntezy PG2, TXj oraz LT4. Szlaki ich metabolizmu s rne. Biosynteza PG i TX2 (prostanoidw) wspzawodniczy 0 substrat, tj. arachidonian, z syntez serii LT4. Te 2 szlaki s znane jako szlaki cyklooksygenazy 1 lipooksygenazy (ryc. 25-5). Istniej 3 grupy eikozanoidw (kada zawierajca PG, TX i LT) syntetyzowane odpowied nio z 3 egzogennych kwasw tuszczowych:
linolanu, arachidonianu i a-Hnolenianu (ryc. 25--6).
EIKOZANOIDY POWSTAJ Z C3O-WIEL0NIENASYC0NYCH KWASW TUSZCZOWYCH

Arachidonian i niektre inne C10 kwasy tuszczowe, z wizaniami podwjnymi poprzedzielanymi grupami metylenowymi, s rdem powstawania eikozanoidw, fizjologicznie i farma kologicznie czynnych zwizkw znanych jako prostaglandyny (PG), tromboksany (TX) i leukotrieny (LT) (p. rozdz. 16).
SZLAK CYKLOOKSYGENAZY JEST ODPOWIEDZIALNY ZA BIOSYNTEZ PROSTANOIDW

Biosynteza prostanoidw (ryc. 25-7), podczas ktrej dochodzi do zuycia 2 czsteczek O2, jest katalizowana przez syntaz endoperoksydu prostaglandyny, wykazujc 2 oddzielne aktywnoci enzymatyczne, cyklooksygenazy i peroksyda-zy. Produkt szlaku cyklooksygenazy, endopero-ksyd (PGH), jest przemieniany do prostagJan-dyn D, E i F, a take do tromboksanu (TXA2 ) i prostacykliny (PGI2 ). Kady rodzaj komrki
Rne bodce, np. anglotensyna II, twadyktntna. adrenalina,
FoEtolipId bonowy
irombina
FOSFOLIPAZA A,
KortykoBteroltJy przeciwzapalne Arachidonian UPOKSYGENA2A
Leukotrieny
Prostaglandyny i tromboksany
Kwas acetylosalicylowy
Indomstacyna
Ryc. 25-5, Przemiana kwasu arachidonowego do prostaglandyn i tromboksanw szlakiem cyklook sygenazy oraz do leukotrienw szlakiem I i po k sygenazy. Na rycinie pokazano, dlaczego steroidy, ktre hamuj cakowite wytwarzanie eikozanoidw, s lepszymi czynnikami przeciwzapalnymi ni kwas acetylosalicylowy i podobne do niego leki, ktre hamuj tylko szlak cyklooksygenazy. Uwaa si, e steroidy przeciwzapalne hamuj fosfolipaz Az przez to, e indukuj inhibitorowe biako lipokortyn.
280 / ROZDZIA 26
Pokarm
Llinolan
I-2H
y-Unolenian
Pros!anofdy;
J+2C
COOH
8,11,14-Eikozatrienoar t (d th omo-y-l in ols n ian)
POD, PGE,
LTD,
GRUPA3 Prostanoidy;
.
Ei kc zatet raanoan
PGD, PGE,
| +2C Oktadekatettaenaan -2H
-COOH
._ ----
PG13
TXAj, Leukatrieny 5 8, 11, 14, 17-Elkozape nlaen o a n
T-2H
ot-Linolenian
LTCS
Dieta
Ry - 25-6. 3 grupy eikozanoidw i ich biosyntetyczne pochodzenie. PG prostaglandyna, PGI prostacykltna, TX tromboksan, LT leukotrien, 1 szlak cyklooksygenazy, 2szlak Itpotcsygenazy Indeks we frakcji dolnej oznacza cakowit liczb podwjnych wiza w czsteczce i seri, do ktrej ten zwizek naley.
wytwarza tylko 1 typ prostanoidu. Kwas acetylosalicylowy hamuje cyklooksygenaz i podobnie dziaa indometacyna. Aktywno egzogennych kwasw tuszczowych jest skorelowana z wytwarzaniem prostagandyn Jakkolwiek istnieje znaczna korelacja midzy aktywnoci poszczeglnych egzogennych kwasw tuszczowych a ich zdolnoci do przeksztacania si w prostaglandyny nie wydaje si, aby egzogenne kwasy tuszczowe wywieray wszystkie swoje fizjologiczne efekty przez biosyntez prostagandyn. Rola egzogennych
kwasw tuszczowych w powstawaniu bon nie ma zwizku z tworzeniem prostagandyn. Pod wpywem prostagandyn nie dochodzi do cofania si objaww niedoboru egzogennych kwasw tuszczowych za zesp niedoboru egzogennych kwasw tuszczowych nie jest spowodowany dhigo trwaym hamowaniem syntezy prostagandyn. Cyklooksygenaza jest enzymem samobjczym" Wyczenie" syntezy prostagandyn zachodzi czciowo dziki godnej uwadze waciwoci cyklooksygenazy, mianowicie enzym ten wyka-
METABOLIZM NIENASYCONYCH KWASOW TUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDW / 281

COOH
Ryc. 26-7. Przemiana kwasu

9 Kwas acetylosalicylowy Indomalacyna
arachidonowego do prostaglandyrt i tromboksanw serii 2.

STNTETAZA PROSTACYKLINOWA COOH
SYNTETAZA TROMBOKSANOWA
COOH
PG prosta-glandyna, TX tromboksan, PGI prostacyklina, HHT hydroksyheptadekatrienoan. * Obydwie te aktywnoci s zwizane z jednym enzymem syntaz endoperoksydw prostaglandyn owych. Podobne przemiany zachodz z prostaglandynami i tromboksanami serii 1 i 3.
zuje 2dolno katalizowania samozagady, czyli jest ona enzymem samobjczym". Inaktywa-cja raz powstaych prostaglandyn jest szybka. Przyczyn tego jest prawdopodobnie obecno w wikszoci tkanek ssakw dehydrogenazy 15-hydroksyprostag landy nowej. Wykazano, e zablokowanie tego enzymu sulfasalazyn lub indometacyn moe przeduy biologiczny okres pltrwania prostaglandyn w organizmie. Prostanoidy s substancjami o duej aktywnoci biologicznej Tromboksany s syntetyzowane w pytkach krwi. Przy uwolnieniu powoduj skurcz naczy i agregacj pytek. Prostacykliny (PGI2) s wytwarzane przez ciany naczy krwiononych i s silnymi inhibitorami agregacji pytek.
Tromboksany i prostacykliny s wic antagoni stami. Niewielk zapadalno na choroby serca, wystpowanie zmniejszonej agregacji pytek i przeduonego czasu krzepnicia u grenlandzkich Eskimosw przypisuje si duemu spoyciu olejw rybnych zawierajcych kwas tuszczowy 20:5 w3 (EPA albo kwas ikozapentaenowy), ktry jest wyjciowym zwizkiem do syn tezy serii 3 prostaglandyn (PG3) oraz trombok-sanu TX3 (ryc. 25-6). PG3 i TX3 hamuj uwalnianie arachidonianu z fostblipidw i two rzenie PG2 oraz TX2. PGI3 ma takie samo silne dziaanie przedwagregacyjne pytek krwi jak PGI2, natomiast TXA3 jest sabszym czynnikiem agregujcym pytki krwi ni TXA2. W rezultacie przewaa wic dziaanie hamujce agregacj pytek krwi. Ponadto w osoczu Eskimo-
282 / ROZDZIA 25 COOH

Gtlcyna
Kwas glutaminowy ' --------- * + - J ^ ^ COOH
EJ
COOH OH
fl
Leukotrlen C,
OH
Ryc. 25-8. Przemiana kwasu arachido nowego do feukotrienw serii 4 szlakiem lipoksygenazy HPETE hydroperoksyeikozatetraenoan, HETE hydroksyeikozatetraenoan. Niektre podobne prze miany zachodz z leukotrienami serii 3 i 5. 1 Peroksydaza, 2 epoksydo hydrolaza leukotrienu A,, 3 S-transferaza glutationo wa; 4 y-glutamylotransferaza, 5 dipeptydaza cysteinyoglicynowa. ____
NH,1
A
o s
Leukotrion D, Glleyna
Cystelna
COOH
Leukotrlen E,
METABOLIZM NIENASYCONYCH KWAS0W TUSZCZOWYCH I EIKOZANOIDOW / 283
sw stwierdza si mae stenia cholesterolu, triacylogliceroli, LDL i VLDL, natomiast zwikszone stenie lipoprotein o duej gsto ci (HDL). Taki profil ste wymienionych lipidw zdaje si przeciwdziaa powstawaniu miadycy naczy i wystpowaniu zawaw serca. Zaledwie 1 ng/m] niektrych prostaglandyn powoduje skurcz mini gadkich u zwierzt. Potencjalnymi wskazaniami do stosowania prostaglandyn m.in. s: zapobieganie zapodnieniu, sprowokowanie porodu przy ciy donoszonej, przerwanie ciy, zagodzenie blu u chorych z chorob wrzodow odka, agodzenie procesw zapalnych, cinienia ttniczego krwi, dy-chawicy oskrzelowej oraz obrzkw bony luzowej nosa. Prostaglandyny zwikszaj stenie cAMP w: pytkach krwi, tarczycy, ciaku hym, ko ciach podowych, w przysadce gruczoowej i w pucach, natomiast zmniejszaj go w komrkach kanalikw nerkowych i w tkance tuszczowej.
pujce potem odczepienie glutaminianu i glicy-ny powoduje kolejno powstanie leukotrienu D4 i leukotrienu E4.
Leukotrieny s silnymi regulatorami wielu procesw chorobowych
Wolno reagujca substancja anafilaksji (SRS-A) jest mieszanin leukotrienw C 4, D4 i E4. Ta mieszanina Jeukotrienw jest 100-1000--krotnie silniejszym czynnikiem kurczcym minie oskrzeli ni histamina lub niektre prostaglandyny. Te leukotrieny, razem z leuko-trienem B4, zwikszaj przepuszczalno naczy krwiononych oraz wywouj chemo -taksj i aktywacj leukocytw. Wydaje si, e zwizki te s wic wanymi regulatorami wielu procesw chorobowych przebiegajcych ze stanami zapalnymi oraz uczestnicz w reakcjach nadwraliwoci bezporedniej, takich jak dy-chawica oskrzelowa. Leukotrieny s aktywne w stosunku do naczy, za 5-lipoksygenaz wykazano w cianie naczy ttniczych.
LEUKOTRIENYS SYNTETYZOWANE W SZLAKU LIPOKSYGENAZY

Lenkotrieny s rodzin skoniugowanych trie-nw powstajcych z kwasw ikozanowych w szlaku lipoksygenazy w leukocytach, komrkach mastocytoma, pytkach krwi i w makro-fagach, jako reakcja zarwno na bodce immunologiczne, jak i nieimmunologiczne. Trzy rne lipoksygenazy (dioksygenazy) katalizuj przyczanie tlenu do atomu wgla w pozycjach 5, 12 i 15 kwasu arachidonowego, powo dujc powstanie hydroperoksydw (HPETE). Jedynie 5-lipoksygenaza bierze udzia w powstawaniu leukotrienw. Najpierw powstaje leukotrien A4, ktry jest metabolizowany albo do leukotrienu B4, albo do leukotrienu C4 (ryc. 25-8). Leukotrien C4 powstaje przez poczenie z glutationem wizaniem tioeterowym. Nast -
PIMIENNICTWO
Hammarstrm S: Leukotrienes. Annu Rev Biochem 1983;52:355. Holman RT: Controi of polyunsaturated acids in tissue lipids. J Am Coli Nutr 1986;5:183. Kinsella JE: Food components with potential therapeutic benefits: The n-3 polyunsaturated fatty acids of fish oils. Food Technology 1986;40:89. Lagarde M, Gualde N, Rigaud M: Metabolicinteractions between eicosanoids in blood and vascular cells. Biochem J 1989;257:313. Moncada S (editor): Prostacyclin, thromboxane and leukotrienes. Br Med Buli I989;39:2O9. Neuringer M, Anderson GJ, Connor WE; The essentiality of a-3 fatty acids for the devdopment and function of the retina and brain. Annu Rev Nutr 1988;8:517. Piper P: Formation and actions of leukotrienes. PhyswlRev 1984;64:744. Smith WL, Borgeat P: The eicosanoids. In: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985.
OC *"
Metabolizm acylogliceroli i sfingolipidw

WPROWADZENIE
Acyloglicerole stanowi wikszo lipidw organizmu. Triacyloglicerole s gwnymi lipi dami tuszczu zapasowego organizmu i zawartego w pokarmach. W dodatku acyloglicerole, zwaszcza fosfolipidy, s gwnym skadnikiem bon plazmatycznych i innych bon ywych organizmw. Fosfolipidy bior take udzia w metabolizmie wielu lipidw. Glikosfingolipi dy, ktre zawieraj reszty sfingozyn y i cukru, jak rwnie kwasw tuszczowych, stanowi 510% lipidw bon plazmatycznych.
(RDS) u noworodkw. Fosfolipidy inozytolo -we s prekursorami wtrnych przekanikw dziaania hormonu, a czynnik aktywujcy py tki krwi jest alkilofosfolipidem,
Glikosfmgolipi-dy, wystpujce w zewntrznej warstwie bony plazmatycznej z ich oligosacharydowymi acuchami wystajcymi na zewntrz, tworz cze glikokaliksu powierzchni komrki. Uwaa si, e s one wane: 1) w komunikowaniu si komrek i kontakcie midzykomrkowym, 2) jako receptory dla toksyn bakteryjnych (np. toksyny, ktra powoduje choler) oraz 3) jako substancje grupowe krwi ABO. Opisano ok. 12
glikolipidowych chorb spichrzeniowych (np.
Rola triacyloglicerolu w transporcie i spich-rzaniu lip idw oraz w patogenezie rnych chorb, takich jak otyo, cukrzyca i hiper- lipoproteinem ie, jest szczegowo opisana w dalszych rozdziaach. Fosfoglicerole, fosfosfin-golipidy i glikosfingolip idy s amfipatycznymi lip idam i i dlatego s id ealn ie dopasowane do tego, aby spen ia funkcj gwnych skadnikw lip idowych bon plazmaty cznych. Niektre fosfolipidy speniaj specjalne funkcje, np. dipa-1 m i t o i 1 o 1 ecy t y n a (dipa 1 mi toi lof o sf at y d y loch oli -na) jest gwnym skadnikiem surfaktantu pucnego, ktrego brak u wczeniakw jest przyczyn zespou niewydolnoci o ddechowej
choroba Gauchera, choroba Tay-Sachsa); s one spowodowane niedoborem glikolipidowych hydrolaz normalnie wystpujcych w lizo-somach.
KATABOLIZM ACYLOGLICEROLI NIE JEST ODWRCENIEM ICH BIOSYNTEZY Katabolizm triacy logliceroli zaczyna si od hydrolizy
Triacyloglicerole musz zosta zhydrolizo-wane przez odpowiedni lipaze do ich skad* nikw, tj. kwasw t uszczowych i glicerolu zanim nastpi dalszy ich katabolizm. Taka hydroliza (lipoliza) zachodzi gwnie w tkance
Byc. 26-1. Biosynteza triac^loglicerolu i fosfolipidw. 1 szlak monoacyloglicerolowy, 2 szlak glicerolofosf ora nowy, 3 szlak dihydroksyacetonofosforanowy. Diacy logi icerootransferazy fosfoetano-loaminowej nie ma w wtrobie.
AOP
NAD*
HjC-OH I HO-C- H H,C-OH Gllcero!

I
KINAZA G UCE R OLO WA
DEHYDRO GENAZA HjC-OH GLICER OLO-3FOSFORANO WA HO-C-H - -3-tosforan H Z C-OAcylo- CoA (g owni e nasycony) ACYLOTRANSFERAZAI GLICER OLO--a-fOSF O RA N O WA ~* CoA
** CoA
- Ghfcc iiz.a H, C--O- Di hydro ksyaoet ono-fosfor an Acyl o-CoA (zwykl e nienasycony)
DIHYDROKSYACETONO-FOSFORA
NO WA
NADPH . H"*
ACYLOTRANSFERAZA
O H j C - O - C - R ,- * HO-CH n, c o c H O HjC-OH 2- U D n oa cy I og I ce ro!

O II HjC-O-C-H, C=O
Acyl o-CaA ACYLOTRAMSFI Mp N O A CYL O GLI CE - i S OLO W A (w jelicie ) C hol Ina (otanol oami na)
H,C-O- 1-Acvlogll Gero]ot-Acylod I hyd rpksy--acetonofosfofan ff (lizofosfatydan) Âcylo-CoA (fldwnle nlenasyoony) ACYLOTRA NSFEfl AZA 1-ACYLO GLICEROLO-3-FOSFO RANO WA Lipidy eterowe ~^CoA
O It HjC-O-C-R, fii-C~O- c- H
R E D UK TA2A 1 -A C YL ODIHY D R OKSYACETO N O -FOSFO RAN O WA
II
O 1,2-DI acyl ogl ioe r o I o1 o sf o ra n FOSFOHYOROLAZA (fosfatydan, kwas FOS fosfatydowy) FATY0A N 0 WA
H,C-O-
CTP
Fosfochol ma i to sto e t an o lo a m i n a
CYT Y DYL O- TRANSF ERAZA FOSFO CH OLINO WA

PP,
C DP -crrallna (CDP -etanoloaml na) DlACYLOGLICEROLCh TRANSFERAZA-F0 SFOCHOLIN0WA CYTYDYLOTRANSF6RAZA
HjC-O-C-R, Hj- C- O- C-H O HS C-O- Chollna (elan o loa mina) Fosfatvdv1ocriolina

l _CTP-FOSFATYOANOWA_
-PP,
ACYLOTRANSFERAZA H?c-o-c-n, DIACYLOGLICEROLOWA
Rj-C-O-C-H
M; C -O - - ATP CD P-d
O Cytydyna M P llcoro I lacv!og
Kardioliplna (NOZYTOLOTRANSF ERAZA CDP-DIACYLOGLICE HOLOWA

ADP
Hj COC> Inozytol
R,
-S-
-<H;C-O-C-R,
Hj-C-O-C-H
O
................
l
Rj-C-O-C-H
n, - c- o - c - H HjC-o-@-lnoz/tol- Fo sfalyclylol nozytolo-4-fosforan
H;C O-C R
Trlacylogltoerot
H;C-O- o
inozytot Fostatydylol nozylol (foafatytMoetan oloaml na) Fosfal ydyloel anoloaml na Foafatydyloseryna Etan oi oa ml na [KINAZA | Seryna
AD P * '
H;C-O--R, R,- C- O- C- H o H,c-o-@- inozytol
Fosfatydyo In oyto lo-4,5- blsfosfor an
286 / ROZDZIA 26
tuszczowej. Uwolnione w wyniku lipolizy wolne kwasy tuszczowe dostaj si do osocza, gdzie wystpuj w postaci zwizanej z albumin. Nastpnie wolne kwasy tuszczowe s wychwytywane przez tkanki i utleniane lub ponownie estryfikowane. Wiele tkanek (cznie z wtrob, sercem, nerkami, miniami szkieletowymi, pucami, gonadami mskimi, mzgiem i tkank tuszczow) ma zdolno utleniania kwasw tuszczowych o dugim acuchu wglowym, chocia mzg niezbyt atwo pobiera je z krwi. Zuytkowanie glicerolu zaley od tego, czy dana tkanka ma konieczny do tego aktywujcy enzym kinaz glkerolow (ryc. 26-1). Enzym ten wykazano w znacznych ilociach w wtrobie, nerkach, jelitach, brunatnej tkance tuszczowej i w gruczole sutkowym w okresie laktacji.
KWAS FOSFATYDOWY JEST WSPLNYM PREKURSOREM BIOSYNTEZY TRIACYLOGLICEROLI I FOSFOGLICEROLI

Chocia reakcj hydrolizy triacyloglicerolj z udziaem lipazy mona odwrci w warun kach laboratoryjnych, nie jest to jednak mechanizm, przez ktry acyloglicerole s syntetyzowane w tkankach. Zarwno kwasy tuszczowe, jak i glicerol musz zosta zaktywowane przez ATP zanim bd mogy by wbudowane do acylogliceroli. Kinaza glicerolowa katalizuje aktywacj glicerolu do sn-glicerolo-3-fosforanu. Jeeli tego enzymu nie ma lub jego aktywno jest maa, jak to ma miejsce w miniach lub w tkance tuszczowej, wikszo glicerolo-3--fosforanu musi pochodzi ze zwizku poredniego glikolizy dihydroksyacetonofosforantt, ktry przeksztaca si w glicerolo-3-fosforan przez redukcj z NADH, katalizowan przez dehydrogenaz gliceroIo-3-fosforanow (ryc, 26-1). tuszczowe s aktywowane do acylo-CoA pod wpywem enzymu syntetazy acylo-CoA z udziaem ATP i CoA (p. str. 261). 2 czsteczki acylo-CoA wi si z glicerolo-3-fosforanem, tworzc fosfatydan (l,2-diacyloglicerolo-3-fos-foran). Reakcja ta przebiega w 2 etapach przez lizofosfatydan i jest katalizowana najpierw przez acyloransferaz gIicerolo-3-fosforanow, a nastpnie przez acylotransferaz l-acyloglice-rolo-3-fosforanow (acylotransferaz lizofosfa-tydanow). Pod wpywem fosfohydrolazy fos-
fatydanowej fosfatydan jest przeksztacany do 1,2-diacyloglicerolu. W bonie luzowej jelita istnieje szlak monoacyloglicerolowy, w ktrym monoacyloglicerol jest przeksztacany do 1,2-diacyloglicerolu pod wpywem acylotrans-ferazy mo no ac>log lice rolo w ej. Nastpna czsteczka acylo-CoA wchodzi w reakcj z diacylog-licerolem, tworzc triacyloglicerol. Reakcja ta jest katalizowana przez acylotransferaz diacy-loglicerolow. Wikszo aktywnoci tych enzymw jest umiejscowiona w siateczce rdplaz-matycznej komrek, chocia niektre z nich znajduj si w mitochondriach, np. acylotrans-feraza glicerolo-3-fosforanowa. Aktywno fosfohydrolazy fosfatydanowej wystpuje gwnie we frakcji supernatantu pozbawionej struktur subkomrkowych, ale pewne jej iloci s zwizane z bonami. Dihydroksyacetonofosforan moe by acylowany i przemieniany do lizofos-fatydanu po redukcji przez NADPH. Ilociowe znaczenie tego szlaku przemiany jest kontrowersyjne. Ten szlak wydaje si by bardziej istotny w peroksysomach, gdzie uczestniczy w syntezie lipidw eterowych. syntetyzowane albo z fosfatydanu, np. fosfatydyJoinozytol, albo z 1,2-diacyloglicerolu, np. fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloa-mina. W syntezie fosfatydyloinozytolu, cytydy-notrifosforan (CTP), bogatoenergetyczny fosforan wytwarzany z udziaem ATP (p, str. 137) reaguje z fosfatydanem, tworzc cyydynodifos-fodiacyloglicerol (CDP-diacyloglicerol). Osta tecznie ten zwizek reaguje z inozytolem w reakcji katalizowanej przez CDP-diacylogliceroio-transferaz inozytolow, tworzc fosfatydyioi-nozytol (ryc. 26-1). Przez kolejne fosforylacje fosfatydyloinozytol jest przeksztacany naj pierw do fosfatydyloinozytolo-4-fosforanu, a nastpnie do fosfatydyloinozyto!o-4,5-bisfos-foranu. Ten ostatni jest rozkadany do diacylo-glicerolu i inozytolotrisfosforanu po zadziaaniu na komrk hormonu, ktry zwiksza stenie Ca2+, np. wazopresyny. Te 2 produkty odgrywaj rol drugiego przekanika w dziaaniu hormonu. W biosyntezie fosfatydylocholiny i fosfatydy-loetanoloaminy (lecytyn i kefalin) cholina lub etanoloamin a musz najpierw zosta przeksztacone w aktywn choiin" lub aktywn etanoioamin". Jest to proces 2-etapowy, w ktrym zachodzi najpierw reakcja z ATP, z wytworzeniem odpowiednich monofosfora-nowych pochodnych, a nastpnie reakcja z CTP
Biosynteza fosfoiipi-dy s
fosfogliceroli.
Te
Biosynteza triacylogliceroli. Kwasy
METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPIDW / 287
z wytworzeniem cytydynodifosfocholiny (CDP--choliny), lub cytydynodifosfoetanoloaminy (CDP-etanoloaminy). W takiej postaci cholina lub etanoloamina reaguj z 1,2-diacylogiicero-lera w ten sposb, e ufosforylowana zasada (fosfbchoiina albo fosfoetanoloamina) jest przenoszona na 1,2-diacy logi ice roi z wytworzeniem albo fosfatydylocholiny, albo fosfatydylo-etanoloaminy. Cytydylotransferaza wydaje si by regulacyjnym enzymem szlaku biosyntezy fosfatydylocholiny. Fosfatydyloseryna powstaje z fosfatydylo--etanolaminy w bezporedniej reakcji z seryn. Fosfatydyloseryna moe odtwarza fosfatydy-loetanoloamin przez dekarboksylacj, W wtrobie wystpuje alternatywna droga umoliwiajca bezporedni przemian fosfatydyloetano-loaminy w fosfatydylocholin przez kolejne metylacje reszty etanoioaminowej przy uyciu S-adenozylometioniny jako dawcy grup metylowych. Z kolei grupa metylowa w metioninie moe pochodzi z metylo-H+-foianu (p. ryc. 53-15). Pomimo tych moliwych szlakw wytwarzania choliny. jest ona uwaana za egzogenny skadnik poywienia dla wielu gatunkw ssakw, chocia nie ustalono tego dla czowieka. Fosfolipidem wystpujcym w mitochond-riachjest kardiolipina (difosfatydyloglicerol, p. str. 179). Powstaje ona z fosfatydyloglicerolu, ktry jest syntetyzowany z CDP-diacyloglicero-lu (ryc. 26-1} oraz glicerolo-3-fosforanu wedug schematu przedstawionego na ryc. 26-2.
Biosynteza eterowych fosfolipidw glicerolowych oraz plazmalogenw.
Surfaktant pucny. Jest wydzielin powierzchniowo aktywn, zoon gwnie z lipidu z niewielk iloci biaka i wglowodanw. Zapobiega ona zapadaniu si pcherzykw pucnych. Aktywno surfaktantu jest przypisywana gwnie obecnoci fosfolipidu dipalmitoilofos-fatydylocholinie, ktry jest syntetyzowany krtko przed porodem u donoszonego dziecka. Niedobr surfaktantu w pucach wielu niedo-noszonych noworodkw jest przyczyn zespou niewydolnoci oddechowej (RDS). Podawanie naturalnego lub sztucznego surfaktantu ma korzystne dziaanie terapeutyczne.
CDP-dlacylogltoeral
Ryc. 26-2. Biosynteza kardioiipiny.
Plazmalogenowy diacyloglicerol jest to taki zwizek, w ktrym w pozycji 1 (lub 2) glicerolu znajduje si reszta alkenylowa, zawierajca wizanie aldehydogenne eteru winylowego (-CHj - O - CH = CH - R). Prekursorem czci glicerolowej jest dihydroksyacetonofosforan (ryc. 26-3), ktry reaguje z acylo-CoA, tworzc 1-acylodihydroksyacetonofosforan. Nastpnie zachodzi reakcja wymiany midzy grup acylo-w i alkoholem o dugim acuchu wglowym z wytworzeniem 1 -alkilodihydroksyacetonofos-foranu (majcego wizanie eterowe). Zwizek ten w obecnoci NADPH jest przemieniany w l-alkiloglicerolo-3-fosforan. Po nastpnej acylacji, w pozycji 2, utworzony l-alkilo-2-acy-loglicerolo-3-fosforan (analogiczny do fosfaty-danu z ryc. 26-1), jest hydrolizowany z wytworzeniem pochodnej glicerolu pozbawionej reszty fosforanowej. Plazmaiogeny powstaj przez desaturacj odpowiednich pochodnych z fosfoetanoloamina (ryc. 26-3). Znaczn cz fosfolipidw w mitochondriach stanowi plazmaiogeny. Czynnik aktywujcy pytki krwi (PAF) jest syntetyzowany z odpowiedniej pochodnej fosfocholinowej, a zidentyfikowano go jako l-alkilo-2-acetylo-i7j-glicerolo-3-fosfocho-lin. Jest on wytwarzany przez wiele komrek krwi oraz inne tkanki. Powoduje on agregacj pytek krwi w tak maych steniach, jak 10"11 mol/l. Ma on take waciwoci hipo-tensyjne i wrzodotwrcze. Fosfolipazy pozwalaj na degradacj oraz przemodelowanie glicerolofosfolipidw Degradacja wielu zoonych czsteczek w tkankach przebiega do cakowitego ich rozoenia, np. biaka s rozkadane do aminokwasw. Wobec tego mona okreli czas ob -
CM CM P PKardiolrpma sn-Gllceroloi- ost atyd yl og I i ce r o laf osf 3-fosforan o ra n Foefatydyloglicerol (dttosfatydyloglloeral)
HiCOH
Acylo-CoA
H 3C -O -C- R,
ml A ^
_I ;YLI I
R,-(CH ; I,- OH H
NADPH-fH NAOP
ACYLO
H^C-O-IC H^-R,
~
HOOC-R,
SFEHA2 AI H,C~O-(p)
|RH> UKTAZA |
i -Al ki I o g I icero lo-3-f osf o ra n r aceton ofoaforati SFERA2, Acyto-CoA ACYLO-TRAN CDP-etanoloamlna l O H; C-
i . 1-Acytodl hydro DihydrokByaeetono-fosfor HjC- O-O ksy-aoetonofosfora an n
lf R j-C - O-C -H 1-Alki!o-2-acy!ogl(cerolo -a-insfoetaf w Da ml na
CMP k.
i - i
O II
H^C-O I
1ACVLC>GLICEROLO -C - O- C- H TRANSFERAZA IP0SF0HYDR0LA2AI I HjC-OH FOSFOETA N OLO-A 1-Alkilo-2-acy1oglicerol HjC-0- 1 - Alkilo-2-acy M1NOWA -CDP-chollna DiACYLOGLICEHOLOTFIANSFERAZA FOSFOCHOLINOWA
R,
log lloeroo-3-tosfof an
NADPH, O*
CMP
Alktlodiacylogllcerole
[DESATURAZA I
O CO HUC -OHi C -O -C H -C H -f t, O H^-O-ICH^-R,
R) COOH
V
HjC-G-ICHA- R! HO -C -H
I FOSF0L1PA2A |
1 -Alkarylo-E-aeylogllcorolo- 3-f osf oatanoloamlna, pla mato gen
Cholina 1-Alkilo-2-acylog!icerolo-3 -fosfocholina
Cholina
i-Aikilo-2-iizoglioerolow 3-fosfcchalina
Acetylo-CoA
O HjC O-
ACYLOTRANSFERAZA | II i H^-C-O-C-H
Ryc. ?6-3. Biosynteza lipidw eterowych, plaz-malogenw i ciynrrika aktywujcego pytki {PAF). W szlaku syntezy PAF rfe novo acetylo-CoA jest wbudowywany w etapie*, unikajc ostatnich 2 etapw pokazanych tutaj.
Cholina
1 -A Ikllo -2-acety lo g I icef o I a-3-iosf oc hol i na PAF
METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOLIPiDW / 289
o
O
II
HjC-O-C-fi,
I
FOSFOLIPAZA A,J
i j -C - O- C- H HjC-O-(P)-Cf)ollna Fosfatydyloohollna H,0

jFOSFOLIFAZAA; | Acylo-CoA
R3
0 - - C FSFOLIPAAD I R, C --O-C -H
O
HjC-0 + P -+ O I O
FD3FOLIPAZA A,
ZASADA AZOTOWA
H,C-O-C-R 1 HO- OH H 3C-O--CHolina

Lizofosfatydylocholina (> iz o lecytyna) H ,0 ILIZOFOSFOLIPAZA
| FOSFOLIPAZA C | Ryc. 26-5. Mi ejsca hydf olitycznego dzia ani a fos-
folipaz na substrat fosfolipidowy.
R, -COOH H2C-OH HO -C -H
l
Gl ioery lofosfocho lina HYDROLAZA GUCERYLO-FOSFO CHOLtNOWA
HO-C-H
I icero I o-3-f o sio ran
+ Chollna
HjC-O- src-G
Ry c . 2 6 -4 . M e t ab o lizm l us t ity u ylij Uio iii iy (l u ^y ty
ny).
rot u (turnover time) dla takich czsteczek. Chocia fosfolipidy s aktywnie degradowane, kada cze skadowa ich czsteczki ulega obrotowi (rozpadowi i re syn tezie) z odmienn szybkoci, np. czas obrotu grupy fosforanowej jest inny ni czas obrotu grupy 1-acylowej, Jest to spowodowane obecnoci enzymw, ktre umoliwiaj czciow degradacj z nastpujc zaraz po niej resyntez (ryc. 26-4). Fos-folipaza Aj katalizuje hydroliz wizania estrowego w pozycji 2 gl icero lofosfolipid w z wytworzeniem wolnego kwasu tuszczowego i lizo-fosfolipidu, ktry moe zosta ponownie acylo-wany przez acylo-CoA w obecnoci acylotrans-ferazy.
Alternatywnie lizofosfolipid (np. lizolecyty-na) moe by atakowana przez lizofosfoiipaz (fosfolipaz A^, ktra usuwa pozosta grup 1 -acylow, pozostawiajc glicerol poczony losfodiestrowo z odpowiedni zasad. Ten ostatni zwizek moe by rozkadany przez odpowiedni hydrolaz z uwolnieniem glicero-Io-3-fosforanu i zasady. Fosfolipaza Aj dziaa na wizanie estrowe w pozycji 1 fosfolipidw (ryc. 26-5). Fosfolipaza C atakuje wizanie estrowe w pozycji 3, uwalniajc 1,2-diacylo-glicerol i ufosforylowan zasad. Jest to jedna z gwnych toksyn wytwarzanych przez bakterie. Fosfolipaza D jest enzymem opisywanym gwnie u rolin, a katalizujcym odhydrolizo-wanie zasady azotowej od fosfolipidw. Lizo lecytyna moe powstawa alternatywn drog, z udziaem acylotransferazy lecytyna: : cholesterol (LCAT), Ten enzym, wystpujcy w osoczu, a syntetyzowany w wtrobie, katali zuje przeniesienie 1 reszty kwasu tuszczowego z pozycji 2 lecytyny na cholesterol z wytworzeniem estru cholesterolowego. Enzym ten ma by odpowiedzialny za du ilo estru cholesterolowego zawartego w li po proteinach osocza. Nastpstwa niedoboru LCAT s dyskutowane na str. 321
A C E T Y LO T B A N S F E R A Z A LEC YTYN A C H O LESTER O L
Lecytyna + cholesterol Lizolecytyna + Ester cholesterolowy
Nasycone kwasy tuszczowe o dugim acuchu wystpuj przewanie w pozycji 1 fosfolipidw, podczas gdy wielo nienasycone kwasy (np, prekursory prostaglandyn) s wbudowa-
19 Biochemia
290 / ROZDZIA 26
ne raczej w pozycji 2. Wbudowywanie kwasw tuszczowych do lecytyny odbywa si przez kompletn syntez fosfolipidu, przez transacy-lacje midzy estrami cholesterolu i lizolecytyn i przez bezporedni acylacje lizolecytyny z udziaem acylo-CoA. Wobec tego moliwa jest ciga wymiana kwasw tuszczowych, zwaszcza gdy chodzi o wprowadzanie egzogennych kwasw tuszczowych do czsteczek fosfolipi-dw. WSZYSTKIE SFINGOLIPIDY POWSTAJ Z CERAMIDU Aminoalkohol sfingozyna (ryc, 26-6) jest syntetyzowany w siateczce rdplazrnatycznej. Po zaktywowaniu, polegajcym na poczeniu z foNH3 C H3 -<C H Palmltollo-CoA
+
sforanem pirydoksalu, aminokwas seryna czy sie z palmitoilo-CoA, tworzc po odczeniu CQ2 3-ketosfinganine. Sama sfingozyna powstaje po etapie redukcji, o ktrym wiadomo e uczestniczy w nim NADPH jako dawca wodorw. Potem nastpuje etap oksydacyjny, analogiczny do etapu P-oksydacji z udziaem dehy-drogenazy acylo-CoA, w ktrym uczestniczy enzym bdcy flawoprotein. Ceramid (N-acylosfingozyna) powstaje pr2ez poczenie acylo-CoA i sfingozyny (ryc. 26-7).
Sflngomlellna Acylogllcerol Fosfatydylochnilna
Sflngo zyna
-- ^
Ce ram id
, - Sfingo m W I na
Acyfo-CoA
CoA
CDP- CMP -oholf na
Ryc. 26-7. Biosynteza ceramidu i sfingomieliny.
CoA S H
Grup acylow czsto jest reszta dugoacu-chowego kwasu nasyconego lub monoenowego. Sfingomieliny s fosfolipidami (p. str. 181) powstajcymi w wyniku reakcji ceramidu z CDP-cholin albo z fosfatydylocholin; pierwsza reakcja jest analogiczna z t, jaka zachodzi podczas biosyntezy fosiatydy locho liny (ryc. 26-1).
3-Ketosiinganina NAD P H+H
REDUKTAZA 3-KETOSRNGANINOWA NADP

+
I I OH NHa + Dlhydrosflngozyrta REDUKTAZA SFINGANINOWA \
I I OH NH3 + Sflngozyna Ryc. 26-6. Biosynt eza sfi ngoz/ ny. Fp-flawoprot e-ina.
Glikosfingolipidy s poczeniem ceramidu z jedn lub wieloma resztami cukrowymi W wielu glikosfingolipidach, zwaszcza w mzgu, jest charakterystyczne wystpowanie kwasw tuszczowych C24 (kwasw lignocery-n owego, cer brono we go i nerwonowego). Kwas lignocerynowy(C23H47COOH) jest w caoci syntetyzowany z acetylo-CoA. Kwas cer-bronowy jest 2-hydroksypochodn kwasu lig-nocerynowego i jest z niego syntetyzowany. Kwas nerwonowy (C;3 H4;COOH) jest mono-nienasyconym kwasem i powstaje przez elonga-cj kwasu olejowego. Najprostszymi glikosfingolipidami (cerebro-zydami) s galaktozyloceramid (GalCer) i gluko-zyloceramid (GlcCer). GalCer jest gwnym lipidem mieliny, podczas gdy GlcCer jest gwnym glikosfingolipidem tkanek pozanerwo-wych oraz prekursorem wikszoci bardziej
METABOLIZM ACYLOGLICEROLI I SFINGOUPiDW / 291

UDPGIc [EPIMERAZA| Acyl-CoA CoA Sfngozyna ^> * , UDPGal UDP PAPS f Galaktozyloceramld ( Sulfogalaklozyloceramid Cerami d ^-*- (cerebrazyd) --------------- ^-*(aurtaNdl
(sulfatyd)
Ryc. 26-8. Biosynteza galaktozyloceramidu i jego siarczanowej pochodnej, PAPS aktywny siarczan' fosfoadenozyno-B-tosfosiarczan.
Acylo-CaA CoA
UOPGIc
UDP
UDPGal Glukozylaceramid -(Cer-Glc)
UDP
Stingozyna
Ceramtd
Cer-GIcGal
Prosty gangilozyd (mon QS ialogan g I! ozyd) Cer-GIcGal-GalNAc-Gal ---------- Ne!,Ac

(G MI)
CMP-NeuAc
CM P
UDP
' UDPGal
UDP
UDP-N-acBtylogalaktazoamina
Wysze ganfllbzydy
[disialo-1 trisialogangllozydy)
Cer-GIc-Gal-GalNAc
NeuAc
Cer-GIc-Gal I NeuAc
Ryc. 26-9. Biosynteza gangliozydw. NeuAc kwas N-acetyloneuraminowy
zoonych glikosfingolipidw. Epimeraza ury-dynodifosfogalaktozowa (ryc. 26-8) katalizuje epimeryzacj glukozy do galaktozy, przeksztacajc urydynodifosfoglukoz (UDPGIc) w ury-dynodifosfogalaktoz (UDPGal). W mzgu re akcja przebiega podobnie do przedstawionej na ryc. 22-5 dla wtroby i gruczou sutkowego. Galaktozyloceramid powstaje w wyniku reakcji midzy ceramidem i UDPGal. Sulfagalaktozy-loteramid jest rezultatem dalszej reakcji z 3'--fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanem (PAPS; -aktywny siarczan"). PAPS uczestniczy take
w biosyntezie innych suliblipidw, tj. sulfo(gala-kto)gicerololipidw i estrw siarczanowych steroidw, Gangliozydy s syntetyzowane z ceramidu przez stopniowe przyczanie zaktywowanych cukrw (np. UDPGIc i UDPGal) oraz kwasu sjalowego, ktrym zwykle jest kwas N-atetylo-ne u mm i na wy (ryc. 26-9). Moe powstawa wiele gangliozydw o coraz wikszej masie czsteczkowej. Wikszo enzymw przenoszcych cukry z nukleotydocukrw (glikozylotransferazy) jest umiejscowiona w aparacie Golgiego.
292 / ROZDZIA 26
Glikosfingolipidy s skadnikami zewntrznej warstwy bony plazmatycznej i s wanymi strukturami uczestniczcymi w kontakcie midzykomrkowym i komunikowaniu si komrek. Niektre z nich s antygenami, np. antygen Forssmana i antygeny ukadu grupowego krwi ABO, Podobne acuchy oligosacharydowe wystpuj w glikoproteinadi bon komrkowych. Niektre gangliozydy funkcjonuj jako receptory toksyn bakteryjnych (np. toksyny cholery, ktra nastpnie aktywuje cyklaz adenylano-w).
FOSFOLIP1DY I SFINGOLIPIDY UCZESTNICZ W PATOGENEZIE STWARDNIENIA ROZSIANEGO I LIPIDOZ

Pewne choroby charakteryzuj si wystpowaniem nieprawidowych iloci wspomnianych powyej lipidw w tkankach, czsto w tkance nerwowej. Choroby te mona podzieli na 3 grupy: 1) prawdziwe choroby demielinizacyj-ne, 2) sfmgoiipidozy oraz 3) leu kody strofie. W stwardnieniu rozsianym, ktre jest chorob
Tabela 26-1. Zestawienie sfingolipidoz

Choroba Fukozydoza Niedobr enzymu oc-Fukozydaza Nagromadzajcy si lipid Cer-GIc-Gal-GalNAc-GaljFuc Izoantygen H Cer-Glc-Gal(NeuAc)-GalNAc|Gal GM1-Gangliozyd Cer-Glc-Gal(NeuAc)jGalr\!Ac GM2Gangliozyd Cer-GIc-Gal-GalJGalNAc Globozyd plus G^2 gangliozyd Cer-GIc-GalJGal Globotriaozylocefamid Objawy kliniczne Zwyrodnienie mzgu, przykurcz miniowe, gruba skra Niedorozwj umysowy, powikszenie wtroby, znieksztacenia koca Niedorozwj umysowy, lepota, osabienie mini Takie same, jak w chorobie Tay-Sachsa, ale postpujce znacznie szybciej Wykwity skrne, niedo-czynno nerek (pefne objawy tylko u osobnikw mskich, gen recesywny zwizany z chromosomem X) Postpujce uszkodzenie mzgu, powikszenie wtroby i ledziony Niedorozwj umysowy, a u dorosych zaburzenia psychiczne, demielinizacja Niedorozwj umysowy, prawie zupeny brak mieli-ny Powikszona wtroba i ledziona, ubytki osteolitycz-ne koci dugich. U dzieci niedorozwj umysowy Powikszona wtroba i ledziona, niedorozwj umysowy; zgon we wczesnym okresie ycia Chrypka, zapalenie skry, znieksztacenie koca, niedorozwj umysfowy, zgon we wczesnym okresie ycia
Uoglniona gang-liozydoza Choroba Tay-Sach-sa
Gurf)-galaktozyda-
Hekso2oaminidaza A
Odmiana choroby Heksozoaminidaza Tay-Sachsa albo A i B choroba Sandhoffa Choroba Fabry'ego u-Galaktozydaza
Lipid oia laktozy-doceramid owa Leukodystrofia metach romatyczn a
Laktozydaza cerami-dowa (f}-galaktozy-daza) Ary losu Ifataza A
Cer-Glc|Gal Laktozydoceramid Cer-GaljOSOj 3-Sulfogalaktozyloceramid Ce^Gal Galaktozyioceramid CeriGlic Glukozy loceramid
p-Galaktozydaza Choroba Krabbego p-Glukozydaza Choroba Gauchera
Sfingomielinaza Choroba Mieman-na-Picka Ceramidaza Choroba F3fbera
CerjP-cholina Sfingomielina
AcyljSfingozyna Cera m id
NeuAc kwas N-acetyloneu/aminowy, Cer ceramid; Glc glukoza, Gal galaktoza, Fuc fukoza. Wizania oznaczone j s miejscami reakcji katalizowanej przez enzym, ktrego niedobr wystpuje
METABOLIZM ACYLOGL1CEROLI I SFINGOLIPIDOW / 293
demielinizacyjn, stwierdza si utrat z substancji biaej zarwno fosfolipidw (zwaszcza plaz-malogenu etanoloaminowego), jak i sfmgolipi-dw. Wynikiem tego jest zblienie skadu chemicznego substancji biaej mzgu do skadu substancji szarej. W substancji biaej u takich chorych mona stwierdzi obecno estrw cholesterolu, chocia normaln ie ich tam nie ma, a w pynie mzgw o- rdzeniowym wystpuje zwikszone stenie fosfolipidw. Sfingoiipidozy s grup chorb dziedzicznych, czsto ujawniajcych si ju w dziecistwie. Choroby te zalicza si do duej grupy zaburze lizosomalnych. Choroby charakteryzujce si spichrzaniem lipidw maj kilka staych cech: 1. W rnych tkankach stwierdza si spichrzanie zoonych lipidw, w ktrych skad wchodzi wsplny skadnik ceramid. 2. Szybko syntezy spich-rzanego lipidu jest porwnywalna do szybkoci u zdrowych osb. 3. Enzymatycznym defektem jest niedobr swoistego hydrolityczneg
enzymu lizosomalnego, niezbdnego do rozkadania na gromadzanego lipidu. 4. Stopie
u nienarodzonego podu. Zestawienie najwaniejszych lipidoz przedstawiono w tab. 26-1.

Skutkiem licznych postaci niedoboru sulfataz
jest spichrzanie w tkankach sulfogalaktocera-midu, estrw siarczanowych steroidw i proteo-glikanw. Jest to spowodowane zoonym niedoborem arylosulfataz A, B i C oraz sulfatazy steroidowej.
PIMIENNICTWO
Boyer PD (editor): The Enzymes, 3rded. Vol 16: Lipid Enzymoiogy. Academic Press, 1983. Brady RO: Sphingolipidoses. Annu Rev Biochem 1978;47:87. Hawthorne JN, Ansell GB (editors): Phosphoiipids. Bfeevier, 1982. Snyder F: Biochemistry of platelet-activating factor. PSEBM 1989; 190:125. Various authors: In: The Metaboik Basis oflnherited Disease, th ed. Scriver CR et al (editors). McOraw-Hill, 1989. Various authors: Metabolism of triacylglycerols; phospholipid metabolism; ether-linked glyrerolipids; sphingolipids. In: Biochemisiry of Lipids and Hormones. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummiugs, 1985. VanGolde LMG. Batenburg JJ, Robertson B; The pulmonary surfaelant system: biochemical aspects and functional significance. Physiol Rev 1988;68:374. Watts RWE, Gibbs DA: Lysosomal Storage Diseases: Biochemical and Clinical Aspects. Taylor & Fran-cis, London, 1986.
niedoboru aktywnoci enzymu, warunkujcego spichrzanie lipidu, jest podobny we wszystkich tkankach chorego z ttj. wad. Na podstawie tej jednakowej aktywnoci opracowano metody rozpoznawania, -dziki ktrym stao si moliwe rwnie wykrycie heterozygotycznych osb z tymi nieprawidowociami genetycznymi, odpowiedzialnymi za przenoszenie choroby, a take wykazanie wystpowania dystrofii sfmgolipidowej
Transport i magazynowanie lipidw

WPROWADZENIE Tuszcze wchonite z pokarmw i lipidy syntetyzowane przez wtrob i tkank tuszczow musz by transportowane midzy rnymi tkankami i narzdami, aby mogy by zuytkowane i magazynowane. Poniewa lipidy s nierozpuszczalne w wodzie, powstaje problem, jak je transportowa w rodowisku wodnym, jakim jest osocze krwi. Zosta! on rozwizany dziki asocjacji niepoiarnych lipidw (triacylogliceroli i estrw cholesterolu) z amfi-patycznymi lipidami (fosfolipidami i cholesterolem) oraz z biakami, przez co powstaj mieszajce si z wod lipoproteiny. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE U zwierzt wszystkoernych, takich jak czowiek, spoywajcych posiki przedzielone okresami postu, nadmiar energii zostaje zmagazynowany w fazie anabolicznej procesu karmienia, po ktrej nastpuje okres negatywnej rwno wagi energetycznej, w czasie ktrego organizm czerpie potrzebn mu energi ze swoich zapasw wglowodanowych i tuszczowych. Lipoproteiny porednicz midzy tymi cyklami, transportujc lipidy z jelita (w postaci chylomi-kronw) i z wtroby (w postaci lipoprotein o bardzo maej gstoci VLDL) do wikszoci tkanek, gdzie s utleniane, lub do tkanki tuszczowej, gdzie s magazynowane. Z tkanki tuszczowej tuszcz jest mobilizowany jako wolne kwasy tuszczowe (WKT), ktre, dostajc si do krwi, cz si z albuminami surowicy. Nieprawidowoci przemiany lipidw mog by spowodowane zaburzeniami syntezy lub utyli-
zacji lipoprotein i mog powodowa rne hipolipoproteinemie lub hiperlipoproteinemie. Najbardziej powszechna z nich wystpuje u chorych na cukrzyc (diabetes melitus), u ktrych niedobr insuliny jest przyczyn nadmiernej mobilizacji WKT oraz zmniejszonego zuyt-kowywania chylomikronw i VLDL, prowadzcych do powstawania hipertriacyloglicerole-mii. Wikszo innych stanw patologicznych dotyczcych zaburze transportu lipidw jest uwarunkowana dziedzicznymi wadami syntezy czci apoproteinowej lipoprotein, kluczowych enzymw ich przemiany lub receptorw lipoprotein. Niektre z tych wad powoduj hiper-cholesterolemic i przedwczesn miadyc (athe-rosclerosis). Nadmierne spichrzanie tuszczw jest cech otyoci, ktrej jedna z postaci jest spowodowana wadliw termogenez induko-wan diet w brunatnej tkance tuszczowej. LIPIDY S TRANSPORTOWANE W OSOCZU JAKO LIPOPROTEINY Zidentyfikowano 4 gwne grupy lipoprotein Przez wyekstrahowanie lipidw osocza odpowiednim rozpuszczalnikiem tuszczowym i po rozdziale wycigu na poszczeglne klasy lipidw mona wykaza w nim obecno triacy-logikeroli, fosfolipidw, cholesterolu i estrw cholesterolu oraz niewielkie iloci niezestryfiko-wanych, dugoacuchowych kwasw tuszczowych (wolnych kwasw tuszczowych), ktre stanowi mniej ni 5% cakowitej iloci kwasw tuszczowych wystpujcych w osoczu. Ta frakcja wolnych kwasw tuszczowych (WKT; ang. Free Fatty Acids FFA) jest najbardziej aktyw-
TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDW / 295 Tabela 27-1. Lipidy osocza krwi u czowieka Lipid Triacyloglicerol + Cakowite fosfolipidy Cakowity cholesterol Wolny cholesterol (nie--zegtryf i kowany} Wolne kwasy tuszczowe (niezestryfikowane)
1,6 3,1 5,2 1,4 0,4
Gsto _ Miejsce , starlu
mmol/l rednio zakres 0,9-2,0 1,8-5,8 2,8-8,3 0,7-2,7 0,2-0,6
<0,96 1,006-1,063 iLDL) < 1.006 (VLDL) 1,063-1,21 (HDL)
Chylomlkrony
^Lipoproteiny Pre-/Hipoprotalny a-LIpoprotelny
Ryc. 27-1. Elektroforetyczny rozdzia lipoprotein
Z catej iloci kwasw tuszczowych 45% znajduje si w triacyloglicerolach, 35% w fosioiipidach, 15% wystpuje jako estry cholesterolu, a mniej ni 5% to wolne kwasy tuszczowe * Waha si w zalenoci od stanu odywienia Oznaczone jako fosfor lipidowy
+
n metabolicznie frakcj lipidw osocza. Stenie gwnych klas lipidw osocza krwi przedstawiono w tab. 27-1. Czysty tuszcz ma gsto waciw mniejsz od wody. Wobec tego obserwuje si malejc gstC w miar zwikszania proporcji lipidu do biaka w lipoproteinach (tab. 27-2). T cech fizyczn wykorzystano do rozdziau lipoprotein osocza metod ultra wirowani a. Szybko, z jak kada lipoproleina wznosi si przez roztwr NaCl (gsto waciwa 1,063) moe by wyraona w jednostkach flotacji Svedberga (Sf). Jedna jednostka Sf jest rwna 10 -11 cm/s/ /dyna/g w temp. 26C, Skad rnych frakcji lipoproteinowych otrzymanych metod wiro wania przedstawiono w tab. 27-2. Z tabeli tej wynika, e rne klasy chemiczne lipidw wystpuj w wikszoci frakcji lipoproteinowych w rnych ilociach. Poniewa frakcje lipo-proteinowe o okrelonych gstociach speniaj okrelone funkcje fizjologiczne, sama analiza chemiczna lipidw osocza (z wyjtkiem WKT), dostarcza tylko niewielu informacji o ich znaczeniu w patofizjologii. Poza zastosowaniem technik polegajcych na wykorzystaniu rnic gstoci, lipoproteiny mona rozdzieli na podstawie ich waciwo ci elektrofor ty cznych na a -, 0- oraz pre-P--li po proteiny (ryc. 27-1) i mona je zidentyfikowa dokadniej za pomoc immunoelektrofore-
Poza WKT zidentyfikowano 4 gwce grupy lipoprotein o wanym znaczeniu fizjologicznym oraz diagnostycznym. S to: 1) chylomikrony, powstajce z wchanianych w jelicie triacylo-gliceroli, 2) lipoproteiny o bardzo maej gstoci (VLDL lub pre-P-lipoproteiny), pochodzce z wtroby i speniajce funkcj eksportera tria-cylogliceroli z tego narzdu, 3) lipoproteiny 0maej gstoci (LDL lub P-lipoproteiny), bd ce przedstawicielem kocowych produktw katabolizmu VLDL oraz 4) lipoproteiny o duej gstoci (HDL lub a-lipoproteiny), biorce udzia w metabolizmie VLDL i chylomi kranw, a take w przemianie cholest erolu. Triacylo glicerol jest gwnym lipidem chyJomikronw 1VLDL, podczas gdy cholesterol i fosfolipidy s dominujcymi skadnikami lipidowymi odpo wiednio LDL i HDL (tab. 27-2). Amfipatyczne lipidy s istotnymi skadnikami lipoprotein Typowa iipoproteina taka jak chyloinik-ron lub VLDL skada si z rdzenia lipidowe-go, zawierajcego gwnie triacyloglicerole i estry cholesterolu, otoczonego pojedyncz warstw powierzchniow zoon z czsteczek amfipaty-cznyeh fosfolipidw i cholesterolu. Te czsteczki s tak uoone, e ich grupy polarne s skierowane na zewntrz, do rodowiska wodnego, tak jak w bonie komrkowej (p. str. 187), Biakowe czci lipoprotein s znane jako a po lipoproteiny lub apoproteiny Stanowi one ok. 60% masy niektrych HDL, a zaledwie 1% masy chyl orni kro nw. Niektre apolipoprotei-ny s cile zintegrowane z czci lipidow, tak
Tabela 27-2. Skad lipoprotein osocza u czowieka rdo rednica [nm] Frakcja
Gsto
Skad Biako [%] Procent cakowitych lipidw Cakowite lipidy [%] Triacy-lo Fosfoli Estry Choleste Wolne glice-rol pidy choleste rol kwasy (wolny) rolu tuszczowe 98- 99 90- 93 89 79 67 43 1 88 56 29 13 16 13 0 46 0 8 20 26 28 43 3 15 34 48 31 29 0 18 9 10 10 60 11 6 100
Chylomikrony Lipopfoteiny o bardzo maej gstoci (VLDL) Lipoprotetny o poredniej gstoci (IDL) Lipoproteiny o maej gstoci (LDL) Lipoproteiny o duej gstoci HDLj HDL3 WKTalbumina
Jelito Wtroba i jelitu VLDL i chylomikrony VLDL Wtroba i jelito. VLDL? Chylomikrony? Tkanka tuszczowa
90-1000 30-90 25-30 20-25 10-20 7,5-10
< 0r95 0.95-1,006 1,006-1,019 1,019-1,063 1,063-1,125 1,125-1,210 > 1,2810
> 400 20-400 12-20
1-2 7-10 1 1 2 133 57 99
2-12
WKT wolne kwasy tuszczowe. VHDL (ang.; very high density lipoproteins) jest niewielk frakcj o gstoci 1,21 -1,25,
TRANSPORT I MAGA ZYNOWANIE LIP ID W / 297 Obwodowa apolipo protein a (np, Apo-C}
Jednowarstwowa bona zbudowana gwnie
Wolny
cholesterol
Fosfotlpld z
Trlacylogllcerol lipidw amflpatycznych
c- 27-2. Uoglniona
budowa lipoproteiny osocza. Naley

'Rdzeft zoony ' g wnie z nie polarnych lipidw
zauway podobiestwa Integralna s apoll po z bfon plazmatycz-n. Niedawne badania wskazuj, e proteina "V,, {np. niewielkie iloci estrw cholesterolu i apo-B) triacyloglicerolu znajduj si w powierzchniowej warstwie, a mae iloci wolnego cholesterolu wystpuj w warstwie rdzeniowej.
e nie mona ich usun z czstek lipopro-teinowych, podczas gdy inne mog by swobodnie przenoszone do innych lipoprotem (ryc. 27-2), Skad apolipoprotein jest charakterystyczny dla danej lipoproteiny W kadej lipoproteinie wystpuje 1 lub wicej apolipoprotein (biaek lub polipeptydw). Wedug nomenklatury ABC gwn apolipoprotei-n HDL (ot-lipoproteiny) okrela si jako apoli-poprotein A. Gwn apolipoproteina. LDL (P~hpoproteiny) jest apolipopro_tinajgv. ktra znajduje si rwnie w VLDL i w chylomik-ronach. Jednake apo B chylomikronw (B-48) jest mniejsza ni apo B pochodzca z LDL lub VLDL (B-100). B-48 jest syntetyzowana w jelicie, natomiast B-100 w wtrobie (u szczura wtroba wydaje si syntetyzowa 2arwno B-48, jak i B-100). Apo B-100 jest zapewne najduszym acuchem ze znanych pojedynczych acuchw polipeptydowych, zoonym z 4536 reszt ami-nokwasowych. Apo B-48 (majca wielko 48% apo B-100) jest syntetyzowana na tym samym mRNA, co apo B-100. Zapewne w jelicie kodon stop, ktrego nie ma w odpowiednim DNA genomu, jest wprowadzany do RN A w procesie
posttranskrypcyjnej jego obrbki w taki sposb, e translacja zatrzymuje si na reszcie aminokwasu 2153. Apolipoproteiny C-I, C-II i C-HI s maymi polipeptydami swobodnie dajcymi si przenosi midzy rnymi lipo-proteinami (tab. 27-3). Wglowodany stanowi ok. 5% masy apo-B i zawieraj mannoz, galaktoz, fukoz, glukoz, glukozoamin oraz kwas sjalowy. Niektre lipoproteiny s wic take glikoproteinami. W lipoproteinach oso cza znaleziono rwnie inne apolipoproteiny. Jedn z nich jest bogata w arginin apolipo-proteina E wyizolowana z VLDL i HDL. Za wiera ona arginin w iloci a 10% wszystkich aminokwasw i stanowi 510% wszystkich apolipoprotein VLDL u zdrowych osb. Nadmierne jej iloci stwierdza si u chorych z hiper-lipoproteinemia. typu III o szerokim pa mie P-VLDL. Apolipoproteiny speniaj rne funkcje: 1) s kofaktorami enzymw, np. C -Il jest kofak-torem Jipazy lipoproteinowej, AA acylotrans-ferazy lecytynaxholesterol, 2) mog dziaa jako b ia ka przenos zce lipid y, n p. apo D w HDL, 3) dziaaj jako Ugandy w interakcjach z receptorami lipoprotein w tkankach, np. apo B-100 i apo E w interakcji z receptorami LDL, apo E z receptorami remnantw, a apo A-I z receptorami HDL,
298 / ROZDZIA 27 T abela 27-3. A polipoproteiny lipoprotein osocza czowieka Apo 1 i pop rotei na A-l A -ll
Li po proteina
HDL, chylomikro ny HDL, chylo mikro ny
Masa czsteczko wa { D a) 28000 17000
Dodatkowe uwagi
Aktywator acylotransferazy lecytyna: cholesterol (LCAT) Zbudowana z 2 identycznych mono merw poczonych mostkiem disiar-czko wym. inhibitor LCAT? Syntetyzo wana w wtrobie. Ligand dla receptora LDL Syntetyzowana w jelicie Moliwe, e aktywator LCAT Aktywator poza wtrobowej lipazy li po proteinowej Wiele postaci pohmorficznych zale nie od zawartoci kwasw sjalowych Moliwe, ze identyczna z biakiem przenosz cym estry cholesterolu Obecna w nadmiarze w (5-VLDL u chorych z hiperlipoproteinemi typu III. Jest to jedyna apolipoproteina znajd ujca si w HD L c u zwierzt z hipercholesterolemi wywoan diet Ligand dla receptora remnantw chylo mikro nw w wtro bie i dla receptora LDL
B-100 B-48 Cl C-ll
LDL, VLDL. IDL Chylo mikro ny, chyiomi-krony resztko we VLDL, HDL VLDL, HDL, chylo mikro ny VLDL, HDL, chylo mikro ny Subfrakcja HDL VLDL, HDL, chylomikrony, chylomikro ny resztko we
550000 260000 7 600 8 800 8750 20000 34 000
c-m
D E (bogata w argmi-ne)
WOLNE KWASY TUSZCZOWE S BARDZO SZYBKO METABOLIZOWANE Wolne kwasy tuszczowe (WK.T, FFA, nieze-stryfikowane kwasy tuszczowe) osocza pochodz z lipolizy triacylogliceroii w tkance tuszczowej albo powstaj w wyniku dziaania lipazy lipoproteinowej w czasie wychwytywania tria-cylogliceroli osocza prze2 tkanki. W surowicy wystpuj one w poczeniu z albumin w ste niach wahajcych si miedzy 0,12 u.mol/ml osocza. S to gwnie dugoacuchowe kwasy tuszczowe znajdowane w tkance tuszczowej (np. palmitynowy, stearynowy, olejowy, pal-mitoolejowy, hnolowy i inne wielonienasycone kwasy tuszczowe) oraz w niewielkich ilociach rne inne dugoa cuch owe kwasy tuszczowe. Opisano miejsca wice dla kwasw tuszczowych na albuminie majce rne powinowactwo. W warunkach sytocL notuje si mae stenie wolnych kwasw tuszczowych w surowicy. Zwiksza si ono do ok. 0,5 jimol/ml
w fazie poposikowej i do 0,7 ^mol/ml i 0,8 u.mol/ml w stanie cakowitego godu. W niewy-rwnanej cukrzycy stenie ich moe si zwikszy do 2 ^mol/ml. Stenie WKT zmniejsza si tu po jedzeniu i zwiksza si przed nastpnym posikiem. U takich zwierzt jak przeuwacze, odywiajcych si w sposb cigy i u ktrych zachodzi nieprzerwany napyw skadnikw pokarmowych 7 jelita do krwi, stenie wolnych kwasw tuszczowych w osoczu jest mae. Szybko usuwania wolnych kwasw tuszczowych z krwi jest wyjtkowo dua. Cz WKT pobranych przez tkanki jest utleniana i pokrywa w godzie 2550% zapotrzebowania energetycznego organizmu. Pozostaa cz pobranych WKT jest estryfikowana. Iloraz oddechowy (RQ), oznaczony w okresie godu, wskazuje na to, e spalaniu ulega znacznie wicej tuszczw ni to wynika z iloci utlenionych wolnych kwasw tuszczowych. Na t rnic skada si utlenianie estrw lipidowych pochodzcych z krcej krwi lub obecnych w tkankach. Ostatnie ma szczeglnie znaczenie w mie-
TRANSPORT I MAGAZYNOWANIE LIPIDW / 299
niach szkieletowych i w sercu, gdzie mog wystpowa w do znacznych ilociach zapasy lipidu w komrkach miniowych.
Obrt (ang. turnover) wolnych kwasw tuszczowych jest wprost proporcjonalny do stenia wolnych kwasw tuszczowych. Oznacza to, e
do roli albumin surowicy w pozakomrkowym transporcie dugolacuchowych kwasw tuszczowych. TRIACYLOGLICEROLE S TRANSPORTOWANE Z JELITA W CHYLOMI KROWACH, A Z WTROBY W LIPOPROTEINACH O BARDZO MAEJ GSTOCI Jak sama nazwa wskazuje, chylomikrony znajduj si w chonce, czyli limfie (ac: chylu). Powstaj one jedynie w ukadzie odprowadzajcym chlonke z jelita. S odpowiedzialne za transport wszystkich lipidw zawartych w pokarmach do ukadu krenia. W chonce stwierdza si rwnie mniejsze czstki lipoproleinowe o nieco wikszej gstoci, wykazujce fizykochemiczn charakterystyk czstek VLDL. Skad chemiczny tych mniejszych czstek przypomina raczej chylomikrony ni VLDL, wskazujc na to, e powinno si je uwaa raczej za
szybko wytwarzania wolnych kwasw tuszczowych w tkance tuszczowej jest czynnikiem kontrolujcym stenie wolnych kwasw tuszczowych w osoczu, co z kolei determinuje pobieranie wolnych kwasw tuszczowych przez inne tkanki. Stan odywienia nie wydaje si mie wielkiego wpywu na frakcje wolnych kwasw tuszczowych pobieranych przez tkanki, wpywa natomiast na proporcje iloci kwasw tuszczowych utlenianych w stosunku do estryfikowanych. W stanie godzenia wicej kwasw tuszczowych si utlenia ni w stanie sytoci, W cytozolu komrek wikszoci tkanek stwierdzono obecno biaka wicego kwasy tuszczowe, czyli biaka Z. Uwaa si, e rola tego biaka w wewntrzkomrkowym transporcie wolnych kwasw tuszczowych jest podobna
wiato jelita
Kanalik ciowy Komrka rdblonka
Wosowate naczynie Krwionone
Naczynie llmfatyczne prowadzce do przewodu piersiowego
E wiato zatoki ylnej
Ryc. 27-3. Tworzenie i wydzielanie (A) chyiomtkronw przez komrki jelita oraz (B) lipoprotein o bardzo maej gstoci przez komrk wtrobow. RER szorstka siateczka rdpiazmatyczna, SER gadka siateczka rdplazmatyczna, G aparat Golgiego, N jdro, C chylomikrony, VLDL lipoproteiny o bardzo maej gstoci, E rdbonek, SD przestrze okotozatokowa {Dissego) zawierajca osocze krwi. Rycina jest schematycznym przedstawieniem zdarze, ktre mona zobaczy w mikroskopie elektronowym. __________________________________________________________________
300 / ROZDZIA 27
mae chylomikrony ni za VLDL. Ich wytwarzanie odbywa si nawet w okresie godzenia, a ich lipidy pochodz gwnie z ci i z wydzieliny cian jelita. Ilo wytwarzanych chylomikronw o normalnej wielkoci zwiksza si z iloci triacylogliceroli wchonitych ze wiata jelita. Wikszo VLDL osocza jest pochodzenia wtrobowego. S one przenonikami triacylogliceroli z wtroby do tkanek poza wtrobowych. Istnieje wiele podobiestw w mechanizmie wytwarzania chylomikronw przez komrki jelita i VLDL przez hepatocyty wtroby (ryc. 27-3). Apoiipoproteina B jest syntetyzowana przez rybosomy w szorstkiej siateczce rdplaz-matycznej i wbudowywana do lipoprotein w gadkiej siateczce rdplazmatycznej, ktra jest gwnym miejscem syntezy triacylogliceroli. Nastpnie lipoproteiny przechodz przez apa rat Golgiego. gdzie jak si sdzi do lipoproteiny przyczane s reszty cukrowcowe. Chylomikrony albo VLDL s uwalniane z komrki jelita lub wtroby przez fuzj pcherzyka wydzielniczego z bon komrkow (zjawisko to okrela si jako odwrotn pinocytoz). ChyT Gid e ty . Receptor remnantw ohylomikronu (Apo-E) Chyjo mikron wieo utworzony
lomikrony przechodz do przestrzeni midzy komrkami jelitowymi, skd dostaj si do ukadu limfatycznegojelita. VLDL s wydzielane przez komrki miszu wtrobowego do przestrzeni okolozatokowej (Dissego), skd dostaj si do zatok wtrobowych, przenikajc przez okienka rdbonka naczy. Podobiestwa pomidzy tymi dwoma procesami i mechanizmami anatomicznymi s uderzajce, gdy pomijajc gruczo sutkowy jelito i wtroba s jedynymi tkankami, z ktrych s wydzielane lipidy w postaci lipoprotein. Niezdolno czstek lipidowych o rozmiarach chylomikronw i VLDL do przechodzenia przez komrki rdbonka naczy wosowatych, bez uprzedniej hydrolizy, jest prawdopodobnie przyczyn, dla ktrej tuszcze pokarmowe dostaj si do krenia poprzez ukad limfatyczny (ductus thoracicus), a nie przez ukad yy wrotnej. Chocia zarwno chylomikrony, jak i VLDL izolowane z krwi zawieraj apoli po proteiny C i E, lipoproteiny te i.n statu nascendi zawieraj ich bardzo niewiele albo wcale. Wydaje si wic, e do chylomikronw i VLDL syntetyzowanych de novo przyczanie polipeptydw apo C r apo
Romnant chytomlkronu
Glloerol
JELFTO CIENKIE
27-4.
TKANKI POZAWTFIOBOWE ILIFAZA LIPOPHOTEINOWAl -Kwasy tuszczowe
Metaboliczne chylomikronw. A apolipoproteina A, B-48 apoiipoproteina B-48, apolipoproteina C, E apolipoproteina E, HDL lipoproteina o duej gstoci, TG triacylo-giicerol, C cholesterol i estry cholesterolu, P fosfolipid. Przedstawiono tytko ilociowo dominujce lipidy. losy

wieo wytworzona VLDL
Receptor LDL Apo-B-1QO Apo-E Kwasy tuszczowe Cholesterol WTHOBA Receptor LDL
"KANKI POZAWTHOBOWE
. Kwasy ~ tuszczowe
I w tkankach pozawlrobowych (np. w limfocytach, fibro toastach) drog endocytozy
IDL Jremnant VLDL) Gllcerol TKANKI POZAWTROBOWE
Rvc. Z7-5. Metaboliczne losy lipoprotein o bardzo maej gstoci (VLDL) i biosynteza lipoprotein o maej gstoci (LDL). A apolipoproteina A, B-100 apolipoproteina B-100, apolipoproteina C, E apolipoproteina E, HDL lipoproteina o duej gstoci, TG triacyloglicerol, IDL lipoproteina o poredniej gstoci, C cholesterol i estry cholesterolu, P fosfolipid. Pokazano jedynie lipidy przewaajce ilociowo.
E z HDL zachodzi dopiero wwczas, gdy chylomikrony i VLDL znajduj si w ukadzie krenia (ryc. 27-4 i 27-5). Bardziej szczegowy opis czynnikw kontrolujcych wtrobowe wydzielanie VLDL podano niej. Apo B jest istotna w tworzeniu chylomik-ronw i VLDL. W a beta li pop rot ine mii (rzadkiej chorobie) apo B nie jest syntetyzowana; hpoproteiny zawierajce t apolipo protein nie s wytwarzane, przez co dochodzi do spich-rzania lipidw w jelitach i w wtrobie. KAT ABOLIZM CHYLOMIKRONOW I LIPOPROTEIN O BARDZO MAEJ GSTOCI JEST SZYBKIM PROCESEM Oczyszczanie krwi z chylomikronw, oznaczane znikaniem znakowanych chylomikronw z krenia, jest szybkie. Biologiczny okres p-trwania tych czstek jest rzdu minut u ma-
ych zwierzt (np. u szczura) i nieco duszy u wikszych zwierzt (np. u czowieka), u ktrych i tak wynosi mniej ni 1 h. Wiksze czstki s szybciej katabolizowane ni mae. Jeeli poda doylnie chylomikrony ze znakowanymi kwasami tuszczowymi triacyloglicerolu, to ok. 80% znakowanych kwasw stwierdza si w tkance tuszczowej, sercu i miniach, a ok. 20% w wtrobie. Poniewa dowiadczenia z perfun-dowan wtrob wykazay, e wtroba nie me-tabolizuje w istotnym stopniu chylomikronw ani VLDL, obecno znakowanych kwasw w wtrobie jest zapewne zjawiskiem wtrnym i pochodzi z przemiany tych lipoprotein w tkankach pozawtrobowych. Triacyloglicerol chylomikronw i VLDL jest hydrolizowany prze z lipaz lipoproteinow Istnieje znamienna korelacja midzy zdolnoci tkanek do wbudowywania kwasw tuszczowych z triacylogliceroli lipoprotein a aktyw-
302 / ROZDZIA 27
noci enzymu lipa/y lipoproteinowej. Ten enzym ic:iL umiejscowiony na cianach wosowatych naczy krwiononych zakotwiczony proteo-glikanowym acuchem siarczanu heparanu. Jego obecno wykazano w wycigach z serca, tkanki tuszczowej, ledziony, puc, rdzenia nerki, aorty, przepony oraz gruczou sutkowego w okresie Laktacji. Prawidowa krew nie zawiera znaczcych iloci tego enzymu, jednak po wstrzykniciu heparyny lipaza li po protein owa zostaje uwolniona do krwiobiegu z jej zakotwiczenia siarczanem heparanu. Procesowi temu towarzyszy klarowanie iipemicznego osocza. Lipaza jest rwnie uwalniana z wtroby po podaniu duych iloci heparyny (lipaza wt robowa uwalniana heparyn), ale ten enzym ma waciwoci odmienne od lipazy lipoprotcino-wej i nie reaguje atwo z chyl om ikro na mi. Do aktywnoci lipazy lipoproteinowej s potrzebne, jako kofaktory, fosjfolipidy oraz apoli-poproteina C-II. Apo C-II ma swoiste miejsce wizania fosfolipidu, przez ktre jest ona zwizana z lipoprotein. A zatem chylomikrony i VLDL dostarczaj enzymowi potrzebnemu do przemiany tych lipoprotein zarwno kofakto-rw, jak i substratu. Hydroliza zachodzi wwczas gdy lipoproteiny s przyczone do enzymu na powierzchni rdblonkw. Triacyloglicerol jest hydrolizowany stopniowo poprzez diacy lo-glicerol do monoacylogiicerolu, ktry w kocu jest hydrolizowany do glicerolu i wolnego kwasu tuszczowego. Niewielka ilo uwolnionych kwasw tuszczowych wraca do krwiobiegu, gdzie jest wizana z albumin, ale znaczna wikszo z nich jest transportowana do tkanki (ryc. 27-4 i 27-5). Lipaza lipoproteinowa serca ma ma warto Km dla triacyloglicerolu, podczas gdy Km tego enzymu w tkance tuszczowej jest 10-krotnie wiksza. Gdy stenie triacylogliceroli osocza zmniejsza si przy przejciu ze stanu sytoci w stan godu, wwczas sercowy enzym pozostaje nadal wysycony substratem, natomiast wysycenie enzymu w tkance tuszczowej zmniejsza si, co sprawia, e nastpuje intensywniejsze pobieranie kwasw tuszczowych przez serce ni przez tkank tuszczow. Podobne odwrcenie kierunku pobierania kwasw tuszczowych nastpuje podczas laktacji, w czasie ktrej zmniejsza si aktywno lipazy lipo-proteinowej w tkance tuszczowej, a zwiksza si w gruczole sutkowym, pozwalajc na pobieranie dugoacuch owych kwasw tuszczowych, z triacylogliceroli lipoprotein potrzebnych do syntezy tuszczu mleka.
W tkance tuszczowej insulina zwiksza syntez lipazy lipoproteinowej w adypocytach i jej przemieszczanie do powierzchni luminarnej rdbonka naczy wosowatych. Dziaanie lipazy lipoproteinowej powoduje powstawanie resztkowych lipoprotein (remnantw) Wynikiem dziaania lipazy lipoproteinowej jest utrata z chylomikronw ok. 90% triacylo gliceroli i utrata apo C (ktra powraca do HDL), ale nie apo E, ktra pozostaje poczona z powstaymi czstkami, okrelonymi jako re-tnnanty chylomikronw lub chylomikrony resztkowe (od angielskiego remnant" - pozostao, resztka). Te czstki maj rednic o poow mniejsz ni pierwotne chylomikrony. Na skutek utraty triacylogliceroli s one bogatsze w cholesterol i estry cholesterolu (ryc. 27-4). Podobne zmiany zachodz w VLDL, ktre zamieniaj si w remnanty VLDL, okrelane jako IDL (od angielskiej nazwy intermediate--density lipoproteins, czyli lipoproteiny o po redniej gstoci) (ryc. 27-5). Wtroba jest odpowiedzialna za wychwytywanie remnantw lipoprotein Remnanty chylomikronw s wychwytywa ne przez wtrob, a zawarte w nich estry cholesterolu i triacyloglicerole s hydrolizowa-ne i meiabolizowane. Wychwytywanie to wydaje si odbywa za porednictwem receptora swoistego dla apo E {ryc. 27-4), Badania z uyciem VLDL zawierajcych znakowan apo B-100 wykazay, e VLDL s prekursorami IDL oraz LDL. Tylko 1 czsteczka apo B-100 wystpuje w kadej z wymienionych lipoprotein i ta czsteczka pozostaje nie zmieniona w czasie przeksztacania lipoprotein. Kada czstka LDL pochodzi wic od pojedynczej czstki VLDL (ryc. 27-5). IDL s przeksztacane jedn z 2 moliwych drg. Mog one by wychwytywane bezporednio przez wt rob za porednictwem receptorw LDL (wi cych apo B-100 i apo E), lub te mog by przeksztacane w LDL. U szczura wikszo apo B z VLDL pojawia si w wtrobie, a tylko niewielki procent w LDL. Moe to by spowodowane faktem, e u szczura cz czstek VLDL zawiera apo B-48 zamiast apo B-100. Jeeli wtrobowy receptor dla apo E wyklucza wychwytywanie czstek zawierajcych apo B-100, ale me czstek zawierajcych apo B-48,
to jest to wytumaczeniem wikszego usuwania przez wtrob szczura I DL i mniejszego wytwarzania LDL u szczurw.
znajdujcych si w osoczu chorych z niedoborem enzymu acyibtransferazy lecytyna : chole-
LDL S METABOLIZOWANE ZA POREDNICTWEM RECEPTORA LDL

Jak to opisano wyej, wikszo LDL powstaje 2 VLDL; istniej jednak dowody na to, e pewna ich iJo jest wytwarzana bezporednio przez wtrob. Okres poowicznego znikania z krwi apoproteiny B-100, wystpujcej w LDL, wynosi ok. 2,5 dnia. Badania w hodowli fibroblastw, limfocytw i komrek mini gadkich ttnic, a take wtroby wykazay istninje_swQisiy_ch miejsc wicych, czyli receptorw LDL, tzw. receptorw B-100 E. Receptor ten tale nazwano, poniewa jest on swoisty dla apo B-100, ale nie dla apo B-48, a w pewnych warunkach wie lipoprotei-ny bogate w apo E. W apo B-48 brakuje domeny znajdujcej si przy karboksylowym kocu apo B-100, ktra zawiera ligand dla receptora LDL.
W rodzinnej hipercholesterolemii wystpuje wa-
da tych receptorw. Okoo 50% LDL ulega degradacji w tkankach pozawtrobowych, a pozostae 50% w wtrobie. Istnieje dodatnia korelacji midzy wystpowaniem miadycy naczy wiecowych a steniem LDL w osoczu. Dalsza dyskusja na temat regulacji receptora LDL p. str. 319.
HDL UCZESTNICZ ZARWNO W METABOLIZMIE TRIACYLOGLICEROLU, JAK I CHOLESTEROLU

HDL s syntetyzowane i wydzielane zarwno w wtrobie, jak i w jelicie (ryc. 27-6). Jednake HDL nowo wytworzone (wieo wydzielone) w jelitach nie zawieraj apolipoproteiny C ani E, a jedynie apolipoprotein A. Apo C i apo E s wic syntetyzowane w wtrobie i przenoszone do jelitowych HDL wwczas, gdy te ostatnie
znajd si w osoczu. Gwn funkcj HDL jest dziaanie jako skadowisko dla a po li po protein C i E, ktre s potrzebne w metabolizmie chylo-mikronw i VLDL (p, ryc. 27-4 i 27-5).
sterol (LCAT) oraz w osoczu chorych na taczk zastoinowij. LCAT oraz jej aktywator apolipoproteina A-1 wi si z tym tworem dyskoidalnym. Katalizowana przez LCAT reakcja zamienia fosfolipid i wolny cholesterol znajdujce si na powierzchni HDL w estry cholesterolu i izolecytyn. Niepoarne estry cholesterolu przemieszczaj si do hydrofobowego wntrza struktury bilamelarnej, a lizolecy-tyna zostaje przeniesiona na albumin osocza. Reakcja postpuje dalej i wytwarza niepolarny rdze, ktry rozpycha podwjn bon czstek a do uksztatowania si sferycznego pseudo-micelarnego HDL, pokrytego bon zoon z polarnych lipidw i apolipoprotein. Zestryfi-kowany cholesterol moe by przenoszony z HDL do lipoprotein o mniejszej gstoci, np. do chylomikronw, VLDL i LDL, za pored nictwem biaka przenoszcego estry cholesterolu (apo D), ktre jest jeszcze jednym skadnikiem HDL. Biako przenoszce estry cholesterolu umoliwia wic transport estrw cholesterolu HDL do wtroby poprzez resztkowe chylo-mikrony i VLDL albo przez wychwytywanie LDL w wtrobie. Ukad LCAT uczestniczy wic w usuniciu nadmiaru niezestryfikowa-nego cholesterolu z lipoprotein i z tkanek. Wtroba, a moliwe e i jelita, wydaj si by miejscem kocowej degradacji apolipoprotein HDL. Nie jest jasne, czy w tym procesie uczestniczy swoisty receptor dla HDL, czy dla apo A. Zaproponowano istnienie cyklu HDL, odpowiedzialnego za transport cholesterolu z tkanek do wtroby (szczegy s przedstawione na ryc. 27-6). To wyjania, dlaczego stenie HDLj w osoczu
zmienia si odwrotnie proporcjonalnie do stenia chylomikronw i VLDL, a wprost proporcjonalnie do aktywnoci lipazy lipoprotei-nowej. Stenia HDL (HDL 2 ) s odwrotnie pro porcjonalne do czstoci wystpowania miadycy naczy wiecowych by moe dlatego, e odzwierciedlaj one
Nowo wytworzone HDL skadaj si z dys-koidalnych podwjnych bon fosfolipidowych zawierajcych apolipoprotein i wolny cholesterol. Te lipoproteiny s podobne do cz4Stek
wydajno usuwania cholesterolu z tkanek. HDL,; znajduj si we krwi zwierzt, u ktrych wystpuje indukowana diet hipercholesterolemia. Ta lipoproteina jest szczeglnie bogata w cholesterol, a jej jedyn apolipoproteina jest apo E. Jest ona wychwytywana przez wtrob poprzez receptor remnan-tw wicy apo E oraz poprzez receptory LDL. To wanie dlatego te ostatnie bywaj czasem oznaczane jako receptory wice apo B-100 E. Pytki miadycowe maj komrki,
304 / ROZDZIA 27
Clttci
I Kwasy ciowe
Dyskoldatna nowe postacie HDL
Dwu warstwa fosiollpidowa
Ryc.
27-6. Metabolizm lipoprotein o duej gstoci (HDL). HRHL lipaza uwalnialna przez heparyn, LCAT acylotransferaza lecytyna : cholesterol, LPL lipaza tipoproteinowa, C cholesterol, CE estry cholesterolu, PL
Chylomlkron y VLDL
fosfolipid, WKT wolne kwasy tuszczowe, A-l apolipoproteina A-l. Na rycinie przedstawiono rol 3 enzymw HRHL, LCAT i LPL w postuiowanym cyklu HDL, sucym do transportowania cholesterolu z tkanek do wtroby HDL2, HDL3 p. tab. 27-2. Poza triacyloglicerolem, HRHL hydrofizuje fosfolipidy na powierzchni HDL 2, uwalniajc cholesterol, ktry jest wykorzystywany przez wtrob. Rwnoczenie powstaj mniejsze czstki o wikszej gstoci. Aktywno HRHL zwiksza si pod wpywem aridrogenw, a maleje pod wpywem estrogenw, co moe by przyczyn wikszego stenia HDL2w osoczu kobiet.
ktre wychwyciy tyle cholesterolu, e zmieniy si w przeadowane estrami cholesterolu komrki piankowate. Wikszo tych komrek pochodzi z makrofagw, ktre pochony nieprawidowe, bogate w cholesterol lipoprote -
iny, takie jak chemicznie zmodyfikowane LDL lub p-VLDL(p. str. 319). Makrofagi wydzielaj zarwno cholesterol (przekazujc go odpowiedniemu biorcy, takiemu jak HDL), jak i apo E. Ta apolipoproteina E, po odpowiednim przetwo-
reniu w obecnoci LCAT, moe by rdem bogatej w cholesterol HDLC. HDLC mogaby wic by wanym ogniwem w przemieszczaniu cholesterolu z tkanek do wtroby (odwrcony transport cholesterolu").
Wszystkie lipoproteiny osocza s. wzajemnie ze sob powi zanymi ogniwami jednego lub kilku cykli metabolicznych, a wszystkie razem s odpowiedzialne za zoony proces transportu lipi dw w osoczu.
WTROBA ODGRYWA GWN ROL W TRANSPORCIE I METABOLIZMIE LIPIDW

Uprzednio sdzono e wikszo przemian lipidw odbywa si w wtrobie. Odkrycie, e wikszo tkanek ma zdolno cakowitego utleniania kwasw tuszczowych oraz nagromadzona z czasem ilo informacji o tym, e tkanka tuszczowa jest nadzwyczaj aktywnym metabolicznie narzdem, zmusiy do zmodyfikowania tego pogldu o dominujcej roli wt roby. Jednake koncepcja, przypisujca wtrobie bardzo wan i jedyn w swoim rodzaju rol w przemianie lipidw, pozostaje nadal obowizujca. Wtroba sprawuje nastpujce bardzo wane funkcje w przemianie lipidw: 1) uatwia trawienie i wchanianie lipidw z przewodu pokarmowego, dlatego e wytwarza zawierajc cholesterol i sole kwasw ciowych syntetyzowane w wtrobie (p. str. 345), 2) wtroba ma aktywne ukady enzymatyczne niezbdne do syntetyzowania i utleniania kwasw tuszczowych (p. rozdz. 23 i 24), syntetyzowania triacylogliceroli, foslblipidw (p. rozdz. 26) i cholesterolu (rozdz. 27), 3) syntetyzuje lipoproteiny osocza (opisane w tym rozdziale), 4) przeksztaca kwasy tuszczowe w ciaa ketonowe (ketogeneza) (p. rozdz. 24), 5) odgrywa integrujc rol w przemianie lipoprotein osocza (patrz ten rozdzia).
czowe uyte do syntezy wtrobowych triacylogliceroli pochodz z 2 moliwych rde: 1) z syntezy w wtrobie z acetylo-CoA pochodzcego z wglowodanw oraz 2) z kwasw tuszczowych wychwytywanych z krenia. Pierwsze rdo dominuje w stanie sytoci, gdy synteza kwasw tuszczowych zachodzi intensywnie, a stenie kwasw tuszczowych wkracej krwi jest mae. Poniewa normalnie w tych warunkach triacyloglicerole nie gromadz si w wt robie, naley sdzi, e s przez ni wydalane w postaci VLDL z tak sam szybkoci, z jak s syntetyzowane. Natomiast w czasie godzenia, podczas spoywania pokarmw bogatych w tuszcze lub w cukrzycy stenie krcych wolnych kwasw tuszczowych jest zwikszone i wicej kwasw jest wychwytywanych przez wtrob. W tych warunkach lipogeneza jest zahamowana i wolne kwasy tuszczowe s gwnym rdem kwasw tuszczowych zawartych w triacyloglicerolach wtroby oraz VLDL. Mechanizmy enzymatyczne uczestniczce w syntezie triacylogliceroli i fosfolipidw opisano na slr. 286. Czynnikami, ktre powoduj zarwno zwikszenie syntezy triacyloglicerolu, jak i wydzielania VLDL w wtrobie, s: 1) stan sytoci, a nie godzenia, 2) karmienie pokarmami o duej zawartoci wglowodanw (zwaszcza, gdy zawieraj one sacharoz lub fruktoz), prowadzce do znacznej lipogenezy i estryfikacji kwasw tuszczowych, 3) due stenie krcych we krwi wolnych kwasw tuszczowych, 4) spoywanie etanolu oraz 5) due stenie insuliny, a mae stenie glukagonu, co wzmaga syntez i estryfikacj wolnych kwasw tuszczowych, a hamuje ich utlenianie.
Brak rwnowagi midzy wytwarzaniem triacylogliceroli a ich wydzielaniem jest przyczyn stuszczenia wtroby (ryc. 27-7)
Istnieje zaleno midzy wydzielaniem VLDL przez wtrob a skadem spoytych pokarmw
Powyej opisano procesy komrkowe uczestniczce w tworzeniu i wydzielaniu VLDL (str. 322). Wtrobowe triacyloglicerole s bezporednimi prekursorami triacylogliceroli zawartych w VLDL osocza krwi (ryc. 27-7). Biosynteza triacylogliceroli stanowi bezporedni bodziec do tworzenia i wydzielania VLDL: Kwasy tusz20 Biochemia
Z rozmaitych powodw lipidy, gwnie jako triacyloglicerole, mog sie nagromadzi w wtrobie. Znaczne ich spichrzenie jest uwaane za stan chorobowy. Gdy nagromadzanie si lipi dw ma charakter przewleky, dochodzi do rozwoju zmian wknistych, przechodzcych w marsko (cirrhosis) i upoledzajcych czynno wtroby. Wyrnia si 2 gwne typy stuszczenia wtroby: 1. Pierwszy typ jest zwizany ze zwikszonym
steniem wolnych kwasw tuszczowych osocza,
spowodowanym mobilizacj tuszczw z tkanki
306 / ROZDZIA 27 VLDL

A po -C KREW wiao wytworzona VLDL Kwas orotowy Reszty glikozylowe Gadka siateczka rdplazmatyczna
HDL
' Apo-E*
J
A po-A Apo-C Apo-E
Tatra chlorek wgla Puromycyna ln ^ < Etlonlna Syntez a i f blatka
Apo-B-100 Apo-C Apo-E
\ f
Poiirybosomy
ou
Szorstka siateczka rdplazmatyczna
OD
wiey taft cuch policeptydowy
Karmienie cholesterolem niedobr EFA
Niedobr ofiollny 1,2-Dlaoylogllcerol CDP-chollna Fosfochollna . Chollna
Etanol Acyto-CoA
_. Utlenianie
WKT
Llpogeneza z wglowodanw
Ryc. 27-7. Synteza lipoprotein o bardzo malej gstoci (VLDL) oraz prawdopodobne miejsca dziaania czynnikw powodujcych spichrzanie triacylogliceroii i stuszczenie wtroby EFA egzogenne kwasy tuszczowe, WKT wolne kwasy tuszczowe, HDL iipoproteiny o duej gstoci, ApoA apolipo-proteina A, ApoB apolipoproteina B, ApoC apolipoproteina C, ApoE apolipoproteina E. Zaznaczone szlaki s podstaw dla zdarze przedstawionych na ryc. 27-3 B.
tuszczowej albo z hydroliz triacylogliceroli lipoprotein lub chylomikronw przez Iipa2 lipoproteinow tkanek poza wtrobowych. Zwikszone iloci wolnych kwasw tuszczowych osocza s wychwytywane przez wtrob i estryfikowane. Wytwarzanie lipoprotein nie
nada za napywem wolnych kwasw tuszczowych, co jest przyczyn nagromadzania si triacylogliceroli i stuszczenia wtroby. Ilo triacyloglicerohi w wtrobie znacznie si zwiksza podczas godzenia oraz spoywania
pokarmw o duej zawartoci tuszczw.
W wielu stanach (np. w godzeniu) jest zaburzona zdolno wydzielania VLDL przez hepatocy-ty. Moe to by spowodowane maym steniem insuliny i upoledzon syntez biaka. W niewy-rwnanej cukrzycy {diabetes mellitus), w zatruciu ciowym u owiec i w ketozie byda nacieczenie tuszczami moe by tak znaczne, e powoduje widoczn blado lub tuszczowaty wygld i powikszenie wtroby. 2. Drugi typ stluszczenia wtroby jest zwykle spowodowany metabolicznym blokiem wytwarzania lipoprotein osocza, co pozwala na nagromadzenie si tnacylogliceroli w wtrobie. Teoretycznie to upoledzenie moe by spowodowane a) zablokowaniem syntezy apohpo-protein, b} zablokowaniem tworzenia iipopro-tein z lipidu i apolipoproteiny, c) niedoborem w dostarczaniu fosfolipidw, ktre s w lipo-proteinach lub d) niewydolnoci samego mechanizmu wydzielania. Typem stuszczenia wtroby, ktry byt przedmiotem licznych bada u szczura, jest stusz-czenie wywoywane niedoborem choliny i dlatego zwizek ten bywa nazywany czynnikiem lipotropowym. Poniewa do syntezy choliny s potrzebne labilne grupy metylowe, ktrych dawc jest metionina w procesie transmetylacji (p. rozdz. 32 i 33), niedobr choliny w rzeczywistoci jest spowodowany niedostatkiem grup metylowych tego typu, jaki zawiera metionina. Sugerowano kilka rnych mechanizmw, ktre mogyby wyjani rol choliny jako czynnika lipotropowego, m.jn. taki, e brak choliny po woduje niedobr fosfolipidw niezbdnych do syntezy lipoprotein. Antybiotyk puromycyna hamuje biosyntez biaka i powoduje stuszczenie wtroby oraz znaczne zmniejszenie stenia VLDL u szczurw. Innymi zwizkami o podobnym dziaaniu s: elionina {kwas cc-amino-y-merkaptoetylo-masowy). tetrachlorek wgla, chloroform, fosfor, ow i arsen. Cholina nie chroni organizmu przed toksycznym dziaaniem tych czynnikw, ale wydaje si przyspiesza proces zdrowienia. Jest bardzo prawdopodobne, e tetrachlorek wgla wpywa rwnie na sam mechanizm wydzielania lub na czenie si lipidu z apolipo-protein. Dziaanie tetrachlorku wgla nie jest bezporednie, ale zaley od przeksztacenia jego czsteczki. Prawdopodobnie polega ono m.in. na tworzeniu wolnych rodnikw, ktre uszkadzaj lipidy bon siateczki rdplazmatycznej, tworzc nadtlenki lipidowe. Uzupenienie diety witamin Ejest czynnikiem ochronnym przeciw
peroksydacji lipidw indukowanej tetrachlor-kiem wgla. Uwaa si e dziaanie etioniny polega na zmniejszeniu dostpnoci ATP. Wynika to z tego, e etionina, zastpujc metionin w S-adenozylometiomnie, wie pewn cz dostpnej puli adenylanw i zapobiega tworzeniu si ATP. Kwas orotowy take powoduje stuszczenie wtroby. W tym przypadku VLDL gromadzi sie w aparacie Golgiego. Dlatego uwaa si, e kwas orotowy zaburza glikozyla-cj lipoprotein i hamuje ich uwalnianie, co jest przyczyn znacznego zmniejszenia si w osoczu stenia lipoprotein zawierajcych apo B. Niedobr witaminy E nasila martwic wtroby wystpujc w przebiegu jej stuszczenia wywoanego brakiem chohny. Podanie witaminy E lub selenu ma ochronne dziaanie przeciw peroksydacji lipidw. Tuszczowe nacieczenie wtroby moe by spowodowane poza niedoborem biaka take niedoborem egzogen nych kwasw tuszczowych i witamin (np. kwasu hnolowego, pirydoksyny i kwasu pantotenowego). Uwaa si e niedobr egzogennych kwasw tuszczowych upoledza syntez fosfolipidw. To sprawia, e takie substancje, jak cholesterol, ktre wspzawodnicz o niezbdne dla estryfikacji egzogenne kwasy tuszczowe, mog take powodowa stuszczenie wtroby. Etanol take powoduje stuszczenie wtroby Alkoholizm powoduje spichrzenie thiszczw w wtrobie, hiperlipemi i ewentualnie mars-ko wtroby {cirrhosis hepatis). Dokadny mechanizm dugotrwaego dziaania etanolu jest wci niepewny. Nie jest jasne, czy w procesie spichrzania thiszczw jak rol odgrywa dodatkowa mobilizacja wolnych kwasw tuszczowych, chocia wielokrotnie wykazano, e pojedyncza toksyczna dawka etanolu, podana szczurowi, powoduje zwikszenie stenia wolnych kwasw tuszczowych w osoczu. Jednake spoywanie etanolu przez duszy okres powo duje spichrzenie kwasw tuszczowych, w wtrobie, ktre raczej pochodz z endogennej syntezy ni z mobilizacji z tkanki tuszczowej. Po spoyciu alkoholu nie stwierdza si upoledzenia syntezy biaka w wtrobie. Istniej przekonujce dowody na to, e utlenianie etanolu w wtrobie wzmaga syntez triacylo -gliceroli i hamuje utlenianie kwasw tuszczowych oraz zmniejsza aktywno cyklu cytrynia-nowego. Zmniejszenie aktywnoci tego cyklu jest spowodowane utlenianiem etanolu przez
308 / ROZDZIA 27
dehydrogenaz alkoholow, co prowadzi do nadmiernego wytwarzania NADH.

DEHYDROGENAZA ALKOHOLOWA
TKANKA TUSZCZOWA JEST GWNYM M AGAZYNEM TRIACYLOGLICEROLI W ORGANIZMIE Zapasy triacylogliceroli w tkance tuszczowej ulegaj cigle lipolizie (hydrolizie) i reestryfika-cji (ryc. 27-8). Te 2 procesy nie s prostym odwrceniem tej samej reakcji. Przebiegaj one cakowicie odmiennymi szlakami zawierajcymi inne porednie zwizki i inne enzymy. Wiele czynnikw ywieniowych, metabolicznych i hormonalnych, ktre reguluj przemian tkanki tuszczowej dziaa albo na proces estryfikacji, albo na lipoliz. Wypadkow tych 2 procesw jest wielko puli wolnych kwasw, tuszczowych w tkance tuszczowej. Pula ta determinuje stenie wolnych kwasw tuszczowych krcych w osoczu. Poniewa stenie wolnych kwasw tuszczowych ma bardzo duy wpyw na metabolizm innych tkanek, zwaszcza wtroby i mini, czynniki dziaajce w tkance tuszczowej i regulujce wypyw z niej wolnych kwasw tuszczowych, wywieraj wpyw sigajcy daleko poza sam tkank tuszczow. Dostpno glicerolo-3-fosforanu reguluje estryfikacj. Lipoliza jest kontrolowana przez lipaz wraliw na hormony W tkance tuszczowej triacylogltcerol jest syntetyzowany z acylo-CoA i glicerolo-3-fosforanu wedug mechanizmu przedstawionego na ryc. 26-1. Poniewa w tkance tuszczowej aktywno enzymu kinazy glicerolowej jest maa, glicero! nie moe by wykorzystany w znaczniejszym stopniu do estryfikacji z acylo-CoA. Dlatego pod wzgldem dostarczania glicerolo-3--fosforanu tkanka tuszczowa jest zalena od glikoiizy i od dostpnoci glukozy. Triacyloglicerol jest hydrolizowany pod wpywem lipazy wraliwej na hormony. Produktami tej reakcji s wolne kwasy tuszczowe i gli-cerol. Lipaza ta jest odmienna od lipazy lipo-proteinowej, ktra katalizuje hydroliz triacylogliceroli zawartych w iipoproteinach przed ich wychwytem przez tkanki pozawtrobowe (p. str. 302). GJicerol, nie mogc by wykorzystany przez tkank tuszczow, przenika do osocza krwi, skd jest wychwytywany i zuytkowywa-ny prze2 takie narzdy, jak wtroba i nerka, ktre maj aktywn kinaz giicerolow. Wolne kwasy tuszczowe powstajce w procesie lipo-lizy mog by ponownie przeksztacone w tka-
CH,-CH*-OH Etanol -. ---------- , CHj- CHO + NADH + H Aldehyd octowy
Powstajcy w tej reakcji NADH wspzawodniczy z rwnowanikami redukcyjnymi pochodzcymi z utleniania innych substratw o acuch oddechowy, hamujc w ten sposb utlenianie tych substratw. Zwikszenie stosunku [NADH]/[NAD+] powoduje przesunicie w lewo rwno wagi jablczan ^ szcza wio octan, co moe zmniejszy aktywno cyklu cytryniano-wego. Sumarycznym skutkiem zahamowania utleniania kwasw tuszczowych jest wzmoenie estryfikacji kwasw tuszczowych do triacy-logliceroli, co wydaje si by przyczyn stusz-czenia wtroby. W wyniku utleniania etanolu powstaje najpierw aldehyd octowy, ktry jest utleniany w mitochondriach do kwasu octowego przy udziale dehydrogenazy aldehydowej. Innymi skutkami spoywania etanolu moe by m.in. zwikszona lipogeneza i zwikszona synteza cholesterolu z acetylo-CoA. Zwikszony stosunek [NADH]/[NAD+] powoduje take zwikszenie stosunku [mleczan]/[pirogronian], czego wynikiem jest hiperlaktacydemia, ktra z kolei jest przyczyn 2mniejszenia zdolnoci nerek do wydalania kwasu moczowego. Upo ledzenie wydalania kwasu moczowego jest prawdopodobnie przyczyn pogorszenia si dny moczanowej po wypiciu alkoholu. Chocia gwna droga przemiany etanolu przebiega szlakiem dehydrogenazy alkoholowej, pewna jego ilo jest metabolizowana przez ukad mikro-somalny zaleny od cytochromu P -450, w ktrym uczestnicz take NADPH i O2. Aktywno tego ukadu zwiksza si w przewlekym alkoholizmie i moe by przyczyn zwikszenia metabolicznego usuwania etanolu z krwi w tych warunkach, na co wskazuj zwikszone stenia aldehydu octowego i octanu.
CH 3 -CH a0H + NADPH + H Etanol -* CH,-CHO Aldehyd octowy
2HaO
TRANSPORT I MAGAZYNOWANfE LIPIDW / 309
Glukoza
G lice roi
Ryc. 27-8. Metabolizm tkanki tuszczowej. Upaza wraliwa na hormony jest aktywowana przez ACTH, TSH, glukagon, adrenalin, noradrenalin i wazopresyne, za hamowana przez insulin, prostag landy n E, i kwas nikotynowy. Szczegy powstawania glicerolo -3-fosforanu z produktw porednich glikolizy przedstawiono na ryc. 26-1. PPP szlak pentozofosforanowy, TG triacyloglicerol, WKT wolne kwasy tuszczowe, VLDL lipoproteina o bardzo maej gstoci.
ce tuszczowej w acylo-CoA dziaaniem syci-tetazy acylo-CoA i mog by reestryfikowane z glicerolo-3-fosforanem, tworzc triacyloglicerol. W tkance tuszczowej istnieje zatem cigy cykl lipolizy i reestryfikacji. Gdy szybko reesl-ryfikacji nie jest dostatecznie dua, aby zrwnoway szybko lipolizy, wwczas dochodzi do nagromadzenia wolnych kwasw tuszczo wych, ktre przenikaj do osocza, gdzie wi si z albumin i sa. przyczyn zwikszenia
stenia wolnych kwasw tuszczowych w osoczu. S one najwaniejszym rdem energetycznym dla wielu tkanek. Zwikszony metabolizm glukozy zmniejsza uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych Przy zwikszeniu zuycia glukozy przez tkank tuszczow zmniejsza si wypyw z niej wolnych kwasw tuszczowych. Pomimo tego
310 / ROZDZIA 27
utrzymuje si uwalnianie glicerolu. Sugeruje to, e hamujcy wpyw glukozy na uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych nie jest spowodowany zmniejszeniem lipolizy. Uwaa si, e jest to spowodowane dostaw glicero-lo-3-fosforanu, ktry nasila procesy estryfikacji wolnych kwasw tuszczowych po ich uprzednim przeksztaceniu w acylo -CoA. Glukoza w tkance tuszczowej moe wcho dzi w wiele szlakw metabolicznych, cznie z utlenianiem do CO2 poprzez cykl cytryniano-wy, z utlenianiem poprzez szlak pentozofos-foranowy, przeksztaceniem w dugoacucho-we kwasy thiszezowe oraz wytworzeniem acylo-glicerolu poprzez glicerolo-3-fbsforan. Gdy zuycie glukozy jest due. wwczas wiksza cz pobranej glukozy jest utleniana do CO2 i przetwarzana w kwasy thiszczowe. Jeeli jednak cakowite zuycie glukozy si zmniejsza, wikszo jej jest przeksztacana w glicerolo-3-fosforan, wykorzystywany do estryfikacji z acylo-CoA. Proces ten pomaga-zminimaiizowa wypyw wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej. Wolne kwasy tuszczowe s wychwytywane przez tkanki w wyniku aktywnoci lipazy lipoprotei nowej W tkance tuszczowej istnieje wicej ni 1 pula wolnych kwasw tuszczowych. Wykazano, e pula wolnych kwasw tuszczowych (ryc. 27-8, pula 1) powstajca w wyniku lipolizy triacylo-gliceroli, jest t sam pul, ktra dostarcza kwasw tuszczowych do estryfikacji. Jest to take ta sama pula, z ktrej wolne kwasy tuszczowe s uwalniane do osocza. Jednake kwasy tuszczowe pobierane z osocza w wyniku dziaania lipazy lipoproteinowej na triacyloglicerole chylomikronw lub VLDL nie mieszaj si z pul 1, zanim nie zostan wbudowane w triacylo glicerole, lecz przechodz przez bardzo ma pul 2, o bardzo duej liczbie obrotw (krtkim okresie ptrwania). HORMONY REGULUJ MOBILIZACJ TUSZCZW Insulina zmniejsza uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych Na szybko uwalniania wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej dziaa wiele hormonw, ktre wpywajâlbo na szybko estryfikacji, albo na szybko lipolizy. Insulina hamuje uwalnianie wolnych kwasw tuszczo-
wych z tkanki tuszczowej, czego nastpstwem jest zmniejszenie stenia wolnych kwasw tuszczowych w osoczu. Wzmaga ona lipogenez i syntez acyloglicerolu oraz nasila utlenianie glukozy do CO2 w szlaku pentozofosforano-wym. Te dziaania insuliny s zalene od obecnoci glukozy. W duej mierze mog one by wyjanione pobudzajcym wpywem insuliny na pobieranie glukozy przez komrki tkanki tuszczowej. To dziaanie insuliny polega na spowodowaniu przemieszczania przenonikw glukozy z aparatu Golgiego do bony plazmatycznej. Wykazano rwnie, e insulina wzmaga aktywno dehydrogenazy pirogronianowej, karhoksy-lazy acetylo-CoA oraz acylotransferazy glicerolo--3-fosforanowej, wzmacniajc przez to skutki wynikajce ze wzmoonego pobierania glukozy, zwikszajce wytwarzanie kwasw tuszczowych i acylogliceroli. Wiadomo, e wymienione powyej 3 enzymy s regulowane w sposb skoordynowany przez modyfikacje kowalencyjne, tj. przez mechanizm fosforylacji i defosforylacji. Zasadniczym dziaaniem insuliny w tkance tuszczowej jest hamowanie aktywnoci lipazy wraliwej na hormony. W wyniku tego dziaania zmniejsza si uwalnianie nie tylko wolnych kwasw tuszczowych, lecz take glicerolu. Tkanka tuszczowa jest znacznie bardziej wraliwa na dziaanie insuliny ni wiele innych tkanek, co wskazuje na tkank tuszczow jako gwne miejsce dziaania insuliny In vivoDua liczba hormonw ma zdolno pobudzania lipolizy W odrnieniu od insuliny, inne hormony przyspieszaj uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej i zwikszaj stenie wolnych kwasw tuszczowych w osoczu dziki temu, e zwikszaj szybko hydro lizy spichrzanych triacylogliceroli (ryc. 27-9). Wrd tych hormonw znajduj sie m.in. adrenalina, noradrenalina, glukagon, kortykotro-fina (ACTH), <x- oraz p-melanotrofina (MSH), tyreotrofina (TSH), hormon wzrostu (GH) i wa-zopresyna. Wiele z nich aktywuje lipaz wraliwa, na hormony. W celu osignicia optymal nego skutku w wielu 2 tych procesw lipolizy jest potrzebna obecno glikokortykoidw i hormonw tarczycy. Same te hormony nie wzmagaj w znaczny sposb lipolizy, ale dziaaj uatwiajco lub permisywnie w stosunku do innych lipolitycznych czynnikw wewntrzwydziel niczych.
Blokery ' \ 0-adrenergiczns j^ Hormony--^) \ tarczycy \
Adrenalina, nnradrenalina
/ A C T H, \ I TSH, ) Nglukagon'
insulina, proatag landy na E Kwas nikotynowy ATP
W KT + diacylaglicerol
WKT + monoacylogllcerol
CYKUAZA G.TPADENYLANOWA
--WKT -*-'
l"acylog licerolawa b wraliwa na hormony

ATP WKT + glicerol
Hormon WZf08tu
Metyloksantyrty (np . kofeina} .._ FOSFODIESTEFIAZA
inhibitory"' ,-"'"*! syntezy ,'' biaka / Adenozyna
')&
,-
eJ
cAMP-zalena kJnaza b iaek cAMP ADP

x
Llpaza triacyloglicero Iowa a wraliwa na hormony (aktywna)
Fosfataza lipazy THIACYLO -GLICERO L

'Inhibitory
Insulina
Llpaza dlacylogllcerolowa monoacylogHeerolowa
Hormon tarczycy
5'AMP ^ Glukokortykoldy
biosynt ezy
biaka
Ryc. 27-9. Kontrola lipolizy w tkance tuszczowej, TSH tyreotropina, WKT wolne kwasy tuszczowe. Zauwa kaskadow sekwencj reakcji zmierzajc do zwielokrotnienia na kadym etapie. Bodzi ec lipolityczny jest wyczony" przez: 1) usunicie hormonu pobudzajcego, 2) dziaanie fosfatazy lipazy, 3) hamowanie lipazy i cyklazy adenylanowej dziaaniem duych ste WKT, 4} hamowanie cyklazy adenylanowej dziafaniem adenozyny oraz 5) usunicie cAMP w reakcji katalizowanej przez fosfod ieste ra, ACTH, TSH i glukagon raczej nie mog aktywowa cyklazy adenytanowej in i/ivo, gdy niezbdne do tego stenia hormonu//? vitro s znacznie wiksze ni znajdywane w kreniu Pozytywne () i negatywne (G) skutki regulacyjne s zaznaczone przerywanymi liniami, a przepyw substratw cigymi liniami.
Te hormony, ktre szybko pobudzaj lipoliz, np. aminy katecholowe, czyni to pobudzajc aktywno cyklazy adenylanowej, enzymu, ktry przemienia ATP w cAMP. Ten mechanizm jest analogiczny do tego, ktry jest odpowiedzialny za hormonalne pobudzenie glikogenolizy (p. rozdz. 20). cAMP, pobudzajc cAMP-zalen kina/ biaek, przeksztaca nieaktywn, wraliw na hormon, lipaz triacyloglicerolow w aktywn lipaz. Lipoliza jest w duej mierze kontrolowana przez ilo cAMP znajdujcego si w tkance. Wobec tego procesy, ktre rozka daj lub chroni przed rozkadem cAMP, maj wpyw na lipoliz. cAMP jest rozkadany do 5'-AMP przez enzym fosfodiesteraz cykli-
cznego 3',5'-nukleotydu. Ten enzym jest hamowany przez metyloksantyny, takie jak kofeina i reoillina. Wiadomo, e picie kawy zawierajcej kofein powoduje zwikszenie WKT w osoczu czowieka. Insulina dziaa antago ni stycznie w stosunku do hormonw Iipolityc2nych. Obecnie si uwaa, e lipolka moe by bardziej wraliwa na stenie insuliny ni proces zuywania glukozy i est-ryfikacja kwasw tuszczowych. Przeciwli-polityczne dziaania insuliny, kwasu nikotynowego i prostaglandyny E, mog by spowodowane hamowaniem syntezy cAMP w miej scu dziaania cykJazy adenyJanowej. Insulina pobudza take fosfodiesteraz. Moliwe mecha-
312 / ROZDZIA 27
nimy dziaania hormonw tarczycy na lipaz polegaj na zwikszeniu stenia cAMP, uwarunkowanym uatwionym przenikaniem bodca z miejsca na receptorze, umiejscowionego po zewntrznej stronie bony komrkowej, do miejsca cykJazy adenylanowej umiejscowionej po wewntrznej stronie bony, a take na hamowaniu aktywnoci fosfodiesterazy. Pobudzajcy wpyw hormonu wzrostu na lipoliz jest powol ny. Zaley on od syntezy biaek uczestniczcych w wytwarzaniu cAMP. Glikokortykosteroidy pobudzaj lipoiiz poprzez syntez de now biaka lipazy w sposb niezaleny od cAMP, co moe by hamowane przez insulin. Te fakty pomagaj wyjani rol przysadki mzgowej i kory nadnerczy w pobudzaniu mobilizacji tuszczw. Wspczulny ukad nerwowy, wskutek uwalniania noradrenaliny w tkance tuszczowej, odgrywa gwn rol w mobilizacji wolnych kwasw tuszczowych, dziaajc tonizujco na ten proces nawet przy braku wzmoonej aktywnoci nerwowej. Wobec tego wzmoon lipoliz, spowodowan wieloma czynnikami opisanymi powyej, mona zredukowa lub nawet cakowicie zahamowa przez odnerwienie tkanki tuszczowej, przez blokad zwojw wspczulnych hek-sametonium lub przez zuboenie zapasw noradrenaliny rezerpin. U RNYCH BADANYCH GATUNKW WYKSZTACIY SI ROZMAITE MECHANIZMY SUCE SUBTELNEJ KONTROLI METABOLIZMU TKANKI TUSZCZOWEJ Tkanka tuszczowa czowieka nie wydaje si by wanym miejscem lipogenezy. Wskazuje na to obserwacja, e nie ma znaczcego wbudo-wywania znacznikw do dugoacuchowych kwasw tuszczowych ze znakowanej glukozy lub pirogronianu. Ponadto ATP-zalena liaza cytrynianowa, kluczowy enzym lipogenezy, wydaje si by nieobecna w tkance tuszczowej, a w wtrobie wykazuje bardzo ma aktywno. Inne enzymy, np. dehydrogenaza gluko-zo-6-fosforanowa i enzym jabezanowy, ktrych aktywno u szczura ulega adaptacyjnym zmianom zalenym od zwikszajcej si intensywnoci lipogenezy, nie ulegaj podobnym zmia nom w tkance tuszczowej czowieka. W zwizku z tym sugerowano, e u czowieka istnieje
zesp nadmiaru wglowodanw", spowodowany wyjtkowym ograniczeniem zdolnoci organizmu do usuwania nadmiaru wglowo danw przez lipogenez. U ptakw lipogeneza jest ograniczona do wtroby, gdzie jest ona bardzo istotna, poniewa dostarcza lipidw potrzebnych do tworzenia jaj pobudzonego przez estrogeny. Ludzka tkanka tuszczowa nie jest wraliwa na dziaanie wikszoci hormonw lipolitycz-nych, poza aminami katecholowymi. Dalszymi ciekawostkami s: brak reakcji lipolitycznej na dziaanie adrenaliny u krlika, winki morskiej, wini i kurczcia, bardzo znaczne dziaanie lipo-lityczne glukagonu u ptakw, przy braku prze-ciwlipolitycznego dziaania insuliny oraz brak syntezy acylogliceroiu i glicerolu z glukozy u gobia. Biorc pod uwag gbokie zaburzenie metabolizmu wystpujce w cukrzycy (ktre jest spowodowane gwnie zwikszonym uwalnia-niem wolnych kwasw tuszczowych z ich magazynw) oraz fakt, e podanie insuliny w duej mierze poprawia le zaburzenia, naley wysnu wniosek, e insulina odgrywa
pierwszoplano w rol w regulacji metabolizmu tkanki tuszczowej.
BRUNATNA TKANKA TUSZCZOWA POBUDZA TERMOGENEZ Brunatna tkanka tuszczowa uczestniczy w metabolizmie szczeglnie wwczas, gdy jest konieczne wytwarzanie ciepa. Ten fakt tumaczy, e ta tkanka jest bardzo aktywna metaboli-cznie u niektrych gatunkw zwierzt w okresie budzenia si ze snu zimowego, u zwierzt naraonych na zimno (termogeneza bezdreniowa) oraz przy wytwarzaniu ciepa, u noworodkw. Chocia nie jest to pierwszoplanowa tkanka u ludzi, ostatnio wykazano, e jest aktywna u osb zdrowych, u ktrych wydaje si ona odpowiada za termogenez indukowan przez diet". Ten fakt tumaczy, dlaczego niektre osoby mog Je i nie by otyymi". Godne uwagi jest to, e ilo brunatnej tkanki tuszczowej jest mniejsza lub w ogle brak jej u ludzi otyych. Brunatn tkank tuszczow charak teryzuje dobrze rozwinite ukrwienie, dua zawarto mitochondriw i cytochromw, ale maa aktywno syntazy ATP. Metabolicznie przewaa utlenianie zarwno glukozy, jak i kwasw tuszczowych.

STRONA ZEWNTRZNA WEWNTRZNA BONA MITOCHONDRIALNA STRONA WEWNTRZNA
Noradrenallna
KffN
ATP
cAMP
f I -------------------------------- 1 i.
Ciepo
Noradrenalina, uwalniana z zakocze nerww wspczunycli, jest wana do wzmoenia lipolizy w brunatnej tkance tuszczowej. Utlenianie i fosforylacja nie s skojarzone w brunatnej tkance tuszczowej, czego wyrazem jest brak wpywu dinitrofenolu na zuycie tlenu i brak kontroli oddechowej wywieranej przez ADP. Fosforylacje, ktre zachodz, maj miejsce na poziomie substratu, np. w reakcji katalizowanej przez tiokinaz bursztynianow
oraz w glikolizie. W procesie utleniania wytwarza si wic duo ciepa, a tytko niewiele energii swobodnej jest wizane w postaci ATP. W katego-
Laficuch oddechowy Trfaoyfo.
WKT
Tarmogsnlna Acyio-CoA -*-j Rwnowaniki
redukcyjne
riach teorii chemiosmotycznej dzieje si tak, e gradient ste protonw, istniejcy nor malnie po obydwch stronach wewntrznej bony mJtochondrialnej skojarzonych mitochon-driw, w brunatnej tkance tuszczowej ulega cigej dyssypacji dziaaniem ciepotwrczego biaka termogeniny, ktrego mechanizm dziaania polega na tworzeniu drogi swobodnego przenikania protonw przez bon. Wyjaniaoby to pozorny brak efektu zwizkw rozkojarza-jacych (ryc. 27-10).
PIMIENNICTWO Borensztajn J (edilor): Lipoprotein Lipase. Eveuer Publishers, Chicago, 1987. Brewer HB, et al: Apolipoproteins and lipoproteins in human plasma: An overview. Clin Chem 1988;34:B4. Brown Ms, Goldsten JL: Lipoprotein metabolisra in the macrophage: Implication for cholesterol deposition in atherosclerosis. Amtu Rev Biochem 1983;52:223. Eisenberg S: High densiiy lipoprotein metabolism. J Lipid Res 1984;25:1017. Fielding CJ, Fielding PE: Metabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemiitry of&ptds and Membmnes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummings, 1985. Himms-Hagen J: Brown adipose tissue metabolism and thermogenesis. Ann Rev Nutr I985;5:69. Liber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injor>- to liver and other tissues. New Eng JMed 1988:319:1639. Sparks JD, Sparks CE: Apolipoprotein B and lipoprotein metabolisra, Ath Lipid Res 19S5;21:t.
C iepo
JMuKeotydy purynowe
Transporter karnltynowy
Ôksydacja
Ryc. 27-10. Termogeneza w brunatnej tkance tuszczowej. Aktywno acucha oddechowego wytwarza ciepo, prowadzc rwnoczenie translokacj protonw (p. str. 151). Gdy te protony wracaj do kompartmentu wewntrzmitochondrialnego za porednictwem termogeniny, nastpuje rozproszenie ciepa, zamiast wytwarzania ATP, ktre zachodzi wwczas, gdy protony powracaj za porednictwem F^syntazy ATP. Jeeli brunatna tkanka tuszczowa nie jest pobudzana, to przejcie H przez termo-genin jest zahamowane przez nukleotydy purynowe. Pod wpywem noradrenaliny ta inhibicja zostaje zniesiona, gdy s wytwarzane wolne kwasy tuszczowe (WKT) i acylo-CoA. Zauwa podwjn rol acylo-CoA, z jednej strony uatwiaj dziaanie termogeniny, z drugiej za dostarczaj rwnowanikw redukujcych dla acucha oddechowego. Zaznaczone s pozytywne () i negatywne (0) skutki regulacyjne.
28
Synteza, transport i wydalanie cholesterolu

Pater A. Mayes, PhD, DSc
WPROWADZENIE Cholesterol wystpuje w tkankach oraz w li-poproteinach osocza jako wolny cholesterol albo w poczeniu z kwasami tuszczowymi o dugim acuchu wglowym jako estry cholesterolu. Jest on syntetyzowany w wielu tkankach z acetyl o-Co A i ostatecznie wydalany z organizmu z ci jako cholesterol lub sole kwasw ciowych. Cholesterol jest prekursorem wszystkich innych steroidw w organizmie, takich jak: korty kos teroidy, hormony pciowe, kwasy ciowe i witamina D. Jest typowym produktem metabolizmu zwierzcego, a wic znajduje si w pokarmach pochodzenia zwierzcego, takich jak: tko jaja, miso, wtroba i mzg.
sza jego rola w procesach patologicznych polega na uczestniczeniu w powstawaniu miadycy {(itherosderosis) yciowo wanych ttnic, stajc si przyczyn chorb naczy mzgowych, ttnic wiecowych i naczy obwodowych. Nasilenie miadycy naczy wiecowych wykazuje dodatni korelacj ze stosunkiem stenia cholesterolu LDL do cholesterolu HDL. CHOLESTEROL POCHODZI MNIEJ WI CEJ W TEJ SAMEJ ILOCI Z POKARMW CO I Z BIOSYNTEZY
Okoo poowa cholesterolu organizmu czowieka pochodzi z syntezy (ok. 500 mg/24 h), pozostaa za ilo jest dostarczana z pokarmem. Okoo 50% syntetyzowanego cholesterolu pochodzi z wtroby, 15% z jelit, za znaczna cz pozostaej iloci syntetyzowanego w orZNACZENIE BIOMEDYCZNE ganizmie cholesterolu pochodzi ze skry. Praktycznie wszystkie tkanki zawierajce koCholesterol jest amfipatycznym lipidem i jako taki jest istotnym strukturalnym skadni kiem mrki jdrzaste s zdolne do syntetyzowania bon oraz zewntrznej warstwy Hpoprotein cholesterolu. Za syntez jest odpowiedzialna osocza. Ponadto lipoproteiny transportuj wolny zarwno frakcja mikrosomalna (siateczka cholesterol w krcej krwi, gdzie wymienia si rd-plazmatyczna), jak i frakcja cytozolowa on, na zasadzie rwnowagi, z cholesterolem komrki. innych lipoprotein i bon. Cholesterol zestryfi-kowany jest postaci zapasow rdem wszystkich atomw wgla cholesterolu znajdujcego si w wikszoci cholesterolu jest acetylo-CoA Biosynteza cholesterolu moe by podzielona tkanek. Jest on transportowany jako cargo" w rdzeniu Iipo-protein osocza .fCDD jest na 5 etapw. porednikiem w pr^ noszeniu cholesterolu i 1. Najpierw nastpuje synteza mewalonianu, zwizku powstajcego z estrw cholesterol u do wielu Tkanek. 6-wglowego Wolnycholesterol jest usuwany z tkanek przez acetylo--CoA (ryc. 28-1). 2. Nastpnie dochodzi fHDJ^ i transportowany do wtroby, gdzie jest do wytworzenia jednostki izoprenoidowej z przeksztacany w kwasy ciowe. Cholesterol mewalonianu przez utrat COZ (ryc. 28-2). 3. 6 jest gwnym skadni kiem kamieni ciowych. jednoJednake najwaniej-
SYNTEZA , TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 315
C H 3 -C - S - Co A 2-Acatylo-CoA | TIOLAZA | CoA-SH

CH3
ot *
O
CM
- CH ; - C~S - CoA 0 Acetoaceylo-CoA
o
H3-!-S-CoA
Acetylo-CaA SYNTAZA KMG-CoA
CH, C o A .S H O l
Ol
:- ! |
- OOC -CH ; - C-C H j- C - S -Co A I OH 3-Hydrofoy-3-metylaglutaryto-CaA (HMG-CoAJ

IREDLKTAZA HMG-CoA
zolowy tiola/a. W wtrobie acetoacetylo--CoA moe powstawa alternatywnie w taki sposb, e acetooctan wytworzony w szlaku ketogenezy wewntrz mitochondrium (p. rozdz. 24) dyfunduje do cytozolu. gdzie moe by aktywowany do acetoacetylo-CoA dziaaniem syntazy acetoacetylo-CoA. Reakcja ta wymaga obecnoci ATP i CoA. W wyniku kondensacji acetoacetylo-CoA z kolejn czsteczk aceiylo--CoA (reakcje te katalizuje syntaza HMG-CoA) powstaje HMG-CoA. HMG-CoA jest przeksztacany w mewalonian w 2-etapowej redukcji z udziaem NADPH i mikrosomalnego enzymu reduktazy HMG--CoA. Reakcja ta jest uwaana za etap ograni czajcy szybko szlaku biosyntezy o cholesterolu (ryc. 28-1).
Etap 2. Z mewalonianu powstaj aktywne jednostki izoprertoidowe. Mewa-
2NADPH+2H
Cholesterol Mewastaryna Lowastafyrra
c
0 ^ 2N A DP + +C0 A .S H OCH^
-OOC -CH 2 - C - C H . - C H ^ O H I OH
Mewalonlan
Ryc. 28-1. Biosynteza mewalonianu. HMG reszta 3-hydroksy-3-metyloglutarylowa. Reduktaza HMG-CoAjest hamowana przez cholesterol i metabolity grzybw, mewastatyn (Compactin) i lo-wastatyne (Mevinolin), ktre dziaaj kompetycyj-nie w stosunku do HMG-CoA.
stek izoprenoidowych kondensuje tworz c produkt poredni skwalen. 4, Skwalen cyklizuje i powstaje macierzysty steroid lanosterol. 5. Z lanosterolu powstaje cholesterol w wyniku kilku dalszych reakcji zwizanych z utrat 3 grup metylowych (ryc. 28-3).
Etap 1. Z acetylo-CoA powstaje HMG-CoA i mewalonian Szlak prowadzcy przez HMG-CoA (3-hydroksy-3-metyloglu-tarylo-CoA) przebiega wedug tej samej sek wencji reakcji, jaka zostaa opisana w rozdz. 24 przy syntezie cia ketonowych w mitochond-riach. Poniewa synteza cholesterolu jest procesem pozamitochondrialnym, te 2 szlaki przebiegaj oddzielnie. Na pocztku 2 czste czki acetylo-CoA kondensuj tworzc acetoa-cetylo-CoA. Reakcj te katalizuje enzym cyto-
lonian jest fosforylowany przez ATP z wytworzeniem kilku aktywnych ufosforylowanych zwizkw porednich (ryc. 28-2). Przez dekar-boksylacj powstaje aktywna jednostka izopre-noidowa izopentenylopiro fosforan. Etap 3. 6 jednostek izoprenoidowych tworzy skwalen. W tym etapie dochodzi do kondensacji 3 czsteczek izopentenylopirofos-foranu z powstaniem pirofosforanu famezylu. Odbywa si to wskutek izomeryzacji izopen-tenylopirofosforanu, w czasie ktrej dochodzi do przesunicia wizania podwjnego i wytworzenia pirofosforanu dimetyloalilu. Z kolei nastpuje kondensacja z inn czsteczk izopentenylopiro fosforanu i wytworzenie 10-wg-lowego zwizku poredniego, pirofosforanu geranylu (ryc, 28-2). W wyniku dalszej kondensacji z izopentenylopirofosforanem powstaje pirofosforan farnezylu. 2 czsteczki pirofosforanu farnezylu kondensuj przy kocu piro fosforanowym. W tej reakcji naj pierw odszczepia si 1 pirofosforan i powstaje pirofosforan preskwalenu, po czym nastpu je redukcja z udziaem NADPH i oderwanie pozostaej reszty piro fosforanowej. Produk tem tych reakcji jest skwalen. Moe istnie alternatywny szlak zwany spiciem trans--metyloglutakonylanowym". W tym szlaku jest eliminowana znaczna cz (5% w wtrobie w stanie sytoci, a do 33% w wtrobie w stanie godzenia) pirofosforanu dimetyloalilu, ktry wraca do HMG-CoA przez (rans-3-metyloglu-takonylo-CoA. Ten szlak moe mie znaczcy wpyw regulacyjny na sumaryczn szybko syntezy cholesterolu.
316 / ROZDZIA 28 CH3 OH

ATP ADP CH, ^L _ - O O C KINAZA CH MEWALONIANOWA , 2 O OH
-ooc
\r
CH5 C H: Mewalonian
CH,
OH
\if \ / \C
5-Fosforan mewalonianu ATP
CH
-C P J
KINAZA FOSFOMEWALONIANOWA
ADP
CH3 ADP CH3
OH
ATP
CH, CH; O- - 3-Fosto-5-plrofosoran rnawalonlanu ~ COj+Pj HMG-CoA

CH3 I ^ ____ C / C H, 'Izopentenylo-IRNA OS-PRENYLOTRANSFERAZA DEKARBOKSYLAZ A PIROFOSFOMEWALONIANOWA
AA
H5 CH2 5-Plrofosforan mewalonlanu
Spicie trans-matyloglutakonanowa ^
'
^ / \
Pirofostoran 3,3-dimetyloallilu
IZOMEflAZA IZOPENTENYLO-D tFOSFORANOWA
Piralosforan Izopentenylu
__
CH3
JL _
CH3
CH3 Hem a
CH
CH, CH Pirofosforan geranylu
CIS-PRENYLOTRANSFERAZA acuch boczny _ ubichlnonu ^
Dollchol Skwalen
Ryc. 28-2. skwa len u, idoMcholu, HMG
Biosynteza ubichinonu reszta
3-hydroksy-3-meiylo'gluiarylowa: x cytokinina. Reszta farnezylowa jest obecna w hemie a oksydazy cyto chrom owej. Wgiel zaznaczony * staje si C,, lub C 12 w skwatenie. Syntetaza skwalenowa jest enzymem mikrosomainym; wszystkie inne enzymy zaznaczone na schemacie s rozpuszczalnymi biakami cytozolowym i. _________
SYNT EZA, T RANSPORT I WYDALANIE CHOLEST EROLU / 317
CH, CH 3 - C~S -CoAAcetylc-CoA

O ul O
" OOC -CH!-C -CH3 -CH20H l

OH Mewalontan
T
CHa~C
CH CH; Jednoalka
ol
a ^"1
ca
H,0
izoprenoldowa
Daamosterol (24-ae hyd r oe ho I astero i)
CH,
*aH "^
H2 C
^=c"'
LANOSTEROLOCYKLAZ A O KSY DOSKWALENOW A
HO
Cholesterol
Ryc. 28-3. Biosynteza cholesterolu. Ponumerowane pozycje oznaczaj numery atomw wgla piercienia steroidowego. 'Odnosi si do znakowania skwalenu na ryc. 28 -2.
w tanosterol. Skwaien ma budow przypominajc piercie steroidowy (ryc. 28-3). Przed zamkniciem piercienia skwaien jest przeksztacany w 2,3 -tlenek. Reakcj t, zachodzc w siateczce rd plazma ty cznej, katalizuje ok-sydaza o mieszanej funkcji zwana epoksydazij
Etap 4. Skwaien jest przeksztacany
skwalenow, W trakcie cykiizacji, katalizowanej przez lanosterolocyklaz 2,3-oksydoskwatenow, grupa metylowa przy C14 zostaje przeniesiona do C]3, a grupa metylowa z C8 na CM .
Etap 5. Lanosterol jest przeksztaca-
ny do cholesterolu. W tym ostatnim etapie (ryc, 28-3) przejcie lanosterolu w cholesterol
318 / ROZDZIA 28
zachodzi w bonach siateczki rdplazmatycz-nej i obejmuje zmiany w piercieniu steroido-wym oraz w acuchu bocznym. Grupa metylowa przy C,4 zostaje utleniona do CO2 i powstaje 14-demetyloianosteroI. Podobnie 2 grupy metylowe przy C4 zostaj usunite, czego wynikiem jest zymosterol. Z zymosterolu tworzy si przez przesunicie podwjnego wizania z pozycji pomidzy Cg i C9 do pozycji pomidzy C3 a C7, A7>24-cholestadienol. Na tym etapie powstaje, przez dalsze przesunicie podwjnego wizania w piercieniu B do pozycji midzy C; a Cfi jak w cholesterolu des most er o I W kocu, po redukcji podwjnego wizania w acuchu bocznym, powstaje cholesterol. Reakcja ta moe zachodzi na kadym etapie biosyntezy cholesterolu. Dokadna kolejno, w jakiej rzeczywicie zachodz opisane powyej etapy, nie jest znana z pewnoci. Jest prawdopodobne, e zwizki porednie od skwalenu do cholesterolu s zwizane ze swoistym biakiem nonikowym, znanym jako biako przenoszce skwalen i steroJe. To biako wie sterole i inne nierozpuszczalne lipidy, umoliwiajc im wchodzenie w reakcje w wodnej fazie komrki. Ponadto jest prawdopodobne, e cholesterol, wanie w formie zwizanej ze specjalnym biakiem nonikowym, jest przeksztacany w hormony steroidowe i w kwasy ciowe, a take uczestniczy w tworzeniu bon i lipo-protein. Pirofosforan farnezylu jest zwizkiem wyjciowym do wytwarzania innych wanych zwizkw izoprenoidowych Pirofosforan farnezylu jest kluczowym zwizkiem, od ktrego rozgaziaj si szlaki syntezy innych poliizoprenoidw, dolicholu i ubichino-nu. Alkohol poliizoprenylowy dolichol (p. str. 184 i str. 756) powstaje przez dalsze doczanie, maksymalnie 16 reszt, izopentenylopiro fosforanu, natomiast acuch boczny ubichinonu (p. str. 149) przez doczenie dalszych 37 takich jednostek. SYNTEZA CHOLESTEROLU JEST REGULOWANA IMA ETAPIE REDUKTAZY HMG-CoA Synteza cholesterolu jest regulowana blisko pocztku szlaku na etapie reduktazy HMG--CoA. U_. .godzonych zwierzt stwierdza si znaczne zmniejszenie aktywnoci reduktazy
JJMG-CoA, co wyjania fakt zmniejszania syntezy cholesterolu w czasie godzenia. Istnieje mechanizm sprzenia zwrotnego, dziki ktremu rcduklazt IIMG-CoA w wtrobie jest hamowana przez cholesterol gwny produkt szlaku. Poniewa nie udao si wykaza bezporedniego hamowania enzymu przez cholesterol, wydaje si moliwe, e cholesterol (albo jego metabolit, np. sterol z wprowadzonym dodatkowo tlenem) dziaa albo przez represj syntezy nowego biaka reduktazy, albo przez indukcj syntezy enzymw rozkadajcych istniejc re-duktaz. Syntez cholesterolu jest rwnie hamowana przez cholesterol zawarty w LDL, wychwytywany przez receptory LDL (receptory apo-B-100, E). Istniej okoodobowe wahania dotyczce zarwno szybkoci syntezy cholesterolu, jak i aktywnoci reduktazy HMG-CoA. Wpyw cholesterolu na aktywno reduktazy moe jednak wystpi szybciej, ni to mona by wyjani zmianami szybkoci syntezy biaka. Podanie insuliny lub hormonu tarczycy z wiek-sza~a~k~tywno reduktazy HMCCoA, podczas gdy glukagon i gluko korty kos teroidy j zmniejszaj. HMG-CoA wystpuje zarwno w postaci aktywnej, jak i nieaktywnej. Te postacie mog odwracalnie w siebie przechodzi dziaaniem mechanizmw fosforylacji defosforylacji. Niektre z tych mechanizmw mog by zalene od cAMP i przez to wraliwe na glukagon, a moliwe, e i na insulin (ryc. 28-4). Wpyw zmiennych iloci cholesterolu spoytych w pokarmach na endogenne wytwarzanie cholesterolu badano u szczurw. Przy poday jedynie 0,05% cholesterolu w diecie, 70-80% cholesterolu zawartego w wtrobie, jelicie cienkim i nadnerczach pochodzio z biosyntezy w organizmie, natomiast gdy stenie cholesterolu w poywieniu zwikszono do 2% jego endogenne wytwarzanie byo mniejsze Wydaje si, e jest hamowana jedynie wtrobowa synteza cholesterolu. Dowiadczenia z perfundo-wan wtrob wykazay, e bogate w cholesterol resztkowe chylomikrony wychwytywane przez wtrob (p. str. 303) hamuj syntez sterol i. Prby zmniejszenia stenia cholesterolu w osoczu u ludzi przez zmniejszenie poday cholesterolu w pokarmach daj zmienne wyni ki. Na og zmniejszenie iloci cholesterolu w diecie o 100 mg powoduje zmniejszenie jego stenia w surowicy o ok. 0,13 mmcrt/1.
SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 319
AT P
KINAZA KINAZY REDUKTAZY
KINAZA REDUKTAZY (nieaktywna)
FOSFATAZY BIAEK
Insulina ?
ADP
KINAZA HEDUKTAZY (aktywna)
e
H,0
ADP Glukagon I
ATP,
HMG-CoA
Cholesterol
J
e
REDUKTAZ A HMG-CoA (aktywna)
FOSFATAZY BIAEK
BEDUKTAZA HMG-CoA (nieaktywna)
Utosforylowany f inhlbltor-1 "* cAMP
Oksy ster ole Synteza
Ryc. 28-4. Moliwe mechanizmy regulacji syntezy cholesterolu przez reduktaz HMG-CoA. Insulina odgrywa dominujc rot w porwnaniu z glukagonem.
WIELE CZYNNIKW WPYWA NA RWNOWAG CHOLESTEROLU W TKANKACH Na poziomie tkanki rozwaa si nastpujce procesy jako stanowice o rwnowadze cholesterolu komrkowego {ryc. 28-5). Zwikszenie stenia cholesterolu w komrkach moe by spowodowane: 1) pobieraniem przez receptory, np. za porednictwem receptora LDL, lipoprotein zawierajcych cholesterol, 2) pobieraniem przez komrk lipoprotein zawierajcych cholesterol bez porednictwa receptorw, 3) wychwytywaniem przez bon komrkow wolnego cholesterolu z lipoprotein bogatych w cholesterol, 4) syntez cholesterolu oraz 5) hydroliz estrw cholesterolu przez
enzym esteraze cholesterolow.
wem cholesterolu z bon komrkowych do lipoprotein o maym potencjale cholesterolowym, zwaszcza do HDLj albo do czstek HDL wieo syntetyzowanych de novo (proces ten jest pobudzany przez LCAT-acylotransferaz lecytyna: cholesterol), 2) estryfikacj cholesterolu przez ACAT (acylotransferaz acylo-CoA:cho-lesterol) oraz 3) zuywaniem cholesterolu do syntezy innych steroidw, takich jak hormony lub kwasy ciowe w wtrobie. Receptor LDL jest intensywnie regulowany Receptory LDL (apo B-100, E) znajduj si na powierzchni komrek we wgbieniach, ktre s pokryte od strony cytozolowej bony komrkowej biakiem zwanym klatryn. Receptor jest glikoprotein przezbonow, a jej miejsce wice apo B-100 jest umiejscowione na N-koricu wystajcym na zewntrz komrki.
Zmniejszenie zawartoci cholesterolu w komrkach moe by spowodowane: 1) wypy -
320 / ROZDZIA 28
BONA KOMRKOWA
Ftewptcty U3L (Apo-B-100, E) w opfaszczortym zagbieniu
LDL
HDL Ryc. 28-5. Czynniki wpywajce na rwnowag cholesterolu na poziomie komrki. C cholesterol, CE estry cholesterolu, ACAT acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT acytotransferaza lecytyna : cholesterol, A-l apolipoproteina A-l, LDL lipoproteina o maej gstoci, VLDL lipoproteina o bardzo maej gstoci.
Receptor reaguje z ligandem LDL, tj. apo-B--100. Czstka LDL w caoci jest wchaniana przez endocytoz. Jest ona nastpnie rozkadana w Jizosomach, ktry to rozkad obejmuje zarwno hydroliz apoproteiny, jak i estrw cholesterolu. Cholesterol jest nastpnie przemieszczany do cytozolu komrki. Receptory nie s rozkadane, lecz wracaj na powierzchni komrki. Ten napyw cholesterolu do komrki hamuje aktywno reduktazy HMG-CoA i syntez cholesterolu oraz pobudza aktywno ACAT. Wydaje si, e liczba receptorw LDL na powierzchni komrki jest regulowana zgod nie z zapotrzebowaniem komrki na cholesterol niezbdny do budowy bon i syntezy hormonw steroidowych. Napyw cholesterolu do komrki zmniejsza wic liczb receptorw LDL zjawisko nazywane po angielsku down reguiation" (ryc. 28-5).
Receptor apo B-100, E jest receptorem LDL o duym powinowactwie" i moe by wysyco-ny w wikszoci zaistniaych warunkw. Poza tym wydaj si istnie receptory LDL o maym powinowactwie", jak rwnie szlak wnikania cholesterolu do komrki za pomoc mechanizmu niereceptorowego, okrelany jako szlak oczyszczajcy" (scavenger pathway"), ktry nie jest regulowany.
TRANSPORT CHOLESTEROLU MIDZY TKANKAMI ODBYWA SI ZA POREDNICTWEM LIPOPROTEIN OSOCZA (p. ryc. 28-6)
U ludzi stenie cakowitego 'Cholesterolu w osoczu wynosi ok. 5,2 mmo[/l; zwiksza si ono z wiekiem, wykazujc du zmienno
osobnicz. Wikszo cholesterolu znajduje si w osoczu w posUici êstryfikowanej. Cholesterol jest transportowany i]ni<!i w lipoproteinach osocza, a ^ W warunkach, w ktrych dominujca, lipoprotein osocza jest VLDL, wiksza ilo cholesterolu przypada na K Trakcj. Cholesterol spoyty wraz z pokarmami dopiero po kilku dniach miesza sie (osiga rwnowag) z cholesterolem osocza, a po -
trzeba kilku tygodni, aby osign stan rwnowagi z cholesterolem tkanek. Obrt cholesterolu w wtrobie jest stosunkowo szybki w porwnaniu z biologicznym okresem ptrwania cholesterolu w caym organizmie czowieka, ktry wynosi kilka tygodni. Wolny cholesterol w osoczu i w wtrobie osiga stan rwnowagi w cigu godzin. Estry cholesterolu zawarte w poywieniu s hydrolizowane do wolnego cholesterolu, ktry
KRENIE JELIT OWO-WTROBOWE ZYLA WROTNA WTROBY Poywlente (0,5 g/24 h) C
?
JELITO
C Kwasy (0,5 g/24 h) ciowo (0^ g/Z4 h) Kat
Hyc. 28-6. Transport cholesterolu midzy tkankami u ludzi, C wolny cholesterol, CE estry cholesterolu, VLDL lipoprotein o bardzo malej gstoci, I DL lipoprotein o poredniej gstoci, LDL lipoprotein o malej gstoci, HDL lipoprotein o dueej gstoci, ACAT acylotransferaza acylo-CoA : cholesterol, LCAT ...acy I otr n sfera za lecytyna : cholesterol, A -l apotipoproteina A-l, D apolipoproteina D, LPL lipaza lipoproteinowa. ____________
Biochemia
322 / ROZDZIA 28
miesza si z wolnym cholesterolem z poywienia i cholesterolem ci, zanim wchonie si z jelita razem z innymi lipidami. Nastpnie miesza sie z cholesterolem syntetyzowanym w jelitach i zostaje wbudowany do chylornikronw. Z wchonitego w jelitach cholesterolu 8090% zostaje zestryfikowane z dhigoac uch owymi kwasami tuszczowymi w bonie luzowej jelit. Sterole rolinne (sitosterole) sabo wchaniaj si w przewodzie pokarmowym. Gdy chylomik-rony reaguj z lipaz lipoprofeinow i powstaj resztkowe chylomikrohy, wwczas nastpuje utrata jedynie ok. 5% estrw cholesterolu. Reszta jest wychwytywana przez wtrob, gdy resztkowe chyloralkrony reaguj- iieceptorem -flELJLi_ hydrolizowana do wolnego cholesterolu, VLDL powstae w watro biejr^npg r-tiu cholesterol rtn osonzn If-rlna'lc7e u 1iiH?i jpst to gwnie wolny cholesterol, gdy aktywno ACAT w wtrobie jest maa. Lstry cholesterolu zawarte w VLDL pochodz gwnie z dziaania LCAT w osoczu. Wikszo cholesterolu zawartego w VLDL pozostaje w resztkowych VLD L. ktre s wychwytywane przez wtrob albo przetwarzane do LDL. Te ostatnie z kolei wi si z receptorami LDL wtroby i tkanek po/a-wtrobowych. LCAT jest odpowiedzialna za powstawanie wikszoci estrw cholesterolu osocza U ludzi aktywno LCAT osocza jest odpowiedzialna praktycznie za obecno wszystkich estrw cholesterolu w osoczu. (Tak nie jest u innych gatunkw, takich jak szczur, w ktrego wtrobie jest znaczna aktywno ACAT, pozwalajca na znaczny eksport estrw cholesterolu w VLDL syntetyzowanych de no-vo). Aktywno LCAT jest zwizana z typem HDL zawierajcym apo A-L Gdy cholesterol zawarty w HDL zostaje zestryfikowany, wytwarza si gradient stenia wcigajcy wolny cholesterol z tkanek i z innych lipoprotein do czstek HDL (ryc. 28-6). W wyniku tych procesw gsto waciwa HDL si zmniejsza, tworzc tzw. HDL,, o ktrej si sadzi ..e dostarcza cFolesterolu do wtroby__(ryc- 28-6). HDL spenia wic wan funkcj w odwrconym transporcie cholesterolu, tj. procesie, przez ktry cholesterol tkanek jest przemieszczany do wtroby.
Biako przenoszce estry cholesterolu uatwia przenoszenie estrw cholesterolu midzy lipoproteinami To biako, znajdywane w osoczu ludzi, lecz nie u szczurw, jest take zwizane HDL i wydaje si by identyczne z apo D. Uatwia ono przenoszenie estrw cholesterolu z HDL do VLDL, LDL, a w mniejszym stopniu do chylo-mikronw w wymianie za triacyloghcerol. Znosi ono w ten sposb hamowanie w obrbie HDL aktywnoci LCAT produktem reakcji katalizo wanej przez ten enzym. U ludzi dua ilo estrw cholesterolu, utworzonych dziaaniem LCAT w HDL, trafia do wtroby poprzez resztkowe VLDL (IDL) albo LDL (p. ryc. 28-6). CHOLESTEROL, PRZEZNACZONY DO WYDALENIA Z ORGANIZMU, MUSI WEJ DO WTROBY I BY WYDALONY Z CI ALBO JAKO CHOLESTEROL, ALBO JAKO KWASY CIOWE (ICH SOLE) W cigu jednego dnia z organizmu wydala si ok. 1 g cholesterolu. Prawie poowa, po prze ksztaceniu w kwasy ciowe, wydala si z kaem. Pozostaa ilo jest wydalana w postaci obojtnych steroidw. Znaczna cz cholesterolu wydalana z ci ponownie wchania si w jelitach. Uwaa si, e przynajmniej pewna ilo cholesterolu, ktry jest prekursorem stero-li wystpujcych w kale, pochodzi z bony luzowej jelita. Koprostanol jest gwnym stero-lem w kale. Jest on wytwarzany z cholesterolu w dolnych odcinkach jelita pod wpywem dziaania miejscowej flory bakteryjnej. Dua cz wydalanych z ci soli kwasw ciowych jest reabsorbowana do krenia wrotnego, a nastpnie wychwytywana przez wtrob i ponownie wydalana z ci. Zjawisko to jest znane jako krenie jelito wo-wtro bo we. Sole_kw_asw ciowych lub ich pochodne, ktre nie zostay wchonite w jelitach, s wydalane z kaem. Sole kwasw ciowych ulegaj przemianom pod wpywem bakterii jelitowych, tworzc wtrne kwasy ciowe. Kwasy ciowe s wytwarzane z cholesterolu Pierwotne kwasy ciowe s syntetyzowa ne w wtrobie z cholesterolu w kilku etapach porednich. Kwas cholowy jest kwasem cio-
NADPH + H
NADP*
Cholesterol Kwas gllkochol owy
}7g-HYDRO KSYLAAJ Witamina C
e
HQ -
OH
7cc- Hyd ro Ksyc h o I estero I
ciowe
|12i-HYD R OKSY -| I LA7A

Oj
,I+
NADPH + H 2 CoA-SH
+
Kwas taurocholowy (pbrwotny kwas itelowy) Kwas l auroi glikochenodeoksycholowy (pierwotne kwasy iteiowe} Oekonrugscja 7o-dehycfrokaylacja
Cholollo-CoA
j^N^N, COOH
rrj
Kwas deoksycholowy (wlrny kwas folowy) (pierwotny kwas ciowy) Dekonlugacja ------------------- 7-de hyd ro ksylacja HO
j-^Y]
COO
Kwas lltocholowy (wtOrny kwas ciowy)
Rye. 28-7. Biosynteza i degradacja kwasw ciowych. 'Katalizowane przez enzymy bakteryjne.
wym wystpujcym w ci w najwikszej iloci. Zarwno kwas cholowy, jak i chenodeoksycho-lowy powstaj ze wsplnego prekursora, ktry sam pochodzi z cholesterolu (ryc. 28-7). 7a-Hydroksylacja cholesterolu jest pierwsz reakcj w szlaku biosyntezy kwasw ciowych i to wanie ta reakcja jest etapem ograniczajcym nasilenie caego szlaku. Reakcja ta jest
katalizowana przez 7<x-hydroksylazc, ktra jest enzymem mikrosomalnym. Wymaga ona udziau tlenu, NADPH i cytochromu P -450. Enzym ten wydaje si by typow monooksygenaz, podobnie jak i enzymy dalszych etapw hydro-ksylacyjnych. Niedobr witaminy C zaburza tworzenie kwasw ciowych na etapie 7ot--hydroksyacji, prowadzi do spichrzania choie-
324 / ROZDZIA 28
sterolu i miadycy naczy u winek morskich chorych na gnilec. Szlak biosyntezy kwasw ciowych rozgazia si we wczesnych stadiach i jedna droga prowadzi do kwasu cholowego, charakteryzujcego si obecnoci dodatkowej grupy a -OH w pozycji 12, druga za do kwasu chenode-oksycholowego. Poza t rnic, w obydwch szlakach zachodz podobne reakcje hydroksy-lacji i skracania acucha bocznego (ryc. 28-7), tak e powstaj typowe struktury kwasw ci o wych z gru p a mi a -O H w p o zycj ach 3 i 7 i z cakowicie wysyconym piercieniem steroid owym. Kwasy ciowe przechodz do ci jako poczenia z glicyn lub z tauryn. Uwaa si, e nowo syntetyzowane kwasy ciowe w komrce wtrobowej wystpuj jako tioestry CoA, tj, jako choloilo-CoA albo chenodeoksycholoilo--CoA (ryc. 28-7). Pochodne CoA powstaj przy udziale enzymu aktywujcego wystpujcego w mikrosomach wtroby. Inny enzym katalizuje poczenie odpowiednich pochodnych CoA z glicyn lub z tauryn, tworzc kwasy gliko-cholowy lub glikochenodeoksycholowy oraz taurocholowy lub taurochenodeoksycholowy. S to tzw. pierwotne kwasy ciowe. U ludzi stosunek glicyny do tauryny w tych pocze niach wynosi normalnie 3:1. Poniewa zawiera znaczne iloci jonw sodowych i potasowych, a jej pH jest zasadowe, naley przyj, e kwasy ciowe i ich poczenia wystpuj w postaci soli, diatego niekiedy jest uywany termin sole kwasw ciowych". Pewna cz pierwotnych kwasw ciowych moe podlega dalszym przemianom w jelicie, dziki aktywnoci bakterii jelitowych. Te przemiany mog obejmowa od szczepienie przyczonej uprzednio glicyny i tauryny oraz grupy 7a-OH. W ten sposb powstaj wtrne kwasy ciowe, kwas deoksycholowy z kwasu cholowego i litocholowy z kwasu chenodeoksy-cholowego (ryc. 28-7). Prawie wszystkie kwasy ciowe powracaj do wtroby w kreniu jelito wo- wtrobowym Chocia produkty trawienia tuszczu, cznie z cholesterolem, zostaj wchonite w pocztkowych 100 cm jelita cienkiego, pierwotne i wtrne kwasy ciowe s wchaniane wycznie w jelicie krtym. W kreniu wrotnym wraca do wtroby ok. 9899% kwasw ciowych wydzielonych do wiata jelita. Zjawisko to jest
znane jako krenie jelitowo-wtrobowe. Jedriafce kwas-itochoowy, ze wzgldu na jego nierozpuszczano, nie wchania si zwrotnie w znaczniejszych ilociach. Niewielka cz soli kwasw ciowych, moe tak niewiele jak 500 mg/24 h, unika wchaniania zwrotnego i jest eliminowana z kaem. Jakkolwiek jest to niewielka ilo, to jednak jest to gwna droga eliminacji cholesterolu. Krenie jelitowo-wtrobowe kwasw ciowych jest tak wydajne, e kadego dnia stosunkowo maa pula kwasw ciowych (ok. 35 g) moe cyklicznie przej przez jelito 610 razy z niewielk tylko ich utrat w kale, wynoszc nie wicej ni 12% iloci, ktra przesza przez krenie jelitowo-wtrobowe. Jednak kadego dnia taka
sama ilo kwasw ciowych, Jaka zostaa utracona z kaem, jest syntetyzowana w wtrobie z
cholesterolu, tak e wielko puli kwasw ciowych jest staa, nad czym czuwa ukad kontrojny oparty na sprzeniu zwrotnym. Synteza kwasw ciowych jest regulowana na etapie 7tx-hydroksylazy Gwnym etapem ograniczajcym szybko biosyntezy kwasw ciowych jest reakcja katalizowana przez 7a-hydroksylaze, a w biosyn-
tezie cholesterolu jest to etap katalizowany przez reduktaze HMG-CoA (ryc. 28-1). Aktywnoci tych 2 enzymw czsto ulegaj rwnolegym zmianom, co sprawia, e trudno stwierdzi, czy hamowanie syntezy kwasw ciowych ma miejsce pierwotnie na etapie dziaania reduktazy HMG-CoA, czy na etapie reakcji 7ot-hydroksyla-zy. Obydwa enzymy ulegaj takim samym oko-odobowym zmianom aktywnoci, jednak pobudzajcy wpyw karmienia cholesterolem na aktywno 7a-hydroksylazy wydaje si by raczej reakcj na sam aktywno enzymu ni wyni kiem zwikszonej dostpnoci substratu. Kwasy ciowe z pewnoci wywieraj zwrotny wpyw hamujcy na aktywno 7a-hydroksylazy, ale mechanizm tego hamowania nie wydaje si by bezporednim dziaaniem alosterycznym. Pod tym wzgldem powrt kwasw ciowych do wtroby, przez krenie jelitowo-wtrobowe, stanowi wany czynnik kontroli, ktry, jeli zostaje przerwany, prowadzi do aktywacji 7a--hydroksylazy. Niedawne badania wykazay, e 7a-hydroksylaza (jak rwnie reduktaza HMG--CoA) moe by regulowana przez kowalencyjn fosforylacj i defosforylacj. W odrnieniu od reduktazy HMG-CoA, posta ufosforylowana 7cc-hydroksylazy jest bardziej aktywna.
SYNTEZA, TRANSPORT I WYDALANIE CHOLESTEROLU / 32S
Hipercholesterolemi mona leczy przez przerwanie krenia jelitowo - wtrobowego kwasw ciowych Znaczne zmniejszenie stenia cholesterolu osocza mona osign za pomoc ywicy cho-lestyraminy (Questran) lub chirurgicznie przez wyczenie jelita krtego. Obydwa sposoby powoduj zablokowanie wchaniania zwrotnego kwasw ciowych. Wwczas, w wyniku zniesienia hamowania zwrotnego, wywieranego przez kwasy ciowe, przemiana cholesterolu w kwasy ciowe znacznie si zwiksza w deniu do utrzymania staej puli kwasw ciowych. W nastpstwie tego zwiksza si liczba receptorw LDL w wtrobie, powodujc wzmoone wychwytywanie LDL przez hepato-cyty i w konsekwencji zmniejszenie stenia cholesterolu w osoczu. Stenie cholesterolu w surowicy jest skorelowane z czstoci wystpowania miadycy ttnic i z chorob niedokrwienn serca Spord lipidw surowicy najczciej wskazywano na cholesterol jako najbardziej zaangaowany w t zaleno. Jednake i inne parametry, takie jak stenie triacylogliceroli w surowicy, wykazuj podobne koreiacjevCho-rzy 2 chorob ttnic mog mie jedn z nastpujcych nieprawidowoci: 1) zwikszone stenia VLDL przy prawidowych steniach LDL, 2) zwikszone stenie LDL przy prawidowych steniach VLDL, 3) zwikszenie ste obydwu frakcji lipoprotein. Wystpuje wwnie odwrotna zaleno midzy steniami HDL (HDL2) a chorob niedokrwienn serca. Niektrzy badacze uwaaj, e progn o stycznie najbardziej znaczcy jest stosunek cholesterol LDL : HDL. T zaleno mona wyjani, biorc pod uwag proponowane role frakcji LDL w transporcie cholesterolu do tkanek, a frakcji HDL, dziaajcej jako czyciciel cholesterolu, w odwrotnym kierunku (w transporcie cholesterolu z tkanek do wtroby). Miadyca naczy charakteryzuje si odkadaniem cholesterolu i estrw cholesterolu z lipo-protein zawierajcych apo B -100, w tkance cznej cian naczy ttniczych. Chorobom, w ktrych wystpuj dugotrwae zwikszenia stenia VLDL, 1DL lub LDL we krwi (np. cukrzycy, nerczycy lipidowej, hipotyreozie i innych stanach przebiegajcych z hiperlipidemi), towarzyszy zwykle przedwczesna lub cisza miadyca.
Jak wykazuj badania dowiadczalne, podatno na rozwj miadycy zaley od gatunku zwierzt. Krliki, winia, mapa i czowiek s gatunkami, u ktrych miadyc mona wywoa karmieniem cholesterolem. Szczur, pies i kot s pod tym wzgldem odporne. Tyroidektomia lub podawanie lekw pochodnych tiouracylu umoliwia wywoanie miadycy u psa i szczura. Mae stenie cholesterolu we krwi jest charakterystyczne dla nadczynnoci tarczycy. Zmiany w skadzie diety odgrywaj wan rol w zmniejszaniu stenia cholesterolu w surowicy Czynniki dziedziczne maj najwikszy wpyw na stenie cholesterolu we krwi. Z czynnikw rodowiskowych i pokarmowych, ktre powoduj zmniejszenie stenia cholesterolu we krwi, najkorzystniejszym czynnikiem jest zastpienie w diecie pewnej iloci nasyconych kwasw tuszczowych wielontenasyconynii i mononiena-syconymi kwasami tuszczowymi. Naturalnie wystpujce oleje, ktre zawieraj wieloniena-sycone kwasy tuszczowe w duych ilociach, to olej sonecznikowy, z nasion baweny, kukurydzy i soi, za olej z oliwek zawiera znaczne iloci mononienasyconych kwasw tuszczowych. W odrnieniu od wymienionych olejw, maso, tuszcz woowy i olej kokosowy zawieraj due iloci nasyconych kwasw tuszczowych. Sacharoza i fruktoza maj wikszy wpyw na zwikszenie stenia lipidw we krwi, zwaszcza triacylogliceroli, ni inne wglowodany. Przyczyna, dla ktrej wielonienasycone kwasy tuszczowe powoduj zmniejszenie stenia cholesterolu wci nie jest jasna. Wysunito wiele hipotez w celu wyjanienia tego zjawiska, min, przypuszcza si, e pobudzaj one wydalanie cholesterolu do jelita i pobudzaj utlenianie choiesteroJu do kwasw ciowych. Jest cakiem moliwe, e estry cholesterolu z wielo-ntenasyconymi kwasami tuszczowymi s szybciej metabolizowane przez wtrob i inne tkanki, co mogoby zwiksza szybko ich obrotu i wydalania. Inne dane wiadcz o tym, e dziaanie to jest gwnie spowodowane przemieszczaniem cholesterolu z osocza do tkanek, poniewa wielonienasycone i mononienasycone kwasy tuszczowe zwikszaj liczb receptorw LDL, przez co zwikszaj szybko kataboliz-mu LDL, natomiast nasycone kwasy tuszczowe maj odwrotne dziaanie na liczb receptorw LDL. Nasycone kwasy tuszczowe powoduj take powstawanie mniejszych c zstek
326 / ROZDZIA 28
VLDL, ktre zawieraj stosunkowo wicej cholesterolu i s zuywane przez tkanki pozawt-robowe z mniejsz szybkoci ni wiksze czstki. Takie zmiany mog sprzyja aterogenezie. Styl ycia wpywa na stenie cholesterolu w surowicy Wrd innych czynnikw, o ktrych si sdzi, e uczestnicz w powstawaniu choroby niedokrwiennej serca naley wymieni nadcinienie ttnicze, palenie tytoniu, otyo, brak ruchu i picie mikkiej wody, a nie twardej. Zwik szenie stenia wolnych kwasw tuszczowych osocza, pobudzajce wydzielanie VLDL przez wtrob do krwi, jest kolejnym czynnikiem zwikszajcym stenie triacylogliceroli i cholesterolu w osoczu. Czynnikami prowadzcymi do wikszych albo zmieniajcych si ste wolnych kwasw tuszczowych s m.in. stres emocjonalny, nikotyna pochodzca z palenia papierosw, picie kawy i spoywanie kilku duych posikw zamiast czstego przyjmowania maych iloci pokarmw. Kobiety w okresie premenopauzalnym wydaj si by chronione przed wieloma tymi szkodliwymi czynnikami by moe dlatego, e maj one wiksze stenie HDL ni mczyni i kobiety w okresie pome-nopauzalnym. Kiedy dieta zawodzi mona stosowa leki hipolipemizujce, ktre zmniejsz stenie cholesterolu w surowicy O wielu lekach wiadomo, e blokuj tworzenie cholesterolu na rnych etapach szlaku jego biosyntezy. Wiele z tych lekw ma dziaanie szkodliwe, ale pochodzce z grzybw inhibitory reduktazy HMG-CoA mewastattn i lowastatin zmniejszaj stenie cholesterolu LDL, powodujc niewiele dziaa niepodanych. Sitoste-rol jest czynnikiem zmniejszajcym stenie cholesterolu, dziaajcym przez blokowanie wchaniania cholesterolu z przewodu pokar mowego. ywice, takie jak kolestypol i chole-styramina (Questran), zapobiegaj wchanianiu soli kwasw ciowych, czc si z nimi, przez co zwikszaj ich utrat z kaem. Hipolipemizujce dziaanie klofi bratu i gemfibrozylu polega m.in. na pobudzeniu utleniania napywajcych do wtroby wolnych kwasw tuszczowych, a nie na ich estryfikacji, przez co zmniejsza si wydzielanie przez wtrob VLDL zawierajcych tria-cyloglicerol i cholesterol. Ppnadto wymienione leki uatwiaj hydroliz triacylogliceroli VLDL przez lipaz lipoproteinow. Probucol wydaje si
zwiksza katabolizm LDL w sposb niezaleny od receptorw. Kwas nikotynowy zmniejsza napyw do krwi i wtroby WKT, dziki temu, e hamuje lipoliz w tkance tuszczowej, a tym samym wytwarzanie VLDL w wtrobie. Pierwotne zaburzenia lipoprotein osocza (dyslipoproteinemie) s dziedziczne Pewna liczba osb ma wrodzone wady przemiany lipoprotein, prowadzce do stanu hipo-lipoproteinemii albo hiperlipoproteinemii. Wiele innych osb z takimi chorobami, jak cukrzyca, niedoczynno tarczycy i miadyca, ma nieprawidowe profile lipoprotein o we osocza, ktre s bardzo podobne do wystpujcych w pierwotnych wrodzonych wadach przemiany lipoprotein. Praktycznie kade z tych pierwotnych zaburze jest spowodowane wad na ktrym z etapw tworzenia, transportu albo rozkadania lipoprotein (p. ryc. 27-4, 28-5 i 28-6). Nie wszystkie te zaburzenia s szkodliwe. A. Hipolipoprotsinemie choroba wrodzona charakteryzujca si bra kiem (J-lipoprotein (LDL) w osoczu. Lipidy we krwi wystpuj w bardzo maych steniach zwaszcza acyloglicerole, ktrych praktycz nie nie ma, poniewa nie s syntetyzowane chylomikrony ani VLDL. W tej wadzie dochodzi do spichrzania acyloglicerolu zarwno w cia nach jelit, jak i w wtrobie. Abetalipoproteine mia jest spowodowana wad syntezy apoli poproteiny B. 2. Rodzinna hipobetalipoproteinemia. W hipobetalipoproteinemii stenie LDL wy nosi 1050% stenia prawidowego, ale two rzenie chylomikronw zachodzi. Naley wic sdzi, e apo -B jest istotna dla transportu triacylogliceroli. Wikszo osb z t wad jest klinicznie zdrowa i cieszy si dugim yciem. 3. Rodzinny niedobr -/-lipoprotein (choroba wyspy Tangier). U osb ho mozygotycznych prawie nie ma w osoczu HDL, za w tkankach stwierdza si nagromadzenie estrw cholesterolu. Nie ma zaburzenia w tworzeniu chylomikronw, ani wydzielaniu VLDL przez wtrob. Jednak w obrazie elektro foretycznym nie ma pre-pMipoprotein, ale zamiast tego stwie rdza si szerokie pasmo fi, zawierajce endogen ny triacyloglicerol. Dzieje si tak dlatego, e prawidowe pasmo pre-p zawiera inne apoJipoproteiny normalnie dostarczane przez HDL.
1. Abetalipoproteinemia. Jest to readka
U chorych wystpuje skonno do rozwinicia si hipertriacylogiicerolemii, spowodowanej brakiem apo-C-II, ktra normalnie aktywuje lipaze li po pro lei now. B. Hiperlipoproteinemie tetnowej (typ < ) Ten stan charakteryzuje si bardzo powolnym klirensem chylomikronw z krenia, prowadzcym do nienormalnie du ych ste chylomikronw w osoczu. Moe by take zwikszone stenie VLDL, nato miast zmniejszone LDL i HDL. Ten stan jest indukowany spoywaniem tuszczw. Mona go skorygowa przez zmniejszenie w diecie iloci tuszczw, a zwikszenie iloci zoo nych wglowodanw. Pewna odmiana tej cho roby jest spowodowana niedoborem apo-C-II, potrzebnej jako kofaktor lipazy lipoproteinowej. 2. Rodzinna hipercholesterolemia (typ II). Chorzy charakteryzuj si hiperbeta lipoproteinemi (LDL), ktra jest przyczyn zwikszonego stenia cakowitego cholestero lu. Moe take wystpi tendencja do zwik szenia stenia VLDL (w typie Ilb). U chorych moe wystpi nieco zwikszone stenie triacyloglkerolu, chocia osocze w odrnieniu od innych typw hiperlipoproteinemii pozostaje przejrzyste (klarowne). Powszechnym zjawis kiem jest odkadanie si lipidw w tkankach, np. w postaci takw (xanthoma) lub ognisk miadycowych (atheroma). Typ II hiperlipo proteinemii moe take powsta jako zjawisko wtrne u chorych z niedoczynnoci tarczycy. Choroba jest spowodowana zmniejszonym kli rensem LDL z krenia uwarunkowanym wad liwymi receptorami LDL. Wada ta jest zwizana ze zwikszeniem czstoci wystpowania mia dycy. W leczeniu moe by przydatne zmniej szenie poday cholesterolu i nasyconych kwa sw tuszczowych. Inn chorob wywoujc hipercholesterolemi, ale spowodowan inn przyczyn, jest choroba Wolmana (choroba spichrzania estrw cholesterolu). Jest ona spowo dowana niedoborem hydrolazy estrw chole sterolu w lizosomach takich komrek, jak fibroblasty, ktre normalnie metabolizuj LDL. 3. Rodzinna hiperlipoproteinemia ty pu III (choroba szerokiego pasma p, choroba upoledzonego usuwania re mnantw, rodzinna dysbetaltpoproteinemia) Ten stan charakteryzuje si za rwno zwikszeniem stenia resztkowych chylomikronw, jak i remnantw VLDL; s to
1. Rodzinny niedob r Hpazy lipopro-
lipoproteiny o gstoci mniejszej ni 1,019, a charakteryzujce si w elektroforogramie jako szerokie pasmo p (p-VLDL). Powoduj one hipercholesterolemi i hipertriacyloglicero-lemi. Wystpuj ltaki (xanthoma) i miadyca zarwno ttnic obwodowych, jak i ttnic wiecowych. Zalecane jest leczenie, polegajce na redukcji masy daa i stosowaniu diety zawierajcej zoone wglowodany, nienasycone kwasy tuszczowe oraz mao cholesterolu. Choroba jest spowodowana wadliwym metabolizmem remnantw w wtrobie, uwarunkowanym obecnoci nieprawidowych apo , ktre zwykle wystpuj w 3 izoformach: E2, E3 i E4. U chorych z typem III hiperlipoproteinemii wystpuje tylko forma E2 t ktra nie reaguje z receptorem E. 4. Rodzinna hipertriacyloglioerolemia (typ IV). Ten stan charakteryzuje si duymi steniami endogennie wytwarzanych triacylogliceroli (VLDL). U chorych z t wad stenie cholesterolu zwiksza si proporcjonalnie do hipertriacyloglicerolemii. Czsto wystpuje nie tolerancja glukozy. Zarwno LDL, jak HDL wystpuj w steniach poniej normy. Ten pro fil lipoproteinowy czsto jest powizany z wy stpowaniem choroby niedokrwiennej serca, insulinoniezalenej cukrzycy typu II, otyoci oraz wielu innych stanw, cznie z alkoholizmem oraz przyjmowaniem gestagenw. Leczenie pier wotnej hiperiipoproteinemii typu IV polega na redukcji masy ciaa, zastpieniu prostych wg lowodanw w diecie wglowodanami zoonymi, spoywaniu pokarmw zawierajcych nienasy cone tuszcze i mao cholesterolu, a take na stosowaniu lekw hipolipemizujcych. 5. Rodzinna hiperlipoproteinemm ty pu V. Profil lipoproteinowy osocza jest zoo ny, gdy wystpuje zarwno zwikszone ste nie chylomikronw, jak i VLDL, co powoduje zarwno hipertriacyloglicerolemi, jak i hiper cholesterolemi. Stenia LDL i HDL s mae. taki s czste, ale wystpowanie miadycy nie jest uderzajco czste. Tolerancja glukozy jest zmniejszona i czsto zwizana z wystpowa niem otyoci i cukrzycy. Przyczyna wystpowa nia tego stanu, ktry ma charakter rodzinny, nie jest jasna. Leczenie polega na redukcji masy ciaa i stosowaniu w diecie niezbyt duej iloci wglowodanw i tuszczw. Sugerowano, e dalsz przyczyn hiperlipoproteinemii jest nadmierne wytwarzanie apo B, co moe by przyczyn zwikszonego stenia VLDL i LDL w osoczu.
328 / ROZDZIA 28
6. Rodzinna hiperalfalipoproteinemia. Jest to rzadki stan zwizany ze zwikszonym steniem HDL, okazujcy si by dobroczynny dla zdrowia.
PIMIENNICTWO
Bjrkhem I, Akerlund JE: Studies on the link between HMG-CoA reductase and cholesterol 7a-hydro-xylase in rat liver, /. Lipid Res 1988;29:136. Brown MS, Goldstein JL: Lipoprotein metabolism in the macrophage: lmplications for cholesterol depo-sition in atherosclerosis. Annu Rev Biochem 1983;52:223. Fears R, Sabin JR (editors): Cholesterol 7tt.-Hydro-xylase (7v.-Manooxygenase). CRC Press, 1986. Fielding CJ, Fielding PE: Mefabolism of cholesterol and lipoproteins. Page 404 in: Biochemistry of Lipids and Membranes. Vance DE, Vance JE (editors). Benjamin/Cummmgs, 1985. Kane JB, Havel RJ: Treatment of hypercholesterole-mia. Annu Rev Med 1986;37:427. Mahley RW, Innerarity TL: Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis. Biockim Biophys Acta 1983;737:197. NIH Publication No 88-2925: Report of the Expert Panel on Detection, Evaltmtian and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults. January, 1988. Rudney H, Sexton RC: Regulation of Cholesterol Biosynthesis, Annu Rev Nutr 1986;6:245.
C. Rodzinny niedobr acylotransf era-zy lecytyna: cholesterol (LCAT). U osb z t wad stenie estrw cholesterolu i
Hzolecy-tyny jest mae, natomiast cholesterolu i lecytyny zwikszone. Osocze czsto jest mtne. Nieprawidowoci wystpuj takie w lipoproteinach. Jedna z frakcji HDL zawiera dyskowate struk tury uoone w stosy lub rulony, ktre s najwidoczniej wieo powstaymi HDL niezdolnymi do pobrania cholesterolu ze wzgldu na nieobecno LCAT. Wystpuje take nieprawidowa subfrakcja LDL, lipoproteina X, skdind znajdywana jedynie u chorych z cholestaz. VLDL s take nieprawidowe, wdrujce w elektroforezie z p-lipoproteinami (|3-VLDL). Chorzy z chorobami miszu wtrobowego take wykazuj zmniejszenie aktywnoci LCAT i nieprawidowoci w lipidach surowicy i lipoproteinach.
Integracja metabolizmu i dostarczanie substratw energetycznych do tkanek

29
WPROWADZENIE
Wglowodany i Hpidy speniaj wiele funkcji strukturalnych i metabolicznych. Najwikszy wpyw tych zwizkw na metabolizm i zdrowie polega jednak na tym, e s gwn ymi sub-stratami energetycznymi zawartymi w pokarmach. Regulacja dopywu tego rda energii i sposb, w jaki jest on zintegrowany z innymi tkankowymi substratami energetycznymi, s w centrum zainteresowania badaczy, poniewa wkraczaj one w wiele innych procesw metabolicznych i maj zwizek z chorobami metabolicznymi.
jako wynik zaburze rwnowagi metabolicznej spowodowanej intensywn laktacj {np. chara kteryzujc si ketoz u byda), albo jako wynik zwikszonego zapotrzebowania metaboliczne go wystpujcego podczas ciy, a bdcego np. przyczyn zatrucia ciowego u owiec. Wszystkie te stany s patologicznymi postaciami zespou godzenia, wystpujcego jako powikanie wielu zespow klinicznych przebiegajcych ze zmniejszonym aknieniem.
NIE WSZYSTKIE Z GWNYCH SKADNIKW POKARMOWYCH ULEGAJ WZAJEMNYM PRZEKSZTACENIOM (p. ryc. 29-1)
Fakt, e zwierzta mog si sta otuszczone, gdy karmi sieje diet o przewadze wglowodanw, wskazuje na atwo przeksztacania wglowodanw w tuszcze. Jednake, jak to ju wspomniano, u ludzi istniej zapewne ograniczone moliwoci przeksztacania glukozy w kwasy tuszczowe. Najbardziej znaczc reakcj w tym wzgldzie jest przemiana pirogronia-nu do acetylo-CoA, poniewa wanie acetylo--CoA jest materiaem wyjciowym do syntezy dugoacuchowych kwasw tuszczowych. Odwrotny proces, tj. przemiana kwasw tuszczowych w glukoz nie zachodzi, poniewa reakcja katalizowana przez
dehydrogeaaz piro-groniaaow jest zasadniczo nieodwracalna, co zapobiega bezporedniemu
W stanie dodatniej rwnowagi energetycznej znaczna cz energii pobranej z pokarmami jest magazynowana jako glikogen albo jako tuszcze. Jednak w wielu tkankach, nawet w stanie sytoci, kwasy tuszczowe s utleniane prefe-rencyjnie w stosunku do glukozy, co zaznacza si szczeglnie w warunkach niedoboru energetycznego lub przy godzeniu. Ma to na celu zaoszczdzenie glukozy dla tych tkanek (np. dla mzgu i erytrocytw), ktre potrzebuj glukozy w kadych warunkach. Mechanizmy regulacyjne, czsto za porednictwem hormonw, zapewniaj wic dostaw rda energii dla wszystkich tkanek i w kadym czasie, poczwszy od stanu sytoci a do stanu cakowitego godu. Zaamanie si tych mechanizmw zdarza si jako skutek nierwnowagi hormonalnej (np. indukowanej niedoborem insuliny w cukrzycy),
przeksztacaniu acetylo-CoA w pirogronian. Ponadto nie moe zachodzi przeksztacenie (sumarycznie) acety-lo-CoA w szczawiooctan, nawet przez cykl
330 / ROZDZIA 29
Wglowodany Tuszcze Trlacylogiieeroi
GHkogen v Glukoza
Seryna
Tryptolan Treonina \ Glioyna Fenyloalanlna Tyrozyna Leucyna^
Hydroksyprollna
Szczaw! ooclan Asparaglnlan Fanyloalanina
Cylrynlan Cykl kwasu cytrynowego
1
Tyrozyna Izoleucyna \
Proplony(o-CoA
- - Fu maran
a-Katoglutaran Arginina Glutami Glutamlnlan ( Ornltyna Prollna Htstydyna \
t \t
Proplonlan I M etlonlna
Sukcyny(o-CoA
Wallna Wgle m1 -to3 kwasw tuszczowych o nieparzystej kolbie atomw wf flta
1
Hydroksyprollna
Ryc. 29-1. I nterkon wersja gwnych skadnikw pokarmowych.
cytrynianowy, gdy 1 czsteczka szczawiooc-tanu jest niezbdna do kadej reakcji kondensacji z acetylo-CoA, podczas gdy w cyklu regeneruje si tylko 1 czsteczka szczawiooctanu. Z podobnych powodw nie moe zachodzi netto przeksztacenie kwasw tuszczowych o pa-
rzystej liczbie atomw wgla (ktre wytwarzaj acetylo-CoA) w glukoz lub glikogen. jedynie kocowy trjwglowy fragment kwasu tuszczowego o nieparzystej liczbie atomw wgla jest glukogenny. Jest nim propionylo-CoA, powstajcy jako kocowy produkt p -oksydacji
INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATW ENERGETYCZNYCH / 331
tych kwasw. Jest jednak moliwe wystpowanie znakowanych atomw wgla kwasu tuszczowego w glikogenie po przejciu przez cykl cytrynianowy. Dzieje si tak dlatego, e szcza-wiooctan jest zwizkiem porednim zarwno cyklu kwasu cytrynowego, jak i szlaku ghiko-neogenezy. Glicerol, bdcy czci triacylo-glicerolu, moe bra udzia w tworzeniu glukozy po aktywacji do glicerolo-3-fosforanu. Wiele spord szkieletw wglowych aminokwasw endogennych moe powsta z wglowodanw przez cykl kwasu cytrynowego i transaminacj. Przez odwrcenie tych proce sw z aminokwasw glikogennych powstaj szkielety wglowe, ktre s albo metabolitami cyklu cytrynianowego, albo ich prekursorami. S one zatem atwo przeksztacane drog gluko-neogenezy w glukoz i w glikogen. Aminokwasy ketogenne s przemieniane do acetooctanu, ktry jak i inne ciaa ketonowe jest metabolizo-wany w tkankach pozawtrob owych, tworzc acetylo-CoA. Z tych samych powodw, dla ktrych kwasy tuszczowe nie mog by przetwarzane w wglowodany, nie moe rwnie zachodzi prze miana kwasw tuszczowych do aminokwasw glikogennych. Nie jest rwnie moliwe odwrcenie szlaku rozkadu aminokwasw keto-genhych i innych nalecych do niezbdnych skadnikw poywienia, tzw. aminokwasw egzogennych. Przemiana szkieletw wglowych aminokwasw glikogennych do kwasw tuszczowych jest moliwa albo przez utworzenie pirogronianu i acetylo-CoA, albo przez od wrcenie pozamitochondrialnych reakcji cyklu cytrynianowego od a-ketoglutaranu do cytrynianu, a nastpnie zadziaanie ATP -zalenej liazy cytrynianowej i wytworzenie acetylo-CoA (p. rozdz. 23), Jednak w wikszoci warunkw naturalnych, np. w okresie godzenia, rozpadowi biaek i aminokwasw towarzyszy rozpad tuszczw. Sumarycznie wic przeksztacanie aminokwasw w tuszcze nie jest procesem ilociowo znaczcym, moe z wyjtkiem przypadkw, w ktrych zwierzta s karmione diet bogat w biako.
EKONOMIA PRZEMIANY WGLOWODANW LIPIDW OBEJMUJE CAY ORGANIZM Glukoza jest metaboliczn koniecznoci w kadym stanie odywienia
Opisano uprzednio wiele szczegw wspzalenoci midzy przemian wglowodanw i tuszczw w rnych tkankach, zwaszcza atwe przetwarzanie wielu substancji glukogen-nych w glukoz i w glikogen przez glukoneogc-neze. Glukoneogeneza jest bardzo wana, poniewa niektre tkanki i typy komrek, cznie z orodkowym ukadem nerwowym i erytrocytami, s znacznie bardziej zalene od cigego dostarczania glukozy ni inne. Pewien minimalny dopyw glukozy do tkanek pozawtrobo -wych jest prawdopodobnie niezbdny do utrzymania odpowiednich ste szczawiooctanu, aby zachowa integralno cyklu cytrynianowego. Ponadto glukoza wydaje si by gwnym rdem glicerolo-3-fosforanu w tych tlcankach, ktre s pozbawione aktywnoci kinazy glicero-lowej. Istnieje zatem pewne minimalne i obligatoryjne utlenianie glukozy w kadych warun kach. Due iloci glukozy s take niezbdne do odywiania podu i do syntezy laktozy mleka. Pewne dodatkowe mechanizmy, poza glukoneogeneza, zapewniaj dostarczanie glukozy w okresach jej niedoboru. Dzieje si to przez oszczdzanie
utleniania glukozy kosztem innych substratw. Preferencyjne zuywanie cia ketonowych i wolnych kwasw tuszczowych oszczdza glukoz w celu spenienia przez ni jej istotnych funkcji
Ciaa ketonowe i wolne kwasy tuszczowe powoduj oszczdniejsze utlenianie gJukozy w miniach, upoledzajc: jej wnikanie do komrek, fosforylacj do glukozo-6-fosforanu, reakcj katalizowan przez fosfofruktokinaz i reakcj oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu. Utlenianie wolnych kwasw tuszczowych i cia ketonowych powoduje zwiksze nie wewntrzkomrkowego stenia cytrynia nu, ktry z kolei jest allosterycznym inhibitorem fosfofruktokinazy. Te i inne obserwacje, ktre wykazay, e w perfundowanym sercu acetooctan jest utleniany preferencyjnie w stosunku do wolnych kwasw tuszczowych, uzasadniaj wniosek, e w warunkach niedobo-
332 / ROZDZIA 29
Acyio-CoA //TK A NK / TUSZCZOWA
GHcerolo-3-fosforan
/POZAWATRCIBOWE'//' np. MISIE SESCOWY''
VLDL
zwizki ketonowe
WKT
tti
Glukoza
^ i
Acylo-CoA
>
Gllcerolon3-foeforan
2CO3
Glikogen Giukozo-6-fciHtoran Aminokwasy, mleczan
Ryc. 29-2. Metaboliczne zalftnoci midzy tkank tuszczow, wtrob i tkankami poza wtrobowym i. Zakropkowane przestrzenie przedstawiaj obszary dziaania lipazy lipoproteinowej ciany naczy woso watych, WKT wolne kwasy tuszczowe, VLDL Iipoproteiny o bardzo malej gstoci.
INTEGRACJA METABOLIZMU I DOSTARCZANIE SUBSTRATW ENERGETYCZNYCH / 333
ru wglowodanw dostpne substraty energetyczne s utleniane w nastpujcej kolejnoci preferencyjnej: 1) ciaa ketonowe (i prawdopodobnie inne krtkoacuchowe kwasy tuszczowe, np. octan), 2) wolne kwasy tuszczowe oraz 3) glukoza. Nie oznacza to, e utlenianie okrelonego substratu energetycznego cakowicie wyklucza utlenianie jakiegokolwiek innego (ryc. 29-2). Te mechanizmy funkcjonuj w sposb bardziej zaznaczony w tych tkankach, ktre maj znaczn wydolno tlenowej przemiany kwasw tuszczowych, np. w sercu i we wknach miniowych typu powolnego (czerwonego) ni w tkankach z ma wydolnoci, np. we wknach miniowych typu szybkiego (biaego). Poczenie efektu woinych kwasw tuszczowych (polegajcego na oszczdzaniu zuywania glukozy przez serce i misie) oraz efektu zaoszczdzonej glukozy (hamowania mobilizacji wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej) nazwano cyklem glukoza-kwasy tuszczowe.
W CZASIE GODZENIA NASTPUJE CIGE DOSTARCZANIE SUBSTRATW ENERGETYCZNYCH DLA TKANEK

U zwierzt karmionych diet bogat w wglowodany jest oszczdzane utlenianie kwasw tuszczowych. Dzieje si tak dlatego, poniewa jest hamowana lipoliza w tkance tuszczowej pod wpywem duych ste glukozy i insuliny. Skutkiem tych procesw jest mae stenie wolnych kwasw tuszczowych (ryc. 29-3). Gdy zwierz przechodzi ze stanu sytoci do stanu godzenia, wwczas dostpno glukozy z pokarmu si zmniejsza, przez co zostaje uruchomiony glikogen wtroby w celu utrzymania odpowiedniego stenia glukozy we krwi. Stenie insuliny we krwi si zmniejsza, natomiast stenie giukagonu si zwiksza. Poniewa zuycie glukozy w tkance tuszczowej zmniejsza si, a dziaanie insuliny hamujce lipoliz staje si mniejsze, nastpuje mobilizacja tuszczw w postaci womych kwasw tuszczowych i glice-rolu. Wolne kwasy tuszczowe s transportowane do tkanek, gdzie s utleniane ajbo estryfiko-
G utgon osacza
"x /' V
/\
i
__
-i ------
yf
c--N
\\
\ / /J
V
? ^-/
Glukoza Krwi
12-24 Godzfny gtodzertta
Ryc. 29-3. Wzgldne zmiany parametrw metabolicznych po rozpoczciu godzenia.
334 / ROZDZIA 29
wane. Glicerol, po aktywacji do glicerolo-3-- fosforanu, wcza si gwnie w wtrobie i w nerkach w pul wglowodanow. Podczas tej fazy przejciowej od stanu sytoci do stanu cakowitego godzenia, endogenne wytwarzanie glukozy nie nada za jej zuywaniem i utlenianiem, poniewa zapasy glikogenu wtroby zostaj wyczerpane. Odzwierciedleniem tych procesw jest zmniejszenie stenia glukozy we krwi oraz mobilizacja tuszczw, zachodzca z coraz to wiksz szybkoci. Jednak ju po kilku godzinach stenia wolnych kwasw tuszczowych i glukozy stabilizuj si na poziomie charakterystycznym dla stanu na czczo (odpowiednio 0,7 0,8 inmol/1 oraz 3,33,9 mmol/1). Naley zaoy, e w tym stadium w caym organizmie zwierzcia nastpio zrwnowaenie midzy dostaw glukozy, a zapotrzebowaniem tkanek na jej zuytkowanie i utlenianie. Stan taki osiga si przez zwikszone utlenianie wolnych kwasw tuszczowych i cia ketonowych oraz ograniczenie utleniania glukozy do moliwego minimum. Ta subtelna rwnowaga zostaje zaburzona w stanach, w ktrych zapotrzebowanie na glukoz jest zwikszone, lub gdy uytkowanie glukozy przez tkanki jest upoledzone. W takich przypadkach dochodzi do dalszej mobilizacji tuszczw. Dostarczanie wglowodanw przez tkank tuszczow w postaci glicerolu jest wan funkcj, poniewa jest to jedyne rdo wglowodanw, oprcz glukoneogenezy z biaek, w godujcym organizmie dla tych procesw, ktre musz zuytkowywa glukoz. U czowieka w dugotrwaym godzie zmniejsza si gluko-neogeneza z biaek wskutek zmniejszonego uwalniania aminokwasw, zwaszcza alaniny z mini. Towarzyszy temu adaptacja mzgu do zastpienia okoo polowy utlenianej glukozy utlenianiem cia ketonowych. Ketoza jest metaboliczn adaptacj do godzenia Pierwotn funkcj ketogenezy jest usuwanie z wtroby nadmiaru wgli kwasw tuszczowych w postaci zwizkw, ktre s atwo utleniane przez tkanki pozawtrobowe zamiast glukozy. Ketoza jest rezultatem zmniejszonej dostpnoci wglowodanw. Zwikszenie ketogenezy powoduje (p. ryc. 24-9 i 24-10); 1. Nierwnowaga midzy estryfikacj a lipoliz w tkance tuszczowej, czego nastpstwem jest uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych do krenia. Wolne kwasy tuszczowe s gwnym substratem do wytwarzania cia ketonowych
w wtrobie. Oznacza to, e wszystkie czynniki metaboliczne i wewntrzwydzielnicze, wpywajce na uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej, wpywaj rwnie na ketogenez. 2. Podczas wnikania wolnych kwasw tuszczowych do wtroby rwnowaga midzy ich estryfikacj a utlenianiem zaley od palmitoilotransferazy karnitynowej I, ktrej aktywno jest porednio zwikszana przez zwikszenie stenia wolnych kwasw tuszczowych i zwikszenie stosunku [glukagon]: [insulina]. 3. Przy zwikszonym utlenianiu kwasw tuszczowych wiksza ich ilo przetwarza si w ciaa ketonowe, a mniej tworzy si CO2. Proces ten jest regulowany w taki sposb, e cakowite wytwarzanie ATP w wtrobie pozostaje stae. Uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej w stanie godu moe by kontrolowane przez sprzenie zwrotne, polegajce na tym, e ciaa ketonowe i woine kwasy tuszczowe bezporednio pobudzaj trzustk do wytwarzania insuliny. W wikszoci przypadkw uwalnia si nadmiar wolnych kwasw tuszczowych w stesun-ku do zapotrzebowania na ich utlenianie, przez co znaczna ich cz jest estryfikowana nawet w czasie godzenia. Poniewa wtroba wychwytuje i estryfikuje znaczn cz kwasw tuszczowych uwalniajcych si z tkanki tuszczowej, mona powiedzie, e ten narzd odgrywa istotn rol regulacyjn w usuwaniu nadmiaru wol nych kwasw tuszczowych z krenia. Gdy poda wglowodanw jest wystarczajca, wwczas wikszo napywajcych kwasw tuszczowych jest estryfikowana w wtrobie i nastpnie eksportowana z wtroby jako VLDL, ktre s zuytkowywane przez inne tkanki. W przypadku nadmiernego napywu wolnych kwasw tuszczowych wtroba dysponuje alternatywn drog ich przemiany, tj. ketogenez, ktra pozwala wtrobie kontynuowa eksport wikszoci napywajcych kwasw tuszczowych w postaci atwej do zuytkowania przez tkanki pozawtrobowe i to w kadym stanie odywienia. Wikszo powyszych procesw przedstawiono na ryc. 29-2. Naley zwrci uwag, e istnieje cykl wglowodanowy, obejmujcy uwalnianie glicerolu z tkanki tuszczowej i jego przetworzenie w wtrobie do glukozy. Powstaa w ten sposb glukoza wraca ponownie do tkanki tuszczowej, zamykajc cykl. Inny cykl, cykl Hpidowy, obejmuje uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych przez tkank tuszczow,
INTEGRACJA METABOLIZMU 1 DOSTARCZANIE SUBSTRATOW ENERGETYCZNYCH / 335
ich przetransportowanie do wtroby i estryfika-cj w tym narzdzie oraz powrotny transport powstaych estrw do tkanki tuszczowej w postaci VLDL. Patologiczna ketoza jest spowodowana zwielokrotnionym dziaaniem czynnikw powodujcych ketoz godow Ketoza wystpujca w godzie i przy karmieniu tuszczami jest stosunkowo agodna, w porwnaniu ze stanem spotykanym w niewy-rwnanej cukrzycy, zatruciu etaowym u owiec albo w ketuzie u byda w okresie laktacji. Gwn przyczyn tych stanw jest jeszcze znaczniejsza niedostpno wglowodanw dla tkanek ni w agodnych stanach ketozy. W agodniejszych postaciach cukrzycy, przy karmieniu tuszczami i w przewlekym godzeniu, glikogen wystpuje w wtrobie w zmiennych ilociach, natomiast stenie wolnych kwasw tuszczowych jest mniejsze, co prawdopodobnie jest przyczyny mniej cikiej ketozy wystpujcej w tych stanach. W cukrzycy typu I brak (albo wzgldny brak) insuliny prawdopodobnie wpywa na tkank tuszczow bardziej ni na jakkolwiek inn tkank, z powodu niezwykej wraliwoci tej tkanki na ten hormon. Skutkiem tego jest uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych w ilociach powodujcych zwikszenie ich stenia w osoczu krwi do wartoci przekraczajcych 2-krotnie prawidowe stenie na czczo u osb zdrowych. Wystpuje rwnie wiele zmian aktywnoci enzymw w wtrobie, nasilajcych glukoneogenez i eksport glukozy do krwi pomimo wystpowania znacznej hiper-glikemh. W ketozie przeuwaczy zachodzi intensywne pobieranie glukozy z krwi przez pody bliniacze lub proces intensywnej laktacji (ryc. 29-2).W rezultacie rozwija si kracowa hipoglikemia, poczona z niezwykle ma iloci glikogenu
w wtrobie. Ketoza powstajca w tych warunkach bywa bardzo cika. W miar rozwoju hipoglikemii zmniejsza si wydzielanie insuliny, przez co zmniejsza si nie tylko zuywanie glukozy, lecz rwnoczenie wzmaga si lipoliza w tkance tuszczowej. Kobiety w ciy czsto maj agodn ketoz. W nie leczonej cukrzycy typu I zgon jest spowodowany powikaniami kwasicy uwarunkowanej dugotrwa utrat zasad, niezbdnych do zobojtnienia kwanych zwizkw ketonowych wydalanych z moczem (p. rozdz. 62. Przypadek 8: Cukrzyca przebiegajca z kwasic ketonow). W zatruciu dowym owiec zgon nastpuje szybko z powodu cikiej hipoglikemii.
PIMIENNICTWO
Caprio S et al: Oxidative fuel metabolism during mild nypoglycemia: critical role free fatty acids. Am J Physiol 1989:256:E413. Cohen P: Comroi of Enzyme Activitv, 2nd ed. Chapman & Hali, 1983. Hue L, Van de Werve G (editors): Short-Term Regulation of Liver Metabolism. Elsevier/North Holland, 1981. Knopp RH et al: Lipoprotein metabolism in pregnancy, fat transport to the ferus and the effects of diabetes. Biol Neonate 1986;5O:297. Maycs PA, Laker ME: Regulation of ketogenesis in the liver. Biochem Soc Trans 1981;9:339. McGarry JD, Foster DW. Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body produetion. Annu Rev Biochem 1980;49:395. Siess EA, Kientsch-Engel Rl, Wieland OH: Concentration of free oxaloacetate in the mitochondrial compartment of isolated liver cells. Biochem J 1984;218:171. Zorzano A et al: Effects of starvation and exercise on concentrations of citrate, hexose phosphates and glycogen in skeletal muscle and heart; Evidence for selectivc operation of the ghicose-fatty acid cycle. Biochem J 1985;232:585.
CZSC Metabolizm biaek aminokwasw
Biosynteza aminokwasw, ktre nie musz by dostarczane w poywieniu

30
WPROWADZENIE
Czsto mwi si o aminokwasach, ktre musz by dostarczone w poywieniu, jako o podstawowych" i niezbdnych", i o aminokwasach niekoniecznie wystpujcych w pokarTabela 30-1. Zapotrzebowanie na aminokwasy u czowieka Aminokwasy, ktre Aminokwasy, ktre musz by dostarczo- nie musz by dostarne w poywieniu czona w poywieniu Arginina* Histydyna* Izoieucyna Leucyna Lizy na Metionina Fenyloalanina Treonina Tryptofan Walina Alanina Asparagina Asparaginian Cysteina Glutaminian Glutamina Glicyna Hydroksyprolina" Hydroksylizyna** Prolina Seryna Tyrozyna
mie, jako o nie podstawowych" i nie niezbdnych" (tab. 30-1). Chocia w sensie ywienia terminy te s poprawne, zaciemniaj one pod-stwow, biologiczn natur wszystkich 20 aminokwasw. Mona udowodni, e aminokwasy, ktrych nie trzeba dostarcza w poywieniu s waniejsze dla komrki od tych, ktre musz by dostarczone w poywieniu, skoro organizmy (np. czowiek) zatraciy zdolno syntezy ostatniej, ale nie pierwszej grupy. Poniewa ksika ta kadzie nacisk na procesy metaboliczne tkanek ludzkich, bdzie tu omwiona tylko biosynteza aminokwasw, ktre nie musz by dostarczone w poywieniu, a nie bdziemy omawia tych, ktre s biosyn-tetyzowane przez roliny i mikroorganizmy, i musz by dostarczone w poywieniu.
Znaczenie medyczne materiau zawartego w tym rozdziale wie si ze stanami niedoboru aminokwasw, ktre mog wynika z faktu, e konieczne w poywieniu aminokwasy nie wystpuj w poywieniu lub wystpuj w niedostatecznych ilociach. Poniewa pewne zboa s stosunkowo ubogimi rdami tryptofanu i lizy-ny, moe wystpi stan dramatycznego niedo-
'Czciowo niezbdny w poywieniu. Syntetyzowany z niedostateczn szybkoci , aby podtrzyma rozwj dzieci. "Niekonieczny do syntezy biaka, ale tworzcy si podczas zmian potranslacyjnych kolagenu.
22 - Biochemia
338 / ROZDZIA 30
boru tych aminokwasw w regionach, w ktrych poywienie opiera si na tych zboach i nie jest uzupeniane przez takie rda biaka, jak mleko, ryby i miso. Kwashiorkor i wyniszczenie (ang. marasmus) s endemiczne w pewnych regionach Afryki Zachodniej. Kwashiorkor pojawia si wwczas, gdy dziecko po odjciu od piersi matki przechodzi na diet skrobiow ubog w biako. W wyniszczeniu istnieje niedobr zarwno energetycznego poywienia, jak i swoistych aminokwasw. PODCZAS EWOLUCJI ZWIERZTA WYSZE TRAC ZDOLNO DO BIOSYNTEZY AMINOKWASW, KTRYCH TWORZENIE WYMAGA DUGIEGO CIGU REAKCJI Istnienie zapotrzebowania na poywienie sugeruje, e zaleno od dostarczania z zewntrz potrzebnego zwizku poredniego moe mie wiksz warto do utrzymania si przy yciu ni zdolno do jego biosyntezy. Jeeli swoisty intermediat wystpuje w poywieniu, to organizm, ktry moe go syntetyzowa, rozmnaajc si przekazuje przyszym pokoleniom informacj genetyczn o ujemnej wartoci tej zdolnoci dla przeycia. Zdolno ta dla preeyTabela 30-2. Enzymy biorce uctzial w syntezie aminokwasw z amfibolicznych zwizkw porednich Liczba enzymw potrzebna do syntezy
Aminokwasy, ktre nie Aminokwasy, ktre musz by dostarczone musz by dostarczone w poywieniu Arg1 His
Thr Met
cia jest ujemna, a nie zerowa, poniewa or ganizm zuywa ATP i rodki pokarmowe na syntez niepotrzebnego DNA. Liczba enzymw wymagana przez komrki prokariotyczne do biosyntezy aminokwasw niezbdnych w poywieniu jest ogromna w porwnaniu z liczb enzymw potrzebn do syntezy aminokwasw, ktre nie musz by dostarczone w poywieniu (tab. 30-2). To sugeruje, e poyteczne dla przeycia organizmu jest utrzymanie zdolnoci wytwarzania atwych" aminokwasw, nat omiast strata zdolnoci do syntezy aminokwa sw trudnych". WIKSZO AMINOKWAS W, KTRE NIE MUSZ BY DOSTARCZANE W POYWIENIU, TWORZY SI Z AMFIBOLICZNYCH ZWIZKW POREDNICH W KRTKICH SZLAKACH ANABOL1CZNYCH Z 12 aminokwasw, ktre nie musz by dostarczone w pokarmie (tab. 30-1), 9 tworzy si z amfibolicznych zwizkw porednich. Pozostae 3 (Cys, Tyr, Hyl) tworz si z aminokwasw, ktre musz by w poywieniu. Dehydrogenaza glutaminianowa., syntetaza glutaminowa i transaminazy zajmuj centraln pozycj w biosyntezie aminokwasw. Wyni kiem ich wsplnego dziaania jest katalizowanie przeksztacenia nieorganicznego jonu amono wego w organiczny azot a-aminowy rnych aminokwasw. Glutaminian. Redukcyjna aminacja a-ke-toglutaranu jest katalizowana przez dehydroge-naz glutaminianow (ryc. 30-1). W dodatku do
NAD(P)H + H NAD(P]-
w poywieniu Ala Asp Asn=
5 (4 wsplne)
7 6 6
1
1 1
Glu
Gin' Hyl3 Hyp4 Pro1 Ser Gly= Cys6 Tyr'_
! 6
1
1
1
Lys 8 Ile 8 (6 wsplnych) Val 1 (7 wsplnych) Leu 3 (7 wsplnych) Phe 10 Trp 5 (8 wsplnych)
59
1 3 3 1
Ryc.
30-1 .
NH, '
2 1
17
z Glu. z Asp, z Lys. z Pro. z Ser. z Ser. plus S-a . z Phe.
Reakcja dehydrogenazy glutaminiano-wej. Redukcyjna aminacja a-ketoglutaranu przez NHl zachodzi kosztem NAD(P)H.
BIOSYNTEZA AMINOKWASW / 339
NH+ O O
NH. Mg-ATP L-Glulamlna Mg-ADP+P;
Ryc. 30-2. Reakcja syntetazy glutaminowej.
Asparagina. Synteza asparaginy z aspara-ginianu, katalizowana przez syntetaz asparaginowa (ryc. 30-4), przypomina syntez glutaminy (ryc. 30-2). Tym niemniej enzym ssakw wykorzystuje jako rdo azotu raczej glutami n ni jon amonowy; syntetaza asparaginowa u ssakw nie przycza nieorganicznego azotu, natomiast bakteryjna syntetaza asparaginowa wykorzystuje jon amonowy i wskutek tego przycza azot. Tak jak w przypadku innych, reakcji, w ktrych tworzy si PPj: hydroliza PP; do P| przez pirofosfataz zapewnia, e reakcja jest silnie uprzywilejowana energetycznie.
Mg-ATP
tworzenia L-glutaminianu z amfi bo licznego zwizku poredniego a-ketoglutaranu, reakcja ta stanowi kluczowy, pierwszy etap w biosyntezie wielu dodatkowych aminokwasw. Glutamina. Biosynteza glutaminy z gluta-minianu jest katalizowana przez syntetaz glutaminow (ryc. 30-2). Reakcja wykazuje zarwno podobiestwa, jak i rnice w porwnaniu z reakcj katalizowan przez dehydrogenaz glutaminianow. Obie reakcje wbudowuj azot nieorganiczny -jedna w grup aminow, druga w wizanie amidowe. Obie reakcje s poczone z reakcjami wysoce egzoergicznymi: w przypadku dehydrogenazy glutaminianowej z utlenieniem NAD(P)H, a w przypadku syntetazy glutaminowej hydroliz ATP.
NH,
NH,
H,N
O L-Asparaglnlan L-Asparagina
R NH3 -
Mg-AMP + PP,
Ryc. 30-4. Reakcja syntetazy asparaginowej. Naley zwrci uwag na podobiestwa i rnice w porwnaniu z reakcj syntetazy glutaminowej (ryc. 30-2).
Alanina i asparaginian. L-alanina powstaje w wyniku transaminacji pirogronianu, natomiat w wyniku transaminacji szczawiooc-tanu tworzy si L-asparaginian (ryc. 30-3). Przeniesienie grupy a-aminowej glutami nia u na te amfiboliczne zwizki porednie ilustruje zdolno transaminaz do kierowania jonu amonowego, przez glutaminian, w oc-aminowy azot aminokwasw.
Plrogronlan Q GlulubAsp ot-Ketoglutaran lubazczawiooctan
Ryc. 30-3. Tworzenie alaniny przez transami nacj pirogronianu. Donorem grupy aminowej moe by glutaminian lub asparaginian. Innym produktem jest a-ketoglutaran lub szczaw i oo etan.
Seryna. Seryna tworzy si ze zwizku po redniego glikolizy D-fosfoglicerynianu (ryc. 30-5). Grupa ot-hydroksylowa jest utleniana przez NAD + do grupy ketonowej, a nastpnie podlega transaminacji, tworzc fosfoseryn. Ta jest wwczas defosforylowana, dajc seryn. Gicyna. Synteza glicyny w tkankach ssakw jest prowadzona kilkoma drogami. Cyto-zol wtroby zawiera Lransaminazy glicynowe, ktre katalizuj syntez glicyny z glioksalanu i glutaminianu lub alaniny. W przeciwiestwie do wikszoci reakcji transaminacji, ta silnie uprzywilejowuje syntez glicyny. Dwoma dodatkowymi wanymi szlakami tworzenia glicyny u ssakw jest jej synteza z choliny (ryc. 30-6) i z seryny przez reakcj katalizowan przez hydroksymetylotransferaz serynow (ryc. 30--7). Prolina. U ssakw i niektrych innych form ycia prolina tworzy si z glutaminianu wskutek odwrcenia reakcji kataboiizmu proliny (ryc. 30-8).
340 / ROZDZIA 30
OKSYDAZA SARKO2YNOWA i
o
3- Fosf o- D-g! loory nlan L- - N A D +
9
(P)-O o
DEHYDROGENAZA ALDEHYDU BETAINY Fosfo hyd ro teyplrog ron lan
NH,+
Fosfo-L-swyna
R yc. 30- 5. Bi osynt eza ser yny. a - A A a- am i nokw asy, a-K A a- ket okw asy.
OKSYDAZA DIMETYl.OGLlCYNOWA
Cysteina. Cysteina, ktrej obecno w po ywieniu nie jest konieczna, tworzy si z metio-niny (koniecznej w poywieniu) i seryny (niekoniecznej w poywieniu). Metionina ulega najpierw przemianie w homocystein przez S-ade-nozylometionine i S-adenozylohomocystein (p. rozdz. 32). Przeksztacenie homocysteiny i seryny w cystein i homoseryn przedstawiono na ryc. 30-9. Tyrozyna. Tyrozyna powstaje z fenyloala-niny w reakcji katalizowanej przez hydroksyla-z fenyloalaninow (ryc. 30-10). Podczas gdy fenyloalanina jest aminokwasem niezbdnym w poywieniu, tyrozyna nim nie jest dostarczone poywienie powinno zawiera odpowiednie iloci fenyloalaniny. Reakcja jest nieodwracalna, dlatego tyrozyna nie moe zastpo -
ICHjO) Formaldahyd i
NHJ
Silcyna
Ryc. 30-6. Powstawanie glicyny z cboliny.
wa w poywieniu fenyloalaniny. Kompleks hydroksylazy fenyloalaninowej jest oksygenaz o mieszanej funkcji, wystpuje w wtrobie ssakw, ale nie wystpuje w innych tkankach.

MetytenoH^-follan
i
NH,*
NH +
!
Glteyna
Seryna
HO ]
+/
O
L-Seryna
Ryc. 30-7. Reakcja hydroksym etyl otr nsf era zy se-rynowej. Reakcja jest atwo odwracalna. H4-fo)ian tetrahydrofolian.
O
L-GkJtamlnten
L-Glutam/lo-y-eemialoohyd L-Cysteina
L-Homowryna
A'-Pirolldyno-5-karboksyian
Ryc. 30-9. Przeksztacenie homocysteiny i seryny w homoseryn i cysteine. Naley zauway, e podczas gdy siarka cysteirty pochodzi z transsui-fu racji z metioniny, szkieletu wglowego dostarcza seryna.
L-Prollna Ryc. 30-8. Biosynteza proliny zglutaminianu przez odwrcenie reakcji katabolizmu proliny.
Reakcja polega na wbudowaniu jednego atomu tlenu w pozycjepara fenylo alaniny, podczas gdy drugi atom jest redukowany z utworzeniem wody (ryc. 30-10). Moc redukcyjn, zawart
ostatecznie w NADPH, natychmiast dostarcza tctrahydrobiopteryna. przypominajca pterydy-ne kwasu foliowego. Hydroksyprolina. Poniewa prolina suy jako prekursor hydroksyproliny, prolina i hydroksyprolina nale do rodziny glutaminianu. Chocia w tkankach ssakw wystpuje zarwno 3-, jak i 4-hydroksyprolina, wszystkie podane niej fakty dotycz tylko ran.s-4-hyclroksy-proliny, Hydroksyprolina, podobnie jak hydroksyli-2yna, jest prawie wycznie zwizana z kolagenem, biakiem wystpujcym w najwikszej ilo-
342 / ROZDZIA 30 NADP+ NADPH+H+
TetrahydroDmydra-blopteryna biopteryna
L-Fanyloalanlna
L-Tyroiyna
H 0H
OH H
Tatra hyd ro bi o ptery n a
Ryc. 30-10. Reakcja hydroksylazy fenyloalanino-wej. Bior udzia 2 rne enzymy. Enzym II katalizuje redukcj dihydrobiopteryny przez NADPH i enzym I redukcj O2 do H2O oraz fenyloalaniny do tyrozyny Reakcja ta wie si z zaburzeniami metabolizmu fenyloalaniny omawianymi w rozdz. 32.
i-Ketoglularan [ "OJ-Bursztyn la n
Ryc. 30-11. Reakcja hydroksylazy prolilowej. Sub-stratem jest peptyd bogaty w prolin. Podczas przebiegu reakcji tlen czsteczkowy wbudowuje si zarwno do bursztynianu, jak i do proliny (wykaza13 no wykorzystujc izotop tlenu O2).
W przeciwiestwie do grup hydroksylowych hydroksylizyny, ktre su jako miejsca przyczenia reszt galaktozyd owych i glukozowych, grupy hydroksylowe hydroksyproliny kolagenu nie s podstawione. Wyjtkow cech metabolizmu hydroksyproliny i hydroksylizyny jest to, e jeli aminokwasy te pochodz z biaka przyjmowanego poywienia, to nie s wczane do kolagenu. Nie ma adnego tRNA zdolnego przyczy hydro-ksyprolin i hydroksylizyn i wbudowa je w wyduajcy si acuch polipeptydowy. Pro-lina zawarta w pokarmie jest prekursorem hydroksyproliny kolagenu, natomiast lizyna prekursorem hydroksylizyny kolagenu. Hydroksy-lacje proliny lub lizyny katalizuje hydroksylaza prolilowa lub hydroksylaza lizylowa, enzymy zwizane z frakcj mikrosomaln wielu tkanek (skry, wtroby, puc, serca, mini szkieletowych i zi a minujcych ran). Enzymy te s hydro-ksylazami peptydowymi, poniewa hydroksyla-cja zachodzi tylko po wbudowaniu proliny i lizyny do polipeptydu. Obie hydroksylazy s oksygenazami o mieszanej funkcji, ktre wymagaj w dodatku do substratu obecnoci tlenu czsteczkowego, askorbinianu, Fe2 "1 " i a-ketoglutaranu. Intensywniej badano hydroksylaz prolilowa, ak okazuje si, e hydroksylaza lizylowa jest bar dzo podobna. Na kady mol hydroksylowanej proliny, 1 mol oc-ketoglutaranu ulega dekarbok-sylacji do bursztynianu. Podczas tego procesu 1 atom tlenu czsteczkowego wbudowuje si w prolin i 1 w bursztynian (rys. 30-11). Hydroksylizyna. 5-Hydroksylizyna (a,e--diamino-S-hydroksykapronian) wystpuje w kolagenie, ale nie wystpuje w wikszoci innych biaek ssakw, Hydroksylizyna kolagenu pochodzi bezporednio z lizyny, ale nie z hydroksylizyny poywienia. Zanim lizyna ulegnie hydroksylacji musi by wbudowana w peptyd. HydroksyJacje peptydu lizylowego katalizuje wwczas hydroksylaza lizylowa, ok-sydaza o mieszanej funkcji, analogiczna do hydroksylazy prolilowej (ryc. 30-11). 7- Ketokwasy 3 aminokwasw o rozgazionych acuchach bocznych mog zastpi w poywieniu czowieka odpowiadajce im aminokwasy Chocia leucyna, walina i izoleucyna s dla ludzi i innych wyszych zwierzt aminokwasami, ktre musz by dostarczone w pokarmie, tkanki ssakw maj transaminazy, ktre od -
ci w tkankach ssakw. Kolagen zawiera ok. 1/3 glicyny, 1/3 proliny i hydroksyproliny. Hydro-ksyprolina, ktra stanowi wiele reszt amino-kwasowych kolagenu, chroni potrjny heliks kolagenu przed trawieniem przez proteazy.
wracalnie katalizuj wzajemne przemiany wszystkich 3 aminokwasw i odpowiadajcych im a-ketokwasw. Dlatego odpowiednie a-keto-kwasy mog zastpowa w poywieniu odpowiadajce im aminokwasy. Histydyna i arginina s uwaane jako aminokwasy czciowo niezbdne w poywieniu Arginina, aminokwas ktry musi by dostarczony w poywieniu dla rozwoju czowieka, moe by syntetyzowana przez szczury, ale w ilociach niewystarczajcych do prawidowego wzrostu. Histydyna, podobnie jak arginina, nie jest cakowicie niezbdna w poywieniu. W nieobecnoci histydyny u dorosych ludzi i-dorosych szczurw bya utrzymywana przez krtki okres rwnowaga azotowa. Rosnce zwierz wymaga jednak w poywieniu histydyny. Jeeli badania
byyby prowadzone w duszych okresach, jest prawdopodobne, e ujawnioby si zapotrzebowanie na histydyn rwnie u dorosego czowieka. PIMIENNICTWO
Cardinale GJ, Udenfriend S: Prolyl hydroxylase. Adv Eniymol 1974;41:245. Mercer LP, Dodds SJ, Smith DI: Dispensable, indispensable, and conditionally indispensable amin o acid ratios in the diet. Chapter 1 in Vol. 1 of; Adsorption and Utilization of Amino Acids. Friedman M (editor). CRC Press. 1989. Rosenberg LE. Serwer CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Disease. Bondy PK, Roscnberg LE (editors). Saunders, 1980. Tyler B: Regulation of the assimilation of nitrogen tompounds. Annu Rev Biochem 1978;47:1127.
31
WPROWADZENIE
Katabolizm biaek i azotu aminokwasw

Victor W. Rodwet, PhD
W tym rozdziale bdzie omwiony sposb, w jaki azot jest usuwany z aminokwasw i przeksztacany w mocznik oraz problemy medyczne pojawiajce si wskutek zaburze tych reakcji. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Amoniak, pochodzcy gwnie z a-amino-wego azotu aminokwasw, jest dla ludzi potencjalnie toksyczny. Mechanizmy, ktre powoduj, e amoniak jest toksyczny, nie s cakowicie poznane. Czowiek usuwa amoniak przez przeksztacenie go w nietoksyczny zwizek chemiczny mocznik. Prawidowy przebieg szlaku metabolicznego, ktry przeksztaca amoniak w mocznik cykl mocznikowy jest istotny do utrzymania zdrowia. W warunkach, w kt rych funkcja wtroby jest powanie zagroona, np. u chorych z zaawansowan marskod wtroby (gdzie prawidowe hepatocyty s zastpione przez fibrobiasty i kolagen) lub ostrym zapaleniem wtroby stenie amoniaku we krwi si zwiksza, co w rezultacie powoduje objawy kliniczne. W przypadku nielicznych dzieci urodzonych z brakiem aktywnoci jed nego z enzymw cyklu mocznikowego waciwe leczenie wymaga zrozumienia biochemii syntezy mocznika. WYMIANA BIAKA ZACHODZI WE WSZYSTKICH FORMACH YCIA Biaka ywych komrek s stale odnawiane przez wymian biaka, nieprzerwany proces degradacji i nastpnie resyntezy z wolnych amino-
kwasw. Fizjologiczne znaczenie wymiany biaka jest wykazane przez jej obecno we wszystkich formach ycia, nawet u bakterii rosncych logarytmicznie w bogatym podou. Chocia wymiana obejmuje zarwno syntez, jak i degradacj biaek, rozdzia ten omawia degradacj biaek i aminokwasw. Syntez biaek opisano w rozdz. 40. Klinicyci i dietetycy uywaj swoistych terminw w celu scharakteryzowania rnych stanw bilansu azotowego Swoiste terminy opisuj stan metabolizmu azotu u ludzi. Bilans azotowy dotyczy rnicy midzy cakowitym azotem spoytym a ca kowitym azotem wydalonym. Przyjcie wicej azotu ni wydalenie stanowi dodatni bilans azotowy, stan typowy dla rosncego dziecka lub kobiety w ciy. W rwnowadze azotowej, typowej dla dorosego czowieka, ilo azotu spoytego odpowiada iloci azotu wydalonego w kale i moczu. Ujemny bilans azotowy, w ktrym ilo azotu wydalonego przewysza ilo azotu spoytego, charakteryzuje pewnych chorych po operacjach, chorych z zaawansowanym rakiem i osoby, ktre przyjmuj nied o stateczn ilo azotu (np. w kwashiorkor) lub diet ubogobia-kow. Kadego dnia doroli degraduj 12% biaka ich organizmu Wymiana 12% cakowitego biaka ciaa dziennie u zdrowego czowieka wynika gwnie z degradacji biaka mini. 7580% uwolnionych aminokwasw jest wwczas ponownie wykorzystywanych do syntezy biaka. Azot pozostaych jest katabolizowany do mocznika.
KATABOLIZM BIAEK I AZOTU AMINOKWASW / 345

Biako organizmu Ponowne wykorzystanie do syntezy nowego biaka (15 - 2B g azotu dziennie) Aminokwasy
Degradacja biaka (2 0- 3 5g azotu dziennie)
Kalabollzm (5 7 g azotu dziennie)
Ryc. 31 -1. Zalenoci ilociowe zachodzce midzy obrotem biaek i aminokwasw.
zynowej wynosi ok. 2 h, a tm reduktazy HMG--CoA moe wynosi tylko 30 min. Te wartoci wyranie kontrastuj z okresem poowicznego rozpadu powyej 100 h dJa aldolazy, dehyd-rogenazy mleczanowej i cytochromw. Domeny bogate w Pro, Ser, Asp i Glu, okrelane jako sekwencje PEST, wystpuj w biakach z krtkim okresem poowicznego rozpadu. W reakcji na potrzeby fizjologiczne szybko degradacji kluczowych enzymw regulatorowych moe by przyspieszona lub opniona, zmieniajc stenie enzymu i std podzielenie metabolitw midzy rne szlaki metaboliczne.
Aminokwasy przyjte w nadmiarze w stosunku do potrzeb s degradowane, a nie przechowywane

Utrzymanie zdrowia typowego zachodniego dorosego czowieka wymaga 30 60 g biaka dziennie lub jego rwnowanikw w postaci wolnych aminokwasw. Niemniej jako biaka (proporcja niezbdnych aminokwasw w poywieniu wzgldem ich proporcji w syntetyzowanych biakach) ma szczeglne znaczenie. Nadmiar aminokwasw nie jest magazynowany. Bez wzgldu na ich pochodzenie, te ktre bezporednio nie zostay wczone do nowego biaka s szybko degradowane. Spoycie nadmiaru aminokwasw nie suy zatem adnemu poytecznemu celowi, ktry nie moe rwnie dobrze by speniony i przy niszym nakadzie przez wglowodany i lipidy.
a szkielety wglowe do amfibolicznych zwizkw porednich (ryc. 31-1). W spoeczestwie zachodnim ta dzienna strata wynosi do 3040 g biaka lub 5 7 g azotu.
Poszczeglne biaka s degradowane z rn szybkoci. rednia szybko degradacji biaka w danej komrce, tkance lub w caym organizmie odzwierciedla redni warto dJa rnych biaek. Szybko degradacji lub poowicznego rozpadu biaek w odpowiednich tkankach odpowiada ich fizjologicznemu wymaganiu. rednia szybko degradacji moe by niezmiernie dua, gdy tkanka ulega powanemu struktural nemu przeksztaceniu (np. tkanka macicy podczas ciy lub tkanka ogona kijanki podczas metamorfozy). Degradacja biaek mini szkieletowych take si zwiksza podczas ostrego godzenia.
Szybko degradacji biaka znacznie si rni midzy biakami oraz w rnych stanach fizjologicznych
PROTEAZY I PEPTYDAZY DEGRADUJ BIAKA DO AMINOKWASW

Analogicznie do procesw zachodzcych w przewodzie odkowo-j elito wy m, proteolityczne trawienie endogennych biaek w obrbie komrek wymaga proteaz i peptydaz. Wewntrzkomrkowe proteazy hydrolizuj wewntrzne wizania peptydowe biaek, tworzc pep-tydy. Te peptydy s wtedy degradowane do wolnych aminokwasw przez peptydazy. En-dopeptydazy przecinaj wewntrzne wizania w peptydach, tworzc krtsze peptydy, Amino-peptydazy i karboksypeptydazy usuwaj wwczas odpowiednio aminokwasy z N- i C-kocw peptydw. Ostatecznymi produktami s wolne aminokwasy.
Okres poowicznego rozpadu biaek waha si od 30 min do powyej 150 h
Poniewa in vivo szybko degradacji biaka odpowiada kinetyce reakcji I-rzdu, wraliwo enzymu aa degradacj jest wyraona przez jego okres poowicznego rozpadu tt. Jest to czas wymagany do zmniejszenia jego stenia do 50% wartoci pocztkowej. Okres poowicznego rozpadu enzymw wtroby waha si od mniej ni 40 min do powyej 150 h. Wiele kluczowych enzymw regulatorowych wykazuje krtki okres poowicznego rozpadu. Na przykad t,,2 oksygenazy tryptofanowej i transaminazy tyro-
346 / ROZDZIA 31
Biaka s degradowane na szlaku ATP-zalenym i ATP-niezalenym Wewntrzkomrkowe biaka komrek euka-riotycznych s degradowane w 2 gwnych szlakach. Pozakomrkowe, zwizane z bon, i dugo yjce biaka wewntrzkomrkowe s degradowane w organeliach komrkowch, nazwanych lizosomami, w procesach ATP-niezalenych. Przeciwnie, degradacja nieprawidowych i innych krtko yjcych biaek wymaga ATP i ubikwityny, i przebiega w cytozolu. Receptory asjaloglikoprotein hepatocytw przyczaj i internalizuj glikoproteiny przeznaczone do degradacji Jakie czynniki wyznaczaj" biako do szybkiej degradacji? Dla biaek w kreniu (np. pewnych hormonw peptydowych) strata czsteczki kwasu sjalowego, od kocw niereduku-jacych ich acuchw oligosacharydowych, sygnalizuje ich degradacj. Te pozbawione kwasu sjalowego glikoproteiny s rozpoznawane przez asjaloglikoproteinowy receptor hepatocytw i internalizowane. Wwczas s one degradowane w lizosomach przez proteazy zwane katep-synami. Ubikwityna wyznacza" wiele wewntrzkomrkowych biaek do degradacji Wiele wewntrzkomrkowych biaek jest wyznaczanych" do degradacji przez ubikwityn, maoczs teczko we (8,5 kD) biako wystpujce we wszystkich komrkach eukariotycz-nych. Pierwszorzdowa struktura ubikwityny jest bardzo konserwatywna. Tylko 3 z 76 reszt aminokwasowych rni ubikwityn drodow od ludzkiej. Czsteczki ubikwityny przyczaj
si do biaka przeznaczonego do degradacji na drodze reakcji zalenych od ubikwityny. S one przyczane w 3-etapowym procesie, koczcym si utworzeniem wizania izopeptydowego midzy kocem karboksylowym ubikwityny i g-aminow grup reszty iizyny w biaku (ryc. 31-2). To czy biako zostanie zmodyfikowane przez ubikwityn zaley od rodzaju aminokwasu obecnego na jego N-kocu. Reakcja z ubi-kwityn jest opniana przez N-kocow reszt metioniny i seryny, a przyspieszana przez reszt kwasu asparaginowego i argininy. ZALENIE OD ICH NISZY EKOLOGICZNEJ, ZWIERZTA PRZEKSZTACAJ AZOT W RNE PRODUKTY KOCOWE Zwierzta przeksztacaj azot z aminokwasw i innych rde w jeden z 3 produktw kocowych: amoniak, kwas moczowy lub mocznik. Ktry z produktw przewaa u rnych zwierzt, zaley od dostpnoci wody w ich specyficznej niszy ekologicznej. Organizmy amonoteliczne, ryby kostnoszkieletowe, wydalaj azot jako amoniak. Ich nisza wodna, zmuszajca do cigego usuwania wody, uatwia stae wydalanie bardzo toksycznego kompo nentu amoniaku. Natomiast zwierzta ldo we przeksztacaj azot albo w kwas moczowy (urykoteliczny tryb ycia), albo w mocznik (organizmy ureoteliczne). Ptaki, ktre musz zarwno zachowywa wod, jak i utrzymywa ma mas ciaa s urykoteliczne. Kwas moczowy, stosunkowo nierozpuszczalny produkt koco wy, jest wwczas wydalany jako pstae guano. Zwierzta ldowe, a take czowiek, s ureoteliczne, przeksztacajce azot w dobrze rozpusz czalny nietoksyczny zwizek mocznik. Nie-
o
1.
UBCO" + E, -SH + ATP -AMP + PP, + UBCSE1 O O UBCSE, + E, -SH -* E, -SH + UB-CSE,
2.
O E O H 3. UBC-^SE2+ H2NE Biako 4 Ej -SH + UBCN-e Biako c. 31-2. Reakcje czstkowe w przyczaniu ubikwityny (UB) do biaka. 1. Terminalna grupa karboksylowa COOH ubikwityny tworzy wizanie tioestrowe z grup -SH enzymu E, w reakcji kierowanej przez przeksztacenie ATP wAMPi PP,. 2. Reakcja wymiany tioestru przenosi zaktywowang ubikwityn na enzym E;. 3. Enzym E3 katalizuje transfer ubikwityny na e-aminowe grupy lizyny docelowego biaka.
zwykle maa toksyczno mocznika jest niejednokrotnie zaciemniona przez zwikszone stenie mocznika we krwi osb z chorobami nerek. To zwikszone stenie mocznika we krwi jest konsekwencj, ale nie przyczyn, chorb nerek. BIOSYNTEZA MOCZNIKA PRZEBIEGA W KILKU ETAPACH Ze wzgldw dydaktycznych omwienie biosyntezy mocznika podzielono na 4 etapy: 1) transaminacja, 2) deaminacja oksydacyjna, 3) transport amoniaku i 4) reakcje cyklu mocznikowego. Rycina 31-3 wie te zagadnienia w cakowity katabolizm azotu aminokwasowe-go. Chocia kady etap odgrywa take rol w biosyntezie aminokwasw, najpierw zostanie rozpatrzony z perspektywy ich katabolizmu.
a-Aminokwas i-Ketokwas
sydacyjn. Powstay wglowy szkielet" jest wwczas degradowany w szlakach, ktre bd opisane w nastpnym rozdziale. W tym rozdziale omwiono los samego azotu. Fosforan pirydoksalu jest obecny w miejscu katalitycznym wszystkich transaminaz Fosforan pirydoksalu tworzy istotny cz miejsca katalitycznego transaminaz i wielu innych enzymw, ktrych substratami s aminokwasy. We wszystkich reakcjach aminokwasw, zalenych od fosforanu pirydoksalu, wstpnym etapem jest tworzenie zwizku poredniego zasady Schiifa poczonego z enzymem. Ten zwizek poredni, stabilizowany pr2ez interakcj z kationowym regionem miejsca aktywnego, moe by przeksztacany w sposb, ktry obejmuje uwolnienie ketokwasu z utworzeniem zwizanego z enzymem fosforanu pirydoksaminy. Poczona aminowa forma koenzymu moe wwczas tworzy z ketokwa-sem analogiczny zwizek poredni typu zasady Schiffa. Podczas transaminacji przyczony koenzym suy jako przenonik grup aminowych. Wobec tego, e staa rwnowagi dla wikszoci reakcji transaminacji jest bliska 1, transamina cja jest procesem atwo odwracalnym. To po zwala ransaminazom funkcjonowa zarwno w kataboiizmie, jak i biosyntezie aminokwa sw. Transaminacja kieruje azot ::-aminokwasw do glutaminianu Transaminacja, katalizowana przez transa-minazy lub aminotransferazy, obejmuje wzajemne przemiany pary aminokwasw i pary keto-kwasw. S to gwnie a-aminokwasy i a-keto-kwasy (ryc. 31-4). Dwie transaminazy, transaminaza alanina--pirogronian (transaminaza alaninowa) i transaminaza glu tam i nian-a-ke to glut ara n (transa-minaza glutaminianowa), wystpujce w wikszoci tkanek ssakw, katalizuj przeniesienie grup aminowych z wikszoci aminokwasw, tworzc alanin (z pirogronianu) i glutaminian (z ce-ketoglutaranu) (ryc. 31-5). Transaminazy s swoiste tylko dla, jednej pary - aminokwasw i a-ketokwasw. Kada transaminaza jest swois ta dla danej pary aminokwasw i ketokwa -sw jako jednej pary substratw, ale nieswoista
a-Ketoglutaran
Transami nacja L-G lutami nian Deamlnacja oksydacyjna Cykl nweanlkowy CO, Mocznik Ryc. 31 - 3. Oglny przepyw azotu w kataboiizmie amino kwasw.
NH3
USUNICIE GRUPY < AMINOWEJ JEST WSTPN REAKCJ KAT ABOLIZMU AMINOKWASW Wolne aminokwasy? pochodzce z egzogennych biaek poywienia lub z degradacji biaek endogennych w procesach opisanych powyej, s metabolizowane w identyczny sposb. Ich a-aminowy azot jest najpierw usuwany albo przez transaminacj albo przez deaminacj ok -
348 / ROZDZIA 31
i hydroksyprolin. Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. 8-Aminowa grupa ornityny (ale nie e-aminowa grapa lizyny) atwo ulega transaminacji, tworzc 7-semialde-hyd glutaminianu (p. ryc. 32-3). W pewnych stanach chorobowych stenie transaminaz w surowicy jest zwikszone (p. Suplement). OKSYDAZA L-AMINOKWASOWA RWNIE PRZEKSZTACA 5- AMINOKWASY W ct-KETO KWASY Tlenowa przemiana wielu aminokwasw w odpowiadajce im ketokwasy zachodzi w wtrobie i nerkach ssakw. Chocia pr awie cala aktywno w stosunku do a -aminokwasw jest wynikiem wsplnego dziaania transaminaz i dehydrogenazy L-glutaminianowej, w wtrobie i nerkach ssakw jest rwnie aktywna oksydaza L- i D-aminokwasowa, enzym bardzo rozpowszechniony u innych zwierzt i drobnoustrojw. Oksydazy aminokwasowe s autoutleniajcymi si flawoproteinami Zredukowany FMN lub FAD oksydaz ami-nokwasowych jest ponownie utleniany bezporednio przez tlen czsteczkowy, tworzc nadtlenek wodoru (H2 Oj) bez udziau cytochro-
Ryc. 31-4. Transaminacja. Reakcj przedstawiono dla dwch a-aminokwasw i dwch ot-ketokwa-sw. Grupy nie ot-aminowe lub karbonylowe rwnie uczestnicz w transaminacji, chocia stosunkowo rzadko. Reakcja jest atwo odwracalna ze stal rwnowagi rwn ok. 1.
Plrogronlan
L-Alanlna a-Ketoglutaran
a A m l n o k w a s L-Glutamlnan a-Ketokwas a-Am ino kwas a-Ketokwas
Ryc. 31-5. Transaminazaalaninowa (gfira) itrans-amtnaza glutaminianowa (di).
dla innej pary, ktr moe tworzy jakikolwiek aminokwas z odpowiadajcym mu ketokwa-sem. Poniewa alanina jest take substratem w reakcji transaminazy glutaminianowej, cay azot aminowy z aminokwasw, ktre mog ulega transaminacji, moe by gromadzony w glutaminianie. Jest to wane, poniewa L-glutaminian jest jedynym aminokwasem w komrkach ssakw ulegajcym deaminacji oksydacyjnej ze znaczn szybkoci. Tworzenie amoniaku z grup tx-aminowych przebiega wic gwnie poprzez przemian w azot a-aminowy L-glutaminianu.
OKSYDAZA AMINOKWASOWA
Riw|n(
O
a-lmtnokwas
H jO
NH * -*' KATALAZA
O C
1 O a-Katokwas 140, 1
Transaminacja nie jest ograniczona do grup a-aminowych. Substratamj w
transaminacji jest wikszo aminokwasw (ale nie wszystkie). Wyjtki obejmuj lizyn, treonin oraz cykliczne iminokwasy proline
Ryc. 31-6. Deaminacja oksydacyjna katalizowana przez oksydaz L-aminokwasow (oksydoreduk taza L-a-aminokwas: O2). a-lminokwas w nawia sie nie jest trwaym produktem porednim. ______
mw Jub innych przenonikw elektronw (ryc. 31-6). Kata luz a, ktra powszechnie wystpuje w tkankach, szczeglnie w wtrobie, rozkada toksyczny H2O2 do O2 i HÔ. Chocia reakcje oksydazy a min o kwasowej s odwracalne, w nieobecnoci katalazy a -ketokwasowy produkt jest nieenzymatycznie dekarboksylowany przez H2O2 z utworzeniem kwasu karboksylo-wego uboszego o jeden atom wgla. Niemniej jest wtpliwe, czy ta dekarboksylacja zachodzi w jakim duym stopniu w nie uszkodzonych tkankach ludzkich. W reakcji oksydazy aminokwasowej (ryc. 31-6) aminokwas jest najpierw odwodorowany przez flawoproteine oksyda2y, tworzc a-imi-nokwas. Ten spontanicznie przycza czsteczk wody i rozkada si na odpowiedni a-keto-kwas z utrat oc-iminowego azotu w postaci jonu amonowego.
Dehydrogenaza ^lutaminianowa wykorzystuje jako kosubstratNAD+ lubNADP + . Reakcja jest odwracalna i przebiega zarwno w ka-taboJizmie, jak i biosyntezie aminokwasw. Jej zadaniem jest nie tylko oddzielenie azotu od giutaminianu i wbudowanie go do mocznika (kataboiizm), lecz take katalizowanie aminacji a-ketoglutaranu przez wolny amoniak (p. rozdz. 30).
AMONIAK WE KRWI POCHODZI TAKE Z AMONIAKU UTWORZONEGO PRZEZ BAKTERIE JELITOWE

Amoniak* wchania si z jelita do krwi yy wrotnej, w ktrej stenie amoniaku jest wiksze ni we krwi krenia oglnego. W warunkach prawidowych wtroba szybko usuwa amoniak z krwi yy wrotnej, tak e krew opuszczajca wtrob (i w rzeczywistoci caa krew obwodowa) jest faktycznie pozbawiona amoniaku. Jest to wane, skoro nawet znikome iloci amoniaku s toksyczne dla orodkowego ukadu nerwowego. Przy powanym upoledzeniu funkcji wtroby lub rozwiniciu obocznyeh pocze midzy yami wrotn i krenia duego (jak to moe zachodzi w marskoci wtroby), krew wrotna moe omin wtrob, przez co stenie amoniaku we krwi krenia oglnego moe si wwczas zwikszy do poziomu toksycznego.
DEHYDROGENAZA L-GLUTAMINIANOWA ZAJMUJE CENTRALN POZYCJ W METABOLIZMIE AZOTU

Grupy aminowe wikszoci aminokwasw w wyniku transaminacji s ostatecznie przeno-szone*na a-ketoglu taran z utworzeniem L-glu-taminianu (ryc. 31 -3). Uwolnienie azotu aminowego jako amoniaku jest katalizowane przez dchydrogenaz L-glutaminianow, enzym o duej aktywnoci, rozpowszechniony w wielu tkankach ssakw (ryc. 31-7). Dehydrogenaza glu-taminianowa wtroby jest enzymem regulato rowym, na ktrego aktywno wpywaj allos-teryczne modyfikatory, takie jak ATP, GTP i NADH, ktre hamuj enzym i ADP, ktry go aktywuje. Pewne hormony maj wpyw na aktywno dehydrogenazy glutaminia nowej in vuro.
NAD(P}
+
Zatrucie amoniakiem jest grone dla ycia
L-Glutamlnlan
a-KefogJutarari
Do objaww zatrucia amoniakiem nale drgawki, bekotliwa mowa, upoledzenie ostroci widzenia, a w cikich przypadkach piczka i zgon. Objawy te przypominaj symptomy zespou piczki wtrobowej, ktre wystpuj wwczas, gdy stenie amoniaku we krwi i prawdopodobnie w mzgu jest zwikszone. Uwaa si, e zatrucie amoniakiem jest czynnikiem etiologicznym piczki wtrobowej. Zatem leczenie jej polega na stosowaniu metod zmniejszajcych stenie amoniaku we krwi.
Ryc. 31-7. Reakcja katalizowana przez f dehyd-rogenaz L-gtutaminianow. NAD(P) + oznacza, e kosubstratem moe by albo NAD , albo NADP+. Reakcja jest odwracalna, ale stal rwnowagi uprzywilejowuje tworzenie giutaminianu.
* Obecny w fizjologicznym pH prawie wycznie jako jon amonowy ^
350 / ROZDZIA 31
TWORZENIE I WYDALANIE AMONIAKU PRZEZ NERKI UTRZYMUJE RWNOWAG KWASOWO-ZASAD OW Zawarto amoniaku we krwi yl nerkowych przewysza jego stenie w ttnicach nerkowych wskazujc, e nerki wytwarzaj amoniak, ktry przechodzi do krwi. Jednake wydalanie do moczu amoniaku wytwarzanego przez komrki kanalikw nerkowych stanowi najwaniejszy aspekt metabolizmu amoniaku nerkowego. Wytwarzanie amoniaku, wany mechanizm kanalikw nerkowych w regulacji rwnowagi kwasw o-zasad owej i zatrzymywania kationw, znacznie si zwiksza w kwasicy metabolicznej i maleje w zasadowicy. Ten amoniak nie pochodzi z mocznika, lecz z wewntrzkomrkowych aminokwasw, zwaszcza glutaminy. Uwalnianie amoniaku jest katalizowane przez nerkow glutaminaz (ryc. 31-8). Chocia amoniak moe by wydalany jako sole amonowe szczeglnie w kwasicy metabolicznej wikszo jego jest wydalana w postaci mocznika, gwnego skadnika azotowego moczu. Amoniak, stale produkowany w tkankach, ale obecny tylko w ladowych ilociach we krwi obwodowej (100 200 u.g/1), jest szybko usuwany z krenia przez wtrob i przeksztacany w glutaminian, glutamin lub w mocznik.
Syntetaza glutaminowa przeksztaca amoniak w nietoksyczn glutamin do transportu midzy tkankami O usuwaniu amoniaku przez dehydrogenaze glutaminianow wspomniano powyej. Tworzenie glutaminy jest katalizowane przez syn-tetaz glutaminow (ryc. 31-9), enzym mito-chondrialny, wystpujcy w najwikszych ilociach w tkance nerkowej. Synteza wizania amidowego glutaminy dokonuje si kosztem hydrolizy ATP do ADP i P ; . Reakcja jest dlatego silnie uprzywilejowana w kierunku syntezy glutaminy.
II C II O O L-Glutamlnl an Mg-ATP
u,
SYNTETAZA GLUTAMINOWA Mg-AOP NH* H^
L-Glutamirta
RYC. 31-9. Reakcja katalizowana przez syntetaz glutaminow. Reakcja silnie uprzywilejowuje syntez glutaminy.
L-Glutamlnlari
Ryc. 31 -8. Reakcja katalizowana przez glutamina-ze zachodzi w zasadzie nieodwracalnie w kierunku tworzenia glutaminianu i HH^. Naley zwrci uwag, e usuwany jest azot amidowy, a nie azot s-aminowy.
Glutaminaza i asparaginaza uwalniaj amoniak z glutaminy i asparaginy Uwalnianie azotu amidowego glutaminy w formie amoniaku zachodzi w wyniku hydro-litycznego usunicia amoniaku, katalizowanego przez glutaminaz (ryc. 31-8). W reakcji katalizowanej przez glutaminaz, w odrnieniu od reakcji katalizowanej przez syntetaz glutaminow, nie bior udziau nukleotydy adeninowe. Glutaminaza sprzyja tworzeniu glutaminianu, nie ma natomiast wpywu na syntez glutaminy. Syntetaza glutaminowa i glutaminaza kataiizu-j wzajemn przemian wolnego jonu amono wego i glutaminy (ryc. 31-10) w sposb przypominajcy wzajemn przemian glukozy i glukozo-6-fosforanu katalizowan przez glukokinaz i glukozo-6-fosfataze (p. rozdz. 18). Reakcja, analogiczna do reakcji katalizowanej przez glu-
KATABOLIZM BIA EK I A ZOTU AMINOK WASW / 351 Glu + Mg-ATP

Glu
Mg-ADP + P:
MIDZYNARZDOWA WYMIANA UTRZYMUJE STAE STENIE KRCYCH AMINOKWASW Utrzymanie stanu stacjonarnego ste ami nokwasw w osoczu midzy posikami zaley od rwnowagi netto midzy aminokwasami uwolnionymi z endogennych zapasw biakowych i wykorzystanymi przez rne tkanki. Minie wytwarzaj wicej ni 50% cakowitej puli wolnych aminokwasw, podczas gdy wtroba jest miejscem enzymw cyklu mocznikowego niezbdnych do usuwania odpadkw azotowych. Dlatego minie i wtroba odgrywaj gwn rol w okreleniu stenia krcych aminokwasw i ich wymianie. Minie. Alanina i glutamina odpowiadaj za ok. 50% cakowitego azotu ot-a mi no kwasowego uwolnionego z tkanki miniowej. Natomiast minie stale wychwytuj z krema mae iloci seryny, cysteiny i glutaminianu. Wtroba i jelito. Wtroba i jelito (tkanki trzewne) nieprzerwanie pobieraj z osocza znaczne iloci alaniny i glutaminy, gwne aminokwasy uwalniane przez minie. Wtroba jest najwaniejszym miejscem wychwytywania alaniny, za jelito glutaminy. W jelicie wikszo grup aminowych glutaminy uwalnia si z tej tkanki jako alanina lub wolny amoniak. Seryna jest take wychwytywana przez te same tkanki trzewne, jak rwnie przez minie. Nerki. Nerki s gwnym rdem uwal niania seryny; ponadto uwalniaj one mae, ale znaczce, iloci alaniny. Nerki pobieraj z krenia glutamin, prolin i glicyn. W ten sposb istnieje do cisa zgodno midzy uwalnianiem wikszoci aminokwasw z mini szkieletowych i ich wychwytywaniem przez tkanki trzewne. Mzg. Wychwytywanie waliny przez mzg przewysza pobieranie wszystkich innych aminokwasw przez ten narzd. Zdolno mzgu szczura do utleniania aminokwasw o rozgazionym acuchu (leucyna, izoleucyna i walina) jest co najmniej 4-krotnie wiksza ni mini i wtroby. Chocia w stanie poresorpcyjnym znaczne iloci tych aminokwasw o rozgazionym acuchu s uwalniane z mini, nie s one pobierane przez wtrob i dlatego istnieje moliwo, e mzg jest gwnym miejscem ich wykorzystania.
N \ i .'
Jon amonowy H,0
Glutamina
Ryc. 31 -10. Wzajemna przemiana amoniaku i glutaminy katalizowana przez syntetaze glutaminow i glutaminaz, Obie reakcje przebiegaj w kierun kach wskazanych strzakami. Glutaminaza katalizu je wycznie deamidacj glutaminy, natomiast syn-tetaza glutaminowa wycznie syntez glutaminy z glutarninianu. Glu glutaminian.
taminaz, jest katalizowana przez L-asparagi-naz zwierzt, rolin i bakterii. Zarwno aspa-raginaza, jak i glutaminaza byy badane jako czynniki przedwnowotworowe, gdy pewne nowotwory wykazuj nieprawidowo due zapotrzebowanie na glutamin i asparagin. Wtroba przeksztaca amoniak w mocznik Podczas gdy w mzgu gwnym mechanizmem usuwania amoniaku jest tworzenie glutaminy, w wtrobie najwaniejszym szlakiem jest tworzenie mocznika. Tkanka mzgowa moe tworzy mocznik, chocia to nie odgrywa wikszej roli w usuwaniu amoniaku. Tworzenie glutaminy w mzgu musi by w nim poprzedzone przez syntez glutarninianu, poniewa jego ilo dostarczana przez krew jest niewystarczajca w obecnoci duego stenia amoniaku we krwi. Bezporednim prekursorem glutarni nianu jest a-ketoglutaran, W ten sposb tworzenie glutaminy z amoniaku mogoby szybko pozbawi cykl kwasu cytrynowego zwizkw porednich, chyba e mog one by zastpione przez zwizki porednie powstae przez przyczenie CO2, tj. szczawiooctan powstay z przeksztacenia pirogronianu (p. rozdz. 18). W mzgu rzeczywicie zachodzi w duym stopniu wbudowywanie CO2 w aminokwasy, prawdopodobnie w cyklu kwasu cytrynowego, i po wnikniciu amoniaku wicej szczawi o octanu wcza si w syntez glutaminy (a nie asparagi-nianu) przez a-ketoglutaran.
352 / ROZDZIA 31
Zoony ukad wymiany midzyn a rzdowej charakteryzuje stan po resor pcyjny Rycina 3 1 -1 1 podsumowuje stan poresorp-cyjny. Wolne aminokwasy, szczeglnie alanina i glutamina, s uwalniane do krenia z mini.
Wtroba
Ryc. 31-11, Midzyn a rzd o wa wymiana amino kwasw w stanie poresorpcyjnym. Wykazano klu czo w role alaniny wrd aminokwasw uwol nionych z mini i jelita t wychwytywanych przez wtrob. (Reproduko wano za zgod z: Felig P.: Metabolizm amino kwasw u czo wieka. A nnu. Rev. Biochem, 1975; 44:937, Copyright 1975 przez A nnual Reviews. Inc).
Alanina, ktra okazuje si by rodkiem transportu azotu w osoczu, jest wychwytywana gwnie przez wtrob. Glutamina jest pobierana przez jelito i nerki, ktre przeksztacaj znaczn jej cze w alanin. Glutamina suy take jako rdo amoniaku do wydalania przez nerki. Nerki stanowi gwne rdo seryny wychwytywanej przez takie tkanki jak wtroba i minie. Aminokwasy o rozgazionym acuchu, zwaszcza walina, s uwalniane przez minie i pobierane gwnie przez mzg. Alanina suy jako kluczowy prekursor glukozy pochodzenia biaikowego, tj. kluczowy aminokwas glukoneogeniczny (ryc. 31-12). W wtrobie szybko syntezy glukozy z alaniny i seryny jest duo wiksza ni obserwowana w przypadku wszystkich innych aminokwasw. Zdolno wtroby do glukoneogenezy z alaniny jest ogromna, aie nie osignie ona nasycenia, a stenie alaniny nie bdzie rwne 9 mmol/1, tj. 2030-krotnoci jej poziomu fizjologicznego. Przewaga alaniny nad innymi a-aminokwasami wychwytywanymi z mini odzwierciedla jej syntez w miniu przez ransaminacj piro-gronianu.
WTROBA
MISIE
Gfukoza
iPlrogronian _Mocznik Alanina Aminokwasy
Alanina
Ryc. 31-12. Cykl glukoza- alanina. Alanina jest syntetyzowana w miniach, przez transami nacj po cho dzcego z gluko zy piro gro nianu, uwalniana do krwto biegu i wyc hwytywa na przez wtrob. W wtrobie szkielet wglowy alaniny jest przeksztacany w glukoz, ktra uwalniana do krwiobiegu jest wychwytywana przez miS nie i wykorzystywana do resyntezy alaniny. (Reproduko wano za zgod z: Felig P,: Metabolizm aminokwasw u czo wieka. Ann u. Rev. Biochem. 1975; 44:938, Copyright 1975 przez A nnual Reviews. Inc).

-Ala
Ryc. 31-13. Miedzy aminokwasw zaraz
narzdowa wymiana po posiku.
Midzy narzdowa wymiana rozgazionych aminokwasw nastpuje po

Misie 60% aminokwas w o acuchu rozgazio nym
Mocznik tworzy si z amoniaku, dwutlenku wgla i

Wtroba
posiku Po przyjciu boga to biakowego posiku, tkanki trzewne uwalniaj aminokwasy, gwnie z acuchem rozgazionym (ryc. 31-13), natomiast minie szkieletowe rwnie gwnie je wychwytuj. Aminokwasy te po przyjciu pokarmu s take utleniane w miniach i prawdopodobnie su jako gwne donory grup aminowych w transaminacji pirogronianu do alaniny. Aminokwasy o rozgazionym acuchu odgrywaj specjaln rol w metabolizmie azotu zarwno na czczo, kiedy dostarczaj mzgowi rda energii, jak i po posiku, kiedy s wychwytywane gwnie przez minie i zachowane przez wtrob. W miniach wydaj si one stanowi wane rdo energii oraz azotu. MOCZNIK JEST GWNYM KOCOWYM PRODUKTEM KATABOLIZMU AZOTU U LUDZI Umiarkowanie aktywny mczyzna, spoywajcy dziennie ok. 300 g wglowodanw, 100 g tuszczowi lOOgbiaka, musi wydala ok. 16,5 g azotu w cigu doby, przy czym 95% tej iloci jest wydalane przez nerki i pozostaie 5% z kalem. Gwnym szlakiem wydalania azotu u ludzi jest mocznik syntetyzowany w wtrobie, uwalniany do krwi i wydalany przez nerki. U ludzi pozostajcych na diecie spoywanej w pastwach zachodnich, mocznik stanowi 8090% wydalanego azotu.
23 Biochemia
asparaginianu w reakcjach cyklu mocznikowego Na rycinie 31-14 przedstawiono reakcje i zwizki porednie w biosyntezie 1 mola mocznika z 1 mola jonu amonowego, dwutlenku wgla (aktywowanego przez Mg2+ i ATP) oraz a-aminowego azotu asparaginianu. Cay proces wymaga 3 moli ATP (2 z nich s przeksztacane do ADP + Pi, a 1 w AMP + PP() i sukcesywnego udziau 5 enzymw katalizujcych reak cje ponumerowane na ryc. 31-14. Z 6 aminokwasw, uczestniczcych w syntezie mocznika, 1 (N--acetyloglutaminian) dziaa jako aktywator enzymu, a nie jako zwizek poredni. Pozostae 5 asparaginian, arginina, ornityna, cytrulina i argininobursztynianwszystkie dziaaj jako noniki atomw, z ktrych ostatecznie powstaje mocznik. Dwa z nich (asparaginian i arginina) wystpuj w biakach, podczas gdy pozostae 3 (ornityna, cytrulina i argininobursztynian) nie wchodz w skad biaek. Gwn funkcj metaboliczn tych 3 ostatnich aminokwasw u ssakw jest udzia w syntezie mocznika. Naley zwrci uwag, e wytwarzanie mocznika jest czciowo procesem cyklicznym. Ornityna wykorzystana w reakcji 2 jest regenerowana w reakcji 5. W ten sposb podczas syntezy mocznika nie ma adnych strat lub zyskw ornityny, cytruliny, argininobursztynianu lub argininy; natomiast zuywa si jon amonowy, CO2, ATP i asparaginian.
354 / ROZDZIA 31
2Mg-ATP
2M9-ADP + P,
HC - C O O TRANSKAflBAMOILAZA ORNfTYNOWA OOC-C H
Fu maran
coo C HZ -N H C QY\ SYNTETAZA AHGININO-BURSZTYN IANOWA COO" Arglnl nobursztynmn
coo-
Mg-ATP COO" -C-H

CO O" L-Asparagl rtian
AMP + Mg-PP,
Ryc. 31-14. Reakcje i produkty porednie biosyntezy mocznika. Grupy amino we biorce udzia w tworzeniu mocznika zaciemnio no. * E nzymy mitocho ndrialne.
Synteza karbamoiofosforanu z jonu amonowego i dwutlenku wgla wymaga 2 czsteczek ATP Tworzenie karbamoiofosforanu jest katali zowane przez syntetaz karbamoilofosforanow, enzym wystpujcy w mitochondriach wtroby wszystkich organizmw ureotelicznych, cznie z czowiekiem. 2 mole ATP, ulegajce w czasie tej reakcji hydrolizie, dostarczaj siy napdowej do syntezy 2 wiza kowalencyjnych w kar-bamoilofosforanie wizania amidowego i mieszanego wizania midzy kwasem karbo-
ksylowym a bezwodnikiem kwasu fosforowego. Oprcz Mg2 + wymagany jest kwas dwukarbo-ksylowy. preferencyjnie N-acetyloglutaminian. Jego obecno powoduje gbok zmian kon-formacyjnij w strukturze syntetazy karbamoilo-fosforanowej, w wyniku ktrej pewne grupy suifhydrylowe zostaj wyeksponowane, inne schowane, a ponadto wpywa on na powinowactwo enzymu do ATP. Syntetaza karbamoilofosforanowa dziaa w poczeniu z mitochondrialn dehydrogenaz glutaminianow, przenoszc azot z glutaminia -
nu (i tym samym ze wszystkich aminokwasw; p. ryc. 31-3) na karbamoilofosforan i w kocu na mocznik. Podczas gdy stal rwnowagi reakcji katalizowanej przez dehydrogenaze glu-taminianow sprzyja raczej tworzeniu glutami-nianu ni amoniaku, to usuwanie amoniaku przez syntetaz karbamoilofosforanow i utlenianie a-ketoglutaranu przez enzymy cyklu kwasu cytrynowego w mitochondriach powo duj uprzywilejowanie katabolizmu glutami-nianu. Dziaanie to zwiksza obecno ATP. ktry, oprcz tego e jest substratem w syntezie karbamoilofosforami, pobudza jednokierunkowo aktywno dehydrogenazy glutaminianowej w stron tworzenia amoniaku. Kondensacja karbamoilofosforanu z ornityn tworzy cytrulin Utworzenie cytruliny +P ( wskutek przeniesienia reszty karb amo ii owej z karbamoilofosforanu na ornityn katalizuje transkarbamoila-za L-ornitynowa z mitochondriw wtroby. Reakcja jest bardzo swoista dla ornityny i rwnowaga reakcji przechyla si znacznie w stron syntezy cytruliny (ryc. 31-14). Kondensacja cytruliny z asparaginianem tworzy arguiinobursztynian W reakcji katalizowanej przez syntetaz ar-gininobursztynianow asparaginian i cytrulina cz si razem przez grup aminow asparagi-nianu. Reakcja wymaga ATP i jej rwnowaga przechyla si znacznie w stron syntezy ar-gininobursztynianu (ryc. 31-14). Rozszczepienie argininobursztynianu tworzy arginin i fumaran Odwracalne rozszczepienie argininobursztynianu do argininy i fumaranu katalizuje ar-gininobursztynaza, enzym wtroby i nerek ssakw. Reakcja przebiega na zasadzie eliminacji trans. Utworzony fumaran moe w reakcjach katalizowanych przez fumaraz i dehydrogenaze jablczanow przeksztaci si w szczawiooc-tan, ktry ulega trans animacji, regenerujc asparaginian. Rozszczepienie argininy uwalnia mocznik i odtwarza ornityn Reakcja ta zamyka cykl mocznikowy i regeneruje ornityn, substrat dla reakcji 2.
robie wszystkich organizmw ureotelicznych. Mniejsze iloci arginazy wystpuj take w tkance nerkowej, mzgu, gruczoach sutkowych, tkance jder i skrze. Co2+ lub Mn2+ aktywuj arginaz wtroby ssakw. Ornityn i lizyna s potencjalnymi inhibitorami kompetycyjnymi argininy.
ZNANE ZABURZENIA METABOLICZNE S ZWIZANE Z KAD REAKCJ CYKLU MOCZNIKOWEGO

Szybko syntezy mocznika ograniczaj reakcje katalizowane przez syntetaz karbamoilofosforanow (reakcja 1), transkarbamoilaz or-nitynow (reakcja 2) i arginaz (reakcja 5) (ryc. 31-14). Poniewa cykl mocznikowy przeksztaca toksyczny amoniak w nietoksyczny mocznik, wszystkie zaburzenia syntezy mocznika powoduj zatrucie amoniakiem. Najcisze zatrucia wystpuj w przypadkach, gdy blok metaboliczny dotyczy reakcji 1 lub 2 poniewa w wyniku syntezy cytruliny wystpuje pewnego stopnia kowalencyjne wizanie amoniaku z wglem. Klinicznymi objawami wsplnymi dla wszystkich zaburze cyklu mocznikowego s: wymioty w wieku niemowlcym, unikanie pokarmw bogatobiakowych, ataksja przerywana, nerwowo, letarg i opniony rozwj umysowy. Objawy kliniczne i leczenie wszystkich 5 omwionych poniej zaburze s podobne. Znaczn popraw obserwuje si przy spoywaniu pokarmw o maej zawartoci biaka, co moe w duym stopniu zapobiec uszkodzeniu mzgu. Aby unikn gwatownego zwikszenia stenia amoniaku we krwi, poywienie naley rozoy na czste, niewielkie posiki. Hiperamonemia typu I. Opisano ok. 24 przypadkw niedoboru syntetazy karbamoilo-fosforanowej (reakcja 1, ryc. 31-14). Jest to prawdopodobnie zaburzenie rodzinne. jest zwizane z chromosomem X i powoduje je niedobr transkarbamoilazy ornitynowej (reakcja 2, ryc. 31-14). U matek take wystpuje hiperamonemia i niech do pokarmw bogatobiakowych. Staym objawem jest zwikszone stenie glutaminy we krwi, pynie mzgowo--rdzeniowym i moczu. Przypuszczalnie odzwierciedl to zwikszon syntez glutaminy przez syntjaSe glutaminow spowodowan zwikszony nateniem amoniaku w tkankach.
Hiperamonemia typu I I . Zaburzenie to
Hydro-lityczne rozszczepienie grupy guanidynowej argininy katalizuje arginaza wystpujca w wt-
356 / ROZDZIA 31
Cytruinemi a. To rzadkie zaburzenie jest prawdopodobnie dziedziczone jako cecha rece-sywna. Znaczne iloci (12 g na dob) cytruliny wydalaj si z moczeni i zarwno w osoczu, jak i w pynie mzgowo-rdzeniowym stenie cyt-ruliny jest znacznie zwikszone. U 1 chorego zaobserwowano cakowity brak aktywnoci syntctazy argminobursztynianowej (reakcja 3, ryc. 31-14). U innego Kmdla cytmliny bya 25 razy wiksza od wartoci prawidowej. Sugeruje to mutacj powodujc znaczn, ale nie ,,letal-n", modyfikacj miejsca katalitycznego syn-tetazy. Cytrulina (i argininobursztynian; p. niej) moe suy jako nonik azotu, skoro zawiera ona azot przeznaczony do syntezy mocznika. Podawanie argininy zwiksza u tych chorych wydalanie cytruliny. Podobnie podawanie benzoesanu nasila wbudowywanie azotu amoniaku w hipuran przez glicyne fp. ryc. 33-1).
Acyduria argininobursztynianowa. Ta
rzadka, recesywnie dziedziczna choroba, charakteryzujca si zwikszonym steniem argini-nobursztynianu we krwi, pynie mzgowo-rdze-niowym i moczu, czsto wie si z wystpowaniem amliwych, rosncych kpkami wosw (trichorrhexis nodosa). Chocia s znane zarwno wczesne, jak i pniejsze pocztki choroby, pojawia si on a zawsze w 2 roku ycia i zazwyczaj koczy si zgonem w dziecistwie. Acyduria argininobursztynianowa jest skutkiem braku aktywnoci argininobursztynazy (reakcja 4, ryc, 31-14). Hodowane fibroblasty skry zdrowych ludzi zawieraj ten enzym, natomiast nie stwierdza si jego obecnoci w fib-roblastach chorych z acydemi argininobursz-tynianowa.. Argininobursztynaza nie wystpuje rwnie w mzgu, wtrobie, nerkach i erytrocytach chorych z tym zaburzeniem. Chocia mona je atwo zdiagnozowa. na podstawie dwuwymiarowej chromatografii bibuowej mo czu, po wybarwieniu pojawiaj si nieprawidowe plamki z powodu tendencji argininobursz-tynianu do tworzenia cyklicznych bezwodnikw, to potwierdzeniem rozpoznania jest pomiar erytrocytarnego stenia argininobursztynazy. W celu wczesnego wykrycia zaburzenia,
ten test mona przeprowadzi na krwi z ppowiny. Poniewa argininobursztynaza jest obecna w komrkach z pynu owodniowego, moliwa jest rwnie diagnoza przez nakucia owodni. Z powodw opisanych przy omawianiu cyt-rulinemii, podawanie argininy i benzoesanu sprzyja znacznemu wydalaniu azotu rwnie u tych chorych. Hiperargininetnia. To zaburzenie w syntezie mocznika charakteryzuje sie zwikszonym steniem argininy we krwi, pynie mzgowo--rdzeniowym, maym steniem arginazy w erytrocycie (reakcja 5, ryc. 31-14) i skadem aminokwasw w moczu przypominajcym lizyno-cys-tynuri. Prawdopodobnie skad ten odzwier ciedla wspzawodnictwo argininy z Hzyn i cysty n w reabsorpcji w kanaliku nerkowym. U chorych z hiperargininemi ubogobiakowa dieta zmniejsza stenie amoniaku w osoczu i powoduje zanik profilu aminoacydurii, obserwowanej w lizyno-cystynurii.
PIMIENNICTWO Adams E, Frank L: Metabolism of proline and the hydroxyprolines. Annu Rev Biochem 19K0;49:1005. Batshaw ML et al: Treatment of inbom errors of urea synthesis: Actwation of alternative pathways of waste nitrogen synthesis and escretion, JV Engl J Med 1982;3i:1387. Felig P: Amino acid metabolism in man. Annu Rev Biochem 1975;44:933. Msall M et al: Neurologie outeome in chiidren with inborn errors of urea synthesis: Outeome of urea-cydeenzymopathies. NEnglJMed 1984;3Jft]500. Rosenberg LE, Scriver CR: Disorders of amino acid metabolism. Chapter 11 in: Metabotic Contro! and Disease. Bondy PK, Rosenberg LE (cditors). Saunders, 1980. Stanbury JB et al: The Mctabolk Basis oj htherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983. Torchinsky YM: Tran sami na tion: Its discovery, biologicai and clinical aspects (1937-1987). Trends Biochem Sci 1987:12:115. Wellner D, Meister A: A srvey of inborn errors of amino acid metabolism and transport in man. Annu Rev Biochem 19S1;5O:911.
Katabolizm szkieletw wglowych aminokwasw

Victor W. Rodweil, PhD
32
WPROWADZENIE
Ten rozdzia dotyczy przeksztacenia szkieletw wglowych, pospolitych L-aminokwasw w amfiboliczne zwizki porednie oraz chorb metabolicznych lub wrodzonych wad metabolizmu" skojarzonych z tymi szlakami metabolicznymi.
Historycznie niektre zaburzenia w metabolizmie aminokwasw odegray kluczow rol w wyjanieniu szlakw, w ktrych u zdrowego czowieka aminokwasy ulegaj przemianie. Chorob y te nale do rzadkoci i wydaje si mao prawdopodobne, aby miaa z nimi do czynienia, wikszo lekarzy praktykw. Zaburzenia te jednak stary si gronym wyzwaniem dla psychiatry, pediatry, konsultanta z genetyki albo biochemika. Wykrywa si je najcz ciej u dzieci. Niejednokrotnie s przyczyn mierci we wczesnym wieku i nie leczone powoduj czsto nieodwracalne uszkodzenia mzgu. Istotne jest wczesne ich rozpoznanie i natychmiastowe, jeeli to moliwe, podjcie waciwego leczenia. Niektre enzymy zwizane z wadami metabolizmu aminokwasw daj si wykry w hodowli komrek pynu owodniowego, wobec tego moliwa jest diagnostyka prenatalna przez nakucie o wodni. Obecne leczenie polega przede wszystkim na stosowaniu diety ubogiej w aminokwasy, ktrych katabolizm jest uszkodzony. Technologia rekombinacji DNA moe ewentualnie dostarczy rodka korygujce go wady genetyczne w wyniku terapii genowej". Te zaburzenia metaboliczne s wyrazem mu-
tacji genetycznych powodujcych wytwarzanie biaek o zmodyfikowanych strukturach pierw-szorzdowych. Podczas gdy niektre zmiany w sekwencji aminokwasowej enzymw maj tylko niewielki wpyw albo nawet nie okazuj adnego wpywu, inne mog gboko narusza struktur trzeciorzdow centrw katalitycznych lub regulatorowych. Zmodyfikowany lub zmutowany enzym moe mie zmienion skuteczno katalityczn (maa warto Vmai(S, bd dua Km), albo zaburzon zdolno wizania allosterycznego regulatora jego aktywnoci. Rnorodne mutacje mog wywoywa te sam chorob, np, jaka mutacja, ktra znacznie zmniejsza funkcj katalityczn liazy arginino-bursztynianowej (p. ryc. 31-14), wywoa wad metaboliczn znan jako kwasica (acydemia) argininobursztynianowa. Jest jednak wielce nieprawdopodobne, aby wszystkie przypadki tej kwasicy reprezentoway t sam zmian struktury pierwszorzdowej liazy argininoburszty-nianowej. Na poziomie czsteczek s to odrbne choroby molekularne. Niektre znane zabu rzenia metabolizmu aminokwasw omwiono w tym rozdziale. Po inne przykady Czytel nik powinien sign do waniejszych publikacji przegldowych, ktre specjalizuj si w tym zagadnieniu, np. Scriver i wsp. The Meabolic Basie of Inherited Disease, wyd. 6, 1989.
AMINOKWASY S PRZEMIENIANE W SUBSTRATY DO BIOSYNTEZY WGLOWODANW I LIPIDW

Prace badawcze z okresu 19201940 dotyczce odywiania, potwierdzone przez dowiadczenia przeprowadzone w latach 19401950,
358 / ROZDZIA 32
Ac8ioacetyto-CoA
Asparagmtan
Lys Phe Trp Tyr
Asn
Tabela 32-1. Losy szkieletw wglowych po wszechnie wystpujcych L- a -aminokwasw Aminokwasy przeksztacone w amfiboliczne zwizki porednie tworzce glikogen i tuszcza glikogen tuszcze (aminokwasy (aminokwasy (aminokwasy iatukoaenne ketogenne} glukogenne) ketogenne)
Ala Arg Asp
Cys
Ryc. 32-1. Amfiboliczne produkty porednie po-wstajce ze szkieletu wglowego aminokwasw.
kwas moe by przemieniany b w wglowodan (13 aminokwasw), tuszcz (1 aminokwas), bd w oba typy tych zwizkw (5 aminokwasw) (tab. 32-1). Rycina 32-1 przedstawia przebieg owych wzajemnych przeksztace.
Hyp Met Pro Ser Thr Val
Leu
Ile Lys
Glu Glv His
Phe Trp Tyr
REAKCJ WSTPN DLA WIELU AMINOKWASW JEST USUNICIE AZOTU (-AMINOWEGO

Usunicie azotu ac zazwyczaj (ale nie zawsze, przykadem: prolina, hydroksyprolina, lizyna) obejmuje transaminacj. A20t ten, jak tylko zostanie usunity, moe by wykorzystany w procesach anabolicznych (np. w biosyntezie biaka) Jub przeksztacony w mocznik i wydalony. Pozostajcy szkielet wglowy, wolny od azotu, w wikszoci przypadkw jest utlenionym wglowodorem, ulegajcym degradacji do ainfibolicznych zwizkw porednich w reak -
z uyciem aminokwasw znakowanych izoto-powo, podtrzymay pogld, o wzajemnej przeksztaca Inoci atomw wgla tuszczu, wglowodanu i biaka oraz ustaliy, e kady amino-
KATAB0L1ZM SZKIELETW WGLOWYCH AMINOKWASW / 359
H.O
CT
PYR
ALA
|ASPARAGINAZA I
COO" L-Asparaglna
H - C - l AMINOTRANSFERAZ/ COO L-Asparaginian
C-0
cocr
Szczawiooctan
NH. CHj,
PYR
CH;
ALA
c=o
I COO"
H,o
V
COO" L-Glutamlna GLUTAMINAZA
AMINOTRANSFBWA L-Giulamlnlan
a-Ketag tu taran
coo -
Ryc, 32-2. Katabolizm L-asparaginy (gra) i L-glutaminy (dl) w amfiboliczne zwizki porednie. PYR pirogronian, ALA L-alanina. Zaciemnienie grup funkcyjnych na tej rycinie i nastpnych uwydatnia czci czsteczek ulegajce przemianie chemicznej.
cjach podobnych do tych, przy udziale ktrych inne utlenione wglowodory s katabolizowa-ne. Deamidacja asparaginy dostarcza asparaginianu, ktry ulega transami nacji, tworzc szczawiooctan Wszystkie 4 wgle asparaginy i asparaginianu przeksztacaj si w szczawiooctan przy udziale asparaginazy i aminotransferazy (ryc. 32-2, gra). Nie jest znana wada metaboliczna zwizana z tym krtkim szlakiem kata bo licznym. Wada w transaminacji moe mie konsekwencje, ktre nie s do pogodzenia z yciem, poniewa aminotransferazy speniaj centralne funkcje zarwno w anabolizmie, jak i w katabolizmie. Deamidacja glutaminy dostarcza glutaminianu, ktry ulega transami nacji, tworzc a -ketoglutaran Katabolizm glutaminy i glutaminianu przebiega podobnie jak asparaginy i asparaginianu, ale z powstaniem ct-ketogmtaranu (2-okso-glutaranu*) (ryc. 32-2. dl). Wprawdzie zarwno glut a mi nia, jak i asparaginian s substrata-mi dla tej samej aminotransferazy, deamidacj asparaginy i glutaminy katalizuj odrbne en zymy: glutaminaza i asparaginaza.
Przyp. tum.
Prawdopodobnie z powodw podanych powyej dla asparaginy i asparaginianu nie s znane wady metaboliczne szlaku katabolicz-nego glutamina glutaminian. Wszystkie 5 atomw wgla proliny tworz -j-ketoglutaran Prolina utlenia si do dehydroproliny, ktra po przyczeniu czsteczki wody tworzy y-se-mialdehyd glutaminianu. Ulega on utlenieniu do glutaminianu i transaminacji do ot-keto-glutaranu (ryc. 32-3, na lewo). Opisano 2 genetycznie odrbne hiperproline-mie, obie jako wyranie autosomalne cechy recesywne. Pomimo opnienia w rozwoju umysowym w poowie znanych przypadkw, aden typ nie zagraa yciu. Hiperprolinemia typu I. Miejscem bloku metabolicznego w tej hipcrprolinemii jest dehy-drogenaza prolinowa (ryc. 32-3). W przeciwiestwie do hiperprolinemii typu II, brak tu uszkodzenia katabolizmu hydroksyproliny. Hetero-zygoty typu I wykazuj tylko agodn hiper-prolinemi. Model zwierzcy, mysz Pro/Re, ma tylko 10% aktywnoci dehydrogenazy prolino-wej prawidowej wtroby, czny jest umiejscowiony w dehydrogenazie, ktra katalizuje utlenianie 7-semialdehydu glutaminianu do glutaminianu (ryc. 32-3). Enzym ten funkcjonuje w katabolizmie hydroksy proliny (p. niej). Okazuje on zatem wpyw zarwno na
Hiperprolinemia typu I I . Blok metaboli-
360 / ROZDZIA 32
DEHYDROGENAZA PROLINOWA REAKCJA NIEENZYMATYCZNA L-Ornltyna NH/ a-Keloglutaran AMINOTHANSFERAZA
y-Se ml aldehyd L-glutamlnlanu
NAD"
0EHYDH0GENA2A SEMIALDEHYDO-L-GLUT AMINOWA
NADH+H+
CH
L-Glutammlan
i
^ -P y r ^-Al a O
AMIOTRANSFEHAZA|
(
n-Ketoglutaran
Ryc. 32-3. Katabo lizm pro liriy (na lewo) 1 L-argininy (na prawo) w a- ketoglularan. Cyfry w kkach zaznaczaj miejsca wad metabo licznych. 1 hiperpro linemia typu I, 2 hiperpro linemia typu II, 3 hiperargininemia (p. rozdz. 31),
KATABOLIZM SZKIELETW WGLOWYCH AMINOKWASW / 361
katabolizm proliny, jak i hydroksyproliny, a mocz zawiera A^pirolinoO-hydroksy^-kar-boksytan, kataboiit hydroksyproliny (p. ryc. 32-12). Heterozygoty typu II, niepodobnie do heterozygot typu I, nie wykazuj adnej hiper-prolinemii. Arginaza przeksztaca arginin w ornityn, ktra, ulegajc transaminacji na wglu s, tworzy oc -ketoglutaran Wprawdzie arginina i histydyna rwnie tworz a-ketoglutaran, najpierw z tych 6-wglo-wych aminokwasw musz zosta usunit e: 1 atom wgla oraz 2 (histydyna) lub 3 (arginina) atomy azotu. W przypadku argininy proces ten wymaga tylko 1 etapu; hydroli ty czne go usunicia grupy guanidynowej. katalizowanego przez arginaz. Produkt reakcji, ornityna, ulega wtedy transaminacji na grupie 5-amitiowej, two rzc y-semialdehyd glutaminianu, ktry przeksztaca si w a-ketoglutaran w sposb opisany powyej dla proliny (ryc. 32-3). Hiperargininemi, zaburzenie metaboliczne spowodowane niedoborem arginazy, omwio no w rozdz. 31 wraz z wadami metabolicznymi cyklu mocznikowego, Katabolizm histydyny ostatecznie dostarcza oc-ketoglutaranu W przypadku histydyny usuniecie zbdnego atomu wgla oraz azotu wymaga 4 reakcji (ryc. 32-4). Deaminacja histydyny wytwarza uroka-nian. Przeksztacenie urokanianu w 4-imidazo-Iono-5-propioaian, katalizowane przez uroka-naz, obejmuje zarwno przyczenie czsteczki wody, jak i wewntrzczsteczkowa reakcj ok-sydoredukcyjn. Wprawdzie 4-imidazolono-5--propionian moe sie wczy w dodatkowe szlaki metaboliczne, jego przeksztacenie w a-ketoglutaran obejmuje hydroliz do N-formiminoglutaminianu, a nastpnie przeniesienie grupy formiminowej na wgiel ot tet-rahydrofolianu, z utworzeniem N5-fonnimino-tetrahydrofolianu. U chorych z niedoborem kwasu foliowego zachodzi czciowe lub cakowite zablokowanie tej oslatniej reakcji i N-formiminoglutaminian (Figlu) jest wydalaRvc. 32-4. Katabolizm L-histydyny w a-keto-gfutaran. Reakcja katalizowana przez amonia-ko-liaz histydynow (Inaczej: histydaza nazwa nie zatecana) reprezentuje miejsce prawdopodobnej wady metabolicznej w histydynemii.
AMONIAKO-LIAZ A HISTYDYNOW
HYDRATAZA UR0KAN1AN0WA (UROKANAZA)
O
H,folian -
o
FORM1MINOTRANS FEH AZA GLUTAM1NIAN0WA
N- Fo rm Im inog! utam i n ia n (Figlu)
N-Formi(nino -H,folian
L-G lutami nia
[AMINOTRANFERAZAJ
4
a-Kato gluta ran
362 / ROZDZIA 32
ny w moczu. To stao si podstaw testu na niedobr kwasu foliowego. Polega on na wykrywaniu w moczu N-formiminoglutaminianu po wprowadzeniu duej dawki histydyny. Histydynemia jest dziedziczona jako auto-somalna cecha recesywna. Ponad polowa dotknitych ni osb jest opniona w rozwoju umysowym i wykazuje charakterystyczn wad wymowy. W uzupenieniu do zwikszonych zawartoci histydyny we krwi i w moczu zwiksza si wydalanie imidazolopirogronianu (ktry w barwnej prbie z chlorkiem elazowym moe by pomylony z fenylopirogronianem i sta si przyczyn bdnego rozpoznania fenyloketonu-rii). Metaboliczn wad w histydynemii jest niedostateczna aktywno w wtrobie amonia -ko-liazy histydynowej (inaczej: histydazy nazwa nie zalecana), co uszkadza przeksztacanie histydyny w urokanian (ryc. 32-4). Sprzyja to transami nacji do imidazolopirogronianu. W moczu wydala si nadmiar imidazolopirogronianu, a take produktw jego redukcji, tj. imidazolooctanu oraz imidazolomleczanu. Wydatne zwikszenie wydalania histydyny cechuje prawidow ci. Jest to odzwierciedleniem zmian w czynnoci nerek. 6 AMINOKWASW TWORZY PIROGRON1AN Wszystkie atomy wgla glicyny, alaniny, cy-steiny i seryny ale tylko 2 atomy wgla treoniny formuj pirogronian, ktry moe by nastpnie przeksztacony w acetylo -CoA.
L-Treonina
H^Folian
Mety ten oH41o!lan
m
O
L-Seryna
Gil cyna
Ryc. 32-5. atwo odwracalna reakcja hydroksy-metylotransferazy serynowej. H4 foilan tetrahyd-rololian.
Glicyna I L-Sery na Cysty na
L-
L- Alanina - Pirogronian*-L-Cystei na
wane przez kompleks syntazy glicynowej. Ta odwracalna reakcja (ryc. 32-6) pod niektrymi wzgldami przypomina przemian pirogronia-nu w acetylo-CoA przy udziale enzymw kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. Oba kompleksy stanowi makromolekularne agregaty w mitochondriach wtroby. Reakcje systemu rozszczepiajcego glicyn s prawdopodobnie gwn drog nie tylko w katabolizmie glicyny, lecz take seryny u ludzi i wielu innych krgowcw. Glicynuria. To rzadko wystpuj ce zaburzenie charakteryzuje si nadmiernym wydala niem glicyny w moczu i tendencj do tworzenia szczawianowych kamieni nerkowych. Wydaje si ona by cech dominujc, prawdopodobnie sprzon z chromosomem X. Przy prawidowych steniach glicyny w osoczu, wydalanie tego aminokwasu w moczu siga 8,113,5 mmol/24 h (6001000 mg/24 h), wobec czego glicynuri przypisuje si niewydolnoci wchaniania zwrotnego (Inaczej: reabsorpcji) glicyny w kanalikach nerkowych. zuje si cigym, wzmoonym wydalaniem w moczu szczawianw, niewspmiernym do ich pobierania w poywieniu. W nastpstwie postpujcej obustronnie szczawiano-wapnio-wej kamicy moczowej, wapnicy nerek {neph-rocakinosis) i nawracajcego zakaenia drg moczowych dochodzi w dziecistwie lub we wczesnej modoci do zgonu z powodu niewydolnoci nerek lub nadcinienia. Nadmiar szczawianw najwidoczniej pochodzi z glicyny, ktra moe ulec deaminacji do glioksylanu, prekursora szczawianu. Wada metaboliczna jest zaburzeniem przemiany glioksyjanu zwizanym z zaburzeniem w katabolizmie glioksylanu, ktrego nadmiar utlenia si do szcza wianu.
Pierwotna hiperoksaluria. Charaktery-
Acetylo-CoA
Katabolizm glicyny przebiega z udziaem rozszczepiajcego j systemu Wprawdzie glicyna moe utworzy pirogro nian w wyniku przeksztacenia w seryn (ryc. 32-5), gwny szlak katabo]izmu glicyny u krgowcw obejmuje przeksztacenie w CO2, NH + i Ns , N'-metylenotetrahydrofolian, katalizo-

H.Follan PLP
SYNTAZA GLICYNOWA
,O~ + NAD
*-
NH4 + + NAOH + H +
o
Gllcyna Ryc. 32-6. Odwracalne przesunicie glicyny przez mitochondrialny kompleks syntazy glicynowej. PLP fosforan pirydoksalu.
NH
HX
HO
T o
NH L-Alanina
L-Seryna
' -c-"
DEHYDRATAA 1 SERYNOWA
Ryc. 32-7. Przemiana alaniny i seryny w pirogronian. Reakcje katalizowane zarwno przez aminotrans-feraz alaninow, jak i dehydrataz serynow wymagajc fosforanu pirydoksalu. Reakcja katalizowana przez dehydrataz serynowg przebiega z usuniciem czsteczki H2O z seryny, tworzc nienasycony aminokwas. Ten jest przeorganizowany w cc-iminokwas, ktry samorzutnie hydrolizuje do pirogronianu i amoniaku. Glu glutami nia, oc-KG a-ketoglutaran.
Tran sam i nacja alaniny dostarcza pirogronianu Pirogronian utworzony w wyniku transami-nacji alaniny (ryc. 32-7) moe by dekarbok-sylowany do acetylo-CoA, w reakcji katalizowanej przez kompleks dehydrogenazy pirogro-nianowej. Prawdopodobnie, z przyczyn wymienionych przy katabolizmie glutaminianu i asparaginia-nu, nie wykryto adnego metabolicznego zaburzenia w katabolizmie a-alaniny. Katabolizm seryny przebiega poprzez jej przeksztacenie w glicyn Przemiana seryny w pirogronian, katalizowana przez dehydrataz serynow, enzym z fosforanem pirydoksalu, obejmuje usunicie czsteczki wody i hydrolityczn strat amoniaku z intermediatu aminokwasu (ryc. 32-7). Wprawdzie w wtrobie szczura i winki morskiej przeksztacenie seryny w pirogronian katalizuje de-hydrataza serynow, u czowieka i wielu innych krgowcw seryna rozpada si gwnie do glicyny oraz N5,N1(1-metylenotetrahydro foliami. Reakcj pocztkow katalizuje hydroksymety-lotransferaza serynowa (ryc. 32-5). Dalszy katabolizm seryny pokrywa si z katabolizmem glicyny {ryc. 32-6).
Reduktaza cystynowa redukuje cystyn do cysteiny Siarka, podobnie jak wgiel i azot, ulega cigej recyklizacji w biosferze w wyniku zespolonych aktywnoci metabolicznych organizmw prokariotycznych i eukariotycznych. Ssaki uczestnicz w tym cyklu przez katabolizm organicznych zwizkw siarki w nieorganiczne. Na przykad czowiek wydala 2030 mmol siarki na dob, przewanie w postaci nieorganicznych siarczanw. Gwnym katabolicznym przeznaczeniem cy-styny u ssakw jest jej przeksztacanie w cys-tein, katalizowane przez reduktaz cystynowa (ryc. 32-8). Katabolizm cystyny czy si nastpnie z katabolizmem cysteiny. Przeksztacenie cysteiny w pirogronian moe obejmowa wstpn reakcj utleniania Katabolizm cystein y odbywa si w 2 szla kach: bezporedniego utleniania (suliinian cysteiny) i szlaku transaminacji (3-merkaptopiro-gronian). Przeksztacanie cystyny w sulfinian cysteiny (ryc. 32-9) jest katalizowane przez dioksygenaz cysteinow, enzym wymagajcy Fe2+ i NAD(P)H. Dalszy katabolizm cysteino-sulfinianu obejmuje prawdopodobnie transami-
364 / ROZDZIA 32
REDUKTAZA CYSTYNOWA!

&
! CH,
II O
NADH + H
NAD L-Cy
O " II
slyna Ryc. 32-8. Reakcja katalizowana przez reduktaze cystynowa
L-Cystelna
NH3
T O
Cystelna [O]
DIOKSYGENAZA \ CYSTEINOWA a-K eto kwas AMiNOTRANSFERAZA
{(-Aminokwas L-Cysteinosulfinlfln
H,C'^C'0"
a-Aminokwas
C II O
3-Markaptoptrcgranian (to pirg ronlan)
Plrogronian
C
DEKYDROGENAZA MLEC2AN0WA
0-Sufflnylopirooronlan [SWHKOTHANSFE
DESULFINAZA
2H HXS
NADH H NAD
+
h 2"
C
3-Merkaptomleczan
HS
Plrogronlan
Ryc. 32-9. Katabolizm L- cysteiny na szlaku bezporedniego utlenienia (cysteinosulfinian) (na lewo) oraz na szlaku transaminacji (3-merkaptopirogronian) (naprawo), p-sulfinylopirogronian jest przypuszczalnym zwizkiem porednim. Utlenienie siarczynu, utworzonego w ostatniej reakcji na szlaku bezporedniego utleniania, jest katalizowane przez oksydaz siarczynow, st-KA a-ketokwas, a-AA a-aminokwas.
nacj do [-sulfinylopirogronianu, chocia ten katabolit powinien by jeszcze wyizolowany. Przeksztacenie p-sulfinylopir ogromami wpiro-gronian i suMInian moe nie by katalizowane enzymatycznie. Desulfinacja zachodzi niezwykle szybko, nawet w nieobecnoci katalizy enzymatycznej. Wstpna transaminacja cysterny dostarcza 3-merkaptopirogronianu Swoiste aminotransferazy: cysteinowa oraz glutaminianowa bd asparaginianowa z wtroby i nerek ssakw katalizuj odwracaln transaminacj cysteiny w 3-merkaptopirogro-nian (tiolopirogronian) (ryc. 32-9). Czsteczka 3-merkaptopirogronianu moe nastpnie zo sta zredukowana przez dehydrogenaz L-mle-czanow. Produkt, 3-merkaptomleczan, prawidowy skadnik moczu ludzkiego w postaci jego mieszanego disiarczku z cystein, wydala si w zwikszonych ilociach z moczem chorych
disulfiduri merkaptomleczano -cys teinow. Al-
nia atomu siarki*^ tworzc pirogronian i H2S (ryc. 32-9). W tabeli 32-2 podsumowano znane zaburzenia katabolizmu aminokwasw siarkowych.
Cystynuria (cystyno-lizynuria) W tej

dziedzicznej chorobie metabolicznej wydalanie cystyny z moczem przewysza 2030-krotnie wartoci prawidowe. Towarzyszy temu rwnie znaczne zwikszenie wydalania lizyny, ar-gininy i ornityny, co sugeruje upoledzenie mechanizmw wchaniania zwrotnego w nerkach tych 4 aminokwasw. Cystynuria" jest wic nazw niewaciw. Cystyno-lizynuria moe by teraz preferowanym terminem opisowym tej choroby. Z powodu wzgldnej nierozpuszczalnoci cystyny, u chorych z cystynuria wytrca si ona w kanalikach nerkowych i tworzy kamienie cystynowe. Gdyby nie moliwo takiego powikania, cystynuria byaby zupenie nieszkodliw wad.
Przyp. tlura.
ternatywnie, de-sulfuracji odszczepie-
3-merkaptopirogronian ulega (odsiarczaniu, ij. reakcji
Tabela 32-2. Wrodzone wady w metabolizmie aminokwasw zawierajcych siai k Nazwa Odsyacze Wada Hornocystynuria 1 Homocystyrturia II Homocystynuria III f)-syntaza cystati on inowa 5 T0 Reduktaza N ,N -mety len otetra hydro-folianowa Maa aktywno transmetylazy s N -mety-lotetrahydrofoliano-homocyste i nowej wskutek niezdolnoci do syntezy merylo-kobalaminy Maa aktywno transmetylazy s N -mety-lotetrahycirofoliano-homocyst einowej wskutek zaburzenia wchaniania kobala-mirsy w jelicie Adenozylotransferaza metioninowa wtroby* y-Liaza cystationinowa (cystationaza) Oksydaza siarczynowa Ryc. 32-22 Ryc. 30-9, reakcja 2 Ryc. 32-9, legenda
Ryc 30-9, reakcja 1
Homocystyrturia IV
Hipermeiioninemia Cysta tionimiria Sulftturia (sulfocysieinuria)
Cysrynoza 2Laburzenie funkcjonowania lizosomw Disulfiduri Siarkotransferaza Ryc. 32-9 3-merkaptopirogro-niano-cystein 3-merkaptopirogro-nianowa owa Syndrom niedostatecznej absorp- Niewydolno wchaniania metioniny z cji metioniny jelita Moe rwnie wystpowa w cystationirturii, tyrozynemii i nietolerancji na fruktoz.
366 / ROZDZIA 32
CH 2 -$ - S -C H 2 HCNH3+ CO OCH2 HC NH, '
wstawa kosztem cysteiny, zmniejsza skonno do tworzenia krysztaw cystyny i kamieni. tyny). W cystynozie, ktra jest rwnie chorob dziedziczn, krysztay cystyny odkadaj si w wielu tkankach i narzdach (szczeglnie w ukadzie siateczko w o-rdbonko wy m). Towarzyszy jej zazwyczaj uoglniona aminoaey-duria. Inne czynnoci nerek s rwnie przewanie uszkodzone, a chorzy zwykle umieraj we wczesnym wieku z wszystkimi objawami ostrej niewydolnoci nerek. Homocystynurie. Czstotliwo wystpo wania tych wrodzonych wad katabolizmu me-tioniny ocenia si na ok. 1/160000 urodze. Ho-mocystyna (do 2,22 mmol/24 h = 300 mg/24 h),
Cystynoza (choroba spichrzania cys-
oo(Cystelna) (Homocysteina}
Ryc. 32-10. Mieszany disiarczek cysieiny i homo-cysteiny.
Mieszany disiarczek L-cysteiny i L-homocys-teiny (ryc. 32-10), wystpujcy w moczu chorych z cystynuri, jest nieco lepiej rozpuszczalny ni cystyna. Rozlego, w jakiej on moe po HO
^H +
Treonina
O CH3
Aldefryd octowy FAD EHYDROGENAZA ALDEHYDOWA
LALDOLAZA
TREONINOWA
^ H3 +
ROZSZCZEPIENIE GLICYNY (P- W- 32-
CO 2 + NH 4 +Metylen o-H4fo1lan
O
Gllcyna HYDROKSYME7YLOTHANSFERAZA SEHYNOWA H 4 F o il an * /
Mg-ATP
H2C HO
L-Seryna (p. ryc. 32-7) DEHYDHATAZA NH4- SEHYNOWA
Mg-ADP NADH+H i- Co A
O
Aoetyto-CoA
NAD " CO,
CoASH
Pircgronian
DEHYDBOGENAZA PIROGHONIANOWA
Ryc. 32-11. Przemiana treoniny i glicyny w seryn, pirogronian i acetylo -CoA, f B 10 -Hfolian formylo[5-10]tetrahydrofolian
w niektrych przypadkach wraz z S-adenozylo-metionin jest wydalana z moczem, a stenie metioniny w osoczu si zwiksza. Homocystynuria powoduje przynajmniej 4 wady metaboliczne (tab. 32-2). Kliniczne objawy towarzyszce homocystynurii typu I to: zakrzepica, osteoporoza (zrzeszotnienie koci), zwichnicie soczewek w oczach oraz czsto opniony rozwj umysowy. Znane s 2 postacie tej choroby, tj. wraliwa i niewraliwa na witamin Bfi. Zmianom chorobowym zapobiega stosowanie diety z mat zawartoci metioniny, a du cysteiny, jeeli zostao rozpoczte odpowiednio wczenie. Inne typy homocystynurii odzwierciedlaj wady w cyklu remetylacji (tab. 32-2). Aldolaza treoninowa inicjuje katabolizm treoniny Przy udziale aldolazy treoninowej treonina rozszczepia si do glicyny oraz aldehydu octowego, ktry tworzy nastpnie acetylo-CoA (ryc. 32-11). Katabolizm glicyny omwiono powyej. Katabolizm hydroksyproliny przypomina katabolizm proliny Czsteczka 4-hydroksy-L-proliny przeksztaca si w pirogronian i glioksylan (ryc, 32-12), Mitochondrialna dehydrogenaza katalizuje przeksztacenie hydroksyproliny w L-A1-piro-!ino-3-hydroksy-5-karboksylan. Pozostaje on w nieenzymatycznej rwnowadze z Y-semial-dehydem 7-hydroksy-L-glutaminianu, utworzonym po dodaniu czsteczki wody. Semial-dehyd utlenia si do odpowiedniego kwasu karboksylowego, e ry tro-y- hy dr oksy- L-gluta-minianu i ulega transaminacji do a-ket0-7-hydro ksyglutaranu. Rozszczepienie typu aldolowe-go dostarcza glioksylanu oraz pirogronianu. zuje si duym steniem 4-hydroksy pro liny w osoczu. Miejscem zaburzenia metabolicznego tej autosomalnej cechy recesywnej jest dehyd-rogenaza 4-hydroksy pro linowa (ryc. 32-12). W przeciwiestwie do hiperprolinemii typu II, nie towarzyszy temu uszkodzenie katabolizmu
DEHYDROGENAZA HYDROKSYPROLINOWA
L-A'-P iro II no -3-hyd roksy-5-karbo ksyl an
REAKCJA NIEENZYMATYCZNA
OH
4
y-Semlaldehyd y- hydroksy-L-gtutaminianu
NAD1
[2) [DEHYDROGENAZA
c^
1 1
cHf
cr
n
o
a-KA
o
[AM1NOTRANSFERAZA|
Erylro-y-hyd ro kay- L-glutamlnian
Hiperhydroksyprolinemia. Charaktery-
k'M,
-Keo -y-hydrokByglutaran ALDOLAZA
Ryc. 32-12. Zwizki porednie w katabolizmie L-hydroksyproliny, st-KA a-ketokwas, a-AA a-aminokwas. Cyfry w kku reprezentuj miejsca wad metabolicznych: 1 hiperhydroksyprolinemia, 2 hiperhydroksyprolinemia typu II.
II
Glioksylan
O
Pirogronian
368 / ROZDZIA 32
proliny, poniewa zaatakowany enzym funkcjonuje jedynie w katabolizmie hydroksyproli-ny. Stan ten nie ma adnego wpywu na metabolizm kolagenu i, podobnie do hiperproHnemii, wydaje si by nieszkodliwy. 12 AMINOKWASW TWORZY ACETYLO CoA Wszystkie aminokwasy tworzce pirogro-nian (alanina, cysteina, cystyna, glicyna, hydro-ksyprolina, seryna i treonina) dostarczaj acety-lo-CoA (przypomnij dehydrogenaz pirogro-nianow). Ponadto 5 aminokwasw formuje acetylo-CoA bez wstpnego wytwarzania piro-gronianu. Te obejmuj fenytoalanin, tyrozyn, tryptofan, lizyne i leucyn. 5 kolejnych reakcji przeksztaca tyrozyn w fumaran i acetooctan Kilka zwizkw porednich metabolizmu tyrozyny (ryc. 32-13) odkryto podczas badania choroby genetycznej u ludzi alkaptonurii. Chorzy z alkaptonuri wydzielaj homogen-tyzynian w moczu i wiele poytecznych informacji uzyskano przez ich odywianie prekursorami homogentyzynianu.
Izomeryzacja z nastpcz hydroliz tworzy fumaran oraz acetooctan. Prze-
nianowa nazwa nie zalecana), metaloproteina zawierajca elazo, otwiera piercie aromatyczny. Piercie benzenowy homogentyzynianu zostaje rozerwany, formujc maleiloacetooctan w reakcji oksydacyjnej katalizowanej przez 1,2-dioksygenaz homogentyzymanow wtroby ssakw.
ksztacenie maleiloacetooctanu w fumaryloace-tooctan, czyli izomeryzacj cis w trans, katalizuje izomeraza cis, trans maleiloacetooctanowa. W wyniku hydrolizy fumaryloacetooctanu, przy udziale hydrol azy fumaryloacetooctanowej (inaczej: fumaryloacetoacetazy), powstaje fumaran i acetooctan. Acetooctan moe nastpnie przeksztaci si w acetylo-CoA i octan w reakcji, ktr katalizuje acylotransferaza acetylo--CoA (inaczej: p-ketotiolaza nazwa nie zalecana) (p. rozdz. 23). Kilka zaburze metabolicznych charakteryzuje si tyrozynemi, tyrozynuri i fenyloacyduri Tyrozynemi typu I (tyrozynoza). W tyrozynozie nagromadzenie metabolitw niekorzystnie wpywa na aktywno kilku enzymw i systemy transportu. Patofizjologia jest zatem zoona. Wada metaboliczna tkwi przypuszczalnie w hydrolazie fumaryloacetooctanowej (ryc. 32-15) i prawdopodobnie rwnie w hydrolazie maleiloacetooctanowej. Znane s zarwno ostre, jak i przewleke postacie tyrozy-nozy. W ostrej tyrozynozie u niemowit wystpuje biegunka, wymioty, zapach przypomi najcy kapust" oraz brak prawidowego roz woju i wzrostu. Zgon z powodu niewydolnoci wtroby, w przypadku nie leczonej ostrej tyro-zynozy, nastpuje w cigu 68 miesicy, W ty-rozynemii przewlekej podobne, ale agodniejsze, objawy prowadz do zgonu w wieku 10 lat. W osoczu zwiksza si stenie tyrozyny (0,330,67 mmol/l = 612 mg/dl) jak rwnie dodatkowych aminokwasw, szczeglnie me-tioniny. Leczenie obejmuje diet z ma zawartoci tyrozyny i fenyloalaniny, a niekiedy take metioniny.
Transaminacja tyrozyny dostarcza p-hydroksyfenylopirogronianu. Transa-minacj tyrozyny do

p-hydroksyfenylopiro-gronianu katalizuje aminotransferaza tyrozy-nowa (aminotransferaza tyrozyna: a-ke togi u taran), tj. ulegajcy indukcji enzym wtroby ssakw.
Dioksygenaza4-hydroksyfenylopirogronianowa (inaczej: hydroksylaza p-hydro-ksyfenylopirogronianowa). metaloproteina zawierajca mied, utlenia p-hydroksy-fenylopirogronian do homogentyzynia nu. Chocia ta reakcja
(ryc. 32-13) wydaje si obejmowa hydroksylacj /7-hydroksyfenylopi-rogronianu w pooeniu orto, z towarzyszc oksydacyjn utrat wgla karboksy 1 owego, w rzeczywistoci polega ona na wdrwce acucha bocznego. Hydroksylacja piercienia i wdrwka acucha bocznego zachodzi w sposb zgrany. Ze wzgldu na to, e fizjologicznym czynnikiem redukujcym jest askorbinian, chorzy z gnilcem (szkorbutem) wydalaj niecakowicie utlenione produkty metabolizmu tyrozyny. Enzym 1,2-dioksygenaza homogenty-zynianowa (inaczej: oksydaza homogentyzy-
Tyrozynemia typu II (zesp Richne-ra-Hanharta). Prawdopodobnym
umiejscowieniem wady metabolicznej w tyrozynemii typu II jest aminotransferaza tyrozynowa wt roby (ryc. 32-13). Klinicznie stwierdzone zmiany obejmuj: zwikszone stenie tyrozyny w osoczu (0,22 0,27 nunol/l=4 5 mg/dl)
[O)
DIOKSYGENAZA < FEMYLOPIHOGRON1ANOWA Giutaiinn (O! Askorbinian, 'CO,
Homogantyzynlan
XH, g CH, Tc^

M AMINO-TR ANSFERAZA TYROZYNOWA
2 O"
**c
U
MX
II I -HYOROKSY-l RONLANOWA 1
o
p -Hydroksyfenylopirogrontan
Maldlo acetoodan (przepisano) II O
IZOMERAZA Cis. trans MALEILO-ACET OOCTANDWA 1,2-DIOKSYGENAZA tnOMOGENTYZYNIANOWA Maleiloacetaoctan
CD
Fumaryloacetooctan
r ;
N
H;O
~ CoA O Aoeylo-CoA
Fumaran
+
Aoetoootan
o c
CoA^SH
ACYLOTRAMSFEHAZA ACETYLO-CoA
!J
X
FUMARYL OACETOA CETAZA
O .T
O
Octan
I
z . o
Hyc. 32-13. Zwizki porednie w katabolizmie tyrozyny. Wszystkie reakcje, oprcz katalizowanej przez acylotrartsferaze acetylo -CoA, omwiono w tekcie. Ponumerowano atomy wgla zwizkw porednich, aby Czytelnik mg ledzi ostateczny los kadego z nich (p. te ryc. 32-15). ot-KG a-ketoglutaran, G)u glutaminian, PJ.P fosioran pirydoksatu. Cyfry w kkach reprezentuj prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 tyrozynemta typu II, 2 tyrozynemia noworodkw, 3 alkaptonuria, 4 tyrozynemia typu I lub tyrozynoza. __________________________
370 / ROZDZIA 32
uszkodzenia narzdu wzroku i skry oraz umiarkowane opnienie rozwoju umysowego. Tyrozyna jest jedynym aminokwasem, ktrego stenie w osoczu ulega zwikszeniu. Jednak tzw. klirens nerkowy i wchanianie zwrotne tyrozyny pozostaj w granicach prawidowych. Metabolitami wystpujcymi w osoczu s: ^-hydroksyfenylopirogronian, />-hydro ksyfeny-lomleczan, /?-hydroksyfenylooctan, N-acetylo-tyrozyna i tyramina (ryc. 32-14).
Tyrozynemia noworodkw (neonata-na). Jak sdzi si, zaburzenie to jest
wynikiem wzgldnego niedoboru hydroksylazy p-hydro-ksyfenytopirogronianowej (ryc. 32-13). Zwikszaj si stenia tyrozyny i (enyloalaniny we krwi, a w moczu tyrozyny, />-hydroksyfeny-
looctanu, N-acetylotyrozyny i tyraminy. Leczenie polega na stosowaniu diety ubogiej w bia ko. Alkaptonuria. To wrodzone zaburzenie metaboliczne, odnotowane ju w XVI stuleciu, scharakteryzowano w 1859 r. Choroba ma due znaczenie historyczne, staa si bowiem podstaw idei Garroda dotyczcych zaburze me tabolicznych. Najbardziej charakterystycznym objawem klinicznym alkaptonuni jest ciemnienie moczu przechowywanego na powietrzu. W pniejszym stadium choroby nastpuje uoglniona pigmentacja tkanki cznej (ochrono-za) i pewna posta zapalenia staww. Wad metaboliczn jest brak 1,2-dioksygenazy homo-gentyzynianowej (ryc. 32-13). Substrat, homo-
DEKARBOKSYLAZA TYROZYNOWA
AMINOTHANSFERAZA TYHOZYNDWA
OH
p-Hyd ro ksyfenyl oplfogranian OKSYOAZA TYHAMINOWA DEHYDROGENAZA
-NADH + HDEHYDROGENAZA I
NADH+H
OH
N-Acety] o-L-ty rozyn a
OH
p-Hyd ro ksyfenylooctan
p
p-Hyctfoksyfenyfom leozan
Ryc . 32 -14 . Alt er nat yw ne kat abolit y t yr ozyny; p - hydr oksyf enyl oacet al dehyd t w or zy si e j ako zwi zek por edni podczas utl eni ani a t yr am i ny do p - hydr oksyf enyl ooct anu.
KATABOLIZM S ZKIE LETW W GLOWYCH AMINOKWA SW / 371
gentyzynian, przechodzi do moczu, w ktrym w obecnoci powietrza utlenia si do ciemnobrzowego barwnika. Opisano ponad 600 przypadkw alkaptonurii. Czsto jej wystpowania szacuje si na 25/1000 000 urodzonych dzieci. Alkaptonuria dziedziczy si jako auto-somalna cecha recesywna. Dotychczas nie jest dostpne adne diagnostyczne postpowanie w celu wykrycia heterozygot. Mechanizm ochronozy obejmuje utlenianie homogentyzynianu prze2 lakkaz (inaczej: ok-sydaz polifenolow nazwa nie zalecana), tworzc octan benzochinonu, ktry polimeryzuje i wie si z wielkoczs teczkami tkanki cznej.
Octan banzochinonu
Hydroksylacja fenyloalaniny tworzy tyrozyn Fenyloalanina jest najpierw prz eksztacana w tyrozyn przez 4-monooksygenaz fenyloala-ninow (inaczej: hydroksylaza fenyloalanino-wa) (p. ryc. 30-10). Wzr znakowania w amfi-bolicznych produktach, fumaranie i acetooc-tanie(ryc. 32-15), jest wic taki sam jak w przypadku tyrozyny (ryc. 32-13).
r
H"
,H,-C OO-
"OO-
+ CH, CH,
Fumaran
Aeetooctan Dwutlenek wgla
Ryc. 32-15. Ostateczne losy kadego w gla feny-toalaniny. Obraz znakowania izotopowego w ostatecznych katabo litach lenyloalaniny (i tyrozyny).
Liczne zaburzenia metaboliczne cechuj szlaki katabolizmu fenyloalaniny Gwne zaburzenia metaboliczne z uszko dzon zdolnoci przeksztacania fenyloalaniny w tyrozyn (p. ryc. 30-12) mog by sklasyfikowane w 3 obszerne grupy: wady w 4-monook-sygenazie fenyloalaninowej (hiperfenyloalani-nemia typu I lub klasyczna fenyloketonuria), wady w reduktazie dihydrobiopterynowej (hi-perfenyloalaninemia typu II i III) oraz wady w biosyntezie dihydrobiopteryny (hiperfenyloal-aninemia typu IV i V). Zidentyfikowano jeszcze dodatkowe typy (tab. 32-3). Gwn konsekwencj nie leczonej hiperfeity-loalaninemii typu I (klasycznej fenyloketonurii; skrt PKU) jest niedorozwj umysowy. Dodatkowe kliniczne objawy obejmuj ataki padaczkowe, psychozy, wyprysk oraz zapach mysi". Mog one jednake nie pojawi si w przypadku wczesnego rozpoznania i podjcia waciwego leczenia. Ze wzgldu na to, e dostpno modeli zwierzcych i bezzwoczna interwencja dietetyczna mog zapobiec inaczej nieuniknionemu opnieniu w rozwoju umysowym, fenyloketonuria suya jako model w badaniach takiego niedorozwoju zwizanego z chorobami metabolicznymi. W klasycznej fenyloketonurii, dziedzicznym zaburzeniu o czstotliwoci wystpowania 1/10000 urodzonych dzieci, stenie komponentu I, tj. 4-monook-sydazy fenyloalaninowej wtroby (p. ryc. 30-10) stanowi w przyblieniu rednio 25% normy i enzym ten jest niewraliwy na 'CO, regulacj poprzez fenyloalanin. Ze wzgldu na uniemoliwione przeksztacenie fenyloalaniny w tyrozyn, u chorych wytwarzane s alternatywne kata-bolity(ryc. 32-16). Zaliczaj si do nich: fenylo-pirogronian (z deaminacji fenyloalaniny), feny-lomleczan (z redukcji fenylopirogronianu) i fe-nylooctan (z dekarboksylacji i utlenienia fenylo-pirogronianu). Dua cz fenylooctanu wydala si z moczem w postaci fenyloacetyl o glutaminy. Tabela 32-4 ilustruje chemiczny obraz krwi i moczu chorego z fenyloketonuria. Wprawdzie fenylopirogronian mona oznaczy za pomoc prostego biochemicznego testu plamkowego, ostateczne rozpoznanie wymaga wykrycia zwikszonego stenia fenyloalaniny w osoczu. Pogorszeniu sprawnoci umysowej dzieci dotknitych fenyloketonuria daje si zapobiec, jeeli spoywa si pokarmy z bardzo ma zawartoci fenyloaianiny. Przestrzegania diety mona zaprzesta w wieku 6 lat, kiedy to due
l_-Fenyto alanina
372 / ROZDZIA 32 Tabela 32-3. Hiperfenyloalaninemie" Typ Przypadek Fenyloketonuria Uporczywa hiperfenyloalamnemia Przejciowa agodna hiperfenyo alaninemia IV V VI VII Niedobr reduktazy dihydroptery-dy nowej Anormalna funkcja dihydrobio-pteryny Uporczywa hiperfenyoalaninemia i tyrozynemia Przejciowa neonatalna tyrozy-nemia Dziedziczna tyrozynemia Wada Brak 4-monooksygenazy lenyloalaninowej Niedobr 4-monooksygena-zy fenyloalaninowej Opnienie w dojrzewaniu 4-monooksygenazy lenyloalaninowej Niedobr lub brak reduktazy d i hy d ro pteryd y n o w e j Wada w syntezie dihydrobio-pteryny ? Katabolizm tyrozyny Zahamowanie dioksygenazy 4 - hyd roksy f en y I o p i rog ro -nianowej Niedobr: dioksygenazy 4-hydroksyfenyiopirog roni nowej cytoplazmatycznej aminoiransferazy tyrozynowej fumaryloacetoacetazy Dieta z ma zawartoci tyrozyny Leczenie Dieta z mat zawartoci feny loalaniny adne, albo czasem leczenie dietetyczne Jak w typie II
Dopa, 5-hydroksytryptofan, karbidopa Dopa, 5-hydroksytryptofan, karbidopa Zmniejszone pobieranie fe-nyloa taniny Witamina C
VIII
Dieta z ma zawartoci tyrozyny oraz wstrzykiwanie glutationu
* Zmodyfikowano i reproduko wano za zgod z: Tourian A, Sidbury JB: Phenytketonuria and hyperphenylalaninemia; s. 273 w: Stanbury JB i wsp. (redaktorzy); The Metabolic Basis of tnherited Disease, wyd. 5, McGraw-Hill, 1983.
Tabela 32-4, Metabolity fenyloalaniny, ktre gromadz si w osoczu i moczu chorych na fenytoketonuri Metabolit Osocze mmol/l (mg/ctl) prawidowe chory na feny lo-ketonu ric Mocz mmol/l (mg/dl) prawidowy 1,82 (30) 5,22-7,83 (200-300) chory na fenylo-ketonurie 18,2-66,6 (300-1000) 18,2-133,3 (300-2000) 17,6-33,3 (290-550) zwikszenie 52,7 (2400)
Fenyloalanina Fenylopirogronian Fenyiomleczan Fenylooctan Fenyloacetylo-glut amina
0,06-0,12 (1-2)
p
0,91-3,82 (15-63) 0,18-1,08 (0,3-1,8)

Fen y to a cety I og I utam i n a NH3 L-Fenyloalanina ot-Ketoglutaran
+
stenia fenylopirojjronianu na podstawie reakcji z chlorkiem elazowym. Podawanie fenyloalaniny chorym na fenyloketonuri mogoby spowodowa przeduajce si zwikszenie zawartoci tego aminokwasu we krwi, dowodzce zmniejszonej tolerancji na fenyl o alanin. Jednake u rodzicw dzieci chorych na fenyloketonuri take stwierdzono nieprawidowo ma tolerancj na wstrzyknit fenyloaanin i due stenie fenyloalaniny na czczo. Defektywny gen odpowiedzialny za fenyloketonuri moe by w ten sposb wykryty biochemicznie u feno-typowo prawidowych rodzicw heterozygoty-cznych. aden azot lizyny nie uczestniczy w transami nacji Ssaki przeksztacaj nietknity szkielet L-li-zyny w a-aminoadypinian i cc-ketoadypinian (ryc. 32-17) poprzez sacharopin (ryc. 32-18), produkt poredni w biosyntezie lizyny u grzybw. Czsteczka L-lizyny kondensuje najpierw z a-ketoglutaranem, tworzc zasad Schiffa. Ta ulega redukcji do sacharopiny przez dehyd-rogenaz, a nastpnie utlenieniu przez drug oksydoreduktaz. W wyniku przyczenia czsteczki wody tworzy si L-glutaminian i 5-semi-aldehyd L-a-aminoadypinianu. Czysty wynik tego cigu reakcji jest rwnowany usuniciu atomu azotu w pozycji e z lizyny wskutek transaminacji. Niezbdnymi koenzymami jednak w tej re akcji s NAD + i NADH. Dalszy katabolizm a-aminoadypinianu obejmuje transaminacj do a-ketoadypinianu, prawdopodobnie z nastpujc oksydacyjn dekar-boksylacj do glutarylo-CoA. Podczas gdy lizy-na jest zarwno glikogenna, jak i ketogenna, natura kolejnych katabolitw glutarylo-CoA u ssakw pozostaje nieznana. Dwie rzadko wystpujce nieprawidowoci metaboliczne wynikaj z zaburzonego prze ksztacenia L-lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopin (ryc. 32-18).
HjC-NH3 + COO" COO
CONH, Ryc. 32-16. Alternatywne szlaki katabolizmu fenyloalaniny w fenyloketonurii Reakcje zachodz rwnie w wtrobie osb zdrowych, lecz maj znikome znaczenie w obecnoci funkcjonujcej hydroksyla-zyfenyloalaninowej. Glu glutaminian, Ginglutamina.
stenia fenyloalaniny i jej pochodnych prze staj by grone dla mzgu. Wprawdzie zawarto fenyloalaniny w osoczu oznacza si za pomoc zautomatyzowanej mikrometody, w ktrej na jedno oznaczenie potrzeba zaledwie 20 ul krwi, nieprawidowe due stenia fenyloalaniny we krwi noworodkw mog wystpi dopiero w 3. lub 4. dniu ycia, a nie bezporednio po urodzeniu. Co wicej, u dzieci urodzonych przedwczenie prba daje niekiedy wynik faszywie dodatni mi skutek opnionego dojrzewania enzymw uczestniczcych w katabolizmie fenyioalaniny. Uyteczny, ale mniej wiarygodny, masowy test polega na wykryciu w moczu zwiks zonego
C
cooL-Lizyna
cooa-Aminoadypinian
C lCH)
c=o ooa-Ketoadypinian
Ryc. 32-17. Przemiana L-lizyny w a-aminoadypinian i a-ketoadypinian. Wielokrotne strzatki reprezentuj wielokrotne reakcje.
a-Ketoglutaran
O;
.
NAOH+H+ NAD+"O" CK P"

DEHYDROGENAZA S^CHAROPINOWA TWORZCA L-LIZYN Sacharopina
NH+
CH:
L-LIzyna
T
CH
C^- C H'
NAD+ NADH+H+ - Q NH*
D EHYOROGENAZA SACHAROPINOWA TWORZCA L-GLUTAMINIAN
- C H' ^ -
? CH, i
NH
CH^
n-
L-ot-Am inoadypinian
L-B-arninoadyplniianu
Glu
\^r P2 CH
a-Ketoadyplnian
A CoA*SH
-CO, +HO
|AMINOIRANSFERAZAl
co,
Glu(afylo-CoA
Ryc. 32-18. Katabolizm L-lizyny. (a-KG a-ketoglutaran, Glu^glutaminian, PLP fosforan pirydoksalu). Cyfry w kotkach wskazuj prawdopodobne miejsca wad metabolicznych: 1 okresowa hiperlizynemia z hiperamonemi i 2 uporczywa hiperlizynemia bez hiperamonemii. __________
Okresowa hiperlizynemia z towarzyszc hiperamonemi. W okresowej hiper-lizynemii spoycie prawidowych iloci
biaka wywouje hiperlizynemi. Hiperamonemi powstaje wtedy w wyniku kompetycyjnego zaha mowania aktywnoci arginazy wtroby przez zwikszenie stenia lizyny w tkankach. Terapia pynami oraz ograniczenie pobierania izyny agodzi zarwno hiperamonemi, jak i jej ob jawy kliniczne. Przeciwnie, stosowanie obcienia lizyn przyspiesza wystpienie przeomu i piczki.
Nawracajca hi-peramonemii.
Niektrzy chorzy s opnieni w rozwoju umysowym. Nie towarzyszy temu adna hiperamonemi, nawet jako reakcja na obcienie lizyn. Katabolity lizyny mog lub nie mog nagromadza si w pynach biologicznych. Uwaa si, e nawracajca hiperlizynemia dziedziczy si jako autosomalna cecha recesyw-na. Oprcz uszkodzenia przeksztacenia lizyny i a-ketoglutaranu w sacharopine, niektrzy chorzy wydaj si mie dodatkow wad przeksztacania sacharopiny w L-glutaminian 16-se-mialdehyd a-amiaoadypinianu (ryc. 32-18). Katabolizm tryptofanu inicjuje 2,3-dioksygenaza tryptofanowa, metaloproteina zawierajca elazoporf i ryn Poczenia atomw wgla zarwno acucha bocznego, jak i piercienia aromatycznego mog ulega kompletnej degradacji do amfibolicz-nych zwizkw porednich na szlaku kinureni-nowo-antranilanowyin (ryc. 32-19) o wanym znaczeniu nie tylko w rozkadzie tryptofanu, lecz take w przeksztacaniu tego aminokwasu w nikorynainid (amid nikotynianu). Enzym 2,3-dioksygi'naza tryptofanowa (inaczej: oksygenaza tryptofanowa lub pirolaza tryptofanowa nazwy nie zalecane) katalizuje rozszczepienie piercienia indolowego z wbudowaniem 2 atomw tlenu czsteczkowego, co wytwarza N-formylokinurenin. Ta 2,3-dioksygenaza, elazoporfirynowa metaloproteina, jest indukowana w wtrobie przez kortyko-steroidy nadnerczy oraz tryptofan. Znaczna porcja nowo syntetyzowanego enzymu wyst-pujewpostaci utajonej, wymagajcej aktywacji. Tryptofan rwnie stabilizuje go na degradacj proteolityczn. Pochodne kwasu nikotynowego, wczajc NADPH, hamuj 2,3-dioksyge-naz tryptofanowa na zasadzie sprzenia zwrotnego.
hiperlizynemia
bez
Hydrolityczne usunicie grupy formylowej z N-formy)okinureniny, katalizowane przez for-Fnamidaz (inaczej: formylaz kinureninow nazwa nie zalecana) wtroby ssakw dostarcza kinureniny (ryc. 32-19). Enzym ten katalizuje podobne reakcje z rnymi formyloaminami aromatycznymi. Kinurenina moe ulec dezaminacji w wyniku transaminacji grupy aminowej bocznego acucha do ketoglutaranu. Powstaa pochodna ketonowa, 2-amino-3-hydroksybenzoilopiro-gronian, traci czsteczk wody i spontaniczne zamknicie piercienia tworzy kwas kinurenowy, produkt uboczny, ktry nie powstaje w gwnym szlaku katabolizmu tryptofanu (ryc. 32--19). Dalszy metabolizm kinureniny obejmuje przeksztacenie jej w 3-hydroksykimirenin, a nastpnie w 3-hydroksyantraniian. Hydroksy-lacja wymaga tlenu czsteczkowego w reakcji zalenej od NADPH, przypominajcej hydro-ksylacj fenyloalaniny (p. rozdz. 30). Alternatywny metabolit tryptofanu, ksanturenian, nagromadza s przy niedoborze witaminy B6 Kinurenina i hydroksykinurenina s przeksztacane w hydroksyantranilan prze2 kinure-ninaz, enzym z fosforanem pirydoksalu. Niedobr witaminy B6 powoduje czciow niewydolno w katabolizmie tych pochodnych kinu-reninowych, ktre przedostaj si do rnych tkanek pozawtrobowych, gdzie s przekszta cane w ksanturenian (ryc. 32-20). Ten nienormalny metabolit wystpuje w moczu w przypadku niewystarczajcego przyswajania z poywienia witaminy Bf). Odywianie nadmiarem tryptofanu wywouje wydalanie ksanturenianu przy niedoborze witaminy B. U wielu zwierzt przeksztacanie tryptofanu w kwas nikotynowy powoduje, e dostarczanie tej witaminy w poywieniu staje si zbyteczne. Tryptofan moe cakowicie zastpi t witamin u szczurw, krlikw, psw i wi; u czowieka i innych zwierzt tryptofan zwiksza wydalanie z moczem pochodnych kwasu nikotynowego (np. N-metylonikotynamidu). W przypadku niedoboru witaminy Be synteza NAD + i NADP+ moe by upoledzona w wyniku niedostatecznej przemiany tryptofanu w kwas nikotynowy do wytwarzania nukleotydw pirydynowych. Synteza tych nukleotydw przebie ga prawidowo przy dostarczeniu odpowiedniej iloci kwasu nikotynowego, nawet w nieobecnoci witaminy B6.
NH3
Oz
Mrwcian
NH3+
L-Klnurenlna
V
2.3-DIOKSYGENAZA TRYPTOFANOWA (Indukowana) L-Tryptofan N-Formylo- L-klnurenina FORMAMIDAZA
-i
IjjjHBBjjjjfl
H3 C HjO
* KINUREN1NAZA
A
O ,
O,
VNADPH + H + 3-MONOOKSYGENAZA KINURENINOWA 2-Akro lei lo-3-am in of u m aran
V
3.4-DIOKSTGENAZA 3-HYDROKSYANTHANILOWA
NH3 OH
3-L-Hydroksyk In u roni na
CO;
T
NADH+H+
NAD
CH2
NAD(P) <
o-^-
A __
CH, HaC
1 NH,*
1O \
"" NHJ
Szozawlokrotonian
NADIP)H + H +
Serr (aldehyd 2-amlno-cfaicte-mukonlanu
A ___
-CH;
no
a-Ketoadypinlan a-Ketoadypin!an (przepisano)
! + HjO (p. ryc, 34-18)
Ryc. 32-19. K atabolizm tryptofanu. P LP fosforan pirydoksalu.
KATABOLIZM AMINOKWASW / 377
SZKIELETW WGLOWYCH
Metionlna
S -CO , CM,
n-Keto
i-'
glut ara n
CO,
- Ac Co A Izoleuoyna ---------------- . Proplonylo -CoA
-CO,
Walina Metylo ma lo nyl - CoA
O" HO
Sukcynylo-CoA Ryc. 32-21. Oglny metabolizm metioniny, izo leucyny i waliny

Ksanturenian
Ryc. 32-20. Powstawanie kwasu ksanturenowego w sianie niedoboru witaminy B6. Przeksztacenie metabolitu tryptofanu 3-hydroksykinureniny w 3-hydroksyantranilan jest upoledzone (p. ryc. 32-19). Dua jej cz przeksztaca si zatem w ksanturenian.
CHbroba Hartniipa, dziedziczne zaburzenie metabolizmu tryptofanu, charakteryzuje si wysypk skrn przypominajc pelagr, nawracajc ataksj mdkow i upoledzeniem urny sto wy m. Mocz zawiera zwikszone iioci indolooctami (a-N [ind o lo-3-acetyl o] glutaminy) oraz tryptofanu. METIONINA, 1ZOLEUCYNA I WALINA S KATABOLIZOWANE DO SUKCYNYLO-CoA Wprawdzie sukcynylo-Co A (bursztynylo--CoA) jest amfibolicznym produktem koco wym katabolizmu metioniny, izoleucyny i wali-ny, w rzeczywistoci przemianie ulega tylko cz ich szkieletu wglowego (ryc. 32 -21). W tworzeniu sukcynylo-CoA uczestnicz tylko 4/s atomw wgla waliny, 3/s tych atomw metioniny i jedynie ich polowa w przypadku izoleucyny. Atomy wgla karboksylowego wszystkich 3 aminokwasw tworz. CO2. Kocowe 2 atomy wgla izoleucyny formuj acety-lo-CoA, a grupa metylowa metioniny jest usuwana w caoci jako taka.
To, co nastpuje w dalszym tekcie, dotyczy tylko przeksztacenia metioniny oraz izoleucyny w propionylo-CoA, a waliny w metylo-malonylo-CoA. Reakcje prowadzce do propionylo -CoA przez metyl omal onylo-Co A do sukcynylo-CoA omwiono w rozdz. 23, w zwizku z kataboliz-mem propionianu i kwasw tuszczowych o nieparzystej liczbie atomw wgia. Atomy wgla metioniny tworz propionylo-CoA poprzez homocystein, cystationin i ,-ketoglutaran Czsteczka L-metioniny kondensuje najpierw z ATP, tworzc S-adenozylometionin*, aktywn metionin" (ryc. 32-22). Aktywowana grupa S-metylowa moe by przenoszona na rne akceptory. Usunicie grupy metylowej wytwarza S-adenozylohomocystein. Hydroli za wizania S-C dostarcza L-homocysteiny oraz adenozyny. Homocysteina czy si nastpnie z seryn, tworzc cystationin (ryc. 32 -23). W wyniku hydrol i tycznego rozszczepienia cys-tationiny powstaje L-homoseryna i cysteina, tak e ostatecznym wynikiem jest przeksztacenie homocysteiny w homoseryn, a seryny w cysteinc. Te 2 reakcje uczestnicz zatem
* Zwizkami, ktrych grupy metylowe pochodz z S-adenozylometioniny s: betainy, cholina, kreaty-na, epinefryna, melatonina, sarkozyna, aminokwasy N-melylowane oraz wiele alkaloidw pochodzenia rolinnego.
378 / ROZDZIA 32
coo 13N--H HSO
COO <-H3N-C-H CHS

CHS S------- CH ADENOZYLOTRANSFEHAZA L-METIONINOWA t CH
+ rr,
Adenina
HO
OH S-Ade n ozylo-L- rnatlo n I n a (, aktywna metlonina")
L-Metionina Ryc. 32-22. Utworzenie S-adenozy!ometioninY. ~ CH 3 reprezentuje duy potencja) transferu aktywnej metio niny".
rwnie w biosyntezie cysteiny z seryny (p. rozdz. 30). Homoseryn przeksztaca w a-keto-malan y-liaza cyst a ti o ni nowa (inaczej: deami-naza homoserynowa nazwa nie zalecana) (ryc. 32-24), Przeksztacenie a-ketomalanu w prflpionylo-CoA przebiega na sposb oksydacyjnej karboksylacji a-ketokwasw (np. pirogronianu. a-ket o glut ara mi) w celu utworzenia pochodnych acylo-CoA. Metaboliczne zaburzenia katabolizmu metioniny przedstawia tab. 32-2. 2 POCZTKOWE REAKCJE KATABOLICZNE S WSPLNE DLA WSZYSTKICH 3 ROZGAZIONYCH AMINOKWASW Katabolizm leucyny, waliny oraz izoleucyny obejmuje pocztkowo te same reakcje. Nastpnie szkielet kadego aminokwasu wchodzi na swj wasny unikatowy szlak prowadzcy do amfibolicznych zwizkw porednich (ryc. 32--25 i 32-26). Charakter tych amfibolicznych produktw kocowych okrela, czy dany ami nokwas jest glukogenny (walina), ketogenny (leucyna) lub dwojaki (izoleucyna). Wiele z tych
reakcji dokadnie przypomina reakcje kataboliz-IDU kwasw tuszczowych o acuchach prostych i rozgazionych. Numery reakcji w
Ten sam enzym wydaje si katalizowa transaminacj wszystkich 3 aminokwasw rozgazionych Za odwracaln transaminacj (reakcja 1, ryc. 32-26) wszystkich 3 rozgazionych aminokwasw przypuszczalnie odpowiada jedna amino-transferaza. Ze wzgldu na odwracalno owej reakcji dobowe zapotrzebowanie na te aminokwasy w poywieniu mog pokry odpowiednie a-ke tok wsy. Oksydacyjna dekarboksylacja rozgazionych 3 -ketokwasw jest analogiczna do przeksztacenia pirogronianu w acetylo-CoA Dehydrogenaza a-ketokwasu o acuchu rozgazionym (reakcja 2, ryc. 32-26), wewntrz-mitochondrialny kompleks wieloenzymowy, katalizuje oksydacyjn dekarboksylacj a-keto-izokaproniami (z leucyny), ct-keto-|3-metylowa-lerianianu (z izoleucyny) i a-ketoizowaleriania-nu (z waliny). Podjednostki kompleksu dehyd-rogenazy a-ketokwasu s analogiczne do kompleksw dehydrogenazy pirogronianu: dekar-hoksylaza a-ketokwasu, transacylaza i dehydrogenaza dihydrolipoilowa. Tak, jak w przypadku dehydrogenazy pirogronianowej, kompleks jest inaktywowany, kiedy ulega fosforyla-cji przez ATP i kinaz biaek. Niezalena od Ca2+ fosfataza fosfoproteinowa katalizuje jego defosforylacj i towarzyszc temu reaktywa cj. Stan fosforylacji moe w ten sposb regulowa katabolizm aminokwasw rozgazionych. Kinaz biaek hamuj: ADP, produkty a-keto-kwasw o acuchu rozgazionym,' czynniki hipolipemiczne, jak klofibrat i dichlorooctan, a take tloestry koenzymu A (np. acetoacetylo-
dalszym tekcie odpowiadaj numeracji reakcji na ryc. 32-26 32-29.
KATABOLIZM SZKIELETW WGLOWYCH AMINOKWASW / 379 HO

c
NH3 I
II O L-Metionina -AT P
,cr
H O
L-Hornoseryna II
H3O
S-Aden ozy I o-L-metionl n a ^- A kc e p to r
'CH]
Nfc CH,-Akoeptor
IIo \ W
S-Aden ozy lo-L-h om ocystei n a
H3C
lenozyna
H
CT
o
1 ^ L-Homocysteina CYSTATIONtNOWA NH3
+
H3CV
-
UL lit | |
T . 1
7
H,0
0
/ -H 2 O
i
L-Seryna
S
(
\ NH4 >
Cystationina NHn
CH
II
1 1
9
KtH3+
L-Cysteina
a-Ketorna4fan
NH a-Kelomalan (p.ryc. 31-24)
Ry. 32-24. Przeksztacenie L-homoseryny wa-ke-tomalan katalizowane przez y-liaz cystationino-w (inaczej: deaminaz homoserynow nazwa nie zalecana).
-CoA). Spord cx-ketokwasw o acuchu rozgazionym najpotniejszym inhibitorem jest a-ketoizokapronian(a-ketoteucyna).

"CH 2^ ^S-CoA
Proplonylo-CoA
Ryc. 32-23. Przeksztacenie mationiny w propio-nylo-CoA.
Odwodorowanie rozgazionych tioestrw acylo -CoA jest analogiczne do reakcji w katabolizmie kwasu tuszczowego Reakcja 3 jest analogiczna do odwodorowa-nia tioestr w acylo-CoA o prostym acuchu w katabolizmie kwasw tuszczowych. Wpraw-
380 / ROZDZIA 32
Lsucyna, wal i na, izoleueyna
Odpo wi ednie a -ketokwasy
Ryc. 32-25. Kataboiizm amino kwasw o acu chach rozgazionych Reakcje 1 - 3 s wsplne dla wszystkich 3 aminokwasw. Pogrubione linie prze cinajce strzaki zaznaczaj miejsca blok w metabolicznych w 2 chorobach rzadko wystpujcych u ludzi. Przy 2 choroba z moczem o zapachu syropu klonowego, wada w metabolizmie 3 aminokwasw; przy 3 kwasica izowaferianowa, wada w kataboiizmte leucyny.
C Oj + od po wi e d ni e ti oealry acyl o -CoA
Odpowiednie a-, 0-nienasycone tloestry acylo-CoA Val / Sukcynylo-CoA Leu Propionylo-CoA + acetylo-CoA p-Hyd ro ksy-P-metylo g lu ta ry lo-CoA
T<
Ryc. 32-26. Analogiczne pierwsze 3 reakcje w ka-tabolizmie leucyny, waliny oraz izoleucyny. Zauwa analogi w reakcjach 2 i 3 do katabolizmu kwasw tuszczowych. Ta analogia jest kontynuowana, jak wykazanow nastpnych rycinach. a-KA ot-keto-kwas, a-AA a-amino kwas.
C H,
,CH H3C
L-Leuoyna
O
a-K etokwas
CH3
CH3
L-l Zole u cyn a
O
x-Ke!okw as
H3C.
0
-CH
L-Wallna -*- -Ketokwas
^*- a- Ar nl nok w a s
O.
- a-Ami nokwas
V
"N- I- ''
O
II
H3C
a- K et o iz ka p r o n i a n
-CoA*SH
x- Keto <t- Keto-^- metylowa ler ia n i an
--CoA.SH
CH3
H3 C
Izowaterylo^CoA
H3C
S-CoA
CH:i
I
\* Ln
12H] O
CH3 a-Metylo butyrylo-Co A

[2 H]
5 t.oA Izowalerianian Co A .S H
^-Metylo kroto nylo- CoA
S~CoA CH3
Metaakryl No -CoA
TyaWo-CoA
dzie pojedynczy enzym moe katalizowa od-wodorowanie wszystkich 3 rozgazionych tioe-strw acylo-CoA, poredni dowd implikuje konieczno przynajmniej 2 enzymw, W acy-tlemii i/o walerianowej, po spoyciu pokarmw bogatych w biako, nagromadza si we krwi izowalerianian (produkt deacylacji izowalerylo--CoA). Nie dochodzi w niej do zwikszenia iloci innych rozgazionych a-ketokwasw. 3 reakcje s swoiste dla katabolizmu leucyny
leucyny) przeksztaconej w acetooctan. To wbudowanie CO2 (reakcja 4L, ryc. 32-27) wymaga obecnoci biotynylo-CO2 i tworzy (-metylo-glutakonylo-CoA.
Reakcja 5L, p-metytogluta-konylo-CoA.
uwodnienie
Produkt, p-hydroksy-p-me-tyloglutarylo-CoA, jest prekursorem zarwno zwizkw ketonowych (reakcja 6L, ryc. 32-27), jak i mewalonianu, a std cholesterolu oraz innych poliizoprenoidw (p. rozdz. 29).
Reakcja 6L, rozszczepienie p-hydro-ksy-p-metyloglutaryia-CoA.

Rozszczepienie f3-hydroksy-P-metylogrutarylo-CoA na acetylo-CoA i acetooctan zachodzi w mito-chondriach wtroby, nerek i serca. To tumaczy silne ketogenne dziaanie leucyny, poniewa oprcz 1 mola acetooctanu powstajcego z 1 mola leucyny moe si utworzy l ji mola
Reakcja 4L, karboksylacja |i-metylo-krotonylo-CoA. Kluczowym
spostrzeeniem, ktre doprowadzio do wyjanienia keto-gcnnego dziaania leucyny, byo odkrycie, e 1 mol CO2 by umocowany" (tj. zwizany kowalencyjnie) z kadym molem grupy izo-propylowej (z terminalnej grupy izopropylowej
0-Metylokro1onylo-CoA
Biotynylo-* CD
Mg-ADP+Pi
. Blotyna
Mg-ATP
o
^-MetytoglutakonylchCoA
rHi
C
OH
0-Hyd ro ksy-^rnety lo g I utaryio-C oA
O
'O'
9
CH. CH
O r* r1
Acetoootan
Acetylo-Co A
Ryc. 32-27. Katabolizm fi-rnetylokrotonylo-CoA pochodzcego z L-leucyny. * Atomy wgia pochodzce z CO,.
382 / ROZDZIA 32
zwizkw ketonowych z pozostaego produktu, acetylo-CoA (p. rozdz. 29). 4 reakcje s swoiste dla katabolizmu wafiny
CH3
o
li
Reakcja 4V. uwodnienie metyloakry-lilo-CoA. Reakcj t, ktra z
Metakrylilo-CoA
do du szybkoci zachodzi nieenzymatycznie, katalizuje hydrataza enoilo-CoA, hydrolaza o szerokiej swoistoci dla tioestrw L-p-hydro ksyacy-lo-CoA majcych 49 atomw wgla.
HO
I
CH3 ^-Hydroksylzobutyryto-CoA
Reakcja 5V, deacylacja [l-hydroksy-izobutyrylo-CoA. Tioester Co
A nie jest sub-stratem dla nastpnej reakcji (reakcja 6V, ryc. 32-28), wobec tego musi on najpierw ulec deacy-lacji do p-hydroksyizomalanu (reakcja 5V. ryc. 32-28) przy udziale deacylazy, dla ktrej drugim substratera jest jedynie P-hydroksypropionylo--CoA.
Reakcja 6V, (>-hydroksy-izomalanu.
utlenienie
Odwracalne, zalene od NAD"*", utlenienie pierwszo rzdowej grupy alkoholowej p-hydroksyizomalanu do aldehydowej (reakcja 6V, ryc. 32-28) tworzy semialdehyd metylo-malonianu.
I CH-, /I-Hyd ro ksyizo m as I an
NADH + H O I! II O
HC,
Reakcja 7V, los semialdehydu mety-lomalonianu. Przypuszczalnym

przeznaczeniem semialdehydu metylomalonianu jest trans-aminacja i przeksztacenie do sukcynylo-CoA. Transaminacja tworzy a-aminoizomalan, prawidowy aminokwas moczu (reakcja 7V, ryc, 32-28). Drugie gwne przeznaczenie obejmuje oksydacyjn acylacj do metylomalonylo-CoA oraz izomeryzacj do sukcynylo-CoA (reakcje 8V i 9V, ryc. 32-28). Izomeryzacja (reakcja 9V, ryc. 32-28) wymaga obecnoci koenzymu ade-nozynokobalaminy i jest katalizowana przez mutaz metylomaionylo-CoA. Ta reakcja ma due znaczenie nie tylko w katabolizmie waliny lecz take dla propionylo-CoA, katabolitu izo-leucyny (ryc. 32-29). Przy niedoborze kobalami-ny (witaminy B|2) aktywno ulega uszkodzeniu. To powoduje ywieniow wad metaboliczn" u przeuwaczy, wykorzystujcych pro-pionian (z fermentacji w waczu) jako rdo energii. Przegrupowanie do sukcynylo-CoA odbywa si wskutek wewntrzczsteczkowego przesunicia grupy karboksylo-CoA. 3 reakcje s swoiste dla katabolizmu izoleucyny Badania nad odywianiem zwierzt zidentyfikoway pocztkowo izoleucyn jako gluko-genn i w niewielkim stopniu ketogenn. Syn-
I CH3
Semialdehyd metylom alanian u COASH NADI H,C. -AA a-KA NH3 I
CH ' S - C o A
CH
O II
I CoAS"
I CH3 CH3 Metylomalonylo-CoA KOENZYM B1( O 0-Aminolzomalan
I I
HSC
S-CoA
Sukcynylo-CoA
Ryc. 32-28. Dalszy katabolizm metakry!ilo-CoA utworzonego z L-waliny (p. ryc. 32-26). a-KA -ketokwas, s-AA a-aminokwas.
KATABOLiZM SZKIELETW WGLOWYCH AMINOKWASW / 383

Acetylo-CoA
Reakcja 61, s-metyloacetoace-tylo-CoA.

CH3
Tyglilo-CoA Propionylo-CoA
tioliza
Ryc. 32-29. Dalszy katabolizm tyglilo-CoA powstaego z L-izoleucyny.
Rozszczepienie tiolityczne wizania czcego wgle 2. i 3. w czsteczce a-mety-loacetylo-CoA przypomina tioliz acetoacety-lo-CoA przez acetyl o tran sferaz acetylo-CoA (inaczej: (3-ketotioIaz). Produkty: acetylo-CoA (ketogenny) i propionylo-CoA (glukogenny) nadaj izoleucynie waciwoci ketogenne i glu-kogenne. Kilka zaburze metabolicznych wie si ze szlakiem katabolicznym aminokwasw o acuchu rozgazionym Hiperwalinemia. Ta rzadko wystpujca choroba metaboliczna, charakteryzujca sie zwikszonym steniem w osoczu waliny (ale nie leucyny lub izoleucyny) jest wyrazem niezdolnoci do przeprowadzenia transami nacji waliny do a-ketoizowalerianianu (reakcja 1, ryc. 32-26). Transaminacja leucyny oraz izoleucyny pozostaje nieuszkodzona.
H,C
S~CoA
s-Metyl o-0 -hyd ro teybutyrylo-CoA
[2H]
O
li
CH3
a M etyI o actrtoacetyI o-Co A
tez glikogenu z izoleucyny potwierdzono pniej posugujc si D2O. Zastosowanie znakowanych l4C-intermediatw oraz skrawkw wtroby dowiodo, e szkielet izoleucyny ulega rozszczepieniu na acetylo-CoA i propionylo--CoA (ryc. 32-29). Reakcj t, podobnie jak analogiczna w katabo-lizmie waliny (reakcja 4V, ryc. 32-28) katalizuje hydrataza enoilo-CoA (inaczej: krotonaza nazwa nie zalecana). Reakcja 51, od wodorowa nie :: -mety lo-p-hydroksybutyrylo-CoA. Jest ona analogiczna do reakcji 5V w katabolizmie waliny (ryc. 32-28).
Reakcja 41, uwodnienie tyglilo-CoA.
gazionych). Najbardziej charakterystyczn waciwoci tej dziedzicznej choroby (wystpujcej z czstotliwoci 510/1 000 000 urodze) jest zapach moczu przypominajcy zapach syropu klonowego lub przypalonego cukru. Zawarto leucyny, izoleucyny, waliny oraz ich oc-ketok wsw w osoczu i w moczu jest znacznie zwikszona. W moczu s rwnie obecne mniejsze iloci ct-hydrok syk wsw o acuchu rozgazionym, utworzonych w wyniku redukcji a-ketokwasw. Choroba uwidacznia sie pod koniec pierwszego tygodnia ycia pozamacicznego. Oprcz opisanych wyej zaburze biochemicznych niemowie z trudem daje si karmi, moe wymiotowa i by w letargu. Rozpoznanie przed pierwszym tygodniem ycia jest moliwe tylko za pomoc analizy enzymatycznej. Rozlege uszkodzenia mzgu wystpuj u dzieci przeywajcych. Dzieci nie leczone umieraj zwykle pod koniec pierwszego roku ycia. Wada biochemiczna polega na braku lub znacznym zmniejszeniu aktywnoci dekarbok-sylazy a-ketokwasowej, ktra katalizuje przemiany wszystkich 3 a-ketokwasw o acuchu rozgazionym do CO2 oraz tioestrw acylo--CoA (reakcja 2, ryc. 32-26). Mechanizm zatrucia pozostaje nieznany. Rozpoczcie leczenia w pierwszym tygodniu ycia moe w znacznym stopniu zapobiec stra-
Choroba moczu o zapachu syropu klonowego" (ketonuria acuchw roz-
384 / ROZDZIA 32
szliwym skutkom tej choroby. Pokarmy bia kowe zastpuje si mieszanin oczyszczonych aminokwasw, spord ktrych eliminuje si leucyn, izoleucyn I walin. Jeeli tylko stenie tych aminokwasw w osoczu zmniejszy si poniej poziomu prawidowego, chorzy powracaj do diety w postaci mleka oraz innych pokarmw w ilociach pokrywajcych, lecz nie przekraczajcych, zapotrzebowanie na aminokwasy o acuchach rozgazionych. Nie ma adnych kryteriw, kiedy jeeli w ogle jest to moliwe mona zagodzi ograniczenia ywieniowe. rozgazionych. Ta odmiana choroby mo czu o zapachu syropu klonowego", jest zapewne konsekwencj mniej gronej strukturalnej modyfikacji dekarboksylazy oc-ketokwasowej. Poniewa chorzy maj upoledzon, niemniej jednak wyran zdolno do katabolizmu leucyny, walin y oraz izoieucyny, objawy choroby moczu o zapachu syropu klonowego" wystpuj w pniejszym okresie ycia i tylko przejciowo. W przypadku terapii ywieniowej rokowania dla tych chorych s pomylni ej s ze. Choroba, .moczu o zapachu syropu klonowego" oraz nawracajca ketonuria rozgazionych acuchw odzwierciedlaj mutacje powodujce rne zmiany w strukturze pierwszorzedowej tego samego enzymu. Prawdopodobnie szeroki zakres aktywnoci, od otwartej choroby przez objawy nawracajce do wartoci prawidowych, zdarza si u poszczeglnych chorych. Acydemia izowalerianowa. Istotnymi zmianami s: wo serowa" oddechu i pynw ustrojowych, wymioty, kwasica i piczka wywoana nadmiernym spoyciem biaka. Uszkodzonym enzymem jest dehydrogenaza izowale-rylo-CoA (reakcja 3, ryc. 32-26). W ten sposb nagromadza si izowalerylo-CoA, ktry hydro-lizuje do izowalerianianu i wydala z moczem oraz potem. Zaburzenia w katabolizmie metylomalonylo-CoA odzwierciedlaj niewydolno w przemianie witaminy B12 do jej koenzymu Przeksztacenie w amfiboliczne intermedia-ty propionylo-CoA (pochodzcego z izoieucyny, metioniny, acucha bocznego cholesterolu
oraz kwasw tuszczowych o nieparzystej liczbie atomw wgla) obejmuje zalen od biotyny karboksylacj do metylomalonylo-CoA. Metylomalonylo-CoA powstaje rwnie z waliny bezporednio (tj. bez uprzedniego utworzenia propionylo-CoA). W reakcji zalenej od koenzymu witaminy B i3 metylomalonylo-CoA izo-meryzuje nastpnie do sukcynylo-CoA. Chorzy z niedoborem witaminy B^ wydalaj z moczem metylomalonian. Ta acyduria metylomalonia-nowa ustpuje po podaniu wystarczajcych iloci witaminy B]2.
Nawracajca ketonuria acuchw
Acydamia propionianowa. Niedobr
karboksylazy propionylo-CoA charakteryzuje si duym steniem propionianu w surowicy. Leczenie polega na przestrzeganiu diety mao-biakowej i stosowaniu rodkw przeciwdziaajcych kwasicy metabolicznej. Acyduria metylomaionowa. Znane s 2 postacie. Jedna reaguje na farmakologiczne stenie witaminy B]2. Typ drugi wymaga leczenia za pomoc masywnych dawek witaminy B^ (1 g na dob).
PIMIENNICTWO
Cooper AJL; Biochermstry of the sulfur-containing amino acids. Annu Rev Biochem 1983;52:187. Paxton R, Harris RA: Isolation of rabbit liver branched chain a-ketoacid dehydrogenase and regulation by phosphorylation. J Blol Chem 1982;257:14433. Paxton R, Harris RA: Regulation of branched-chain a-ketoacid dehydrogenase kinase. Arch Biochem Biophys 1984;231:48. Rosenberg LE, Serwer CR: Disorders of amino acid naetabolisin. Chapter 11 in: Metaboiic Control and Bueme. Bondy PK, Rosenberg LE (editors). Saunders, 1980. Scriver CR et al (editors): The Metaboic Basis oj Inherited Disease, 6th ed. McGraw-HM, 1989. Wellner D, Meister A: A survey of inborn errors of amino acid metabolismand transport in man. Annu Rev Biochem (981:50:911.
Przemiana aminokwasw w wyspecjalizowane produkty

33
WPROWADZENIE
Aminokwasy stanowi gwne rdo azotu dla zwierzt i su jako prekursory dla innych skadnikw azotowych. Wikszo z nich to zwizki nieami no kwasowe, wobec czego omwienie ich zbiega si ze szlakami metabolicznymi przedstawionymi w innych rozdziaach tego podrcznika. Fizjologicznie wane produkty pochodzce z aminokwasw to: hem, pury-ny, pirymidyny, hormony i neuroprzekaniki (neur o transmitery), wczajc biologicznie aktywne" peptydy. Ponadto wiele biaek zawiera aminokwasy, ktre zostay zmodyfikowane w celu wypenienia swoistych funkcji, np. zwizania wapnia lub poprzecznego poczenia, i w ten sposb reszty aminokwasowe w tych biakach su jako prekursory dla owych zmodyfikowanych reszt. Wystpuj take mae pep-tydy lub czsteczki peptydopodobne nie syn tetyzowane na rybosomach, ktre wykonuj swoiste czynnoci w komrce.
GLICYNA UCZESTNICZY W BIOSYNTEZIE HEMU, PURYN, POCZE GL1CYNOWYCH IKREATYNY

Synteza hemu. Atomy wgla ot i azotu glicyny s wykorzystywane w syntezie porfiry-nowej czci hemoglobiny (p. rozdz. 34), Atom azotu w piercieniu pirolowym pochodzi z azotu glicyny, a przylegajcy atom wgla z wgla
O"
Mg-ATP Mg-ADP + P,
Histamina, biologicznie aktywna amina, utworzona w wyniku dekarboksylacji histy-dyny, odgrywa gwn rol w reakcjach alergicznych. Swoiste neuroprzekaniki pocho dzce z aminokwasw obejmuj: y-amino-maian z giutaminianu, 5-hydroksytryptami-n (serotonin) z tryptofanu oraz dopamin, noradrenaiin i adrenalin z tyrozyny. Wiele lekw stosowanych w leczeniu stanw neurologicznych i psychiatrycznych wpywa na metabolizm wymienionych wyej neuroprzeka-nikw.
25 Biochemia
CoA-SH
Hipuran Ryc.
33-1. Biosynteza hipuranu
386 / ROZDZIA 33
ot glicyny. Wgiel a jest rwnie rdem atomw mostkw metylenowych czcych piercienie pirolowe. Zaburzenia metabolizmu hemu s omwione w rozdz. 34. Caa czsteczka glicyny tworzy pozycje 4, 5 i 7 w szkielecie purynowym (p. rozdz. 36).
Synteza nukleotydw purvnowych.
cyna wie si z kwasem cholowym w kwas ciowy glikocholowy. Z benzoesanem glicyna tworzy hipuran (ryc. 33-1). Zdolno wtroby do ilociowej przemiany benzoesanu w hipuran wykorzystywano dawniej jako prb czynnociow wtroby. Synteza kreatyny. Sarkozyna (N-metylo-glicyna), skadnik kreatyny, pochodzi z glicyny i S-adenozylometioniny.
Tworzenie pocze glicynowych. Gli-
Ergotloneina
-cHrNH'+
NH
CH;
o
Karnozyna
- ALANINA JEST GWNYM AMINOKWASEM OSOCZA Alanina wraz z glicyna stanowi znaczn cz azotu aminowego w osoczu ludzkim. Alanina jest rwnie gwnym skadnikiem cian komrek bakteryjnych, czciowo jako D -izomer: 3950% u Streptococcus faecalis i 67% u Sta-phylococcus aureus. I
CH O
Homo kar n ozyn a Ryc. 33- 2. Zwizki spo krewnione z histydyn. Prosto kty ujmuj kompo nenty nie pocho dzce z histydyny.
Anse ry na
O. NH
SSAKI TWORZ |i -ALAI\ HN Z URACYLU I KAT ABOLIZUJ J PRZEZ SEMIALDEHYD MALONIANU W tkankach znajduje si niewiele wolnej P-alaniny, znacznie wicej wystpuje w postaci p-alanylowych dipeptydw oraz koenzymu A (p. ryc. 18-6). Wprawdzie mikroorganizmy wytwarzaj p-alanin przez dekarboksylacj p-asparaginia-nu, fi-alanina tkanek ssakw pochodzi gwnie z katabolizmu uracylu, karnozyny i anseryny (ryc. 33-2). Katabolizm p-alaniny u ssakw obejmuje transaminacj do semialdehydu malonianu, ktry utlenia si do octanu i dalej do CO2. W rzadko wystpujcym zaburzeniu metabolicznym, jakim jest hiper-p aiartinemia dochodzi do zwikszenia stenia P-alaniny w pynach ustrojowych oraz w tkankach. Stenia tauryny i P-aminoizomalanu s rwnie zwikszone.
KARNOZYNA JEST DIPEPTYDEM (3-ALANYLOWYM P-Alanina wystpuje gwnie jako karnozyna, dipeptyd ludzkich mini szkieletowych (ryc. 33-2). cile spokrewniony dipeptyd (3-alanyJo-wy, anse ry na (N-metylokarnozyna, ryc. 33-2), wystpuje obficie u gatunkw, u ktrych minie szkieletowe odznaczaj si szybk czynnoci skurczow (koczyny krlika, minie
PRZEMIANA AMINOKWASW W WYSPECJALIZOWANE PRODUKTY / 387
piersiowe ptakw). Brak jej w miniach czowieka. W ten sposb moe on spenia funkcje fizjologiczne odrbne od karnozyny. P-Alanylo-imidazol buforuje pH minia szkieletowego kurczcego si beztlenowo. Kar-nozyna i a n sery na wzmagaj aktywno ATPazy miozynowej in vitro. Oba dipeptydy chelatuj rwnie mied i pobudzaj pobieranie zwizkw miedzi. Dipeptydy p- alanylowe s syntetyzowane i degradowane na krtkich szlakach Karnozyna powstaje z p-alaniny i L-histydy-ny w reakcji wymagajcej ATP, katalizowanej przez syntetaz karnozyny:
ATP + L-Histydyna + [3-Alanina > - AMP + PP + Karnozyna
z chorob Hartnupa reakcja histydynemii jest prawidowa, jeeli Icarnozyna znajduje si w pokarmie, ale jest osabiona po podaniu L-histydyny. Homokarnozyna jest dipeptydem orodkowego ukadu nerwowego Fizjologiczna funkcja homokarnozyny (y--aminobutyrylo-L-histydyny; ryc. 33-2), dipep-tydu orodkowego ukadu nerwowego, spokrewnionego strukturalnie i metabolicznie z kar-nozyn, nie jest znana. Ten dipeptyd y-amino-malanu i L-histydyny wystpuje w tkance mzgu ludzkiego, gdzie jego stenie zmienia si wraz z badanym obszarem. Biosynteza homo karnozyny w ludzkim mzgu wydaje si by katalizowana przez syntetaz homo karnozyno w. Dipeptydaza aminoacylohistydynow su rowicy nie hydrolizuje jednak homokarnozyny. FOSFORYLOWANE RESZTY SERYLOWE I TREONYLOWE WYSTPUJ W WIELU BIAKACH Duo czsteczek seryny w fosfoproteinach wystpuje w postaci O-fosfoseryny. Sery na uczestniczy w syntezie sfingozyny (p. rozdz. 26) oraz puryn I pirymidyn. Wgiel jest rdem grup metylowych tyminy (i choliny) oraz atomw wgla w pozycjach 2 i 8 rdzenia purynowe-go (p. rozdz. 36). Treonina nie ulega tran sam i nacji, wobec czego D-izomer i ot-ketokwas nie s wykorzystywane przez ssaki. W niektrych biakach treonina wystpuje jako O- fosfo treonina. S-ADENOZYLOMETIONINA STANOWI GWNE RDO GRUP METYLOWYCH W BIOSYNTEZIE Metionin, jako donora grup metylowych, omwiono w rozdz. 32. W postaci S-adenozylo-metioniny jest ona gwnym rdem grup metylowych w organizmie, ktre mog by wykorzystywane zarwno w postaci nie naruszonej, jak i po utlenieniu. Wgiel grupy metylowej moe take posuy do utworzenia reszty jednowglowej, czcej si z glicyn w procesie syntezy seryny, Metionina funkcjonuje jako S-adenozylometionina w charakterze prekursora dla 1,3^diaminopropanu, czci poliamin sperminy i spermidyny (p. niej).
Anseryna powstaje z karnozyny (donorem grupy metylowej jest S-adenozylometionina) w reakcji katalizowanej przez N-metylotrans-feraz karnozynow:
S-Adenozylometionina + Karnozyna - - S-Adenozyiohomocysteina + Anseryna
Oglna reakcja obejmuje zwizany z enzymem p-alanyloadenyian. Karnozyna jest hydrolizowana do p-alaniny i L-histydyny przez wystpujcy w surowicy metaloenzym zwizany z cynkiemdipeptydaz
aminoacylohistydynow (inaczej: karnozynaza
lub hydrolaza karnozynow nazwy nie zalecane) . Niedobr tego enzymu w surowicy to zaburze-
nie dziedziczne, prawdopodobnie autosomalne, recesywne, charakteryzujce si uporczyw kar-nozynuri i sporadycznie rwnie hiperkarnozy-nemi. Karnozynuria utrzymuje si nawet po wyczeniu karnozyny z poywienia. Reakcja na diet karnozynow uatwia rozpoznanie choroby Hartnupa Tkanka nerki i enterocyty jelitowe pobieraj karnozyn i i p-alanin za pomoc nonikw bonowych, ktre rozrniaj jeden substrat od drugiego i oba od innych dipeptydw. Zdolno do zrnicowanego pobierania P -alaniny od karnozyn y znalaza zastosowanie do zidentyfikowania choroby Hartnupa, dziedzicznego zaburzenia w transporcie niektrych obojt nych a-aminokwasw (p. rozdz. 32). U osb
388 / ROZDZIA 33
SIARCZAN ZAWARTY W MOCZU POCHODZI GWNIE Z CYSTEINY

Siarczan zawarty w moczu powstaje niemal cakowicie z utlenienia cysteiny. Siarka metioni-ny (jako homocysteiny) jest przenoszona na seryn (p. ryc. 30-9) i w ten sposb przyczynia si porednio do puli siarczanw zawartych w moczu (tj. za porednictwem cysteiny). L-Cysteina suy jako prekursor tioetanoloami-nowcj czci koenzymu A oraz tauryny, ktra sprzga si z kwasami ciowymi, formujc np. kwas taurocholowy.
boksylaza histydynowa, wystpujcy w wikszoci tkanek, katalizuje dekarboksylacj his-tydyny. Do zwizkw histydynowych wystpujcych w organizmie nale: ergotioneina, w erytrocytach i w wtrobie, karnozyna i anseryna (ryc. 33-2). Prawdopodobnie z anseryny pochodzi 1-metylohistydyna wystpujca w moczu ludzkim. W nim zidentyfikowano take 3-metylo-histydyn w iloci 3,2 mmol/1 (= ok. 50 mg/dl). Pojawia si ona w niezwykle maych iiociach w moczu chorych na chorob Wilsona (p. rozdz. 58).
ARGININA PRZEZ ORNITYN JEST PREKURSOREM PO LI AM IN

Arginina suy jako dawca grupy formamidy-nowej w syntezie: kreatyny u Naczelnych (p. ryc. 33-10) oraz streptomycyny u Streptomyc.es. Inne jej przeznaczenia obejmuj przeksztacanie, przez ornityn, w putrescyn, spermin i spermidyn (ryc. 33-3) oraz biosyntez fosforanu argininy (funkcjonalnego analogu fosforanu kreatyny) w miniach bezkrgowcw. W uzupenieniu do jej roli w biosyntezie mocznika (p. rozdz. 31), ornityna_(z metionin) stanowi prekursor wystpujcych powszechnie
DEKARBOKSYLACJA HISTYDYNY TWORZY HISTAMIN

Histamina pochodzi z histydyry w wyniku jej dekarboksylacji katalizowanej w tkankach ssakw przez dekarboksylaz [.-aminokwasw aromatycznych. Enzym ten powoduje rwnie de-karboksylacje czsteczek: dopa, 5-hydroksy-tryptofanu, fenyloalaniny, tyrozyny i tryp-tofanu (p. niej). Dekarboksylacj hamuj oc-m etyl oaminok wsy, ktre w ten sposb znalazy zastosowanie w klinice jako czynniki obniajce cinienie krwi. Odmienny enzym, dekar-
JBiaka|
I Prollnal
y-emialdehyd glutamimanu
Putrescyna, sperm idyna spermlna
Glutamin ian
Ryc. 33-3. Metabolizm argininy, ornityny i proliny. W tkankach ssakw zachodz wszystkie reakcje zaznaczone strzakami cigymi. Synteza putrescyny i sperminy przebiega zarwno u 'ssakw, jak i u bakterii. Fosforan ornityny wystpuje w miniach bezkrgowcw, gdzie funkcjonuje jako fosfagen analogiczny do fosforanu kreatyny w tkankach ssakw. ______________________________

A' B
\ t'
H, CH^ CH^
r"* LJ "^^ "1" r* Ul i* W Kl
H3 *
1,3-Oiaminopropan (A) A
Spermidyna B A
,1, ______
1,4-Diaminobutan (B) (pulrescyna)
Spermina
^c< - N H ;
1,5-Diaminopenian (kadaweryna} Ryc. 33-4. Struktury naturalnych poliamin Zauwa, e spermidyna i spermina s polimerami diaminopropanu (A) i diaminobutanu (B). Diaminopentan {kadaweryna) rwnie wystpuje w tkankach ssakw.
u ssakw (i bakterii) pojiamin: sperm idy ny i sp^n^ny (ryc. 33-4). Zdrowi ludzie biosyn-tetyzujt) w przyblieniu 0,5 mmol sperminy dziennie. Farmakologiczne dawki poliamin obniaj temperatur i cinienie. Spermidyna i spermina bior udzia w rnorodnych procesach fizjologicznych, ktre laczy wsplna ni cise powizanie z proliferacj i wzrostem komrkowym. One s czynnikami wzrostu w hodowlach komrek ssakw i bakterii uczestniczcych w stabilizacji nie naruszonych komrek, organelii subkomrkowych oraz bon. W konsekwencji ich mnogich adunkw dodatnich poliaminy asocjuja. chtnie z po-lianionami, np. DNA i RNA, i s zaangaowane w takie fundamentalne procesy, jak stymulacja biosyntezy DNA i RNA, stabilizacja DNA oraz upakowanie DNA w bakteriofagu. Poliaminy maj take rnorodny wpyw na syntez biaka i dziaaj jako inhibitory enzymw, wczajc kinazy biaek. Wprawdzie obecnie nie jest moliwe wytumaczenie (w precyzyjnych okreleniach mecha-nistycznych) sposobu oddziaywania poliamin na jakie swoiste procesy metaboliczne, istotna ich natura w metabolizmie ssakw zostaa przekonywajco udokumentowana przez dowiad czenie nastpujcego typu. Pocztkowa reakcja w biosyntezie poliamin jest katalizowana przez dekarboksylaz ornitynow (ryc. 33 -5). Doda-
nie do hodowli komrek ssakw inhibitorw aktywnoci dekarboksylazy ornitynowej (np. L-metyloornityny lub difluorometyloornityny) wyzwala nadprodukcj dekarboksylazy ornitynowej. To sugeruje istotn rol fizjologiczn tego enzymu, ktrego jedyn znan funkcj jest biosynteza poliamin. Biosynteza poliamin jest wana dla wzrostu komrek i tkanek Na rycinie 33-5 podsumowano biosyntez poliamin w tkankach ssakw. Zauwa, e cz putrescynowa spermidyny i sperminy pochodzi z L-ornityny, a fragment diaminopropa-nowy z L-metioniny przez uformowania zwizku poredniego S-adenozylometioniny. Dekar-boksylaza orni ty no w a i de kar boksy laza S-ade-nozylometioninowa s to indukowane enzymy z krtkimi okresami ptrwania. Przeciwnie, syntazy sperminowe i spermidynowe nie s enzymami ani indukowanymi, ani niezwykle abilnymi. Spord enzymw biosyntezy poliamin u ssakw 2 (dekarboksylaza ornitynow i dekarbo-ksylaza S-adenozylometioninowa) budz zainteresowanie ze wzgldu na regulacj ich obu, jak rwnie moliwo ich wykorzystania w chemioterapii kierowanej enzymatycznie. Biologiczny okres ptrwania dekarboksylazy ornitynowej (w przyblieniu 10 min) jest krtszy od
390 / ROZDZIA 33
Metionina
+ Mg-ATP
. M g -PP;
CH,
OEKAfIBOKSYLAZA OHNITYNOWA S-Aden ozy lometion in a
OHOH
OEKARBOKSYLAZA S-ADE-NOZYLOMETIONIN OWA
coo~
Dekarboksylowana S-adenozylamettonlna SYNTAZA SPERMIDYNOWA
OHOH
Metylo-tl oadencTyna
Spennldyna Da karbo ksylowan a S-adenozylometloninaSYNTAZA SPEHMINOWA Melylo-tlo adenozyna
Spermina
Ryc. 33-5. Zwizki porecTnie i enzymy uczestniczce w biosyntezie spermidyny i sperminy. Grupy metylenowe podano w postaci skrtowej, aby uatwi uwidocznienie caoci procesu.
biologicznego okresu ptrwania jakiegokol wiek innego znanego enzymu ssakw, a jej aktywno szybko i gwatownie reaguje na wiele bodcw. Zwikszenie aktywnoci dekarbok-sylazy ornitynowej 10200-krotne nastpuje szybko po podaniu hodowanym komrkom ssakw hormonu wzrostu, kortykojteroidw, testosteronu lub naskrkowego czynnika wzro stu, Poliaminy wprowadzone do hodowli ko mrkowej pobudzaj syntez biaka o nazwie antyzym (ang. antizyme), ktre wie si z de-karboksylaz ornitynow i hamuje jej funkcje. Aktywno dekarboksylazy ornitynowej wydaje si by kontrolowana w wyniku oddziaywania biako-biako, przypominajcego regulacj aktywnoci trypsyny przez biakowe inhibitory trypsyny. Difluorometyloornityna, samobj czy inhibitor" dekarboksytazy ornitynowej, bya wykorzystywana do wyizolowania linii komrkowych mutantw, ktre wytwarzaj w nadmiernych ilociach dekarboksylaz ornitynow i hamuj replikacj komrki przez chemioterapi kierowan enzymatycznie.. Dekarboksylaza S-adenozylometioninowa, jedyny znany enzym eukariotyczny ze zwizanym pirogronianem jako niezbdnym kofak-torem (dekarboksylazy zwykle zawieraj fosforan pirydoksalu, ktrego brak w dekarbok-sylazie S-adenozylometioninowej), ma krtki biologiczny okres pttrwania (12 h) i reaguje na promotory wzrostu komrkowego w sposb jakociowo podobny do karboksylazy ornitynowej. Zarwno jednak szybko, jak i rozlego s mniej dramatyczne. Dekarboksylaza S-adenozylometioninowa (ryc. 33-5) ulega zahamowaniu przez dekarboksylowan S-adeno-zylometionine i jest aktywowana przez putres-cyne. Produkty katabolizmu poliamin s wydalane z moczem Na rycinie 33-6 przedstawiono katabolizm poliamin w tkankach ssakw. Enzym, oksy^daza poliaminowa, wystpujcy w peroksysomach wtroby i utlenia spermin do spermidyny, a nastpnie sperm idy n do putrescyny, Obie czci diaminopropanowe s przeksztacane w aldehyd P-aminopropionowy. Nastpnie putrescy-na jest czciowo utleniana do MHj iCC^przez mechanizmy, ktre pozostaj do wyjanienia. Jednak gwne czci putrescyny i spermidyny s wydalane z moczem w postaci koniugatw (zwizkw sprzonych), przede wszystkim jako pochodne acetyl owe.
HA
Aldehyd
NH3
fi-am Inopro -plonlanu
Aldehyd 0-amino pro-pioni anu
Puirsscyna
NH+ +CO3
Ryc. 33-6. Katabolizm poliamin. Aby uatwi przedstawienie procesu struktury podano w -formie skrtowej. ___ _____________________
Z TRYPTOFANU WYTWARZA SI SEROTONINA Drugi szlak metabolizmu tryptofanu obejmuje jego hydroksylacj do 5-hydroksytryptofanu. Utlenienie tryptofanu do pochodnej hydroksylowej przebiega analogicznie do przemiany fenyloalaniny w tyrozyn (ryc. 30 -10), a 4-monooksygenaza fenyloalaninowa katalizuje rwnie hydroksylacj tryptofanu. W wyniku dekarboksylacji 5-hydroksy tryptofanu powstaje 5-hydroksytryptamina (serotonina) (ryc. 33-7), wany czynnik zwajcy naczynia krwionone i stymulator skurczu mini gadkich.
392 / ROZDZIA 33
O, >
Wydalane jako koniugaty 5-Hydroksyindolo-3-octan
5-Hydroksytryptofan 5-Hydroksytryptamina
Wydalany Melatonina w postaci sprzonej (N -acetylo-5-meioKsyserotonlna)
Wydalany w postaci sprzonej
Ryc. 33-7. Biosynteza i metabolizm melatoniny. [NH*] przez transami nacj, MAO oksydaza aminowa (oksydaza monoaminowa nazwa nie zalecana).
Dekarboksylaza 5-hydroksytryptofanowa, ktra wytwarza serotonine z hydroksytryptofanu, wystpuje w nerkach (psa i winki morskiej), w wtrobie i odku. Szeroko rozpowszech niona dekarboksylaza aromatycznych amino-
kwasw moe rwnie katalizowa dekarbok sylacje 5-hydroksytryptofanu. Wikszo serotoniny jest w wyriiku oksydacyjnej deaminacji przemieniana do 5-hydroksyindolooctanu. Katalizuje t reakcj oksydaza
aminowa (inaczej: oksydaza monoaminowa nazwa' nie zalecana) (ryc. 33-7). Do inhibitorw tego enzymu naley iproniazyd. Pobudzenie psychiczne, wywoane przez podanie tego leku, jest przypisywane jego zdolnoci przeduania pobudzajcego dziaania serotoni-ny przez hamowanie aktywnoci oksydazy ami nowej. W prawidowym moczu ludzkim wydala si dziennie 10,5242,06 umol (28 mg) 5-hy-droksyindolooctanu.
i kwasem glukumnowym (6%). Cz puli melatoniny przeksztaca si w zwizki niein-dolowe.
Znacznie zwikszone wytwarzanie serotoniny wystpuje w zoliwym rakowiaku (argentaf-finoma), chorobie charakteryzujcej si szerokim rozprzestrzenieniem si komrek nowo tworowych wytwarzajcych serotonin w tkance srebroch onnej jamy brzusznej. Rakowiak jest rozpatrywanyjako zaburzenie metabolizmu tryptofanu, w ktrym, znacznie wiksza ni zwykle, cz puli tego aminokwasu ulega przemianie na szlaku hydroksyjndolowym. W warunkach prawidowych tylko 1% tryptofanu przeksztaca si w serotonin, ale u chorego na rakowiaka przemianie tej ulega nawet 60% tryptotanu. Takie przesunicie metabolizmu znacznie zmniejsza wytwarzanie kwasu nikotynowego z tryptofanu, co w konsekwencji moe spowodowa wystpienie objaww pelagry, a take uiemnego bilansu azotowego. Innymi metabolitami serotoniny, zidentyfikowanymi w moczu chorych na rakowiaka, s; 5-hydro-ksyindoloaceturan (poczenie glicyny z 5-hyd-roksyindoooctanem) oraz N-acetyl o sero toni -na sprzona z kwasem glukuronowym.
Zwikszone wytwarzanie serotoniny zachodzi w zoliwym rakowiaku
Tryptofan moe ulega przemianie w kilka pochodnych indolowycfi (33-7). Produktami kocowymi tych przeksztace, pojawiajcymi si w moczu, s przede wszystkim: 5-hydro-ksyindolooctan, gwny kocowy produkt szlaku prowadzcego od hydroksytryptofanu do serotoniny, oraz indolo-3-octan, powstajcy w wyniku dekarboksyiacji i utlenienia indolopi-rogronianu, ketokwasu pochodzcego z tryptofanu. Nerki i wtroba ssakw oraz bakterie z kau ludzkiego dekarboksyluj tryptofan do tryp-taminy, ktra moe by dalej utleniania do indolooctanu. Chorzy z fenyloketonuri wydalaj zwikszone iloci indolooctanu (oraz in-dolomleczanu, powstajcego w wyniku redukcji indolopirogronianu).
Metabolity tryptofanu s wydalane z moczem i kaem
MELANINY S POLIMERAMI KATABOLITW TRYPTOFANU

Biosynteza melaniny jest skomplikowana wskutek wyduonych i rozgazionych szlakw biosyntezy zoonych chemicznych struktur he-teropolimerw mekniny, a take ich nieroz-puszczalnoci, co utrudnia okrelenie ich struktury. Melaniny s syntetyzowane w melanoso-mach czstkach zwizanych z bonami w obrbie melanocytw. Sdzi si, e powstajcy polimer eumelaniny wychwytuje wolne rodniki i ulega czciowej degradacji przez H2O2, wytwarzany podczas procesu autooksydacji. Feo-melaniny i eumelaniny wchodz w kompleks z biakami macierzy melanosomalnej, wytwarzajc melanoprotein. Na rycinie 33-8 przedstawiono znane zwizki porednie oraz reakcje w biosyntezie eumelaniny i feomdaniny. Reakcj pocztkow katalizuje monooksygenaza monofenolowa (inaczej: tyrozynaza nazwa nie zalecana), enzym zaleny od miedzi. Reakcja katalizowana przez ten enzym ulega zaburzeniu w oezno-skrnym al-binizmie tyrozynazo-ujemnym (p. niej).
Melatonina wytwarza si podczas N-acetyiacji serotoniny

Melatonina powstaje z serotoniny w wyniku N-acetylacji z nastpcz metylacj grupy 5-hyd-roksylowej (ryc. 33-7). Proces ten zachodzi w tkance szyszynki. W uzupenieniu do metyla-cji N-acetyloseryny, zachodzi rwnie bezporednia metylacj serotoniny oraz jej metabolitu 5-hydroksyindolooctanu (ryc. 33-7). Serotonina i 5-metyloksytryptarnina s przeksztacane w odpowiednie kwasy pod wpywem oksydazy aminowej. Z krwiobiegu melatonina jest wychwytywana przez wszystkie tkanki, wczajc mzg, ale ulega szybkiej przemianie w wyniku hydroksylacji w pozycji 6, z nastpczym sprzeniem z siarczanem (70%)
Zwizek poredni benzoliazyny
TH1CHOCHROMY MONOOKSYGENAZA MONOFENOLOWA

p
(3,4- d i hyd ro ksyfen yloalan fn a) OKSYDAZA KATECHOLOWA
zredukowany "\
Dopachinon
MELANINY TYPU MIESZANEGO
Ryc. 33-8. Poznane zwizki porednie i reakcje w biosyntezie eumeianin i feomelanin. Polimery melaniny zawieraj zarwno eumelanin, jak r feomelanin w zmiennych proporcjach. Strzaki kreskowane wskazuj, ktre zwizki porednie przyczyniaj si do syntezy eumelanin w rnych proporcjach. Cyfry w kkach wskazuj na prawdopodobne regulatorowe reakcje szlaku biosyntetycznego. Reakcja 1, katalizowana przez monooksygenaz monoienolow i oksyda2 katecholow (ogem: tyrozynaz), jest wadliwa (niepena) w ty rozynazo- ujemnym albinizmie oczno-skrnym.
Kilka wad w biosyntezie melaniny moe spowodowa albinizm Termin albinizm" obejmuje wiele objaww klinicznych, charakteryzujcych hipomelanoz powstajc z dziedzicznych wad komrek barwnikowych (melanocytw oczu j skry). Jest znane kilka poytecznych modeli albinizmu u gryzoni. Objawy kliniczne, wsplne dla wszystkich 10
postaci albinizmu oczno-skrnego, obejmuj
S-Adefiozylohomocystaina
jr- H, b ioptaryna 3-MONOOKSYGENAZA TYROZYNOWA
H. bloptaryna
osabione zabarwienie skry i oczu. Wszystkie 10 postaci mona zrnicowa na podstawie ich waciwoci klinicznych, biochemicznych, ultra-slrukturalnych i genetycznych. tyrozynazo-negatywnych) jest cakowity brak widocznego barwnika. Cebulki wosw u tych chorych nie s zdolne do przeksztacenia in vitro dodanej tyrozyny w barwnik, a ich melanocyty zawieraj bezbarwne melanosomy. Albinosi tyrozyn a/ o -doda tui (inaczej: tyrozy-nazo-pozytywni) maj nieco barwnika, chocia moe by on niewidoczny u biaych" niemowlt. Barwa wosw waha si od biaotej do jiisnobrzowej i bywaj zabarwione znamiona. Melanocyty cebulek wosw mog zawiera lekko zabarwione melanosomy, ktre przeksztacaj ta vitro tyrozyn w czarn eumelani-ne. Bielaetwo oczne zdarza si albo jako cecha autosomalna recesywna, albo sprzona z chromosomem X. Melanocyty u albinoswz bielact-wem ocznym u heterozygot sprzonych z chromosomem X (ale nie u autosomalnych recesyw-nych) zawieraj makromelanosomy. Siatkwki oczu u heterozygot eskich z bielactwem ocznym sprzonym z chromosomem X (odmiana Nettleship) wykazuj mozaikowy wzr rozmie szczenia barwnika zwizany z przypadkow inaktywacj chromosomu X. Precyzyjne zaburzenia metaboliczne, prowadzce do hipomela-nozy w bielactwie ocznym, pozostaj nieznane.
Aibinoidyzm oczno-skrny jest dziedziczony U albinosw tyrozynazo -ujemnych (inaczej:
TRANSFERAZA Dopamlna
N-METYLOFENYLO ETANOLOAMINOWA
OH
Adrenalina
jako autosomalna cecha recesywna, U chorych, poza rzadkimi wyjtkami, nie wystpuje oczopls, wiatowstrt i zmniejszona ostro widzenia. Z TYROZYNY WYTWARZA SI ADRENALINA I NORADRENALINA Tyrozyna jest prekursorem adrenaliny i noradrenliny,-itre"^Tcyiw"afane w komrkach pochodzenia nerwowego. Chocia DOPA jest
Ryc. 33-9. Przemiana tyrozyny w adrenalin i nor-adrenalin w komrkach nerwowych i nadnerczy. PLP fosforan pirydoksalu.
396 / ROZDZIA 33 NH, H,N+ =

(Nerki) TflANSAMIDYNAZA AGRININO-GLI CYNOWA
H,N-CH2-COO'
Glicyna
HNCH,.COO "
Ornltyna Glikocyjamina (guanidynooctan) ( i. aktywne j met (Wtroba) i o ni ny') ATP S-Adanozylo-met METYLOTRANSFERAZA ionlna ADP
oo L-Arginlna
homocystelna REAKCJA NIEENZYMATYCZNA W MINIU HN=C CH;
HN;
Pi+HsO
tC
CH-,
Kreatynina Ryc.
N CH3
33-10. Biosynteza
kreatyny i kreatyniny.
Fosforan kreatyny
Bursztyn lan
DEKARBOKSYLAZA L-GLUTAMINIANOWA
[A MIN OT R ANSF ERAZ A ] a -A A
cooy-HydroKsymaS!an CHS
cooDEHYDROGENAZA MLECZANOWA a-Ketoglutaran
DEHYDflOGENAZA SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANOWEGO
cooSemlaldehyd bursztyn anu
Ryc. 33-11. Metabolizm y- aninomalanu. a -KA a-ketokwasy, a-AA ^-amino kwasy, PLP fosforan pirydoksalu.
zwizkiem porednim w powstawaniu zarwno melainy w melanocytach, jak i adrenaliny w komrkach neuronowych, odmienne enzymy przeprowadzaj reakcje hydroksylacji w rnych typach komrkowych. Enzym 3-raonook-sygenaza tyrozynowa (inaczej: hydroksylaza tyrozyny nazwa nic zalecana) tworzy czsteczk DOPA w komrkach neuronalnych i nadnerczy na szlakach wiodcych do wyproduko wania noradrenaliny (ryc. 33-9). Dekarboksylaza DOPA, enzym zaleny od fosforan u pirydoksal u, wytwarza dopamin. Ta ostatnia ulega dalszej hydroksylacji przez p-mo-nooksydaz dopaminow (inaczej: p-oksydaz dopaminow nazwa nie zalecana), enzym zaleny od miedzi, ktry wydaje si wykorzys tywa witamin C, aby wytworzy noradrenali-ne. W rdzeniu nadnerczy N-metylotransferaza fenyloetanoloaminowa posuguje si S-adeno-zylometionin do metylacji pierwszorzdowej aminy noradrenaliny, w celu utworzenia adrenaliny (ryc. 33-9). Tyrozyna jest rwniejirekursorem hormo syny (p. rozdz. 47).
UTWORZONY Z GLUTAMINIANU y-AMINOMALAN ULEGA PRZEMIANIE DO SEMIALDEHYDU BURSZTYNIANU

Czsteczka y- amin o mas anu (GABA) powstaje w wyniku dekarboksylacji L-glutaminia-nu, w reakcji katalizowanej przez enzym zaleny d fosforanu pirydoksalu, dek ar boksy laz L-glu ta minia now (ryc. 33-11). Ta dekarboksylaza znajduje si w tkankach orodkowego ukadu nerwowego, gwnie w substancji szarej. Dwie kolejne, mniej wane, reakcje rwnie przeksztacaj putresycyn w y-aminomalan. Jedna obejmuje deaminacj przez fyksydarz aminow (oksydaz diaminow nazwa nie zalecana), druga wykorzystuje N-acetylowane produkty porednie. Wzgldne znaczenie tych 3 szlakw biosyntezy y-aminomalanu zmienia si wrd tkanek i wraz ze stadium rozwojowym. Na przykad arnityna (ryc. 33-5) jest skutecznie przeksztacana w y-aminomalan w tkance embrionalnej siatkwki kury oraz w zakoczeniach nerwowych dojrzaego mz gu. Katabolizm y-aminomalanu (ryc. 33-11) obejniuje transaminacj katalizowan przez aminotransferaz y-aminoma sianow do se-mialdebydu bursztynianu. Semialdehyd bursz-tynianu moe by redukowany do y-hydro-ksymalanu w reakcji katalizowanej przez dehy-drogenaz L-mleczanow lub utleniany do produktu poredniego cyklu cytrynian owego, bursztynianu, a nastpnie do CO2 i H2 O. Wraz z anionami innych aminokwasw y-ami-nomaian jest sfabo transportowany przez ko mrkowe bony plazmatyczne. Stenia y-ami nomalan u w moczu zmieniaj si bezporednio z jego steniami w surowicy. Wprawdzie wada biochemiczna nie zostaa sprecyzowana, moe by jednak wynikiem upoledzonej transamina-cji y-aminomalanu do semialdehydu bursztynianu.
WYDALANA KREATYNINA JEST ODZWIERCIEDLENIEM MASY MINIOWEJ

Kreatyna wystpuje w miniach, mzgu i krwi zarwno jako fosfokreatyna, jak i w stanie wolnym. ladowe iloci kreatyny s rwnie w prawidowym moczu. Kreatynina, bezwodnik kreatyny, jest wytwarzana w znacznej mierze w miniu w wyniku nieodwracalnego nieen-zymatycznego odwodnienia fosfokreatyny (ryc. 33-10). Wydalanie dobowe kreatyniny w moczu przez dan osob jest w znacznym stopniu stae, nie zmienia si z clnia na dzie oraz pozostaje proporcjonalne do masy mini. W biosyntezie kreatyny uczestnicz bezporednio 3 aminokwasy, tj. glicyna, arginina i metionina. Pierwsz reakcj jest tran sam idy nacja, tj. przeniesienie grupy amidynowej z ar-gininy na glicyn z utworzeniem guanidynooc-tanu (glikocyjaminy). Zachodzi ona w nerce, a nie w wtrobie ani w miniu sercowym. Synteza kreatyny koczy si w wtrobie reakcj metylacji glikocyjaminy przy udziale aktywnej metioniny" {ryc. 33-10).
PIMIENNICTWO
Scriver CR et al (editors): The Metabolic Basis of Inherited Diseasa, 6th ed. McGraw-Hill, I9S9. Tabor CW, Tabor H: Polyamines. Annu Rev Biochem 19S4;53:749.
34
Porfiryny i barwniki ciowe

WPROWADZENIE W rozdziale tym omwiono biochemi por firyn i barwnikw ciowych. Te 2 zagadnienia s ze sob cile powizane, poniewa hem jest syntetyzowany z porfiryn i elaza, a produktami jego degradacji s barwniki ciowe i elazo. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Znajomo biochemii porfiryn i hemu stanowi podstaw do zrozumienia rnorodnych funkcji hemoprotein w organizmie (udzia w transporcie tlenu, transporcie elektronw, metabolizmie lekw itd.). Grup chorb spowodowanych zaburzeniami w biosyntezie porfiryn s porfirie. Chocia nie nale one do powszechnych, spotyka si je u pacjentw dermatologw, hepatologw i psychiatrw. Znacznie bardziej powszechnymi, z klinicznego punktu widzenia, s taczki spowodowane zwikszonym steniem bilirubiny w osoczu. Wiksza zawarto bilirubiny w osoczu, bdca wyni kiem zwikszonego wytwarzania lub niewydolnoci wydalania bilirubiny, jest obserwo wana w przypadku licznych chorb od wirusowego zapalenia wtroby do nowotworw trzustki. METALOPORFIRYNY S ZWIZKAMI WANYMI W PRZYRODZIE Porfiryny s zwizkami cyklicznymi, zbudowanymi z 4 piercieni pirolowych poczonych mostkami metinowymi (ry 34-1). Charaktery-
styczn waciwoci porfiryn jest tworzenie kompleksw z jonami metali, ktre cz si z atomami azotu piercieni pirolowych. Przykadami s takie elazo porfiryny, jak hem hemoglobiny oraz porfiryna zawierajca magnez, tj. chlorofil, barwnik rolin zielonych biorcy udzia w fotosyntezie. W przyrodzie metaloporfiryny wystpuj w postaci sprzonej z biakami, tworzc liczne
HC
XH
N H Plrol
c
.H
IV H
?HC C
HNN
C=CH &
H
H
t
(CHltN.) Ryc. 34-1. Czsteczka porfiryny Piercienie oznaczono cyframi rzymskimi I, II, III, IV, a pozycje podstawnikw w piercieniach pirolowych cyframi arabskimi 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7, S. Mostki metinowe (-HC=) okrelono jako a, 3, y, 6,
Porfifyna
PORHRYNY I BARWNIK! CIOWE / 399
zwizki odgrywajce istotn rol w procesach biologicznych. Nale do nich: Hemoglobiny- S to elazo po rfiryny zwi zane z biakiem globin. Maj zdolno odwracalnego wizania tlenu. Su jako rodek transportu tlenu we krwi (p. rozdz. 7). Struktur hemu przedstawiono na ryc, 7-2. Erytrokruoryny. S to biaka elazoporfi-rynowe wystpujce we krwi i w pynach tkankowych niektrych bezkrgowcw. Funkcja ich odpowiada funkcji hemoglobin. Mioglobiny. S to biaka oddechowe wystpujce w komrkach mini krgowcw i bezkrgowcw. Czsteczka mioglobiny przypomina podjednostk hemoglobiny. Cytochromy. S to biaka biorce udzia w transporcie elektronw w reakcjach utleniaj co-red u kujcych. Wanym przykadem jest cytochrom c o masie czsteczkowej ok. 13 000 i jednym atomie elaza na czsteczk, Katalazy. S to enzymy elazo porfiry no we rozkadajce nadtlenek wodoru; niektre z nich
1 2 A P
otrzymano w postaci krystalicznej. W rolinach aktywno katalazy jest bardzo maa, ale podobne funkcje peni enzym elazo porfiry no wy - peroksydaza. zym elazo porfiry nowy katalizujcy utlenianie tryptofanu do formy loki nureniny. Naturalne porf iryny zawieraj acuchy boczne podstawione do szkieletu porf i nowego Porfiryny wystpujce w przyrodzie s zwizkami, w ktrych 8 atomw wodoru porfiny, oznaczonych na ryc. 34-1, jest podstawionych rnymi acuchami bocznymi. W celu prostego przedstawienia tych podstawie Fischer zaproponowa uproszczony wzr, w ktrym mostki metinowe s pominite, a kady piercie pirolu ma posta klamry z zaznaczonymi pozycjami acuchw bocznych numerowanymi jak na ryc. 34-2. Na rycinach 34-234-4 przedstawiono rne porfiryny (A [octan] = CH2COOH; P [propionian]= -CH2 -CH2 COOH; M [metyl] = -CH3; V [winyl] = -CH = CH2 ). Przedstawione na ryc. 34-2 uoenie podstawnikw A i P w uroporfirynie jest asymetryczne (w piercieniu IV kolejno uoenia acuchw kwasu octowego i propionowego jest odwrcona), Porfiryny z tym typem asymetrii podstawnikw s okrelone jako porfiryny typu III. Porfiryny z cakowicie symetrycznym uoeniem podstawnikw s natomiast okrelane jako porfiryny typu L W przyrodzie wystpuj
2,3 Dioksyyenaza tryptofanowa. En-
5 Ryc. 34-2.
Uroporfiryna III.
P
A
t A
k __
A
Uroporfiryny wykryto po raz pierwszy w moczu, ale nie jest to Jedyne miejsce Ich wystpowania
*
P A
Uroporfiryna I
Uroporfiryna III M P M Koproporfiryny po raz pierwszy wyizolowano z kau, ale znajduj sie one take w moczu
P M
i
P M
Koproporfiryna I
Koproporfiryna III
Ryc. 34-3. Uroporfiryny i koproporf iryny.
400 / ROZDZIA 34 M
M P
V
1V
I V
M M (FERRECHELATAZAJ
V M
1 i
Protoporfiryna lii (IX) {macierzysta porfiry na dla
P M Hem hemu) (grupa prosietyczna hemoglabiny) do protoporfiryny z utworzeniem hemu.
Ryc. 34-4. Przyuczenie elaza
porfiryny typu I i Ul, przy czym porfiryny typu III s znacznie bardziej rozpowszechnione i istotne, poniewa naley do nich hem (ryc. 34-3). Hem i jego bezporedni prekursor protoporfiryna IX (ryc. 34-4) s porfirynami typu III (tj. grupy metylowe rozmieszczone s asymet rycznie, jak w koproporfirynie typu III). Jednake zalicza sieje czasami do szeregu IX, gdy byy oznaczone jako dziewite w serii izomerw postulowanych przez Hansa Fishera, pioniera w dziedzinie bada chemii porfiryn.
UKAD PORFIRYNOWY HEMU JEST SYNTETYZOWANY Z SUKCYNYLO-CoA I GLICYNY

Syntez porfiryn w ywych komrkach przeanalizowano na przykadzie hemu, elazoproto-porfiryny hemoglobiny. Dwoma zwizkami wyjciowymi s: sukeynylo-CoA, pochodzcy z cykiu kwasu cytrynowego zachodzcego w mi-tochondriach i glicyna. Niezbdny jest rwnie fosforan pirydokalu, ktry aktywuje" glicy-ne. Produktem reakcji kondensacji sukcynylo--CoA i glicyny jest kwas a-amino-fS-ketoadypi-nowy, ktry natychmiast jest dekarboksylowa-nydo kwasu 8-ami no lewul ino wego (ALA) (ryc. 34-5). Etap ten katalizuje syntaza ALA, ktra jest enzymem kontrolujcym nasilenie biosyntezy porfiryn w wtrobie ssakw. SyjitezaÂLA, zachodzi w rmtochcndriach, W cy_tozolu, przy udziale syntazy porfobilinogen owej, konden-suj 2 czsteczki ALA, tworzc porfobilinogen (PBG) i 2 czsteczki wody (ryc. 34-5). Syntaza porfobilinogen owa jest enzymem zawierajcym cynk, a hamuj e j ow. Kondensacja 4 czsteczek PBG prowadzi do utworzenia tetrapirolu, tj. porfiryny (ryc. 34-6).
X?_4,CZftsteczki. kondensuj liniowo, tworzc acuchowy tetrapirol hydroksymetylenobi-lan. Reakcj katalizuje syntaza u roporfiry no genowa I, znana rwnie jako deaminaza por-fobilinogcnowa. Hydroksymetylenobilan ulega samorzutnej cyklizacji do uroporfirynogemi I (lewa strona ryc. 34-6) lub jest przeksztacany w uroporfirynogen III pod wpywem syntazy uroporfirynogenowej I i kosyntazy uroporfiry-nogenowej III (prawa strona ryc. 34-6). W warunkach fizjologicznych powstaje prawie wycznie izomer uroporfirynogen u typu III, ale w niektrych porfiriach (omawianych poniej) tworz si rwnie izomery porfiry no genw typu I. W uroporfirynogenach piercienie pirolowe s poczone mostkami metylenowymi ( CH2 ), ktre nie tworz ukadu sprzonych wiza podwjnych. Dlatego te zwizki te (jak wszyst kie porfirynogeny) s bezbarwne. Porfirynoge-ny atwo utleniaj si do odpowiednich porfiryn. Reakcje utleniania katalizuje wiato i utworzone porfiryny. Uroporfirynogen III przeksztaca si w ko-proporfirynogen III w wyniku dekarbokylacji acuchw kwasu octowego do grup metylowych^ Reakcj katalizuje dekarboksylaza jiropor-firynogenowa, ktra przeksztaca rwnie~uro-porfirynogen I w kopro porfiry no gen I (ryc, 34-7). Koproporfirynogen III wnika do mito-chondriw, gdzie powstaje protoporfirynogen nT,"a nastpnie protoporfirynaJII^ Wydaje si, e ta przemiana zacfiocIzT w kilku etapach. Znajdujca si w mitochondriach oksydaza ko-proporfirynogenowa katalizuje dekarboksylacj i utlenianie 2 acuchw kwasu propionowego z utworzeniem protoporfirynognu. Substra -tem dla tego enzymu jest wycznie koproporfirynogen typu III, co mogoby tumaczy brak naturalnego wystpowania p roto porfiryny
PORFIRYNY I BARWNIKI CIOWE / 401

COOH
Sukcynylo-CoA ( aktywny" bursztyn tan)
CHj CHJ
C= O ; S-CoA
SYNTAZA 5-AMINOLEWULIMANOWA
COOH
COOH
SYNTAZA Â MINOLEWULINiANOWA
U
C=O H-C-l
CH,
CoA-SH
CO,
CH, c=o
--H-C-NH, H
f i
Glicyna
Fosforan plrydoksalu
JH-
a-Ami n o-0-ketoady p In lan
a-Aminolewulinlan (ALA)
i.C~NH,
COOH
COOH CH,
COOH CH, t
COOH CH,
COOH
J _
SYNTAZA P0RF08ILIN0GENOWA
NH
H*
---C
CH,
I
NH,
Porto bili nogen (prekursor plrolu)
CH
CH,
H,
2 czsteczKI j-arnlnolewullnlanu
Ryc. 34-5. Biosynteza porfobilinogenu. Syntaza 8-aminolewulinianowa znajduje si w mitochondriach, podczas gdy syntaza porfobilinogenowa w cytozolu.
typu I. Utlenianie protoporfirynogenu do pro-toporfiryny katalizuje inny enzym mitochond-rialny oksydaza protoporfirynogenowa. W wtrobie ssakw warunkiem przeksztacenia koproporfirynogenu w protoporfiryn jest obecno tlenu czsteczkowego. Tworzenie hemu polega na wbudowaniu Fe do protoporfiryny Kocowy.eLp syntezy_hemu,p.olega-na wbudowaniu jonu elazawego do protoporfiryny w reakcji katalizowanej przez syntaz hemow, czyli fcrrechelataz, umiejscowion w mito-cbondriach (ryc. 34-4). Zestawienie etapw biosyntezy pochodnych porfiryny z PBG przedstawiono na ryc. 34-8. Biosynteza hemu zachodzi w wikszoci tkanek ssakw, z wyjtkiem dojrzaych erytrocytw, ktre nie zawieraj mitochondriw. Opisane powyej porfirynogeny s bezbarwne i, w porwnaniu z odpowiadajcymi im barwnymi porfirynami, zawieraj 6 dodatko wych atomw wodoru. Wiadomo obecnie, e te zredukowane porfiryny (porfirynogeny),
26 Biochemia
a nie odpowiadajce im porfiryny, s zwizka mi porednimi w biosyntezie protoporfiryn i hemu.
Kluczowym enzymem regulujcym biosyntez hemu jest syntaza ALA Reakcj ograniczajc syntez hemu jest kondensacja sukcynylo-CoA i glicyny 2 utworzeniem ALA, katalizowana przez syntaz kwa su 5-aminolewulinowego (syntaza ALA) (ryc, 34-5). Syntaza ALA jest enzymem podlegajcym regulacji. Uwaa si, e hem, przypuszczalnie przez czsteczk aporepresora, dzialajako_ ujemny regulator; . . gromadzenia sf syntazy ALA. Mechanizm represji i derepresji przedstawiono schematycznie na ryc. 34-9. Moliwe, e na tym etapie ma miejsce rwnie hamowanie na zasadzie sprzenia zwrotnego, lecz gwny wpyw regulujcy hemu polega na tym, e sz^bkoâgromadznia si syntazy ALA zna cznie si zwiksza w nieobecnoci hemu, a maleje w jego obecnoci. Syntaz ALA Z wtroby ssakw charakteryzuje szybki obrt metaboli czny (okres pltrwania wynosi ok. 1 h) waciwy
A czsteczki porfociiinogenu
4NH,
SYNTAZA UROPORFI-RY NOGENOWA
Hyd roksy metylen o b ila n SAMORZUTN A CYKL1ZACJA SYNTA2A UR0POR-FIRYNOG ENOWA I KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA lll
(acuchowy tetrapirol) Uroporflrynagan typu i Uroporflrynogen typu II!
Ryc. 34-6. Przekszta cenie porfobilinogenu w uroporfirynogeny.
A
1
l
p A
r IV ni m
Wk ------ ,P
4CO3
L
IV lll II
Ko pro porfiry nogen I
Pi,
Uroporfirynogen I
|DEKARBOKSYLAZA | UROPORFIRYUOGENOWA
M
iv
TT
Koproporfirynogen lll
M P
IM A Uroporflrynogen lll
4COj
Ryc. 34-7. Dekarboksylacja uroporfirynogenw do koproporfirynogenw w cytozolu. A octan, M metyl, P propionian.
PORFIRYNy I BARWNIKI CIOWE / 403

Porto bil ino gen SYNTAZA UROPORFRYNDGENOWA I Hyd ro ksymety len obi! an KOSYNTAZA UROPORFIRYNOGENOWA II! SYNTAZA UHOPORFIRYNOGENOWA I - S A MO RZ UT NIE
wiato
s 6HUroporfiryna -oUmpoffirynogen wiato 6H
\ Uroporfirynogen I Uroporftryna 1
DEKARBOKSYLAZA URO PO RFIR YNO GEN OWA
4CO5
K oproporfii yna -^-^ K o p r o p o r fi r y n o g e n Koproporfirynogen IM wiato Ko pr op ar fl ry na ---------------------------------------- ^ I OKSYDAZA KOPROPO RFi RYNO GENO WA wiate |
Protoporfi rynogen III Lub wi ato In vltro OKSYDAZA PROTOPORFIRYNOGENO WA
Protoporfiryna I FERRECHELATAZA Fe!
Hem
Ryc. 34-8. Eiapy biosyntezy pochodnych porfiryny z porfobilinogenu.
dla enzymw katalizujcych reakcje ograniczajce tempo przemian. Wiele ksenobiotykw (p. rozdz. 60) powoduje znaczne zwikszenie stenia syntazy ALA w wtrobie czowieka. Wikszo tych zwizkw jest metabolizowana w wtrobie przy udziale swoistej hemoproteiny, tj. cytochromu P-450. Metabolizm ksenobiotykw pociga za sob zwikszone wykorzystanie hemu przez cytochrom P-450, powodujc zmniejszenie wewntrzkomrkowego stenia hemu, co z kolei wpywa na derepresj syntazy ALA i przyspieszenie syntezy hemu zgodnie z zapotrzebowaniem komrki. Indukcja syntazy ALA w wtrobie zaley od wielu innych czynnikw. Glukoza zapobiega indukcji syntazy ALA, elazo w postaci kom-
pleksw chelatowych dziaa synergicznie na indukcj syntazy ALA w wtrobie, a steroidy uatwiaj derepresj syntazy ALA wywoan in vivo lekami. Podanie hematyny zapobiega natomiast derepresji syntazy ALA, jak rwnie innych hemoprotein w wtrobie, wywoanej in vivo lekami. Znaczenie niektrych z tych mechanizmw regulacyjnych omwiono w czci powiconej chorobom sklasyfikowanym jako porfirie.
404 / ROZD2IA 34
Hemoproteiny
1 1
PORFIRYNY S BARWNE FLUORYZUJ

Porfirynogeny s bezbarwne, podczas gdy porfiryny s barwne, W badaniach porfiryn i ich pochodnych due znaczenie maj charakterystyczne widma pochaniania zarwno w wietle widzialnym, jak i nadfioletowym. Przykadem moe by krzywa absorpcji roztworu porfiryny w 5% kwasie solnym (ryc. 34-10). Na szczegln uwag zasuguje wyrane pochanianie w pamie o dugoci ok. 400 nm, charaktery styczne dla piercienia porfirynowego niezalenie od rodzaju acuchw bocznych porfiryn. To pasmo pochaniania jest okrelone mianem pasma Soreta od nazwiska jego odkrywcy. Porfiryny rozpuszczone w mocnych kwasach nieorganicznych lub rozpuszczalnikach organicznych i nawietlone wiatem UV wykazuj siln czerwon fluorescencj. Jest ona tak charakterystyczna, e jest czsto wykorzystywana do wykrywania maych iloci wolnych porfiryn. Absorpcja i fiuorescencja porfiryn s spowodowane obecnoci wiza podwjnych. Jak ju wspomniano, redukcja (w wyniku przyczenia wodoru) mostkw metinowych ( HC=) do metylenowych ( CH2 ) prowadzi do powstania bezbarwnych zwizkw zwanych porfiryno-genami.
Biaka Hem --------------------. FEHRECHELATAZA presor
a.
Protoportlryna It! OKSYDAZA PROTOPOfr 7. FIRYNOGENOWA Protoporf rynogen |]| OKSYDAZA r.OPROPOR-6 FIRYNOGENOWA Kaproporfitynoflen III DEKARBOKSYLAZA URO-Is PORFIRYNOGENOWA Uroporfirynogen Uli KOSYNTAZA imDPORFl-, RYNOGENOWA III Hyctraksymetylanobi la n SYNTAZA UROPORFI-a RYNOGENOWA I Porfobilmogen SYNTAZA PORFO-2 BILINOGENOWA ALA
Wykrywanie obecnoci koproporfiryn i uro-porfiryn jest istotne z klinicznego punktu widzenia, gdy zwizki te s wydalane w zwikszonych ilociach w przypadku porfirii. Obecne w moczu i kale zwizki mona rozdzieli za pomoc ekstrakcji odpowiedni mieszanin rozpuszczalnikw, a nastpnie zidentyfikowa
Porfiryny i ich prekursory wykrywa st za pomoc spektrofotometrii
SYNTAZA ALA Sukcynylo-CoA + Glteyna
Ryc.34-9. Metabolity porednie, enzymy i regulacja syntezy hemu. Numeracja enzymw zgodna z numeracj w tab, 34-1. Brak enzymw 2-8 powoduje porfirie. Regulacja syntezy hemu odbywa si na poziomie symazy ALA za pomoc mechanizmu represja-de represja przez iem i jego hipotetyczny aporepresor. Linie przerywane wskazuj negatywn () regulacj przez represj.
/ /
\ \ \
" J
1
Ryc. 34-10. Widmo absorpcji hematoporfiryny (0,01% roztwr w 5% HCt)
A / ^ s
300
400
500
600
700
Dugo fali (nm)
i oznaczy ilociowo metodami spektrofotomet-rycznymf. Stosujc odpowiednie testy kolorymetryczne mona rwnie oznaczy w moczu ALA i PBG. PORFIRIE S CHOROBAMI GENETYCZNYMI ZWIZANYMI Z METABOLIZMEM HEMU Porfiife.nalea. do grupy chorb wrodzonych zwizanych zjabujrzejjiamilnetarjolizmu hemu, wynikajcych z mutacji genw odpowiedzial-nych za syntez enzymw uczestniczcych w biosyntezie hemu. Chocia nie wystpuj one powszechnie, naley je bra pod uwag, a szczeglnie w pewnych okolicznociach (np. w diagnostyce rnicowej ostrego brzucha lub rnorodnych zaburze o charakterze neuropsychicz-nym), aby unikn niewaciwego postpowa nia z chorymi. Przypuszcza si, e krl Jer2y III chorowa na porfiri mieszan, ktra moga by przyczyn jego okresowych odosobnie na zamku Windsor i pewnych jego pogldw odnonie do amerykaskich kolonistw. Take nadwraliwo skry na wiato (powodujca aktywno nocn) i cikie znieksztacenia wystpujce u niektrych ofiar wrodzonej porfirii erytropoetycznej sugeroway, e osoby te mogy by prototypami wilkoakw. Biochemia tkwi u podstaw przyczyn, rozpoznawania i leczenia porfirii Biorc pod uwag zmniejszenie aktywnoci kadego z enzymw 3--8 na ryc. 34-9 (p. tab. 34-1) wyrnia si 6 typw porfirii. Oznaczenie aktywnoci 1 lub kilku z tych enzymw w odpowiednim materiale (np. erytrocytach) jest podstaw diagnostyki porfirii. Dotychczas nie stwierdzono przypadkw z ma aktywnoci enzymu 1 (syntaza ALA), a zmniejszenie aktywnoci enzymu 2 (syntaza porfobilinogenowa) jest zjawiskiem obserwowanym bardzo rzadko. Porfiri dziedziczy si autosomalnie dominu-jco, z wyjtkiem wrodzonej porfirii erytropoe-tyc2nej, ktr dziedziczy si w sposb recesyw-ny. Nieprawidowoci w genach odpowiedzialnych za syntez enzym w biorcych udzia w biosyntezie hemu okrela si technikami rekombinacji DNA. Podobnie, jak w przypadku wikszoci chorb wrodzonych, kliniczne objawy porfirii s wynikiem nagromadzenia metabolitw poprzedzajcych blok enzymatyczny lub braku metabo-
litw wystpujcych za blokiem enzymatycznym. Jeli wada metaboliczna dotyczy pocztkowych etapw biosyntezy hemu, tj. poprzedzajcych tworzenie porfiry no genw (np. enzymu 3 na ryc. 34-9, porfiria ostra przerywana) nastpuje nagromadzenie ALA i PBG w tkankach i pynach ustrojowych (ryc. 34-11). Zarwno kady z tych zwizkw, jak i oba razem oddziauj toksycznie na nerwy brzuszne i orodkowy ukad nerwowy, powodujc ble brzucha i objawy neuropsychiczne charakterystyczne dla tego typu porfirii. Biochemicznym podoem tych objaww jest prawdopodobnie hamujcy wpyw ALA na aktywno ATPazy w tkance nerwowej i (lub) wychwytywanie ALA przez mzg, powodujce w bliej nie wyjaniony sposb poraenie przewodnictwa. Blok enzymatyczny wystpujcy w pniejszych etapach szlaku powoduje nagromadzenie porfirynogenw okrelonych na ryc. 34 -9 i 34-1!. Produkty ich utlenienia, czyli odpowiednie porfiryny, powoduj nadwraliwo skry na wiato widzialne o dugoci fali ok. 400 nm. Porfiryny eksponowane na wiato o tej dugo ci fali przechodz w stan wzbudzenia i reaguj z tlenem czsteczkowym, wytwarzajc rodnikowe formy tlenu, ktre uszkadzaj lizosomy i inne organelle komrkowe. Uwolnione en zymy powoduj zmiany w skrze, a do powstawania blizn. Innym kryterium klasyfikacji porfirii moe by rodzaj tkanki lub komrki, w ktrych wystpuj nieprawidowoci metaboliczne. S to przede wszystkim tkanki i komrki szczeglnie aktywne w syntezie hemu, takie jak szpik kostny syntetyzujcy znaczne iloci hemoglobiny w cigu doby oraz wtroba bardzo aktywnie syn tetyzujca cytochrom P-450. Zgodnie z t klasyfikacj wyrnia si porfiri eryrropoetyczne, wtrobowe oraz erytropoeryczno-wrrobowe (postacie mieszane). Typy porfirii nalece do kadej z tych klas przedstawiono w tab. 34-1. Przyczyny ujawniania si w przypadku okrelonej porfirii zaburze metabolicznych, gwnie w jednym typie tkanek, nie s do koca wyjanione. Przypuszcza si, e wynika to z rnej aktywnoci enzymw syntezy hemu w rnych tkankach i komrkach. Jak ju wspomniano, syntaza ALA jest kluczowym enzymem regulujcym szlak biosyntezy hemu. Chocia enzym ten nie jest bezporedni przyczyn 6 omawianych typw porfirii, jego regulacja stanowi podstaw zrozumie-
406 / ROZDZIA 34 Tabela 34-1. Gwne objawy porfirii Wada enzymatyczna typ i (klasa) 3. Syntaza uroporfiryno-genowa 1 Porfiria ostra przerywana (wtrobowa)
Porfiria objawy kliniczne Ble brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne Brak nadwraliwoci skry na wiatfo Nadwraliwo skry na wiato Nadwraliwo skry na wiato Nadwraliwo skry na wiato Ble brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne Nadwraliwo skry na wiato Ble brzucha Zaburzenia neuropsy-chiczne
Wyniki testw laboratoryjnych PBG w moczu Uroporfiryna w moczu + +
4. Kosyntaza uropor-firynogenow3 IM 5. Dekarboksylaza uro-porfirynogenowa 6, Oksydaza kopropor-firynogenowa
Wrodzona porfiria erytropoetyczna (erytropoetyczna) Porfiria skrna pna (wtrobowa) Koproporfiria wrodzona (wtrobowa)
Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu Uroporfiryna w moczu + PBG w moczu PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + Koproporfiryna w kale + PBG w moczu + Uroporfiryna w moczu + P rato porfiry na w kale + P rato porfiry na w kale + P rato porfiry na w erytrocytach +
7. Oksydaza protopor-firynogenowa
Porfiria mieszana (wtrobowa)
8. Ferrechelataza
Nadwraliwo skry Protoporfiria erytrona wiato poetyczna (erytropo-etyczno-wt robowa)
Tabela zawiera wyniki bada biochemicznych typowych dla ostrych stanw porfirii. W okresie utajenia wyniki niektrych oznacze mog by prawidowe. * Numeracja enzymw odpowiada numeracji na ryc. 34 -9.
Mutacja W DMA
Nieprawidowocl w obrbie enzymw syntezy hemu
Nagromadzanie ALA oraz RBG I (lub) zmniejszenie stenia hemu w komrkach i pynach ustrojowych
Nagromadzenie porfirynogenow w skrze i tkankach
Zaburzenia neuropaycniozne
Samorzutne utienianie porfirynogenow do porfiryrr
Nadwraliwacskorynaiwiato
Ryc. 34-11. Biochemiczne podstawy gwnych objaww klinicznych porfiru
nia tych chorb. Syntaza ALA ulega zarwno indukcji,'jak i represji, a jej aktywno w pewnych warunkach moe si znacznie zwikszy (a do 50 razy). Wiele lekw (np. barbiturany, gryzeofulwina) indukuje syntaze ALA. Mechanizm tej indukcji w wikszoci przypadkw polega na indukcji cytochromu P-450 (p. rozdz. 60), a zwikszone zapotrzebowanie na hem powoduje derepresj (indukcj) syntazy ALA. U chorych z porfiri zwikszenie aktywnoci syntazy ALA prowadzi do zwikszenia stenia potencjalnie szkodliwych prekursorw hemu poprzedzajcych blok metaboliczny. Przyjmowanie lekw, ktre indukuj cytoehrom P -450 (induktory mik roso mai ne), moe wic wywoa napad porfirii. Podstaw rozpoznania swoistej postaci porfirii s; wywiad dotyczcy samego chorego i wywiad rodzinny, badania przedmiotowe chorego i odpowiednie testy laboratoryjne. Gwne dane, dotyczce 6 postaci porfirii, przedstawiono w tab. 34-1. Zatrucie oowiem moe rwnie wpywa na metabolizm hemu w wyniku wizania oowiu z grupami SH takich enzymw, jak ferrechelataza czy syntaza porfobilinogenowa. Powoduje to zwikszenie zawartoci protopor-firyny w erytrocytach oraz ALA i kopropor-firyny w moczu. Naley mie nadziej, e w przyszoci moliwe bdzie leczenie porfirii na poziomie genu. Tymczasem leczenie ma charakter objawowy. Chorzy powinni unika rodkw znieczulaj cych oraz lekw, w tym rwnie alkoholu, ktre indukuj cytochrom P-450. Przyjmowanie duych iloci pokarmu bogatego w wglowodany (obcienie glukoz) lub podawanie hematyny (wodorotlenek hemu) moe powodowa represj syntazy ALA, a tym samym zmniejsza tworzenie szkodliwych prekursorw hemu. W przypadku chorych z wraliwoci skry na wiato korzystne jest stosowanie {3-karotenu; zwizek ten zmniejsza wytwarzanie wolnych rodnikw, zmniejszajc tym samym nadwraliwo skry na wiato. Pomocne mog by rwnie ekrany soneczne eliminujce zakres wiata widzialnego.
PRODUKTEM KATABOLIZMU HEMU JEST BILIRUBINA

U dorosego czowieka fizjologicznie w cigu godziny rozpada si 12xlO 9 erytrocytw. W cigu dnia osoba o masie ciaa 70 kg metabo-
iizuje ok. 6 g hemoglobiny. C_zej_ biakowa jilobina moe by ponownie wykorzystana jako taka lub w formie jej skadowych amino kwasw, a eUzo_hm.Qwe jest wczane w oglna pule elaza w organizmie, rwnie w celu ponownego wykorzystania. Natomiast pozbawiona elaza cze porfirynowa hemu jest degradowana, gwnie w komrkach siateczko-wo-rdbonkowych wtroby, ledziony i szpiku kostnego. Katabolizm hemu, pochodzcego ze wszyst kich hemoprotein, jzachodzi we frakcji raikro-somalnej komrek siateczkowo-rdbon -kowych przez zoony ukad enzymatyczny, okrelany mianem oksygenazy hemowej. Dziaanie oksygenazy hemowej poprzedza zwykle utlenienie elaza w hemie do formy elazowej l z utworzeniem heminy oraz lune poczenie z"albumin do methemalbuminy. Oksygenaza Uemawa jest indukowana pod wpywem sub-suatu i jest sprzona z mi krosom alnym acuchem przenoszenia elektronw. Jak przed stawiono na ryc. 34-12, w obecnoci NADPH hemina ulega redukcji, po czym rwnie przy udziale NADPH do wizania a-metinowego midzy I i II piercieniem pirolowym porfiryny przycza si grupa hydroksylowa, a jon elazawy jest ponownie utleniany do jonu elazowego. W konsekwencji w obecnoci tlenu uwalnia si jon elazowy i odcza si tlenek wgla, a w wyniku rozerwania piercienia tetrapirolowego po wstaje rwnomolarna ilo biliwerdyny lX-a. Hem peni w tej reakcji funkcj katalizatora. U ptakw i pazw zielona biliwerdyna IX-tx wydala si; u_ ssakw reduktaza bili werdy nowa ^Hjjkiîp mostek m et ino w. y .miedzy piercieniami pirolowymi III i IVdo grupy metylenowej, tworzc bilirubin IX ^- barwnik ty (ryc. 34-12). Ocenia si, e 1 g hemoglobiny dostarcza 59,9 jrniol ( = 35 mg) bilirubiny. Dobowe wytwarzanie bilirubiny u czowieka wynosi ok. 427,5598,5 urnol < = 250350 mg). Chemiczne przeksztacenie hemu do bilirubiny przez komrki siateczkowo -rdbonkowe mona obserwowa in vivo na przykadzie krwiaka, w ktrym purpurowa barwa hemu przechodzi powoli w te zabarwienie bilirubiny. Dalszy metabolizm bilirubiny zachodzi gwnie w wtrobie. Mona w nim wyrni 3 procesy: 1) wychwytywanie bilirubiny przez komrki miszowe wtroby, 2) sprzganie bilirubiny w siateczce rdplazmatycznej gadkiej i 3)
%/
408 / ROZDZIA 34
Hen-
HN
l
t
Hemina
p^
|Ji - 11
-N
HN
H
/=
rf
HN NADPH -NADP
i
-t Bilirubina IXa HN NADP NADP-^J H -^
nr?
Vi
H H
V
n r
Fea+ (ponownie wykorzystywany) i CO (wydychany) NADPH NADP
HN m
\ = /
Ji_
i r v
m
Biliwerdyna IX a -N
y
Bvc. 34-12, Schemat mikrosomalnego ukadu oksygertazy hemowej (zmodyfikowany wg Schmida R., McDonougha A. F. w: The Porphyrins. Dolphin D. [red.]. Academic Press, 1978).
wydalanie sprzonej bilirubiny w ci. Kady z tych procesw bdzie rozpatrywany oddzielnie. Bilirubina jest wychwytywana przez wtrob SJaifeo~tozpti szcza na w osoczu i wodzie bilirubina wie si z biakami osocza, a gwnie z albumin. Kada czsteczka albuminy ma 1 miejsce o duym i 1 miejsce o maym powinowactwie do bilirubiny. W przeliczeniu na 1000
ml osocza ok. 427,5 umol( = 250 mg) bilirubiny wie si silnie z albumin w miejscu jej duego powinowactwa do bilirubiny. Nadmiar bilrrubi-ny wie si tylko luno i tym samym atwo ulega odczeniu i dyfuzji do tkanek. Niektre zwizki, takie jak antybi otyki i leki, wspzawodnicz z bilirubin o miejsce o duym powinowactwie w albuminie. Zwizki te mog zatem wypiera bilirubin z poczenia z albumin, odgrywajc du rol klinicz n.
W^ wtrobie bilirubina odcza si od al buminy Tworzenie diglukuronidu bilirubiny przebie,i przy udziale nieswoistego ukadu^' ga w pobliu bieguna ciowego hepatocytu przenonikowego przenika przez biegun naczy- (otaczajcego kanalik ciowy) przy udziale niowy hepalocytu do wntrza komrki. Ten ukad UDPglukuronozylotransferazy lub enzymu kauatwiajcy transport charakteryzuje si du talizujcego przeksztacenie 2 czsteczek wydajnoci i nawet w warunkach patologicznych mono-glukuronidu bilirubiny w 1 czsteczk nie ogranicza szybkoci i przemian bilirubiny. diglukuronidu bilirubiny i 1 czsteczk Poniewa ukad uatwiajcy transport umo- niesprzonej bilirubiny (ryc. 34-14). Dalsz liwia utrzymanie rwnowagi bilirubiny po obu charakterystyk ukadu sprzgania bilirubiny stronach bieguna naczyniowego hepatocytu, przedstawiono w czcci powiconej bilans wychwytywania bilirubiny zaley od jej wrodzonym zaburzeniom sprzgania bilirubiny. usuwania w wyniku dalszych etapw szlaku Aktywno UDPglukuronozylotransferazy metabolicznego. jest indukowana przez wiele stosowanych w klinice lekw jak fenobarbital. Sprzganie bilirubiny zachodzi w wtrobie Bilirubina wydziela si do w \y^{rnhif w wyniku przyczenia grup ci polarnych, bilirubina .przeksztac si w posta Wydzielanie sprzonej bilirubiny do ci rri7pns7r;7tiir^] w \yp/-rig i '"jfdziela si do ci. przebiega wbrew gradientowi ste na zasadzie rozpuszczalnoci w wodzie, transportu aktywnego, kt ry prawdopodobnie czyli zwikszenia polarnoci bilirubiny, spenia funkcj regulujc dla caego metabolizdgko-nuje si w wyniku sprzgania i przebiega, mu bilirubiny w wtrobie. Transport sprzonej przynajmniej pocztkowo, w siateczce bilirubiny do ci jest indukowany przez te rdplazma- f. F r 7 V ud zial e s woist ycn same leki, ktre indukuj proces sprzgania enzybilirubiny. Ukady sprzgania i wydzielania _ y j g E J . F y y bilirubiny stanowi wic skoordynowan jedmw. U ssakw wikszo bilirubiny wydala si nostk funkcjonaln. dp ci w postaci diglukur""idn h^nNny (ryc. W warunkach fizjologicznych praktycznie 34-13)! Tworzenie' poredniego cala (> 97%) bilirubina wydzielana do ci jest monoglukuro-nidir bilirubiny jest katalizowane w postaci sprzonej. Znaczne iloci bilirubiny przez niesprzonej w ci mona znale jedynie po urydy-nodifosfoglukuronozylotransferaz (U fototerapii. DPglu-kuronozylotransferaz), enzym Wtroba dysponuje wieloma ukadami wywystpujcy w siateczce rdplazmatycznej dzielajcymi do ci produkty metabolizmu gadkiej w prawdopodobnie wicej ni jednej zwizkw wystpujcych naturalnie oraz prepostaci. Reakcj przedstawiono na ryc. 34-14. paratw farmaceutycznych. Niektre z nich s Zachodzi ona przede wszystkim w wtrobie, ale wsplne z ukadem wydzialajcym take w nerkach i bonie luzowej jelita. diglukuro-nid bilirubiny, podczas gdy inne Nieprawidowe stenie sprzonej bilirubiny w dziaaj niezalenie. surowicy czowieka jest gwnie zwizane z obecnoci mono-glukuronidw. o
-OOC<CHjOLC-O-C C-0 -C|CH; O)4COO-
M H
M H
Ryc. 34-13. Struktura digiukuronidu bilirubiny (bilirubina sprzona, bezporednia). Kwas glukurono-wy wie si estrowo z 2 resztami kwasu propionowego, tworzc acyloglukuronid.
410 / ROZDZIA 34
DEHYDflOGENAZA LI DPlto UDP-glukoza. 2 NA D
Kwas UDP-glukuronowy 2 NAD H +2 H
Kwas UDP-glukuronowy Bilirubina
UOP-GLUKURONOZYLOTflANSFERAZA Monog I uku ro ni d bilirubiny UDP UDP-GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA Dlglukuronid bilirubiny GLUKURONOZYLO TRANSFERAZA GLUKURON1DU BILIRUBINY UDP
Kwas UD P-glu kuro nawy
+
Monoglukuronid bilirubiny 2 czsteczki monogiukurortW u bilirubiny
Oiglukuronid bilirubiny
Bilirubina
Ryc. 34-14. Sprzenie bilirubiny z kwasem glukuronowym. Donor gtukuronianu, kwas UDP-gfukuro-nowy, tworzy si z UOP-glukozy
Sprzona bilirubina jest redukowana do urobilinogenu przez bakterie jelitowe W miar, jak sprzona bilirubina dociera do jelita krtego i jelita grubego, swoiste enzymy bakteryjne (p-glukuronidazy) usuwaj kwas glu-kuronowy, a flora bakteryjna kau redukuje barwnik do bezbarwnych zwizkw tetrapiro-lowych, zwanych urobilinogenami (ryc. 34-15). W jelicie kretyni oraz w jelicie grubym pewna cz urobilinogenw wchania si i ponownie wydala z wtroby, stanowic krenie jelitowo--wtrobowe barwnikw
ciowych. W warunM
kach nieprawidowych, zwaszcza przy wytwarzaniu nadmiernej iloci barwnikw cio.wych Jub w przypadku choroby wtroby upoledzajcej krenie jli to wo-watro bo we, nastpuje wydalanie urobilinogenu rwnie z moczem. W warunkach fizjologicznych wikszo bezbarwnych urobilinogenw. powstaych w kr-nicy pod wpywem flory bakteryjnej wystpujcej w kale, utlenia si do urobilin (zwizkw barwnych) i wydala z kalem (ryc. 34-15). Utlenianie pozostaych urobilinogenw powoduje ciemnienie kau na powietrzu.
H,C N NH H OH M HN \= \
CHj
P M
Mszoblllrubinogen Sterkobllinogen (L-u robi lin ogan)
Ryc. 34-15. Struktura niektrych barwnikw ciowych.
HIPERBILIRUBINEMIA WYWOUJE TACZK Zwikszenie stenia bilirubiny we krwi powyej 17 umol/1 (=1 mg/dl) nazywamy hiper-bilirubinemi. Hiperbilirubinemia moe by wynikiem wytwarzania wikszej iloci bilirubiny ni wydala zdrowa wtroba lub te skutkiem niewydolnoci uszkodzonej wtroby do wydalania bilirubiny powstajcej w ilociach prawidowych. Przyczyn liiperbilirubinemii, jeli nie stwierdza si uszkodzenia wtroby, moe by rwnie zaczopowanie przewodw ciowych wtroby, uniemoliwiajce wydalanie ci. We wszystkich tych przypadkach bilirubina groma dzi si we krwi i po przekroczeniu pewnego stenia dyfunduje do tkanek, powodujc ich zacenie. Zjawisko to okrela si mianem taczki. Oznaczenie stenia bilirubiny w surowicy ma ogromne znaczenie w badaniach klinicznych taczek. Van den Bergh jako pierwszy wprowadzi metod ilociowego pomiaru zawartoci bilirubiny w surowicy, wykorzystujc test Ehr-licha na bilirubin w moczu. Test Fhrlicha polega na reakcji diazowanego kwasu sulfanilo-wego (odczynnik diazowy Ehrlicha) i bilirubiny z utworzeniem czerwono-purpurowego zwizku arowego. W oryginalnej metodzie Ehrlicha do rozpuszczenia zarwno bilirubiny, jak i odczynnika diazowego wykorzystywano metanol. Przypadkowe pominicie przez Van den Bergha metanolu podczas oznaczania barwnikw ciowych w ci doprowadzio do wykrycia, e reakcja barwna zachodzi bezporednio". Posta bilirubiny reagujc w nieobecnoci metanolu okrelono jako bezporedni". Nastpnie stwierdzono, e taka sama reakcja zachodzi take w surowicy chorych z taczk mechaniczn. Niemniej dodawanie metanolu byo nadal konieczne przy oznaczaniu bilirubiny w surowicy prawidowej oraz bilirubiny wystpujcej w zwikszonej iloci w surowicy chorych z taczk hemolityczn, u ktrych nie stwierdzono niedronoci przewodw ciowych. Posta bilirubiny, ktr mona byo oznaczy jedynie po dodaniu metanolu, okrelono jako poredni". Obecnie wiadomo, e bilirubina porednia jest bilirubin woln" (niesprzona.), ktra przechodzi do tiepatcytw z komrek siateczko-wo-r~dboukowych, gdzie powstaje w wyniku rozpadu ukadu porfirynowego hemu. Poniewa ta bilirubina nie rozpuszcza si w wodzie,
reakcja z odczynnikiem diazowym wymaga obecnoci metanolu. W wtrobie bilirubina wolna czy si z kwasem glukuronowym i w postaci sprzonej, jako glukuronid bilirubiny, wydziela si do ci. Bilirubina sprzona, jako rozpuszczalna w wodzie, reaguje bezporednio z odczynnikiem diazowym, a wic bilirubina bezporednia" Van den Bergha odpowiada bilirubinie sprzonej (glukuronid bilirubiny). W zalenoci od typu bilirubiny wystpujcej w osoczu, tj. bilirubiny niesprzonej lub bilirubiny sprzonej, hiperbilirubinemie mona sklasyfikowa odpowiednio jako hiperbilirubinemie retencyjn (miszow) oraz hiperbilirubinemie zwrotn (zastoinow), w ktrej nastpuje wtrne wchanianie si barwnika do krwi. Tylko bilirubina niesprzona moe przenika pr/c/ barier krew-mzg do orodkowego ukadu nerwowego; a zatem encefalopatia spowodowana hiperbilirubinemia (kemicterus) moe wystpi wycznie w przypadku retencji bilirubiny, czyli niesprzonej hiperbilirubinemii. Tylko sprzona bilirubina moe pojawi si w moczu. Zgodnie z tym taczka z obecnoci barwnikw ciowych w moczu wystpuje tylko w przypadku hiperbilirubinemii sprzonej (zwrotnej), a. taczka bez barwnikw ciowych w moczu w przypadku nadmiaru bilirubiny niesprzonej. Hiperbilirubinemia niesprzona Ze wzgldu na du wydajno metabolizo-wania bilirubiny w wtrobie, nawet w przypadku znacznej hemolizy, hiperbilirubinemia niesprzona jest zazwyczaj niewielka < 68,4 umol/1 (= <4 mg/dl). Jednake upoledzenie metabolizowania bilirubiny, na skutek wady nabytej bd wrodzonej nieprawidowoci, moe spowodowa wystpienie hiperbilirubinemii. Najczciej spotykanymi przyczynami hiperbi lirubinemii niesprzonej s: kw. Ten przejciowy stan jest najczstsz przyczyn hiperbilirubinemii niesprzonej. Jest ona wynikiem nadmiernej hemolizy i niedojrzaoci ukadu wtrobowego do wychwytywania, sprzgania i wydzielania bilirubiny. Zmniejszona jest nie tylko aktywno UDPglu-kuronozylotransferazy, ale przypuszczalnie rwnie synteza substratu dla tego enzymu, czyli kwasu UDPgiukuronowego. Ze wzgldu na fakt, e zwikszone stenie bilirubiny jest spowodowane przez bilirubinemi niesprzona, moe ona przenika przez barier krew-mzg,
taczka fizjologiczna" noworod -
412 / ROZDZIA 34
gdy jej zawarto w osoczu przekroczy ilo silnie wizan przez albumin 340 428 jimol/1 (= 20 25 mg/dl). Nastpstwem toksycznego dziaania bilirubiny jest kernicterus, taczka jder podstawnych mzgu, powodujca upoledzenie umysowe. Skuteczne jest podawanie fen o bar bi tal u, ze wzgldu na jego zdolno indukowania ukadu metabolizujcego bilirubin niesprzon. Ponadto fototerapia wiatem widzialnym (przez niewyjaniony dotychczas mechanizm) pobudza wydzielanie przez wtrob bilirubiny niesprzonej w wyniku przeksztacenia pewnej iloci bilirubiny w inne pochodne wydalane w ci, takie jak fragmenty maleimidowe i izomery geometryczne.
owoci klirensu wtrobowego bilirubiny, bdce wynikiem upoledzenia wychwytywania bilirubiny przez komrki miszowe wtroby, jak rwnie zmniejszon aktywno UDPglukurono-zylotransferazy bilirubiny.
Hiperbilirubinemia toksyczna. Hiper-biiirubinemia niesprzon moe by

wynikiem zaburzenia czynnoci wtroby, wywoanego przez takie toksyny, jak: chloroform, arsfena-mina. tetrachlorek wgla, acetaminofen, wirus zapalenia wtroby, marsko lub zatrucie grzybami z rodzaju Amanita, Chocia wikszo z tych nabytych zaburze jest skutkiem uszkodzenia komrek miszowych wtroby, towarzyszy im czsto niedrono przewodw ciowych w obrbie wtroby powodujca wystpowanie hiperbilirubinemii sprzonej,
Zesp Criglera-Najjara, typ I; wrodzona taczka niehemolityczna. Zesp
Criglera-Najjara typu I jest rzadkim zaburzeniem dziedziczonym jako cecha recesywna au-tosomalna, ujawniajcym si u czowieka na skutek wady metabolicznej w sprzganiu bilirubiny. Charakteryzuje si on cik taczk wrodzon z powodu braku aktywnoci UDPglu-kuronozylotransferazy w wtrobie. Choroba /. vykle koczy si zgonem w cigu pierwszych 15 miesicy ycia, chocia istniej doniesienia o nastolatkach, u ktrych choroba nie ujawnia si a do okresu dojrzewania pciowego. Dzieci te poddawano fototerapii powodujcej pewne zmniejszenie stenia bilirubiny w osoczu. Fe-nobarbital nie wpywa na tworzenie glukuroni-dw bilirubiny u chorych z zespoem Criglera--Najjara typu I. U chorych nie leczonych ste nie bilirubiny w surowicy przewysza zwykle 340 umol/1 ( = 20 mg/dl). si, e to zaburzenie wrodzone wynika z lejszej wady genetycznej w systemie sprzgania bilirubiny i ma znacznie agodniejszy przebieg. Stenie bilirubiny w surowicy nie przekracza zazwyczaj 340 |omol/l ( = 20 mg/dl), niemniej caa bilirubina jest gromadzona w postaci niesprzonej. W ci chorych stwierdza si mono-glukuronid bilirubiny, co pozwala przypuszcza, e wada genetyczna dotyczy UDPglukuro-nozylotransferazy wtrobowej, ktra docza drug reszt glukuronianu do monoglukuronidu bilirubiny. Chorzy z tym zespoem reaguj na podawanie duych dawek fenobarbitalu. Zesp Gilberta. Zesp Gilberta stanowi niejednorodn grup zaburze, z ktrych wik szo uwaa si obecnie za wynik hemolizy wyrwnawczej zwizanej z'hiperbilirubinemi niesprzon. Stwierdza si take nieprawid Zesp Criglera-Najjara, typ I I . Wydaje
Htperbilirubinemi sprzon mona wykry badajc mocz Poniewa bilirubina sprzona jest rozpuszczalna w wodzie, mona j wykry w moczu chorych z hiperbilirubinemia sprzon; dlatego te mwi si o nich czsto, e maj taczk z wydalaniem barwnikw ciowych z moczeni (z choluri). Najczciej spotykanymi przyczynami hiperbilirubinemii sprzonej s:
Przewleka taczka samoistna (zesp Dubina-Johnsona). To zaburzenie,
dziedziczone jako cecha autosomalna recesywna, charakteryzuje si hiperbilirubinemia sprzon w dziecistwie lub u dorosego czowieka. Hiperbilirubinemia jest wynikiem upoledzenia wydzielania wtrobowego bilirubiny sprzonej do ci. Wada ta nie ogranicza si do bilirubiny, ale dotyczy take wydzielania estrogenw i zwizkw stosowanych w testach klinicznych, takich jak barwnik bromosulfoftaleina. Cech znamienn u chorych z zespoem Dubina-Johnsona jest obecno w hepatocytach rodkowego obszaru zrazika nietypowego, dotychczas nie zidentyfikowanego pigmentu. Hiperbilirubinemi sprzon wywouje take zablokowanie przewodw ciowych wtrobowych lub przewodu ciowego wsplnego. Uwaa si, e przechodzenie barwnikw ciowych z krwi do komrek wtroby przebiega prawidowo, lecz nie s one wydzielane. Konsekwencj tego zaburzenia jest wchanianie bilirubiny sprzonej do y wtrobowych i naczy chonnych. Wszystkie postacie poza wtrb owych taczek mechanicznych (zaporowych, zastoino-
Niedrono przewodw ciowych.
PORHRYNY 1 BARWNIKI CIOWE / 413 Tabela 34-2. Wyniki analizy biochemicznej pacjentw zdrowych oraz z trzema rnymi rodzajami taczek Stan zdrowia Prawidowy Surowica bilirubina Bezporednia: 1,7-6,8 umol/l Mocz urobilinogen 0-6,75 nmol/24h Mocz bilirubina Brak 67,48-472,4 umol/24 h (40-280 mg/24 h) Ka urobilinogen
Niedokrwisto hemolityczna Zapalenie wtroby
(0,1 -0,4 mg/dl) (0-4 mg/24 h) Porednia: 3,4-12 umol/l (0,2-0,7 mg/dl) Zwikszenie stenia Zwikszenie poredniej Zwikszenie stenia Zwikszenie bezporedniej i poredniej Zwikszenie stenia Brak bezporedniej
Brak
Zwikszenie
Wystpowanie Zmniejszenie
taczka mechaniczna
Wystpowanie Iloci ladowe lub brak
* Najczciej wystpujc przyczyn taczki mechanicznej (pozawtrobowej) jest rak gowy trzustki oraz kamienie w przewodach ciowych
wych) oraz niektre postacie taczki miszowej (postacie cholestatyczne) charakteryzujce si hiperbittrubinemi sprzon, okrela si mianem taczki cholestatycznej. Wystpowanie urobilinogenu w moczu jest wskanikiem klinicznym Zazwyczaj w moczu znajduje si jedynie ladowe iloci urobilinogenu. W przypadku cakowitego /a czopw ani a przewodu ciowe go nie stwierdza si w og le urobilinogenu w moczu, poniewa bilirubina, z ktrej po wstaje, nie przedostaje si do jelita, gdzie mogaby by przeksztacona w urobilinogen, W takim przypadku obecno w moczu bilirubiny, przy braku urobilitiogenu, wskazuje na taczk mechaniczn rdwtrobow lub pozawlrobo-w. W taczce hemolitycznej zwikszone wytwarzanie bilirubiny prowadzi do zwikszonego wytwarzania urobilinogenu, ktry pojawia si w moczu w duych ilociach. W moczu chorego na taczk hemolityczna. bilirubina zazwyczaj nie wystpuje (niesprzona bilirubina nie przenika bowiem do moczu), tak e zwikszenie
wydalania urobilinogenu i brak bilirubiny w moczu sugeruj wystpowanie taczki hemolitycz-nej. Wzmoony, z jakichkolwiek
liwa) powoduje rwnie zwikszenie urobilinogenu w moczu. W tabeli 34-2 podsumowano wyniki analizy biochemicznej chorych z rnymi rodzajami taczek: niedokrwistoci hem o lityczn (przyczyna przedwtrobowa), zapaleniem wtroby (przyczyna wtrobowa) i zaczopowaniem przewodu ciowego wsplnego (przyczyna za wtrobowa).
PIMIENNICTWO
Billett,HH, Porphyrias; Inbornerrorsinhemeprodu etion. Hosp Pract 1988; 41:60. Goldberg A et al: Porphyrin metabolism and Ibe porphyrias. In: Oxford Textbook of Median. 2nd ed- Weatherall DJ et al (editors). Oxford University Press, 1987. Kappas A, Sassa S, Anderson KE: The porphyrias. In:'-The Metabolu Basis of Inherited Disease, 5th et. Staûry JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Meyer UA, Porphyrias. In: Harrison's Principles of Internat Medii-me, l lt h ed. Braunwald E et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Wolkoff AW, Chowdliury JR, Arias IM. Hereditary jiiundice a.nd disorders of bilirubin metabolism. In: The MetaboJic Basis of btheriied Disease, 5th ed, Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983.
przyczyn, proces niszczenia krwinek (np. niedokrwisto zo-
CZ IV Budowa, czynno i replikacja makroczsteczek informacyjnych Nukleotydy

35
koenzymw (AMP), akceptorami oksydacyjnej fosforylacji (ADP). allosterycznymi regulatorami aktywnoci enzymatycznej i wtrnymi przekanikami" (cAMP, cGMP). Syntetyczne analogi naturalnie wystpujcych nukeotydw s stosowane w chemioterapii nowotworw jako inhibitory enzymw i mog zastpi w kwasach nukleinowych naturalnie wystpujce nukleotydy. W terapii zmierzajcej do zahamowania wzrostu komrek rakowych lub niektrych wirusw czsto stosowano analogi zasad nukleozydw lub nukleotydw, ktre hamuj syntez DNA lub RNA. Do zwizkw tych nale: 5-fluorouracyl, 5'-jodo-2'-deoksy-urydyna, 6-tioguanina, 6-merkaptopuryna, 6-a-zaurydyna i arabinozyd cytozyny (p. niej). Allopurynol, analog puryny, jest szeroko stosowany w leczeniu dny.
WPROWADZENIE
Nukleotydy bior udzia w rnych proce sach biochemicznych. Najlepiej jest poznana rola nukleotydw purynowych i pirymidynowych* jako monomerycznych prekursorw RNA i DNA, Jednak rybonukleotydy purynowe to take wszechobecne rda duej energii (ATP), sygnay regulatorowe (cykliczny AMP [cAMP] i cykliczny GMP [cGMP]), a take komponenty koenzymw FAD, NAD+ oraz NADP+, a S-adenozy lornet ionina jest donorem grup metylowych. Nukleotydy pirymidy no we, oprcz tego, e stanowi monomeryczne preku-rsory syntezy kwasw nukleinowych, s take pproduktami o duej energii, takimi jak UDP-glukoza i UDP-galaktoza, biorcymi udzia w metabolizmie wglowodanw, oraz CDP-acyloglicerol w syntezie tuszczw.
Heterocykliczne zasady purynowe i pirymi-dynowe s macierzystymi czsteczkami nuk-leozydw i nukleotydw. Nukleotydy s wszechobecne w ywych komrkach, gdzie speniaj liczne, kluczowe funkcje, np.: wbudowy-wanie w kwasy nukleinowe ich rybozowych (RNA) lub deoksyrybozowych (DNA) postaci, przenoszenie energii (ATP); s one czciami
HETEROCYKLICZNE ZASADY NUKLEOTYDW S POCHODNYMI PURYNY I PIRYMIDYNY

Zasady purynowe i pirymidy nowe (puryny i pirymidyny) nukleotydw powstaj przez podstawienie atomw w aromatycznym piercieniu macierzystych heterocykli puryny i pirymidyny (ryc. 35-1). Naley zwrci uwag, e kierunek, w ktrym atomy -czonowego piercienia s oznaczone, jest odwrotny w purynie (przeciwny
416 / ROZDZIA 35
ruchom wskazwek zegara) i inny w pirymidynie (zgodny ze wskazwkami zegara). Jednake
II
.CH
atom 5 (wgiel) jest tak samo oznaczony w obu zwizkach, Puryny i pirymidyny s paskimi czsteczkami jest to waciwo o duym znaczeniu dla struktury kwasu nukleinowego (p. rozdz. 38). Terminy gwne" i pomniejsze" zasady odnosz si do ich wzgldnej obfitoci, a nie do znaczenia fizjologicznego Poniewa w komrkach niektre puryny i pirymidyny wystpuj w znacznie wikszej iloci ni inne, zwyczajowo rozrnia si puryny i pirymidyny gwne i drugorzdne. Jednak ze wzgldu na to, e te dodatkowe puryny i pirymidyny odgrywaj take kluczowe role w metabolizmie, to rozrnienie polega jedynie na ich wzgldnej iloci, a nie na ich wzgldnym znaczeniu fizjologicznym. Gwnymi purynami i pirymidynami kwa sw nukleinowych zarwno u prokariontw, jak i eukariontw s: puryny adenina i guanina oraz pirymidyny cytozyna, tymi na i uracyl (ryc. 35-2 i 35-3). Puryny, hipoksantyna i ksan-tyna (ryc. 35-3), s metabolitami adeniny i gua-niny, a czowiek wydala utlenion puryn kwas moczowy jako kocowy produkt katabolizmu purynowego. Dodatkowe zasady s obecne w DNA i transferowym RNA (tRNA) zarwno u prokarion tw jak i eukariontw. Inne, ktrych funkcje s sabo poznane, znajduj si jedynie w kwasach nukleinowych bakterii i wirusw. Na przykad bakteryjny i ludzki DNA zawiera 5-metyIo-cyfozyn, a fagowy DNA 5-hydroksymetylocy-tozyn (ryc. 35-4). Drugorzdne zasady mRNA komrek ssakw to
N^-metyloadenina, N fi , N6 --dimetyloadenina i N7-metyioguanina (ryc. 35--5).
Puryna Pirymldyna Ryc. 35-1. Struktura puryny i pirymidyny, pozy cje atomw ponumerowano zgodnie z systemem mi dzynarodowym. NH,
Cytozyna (2-oksy-4-am In op iry m Idyn a)
Tym In a (2,4-dioKsy-5-metyloplrymldyna)
Uracyl (2,4-d loksypl ry m i dyna)
Ryc. 35- 2. 3 g wne zasady pirymidyno we wy stpujce w nukleotydach. NH,
HjN Adenina (6-amlnopuryna) a)
~NT
NH
Guanina (2- am In o-6-o ksypu ryn
CHZOH
Hipoksantyna (6-oksypuryna)
Ksantyna (2,6-dloksypuryna)
5-Metyloeytozyna
5-Hyd roksy mety tocyi ozy na
Ryc. 35-3. Gwne zasady puryno we nukleoty - dw.
Ryc. 35-4. S trukt ura 2 rzadkich, naturalnie wy stpujcych, zasad pirymidyno wych.
NUKLEOTYDY / 417
N',N*-DI metyloaden in a
N'-Metylog u an in a
Ryc. 35-5. Struktura 2 rzadkich, naturalnie wy stpujcych, zasad purynowych.
Metylowane puryny i pirymidyny maj waciwoci farmakologiczne Metylowane puryny rolinne o waciwociach farmakologicznych zawieraj: kawa (kofeina czyli 1,3,7-trimetyloksantyna), herbata (teofilina, czyli 1,3-dimetyloksantyna) i kakao (teobromina, czyli 3,7-dimetyloksantyna) (ryc. 35-6).
Kofeina (1,3,7-lrimetylo-ksantyna) Taoftllna (1,3-dlmelylo-ksantyna)
Tym In a (laktam) NH
Adenina (laktam) O
Adenina (laktym) Guanina OH (laktym)
H3 C
H,N
Guanina (laktam)
Ryc. 35-7. Postacie tautomeryczne cytozyny, ty-miny, adeniny i guaniny; wskazano postacie dominujce.
Teobromina (3,7-dlmetyloksantyna)
form tautomeryczn guaniny i tyminy jest forma laktamowa. W rozdziale 39 i 41 omwiono znaczenie tautomeryzmu laktam/laktym w parowaniu zasad i mutagenezie. MAA ROZPUSZCZALNO ZASAD PURYNOWYCH W KWANYM pH ST ANOWI PROBLEM MEDYCZNY W obojtnym pH najmniej rozpuszczalnymi zasadami s guanina i hipoksantyna, jednak guanina w warunkach fizjologicznych nie wystpuje w ludzkim moczu. Chocia sole kwasu
Ryc. 35-6. Metylowane ksaniyny zawarte w poywieniu.
Puryny i pirymidyny wykazuj tautomeryzm typu keto-enol Puryny i pirymidyny istniej w formie lak-tymowej ( OH) lub laktamowej ( = 0) (ryc. 35-7). W warunkach fizjologicznych gwn
27 Biochemia
418 / ROZDZIA 35
moczowego (moczcy) s wzgldnie rozpuszczalne w wodzie w obojtnym pH, kwas moczowy jest nierozpuszczalny w roztworach o niskim pH (np. w moczu). Ks anty na i kwas moczowy mog wystpowa jako skadniki kamieni moczowych. WOLNE PURYNY I PIRYMIDYNY WYSTPUJ W ZNACZNIE MNIEJSZEJ ILOCI NI ODPOWIADAJCE IM NUKLEOZYDY I NUKLEOTYDY Nukleozydy (ryc. 35-8) skadaj si z cukru (zwykle D-rybozy lub 2-deoksy-D-rybozy) doczonego do puryny lub pirymidyny przez wzgldnie labilne w rodowisku kwanym wizanie P-N-glikozydowe przy Ne (puryna) lub N1 (piry-midyna). Gwnymi ryb o nukleo ydami s: adenozyna (D-ryboza zwizana z N9 adeniny), guanozyna (D-ryboza zwizana zN' guaniny), cytydyna (D-ryboza zwizana z N1 cytozyny) i urydyna (D-ryboza zwizana z N1 uracylu). 2'-Deoksyrybonukleozydy skadaj si z 2-deoksy-D-rybozy zwizanej z pozycjami opisanymi wyej rwnie przez wizanie [i-N-glikozydowe.
Elementy przestrzenne przeszkadzaj rotacji wok wizania N-glikozydowego i w naturalnie wystpujcych nukleozydach dominuje konformacja ant y (ryc. 35-9). Jak wskazano w rozdz. 38, posta anty jest istotna do uplasowania komplementarnych zasad purynowych i pirymidynowych w dwupasmowym DNA. Jednak powszechnie stosowane przedstawianie D-rybozy nakazuje prezentowanie nukleozy-dw i nukleo ty d w, w tym i innych rozdziaach, w mniej popularnej konformacji syn. Nukleotydy s fosforylowanymi nukleozydami Mononukleotydy s to nukleozydy majce pojedynczy fosforan zamiast grup hydroksylowych cukru (na og rybozy lub 2r-deoksyrybo-zy(ryc. 35-10). Na przykad adenozynomonofos-foriin (AMP lub adenylan) jest zoony z adeniny, rybozy i fosforanu. Jedynymi cukrami, zwizanymi zwykle z uracylem i tymin, s odpowiednio D-ryboza i 2'-deoksy-D-ryboza. W tabeli 35-1 przedstawiono zalenoci midzy gwnymi purynami i pirymidynami a odpowiadajcymi im monofosforanami 5-oksy-^ i 5'--deoksyrybonukleozydw. DNA jest polimerem zoonym z dTMP, dCMP, dAMP
OH
OH ,
Cytydyna R yc. 35- 8.
St r ukt ur a r ybo nu kl eozyct w
OH
OH
Guanozyna
N U K LE O TY D Y / 4 19
OH Ryc. 35- 9. syn i ant y K onf or m acj e adenozyny
OH
HO
A nt y OH OH
OH Ry c. 35- 10. Str ukt ur a kw asu adenyl ow eg o ( A M P ) ( po l ew ej st r om e) i kw asu 2- deoksy ade nyl ow ego; dA M P ( po pr aw ej str oni e) .
Tabel a 35 -1. G w ne zasady, nukl eozydy i nukl eot ydy Zasad a A deni na ( A ) G uani na ( G) Cytozyna (C) U racy I (U) Zasada A deni na ( A ) G uani na ( G) Cytozyna (C) Tymi na ( T) Rybonukleozyd Adenozyna Gua noyna Cy ty dyn a Urydyna Deo k sy ry bon u k I eozy d Deoksyadenozyna Deoksyguanozyna Deoksycyt ydyna Tymidyna Rybonukleotyd (5'-monofosfor an) A den ozy no- 5' - m on of osf or an ( A M P ) Gua noyno - 5'-monof osf ora n (GMP) C yt yd yn o - 5' - m o nof o sf or a n ( C M P ) U r ydy n o- 5' - m on of o sf or a n ( U M P ) Deoksyrybonukleotyd (5'-monofosforan) O eoksyadenozy no - 5'- m onof osf or an ( dA M P) D eoksyg uan ozyn o - 5'- m on of osf or an ( dG M P ) D eok sycyt y dyn o - 5' - m o nof osf or a n ( dC M P ) Ty m i dy n o- 5- m or i of o sf or a n ( d T M P )
420 / ROZDZIA 35
i dGMP, a RNA polimerem zoonym z UMP, CMP, AMP i GMP. Od powyszych struktur nukleozydw s wyjtki. Na przykad w tRNA ryboza jest czasami zwizana z 5 atomem uracylu przez wizanie wgiel-wgiel, a nie jak zwykle przez wizanie N-do-C. Ta nietypowa czsteczka jest pseudo-urydyn (f). tRNA zawiera dodatkowe nietypowe nukleotydy, np. TMP, czyli rymine zwizan z rybozomonofosforanem (ryc. 35-11). TMP tworzy si po syntezie tRNA na drodze metylacji UMP przez S-adenozylometionin. Podobnie kwas pseudourydynowy (^MP) tworzy si przez przegrupowanie w kwasie urydyo-wym po syntezie czsteczki tRNA. Pozycj reszty fosforanowej w nukleotydzie oznacza si numerem atomu ze znakiem prim". Na przykad adenozyna z reszt fos foranow zwizana z 3 atomem wgla cukru rybozy to adenozyno-3'-monofosforan. Znak prim" odrnia atomy cukru od atomw puryn lub pirymidyn, ktre nie s nim oznacza ne (ryc. 35-12). A, G, C, T i U oznaczaj odpowiednio nukleozydy adeniny, guaniny, cytozyny, tyminy i uracylu. Przedrostek d wskazuje, e cukrem jest 2'-deoksy-D-ryboza. Skrt ,,MP" (mono-fosforan) dodaje si do skrtu oznaczajcego nukleotyd. Oznaczenie 5' jest pomijane, gdy fosforan jest zestryfikowany z wglem 5' rybozy lub 2'-deoksyrybozy, np. guanozyno-5'-- monofosforan ma skrt GMP. Dodatkowe reszty fosforowe s zwizane z cukrem mononukleotydu przez wizanie typu bezwodnika kwasowego, tworzc di- i trifosforany nukleozydw, takie jak ADP (adenozy-nodifosforan) i GTP (guanozynotrifosforan) (ryc. 35-13). Warto przypomnie, e kwasowe
NH
Ryc. 35-12. Adenozyno-3'-monofosforan (po lewej stron/e) i 2'-deoksyadenozyno-5'-monofos-foran (po prawej stronie).
bezwodniki maj wysoki potencja przenoszenia grupy i e AG0 dla hydrolizy ATP do ADP wynosi 30 kJ/mol ( = 7 kcal/mol). Trifosforany nukleozydw uczestnicz w tworzeniu wiza kowalencyjnych Poniewa wszystkie trifosforany puryn i pirymidyn maj wysoki potencja przenoszenia grupy, uczestnicz one w licznych reakcjach, w ktrych tworz si wizania kowalencyjne. Czoowym przykadem jest polimeryzacja gwnych trifosforanw w trakcie syntezy DNA lub RNA. W dodatku swoiste di- i trifosforany nukleozydw speniaj swoiste funkcje fizjologiczne w rnych tkankach i rnych ywych organizmach.
Pochodne adenozyny. ADP i ATP s
odpowiednio substratami i produktami dla fos-forylacji oksydacyjnej, a ATP jest gwnym
03P
OH
f
OM
OH
Ryc. 35-11. Kwas urydylowy (UMP) (po lewej stronie) i kwas tymidylowy (TMP) (po prawej stronie).
NUKLEOTYDY / 421
Adenina Ftyboza HO OH
O" O O-/ HO-P-O-P-O-P

II I M
"
Aaenozyno-S'-monofo5foran (AMP) Adenazyno-5 -difosforan (ADP) Adenozyn o-5'-tr[fosforan (ATP)

r
Ryc 35-13. Adenozyna, jej monofosforan, difos-foran i ATP,
wewntrzkomrkowym przenonikiem wolnej energii. rednie wewntrzkomrkowe stenie ATP, wystpujcego w najwikszych ilociach wolnego mikleotydu komrek ssakw, wynosi ok. 1 mmol. Cykliczny AMP (cAMP, czyli adenozyno-3', 5'-mo no fosforan), wytworzony z ATFw rea-kcji katalizowanej przez cyklaz adenylanow
ATP
CYKLAZA ADENYLANOWA -pp,
(ryc. 35-14), poredniczy w wielu procesach wewntrzkomrkowych. Aktywno cyklazy adenylanowej jest regulowana przez zoone interakcje, a w wielu z nich bior udzia receptory hormonw (p. rozdz. 44). Wewntrzkomrkowe stenia cAMP (ok. 1 u.mol) s o ok. 3 rzdy wielkoci mniejsze od ste ATP. Hydroliza cAMP, katalizowana przez fosfodies-teraz cAMP (ryc. 35-14) prowadzi "do" wytworzenia 5'.- M| \_ " Wczanie reszty siarczanowej w wizanie estrowe w takich zwizkach, jak siarczany pro-teoglikanw (p. rozdz. 43), wymaga najpierw aktywacji" reszty siarczanowej w reakcji z ATP prowadzcej do powstania adenozyno--3'-fosfo-5'-fosfosiarczatm (PAPS, czyli fosfoa-denozynofosfosiarczanu) (ryc. 35-15). PAPS jest te substratem w reakcji wizania siarczanw. S-Adenozylunietionina (ryc 35-16). Posta aktywnej metioniny suy jako donor grup metylowych w reakcjach metylacji i jako rdo propylaminy do syntezy poliamin (p. rozdz. 33).
AMP-P-P
ATP
ADP
(ATP) J Adenina-Hyboza- -O -S03 " Ryo. 35-15. Powstawanie adenozyno-3'-fosfo--5'-fosfosiarczanu.

NH2
N O -------- CH,
-o-p=o
O H Cykliczny 3',5'~AMP
r>
H,0
FOSFO-DIE STERA2A
cooCH -CH,-CH3 NH3+

i
+
Metionina
l\
HO
/
OH
AMP Ryc. 35-14. Powstawanie cAMP z ATP z udziaem cyklazy adenyfanowej i hydroliza cAMP przez fosfodiesteraz cAMP.
Adenozyna
Ryc. 35-16. S-Adenozylometionina.
422 / ROZDZIA 35
Pochodne gua noyny, Utlenianie a-keto-glutaranu do sukcynylo-CoA wymaga fosfory-lacji GDP do GTP. GTP jest konieczny do aktywacji cyklazy adenylanowej przez niektre hormony i suy zarwno jako allosteryczny regulator, jak i rdo energii do syntezy biaek na polisomach. GTP odgrywa zatem wantj rol w utrzymaniu rodowiska wewntrznego. Cykliczny GMP (cGMP, czyli guanozyno--3\5'-monofosforan) (ryc. 35-17) jest take sygnaem wewntrzkomrkowym, czyli wtrnym przenonikiem (messenger) zewntrzkomrko-wych zmian, cGMP jest tworzony z GTP przez cyklaz guanylanow. Podobnie jak cyklaza adenylanowa, cyklaza guanylanowa jest regulowana przez rne efektory, z hormonami wcz nie. Podobnie jak cAMP, cGMP jest take katabolizowany przez fosfodiesteraz do jego 5'-monofosforanu, GMP.
take przez deaminacj AMP, a reakcja przebiegajca w tkance miniowej stanowi cz cyklu nukleotydw purynowych (ryc. 35-18). Amina-cja IMP, odtwarzajca AMP, wymaga amoniaku pochodzcego z asparaginianu. Defosforyla-cja IMP daje nukleozyd inozynowy (rybonuk-leozyd hipoksantyny), zwizek poredni re akcji rezerwowej cyklu purynowego (p. rozdz. 36).
Pochodne uracylu. Pochodne UDP--cukier bior udzia w epimeryzacji cukru
(np. wewntrzne przeksztacenie glukozo- i gaiak-tozo-1-fosforanu), a UDP-glukoza jest donorem glikozylu w biosyntezie glikogenu i disacha-rydw glikozydowych. Zwi zki UDP-cukry bior take udzia w biosyntezie oligosachary-dw glikoprotein i proteoglikanw (p. rozdz. 55). Wreszcie UDP-kwas glukuronowy jest donorem kwasu giukuronowego w reakcjach ko-
Tabela 35-2. Wiele koenzymw i zwizkw pokrewnych jest pochodnymi adenozyno-monofos-foranu

NH,
RAdsnozyna D-Ryboza
Ryc. 35-17. Cykliczny 3',5'-guanozynomonofos-foran (cykliczny GMP, cGMP)
Pochodne hipoksantyny. Rybonukleo-tyd ksantyny (IMP, czyli i noy

nia) jest prekursorem wszystkich rybonukleotydw puryno wych syntetyzowanych de noro. IMP powstaje
Koenzym
R' H
H
R" H
H
Aktywna metionina Metionina* Adenylany amino- Aminokwas kwasw Aktywny siarczan 3', 5'-Cykliczny AMP NAD" NADP +
FAD
0
1 1
H H H
PO*PO^-
H .. .. ..
H
H
2 2 2
H H
CoA SH * AMP
GTP
I IAZA ADFNV|_O-BURSZT YNtANOWA
PO=" 2
Ryc. 35-18. Cykl nukieotydw purynowych.
Zastpuje reszt fosforanow. R jest pochodn witaminy B.
NUKLEOTYDY / 423
niugacji, takich jak tworzenie glukuromdu bilirubiny (p. rozdz. 34). do biosyntezy w tkankach zwierzcych niektrych fosfoglicerydw. Reakcje obejmujce cera-mid i CDP-cholin s odpowiedzialne za syn tez sfingomieliny i innych podstawionych sfm-gozydw. Opisano cykliczne nukleotydy pochodne cytydyny, analogiczne do takich pochodnych adenozyny i guanozyny.
Pochodne cytozyny. CTP jest potrzebny
Wiele koenzymw jest pochodnymi nukleotydw
HO 5-J od o-2-d eoksyu ry dyn a SH
Liczne koenzymy zawieraj nukleotydy oraz zwizki podobne do nukleotydw purynowych i pirymidy nowych (tab. 35-2).
SYNTETYCZNE ANALOGI NUKLEOTYDW MAJ ZASTOSOWANIE W MEDYCYNIE KLINICZNEJ

Syntetyczne analogi puryn i pirymidyn, nuk-leozydw i nukleotydw s szeroko stosowane w medycynie dowiadczalnej i klinicznej. Zwykle stosuje si je w celu wyjanienia roli nukleotydw jako komponentw kwasw nuklei nowych niezbdnych dia wzrostu i podziau komrek. Aby komrka moga si podzieli, musi by zreplikowany DNA. Wszystkie prekur-sory DNA prawidowe deoksyry bo nukleotydy puryn i pirymidyn musz by zatem dostpne. Jednym z najbardziej wanych skadnikw farmakopei onkologicznej jest grupa syntetycznych analogw puryn i pirymidyn i ich nukleozydw. W podejciu farmakologicznym uywa si analogu, w ktrym zostaa zamieniona albo heterocykliczna struktura piercienia albo czsteczka cukru tak, aby uzyska dziaanie toksyczne, gdy analog jest wbudowany w swoiste skadniki komrki. Wiele z tych dziaa odzwierciedlaj 2 procesy: 1) zahamowanie przez lek swoistych enzymw niezbdnych do syntezy kwasw nukleinowych lub 2) wbudowanie metabolitw leku w kwasy nukleinowe, gdzie zaburzaj one parowanie zasad niezbdne do prawidowego przenoszenia informacji. Jako przykad mona po da 5-fluoro- lub 5-jodo pochodne uracylu lub deoksyurydyny, ktre speniaj funkcj odpo wiednio analogu tyminy i tymidyny (ryc. 35-19). Zarwno 6-tioguanina, jak i -merkaptopuryna, w ktrych grupy hydroksylowe w pozycji 6 za6-Merkaptopuryna
Ryc. 35-19. Syntetyczne analogi pirymidyn {u gry) i syntetyczne analogi puryn (u dou). ____
stpuj grupy tiolowe, maj szerokie zastosowanie kliniczne. Analogi takie jak 5- lub -azau-rydyna, 5- lub 6-azacytydyna i 8-nzaguanina (ryc. 35-20), w ktrych heterocykliczny atom wgla w piercieniu zastpiono atomem azotu maj rwnie zastosowanie kliniczne. Purynowy analog 4-hydroksypirazolopiry-midyna (allopurynol), stosowany w leczeniu hiperurykemii i w skazie moczanowej, hamuje
> HO OH
H
6-Azaurydyna
8-Azaguanina
Ryc. 35-20. 6-azaurydyna i 8-azaguanina.
H 5-Fluorouracyl
6-Tioguanina
424 / ROZDZIA 35 0 0 0 II II II B-R-0 P 0-P-0-P-0Allopurynol (laktym)
I o-
I I oo-
Maelerzysty trlfosforan nukleozydu 0 0 0 II II II B - R -0 - P- O- P -C H ^- p- O1 I I
o-
o-
o-
Pochodna ^^met/lenowa
HO
Arabinozylocytozyna
B II0
H || BR0POPN-P0
0 II
I o-
I o-
I o-
Pochodna
Ryc. 35-Z2. Syntetyczne pochodne trifosfora-nw nukleozydw niezdolne do hydrol i tycz n eg o oddzielenia kocowej reszty fosforanowej. B zasada purynowa lub pirymidynowa, R ryboza lub deoksyryboza. Pokazano macierzysty trifosfo-ran nukteozydu ulegajcy hydrolizie {u gry) oraz nie ulegajce hydrolizie p,7-metyleno (rodek) i p,7-imino (df) pochodne.
Azatiopryna Rye. 35-21. 4-Hydroksypirazoiopirymidyna (allopurynol). arabinozylocytozyna (cytarabina) iaza-tiopryna.
de novo biosyntez puryny i oksydaze ksan-tynow. Nukleozydy zawierajce jako czsteczk cukrow arabinoz zamiast rybozy, np. cyta-rabina (arabinozylocytozyna, Ara-C) s stosowane w chemioterapii nowotworw i zakaeniach wirusowych (ryc. 35-21). Azatiopryna, ktra jest katabolizowana do 6-merkaptopuryny, ma zastosowanie w transplantacji narzdw dla supresji reakcji immunologicznego odrzucenia przeszczepu. Midzy licznymi analogami nukleozydw, majcych aktywno przeciwwirusow, 5-jododeoksyury-dyna (patrz wyej) jest skutecznym lekiem sto-
sowanym miejscowo w opryszczkowym zapaleniu rogwki zakaenie rogwki przez wirus opryszczki. Liczne analogi rybonukleotydw puryn i pirymidynr z nieu legajcym i hydrolizie grupami di- i trifosforanowymi, zostay zsyn-tetyzowane do uytku in vitro. Analogi te pozwalaj badaczowi oznaczy, czy dane biochemiczne skutki dziaania dii trifosfonuk-teozydw wymagaj hydrolizy albo czy skutki przez nie wywoane polegaj na zajciu swoistych miejsc wicych nukleotydy w czsteczkach enzymw lub biaek regulatorowych. Na rycinie 35-22 przedstawiono nieulegajce hyd rolizie analogi GTP.
PIMIENNICTWO
Mainwanng WIP, Parrish JH, Pickering JD. Mann NH; Nucleic Acid Biochemistry and Molecular Biology. Blackwell Scientific Publications. !982.
Metabolizm nukleotydw
*%/*
purynowych
i pirymidynowych
36
WPROWADZENIE
W rozdziale tym omwiono trawienie, biosyntez i kataboiizm nukleotydw purynowych i pirymidynowych oraz wybrane choroby zwizane z wadami genetycznymi w tych procesach.
PURYNY I PIRYMIDYNY NIE S NIEZBDNE W LUDZKIM POYWIENIU

Podczas gdy zwierzta przyjmuj kwasy nukleinowe i nukleotydy z poywieniem, przeycie nie zaley od wchaniania i zuytkowania tych zwizkw, poniewa czowiek i wikszo krgowcw atwo syntetyzuj de novo nukleotydy purynowe i pirymidynowe z ich amfi bo licznych zwizkw porednich. Organizm ludzki przemienia wikszo puryn uzyskanych z pobranych nukleoprotein w kwas moczowy (ryc. 36-1). Niewiele (lub wcale) puryn i pirymidyn pobranych z poywieniem jest wbudowanych do kwasw nukleinowych tkanek, natomiast zwizki podane pozajelitowe s wbudowywane, dlatego wbudowywanie wstrzyknitej [3H] ty-midyny bezporednio do nowo syntetyzowanego DNA stanowi szeroko uywan technik oznaczania stopnia syntezy DNA zarwno in vivo, jak i in ritro.
Ai nukleotydy dostarczane z poywieniem, ani ich macierzyste zasady purynowe i pirymi-dynowe nie s wbudowywane zarwno w kwasy nukleinowe tkanek ludzkich, jak i w pochodne puryn i pirymidyn, np. w ATP, NAD + albo koenzyn A. Nawet jeli dostarczone poywienie jest bogate w nukleoproteiny, organizm ludzki buduje skadniki kwasw nukleinowych tkanek z amfi bo licznych zwizkw porednich. Ta synteza de novo pozwala na wbudowanie do DNA analogw puryn i pirymidyn, majcych potencja lekw przcciwnowotworowych. Stopie syntezy oksy- i deoksyrybonukleotydw puryno wych i pirymidynowych jest precyzyjnie regulowany przez mechanizmy, ktre zapewniaj wytworzenie tych zwizkw w odpowiednich ilociach i w czasie odpowiednim do zmiennego zapotrzebowania fizjologicznego. Te mechanizmy obejmuj szlaki awaryjne typu salvage" (reakcje rezerwowe) dla reutytizacji zasad purynowych i pirymidynowych uzyskanych in vivo przez degradacj kwasw nukleinowych. Choroby ludzi, zwizane z nieprawidowociami metabolizmu puryn i pirymidyn, obej muj skaz moczanow, zesp Lescha-Nyhana, niedobr deaminazy adenozynowej i niedobr fosforylazy nukleozydowej puryn.
ENZYMY PRZEWODU POKARMOWEGO DEGRADUJ POBRANE KWASY NUKLEINOWE DO PURYN I PIRYMIDYN

Kwasy nukleinowe, wyzwolone ze strawionych nukleoprotein przez proteoliz w przewodzie pokarmowym, s degradowane do mono-nukleotydw przez rybonukleazy, deoksyrybo-nukleazy i polinukleotydazy, Nukleotydazy i fosfatazy hydrolizuj mononukleotydy do nukleozydw, ktre s albo absorbowane albo dalej degradowane do zasad purynowych i pirymidynowych przez fosforylazy jelitowe. Zasady
426 / ROZDZIA 36
OH OH Adenozyna DEAMINAZA ADENOZYNOWA
HOH2C C
nf"
T L>
HOH.C -
OH OH Guanozyna
-P FOSFORYLAZA NUKLEOZYDOWA PURYN
Hybozo-1-fosforan
FOSFORYLA2A NUKLEOZYOOW PUHYN OKSYDAZA KSANTYNOWA
Rybozo-1fosforan
Hipoksantyna H0 + 0,
H,0
Ksantyna
Guanina
OKSYDAEA KSANTYNOWA
Kwas moczowy
RYC. 36-1. Wytwarzanie kwasu moczowego z nulOeozydw purynowych przez zasady purynowe hipoksantyn, ksantyn i guanin. Deoksyrybonukleozydy purynowe s degradowane przez ten sam szlak metaboliczny i enzymy, ktre znajduj si w bonie luzowej przewodu pokarmowego ssakw.
METABOLIZM NUKLEOTYDW PURYNOWYCH I P1RYMIDYNOWYCH / 427
purynowe, utlenione do kwasu moczowego (ryc. 36-1), mog by absorbowane, a nastpnie wydalane z moczem. ZWIERZTA TWORZ NUKLEOTYDY Z AM FI BO LICZNYCH ZWIZKW POREDNICH Czowiek i inne ssaki syntetyzuj nukleotydy purynowe z amfibolicznych zwizkw porednich w ilociach wystarczajcych zarwno do syntezy kwasw nukleinowych, jak i do dodatkowych czynnoci wymienionych w rozdz. 35. U niektrych krgowcw biosynteza nukleoty-dw suy dodatkowym celom. Chocia ssaki i inne zwierzta ureoteliczne wydalaj odpady azotowe w postaci mocznika, zwierzta urykote-liczne (ptaki, gady, play) wydalaj odpady azotowe jako kwas moczowy. Poniewa reakcje syntezy de novo nukleotydu purynowego s analogiczne u organizmw ureotelicznych i ury-kotelicznych, ywe organizmy urykoteliczne musz przeto syntetyzowa nukleotydy purynowe w wzgldnie wikszym stopniu. Inozynomonofosforan (IMP), macierzysty mononukleotyd purynowy, tworzy si z amfibolicznych zwizkw porednich Na dugo zanim poznano detale wyduonej drogi biosyntezy IMP, badania przy uyciu znacznikw izotopowych pozwoliy na zidentyfikowanie rda kadego z atomw w zasadzie purynowej (ryc. 36-2). Te wczesne badania izotopowe utoroway drog do odkrycia reakcji i zwizkw porednich omawianych niej. W teGlutamina Gllcyna
N -Formylo. tetrahytirofolian
N'.N"-Metenylotetrahydrofolian
Ryc. 36-2. Pochodzenie atomw azotu i wgla w piercieniu purynowym. Atomy 4, 5 i 7 (przyciemnione) pochodz z glicyny.
kcie podanym niej cyfry arabskie poszczeglnych akapitw odpowiadaj ponumerowanym reakcjom na ryc. 36-3, a cyfry rzymskie zwizkw odpowiadaj strukturom zwizkw porednich z tej ryciny. Przeniesienie pirofosforanu z ATP do C-l D-rybozo-5-fosforanu (I) tworzy 5-fosforybozylo-I-pirofosforan, PRPP (II), take zwizek poredni dla NAD + , NADP + i biosyntezy nukleotydu pirymidynowego. Przeksztacenie PRPP (II) i glutaminy do 5-fosfo-P-D-rybozyloaminy (III) obejmuje wy rugowanie pirofosforanu przez azot amidowy glutaminy z inwersj konfiguracji przy C-l. Ksztatuje to wizanie P-N-glikozydowe ko cowego nukleotydu. Kondensacja glicyny ze zwizkiem (III) daje glicynoamidorybozylo-S-fosforan (IV) I wnosi 3 atomy, ktre ostatecznie stan si atomami C-4, C-5 i N-7 puryny. Przeniesienie na zwizek (4) grupy formylowej z N5,NIO-metenylotetrahydrofolianu (N5N10 -metenylo-THF) tworzy formyloglicynoamidorybozylo-5-fosforan (V) i dodaje C-8 do przyszej zasady purynowej. Dodanie do zwizku (V) grupy amido wej pochodzcej z glutaminy daje formyloglicynoamidorybozyJo-5-fosforan (VI) i wnosi atom N, ktry stanie si N -3 w piercieniu purynowym. Eliminacja czsteczki wody, ktrej towa rzyszy zamknicie piercienia imidazolowego. w y t wa rza ami no i mi da zo lory boy lo-5-fosforan (VII). Pocztkow reakcj, ktra wymaga ATP, jest przeniesienie grupy fosforanowej z ATP do oksogrupy zwizku (V I). Atak nukleofilowy przez przylegy azot grupy aminowej przemiesz cza P., czemu towarzyszy zamknicie piercienia imidazolowego. Dodanie do zwizku (VII) CO2, reakcja, ktra nie potrzebuje ani ATP, ani biotyny, daje a m i noimidazo lok a rbo k sy lo-ry boy lo-5-fosfora n (VIII). Dodany wgiel stanie si atomem C -6 puryny. Reakcja 8 i 9 przypomina przekszta cenie orni ty ny w arginin w cyklu moczniko wym (ryc. 31-13). Kondensacja asparaginianu ze zwizkiem (VIII) tworzy aminuimidazolobursztynylokarboksyamidorybozylo-S-fosforan (IX) i wprowadza N-l do piercienia purynowe go. Grupa bursztynowa w zwizku (IX) od dziela si jako fumaran, dajc aminoimidazolokarboksyamidorybozylo-5-fosforan(X).
) O-C Hj ATP AMP SYNTETATAZA PRPP OH OH a-O-Rybo ) O CH, Glutamina zo-5-f DS1CP ran
4
NH,
- O-CHj Glutamin tan
NH N",N -MetenyloH lolian H tallan
(I) AMIDOTRANSFERAZA GLLTTAMYLO-PRPP OH OH PRPP (II) OH OH 5-F osf o-0-D-rybozyioa mina (III) Gllcynoamldo-rybo zylo-5-feaforan ()V) H FOHMYLOTRANSFERAZA
-ooc
L ^C^^
R-5Fomiyloglcynaiiildo rybozylo-5-fosoran (V) Glutamina ATP Asparaglnlan I CH2 Glutamin i an -
-ooc cooI CH Fumaran HC
-ooc
CO,
H3O ATP, Mg= Zamknicie piercienia

+
I
-OOC
f
~
ooc
R-5-
H,O Amlno im id azo lo kar bo ksy lanorybozy to-5-fosf o ran (VIII) Aminoimidazo lory boy io-5-fosioran (VII)
HN
i m idazo I bu rszty ny to karb -ksyamldorybozyio-5-fosto ra n (IX) LtAZA ADENYLD-BURSZTYN WNOWA O N'-Formylt>-H,folian H4foltan
Formyloolteynamldynorybozylo-5-fostoran (VI)
II
Cl| FORMYLOTRANSFERA A] H II CH
-ksyam i d o ryb ozylo -5-f osf r a r. ( X I )
O H,0 HN' Zamkniecie piercienia
II
II
CH
Amlnoimidazoto kafbo -ksyam i a ory bozylo-5-f o s f a ran
R-5-
Amidolmldazolokarbo
Inozynomonotostoran (IUP) (XII)
Ryc. 36-3. Szlak de novo biosyntezy puryn z 5-osory-boy i ATP. (Objanienie patrz w tekcie). PO^" lub
METABOLIZM NUKLEOTYDW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 429
Formylowanie zwizku (X) przez N10-formylo-THF daje amidoimidazolokarnoksyamidorybozylo-5-fosforan (XI). Nowy wgiel b dzie stanowi! C-2 w szkielecie puryny. Zamknicie piercienia zwizku (XI) daje pierwszy nukleotyd purynowy, kwas inozynowy (XII) (monofosforan inozyny, czyli IMP). Wielofunkcjonalne polipeptydy powstae przez fuzje genw katalizuj liczne reakcje w biosyntezie nukleotydw purynowych U prokariontw kada reakcja pokazana na ryc. 36-3 jest katalizowana przez rny polipep-tyd. Jednake u eukariontw fuzja genw data w wyniku ewolucji pojedyncze polipeptydy z licznymi funkcjami katalitycznymi. Taka ewolucja niesie 2 gwne korzyci. Pierwsza dotyczy skatalizowania metabolitw. Blisko miejsc katalitycznych ssiadujcych aktywnoci zapewnia fizyczn blisko danego produktu do miejsca aktywnoci katalitycznej, dla ktrego jest on substratem. Druga korzy wynika z tego, e fuzja genw zapewnia wytwarzanie jednakowych iioci rnych aktywnoci katalitycz-
nych. Na rycinie 36-3 przedstawiono, jak 3 wielofunkcjonalne polipeptydy u eukariont w katalizuj wicej ni ] reakcj. S to syntaza 5' -fosfory boy loami noimidazolo wa (kata lizuje reakcj 3,4 i 6), syntaza 5'-fosfory boy loaminoi-mid azolo bursztyny lok ar boksy a mi do wa (k a t a J i -uje reakcj 7 i 8) i syntaza IMP (katalizuje reakcj 10 i 11). Leki, ktre interferuj z metabolizmem tetrahydrofolianu (THF) mog blokowa biosyntez nukleotydu pury nowego Dwa atomy wgla, wczone podczas reakcji 4 i 10, ktre staj si atomami 8 i 2 piercienia purynowego, pochodz z N5,N10-metenylo--THF i NJ0-formylo-THF. N5,N'-metenylo--THF jest tworzony przez utlenienie NS,N10--metyleno-THF. Jednake raz zsyntetyzowany N5 ,N10 -metenylo-THF jest zaangaowany w syntez puryn albo bezporednio, albo po przeksztaceniu do N10-formylo-THF. Zahamowanie syntezy tych zwizkw tetrahydrofo-lianowych moe zatem hamowa syntez puryn de novo.
ooc-c-c-cooH, I R-5- GTP, Mg2
-ooc-c-c-cooH2 O H H "OOC-C = C COO"
J_
Adenyloburs2t>nian (AMPs} LIAZA ADENYLO-BUHSZTYNIAN OWA Ad en ozyno mo notorforan (AMP)
Inozynomon otfosforan (IMP]
SYNTETAZA ADENYLO-BURSZTYN WNOWA
NAD *
-N
i
R-S-(> Guanozynomonotosforan (GMP)
Ksantozy no mo nofoaforan (XMP)
Ryc. 36-4. P rzeksztacenie IMP w AMP i GMP.
430 / ROZDZIA 36
Utlenianie i aminacja IMP daje AMP iGMP Na rycinie 36-4 s naszkicowane reakcje i zwizki porednie, przez ktre IMP jest zamieniane do AMP i GMP; cyfry arabskie odnosz si do tych reakcji. Dodanie asparaginianu do IMP daje adenylobursztynian. Reakcja ta, katalizowana przez syntetaz adenylobursztynianow, z grub sza przypomina reakcje 8, ale wymaga ona swoicie GTP; wymg ten stwarza potencjalne miejsce do regulacji syntezy nukleotydu adeniny (p. niej). Odczenie fumaranu daje adenozyno-5'monofosforan (AMP). Reakcja ta jest katali zowana przez liaz adenylobursztynianow, ten sam enzym, ktry katalizuje reakcj 9. Utlenienie IMP przez NAD+, katalizo wane przez dehydrogenaze IMP, daje ksantozynomonofosforan (XMP). Wprowadzenie grupy aminowej, po chodzcej z grupy amidowej glutaminy, biegnie analogicznie do reakcji 5. Niektre analogi glutaminy hamuj biogenez nukleotydu purynowego Liczne anty metabolity, bdce analogami glutaminy, s efektywnymi inhibitorami biosyntezy nukleotydu purynowego. Azaseryna (Odiazoacetylo-L-seryna) jest antagonist glutaminy, szczeglnie w reakcji 5. Diazonorleucy-na [(6-diazo-5-okso)-L-norleucyna] blokuje reakcje 2, a 6-merkaptopuryna, oprcz innych dziaa, hamuje reakcje I3 i l4.Kwasmikofeno-lowy swoicie hamuje reakcje 14. Przeksztacenie AMP i GMP do ich di -i trifosforanw zachodzi stopniowo Przeksztacenie AMP i GMP do odpowiednich im di- i trifosforanw nukleozydw za chodzi w 2 etapach {ryc. 36-5). Sukcesywne przeniesienie grup fosforowych z ATP jest katalizowane odpowiednio przez kinaz nukleozydo-monofosforanow i kina/ nukleozydod ifosforano w. Enzym, ktry fosforyluje adenylan, jest take nazywany miokinaz.
ATP ADP ATP ADP V ^^ Dlfosforari V ^ Trifosforan
PURYNY I ICH NUKLEOZYDY MOG BY PRZEMIENIANE BEZPOREDNIO DO MONONUKLEOTYDOW PRZEZ REAKCJE TYPU SALVAGE" Przeksztacenie wolnych puryn i nukleozydw purynowych wprost w mononukleotydy przez reakcj typu ,.salvage" (reakcja rezer wowa) wymaga znacznie mniej energii ni synteza nukleotydw de novo. Ilociowo waniejszym mechanizmem jest fosfory boy lacj a wolnej puryny (Pu) przez PRPP, dajca 5'-mononuk-leotyd (Pu-RP).
Pu + PP-RP -. PP, + Pu-RP
Fosforybozylacj zasady purynowej katalizuj 2 enzymy zalene od PRPP: fosforybozylo-transferaza adeninowa, ktra zamienia adenin w AMP (ryc. 36-6), i fosforybozylotransferaza hipoksantynowo-guaninowa, ktra katalizuje dodanie PRPP do hipoksantyny lub guaniny, w wyniku czego powstaje IMP lub GMP (ryc. 36-7).
C rys v
J
H
r*
PRPP
FOSFORYBOZYLOTRANSFERAZA ADENINOWA
AMP Ryc. 36-6. Fosfory boy I a ej a adeniny jest katalizowana przez fosforybozylotransferaz adeninow.
Drugi mechanizm typu salvage" obejmuje bezporedni fosforylacj rybonukleozydu purynowego (PuR) przez ATP
PuR + ATP -* ADP + PuR-P
Monofoeioran
Ryc. 36-5. Przeksztacenie monofosforanu nuk-leozydu do di- i trifosforanu
Kinaza adenozynowa katalizuje fosforylacj adenozyny i deoksyadenozyny do AMP lub dAMP, podczas gdy kinaza deoksycytydynowa
METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH 1 PIRYMIDYNOWYCH / 431
PflPP
PP
CV
N
'O-jP-OCH
Hipoksantyna FOSFORYBOZYLOTHANSFERAZA HIPOKSANTTNOWO-GUANINOWA
Dostpno PRPP jest gwnym determinantom nasilenia biosyntezy nukleotydw purynowych Synteza de novo IMP zuywa 6 mol rwnowanikw ATP + glicyn, glutamin, meteny-lo-THF i asparaginian. Aby uzyska wydajne zuytkowanie zasobw, jest zatem konieczne, aby komrki reguloway de novo biosyntez puryn. Gwnym detcrminantcm
HO IMP
HO
nasilenia syntezy de novo nukleozydw purynowych jest stenie PRPP. To stenie z
kolei jest determinowane przez wzgldn szybko syntezy PRPP, jego zuytkowanie i degradacj. Stopie syntezy PRPP zaley zarwno od dostpnoci rybozo-5--fosforanu, jak i od aktywnoci syntetazy PRPP. Aktywno syntetazy PRPP jest wra liwa na stenie fosforanu i rybonukleotydw purynowych, ktre dziaaj jako regulatory allosteryczne (ryc. 36-8). Zuytkowanie PRPP
Rybozo-5-f osfo ran
GMP
0
PRPP
Hyc. 36-7. Fos fory boy la c;a hipoksantyny t guani-ny prowadzi do utworzenia odpowiednio IMP i GMP. Obie reakcje s katalizowane przez fosfory boy I otr nsfe ra tiipoksantynowo-guanino-w.'
5-Fosforybazyloaml na
fosforyluje deoksycytydyn, de o ksy adenozyn i 2'-deoksyguanoyn odpowiednio do dCMP, dAMP i dGMP. BIOSYNTEZA WTROBOWYCH NUKLEOTYDW PURYNOWYCH JEST DOKADNIE REGULOWANA Wtroba ssakw, gwne miejsce syntezy de noro nukleotydw purynowych, dostarcza za sad purynowych i ich nukleozydw, ktre tworz rezerw do zuytkowania w tkankach niezdolnych do ich syntezy de novo. Na przykad w tkance mzgowej jest mae stenie amido-transfera2y PRPP, a tkanka mzgowa czowieka przynajmniej czciowo zaley od egzogennych puryn. Erytrocyty i granulocyty obojet-nochonne nie mog syntetyzowa 5-fosforybo-zyloaminy i dlatego musz korzysta z egzogennych puryn do syntezy nukleotydw purynowych. Jednak krce limfocyty maj pewn zdolno do syntezy puryn cle novo.
ADP GDP AMP ATP GTP
IMP
Ryc. 36-8. Kontrola nasilenia syntezy de novo nukleotydw purynowych. Linie cige przedsta wiaj cig reakcji chemicznych, a linie przerywane ilustruj zahamowanie (Q) przez sprzenie zwrotne przez kocowe produkty szlaku. Reakcje i s katalizowane odpowiednio przez synteta-z PRPP i amid otr nsieraz glutamino-PRPP.
432 / ROZDZIA 36
odzwierciedla gwnie aktywno reakcji rezerwowych (typu salvage") dia hipoksanty ny i guaniny, a tylko wtrnie stopie syntezy puryn de noro. Ten wniosek wynika z obserwacji, e stenie PRPP w erytrocytach i fibroblastach w hodowlach pochodzcych od mczyzn z wrodzonym niedoborem fosforybozylotrans-ferazy hipoksantynowo-guaninowej byo wielokrotnie zwikszone. AMP i GMP reguluj przez sprzenie zwrotne amidotransferaz glutamylo-PRPP Amidotransferaza glutamylo-PRPF (reakcja 2, ryc. 36-3), pierwszy enzym wycznie zaangaowany w syntezie puryn de navo, jest wraliwa na zwrotne zahamowanie przez nukleotydy purynowe, szczeglnie AMP i GMP, ktre hamuj, wspzawodniczc z PRPP (ryc. 36-8). Jednak regulacja syntezy puryn de novo przez amidotransferaz ma prawdopodobnie mniej sze znaczenie fizjologiczne ni regulacja syn-tetazy PRPP. Sprzenie zwrotne AMP i GMP reguluje ich syntez z IMP Dwa mechanizmy reguluj przeksztacanie IMP do GMP i AMP (ryc, 36-9). AMP przez sprzenie zwrotne reguluje syntetaze adenylobu-rsztynianow, a GMP przez sprzenie zwrotne hamuje dehydrogenaz IMP. Co wicej, prze -
ksztacenie IMP w adenylobursztynian na dro dze do syntezy AMP wymaga GMP, a przeksztacenie ksantynianu (XMP) w GMP wyma ga ATP. Wzajemna regulacja midzy przemianami w metabolizmie IMP suy wic osabieniu syntezy jednego nukleotydu purynowego wwczas, gdy zachodzi niedobr drugiego nukleotydu. Fosfory boy otra n sferaza h ipo k sa ntyn owo -gu-aninowa, ktra przemienia hipoksantyn i gua-nin odpowiednio do IMP i GMP (ryc. 36-7), jest take hamowana przez te same nukleotydy. REDUKCJA NDP DAJE dNDP Redukcja deoksyrybonukleotynw puryn i pirymidyn przy wglu 2'rybozy odpowied niego difosforanu rybonukleotydu (NDP) jest katalizowana przez kompleks reduktazy rybo-nukleotydowej (ryc. 36-10). System ten dziaa jedynie w komrkach, ktre aktywnie syntetyzuj DNA przed podziaem komrek. Redukcja wymaga tioredoksyny (biakowy kofaktor), reduktazy tioredok synowej (flawoprotema) i NADPH. U niektrych bakterii, ale nie u ssakw, reakcja ta wymaga take kobalaminy (witaminy B12). Zredukowana tioredoksyna, uzyskana z utlenionej tioredoksyny w reakcji katalizowanej przez NADPH: reduktaza tiore-doksynowa, jest bezporednim czynnikiem redukujcym NDP (ryc. 36-10).
REDUKTAZA HYBO NUKLEOTYOOWA ifoaforan rybonukieozydu 0 (fosforan 2 -deoksyrybonukleozydu
Tioredoksyna Tloredoksyna u Kanion a zredukowana
IMPRyc. 36-9. Regulacja przemiany IMP do nuk-leotydw adenozyny i guanozyny. Linie cige przedstawiaj cig reakcji che/nicznych. a linie przerywane regulacj zarwno przez dodatnie (), jak i ujemne (0) sprzenie zwrotne.
NADP
NADPH + H
Ryc. 36-10. Redukcja difosforanw rybonukleo-zydudodifosforanw2'-deoksyrybon ukleozydw.

CDP
-*
3(=)R
2'dCT P -** 2'dCDP-
ATP
Kwas moczowy !*, tO] + H2 O ^ LJHYKA2A
UDP-
fi
--. - P 2 CdTT P
CO.
b
GDP* >2 ' d G D P
Alantoina
ADP
R y c , 3 6 -1 2 . P r z e ks z t a c e n ie k w a s u m o c z o w e g o w aiam m .
Ry c . 3 6 -1 1 . R eg ul ac ja re d ukc ji p ur y no w yc h i p iry- m i d y n o w y c h rybo n ukle otyd w do o d p o w i e d n ic h 2 ' - c ie o ks yryb o n u kle o tyd w. L inie ci g le p rze ds ta wi aj c ig re akc ji c he m ic zn yc h, a linie p rze ry w a ne uje m ne ( Q ) l ub d o d at nie ( ) s p rz e nie z w ro t ne .
cienkiego i nerek (ryc. 35-1). Oksydaza ksan-tynowa jest potencjalnym miejscem farmakologicznej interwencji u chorych z hiperurykemi i skaz moczanow (por, niej).
Redukcja difosforaaw rybonukleozydw (NDP) do difosforanw deoksyrybonukieozy-dw podlega zoonej regulacji (ryc. 36-11), w wyniku ktrej uzyskuje sie zrwnowaone wytwarzanie deoksyrybonukleotydw dla syn tezy DNA.
TWORZENIE WIZANIA P-N-GLIKOZYDOWEGO WYSTPUJE W P2NYCH ETAPACH BIOSYNTEZY NUKLEOTYDW PIRYMIDYNOWYCH

Synteza de novo nukleozydw pirymidyno-wych i purynowych obejmuje rne wsplne prekursory: PRPP, glutamin, CO2, asparagi-nian. a dla nukleotydu tymidyny pochodne tctrahydrotolianu. Uderzajca rnica midzy tymi procesami biosyntezy polega na tym, e podczas, gdy fosforan rybozy jest integraln czci najwczeniejszego prekursora w syntezie nukleotydu purynowego (p. ryc. 36-3), przyczeni? czsteczki fosforanu rybozy do N-3 zasady pi rym idy nowej zachodzi w pnej fazie biosyntezy (ryc. 36-13). Cyfry arabskie w akapitach poniej odpowiadaj numerom reakcji na ryc. 36 -13. (1) Synteza piercienia pirymidynowego zaczyna si od utworzenia karbamoilofosforanu z glutaminy, ATP, CO2 w reakcji katalizowanej przez cytoplazmatyczn syntaze karbamoilofos-furanow. Przeciwnie, syntaza karbamoilowa, biorca udzia w syntezie mocznika, jest en-
ORGANIZM LUDZKI KATALIZUJE PURYNY DO KWASU MOCZOWEGO

Podczas gdy nisze naczelne i inne ssaki katabolizuj kwas moczowy, przez hydroliz katalizowan urykaz, dalej do ko cowego rozpuszczalnego w wodzie produktu alantoiny (ryc. 36-12), kocowym produktem kataboliz-mu puryn w organizmie ludzkim jest kwas moc2owy. Gady, ptaki i play, ktre podobnie jak czowiek nie maj urykazy, wydalaj kwas moczowy i guanine jako produkty kocowe katabolizmu zarwno puryn, jak i biaka. Guanina i hipoksantyna tworz kwas moczowy z ksantyny w reakcji katalizowanej przez guanaz i oksyda/ ksantynow wtroby, jelita
Biochemia
434 / ROZDZIA 36
CO; + Glutam ina + AT P SYNTETAZA KARBAMOILOFOSFORANOWA
-n-c4
"a"
Karbamoilofosforan (CAP)
KARBAMOILO-THANSFERA ZA ASPARAGINIANOWA
o-c.
DIHYDROOROTAZA
T
Kwas asparaginowv
H H COO"
H Kwas karbamoilo-a sparaginowy (CAA)
T
NAD DEHYDROGENAZA DIHYDROOROTANOWA NADH + H +
COO" Kwaa dlhydroorotowy (DHOH)
CO,
PRPP
DEKARBOKSYU\ZA OROTYDYNO-5-FOSFOHANOWA OMP
FOSFOHYBOZYLOTRANSFERAZA OROTANOWA
COO'
Kwas orotowy (OA)
UDP(Dlfosforan REDUKTAZA HYBONUKLEOTYDOWA
UTP ATP Glutamina
dUMP ^- N ,N -Metyle no
i 1
SYNTETAZA TYMIDYLNOWA
H,follan H,tollan
Ryc . 36 -13 . S zl ak bi osynt ezy nukl eot ydw pir ymi dynow ych.
zymem mitochondrialnym. Ta kompartmenta-cja zabezpiecza niezalen dostaw fosforanu karbamoilu dla tych procesw. Kondensacja karbamoilofosforanu z asparaginianem tworzy karbamoiloasparaginian w reakcji katalizowanej przez karbamoilotransferaz asparaginianow. Zamkniecie piercienia przez utrat wo dy, katalizowane przez dihydroorotaz, prowa dzi do utworzenia kwasu dihydroorotowego. Odjcie wodorw od atomw wgla 5 i 6 przez NAD + wprowadza wizanie podwj ne, tworzc kwas octowy. Ta reakcja jest katali zowana przez mitochondrialny enzym dehydrogenaz dihydruorotanow Wszystkie inne en zymy biorce udzia w syntezie de novo pirymidyn s enzymami cytoplazmatycznymi. Dodanie czsteczki rybozofosfo ran owej z PRPP tworzy wizanie p-N-glikozydowe z po wstaniem orotydynomonufosforanu (OMP). Re akcj t, analogiczn do reakcji lrans-rybozylacji na ryc. 36-7, katalizuje fosforybozylotransferaza orotanowa. Podczas dekarboksylacji orotanu po wstaje lirydynomonofosforan (UMP) pierw szy rzeczywisty rybonukleotyd pirymidynowy. (7 i 8) Po przeniesieniu reszty fosforanowej z ATP tworzy si UDP i UTP w reakcjach analogicznych do reakcji fosforylacji monofos-fbranw nukleozydw purynowych (ryc. 36-5). (9) UTP jest aminowany do CTP przy udziale glutaminy i ATP. Redukcja difosforan w rybonukleotydw (NDP) do odpowiednich dNTP zachodzi w reakcjach analogicznych do reakcji dla nukleotydw purynowych (p. ryc. 36-10 i 36-11). dUMP moe przyj reszt fosforano w z ATP, tworzc dUTP (nie pokazano). Alternatywnie, poniewa dUMP jest substratem dla dTMP, dUDP jest defosforylowany do dUMP. Metylacja dUMP przy C-5 przez N10-metyleno-TNF, katalizowana przez syntetaz tymidylanow, powoduje utworzenie tjmidylanu (tymidynomonofosforan, dTMP).
Przeciwnowotworowy lek metotreksat blokuje redukcj dihydrofolianu
metylowej, a nonik tetrahydrofolianowy jest utleniany do dihydrofoUanu. Aby zasza dalsza synteza, dihydrofolian musi by zredukowany do tetrahydrofolianu w reakcji katalizowanej przez reduktaz dihydrofolianow. W zwizku z tym komrki dzielce si, ktre musz wytwarza TMP i dihydrofolian, s szczeglnie wraliwe na inhibitory reduktazy dihydrofolia-nowej. Jednym z takich inhibitorw jest metotreksat (ametopteryna) szeroko stosowany lek przeciwnowotworowy.
RYBO-IDEOKSYRYBONUKLEOTYDY URACYLU I CYTOZYNY S SUBSTRATAMI W REAKCJI REZERWOWEJ PIRYMIDYNY

Podczas gdy komrki ssakw nie maja efektywnej drogi do zachowania rezerw wolnych zasad pirymidynowych, reakcje rezerwowe przemieniaj rybonukleozydy pirymidynowe, urydyn i cytydyn, oraz deok syry bonu kle ozy-dy, tymidyn i deok sycy ty dyn, w odpowiednie nukleotydy(ryc. 36-14). 2'-Deoksycytydynajest fosforylowana przez kinaz deoksycytydynow, enzym, ktry take fosforyluje deoksyguanozy-
ATP ADP
UrydynaKINAZA UHYDYNOWO-CYTYDYMOWA Cytydyna Tym idy na
- U MP
-d iMp
ATP
AD?
KINAZATYMIDYNOWA I ATP ADP
DeoksycylyOyna.
. Reakcja 12 na ryc. 36-13 jest jedyn reakcj w biosyntezie nukleotydu pirymidyny, ktra wymaga pochodnej tetrahydrofolianu. Podczas procesu przeniesienia reszta metylenowa N5, NIO-metyJeno-THF jest redukowana do reszty
-dCMP
|KINAZA DEOKSYCYTYDYNOW] Ryc. 36-14. Reakcje kinaz nukleozydw pirymidy-nowych odpowiedzialne za tworzenie monofos-foranw nukleozydw pirymidynowych.
436 / ROZDZIA 36
n i deoksy adenozyn. Fosfory boy otra nsfera-za orotanowa (reakcja 5, ryc. 36-13), enzym biorcy udzia w syntezie de novo nukleotydw pirymidyny, moe syntetyzowa OMP z kwasu orotowego.
semialdehyd tworzy sukcynylo-CoA (p. ryc. 21-2).
Pseudourydyna jest wydalana w stanie nie zmienionym
ANALOGI PIRYMIDYNY SSUBSTRATAMI DLA NIEKTRYCH ENZYMW SYNTEZY NUKLEOTYDU Pl RYM I DYMOWEGO
Podczas gdy fosforybozylotransferaza orotonianowa nie moe uywa normalnych zasad pirymidynowych jako substratw, katalizuje ona jednak przeksztacenie allopurynolu (4-hyd-roksypirazolopiramidyna) do nukleotydu, w ktrym rybo zofosfo ran jest doczony do N-l piercienia pirymidy nowego allopurynolu. Take lek przeciwnowotworowy 5-fIuorouracyl jest fosfory boy Iow any przez fosfory boy otr ansfe-raz orotanowa.
Poniewa aden z enzymw u ludzi nie katalizuje hydrolizy lub fosforolizy pseudourydyny, ten niezwyky nukleotyd, ktry po raz pierwszy wykryto w moczu ludzi, u osb zdrowych jest wydalany z moczem w stanie nie zmienionym.
BIOSYNTEZA NUKLEOTYDW PIRYMIDYNOWYCH JEST REGULOWANA ZARWNO NA POZIOMIE EKSPRESJI GENU, JAK I AKTYWNOCI ENZYMATYCZNEJ
Dwa pierwsze enzymy biorce udzia w biosyntezie nukleotydw pirymidy nowych s wraliwe na regulacj allosteryczn. Co do regulacji przez ekspresj genu, 3 pierwsze i 2 ostatnie enzymy s regulowane przez skoordynowan represj i derepresj. Syntetaza karhamoilofos-forano w a jest hamowana przez UTP C nuk-leotydy purynowe, a aktywowana przez PRPP (ryc. 36-16). Karbamoilotransferaza asparagi-iiianowa jest bardzo wraliwa na hamujce dziaanie CTP. Waciwoci allosteryczne kar-bamoilotransferazy asparaginianowej u proka-riontw stanowi klasyczny obiekt bada allos-terii.
KATABOLIZM PRYMIDYN WYTWARZA PRODUKTY ROZPUSZCZALNE W WODZIE

K atabolizm pirymidyn. ktry zachodzi gwnie w wtrobie, prowadzi do wytworzenia atwo rozpuszczalnych produktw kocowych (ryc. 36-15). Kontrastuje to z katabolizmem puryn, w wyniku ktrego powstaje bardzo sabo roz puszczalny kwas moczowy i moczan sodu. Uwolnienie CO2 (wydalonego przez oddychanie) z wgla (C2) rdzenia pirymidyny Teprezen-tuje gwny szlak dla katabolizmu uracylu, cytozyny i tyminy. P-Alanina j p-aminoizoma-lan s kocowymi produktami katabolizmu cytozyny, uracylu i tyminy. Wydalanie (3-aminoizomalanu zwiksza si w biaaczce i po ekspozycji promieniami X z powodu zwikszonego niszczenia komrek i ich DNA. Nieprawidowe due wydalanie p-ami-noizomalanu, spowodowane recesywn ekspresj genu, zachodzi u hetcrozygotycznego potomstwa (heterozygot), skdind zdrowych osobnikw. Okoo 25% badanych osb, z pochodzenia Chiczykw i Japoczykw, stale wydala due iloci P-aminoizomasianu. Chocia wiemy mao, jak organizm ludzki degraduje p-aminoizomalan, nerka wjni metabolizuje go przez transaminacj do semialdehydu metylo-malonianu. Po utlenieniu do propionianu ten
ZRWNOWAONE WYTWARZANIE PREKURSORW KWASW NUKLEINOWYCH WYMAGA SKOORDYNOWANEJ KONTROLI BIOSYNTEZY NUKLEOTYDW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH
Biosynteza pirymidyny i biosynteza puryn biegnie rwnolegle, jeli wemie si pod uwag stosunki molowe; sugeruje to skoordynowan kontrole obu tych procesw, Syntetaza PRPP (reakcja 1, ryc. 36-3), enzym, ktry katali zuje reakcj wytwarzania podstawowego prekursora obu procesw, podlega zahamowaniu przez sprzenie zwrotne zarwno przez nuk -leotydy purynowe, jak i pirymidy no we oraz aktywacji przez PRPP. S wic liczne miejsca, w ktrych zachodzi krzyowa regulacja midzy syntez nukleotydw purynowych i pirymidy-n owych.
METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PtRYMIDYNOWYCH I 437
Tymlna
-~.
NADPH + H
+
Di hyd roty mina Dihydrouracyl 0-llretdopropionian N-k a r ba m o ilo-^-al a n I n a H5N

i
COO '
H, N - C H, - C H2 - C O O " ^
Âlanina
J O'
H H ZO
^- Ureidolzom a lan (N- Garbar o Ho-0-am ino -Izomalan)
H 3 N -CH;,-CH COO CH3 ^-Aminoizomalan
Ryc. 36-15. Rozkad pirymidyn.
SKAZA MOCZANOWA JEST ZABURZENIEM KATABOLiZMU PURYNOWEGO

Tak jak dla. kadego sabego kwasu wzgldne proporcje niezdysocjowanego kwasu (kwas moczowy) i jego sprzonej zasady (moczan sodu) zale od pH. W fizjologicznych wartociach pH musimy rozway jedynie dysocjacj pierw-
szego protonu z kwasu moczowego (pK = 5,75) poniewa drugi proton (pK=]0,3) d ysocjuje przy wartociach pH znacznie wyszych od pH jakiegokolwiek pynu ustrojowego. W pynach ustrojowych wystpuje wic kwas moczowy i jego sl monosodowa. W hiperurykemii stenie moczanu sodu w surowicy przewysza gra nice rozpuszczalnoci. Krysztay moczanu sodu mog si zatem tworzy w tkankach mikkich
438 / ROZDZIA 36
NuKleotycfy purynowe -------
PRPP -------
natomiast kwas moczowy wystpuje w pynie kanalikowym kanalikw nerkowych znajdujcych si za odcinkiem kanalikw zakwaszajcych mocz. Powstawanie kamieni zoonych z kwasu moczowego mona wic zahamowa przez alkalizacj moczu. Metody izotopowe pozwalaj zmierzy oglnoustrojowa, pul moczanw Po doylnym podaniu (1!N)-kwasu moczowego osobom zdrowym i chorym na skaz moczanow, stopie rozcieczenia izotopu uywa si do wyliczenia ogl noust rojowej wymienialnej puli moczanw. Pula ta u zdrowych mcz yzn wynosi 7,08 mmol (=1200 mg), a u zdrowych dorosych kobiet 3,54 mmol ( = 600 mg), natomiast u chorych ze skaz moczanow bez guzkw dnawych 11,823,6 mmol ( = 2000-^000 mg), a nawet 182,9 mmol ( = 31 000 mg) u chorych z cik skaz moczanow z guzkami dnawymi. Moczan sodu jest aktywnie reabsorbowany i czciowo wydzielany w kanaliku proksymal-nym. W ptli nefronu zachodzi dalsze wydzielane moczanw do wiata nefronu, natomiast w kanaliku krtym dystalnym zachodzi ponowne, chocia tylko czciowe, jego wchanianie zwrotne. Wydalanie netto kwasu moczowego z moczem u zdrowego czowieka wynosi 2,36 3,54 mmo/24 h (= 400600 mg/24 h). Wiele zwizkw farmakologicznych i naturalnie wystpujcych wpywa na wchanianie nerkowe i wydalanie moczanu sodu. Na przykad kwas acetylosalicylowy w duych dawkach hamuje kompetycyjnie zarwno wydzielanie moczanw przez kanaliki nerkowe, jak i jego wchanianie zwrotne.
ATP + Rybozo--5-toafor an Asparaginian
ATP + COj + Glutamina
O
UDP
TDP
"TMP-
dUDP
Ryc. 36-16. Kontrola syntezy nukleotydu pirymi-dynowego. Linie cige ilustruj cig reakcji chemicznej. Linie przerywane pokazuj pozytywn () i negatywn () regulacj przez sprzenie zwrotne.
CTP
i stawach w postaci depozytw, okre lanych jak~o "guzki dnawe. Proces ten wywouje ostr
reakcj zapaln, ostre (moczanowe) zapalenie staww, ktre moe przej w przewleke (mo czanowe) zapalenie staww.
Podczas gdy mocz o pH 5 moe by wysycony moczanami do stenia 892 umol/1 (= 15 mg/dl), w moczu o pH 7 rozpuszcza si 8922--11896 umol/I (=150200 mg/dl) moczanw. W moczu prawidowym, o pH najczciej niszym od 5,75, przewaa kwas moczowy. W odcinkach kanalikw nerkowych proksymalnie pooonych w stosunku do kanalika dystalnego i zbiorczego (gdzie gwnie zachodzi zakwaszenie moczu) w moczu wystpuje moczan sodu,
Krysztay moczanowe maj znaczenie diagnostyczne w skazie moczanowej W skazie moczanowej znaczenie diagnostyczne ma uwidocznienie w granulocytach obojt-nochonnych w pynie stawowym, w wietle spolaryzowanym i w mikroskopie wietlnym, iglastych, intensywnie wieccych podwjnie zaamujcych wiato krysztaw moczanu so du. Krysztay maj barw t, gdy ich duga o jest rwnolega, lub niebiesk, gdy o jest prostopada do paszczyzny wiata spolaryzowanego.
______________ METABOLIZM NUKLEOTYD&W PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 439

Tabela 36-1. Dziedziczne zaburzenia metabolizmu purynowego i towarzyszce im nieprawidowoci enzymatyczne Zaburzenie kliniczne
Dna Syntetaza PRPP Dna Syntetaza PRPP Dna Syntetaza PRPP Dna HGPRTaza*
Zesp Lescha-Ny-hana
Uszkodzony enzym
Charakter uszkodzenia
Charaktery styka zaburzenia klinicznego
Typ dziedzicznoci
Mad aktywno (zwi- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzony z chromone wydalanie pufyn kszenie Vmaks.) somem X recesywny Oporno na zaha- Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzony z chromomowanie w reakcji ne wydalanie puryn somem X recesywny sprzenia zwrotnego Maa Km dla Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Prawdopodobnie sprzony z chromosomem rybozo-5-fosforanu ne wydalanie puryn X recesywny Czciowy niedobr Zupeny niedobr Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzony z chromone wydalanie puryn somem X tecesywny Nadmierne wytwarzanie i nadmier- Sprzony z chromone wydalanie puryn; poraenie m- somem X recesywny dkowe i samookaleczenia Niedobr immunologiczny zfozony Autosomalny recesy(komrki T i B), deoksyadenozy- wny nuria Niedobr komrek T, inozynuria, Autosomalny recesydeoksyinozynuria, guanoiynuria, wny deoksygua noyn uria, hipouryke-mia Kamica nerkowa 2,8-dihydroksy-adeninowa Kamica nerkowa ksantynowa, hi-pourykemia Autosomalny recesywny Autosomalny recesywny
HGPRTaza Ciki niedobr
Niedobr immunologiczny Deaminaza adeno-zynowa Niedobr immunologiczny Fosforylaza nuk-ieozydowa puryn Kamica~nerkowa
Ciki niedobr
Zupeny niedobr Fosforybozylotransferaza adeninoZupeny niedobr wa Oksydaza ksanty-nowa
Ksantynuria
* HGPRTaza = o sf o ry boy I otr n sferaza hipoksantynowo -guaninowa.
ZABURZENIA W MET ABOLIZMIE PURYN OBEJMUJ CHOROBY PRZEBIEGAJCE Z HIPERURYKEMI LUB HIPOURYKEMI Zaburzenia w metabolizmie puryn (tab. 36-1) obejmuj choroby przebiegajce z hiperuryke-mi lub hipourj kemi oraz choroby charakteryzujce si niedoborem immunologicznym. Hiperurykemie mog by dalej klasyfikowane na podstawie wydalania z moczem prawidowych lub nadmiernych (ponad 3,54 mmol/ 24 h = 600 mg/24 h) iloci moczanw (tab. 36-2). Niektre zaburzenia s spowodowane swoistymi niedoborami enzymatycznymi. W innych hiperurykemia jest zjawiskiem wtrnym, np.
Tabela 36-2. Klasyfikacja chorych z hipemrykemi I. Prawidowe wydalanie moczanw; upoledzone wydalanie nerkowe odpowiedzialne za zwikszone stenie moczanw w surowicy II. Nadmierne wydalanie moczanw z powodu nadmiernego wytwarzania A Wtrna zmiana towarzyszca innym chorobom, np nowotwory, uszczyca B Znane niedobory enzymatyczne odpowiedzialne za nadmierne wytwarzanie 1 Nieprawidowoci syntezy PRPP 2. Niedobory fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej 3. Niedobory g!ukozo-6-fosfatazy C. Uszkodzenia nieznane
440 / ROZDZIA 36
spowodowanym nowotworem lub uszczyc, charakteryzujcymi si wzmoonym obrotem tkankowym. Zesp Lescha-Nyhana jest przejawem cakowitego braku fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ni nowej Zesp Lescha-Nyhana jest nastpstwem braku aktywnej fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-gua ninowej (HGPRTazy), enzymu rezerwowego1 ' szlaku syntezy puryn (ryc. 36-7). To zaburzenie recesywne, dziedzicznie sprzone z chromosomem X, charakteryzuje uszkodzenie orodkowego ukadu nerwowego, przebiegajce z choreoatetoz i zwikszonym napiciem miniowym, znaczn hiperurykemi z nadmiernego wytwarzania, poczon czst o z kamic moczanow i zespoiem samookalecze-nia. Mniej szkodliwym mutacjom, w wyniku ktrych powstaje czciowy niedobr HGPRTazy, towarzyszy u mczyzn znaczna hiperurykemia, przebiegajca bez wyranych objaww klinicznych. Nadmierne wytwarzanie puryn w niedoborze HGPRTazy jest wyrazem oszczdzania PRPP w szlaku rezerwowym syntezy puryn z nastpujcym zwikszeniem wewntrzkomrkowego stenia PRPP. Chorob von Gierkego charakteryzuje nadmierne wytwarzanie puryn i hiperurykemia Nadmierne wytwarzanie puryn i hiperuryke-O ^ ^ t gluko^ ^ ^ ^ g zo- -fosfatazy) s zjawiskami wtrnymi w od-nisjeniudo wzmoonego wytwarzania rybozo--5-fcsforanu, prekursora PRPP. Wsptowarzyszca kwasica mleczanowa podwysza jedynak nerkowy prg wydalania moczanw, przyczyniajc si do gromadzenia moczanw w caym organizmie. Hipourykemie powstaj w wyniku nadmiernego wydalania lub zmniejszonego wytwarzania kwasu moczowego Psy daimatyriskie, ktre niekompletnie reab-sorbuj kwas moczowy, wydalaj moczany i kwas moczowy w nadmiarze w stosunku do ich stenia w surowicy. Podobne wady obserwuje si u ludzi z hipourykemi.
Hipourykemia towarzyszy niedoborowi oksydazy ksanty nowej Hipourykemi i wzmoone wydalanie hipo-ksanfyny i ksantyny jest zwizane z niedoborem oksydazy ksantynowej, spowodowanym albo wad genetyczn, albo cikim uszkodzeniem wtroby. W powanym niedoborze oksydazy ksantynowej u chorych "moe wystpi zwikszona ksantynuria i
kamica ksantynowa.
Wady genetyczne powoduj niedobr deaminazy adenozynowej i fosforylazy nukleozydowej puryn zany z cikim zoonym niedoborem immunologicznym, chorob, w ktrej zarwno limfocyty pochodzenia grasiczego (komrki T), jak i pochodzenia szpikowego (komrki B) s nieliczne i wykazuj zaburzenia czynnoci. Niedobr fosforyiazy nukleozydowej puryn jest zwiNiedobr deaminazy adenozynowej jest zwi -
zany z powanym niedoborem limfocytw pochodzenia grasiczego przy prawidowej czynnoci komrek B. Oba zaburzenia s autosomalne i recesywne. Zaburzenia immunologiczne wynikaj ?e spichrzenia dGTP i dATP, ktre hamuj allosterycznie reduktaz rybonukleotydow i przez to pozbawiaj komrki prekursorw DNA, szczeglnie dCTP. Niedobr puryn u ludzi wystpuje rzadko Stany niedoboru purynowego u udzi s-ogra-niczone do sytuacji przypisywanych przede wszystkim niedoborom kwasu foliowegoj by moe witaminy B12, gdy ta ostatnia powoduje wtrny niedobr pochodnych folianw. NADMIERNE WYTWARZANIE KAT ABOLITW PIRYMIDYNOWYCH JEST RZADKO ZWIZANE ZE ZNACZ CYMI KLINICZNIE NIEPRAWIDOWOCIAMI Produkty-kataboizmu pirymidyny, odwrotnie ni puryny, s rozpuszczalne "wwodzie. Dlatego nawet w przypadku, gdy zachodzi nadmierne wytwarzanie pirymidyny rzadko pojawiaj si wykrywalne klinicznie nieprawidowoci (tab. 36-3). W hiperurykemii, ktrej towarzyszy nadmierne wytwarzanie PRPP, zachodzi nadmierne wytwarzanie nukleotydw pirymidynowych i zwikszone wydalanie fi-ala-niny. Poniewa do syntezy tymidylanu jest
METABOLIZM NUKLEOTYDOW PURYNOWYCH I PIRYMIDYNOWYCH / 441 Tabela 36-3. Wrodzone zaburzenia metabolizmu pirymidyn i towarzyszce im nieprawidowoci enzymatyczne Zaburzenie kliniczne Acyduria p-amino-izomalan owa Orotoacyduria typu I Uszkodzony enzym Transami naza Fosfory bozylotransfera -;a orotowa i dekarbok-sylaza o roty dyl a nowa Dekarboksylaza orotydylanowd Cechy zaburze klinicznych Brak objaww, czste zaburzenie u ludw Wschodu Krysztay kwasu orotowego w moczu i niedokrwisto megaioblastyczna. Niedobr immunologiczny Remisja po podaniu doustnym urydyny Orotydynuria i acyduria orotowa, niedokrwisto megaioblastyczna Re misja po podaniu doustnym urydyny Typ dziedzicznoci Autosomalny recesywny Autosomalny rce sywny
Orotoacyduria typu II
Autosomalny rce-sywny
Nietolerancja biaek, encefalopatia Sprzony z chroX Niedobr Karbamoilotransferaza wtrobowa i acyduria orotowa o lek- mosomem recesy-wny kim nasileniu karbamoi-iotransfer ornitynowa azy ornity-nowej
potrzebny N5,N10-metyleno-THF, zaburzenia w metabolizmie folianw i witaminy B12 powoduj niedobory dTMP (w przypadku niedoboru witaminy B, 2 przez mechanizm poredni). Acyduria P-aminomalanowa bya omwiona po przednio w zwizku z katabolizmem pirymidyn. Acyduria orotowa, ktra towarzyszy zespoowi Reye', jest prawdopodobnie procesem wtrnym, wynikajcym z niezdolnoci silnie uszkodzonych mitochondriw do zuytkowania kar-bamoilofosforanu, ktry moe wwczas by dostpny do nadmiernego wytwarzania cyto-zolowego kwasu orotowego. Chorzy na orotoacyduri s pi rym idy nowy mi auksotrofami, reagujcymi na nukleozydy pirymidynowe w poywieniu W czciej wystpujcym typie I tej choroby stwierdza si niedobr zarwno fosfory boy lo-transferazy orotanowej, jak i orotydy anowej (reakcja 6, ryc. 36-13). Gwnym wydalanym nieprawidowym produktem jest kwas orotowy. Oba typy chorych s auksotrofami, ktrzy reeaguj na podan urydyn. Znacznie zwikszona aktywno karbamoilo-transferazy asparagi nia owej i dihydroorotazy u chorych z orotoacyduria typu I powraca do normy po doustnym podaniu urydyny.
dekarboksylazy
Niedoborowi enzymu cyklu mocznikowego towarzyszy wzmoone wydalanie prekursorw pirymidyny Wzmoone wydalanie kwasu orotowego, uracylu i urydyny opisano u chorych z niedoborem wtrobowego mitochondrianego enzymu
karbamoilotransferazy ornitynowej. Nagroma-
dzony fosforan karbamoilu, substrat tego enzymu, przechodzi do cytozolu, gdzie jest uyty do syntezy nukleotydw pirymidynowych. Powstajca w wyniku tego saba acyduria orotowa wzmaga si wwczas, gdy chorzy spoywaj poywienie z du zawartoci azotu. Leki mog eliminowa acyduri orotowa Analogpuryny allopurynol(p. ryc. 35-21) jest inhibitorem oksydazy ksantynowej stosowanej w leczeniu skazy moczanowej, Allopurynol, substrat fosfory boy 1 o transferazy orotanowej (reakcja 5, ryc, 36-13) hamuje kompetytywnie fosfory boy lacj naturalnego substratu kwasu orotowego. Ponadto powstajcy produkt nuk-leotydowy hamuje dekarboksylaz orotydylano-w (reakcja 6, ryc. 36-13) wy twarzajc orotoacyduri lub orotydynuri. Poniewa szlak biosyntezy de novo nukleotydu pi rym idy nowego przystosowuje si do takiego hamowania, organizm ludzki jest tylko przejciowo pozbawiony nuk-ieotydw pirymidynowych we wczesnym okresie leczenia. 6-A/aury dyna, po przeksztaceniu do 6-azau-rydylanu, kompelytywnie hamuje dekarboksy-
442 / ROZDZIA 36
laz orotydylanow (reakcja 6, ryc. 36-13) silnie wzmagajc wydalanie kwasu orotowego i oro-tydyny.
PIMIENNICTWO Ames BN, Cathcarl R, Sthwiers E, Hochstein P: Uric acid provides an anlioxidant defense in huraans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: A hypoLhesis. Proc Nati Acad Sci USA 19S1; 78:6858. Benkovic SJ: The transfomiylase enzymes in de novo purine biosynthesis. Trends Biochem Sci 1984;9:320.
Holmgren A: Thioredoxin. Annu Rev Biochem 1985; 54:237. Joties M: Pyrimidine nucleotide biosynthesis in animal cells. Annu Rev Biochem 1980; 49:253. Martin DW Jr, Gelfand EW: Biochemistry of diseases of immunodevelopment. Annu Rev Biochem 1981; 50:845. Schinke RT: Methotrexate resistance and gene amplification. Mechanisras and implications. Cancer 1986; 57:1912. Seegmiller JE: Overview of the possible relation of defects in purine metabolism to imraune deficiency. Ann NY Acad Sci 1985; 45:9. Stanbury JB et al (editors): The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 5th ed. McGraw-Hill, 1983.
Struktura i funkcja kwasw nukleinowych

Dary! K. Granner. MD
37
WPROWADZENIE
Odkrycie, e informacja genetyczna jest zakodowana wzdu czsteczki polimeru, zoonej z 4 rodzajw jednostek monomerycznych, jest wielkim osigniciem naukowym tego stulecia. Ta czsteczka polimeru, DNA, jest chemiczn podstaw dziedzicznoci. Skada si ona z genw, podstawowych jednostek informacji genetycznej. Geny kontroluj syntez rnych typw RJSA, wikszo z nich bierze udzia w syntezie biaek. Geny nie dziaaj autonomicznie; ich replikatja i funkcja s kontrolowane przez sabo jeszcze poznane sprzenia zwrotne, w ktrych same produkty genw odgrywaj krytyczn rol. Wiedza o strukturze i funkcji kwasw nukleinowych jest podstawowa do zrozumienia genetyki i stanowi podstaw do dalszych bada.
obserwowali oni, e genetyczna determinacja otoczki swoistych pneumokokw moe by przeniesiona do innych pneumokokw o wyranie odmiennym typie otoczki przez wprowadzenie oczyszczonego DNA od pierwszych do drugich. Autorzy ci okrelili czynnik, ktry dokonuje tej zmiany, jako czynnik transfor mujcy" (pniej wykazano, e by to DNA). W pniejszym okresie ten typ manipulacji genetycznej stal si pospolity. Podobne do wiadczenia wykonano ostatnio posugujc si drodami, hodowanymi w kulturach komr kami ssakw i zarodkami owadw oraz gryzoni jako biorcw, a klonowanym DNA jako dawc informacji genetycznej. Chemiczn natur jednostek deoksynukJeo-tydowych DNA deoksyadenylan, deoksygua-nylan, deoksycytydylan i tymidylan opisano w rozdz. 35. Te monomeryczne jednostki DNA s utrzymane w postaci polimeru przez mostki 3', 5'-fosfodiestrowe, tworzc w ten sposb pojedyncze pasmo przedstawione na ryc. 37-1. Tre infor macyjna DNA (kod genetyczny) iest zawarta w'"seTiwencji, w ktrej te monomery deoksyrybonukleotydy purynowe i pirymi-dynowe s zorganizowane. Czsteczka polimeru DNA, jak to pokazano, jest polarna; na jednym kocu ma grup 5'-hydroksylow lub fosforanow, a na drugim grup 3'-fosforanow lub hydroksylow. Znaczenie tej popularnoci zostanie wyjanione w dalszej czci rozdziahi. Poniewa informacja genetyczna jest zawarta w kolejno uoonych jednostkach monomerycznych w czsteczkach polimeru, musi istnie mechanizm reprodukowania, czyli replikowania tej swoistej informacji majcej bardzo duy
DNA skada si z 4 deoksynukleotydw
Chemiczna podstawa dziedzicznoci i chorb genetycznych jest zawarta w strukturze DNA. Gwny szlak informacyjny (tj. kierowanie przez DNA syntez RNA, ktry z kolei kieruje syntez biaek) zosta ju wyjaniony. Wiedza ta zostaa uyta dla sprecyzowania fizjologii komrkowej i patofizjologii chorb na poziomie molekularnym.
DNA ZAWIERA INFORMACJ GENETYCZN

Fakt, e DNA zawiera informacj genetyczn wykazali po raz pierwszy w 1944 r. w serii dowiadcze Avery, MacLeod i McCarty. Za-
/ ROZDZIA 37
H \. yl H
3' H
Ryc. 37-1. Segment jednego pasma czsteczki DNA, w ktrej zasady purynowe i pi rym idy no we: adenina (A), tymina (T), cytozyna (C) i guartina (G) s poczone przez fosfod iestro we wizania (szkielet) midzy resztami 2'-deoksyrybozylowymi zwizanymi z zasadami przez wizanie N-glikozydowe. Zwr uwag, e szkielet wiza fosfod i estrowych wykazuje polarno (tj, ukierunkowanie).
stopie wiernoci. Ten wymg, razem z danymi uzyskanymi za pomoc dyfrakcji promieni X przez czsteczk DNA, i spostrzeenia Char-gaffa, e w czsteczkach DNA stenie nukleotydw deoksy a de noy nowych (A) rwna si steniu nukleotydw tymidynowych (T) iA^JJ^ji stjêniejiukleotyd w deoksyguano-zynowych (G) rwna si steniu nukleotydw deoksycytydynowych (C) (G = C) pozwoliy zaproponowa we wczesnych latach 50. model dwupasmowej czsteczki DNA. Propozycj tak przedstawili Watson,~Crick i Wilkins. Model, ktry ci uczeni zaproponowali, przedstawiono na ryc. 37-2. 2 pasma prawoskrtnej dwupasmowej czsteczki s utrzymane przez wizania wodorowe midzy zasadami puryno-wymi a pi rym idy no wy mi odpowiadajcych sobie czsteczek linijnych. Wytworzenie par midzy nukleotydami purynowymi a pirymidyno-
wymi naprzeciwlegych pasmach jest bardzo swoiste i zaley od wiza wodoro wych A i T oraz G i C (ryc. 37-3). W dwupasmowej czsteczce ograniczenia narzucone przez moliwo rotacji wok wiza nia fosfodiestrowego, uprzywilejowana konfiguracja antywizania glikozydowego (p. ryc. 35-9) oraz dominujce tautomery (p. ryc. 35-4) 4 zasad (A, G, T i C) pozwalaj tylko na sparowanie A wycznie z T i G wycznie z C, jak to przedstawiono na ryc. 37-3, Takie ograniczenie w parowaniu zasad wyjania wczeniejsz obserwacj, e w_dwupasmowej czsteczce DNA ilo A rwna si iloci T, a ilo G rwna si iloci C. 2 pasma, z ktrych kade jest polarne, w dwupasmowej czsteczce s przeciwlege; tj. jedno pasmo biegnie w kierunku 5' do 3', a drugie w kierunku 3' do 5'. Jest to analogiczne do 2 rwnolegych ulic, z ktrych
STRUKTURA I FUNKCJA KWAS W NUK LEINOWYCH / 44S 3,4 nm 2,0 nm
Rowek mniejszy I
wikszy
nm
Ryc. 37-2. Model Watsona-Cricka dwupasmowej helikalnej struktury postaci B DNA. Na lewo: Schemat struktury. Strzaka pozioma pokazuje szeroko (rednic) podwjnego heliksu (2,0 nm), a strzaka piono wa dugo jednego petnego zwo ju heliksu (3,4 nm). Centralna o podwjnego heiiksu jest pokazana jako pio nowa linia. Krtkie strzaki wskazuj polarno przeciwlegych pasm. (A adenina, C cytozyna; G guanina; T tymina; P fosforan, S cukier [deoksyryboza]). Na prawo: Model przestrzenny struktury DNA. (Zdjcie wg James D, Watson, Molecutar Biology of the Gene, 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 196 5, by W. A. Benjamin, Inc, M enlo Park, CalifJ. _______________________
kada jest jednokierunkowa, ale ruch na nich biegnie w odwrotnych kierunkach. W dwupasmowych czsteczkach DNA informacja genetyczn mieci si w sekwencji nukleotydw na jednym pamie, nazywanym pasmem matrycowym; przeciwlege do niego pasmo jest pasmem kodujcym, poniewa odpowiada ono trans-kryptowi RNA, ktry z kolei koduje biako. Na rycinie 37-3 przedstawiono, jak 3 wizania wodorowe utrzymuj nukleotyd deoksygua-nozynowy z nukleotydem deoksycytydyno-wym, podczas gdy druga para, para A-T. jest poczona 2 wizaniami wodorowymi. Wizanie G^T jest wic mocniejsze o ok. 50%. Z po-woduiej dodatkowej siy wizali, a take z powodu interakcji typu stacking" regiony DN A o duej liczbie wiza G-C s bardziej oporne na denaturacj, czyli topnienie", ni regiony o duej liczbie wiza A-T.
DNA istnieje w postaci kilku dwupasmowych helikalnych struktur Dotychczas opisano 6 postaci czsteczek DNA (A do E i Z), ale wikszo z nich znaleziono tylko w rygorystycznych warunkach dowiadczalnych. Postacie te odrnia; 1) liczba par zasad, ktre zajmuj kady zwj heliksu, 2) nachylenie, czyli kt midzy kad par zasad, 3) rednica heliksu czsteczki i 4) kierunek skrtu (prawy lub lewy) podwjnego heliksu (tab. 37-1). Niektre z tych postaci ulegaj przeksztaceniu wewntrznemu przez zmian takich warunkw, jak stenie soli i hydratacja. Moliwe, e takie przeksztacenie wewntrzne moe si zdarza in vivo. Posfo B, powszechnie dominujca posta DNA w warunkach fizjologicznych (mae stenie soli, duy stopie hydratacji), ma wielko skoku 3.4 nm na kady zwj (ryc. 37-2). W ob-
446 / ROZDZIA 37 CH3 O-. N

Cukier O Tymidyna
Adenozyna
Ryc. 37-3. Wzajemne parowanie midzy deok-syadenozyna. i tymidyna. obejmuje wytworzenie 2 wiza wodorowych 3 takie wizania tworz si midzy deoksycytydyn i deoksyguanoyn. Linie przerywane przedstawiaj wizania wo d oro we. W DNA czsteczk cukrow jest 2 -deoksyryboza, podczas gdy w RNA D-ryboza.
rbie kadego zwoju mieci si lOpar zasad (pz) (liczba ta moe si zmienia midzy 10,0-10,6 pz na kady zwj), kada z paskich zasad uktada si jedna nad drug,, przypominajc 2 skrcajce si stosy monet przyoonych bok <Jb boku. Na kadym poziomie 2 stosy s zczone wizaniami wodorowymi midzy dwoma monetami z 2 przeciwlegych stosw, a take utrzymywane przez 2 prawoskrtne wstgi owiT abela 37-1. Cechy niektrych struktur DNA Typ Kierunek skrtu A B Z Prawy Prawy Lewy Liczba Odlego par midzy rednica zasad ssiedni heliksu na 1 zwj par zasad 11 10 12 0,256 nm Cr,338 nm 0,371 nm 2,3 nm 1,9 nm 1,8 nm
jajce 2 stosy i reprezentujce szkielet fosfodies-Trwy. Odmian tej podstawowej struktury jest posta A, ktrej powstaniu sprzyja rodowisko nieco niniej uwodnione i o wikszej liczbie jonw Na+ i K + . Ta prawoskrtna struktura zajmuje wicej miejsca ni posta B, ma wicej par zasad na 1 skrt i przypomina struktur dwupasmowego RNA i podwjnego hybrydu DNA-RNA. Postacie CE s take prawo skrtne, obserwuje si je w bardzo swoistych warunkach dowiadczalnych i sdzi si, e nie istniej one in vivo. Formy Z-DNA s podwjnymi lewoskrt -nymi heliksami, w ktrych szkielet fosfodiest-rowy biegnie zygzakiem (zigzag1") wzdu czsteczki -- std nazwa Z -DNA. Z-DNA jest najmniej skrcony (12 pzna 1 zwj), jego heliks ma najmniejsz znan rednic i jedynie 1 rowek (p. niej). Z-DNA egzystuj jako sekwencje powtarzajcych si naprzemiennych deoksynu-kleotydw purynowych i pirymidy nowych (GC lub AC). lecz wymagaj one take warunkw stabilizujcych. Do warunkw stabilizujcych zalicza si m.in.: 1) obecno duego stenia soli lub swoistych kationw, takich jak sper-mina lub spermidyna, 2) duy stopie ujemnego skrcenia DNA (p. rozdz. 38), 3) wizanie biaek swoistych dla Z-DNA i 4) zmetylowanie pozycji przy C5 niektrych nukleotydw deok-sycytydynowych w sekwencji naprzemiennej. Z-DNA moe powodowa skutki regulatoro-we zarwno~w obszarze proksymalnym, jak i dystalnym w stosunku do swego pooenia. Niektre biaka, ktre wi si w mniejszym rowku B-DNAj prawdopodobnie nie mog si wiza z postaci Z. W dodatku odwrcenie (rewersja) gostaci Z do postaci B-DNA, zdarze-m.6,. ktre moe zaj w nastpstwie utraty grup metylowych z 5-metylodeoksycytydyny, zachodzi prawdopodobnie wskutek rnic w skrca 1-noci DNA w obszarze dystalnym do aktual nego miejsca zajmowanego przez Z-DNA, Jak to bdzie omawiane niej, torsyjne skrcanie i rozkrcanie, jak. te metylacja deoksycytydyny mog wpywa na aktywno genw. Istnienie Z-DNA wykazano w chromosomach muszki owocowej {Drosophila), posugujc si przeciwciaami, ktre rozpoznaj i wi si do Z-DNA. Ludzki DNA -ma- regiony, rozproszone w obrbie genomu, stanowice potencjalne odcinki do utworzenia postaci Z-DNA; mog rwnie istnie warunki stabili zujce t posta.
STRUKTURA I FUNKCJA KWASW NUKLEINOWYCH / 447
Denaturacja (topnienie) DNA jest uywana do analizy jego struktury Dwupasmowa struktura DNA w roztworze moe by "stopiona przez podwyszenie temperatury lub zmniejszenie stenia solj_ W tym procesie nie tylko 1 pasmu zasad odrywaj si od siebie, lecz take same zasady zmieniaj paszczyzn wzajemnego pooenia, podczas gdy s one stale jeszcze zwizane, jako polimer, szkieletem wiza fosfodiestrowych. Takiej denaturacji czsteczki DNA towarzyszy zwikszenie optycznej wartoci absorpcji zasad pury-nowych i pirymidynowych; zjawisko to okrela si jako efekt hiperchromiczny denaturacji. Dwupasmowa czsteczka DNA, dziki efektowi typu ,,stacking" (oddziaywania midzy ssiadujcymi parami zasad) i dziki wizaniom wodorowym midzy zasadami, tworzy sztywne twory paJeczkowe; w roztworze ma du lepko, ktra zmniejsza si po deoaturacji. Podczas denatu racji pasma danej czsteczki DNA oddzielaja^_si od siebie w pewnym prze-dzta^Lejn2e_ralury. Punkt rodkowy przejcia temperatury nazywa si temperatur topnieniu. czyli Tm . ffiactoieJjjialey od skadu zasad .. stenia soli w roztworze. ONA 0 duej liczbie par G-C, ktre maj 3 wizania wodorowe, topi si w wyszej temperaturze ni DNA .o du ej liczbie par A- T, ktre maj 2 wizania wodorowe. Dziesiciokrotne zwik szenie stenia jednowartociowych kationw powoduje zwikszenie wartoci Tm o 16,6C. Formamid , ktry jest czsto uywany w do wiadczeniach z rekombinowanym DNA, des tabilizuje wizania wodorowe midzy zasadami 1 przez to zmniejsza warto Tm. Pozwala to na oddzielenie pasm DNA albo hybrydw DNA-RNA w znacznie niszej temperaturze i mini malizuje pknicia pasm, ktre zachodz w wy sokich temperaturach. Czsteczka DNA ma row ki Szczegowe badanie modelu DNA, przedstawione na ryc. 37-2, ujawnia rowek wikszy i rowek mniejszy wijce si wzdu czsteczki rwnolegle do szkieletu fosfodiestrowego. Biaka mog oddziaywa swoicie z eksponowanymi atomami nuklcotydw (zwykle przez wizania wodorowe) w obrbie tych rowkw i przez to rozpoznawa i wiza ze swoistymi sekwencjami nukleotydowymi, bez rozrywania sparowanych zasad w dwupasmowej czsteczce DNA. Jak to omawiano w rozdz. 39 i 41, biaka
regulatorowe przez takie oddziaywanie mog kontrolowa ekspresj swoistych genw. DNA istnieje w postaciach zrelaksowanej i silnie skrconej (posta kbka) W niektrych organizmach, takich jak _bak-_Ieik l._w bakteriofagach i licznych wirusach zwierzcych typu DNA koce czsteczek DNA wi si, tworzc zamknit czsteczk kolist nie majc koca. To oczywicie nie zaburza polarnoci czsteczek, ale eliminuje wolne 3' i 5' grupy hydroksylowe i fosforowe, Zamknite czsteczki koliste istniej w postaci zrelaksowanej (rozlunione) i w postaci bardzo skrconej. Nadmierne skrcenia s wprowadzone wow-"fias, gdy zamknita kolista czsteczka jest skrcona wok swej wasnej osi, lub te gdy jest skrcona czsteczka linijna dwupasmowego DNA, ktrej koce s zakotwiczone. Ten pro ces, wymagajcy energii, wprowadza napicia do czsteczki; czym wiksza iiczba superskr-tw" tym wiksze napicie, czyli torsja (przetestuj to na gumowej tamie). Ujemne siinejzwoie tworz si wwczas, gdy czsteczka prawo-skrtnego dwupasmowego heliksu, znajdowana w B-DNA, jest skrcona w kierunku odmien nym od kierunku wskazwek zegara. Taki DNA nazywa si rozwinitym. Energia potrzebna do uzyskania tego stanu jest w pewnym sensie zmagazynowana w superskretach. Przejcie zatem do innej postaci, ktre wymaga energii, jest uatwione przez rozkrcenie. Jednym z takich przej jest oddzielenie pasm, co jest niezbdne do replikacji DNA i transkrypcji. DNA w postaci superskrtw jest zatem preferowan postaci istniejc w ukadach biologicznych. Enzymy, ktre katalizuj topologiczne zmiany DNA s nazywane topoizomeraza-mi. Topoizomerazy mog wprowadza rozlunienie albo superskrty w czsteczce DNA. Najlepiej scharakteryzowan topoizomeraz jest giraza bakteryjna, ktra wprowadza negatywne superskrty w DNA przy uyciu ATP jako rda energii. DNA SUY JAKO MATRYCA DO REPLIKACJI I TRANSKRYPCJI Informacja genetyczna zmagazynowana w sekwencji nukleotydowej DNA suy 2 celom. Jest ona rdiem informacji do syntezy wszyst kich czsteczek biakowych komrki i organiz-
448 / ROZDZIA 37
mu oraz dostarcza informacji dziedziczonej przez komrki potomne i potomstwo. Obie te funkcje stawiaj wymg, e DNA musi suy jako_matryca w pierwszym przypadku do transkrypcji informacji na RNA, a w drugim do replikacji informacji dla 2 potomnych .czs teczek DNA. - IComplementarno w dwupasmowym modelu DNA Watsona i Cricka silnie sugeruje, e replikacjii DNA zachodzi w sposb semikonserdwupasmowej
STARE
NOWE
STARE
dd]I~i~aT
p macierzystej czsteczki DNA odd]eIa~5i~aaT ~s"wgo_ komplementarnego pasma w czasie replik acjj, wwczas kade z nich suy jako mat ryca, na ktrej syntetyzuje si nowe pasmo komplementarne (ryc. 37-4). Dwie wytworzone na nowo dwupasmowe siostrzane czsteczki DNA* kada zawierajca 1 paSDSP Osompemen -tarnc..a.nie identyczne) z macierzystej dwupas-mn.wej.czstczki DN A, s nastpnie sortowane rmpjlm/ 7 *ifrtoouif komrki frvc 37~51 K.riLtiTi z komrek potomnych zawiera czsteczki DNA z informacj identyczn z t, jak miaa czs teczka macierzysta. Pzachowawczy (sem i konserwatywny) charakter replikacji DNA^ wykazali jednoznacznie u bakterii Escherichid~~dt~ Meselson i Stahl w klasycznym dowiadczeniu, stosujc ciki izotop azotu i techniki wirowania rwnowanego. Pod wzgldem chemicznym DNA E. coli jest identyczny z DNA czowieka, cho oczywicie sekwencje nukleotydw rni si, a ludzka komrka zawiera 1000 razy wicej DNA ni bakteria. Chemia replikacji DNA u prokarion-tw, takich jak E. coli, jest identyczna z chemi replikacji u eukariontw z ludzkimi wcznie, mimo, e enzymy prowadzce reakcje syntezy DNA s rne. Wszelkie spostrzeenia odnonie do natury chemicznych reakcji kwasw nukleinowych u prokariontw bardzo prawdopodobnie stosuj si te do eukariontw. Istotnie, dowiadczenia Meselsona i Stahla. wykonane na komrkach ssakw, day wyniki porwnywalne do tych, jakie otrzymano przy uyciu E. coli. RNA RNI SI OD DNA POD WZGLDEM WACIWOCI CHEMICZNYCH Kwas rybo nukleino wy (RNA) jest polimerem zoonym z rybo nukleotydw pury nowych i pirym idy nowych, poczonych midzy sob
STARE
NOWE
NOWE
Ryc. 37-4. Dwupasmowa struktura DNA i funkcja matrycowa kadego starego pasma, na ktrej jest syntetyzowane nowe komplementarne pasmo (zaciemnione). (Wg James D. Watson Molecular Biology of the Gene. 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965, by W. A. Beniamin, Inc, Menlo Park, Calif)
STRUKTURA I FUNKCJA KWASW NUKLEINOWYCH
Oryginalna czsteczka macierzysta
Drugie pokolenie Pierwsze pokole id czsteczek siostrzanych czsteczek stost ranych Konserwatywny
Sarn (konserwatywny .. (
Ryc. 37-5. Oczekiwane rozmieszczenie pasm macierzystych DNA w przypadku sem i konserwatywnego i konserwatywnego mechanizmu replikacji. Pasma macierzyste s oznaczone jako linie pene, pasma syntetyzowane od nowa jako Finie otwarte Mechanizm repiikacji DNA jest semikonserwatywny. (Przerysowane i zreprodukowane za zgod z: Lehninger A. L: Biochemistry, 2nd ed. Worth, 1975).
prz&z 3', 5; wizania fosfodiestrowe^.aaalo.gicz-ne da.lych, ktre wystpuj w DNA (ryc. 37-6). RNA, chocia ma wiele wsplnych cech z DNA, ma te swoiste rnice: 1. W RNA czsteczk cukru,,/ ktr s zwizane losforany oraz zasady purynuwe i piryP"^ygflfi*i^t.rybyza, a nie 2-deoksyryboza jak _w_DNA. Komponenty pirymidynowe w RNA rni si od tych, ktre wystpuj w DNA. Chocia RN^zawiera rybonukleotydy adeniny, guaniny i cytozyny, to nie zawiera ty miny ,_z wyjt kiem rzadkiego przypadku wymienionego poni ej. Zamiast tynuny RNA zawiera rybonukleotjd uracylu. RNA wystpuje jako pasmo pojedyncze, ppdczas_.gdy DNA wystpuj e jako clwupasmowjLczsteczka helikalna. Jednake w okre lonych sekwencjach, zawierajcych komplemen tarne zasady o odwrotnej polarnoci, pojedyn cze pasmo RNA, jak to przedstawiono na ryc. 37-7, jest zdolne do zawinicia si na nim saaiym, tak jak spinka do wosw, przyjmujc w ten sposb cechy struktury dwupasmowej.
29 Biochemia
4.._Poniewa czsteczka RNA jest pojedynczym pasmem komplementarnym tylko do 1 z 2 pasm genu, iJo guaniny nie musi si rwna iloci cytozyny, ani ilo adeniny nie musi si rwna iloci uracylu. 5. RNA moe by hydrolizowany przez odczyn zasadowy do 2\ f cyklicznych dicstrw mono-nukieotydw, zwizkw, ktre nie powstaj po dziaaniu aa DNA alkaliami, poniewa DNA nie ma grup 2'-hydroksylowych. Labilno RNA w stosunku do rodowiska zasadowego jest uyteczna zarwno dla diagnostyki, jak i dla analizy. Informacja w pojedynczym pamie RNA jest zawarta w sekwencji nukleotydw puiynowych i pirymidynowych (struktura pierwszorzdo-wa") w obrbie tego polimeru. Sekwencja a jest komplementarna do matrycowego pasma genu, z ktrego bya przepisana. Ze wzgldu na t komplementamo, czsteczka RNA moe si swoicie wiza wedug reguy parowania zasad do jej matrycowego pasma DNA; nie bdzie si ona wizaa (hybrydyzowaa") z drugim (kodujcym) pasmem tego genu. Sekwencja czste-
450 / ROZDZIA 37
NH2
Ryc. 37-6. Segment czsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA), w ktrej zasady purynowe i pirymidyno we adenina (A), uracyl (U), cytozyna (C) i guanina (G) s utrzymywane razem przez wizania fosfod i estrowe midzy resztami rybozylowymi zwizanymi z zasadami wizaniami N -glikozydowy-mi. Zwr uwag, e polimer wykazuje polarno oznaczon przez reszty fosforanowe zwizane w po zycji 3' i 5'.
czijiJNA (z wyjtkiem U, ktre zastpuje T) jest taka sama, jak kodujcego pasma genu (ryc. 37-8). Prawie wszystkie rodzaje z licznych rodzajw RNA s zwizane z niektrymi aspektami syntezy biaek Czsteczki cytoplazmatycznego RNA, ktre su jako matryce do syntezy bia ek (tj. te, ktre przenosz informacje z DNA do orodkw syntetyzujcych biako) s nazwane informacyjnym RNA lub mRNA (ang. messenger
nego RNA (mRNAj na swoist sekwencj spo! i mery zo wanych aminokwasw. Znaczna cz RNA syntetyzowanego na matrycy DNA w komrkach eukariotycznych, w tym rwnie w komrkach ssakw, jest
degradowana w obrbie jdra i nigdy nie suy
RNA). Liczne inne czsteczki cytoplazmatycz-
nego RNA (rybosomalny RNA, czyli rRNA)
odgrywaj rol strukturaln przez co bior udzia w tworzeniu rybosomw (system orga-nelli do syntezy biaek) alboFsu jako czsteczki cznika (tRNA) do translacji informacyj-
jako jednostka strukturalna lub informacyjna w cytoplazmie komrkowej. W komrkach ludzkich istniej drobnoczs-teczkowe jdrowe RNA (smali nuclear RNA, sriRNA), ktre nie s bezporednio wczone w proces syntezy biaek, ale odgrywaj rol w przeksztacaniu (processing) RNA i budowie komrkowej. Te stosunkowo mae czsteczki zawieraj 90300 nukleotyd w (tab. 37-3). Materiaem genetycznym niektrych wiru sw zwierzcych i rolinnych jest RNA, a nie DNA. Cho niektre wirusy RNA nigdy nie
STRUKTURA I FUNKCJA KWASW NUKLEINOWYCH /,
Ptla
C G C G Szypua G C AU AU A U U G U G C C G-C U A U A U C U A C G G-C
Ryc. 37-7. Schematyczny obraz dru go rzdowej struktury czsteczki jednopasmowego R MA, w ktrej wytworzya si szypua i ptla {struktura spinki do wtosw) wskutek wewntrzczsteczkowego parowania zasad.
maj przepisanej swojej informacji na czsteczki DNA, liczne zwierzce wirusy RNA zwaszcza retrowirusy (np. wirus HIV, czyli AIDS) - s przepisane przez RNA-zalen polimraz DNA, tj. tzw. odwrotn transkryp-tzc na DNA, w wyniku tego powstaje dwupasmowa, kopia DNA genomu RNA. W licznych przypadkach powstajcy dwupasmowy przepisany DNA jest wczony (integrowany) w genom gospodarza i nastpnie suy jako matryca do ekspresji genw, z ktrej take mog by przepisane wirusowe genomy RNA.
RNA jest zorganizowany w kilka unikatowych struktur We wszystkich organizmach prokariotycz-nych i eukariotycznych istniej 3 gwne klasy RNA: informacyjny RNA (mRNA), transferowy RNA (tRN A) i rybosomalny RNA (rRNA). Kada z tych klas rni si od innych wielkoci, funkcj i ogln stabilnoci. Informacyjny RNA (mRNA). Ta klasa RNA jest najbardziej heterogenna odnonie do wielkoci i stabilnoci. Wszystkie czsteczki tej klasy funkcjonuj jako przenoniki informacji z genu do orodkw syntetyzujcych biako, gdzie kada z nich suy jako matryca, na ktrej poiimeryzuj"armokwasy w swoistej sekwencji, aby utworzy swoist czsteczk biakow jako kocowy produkt genu (ryc. 37 -9). Informacyjny RNA, zwaszcza u eukarion-tw, ma niektre charakterystyczne cechy chemiczne. Koniec 5' czsteczki mRNA jest opatrzony czapeczk" (kapturkiem", an g. cap) z.kjonz tritosforanu 7-metyloguanozyny, ktry jest przyczony do przylegego 2'-O-metylo-rybomikleozydu do jego grupy 5'-hydroksylo-wej przez 3 reszty fosforanowe (ryc. 37-10). Czsteczki mRNA zawieraj czsto wewntrzne -metyloadenylany i inne nietylowane nukleo-tydy 2'-O-rybozy.,,Czapeczka" prawdopodob ywarol w rorpo/nanin mRNA przez nie dpry a tAk&pomagaw-stabilizacji mRNA poprzez 5êgzonukleaz. Maszyneria" syntetyzujca biako rozpoczyna translacje mRNA na biako od koca 5 r , czyli koca z czapeczk", metylo-wanych nukleotydw. Drugi koniec wikszoci mRNA, koniec 3 -hydroksylowy, ma doczony polimer zbudowany z 200250 nukleotydw adenylowych. Swoista funkcja tego ogona" poli(A) na 3'-hydroksylowym kocu czsteczek mRNA nie jest w peni poznana, ale wydaje si, e y niw swoistyrfi mRNA-Chronic ppjpd g^kiem
Pa s ma D N A: Ko d u j c e 5 ' -T G G A A T T G T G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A C A G G A A A C A G C T A T G A C C A T G - 3 ' M a t r y c o w e -- 3 - A C C T T A A C A C T C G C C T A T T G T T A A A G T G T G T C C T T T G T C G A T A C T G G T A C - 5 ' Tr an s kr y pt RNA 5

1
pAU U GUG A6CGGA U A A C A A U U U C A C A C A G G A A A C A a C U A U G A C C A U B
3'
Ryc. 37-8. Wspzalenoci midzy sekwencjami transkryptu RNA i jego genu, w ktrym pokazano kodujce i niekodujce (matrycowe) pasma oraz ich polarno. Transkrypt RNA o polarnoci 5' do 3' jest komplementarny do pasma matrycowego o poiarnoci 3' do 5'. Zwr uwag, e sekwencja w tra nskrypcje RNA i jego poiarno jest taka sama, jak pasma kodujcego, z wyjtkiem U w transkrypcie zastpujcym T w genie. _____ ______ _____________________________
452 / ROZDZIA 37 DNA
mRNA 5'. Synteza biaek na matrycy mRNA Rybosom . 3'
Ryc. 37-9. Ekspresja informacji genetycznej DNA w formie transkryptu mRNA Ten ostatni jest nastpnie przepisany (translacja) przez rybosomy na czsteczk swoistego biaka
H,N NH,
Ryc. 37-10. Struktura czapeczki" doczonej do koca 5' wikszoci czsteczek eukariotycznego informacyjnego RNA. Trifosforan 7-metyloguanozyny jest zwizany z kocem 5' mRNA, ktry zwykle zawiera nukleotyd purynowyzmetyiowany w pozycji 2 rybozy (nukleotyd 2-0-metylo puryny).
O'
STRUKT URA I FUNKCJA KWA SW NUK LE iNOWYCH / 453
Niektre czsteczki mRNA, wczajc^? to niektre mRNA histonw, nie maj poli(A). Ogon poli(A) moe tworzy wizania na zasadzie parowania zasad z polimerami oligodeoksytymidyny, zwizanej ze staym podoem, np. celuloz, i dziki temu moe by uyty do oddzielenia czsteczek mRNA od innych rodzajw RNA. Czsteczki mRNA cytoplazmy komrek ssa-kwrwczajc komrki ludzkie, nie s produktami bezporednio syntetyzowanymi na matrycy DNA, ale.sa_ tworzone przez przeksztai-cenkuz.prekursorowej czsteczki przed wejciem do cytoplazmy. W jdrach ssakw bezporednie produkty transkrypcji genw stanowi wigc 4. klas czsteczek RNA. Te jdrowe czsteczki RNA s bardzo heterogenne co do wielkoci i s cakiem due. Czsteczki jd-rowegojiteragennegp fiNAihnRNA) maj mas czsteczkow powyej 107, podczas gdy masa czsteczkowa (MW) czsteczek mRNA jest na ogl mniejsza ni 2 x 106. Jak to przedstawiono w rozdz. 39, czsteczki hnRNA podiegaja_gb-rbce do czsteczek mRNA. kflre nastpnie wnikaj do cytoplazmy i su jako matryce do syntezy biaek. RNA transferowy (tRNA). Czsteczki tRNAskladajsizok. 75nukleotydw.S.a_aa j (p. rozdz. 39). Czsteczki p kd li i l b tRNA slu_JJ^ft.iaeaM-kt-do translacji in.lbr-iriacjL, zawartej w sekw-encji^ nukleotydow inRNA na swoiste aminokwasy. W kadej komrce istnieje przynajmniej 20 rodzajw czsteczek tRNA i przynajmniej 1 (a czsto kilka) odpowiada kademu z 20 aminokwasw po trzebnych do syntezy biaka. Chocia kada swoista czsteczka tRNA rni si od innych sekwencj nukleotydow, to czsteczki tRNA jako klasa maj wiele wsplnych cech. Struktura pjerwszorzdowa, tj. sekwencja nukleotydow, wszystkich czsteczek tRNA pozwala na sfadowanie ich, a wewntrzczs teczko wa kompletne ntarno zasad pozwala wytworzy dru-gorzdow struktur, ktra jest podobna do .licia koniczyny (ryc. 37-11). Wszystkie czsteczki tRNA zawieraj 4 gwne ramiona. Kumie akceptorowe skada sie z szy-puty utworzonej ze sparowanych zasad, ktra koczy si sekwencj CCA (5'-3'). Aminokwasy wi si swoimi grupami karboksylowymi przez wizanie estrowe do grupy 3'-hydroksylo-wej reszty adenozylowej. Inne ramiona maj szypuy ze sparowanych zasad i ptle zasad nie
Rami - "* receptorowe
5'P
Region wiza wodorowych pomidzy param! zasad
i dodatkowe
U \T__?/i Alkilowa na puryna J M , Rami antykodonowe Ryc. 37-11. Typowy acylo- tRNA, w ktrym ami nokwas (aa) jest zwizany 3' - kocow sekwencj CCA, Oznaczo no antykodo n oraz ramio na T f C i dihydro uracylo we (DHU), jak rwnie pozycj wewntrecziisteczkowych wiza wodorowych mi dzy parami zasad. (Wg James D. Watson, Molecular Biology of tha Gene, 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965, by W. A. Benjamtn, Inc, Menlo Park, Calif.)
sparowanych (ryc. 37-7). Rami antykodonowe przy kocu szypuly o sparowanych zasadach rozpoznaje tryplet nukleotydow, czyli kodon (omwiono w rozdz. 40) matrycy mRNA. Ma ono sekwencj nukleotydow komplementarnych do kodonu i jest odpowiedzialne za swoisto tRNA. Rami D zostao tak nazwane dziki obecnoci zasady dihydrourydyny, a rami T f C ze wzgldu na obecno sekwencji T, pseudonrydyny i C. podatkowe ramie jest najbardziej zmienn cecn tRNA i stanowi podstaw do klasyfikacji czsteczek tRNA. Klasa ljtKA (_ok. 75% wszystkich tRA) ma dodatkowe rami dugoci 3 5 pz. Klasa 2 tRNA ma dodatkowe rami dugoci 1321 pz i czsto struktur typu szypua -ptla. Drugorzdow struktur czsteczek tRNA utrzymuj sparowane zasady w tych ramio -
454 / ROZDZIA 37 T abela 37-2. Czci skado we rybosomw ssakw Komponent Masa czsteczkowa Biako Liczba Masa Wielko RNA Masa czsteczkowa 7x10 35000 45000 fl 1,6*10
!
Liczba zasad
40 S pod jednostka 60 S podjednostka
1,4* 10 s 2,8 x 10
35 50
7 x1 05 1x-| 0 6
18 S 5 S 5,8 S 28 S
1900 120 160
4700
Podjednostki rybosomalne s okrelone stosownie do ich szybkoci sedymentacji w jednostkach Svedberga (40 S lub 60 S). W tabeli przedstawiono cakowit mas czsteczkow kadej z nich. Pokazano rwnie: liczb unikatowych biaek i ich cakowit mas czsteczkow, skadowe RNA kadej podjednos tki, ich wielko (w jednostkach Svedberga), mas czs teczkow i liczb zasad.
nach, stanowic sta cech tRNA. Rami akceptorowe ma 7 pz, ramiona T f C i antykodo-nowe 5 pz, a rami D3 (lub 4) pz. Chocia tRNA s trwale u prokariontw, u eukariontw s one nieco mniej trwae. Od wrotnie jest z mRNA, ktry jest nietrway u prokariontw, ale na og trway w organiz mach eukariotycznych.
rybosomalnego RNA, w duym stopniu zmety-lowane, s na terenie jderka upakowane wraz ze swoistymi biakami rybosomalnymi. W cyto-plazmie rybosomy s do trwale i zdolne do wejcia w wiele cykli transiacyjnych. Funkcje RNA w rybosomie nie s w peni poznane, lecz s one niezbdne do uformowania struktury rybosomu i zdaj si mie kluczow rol w wizaniu mRNA do rybosomw i w jego translacji. M a o c z s t e c z k o we t r wa e R N A . W komrkach eukariotycznych znajduj si w duej iloci dyskretne, ewolucyjnie zachowywane, maoczstczkowe, trwae rodzaje RNA. Wikszo tych czsteczek egzystuje w postaci rybonukleoprotein i s one rozmieszczone w jdrze, w cytoplazmie albo w obu tych czciach komrki. Maj one od 90300 nukleotydw
Tabela 37-3. Niektre rodzaje mat o czsteczko wych, trwaych RNA wystpujcych w komrkach ssakw Dugo Nazwa (nukleotydw) U1 U2 U3 U4 U5 U6 4,5 S 7S 7-2 7-3 165 188 216 139 118 106 91-95 280 290 300 Liczba czstecze k w komrce U10 6 5*10= 3* 105 1 * 10s 2* 10B 3* 10 ! 3*10* 5*10= 1*10E 2*10 s Umiejscowienie N u kleopi azma/ hn R N A Nukleoplazma Jdro Nukleoplazma Nukleoplazma Ziarnistoci perictiromatynowe Jdro i cytoplazma Jdro i cytoplazma Jdro i cytoplazma Jdro
^ j ^ ^ j g
Rybosomalny RNA (rRNA). Rybosom

jest iiukleoproteinowa sH^^lurfl flylppla7matyczn, iijra funkcjonuje jako maszyneria" do syntezy biaek na matrycach mRNA. Na rybo-somacb czsteczki mRNA i tRNA wspdziaaj w procesie translacji na swoiste czsteczki biaek informacji przepisanej uprzednio z genu. Skadowe komponenty rybosomu ssakw, ktry ma mas czsteczkow ok. 4,2 x \06 i szybko sedymentacyjn 80 S (jednostek Svedber-ga) przedstawiono w tab. 37-2. Rybosom ssa kw zawiera 2 gwne podjednostki nukleo-proteinowe, wiksz o masie czsteczkowej 2,8 x 10s (60S) i podjednostk mniejsz o masie czsteczkowej 1.4 x 106 (40S). Podjednostka 60S zawiera 5S rybosomalny RNA {rRNA), 5,8S rRNA i 28S rRNA; znajduje si tam take ponad 50 swoistych polipeptydw. Mniejsza podjednostka, czyli podjednostka 40S, zawiera pojedyncz czsteczk 18S rRNA oraz ok. 30 acuchw poiipeptydowych. Wszystkie czsteczki rybosomalnego RNA, z wyjtkiem 5S rRNA, pochodz z przeksztacenia na terenie jdra pojedynczej prekursorowej czsteczki 45S RNA (p. rozdz. 40). Czsteczka 5S rRNA ma take swoj wasn czsteczk prekursorow, ktra jest niezalenie przepisywana. Czsteczki
STRUKTURA I FUNKCJA KWASW N U KLE IM OWYCH / 455
i wystpuj w komrce w liczbie 100000- -1000000 kopii. Mae jdrowe czsto nazywane ,,sniirps" mog mie znaczenie w regulacji genw. Czsteczka U7 wydaje si odgrywa rol w wytworzeniu prawidowego koca 3' w histonowym mRNA. Czsteczki U4 i U6 mog by potrzebne przy obrbce poli(A), a czsteczka Ul jest wczona w wycinanie intronu i obrbk mRNA (p. rozdz. 39). W tabeli 37-3 przedstawiono niektre cechy maoczsteczkowych trwaych RNA.
czsteczki rybonukleoprotein,
PIMIENNICTWO lluni T: DNA Makes RNA Miiko Protein. Esewier, 1983. Rich A et al: The chemistry and biology of left-handed Z-DNA. Anrtu Rev Biochem 1984;53:847. Turner Pr Con trolli ng roi es for snurps. Natur !985;31:105. Wa(son JD: The Doubk Helix. Atheneum, 1986. Watson JD, Crick FHC: Molecular structure of nucleic acids. Natur 1953;171:737. Zieve GW: Two groups of smali stable RNAs. Celi
1981;25:296.
38
Organizacja i replikacja DNA

Dary/ K. Granner, MD
WPROWADZENIE
W organizmach prokariotycznyh DNA jest na og nie zwizany z biakami innymi ni te, ktre s zwizane z replikacja i transkrypcj DNA, W organizmach eukariotycznych dua cz DNA jest pokryta rnymi biakami. Biaka te i DNA tworz chromatyn, zoon struktur, ktra umoliwia liczne konfiguracje czsteczki DNA i takie rodzaje kontroli, ktre s unikatowe dla organizmu eukariotycznego. Informacja genetyczna DNA chromosomu moe by przekazywana przez wiern replikacj (DNA), lub te moe podlega wymianie w licznych procesach, takich jak crossing over", rekombinacja i konwersja. Procesy te zabezpieczaj zdolno do adaptacji i warunkuj rnorodno organizmu, aie mog take prowadzi do powstania procesu chorobowego. Rephkacja DNA, proces bardzo zoony i uporzdkowany, postpuje zgodnie z pokr-noci 5' do 3' typow dla syntezy RNA opisanej w innych rozdziaach. W komrkach eukariotycznych replikacja DNA w chromosomach zaczyna si w licznych miejscach i postpuje jednoczenie w obu kierunkach. Do syntezy i naprawy DNA, procesw postpujcych wedug reguy parowania zasad Watsona i Cricka, potrzebne s liczne enzymy.
prawidowy produkt genu^ Mutacja w obrbie komrki rozrodczej bdzie przeniesiona na potomstwo (jest to tzw. pionowe przeniesienie choroby dziedzicznej). Liczne czynniki, obejmujce wirusy, zwizki chemiczne, promieniowanie nadfioletowe i promieniowanie jonizujce zwikszaj tempo mutacji. Mutacje dotycz komrek somatycznych i s. przenoszone na nastpne generacje komrek w obrbie organizmu. Jest oczywiste, e wiele chorb i prawdopodobnie wikszo nowotworw zoliwych powstaje wskutek horyzontalnej transmisji mutacji.
CHROMATYNA JEST MATERIAEM CHROMOSOMALNYM Z JDER KOMREK ORGANIZMW EUKARIOTYCZNYCH

* _ak)a.da. si z bardzo dugich dwupasmow-ych czsteczek DNA i prawie rwnej masy maych biaek zasadowych, zwanych htstonunik jak rwnie z mniejszej iloci niehistonowych (wikszo z nich s to biaka kwane i wiksze ni histony) uiiaiejiklsiRNA. Badania chromatyny przy zastosowaniu mikro-
Mgtacje s wynikiem zmian w sekwencji zasad DNA. Mutacje mog nastpi w wyniku nieprawidowej replikacji, przefitie|SZd ab iiaprawy DNA i zachodz z czstoci ok. 1 na kadych 106 podziaw komrkowych. W wyniku mutacji, ktre zachodz w kodujcych lub regulatorowych regionach DNA, powstaje nie-
* Tak daleko, jak to jest moliwe, dyskusja w tym rozdziale oraz w rozdz. 39, 40 i 41 bdzie si odnosia do ssakw, ktre nale oczywicie do wyszych organizmw eukariotycznych. W pewnych przypad kach bdzie konieczne odnosi si do spostrzee poczynionych na organizmach prokariotycznych, takich jak bakterie i wirusy. W tych przypadkach bd to take informacje, ktre mog by ekstrapolowane na ssaki. Podzia materiau przedstawionege w rozdz, 3741 jest cokolwiek arbitralny, a opisane procesy nie powinny by odbierane jako procesy niezinte-growane i wzajemnie niezalene.
ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 457
skopu elektronowego wykazafy zbite, kuliste czsteczki, zwane nukleosomami, ktre maj ok. 10 nm rednicy i s powizane pasmami DNA (ryc. 38-1). ----.""
ca N ma wikszo aminokwasw zasadowych. Wymienione 4 histony rdzenia nuklcosoniu podlegaj 5 rodzajom modyfikacji w reakcjach kowalencyjnych: acety lacji, metylacji, fos fory lacji, ADP-ryboylaji i zwizaniu .kowalencyjnemu (wycznie histonu H2A) z jdrowym biakiem ubikwityn. Te modyfikacje histonw zapewne odgrywaj pewn mao jeszcze poznan rol w strukturze ehromatyny i w jej czynnoci. Histony usunite z ehromatyny oddziaywaj wzajemnie w bardzo swoisty sposb.Jrj3JJ34, agreguj, tworzc tetramer zawierajcy po 2 cz-5iecAi kadego z nich (H3/H4)2, podczas gdy H2A i H2B tworz, dimery (H2A-H2B) i wysze kompleksy oligomerw (H2A-H2B)n. W maym steniu soli tetramer H3-H4 nie asocjuje z di-merem lub oligomerem H2A-H2B, a Hl nie czy si wprost z innymi histonami w roz tworze. NukJeosom jest struktur zawierajc h i stan i DNA Gdy tetramer H3-H4 i dimer H2A-H2B s zmieszane z czystym dwupasmowym DNA, wwczas obserwuje si ten sam wzr dyfrakcji promieni X, jak w wieo izolowanej chromaty-nie. Badania w mikroskopie elektronowym potwierdzaj obecno zrekonstruowanych nuk-leosomw. Rekonstrukcja nukleosomw z DNA i histonw H2A, H2B, H3 i H4 nie zaley od tego, czy rne te komponenty pochodz z tych samych komrek. Do rekonstrukcji rdzenia nukleosomu nie s potrzebne ani histonHl, ani biaka niehistonowe. W nukleosomie DNA jest dodatkowo nawinity, jako lewoskrtny heliks, na powierzchni podobnego do dysku oktameru histonw, skadajcego si z tetrameru H3-H4 (H3/H4)2 zajmujcego cz centraln nukleosomu i 2 dime-rw H2A-H2B (ryc. 38-2). Histony rdzenia nukleosomu oddziaywaj z DNA na wewntrznej powierzchni superzwoju. Sam tetramer (H3/H4)2 narzuca DNA waciwoci podobne do tych, jakie ma cay nuk-leosom; tetramer odgrywa przeto gwn rol w tworzeniu nukleosomu. Dodanie 2 dimerw H2A-H2B stabilizuj e pierwotn czsteczk i wie silnie 2 dodatkowe pskoki spirali DNA, uprzednio jedynie luno zwizane do tetrameru (H3/H4)3.1,75 saperhelikalnego zwoju DNA owija si wic wok powierzchni oktameru histonu, chronic 146 par zasad DNA i tworzc rdze aukleosotnti (ryc. 38-2). Gdy DNA owija si wok powierzchni oktameru
Ryc. 38-1. Zdjcie z mikroskopu elektronowego nukleosomw przywizanych do nici kwasu nuk-(einowego (DNA), (Biay odcinek odpowiada 2,5 nm.) (Reprodukowane za zgod z: Oudet P, Gross-Beliard M., Chambon P.: Electron micros-copic and biochemical evidence that chromaiin structure is a repeating unit Celt 1975; 4:281)
Histony s najbardziej obfitymi biakami chromatyny Jlistony-^s nieco heterogenne, skadaj si z wielu blisko spokrewnionych biaek. Wrd histonw najsabiej zwizane z chromayrt s histony HI i dlatego s atwo usuwane roz tworem soli, w wyniku czego chromatyna staje si rozpuszczalna. Wyizolowany rdze nukleo-.somw zawiera 4 klasy histonw: H2A, H2B, H3 i H4. Struktura sabo lizy no-bogatych histonw H2A i H2B jest w znacznym stopniu zachowywana (konserwowana) midzy gatunkami, podczas gdy struktura arginino--bogatych histonw H3 i H4 jest cile zachowywana midzy gatunkami. Takie silne zachowywanie nasuwa wniosek, e czynno histonw jest identyczna we wszystkich komrkach eukanotycznych i e caa czsteczka (histonu) jest wczona swoicie w penienie takiej funkcji. 2/3 koca C czsteczek histonw ma zwyky skad aminokwasw, natomiast1 /3 ko-
458 / ROZDZIA 38
-H1 O klamer 148 par zasad historio wy chronionych (1,75 zwoju superbelikalnego} + H1 166 par zasad (2 skrty superhetikalne) chronione raz eksponowany (nie-chroniony) DNA cznikowy
Ryc. 38-2. Model struktury nukleosomu {nalewo) i czci rdzennej nukleosomu (na prawo), w ktrych DNA jest owinite wok powierzchni pas kiego cylindra biakowego skadajcego si z 2 czsteczek kadego z histonw H2A, H2B, H3 i H4. Histon H1 (obszar zaciemniony) powoduje zwikszenie liczby chronionych par zasad. (Reprodukowano za zgod z: Laskey R. A., Earnshaw W. C: Nucleosome assembly. Nawre 1980, 286:763).
kowego rozmieszczenia nukleosomw, zwanego fazowaniem, nie jest znana. Prawdopodobnie jest to zwizane ze wzgldn fizyczn gitkoci pewnych sekwencji nukleotydowych, ktre s zdolne do przyjcia formy zaamanej (kinking) w obrbie superspirali. Dalsze upakowanie nukleosomw w jdrach jest zalene od interakcji histonw Hl z dwupasmow czsteczk DNA wic nukieosomy. Topologia oddziaywania dwupasmowego DNA z histonami Hl, z wytwarzaniem regionw przerywnikw midzy nukleosomami, nie jest bliej poznana.
STRUKTURY WYSZEGO RZDU DECYDUJ O UPAKOWANIU CHROMATYNY

Chromatyn badana za pomoc mikroskopu elektronowego wykazuje, oprcz struktury sa mych nukleosomw, 2 struktury wyszego rzdu: ni chromatynow 10 nm i 25- 30 nm. Struktura podobna do dysku nukleosomu ma rednic 10 nm i wysoko 5 nm. Ni 10 nm skada si z nukleosomw uoonych w taki sposb, e ich brzegi si spotykaj, a ich paskie powierzchnie le rwnolegle do osi nici (ryc. 38-3). Ni 10 nm jest prawdopodobnie dodatkowo skrcona, tworzc 30 nm ni chromatynow o 67 nukleosomach na 1 skok (ryc. 38-3). Kady zwj superspirali jest wzgldnie paski, a powierzchnie nukleosomw nastpujcych po
O wkna Wkno 30 nm
histonu, tworzc nukleohiston, kolejno kontaktu czsteczki DNA z hist onami zachodzi w nastpujcym porzdku:
H2AH2BH4H3H3H4H2BH2A
Histon Hl wie si. z DNA wwczas, gdy czsteczka DNA wchodzi i wychodzi z rdzenia nukleosomu w taki sposb, e czy 2 zwoje superspirali DNA dugoci 166 par zasad, tworzc nukleosom (ryc. 38-2). Formowanie nukleosomw jest prawdopo dobnie wspomagane przez kwane biako jdrowe nukleoplazminc. Mocne zasadowe histony mog wiza silnie kwany DNA przez tworzenie mostkw typu soli. Oczywicie takie nieswoiste oddziaywania histonw z DNA byyby destrukcyjne dla tworzenia nukleosomw i funkcji chromatyny. Niikleoplazmina jest penta-merem kwanego biaka, ktre nie wie si ani z DNA, ani z chromatyn, ale moe oddziaywa odwracalnie z oktamerem histonowym w taki sposb, e histony nie mog przylega nieswoicie do ujemnie naadowanych powierzchni, takich jak DNA. Wydaje si zatem, e nukjeopiazmina utrzymuje w iadrze rodowisko jonowe, prowadzaê_(io-siw)isiego_oddziaywa-riv& histonw i DNA oraz tworzenia nukleosomw. Gdy zostaje .utworzona. struktura~~uk-leosomu, nukleoplazmina zostaje uwolniona z histow. Nukieosomy wykazuj preferencj do pewnych regionw na szczeglnych czsteczkach DNA, ale podstawa takiego nieprzypad-
Ryc. 38-3.
W kro 10 nm
Proponowana struktura 30 nm wkna chromatyny, skadajcego si z 10 nm' wkna nukleosomatnego dodatkowo skrconego. O 30 nm wkna jest prostopada do paszczyzny papieru.
ORGANIZACJA I REFLIKACJA DNA / 459
sobie skrtw s prawie rwnolegle jedna wzgldem drugiej. Histony Hl wydaj si stabilizowa ni 30 nm, ale ich pozycja i pozycja przerywnika DNA o rnej dugoci nie zostay jeszcze zdefiniowane. Jest moliwe, e nukleoso-my mog tworzy rne upakowane struktury. Aby wytworzy chromosom mitotyczny 30 nm ni musi ulec dalszemu, ok. 100-krotnemu, upakowaniu swojej dugoci (p. niej). W chromosomach interfazowycti nici chroma-tyny s zorganizowane w ptle lub jlomeny ,p dugoci 30000 100 000 par zasad zakot wiczone w jdrze w strukturze szkieletowej (lub macierzy podporowej). W obrbie tych domen niektre sekwencje DNA mog by umiejscowione w sposb nieprzypadkowy. Sugeruje si, e kada wyptlona domena chromatyny odpowiada oddzielnej funkcji genetycznej zawierajc zarwno kodujce, jak i niekodujce regiony genu. NIEKTRE REGIONY CHROMATYNY S AKTYWNE"; INNE REGIONY S NIEAKT YWNE" Oglnie kada komrka indywidualnego organizmu wielokomrkowego zawiera t sam informacj genetyczn w postaci takich samych sekwencji DNA. Zatem rnice midzy rnymi rodzajami komrek w obrbie jednego organizmu mog by wytumaczone zrnicowan ekspresj wsplnej informacji genetycznej. Chromatyna zawierajca geny aktywne (tj. chromatyna aktywna transkrypcyjnie) rni si pod wieloma wzgldami od regionw nieaktywnych. Struktura nukleosomalna aktywnej chromatyny jest zmieniona lub w bardzo aktywnych regionach jest jej brak. DNA w aktywnej chro-maty_nie zawiera obszerne regiony (dugoci ok. TOOOOO par zasad), ktre s wraliwe na trawienie iiuklca/. tak jak DNaza I. Wraliwo regionw chromatyny na DNaz I, ktre s aktywnie transkrybowane, odzwierciedla raczej tylko potencja dla transkrypcji ni sam transkrypcj, a w wielu systemach jest skorelowana ze wzgldnym brakiem 5'-metylodeoksycytydy-ny w DNA. W obrbie duych regionw aktywnej chromatyny" istniej krtkie odcinki o 100300 nukleotydach, ktre wykazuj nawet wiksz {20-krotn) wraliwo na DNaz I. Te miejsca nadwraliwe prawdopodobnie wynikaj z konformacji strukturalnej, ktra sprzyja dostpno-
Jdnukkazy-DN A, Regiony te s zwykle umiejscowione bezporednio przed aktywnym genem i w regionach tych struktura nukleosomalna jest przerwana w wyniku zwizania biaek niehis-tonowych (p. rozdz. 39 i 41). Wydaje si, e w wielu przypadkach, gdy gen jest zdolny do transkrypcji, musi on mie nadwraliwe miejsce w chromatynie w regionie bezporednio poprzedzajcym gen. Biaka biorce udzia w transkrypcji oraz biaka zaangaowane w utrzymaniu dostpu do matrycowego pasma DNA bior udzia w powstawaniu miejsc nadwra-liwych. Miejsca nadwraliwe czsto dostarczaj pierwszej wskazwki odnonie do obecnoci i umiejscowienia elementu kontrolujcego transkrypcj. Chromatyna nieaktywna transkrypcyjnie jest w interiazle gsto upakowana, co mona stwierdzi przy uyciu mikroskopu elektronowego. Nazywa siej heterochromatyn. Chromatyna aktywna" transkrypcyjnie wybarwia si jako substancja mniej gsta i okrela si j jako euchromatyne. Euchromatyna replikuje si zwykle wczeniej w cyklu komrkowym ssakw ni heterochromatyn (p. niej). S 2 typy hetero-chromatyny: konstytutywna i fakultatywna, Heterochromatyn konstytutywna jest zawsze upakowana, a "wic jest nieaktywna. Hetero-chromatyne konstytutywn znajduje si w regionach w pobliu centromeru i w kocach chromosomw (w telomerach). He ter ochrom a-tyoa fakultatywna jest niekiedy skondensowana, ale kiedy indziej jest aktywnie przepisywana, a. wic nieskondensowana i majca wygld euchromatyny. Spord 2 eskich chromosomw X u ssakw 1 chromosom jest prawie cakowicie nieaktywny transkrypcyjnie i jest chromosomem heterochromatycznym. Jednake heterochromatyczny chromosom X ulega dekondensacji w okresie gametogenezy j staje si aktywnym transkrypcyjnie we wczesnej emb-riogenezie; tak wic jest to chromosom o fakultatywnej heterochromatynie. Niektre komrki insektw, np. Chironomus, zawieraj chromosomy olbrzymie, ktre ulegy replikacji w 10 cyklach, ale siostrzane chroma-tydy nie oddzieliy si. Kopie DNA le jedna obok drugiej w precyzyjnym ukadzie i w rezultacie tworz chromosom prkowany, zawierajcy regiony chromatyny skondensowanej i jasne prki chromatyny bardziej rozproszonej. Transkrypcyjnie aktywne regiony tych chromosomw politenicznych o silnie rozlunionej budowie tworz pufy" zawierajce enzymy
460 / ROZDZIA 38
Bp-
Ryc. 38-4. Korelacja midzy aktywnoci polime-razy RNA klasy II a syntez RNA. U larwy Chirono-mus tentans wiele genw aktywuje si pod wpywem szoku cieplnego (39X, 30 min). A: Rozmieszczenie RNA polimerazy B (zwanej take klas II) w izolowanym IV chromosomie linianki. Enzym uwidoczniono przez immunofluorescencj, stosujc przeciwciao przeciw pohmerazie. Swoiste prki w chromosomie IV oznaczono symbolami 5C i BR3; pufy pokazuje strzaka, B: Auto radiogram chromosomu IV po inkubacji z 3 H-urydyn w celu wyznakowania RNA. Zwr uwag na zgodno fiuorescencji z obecnoci radioaktywnego RNA (punkty). Odcinek skali =7 \im (Reprodukowano za zgod z: Sass H.: RNA polymerase B in potytene chromosomes. Celi 1982; 28:274. Copyright 1982 by the Massachusetts Instituteof Techno-logy).
Ryc. 38-5. Dwie siostrzane chromatydy ludzkiego chromosomu Nr12. * 27,850. (Reprodukowanoza zgod z: DuPraw E. J.: DNA and Chromosomes. Holt, Rinehart, and Winston, 1970).
odpowiedzialne za transkrypcj; s to miejsca, gdzie przebiega synteza RNA (ryc. 38-4).
DNA JEST ZORGANIZOWANY W POSTACI CHROMOSOMW

W met a fazie chromosomy ssakw wykazuj 2-osiow symetrie z identycznymi siostrzanymi chromatydami poczonymi w centromerze, ktrego wzgldne pooenie jest charakterystyczn cech danego chromosomu {ryc. 38-5). Kada siostrzana diromatyda zawiera czsteczk dwupasmowego DNA, W czasie Lnterfazy upako-
wanie czsteczki DNA jest mniej zbite ni w skondensowanym chromosomie metafazo-wym. Chromosomy metafazowe s nieaktywne transkrypcyjnie. Lud zki geno m h ap loid aln y ski ad a si z 3,5 x 10 par zasad, czyli par nukleotydw i ok. 1,7 x 107 nukleosomw. Zatem kada z 23 chromatyd w ludzkim genomie haploidalnym zawiera rednio 1,5 x 10B nukleotydw w jednej dwupasmowej czsteczce DNA. Dugo kadej czsteczki DNA musi by zredukowana ok. 8000 razy, aby si wytworzya struktura skondensowanego chromosomu interfazowego! W chromosomach, metafazowych 25 30 nm nici chro-matynowe s take sfadowane w upetlone domeny, ktrych proksymalne koce s zakotwiczone do niehistonowego biakowego rusztowania. Stopie upakowania kadego rzdu struktury DNA jest podsumowany w tab. 38-1. Upakowanie nukleoprotein w obrbie chro matyd nie jest przypadkowe, o czym wiadczy charakterystyczny wzr po wybarwieniu chro -
ORGANIZACJA I REPLIKACJA DNA / 461 Tabela 38-1. Wspczynniki upakowania kadego rodzaju struktur DNA Wspczynnik Posta w chrnmatynie upakowania 1,0 1-10
WIKSZA CZ GENOMU SSAKW NIE JEST TRAlMSKRYBOWANA Genom haploidaJny kadej komrki ludzkiej skada si z 3,5 x 10a par zasad DNA podzielonych na 23 chromosomy. Cay genom hap-loidalny skada si z DNA wystarczajcego na zakodowanie ok. 1,5 min par genw. Jednake badania nad tempem mutacji i zoonoci genomw organizmw wyszych wybitnie sugeruj, e u ludzi wystpuje tylko ok. 100000 rodzajw podstawowych biaek. To nasuwa wniosek, e wikszo DNA nie jest DNA kodujcym, czyli zawarta w nim informacja nie jest nigdy tumaczona na sekwencje aminokwasw czsteczki biakowej. Z pewnoci pewien nadmiar sekwencji DNA suy do regulacji ekspresji genw w czasie rozwoju, rnicowania i adaptacji do rodowiska. Pewien nadmiar tworz sekwencje wtrcone, ktre rozdzielaj kodujce regiony genu, ale wikszo nadmiaru sekwencji skada si z wielu rodzin sekwencji powtarzajcych, ktrym nie przypisuje si jeszcze jasno okrelonych funkcji. DNA eukariotycznego genomu moe by
Nagi" dwupasmowy heliks DNA 10 nm ni nukleosomalna
25 30 nm ni chromatynowa zawierajca superhelikalne nukleosomy Skondensowane ptle chromosomw rnetafazowych
40-60 8000
mosomw swoistymi barwnikami, takimi jak kwinakryna lub barwnik Giemsy (ryc. 38-6). Wzr wybarwiania (prkowania) caego zestawu chromosomw od osobnika do osobnika w obrbie jednego gatunku jest wysoce powtarzalny; niemniej rni si on znacznie od innych, nawet blisko spokrewnionych, gatunkw. Upakowanie nukleoprotein w chromosomach wyszych organizmw eukariotycz-nych musi by w jaki sposb zalene od gatunkowo swoistych cech czsteczek DNA.
i
10 11
\7
14
16
19
20
21
t* >
17
4%
22 Ryc. 38-6. Ludzki kariotyp (czowieka z normalnym zestawem 46 XY), w ktrym chromosomy wybawiono barwnikiem wg metody Giemsy i uoono stosownie do Konwencji Paryskiej (Dziki uprzejmoci H. awce i F. Conte),
462 / ROZDZIA 38
podzielony na rne klasy sekwencji". S4 to: sekwencje unikatowe, czyli niepowtarzajce DNA i sekwencje DNA powtarzajce, W geno-mie haploidalnym unikatowe sekwencje DNA zawieraj zwykle pojedyncze kopie genw kodujcych biaka. Sekwencje powtarzajce DNA w genomic haploidalnym zawieraj sekwencje, ktre zmieniaj si odnonie do liczby kopii od 2 a do 107 kopii na 1 komrk. Ponad poow DNA w organizmach eukariotycznych stanowi sekwencje unikatowe, czyli niepowtarzjce Dane szacunkowe (jak rwnie rozmieszczenie powtarzajcych DNA) s oparte na licznych technikach hybrydyzacji DNA-RNA. Podobne techniki s stosowane do okrelenia liczby aktywnych genw w populacji unikatowych sekwencji DNA. W drodach, niszym organizmie eukariotycznym. wystpuje ekspresja ok. 4 000 genw. W typowych tkankach wyszych organizmw eukariotycznych (np. wtroba i nerka ssakw), ekspresji ulega 10 000-15 000 genw. Regiony kodujce s czsto przerywane sekwencjami wtrconymi Kodujce regiony DNA, z ktrych transkryp-ty ostatecznie pojawiaj si w cytoplazmie jako pojedyncze czsteczki mRNA, s zwykle poprzerywane w gen omie duymi sekwencjami wtrconymi niekodujcego DNA. Wskutek tego pierwotne transkrypty DNA-hnRNA zawieraj niekodujce sekwencje RNA, ktre musz by usunite w takim procesie, w ktrym take zachodzi wzajemne poczenie odpowiednich segmentw kodujcych z wytworzeniem dojrzaego mRNA. Wikszo sekwencji kodujcych pojedynczy mRNA jest poprzerywanych w genomie (a zatem i w pierwotnym transkryp-cie) przynajmniej przez 1, a w niektrych przypadkach a przez 50 niekodujcych sekwencji wtrconych (introny). W wikszoci przypadkw introny s znacznie dusze ni przylege regiony kodujce (eksony). Obrbk pierwo tnego transkryptu, ktra obejmuje zabranie in tron w i poczenie przylegych eksonw, opisano szczegowo w rozdz. 39. Funkcja sekwencji wtrconych, czyli iDtronw nie jest jasna. Mog one suy do rozdzielenia domen funkcjonalnych (eksonw) zakodowa nej informacji w takiej postaci, ktra pozwala, aby rearanacje genetyczne przez rekombinacj
przebiegay szybciej ni w przypadku, gdyby wszystkie regiony kodujce dla danej funkcji genetycznej byy w postaci cigej. Takie zwikszone tempo rearanacji genetycznej funkcjonalnych domen moe prowadzi do szybkiej ewolucji funkcji biologicznych. W ludzkim DNA przynajmniej 20 30% genomu skada si z sekwencji powtarzajcych Powtarzajce sekwencje DNA mog by oglnie sklasyfikowane jako umiarkowanie powtarzajce i czsto powtarzajce. Czsto powtarzajce sekwencje skadaj si z odcinkw o dugoci 5500 par zasad, powtrzonych wiele razy w postaci tandemu. Sekwencje te s zwykle zgrupowane w centromerach i telomerach chromosomu i wystpuj w ok. 110 min kopii w genomie haploidalnym. Sekwencje te s trans-krypcyjnie nieaktywne i mog odgrywa w chromosomie rol strukturaln. Umiarkowanie powtarzajce sekwencje, ktre wystpuj w genomie w liczbie mniejszej ni 106 kopii na genom haploidalny, nie s zgrupowa ne, lecz rozproszone wrd sekwencji unikatowych i s klasyfikowane jako krtkie lub dugie. Dugie sekwencje rozproszone maj dugo 50007000 par zasad i wystpuj w genomie haploidatnym w liczbie 1000100000 kopii. Te dugie rozproszone sekwencje s otoczone z kadego koca przez sekwencje powtrzone wprost (ang, direct repeats) o 30O600 parach zasad (ryc. 38-7), ktre bardzo przypominaj dugie kocowe sekwencje powtarzajce (ang. long terminal repeats, LTR) wystpujce na kocach zintegrowanych DNA retrowirusw, W wielu przypadkach te dugie sekwencje rozproszone
Dtugie rozproszone sekwencja powtarzajce (5 7tyslcypar zasad) abc a'b'c' abc a'b'c*
Sekwencje - powtarzajce proste (300 -60G par zasad)
Ryc. 38-7. Obraz dugich rozproszonych sekwencji powtarzajcych z kocowymi krtkimi prostymi sekwencjami powtarzajcymi (abc) i ich sekwencjami komplementarnymi (a'b'c').
s transkrybowane przez potimeraz U i zawieraj czapeczki metylacyjne" nieodrnialne od tych zawartych w mRNA. ny spokrewnionych, ale indywidualnie rnych, sekwencji o dugoci od kilku do kilkuset par nukleotydw. Krtkie sekwencje powtarzajce s aktywnie przepisywane albo jako integralne skadowe intronw, albo jako dyskretne elementy przepisywane przez DNA-zalen poli-meraz RNA III (p. rozdz. 39). Wrd krtkich rozproszonych sekwencji powtarzajcych w ge-nomie ludzkim rodzina Alu wystpuje w 500 000 kopii na genom haploidalny i stanowi przynajmniej 36% ludzkiego genomu. Skadowe ludzkiej rodziny Alu i ich spokrewnione analogi u innych zwierzt s przepisywane jako integralne komponenty hnRNA lub jako dyskretne czsteczki RNA, zawierajce dobrze poznane 4,5S RNA i 7S RNA. Jednostki nalece do tych szczeglnych rodzin s bardzo konserwatywne w obrbie gatunkw, jak rwnie w obrbie gatunkw ssakw. Struktury krt kich sekwencji powtarzajcych, wczajc w to rodzin Alu, przypominaj kocowe sekwencje powtarzajce retrowirusw i mog by elementami przemieszczajcymi si, zdolnymi do przeskakiwania" z rnych miejsc do innych w obrbie genomu (p. niej).
Krtkie sekwencje powtarzajce tworz rodzi-
MATERIA GENETYCZNY MOE PODLEGA ZMIANOM I MOE ULEGA REARANACJI

Zmiany sekwencji zasad purynowych i piry-midynowych w genie spowodowane zamian, ubytkiem lub insercj jednej lub wicej zasad mog prowadzi do zmienionego produktu genu, ktrym to produktem w wikszoci przypadkw jest biako. Taka zmiana materiau genetycznego daje mutacj, ktrej nastpstwa bd omawiane dokadnie w rozdz. 40. Rekombinacja chrom os o ma I na jest jedn z drg rearanacji materiau genetycznego Organizmy prokariotyczne i eukariotyczne wykazuj zdolno wymiany informacji genetycznej midzy podobnymi, czyli homologicznymi, chromosomami. Zdarzenie wymiany, czyli rekombinacja, zachodzi przede wszystkim w okresie mejozy w komrkach ssakw i wymaga rwnolegego ustawienia homologicznych
Ryc. 38-8. Proces rekombinacji (crossing over) midzy homologicznymi chromosomami prowadzcy do powstania rekombinantw chromosomowych.
chromosomw, co prawie zawsze zachodzi z wielk precyzj. Na rycinie 38-8 pokazano, jak przebiega proces ,,crossing-over". Wynikiem tego procesu jest rwna i wzajemna wymiana informacji genetycznej midzy homologicznymi chromosomami. Jeli homologiczne chromosomy maj rne allele ych samych genw, crossing-over moe spowodowa zauwaalne i dziedziczne rnice w sprzeniu genw. W rzadkich przypadkach, gdy uoenie homologicznych chromosomw nie jest dokadne, crossing-over lub zdarzenie rkombinacyjne powoduj nierwn wymian informacji. Jeden z chromosomw moe otrzyma mniej materiau genetycznego, a zatem moe mie delecje, podczas gdy drugi
464 / ROZDZIA 38
LEPORE
Ryc. 38-9. Proces nierwnowanej rekombinacji w regionie genomu ssakw generujcych geny strukturalne dia hemoglobiny i powstawanie nierwnowanych produktw rekombinacji 8 -6 Lepore i 0-5 Lepore. Przykady pokazuj miejsca regionw, w ktrych zasza rekombinacja, (Reprodukowane za zgod S z: Clegg J, B., Weetherall D, J.: |3 Thalassemia: Time for a reappraisal? Lancet 1974; 2:133).
partner pary chromosomw otrzymuje wicej materiau genetycznego w postaci doczenia lub podwojenia (ryc. 38-8), Nierwny crossing--over wystpuje u ludzi, na co wskazuje obecno hemoglobin typu Lepore lub anty-Lepore. Nierwny crossing-over oddziauje na tandemow organizacj powtarzajcych DNA czy to bd np. spokrewnione geny globiny, jak na ryc, 38-9, czy bardziej liczne powtarzajce sekwencje DNA. Nierwny crossing-over, powtarzajcy w wyniku polizgu", powoduje zwikszenie lub zmniejszenie liczby kopii rodziny sekwencji powtarzajcych i moe mie udzia w ekspansji i utrwalaniu wariantw w obrbie tego upo rzdkowanego obszaru. Niektre wirusy mog by wczone w chromosomy Niektre wirusy bakteryjne (bakteriofagi) s zdolne do rekombinacji z DNA bakteryjnego gospodarza w taki sposb, e informacja genetyczna bakteriofaga zostaje wbudowana linijnie do genetycznej informacji gospodarza. Ta integracja, ktra jest form rekombinacji, za chodzi w mechanizmie pokazanym schematycznie na ryc. 38-10, Struktura kolistego genomu bakteriofaga zostaje przerwana, podobnie jak czsteczka DNA gospodarza; odpowiednie koce s ponownie spojone z zachowaniem polar-noci. W celu uproszczenia, DNA bakteriofaga jest pokazany jako czsteczka wycignita (li-nijna") w postaci zintegrowanej w czsteczce bakteryjnego DNA; czsto pozostaje ona rwnie jako zamknite koo. Miejsce, w ktrym genom bakteriofaga integruje, czyli rekombinu-
je, 7. genomem bakteryjnym jest wybrane przez 2 mechanizmy. Jeli bakteriofag zawiera sekwencje DNA homologiczne do sekwencji czsteczki DNA gospodarza, to moe zaj zdarzenie rkombinacyjne analogiczne do zdarzenia, jakie zachodzi midzy homologicznymi chromosomami. Jednake niektre bakteriofagi syntetyzuj biaka, ktre wi swoiste miejsca
=t
. 38-10. Integracja koowego genomu (zawierajcego geny A, B i C) z czsteczk DNA gospodarza (zawierajc geny 1 i 2) i nastpujce uboenie genw.
ORGANIZACJA I BEPLIKACJA DNA / 465
w chromosomach bakteryjnych z niehomologi-cznymi miejscami okrelonej czsteczki DNA bakteriofaga. Integracja taka zachodzi w okrelonym miejscu i nazywa si miejscowo swoista". Liczne wirusy zwierzce, zwaszcza wirusy onkogenne, albo bezporednio, albo w przypadku wirusw RNA przez transkrypty DNA, mog by integrowane w chromosomy komrek ssakw. Integracja DNA wirusw zwierzcych do genomu zwierzcego na og nie jest miejscowo swoista". Transpozycja moe wytwarza przeksztacone geny" W komrkach eukariotycznych mae elementy DNA, ktre na pewno nie s wirusami, maj zdolno do transpozycji, czyli opuszczania i wczania si w obrb genomu gospodarza, w taki sposb, e funkcja ssiadujcych sekwencji DNA zostaje naruszona. Te ruchome (mobilne) elementy, s czasami nazywane skaczcym DNA", mog nie ze sob flankujce odcinki DNA i przeto mog gboko wpywa na procesy ewolucji. Jak wspomniano wyej, rodzina Alu rednio powtarzajcych sekwencji DNA ma charakterystyczne cechy strukturalne, podobne do odcinkw kocowych retrowirusw, ktre u tych ostatnich s4 odpowiedzialne za wczanie i opuszczanie genomu ssakw. Bezporednim dowodem na transpozycj innych maych elementw DNA w genomie czowieka byo odkrycie przeksztaconych genw" dla czstek i mm un o globuliny, czsteczek a-glo-biny i wielu innych. Te przeksztacone geny skadaj si z sekwencji DNA identycznych lub prawie identycznych do tych, jakie znajduj si w informacyjnym RNA kodujcym produkt odpowiedniego genu, W takich sekwencjach DNA, nietranskrybowany region 5', region kodujcy bez intronu i 3' sekwencja (poli)A s uoone w sposb cigy. Takie szczeglne uoenie sekwencji DNA musiao powsta przez wsteczn traskrypcj przeksztaconej czsteczki informacyjnego RNA, z ktrej zostay zabrane regiony intronowe i dodany szlak (poIi)A. Jedynym poznanym mechanizmem, ktry mg by uyty do integracji odwrotnego transkryptu do genomu jest zdarzenie typu transpozycji. Istotnie, takie przeksztacone geny" maj krtkie kocowe sekwencje powtarzajce przy kadym ze swych kocw, podobnie jak sekwencje, ktre ulegy transpozycji u niszych organizmw. Niektre z tych przeksztaconych genw
30 Biochemia
w trakcie ewolucji zostay przypadkowo zmienione tak, e obecnie maj nonsensowne kodo-ny, ktre uniemoliwiaj ekspresj tych genw (p. rozdz. 40). Geny takie okrela si nazw pseudogeny". Konwersja genu powoduje rearanacj Oprcz nierwnego ,,crossing-over" i transpozycji, trzeci mechanizm moe wpywa na gwatowne zmiany w materiale genetycznym. Podobne do siebie sekwencje na homologicznych lub niehomologicznych chromosomach mog przypadkowo wytwarza miedzy sob sparowane struktury dwupasmowe i eliminowa wszystkie sekwencje niesparowane. Proces ten moe prowadzi do przypadkowego utrwalenia w rodzinie sekwencji powtarzajcych jednego lub drugiego wariantu i przez to powodowa, e sekwencje skadowe rodzin powtarzajcego DNA staj si jednolite. Ten ostatni proces
nazywany jest konwersj genu.
W diploidalnych organizmach eukariotycznych, takich jak ludzie, komrki, ktre przeszy przez faz S, zawieraj tetraploidaln ilo DNA. Wystpuje ona w postaci siostrzanych chromatyd w kadej parze chromosomw. Kada z tych siostrzanych chromatyd zawiera identyczn informacj genetyczn, poniewa kada z nich jest produktem semikonserwatywnej re-plikacji oryginalnej macierzystej czsteczki DNA tego chromosomu. Midzy tymi genetycznie identycznymi siostrzanymi chromay dam i zachodzi crossing-over. Oczywicie takie wymiany siostrzanych chromatyd (ryc. 38-11) nie
maj konsekwencji genetycznych tak dugo, jak dugo wymiana jest wynikiem rwnego cros-sing-over. W komrkach ssakw w czasie prawidowe go rozwoju lub rnicowania zachodz niektre interesujce rearanacj genw. Na przykad u myszy geny VL i CL dla pojedynczej czsteczki immunoglobuliny (p. rozdz. 41) s w germinal-nej linii DNA oddalone od siebie. W DNA komrek zrnicowanych wytwarzajcych im-munogiobulin (komrki plazmatyczne) te same geny VL i CL fizycznie zbliyy si do siebie w obrbie genomu i utworzyy 1 jednostk transkrypcyjn. Jednak nawet wwczas taka rearanacja DNA w czasie rnicowania nie spowodowaa cigego uoenia genw VL i CL w czsteczce DNA. Zamiast tego w czsteczce DNA s zawarte rozproszone, czyli wtrcone, sekwencje o dugoci ok. 1200 par zasad w miej-
466 / ROZDZIA 38
Ryc, 38-11. Wymiany siostrzanych chromatyd midzy ludzkimi chromosomami Wymiany wykryo przez barwienie wg Giemsy chromosomw komrek, ktre miay 2 cykie replikacji w obecno ci bromodeok-syurydyny. Strzaki pokazuj niektre regiony wymian (Dziki uprzejmoci S Wolff i J. Sodycote).
scu lub ssiedztwie poczenia regionw V i C. Te wtrcone sekwencje s przepisane na RNA wraz z genami VL i CL, a sekwencje wtrcone zostaj usunite z RNA w czasie jego przeksztace w obrbie jdra (p. rozdz. 39 i 49). SYNTEZA I REPLIKACJA DNA S CILE KONTROLOWANE adaniem., replikacji DNA jest dostarczenie potomstwu mformagi genetycznej zawartej w"czsteczemaderzyslej. Repiikacja DNA musi wic by kompletna i przeprowadzona z duym stopniem wiernoci, aby utrzyma stabilno genetyczn w obrbie organizmw i
kacji DNA u Escherichia coli, a nastpnie opisa wystpowanie w tym organizmie enzymu, nazwanego obecnie polimeraz DNA I. Ten enzym ma liczne aktywnoci katalityczne, zoon struktur i powinowactwo do trifosforanw 4-deoksyrybonukleozydw adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy. Reakcja polimeryzacji katalizowana przez polimeraz DNA I u colt suya jako prototypowa reakcja dla wszystkich polimeraz DNA zarwno u organizmw prokariotycznych, jak i eukariotycznych, cho obecnie wiadomo, e gwna rola tej polimerazy polega raczej na zachowaniu wiernoci i udziale w procesach naprawczych ni na replikacji DNA. Inicjacja syntezy DNA wymaga zapocztkowania przez RNA Inicjacja syniezy pNA (ryc. 38-12) wymaga zapocztkowania przez kr tkie fragmenty RNA. o dugoci ok. 10200 nukleotydw.
gatunkw. Proces replikacji DNA jest zoony i obejmuje wiele funkcji komrkowych i wiele procesw weryfikacyjnych, gwarantujcych wierno replikacji. Arthur Kornberg dokona pierwszych obserwacji enzymologicznej repli-
'
Doczanie pierwszego dNTP Ryc. 38-12. Inicjacja syntezy DNA na primerze RNA i nastpujce doczenie drugiego trifosfora -nu deoksyrybonukleotydu
ri" H N* ft/> -^ /W
*H
DoczanledrugtegodNTP
468 / ROZDZIA 38
Proces zapocztkowania obejmuje atak nuk-leofilowy grupy 3'-hydroksylowej primera j<NA aa a-fosforan trifosforanu deoksynuk-leozydu z od szczepieniem piro fosforanu. Grupa 3'-hydroksylowa wieo przyczonego mono-fosforanu deoksyrybonukleozydu staje si wolna do przeprowadzenia nukleofilowego ataku na nastpny wchodzcy trifosforan deoksyrybonukleozydu, ponownie na jego reszt a-fosfo-ranu z od szczepieniem piro fosforanu. Oczywicie wybr odpowiedniego deoksyry.honukleoty-du, ktrego terminalna grupa 3'-hydroksylowa bdzie podlegaa atakowi, zaley od odpowiedniego parowania z siostrzanym pasmem czste czki DNA, stosownie do reguy zaproponowa nej pierwotnie przez Watsona i Cricka (ryc. 38-13). Gdy w odpowiednim miejscu .na matrycy jest; umiejscowiona czsteczka monofos-fJ ks vrv bonuk leozy du adeniny, wcza
si trifosforan tymidyny w rosncym nowym p^mSy- a jego reszta cc-tostranowa bdzie atakowana pr?e7 grup .1'-hydroksyl ow mono-fbsforami deoksyrybonukleraydujwio dodanego do polimeru. Przez ten stopniowy proces asmo matrycowe dyktuje, ktry trifosforan deoksyrybonukleozydu jest komplementarny i prze? wizania wodorowe utrzymuje go w miejscu, podczas gdy grupa 3'-hydroksyiowa ros ncego pasma atakuje i powoduje inkorporacj nowego nukleotydu do polimeru. Te fragmenty DNA, ktre zostaj doczone do czsteczki inicjujcego RNA, zostay wykryte przez Oka-zaki i nazywane s obecnie fragmentami Okaza-ki (ryc. 38-14). U ssakw, gdy powstanie wiele fragmentw Okazaki, kompleks replikacyjny zaczyna usuwa primery RNA i uzupenia ubytki powstae przez ich usunicie odpowiednimi deoksynukleotydami, dobieranymi przez
Prlmar RNA
Rosncy polimer DNA
Doczanie TTP
Ryc. 38-13. Synteza DNA inicjowana przez primer RNA ilustrujca funkcj matrycow komplementar nego pasma macierzystego DNA.
O R G A N I ZA C JA i R E P L1K A C JA D N A / 46 9 OMA matrycowy 3' ; 5' Primer RNA Nowo syntetyzowane pasmo ONA lOpz 10 pz 100 pz ------------H h H
Fragmenty Okazak! Ryc. 38- 14. Ni eci g a poli m eryzacj a deoksyrybonukl eozydw i tw or zeni e fr agm ent w O kazakL
parowanie zasad, a nastpnie czenia fragmentw nowo zsyntetyzowanych. DNA przez enzymy zwane iiga/ami DNA. Proces replikacji jest polarny Jak ju wspomniano, czsteczki DNA s dwupasmowe i 2 pasma s przeciwrwnolege, tj. biegn w przeciwnych kierunkach. Replika-cja..X>NA u prokariontw i eukariontw zachodzi rwnoczenie na obu pasmach. Jednak w adnym organizmie nie ma enzymu zdolnego polimeryzowa DNA w kierunku 3' do 5' tak, e oba nowo replikujce pasma DNA nie mog wydua si rwnoczenie w tym samym kie runku. Niemniej len sam enzym prowadzi re-plikacle obu pasm w tym samym czasie.JEajfc dyngsy-enzym-replikuje Jedno pjtsnio (pasmo wLadce-")_w_spasb cigy w kierunku 5' do 3'. tj. w tym samym kierunku replikacji. Taki sam enzym prowadzi implikacj siostrzanego pasma Gipftsmfi.opnione") w sposb niecigly polimeryzujc nukleotydy w krtkich odcinkach 150250 nukleotydw znowu w kierunku 5' do 3', ale w tym samym czasie synteza biegnie w kierunku tylnego koca poprzedzajcego primera RNA, a nie w kierunku mozreplikowa-nej czci czsteczki. Taki proces poowicznej
Pocztek repllkacjl
nietiglej syntezy DNA jest pokazany schematycznie na ryc. 3&-15. W jdrowym genomie ssakw wikszo pri-merw RNA jest usuwanych w trakcie procesu replikacji, podczas gdy w replikacji mitochon-drialnego genomu mak odcinki RNA pozostaj jako integralna cz zamknitych koowych struktur DNA. Polimeryzacja i naprawianie DNA wymaga licznych enzymw W komrkach ssakw istnieje klasa polime-raz DNA, zwana polimeraz et, ktra znajduje si w jdrze i jest odpowiedzialna za replkacj chromosomw. 1 czsteczka polimerazy a jest zdolna polimeryzowa 100 nukleotydw na sekund; jest to tempo 10-krotnie mniejsze ni tempo polimeryzacji deoksynukleotydw przez bakteryjn polimeraz DNA. To zmniejszenie tempa polimeryzacji moe by wynikiem oddziaywa nukleosomw. Nie wiadomo, jak polimeraza DNA pokonuje nukleosomy w procesie replikacji DNA. Jednak po zreplikowaniu DNA budujce si nukleosomy s rozmiesz czone przypadkowo na kadej z nici siostrza nych. Nowo zsyntetyzowane rdzenie histonw, w postaci oktameru, doczaj si do drugiego
3' 51
-5' -3
Oglny kierunek replikacji Ryc. 38 -15. Pr oces pt ci gt ej i j ednoczesnej r epl t kacji obu pasm dw upasm ow ego D NA .
470 / ROZDZIA 38
Pocztek replikacji
.Baka replikaoyjna"
Biaka
rozwijajce u nasady wideek repllkacyjnych
Kierunki reputacji
Ryc. 38-16. Powstawanie baniek replikacyjnych" w procesie syntezy DNA. Przedstawiono replikacj w obu kierunkach i proponowane pozycje biaek rozwijajcych w widekach replikacyjnych.
pasma w miar posuwania si wideek replikacyjnych. Poiimeraza o mniejszej masie czsteczkowej, tzw. poiimeraza p\ wystpuje take w jdrach komrek ssakw, ale nie jest odpowiedzialna za zwyk replikacj DMA. Moe ona suy w procesach naprawczych DNA (p. niej). Mitochondrialna poiimeraza DNA, poiimeraza 7, jest odpowiedzialna za replikacj miJochond-rialnego genomu, innej czsteczki DNA, ktra istnieje w postaci kolistej. Cay genom ssakw replikuje si w cigu 9 h okres potrzebny do utworzenia tetra-ploidalnego genomu z genomu diploidalnego w replikujcej komrce. Proces ten wymaga obecnoci licznych miejsc zapocztkowania re plikacji DNA, ktre tworz zgrupowania zawierajce ok. 100 takich jednostek replikacyjnych. Replikacja przebiega w obu kierunkach wzdu chromosomu i oba pasma s replikowane jednoczenie. Taki proces replikacji wytwarza baki replikacyjne" (ryc. Liczne miejsca, ktre su jako pocztki replikacji DNA w komrkach eukariotycznych, s sabo okrelone, wyjtek stanowi niektre wirusy zwierzce i drode. Jest jasne, e inicjacja jest regulowana zarwno w przestrzeni, jak i czasie, poniewa zgrupowania przylegych miejsc rozpoczynaj replikacj w sposb zsynchronizowany. Sugeruje si, e funkcjonalne domeny chroma tyny replikuj jako pene jednostki, co nasuwa wniosek, e pocztki replikacji s umiejscowione swoicie w odniesieniu do jednostek transkrypcji. W czasie replikacji DNA*2,pasma musz by od siebie oddzielone, aby kade z nich mogo suy jako matryca, ktra poprzez wizania
38-16).
wodorowe swoich zasad nukleotydw wie wprowadzane trifosforany deoksynukleozy-dw. Oddzielenie dwupasmowego heliksu DNA osiga si przez czsteczki biaka, ktre stabilizuj struktur je d no pasmow w miar posuwania si wideek replikacyjnych. Te biaka stabilizujce wi si stechiometrycnie"~do_ pojedynczych pasm, nie zaburzajc jednoczenie zdolnoci nukleotydw do penienia ich funkcji matrycowych (ryc. 38-17). Aby uzyska oddzielenie pasm, oprc2 rozdzielenia 2 pasm podwjnego heliksu, musi zachodzi proces rozkrcenia czsteczki (raz na kade 10 par nukleotydw). Biorc pod uwag czas, w ktrym musi zaj replikacja DNA, proces rozkrcenia musi zachodzi segmentami. We wszy-
Ryc. 38-17. Hipotetyczny schemat dziaania biaka wicego jednopasmowe sekwencje DNA w re gionie wideek replikacyjnych. Po zwizaniu jednopasmowych regionw matrycy i uatwieniu replika cji biako podlega recyklizacji. (Dziki uprzejmoci B. Albertsa). ______
stkich organizmach istniej liczne obrotowe wideki ,,swivels" rozproszone w czsteczkach DNA. Mechanizm funkcji swivels" polega na dziaaniu swoistych enzymw, ktre wprowadzaj przerwy w 1 pamie rozkrcajcego si podwjnego heliksu, co umoliwia postpowa-niau>rocesu rozkrcania heliksu. Przerwy s szybko-ponownie spajane bez nakadu energii, ponjewiti. tworzy si jednoczenie wysokoenergetyczne, .wizanie kowalencyjne midzy przerwanym wizaniem fosfodiestrowym a enzymem wykazujcym aktywno przerywania I spajania pasma (ang. nicking-sealing enzyme). finzymy takie s nazwane topoizomerazami DNA. Proces ten jest przedstawiony schematy-
cznie na ryc. 38-15: i porwnany do ATP--zalenego procesu spajania prowadzonego przez ligazy DNA. Topoizomerazy s take zdolne do rozkrcania superzwinietgo DNA. Superzwinity DNA jest struktur wyszego rzdu kolistych czsteczek DNA skrconych wok rodka, jak to pokazano na ryc. 38-19. W jednym gatunku wirusw zwierzcych re.-trowirusy) istnieje klasa enzymw zdolnych do syntezy jednopasmowej, a nastpnie dwupas mowej czsteczki DNA z jednopasmowej mat rycy RNA. Ta polimeraza, RNA-zalena poli-meraza DNA, czyli odwrotna transkryptaza" syntetyzuje najpierw hybrydow czsteczk DNA-RNA, wykorzystujc genom RNA jako
Ligaza DNA E + AT P = E (AMP-Enzym)
Stopie 1
Topolzomeraza I DNA
Nacicie O 3' pojedynczego pasma przez M enzym
Istniej E}ce nacicie Jednego pasma
Sioplen 2
Tworzenie wizania wysokoenergetycznego
Stopie 3
Naprawione nacicie
Naprawione nacicie
Ryc. 38-18. Porwnanie 2 typw reakcji naprawiania naci w DMA Cig reakcji po stronie prawej jest katalizowany DNA ligaz; reakcje po stronie lewej topoizomeraz I DNA. (Nieco zmody fikowane i zreprodukowane za zgod Lehninger A. L: Biochemistry. 2nd ed, Worth, 1975). _________________
472 / ROZDZIA 38
Mitcza
Ryc. 38-20. Cyk) komrkowy w komrkach ssakw. Faza syntezy DNA (faza S) jest oddzielona od mitozy przez przerw Gf (gap 1) i przerw G2 (gap 2). Strzaka wskazuje kierunek progresji cyklu.
Ryc. 38-19. Superzwoje DNA. Lewoskrtny sole-noidalny superzwj (na lewo) i forma odwrcona, prawoskrtny wewntrznie zwinity superzwj powstajcy po usuniciu cylindrycznego rdzenia. Takie przeksztacenie jest analogiczne do tego, ktre zachodzi po rozerwaniu nukleosomw w wyniku ekstrakcji histonw z chromatyny duymi steniami soli.
matryc. Swoisty enzym, RNaza H degraduje pasmo RNA, a pozostae pasmo DNA suy z kolei jako matryca do utworzenia dwupasmowej czsteczki DNA zawierajcej informacje istniejc pierwotnie w genomie RNA zwierzcego wirusa. Synteza DNA zachodzi w czasie fazy S cyklu komrkowego W komrkach zwierzcych, wczajc take komrki ludzkie, replikacja DNA genomu zachodzi tylko w okrelonym czasie ycia komrki. C2as ten jest nazwany okresem syntezy albo faz g. Okres ten jest zwykle czasowo od dzielony od fazy mitotycznej przez okresy, w ktrych nie zachodzi synteza DNA okrelan ych jako p rzerwa 1 (an g. gapi - - Gi ) i przerwa 2 (ang. gap2 G:), ktre maj miejsce odpowiednio przed i po fazie S (ryc. 38-20). Komrka reguluje syntez swego DNA, gwnie przez dopuszczenie procesu syntezy tylko
w okrelonych czasach, a synteza DNA zachodzi gwnie w komrkach przygotowujcych si do podziau w procesie mitozy. Regulacja wejcia komrki w faz S obejmuje cykliczne nukleotydy purynowe i prawdopodobnie sub-straty do syntezy DNA, ale mechanizm ten nie jest znany. Liczne wirusy wywoujce nowotwory (onkowirusy) s zdolne zmieni lub przerwa ograniczenia, ktre zwykie kontroluj wejcie komrki ssakw z fazy Gi do fazy S. Ten mechanizm take nie jest poznany, ale prawdopodobnie obejmuje fosforylacj s woistych czsteczek biaek gospodarza, W czasie fazy S komrki ssakw zawieraj wiksze iloci polimerazy a DNA ni w niesyn-tetyzujcych fazach cyklu komrkowego. Dalej, enzymy, ktre s odpowiedzialne za wytworzenie substratw do syntezy DNA, tj. trifo-s fora nw deoksyrybonukleozydw, zwikszaj take swoj aktywno, ktra zmniejsza si po fazie syntezy, a do ponownego pojawienia sie sygnau do ponowienia syntezy DNA. W czasie fazy S jdrowy DNA jest replikowany kompletnie raz i tylko raz. Wydaje si, e raz zrep-likowanachromatyna jest tak naznaczona", e jej dalsza replikacja jest niemoliwa do momentu, a przejdzie ona ponownie przez okres mitozy. Sugeruje si, e metylacja DNA moe suy jako taki kowalencyjnie zwizany znacznik. Zwykle dana para chromosomw replikuje rwnoczenie i w okrelonej czci fazy S w ka-
dym cyklu replikacyjnym. W obrbie chromo somu zgrupowania jednostek replikacyjnych s replikowane w sposb skoordynowany. Natura sygnaw, klre reguluj syntez DNA na tych poziomach, nie jest znana, ale regulacja wydaje si by wewntrzn waciwoci kadego indywidualnego chromosomu. Uszkodzony DNA jest naprawiany przez enzymy Utrzymanie integralnoci informacji w czsteczkach DNA jest problemem o najwikszym znaczeniu dla przeycia poszczeglnego organizmu, jak i przeycia gatunkw. Std mona wycign wniosek e gatunki, ktre przeyy, wytworzyy w procesie ewolucji mechanizm do naprawiania uszkodze DNA, zachodzcych w wyniku bdw replikacyjnych lub ujemnych wpyww rodowiskowych. Okrelono, e uszkodzenia w czasie replikacji DNA lub indukowane rodowiskowo powoduj rednio 6 zmian nukleotydw na rok w komrkach linii rozrodczej jednego osobnika. Przypuszczalnie przynajmniej taka sama liczba zmian nukleoty-dowych, czyli mutacji, musi zachodzi w cigu roku rwnie w komrkach somatycznych. Jak to opisano w rozdz. 37, gwna odpowiedzialno za wierno replikacji ley w swoistym parowaniu zasad nukleotydw. Odpowiednie parowanie zaley od obecnoci preferowanych postaci tautomerycznych nukleotydw purynowych i p i rym idy nowych (p. ryc. 35-7), ale rwnowaga, w ktrej jeden tauto-mer jest bardziej stabilny ni inny, wynosi tylko 104 lub 10s na korzy tautomeru o wikszej stabilnoci. Chocia wielko ta nie jest wystarczajco korzystna, aby zapewni wymagan wierno, faworyzowanie wybranych tautome-rw, a zatem odpowiednie parowanie zasad, moe by zapewnione przez 2-krotne monitorowanie procesu parowania 2asad. Takie podwjne monitorowanie zachodzi zarwno w systemach bakteryjnych, jak i systemach komrek ssakw: po raz pierwszy w trakcie wczania trifosforanw deoksyrybonukleozydw, a p niej przez ponown kontrol i mechanizm wymagajcy energii, ktry usuwa wszystkie nieprawidowe zasady, ktre mog si pojawi w nowo wytworzonym pamie. Ten podwjny proces monitorowania nie pozwala na powstanie bdw z nieodpowiedniego parowania za sad z powodu obecnoci niefaworyzowanych tautomerw z czstoci wiksz ni raz na kade 108 101 par zasad. U E, coli czsteczk
odpowiedzialn za taki mechanizm monitorowania jest aktywno egzonukleazowa 3'-5' wbudowana"' w polimeraz DNA, ale polime-razy DNA ssakw nie maj takich korekcyj nych waciwoci nukleazowych. Tak funkcj naprawcz sprawuj inne enzymy. Uszkodzenia DNA, wywoane przez czynniki rodowiskowe, fizyczne i chemiczne, mog by sklasyfikowane jako 4 typy (lab. 38-2). Uszkodzone regiony DNA mog by naprawione, wymienione przez rekombinacj lub zachowane. Zachowanie regionw uszkodzonych prowadzi do mutacji i jest potencjaln przyczyn mierci komrki. Proces naprawy i wymiany korzysta z faktu powielenia informacji w dwupasmowej heliksalnej strukturze DNA. Uszkodzony region w jednym pamie moe by przywrcony do swej postaci oryginalnej na podstawie komplementarnej informacji zachowanej w pamie nie uszkodzonym. Kluczem do wszystkich procesw naprawczych i rekombinacyjnych jest pocztkowe rozpoznanie uszkodzenia i albo naprawienie go w czasie tego rozpoznania, albo oznakowanie go do naprawienia w przyszoci. Depurynacja DNA, ktra zachodzi spontanicznie dziki ter-molabilnoci wi-zania N-glikozydowego pu-ryn, zachodzi z prdkoci 500010000 na komrk na dob w temp. 37C. Swoiste enzymy rozpoznaj miejsca depurynowane i za Tabefa 38-2. Rodzaje uszkodze DNA I. Zmiana 1 zasady A. Depurynacja B. Deaminacja cytozyny do uracylu C. Deaminacja adeniny do hipoksantyny D. Alkilacja zasady E. Insercjo lub delecja nukleotydu F. Inkorporacja analogu zasady II. Zmiana 2 zasad A, Powstanie dimeru tymina-tymina induko wane promieniowaniem nadfioletowym B. Wizanie poprzeczne dwufunkcyjnym czynnikiem alkilujcym III. Pknicie acucha A. Promienie jonizujce B. Rozpad wiza losfodiestrowych pod wpywem radioaktywnoci [V. Wizania poprzeczne A. Midzy zasadami tego samego pasma lub pasm przeciwlegych B. Midzy DNA i czsteczkami biaka (np. histony)
474 / ROZDZIA 38
stpuj je odpowiednimi purynami bezporednio bez przerwania wiza fosfodiestrowych. WDNA zasady, cytozyny i adeniny ulegaj spontanicznej deaminacji z wytworzeniem odpowiednio uracylu i hipbicsantyny, Poniewa ani uracyl ani hipoksantyna w warunkach prawidowych nic wystpuj w DNA, nie jest zaskoczeniem, e swoiste N-glikozydazy mog rozpoznawa te nieprawidowe zasady i usuwa je z DNA. Takie usunicie zasad stanowi oznakowanie miejsca wady i pozwala endonukleazie
apurynowej lub apirymidynowej naci odpo -
W podobnych seriach procesw, obejmujcych pierwotnie rozpoznane uszkodzenia, mog by usuwane z DNA alkilowane zasady i analogi zasad, a czsteczka DNA jest przywracana do jej pierwotnej treci informacyjnej. Naprawa insercji lub delecji nukleotydowych zachodzi zwykle przez mechanizmy rekombina-cyjne z rwnoczesn replikacj lub bez replika-cji. tworzenie dimerw pjrymidyna-pirymidyna. gwnie dimerw 2 przylegych tymin w tym samym pamie (ryc. 38-22). Istniej 2 mechanizPromieniowanie nadfioletowe indukuje wy-
wiednio szkielet pasma w pobliu uszkodzenia. Nastpnie kolejne dziaania egzonukleazy, naprawczej polimerazy DNA i ligazy przywracaj DNA jego stan oryginalny (ryc. 38-21). Ta seria zdarze ma nazw naprawa przez wydcie.
Ryc. 38-22. Dimer tym i na-tymi na utworzony po-
D-Ryboza
A T C G G C T t A T C C G A T 1 1 1 1 1 1 1 1 1 M I M A T A G C C G A G T G G C T A
i
H3C
D-ftyboza
Energia cieplna
A T C G G C T U A T C C G A T
1 1 1 1 1 1 ! 1 1 1 1 1 1 1 1
T A G C C G A G T A G G C T A
DNA-GLIKOZYDAZA URACYLOWA A T C G G C T U A T C C G A T
przez wizania typu cyklobutanu midzy po-toony-mi w ssiedztwie resztami tyminy DNA.
M M I I !
1 1 M 1 M
my usunicia lub naprawienia takich Jirnerw tymina-tymina. Jeden z nich to mechanizm typu
naprawa przez wycicie, analogiczny do opisanego wy ej, a drugi mechanizm p_ol_ega na fotoreaktywacji wiatem widzialnym swoistego
T A G C C G A G T A G G C T A NUKLEAZY
A T C G G CT C C G A T M I M
II
II
MI
T A G C C G A G T
i
A G G C T A POLIMERAZA DNA + LIGAZA DNA
A T C G G C T UA T C C G AT T A G CC G A GT A GG C TA
II M II II M I M II
Ryc. 38-21. Naprawa ONA przez wycinanie. En zym DNA-glikozydaza uracylowa usuwa uracyl powstay podczas spontanicznej deaminacji cyto zyny w DNA. Endonukleaza przecina wizanie fosfodiestrowe w pobliu miejsca uszkodzenia; nastp nie, po usuniciu przez endonukleaz kilku zasad, ubytek jest uzupeniony dziki.dziaaniu polimerazy naprawczej i pasmo jest ponownie spojone przez ligaz (Dziki uprzejmoci B. Albertsa) _______
enzymu, ktry bezporednio in situ przeksztaca wytworzony dimer do 2 monomerw. Pknicia w pojedynczym pamie, indukowane przez promienie jonizujce, mog by naprawiane przez bezporednie spojenie lub przez rekombinacj. Mechanizmy odpowiedzialne za napraw wiza poprzecznych" midzy zasadami przeciwlegych pasm dwupasmowego heli-ksu DNA lub midzy DNA i czsteczkami biaek s sabo poznane. Uszkodzenia wywoane promieniami jonizujcymi i przez alkilacje s zwykle naprawiane przez wycicie i resynteze krtkich odcinkw. Uszkodzenia promieniowaniem nadfioletowym i poprzeczne wizania miedzy pasmami sa naprawiane przez wycicie i resynteze wikszych
odetrtk&w DNA^W komrkach ssakw replikacja naprawcza moe by obserwowana jako cja prekursorw DNA (radioaktywnej tymidyny) do DNA w okresie, w ktrym komrka nie jest w fazie S. Zwikszonej aktywnoci typu wycicienaprawa, jako reakcji na czynniki uszkadzajce ONA, towarzyszy w komrkach ssakw zwikszona aktywno enzymu polimerazy poli (ADP-rybozy). Enzym ten do ADP-rybozylacji chroma ty ny wymaga koenzymu NAD+. Doda-jejjn gwnie czsteczk mono(ADP-rybozy), nie, w pewnym stopniu take homopolimerowy acuch ADP-rybozy. Nie jest jasne, jak funkcj w procesie wycicianaprawy peni polime-raza poli{ADP-rybozy} lub jej produkt (ADP--ryboza). Istnieje czasowa zaleno midzy zwikszon aktywnoci naprawcz i zwikszeniem aktywnoci swoistego enzymu. W dodatku zahamowanie enzymu swoistymi inhibitorami zapobiega spojeniu zamanych nici DNA. Zwikszenie aktywnoci polimerazy poli (ADP-rybozy) wydaje si by reakcj na frag-mentacj DNA w jdrze. Taka fragmentacja moe by indukowana pierwotnie przez czynniki fizyczne, takie jak promieniowanie X, lub wtrnie przez mechanizmy nacinajce DNA jako reakcja na inne czynniki chemiczne lub fizyczne, takie jak promieniowanie nadfioletowe lub zwizki alkilujce. Aktywno polimerazy jest dostatecznie dua, aby zmniejszy ilo wewntrzkomrkowego NAD + w nastpstwie uszkodze DNA czynnikami rodowiskowymi.
Skra pergaminowa ta barwnikowa {xeroder-ma pigmentosum) jest aulosomaln, nieprogramu warta synteza DNA, tj. inkorpora
JWkomrkach pochodzcych z wikszoci, jeli nie wszystkich, grup komplementacyjnych xeroderma pigmentosum, w reakcji na ekspozycj na wiato nadfioletowe spostrzega si nieprawidow przejciow lub ilociow reakcj ze strony polimerazy poi(ADP-rybozy). Wydaje si, e nieprawidowa reakcja przynajmniej w jednej grupie komplementacji jest spowodowana niezdolnoci do nacicia pasma DNA w miejscu uszkodzenia, poniewa dodanie deo-ksyrybonukleazy do wadliwych permeabilizo-wanych komrek prowadzi do prawidowego lub prawie prawidowego zwikszenia aktywnoci polimerazy poli{ADP-rybozy). U chorych z ataxia teleangiectasia, autoso-malnej, recesywnej choroby u ludzi powodujcej ataksj mdkow i nowotwory ukadu limforetykularnego (choniakosiateczkowego), istnieje wzmoona wraliwo na uszkodzenia promieniami X. Chorzy z niedokr wist oci Fan-coniego, autosomaln niedokrwistoci recesywn, charakteryzuj si take wzmoon zapadalnoci na nowotwory i niestabilnoci chro-mosomaln, wykazuj prawdopodobnie wad liw napraw uszkodze wywoanych wizaniami tzw. poprzecznymi. Wszystkim tym 3 zespoom klinicznym towarzyszy zwikszona zapadalno na nowotwory. Jest moliwe, e w przyszoci zostan odkryte u ludzi inne choroby wynikajce z zaburze zdolnoci naprawy DNA.
PIMIENNICTWO
Kornberg, A: / Bied Chem 1988; 263:1. lgo-K-emenes T, Horz W, Zachau HG: Chromatin. Annu Re\ Biochem 1982; 51:89. Jelinek WR, Schmid CW: Repetitive seuences in eukaryotic DNA and their cxpression. Annu Rev Biochem 1982; 51:813. McGhcc JD, Felsenfeld G: Nucleosome structure. Annu Rev Biochem 1980; 49:1115. Sancar A, Sancar G: DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem 1988: 57:29. Campbell JL: Eucaryotjc DNA replication. Annu Rev Biochem 1986; 55:733. Gross DS, Garrard WT; Annu Rev Biochem 1988; 57:159.
recesywn chorob genetyczn. Kliniczne objawy obej muj znaczn wraliwo na promieniowanie soneczne (nadfioletowe) z nastpujcym po wstawaniem mnogich nowotworw skry i przedwczesn mierci. Wrodzona wada dotyczy naprawy uszkodzonego DNA. Komrki osb chorych na xewderma pigmentosum, hodowane w kulturach, wykazuj maf aktywno w procesie rozbijania dimeru tyminy na drodze fotoreak-tywacji. Jednak w tej chorobie procesy naprawcze DNA s bardzo zoone; istnieje przynajmniej 7 grup komplementacji genetycznej.
39
Synteza, przeksztacanie i metabolizm RNA

Dary/ K, Granner, MD
WPROWADZENIE I ZNACZENIE DLA BIOMEDYCYNY

Transkrypcja czsteczki RNA z DNA jest bardzo zoonym procesem, w ktry jest wczony jeden z enzymw z grupy polimeraz RNA oraz liczne towarzyszce biaka. Podstawowe etapy, konieczne do syntezy pierwotnego trans-kryptu, to inicjacja, elongacja i terminacja. Najlepiej znany jest etap inicjacji. Zidentyfikowano liczne regiony DNA (na og umiejscowione pod prd", czyli na lewo od miejsca inicjacji) oraz czynniki biakowe, ktre wi si do tych sekwencji i reguluj inicjacj transkrypcji. Ten proces jest najlepiej poznany u proka-riontw i wirusw, ale w ostatnich latach dokonano znacznego postpu w poznaniu procesu transkrypcji w komrkach ssakw. Niektre RNA, a zwaszcza mRNA maj bardzo rny okres przeycia w komrce. Wane jest po znanie podstawowych zasad metabolizmu RNA, poniewa modulacja tego procesu powoduje zmiany w stopniu syntezy biaek i w nastpstwie zmiany metaboliczne. Jest to sposb, w jaki wszystkie organizmy adaptuj si do zmian w rodowisku, a take sposb, w jaki powstaj i utrzymuj si zrnicowane struktury i funkcje komrki u wyszych organizmw wielokomrkowych. Czsteczki RNA syntetyzowane w komrkach ssakw s czsto bardzo rne od tych, ktre s wytwarzane w organizmach prokario-tycznych. Odnosi si to zwaszcza do transkryp-tw kodujcych mRN A. mRJÂji,oxgaiiizmw ptkâoi^czrj^ch moe ulega translacji w ta kiej "postaci,~w jakiej zosta ^syntetyzowany, podczas" gdy w komrkach, s&Jp w wikszo RNA jest syntetyzowana jako czsteczki prekur-
sajowe, ktre ulegaj przeksztaceniom .(ob rbce") w dojrzay, aktywny RNA. Bdne przeksztacenie i skadanie transkryptw mRNA jest przyczyn takich chorb, jak niektre typy talasemii (p. rozdz. 42).
RNA JEST SYNTETYZOWANY NA MATRYCY DNA PRZEZ POLIMERAZ RNA

Proces syntezy RNA (transkrypcji RNA) na matrycy DNA najlepiej scharakteryzowano w organizmach prokariotycznych. Mimo e w komrkach ssakw synteza RNA i przeksztacanie transkryptw RNA s rne ni w organizmach prokariotycznych, proces syn-tszyRNj jako taki, jest cakiem podobny w tych 2 klasach organizmw. Dlatego te opis-syntezy RNA w organizmach prokariotycznych odnosi si do organizmw eukariotycznych, mimo e enzymy biorce udzia w tym procesie i sygnay regulatorowe s rne. Sekwencja rybonukleotydw w czsteczce RNA jest komplementarna do sekwencji deok-syrybonukleotydw 1 pasma w dwupasmowej czsteczce DNA (p. ryc. 37-8). Pasrnov ktre ulega transkrypcji na czsteczk RN.A nazywa si matrycowym pasmem DNA. Drugie pasmo DNA czsto okrela si jako pasmo kodujce danego genu. Jest ono tak nazwane poniewa, 7 wyjtkiem tego, e ma T zamiast U, od powiada ono dokadnie sekwencji pierwotnego transkryptu, w ktrym zawarty jest kod dla Biaka - produktu danego genu. W przypadku dwupasmowej czsteczki DNA, zawierajcej liczne geny, pasmo matrycowe dla kadego z genw niekoniecznie jest tym samym pasmem
S Y N TE ZA , P R ZE K S Z TA C A N I E I M E TA B O LI Z M R N A / 4 7 7 Gen 5 P-P-P
P
Gen A
Gen B
Gen C
Tran skrypt RNA
Pasma matrycowe Ryc. 39-1. Na rycini e t ej pokazano, ze geny m og by t ranskr ybow ane z obu pasm DNA . S tr zaki wskazuj kierunek t ranskrypcji {poi ar no}. Zwr uw ag, e pasm o m atr ycow e jest zawsze odczyty w ane w ki er unku 3'- 5'. P asm o pr zeciw l eg e j est zw ane koduj cym , poni ew a j est ono i dent yczne ( z w yj t ki em z am i an y T na U ) do t r ans kr ypt u m R NA ( pi erw ot ny t r anskr ypt w kom r kach euka- r iotycznych) , kt r y koduje bi akowy pr odukt genu.
Kompleks RNAP Ryc. 39-2. Polimeraza FINA (RNAP) katalizuje polimeryzacj rybo nukleotydw na sekwencje RNA, ktre s komplementarne do pasma mat rycowego genu Transkrypt RNA ma t sam poiar no (5' do 3'), co kodujce pasmo DNA , ale zawiera U zamiast T. RNAP z Escherichia coli skada si z kompleksu 2 a podjednostek i 2 [} podjednos-tek (P i p") tworzcych kompleks rdzeniowy. Holo- enzym zawiera podjednostk 6 w momencie, gdy kompleks znajduje si w ssiedztwie miejsca startu (ok. 10 pz), a nastpnie transkrypcja postpuje jedynie przy uyciu kompleksu rdzeniowego. Ba ka" transkrypcyjna obejmuje obszar 17 nukleotydw sto pio nego DN A (zdenaturo wanego DNA ), a cay kompleks pokrywa 30- 75 pz w zalenoci od ko normacji RNAP.
w dwupasmowym heliksie DNA (ryc. 39-1). Dan;paspe-wtiwupasmowej czsteczce DNA moe wic suy jako pasmo matrycowe dla niektrych genw i jako pasmo kodujce dla innych genw. Naley zwrci uwag, e sekwencja nukleotydw transkryptu DNA bdzie taka sama (z wyjtkiem U, ktra zastpuje T) jak w pamie kodujcym. Informacja na pamie matrycowym jest odczytywana w kierunku 3' do 5'. ------*. DNA-zalena polimeraza RNA jest enzymem odpowiedzialnym za polimeryzacj rybonukjeo-tydjw-6 sekwencji kornplcmentarnej do pasma mîxyco.wgtLgenu (p. ryc. 39-2 i 39-3). Enzym przyjaczajsic do swoistego miejscajEgjnotpta, na_p_a^nie_jn,atrycowym. Nastpuje po tym itucjiiia^syntfiZRHA w_.mmkcie startui.pioees p_ostj3iyc.dalej, a osignie sekwencje teimjna-cyjne (ryc. 39-3). Jednostka transkrypcji jest to regifin_I2NA rozcigajcy si midzy promoto-rern_i lermmatorL-m. Produkt RNA, ktry jest -syBtetyztyany wjenmku 5"" do 3r, nazywamy kariotycznych moe on reprezentowa produkt kodowany przez kilka przylegych do siebie genw; w komrkach ssakw jest to zwykle produkt pojedynczego genu. Knike.5' pierwotnego transkryptu RNA i dojrzaego cytoplaz-matycznego RNA s identyczne. Miejsce startu transkrypcji odpowiada wic imWeotydowi koca 5' roRNA Pierwotne transkryply generowane KNA 11 s szybko opatrzone 7-melyloguanozylotrifosforanem (p. ryc. 37-10) --^czaggczka" ktiajutrzymujesi i pojawia si na kocu 5' dojrzaego cytoplaz-matycznego mRNA. Te ,.czapeczki metylacyj-ne" s przypuszczalnie potrzebne do przeksztace (obrbki): pierwotnego transkryptu do
r yc . 3 7 - 1 0 ) ^g piamaiuym trangkr^pî iAT^roani^maJ -h prn-
mRNA, do translacji mRNA i do ochrony mRNA przed atakiem egonukieoiitycznym w kierunku 5 : -* 3'. kterii Escherichia coli wystpuje ja k& czsteczka rfooiiLi z 4 podjedtiostek. 2 z nich s identyczne Ipodjednostki a), a 2 s podobne co do wielkoci, ale nie identyczne (podjednostka p i P') (ryc. 39-2). RNAP zawiera take 2 atomy cynku. Rdze polimerazy RNA posuguje si swoistym czynnikiem biakowym (czynnik sigma [o]), ktry pomaga rdzeniowi enzymu doczy si mocniej do swoistej sekwencji deoksyrybonuk-leotydowej regionu promotora. Bakterie zawieraj wiele czynnikw o, ?. ktrych kady dziaa jako biako regulatorowe, ktre modyfikuje swoisto rozpoznania promotora polimerazy RNA. Pojawianie si rnych czynnikw a jest w systemach prokariotycznych skorelowane w czasie z rnymi programami ekspresji genw, takimi jak rozwj bakteriofagw, sporula-cja i reakcje na szok cieplny.
RN..(RHAJEXba-
478 / ROZDZIA 39
Negatywne czynniki kontrolne: represory Pozytywne czynniki kontrolne: aktywatory Holoenzym pollmerazy RNA
Rdze pollmerazy
2. Ini cj aoj a ni ci H N A pppApX 4. Terml nacj a transkrypcji nici RNA I uwol nieni e enzymu a El ong acj a ni ci R N A PPPA Czynniki sigma Czynniki term i nacji Czynnl W antyierrnlnaojt XTP
+ATP+XTP Uwolnienie sigma wizanie nusA
Ryc. 39-3. Cykl transkrypcyjny u bakterii. Transkrypcj RNA bakteryjnego przedstawiono w 4 etapach: 1. Wizanie z matryc. Polimeraza RNA (RNAP) wie si z DNA i lokalizuje promotor. Z. Inicjacja nici. Holoenzym RNAP (rdze+czynniki 6) katalizuje przyczenie pierwszego nukleotydu (zwykle ATP lub GTP) do drugiego trifosforanu rybonukleozydu z wytworzeniem dinukleotydu, 3. Elongacja nici. Kolejne reszty nukleotydowe s doczane do 3' -OH koca powstajcej czsteczki RNA; czynnik 5 dysocjuje od holoenzymu, gdy ni RNA osignie dugo ok. 10 zasad. 4. Terminacja nici i uwolnienie enzymu. Ukoczona ni RNA i RNAP s uwolnione z matrycy. Regeneruje si hoioenzym RNAP, ktry odnajduje promotor i cykl rozpoczyna si od nowa. {Zreprod u kowano z niewielkimi modyfikacjami z: M, Chamberiin, The Enzymes, vol. XV, 1982). _____
SYNTEZA RNA OBEJMUJE INICJACJ, ELONGACJ ITERMINACJ

Proces syntezy RNA pokazany na ryc. 39-3 obejmuje najpierw zwizanie czsteczki hoi.opo-Htnerazy RNA do matrycy w miejscu promoto-rowym. Po.zwizaniu nastpuje zmiana konformacji RNAP, a nastpnie pierwszy nukleotyd (zwykle purynowy) wie si z miejscem inicjacji p podjednostki enzymu. W obecnoci 4 nuk-letydow"RNAP przemieszcza si do drugiej zasady na matrycy, tworzy si wizanie fos-fodiestrowe, a tworzcy sie acuch RNA jest
teraz zwi zany w miejscu polimeryzacji na ~(J podjednostce RNAP. (Nasuwa si analo gia "do" miejsc A i P na rybosomie; p. ryc. 40-7 i 40-8). Inicjacja tworzenia czsteczki RNA przy jej kocu 5' nastpuje z oddzieleniem czynnika-cr, a elongacja czsteczki RNA biegnie przeciw-rwnolegje do jej matrycy w kierunku od 5'do jJTEnzym polimeryzuje rybonukleotydy wedug swoistej sekwencji dyktowanej przez pasmo matrycowe i reguy parowania zasad wedug Watsona-Cricka. W trakcie reakcji polimeryzacji uwalnia si pirofosforan. Zarwno u proka-riontw, jak i u eukariontw rybonukleotyd
SYNTEZA, PRZEKSZTACANIE I METABOLIZM RNA / 479
puiynaw.y-4es.t .zw.ykk pierwszym, ktry ulega polimeryzacji w czsteczce RNA. Wmiar^k4iomplkjLelongacyjny. zawierajcy rdze poliinerazy RNA. przemieszcza si wzdluz czsteczkiJD2&. jnusi nastpi rozwinicie heliksu DNA, aby udostpni miejsca do odpowiedniego parowania zasad do mik-leotydw ua pamie matrycowym. Odcinek rozwijajcego si DNA ma stal wielko w okresie transkrypcji, ktra wynosi ok. 17 par zasad na czsteczk polimerazy. Wydaje si wic, e wielko regionu rozwinitego DNA jest dyktowana przez polimeraz i jest niezalena od sekwencji DNA w obrbie kompleksu. Sugeruje to, e polimraza^RNA.jesi.zwi^zana z aktywnoci typu rozwijajcego (ang, ,,un-windase"). ktra otwiera heliks DNA. Fakt, e podwjny heliks musi ulec rozwiniciu, i e pasma oddzielaj si przynajmniej przejciowo w okresie transkrypcji nasuwa wniosek, e
w komrkach eukariotycznych struktura nuk-leosomw ulega rozerwaniu. Termmacja syntezy czsteczki RNA jesl-wy-znaczona przez sekwencj na pamie matryco wym czsteczki DNA, ta sekwencja sygnalna jest rozpoznana przez biako terminacji nazwane czynnikiem rho [p]. Po ukoczeniu syntezy czsteczki RNA rdze enzymu (polimerazy) oddziela si od matrycy DNA. W obecnoci innego czynnika enzym rozpoznaje promotor i synteza nowej czsteczki RNA zaczyna si ponownie. To samo pasmo matrycowe genu moe przepisywa jednoczenie wicej ni 1 czsteczka polimerazy RNA, ale proces ten jest sfazowany i rozmieszczony w taki sposb, e w danym momencie ulega transkrypcji inna cz sekwencji RNA. Na rycinie 39-4 przedstawiono zdjcie przebiegu syntezy RNA z mikroskopu elektronowego-
/%^: ;-** ^m< :;V ,-
Ryc. 39-4. Fotografia z mikroskopu elektronowego ficznych kopii genw rybosomalnego RNA u pazw w trakcie transkrypcji. Powikszenie ok 6000 x. Zauwa, e dugo transkryptw zwiksza sie, w miar jak czsteczki polimerazy RNA posuwaj si wzdu poszczeglnych genw rybosomalnego RNA. Proksymai-ny, pocztkowy region transkrybowanego genu ma zatem krtkie przymocowane do genu transkrypty, podczas gdy znacznie dusze transkrypty s zwizane z dystalnym kocem genu. Strzaki pokazuj kierunek (5' do 3) transkrypcji, poczwszy od miejsca inicjacji do miejsca terminacji. (Reprodukowano za zgod z: Miller O. L. Jr, Beatty B. R,: Portrait of a gene. J. Celi Physiol. 1969, 74 [Suppl. 1]: 225),
480 / ROZDZIA 39
KOMRKI SSAKW ZAWIERAJ LICZNE DNA-ZALENE POLIMERAZY RNA

Waciwoci polimeraz ssakw przedstawiono w tab. 39-1. Kada z tych DNA-zalenych polimeraz RNA jest odpowiedzialna za transkrypcj rnych klas genw. Masa czstecz Tabela39-1. Mianownictwo zwierzcych DNA -zalenych polimeraz RNA Klasa Wraliwo na 3-amanityn Gwny enzymu produkt I (A) rRNA Niewraliwa II (B) Wraliwa na mat stenia 8 a (10" do 10- mo!/l) III <C) Wraliwa na due stenia
hnRNA(mRNA) tRNAi5SRNA
kowa (MW) polimeraz RNA dla 3 gwnych klas eukariotycznego RNA waha si w granicach 500000 600 000. Wszystkie z tych polimeraz maj podstawow organizacj podjed-nostek strukturalnych, podobn do bakteryjnej polimerazy RNA. Wszystkie maj 2 due pod-jednostki i kilka mniejszych podjednostek. Wspczesne badania z zastosowaniem klonowania i sekwencjonowania DNA wskazuj, e eukariotyczne polimerazy RNA wykazuj due podobiestwo aminokwasw z prokariotycz-nymi polimerazami RNA. Funkcje kadej z podjednostek nie s jeszcze poznane. Niektre mog mie funkcje regulatorowe, suce poli-merazie w rozpoznawaniu swoistych sekwencji, takich jak sygnay promotorowe i sygnay ter-minacyjne. a-Amanityna, toksyna grzyba Ama-nita phalloides jest swoistym inhibitorem euka-riotycznej nukleoplazmatycznej DNA-zalenej polimerazy RNA (polimeraza RNA II); tok syna ta okazaa si potnym narzdziem badawczym (tab. 39-1).
sekwencji sygnalnych dla inicjacji i termi-nacji. Kwestia .jak RNAP znajduje waciwe miejsce dla inicjacji transkrypcji?" nie jest kwesti bah, jeli wemie si pod uwag zoono genomu. Esckerichia coli ma ok. 2 x 103 miejsc inicjacji transkrypcji w DNA o ok. 4x 10" par zasad. Sytuacja jest jeszcze bardziej zoona u ludzi, gdzie ok. 105 miejsc inicjacji transkrypcji jest rozproszonych wrd 3 x 109 par zasad DNA. RNAP moe wiza si z wieloma regionami DNA, ale przeszukuje ona sekweecje ntÂz prdkoci ok. 103pz/s, a2.domo.jnen.lu, gdy rozpozna pewne swoiste regiony w.D.N.A. z ktrymi wie si z duym powinowactwem. Region taki jest nazywany promotorem, a zwizanie RNAP z promotorem zapewnia dokadn inicjacj transkrypcji. Promotory bakteryjne maj dugo ok. 40 nukleotydw (40 par zasad, czyli 4 zwoje podwjnego heliksu DNA); jest to region do statecznie may, aby by pokrytym przez czs teczk holopolimerazy RNA E. coli. Na tym obszarze promotora s 2 krtkie konserwowane sekwencje. Okoo 35 par zasad w gr od miejsca startu transkrypcji znajduje si sekwencja o 8 parach nukleotydw 5 -TGTTGACA-3' przedstawiona na ryc. 39-5. Bardziej proksyma-lnie do miejsca startu transkrypcji, ok. 10 nukleotydw w gr, jest sekwencja o 6 parach nukleotydw bogata w AT "(5r-TATAAT-3r). Ta ostatnia sekwencja ma nisk temperatur topnienia, poniewa brak jest w niej par nukleotydw GC. Wskutek tego sekwencja TATA, czyli ramka Pribnowa, uatwia dysocjacj mi-dzy pasmem kodujcyrrn rnckodujcyfHTw;' nuklgpiydjowej promojhura bezporednio w 3J\'_na kodujcym pamie. Inne bakterie maj odmienne kombinacje (ramki), ale na og maj 2 komponenty promotora; maj one tendencje zajmowa t sam pozycj wzgldem miejsca startu transkrypcji i we wszystkich przypadkach sekwencje midzy ramkami nie s do siebie podobne. U E. coli transkrypcyjne rho-zalene sygnay terminacji maj rwnie wyrane sekwencje zgodne, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Zachowawczo zgodna (konsensus) sekwencja, ktra ma dugo 40 par nukleotydw zawiera przerwan, odjwrjjceB<j~sdLaKQCJ^Q^xzojia, ia p.tjlpji^ gar zasad T. r jak postpuje transkrypcja przez ten od -
NIEKTRE SEKWENCJE DNA S WANYMI SYGNAAMI TRANSKRYPCJI

Analiza sekwencyjna DNA swoistych genw, uzyskana za pomoc technologii rekombinacji DNA, umoliwia rozpoznanie licznych sekwencji wanych w procesie transkrypcji genw. Na podstawie bada licznych genw bakteryjnych moliwe byo zbudowanie zgodnych modeli

Miejsce Gtartu transkrypcji Tran skrybo wany region genu Pasmo kodujce 5' Pasmo matrycowe 3'
TGTTGACA
Region 35
TATAAT
* +1
__ z
DNA
Region K
5 PPP-
transkrypcji
(RNA)
Produkt
Ryc. 39-5. Promotory bakteryjne, takie jak pokazany na tej rycinie promotor E. coli. maj 2 wsplne regiony wysoko konserwowanych sekwencji nukleotydowych. Regiony te s umiejscowione 35 i 10 pz w gr (w kierunku 5' pasma kodujcego) od miejsca startu transkrypcji, ktre oznaczono symbolem +1. Wszystkie nukleotydy w gr od miejsca inicjacji transkrypcji okrela si umownie za pomoc liczb ujemnych. Elementy sekwencji regulatorowych DNA {ramka TATA, itp.) s take umownie podawane w kierunku 5'do 3', tak jak w pamie kodujcym. Jednak te elementy funkcjonuj tytko na dwupasmowym DNA,
Kierunek transkrypcji Pasmo kodujce -Pasmo matrycowe-
AGCCCGC TCGGGCG
GCGGGCT TTTTTTTTCGCCCGA AAAAAAAA-
DNA
Pasmo kodujce -Pasmo matrycowe-
AAAAAAAA-
DNA
UUUUUU
Tran skrypt RNA
Ryc. 39-6. Bakteryjny sygna terminacji transkrypcji w genie zawiera odwrcon sekwencj powtarzajc si (2 pola objte ramk) podzielon cznikiem, po ktrej nastpuje cig bogaty w pary AT {rycina ugory). Sekwencja powtarzajca odwrcona po transkrypcji na RNA moe generowa struktur drugorzdow (dwuniciow) w transkrypcje RNA, jak to pokazano w dolnej czci ryciny.
powtrzony ukad sekwencji pt moe wyJwo,Ezy wswntrzczs-teczJcow struktur petlow, jak to przedstawiono na ryc. 39-6. Transkrypcja biegnie dalej do regionu AT w kocu genu i tam za pomoc czynnika biakowego koczcego transkrypcj, zwanego czynnikiem rho (p), polimeraza RNA zatrzymuje si i dysojuje. a pierwotny irans-krypt oddziela si od DNA.
31 Biochemia
W komrkach ssakw sygnay transkrypcyjne s, co nie jest zaskoczeniem, bardziej zoone Jest jasne, e sygnaiy (sekwencje sygnalne) w DN A, ktre kontroluj transkrypcj w ko mrkach eukariotycznych, s rnego rodzaju. Dwa fypy sekwencji sygnalnych s umiejscowione w proksymalnym regionie do promotora. Jedna z nich okrela na czsteczce DNA miejs-
482 / ROZDZIA 39
+1
Region kodujcy tk
Ryc. 39-7. Sygnalne elementy transkrypcji i regulatorowe czynniki biakowe wice DNAwgeniekinazy tymidynowej (tk) DNA-zalena poiimeraza II RNA wie si z regionem w d od regionu ramki TATA (ktry wie czynnik trans^rypcyjny TFIID) i inicjuje transkrypcj od pojedynczego okrelonego nukleotydu. Czsto tego zdarzenia zwiksza si wwczas, gdy s obecne elementy c/5 pooone w gr (na lewo) o pocztku genu (ramki GC i CAAT). Te elementy sygnalne wi odpowiednio czynniki transkrypcyjne Sp1 i CTF i mog funkcjonowa, w pooeniu o odwrconej polarnoci (strzaki). ty, gr>ML.ma_gif .iaiY};f: tramaltrypija, irmg determinuj tak-iêsto ten pr^tlt^ "> * Taj"^ Na Ta ba la 39-2. Niektre elementy transkrypcji i czynniki, ktre si z nimi wi, i ktre znaleziono w genach ssakw, przepisywane przez polimeraz RNA II. Sekwencje DNA tych elementw podano w nawiasach. Maa litera n oznacza kady z nuk-ieotydw Element TATA box (TATAAT) CAAT box (CCAAT) TGG(n)6.7GCCAA GC box (GGGCGG) Ig oktamer (ATTTCGAT) Element wstrzsu cieplnego (Cnn GAAnn TTCnnG) Czynnik TFIID Biaka wice CAAT NF1 (czynnik jdiowy)
Sp1
przykad w genie kinazy tymidynowej wirusa Herpes simplex, ktry do ekspresji genw po suguje si czynnikami transkrypcyjnymi po chodzcymi od gospodarza, ktrym jest komr ka ssakw, znajduje si unikatowe miejsce star tu transkrypcji; dokadno transkrypcji z tego miejsca startu zaley od sekwencji nukleotydowej umiejscowionej f nnkiatydw w r od miejsca startu (ryc. 39-7). Region ten ma sekwencje IATAAAAG i wykazuje znaczn homologi do czynnociowo spokrewnionej ra mki Pribnowa (TATAAT), ktra u prokariontw jest umiejscowiona ok. 10 par zasad w gr od punktu startu mRNA. Polimeraza RNA \S prawdopodobnie wie si do DNA w regionie ramki TATA i nastpnie zaczyna transkrypcj pasma matrycowego w miejscu odlegym o 32 nukleotydy w d (na prawo'). Ramka TATA wydaj E
NFXB (czynnik b genu acucha^, tmmunoglobuliny) Czynnik transkrypcyjny wstrzsu cieplnego
mi&jsca startu, okrelaj, jak czsto ma zacho dzi, zdarzenie transkrypcyjne. Mutacje w tych regionach zmniejszaj czsto startu transkry pcji 1020 razj. l.c.dcmenty DNA nazywaj si ramkamipC i CAAT, poniewa wystpuj tam tego typu sekwencje (tab. 39-2), Jak przed stawiono na ryc. 39-7, jâday tych ramek wiê unikatowe biaki^ -Sp^w-pfzypadkoii&fflii GC i Clf lalb^CTEPB, NF1, NFY) j^_przypadku" ramki CAAT. Czsto inicjacji transkrypcji jestnastcpslw"ern rui7inhni!^-" Ttje.nVi' biakami _g ONA, podczas gdy oddziaywanie biako-DNA z famic '1A'1 A"zapewma_wisni0 jnic-" ^ N A okrela sie jako elementy ^ ^ ^ j y o aktywnoci cis, poniewa s one umiejscowione na tej samej czsteczce DNA, na ktrej mieci si
gen podlegajcy regulacji. Czynniki biakowe okrela si jako czynniki typu trans, poniewa pochodz one od genw umiejscowionych prawdopodobnie na innych chromosomach. Elementy umiejscowione w gr od genu (na lewo od genu) odpowiadaj za wierno i czsto inicjacji i podlegaj rygorystycznym wymaganiom zarwno co do ich pozycji, jak i orientacji. Zmiany w pojedynczych zasadach maj dramatyczny wpyw na ich funkcj. Krytyczna jest odlego tych elementw od miejsca startu i w zasadzie nie s one aktywne, jeli zostanie odwrcona ich orientacja normalnie biegnca w kierunku 5' do 3' (ryc. 39-8). Trzecia kasa sekwp.ncii noisLiiD^zmacniania lub inicjacji transkrypcji eukariolycznych genw. Elementy te s nazywane w zalenoci od skut: ku. jaki wywouj elementarni (enhancers) lub tumicymi (silencers) t pcj. Elementy te znaleziono w rnych miejs-
SYNTE ZA, PRZEKS ZTACANIE I METABOLIZM R NA / 483
Ekspresja regulowana
Ekspresja podstawowa j
Inne elementy regulatorowe
Sekwencje wzm ac niajce ( + ) I wyciszajce
(-)
HHh
Elementy w gr od genu (ramka CAAT) ttp.
Elementy blisze genu (ramka TATA)
+1
Gen strukturalny V/ -------------
1
ukturalny j
Ryc. 39- 8. Schematyczny diagram pokazujcy transkrypcyjne regiony kontrolne hipotetycznego eukariotycznego genu klasy II (dajcego jako pro dukt mRNA}. Taki gen moe by podzielo ny na regio n strukturalny i regulatorowy, a miejsce graniczne tych regionw jest zdefinio wane jako miejsce startu transkrypcji (+1 -w- *). Gen strukturalny zawiera sekwencj DNA, ktra jest transkrybowana na mRNA, ktry ostatecznie ulega translacji na biako. Region regulatorowy skada si z 2 elementw zapewniajcych podstawow ekspresje genu Komponent proksymalny, zwykle ramka TATA, kieruje polimeraz II RNA na odpowiednie miejs ce (co zapewnia wierno transkrypcji). Inny kompo nent, element pooony w gr, okrela czsto inicjacji. Spord tych elementw najlepiej jest poznane biako CAAT, ale wystpuj inne sekwencje (Sp1, NF1, AP1, itp.), ktre mog by uyte w rnych genac h. W regulowanej ekspresji bior udzia elementy, ktre wzmacniaj (enhancers) lub wyciszaj (silencers) ekspresj oraz elementy, ktre porednicz w reakcji na rne sygnay, jak hormony, szok cieplny, metale i zwizki chemiczne. Swoista tkanko wo ekspresja jest zapewnio na take przez swoiste sekwencje tego typu. Jest moliwe, e te 2 regiony regulatorowe nakadaj si funkcjonalnie (pokazuje to linia czca). Zalenoci funkcjonalne od orientacji wszystkich tych elementw pokazuj strzaki wewntrz prosto ktw. Na przykad element proksymalny musi mie orientacj 5' do 3'. Elementy pooone w gr od elementw proksymalnyc h najlepiej funkcjo nuj w orientacji 5' do 3', ale niektre z nich mog mie o dwrco n orientacj (odwrcon polarno). Linie przerywane po kazuj, e niektre elementy nie s uplaso wane na stae w stosunku do miejsca startu transkrypcji. Istotnie, niektre elementy odpowiedzialne za regulowan ekspresj mog by umiejscowione jako elementy rozproszone wrd elementw uplasowanych w gr o d genu lub mog by one umiejscowione w d od miejsca startu transkrypcji (np. w obrbie intro nw).
cach zarwno w gr, jak i w d od miejsca startu transkrypcji. W odrnieniu od elemen tw lecych proksymalnie i w gr od promo tora, sekwencje wzmacniajce i tumice mog wywiera swj wpyw take wwczas, gdy s umiejscowione w odlegoci setek lub tysicy zasad od jednostek transkrypcyjnych umiejscowionych na tym samym chromosomie (cis sprzonych). Jest zaskakujce, e sekwencje wzmacniajce i tumice s aktywne niezalenie od ich orientacji (polarnoci). T3, TRH, cAMP, prolaktyny itp.) dziaaj jako sekwencje wzmacniajce lub tumice, albo w sprzeniu z nimi (p. rozdz. 44). Inne procesy wzmacniaj lub tumi ekspresj genu, np. reakcje na wstrzs cieplny, metale (Cd 2+ i Zn2+ ) i niektre toksyczne zwizki chemiczne (np. dioksyna), dziaajc przez swoiste elementy regulatorowe. Tkankowo swoista ekspresja genw, np. gen albuminy w wtrobie, zachodzi take przez swoiste sekwencje DNA. Wspln cech tych podstawowych i regulatorowych elementw jest to, e zawsze zachodzi
Elementy reakcji hormonalnej (dla steroidw,
interakcja swoistych biaek z sekwencjami DNA. Wiele takich czynnikw zidentyfikowano (tab. 39-2), a wielki wysiek badawczy powica si analizie wpywu oddziaywa biako--DNA na transkrypcj genu.
Sygnay terminacji transkrypcji dla eukarioty-cznej polimerazy RNA klasy II s
sabo poznane. Jednak wydaje si, e sygnay terminacji znajduj si daleko w d (na prawo) od sekwencji kodujcych genw eukariotycznych. Na przykad sygna dla terminacji transkrypcji mysiej P-globiny wystpuje w licznych miejscach 1000 do 2000 zasad od miejsca, w ktrym jest dodawana sekwencja (ogon) poli (A). Niewiele wiadomo o procesie terminacji ani o tym, czy w proces ten s wczone swoiste czynniki terminacji podobne do bakteryjnego czynnika p. Wiadomo jednak, e koniec 3' mRNA jest syntetyzowany_w_jakxesie potranskrypcyjnym TwyHajeji pr^biega w 7 fflzftch. Pn przejciu pomerazy RNA klasy II regionu jednostki transkrypcyjnej kodujcego 3' kocowy frag ment traskryptu, endonukeaza RNA przecina pierwotny transkrypt w miejscu ok. 15 zasad
4-84 / ROZDZIA 39
.w kierunku 3' od sekwencji AAUAAA, ktra wydaje si by sygnaem do przecicia transkryptw eukariotycznych. Wreszcie nowo utworzony koniec 3' jest poliadenylawan y w nirkieplazmie, jak to opisano niej.
ELEMENTY DNA TYPU CIS W GENACH KLASY III S UMIEJSCOWIONE WEWNTRZ GENU
polimcraza RNA klasy III, ktra odpowiada za transkrypcj genw tRNA geW inaoczsteczkowych RNA (p;- rozdz. 37) rozpoznaje promotor, ktry jest umiesz czony wewntrz genu, ktry ma ulec ekspresji, a nie w gr od punktu startu transkrypcji. W przypadku eukariotycznych genw tRNA s wewntrzne oddzielne bloki (A i B) sekwencji, ktre dziaaj jako promotor wewntrzgenowy. Sekwencje w obrbie blokw A i B w dojrzalej czsteczce tRNA znajduj si w regionach dob rze konserwowanych i bior udzia w wytworze niu odpowiednio ptli DHU i ptli TC (ryc. 37-11). Dziki manipulacji struktur genw tRNA wykazano, e optymalna odlego dla funkcji promotora midzy blokami A i B wynosi 30 40 par zasad, i e punkt startu transkrypcji znajduje si midzy 10 16 par zasad.w gr od bloku A. Dla genu 5S RNA, ktry take jest przepisywany przez polimeraz RNA klasy III, istnieje swoisty transkrypcyjny czynnik bia kowy, ktry prawdopodobnie, przez interakcj z czsteczk RNA polimerazy klasy III, umo liwia dopasowanie jej miejsca katalitycznego do punktu startu transkrypcji na DNA. Podobny mechanizm, wykorzystujcy swoiste czynniki transkrypcyjne o aktywnoci trans, moe by wczony w transkrypcj genu tRNA.
m rk ach pro kariot yczn ych t ransk ryp cj a i translacja s ze sob sprzone. W konsekwencji prkariotyczne mRNA podlegaj niewiel kim modyfikacjom i przeksztaceniom przed rozpoczciem swojej czynnoci w procesie syntezy biaek. Prkariotyczne czsteczki rRNA i tRNA s przepisywane w postaci jednostek znacznie duszych ni ich czsteczka kocowa. W istocie liczne jednostki transkrypcji tRNA zawieraj wicej ni 1 czsteczk. Zatem w organizmach prokariotycznych do wytworzenia dojrzaych czynnociowo czsteczek jest niezbdne przeksztacenie prekursorowych czsteczek rRNA i tRNA. Prawie wszystkie pierwotne transkrypty eu-kariotyczne RNA podlegaj duym przeksztaceniom w okresie midzy czasem, w ktrym zostaj zsyntetyzowane a czasem, w ktrym su swojej funkcji kocowej; przeksztaceniom podlegaj zarwno mRNA, jak i czsteczki strukturalne, takie jak rRNA, 5S RNA albo tRNAjfoces.. przeksztacenia /ach ody i gwnie w obre-bk jdra. Proces ten obejmuje dodanie czapeczki metylacj jnej, reakcje nuklco-litycznc i reakcje czenia (ligacji), dodanie niik-leotydw kocowych i modyfikacje nukleozydw. Jednak wiadomo, e w komrkach ssakw 50-70% jdrowego RNA, wczajc w to RNA, ktre otrzymay czapeczki w kocach 5', nie znajduje si w cytoplazmatycznym mRNA. Ten jdrowy ubytek RNA jest znaczco wikszy ni naleaoby tego oczekiwa jedynie jako wyniku utraty samych sekwencji wtrconych (patrz niej). Dokadna rola widocznego nad miaru transkryptw w jdrze komrek ssakw nie jest znana.
ZANIM CZSTECZKI RNA STAN SI CZSTECZKAMI AKTYWNYMI CZYNNOCIOWO. CZSTO S PRZEKSZTACANE

W organizmach prokariotycznych pierwotne transkrypty genw kodujcych mRN A s uyte jako matryce do translacji nawet przed uko czeniem transkrypcji. Dzieje si tak prawdopodobnie dlatego, e miejsce transkrypcji nie jest ograniczone do obszaru jdra, jak to ma miejsce w organizmach eukariotycznych. Zatem w ko-
KODUJCE CZCI (EKSOIUY) WIKSZOCI GENW EUKARIOTYCZNYCH S POPRZEDZIELANE INTRONAMI

W wyniku postpu w technice klonowania i sekwencjonowania DNA stao si oczywiste, e midzy porcjami wieluênw kodujcyi arnioakwast (eEsony) s rozproszone dugie sekwencje DNA, ktre nie nios informacji genetycznej ostatecznie przetumaczonej na sekwencj aminokwasw w czsteczce biakowej (p. rozdz, 38). W rzeczywistoci te sekwencje przerywaj kodujce regiony genw J struktura!-nych. TerTrtn|cone sekwencje (introny).znajduj si w-wtkszoci, ale nie we wszystkich genach
SYNTEZA, PRZEKSZTACANIE I METABOLIZM RNA f 4S
wyszych organizmw eukariotycznych. Pier wotne transkryp ty genw strukturalnych zawie-nija.RNA komplementarny do sekwencji wtrconych. Icdnakickwcncjc mtronowe w RNA s -^. wycite z tTgij^Tr^, g ftrsru transkryptu. sa. jijdra tidpowicdntET5fet!l*j4iilCZme (ligacja) zanim pows, tajca czsteczka mRJ\A pojawi si w cytoplazmic, gdzie bdzie suya do translacji (ryc. 39-9 i 39-101. Wyjaniono mechanizmy, przez ktre intro-ny s usuwane z pierwotnego transkryptu na terenie jdra, mechanizmy spajania eksonw z wytworzeniem dojrzalej" czsteczki mRNA i mechanizmy transportu czsteczki mRNA do cytoplazmy. Mimo e sekwencje nukleotydw w intronach rnych eukariotycznych trans-kryptw, a nawet te w obrbie pojedynczego
transkryptu, s bardzo heterogenne, w kadym z 2 pocze ekson-intron (miejsce spojenia) sekwencje s dobrze konserwowane (sekwencje konsensus pokazane s na ryc. 39-10). Swoista struktura, zwana spiiceosomem, bierze udz w przeksztaceniu pierwotnego transkryptu na mRNA. Spliceosomy skadaj si zpierwotnego transkryptu, 4 maoczs teczko wy ch RNA (Ul, U2, U5 i U4/U6) i nieokrelonej liczby biatek. Czsteczka Ul snRNAjest komplementarna do sekwencji konsensus w miejscu skadania 5', U2 do miejsca rozgazienia, a U5 do miejsca skadania 3'. Te czsteczki snRNA wnosz prawdopodobnie aktywno katalityczn. Obecnie odkryto, e w procesie usuwania sekwencji intronowych z pre-mRNA tworzy sie niezwyka czsteczka RNA i przypominajca
Two rzen ie stru ktu ry
Nacicie przy koficu 3' Intronu
Cap[
G-G
Ugacja ekaonu 1 do Ka ca S'eksonu Z Enzymatyczne strawtenre [ntronii
Ryc. 39-9. Przeksztacanie pierwotnego transkryptu (hnRNA) w mRNA. W tym hipotetycznym transkrypcie lewy koniec intronu jest przecity (|) i intron tworzy ptl (lasso) midzy swoim kocem 5' i A przy kocu 3' w obrbie sekwencji konsensus UACUAAC. Nastpuje wwczas nacicie prawego koca intronu (O). Powoduje to uwolnienie ptli, ktra jest strawiona enzymatycznie, a ekson 1 ulega poczeniu z eksonem 2 przez reszty G.
Sekwencja kon UAAGU IntronRyc. 39-10. Sekwencje konsensus w miejscu poczenia. -l Ekson 3'
486 / ROZDZIA 39
lasso. Okazuje si, e koniec 5' sekwencji wtrconej, czy si przez wizanie fosfodiestrowe 2r-5' z reszt nukleotydu adenylowego 28-37 nukleotydw w gr (na lewo) od koca 3' sekwencji wtrconej (intronu). Proces ten i omawiana struktura jest schematycznie przedstawiona na ryc. 39-9. Wydaje si, e rozwizano tajemnic wzajemnych relacji hnRNA i odpowiadajcego mu dojrzaego mRNA w komrkach eukariotycz-nych. Cza^leczkiJinRNA s pierwotnymi trans-kryptami oraz produktami swoich wczesnych przeTztaloent^ "dodaniu czapeczek i sekwencji poli(A) oraz zabraniu czci odpowiadajcej mtronom, czsteczki te s transportowane do cytoplazmy jako dojrzae czsteczki mRNA. Przeksztacanie czsteczek hnRNA moe potencjalnie shiyiTSo regulacji ekspresji genw. Wykazano, e alternatywne wzory skadania RNA mog by przedmiotem kontroli rozwoju embrionalnego. Mona poda liczne przykady, ale 3 z nich okrelaj istot zagadnienia. Na przykad cytoplazmatyczne mRNA dla a-amy-lazy w liniance szczura i wtrobie szczura rni si sekwencjami 5', podczas gdy pozostaa cz mRNA genw zawierajcych region kodujcy i miejsce dodania sekwencji poli(A) s identyczne. Dalsza analiza wykazaa, e chocia pierwotne transkrypty s due i nakadajce si, rne miejsca skadania s uyte do poczenia 2 rnych czapeczek i sekwencji liderowych do takiego samego trzonu mRNA. W dodatku alternatywne wzory skadania DNA s uyte do wytworzenia 2 rnych mRNA kodujcych ciki acuch immunog] obu liny jeden, ktry koduje ciki acuch biakowy zwizany z bon i drugi, ktry koduje ciki acuch biaka ulegajcy wydzielaniu (p. rozdz. 41). Skadanie (spajanie) RNA jest zwykle niezbdne w celu wytworzenia czsteczek informacyjnego RNA, a wymg skadania jest dodatkowym mechanizmem zrnicowanej regulacji ekspresji genu. Przynajmniej 1 posta p -talasemii, choroby, w ktrej gen p-globiny jest silnie wytumiony, pojawia si w wyniku zmiany nukleotydw w miej scu poczenia ekson-intron, co wyklucza usunicie intronu i przez to prowadzi do zmniejszonej syntezy acucha p lub j wyklucza. Jest to konsekwencja przerwania normalnej ramki odczytu w mRNA. Jest oczywiste, e wada w podstawowym procesie, jakim jest skadanie RNA, zmniejsza dokadno, jak musi mie proces skadani a RNA-RNA.
RNA MOE DZIAA JAKO CZYNNIK KATALITYCZNY

Jako dodatek do katalitycznej aktywnoci wnoszonej przez snRNA w ksztatowaniu czsteczki mRNA, przynajmniej 3 inne reakcje przeksztacenia RNA s katalizowane przez RNA. Obserwacje, przeprowadzone na orga-nellach rolin, drody, wirusw i komrek wyszych eukariontw, wykazuj, e RNA moe dziaa jako enzym. Odkrycie to zrewolucjonizowao nasze pojcia o dziaaniu enzymw i pocztkach ycia.
INFORMACYJNY RNA (mRNA) JEST MODYFIKOWANY NA KOCACH 5' i 3'

Jak wspomniano wyej, czsteczki mRNA ssakw maj struktur zwan czapeczk na kocu 5' i wikszo z nich ma sekwencj (ogon) poli(A) w kocu 3'. Struktura czapeczki jest dodana do koca 5' nowo przepisywanego prekursora mRNA w jdrze przed t ransportem czsteczki mRNA do cytoplazmy. Sekwencja poli(A)(gdy wystpuje) jest dodana albo w jdrze, albo w cytoplazmie. Wtrne metylacje czsteczek mRNA w obrbie grup 2'-hydroksylowych i atomu N6 reszt adenylanowych wystpuj po pojawieniu si czste czki mRNA w cytoplazmie. Czapeczka 5' transkryptu RNA jest niezbdna do wytworzenia kompleksu rybo nukleoprotei nowego, do reakcji skadania, i moe by wczona w transport mRNA oraz rozpoczcie translacji, a take osania koniec 5' mRNA przed atakiem egzonukleaz dziaajcych w kierunku 5' *3r . Rola sekwencji poli(A) jest nieznana, ale wydaje si, e polega ona na osonie koca 3' RNA przed atakiem cgzonukleazy dziaaj cej w kierunku 3'-+ 5'. W adnym przypadku wystpowanie lub brak sekwencji poli(A) nie determinuje, czy prekursorowa czsteczka obecna w jdrze pojawi si w cytoplazmie, poniewa nie wszystkie czsteczki hnRNA zawierajce sekwencj poli{A) wchodz w skad cytoplaz-matycznego mRNA, ani nie wszystkie cytoplazmatyczne czsteczki mRNA zawieraj sekwencj poli(A) (histony s najlepiej zauwaalnym przykadem). W komrkach ssakw reakcje cytoplazmatyczne mog dodawa i usuwa re szty adenylanowe z sekwencji poli(A); procesy te s zwizane ze zmian stabilnoci mRNA.
Wielko czsteczek cytoplazmatycznego mRNA, nawet po usuniciu sekwencji poli(A), jest znacznie wiksza, czsto 23 razy, od wielkoci wymaganej do kodowania swoistych biaek, dla ktrych stanowi one matryc. Dodatkowe nukleotydy wystpuj w regionach nie ulegajcych translacji (niekodujcych) zarwno po stronie 5', jak i 3' regionu kodujcego; najdusze sekwencje nie ulegajce translacji znajduj si zwykle przy kocu 3'. Waciwa rola tych sekwencji nie jest znana, ale s one wczone w przeksztacanie RNA, transport, degradacj i translacj. Transportujcy RNA (tRNA) jest znacznie modyfikowany Czas teczki _tRNA, jak to opisano w rozdz. 37 i 40,~sIu jako czsteczki adaptacyjne do translacji mRNA na sekwencje aminokwasw jw^KSEacnTCsteczki tRNA zawieraj liczne modyfikacje zasad podstawowych A, U, G i C. Niektre" z nich s to proste metylowane pochodne, a niektre maj przeksztacone wizania glikozydowe. Czsteczki tRNA u proka-riontw i u eukariontw s przepisywane w po-taclduych czsteczek prekursorowych, zawierajcych czsto wicej ni 1 tRNA i wtedy podlegaj przeksztaceniom nukleolitycznym i zmniejszeniu wielkoci; proces jest katalizowany przez swoist klas rybonukleaz. W dodatku geny niektrych czsteczek tRNA maj, bar dzo blisko czci odpowiadajcej ptli antyk o-donowej, pojedynczy intron o dugoci 10-40 nukieotydw. Te introny w genach tRNA s przepisywane; dlatego te przeksztacanie prekursorowych transkryptw wielu czsteczek tRNA musi obejmowa usunicie intr.ouw i odpowiednie rlp^-nie rpginn^ antyjcodoiiowego tak, aby powstaa aktywna czsteczka adaptacyjna do syntezy biaek. Enzymy nukleolity-czne, przeksztacajce prekursory tRNA, rozpoznaj najpewniej 3 -wy miarow struktur, a nie tylko sekwencj liniow RNA. Dziki temu ten ukad enzymatyczny przeksztaca tylko te czsteczki, ktre s zdolne do sfal-dowania w produkty majce waciwoci czynnociowe. Dalsze modyfikacje czsteczek tRNA obejmuj alkilacj nukieotydw i doczenie charak-terystycznej kocwki C-C-A przy kocu 3' czsteczki. Ta kocwka C-C-A jest miejscem przyczenia swoistego aminokwasu, ktry ma wej w reakcj polimeryzacji podczas syntezy biaka. Metylacja prekursorw tRNA u ssa-
kw zachodzi prawdopodobnie w jdrze, pod czas gdy o"9cTcie i doczenie C-C-A s czynnociami cytoplazmatycznymi, poniewa kocwki te maj szybszy metabolizm ni same czsteczki tRNA. W cytoplazmie komrek ssakw s enzymy niezbdne do doczenia aminokwasw do reszt C-C-A. Rybosomalny RNA (rRNA) jest syntetyzowany jako dua czsteczka prekursorowa W komrkach ssakw 2 wiksze czsteczki rRNA i 1 mniejsza czsteczka rRNA s przepi sane jako cz pojedynczej duej czsteczki prekursorowej (ryc. 39-11). Czsteczka prekursorowa jest nastpnie na terenie jderka prze ksztacana, w wyniku czego powstaj skadowe RNA dla podjednostek rybosomw znajduj cych si w cytoplazmie. Geny rRNA s umiejscowione w jderkach komrek ssakw. W kadej komrce znajduj si setki kopii tych genw. Geny rRNA s przepisywane jako jednostki, z ktrych kada koduje (w kierunku 5'-*3') 18S, 5,_8S i 28S rybosomalny RNA. Pierwotny transkrypt j ?st czsteczk o masie 45S silnie z me ty 1 owa n nart renie jderka. Prekursorw a czsteczka 45S, dajca ewentualnie segment 28S, zawiera 65 grup metylowych w rybozach i 5 grup metylowych w zasadach. Metylowane s tylko te czci prekursora, ktre ewentualnie stan si stabilnymi czsteczkami rRNA. Czsteczka prekursorowa 45S jest przeksztacana nukleolitycznie, ale sygnay do tego przekszta cania s zupenie inne ni te, ktre znajduj si w hnRNA. Std przeksztacanie nukleolityczne zachodzi na drodze mechanizmu swoistego i odmiennego od tego, ktry jest odpowiedzialny za przeksztacenie hnRNA do mRNA. Jak przedstawiono na ryc. 39-11 prawie poowa oryginalnego pierwotnego transkryptu jest degradowana. W czasie przeksztacania rRNA zachodzi dalsza metylacja i ewentualnie na terenie jad erek acuchy 28S cz si z biakami rybosomalnymi i tworz wiksz podjednostk rybosomaln o masie 60S. Czsteczka 5,8S rRNA powstaje take z prekursorowego .Rhl A 45S na terenie jderka i staje si integraln czci podjednostki rybosomalnej. Mniejsze rybosomalne podjednostki (40S) tworz si przez poczenie odpowiednich biaek ryboso-malnych z czsteczk 18S rRNA.
488 / ROZDZIA 39
|5.es
Ryc. obraz 39-11. Schematyczny
przeksztacania rybosomalnego RNA, Kocowe produkty s pokazane jako zaczernione paeczki. Seria zoonych procesw potranskrypcyjnych, obejmujcych przeksztacanie przy uyciu auto- i egzonukleolitycznych, swoistych dla RNA, rybonukleaz generuje rR NA klas 18S, 5,8S i 28. Czsteczki 5,8S i 28S s zwizane ze sob wizaniami wodorowymi. Na ryc. 39-4 pokazano fotografi z mikroskopu elektronowego rybosomalnych genw w trakcie transkrypcji.
28S
KWASY NUKLEINOWE S TRAWIONE PRZEZ SWOISTE NUKLEAZY

Od wielu lat s znane enzymy zdolne do rozkadu kwasw nukleinowych. Enzymy te s klasyfikowane w rny sposb. Te, ktre s swoiste w.stosunku do kwasu_de.Qksyjpy.bonuk-kinowego nazywa sie deoksyryhonukLeazami, a te, ktre swoicie Tiydrolizuj kwasy rybonuk-leinowe s rybonukleazami, W obrbie kadej
z tych klas znajduj si enzymy zdolne do rozszczepienia wewntrznych wiza fosfodies-trowych, w wyniku czego powstaj kocwki 3'-hydroksylowe i 5'-fosforanowe albo 5'-hyd-roksylowe i 3'-fosforanowe. Enzymy te nazywa si endonukleazami. Niektre z nich zdolne s do hydrolizy obu pasm dwupasmowej czsteczki, podczas gdy inne mog przecina pojedyncze pasma kwasw nukleinowych. Niektre nukleazy mog hydrolizowa tylko niesparowa-
SYNTE ZA, PRZEKS ZTACANIE I METABOLIZM RNA / 489
ne pojedyncze pasma, podczas gdy inne maj zdolno' hydrolizowania pojedynczych pasm pozostajcych w strukturze dwupasmowej czsteczki. Istniej klasy endonukleaz. _ktre rozpoznaj swoiste sekwencje w DNA; wikszo z nich to endonukleazj restrykcyjne, ktre obecnie stay si wanym narzdziem w genetyce molekularnej i naukach medycznych. W tabeli 42.1 przedstawiono list niektrych obecnie znanych endonukleaz restrykcyjnych. Niektre nukleazy s zdolne hydrolizowa nukleotyd tylko wwczas, gdy znajduje si on na kocu czsteczki; s to egzonukieazy. Eg-zonukleazy dziaaj tlkoWjectayjiJeruK y j y j y j J . 3' aipo a - 5 j. u bakterii egôrtuiOeaza 3'- 5' jest mtegraTn"zci replikacyjnej maszynerii DNA, gdzie suy do odcicia wieo dodanego deoksynukleotydu w przypadku bdnego parowania zasad.
REGULACJA ROZPADU STANOWI JESZCZE INNY MECHANIZM REGULUJCY ILO INFORMACYJNEGO RNA
Chocia w komrkach ssakw wikszo mRNA jest bardzo stabilna (okresy ptrwania wynosz godziny) obrt innych jest bardzo szybki (okresy phrwania 10 30 min). W aie-ktrych przepadkach stabilno mRNA pod lega regulacji. Ma to wane implikacje, poniewa zwykle mamy do czynienia z prost zalenoci midzy iJoci mRNA a przetumaczeniem tego mRNA na kodowane przez niego biako. Zmiany w stabilnoci swoistych mRNA mog mie przeto due wpywy na procesy biologiczne. Informacyjne RNA egzystuj w cytopiazmie jako czsteczki rybonukleoproteinowe (RNP).
Niektre z biaek ehroni mRNA przed trawieniem przez- Hukleazy, podczas gdy inne mog w pewnych warunkach pobudza ata k nuk-leazowy. Sdzi si, e mRNA s stabilizowane ub destabilizowane przez interakcje biaek z ich rnymi strukturami i sekwencjami. Niektre efektory, np. honnony, mog regulowa stabilno mRNA przez zwikszanie lub zmniejszanie iloci tych biaiek. Obecnie wiadomo, e koce czsteczek mRNA odpowiadaj za stabilno mRNA (p. ryc. 39-12). Struktura, zwana czapeczk, w kocu 5r cuka-riotycznego mRNA zapobiega atakowi 5' eg-zonukleaz, a sekwencja poli (A) zapobiega "aktywnoci 3' egzonukieaz. Zakada si, e w czsteczkach mRNA majcych te struktury pojedynczy atak endonukleolityczny pozwala na atak egzonukieaz i strawienie caej czste czki. Sdzi si, e inne struktury (sekwencje) w obrbie 5' niekodujcych sekwencji (5' NCS), w obrbie regionu kodujcego i w obrbie 3'NCS mog pobudza albo zapobiega temu pocztkowemu dziaaniu endonukleaz (ryc. 3912). W celu ilustracji podano kilka przykadw. Usunicie 5'NCS powoduje 3 5-krotne przeduenie okresu ptrwania c-myc mRNA. Skrcenie kodujcego regionu histonowego mRNA powoduje przeduenie okresu ptrwa-oia. Rodzaj autoregulacji stabilnoci mRNA porednio obejmuje region kodujcy. Wolna tubulina wie si z pierwszymi 4 aminokwasami powstajcego acucha tubuliny, w miar jak ten wyania si z rybosomu. Powoduje to ak tywacj RNazy zwizanej z rybosomem, ktra nastpnie trawi mRNA tubuiiny. Struktury przy kocu 3', cznie z sekwencj poli(X7 wymagaj tub osabiaj stabilno swoi stych mRNA. Brak sekwencji poli(A) jest zwizany z szybkim rozk adem mRNA, a zabranie
Czapeczka -----
5'NCS
Sekwencja Kodujce
3'NCS
--- A -A -A -A -A"
AUUUA
Ryc. 39-12. Struktura typowego eukariotycznego mRNA pokazujca elementy biorce udzia w regulacji stabilnoci mRNA. Typowy eukariotyczny mRNA ma 5' niefcoduja.ee sekwencje (5' noncoding sequences, 5' NCS), region kodujcy i 3' NCS. Prawie wszystkie eukariotyczne mRNA maj czapeczk zmodyfikowa nych nukleotydw (cap) w ko cu 5' i wikszo ma w ko cu 3' trakt (ogo n") sekwencji poliadenylo -wych. Czapeczka u ko ca 5' i ogo n poli (A) u ko ca 3' chro ni mRNA przed atakiem egzo nukieaz.
490 / ROZDZIA 39
poli(A) z niektrych RNA powoduje ich destabilizacj. Histonowe mRNA nie maj sekwencji poli(A), ale przy kocu 3' maj sekwencj, ktra moe tworzy struktur ptli z szypu i ta struktura wydaje si by odpowiedzialna za oporno na atak egzonukleolityczny. mRNA histonu H4jest np, degradowany od koca 3' do 5', ale tylko wwczas, gdy zajdzie pojedyncze przecicie endonukleolityczne w odlegoci ok. 9 nukleotydw do koca 3', w rejonie zdolnym wytworzy struktur ptli z szypu. Struktury typu ptla z szypul w obrbie 3* niekodujcych sekwencji koca 3' s take krytyczne dla regulacji jonami elaza mRNA kodujcego receptor transferyny. Struktury ptla-szypua s rwnie zwizane ze stabilnoci mRNA u bakterii, co sugeruje, e mechanizm ten jest szeroko wykorzystywany. Inne sekwencje koca 3' pewnych eukarioty-cznychmRNA bior udzia w destabilizacji tych czsteczek. Szczeglnie interesujce s regiony bogate w sekwencje AU, z ktrych wiele zawiera sekwencje (motyw) AUUUA. Sekwencje takie znajduj si w mRNA, ktre maj krtki okres ptrwania i obejmuj mRNA dla wielu on-kogenw i cytokin. Wano tego regionu uwypukla dowiadczenie, w ktrym sekwencja odpowiadajca regionowi niekodujcemu 3' krtko yjcego mRNA,czynnika stymulujcego kolonie (CSF), ktry zawiera motyw AU U U A, byta dodana do koca 3' mRNA P -globiny. Zamiast uzyskania duej stabilnoci taki hyb rydowy mRNA |3-globiny stal si krtko yjcym mRNA, CO jest cech charakterystyczn mRNA CSF. Z tych kilku cytowanych przykadw jasno wynika, e liczne mechanizmy
uczestnicz w regulacji stabilnoci mRNA, podobnie jak liczne mechanizmy bior udzia w regulacji syntezy mRNA CSF. Skoordynowana regulacja tych 2 procesw daje komrce znaczn zdolno adaptacyjn.
PIMIENNICTWO
Breathnach R, Chambon P: Organization and eipression of eucaryotic split genes coding for proteina. Annu Rev Biochem 1981;5O:349. Dynan WS, Tjian R: Control of eucaryotic mRNA synthesis by seuence specific DNA binding proteins. Natur (ondon) 1985i3I6:774. Maniatis T, Read R; The role of smali nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splieing. Natur (London) 1987:315:671. McClure WR: Protein-nucleic acid interactions in transcription: A molecular analysis. Annu Rev Biochem 1985;54:171. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes ia mammalian cells. Celi 1986; 46:795. Nevins JR: The pathway of eukaryotic mRNA formation. Annu Rev Biochem 1983,52:44J. Pacigett RAet al: Splicingof messenger RNA precursors. Annu Rev Biochem 1986;55:1119. Ross J: The turnover of messenger RNA. Sci Ani 1989;260:48. Ruskin B et al: Excision of an intact intron as a novel lariat structure during pre-mRNA splicing in vitro. Cel! 1984;38:317. Sentenec A: Eucaryotic RNA polymerases. Crit Rev Biol 1985;18:31. Shapiro DJ et al: Regulation of mRNA stability in eukaryotic cells. Bioessays 1987;6:221, Sliarp PA; On the origin of RN A splicing and introns. Celi 1985;42:397.
Synteza biaek i kod genetyczny

Dary! K. Granner, MD
40
do sekwencji nukleotydw w kodujcym pamie odpowiedniego genu, stosownie do reguy parowania zasad. Wiele rnych klas RNA bierze udzia w kierowaniu syntez biaek. U prokariontw zachodzi linijna wspzaleno midzy genem a informacyjnym RNA (mRNA) przepisywanym z genu i produktem nohpeptydowym. Sytuacja ta jest bardziej sTcompIikowana w komrkach wyszych organizmw eukariotycznych, w ktrych pierwotny transkrypt, heterogenny jdrowy RNA (hnRNA), jest znacznie duszy ni dojrzay mRNA. Dua czsteczka hnRNA zawiera ko dujce regiony (eksony), ktre bd tworzyy dojrzay mRNA, oraz dugie sekwencje wtrcone (introny), ktre oddzielaj eksony. hnRNA podlega przeksztaceniom na terenie jdra i introny, ktre czsto stanowi wiksz cz hnRNA ni eksony, zostaj usunite. Eksony s w tym procesie czone i tworz dojrzay mRNA, ktry jest transportowany do cy toplaz-my, gdzie ulega translacji na biako. Komrka musi mie niezbdny mechanizm do dokadnego i wydajnego przetumaczenia informacji z nukleotydowej sekwencji mRNA na sekwencj aminokwasw odpowiedniego swoistego biaka. Wyjanienie i zrozumienie tego procesu, zwanego translacj, byo moliwe po zamaniu kodu genetycznego. Ju we wczesnym okresie bada byo wiadomo, e czsteczki mRNA jako takie nie maj powinowactwa do aminokwasw, a zatem translacja informacji zawartej w sekwencji nukleotydw mRNA na sekwencj aminokwasw w biaku wymaga poredniczcej czsteczki adaptacyjnej. Taka czsteczka adaptacyjna musi z jednej strony rozpozna sekwencj nukleotydow, a z drugiej swoisty aminokwas. Za pomoc takiej czsteczki
WPROWADZENIE
Litery A, G, T i C odpowiadaj nukleotydom wystpujcym w DNA. S one zorganizowane w 3 literowy kod zwany kodonem, a zbir tych kodonw obejmuje kod genetyczny. Linijny szereg kodonw (gen) okrela syntez rnych czsteczek RNA, z ktrych wikszo jest wczona w syntez biaek. Synteza biaek zachodzi w 3 gwnych etapach: inicjacji, elongacji i termin acji. Proces ten przypomina replikacj DNA i generaln zasad transkrypcji i faktycznie przebiega z zachowaniem polarnoci 5'3'.
Zrozumienie syntezy biaek i wyjanienie mutacji byo niemoliwe zanim nie zosta wyjaniony kod genetyczny. Kod genetyczny stanowi podstaw do wyjanienia, w jaki sposb wady w biakach mog wywoywa choroby genetyczne oraz w diagnostyce i w pewnych przypadkach leczenia tych chorb. Ponadto patofizjologia wielu zakae wirusowych jest zwizana ze zdolnoci wirusw do przerywania syntezy biaek gospodarza.
INFORMACJA GENETYCZNA PRZEPYWA Z DNA DO RNA DO BIAEK

Informacja genetyczna zawarta w sekwencji nuktetsdytw DNA jest przepisywana w jdrze komrkowym na swoist sekwencj nukleoty-dw w czsteczce RNA. Sekwencja nukJeoty-dc-w w transkrypcie RNA jest komplementarna
492 / ROZDZIA 40
adaptacyjnej komrka moe wprowadzi aminokwas w odpowiedni pozycj sekwencji biakowej dyktowanej sekwencj nukleotyd w swoistego mRNA, Istotnie funkcjonalne grupy aminokwasw nie kontaktuj si bezporednio z matryc mRNA.
KOD GENETYCZNY JEST ZDEGENEROWANY, JEDNOZNACZNY, NIENAKADAJCY SI, BEZPRZESTANKOWY I UNIWERSALNY

Trzy spord kodonw nie koduj swoistego aminokwasu; nazwano le Kodonami nonsensownymi. Przynajmniej 2 z tych nonsensownych kodonw s uywane w komrce jako sygnay terminach'. Okrelaj one, gdzie naley zatrzyma polimeryzacj aminokwasw w czsteczce biakowej. PzostayTi 61 kodonw koduje 20 aminokwasw. W kodzie genetycznym wystpuje zatem ljfeff&ilgffJtfijjC;tztl-i e |igzne j^ n! sam aminokwas, iiada-nie kodu genetycznego wskazuje, e 64 moliwe kodony mog by zgrupowane w 16 rodzin. Rodzin tworz takie kodony, ktre maj. te same pierwsze 2 zasady (tab. 40-1). Kada rodzina zajmuje pojedyncz kolumn midzy Imiami poziomymi, np. kodony CCN, gdzie moe by U, C, A i G, definiuj rodzin umiejscowion w 2 kolumnie 2 przedziau od gry. W niektrych rodzinach wszystkie 4 ko dony koduj ten sam aminokwas, podobnie jak czonkowie rodziny CC opisani wyej. Odnosi si to do rodzin niemieszanych. Kodonw nie-mieszanych jest 8 wrd 16 rodzin kodonw (tab. 40-1). Te rodziny kodonw, ktre koduj wicej ni 1 aminokwas, okrela si jako rodziny mieszane. W 6 rodzinach, spord rodzin mieszanych, kodony zawierajce pirymidyn (U lub C) w 3 pozycji koduj 1 aminokwas, podczas gdy kodony zawierajce w 3 pozycji puryn (A lub G) koduj inny aminokwas albo stanowi sygna lerminacji acucha (tab. 40-1). Pozostae 2 rodziny rodzina UG i rodzina AU nie wykazuj adnego z tych wzorw i s unikatowymi. Na og wic 3 nukleotyd w ko-donie jest mniej wany ni pozostae 2 w okreleniu swoistego aminokwasu, jaki musi by wbudowany do biaka i zjawisko to odpowiada gwnie za degeneracj kodu. Jednak dla ka dego swoistego kodonu wskazuje si tylko pojedynczy aminokwas; z rzadkimi wyjtkami kod genetyczny jest jednoznaczny, ti. dany swoisty kodiiiujesIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino diiijIriEZjpisany dopryedjaiGzegojimino kwasu. Rozrnienie midzy _dwuznc_znosci a degeneracj jest wanyni,. godnym podkrelenia, pojciem. Jednoznaczny, ale zdegeneFswafty-kodjaoe by objaniony w kategoriach molekularnych.
SEKWENCJA NUKLEOTYDW CZSTECZKI mRNA SKADA SI Z SERII KODONW, KTRE ODPOWIADAJ KADEMU AMINOKWASOWI
Czsteczki adaptacyjne, biorce udzia w translacji kodbnow na sekwencje aminokwasw w biaku, sa czsteczkami ti (tRNA). Ryfeosom jest skadnikiem komrki, na ktrym oddziaTuj~ze~roba-rGe wspomniane elementy funkcjonalne, aby zoy czsteczk biaka. Liczne rybosomy mog zbiera si w zespoy biorce udzia rwnoczenie w procesie tumaczenia pojedynczej czsteczki mRNA; zespoy takie nazywamy poiisoniami. Polisomy przyczone do bon cytoplazmy tworz szorst k siateczk rodplazmayczn, ktra suy dla syntezy integralnych biaek bon wewntrznych i biaek, ktre bd wydzielone z komrki. Struktury polisomalne znajduj si take w cy-toplazmie w postaci wolnej; zachodzi na nich synteza tych biaek, ktre pozostan w obrbie komrki. Do syntezy zestawu biaek, komrkowych potrzeba 20 rnych aminokwasw, dlatego musi by przynajmniej 20 oddzielnych kodo-nwj ktre obejmuj kod genetyczny. Poniewa w mRNA wystpuj tylko 4 rne mikleotydy. na kady kodon musi przypada wicej ni 1 nukleotyd purynowy lub pi rym idy no wy. Ko-dony, z ktrych kady skadaby si z 2 flufc-leotydw, dayby tylko 16 (4') swoistych kodonw, podczas gdy kodony o 3 nukleotydach dayby 64 (43) swoistych kodonw. W wyniku pierwszych spostrzee Matthaei i Nirenberga wiemy obecnie, e kady z kodonw ma sekwencj 3 aukJcotydw, czyli kod skada si z tripletw niikjegfrflw. Zamanie kodu genetycznego w duej mierze zaleao od chemicznej syntezy polimerw nukleotydo-wych, a zwaszcza tripletw nukleotydo-wych.
SYNTEZA BIAEK I KOD GENETYCZNY / 493 Tabela 40-1. Kod genetyczny ko do ny w info rmacyjnym RNA)"
Pierwszy nukleotyd U Phe U Pne Leu Leu Leu C Leu Leu Leu Ile A de Ile" Met Val G Val Val Val Drugi nukleotyd C Ser Ser Ser A Tyr TVr Term Term His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Trzeci nukieotyd
G
Cys Cys Term' Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg* Arg" Gly Gly Gly Gly U C A G U C A
Ser Pro
Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala
G
U
nukleotyd w antykodonie, ktry rozpoznaje 3. zasad (w kierunku 3') kodonu, moe by mniej dyskryminujcym (rodziny mieszane) albo nie-dyskryminujcym (rodziny niemieszane), a mi mo to jest w stanie wprowadzi odpowiedni, aktualnie potrzebny, aminokwas. Zjawisko to zmniejsza rygor parowania midzy 3 zasad kodonu a komplementarnym nukleotydem w antykodonie i objania je hipoteza tolerancji (wobble" hypothesis). Zjueltcznymi wyjtkami dany swoisty kodon bdzie wprowadza! tylko 1 swoisty aminokwas, chocia .dany swoisty aminokwas moe by rozpoznany przez wicej ni 1 kodon. "Jak "to wyjanimy niej odczytywanie kodu genetycznego w trakcie procesu synt^^y jj d d j h i
C
A G U C A G
* Okrelenia pierwszy, drugi i trzeci nukleotyd o dno sz si do i ndy wid ua lnyc h nukleo ty d w w ko do nie tripleto wym. U nukleo tyd urydyny; C nukleotyd cytydyny, A nukleotyd adeniny; G nukleotyd guaniny; Met kodon inicjuj cy acuch peptydowy; Term kodon koczcy acuch. A UG triplet kodujcy Met, suy jako kodo n inicjujcy w komrkach ssakw. (S krty aminokwasw s objanio ne w rozdz. 3). ** W mitocho ndriacb ssakw AUA koduje Met a UGA Trp; kodony AGA I AGG su J3ko sygnay koczce acuch.
Rozpoznanie swoistych kodonw w mRNA przez adaptacyjne czsteczki tRNA jest zalene od ich regionu antykodonowego i regu swoistego parowania zasad. Kada czsteczka tRNA zawiera swoist sekwencj komplementarn do kodonu, ktr nazywa si antyk odo ne m. Dla danego kodonn_jw~ -riRNA lylko pojedynczy roTaj czsteczki tRNA ma odpowiedni an ty kod on. Poniewa kada czsteczka tRNA moe by obarczona tylko 1 swoistym aminokwasem, dlaiego kady kodon okrela tylko 1 aminokwas. Jednak niektre czsteczki tRNA mog uywa antykodonu do rozpoznawania wicej ni 1 kodonu. Jak mona zaobserwowa na przykadzie niemieszanych rodzin kodonw,
g ^^y nie obejmuje adnych nakadajcych si kodonw. Kod genetyczny jest wiec kodem nienak-aeJajcym si. Od momentu, od ktrego zacznie si odczytywanie od swoistego kodonu nie ma znakw przestankowych midzy kodonami 1 przekaz informacji jest odczytywany z cigej sekwencji triplctw nukleotydowych, a do cza su gdy osignie si kodon nonsensowny. Dotychczas sdzono, e kod genetyczny jest uniwersalny. Obecnie wykazano, e grupa czsteczek tRNA w mitochondriach (ktre zawieraj oddzielny i rnicy si od cytoplazmatycz-nego mechanizm translacyjny) u niszych i wyszych eukariontw, z czowiekiem wcznie, odczytuje 4 kodony w sposb inny ni czsteczki tRNA w cytoplazmie nawet tych samych komrek. Jak to wynika z tab. 40-1, kodon AUA jest odczytywany jako Met, a UGA koduje Trp w mitochondriach u ssakw. Te 2 kodony mieszcz si w 2 rodzinach kodonw okrelonych jako unikatowe: w rodzinie UG i rodzinie AU. Oczywicie w celu zmniejszenia liczby czsteczek tRNA, niezbdnych do trans lacji kodu genetycznego, mitochondria byy zdolne przeksztaci rodzin UG i rodzin AU do prostych typw mieszanych. Ponadto kodo ny AGA i AGG s odczytywane jako sygnay stop, czyli kodony terminacji acucha, a nie jako kodony Arg. W wyniku tego mitochondria potrzebuj jedynie 22 rodzaje czsteczek tRNA, aby odczyta swj kod genetyczny, podczas gdy system translacji w cytoplazmie ma peny ze
staw 31 rodzajw czsteczek tRNA. Oprcz tego wyjtku kod genetyczny jest uniwersalny. Czsto, z jak jest uywany kodon kadego aminokwasu, rni si znacznie midzy gatun kami i w obrbie rnych tkanek tego samego gatunku. Zestawienia czstoci uywania kodo-
494 / ROZDZIA 40
nw staj si coraz dokadniejsze w miar jak coraz wicej genw jest sekwencjonowanych. Ma to due znaczenie, poniewa badacze potrzebuj odtworzy struktur mRNA na podstawie dedukcji sekwencji aminokwasw w czci biaka w celu uzyskania, na drodze syntezy, sondy oligonukleotydowej niezbdnej do rozpoczcia procesu klonowania rekombinacyjne-go DNA.
DLA KADEGO Z 20 AMINOKWASW ISTNIEJE PRZYNAJMNIEJ 1 RODZAJ TRANSFEROWEGO RNA (tRNA)

Czsteczki tRNA maj zadziwiajco podob ne funkcje i trjwymiarowe struktury. Funkcja czsteczek rRNA jako adaptatorw wymaga obarczenia kadego swoistego tRNA swoisty m aminokwasem. Poniewa nie ma powinowact wa kwasw nukleinowych do swoistych grup funkcyjnych aminokwasw, rozpoznania musi dokona czsteczka biaka zdolna do rozpoz nania swoistej czsteczki tRNA i swoistego aminokwasu. Dla tych swoistych funkcji rozpoznawczych i dla waciwego doczenia 20 aminokwasw do swoistych czsteczek tRNA jest konieczne przynajmniej 20 swoistych enzymw. Proces^ rozpoznania i doczenia aminokwasu (proces oTiarczenla tRNA} przebiega w 2 etapach dla kadego enzymu swoistego dla kadego z 20 aminokwasw. Enzymy te s nazwane syntetazami aminoacyla-tRNA...Tworz one aktywny kompleks poredni amino-acylo-AMP-enzym, ktry przedstawiono na ryc. 40-1. Swoisty kompleks aminoacylo-MP--enzym rozpoznaje nastpnie swoisty tRNA, do ktrego docza reszt aminoacylow przy po-
zycji 3'-hydroksylowej kocowej adenozyny. Aminokwas pozostaje przyczony do swoi-stegtrtRN wizaniem estrowym do czasu, a bdzie uyty do polimeryzacji w swoistej pozycji w trakcie tworzenia prekursora polipeptydowe^~ go czsteczki biakowej. Na tym etapie naszych rozwaa musimy powrci do wanych regionw czsteczki tRNA opisanych w rozdz. 37 (i zilustrowanych na ryc. 37-11). Rami tymidyna-pseudoury-dyna-cytydyna (T?) jest wczone w proces wizania aminoacylo-tRNA do powierzchni rybosomu w miejscu syntezy biaka. Rami D jest jednym z miejsc istotnych do waciwego rozpoznania danego rodzaju tRNA przez waciw mu syntetaz aminoacylo-tRNA. Rami akceptorowe, umiejscowione przy kocu 3'^hy-droksyloadenozylowym jest miejscem.doczenia swoistego aminokwasu. Region antykodonowy skada si z JLouk-leotydw i jest rozpoznawany przez 3-liteiawy kodon w mRNA (ryc. 40-2). Sekwencja ta, odczytywana w ptli antykodonowej w kierun ku 3' do 5', skada si z: dowolnej zasady zmodyfikowanej puryny-X-Y-Zpirymidyny--pLrymidyny5'. Zwr uwag, e kierunek odczytu antykodonu jest 3' do 5', podczas gdy kod genetyczny w tab. 40-1 jest odczytywany w kierunku 5' do 3', poniewa kodon mRNA i ptla antykodonu w tRNA s przeciwrow-noJege pod wzgldem komplementamoci. Degeneracja kodu genetycznego odnosi si gwnie do ostatniego nukleotydu w triplecie kodonowym, co sugeruje, e parowanie zasad midzy tym ostatnim nukkoiydem a odpowiadajcym mu nukleotydem w antykodonie nie jest precyzyjne. Jak to przedstawiono wyej, zjawisko to objania hipoteza tolerancji; w tym
ATP
HOOC-HC-R
Enzym (Enz} SYNTETAZA AMINOACYLO-tRNA Aminokwas (AA)
Enz Adenina Ryhoza-OP 0-C CH-R OH

EnZnAMP-AA (aktywowany aminokwas) tR NA Kompleks amlnoacyla--AMP-e nzym
AMP + Enz
NH.
tR NA -A A Aminoacylo-tRNA
Ryc. 40-1. Tworzenie aminoacylo-tRNA. Dwustopniowa reakcja przy udziale enzymu syntetazy aminoacylo-tRNA prowadzi do utworrenia aminoacylo-tRNA. Pierwsza reakcja obejmuje utworzenie kompleksu AMP-aminokwas-enzym. Taki zaktywowany aminokwas jest przenoszon y nastpnie na odpowiedni czsteczk tRNA. AMP i enzym uwalniaj si i enzym moe by ponownie uyty w reakcji.
SYNTE ZA BIAEK I KOD GENET YCZNY / 495 kodon
mRNA
5'
nie odgrywa roli w rozpoznaniu kodonu. Jak to zanotowano wyej reszta aminoacylowa nigdy nie kontaktuje si bezporednio z matryc mRNA zawierajc kodony.
MUTACJA POWSTAJE W WYNIKU PEWNYCH TYPW ZMIAN, KTRE ZACHODZ W SEKWENCJI NUKLEOTYDW
Chocia pocztkowa zmiana moe nie zachodzi w kodujcym pamie dwupasmowej czsteczki DNA w danym genie, to po replikacji siostrzane czsteczki DNA, zawierajce mutacje w pamie kodujcym, bd si segregowa i pojawi si w populacji organizmw.
i)Ramieantytw<Jonowe 2)RamiT^C
3) Ftaml O
Ryc. 40-2. Rozpoznanie kodonu przez antykodo n Jednym z kodo nw dla fenyloalaniny jest U -U-U. tRNA obarczony fenyloalanin (Phe) ma komple mentarn sekwencj A-AA, ktra na zasadzie paro wania zasad tworzy kompleks z kodonem. Regio n antykodonowy zwykle skada si z sekwencji 7 nukleotydw w ko lejnoci od 3' do 5': nukleotyd u zmiennego (N), zmodyfikowanej puryny (P u*), X, Y, Z i 2 pirymidyn (Py).
Niektre mutacje zachodz na drodze podstawienia zasad

Zmiany w pojedynczej zasadzie (mutacje punktowe) mog by typu tranzycji lub iranswersji. W pierwszym przypadku dana pirymidyna jest zamieniona na inn pirimidyn lub dana puryna jest zamieniona na inn puryn. Transwersje s to zmiany puryny na 1 z 2 pirymidyn albo zamiany pirymidyny na 1 z 2 puryn, jak to przedstawiono na ryc. 40-3.
swoistym miejscu parowania nukleotydu do nukleotydu kodon i antykodon s w stanie rozchwiania". Na przykad 2 kodony dla argininy A-G-A i A-G-G mog si wiza z tym samym antykodonem majcym uracyl przy swoim kocu 5'. Podobnie 3 kodony dla glicy-ny, G-G-U, G-G-C i G-G-A, mog tworzy pary zasad z 1 kodonem C-C-I. I" jest nuk-leotydem inozyny, inn jeszcze szczegln zasad pojawiajc si w czsteczkach tRNA. Rozpoznanie kodonu przez czsteczk tRNA nie zaiey od aminokwasu, ktry jest zwizany przy kocu 3'-hydroksylowym. Wykazano to w pomysowym dowiadczeniu przez obarczenie tRNA swoistego dla cysteiny (tRNAcys) cystein radioaktywn. Na drodze chemicznej reszta cysteinylowa zostaa nastpnie zmieniona tak, aby uzyska czsteczk tRNA swoist dla cysteiny, ale obarczon alanin. Chemiczna transformacja reszty cysteinylowej do alanilo-wej nie zmienia czci antykodonowej cysteino-swoistej czsteczki tRNA. Gdy taki alanilo--tRNA^s zosta uyty do translacji hemoglobi-nowego mRNA, wwczas radioaktywna alanina zostaa wbudowana w normalne miejsce cysteinowe w czsteczce biaka hemoglobino-wego. Dowiadczenie to wykazao, e pochodna
Tranzyoje Transwersje Ryc. 40-3. Schematyczne przedstawienie mutacji typu tranzycji i transwersji. ___________
Jeli sekwencja nukleotydowa genu zawierajca mutacj ulega transkrypcji na czsteczk RNA, to czsteczka RNA bdzie miaa zmian w postaci komplementarnej zasady w miejscu odpowiadajcym tej mutacji. Zmiany pojedynczej zasady w czsteczkach mRNA mog powodowa rne skutki, jeeli ulegn translacji na biako: tek, poniewa kod jest zdegenerowany. Bdzie to tym bardziej prawdopodobne, gdy zmieniona zasada w czsteczce mRNA jest 3. nuk-leotydem kodonu. Zgodnie z hipoteza, toleran1. Moe nie wystpi aden wykrywalny sku -
496 / ROZDZIA 40
cji, translacja kodonu jest mao wraliwa na zmian w pozycji 3. Skutek typu mutacji sensu (missense) zajdzie wwczas, gdy odmienny aminokwas zostanie wbudowany w odpowiednie miejsce w czsteczce biaka. Taki blednie dobrany aminokwas, czyli mutacja sensu, w zaleno ci od umiejscowienia w swoistym biaku moe by akceptowalny, czciowo akceptowalny lub nie akceptowalny w odniesieniu do funkcji tej czsteczki biakowej. Ze szczegowej ana lizy kodu genetycznego mona wycign wnio sek, e wikszo zmian w pojedynczej zasa dzie prowadzi do zastpienia 1 aminokwasu przez inny aminokwas majcy raczej podobne grupy funkcjonalne. Jest to bardzo skuteczny mechanizm, ktry zapobiega drastycznym zmianom w fizycznych waciwociach czste czki biakowej. Jeli zachodzi bdny akcep towalny skutek, to powstajca czsteczka bia kowa moe nie by odrniana od normal nej czsteczki. Jeli zachodzi bd nie akceptowal ny, czsteczka biakowa nie bdzie zdolna spra wowa przypisanej jej funkcji. Kodon typu nonsens moe si pojawia i powodowa przedwczesn terminacj w proce sie wbudowywania aminokwasw do acucha peptydowego, w wyniku czego zostaje wytwo rzony tylko fragment zamierzonej czsteczki
biakowej. Jest due prawdopodobiestwo, e przedwczenie ukoczona czsteczka biaka lub fragment peptydu nte bd speniay przypisanej im funkcji. Czsteczka hemoglobiny moe by uyta do wykazania skutkw zmian w pojedynczej zasadzie w strukturalnym genie hemoglobiny Niektre mutacje nie powoduj widocznego skutku. Brak skutku wynikajcego ze zmiany w pojedynczej zasadzie moe by wykazany tylko przez sekwencjonowanie nukleotydw w czsteczkach mRNA lub w genach hemo globiny u duej liczby osb majcych normalne czsteczki hemoglobiny. Jednake mona dedu-kowa, e kodon waliny w pozycji 67 acucha P hemoglobiny nie jest identyczny u wszystkich osb majcych normalny acuch b1 hemoglobiny. Hemoglobina typu Milwaukee ma w pozycji 67 kwas glutaminowy; hemoglobina typu Bristol ma w tej pozycji kwas asparaginowy. Aby wyjani zmiany aminokwasu zmianami w pojedynczej reszcie kodonu dla aminokwasu 67, naley wnioskowa, e mRNA kodujcy hemoglobin typu Bristol zawiera! kodon G-U-U lub G-U-C zanim wystpia zmiana do G-A-U lub G-A-C, kodonw kodujcych kwas asparagi nowy (ryc. 40-4). Jednak mRNA kodujcy
Hb Milwaukee
Hb Bristol Asparaglnlan
(Glutamlnlan)
Hb A (normalna) Walfna
HbSydney /HS7 Alanina
GAU
+ -------------
GUU
------ * -
GCU
GAC
-* -------------
GUC
------ +- GCC ------ +~ GCA ------ - GCG
G A A - * ---------------
GUA
GAG
** ---------------
GUG
Ryc, 40-4. W warunkach prawido wych walina w pozycji 67 iacucha p hemoglobiny A mo e by ko dowana jednym z 4 ko do nw po kazanych w prosto kcie. W hemoglo binie pato logicznej typu Milwaukee aminokwas w pozycji 67 acucha P zawiera gfutaminian kodowany przez G A A lub G A G kady z tych kodonw moe powsta z jednostopniowejtranswersji kodonw waliny G - U A lub G-U-G. Podobnie alanina, obecna w pozycji 67 acucha hemoglobiny typu Sydney, moga powsta -w wyniku jed nos to pni owej tranzycji jeefnego z 4 kodonw waliny. Jednak reszta asparaginianu w pozycji 67 hemoglobiny typu 8risto l moga powsta w wyniku jednostopnio wej transwersji jedynie z kodonw waliny G-U-U lub G U C .
SYNTEZA BIAEK I KOD GENETYCZNY / 497
hemoglobin typu Milwaukee powinien mie mniej w 2 rodzinach Japoczykw. Ta hemow pozycji 67 kodon G-U-A lub G-U-G, aby globina ma asparagtne, ktra zastpia izyn zmiana w pojedynczym nukieotydzie moga w pozycji 61 acucha p. Odpowiadajca temu spowodowa pojawienie si kodonw kwasu transwersja moga by albo A-A-A lub A-A-G glutaminowego G-A-A lub G-A-G. Hemoglo- zamieniona albo na A-A-U lub na A-A-C. bina typu Sydney, ktra zawiera alanin w po- Zastpienie swoistej lizyny asparagin pozornie zycji 67, moga powsta przez zmian pojedyn- nie zmienia normalnej funkcji acucha P u tych czego nukleotydu w ktrymkolwiek z 4 kodo- osobnikw. nw waliny (G-U-U, G-U-C, G-U-A lub Czciowo akceptowalne mutacje G-U--G), co dao kodony alaniny sensu. Najlepszym przykadem czciowo akodpowiednio: G-C-U, G-C-C, G-C-A lub ceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, rodek) G-C-G. jest hemoglobina S (hemoglobina wystpujca w niedokrwistoci sierpowatej), w ktrej normalnie Podstawienie aminokwasw wystpujcy aminokwas w 6 pozycji acucha powoduje mutacje sensu p-globiny kwas glutaminowy zosta Akceptowalne mutacje sensu. Przy- zastpiony wahn. Odpowiadajca temu zmia-' kadem akceptowalnej mutacji sensu (ryc. 40-5, na pojedynczego nukleotydu w kodonie kwasu u gry) w strukturalnym genie acucha P he - glutaminowego G-A-A lub G-A-G byaby moglobiny moe by wykryta obecno zmie- G-U-A lub G-U-G w kodonach waliny. Jest nionej hemoglobiny, o odmiennych waciwo- oczywiste, e te mutacje sensu zaburzaj norciach elektrofbretycznych, ktra wystpuje malne funkcje i prowadz do niedokrwistoci w erytrocytach z pozoru zdrowego osobnika. sierpowatej, jeeli zmutowany gen jest obecny Hemoglobin typu Hikari znaleziono przynaj Czsteczka biaka Akceptowalna mutacja sensu Hb A acuch j
Aminokwas AAA
Kodony lub AAG
Hb Hikari acuch fi
1 1
61 hzyna
AAU
IX!
lub lub lub
AAC
Czciowa akceptowalna mutacja sensu
HbA, acuch
Hb S acuch fi
T
Afiparaglna Wallna
GAA
G AG
GUA
i I
GUG
Nleakoeplo walna mutacja sensu
Hb M (Boston), acuch a
Ct W \
58Histydyna
, I
lub
CAC
\0 lub UAC
Tyrozyna
Ryc. 40-5. Przykady 3 typw mutacji sensu, w wyniku ktrych powstaj patologiczne acuchy hemoglobiny. Wskazano zmiany w aminokwasach i moliwe zmiany w odpowiadajcych im kodonach. Mutacja w acuchu p hemoglobiny Hikari ma prawidowe waciwoci fizjologiczne, ale rni si pod wzgldem ruchliwoci elektroforetycznej. Hemoglobina S ma mutacj w acuchu p i zachowuje czciow funkcj; hemoglobina S wie tlen, ale w postaci odtlenowanej wytrca si. Hemoglobina M Boston zawiera mutacj w acuchu a, umoliwia utlenienie jonu el azawego hemu do jonu elazowego, przez to w ogle nie moe wiza tlenu. ________________________________
32 Biochemia
498 / ROZDZIA 40
w stanie homozygotyc2nym. Zmiana kwasu glutaminowego na wahn moe by rozpat rywana jako czciowo akceptowana, poniewa hemoglobina S moe wiza i oddawa tlen, chocia proces ten nie jest zupenie normalny.
Nie akceptowane mutacje sensu. Nie
akceptowana mutacja sensu (ryc. 40-5, dl) w genie hemoglobiny daje niefunkcjonaln czsteczk hemoglobiny. Na przykad mutacje wystpujce w hemoglobinie M generuj czsteczki, ktre umoliwiaj utlenienie elaza Fei + reszty hemowej do Fe 3+, w wyniku czego powstaje methemoglobina, Methemogobina nie moe transportowa tlenu (p. rozdz. 7). Mutacje typu przesunicia ramki odczytu powstaj w wyniku delecji lub insercji nukfeotydw w genie i w ten sposb wytwarzaj zmienione sekwencje nukleotydowe w czsteczkach mRNA W wyniku delecji pojedynczego nukleotydu w kodujcym pamie genu powstaje zmieniona ramka odczytu w mRNA. Maszyneria" uczes tniczca w translacji mRNA nie rozpoznaje brakujcej zasady, poniewa w trakcie odczytywania kodonw nie ma znakw przestankowych. W wyniku tego powstaje gboka zmiana w sekwencji spolimeryzowanycb aminokwasw, jak to przedstawiono w przykadzie 1, na ryc. 40-6. Zmieniona ramka odczytu daje w rezultacie znieksztacon translacj mRNA na caym obszarze dystalnym od miejsca delecji pojedynczego nukleotydu. Nie tylko jest znieksztacona sekwencja aminokwasw na obszarze dystalnym od tej deJecji, ale odczytywanie informacji moe take ujawni nonsensowny kodon i w ten sposb moe zaj synteza znieksztaconego i przedwczenie ukoczonego polipeptydu w jego kocu karboksylowym (przykad 3, ryc. 40-6). Jeli delecji w genie ulegn 3 nukleotydy albo wielokrotno 3, to odpowiadajcy informacyj ny RNA, gdy ulegnie translacji, da biako, w ktrym brak bdzie odpowiedniej liczby aminokwasw (przykad 2, ryc. 40-6). Poniewa ramk odczytu stanowi triplet, faza odczytu nie zostanie zmieniona dla tych kodonw, ktre le dystalnie od miejsca delecji. Jeli jednak zachodzi delecja 1 lub 2 nukleotydw tu przed albo w obrbie normalnego kodonu terminacji {kodonu nonsensownego),, to moe doj do zaburze w odczytaniu sygnau normalnej terminacji. Taka delecja moe prowadzi do od -
czytywania ponad sygnaem terminacji do momentu, a znajdzie si nastpny inny kodon nonsensowny (przykad 1, ryc. 40-6). Doskonaym przykadem takiego zjawiska s dyskusje powicone hemoglobino patiom. Insercje 1, 2 lub niewiel o krotnoci 3 nukleotydw do genu daj w wyniku mRNA, w ktrym ramka odczytu jest zmieniona w czasie translacji i zachodzi taki sam skutek, jak w przypadku delecji. Moe to by a) znieksztacona sekwencja aminokwasowa dystalna od miejsca insercji, b) generacja kodonu noosensowego w miejscu insercji 1ub w czci dystalnej albo te niemono rozpoznawania sygnau terminacyj-nego (reading through). Jeli po delecji w genie nastpi insercj (lub odwrotnie), to taka inser-cja ponownie ustawi prawidowo ramk odczytu (przykad 4, ryc. 40-6). Przy translacji odpowiedniego mRNA uzyska si znieksztacon sekwencj aminokwasow midzy insercj a delecja, W obszarze po przywrceniu ramki odczytu sekwencja aminokwasow bdzie prawidowa. Mona sobie wyobrazi, e rne kombinacje delecji i insercji albo delecje i insercje dadz informacj dla biaka, ktrego-cz bdzie nieprawidowa, ale ta cz otoczona bdzie przez normaln sekwencj aminokwasw. Takie zjawisko wykazano w sposb przekonujcy u bakteriofaga T4; odkrycie to dostarczyo wanego dowodu, e ramk odczytu stanowi triplet. Mutacje supresorowe redukuj skutki mutacji sensu, mutacji nonsensowych i przesuniecie ramki odczytu Powysza dyskusja na temat zmienionych produktw biakowych w wyniku mutacji genw jest oparta na normalnie funkcjonujcych czsteczkach tRNA. W organizmach prokario-tycznych i niszych organizmach eukariotycz-nych odkryto jednak czsteczki tRNA, ktre funkcjonuj nieprawidowo i ktre same s wynikiem mutacji. Niektre z tych nieprawid owych czsteczek tRNA s zdolne do supresji skutkw mutacji w odlegych genach strukturalnych. Te supresorowe czsteczki tRNA, zwykle powstae w wyniku zmian w ich regionach antykodonowych, s zdolne do supresji mutacji sensu, mutacji nonsensownych i mutacji z przesunicia ramki odczytu. Poniewa jednak czsteczki supresorowego tRNA nie s zdolne rozrni kodon prawido wy od kodonu po wstaego w wyniku mutacji genu, ich obecno w komrce prowadzi zwykle do zmniejszonej
SYNTEZA BIAEK i KOD GENETYCZNY / 499
Stan normalny
| Typ dziki ;
mRNA Poipeptyd Przykad 1
UAG UUUG
AUG
GCC
UCU
UGC
A AA
GGC
UAU
AG U
AGU
UAG... STOP
Met ----- Ala ------ Ser ------ Cys ------ Lys ------ Gly------- Tyr ------Ser ------- Ser
mRNA Pollpeptyd
UAG
UUUG
AUG MetAla
AG.
Sekwencja znieksztacona
Przykad 2
| D8lec]a(-3) | mRNA UAG UUUG AUG Met GCC A l aUCU

Ser
Pollpeptyd
AAA Lys
GGC
UAU
AGU
-Gl y
---- Tyr --- Ser
AGU UAG... - S e r STOP
Przyfcteda
I Inaercja (+1} | mRNA Pollpeptyd M e t A la Sekwencja znieksztacona
UAG
UUUG
AUG
GCC
AGG
CUA -Leu
UAG STOP
UAG
UUAG...
Przykt*d4
Insercja ) Deleoja ( 1]
mRNA Pollpeptyd
UAG
UUUG
AUG
GCC
UCU -Se r-
UUG
CAA
AGG
UAU
AGU
AGU
UAG... STOP
M et- - A l a -
-Leu ----- Gin ------ Arg ------- Tyr ------Ser -------Ser

SakwencjE znieksztacona
Ryc. 40-6. Wpyw delecji i insercji w genie na sekwencj nukleotydw w transkrypcje mRNA i na sekwencj aminokwasw w acuchu polipeptydowym uzyskanym z mRNA. Strzaki pokazuj miejsca delecji i insercji, a liczby w owalach odpowiadaj liczbie usunitych lub wczonych reszt nuk-leotydowych.
ywotaoci komrki. Na przykad czsteczki tRNA tumice mutacje nonsensowne mog tumi prawidowe sygnay terminacji i umoliwia translacj mimo obecnoci kodonu stop" (read-through") wwczas, gdy nie jest to podane. Czsteczki supresorowego tRNA typu przesunicia ramki odczytu mog odczyty-
wa kodon prawidowy i skadow cz przylegego kodonu, dajc w len sposb przesuni cie ramki take wwczas, gdy nie jest to potrzebne. Czsteczki supresorowego tRNA mog istnie w komrkach ssakw poniewa u tych ostatnich zachodzi zjawisko transkrypcji read-through".
500 / ROZDZIA 40
Proces syntezy biaek, podobnie jak replikacja DNA i transkrypcja genu, moe by podzielony na 3 fazy: inicjacj, elongacj i terminacj W rozdziale 39 opisano oglne cechy strukturalne rybosomw i proces ich montowania. Te twory ziarniste su jako maszyneria", na ktrej sekwencja nukleotydw mRNA jest tumaczona na sekwencj aminokwasw w okrelonym biaku. Translacja mRNA zaczyna si blisko koca 5' od tworzenia odpowiedniego koca aminowego czsteczki biakowej. Informacja jest czytana w kierunku od 5' do 3' i koczy si utworzeniem koca karboksylowe-go biaka. Ponownie wystpuje tutaj pojcie polarnoci. Jak to opisano w rozdz. 39, transkrypcja genu na odpowiedni mRNA albo jego prekursor prowadzi najpierw do utworzenia koca 5' czsteczki RNA. U prokariontw pozwala to na rozpoczcie translacji mRNA zanim zostanie ukoczona transkrypcja genu. W organizmach eukariotycznych proces transkrypcji zachodzi w jdrze komrkowym, a translacja mRNA zachodzi w cytoplazmie. Wyklucza to jednoczesn transkrypcj i translacj w organizmach eukariotycznych i umoliwia proces przeksztacenia niezbdny do wytworzenia dojrzaego mRNA z pierwotnego trans-kryptu hnRNA. Inicjacja obejmuje zoone struktury i biaka (p. ryc. 40 -7) Jak to opisano w rozdz. 39 koce 5' w wikszoci czsteczek mRNA w organizmach eukariotycznych s opatrzone czapeczk metylacyj-n. Ta metyloguanozylotrifosforanowa czapeczka uatwia wizanie czsteczek mRNA do podjednostki 40S rybosomu. Zanim zostanie ona zwizana z 40S rybosomera, ulega modyfi kacji dziki dziaaniu kilku biaek zdolnych do wizania si z mRNA: eIF -4A, eIF-4B, eIF-4E i eIF-4F. Obecno kompleksu eIF-4F wicego czapeczk, a skadajcego si z 4 polipep-tydw (24 kd, 46 kd, 73 kd i 220 kd) jest niezbdna do inicjacji syntezy biaka na mRNA opatrzonym czapeczk charakterystyczn dla organizmw eukariotycznych. Pierwszy kodon,
ktry ulega translacji, to zazwyczaj A-U-G. 18S rybosomainy RNA (rRNA) podjednostki rybo-somalnej 40S wie si z regionem mRNA, ktry poprzedza pierwszy kodon ulegajcy translacji. To wizanie mRNA do podjednostki rybosomalnej 40S wymaga obecnoci czynnika biakowego, czynnika inicjacji 3 (IF-3). ^7 W nastpnym etapie aminoacylo-tRNA, od powiadajcy pierwszemu kodonowi, wchodzi w reakcj z GTP i czynnikiem inicjacyjnym 2 (IF-2), tworzc kompleks. Kompleks ten w obecnoci czynnika inicjacji 1 (IF-1) docza anty_koilQn_tRNA do 1 kodonujoRNA, two-rzac-kampieks iniciacyjny z podjednostk 40S rybosomu. Po uwolnieniu czynnikw inicjacyj-nych (IF-l, IF-2 i IF-3) docza si podjednostk rybosomalna 60S i GTP ulega hydrolizie, W ten sposb zostaje ukoczone formowanie rybosomu SOS. Kompletny rybosom zawiera 2 miejsca dla czsteczek tRNA. Miejsce peptydylowe (miejsce P) zawiera czsteczk peptydylo-tRNA zwizan z waciwym kodonem mRNA. Miejsce aminoacylowe (miejsce A) obejmuje aminoacylo-tRNA zwizany z odpowiadajcym nTu kodonem na mRNA. W momencie tworzenia kompleksu inicjacyjnego na \\ kodonie, czs teczka aminoacylo-tRNA wchodzi w miejsce P, pozostawiajc wolne miejsce A. Ramka odczytu zostaje wic zdefiniowana popr2ez zwizanie tRNA do 1. kodonu mRNA. kodonu, ktry ulegnie translacji. Rozpoznanie tego 1. kodonu inicjujcego jest oczywicie zalene od drugo-rzdowej struktury czsteczki mRNA, a ponadto u prokariontw i by moe eukariontw obejmuje swoist sekwencj nukleotydw komplementarnych do segmentu 16S (18S) rybo-somalnego RNA. U prokariontw w inicjacj syntezy wikszoci, jeli nie wszystkich, czsteczek biakowych jest wczony swoisty aminoacylo -tRNA. U prokariontw wikszo biaek jest inicjowana N-formylometionylo-tRNA. Mimo e me-tionina wystpuje jako N-kocowy aminokwas w wielu biakach eukariotycznych, u tych ostatnich metionylo-tRNA nie jest formylowany. U prokariontw N-formylowanie czsteczki
Ryc. 40-7. Schematyczna ilustracja inicjacji syntezy biaka na matrycy mRNA zawierajcej czapeczk metylacyjn na kocu 5' i sekwencj poii(A) na kocu 3'. IF -1, IF-2 i IF-3 przedstawiaj odpowiednio czynnik inicjujcy 1, 2 i 3, a struktura podobna do szpilki do wosw z symbolem Met na jednym kocu ilustruje metionylo-tRNA, Miejsce P i miejsce A s odpowiednio miejscem wicym peptydylo-iRNA i aminoacylo-tRNA na rybosomie.

Kodon Inicjujcy 5' Czapeczka G T P-8' C = AUG
m
3' Ogon polt(A) n Hh "
+
V 1F-3 J tyDoMmu
mHNA l3 ' IAl n
J
5'
GTF
I
IM '
Met
GTP
R y c . 4 0 -7 . Podjsdnoslka rybosomu
+ IF-2 + IM G^P-fi*
Miejsce P
502 / ROZDZIA 40
metionylowej tRNA jawi si jako wizanie peptydowe bdnie rozpoznawane przez miejsce P rybosomu. U prokariontw istnieje take enzym zdolny do usuwania N-kocowej reszty formylowej lub N-kocowej reszty metionylowej (albo obu) 2 czsteczek biakowych, w wielu przypadkach nawet przed ukoczeniem syntezy czsteczki biakowej. Elongacja nastpuje przez przemieszczenie (p. ryc. 40-8) W kompletnym rybosomie SOS, utworzonym w procesie inicjacji, miejsce A pozostaje wolne. Zwizanie odpowiedniego aminoacyio -tRNA w miejscu A wymaga rozpoznania odpowiedniego kodonu. Czynnik elongacyjny 1 (EF-1) tworzy kompleks z GTP i wchodzcym aminoacylo-tRNA (ryc. 40-8). Kompleks ten pozwala na wejcie aminoacylo-tRNA na miejsce A z jednoczesnym uwolnieniem EF-l-GDP i fosforanu. Jak przedstawiono na ryc. 40-8, EF-l-GDP ulega recyklizacji do EF-l-GTP przy udziale innych rozpuszczalnych czynnikw biakowych i GTP. Grupa a-aminowa nowego aminoacylo--tRNA w miejscu A dokonuje nukleofilowego ataku na zestryfikowan grup karboksylow peptydylo-tRNA, zajmujcego miejsce P. Reakcja ta jest katalizowana komponentem bia kowym podjednostki rybosomalnej 60S pep-tydylotransferaz. Poniewa aminokwas aminoacylo-tRNA jest ju zaktywowany", dla tej reakcji nie jest wymagane dalsze rdo energii. W wyniku tej reakcji zachodzi przyczenie rosncego acucha peptydowego do tRNA w miejscu A. Po usuniciu reszty p eptydowej z tRNA w miejscu P, oswobodzony tRNA szybko dyso-cjuje i opuszcza miejsce P. Nowo utworzony peptydylo-tRNA ulega przemieszczeniu z miejsca A do pustego miejsca P przy udziale czynnika elongacji 2 (EF-2) i GTP. W procesie przemieszczania GTP jest hydrolizowany do GDP i fosforanu. Przemieszczenie nowo utworzonego peptydylo-tRNA i odpowiedniego kodonu na miejsce P uwalnia miejsce A dla nastpnego cyklu rozpoznania kodonu przez aminoacylo-tRNA i dla elongacji. Zwizanie reszty aminoacylowej przez czsteczk tRNA wymaga hydrolizy ATP do AMP, rwnowanej hydrolizie 2 ATP do 2 ADP oraz fosforanw. Wejciu aminoacylo -tRNA na miejsce A towarzyszy hydroliza jednego GTP do GDP. Podobnie przemieszczenie nowo
utworzonego peptydylo-tRNA z miejsca A do miejsca P przez EF-2 powoduje hydroliz GTP do GDP i fosforanu. W sumie zapotrzebowanie energetyczne na wytworzenie 1 wizania peptydowego obejmuje rwnowanik energii powstaej z hydrolizy 2 czsteczek ATP do ADP i 2 czsteczek GTP do GDP, czyli hydrolizy 4 bogatoenergetycznych wiza fosforano wych. Terminacja nastpuje w momencie, gdy zostaje rozpoznany kodon nonsensowny (p. ryc. 40-9) Po licznych cyklach elongacji, powodujcych spolimeryzowanie aminokwasw w czsteczk biakow, w miejscu A pojawia si nonsensowny terminujcy kodon mRNA. W warunkach prawidowych nie istnieje tRNA zawierajcy antykodon zdolny do rozpoznania takiego sygnau terminacji. W komrce istniej czynniki uwalniajce zdolne do rozpoznania sygnau terminacji w miejscu A (ryc. 40-9). Czynnik uwalniajcy, w poczeniu z GTP i transferaz peptydyiow, powoduje hydroliz wizania midzy peptydem a tRNA zajmujcym miejsce P. W wyniku tej hydrolizy z miejsca P uwalnia si biako i tRNA. W nastpstwie hydrolizy i uwolnienia biaka oraz tRNA rybosom SOS dysocjuje do podjednostek 40S i 60S, ktre nastpnie wchodz ponownie do cyklu. Czynniki uwalniajce s zatem biakami, ktre hyd-rolizuj wizanie peptydylo-tRNA w momencie, gdy nonsensowny kodon zajmuje miejsce A. W procesie translacji tej samej czsteczki mRNA moe bra udzia jednoczenie wiele rybosomw. Poniewa rybosomy maj stosunkowo duy wymiar czsteczki, wi si z mRNA w odlegoci nie mniejszej ni 80 nukleotydw. Liczne rybosomy zwizane z t sam czsteczk mRNA tworz polirybosom albo polisom". W systemie nierestrykcyjnym liczba rybosomw zwizanych z mRNA (a zatem wielko polirybosomw) jest skorelowana dodatnio z dugoci czsteczki mRNA. Oczywicie masa czsteczki mRNA jest cakiem maa w porwnaniu do masy pojedynczego rybosomu. Pojedynczy rybosom ssakw jest zdolny do wytworzenia ok. 100 wiza peptydowych w kadej minucie. Polirybosomy aktywnie syntetyzujce biaka mog egzystowa jako wolne ziarenka w cytoplazmie komrkowej albo mog by przyczepione do boniastych struktur cyto-plazmatycznych okrelanych jako siateczka
3' (AL
GDP
3'(A)
Ryc. 40-8. Schemat procesu elongacji pepiydu w trakcie syntezy biaka. (Wale kika, oznaczone n-1, n, n+1 itd., oznaczaj reszty aminokwasowe w nowo powstajcej czsteczce biakowej. EF-1 i EF-2 przedstawiaj odpowiednio czynnik elongacyjny 1 i 2. Miejsca pepty-dyio-tRNA i aminoacylo-tRNA na rybo-somie s odpowiednio oznaczane jako miejsce P i A.
504 / ROZDZIA 40 Kodon termlnacyjrty (nonsensowny)
G TP-5
60P +
tRNA
Ryc. 40-9. Schemat ilustrujcy proces terminacji syntezy bi3tka. Miejsca peptydylo-tRNA i amtnoacylo--tRNA s oznaczone odpowiednio jako miejsce P i A. Hydroliza kompleksu peptydylo-tRNA jest oznaczona jako wejcie H2O. Symbole N i C oznaczaj odpowiednio aminokwasy na kocu NH 3 i karboksylowym i ilustruj polarno syntezy biaka
SYNTEZA BIAEK i KOD GENETYCZNY / 505
rdplazmatyczna. Doczepienie ziarnistoci po-lirybosomalnych do siateczki rd plazma ty cz-nej jest odpowiedzialne za jej szorstki" wygld, co atwo zaobserwowa w mikroskopie elektronowym. Biaka syntetyzowane na poliryboso-mach przyczepionych do siateczki s wydzielane do wntrza cystern pomidzy listkami szorstkiej siateczki rdplazmatycznej, a nastpnie eksportowane dalej. Niektre z produktw biakowych szorstkiej stateczki rdplazmatycznej s upako-wywane jako czsteczki zymogenu w obrbie aparatu Golgiego w ceiu ewentualnego dalszego ich eksportu (p. rozdz. 42). Czsteczki poliryboso-malne, ktre znajduj si w cytosolu w stanie wolnym, s odpowiedzialne za syntez biaek potrzebnych dla funkcji wewntrzkomrkowych. Zoona maszyneria syntezy bia ka moe by wykorzystana w reakcjach obronnych organizmu, inicjowanych zagroeniem rodowiskowym, lub moe sta si czci mechanizmu chorobowego Ferrytyna, biako wice elazo, zapobiega osigniciu toksycznego stenia zjonizowane-go elaza (Fe2+ ) w obrbie komrek. elazo pobudza syntez ferrytyny przez aktywacj 1 lub.wicej biaek cytoplazmatycznych, ktre nastpnie mog si wiza ze swoistym regio nem sekwencji nie ulegajcych translacji przy kocu 5' mRNA ferrytyny. Interakcja biako--mRNA aktywuje ferrytynowy mRNA i powo duje jego translacj. Taki mechanizm zapewnia szybk kontrol syntezy biaka, usuwajc Fe 2+ czsteczk potencjalnie toksyczn. Maszyneria syntezy biaka moe by take modyfikowana w procesie, ktry jest szkodliwy dla komrki. Wirusy replikuj, wykorzystujc procesy komrki gospodarza cznie z procesami syntezy biaka. Niektre czsteczki wiruso wego mRNA ulegaj translacji znacznie wydajniej ni czsteczki komrki gospodarza (np. mengorm, wirus zapalenia mzgu i minia sercowego). Inne, np. reowirus i wirus opryszcz-kowego zapalenia jamy ustnej, replikuj w sposb nadmierny i ich mRNA wspzawodnicz z czsteczkami mRNA komrki gospodarza o ograniczon ilo czynnikw translacji. Inne wirusy hamuj syntez biaek komrki gos podarza, uniemoliwiajc wytworzenie pocze mRNA z rybosomem 40S. Wirus polio osiga to przez aktywacj proteaz komrkowych, ktre degraduj 220 kd skadnik kom-
pleksu wicego czapeczk z eIF-4F opisanego wyej. POTRANSLACYJNA MODYFIKACJA MA WPYW NA AKTYWNO WIELU BIAEK Niektre wirusy zwierzce, m.in. wirus polio (wirus typu RNA), syntetyzuj dugie, policys-ronowe biaka na 1 dugiej czsteczce mRNA. Czsteczki takich biaek s nastpnie przecinane w okrelonych miejscach, w wyniku czego powstaje wiele swoistych biaek, koniecznych do funkcji wirusowych. W komrkach zwierzcych wiele biaek jest syntetyzowanych na 1 matrycy mRNA jako czsteczka prekursorowa, ktra nastpnie musi by zmodyfikowana tak, aby powstao aktywne biako. Przykadem i prototypem jest insulina, ktra jest biakiem maoczs-teczkowym majcym dwa acuchy polipeptydo-we zawierajce midzyczsteczkowe i wewntrz-czsteczkowe mostki disiarczkowe. Czsteczka insuliny jest syntetyzowana jako jednoaricucho-wy prekursor, czyli prohormon, ktry faduje si, umoliwiajc powstanie mostkw disiarczko-wych. Nastpnie swoista proteaza wycina segment, ktry czy 2 acuchy tworzc funkcjonaln czsteczk insuliny (p. ryc. 52-3). Wiele innych peptydw jest syntetyzowanych jako proproteiny, ktre, zanim osign bio logiczn aktywno, wymagaj modyfikacji. Liczne potranslacyjne modyfikacje obejmuj usunicie reszt aminokwasowych z koca aminowego, co zachodzi przez dziaanie swoistych aminopeptydaz. Kolagen, biako wystpujce w wielkiej iloci w przestrzeniach pozakomr-kowych u wyszych eukariontw, jest syntetyzowany jako prokolagen. 3 czsteczki polipep-tydu prokolagenu, czsto nie majce identycznej sekwencji, ukadaj si podunie, a proces ten zaley od obecnoci swoistych peptydw na kocu aminowym. Nastpnie swoiste enzymy przeprowadzaj hydroksylacj i oksydacj swoistych reszt aminokwasowych w obrbie czs teczek prokolagenu w celu wytworzenia wiza poprzecznych powodujcych wiksz stabilno. Peptydy w kocu aminowym s odcite od czsteczki i w ten sposb tworzy si produkt kocowy mocna, nierozpuszczalna czsteczka kolagenu (p. rozdz. 58). Znane s rwnie inne potranslacyjne modyfikacje biaek. Na przykad czste s modyfikacje przez acetylacj, fosforylacj i glikozylacj.
506 / ROZD ZIA 40
WIELE ANTYBIOTYKW DZIAA SKUTECZNIE, PONIEWA HAMUJ ONE WYBIRCZO SYNTEZ BIAKA BAKTERII
Rybosomy bakterii i rybosomy w mitochond-riach komrek wyszych organizmw eukariotycznych rni si od rybosomw opisanych w rozdz. 37. Rybosom bakteryjny jest mniejszy (TOS, a nie SOS) i ma rny, nieco uproszczony, zestaw czsteczek RNA i biaek. Te rnice wykorzystano do celw klinicznych, poniewa wiele skutecznie dziaajcych antybiotykw od-dziaywuje swoicie z biakami prokariotycz-nych rybosomw, hamujc syntez biaek. W wyniku takiego oddziaywania zachodzi za-
hamowanie wzrostu lub mier bakterii. Wikszo najbardziej skutecznych antybiotykw tej klasy (np. tetracykliny, linkomycyna, erytromycyna i chloramfenikol) nie oddziaywuje ze swoistymi biakami eukariotycznych czsteczek rybosomalnych i przez to nie s one toksyczne dla eukariontw. Inne antybiotyki hamuj syntez biaka na wszystkich rybosomach (puromycyna) albo na rybosomach komrek eukariotycznych (cyklo-heksymid). Puromycyna, ktrej struktur przedstawiono na ryc. 40-10 jest strukturalnym analogiem tyrozynylo-tRNA. Puromycyna jest wbudowywana przez miejsca A na rybosomie do karbok syk o licowego peptydu, ale proces ten powoduje przedwczesne uwolnienie polipepty-
OCH,
O" tRNA- 0-P- O-CHÔ.
NO
Rvc. 40- 10. Porwnanie struktury antybiotyku puromycyny (gra) i 3' ko co wej czci tyrozylo -tRNA (cf).
du. Puromycyna, jako analog tyrozynylo--tRNA, skutecznie hamuje syntez biaka zarwno u prkariontw, jak i eukariontw. Toksyna bonicy, egzotoksyna Carynebacte-rium diphteriae, wprowadzona ze swoistym fa-giem lizogenicznym katalizuje ADP rybozyiacj czynnika EF-2 w komrkach ssakw.Ta modyfikacja inaktywuje EF-2 i przez to hamuje swoicie syntez biaka w komrkach ssakw. Liczne zwierzta {np. myszy) s oporne na toksyn bonicz. Oporno ta wynika z niezdolnoci toksyny boniczej do przejcia przez bton komrkow, a nie z niewraliwoci mysiego EF-2 na ADP rybozylacj przez NAD w reakcji katalizowanej toksyn bonicz. Liczne z tych zwizkw, a zwaszcza puromycyna i cykloheksymid, s klinicznie bezuyteczne, ale byy uyteczne w celu wyjaniania roli syntezy biaka w regulacji procesw metabolicznych, zwaszcza indukcji enzymw przez hormony.
PIMIENNICTWO
BanerjeeAK: 5-Terminalcapstnictureineucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiot Rev 1980;44:175.
Barrell BG et al: Different pattern of codon recog-nition by mammalian mitochonrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci USA 77:3164. Caskey CT: Peptide chain tennination. Trends Biochem Sci 1980;5;234. Drak JW, BaltzRHiThebiochemistry ofmutagene-sis. Annu Rev Biochem 1976;45:1I. Forget BG: Molecular genetics of human hemoglobin synthesis. Ann Int Med 1979;91:605. Kozak M: Comparison of initiation of protein synthesis in procaryotes, eucaryotes and organelles. Microbiol Rev 1983;47:1. Maitra U, Stringer EA, Chaudhuri, A: Initiation factors in protein biosynthesis. Annu Rev Biochem 1982;51:869, Pelletier J, Sonenberg N: Internal initiation of trans-lationofeukaryoticmRNAdirectedby asequence derived from picornavirus mRNA. Natur (Lon-donj 1988;334:320. Schlessinger D; Genetic and antibiotic modification of protein synthesis. Annu Rev Genet 1974;8:135. Schneider RJ, Sfienk T: Impact of virus infectioo on host celi protein synthesis. Annu Rev Biochem 1987^56:317. Shatkin AJ: mRNA cap binding proteins: Essential factors for initiating translation. Cel! 1985;4:223. Wool I: The structure and function of eukaryotic ribosomes. Annu Rev Biochem 1979;48:719.
41
WPROWADZENIE
Regulacja ekspresji genu

Daryl K. Granner, MD
Organizmy przystosowuj si do zmian rodowiskowych przez zmian ekspresji genw. Proces zmian ekspresji genw zbadano szczegowo u bakterii i wirusw; na ogl polega on na interakcji swoistych biaek majcych zdolno wizania z rnymi regionami DNA w bezporednim ssiedztwie miejsca startu transkrypcji. Taka interakcja biaek moe mie pozytywny lub negatywny wpyw na transkrypcj. Komrki eukariotyczne stosuj t podstawow regu regulacji transkrypcji, ale wykorzystuj rwnie inne mechanizmy. Takie procesy jak: wzmacnianie/wyciszanie, ekspresja tkankowoswoista, regulacja za pomoc hormonw, metali i zwizkw chemicznych, amplifikacja genw, rearan-acja genw oraz modyfikacje potranskrypcyjne s take uywane do kontroli ekspresji genw.
Li czne z mechanizmw kontroli ekspresji genu s wykorzystywane jako reakcje na hormony i C2ynniki terapeutyczne. Zrozumienie tych procesw moe prowadzi do opracowania zwizkw, ktre hamuj czynno lub zatrzymuj wzrost organizmw chorobotwrczych.
ktre maj amplifikowane lub przegrupowane geny do wykonywania swoistych funkcji komrkowych. Ekspresja informacji genetycznej musi by regulowana w czasie ontogenezy i rnicowania organizmu i jego komrkowych komponentw. Aby organizm mg adaptowa si do rodowiska i magazynowa energi i sub-straty odywcze, ekspresja informacji genetycznej musi by rwnie wraliwa na sygnay zewntrzne. W miar ewolucji organizmw pojawiay si coraz to bardziej skomplikowane mechanizmy regulacyjne, ktre daway organizmowi i jego komrkom moliwo takiej reakcji, ktra umoliwiaa przeycie w zoonym rodowisku. Komrki ssakw maj ok. 1000 razy wicej informacji ni bakteria Escherichia coli. Znaczna cz tej dodatkowej informacji genetycznej prawdopodobnie suy regulacji ekspresji genw w czasie rnicowania tkanek i takim procesom biologicznym w organizmie wielokomrkowym, ktre zapewniaj organizmowi jego przetrwanie w zoonych czynnikach rodowiskowych. W uproszczeniu s 2 typy regulacji genu:
regulacja pozytywna ii regulacja negatywna (tab.
41-1). Gdy ekspresja informacji genetycznej ilociowo sie zwiksza, dziki obecnoci swoistego elementu regulatorowego, wwczas regulacja jest pozytywna; gdy ekspresja informacji genetycznej jest zmniejszona pod wpywem swoTabela 41-1. Wpyw regulacji pozytywnej i negatywnej na ekspresj genw Wskanik ekspresji genu Regulacja negatywna Jest regulator Zmniejszenie Brak regulatora Zwikszenie Regulacja pozytywna Zwikszenie Zmniejszenie
REGULOWANA EKSPRESJA GENW JEST NIEZBDNA DO PROCESU ROZWOJU, RNICOWANIA I ADAPTACJI

Informacja genetyczna, wystpujca w kadej komrce somatycznej ôrganizmw wielokomrkowych, jest praktycznie identyczna. Wyjtek stanowi nieliczne rodzaje komrek,
REGULACJA EKSPRESJI GENU / SOS
istego elementu regulatorowego, wwczas regulacja jest negatywna. Czynnik lub czsteczka, ktre pofednicz w regulacji negatywnej s negatywnym regulatorem, a czynniki poredniczce w regulacji pozytywnej s regulatorami pozytywnymi. Jednake podwjna regulacja negatywna moe dziaa jako regulacja pozytywna. Elektor, ktry hamuje funkcj regulatora negatywnego, ujawnia si wiec jako regulator pozytywny. Wiele regulowanych systemw, ktre dziaaj jak systemy indukowane, jest w rzeczywistoci systemami ulegajcymi derepresji na poziomie molekularnym. (Opis tych. zjawisk podano w rozdz. 11).
W SYSTEMACH BIOLOGICZNYCH ISTNIEJ 3 TYPY CZASOWEJ REAKCJI NA SYGNA REGULATOROWY

Takie 3 typy reakcji przedstawiono schematycznie na ryc. 41-1 jako stopie ekspresji genu w reakcji na sygna indukujcy w skali czasu. Reakcja typu A charakteryzuje si wzmoon ekspresj genu, ktra zaley od staej obecnoci sygnau indukujcego. Gdy sygna indukujcy jest usunity, wwczas stopie ekspresji genu zmniejsza si do wartoci podstawowej, ale ekspresja ta ponownie si zwiksza wskutek
1 Typ A c/t genu
1
i
Czas
-fleganaracjaCzas Sygna T ypC
Czas Sygna
Ryc, 41-1. Schemat aktywacji genu jako reakcja na swoiste sygna y reguiatorowe, takie jak hormon.
510 / ROZDZIA 41
reakcji na ponowne pojawienie si swoistego sygnau. Ten typ reakcji czsto obserwuje si u wielu wyszych organizmw po ekspozycji na takie czynniki indukujce, jak hormony steroi-dowe (p. rozdz. 45). Reakcja typu B wykazuje wzmoony przejciowy stopie ekspresji genu, nawet jako reakcja na stale trwajcy sygna regulatorowy. Gdy ustaje sygna regulatorowy i komrka powraca do stanu prawidowego, wwczas moe mie miejsce druga przejciowa reakcja na nastpny sygna regulatorowy. Zjawisko reakcja-odczula nie-regeneracja cechuje mechanizm dziaania rodkw farmakologicznych, ale jest take cech wielu procesw zachodzcych w warunkach naturalnych. Ten typ reakcji zachodzi zwykle w procesie rozwoju organizmu, gdy jest potrzebny tylko w okresie przejciowym produkt okrelonego genu, mimo trwaej obecnoci sygnau. Reakcja typu C na sygna regulatorowy obejmuje zwikszony stopie ekspresji genu, ktry trwa nieskoczenie nawet po usuniciu, sygnau. W takim systemie sygna dziaa jak mechanizm spustowy. Gdy raz ekspresja genu w komrce zostaje zainicjowana, wwczas ekspresja ta nie moe by zakoczona nawet w komrkach potomnych; jest to zatem zmiana nieodwracalna i dziedziczna (w sensie komrkowym).
wszystkie wnioski dotyczce tej Fizjologii uzyskano z bada genetycznych. Zanim wyjanimy fizjologi ekspresji genu, musz by zdefiniowane niektre specjalistyczne terminy genetyczne uywane w systemach prokariotycznych. Cystrun jest najmniejsz jednostk ekspresji genetycznej. Jak to opisano w rozdz. 11 niektre enzymy i inne czsteczki biakowe s zoone z 2 lub wicej nieidentycznych podjednostek. Koncepcja 1 gen 1 enzym" nie jest wic ju obecnie zasadna. Cystron jest jednostk genetyczn kodujc struktur podjednostki czsteczki biakowej dziaajcej jako najmniejsza jednostka ekspresji genetycznej. Idea 1 gen 1 enzym moe by obecnie uwaana jako koncepcja 1 cystron 1 podjednostka. Gen indukowalny jest to gen, ktrego ekspresja zwiksza si w wyniku reakcji na swoisty sygna regulatorowy indtiktor. Ekspresja niektrych genw jest konstytutywna, co oznacza, e ekspresja ich utrzymuje si na staym poziomie i nie podlega regulacji. W wyniku mutacji niektre produkty genw induko-walnych s syntetyzowane w sposb konstytutywny. Mutacj, w ktrej wyniku nastpuje ekspresja konstytutywna genu, ktry ijprzednio by genem regulowanym, nazywamy mutacj konstytutywn.
W cigu ostatnich 20 lat wraz ze zrozumieniem, jak przepywa informacja z genu za porednictwem informacyjnego RNA do swoistej czsteczki biakowej, rozwina si szczegowa wiedza o regulacji ekspresji genw w komrkach prokariotycznych. Wikszo szczegowej wiedzy o molekularnych mechanizmach regulacji ograniczaa si a do wspczesnych lat do prokariontw i niszych eukarion-tw. Byo to moliwe dziki zaawansowanej analizie genetycznej, dostpnej przede wszystkim u tych prymitywnych organizmw. Wspczesne postpy w technologii rekombinacji DNA pozwoliy na rozpoczcie bardziej wyszukanej analizy ek spresji genu u ssakw. W tym rozdziale pocztkowa dyskusja bdzie si koncentrowaa na systemach prokariotycz nych. Nie bd dyskutowane bardziej zaawansowane badania genetyczne, ale raczej bdzie dyskutowany problem, ktry moe by nazwany fizjologi ekspresji genu. Jednak prawie
Organizmy prokariotyczne stanowi modele do bada regulacji ekspresji genw w komrkach ssakw
ANALIZA METABOLIZMU LAKTOZY U E. COLI DOPROWADZIA DO SFORMUOWANIA HIPOTEZY OPERONU

W 1961 r. Francois Jacob i Jacues Monod opisali w swojej klasycznej pracy model opero-nu. Ich hipoteza w duej mierze opieraa si na obserwacjach regulacji metabolizmu laktozy przez bakterie jelitowe Escherichia coli. Mechanizm molekularny odpowiedzialny za regulacj genw biorcych udzia w metabolizmie laktozy naley obecnie do najlepiej poznanych mechanizmw regulacyjnych w kadym organizmie. Ji-Galaktozydaza hydrolizuje p-galaktozyd laktozy do galaktozy i glukozy (ryc. 41-2). Gen strukturalny p-galaktozydazy (gen lac Z) wystpuje cznie z genem odpowiedzialnym za przenikanie galaktozy do komrki (Y) i z genem acetylazy galaktozydowej (A), ktrej funkcja nie jest dobrze poznana. Geny strukturalne dla tych 3 enzymw s fizycznie poczone i stanowi operon lac. przedstawiony na ryc. 41-3.
REGULACJA EKSPRESJI GENU / S11

Wizanie /f -gllkozydowe /f-GALAKTOZYDAZA
H HO H
I I HO
HO
' H CH,OH
CH3OH
OH
H;O
Laktoza Galafctoza Glukoza
Ryc. 41-2. Hydroliza laktozy do galaktozy i glukozy przez p-galaktozydaz.__________________

Miejsce s Operator pen Y gen A
promotora' Operon lac
Ryc. 41 -3. Zalenoci przestrzenne pooenia genw strukturalnych i regulatorowych operonu lac. Gen Z koduje Pgataktozydaze, gen Y permeaze, a gen A acetylaz. Gen i" koduje biako represora operonu lac.
Takie genetyczne uszeregowanie genw strukturalnych i ich genw regulatorowych zapewnia skoordynowan ekspresj 3 enzymw wczonych w metabolizm laktozy. Kady z tych sprzonych genw jest przepisywany na wielk czsteczk mRNA, ktra zawiera iiczne i niezalene kodony startu translacji (AUG) i za trzymania translacji (UAA) dla kadego cys-tronu. Taki typ czsteczki mRNA nazywa si policystronowym mRNA. Po licy strono we mRNA wystpuj gwnie w organizmach pro-kariotycznych. Gdy bakterie E. coli zostaj eksponowane na laktoz lub swoisty analog laktozy, wwczas ekspresja aktywnoci p-galaktozydazy, permea-zy galaktozydowej i acetylazy gal aitozyd owej zwiksza si 10100-krotnie. Jest to reakcja typu A przedstawiona na ryc. 41-1. Po usuniciu sygnau, tj. induktora, nasilenie syntezy tych 3 enzymw-sie zmniejsza. Poniewa u bakterii nie zachodzi znaczcy rozpad tych enzymw, stenie fS-galaktozydazy oraz pozostaych 2 enzymw pozostaje takie samo, a nie zostanie zmniejszone przez podzia komrkowy. Gdy bakterie E. coli s eksponowane zarwno na laktoz, jak i na glukoz, jako rda
wgla, to najpierw metabolizuj glukoz, nastpnie chwilowo ograniczaj wzrost do czasu, a geny operonu lac zostaj indukowane i umoliwi metabolizm laktozy. Chocia laktoza jest obecna od pocztku fazy wzrostowej bakterii, komrka nie indukuje enzymw niezbdnych do katabolizmu laktozy, zanim nie wyczerpie si glukoza. Fenomen ten pocztkowo przypisywano represji operonu laktozowego przez pewne katabolity glukozy; std zjawisko to nazwano represj kataboliczn. Obecnie wiadomo, e represja kataboliczn" w istocie powstaje za porednictwem biaka catabolite gene ac-tivator protein (CAP) w poczeniu z cyklicznym AMP {cAMP; p. str. 221). Ekspresja wielu ukadw indukowalnych enzymw lub opero -nw u E. coli i innych prokariontw jest wraliwa na represj kataboliczn, co bdzie opisane poniej. Fizjologia indukcji operonu lac jest dobrze poznana na poziomie molekularnym (ryc. 41--4). Ekspresja normalnego genu i operonu lac jest konstytutywna; jest to ekspresja na staym poziomie, w wyniku ktrej tworz si podjed-nostki represora lac. Czsteczka represora lac skada si z 4 identycznych podjednostek
512 / ROZDZIA 41
Operator Promotor Gen Z A. Poiimeraza RNA nie moe przepisa operatora lub dystainych genw (Z,Y/i) RNA Gen Y Gen A
P o d je d no s tkl rep resora Represor (tetratrar} CAP-AMP
Obecny Induktor brak glukozy
N ie a kt y w n y ^ ^ rep res o r t.
Poiimeraz a RNA przepisuj ca geny
Induktory
Biako /t-galaktozydazy
Biako permeazy
Siatko acetyl azy
Ryc.41 -4. Mechanizm represji i derepresji operonu laktozy. Gdy brak jest induktora (A) produkty genu i", ktre s syntetyzowane konstytutywnie tworz czsteczk represora, ktra wie si z locus operatora i zapobiega zwizaniu polimerazy RNA z locus promotora, uniemoliwiajc nastpujc transkrypcj strukturalnych genw Z, Y i A. Gdy induktor jest obecny (B), wwczas konstytutywnie dziaajcy gen i" wytwarza czsteczki represora, ktre s inaktywowane przez induktor i przez to nie mog wiza si z locus operatora, W obecnoci cAMP i wicego go biaka (CAP) poiimeraza RNA moe przepisa strukturalne geny Z, Y i A, a pot i cy stron owa czsteczka mRNA moe ulec translacji na odpowiadajce im czsteczki biakowe f)-galaktozydazy, permeazy i acetylazy, umoliwiajc katabolizm laktozy.
o m.cz. 38 000. Czsteczka biaka represorowe-go - - produkt genu i" ma due powinowactwo (Kd ok. \0~ lz mol/l) do locus operatora. Locus operatora jest to region dwupasmowego DNA o dugoci 27 par zasad, majcy 2-osiow symetri rotacyjn (pokazan jako cige linie wok kropkowanej osi) w regionie obejmujcym 21 par zasad, jak to przedstawiono poniej:
grubionymi literami na pokazanej wyej sek wencji). W kadym czasie tylko 2 podjednostki represora wi sie z operatorem, a w obrbie regionu dugo ci 17 par zasad przynajmniej 1 zasada kadej pary zasad jest wczona w pro ces rozpoznania i wizania represora lac. Wi zanie zachodzi gwnie w wikszym rowku bez rozerwania dwupasmowej, opartej na sparowanych zasadach, struktury DNA operatora. Locus operatora jest pooony midzy miejscem promotora, w ktrym wie si DNA-zalena 5'AAT TGTGAGC G GATAACAATT poiimeraza RNA w momencie rozpoczynania 3' TTA ACACTCG C CTATTGTTAA transkrypcji, a miejscem inicjacji transkrypcji * Z, czyli strukturalnego genu Najmniejsza dugo operatora dla represora genu lac, ktra warunkuje jeszcze skuteczne dziaa- p-galaktozy-'dazy (ryc. 41-3). Po zwizaniu nie, wynosi 17 par zasad (zaznaczonych posi w lo cus
REGULACJA EKSPRESJI GENU / 513
operatora czsteczka represora uniemoliwia transkrypcj locus operatora, jak rwnie dys-talnych strukturalnych genw Z, Y i A. Czsteczka represora dziaa wiec tu jako negatywny regulator; w jej obecnoci (i w nieobecnoci induktora, p. niej) jest uniemoliwiona ekspresja genw Z, Y i A. W kadej komrce na 1 operator przypada normalnie 2040 czs teczek tetramerowego represora. Analog laktozy, ktry jest zdolny indukowa operon lac, ale jednoczenie sam nie suy jako substrat do |t-galaktozydazy, stanowi przykad induktora poronnego. Dodanie laktozy lub induktora poronnego do bakterii, rosncych na le uytkowanym rdle wgla (np. takim jak btirsztynian), powoduje szybk indukcj enzymw operonu lac. Mae iloci induktora poronnego lub laktozy s zdolne do wniknicia do komrki nawet w nieobecnoci permeazy. Zarwno te czsteczki represora, ktre s zwizane z loci operatora, jak rwnie te, ktre wystpuj w stanie wolnym w eytozolu maj due powinowactwo do induktora. Zwizanie induktora z czsteczk represora skomplekso-wan z operatorem powoduje zmiany konfor-macyjne w strukturze represora i prowadzi do dysocjacji jego od DNA. Jeli DNA-zalena polimeraza RNA bya ju wczeniej doczona do kodujcego pasma w miejscu promotorowym, to transkrypcja zajdzie. Polimeraza generuje policystronowy RNA, ktrego koniec 5' jest komplementarny do pasma matrycowego operatora. W ten sposb induktor wywo uje derepresj operonu iac i pozwala na transkryp cj strukturalnych genw [S-galaktozydazy, permeazy galaktozydowej i acetylazy galaktozydo-wej. Translacja policystronowego mRNA moe zachodzi nawet wtedy, zanim zakoczy si transkrypcja. Derepresja operonu lac pozwala komrce na syntez enzymw niezbdnych do katabolizy laktozy jako rda energii. Aby polimeraza RNA moga zwiza si z miejscem promotorowym, musi by obecne biako CAP (catabolite gene activator protein), z ktrym jest zwizany cAMP. Odpowiedni mechanizm pozwala na gromadzenie przez bakteri cAMP tylko wwczas, gdy jest ona pozbawiona rda wgla. W obecnoci glukozy lub glicerolu, w steniach zapewniajcych wzrost bakterii, bdzie niedostatek cAMP do zwizania si z biakiem CAP. W obecnoci glukozy i glicerolu brak jest wic biaka CAP wysyconego cAMP i DNA--zalena polimeraza RNA nie moe zainicjowa transkrypcji operonu lac. W obecnoci kom33 Biochemia
pleksu CAP-cAMP, ktry wie si do DNA w gr od miejsca promo torowego, transkryp cja moe zachodzi (ryc. 41-4). Regulator CAP--cAMP dziaa wic jako pozytywny regulator, poniewa jego obecno jest wymagana do ekspresji genu. Operon lac podlega zarwno pozytywnej, jak i negatywnej regulacji. Gdy gen i" jest zmutowany w ten sposb, e jego produkt - represor lac - nie jest zdolny do zwizania si z DNA operatora, wwczas w organizmie zajdzie konstytutywna ekspresja operatora lac. Odwrotnie, gdy w organizmie zajdzie mutacja genu i", uniemoliwiajca zwizanie induktora z represorem, organizm taki pozostanie w stanie represji nawet w obecnoci czsteczki induktora, poniewa induktor nie moe zwiza represora w locus operatora w celu derepresji operonu. Bakterie wytwarzajce w locus operatora takie mutacje, ktre nie pozwalaj na zwizanie przez sekwencje operatora normalnej czsteczki represorowej, bd wykazyway konstytutywn ekspresj genw operonu lac. Przecznik genetyczny u bakteriofaga lambda (X) stanowi wzorzec dla interakcji biako -DNA w komrkach eukariotycznych Niektre bakterie stanowi rdo wirusw, ktre istniej w stanie upienia w chromosomie bakteryjnym lub mog replikowa w bakterii i doprowadza do lizy i zabicia bakteryjnego gospodarza. Niektre bakterie E. coli wytwa-P-giobiny; w wyniku tych mutacji powstaje bakteriofaga X. Podczas zakaenia wraliwych E. coli wirusem X, ten ostatni wstrzykuje do komrki bakteryjnej linijny, dwupasmowy genom DNA o dugoci 45 000 par zasad (ryc. 41-5). W zalenoci od stanu odywczego komrki bakteryjnej DNA X albo integruj e si z genomem gospodarza (szlak lizogeniczny) i pozostaje tam w stanie upienia do czasu aktywacji (p. niej), albo te zaczyna replikowa si do czasu wytworzenia ok. 100 kopii kompletnego, opakowanego w biako wirusa, ktry w tym momencie powoduje li swego gospodarza (szlak lityczny). Nowo utworzone czsteczki wirusa mog nastpnie zakaa inne wraliwe bakterie. Wirus X,, po integracji z genomem gospodarza pozostaje w stanie upienia do momentu, a lizogeniczny bakteryjny gospodarz b dzie ekspon owany na czynniki uszkadzaj ce DNA, W reakcji na taki bodziec uszka -
514 / ROZDZIA 41
Promieniowanie nadfioletowe
Byc. 41-5. Zakaenie bakterii E. coli fagiem lambda zaczyna si wwczas, gdy czsteczka wirusa przyczepia si do komrki bakteryjnej (1) i wstrzykuje swj DNA (linia pogrubiona) do komrki (2). Zakaenie moe biec dalej 2 drogami w zalenoci od tego, ktre z 2 zestaww genw wirusa zostaj wczone (uaktywnione). Droga hzogeniczna prowadzi do integracji wirusowego DNA z chromosomem bakteryjnym (4, 5), gdzie wirusowy DNA ulega biernej replikacji wraz z podziaem komrki bakteryjnej. Drzemicy wirus nazywamy profagiem, a komrk, ktra go wytwarza, nazywamy lizogenem. W alter natywnej drodze zakaenia litycznego wirusowy DNA replikuje samodzielnie (6) i steruje syntez biaek wirusowych (7) Wytwarza si ok. 100 nowych casteczek wirusowych. Namnaajce si wirusy doprowadzaj do lizy lub rozsadzenia komrki (8). Profag moe by wyind u kowany" takim czynnikiem, jak promieniowanie nadfioletowe (9). Czynnik indukujcy przerzuca przecznik tak, e inny zesp genw ulega wczeniu Wirusowy DNA wypetla si z chromosomu (10) i replikuje; wirus wchodzi na drog lityczn. (Reprodukowane za zgod z: Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A gen etic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).
dzajcy upiony bakteriofag zostaje indukowany" i geny jego wasnego genomu, niezbdne do wycicia go z chromosomu gospodarza, niezbdne do replikacji jego DNA do syntezy biaek otoczki i enzymw litycznych, zaczynaj by przepisywane i nastpnie ulegaj translacji.
To zdarzenie dziaa jak spust (trigger) lub reakcja typu C (ryc. 41-1); tzn. gdy bakteriofag A. raz zaangauje si w proces indukcji, wwczas nie ma powrotu do stanu wyjciowego zanim komrka nie ulegnie lizie, a zreplikowany bakteriofag nie zostanie uwolniony. Ten przecz-
REGULACJA EKSPRESJI GENU / 515 Gm rsprssora B RNAraprasora --*"-" 0R3 Gen ero
0R2
ORI
J 1111 u j t ] i N i u 11 Ji h i u i N u u i J i ji 1111 y 111 i L n 111111 iii f 11111 n
Promotor repraaora
Promotor ero
X ero R NA
i l i l i l l i i l i l i
i l
Ryc. 41-6. Prawy operator (OR) jest pokazany w tej serii rycin z uwidocznieniem coraz wikszych szczegw. Operator jest regionem wirusowego DNA o dugoci ok. 80 par zasad ( = pz) (A). Po jego lewej stronie ley gen kodujcy represor X., po jego prawej stronie gen ero. Gdy region operatora powikszymy (B), uwidaczniaj si jego 3 podregiony OR1, OR2 i OR3r z ktrych kady ma dugo 17 pz. S to miejsca sygnalne, do ktrych moe wiza si zarwno represor, jak i biako ero. W miejscach tych nakadaj si 2 promotory: sekwencje zasad, do ktrych wie si polimeraza RNA w celu przepisania genu na mRNA (linie faliste), ktry nastpnie ulega przetumaczeniu na biako. Fragment ryciny (C) przedstawia w powikszeniu miejsce 0R1 wraz z sekwencj zasad. Zauwa, ze w tym regionie chromosomu X oba pasma DNA su jako matryca dla transkrypcji {p. rozdz. 39). (Reprodukowano za zgod z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O,: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).
nik ze stanu upienia albo ze stanu profaga do zakaenia litycznego jest dobrze poznany na poziomie genetycznym i molekularnym i bdzie opisany szczegowo. Zjawisko przeczenia w bakteriofagi! X zachodzi w obrbie jego dwupasmowej czsteczki DNA, okrelanej jako prawy operator" (O R) 0 dugo ci 80 par zasad (ryc. 41-6A), Prawy operator jest ograniczony ze strony lewej przez gen strukturalny represora , , az prawej strony przez gen strukturalny kodujcy biako regula torowe zwane ero. Jeeli bakteriofag X jest w stanie profaga, to jest w stanie zintegrowa nym z genomem gospodarza, jedynym genem wirusa X, ktry ulega ekspresji, jest gen re presorowy. Gdy bakteriofag znajduje si w sta nie wzrostu litycznego, wwczas gen represorowy nie ulega ekspresji, ale w stanie ekspresji jest gen ero oraz wieie innych genw wirusa X. Gdy gen represorowy jest wczony, wwczas ero jest wyczony, a gdy gen ero jest wczony, wwczas gen represorowy jest wyczony. Jak wida te 2 geny reguluj wzajemnie swoj ekspresj 1 ostatecznie decyduj o wyborze litycznego lub lizogenicznego wzrostu baktenofaga X. Decyzja o transkrypcji genu represorowego lub transkryp cji genu ero jest przykadem przecznika mole kularnego. Region operatorowy moe by podzielony na 3 podregiony, kady skadajcy si z 17 par
zasad o podobnej, ale nie identycznej sekwencji DNA, zczonych jedna z drug (ryc. 41-6B). Kady z tych 3 podregionw, OR1, OR2 i OR3 moe wiza biako represorowe lub biako ero gwnie przez kontakt midzy represorem a dwupasmowym heliksem DNA w obrbie rowka wikszego. Region DNA midzy genami ero a represorem zawiera take 2 sekwencje promotorowe, ktre kieruj wizaniem polime-razy RNA o swoistej orientacji wwczas, gdy polimeraza rozpoczyna transkrypcj przylegych genw. Jeden promotor zawiaduje polimeraza RNA tak, aby przepisywaa ona w kierunku na prawo, a wic przepisywaa gen ero i inne geny dystalne, podczas gdy inny promotor zawiaduje transkrypcj genu represorowego w kierunku na lewo (ryc. 41-6B). Produkt genu represorowego, biako represorowe o 236 aminokwasach, istnieje jako czsteczka o 2 domenach, w ktrych domena koca aminowego wie si do DNA operatora, a domena koca karboksylowego pobudza zwizanie jednego biaka represorowego z drugim bia kiem, w wyniku czego powstaje dimer. Czsteczki represorowe w postaci dimerii wi si z DNA operatora znacznie silniej ni posta monomeryczna (ryc. 41-7A-C). Produkt genu ero, 66 aminokwasowe biako ero ma pojedyncz domen, ale take wie si z DNA operatora znacznie silniej jako dimer
516 / ROZDZIA 41
(ryc. 41-7D). Oczywicie pojedyncza domena biaka ero poredniczy zarwno w wizaniu operatora, jak i dimeryzacji. W bakterii lizogenicznej, tj. zawierajcej pro-faga X., dimer represora K wie sie preferencyj-nic do OR) i w czasie tego procesu, przez dziaanie kooperatywne, wzmacnia (rzdu 10--krotnie) wizanie si innego dimeru represora do OR2 (ryc. 41-8). Powinowactwo represora do regionu O R 3 jest najmniejsze z wszystkich
3 podregionw operatora. Zwizanie represora z ORI powoduje 2 gwne skutki. Zajcie pod-regionu OR1 przez represor blokuje wizanie
polimerazy RNA do prawego promotora, co
zapobiega ekspresji genu ero. Po wlre, jak to wspomniano wyej, dimer represora zwizany z OR1 wzmacnia wizanie dimeru represora do OR2 . Zwizanie represora do OR2 wywiera dodatkowy wany skutek w postaci wzmocnienia wizania polimerazy RNA do lewos tron-
ero
Byc. 41 -7. Schematyczne struktury molekularne cl (represor I pokazany w Ar B i C) oraz biaka ero. Biako represora X jest acuchem polipeptydowym o 236 aminokwasach. acuch ulega sfadowaniu na 2 podstruktury o ksztacie hantli (ciarkw gimnastycznych): domen w kocu aminowym (NH 2) i domen w kocu karboksylowym (COOH). Te 2 domeny s poczone fragmentem acucha polipeptydowego wraliwego na przecicie proteazami (2 strzaki na ryc. A). Czsteczki pojedynczego represora (monomery) maj tendencj do asocjowania i utworzenia formy dimeru (B); dimer moe dysocjowa, dajc ponownie monomery. Forma dimeru jest utrzymywana gwnie dziki kontaktowi domen w kocu karboksylowym (zakreskowane). Dimery represora wi si (t mog opuszcza) z miejscami sygnalnymi w regionie operatora; ich najwiksze powinowactwo jest do miejsca OR1 (C). Kontakt z DNA zachodzi przez domen aminoterminaln czsteczki represora (zacieniowane). Biako ero ma pojedyncz domen odpowiadajc za dimeryzacj i inne miejsca promujce wizanie dimerw do operatora, zwaszcza do OR3. (Reprodukowano za zgod z : Ptashne M., Johnson A. D., Pabo C. O.: A genetic switch in a bacterial virus. Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).
Ryc. 41 -8. Konfiguracja przecznika w 4 etapach cyklu yciowego bakteriofaga X. Droga lizogeniczna (w ktrej wirus pozostaje w stanie drzemania jako profag) zostaje wybrana wwczas, gdy dimer represora wie si z OR1, przez co umoliwia zwizanie OR2 przez inny dimer. W stanie profaga (gra) dimery represora zwizane z OR1 i OR2 zapobiegaj zwizaniu si polimerazy RNA z prawym promotorem i blokuj syntez biaka ero (kontrola negatywna). Czsteczki represora wzmagaj take wizanie polimerazy do lewego promotora (kontrola pozytywna), w wyniku czego gen represorowy ulega transkrypcji na RNA (linia falista) i syntetyzuje si wicej czsteczek represora, utrzymujc stan lizogeniczny. Indukcja profaga nastpuje po aktywacji proteazy recA przez promieniowanie nadfioletowe, ktra hydrolizuje monomery represora. Zostaje przez to przesunita rwnowaga midzy wolnymi monomerami, wolnymi dimerami i zwizanymi dimerami, a dimery opuszczaj miejsce operatora, Polimeraza nie ma warunkw do wizania si z lewym promotorem, w wyniku czego nie jest duej syntetyzowany represor. W miar postpu indukcji wszystkie /oc/operatora s oprnione z czsteczek represora, dziki czemu potimeraza moe si wiza do prawego promotora i zaczyna syntetyzowa si biako ero. W czasie wczesnego wzrostu litycznego pojedynczy dimer ero wie si do OR3 miejscem, do ktrego biako ero ma najwiksze powinowactwo. Poiimeraza RNA nie moe teraz wiza si do lewego promotora, ale udostpniony pozostaje prawy promotor. Polimeraza wie si do prawego promotora i gen ero oraz inne wczesne geny lityczne ulegaj transkrypcji. Nastpuje wzrost lityczny. (Reprodukowano za zgod z : Ptashne M., Johnson A, D,, Pabo C O.: A genetic switch in a bacterial virus, Sci. Am. /Nov/ 1982; 247:128).
nego promotora, ktry nakada si z podregio-nem C>R2,i przez to wzmaga transkrypcj i nastpnie ekspresj genu represorowego. To wzmocnienie transkrypcji zachodzi przypuszczalnie przez bezporednie dziaanie biako-bia-tko pomidzy polimeraz RNA zwizan z promotorem a represorem zwizanym z OR2. Re-presor X, jest wiec zarwno negatywnym regulatorem zapobiegajcym transkrypcji genu ero, jak i pozytywnym
regulatorem wzmacniajcym
Profag
transkrypcj swego wasnego genu represoro~ wego. To podwjne dziaanie represora jest odpowiedzialne za stabilny stan upionego bak-teriofaga X; represor nie tylko zapobiega ekspresji genw niezbdnych do lizy, lecz take pobudza ekspresj samego siebie, aby stabilizowa ten stan zrnicowania. W przypadku, gdy stenie biaka represora jest bardzo due, wwczas represor moe si wiza do OR3 i przez to zmniejszy transkrypcj genu represorowego
OR3 Fciimeraza RNA
0=2
O1
Indukcja (1] Pollmeraza RNA
indukcja (2)
Polimeraz RNA
\ W W W VT \V WWWWU
0*3
Wczesny wzrost lityczny Promotor represora
0,2
0R1
Promotor ero Polimeraza HNA
\ V > . \\ Vv. W W W W W
0=3
Promotor ropresora
0H2
01
Promotor ero
Ryc. 41 -8.
518 / ROZDZIA 41
z lewostronnego promotora do czasu, a ste nie represora si zmniejszy i represor oddysoc-juje od OR3. Gdy sygna uszkadzajcy DNA, taki jak promieniowanie nadfioletowe, zaatakuje lizo-geniczn bakteri-gospodarza, wwczas s wytwarzane jednopasmowe fragmenty DNA. ktre aktywuj swoiste proteazy kodowane przez gen bakteryjny nazwany genem recA(ryc. 41-8). Aktywowana proteaza recA hydrolizuje t cz biaka represorowego, ktra wie domen czsteczki przy kocu aminowym z domen przy kocu karboksylowym. Takie cicie domen represora powoduje dysocjacj di mero w represora, co z kolei powoduje dysocjacj czsteczek represora z OR2 i ewentualnie z OR1. Mona przewidzie skutki usunicia represora z OR1 i z OR2. Polimeraza RNA natychmiast uzyskuje dostp do prawego promotora i rozpoczyna transkrypcj genu ero, a wzmacniajce dziaanie represora w podregionie OR 2 na transkrypcj w kierunku lewym si zatraca (ryc. 41-8). Biako ero. uzyskane z nowo przepisywanego genu ero, wie si z regionem operatora jako dimery, ale kolejno jego preferencji jest odwrotna ni biaka represorowego (ryc. 41-8). Biako ero, wie si najsilniej do OR3, ale nie ma skutku wspdziaania biaka ero w podregionie OR3 na wizanie biaka ero do OR2. Przy zwikszajcych si steniach ero biako bdzie si wizao do O R2 i ewentualnie do ORI. Zajcie podregionu OR3 przez biako ero natychmiast wycza transkrypcj z lewego promotora a zatem zapobiega dalszej ekspresji genu represorowego. W ten sposb przecznik dziaa w peni skutecznie: gen ero jest teraz w stanie ekspresji, a gen represorowy jest w peni wyczony. Zdarzenie to jest nieodwracalne i ekspresja innych genw A, moe mie miejsce jako cz cyklu litycznego. Gdy stenie represora ero osiga du warto, wwczas biako ero zajmie ewentualnie podregionORl, przez co spowoduje wyczenie wasnego genu; proces ten jest niezbdny do oddziaywania na kocowe etapy cyklu litycznego. Trjwymiarow struktur biaka ero i biaka represora X poznano dziki krystalografii przy uyciu promieni X, a modele wizania tych biaek i skutki opisanych wyej zdarze genetycznych i molekularnych zostay zaproponowa ne i przetestowane. Dotychczas system ten przedstawia najlepiej poznane zdarzenia molekularne zwizane z regulacj genu.
REGULACJA GENU U PROKARIONTW I EUKARIONTW RNI SI W WIELU WANYCH ASPEKTACH

Oprcz regulacji transkrypcji, komrki euka-riotyczne stosuj rne mechanizmy w celu regulacji ekspresji genu (p. tab. 41-2). W komrkach eukariotycznych bona jdrowa fizycznie
Tabela 41 -2. W komrkach eukariotycznych eks presja genu jest regulowana przez transkrypcj i innymi etrogami Inna metody regulacji Amplifikacja genu Rearanacja genu Przeksztacanie RNA Alternatywne skadanie mRNA Transport mRNA z jdra do cytoplazmy Regulacja stabilnoci mRNA
rozdziela proces transkrypcji genu od procesu translacji, poniewa rybosomy znajduj si jedynie w cytoplazmie. W_proces ekspresji genw eukariotycznych wcza si znacznie wicej etapw, zwaszcza dotyczcych przeksztace RNA, ni w proces ekspresji genw prokarioty-cznych; te etapy mog stanowi dodatkowe miejsca na wpywy czynnikw regulujcych w porwnaniu z prokariontami. Etapy przeksztacania RNA w komrkach eukariotycznych obejmuj modyfikacj koca 5' pierwotnego transkryptu. dodanie acucha poliadeny-lowego do koca 3' transkryptw oraz wycicie regionw intronowych do generowania poczonych eksonw w dojrzaej czsteczce mRNA. Dotychczasowa analiza ekspresji genu eukariotycznego dostarczya dowodu, e regu-lacja zachodzi na poziomie transkrypcji, prze ksztace jdrowego RNA i stabilnoci mRNA, Wykazano take, e zachodzi amplifikacja i rearanacja genw, co ma wpyw na ekspresj genw. Dziki pojawieniu si technologii rekombinacji (czyli inynierii genetycznej) DNA, w obecnych latach poczyniono znaczny postp w zro zumieniu ekspresji genw eukariotycznych. Je dnak wobec faktu, e wikszo organizmw eukariotycznych zawiera znacznie wicej informacji genetycznej ni organizmy prokariotycz-ne, i e manipulacja genami u tych pierwszych jest ograniczona, molekularne aspekty regulacji
genw eukariotycznych s znacznie mniej poznane ni przykady dyskutowane uprzednio w tym rozdziale, W nastpnych podrozdziaach opisano krtko kilka rnych typw regulacji genw eukariotycznych. Geny eukariotyczne mog by amplif ikowane podczas rozwoju osobniczego i podczas odczynu na zwizki chemiczne W, okresie wczesnego rozwoju organizmw wielokomrkowych pojawia si gwatowne zapotrzebowanie na swoiste czsteczki, takie jak rybosomalny RNA i informacyjny. RNA, do syntezy biatek, z ktrych tworz si takie tkanki, jak osonka jajowa. Jednym ze sposobw, ktre mog wzmc syntez takich czsteczek, jesl: zwikszenie liczby genw dostpnych do "transkrypcji tych czsteczek. Wrd powtarzajcych sekwencji DNA znajduj si setki kopii genw rybosomalnego RNA i tRNA. Geny te preegzystuj w postaci licznych kopii w materiale genetycznym gamet i w ten sposb s przenoszone z pokolenia na pokolenie w wielkiej liczbie kopii. W niektrych szczeglnych organizmach, takich jak muszka owocowa (Dro-saphila) w czasie oogenezy zachodzi amplifika-cja ju uprzednio niewielu istniejcych genw, np. tych, ktre koduj biaka chorionu (osonki jajowej). Nastpnie takie amplifikowane geny, ktre powstaj prawdopodobnie w procesie powtarzajcej inicjacji w czasie syntezy DNA (zoone banieczki replikacyjne), dostarczaj licznych miejsc do transkrypcji genw (ryc. 38-15 i 41-9).
Geny s36 $38
W ostatnich latach byo moliwe pobudzenie do amplifikacji okrelonych genw w komrkach ssakw hodowanych w kulturach. W niektrych przypadkach byo moliwe uzyskanie kilkuset kopii swoistych genw podczas ekspozycji komrek na zwikszane dawki wybranych zwizkw chemicznych, U chorych otrzymujcych metotreksat, w ceiu leczenia nowotworu, obserwowano rozwj opornoci na lek w komrkach nowotworowych wskutek zwikszenia liczby genw kodujcych reduktaz dihy-drofolianow, ktra jest wczona w metabolizm metotreksatu. Podobna amplifikacja genw zachodzi spontanicznie in vivo, tj. bez dodanego z zewntrz czynnika wybirczego, a nie zamierzone dodatkowe cykle replikacji mog zosta zamroone" w genomie pod wprywem presji odpowiednich czynnikw wybirczych. Utworzenie aktywnych genw immunoglobuliny obejmuje wybircz rearanacj DNA Jedn z najbardziej interesujcych i zoo nych kwestii, podnoszonych w obecnej dekadzie przez biologw, jest problem genetycznych i molekularnych podstaw rnorodnoci prze ciwcia (p. rozdz. 55). Postpy immunologii wykazay niezbicie, e komrki ukadu obronnoci humoralnej podlegaj rnicowaniu, wytwarzaj przeciwciaa o takiej samej swoistoci, ale o rnych funkcjach efektorowych. W cigu ostatnich lat wiele laboratoriw znacznie si przyczynio do zrozumienia podstaw rnorodnoci przeciwcia i regulacji ekspresji genw immunoglobulinowych w czasie rozwoju i rnicowania. Jak to opisano w rozdz. 39, sekwencje kodujce, odpowiedzialne za powstawanie swoistych czsteczek biakowych, nie wystpuj w jednym bloku u ssakw. Jako pierwsze rozpoznano kodujce segmenty zmiennej i staej domeny lekkiego acucha immunoglobuliny znajdujce si w oddzielnych miejscach w obrbie genomu. Jak to opisano szczegowo w rozdz. 55 czsteczki immunoglobuliny s zoone z 2 typw acuchw polipeptydowych: acucha lekkie go (L, light) i cikiego (H, heavy) (p. ryc. 55-6). Kady z acuchw L i H jest podzielony na region zmienny (V) N-kocowy i region stay (C) przy kocu karboksylowym. Regiony V s odpowiedzialne za rozpoznanie antygenu (obcych czsteczek), a regiony stae za funkcje etektorowe, ktre determinuj, jak czsteczka przeciwciaa potraktuje antygen.
nleampllf I kowane
Ryc. 41-9. Schematycina ilustracja ampltfikacji genw s36 i s38 biaka chorionu. (Reprodukowano za zgod z: Chisholm R: Gene amplificatton during development. Trends B/ochem. Sci. 1982; 7:161).
520 / ROZDZIA 41
S znane 3 niesprzone rodziny genw odpowiedzialnych za struktur czsteczki immunoglobuliny. 2 rodziny s odpowiedzialne za acuchy lekkie (acuchy \ i X ) oraz jedna rodzina za syntez cikich acuchw. Kady acuch lekki jest kodowany przez 3 oddzielne segmenty: segment zmienny {Vi), czcy (JL) i stay (CL)- Haploidalny genom ssakw zawiera ponad 500 segmentw V,,, 5 lub 6 segmentw JL i przypuszczalnie 10 lub 20 segmentw C L . W czasie rnicowania im-
foidalnej komrki B segment VL jest przeniesiony z odlegego miejsca tego samego chromosomu na pozycj blisz tego regionu genomu, ktry zawiera segmenty JL i CL. Taka rearana-cja DNA umoliwia nastpnie transkrypcj segmentw VL, JL i CL w postaci pojedynczego prekursora mRNA, ktry nastpnie ulega przeksztaceniu, dajc mRNA dla swoistego acucha lekkiego przeciwciaa. Przez rearanacj rnych segmentw VL, JL i CL w obrbie genomu ukad odpornociowy moe dawa
C H 1 Zawias C H2 C H3
C3 Cl
jimRNA
C..2b
*C2a C
2b mRNA LVDJ
Byc. 41-10. Zdarzenie rekombinacyjne prowadzce do powstania genu kodujcego ciki acuch immunoglobuliny (y 2b). A: DNA Unii zarodkowej przed rearanacj. Istnieje zesp przynajmniej 50 genw (z ktrych kady ma krtk sekwencj liderow) kodujcych cz zmiennego (V) regionu, zesp segmentw D kodujcych gwnie 3, region hiperzmienny i w pewnej odlegoci od niego 4 segmenty J, ktre uzupeniaj sekwencj kodujc regionu V. Segmenty J le w odlegoci ok. 8000 zasad od genu Cn, ktry jest umiejscowiony na pocztku zespou genw kodujcych region C acucha H immunoglobuliny. Sekwencje C s poprzerywane sekwencjami niekodujcymir dajc seri eksonw odpowiadajcych domenom oraz zawiasie w sekwencji aminokwasowej regionu C, B: W trakcie pierwszego zdarzenia translokacyjnego kady z segmentw V, D i J ulega rekombinacji, dajc kompletny acuch n jednostki transkrypcyjnej. Tran skrypt jest kopi pokazanego na rycinie genu, ale sekwencje niekodujce (introny) s usuwane w procesie skadania, ktry prowadzi do wytworzenia cigej kodujcej sekwencji umRNA. C: Drugie zdarzenie translokacyjne, zwane przeczeniem cikiego acucha, usuwa segmenty genw C\i, Cy3i Cyl i umieszcza segment V-D-J i czci intronu J-C41 w pobliu genu Cy2b. Po transkrypcji introny s usuwane w trakcie skadania mRNA, co prowadzi do uzyskania cigej, kodujcej sekwencji w y2b mRNA. (Reprodukowano za zgod z: Molgaard H. V,: Assembly ot immunoglobulin heavy chain genes. Natur 1980; 286:659)
niezmiernie rnorodn bibliotek (miliony) czsteczek immunoglobulin swoistych antyge-nowo. Taka rearanacja DNA jest okrelana jako czenie V-J acucha lekkiego. acuch ciki jest kodowany przez 4 segmenty genowe: VH, D (diversity), JH i segment DNA kodujcy CH. Region zmienny acucha cikiego powstaje przez poczenie segmentw VH z segmentem D oraz JH- Powstay region DNA VH-D-J H jest nastpnie doczony do jednego z 8 genw CH- Te geny CH (C,,, Q, CT3, G,l, CY2b, C72a i CE) determinuj klas lub podklas czsteczki immunoglobulin IgM, IgG, IgA itd. (p. rozdz. 55). Przykad takiej rearanaeji i procesw przeksztacajcych, w wyniku ktrych powstaje gen kodujcy ciki acuch Cy2b, przedstawiono na ryc. 41-10.
W PROCES ROZWOJU I RNICOWANIA SA WCZONE RNE WPYWY NA STRUKTUR CHROMATYNY

Wikszo DNA w komrkach prokariotycz-nych jest zorganizowana w postaci genw i matryce te mog by stale przepisywane. W komrkach ssakw sytuacja ta jest bardzo odmienna. Tutaj stosunkowo maa cz cakowitego DNA jest zorganizowana w postaci genw i przylegych do nich regionw regulatorowych. Nieznana jest funkcja nadmiaru DNA (jest to jeden z powodw, dla ktrego jest tak due zainteresowanie sekwencjonowaniem caego ge-nomu ludzkiego). Dodatkowy poziom kontroli znajduje si na poziomie struktury chromatyny. Jak to podano w rozdz. 38 istniej due regiony chromatyny, ktre s nieaktywne tran skry pcyj nie, podczas gdy inne regiony s aktywne lub potencjalnie aktywne. Z nielicznymi wyjtkami kada komrka zawiera ten sam zestaw genw (z wyjtkiem komrek wytwarzajcych przeciwciaa). Rozwj wyspecjalizowanych narzdw, tkanek i komrek oraz ich funkcji w organizmie zaiey od zrnicowanej ekspresji genw. Tak zrnicowan ekspresj osiga si m.in. przez udostpnienie do transkrypcji rnych regionw chromatyny w komrkach rnych tkanek. Na przykad DNA zawierajcy zesp genw P-globiny wystpuje w aktywnej" chroma ty nie w retykulocycie, natomiast w komrce miniowej jest w chromatynie nieaktywnej". Mechanizmy, ktre determinuj chromatyn
aktywn" lub nieaktywn" nie s znane, ale prawdopodobnie proces ten polega na interakcji biako -DNA. Ponadto, jak to opisano w rozdz, 38, istniej dowody, e metylacja reszty deoksycytydyno-wej (w obrbie sekwencji 5' -"CpG-3') w DNA moe wpywa na oglne zmiany w chromatynie, takie, ktre wykluczaj jej aktywn transkrypcj. Na przykad w wtrobie myszy mog ulega ekspresji tyiko niemetylowane geny ry-bosomalne; s take dowody, e wiele wirusw zwierzcych nie ulega transkrypcji, gdy ich DNA jest metylowany. Jednake nie jest moliwe uoglnienie pogldu, e metylowany DNA nie jest aktywny trans kry pcyj nie i e caa nieaktywna chromatyna jest metylowana, albo e aktywny DNA nie jest metylowany. DNA eu-kariotyczny, ktry znajduje si w aktywnym" regionie chromatyny, moe by przepisywany. Podobnie jak w komrkach prokariotycznych promotor narzuca miejsce, w krym polimeraza RNA rozpocznie transkrypcj, aJe ten promotor nie moe by czsto zdefiniowany jako obszar -35 i -10, zwaszcza w komrkach ssakw (p. rozdz. 39). W komrkach eukariotycz-nych take czynniki typu trans na og pochodz z innych chromosomw (a wic dziaaj w systemie trans), podczas gdy sprawa ta jest dyskusyjna w przypadku komrek prokariotycznych zawierajcych pojedynczy chromosom. Dodatkow zoono wnosz elementy/czynniki, ktre wzmagaj lub wyciszaj transkrypcje, ktre okrelaj ekspresj swoist tkankowo i ktre moduluj dziaanie wielu czsteczek efektorowych.
NIEKTRE ELEMENTY DNA WZMACNIAJ LUB WYCISZAJ TRANSKRYPCJ GENW EUKARIOTYCZNYCH

Oprcz prostych zmian w chromatynie, ktre wpywaj na aktywno transkrypcyjn, gromadz si dowody, e w obrbie DNA znajduj si elementy, ktre uatwiaj lub wzmacniaj inicjacj transkrypcji w obszarze promotora. Na przykad u wirusa naczelnych (SV40) jest region pooony ok. 200 pz w gr od promotora genw wczesnych; region ten, zoony z 2 identycznych tandemowych sekwencji o dugoci 72 pz, moe silnie wzmaga transkrypcj genw in vivo. Kady z tych elementw o 72 pz moe by podzielony na grupy mniejszych elementw; tak
S22 / ROZDZIA 41
wic niektre elementy wzmacniajce transkrypcj maj bardzo zoon budow. Elementy wzmacniajce transkrypcj (enhancer) rni si od promotora pod wzgldem 2 znaczcych cech. .Mog one wywiera pozytywny wpyw na transkrypcj nawci wwczas, gdy s oddzielone od promotora przez tysice par zasad, dziaaj one bez wzgldu na polarno, a take s aktywne, jeeli znajduj si w gr (5P) lub w dl (3') od promotora. Sekwencje, wzmacniajce maj charakter oglny; mog one pobudza kady promotor, ktry znajdzie si w ich ssiedztwie. Element wzmacniajcy virusa SV40 moe np. wywiera wpyw na transkrypcje genu P-globiny przez 200-krotne zwikszenie transkrypcji genu w komrkach zawierajcego w obrbie tego samego plazmidu zarwno sekwencj wzmacniajc, jak i gen P-globiny (p. niej oraz ryc. 41-11), Element wzmacniajcy transkrypcje nie wydaje si wytwarza produktw, ktre dziaaj na promotor, poniewa jest on aktywny tylko wwczas, gdy istnieje w obrbie tej samej czsteczki DNA, gdzie istnieje promotor (czyli znajduje si w pooeniu cis do promotora). Obecnie wyizolowano biaka wice sekwencje wzmacniajce, co powinno pomc w wyjanieniu mechanizmu dziaania tych elementw. Sekwencje wzmacniajce wydaj si wnosi nadwraliwo na nukleaz w obrbie tych regionw, w ktrych one si znajduj (p. rozdz. 38). Podsumowanie waciwoci sekwencji wzmacniajcych przedstawiono w tab. 41-3.
Tabela 41-3. Podsumowanie waciwoci sek wencji wzmacniajcych transkrypcj (enhancer) Waciwoci sekwencji wzmacniajcych Dziaaj wwczas, gdy s umiejscowione w duej odlegoci od promotora Dziaaj wwczas, gdy s umiejscowione w gr (na lewo) lub w d (na prawo) od promotora Dziaaj wwczas, gdy s zorientowane w obu kierunkach Dziaaj przez promotory herero logiczne Dziaaj przez zwizanie 1 lub wicej biaek
Element odpowiadajcy
A
SV40
Promotor
Uer strukturalr
$ globlna
P globlna
B -d
SV40 fi globlna fi globlna
D-
GRE
CAT
Zidentyfikowano take elementy dziaajce w ukadzie cis, ktre zmniejszaj lub wyciszaj ekspresj swoistych genw. Tylko nieliczne takie elementy zostay zbadane tak, e niemoliwe s uoglnienia co do ich mechanizmu dziaama.
Ryc. 41-11. Schematyczne objanienie dziaania sekwencji wzmacniajcych transkrypcj {enhan cer) i innych regulujcych elementw dziaajcych w ukadzie cis. W tym modelu gen chimeryczny skada si z genu reportera (genu strukturalnego), ktry koduje biako, atwe do oznaczenia, promoto ra, ktry zapewnia inicjacj transkrypcji oraz do mniemanego elementu regulatorowego. Przykady A i B ilustruj fakt, e sekwencje wzmacniajce transkrypcj (np. SV40) mog dziaa w obu orien tacjach i na promotor heterologiczny. Przykad C pokazuje, e regulatorowy element meta I ot i o ne i-ny mt (ktry pod wpywem kadmu lub cynku indukuje transkrypcj endogennego genu mt i syn tez biaka wicego metal) moe dziaa przez promotor kinazy tymidynowej (k) w procesie wzmocnienia transkrypcji genu ludzkiego hormonu wzrostu (hGH). Konstrukty uzyskane metod in ynierii genetycznej wprowadzono do przedjdrza mskiego jednokomrkowych embrionw myszy, ktre umieszczano w macicy matki zastpczej i uzyskiwano zwierzta transgeniczne. Wrd potom stwa uzyskanego w tych warunkach byo takie, ktre na podanie jonw cynku w wodzie do picia reagowao zwikszeniem stenia hormonu wzros tu w wtrobie. W takim przypadku te zwierzta transgeniczne reagoway na due stenie hormo nu wzrostu podwojeniem wzrostu w porwnaniu do swego normalnego rodzestwa w miocie. Przykad D pokazuje, e element reakcji na glikokor-tykosteroidy (GRE) bdzie dziaai przez promotor homologiczny (gen PEPCK) lub heterologiczny i e promotor genu PEPCK zawiera take element, ktry dziaa zarwno jako enhancer na poziomie podstawowym, jak i jako element odpowiadajcy na cykliczny AMP (CRE).
Swoista tkanko w o ekspresja moe by wynikiem dziaania sekwencji wzmacniajcych lub wyciszajcych Poznano obecnie wiele genw, ktre wytworzyy elementy wzmacniajce umiejscowione w rnych miejscach w stosunku do regionw kodujcych. Oprcz tego, e elementy wzmacniajce wzmagaj transkrypcj genw, niektre z nich maj zdolno wzmacniania transkrypcji swoistej tkankowe Na przykad element wzmacniajcy, zwizany - genami immunoglobuliny i umiejscowiony miedzy regionem J i C, wzmaga ekspresje tych genw w sposb wybirczy w komrkach limfbidalnych. Elementy wzmacniajce zwizane z genami enzymw trzustkowych sti zdolne do wzmocnienia transkrypcji nawet w stosunku do niespokrewnionych, ale fizycznie sprzonych, genw w sposb swoisty w komrkach trzustkowych myszy, do ktrych specjalnie spreparowane konstrukty genu byy wprowadzone metod mikrochirurgii na poziomie pojedynczej komrki embrionalnej. Uycie takiego zwierzcia transgenicznego okazao sie
szenie ekspresji genu reporterowego, jeli DNA bdzie zawiera element reagujcy na hormon lub jony metalu (ryc. 41-12). Umiejscowienie elementu moe by ustalone przez uywanie do konstrukcji coraz to krtszych fragmentw DNA, delecje lub mutacje punktowe (ryc. 41--13).
Taka strategia z uyciem transfekowanych komrek w hodowli lub zwierzt transgenicznych
umoliwia identyfikacj dziesitkw sekwencji

Promotor testowany Gen reportera wy
5'L
J3'
CAT
GEN FUZYJNY: PHOMOTOR PEPCK REGULUJCY GEN CAT
PEPCK
I TRANSFEKCJA PRZY UYCIU DNA STRCONEGO CaHPO,
bardzo uyteczne w badaniach nad swoist tkankowo ekspresj genw. Na przykad, gdy DNA zawierajcy element wzmacniajcy swoisty dla komrek P trzustkowych (nalecy do genu insulinowego) sprzono w wektorze z duym antygenem T wirusa polioma, konstrukcja taka powodowaa u myszy transgenicznych powstanie nowotworw wywodzcych si z komrek p\ Nowotwory nie rozwijay si w adnej innej tkance. Swoista tkankowo ekspresja genu moe by alem indukowana za porednictwem elementw wzmacniajcych lub elementw do nich podobnych. Geny chimeryczne s uywane do badania elementw wzmacniajcych i innych elementw regulatorowych Przez zczenie regionw DNA podejrzanych o sekwencje regularowe z rnymi genami repo-rterowymi (geny fuzyjne lub geny (p. ryc. 41-11,41-12) mona oznaczy te regiony w ssiedztwie genw strukturalnych, ktre maj wpyw na ich ekspresj. Fragmenty DNA, ktre s podejrzane o funkcje elementw regulatorowych, s wizane do odpowiedniego genu repo-rterowego i wprowadzone do komrki gospodarza (ryc. 41-11). Podstawowa ekspresja genu reporterowego bdzie si zwikszaa, jeli fragment DNA zawiera sekwencj wzmacniajc. Dodanie do poywki kultur hormonu lub metalu cikiego bdzie powodowao zwikchimeryczne)
Podzielenie i ponowne wysiania Kontrola ZBlOR PO 24 h OZNACZENIE .AKTYW NOCI CAT Identyfikacja elementw kontrolnych
Hormony
Ryc. 41-12. Uycie genw fuzyjnych do okrelenia regulatorowych elementw DNA. Fragment DNA, uwaany za nonik jednego lub wicej elementw regulatorowych, jest wczony w wektor plazmido wy, ktry zawiera odpowiedni gen reporterowy kodujcy bakteryjny enzym aminotransferaz chloramienikotu {CAT). Komrki ssakw nie za wieraj CAT, zatem wykrycie tej aktywnoci w eks traktach komrkowych oznacza, e komrki zostay skutecznie zakaone plazmidem. Zwikszenie ak tywnoci CAT ponad poziom podstawowy, np. po dodaniu hormonu glikokortykosteroidowegoozna cza, e region DNA, uyty jako insert zawiera aktywny element reakcji na hormon glikokortykosteroidowy {GRE). Mog by przygotowane inserty zawierajce coraz to krtsze fragmenty DNA, regiony z wewntrznymi delecjami lub regiony z mutacjami punktowymi. Takie inserty mog pre cyzyjnie okrela elementy regulatorowe odpowia dajce na sygnay. ________________________
524 / ROZDZIA 41
KONSTRUKTY GENW FUZYJNYCH Hormon: INDUKCJA T abela 41-4. Przykady biaek regulatoro wych CAT transkrypcji, ktre zawieraj rne motywy struk -C A B turaine wice DNA o *
+ o
Motyw wicy Hel rks- skrt- heliks

+ o
Organizm E. cali
Biako regulatorowe Represor lac CAP Represory ero, X, tryptofanowyi434 Biaka homeo box ? biaka po u Biako genu 32 Gal 4 Serertdrpity, Hunchback TFIIIA Rodzina receptorw steroido wych, Sp1 GCN4 C/EBP, Fos, Jun/Ap1, c-myc, n-myc, l-myc
Fag
Ssaki Palec cynkowy (Zinc finger) E. coli Drode Drosophita Xenopus Ssaki
S-
CAT}
i i i i i i r
-1000
-500 Pozycja nuklaotydu -I l --- 1-<---- 1 -- rHRE C
O -i HRE A
Ryc. 41-13. HRE B -iransfekcja W celu Podejcie gen fuzyjny zlokalizowania (A, B i C) elementw reakcji na hormon. Gen fuzyjny, zbudowany tak, jak to pokazano na ryc. 41-12, wprowadzono na drodze transfekcji do komrek biorcw. Analizujc moment utraty reakcji na odpowiedni hormon (przez oznaczenie aktywnoci CAT) w miar delecji koca 5' mona zlokalizowa elementy reakcji na swoisty hormon.
Zamek leucynowy (Leucine zipper)
Drode Ssaki
o cechach wzmacniajcych, wyciszajcych, elementw swoistych tkankowo, elementw rea gujcych na hormony, jony metali, zwizki chemiczne itd. Aktywno genw w kadym momencie przejawia si jako oddziaywanie tych licznych elementw DNA funkcjonujcych w ukadzie cis z odpowiadajcymi im czyn nikami typu trans. Wyzwaniem dla nauki jest problem poznania, jak one dziaaj. KILKA MOTYWW STRUKTURY POREDNICZY W WIZANIU BIAEK REGULATOROWYCH DO DNA Swoisto kontroli transkrypcji wymaga, aby biaka regulatorowe wizay si z duym powinowactwem do odpowiednich regionw DNA. Wiadomo, e 2a wiele z tych swoistych o& dziaywa biako -DNA s odpowiedzialne 3 unikatowe motywy w strukurze biaka: heliks--skrt-heJiks, palec cynkowy i zamek kucynowy. Przykady biaek zawierajcych te motywy s przedstawione w tab. 41-4. Porwnanie aktywnoci wicej biaek, ktre zawieraj te motywy, prowadzi do licznych wanych uoglnie. Oto one:
Wizanie musi wykazywa due powino wactwo do swoistego miejsca w DNA i mae powinowactwo do innych regionw DNA. Mae regiony biaka wchodz w bezpore dni kontakt z DNA; pozostaa cze biaka moe zapewnia odpowiedni informacj od nonie do rozpoznania regionu DNA, albo te moe by wcignita w dimeryzacj monome rw biaka wicego. Oddziaywania biako-DNA s utrzymy wane przez wizania wodorowe i siy Van der Waalsa. Motywy, ktre znajduj si w tych biakach s unikatowe; obecno ich w biaku o nieznanej funkcji moe nasuwa przypuszczenie, e biako to wie sie z DNA. Biaka z motywami heliks-skrt-heliks lub zamek leucynowy tworz symetryczne dimery, a odpowiadajce im miejsca wice w DNA s symetrycznymi palindromami. W przypadku biaek majcych motyw palec cynkowy miejsce wice powtarza si 29 razy. Cechy te po zwalaj na kooperatywne wspdziaanie mi dzy miejscami wizania i zwikszaj stopie i powinowactwo wizania. Motyw heliks-skrt-heliks (hefix-turn-helix) Motyw heliks-skrt -heliks jest pierwszym motywem, ktry opisano i ktry by najlepiej
* O symetrii podwjnej
Ry. 41-14. Schematyczna ilustracja trjwymiarowej struktury biaka ero i jego wizania do DNA przez motyw heliks-skrt-heliks. Monomer ero skada si z 3 przeciwrwnolegtych paszczyzn [JJ^ ft3) J3he1ikswa (a, a3). Motyw heiika skrt- heliks powstaje wskutek tego, e heliksy 013 i a2 s utrzymane pod kterii 90 urie/-skrt 4 aminokwasw, Heliks a3 biaka ero stanowi powierzchni rozpoznajc DNA (przyciemnione). 2 monomery asocjuj poprzez prze i wrw no lege paszczyzny fo z wytworzeniem dimeru, ktry ma 2-krotn symetri (na prawo). Dimer ero wie si do DNA przez swoje 1x3 heliksy, z ktrych kady kontaktuje si z ok. 5 pz na tej samej powierzchni rowka wikszego DNA. Odlego midzy 2 porwnywalnymi punktami na 2 heliksach na DNA wynosi 34 A, co odpowiada odlegoci 1 kompletnego zwoju podwjnej spirali DNA. (Dziki uprzejmoci Dr Brian Mathews).
zbadany. Analiza trjwymiarowej struktury -wyjawia, e kady z monomerw srzeciwrwnolegych paszczyzn 41-14). pjmer powstaje przez zwizanie przeciw rwno legych paszczy? 11 fSj. Skrty atjTwbrz powierzchni roz-pozmijc DNA, a reszta czsteczki wydaje si by wczona w stabilizacj tych struktur. rednia rednica skrtu 7 wynosi 120 nm, co odpowiada w przyblieniu szerokoci wikszego rowka DNA w formie B. Domena kadego monomeru ero, rozpoznajca DNA, oddziay-wuje z 5 pz, a miejsca wice dimer obejmuj 340 nm, co pozwala na dopasowanie kolejnych pskrtw w rowku wikszym na tej samej powierzchni (ryc. 41-14). Analiza za pomoc promieni X represora X, czyli CRP (biako receptora cyklicznego AMP u Escherichia coli), represora tryptofanu i represora faga 434 potwierdza dimeryczn struktur heliks-skrt-heliks.
Motyw palec cynkowy" (zinc finger) Drugim poznanym motywem wicym DNA by motyw palec cynkowy". Byo wiadomym, e biako TFIIIA, ktre jest pozytywnym regulatorem transkrypcji genu 5S RNA, wymaga do swej aktywnoci jonw cynkowych. Analiza strukturalna i biofizyczna wykazay, e kada czsteczka TFIIIA ma 9 jonw cyn kowych w powtarzajcym si skoordynowanym kompleksie, utworzonym przez blisko rozmieszczone reszty cysteina-cysteina, po ktrych nastpuje sekwencja 12-13 aminokwasw, a nastpnie para histydyna-histydyaa (ryc. 41-15). W niektrych przypadkach, mianowicie w przypadku rodziny receptorw steroidowych i tarczycowych, dublet his-his jest zastpiony przez drug par cys-cys. Biako zawierajce palec cynkowy wydaje si lee na jednej paszczynie heliksu DNA, a jego nastpujce po sobie palce
526 / ROZDZIA 41
si, e struktura^, ta .umoliwia poczenie, na wzr zamka byskawicznego, i utworzenie mocnego kompleksu dimerowego przez 2 identyczne monomery, lub te wytworzenie heterodime-HTfnp. biaka Fos i Jun tworzce beterodimer API {ryc. 41-16). Taka interakcja biako-biako moe suy do wzmocnienia wizania oddzielnych domen biaka, wicych DNA z sekwencjami docelowymi w DNA (ryc. 41-16).
, Palce cynkowe" Cys- Cys . Palce cynkowa" Cys-Hls
Ryc. 41 -15. Palce cynkowe" (zinc finger) stano wi serie powtarzalnych domen (2-9), z ktrych kada osadza si w postaci tetraedralnej konfor macji na atomie cynku. W przypadku TFII1A koor dynacj zapewnia para reszt cysteiny (C) oddzielo nej przez 12-13 aminokwasw od pary reszt his tydyny (H). W,,palcach cynkowych" innych biaek drug par take stanowi reszty C. Palce cyn kowe" wi si w rowku wikszym, przy.czym przylege palce wchodz w kontakt z 5 pz wzdu tej samej paszczyzny hetiksu DNA _______ , ^ ^ _
s uoone naprzemiennie w obrbie 1 skrtu w duym rowku. Podobnie jak w przypadku domeny rozpoznajcej, w biaku typu heliks--skrt -heliks kady palec cynkowy biaka TFIIIA kontaktuje ok. 5 pz DNA. Znaczenie tego motywu dla funkcji hormonw steroido-wych podkrela dowiadczenie przyrody". Mutacja pojedynczego aminokwasu w 1 z 2 palcw cynkowych biaka receptora kalcytriolu powoduje oporno na dziaanie tego hormonu i pojawienie si klinicznego zespou krzywicy (rozdz. 48). Motyw zamek leucynowy (leucine zipper) Szczegowa analiza sekwencji o 30 aminokwasach w kocowym karboksyJowym regionie biaka C/EBP. wicego nukleotydow sekwencj wzmacniajc w DNA (enhancer), pozwolia na ujawnienie nowej struktury. Jak to przedstawiono na ryc. 41-16 region tego biaka tworzy a hdiks, w ktrym reszty leucynyjaj-muj cyklicznie powtarzajce si miejsca co aminokwasw. Organizacja taka obejmuje helikalnych skrtw i 4 powtarzajce si leucyny. Podobne struktury znaleziono w wielu innych biakach zwizanych z regulacj trans krypcji w komrkach ssakw i drody. Sdzi
Domeny tych biaek regulatorowych, wice DNA i majce funkcje transaktywacji, s oddzielne i nie oddziauj wzajemnie ze sob Zwizanie biaka do DNA wywouje zmian oglnej konformacji DNA, co pozwala zwizanemu biaku aktywowa transkrypcj, lub te te 2 funkcje mog by obsuone przez oddzielne i niezalene domeny. Dowiadczenia z wymian domen sugeruj t ostatni moliwo. Genowy produkt GALI bierze udzia w me tabolizmie galaktozy u drody. Gen ten jest pozytywnie regulowany przez biaka GAL4, ktre wi si do sekwencji aktywatorowej (UAS), pooonej w gr od genu, przez domen przy kocu aminowym GAL4. Koniec biaka GAM, o dugoci 73 aminokwasw, ktry ma zdolno wizania DNA, usunito i zastpiono wic DNA domen biaka lex A z E. coli. W wyniku tego powstaa czsteczka, ktra nie wizaa si do GALI sekwencji aktywatorowej UAS i oczywicie, ktra nie aktywowaa genu GALI (ryc. 41-17). Jeli jednak do regionu promotora genu GAL wprowadzono operator lex A, to powstae w wyniku tego zabiegu biako hybrydowe wizao si do tego promotora (w obrbie operatora lex A) i aktywowao trans krypcj GALI. Dowiadczenie to, ktre powtarzano wielokrotnie (wczajc take biaka fuzyjne z glukokortykoidowym receptorem lex A, ktre to biaka aktywoway w ukadzie trans geny reagujce na glukokortykoidy), dostarcza solidnego dowodu, e region koca karbo-ksylowego biaka GAL4 powoduje aktywacj transkrypcji. Domeny wice DNA i majce funkcje transaktywacji s wic niezalene i nie oddziaujce wzajemnie. Regiony przy kocu karboksylowym maj du koncentracj ujemnie naadowanych aminokwasw. Domeny te, czsto okrelane jako kwane plamy" albo ujemne wzy", prawdopodobnie oddziauj z dodatnio naadowanymi regionami niekt rych komponentw kompleksu transkrypcyj-nego.
NH,
NH
Ryc. 41-16. Motyw zamka ieucynowego" (leucinezipper). Rycina po stronie lewej {A) pokazuje analiz helikainego kota karboksylowej czci biaka C/EBR wicego DNA. Sekwencja aminokwasw jest pokazana jako wizanie koniec do koca biegnca w d (pod paszczyzn papieru) wzdu osi a-heliksu. Koo heiikalne skada si z 7 szprych, ktre odpowiadaj 7 aminokwasom obejmujcym kady z 2 skrtw a-heliksu. Zauwa, e reszty leucyny (L) pojawiaj si w co 7. pozycji. Inne biaka majce zamki leucynowe" maj podobny ukad helikainego koa. Schematyczny model domeny wicej DNA biaka C/EBP jest pokazany po stronie prawej (B). 2 identyczne acuchy polipeptydowe C/EBP s trzymane w formie dimeru przez domen zamka Ieucynowego" kadego z polipeptydw (oznaczonych na rycinie jako "prostokty z doczepionymi owalami). Taka struktura jest najwidoczniej wymagana aby utrzyma domeny wice DNA kadego polipeptydu (zaczernione prostokty) w odpowiedniej konformacji niezbdnej do zwizania z DNA. (Rycina dziki uprzejmoci Stevena McKinght).
Komrki eukariotyczne, oprcz wpywania na wydajno promotora, wykorzystuj do kontroli ekspresji genw alternatywne przekszta canie RNA. Ma to miejsce w odniesieniu do alternatywnych promotorw, miejsc granicz nych intron-ekson lub miejsc poliadenylacji. Czasami powoduje to heterogennoc transkryp-tw w komrce, ale znacznie czciej ten sam pierwotny transkrypt jest przeksztacany odmiennie w rnych tkankach. Kilka przykadw kadego z tych typw regulacji przedstawiono poniej. Uycie naprzemiennych miejsc startu transkrypcji daje w rezultacie rne eksony przy kocu 5' w mRNA, odpowiadajcym amylazie i lekkiemu acuchowi miozyn u myszy, gluko-kinazy u szczurw oraz alkoholowej dehyd-rogenazy i aktyny u Drosophila. Wybr alternatywnego miejsca poliadenylacji w
pierwotnym
Alternatywne przeksztacanie RNA stanowi inny mechanizm kontrolny
transkrypcje cikiego acucha immunoglobu-liny u daje w wyniku czsteczki mRNA albo o dugoci 2700 zasad (u^), albo o dugoci 2400 zasad (u.^. W wyniku tego powstaj biaka o rnych regionach przy kocu karboksylo-wym, przy czym biako jara pozostaje umocowane do bony komrkowej limfocytu B, a im-munoglobulina ujest wydzielana. Alternatywne skadanie i przeksztacanie powoduje wytworze nie 7 unikatowych mRNA a-tropomiozyny w 7 rnych tkankach. Nie jest jasne, w jaki sposb zapadaj decyzje odnonie do przeksztace i skadania RNA, ani te czy te etapy mog by regulowane.
Regulacja stabilnoci informacyjnego RNA stanowi inny mechanizm kontrolny
Stabilno czsteczek informacyjnego RNA w cytoplazmie moe w sposb oczywisty wpywa na poziom ekspresji genu w kierunku
528 / ROZDZIA 41 GAL4

Aktywny
Ryc. 41 -17. Dowiadczenie z wymian domen wykazujce, e funkcje wizania biaka do DNA i aktywacji transkrypcji egzystuj jako funkcje oddzielne. Promotor genu GAL1 zawiera pooon na lewo sekwencj aktywujc {UAS), ktra wie regulatorowe biako GAL4 {przykad A). Oddziaywanie GAL4 z t sekwencj powoduje pobudzenie transkrypcji genu GALI. Biako fuzyjne, w ktrym zabrana zostaa domena GAL4 u koca aminowego i podstawiona regionem wicym DNA biaka lexA E. coli, nie stymuluje transkrypcji genu GAL1, poniewa domena lexA nie moe zwiza si z UAS {przykad B), Biako fuzyjne lexA-GAL4 wzmaga transkrypcj genu GAL1 wwczas, gdy do regionu promotora GAL1 wstawi si sekwencj operatora lexA (przykad C). _______________________________________ * _____
pozytywnym lub negatywnym. Zakadajc stay stopie transkrypcji, stabilizacja mRNA bdzie prowadzia do zwikszenia akumulacji mRNA i odwrotnie. W poprzednim rozdziale omawiano mechanizmy biorce udzia w regulacji stabilnoci mRNA. Kady z tych mechanizmw jest potencjalnym miejscem kontroli, na ktre mog oddziaywa hormony i inne efektory. Niektre hormony wpywaj na syntez i degradacj swoistych czsteczek mRNA. Na przykad est-radiol przedua okres ptrwania mRNA wite-logeniny od kilku godzin do ponad 200 godzin. Zjawisko to, w powizaniu z faktem, e estrogeny zwikszaj stopie transkrypcji tego genu rzdu 46 razy, powoduje dramatyczne zwikszenie iloci mRNA witeiogeniny.
PIMIENNICTWO
Breitbart RE, Andreadis A, Wadal-Ginard B: Alter-native splicing: A ubiquitous mechanism for the
generation of multiple protein isoforms from single genes. Annu Rev Biochent 1987;56:467. Jacob F, Monod J: Genetic regulatory mechanisms in protein synthesis. J Mol Biol 1961;33TS. Klug A, Rhodes D: Zinc fingers": A novel protein motif for nucleic acid recognition. Trends Biochem Sci 1987;12. Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL: The leucine zipper: A hypothetical structure common to a new elass of DNA binding proteins. Science 1989;240:1759. McKnight S, Tjian R: Transcriptional selectivity of viral genes in mammalian oells. Celi 1986;46:795. Ptasne M: Gene regulation by proteins acting nearby and ai a distance. Natur (London) 1986;322:697. Ptasne M: A genetic switch. Celi Press and Blackwell Scientific Publications, 1986. Shimizu A, Honjo T: Immunoglobulin c)ass switching. Cdi 1984;3fe801. Schlief R; DNA binding by proteins. Science 1988;241:1182. Struh) K: ftomoters, activator proteins and the mechanism of transcriptional initiation in yeast. Cel! 1987;49:295. Wu R, Bah! CP, Narang SA: Lactose operator-repressor interaction. Curr Top Celi Reg
1978;13:137.
Technologia rekombinacji DNA

WPROWADZENIE
Technologia rekombinacji DNA, nazywana czsto inynieri genetyczn, dokonaa rewolucji w biologii. Wykazuje ona coraz to wikszy wpyw na medycyn kliniczn. Na podstawie analizy rodowodw i badania biaek wczo nych w proces chorobowy zgromadzono du wiedz o ludzkich chorobach genetycznych, ale w wielu przypadkach, w ktrych swoista wada genetyczna jest nieznana, podejcie takie nie moe by zastosowane. Nowa technologia pokonuje te ograniczenia, czerpic bezporednio informacj z czsteczki DNA. Rozdzia ten ma za zadanie nawietlenie tego do zoonego zagadnienia. Przedstawia on podstawowe koncepcje technologii rekombinacji DNA, zastosowanie jej w medycynie klinicznej oraz sownik. Aby ten rozdzia by moliwie wyczerpujcy znajd si w nim pewne powtrzenia dyskutowane ju w innych rozdziaach.
wtroby typu B) i do testw diagnostycznych (np. test do wykrywania AIDS). 5. Technologia rekombinacji DNA jest stosowana w diagnostyce aktualnie wystpujcych chorb i do przewidywania ryzyka rozwoju okrelonej choroby. 6. Specjalne techniki doprowadziy do znaczcego postpu w medycynie sdowej. 7. Moe by opracowane leczenie genowe'niedokrwisto-ci sierpowa tej, talasemii, niedoboru deaminazy adenozynowej i innych chorb.
WYJANIENIE PODSTAWOWYCH CECH DNA DOPROWADZIO DO TECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA DNA jest zoonym biopolimerem zorganizowanym w podwjny hsliks
Podstawowym elementem organizacji jest sekwencja zasad purynowych (adeniny [A] lub guaniny [G]) oraz pirymidynowych (cytozyny [C] lub tyminy (Tj). Zasady te s doczone w pozycji C-1' do cukru deoksyrybozy, a zasady poczone s razem poprzez wizanie fosfodies-trowe, czce czsteczki cukru w pozycjach 3' i 5' (p. ryc. 37-1), Naprzemienne grupy deok syrybozy i fosforanowe tworz szkielet podwjnego heliksu (p. ryc. 37-2). Te wizania 3'-5' okrelaj take orientacj danego pasma w czsteczce DNA, a poniewa 2 pasma biegn w przeciwnych kierunkach okrela si je jako przeciw-rwnolege.
Poznanie technologii rekombinacji DNA jest wane z wielu wzgldw. 3. Eksplozja informacji, dotyczca tej dziedziny jest zdumiewajca. Aby zrozumie i mc ledzi t dziedzin naley doceni jej podstawowe koncepcje. 2. Obecnie mamy racjonalne podejcie do zrozumienia molekularnej podstawy licznych chorb (np. rodzinna hipercholesteroiemia, niedo-krwisto sierpowata, t&i&semk, fibrosis cystica, dystrofia miniowa). 3. Stosujc technik rekombinacji DNA mona wyprodukowa biaka czowieka w duych ilociach, niezbdnych dla lecznictwa (np. insulina, hormon wzrostu, aktywator plazminogenu). 4. W ten sposb mona uzyska biaka do szczepionek (np. zapalenia
J4 - Biochemia
Parowanie zasad jest jednym z najbardziej podstawowych poj w odniesieniu do struktury i funkcji DNA
Adenina i tymina, podobnie jak guanina i cytozyna, dziki wizaniom wodorowym zawsze wystpuj jako pary (p. ryc. 37-3). Mwimy,
530 / ROZDZIA 42
e pary te s komplementarne i e zawarto guaniny we fragmencie dwupasmowego DNA bdzie zawsze rwna zawartoci cytozyn y w tym fragmencie; podobnie zawarto tyminy 1 adeniny jest rwnie jednakowa. Sparowanie zasad i oddziaywania hydrofobowe miedzy zasadami utrzymuj razem 2 pasma DNA. Te wzajemne oddziaywania mog by zmniejszo ne przez ogrzanie DNA prowadzce do denaturacji. Reguy parowania zasad przewiduj, e 2 komplementarne pasma DNA mog po re naturacji ponownie czy si dokadnie nuk leotyd w nukleotyd; zjawisko to zachodzi ww czas, gdy temperatura roztworu jest powoli obniana do normalnej temperatury. Faktycz nie stopie sparowania zasad (albo sparowania bdnego) moe by oznaczany na podstawie temperatury potrzebnej do procesu denaturacji-renaturacji. Segmenty DNA o duym stop niu prawidowego sparowania wymagaj wo enia wikszej energii (ciepa), aby uzyska denaturacj, albo te mwic inaczej cile Sparowany segment wytrzyma wysz tempera tur zanim pasma ulegn rozdzielaniu. Reakcja ta jest uyta do okrelenia znacznych rnic midzy 2 sekwencjami DNA i stanowi podstaw hybrydyzacji, ktra jest zasadniczym elementem procesw opisanych niej. Kady ludzki genom haploidalny zawiera ok. 3 x KF par zasad (pz). Jeli dugo przecitnego genu wynosi 3 x 103 pz (3 kilozasady [kz]), cay genom skadaby si z 106 genw, zakadajc, e nie ma nakadania si genw i e transkrypcja przebiega tylko w jednym kierunku. Sdzi si, e u czowieka jest tylko ok. 10 s genw, a tylko 10% DNA koduje biaka. Funkcja pozostaych 90% ludzkiego genomu nie jest jeszcze dokad nie okrelona. Dwupasmowy helikalny DNA jest upakowany w bardziej zbite struktury za pomoc biaek, gwnie biaek zasadowych zwanych histonami. Ta kondensacja moe odgrywa rol regulatora i z pewnoci suy praktycznym celom. Gdyby DNA wystpujcy w jdrze komrki byl linijnie rozcignity, zajmowaby ok. 1 m dugoci. Biaka chromosomalne powoduj skondenso wanie tak dugich czsteczek DNA w taki sposb, e DNA zostaje upakowany w jdrze w objtoci kilku jim3. Geny s zorganizowanymi elementami DNA Geny prokariotyczne zwykle skadaj si z maego regionu regulatorowego (100500 pz)
i du ego s egmen tu k odu jcego b i ako (50010 000 pz). Czsto kilka genw jest kontrolowanych przez pojedyncz jednostk regulatorow. Wikszo genw ssakw ma bardziej zoon struktur, w ktrej regiony kodujce s poprzerywane regionami niekodujcymi; te ostatnie s usuwane w trakcie przeksztacania pierwotnego transkryptu RNA w dojrzay informacyjny RNA (mRNA, messenger RNA). Regiony kodujce (czyli regiony, ktre pojawiaj si w dojrzaym RNA) s nazywane eksonami, a regiony niekoduja.ee, ktre s wtrcane midzy eksony nazywaj sie intronami (ryc. 42-1). ln-trony s zawsze usuwane z prekursorowych czsteczek RNA przed ich przemieszczeniem do cytoplazmy. Proces, w trakcie ktrego introny s usuwane z prekursorowego RNA, a eksony s czone razem,) nazywamy skadaniem jtN_A (RNA splicing). Nieprawidowe przeksztacanie pierwotnego transkryptu w dojrzay mRNA moe prowadzi u ludzi do stanw chorobowych (p. niej); podkrela to znaczenie potrans-krypcyjnego przeksztacania RNA. Regiony regulatorowe swoistych genw eukariotycz-nych s zwykle umiejscowione w DNA,-ktry ogranicza miejsce inicjacji transkrypcji od koca^ (5' flankujce sekwencje DNA). Czasami takie sekwencje s znajdywane w obrbie samego _ge"fiu albo w regionie, ktry flankuje komec 3' genu. W komrkach ssakw kady gen ma swj wasny region regulatorowy. Liczne geny eukariotyczne (i niektre wirusy, ktre replikuj wTcomrkach ssakw) maj specjaJneêgio-ny, zwane sekwencjami wzmacniajcymi (enhan-cer), ktre powoduj nasilenie stopnia trans krypcji. Niektre geny maj take sekwencje DNA zwane sekwencjami wyciszajcymi (silen-cers), ktre zmniejszaj transkrypcj. Geny ssakw s zoonymi strukturami o wielu komponentach. Geny s przepisywane na RNA Przepyw informacji zachodzi na og od DNA do mRNA i dalej do biaka, tak jak to przedstawiono na ryc. 42-1 i co opisano dokadniej w rozdz. 41. Jest to proces cile kontrolowany, obejmujcy wiele zoonych etapw, z ktrych kady bez wtpienia jest regulo wany przez 1 lub wicej enzymw albo innych czynnikw; nieprawidowa funkcja jakiegokolwiek z tych etapw moe wywoa stan chorobowy.
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI
Podstawowy region promotora Miejsce startu transkrypcji Miejsce dodania poll(A) Ekson
. Ftegion regulatorowy
Ekaon
5 Ftegion nleko dujcy
Intro n
3' Region niekodujcy
Transkrypcja JDRO Pierwotny iransKrypt RNA PPP-J Modyfikacja
kocw 5'l 3'

Tran skrypt zmodyfikowany Czapeczka
\A A
Ogon poli(A) Usunicie intronw i skadania aksonw
Przeksztacony Jdrowy mFtNA
-AAA A
CYTOPLAZM A mRNA
_ Transport przez bono _______ jdrow
-AAA A
Translacja
Biako
COOH
Ryc._42r1. Organizacja jednostki transkrypcyjnej w organizmach eukariotycznych i szlak ekspresji eukariotycznego genu. Geny eukariotyczne maj regiony strukturalne i regulatorowe. Region strukturalny skada sie z DNA kodujcego i niekodujacych sekwencji DNA u kocw 5' i 3'. Region kodujcy dzieli si na 2 czci: 1) ekso ny, ktre ewentualnie stan si do jrzaym mRNA i 2) intro ny, ktre s usuwane z pierwotnego transkryptu w trakcie iego przeksztacenia. Region strukturalny jest ograniczony przy kocu 5' przez miejsce inicjacji transkrypcji, a przy kocu 3' przez miejsce dodania poli (A) lub miejsce te rminacji. Region promotora, ktry zawiera swoiste sekwencje DNA oddziaujce z rnymi czynnikami biakowymi regulujcymi transkrypcj, jest opisany szczegowo w rozdz. 39 i 41. Transkrypt pierwotny ma specjaln struktur, czapeczk" przy swym ko cu 5' i sekwencje (A)n przy ko cu 3'. Transkrypt ten jest przeksztacany w celu usunicia intronw, a dojrzay mRNA jest nastpnie transportowany do cytoplazmy, gdzie ulega przettumaczeniu na biako. _________________________________________ . ^ _ _ _ _____
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA OBEJM UJE IZOLOWANIE MANIPULACJ DNA W CELU UZYSKANIA CZSTECZEK CHIMERYCZNYCH Izolowanie i manipulacja PNA, wczajc w to spajanie typu koniec do koca sekwencji Z; rnych odlegych rde, w celu uzyskania czsteczek chimerycznych -{np. czsteczek zawierajcych sekwencje zarwno Judzkich, jak
i bakteryjnych DNA w sposb niezaleny od organizacji sekwencji), jest podstawa techniki inynierii genetycznej. Obejmuje ona liczne, unikatowe metody i odczynniki. Enzymy restrykcyjne przecinaj acuchy DNA w swoistych miejscach Niektre endonukleazy, czyli enzymy, ktre przecinaj DNA w swoistych sekwencjach w obrbie czsteczki (w odrnieniu od egzonukleaz,
532 / ROZDZIA 42
ktre trawi czsteczki DNA od- kocw), s pod stawowym i narzdziami w inynierii genetycznej. Enzymy te pierwotnie nazwano-enzymami restrykcyjnymi, poniewaicubecao-w-ianej bakterii ograniczaa wzrost pewnych wirusw bakteryjnychj zwanych bakteriofagami. nzy-_ myrestrykcyjne prze cinaj DNA na krtkie Tcawaki wmiejscsich_sw,Qistych sekwencji, w odrnieniu do wikszoci metod enzymatycz nych, chemicznych lub fizycznych. Jt.tre przecinaj DNA w miejscach dowolnych. Te.enzymy--obronng.(dotychczas wykryto ich ponad 200) chroni^JDNA^bakteni gospodarza przed-DNA obcych organizmw (gwnie zakanych fagw). Enzymy te wystpuj jednak w tych komrkach, ktre maj towarzyszcy enzym zdolny do mctylowania DNA gospodarza, kt -ry_tp proces /mienia DNA gospodarza w sub-strat nieodpowiedni do trawienia enzymem restrykcyjnym. Swoiste dla okrelonych miejsc DNA metylazy i enzymy restrykcyjne wystpuj zawsze w bakteriach jako pary. Nazwy enzymw restrykcyjnych pochodz od nazwy bakterii, z ktrej /ustay wyizolowane. Na przykad Eco Rl jest enzymem restrykcyjnym z Escherichia coli, a Bam HI pochodzi z Bacilius amyoliuefaciens (tab. 42-1). Pierwsze 3 litery w nazwie enzymu restrykcyjnego skadaj si z pierwszej litery nazwy rodzaju (E) i pierwszych 2 liter nazwy gatunku (co). Symbol ten moe by uzupeniony okreleniem szczepu (R) i cyfr rzymsk (I) w celu wskazania kolejnoci, w jakiej enzymy zostay odkryte (np. Eco RI, Eco RII). ^Kady enzym restrykcyjny rozpoznaje i przecina sekwencj o dugoci 4 7 pz w.dwu-asmow_y.ni DNA. Takie przecicia DNA daj vv wyniku tpe koce (Kpa 1) lub koce nakadajce si, czyli koce lepkie (Bam HI), zalenie od mechanizmu cicia; jakim posuguje si enzym (ryc. 42-2). Koce lepkie sa szczefll-nif* UTrytPrftnii **' 1-T-irnrtriilr "ji h)'hrvriff'"vch. czyli chimerycznych, czsteczek DNA (p. niej). Jeli w obrbie danej czsteczkiDNA nukleotydy s rozmieszczone przypadkowo, mona wyliczy jak czsto dany enzym bdzie przecina ca czsteczk DNA, DJa_JcajdgajiiiJsca_w_czas-teczce-DNAs 4 moliwoci (A, C, G lub T); ztitpm enTiym restrykcyjny. Vt"<-" T>7poznaje sekwencje o d h i Z î^ inny enzym, ktry rozpoznaje sekwencj o_6_pz bdzie przecina raz co 4096 pz (46), f)any fragmeaL.DNA bdzie mia charakterystyczne
linijnc uoenie mirjtjr. Hprjjj (jp t]iS7nvcli eni )N A sreilr^fl r.n p
Tabala 42-1. Wybrane endonukleazy restrykcyjne i ich swoiste sekwencje* Endonukleaza Bam Hl Bgl II Przecinane sekwencje Pochodzenie bakteryjne
1
G G A T C C T A A 1 C Bacillus amyloliqueG G faciens H
c 1
A T T A A T T A
C T Bacillus globigii
T C
G A
Eco Rl
1
A
T C Escherichia coli A G RY13 T G C
C T i Eco Rll
C C T G G G A C
Escherichia coli R245 influ-
T
Kind III Hha I
A A T T
G C T T Haemophilus C G A A enzae Rd
G C G i
Haemophilus' haemolyticus
C G C G
Hpa i
A C Haemophilus parainA C A A T T T G fiuenzae G T T i
Mst II
Pst I
T \l G G Szczep Microcoieus fA G G A N C C T C T G C i G Providencia stuanii G A C G A T C 164

C C
ri
Tag I
T c G A A G C T
Thermus aquaticus
YTI
T
* A adenina; C cytozyna; G guanina; T tymina. Strzaki pokazuj miejsce przecicia; w zalenoci od miejsca przecicia tworz si lepkie koce (np. Bam HI) lub tpe koce (np. Hpa I). Dugo rozpoznawalnych sekwencji wynosi 4 pz {Taq I), 5 pz (Eco Rll), 6 pz (Eco Rl) lub 7 pz (Mst II). Umowny zapis sekwencji: pasmo grne w kierunku : 5' do 3', pasmo dolne 3' do 5 , czyli o odwrotnej polarnoci Zwr uwag, e wikszo rozpoznawalnych sekwencji jest sekwencjarni palindro-mowymi (tj. odczytywane s tak samo w odwrotnych kierunkach na 2 pasmach). Reszty N oznaczaj, e moe wystpowa tu jakikolwiek nukleotyd.
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI ONA / 533 A. Lepkie, czyli nierwna koce ------ GGA TCC BamHI CCTAGG
B. Tp koce ------- GTTAAC
G GATCC C C TA G GTT GAACTTG CAA
Hpal
----- CAATTG ----- " \
Ryc. 42-2. Wynik trawienia endonukleaz restrykcyjn. Trawienie endonukleaz restrykcyjn daje fragmenty DNA z kocami lepkimi, czcymi si ze sob (A), lub z kocami tpymi (B). Jest to wana okoliczno do opracowania strategii klonowania. ________________________________________
zjmwy-copozwala na konstrukcj map restrykcyjnych. Gdy DNA jest trawiony danym enzymem, wwczas koce wszystkich fragmentw DNA bd miay t sam sekwencj. Uzyskane fragmenty mog by wyizolowane przez elektroforez" na elu z agarozy lub poliakrylamidu (przenoszenie fragmentw DNA jest dyskuto -
wane niej); jest to podstawowy etap w procesie klonowania i gwne zastosowanie enzymw restrykcyjnych. Inne enzymy dziaajce na DNA i RNA s wan czci technologii rekombinacji DNA. Liczne z tych enzym w s podane w tym i nastpnych rozdziaach (tab. 42 -2).
Tabela 42-2. Enzymy stosowane w badaniach technik rekombinacji DNA* Enzym Fosfataza alkaliczna Reakcja Defosforyluje koce 5' DNA i RNA Podstawowe zastosowanie Usuwanie grup 5'-PO4 przed znakowaniem kinaz dla uniknicia samospoje-nia
Nukleaza BAL 31 Ligaza DNA Polimeraza DNA I
Degraduje zarwno 3', jak i 5' koce Progresywne skracanie czsteczek DNA DNA Katalizuje wizania midzy czsteczkaSkadanie czsteczek DNA mi DNA Syntetyzuje dwupasmowy DNA z jed-nopasmowego DNA Synteza dwupasmowego cDNA; nick translation
DNaza I
W odpowiednich warunkach przecina Nick translation; mapowanie miejsc 1 pasmo w DNA nad wraliwych Usuwa nukleotydy od kocw 3' DNA Sekwencjonowanie DNA; mapowanie interakcji DNA-biatko
Egzonukleaza III Egzonukleaza X Kinaza polinukleotydo-wa Odwrotna transkrypta-za Nukleaza Sl
Usuwa nukleotydy z kocw 5' DNA Sekwencjonowanie DNA Przenosi kocowy fosforan (pozycja y) H z ATP do grup 5'-OH DNA lub RNA Znakowanie DNA lub RNA P
Transferaza terminalna
Syntetyzuje DNA n_matn/CJlNA___ Synieza cDNA z mRNA; mapowanie koca 5' RNA Degraduje jednopasmowy DNA Usuwanie struktur spinka do wosw" w syntezie cDNA; mapowanie RNA (zarwno koca 5' jak 3') Dodaje nukleotydy do kocw 3' DNA Dodawanie ogonw monopolimero-wych
'Adaptowano za zgod z: Emery AEH: Str. 41 w; Introduction to Recombinant DNA. Wiley, 1984.
534 / ROZDZIA 42
W celu uzyskania chimerycznych czsteczek DNA stosuje si trawien ie i ponowne spajanie DNA TedmoJogia spajania DNA przez lepkie koce jest atwa, ale czsto s wymagane specjalne techniki, aby pokona problemy nieodczne dla tego podejcia. Lepkie koce wektora mog si czy ponownie same ze sob bez wczenia do wektora fragmentw DNA, ktre zamierzalimy wprowadzi. Fragmenty DNA mog take czy sie przez lepkie koce, dajc w ten sposb tandemowe, Ueterogenne inserty. Lepkie koce mog by rwnie niedostpne albo mog wystpowa w nieodpowiednim pooeniu. Aby omin te problemy stosuje si enzym, ktry. daje., te.pe~ko.nce,, do ktrych dodaje si kocwki, stosujc enzym fjgjaze. Jeeli dodaje si do kocw 3' wektora poli d(G), a poli d(C) do kocw 3' obcego DNA, to 2 czsteczki mog si czy kada ze sob, omijajc wyej wymienione problemy. Ta procedura, nazwana dodawaniem ogonw homo-poiimerw, tworzy miejsce restrykcyjne dla enzymu Sma 1, umoliwiajc w ten sposb atwe odzyskanie fragmentu. W niektrych przypadkach do tpych kocw DNA wie si czniki syntetycznych oligonukleotydw, zawierajcych sekwencj dla enzymu restrykcyjnego, ktry nam odpowiada. Bezporednie zwizanie tpych kocw uzyskuje si enzymem bakterio-fagowym ligaz T4 DNA. Ta technika, chocia trudniejsza ni wizanie kocw lepkich, ma te wyszo, e mona czy jakiekolwiek pary na kocach fragmentu. Wad tej techniki jest brak kontroli nad orientacj inser-tu lub nad liczb spojonych czsteczek, a take trudnoci w odzyskaniu insertu. Chimeryczny DNA namnaa si przez klonowanie
Klon jest to dua populacja identycznych czs teczek, bakterii lub komrek, ktre pochodz od
wsplnego przodka. Klonowanie pozwala na wyprodukowanie duej liczby identycznych czsteczek DNA, ktre nastpnie mog by scharakteryzowane albo uyte do innych celw. Technika ta oparta jest na fakcie, e chimeryczne, czyli hybrydowe, czsteczki DNA mog posuy do konstrukcji wektorw klonujcych, ktrymi s zwykle plazmidy bakteryjne, fagi albo kosmidy; konstrukcje takie podlegaj re-plikacji w komrce gospodarza pod "kontrol swoich wasnych systemw. W ten sposb chi meryczny DNA jest namnaany (amphfikowa-
ny). Ogln procedur przygotowania wektorw klonujcych przedstawiono na ryc. 42 -3. Bakteryjne plazmidy s to mae, koowe czsteczki dwupasmowego DNA, ktrych naturaln funkcj jest nadawanie komrce gospodarza Opornoci na antybiotyki. Plazmidy maj wiele waciwoci, ktre s niezwykle uyteczne do konstrukcji wektorw klonujcych. Istniej one jako pojedyncze lub liczne kopie w obrbie bakterii i replikuj niezalenie od bakteryjnego DNA. Znane s kompletne sekwencje DNA licznych plazmidw; dziki temu dostpne s precyzyjne miejsca przeci enzymami restrykcyjnymi dla insercji obcego DNA. Plazmidy s mniejsze ni chromosom gospodarza (bakterii) i przeto mona je atwo oddzieli od bakteryj nego DNA, a dany fragment DNA mona atwo uzyska przez przecicie plazmidu enzymem swoistym dla miejsca restrykcyjnego, w ktre wczono oryginalny odcinek DNA. Fagi zawieraj zwykle czsteczki linijnego DNA, do ktrych moe by wczony obcy DNA w licznych miejscach restrykcyjnych. Chimeryczny DNA otrzymuje si po przejciu faga przez jego cykl lityczny i po uzyskaniu dojrzaych zakanych czsteczek fagowych. Wyszo wektorw fagowych polega na tym, e podczas gdy plazmidy mog przyj fragmenty DNA o dugoci 610 kz, fragmenty przyjmowane przez fagi mog mie dugo 1020 kz; ograniczenie to narzuca ilo DNA, ktra moe by upakowana w gwk faga. Jeszcze dusze fragmenty DNA mog by klonowane w kosmidach, ktre maj kombinacj najlepszych cech plazmidw i fagw. Kos-midy s to plazmidy, ktre maj sekwencj DNA, tzw. miejsca cos, niezbdne do upakowania X DNA do czsteczki faga. Wektory te rosn w postaci plazmidw w bakteriach, ale poniewa zabiera si z nich wiksz cz niepotrzebnego DNA, wicej chimerycznego DNA moe by upakowane do gwki czsteczki. Wcale nierzadkie s kosmidy, ktre nios inserty chimerycznego DNA o dugoci 3550 kz. Porwnanie tych wektorw p. tab. 42-3. Insercja DNA do funkcjonalnego regionu
Tabela 42-3. Pospolite wektory do klonowania Wektor
Plazmid pBR322 Charon X 4A Kosmidy
Wielko insertu DNA 0,01-10 kz 10-20 kz 35-50 kz
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 535
Restrykcyjn a endonukteaza Eco Hl
Kaowy plazmidowy DNA
Unijny plazmidowy DNA z lapktml kooaml
I Restrykcyjna endonukleaza Eco Rl
AATT TTAA
Fragmenty ludzkiego DNA przecite endonukleaz restrykcyjny zawiera jce lepkie koca
Czsteczka plazmidowego DNA z inserlem ludzkiego DNA (rakom blnantowa czsteczka DNIA)
Ryc'42-3. Uycie nukleaz restrykcyjnych w celu uzyskania nowych rekombinacyjnych, czyli chimerycz nych, czsteczek DNA Plazmidowy DNA, po wprowadzeniu z powrotem do komrki bakteryjnej (w procesie zwanym transformacj), replikuje si nie tylko sam, ale replikuje rwnie fizycznie poczony insert nowego DNA. Poniewa ponowne poczenie lepkich kocw jak to pokazano regeneruje t sam sekwencj DNA, rozpoznawan przez pierwotnie uyty enzym restrykcyjny, sklonowany insert DNA moe by ponownie precyzyjnie wycity z koowego plazmidowego rekombinata t sam endonukleaz. Jeli, jako rdo DNA ludzkiego, uyje si mieszaniny wszystkich fragmentw DNA uzyskanych przez trawienie caiego ludzkiego DNA pojedyncz nukleaz restrykcyjn mona uzyska miliony rnych typw czsteczek rkombinacyjnego DNA, a kady z typw bdzie czysty (jednorodny) w swoim bakteryjnym klonie. (Zmodyfikowano i reprodukowano za zgod z: Cohen S. N.: The maniputation of genes. Sci. AM (Juty) 1975; 233:34). _______ _____________________
moe interferowa z czynnoci tego regionu, naley wic uwaa, aby nie nastpio przerwanie podstawowych funkcji wektora. T koncepcj wykorzystuje si jednak w technice selekcji. Popularny wektor plazmidowy pBR322 ma geny opornoci zarwno dla tetracykliny (tet), jak rwnie ampicyliny (amp). Pojedyncze miejsce dla enzymu restrykcyjnego Pst I w obrbie genu opornoci na ampicylin jest uywane zwykle jako miejsce insercji dla fragmentu obcego DNA. Oprcz uzyskania lepkich kocw (tab. 42-1 i ryc. 42-2), wczony w to miejsce obcy DNA przerywa gen opornoci na am -
picylin i sprawia, e bakteria noszca taki plazmid staje si wraliwa na ampicylin (ryc. 42-4). Rodzicielski plazmid, ktry dostarcza opornoci na 2 antybiotyki moe wic by tatwo oddzielony od chimerycznego plazmidu, ktry jest oporny jedynie na tetracyklin. Dodatkowym potwierdzeniem faktu, e insercja miaa miejsce, moe by oszacowanie wielkoci plazmidowego DNA uzyskane z domniemanego rekombinantu podczas elektroforezy na elu agarozowym, poniewa czsteczka chimerycznego DNA jest dusza ni DNA wektora gospodarza.
536 / ROZDZIA 42
Gen opornoci na ampicylin Gen opornoci na tetracyklin
Nastpnie wczy Insert DNA po Pst I
PBR322 - gospodarz
pBR32E czsteczka chimeryczna
Ryc. 42-4. Metoda przesiewu rekombinantw w celu uzyskania wczonych fragmentw DNA. Do plazmidu pBR322 w unikatowe miejsce Pst I wczono fragment obcego DNA. To wstawienie przerwao gen kodujcy biako wnoszce oporno bakterii gospodarza na ampicylin. Skutkiem tego .ptazmid chimeryczny nie jest w stanie przey po wysianiu na poywk zawierajc ten antybiotyk. Do odrnienia klonw plazmidowych, ktre zawieraj insert, moe by zatem zastosowana zrnicowana wraliwo na tetracyklin i ampicylin.
Klony rekombinantw genomu danego organizmu tworz jego bibliotek Zastosowanie kombinacji enzymw restryk cyjnych, i rnych wektorw do klonowania pozwala na upakowanie w wektorach caego genomu danego organizmu. Zbir takich rnych klonw rekombinantw nazywa si bibliotek. Biblioteka genomowajestprzygptpwana z cakowiiego DNA-linti konioiTioweJJub tkanki. Biblioteka cDNA reprezentuje zbir mRNA wdanej tkance. Bijlioiejyjinomowe uzyskuje si dziki czciowemu trawieniu cakowitego DNA enzymami restrykcyjnymi, ktre tn DNA czsto, tzn. na krtkie odcinki (np. Sau IIIA). Podane jest uzyskanie raczej duych fragmentw, tak aby wikszo genw bya pozostawiona w stanie nie naruszonym. Do konstrukcji takich bibliotek preferowane s wektory fago we, poniewa fagi akceptuj due fragmenty DNA (do 20 kz). Ostatecznym celem jest uzyskanie penej biblioteki. Liczba fragmentw, niezbdnych dla osignicia tego celu, jest odwrotnie skorelowana z rozmiarem fragmentw i zalena wprost od rozmiaru genomu (tab. 42-4). Biblioteka genomu ludzkiego, ktra
zawiera 10 6 rekombinacyjnych fragmentw o duej dugoci, ma 99% szans by bibliotek kompletn. Wobec tego szans na znalezienie pojedynczej kopii genu s bardzo due. Biblioteki cDNA przygotowuje si izolujc najpierw populacj czsteczek mRNA z tkanki, jiastejpnie kopiujc te czsteczki na dwupasmowy DNA, stosujc (koiejno) odwrotn 'Efanskryptaz i DNA polimeraz. Z przyczyn technicznych rzadko, uzyskuje .si kopie cDNA o penej dugoci, tak e s zwykle klonowane mniejsze fragmenty DNA. jUaajydj s czsto preferowane jako wektory do sporzdzania bibliotek cDNA, poniewa s one wygodniejsze w..pracy ni fagi lub kosmidy, chocia wektory z rnych fagw X maj szczeglne zalety do klonowania DNA (p. niej). Wektorw ktrym jest aktualnie syntetyzo wane biako Ipjz"ezr"gerr3îEowaaz6ny ieehn o-logi rekombinacji DNA, nazywa si wektftrem ekspresyjnym. Takie wektory s obecnie powszechnie stosowane w celu wykrycia swoistych czsteczek cDNA w bibliotekach i do produkcji biaek technikami inynierii genetycznej. Wektory te s tak konstruowane, aby zawieray
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 537 Tabela 42-4. Skad penych bibliotek genomo-wych* rdo E coli Drode Drosophila
Ssaki
Pena biblioteka genomowa 1 500 Iragmentw 4 500 Iragmentw 50 000 fragmentw 800 000 fragmentw
biblioteki rekombjnacyjne w wektorze X gtll mog by przesiewane zarwno sondami cDNA, jak i sondami przeciwcia. Biblioteki stosowane do przesiewu sondami w celu wykrycia swoistych genw i czsteczek cDNA Rnorodne czsteczki mog by uyte jako sondy" do poszukiwania swoistych genw lub czsteczek cDNA w bibliotekach lub do ilociowego okrelenia DNA i RNA rozdzielonych podczas elektroforezy na rnych elach^^Sa-^fiUfll sf nii "fVii fra-gmentv DNA liiIT RNA znakowane przy uyciu nukleotydu zawierj-fTfjfliM?p Aiv sonda bya uyteczna i skuteczna musi ona rozpoznawa komplementarn sekwencj. W celu przeszukiwania biblioteki cDNA w odniesieniu do dugich fragmentw cDNA lub przeszukiwania biblioteki genomowej w odniesieniu do sekwencji komplementarnej kodujcego regionu genu mog by uyte cDNA syntetyzowane na swoistych mRNA jako matrycach. Popularn technik wyszuki-w&nia._.swaislycii genw jest wzicie krtkiej sekwencji aminokwasowej i, stosujc zestawienie kodonw dla tej sekwencji (p, rozdz. 40), sporzdzenie sondy oligonukeotydowej, ktra wykryje odpowiadajcy fragment DNA w bibliotece genomowej. Jeli sekwencje sondy komplementarnej dokadnie pasuj do sekwencji poszukiwanych, to sondy "o dugoci 1520 nukleotydw bd z nimi hybrydyzoway. Sondy cDNA s stosowane do wykrywania fragmentw DNA metod Southerna i do wy krywania ilociowego RNA.jnetod Northern. Techniki blotting" i hybrydyzacji pozwalaj na uwidocznienie swoistych fragmentw TJwadocznienie swoistych fragmentw DNA i RNA spord wielu tysicy kontaminuj-cych" czsteczek wymaga uycia kilku technik, ktre okrela si zbiorczym terminem przeniesienie plam (bot transfer), Na rycinie 42-5 przedstawiono procedury przeniesienia plam metod-Soitfherita (DNA), metod Northern (RNA) i Western (biako). (Pierwsza technika uzyskaa nazw od badacza, ktry j opracowa, a inne nazwy wziy si z laboratoryjnego argonu i zostay zaakceptowane). Te metody s uyteczne do oznaczenia liczby kopii genu w danej tkance albo okrelenia, czy gen ma due zmiany strukturalne (delecje, insercje lub rea-ranacje). W pewnych przypadkach, jeli jest
* Liczba przypadkowych fragmentw (unikato wych klonw), ktre powinna zawiera biblioteka zapewniajca, e jest reprezentowany kady pojedynczy gen, jest odwrotnie proporcjonalna do redniej wielkoci Iragmentw uytych do sporzdzenia biblioteki i wprost proporcjonalna do liczby genw w organizmie. Liczby podane w tabeli przedstawiaj liczb fragmentw (niezalenych klonw) niezbdnych do uzyskania 99% pewnoci znalezienia danej sekwencji DNA w bibliotece rekombinacyj-nego DNA o redniej wielkoci insertu 2x1(r nukleotydw. Rnice wynikaj ze zmiennoci stopnia zoonoci genomu midzy organizmami. Liczba niezbdnych klonw jest wyliczona z wzoru: N=In (1 - P) ln(1 f) gdzie P jest danym prawdopodobiestwem, a f frakcj cakowitego genomu zawart w pojedynczym-klonie, W przypadku genomowej biblioteki 9 ssakw, przedstawionej wyej, przyjmujc 3x10 nukfeotydw jako wielko genomu haploidalne-go, rwnanie to ma posta jak niej: N = In (10,99)
ln
< 1 [ 3 x10 s J
Wyszo, jak przedstawia biblioteka zioona z duych fragmentw DNA. jest oczywista, gdy rozwie si to rwnanie biorc wielko fragmen3 4 tw 5 x 10 nukleotydw zamiast 2 x 10 nukleotydw.
bardzo aktywne promotory indukcyjne, odpowiednie i bdce w fazie kodony inicjacyjne dla translacji, sygnay zarwno do transkrypcji, jak i terminacji translacji oraz, jeli potrzeba, odpowiednie sygnay do przeksztacania biaka. Niektre wektory ekspresyjne zawieraj nawet geny inhibitorw proteazy, aby w ten sposb uzyska zwikszone iloci kocowego produktu. Wektor X gt 11 jest powszechnie uywany do konstrukcji bibliotek, poniewa akceptuje wiksze czsteczki cDNA, ktre s replikowane i tumaczone na biaka; w tym stanie rzeczy
538 / ROZDZIA 42
Southarn Northe r Western Bi a ko y ^
nn
j
elowa
i
IcOfJA*
CJC3 E=l
IcDNA*
OOD
W
------
Przeniesienie na bibu
Przeciwciao* sond
Doda
Autoradlogram
Ryc. 42-5. Technika przenoszenia plam. W technice Southerna, czyli przenoszenia DNA, wyizolowany z linii komrkowej lub tkanki DNA trawi si jednym lub wieloma enzymami restrykcyjnymi. Mieszanin inkubacyjn nanosi si do studzienek w elu agarozowym lub poliakrylamidowym i eksponuje_na pole elektryczne prdu staego. DNA dziki adunkowi ujemnemu wdruje w kierunku katody; mae fragmenty wdruj najszybciej. Po odpowiednim czasie DNA denaturuje si agodn alkatizacj i przenosi na bkm nitrocelulozow (filtr) w postaci dokadnej repliki ukadu prkw na elu technik przenoszenia plam (blotting) opracowan przez Southerna. DNA wie si z bibu przez wygrzewanie i nastpnie bibu eksponuje na znakowan sond cDNA, ktra hybrydyzuje z komplementarnymi fragmentami DNA zwizanego z filtrem. Po dokadnym przemyciu bibu eksponuje si na film rentgenowski, ktry po wywoaniu ujawnia swoiste prki odpowiadajce fragmentom DNA, ktre rozpoznay sekwencje cDNA sondy. Koncepcja techniki przenoszenia plam RNA, czyli metoda Northern jest podobna. Przed przeniesieniem RNA jest poddany elektroforezie. Technika przeniesienia wymaga nieco odmiennego postpowania ni przeniesienie DNA, aby przede wszystkim zapewni pozostawienie nietknitych czsteczek RNA; oglnie metoda ta jest nieco trudniejsza. Przenoszenie plam biaek, czyli technika Western, polega na elektroforezie i przeniesieniu biaek na filtr nitrocelulozowy, a nastpnie uycie jako sondy swoistego przeciwciaa lub innych sond molekularnych.
zmieniona swoista zasada, w wyniku czego zmienia si miejsce restrykcyjne, metody te mog wykry mutacj punktow. Techniki przeniesienia plamy typu Northern i Western s stosowane do okrelenia wielkoci i iloci swoistych czsteczek RNA i biaek. kowa jest metod za pomoc ktrej identyfikuje si i oczyszcza swoiste klony. Bakterie s hodowane w postaci kolonii na pytce agarowej, ktr nastpnie pokrywa si nitrocelulozow bibu filtracyjn. Komrki z kadej kolonii przylepiaj si do filtru i s do niego trwale ufiksowane przez podgrzanie, co jednoczenie z dziaaniem NaOH, doprowadza take do iizy komrek i denaturacji DNA, a nastpnie po Hybrydyzacja kolonii lub hyhrydyzacja pyt -
zwoli na jego hybrydyzacj z sond. Sond radioaktywn dodaje si do filtru i po przemyciu kompleks hybrydowy jest lokalizowany przez ekspozycj filtru na klisz fotograficzn. Po zidentyfikowaniu plamy na auto radio gramie z koloni, ta ostatnia moe by wyodrbniona z pytki. Podobna strategia jest stosowana do identyfikacji fragmentw DNA w bibliotekach fagowych. Kolejne etapy tej procedury daj w wyniku wyizolowany klon (kolonie bakteryjne) lub koloni pochodzc z indywi dualnego faga. Wszystkie metody hybrydyzacji, omawiane w tej czci, zale od swoistych waciwoci parowania zasad komplementarnych pasm kwasw nukleinowych opisanych wyej. Do -
kadne sparowanie daje atwo hybryd oporn na wysokie temperatury w trakcie reakcji hyb-rydyzowania i przemywania. Kompleksy takie tworz si rwnie w maych steniach soli. Parowanie zasad, przebiegajce z mniejsz dokadnoci, nie toleruje takich ostrych warunkw, tj. podwyszonych temperatur i maych ste soli; w takim przypadku hybrydyzacja albo nie zachodzi albo hybrydy zostaj rozerwane w czasie przemywania. Rodziny genw, majcych pewien stopie homologii, mog by wykryte przez zmian ostroci warunkw hyb-rydyzacji i przemywania. To podejcie pozwala take na midzy gatunkowe porwnania danego genu. Do analizy czsteczek rekombinacyjnego DNA stosuje si sekwencjonowanie DNA Segmenty czsteczek swoistego DNA, uzyskane technik rekombinacyjnego DNA, mog by analizowane odnonie do ich. sekwencji
nukleotydowej. Metoda ta zaley od istnienia duej liczby identycznych czsteczek DNA, Wymg len moe by speniony przez klonowanie danego fragmentu, stosujc wyej opisane techniki. Enzymatyczna metoda (metoda Sangera) sekwencjonowania DNA wykorzystuje swoiste dideoksynukleotydy, ktre kocz syntez pasma DNA w miejscu swoistego nuk-leotydu w trakcie syntezy pasma na oczyszczonej matrycy kwasu nukleinowego. Reakcje s tak dobrane, e uzyskuje si populacj fragmentw DNA reprezentujcych zatrzymanie syntezy na kadym nukleotydzie. Wprowadzajc radioaktywny znacznik w miejsce naprzeciw miejsca terminacji mona uzyska oddzielne fragmenty, ktre s segregowane pod wzgldem wielkoci za pomoc elektroforezy na elu po-liakryiamidowym. Po sporzdzeniu autoradio-gramu kady z fragmentw da pasmo na kliszy rentgenowskiej. Pasma te, czytane po kolei, daj sekwencj DNA (p. ryc. 42-6). Obecnie jest opracowana metoda pautomatycznego sek -
Reakcja:
ddATP
ddTTP
ddCTP
Sekwencja oryginalnego pasma
ddGTP -
* -A-G-T-C-T-T-G-G-A-G-C-T-3
i _
11
3 t _
..
1
A T Zasada koczca
A G T C T T G G A G C T
Ryc. 42-6. Sekwencjonowanie DNA metod opracowan przez Sangera. Drabinkowy ukad prkw na elu od dotu do gry przedstawia stopniowo wyduajce fragmenty pasma oryginalnego DNA. Wiedzc, ktra ze swoistych reakcji dideoksynukleotydowych zostaa wykonana w celu uzyskania mieszaniny fragmentw, mona oznaczy sekwencj nukieotydw od znakowanego koca w kierunku koca nieznakowanego na podstawie odczytywania" elu. Reguy parowania zasad wg Watsona-Cricka (A-T, G-C) dyktuj sekwencj drugiego (komplementarnego) pasma. ______________________________
<
540 / ROZDZIA 42
Sekwencja docelowa START CYKL1
VW
vAW
wencjonowania DNA. Inna metoda (Maxama i Gilberta) wykorzystuje metody chemicznego przecinania DNA w miejscu swoistych nuk-leotydw.
Synteza oligonukleotydw jest
CYKL 2 VSA/
V\A>
CYKL 3
W\A
obecnie metod rutynow Rutynow metod laboratoryjn jest zautomatyzowana synteza chemiczna umiarkowanie dugich (~100 nukleotydw) oligonukleotydw o precyzyjnej danej sekwencji. Kady cykl syntezy zajmuje kilka minut, tak e synteza caej czsteczki moe by wykonana w ci gu godzin w zalenoci od jej dugoci. Takie oligonukleotydy s obecnie konieczne do sek-wencjonowania DNA, przeszukiwania bibliotek., okrelania przesuni w mobilnoci DNA, polimerazowej reakcji acuchowej (p. niej) i licznych innych zastosowa. Poiimerazowa reakcja acuchowa (PCR) pozwaa na amplifikacj sekwencji DNA Poiimerazowa reakcja acuchowa jest metod suc do amplifikacji okreslonycrrsekwen-cji DNA. Swoisto tej reakcji jest oparta na uyciu 2 primerw oligonukieotydowych, ktre hybrydyzuj do komplementarnych sekwencji pooonych na przeciwlegych pasmach DNA i flankujcych interesujc nas sekwencj docelowy (ryc. 42-7), Prbk DNA jest najpierw podgrzewana, aby..rozdziei 1 pasia, nastpnie sekwencje primerw wiajj&jjicj DNA i kade z pasm jest kopiowane przez polimeraz DNA p_oczwszy od miejsca pnmera. Kade z 2 pasm D.NA suy jako matryca do syntezy nowego DNA, poczwszy od 2 primerw. Powtarzane cykle denaturacji cieplnej, czenia primerw do ich sekwencji komplementarnych i wyduenie sekwencji primerw przez polimeraz DNA daj ostatecznie eksponencjaln amplifikacj
Ryc. 42-7. Uycie polimerazowej reakcji acuchowej do amplifikacji swoistych sekwencji genowych. Dwupasmowy DNA jest podgrzewany w celu rozdzielenia na pojedyncze pasma. Pasma te wi 2 okrelone primery, ktre s komplementarne do swoistych sekwencji na przeciwlegych pas mach, i ktre okrelaj fragment przeznaczony do amplifikacji. Polimeraza DNA wydua primery w obu kierunkach i syntetyzuje 2 pasma komplementarne do 2 pasm oryginalnych. Cykl ten powtarza si wielokrotnie, dajc zamplifikowany produkt o okrelonej dugoci sekwencji.
vw*
wv
nTrffl
ÂA/
WV
segmentw DNA o okrelonej dugoci. Na. _ rb û ludzi. Dwiejechniki pozwalaj uzyska pocztku , .stosowania reakcji PCR uywano ten cel: hybrydyzacja komrek somatycznych poimerazy DNA z E. coli; polimeraza bya oraz hybrydyzacja in situ. Hybrydyzacja in situ niszczona przez kady cykl denaturacji cieplnej. jest najprostsz i najbardziej bezporedni proPodstawienie stabilnej termicznie polimerazy cedur, w ktrej radioaktywna sonda jest dodaD..N z Thermus aguaticus, organizmu, ktry wana do rozproszonych na powierzchni szkieka yje i replikuje si w temp. 70-80C, omino mikroskopowego chromosomw problem wraliwoci enzymu na temperatur i metafazo-wycja,. Dokadne miejsce pozwolio na automatyzacj reakcji PCR, hybrydyzacji okrela si przez naoenie na poniewa reakcja prowadzona t polimeraz szkieko emulsji fotograficznej i po ekspozycji moe przebiega w temp. 70C. Pozwolio to porwnanie rozmieszczenia ziaren w obszarach take zwikszy swoisto i wydajno DNA. strukturalnych chro mosomw. Pozwala to Mona uzyska zamplifikowane sekwencje czsto na umiejscowienie genu w okrelonym DNA krtkie, np. 50100 pz oraz dugie o 2,5 prku lub regionie chromosomu. Niektre z kpz. 20 cykli w reakcji PCR daje amplifikacj genw Judzkich, umiejscowione za pomoc tej rzdu ~1G6, a 30 cykli rzdu ~109. Reakcja metody, przedstawiono w tab. 42-5. PCR pozwala na amplifikacj i analiz DNA z W tabeli tej przedstawiono jedynie wybrane pojedynczej komrki, cebulki wosowej lub prbki, poniewa dotychczas zmapowano ju .nasienia. Oczywiste jest zastosowanie reakcji setki genw. Mapa genomu ludzkiego bdzie PCR w medycynie sdowej. Metoda PCR jest kompletowana w nadchodzcych latach; ist take stosowana do: 1) wykrywania czynnikw niej take zamierzenia zsekwencjonowania cazakanych, zwaszcza latentnych wirusw, 2) ego genomu ludzkiego. Z dotychczasowych prenatalnej diagnostyki genetycznej, 3) wykry- bada wyaniaj si nastpujce wnioski: 1. wania polimorfizmu alleli, 4) precyzyjnego usta- Geny, ktre koduj biaka o podobnych funkclania typu tkanek do transplantacji i 5) do jach, mog by umiejscowione na oddzielnych bada nad ewolucj, stosujc archeologiczne chromosomach (a- i P-globiny). 2. Geny, ktre prbki DNA. Rwnie liczne s zastosowania stanowi cz rodziny, mog take mieci si techniki PCR do problematyki bada podsta - w oddzielnych chromosomach (hormon wzrostu wowych i z pewnoci pojawi si nowe mo- i prolaktyna). 3. Geny odpowiedzialne za wiele liwoci zastosowania tej metody. chorb dziedzicznych, wywoanych niedoborem swoistych biaek, wczajc w to rwnie choroby zwizane z chromosomem X, s umiej PRAKTYCZNE ZASTOSOWANIE scowione w miejscach swoistych. Moe najTECHNOLOGII REKOMBINACJI DNA ciekawszy jest fakt, e dziki dostpnoci okreSTALE SI ZWIKSZA lonych sklonowanych fragmentw restrykcyj nych byo moliwe umiejscowienie Wyizolowanie swoistego genu z caego chromoso-malne wielu zaburze o nieznanym geno-mu wymaga takich technik, ktre niedoborze biakowym, np. plsa wica umoliwiaj wyrnienie jednej milionowej Huntingtona chromosom 4; mukowiscydoza czci. Identyfikacja obszaru regulatorowego, chromosom 7; torbielowato nerek u ktry moe mie dugo tylko 10 pz, wymaga dorosych chromosom 16; dystrofia czuoci wyrniajcej 1 cz z 3xlO8; taka miniowa typu Duchenne chromosom X. choroba, jak niedokrwisto sierpowata jest Z chwil umiejscowienia wady do regionu spowodowana przez mutacj pojedynczej DNA, ktry ma cechy budowy genu (ryc. 42-1) zasady, co wymaga precyzji rzdu 13 x 105. mona skonstruowa gen syntetyczny i uzy^.a Technologia rekombinacji DNA jest jego ekspresj w odpowied nim wektorze oraz dostatecznie skuteczna, aby sprosta tym okreli jego funkcj albo mona wymogom. zsyntetyzowa domniemany peptyd na podstawie dedukcji z ukadu otwartej ramki Mapowanie genw pozwala odczytu w obrbie regionu kodujcego. Przena umiejscowienie swoistych genw ciwciaa przeciwko takiemu peptydowi mona w okrelonych chromosomach uy w celu zbadania, czy taki peptyd ulega Umiejscowienie genw ekspresji u zdrowych osobnikw i czy jest unioliwia.sp.orzdze-nie mapy ludzkiego nieobecny u osobnikw z okrelonym zespoem genomu, Pozwala to na uzyskanie uytecznych genetycznym. informacji w opisie cho-
542 / ROZDZIA 42 Tabela 42-5. Umiejscowienie genw u czowieka*

Gen
Chromosom 11p15 6p23-q12 17q21 -qter 16p12-pter 11q12 20g13-qter 12q24 Xq26-q27
Choroba
Insulina Prolaktyna Hormon wzrostowy a-Globina P-Globina

Deaminaza adenozynowa
Niedobr hormonu wzrostu a-Ta I asem i a p-Talasemia, niedok-rwtsto sierpowata Niedobr deaminazy adenozynowej Fenyloketonuria Zesp Lescha-Nyhana Plsawica Huntingtona
Hydroksylaza fenyloalaniny Fosfory boy 1 otr nsferaza hipoksantynowo-guaninowa Segment G8 DNA
* Tabela ta przedstawia chromosomalne umiejscowienie niektrych genw i chorb zwizanych z niedoborem lub nieprawidowym wytwarzaniem produktw genowych. Omawiany chromosom jest wskazany przez pierwsz podkrelon cyfr lub liter. Inne cyfry i litery odnosz si do szczegowego umiejscowienia podanego w: McKusick VA: Mendeiian Inheritance in Man, 6 th ed. Johns Hopkins Univ. Press, 1983.
Okrelone biaka mog by produkowane do celw badawczych 1 diagnostycznych Praktycznym celem bada nad rekombinacy-jnym DNA jest uzyskanie materiaw do zastosowa w biomedycynie. Ta technologia ma 2 okrelone zalety: 1, Moe ona dostarczy duych iloci materiau, ktre nie byyby mo liwe do otrzymania zwykymi metodami oczysz czania (np. interferon, aktywator plazminogenu). 2. Moe ona dostarcza ludzkiego materia u (np, insulina, hormon wzrostu). Korzyci w obu tych przypadkach s oczywiste. Chocia pierwotnym celem jest dostarczenie produktw, na og biaek, do leczenia (insulina) lub diag nostyki (test do wykrywania AIDS) chorb ludzi i zwierzt lub do celw zapobiegania (szczepionka przeciwko wirusowi zapalenia w troby B), s take inne realne i potencjalne zastosowania o wartoci rynkowej, zwaszcza w rolnictwie. Przykadem tego ostatniego za stosowania s usiowania uzyskania, na drodze inynierii genetycznej, rolin, ktre s bardziej oporne na ekstremalne warunki suszy lub tem peratury albo bardziej wydolne w asymilacji azotu.
Technologia rekombinacji DNA ma zastosowanie w molekularnej analizie chorb
runkach naturalnych, podobnie jak w wikszoci ludzkich struktur, wystpuje normalna zmienno sekwencji DNA, .Zmienno w sekwencji ,UNA,zyn polimorfizm. zachodzi z czstoci 1 na kadych 500 nukleotydw, czyli ok. 107 razy na genom. Nie ulega wtpliwoci, e zmienno polega na delecjach i insercjadi DNA oraz podstawieniach pojedynczych zasad. U zdrowych ludzi zmiany te zachodz zwykle w niekodujcych regionach DNA lub w miejscach, ktre nie wywouj zmian w funkcji kodowanego biaka. Polimorfizm st ruktury DNA moe mie zwizek z niektrymi chorobami i moe by uyty do poszukiwania swoistego genu odpowiedzialnego za chorob, jak to opi sano niej. Polimorfizm ma take rne za stosowania w medycynie sdowej. rob. Genetyka klasyczna uczy, e wikszo chorb genetycznych jest spowodowana mutacjami punktowymi, w wyniku ktrych dochodzi do syntezy uszkodzonych biaek. Podejcie to jest nadal prawdziwe, cho naley tu zazna czy, e choroba genetyczna moe by take wynikiem dezorganizacji jakiegokolwiek etapu
Naturalna zmienno genowa. W wa-
Zmienno genowa powodujca cho -
przemian opisanych w pocztkowych ustpach tego rzdziauT "ilustrowanych na ryc. 42-1. Zagadnienie to dobrze ilustruj badania nad genem fi-globiny. Gen ten jest umiejscowiony w zespole genw na chromosomie 11 (ryc. 42-8), \
5'G, A7 t(3
a jego bardziej szczegow wersj przedstawiono na ryc. 42-9. Nieprawidowe wytwarzanie p-globiny prowadzi do wielu chorb i jest spowodowane r norodnymi uszkodzeniami w obrbie genu i w jego otoczeniu (tab. 42 -6).
D D D
10 kz
3'
Hemoglobino patia
0-Talasemla
Hemoglobina Lepore
Ryc. 42-8. Schematyczny obraz zespou genw p-globiny i niektrych zaburze genetycznych. Gen fi-globiny jest umiejscowiony w chromosomie 11 w cisym powizaniu z 2 g enami y-globiny i genem 8-globiny. Rodzina genw pjest uoona w kolejnoci 5' - -Gy-Ay- f p-S-p-3'. Locus 5 ulega ekspresji we wczesnym okresie podowym (c^ 2). Geny y ulegaj ekspresji w yciu podowym, dajc hemoglobin podow (HbF, a2y2)- Hemoglobina osobnikw dorosych skada si z HbA(OjP2) li>b HbA2 (o^Sj). Gen f p jest pseudogenem, ktry wykazuje homologi sekwencji z p, ale zawiera mutacje, ktre zapobiegaj jego ekspresji. Delecje (czarne paski) w obrbie (ocus p powoduj powstanie -talasemii (niedobr lub brak [P] P-globiny), Delecja genw 5 i P jest przyczyn powstania hemoglobiny Lepore (w ktrej obecna jest tylko hemoglobina a). Inwersja (AyP) w tym regionie (pasek niezaciemniony z napisem Inwersja") niszczy funkcje genu i take powoduje talasemie (typ III). Kady z typw talasemii ma tendencj do wystpowania w pewnych populacjach, np. delecja (Ay5() i inwersja pojawiaj si u osb z Indii, Znacznie wicej delecji zmapowano w tym regionie chromosomu i kadej z nich towarzyszy pewien typ talasemii.
00
00 0
AA
TT T
AA
Ryc. 42-9. Mutacje w genie p-giobiny powodujce taiasemie, Gen P-globiny pokazany jest w orientacji 5' r do 3', Pola zakreskowane ilustruj regiony 5 i 3' nie ulegajce translacji. Czytajc w kierunku od 5' do 3' pola zaciemnione s eksonami 1 -3, a przestrzenie niezacienione intronami 1 i 2, Mutacje dotyczce kontroli transkrypcji ( #) s umiejscowione w regionie DNA flankujcym gen od koca 5'. Wskazano przykadowo zidentyfikowane mutacje nonsensowne (A), mutacje dotyczce przeksztace RNA (O) i przecinania RNA (O)- W niektrych regionach znaleziono liczne mutacje. Oznaczono je klamrami (,!,).
S44 / ROZDZIA 42 Tabela biny 42Zmiana Mutacje punktowe 6. Zmiany strukturalne Uszkodzona funkcja Fadowanie biaka
1
w genie p-glo-
Choroba
Delecje
Rearanacje
Niedokrwisto sierpowata Kontrola transkrypcji P-Talasemia Mutacje typu przesunicia ramki odp-Talasemia czytu i nonsensowne Przeksztacanie RNA p-Talasemia Wytwarzanie mRNA p-Ta lasem i a Hemoglobina Lepore Wytwarzanie mRNA P-Talasemia typ III
i .niszczy miejsce rozpoznania enzymu restrykcyjnego Mst II (CCTNAGG; wskazane przez ma strzak pionow; tab.42-1). Inne miejsca dla Mst II, umiejscowione w kierunku 5' i 3' od Delecje, insercje i rearanacje DNA. miejsca omawianego (ryc. 42-10), nie s objte Badania bakterii, wirusw, drody i muszki mutacj, a zatem bd przecite. W wyniku tego owocowej wskazuj, e fragmenty DNA mog w inkubacja z enzymem restrykcyjnym DNA od obrbie genomu przemieszcza si z jednego osobnikw normalnych (AA), heterozygot (AS) miejsca na drugie. Delecja krytycznego i homozygot (SS) da 3 rne wzory prkw frag-mentu DNA, rearanacja DNA w obrbie uzyskanych metod Southerna (ryc. 42-10). genu albo insercja fragmentu DNA do Przykad ten ilustruje jak mona ustali rodo kodujcego lub regulatorowego regionu mog wd DNA, stosujc zasady omwione w tym wywoywa-takie zmiany w ekspresji genu, rozdziale. Analiza rodowodu jest stosowana ktre prowadz do choroby. Molekularna w odniesieniu do licznych chorb genetycznych anafiza p-talasemii dostarcza znowu licznych i jest najbardziej uyteczna w przypadku chorb przykadw takich
kadem jest choroba zwana niedokrwistoci sierpowata, ktra jest spowodowana mutacj pojedynczej zasady w caym genomie zoonym z 3 x l O 9 pz; jest to substytucja T przez A w DNA, ktra nastpnie powoduje zmian A na U w mRNA odpowiadajc .kodonowi w genie p-globiny (ryc. 7-20). Zmieniony kodem okrela inny aminokwas (walin zamiast kwasu glutaminowego), co powoduje nieprawidowoci strukturalne C7stcczki fi-glohiny. Inne mutacje punktowe w obrbie genu P-globiny i jego otoczeniu powoduj zmniejszenie, a w niektrych przypadkach zatrzymanie wytwarzania rzaj takiego agodnego (temperate") wirusa p-talasemia. Talasemie charakteryzuj si wadami w syntezie podjednostek hemoglobiny, a (-talasemia powstaje wwczas, gdy jest niedostateczne wytwarzanie p-globiny. Na rycinie 42-9 przedstawiano mutacje punktowe, ktre mog wpywa na wytwarzanie normalnego mRNA (a zatem normalnego biaka), a ktre s uwikane w powstawanie p-talasemii.
Mutacje punktowe. Klasycznym przy-
procesw, a zwaszcza delecji, ktre s przyczyn choroby (ryc. 42-8). Zesp genw globi-ny wydaje si by szczeglnie podatny na tego typu uszkodzenie. Delecje w zespole genw cc-globiny, umiejscowionym na chromosomie 16, powoduj powstanie ct-talasemii. Istniej silne zwizki etniczne z licznymi typami tych delecji, tak e pnocni Europejczycy, Filipi-czycy, rasa czarna i ludzie zamieszkali w rejonie Morza rdziemnego maj rne typy uszkodze, a wszystkie z nich powoduj brak hemoglobiny A i a-talasemi. Podobna analiza moe by wykonana dla licznych innych chorb. Mutacje punktowe s zwykle okrelane na drodze sekwencjonowania danego genu, cho przypadkowo, gdy mutacja niszczy albo stwarza nowe miejsce restrykcyjne, technika analizy fragmentw restrykcyjnych moe by uyta do wykazania uszkodzenia. Delecje lub insercje DNA, wiksze ni 50 pz, czsto s wykrywane technik blotting" wed ug Southerna. Analiza rodowodu. Niedokrwisto sier powata ponownie dostarcza doskonaego przykadu jak technologia rekombinacji DNA moe by zastosowana do bada nad chorob u czowieka. Podstawienie T przez A w pamie matrycowym DNA genu P-globiny zmienia sekwencj w regionie, ktry odpowiada 6 kodonowi z sekwencj
C C T G A G G pasmo kodujce pasmo G G A C CDC C matrycowe
na sekwencj
pasmo kodujce C C T G T G G G G pasmo matrycowe A C@C C
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA / 54S

A Miejsca restrykcyjne Mst tl w obrbie I wokot genu /f -globlny Pr awidowy (A) 5
:
3'
1,15 kz 0,2 kb
Niedokrwlsto& 5-slerpowata (S) 1.35 kz
B. Analiza rodowodu
nWielko fragmentu
- 1,35 pz
- 1,15 pz
AS
AS
SS
AA
AS
Fenotyp
Ryc. 42-10. Analiza rodowodu niedokrwistoci sierpowatej. Grny fragment ryciny (A) pokazuje pierwsz cz genu (3-globiny i miejsce restrykcyjne Mst II (f) w genie p-globiny prawidowym (A) i genie w niedokrwistoci sierpowatej (S), U osb zdrowych trawienie ONA enzymem restrykcyjnym Mst II daje fragmenty o dugoci 1,15 kz i 0r2 kz. Zamiany T na A, jakie zachodz u chorych na niedokrwisto sierpowat, usuwaj jedno z 3 miejsc restrykcyjnych w obrbie genu f -globiny, w wyniku czego po trawieniu Mst 11 powstaje tylko pojedynczy fragment o diugoci 1,35 kz, Te rnice w dugoci fragmentw s atwo wykrywalne technik Southerna (B). (Na tej rycinie fragment 0,2 kz wyszed pozazel). Analiza rodowodu pokazuje 3 moliwoci: AA osoba zdrowa (O); AS heterozygota {o, |J); SS homozygota () Podejcie to pozwala na prenataln diagnoz niedokrwistoci sierpowatej lub nosicieli tej choroby () __________________ ^ _ _ _ ^ _________________________________
spowodowanych delecjami i insercjami lub rzadziej w przypadku zmian w miejscu restrykcyjnym, jak to podano na przykadach cytowanych w tym ustpie. Analiza taka jest uatwiona przez zastosowanie reakcji PCR, ktra moe dostarczy dostatecznej iloci DNA dla takiej analizy.
.15 Biocheimj
prenatalna jest moliwa w przypadku, gdy jest znana wada gen etyczna i gdy jest dostpna swoista sonda molekularna. DNA uzyskany z "niewielkiej iloci (np. 10 ml) pynu owod-niowego (albo z biopsji kosmwek) moe by
Diagnostyka prenatalna, Diagnostyka
546 / ROZDZIA 42
uyty do aaalizy metod Southerna. Pid, majcy wzr restrykcyjny AA (ryc. 42-10), nie jest chory na niedokrwisto sierpowat, ani nie jest jej nosicielem. U podu majcego wzr SS rozwinie si niedokrwisto sierpowat. Obecnie s dostpne sondy do tego typu analizy dla wielu chorb genetycznych.
Polimorfizm dugoci, fragmentw restrykcyjnych (RFLP). Przytaczane wyej
rnice w sekwencjach DNA mog wynika ze zmiennoci miejsc restrykcyjnych, w wyniku czego fragmenty restrykcyjne maj rne dugoci. Wrodzone rnice wzoru restrykcyjnego (np. zmienno w DNA zachodzca w oglnej populacji w stopniu wikszym ni 1 %) s znane jako polimorfizm dugoci fragmentw restrykcyjnych, czyli RFLP (restrietion fragment length polymorphism). RFLP powstae w wyni-ku zmian w pojedynczej zasadzie (np. niedo-krwfsto sierpowat) albo w wyniku delecji lub insercji DNA w obrbie fragmentu restrykcyj nego (np. talasemie) s uytecznym narzdziem diagnostycznym, Polimorfizm taki znaleziono w znanych genetycznych loci, a take w obrbie sekwencji, ktrych funkcja nie jest znana; tak wic polimorfizm RFLP moe prowadzi do zniszczenia funkcji genu, lub te nie mie adnych konsekwencji biologicznych. Polimorfizmy RFLP s dziedziczne i segreguj si wedug wzoru Mendla. Polimorfizm RFLP (dotychczas poznano prawie 350) jest gwnie uywany w celu okrelenia chorb dziedzicznych, w ktrych nie znamy ubytku funkcji. RFLP moe by uyty do ustalenia
grap sprze, ktre nastpnie, w procesie zwanym kroczenie po chromosomie, moe ewentualnie okreli locus zwizany z chorob. W metodzie kroczenia po chromosomie (ryc. 42-11) fragment przedstawiajcy 1 z kocw dugiego odcinka DNA jest uytydo izolowania innego fragmentu, ktry pokrywa si z pierwszym, ale wychodzi poza jego obrb. Kierunek tego wyjcia jest okrelany przez mapowanie restrykcyjne i proces ten jest powtarzany stopniowo, a uzyska si sekwencj stanowic przedmiot zainteresowania. Choroby sprzone z chromosomem X s szczeglnie odpowiednie do tego typu podejcia, poniewa ekspresji ulega tylko 1 allel. Dziki temu ok. 20% wszystkich zdefiniowanych RFLP jest umiejscowionych w obrbie chromosomu X i prawie kompletna mapa sprze na tym chromosomie zostaa opracowana. Stosujc technik RFLP znaleziono gen dystroiii miniowej typu Du-chenne sprzony z chromosomem X. Podobnie wad w plsawicy Huntingtona umiejscowiono w kocowym regionie krtkiego ramienia chromosomu 4, a wada wywoujca torbielowato nerek jest sprzona z locus a-globiny w chromosomie 16. Terapia genowa. Choroby wywoane nie doborem produktu genowego (tab. 42-5) mog by odpowiednie do leczenia zastpczego. Strategia takiego leczenia polega na sklonowaniu genu (np. genu, ktry koduje deaminaz adenozyny) w wektorze, ktry moe by pobrany przez komrk gospodarza i wczony do geno-mu. Komrki prekursorowe szpiku kostnego s
3'
Nienaruszony 5' -DNA Fragmenty
Sonda pocztkowa
c. 42-11. Technika kroczenia po chromosomie. Zamiar polega na izolowaniu genu X z duego odcinka DNA. Dokadne pooenie tego genu nie jest znane, ale jest dostpna sonda ( ) komplementarna do fragmentu DNA (na rycinie pokazano sond do koca 5'), jak rwnie dostpna jest biblioteka zawierajca seri nakadajcych si fragmentw DNA. W celu uproszczenia pokazano tylko 5 takich fragmentw. Pocztkowo sonda bdzie hybrydyzowaa tylko z klonami zawierajcymi fragment 1, ktry mona nastpnie wyizolowa i uy'jako sond do wykrycia fragmentw 2. T procedur powtarza si a do hybrydyzacji fragmentu 4 z fragmentem 5, ktry zawiera ca sekwencj genu X.
przydatne do tego celu, poniewa komrki takie mog zasiedli szpik i tam si namnaa. Wprowadzony gen moe zacz kierowa ekspresj swego biakowego produktu i w ten sposb naprawia ubytek w komrce gospodarza. Takie zastpienie genu w komrce somatycznej oczywicie nie moe by przekazane potomstwu. Opracowano inne strategie do zmiany linii komrek rozrodczych, ale strategie te zbadano jedynie na zwierztach dowiadczalnych. Pewien odsetek genw wstrzyknitych do zapodnionego jaja myszy moe by wczony do genomu i mona go znale zarwno w komrkach somatycznych, jak i komrkach rozrodczych. Takie zwierzta transgeniczne okazay si bardzo uyteczne w analizie swoistych tkan-kowo wpyww na ekspresj genw oraz wpywu nadmiernego wytwarzania produktw genowych (np. hormonu wzrostu lub onkogenw) oraz w poszukiwaniu genw zwizanych z rozwojem osobniczym, procesem, ktry dotychczas byo trudno bada. Podejcie z uyciem metody transgenicznej zastosowano wspczenie w celu skorygowania wad genetycznych u myszy. Do zapodnionych jaj, uzyskanych od myszy z genetycznym hipogonadyzmem, wstrzykiwano DNA zawierajcy kodujc sekwencj prekursora biakowego hormonu uwalniajcego gonadotropine (GnRH). Gen ten ulega ekspresji i podlega prawidowej regulacji w podwzgrzu pewnej liczby myszy, a zwierzta te byy pod wszystkimi wzgldami prawidowe. Ich potomstwo nie wykazywao niedoboru GnRH. Jest to zatem dowd na somatyczn ekspresj transgenu i na jego egzystencj w komrkach rozrodczych.
SOWNICZEK
Auta radiografia. Wykrywanie czsteczek radio aktywnych (np. DNA, RNA, biako) przez uwidocznienie ich elektw na filmie fotograficznym. Baktertofag. Wirus, ktry zakaa bakteri. Biblioteka. Zbir sklonowanych fragmentw, ktre reprezentuj cay genom. Biblioteki mog by albo genomowe (w ktrych s reprezentowane zarwno introny, ;ak i eksony oraz inne sekwencje DNA) lub biblioteka cDNA {w ktrej s reprezentowane jedynie eksony}. cDNA. Czsteczka jedno pasmowego DNA, ktra jest komplementarna do czsteczki mRNA i jest na niej syntetyzowana przy uyciu odwrotnej transkryptazy Chimeryczna czsteczka. Czsteczka (np. DNA, RNA, biako) zawierajca sekwencje uzys-
kane z 2 rnych rodzajw sekwencji (np. 2 rnych genw. . Endonukleaza. Enzym, ktry przecina wewntrzne wizania DNA lub RNA Ekson. Sekwencja w genie, ktra jest reprezentowana (ulega ekspresji) w czsteczce mRNA. Egzonukeaza. Enzym, ktry odcina nukleotydy w DNA lub RNA od koca 3' lub 5'. Hybrydyzacja. Swoista reasocjacja komplementarnych pasm kwasw nukleinowych (DNA z DNA, DNA z RNA lub RNA z RNA) nsert. Dodatkowa sekwencja w DNA na og wprowadzona technikami rekombinacji DNA. Intron. Sekwencja w genie, ktra jest przepisana na RNA, ale wycita i usunita przed translacja, w trakcie przeksztacania pierwotnego transkry-ptu. Klon. Dua liczba komrek lub czsteczek, ktre s identyczne z pojedyncz macierzyst komrk lub czsteczk. Kosmid. Plazmid, do ktrego wczono sekwencje DNA bakteriofaga X, ktre s niezbdne d/a upakowania DNA (miejsca cos); pozwala to na upakowanie in vitm plazmidowego DNA. Lepkie koce DNA. Komplementarne pojedyncze pasma DNA wystajce na przeciwlegych kocach dwupasmowej czsteczki DNA lub wystajce z kocw rnych dwupasmowych czsteczek (p. take tpe koce). Ligacja. Katalizowane enzymatycznie czenie przez wizania fosfod i estrowe 2 odcinkw DNA lub RNA; odpowiednimi enzymami s ligazy DNA i RNA. Nick translation. Technika znakowania DNA oparta na zdolnoci polimerazy DNA z . coli do degradowania pasma DNA, ktre zostao nacite, i do nastpujcej resyntezy tego pasma; jeli zastosuje si radioaktywne trifosforany nukleo-zydw, to nowo syntetyzowane pasmo bdzie wyznakowane i bdzie mogo by uyte |ako radioaktywna sonda. Northern bot. Metoda przenoszenia RNA z eu agarozowego na bon (filtr) nitrocelulozow, na ktrej czsteczki RNA mog by wykryte odpowiedni sond. Oligonukleotyd. Krtka zdefiniowana sekwencja nukleotydw, poczonych typowym wizaniem fosfod i estrowym. Odwrotna transkrypcja. Synteza DNA na matrycy RNA katalizowana odwrotn transkryptaz Palindrom. Sekwencja dwupasmowego DNA. ktra jest taka sama, gdy 2 pasma s czytane w przeciwnych kierunkach. Plazmid. Maa, pozachromosomalna, koowa czsteczka DNA, ktra replikuje niezalenie od DNA gospodarza. Polimerazowa reakcja acuchowa (PCR). Enzymatyczna metoda wielokrotnego kopiowania dwupasmowego DNA, ktre moe stanowi np. sekwencj okrelonego genu.
548 / ROZDZIA 42 Pseudogen. Nieaktywny segment DNA powstay wskutek mutacji aktywnego genu macierzystego. Rekombinacyjny DNA. Zmieniony DNA, powstay w wyniku msercji sekwencji deoksynuk-eotydowych (ktre uprzednio nie byy obecne), do okrelonej czsteczki DNA na drodze reakcji enzymatycznych lub chemicznych. Restrykcyjny enzym. Endonukfeaza, ktra prze cina oba pasma DNA w bardzo swoistych miejscach okrelonych sekwencj zasad. Sonda. Czsteczka uyta do wykrywania obecnoci swoistego fragmentu DNA lub RNA, np. w kolonii bakteryjnej, sformowana z biblioteki genetycznej lub w czasie analizy technikami przenoszenia plam; zwyke uywanymi sondami s czsteczki cDNA, syntetyczne oligodeoksy-nukleotydy o okrelonej sekwencji i przeciwciaa przeciwko swoistym biakom. Southern bot. Metoda przenoszenia DNA z elu agarozowego na bon (filtr) nitrocelulozow, na ktrej DNA moe by wykryty przy uyciu odpowiedniej sondy (np. komplementarnego DNA lub RNA). Spinka do wosw (hairpin). Dwupasmowy odcinek utworzony dziki sparowaniu zasad midzy ssiednimi komplementarnymi sekwencjami pojedynczego acucha DNA lub RNA. Splicing (skadanie RNA). Usuwanie intronw z RNA z jednoczesnym czeniem eksonw. Sygna. Znak pozwalajcy na obserwacj ko cowego produktu, gdy np. swoiste sekwencje DNA lub RNA s wykrywane metod autoradio-grafii lub inn metod. W ceu uzyskania sygnau stosowana jest zwykle hybrydyzacja z komplementarnym radioaktywnym polinukleotydem (np. technika Southerna lub technika Northern). Tandem. Liczne kopie tej samej sekwencji {np. DNA), ktre le przylege jedna do drugiej. Terminalna transferaza. Enzym, ktry dodaje nukleotydy jednego typu (np. reszty deoksyade-nonukteotydylowe) do koca 3' pasm DNA. Tpe koce. 2 pasma DNA, majce koce zrwnane z sob (p. lepkie koce). Transkrypcja. Synteza RNA na matrycy DNA. Transgeniczny. Termin opisujcy wprowadzenie nowego DNA do komrek rozrodczych przez wstrzyknicie do jdra komrki jajowej. Translacja. Synteza biaka na matrycy mRNA. Wektor. Plazmid lub bakteriofag, do ktrego moe by wprowadzony obcy DNA w celu sklonowa-nia. Western bot. Metoda przenoszenia biaka na bon (filtr) nitrocelulozow, na ktrej biako to moe by wykryte odpowiedni sond, np. przeciwciaem. PIMIENNICTWO Beaudet AL: Bibliography of cloned human and other selected DNAs. Am J Hunt Genet 1985; 37:386. Berger SL, Kimmel AR: Guide to Moleculor Coning Techniques, Vol 152, Methods in Enzymology, Academic Press, New York, 1987. DNA inmedtcine. Lance* 1984; 2:853,908,966,1022, 1086, 1138, 1194, 1257, 1329, 1380, 1440. Gusetla JF: Recombinant DNA techniues in the diagnosis and treatment of inherited disorders. J Clin Invest 1986; 77:1723. Kan YW et al: Pages 275 283 in: Thalossemia: Recent Advance$ in Detectian and Treatmettt. Cao A, Carcassi U, Rowley P (edttors). AR Liss, 1982. Lewin B: Genes III. Wiley, 1987. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J: Molecuhr Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. Martin JB, Gusella JF: Huntington's disease: Pathogenesis and management. N Engl 3 Med 1986: 315:1267. Orkin SH et al: Improved detection of the sickle mutation by DNA analysis: Application to prenatal diagnosis. N Eng J Med 1982; 307:32. Watson JD, Tooze J, Kurtz DT: Recombinant DNA: A Short Course. Freeman, 1983. Weatherall DJ: The New Genetics and Clinicai Practice, 2nd ed. Oxford Univ Press, 1986. Yuan R: Structure and mechanism of multifunctional restriction endonucleases. Annu Rev Biockem 1981; 50:285.
CZ V Biochemia zewntrzkomrkowej i wewntrzkomrkowej komunikacji Btony: struktura, organizacja i funkcja

43
WPROWADZENIE
Bony s strukturami o bardzo duej lep koci, chocia wci jeszcze plastycznymi. Bony plazmatyczne tworz zamknite obszary wok komrkowej cytoplazmy, oddzielajc jedn komrk od drugiej, umoliwiajc tym samym ich indywidualizacje. Bony plazmatyczne charakteryzuj si wybircz przepuszczalnoci i dziaaj jako bariery, dziki ktrym moliwe jest istnienie rnic w skadzie wntrza i zewntrznego otoczenia komrki. Wybircza przepuszczalno uwarunkowana jest istnie niem kanaw i pomp dla jonw i substratw, a take obecnoci specyficznych Veccptorw dla odbioru sygnaw, np. hormonw. Bony plazmatyczne wymieniaj take skadniki ze rodowiskiem pozakomrkowym w procesach egzocytozy i endocytozy, za specjalne przestrzenie w strukturze bon zcza szczelinowe umoliwiaj wymian materiau midzy przylegajcymi komrkami. Dziki istnieniu bon moliwe jest take powstawanie wyspecjalizowanych odrbnych obszarw (kompartmentw) wewntrz komrek. Takie wewntrzkomrkowe bony otaczaj wiele morfologicznie odrbnych struktur (orga-nelli), np. mitochondria, siateczk rdplazma-tyczn, siateczk sarkoplazmatyczn, aparat
Golgiego, ziarnistoci wy dziel nicze, lizosomy i bon jdrow. Bony, lokalizujc enzymy dziaaj jako integralne elementy w stymulacji sprzenia pobudzenie odpowied oraz s miejscami transdukcji energii np. w procesach fotosyntezy i oksydacyjnej fosforyiacji.
Wiksze zmiany w strukturze bon mog zakci rwnowag wodn i przepyw jonw, a tym samym kady z procesw zachodzcych wewntrz komrki. Specyficzne niedostatki lub zmiany okrelonych skadnikw bon prowadz do wielu chorb. Przykadami tego s m.in.: nieobecno w lizosomach kwanej maltazy, wywoujca chorob zwizan z gromadzeniem glikogenu typu II; brak przenonika jodkowego wywoujcy wrodzone powikszenie tarczycy (p, ryc. 47-2); zaburzenie w endocytozie lipo-protein o maej gstoci, bdce przyczyn hipercholesterolemii i wczesnego rozwoju choroby naczy wiecowych. Prawidowy stan bon gwarantuje normalne funkcjonowanie komrek.
550 / ROZDZIA 43
UTRZYMYWANIE NORMALNEGO RODOWISKA WOK I WEWNTRZ KOMRKI JEST WYM OGIEM PODST AWOWYM ycie powstao w rodowisku wodnym; reakcje enzymatyczne, procesy komrkowe, sub-komrkowe i inne rozpoczy si w tym orodku. Skoro wikszo ssakw yje w rodowisku gazowym, to w jaki sposb utrzymywane jest rodowisko wodne? To zadanie, dziki zatrzymaniu i kompartmentyzacji wody w organizmie, speniaj wanie bony komrkowe. Woda w organizmie jest kompartmentyzowana Woda stanowi ok. 56% beztuszczowej masy ciaa ludzkiego i rozmieszczona jest w dwch duych obszarach.
Tabela 43-1. Porwnanie redniego stenia rnych substancji wewntrz i na zewntrz komrek zwierzcych S u b s t a nc j a Pyn pozaPyn rd komrkowy komrkowy
Na + K
+ 2+
140 mmol/l 4 mmol/l 2,5 mmol/l 1.5 mmol/l 100 mmol/l 27 mmol/l 2 mmol/i 70 g/l* 5,5 mmol/l
10 mmol/l 140 mmol/l 0,1 mmol/l 30 mmol/l 4 mmoi/l 10 mmol/l 60 mmol/l 160 g/l 0-1 mmol/l
C a ( zj oni zow any) Mg

2
ciHCO3
Biaka Glukoza
Pyn wewntrzkomrkowy lub rd -komrkowy (ICF intracellular
Pyn zewntrzkomrkowy lub poza-komrkowy (ECF extracellular
fluid). Ten obszar obejmuje -f cakowitej iloci wody i stanowi rodowisko dla; 1) wytwarzania, magazynowania i wykorzystania energii; 2) procesw samonaprawczych; 3) replikacji i 4) wykonywania okrelonych funkcji.
* Dotyczy stenia biaka w osoczu. W pynie rdmiszowym stenie biaka jest < 20 g/l (przyp tum.}.
fluid). Ten obszar zawiera ok. y ogl no ustrj owej iloci wody rozdzielonej midzy osoczem krwi a kom-partmentem rdmiszowym. Pyn pozako-mrkowy jest ukadem dostawczym. T drog dostarczane s do komrek skadniki odywcze (np. glukoza, kwasy tuszczowe, aminokwasy), tlen, rne jony, w tym pierwiastki lado we i wiele zwizkw regulujcych (hormonw), ktre koordynuj funkcje znacznie oddalonych od siebie komrek. Pyn pozakomrkowy usuwa dwutlenek wgla, substancje odpadowe, skadniki toksyczne i produkty detoksykacji z bezporedniego rodowiska komrkowego. Skad jonowy rodowiska rd kom orkowego rni si znacznie od skadu jonowego rodowiska pozakomrkowego Jak pokazano w tab. 43-1 rodowisko we wntrzne komrki jest bogate w K+ i Mg2+, a podstawowym anionem jest jon fosforanowy. Pyn pozakomrkowy charakteryzuje si du zawartoci Na+ i Ca2+, a podstawowym anionem jest tu jon chlorkowy Cl~. Naley zwrci uwag na stenie glukozy,' ktre jest wiksze w pynie pozakomrkowym ni wewntrz ko-
mrki. Stenie biaek, odwrotnie ni glukozy, jest wiksze wewntrz komrek ni w pynie pozakomrkowym. Skd taka rnica? Przypuszcza si, e pierwotne morze, w ktrym powstao ycie, byo bogate w K+ i Mg2 + . Z tego te wynika, e reakcje enzymatyczne i inne procesy biologiczne zachodz najlepiej w tym wanie rodowisku i od tego czasu istnieje to wysokie stenie tych jonw wewntrz kom rek. Komrki byy naraone na znaczn selekcj w okresie, kiedy morze stopniowo zmieniao swj skad i stao si bogate w Na+ i Ca2+. Do wytworzenia cakowicie nowego zestawu procesw biochemicznych i nowej maszynerii fizjologicznej konieczne byyby ogromne zmiany; zamiast tego komrki wytworzyy bariery bony z wbudowanymi w nie pompami, aby zachowa wewntrzne mi kro rodowisko. BONY S ZOONY MI STRUKTURAMI ZBUDOWANYMI Z LIPIDW, BIAEK I WGLOWODANW Rne bony wewntrz komrki i midzy komrkami zbudowane s z rnych skadnikw, jak to wykazuje stosunek biaek do lipidw (ryc. 43-1). Rnice te nie s zaskakujce, jeeli bierze si pod uwag bardzo zrnicowane
BONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 551
lo, 23
. Mlellna 0, Komrki
85
Kwasy tuszczowe
wtroby
myszy
0
R,-C-O-'CH,
oI
>>CH,-0-P-0-Rj
Prciki siat kwki wou Erytrocyty ludzkie
1.1
1.3
Gllcerol
Alkohol
Ameba
Komrki HeLa Zewntrzna bona mltochondrlalna
Ryc. 43-2. Fosfogliceryd z umiejscowieniem kwasw tuszczowych (R1 i R2), glicerolu i fosforylo-wanego alkoholu. W kwasie fosfatydowym R3 jest wodorem.
1.5
estrowym i jeden fosforylowany alkohol (ryc. 43-2). Wymienione kwasy tuszczowe s zwykle czsteczkami o jednakowej liczbie atomw wgSiateczka 2,0 la. Najczciej wystpuj w nich 14- lub rdplazmatyczna 16--wglowe acuchy. Kwasy te nie s rozgazione i mog wystpowa zarwno w Wewntrzna 3,2 postaci nasyconej, jak i nienasyconej. bona mltochondrialna Najprostszym fosfoglicerydem jest kwas i i i fosfatydowy, ktry jest 0 1 2 3 4 l,2-diacyloglicero-3-fosforanem. Jest to Stosunek biaek do lipidw podstawowy zwizek poredni w tworzeniu si wszystkich innych fosfolipidw (p. rozdz. 25). Ryc:43-1. Stosunek biaek do lipidw w rnych bonach. Biaka wystpuj w jednakowych ilo W innych fosfolipidach fosforan w pozycji 3 jest ciach lub przewyszaj iloci lipidw niemal we estryfikowany alkoholem, takim jak wszystkich bonach. Wyjtkowym odstpstwem etanolo-amina, cholina. seryna, glicerol lub jest mielina, elektryczny izolator wystpujcy w inozytol (p. str. 173). wielu wknach nerwowych. Druga klasa fosfolipidw to sfingomieliny, ktre maj szkielet sfingozynowy, a nie glicero-lowy. Kwas tuszczowy przyczony jest wizaniem amidowym do grupy aminowej funkcje tych Won. S one asymetrycznymi zam- sfingozyny. Pierwszorzdowa grupa knitymi strukturami warstwowymi majcymi hydroksylowa sfingozyny jest estryfikowana powierzchnie zewntrzne i wewntrzne. Te war- przez fosfocholin. Sfingomieliny, co stwowe struktury s niekowalencyjnymi zbiora- odzwierciedla ich nazwa, s gwnymi mi stabilnymi i aktywnymi biochemicznie. skadnikami osonek mielinowych. W bonach zakotwiczone s okrelone czste Glikosfingolipidy. S lipidami zawieraj czki biaek, i tu wanie peni specyficzne cymi skadnik wglowodanowy. S nimi cerebfunkcje charakterystyczne dla organelli, kom - rozydy i gangliozydy, bdce rwnie pochodrek, czy te organizmu. nymi sfingozyny. Cerebrozydy i gangliozydy rni si od sfingomielin podstawnikiem przyPodstawowymi lipidami bon komrek czonym do pierwszorzdowej grupy hydrozwierzcych s fosfolipidy, ksylowej sfingozyny. W sfingomielin ach glikosfingolipidy i cholesterol fos-focholina jest przyczona do grupy Fosfolipidy. Spord dwch gwnych alkoholowej. Cerebrozyd zawiera w tym grup fosfolipidw wystpujcych w bonach miejscu pojedyncz reszt heksozy bdc fosfoglicerydy wystpuj czciej. Skadaj si glukoz lub gala-ktoz. Gangliozyd zawiera one ze szkieletu glicerolowego, do ktrego przy- acuch 3 lub wicej wglowodanw, z ktrych czone s dwa kwasy tuszczowe wizaniem przynajmniej jeden jest kwasem sjalowym przyczonym do pierw-szorzdowego alkoholu, jakim jest sfingozyna.
1.1
552 / ROZDZIA 43
Sterole. Najczciej wystpujcym w bonach sterolem jest cholesterol, ktry wystpuje niemal wycznie w bonach plazmatycznych komrek zwierzcych, lecz moe wystpowa take, cho w mniejszych ilociach, w mitochon-driach, aparacie Golgiego i w bonach jdrowych. Cholesterol wystpuje zwykle w wikszej iloci w zewntrznej stronie bon plazmatycznych. Wchodzi on midzy fosfolipidy bon kierujc swoj grup hydroksylow w stron fazy wodnej, a pozosta cz czsteczki w stron dwuwarstwy. W temperaturach powyej przejcia fazowego (patrz dyskusja o modelu pynnej mozaiki, poniej), jego sztywny piercie sterolowy oddziauje z acuchami acylo-wymi fosfolipidw, limitujc ich ruchliwo i tym samym zmniejszajc pynno bon. Z drugiej strony, gdy temperatury zbliaj si do temperatury przejcia fazowego, interakcja cholesterolu z acuchami acylowymi interferuje z ich wyrwnywaniem (jeden wobec drugiego); to zjawisko zmniejsza temperatur, w ktrej ciecz przechodzi w el, co obserwuje si przy utrzymywaniu bon w niszych temperaturach. Bony s amf ipatyczne Wszystkie podstawowe lipidy wystpujce w bonach zawieraj zarwno regiony hydrofobowe, jak i hydrofilowe, i dlatego nazywane sa amfipatycznymi. Gdyby hydrofobowe regiony byy oddzielone od reszty czsteczki, byyby one nierozpuszczalne w wodzie, ale rozpuszczalne w oleju. Odwrotnie, gdyby hydrofilowe regiony byy oddzielone od reszty czsteczki,
Polarna gwka
Niepolarne wglowodorowe ogony
byyby nierozpuszczalne w oleju, a rozpuszczalne w wodzie. Amfipatyczne lipidy bonowe maj polarne gwki i niepolarne ogony, jak to przedstawiono na ryc. 43-3. Nasycone kwasy tuszczowe tworz proste ogony, podczas gdy nienasycone kwasy tuszczowe, ktre zwykle wystpuj w bonach w postaci cis. tworz skrcone ogony. Im wicej skrtw jest w ogonie, tym mniej gsto upakowane staj si bony i tym bardziej s one cieke. Detergenty s amfipatycznymi czsteczkami wanymi zarwno w biochemii, jak i w gospodarstwie domowym. Ich struktura czsteczkowa jest podobna do struktury fosfolipidw. Lipidy bon uoone s dwuwarstwowo Amfipatyczny charakter fosfolipidw sugeruje, e obydwa regiony tych czsteczek maj niezgodne rozpuszczalnoci; jednak w takich rozpuszczalnikach jak woda fosfolipidy organizuj si w posta zadowalajc" termodynami-cznie oba regiony, Micella (ryc. 43-4) to wanie
S S
Ryc. 43-4. Schematyczny przekrj micelli. Polarne grupy gwki znajduj si w wodzie, podczas gdy hydrofobowe wglowodorowe ogony otoczone s innymi wglowodorami i dlatego chronione s przed wod. Micelie s strukturami sferycznymi.
Ryc. 43-3. Schematyczne przedstawienie fosfoli-pidu bd innego lipidu bon Polarna grupa gwki jest hydrofitowa, a wglowodorowy acuch jest hydrofobowy lub lipofilowy. Kwasy tuszczowe w ogonach s nasycone (S) lub nienasycone (U). Kwasy S s przyczone do glicerolu przy wglu 1, a kwasy U przy wglu 2.
taka struktura: hydrofobowe regiony s osonite od wody, podczas gdy hydrofilowe grupy polarne ulokowane s w rodowisku wodnym.
Lipidowa dwu warstwa. Jak wykazali to

biisko 60 lat temu Gorter i Grendel; warstwa bimolekularna, czy te podwjna, moe spe nia termodynamiczne wymagania amfipatycz -
nych czsteczek w rodowisku wodnym. Dwu-warstwar istnieje jako arkusz, w ktrym hydrofobowe regiony fosfo lipid w s chronione przed rodowiskiem wodnym, podczas gdy hyd-rofilowe regiony s zanurzone w wodzie (ryc. 43-5). Tylko regiony hydrofitowe albo naroa
Roztwr wodny
cze*
mu Ul
Roztwr wodny
hydrofobo-
hydratu owa
Ryc. 43-5. Schemat poprzecznego cicia przez dwuwarstw bony utworzonej z czsteczek fosfolipidowych. Ogony nienasyconych kwasw tuszczowych s zaamane i wymagajc wi cej miejs ca oddalaj od siebie polarne gwki uatwiajc tym samym moliwo przemieszcze. To jest przyczy n wikszej pynnoci" bony, (Rycina nieznacznie zmodyfikowana i reprodukowana za zgod z: Stryer L, Biochemistry, wyd, 2, Freeman, 1981),
Natychmiast pojawiaj si dwie kwestie. Pierwsza, ile materiau biologicznego rozpuszcza si w tuszczach i tym samym moe atwo przedosta si do komrki? Gazy, takie jak tlen, dwutlenek wgla i azot, jako mat czsteczki reagujce w niewielkim stopniu z rozpuszczalnikami atwo dyfunduj przez hydrofobowe regiony bony. atwo przechodz przez dwuwarstwy pochodne lipidw, np. hormony steroidowe. Organiczne czsteczki nie bdce elektrolitami cechuj si szybkoci dyfuzji zalen od wspczynnikw podziau w ukadzie olej woda (ryc. 43-6); im wiksza jest zdolno czsteczki do rozpuszczania si w oleju, tym wiksza jest szybko dyfuzji przez bony. Druga kwestia dotyczy czsteczek, ktre nie s rozpuszczalne w tuszczach. W jaki sposb uksztatowuj si przezbonowe gradienty ste dla czsteczek nierozpuszczalnych w tuszczach? Odpowied na to pytanie zwizana jest z wystpowaniem w bonach biaek, s one bowiem take czsteczkami amfipatycznymi, ktre mog by wbudowane w odpowiednie regiony amfipatyczne lipidowej dwuwarstwy. Biaka tworz kanay dla ruchu jonw i maych czsteczek, a take su jako przenoniki dla wikszych czsteczek, ktre w inny sposb nie mogyby przej przez dwuwarstwe. Proces ten opisano poniej. Biaka bon s zwizane z lipidow dwuwarstwa Fosfolipidy bon dziaaj jako rozpuszczal niki dla biaek membranowych, tworzc rodowisko, w ktrym biaka te mog peni swoje funkcje. Spord 20 aminokwasw tworzcych pierwszorzdow struktur biaek grupy funkcyjne zwizane z a atomem wgla s silnie
dwuwarstwowego arkusza s eksponowane na niesprzyjajce rodowisko, lecz nawet te eksponowane naroa mog by eliminowane dziki zaamaniu arkusza" w celu stworzenia zamknitego pcherzyka bez naroy. Zamknita dwuwarstwa stanowi jedn z najbardziej istot nych waciwoci bon. Jest ona nierozpuszczalna dla wikszoci rozpuszczalnych w wodzie czsteczek, gdy byyby one nierozpuszczalne w hydrofobowym wntrzu dwuwarstwy.
Tryptolan IGluko za oza \ Mocznik Gllcerol
Indol
Kr"
10""
10" 10-* 10" 10Wspdczynnlk przanlkalnoiol (cm/s)

Maa ------------------------------- > D ua PrzenikalnoBc
Wi
10=
Y 43-6. Wspczynniki przenikanoci dla wody, niektrych jonw i innych maych czsteczek w liptdowych dwuwarstwach bon. Czsteczki, ktre szybko przechodz przez okrelon bon, okrela si jako majce wysoki wspczynnik przenikania. (Wedug: Stryer L, Biochemistry wyd., 2. Freeman, 1981, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).
554 / ROZDZIA 43
hydrofobowe w 6 przypadkach, sabo hydrofobowe w kilku przypadkach, a w pozostaych aminokwasach nawet hydrofilowe. Jak to opisano w rozdz. 6, oc-helikalna struktura biaek minimalizuje hydrofllowy charakter wiza pe-ptydowych. Tym samym biaka mog mie charakter amfipatyczny i tworz integraln cz bony, gdzie hydrofilowe regiony wystaj zarwno do wntrza, jak i na zewntrz, przy czym hydrofobowe regiony przenikaj przez hydrofobowe wntrze dwuwarstwy. W istocie, te czci biaek membranowych, ktre przenikaj btony, maj znaczc ilo hydrofobowych aminokwasw i du zawarto struktur a-heli-kalnych lub skadajcych si w arkusze p. Liczba rnych biaek w bonie wynosi 68 w siateczce sarkoplazmatycznej, a ponad 100 w bonach plazm a tycz nych. W ich skad wchodz: enzymy, biaka transportujce, biaka strukturalne, antygeny zgodnoci tkankowej i receptory dla rnych czsteczek. Poniewa kada bona ma rny skad biaek, nie moe istnie takie pojcie jak typowa struktura bon. En zymatyczne waciwoci kilku rnych bon przedstawiono w tab. 43-2.
T abela 43-2. E nzymatyczne markery w rnych bonach* Enzymy Bony Bona piazmatyczna 5'nukleotydaza Cyklaza adenylanowa + Na7K -ATPaza G1 u kozo - 6 - f osf ataza Galaktozylotransferaza Syntaza ATP
szybciej ni kady z jej skadnikw. Ten problem jest dyskutowany z wikszymi szczegami w rozdziale powiconym endocytozie. Wan cech bon jest asymetria Asymetria jest czciowo spowodowana nieregularnym rozmieszczeniem biaek w bonach. Asymetria typu wewntrzzewntrz jest take spowodowana zewntrzn lokalizacj wglowodanw przyczonych do biaek membranowych. Dodatkowo, specyficzne enzymy s zlokalizowane wycznie po stronie zewntrznej lub wewntrznej bon, jak np. w bonach mito-chondrialnych i plazmatycznych. Istniej rwnie regionalne asymetrie w bonach. Niektre, np. wystpujce na kosmko-wym biegunie komrek luzwkowych, s widoczne niemal makroskopowo. Inne, takie jak w zczach szczelinowych, w zczach zwartych i w synapsach, pojawiaj si w mniejszych regionach bon i generuj odpowiednio mniejsze lokalne asymetrie. Istnieje rwnie asymetria poprzeczna (wewntrzzewntrz) fosfolipidw. Zawierajce cholin fosfolipidy (fosfatydylocho)ina i sfin-gomielina) zlokalizowane s przede wszystkim w zewntrznej molekularnej warstwie: amino-fosfolipidy (fosfatydyloseryna i etanol o a mi na) za w warstwie wewntrznej. Cholesterol zasadniczo wystpuje w wikszych ilociach w warstwie zewntrznej ni w wewntrznej. Oczywicie, jeeli taka asymetria w ogle istnieje, to ruchliwo poprzeczna fosfolipidw membrano wych (flip-flop) powinna by ograniczona. W rzeczywistoci, fosfolipidy w syntetycznych dwuwarstwach cechuj si niezwykle powoln szybkoci procesu flip-flop; okres ptrwania tej asymetrii moe wynosi dni lub tygodnie. Jednak, gdy okrelone biaka membranowe, takie jak biako bony plazmatycznej erytrocytw, glikoforyna, s sztucznie wbudowane do syntetycznej dwuwarstwy, czsto procesu flip--flop fosfolipidw moe wzrosn nawet 100--krotnie. Mechanizmy rzdzce asymetri lipidw nie s znane. Enzymy zwizane z syntez fosfolipidw zlokalizowane s po cytoplazmatycznej stronie bon pcherzykw mik roso mai nych. Przypuszcza si wic, e istniej translokazy, ktre przenosz okrelone fosfolipidy z wewntrznej warstwy do zewntrznej. Rwnie specyficzne biaka, ktre w sposb preferencyjny wi okrelone fosfolipidy, mog wystpowa w dwch arkuszach, co prowadzi do asy met -
Siateczka rdplazma -tyczna Aparat Golgiego Wewntrzne btony mi-tochondrialne
' Bony zawieraj wiele biaek. Niektre z nich maj aktywno enzymatyczn, niektre zlokalizo wane s wycznie w okrelonych bonach i dlatego mog by uyte jako markery ledzenia stopnia oczyszczania bon.
turami. Lipidy i biaka w bonach cechuj si szybkociami obrotu metabolicznego podob nymi do tych, jakie wystpuj w innych obszarach komrki. Rne lipidy maj rne szybkoci obrotu metabolicznego. Rwnie rne biaka membranowe cechuj si znacznym zrnicowaniem szybkoci obrotu metabolicznego. Bona sama w sobie moe przeksztaci si
Bony i ich skadniki s dynamicznymi struk -
rycznego lipido-wych.
rozmieszczenia
czsteczek
Istniej integralne i powierzchniowe biaka membranowe Wikszo biaek membranowych to integralne skadniki bon (wspdziaaj one z fos-folipidami) i w rzeczywistoci wszystkie z tych, ktre byy dokadnie badane, zajmuj 510 nm w poprzek dwuwarstwy. Te integralne biaka s zwykle globularne i amfipatyczne. Skadaj si one z 2 hydrofilowych kocw rozdzielonych hydrofobowym regionem, ktry przecina hydrofobowe wntrze dwuwarstwy. Im lepiej poznaje si struktur integralnych biaek: membranowych, tym bardziej oczywisty staje si fakt, e niektre z nich (szczeglnie czsteczki transportujce) mog przenika przez dwuwarstw wiele razy, co przedstawiono na ryc. 43-9, Integralne biaka s asymetrycznie wbudowane w dwuwarst w bony (ryc. 43-7). Niektre biaka uzyskay sw asymetryczn orientacj w bonie w czasie ich wbudowywania
do dwuwarstwy lipidowej. Hydrofilowe zewntrzne regiony amfipatycznego biaka, ktre zostay zsyntetyzowane wewntrz komrki, musz przenikn przez hydrofobowe wntrze bony, aby znale si na zewntrz niej. Na przykad ankiry na, biako peryferyjne, jest zwizana z integralnym biakiem ,,band III" bony eryt rocytw. Spektryna, cyt o szkielet owa struktura wewntrz erytrocytu, jest zwizana z ankiryn, przez co odgrywa wan rol w utrzymaniu jego dwuwklsego ksztatu. Czsteczki immuno-globulin w bonach plazmatycznych limfocytw s integralnymi biakami membranowymi i mo g by uwolnione dziki zrzuceniu z siebie maych fragmentw bon. Wiele czsteczek receptorw hormonalnych to biaka integralne, za specyficzne hormony polipeptydowe, ktre wizane s przez te czsteczki receptorowe, mog przez to by uznane za biaka peryferyjne. Biaka peryferyjne, takie jak hormony pep-tydowe, mog nawet organizowa rozmieszczenie biaek integralnych, jak np. ich receptory w paszczynie dwuwarstwy (patrz poniej).
acuchy wglo wodanowe
Biatka integralne
Biaka peryferyjne
Lipid
Ryc. 43-7. Model pynnej mozaiki opisujcy struktur bon. Bona skada si zdwuczsteczkowej warstwy lipidw z biakami, ktre albo s wbudowane do niej, albo zwizane s z jej cytoplszmatyczn powierzchni. Integralne biaka bon s silnie zakotwiczone w warstwie lipidowej. Niektre z tych biaek przenikaj bony cakowicie wystajc jak gdyby z obu stron~dw u warstwy i nazywane s biakami transmembranowymi, podczas gdy inne biaka zakotwiczone s w zewntrznej lub wewntrznej warstwie lipidowej dwuwarstwy. Luno zwizane z wewntrzn powierzchni bony s biatka peryferyjne. Wiele z tych biaek i tuszczw ma wystajce na zewntrz acuchy oligosacharydowe. (Wedug: Junqueira L C, Carbeiro J., Long J. A.: Basie Histology, wyd, 5, Appletan i Lange, 1986, za zezwoleniem), _________
S56 / ROZDZIA 43
SZTUCZNE BONY MOG BY UYTE DO BADANIA FUNKCJI BON

Sztuczne systemy bonowe mog by przygotowane rnymi metodami. Systemy te zasadniczo skadaj si z jednego lub wicej fos-fohpidw pochodzenia naturalnego lub syn tetycznych, ktre mog by spreparowane (np. przez agodn sonifikacj) w postaci sferycznych pcherzykw, w ktrych lipidy tworz dwuwarstw. Takie pcherzyki otoczone dwu-warstw lipidw nazywamy liposomami. Niektre z zalet stosowania sztucznych systemw membranowych w badaniach funkcji bon opisano poniej. Skad lipidw bon mona zmieni, co pozwala na systematyczne badania wpywu zmiennego skadu lipidw na okrelone funkcje bon. Dla przykadu, pcherzyki mog by utworzone wycznie z fosfatydylocholiny lub, alternatywnie, z okrelonej mieszaniny rnych fosfolipidw. glikolipidw i cholesterolu. Ro dzaje kwasw tuszczowych uytych lipidw mog rwnie by zmieniane dziki zastosowa niu syntetycznych lipidw o znanym skadzie, co umoliwia systematyczne badanie wpywu skadu kwasw tuszczowych na okrelone fun kcje bon (np. transport). Oczyszczone biaka membranowe lub en zymy mog by wbudowywanc do pcherzykw w celu wyjanienia, jakie czynniki (np. specyfi czne lipidy lub pomocnicze biaka) s wymaga ne przez biaka, aby przywrci ich funkcj. Badania oczyszczonych biaek, np. Ca2+/ATP-azy siateczki sarkoplazmatycznej, w okrelo nych przypadkach sugeroway, e do regenera cji pompy jonowej s wymagane tylko pojedyn cze biako i pojedynczy lipid. rodowisko tych systemw moe by do kadnie kontrolowane i systematycznie zmienia ne (np. stenie jonowe). Systemy te mog by rwnie eksponowane na rne znane ligandy, jeeli, dla przykadu, liposomy zawieraj specy ficzne receptory biakowe. Gdy sporzdza si liposomy, mona na adowa"' je okrelonymi substancjami, np. le kami lub izolowanymi genami. Istnieje due zainteresowanie badaniami nad uyciem lipo somw do dystrybucji lekw do okrelonych tkanek. Gdyby niektre skadniki (np. przeciw ciaa wobec okrelonych czsteczek zlokalizo wanych na powierzchni komrki) mogy by wbudowane do liposomw w taki sposb, aby liposomy te trafiay do okrelonych tkanek lub
nowotworw, efekt terapeutyczny mgby by istotny. DNA zamknity wewntrz liposomw staje si mniej wraliwy na ataki nukleaz; to podejcie moe by uyteczne w terapii genowej.
FUNKCJONALNIE BONY S DWUWYMIAROWYMI ROZTWORAMI INTEGRALNYCH GLOBULARNYCH BIAEK ROZPUSZCZONYCH W CIEKEJ FOSFOLIPIDOWEJ MACIERZY
Ten model pynnej mozaiki dotyczcy struktury bion zosta zaproponowany w 1972 r. przez Singera i Nicolsona (ryc. 43-7). Wczeniejszym potwierdzeniem tego modelu bya szybka i przypadkowa redystrybucja gatunkowo specyficznych integralnych biaek w bonie plazmatycz-nej komrki bdcej midzy gatunkow hybryd utworzon przez sztuczn fuzj dwch rnych komrek rodzicielskich. Pniej wykazano, e fosfolipidy rwnie ulegaj szybkiej redystrybucji w paszczynie bony. Dyfuzja ta, nazywana dyfuzj translacyjn (boczn),*moe by bardzo szybka; w rzeczywistoci, jedna czsteczka fosfolipidu moe w paszczynie bony przemieszcza si o kilka mikrometrw na sekund.
Zmiany fazowe, a tym samym konsystencja bon, s cile zalene od skadu lipidw tworz -
cych je. W lipidowej dwuwarslwie acuchy hydrofobowe kwasw tuszczowych mog by bardzo wyrwnane lub uporzdkowane dla zabezpieczenia stosunkowo sztywnej struktury. Gdy temperatura wzronie, hydrofobowe a cuchy boczne przechodz ze stanu uporzdkowanego do stanu nieuporzdkowanego uzyskujc cieczopodobn lub ciek konsystencj. Temperatura, w ktrej struktura przechodzi z uporzdkowanej w nieuporzdkowan, nosi nazw temperatury przejcia fazowego. Dusze i bardziej nasycone acuchy kwasw tuszczowych cechuj si wyszymi temperaturami przejcia fazowego, tzn. wymagaj wyszych temperatur do zmiany struktury na ciek. Nienasycone wizania, ktre istniej w konfiguracji cis, powoduj upynnianie dwuwarst-wy przez zmniejszenie zwartoci upakowania acuchw bocznych bez zmniejszania ich hyd-rofobowoci (ryc. 43-3). Fosfolipidy bon komrkowych zwykle zawieraj przynajmniej 1 nienasycony kwas tuszczowy z przynajmniej 1 wizaniem podwjnym typu cis.
BONY: STRUKTURA, ORGANIZACJA I FUNKCJA / 557 Cholesterol dziaa take jako czsteczka regu lacyjna w bonach, wytwarzajc stany poredniej
TWORZENIE SI BON
Oceniajc tworzenie bon trzeba wzi pod uwag zarwno lipidy, jak i biaka. Omwienie tych pierwszych bdzie krtkie, gdy niewiele wiadomo o tym, w jaki sposb lipidy s wbudo-wywane w bony. Wicej uwagi powicimy natomiast wbudowywaniu biaek w bony siateczki rdplazmatycznej (ER), aparatu Golgiego (GA) i powierzchni komrek (bony plazmaty-czne) zwierzcych. Zostan omwione take inne problemy, ktre pojawiy si przy ocenie biosyntezy innych bon (np. mitochondriw). Due znaczenie ma fakt, e sekwencja specyficznych aminokwasw (lub mannozo-6-fosforanu w przypadku lizosomw) ukierunkowuje wiele biaek do jedynej w swoim rodzaju lokalizacji w komrce. Zlokalizowanie takich biaek w odpowiednich organellach nastpuje za porednictwem sygnau. Wyjanienie sekwencji docelowych uatwia w znaczcym stopniu technologia rekombinacji DNA. Umoliwia ona take wprowadzenie do biaek lub wycicie z nich okrelonych sekwencji. Czsteczki cDNA dla tak zmienionych biaek mog by wbudowane do odpowiednich komrek drog transfekcji; zmiany w komrkowym rozmieszczeniu s potem wykrywane za pomoc fluoryzujcych przeciwcia lub innymi technikami. Wydzielane biaka zwykle przed opuszczeniem komrki przechodz od siateczki rd-plazmatycznej (ER) do aparatu Golgiego (GA), a std do bony plazmatycznej (PM) (ER - GA -*PM). Ten fakt uzasadnia omawianie niektrych aspektw ich biosyntezy. Jest oczywiste, e tego rodzaju biaka powinny zawiera specyficzne sekwencje oznaczajce, e s one zdolne do sekrecji, lub alternatywnie biaka te musz wykazywa brak sygna w sprawiajcych, e inne biaka staj si rezydentami memb ran. Wydaje si, e dane pozwalajce odrni te dwie moliwoci bd niedugo dostpne.
pynnoci. Jeeli acylowy acuch boczny wystpuje w fazie nieuporzdkowanej, cholesterol bdzie wywiera wpyw kondensujcy; jeeli za acylowy acuch boczny bdzie uporzdkowa ny lub w krystalicznej fazie, cholesterol wprowadzi nieu po rzd kowanie. Przy duych wartociach stosunku cholesterol/fosfolipid, temperatury przejcia fazowego s niewyznaczalne. Pynno Won w istotnym stopniu determinuje ich funkcje. Jeeli pynno ta wzrasta, zwiksza si rwnie ich przepuszczalno dla wody i maych hydrofilowych czsteczek. Ze wzrostem pynnoci bon zwiksza si take mobilno boczna integralnych biaek. Jeeli aktywna cz biaka integralnego odpowiedzialna za okrelone funkcje znajduje si wycznie w jego regionach hydrofilowych, to zmiana pynnoci lipidw bdzie prawdopodobnie miaa jedynie niewielki wpyw na aktywno tego biaka; jeeli jednak biako to uczestniczy w funkcji transportowej, a biorce udzia w transporcie skadniki przenikaj przez bon, to zjawiska zachodzce w fazie tipidowej mog w istotny sposb wpywa na szybko transportu. Wyjtkowo dobrym przykadem zmian funkcji wywoanych zmianami w pynnoci jest receptor insulinowy (p. rozdz. 52). Gdy stenie nienasyconych kwasw tuszczowych w bonie wzrasta (przy hodowli komrkowej w poywce bogatej w takie czsteczki) zwiksza si rwnie pynno bony. To zmienia receptor do tego stopnia, e wie on wicej insuliny. Stan ciekoci i stan mobilnoci bocznej moe w pewnych warunkach by ograniczony do okrelonych regionw w bonie. Przykadem s interakcje biako-biako, zachodzce w paszczynie bony, ktre powoduj, e integralne biaka tworz sztywn macierz w przeciwiestwie do czciej spotykanych sytuacji, gdzie lipidy dziaaj jako macierz. Zcza szczelinowe, zcza zwarte i regiony zawierajce bak-teriorodopsyn szkaratnych bon halobakterii s dobrymi przykadami koegzystencji przylegajcych do siebie rnych macierzy. Niektre z oddziaywa biako-biako w paszczynie bony mog nastpowa za porednictwem pe ryferyjnych biaek wicych, takich jak przeciwciaa lub lektyny, ktre znane s ze zdolnoci do umiejscawiani a si na powierzchni bon. W taki sposb peryferyjne biaka, dziki zdolnoci do specyficznych przycze, mog ogranicza ruchliwo biaek integralnych w bonie.
Asymetria bon powstaje w czasie ich tworzenia
Aparat Golgiego i pcherzyki siateczki rd-plazmatycznej (ER) wykazuj poprzeczn asymetri zarwno lipidw, jak i biaek, a asymet rie te powstaj w czasie fuzji z bonami plaz-matycznymi. Wntrze pcherzyka po fuzji staje si zewntrzn stron bony plazmatycznej, a cytoplazmatyczna strona pcherzyka pozos taje cytoplazmatyczn stron bony (ryc. 43-8). Poprzeczna asymetria w bonach istnieje w p-
558 / ROZDZIA 43
Biaka bonowe Zewntrzna powierzchnia
Bona plazmatyczna pech

Biaka Integralna Bona pcherzyka
Cytoplazma
Ryc. 43- 8. Zlewanie si pcherzykw z bo n plazmatyczn zachowuje orientacj kadego b iaka integralnego zakotwiczonego w dwuwarstwie pcherzykw. Pocztkowo N - koniec biaka skierowany jest do wntrza pcherzyka. Po fuzji N - koniec znajduje si na zewntrznej powierzchni bony plazmatycznej. Fakt, e orientacja biaka nie zostaa odwrcona, wynika ze spostrzeenia, e drugi koniec czsteczki, C-koniec, jest zawsze zanurzony w cytoplazmie. wiato pcherzyka i przestrze pozakomrkowa s topologicznie rwnowane wzgldem opisanego przeksztacenia. (Wedtug: Lodish H. F., Rothman J. E.: The assembfy of celi membranes; Sci. Am. 1979, 240, 43, za zezwoleniem).
cherzykach ER zanim zlej si one z bon plazmatyczn, dlatego te gwnym problemem montau bon jest sposb, w jaki integralne biaka mog by wbudowywane asymetrycznie w lipidow dwuwarstwe siateczki rdplazmatycznej. " Gwn klas lipidw w bonach s fos-folipidy. Enzymy odpowiedzialne za syntez
fosfolipidw zlokalizowane s na powierzchni cytoplazmatycznej cystern siateczki rdplaz-matycznej. Skoro fosfolipidy zlokalizowane s po tej stronie siateczki, wbudowywuj si one prawdopodobnie samorzutnie w term ody nami-cznie stabilne dwuczsteczkowe warstwy, powodujc rozrastanie si bony i promujc tym samym odczenie si od niej pcherzykw lipi-

N N N N Cytocfirom b, Pod jednostka POWIERZCHNIA POZACYTO-P LftZMATYCZNA
Rona przenoniki (np. glukozy Neuramidaza wirusa grypy Receptor as]aloglikcp'otemowy Receptor transteryny cz niezmienna acucha HLADR Raca oto r LDL Ciki taflCUCtl HLA -A Hemaglutynina indukowana wirusem grypy C Receptory i i IGF -1 receptora acetylocholiny Rodopsyna wolowa
Ryc. 43-9. Rnorodno mechanizmw insercji biaek do bon. Ta schematyczna reprezentacja przedstawiajca wiele moliwych orientacji pokazuje cz peptydu wewntrz bony jako a -heliksy), a inne jego czci jako linie. N to NH2-koniec, a Cto COOH-koniec. (Wedug: Wickner W. T., Lodish H. F.: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985, 230, 400. Copyright (C) 1985 by the American Association for ihe Advancement of Sciences, za zezwoleniem).
dowych. Ten proces okrela si jako formowanie bon. Takie pcherzyki lipidowe rozpoczynaj swoj wdrwk i zlewaj si z innymi bonami, takimi jak bony aparatu Goigiego. ktre z kolei mog zlewa si z bonami plazmatycznymi. Biaka cytoplazmy, ktre wychwytuj fosfolipidy z jednej bony i przenosz je do innej
nazywane s biakami wymiany fosfolipidowej.
Prawdopodobnie wpywaj one na specyficzny skad lipidw w rnych bonach. Rnorodno drg, jakimi biaka s wbudo-wywane w bony, pokazano na ryc, 43-9. Modele kadego z tych typw wbudowywania nie bd przedstawione w tym opracowaniu, zostan natomiast omwione w zarysie problemy dotyczce wbudowywania biaek w bony siateczki rdplazma ty cznej i aparatu Golgiego, a take w bony plazmatyezne.
Hipotez sygnaow zaproponowali Sabatini i Blobel. Wykazali oni, e biaka syntetyzowane

na zwizanych z bon polirybosomach (np.
Hipoteza sygnaowa" opisuje monta bon
biaka sekrecyjne, niektre integralne biaka bon plazmatycznych, bon aparatu Golgiego, bon siateczki rdplazmatycznej) miay na
N-kocu wyduenie peptydowe, tzw. peptyd sygnaowy, ktry by odpowiedzialny za ich wizanie z bonami siateczki. Biaka, ktrych synteza przebiegaa w caoci na wolnych poliry-bosomach (np, biaka cytozolowe, zewntrzne biaka wewntrznej strony bon plazma tycznych, mitochondrialne biaka kodowane przez jdrowy DNA, biaka peroksysomalne) nie ma j tego sygnaowego peptydu. Wanym aspek tem tej hipotezy jest zasygnalizowanie, i wszystkie cytoplazmatyczne rybosomy maj t sam struktur i e rnice midzy rybosomami zwizanymi z bon a wolnymi zale wycznie od wyej omwionych biaek, ktre maj sygnaowe peptydy. Wiele dowiadcze potwierdzio t oryginaln hipotez. Przebieg syntezy wielu biaek membranowych na polirybosomach zwizanych z bonami potwierdza, e hipoteza sygnaowa odgrywa istotn rol w koncepcji tworzenia bon. Niektre waciwoci peptydw sygnaowych zostay podsumowane w tab. 43-3. Rycina 43-10 przedstawia podstawowe cechy hipotezy sygnaowej w odniesieniu do przenikania biaek sekrecyjnych przez bon ER. Czsteczki mRNAdla takich biaek maj zakodowane informacje dla sygnaowego peptydu lokalizujc go przy N -k ocu. Biako wbudowuje sie
560 / ROZDZIA 43 Tabela 43-3. Niektre waciwoci peptydw sygnaowych Zwykte, ale nie zawsze, zlokalizowane s przy N-kocu Zawieraj ok. 1225 aminokwasw Metionina jest zwykle N-kocowym aminokwasem Zawieraj centralny pk hydrofobowych aminokwasw Zawieraj co najmniej 1 dodatnio naadowany aminokwas pooony blisko N-koca Zwykle odszczepiaj przy C-kocu reszt Ala przy udziale sygnaowej peptydazy
w bon rwnolegle z translacj jego mRNA na polisomach. Proces ten nazywamy insercj ko-translacyjn Gdy sygnaowa sekwencja biaka wynurza si z rybosomu, jest ona rozpoznawana przez czsteczk rozpoznajc sygna (SRP signal recognition particle), ktra blokuje dalsz translacje wtedy, gdy zostao spolimery-
zowanych ok. 70 aminokwasw (40 schowane w duym rybosomalnym kompleksie, a 30 wystaje na zewntrz). Czsteczka SRP zawiera 6 biaek i jest zwizana z 7S RNA, ktry jest cile spokrewniony Z sekwencj rodziny Alu czsto powtarzajc si w DNA (p. rozdz. 38). Blok SRP nie jest uwalniany dopki kompleks SRP-sekwencja glwna-rybosom jest zwizany z tzw. ,.biakiem dokowym" bdcym receptorem dla SRP na siateczce rdplazmatycznej. K.otranskcyjna insercja tego biaka do siateczki rozpoczyna si wtedy w tym wanie miejscu. Proces wyduania si pozostaej czci czsteczki biaka kieruje powstajce biako w ca szeroko lipidowej dwuwarstwy, gdy rybo-somy pozostaj przyczon e do retikulum. W ten sposb powstaje szorstka strona siateczki rdplazmatycznej (ribosome studded ER). Ry-bosomy pozostaj przyczone do niej w czasie syntezy biaek membranowych, ale s uwalniane i rozpadaj si na podjednostki, gdy
Peptyd sygnaowy SRP
Receptor ryb os o mowy
Receptor sygnaowy
Ryc. 43-10. Schemat hipotezy sygnaowej dla transportu biaek wydzielniczych przez bony siateczki rdplazmatycznej. Rybosomy syntetyzujce biako przemieszczaj si wzdu informacyjnego RNA ustalajc sekwencj aminokwasw w biaku (informacyjny RMA oznaczony jest lini midzy 5' a 3'). Kodon AUG oznacza stan informacji dla biaka. Linia poprzecznie kreskowana, wystpujca po AUG, reprezentuje kodony dla sygnaowej sekwencji. W miar rozrastania si biaka i jego wystawania poza du rybosomaln podjednostk sygnalna sekwencja jest eksponowana i wie si z czsteczk rozpoznajc sygna (SRP signai recognition particle}. Translacja jest blokowana dopki kompleks nie zwie si z biakiem dokowym" oznaczonym czarnym supkiem na bonie siateczki rdplazmatycznej. Jest tam take receptor (nie zaczerniony supek) dla samego rybosomu. Interakcja rybosomu i powikszajcego si acucha peptydowego z bon siateczki rdplazmatycznej powoduje otwarcie porw, przez ktre biako jest transportowane do wewntrznej przestrzeni rdpiazmatycznej siateczki. W czasie transportu sygnaowa sekwencja wikszoci biaek zostaje usunita przez enzym zwany sygnaow peptydaz. Kompletne biako jest albo uwolnione przez rybosom, ktry potem rozpada si na swoje dwie skadowe, tj, ma i du podjednostk rybosomu. Koniec biafka znajduje si wewntrz siateczki rdplazmatycznej. (Wedug: Newly mad proteins zip through the celi; Science 1980, 207, 154. Copyright 1980 by the American Association for the Advancement of Science, nieznacznie zmodyfikowana, za zezwoleniem).
synteza biaka jest zakoczona, owna sekwencja jest nacinana przez peptydaz sygnaow, a wglowodan zostaje przyczony w momencie, gdy wczeniej zsyntetyzowana cz biaka wchodzi do wntrza siateczki. Integralne biaka membranowe siateczki rdplazmatycznej, takie jak cytochrom P -450, nie przenikaj cakowicie przez bon. Zamiast tego rezyduj one w bonie siateczki majc nienaruszony peptyd sygnaowy. Najwidoczniej ich przejciu przez t bon zapobiega sekwencja aminokwasw zwana sygnaem stop. Wydzielane biaka przenikaj cakowicie przez membranow dwuwarstw i s wyrzucane do wiata siateczki. Skadniki wglowodanowe s przyczone (zwykle przez dolichoio-pirofos-fo-oligosacharydy, p. rozdz. 57) dopiero wtedy, gdy biaka przechodz przez wewntrzn cze bony siateczki rdplazmatycznej. Proces ten nosi nazw kotranslacyjnej glikozylacji. To jest przyczyn, e biaka wydzielnicze znajdujemy w wietle aparatu Golgiego, gdzie ich wglowodanowe acuchy s modyfikowane przed wydzieleniem. Istniej powane dowody, e gwna sekwencja wiodca uczestniczy w procesie insercji biaek do bon siateczki. Zmutowane biaka zawierajce zmienion sekwencj wiodc, w ktrej hydrofobowy aminokwas zastpiony jest aminokwasem hydrofilowym, nie s wbudowywane w bony siateczki. Biaka niemem-branowe, jak hemoglobina, do ktrych sygnaowe sekwencje zostay wczone metodami inynierii genetycznej, mog by wbudowywane do bon, a nawet wydzielane. Biaka mog by wbudowywane do bon siateczki endoplazmatycznej w rny sposb Mechanizmy zwizane z insercj biaek do bon obejmuj: Kotranslacyjn insercj za porednictwem sygnau stop np. cytochrom P-450 (p. wyej). Syntez na wolnych polirybosomach i p niejsze przyczenie do bony siateczki rdplaz matycznej np. cytochrom b5. Zatrzymywanie w obrbie siateczki endo plazmatycznej przez specyficzne sekwencje aminokwasowe. Ostatnie badania wykazay, e wiele biaek ma sekwencj KDEL (Lys -Asp-Glu-Leu) na C-kocu. Ta sekwencja powodu je, e bd one przyczone do wewntrznej ciany cysterny siateczki rdplazmatycznej wzgldnie luno.
36 - Biochemia
4. Niektre biajka przeznaczone dla bon siateczki rdplazmatycznej mog przej do aparatu Golgiego drog transportu pcherzykowego, a potem powrci do siateczki, aby by do niej wbudowane. Powysza lista wskazuje, e w biosyntez biaek bony siateczki jest wczonych wiele zrnicowanych mechanizmw; podobna sytuacja prawdopodobnie wystpuje i w innych bonach (np. mitochondrialnych i plazmatycz-nych). Sekwencje docelowe zostay zidentyfikowane jedynie dla kilku z wymienionych wyej mechanizmw (np. sekwencje KDEL). Wykazano, e obrt lipidw w bonach siateczki rdplazmatycznej wtroby szczura jest generalnie znacznie szybszy ni obrt biaek, co oznacza, e obrt lipidw i obrt biaek s od siebie niezalene. Rwnie szybko obrotu biaek tych bon jest zmienna w szerokim zakresie, niektre wykazuj szybkie (godziny), inne powolne (dni) obroty. Dlatego te poszczeglne lipidy i biaka bon siateczki s wbudowane w nie w sposb wzgldnie niezaleny od siebie; jest to zjawisko charakterystyczne dla wikszoci bon. Biaka przemieszczaj si przez komrkowe obszary do waciwych bon Schemat ilustrujcy moliwy przepyw biaek membranowych drog ER - GA - PM pokazany jest na ryc. 43-11. Poziome strzaki okrelaj etapy transportu, ktre mog by niezalene od sygnaw docelowych. Przepyw okrelonych biaek membranowych z siateczki do bony pla-matycznej (opisywany jako przepyw masowy, gdy nie jest on wybirczy), moe zachodzi bez adnych sekwencji docelowych uczestniczcych w tym procesie. Z drugiej strony insercj staych biaek membranowych do siateczki rdplazmatycznej i aparatu Golgiego moe zalee od specyficznych sygnaw (np. KDEL lub sekwencji stop dla siateczki). Podobnie transport do Hzosomw i do pcherzykw wydzielniczych moe take nastpowa za porednictwem sygnaw (mannozo-6-fosforan w przypadku okrelonych enzymw lizosomalnych). Podstawowy mechanizm umoliwiajcy dotarcie biaka syntetyzowanego na zwizanych z bonami polir ybosomach do struktur aparatu Golgiego lub bony plazmatycznej drog prze pywu masowego oparty jest na transporcie pcherzykowym. Nie wiadomo dzi, w jaki sposb biaka syntetyzowane na szorstkiej stronie
562 / ROZDZIA 43
Lizosomy
Siateczka rd plazma. tycz na
Ap. Go Ig lego -cis {powierz ohnla tworzca)
Ap. Goiglego -strefa przejciowa
Ap.GoIglagc -trans (p o wierzchnia
dojrzewajca) -ty
Powierzchnia komrki
Pcfterzykl wydztanlcze Ryc. 43-11. Przepyw biaek bonowych z siateczki rdplazmatycznej na powierzchni komrki. Poziome strzaki oznaczaj etapy, ktre zostay uznane za niezale ne od sygnaw i dlatego reprezentuj one przepyw masowy. Otwarte pionowe strzaki w kolejnych kwadratach wskazuj na retencj biaek, ktre znajduj si w bonach zaznaczonych organelli. Otwarte pionowe strzaki poza narysowanymi prosto ktami wskazuj na uwarunkowany sygnaem transport do lizosomw i do zapasowych ziarnistoci sekrecyjnych (Wedug Pfeffer i Rothman, 1987).
siateczki s wbudowywane do odpowiednich pcherzykw. Pcherzyki uczestniczce w przepywie masowym wydaj si by wolne od klatryny, podczas gdy te pcherzyki, ktre zwizane s z docelowym transportem biaek do lizosomw i do pcherzykw wydziel ni czy ch, wydaj si by pokryte tym biakiem. Nie zostao jeszcze potwierdzone istnienie specyficznych sekwencji, ktre koduj sygnay wskazujce ich przeznaczenie dla aparatu Golgiego lub bony plazmatycznej. Wydaje si prawdopodobne, e niektre biaka przeznaczone do wbudowania do bony plazm a tycz nej drog transportu pcherzykowego mog nie zawiera specyficznych sygnaw i e ich ostateczne przeznaczenie wynika z braku innej moliwoci. Nie wyjaniono rwnie dotychczas, czy pojedyncze pcherzyki (atwo widoczne w mikroskopie elektronowym) zawieraj tylko jedno biako czy wiele biaek. Aparat Golgiego peni dwie wane roie w syntezie bon; 1) uczestniczy w modyfikowaniu acuchw oligosacharyd owych bon i innych N-wizanych glikoprotein (rozdz. 57); 2) bierze udzia w sortowaniu rnych biaek zgodnie z ich wewntrzkomrkowym przeznaczeniem. Wszystkie skadowe aparatu Golgiego uczestnicz w pierwszym punkcie, podczas gdy powierzchnia dojrzewania trans aparatu Golgiego uczestniczy szczeglnie w drugim punkcie i jest bardzo bogata w pcherzyki. Okrelone biaka wewntrznej strony bony plazmatycznej mog by syntetyzowane na wolnych rybo-somach, a dopiero potem zostaj wbudowane w bony siateczki. Ostatnie osignicia wykorzystujce system in vitro do badania transpor-
tu pcherzykowego i losw transportowanych przez nie biaek powinny wyjani wiele problemw z tym zwizanych. Mitochondrialne biaka syntetyzowane s w mitochondriach i poza nimi * Mitochondria zawieraj wiele biaek. Okrelone biaka (np. niektre biaka integralne bon) s syntetyzowane w mitochondriach przy uyciu mitochondrialnego ukadu syntezy biaek. Jednak wikszo biaek syntetyzowana jest na zewntrz mitochondriw i musz one by przeniesione do rodka. Szczeglnie dobrym ukadem dla bada mechanizmw importu takich biaek mitochondrialnych okazay si komrki drody. Najwiksze osignicia zarejestrowa no w badaniach nad biakami wystpujcymi w mitochondrialnej macierzy (np. podjednostki Fj-ATP-azy). Te biaka s syntetyzowane na wolnych polirybosomach. Kolejno przechodz one przez zewntrzne i wewntrzne bony mitochondriw, aby dotrze do celu. Przypuszcza si, e musz one by w formie niep o fadowanej, aby przej przez te bony. ATP musi by obecny, aby mg nastpi import biaek. Nie jest jeszcze jasne, czy ATP wpywa na potencja elektryczny, czy na siy protonomotoryczne dziaajce w poprzek bony wewntrznej, czy te odgrywa on jak rol w rozwijaniu si importowanego biatka. Wykazano, e te biaka zawieraj sekwencj sygnaow, o dugoci do 70 aminokwasw, ktra musi zawiera take okrelone dodatnio naadowane aminokwasy. Ta sekwencja jest rwnoznaczna sygnaowi pep-tydowemu, kierujcemu te biaka do macierzy;
gdy to wyduenie peptydowe zostanie odcite, biaka te nie bd miay moliwoci wnikania. Na powierzchni zewntrznej bony mitochond-rialnej istniej prawdopodobnie receptory dla importowanych biaek. Presekwencja moe by odszczepiona przez metaloproteazy wystpujce w macierzy. Niektre inne biaka mitochond-rialne nie zawieraj presekwencji, co sugeruje istnienie wielu mechanizmw i drg wykorzystywanych przez biaka w celu wniknicia do mitochondriw. Szczeglnymi przypadkami s lizosomy i inne organelle Jak napisano w rozdz. 57, okrelone hydro-lazy przeznaczone dla lizosomw zawieraj reszty mannozo-6-fosforanu, ktry znakuje je w szczeglnym celu. Coraz wicej dowodw potwierdza istnienie swoistych sekwencji dla znakowania biaek przeznaczonych dla innych organelli, takich jak jdra i peroksysomy; problem ten jest przedmiotem intensywnych bada. Niektre z poznanych sekwencji lub sygnaw, ktre doprowadzaj rne biaka do ich wa ciwych wewntrzkomrkowych lokalizacji, przedstawiono w tab. 43-4.
Tabela 43-4. Sekwencje lub zwizki, ktre kieruj biaka do okrelonych organelli Sekwencja lub zwizek Docelowe organelle Sekwencja peptydu sygnaowego Sekwencja KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) Sekwencja N-kocowa (70-resztowy fragment) Bony siateczki Luminaina strona bon siateczki Mitochondrium
komrkowego. Aby zoone biologiczne procesy mogy by koordynowane, wielokomrkowe organizmy musz take mie rodki dla komunikowania si midzy przylegajcymi i odlegymi komrkami. Te sygnay musz dotrze do bony i przej przez ni, lub te musz powsta jako konsekwencja pewnych interakcji z bon. Niektre z gwnych mechanizmw wykorzystywanych do tych celw przedstawiono w tab. 43-5.
Tabela 43-5. Przenoszenie materiau i informacji przez bony Ruch maych czsteczek przez bony Dyfuzja (bierna i u atwiona) Aktywny transport Ruch duych czsteczek przez bony Endocytoza Egzocytoza Transmisja sygnaw przez bony Receptory powierzchni komrek Transdukcja sygnaw (np. glukagon -cAMP) InPrnalizacjasygnau (sprzonazendocyto z, np. receptor LDL) Ruch do wewntrzkomrkowych receptorw {hormony steroidowe; rodzaj dyfuzji) Midzykomrkowy kontakt i komunikacja
Krtkie sekwencje za- Jdro sadowych aminokwasw Mannozo-6-fosforan Lizosomy
WYBIRCZOC BON OKRELA ICH WYSPECJALIZOWANE FUNKCJE Jeeli bona plazmatyczna jest wzgldnie nieprzepuszczalna, to w jaki sposb wikszo czsteczek dostaje si do komrki? W jaki sposb zapewniona jest wybirczo tego przenikania? Odpowiedzi na te pytania s wane dla zrozumienia, jak komrki dostosowuj si do stale zmieniajcego si rodowiska zewntrz-
Niektre mae czsteczki przechodz przez bony Czsteczki mog biernie przenika przez dwuwarstw zgodnie z elektrochemicznym gradientem w wyniku prostej lub uatwionej dyfuzji. To spontaniczne przemieszczanie w kierunku rwnowagi kontrastuje z aktywnym trans portem, ktry wymaga energii, gdy ruchy s przeciwne do elektrochemicznego gradientu. Na rycinie 43-12 przedstawiono schemat tych zjawisk. Bierna dyfuzja. Jak opisano powyej, niektre substancje rozpuszczone, takie jak gazy, mog wnika do komrki dyfundujc zgodnie z elektrochemicznym gradientem przez bon, co nie wymaga energii metabolicznej. Prosta dyfuzja przez bon jest ograniczona termiczn agitacj" danej molekuy, a take przez gradient ste w poprzek membrany i przez rozpuszczalno substancji rozpuszczanej (wspczynnik przenikania, ryc. 43-6) w hydrofobowym wntrzu dwuwarstwy bony. Rozpu-
564 / ROZDZIA 43 Transportowana \ Biako Kanaowe Btatko nonikowe /^
Dwuwarstwa llpidowa
Gradient elektrochemiczny
/ V
Prosta dyfuzja Dyfuzja uatwiona Transport bierny
\
Transport aktywny
Ryc. 43-12. Wiele maych nie naadowanych czsteczek przechodzi swobodnie przez lipidow dwuwarst - w. Naadowane czsteczki, wiksze nie naadowane czsteczki i niektre mae nie naadowane czsteczki przenoszone s przez kanay i pory lub przez specyficzne bi aka transportowe. Bierny transport nastpuje zawsze zgodnie z gradientem elektrochemicznym w kierunku rwno wagi. Aktywny transport zachodzi w kierunku przeciwnym do elektrochemicznego gradientu i wymaga wydatkowania energii, podczas gdy transport bierny nie wymaga energii. {Wedug: A lberts B. i wsp.; Moleculw Biology of the Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).
szczalno jest odwrotnie proporcjonalna do iloci wiza wodorowych, ktre musz zosta rozenvane, aby umoliwi substancji rozpuszczonej, znajdujcej si w zewntrznej fazie wodnej, wbudowanie si w,hydrofobow dwuwarst-w. Elektrolity, jako sabo rozpuszczalne w lipidach, nie tworz wiza wodorowych z wod, ale tworz otoczki z wody dla hydratacji na drodze elektrostatycznej interakcji. Wielko tej otoczki jest wprost proporcjonalna do gstoci adunku jonu. Jony z du gstoci adunku maj wiksz otoczk hydratacyjn i przez to mniejsz szybko dyfuzji. Na+ np. ma wiksz gsto adunku ni K+. Uwodniony jon sodu jest wic wikszy ni uwodniony jon potasu i dlatego potas przenika atwiej przez bony. W naturalnych bonach, w przeciwiestwie do syntetycznych dwuwarstw membranowych, istniej przezbonowe kanay, bdce strukturami przypominajcymi pory, ktre zbudowane s z biaek tworzcych szlaki wybirczego przewodzenia jonowego. Kanary przewodzenia ka-
tionowego maj rednic otworw 58 nm i s ujemnie naadowane wewntrz kanau. Przepuszczalno kanau zaley od wielkoci jonu, wielkoci jego hydratacji i od wartoci gstoci adunku jonu. Wykazano istnienie specyficznych kanaw dla jonw Na +, K+ i Ca2+ . Bony komrek nerwowych zawieraj dobrze zbadane kanay jonowe, ktre odpowiedzialne s za potencjay czynnociowe powstajce w poprzek bony. Aktywno niektrych z tych kanaw jest kontrolowana przez neurotrans-mitery; dlatego te aktywno kanaw moe by regulowana. Jeden jon moe regulowa aktywno kanau innego jonu. Dla przykadu, spadek stenia jonu Ca2+ w pynie pozakom-rkowym powoduje wzrost przepuszczalnoci bon i wzrost dyfuzji jonw Na+. To depolary-zuje bony i wyzwala bodziec nerwowy. Zjawisko to moe tumaczy pojawienie si zdrt wienia, mrowienia i skurczw mini, tak charakterystycznych dla stanw chorobowych przebiegajcych z niskimi steniami jonw wapnia w surowicy.
Kanay s otwarte tylko przez krtki okres, co znaczy, e s bramkowane. Bramki mog otwiera si lub zamyka. W kanaach bramkowanych ligandami okrelona czsteczka wie si z receptorem i otwiera kana. Kanay bramkowane napiciem otwieraj sie (lub zamykaj) w odpowiedzi na zmian potencjau bonowego. Niektre drobnoustroje s zdolne do syntezy maych organicznych czsteczek, zwanych jo-noforami, ktre funkcjonuj na zasadzie ruchu posuwisto-zwrotnego, wahadowego" (zasada czenka") w celu przemieszczania jonw przez bon. Jonofory te zawieraj hydrofilowe centra, ktre wi okreJone jony i jednoczenie s otoczone przez peryferyjne regiony hydrofobowe; taka struktura pozwala czsteczkom rozpuszcza si dobrze w bonach i dyfundowa przez nie. Inne czsteczki, jak np. dobrze zbadany polipeptyd gramicydyna, zdolne s do two rzenia kanaw. Toksyny bakteryjne, takie jak toksyna bonicy, i aktywne skadniki dopeniacza, mog wytworzy due pory w bonie komrkowej, dziki czemu moliwe staje si przejcie makromoleku bezporednio do pynu rdkomrkowego. Podsumowujc, czysta dyfuzja substancji zaley od: 1) jej gradientu ste w poprzek bony (substancje rozpuszczane przemieszczaj si w kierunku od duych do maych ste); 2) pola elektrycznego w poprzek bony (substancje rozpuszczane przemieszczaj si w kierunku roztworu majcego przeciwny adunek); 3) wspczynnika przepuszczalnoci danej substancji przez bon; 4) gradientu cinienia hyd-
rostatycznego w poprzek bony (wzrost ci nienia spowoduje wzrost szybkoci i czstoci zetkni czsteczki z bon); 5) temperatury (podwyszenie temperatury spowoduje wzrost ruchliwoci czsteczek, co zwiksza czstotliwo kolizji midzy nimi a bon).
UATWIONA DYFUZJA I AKTYWNY TRANSPORT

Systemy transportowe mona opisa w sensie funkcjonalnym na podstawie liczby przenoszonych czsteczek oraz na podstawie kierunku ruchu (ryc. 43-13), lub te uwzgldniajc, czy odbywa si on w kierunku uzyskania rwno wagi, czy odwrotnie. System uniportowy powoduje dwukierunkowy ruch okrelonej czste czki. W systemach kotransportowych przeniesienie jednej substancji rozpuszczonej zaley od stechiometrycznych rwnolegych lub kolejno po sobie nastpujcych przeniesie innych substancji rozpuszczonych. Symport opisuje ruchy takich substancji rozpuszczonych w tym samym kierunku. Przykadem s transporty proton--wglowodan w bakteriach oraz Na "'"-wglowodan (glukoza, mannoza, galaktoza, ksyloza i arabinoza), a take Na+-aminokwasowe transporty w komrkach ssakw. Antyportowe systemy odpowiedzialne s za ruch dwch czsteczek w przeciwnych kierunkach (np. Na+ do rodka i Ca2+ na zewntrz). Czsteczki, ktre nie mog w sposb samorzutny swobodnie by przenoszone przez Iipidow dwuwarstw bon,
JDwuwarstwa Hpldowa
Unlport
Symport Kotransport
Antyport
c. 43-13. Schematyczne przedstawienie rodzajw systemw transportowych, Transportery mog by klasyfikowane uwzgldniajc kierunek ich ruchu, lub te fakt, czy przemieszczana jest jedna czy wicej specyficznych czsteczek. (Wedug: Alberts B. i wsp.; Molecular Biology of he Celi. Garland, 1983, za zezwoleniem).
566 / ROZDZIA 43
czyni to przez asocjacj z biakami transportujcymi. W to zjawisko wczone s dwa procesy: uatwiona dyfuzja i aktywny transport, a take bardzo specyficzne systemy transportowe. Uatwiona dyfuzja i aktywny transport maj wiele cech wsplnych. Oba przebiegaj z udziaem biaek, transportujcych i oba wykazuj specyficzno dla jonw, wglowodanw i aminokwasw. Badania mutacji w komrkach bakteryjnych i zwierzcych (wczywszy takie, ktre dotycz chorb u ludzi) potwierdziy te przypuszczenia. Uatwiona dyfuzja i aktywny transport przypominaj reakcje substrat -enzym z wyjtkiem wystpowania kowalencyjnej interakcji. Podobiestwa s nastpujce: 1) ist nieje specyficzne miejsce wizania dla substancji rozpuszczonej; 2) biako transportujce jest wysycane, dlatego te istniej maksymalne szybkoci transportu (Vmas; p. ryc. 43-14); 3) istnieje staa wizania (Km) dla substancji rozDyfuzja . bierna
2
L
Dyfuzja za porednictwem nonika
czas gdy aktywny transport przebiega zwykle w jednym kierunku; 2) aktywny transport zwykle zachodzi w kierunku przeciwnym do pola elektrycznego lub chemicznego gradientu, dlatego te wymaga energii. Uatwiona dyfuzja. Niektre substancje rozpuszczone dyfunduj zgodnie z gradientem elektrochemicznym przez bon znacznie szybciej ni mona oczekiwa na podstawie ich wielkoci, adunku lub wartoci wspczynnika podziau. Ta uatwiona dyfuzja cechuje si odmiennymi waciwociami od tych, ktre znane s dla prostej dyfuzji. Szybko uatwionej dyfuzji bdcej systemem miiportowym moe osign stan nasycenia; oznacza to, e liczba miejsc biorcych udzia w dyfuzji okrelonej substancji rozpuszczonej jest wielkoci skoczon. Wiele systemw uatwionej dyfuzji cechuje si stereo specyficznoci, jednak podobnie jak prosta dyfuzja nie wymagaj one energii metabolicznej. Jak opisano wczeniej, zewntrzno-wewntrzna asymetria biaek membranowych jest wielkoci sta, a ruchliwo biaek w poprzek (raczej ni do) bony jest nieczsta; dlatego poprzeczna ruchliwo specyficznych biaek transportujcych nie jest prawdopodobnie uwarunkowana procesami uatwionej dyfuzji, z wyjtkiem tych, ktre uczestnicz w jonoforach mikroorganizmw, co opisano wczeniej.
Mechanizm ping -pong" (ryc. 43-15) tumaczy uatwion dyfuzj. W tym modelu biako
transportujce istnieje w dwu podstawowych konformacjach. W stanie ,,pong" jest ono eksponowane na due stenia substancji rozpusz Stenie substancji rozpuszczonej czonej i czsteczki tej substancji przyczaj si Ryc. 43- 14. Porwnanie kinetyki dyfuzji z udzia - do specyficznych miejsc w biaku transportujem transportera (uatwionej) z biern dyfuzj. cym. Transport zachodzi wtedy, gdy zmiana Szybko ruchu wiej ostatniej jest wprost proporc - /konformacyjna wystawi biako transportujce jonalna do st enia substancji rozpuszczonej, pod- w stron niszych ste substancji rozpuszczas gdy proces wykazuje cechy nasycenia, gdy czonej (stan ping"). Proces ten jest cakowicie uczestniczy w nim transporter. V m3X oznacza makodwracalny i rzeczywisty przepyw w poprzek symaln szybko. Stenie w poowie maksymal nej szybkoci jest zgodne ze sta wizania (K m) bony zaley od gradientu stenia. Szybko, z ktr substancja rozpuszczona wchodzi do Transportera dla substancji rozpuszczonej. komrki na zasadzie uatwionej dyfuzji, wyznaczona jest nastpujcymi czynnikami: 1) puszczonej i dlatego cay system moe by gradientem stenia w poprzek bony; 2) iloci opisany przez Km (p. ryc. 43-14); 4) struktural biaka transportujcego (jest to gwny czynnik nie podobne inhibitory kompetycyjne blokuj kontrolny); 3) szybkoci oddziaywania mi dzy substancj rozpuszczon a biakiem transtransport. P 4) szybkoci zmiany Zasadnicze rnice s nastpujce: 1) uat - portujcym; obu stanw biaka, wiona dyfuzja moe by dwukierunkowa, pod- konforma-cyjnej naadowanego substancj rozpuszczon i uwolnionego od substancji rozpuszczonej.
oo
Ryc, 43-15. Model ping-pong" uatwionej dyfuzji. Biako transportujce (zakreskowane struktury) w dwuwarstwie lipidowej ascocjuje z substancj rozpuszczon w wysokich steniach na jednej stronie btony. Nastpnie dochodzi do konformacyjnej zmiany (pong" do ping") i substancja rozpuszczona jest rozadowana od strony nowej rwnowagi Pusty przenonik powraca wtedy do swojej oryginalnej konformacji (ping" do pong"), aby zamkn cykl przemiany.
Hormony reguluj uatwion dyfuzj przez zmiany w liczbie dostpnych biaek transportujcych. Insulina zwiksza transport glukozy w tkance tuszczowej i w miniach czerpic biaka transportujce z zapasw wewntrzko mrkowych (p. ryc. 52-9). Insulina zwiksza take transport aminokwasw w wtrobie i innych tkankach. Jedn z koordynowanych akcji hormonw glikokortykoidowych jest wzmoenie transportu aminokwasw do wtroby, gdzie su one jako substraty dla procesu glukoneo-genezy. Hormony wzrostu zwikszaj transport aminokwasw do wszystkich komrek, a estrogeny do tych, ktre znajduj sie w macicy. Istnieje co najmniej 5 rnych ukadw transportujcych dla aminokwasw w komrkach zwierzcych. Kady z nich jest swoisty dla grupy blisko spokrewnionych aminokwasw, a wikszo z nich dziaa w systemie symportu Na + (ryc. 43-13). transportu rni si od dyfuzji tym, e czsteczki przenoszone s niezgodnie z rwnowag termodynamiczn; dlatego te wymagana jest tu energia. Jej rdem moe by hydroliza. ATP, ruch elektronw lub wiato. Utrzymywanie gradientw elektrochemicznych w ukadach biologicznych jest tak wane, e pochania to ok. 3040% energii wydatkowanej w komrce. W zasadzie komrki utrzymuj wewntrz niskie stenie Na+ i wysokie stenie K4 (tab. 43-1), wraz z ujemnym potencjaem elektrycznym wewntrz. Pomp, ktra utrzymuje te gradienty, jest A PT-aza, ktra jest aktywowana przez Na+ i K+ (ryc. 43-16). ATP-aza ta jest
STRONA WEWNTRZNA
STRONA ZEWNTRZNA
ATP
Transport aktywny. Proces aktywnego
Ryc 43-16. Stechiometria pompy + + + Na /K -ATP--aza. Ta pompa przenosi 3 jony !Ma z wntrza komrki na jej zewntrzn stron i + wprowadza 2 jony K z zewntrznej strony do jej wntrza na kad czsteczk ATPhydrolizowartdo AD P przez zwizan z bon ATP-az. Strofantyna i inne glikozydy nasercowe hamuj dziaanie tej pompy przez oddziaywanie na zewntrzkomrkow powierzchni bony (dziki uprzejmoci R. Post).
integralnym biakiem membranowym i do uaktywnienia wymaga fosfolipidw. Ma ona katalityczne centra zarwno dla ATP, jak i dla Na+ po cytoplazmatycznej stronie bony, ale miejsce wizania K f zlokalizowane jest po zewntrznej stronie bony komrkowej. Strofantyna lub inne giikozydy naparstnicy hamuj t ATP -az przez wizanie do zewntrzkomorkowych domen. Zjawisko to moe by antagonizowane przez zewntrzkomrkowy K+ .
568 / ROZDZIA 43 Przewodzenie bodcw nerwowych zachodzi w gr i w d bony Bona utworzona na powierzchni komrek neuronalnych utrzymuje rnic potencjaw elektrycznych miedzy wntrzem a zewnt rzem" (napicie elektryczne) i jest elektrycznie wzbudzalna. Gdy zostanie pobudzona bodcem chemicznym, za porednictwem specyficznego synaptycznego receptora bonowego (patrz dyskusja o przenoszeniu biochemicznych sygnaw, poniej), otwory w bonie otwieraj si, aby umoHwi szybkie wnikanie Na+ lub CaJ+ (poczone lub nie poczone z wypywem K+), Prowadzi to do szybkiego zaniku istniejcego gradientu napicia, dziki czemu ten odcinek bony ulega depolaryzacji. Pompy jonowe w Wonie jednak szybko odtwarzaj to napicie. Gdy due powierzchnie bony ulegaj w ten sposb depolaryzacji, to zaburzenia elektrochemiczne przemieszczaj si w sposb podobny do fali wzdu bony generujc impuls nerwowy. Osonki mielinowe wytworzone przez komrki Schwanna pokrywaj wkna nerwowe tworzc elektryczny izolator, ktry otacza wikszo nerwu i znacznie przyspiesza propagacj fali (sygnau) umoliwiajc wypyw lub napyw jonw tylko w miejscach bony nie pokrytych izolatorem. Osona mtelinowa zbu dowana jest z fosfolipidw, gwnie z sfin-gomieliny i cholesterolu, a take z biaka i gliko-sfin go lipidw. Zwizanych jest z ni zaledwie kilka biaek integralnych lub peryferyjnych; to one powoduj utrzymywanie si razem wielu membranowych dwuwarstw tworzcych hydrofobow izolacyjn struktur, nieprzepuszczaln dla jonw i wody. Ntektre choroby, jak stwardnienie rozsiane czy zesp Guillain-Barre, charakteryzuj si demielinizacj i zaburzeniami przewodzenia nerwowego. Istnieje kilka mechanizmw tr ansportu glukozy W tym rozdziale zostanie omwionych kilka mechanizmw transportu glukozy. Aby moga by ona wykorzystana jako rdo energii, musi wnikn do komrki. W adypocytach i w miniach glukoza wnika do komrek za porednictwem specyficznego systemu transportowego, ktry wspomagany jest przez insulin. Zmiany w transporcie s przede wszystkim spowodowane zmianami Vma:i (prawdopodobnie spowodowane przez wiksz liczb1 lub przez bardziej aktywne przenoniki), ale mona take zaobserwowa zmiany w K. Transport glukozy mo na rozpatrywa w rnym ujciu. Jego zasady opisano wyej. Glukoza i Na+ wi si w rnych miejscach na przenoniku glukozowym. Na+ przenika do komrki zgodnie z elektrochemicznym gradientem i pociga glukoz za sob (ryc. 43-17), Dlatego im wyszy jest graSWIATO JELITA
Glukoza PYN POZAKOM0HK0WY Ryc. 43- 17. Przezkomrko wy ruch gluko zy w komrkach jelita Glukoza przechodzi za jonem Na* przez lumi naln bo n komrek nabo nkowych. Gradient Na*, ktry napdza ten aymport, wy twarza si przez wymian Na +/K + , zachodzc na bonie podstawowej w stron przestrzeni pO2ako mrkowej. Glukoza wystpujca w wysokich st eniach wewntrz komrki przemieszcza si zgod nie z gradientem ste do pynu poza komrkowe go na drodze uatwionej dyfuzji (mechanizm uni portu). _____ _____________
dient Na+, tym wicej glukozy wnika do komrki, natomiast gdy stenie Na+ w pynie poza-komrkowym jest mae, dokomrkowy trans port glukozy zatrzymuje si. Da utrzymania duego gradientu Na +, symport Na+-glukoza zaleny jest od gradientw generowanych przez pomp Na+/K+, ktra utrzymuje mae wewntrzkomrkowe stenie Na + . Podobne mechanizmy obserwuje si przy transporcie innych wglowodanw, a take aminokwasw. Przezkomrkowy transport wglowoda nw wymaga jeszcze jednego dodatkowego skadnika: uniportu, ktry pozwala glukozie zgromadzonej wewntrz komrki przemieszcza si przez inne bony w kierunku n owej
rwnowagi; zachodzi to np. w jelicie i w komrkach nerki. Komrki transportuj przez bony plazmatyczne take makromolekuy Endocytoza jest procesem, dziki ktremu komrki pobieraj due czsteczki. Niektre z nich (np. polisacharydy, biaka i polinuk-leotydy) mog by rdami skadnikw odywczych. Endocytoza stanowi mechanizm regulujcy zawarto niektrych skadnikw memb ranowych, czego najlepszym dowodem s receptory hormonw. Jest ona procesem pozwalajcym na poznanie wikszej liczby szczegw dotyczcych funkcjonowania komrki. DNA jednego typu komrki moe by uyty w procesie transfekcji innej komrki i zmieni tym samym jej funkcje lub jej fenotyp. W tych dowiadczeniach czsto uywany jest specyficzny gen, co pozwala na unikatow drog badania i analizowania procesw regulowanych przez niego. Transfekcja DNA zaley od endocytozy; endocytoza jest odpowiedzialna za wniknicie
DNA do komrki. W takich dowiadczeniach zwykle wykorzystuje si fosforan wapnia, gdy CaJ+ pobudza endocytoz i wytrca DNA, co uatwia jego endocytoz. Zarwno endocytoza, jak i egzocytoza wymagaj utworzenia si pcherzykw z bony plazmatycznej lub z bon plazmatyczn. Endocytoza. Wszystkie komrki eukario-tyczne w sposb cigy trawi czci swoich bfon. Endocytarne pcherzyki powstaj w mo mentach uwypuklania si do wewntrz segmentw bony plazmatycznej, co powoduje zamknicie w nich niewielkiej objtoci pynu zewntrzkomrkowego i wystpujcych w nim skadnikw. Pcherzyki takie odrywaj si od bony, nastpuje fuzja membran plazmatycz-nych i otwr po pcherzyku w miejscu pierwo tnego dorodkowego wpukienia zasklepia si (ryc. 43-18). Pcherzyk taki zlewa si z innymi strukturami membranowymi, co wyjania transport zawartoci pcherzyka do innych ob szarw komrki, lub nawet poza ni. Wikszo pcherzykw endocytarnych zlewa si z pierwo-
Ryc, 43-18. Dwa typy endocytozy. Endocytarny pcherzyk (V) tworzy si w wyniku wpuklenia okrelonej partii bony plazmatycznej w kierunku cytoplazmy. Endocytoza dotyczca pynw (A) jest przypadkowa i nieukierunkowana. Endocytoza, w ktrej poredniczy receptor (B) jest wybircza i zachodzi w ciokach (CP) pokrytych klatryn (postrzpiona otoczka). Wybirczo t zapewnia receptor (czarne kwadraty), ktry jest specyficzny dla wielu czsteczek. W tym ostatnim procesie powstaj otulone pcherzyki (CV).
570 / ROZDZIA 43
tnymi lizosomami, tworzc lizosomy wtrne, ktre zawieraj enzymy hydrolityczne i tym samym s wyspecjalizowanymi strukturami wykorzystywanymi rd komrkowe Skadniki makromolekularne s trawione i powstaj aminokwasy, proste cukry i nukleotydy, ktre z kolei dyfunduj poza pcherzyki do cytoplaz-my, gdzie mog by ponownie uyte. Endocyto-za wymaga: 1) energii, zwykle pochodzcej z hydrolizy ATP; 2) Ca2+ w pynie zewntrz-komrkowym i 3) kurczliwych elementw w komrce (prawdopodobnie ukadw mikrofila -mentowych). Istniej dwa zasadnicze typy endocytozy. Fagocytoza zachodzi tylko w wyspecjalizowanych komrkach, takich jak makrofagi i granu-locyty. Fagocytoza zwizana jest z wchoniciem duych czsteczek, jak wirusy, bakterie, komrki i resztki komrek. Makrofagi s niezwykle aktywne w tym procesie i mog wchon substancje, stanowice nawet 25% swojej objtoci na godzin. Dziaajc w ten sposb makrofag moe zuy 3% swoich bon paz-matycznych w kadej minucie lub ca swoj bon w cigu 30 min. Pinocyroza jest waciwoci wszystkich komrek i pozwala na pobieranie przez komrk pynw i ich zawartoci. Tutaj take wyr niamy dwa typy. Pinocytoza pynnej fazy jest niewybirczym procesem, w ktrym pobranie substancji rozpuszczonej przez tworzenie maych pcherzykw jest wprost proporcjonalne do stenia tej substancji w pynie pozakomr-kowym otaczajcym komrk uczestniczc w tym procesie. Tworzenie si tych pcherzykw jest niezwykle aktywnym procesem. Fibro-blasty np. zuywaj swoj bon plazmatyczn 3 razy szybciej ni makrofagi. Proces ten zachodzi szybciej ni wytwarzanie nowych bon. Poniewa w procesie pinocytozy cakowita powierzchnia i objto komrek tylko niewiele sie zmieniaj, bony musz si odtwarza na drodze egzocytozy lub przez recyklizacj tak szybko, jak szybko s usuwane przez endocytoz. Drugi etap pinocytozy, pinocytoza absorpcyjna, jest wybirczym procesem, w ktrym uczestniczy receptor odpowiedzialny przede wszystkim za pobieranie ma kro moleku, dla ktrych istnieje skoczona liczba miejsc wicych na bonie plazmatycznej. Receptory te cechujce si wysokim powinowactwem, pozwalaj na wybircz koncentracj tigandw z medium, minimalizujc pobieranie pynw lub rozpuszczonych nie zwizanych makromoleku, a take
w znacznym stopniu zwikszaj szybko wnikania specyficznych moleku do komrki. Pcherzyki powstajce w czasie pinocytozy absorpcyjnej powstaj z wpukle (dokw) bony, ktre pokryte s od strony cytoplazmatycznej materiaem filamentarnym. W wielu ukadach tym materiaem filamentarnym jest klatryna; jest ona prawdopodobnie peryferyjnym bia kiem membranowym. Pokryte doki mog stanowi nawet 2% powierzchni niektrych komrek. Na przykad lipoproteiny o maej gstoci (LDL) i ich receptor (p. rozdz. 26} wnikaj poprzez pokryte doki zawierajce receptor LDL. Te endocytarne pcherzyki, zawierajce LDL i jego receptor, zlewaj si z lizosomami w komrce. Receptor jest uwalniany i ponownie przemieszczany do zewntrznej bony komrkowej, natomiast apolipoproteina LDL jest degradowana, a estry cholesterolowe s meta-bolizowane. Synteza receptorw LDL jest regulowana dru go rzdowymi lub trzeciorzdowymi nastpstwami pinocytozy, tj. przez produkty metabolizmu, takie jak cholesterol, uwolnione w czasie degradacji LDL. Defekty w budowie receptora LDL lub w jego wnikaniu do komrki s wane z medycznego punktn widzenia i zostay omwione w rozdz. 26. Inne makromolekuy, w tym wiele hormo nw, zwizane s z procesem absorpcyjnej pinocytozy i tworz receptosomy jako pcherzyki, ktre omijaj lizosomy i dostarczaj swoj zawarto do innych wewntrzkomrkowych obszarw, takich jak aparat Golgiego. Absorpcyjna pinocytoza zewntrzkomrko-wych glikoprotein wymaga, aby miay one specyficzny wglowodanowy sygna rozpoznawczy. Te sygnay rozpoznawcze zwizane s z membranowymi czsteczkami receptorw, ktre odgrywaj rol analogiczn do tej, jak odgrywa receptor LDL. Receptor galaktozylo-wy na powierzchni hepatocytw jest pomocny w absorpcyjnej pinocytozie asjaloglikoprotein z krcej krwi. Kwane hydrolazy pobierane na drodze absorpcyjnej pinocytozy przez fibro-blasty s rozpoznawane dziki wystpowaniu w nich mannozo-6-fosforanu. Prawdopodobnie reszta ma nnoz o-6-fosforan owa odgrywa take wan rol w wewntrzkomrkowym transpor cie kwanych hydrolaz do lizosomw, w ktrych s one syntetyzowane (p. rozdz. 57). Nie jest cakowicie wyjaniony proces endocytozy za porednictwem receptorw w przypadkach wirusw: zapalenia wtroby (uszka -
Egzocytaza
Endocytoza
Ryc. 43-19. Porwnanie mechanizmw endocytozy i egzocytozy. Egzocytoza wymaga kontaktu dwu wewntrznych powierzchni (cytoplazmatyczna strona) monowarstwy, podczas gdy endocytoza jest wynikiem kontaktu dwch zewntrznych powierzchni monowarstwy.
dzajcych hepatocyty) czy poliomyelitis (uszkadzajcych neurony motoryczne) i AIDS. Toksyczno elaza take rozpoczyna si znacznym jego pobieraniem przez komrki na drodze endocytozy. Egzocytoza. Wikszo komrek uwalnia makromolekuy do rodowiska na drodze eg zocytozy. Proces ten wystpuje take w zjawisku remodelowania bon, gdy skadniki syntetyzo wane w aparacie Golgiego s przenoszone w pcherzykach do bonplazmatycznych. Sygnaem dla egzocytozy jest czsto hormon, ktry, gdy zwie si Z receptorem powierzchniowym komrki, wywouje lokalne i przemijajce zmiany w steniu Ca3+. Jony wapnia z kolei uruchamiaj- egzocytoz. Rycina 43-19 przedstawia porwnanie mechanizmw egzocytozy i endocytozy. Czsteczki uwalniane przez egzocytoze mona zaliczy do 3 grup: 1) mog one przycza si do powierzchni komrki i sta si peryferyj nymi biakami, np. antygeny; 2) staj si one czci zewntrzkomrkowej macierzy, np. kolagen i glikozaminoglikany; 3) mog one przej do pynu zewntrzkomrkowego i by sygnaem dla innych komrek. Insulina , parathor-mon i katecholaminy znajduj si w ziarnisto-ciach i s poddane obrbce w komrkach, a po zadziaaniu okrelonego bodca zostaj uwolnione (p, rozdz. 48, 50 i 52). Niektre sygnay s przenoszone w poprzek bon Sygnay biochemiczne specyficzne, takie jak neurotransmitery, hormony i immunoglobuliny, wi si ze swoistymi receptorami (biaka integralne) znajdujcymi si po zewntrznej stronie bony plazmatycznej, przekazujc nastpnie informacje poprzez t bon do cyto-plazmy. Mechanizm ten wymaga wytworzenia szeregu sygnaw, m.in. cyklicznych nukleoty-
dw, wapnia, fosfozytydw i diacyloglicerolu. Szczego wo mechanizm t en o m wiono w rozdz. 45. Informacja moe by przekazana przez kontakty midzykomrkowe Istnieje wiele miejsc midzykomrkowych kontaktw w organizmie metazoicznym. Wymaga to kontaktu midzy bonami plazmatycz-nymi indywidualnych komrek. Komrki blisko ze sob ssiadujce wytworzyy w tym celu wyspecjalizowane regiony na swoich bonach. Zcza szczelinowe porednicz i reguluj przechodzenie jonw i maych czsteczek przez wskie i hydrofilowe wntrze kanalikw, czcych cytoplazm przylegajcych komrek. To wanie jest przyczyna, e jony i mae czsteczki mog przenika z jednej komrki do drugiej w spos b kontrolowany.
PIMIENNICTWO
Blobel G et al: Tramlocation of proteins across membranes: The signal hypothesis and beyond, Symp Soc Exp Biol 1979;33:9. Dautry-Varsat A, Lodish HF: How receptors bring proteins and particles into cells. Sci Am (May) 1984;250:52. Dawidowicz EA: Dynamics of membran lipid metabolism and turnover. Annu Rev Biochem 1987;56:43. Ellers M, Schatz G: Protein Unfold ing and the Energetics of Protein Translocation across Biological Membranes. Celi 1988;52:481. Goldstein J et al: Receptor-mediated endocytosis. Annu Rev Cel! Biol 1985;1:1. Lodish HF: Transport of secretory and membran glycoproteins from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi: A rale-limiting step in protein maturation and secretion. J Biol Chem
1988;263:2107.
572 / ROZDZIA 43 Matlin, KS: The sorting of proteins to the plasma m em bran in epithelia! cells. J Celi Biol 1986; 103:2565. Pfeffer SR, Rothman JE: Biosyntnetic protein transport and sorting by the endoplasmic reticulum and Golgi. Annu Rev Biochcm 1987;56:829. Roise D, Schatz G: Mitochondriai preseuences. J Biol Chem 19 88; 263:4 509. Singer SJ, Nicolson GL: The fluid tnosaic model of the structure of oell membranes. Science 1972;175:720. Stahl P, Schwartz AL: Receptor-mediated endocyto-sis. J. Clin lnvest 1986;77:657. Stein WD: Transport and Diffusion Across Celi Membranes. Academic Press, 1986. UnwinN, HendersonR: Thestructuresof proteinsin biological membranes, Sci Am (Feb) 1984;25(h78. Walter P, Gilmore R, Blobel G: Protein translocation across the endoplasmic reticulum. Celi 1984;38:5. Wickner WT, Lodish HF: Multiple mechanisms of protein insertion into and across membranes. Science 1985;230:400.
Charakterystyka ukadw hormonalnych

44
WPROWADZENIE
Celem tego rozdziau jest dostarczenie informacji o zmieniajcej si istocie ukadu we-wntrzwydzielniczego i definicjach kilku podstawowych koncepcji, ktre przewija si bd w kolejnych podrozdziaach.
Postp, jaki dokona si w zakresie bada nad funkcjonowaniem ukadu wewntrzwy dziel niczego umoliwiajcy odpowiedzi na pytania, dlaczego niektre gruczoy endokrynne znaj duj si w ssiedztwie drugich, w jaki sposb wytwarzane s hormony, jak rwnie koncepcje o wystpowaniu komrek docelowych, receptorw oraz kontroli wydzielania hormonw opartej na mechanizmach sprzenia zwrotnego ma bezporednie implikacje kliniczne. Obecnie mona dokadnie okreli przyczyny niektrych chorb ukadu wewntrz wydziel niczego. Wiele z nich spowodowanych jest defektami receptorowymi, chocia zapewne i inne przyczyny tych chorb zostan wkrtce zidentyfikowane.
WYSPECJALIZOWANE TKANKI ORGANIZMW WIELOKOMRKOWYCH POTRZEBUJ ZOONEJ KOORDYNACJI

Cech charakterystyczn ustrojw wielokomrkowych jest wystpowanie rnorodnych tkanek penicych swoiste funkcje, niezbdne
dla przeycia tych organizmw. Konieczne s rwnie mechanizmy dla "komunikacji rdko-mrkowej, zapewniajce koordynacj procesw adaptacyjnych na zmiany rodowiska zewntrznego i wewntrznego. Rozwiny si dwa oglne ukady speniajce le czynnoci. S nimi: ukad nerwowy, przekazujcy sygnay lub informacje za porednictwem niezmieniajcego si systemu strukturalnego oraz ukad wewntrz wy dzielni-czy, wydzielajcy rne hormony w swoistych gruczoach, przenoszone jako sygnay do komrek przylegajcych lub do tkanek oddalo nych od tych gruczow. Obecnie wiadomo, e wystpuje zadziwiajca zbieno w dziaaniu tych systemw regulatorowych. Regulacja nerwowa jest bardzo wana. I tak np. epinefryna (adrenalina) jest wytwarzana i wydzielana przez komrki pozazwojowe rdzenia nadnerczy, za wazopresyna jest syn tetyzowana w podwzgrzu i transportowana aksonami do przysadki nerwowej (tylnej czci przysadki mzgowej), gdzie jest wydzielana do krwiobiegu. Wiele neuroprzekantkw (kate-cholaminy, dopamina, acetylocholina itd.) jest podobnych do hormonw, jeli uwzgldni si ich syntez, uwalnianie, transport i mechanizm dzia ania. I tak np. aminy katecholowe s neuroprzekanikami dla jednej tkanki za hormonami dla innych tkanek. Innym takim przykadem jest fakt wykrycia niedawno pewnych metabolitw steroidw nadnerczowych bdcych modulatorami receptorw y-amino-ma -lanowych (GABA) w mzgu, o dziaaniu podobnym do barbituranw. W kocu naley wspomnie, e niedawno znaleziono w mzgu wiele hormonw tj. insulin, ACTH, wazoaktywny polipeptyd jelitowy (VIP), somatostatyn, hor mon uwalniajcy tyreotropin (TRH) oraz cho-
574 / ROZDZIA 44
lecystokinin. Do wyjanienia pozostaje, czy wszystkie wymienione hormony syntetyzowane s w mzgu i czy dziaaj tam jako neuro-modulatory lub neuroprzekaniki. Skoro w m zgu wykryto swoiste receptory dla wielu z wymienionych hormonw, moliwe jest, e dziaaj one w mzgu. Pojecie hormon" pochodzi od greckiego sowa, oznaczajcego pobudzi do dziaania". Wedug klasycznej definicji pod pojciem hormonu naley rozumie substancj, syntetyzowan w jednej tkance i przenoszon krwi do innego narzdu, w ktrym rozwija swoje dziaanie. Ta definicja hormonu wykazuje zbyt may zakres, wiadomo bowiem, e hormony mog dziaa rwnie na przylegajce komrki w okrelonej tkance (dziaanie to okrela si jako parakrynne), a nawet na komrki, w ktrych s syntetyzowane (dziaanie to okrela si
jako autokrynne).
CECH ZNAMIENN UKADU WEWNTRZWYDZIELNICZEGO JEST JEGO RNORODNO Jedn z najbardziej znamiennych cech ukadu wewntrzwydzielniczego jest to, e zabezpiecza ustrj w liczne sposoby rozwizywania problemw. Celem tego podrozdziau jest krtkie przedyskutowanie wybranych przykadw najlepiej ilustrujcych rnorodno ukadu wewntrzwydzielniczego . Gruczoy wewntrzwydzielnicze s przewanie pochodzenia nabonkowego i rozmieszczone strategicznie Gruczoy wydzielania wewntrznego s najczciej pochodzenia nabonkowego. Szczeglnymi wyjtkami od tej reguy s: komrki Leydiga wywodzce si z tkanki cznej gonady mskiej a wytwarzajce testosteron, komrki ziarniste jajnika, produkujce estrogeny oraz komrki sekrecyjne przysadki nerwowej, wywodzce si z komrek nerwowych. Grzebie nerwowy (neural crest) ma by embriologicz-nym zalkiem licznych rodzajw komrek endokrynnych. Jeli to jest prawd, atwo sobie wytumaczy zwizek midzy orodkowym ukadem nerwowym a ukadem wewntrzwy-dzielniczym. Skoro tkanka wywodzca si z grzebienia nerwowego moe si pojawi w kadym narzdzie, atwo sobie wytumaczy wy-
twarzanie niektrych hormonw w mzgu i tkankach wywodzcych si przewanie z jelita rodkowego pierwotnego lub z przedniej czci prajelita. Tumaczy to rwnie zespoy ekto-powej syntezy hormonw, w ktrych zachodzi wytwarzanie hormonw przez niewaciw" tkank (np. wytwarzanie parathormonu lub ACTH przez komrki raka puc). Oglnie biorc, zespoy te dotycz raczej ograniczonej liczby hormonw peptydowych, natomiast licznych i rnorodnych tkanek. O ile powszechnie uwaano, e zespoy te s wyraze m aktywacji milczcych" genw w obrbie okrelonej komrki, obecnie wydaje si, e zespoy te s wyrazem aktywacji upionych" komrek wykazujcych wsplnych przodkw w obrbie tkanki. Inny dziwny przykad to zespoy wielo-gruczolakowatoci wewntrz w ydzielniczej (mul-tiple endocrine neoplasia syndromes MEN), w ktrych stwierdza si rodzinne wystpowanie nowotworw w kilku gruczoach wewntrzwy-dzielniczych rwnoczenie. Cech tych zespow jest nadmiernie wytwarzanie hormon w peptydowych lub amin katecholowych czsto przez jedn i t sam tkank. Komrki wytwarzajce hormony nie s rozmieszczone przypadkowo. Wystpuj one w rnych tkankach dla okrelonych celw. Lokalne wystpowanie wysokich ste hormonw (tj. wyszych od wystpujcych w osoczu krwi) jest potrzebne dla swoistych procesw biologicz nych. Dla przykadu naley poda, e miejscowe stenie testosteronu, niezbdne w procesie sperma to genezy, jest wysze od wystpujcego w osoczu krwi. Tym faktem naley tumaczy wystpowanie komrek Leydiga wytwarzaj cych testosteron tu obok n a sie io wodo w. Do powstania ciaka tego potrzebne jest bardzo due miejscowe stenie estrogenw. Tumaczy to bliskie pooenie komrek ziarnistych pcherzyka jajnikowego (Graafa) w stosunku do ciaka tego. Gros dziaania insuliny i glukagonu polega na regulacji wytwarzania glukozy w wtrobie (w procesie glukoneogenezy przyp- tumacza); dlatego istnieje bliskie powizanie wysp trzust kowych z kreniem wrotnym wtroby. Kor-tyzoi, ktry jest niezbdny w duych steniach w rdzeniu nadnerczy do indukcji N-metylo--transferazy fenyloetanoloaminowej (jest to enzym okrelajcy wydajno biosyntezy katecho-lamin), dociera tam drog wrotnego ukadu naczyniowego, biorcego swj pocztek w korze nadnerczy. Istnieje cisy zwizek midzy
CHARAKTERYSTYKA UKADW HORMONALNYCH / 575
podwzgrzem a przedni czci przysadki mzgowej (przysadka gruczoowa), co sprawia, e wysokie stenia bardzo iabilnych hormonw uwalniajcych podwzgorza docieraj atwo do narzdu docelowego, tj. do przysadki gruczoowej za porednictwem swoistego wrotnego ukadu naczyniowego. W kocu naley wspomnie o wyjtkowym rozmieszczeniu swoistych komrek wysp trzustkowych wobec siebie. Wytwarzajc miejscowo wysokie stenia somato-statyny, polipeptydu trzustkowego, glukagonu i insuliny, sekrecja kadego z tych hormonw wpywa na wydzielanie pozostaych hormonw. Biosynteza hormonw i modyfikacja tej biosyn tezy s harmonijnie zgrane ze swoistymi zadaniami czynnociowymi tych hormonw Istnieje wielka rnorodno w zakresie struktury chemicznej oraz w mechanizmach biosyntezy i przemian po syntetycznych w odniesieniu do poszczeglnych aktywnych hormonw. I tak hormony mog powstawa z prekursorw lipi-dowych, przez modyfikacj struktury aminokwasu tyrozyny, lub te drog syntezy biaek prostych lub zoonych (np. glikoprotein). Hormony mog by syntetyzowane i wydzielane w swej ostatecznej postaci. Do takich hormonw nale aldosteron, hydrokortyzon, trijodotyronina (T3), estradiol i aminy katecho-lowe. Inne hormony musz ulec obrbce w obrbie komrki, zanim zostan wydzielone lub zanim nabd penej aktywnoci biologicznej. Takimi przykadami s: insulina, ktra jest syntetyzowana jako proinsulina (jest ona prototypem biaek prekursorowych) oraz hormon przytarczyc parathormon (PTH). Ten ostatni wywodzi si z co najmniej dwch prekursorw peptydowych (prepro- i pro-PTH), z ktrych powstaje w peni aktywna posta hormonu przez odcicie dwch polipeptydw. Opis biaek prekursorowych, ich syntezy i rdkomr-kowej obrbki do kocowego produktu przed stawiono w rozdz. 43. Jeszcze bardziej zoonym przykadem jest proopiomelanokortyna (POMC), skadajca si z 285 aminokwasw, a bdca produktem pojedynczego genu. POMC ulega rozpadowi z wytworzeniem takich hormonw, jak ACTH, P-lipotropiny, fS-endorfiny, ot-melanotropiny (cc-MSH) i P-melanotropiny (P-MSH) oraz innych hormonw poiipeptydowych dotychczas jeszcze nie zidentyfikowanych. Obrbka (prze-
wych. Konwersja moe zachodzi w narzdzie docelowym, np. konwersja T4 do T3 zachodzi w wtrobie i przysadce mzgowej, za testosteronu do dihydrotestosteronu w drugorzdo -wych tkankach pciowych. Konwersja obwodowa moe zachodzi rwnie w tkankach niedo-celowych. I tak dehydroepiandrosteron jest wytwarzany w nadnerczach, natomiast ulega konwersji do androstendionu w wtrobie. Ten ostatni metabolit moe ulec dalszej konwersji do testosteronu, estronu lub estradiolu w ady-pocytaeh, wtrobie lub skrze. Konwersja nieaktywnego hormonu w hormon czynny moe zachodzi zarwno w tkankach docelowych jak i niedocelowych. Przykadem tego jest konwersja witaminy D3 skry do 25-hydroksycholekal-cyferolu w wtrobie oraz przeksztacanie tego ostatniego metabolitu do 1,25-dihydroksycho-lekalcyferolu w nerkach (p. rozdz. 48). Hormony wydzielane przez bardzo rne tkanki i wykazujce rne komrki docelowe mog wykazywa podobiestwo strukturalne. I tak np. hormony glikoproteinowe przysadki gruczoowej (tyrcotropina TSH, folitropina FSH, lutropina LH) lub oyska (gonado-tropina kosmwkowa HCG) s heterodime-rami skadajcymi si z podjednostek a i p, przy czym podjednostka a jest identyczna we wszystkich wymienionych hormonach.
Niektre hormony ulegaj konwersji do czs teczek bardziej aktywnych w tkankach obwodo-
ksztacanie) tej czsteczki prekursorowej jest tkankowo swoista '(p. rozdz. 46). Przykadem moe najbardziej drastycznym wystpowania duego prekursora hormonalnego jest tyreoglobulina. Jest to dua czsteczka biakowa (masa czsteczkowa wynosi 660000 D) wystpujca w pcherzykach gruczou tarczowego. Wrd 5000 aminokwasw czsteczki tyreoglobuliny znajduje si 120 reszt tyrozylo-wych, z ktrych tylko nieliczne ulegaj jodowaniu w procesie biosyntezy hor monw tarczycowych (p. rozdz. 47). Caa czsteczka tyreoglobuliny musi ulec degradacji, aby uwolni zaledwie kilka czsteczek tetrajodo(T4) lub trijodotyroniny (T3).
576 / ROZDZIA 44
DOCELOWYM NARZDEM HORMONW MOE BY WICEJ NI JEDNA TKANKA: KONCEPCJA NARZDU DOCELOWEGO (TARCZOWEGO)
U czowieka wystpuje ok. 200 rodzajw zrnicowanych komrek. Tylko niekt re z nich wytwarzaj hormony. Wystpujce u czowieka 75 bilionw (75 x 10t2) komrek to komrki docelowe dla jednego lub wicej z ok. 50 znanych hormonw. Hormon moe mie tylko jedn tkank docelow, tub te moe oddziaywa na kilka tkanek rwnoczenie. Klasyczna definicja jako tkank docelow okrela tak, ktra charakteryzuje si unikaln reakcj biochemiczn lub fizjologiczn na bodziec hormonalny, np. tarczyca jest swoistym narzdem docelowym dla TSH; TSH zwiksza liczb i wielko komrek gronek tarczycowych i pobudza wszystkie etapy enzymatyczne zwizane z biosyntez hormonw tarczycowych, W odrnieniu od TSH insulina dziaa na wiele tkanek. Pobudza wychwyt glukozy i jej utlenianie w miniach, Hpogenez w tkance tuszczowej, transport aminokwasw do hepatocy-tw i limfocytw oraz syntez biaek w wtrobie i miniach, eby wymieni jedynie kilka efektw tego hormonu. Ostatnio, po zidentyfikowaniu swoistych receptorw hormonalnych na powierzchni komrek lub w obrbie komrek, definicja narzdu lub tkanki docelowej zostaa poszerzona. Obejmuje ona jakkolwiek tkank, wykazujc zdolno wizania hormonu przez swoisty receptor, niezalenie od wystpowania lub niewystpowania klasycznego efektu biochemicznego lub fizjologicznego dla danego hormonu (np. wizanie insuliny przez komrki rdbonkowe). Ta definicja take nie jest idealna, ma ona jednak warto heurystyczn, uzmysawia bowiem, e nie wszystkie efekty dziaania hormonw zostay wyjanione. Oglna odpowied na okrelony hormon zaley zarwno od jego stenia we krwi, jak i od narzdu docelowego. Z kolei stenie miejscowe hormonu w narzdzie docelowym zaley od: 1) nasilenia syntezy i wydzielania hormonu, 2) odlegoci dzielcej narzd wydzielania wewntrznego od narzdu docelowego, 3) staej wizania lub dysocjacji hormonu ze swoistymi biakami nonikowymi osocza (jeli takie wystpuj), 4) szybkoci konwersji nieaktywnego lub sabo aktywnego prekursora w aktywny hormon, oraz 5) szybkoci oczyszczania
krwi z danego hormonu poprzez jego wydalanie z ustroju lub biodegradacj (procesy te za chodz gwnie w wtrobie i nerkach). Od powied tkanki docelowej na bodziec hormonalny zaley z kolei od 1) wzgldnej aktywnoci i (lub) stopnia wysycenia hormonem swoistych receptorw hormonalnych bon komrkowych, cytoplazmatycznych lub jdrowych oraz 2) po-receptorowej amplifikacji lub supresji sygnau hormonalnego. Zmiany wymienionych czynnikw mog wpywa na nasilenie reakcji indukowanej hormonem w narzdzie docelowym i naley je uwzgldni rozpatrujc dziaanie klasycznych ptli sprzenia zwrotnego.
WYSTPOWANIE ZARWNO UJEMNEGO, JAK I DODATNIEGO SPRZENIA ZWROTNEGO JEST MECHANIZMEM KONTROLUJCYM
Utrzymywanie si fizjologicznych ste hormonw we krwi jest wynikiem dziaania rnorodnych mechanizmw homeostatycznych na linii gruczo wydzielania wewntrznego narzd docelowy, W mechanizmach tych czsto poredniczy jeden lub wicej gruczow. Powszechnie wystpuje kontrola sekrecji hormonw na zasadzie ujemnego sprzenia zwrotnego, szczeglnie w takich ukadach jak; podwzgrze--przysadka mzgowa-gruczo docelowy. Przykad takiego sprzenia zwrotnego przedstawia ryc. 44-1. Jak wida na rycinie, podwzgrzowy hormon uwalniajcy pobudza syntez i uwal nianie hormonu przedniego pata przysadki mzgowej, ktry z kolei stymuluje wytwarzanie hormonu w narzdzie docelowym. Wysokie stenia hormonu tego ostatniego hamuj syntez i dziaanie hormonu podwzgrzowego, i odwrotnie, mae stenia pobudzaj ukad na poziomie podwzgrza. Wyjtkow cech tego szczeglnego ukadu jest to, e synteza hormonu przysadki gruczoowej moe si zmniej szy w nastpstwie dziaania tzw. krtkiej ptli sprzenia zwrotnego. Dziaanie takiego systemu zapewnia precyzyjn kontrol stenia hormonu w osoczu. Pokazuje on, e w obrbie jednego ukadu wewntrz wy dzielniczego istnieje wiele hormonw i wiele tkanek docelowych. Istnienie takich ptli" kontroli wydzielania hormonw wykazano dla nadnerczy, tarczycy oraz gonady mskiej i eskiej. W innych przypadkach regulacja mechaniz-
CHARAKTERYSTYKA UKADW HORMONALNYCH / 577 e

Krotka ptla
Hormon ' uwalniajcy
e (PRZEDNI
MZGOWEJ)
PODWZGRZE PAT PRZYSADKI
Ryc. 44-1. Przykad ukadu kontrolnego opartego na zasadzie ujemnego sprzenia zwrotnego, regulujcego czynno tarczycy, nadnerczy, jajnikw i gonady mskiej.
NARZD DOCELOWY
padkach ptie sprzenia zwrotnego nie zostay jeszcze okrelone,' najczciej dlatego, e nieznane s kocowe produkty dziaania hormonu. Liczne zjawiska patofizj o logiczne, takie jak wstrzs, uraz, hipoglikemia, bl i stres wpywaj na czynno osi podwzgrze-przysadka--narzd docelowy poprzez oddziaywanie na wysze orodki mzgowe. Wymienione czynniki pobudzajce wykazuj znaczny wpyw na przemian amin katecholowych i hormonu wzrostu, jak rwnie na czynno kory nadnerczy, tarczycy i gonad, chocia jeszcze sabo poznano poszczeglne ogniwa dziaania tych czynnikw. W chorobach wydzielania wewntrznego oraz przemiany materii wspomniane mechanizmy sprzenia zwrotnego ulegaj zaburzeniu. W celu wykrycia zaburze tych ukadw uywa si testw diagnostycznych odrniajcych stany fizjologiczne od chorobowych. RECEPTORY HORMONALNE ODGRYWAJ GWN ROL Receptory wykazuj zdolno precyzyjnego odrniania czsteczek Rycina 44-2 pokazuje gwne zasady dziaania hormonalnego ukadu komunikacji. Stenie hormonw w pynie pozakomrkowym jest zwykle bardzo mae i waha si w granicach od 1O"1S do 10~e mol/l. S to stenia znacznie nisze w porwnaniu do ste licznych, strukturalnie podobnych do hormonw czsteczek (substancje steroidowe, aminokwasy, peptydy, biaka) i innych substancji krcych we krwi. Stenia tych ostatnich wahaj si od tO~5 do 10"3 mol/l. Dlatego te komrki docelowe musz odrni nie tylko rne hormony obecne we krwi w maych steniach, ale rwnie rozpozna je wrd czsteczek wystpujcych w 106 do I09-krotnie wikszym steniu. Ten wysoki stopie dyskryminacji poszczeglnych czsteczek zapewniaj struktury komrkowe zwane receptorami. Hormony rozpoczynaj swoje dziaanie biologiczne wic si ze swoistym receptorem ko mrkowym. Kady skuteczny ukad kontroli musi jednak rwnie obej mowa-mechanizmy hamujce efekty hormonalne. Zachodz one zwykle w ten sposb, e efektor odcza si od receptora. Pod pojciem komrki docelowej naley rozumie komrk wykazujc zdolno wizania
mem ujemnego sprzenia zwrotnego jest reali zowana za porednictwem zmiany stenia okrelonych metabolitw lub substratw po wstaych w nastpstwie dziaania hormonu na komrk docelow. I tak np. wzrost stenia glukozy w osoczu krwi, czyli hiperglikemia, pobudza uwalnianie insuliny, ktra z kolei nasila pobr i utylizacj glukozy przez liczne tkanki; w nastpstwie tych procesw stenie glukozy normalizuje si, dziki czemu uwalnianie insuliny maleje, W okrelonych warunkach chorobowych uwalnianie insuliny do krwi moe by nadmierne, co moe by przyczyn wystpienia hipoglikemii. Odpowiedzi fizjologiczn na taki grony dla ycia stan jest uwalnianie amin katecholowych, hormonu wzrostu, glukagonu, ACTH, wazopresyny i an-giotensyny II, tj. hormonw zwikszajcych stenie glukozy we krwi. Jak wida, rozwina si zoona sie mechanizmw regulujcych stenie krytycznego metabolitu (w omawia nym przypadku glukozy) niezbdnego dla czynnoci mzgu. W innych przypadkach hormony dziaaj na zasadzie dodatniego sprzenia zwrotnego. I tak na przykad estrogeny i progesteron s potrzebne do wystpienia wzrostu sekrecji LH, indukujcego owulacj oraz powstanie ciaka tego, jak rwnie dalsz syntez wymienionych hormonw steroidowych. W wielu przy37
578 / ROZDZIA 44
o
A
/
Rnorodno czsteczek w pynie pozakomrkowym
w
1
v
3
l _ J
4
2
---
Hormon
Rodzaje komrek
Ryc. 44-2. Swoisto i wybirczo receptorw hormonalnych. W pynie pozakomrkowym znajduje si wiele rnorodnych czsteczek, lecz tylko kilka z nich jest rozpoznawanych przez receptory hormonalne. Receptory te musz je rozpozna wrd innych czsteczek wystpujcych w wysokich steniach. Komrka moe mie tylko jeden rodzaj receptora, lub te receptory dla kilku hormonw.
okrelonego hormonu przez swoisty receptor. Zjawisko interakcji midzy hormonem a jego receptorami mona okreli ilociowo, uywajc ligandw radioaktywnych, wykazujcych waciwoci wizania hormonw. W badaniach zjawiska wymienionej interakcji wane s nastpujce elementy; 1) radioaktywno nie moe zmieni aktywnoci biologicznej ligandu, 2) wizanie musi mie charakter swoisty, tj. znakowany ligand musi zosta wyparty przez nie-znakowanego agonit lub antagonist, 3} wizanie musi by wysycalne" oraz 4) wizanie powinno zachodzi w zakresie ste wywoujcych spodziewan odpowied biologiczn. W obrbie receptora wystpuje zarwno domena rozpoznajca, jak i sygnalizacyjna Wszystkie receptory, zarwno dla hormonw polipeptydowych, jak i steroidowych, maj przynajmniej dwie domeny czynnociowe. Domena rozpoznajca wie hormon, za drugi obszar receptora wytwarza sygna czcy proces rozpoznawania hormonu z jak czynnoci rdkomrkow. Proces wizania hormonu dowodzi, e pewien obszar jego czsteczki wykazuje struktur komplementarn do okrelonego obszaru czsteczki receptora. Stopie tej kom-
plementarnod okrela si wizania hormonu z receptorem wyraon wspczynnikiem powinowactwa (K) (affinity of binding). Jeeli natywny hormon wykazuje warto K umownie okrelon jako 1, inne czsteczki naturalne wykazywa bd wartoci K od 0 do 1. W rzeczywistoci absolutne wartoci powinowactwa poszczeglnych czsteczek do receptora mog si rni 1012-krotnie. Syntetyzowano nawet Ugandy o wzgldnej wartoci K>1. Te ostatnie uywane s w badaniach rnych aspektw biologii receptora. Proces trans du kej i sygnau odbywa si naj czciej dwiema drogami. Czsteczki hormonu biakowego lub polipeptydowego, lub te amin katecholowych czc si z receptorami zlokalizowanymi w bonie plazmatycznej wyzwalaj sygna regulujcy rne czynnoci rodkom orkowe, najczciej poprzez zmian aktywnoci jakiego enzymu. Hormony steroidowe oraz tarczycy wi si z receptorami rdkomr-kowymi, za powstay w ten sposb kompleks hormon-receptor sam jest sygnaem {patrz ni ej)Dotychczas poznano sekwencj ami no kwasow wymienionych dwch domen dla wielu receptorw wicych hormony polipeptydo-we, W celu uzyskania zmiany siy wizania
hormonu do receptora oraz aktywnoci biologicznej hormonu dokonano syntezy jego analogw rnicych si od natywnego hormonu okrelonymi podstawnikami aminokwasowy-mi. Receptory hormonw steroidowych maj wiele domen czynnociowych; jedna z nich wie si z hormonem, druga z okrelonym obszarem acucha DNA, trzecia pobudza (lub te hamuje) proces transkrypcji genu, za czwarta moe okrela powinowactwa (high affmity binding) do DNA. Podwjna funkcja receptora, tj, zdolno wizania hormonu i inicjacja okrelonej czynnoci rodkom orkowej ley u podstawy tzw. sprzenia receptorowo-efektorowego (receptor--effector coupling) stanowicego pierwszy etap amplifikacji odpowiedzi hormonalnej. Ta cecha odrnia receptor komrki docelowej od biaek nonikowych osocza, ktre wprawdzie wi hormony, lecz nie indukuj okrelonego sygnau hormonalnego. Receptory i biaka transportowe (nonikowe) wykazuj dziaania wzajemnie si uzupeniajce Wane jest odrnienie wizania hormonw przez receptory od czenia si hormonw z rnymi biakami transportowymi (nonikowymi).
Tabela 44-1. Porwnanie receptorw hormonal nych z biakami nonikowymi hormonw w osoczu krwi Biaka noni Cecha Stenie Receptory
kowa hormonw w osoczu
Bardzo mae Bardzo due (tysice na (miliardy/fil) jedn komrk)
Tabela 44-1 przedstawia kilka cech tych dwch rodzajw biaek. Na jedn komrk przypada tysice czsteczek receptorowych wicych okrelony iigand (hormon), wykazujcych wysokie powinowactwo i wysok swoisto. Receptory mog rozpozna i wyselekcjonowa swoiste czsteczki przy gradiencie stenia rzdu 10* lub 107. Ponadto wizanie hormonu przez receptory jest wysycalne przy fizjologicznych steniach tego hormonu. Inter akcje zachodzce midzy hormonem a receptorem s zalene od siy jonowej, temperatury i pH roztworu. Te ostatnie cechy s rne, cho charakterystyczne dla poszczeglnych hormonw i ich receptorw. U podstawy wizania hormonu przez swoisty receptor le mechanizmy hydrofobowe i elektrostatyczne, przez co wizanie to jest szybko odwracalne, z wyjtkiem okrelonych przypadkw. Krce we krwi hydrofobowe steroidy i hormony tarczycy zwizane s ze swoistymi biakami transportowymi (nonikowymi). Ilo biaek nonikowych jest znacznie wiksza ni liczba rdkomrkowych biaek receptorowych dla tych hormonw; odznaczaj si one jednak sabszym powinowactwem i mniejsz swoistoci w porwnaniu do receptorw. Biaka nonikowe, wic okrelony hormon, stanowi rodzaj puli rezerwowej dla tego hormonu; kompleks biako nonikowe-hormon nie ulega bowiem ani metabolizacji, ani te wydaleniu z ustroju. Tylko frakcja hormonu wolnego, nie zwizanego z biakami nonikowymi, wykazuje aktywno biologiczn. Hormony pept ydowe i biakowe nie maj biaek nonikowych w osoczu krwi, przez co wykazuj znacznie krtszy okres ptrwania (wynoszcy sekundy lub mi nuty) ni hormony steroidowe (ktrych okres ptrwania wynosi kilka godzin). Zatezno midzy liczb receptorw zwizanych z hormonem a jego dziaaniem biologicznym jest zoona Jak wida na ryc. 44-3A, stenia hormonu wykazuj czsto proporcjonalno do nasilenia swoistego dziaania biologicznego. Dotyczy to gwnie hormonw steroidowych, ale rwnie niektrych hormon w peptydowych. Jest to zjawisko zaskakujce, uwzgldniajc liczne etapy dzielce proces wizania hormonu przez receptor od wystpienia zoonej reakcji na ten hormon, na ktr si skadaj m.in. indukcja enzymatyczna, rozpad komrki i transport ami-
Powinowactwo Bardzo due mol/l) Swoisto wizania Wysycenie przy steniach fizjologicznych Odwraca no wizania Zdolno wywoanta sygnau dla komrki Dua
Tak
Mae mol/l) Maa

Nie
Tak Tak
Tak
Nie
580 / ROZDZf A 44 A. Nie ma receptor w zapasowych IM -, 50= 100-, Wizanie
B. S receptory zapasowe
50-
-log stenia hormonu
ir
6 _
------- Efekn ......... Efekt2
. ---- 1 ------- r
10 9 8 7 log stenia hormonu
Ryc. 44-3. Porwnanie wizania hormo nu z jego dziaaniem bioiogiczym w nieobecnoci (A) lub obecnoci (B, efekt 2) receptorw zapasowych. W niektrych przypadkach efekt biologiczny jest cile sprzo ny z wizaniem hormonu przez okrelon tkank, podczas gdy w innych przypadkach efekt biologiczny wykazuje zjawisko zapasowych receptorw" (porwnaj efekt 1 z efektem 2 na rycinie B).
nokwasw. W innych przypadkach stwierdza si znamienna dysocjacje midzy liczb receptorw zajtych przez hormon a biologicznymi skutkami jego dziaania, rj. obserwuje si maksymalny efekt biologiczny hormonu wtedy, kiedy tylko maty odsetek receptorw jest zwizanych przez hormon (p. ryc. 44-3B, efekt 2). Receptory bezporednio nie uczestniczce w reakcji biologicznej na hormon okrelane s jako receptory zapasowe (spare receptors). Obecno receptorw zapasowych obserwuje si w reakcjach wywoanych przez wiele hormonw peptydowych. Sdzi si, e te receptory zwikszaj wraliwo komrki docelowej na mae stenia hormonu oraz, e stanowi rezerwuar receptorw. Koncepcja wystpowania receptorw zapasowych ma charakter operacyjny i zaley od tego, ktry aspekt odpowiedzi hormonalnej jest badany oraz jaka tkanka w niej bierze udzia. Przykadem tego jest wystpowanie wspaniaej zgodnoci zachodzcej midzy wizaniem LH i wytwarzaniem cAMP przez komrki ziarniste pcherzykw jajnika (przy aktywacji cyklazy adenylanowej przez jakikolwiek hormon zwykle nie stwierdza si receptorw zapasowych); natomiast steroido-geneza, ktra jest cAMP -zalena, zachodzi w tych komrkach wtedy, kiedy mniej ni 1 % wszystkich receptorw jest zwizanych przez hormon (porwnaj efekt !*z efektem 2 przedstawionym na ryc. 44-3B). Transkrypcja genu
dla karboksykinazy fosfoenolopirogroniano-wej ulega supresji, jeli liczba receptorw insulinowych na hepatocytach zwizanych z tym hormonem jest znacznie mniejsza ni 1%, podczas gdy w tymocytach stwierdza si wysoce znamienn korelacj midzy liczb receptorw zwizanych przez insulin a nasileniem transportu aminokwasw. Innym przykadem dyso-cjacji zachodzcej midzy liczb zwizanych przez hormon receptorw a efektami biologicznymi danego hormonu jest wpyw amin kate-cholowych na skurcz mini, lipoliz i transport jonw. Przyjmuje si, e wymienione reakcje kocowe odzwierciedlaj dziaanie kaskadowe lubuwielokrorniajce tych hormonw. Opisano wystpowanie zmiennej czuoci poszczeglnych reakcji na hormon w obrbie jednej i tej samej komrki. Przy wzrastajcej liczbie zwizanych przez hormon receptorw insulinowych adypocytw w pierwszej kolejnoci wzrasta lipogeneza, a w nastpnej utlenianie glukozy, transport aminokwasw i synteza biaek. Liczba receptorw hormonalnych komrki moe si zwiksza (up-reguation) lub zmniejsza (down - reguation) Liczb receptorw na powierzchni komrki lub wystpujcych w jej obrbie cechuje stan dynamiczny; podlega on regulacjom fizjologicznym i moe si zmienia w stanach chorobo -
wych lub pod wpywem zabiegw ieczniczych. Najwicej wiadomo o receptorach bony plaz ma tycznej. W bonie komrkowej regulacji podlega zarwno liczba receptorw hormonalnych, jak i powinowactwo hormonw do tych receptorw. Zmiany te mo g by szybkie i w znamiennym stopniu wpynjj na nasilenie reakcji komrki na dziaanie hormonu. Na przykad ekspozycja komrek na agonistw (3-adrenergicznych przez minuty lub godziny sprawia, e stosowanie wikszego stenia ago-nisty nie tylko nie nasila aktywacji cyklazy adenylanowej, lecz nawet moe by przyczyn cakowitej utraty jej aktywnoci biologicznej. Ten proces odczulania (desensytyzacji) komrki na hormon odbywa si dwoma mechanizmami. Pierwszy polega na utracie receptorw z bony plazma ty cznej. To zmniejszanie si liczby receptorw (down regulation) polega na rdkomr -kowej sekwestracji receptorw, tj. na oddzieleniu ich od innych skadowych ukadu odpowiedzi hormonalnej, w tym rwnie na oddzieleniu podjednostki regulacyjnej cyklazy adenylanowej od jej podjednostki katalitycznej (p. rozdz. 45). Usunicie agonisty ze rodowiska powoduje ponowne pojawienie si receptorw na powierzchni komrki oraz przywraca wraliwo komrki na dany hormon. Drugi mecha-nizmt>dczulania na hormon polega na kowalencyjnej modyfikacji receptora poprzez fosforylaA. Nie ma receptorw zapasowych
cj. Ten zaleny qd cAMP proces nie zmienia liczby receptorw, ani te nie powoduje ich translokacji. Dowiadczenia nad rekonstytucja, receptora wykazay, e fosforylowany receptor nie jest zdolny aktywowa cyklaz, tak e dochodzi do rozkojarzenia funkcji wizania hormonu oraz procesu aktywacji komrki. Zjawisko fizjologicznej adaptacji komrek drog zmniejszania liczby receptorw (down regulation) obserwuje si midzy innymi po zadziaaniu insuliny, glukagonu, tyreoliberyny (TRH), hormonu wzrostu, LH, FSH i amin katecholo-wych. Kilka hormonw, takich jak angioten-syna II i prolaktyna, wykazuje odwrotny wpyw na liczb swoich receptorw, tj. hormony te zwikszaj liczb receptorw (zjawisko to okrela si jako up regulation). Taka zmiana liczby receptorw moe zachodzi w krtkim czasie (w cigu minut lub godzin) i najpewniej stanowi wany mechanizm regulacji odpowiedzi biologicznej. Sposb w jaki utrata receptorw wpywa na odpowied biologiczn indukowan hormonem, zaley od obecnoci lub nieobecnoci receptorw zapasowych. Rycina 44-4 przedstawia wpyw utraty Liczby receptorw do f wartoci normalnej na przebieg krzywej odzwierciedlajcej zaleno efektu biologicznego od stenia hormonu w obecnoci i nieobecnoci receptorw zapasowych. W nieobecnoci
B. S receptory zapasowe
r
10 log (stete hormonu)
r
S 8 7 log (slzenle hormon u) Prawidowa liczba receptorw - - tkrotne zmniejszenie liczby receptorw
Ryc. 44-4. Wpyw 5 - krotnego zmniejszenia liczby receptorw na efekt biologiczny uk adu nie majcego {A) i majcego (B) receptory zapasowe. ______________________________________
582 / ROZDZIA 44
receptorw zapasowych maksymalna odpowied na dziaanie hormonu wynosi 20% wartoci obserwowanej przy normalnej liczbie receptorw (cz A ryc. 44-4) (efekt odpowiada wartoci Vmax). W obecnoci receptorw zapasowych {cz B ryc. 44-4) uzyskuje si maksymalna reakcj, lecz przy steniu hormonu piciokrotnie wikszym od pierwotnego stenia skutecznego (efekt analogiczny do efektu Receptory s biakami Najwicej informacji uzyskano na temat receptora acetylocholi nowego, ktry atwo oczyci i ktry wystpuje we wzgldnie duych ilociach w narzdzie elektrycznym wgorza Torpedo caifomica. Receptor skada si z czterech pod-jednostek o konfiguracji a.%, p, y, 8. Dwie jednostki et wi acetylochohn. Uywajc techniki mutagenezy okrelonych regionw receptora udao si wykaza, ktry obszar pod-jednostki a uczestniczy w formowaniu przez-blonowego kanau jonowego, penicego gwn czynno receptora acetylocholinowego. Inne receptory wystpuj w bardzo maej liczbie, std te proces ich oczyszczania i charakteryzowania jest trudny. Jednak dziki technice rekombinacji DNA, istnieje dzisiaj moliwo uzyskania iloci receptorw wystarczajcej do bada. Ten fakt sprawi, e stay si one przedmiotem intensywnych studiw. I tak receptor insulinowy jest heterotetramerem (a2, p2), w ktrym podjednostki poczone s ze sob licznymi wizaniami dwusiarczkowymi. Pod-jednostka zewntrz bon owa a czy si z insulin, podczas gdy pedjednostka p1, sprzgajca zewntrzn i wewntrzn warstw bony, przekazuje sygna do komrki, najpewniej za porednictwem komponentu cytoplazmatycz-nego tego polipeptydu, bdcego kinaz tyrozy-now. Podobn struktur wykazuj receptory dla insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (lgF-1), nabonkowego czynnika wzrostowego (ECF) oraz lipoprotein o niskiej gstoci (LDL) (p. ryc. 52-12). Receptory dla innych hormonw polipeptydowych zostay sabiej scharakteryzowane. Przyjmuje si jednak, e i one skadaj sie z podstawowego komponentu biakowego, wraliwego na dziaanie rnych peptydaz i enzymw proteolitycznych. W wielu przypadkach proces wizania hormonu przez receptor wymaga obecnoci wiza dwusiarczkowych, fosfolipidu i komponentu wglowodanowego.
Receptory hormonw steroidowych s rwnie biakami. W ostatnich latach poznano funkcj tych czsteczek, za obecnie zaczynamy poznawa ich struktur. Dobrym przykadem jest receptor glukokortykoidowy (ryc. 49-6). Ma on kilka domen funkcyjnych: 1) domen wic hormon, zlokalizowan w C-korico-wym odcinku, 2) przylegajc do niej domen wic DNA, 3) obszar rozpoznajcy, pooony w N-kocowej czci czsteczki, niezbdny do wizania odcinka acucha DNA i zawierajcego wikszo domen antygenowych czsteczki oraz 4) jedn lub wicej domen aktywujcych lub hamujcych transkrypcj genu. Istnienie wymienionych domen funkcyjnych potwierdzono w badaniach receptorw syntetyzowanych metodami inynierii genetycznej za pomoc swoistego dla danego receptora cDNA. Wydaje si, e rne typy receptorw steroidowych maj tak sam ogln struktur (opisan wyej) i odznaczaj si znaczn homologi w zakresie sekwencji aminokwasowej w wyej opisanych domenach. Wystpuje rwnie godna uwagi homologi midzy wymienion klas receptorw a onkogenem \-erb A. Nieprawidowoci w strukturze receptorw hormonalnych uczestnicz w patogenezie rnych chorb Wyjanienie roli receptorw w dziaaniu hormonw byo punktem wyjcia do bada nad przedstawia 3 ogme grupy defektw receptorowych. W pierwszej przyczyn choroby s przeciwciaa skierowane przeciwko swoistemu receptorowi hormonalnemu. Przeciwciaa nalece do klasy IgG mog blokowa wizanie si hormonu ze swoim receptorem (tak sytuacj spotyka si w acanthosis nigricans przebiegajcej z insulin o opornoci oraz w astmie oskrzelowej), mog naladowa dziaanie waciwego hormonu (przykadem tego jest choroba Grave-sa-Basedowa) lub przyspiesza obrt metaboliczny receptora (na przykad w myasthenia gra-vis). W drugiej grupie nie stwierdza si wizania hormonu z receptorem. Nie jest jasne, czy przyczyn tego zjawiska jest brak odpowied nich receptorw, lub te receptor jest obecny, lecz wykazuje okrelony defekt. Trudnoci w tym zakresie wynikaj std, e wykrywanie wikszoci receptorw oparte jest na okrelaniu ich powinowactwa do hormonw.
rol nieprawidowoci w zakresie jego funkcji w patogenezie pewnych chorb. Tabela 44-2
CHARAKTERYSTYKA UKADW HORMONALNYCH / 583 Tabela 44-2. Choroby receptorowe ' Choroba Choroba Gravesa-Basedowa (nad-czynno tarczycy) Acanthosis nigricans z odpornoci na insulin Myasthenia gravis Dla TSH Dla insuliny Dla acetytocholiny Receptor Przyczyna choroby Przeciwciao pobudza receptor TSH Przeciwciao blokuje wizanie insuliny do receptora Przeciwciao nasila obrt metaboliczny receptora acety I oc hol i nowego Przeciwciao blokuje wizanie neurotransmitera do receptora Niedobr receptora Niedobr receptora Niedobr receptora i
>
Astma
Adrenergiczny
Moczwka prosta nerkowopo-c Dla ADH ho dna, wrodzona Zesp femtnizujcych jder Rzekoma niedoczynno przytar-czyc Krzywica typu II oporna na witamin D Otyo Cukrzyca typu II (insulinoniezale-na-NIDDM) Dla androgenw Dta PTH Dla kalcytriolu (1,25/OH/2D3) Dla insuliny Dla insuliny
Niedobr receptora Obnione wizanie przez receptor Obnione wizanie przez receptor hormonu hormonu
Trzecia grupa obejmuje choroby spowodowano-nieprawidow regulacj liczby i powinowactwa receptorw. Chorzy z otyoci lub chorzy na cukrzyce typu II i z otyoci czsto wykazuj objawy nietolerancji glukozy i oporno na insulin pomimo wystpowania podwyszonych ste tego hormonu w osoczu. Chorzy ci wykazuj mniejsz liczb receptorw insulinowych (indukowanych zjawiskiem down-regulation) w komrkach docelowych dla tego hormonu, tj. w adypocytach, hepatocy-tach i komrkach mini szkieletowych. W miar zmniejszania masy ciaa u chorych tych obserwuje si obnianie si stenia insuliny w osoczu krwi, wzrost liczby receptorw insulinowych w komrkach docelowych dla tego hormonu, popraw wraliwoci na insulin oraz zmniejszanie si nietolerancji wglowodanw. Nowsze badania w dziedzinie biologii molekularnej sugeruj, e nieprawidowoci w zakresie sprzenia zachodzcego midzy receptorem dla czynnika wzrostowego a reakcj komrki efektorowej mog by przyczyn niekontrolowanego wzrostu komrek nowotworowych (zoliwych). Przykady te s ilustracj wielu
chorb indukowanych nieprawidow funkcj receptora.
PIMIENNICTWO
Ginsberg BH: Synthesis and regulation of receptors for polypeptide honnones, Pages 5997 in: Bio-logicai Regulation and Dewlopment. Vol 3B, Yama-moto K (editor). Plenum Press, 1985. Granner DK, Lee F: The multiple endocrine neop-lasia syndromes. Chapter 76 in: Comprekensive Textbook of'Oncology. Moosa AR, Robson MC, Schimpff SC (editors). Williams & Wilkins, 1984. Mishina M et al: Expression of functional acetyl-choline receptor frotn cloned cDNAs. Natur 1984;307:604. Roth J, Taylor Sl: Receptors for peptide hormones: Alterations in disease of humans. Annu Rev Physiol 1982;44:639. Roth i et al: The evolutionary origins of hormones, neurotransmitters, and othcr ejttracellular messen-gers. N Eng! J Med 1982;306:523. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Motet ul ar mech ani sms of receptor desensitization using the p-adrenergic recepto r-coupled adenylate cyclase system as a model. Nautre 1985;317:124.
45
Dziaanie hormonw
Dsryl K. Granner, MD
WPROWADZENIE
Dziaanie hormonu na poziomie komrkowym zaczyna si od poczenia go ze swoistym receptorem. Klasyfikacja hormonw moe by oparta na lokalizacji receptorw dla tych hormonw lub te na tym, jaki rodzaj sygnau lub wtrnego przekanika poredniczy w dziaaniu hormonu na poziomie komrki. Dotychczas poznano dokadnie liczne rodzaje wtrnego przekanika, lecz dla wielu hormonw nie zdefiniowano jeszcze rodkom orkowego sygnau. Znaczne s postpy w zakresie wyjanienia mechanizmu dziaania hormonw w obrbie komrki, szczeglnie w odniesieniu do wpywu tych substancji na ekspresj swoistych genw.
KLASYFIKACJA HORMONW MOE BY OPARTA NA RNYCH PODSTAWACH

Hormony mona sklasyfikowa na podstawie ich struktury chemicznej lub rozpuszczalnoci w rnych rodowiskach, lokalizacji receptora hormonalnego lub rodzaju sygnau poredniczcego dziaanie hormonu w obrbie komrki. Tabela 45-1 przedstawia klasyfikacj hormonw opart na ostatnich dwch cechach, za tab. 45-2 oglne cechy kadej z dwch grup wymienionych w pierwszej tabeli. Hormony grupy I maj waciwoci lipofilne i s, z wyjtkiem Ty i T4, pochodnymi cholesterolu. Po wydzieleniu do krwi, zostaj one zwizane przez biaka nonikowe (transportowe), przez co odpada problem ich rozpuszczalnoci i wydua si ich okres ptrwania w osoczu krwi. Czsteczki tych hormonw, nie zwizanych z biakami nonikowymi, atwo prze chodz przez bony plazmatyczne wszystkich komrek, czc si po drodze z receptorami cytoplazmatycznymi lub jdrowymi w komrkach docelowych. Przyjmuje si, e kompleks z!oony z hormonu i jego receptora spenia rol rdkomr-kowego przekanika dla tej grupy hormonw. Druga dua grupa skada si z hormonw rozpuszczalnych w wodzie wicych si z receptorami bony plazma tycz nej komrki docelowej. Hormony, wice si z bon plazmatycz-n komrek, komunikuj si z rdkomrko-wymi procesami metabolicznymi za porednictwem czsteczek, okrelanych jako drogie przekaniki (second messenger sam hormon okrelany jest jako pierwszy przekanik). Te ostatnie powstaj w wyniku interakcji hormonu z receptorem. Koncepcja drugiego przekanika
Racjonalna diagnostyka i terapia okrelonej choroby opieraj si na znajomoci jej patofizjologii oraz moliwoci ilociowej analizy tej ostatniej. Choroby ukadu wewntrzwydzielni-czego, najczciej spowodowane nadmiernym lub niedostatecznym wytwarzaniem okrelonego hormonu, s bardzo dobrymi przykadami zastosowania wynikw bada nauk podstawo wych w medycynie klinicznej. Znajc oglne mechanizmy dziaania hormonw oraz rozu miejc fizjologiczne i biochemiczne skutki dziaania kadego z nich, mona rozpozna chorob endokrynn, bdc nastpstwem zaburz onej rwnowagi hormonalnej oraz skutecznie j le czy.
DZIAANIE HORMONW / 585 Tabela 45-1. Klasyfikacja hormonw oparta na mechanizmie ich dziaarjia Grupa I. Hormony wice si z recep torami rdfcomrkowymi Estrogeny Kaicytriol [1-25(OH),D3] Glukokortykoidy Androgeny Minera lokortykoidy Hormony tarczycy {Ta i Tt) Progestyny Grupa II. Hormony wice si z receptorami powierzchni komrkowej A. Drugim przekanikiem jest cAMP Parathormon Hormon adrenokortykotropowy {ACTH) Opioidy Angiotensyna II Hormon antydiuretyczny (ADH) Acetyl ochot i na Glukagon Folitropina (FSH) Kortykoliberyna (CRH) Gonadotropina kosmwkowa (hCG) Kalcytonina Lipotropina (LPH) Katecholaminy a-adrenergiczne Lutropina (LH) Somatostatyna Melanotropina (MSH) Katecholaminy p-adrenergiczne Tyreotropina (TSH) B. Drugim przekanikiem jest cGMP Przedsionkowy czynnik natriuretyczny (ANF) C. Drugim przekanikiem s jon wapniowy lub Acetylochoiina (receptor rnuskarynowy) (i) fosfatydyloinozytydy: Oksytocyna Katecholaminy c^-adrenergiczne Gonadoliberyna Cholecystokinina Angiotensyna II G astry na Substancja P Tyreoliberyna (TRH) Wazopresyna D. Przekanik rd komrko wy jest nieznany Nerwowy czynnik wzrostowy (NGP) Somatomammotropina kosmwkowa (CS) Naskrkowy czynnik wzrostowy (EGF) Hormon wzrostu (GH) Insulina Fibrobiastyczny czynnik wzrostowy (FGF) Czynniki wzrostowe insulinopodobne (IGF-I, IGF-II) Prolaktyna Czynnik wzrostowy pochodzenia pytkowego (PDGF)
pochodzi z obserwacji Sutherlanda, ktry wykaza, e epinefryna, wic si z bon plaz-matyczn erytrocytw gobia, zwiksza stenie rdkomrkowcgo eAMP. W serii kolej nych dowiadcze wykazano, e cAMP bierze udzia w dziaaniu biologicznym licznych hormonw. Hormony, dla ktrych udowodniono w sposb jednoznaczny taki mechanizm dziaania, zestawione s w grupie HA tab. 45-1. Jak dotychczas tylko dla przedsionkowego hormonu natriuretycznego (ANF) drugim przeka nikiem jest cGMP. Zapewne do tej grupy (grupa IIB tab. 45-1) docz i inne hormony. Okazao si, e dta wiehi hormonw, dla ktrych za drugi przekanik uwaano cAMP, w rzeczywistoci s nimi jony wapniowe lub (i) metabolity zoonych fosfoinozytydw. Hormony te zestawiono w pkt. IIC tab. 45-1. Dotychczas nie zidentyfikowano drugiego przekanika dla grupy
IID, tj. dla bardzo ciekawej klasy hormonw. Nie bdzie zaskoczeniem, jeli si okae, e dziaanie tej grupy hormonw zaley od wielu mediatorw lub rnych mechanizmw. Kilka hormonw mona zaliczy do wicej ni jednej grupy. Podana klasyfikacja hormonw zapewne ulegnie zmianie w miar uzyskania nowych informacji. HORM ONY GRUPY I M AJ RECEPTORY ZLOKALIZOWANE SRDKOMRKOWO ORAZ WPYWAJ NA EKSPRESJ GENW Oglne zasady dziaania hormonw tej grupy przedstawia ryc. 45-1. Te lipofilne czsteczki przenikaj przez bony plazmatyczne wszystkich k omrek, wi si natomiast tylko ze
586 / ROZDZIA 45
8LONA KOMRKOWA
JDRO KOMRKOWE
A +
Receptor U Aktywacja' Kompleks hormon receptor Sekwencja odpowiedzi hormonalnej (HRE)
DNA (chromatyna)
mHNA Translacja Swoiste biako Odpowlei metaboliczna
Ryc. 45-1. Hormon steroidowy lub tarczycy wie si ze rdkomrkowym receptorem wywotujc zmian konformacyjn. Nastpnie kompleks ten wie si do swoistego fragmentu nici DNA, tj. do sekwencji odpowiedzi hormonalnej (hormone response element); w wyniku tej interakcji dochodzi do aktywacji lub supresji ograniczonej liczby genw.
swoistym receptorem wysokiego powinowactwa w komrkach docelowych. Kompleks zoony z hormonu i receptora ulega nastpnie aktywacji" (zalenej od temperatury i siy jonowej rodowiska), w wyniku ktrej zmienia si jego wielko, konformacja oraz adunek powierzchniowy. W wyniku takich zmian kompleks staje si zdolny do wizania si z chroma-tyn. Dla zrozumienia istoty sprawy nie ma wikszego znaczenia, czy proces wizania hormonu z receptorem i aktywacja kompleksu zachodz w cytoplazmie czy w jdrze komrkowym (problem ten jest przedmiotem dyskusji). Kompleks hormon-receptor wie si ze swoistym fragmentem DNA okrelanym jako ,,element (lub sekwencja) odpowiedzi hormonalnej" {hormone response element"), aktywujc lub inaktywujc okrelone r geny. Wpywajc w sposb selektywny na transkrypcj okrelonego genu i produkcje odpowiadajcego mu
mRNA, zmienia stenia swoistych biaek oraz procesy metaboliczne. Skutek biologiczny kadego hormonu jest wysoce swoisty. Oglnie biorc hormony zmieniaj mniej ni 1% biaek i mRNA w komrce docelowej. Przedmiotem dalszej dyskusji bdzie gwnie dziaanie steroidw i hormonw tarczycy na poziomie jdra komrkowego, poniewa zostao ono zupenie dobrze poznane. Opisano rwnie bezporedni wpyw wymienionych hormonw na rne or-ganella subkomrkowe i bony. Przewaaj dowody, e hormony steroidowe wpywaj gwnie na transkrypcj genw, chocia mog one, podobnie jak liczne hormony innych grup (o-mawiane niej), oddziaywa na dowolny etap" szlaku informacyjnego przedstawionego na ryc. 45-2. Chocia biochemia procesu transkrypcji genu w komrkach u ssakw nie zostaa jeszcze dobrze poznana, mona przyj oglny model wymaga strukturalnych, niezbdnych
DZIA A NIE HORM ONW / 587 T abela 45-2. Cechy oglne poszczeglnych kas ho rmo nw
GEN Transkrypcja TRANSKRYPT r Degradacja
Grupa 1
Rodzaj hormo- Hormony steroinu dowe, jodotyro-
Grupa II
Homnony polipeptydowe, biakowe lub glikoproteinowe, aminy katechdowe Hydrofilne
niny, kalcytriol
RozpuszczalLipofine no Zwizanezbia - Tak ikami przeno nikowymi
JDRO KOMRKOWE Procesy modyfikujce Degradacja mRNA
Nie
Transport aktywny z nieaktywny mRNA
Osoczowy okres Dugi (godziny do Krtki (minuty) ptrwanta dni) Lokalizacja re- rd kom orkowa W bo nie plaz ceptora Charakter dru- Kompleks recepgiego przeka - tor-hormon nika matycznej !+ cAMP, Ca , metabolity zo onych fosfoinozytydw i inne
CYTO PLAZMA
Translacja BIAKO
Ryc. 45-2. Szlak informacyjny". Hormo ny mog oddziaywa na kady z wymienio nych etapw szlaku informacyjnego.
Sekwencja odpowiedz hormonalnej (HRE)
Fragment pro motorowy (PE)

\
Gen
i j ___________ |/ / / / / / /
5' -------5 1
O 1
-------
f-
-. '. ' .*"
1 Miejsce Inicjacji transkrypcji __ I L__ i .

Miejsce (erminacii transkrypcji Regulatorowy fragment nici DNA Ryc.
Strukturalny fragment nici DNA
45-3. Wymagania strukturalne niezbdne dla procesu hormonalnej regulacji transkrypcji genu.
dia regulacji transkrypcji genu przez hormon steroidowy lub hormony tarczycy {ryc. 45-3). Geny te musz si znajdowa w obszarach otwartej", trans kry pcyj nie aktywnej chroma-tyny oznaczonej na ryc. 45-1 jako wystajca baka podatnej na trawice dziaanie DNA-zy. Dotychczas przebadane geny wykazuj przynajmniej dwa oddzielne odcinki regulatorowe (obszary kontrolujce"), zlokalizowane w sekwencji DNA przylegajcej bezporednio do koca 5' regionu inicjacji transkrypcji (ryc. 45-3). Pierwszy z nich, tzw. element promotoro-wy (PE promotor element) ma charakter nieswoisty (generyczny), gdy wystpuje w ta-
kiej samej lub innej postaci we wszystkich genach. Ten element okrela miejsce wizania si poliraerazy RNA II do DNA i tym samym dokadno inicjacji transkrypcji (p. rozdz. 41). Drugim fragmentem, poznanym w wielu genach regulowanych przez hormony steroidowe jest tzw. sekwencja odpowiedzi hormonalnej (HRE hormone response element). Jest ona umiejscowiona nieco dalej od k oca 5' ni odcinek promotorowy (PE) i moe si skada z kilku oddzielnych fragmentw. HRE najpewniej moduluje czsto inicjacji transkrypcji i jest mniej zaleny od pooenia i orientacji przestrzennej. Pod tym wzgldem jest podobny
588 / ROZDZIA 45 do fragmentw wzmacniajcych transkrypcje Tabela 45-3. Sekwencje DNA dla kilku HRE
(enhancer elements) wystpujcych w innych genach (p. rozdz. 41). Oglnie mwic HRE zlokalizowany jest w pamie DNA przed fragmentem inicjacji transkrypcji i oddzielony od tego ostatniego przez kilkaset nukleotydw. Dokadne pooenie HRE jest rne dla po szczeglnych genw. W niektrych przypadkach zlokalizowany jest w obrbie samego genu. Geny kontrolowane przez kilka hormon w maj odpowiadajc im liczbowo HRE. Rwnie transkrypcja indukowana hormonami pep-ty do wy mi odbywa si poprzez odpowiedni HRE, chocia pocztek inicjacji tego procesu rni sie od wyej opisanego dla hormonw steroidowych, np. wiele hormonw, dla ktrych drugim przekanikiem jest cAMP, oddziauje na transkrypcj. W tych przypadkach czynnikiem przenoszcym sygna (podobnym do kompleksu receptorhormon steroidowy lub hormon tarczycy) jest specjalne biako, okrelane jako biako wice sekwencj HRE powstae pod wpywem cAMP" (cAMP response element binding protein) (CREB). W tabeli 45-3 podano sekwencje konsensus DNA dla kilku HRE. Fragment HRE odznacza si tym, e wie si lepiej z kompleksem hormonreceptor ni otaczajce go fragmenty nici DNA lub DNA pochodzce z innego rda. W wyej opisanych przypadkach potwierdzono wystpowanie tego rodzaju swoistego wizania. HRE musi rwnie inicjowa odpowied na dziaanie hormonu. Domniemana sekwencja regulatorowego DNA moe by sprzona z genami reporte rowymi dla realizacji takiego dziaania. Normalnie te geny fuzyjne (fusion genes) zawieraj geny repor-terowe, na ktre hormony zwykle nie maj wpywu. Czsto geny te nie ulegaj normalnej ekspresji w badanych tkankach. Wrd po wszechnie stosowanych gen w reporterowych naley wymieni geny dla: globiny, kinazy tymi-dynowej, bakteryjnej acetylotransferazy chlo-ramfenikolowej i lucyferazy. Jeeli po transfek-cji genu fuzyjnego do komrki docelowej hormon wykazuje dziaanie regulujce transkrypcj genu reporterowego, wwczas mona twierdzi, e HRE zosta zdefiniowany. Posugujc si tak technik mona okreli wpyw zmian pooenia, orientacji i podstawienia zasad w acuchu DNA na dziaanie HRE. Przedmiotem intensywnych bada jest mechanizm wpywu interakcji kompleksu hormon-receptor z HRE na proces transkrypcji. Inicjacja transkryptu jest prawdopodobnym mechanizmem kontroli
Hormon/ Elektor
Progestyny M i neraokorty ko idy
HRE
Sekwencja DNA*
GGTACAnnnTGTTCf _ " _ ". _ " AGGTCAnnnTGTCCT GATCAnnnnnTGACC'
Glukokortykoidy GRE
PRE MRE ARE ERE TRE
Androgeny Estrogeny Hormony tarczycy
Kwas retinolowy RRE cAMP CRE TGAC GTCA

1
* Litery oznaczaj trifosorany nukleotydw, n" oznacza, e w tym pooeniu moe by uyty ktrykolwiek z czterech nukteotydw. Strzaki skierowane w przeciwnych kierunkach wskazuj na wystpowanie nieco niedoskonaej, odwrconej sekwencji palindromowej w wielu HRE; w niektrych przypadkach te ostatnie okrela sie jako sekwencj poowicznie wic" (haIf-binding sites"), poniewa kady z nich wie jeden mono mer receptora. HRE oznaczone jako GRE, PRE, MRE i ARE wykazuj tak sam sekwencj zasad w nici DNA, Swoisto moe by uwarunkowana rd kom orkowym steniem receptora hormonalnego lub sekwencj DNA flankujc nie wystpu jc w sekwencji konsensus. Druga grupa HRE dotyczy hormonw tarczycy, estrogenw i kwasu retinotowego. Te HRE s bardzo do siebie podobne rnic si fragmentem dzielcym powki palin-dromowe. Wszystkie te H R t maj sekwencj konsensus, z wyjtkiem HRE dla hormonw tarczycy. Jego sekwencja odpowiada TRE dla genu hormonu wzrostu. Receptor kwasu retinolowego moe wiza si z tak sam sekwencj jak receptor hormonw tarczycy. Hormony peptydowe, dziaajce 2a porednictwem zmiany stenia rdkomr-kowegocAMP, oddziaywuj na proces transkrypcji za porednictwem CRE.
tego procesu, chocia moliwy jest rwnie jego wpyw na proces elongacji i terminacji. Przypuszcza sie, e istniej sekwencje DNA kontrolujce proces transkrypcji, pooone w pewnym oddaleniu od koca 5* sekwencji sygnaowej lub w d za kocem 3*, albo w obrbie genu, albo te poza nim. Mog rwnie wystpowa mechanizmy regulacji typu trans (tj. przez inne chromosomy).
DZIAANIE HORMONW / 589
HORM ONY GRUPY (I (HORMONY PEPTYDOWE) MAJ RECEPTORY UMIEJSCOWIONE W BONIE PLAZMATYCZNEJ I DZIAAJ ZA POREDNICTWEM PRZEKANIKW RDKOMRKOWYCH Najwiksza liczba hormon w: a) jest rozpuszczalna w wodzie, b) nie wie si z biakami nonikowymi (przez co wykazuj krtki po-kres trwania w osoczu) oraz c) zapocztkowuje odpowied hormonaln wic si z receptorem zlokalizowanym w bonie plazmatycznej (tab. 45-1 i 45-2). W mechanizmie dziaania tych hormonw bior udzia rdkomrkowe przekaniki. Wiee hormonw dziaa za porednictwem cAMP jako drugiego przekanika cAMP (cykliczny AMP, kwas 3', 5'-adenylo-wy p. str. 215) jest wszdobylskim nuk-leotydem po wstaym z ATP pod wpywem dziaania cyklazy adenylanowej. Odgrywa on decydujc rol w dziaaniu licznych hormonw. Pod wpywem tych ostatnich (tab. 45-4) rdkomrkowe stenie cAMP zwiksza si tub zmniejsza, przy czym efekt ten moe by rny w rnych tkankach. I tak epinefryna powoduje duy wzrost stenia cAMP w mi niach szkieletowych, natomiast wzgldnie mae zmiany stenia tego nukleotydu w wtrobie.
Tabela 45-4. Subklasyfikacja hormonw grupy 1I.A (p. tab. 45-1) Hormony pobudza- Hormony hamujce jce oykiaz adeny- cyklaz adenylanolanow (H s) w (Hj) ACTH
ADH
Odwrotny wpyw na stenie cAMP wykazuje glukagon (wywoujc znaczny wzrost jego stenia w wtrobie za may wzrost w miniach szkieletowych). Tkanki reagujce na kilka hormonw tej samej grupy posiadaj niepowtarzalne receptory sprzone zjedna i t sam czsteczk cyklazy adenylanowej. Najlepszym tego przykadem jest adypocyt, w ktrym dochodzi do aktywacji cyklazy adenylanowej i wzrostu stenia cAMP pod wpywem takich hormonw jak epinefryna. ACTH, TSH, glukagon, MSH iwazopresyna (ADH). Maksymalne efekty dziaania kilku hormonw dziaajcych rwnoczenie na komrk docelow nie maj charakteru addycyjnego. Ponadto dziaania ni szczce jeden rodzaj receptora nie maj wpywu na odpowied komrki indukowan innymi hormonami. tego ukadu, wystpujcego w komrkach ssak w, przedstawia ryc. 45-4. Interakcja hormonu ze swoim receptorem jest przyczyn aktywacji lub inaktywacji cyklazy adenylanowej. W procesie tym porednicz przynajmniej dwa biaka regulatorowe GTP -zalene oznaczone jako Gs (biako pobudzajce) i Gi (biako hamujce). Kade z tych biaek skada si z trzech podjednostek a, p i y. Cyklaza adenylanowa, umiejscowiona na wewntrznej powierzchni bony plazmatycznej, katalizuje powstawanie cAMP z ATP w obecnoci jonw magnezowych (p. ryc. 34-14). To co pierwotni e uwaano za jedno biako z dwiema domenami funkcyjnymi w rzeczywistoci jest nadzwyczaj zoonym ukadem. W cigu ostatnich 15 lat dziki licznym badaniom ustalono biochemiczn niepowtarzalno receptora hormonalnego oraz GTP-zaJene domeny regulatorowe i katalityczne kompleksu cyklazy adenylanowej przedstawionej na ryc. 45-4. Przedstawiony na rycinie model wyjania, w jaki sposb rne hormony peptydowe mog pobudza (s) lub hamowa (i) wytwarzanie cAMP (tab. 45-4). Dwa rwnolege ukady, jeden pobudzajcy (s) i jeden hamujcy (i) umiejscowione s na pojedynczej czsteczce katalitycznej (c). Kady z nich skada si z receptora R s lub Rj oraz z kompleksu regulatorowego Gs i Gi. Biaka regulatorowe Gs i Gj s trimerami z podjednostek a, p i y. Podjednostki p i y biaka Gs wydaj si by identyczne z wystpujcymi w biaku G;. Podjednostka a biaka Gs (okrelana jako a s) wykazuje mas czsteczkow rwn 45 000 i r-
Ukad cyklazy adenylanowej. Skadowe
Substancje j3-adrenergiczne Kalcytonina CRH (kortykoliberyna) FSH (folitropina) Gtukagon bCG (gonadorropina kos mwko wa, ludzka) LH (lutropina) LPH (lipotropirta) MSH (melanotropina) PTH (parathormon) TSH (tyreotropina)
Acetylochoiina Substancje ctj-adrenergiczne Angiotensyna II Opioidy Somatostatyna
590 / ROZDZIA 45
CYTOPU\Z MA ATP cAMP
Ryc. 45-4. Sygna indukowany przez kompleks hormon-receptor przekazywany jest za porednictwem kompleksu biaka regulatorowego Gs (pobudzajcego) lub Gj (hamujcego) na ukad cyklazy adenylano-wej (C), przez co dochodzi do stymulacji (s) lub hamowania (i) produkcji cAMPzATP. (Wedug: Gilman A, G.-. G proteins aoddual control of adenylatecyclase. Celi 1984r36,577. Copyright the Massachusetts Institute of Technology, za zezwoleniem).
ni si od podjednostki a biaka G, (okrelanego jako oij) o masie czsteczkowej 41 000. Poczenie si hormonu z Rs lub Ri indukuje aktywacj biaka G, wyraajc si wizaniem GTP do podjednostki x(proceg Jen jest zaleny od jonw Mg2+ ) oraz od szczepieniem podjednostek P i y od podjednostki a zgodnie z rwnaniem
GTP PY H a-GTP + Py GTP-aza
kompleksu Oj-GDP. Reaktywacja podjednostki Oj odbywa si na drodze wymiany GDP na GTP.

Toksyna krztuca aktywuje cyklaz adeny-lanow w sposb nieodwracalny poprzez ADP rybozyiacj podjednostki aif przez co uniemo liwia aktywacje tej ostatniej. Fluorek sodu, bdcy innym nieodwracalnym
Podjednostka Og posiada wewntrzn aktywno GTP-azow, za jej aktywna posta cts--GTP ulega inaktywacji przez hydroliz GTP do GDP. Z kolei odnowieniu ulega trimeryczna
posta kompleksu Gs. Toksyna cholery, znana jako nieodwracalny aktywator cyklazy, powoduje ADP rybozylacje podjednostki os przez co inaktywacji ulega CTP-aza, za podjednostka ots zachowuje swoj posta aktywn. Podjednostka
ott take wykazuje aktywno GTP-azow, jednake GDP nie odszczepia si swobodnie od
aktywatorem cyklazy, przypuszczalnie dziaa na podjednost-k ots lub a*, poniewa wpywa w sposb podobny na kompleksy regulatorowe Gs i Q. Nie okrelono dotychczas waciwej roli wymienionych podjednostek ot, p1 i y. Zbadano dwie moliwoci. Podjednostki as i a-, w sposb niekompetycyjny reaguj z cyklaz adenylano-w (C), wywoujc przeciwne efekty. Skutek netto byby zaleny od stosunku aktywnej postaci as do aktywnej postaci OL,. Niestety aktywna posta a, wykazuje sabe dziaanie hamujce na C w ukadach izolowanych. Std bardziej prawdopodobne wydaje si, e podjednostka P kompleksu Gj hamuje podjednos tk a s . W tym modelu podjednostka <* wic podjednostk (J, speniaby rol antyinhibitora cyklazy
adenylanowej t jako taka nie wykazaaby adnego bezporedniego dziaania. Wiele skadowych ukadu cyklazy zostao ju oczyszczonych, w tym rwnie jej podjednostka katalityczna. Obecnie nie ulega ju wtpliwoci, e istnieje cala rodzina biaek G. Transducyna, bdca biakiem sprzgajcym impuls wietlny z fotoaktywacj w obrbie siatkwki, jest podobna do biaka G cyklazy adenylanowej. Takie samo podobiestwo wykazuj produkty on-kogenw ras. Niepowtarzalne biako, okrelane jako Go, wyizolowane zostao z tkanki mzgowej. Inne, sabiej scharakteryzowane biaka tej rodziny, wydaj si odgrywa rol w przez-bonowym transporcie wapnia i potasu oraz w przemianie fosfoinozytydw. Znaczenie tych skadnikw podkrela niej opisane dowiadczenie przyrody". Rzekoma iiiedoczynno przytarczyc jest zespoem chorobowym charakteryzujcym si hipokalcemi i hiperfosfatemi, tj. gwnymi objawami niedo-czynnoci przytarczyc oraz innymi wrodzonymi defektami. Osoby dotknite tym zespoem nie wykazuj jednak upoledzonej czynnoci przytarczyc. Wydzielaj one due iloci biologicznie aktywnego PTH. Niektrzy z tych chorych wykazuj jednak oporno narzdu docelowego na PTH o charakterze defektu porecep-torowego. Chorzy ci wykazuj czciowy niedobr biaka G (prawdopodobnie tylko niedobr podjednostki as), przez co dochodzi do niewystpowania sprzenia pomidzy wizaniem PTH z receptorem a pobudzeniem cyklazy adenylanowej. U innych chorych PTH indukuje powstawanie cAMP, natomiast brak jest odpowiedzi na ten drugi sygna w obrbie komrki. Std nie jest zaskoczeniem, e chorzy z rzekom niedoczynnoci przytarczyc czsto wykazuj rwnie upoledzon reakcj na inne hormony, takie jak TSH, glukagon i zwizki p-adrenergiczne (dla ktrych cAMP jest drugim przekanikiem). Kinaza biaek. W komrkach prokariotyc2-nych cAMP wie si ze swoistym biakiem okrelanym jako kata bo liczne biako regulatorowe (catabolite regulatory protein CRP). Biako to wie si bezporednio z DNA i wpywa na ekspresj genw. Analogia z opisanym wyej mechanizmem dziaania steroidw jest oczywista. W komrkach eukariotycznych cAMP wie si z kinaz biaek, bdc czsteczk heterotetrameryczn, zoon z dwch podjednostek regulatorowych (R) i dwch pod-jednostek katalitycznych (C).
Reakcj wizania cAMP przedstawia nastpujce rwnanie:

4cAMP+ R 2C a i R 2- (4cAMP) + 2C
Kompleks R2C2 nie wykazuje aktywnoci enzymatycznej, lecz po zwizaniu si R z cAMP dochodzi do odczenia si R od C, przez co aktywacji ulega C (ryc. 45-5). Aktywna podjednostka C katalizuje przenoszenie reszty fosforanowej z ATP{Mg2+) na seryn lub treonin caego szeregu biaek. Miejscem fosforylacji jest zwykle sekwencja -Arg-Arg-X-Seri -Lys-Arg--S-S-Ser- gdzie w miejscu X moe wystpowa dowolny aminokwas. Pierwotnie wyrniano kinazy biaek cAMP--zaene i cAMP -niezalene. Jak wida w tab. 45-5, problem ten star^si znacznie bardziej zoony po wykazaniu, e fosforylacja biaek stanowi wany mechanizm regulatorowy. Wymienione w tabeli kinazy s niepowtarzalnymi czsteczkami rnicymi si liczb podjednostek wchodzcych w ich skad, mas czsteczkow, autofosforylacj, wartoci Km dla ATP i swoistoci substratow. W najwikszych szczegach przebadano cAMP-zalen kinaz biaek I i II. Kinazy te wykazuj tak sam podjednostk C, lecz skaTabela 45-5. Oczyszczone kinazy biaek Reagujce (wraliwe) na hormony Kinaza zalena od Ca/kalmoduliny Kinaza zalena od Ca/fosfolipidu Kinaza II kazeiny Kinaza typu I i II zalena od cAMP Kinaza zalena od cGMP Kinaza tyrozynowa zalena od naskrkowego czynnika wzrostowego Kinaza zalena od cyklicznego nukleotydu owadw Kinaza tyrozynowa zalena od insuliny Kinaza lekkich acuchw miozyny Kinaza fosforylazy Kinaza dehydrogenazy pirogronianowej Nie wiadomo, czy reaguj na hormony elF-2-a-kinaza zalena od dsRNA e)F-2-a-kinaza zalena od hemtny Kinaza I aktywowana przez proteaz Kinaza rod o psy ny Wirusowa kinaza tyrozynowa typu I, l( i 1(1 Kinazy mogce reagowa na hormony Kinaza I kazeiny Kinaza II aktywowana przez proteaz
592 / ROZDZIA 45
Nieaktywna kinaza biaek
Biako Hormon
ATP
Cyklaza
Hecepior regulatorowe adenylanowa () | FOSFODIESTERAZA BONA KOMRKOWA
GTP-za lezne
5'AMP
Aktywna kinaza
bUtofc
' Mg -ATP Blarko
1+ N
Fosfoprotalna
Fosfataza
" Elekty flzjoloBlczne
Ryc. 45-5. Hormonalna regulacja procesw komrkowych poredniczonych kinazami biafek zalenymi od cAMP. cAMP () powstay w wyniku dziaania cyklazy adenylanowej wie si z podjednostk regulatorow (R) cAMP-zalenej kinazy biaek. Wynikiem tej reakcji jest uwalnianie i aktywacja podjednostki katalitycznej (C). (Za pozwoleniem J. Corbin).
daj si z rnych podjednostek R. Pierwotnie odrniano je na podstawie odmiennego adunku powierzchniowego i wynikajcych std szybkoci elucji z kolumny uywajc chromatografii jonowymiennej (typ I jest bardziej kwany i ulega elucji przy niszych steniach soli ni typ II). Wikszo tkanek wykazuje obecno obu postaci kinaz, natomiast istniej znaczne rnice midzygatunkowe i midzy narzdowe w odniesieniu do rozmieszczenia tych izozymw. Ostatnie badania sugeruj, e typ I rni si od typu II reakcj na rne kombinacje analogw cAMP. Takie badania mog by poyteczne przy okrelaniu izozymu poredniczcego w swoistej reakcji biologicznej. Istniej rwnie fakty, dowodzce, e stymulacja hormonalna swoicie podwysza aktywno albo kinazy typu I albo typu II. Wiele innych kinaz biaek uczestniczy w mechanizmie dziaania hormonw. Rol tych kinaz przedstawiono na ryc. 45-6 i w dalszych czciach niniejszego rozdziau, (inazy zalene od naskrkowego hormonu wzrostowego lub in -
suliny s niepowtarzalne dlatego, e aktywno enzymatyczna zlokalizowana jest w obrbie receptora i e aktywacja kinazy zalena jest od poczenia si hormonu z receptorem (p. rozdz. 52). Inn wyrniajc cech jest to, e kinazy te preferencyjnie katalizuj fosibrylacj reszt tyro-zynowych, podczas gdy fosforylacja tyrozyny nie jest czsto spotykana w komrkach ssakw. Rola jak odgrywaj te kinazy biaek, fos-forylujce tyrozyn, a wystpujce w obrbie receptora, w mechanizmie dziaania hormonw nie jest jasna. Moliwe, e hormon zapoczt kowuje kaskad fosforylacji oraz e jeden lub wicej produktw tej kaskady s rodkomr-kowymi przekanikami. Fosfoproteiny. Zakada si, e dziaanie cAMP w komrkach eukariotycznych odbywa si za porednictwem fosforylacji lub defos-forylacji biaek. Kontrola efektw dziaania cAMP, obejmujcych tak rnorodne procesy, jak steroidogeneza, wydzielanie, transport jo nw, przemiana wglowodanw i tuszczw, indukcja enzymatyczna, regulacja genw,
Wieloczynnociowa Kinaza kalmoduliny
Ryc. 45-6. Interakcja pewnych hormonw z receptorem powoduje aktywacj fosfolipazy C. W procesie tym uczestniczy swoiste biako G, ktre rwnie moe aktywowa kana wapniowy. W wyniku dziaania 11 fosfolipazy C powstaje IP=, ktry uwalnia jony Ca ' " ze rodkom orkowych magazynw oraz diacyloglrcerol (DAG), aktywujcy kinaz biaek C. W tym schemacie aktywowana kinaza biaek C katalizuje fosforylacj 2+ swoistych substratw, ktre z kolei zmieniaj procesy fizjologiczne. Podobnie, rwnie kompleks Ca -kalmodulina (Cam) moe aktywowa swoiste kinazy. W wyniku tych dziaa substraty ulegaj modyfikacjom, co z kolei zmienia reakcje fizjologiczne.
wzrost komrek i ich replikacja, mogaby by zalena od swoistej kinazy biaek, swoistej fosfatazy lub od swoistych substratw fosforylacji. W niektrych przypadkach zidentyfikowano fosfoprotein, uczestniczc w okrelonym szlaku metabolicznym. Fosfoproteiny uczestnicz ce w wikszoci procesw wymienionych wyej niestety nie s dotychczas znane. Wymienione substraty mog by pomocne w okrelaniu tkanki docelowej i zapewne determinuj nasilenia reakcji w obrbie okrelonej komrki. Wiele biaek moe ulec fosforylacji, w tym kazeina, histony i protamina. Takie fosforylacje mog jednak by tylko zjawiskiem wtrnym, chocia mog by uyteczne przy oznaczaniu aktywno Biochemia
ci kinazy biaek. Do niedawna, jedynymi dziaaniami cAMP, ktre bliej zdefiniowano, byy jego dziaania poza jdrem komrkowym. Opisany zostai wpyw cAMP na transkrypcj kilku genw. Wydaje si, e w tych przypadkach cAMP dziaa za porednictwem biaka CREB opisanego wyej. Fosfodiesterazy. Dziaanie hormonw wywoujce podwyszenie rodkomrkowego stenia cAMP moe zosta zakoczone kilkoma sposobami, w tym poprzez hydroliz cAMP katalizowan przez fosfodiesterazy. Obecno tych enzymw hydrolitycznych zapewnia szybki obrt sygnau (tj. cAMP) i tym samym szybkie zakoczenie procesu biologicznego in-
594 / ROZDZIA 45
dukowanego bodcem hormonalnym, skoro tylko ten ostatni przestaje dziaa. Fosfodies-terazy cAMP wystpuj w postaciach, charak teryzujcych si nisk lub wysok wartoci Km i podlegaj zarwno regulacjom hormonalnym, jak i przez takie rdkomrkowe przekaniki jak jony wapnia (prawdopodobnie dziaajce poprzez kalmodulin). Inhibitory fosfodiestera-zy, w tym szczeglnie metylowane pochodne ksantyny (takie jak kofeina), podwyszaj rdkomrkowe stenie cAMP i wywouj efekty podobne do hormonw lub wyduaj dziaanie tych ostatnich. ntroli dziaania hormonu polega na regulacji reakcji defosforylacji biaka. Same fosfatazy fosfoprotein podlegaj regulacji przez procesy fosforylacji i defosforylacji oraz przez inne rnorodne czynniki. Najwicej wiadomo o roli fosfatazy w regulacji przemiany glikogenu mini szkieletowych. W tkance tej opisane zostay dwa rodzaje fosfataz fosfoprotein owych. Typ I preferencyjnie defosforyluje podjednostk P kinazy fosforylazowej, za typ II defos-foryluje podjednostk a. Aktywno fosfatazy typu I reguluj dwa ciepooporne inhibitory biakowe. Inhibitor -1 jest fosforylowany i ak tywowany przez kinaz biaek cAMP-zalen, podczas gdy inhibitor-2 (ktry wydaje si by podjednostk inaktywowanej fosfatazy) ulega take fosforylacji by moe przez kinaz-3 syn-tazy glikogenowej. W wyniku fosforylacji in-hibitora-2 dochodzi te do aktywacji fosfatazy. Pewne fosfatazy mog atakowa swoiste ugrupowania chemiczne, np. mog wystpowa fosfatazy odszczepiajacc^grup fosforanow od reszty tyrozynowej.
Fosfatazy fosfoprotein. Inny sposb ko-
Jeden hormon uywa cGMP jako drugiego porednika Cykliczny GMP powstaje z GTP pod wpywem cyklazy guanyianowej wystpujcej w postaci rozpuszczalnej i zwizanej z bon komrkow. Kady z tych izozymw wykazuje niepowtarzalne waciwoci kinetyczne, fizykochemiczne i antygenowe. Przez pewien czas cGMP uwaano za czynnociowego antagonist cAMP. Obecnie wydaje si, e cGMP zajmuje wyjtkow pozycj w mechanizmie dziaania hormonw. Atriopeptyny, rodzina peptydw wytwarzanych przez kardiomiocyty przedsionkw, wywouj natriurez, diureze i rozszerzenie naczy oraz hamuj sekrecje aldosteronu. Te peptydy (np. przedsionkowy czynnik na- * triuretyczny) wi si i aktywuj cyidaz gna-nylanow, zwizan z bon plazma tyczn.. W wyniku tej reakcji wzrasta stenie cGMP, w niektrych przypadkach a 50 -krotnie. Przypuszcza si, e wyej wymienione efekty at-riopeptyn s spowodowane wzrostem generacji cGMP. Inne fakty wskazuj na udzia cGMP w procesie wazodylatacji. Wiele zwizkw, wrd ktrych znajduj si nitroprusydek, nit rogliceryna, azotyn sodu i azydek sodu, powo duj rozkurcz miocytw naczyniowych i s bardzo silnymi lekami rozszerzajcymi naczynia krwionone. Zwizki te zwikszaj stenie cGMP aktywujc rozpuszczaln posta cyklazy guanyianowej. Efekt ten nasilaj i wyduaj w czasie inhibitory fosfodiesterazy cGMP. Uwalniajce si zwikszone iloci cGMP aktywuj cGMP-zalen kinaz biaek, ktra z kolei katalizuje fosforykcj szeregu biaek miocytw naczyniowych, w tym rwnie acuchw lekkich miozyny. Przypuszczalnie proces ten uczestniczy w relaksacji miocytw i wazodylataWiele hormonw dziaa za porednictwem jonw wapnia lub fosfoinozytydw Jon wapniowy jest wanym regulatorem: a) rnych procesw komrkowych w tym proce su skurczu minia, b) sprzenia zachodzcego midzy bodcem sekrecyjnym a sekrecj, c) ukadu krzepnicia krwi, d) aktywnoci en zymw i pobudliwoci komrkowej. Jest on rwnie rdkomrkowym przekanikiem w mechanizmie dziaania hormonw. Przemiana wapnia. Stenie wapnia oglnego w pynie pozakomrk owym wynosi ok, 2,5 mmol/1. Podlega on bardzo cisej kontroli
cAMP opuszczaj komrki i mog by atwo wykrywane w pynach pozakomrkowych. Tak np. w wyniku dziaania glukagonu na wtrob lub wazopresyny i PTH na nerki mona st wierdzi podwyszone stenia cAMP w osoczu krwi lub w moczu. Fakt ten ley u podstawy testw diagnostycznych majcych na celu okrelenie reaktywnoci narzdw docelowych na ww. hormony. U ssakw pozakomrkowy cAMP ma znikom aktywno, lub te nie ma adnej aktywnoci biologicznej. Jest on natomiast nadzwyczaj wanym przekanikiem rd-komrkowym u niszych eukariontw i proka-riontw.
Pozakomdrkowy cAMP. Pewne iloci
<p, rozdz, 48). Stenie rd komrkowego wolnego jonu wapniowego jest znacznie nisze, wynosi 0,1 10 umol/1, za stenie wapnia w takich organdlach subkomrkowych jak mi-tochondria lub siateczka rdplazmatyczna waha si od 1 do 20 [imol/1. Pomimo wystpowania 500010000-krotnego gradientu midzy steniem wapnia poza- i rodkom orkowego i sprzyjajcego przezblonowego gradientu elektrycznego, wnikanie Ca2 + do kom rek jest utrudnione. Istniej 3 drogi prowadzce do zmiany stenia Ca2+ w cytoplazmie. Pewne hormony (hormony klasy IIC tab. 45-1) zwikszaj przepuszczalno bony komrkowej dla Ca 2+ , przez co wzrasta napyw jonw wapnia do komrki. Proces ten zachodzi najprawdopodobniej za porednictwem mechanizmu wymiany jonw Na+ na Ca2 + , wykazujcego znaczn pojemno, lecz niskie powinowactwo dla jo nw C&2 +. Istnieje rwnie pompa wapniowo--protonowa (Ca2+/2H+) zalena od ATP -azy, wyrzucajca jony CaJ + na zewntrz komrki mechanizmem wymiany na jony H+. Wykazuje ona wysokie powinowactwo dla jonw Ca2 + , lecz ma pojemno. Jest ona prawdopodobnie odpowiedzialna za regulacj delikatnych zmian stenia wapnia w cytoplazmie. W kocu jony wapnia mog ulec mobilizacji lub odkadaniu w mitochondriach i siateczce endoplazmatycz-nej. Dwie obserwacje przyczyniy si do zrozumienia mechanizmu udziau jonw wapnia jako rdkomrkowego przekanika w dziaaniu hormonw. Pierwsza z nich to stwierdzenie szybkich zmian rdkomrkowego stenia wapnia, ktre s bezwzgldnym dowodem roli jonw Ca2+ jako przekanika rdkomrkowego. Zmiany takie wykazano rnymi technikami, w tym rwnie przy uyciu Quin 2 lub Fura 2 tj, zwizkw fluoryzujcych, chelatujacych jony wapnia. Uywajc tych zwizkw mona okreli ilociowo szybkie zmiany stenia jonw wapnia zachodzce w zakres ach poniej 1 umol/1. Drug wan obserwacj, ktra sugerowaa udzia jonw wapnia w mechanizmie dziaania hormonw, byo poznanie rd komrkowych obiektw dziaania tych jonw. Odkrycie Ca2 + --zalenego regulatora aktywnoci fosfodiestera-zy legio u podstawy racjonalnej interpretacji zjawiska rdkomrkowej interakcji, zachodzcej pomidzy jonami wapnia a cAMP. KaImodulina. Jako kalmodulin okrela si Ca2+-zalene biako regulatorowe o masie czs-
teczkowej 17000, iiomologiczne w swej strukturze i czynnoci do tropiny C bdcej biakiem mini. Kalmodulina wykazuje 4 miejsca wice CaJ+, po wysyceniu ktrych dochodzi do znaczcej zmiany konformacyjnej, tak e wikszo czsteczki przybiera struktur a-heliksu. Ta zmiana konformacyjna zwizana jest przypuszczalnie ze zdolnoci kalmoduliny do aktywowania lub inaktywowania enzymw. Interakcja jonw wapnia z kalmodulina (w wyniku czego dochodzi do zmiany aktywnoci tej ostatniej) jest koncepcyjnie podobna do wizania cAMP z kinaz biaek, przez co ulega ona aktywacji. Kalmodulina jest czsto tylko jedn z licznych podjednostek wielu kompleksw biakowych. Uczestniczy ona szczeglnie w regulacji aktywnoci rnych kinaz i enzymw syntezy i rozkadu cyklicznych nukleotydw. Czciow list enzymw regulowanych bezporednio lub porednio zmianami stenia Ca2+ (najpewniej za porednictwem kalmoduliny) przedstawia tab. 45-6.
Tabela 45-6. Enzymy regulowane przez Ca' /kalmodulin Cyklaza adenyianowa i+ Ca -za!ena kinaza biaek Kinaza biaek. Ca /fosfotipidowo-zalena Fosfodiesteraza cyklicznego nukfeotydu Dehydrogenaza gliceroto-3-fosf ora nowa Syntaza glikogenowa Cyklaza guanylanowa Kinaza miozyny NAD-kinaza Fosfoiipaza A2 Kinaza fosforytazy Fosfataza 2B fosfoproteinowa Karboksylaza pirogronianowa Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa
2+ ;
Oprcz dziaania na enzymy i transport jonw Ca2+ kalmodulina reguluje aktywno licznych elementw strukturalnych komrki. Wrd nich naley wymieni kompleks akty-na-miozyna mini gadkich (znajdujcy si pod kontrol P-adrenergiczn) oraz rne procesy, w ktrych bior udzia mikrofilamenty w nie kurczcych si komrkach (ruchliwo komrek, zmiany konformacyjne, mitoz, uwalnianie ziarnistoci i endocytoz).
596 / ROZDZiA 45
Jony wapnia s mediatorami dziaania hormonw Za udziaem jonw wapnia w mechanizmie dziaania hormonw przemawiaj nastpujce obserwacje: 1) dziaanie wielu hormonw ulega osabieniu w rodowisku pozbawionym Ca2 + lub w stanach zuboenia komrek w wap, 2) dziaanie hormonw mona naladowa uywajc substancji zwikszajcych stenie wapnia rdkomrkowego np. jonoforu wapnia A 23187 oraz 3) dziaanie hormonw ma wpyw na napyw wapnia do komrki lub przemieszczenie Ca2+ w obrbie komrki. Procesy te badano w pewnych szczegach w przysadce mzgowej, miniwce gadkiej, pytkach i li-niankach. Najwicej jednak wiadomo o udziale Ca2+ w mechanizmie dziaania wazopresyny i katecholamin a-adrenergicznych dotyczcego regulacji przemiany glikogenu w wtrobie. Pokazano to na ryc, 19-5 i 19-7. Dodanie do izolowanych hepatocytw agoni-stw at -adrenergkznych lub wazopresyny wywouje 3-krotny wzrost stenia CaJ+ w cyto-plazmie (od 0,2 do 0,6 umol/J w cigu kitka sekund). Zmiana ta wyprzedza i jest rwna wzrostowi aktywnoci fosforylazy a, za stenia hormonw potrzebnych do wywoania wymienionych efektw s porwnywalne. Efekt dziaania Ca2+ ulega zahamowaniu przez ctt--antagonistw, za usuniciu hormonu ze rodowiska towarzyszy szybki spadek stenia Ca2 + w cytoplazmie i aktywnoci fosforylazy a. rdem jonw Ca2 + s depozyty tego jonu w organellach rd komrkowych. S one wystarczajce do wywoania pierwszych efektw dziaania hormonw.^Przy duszym dziaaniu hormonw potrzebny jest zwikszony napyw Ca2 + do komrki lub hamowanie wypywu tego jonu z komrki za porednictwem pompy wap niowej. Aktywno tej ostatniej moe zalee od wzrostw cAMP towarzyszcych ww. zmianom stenia Ca2+. Aktywacja fosforylazy jest wynikiem konwersji fosforylazy b do fosforylazy a przez enzym kinaz fosforylazy b. Enzym ten zawiera kalmodulin w swej podjednostce 8, za jego aktywno wzrasta przy wzrocie stenia Ca2 + z 0,11 (imol/1, tj. w zakresie ste, przy ktrych hormony zwikszaj stenia Ca + w wtrobie. Sprzenie wystpujce midzy rdkomrkowym steniem Ca2 + i aktywacj fosforylazy nie podlega ju wtpliwoci. Aktywno wielu enzymw o znaczeniu krytycznym dla pewnych szlakw metabolicznych
regulowana jest przez zmiany stenia Ca3 + lub (i) fosforylacj tych enzymw. Wrd takich enzymw wymieni naley m.in. syntaz gliko-genow, kinaz pirg roni now, karboksylaz pirogronianow, dehydrogenaz glicerolo-6--fosforanow oraz dehydrogenaz pirogronianow. Nie jest pewne, czy kalmodulina bezporednio uczestniczy w regulacji wymienionych enzymw, czy tez uczestnicz w niej niedawno odkryte kinazy biaek, zalene od Ca3+/kal-moduliny lub Ca^/fosfolipidu. Przemiana fosfotnozytydu odgrywa rol w dziaaniu hormonw zalenych a+ od Ca Musi istnie sygna zapewniajcy komunikacj midzy receptorem hormonalnym bony komrkowej a rdkomrkowymi rezerwuarami wapnia. Najlepszymi kandydatami na taki sygna wydaj si by produkty przemiany fosfoinozytydu. Receptory dla acety locho liny, hormonu antydiuretycznego i katecholamin oc,--adrenergtcznych, wystpujce na powierzchni bony plazmatycznej, po poczeniu si ze swoimi swoistymi ligandami, s potnymi aktywatorami fosfolipazy. Proces wizania si hor monu z receptorem oraz aktywacja fosfolipazy C s ze sob sprzone przez unikatowe biako G (ryc. 45-6). Fosfolipaza C katalizuje hydro liz fosfatydyloinozytoio-4,5-bisfosforanu do trifosforanu inozytolu i 1,2-diacyloglicerolu (ryc. 45-7). Cho sam diacyloglicerol moe aktywowa kinaz biaek C, aktywno tego enzymu zaley jednak rwnie od obecnoci wolnych jonw wapnia. Trifosforan inozytoiu jest efektywnym uwalniaczem wapnia ze rd-komrkowych magazynw, takich jak siateczka sarkoplazmatyczna i mitochondria. Tak wic hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfos-foranu jest przyczyn aktywacji kinazy biaek C i wzrostu stenia Ca2 + w cytoplazmie. W obecnoci ACTH i cAMP w korze nadnerczy, angiotensyny, jonw K"1 ", serotoniny, ACTH i dibutyrylo-cAMP w warstwie kb-kowatej nadnerczy, LH w jajnikach oraz LH i cAMP w komrkach Leydiga gonady mskiej, w wymienionych tkankach stwierdza si zwikszone iloci kwasu fosfatydowego, fosfoinozy-tolu i polifosfoinozytydw. Mona by przyto czy kilka innych przykadw. Na ryc. 45-6 przedstawiono rol jak od grywaj jony Ca2+ i produkty rozpadu fosfoinozytydu w mechanizmie dziaania hormonw. W tym schemacie aktywna kinaza biaek
R R, OH I I I 1,2-Diacy log lice roi (DAG)
Fosfaiydy tol nozyto to-4,5-blstosf oran (PIP,)
I nozytob-1,4.5-trisf osf o ran
Ryc. 45-7. Fosfolipaza C rozkada fosfatydyloinozytylo-bisfosforan (PIPa) do diacytoglicerolu i inozytolo-bts-fosforanu. Ri jest zazwyczaj stearynianem, za Rj-arachidonianem. IP3 moe ulec defosforylacji {do nieaktywnego inozytolo-1,4-bisfosforanu (1-1,4P2) lub "fosforyIacji (do potencjalnie aktywnego 1,3,4,5-tetra fosforan u inozytolu 1-1, 3, 4, 5-P4). ___
C katalizuje fosforylacj swoistych substratw, ktre nastpnie zmieniaj procesy fizjologiczne. Podobnie kompleks Ca2+-kalmodulina (Cam) moe aktywowa swoiste kinazy. Te ostatnie z kolei modyfikuj substraty, przez co zmieniaj reakcje fizjologiczne. Dla niektrych hormonw rd kom orkowy przekanik jest nieznany Dua grupa wanych hormonw nie ma zidentyfikowanego przekanika rdkomrko-wego. Jest dziwne, e hormony te tworz due grupy. Do jednej nale insulina, czynniki in-sulinopodobne (IGF-I i IGF-II) i wiele rnych hormonw, majcych wsplnego przodka. Druga grupa skada si z biaek kodowanych przez rodzin genu hormonu wzrostowego (hormon wzrostu, prolaktyna, somatomammotro-pina kosmwkowa); s one wyranie ze sob spokrewnione (p. rozdz. 46). Podzia na wymienione dwie grupy nie jest ostry, skoro w wieiu dziaaniach hormonu wzrostu bierze udzia IGF-I. Oksytocyna jest hormonem nie zaliczanym do adnej z wymienionych dwch grup. Woono wiele wysiku, by znale rdko-mrkowy mediator dziaania insuliny. Wrd kandydatw na taki mediator proponowano m.in. cAMP, cGMP, H2O2, Ca2+ i sam insulin. W wycigach tkankowych znaleziono rne substancje poredniczce, bdce pochodnymi peptydw lub fosfolipidw, lecz dotych-
czas nie zostay one oczyszczone i scharakteryzowane. Niedawna obserwacja, e receptor insulinowy wykazuje wewntrzn aktywno kinazy tyrozynowej zapocztkowaa badania, majce na celu znalezienie ukadu fosforylacji, mogcego wyjani dziaanie insuliny. Nie jest to obserwacja odosobniona, skoro receptor dla naskrkowego czynnika wzrostowego jest rwnie kinaz tyrozynow. W rzeczywistoci ten ostatni fakt by punktem wyjcia dla bada nad receptorem insulinowym. W kocu naley wspomnie, e czynnik wzrostowy pochodzenia pytkowego jest rwnie kinaz tyrozynow, bardzo przypominajc v-sb i c-sis, tj. produkty onkogenw swoistych wirusw i komrek. Pobudzenie komrek docelowych dla hormonu wzrostowego pochodzenia pytkowego, tj. fib-roblastw, komrek glejowych lub komrek mini gadkich, jest przyczyn powstawania kilku produktw genowych, uczestniczcych w replikacji wymienionych komrek. Prawdopodobne wydaje si, e ta dua grupa hormonw posuguje si rnymi mechanizmami sygnalizacji rdkomrkowej. Wydaje si, e tradycyjne przekaniki nie odgrywaj tu okrelonej roli. PIMIENNICTWO
Andersen JE: Theeffectof steroid hontiones on gene transcription. In: Biahgical Reguiation and Deveh-
598 / ROZDZIA 45 pment. Ooldbergcr RF, Yamamoto KR (editors). Vol 3B: Hormone Aclion. Plenum Press, 1985. Blackmore PF, Eston JH: Mechanisms involved in the actions of calcium dependent hormones. In: Biockemical Action of the Hormones. Vol 12. Lit* wack G (editor). Academic Press, 1985. Beato, M: Gene regulation by steroid hormones. Celi 1989;56:335. Enhancers and eukaryotic gene espression. In: Cur-rent Communications in Mokcular Biology. Oluz-man Y, Shenk T (editors). Cold Spring Harbor Press, 1983. Gilman A: G proteins and dual control of adenylate cyclase. Celi 1984;36:577. Rasmussen H: The calcium messenger system. (2 parts.) N Engl J Med 1986;314:J094, 1164.
Przysadka mzgowa i hormony podwzgrza

46
WPROWADZENIE
Przedni pat przysadki mzgowej (przysadka gruczoowa) wydziela, pod kontrol hormonw podwzgrzowych, grup hormonw (hormony tropowe), regulujcych wzrost i czynno innych gruczow wydzielania wewntrznego lub wpywajcych na reakcje metaboliczne innych tkanek docelowych. Tylny pat przysadki mzgowej wytwarza hormony regulujce rwnowag wodn oraz wytrysk mieka z gruczou sutkowego w czasie laktacji.
Utrata czynnoci przedniego pata przysadki mzgowej (panhypopituitarismus) jest przyczyn zaniku tarczycy, kory nadnerczy i gonad. Wtrne skutki niedoboru hormonw gruczow bdcych narzdami docelowymi dla hormonw tropowych przysadki dotykaj wikszoci narzdw i tkanek oraz wiele oglnych procesw, takich jak przemiana biaek, tuszczw, wglowodanw oraz wodno-elektrolito-wa. Utrata czynnoci tylnego pata przysadki jest przyczyn moczwki prostej wyraajcej si niezdolnoci nerek do zagszczania moczu.
Skrty uywane w tym rozdziale ACTH korADH CG
hormon kortykotropow y,
tykotropina hormo n antydiuretyczny, wa zo presy na go nadotro pina kosmwko wa
GnRH IGF 1,-11
hormo n uwalniajcy go nado tropine, gonadohberyna czynnik wzro sto wy ins uli no podobny 1 i II lutro pina lipotro pina melanotropina, hormo n pobudzajcy melanocyty czynnik wzrostu nerw w rodzina peptydw proopiome ianokortyny ho rmo n hamujcy uwalnianie protakiyny, prolaktostatyna prolaktyna hormo n ham uj cy uwalnianie somatotropiny, somatostatyna trijo dotyro nina tyroksyna, tetrajodotyronina ho rmo n uwalniajcy tyreotro ptn, tyreoliberyna tyreotropina wazo aktywny peptyd jelito wy
LM
CLIP pata
CRH CS
peptyd
poredniego
LPH MSH NGF
FSH GAP GH
przysadki podobny do korty-kotropiny ho rmo n uwalniaj cy ko rtyko tropin, kortykoliberyna so mato mammotropina kosmwko wa, laktogen oysko wy folitro pina peptyd zwizany z GnRH hormo n wzro stu (so matotrapina)
PO MC PRIH lub PIH

PRL
SRIN T3
T
GH RH
lub GRH hormo n uwalniajcy ho rmo n wzrostu, somatoliberyna GHRIH ho rmo n ha m ujcy uwalnianie hormonu W2rostu, somatostatyna ____________
TRH TSH VIP
600 / ROZDZIA 46
HORMONY PODWZGRZOWE REGULUJ CZYNNO PRZEDNIEGO PATA PRZYSADKI MZGOWEJ

Uwalnianie (a w niektrych przypadkach rwnie wytwarzanie) kadego z hormonw wymienionych w tab. 46-1 znajduje si pod
cig kontrol przynajmniej jednego hormonu podwzgrzowego. Hormony podwzgrzowe uwalniaj si z zakocze podwzgrzowych wkien nerwowych do przestrzeni okoowo-niczkowej ukadu podwzgrzowego, po czym dostaj si przez odyg do przysadki gruczoowej za porednictwem s pecjalnego krenia
Tabela 46-1. Hormony osi podwzgrze-przysadka-narzd docelowy tworz integralne ptle sprzenia zwrotnego* Hormon przysadki Hormon Hormon podwzgwydzielany Skrt gruczoowej, na ktry przez docelowy gruczo rzowy dziaa hormon pod- endOkrynny wzgrzowy** Korty koi ibery na Tyreoliberyna Gonadotiberyna Somatoliberyna Somatostatyna Prolaktostatyna, dopa-mina i GAP
CRH
TRH
ACTH (LPH, MSH, en-dorfiny) TSH (PRL) LH, FSH

GH
Hydrokortyzon
GnRH (LHRH, FSRH) GHRH.GRH GHRIH.SHIH PRIH lub PIH
Androgeny, progestyny IGF-1; inne?
estrogeny,
GH (TSH, FSH,ACTH)
PRL
IGF-I, T3 i T4; inne?Neurohormony (?)
* Oglny schemat sprzenia zwrotnego dla kadego ukadu mona sporzdzi wstawiajc odpowiedni hormon podwzgrzowy, przysadkowy i gruczou efektorowego na odpowiednie miejsce ryc. 44-1. ** Hormon podwzgrzowy wykazuje wtrne lub sabsze dziaanie na hormon ujty w nawiasach.
Tabela 46-2. Struktura hormonw uwalniajcych (liberyn) podwzgrza Hormon

TRH
Struktura (pyro)Glu-His-Pro-NH2 Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NHZ {pyro)Gu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 HO \ HOL /-\-CH2CHjNHi Peptyd zwizany z GnRH (GAP) Ser-GIn-Glu-Pro-Pro-ile-Ser-Leu-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Glu--V al-Leu-Glu-Met-Thr-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-A)a-Gln-Gln-Ala-His-Ser-Asn--Arg -Lys-Leu-Leu-Asp-lle-Ala-NH2 Tyr-Ala-Asp-A)a-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Vai-Leu-Gly-Gih-Leu--Ser -Ala-Afg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser--AsnGln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH 2
Somatostatyna GnRH PRIH Owcza korty kotibery na Ludzka somatoliberyna
PRZYSADKA MZGOWA I HORMONY POD WZGRZA / 601
wrotnego, czcego podwzgrze z przednim patem przysadki. Struktur kilku hormonw podwzgrzowych przedstawiono w tab 46 -2. Hormony podwzgrzowe uwalniane s pul-sacyjnie (epizodycznie), za izolowane komrki docelowe przysadki gruczoowej reaguj lepiej na pulsacyjn ni cig ekspozycj tych hormonw (podwzgrzowych). Uwalnianie hitro-piny (LH) i folitropiny (FSH) jest regulowane przez wsplny hormon uwalniajcy gonado-liberyn (GnRH). Z kolei wydzielanie tej ostatniej jest zalene od stenia krcych we krwi hormonw gonadalnych docierajcych do pod-wzgrza (patrz ptla sprzenia zwrotnego przedstawiona na ryc. 44-1). Podobne ptle sprzenia zwrotnego istniej dla wszystkich ukadw podwzgrze-przysadka-gruczoy docelowe. Uwalnianie ACTH jest gwnie kontrolowane kortykolifaeryn (CRH), chocia i inne hormony, takie jak ADH, aminy katecholowe. VIP i angiotensyna II wpywaj na jej wydzielanie. Z kolei uwalnianie CRH jest zalene od stenia koityzolu we krwi, glukokortykoidu, wydzielanego przez nadnercza. Uwalnianie tyreotropiny (TSH) zalene jest gwnie od tyreoliberyny (TRH), za wydzielanie tej ostatniej regulowane jest przez hormony tarczycy T3 (trijodotyro-ninjr i T4 (tyroksyn). Hamujcy wpyw na uwalnianie TSH wykazuje jednak rwnie so-matostatyna. Uwalnianie i produkcja hormonu wzrostu (GH) znajduj si pod sta kontrol podwzgrzowego hormonu pobudzajcego oraz hormonu hamujcego wydzielanie GH. Ponadto regulacja wydzielania GH znajduje si pod wpywem obwodowej ptli sprzenia zwrotnego. IGF-I (somatomedyna C), ktry jest porednikiem niektrych efektw GH, pobudza uwalnianie somatostatyny, hamujcej uwalnianie somatoliberyny (GHRH). Regulacja syntezy i uwalniania prolaktyny znajduj si pod sta kontrol hamujcych czynnikw podwzgrzowych. Jest to wyjtkowy hormon, wydzielanie ktrego zaley od wspdziaania czynnikw nerwowych (np. dranienie broda wki piersiowej) realizowanych przez neuroprze-kaniki oraz od neurohormonw. Dopamina hamuje syntez (hamujc transkrypcj genu dla prolaktyny) i uwalnianie prolaktyny, lecz nie jest jedynym czynnikiem odpowiedzialnym za hamowanie wydzielania tego hormonu. Ostatnio odkryto neuropeptyd zoony z 56 aminokwasw wykazujcy dziaanie podobne zarwno do GnRH, jak i prolaktostatyny (PRIH)
std okrelany jest jako peptyd zwizany z GnRH (GAP). GAP jest potnym inhibito rem uwalniania prolaktyny i by moe jest tym hormonem, ktrego dotychczas nie udao si zidentyfikowa. Wystpowanie GAP tumaczy dziwny zwizek zachodzcy pomidzy sekrecj GnRH i prolaktyny, szczeglnie u niekrych gatunkw zwierzt. Wiele hormonw podwzgrzowych, w tym szczeglnie tyreoliberyna (TRH), kortykolibe-ryna (CRH) i somatostatyna wystpuje rwnie w innych obszarach mzgu i w wielu tkankach obwodowych. Pierwotnie uwaano, e dziaanie pobudzajce hormonw uwalniajcych podwzgrza na przysadk mzgow odbywa si za porednictwem cAMP, Nowsze badania sugeruj udzia w tym procesie mechanizmu wapniowo-fosioli-pidowego, podobnego do opisanego wyej. Na temat, czy hormony uwalniajce wpywaj rwnie na syntez odpowiedniego hormonu w przysadce mzgowej, istniej rozbiene opinie, chocia ostatnio wykazano, e GHRH pobudka transkrypcj genu kodujcego GH i TRH transkrypcj genu prolaktyny. PRZEDNI PAT PRZ YSADKI MZGOWEJ WYTWARZA DU LICZB HORMONW POBUDZAJCYCH RNORODNE PROCESY FIZJOLOGICZNE I BIOCHEMICZNE W TKANKACH DOCELOWYCH (TARCZOWYCH) Tradycyjnie hormony przedniego pata przysadki mzgowej omawiano oddzielnie. Uwzgldniajc wyniki nowszych bada dotyczcych syntezy tych hormonw oraz rdkomrko-wych mediatorw ich dziaania (tab, 45-1) hormony przysadki gruczoowej mona podzieli na trzy grupy: pierwsza z nich obejmuje hormon wzrostu, prolaktyn i somatomammotropin kosmwkow, druga hormony glikoprotei-nowe oraz trzecia rodzin hormonw po chodnych proopiomei ano korty ny. Hormon wzrostu, prolaktyna i somatomammotropina kosmwkow tworz jedn grup hormonw Hormon wzrostu (GH), prolaktyna (PRL) i somatomammotropina kosmwkow (CS, la-ktogen oyskowy) tworz rodzin hormonw biakowych wykazujcych bardzo podobn se-
602 / ROZDZIA 46 Mron

Ekson 1
3'
Rvc. 46-1. Schemat struktury genu tudzkiego hormonu wzrostu (z uwzgldnieniem takiej samej skali dla wszystkich jego skadowych). Gen wykazuje dugo ok. 45 kb i skada si z 5 eksonow i 4 intronw. Obszary zakreskowane oznaczaj niekodujce sekwencje eksonu 1 i 5. Strzaki oznaczaj kierunek transkrypcji. __________________________________________________
kwencj aminokwasow. Liczba aminokwasw GH, CS i PRL waha si u rnych gatunkw zwierzt od 190 do 199. Kady z tych hor monw zawiera jedn tylko reszt tryptofano-w (w pooeniu 85 w GH i CS, za w pooeniu 91 w PRL) oraz dwa homologiczne wizania dwusiarczkowe. Homologia midzy skadem aminokwasowym ludzkiego GH i CS wynosi a 85%, za pomidzy ludzkim GH a ludzk prolaktyn 35%. Ta homologia aminokwasow sprawia, e wymienione trzy hormony wykazu j wsplne determinanty antygenowe, co nie jest zaskoczeniem oraz, e wszystkie one pobudzaj wzrost i wykazuj dziaanie laktogenne. S one wytwarzane w swoistych tkankach, tj. GH i PRL wytwarzane s w przysadce gruczoowej, za CS w komrkach syncytium trofoblastycz-nego oyska. Kady z tych hormonw podlega odmiennej regulacji (p. tab. 46-1). Na podstawie uderzajcych podobiestw, wiele lat temu przypuszczano, e wymienione hormony powstay przez duplikacj wsplnego genu-przodka. Uywajc techniki rekombinacji genetycznej wykazano jednak, e istniej, liczne geny dla GH i CS \i naczelnych i u ludzi, natomiast tylko pojedynczy gen kodujcy PRL, bdcy piciokrotnie wikszy od genu GH i CS. Ponadto stwierdzono, e ludzki laktogen oyskowy jest odmian ludzkiego hormonu wzrostu oraz, e geny dla GH i CS umiejscowione s u czowieka na chromosomie 17, podczas gdy dla PRL na chromosomie 6. Istnieje znaczna rozbieno ewolucyjna wymienionych genw. I tak tkanki szczura i bydta maj pojedyncz kopi GH i PRL w genornie haploidalnym, za czowiek pojedynczy gen dla PRL. Czowiek ma jeden czynny gen dla GH (GH-N) i jego wariantu (GH-V), za dwa geny dla CS, ktre ulegaj ekspresji (CS-A i CS-B) i jeden nie ulegajcy ekspresji (CS-L). Wiele gatunkw map ma przynajmniej 4 geny rodziny GH-CS. Sekwencja kodujca dla wszystkich tych genw
zawarta jest w 5 eksonach poprzedzielanych 4 intronami (ryc. 46-1). Geny te wykazuj wysok homologi w regionach flankujcych 5' koce oraz w zakresie sekwencji kodujcych (homologia ta wynosi ok. 95% w obszarze kodujcym), rni si natomiast sekwencj na kocach 3'. Miejsca przeksztacenia i skadania (splicingu) s w wysokim stopniu zachowane, pomimo e introny genu PRL s znaczn ie dusze. Rodzina ludzkiego genu GH-CS jest umiejscowiona w okolicy q 22-24 drugiego ramienia chromosomu 17. Na rycinie 46-2 przedstawiono wzajemne usytuowanie kadego z tych genw wobec siebie poczwszy od koca 5' do koca 3'. Geny ulegaj transkrypcji poczwszy od koca 5' w kierunku do 3. Gen dla GH-N oddzielony jest od genu CS-B sekwencj o wielkoci ok. 45 kb.
hGH-N hCS-L hCS-A
hGH-V hCS-B
Ryc. 46-2. Umiejscowienie i polarno rodziny genw na chromosomie 17 dla ludzkiego GH i CS. Przedstawiona jest lokalizacja genw tudzkiego GH i CS w stosunku do kocw 5' i 3' pasma DNA. Strzaki oznaczaj kierunek transkrypcji. ____
Sekwencja genu GH-N koduje sekwencj aminokwasow GH krcego we krwi. Gen ten jest wraliwy na DNA-zc I, co do wodzi, e jest zlokalizowany w obszarze aktywnej chro-matyny". Gen GH-V, jeli ulega ekspresji, koduje biako rnice si 13 aminokwasami od GH zakodowanego w sekwencji GH-N. Gen GH-V jest oporny na dziaanie DNA-zy I, co wskazuje na to, e zapewne nie jest aktywny. Obecno genu GH-V stwierdza si u chorych wykazujcych brak genu GH-N (tj. u chorych
PRZYSADKA MZGOWA I HORMONY PODWZGRZA / 603
z dziedzicznym niedoborem GH). Poniewa u chorych tych wystpuje zupeny brak GH, naley przypuszcza, e gen GH-V jest nieaktywny, lub te produkuje czsteczki hormonu wzrostu pozbawione aktywnoci biologicznej. Fakt, e chorzy d wytwarzaj przeciwciaa anty-GH po podaniu egzogennego GH sugeruje, e ich ukad i mmunologiczny nigdy nie zetkn si przedtem z tym antygenem {biakiem hormonalnym). Ekspresj genw CS-A i CS-B stwierdza si w oysku; nie stwierdza si natomiast ekspresji genu CS-L (jest to gen niemy"). Hormon wzrostu (GH) Synteza i budowa. Hormon wzrostu jest syntetyzowany w komrkach somatotropo wych przysadki gruczoowej, tj. w podgrupie komrek kwasochonnych. Komrki te stanowi najliczniejsz grup komrek przysadki mzgowej. Stenie GH w przysadce wynosi 515 mg/g tkanki, tj. stenie to jest znacznie wysze ni innych hormonw przysadkowych (wyraajce si w ug na gram tkanki przysadkowej). U wszystkich ssakw GH skada si z pojedynczego acucha polipeptydowego o masie czsteczkowej ok. 22 000. Ogln struktur ludzkiego GH, zoonego z 191 aminokwasw, przedstawia ryc. 46-3. Pomimo e istnieje due podobiestwo w sekwencji amino-kwasowej midzy GH rnych gatunkw, tylko ludzki GH oraz GH uzyskany od naczelnych s aktywne u czowieka. Obecnie dostpny jest dla celw leczniczych GH uzyskany metod rekombinacji DNA.
ne. Hormon wzrostu jest niezbdny dla wzros tu w okresie pourodzeniowym i dla prawidowej przemiany wglowodanowej, lipidowej, azotowej i mineralnej. Wpyw GH na wzrost nastpuje za porednictwem IGF-I kodowanego przez gen nalecy do rodziny czynnikw wzrostowych insulinopodobnych. Czynnik ten okrelano pierwotnie jako czynnik sulfatacji (sul-fation factor), poniewa pobudza wbudowywa-nie siarczanw do tkanki chrzestnej. Z kolei okrelano go jako somatomedyn C. Pod wzgl dem struktury jest podobny do proinsuiiny (p. rozdz. 52 i ryc. 52-5). Innym polipeptydem bardzo podobnym lub nawet identycznym pod wzgldem aktywnoci biologicznej do IGF -I jest polipeptyd IGF-II, okrelany u szczura jako czynnik pobudzajcy rozrost (MSA multi-plication stimulating activity). Zarwno IGF-I, jak i IGF-II wi si z receptorami bonowymi. Mona je odrni od siebie uywajc swoistych metod radioimmunologicznych. IGF-I skada si z 70, za IGF-II z 67 aminokwasw. Stenie IGF-II w osoczu jest dwukrotnie wysze od stenia IGF-I, pomimo e efekt biologiczny GH wykazuje bardziej bezporedni korelacj ze steniem IGF-I. Chorzy z niedoborem IGF-I, lecz prawidowym steniem IGH-II (tj. osoby z karowatoci z niedoboru GH i Pigmeje, p. tab. 46-3) wykazuj upoledzony wzrost. GH wykazuje kilka dziaa 1. Synteza biaka. GH wzmaga transport aminokwasw do komrek mini oraz nasila
Dziaanie fizjologiczne i biochemicz-
Ludzki hormon wzrostu
Prolaktyna owcza
Ryc. 46-3. Porwnanie oglnej struktury ludzkiego hormonu wzrostu (po stronie lewej) ze struktur prolaktyny owczej (po stronie prawej). Hormon wzrostu wykazuje wizanie dwusiarczkowe midzy aminokwasami w pozycjach 53 i 165 oraz 182 i 189, w prolaktynie wizania dwusiarczkowe wystpuj midzy aminokwas ami w pozycji 4 i 11, 58 i 173 oraz 190 i 198.
604 / ROZDZIA 46 Tabela 46-3. Zachowanie si hormonu wzrostu (GH), insulinopodobnego czynnika wzrostowego I (IGF-I) i II (IGF-I!) w karowatoci Stenie w osoczu
GH
Reakcja na egzoIGF-II Mae lub prawidowe Prawidowe Mae genne podanie GH Dodatnia Ujemna Ujemna
IGF-I Mae Mae Mae
Karowato z niedoboru GH Pigmeje Karowato typu Larona
Mae Prawidowe Due
syntez biaka (mechanizmem nie zwizanym z transportem aminokwasowym). Zwierzta, ktrym podawano GH, wykazuj dodatni bi lans azotowy, wyraajcy si oglnym wzrostem syntezy biaka, obnieniem stenia w osoczu aminokwasw i mocznika oraz spadkiem wydalania aminokwasw i mocznika z moczem. Zmianom tym towarzysz wzmoona synteza RNA i DNA w niektrych tkankach. Pod tym wzgldem efekty GH s podobne do wystpujcych po podaniu insuliny. Przemiana wglowodanw. Oglnie m wic, GH wykazuje antagonistyczne dziaania w stosunku do insuliny. Wystpujca po poda niu GH hiperglikemia jest wynikiem zarwno zmniejszonej utylizacji glukozy przez tkanki obwodowe, jak i wzmoonego wytwarzania glukozy w wtrobie w procesie zwanym glukoneogenez. W wtrobie GH zwiksza zawarto glikogenu najpewniej drog stymulacji gluko neogenezy z aminokwasw. Moe rwnie wy stpi upoledzenie glikolizy na kilku etapach. W mechanizmie spad_ku glikolizy w miocytach moe rwnie uczestniczy wzmoona mobili zacja kwasw tuszczowych z zapasw triacyloglicerolu. Dugotrwae podawanie GH moe by przyczyn cukrzycy. Przemiana lipidw. GH pobudza uwal nianie wolnych kwasw tuszczowych i glicerolu z tkanki tuszczowej, podnosi stenie wolnych kwasw tuszczowych we krwi oraz zwiksza utlenianie wolnych kwasw tuszczowych w w trobie. W warunkach niedoboru insuliny (wy stpujcego np. u chorych na cukrzyc) moe rwnie pojawi si nasilona ketogeneza. W patomechanizmie wymienionych skutkw dziaa nia GH na przemian lipidw i wglowodanw prawdopodobnie nie bierze udziau IGF -1. Przemiana elektrolitowa GH, a bardziej prawdopodobnie IGF-I sprzyjaj powstawaniu dodatniego bilansu wapniowego, magnezowe-
go i fosforanowego oraz retencji w ustroju Na+, K+ i Cl". Wp yw GH lub IGF-I na gospodark wapniowo-fosforanow jest nastpstwem oddziaywania tych hormonw na koci (pobudzaj one wzrost koci dugich na poziomie jej nasady u dzieci oraz wzrost akralny i apozycyj-ny koci u dorosych). U dzieci GH pobudza ponadto tworzenie si tkanki chrzestnej. 5. Efekty prolaktynopodobne. GH, wic si z receptorami laktogenowymi, wykazuje wiele efektw podobnych do wystpujcych po podaniu prolaktyny (pobudza gruczo sutkowy, lak-togenez oraz wytwarzanie mleczka w wolu gobi). dobr GH spowodowany ogln niedoczyn-noci przysadki gruczoowej (panhypopituita-rismus) !ub wybirczym niedoborem tego hor monu jest przyczyn powanych nastpstw u dzieci, poniewa dzieci te nie osigaj odpowiedniego wzrostu. Skutki metaboliczne niedoboru GH s mniej kopotliwe. Rne rodzaje karowatoci pomagaj zrozumie znaczenie rnych faz dziaania GH (tab. 46 -3). Karty z niedoborem GH reaguj w sposb normalny na podawanie egzogennego GH. Opisano dwa rodzaje opornoci narzdw docelowych na dziaanie GH. Kary typu Larona wykazuj nadmierne iloci GH-N, lecz ich hepatoeyty pozbawione s receptorw dla GH. U Pigmejw wystpuje defekt poreceptorowy, przez co wypada dziaanie GH, w ktrym poredniczy IGF-I. Nadmiar GH, najczciej spowodowany gru-czolakiem kwasochonnym przysadki, jest powodem gigantyzmu, jeli nie doszo jeszcze do zamknicia szpar nasadowych. U takich cho rych obserwuje si przyspieszony wzrost koci dugich. Akromcgalia jest nastpstwern nadmiernego uwalniania si GH w fazie ycia, kiedy doszo ju do zamknicia szpar nasadowych
Patofizjologia hormonu wzrostu. Nie-
PRZYSADKA MZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 605
koci, czyli po ukoczeniu wzrostu koci dugich. Akralny wzrost koci jest przyczyn typowych zmian twarzy (wystajca szczka dolna, powikszenie nosa), wystpowania powikszonych doni, sLp i czaszki. Wrd innych anomalii naley wymieni powikszenie narzdw trzewiowych, zgrubienie skry oraz wiele zaburze metabolicznych, w tym cukrzyc. Znajomo regulacji wydzielania GH jest podstaw racjonalnego stosowania testw uywanych w diagnostyce wymienionych stanw chorobowych. U chorych z niedoborem GH nie s twierdza si wzrostu stenia tego hormonu w osoczu krwi po stosowaniu bodca hipo-glikemicznego, po podaniu argininy lub 1-dopa. U chorych z gigantyzmem lub akromegali, spowodowanych nadmiern sekrecj GH przez gruczolak, nie obserwuje si supresji stenia GH w osoczu po podaniu glukozy. Prolaktyna (PRL, hormon laktotropowy, mammotropina, hormon luteotropowy) biakowym o masie czsteczkowej ok. 23 000. Oglna jej struktura jest podobna do pokazanej dla GH na ryc. 46-3. Wydzielana jest przez kwasochonne komrki laktotropowe przysadki gruczoowej. Liczba i wielko tych komrek powikszaj si gwatownie w czasie ciy. Podobiestwa strukturalne i czynnociowe midzy GH, PRL i CS zostay przedstawione wyej.
cja PRL moe by przyczyn ginekomastii (powikszenie sutkw) i impotencji. Somatomammotropina kosmwkowa (CS, laktogen oyskowy) U czowieka trzeci czon rodziny GH-PRL--CS nie wykazuje okrelonej czynnoci. W testach biologicznych CS wykazuje dziaanie laktotropowe i luteotropowe oraz efekty metaboliczne jakociowo podobne do opisanych dla hormonu wzrostu hamuje utylizacj glukozy przez komrki, pobudza uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych i glicerolu, wzmaga zatrzymywanie azotu i wapnia w ustroju (pomimo wzrostu wydalania wapnia z moczem) oraz zmniejsza wydalanie fosforu i potasu z moczem. Hormony glikoprotemowe tworz drug grup hormonw przysadki gruczoowej Najbardziej zoonymi hormonami biakowymi dotychczas odkrytymi s hormony gliko-proteinowe przysadki gruczoowej i oyska tj. hormon tyreotropowy (tyreotropina TSH), hormon luteotropowy (lutropinaLH), hormon pobudzajcy pcherzyki jajnikowe Graafa (foli-tropina FSH) oraz gonadotropina kosmwkowa (CG). Hormony te wpywaj na rne procesy biologiczne, pomimo e wykazuj znaczce podobiestwa strukturalne. Ta klasa hormonw wystpuje u wszystkich ssakw. Czsteczki tych hormonw reaguj podobnie jak inne hormony peptydowe lub biakowe z receptorami bony komrkowej i aktywuj cyklaz ade -nylanow, tj. ich przekanikiem rdkomr-kowym jest cAMP. Kady z tych hormonw skada si z dwch podjednostek a i p, poczonych ze sob nieko-walencyjnie. Podjednostki a s identyczne dla wszystkich tych hormonw w obrbie jednego gatunku i istniej znaczne podobiestwa strukturalne midzy poszczeglnymi gatunkami. Aktywno biologiczna tych hormonw zdeter minowana jest przez podjednostk p. Sama podjednostka p nie jest aktywna biologicznie, za rozpoznanie swoistego receptora przez hormon zalene jest od interakcji okrelonych obszarw obu jego podjednostek. Czsteczki hybrydowe midzy wymienionymi hormonami s w peni aktywne. 1 tak czsteczka hybrydowa skadajca si z TSHa LHp wykazuje aktywno lutropiny, za czsteczka zoona z podjednostki a ludzkiej tyreotropiny (hTSHa) i podjednostki P mysiej tyreotropiny (mTSHp) wykazu-
Synteza i struktura. PRL jest hormonem
Rola fizjologiczna i biochemiczna

prolaktyny. Prolaktyna uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu laktacji u ssakw. Przy steniach fizjologicznych prolaktyna dziaa tylko na gruczoy sutkowe odpowiednio przygotowane hormonami gonadalnymi. Przy nadmiernych steniach prolaktyna stymuluje wzrost gruczow sutkowych rwnie u kobiet pozbawionych jajnikw oraz u mczyzn. U gryzoni PRL jest zdolna do podtrzymywania ciaka tego std okrelenie hormon uteo-tropowy. Czsteczki podobne do PRL wydaj si uczestniczy w procesie adaptacji ryb sono-wodnych do warunkw sodko wodnych, w procesie linienia gadw oraz w wytwarzaniu mleczka w wolu ptakw. Nieznany jest rdkomr -kowy mediator dziaania PRL. Mia nim by polipeptyd, lecz nie zostao to potwierdzone. dzielajce prolaktyn s przyczyn braku miesiczki (amenorrhoea) i mlekotoku (galactor-rhoea) u kobiet. U mczyzn nadmierna sekre-
Patofizjologia prolaktyny. Guzy wy-
606 / ROZDZIA 46
je aktywno tyreotropow (u myszy). Wynika z tego, e midzygatunkowe rnice midzy podjednostkami a i P nie maj wpywu na wizanie niekowalencyjne pomidzy nimi, ani te na aktywno biologiczn domeny podjed-nostki p. Kada podjednostka jest syntetyzowana na matrycy swoistych sekwencji mRNA oddzielnych genw. Przypuszcza si, e wszystkie hormony tej grupy pochodz od wsplnego przodka genowego, ktry rozpada si na dwie czsteczki a i p oraz, e ta ostatnia ulega dalszej ewolucji, stajc si rdem oddzielnych hormonw. Wiele wiadomo o strukturze tych czsteczek, np. karboksykocowy pentapeptyd podjedno-stki a jest istotny dla wizania z receptorem, lecz nie dla poczenia si tej podjednostki z podjednostka p. Cech odrniajc hormony grupy glikoproteinowej od hormonw pozostaych grup, jest glikozylacja. W kadym hormonie glikoproteinowym podjednostka a zawiera dwi e czsteczki oligosacharydw zwizanych z asparagin, za podjednostka p albo 1, albo 2 takie czsteczki. Glikozylacja moe by potrzebna w procesie interakcji podjednostki a i podjednostki p. Podjednostka a zawiera 5, za podjednostka p 6 mostkw S -S. Wolne podjednostki a mona znale w przysadce i w oysku. Ten fakt oraz obserwacja, e translacja podjednostek a i p odbywa si na matrycy oddzielnych mRNA, potwierdzaj koncepcj, e synteza jednej podjednostki jest niezalena od drugiej oraz, e podje dnostka P jest skadow decydujc o syntezie caej czsteczki hormonu. Wszystkie hormony tej grupy syntetyzowane s jako preprohormony i poddawane potranslacyjnej obrbce w obrbie komrki, dziki czemu powstaje hormon gliko-zylowany, mony te odpowiedzialne s za gametogenez i steroidogenez w gonadach. Kady z tych hormonw jest glikoprotein o masie czsteczkowej ok. 25 000.
2. Hormon luteinizujcy (lutropina LH). LH wie si ze swoistymi receptorami bon plazmatycznych pobudzajc produkcj progesteronu w komrkach ciaka tego oraz testosteronu w komrkach Leydiga, Srdkomrko-wym mediatorem dziaania LH jest cAMP, Nukleotyd ten wykazuje dziaanie podobne do LH, pobudzajc konwersj octanw do skwale-nu (jest to prekursor syntezy cholesterolu), oraz konwersj cholesterolu do 2ac-hydroksycholes-terolu niezbdnego metabolitu w szlaku syntezy progesteronu i testosteronu. Dziaanie LH jest bardziej szczegowo opisane w rozdziale 51. Istnieje cise sprzenie midzy wi zaniem LH z receptorem a powstawaniem cAMP; steroidogeneza wystpuje jednak tylko wtedy, kiedy doszo do maych wzrostw cAMP. Dowodzi to obecnoci receptorw zapasowych" w tym procesie (p, ryc. 43-3). Dugotrwaa ekspozycja komrek docelowych na LH jest przyczyn spadajcej ich wraliwoci na ten hormon uwarunkowanej prawdopodobnie zmniejszeniem si liczby receptorw (down regulation"). Zjawisko to moe by wykorzystywane jako sposb kontroli urodze.. 3. Ludzka gonadotropina kosmwkowa (hCG). Hormon ten jest glikoprotein syntety zowan w komrkach syncytium trofoblastu oyska. Jest on dimerem zoonym z podjed nostek a i p (J est to struktura typowa dla tej gnipy hormonw) najbardziej podobnym do LH. Jego stenie we krwi oraz wydalanie z moczeni wzrastaj ju krtko po implantacji zapodnionego jaja (patrz wyej). Std oznacza nie hCG wykorzystywane jest w wielu testach wykrywania ciy. glikoprotein o strukturze dimerycznej a|3 i masie czsteczkowej ok. 30 000. Podobnie jak inne hormony tej klasy, TSH, wic si z receptorami bon plazmatycznych, aktywuje cykiaz adenylanow i wzmaga syntez cAMP, Wzrost tego ostatniego odpowiedzialny jest za udzia TSH w biosyntezie hormonw tarczycy. Mniej pewne jest dziaanie troficzne TSH na tarczyc. Mona wymieni wiele przykadw ostrego " wpywu TSH na czynno tarczycy. Efekt nastpuje w cigu minut i wyraa si aktywacj wszystkich faz biosyntezy T3 i T4, tj. procesu koncentracji jodkw w tarczycy, wbudowywa-nia jodu do piercienia tyrozyny, sprzgania jodotyrozyn i hydrolizy tyreoglobuliny, TSH wykazuje rwnie dziaanie przewleke na tarczyc. Skutki tego dziaania wystpuj po kilku
Hormon tyreotropowy (TSH). TSH jest
Gonadotropiny (FSH, LHr hCG). Hor-
1. Hormon dojrzewania pcherzykw (foli-tropina FSH). Hormon ten wie si z
receptorami bon plazmatycznych komrek docelo wych tj. komrek pcherzykw jajnikowych (Graafa) oraz komrek Sertolego gonady mskiej. W nastpstwie wizania si z receptorem dochodzi do aktywacji cyklazy adenytanowej i wzrostu syntezy cAMP. Efekty dziaania FSH opisane s w wikszych szczegach w rozdziale 51.
PRZYSADKA MZGOWA I HORMONY POD WZGRZA / 607
dniach stosowania TSH i wyraaj si wzrostem syntezy biaek, fosfolipidw, kwasw nukleinowych oraz wielkoci i liczby komrek tarczycy. Skutki metaboliczne dugotrwaego stosowania TSH s nastpstwem syntezy i dziaania hormonw tarczycy. Peptydy rodziny proopiomelanokortyny (POMC) s wynikem zoonego procesu przeksztacania Rodzina POMC skada si z peptydw dziaajcych jako hormony (ACTH, LPH, MSH), neuroprzekaniki lub neuromodulatory (endor-finy). Prekursorem POMC jest czsteczka zoona z ok. 285 aminokwasw, ulegajca rnym procesom w rnych obszarach przysadki.
Rozmie szc ze nie , prze ks ztace nie i skutki dziaania produktw genu
POMC. Ekspresja genu POMC odbywa sie w przednim i porodkowym pacie przysadki mzgowej. Najbardziej staa sekwencja u r nych gatunkw umiejscowiona jest we fragmencie N-kocowym oraz w obszarze sekwencji ACTH i p-endorfin. Zarwno POMC, jak i jego produkty stwierdza si rwnie w kilku innych tkankach krgowcw, np. w mzgu, oysku, przewodzie odkowo-j elito wy m, w przewodach-ukadu pciowego, w pucach i limfocytach. S one raczej wynikiem ekspresji genw w wymienionych narzdach, a nie ich absorpcji z osocza. Podobne peptydy stwierdzono rwnie u wielu gatunkw niekrgowcw. Proces przeksztacania POMC w przednim pacie przysadki rni si od wystpujcego w pacie porodkowym. Pat porodkowy ma charakter szcztkowy u dorosych ludzi, lecz
. i
jest aktywny u ludzkich podw, kobiet ciarnych w pnej fazie ciy oraz u wielu gatunkw zwierzt. Proces przeksztacania POMC w tkankach obwodowych (w przewodzie pokarmowym, oysku, w drogach pciowych mczyzn) jest podobny do wystpujcego w pacie porodkowym. Istniej trzy gwne grupy hormonw pochodnych POMC. Pierwsza obej muje ACTH, z ktrej moe powsta oc-MSH oraz peptyd kortykotropinopodobny poredniego pata przysadki (CLIP). Druga grupa skada si z p-lipotropiny (fi-LPH), z ktrej mog powsta y-LPH, p-MSH i P-endorfiny i z tych ostatnich endorfiny a t y. Trzecia grupa skada si z duego N -kocowego peptydu, z ktrego powstaje y-MSH. Rnorodno wymienionych produktw POMC spowodowana jest wystpowaniem licznych ugrupowa zoonych z dwch aminokwasw zasadowych, bdcych potencjainymi miejscami dziaania enzymw trypsynopodobnych. Kady z wymienionych peptydw wyprzedzaj reszty Lys-Arg, Arg-Lys, Arg-Arg lub Lys-Lys. Po translacji segment prohormonu ulega rozszczepieniu, po czym nastpuje modyfikacja czsteczki drog glikozylacji, acetylacji i fosforylacji. Kolejny rozpad zachodzi midzy sekwencj AC TH i P-LPH, w wyniku ktrego powstaje ACTH na kocu N, za P-LPH na kocu C (ryc. 46-4). Proces ten zachodzi zarwno w przednim jak i porednim pacie przysadki. Po odszczepieniu sekwencji ACTH^JJ, w przednim pacie nie zachodzi ju wicej adna istotna dalsza obrbka tego hormonu. W pacie porednim ACTH!.39 ulega rozpadowi do a-MSH1.13 i CLIP]8 .39 , za 0-LPH41_,M do 7-LPH42.101 i [J-endor-4-i34. za p-MSHgôiPOwstajez Y -LPH.
ACTH (1-39)
0-LPH (42-134]
...
1
,.:
a-MSH (1-13) CLIP (18-39) 7-LPH (42-101)
I
0-Endorflna
(104-134) II 0-MSH (84-101) 7-Endorfina 1104-118)

1 1
(104-117)
Ryc. 46-4. Produkty rozpadu proopiomelanokortyny (POMC), MSH hormon pobudzajcy melartocyty, CLIP peptyd kortykotropinopodobny poredniego pata przysadki mzgowej, LPH lipoiropina.
608 / ROZDZIA 46
Wymienione peptydy ulegaj znacznym dodatkowym modyfikacjom. Znaczna cz N-kocowego peptydu i ACTH 1.39 ulega gliko-zylacji wprzednim pacie przysadki mzgowej. MSH wystpuje przewanie w postaci N-acety-lowanej i C-amidowanej. a-MSH deacetylowa-na wykazuje mniejsz aktywno. p-Endorfina ulega szybkiej acetylacji w pacie porednim. W odrnieniu od a-MSH acetylowana p-en-dorfina jest okoo 1000-krotnie mniej aktywna od postaci nieacetylowanej, moliwe wiec, e P-endorfina jest nieaktywna w przysadce mz gowej. W podwzgrzu czsteczki te ulegaj acetylacji i dlatego s widocznie aktywne. p-En-dorfina utega rwnie modyfikacji na kocu C, stajc si rdem endorfiny a i y (ryc. 46-4). Wymienione 3 endorfiny (a, p, y) s gwnymi endorfinami poredniego pata przysadki mzgowej u gryzoni. Duy fragment N-kocowy najprawdopodobniej take zostaje pocity, stajc si rdem y-MSH w przysadce szczurzej i bydlcej. Mao jest jednak wiadomo o tym N-kocowym fragmencie. Informacje o struk turze wymienionych hormonw uzyskano gwnie w badaniach przysadek pochodzcych od gryzoni. Wydaje si jednak, e oglny schemat powstawania wymienionych hormonw dotyczy rwnie innych gatunkw. Doda jednak naley, e dotychczas nie uzyskano dokadnych informacji o funkcji wikszoci peptydw pochodnych POMC. Dziaanie i regulacja swoistych peptydw 1. Struktura i mechanizm dziaania hormonu adrenokortykotropowgo (kortykotropiny ACTH). ACTH, fedcy acuchem polipep-tydowym zoonym z 39 aminokwasw (ryc. 46-5), jest regulatorem wzrostu i czynnoci kory nadnerczy. N-kocowa sekwencja 24 aminokwasw jest niezbdna dla wystpienia penej aktywnoci biologicznej i jest ona taka sama u rnych gatunkw. W odrnieniu od niej C-kocowa sekwencja aminokwasowa wykazu je du zmienno midzygatunkow. Do testw diagnostycznych uywany jest syntetyczny analog ACTH,.^. ACTH wzmaga syntez i uwalnianie steroi dw nadnerczowych, stymulujc konwersj cholesterolu do pregnenolonu. Ten etap steroi-dogenezy polega na konwersji C37-steroidw do C^-steroidw przez odszczepienia 6-wglowego acucha bocznego. Skorb pregnenolon jest prekursorem dla wszystkich steroidw nadner-
10
II
Sekwencja staa, niezbdna do wywoania palnej aktywnofcl biologiczne)

24 23 22 21 20 19 18 1? 16 **"^? 25
Sakwa reja zmienna, niepotrzebna do wywoania Gly) _ aktywnoci blologlczrej
30
31
32
33
3*
35
38
37
Ryc. 46-5. Budowa (ACTH).
ludzkiej
kortykotropiny
czowych (p. ryc. 49-3), po dugotrwaym podawaniu ACTH obserwuje si nadmiern syntez gluko- i mineralokortykoidw, jak rwnie de-hydroepiandrosteronu (prekursora androge-nw), W warunkach fizjologicznych udzia ACTH w regulacji mineraokortykoidw i and-rogenw jest minimalny. ACTH pobudza wzrost nadnerczy (jest to efekt troficzny) pobudzajc syntez biaek i RNA. ACTH, podobnie jak inne hormony pep-tydowe, wie si z receptorem bon plazmaty-cznych. Ju po kilku sekundach interakcji ACTH z receptorem obserwuje si znaczny wzrost stenia rdkomrkowego cAMP. Analogi cAMP potrafi naladowa dziaanie ACTH, lecz w procesie tym udzia bior rwnie jony wapnia. 2. Patofizjologia ACTH. Nadmierne wytwarzanie ACTH przez guz przysadki lub poza-przysadkowy jest przyczyn zespou Cushinga. Sabe dziaanie melanotropowe ACTH oraz towarzyszce sekrecji ACTH uwalnianie P- lub ot-MSH s przyczyn hiperpigmentacji skry. Skutki metaboliczne nadmiernego wydzielania steroidw nadnerczowych wyraaj si 1) ujemnym bilansem azotowym, potasowym i fosforowym, 2) retencj sodu objawiajc si nadcinieniem ttniczym lub/i obrzkami, 3) nietolerancj wglowodanow lub jawn cukrzyc, 4) podwyszonym steniem kwasw tuszczowych w osoczu oraz 5) spadkiem liczby eozyno-filw i limfocytw, natomiast wzrostem leukocytw wielojdrzastych. Chorzy z zespoem Cushinga charakteryzuj si zanikiem mini szkieletowych oraz swoistym rozmieszczeniem si tkanki tuszczowej okrelanym jako otyo tuowiow. Przy wypadaniu produkcji ACTH spowodowanej guzem, zakaeniem lub zawa -
PRZYSADKA MZGOWA [ HORMONY PODWZGORZA / 609
lem przysadki mzgowej objawy kliniczne s przeciwstawne do wystpujcych w nadprodukcji ACTH. da si z C-kocowego 91 aminokwasowego polipeptydu POMC (ryc. 46-4). p-LPH zawiera sekwencj aminokwasow p-MSH, y-LPH, Met-enkefaliny i p-endorfiny. Z wymienionych hormonw w ludzkiej przysadce mzgowej stwierdzono y-LPH, p-LPH i p-endorfin, nie wykryto natomiast p-MSH. p-LPH znajduje si tylko w przysadce mzgowej, poniewa w innych tkankach ulega ona szybkiej konwersji do y-LPH i p-endorfiny, fkLPH skada si z polipeptydu zoonego z 7 aminokwasw (p-LPH 47.53), identycznego do sekwencji ACTH4.10. P-LPH pobudza lipoliz i mobilizacj tkanki tuszczowej, chocia jej rola fizjologiczna jest niewielka. Najpewniej suy ona tylko za prekursora P-en-dorfiny. End o rfin y. p - en do rfi n y s k ad aj s i z C-kocowej sekwencji 31 aminokwasw p-LPH (ryc. 46-4). Endorfina ot i y s pochodnymi endorfiny p, od ktrej zostao odszczepio-nych 15 lub 14 aminokwasw od fragmentu C-kocowego. Peptydy te wystpuj w przysadce mzgowej, gdzie ulegaj acetylacji (patrz wyej) i przez to inaktywacji biologicznej. W innych miejscach (np. w neuronach orodkowego ukadu nerwowego) nie ulegaj biochemicznej modyfikacji i dlatego speniaj role neuroprze-kainikw lub neuromodulatorw. W orodkowym ukadzie nerwowym endorfiny wi si tymi samymi receptorami co opiaty morfinowe, dziki czemu mog uczestniczy w kontroli percepcji blu. Wykazuj one 1830-krotnie silniejsze dziaanie przeciwblowe ni morfina (uwzgldniajc mas czsteczkow tych substancji). Sekwencja aminokwasowa enkefaliny wystpuje w czsteczce POMC, lecz nie jest ona wyprzedzana aminokwasami dwu zasadowymi, przez co widocznie nie ulega odszczepieniu i ekspresji.
P-lipotropina (P-LPH). Hormon ten ska-
wikszych czsteczek a lub P-LPH. a-MSH wykazuje sekwencj aminokwasowa identyczn z sekwencj ACTHI_B, lecz jest acetylowana na kocu N czsteczki. ot-MSH i CLIP wystpuj najczciej u zwierzt z dobrze rozwinitym patem porednim przysadki. Nie stwierdza si ich u ludzi w yciu pozapodowym. Chorzy z niedoborem glukokortykoidw (choroba Addisona) wykazuj nadmiern pig-mentacj skry, spowodowan nadmiern aktywnoci MSH. Moe by ona spowodowana nadmiernym wydzielaniem ACTH (prekursora a-MSH), lub, co jest bardziej prawdopodobne, wspwystpujc zwikszon sekrecj p -i y-LPH, wykazujcych aktywno MSH.
TYLNY PAT PRZYSADKI MZGOWEJ ZAWIERA DWA AKTYWNE HORMONY WAZOPRESYN I OKSYTOCYN
Wazopresyna, ktrej nazwa wywodzi si std, e hormon ten podany w dawkach farmakologicznych podnosi cinienie ttnicze, okrelana jest rwnie jako hormon antydiuretyczny (ADH). Ta ostatnia nazwa jest bardziej waciwa, poniewa gwne dziaanie fizjologiczne tego hormonu polega na pobudzaniu resorpcji wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Drugim hormonem przysadki nerwowej jest oksytocyna. Hormon ten ma przyspiesza pord wywoujc skurcze mini gadkich macicy. Ta fizjologiczna rola oksy tocyny jest jednak kwestionowana. Ma ona raczej uczestniczy w wydzielaniu mleka przez gruczo sutkowy. Wymienione dwa hormony wytwarzane s przez podwzgrze, skd transportowane s ak-soplazm do zakocze nerwowych tyinej czci przysadki mzgowej. Pod wpywem odpowiednich bodcw hormony te s uwalniane do krwi, Celem takiego systemu regulacji wydzielania tych hormonw jest najpewniej uniknicie bariery, dzielcej krew od tkanki mzgowej. ADH jest syntetyzowana gwnie w jdrach nadwzrokowych (nuclei supraoptici), za oksytocyna w jdrach przykomorowych (nucei paraventriculares). Kady z tych hormonw transportowany jest aksonami wraz ze swois tymi biakami nonikowymi, zwanymi neuro-tlzynami. Zarwno neurofizyna I, jak i II syn tetyzowane s z oksytocyna i adiuretyn jako czci jednego biaka (czasem okrelonego jako propresofizyna), kodowanego przez pojedyn-
Hormon pobudzajcy melanocyty (melanotropina, MSH). U niektrych ga-
tunkw zwierzt MSH pobudza melanogenez, powodujc rozproszenie rdkomrkowych ziarnistoci melaniny, prze2 co dochodzi do ciemnienia skry. W obrbie czsteczki POMC zawarte s 3 rnice si od siebie czsteczki MSH okrelane jako oc, P i y. Dwie z nich (a i p) wydzielane s przez niektre inne gatunki zwierzt (poza czowiekiem). U ludzi, krc a we krwi melanotropina zawarta jest w obrbie
610 / ROZDZIA 46
czy gen, Neurofizyna I i II s unikatowymi biakami o masie czsteczkowej 19 000 (neurofizyna I) i 21 000 (neurofizyna II). ADH i oksytocyna wydzielane s oddzielnie do krenia wraz ze swoimi neurofizynami. We krwi kr jako polipeptydy wolne, nie zwizane z biakami osocza. Wykazuj one bardzo krtki okres ptrwania, wynoszcy 24 minuty. Struktura ADH i oksytocyny pokazana jest poniej.
Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cvs-Pro-Arg-Gly-NH 2 A rg i n i no wazo p res y na Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH a Liz y no wazop resy na Cys-Tyr-lle-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-G1y-NH a Oksytocyna
Kady z tych hormonw jest nonapeptydem zawierajcym czsteczki cysterny w pozycjach 1 i 6 poczone ze sob mostkiem dwusiarcz-kowym. Wikszo zwierzt wytwarza argini-nowazopresyn. U wi i spokrewnionych z nimi gatunkw zwierzt w miejscu argininy w pozycji 8 wystpuje lizyna. Podobiestwo strukturalne miedzy ADH i oksytocyna tumaczy, dlaczego hormony te wywouj pewne wsplne efekty biologiczne. Gwnym miejscem inak-tywacji tych peptydw jest wtroba, chocia znaczne iloci ADH wydzielane s przez nerki. Oksytocyna Regulacja sekreji. Dranienie brodawek piersiowych jest gwnym bodcem uwalniajcym oksytocyn. Drugorzdnymi bodcami s rozdcie pochwy i macicy. Wiele czynnikw pobudzajcych uwalnianie proiaktyny uwalnia rwnie oksytocyn. Sugerowano nawet, e fragment oksytocyny jest czynnikiem uwalniajcym prolaktyn. Estrogeny pobudzaj, za progesteron hamuje syntez oksytocyny i neu-rofizyny I. ania oksytocyny jest nieznany. Powoduje ona skurcz miniwki macicy, przez co uywana jest, w dawkach farmakologicznych, do zapocztkowania porodu u kobiet. Jest ciekawe, e po zniszczeniu powrzka podwzgrzowo-przy-sadkowego u zwierzt ciarnych nie zawsze obserwuje si zaburzenia przy urodzeniu poto-
mstwa. Gwne dziaanie oksytocyny wydaje si jednak polega na obkurczeniu komrek mi-niowo-nabonkowych otaczajcych pcherzyki sutkowe. W wyniku takiego dziaania mleko zawarte w przewodach pcherzykowych ulega transportowi do brodawki sutkowej i wytryskowi. Receptory dla oksytocyny wystpuj w bonach komrkowych zarwno macicy, jak i sutkw. Liczba ich ulega wzrostowi pod wpywem estrogenw, za zmniejszeniu pod wpywem progesteronu. Wzrost stenia estrogenw, natomiast spadek progesteronu bez porednio przed rozwizaniem ciy, dobrze tumacz wystpowanie zjawiska laktacji tu przed porodem. Pochodne progesteronu s powszechnie stosowanymi substancjami hamujcymi laktacje u kobiet po porodzie. Wydaje si, e oksytocyna i neurofizyna I wytwarzane s rwnie w jajnikach, gdzie oksytocyna moe hamowa steroidogenez. Strukturami niezbdnymi dla dziaania oksytocyny s: N-kocowa grupa NH2 cys-teiny, grupa fenolowa tyrozyny, grupy karbok-syamidowe asparaginy, glutaminy i glicynami-du oraz mostek dwusiarczkowy. Przez delecje i substytucj wymienionych grup wytworzono liczne analogi oksytocyny, np. po usuniciu N-koricowej grupy aminowej cystyny (w pozycji 1} powstaa w ten sposb dea mi no oksytocyna wykazuje 45 krotnie wiksze dziaanie an-tydiuretyczne od oksytocyny. Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna) Regulacja sekreji. Bodce nerwowe, stymulujce uwalnianie ADH, ulegaj aktywacji przez wiele rnorodnych czynnikw. Najwaniejszym bodcem fizjologicznym dla uwalniania ADH jest wzrost molalnoci osocza. W uwalnianiu ADH bior udzia osmoreceptory umiej scowione w podwzgrzu oraz baroreceptory, zlokalizowane w sercu i w innych obszarach ukadu naczyniowego. Rozcieczenie krwi, obniajc molalno osocza, wywiera odwrotny (hamujcy) wpyw na wydzielanie ADH. Wrd innych bodcw wydzielania ADH wymieni naley: stresy fizyczne i psychiczne oraz leki, takie jak acetylocholma, nikotyna i morfina. Wymienione bodce pobudzaj gwnie syntez ADH i neurofizyny II, nie wpywaj natomiast na uwalnianie zapasw tego hormonu. Epinef-ryna oraz leki zwikszajce objto osocza hamuj sekrecj ADH. Podobne dziaanie ma etanol.
Mechanizm dziaania. Mechanizm dzia-
PRZYSADKA MZGOWA I HORMONY PODWZGORZA / 611
komrkami docelowymi dla ADH w stanach fizjologicznych s komrki dystalnych kanalikw krtych i zbiorczych nerki. Kanaliki te przechodz przez rdze nerki, ktrego pyn rdmiszowy wykazuje do 4-krotnie wysz molalno ni osocze. Komrki tych kanalikw s wzgldnie nieprzepuszczalne dla wody, tak e w nieobecnoci ADH nie dochodzi do zagszczenia moczu, co w konsekwencji zwiksza dobow objto moczu powyej 2 1. ADH zwiksza przepuszczalno komrek kanalikowych dla wody i umoliwia wyrwnanie molalnoci moczu zawartego w kanalikach z hi-perosmolalnym pynem rdmiszowym. W wyniku tego procesu dobowa objto moczu zmniejsza si do 0,51,01. Receptory ADH wystpuj w luminalnych bonach ptezmatycz-nych komrek kanalikowych. Receptor dla ADH, po poczeniu si z hormonem, aktywuje uyklaz adenylanow, za pozostay cAMP peni funkcj mediatora rdkomrkowego ADH w komrkach nerkowych. To dziaanie fizjologiczne uzasadnia okrelenie hormon anty-diuretyczny". cAMP oraz inhibitory ibsfodies-terazy np. kofeina, wykazuj dziaanie podobne do ADH. W badaniach in vivo, wzrost stenia wapnia w pynie opukujcym luminaln powierzchni komrek kanalikowych, hamuje efekt ADH na przezcewkowy ruch wody, najpewniej poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej. Wzrost stenia Ca2+ nie hamuje jednak samego dziaania cAMP. Obserwacja ta cho czciowo tumaczy patomechanizm wydalania zwikszonych iloci moczu u chorych z hiper-kalcemi. Patofizjologia. Nieprawidowoci w sek-recji lub dziaaniu ADH mog by przyczyn moczwki prostej, charakteryzujcej si wydalaniem wzmoonych iloci rozcieczonego moczu. Moczwka prosta typu orodkowego spo wodowana jest niedoborem ADH, uwarunkowanym zniszczeniem drogi podwzgrzowo--przysadkowej (wystpujcym przy zamaniach koci podstawy czaszki), guzem mb infekcj przysadki mzgowej, lub dziedzicznym defektem syntezy tego hormonu. W moczwce prostej nerkowopochodnej (w postaci dziedzicznej), wydzielanie ADH jest prawidowe, natomiast receptor dla tego hormonu jest uszkodzony (p. tab. 43-2). Dziedziczny defekt receptora ADH naley odrni od defektu nabytego, wystpujcego w nabytej moczwce prostej norko w o pochodnej, spowodowanej najczciej po-
Mechanizm dziaania. Najwaniejszymi
dawaniem farmakologicznych dawek soli litu chorym z psychoz maniakalno-depresyjn. Nieadekwatne w stosunku do aktualnej osmolalnoci osocza, wzmoone wydzielanie ADH wystpuje u chorych z rnymi guzami (ektopowe nadmierne wydzielanie ADH przez nowotwr), zwykle z nowotworami puc lub u chorych z zakaeniami puc, chorobami mzgu lub niedoczynnoci tarczycy. Przymiotnik nieadekwatne" oznacza, e wystpuje normalna lub nawet wzmoona sekrecja ADH u osb wykazujcych hipoosmolalno osocza. W nastpstwie, u takich chorych stwierdza si sta lub postpujc hiponatremi spowodowan rozcieczeniem osocza oraz wydzielaniem moczu hipertonicznego. PIMIENNICT WO Hormony przedniego pata przysadki
Douglass J, Civeili O, Herbert E: Polyprotein gene expression: Generation ofdiversityof neuroendocrine peptides. Annu Rev Biochem 1984;53:665. Frantz AG: Prolactin. N Engl J Med 1978;298:201. Krieger DT: The multiple faces of pro-opiomelanocortin, a prototype precursor molecule. Clin Res 1983;3:342. Nikolics K et al: A prolactin-inhibiting factor with the precursor for human gonad otropin-releasing hormone. Natur 1986;316:511, Pierce JG, Parsons TF: Glycoprotein hormones: Structure and function. Annu Rev Biochem 198!; 50:465. Seeburg P: The human growth hormone gene family: Structure and evolution of the chromosomal locus. Nucletc Acids Res 1983;11:3939.
Hormony tylnego pata przysadki

Chord IT: The posterior pituitary gland. Clin Endocrinol 1975;4:89. Robertson GL: Regulation of vasopressin function in health and disease. Recent Prg Norm Res 1977; 33:333.
Hormony podwzgrza
Imura H et al; Effect of CNS peptides on hypot-halamic regulation of pituitary secretion. Adv Biochem Psychopharmacoi 1981;28:557. Labrie F et al: Mechanism of action of hypothalamic hormones in the adenohypophysis. Annu Rev Phy-siol 1979;41:555. Reichlin S; Systems for the study of regulation of neuropeptide secretion. In: Neurosecretion and Brain Peptides: ImpUcationsfor Brain Function and Neurological Disease, Martin JB, Reichlin S, Bick KL (editors). Raven Press, 1981.
47
WPROWADZENIE
Hormony tarczycy reguluj ekspresj genw, rnicowanie tkanek i oglny rozwj. Gruczo tarczowy wytwarza dwa jodowane aminokwasy: a^^-trijodotyronin (T3 ) i 3,5,3' ,5'-tetrajo-dotyronin (T4, tyroksyna). Ich znaczenie w regulacji przemiany materii, rozwoju i rnicowaniu tkanek poznano ju dawno. Hormony te, ktrych struktur przedstawiono na ryc. 47-1, reguluj ekspresj genw przy pomocy mechanizmw podobnych do wystpujcych przy hormonach steroidowych.
Hormony tarczycy
funkcji. Radioaktywny jod kryje w sobie rwnie potencjalne ryzyko wywoania raka tar czycy, jeli gruczo ten przez duszy czas jest eksponowany na dziaanie radioizotopu (np. po wybuchach nuklearnych). Niebezpieczestwo to dotyczy szczeglnie niemowlt i modziey, u ktrych komrki tarczycy dziel si jeszcze aktywnie.
BIOSYNTEZA HORMONW TARCZYCY ZWIZANA JEST Z TYREOGLOBULIN I PRZEMIAN JODKW

Hormony tarczycy odrniaj si od innych hormonw tym, e dla ich aktywnoci biologicznej potrzebny jest pierwiastek ladowy jod. W wikszej czci wiata jod wystpuje w niewielkich ilociach w ziemi, co sprawia, e jego zawarto w rodkach spoywczych jest maa. Ten fakt tumaczy, dlaczego rozwin si zoony mechanizm zatrzymywania tego istotnego pierwiastka ladowego w ustroju i przeksztacenia go w posta nadajc si do wbudo-wywania do zwizkw organicznych. W tym samym czasie tarczyca musi syntetyzowa tyro-nin i synteza ta zachodzi w tyreoglobulinie. Procesy te zostan omwione oddzielnie, chocia przebiegaj rwnolegle.
Choroby tarczycy nale do najczciej wystpujcych endokrynopatii. Zarwno diagnostyka jak i leczenie tyreopatii s cile oparte na znajomoci fizjologii i biochemii hormonw tarczycy. Dostpno radioizotopw jodu w istotnym stopniu pomoga wyjani jego fizjologi i biochemi. Radioaktywny jod, gromadzc si w tarczycy, jest szeroko wykorzystywany w diagnostyce i terapii zaburze jej
Skrty uywane w tym rozdziale - dijodotyrozyna monojodotyrozyna trijodotyronina tyroksyna, tetrajodotyronina TBG globulina wica tyroksyn TBPA frakcja prealbumin wicych tyroksyn TRH hormon pobudzajcy tyreotropi n, tyreoliberyna TSH tyreotropina TSI immunoglobuliny klasy IgG pobudzajce tarczyc MIT T3 T4
DIT
Tyreoglobulina jest biakiem zoonym

Biosynteza. Tyreoglobulina jest prekursorem T* i T3. Jest to due biako jodowane i gli-kozylowane o masie czsteczkowej 660 000 przy czym wglowodany stanowi 810%, za jod 0,21% caej masy tyreoglobuliny. Zawarto jodu w czsteczce tyreoglobuliny zalena jest od zawartoci tego pierwiastka w poywieniu. Tyreoglobulina skada si z dwch podjednostek.
HORMONY TARCZYCY I 613
ci luminalnej i magazynowana w pozakomr-kowym koloidzie "pcherzy kowym. CH,CH-COOH Ze wiata pcherzykw tyreoglobulina HO I ponownie dostaje si do komrek NH, pcherzykowych. Przemieszczajc si od 3-M o no) od o tyrozyna (MIT) powierzchni luminalnej do bazal nej komrek pcherzykowych tyreoglobuliny ulega I hydrolizie do aktywnych hormonw T3 i T4. CH,CH-COOH Wszystkie wymienione etapy biosyntezy nasilaj si pod wpywem TSH. Hormon ten (l u b cAMP) stymuluje rwnie transkrypcje NH, genu kodujcego tyreoglobutin. 3,5-Dljodotyrozyna (DIT) Hydroliza. Tyreoglobulina jest zapasow postaci T3 i T4 w koloidzie. W normalnej tarczycy zapasy dla tych hormonw wystarCH,CH-COOH czaj na kilka tygodni. W cigu zaledwie kilku minut po zadziaaniu TSH (lub cAMP) stwierNH, dza si znaczny wzrost mikrokosmkw na 3,5,3',5' szczytowej (apikalnej) donie komrek pcherzykowych. W procesie tym, zalenym od -Tetrajodotyronlna (tyroksyna, TJ mik-rotubul, tyreoglobulina jest I I wychwytywana przez mikrokosmki i przemieszczana do komrek pcherzykowych -CH 2 CH-C OO H mechanizmem pinocy tozy. 2 __ / | Te fagosomy zlewaj si z lizosomami twoNH2 rzc fagolizosomy, w ktrych zachodzi hydro3,5j3'-Trljodotyronina (T3) liza tyreoglobuliny do aminokwasw, w tym rwnie do jodotyronin, pod wpywem rnych I I proteaz kwanych i peptydaz. Powstae T4 i T3 wydalane s z bazalnego bieguna komrek pcherzykowych do krwi, najpewniej za porednictwem transportu uatwionego. Stosunek T4:T3 we krwi tarczycy jest mniejszy ni w tyreo-globulinie, co sugeruje, e zachodzi okrelona, wybircza dejodynacja T4 w tym 3,3',5'-Trl]odolyronlna {odwrotna T,, rTJ narzdzie endokrynnyrn. Dziennie wydzielanych jest ok, 50 (j.g jodu pod postaci Ryc. 47-1. S truktura chemiczna ho rmo nw tar czycy i zwizkw po krewnych. hormonw tarczycy. Przy rednim wychwycie jodu przez tarczyc (wynoszcym 2530% jodu spoytego z pokarmami) zapotrzebowanie na ten Zawiera ona 115 reszt tyrozynowych, z ktrych pierwiastek wynosi 150200 (ig/d. kada jest potencjalnym miejscem jodowania. Jak o tym wspomniano ju wyej, wikszo Okoo 70% jodu czsteczki tyreoglobulinowej jodu zawartego w tyre o globulinie nie wystpuje wystpuje w postaci nieaktywnych prekurso - w postaci jodotyronin, lecz (ok. 70%) pod rw, tj. monojodotyrozyny (MIT) i postaci nieaktywnej MIT i DIT. Te ostatni e dijodotyrozy-ny {DIT), za 30% w postaci reszt dwa aminokwasy s uwalniane w wyniku hydjodo ty ronino-wych T4 i T3. Przy dostatecznej rolizy tyreoglobuliny. Jod zawarty w MIT i DIT poday jodu stosunek T4 i T3 wynosi 7:1. W zostaje odzyskany" dziki enzymowi stanach niedoboru jodu ten stosunek ulega dejo-dynazie. Enzym ten, ktry jest zaleny od zmniejszeniu, podobnie jak stosunek DIT:MIT. NADPH, wystpuje rwnie w nerkach i wt Przyczyna syntezy duej czsteczki robie. Jod uwolniony z MIT i DIT stanowi tyreoglobuliny, zoonej z ok. 5 000 wan pul tego pierwiastka w obrbie tarczycy aminokwasw, po to by wytworzy zaledwie i rni si od anionu I~ wchodzcego do kilka tylko czsteczek zmodyfikowa nego tarczycy z krwi. W stanie rwnowagi ilo jodu dipeptydu, wydaje si tkwi w tym, e wchodzcego do tarczycy jest rwna iloci tego sprzgania reszt tyrozylowych i organifikacja pierwiastka opuszczajcego ten gruczo. Jeeli jodu wymagaj znacznej konformacji czsteczki tyreoglobuliny. Tyreoglobulina jest syntetyzowana w czci bazalnej komrek pcherzykw tarczycowych skd transportowana jest do cz -
,-
"A
*=*
'L,
614 / ROZDZIA 47
jedna trzecia cz jodu tyre o globulin owego i DIT, s dostpne ponownej biosyntezie w ob-opuszcza tarczyc (pod postaci T4 i T3 ),pozos- rbie tego gruczou. Przemiana jodkw skada tale dwie trzecie, pochodzce z dejodynacji MIT si z kilku odrbnych etapw (p. ryc. 47 -2). IWIATO PCHERZYKA TARCZYCOWEGO
Ryc. 47-2. Schemat jodkowego I w pcherzyku tarczycowym Przedstawiono komrk pcherzyka tarczycowego zwrcon u gry do wiata pcherzyka (przestrze zakropkowana), za na dole do przestrzeni pozakomrkowej (rdmizszowej). Aniony ! wchodz do komrki za pomoc pompy lub dyfuzji biernej. Synteza hormonw tarczycy zachodzi w wietle pcherzyka; jest ona reakcj wieloetapow. W wielu jej etapach udzia bierze peroksydaza. Uwolnienie hormonw tarczycy z tyreoglo-buliny zachodzi przez hydroliz. Tgb tyreoglobulina, MIT monojodotyrozyna, DIT dijodotyrozyna, Ta trijodotyronina, T, tetrajodotyronina. Gwiazdka oznacza miejsca wystpowania dztdzicznych defektw enzymatycznych, bdcych przyczyn wrodzonego wola przebiegajcego czsto z niedoczyn-noci tarczycy.
PRZESTR ZEC P0ZAK0M0 RKOWA (SRODMt SZOWA) przemiany anionu
MI T M I T . DIT, DIT Sprz ganie'
T3, T,
HORMONY TARCZYCY / 615
cy. Gruczo tarczowy, podobnie jak wiele innych narzdw lub tkanek typu nabonkowego (np. gruczo sutkowy, kosmwka, linianki, odek) wykazuj zdolno zagszczania I", wbrew obecnoci znacznego gradientu elektrochemicznego. Jest to energochonny proces sprzony z pomp zalen od Na+/K+ ATP--azy. Aktywno tarczycowej pompy I~ mona oddzieli od kolejnych etapw biosyntezy hormonw tarczycy stosujc inhibitory procesu organifikacji I~, bdce pochodnymi tiomocz-nika (ryc. 47-3). Iloraz ze stenia jodu w tarczycy (T) do stenia tego pierwiastka we krwi (S) (iloraz T:S) jest odzwierciedleniem aktywnoci wymienionej pompy lub mechanizmu zagszczajcego I~. Aktywno tej pompy wyrao na ilorazem T/S jest kontrolowana gwnie przez TSH i waha si moe od 500 u zwierzt przewlekle stymulowanych TSH, do 5 lub mniej u zwierzt pozbawionych przysadki mzgowej. U ludzi spoywajcych diet o normalnej zawartoci jodu iloraz T:S wynosi ok. 25. Tylko bardzo maa ilo jodkw wnika do tarczycy na zasadzie dyfuzji. Anion I", ktry nie ulega organifikacji do MIT lub DIT (ok. 10%) opuszcza tarcz yc w ten sam sposb. Mechanizm transportu I~ do tarczycy hamu j dwie grupy zwizkw. Pierwsz grup tworz nadchlorany (ClOl), nadreniany (ReOi), nad-technecjany (TeO'i), tj. aniony o podobnej czciowo swoistej objtoci do anionu I~. Aniony te dziaaj konkurencyjnie do I~ w odniesieniu do przenonika jodkowego i ulegaj zagszczaniu przez tarczyc. Radioaktywny TeO^. jest powszechnie stosowany w badaniach transportu anionu I" u ludzi. Linearny anion rodankowy (SCN~) jest przedstawicielem drugiej grupy zwizkw bdcych kompetycyjnymi inhibitorami transportu I~, lecz nie ulegajcymi zagszczeniu w tarczycy. Te inhibitory trans I N-C
H NH2
1. Zagszczanie jodkw (I )w tarczy -
portu I~ pozwalaj ujawni wystpowanie szybkiej dyfuzji wymienialnego I z tarczycy i wykorzystywane s w diagnostyce defektw procesu organifikacji jodu w tarczycy. Po podaniu inhibitora transportu I~ w steniu hamujcym koncentracje I~, ilo zgromadzonego w tarczycy I ' (mierzonego z reguy przy uyciu izotopu 131I) opuszczajcego ten gruczo jest miar frakcji jodu niezwizanego, tj. jodu, ktry nie uleg organifikacji. U chorych z czciowym defektem w zakresie organifikacji jodu ilo 131I uwalniajcego si z tarczycy po podaniu nadchloranw jest wiksza ni u osb zdrowych. 2. Utlenianie l ~ . Tarczyca jest jedyn tkank wykazujc zdolno utleniania anionu I~ do wyszej wartociowoci. Jest to niezbdny etap w procesie organifikacji I" i biosyntezy hormonw tarczycy. Tn etap wymaga obecno ci peroksydazy, zawierajcej hem i wystpuje na luminalnej powierzchni ko mrek pcherzy kw tarczycowych. Peroksydaza tarczycowa jest biakiem tetra-merycznym o masie czsteczkowej 60 000. Do procesu utlenienia enzym ten wymaga nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru (HjCb) wytwarzany jest przez enzym zaleny od NADPH, przypominajcy reduktaze cytochromu C. Utlenianie I~, i co za tym idzie, jego wbudowywanie do MIT i DIT, hamuje wiele zwizkw. Do najwaniejszych z nich, z punktu widzenia klinicznego, nale leki bdce pochodnymi tiomo-cznika. Niektre z nich przedstawiono na ryc. 47-3. S one znane jako leki przeciwtarczyco-we7 ', poniewa dziaaj one hamujco na ten etap biosyntezy hormonw tarczycy. 3. Jodowanie tyrozyny. Utleniony anion I~ reaguje z resztami tyrozylowymi tyreoglobuliny; w reakcji tej uczestniczy prawdopodob nie tyreoperoksydaza. Najpierw ulega jodowa niu wgiel w pozycji 3, a nastpnie wgiel w pozycji 5 piercienia aromatycznego tyrozyH NCH
I NH,
Tio/noeznik
y
H
Tlouracyl
>
V f
NC S =C H
PropylotlouracyJ
,CH N-CC3H7
s=<(
NCH CH3
Ryc. 47-3. Leki przeciwtarczycowe, pochodne tiomocznika.
616 / ROZDZIA 47
ny. W wyniku tych reakcji powstaje MIT iub DIT. Reakcja ta, czasami okrelana jako or-ganifikacja jodu, zachodzi w cigu sekund w wietle pcherzyka tarczycowego. Po organi-fikacji jod nieatwo opuszcza tarczyce. Wolna tyrozyna moe ulec jodowaniu, lecz nie zostaje wbudowywana do biaek, poniewa aden tRNA nie rozpoznaje jodowanej tyrozyny. dwch czsteczek DIT w celu wytworzenia T4) lub jednej czsteczki DIT z jedn czsteczk MIT, w celu wytworzenia Tj, zachodzi w obrbie czsteczki tyreo globu liny. Nie wyklucza si, e rwnie wolna czsteczka MIT wzgldnie DIT ulega sprzganiu ze zwizan w tyreoglo-bulin czsteczk DIT. Poniewa nie znaleziono dotychczas oddzielnego enzymu sprzgajcego, a proces ma charakter reakcji,utleniania, przyjmuje si, e reakcj t katalizuje tyreoperok-sydaza (patrz pkt 2), pobudzajc tworzenie si wolnych rodnikw jodotyrozynowych. Tak hipotez potwierdza m.in. to, e te same leki, ktre hamuj utlenianie I~, hamuj rwnie proces sprzgania. Powstae hormony tarczycy stanowi integraln cz tyreoglobuliny tak dugo, jak dugo ta ostatnia nie ulega degrada cji. Hydroliz tyreoglobuliny pobudza TSH, natomiast hamuje I". Ten ostatni fakt jest czasami wykorzystywany w leczeniu nadczyn-noci tarczycy za pomoc jodku potasowego.
4. Sprzganie jodotyrozyn. Sprzganie
HORMONY TARCZYCY ULEGAJ ZWIZANIU PRZEZ BIAKA NONIKOWE W OSOCZU A NASTPNIE PRZEMIANIE
Poowa do \ oginoustrojowego T4 i T3 znajduje si poza tarczyc i wikszo tych hormonw jest zwizanych przez dwa swoiste biaka wice, tj.przez globulin wic tyroksyn
(thyroxine binding globulin TBG) oraz prcal-humine wic tyroksyn (thyroxine binding prealbumin TBPA). Pod wzgldem ilociowym waniejsza z nich jest TBG, bdca gliko-protein o masie czsteczkowej 50000. Wykazuje ona 100-krotnie wiksze powinowactwo do T4 i T3 ni TBPA. Jej pojemno wizania tych hormonw wynosi 20 ug na 100 ml osocza. W warunkach prawidowych TBG wie nieko-walencyjnie prawie ca ilo T4 i T3 wystpujc w osoczu (p. tab. 47-1). Niewielka pod wzgldem ilociowym frakcja T4i T3 nie zwizana z biakami nonikowymi odpowiedzialna jest za aktywno biologiczn tych hormonw. Pomimo e oglne slenia T4 i T3 znacznie si od siebie rni, stenie wolnej (nie zwizanej z biakami nonikowymi) T3 jest zblione do stenia wolnej T4, chocia okres pltrwania T4 jest 4-krotnie duszy od T3 . Stenie TBG zalene jest od wielu czynnikw regulacyjnych co ma istotne znaczenie dla bada czynnoci tarczycy, w ktrych oznacza si najczciej cakowite stenie T4i T3 a nie stenie frakcji wolnej tych hormonw. Biosynteza TBG zachodzi w wtrobie i wzrasta pod wpywem estrogenw (np. u kobiet ciarnych lub zaywajcych doustne leki antykoncepcyjne). Spadek syntezy TBG obserwuje si po leczeniu androgenami lub glikokortykoidami oraz w przebiegu pewnych chorb wtroby. Zdarzaj si rwnie genetycznie uwarunkowana nadprodukcja lub niedobory TBG. We wszystkich tych stanach obserwuje si zmienione oglne stenia T4i T^, natomiast nie zmienione stenia wolnej frakcji (nie zwizanej z biakami nonikowymi) tych hormonw. Fenytoina i kwas salicylowy s lekami kompetycyjnie wicymi si z TBG (przez co wypieraj T4 i T3 z TBG). W nastpstwie dziaania tych lekw dochodzi do spadku oglnego stenia tych hormonw we krwi, przy czym stenie frakcji
Tabela 47-1. Charakterystyka T. i T, wystpujcych w osoczu krwi Cakowite stenie hormonu nmol/l (Kg/dl) Stenie wolnego hormonu (nie zwizanego z biakiem) jako % stania cakowitego w ng/dl w molach Okres ptrwania (w dniach)
T3
103 (8) 2,29 ' (0,15)
0,03 0,3
-2,24 -0,4
3,0x10~
11
6,5 1,5
-0,6x10"
11
HORMONY TARCZYCY / 617
nie zwizanej z TBG (stenie wolnej T4 i T3) nie ulega zmianie. Ten fakt naley uwzgldni przy interpretacji wynikw testw diagnostycznych. W procesie pozatarczycowego odjodowania T4 ulega konwersji do T3. Skoro w komrkach docelowych T3 wykazuje dziesiciokrotnie silniejsze powinowactwo do receptora ni T4, uwaa si, e T3 jest gwnym, metabolicznie aktywnym hormonem tarczycy. Okoo 80% krcej we krwi T4 ulega w tkankach obwodowych konwersji do T3 lub odwrotnej T3 (rTj), Ta konwersja jest rdem wikszoci Tj powstajcej w ustroju. Odwrotna T3 jest bardzo sabym agonist T3 powstajcym we wzgldnie wikszych ilociach w przewlekych chorobach, w stanach godzenia wglowodanowego i u podw. Propylotiouracyl i propranolol zmniej szaj konwersje T4 do T3. Inne mechanizmy przemiany hormonw tar czycy polegaj na ich cakowitym odjodowaniu oraz inaktywacji poprzez deaminacj i dekar-boksylacj. W wyniku glukuronidacji lub sul-fatacji zachodzcej w wtrobie, powstaj czsteczki bardziej hydrofilne, wydalane z ci, po czym ponownie resorbowane z przewodu pokarmowego, odjodowane w nerkach i wydalone z moczem pod postaci glukuronidw.
HORMONY TARCZYCY DZIAAJ NA POZIOMIE JDRA KOMRKOWEGO

Hormony tarczycy wi si ze swoistymi receptorami wysokiego powinowactwa zlokalizowanymi w jdrze komrkowym komrek docelowych. T3 wykazuje 10-krotnie silniejsze powinowactwo do tych receptorw ni T4. Pytanie, czy caa aktywno biologiczna hormonw tarczycy poredniczona jest przez T3, jest przedmiotem spornym, poniewa zarwno T4, jak i T3 s hormonami aktywnymi. Hormony tarczycy wi si z biakiem cytoplazmy wykazujcym sabe powinowactwo do Tj i T4. Biako to jest zapewne rne od biaka receptorowego jder komrkowych. Wizanie hormonw tarczycy przez biaka cytoplazmatyczne ma najpewniej na celu trzymanie" tych hormonw w ssiedztwie swoistych receptorw jdrowych. Oglna funkcja hormonw tarczycy polega na stymulacji konsumpcji tlenu. Wedug hipotezy Edelmana i wsppracownikw znaczna ilo energii zuytkowana przez komrk wykorzystywana jest do napdzania pompy Na /K+-
-ATP-azowej. Hormony tarczycy nasilaj czynno tej pompy poprzez zwikszanie liczby jednostek pompujcych. Skoro wszystkie komrki maj tak pomp i faktycznie reaguj na hormony tarczycy, uwaa si, e podstawowy mechanizm ich dziaania polega na zwikszaniu utylizacji ATP i zwizanej z ni wzmoonej konsumpcji tlenu w procesie fosforylacji oksydacyjnej. Innym wanym skutkiem dziaania T4 i T3 jest wzrost syntezy biaka oraz dodatni bilans azo towy. Hormony tarczycy, podobnie jak hormony steroidowe, pobudzaj lub hamuj syn tez biaka nasilajc lub obniajc transkrypcj odpowiednich genw (p. ryc. 45-1). W przypadku T3 i T4 czynnikiem dziaajcym w ukadzie trans jest kompleks jecepiora z hormonem tarczycowym zawsze umiejscowionym w jdrze komrkowym. Element odpowiedzi hormonalnej, dziaajcy w ukadzie cis oraz wicy si z tym kompleksem, skada si z nastpujcej centralnej sekwencji DNA GATCAnnnnnn TGACC (p. tab. 45-3). Midzy tymi dwiema kasami hormonw uczestniczcych w procesie wzrostu, tj. midzy hormonami tarczycy a samym hormonem wzrostu (somatotropin), istnieje ciekawa wsppraca. T3 i glukokortykoidy nasilaj transkrypcj genu kodujcego hormon wzrostu, przez co wzrasta biosynteza GH. Ten fakt wyjania klasyczn obserwacje braku GH w przysadkach mzgowych zwierzt z niedoborem Tj. Wyjania on rwnie, chocia tylko czciowo, anabohczne dziaanie tego ostatniego hormonu. Bardzo due stenia T., s przyczyn spadku syntezy biaka oraz wystpienia ujemnego bilansu azotowego. Hormony tarczycy s znanymi, wanymi modulatorami procesw rozwojowych. Jest to naj lepiej widoczne w metamorfozie pazw. I tak hormony tarczycy s potrzebne w procesie przeksztacenia si kijanki w ab. W procesie tym dochodzi do resorpcji ogonka, proliferacji zawizkw koczyn, konwersji syntezy hemoglobiny podowej na hemoglobin typu doros ego, pobudzenia enzymw cyklu mocznikowego (syntetazy karbamoilofosforanowej), przez co dochodzi do wydalania mocznika zamiast NHt oraz do zmian naskrka. Wymienione zmiany s zapewne wynikiem regulacji ekspresji swoistych genw przez te hormony. Hormony tarczycy s potrzebne do normalnego rozwoju czowieka. Niedoczynno tarczycy wystpujca w yciu podowym lub u noworodkw jest
618 / ROZDZIA 47
przyczyn matoectwa (kretynizmu); jest to stan chorobowy charakteryzujcy si licznymi defektami wrodzonymi oraz cikim nieodwracalnym niedorozwojem umysowym. PATOFIZJOLOGIA WIELU CHORB TARCZYCY WYKAZUJE ZWIZEK Z SEKRECJ TSH, T 3 iT, Wole oznacza powikszon tarczyc Wolem okrela si jakiekolwiek powikszenie tarczycy. Wole proste jest wyrazem mechanizmu kompensacyjnego spowodowanego niedostatecznym wytwarzaniem hormonw tarczycy. Wsplnym mianownikiem dla wszystkich tych stanw jest podwyszony poziom TSH w surowicy krwi. Wrd przyczyn wola prostego naley wymieni niedobr jodkw w poywieniu, nadmiern poda jodkw u osb z uszkodzonym mechanizmem autoregulacji syntezy hormonw tarczycy oraz rnorodne dziedziczne zaburzenia biosyntezy hormonw tarczycy. Wrd tych ostatnich mona wymieni:)) zaburzenia w zakresie transportu anionw I~, 2) zaburzenia procesu jodowania lub 3) sprzgania, 4) niedobr dejodynazy oraz 5) biosyntez nieprawidowych biaek jodowanych. Wystpowanie czciowych zaburze na poziomie poszczeglnych etapw biosyntezy hormonw tarczycy moe by przyczyna wystpowania wola prostego u osb dorosych. Cikie zaburzenia natomiast s przyczyn nied oczy nnoti tarczycy. Leczenie wola prostego polega na podawaniu egzogennych hormonw tarczycy. Suple-mentacja lub restr ykcja poday I s waciwym postpowaniem tylko w okrelonych rodzajach wola. Niedostateczna ilo wolnej T, lub T4 jest powodem niedoczynnoci tarczycy Tak sytuacj spotyka si w pierwotnej niedoczynnoci tarczycy, lecz moe ona by rwnie spowodowana chorob przysadki mzgo wej lub podwzgrza. W niedoczynnoci tar czycy stwierdza si obnienie podstawowej przemiany materii oraz aktywnoci innych procesw zalenych od hormonw tarczycy. Gwnymi objawami niedoczynnoci tarczycy s: zwolnienie czynnoci serca, nadcinienie rozkurczowe, oglne spowolnienie, senno, zaparcia, nadwraliwo na zimno, sucha skra, amliwo wosw oraz bladota cera. Obec-
no innych objaww zalena jest od wieku, w ktrym choroba si rozwina. Niedoczyn-no tarczycy, pojawiajca si w pnym dziecistwie, przejawia si niskim wzrostem, nte ma tu jednak upoledzenia umysowego. Rne rodzaje etiologiczne niedoczynnoci tarczycy leczy si podawaniem egzogennych hormonw tego gruczou. Nadczynno tarczycy (tyreotoksykoza) spowodowana jest nadmiernym wytwarzaniem hormonw tarczycy Wiele jest przyczyn nadczynnoci tarczycy. W USA w wikszoci przypadkw przyczyn nadczynnoci tarczycy jest choroba Gravesa. Jest ona spowodowana wytwarzaniem immutio-globulin klasy IgG pobudzajcych receptory tyre-otropinowe (thyroid stimulating immunoglobu-lins TSI) (p. tab. 43-2). S one przyczyn powikszania si tarczycy i nadmiernej, niekontrolowanej biosyntezy T3 i T4, spowodowane nie wy stpieniem sprzenia zwrotnego midzy TSI a wytwarzaniem hormonw tarczycy. Ob jawy chorobowe dotycz wielu ukadw. Wrd nich naley wymieni tachykardi, wysok amplitud cinienia skurczowo-rozkurczowego, nerwowo, bezsenno, chudnicie pomimo wzmoonego apetytu, osabienie, nadmierne pocenie si, nietolerancj ciepa oraz zarowion, wilgotn skr. Leczenie nadczynnoci tarczycy spowodowanej chorob Gravesa polega na stosowaniu lekw blokujcych biosyntez hormonw tarczycy, niszczeniu miszu tarczycowego za pomoc radioaktywnego jodu (ilI) lub rwnoczesnym stosowaniu obu sposobw terapii. Czasami usuwa si tarczyc chirurgicznie. PIMIENNICTWO
Chopra U et al: Pathways of metabolism of thyroid hormones. Recent Prg Horm Res 1978;34:531. Larsen PR: Thyroid-pituitary iateraction: Feedback regulation of thyrotropin secretion by thyroid hormones. N Engl J Med 1982;396:23. Oppenheimer JH: Thyroid hormone action at the nuciear level. Ann Intern Med 1985;102:374. Robins J et al: Thyrosin e transport proteins of plamsa: Molecular properties and biosynthesis. Recent Prg Horm Res 1978;34:477. Samuels H: Regulation of gene expression by thyroid hormone. J Clin Invest 1988;81:957.
Hormony regulujce przemian wapniow

48
WPROWADZENIE
Jony wapniowe s regulatorami licznych wanych procesw fizjologicznych i biochemicznych. Wrd nich naley wymieni pobudliwo
nerwowo-miniow, krzepnicie krwi, procesy sekrecyjne, integralno morfologiczn bon, transport przez bony plazmatyczne, reakcje en zymatyczne, uwalnianie hormonw i neuroprze-kanikw oraz rdkomorkowe dziaanie licz nych hormonw. Ponadto
waciwe stenia Ca2+ iPOJ~wpyniepozakomrkowymioko -stnej^p otrzebne s w procesie mineralizacji koci. Do prawidowego przebiegu wymienionych procesw stenie CaI+ w osoczu musi by utrzymywane w wskich granicach. Treci tego rozdziau jest wyjanienie mechanizmw zabezpieczajcych izokalcemi.
Odchylenia stenia wapnia zjonizowanego od wartoci prawidowej mog by przyczyn licznych zaburze i s grone dla ycia. A 3% chorych hospitalizowanych wykazuje zaburzenia homeostazy wapniowej.
WAP WYSTPUJE W KOCIACH I PYNIE P0ZAK0MRKOWYM

Zawarto wapnia w ustroju wynosi ok. 1 kg. Z tej iloci 99% znajduje si w kociach, gdzie wraz z fosforanami tworzy krysztaki hydro-ksyapatytu, stanowice nieorganiczny skadnik struktury koci. Ko jest tkank dynamiczn, ulegajc cigej przebudowie pod wpywem zmieniajcych si obcie. W stanie rwno-
wagi nasilenie osteogenezy (nowotworenia koci) jest rwna nasileniu osteolizy (resorpcji koci). Wikszo wapnia wystpujcego w kociach nie jest swobodnie wymienialna z wapniem pynu pozakomrkowego (ECF). Tak wic oprcz funkcji mechanicznej koci s wielkim rezerwuarem wapnia. Okoo 1% wapnia wystpujcego w kociach stanowi pul wapnia wymi enialnego. Ta pula tworzy wraz z drobn czci wapnia przestrzeni podokostnowej (wynoszc 1 % wapnia cakowitego tej przestrzeni) tak zwan wymienialn pul Ca*+. Hormony omawiane w tym rozdziale reguluj stenie wapnia w pynie pozakomorkowym oddziay-wujc na transport wapnia poprzez bon oddzielajc przestrze wodn pozakomrkow systemow od przestrzeni wodnej kostnej (jest to przestrze otaczajca osteocyty i umiejscowiona pod warstw osteoblastw i osteoklas-tw przyp. tumacza). Transport ten pobu dza gwnie parathormon, chocia uczestniczy w nim rwnie kalcytriol (1,25-dihydroksycho-lekalcyferol). Obecny w osoczu wap wystpuje w trzech postaciach: l)jako wap w kompleksach z kwasami organicznymi, 2) zwizany z biakami i 3) /jonizowany. Okoo 6% wapnia cakowitego osocza jest zwizanych (skompleksowanych) z anionami cytrynianowymi, fosforanowymi lub innymi. Pozostay wap wystpuje w postaci zwizanej z biakami (gwnie albuminami) lub zjonizowanej, nie zwizanej z biakami (po 47% wapnia cakowitego). Stenie wapnia zjonizowanego (Ca2+) u wikszoci ssakw, ptakw i ryb sodkowodnych utrzymywane jest w steniach od 1,1 do 1,3 mmol/1 i stanowi biologicznie aktywn frakcj tego pierwiastka. Ustrj czowieka wykazuje niewielk tolerancj na znaczniejsze odchylenia stenia Ca2+ od
620 / ROZDZIA 48
wymienionych wartoci. W razie spadku stenia wapnia zjonizowanego zwierz wykazuje wzmoon pobudliwo nerwowo -miniow i mog wystpi drgawki tyczkowe. Znaczne wzrosty stenia wapnia w osoczu mog by przyczyn mierci spowodowanej poraeniem mini i piczk. Stenie wapnia zjonizowanego w osoczu wraz ze steniem towarzyszcego mu anionu fosforanowego znajduje si blisko ich iloczynu rozpuszczainoci. Dlatego wydaje si, e wizanie wapnia z biakami moe zapobiec wytrca niu si wapnia z roztworu i powstawaniu ekto-powych zwapnie (kalcyfikacji). Zmiany stenia biaek w osoczu krwi (gwnie uwarun kowane zmian stenia albumin, a w mniejszym stopniu zmian stenia globulin, ktre rwnie wi wap) s powodem rwnolegle przebiegajcych zmian stenia wapnia cakowitego. Np. spadek stenia albumin o 10 g/J jest powodem obnienia si poziomu wapnia cakowitego o ok. 0,2 mmol/1 (0,8 mg/dl). Zmian przeciwn obserwuje si w razie wzrostu stenia albumin. Wizanie wapnia przez biaka osocza jest zalene od pH. I tak kwasica zwiksza stenia wapnia zjonizowanego, natomiast zasadowica, zwikszajc wizanie wapnia przez biaka osocza, jest przyczyn spadku stenia Ca2+. Spadek stenia Ca2 + jest prawdopodobnie przyczyn wystpienia zdrtwieli i mrowie u chorych z zespoem hiperwentyJacyjnym, charakteryzujcym si zasadowica oddechow. W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ UCZESTNICZ G,0WNIE DWA HORMONY Pa rat hormon (PTH) jest polipeptydem jednoacuchowym zoonym z 84 aminokwasw Hormon ten (o masie czsteczkowej 9500) nie zawiera w swojej strukturze wglowodanw lub innych czsteczek zwizanych z nim kowalen-cyjnie (ryc. 48-1). Pena aktywno biologiczna zwizana jest z N-kocowym fragmentem hormonu. N-kocowy fragment, skadajcy si z 34 aminokwasw (PTHj -), wykazuje pen aktywno biologiczn. Fragment PTH3;_34 jest gwnie odpowiedzialny za wizanie si z receptorem. PTH powstaje z czsteczki prekursorowej zoonej z U 5 aminokwasw (ryc 48-1). Bezporednim prekursorem PTH jest proPTH, r-
nicy si od natywnego hormonu obecnoci bardzo zasadowego heksapeptydu na N-kocu. Znaczenie czynnociowe tego heksapeptydu jest niejasne. Pierwotnym produktem transkrypcji genu kodujcego ten hormon jest preproPTH, bdcy bezporednim prekursorem proPTH. PreproPTH rni si od proPTH obecnoci dodatkowego acucha polipeptyd owego na N-kocu, zoonego z 25-aminokwasw. Ten dodatkowy polipeptyd ma charakter hydrofobowy, podobnie jak sekwencje liderowe lub sygnalne innych biaek sekrecyjnych. Szczegow sekwencj aminokwasow preproPTH, prePTH i PTH przedstawiono na ryc. 48-1. Sekwencj zjawisk zwizanych z przeksztaceniem preprohormonu PTH do PTH,^ przedstawiono na ryc. 48-2. PreproPTH ulega transferowi do cystern siateczki endoplazmatycznej podczas trwajcej jeszcze translacji mRNA (kodujcego PTH) na rybosomach. Podczas tego transferu, fragment sygnalny prepropeptydu, zoony z 25 aminokwasw, uiega odszczepie-niu, dziki czemu powstaje proPTH, Nastpnie ten ostatni ulega przemieszczeniu do aparatu Golgiego, gdzie zachodzi enzymatyczne od-szczepienie heksapeptydu na N-kocu. W wyniku tej reakcji powstaje ostateczna dojrzaa" czsteczka PTH. Czsteczki PTH zlokalizowane w pcherzykach sekrecyjnych uwalniajcych si z aparatu Golgiego mog ulec I) magazyno waniu w puli zapasowej", 2) degradacji lub 3) wydzielaniu do krwi. Synteza, sekrecja i przemiana PTH s regulowane Regulacja syntezy. Na szybko syntezy i degradacji proPTH nie ma wpywu stenie Ca2+ w rodowisku, pomimo e synteza i wydzielanie PTH znamiennie wzrastaj przy obnionych steniach zjonizowanego wapnia. Rzeczywicie a 8090% powstaiego w obrbie komrek lub w ukadach dowiadczalnych proPTH nie ulega przeksztaceniu do PTH. Z powyszego faktu naley wnioskowa, e wikszo powstaego proPTH jest szybko rozkadana. Pniej wykryto, e nasilenie degradacji proPTH zmniejsza si przy niskich ste niach Ca2+ , natomiast wzrasta, jeli stenia Ca2 + s wysokie. Sugeruje to, e zmiany stenia Ca2+ wpywaj na syntez PTH oddziaujc na szybko degradacji proPTH a nie jego syntez. Nieustajca i staa synteza proPTH (synteza konstytutywna) znajduje swoje odzwierciedlenie w steniach mRNA kodujcego
HORMONY REGULUJCE PRZEMIAN WAPNIOW / 621

-Sekwencja sygnalna (prei Sekwencja Lysf AlaISer(MBMet) - NH,
Ryc. 48-1,
patn aktywno Struktura bydlcego pre-proPTH. Strzaki wskazuj na biologiczna dziaania enzymw rozszczepiajcych hormon w obrbie przytarczyc (strzaki oznaczone jako [1-5]) lub w obrbie (strzaki oznaczone jako [4-5]) po jego wydzielaniu do krwi. Fragment Ckocowy
Sakwencja warunkujca
miejsca wtroby Do
ValfLeur Ile TLysfAiatLyslPralGIfl - C
OH
fragmentu biologicznie aktywnego (PTH,_M) przyczona jest sekwencja aminokwasw, nie majca wpywu na aktywno hormonu i jego wizanie z receptorem. {Wedug J. F. Habener: Recent advances in parathyroid hormone research. Clin. Biochem. 1981, 14, 223, w niewielkiej modyfikacji i za zezwofeniem).
PTH, ktre nie zmieniaj si pomimo zaocznych waha stenia Ca2 + w pynie pozakom-rkowym. Wydaje si, e zwikszenie syntezy PTH jest moliwe jedynie poprzez przerost lub rozrost komrek gwnych przytarczyc, wytwarzajcych ten hormon. PTH rozpoczyna si ok. 20 min po syntezie proPTH i nie ma na ni wpywu stenie Ca2+. Wystpuje ona po wbudowaniu hormonu do pcherzykw sekrecyjnych. Nowo powstay PTH moe zosta natychmiast wydzielony do krwi lub te zmagazynowany w pcherzykach sekrecyjnych, a dopiero pniej wydzielony. Proces rozkadu rozpoczyna si w chwili wejcia
Regulacja przemiany PTH. Degradacja
pcherzykw sekrecyjnych do przedziau (kom-partmentu) zapasowego. W wyniku proteolitycznej degradacji powstaj swoiste produkty rozpadu (ryc. 48-1, 48-2), we krwi za stwierdza si due stenia C-kocowych fragmentw czsteczki PTH. Te fragmenty, o masie czsteczkowej ok. 7000, skadaj si z odcinka PTH37.S4 i w mniejszym stopniu odcinka PTH34.N4 acucha polipep-tydowego tego hormonu. Wikszo nowo po wstaego PTH ulega rozkadowi. Na 2 mole wydzielonych C-kocowych fragmentw przypada 1 mol natywnego PTH. Tak wic wikszo krcego we krwi PTH skada sie z fragmentw C -kocowych. Dotychczas nie stwier-
622 / ROZDZIA 48
Pre (31) 16) 1
PTH 84
Siateczka srd -plazmatyczn a szorstka komrek gwnych przytarczyc
Synteza stal
LSS
(6)
84
Aparat Gol g lego komrek gwnych przytarozyc Paeksztatcante
1
1
1 84
36 37
Fragmenty krce we krwi Wydzielanie
11
84 1
Maf e e te .C a" * + r Dueatz.Ca^ Ziarnistoci sekrecyjne Upakoutywa nie" -I- komrek g wnych przytarczye Degradacja [komrki Kupftera w wtrobie) CAMP Mae 2 et; Ca
Ryc. 48-2. Prekursory i produkty rozpadu PTH oraz umiejscowienie tych procesw w przytarczycach i w wtrobie. Liczby podane w nawiasie wskazuj ilo aminokwasw tworzcych fragment pre(31) i pro(6). ____________________________________
dzono adnych efektw biologicznych induko wanych tymi fragmentami. Wydaje si, e wy duaj one okres ptrwania PTH w kreniu. W przytarczycach stwierdzono wystpowanie licznych enzymw proteolitycznych, w tym r wnie katepsyny B i D. Katepsyna B rozkada czsteczk PTH na dwa fragmenty, tj. PTH1_36 i PTH37_S4. Fragment PTH37_84 nie ulega dal dji f f
37S4
3784
szej degradacji, natoiflfast fragment j^ ulega szybkiemu rozpadowi do di- i tripep-tydw. We krwi krcej nigdy nie stwierdzono obecnoci proPTH, natomiast stwierdzono mae (jeli w ogle) iloci PTH,.^ uwolnione z przytarczyc do krwi. Identyfikacj preproPTH przeprowadzono drog rozszyfrowania sekwe ncji genu kodujcego syntez PTH. Wikszo rozkadu proteolitycznego PTH odbywa si w samych komrkach przytarczyco-wych. W licznych badaniach wykazano jednak, e raz wydzielony do krwi PTH ulega roz kadowi proteolitycznemu w licznych tkankach. Dotychczas nie okrelono ilociowego udziau poszczeglnych tkanek pozaprzytarczycowych w procesie proteolitycznego rozkadu PTH. Nie jest rwnie jasne, czy enzymy proteolityczne, rozkadajce PTH w samych przytarczycach s
identyczne z proteazami tkanek pozaprzytar-czycowych, rozkadajcymi ten hormon, oraz czy sposb degradacji oraz fragmenty rozpadu PTH w tych tkankach s identyczne z wystpujcymi w przytarczycach. W przemianie wydzielonego przez przytar-czyce PTH uczestnicz takie narzdy, jak wtroba i nerki. Po hepatektomii we krwi krcej nie stwierdzono fragmentw PTH34.Mi PTH37.144 co sugeruje, e wtroba jest gwnym miejscem ich powstawania. Rola nerek moe polega na usuwaniu tych fragmentw z ustroju. Gwnym miejscem proteoJizy PTH na obwodzie (poza przytarczycami) s komrki Kupffera, przylegajce do rdzatokowych drg wtroby. En-dopeptydaza, zapocztkowujca rozpad PTH na fragmenty N- i C-kocowe umiejscowiona jest na powierzchni tych komrek (podobnych do makrofagw), bdcej w staym kontakcie z osoczem krwi. Enzym ten, bdcy rwnie katepsyna B, rozszczepia acuch polipeptydo-wy PTH midzy reszt aminokwasow w pozycji 36 i 37. Podobnie jak w przytarczycach, fragment C-kocowy dostaje si do krwi krcej, natomiast fragment N-kocowy ulega szybkiej dalszej degradacji.
Regulacja sekrecji. Istnieje odwrotna zaleno miedzy wydzielaniem czy steniem PTH a steniem wapnia zjonizowanego i magnezu w surowicy krwi. Stenie PTH w surowicy obnia si liniowo w miar wzrostu kalcemii od 1 mmol/1 (4 mg/dl) do 2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl). Obecno biologicznie aktywnego PTH w surowicy krwi u chorych z kalcemi 3=2,62 mmol/1 (10,5 mg/dl) wskazuje na obecno nadczynno-ci przytarczyc. Istnieje liniowa zaleno midzy iloci uwalnianego PTH a steniem cAMP w komrkach przytarczyc. W procesie tym najpewniej uczestnicz, jony Ca2~, za czym przemawia wystpowanie odwrotnej zalenoci midzy rdkomr-kowym steniem wapnia i cAMP. Udzia Ca2+, w tym procesie moe polega na znanym oddziaywaniu tego jonu na tbsfodiesteraz (w ktrym poredniczy kinaza biaek zalena od Ca:+ kalmoduliny) lub na hamowaniu kinazy adenylanowej. Fosforany nie wykazuj adnego bezporedniego wpywu na wydzielanie PTH. Przytarczyce maj wzgldnie niewielkie iloci ziarnistoci zapasowych zawierajcych PTH. Wystarczaj one do podtrzymania maksymal nego wydzielania tego hormonu zaledwie przez 1,5 godziny. Cecha ta odrnia przytarczyce od wysp Langerhansa trzustki, zawierajcych zapasy insuliny wystarczajce na kilka dni, oraz od tarczycy, ktrej zapasy hormonw wystar czaj na kilka tygodni. Dlatego te PTH musi by nieustannie syntetyzowany i wydzielany. W mechanizmie dziaania PTH uczestniczy receptor bonowy PTH wie si z biakowym receptorem bonowym o masie czsteczkowej 70 000. Receptor ten, wystpujcy w komrkach koci, wydaje si by identyczny z receptorem obecnym w nerkach. Nie stwierdzono obecnoci tego receptora w komrkach nieefektorowych (nietarczowych) dla tego hormonu. Interakcja hormonu z receptorem uruchamia nastpujc typow reakcj kaskadow; aktywacja cyklazy adenylanowej wzrost stenia rdkomrkowego cAMP-*-wzrost stenia rdkomrkowego wapnia - fosforylacja swoistych biaek rdkomr-kowych przez kinazy -> aktywacja rdkomr-kowych enzymw lub biaek, bdcych kocowymi porednikami efektw biologicznych hormonu. Zesp reakcji indukowanych PTH, podobnie jak licznymi innymi hormonami pep-tydowymi lub biakowymi, jest przyczyn wy-
stpienia zjawiska zmniejszenia liczby recepto-
rw (down regulation of receptor number) bdcego przyczyn spadku wraliwoci komrek
tarczowych na ten hormon. W mechanizmie tym mog uczestniczy procesy toczce si z udziaem cAMP w podanej wyej kaskadzie. Gwne znaczenie biologiczne PTH polega na udziale tego hormonu w homeostazie wapniowej Gwn rol PTH w homeostazie wapniowej podkrela obserwacja, e hormon ten pojawi si dopiero u zwierzt morskich prbujcych dostosowa si do ycia w warunkach ldo wych. Utrzymywanie si bilansu wapniowego w granicach fizjologicznych zaley od dugotrwaych skutkw dziaania PTH na wchanianie jelitowe wapnia za'porednictwem kalcyt-riolu. Jeeli w wyniku duszego niedoboru wapnia w poywieniu wchanianie Ca2+ w jelitach jest niedostateczne, wwczas zostaje uruchomiony zoony mechanizm regulacyjny, w ktrym uczestniczy rwnie PTH. PTH przywraca normalne stenie wapnia w pynie poza-komrkowym dziaajc bezporednio na koci i nerki oraz porednio rwnie na bon luzow jelit (PTH pobudzajc syntez kalcytriok w nerkach pobudza wchanianie Ca w jelitach). PTH 1) nasila rozpuszczanie koci (osteoliz), od-dziaywujc zarwno na jej cz organiczn, jak i nieorganiczn, przy czym uwolnione Ca2+ dostaj si do przestrzeni wodnej pozakomr-kowej, 2) zmniejsza wydalanie wapnia przez nerki, czyli klirens nerkowy tego jonu, przez co wzrasta stenie wapnia w pynie pozakomr-kowym oraz 3) nasila skuteczno wchaniania wapnia przez jelita, pobudzajc syntez kalcyt-riolu w nerkach. Dziaanie PTH na nerki wystpuje najszybciej, lecz skutek biologiczny tego hormonu jest najwikszy w kociach. PTH zapobiega wic wystpieniu hipokalcemii w razie niedoboru tego jonu w pokarmach, jednak kosztem zuboenia masy kostnej. PTH wpywa rwnie na homeostaz fosforanow Anionem wicym si z kationem wapnia jest zwykle anion fosforanowy, za czym przemawia fakt, e krysztaki hydroksyapatytu, wystpujce w kociach skadaj si z fosforanu wapnia. W razie wystpowania osteolizy indukowanej przez PTH, wraz z wapniem uwalniaj si rwnie fosforany. PTH zwiksza rwnie nerkowy klirens fosforanw. Dziaanie
624 / ROZDZIA 48
netto PTH na koci wyraa si wic wzrostem stenia wapnia, natomiast spadkiem stenia fosforanw w pynie poza komrkowym. Dziki takiemu dziaaniu PTH nie dochodzi, co jest wane, do przesycenia osocza w wap i fosforany. Niedobr PTH jest przyczyn niedoczy nnoci przytarczyc. Gwnymi markerami tego stanu chorobowego s spadek stenia wapnia zjoni-zowanego oraz wzrost stenia fosforanw nieorganicznych w surowicy krwi. Wrd objaww chorobowych naley wymieni nadwraliwo nerwowo-miniow wyraajc si skurczami spastycznymi mini lub tyczk. Cika i nagle wystpujca hipokalcemia (hipokalcemia ostra) moe by przyczyn: poraenia mini oddechowych z powodu kurczu tcowego, kurczu goni (laryngospasmus), cikich drgawek a nawet mierci. Przewleka hipokalcemia jest przyczyn zmian skrnych, zamy oraz zwapnie jder podstawy mzgu. Niedoczyn-no przytarczyc jest zwykle spowodowana niezamierzonym chirurgicznym usuniciem przytarczyc (w czasie strumektomii) lub uszkodzeniem tych gruczow w czasie zabiegu chirurgicznego na szyi (wwczas mwimy o wtrnej niedoczynnoci przytarczyc). Czasami jest ona wynikiem
uszkodzenia tych gruczow przez pro ces autoimmunologiczny (wwczas mwimy o
Patofizjologia
twr zoliwy. Gwnymi objawami biochemicznymi nadczynnoci przytarczyc s podwyszone stenie wapnia zjonizowanego i PTH oraz obnione stenie fosforanw nieorganicznych w surowicy krwi. Dugotrwajca (przewleka) nadczynno przytarczyc charakteryzuje si rozleg resorpcj koci oraz rnymi zaburzeniami ze strony nerek, takimi jak kamica nerkowa i zwapnienie nerek, czste, na wrotowe stany zapalne drg moczowych oraz (w cikich przypadkach) niewydolno nerek.
Wtrna nadczynno* {hyperpara-thyreoidismus przytarczyc
secundarius) charakteryzuje si rozrostem (hiperplazj) przytarczyc i zwikszon sekrecj PTH. Moe ona wystpowa u chorych z postpujc niewydolnoci nerek, U takich chorych wtrna nadczynno przytarczyc spowodowana jest przypuszczalnie upoledzon konwersj 25-OH-D3 do l,25(OH)rD3przez uszkodzony misz nerkowy. W wyniku niedoboru 1,25(OH)2-D3 dochodzi do niedostatecznego wchaniania wapnia z przewodu pokar mowego, co w konsekwencji jest przyczyn wtrnej nadczynnoci przytarczyc. Ta ostatnia jest mechanizmem kompensacyjnym, majcym na celu utrzymywanie stenia wapnia w pynie pozakomrkowym w granicach prawido wych.
pierwotnej niedoczynnoci przytarczyc).
KALCYTRIOL (1,26(OH)2-D,) DZIAA NA KILKU POZIOMACH HOMEOSTAZY WAPNIOWEJ

Rys historyczny. Krzywica, bdca choro b dziecic, charakteryzujc si niedostateczn mineralizacj oraz okaleczajcymi deformacjami koci, wystpowaa epidemicznie w Ameryce Pnocnej i Europie Zachodniej jeszcze na pocztku biecego stulecia. Wyniki wielu bada wskazyway na to, e choroba ta spowodowana jest niedoborem jakiego skadnika w poywieniu. Po odkryciu, e powstawaniu krzywicy mona zapobiec przez zaywanie tranu, otrzymywanego z wtroby dorsza, oraz po wykazaniu, e aktywnym skadnikiem w tym tranie nie jest witamina A, aktywny czynnik (wystpujcy w tym tranie), zapobiegajcy powstawaniu krzywicy, okrelono jako witamina D. Prawie w tym samym czasie wykazano, e powstawaniu choroby mona zapobiec przez nawietlanie skry promieniami ultrafioletowymi sztucznymi lub sonecznymi. Nastpnie wykazano, e u dorosych wystpuje odpowied-
omwiona w rozdz. 45. To dziedziczne zaburzenie charakteryzuje si syntez prawidowego PTH, natomiast opornoci narzdw docelowych na dziaanie tego hormonu. Skutki biochemiczne tego zaburzenia s identyczne z wystpujcymi w klasycznej niedoczynnoci tarczycy. Chorobie towarzysz zwykle rne nieprawidowoci rozwojowe takie jak niski wzrost, skrcenie koci rdrcza i rdstopia oraz niedorozwj umysowy. Istnieje kilka postaci rzekomej niedoczynnoci przytar czyc spowodowanych: 1) niedoborem biaka regulatorowego Gs cyklazy adenylanowej i 2) defektem biochemicznym na etapie dziaania PTH, pooonym za cAMP. Nadczynno przytarczyc (hyperparathyreoi-dismus) charakteryzuje si nadmiern produkcj PTH najczciej przez gruczolak przytarczyc. Przyczyn tego stanu chorobowego moe by rwnie rozrost (hyperplasia) przytarczyc, lub te ektopowe wytwarzanie PTH przez nowo-
Rzekoma niedoczynno przytarczyc (pseudo-hypoparathyreoidismu) zostaa
nik krzywicy, okrelany jako ostcomalacja. charakteryzujcy si upoledzon mineralizacj koci oraz reagujcy rwnie na podawanie witaminy D. Punktami wyjcia dla kolejnych postpw w tej dziedzinie bya obserwacja, e chorzy z chorobami wtroby i nerek nie reaguj w sposb normalny na podawanie witaminy D. Badania nad struktura, i funkcj witaminy D w cigu ostatnich 50 lat nabray duego rozmachu, szczeglnie w ostatnich kilku latach.
Gwna rola biologiczna kalcytriolu polega na pobudzaniu wchaniania wapnia i fosforanw w przewodzie pokarmowym
Kalcytriol jest jedynym hormonem pobudzajcym transport wapnia ze wiata przewodu
pokarmowego przez warstw nabonka jelitowego wbrew wystpujcemu gradientowi stenia Ca2+. Poniewa synteza kalcy triou podlega okrelonym regulacjom (ryc. 48-3), konieczny jest subtelny mechanizm kontroli stenia Ca2+ w piynie pozakomorkowym, dziaajcy w warunkach znacznych waha zawartoci wapnia w poywieniu. Mechanizm ten zapewnia utrzymywanie stenia wapnia i fosforanw na poziomie potrzebnym do tworzenia si krysztakw hydroksyapatytu na wknach kolagenowych koci. W stanach niedoboru w itaminy D (cile mwic niedoboru kalcytriolu) nowo-tworzenie koci ulega zwolnieniu, za proces remodelacji koci jest zaburzony. Procesy te s regulowane gwnie przez PTH, dziaajcy na komrki kostne, chocia dla prawidowego ich
wiato soneczne
7-Dehydrocholealerol -
- Prowltamlna D,-
* Witamina D! 25- Hydroksylazs
Inne
WTROBA
metaol.ty
1,24,25(OH)3-D3
--------- 25-Hydroksyoriolekalcyterol (2SOH-D3)
HO"' 7- Dehyd rochoiesiercl Witamina D, 1,25(OH},-D 3(kalcytrio!)
Ryc. 48-3. Powstawanie i hydroksylacja witaminy D. Proces 25-hydroksylacji odbywa si w wtrobie, za dalsze hydroksylacje w nerkach. W nerkach powstaje zarwno 24,25(OH)a-D3, jak i 1,25 (0H)-D3. Na rycinie pokazano rwnie struktur 7-dehydrocholesteroiu, witaminy Dî 1,25 (OH)2~D3 (kalcytriolu). (Wedug Ganong W. F,: fteview of Medical Physiology. Wyd. 4 Appleton and Lange, 1989, za zezwoleniem).
40 -- Biochemia
626 / ROZDZIA 48
przebiegu potrzebne s mae stenia kalcyt-riolu. Kalcytriol nasila rwnie dziaanie PTH w nerkach, tj. wch anianie zwrotne wapnia w kanalikach nerkowych. W syntezie i przemianie kalcytriolu uczestniczy kilka tkanek. Procesy te s cile regulowane Biosynteza. Kalcytriol wykazuje wszelkie cechy hormonu. Jest on produktem serii reakcji enzymatycznych, wymagajcych transportu czsteczek prekursorowych do kilku rnych tkanek (ryc. 48-3). Aktywna czsteczka kalcytriolu jest transportowana do innych narzdw, gdzie uczynni procesy biologiczne w sposb podobny jak inne hormony steroidowe. Skra. W pokarmach (tran r ybi, tko jaj) zawarte s niewielkie iloci witaminy D, Wikszo witaminy D, ktra jest wykorzys tana do syntezy kalcytriolu, wytwarzana jest z 7-dehydrocholesterolu w komrkach Malpighiego.skry. Jest ona wprost proporcjonalna do intensywno ci promieniowania ultrafioletowe go i odwrotnie proporcjonalna do stopnia pigmentacji skry. W miar starzenia si zawar toci 7-dehydrocholesterolu w naskrku zmnie jsza si, co wydaje si by przyczyn ujemnego bilansu wapniowego w starszym wieku. Wtroba. Swoiste biako przenoniko we, okrelone jako biako wice witamin D (D-binding protein), wie witamin D3 i jej metabolity, przenoszc je ze skry i jelit do wtroby, gdzie ulegaj 25-hydroksylacji, tj. pie rwszej niezbdnej reakcji syntezy kalcytriolu. 25-hydroksylacja odbywa sie w siateczce endoplazmatycznej. W reakcji tej potrzebny jest magnez, NADPH, tlen czsteczkowy oraz bliej nie scharakteryzowany czynnik cytoplazmatyczny. W reakcji tej uczestnicz reduktaza cytochromu P-450 zalena od NADPH oraz cyto chrom P-450. Reakcja ta nie podlega regulacji 1 odbywa si w mniejszym nasileniu rwnie w nerkach i jelicie cienkim. Nastpnie 25-OH-D3 dostaje si do krenia, gdzie jest glwym metabolitem witaminy wystpujcym w osoczu. Po zwizaniu si z biakiem wicym witamin D, 25-OH-Dj transportowany jest do nerek. Nerki. 25-OH-D3 jest sabym agonist kalcytriolu. Dla penej aktywnoci 25-OH-D3 niezbdna jest jego hydroksylacja przy wglu C[. Zachodzi ona w mitochondriach komrek proksymalnego kanalika krpego przy udziale trzyskadnikowej reakcji monooksygenazowej wymagajcej obecnoci NADPH, Mg2+, tlenu
czsteczkowego i przynajmniej trzech enzymw tj.: 1) nerkowej reduktazy ferredoksynowej bdcej flawoprotein, 2) nerkowej ferredoksyny (bdcej biakiem elazo siarkowym) oraz 3) cytochromu P-450, Ten ukad wytwarza l,25(OH)rD3, ktry jest najbardziej aktywnym naturalnym metabolitem witaminy D. 4. Inne tkanki. oysko zawiera la-hyd-roksylaz i dlatego moe by wanym rdem kalcytriolu pochodzenia pozanerkowego. Podobn aktywno enzymatyczn stwierdzono w wielu rnych tkankach, w tym rwnie w kociach. Znaczenie fizjologiczne poza nerkowej biosyntezy kalcytriolu wydaje si by niewielkie, skoro u nieciarnych i pozbawionych nerek zwierzt w surowicy stwierdza si niewielkie iloci tego hormonu. nie jak w przypadku innych hormonw synteza kalcytriolu regulowana jest mechanizmami opartymi na sprzeniu zwrotnym (ryc. 48-3, tab. 48-1). U zwierzt normalnych podawanie diety
Tabela 48-1. Regulacja aktywnoci 1a-hydi>oksy-lazy Gwne czynniki regulujce Hipokalcemia
PTH
Regulacja syntezy i przemiany. Podob-
Drugorzedowe czynniki regulujce

Estrogeny Androgeny Progesteron Insulina Hormon wzrostu Pro 1 akty na Hormony tarczycy
(|)
(1)
Hipofosfatemia (f) Kalcytriol (J
ubogo wapni owej oraz hipokalcemia wybitnie wzmagaj aktywno lct-hydroksylazy. Zjawisko to wymaga obecnoci PTH, wydzielanie ktrego wzrasta pod wpywem hipokalcemii. Mechanizm dziaania PTH w tym zakresie nie zosta dotychczas wyjaniony. Wiadomo tylko, e hormon ten zwiksza aktywno lot-hydro-ksylazy zarwno u zwierzt z niedoborem witaminy D, jak i u zwierzt leczonych t witamin. Podawanie diety ubogofosforowej oraz hipo fosfatemia rwnie pobudzaj aktywno la--hydroksylazy, chocia wymienione czynniki s sabszymi bodcami od hipokalcemii. Sam kalcytriol jest wanym regulatorem wasnej syntezy. Due stenia kalcytriolu hamuj nerkow la-hydroksylaz, natomiast pobudzaj 24-hydroksylaz katalizujc powstawanie
24,25(OH)rD3, tj. pozornie nieaktywnego produktu ubocznego. Estrogeny, progestyny i and-rogeny znacznie zwikszaj aktywno la-hyd-roksylazy u ptakw w okresie nonoci. Niejasna jest rola wymienionych hormonw, podobnie jak i insuliny, hormonu wzrostu i prolak-tyny, w regulacji biosyntezy kalcytriolu u ssakw. Podstawowa struktura cz steczki sterolowej moe zosta zmodyfikowana alternatywnymi szlakami metabolicznymi, tj. przez hydroksyla-cj w pozycji 1,23,24,25 i 26 oraz powstawanie licznych laktonw. Zidentyfikowano dotych czas przeszo 20 metabolitw, lecz nie udowodniono, aby ktrykolwiek wykazywa aktywno biologiczn. Kalcytriol dziaa na poziomie komrkowym w podobny sposb jak inne hormony steroidowe Uywajc radioaktywnego kalcytriolu wykazano jego wystpowanie w jdrach komrkowych komrek kosmkw i krypt jelitowych,. osteoblastw i komrek dystalnego kanalika nerkowego. Ponadto stwierdzono nagromadzanie si tego hormonu w jdrach komrkowych komrek, pierwotnie nie uwaanych za komr ki docelowe dla tego hormonu. Wrd nich naley wymieni komrki warstwy Malpighiego skry, komrki wysp trzustkowych, niektre komrki mzgu, przysadki mzgowej, jajnikw, gonady mskiej, oyska, macicy, gruczou sutkowego i grasicy oraz komrki prekursoro-we ukadu biaokrwinkowego. Kalcytriol wie si rwnie z komrkami przytarczyc, co sugeruje, e moe on uczestniczy w przemianie PTH.
praca, w ktrej doniesiono o indukcji przez kalcytriol mRNA kodujcego biako wice wap (CBP calcium binding protein). W cytoplazmie wystpuje kilka biaek wykazujcych due powinowactwo do Ca2+. Jedna grupa tych biaek jest zalena od kalcytriolu i obejmuje biaka o rnej masie czsteczkowej, antygenowoci i umiejscowieniu tkankowym (jelito, skra, koci). Najlepiej przebadano CBP pochodzenia jelitowego. Nie wykazano obecnoci CBP w jelitach szczurw z niedoborem witaminy D. Ponadto stwierdzono, e stenie CBP jest zalene od iloci kalcytriolu zwizanego z jdrem. jelita. Transfer jonw Ca2+ lub PO43~ przez bon luzow jelita obejmuje nastpujce etapy: 1) wychwyt tych jonw przez rbek szczoteczkowy i bon mikrokosmkw, 2) transport przez bon plazmatyczn komrek bony luzowej oraz 3) wypyw przez bon podstaw-noboczn do pynu pozakomorkowego. Jest pewne, e kalcytriol wpywa pobudzajco na jeden lub nawet kilka z wymienionych etapw, chocia dokadny mechanizm jego dziaania nie zosta jeszcze poznany. Uwaano, e w wymie nionych procesach aktywnie uczestniczy CBP, dopty nie wykazano, e translokacja jonw Ca2+ zachodzi w cigu 1 - 2 godzin po podaniu kalcytriolu, tj. znacznie wczeniej ni wzrasta stenie CBP. Wydaje si, e CBP, wic Ca2+, chroni komrki bony luzowej przed nadmiernym napywem tych jonw. Wielu badaczy zajmuje si poszukiwaniem innych biaek uczestniczcych w transporcie jonw Ca2+, podczas gdy inni sdz, e w procesie transferu tego jonu, przynajmniej w pierwszej fazie wzrostu napywu Ca2+, uczestnicz zmiany bonowe. W procesie tym maj uczestniczy metabolity polifosfoinozytydw. Patofizjologia. Krzywica wystpuj ca w dziecistwie charakteryzuje si wystpowaniem niskich ste wapnia i fosforu w osoczu krwi, ubog mineralizacj koci oraz zniekszta ceniami szkieletu kostnego. Jest ona najczciej spowodowana niedoborem witaminy D. Wyrnia si dwie postacie krzywicy zalenej od witaminy D. Typ I jest defektem genetycznym dziedziczcym si recesywnie chromosomem auto-somalnym i charakteryzuje si upoledzon konwersj 25-OH-D3 do kalcytriolu. Typ II jest defektem dziedziczcym si recesywnie genem autosomalnym i charakteryzuje si pojedyncz zamian aminokwasow w obrbie sekwencji
Wpyw kalcytriolu na bon luzow
Receptor kalcytriolowy. Receptor kal-cytriolowy naley do rodziny receptorw

steroidowych (patrz ryc, 49-7), Domena tego recep tora wica kalcytriol wykazuje wysokie powinowactwo i ma wydajno. Wizanie kalcyt riolu przez receptor osiga stan wysycenia, wysycanie jest swoiste i odwracalne. Receptor wykazuje motyw palca cynkowego" podobny do innych receptorw steroidowych. wicych si z odpowiedni domen DNA jdrowego. riolu. Od kilku lat wiadomo, e odpowied jelit na kalcytriol zwizana jest z syntez RNA i biaka. Obserwacja, e receptor kalcytriolowy wie si z chromatyn jdrow, sugeruje, e kalcytriol pobudza transkrypcj genow oraz powstawanie swoistego mRNA. Potwierdza to
Produkty genowe zalene od kalcyt-
628 / ROZDZIA 48
jednej domeny palca cynkowego" receptora, wicej si z odpowiedni sekwencj DNA, W wyniku takiej zamiany receptor jest nieczynny. Niedobr witaminy D u dorosych jest przyczyn osteomalacji. Charakteryzuje si ona obnionym wchanianiem wapnia i fosforu w jeli tach oraz matym steniem tych jonw w pynie pozakomrkowym. W konsekwencji tych zmian mineralizacja osteoidu jest upoledzona, sprawiajc, e koci wykazuj zmniejszon twardo. Przy znacznym zaniku lub uszkodzeniu miszu nerkowego produkcja kalcytriolu jest obniona, co w konsekwencji jest przyczyn zmniejszonego wchaniania wapnia z przewodu pokarmowego i wystpienia hipokalcemii. Ta ostatnia jest pTzyczyn wzrostu sekrecji PTH, bdcego wyrazem mechanizmu kompensacyjnego zwikszajcego stenie Ca2+ w pynie pozakomrkowym (jako nastpstwo dziaania osteolitycznego PTH). Wzrost obrotu kostnego oraz zmiany strukturalne koci wystpujce u takich chorych znane s pod pojciem osteo-dystrofii nerkowej. Wczesne leczenie witamin D moe zahamowa ten proces.
oraz przez podobne komrki umiejscowione w gruczole skrzelopochodnym (gandula uhimo-branchiali) innych gatunkw. Komrki te wywodz si z grzebienia nerwowego (crista neura-lis) i wykazuj biochemiczne podobiestwo do komrek wystpujcych w wielu rnych gruczoach wydzielania wewntrznego. Caa czsteczka, wcznie z pcll 7-amino-kwasow na N-kocu utworzon przez mostek Cys-Cys, jest niezbdna dla wystpienia penej aktywnoci biologicznej. Midzy CT poszczeglnych gatunkw istniej znaczne rnice w sekwencji aminokwasowej (np, ludzka i wiska CT maj tylko 14 wsplnych aminokwasw na czn liczb 32), Pomimo tego CT jednego gatunku jest czynna u innych gatunkw i odwrotnie. Najsilniej dziaajca CT zostaa wyizolowana z ososia. Historia CT jest wyjtkowa. W cigu 7 lat (19621968) CT zostaa wykryta, wyizolowana, poznano jej sekwencj aminokwasow oraz dokonano jej syntezy. Pomimo tego jej rola fizjologiczna u czowieka nie jest pewna.
PIMIENNICTWO
De Luca HF, Schnoes HK: Vitamin D: Recent advan-ces. Anmt Rev Biochem 1983;52:411. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endoc-rine system: Steroid metaboUsm, hormone recep-tors, and biological rcsponsc (calcium binding). Endocr Rev 1982;3:331. Potts JT Jr, Kronenberg HM, Rosenblatt M: Parat-hyroid hormone: Chemistry, biosynthcsis and mod of action. Ad\ Protein Chem 1982;35:323.
ROLA KALCYTONINY (CT) W HOMEOSTAZIE WAPNIOWEJ U CZOWIEKA NIE JEST JASNA

CT jest polipeptydem zawierajcym 32 ami nokwasy, wytwarzanym przez komrki C, gwnie tarczycy (rzadziej przytarczyc i grasicy)
Hormony kory nadnerczy

Dary! K. Ganner, MD
49
WPROWADZENIE
Kora nadnerczy wytwarza kilkadziesit rnych zwizkw steroid owych, z ktrych zaledwie kilka wykazuje aktywno biologiczn. Mona je zaszeregowa do trzech grup: glukokor-tykoidw, mineralokortykoidw i androgenw. Dziaanie tych hormonw rozpoczyna si od wizania swoistego receptora rdkomrkowe-go, po czym powstay kompleks hormon-recep-tor wie si ze swoistymi fragmentami DNA indukujc ekspresj genow. Ta ostatnia wyraa si syntez maej liczby biaek, ktre z kolei wpywaj na rne procesy metaboliczne, np. glukoneogenez i rwnowag sodow i potasow. m
w procesie przystosowywania do silnego stresu, Mineralokortykoidy s potrzebne do utrzyma nia normalnej rwnowagi sodowej i potasowej. W medycynie znalazy zastosowanie syntetyczne analogi obu klas ke^rtykoidw. Szczeglnie liczne analogi glukokortykoidw wykazuj silne dziaanie przeciwzapalne. Nadmiernie due lub mae stenia ktregokolwiek hormonu wymienionych klas s przyczyn powanych powika, czasami gronych dla ycia. Dziki badaniu wrodzonych zaburze enzymatycz nych, mona byo pozna poszczeglne etapy steroidogenezy i dao to moliwo poznania sprawnoci sekrecyjnej kory nadnerczy w od niesieniu do poszczeglnych hormonw.
Hormony kory nadnerczy, w tym szczeglnie glukokortykoidy, stanowi istotne ogniwo
Skrty uywane w tym rozdziale ACTH
ADH CBG CRH
KORA NADNERCZY WYTWARZA 3 KLASY HORMONW

W obrbie kory nadnerczy osoby dorosej wyrnia si 3 oddzielne warstwy. Warstw podtorebkow okrela si jako warstw kb-kowat (ona gomerulosa). Wytwarza ona mi nera lokortyk o steroidy. Pod ni znajduje si warstwa pasmowata fzona fascicularis), ktra wraz z warstw siatkowat (ona reticularis), wytwarza glukokortykoidy i androgeny. 2 kory nadnerczy wyizolowano i wykrystalizowano okoo 50 steroidw. Wikszo z nich jest zwizkami porednimi w steroidoge-nezie. Tylko niewiele steroidw nadnerczy wydzielanych jest w duych ilociach i wykazuje znamienn aktywno biologiczn. Kora nad nerczy wytwarza trzy klasy hormonw steroi-dowych, przy czym u podstawy takiej klasyfikacji ley gwnie ich dziaanie biologiczne. Granice midzy tymi klasami hormonw nie s ostre, skoro hormony jednej klasy mog wykazywa rwnie dziaanie hormonw pozostaych klas. I tak wszystkie naturalne glukokor tykoidy wykazuj rwnie dziaanie mineralo-
hormon kortykotropowy, kortykou opina hormon antydiuretyczny, wazopresyna globulina wica kortykosteroidy
DHEA
OOC
GH 3|-OHSD PEPCK POMC

PTH TBG
hormon uwalniajcy kortykotropin, kortykoliberyna dehydroepiandrosteron deoksykortykosteron hormon wzrostu, somatotropina dehydrogenaza 3P-hydroksysteroid owa karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa pro-opiomelanokortyna parat hormon globulina wica hormony tarczycy
630 / ROZDZIA 49
kortykoidowe i odwrotnie. Ten fakt sta si zrozumiay w chwili wykrycia, faktu powszechnego wystpowania ..elementw odpowiedzi hormonalnej'1 poredniczcych w dziaaniu tych hormonw (i progestynw) na poziomie genw (tab. 45-3). Glukokortykoidy s 2l-wglowymi steroidami wykazujcymi liczne efekty biologiczne, wrd ktrych najwaniejszy jest stymulujcy wpyw na glukoneogenez. Kortyzol jest najwaniejszym glukokortykoidem u czo wieka i wytwarzany jest w warstwie pasmowatej kory nadnerczy. Kurtykostcron syntetyzowany zarwno w warstwie pasmowatej jak i kbkowatej, jest gwnym glukokortykoidem u gryzoni, natomiast u ludzi wystpuje w mniejszych ilo ciach. Mineralokortykoidy s rwnie 2l-wg-lowymi steroidami. Gwne ich dziaanie polega na stymulacji retencji sodu i wydzielaniu K^ i H+, szczeglnie w nerkach. Aldosteron jest silniej dziaajcym hormonem tej klasy hormonw. Wytwarzany jest wycznie w warstwie kbkowatej kory nadnerczy. W warstwie pasmowatej i siatkowatej kory nadnerczy wytwarzany jest w duych ilociach prekursor and-rogenw dehydroepiandrosteron oraz saby androgen androstendion. Te steroidy ulegaj przeksztaceniu do silniej dziaajcych androge-nw w tkankach pozanadnerczowych i mog by przyczyn stanw chorobowych u osb z niedoborem niektrych enzymw uczestniczcych w steroidogenezie. W normalnych nadnerczach powstaj tylko niewielkie iloci estrogenw. W niektrych ro dzajach rakw nadnerczy synteza ich moe wzrasta. ^, Audrogeny pochodzenia nadnerczowego s wanymi prekursorami estrogenw (powstaj -
cych prze2 aromatyzacj androgenw w tkan kach obwodowych) u kobiet w okresie pomeno-pauzalnym.
SWOISTE NAZEWNICTWO OKRELA STRUKTUR CHEMICZN STEROIDW

Wspln cech wszystkich steroidw jest struktura 17-wglowego cykl open tan operhyd-rofenantrenu, zoona z 4 piercieni oznaczonych literami A, B, C i D (ryc. 49-1). Dodat kowe atomy wgla mog by doczone w pozycjach 10 i 13 lub w pozycji C J7 w postaci acucha bocznego. Hormony steroidowe oraz ich prekursory i metabolity rni si liczb i rodzajem podstawionych grup, liczb i umiejscowieniem podwjnych wiza oraz konfiguracj stereochemiczn. Zaproponowano bardzo precyzyjne nazewnictwo dla tych chemicznych struktur. Asymetryczne atomy wgla (na ryc. 49-1 s one zacienione) warunkuj wystpowanie stereoizomerti. Ktowe grupy metylowe (C19 i Clg) przyczone do wgli C10 i CtJ zwrcone s do przodu ukadu piercieniowego i stanowi punkt odniesienia. Podstawniki lece w tej samej paszczynie co C19 i C18 oznacza si przedrostkami cis lub p i zaznacza si na rycinach cig lini. Podstawniki lece za paszczyzn ukadu piercieniowego okrela si przedrostkami trans lub a i rysuje si lini przerywan. Wizania podwjne zaznacza si trjktami z podaniem numeru pierwszego wgla, od ktrego ono si zaczyna (np. A3A4 oznacza podwjne wizanie midzy atomami wgla Cj i C4). Hormony steroidowe posiadajce jedn ktow grup metylow i 18 atomw
(OH)
Piercie cyMopentano-pe r hyd r ofenan tre n o wy Numeracja atomw wgla. Asymetryczna atomy wgla
s zaclan lowana
Ryc. 49-1. Cechy strukturalne zwizkw steroidowych
HORMONY KORY NADNERCZY / 631
wgla okrela si jako estrany, posiadajce dwie ktowe grupy metylowe i 19 atomw wgla jako androstany, za hormony posiadajce dwie ktowe grupy metylowe oraz boczny acuch dwuwglowy przy C,7 jako pregnany (czna liczba atomw wgla w pregnanach wynosi 21). Ta informacja (ryc. 49-2) wraz z glosariuszem podanym w tab. 49-1 pozwala zrozumie nazwy chemiczne hormonw naturalnych i syntetycznych przedstawionych w tab. 49-2.
cytoplazmy. W razie stymulacji nadnerczy przez ACTH (lub cAMP) dochodzi do aktywacji esterazy, powstay za wolny cholesterol (nieest-ryfikowany) ulega przemieszczeniu do mito-chondriw, gdzie enzym rozszczepiajcy
acuch boczny zawierajcy cytochrom P -450 (P-450SOC) przeksztaca cholesterol w
W BIOSYNTEZIE HORMONW STEROIDOWYCH NADNERCZY UCZESTNICZY WIELE ENZYMW

Wszystkie hormony steroidowe nadnercza s syntetyzowane w wikszoci z cholesterolu pochodzcego z osocza. Tylko mae iloci cholesterolu pochodz z syntezy in situ wychodzcej z acetyloCoA i prowadzcej poprzez mewalo-nian do skwalenu. Wikszo cholesterolu wystpujcego w nadnerczach jest estryfikowana i magazynowana w kropelkach tuszczowych
pregnenolon. Proces odszczepienia acucha bocznego zwizany jest z podwjn hydroksylacj, najpierw przy wglu C22, a nastpnie przy C20. Dopiero potem dochodzi do odszczepienia 6-wglowego a cucha, tj. izokaproaldehydu i powstania 21--wglowego steroidu (ryc. 49-2). Biako zalene od ACTH by moe wie i aktywuje chole sterol lub P-450SOC. Bardzo skutecznym inhibitorem P-450sa; i biosyntezy steroidowej jest ami-noglutetimid. Wszystkie steroidy powstajce u ssakw wytwarzane s z cholesterolu via pregnenolon za porednictwem szeregu reakcji zachodzcych w mitochondriach lub siateczce rdplazmaty-cznej komrek nadnerczy. Istotn rol w tych reakcjach odgrywaj hydroksylazy wymagajce obecnoci czsteczkowego tlenu i NADPH. Ponadto na pewnych etapach biosyntezy po-
Odazczep lenie bocznego acucha cholesterolu
C - C -C -C
HO
Cholesterol
Pregnenolon + aldehyd tzokapronowy
Podstawowe struktury hormonw steroidowych
HO Testosteron Zwizki Kortyzol 170-Estradiol Zwizki eatranawe (C19) andrastanowe (C19) Zwizki pregnanowe (C :i ) Progesteron
Ryc. 49-2. Odszc2epienie acucha bocznego cholesterolu oraz podstawowe struktury hormonw steroidowych. _________________________________________ ^ _ _ ________ ^ ^ ________
632 / ROZDZIA 49 Tabela 49-1. Nazewnictwo steroidw Przedrostek Kocwka Hydrofcsy-Di hydroksyOkso-Cis Trans-o t-
Cecha chemiczna
- ol dio! - on
Alkohole Ketony (np. dion = 2 grupy ketonowe) Uoenie dwch grup w tej samej paszczynie co Cig Uoenie dwch grup w paszczynie przeciwlegej do C19 Podstawnik w pooeniu trans w stosunku do grupy metylowej Podstawnik w pooeniu cis w stosunku do grupy metylowej C ig Zwizek pozbawiony grupy hydroksylowej Wystpowanie izomerii przy wizaniach CC, COH lub CH np. androsteron (5a) versus isoandrosteron (5p) Odjecie dwch atomw wodoru z wytworzeniem podwjnego wizania Doczenie dwch atomw wodoru do jednego wizania podwjnego Konfiguracja trans piercieni A i B
P - Deoksy izo- lub epiDehydro-Dih ydro-Allo-
Tabela 49-2. Nazwy potoczne i chemiczne niektrych steroidw Nazwa potoczna Nazwa chemiczna Aldosteron Androstendion Cholesterol Dehydroepiandrosteron (DHEA) Deksametazon 11-Deoksykortykosteron (DOC) 11-Deoksykortyzol {zwizek S) Estradiol Estriol Estron Etiochofanolon Sa-Fluorokortyzoi Kortykosteron (zwizek B) Kortyzol (zwizek F) Kortyzon (zwizek E) Prednizoion Prednizon Pregnandiol Pregnantriol Pregnenolon Progesteron Testosteron Triamcynolon 1ip,21-Dihydroksy-3,20-diokso-4-pregnen-l8-al 4-Androsten-3,17-dion 5-Cholesten-3p-ol 3|)-Hydroksy-5-androsten-17-on 9a- Fluoro-16ot-metylo-11 p,17ac,21 -trifiydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion 21 -Hydroksy-4-pregnen-3r20-dion 17,21 -Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1,3,5(10)-Estratrien-3,17p-diol 1.3.5(10)-Estratrien-3.16a,17p-triol 3-Hydroksy-t,3,5(10)-estratrien-3-ol-17-on 33Hydroksy-5p-androstan-17-on 9ot- Fluoro-11 p,17a,21 -trihydroksypregn-4-en-3,20-dion 11p,21-Dihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 11 (3,17a,21 -Trihydroksy-4-pregnen-3,20-dion 1 7a,21 - D ihydroksy-4-prg nen-3,11,20-trion 11 p,17a,21 -Trihydroksypreg na-1,4-dien-3,20-dion 17x,21 -Dihydroksypregna-1,4-dien-3,11,20-trion y 5p-Pregnan-3=t,20a-diol 5p-Pregnan-3%17a,20a-triof 3p-Hydroksy-5-pregnen-20-on 4-Pregnen-3,20-dion 17p-Hydroksy-4-androsten-3-on 9a-Fluoro-11p,16a,17a,21 -tetrahydroksypregna-1,4-dien-3,20-dion
HORMONY KORY NADNERCZY / 633 trzebne s dehydrogenazy, jedna izomeraza i lia-za. Stwiendza si pewn swoisto
komrkow w steroidogenezie, np. 18-hydroksylaza oraz dehydrogenaza I8-hydroksysteroidowa, potrzebne w biosyntezie aldosteronu, wystpuj tylko w komrkach kebkowych nadner czy, przez co synteza tego mineralokortykoidu
ograniczona jest tylko do tej warstwy nadnerczy. Schemat szlakw syntezy 3 gwnych klas steroidowych nadnerczy przedstawia ryc. 49-3. W prostoktach podano nazw enzymw, za zacieniowaniem zaznaczono zmian chemiczn, jak dany enzym powoduje.
A ' - A n d r o s te n - 3 - 1 7 -d io n
11 -DBOksykortykosteron
11-Daoksykartyzoi
11fl-HYDROKSYLAZA
Kortykosts ron 18-HYDHOKSYLAZA 18-HYDROKSYDEHYDROGENAZA
Kortyzol
Aldosleron
Ryc. 49-3. Szlaki uczestniczce w syntezie 3 gtwnych klas steroidw nadnerczowych. Enzymy katalizujce zmian struktury zaznaczon zacieniowaniem umieszczono w prostoktach. (Wedug Harding B. W., w: DeGroot L. J. (red.): Endocfinology, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).
634 / ROZDZIA 49 Synteza mineralokortykoidw odbywa si w warstwie kbkowatej nadnerczy Synteza aldosteronu odbywa si szlakiem mineralokortykoidowym w warstwie kbko watej nadnerczy. Pregnenolon ulega przeksztaceniu do progesteronu przy udziale dwch enzymw zlokalizowanych w siateczce rd-plazmatycznej gadkiej, tj. dehydrogenazy 3 p-hydroksysteroidowej (3 P-OHSD) i A'-4--izomerazy. Po hydroksylacji progesteronu w pozycji C21 powstaje 11-deoksykortykoste-ron (DOC), ktry jest aktywnym mineralokor-tykoidem (zatrzymujcym sd). Przez kolejn hydroksylacje w pozycji C n powstaje kortyko-steron, ktry wykazuje aktywno glukokor-tykoidow i sab aktywno mineralokortyko-idow (wynoszc ok. 5% aktywnoci aldosteronu). U niektrych gatunkw zwierzt, np. u gryzoni, kortykosteron jest najsilniejszym glukokortykoidem. Hydroksylacja w pozycji C21 jest potrzebna dla wystpienia zarwno aktywnoci mineralo-, jak i glukokortykoido-wej. Wikszo steroidw z grup hydroksylow w pozycji C17 wykazuje wiksz aktywno glukokortykoidow i mniejsze dziaanie mine-ralokortykoidowe. W siateczce rdplazmaty-cznej gadkiej komrek warstwy kbkowatej nadnerczy brak jest 17 at-hydroksylazy, natomiast wystpuje enzym mitochondrialny 18--hydroksylaza. W wyniku dziaania 18-hydro-ksylazy na kortykosteron powstaje 18-hydro-ksykortykosteron, ktry, po przeksztaceniu grupy alkoholowej w pozycji C18 na aldehydow, tworzy aldosteron. Jednorazowe rozmieszczenie enzymw w warstwie kbkowatej oraz odrbny mechanizrn regulacji jej czynnoci (patrz niej) byy punktem wyjcia sugestii niektrych badaczy, dopatrujcych si nie tylko w caych nadnerczach wystpowania dwch odrbnych gruczow wydzielania wewntrznego (tj. kory i rdzenia nadnerczy), ale rwnie dwch odrbnych gruczow wydzielania wewntrznego w samej korze nadnerczy. kortyzolu wymaga obecnoci trzech rodzajw hydroksylaz dziaajcych w kolejnoci w pozycjach CJ7, C2] i C ir Pierwsze dwie reakcje zachodz szybko, podczas gdy hydroksylacja przy C21, przebiega wzgldnie wolno. W razie wystpienia najpierw hydroksylacji w pozycji C21, dochodzi do zahamowania 17 a-hydro-ksylazy, przez co aktywacji ulega szlak minera-lokortykoidowy (wytwarzany jest kortykosteron lub aldosteron, zalenie od rodzaju komrek nadnerczowych). 17 a-hydroksylaza jest enzymem wystpujcym w siateczce rdpiaz-matycznej gadkiej oraz dziaajcym albo na progesteron, alboczciej na pregnenolon. 17 a-hydroksyprogesteron, ulegajc hydroksylacji w pozycji C21, tworzy 11-deoksykortyzol, ktry po kolejnej hydroksylacji w pozycji Cn tworzy kortyzol. Ten ostatni jest najsilniejszym naturalnym hormonem glukokortykoidowym u czowieka. 21-Hydroksytaza jest enzymem wystpujcym w siateczce rdplazinatycznej gadkiej, natomiast 11 p-hydroksylaza jest enzymem mitochondrialnym. Tak wic steroido-geneza charakteryzuje si powtarzajcym si transportem substratw steroidowych do i z mi-tochondriw komrek warstwy pasmowatej i siatkowatej (ryc. 49-4).
Pcherzyki Oclan magazynujce
M ITOCHONDRIUM
Kortyzol i Cholestero
VI
11-DaoksyPregnenolon
SIATECZKA HODPLAZMATYCZNA
Cholesterol
9
17l-Hy(lraksyprogBstBron
Synteza glukokortykoidw. Synteza
Ry. 49-4. Subkomrkowa kompartmentaiizacja biosyntezy glukokortykoidw. Steroidogeneza w nadnerczach zwizana jest z kursowaniem prekursorw midzy mitochondriami a siateczk rd-ptazmatyczn. Enzymami uczestniczcymi w biosyntezie s: 1) CM.M liaza, 2} dehydrogenaza 3p--hydroksysteroidowa i A* izomeraza, 3) 17a-hy-droksylaza, 4) 21 -hydroksylaza i 5) 1ip-hydro-ksylaza. (Wedug: Harding B. W.; w: DeGroot L. J. (red.): Endocrinoiogy, tom 2, Grune and Stratton, 1979, w niewielkiej modyfikacji, za zezwoleniem).
androgenem lub prekursorem androgenw po wstajcych w korze nadnerczy jestdehydroepi-androsteron (DHEA). Wikszo 17-hydroksy-pregnenolonu ulega dalszym przeksztaceniom
Synteza androgenw. Najwaniejszym
w szlaku glukokortykoidowym, za tylko mata jego ilo ulega dziaaniu 17, 20-liazy odszcze-piajcej dwuwglowy acuch boczny C20 C2V Enzym ten wystpuje w nadnerczach i gonadach i dziaa wycznie na czsteczki steroi-dowe zawierajce grup cc-hydroksylow w pozycji C 17 . W razie braku jednej z hydrolaz i zahamowania biosyntezy glukokortykoidw (patr2 niej zesp nadnerczowo-pciowy), wytwarzanie androgenw w nadnerczach znacznie si nasila. Wikszo DHEA ulega szybkiej sulfatacji odbywajcej si w poowie w nadnerczach, a w pozostaej czci w wtrobie. Siarczan DHEA jest biologicznie nieaktywny, lecz ulega reaktywacji po usuniciu grupy siarczanowej. DHEA jest rzeczywistym prohormo-nem, poniewa przeksztaca si w silniejszy androgen audrnstendion {DHEA jest sabym androgenem) pod wpywem 3 p-OHSD i A5-4--izomerazy. Mae iloci androstendionu powstaj rwnie w nadnerczach pod wpywem dziaania liazy na 17-hydroksyprogesteron. Przez redukcj androstendionu w pozycji C I7 powstaje testosteron najsilniejszy androgen nadnerczowy. Mae iloci testosteronu powstaj wanie w ten sposb w nadnerczach, wikszo natomiast powstaje drog konwersji w innych tkankach. Z krwi ylnej nadnerczy mona rwnie wyizolowa niewielkie iloci innych steroidw, w tym 11-deoksy korty kos tero n, progesteron, pregnenolon, 17 a-hydroksyprogesteron oraz bard2o niewielkie iloci estradiolu (powstajcego drog aromatyzacji testosteronu). Iloci tych steroidw powstae w nadnerczach nie dorwnuj jednak ilociom tych hormonw wytwa rzanych w innych gruczoach. WYDZIELANIE, TRANSPORT I PRZEMIANA STEROIDOWYCH HORMONW NADNERCZOWYCH WPYWAJ NA ICH DOSTPNO BIOLOGICZN Sekrecja hormonw steroidowych Tylko niewielkie iloci, jeli w ogle, hormonw steroidowych ulegaj magazynowaniu w komrkach nadnerczy (lub gonad). Z reguy hormony te s uwalniane do osocza natychmiast po ich syntezie. Uwalnianie kortyzolu charakteryzuje si okrelon periodycznoci, zalen od rytmu dobowego wydzielania ACTH.
Transport w osoczu Glukokortykoidy. W osoczu krwi korty-zol kry pod postaci woln i zwizan z biakiem. Gwnym biakiem osocza wicym ten hormon jest a-globulina, zwana transkortyn lub globulin wic kortykosteroidy (CBG cortic o steroid binding globulin). CBG syntetyzowana jest w wtrobie, podobnie jak globulina wica hormony tarczycy (TBG). Nasilenie tej syntezy wzmagaj estrogeny. CBG wie wikszo kortyzolu osocza, jeli stenie tego hormonu znajduje si w granicach normy. Znacznie mniejsze iloci kortyzolu zwizane s z albuminami. Rnice w zakresie powinowactwa pozwalaj okreli okres biologicznego p-trwania rnych glukokortykoidw. Kortyzoi wie si mocno z CBG, jego okres ptrwania wynosi 1,5-2 h, KortykEfsteron wie si sabiej z CBG, przez co jego okres ptrwania wynosi mniej ni 1 h. CBG wie nie tylko glukokortykoidy. I tak deoksy korty kosteron i proges teron wykazuj dostateczne powinowactwo do CBG, by konkurowa z kortyzolem o miejsca wizania. Ilo kortyzolu nie zwizanego, a wic wolnego, stanowi ok. 8% stenia kortyzolu cakowitego w osoczu krwi i stanowi biologicznie aktywn frakcj tego hormonu.
Mtneralokortykoidy. Aldosteron, bdcy
najsilniejszym naturalnym mineralokortykoi-dem, nie ma swoistego biaka transportowego w osoczu, lecz tworzy sabe wizanie z albuminami. Korty kosteron i 11-deok sy korty kosteron (s to steroidy wykazujce dziaanie mineralokortykoidowe) wi si z CBG. Te fakty pozwalaj zrozumie mechanizm dziaania aldosteronu (patrz niej). Przemiana i szybko wydalania zale od obecnoci lub nieobecnoci biaek nonikowych Glukokortykoidy. Kortyzoi i jego metabolity stanowi ok. 80% wystpujcych w osoczu 17-hydroksykortykoidw. Pozostae 20% to kortyzon i 11 -deoksy korty zol. Okoo poowa krcego we krwi kortyzolu (podobnie jak kortyzonu i 11-deoksy korty zolu) kry we krwi pod postaci metabolitw dihydro - lub tet-rahydro, powstaych drog redukcji podwjnego wizania w piercieniu A (pod wpywem hydrogenaz zalenych od NADPH) oraz grupy ketonowej w pozycji C3 (pod wpywem od wracalnej reakcji dehydrogenazowej). Znaczne iloci wszystkich wymienionych zwizkw ulegaj dalszej modyfikacji tworzc w pozycji C3
636 / ROZDZIA 49
koniugaty z kwasem glukuronowym (glukuro-nidy) lub w mniejszym stopniu z kwasem siarkowym. Wymienione modyfikacje strukturalne zachodz gwnie w wtrobie, sprawiajc, e lipofiina czsteczka steroidowa staje si rozpuszczalna w wodzie i moe by wydalana z ustroju. U czowieka wikszo koniugatw steroidowych. wydzielanych, z ci do wiata jelita, jest wchaniana do krwi i ponownie wychwytywana przez wtrob, tworzc tzw. krenie jelit owo -wtrobowe. Okoo 70% koniugatw steroidowych zostaje wydalona z moczem, 20% z kaem, a pozostae 10% przez skr.
Mineralokortykoidy. Aldosteron kr-
cy we krwi ulega bardzo szybko klirensowaniu przez wtrob, co nie jest dziwne, poniewa hormon ten nie wie si z biakami nonikowymi osocza. W wtrobie wytwarzane s 3-gluku-ronidy tetrahydroaldosteronu, ktre nastpnie wydalane s z moczem. Androgeny. Androgeny wydalane s jako 17-keto-zwizki. Wrd nich znajduje si siarczan DHEA, androstendion i jego metabolity. Testosteron, wydzielany w maych ilociach przez nadnercza, nie jest 17-keto-zwizkiem, lecz wtroba przeksztaca ok. 50% testosteronu w androsteron i etiocholanolon, ktre s 17--ketostero idami.
Ukad reninowo-angiotensynowy. Ukad ten uczestniczy w regulacji cinienia ttniczego i przemiany elektrolitowej. Gwnym hormonem w tych procesach jest angioten-syna II, oktapeptyd powstajcy z angiotensyno-genu (ryc. 49-5). Synteza angiotensynogemi, bdcego oyglobulin, nastpuje w wtrobie. Jest on substratem dla reniny enzymu wytwarzanego w komrkach ttniczki doprowadzajcej kb uszka nerkowego. Lokalizacja tych komrek sprawia, e s one szczeglnie wra liwe na zmiany cinienia ttniczego. Wiele regulatorw fizjologicznych wpywa na uwalnianie reniny za porednictwem haroreceptorw nerkowych (tab. 49-3). Komrki przyklbuszkowe
Tabela 49-3. Czynniki wpywajce na uwalnianie reniny
Obniane cinienie ttnicze Zmiany pozycji ciaa z poziomej na pionow Zuboenie ustroju w sd Zwizki p-adrenergiczne Prostaglandyrty Czynniki hamujce Czynniki pobudzajce Podwyszone cinienie ttnicze Zmiana pozycji ciaa z pionowej na poziom Obcienie sol Antagonici p-adrenergicz-ni Inhibitory prostaglandyn Potas Wazopresyna Angiotensyna II
ISTNIEJ RNORODNE MECHANIZMY REGULACJI SYNTEZY HORMONW STEROIDOWYCH, NADNERCZY Hormony glukokortykoidowe Sekrecja kortyzolu jest zalena od ACTH. Z kolei wydzielanie ACTH jest kontrolowane przez hormon uwalniajcy kortykotropin (CRH) (zwany rwnie kortykoliberyn). Wydzielanie tych hormonw odbywa si na zasadzie ujemnego sprzenia zwrotnego (p. ryc. 44-1 i tab. 46-1). Hormony minera I oko rtykoidowe Regulacja wydzielania aldosteronu w komrkach kbkowatych kory nadnerczy jest zupenie odmienna od regulacji sekrecji kortyzolu. Gwnymi regulatorami sekrecji aldosteronu s ukad reninowo-angiotensynowy oraz potas. W tej regulacji uczestnicz sd, ACTH i mechanizmy nerwowe.
s rwnie wraliwe na zmiany stenia Na + i CI~ w pynie kanalikowym. Tak wic czynniki powodujce obnienie efektywnej objtoci krwi krcej (odwodnienie, spadek cinienia ttniczego, utrata pynw ustrojowych lub krwi) lub obniajce stenie NaCl w pynie kanalikowym pobudzaj uwalnianie reniny. Nerwy wspczulne nerek, ze swoimi zakoczeniami w komrkach przykbuszkowych porednicz w oddziaywaniu orodkowego ukadu nerwowego lub pozycji ciaa na uwalnianie reniny. W tym mechanizmie regulacji bior udzia receptory p-adrenergiczne. Renina, dziaajc na substrat angioten-synogen, uwalnia dekapeptyd, zwany angioten-syn I. Syntez angiotensynogenu w wtrobie wzmagaj glukokortykoidy i estrogeny. Nad cinienie ttnicze patogenetycznie powizane z tymi hormonami, moe by przynajmniej czciowo spowodowane wzrostem stenia an-

Anglolensynogen Asp -ArgValTyr-lle-His-Pro-Phe-HisLeu-Leu (-400dalszych A i aminokwasw)
Angiotensyna I
Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-PheHi5-Leu
ENZYM PRZEKSZTACAJCY ANGIOTENSYN 1 (KONWERTAZA}
Angiotensyna II
AspArg -ValTvr-lle-HiiPro-Phe
[AMINOPEPTYPAZA| Angiotensyna III
Arg-Va]-Tyr-lle His-ProPhe
ANGIOTENSYNAZY
P rod ukty deg radacj i
Ryc. 49-5. Powstawanie i przemiana angiotensyn. Strzaki wskazuj na miejsca dziaania enzymw rozszczepiajcych.
giotensynogenu. Poniewa stenie krcego angiotensynogenu jest bliskie wartoci Kmw reakcji z renin, mae jego zmiany mog mie znamienny wpyw na powstawanie angioten-syny II. Enzym przeksztacajcy angiotensyit (kon-wcrtaza) jest glikoprotein wystpujc w pucach, komrkach rdbonkowych i osoczu krwi. Katalizuje on odszczepienie dipeptydu od C-koca dekapeptydu angiotensyny I w wyniku czego powstaje oktapeptyd angiotensyna II. Reakcja ta nie wydaje si mie charakteru reakcji regulowanej. Rne analogi nonapep-tydowe angiotensyny I i inne zwizki s kom-petycyjnymi inhibitorami enzymu przeksztacajcego i stosowane s w leczeniu nadcinienia ttniczego reninozalenego. Enzym przeksztacajcy rozkada rwnie bradykinin, bdc silnym czynnikiem rozszerzajcym naczynia. Tak wic enzym ten podwysza cinienie ttnicze krwi dwiema odmiennymi drogami. Angiotensyna II podnosi cinienie ttnicze krwi dziaajc kurczco na letniczki. Jest ona siln substancj wazoaktywn. Hamuje ona uwalnianie reniny z komrek przykbuszko-wych i jest silnym stymulatorem syntezy aldo-
steronu. Pomimo e angiotensyna II dziaa bezporednio stymulujco na nadnercza, nie ma ona wpywu na syntez kortyzolu. U niektrych gatunkw angiotensyna II ulega przeksztaceniu do angiotensyny III, bdcej des-Asp^heptapeptydem, pobudzajcym syn tez aldosteronu rwnie silnie jak angiotensyna II (ryc. 49-5). U czowieka stenie angiotensyny II w osoczu jest 4-krotnie wysze od angiotensyny III, co sugeruje, e wikszo efektw biologicznych spowodowanych jest ok-tapeptydem angiotensyna II. Zarwno angiotensyna II jak i III s szybko rozkadane przez angioteasynazy. Angiotensyna II wie si ze swoistym receptorem komrek warstwy kbkowatej nadner czy. Kompleks hormon-receptor nie aktywuje cyklazy adenylanowej co sugeruje, e cAMP nie poredniczy w dziaaniu hormonu na poziomie komrkowym. Efekty angiotensyny II, polegajce na stymulacji konwersji cholesterolu do pregnenolonu i kortykosteronu do 18-hydro-ksykortykosteronu i aldosteronu, wydaj si zachodzi przy udziale zmian rdkomrkowe-go stenia wapnia i metabolitw fosfolipido-wych podobnie jak to'opisano w rozdz. 45.
638 / ROZDZIA 49
Potas. Wydzielanie aldosteronu jest wra liwe na zmiany stenia potasu w osoczu, Wzrost stenia K+ o zaledwie 0,1 mmol/1 pobudza sekrecj aldosteronu i odwrotnie, spadek kalemii obnia zarwno syntez, jak i wydzielanie tego hormonu. Potas oddziauje na te same etapy biosyntezy aldosteronu co angiotensyna II, chocia mechanizm jego dziaania jest niejasny. Jon potasu, podobnie jak angiotensyna II, nie wpywa na biosyntez kortyzolu. Inne stymulatory. W okrelonych warankach ACTH i sd mog uczestniczy w produkcji aldosteronu u czowieka.
HORMONY STEROIDOWE WYWOUJ LICZNE I RNORODNE EFEKTY METABOLICZNE
ry nadnerczy tylko mineralokortykoidami jest niewystarczajce; glukokortykoidy maj zna czenie decydujce o przeyciu. W odrnieniu od czowieka, u szczurw podawanie mineralokortykoidw jako leczenie substytucyjne w niewydolnoci kory nadnerczy jest zupenie wystarczajce. Zarwno nadmiernie podwyszo ne, jak i obnione stenia obu klas hormonw, spowodowane procesem chorobowym lub postepowaniem leczniczym, s przyczyn powanych powika zwizanych z efektami metabolicznymi tych hormonw.
Glukokortykoidy wpywaj na podstawow przemian materii, mechanizmy odpornociowe i cinienie ttnicze krwi oraz uczestnicz w reakcjach ustroju na stres
Wypadnicie czynnoci kory nadnerczy koczy si mierci, jeli nie rozpoczto dostatecznie wczenie leczenia substytucyjnego. U czowieka leczenie substytucyjne niewydolnoci koTabala 49-4. Efekty biologiczne glukokortykoidw
Szczegowy opis metabolicznych efektw hormonw glukokortykoidowych mona zna le w standardowych podrcznikach fizjologii, Krtkie zestawienie tych efektw znajduje si w tab, 49-4,
I. Wpyw na poredni przemian materii 1. Wzrost wytwarzania glukozy w wtrobie spowodowany: a. Zwikszonym napywem aminokwasw (substratw glukoneogenetycznych) z tkanek obwodowych b. Wzrostem glukoneogenezy uwarunkowanym aktywacj kluczowych enzymw tego procesu c. Maksymalizacj innych kluczowych reakcji (uwarunkowanych permisyjnym dziaaniem glukokortykoidw) 2. Wzrost odkadania si glikogertu w wtrobie poprzez aktywacje syntazy glikogenowej Wzrost I i po I i zy (w koczynach); mog stymulowa lipogenez w innych miejscach (twarz, tuw) szczeglnie wtedy, gdy ich stenie w osoczu jest wysze od fizjologicznego Stymulacja przemiany biaek i RNA. Przy fizjologicznych steniach glukokortykoidw jest to dziaianie anaboliczne, natomiast przy steniach wyszych od fizjologiczn ych dziaanie kataboliczne Redukcja reakcji immunologicznych. Hormony te powoduj rozpad limfocytw, ktry jest gatunkowo i komrkowo swoisty Supresja reakcji zapalnych przez: a. Zmniejszanie liczby krcych leukocytw i migracji leukocytw tkankowych b. Hamowanie proliferacji fibroblastw c. Stymulacj powstawania lipokortyn, ktre hamujc fosfolipaz A2, zmniejszaj syntez bardzo silnych substancji zapalnych, tj. prostaglandyn i leukotrien III. Inne efekty glukokortykoidw S niezbdne do utrzymania prawidowego cinienia ttniczego oraz prawidowej objtoci minutowej serca (rzutu serca) S niezbdne do utrzymania prawidowej rwnowagi wodnoelektrolitowej najpewniej poprzez hamowanie uwalniania ADH (przez co wpywaj na wydalanie H2O przez nerki) i stymulacj syntezy angiotensynogenu (przez co wpywaj na retencj Na w nerkach). Te efekty glukokor tykoidw porednio oddziauj na cinienie ttnicze krwi S niezbdne, wraz z hormonami rdzenia nadnerczy, w reakcji ustroju na stres
II. Dziaanie na mechanizmy odpornociowe:
HORMONY KORY NADNERCZY / 639 Hormony mineralokortykoidowe wpywaj na r wnowag elekrolit ow i transport jonw Hormony mineralokortykoidowe dziaaj w nerkach pobudzajc aktywny transport Na + w kanalikach krtych dystalnych i zbiorczych. Efektem netto" ich dziaania jest retencja sodu. Hormony te pobudzaj rwnie w ner kach sekrecje jonw K+, H+ i NHî wpywaj na transport jonw w innych tkankach nabonkowych, w tym w gruczoach potowych, bonie luzowej jelit i liniankach. Dziaanie mineralokortykoidowe aldosteromi jest 3050 razy silniejsze ni deoksykortykosteronu (DOC) i 1000-krotnie silniejsze ni kortyzolu lub kor-tykosteronu. Jako najsilniejszy naturalny rnine-ralokortykoid, aldosteron jest gwnym hormonem regulacji gospodarki sodowej i potasowej u czowieka. Kortyzol, cho wykazuje znacznie sabsze dziaanie minera ot rop owe, wywiera rwnie znamienny wpyw na retencj Na+ i wydalanie K+ przez to, e wytwarzany jest w znacznie wikszych ilociach ni aldosteron. Mniejsze znaczenie w regulacji gospodarki Na+ i K+ ma DOC, poniewa jego wytwarzanie jest bardzo mae. Do wystpienia skutkw dziaania aldostero-nu potrzebna jest synteza biaek i RNA, co sugeruje, e w mechanizmie dziaania tego hormonu uczestnicz swoiste produkty genowe. MECHANIZMY DZIAANIA HORMONW STEROIDOWYCH NADNERCZY S DO SIEBIE PODOBNE Hormony glukokortykoidowe rozpoczynaj swoje dziaanie w komrkach docelowych reagujc ze swoistym receptorem. Ten etap jest niezbdny, by mogy one wnikn do jdra komrkowego i zwiza si z DNA. Na og stwierdza sie wysok dodatni korelacj midzy wielkoci powinowactwa hormonu z receptorem a nasileniem okrelonego efektu biologicznego. Dotyczy to szerokiej skali aktywnoci tych hormonw. 1 tak steroid wykazujcy 10-krotnie sabsze powinowactwo do receptora ni np. kortyzol wywouje odpowiednio mniejsze dziaanie biologiczne przy okrelonym steniu tych steroidw. W mechanizmie dziaania hormo nw steroidowych na og nie uczestnicz receptory zapasowe". Biologiczne dziaanie hormonu steroidowego zaley zarwno od jego zdolnoci wizania si z receptorem, jak rwnie od stenia wolnego hormonu (nie zwizanego z biakiem transportowym) w osoczu. Kortyzol, kortykosteron i aldosteron wszystkie te hormony wykazuj silne powinowactwo do receptora glukokor-tykoidowego, niemniej jednak w warunkach fizjologicznych gwnym hormonem wicym si z receptorem glukokortykoidowym jest kortyzol, poniewa jego stenie w osoczu krwi jest najwysze. W pewnych stanach chorobowych (np. w niedoborze 17 a-hydroksylazy) kortykosteron jest gwnym glukokortykoidem, W odrnieniu od niego, aldosteron nigdy nie osiga stenia w surowicy potrzebnego do wystpienia efektw glukokortykoidowych. Domeny czynnociowe receptora glukokortykoidowego zostay rozszyfrowane Liczne badania biochemiczne, immunologiczne i genetyczne doprowadziy do poznania struktury receptora glukokortykoidowego przedstawionego schematycznie na ryc. 49-6. N-kocowa powka receptora zawiera wikszo domen antygenowych oraz obszar modulujcy czynno promotorow (frans-aktywa-cj). C-kocowa poowa receptora zawiera do men wic DNA i hormon. Domena wica DNA znajduje si bliej rodka czsteczki, podczas gdy domena wica hormon zlokalizowana jest blisko C-koca. Obie te domeny s niezbdne w rans-aktywacji procesu transkrypcji genu. Dla dimeryzacji dwch czsteczek receptora potrzebna jest pewna sekwencja ami-nokwasowa na C-kocu, Sdzi si, e reakcja dimeryzacji jest potrzebna przy wizaniu si receptora do kadej z dwch powek" elementu odpowiedzi na glukokortykoidy (GRE) (p. strzaki w tab. 45-3). Wydaje si, e do procesu wniknicia receptora do jdra komr kowego (czyli dla jego lokalizacji w Jdrze") potrzebne s dwa oddzielne obszary. Sekwencja aminokwasowa receptora, ustalona na podstawie analizy odpowiadajcego mu cDNA, wykazaa wystpowanie dwch obszarw obfitujcych w reszty Cys-Lys-Arg w obrbie domeny wicej DNA. Porwnujc te obszary z innymi biakami wicymi DNA (szczeglnie TFIIIA), mona zakada wystpowanie struktury biaka, posiadajcego dwa palce" (przy czym kady z nich ma w rodku atom cynku), ktre wi si z jednym skrtem pasma DNA. Jest to jedna z postaci interakcji
640 / ROZDZIA 49
omana wica ONA Domena wica hormon
Domena zmienna
m.
cooh
trans aktywacja Translokacja Jdrowa Dimeryzacja Antygenowo Homologia z on kog snem
vrt~ A
Ryc. 49-6. Schemat struktury fudzkiego receptora gfikokortykoidowego zoonego z 777 aminokwasw. W obrbie receptora mona wyrni domeny antygenowe wice DNA oraz wice hormon. Pokazano rwnie inne domeny oraz homologi z onkogenem v-erb-A.
biaek z DNA omawianych w rozdz. 41. Ta obserwacja jak rwnie wynik innych bada, w ktrych wykazano, e C-kocowa powka receptora ghikokortykoidowego jest bardzo podobna do onkogenu v-erb-A oraz e domeny tego onkogenu wice DNA s homologiczne z analogicznymi domenami receptora glukoko-rtykoidowego, estrogenowego i progesterono-wego, doprowadziy do wykrycia nadrodziny steroid o wo-tarczy co wego receptora hormonalnego.
Nadrodzina steroid owo-tarczyco wego receptora hormonalnego. Hormony
steroidowe i tarczycy reguluj wiele procesw uczestniczcych w rozwoju, rnicowaniu, wzrocie, reprodukcji i adaptacji ustroju do zmian rodowiskowych. W ostatnich latach stao si jasne, e wsplny mechanizm mgby wyjani dziaanie tych hormonw na poziomie molekularnym (p. rozdz. 45). W tym mechanizmie istotnym ogniwem s receptory hormonal ne. Poniewa wystpowanie tych ostatnich w ustroju nie jest obfite, analiza strukturalna receptorw staa si moliwa dopiero po wyi zolowaniu klonw cDNA dla kadego z nich. Najpierw poznano struktur receptora gluko-kortykoidowego, estrogenowego i progestero-nowego. Stwierdzenie homologii w zakresie domen wicych DNA dla tych hormonw, jak rwnie wykazanie znacznego podobiestwa tych domen do \-erb-A biaka onkogen-nego, wicego DNA, byy punktem wyjcia dla hipotezy, e wymienione receptory mog nalee do nadrodziny genowej (supergene fami-ly). Jeeli tak, oczywista staa si kolejna hipoteza, e z bibliotek cDNA powinno si
wyizolowa inne receptory, uywajc sond na wsplny obszar (domen DNA) w warunkach zredukowanej hybrydyzacji (p. rozdz. 42). Okazao si, e hipoteza ta bya suszna. Jak to pokazano na ryc. 49-7, okrelone zostay struktury dla wszystkich receptorw steroidowych, rwnie dla kilku receptorw, ktrych dotychczas nie zidentyfikowano. Uderzajca jest dla tych receptorw homologia domen wicych DNA oraz fakt wystpowania oglnej wsplnej organizacji. Omawiane receptory rni si znacznie dugoci, gwnie powki N-kocowego fragmentu czsteczki. Ta obserwacja znacznie przyspieszya zrozumienie mechanizmu transkrypcji genw regulowanych przez te hormony. Dziaanie hormonw glukokortykoidowych polega przewanie na regulacji ekspresji genw Oglne mechanizmy dziaania hormonw glukokortykoidowych zostay opisane w rozdz. 45 i przedstawione na ryc. 45-1. Liczne dowody potwierdzaj suszno koncepcji, e ta klasa hormonw wywiera wpyw na swoiste biaka komrkowe, oddziaywujc na ilo krytycz nych" biaek, najczciej enzymw, w obrbie komrki. Zwykle gfukokortykoidy realizuj swoje dziaanie poprzez regulacj szybkoci transkrypcji swoistych genw w komrkach docelowych, cho mog wpywa rwnie na inne etapy szlaku informacyjnego" (p. ryc. 45-2). Regulacja transkrypcji polega na tym, e kompleks steroid-receptor wie si ze swoistymi sekwencjami DNA, pooonymi w ssiedztwie miejsca inicjacji transkrypcji i, e te obszary
HORMONY KORY NADNERCZY / 641 Domeny Zmienne

DNA
Ugand
777
Receptor GlukoKortykoidowy
984
421
496 528
Mlnsralokortykoldowy 567 633 680 934 Progestynowy
V90<
185 250 311
551 595
Estrogenw/
1 24
89
192
427 Dla wia miny D
162
169 232
4S6
T dla ho rmo n w tarczycy
8S
153 198
462 Ola kwasu retlnol owego
291
358
421
639
V-erf>-A
Ryc. 49-7. Schematyczne porwnania nadrodziny steroidowo-tarczycowego receptora hormonalnego. Sekwencje w obrbie ludzkich receptorw (v-erb-A jest pochodzenia ptasiego) zostay tak przedstawione, by ich domeny wice DNA i wykazujce najwiksze podobiestwo w sekwencji aminokwasowej znajdoway si jedna nad drug Liczby w obrbie za kres kowanego pola oznaczaj procentowe podobiestwo danej domeny do odpowiedniej domeny receptora glukokortykoidowego. Liczby nad pionowymi liniami, odgraniczajcymi poszczeglne domeny, oznaczaj pozycje aminokwasw. N-kotfcowy aminokwas oznaczono jako 1. Wyizolowano wiele innych podobnych czsteczek, lecz nie okrelono ich czynnoci ani ich ligandw. ____________ _______________________
DNA nadaj reakcji na hormon cech swois toci. W jaki sposb interakcja kompleksu steroid-receptor z DNA pobudza lub hamuje transkrypcj, na czym polega swoisto tkankowa tej interakcji oraz dlaczego w jednych tkankach hormon pobudza, za w innych hamuje transkrypcj okrelonego genu oto kilka tylko pyta, na ktre dotychczas brak odpowiedzi. Krtki opis mechanizmu wpywu hormonw glukokortykoidowych na transkrypcj DNA wirusa wywoujcego guz sutka u mys2y jest najlepsz ilustracj stanu wiedzy na temat dziaania hormonw steroidowych. Model wirusa wywoujcego guz sutka jest bardzo uyteczny, poniewa wpyw steroidw jest szybki i wyrazisty i dogbnie zbadano biologi molekularn tego wirusa. Kompleks glukokortykoid-recep4i Biochemia
tor wie si wybirczo i swoicie z sekwencj DNA okrelon jako glukokortykoidowy obszar (element) regulatorowy (GRE glucocor-ticoid regulatory element). Obszar ten zlokalizowany jest o kilkaset zasad w gr w stosunku do miejsca inicjacji transkrypcji. W bliskim ssiedztwie GRE znajduj si sekwencje bardzo podobne do sekwencji konsensus GGTA-CAnnnTGTCT zlokalizowanej we fragmencie regulatorowym genw regulowanych przez glu-kokortykoidy. Glukokortykoidowy obszar regulatorowy poczony z receptorem nasila inicjacj transkrypcji genomu wirusa wywoujcego guz sutka u myszy oraz wykazuje rwnie dziaanie aktywujce na heterologiczne promo-tory. Ten element dziaajcy w ukadzie cis jest czynny rwnie wwczas, kiedy zostanie przesunity do innych obszarw DNA pooonych
442 / ROZDZIA 49
-
r
Genom MTV
GRE \
Promotor MTV
p
( GRE
Promotor MTV Genom MTV
Promotor MTV
Genom MTV -
GRE\
GRE \
Promotor hetero logiczny
r
r
Genom MTV
GRE\
Promotor hetero logiczny
Gen hetero logiczny
Ryc. 49-8. GRE jest wzmacniaczem procesu transkrypcji. Wirus (typ dziki) wywoujcy guz sutka u myszy (MTV) zawiera: obszar w pamie DNA, ktre ulega skopiowaniu do jednostki transkrypcyjnej (genom MTV), promotor i GRE. GRE oddzielony jest normalnie od 5'-kocowego miejsca startowego transkrypcji przez ok. 200 zasad, cho moe dziaa w obu kierunkach GRE moe rwnie ulec ttenslokacji w d od miejsca startowego transkrypcji. Dziaa on rwnie w heterologicznych ukadach promotorowych i kodujcych. Te fakty dowodz, e GRE i inne obszary regulatorowe wyizolowane z rnych genw dziaaj jako wzmacniacze transkrypcji. _________________ ____ " ____
w d lub w gr acucha i pracuje w obu kierunkach. Pod tym wzgldem glukokortykoi-dowy obszar regulatorowy spenia rol wzmacniacza procesu transkrypcji. Wystpowanie tych cech wykazano rwnie w kilku innych genach regulowanych przez glukokortykoidy. S one zestawione na ryc. 49-8. Wydaje si, e niektre geny regulowane przez glukokortykoidy wymagaj obecnoci dodatkowego biaka wicego DNA oraz odpowiadajcego mu obszaru DNA. Gwne dziaanie glukokortykoidw polega na kontroli nasilenia procesu transkrypcji genu, lecz nie jest to ich dziaanie jedyne. Dziki moliwoci mierzenia nasilenia rnych procesw wykazano, e glukokortykoidy reguluj rwnie szybko degradacji swoistych mRNA (np. mRNA kodujcego hormon wzrostu i kar-boksykinaz fosfoenolopirogronianow) oraz obrbk potranslacyjn (np. rnych biaek wirusa wywoujcego guz sutka u myszy). Glukokortykoidy i inne klasy hormonw steroido-wych mog dziaa na kadym etapie szlaku informacyjnego" poczwszy od DNA, a ko-czywszy na kocowym biaku (p. ryc. 45-2), przy czym nasilenie tego dziaania moe by rne i zalene od danego ukadu.
Oglne zasady dziaania hormonu m ineralokorty koidowego (aldosteronu) s podobne do opisanych dla innych hormonw steroidowych (ryc. 45 -1, Z, 3. i tab. 45-3) Chocia wyizolowano swoiste produkty genowe, do wystpienia efektw dziaania aldosteronu potrzebna jest synteza biaek i RNA. Przyjmuje si, e swoiste biaka uczestnicz w transporcie jonw indukowanym aldostero-nem. Receptory o wysokim powinowactwie do adosteronu (K d ~1 nmol/l) stwierdzono w cytoplazmie i jdrach komrek docelowych Obecno takich receptorw stwierdzono w nerkach, liniankach przyusznych i jelicie grubym oraz w innych komrkach, ktrych nie uwaano za komrki docelowe dla aldosteronu (komrki hipokampa i serca). Te receptory wykazuj podobne powinowactwo do aldoste ronu, kortyzolu i kortykosteronu i okrelone zostay jako receptory typu I w celu odrnienia ich od klasycznych receptorw glukokortykoi-dowych (typu II). Uwzgldniajc fakt, e stenie aldosteronu
w osoczu krwi jest znacznie mniejsze od stenia kortyzolu i kortykosteronu, mona by przypuszcza, e receptory typu I zostan zajte gwnie przez te dwa ostatnie steroidy, przez co dziaanie aldostoonu byoby niewielkie. Naley jednak przypomnie, e DOC i kortykosteron s chciwie wizane przez globulin wic kortykosteroidy, tj. przez biako transportowe dla glukokortykoidw, podczas gdy aldosteron nie ma swoistego biaka nonikowego. Ten fakt sprawia, e efektywne stenie wolnego (nie zwizanego z biakiem) aldosteronu w osoczu krwi jest wysze od odpowiedniego stenia zarwno kortykosteronu, jak i DOC Dlatego te aldosteron atwo wnika do komrek co daje mu przewag w konkurencji o wizanie z receptorami typu I in vivo. Wane dla ustroju dziaanie aldosteronu zabezpiecza dodatkowy mechanizm stanowicy rodzaj wentyla bezpieczestwa. Receptor wystpujcy w tkankach docelo wych dla mineralokortykoidw wykazuje bezwzgldn selektywno dla aldosteronu dziki obecnoci enzymu dehydrogenazy 11 p-hydro-ksysteroidowej. Enzym ten przeksztaca kor-tyzol i kortykosteron do odpowiednich 11 p-metabolitw, lecz nie dziaa na aldosteron. Metabolity te nie wi si z receptorami typu I, sprawiajc, e aldosteron ma do niego swobodny dostp. Aldosteron dziaa gwnie na transport jonw Dziaanie aldosteronu na transport sodowy na poziomie molekularnym nie zostao wyjanione. Niemniej wyniki kilku bada -uzasadniaj nastpujc hipotez. Jony Na+ wystpujce w pynie zawartym w wietle kanalikw nerkowych wnikaj biernie do komrek kanalikowych od strony luminal-nej za porednictwem kanaw sodowych. Z kolei jony Na+ przechodz do pynu rdmi-szowego za porednictwem Na+/K+ zalenej pompy ATP-azowej umiejscowionej na biegunie podstawnobocznym komrek kanalikowych. Energi dla tego procesu dostarcza ATP. Aldosteron zwiksza liczb kanaw sodowych w bonie komrkowej luminalnego bieguna komrek kanalikowych, co zapewne jest przyczyn wzrostu rodkom orkowego stenia Na+. Aldosteron zwiksza rwnie aktywno kilku enzymw mitochondrialnych, przez co nasila powstawanie ATP niezbdnego do napdzania pompy Na+/K+ umiejscowionej w bo nie komrkowej po dstawnob ocznego bieguna
komrek kanalikowych. Skutkiem dziaania aldosteronu jest wzrost ilorazu NADH:NAD oraz aktywnoci kilku enzymw mitochondrialnych, w tym syntazy cytrynianowej. Wzrost aktywnoci syntazy cytrynianowej jest wyni kiem rzeczywistej indukcji (poredniczonej opisan wyej transkrypcj genu) i okresowy wzrost tego biaka wykazuje wysok korelacj z dziaaniem aldosteronu na transport Na+. Nie wykazano bezporedniego wpywu aldosteronu na pomp sodow. Tak wic wydaje si, e hormon ten zwiksza rdkomrkowe stenia Na+ oraz stymuluje powstawanie zwizkw wysokoenergetycznych niezbdnych przy wypompowywaniu tego jonu do pynu rdmi-szowego. Inne mechanizmy wydaj si uczestniczy w transporcie jonw K+ i H+, a wrd nich rne biaka regulowane przez aldosteron*. PATOFIZJOLOGIA KORY NADNERCZY Zaburzenia spowodowane nadmiarem lub niedoborem glukokortykoidw Pierwotna niewydolno nadnerczy (choroba Addisona) charakteryzuje si hipoglikemi, niezwyk nadwraliwoci na insulin, nietolerancj stresu, jadowstrtem, chudniciem, nudno-ciami i znacznym osabieniem. Chorzy na chorob Addisona wykazuj niskie cinienie ttnicze, obnione przesczanie kbuszkowe oraz zmniejszon zdolno do wydalania adunku wodnego. W wywiadach czsto podaj naogowe" zjadanie soli. W surowicy krwi stwierdza si mae stenie Na+, natomiast due stenie K+; ponadto obserwuje si wzrost liczby limfocytw i komrek eozynofdnych. U chorych takich stwierdza si nadmiern pigmentacj skry i bon luzowych, uwarunkowan wyrwnawczym wzrostem sekrecji ACTH i produktw transkrypcji genu proopiomelanokortyny (POMC).
Wtrna niewydolno kory nadnerczy uwa-
runkowana jest niedoborem ACTH spowodowanym zawaem przysadki gruczoowej lub jej zniszczeniem przez nowotwr lub zakaenie. Charakteryzuje si podobnymi aberracjami metabolicznymi co pierwotna niewydolno kory
nabonkowe gruczow potowych, linianek i przewo du pokarmowego jest podobny do podanego dla komrek kanalikw nerkowych {przyp. tum.).
* Mechanizm dziaania aldosteronu na komrki
644 / ROZDZIA 49
nadnerczy, rni si od niej jednak nieobecnoci hiperpigmentacji skry i bon luzowych. Nadmiar glukokortykoidw, powszechnie okrelany jako zesp Cushinga, zwykle spowodowany jest podawaniem farmakologicznych dawek tych steroidw. Moe on by rwnie uwarunkowany nadmiernym wydzielaniem ACTH przez gruczolaka przysadki mzgowej, nadmierne wydzielanie glukokortykoidw przez gruczolaka lub raka nadnerczy lub ekto-pow sekrecj ACTH przez nowotwr. Dla chorych z zespoem Cushinga charakterystyczne jest zniknicie dobowego rytmu wydzielania ACTH i kortyzolu. Wykazuj oni obecno hiperglikemii lub cechy nietolerancji glukozy (lub obydwie anomalie metaboliczne) spowodowanej wzmoon gluk one o genez. Ze wzmoon glukoneogenez powizany jest ciki kata-bofizm biaek przejawiajcy si cieczeniem skry, zanikiem mini szkieletowych, osteo-poroz, zanikiem tkanki limfoidalnej. Oglnie mwic u chorych tych stwierdza si ujemny bilans azotowy. Stwierdza si te charakterys tyczne rozmieszczenie tkanki tuszczowej, tj. otyo typu tuowiowego z obecnoci typowego garbu bawolego". Oporno na infekcje, reakcje zapalne oraz gojenie si ran s upoledzone. Wiele objaww, takich jak hipernat-remia, hipokalemia, zasadowica, obrzki i nadcinienie, spowodowanych jest efektami minera okortykoidowymi kortyzolu.
Zaburzenia zwizane z nadmiarem mineralokortykoidw
Mae gruczolaki komrek warstwy kibko-watej nadnerczy s przyczyn pierwotnego aldo-steronizmu (zespou Conna). Do klasycznych objaww tego zespou nale: nadcinienie ttnicze, hipokalemia, hipernatremia i zasadowica nieoddechowa. U chorych z aldosteronizmem pierwotnym nie stwierdza si objaww nadmiaru hormonw glukokortykoid owych, stwierdza si natomiast ma aktywno reninow osocza oraz mae stenia angiotensyny II. Zwenie ttnicy nerkowej z nastpczym spadkiem cinienia perfuzyjnego w nerkach moe by przyczyn przerostu i zwikszonej funkcji komrek przykbuszkowych, przejawiajcych si du aktywnoci reninow osocza oraz podwyszonymi steniami angiotensyny II. Ta ostatnia jest przyczyn wtrnego aidosteroniz-mu, ktry jest podobny do postaci pierwotnej, rnic si od tej ostatniej wysokimi steniami reniny i angiotensyny II w osoczu.
Zmniejszenie iloci enzymw uczestniczcych w steroidogenezie jest przyczyn niedoboru jej produktw kocowych, akumulacji metabolitw porednich oraz nadmiernej syntezy steroidw szlakami alternatywnymi. Wspln cech wikszoci tych zespow, ktre powstaj ju w yciu zarodkowym in utero, jest niedobr kortyzolu, nadmierne wydzielanie ACTH oraz rozrost nadnerczy. Std okrelenie wrodzony rozrost nadnerczy. Inn wspln cech tych zespow jest nadprodukcja androgenw nad-nerczowych. Ta ostatnia jest przyczyn przyspieszonego wzrostu, wirylizacji oraz wystpowania obojnaczych narzdw pciowych. Ten fakt tumaczy alternatywne okrelenie tego schorzenia jako zesp nadnerczowo-pciowy. W 90% przypadkw wrodzony rozrost nad nerczy spowodowany jest dwiema postaciami niedoboru 21-hydroksy!azy, tj. niedoborem czciowym bdcym przyczyn tylko wirylizacji oraz niedobr cakowity przebiegajcy z utrat soli przez nerki. Pozostae przypadki uwarunkowane s niedoborem 11 (S-hydrnksyla/y. Opisano tylko pojedyncze przypadki niedoborw innych enzymw (dehydrogenazy 3 p-hydroksy-steroidowej, 17a-hydroksylazy, desmolazy cholesterolowej, 18-hydroksylazy, 18-dehydro-genazy). Niedobr I8 -hydroksylazy i 18-dehyd-rogenazy s przyczyn tylko niedostatecznej biosyntezy aldosteronu i nie przebiegaj z rozrostem nadnerczy. Niedobr desmolazy cholesterolowej uniemoliwia biosyntez ktregokolwiek steroidu. Dlatego te defekt ten jest zwykle nie do pogodzenia z yciem pozamacicznym.
PIMIENNICTWO Beanto M: Gene regulation by steroid hormones. Celt I989;56:335. Evans R: The steroid and thyroid hormone receptor superfamily: Science 1988;240:889. Granner DK: The role of glucocorticoid hormones as biotogical amplifiers. In: Glucocorticoid Hormone Action. Baxter JD, Rousseau GG (editors). Springer-Verlag, 1979. Gustafsson et al: Biochemistry, molecutar biology and physiology of the glucocorticoid receptor. Endocrine Rev 1987;8:185. MorrisDJ: The metabolism and mcchanismof action of action of aldosterone. Endocr Rev 1981;2:234. Yamamoto KR: Steroid receptor-regulated transcrip(ion of specific genes and gene networks. Ann Rev Genet 1985;19:209.
Wrodzony rozrost (hyperplasia) nadnerczy spowodowany jest niedoborem enzymatycznym
Hormony rdzenia nadnerczy

Dary! K. Granner, MD
50
WPROWADZENIE
Ukad wspczulnonadnerczowy skada si z przywspkzulnego ukadu nerwowego z nerwami cholinergicznymi przed- i zazwojowymi, ze wspczulnego ukadu nerwowego z choliner-gicznymi nerwami przedzwojowymi i adrener-gtcznynii nerwami zazwojowymi oraz z rdzenia nadnerczy. Ten ostatni stanowi w rzeczywistoci wyduenie wspczulnego ukiadu nerwowego, poniewa zakoczenia wkien przdz woj o-wych nerwu trzewnego unerwiaj komrki chromochonne wytwarzajce hormony kate -cholaminowe, tj. dopamin, noradrenalin (nor-epinefryn) i adrenalin (epinefryn). Rdze nadnerczy jest wic wyspecjalizowanym zwojem bez wypustek aksonalnych. Jego komrki syntetyzuj, magazynuj i uwalniaj substancje dziaajce w miejscach oddalonych od rdzenia. Oznacza to, e rdze nadnerczy dziaa jako narzd wewntrzwydzielniczy. Jest on doskonaym przykadem cisego powizania ukadu nerwowego z ukadem endokrynnym, jak to zasygnalizowano w rozdz. 45.
Skrty uywane w tym rozdziale COMT - - O-Metylotransferaza katecholowa DBH - p -Hydroksv4aza dopaminowa (f3-oksydaza dopaminowa} MAO - - Oksydaza monoaminowa P NM T - - N - Metyl otr nsferaza fenyloetanoloamtnowa VMA - - Kwas waniltnomigdatowy
lowe nie s jedynymi hormonami uatwiajcymi przezwycienie stresu. Wspomagaj je gluko-kortykoidy, hormon wzrostu, wazopresyna, an-giotensyna II i glukagon.
HORMONY KATECHOLAMINOWE S 3,4-DIHYDROKSY-POCHODNYMI FENY LOETYLOAM INY *

Dopamina, noradrenalina i adrenalina syntetyzowane s w komrkach chromochonnych rdzenia nadnerczy. Nazwa tych komrek pochodzi std, e zawieraj one ziarnistoci barwice si na kolor czerwono brunatny przy ekspozycji na dwuchromian potasu. Skupiska takich komrek znajduj si rwnie w sercu, wtrobie, nerkach, gonadach, neuronach ad-renergicznych zazwojowego ukadu wspczulnego oraz w orodkowym ukadzie nerwowym. Gwnym produktem rdzenia nadnerczy jest adrenalina. Zwizek ten stanowi 80% wszystkich katecholamin zawartych w rdzeniu. Nie jest ona syntetyzowana w innych tkankach pooonych poza rdzeniem nadnerczy. W odrnieniu od adrenaliny, wikszo noradrena-liny zawarta w narzdach majcych unerwienie wspczu ne syntetyzowana jest insitu (ok. 80% caej zawartoci), pozostaa za ilo wytwarza-
Hormony ukadu wspczulnonadnerczowe-go, cho nie s niezbdne do ycia, s jednak potrzebne w procesie adaptacji do ostrego i przewlekego stresu. Adrenalina, noradrenali-na i dopamina s gwnymi skadowymi reakcji na silny stres. Reakcja ta skada si z licznych, zintegrowanych procesw przystosowawczych w narzdach wanych dla ycia (w mzgu, miniach, ukadzie sercowoplucnym i w wtrobie), kosztem narzdw mniej uczestniczcych (skry, ukadu odkowo-jelitowego, tkanki limfoidalnej) w tej reakcji. Aminy katecho-
646 / ROZDZIA 50
HYDROKSYLAZA TVROZYNOWA
(4-MONOOKSYGENAZA
na jest w innych zakoczeniach nerwowych, skd dociera do komrek docelowych drog krwi. Adrenalina i noradrenalina mog by syntetyzowane i magazynowane przez komrki rdzenia nadnerczy i innych tkanek chromo-chkmnych. Konwersja tyrozyny do adrenaliny obejmuje nastpujce kolejne reakcje: 1) hydroksylacj piercienia benzenowego, 2) dekarboksylacj i 3) hydroksylacj acucha bocznego oraz 4) N-metylacj. Szlak biosyntezy katecholamin i udzia w niej poszczeglnych enzymw przedstawiono na ryc. 50-1, na ryc. 50-2 za przedstawiono schemat ich biosyntezy w komrce c hromocho nnej, Hydroksylaza tyrozynowa jest enzymem decydujcym o wydajnoci biosyntezy katecholamin Tyrozyna jest bezporednim prekursorem katecholamin, za hydroksylaza tyrozynowa (4--monooksygenaza monofenolowa) jest enzymem krytycznym w biosyntezie tych zwizkw, decydujcym o jej nasileniu. Hydroksylaza tyrozynowa wystpuje tylko w tkankach wytwarzajcych katecholaminy i to w postaci bd rozpuszczonej, bd zwizanej z ziarnistociami. Dziaa ona jako oksydoreduktaza z tet-rahydropterydynjako koenzymem, przekszta cajc L-tyrozyn do L-dihydroksyfenyloalani-ny (L-dopa). Jako enzym decydujcy o nasile niu biosyntezy katecholamin, hydroksylaza tyrozynowa podlega rnym regulacjom. Najwaniejszym mechanizmem jest hamowanie jej aktywnoci przez same katecholaminy (hamowanie mechanizmem sprzenia zwrotnego), ktre wspzawodnicz z hydroksylaza o koenzym pterydynowy tworzc z tym ostatnim zasad Schiffa. Hydroksylaz tyrozynowa hamuje kompetycyjnie rwnie cay szereg pochodnych tyrozyny, w tym a-metyl o tyrozyna. Zwizek ten stosowany jest sporadycznie w leczeniu stanu chorobowego przebiegajcego z nadmiarem katecholamin u chorych z guzem chromochon-nym, chocia znane s inne, bardziej skuteczne zwizki obcione mniej licznymi objawami ubocznego dziaania. Trzecia grupa zwizkw hamuje hydroksylaz tyrozynowa, chelatujc elazo, bdce kofaktorem tego enzymu. Przykadem takiego zwizku jest a, a'-dipirydyl. Katecholaminy nie przenikaj przez barier krew-mzg; oznacza to, e musz one by syntetyzowane na miejscu, tj. w samym mzgu. W okrelonych chorobach orodkowego uka -
H
HO
C CIMH,
MONOFENOLOWA)
HI
H
Dopamtna
H.
I
HO\
/I-HYDROKSYLAZA DOPAMINOWA (JS - OKSYDAZA DOPAMINOWA)
HO
I I
C C
No rad ren ati na CH,
U
C CNH
I I
H H
Adrenalina
Ryc. 50-1. Biosynteza katecholamin. PNMT N-mety otra nsferaza fenyloetanoloaminowa. (Wedug Goldfien A.: The adrertal medulla, w: Green-span F. S., Forsharn P. H, (red): Basie and Clinical Endocrinoiogy. Wyd. 2, Appleton and Lange, 1986, w modyfikacji, za zezwoleniem).
HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 647

PYN POZAKOMORKOWY Komrka chromochonna PYN POZAKOMORKOWY
Tyrozyna EINE
DBH ATP Chromogranina A zwizki 0 -adre- nerglczne I chaiinergiczne 0 zwizki K -adfenarglczne Wapfi
Ryc. 50-2. Schemat biosyntezy katechoiamin w komrce chromochtonnej. TH hydroksylaza tyrozy-nowa, DD dekarboksylaza dopa, PNMTN-metylotransferazafenyloetanoloa/ninowa, DBH (J-hyd-roksylazadopaminowa, ATP- adenozynotrifosforan. Biosynteza katecholamin odbywa si w cytoplazmie i w rnych ziarnistociach komrki rdzenia nadnerczy. Niektre ziarnistoci zawieraj adrenalin (epineiryn) (E), inne noradrenaiin, za jeszcze inne obydwa hormony. Po stymulacji caa zawarto ziarnistoci jest uwalniana do pynj pozakomrkowego.
du nerwowego, np. w chorobie Parkinsona stwierdza sie lokalne upoledzenie syntezy do-paminy. W odrnieniu od dopaminy, L-dopa, bdca prekursorem dopaminy, bardzo atwo przenika przez barier krew-nizg, dziki czemu jest "wanym lekiem stosowanym w terapii choroby Parkinsona. Dekarboksylaza dopa jest obecna we wszystkich tkankach Ten rozpuszczony w cytoplazmie enzym wymaga obecnoci fosforanu pirydoksalu w procesie konwersji L-dopa do 3,4-dihydroksyfenylo etyloaminy (dopaminy). Zwizki strukturalnie podobne do L-dopa, np. L- metylodopa, s kom petycyjnym i inhibitorami tej reakcji. Chlorowcowe zwizki tworz z L-dopa zasad Schif-fa oraz hamuj reakcj dekarboksylacji, a-Metylodopa oraz spokrewnione z ni zwizki, takie jak 3-hydroksytyramina (pochodna tyraminy), a-metyl o tyrozyna i metaraminol s skutecznymi lekami stosowanymi w niektrych postaciach etiologicznych nadcinienia ttniczego(i-Hydroksylaza dopaminowa (P-oksydaza dopaminowa) (DBH) katalizuje konwersj dopaminy do noradrenaliny DBH jest oksydaza o mieszanej funkcji. Nonikiem elektronw dla tego enzymu jest askor-
binian, za jego modulatorem fumaran. W centrum aktywnym tego enzymu znajduje si mied. DBH wystpuje prawdopodobnie w specjalnej frakcji subkomrkowej komrek rdzenia nadnerczy, tj. w ziarnistociach wydzielniczych. Tak wic konwersja dopaminy do noradrenali ny zachodzi w tej strukturze rdkomrkowej. DBH jest uwalniana z rdzenia nadnerczy i zakocze nerwowych wraz z noradrenalin. W odrnieniu od noradrenaliny nie moe ona ponownie wrci do zakocze nerwowych na zasadzie powrotnego wychwytu. N-Metylotransferaza fenyloetanoloaminy (PNMT) katalizuje powstawanie adrenaliny Enzym ten, rozpuszczony w cytoplazmie, katalizuje N-metylacj noradrenaliny, dziki czemu powstaje adrenalina. Reakcja ta zachodzi w komrkach rdzenia nadnerczy syntetyzujcych ten hormon. Skoro PNMT jest enzymem rozpuszczalnym, przyjmuje si, e reakcja konwersji noradrenaliny do adrenaliny zachodzi w cytoplazmie. Syntez PNMT indukuj hormony glukokortykoidowe, docierajce z kory do rdzenia nadnerczy rdnadnerczowym ukadem wrotnym. Ukad ten sprawia, e stenia steroidw we krwi rdzenia s 100-krotnie wysze ni we krwi obwodowej. Wydaje si, e tak due stenie glukokortykoidw w rdzeniu nadnerczy jest niezbdne do indukcji PNMT.
648 / ROZDZIA 50
KATECHOLAMINY S MAGAZYNOWE I UWALNIANE Magazynowanie w ziarnistociach chromochonnych
KATECHOLAMINY ULEGAJ SZYBKIEJ METABOLIZACJI

Bardzo niewielkie iloci adrenaliny (mniej ni 5%) s wydalane z moczem. Katecholaminy ulegaj szybkiej metabolizacji pod wpywem O-metylotransferazy katecholowej i oksydazy monoaminowej. W wyniku dziaania tych en zymw powstaj nieaktywne metabolity O-me-tyiowane oraz produkty deaminacji katecholamin (ryc. 50-3). Wikszo katecholamin jest substratem dla obu wymienionych enzymw, za reakcje metylacji i oksydacji mog zachodzi w dowolnej kolejnoci. O-Metylotrartsferaza katecholowa (COMT) jest enzymem cytozolowym wystpujcym w wielu tkankach. Katalizuje ona przyczenie grupy metylowej do piercienia benzenowego zwykle w pozycji 3 (meta) rnych katecholamin. Do reakcji tej potrzebne s kation dwuwar-tociowy oraz adenozylometionina jako donor grupy metylowej. Produktami tej reakcji s, zalenie od wyjciowego substratu, kwas homo-wanilinowy, normtanefryna i metanefryna. Oksydazamonoaminowa (MAO) jest oksydo-reduktaz katalizujc deaminacj monoamin. Wystpuje ona w licznych tkankach, lecz najwiksze jej stenie jest w wtrobie, odku, nerkach i jelitach. Opisano co najmniej 2 izo-zymy MAO. Izozym MAO- A, wystpujcy w tkance nerwowej, katalizuje deaminacj sero-toniny, adrenaliny i noradrenaliny. Izozym MAO-B spotykany jest w tkankach niener-wowych i wykazuje najwiksz aktywno w stosunku do 2-fenyloetyloaminy i benzyloa-miny. Dopamina i tyramina ulegaj metabolizacji pod wpywem obu izozymw. Wiele bada powicono zalenoci midzy zaburzeniami psychicznymi o podou afektywnym a wzrostem lub spadkiem aktywnoci tych izozymw. Inhibitory MAO znalazy zastosowanie w leczeniu nadcinienia ttniczego i depresji, ich zastosowanie ograniczaj jednak powane interakcje zachodzce ze rodkami spoywczymi i lekami zawierajcymi aminy sympatykomime-tyczne. Pochodne O-raetyowe katecholamin ulegaj dalszym przemianom, tj. koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym. Liczba wytwarzanych metabolitw katecholamin jest ogromna. Wrd nich dwie grupy metabolitw maj znaczenie diagnostyczne, poniewa wydalane s z moczem w iloci ach dajcych si zmierzy. Do pierwszej grupy nale-
Komrki rdzenia nadnerczy zawieraj chro-mochonne ziarnistoci. S to struktury rd-komrkowe zdolne do biosyntezy, wychwytu, magazynowania i wydzielania katecholamin. Ziarnistoci te zawieraj oprcz katecholamin wiele innych substancji, takich jak ATP-Mg2+, Ca2+, DBH i biako chromagranin A. Katecholaminy wchodz do tych ziarnistoci ATP-zalenym mechanizmem transportowym i wi ten nukleotyd w stosunku 4; I (stosunek hormonu do ATP). Noradrenalina, magazynowana w tych ziarnistociach, moe je opuci, by nastpnie ulec N-metylacji. Tak powstaa ad renalina wchodzi do nowej populacji ziarnistoci.
Uwalnianie katacholamin jest zalene od jonw Caa+
Pobudzenie nerww rdzenia nadnerczy powoduje zlanie si bon ziarnistoci zapasowych z bon plazmatyczn, co jest przyczyn eg-zocytozy i tym samym uwalniania noradrenali-ny i adrenaliny. Proces ten jest zaleny od Ca2+, i jak wikszo zjawisk zwizanych z egzocyto-z, jest pobudzany przez zwizki cholinergiczne i |3-adrenergiczne, natomiast hamowany przez zwizki a-adrenergiczne (ryc. 50-2). Katecholaminy i ATP s uwalniane w tych samych proporcjach, w jakich wystpuj w ziarnistociach. Wraz z nimi uwalniane s rwnie inne skadniki wymienionych ziarnistoci, takie jak DBH, jony wapnia i chromagranina. Powrotny wychwyt katecholamin przez zakoczenia nerwowe jest wanym mechanizmem oszczdzania tych hormonw i szybkiego przerwania hormonalnej i neuroprzekanikowej ich czynnoci. W odrnieniu od nerww wsp-czulnych, rdze nadnerczy nie dysponuje mechanizmem powrotnego wychwytu i magazynowania raz wydzielonych katecholamin. Uwolniona z nadnerczy adrenalina dostaje si do wtroby i mini szkieletowych, gdzie ulega szybkiej metabolizacji. Tylko bardzo mae iloci noradrenaliny nadnerczowej docieraj do tka nek obwodowych. We krwi katecholaminy kr jako luno zwizane z albuminami. Ich okres biologicznego ptrwania jest niezwykle krtki (wynosi 1030 s).
HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 649

Kwas difiydroksy-fenylooco 3- Metoksytyramlna wy
, CHaO
OH
Kwas hamowa III nowy
Kwas 3-metoksy-4-hy(Jro-k l d t
Ryc. 50-3. Przemiana katecholamin przy udziale O-metylotransferazy kaiecholowej (COMT) i oksydazy monoaminowe) (MAO). (Wedug: Goldfien A.: The adrenal medulla, w: Greenspan F. S. i Forsham P. H. (red.): Basie andCiinical Endocrinotogy. wyd, 2,Appleton and Lange, 1986, reprodukcja za zezwoleniem).
meanefryny, do ktrych nale metoksypo-chodne adrenaliny i noradrenaliny. Do drugiej grupy metabolitw zalicza sie produkt deami-nacji O-metylowanej pochodnej adrenaliny i noradrenaliny, ij, kwas 3-metoksy*4-hydro-ksymigdalowy (okrelany rwnie jako kwas wanilino-migdalowy
VMA) (ryc. 50-3).
U 95% chorych z guzem chromochonnym ilo wydalanych z moczem metanefryn i VMA jesl wzmoona. Oznaczanie wymienionych metabolitw cechuje sie znakomit precyzj diagnostyczn, szczeglnie wtedy, kiedy rwnolegle oznacza si katecholaminy w osoczu lub w moczu.
SYNTEZA KATECHOLAMIN JEST REGULOWANA BODCAMI NERWOWYMI

Pobudzenie nerwu trzewnego, ktrego wkna przedzwojowe docieraj do rdzenia nadner czy, wywouje uwalnianie si (mechanizmem egzocytozy) katecholamin, nonikowych biaek
zawartych w ziarnistociach sekrecyjnych oraz DBH. Stymulacja ta regulowana jest przez podwzgrze i pie mzgowy, chocia nieznana jest dokadna ptla sprzenia zwrotnego. Pobudzenie nerwu trzewnego wzmaga rwnie syntez katecholamin. Ostry stres zwiksza syntez noradrenaliny, nie wpywajc na ilo hydroksylazy tyrozynowej, chocia aktywno jej wzrasta. Hydroksyaza tyrozynowa jest sub-stratem dla cAMP-zalenej kinazy biaek, co sugeruje, e wzrost aktywnoci hydroksylazy wystpujcy po stymulacji nerwowej spowodowany jest jej fosforylacj. Przewleky stres, ktremu towarzyszy aktywacja ukadu wspl-czulnego, indukuje syntez hydroksylazy tyro-zyaowej, przez co ilo tego enzymu wzrasta. Doniesiono rwnie o podobnej indukcji syntezy DBH. Indukcja wymienionych dwch enzymw szlaku biosyntezy katecholamin jest wyrazem mechanizmw adaptacyjnych na stres fizjologiczny i zaley od czynnikw nerwowych (indukujcych syntez hydroksylazy tyrozynowej i DBH) i endokrynnych (indukujcych PNMT).
650 / ROZDZIA 50 KLASYFIKACJA KATECHOLAMIN MOE BY OPARTA NA MECHANIZMIE ICH DZIAANIA Mechanizm dziaania katecholamin przyciga! uwag badaczy przez blisko jedno stulecie. Rzeczywicie, wiele oglnych koncepcji dotyczcych biologii receptorw i dziaania hormonw bierze swj pocztek w badaniach nad mechanizmem dziaania katecholamin. Katecholaminy dziaaj za porednictwem dwch wikszych klas receptorw. S one okrelane jako receptory a-adrenergiczne i P-ad-renergiczne, przy czym kada z nich obejmuje dwie podklasy, tj. a, i a2, i pt i P2. Klasyfikacja ta oparta jest na sile wizania si rnych agonistw lub antagonistw do wymienionych receptorw. Adrenalina wie si i aktywuje zarwno receptory a, jak i p. Jej efekt biologiczny w tkankach zawierajcych obydwie klasy recepto rw zalee bdzie od powinowactwa tego hormonu do poszczeglnych rodzajw receptorw. Noradrenalina w steniach fizjologicznych wie si gwnie z a -receptorami. Struktura receptora p-adrenergicznego jest znana Klonowanie genu i cDNA dla receptora P-adrenergicznego ssakw ujawnio kilka niespodziewanych cech. Po pierwsze wskazano, e gen nie zawiera intronw, naley wic do grupy genw ssakw (do takich genw nale geny histonw i interferonw) nie posiadajcych tych struktur. Po drugie receptor fi-adrenergiczny wykazuje blisk homologi 2 rodopsyn (przynajmniej w zakresie trzech fragmentw pep-tydowych), tj. z biakiem, zapocztkowujcym konwersj bodca wietlnego w reakcj wzrokow. Inne podobiestwa dyskutowane s w dalszej czci rozdziau. Trzy receptory adrenergiczne nalece do wymienionych wyej podgrup sprzone s z ukadem cyklazy adenylanowej Hormony wice si z receptorami P x i P2 aktywuj cyklaz adenylanow, natomiast hormony wice receptor a2 j hamuj (ryc. 45-4 i tab. 45-4). Po zwizaniu hormonu przez receptor dochodzi do przyczenia biaka G, ktre wie sic z kolei z GTP. W wyniku tych reakcji dochodzi albo do stymulacji (jeli zwizaniu ulego biako Gs) albo do hamowania (w razie wizania biaka Gj przez ko mpleks hormon--receptor) cyklazy adenylanowej, tj. do stymulacji lub hamowania syntezy cAMP. Reakcja zatrzymuje si w chwili hydrolizy GTP 'przez GTP-az poczon z podjednostk a receptora (p. ryc. 45-4). Receptory ax s sprzone z procesami zmieniajcymi rdkomrkowe stenia wapnia lub (i) modyfikujcymi przemian fos-fatydyloinozytydw (p. rozdz. 45). W tej reakcji uczestniczy odrbny kompleks zawierajcy biako G.
Tabela 50-1. Skutki biochemiczne i fizjologiczne stymulacji poszczeglnych typw receptorw adrenerl gicznych ** Receptory ['., Receptory ^1 Receptory -i2 Receptory p2 Wzrost glikogenolizy Rozkurcz mini gadkich Stymulacja lipolizy Skurcz mini gadkich odka i jelit Skurcz Wzrost liczby i siy skurnaczy krwiononych czu minia sercowego mini gadkich niei drg moczowo-pcio- ktrych oysk n a czyn i o wych wych Hamowanie: lipolizy uwalniania reniny agregacji pytek sekrecji insuliny Wzrost glukoneogenezy w wtrobie Wzrost glikogenol izy w wtrobie Wzrost gfikogenolizy w miniach Wzrost uwalniania: insuliny glukagonu reniny Rozkurcz mini gadkich oskrzeli naczy krwiononych drg moczowo-pciowych odka i jelit
HORMONY RDZENIA NADNERCZY / 651 ISTNIEJE CZYNNOCIOWE PODOBIESTWO MIDZY RECEPTOREM KATECHOLAMINOWYM A UKADEM REAKCJI WZROKOWEJ
Stymulacja rodopsyny przez wiato indukuje wizanie jej z transducyn, tj. kompleksem zawierajcym biako G, ktrego podjednostka a take wie si z GTP. Z kolei aktywowane biako G pobudza fosfodiesteraze. hydrolizuj-c cGMP. W wyniku tej reakcji zostaj zamknite kanay jonowe zlokalizowane w bonie komrek prcikowych siatkwki, co wyzwala reakcj wzrokow. Reakcja koczy si w chwili hydrolizy przez GTP-az (poczon z podjednostka a receptora) zwizanego z ni GTP. Zestawienie niektrych efektw biochemicznych i fizjologicznych zapocztkowan ych pobudzeniem poszczeglnego typu receptora ad-renergicznego zawiera tab. 50-1. Aktywacja fosfoprotein przez cAMP-zalen kinaz biaek (p, ryc. 45-5) jest przyczyn wielu efektw biochemicznych wywoanych przez adrenalin. GUZY CHROMOCHONNE WYWODZ SI Z RDZENIA NADNERCZY Guzw tych zwykle nie wykrywa si do chwili, kiedy nie wytwarzaj i wydzielaj ad -
renaliny lub norad/enaliny w ilociach wywoujcych ciki zesp nadcinienia ttniczego. W guzach chromochonnych stosunek norad-renaliny do adrenaliny jest czsto podwyszony. Ten fakt moe tumaczy rnice w obrazie klinicznym wystpujce midzy poszczeglnymi chorymi, noradrenalina jest bowiem gwnie przyczyn nadcinienia ttniczego, za adrenalina wzmoonej przemiany materii.
PIMIENNICTW O
Cryer PE: Diseases of the adrenal medulla and sympathetic nervous system. Pages 511-550 in: Endocrinology and Metabolism. Felig P et al (edi-Lors). McGraw-Hill, 1981, Dixon RAF et al: Cloning of the gene and cDNA for mammalian f5-adrenergic receptor and homology with rhodopsin. Natur (London) 1986;321:75. Exton JH; Mechanisms involved in a-adrenergic phenomena: Role of caicium ion in actions of ca tech olani mes in Kver and other tissues. Am J Physiol 1980;238:E3. Kaupp UB: Mechanism of photoreception in verteb-rate vision. Trends Biochem Sci 1986^11:43. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Molecular mechanisms of receptor desensitization using the P-adrenergic receptor-coupled adenylate cyclase system as a model. Natur (Lond on) 1985;317:124. Stiles GL, Caron MG, Lefkowitz RKL: The p-adrener-gic receptor: Biochemical mechanisms ofphysiolo-gical reguiation. Physiol Rev 1984;64:66).
51
WPROWADZENIE
Hormony gonadalne
Gonady s narzdem o podwjnej czynnoci, tj. wytwarzajcym komrki rozrodcze oraz hormony pciowe. Te dwie funkcje realizowane s w bliskim ssiedztwie anatomicznym, wysokie stenia hormonw pciowych sa bowiem nie-
S krt y uyw ane w tym roz dziale ACT H ABP CBG DHE A DHT E2 FSH GnRH hCG hCS LH MIF hormon adrenokortykotropowy, kortykotropina biako wice androgeny globulina wica kortykosteroi dy dehydroepiandrosteron dihydrotestosteron estradiol folitropina (hormo n pobudzaj cy pertherzyki Graafa) hormon uwalniajcy gonadotropiny, go nadoliberyna ludzka gonadotropina kosmwkowa Iud2ka somatomammotropina kosmwkowa lutropina czynnik hamujcy przewody Mullera d eh yd rog en aza 3 p - hyd roksy steroidowa dehydrogenaza 17{i-hydroksysteroidowa laktogen oyskowy globulina wica hormony pciowe globulina wica hormo ny tar czycy globulina wica testostero n i estrogeny
zbdne w miejscu powstawania komrek rozrodczych. Jajniki wytwarzaj komrki jajowe i hormony steroidowe estrogeny i progesteron, gonady mskie (jdra) wytwarzaj plemniki i testosteron. Gonady wytwarzaj, podob nie jak nadnercza, bardzo liczne steroidy, z ktrych tylko kilka wykazuje aktywno hormonaln. Produkcja tych hormonw podlega cisej regulacji na zasadzie sprzenia zwrotnego, w ktrych uczestnicz przysadka mzgowa i podwzgrze. Hormony gonadalne dziaaj za porednictwem mechanizmu jdrowego, podobnego do opisanego dla steroidowych hormonw nadnerczowych.
Prawidowe funkcjonowanie gonad ma ogromne znaczenie dla procesu reprodukcji i, co za tym idzie, dla przetrwania gatunku. I odwrotnie zrozumienie fizjologii i biochemii endokrynologicznej zwizanej z procesem reprodukcji stanowi podstaw wielu metod antykoncepcyjnych. Ponadto hormony gonadalne wykazuj rwnie inne wane dziaanie, np. dziaaj ana-bolicznie i s niezbdne dla utrzymania prawidowego stanu skry, koci i mini.
3H-OHS D 17P-OHS D PL SHBG TBG TEBG
JDRA WYTWARZAJ TESTOSTERON (MSKI HORMON PCIOWY) I PLEMNIKI (MSKIE KOMRKI ROZRODCZE)
Te funkcje realizowane s przez trzy typy wyspecjalizowanych komrek; 1) sperm a t ogonie i bardziej zrnicowane komrki rozrodcze, umiejscowione w kanalikach krtych, 2) komrki Leydiga (okrelone rwnie jako komrki
HORMONY GONADALNE / 653
rdmiszowe) rozrzucone w tkance cznej (zlokalizowanej pomidzy kanalikami krtymi zawierajcymi nabonki plemnik o twrcze) i wytwarzajce testosteron pod wpywem stymulacji LH oraz 3) komrki Sertolego wytwarzajce bon podstawn dla nabonka plemnikotwr-czego w kanalikach krtych oraz rodowisko dia prawidowego rnicowania i dojrzewania komrek rozrodczych. Spermatogenez pobudzaj przysadkowa fblitropina (FSH) i lutropi-na (LH). Wymaga ona rodowiska sprzyjajce go zrnicowaniu komrek rozrodczych oraz stenia testosteronu znacznie wyszego od wystpujcego w kreniu systemowym. Ten warunek jest speniony, poniewa komrki Leydi-ga (wytwarzajce testosteron) znajduj si w bliskoci nabonka plemnikotwrczego kanalikw krtych. Pomimo udziau licznych enzymw w syntezie steroidw gonadalnych, enzym odszczepiajcy acuch boczny cholesterolu oraz dehydrogenaza 3|-hydroksysteroidowa s enzymami katalizujcymi krytyczne etapy tej syntezy Androgeny gonady mskiej wytwarzane s przez komrki Leydiga zlokalizowane w tkance rdmiszowej. Bezporednim prekursorem steroidw gonadalnych jest, podobnie jak i steroidw nadnerczowych, cholesterol. Etapem krytycznym, decydujcym o nasileniu syntezy androgenw gonadalnych, jest odszczepienie acucha bocznego cholesterolu. Proces konwersji cholesterolu do pregnenolonu jest taki sam zarwno w nadnerczach, jdrach, jak i jaj nikach. W ostatnich dwch narzdach pro ces ten pobudzany jest przez LH a nie przez ACTH. Konwersja pregnenolonu do testosteronu wymaga dziaania 5 enzymw. S nimi: 1) dehydrogenaza 30-hydroksysteroidowa (3j3--OHSD), 2) A5'4 izomeraza, 3) 17a-hydroksyla-za, 4) C^^-liaza i 5) dehydrogenaza 170--hydroksysteroidowa (17p-OHSD). Ten szlak biosyntezy testosteronu okrelony jako szlak progesteronowy (Jub szlak A4) przedstawiony jest po prawej stronie ryc. 51-1. Konwersja pregnenolonu do testosteronu moe si rwnie odby szlakiem dehydroepiandrosteronowym (zwanym rwnie szlakiem A5) przedstawionym po lewej stronie ryc. 51-1. W jdrach ludzkich szlak A4 jest szlakiem preferowanym. Poniewa jdra ludzkie s rzadko dostpne do bada,
wikszo informacji dotyczcych szlakw biosyntezy mskich hormonw gonadalnych uzyskano na materiale zwierzcym. Moliwe jest wystpowanie znacznych rnic midzygatun-kowych w tym zakresie. Wymienionych 5 enzymw jest zlokalizowanych we frakcji mikrosomamej jder szczurzych. Stwierdza si bliskie czynnociowe sprzenie midzy aktywnoci 3p-OHSD i ASA--izomerazy oraz midzy aktywnoci 17a-hyd-roksylazy i C]7.2O-liazy. Te pary enzymw pokazane s na ryc. 51-J przedstawiajcej ogln sekwencj poszczeglnych reakcji oraz na ryc. 51 -2, ilustrujcej przykadowo schemat biosyntezy androgenw w bonach mikrosoma-lnych jdra szczura. Ta druga rycina pokazuje, w jaki sposb poszczeglne substraty biosyn tezy testosteronu wchodz do przestrzeni mik-rosomalnej oraz, w jaki sposb przechodz z jednego etapu sziaku A* do nastpnego. Skoro wystpuj 4 potencjalne substraty wobec tylko jednej 3JJ-OHSD, moliwe s liczne szlaki alternatywne. Tak wic o rodzaju szlaku biosyntezy androgenw decyduje prawdopodobne stenie substratu znajdujcego si w ssiedztwie poszczeglnych enzymw uczestniczcych w tym procesie. Wizanie w bonach mikrosomalnych moe wywoa taki gradient.
Dihydrotestosteron (DHT) powstaje z testosteronu przez redukcj piercie nia A szkieletu steroidowego przez Ba-- reduktaz. Jdra ludzkie wytwarzaj
ok. 50 i00 jig DHT na dobi, lecz wikszo DHT pochodzi z konwersji w tkankach obwodowych (p. niej). Jdra wytwarzaj rwnie mae, cho znaczce iloci 170-estradiolu (E2), bdcego eskim hormonem pciowym, cho wikszo E 2 wytwarzana przez mczyzn pochodzi z aromatyzacji testosteronu i androstendionu przez tkanki obwodowe. Przyjmuje si, e w produkcji E 2 uczestnicz komrki Leydiga i Sertolego oraz nabonek plemnikotwrczy w kanalikach krtych. Znaczenie E2 u mczyzny nie zostao dotychczas okrelone, cho wydaje si, e moe uczestniczy w regulacji wydzielania FSH. Wystpowanie zbyt wysokich ste E2 oraz zmian ilorazu stenia wolnego E2 do wolnego testosteronu wie si z pojawieniem gmekomastii (powikszeniem gruczou sutkowego u mczyzn) w okresie pokwitania oraz w okresie po pokwitaniu, szczeglnie u osb starszych oraz chorych z przewlek chorob miszu wtrobowego lub z nadczyn-noci tarczycy.
654 / ROZDZIA 51
C=0
oJCDr
Prag nano ton ii 17a-HYDR0KSYU\ZA
i
Progesteron iii
171-HYDHOKSYLAZA
i i
CH3
UJ
i
i
LBo
17ct - Hy d ro ksy p rog estero n
ii
i
1i7a-Hydrokaypregneno]on
i
C^-LIAZA i1
TEROIDC
C^-LIAZA
o
IX
I I
( J T ^
Dehyd roe p i a n d r oste ro n
LU
A
DEHYDHOGENAZA 170HYDROKSYSTER0ID0WA
DEHYDROt
XiJ~^
Androstendlon DEHYDROGENAZA 170HYDROKSYSTEROIDOWA
T
j ^ -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
A*-AndroEtendlol
Testosteron
Rvo. 51 -1. Szlaki biosyntezy testosteronu Szlak po stronie lewej okrelany jest jako szlak A lub szlak dehydroepiandrosteronowy, za szlak przedstawiony po stronie prawej jako szlak A* lub szlak progesteron owy.

Trzy warstwy stateczki rd -plazmatycznej Pregnenolon 17a- Hydroksyprogesleron
A
i* Ryc. 51-2. Przykadowy

Warstwy hydrofobowe
schemat biosyntezy androgenu w bonie mikrosomalnej jder. Przebieg bony jest horyzontalny, prawdopodobnie tak jak w komrce. W preparatach mikrosomalnych bony te tworz pcherzyki. A androstendion, T testosteron. (Wedug; DeGroot L. J.: Endocrinology, tom 3, Grune and Stratton, 1979, za zezwoleniem), _________________________________________________
Produkcja hormonalna jder jest w znaczcym stopniu zalena od wieku. Testosteron jest gwnym hormonem u podu i nworodka szczurzego, lecz ju krtko po urodzeniu jdra wytwarzaj tylko androsteron. Zdolno syntetyzowania testosteronu przez jdro zostaje przywrcona w okresie pokwita-nia, po czym utrzymuje si przez cae ycie. Podobne obserwacje poczyniono u innych gatunkw zwierzt i wydaje si, e rwnie u czowieka wystpuj zmiany syntezy androgenw przez jdra zalene od wieku. Testosteron wie si ze swoistym biakiem osocza U wikszoci ssakw, w tym i u czowi eka, w osoczu krwi stwierdza si p-gobulin wic
Tabela 51-1. Wizanie hormonw do globuliny wicej hormony pciowe (SHBG) Steroidy ulegajce
wizaniu
Testosteron 17 p-Estradiol D i hy d rotestoste ro n Inne 17 fS-hydroksysteroidy Estron
Steroidy nie wice si Androgeny koniugowane 17 a-Testosteron Dehydroepiandrosteron Kortyzol Progesteron
testosteron, odznaczajc si swoistoci, lub te wysokim powinowactwem i ograniczon pojemnoci (tab. 51-1). Biako to, zwykle okrelane jako globulina wica hormony pciowe (SHBG sex-hormone binding globulin) lub globulina wica testosteron i estrogeny (TEBG testosterone-estrogen-binding globulin) wytwarzane jest w wtrobie. Jego synteza wzrasta pod wpywem estrogenw (u kobiet stenie SHBG w surowicy krwi jest 2-krotnie wysze ni u mczyzn) oraz u chorych z pewnymi chorobami wtroby lub z nadczynnoci tarczycy, natomiast ulega obnieniu pod wpywem and-rogenw, w miar starzenia si oraz w niedo-czynnoci tarczycy. Wiele z wymienionych czynnikw wpywa rwnie na wytwarzanie CBG (p. rozdz. 44) i TBG (p. rozdz. 47). Poniewa SHBG i albuminy wi 9799% krcego we krwi testosteronu, tyiko drobna frakcja tego hormonu wystpuje w surowicy w postaci wolnej (biologicznie aktywnej). Gwna funkcja SHBG wydaje si polega na ograniczaniu stenia wolnego testosteronu w surowicy krwi. Testosteron wykazuje wiksze powinowactwo do SHBG ni estradiol (tab. 51-2). Dlatego te zmiana stenia SHBG powoduje wiksze zmiany stenia wolnego testosteronu ni wolnego estradiolu. Wzrost stenia SHBG w surowicy, wystpujcy u osb starych ora2 chorych z marskoci wtroby lub (i) nadczyn-
656 / ROZDZIA 51
noci tarczycy, jest przyczyn wzrostu ilorazu stenia wolnego E3 i stenia wolnego testosteronu oraz stwierdzanych u nich objaww estrogenizacji. We krwi ylnej jder stwierdza si obecno licznych steroidw. Testosteron jest jednak gwnym steroidem wytwarzanym przez jdra osb dorosych. Dobowe wytwarzanie testosteronu wynosi u zdrowych osb dorosych ok. 5 mg. Podobnie jak inne steroidy testosteron uwalniany jest do przestrzeni pozakomorkowej natychmiast po jego syntezie. Wiele metabolit w testosteronu jest nieaktywnych, podczas gdy inne np. dihydrotestosteron i estradiol wykazuj zwikszon lub zrnicowan aktywno teronu odbywa si dwoma szlakami. W jednym z nich zachodzi oksydacja w pozycji 17, w drugim natomiast redukcja podwjnego wizania piercienia A oraz grupy ketonowej w pozycji 3. Przemiana pierwszym szlakiem zachodzi w licznych tkankach w tym i w wtrobie; produktami tego szlaku s 17-ketosteroidy, ktre s zwykle nieaktywne lub mniej aktywne od hormonu macierzystego. Przemiana drugim szlakiem jest mniej skuteczna i zachodzi gwnie w tkankach docelowych; jest on rdem silnego metabolitu DHT.
Tabela 51-2. Przyblione powinowactwa steroi dw do biaek wicych surowicy* SHBG" CBG" Estradiol Estron Androstendion Testosteron Dihydrotestosteron Progesteron Kortyzol
5 >10 >1O
>100 >100 >100

2 3
2
1
>100 >100
Wedug Stiteri P.K., Febres F.: Ovarian hormone synthesis, circulation and mechanism of action, str. 1401; w: Endocrinology, tom 3, pod redakcj DeGroot L.J., Grune and Stratton, 1979, w adaptacji autora rozdziau. Powinowactwo wyraone jest jako Kd iloci x molowej 10".
Szlaki metaboliczne. Przemiana testos-
Metabolity testosteronu. Najwaniej-
szym metabolitem testosteronu jest DHT. W wielu tkankach, w tym w pcherzykach nasiennych, gruczole fokowym, zewntrznych narzdach pciowych i w niektrych obszarach skry DHT jest aktywn postaci hormonu. Stenie DHT u dorosego mczyzny stanowi 1/10 stenia testosteronu. W cigu doby po -
wstaje ok. 400 ug DHT, natomiast ok. 5 mg testosteronu. Reakcj konwersji testosteronu do DHT katalizuje NADPH-zalena 5-oc-redu-ktaza (p. niej). Testosteron moe wic by uznany za prbhor-mon, poniewa ulega przeksztaceniu do znacznie silniej dziaajcego zwizku (dihydrotestos-teronu) i wikszo tej konwersji odbywa si poza jdrami. Maty odsetek testosteronu ulega take konwersji do estradioiu poprzez aromaty-zacj, tj. reakcj, ktra jest szczeglnie wana w m zgu, gdzi e hormon y te s po mo cne w ksztatowaniu zachowania pciowego zwierzcia. Inny silny androgen, androstandiol, wytwarzany jest rwnie z testosteronu.
OH
15a-Reclulctazal
Testosteron
CWhytJrotestosteron (DHT)
Gwne metabolity I7-ketosteroidowe an-drosteroff i ctiucholannlon ulegaj koniugacji z kwasem glukuronowym lub siarkowym tworzc rozpuszczalne w wodzie glukuronidy iub siarczany, atwo wydalane z ustroju. WIELE HORMONW UCZESTNICZY W REGULACJI HORMONALNEJ JDER LH pobudza steroidogenez w jdrach LH pobudza steroidogenez i wytwarzanie testosteronu, wic si z receptorami bony plazmatycznej komrek Leydiga (podobny receptor dla LH stwierdza si w komrkach ciaka tego jajnika) oraz pobudzajc cyklaz adeny-lanow i, co za tym idzie, zwikszajc rd-komrkowe stenie cAMP. W wyniku takiego dziaania nasila si reakcja odszczepienia acucha bocznego od czsteczki cholesterolu. Tak wiec istnieje podobiestwo midzy dziaaniem LH na jdro i ACTH na nadnercza. Testosteron jest ogniwem mechanizmu sprzenia zwrotnego dziaajcym hamujco na uwalnianie lub (i) syntez GnRH w podwzgrzu (ryc. 51 -3). Spermatogeneza regulowana jest przez FSH i testosteron FSH wic si z komrkami Sertolego po budza syntez biafka wicego androgeny (ABP androgen binding protein). ABP jest glikoprotein wic testosteron. ABP rni si od rdkomrkowego receptora androgenoLH
wego, natomiast jest homologiczny do SHBG. ABP wydzielane jest do wiata kanalikw krtych. W procesie tym testosteron, wytwarzany przez komrki Leydiga, zostaje przeniesiony do miejsca spermatogenezy, gdzie obecny jest w bardzo duym steniu. Jest to krytyczny etap spermatogenezy, poniewa normalne stenia testosteronu we krwi obwodowej lub osigalne przy leczeniu substytucyjnym s niewystarczajce dla tego procesu. Androgeny wpywaj, na kilka zoonych procesw fizjologicznych Androgeny, gwnie testosteron i DHT, uczestnicz w: 1) rnicowaniu pici, 2) spermatoge-nezie, 3) rozwoju drugorzdowych cech pciowych i struktur godowych, 4) przemianach, anabolicznych i regulacji genowej oraz 5) ksztatowaniu si mskiego profilu behawioralnego (ryc. 51-3). Liczne tkanki docelowe, uczest niczce w tych procesach^ dzieli si na takie, ktre reaguj na testosteron, i pozostae, reagujce na DHT, Klasycznymi narzdami docelowymi dla DHT (wykazujcymi te najwiksz aktywno 5-cc-reduktazy) s: gruczo krokowy, pcherzyki nasienne, zewntrzne narzdy pciowe oraz skra okolicy narzdw pciowych. Wrd narzdw docelowych testosteronu naley wymieni: embrionalne struktury wywo dzce si z przewodu Wolffa, spermatogonie, minie szkieletowe, koci, nerki i mzg. Do tychczas nie znaleziono swoistego androgenu uczestniczcego w regulacji pozostaych licznych procesw wymienionych wyej.
Regulacja wydzielania gonadolroplny Spemnatofleneza
J )
Regulacja aktywnoci genu ) Rnicowanie pciowe przewodu Wotffa I Zewntrzna wlryllzacja Dojrzewanie pici owe w o kresie po kwi lania Regulacja aktywnoci ganu KOMRKA DOCELOWA
Ryc. 51-3. Mechanizm dziaania androgenw LH lutropina, T testosteron, DHT dihydrotesto-steron, R receptor androgenowy. (Wedug: WilsonJ. D. i wsp.:Theendocrinecontro! of mae phenotypic development; Aust J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziau, za zezwoleniem).
42 Biochemia
658 / ROZDZIA 51
Androgeny dziaaj za porednictwem mechanizmu jdrowego, podobnego do opisanego dla steroidw nadnerczowych Aktualn koncepcj dziaania androgenw przedstawia ryc. 51-3. Wolny testosteron wnika przez bon plazmatyczna. do wntrza komrek na zasadzie dyfuzji biernej lub uatwionej. Komrki docelowe zatrzymuj testosteron najpewniej dlatego, e hormon wie si ze swoistym receptorem rdkomrkowym. Wikszo zatrzymanego hormonu stwierdza si w jdrach komrkowych, pomimo znacznych rnic wystpujcych w tym zakresie midzy tkankami. Cytoplazma licznych (chocia nie wszystkich) komrek docelowych zawiera enzym 5a--reduktaz przeksztacajcy testosteron w DHT. Jest spraw sporn, czy istniej dwa odrbne receptory dla testosteronu i DHT. Przy zaoeniu, e istnieje tylko jeden rodzaj receptora, powinowactwo jego do DHT jest wysze od powinowactwa do testosteronu. Pojedyncza mutacja genu u myszy jest przyczyn utraty powinowactwa receptora zarwno do DHT, jak i do testosteronu, co sugeruje, e mamy do czynienia tylko z jednym rodzajem biaka receptorowego. Rnice powinowactwa, zwizane ze zdolnoci tkanek docelowych do konwersji testosteronu do DHT, najpewniej decyduj o tym, czy aktywny jest kompleks testosteron--receptor, czy te kompleks DHT-receptor. Lokalizacja kompleksu testosteron/DHT-receptor
w jdrze komrkowym jest procesem niezbdnym do wystpienia dziaania androgenowego. Wizanie kompleksu receptor-steroid przez chromatyn jdrow wydaje si wyprzedza pewien etap aktywacji, za swoisto reakcji zapewnia element odpowiedzi androgenowej".
Podobnie jak inne steroidy (i niektre hormony peptydowe), kompleks testosteron/DHT--receptor aktywuje swoiste geny. Produkty biakowe tych genw s
porednikami licznych, jeli nie wszystkich, efektw dziaania wymienionych hormonw. Testosteron pobudza syntez biaek w drugorzdowych mskich narzdach pciowych. Dziaaniu temu towarzyszy zwykle wzrost oglnokomrkowego RNA, w tym mRNA, tRNA i rRNA. Innym bardziej swoistym przykadem dziaania testosteronu jest wpyw tego hormonu na syntez ABP. Hormon ten zwiksza tempo transkrypcji genu kodujcego ABP, co wyraa si wzrostem iloci mRNA kodujcego to biako. Innym, dobrze przebadanym przykadem, jest aa globulina, bdca gwnym bia kiem wydalanym z moczem u szczurw pci mskiej. Tempo syntezy a 2ji globuliny jest proporcjonalne do ilocrkodujcego j mRNA. Z kolei ilo tego ostatniego zalena jest od tempa transkrypcji genu globuliny. Wszystkie wymienione etapy syn tezy cc2ji globuliny pobudzaj androgeny. Nerka jest wanym narzdem docelowym dla androgenw. Androgeny powoduj oglne powikszenie si tego narzdu oraz indukuj syn-
KOMRKA DOCELOWA KOMRKA LEYDIA
5a-REDUKT AZA|
Niedobory enzymatyczna w zakresie: odszczeplanla acucha bocznego cholesterolu 17ahydro ksylazy konwersji C do Cla redukcji grupy ketonowej w pozycji 17 oksydacji piercienia A do A' -3-ketosteroldow
Niedobr 5a reduktazy
Zaburzenia receptorowe
Oporno u chorych wykazujcych obecno receptora (R + )
Ryc. 51-4. Przyczyny opornoci na androgeny Na rycinie pokazano 4 defekty, dla ktrych ziden tyfikowano wystpowanie mutacji. T testosteron, DHT dihydrotestosteron, R receptor and-rogenowy (Wedug: Wilson J. D. i wsp.: The endocrine controt of mae phenotypic development; Aust. J. Biol. Sci. 1983, 36, 101, w modyfikacji autora rozdziau, za zezwoleniem).
tez licznych enzymw u rnych gatunkw zwierzt,' W kilku narzdach docelowych androgeny pobudzaj podzia komrek. Dziaanie to jest mao zrozumiae. Testosteron lub DHT wraz z estradiolem wydaj si uczestniczy w ekstensywnym i niekontrolowanym dzieleniu si komrek gruczou krokowego stajc si przyczyn agodnego przerostu tego narzdu, wystpujcego a u 75% mczyzn po 60 r. PATOFIZJOLOGIA MSKIEGO UKADU ROZRODCZEGO ZWIZANA JEST Z DEFEKTAMI HORM ONALNYMI Stan chorobowy spowodowany brakiem testosteronu okrela si jako hipogonadyzm. Jeli pojawi si on przed pokwitaniem, wwczas aie dochodzi do rozwoju dru go rzdowych cech pciowych, natomiast jego wystpowanie u dorosych powoduje zanik tych ostatnich. Pierwotny hipogoimdyzm charakteryzuje si pierwotnym uszkodzeniem jder przez proces chorobowy, natomiast hipogonadyzm wtrny jest nastpstwem upoledzonego wydzielania gonado-tropin. Wystpowanie przypadkw izolowanych niedoborw enzymatycznych w szlaku biosyntezy androgenw by to pomocne w okrelaniu znaczenia poszczeglnych jej etapw dla produkcji i dziaania tych hormonw. Na rycinie 51-4 pokazane s szczeble dziaania androgenw poczwszy od biosyntezy testosteronu do dziaania poreceptorowego zarwno tego hormonu, jak i DHT. Opisano co najmniej 5 dokadnie zdefiniowanych defektw biosyn tezy testosteronu. Ponadto znany jest niedobr 5<x-reduktazy. W wielu przypadkach wykrywa si albo brak receptora DHT, albo testosteron owego, albo te receptor ten jest w jakim stopniu nienormalny. W kocu w wielu przypadkach wszystkie oznaczalne parametry, w tym rwnie receptory, s prawidowe, mimo wystpowania cech feminizacji o zmiennym nasileniu. W tych ostatnich przypadkach zawsze stwierdza si mski genotyp. Nasilenie klinicznych objaww jest zalene od nasilenia wystpujcego defektu biochemicznego. U chorych z cakowitym brakiem jakiego enzymu biosyntezy androgenw stwierdza si fenotyp eski pomimo wystpowania genotypu mskiego XY. W odrnieniu od niedoboru cakowitego, w niedoborach naja -
godniejszych stwierdza si tylko aberracj w zakresie lokalizacji cewki moczowej. U osobnikw z genotypem mskim, wykazujcych cakowity brak czynnociowo sprawnych receptorw androgenowych, stwierdza si obecno jder oraz produkcj testosteronu, pomimo wystpowania cakowitej feminizacji zewntrznych narzdw pciowych (jest to tzw. zesp femiuiujcych jder). Jest interesujce, e nie zidentyfikowano niedoboru w zakresie syntezy lub dziaania estrogenw, porwnywalnego do ww. niedoboru androgenw. JAJNIKI WYTWARZAJ ESKIE HORMONY PCIOWE (ESTROGENY I PROGESTYNY) ORAZ ESKIE KOMRKI ROZRODCZE (KOMRKI JAJOWE) Biosynteza i przemiana hormonw jajnikowych s podobne do opisanych dla hormonw mskich Estrogeny tworz rodzin hormonw syntetyzowanych w rnorodnych tkankach. Gwnym estrogenem pochodzenia jajnikowego jest 17 p-estradiol. U innych gatunkw zwierzt estrogenem wytwarzanym w wikszych ilociach w licznych tkankach jest estron. W ciy w oysku wy twa rany jest we wzgldnie duych ilociach estriol. Oglny szlak biosyntezy est rogenw oraz lokalizacja subkomrkowa enzymw uczestniczcych we wczesnych jej etapach s identyczne z biosyntez androgenw. Cechy rnice biosyntez estrogenw od androgenw przedstawione s na ryc. 51-5. Estrogeny wytwarzane s drog aromatyzacji androgenw. W tym zoonym procesie wystpuj trzy hydroksylacje z udziaem O 2 i NADPH. Przyjmuje si, e kompleks enzymatyczny, okrelany jako aromataza, zawie ra oksydaz P-450 o mieszanej funkcji. Jeli substratem dla tego kompleksu enzymatycznego jest testosteron, produkowany jest est-radiol, natomiast jeli substratem tym jest and-rostendion wytwarzany jest estron. Trudne byo zdefiniowanie komrek wytwarzajcych poszczeglne steroidy jajnikowe. Obecnie wydaje si, e w ich syntezie uczestnicz dwa rodzaje komrek. Te komrki s gwnym rdem androstendionu (jest to gwny and-rogen wytwarzany w jajnikach) oraz 17a-hydro-ksyprogesteronu. Z tego ostatniego steroidu komrki ziarniste wytwarzaj estradiol. Proges-
660 / ROZDZIA 51
Cholesterol -
Pregnenolo n
17 -Hydroteypraononoton17 - Hyd ro ksy p rogester o n -
Dehydroepiandrosternn Androstendlon
Inne . metabolity
Progesteron Estron (E, 170-Eslradiol (E,)
Inne metabolity
OH
-0H
Kta-Hydrotcsylaza
Estriol Ryc. 51 -5. Biosynteza estrogenw. (Wedug: Ganong W. F.: Review of Medicsl Physfology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w nieznacznej modyfikacji autora rozdziau, za zezwoleniem).
teron jest wytwarzany i wydzielany przez komrki ciaka tego, ktre produkuj rwnie nieco estradiolu. Znamienne iloci estrogenw powstaj w tkankach obwodowych drog aromatyzacji and-rogenw. U mczyzn aromatyzacja testosteronu przez tkanki obwodowe jest rdem 80% wytwarzanego u nich estradiolu. U kobiet wanym substratem dla estrogenw s androgeny nadnerczowe. W dy 50% wytworzonego E2 jest wynikiem aromatyzacji adrogenw nad-nerczowych. W kocu konwersja androsten-diomi w estron jest gwnym rdem estrogenw u kobiet po menopauzie. Aktywno aro-matazow stwierdza si w komrkach tuszczowych oraz w wtrobie,'skrze i w innych tkankach. Nadmierna aktywno tego enzymu wydaje si uczestniczy w patogenezie zespou
estrogenizacji wystpujcego u osb starych oraz w takich chorobach, jak marsko wtro by, nadczynno tarczycy i otyo. Estrogeny i progestyny s w rnym stopniu zwizane z biakami transportowymi osocza Estrogeny zwizane s z SHBG, za proges tyny z CBG. Estradiol wie si z SHBG 5-krotnie sabiej ni testosteron lub DHT. W odrnieniu od wymienionych steroidw progesteron i kortyzol wykazuj mae powinowactwo do tego biaka nonikowego (p. tab. 51-2). Progesteron i kortyzol wykazuj prawie takie samo powinowactwo do CBG. Z kolei globulina wica kortykoidy (CBG) wykazuje mae powinowactwo do estradiolu i jeszcze mniejsze do testosteronu, DHT lub estronu.
HORM ONY GONA DA LNE / 661
OH
170-Estradlol
Proaesteron
Wymienione biaka nonikowe nie odgrywaj widocznej roli w mechanizmie dziaania tych hormonw na poziomie komrkowym (podobnie jak w dziaaniu innych hormonw steroido-wych), poniewa prawdopodobnie tylko wolny, nie zwizany z biakami hormon wykazuje aktywno biologiczn. Biaka nonikowe speniaj rol krcego rezerwuaru dla wymienionych hormonw. Poniewa wykazuj one wzgldnie wielk pojemno wizania, stanowi one zapewne rodzaj buforu chronicego ustrj przed nagymi zmianami stenia hormonw w osoczu krwi. Wielko klirensu metabolicznego wymienionych steroidw jest odwrotnie proporcjonalna do ich powinowactwa do SHBG. Ten fakt tumaczy szybsze klirensowa-nie estronu ni estradiolu, oraz szybsze kliren-sowanie tego ostatniego ni testosteronu i DHT. Koniugaty wymienionych hormonw (p. niej) nie ulegaj wizaniu ani przez SHBG, ani te przez CBG. W dalszej czci rozdziau omawiane s czynniki regulujce produkcj SHBG. Wielko sekrecji steroidw jajnikowych ulega znacznym wahaniom zalenym od fazy cyklu miesiczkowego i jest proporcjonalna do ich produkcji w jajnikach. Wymienione hormony nie s magazynowane, ulegaj one wydzielaniu natychmiast po ich biosyntezie. Estrogeny i progestyny s aktywnie metabolizowane przez wtrob Estrogeny. Wtroba przeksztaca estradiol i estron w estrioi poprzez szlaki metaboliczne przedstawione na ryc. 51-5. Estradiol, estron i estrioi s substratami dla enzymw wtrobo wych katalizujcych powstawanie pochodnych glukuronidowych lub siarczanowych. Poszczeglne gatunki zwierzt rni si aktywnoci wymienionych enzymw sprzgajcych. I tak np. gryzonie wykazuj tak aktywne ukady
HO'
Octan Cholesterol
^û^V
Progesteron
Sl sodowa glukuronidu -20-pregnandlolu
Ryc. 51-6. Biosynte2a progestero nu i gwne szlaki jego przemiany. Stwierdza si rwnie inne metabolity, (Wedug: Gano ng W. F.: Review of Medical Physiology, wyd. 13, Appleton and Lange, 1987, w niewielkiej modyfikacji autora rozdziau, za zezwoleniem).
662 / ROZDZIA 51
enzymw metabolizujcych, e estrogeny ulegaj prawie cakowitej metabolizacji w wtrobie i po doustnym ich podaniu nie wykazuj praktycznie adnej aktywnoci. U naczelnych te ukady enzymatyczne s mniej aktywne, wic doustnie podane estrogeny s bardziej skuteczne. Steroidy sprzone (z kwasem glukurono-wym lub siarkowym) s rozpuszczalne w wodzie i nie wi si z biakami transportowymi (nonikowymi); ten fakt tumaczy, dlaczego s szybko wydalane z ci, kaem i moczem. Progestyny. Poniewa wtroba aktywnie metabolizuje progesteron do kilku zwizkw,
doustnie podany hormon nie wykazuje dziaania
biologicznego. Gwnym metabolitem proges-tynowym znajdowanym w moczu ludzkim jest sl sodowa glukuronidu-20-pregnandioiu (ryc. 51-6). Okrelone steroidy syntetyczne, np. pochodne 17 ct-hydroksyprogesteronu i 17 a-al-kilopochodne 19-nortestosteronu, wykazuj aktywno progestynow i nie s metabolizo-wane w wtrobie. Ten fakt tumaczy, dlaczego zwizki te s szeroko stosowane jako doustne leki antykoncepcyjne.
GWN FUNKCJ HORMONW JAJNIKOWYCH JEST ICH UDZIA W DOJRZEWANIU I PODTRZYMYWANIU CZYNNOCI UKADU ROZRODCZEGO KOBIETY
Hormony te przygotowuj strukturalne determinanty eskiego ukadu rozrodczego (patrz niej) do reprodukcji: 1) wpywajc na dojrzewanie pierwotnych komrek rozrodczych i 2) powstawanie tkanek pozwalajcych na implanta-cj blastocytu oraz 3) zabezpieczajc hormonalny zegar dla procesu jajeczkowania, 4) zapewniajc rodowisko niezbdne dla podtrzymywania ciy i 5) wpywajc na pord i laktacj. Estrogeny pobudzaj rozwj tkanek uczestniczcych w procesie reprodukcji. Oglnie mwic, hormony te wpywaj na wielko i liczb komrek, pobudzajc syntez biaek, rRNA, tRNA, mRNA i DNA. Pod wpywem estroge nw dochodzi do: 1) proliferacji i rnicowania nabonka pochwowego, 2) proliferacji endomet-rium, przerostu i wyduenia jego gruczow, 3) rozwoju rytmicznej aktywnoci skurczowej myometrium oraz 4) proliferacji przewodw gruczou sutkowego. Ponadto estradiol wykazuje dziaanie anaboliczne na koci i chrzstki, dziki czemu pobudza wzrost. W kocu, est -
rogeny, dziaajc na obwodowe naczynia krwionone, wywouj ich rozszerzenie i rozproszenie ciepa. Progestyny hamuj dziaanie proliferacyjne estrogenw na nabonek pochwowy i przeksztacaj nabonek macicy z postaci proliferacyjnej w sekrecyjn (co wyraa si wzrostem wielkoci i funkcji gruczow wydziel niczych oraz wzrostem zawartoci glikogenu). W ten sposb nabonek macicy przygotowuje si do zagniedenia zapodnionej komrki jajowej. Ponadto progestyny wzmagaj rozwj zrazikowych obszarw gruczow sutkowych, po uprzedniej stymulacji rozwoju przewodw tych gruczow przez estrogeny. Progestyny zmniejszaj przepyw krwi przez naczynia obwodowe, dziki czemu zmniejszaj utrat ciepa. Ten fakt tumaczy wzrost temperatury ciaa w fazie luteal-nej cyklu miesiczkowego, tj. w fazie, w ktrej hormony te s wytwarzane. Ten wzrost temperatury ciaa, zwykle wynoszcy 0,5C, wykorzystywany jest jako oznaka jajeczkowania. Oglnie rzecz biorc, progestyny wymagaj, dla wywoania swego efektu biologicznego, wyprzedzajcego lub rwnoczesnego dziaania estrogenw. Jest to, by moe, uwarunkowane tym, e estrogeny pobudzaj powstawanie receptorw progesteronowych. Wymienione dwie klasy hormonw czsto dziaaj synergistycz-nie, chocia mog by rwnie antagonistami. Liczba pierwotnych komrek jajowych (o-ogonie) w ludzkim jajniku jest najwiksza w 5 miesicu ciy i wynosi ok, 67 min, spadajc do ok. 2 min w okresie porodu. Na po cztk u po k wit ani a wynosi ona t ylko 100 000200 000. Z wymienionych liczb oogonii zaledwie 400500 ulega ostatecznie przeksztaceniu do dojrzaych oocytw. Pozostaa ilo ulega zani kowi w procesie, ktrego mechanizm nie jest jasny, chocia sugeruje si udzia w nim and-rogenw pochodzenia jajnikowego. Dojrzewanie pcherzykw jajnikowych rozpoczyna si ju w niemowlctwie. W okresie przedpokwita-niowym jajniki stopniowo powikszaj si przez to, e wzrasta objto pcherzykw (dziki rozrostowi komrek ziarnistych) oraz narasta ilo tkanki po zanikych atretycznych pcherzykach jajnikowych oraz ilo tkanki zrbowej rdzenia, zawierajcej komrki rdmiszowe i osonko we wytwarzajce steroidy. Stenia hormonw pciowych w osoczu krwi s mae w dziecistwie, chocia wzrastaj one po podaniu egzogennych gonadotropin.
HORMONY GONAPALNE / 663
Naley wic sdzi, e niedojrzay jajnik ma zdolno 'syntetyzowania estrogenw. Uwaa si, e te mae stenia hormonw pciowych hamuj syntez gonadotropin w okresie przed-pokwitaniowym u dziewczt oraz e w okresie pokwitania ukad podwzgrzowo-przysadko-wy staje si mniej wraliwy na supresyjne dziaanie tych hormonw. W okresie pokwitania pulsacyjne wydzielanie GnRH stymuluje wydzielanie lutropiny. Z kolei ta ostatnia powoduje gwatowny wzrost produkcji hormonw jajnikowych. Folitropina (FSH), bdca gwnym stymulatorem sekrecji estrogenw, pobudza dojrzewanie jednego pcherzyka jajnikowego, po ktrym nastpuje jajeczkowanie.
Cykl miesiczkowy zaley od zoonej interakcji trzech gruczow endokrynnych Hormony determinuj czsto wystpowa nia owulacji i parzenia si. Gatunki monoest-ryczne jajeczkuj i parz si raz w roku, natomiast gatunki poliestryczne powtarzaj taki cykl kilka razy w roku. Naczelne maja. cykle miesiczkowe ze zuszczaniem si endometrium bony luzowej macicy na kocu kadego cyklu za parzenie si nie jest cile skojarzone z owu-lacj. Cykl miesiczkowy u kobiety jest wynikiem zoonej interakcji podwzgrza, przysadki mzgowej i jajnika. Normalna dugo jednego cyklu waha
si od 25 do 35 dni (rednio wynosi 28
Faza folikularna
Faza luleafna
36.8-1 C 36,6-r
36.4 2.0 170-HydroKsy-proges teron 1.0-
Podstawowa temperatura ciaa
20 17-HydroKsyprogesteron Progesteron (ng/rnl)
200 P9/mL 100 0 Gonadotroplny (mlU) IRP-hMG/ml
170-Estradloi
25 27 1
9 11 13 (5 17 19 21 23 25 27 1 cyklu
5 Dni
Ryc. 51-7. Zmiany hormonalne i czynnociowe zachodzce podczas typowego cyklu miesiczkowego u kobiety. M miesiczka, IRP hMG midzynarodowy preparat referencyjny dla gonadotropin. (Wedug: Midgley H. R.: w: Hafezy E. S. E., Evans T.N. (red,): Human Reproduction, Harper and Row, 1973, za zezwoleniem).
664 / ROZDZIA 51 dni). Cay cykl miesiczkowy daje si podzieli na faz folikularn (pcherzykow), lutealn i miesiczkowanie (ryc. 51-7). Faza folikularn
(pcherzykowa). Z przyczyn niewyjanionych jeden pcherzyk jajnika zaczyna si powiksza, gwnie pod wpywem FSH. W pierwszym tygodniu fazy pcherzykowej stenia E, s mae. lecz wzrastaj w miar wzrostu pcherzyka. Szczytowe stenie E2 stwierdza si w 24 godziny przed szczytowym steniem LH (i FSH). E2 uczula przysadk mzgow na dziaanie GnRH. Uwalnianie LH moe by wynikiem reakcji na wysokie stenie E2 (jest to rodzaj dodatniego sprzenia"), lub te nastpstwem nagego spadku stenia tego hormonu (ze stenia szczytowego). Cige podawanie wysokich dawek estrogenw (jako doustne leki antykoncepcyjne) hamuje uwalnianie LH i FSH oraz dziaanie GnRH na przysadk mzgow. Stenia progesteronu w osoczu krwi s bardzo mae w fazie folikularnej. Szczytowe stenie LH zwiastuje koniec tej fazy i wyprzedza jajeczkowanie 0 1618 h. Faza lutealn. Po owulacji komrki ziar niste pknitego pcherzyka ulegaj luteinizacji 1 tworz ciako te. tj. struktur rozpoczynaj c w krtkim czasie produkcj progesteronu i w mniejszym stopniu rwnie estradiolu. St enie estradiolu osiga najwyszy poziom w po owie fazy lutealnej (mowa tylko o steniu E2 w fazie lutealnej), po czym stopniowo spada do bardzo maych wartoci. Gwnym hormonem fazy lutealnej cyklu miesiczkowego jest proges teron, ktry, jak to zaznaczono wyej, jest potrzebny do przygotowania i podtrzymywania czynnoci sekrecyjnej endometrium, stanowi cego rdo substratw energetycznych dla za gniedonego blastocytu we wczesnej fazie jego rozwoju. Lutropina jest niezbdna do podtrzy mywania funkcji ciaka tego we wczesnej fazie jego wystpowania. rdem LH przez 10 pierwszych dni trwania fazy lutealnej jest przy sadka mzgowa. Jeli nastpi implantacja za podnionej komrki jajowej (midzy 22 a 24 dniem normalnego cyklu), funkcj przysadko wej lutropiny przejmuje gonadotropina kosmwkowa (hCG), tj. hormon o bardzo podob nej strukturze do LH, wytwarzany przez kom rki cytotrofoblastu zagniedonego zarodka. HCG pobudza syntez progesteronu przez cia ko te, do chwili wytwarzania tego ostatniego w duych ilociach przez oysko. Jeli implan tacja nie nastpi i komrki cytotrofoblastu nie
wytworz hCG, ciako te zanika i pojawia st miesiczka. Po zuszczeniu endometrium rozpoczyna si nowy cykl miesiczkowy. Czas trwania fazy lutealnej wynosi zawsze 14 + 2 dni. Zmiany w czasie trwania jednego cyklu miesiczkowego uwarunkowane s prawie zawsze zmienionym czasem trwania fazy folikularnej (pcherzykowej). Cia pobudza syntez hormonw oyskowych Zagniedony blastocyt wytwarza trofoblast, ktry z kolei przeksztaca si w oysko. oysko jest porednikiem w przekazywaniu substratw energetycznych z krenia matki do podu oraz jest miejscem produkcji wielu hormonw. (hCG). Gwn funkcj hCG, bdcej hormonem glikoproteinowym (strukturalne podobiestwa pomidzy hCG i LH s omwione w rozdz. 46), jest podtrzymywanie czynnoci ciaka tego do chwili wytworzenia przez oysko progesteronu w ilociach potrzebnych do podtrzymywania ciy. Obecno hCG we krwi mona wykaza ju kilka dni po implan-tacji zapodnionej komrki jajowej, co zostao wykorzystane w testach diagnostycznych dla wykazania wczesnej dy. Szczytowe stenia hCG stwierdza si w poowie pierwszego trymestru, po czym obserwuje si stopniowe ob nienie si stenia tego hormonu do koca ciy. Zmiany stenia hCG i innych hormonw zachodzce w ciy przedstawiono na ryc. 51-8. Progestyny. Ciako te jest gwnym rdem progesteronu w pierwszych 68 tygodniach trwania ciy, po czym rol jego przej muje oysko. Pomimo e ciako te nie przerywa swej funkcji, ilo progesteronu wytwarzanego przez oysko w pnej fazie ciy jest 30 40-krotnie wiksza ni produkowana przez ciako te. oysko nie wytwarza cholesterolu, co oznacza, e- jest ono zalene od dostawy tego lipidu przez matk. Estrogeny. W miar trwania ciy stwierdza si stopniowy wzrost stenia w osoczu krwi estradiolu, estronu i estriolu. W najwikszych ilociach wy twarzany jest estriol; jest to odzwierciedlenie wielu podowo-oys -kowej.
Ludzka gonadotropina kosmwkowa
Nadnercza podu wytwarzaj DHEA i siarczan DHEA, ktre w wtrobie podu ulegaj przeksztaceniu do 16cc-hydroksy-pochod-nych. W oysku te ostatnie ulegaj przekszta ceniu do estriolu. Z kolei estriol dostaje si
funkcji
jednostki
HORM ONY GONA DA LNE / 665 Dobowe wydalanie
-36 -33 -30 -27 -24 "'*> -1 8 50-50
-100
-15 -12
-9 -6 -3
100-
42-
70
140 Oni ciy
210
2B0
Ryc. 51-8. Stenia hormonw podczas prawidowej ciy: hCG ludzka gonadotropina kosmwkowa, hCS ludzka somatomammotropina kosmwko wa (dane wzite od kilku autorw, wg Gano ng W, F.; Revhw of Medical P hysiology, wyd. 13, A ppleto n and Lange, 1987). ______________________________
poprzez oysko i krenie matki do wtroby, gdzie ulega koniugacji do glukuronidw i wyda-kniu z moczem (patrz ryc. 51-9). Oznaczenie dobowego wydalania estriolu wykorzystane jest do oceny wielu procesw zachodzcych w ukadzie matka pd. Inna interesujca wymiana substratw mi dzy podem a matk jest potrzebna dla syntezy kortyzolu przez nadnercza podu. Nadnercza podowe nie posiadaj kompleksu enzymatycznego zoonego z dehydrogenazy 3 P-hydro-ksysteroidowej i As'4-izomerazy i dlatego zale-ne s od dostawy oyskowego progesteronu niezbdnego do syntezy
kortyzolu (ryc. 51-9).
hormon okrelany jako laktogen oyskowy (PL). PL bywa rwnie okrelany jako somato-
Laktogen oyskowy. oysko wytwarza
mammotropina lub oyskowy hormon wzros tu, poniewa wykazuje waciwoci biologiczne prolaktyny i hormonu wzrostu. Genetyczne relacje zachodzce midzy tymi hormonami omwione zostay w rozdz. 46. Rola fizjologiczna PL jest niepewna, skoro kobiety nie posiadajce tego hormonu wykazuj normalny prze bieg ciy i rodz normalne dzieci. Nieznany jest mechanizm wyzwalajcy pord Czas trwania ciy jest cile okrelony dla poszczeglnych gatunkw zwierzt. Nieznane s jednak czynniki odpowiedzialne za zakoczenie ciy. Podejrzewa si tu udzia hormonw, chocia nie zostao to udowodnione. Prawdopodobnie chodzi o estrogeny i progestyny,
6 6 6 / R O ZD ZI A 5 1 PLOD
OYSKO Kortyzol MATKA
Kortyzol
Progesteron
Nadnercza Pregnenolon DHEA Siarczan DHEA
"
+
Glukuronld
Wtroba
DHEA siarczan DHEA
Estriol (E3)
Glukuronld eslrolu
t
16a-Hydreksy-DHEA Nerki - 1&r-Hydraksy-DHEA ----- 1
DHEA
Glukuronld estrlolu
w moczu
Wtroba
Ryo. 51-9. Przemiana steroidw w jednostce matczy no-podowej. DHEA dehydroepiandrosteron.
poniewa wpywaj one na kurczliwo macicy. S rwnie dowody na to, e katecholaminy uczestnicz w procesie indukcji porodu. Poniewa oksytocyna zwiksza kurczliwo macicy, wykorzystywana jest jako lek wspomagajcy pord. Doda jeditsk naley, e podanie eg zogennej oksytocyny nie inicjuje porodu, jeli cia nie dobiega koca. Przy kocu ciy liczba receptorw oksytocynowych w macicy jest stokrotnie wiksza ni na pocztku ciy. Wzmoona ilo estrogenw przy kocu ciy by moe zwiksza liczb receptorw ok-sytocynowych (p. rozdz. 46). Po raz rozpocztym porodzie dochodzi do rozszerzenia szyjki macicy, wyzwalajcego odruch nerwowy, pobudzajcy uwalnianie si oksytocyny. Ta ostatnia z kolei nasila skurcze macicy. W tym procesie wan role mog odgrywa rwnie czynniki mechaniczne, tj. nasilenie rozcigania szyjki macicy lub sia dziaajca na misie macicy. Po porodzie dochodzi do gwatownych zmian w rodowisku hormonalnym zarwno matki, jak i podu, zas po wydaleniu oyska we krwi matki stwierdza si szybki spadek stenia pro-
gesteronu (okrelanego jako pregnandiol) i est-riolu (ryc. 51-8). Estradiol i progesteron pobudzaj rozwj gruczou sutkowego, za prolaktyna laktacj Rnicowanie i czynno gruczou sutkowego regulowane sa harmonijnym wspdzia aniem wielu hormonw. Proces ten zapocztkowuj eskie hormony pciowe, estrogeny bowiem pobudzaj wzrost przewodw, za pro-gestyny proliferacj zrazikw sutkowych. Pewien wzrost tkanki gruczoowej i tuszczowej gruczohi sutkowego ma miejsce w okresie po-kwitania. Znaczny rozwj gruczou sutkowego wystpuje w ciy, kiedy tkanka gruczoowa eksponowana jest na due stenia estradiolu i progesteronu. Dla cakowitego rnicowania si gruczou sutkowego (przebadanego przewanie na eksplantach szczurzych tego gruczou) potrzebne s ponadto prolaktyna, glukokor-tykoidy, insulina lub peptyd wzrostowy oraz nie zidentyfikowany jeszcze czynnik surowicy krwi. Z wymienionych hormonw tylko stenie pro-
laktyny ulega dramatycznym zmianom. Wzrasta ono wartoci wyjciowej mniejszej ni 2 ng/ml do powyej 200 ng/ml w pnej fazie ciy. Wpyw wymienionych hormonw na syntez biaek mleka, w tym na laktoalbumin, laktoglobulin i kazein, zosta! szczegowo przebadany. Hormony te pobudzaj syntez biaek zwikszajc ilo swoistych mRNA. Przynajmniej w odniesieniu do kazeiny wzrost ten jest skutkiem wzrostu transkrypcji genowej i stabilizacji mRNA. Progesteron, niezbdny dla rnicowania si zrazikw gruczou sutkowego, hamuje produkcj i wydzielanie mleka w zaawansowanej ciy. Laktacja rozpoczyna si w chwili nagego obnienia si stenia tego hormonu po porodzie. Rwnie stenie prolaktyny w osoczu obnia si szybko po porodzie, sekrecja tego hormonu ulega jednak stymulacji podczas kadego aktu ssania brodawki sutkowej (p. rozdz. 46) podtrzymujc przez to proces laktacji. W razie zakazu karmienia piersi, laktacja stopniowo zanika. Mona j rwnie szybko zakoczy podajc pozajelitowo due dawki androgenu, zanim rozpoczto karmienie piersi. Ssanie brodawki piersiowej stymuluje rwnie uwalnianie si oksytocyny z tylnego pata przysadki nerwowej. Oksytocyna obkurcza komrki miniowo-nabonkowe otaczajce przewody zrazikowe, wyciskajc w ten sposb mleko z gruczou sutkowego. Regulacj syntezy i wydzielania oksytocyny przedyskutowano w rozdz. 46.
Koniec menopauzy charakteryzuje si zanikiem produkcji estrogenw jajnikowych
drugorzdowych cech pciowych, w tym szczeglnie nabonka dolnych drg moczowych i pochwy. Ponadto wanym problemem zdrowot nym u osb starszych jest osteoporoza; kobiety z cikim zanikiem masy kostnej wykazuj nisze od normalnych stenia estronu w osoczu krwi.
Syntetycznych agonistw i antagonistw uywa si zarwno dla promocji, jak i zahamowania zapodnienia oraz dla zahamowania wzrostu guzw
Estrogeny. Wiele zwizkw syntetycznych wykazuje aktywno estrogenow oraz jedn lub kilka korzystnych cech farmakologicznych. Wikszo modyfikacji, vw strukturze estrogenw wprowadzono po to, by zmniejszy przemian tych hormonw w wtrobie oraz, by skuteczne byo doustne ich podawanie. Jednym z pierwszych takich zwizkw by dietylostyl-bestrol. Innymi przykadami takich steroidw o zmodyfikowanej strukturze s 17a-etynyloest-radiol i mestranol, uywane jako doustne teki antykoncepcyjne.
Dletylostylbestrol
Kobiety yjce na zachodniej pkuli przestaj miesiczkowa rednio w 53 r. Ten okres pokrywa si z zanikiem wszystkich pcherzykw jajnikowych i syntezy estrogenw jajnikowych. Nie ma alternatywnego rda progesteronu, natomiast pokane iloci sabego est rogenu, tj. estronu, powstaj przez aromatyza-cj androstendionu (ryc. 51 -5). Stenia estronu w osoczu s jednak zbyt mak, by zahamowa sekrecj gonadotropin przysadkowych. Ten fakt tumaczy wystpowanie bardzo duych ste FSH i LH w osoczu, tak charakterystycznych dla pierwszych lat pomenopauzal-nych. Kobiety po menopauzie s naraone na dwa zjawiska zwizane z katabolizmem tkan kowym indukowanym estrogenopeni. Estron nie zawsze jest w stanie zapobiec zanikowi
Dokonano syntezy licznych zwizkw wykazujcych aktywno antyestrogenow. Kilka z nich znalazo zastosowanie kliniczne. Dziaanie wikszoci tych antagonistw polega na tym, e wi si one kompetycyjnie ze rd-komrkowym receptorem estradiolowym (p. niej).
I7a-Etynyloestrad(ol
668 / ROZDZIA 51 CH3O r-C=CH

Mesiranol
CH3
Octan
--OAc
Cytrynian kiomifenu (Clomid) wykazuje szczeglne powinowactwo do receptorw est-rogenowych podwzgrza. Pocztkowo zwizek ten stosowano jako lek hamujcy podno, podczas gdy obecnie uywany jest do celw przeciwnych, tj. jako lek zwikszajcy podno. Klomifen dziaa kompetycyjnie w stosunku do estradiolu, jeli chodzi o wizanie z receptorami estrogenowymi podwzgrza. W wyniku takiego dziaania dochodzi do odblokowania sekrecji GnRH oraz wtrnie do nadmiernego wydziela nia si LH i FSH przez przysadk mzgow. W nastpstwie dziaania kiomifenu dochodzi do rwnoczesnego dojrzewania licznych pcherzykw jajnikowych oraz, co za tym idzie, do czstego rozwoju ciy mnogiej. Nafoksydyna zwizek niesteroidowy oraz tamoksyfen, czc si z receptorami estrogenowymi, tworz z chromatyn bardzo trwae kompleksy. Uniemoliwia to recyrkulacj receptorw, przez co dochodzi do blokowania dziaania estradiolu na dugi czas. Wymienionych antagonistw uywa si w leczeniu estrogenozalenego raka piersi.
medroksyproossleronu
OH
CsCH
Noretyndron
roksyprogesteron hamuje wystpowanie jajecz-kowania przez kilka miesicy, jeli zostanie podany dominiowo pod postaci dept. Poniewa progestyny hamuj wzrost komrek ww. zwizek jest czciej uywany w leczeniu dobrze zrnicowanego raka endometrium (bona luzowa macicy). Estrogeny i progestyny dziaaj poprzez regulacj ekspresji genw Dziaanie wymienionych hormonw polega na ich wizaniu si ze swoistymi receptorami rdkomrkowymi. Te ostatnie, wic si z okrelonymi obszarami chromatyny lub(i) DNA jdrowego, oddziauj na tempo trans krypcji swoistych genw. Wiele informacji dostarczyy wyniki bada nad wpywem estradiolu i progesteronu na transkrypcj genw koduj cych biako jaj ptasich, w tym szczeglnie owalbuminy i konalbuminy. Dokadny mechanizm dziaania tych hormonw w procesie transkrypcji genw jest wci przedmiotem intensywnych bada. Receptory estrogenw i progesteronowe nale do jednej rodziny genowej Sekwencj aminokwasow receptorw estro-genowych (ER) i progesteron owych (PR) rekonstruowano na podstawie sekwencji odpo wiadajcych im cDNA. Receptory te nale do
^ Cytry nian klomtf enu
Progestyny. Trudne byio wytworzenie zwizkw wykazujcych aktywno progesty-now, lecz pozbawionych dziaania estrogeno-wego lub androgenowego. 17 a-alkilopochodne 19-nortestosteronu (np. noretyndron) u wikszoci kobiet wykazuj minimaln aktywno androgenow. S one uywane jako doustne leki antykoncepcyjne. Inn siln progestyn jest octan medroksyprogesteronu (Provera). Med-
rodziny genowej receptorw steroidowych i hormonw tgrczycy, omawianych w rozdz. 49. Jak to przedstawiono na ryc. 49-3. kady receptor ma kilka domen czynnociowych. Steroidy wi si z miejscami ligandowymi C-koricowego obszaru czsteczki receptorowej. To indukuje zmian konformacyjn umoliwiajc wizanie si receptora z DNA. Domena ER, wica si z DNA, rozpoznaje sekwencj AGGTCAnnnT-GCCCT (jest to sekwencja odpowiedzi estroge-nowej ERE estrogen response element), natomiast domena PR sekwencj GGTA-CAnnnTGTTCT (jest to sekwencja odpowiedzi progesteron owej PRE progesterone response element). Interakcja receptora z DNA umoliwia rnym dziaajcym w konfiguracji trans domenom kadego receptora oddziaywa nie na geny przylegajce do obszarw odpowiedzi hormonalnej. Wzmoona (lub zmniej szona) aktywno swoistych genw wyraa si zmienionym tempem syntezy swoistych biaek, co przejawia si zmian reakcji metabolicznych. Cechy szczeglne. Na uwag zasuguje kilka faktw, dotyczcych mechanizmu dziaania omawianych hormonw: 1) receptory wice hormony pciowe odznaczaj si pewn nieswoistoci, i tak progesteron wie si z receptorem androgenowym, przez co wykazuje sabe dziaanie androgenowe, natomiast kilka androgenow wie si z receptorami estrogeno-wymi, przez co mog naladowa dziaanie tych ostatnich na macic; jak to pokazano na ryc. 49-3, centralne sekwencje obszarw odpowiedzi hormonalnej dla omawianych hormonw wykazuj znaczne podobiestwo. Ten fakt tuma czy, dlaczego niektre hormony wykazuj dziaanie mieszane, tj. androgenowe, jak i proges-tynowe lub estrogenowe; 2) estrogeny zwikszaj liczb zarwno receptorw estrogeno -wych, jak i progesteronowych; 3) wydaje si, e progesteron przyspiesza tempo obrotu was nego receptora; 4) tak zwane sabe estrogeny, np. estriol, podawane czsto dziaaj jak estrogeny silne.
dziau. Tote tylkp wybrane przykady tych zaburze s przedmiotem bliszego omwienia. Pierwotny hipogonadyzm jest nastpstwem procesu chorobowego bezporednio uszkadzajcego jajniki. W nastpstwie tego uszkodzenia upoledzeniu ulega proces jajeczkowania lub(i) czynno endokrynna gonady eskiej. Hipogonadyzm wtrny spowodowany jest wypadniciem gonadotropinowej czynnoci przysadki mzgowej. Dysgeneza gonad (zesp Tur-nera) jest czsto spotykanym zaburzeniem genetycznym, charakteryzujcym si kariotypem XO, wystpowaniem eskich narzdw pciowych zarwno zewntrznych, jak i wewntrznych oraz nieprawidowociami rozwojowymi i opnionym pokwitaniem. Wiele zespow spowodowanych jest nieprawidowociami w zakresie iloci hormonw.
Najczciej wystpuje zespl policystycznych jajnikw (zesp Steina-LeventhaEa), w ktrym na
skutek nadprodukcji androgenow pojawiaj si takie objawy jak hirsutyzm, otyo, nieregularne miesiczkowanie OTaz zmniejszona podno. Rzadko wystpujce guzy zoone z komrek Leydiga oraz jdrzaki (arrhenoblastoma) wytwarzaj testosteron. Guzy okrelone jako ziarniszczaki (granulosa celi tumor) lub otocz-kowiaki (thecoma) produkuj estrony, za rd-jajnikowe guzy zoone z komrek nadnerczy (intraovarian adrenal rest tumor) kortyzol. Przetrwaa tkanka trofoblastyczna jest przyczyn agodnego zaniadu graniastego (mola hydatidosa) mogcego ulec transformacji do zoliwego naboniaka kosmwkowego (chorio-carcinoma). Ostatnie dwa nowotwory wytwarzaj ogromne iloci hCG. Oznaczanie radioim-munologiczne hCG wykorzystywane jest w diagnostyce wymienionych dwch rodzajw niebezpiecznych guzw oraz monitorowaniu skutecznoci ich leczenia.
PIMIENNICTWO Oglne
Huggins C: Two principles in endocrine therapy of cancer. Hormonedcpnval and hormone interference. Ccmcer Res 1965,25:1163. O'MalLey BW: Steroid hormone action in eucaryotic cells. / Clin Inrest 1984;74:307. Wilson JD et al: The endocrioe control of mae phenotypic development, Aust J Bio Sci 1983;36:101.
NIEKTRE ZABURZENIA ESKIEGO UKADU ROZRODCZEGO WYKAZUJ ZWIZEK Z ANOMALIAMI HORMONALNYMI

Omawianie wszystkich zaburze eskiego ukadu rozrodczego przekracza ramy tego roz-
670 / ROZDZIA 51 Hormony jder Chang C et al: Structural analysis of complementary DNA and amino acid seuences of human and rat androgen receptors. Proc Nail Acad Sci USA 198835:7211. Hali PF; Testicular hormones: Synthesis and control. Pages 1511 1520 in: Endocrinoogy, Vol 3. De-Groot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Wilson J; Metabolism of testicular androgens. Chap 25, pp 491508, in: Handbook of Endocrinoogy. Section 7: Endocrinoogy, Vol 5: Mae Reproductive System, Hamilton DW, Greep RP (editors). Ame-rican Physiological Society, Washington DC, 1975.
Hormony jajnikw
Green S et al: Human estrogen receptor DNA: Sequence, expression and homology to N-erb-A, Natur (London) 1986;320:134. Siitcri PK, Fcbrcs F: Ovarian hormone synlhesis, circulation and mechanisms of action. Pages 14011417 iu: Endocrinoogy, Vol 3. DeGroot LJ (editor). Grune & Stratton, 1979. Toft D, Grski J: A receptor molecule for estrogens. Proc Nat Acad Sci USA 1966;55:1574.
Hormony trzustki i odkowo-jelitowe

52
WPROWADZENIE Trzustka stanowi struktur, zawierajc dwa rne narzdy. Cz zrazikowa trzustki wykazuje czynno zewntrzwydzielnkz (egzokryn-n); wydziela ona do wiata dwunastnicy enzymy i jony potrzebne w procesach trawienia pokarmw. Na cz wewntrz wy dzieinicz (en-dokryim) trzustki skadaj si wyspy Langer-hansa. Masa 1 2 min wysp wystpujcych w trzustce stanowi 12% caej masy tego narztfdu. Wyspy 2awieraj kilka rodzajw komrek wymienionych w tab. 52-1.
Tabela . Rodzaje komrek wystpujcych w wyspach Langerhansa 52-1 Procentowy udzia komHormon Nazwa komrek rek w struktu- wytwarzany rze wysp A (luba) Ok. 25% Glukagon B (lub |3) Ok. 70% Insulina D (lub 8)
F
Skrty uywane w tym rozdziale ACTH hormon ad reno korty kotropo wy, adrenokortykotropina EGF naskrkowy czynnik wzrostowy FGf czynnik wzrostowy fibroblastw GIP odkowy polipeptyd hamujcy IGF czynnik wzrostowy insulinopodobny LD lipoproteiny o maej gstoci cukrzyca tnsulinozalena IDDM NIDDM cukrzyca insulinoniezalena PDGF czynnik wzrostowy pochodzenia pytkowego PEPCK karboksykinaza fosfoenoi opirogroni nowa PGF2 prostaglandyna F2 PP polipeptyd trzustkowy VLDL lipoproteiny 0 bardzo maej gstoci
Mniej ni 5% ladowy
Somatostatyna Polipeptyd trzustkowy
Wyspy trzustkowe wydzielaj przynajmniej 4 hormony, tj. insulin, glukagon, somatostatyn i polipeptyd trzustkowy. Wymienione hormony uwalniane s do yy trzustkowej wpadajcej do yy wrotnej. Taki ukad anatomiczny jest ko rzystny z punktu widzenia fizjologicznego, albowiem wtroba jest gwnym miejscem dziaania insuliny i glukagonu. Ostatnie dwa hormony, cho uczestnicz gwnie w przemianie wglowodanw, wykazuj rwnie wpyw na
wiele innych procesw. Somatostatyna, po raz pierwszy wykryta w podwzgrzu, gdzie hamuje wydzielanie hormonu wzrostu, wystpuje w wyszych steniach w wyspach ni podwzgrzu. W trzustce hormon ten uczestniczy w lokalnej regulacji sekrecji insuliny i glukagonu. Polipeptyd trzustkowy wywiera wpyw na wydzielanie sokw przez przewd pokarmowy. Przewd pokarmowy wydziela wiele hormonw, zapewne wicej ni jakikolwiek inny pojedynczy narzd. Do funkcji przewodu pokarmowego nale: a) dostarczanie pokarmw do miejsca ich trawienia, b) stworzenie waciwego rodowiska (odpowiednie pH i stenie jonw, obecno waciwych enzymw) niezbdnego dla procesw trawienia, c) wchanianie produktw trawienia przez bon luzow jelit, przeniesienie ich do przestrzeni pozakomrkowej a stamtd do krenia, skd dostaj si do komrek obwodowych oraz d) wydalanie z ustroju pro-
672 / ROZDZIA 52
duktw odpadowych. We wszytkich tych funkcjach uczestnicz hormony przewodu pokarmowego.
Insulina jest pod wieloma wzgldami modelowym hormonem, ktry jako pierwszy uzyskano w stanie oczyszczonym i krystalicznym oraz syntetyzowano metodami chemicznymi i biologii molekularnej. Badania nad jego biosyntez dostarczyy podstaw dla koncepcji o wystpowaniu prohormonw (propeptydw). Insulina posiada wane implikacje medyczne. Okoo 5% populacji w krajach rozwinitych cierpi na cukrzyce, za dalsze 5% ludzi jest potencjalnie naraonych na rozwijanie si tej choroby. Cukrzyca jest skutkiem niedostatecznego dziaania insuliny spowodowanego niedoborem tego hormonu, lub te opornoci tkanek na ten hor mon. Dziaanie glukagonu nasila cukrzyce, jeli jego dziaanie nie jest hamowane mechaniz mami wyrwnawczymi. Opisano wiele zespow chorobowych spowodowanych nadmiarem hormonw wydzielanych przez przewd pokarmowy. Diagnostyka tych zespow chorobowych moe by trudna z dwch powodw: po pierwsze lekarz czsto nie jest obeznany z symptomatologi tych zespow oraz, po drugie, objawy chorobowe podawane przez chorego lub stwierdzane przez lekarza mog dotyczy rwnoczenie wielu narzdw. Hormony przewodu pokarmowego s przedmiotem zainteresowania rwnie z innego powodu, mianowicie^ wykazuj one bliski zwizek z neuropeptydamf.
a cukrzyc sugerowali w 1909 r. Mayer oraz wl917r. Sharpey-Schaffer. Taki zwizek zosta jednak udowodniony dopiero w 1921 r. przez Bantinga i Besta. Ci ostatni badacze uyli kwanego etanolu do ekstrakcji czynnika wyspowego, ktry wykazywa silne dziaanie hipo-glikemiczne. Czynnik ten nazwali insulin. Szybko przekonano si, e wyspy trzustkowe byda i wi zawieraj insulin, aktywn rwnie u czowieka. W cigu roku insulina znalaza szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy. Okazaa si ona lekiem ratujcym ycie tych chorych. Fakt dysponowania duymi ilociami insuli ny bydlcej i wiskiej mia ogromny wpyw na dalsze badania biomedyczne dotyczce tego hormonu. Insulina bya: 1) pierwszym biakiem dla ktrego udowodniono dziaanie hormonal ne, 2) pierwszym biakiem uzyskanym w postaci krystalicznej (Abel, 1926), 3) pierwszym biakiem, dla ktrego okrelono sekwencj amino-kwasow (Sanger i wsp., 1955), 4) pierwszym biakiem syntetyzowanym metodami chemicznymi (Du i wsp., Zahn, Katsoyanis 1964), 5) pierwszym biakiem dla ktrego wykazano, e produkowane jest pod postaci czsteczki pre-kursorowej (Steiner i wsp. 1967) oraz 6) pierwszym biakiem uzyskanym technologi rekombinacji genetycznej do celw handlowych. Pomimo tych licznych pierwszych" po zycji o mechanizmie dziaania tego hormonu na poziomie molekularnym wiadomo znacznie mniej ni w przypadku innych hormonw.
HORMONAMI TRZUSTKI S: INSULINA, G LUK AGO IM, SOWIATOSTATYNA I POLIPEPTYD TRZUSTKOWY Stenie glukozy we krwi jest regulatorem produkcji insuliny
Rys historyczny. W latach szedziesi tych ubiegego stulecia Langerhans zidentyfikowa wyspy trzustkowe, chocia nie rozumia jeszcze ich funkcji, podobnie jak von Mering i Minkowski. Ci ostatni badacze wykazali w 1889 r e pankreatektomia jest przyczyn cukrzycy. Wystpowanie zwizku przyczynowego midzy czynnoci wysp trzustkowych
Insulina jest polipeptydem skadajcym si z 2 acuchw, tj. z acucha A i B poczonych ze sob mostkami dwusiarczkowymi w pozycjach A7 i B7 oraz A20 i B19. Trzeci, rda-cuchowy mostek dwusiarczkowy czy aminokwasy A6 z Ali. U wikszoci gatunkw zwierzt wymienione 3 mostki dwusiarczkowe s niezmienne, za acuchy A i B skadaj si z 21 (acuch A) lub 30 (acuch B) aminokwasw. Kowalencyjna struktura insuliny ludzkiej (o masie czsteczkowej 5 734) przedstawiona jest na ryc. 52-1. Dla porwnania w tab. 52-2 przedstawiono podstawniki aminokwasowe dla insulin rnych gatunkw zwierzt (w porwnaniu do insuliny ludzkiej). Wystpowanie odmiennych aminokwasw dotyczy zarwno a cucha A, jak i B, a szczeglnie pozycji 8, 9 i 10 acucha A. Dowodzi to, e ten obszar sekwen-
insulina jest polipeptydem heterodimerycznym
HORMONY TRZUSTKI I OADKOWO-JELITOWE / 673

acuch A
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cvs -Cvs-Thr-Ser-Ile-Cvs-S j 8 9 10 11 1 2 1 3 14 15 1 6 1 7 1 8 19 / er-Leu-Tvr-Gln-Leu-Glu -Asn-Tvr-Cvs-Asn 1 2 S S 3 4 5 6 t 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 14 15 1 6 1 7 1 3 19 I 2 1

acuchS Li-Val-Cys-C
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cvs-Glv-Ser-His-Leu-V3l-Glu-Ala-Leu-Tvr-Leu-Val-ys-Gly-Glu-1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 - Arg -G ly-Ph e-Pt) e-Ty r -Th r- Pro- Lys-Th r 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Ryc. 52-1. K ow al encyj na str ukt ur a insuli ny ( W ed ug: G anong W , F.: R evi ew of M edi caiP hysi ot ogy, wyd. 13, A ppl ei on and Lancj e, 1987. A zezw ol eni em).
Tabela 52-2. Rnice w strukturze insuliny pomidzy poszczeglnymi gatunkami ssakw

Gatunek Rnice w sekwencji aminokwasowej w stosunku do insuliny ludzkiej acuch A Aminokwas w pozycji 8 9 10 acuch B Aminokwas w pozycji 30
okrelono determinanty aktywnoci biologicznej tego hormonu (ryc. 52-2). Hydrofobowy C-kocowy obszar acucha B uczestniczy rwnie w procesie dimeryzacji insuliny.
acuch A
cuoriB
Czowiek winia, pies, olbrotowiec (kas2alot) Krlik Krowa, koza Owca Ko Wieloryb
Thr Ser Ile Thr Ser Ile Thr Ser Ile Ala Ser Val Ala Gly Val
Thr G l y Ile Ala
Thr Ala Ser Ala Ala
Ala Ala
Ser Thr
cji aminokwasowej nie jest krytyczny dla wystpowania dziaania biologicznego. Istnieje kilka niezmiennych pozycji i sekwencji w strukturze
insuliny. S$ nimi: 1) pooenie wymienionych 3 mostkw dwusiarczkowych, 2) wystpowanie reszt hydrofobowych w obszarze C-koricowym acucha B oraz 3) niezmienno sekwencji aminokwasowej w obszarze N- i C-kocowym acucha A. Przez modyfikacj chemiczn i wprowadzenie swoistych aminokwasw do wymienionych obszarw struktury insuliny
4 ;
Ryc. 52-2. Obszar czsteczki insuliny niezbdny dla jej aktywnoci biologicznej. Struktura schema tyczna insuliny uzyskana badaniem krystalograficz nym. Pole zakreskowane oznacza obszary ciaste czki insuliny, od ktrych najbardziej zaley aktyw no biologiczna tego hormonu. Reszty w pozycji B24 i B25 s najbardziej podatne na mutacje wpywajce na aktywno biologiczn insuliny. N-koce acuchw A i B zaznaczono znakiem ( + ), za C-koce znakiem {-), Wedug: Tager H, S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetes, 1984, 33,693, przerysowane za zezwole niem autora pracy). ___________ _________
Biochemia
674 / ROZDZIA 52
Istnieje due podobiestwo pomidzy insulin ludzk, wisk i bydlc (tab. 52-2) Insulina wiska rni si od insuliny ludzkiej tylko jednym aminokwasem (w miejsce treoniny w pozycji B30 wystpuje alanina). Insulina bydlca rni si od ludzkiej obecnoci alaniny na miejscu treoniny w pozycji B30, alaniny na miejscu treoniny w pozycji A8 oraz waliny na miejscu izoleucyny w pozycji A10. Wymienione modyfikacje nie maj wpywu na aktywno biologiczn insuliny i w bardzo niewielkim stopniu zmieniaj jej antygenowo. Pomimo e wszyscy chorzy leczeni insulin heterologiczn wykazuj obecno krcych przeciwcia an ty insulin owych (o bardzo maych mianach), tylko u niewielu z nich miano ich jest tak due, e ma znaczenie kliniczne. Insulina wiska i bydlca byy standardowymi lekami stosowanymi w leczeniu cukrzycy do chwili wyproduko-
wania insuliny ludzkiej technologi rekombinacji DNA. Pomimo wystpowania znacznej zmiennoci w strukturze pierwotnej aktywno biologiczna dla wszystkich rodzajw insulin (niezalenie od gatunku) wynosi 2530 IU/mg suchego hormonu. Insulina tworzy bardzo ciekawe struktury kompleksowe. Cynk, wystpujcy w duych steniach w komrkach B, tworzy kompleksy z insulin i proinsulin. Czsteczki insulin wszystkich krgowcw tworz izologic zne dimery dziki wizaniom wodorowym midzy grupami peptydowymi dwch monomerw w pozycjach B24 i B26, za przy duych steniach insuliny dimery ulegaj przekszaceniu do heksamerw, zawierajcych po dwa atomy cynku kady. Ta struktura wyszego rzdu umoliwia badania struktury krystalicznej insuliny. W steniach fizjologicznych insulina wystpuje prawdopodobnie pod postaci monomeryczn.
Byc. 52-3. Struktura ludzkiej proinsuliny. insulina i peptyd C poczone s ze sob w dwch miejscach za porednictwem cznikw di peptyd owych. Po zadziaaniu enzymu trypsyn o podobne go {jasne strzaki) i kilku kolejnych reakcjach katalizowanych przez e nzymy karboksypeptydazopodobne (ciemne strzaki) powstaj heterodimeryczna czsteczka insuliny oraz peptyd C.
HORMONY TRZUSTKI I ODKOWO-JELITOWE / 675
Insulina jest produkowana pod postaci czsteczki prekursorowej Insulina jest syntetyzowana jako preprohor-mon (o masie czsteczkowej 11 500) i jest prototypem dla peptydw powstajcych drog przeksztacenia wikszych czsteczek prekursoro-wych. 23-aminokwasowa hydrofobowa sekwencja pre- lub prowadzca (liderowa) napro wadza czsteczk do cystern siateczki rdplaz-matycznej, po czym ulega od szczepieniu. W wyniku tej reakcji powstaje proinsulina o masie czsteczkowej 9000, wykazujca zmiany kon-formacyjne niezbdne dla wytworzenia waciwych mostk w dwusiarczkowych. Jak wida na ryc. 52-3, czsteczka proinsuliny 2aczyna si od acucha B na N-kocu, poczonego za porednictwem polipeptydu C z acuchem A. Proinsulina ulega kilku procesom rozszczepie-niowym, swoistym dla okrelonych pozycji acucha polipeptyd owego, w wyniku ktrych powstaj rwnowane iloci insuliny i peptydu C. Te procesy enzymatycznego rozszczepienia proinsuliny s przedstawione na ryc. 52-3. (nne hormony komrek wyspowych s rwnie wytwarzane pod postaci czsteczek prekursorowych Synteza innych hormonw wyspowych take wymaga potranslacyjnego przeksztacenia en zymatycznego czsteczek prekursorowych o wyszej masie czsteczkowej. Na rycinie 52-4 znajduje si porwnanie schematycznej struktury polipeptydu trzustkowego, glukagonu i so-matostatyny ze struktur insuliny. Przy rozszczepieniu wymienionych prohormonw uczestniczy kilka kombinacji enzymw endoproteo-litycznych(trypsynopodobnych)ieg zoproteoli-tycznych (podobnych do karboksypeptydazy B), poniewa sekwencja aminokwasowa aktywnego hormonu moe si znajdowa na C-kocu czsteczki prekursorowej (so mato s taty na), na N-kocu (polipeptyd trzustkowy), na obu kocach (insulina) lub w rodkowym fragmencie (glukagon) prekursora. Synteza insuliny i powstawanie ziarnistoci wydzielniczych odbywaj si w organellach subkomrkowych ProinsuJina jest syntetyzowana na siateczce rdplazmatycznej szorstkiej. Enzymatyczne odcicie polipeptydu prowadzcego, czyli lidera (presegmentu), utworzenie wiza dwusiarczkowych oraz proces zaamania odbywaj si w cysternach siateczki rdplazmatycznej (ryc.
Polipeptyd trzustkowy
Insulina
Somatostatyna
Glukagon Ryc. 52-4. Schemat struktury prekursorw wy twarzanych przez 4 gwne rodziny komrek wysp trzustkowych. Odcinki prekursorw odpowiadaj ce waciwym hormonom wymienionym na rycinie oznaczono jako czarne prostokty. Segmenty polipeptydowe nie stanowice czci hormonu przed stawiono jako Finie. Reszty aminokwasw dwuzasadowych (argininy lub lizyny) odpowiadajce miejscom dziaania enzymw przeksztacajcych prohormon w hormon zaznaczono czarnymi punk tami. Naley zwrci uwag na to, e struktur proinsuliny przedstawiono w postaci wyprostowa nej nie wykazujcej wiza dwusiarczkowych. Struktura proinsuliny ma nastpujc sekwencj; acuch B peptyd C acuch A. (Wedtug: Taylor H. S.: Abnormal products of the human insulin gene; Diabetns 1984, 33, 693, za zezwole niem). _____ _____________________
52-3). Z kolei proinsulina zostaje przeniesiona do aparatu Golgiego, gdzie rozpoczyna si proces proteolizy i upakowania hormonu do ziarnistoci wydzielniczych. Dalszy proces dojrzewania ziarnistoci odbywa si w czasie ich wdrwki przez cytoplazm do bony cytoplaz-matycznej. Zarwno proinsulina, jak i insulina, czc si z cynkiem, tworz heksamery. Poniewa 95% proinsuliny ulega przeksztaceniu do insuliny, krysztaki tego ostatniego hormonu s determinantami cech morfologicznych ziarnistoci wydzielniczych. W obrbie ziarnistoci znajduj si rwnowanikowe stenia peptydu C (w stosunku do stenia insuliny); te ostatnie nie tworz jednak struktur krystalicznych. Po zadziaaniu swoistego bodca ziarnisto wy-dzielnicza zlewa si z bon pkzmatyczn i wyrzuca swoj zawarto do przestrzeni pozako-mrkowej. Proces ten okrelany jest jako emio-cytoza.
676 / ROZDZIA 52
Waciwoci proinsuliny i peptydu C rni si od waciwoci insuliny Proinsuliny wykazuj zmienn dhigo acucha polipeptydowego skadajcego si z 78 do 86 aminokwasw. Zmienno ta uwarunkowa na jest zmienn dhigoci polipeptydu C. Proin-sulina wykazuje tak sam rozpuszczalno oraz taki sam punkt izoelektryczny co insulina. Tworzy ona rwnie heksamery z krysztakami cynku i silnie wie przeciwciaa antyinsulino-we. Proinsulina wykazuje aktywno biologiczn mniejsz ni 5% aktywnoci insuliny, co sugeruje, e wikszo miejsc aktywnych insuliny jest zablokowana w czsteczce proinsuliny. W pewnych okolicznociach (u chorych z guzami wysp trzustkowych) rwnolegle z insulin wydzielaniu ulegaj wiksze ni zwykle iloci proin suliny. Poniewa okres ptrwania proinsuiiny jest znamiennie duszy od insuliny, za proinsulina daje silna reakcj krzyow z surowic anty insulin ow, metody radioimmu no logicznego oznaczania insuliny" mog okazyjnie dostarczy wynikw zawyonych w stosunku do rzeczywistej aktywnoci biologicznej insuliny" zawartej w osoczu. Dla peptydu C nie udowodniono adnej aktywnoci biologicznej. Wykazuje on odrbne W stosunku do insuliny i proinsuliny wasnoci antygenowe. Przez oznaczanie peptydu C metod immunologiczn moliwe jest odrnienie insuliny endogennej od egzogennej (po podaniu
insuliny egzogennej nie stwierdza si obecnoci peptydu C w osoczu przyp- tumacza) oraz ilociowe okrelenie insuliny endogennej u osb wykazujcych obecno w surowicy krwi przeciwcia anty insulinowych (obecno przeciwcia antyinsuli nowych w surowicy uniemoliwia oznaczanie insuliny metod immunologiczn). Istniej znaczne rnice w sekwencji amino-kwasowej peptydu C pomidzy poszczeglnymi gatunkami. Ten fakt potwierdza suszno twierdzenia, e peptyd C prawdopodobnie nie po siada adnej aktywnoci biologicznej. Peptydy insu I i nopodobne te maj swoje prekursory Struktura czsteczki prekursorowej nie jest wyjtkowa dla insuliny. Podobn struktur wykazuj blisko spokrewnione z ni peptydy, tj. relaksyna i czynniki wzrostowe insulinopodobne (ryc. 52-5). Wszystkie te hormony wykazuj znaczn homologi w obszarach acucha B i A pooonych na kocach N- i C- czsteczki prekursorowej. Obszary te s ze sob poczone przez segment czcy. W prekursorze relak-syny i insuliny (p. ryc. 52-3) segment czcy zwizany jest na obu kocach przez dwa aminokwasy zasadowe. Po poczeniu si acucha B z acuchem A przez wizania dwusiarcz-kowe, ten segment zostaje wycity przez enzymy proteolityczne, przy czym powstaje hormon dwuaricuchowy. Czynniki wzrostowe insulino-
Ryc. 52-5. Schemat struktury prekursorw peptydw spokrewnionych z insulin. Obszary homologiczne relaksyny, insuliny oraz czynnika wzrostowego insulinopodobnego (IGF) przedstawiono jako czarne prostokty. Sekwencj aminokwasw^ czc acuch B z acuchem A relaksyny lub insuliny oznaczono prostoktami biaymi. Te sekwencje ulegaj wyctciu"(w miejscach zaznaczonych strzakami) przy przeksztaceniu prohormonu do waciwego dwuiacuchowego hormonu. Sekwencj aminokwasow czynnika wzrostowego insulinopodobnego, ktra odpowiada wymienionym peptydom czcym insuliny i relaksyny, lecz nie ulega wyciciu" enzymatycznemu, zaznaczono prostoktem kropkowanym. Dlatego czynnik wzrostowy insulinopoflobny jest hormonem jednoacuchowym. (Wedug: Tager H. S.: Abnormal products of The human insuiin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).
podobne, chocia wykazuj znaczn homologi z insulin i relaksyn w zakresie struktury pierwszorzdowej, nie maj zasadowego dipep-tydu na kocach segmentu czcego, co sprawia, e s niepodatne na rozszczepienie przez odpowiednie enzymy proteolityczne i s hormonami jednoacuchowymi. Wyizolowano ludzki gen insuliny Ludzki gen insulinowy zlokalizowany jest na krtkim ramieniu chromosomu 11 (ryc. 52-6). U wikszoci ssakw stwierdza si ekspresj tylko pojedynczego genu insulinowego, wykazujcego podobn organizacj jak gen ludzki.
1i
Ryc. 52-6. Schemat struktury ludzkiego genu insulinowego. Skonie zakreskowane obszary odpowiadaj sekwencjom nie ulegajcym transkrypcji do odpowiednich sekwencji mRNA. Biae poia odpowiadaj sekwencjom intronw, za pola kropkowane sekwencjom kodujcym. Litery L, B, C i A oznaczaj sekwencje kodujce peptyd w lidero- y {sygnalny) L, acuch B, peptyd C i acuch A. Naley zwrci uwag na to, e sekwencj kodujc peptyd C rozdziela sekwencja intronu. Schemat struktury odpowiada rzeczywistej skali. (Wedug: Tager H. S.: Abnormal proctucts of the human insulin gene; Diabetes 1984, 33, 693, za zezwoleniem).
insuliny. Progowe stenie glukozy, przy ktrym dochodzi do pobudzenia sekrecji insuliny, wynosi 4,45,5 mmol/1 (80100 mg/dl), za maksymalne wydzielanie tego hormonu wystpuje przy glikemii wynoszcej 16,727,8 mmol/1 (300500 mg/dl). Zaproponowano dwie rne hipotezy tu maczce regulacj sekrecji insuliny przez glukoz. Wedug jednej hipotezy glukoza wie si z receptorem umiejscowionym prawdopodobnie w bonie plazmatycznej komrek B, aktywujc w ten sposb mechanizm uwalniania insuliny. Druga hipoteza zakada, e czynnikiem regulujcym sekrecj insuliny s rodkomrkowe metabolity lub tempo ich przepywu przez okre-lony szlak metaboliczny, np. przez cykl pen-lozofosforanowy, cykl kwasw trikarboksylo-wych lub przez szlak glflrlityczny. Istniej dane dowiadczalne dowodzce susznoci obu hipotez. wpywaj na uwalnianie insuliny. Agonici oc-ad-renergiczni, gwnie adrenalina, hamuj uwalnianie insuliny nawet wtedy, kiedy proces ten by pobudzany glukoz. Agonici P-adrenergiczni pobudzaj uwalnianie insuliny prawdopodobnie poprzez zwikszanie stenia rdkomrkowego cAMP (patrz niej). Przewleka ekspozycja na due stenia hormonu wzrostu, kortyzolu, laktogenu oysko wego, estrogenw i progestyn rwnie zwiksza sekrecj insuliny. Nie jest wic zaskoczeniem, e wydzielanie insuliny znacznie wzrasta w pnych stadiach ciy. pobudza wydzielanie insuliny, lecz najczciej uywane w lecznictwie s pochodne sulfonylomo-cznika. Leki, takie jak tolbutamid, pobudzaj uwalnianie insuliny w inny sposb ni opisany wyej dla glukozy. Znalazy one szerokie zastosowanie w leczeniu cukrzycy typu II (in-sulinoniezalenej).
SO2 NH C NHO CH3
Czynniki hormonalne. Liczne hormony
W odrnieniu od nich szczury i myszy maj dwa nieallelowe geny insulinowe. Kady z nich koduje swoist proinsulin, ulegajc prze ksztaceniu do aktywnej czsteczki insulinowej. Synteza ludzkiej insuliny w bakteryjnych ukadach ekspresyjnych, uywajc technologii rekombinacji DNA, jest znakomitym rdem insuliny dla chorych na cukrzyc. Wydzielanie insuliny jest precyzyjnie regulowane Ludzka trzustka wydziela 4050 jednostek insuliny dziennie. Stanowi to ok. 15% hormonu magazynowanego w tym gruczole. Sekrecja insuliny jest procesem energochonnym, w ktrym uczestniczy ukad mikrokanalikw i mikro-filamentw komrek B wysp trzustkowych. W uwalnianiu insuliny bior udzia liczne mediatory. Glukoza. Wzrost stenia glukozy w osoczu jest najwaniejszym regulatorem wydzielania
Czynniki farmakologiczne. Wiele lekw
H3 C
Tolbutarnid
Insulina jest szybko metabolizowana W odrnieniu od czynnikw wzrostowych insulinopodobnych insulina nie ma biaek transportowych w osoczu krwi. Ten fakt tumaczy
678 / ROZDZIA 52
krtki okres ptrwania insuliny wynoszcy w normalnych warunkach mniej ni j5 min. Gwnymi narzdami uczestniczcymi w przemianie insuliny s wtroba, nerki i oysko. 50% insuliny zawartej we krwi ulega kliren-sowaniu przez wtrob po jednorazowym jej przejciu przez ten narzd. Za przemian insuliny odpowiedzialne s
mechanizmy, w ktrych uczestnicz dwa ukady enzymatyczne. Pierwszy z nich zawiera proteaz
jest omawiany bardziej szczegowo w dalszych czciach tego rozdziau.

Wielomocz (poliuria). wzmoone pragnienie (polidypsja) oraz utrata masy ciaa pomimo adekwatnego odywiania kalorycznego s gw nymi objawami niedoboru insuliny. Jak wytuma-
wystpujc w wielu tkankach, natomiast w najwyszym steniu w ww. narzdach. Proteaz t oczyszczono z mini szkieletowych. Wykazano, e jest ona zalena od grup sulfhydrylowych i aktywna przy fizjologicznym pH. Drugi ukad enzymatyczny
czy taki stan rzeczy? U osb zdrowych stenie glukozy w osoczu krwi rzadko przekracza 6,7 mmol/1 (120 mg/dl). Z reguy znacznie wysze stenia spotykane s u chorych, u ktrych dziaanie insuliny jest niedostateczne (ryc. 52-8).
40 0
zawiera transhydrogenaze glutationowo-in-sulinow. Enzym ten redukuje
wizania dwu-siarczkowe, po czym powstae w ten sposb acuchy A i B ulegaj szybkiej degradacji. Nie wyjaniono, ktry z wymienionych mechaniz mw jest bardziej aktywny w warunkach fizjo-logicznycb, ani te, czy wymienione procesy s regulowane. Gwn rol ins uliny w przemianie wglowodanowej, tuszczowej i biakowej mona najlepiej oceni badajc skutki niedoboru insuliny u ludzi Gwnym objawem cukrzycy jest hiperglikt-mia. Jest ona spowodowana: 1) upoledzonym napywem glukozy do komrek, 2) upoledzonym zuytkowaniem (utylizacj) glukozy przez rne tkanki i 3) wzmoonym wytwarzaniem glukozy w wtrobie (w procesie zwanym gluko-neogenez) (ryc. 52-7). Kady z tych proces
W
20 0
n
s"^
1 , 1 ,
Insulina
i i i
200 400 600 800 Stenie glukozy w przestrzeni pozakom rkowej (mg/dl)
Ryc. 52-8. Wnikanie glukozy do komrek mi niowych.
Po przekroczeniu okrelonego stenia glukozy we krwi zwykle stenia 10 mmol/1 (180 mg/dl), zostaje przekroczony grny prg reabsorpcji tego cukru w kanalikach nerkowych, co sprawia, e glukoza wydalana jest z moczem (obecno glukozy w moczu okrela si jako glukozu-ric). W wyniku diurezy osmotycznej zwiksza si objto wydalonego moczu, za wspwys-tpujca translokacja ukadu transportowego glukozy jest zalena od temperatury i energo chonna, a niezalena od syntezy biaka (ryc. 52-9).
Komrka wtrobowa stanowi godny uwagi wyjtek w podanym schemacie dziaania insuliny.
Niedobr Insuliny nadmiar glukagonu)
Wzmoon Upoledzony wychwyt glukozy przez y katabollzm komrki biaek -Wzrost stenia aminokwasw we krwi, utrata zwizkw azotowych z moczem Odwd nie -" nie, kwasica
Wzrs lipolizy
Wzrost stenia wolnych kwasw tuszczowych, ketogenezy, ketonu rl i ketonernil
+
Hlpergllkemla, gllkozurla, d! uraza osmotyczna. utrata elektrolitw
Insulina nie zwiksza napywu glukozy do hepa-tocytw na zasadzie dyfuzji uatwionej, natomiast porednio nasila taki napyw indukujc syntez glukokinazy enzymu przeksztacajcego rdkomrkow glukoz do glukozo-6--fosforanu. Ta szybka fosforylacja sprawia, e stenie wolnej glukozy w hepatocytach jest bardzo mae, co sprzyja napywowi tego cukru do komrek wtrobowych na zasadzie prostej dyfuzji zgodnie z gradientem stenia przez bon komrkow.
Ryc. 52-7. Patofizjologia niedoboru insuliny. (Dziki uprzejmoci R. J. Havela).
HORMONY TRZUSTKI i ODKOWO-JELITOWE / 679

Dysocjacja
Transport U Kady t ran sportowe glukozy
Poczenie
Bona plazmatyczn a
Rya. 52-9. Translokacja transporterw glukozowych przez insulin (Wed ug: Karnieti E, i wsp.: Insulin-stimulated translocation of glucose transport systems in the isolated adipose celi; J. Biol. Chem. 1981, 256, 4772, za zezwoleniem, dziki uprze/moci S. Curshman).
Insulina wzmaga rwnie napyw do komrek, szczeglnie miniowych, aminokwasw, potasu, jonw wapniowych, nukleozydw i fosforanw nieorganicznych. To dziaanie insuliny jest niezalene od jej wpywu na dokomrkowy transport glukozy.
wpywa na rd komrkowe zuytkowanie glukozy za porednictwem wielu mechanizmw omawianych niej.

Przeksztaco rta >w energi Glukoza (w procesie glikolizy) w spoytych 'Przeksztacana pokarmach w tuszcze Przeksztacana w glikogen
Wpyw na utylizacj glukozy. Insulina
U zdrowego czowieka okoo poowa spoytej glukozy jest pf eksztacana w energi w szlaku glikolkycznym, za dalsza poowa zostaje zmagazynowana pod postaci tuszczw i gliko-genu. Glikoliza zmniejsza si, jeli nie ma insuliny, rwnoczenie zahamowane zostaj ana-boliczne procesy glikogenogenezy i lipogenezy. Rzeczywicie u chorego na cukrzyc z niedoborem insuliny zaledwie 5% spoytej glukozy ulega konwersji do tuszczw. Insulina nasila procesy glikolityczne zwikszajc aktywno i stenie kilku gwnych enzymw tego szlaku metabolicznego w tym glukokinazy, fosfofruktokinazy i kinazy piro-gronianowej. Wzrost glikolizy nasila utylizacj glukozy, przez co porednio zmniejsza napyw glukozy do osocza. Insulina obnia rwnie aktywno glukozo-6-fosfatazy, enzymu wystpujcego w wtrobie, lecz nieobecnego w miniach. Poniewa glukozo-6-fosfo ran nie jest w stanie przej przez barier bony plazmatycz-aej, dochodzi, w wyniku hamujcego dziaania insuliny na glukozo-6-fo sfataz, do zatrzymania glukozy w obrbie komrek wtrobowych. Insulina pobudza lipogeneze w tkance tuszczowej 1) dostarczajc acetylo-CoA i NADPH niezbdnych do syntezy kwasw tuszczowych, 2) podtrzymujc normaln aktywno karbok-sylazy acetylo-CoA katalizujcej konwersj ace-tylo-CoA do malonylo-CoA oraz 3) dostarczajc glicerolu niezbdnego do syntezy trigli-cerydw. W niedoborze insuliny aktywno wszystkich wymienionych enzymw jest obniona, przez co spada nasilenie lipogenezy. Inn przyczyn obnionej lipogenezy w stanach niedoboru insuliny s wolne kwasy tuszczowe uwalniane w duych ilociach przez kilka hormonw, normalnie blokowanych przez insuli n. Wzrost stenia wolnych kwasw tuszczowych jest przyczyn hamowania ich wasnej syntezy mechanizmem sprzenia zwrotnego (poprzez hamowanie karboksylazy acetylo-Co-A). Efekt netto insuliny na tkank tuszczow ma wic charakter anaboliczny. Wpyw insuliny na utylizacj glukozy obejmuje jeszcze inny proces anaboliczny. W wtrobie i miniach szkieletowych insulina pobudza konwersj glukozy do glukozo-6-fosforanu, ulegajcego z kolei izomeryzacji do glukozo-t--fosforanu i wbudowaniu do glikogenu przez syntaz glikogenow. Ta ostatnia jest aktywo wana przez insulin. Ten wpyw insuliny jest poredni i ma dwoisty charakter. Insulina ob nia rdkomrkowe stenie cAMP aktywujc
680 / ROZDZIA 52
Wpyw insuliny na produkcj glukozy (glukoneogenez). Wpyw insuliny na
fosfodiesteraz. Poniewa cAMP -zalena fos-forylacja powoduje inaktywacj syntazy gliko-genowej, mae stenia wymienionego nukleo-tydu sprawiaj, e enzym ten wystpuje w postaci aktywnej. Insulina aktywuje rwnie fosfataz katalizujc defosforylacj syntazy gliko-genowej, przez co dochodzi do aktywacji tego enzymu. W kocu insulina hamuje fosforylaz za porednictwem mechanizmu opisanego wyej, a realizowanego przy udziale cAMP i fosfatazy. W wyniku tego procesu dochodzi do spadku uwalniania glukozy z glikogenu. Efekt netto dziaania insuliny na przemian glikoge-now ma wic charakter anaboliczny.
transport glukozy, glikoliz i glikogenogenez realizowany jest w cigu sekund lub minut, poniewa polega na aktywacji lub inaktywacji enzymw drog ich fosforylacji lub defosforya-cji. Duej trwajcy wpyw na glikemi wywiera insulina poprzez hamowanie glukoneogenezy. W procesie tworzenia glukozy z prekursorw nieweglowodanowych uczestnicz: enzymy pobudzane przez glukagon (dziaajcy za pored nictwem cAMP), hormony glukokortykosteroi-dowe oraz, w mniejszym stopniu, zwizki a -i p-adrenergiczne, angiotensyna II i wazo-presyna. Insulina dziaa hamujco na enzymy stymulowane przez glukagon. Gwnym en zymem glukoneogenetycznym jest karboksyki-naza fosfoenolopirogronianowa (PEPCK) przeksztacajca szczawiooctan w fosfoenolopi-rogronian. Nowsze badania wykazay, e insulina zmniejsza stenie tego enzymu, wybirczo hamujc transkrypcj mRNA kodujcego PEPCK (patrz niej). -s kiem wszystkich wyej wymienionych dziaa insuliny jest spadek stenia glukozy we krwi. W tym dziaaniu insulina samotnie przeciwdziaa wielu hormonom, wykazujcym dziaa nie hiperglikemiczne. Dziaanie tych hormonw jest niewtpliwie wyrazem bardzo wanego mechanizmu wyrwnawczego, umoliwiajcego uniknicie potencjalnie miertelnych skutkw dziaania dugotrwaej hipoglikemii na mzg. Dziaanie lip o genetyczne insuliny przedyskutowano przy omawianiu wpywu tego hormonu na utyiizacj glukozy. Insulina jest rwnie potnym inhibitorem lipolizy w wtrobie i tkance tuszczowej, przez co wykazuje rwnie porednio dziaanie anaboliczne. Dziaanie to
Wpyw na przemian glukozy. Skut-
Wpyw na przemian tuszczow.
jest czciowo wynikiem hamujcego dziaania insuliny na powstawanie cAMP w tkankach (stenie tego nukleotydu w tych tkankach podwyszaj glukagon i adrenalina) oraz na aktywno lipazy wraliwej na dziaanie hormonw nasilajcych lipoliz. Ten hamujcy wpyw spowodowany jest prawdopodobnie aktywacj fosfatazy powodujcej defosforylacje, i tym samym inaktywacje lipazy lub kinazy biaek cAMP-zalenej. Dlatego te insulina zmniejsza stenie wolnych kwasw tuszczowych we krwi krcej. To dziaanie insuliny porednio wpywa rwnie na przemian wglowodanw, bowiem wolne kwasy tuszczowe hamuj glikoliz na rnych etapach szlaku glikolitycznego oraz pobudzaj glukoneogenez. To wszystko tumaczy, dlaczego niemoliwe jest omawianie regulacji metabolicznej w kontekcie tylko jednego hormonu lub jednego metabolitu. Regulacja jest zoonym procesem, w ktrym aktywno okrelonego szlaku met abolicznego jest wynikiem interakcji licznych hormonw i metabolitw. U chorych z niedoborem insuliny wzrasta aktywno lipazy, bdca przyczyn wz/ostu lipolizy i stenia wolnych kwasw tuszczowych w osoczu krwi i w wtrobie. U chorych tych wzrasta rwnie stenie glukagonu, tj. hormonu pobudzajcego uwalnianie wolnych kwasw tuszczowych. Glukagon dziaa anta-gonistycznie w stosunku do insuliny, tak e stan metaboliczny chorego na cukrzyce jest odzwierciedleniem wzgldnych ste glukagonu i insuliny. Cz wolnych kwasw tuszczowych ulega metabolizacji do acetylo-CoA (jest to odwrcenie lipogenezy), a nastpnie do CO2 i wody w cyklu kwasw trikarboksyowych (w cyklu kwasu cytrynowego). U chorych z niedoborem insuliny proces ten szybko przekracza pojemno" tego cyklu, przez co acetylo-CoA ulega konwersji do acetoaoetylo-CoA, i kolejno do kwasu acetooctowego i p-hydroksymasowe-go. Insulina odwraca ten ostatni proces. Insulina w sposb wyrazisty wpywa na powstawanie i klirens VLDL i LDL. Steni a tych frakcji fipidowych, a w ich nastpstwie rwnie stenie cholesterolu, czsto ulegaj podwyszeniu u chorych z niedostatecznie kontrolowan cukrzyc, W tym defekcie ma tkwi przyczyna przyspieszonego rozwoju miadycy, stanowicego powany problem u wielu chorych na cukrzyc. O mechanizmach dziaania insuliny mona sobie wyrobi pogld, ledzc ryc. 52 -10, od-

Tuszcze tuszczowa)
(tfcanka
""" rrrn
Glukoza
Gluko zo-6-fosforan ^ . Shunt I heKs o zo ; - m o no f o sf o ! rano wy
\ \ , /
Wolne Kwasy tuszczowe (osocze)
Obecno glukozy
w moczu (glikozuria)
T
ian
i i
Fosforan trlozy *- A m inokwasy Fosfoenolopir ogronian I i PI rogron
A c ylo -Co A
// Trlacylogllceroi
<
"' *S Wzmoona llpollza Wzmoona gllkogenollza
:awloc
------ Upoledzania glikollzy, syntezy

gllkogenu i utylizacji aoetylo -CoA
T
Szcza wio octan Cykl kwasu cytrynowego
^ Wzmoona glukoneogsneza
Ace tyio **. CoA
Ketokwasy (hlperKetonacnia)
Ketokwasy w moczu (keton uria) Cylrynian
a-Ketoglutaran
Amlnolwasy
Bye. 52-10. W cikim niedoborze insuliny dochodzi do nasilenia lipolizy. Znajduje to swoje odzwierciedlenie we wzrocie stenia triacytoglicerolu (triglicerydw) we krwi (hiperlipidemia). Mae iloci acetylo-CoA s metabolizowane w cyklu kwasu cytrynowego (cyklu kwasw trikarboksylowych), pozostaa za cz ulega konwersji do ketokwasw wyraajcej si ketonemi i ketonuri. Poniewa glikoliza jest zahamowana, powstay w wyniku glikogenolizy glukozo -6-fosforan (G-6-P) ulega przeksztaceniu do gfukozy. Proces ten, wraz ze wzmoon glukoneogenez, jest przyczyn hiperglikemii. Wzmoona glukoneogeneza spowodowana jest zwikszonym napywem aminokwasw (pochodzcych z katabolizmu biakowego) oraz wzrostem aktywnoci karboksykinazy fosioenolopirogronianowej (PEPCK), Wszystkie wymienione procesy ulegaj odwrceniu pod wpywem insuliny.
zwierciedlajc kierunki zmian kilku krytycznych szlakw metabolicznych uwarunkowanych nieobecnoci tego hormonu.
generalnie wykazuje wpyw anaboliczny na przemian biaek pobudzajc ich syntez i hamujc degradacj. Insulina pobudza pobieranie aminokwasw obojtnych przez minie, przy czym dziaanie to nie jest sprzone z pobiera-
Wpyw na przemian biaek. Insulina
niem glukozy, ani te z wbudowywaniem tych aminokwasw do biaek. Przyjmuje si, e wpyw insuliny na syntez biaek w miniach szkieletowych i w miniu sercowym realizowany jest na poziomie translacji mRNA. W ostatnich latach wykazano, e insulina wpywa na syntez swoistych biaek powodujc zmiany odpowiednich mRNA. Dziaanie insuliny, ktre moe ostatecznie tumaczy wpyw
682 / ROZDZIA 52
tego hormonu na aktywno lub ilo swoistych biaek, jest przedmiotem dyskusji dalszej czci tego rozdziau.
sulina pobudza mnoenie si licznych komrek w hodowlach oraz moe uczestniczy w regulacji wzrostu in vivo. W badaniach dotyczcych regulacji procesw wzrostowych najczciej uywa si hodowli fibroblastw. W takich komrkach insulina nasila dziaanie czynnika wzrostowego fibroblastw (FGF), czynnika wzrostowego pochodzenia pytkowego (PDGF), naskrkowego czynnika wzrostowego (EGF), estrw forbolowych pobudzajcych nowotwory, prostaglandyny F^PGF^), wazo-prcsyny i analogw cAM P. pobudzajc progresj cyklu komrkowego zatrzymanego w fazie G,. Nowa frapujca dziedzina bada dotyczy aktywnoci kinazy tyrozynowej. Receptor insulinowy, podobnie jak receptor dla peptydw pobudzajcych wzrost, w tym rwnie dla
Wpyw na podziay komrkowe. In-
PDGF i EGF, wykazuje aktywno kinazy tyrozynowej. Interesujcy jest fakt, e co naj mniej 10 produktw onkogenw, spord ktrych wiele jest podejrzanych o dziaanie pobudzajce podzia zoliwych komrek nowotworowych, jest rwnie kinazami tyrozynowymi. Komrki ssakw zawieraj analogi tych on kogenw (protoonkogeny), ktre mog uczestniczy w podziale normalnych komrek. Za susznoci takiego pogldu przemawiaj niedawne obserwacje, e dodanie PDGF lub ko mrek z zatrzymaniem wzrostu (uwarunkowanym niedoborem insuliny) do hodowli normalnych komrek nasila ekspresj co najmniej 2 produktw p roto onkogenw, tj. c-fos i c-myc. Dziaanie insuliny zostao wyjanione Dziaanie insuliny rozpoczyna si z chwil wizania si tego hormonu ze swoistym receptorem glikoproteinowym umiejscowionym na powierzchni komrek docelowych. Skutki dziaania tego hormonu (ryc. 52-11) mog wystpi
Insulina Transpo rt gluKozy Wzrost i replikac|a
komrek
Sygna (sygnay) przBZ bon owy (przez bonowe) Foaforylaeja deostorylacja biaek Aktywacja I hamowanie enzymw
Ryc. 52-11. Relacja midzy receptorem insulinowym a dziaaniem insuliny. Insulina wie si ze swoim receptorem bonowym wyzwalajc jeden lub wicej sygnaw przezblonowych. Ten sygna (lub te sygnay) moduluje (moduluj) bardzo rnorodne zjawiska rd kom orkowe.
w cigu sekund lub minut (wpyw insuliny na transport', fosforylacj biaek, aktywacj lub hamowanie enzymw, syntez RNA) lub po kilku godzinach (synteza biaek i DNA, wzrost komrek). B^cejstojLinsulinc-wy przebadano szczegowo, uywajc technik biochemicznych i rekombinacji DNA, Jest on heterodimerem zoonym z .dwchi rjodjednostek. okrelanych jako a i p, o konfiguracji oti-p^ poczonych ze sob wizaniami -dwusiarczkowymi (ryc. 52-12). Obydwie pod jednostki s obficie glikozylowane, za odszczepienie od nich kwasu sjalowego i galak-tozy zmniejsza wizanie insuliny i aktywno tego hormonu. K.aida z wymienionych podjed-nostek glikoproteinowych wykazuje wyjtkow struktur i czynno. Ppdjednostka cc (o masie czsteczkowej 135 000) pooona jest cakowicie pozakomkgwjp, îae ona insulin prawdopodobnie przez domen bogat w cystein. PodjednosâJ} (o masie czsteczkowej 95 000) jest biakiem przezbonowym, penicym drug wan funkcj receptora (p. rozdz. 45), tj. przekanika sygnau. Cz cyloplazmatyczna lej podjcdnostki wykazuje aktywno kinazy tyrozynowej oraz posiada obszar o waciwociach autofosforylujcych. Obydwa te obszary uczestnicz w transdukcji sygnau i dziaaniu insuliny (p. niej). Na rycinie 52 -12 przedLOL
stawiono uderzajce podobiestwa miedzy 3 receptorami wykazujcymi rne funkcje. Rze czywicie kilka obszarw podjednostki p wykazuje ho mologi w zakresie sekwencji amino-kwasowej z receptorem EGF. Receptor insulinowy ulega nieustannej syntezie i degradacji i wykazuje okres ptrwania wynoszcy 712 h. Receptor jest syntetyzowany w siateczce rdplazmatycznej szorstkiej jako jednoacuchowy peptyd, po czym ulega szybkiej glikozylacji w aparacie Golgiego. Prekursor ludzkiego receptora insulinowego skada si z 1 382 aminokwasw. Jego masa czsteczkowa wynosi 190 000. Ulega on rozszczepieniu z wytworzeniem dojrzaych" podjednostek a i p. Gen kodujcy ludzki receptor insulinowy zlokalizowany jest na chromosomie 19. Receptory insulinowe wystpuj na powierzchni wikszoci komrek ssakw, w iloci do 20 000 na jedn komrk, czsto rwnie na komrkach, ktrych nie uwaa si za typowe komrki docelowe dla tego hormonu. Insulina wywiera wpyw na wiele dobrze poznanych procesw metabolicznych i uczestniczy w procesach wzrostu i rephkacji komrek (patrz wyej), w organogenezie i rnicowaniu tkanek u podw oraz w procesach naprawczych i regeneracyjnych. Struktura receptora insulinowego oraz zdolno rnych insulin do wizania si z rece-
EGF
nsuima
NH, NH,
FRAGMENT RECEPTORA POOONY POZAKOMORKOWO
COOH
CYTOPLAZMATYCZNY FRAGMENT RECEPTORA
)
OO H
Ryc. 52-12. Schemat struktury receptorw LDL, EGF i insulinowego. N -koniec kadego z tych receptorw znajduje si w po z a kom orko wo pooonej czci czsteczki. Prostokty oznaczaj sekwencje aminokwasowe bogate w cystein, wice hormon. Kady receptor posiada krtk domen (zoon z ok. 25 aminokwasw) przenikajc bon plazmatyczn (zaznaczon jako pole zakreskowane) oraz domen rdkomrkow o zmiennej dugoci. Receptor EGF i insulinowy wykazuj aktywno kinazy tyrozynowej zwizanej z domen cytoplazmatyczn (zaznaczon keczkami) oraz miejsca autofosforyfacji pooone w tym obszarze receptora. Receptor insulinowy jest heterodimerem. Jego podjednostki zwizane s ze sob przez wizania dwusiarczkowe (zaznaczone jako kreski poziome), ________________________
684 / ROZDZIA 52
ptorem i wywoania reakcji biologicznych s praktycznie identyczne we wszystkich komrkach i u wszystkich gatunkw zwierzt. Doda jednak naley, e insulina wiska jest 1020--krotnie bardziej skuteczna ni proinsulina wiska, za ta ostatnia jest 1020-krotnie bardziej efektywna ni insulina winki morskiej nawet u tego gatunku zwierzt. Sugeruje to oczywicie bardziej konserwatywny charakter struktury receptora insulinowego ni samej insuliny. W chwili wizania si insuliny z receptorem zachodz nastpujce zjawiska: 1) dochodzi do zmian konformacyjnych receptora, 2) receptory cz si ze sob tworzc mikroagregaty, 3) receptor ulega internalizacji oraz 4) wyzwolony zostaje jeden lub kilka sygnaw. Znaczenie zmian konformacyjnych jest nieznane, za internalizacja receptora jest zapewne wyrazem dziaania mechanizmu regulujcego stenie i obrt receptorw. W stanach przebiegajcych z du ym steniem insuliny w osoczu krwi, np. w otyoci lub akromegalii, liczba receptorw insulinowych jest obniona, za tkanki docelowe (tarczowe) s mniej czue na dziaanie insuliny. Ten proces zmniejszenia si liczby receptorw (down regu a ti on) jest spowodowany ich internalizacj, tj. procesem, w ktrym kompleksy zoone z insuliny i receptora wnikaj do komrki na zasadzie endocytozy, pod postaci pcherzykw pokrytych biakami klatrynowy-rai (p. rozdz, 41). Proces down regulation" czciowo tumaczy oporno na insulin wystpujc w otyoci i cukrzycy typu II. Dotychczas nie oRrelono rdkomrkowego (rdkomrk owych) przekanika (przekanikw) dziaania insuliny Pomimo e mechanizm dziaania insuliny jest przedmiotem bada od 60 lat, w dalszym cigu nie wyjaniono pewnych krytycznych jego elementw, takich jak istoty rdkomrkowego sygnau tego hormonu. Pod tym wzgldem insulina nie jest wyjtkiem, nie zidentyfikowano bowiem rwnie rdkomrk owych poredni kw dla wieiu innych hormonw (p. tab. 45-1). Zaproponowano cay szereg rnych czsteczek jako drugiego przekanika dziaania insuliny. Wrd nich naley wymieni sam insulin, wap, cykliczne nukleotydy (cAMP, cGMP), H2O2, peptydy pochodzenia'bonowego, bonowe glikany ibsfoinozytoiowe, jedno wartociowe kationy oraz kinaz tyrozynow (tj. sam
receptor insuliny). adna z tych czsteczek nie wytrzymaa rygorw sprawdzajcych. Aktualnie zainteresowanie koncentruje si na obserwacji, e sam receptor insuliny jest enzymem insulino wraliwym, poniewa ulega auto fosfory lacj i w chwili zwizania si z insulin. Funkcj fosforylacji przypisuje si podjednostce p, ktra dziaa jak kinaza biaek przenoszc reszt y-fosforanow ATP na reszt tyrozylow podjednostek p (ryc. 52-12). Insulina zwiksza Vmax tej reakcji enzymatycznej, Fosforylacja tyrozyny jest zjawiskiem niezwykym w komrkach ssakw (fosfo tyrozyna stanowi zaledwie 0,03% fosforylowanych aminokwasw normalnej komrki) i moliwe, e nie jest to przypadkiem, e receptory EGF, PDGF i IGF-I wykazuj rwnie aktywno kinazy tyrozynowej. Uwaa si, e aktywno kinazy tyrozynowej stanowi istotny czynnik w dziaaniu licznych produktw onkogenw wirusowych. Relacj tej kinazy tyrozynowej do komrkowych analogw wykazujcych podobne waciwoci pobudzajce wzrost zarwno zoliwych komrek nowotworowych, jak i komrek normalnych omwiono wyej. W miar poznawania struktury ujawniono wystpowanie homologii wysokiego stopnia midzy receptorami i onkogenami, np. midzy receptorem EGF a onkogenem erb-B, midzy receptorem PDGF a onkogenem v-sis oraz midzy receptorem insulinowym a onkogenem v-ros. Nie udowodniono, by kinaza tyrozynow uczestniczya w transdukcji sygnau. Jej udzia w tym procesie mgby polega na fosforylacji swoistego biaka rozpoczynajcego dziaanie insuliny, na inicjacji kaskady fosforylacji-defos-forylacji, na indukowaniu zmiany niektrych waciwoci bony komrkowej lub na tworzeniu produktu zwizanego z bon komrkow, np. glikanu fosfoinozytolowego. Reakcje fosforylacji i defosforylacji biaek uczestnicz w niektrych dziaaniach insuliny Wieie skutkw metabolicznych insuliny, szczeglnie te, ktre nastpuj szybko, s wynikiem reakcji fosforylacji i defosforylacji biaek, zmieniajcych z kolei aktywno enzymatyczn tych ostatnich. List enzymw podlegajcych takim reakcjom przedstawia tab. 52-3. W niektrych przypadkach insulina zmniejsza ste nie rodkom orkowe cAMP (aktywujc fosfo-diesteraz cAMP), w wyniku czego zmniejsza si aktywno cAMP -zalenej kinazy biaek.
HORMONY TRZUSTKI ! ZODK OWO -JELITOWE / 686 T abela 52-3. E nzymy, ktrych stopie fosforylacji i aktywnoci utega zmianie pod wpywem insuliny* Enzym Przemiana cAMP F osod testera za {niska warto K ) Kinaza biaek (cAMP-zalezna) Przemiana glikogenu Syntaza glikogenowa Kinaza fosforylazowa Fosfory laza Glikoliza i glukoneogeneza Dehydrogenaza pirogronianowa Kinaza pirogronianowa 6-Fosfofrukto-2-kinaza Fru ktozo - 2,6 - b isf osf ata za P rzemiana lip idow a Ka r b oksy) aza acety 1 o - C o A Reduktaza hydroksy mety logi uta ryf o- CoA Lipaza triacylogticerolowa Inne Kineza tyrozyn owa (receptor insulinowy) * Wedug Dento n R.M. i wsp .: Apartial viewof themechanism of insulin actio n; Diabetologia 1981, 21, 347, w modyfikacji autora rozdziau, za pozwo leniem. Fosforylacja Wzrost Wzrost Spadek Fosforylacja Defosforylacja Defosforylacja Wzrost Wzrost Wzrost Spadek Defosforylacja Defosforylacja Defosforytacja Defosforylacja Wzrost Spadek Spadek Defosforylacja Defosforylacja Defosforylacja Wzrost Spadek Fosforylacja Sprzenie receptora z podjednostkami C Zm iana akt yw noci Mo liw y mecha n izm
Przykadami takiego dziaania s syntaza glikogenowa i fosforylaza. W innych przypadkach dziaanie insuliny jest niezalene od cAMP i polega na aktywacji (jak w przypadku receptora insulinowego, w ktrym insulina aktywuje kinaze tyrozynow stanowic cz acucha P tego receptora) lub hamowaniu innych kinaz biaek (p. tab. 45 -5), lub te, co zdarza si czciej, na stymulacji fosfataz fosfoprotein. Defosforylacja zwiksza aktywno licznych enzymw kluczowych (tab. 52-3). Te modyfikacje kowaiencyjne umoliwiaj prawie natychmiastowe zmiany aktywnoci enzymw. Insulina wpywa na proces translacji mRIMA Wiadomo, e insulina wpywa na aktywno lub ilo co najmniej 50 biaek wystpujcych w rnych tkankach, przy czym wiele jej efektw jest wynikiem modyfikacji kowalencyjnej
struktury tych biaek. Insulinie przypisuje si rwnie rol w procesie translacji mRNA, gwnie na podstawie wynikw bada nad rybo somalnym biakiem S6 stanowicym skadow rybosomalnej podjednostki 40S. Taki mechanizm dziaania dotyczy wpywu insuliny na syntez biaek w wtrobie, miniach szkieletowych i w miniu sercowym. Wanym dziaaniem insuliny jest jej wpyw na ekspresj genw Dotychczas omawiane przykady dziaania insuliny zachodz w bonie plazmatycznej lub w cytopiaztnie. Insulina wpywa take na swoiste procesy w jdrach komrkowych, przypuszczalnie za porednictwem rd komrkowego mediatora. Enzym karboksykinaza fosfoeno-lopirogronianowa (PEPCK) katalizuje gwny etap glukoneogenezy decydujcy o tempie tego procesu. Insulina hamuje syntez PEPCK i, co
686 / ROZDZIA 52
za tym idzie, rwnie glukoneogeneze. Nowsze badania wykazay, e tempo transkrypcji genu PEPCK zmniejsza si w cigu kilku minut po dodaniu insuliny do hodowli komrek wt-robiaka(ryc. 52-13). Hamowanie procesu trans0.5 100 3,0
Tabela 52-4. Informacyjne RNA regufowane przez insulin Enzymy rd komrkowe A m i n ot ra n sf e ra za tyrozynowa* Karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa* Syntaza kwasw tuszczowych Kinaza pirogronianowa* Dehydrogenaza glicerolo-3-fosf ora nowa* Detiydrogenaza 1 -gliceraldehydowa* Glukokinaza Biaka sekrecyjrte i enzymy Albuminy* Adypsyna* Amylaza* a^-Globuina Hormon wzrostu* Biaka uczestniczce w reprodukcji Albumina jaja kurzego Kazeina*
1.0
1.5 2.0 2.5 Czas po dodaniu Insuliny (h)
Biaka strukturalne 8-Krystalina Inne biaka 33 Wtroby (g , itd.) Tkanki tuszczowej Minia sercowego Mini szkieletowych * Insulina reguluje tempo transkrypcji swoistych mRNA,
Ryc. 52-13. Wptyw insuliny na transkrypcj swoistych genw. Dodanie insuliny do hodowli komrek wtrobiaka H411E powoduje szybki spadek tempa transkrypcji genu PEPCK, W wyniku takiego dziaania stwierdza sie spadek iloci pierwotnego transkryptu w jdrze komrkowym oraz dojrzaego mRNA kodujcego PEPCK, Tempo syntezy PEPCK spada po obnieniu si iloci cyloplazmatycznego mRNA kodujcego PEPCK. (Wedug Sasaki K. i wsp.: Multihormonal regulation of phosphoenol-pyruwate carboxykinase gene transcription; J. Biol. Chern. 1984, 259, 15242, za pozwoleniem).
krypcji jest przyczynVpadku iloci pierwotnego transkryptu oraz dojrzaego mRNA kodujcego PEPCK (mRNAPEPCK), co w nastpstwie prowadzi do zmniejszonego tempa syntezy PEPCK. To dziaanie insuliny zachodzi przy fizjologicznych steniach tego hormonu w surowicy (10~ 12 do 10~ 9 mol/l). Poredniczy w nim receptor insulinowy. Dziaanie to wydaje si by spowodowane zmniejszonym nasileniem inicjacji transkrypcji mRNAPEPCK. Pomimo e badania nad regulacj syntezy PEPCK byty pierwszymi, w ktrych udowodniono wpyw insuliny na proces transkrypcji genu, nie s one ju jedynymi tego rodzaju. Rzeczywicie wydaje si, e jeden z waniejszych mechanizmw dziaania insuliny polega na regulacji syntezy mRNA, Insulina wpywa na wiele swoistych mRNA, cho wiele mRNA bdcych pod wpywem tego hormonu a wy -
stepujcych w wtrobie, tkance tuszczowej, miniach szkieletowych i w miniu sercowym, nie zostao jeszcze zidentyfikowanych (tab. 52--4). W kilku przypadkach wiadomo, e hormon ten wpywa na transkrypcj genu. Insulina wpywa na syntez: 1) enzymw nie opuszczajcych komrek, 2) enzymw i biaek wydzielanych przez komrk oraz 3) biaek strukturalnych (tab, 52-4). Wymienione skutki dziaania insuliny wystpuj w licznych narzdach i tkankach oraz u wielu gatunkw zwierzt. W chwili obecnej wpyw insuliny na regulacj transkrypcji swoistych mRNA jest dobrze udokumentowany. Znaczenie tego mechanizmu dziaania insuliny modulujcego aktywno enzymw jest rwnowane dziaaniu tego hormonu mechanizmem fosforylacji/defosforyla-cji. Wpyw insuliny na proces transkrypcji genu mona tumaczy jej dziaaniem na embriogene-z oraz rnicowanie, wzrost i replikacj komrek.
Rola patofizjofogiczna insuliny jest najbardziej wyraona w cukrzycy Niedobr insuliny lub oporno na dziaanie tego hormonu s przyczyn cukrzycy. Okoo 90% chorych na cukrzyc cierpi na cukrzyc insulinoniezalen (typ H) (non-insulin dependent diabetes metlitus NIDDM). U pozostaych 10% stwierdza si cukrzyc insulinozale-n (typ I) (insulin dependent diabetes mellitus IDDM). Omwione wyej zaburzenia metabo liczne dotycz g wnie cukrzycy typu I. Okrelone, rzadkie sytuacje ilustruj istotne cechy dziaania insuliny. Nieliczni chorzy wytwarzaj przeciwciaa skierowane przeciwko wasnym receptorom insulinowym. Przeciwciaa te uniemoliwiaj wizanie si insuliny ze swoim receptorem, co sprawia e u takich chorych rozwija si zesp cikiej opornoci na insulin (p. tab. 44 -2), Guzy wywodzce si z komrek B wysp Langerhansa s przyczyn hiperinsulinizrnu oraz zespou charakteryzuj cego si cik hipoglikemi. Rola insuliny (a moe rwnie IGF-I lub IGF-II) w organo-genezie i rozwoju jest widoczna na przykadzie rzadkich przypadkw leprechaunizmu (krasno-ludkowatuci). Zesp ten charakteryzuje si ma mas urodzeniow, zmniejszon mas miniow i zmniejszon podskrn tkank tuszczow, twarz elfow oraz opornoci na insulin przy wystpowaniu znacznie podwyszonych ste biologicznie aktywnego hormonu w osoczu. Dzieci takie umieraj we wczes nym dziecistwie. Wiele osb dotknitych lep-rechaunizmem wykazuje brak recep torw in-
sulinowych lub obecno receptorw uszkodzonych.
CZYNNIKI WZROSTOWE INSULINOPODOBNE (IGF-I I IGF-II) NIE S HORMONAMI TRZUSTKOWYMI, LECZ WYKAZUJ PODOBIESTWO STRUKTURALNE I CZYNNOCIOWE DO INSULINY
Trudno oddzieli wpyw insuliny na wzrost i podziay komrkowe od podobnych efektw IGF-I i IGF-II. Rzeczywicie moe wystpowa interakcja insuliny z wymienionymi czynnikami wzrostowymi w tych procesach. O strukturalnym podobiestwie wymienionych biaek wspomniano ju wyej (p. ryc. 52-5). Bardziej szczegowe porwnanie tych hormonw przedstawia tab. 52-5. IGF-I i IGF-II s peptydami jedtioacuchowymi zoonymi z 70 (IGF -I) lub 67 (IGF-II) aminokwasw. Istnieje 62 procentowa homologia pomidzy IGF -I i IGF-II, za 50% reszt aminokwasowych zawartych w tych hormonach jest identycznych z insulin. Czsteczki te maj wyjtkowe domeny antygenowe. Regulacja sekrecji tych hormonw jest rna (tab. 52-5). Insulina jest hormonem silniej oddziaujcym na metabolizm, za czynniki wzrostowe insulinopodobne bardziej pobudzaj wzrost. Kady hormon posiada swoisty dla niego receptor. Receptor dla IGF-I, podobnie jak receptor insulinowy, jest heterodimerem o strukturze a 2 -P 2 i jest kinaz tyrozynow.
Tabela 52-5. Porwnanie insuliny z czynnikami wzrostowymi insuiinopodobnymi (dziki uprzejmoci C.R. Kahn) Insulina IGF-I IGF-l Inne nazwy Somatomedyna C Czynnik stymulujcy ak tywno mnoenia si komrek (MSA)
67
Liczba aminokwasw Miejsce produkcji Regulacja stenia we krwi przez Stenie w osoczu Biaka wice w osoczu Gwna rola fizjologiczna
51
70 Wtroba i inne tkanki Hormon wzrostu, stan odywiania Rzd wielkoci ng/ml Obecne Wzrost koci i chrzstek
Komrki B wysp trzustkowych Glukoz 0,3-2 ng/ml Nieobecne Kontrola przemiany materii
Rne tkanki Nieznany czynnik Rzd wielkoci ng/ml Obecne Nieznana (moe uczestniczy w rozwoju zarodka)
688 / ROZDZIA 52
W odrnieniu od receptora dla IGF-I, receptor dla IGF-II jest polipeptydem jednoacucho-wym o masie czsteczkowej 260 000 i nie jest kinaz tyrozynow. Jest on bardzo podobny, jeeli nie identyczny, z receptorem dia man-nozo-6-fbsforanu. Wystpuje pewne krzyowe wizanie midzy wymienionymi hormonami i ich receptorami, co sprawia, e jeden hormon wykazuje pewn aktywno biologiczn rwnie drugiego hor monu (tab. 52-6). Oglnie mwic, aktywno pobudzajca wzrost wymienionych hormonw koreluje najlepiej z wielkoci ich powinowactwa do receptorw IGF -I lub IGF-II.
Tabela 52-6. Powinowactwo insuliny, IGF -I i IGF-II do rnych receptorw
Hormon insulinowy Receptor
IGF-I Mae Due Mae
IGF-II Prawie adne Umiarkowane Due
Insulina IGF-I IGF-II
Due Umiarkowane Prawie adne
w osoczu glukagonu" immunoreaktywnego jest glukagonem trzustkowym. Pozosta ilo stanowi czsteczki wiksze, biologicznie nieaktywne. Glukagon trzustkowy ma pewne wsplne waciwoci immunologiczne i fizjologiczne z enteroglukagonem peptydem wyekstrahowanym z bony luzowej dwunastnicy. 14 z 27 reszt aminokwasowych sekretyny jest identycznych z glukagonem. Glukagon kry w osoczu w postaci wolnej. Poniewa nie wie si z biakami transportowymi, jego okres ptrwania jest krtki (wy nosi ok. 5 min). Glukagon ulega inaktywacji w wtrobie zawierajcej enzym odszczepiajcy pierwsze dwa N-kocowe aminokwasy midzy Ser2 i Gin3. Poniewa wtroba jest pierwszym narzdem, do ktrego dociera glukagon po jego wydzielaniu i w ktrym hormon ten ulega inaktywacji, stenie jego we krwi wrotnej jest znacznie wysze ni w kreniu obwodowym. Glukoza hamuje wydzielanie glukagonu. Ten fakt podkrela przeciwstawne role metaboliczne' insuliny i glukagonu Nie jest jasne, czy glukoza hamuje bezporednio sekrecje glukagonu, czy te porednikami takiego dziaania s insulina lub IGF -I. Te ostatnie dwa hormony hamuj bezporednio wydzielanie glukagonu. Na sekrecj glukagonu wpywa wiele innych substancji, takich jak aminokwasy, kwasy tuszczowe i zwizki ketonowe, hormony przewodu pokarmowego oraz neuroprzekaniki. Dziaanie oglne glukagonu jest przeciwstawne do dziaania insuliny O ile insulina sprzyja magazynowaniu energii, pobudzajc glikogenogenez, lipogenez i syntez biaek, o tyle glukagon powoduje szybk mobilizacj potencjalnych rde energetycznych, tj. glikogenoliz i lipoliz. Glukagon jest rwnie hormonem najsilniej pobudzajcym glukoneogenez i ma dziaanie ketogen-ne. Wtroba jest najwaniejszym narzdem docelowym glukagonu. Glukagon wie si ze swoistymi receptorami bony plazm a ty cznej he-patocytw, aktywujc cyklaz adenylanow. Powstay cAMP, aktywujc fosforylaz, nasila tempo rozpadu glikogenu, rwnoczenie za hamuje syntaz glikogenow, i co za tym idzie, powstawanie glikogenu (p. rozdz. 45). To dzia-
GLUKAGON JEST ANTAGONIST INSULINY Po podaniu pierwszych handlowo dostp nych preparatw insulinowych obserwowano najpierw wzrost giikeaui a dopiero potem jej spadek. Zwikszenie glikemii byo spowodowane zanieczyszczeniem tych preparatw glukago-nem. By on drugim hormonem odkrytym w komrkach wysp trzustkowych. Glukagon jest rwnie syntetyzowany pod postaci czsteczki prekursorowej Glukagon jest syntetyzowany gwnie przez komrki A wysp trzustkowych. Jest on polipeptydem jednoa cuch owym (o masie czsteczkowej 3485) zoonym z 29 aminokwasw (ryc. 52-E4). Glukagon jest produkowany pod postaci znacznie wikszej czsteczki prekursorowej o masie czsteczkowej 9000. Wyizolowano rwnie czsteczki wiksze, lecz nie ustalono, czy s one rzeczywistymi prekursorami gluka-gonu, czy te peptydami blisko z nim spokrewnionymi. Zaledwie 30-40% wystpujcego
lanie wykazuje pewn swoisto hormonaln i tkankow. I tak glukagon nie wywiera ad nego wpywu na glikogenoliz w miniach, podczas gdy adrenalina jest pod tym wzgldem aktywna zarwno w miniach, jak i w wt robie. Zwikszone stenie cAMP w komrkach wtrobowych pobudza konwersj aminokwasw w glukoz indukujc syntez licznych enzymw szlaku glukoneogenetycznego. Gwnym enzymem tego 'szlaku jest PEPCK. Glukagon, za porednictwem cAMP, zwiksza tempo transkrypcji mRNA genu kodujcego PEPCK, i tym samym syntez PEPCK. Jest to dziaanie
Tabela 52-7. Indukcja lufa represja enzymw przez insulin lub glukagon* Indukcja enzymw przez wysoki iloraz in sulino -glukagonowy (l/G) oraz ich represja przez niski iloraz I/G Glukokinaza Enzym rozszczepiajcy cytrynian Karboksylaza acetylo-CoA Reduktaza HMG-CoA Kinaza pirogronianowa 6-Fosfofrukto-1 -kinaza 6-Fqsfo1rukto-2-kinaza (fruktozo-2,6-bisfos1ataza) Indukcja enzymw przez niski iloraz l/G i ich represja przez wysoki iloraz l/G Glukozo-6-fosfataza Karboksykinaza fosioenolopirogronianowa (PEPCK) Fruktozo-1,6-bisfosfataza * Wedug: Karam J, H., Salber P. R., Forsham P. H.: Pancreatic hormones and diabetic mellitus; w: Basie and Ctinical Endocrino/ogy. Wyd. II, pod redakcj Greenspan F. S., Forsham P. H., Appleton and Lange, 1986, w niewielkiej modyfikacji, za pozwoleniem.
diamet ralnie rne od insuliny, ktra hamuje transkrypcj genu kodujcego PEPCK. Inne przykady przedstawione s w tab. 52-7. Skutkiem dziaania glukagonu w wtrobie jest zwikszone wytwarzanie glukozy. Poniewa wikszo powstaej glukozy opuszcza wtrob, w osoczu krwi stwierdza si wzrost stenia tego cukru po podaniu glukagonu. Glukagon jest silnym czynnikiem lipolitycz-nym. Podwysza on stenie cAMP w adypocy-tach, przez co aktywuje lipaz wraliw na dziaanie hormonw. Uwolnione pod wpywem lipazy kwasy tuszczowe mog zosta przeksztacone do zwizkw ketonowych, tj. acetooctanu i p-hydroksymalanu. Jest to wany aspekt przemiany materii u chorych na cukrzyc, poniewa stenia glukacgnu w osoczu krwi s zawsze podwyszone w stanach niedoboru insuliny. SOMAT OST AT YNA HAMUJE WYDZIELANIE HORMONU WZROSTU (GH) Somatostatyna zostaa po raz pierwszy wyi zolowana z pod wzgrza jako czynnik hamujcy sekrecj hormonu wzrostu. Jest to cykliczny peptyd syntetyzowany w komrkach D wysp trzustkowych pod postaci duego prohormo-nu o masie czsteczkowej 11 500. Tempo transkrypcji genu prosomatostatynowego znacznie si zwiksza pod wpywem cAMP. Prohormon ulega najpierw przeksztaceniu do peptydu zoonego z 28 aminokwasw, a nastpnie do czsteczki o masie czsteczkowej 1640 skadajcej si z 14 aminokwasw (ryc. 52-14). Wszystkie postacie prekursorowe somatostatyny wy kazuj aktywno biologiczn.
10
aiukaoon
NHj-His-Ser-Gbi-Gly-Trir Phe Thr-Ser-Asp-Tyr

1 1 8 1 23
Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Ang Ala Gin Asp Phe Val Gtn Trp Leu Met Asn Thr COOH
ID 14
Somatostatyna
NH2 Ala Gly Cys Lys Asn Phe Phe Trp tys Thr1 1
Phe - Thr - Ser - Cys - COOH Ryc. S2-14. Sekwencje aminokwasowe glukagonu i somatostatyny.
44 Bi ochemia
690 / ROZDZIA 52
Oprcz podwzgrza i wysp trzustkowych somatostatyna wystpuje w licznych tkankach przewodu pokarmowego (gdzie przypuszczalnie spenia rnorodne funkcje) oraz w licznych obszarach orodkowego ukadu nerwowego, gdzie moe by neuroprzekanikiem. Somatostatyna hamuje wydzielanie innych hormonw wysp trzustkowych dziki dziaaniu parakrynnemu. Hormon ten, podany w dawkach farmakologicznych wyranie zmniejsza nasilenie ketozy indukowanej niedoborem insuliny. Zjawisko spowodowane jest zapewne blokowaniem przez somatostatyn sekrecji glu-kagonu, towarzyszcej insulinopenii. Hormon ten zmniejsza rwnie napyw substancji odywczych do tkanek: a) opniajc oprnianie si odka, 2) zmniejszajc sekrecj gastryny i tym samym rwnie kwasu solnego, 3) zmniejszajc wydzielanie przez trzustk enzymw trawiennych, 4) obniajc perfuzj naczy trzew-nych oraz 5) zwalniajc absorpcj glukozy w przewodzie pokarmowym. Mao jest informacji na temat biochemicznego i molekular nego dziaania tego hormonu. NIEZNANA JEST CZYNNO POLIPEPTYDU TRZUSTKOWEGO Polipeptyd trzustkowy o masie czsteczkowej ok, 4200 skada si z 36 aminokwasw. Niedawno stwierdzono, e jest wytwarzany przez komrki F wysp trzustkowych. U czowieka sekrecj tego hormonu pobudzaj posiek biakowy, godzenie, aktywno fizyczna oraz ostra hipo-glikemia, natomiast hamuj j somatostatyna i glukoza podana doylnie. Czynno polipep-tydu trzustkowego jest nieznana, cho sugeruje si, e hormon ten wpywa na zawarto gliko-genu w wtrobie i sekrecj sokw odkowo--jelitowych. HORMONY ZODKOWO-JELITOWE Rozwj endokrynologii, jako samodzielnej dyscypliny naukowej, rozpocz si od wykrycia hormonu zodkowo-jelitowego W roku 1902 Bayliss i Starling, perfundujc odnerwion ptl jelita czczego psa kwasem solnym, zaobserwowali wzrost wydzielania soku trzustkowego. Podobnego zjawiska nie stwierdzili po doylnym podani u kwasu sol-
nego, natomiast obserwowali go po doylnym podaniu wycigu uzyskanego z bony luzowej jelitowej. Badacze ci przypuszczali, e sek-retyna" uwalniana pod wpywem jakiego bodca z bony luzowej grnego odcinka jelit dostaje si drog krwi do trzustki, gdzie pobudza czynno egzokrynn tego gruczou. Bayliss i Starling byli pierwszymi badaczami, ktrzy uyli okrelenia hormon", za sekretyna bya pierwszym hormonem, ktrego czynno zo staa zidentyfikowana. Pomimo e czynno sekretyny poznano ju w 1902 r., potrzeba byo dalszych 60 lat dla okrelenia struktury chemicznej tego hormonu. Przyczyna takiego stanu rzeczy jest obecnie znana: mianowicie rodziny blisko ze sob spokrewnionych peptydw odkowo-jelitowych wykazuj znaczne podobie stwa strukturalne i czynnociowe i wikszo tych peptydw wystpuje pod licznymi postaciami. Wrd waniejszych hormonw odkowo--jelitowych tylko sekretyna wystpuje w jednej postaci. Wystpowanie wielu postaci molekularnych peptydw odkowo-jelitowych zarwno w tkankach przewodu pokarmowego*, jak i we krwi krcej stao na przeszkodzie w ustaleniu liczby i struktury tych czsteczek. Przy rozwizywaniu tych trudnoci pomocna bya koncepcja o wystpowaniu prekursorw hor monalnych. Wykazano, e heterogenno poszczeglnych postaci okrelonego hormonu zaley od tkanki, w ktrej zachodzi synteza hor monu. Wprowadzone niedawno techniki izolacyjne okazay si pomocne przy okrelaniu rnic midzy poszczeglnymi prekursorami jednego i tego samego hormonu. Hormony zodkowo -jelito we wykazuj kilka szczeglnych cech Z tkanek przewodu pokarmowego wyizolowano wicej ni tuzin peptydw wykazujcych wyjtkowe dziaanie (tab. 52-8). Szczegln cech tej grupy hormonw jest to, e wiele z nich spenia kryteria klasycznych hormonw, podczas gdy inne wykazuj dziaania parakrynne lub dziaaj jako neuroprzekaniki lub neuro-modulatory. Inn szczegln cech hormonw odkowo-jelitowych jest to, e nie s one wytwarzane w jednym konkretnym gruczole, jak klasyczne hormony, lecz przez liczne komrki rozrzucone w caym przewodzie pokarmowym. Jest to widoczne w tab. 52-8. Poniewa liczne hormony odkowo-jelito-
HORMONY TRZUSTKI I 2ODKOWO-JELITOWE / 691 Tabela 52-8- Horm ony odkowo-jelitowe Hormon Miejsce syntezy Gastryna Cholecystokinina (CCK) Sekrety na odkowy peptyd harnu-icy (GIP)
Gwne dziaania
Antrum odka, dwunast- Stymulacja sekrecji kwasu solnego i pepsyny nica Dwunastnica, jelito czcze Dwunastnica, jeito czcze Jelito cienkie Stymulacja sekrecji amylazy trzustkowej Stymulacja sekrecji wodorowglanw z sokiem trzustkowym Wzmaga sekrecj insuliny, indukowan bodcem glukozowym, hamuje wydzielanie soku odkowego Rozkurcz mini gadkich, pobudza wydzielanie wodorowglanw z sokiem trzustkowym Zapocztkowuje aktywno motoryczn jelit pomidzy okresami trawiennymi
Wazoaktywny peptyd jeli- Trzustka towy (VIP) Motyli na Somatostatyna Jelito cienkie
odek, dwunastnica, trzu- Liczne efekty hamujce stka Hamuje wydzielanie wodorowglanw i biaka Polipeptyd trzustkowy (PP) Trzustka z sokiem trzustkowym Enkefaliny Substancja P Immunoreaktywno bom-bezynopodobna (BLI) Neurcjtensyna Enteroglukagon odek, dwunastnica, p- Efekty opioidowopodobne cherzyk ciowy Cay przewd pokarmowy odek, dwunastnica Jelito krte Trzustka, jelito cienkie Dziaanie fizjologiczne jest niepewne Pobudza wydzielanie gastryny i CCK Dziaanie fizjologiczne jest nieznane Dziaanie fizjologiczne jest nieznane
we wystpuj w nerwach unerwiajcych tkanki przewodu pokarmowego, nie jest zaskoczeniem, e wikszo z nich wystpuje rwnie w orodkowym ukadzie nerwowym. Istniej rodziny" hormonw o dkowo-jelitowych Uwzgldniajc sekwencj aminokwas owa. oraz podobiestwa czynnociowe, liczne hor mony odkowo -jelitowe mona zakwalifikowa do jednej z niej podanych dwch rodzin". Pierwsza z nich rodzina gastrynowa obejmuje gastryn i CCK, za druga rodzina sekretynowa sekretyn, glukagon, GIP, VIP i glicentyn (ta ostatnia wykazuje dziaanie podobne do glukagonu, cho jest odmiennym peptydem). Neurokrynne peptydy neuroten-syna, peptydy podobne do bombezyny, substancja P i somatostatyna nie wykazuj podobiestwa strukturalnego do adnego z hormonw odkowo -jelitowych, W kocu inn
wspln cech tych ostatnich hormonw jest bardzo krtki okres ich trwania, co sugeruje, e nie odgrywaj one roli fizjologicznej w osoczu krwi. Wzgldnie mao wiadomo o mechanizmie dziaania hormonw odkowo -jelitowych Dane o mechanizmie dziaania peptydowych hormonw odkowo-jelitowych ukazay si znacznie pniej ni innych hormonw. Byo to niewtpliwie spowodowane potrzeb skatalogowania i okrelenia fizjologicznego dziaania tych hormonw. Godnym uwagi wyjtkiem od powyszego stwierdzenia jest hormonalna regulacja sekrecji enzymw przez komrki gwne pcherzykw trzustkowych. Zidentyfikowano 6 rnych klas receptorw w komrkach pcherzykw trzustkowych. S nimi receptory dla: 1) muskarynowych zwizkw cholinergicznych, 2) hormonw rodziny
692 / ROZDZIA 52
gastrynowo-cholecystokininowej, 3) bombezy-ny i pokrewnych peptydw, 4) hormonw ro dziny fizaleminowej i substancji P, 5) sekretyny i VIP oraz 6) toksyny przecinkowca cholery. Hormony receptorw klasy 14 dziaaj za porednictwem mechanizmu wapniowo-fosfo-inozytydowego, za hormony klasy 5 i 6 za porednictwem cAMP.
PIMIENNICTWO
Cohen P: The role of protein phosphorylation in neural and hormonal control of oellular activity. Natur 1982;296:613.
Docherty K, Steiner D: Post-translational proteolysis in polypeptide hormone biosynthesis. Anrtu Rev Physiol 1982;44:625. Granner DK, Andreone T: Insulin modulation of gene expression. In: Diabetes and Metabolism Reviews. Vol I, DeFronzo R (editor). Wiley, 1985. Kahn CR: The molecular mechanism of insulin action. Annu Rev Med 1985;36:429. Kono T: Action of insulin on glucose transport and cAMP phosphodiesterase in fat cells: Involvement of two distinct molecular mechanisms. Recent Prg Horm Res 1983;30:519. Ullrich A et al: Human insulin receptor and its relationship to the tyrosine kinase family of oncogenes. Natur ]985;313:756. Unger RH, Orct L: Glucagon and the A celi. (2 parts.) N EnglJMed 1981;3O4:1518,1975.
CZ VI Zagadnienia wybrane Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w wodzie

53
vi.
WPROWADZENIE
Witaminy s organicznymi rodkami odywczymi niezbdnymi w maych ilociach do rnorodnych funkcji biochemicznych. W zasadzie zwizki te nie s syntetyzowane przez ustrj i dlatego musz by dostarczanez poywieniem. Pierwszymi odkrytymi witaminami byty rozpuszczalna w tuszczach witamina A oraz rozpuszczalna w wodzie witamina B. W miar poznawania nastpnych witamin okazao si, e s one rozpuszczalne albo w wodzie, albo w tuszczach. Ta waciwo (rozpuszczalno w wodzie 1ub w tuszczach) staa si podstaw klasyfikacji witamin. Wszystkie witaminy rozpuszczalne w wodzie nale (z wyjtkiem witaminy C) do grupy witaminy B. Witaminy rozpuszczalne w tuszczach, wykryte pniej ni witamina A, oznaczono dalszymi literami alfabetu (np. witamina D, E, K). Oprcz wsplnej cechy fizycznej, tj. rozpuszczalnoci w wodzie, witaminy tej grupy maj bardzo mao wspl nego z chemicznego punktu widzenia.
mniej niedobr okrelonej witaminy charakteryzuje si swoistym zespoem objaww. Wrd objaww chorobowych spowodowanych niedoborem witamin rozpuszczalnych w wodzie naley wymieni: a) chorob beri-beri (niedobr tiaminy), b) zajady, zapalenie jzyka, ojotok i wiatowstrt (niedobr ryboflawiny), c) pelagr (niedobr niacyny), d) zapalenie nerww obwodowych (niedobr pirydoksyny), e)
niedokrwisto megaloblastyczn, acyduri me-rylomalonow i niedokrwisto zoliw (niedo br kobalamin), f) niedokrwisto megaloblas-tyczna, (niedobr kwasu
foliowego), oraz g) szkorbut (gnilec niedobr kwasu askorbinowego). Niedoboru witamin mona unikn spoywajc rnorodne rodki spoywcze w do statecznych ilociach.
WITAMINY KOMPLEKSU B S KOFAKTORAMI REAKCJI ENZYMATYCZNYCH

Do witamin kompleksu B istotnych w ywieniu czowieka nale: 1) tiamina (witamina Bj), 2) rybofiawina (witamina B2), 3) niacyna (kwas nikotynowy, amid kwasu nikotynowego) (witamina B3), 4) kwas pantotenowy (witamina B s), 5) witamina B6 (pirydoksyna, pirydoksal, piry-doksamina), 6) biotyna, 7) witamina B!2 (koba-lamina) oraz 8) kwas foliowy (kwas pteroilo-glutaminowy). Poniewa witaminy tej grupy s rozpuszcza-
Brak lub wzgldny niedobr witamin w poywieniu s przyczyn charakterystycznych stanw niedoborowych i chorb. Rzadko spotyka si niedobr jednej tylko witaminy grupy B, poniewa dieta niedoborowa jest przyczyn wicloe/yiinikowych stanw niedoborowych. Nie-
694 / ROZDZIA 53
ne w wodzie, nadmiar ich jest wydalany z moczem. Tylko rzadko kumuluj si w ustroju osigajc stenia toksyczne. Z tych te przyczyn ich magazynowanie w ustroju jest ograniczone (z wyjtkiem kobalamin), co sprawia, e musz one by dostarczane regularnie.
TIAMINA
Tiamina skada si z pochodnej pirymidyno-wej i tiazolowej. S one ze sob poczone przez grup metylenow (ryc. 53-1).
H NH,
i
O"
0"
-o-p-o-p-o-II o c-s II o *C-CH,-*

C=C-CHi-CH3-OH
CH3
2,5-Dlmelylo4-Metylo-S-rrydrokay-etylotlazol 6-tilryml(!yna
w np. pirogronianu (ryc. 19-5). Tak powstay zwizek addycyjny ulega dekarboksylacji, usuwajcej CCV Reakcja ta jest katalizowana przez kompleks wieloenzymatyczny okrelany jako kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (szczegy p. rozdz. 19). Dekarboksylacja oksydacyjna a-ketoglutaranu do sukcynylo-CoA i C02 (p. rozdz. 18) jest katalizowana przez kompleks enzymatyczny, ktry jest strukturalnie podobny do kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej. Rwnie w tej reakcji difosforan tiaminy dostarcza stabilnego karboanionu. reagujcego z atomem wgla znajdujcego si w pozycji a a~keto-glutaranu. Difosforan tiaminy uczestniczy rwnie w dekarboksylacji oksydacyjnej kwasw ot-ketokarbok-sylowych pochodnych aminokwasw rozga zionych (rozdz. 32). Rola difosforanu tiaminy jako koenzymu w reakcjach katalizowanych przez transketolaz jest podobna do opisanej wyej w reakcjach dekarboksylacji. Brak tiaminy jest przyczyn choroby beri-beri i pokrewnych zespow niedoborowych U chorych z niedoborem tiaminy dochodzi do zablokowania lub znacznego ograniczenia reakcji zalenych od difosforanu tiaminy i.do akumulacji substratw tych reakcji, tj. pirogronianu, pentoz i pochodnych cc-ketokarbok-sylowych aminokwasw rozgazionych (leucyny, izoleucyny i waliny). Tiamina wystpuje prawie we wszystkich rolinach, a take prawie we wszystkich pokarmach pochodzenia zwierzcego, cho w niewielkich ilociach. Nierafinowane ziarna zb s dobrym rdem tej witaminy. Choroba beri--beri jest spowodowana spoywaniem diety bogato wglowodan owej i ubogotiaminowej, np. zoonej z polerowanego ryu lub innych wyso ce rafinowanych pokarmw (takich jak cukier i jasna mka) jako gwnych rodkw spoywczych. Wczesnymi objawami tej choroby s obwodowa neuropatia, wyczerpanie i brak apetytu. Z kolei ten ostatni jest przyczyn obrzkw oraz zmian zwyrodnieniowych w ukadzie sercowo-naczyniowym i nerwowym oraz miniach. Niedobr tiaminy jest rwnie przyczyn encefalopatii Wernickego. Wystpuje ona czsto u alkoholikw, spoywajcych mao innych pokarmw. Pewna surowa ryba zawiera termo-labilny enzym (tiaminaz) rozkadajcy tiami-n. Nie odgrywa ona jednak wikszej roli w normalnym ywieniu czowieka.
Ryc. 53-1. Tiamina. W czsteczce difosforanu tiaminy w miejscu grupy -OH znajduje si pirofos-foran (u gry).
Difosforan tiaminy jest aktywn postaci tiaminy Konwersj tiaminy do aktywnego difosforanu tiaminy (pirofosforanu tiaminy) katalizuje ATP-zalena difosfotransferaza tiaminowa wystpujca w tkance Mzgowej i wtrobowej (ryc. 53-1). Difosforan tiaminy jest koenzymem w reakcjach enzymatycznych przenoszcych aktywn grup aldehydow Wystpuj dwa rodzaje takich reakcji: pierwsza z nich jest reakcj dekarboksylacji oksydacyjnej a-ketokwasw (np. a-ketoglutaranu i pi-rogronianu lub cc-ketoanalogw leucyny, izo-leucyny i waHny), za druga reakcj katalizowan przez transketolaz (np. w szlaku pentozo-wo-fosforanowym). Wszystkie te reakcje ulegaj zahamowaniu przy niedoborze tiaminy. W kadej z tych reakcji difosforan tiaminy dostarcza reaktywnego atomu wgla w* piercieniu tiazo-lowym, przyjmujcy posta karboanionu, ktry nastpnie moe si poczy z grup karbonylo-
STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 695
YBOFLAWINA Ryboflawina skada si z piercienia izoalok-zyny poczonego z cukrem alkoholowym - rybitolem (p. ryc. 53-2). Jest to substancja barwna i fluoryzujca oraz wzgldnie oporna na ciepo, lecz rozkadajca si pod wpywem wiata. '
Aktywnymi postaciami ryboflawiny s: mononukleotyd f lawinowy (FMN) oraz dinukleotyd flawinowy (FAD) FMN powstaje drog ATP -zalenej fsfory-lacji ryboflawiny (ryc. 53-2). FAD jest wynikiem dalszej reakcji FMN z ATP, w ktrej AMP (pochodzcy z czsteczki ATP) ulega przeniesieniu na FMN (ryc. 53-3). FMN i FAD s grupami prostetycznymt enzymw a ksydo redukcyjnych Enzymy te s znane jako flawoproteiny. Grupy prostetyczne wizane s zwykle silnie, chocia nie kowakncyjnie ze swoimi apoproteina-mi. Wiele enzymw flawoproteinowych zawiera jeden lub wicej metali,""rap. molibden i elazo, bdcych istotnymi kofaktorami. Enzymy te s znane jako metaloflawoprotonry. Enzymy flawoproteinowe s szeroko rozpowszechnione. Ich przedstawicielami jest kilka wanych oksydoreduktaz uczestniczcych w metabolizmie ssakw. Wrd nich wymieni naley oksydaz a- aminokwasu w uczestniczc w deaminacji aminokwasw, oksydaz ksan-tynow biorca udzia w degradacji puryn,
dehydrogenaz aldehydow, uczestniczc w de gradacji aldehydw, mitochondrialn dehydro genaz gh'ceroIo -3-fosforanow, przenoszc r -
D-Rybllol
H,C
H,C
Fiawina
Ryc. 53-2. Ryboflawina. W czsteczce fosforanu ryboflawiny (mononukleotyd flawtnowy FMN) miejsce grupy -OH zajmuje fosforan.
wnowaniki redukujce z cytoplazmy do mito-chondriw, dehydrogenaz sukcynyJow

cykiu kwasu cytrynowego, acylo-oA, fl awoprotein elektrony uczestni1
dehydrogenaz przenoszc
D-Rybilol
NH J
Pl rafo sfo ran
Fiawina
Ryc. 63-3. Dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD).
696 / ROZDZIA 53
czc w utlenianiu kwasw tuszczowych, dehy-drogenaz dihydrolipoilow, uczestniczc w de-karboksyacji oksydacyjnej pirogronianu i a-ketoglutaranu oraz dehydrogenaz NADH bdc wan skadow acucha oddechowego w mitochondriach. Aktywno wszystkich tych enzymw jest upoledzona w niedoborze ryboflawiny. W roli koenzymw piercie izoaloksazyno-wy flawoprotein ulega odwracalnej redukcji tworzc zredukowan posta FMNH 2 iFADH2 (p. ryc. 13-3). Brak ryboflawiny jest przyczyn niegronego zespou niedoborowego Uwzgldniajc wielokierunkowe funkcje metaboliczne ryboflawiny jest zaskoczeniem, e niedobr tej witaminy nie prowadzi do powanych stanw gronych dla ycia. Niemniej w stanach jej niedoboru stwierdza si rnorodne objawy chorobowe, w tym zapalenie kcikw ust, pkanie i zuszczanie si warg, zapalenie jzyka, tojotok i wiatowstrt. Ryboflawina wytwarzana jest przez roliny i drobnoustroje, lecz nie przez ssaki. Drode, wtroba i nerki s dobrymi rdami tej witami ny. Ulega ona wchanianiu w jelitach za porednictwem reakcji fosforylacji-defosforylacji zachodzcej w bonie luzowej. Hormony (hormony tarczycy i ACTH), leki (chloropromazy-na jest inhibitorem kompetycyjnym) i czynniki pokarmowe wpywaj na konwersj ryboflawi ny do jej postaci kofaktorowych. Poniewa ryboflawina jest wiatoczua, niedobr jej moe wystpi u noworodkw z hiperbilirubinemi poddanych fototerajfifc NfACYNA Niacyna jest nazw generyczn (zwyczajow) dla kwasu nikotynowego i amidu kwasu nikotynowego. Obydwa te zwizki mog by rdem witaminy w poywieniu. Kwas nikotynowy jest kwasem monokarboksylowym pochodnym pirydyny (ryc. 53-4).
Aktywnymi postaciami niacyny s amid kwasu nikotynowego, dinukleotyd adeninowy (NAD) oraz fosforan dinukleotydu + nikotynamido--adeninowego (NADP ) Nikotynian jest postaci niacyny potrzebn do syntezy NAD+ i NADP + przez enzymy wystpujce w cytoplazmie wikszoci komrek. Dlatego te amid kwasu nikotynowego zawarty w pokarmach wpierw musi ulec deami-dacji do nikotynianu (ryc. 53-4). W cytoplazmie nikotynian ulega najpierw konwersji do dez-amido-NAD+ w reakcji z 5-fosforybozylo-l--pirofosforanem (PRPP), a nastpnie adenylacji z ATP. Nastpnie grupa amidowa glutaminy ulega przeniesieniu na reszt nikotynianu dez-amido-NAD. W wyniku tej reakcji powstaje NAD +. Ten ostatni moe ulec fosforylacji do NADP+. NAD i NADP s koenzymami licznych enzymw oksydoredukcyjnych Nukleotydy nikotynamidowe odgrywaj wan rol jako koenzymy wielu dehydrogenaz wystpujcych zarwno w cytoplazmie (np. dehydrogenaza mleczanw a), jak i w mitochondriach (np. dehydrogenaza jabczanowa). S one wanymi ogniwami licznych szlakw metabolicznych, wpywajcych na przemian wglowodanw, tuszczw i aminokwasw. Oglnie mona powiedzie, e dehydrogenazy wspdziaajce z koenzymem NAD katalizuj reakcje ok-sydoredukcyjne w szlakach oksydacyjnych (np, w cyklu kwasu cytrynowego), natomiast debyd-rogenazy lub reduktazy wspdziaajce z koenzymem NADP+ wystpuj czsto w szlakach metabolicznych zwizanych z syntez redukcyjn (np. szlak pentozofosforanowy). Mechanizm oksydoredukcji polega na odwracalnej addycji hybrydowego jonu H~ do piercienia pirydynowego oraz generacji wol nego jonu wodorowego (H +) (p. ryc. 13-5). Na przykad:
NAD + AH 2 < NADH + H + A
+ +
Ryc. 53-4. Synteza i rozkad dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD ). W fosforanie + dinuk-ieotydu nikotynamtdoadeninowego (NADP ) grupa 2'-hydroksylowa reszty adenozynowej jest fos-forylowana. U czowieka, lecz nie u kota, cae zapotrzebowanie na niacyn moe by pokrywane przez tryptofan, jeli dostarczany jest w dostatecznych ilociach z pokarmami. Normalnie z tego rda pochodzi f-niacyny. PRPP 5-fosforybozylo-l -pirofosforan, QPRT fosforybozylotransferaza chinolinianowa, PLP fosforan pirydoksalu.
NMcotynamid
-Poktrmy
N motyla mi Ikotyn amid (g wny metabolit w
moczu) 0 ^ ^
Mononukleotyd nikotynianu (NMN)
PPi
PRPP
O Chlnolinian
NH,
Aldehyd 2-amino-3-karboksy mukanawy
OH 3 - Hyd roksyantran II an PLP Kilka etapw (p. fyc. 32-19)
C Hi-C H- C O O " NH,
Adenina
DRyboza
HAD* P o karrr
698 / ROZDZIA 53
Brak niacynyjest przyczyn zespou niedoborowego okrelanego jako pelagra Objawami tego zespou chorobowego s: utrata wagi, zaburzenia trawienia, zapalenie skry, depresja i demencja. Niacyna wystpuje w wielu pokarmach pochodzenia rolinnego i zwierzcego. Przy ocenie wartoci niacynowej" pokarmw naley uwzgldni fakt, e aminokwas egzogenny (niezbdny) tryptofan moe ulec przeksztaceniu do NAD+ (p. ryc. 53-4). Z kadych 60 mg tryp-tofanu moe powsta 1 mg rwnowanika nia-eynowego. Dlatego te dla wywoania stanu
niedoboru niacyny spoyte pokarmy musz by ubogie zarwno w niacyn, jak i w tryptofan.
KWAS PANTOTENOWY Kwas pantotenowy jest wynikiem poczenia si kwasu pantoinowego z P-alanin (ryc. 53-5).
Kwas pantoinowy 0-Alanina
HaC OH
II H
0 ' II
O
II
HO-CH, -C-CH-C-N-CH,-CH,-C-OH Ryc. 53-5,

Kwas pantotenowy.
Takie warunki wystpuj u ludzi, dla ktrych gwnym poywieniem jest kukurydza. Oni wanie s naraeni na wystpienie pelagry. W kukurydzy niacyna jest obecna, lecz w postaci zwizanej jako niacytyna, niedostpna dla przemiany u czowieka. Tylko przez wstpn obrbk tych pokarmw zasadami mona uwolni biologicznie aktywn niacyn. Ludzie, dla ktrych gwnym poywieniem jest sorgo (proso afrykaskie), s rwnie naraeni na rozwj pelagry z powodu duej w nim zawartoci leucyny. Mechanizm niedoboru niacyny u osb spoywajcych gwnie sorgo polega na tym, e zawarte w nich due iloci leucyny hamuj
fosforybozylotransferaz eh inolinianow. tj. g -
wny enzym konwersji tryptofanu do NAD (patrz ryc. 53-4). Naley zauway, e fosforan pirydoksalu, bdcy aktywn postaci witaminy Bs, jest kofaktorem w szlaku syntezy NAD 4 " z tryptofanu (p. r,yc. 53-4), co sprawia, e niedobr witaminy B6 moe nasili niedobr niacyny. Innymi przyczynami pelagry mog by: podawanie lekw takich jak izoniazyd, zesp rakowiaka zoliwego, w ktrym tryptofan ulega przeksztaceniu w serotonin, oraz choroba Har-tnupw, w ktrej wchanianie tryptofanu jest upoledzone. Kwas nikotynowy (lecz nie amid kwasu nikotynowego) stosowano w celach leczniczych dla obnienia stenia cholesterolu w osoczu krwi. Mechanizm takiego dziaania kwasu nikotynowego polega na hamowaniu napywu wolnych kwasw tuszczowych z tkanki tuszczowej, co jest powodem spadku syntezy lipoprotein zawierajcych cholesterol, tj. VLDL, 1DL i LDL.
Aktywnymi postaciami kwasu pantotenowego s koenzym A (CoA) oraz biako przenoszce grupy acylowe (ACP) Kwas pantotenowy wchania si szybko w jelitach, po czym ulega fosforylacji przez ATP. W wyniku tej reakcji powstaje 4'-fosfopantote-nian (ryc. 53-6). Przez przyczenie cysteiny po jej dekarboksylacji czyli przez przyczenie tioe-tanolaminy powstaje 4'-fosfopanteteina, bdca grup czynn zarwno CoA, jak i ACP. Podobnie jak aktywne koenzymy bdce pochodnymi wielu innych witamin rozpuszczalnych w wodzie, tak i CoA zawiera nukleotyd adeninowy. Tak wic 4'-fosfopanteteina ulega adenylacji przez ATP, przy czym powstaje defosfo-CoA. Ostatnia fosforylacja przez ATP polega na przyczeniu reszty fosforanowej do grupy 3'--hydroksylowej rybozy. W wyniku tej reakcji powstaje CoA (ryc. 53-6). Grupa tiolowa dziaa jako przenonik grup acylowych zarwno w CoA, jak i ACP CoA jest przeno nikiem grup acylowych w reakcjach cyklu kwasu cytrynowego, utleniania i syntezy kwasw tuszczowych (patrz str. 251 i 261) oraz w reakcjach acetylacji (np. lekw) i syntezy cholesterolu. ACP uczestniczy w reakcjach syntezy kwasw tuszczowych. Powszechnym zwyczajem jest skrtowe przedstawianie struktury wolnej (zredukowanej) postaci CoA jako CoA-SH, dla podkrelenia, e grupa SH jest grup reaktywn. Niedobr kwasu pantotenowego wystpuje rzadko Przyczyn tego jest fakt obfitego wystpowania kwasu pantotenowego w pokarmach, szczeglnie w tkankach pochodzenia zwierzcego,
STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUS ZCZA LNYCH W WODZIE / 699

ATP ADP
Pantotenlan
H3C OH O i I II H CH,-C-CH C-N-CH5-CH5 COO" O H,C 0 = P O" I 4-Fosfoparrtotenian

ATP Cyst I na
ADP + P, H-.C I OH I O II H O II H COO~ I
CH !-C-CH-C-N-CH i,-CH !-C-N-CH-CH !-SH 0 H3C

= P -0 ~ 1 4Rwtopantoenylocystslna
H,C OH O 0 I I I l u II H CH 2-C -CH- C-N -CH 2 -CH 2 -C-N -CH s-C H j- SH O H,C
= P O"
4 - Foaf opantste I na ATP
ACP
r
PP
V H
CH
/
ATP AOP
0-Alanina OH OH Kwas Dotosfokoanzym A
Me rkaploetano amlna
pantolnowy PlrofoAdenina II H
CH HaC OH O II
sforan
Ry b ozo -3-fosforan
Koenzym A Ryc. 53-6. transportujce Synteza koenzymu A z kwasu pantotenowego. ACP biako grupy acylowe.
700 / ROZDZIA 53
w niepolerowanych ziarnach zb oraz w rolinach strczkowych. Niemniej opisano zesp palcych ng u jecw wojennych, ktry ma by spowodowany niedoborem kwasu pantotenowego. Zesp ten charakteryzuje si zmniejszon sprawnoci procesw acetylacji wystpujc u tych chorych,
c
HOi H3CI
H -C HjO H
H Plrydoksal -ATP
WITAMINA Bs
Witamina B6 skada si z trzech blisko ze sob spokrewnionych pochodnych pirydyny, tj. piry-(toksyny, pirydoksalu i pirydoksaminy (ryc. 53-7) oraz fosforanw wymienionych zwizkw.
Knaza plrydoksalowa
ADP
CHÔH
C- H
CH
,p
HO-r ^^> ^MjJ H C -1 ^.+<J
Y II
o1
.r Un
o-
HO - t f ^ s p H 3C-^+^ N
H
0H
-rr^>|-CHjOH N
H
H Fosforan plrydoksaly
H3 C
Pirydoksyna
Plrydoksal
OH
Ryc. S3-8. Fosforylacja pirydoksalu przez kinaz pirydoksalow. w wyniku ktrej powstaje fosforan pirydoksalu.
Am 1 n ot ra n sTeraza
H CL+^J
N H Pirydoksamina
R C COOH Aldolaza ---------- ^*s (reonlnowa
s 1 ^^
Ryc. 53-7. Naturalne postacie witaminy Bg
ig ------- Dekarboksylaza II C - H
Z wymienionych zwizkw pirydoksyna, fosforan pirydoksalu oraz fosforan pirydoksaminy s gwnymi przedstawicielami witaminy B6 Ryc. 53-9. Wizania kowalencyjne sc -aminokwaktre mo g sta si reaktywne po zwizaniu zawartymi w poywieniu. Wszystkie trzy wy- su, z enzymami swoicie wspdziaajcymi z fosfora mienione zwizki wykazuj tak sam aktywno nem pirydoksalu. _____ biologiczn.
Ryc. 53-10. Rola koenzymu fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji a-aminokwasu. W pierwszej fazie dochodzi do wytworzenia ot-ketokwasu (pochodnego a-aminokwasu) oraz kompleksu fosforan pirydoksaminy apoenzym, po czym zachodzi odwrotna reakcja, tj. aminacja no wego at-ketokwasu (jako substratu) Naley zauway, e fosforan pirydoksalu wie si ze swoim apoenzymem za porednictwem zasady Schiffa (utworzonej przez grup e - amino w reszty lizyny apoenzymu i grup aldehydow pirydoksalu) oraz wizania jonowego (utworzonego przez grup fosforanow koenzymu z apo"enzymem). Grupa ac- aminowa aminokwasu substratowego wypiera grup e - aminow lizyny tworzc now zasad Schiffa.

Fosforan plrydoksalu apoenzym N-Apoenzym
aAminokwas (jako subslral)
^.r. rncr
a Aminokwas (jako produkt)
aKetokwas (Jako produkt)
CH Fosforan plrydo ksamlny enzym
702 / ROZDZIA 53
Aktywn postaci witaminy Be jest fosforan pirydoksalu Wszystkie postacie witaminy B 6 ulegaj wchanianiu w jelitach chocia pewna ilo estrw fosforanowych wymienionych zwiz kw ulega rozkadowi hydro litycznemu w procesie trawienia pokarmw. Gwn postaci witaminy Bfi w osoczu krwi jest fosforan pirydoksalu. Wikszo tkanek zawiera enzym ki-naz pirydoksalow katalizujc fosforylacj (za pomoc ATP) niefosforylowanej postaci tej witaminy do odpowiednich estrw fosforanowych (ryc. 53-8). Chocia fosforan pirydoksalu jest gwnym koenzymem reprezentujcym aktywno witaminy B, tak sam funkcj moe rwnie spenia fosforan pirydoksaminy. Fosforan pirydoksalu jest koenzymem da kilku enzymw przemiany aminokwasowej Tworzc zasad Schiffa (powsta przez poczenie si grupy aldehydowej z grup aminow a-aminokwasu) (ryc. 53-9) fosforan pirydoksalu moe uatwi wystpienie zmian w zakresie pozostaych trzech wiza wgla a-aminowego, tj. moe umoliwi a) transami nacj, b) dekar-boksylacj (p. ryc. 33-9) lub te c) aktywno aldolazow (ryc. 32-11). Rol fosforanu pirydoksalu w procesie transaminacji przedstawia ryc. 53-10. Fosforan pirydoksalu uczestniczy rwnie w glikogenolizie Koenzym ten jest integraln czci mechanizmu dziaania fosforylazy, enzymu biorcego udzia w rozkadzie gjikogenu (str. 220). W dziaaniu tym koenzym-ten na pocztku rwnie tworzy zasad Schiffa z grup e-arainow jednej reszty lizynowej fosforylazy, ktra jednak nie ulega zmianie przez czas trwania fosforolizy wizania glikozydowego 1 ->4, w wyniku ktrej powstaje glukozo-1-fosforan. Fosforylaza mini szkieletowych zawiera 7080% oglnou-strojowej iloci witaminy Ba. Niedobr witaminy B6 moe wystpi u kobiet w czasie laktacji, u alkoholikw oraz podczas leczenia izoniazydem Izolowany niedobr witaminy B6 spotyka si rzadko. Niedobr taki jest zwykle czci niedoboru wielowitaminowego witamin grupy B. Dobrymi rdami tej witaminy s: wtroba, makrela, owoc awokado, banan, miso, jarzyny
i jajka. Moliw przyczyn niedoboru witaminy B6 u dzieci moe by karmienie ich piersi przez matki, ktrych zapasy witaminy BB ulegty wyczerpaniu w nastpstwie dugotrwaego zaywania doustnych lekw antykoncepcyjnych. Rwnie alkoholicy mog wykazywa niedobr witaminy B6 spowodowany przemian etanolu do aldehydu octowego, stymulujcego hydroli z fosforanu pirydoksalu lub pirydoksaminy. Niedobr witaminy B6 moe by rwnie spowodowany izoniazydem szeroko stosowanym lekiem przeciwgruliczym tworzcym hydrazon z pirydoksalem (ryc. 53-11).
H O C H ,
Izonlkotynlan hydrazyny
Reakcja spontaniczna HO CH3
*>c-,-=.-O
\=/ II H I \_J/
Hydrazon pirydoksalu Ryc. 53-11. Powstawanie hydrazonu pirydoksalu (szybko wyda la nego z mo czem) z pirydo ksalu i izonikotynianu hydrazyny (izo niazydu).
BIOTYNA Biotyna jest pochodn imidazolow zawart w licznych naturalnych rodkach ywnociowych (ryc. 53-12). Poniewa znaczn cz
O
II
H-N I H-CI HS C, Ryc. 53-12. Biotyna.
N-H
I CH (CHjhCOOH
-C-H
STRUKTURA I FUNK CJA WIT AMIN ROZP US ZCZALNYCH W WODZIE / 703
zapotrzebowania czowieku na biotyn pokrywa

synteza
jelitowe, niedobr jej nie jest spowodowany niedostateczn poda tej witaminy w pokarmach, lecz defektami w zakresie jej wykorzystania. Biotyna jest koenzymem karboksylaz Biotyna jest skadow swoistych enzymw, zoonych z wielu podjednostek (tab. 53-1), katalizujcych reakcje karboksyjacji. Jon kar-boksylowy ulega przyczeniu do atomu N1 w piercieniu biotyny, przez co powstaje aktywny zwizek poredni karboksybiotyna-enzym (ryc. 53-13). Ten etap wymaga obecnoci
Enzym Rola Tabela 53-1. Enzymy biotynozaiezne wystpujce u zwierzt
tej
witaminy
przez
drobnoustroje
HCO;, ATP, Mg2 + i acetylo-CoA (jako efekto-ra allosterycznego). Z kolei aktywowana grupa karboksylowa ulega przeniesieniu na substrat reakcji np. na pirogronian. Spoywanie surowych jaj moe by przyczyn niedoboru biotyny Biako jaj zawiera termolabilne biako awi-dyn mocno wice biotyn, uniemoliwiajc wchanianie tej witaminy przez jelita, co z kolei moe by przyczyn jej niedoboru. Wrd objaww niedoboru biotyny naley wymieni depresj, halucynacje, ble miniowe i zapalenie skry. Brak enzymu syntazy bolokarboksylazowej katalizujcego przyczenia biotyny do reszty lizyny apoenzymu karboksylazowego, moe by rwnie przyczyn objaww niedoboru? witaminy B6 oraz gromadzenia si w ustroju substratw enzymw biotynozalenych. Substraty te mona wykry w moczu. Wrd tych ostatnich naley wymieni mleczan, (J-metylokrotonian, p-hydroksy-izowalerian oraz p-hydroksypropionian. U niektrych dzieci z niedoborem ww. enzymu wystpuj choroby zwizane z niedoborami immunologicznymi. WITAMINA B12 Witamina B12 wykazuje zoon struktur piercieniow (piercie korynowy), podobn do piercienia porfiry nowego, w rodku ktrej znajduje si jon kobaltu {ryc, 53-14). Wytwarzana jest wycznie przez drobnoustroje. Tak wic nie wystpuje ona w rolinach, jeli nie s
Karboksylaza piro-gro nianowa
Katalizuje pierwsz reakcje w szlaku metabolicznym przeksztacajcym prekursory trj- wglo we w gluko z (gluko -neogeneza) Dostarcza reszty octanowe do syntezy kwasw tuszczowych katalizujc powstawanie ma-lo nylo-CoA Przeksztaca propio nian do bursztyn ian u, ktry nastpnie wchodzi do cyklu kwasu cytryno wego KataboMzm leucyny i pewnych zwizkw izoprenoido wych
Karboksylaza acetyle-Co A
Karboksylaza pro-pio nylo-CoA
Karboksylaza fi-me-tylokrotonylo -CoA
o II O-P-Cf o
I
o
II HW
ATP+HCOa"
ADP Bezwodnik kwasu w g I owo-f osf ro weg o
HC HCH NH CH ------I H C- ( C Hj) ,

Blotyna -enzym
P,
0=C li'
"NH
y
^
l
HC -------- CH HCH HC-ICH J U
i c =o
c=o
Kompleks karboksy-blotyna enzym
|ENZYM - NH|
IENZYM - NH|
Ryc. 53-13. Po wstawa nie ko mpleksu karbo ksybiotyna - enzym. Udzia tego ko mpleksu w pro cesie karbo ksylacji pirogronianu p. ryc. 21 -1.
704 / R 0ZD21A 53
(W Ui-CONH, CH a
CH2
1"*
trobie, co jest zjawiskiem wyjtkowym dla witaminy rozpuszczalnej w wodzie, w postaci zwizanej z transkobalamin.
CONH3
\l/\
Aktywnymi koenzymami witaminy B, a s metylokobalamina i deoksyadenozylokobalamina Z krwi kobalamina zostaje uwolniona i przeniesiona do cytoplazmy jako hydroksykobala-mina. W cytoplazmie nastpuje jej konwersja do metylokobalaminy, albo te witamina wnika do mitochondriw, gdzie ulega konwersji do 5'--deoksy adenozy lokobal aminy. Deoksykobalamina jest koenzymem w procesie konwersji metylomalonylo-CoA do sukcynylo-CoA (ryc. 53-15) Jest to gwna reakcja w szlaku konwersji propionianu do metabolitu cyklu, kwasu cytrynowego. Dlatego te reakcja ta ma znaczenie dla procesu glukoneogenezy. Jest ona szczeglnie wana u przeuwaczy, poniewa propionian jest gwnym produktem fermentacji, zapocztkowanej przez drobnoustroje w waczu, Metylokobalamina jest koenzymem w sprzonej konwersji homocysteiny do metioniny oraz metylotetrahydrofolianu do tetrahy* drofolianu (ryc. 53-15) W tej reakcji grupa metylowa, zwi zana z kobalamina, zostaje przeniesiona na homo-cysteine, przez co powstaje metionina, po czym kobalamina zabiera grup metylow z N5-mety-lotetrafolianu. W wyniku tej ostatniej reakcji powstaje tetrahy drofolian. Korzyciami tej reakcji s: tworzenie zapasw metioniny oraz udostpnienie tetrahydrofolianu do syntez puryn i pirymidyn oraz kwasw nukleinowych. Niedobr witaminy B1a jest przyczyn niedokrwistoci megaloblastycznej Blok wchaniania witaminy B12 spowodowany
brakiem czynnika wewntrznego (np. gastrek-tomi), jest przyczyn niedokrwistoci zoliwej.
H3C
'
H3C
Ryo. 53-14. Witamina B12 (kobalamina). R moe by rne warunkujc powstawanie poszczegl-: nych postaci witaminy, np. przy R = CN powstaje cyjanokobalamina, przy R = OH hydroksykoba-lamina. przy R = r 5 -deoksyadenozylo 5'-deok-syadenozylokabaamina, za przy R = CH3 mety-lokobalamina.
zanieczyszczone drobnoustrojami. U zwierzt witamina B]2 jest magazynowana w wtrobie, gdzie wystpuje pod postaci metylokobalami-ny, adenozylokobalaminy i hydroksykobalami-ny. Wtroba jest wic dobrym rdem witaminy B12, podobnie jak drode. Preparaty handlowe zawieraj cyjanokobalaminc. Do wchaniania witaminy B,a w jelitach niezbdny jest czynnik wewntrzny W procesie wchaniania witaminy B12 porednicz receptory umiejscowione w nabonku jelita biodrowego. Etapem wstpnym i niezbdnym w tym procesie jest wizanie witaminy B 12 przez czynnik wewntrzny wydzielany przez komrki okadzinowe odka. Po absorpcji, witamina B12 ulega zwizaniu przez biako osocza, zwane transkobatamin if, i przeniesieniu do tkanek. Witamina ta jest magazynowana w w-
Na niedobr witaminy B12 naraeni s rwnie jarosze, poniewa witamina ta zawarta jest tylko w pokarmach pochodzenia zwierzcego lub w pokarmach rolinnych zanieczyszczonych drobnoustrojami. Niedobr taki jest przyczyn upoledzenia reakcji katalizowanej przez syn-taz metioninow. Niedokrwistoc jest nastpstwem upoledzonej syntezy DNA, co znajduje
STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W WODZIE / 705

SH 1
- ' r
1 H C NH3+
H C NH COCr Metlonlna
cocr
Homocystelna
SYNTAZA METI ONI NOW A
Matyl oko balami na B,,
"-s
Tetfafolian C H2-C O O "
Metyla-tetralolian
Hyd ra ksyKo ba lam i na
CH, H-C-C OO" I c _ S - CoA

B
1 2
i2------------------ H C H" Deoksyadnozyloko baam Ina -- I --------------------------------------------- C - S Co A
MUTAZA METYLO- j MALONYLO-CoA L M etylom alonylc CoA Su kcy nyloCoA
Ryc. 53-15. Dwie wa ne r eakcje kat alizow ane pr zez enzym y zal ene od koenzym u B 12 -
swoje odbicie w strukturze jder erytroblastw. Z kolei upoledzona synteza DNA jest spowodowana zmniejszon produkcj zasad puryno-wych i pirymidynowych uwarunkowan niedoborem tetrahydrofolianu. Ten ostatni jest nastpstwem zablokowania roli folianu jako donora grup metylowych (folian jest wyapywany do syntezy metylotetrahydrofolianu; proces ten okrelany jest jako puapka folianowa") (p. ryc. 53-15). W niedoborze witaminy B)3 moe wystpi homocystynuria i acyduria metylo-malonowa. Zaburzenia neurologiczne, wystpujce w niedoborze witaminy B12, mog by nastpstwem wzgldnego niedoboru metioniny. Opisano cztery rodzaje wrodzonych zabu rze przemiany kobalaminy. Dwa z nich dotycz, tylko syntezy deoksyadenozylokobalaminy, w pozostaych dwch chorzy nie s zdolni do syntezy albo deoksyadenozylokobalaminy, albo metylokobalaminy.
Kwas foliowy albo folian skada si z zasady pterydynowej, poczonej z jedn czsteczk kwasu p- ani ino benzoesw ego (PABA) i kwasu glutaminowego (ryc. 53-16). Zwierzta pozbaPABA
COCT Kwas
OH PtwytJyna
glutaminowy
Reszta ptera iowa (kwas pierolnowy)
Kwas foliowy Ryc. 53-16. Str ukt ur a i num er acja at om w kw asu fol i ow ego.
KWAS FOLIOWY
Folacyna jest nazw klasy zwizkw, do ktrych nale kwas foliowy i pokrewne substancje wykazujce aktywno biochemiczn kwasu foliowego.
45
wion s zdolnoci syntezy PABA oraz poczenia glutaminianu z kwasem pteroinowym, co sprawia, e s one zalene od dostawy folianu z pokarmami. Gwnymi rdami folianu s drode, wtroba i jarzyny liciaste. W ro -
706 / ROZDZIA 53
linach kwas foliowy wystpuje jako koniugat wieloglutaminianowy. Jego acuch polipepty-dowy skada si z 7 reszt glutami ni ano wy ch poczonych ze sob w pozycji y. Gwnym folianem wtroby jest koniugat pentaglutamy-lowy. Aktywn postaci foliami jest tetrahydrofolian (H 4 -folian) Pochodne folianu zawarte w pokarmach s rozszczepiane do mo no glutamyl o folianu pod wpywem swoistych enzymw jelitowych, a dopiero nastpnie absorbowane. Wikszo tego zwizku ulega redukcji do tetrahydrofolianu w komrkach jelitowych (ryc. 53 -17) przy udziale reduktazy folianowej oraz NADPH jako donora rwnowanikw redukujcych. Aktywnymi koenzymami w tkankach s prawdopodobnie poliglutaminiany tetrahydrofolianowe. Tetrahydrofolian (H -folian) , jest nonikiem aktywnych grup' jednowglowych Grupami jedno wglowy mi przenoszonymi przez H4-folian, a odznaczajcymi si rnym stopniem utlenienia s: grupa metylowa, metylenowa, metenylowa, fonnylowa i formiminowa. Wszystkie one mog ulec przeksztaceniu z jednej postaci w drug (ryc. 53-18). Seryna jest gwnym rdem grup jednowglowych, mianowicie grupy metylenowej. Po przeniesieniu jej na H4-folian powstaj glicyna i N5-, Nl6-metyle-DO-H4-foian, odgrywajcy gwn rol w przemianie grup jednowglowych. Moe on ulec redukcji do Ns-metylo-H4-folianu, odgrywajcego wan rol w metylacji homocysteiny do metioniny. W reakcji tej uczestniczy metylo-kobalamina jako kofaktor (patrz ryc. 53-15). Grupa metylenowa N!, N10-metyleno-H4-folia-nu moe rwnie ulec utlenieniu. W wyniku takiej reakcji powstaje N!, N10-metenylo-H4--folian, ktry moe ulec hydratacji do N10--formylo-H4-folianu lub N5-formylo-H4-foliaiui. Ten ostatni jest rwnie znany jako kwas fnlino-wy. Jest on postaci trwa, nadajc si do doustnego podawania, zredukowanego folianu. H4-folian aktywnie uczestniczy w przemianie htstydyny. Produktem jej rozpadu jest kwas formiminoglutaminowy (Figlu), ktrego grupa formiminowa moe ulec przeniesieniu na H4--folian tworzc N5-formimino-H4-folian. W niedoborze folianu stwierdza si nadmierne powstawanie Figlu po doustnym obcieniu his-tydyn.
OH Kwas to I Iowy
HN
NADPH + H REDUKTAZA FOLIANOWA
NADP
I H*N Y
Tfyrnetoprym Metotreksal OH
Kwas dihydrafotlowy
Kwas tetrahydrolollowy Ryc. 53-17. Redukcja przez reduktaz folianow kwasu foliowego do dthydrofoiowego i kwasu dihydrofoliowego do tetrahydrofoli owego. Trymetoprym jest swoistym inhibitorem reduktazy folianowej bakterii Gram-ujemnych, natomiast ma tylko may wpyw na ten enzym u ssakw. Dlatego uywany jest jako lekprzeciwbakteryjny. Metotrek sat {ametopteryna) wie si silniej z wymienionym enzymem i stosowany jest jako lek przeciwnowotworowy. ___________ j __________________
Niedobr folianu jest przyczyn niedokrwistosci megaloblastycznej Przyczyna* niedokrwistoci u chorych z niedoborem folianu jest podobna do wystpujcej w niedoborze witaminy B1Z. Ns, Ni0-metyleno--H4-folian jest rdem grup metylowych niezbdnych do syntezy tymidylanu. ten ostatni z kolei jest prekursorem niezbdnym w syntezie DNA i erytropoezie (ryc. 53-19). Rwnolegle

Metlonlna Homocystelna Niedobr witaminy B
Seryna Gllcyna
J
NADH + H+
NAD*
Fosforan plrydoksalu
| 1 N?
H
1
t
N, * -mtyteno -H4-tollan
H,-tollan
-O ATP
NADP+
-ADP + P, Mrwczan
NADPH
J
H
Niedob; witaminy B,, iub tolianu
Synteza DNA
-HS O
NH4
CH2
N'
^C H;.
N -mat9nylo-H,-follan N'-form Imlno- ^-lol lan N -Tormylo-H,-follan ^L - g l u t a m l n l a n Niedobr flianu H4 -foHan N-)o rm im Inog I uta ml n lan (Figlu) p. ryc 33-3 L-Hlstyd yna NMormyto-H^follan (kwas toIInowy)
1D
10
Ryc. 53-18. tnterkonwersje grup jednowgiowych przyiczonych do tetrahydrofolianu.
7 0 8 / R O Z D ZI A 5 3 Seryna
H,-folian V Metotreksat H E D U K TA ZA I ^ ^ F F 0 L W N O W A | ^ 7\ H
iT YNfK
H" Dlhydrofollan
H,C , N -rrtetyleno-H,-foian
1B
SYNTAZA TYMIDYLANOWA
ii/ y-daoksyurydylan (dUMP)

5 10
OH H 2- dao ksytymi dyl an (dTMP}
Ryc. 53-19. Transfer grupy metylenowej z N , N -metyleno-H 4 -folianu do deoksyurydylanu, W wyniku tej reakcji po wstaje deo ksytymidylan i dihydrofolian (H 2 -fo(ian).
z redukcj grupy metylenowej do metylowej zachodzi oksydacja H4-folianu do dihydrofolia-nu. Ten ostatni musi ulec redukcji do H4 --foliami, by mg ponownie uczestniczy w ww. reakcji. Ten fakt tumaczy szczegln wraliwo komrek syntetyzujcych tymidyan (niezbdny do syntezy DNA) na inhibitory reduktazy folianowej, takie jak metotreksat (ryc. 53-17 i 53-19). KWAS ASKORBINOWY (WIT AM INA C) Struktura kwasu askorbinowego (ryc. 53-20) przypomina struktur glukozy, z ktrej po wstaje witamina C u wikszoci ssakw (ryc. 22-3). U niektrych naczelnych natomiast, w tym i u czowieka oraz u licznych gatunkw zwierzt (np. u winki morskiej, niektrych gatunkw nietoperzy, ptakw, ryb i bezkrgowcw), brak oksyda^y L-gulonolaktonowej uniemoliwia tak syntez.
Aktywn witamin C jest sam kwas askorbinowy, ktry jest donorem rwnowanikw redukujcych w pewnych kluczowych reakcjach Kiedy kwas askorbinowy dziaa jako donor rwnowanikw redukujcych, sam ulega utlenieniu do kwasu dehydro a skr binowego. Ten ostatni moe by rdem witaminy C. Kwas askorbinowy jest substancj redukujc o potencjale wodorowym wynoszcym +0,08 V, przez co jest zdolny do redukcji takich zwizkw, jak tlen czsteczkowy, azotany i cyto-chrom a i c. Mechanizm-dziaania kwasu askorbinowego w wieJu reakcjach nie zosta jeszcze wyjaniony. Z lepiej udokumentowanych pro cesw wymagajcych obecnoci kwasu askorbinowego wymieni naley nastpujce: Hydroksylacj proliny w syntezie kolagenu (p. rozdz. 59 i ryc. 30-i i), ___ . __ Degradacj tyrozyny utlenienie p-hydroksyfenylopirogFoniaaw do homogentyzynianu wymaga obecnoci witaminy C, dla utrzymy wania miedzi w postaci zredukowanej, tj. w for-
S TR U K TU R A I FU N K C JA W I TA M I N R O ZP U S ZC ZA LN Y C H W W O D ZI E / 7 0 9 Enzym oksydaza L gulonolaktonowa nie wystpuje u
C=O
[2H]
naczelnych, winkt morskiej Ud. HO-C-H I CH2OH CH2OH Gulonolakton Ry c. 53 -20 . K w as askor bi now y, j ego poch odze ni e u ni enacz el nych i j ego utl eni eni e do kw asu dehydroaskor b i nowego. P o j onizacji jest r d em anionu askor bini anow ego. Kwas askorbinowy Kwas dehydroaskorbinowy
mie maksymalnie aktywnej (ryc. 32-13). Kolejny etap przemiany fenyloalaniny jest katalizowany przez 1,2-dioksygenaz homogentyzynia-now, tj. przez enzym zawierajcy jon elazawy i wymagajcy rwnie obecnoci kwasu askorbinowego. 3. Syntez adrenaliny z tyrozyny na etapie dziaania p-hydroksylazy dopaminowej. 4. ania 7 a-hydroksyiazy. Syntez steroidw w korze nadnerczy. Ko ra nadnerczy zawiera due iloci witaminy C, ktre szybko znikaj w razie pobudzenia gru czou hormonem ad renokortyko tropowym. Przyczyna tego zjawiska nie jest jasna, chocia wiadomo, e w steroid o genezie wystpuje kilka etapw o charakterze redukcyjnym. Wchanianie elaza w przewodzie pokar mowym. Ulega ono znacznemu nasileniu w obe cnoci witaminy C. Dziaanie antyoksydacyjoe. Rozpuszczal na w wodzie witamina C moe dziaa jako antyoksydant i hamowa powstawanie nitrozoamin w czasie procesu trawienia. Niedobr witaminy C jest przyczyn gnilca (szkorbutu) Szkorbut jest klasycznym zespoem chorobowym wywoanym niedoborem witaminy C. Jest on spowodowany upoledzon syntez kolagenu, przejawiajc si krwawieniami podskr-
nymi i do innych narzHw, osabieniem mini, obrzkiem dzise oraz chwiejcymi si zbami. Zespl ten ulega wyleczeniu po duszym spoywaniu wieych owocw i wieych jarzyn. Normalne zapasy ustrojowe pokrywaj zapo trzebowanie na witamin C na okres 3-4 miesicy, co sprawia, e objawy gnilca pojawiaj si dopiero po kilku miesicach spoywania pokarmw pozbawionych kwasu askorbinowego.
PIMIENNICTWO
Bekovic SJ: On the mechanism of action of folate and biopterin-requiring enzymes. Annu Rev Biochem , 1980:49:227. Olson RE et a! (editors); Present Knowledge in Nutrition, 5th ed. The Nutrition Foundation, Inc, 1984. Passmore R, Eastwood, MA: Human Nutrition and Dietetks, Churchill Liyingstone, 1986. Rivlin RS: Hormones, drugs aad riboflavin. Nutr Rev 1979;37:241. Rosenberg L: Disorders of propionate, methylmalonate, and cobalamin metabolism.âgcs 474-497 in: The Metaboic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Rubin RH, Swartz MN: Trimethroprim-sulfamethoxazolc. Af Engl J Med 1980;303:426. Sebrell WH Jr: History of pellagra. FedProc 1981;40t 1520. Seetharam B, Alpers DH: Absorption and transport of cobalamin (vitamin B^). Annu Rev Nutr 1982; 2:343.
54
WPROWADZENIE
Struktura i funkcja witamin rozpuszczalnych w tuszczach

Peter A. Mayes, PhD, Dsc
Witaminy rozpuszczalne w tuszczach (lipidach) s czsteczkami apolarnymi, hydrofobowymi, pochodnymi izoprenu (ryc. 54-1). Nie s one syntetyzowane w dostatecznej iloci w ustroju czowieka, dlatego te musz by dostarczane z pokarmami. Warunkiem sprawnego wchaniania tych witamin z przewodu pokarmowego jest prawidowe wchanianie tuszczw. Po absorpcji witaminy te transportowane s we krwi, podobnie jak inne apolarne lipidy, za porednictwem lipo protein lub swoistych biaek nonikowych. Witaminy rozpuszczalne w tuszczach speniaj rnorodne funkcje np. witamina A uczestniczy w procesie widzenia, witamina D w przemianie wapniowej i fosforanowej, witamina E jest antyok-sydantem, za witamrra K uczestniczy w procesie krzepnicia krwi. Pomimo e witamin D (cholekalcyferol) kiedy zaklasyfikowano do tej grupy zwizkw, w rzeczywistoci nie jest witamin, tcz
hormonem.
H,C
I
C CH;
H Ryc. 54-1. Dwa sposoby przedstawienia jednostki izop ren owej.
czyna kurzej lepoty (hemeralopia) i suchoci spojwek (xerophtalmia), niedobr witaminy D krzywicy u dzieci i osteomalacji u dorosych, niedobr witaminy E objaww neurologicznych i niedokrwistoci (u dzieci), niedobr witaminy K (spotykany jest bardzo rzadko u dorosych) krwawie i krwotokw u noworodkw. Ze wzgldu na moliwo magazynowania w ustroju nadmiaru witamin rozpuszczalnych w tuszczach mog wystpi objawy zatrucia, np. po przedawkowaniu witaminy A lub D. Niektrym witaminom, np. witaminie A i p-karotenowi (jest to prowitamina A) przypisuje si waciwoci zapobiegajce rozwojowi raka.
Ze wzgldu na swj charakter lipidowy, zaburzenia w zakresie trawienia i wchaniania tuszczw, manifestujce si wydalaniem stolcw tuszczowych (steatorrkea) mog by przyczyn niedoboru witamin rozpuszczalnych w tuszczach. Wrd przyczyn tych zaburze wymieni naley m.in. stany upoledzonego wytwarzania lub wydalania ci. Niedebr tych witamin w pokarmach jest przyczyn wypadnicia ich funkcji. I tak niedobr witaminy A jest przy-
WITAMINA A
Witamina A lub retinol jest zwizkiem poli-izoprenoidowym posiadajcym piercie cyk-loheksenowy (ryc. 54-2). Witamina A jest nazw zwyczajow odnoszc si do zwizkw pochodzenia zwierzcego, wykazujcych aktywno biologiczn witaminy A. Nale do nich retinol, kwas rcttnolnwy oraz retinal. TyJko retinol wykazuje pen aktywno witaminy A, pozostae dwa zwizki wykazuj niektre, cho
STRUKTURA t FUNKCJA WiTAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TUSZCZACH / 711

CH3 CH3
CH3
A nie jest cakowita, (-karoten wykazuje tylko aktywnoci retinolu (tj. 1 ug retinolu jest rwnowany 6 wg P-karotenu).
CH2OH
CH3 Ryc.
54-2. Retinol
{witamina A).
nie wszystkie, jej waciwoci biologiczne. Pod pojciem retinoidw naley rozumie naturalne postacie oraz analogi syntetyczne retinolu. Prowitamin witaminy A jest (karoten W jarzynach witamina A wystpuje pod postaci prowitaminy tj. p -karotnu. Jest to hy barwnik zoony z dwch czsteczek retinalu poczonych ze sob za porednictwem grup aldehydowych umiejscowionych na kocu acucha wglowego tych zwizkw (ryc. 54-3). Poniewa konwersja p -karotenu do witaminy
ftetlnol (witamina A)
Trawienie witaminy A towarzyszy trawieniu lipidw, po czym witamina A ulega transformacj om w bonie luzowej jelit Estry retinolu rozpuszczone w tuszczach pokarmowych ulegaj zawieszeniu w kroplach ci i hydrolizie w wietle jelita, a nastpnie dopiero wchaniane s przez nabonek jelitowy. Spoyty P-karoten moe ulec rozszczepieniu oksydacyjnemu przez dioksygenaz p-karoteno-v/ (ryc. 54-3). W procesie rozszczepienia potrzebny jest tlen czsteczkowy. Proces ten nasila obecno soli kwasw ciowych. W nastpstwie rozszczepienia p-karotenu powstaj dwie czsteczki aldehydu retinowego (retinalu). W bonie luzowej jelita retinal zostaje zredukowany do retinolu przez swoist reduktaz retina-
Ryc. i jego retinalu
54-3. |.i-Karoten rozpad do (aldehydu
DIOKSYGENAZA 0-KAROTENOWA
Aldehyd retinowy (retinal, witamina A,)
retinowego). Na rycinie pokazano rwnie redukcj retinalu da retinolu oraz utlenienie retinalu do kwasu retinojowego.
CH3
712 / ROZDZIA 54
Iow. W reakcji tej donorem atomw wodorowych jest NADPH. Maa cz retinalu jest utleniana do kwasu retinojowego. Wikszo retinolu jest estryfikowana i wbudowywana do chylomikronw limfy (p. str. 299), skd dostaj si do krwi krcej. Chylomikrony ulegaj degradacji do chylomikronw resztkowych. Te ostatnie, zawierajce retinol, s wychwytywane przez hepatocyty. Karotenoidy mog omin ww. procesy przemiany i dosta sie bezporednio do chylomikronw. Witamina A jest magazynowana w wtrobie i po uwolnieniu do krwi ulega zwizaniu przez biaka transportujce W wtrobie witamina A jest magazynowana w lipocytach pod postaci estru prawdopodobnie w kompleksach lipoglikoproteinowych. Przed uwolnieniem do krwi i dostaniem sie do innych tkanek, estry witaminy A ulegaj hydrolizie, za uwolniony retinol zwizaniu przez apo-bialko wice retinol (apo-retinol binding protein RBP). Powstae holo-RBP zostaje przeksztacone w aparacie Golgiego, a nastpnie uwoinione do osocza. Kwas retinojowy przenoszony jest we krwi przez albuminy. Po dostaniu si do wntrza komrek innych ni hepatocyty retinol zostaje zwizany przez tzw.
komrkowe biako wice retinol (cellular reti-
Retinol, retinal i kwas retinojowy kady z tych zwizkw wykazuje swoiste funkcje biologiczne Retinol moe ulec przeksztaceniu do retinalu i odwrotnie pod wpywem dehydrogenaz lub reduktaz, wystpujcych w wielu tkankach i wymagajcych obecnoci NAD lub NADP. Nale y
doda, e raz powstay kwas retinojowy nie moe powtrnie przeksztaci si w retinal lub
retinol. Ten fakt sprawia, e kwas retinojoWy wpywa na wzrost i rnicowanie komrek, lecz
nie moe zastpi retinalu w procesie widzenia ani retinolu w zakresie dziaania na ukad rozrodczy.
Retinol dziaa jak hormon steroidowy Po zwizaniu przez CRBP retinol przemieszcza si do jdra komrkowego i zostaje zwizany przez biaka jdrowe. W jdrze komrkowym retinol prawdopodobnie uczestniczy w kontroli ekspresji pewnych genw. Pod tym wzgl -
dem witamina A zachowuje si podobnie jak hormony steroidowe. Udzia witaminy w kont roli ekspresji genw wydaje si tumaczy jej niezbdno w procesie fizjologicznej reprodukcji. Retinal jest skadow barwnika wzrokowego rodopsyny Rodopsyna wystpuje w prcikach (komr kach prcikowych) siatkwki odpowiedzial nych za widzenie w sabym wietle. 11-cw-Reti-nal bdcy izomerem cakowicie-fr-ans-retfâlu ulega swoistemu zwizaniu przez biako zwane opsyn tworzc rodopsyn (ryc. 54-4). Przy ekspozycji rodopsyny na wiato, barwnik traci barw ulegajc rozpadowi do cako wicie- transHoOopsyna 3 11
nol binding protein CRBP).
A wystpuj w chwili przekroczenia cakowite* go wysycenia RBP i eksponowania komrek na retinol wolny, nie zwizany biakiem noniko wym. iv
Objawy toksycznoci spowodowane witamin
hY
(foton wiata)
Ryc. 54-4. W prcikach siatkwki oka 11 -c/s-retinal, powstay z cakowicie- trans- retinal u, czy si z opsyn tworzc rodopsyn Absorpcja fotonu przez rodopsyn jest powodem utraty jej zabarwienia i rozpadu doopsyny i cakowicie- trans-retinalu. Dla podtrzymania cyklu tych reakcji niezbdny jest retinal.
STRUKTURA 1 FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TUSZCZACH / 713
-retinalu i opsyny. Reakcji tej towarzyszy zmiana konftirmacyjna indukujca otwarcie kanau wapniowego w prcikach. Wzmoony napyw jonw wapnia do prcika wyzwala impuls nerwowy umoliwiajcy percepcj wiata przez mzg. Kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein To dziaanie mo czciowo tumaczy pobudzajcy wpyw ' kwasu retinojowego na wzrost i rnicowanie tkanek. Sugerowano, e fosforan retinoilowy spenia funkcj przenonika oligosacharydw przez lipidow dwuwars-tw bon komrkowych. Proces ten ma by enzymatyczn trans-cis izomeracj podobn do opisanej wyej trans-cis izomeracji rodopsyny. Nie do odparcia dowodem na to, e kwas retinojowy uczestniczy w syntezie glikoprotein jest fakt akumulacji w stanach niedoboru witaminy A nienormalnie nisko czsteczkowych in-termediatw oligosacharydowo-lipidowych (p. rozdz. 57). Brak witaminy A wywouje charakterystyczne objawy niedoborowe Sa one spowodowane upoledzeniem funkc jonowania rnych mechanizmw komrko wych, w ktrych uczestnicz retinoidy. Jednym z pierwszych objaww niedoboru witaminy A jest upoledzone widzenie nocne, ktre pojawia si przy prawie cakowitym wyczerpaniu si zapasw witaminy A w wtrobie. Dalsze zubo-
enie w witaminÂ jest przyczyn Iceratyzacji nabonka oka, drg oddechowych, ukadu o-dkowo-jelitowego i drg moczowo-pciowych oraz zmniejszenia wydzielania luzu. Sucho spojwek (xerophtalmia) i rogwki prowadzi nieuchronnie do lepoty. Przyczyn niedoboru witaminy A jest gwnie spoywanie pokarmw pozbawionych tej witaminy, a szczeglnie nie-spoywanie jarzyn zawierajcych prowitamin A, tj. (3-karoten Zarwno retinoidy, jak i karotenoidy wykazuj dziaanie przeciwnowotwo ro we Wiele nowotworw u czowieka wywodzi si z komrek nabonkowych. Rnicowanie tych ostatnich zalene jest (jd_ retinoidw. Niektre badania epidemiologiczne wykazay wystpowanie odwrotnej zalenoci midzy zawartoci witaminy A w pokarmach a ryzykiem wystpienia raka. Ponadto w niektrych dowiadczeniach wykazano, e podawanie retinoidw zmniejsza aktywno niektrych karcynogenw. p-karoten jest antyoksydantem, Moe on odgrywa rol w wychwytywaniu wolnych rodnikw nadtlenkowych w tkankach, w ktrych wystpuje mae cinienie czstkowe tlenu. Mechanizm dziaania 0 -karotenu jako antyoksy-dantu polega na stabilizacji wolnych, organicznych rodnikw nadtlenkowych w jego sprzonej alkilowej strukturze (ryc. 54-5). Poniewa (3-karoten jest skuteczny przy maych steniach tlenu, uzupenia on anty oksydacyjne waciwo-
Ch,
CH
ROO*
CH,
CH,
Ryc. 54-5. Powstawanie rezonansowo stabilnego rodnika z atomem wgla w centrum z rodnika nadtlenkowego (ROO*) i p-karotenu. (Wedug: Burton G, W., Ingold K. U.: An unusual type of lipid antioxidant; Science 1984, 224, 569 Copyright (0 1984 by Tne American Association for the Actvancement of Science. Niewielka modyfikacja, za zezwoleniem).
714 / ROZDZIA 54
ci witaminy E, dziaajcej przy duych steniach tlenu (p. str. 185). Anty oksydacyjne waciwoci obu wymienionych witamin rozpuszczalnych w tuszczach mog by odpowiedzialne za ich dziaanie przeciwnowotworowe. WITAMINA D Witamina jest prohormonem steroidowym. Jej przedstawicielem jest grupa steroidw wystpujcych gwnie u zwierzt, cho rwnie w rolinach i drodach. W wyniku przemian biochemicznych z tych steroidw powstaje hormon kalcytrioL, odgrywajcy gwn rol w przemianie wapniowej i fosforanowej (p. str .623). Witaminy D powstaj z prowitamin srgosterolu i 7-dehydrochoiesterolu w wyniku dziaania wiata sonecznego Ergwstcrol wystpuje w rotinach, natomiast 7-dehydrocholesterol u zwierzt. Ergosterol r-
ni si od 7 -dehydrocholesterolu tylko acu chem bocznym (ktry jest nienasycony) oraz dodatkow grup metylow (ryc. 54-6). Piercie B obu zwizkw ulega rozszczepieniu pod wpywem promieni ultrafioletowych wiata sonecznego. Synteza ergokalcyferolti (witaminy D2) odbywa si w rolinach, natomiast cholekalcyferolu (witaminy D3) w skrze zwierzt eksponowanej na dziaanie promieni sonecznych. Obydwie witaminy wykazuj tak sam aktywno biologiczn i s produktami wyjciowymi do syntezy D2-kalcytriolu, lub te D3--kalcytriolu. W dalszej czci rozdziau zostanie opisany tylko D3 -kalcytriol, W syntezie kacytriolu uczestnicz zarwno wtroba, jak i nerki Witamina D3 (lub Dj) zawarta w pokarmach, jest wchaniana w jelitach, po czym dostaje si do krwi, gdzie ulega zwizaniu przez swoiste biako nonikowe. Z krwi witamina D jest wychwytywana przez wtrob, gdzie ulega hyd-rcksylacji w pozycji 25. Enzymem katalizujcym t reakcj jest 25-hydroksylaza
witaminy
CH3
CH3 CH3
HC C H = C H C C H CH,| \ CH3
trgosterol (roliny)
Ergokalcytero l (witamina D,)
H - C - C Hj - C H , C H
CHj CH? CH N CH3
Fotoliza 7 - Dehyd rocholestaro I (zwierzta) Cholekalcyfero l (witamina D,)
Ryc. 54-6. Ergosterol i 7-dehydrochoiesterol oraz konwersja tych zwizkw przez fotolize do ergokal-cyferolu lub cholekalcyferolu.
STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUS ZCZA LNYCH W T US ZCZACH / 71fi

CH3
H - C - C H ; - C H j- C H 2 - C ^ - 0 H CH3
25 -
CH3
25-HYDRO KSYLAZA WTROBOWA Cholekalcyfer ol (witamina D3i 24- HYDROKSYLAZA NERKOWA. KOSTNA OYSKO WA, JELITOWA, CHRZESTNA Hydf oksyoho tekatcyferol [25-hydroksy-witamina O)
1a-HYDROKSYLAZA NERKOWA, KOSTNA LUB OYSKOWA
OH i
HO
CH3 HC-(
- C H2 -
OH,
CH3
HO
CH,
\ CH3 24,23 - Dl hyd roksyoho lekaloyfero I (24,25-dlhydroksy-witamlna O,) 1,25 - D Ihydroksyc h o lekaloyferol (1.25-dltiydroksy-wHamlraa DJ
Ryc. 54-7. Cholekalcyferol moe utec hydroksylacji w pozycji C26 przez enzym wystpujcy w wtrobie. 25-hydroksychoiekalcyfero l ulega dalszej metabolizacji do 1a,25-dihydroksycholekalcyferolu lub do 24,25- dihydroksycholekalcyferolu, Czynniki pobudzajce syntez ta,25 -dihydroksycholekalcyfero)u hamuj syntez 24,25 -dihydroksycholekalcyferolu i odwrotnie.
D3, wystpujca w siateczce rdplazmatycznej hepatocytw. Jest ona enzymem decydujcym o szybkoci produkcji aktywnych metabolitw witaminy D w szlaku syntezy tych zwizkw (ryc. 54-7). 25-hydroksy-Dj jest gwn postaci zapasow tej witaminy w wtrobie. Znaczna cz 25-hydroksy-D;, podlega kreniu jelitowo-wtrobowemu, co sprawia, e zaburzenia tego procesu mog by przyczyn niedoboru witaminy D. W kanalikach nerkowych, kociach i w oysku 25-hydroksy-D3 ulega dalszej hydroksylacji w pozycji 1 przez enzym mitochondrialny
- l-hydroksylaz 25 -hydroksy-D,. W wyniku tej reakcji powstaje 1 a, 25-dihydroksy-D3 (kal-cytriol) bdcy najsilniej dziaajcym metabolitem witaminy O. Regulatorami syntezy tego hormonu s: samo stenie tego metabolitu, jak rwnie stenie PTH i fosforanw w surowicy krwi.
ny obecny w kanalikach nerkowych, chrzstkach, jelitach i oysku. Stenie w surowicy krwi powstajcego w tej reakcji 24, 25-dihyd-roksy-D3 wykazuje ujemn korelacje ze steniem 1,25-dihydroksy-Dj. Dalsze szczegy dotyczce regulacji i roli kalcytriolu w przemianie wapniowej i fosforanowej zostay podane w rozdz. 48. Niedobr witaminy D jest przyczyn krzywicy i osteomalacji Krzywica wystpuje u dzieci, za osteomala-cja u dorosych, nie eksponowanych na dziaanie promieni sonecznych lub ywionych pokarmami nie zawierajcymi dostatecznej iloci witaminy D. Niedobr witaminy D jest przyczyn rozmickania koci spowodowanego brakiem wapnia i fosforanw. Rybi oJej, tko jaj oraz wtroba s dobrymi rdami tej witaminy.
25-hydroksy-D3 moe ulec hydroksylacji rwnie w pozycji 24 przez enzym mitochondrial-
716 / ROZDZIA 54
WITAMINA E (TOKOFEROL)
Istnieje kil ka tokoferoli wystpujcych w przyrodzie. Wszystkie one s izoprenoidowy-mi pochodnymi 6-hydroksychromanw lub to -koli (ryc. 54-8). Najczciej spotykanym w przyrodzie tokofe-rolemjest D-a-tokoferol. Wykazuje on najwiksz aktywno biologiczn wr d tokoferoli. Inne tokoferole odgrywajce znaczenie w ywieniu czowieka zestawione s w tab. 54-t. Proces aktywnego wchaniania tuszczw sprzyja absorpcji witaminy E w jelitach
Upoledzenie wchaniania tuszczw jest przy czyn niedoboru witaminy E, poniewa jest ona
Witamina E jest bardzo wanym naturalnym antyoksydantem

Wydaje si, e witamina E stanowi pierwsz lini obrony przed peroksydacj wielonienasyco-nych kwasw tuszczowych zawartych w fos-folipidach bon komrkowych i
rozpuszczona w tuszczach, a uwalniana i absorbowana z przewodu pokarmowego w trakcie trawienia lipidw. We krwi witamina E jest
transportowana za porednictwem lipoprotein.
Pocztkowo znajduje si w chylomikronach, z ktrymi dociera do tkanek posiadajcych lipaz lipo proteinow. Do wtroby dociera w chylomikronach resztkowych (w remnantach chylomikronw). Z wtroby witamina E wydostaje si wraz z czsteczkami lipoprotein o bardzo maej gstoci. Jest ona magazynowana w tkance tuszczowej.
Tabela 54-1. Naturalnie wystpujce tokoferole, wykazujce znaczenie w ywieniu Tokoferol czowieka Podstawniki 5,7,8 -Tr i mety I oto koi 5,8-Dimetylotokol 7,8- Dimetylot okol 8-Metylotokol
organelli sub-komrkowych. Fosfolipidy bon mitochondria-lnych, siateczki rdplazmatycznej i bon plaz-matycznych wykazuj powinowactwo do cc-to-koferolu i wydaje si, ze witamina ta ulega koncentracji w tych strukturach. Tokoferole dziaaj jako antyoksydanty (przeciwutlenia-cze) przerywajc reakcje acuchowe generujce wolne rodniki. Dziaanie to polega na transferze wodoru fenolowego na wolny rodnik nadtlen-kowy peroksydowanego, wielonienasyconego kwasu tuszczowego (ryc. 54-9 oraz str. 184). Z kolei powstay wolny rodnik fenoksy- reaguje z dalszym wolnym rodnikiem nadtlenkowym. Tak wic a-tokoferol nie jest atwo wcigany do reakcji odwracalnej oksydacji; piercie chro-manu i acuch boczny ulegaj utlenieniu do zwizku nie bdcego wolnym rodnikiem. Jest on pokazany na ryc. 54-10. Ten produkt ok sydacji czy si z kwasem glukuronowym za porednictwem grupy hydroksylowej w pozycji 2 i wydalaniu z ci. W odrnieniu od innych witamin np. niacyny, witaminy B12 i folianu, tokoferol po wypenieniu swojej funkcji nie u\ega recyrkulacji. Dlatego te musi by zastpiony przez nowy tokoferol, by speni swoje zadanie biologiczne w komrce. Antyoksyda-cyjne dziaanie tokoferolu jest najbardziej sku teczne przy wysokich steniach tlenu, dlatego nie jest zaskoczeniem, e witamina ta wykazuje tendencj do gromadzenia si w strukturach lipidowych, eksponowanych na najwiksze cinienia czstkowe tlenu, tj. w bonach krwinek czerwonych oraz w bonach komrkowych drg oddechowych.
i
CH,
<CH3),-
CH,
-CHlCH^-CH-CHj
Ryo. 54-8. a-Tokoferol.
STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TUSZCZACH / 717

ROOH + TocO* ROO* + TocOH RO O' * TocO' Nieaktywny pi wolnego rodr nika
Ryc. 54-9. Aktywno antyoksydacyjna tokoferolu przerywajca acuch generacji rodnikw nadtlenkowych (ROO*). _________________________
: CH3 OH CH3 O -
)I?
4 ^ CH3
CH,~ ^
spowodowana obnion syntez hemoglobiny lub skrceniem okresu ycia krwinek czerwonych. Zapotrzebowanie na witamin E wzrasta przy wzrocie spoycia wielonienasyconych kwasw tuszczowych. Zaywanie olejw mineralnych, ekspozycja na czysty tlen (np. w namiotach tlenowych) oraz choroby przebiegajce z upoledzonym wchanianiem tuszczw w jelitach mog by przyczyn niedoboru witaminy E i wystpienia zaburze neurologicznych. Witamina E ulega rozkadowi pod wpywem gotowania lub innych procesw obrbki rodkw spoywczych, miedzy innymi zamraania w bardzo niskiej temperaturze. Dobrymi rdami witaminy E s: kiekujce ziarna pszenicy, olej z nasion sonecznika, krokosza, kukurydzy lub soi. Cho oleje uzyskane z wtrbek rybich s bogate w witamin A i D, to jednak zawieraj niewielkie iloci witaminy E.
Ryc. 54-10. Produkt oksydacji a-tokoferolu. Podana numeracja informuje o pooeniu oznaczo nych atomw w zwizku macierzystym.
WITAMINA K Witamina E i selen dziaaj synergistycznie. Kady z tych czynnikw zmniejsza zapotrzebowanie ustroju na czynnik drugi Peroksydaza glutationowa, ktrej integralnym skadnikiem jest selen (p. str. 243), stanowi drug lini obrony przed nadtlenkami zanim dojdzie do ich propagacji w reakcjach acuchowych, niszczcych bony i inne struktury komrkowe. Tak wic tokoferol i selen uzupeniaj si wzajemnie w reakcjach niszczcych nadtlenki lipidowe, przy czym jeden z nich zmniejsza zapotrzebowanie na drugi. Ponadto selen jest niezbdny do prawidowej czynnoci trzustki. Ta ostatnia z kolei jest potrzebna w procesie trawienia i wchaniania lipidw, w tym rwnie tokoferolu. Odwrotnie, witamina E zmniejsza zapotrzebowanie na selen, zapobiegajc utracie tego pierwiastka przez ustrj oraz utrzymujc go w postaci aktywnej. Niedobr witaminy E moe by przyczyn niedokrwistoci u noworodkw U ciarnych lub karmicych matek oraz u noworodkw moe zachodzi potrzeba sup-lementacji pokarmw witamin E w celu zapobiegania niedokrwistoci spowodowanej niedoborem tej witaminy. Niedokrwisto moe by Witaminy nalece do grupy K s poliizop-renoidowymi pochodnymi naftochinonu (ryc. 54-11). Menachinon (=menadion) bdcy zwizkiem macierzystym witamin grupy K (ryc. 54-12)
Jednostka Izopranoldowa 2-Metylo-1.4-n aftoeh ino n
Ryc. 54-11. Pochodna naftochinonu oraz jednostka izoprenoidowa. W witaminach grupy K podstawniki R s poliizoprenoidami.
nie wystpuje w przyrodzie. Po jego podaniu in vivo ulega alkilacji do jednego ze zwizkw pochodnych menachinonu (witamina K2). Filo-chinon (witamina K,) jest gwn postaci witaminy K. wystpujc w rolinach, Menachi-non-7 jest jedn z poliizoprenoi ci owych, nienasyconych pochodnych witaminy K wystpujcych w tkankach zwierzcych i syntetyzowanych przez bakterie w jelitach.
718 / ROZDZIA 54
M enadi on ( wi ta mi na K,)
CHS
CH,
= C -CH I -(CH 3 -CH 1 -CH-CH J ) 3 -H

O
Fllochlnon (witamina K,, filonatfon, msflton) O CH3 CH3 (CH ]CH=C-CH1 Jn -H
Menaehlnon-n (witamina K^ n = 6,7 lub 9) Ryc. 54- 12. Postacie witaminy K wystpujce w przyrodzie.
Niezaburzone wchanianie tuszczw jest warunkiem prawidowego wchaniania witaminy K Upoledzone wchanianie tuszczw jest najczstsz przyczyn niedoboru witaminy K. Wystpujce w przyrodzie pochodne witaminy K ulegaj wchanianiu tylko w obecnoci kwasw ciowych i podobnie jak inne lipidy dostaj sie do krwi krcej w chylomikronach za porednictwem rt&szy limfatycznych. Me-nachinon (menadion), jako zwizek rozpuszczalny w wodzie ulega wchanianiu nawet przy braku kwasw ciowych, dostajc si bezporednio do yy wrotnej. Chocia witamina K jest pocztkowo magazynowana w wtrobie, stenie jej w tym narzdzie szybko obnia si, bowiem gromadzenie si witaminy K w wt robie jest ograniczone. Witamina K jest niezbdna w biosyntezie osoczowych czynnikw krzepnicia Udowodniono, e witamina K uczestniczy w utrzymywaniu prawidowych ste II, VII,
IX i X czynnika krzepnicia krwi. Wszystkie te
Witamina K jest kofaktorem karboksylazy katalizujcej powstawanie reszt y-kar boksy gluta mi nia owych w biakach prekursorowych Powstawanie biologicznie aktywnych czynnikw krzepnicia krwi zwizane jest z potrans-lacyjnym przeksztaceniem reszt glutaminiano-wych (Glu) biaek prekursorowych do reszt y-karboksyglutaminianowych (Gla) przez swoist karboksylaz zalen od witaminy K (ryc. 54-13). Protrombma (drugi czynnik krzepnicia krwi) zawiera 10 takich reszt, pozwalajcych na
chelatowanie jonw wapniowych. Proces ten cha-
rakteryzuje si swoist interakcj biaek, jonw wapniowych i fosfolipidw, niezbdn dla wystpienia ich efektu biologicznego (ryc. 54-14).
cocr COn
CH2
"OOC COO"
\/
CH WITAMINA K CH;, I
czynniki s syntetyzowane w wtrobie w postaci

nieaktywnych biaek prekursorowych (p. rozdz. 58).
C C H N C CH N II H (I O ' o R yc . 5 4 -1 3 . K a r b o k s yl a c j a re s z t y g l u to m i ni a n o - wej, katalizowanej przez
witamin K.
STRUKTURA I FUNKCJA WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TUSZCZACH / 719

Glu
Gla
V
C H -C-CH-N-
"
SH SH
Ryc. 54-14. Chelatowanie jonw wapnia przez reszt 7-karboksylog lulamy Iow wystpujc w biakowych czynnikach krzepnicia.
W kilku tkankach zidentyfikowano wystpowanie rwnie innych biaek zawierajcych reszty Gla zalene od witaminy K. Cykl witaminy K" pozwala regenerowa zredukowan posta witaminy K W reakcji katalizowanej w siateczce rdplaz-matycznej przez karboksylaz zalen od witaminy K niezbdna jest obecno tlenu czsteczkowego, dwutlenku w gla (a nie HCOy), oraz postaci hydrochinomiwej (zredukowanej) witaminy K. W siateczce endoplazmatycznej hepa-tocytw wystpuje tzw. cykl witaminy K (ryc. 54-15), w ktrym produkt reakcji karboksylacji 2,3-epoksyd ulega najpierw konwersji do postaci chinonowej witaminy K. Reakcja ta jest katalizowana przez reduktaz 2,3-epoksydow dziaajc w obecnoci niezidentyfikowanego jeszcze reduktora ditiolowego. Reakcja ta jest wraliwa
na hamujce dziaanie anty koagulantw grupy 4-hydroksydikumarynowej (dikuma-rolowej)
Warfaryna Dl ku maro I
Ryc. 54-1 5. A kt yw noci m et aboli czne w tr oby powizane z witamin K. N a rycinie pokazane jest miej sce dziaania anty koagulantw typu dtkum aro- l u. S zczeg y ni ekt r ych r eakcji ni e s jeszcze znane. 1 m onooksygenaza, 2 kar boksyl aza, 3 r edukt aza 2, 3- epoksydow a, 4 redukt aza. ( W ed ug: Sutti eJ. W. The m et abolic roleof vitami n K; Fed. Pr oc. 1980, 39, 2730, modyfikacj a, za zezwol eniem).
takich jak warfaryna (ryc. 54-16). Kolejna redukcja postaci chnonowej do hydro-chinonowej przez NADH zamyka cykl witami ny K. W ten sposb regeneruje si biologicznie aktywna posta witaminy K. Wanym wskazaniem do stosowania witaminy K (jako antidotum) jest zatrucie lekami pochodnymi dikumarolu. Posta chinonowa witaminy K, omijajc etap dziaania reduktazy epoksydowej, jest potencjalnym rdem aktywnej, hydrochinonowej postaci tej witaminy. Skaza krwotoczna noworodkw jest spowodowana niedoborem witaminy K Witamina K wystpuje w rolinach i tkankach zwierzcych uywanych jako pokarm oraz syntetyzowana jest przez mikroflor jelitow.
R y c . 54 - 16 . D i kum ar ol ( bi s - hydr o ksyk um ar y no - 3,3' - mety leno - bis - hydroksyk umaryna)
Te fakty sprawiaj, e u dorosych nie spotyka si stanw niedoboru witaminy K. Na wy stpienie niedoboru tej witaminy s jednak naraone noworodki, poniewa oysko nie transportuje dostatecznie skutecznie witaminy K z krenia matki do podu i przewd pokarmowy u podw jest sterylny bezporednio po urodzeniu. U zdrowych noworodkw stenie witaminy K w osoczu krwi spada bezporednio po porodzie, lecz wraca do normy z chwil rozpoczcia wchaniania pokarmw. W razie zbyt duego spadku stenia protrombiny moe wystpi skaza krwotoczna.
720 / ROZDZIA 54
Niedobr witaminy K. moe wystpi w stanach wadliwego wchaniania tuszczw spowodowanych upoledzon czynnoci egzokrynn trzustki, zaburzeniami wytwarzania i wydalania ci, atrofi bony luzowej jelit lub innymi chorobami charakteryzujcymi si wydalaniem stolcw tuszczowych. Ponadto przyczyn niedoboru witaminy K moe by wyjaowienie
przewodu pokarmowego przez antybiotyki, jeli
poda tej witaminy w pokarmach jest niedostateczna.
PIMIENNICTWO
Adams JS, et al: Vitamin-D synthesis and metaboiism after ultraviolet irradiation of norma! and vitamin--D-deficient subjects. JV Engl Med l982;30:722.
Goodman DS: Vitamin A and retinoids in heatth and disease. N Engl J Med 1984;310:1023. Norman AW, Roth J, Orci L: The vitamin D endocrine system. Endocr Rev 1982;3:331. Olson RE et al (editors): Present Knowiedge in Nutrition, 5th ed, The Nutrition Foundation, Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, Churchi!! Ljvingstone, 1986, Scott, ML: Advances in our understanding of vitamin E. Fed Proc 198O;39:273. Sokol RJ: Vitamin E deficiency and neurologie disease. Annu Rev Nutr 1988;8:351. SpornMB, Roberts AB: Role of retinoids indifferentiation and carcinogenesis. Cancer Res 1983; 43:3034. SuttieJW: The metabolic role ofvitamin K. Fed Proc 1980;39:2730. Whitlon DS, et al: Mechanism of coumarin action: Significane of vitamin K epoxide reductase inhibition. Biochemistry 1978;17:1371.
- -
ywienie
55
s bardziej powszechne, np. niedobory biakowe
(choroba kwashioijkor), witaminowe (xe-rophtahnia jako nastpstwo niedoboru
WPROWADZENIE
Nauka o ywieniu bada jakociowe i ilociowe zapotrzebowanie na pokarmy niezbdne dla podtrzymania dobrego stanu zdrowia. Praktycznie biorc znane s wszystkie skadniki pokarmowe potrzebne do ycia, moliwe jest bowiem utrzymywanie przy yciu zarwno zwierzt, jak i czowieka podajc im pokarmy chemicznie dokadnie okrelone. Wystpuj natomiast znaczne kontrowersje dotyczce zapotrzebowania ilociowego na poszczeglne skadniki pokarmowe szczeglnie w odniesieniu do wiek~u, pici i stylu ycia. Biochemia przemiany materii, przedstawiona w pocztkowych rozdziaach tego podrcznika, dostarczya wiele danych pomocnych dla zrozumienia nowoczesnych koncepcji ywieniowych. W szczeglnoci w poprzednich dwch rozdziaach opisano role biochemiczne witamin rozpuszczalnych w wodzie i tuszczach.
witaminy A), skadnikw mineralnych (niedokrwisto spowodowana niedoborem elaza) lub kaloryczne (spowodowane godzeniem energetycznym). Przyczyn niedoborw ywieniowych moe by rwnie wadliwe wchanianie pokarmw (malabsorption) np. wadliwe wchanianie witaminy B12 i folianu jest przyczyn niedokrwisto-ci megaloblastycznej. Chocia otyo kojarzono zawsze z przejadaniem si w spoeczestwach bardziej rozwinitych, coraz wiksz uwag zwraca si ostatnio na wpyw nadmiernego pobierania okrelonego skadnika pokarmowego na rozwj takich chorb jak miadyca i choroba wiecowa serca, rak piersi i jelita grubego, choroby naczy mzgowych oraz wylew krwi do mzgu oraz marsko wtroby.
Klinicznie jawne niedobory ywieniowe s rzadko spotykane w populacjach bardziej zasobnych, chocia pewien stopie niedoborw ywieniowych moe wystpi wrd ludzi biednych lub starych, u osb o szczeglnych zapotrzebowaniach ywieniowych, np. u dzieci w okresie wzrostu, kobiet ciarnych lub karmicych, u osb chorych lub bdcych w okresie rekonwalescencji oraz u alkoholikw. Czasami takie niedobory s wynikiem wasnego wyboru np. u jaroszw lub te s Spowodowane koniecznoci stosowania u niektrych chorych ograniczonej diety lub ywienia pozajelitowego. W populacjach biednych niedobory ywieniowe
ZAPOTRZEBOWANIA YWIENIOWE MONA DZISIAJ USTALI

W tabeli 55-1 zestawiono istotne dla ycia skadniki pokarmowe.
ENERGIA JEST POTRZEBNA PRZY REALIZACJI WSZYSTKICH CZYNNOCI USTROJOWYCH

Ustrj ssakw potrzebuje dostawy rodkw odywczych w ilociach niezbdnych do pokrycia wydatkw energetycznych zwizanych z wytworzeniem zwizkw wysokoenergetycznych (gwnie ATP) oraz rwnowanikw redukujcych (ZH), uczestniczcych we wszystkich funkcjach ustrojowych (p. ryc. 17-1).
46
l i i . - .: : :
722 / ROZDZIA 55 Tabela 55-1. Istotne (egzogenne) skadniki pokarmowe Czowiek Aminokwasy Histydyna*, izoleucyna, leu-cyna, metionina (cystei-na"*), fenyloalanina (tyrozyna**"), treonina, tryp-tofan, walina Wybrane cechy rnice czowieka od innych gatunkw Arginina** jest niezbdna dla szczurw w okresie wzrostu. Glicyna jest niezbdna dla kurczt, za tauryna dla kotw. U przeuwaczy wikszo aminokwasw naley do aminokwasw endogennych. U innych zwierzt trawoemych z obfit mikroflor w przewodzie pokarmowym zapotrzebowanie na aminokwasy egzogenne jest mniejsze
Kwasy tuszczowe
U kotw kwas arachidonowy jest kwasem egzogenKwas linolowy (kwas ara- nym chidonowy""), kwas ot-li-nolenowy**" Kwas askorbinowy (C), biotyna, kobalamina (B^), kwas foliowy, kwas pantotenowy, pirydoksyna (B6), ryboflawina (Bs), tiamina (B.) Witamina A, D* K ..... Wikszo ssakw potrafi syntetyzowa witamin C z wyjtkiem naczelnych, winek morskich i owocowego nietoperza indyjskiego; u przeuwaczy witaminy rozpuszczalne w wodzie nie nale do istotnych (egzogennych) skadnikw pokarmowych. Zapotrzebowanie na te witaminy jest mniejsze u innych zwierzt trawoemych wykazujcych obfit koloni zacj jelit mikroorganizmami jako rdo witaminy A (retinol), natomiast koty musz otrzyma retinol
Witaminy Rozpuszczalne w wodzie
Rozpuszczalne w tuszczach Skadniki mineralne Makromineralne
E, Wikszo gatunkw potrafi wykorzysta (3-karoten
Wap, chlorki, magnez, fosfor, potas, sd
ladowe (mikroele- Chrom, mied, jod, elazo, Wykazano, e krzem, wanad, nikiel, arsen, fluorki mangan, molibden, selen, i cyna s skadnikami niezbdnymi dla niektrych menty) gatunkw i by moe s rwnie niezbdne dla cynk czowieka; kobalt jest niezbdny do syntezy kobala-miny przez mikroorganizmy przeuwacza Wkna Woda Energia Niezbdne dla penego zdrowia Najbardziej krytyczny skadnik pokarmw Zmienny udzia wglowodanw, tuszczw i biaek w bilansie energetycznym
' Niezbdny u niemowlt i prawdopodobnie rwnie u dzieci i dorosych, ** Moe by czciowo niezbdna u niemowlt. *** Cyst i na, tyrozyna i kwas arachidonowy zmniejszaj zapotrzebowanie odpowiednio na metioni-n, fenyloalanin i kwas linolowy. **" Niektrzy badacze uwaaj, e kwas linoienowy nie naley do niezbdnych skadnikw pokarmowych. ***** Jest wytwarzana przez mikroorganizmy jelitowe, dlatego trudno ustali wielko zapotrzebowa nia w pokarmach, ".......... Ekspozycja skry na wiato zmniejsza zapotrzebowanie na witamin D.
YWIENIE / 723
Wglowodany i tuszcze s gwnymi rdami energetycznymi zawartymi w pokarmach Skadnikami pokarmowymi dostarczajcymi energi s gwnie tuszcze i wglowodany, za w mniejszym stopniu biaka. Udzia poszczeglnych skadnikw pokarmowych w bilansie energetycznym wykazuje znaczne wahania zalene
Tabela 55-2. Ciepo spalania w bombie kalorymetrycznej oraz warto energetyczna podstawowych skadnikw pokarmowych uzyskana przez utlenianie w ustroju czowieka Warto energetyczna w kcal/g (kJ/g) Ciepo Energia Standarspalania uzyskana dowe w bombie przez wsp kaloryme- utlenianie czyntrycznej w ustroju niki mno(H> czowieka enia * 5,4 (22,6) 4,1 (17,2)" 4 (17) Biaka Tuszcze 9,3 (38,9) 9,3 (38,9) 9(38) Wglowo4,1 (17,2) 4,1 (17,2) 4(17) dany 7,1 (29,7) 7,1 (29,7) 7 (29) Etanol Zaadaptowane wg Davidson S. i wsp.: Human Nutrition and Dietetics, Wyd. 7, Churchill Living-stone, 1979. * Standardowe wspczynniki mnoenia uzys kano przez zaokrglenie wartoci ciepa spalania w bombie kalorymetrycznej z uwzgldnieniem wydajnoci absorpcji. '" Wartoci dotycz utleniania biaek z uwzgldnieniem poprawki zwizanej z utrat grup amino wych z moczem.
od rodzaju populacji badanej. Spoycie alkoholu moe stanowi znaczn cz caodziennego poboru kalorycznego. Utrzymywanie si staej masy ciaa w warunkach nie zmieniajcego si zapotrzebowarna energetycznego dowodzi, e warto kaloryczna dostarczonych pokarmw jest wystarczajca dla biecych potrzeb. Wartoci kaloryczne gwnych skadnikw pokarmowych podane s w tab. 55 -2. Dwa fakty wynikajce z tabeli s godne zanotowania: wysoka warto kaioryczna tuszczu (w przeli czeniu na 1 g) w porwnaniu do wartoci kalorycznej wglowodanw i biaek oraz wysoka warto kaloryczna alkoholu. Zalecane zapotrzebowanie energetyczne dla wybranych populacji ludzkich zestawiono w tabeli 55-3. Wiele czynnikw ma wpyw na wydatek energetyczny cznego pobr energetyczny jest rwny jego wydatkowi. Wydatek energetyczny moe si znacznie rni zalenie od wielu czynnikw. Mona go okreli umieszczajc np. zwierzta w izolowanej komorze i mierzc wydatek energetyczny zwizany z utrat ciepa i okrelajc warto energetyczn produktw wydalanych przez ustrj. Znacznie wygodniejsze jest dokonanie pomiaru iloci zuytkowanego tlenu, bowiem w wikszoci warunkw konsumpcja I ] tlenu odpowiada ok. 4;83 kcal (20 kJ).
Indywidualny wydatek energetyczny poszczeglnego czowieka determinuj gwnie cztery czynniki: 1. Podstawowa przemiana materii. Jest to W warunkach wyrwnanego bilansu energety -
ilo energii wydatkowanej na podtrzymywanie
Tabela 55-3. Zalecane normy dla mczyzn i kobiet dotyczce poboru energii*
Wiek (lata)
Mczyni Kobiety ciarne karmice
Masa ciaa (kg) (funty)
Zapotrzebowanie energetyczne <kcal) rednie wahania 2300-3100 1600-2400 12,1 9,2 2900 2200 +300 +500 ( MJ )
23-50 23-50
70 55
154 120
* Dane wzite z pracy Recommended DietaryAllowances, wyd. 10, Foodand Nutrition Board, National Research Councii-National Academy of Sciences, 1989.
724 / ROZDZIA 55
podstawowych czynnoci fizjologicznych w warunkach standardowych (osoba nie powinna spa, powinna przebywa w ciepym pomieszczeniu, za pomiary wydatku energetycznego naley przeprowadzi 12 godzin po ostatnim posiku). Podstawowa przemiana materii jest proporcjonalna do beztuszczowej masy ciaa oraz do powierzchni ciaa. Jest ona wiksza u mczyzn ni u kobiet, u maych dzieci, u osb gorczkujcych oraz u chorych z nadczynnoci tarczycy. Jest natomiast obniona w niedoczyn-noci tarczycy oraz w stanach godzenia kalorycznego. Dziaanie termogeniczne pokarmw. Okre lane jest rwnie jako specyficzne dynamiczne dziaanie pokarm w. Stanowi ono 5-10% ca kowitego wydatku energetycznego. Jest to ilo energii wydatkowanej na trawienie oraz stymu lacje metabolizmu pod wpywem nowych sub stratw. Aktywno fizyczna. Jest to najwiksza zmienna w wydatku energetycznym. Moe ona wzrosn dziesiciokrotnie przy maksymalnym wysiku u atletw w porwnaniu z wydatkiem energetycznym w spoczynku. Temperatura otoczenia. Przy niskiej tem peraturze otoczenia wydatek energetyczny wzrasta z powodu wzmoonej termogenezy spowodowanej dreniem z zimna, za u zwierzt w nastpstwie aktywacji termogenezy w brunat nej tkance tuszczowej (p. str. 313). Przy tem peraturach otoczenia wyszych od temperatury krwi dodatkowa energia jest wydatkowana na chodzenie. BIAKA SA RDEM SWOISTYCH AMIN OKWASW I AZOTU POTRZEBNEGO DO SYNTEZY PODSTAWOWYCH ZWIZKW AZOTOWYCH W warunkach prawidowych biaka pokrywaj zapotrzebowanie na azot aminokwasowy oraz na same aminokwasy. Biaka zawarte w pokarmach s trawione do aminokwasw, ktre dostaj si do krwi. Ustrj czowieka potrzebuje 20 rnych aminokwasw do syn tezy swoistych biaek i innych, zwizkw azotowych, takich jak zasady purynowe i pirymidy-nowe oraz hem.
Aminokwasy niezbdne (egzogenne) s aminokwasami jakich ustrj nie potrafi syntetyzowa. Dlatego te musz by dostarczane z pokarmami Do aminokwasw niezbdnych dla czowieka nale: histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina (tab. 55-1). Dwa dalsze aminokwasy, cysteina i tyrozyna, mog powsta z aminokwasw egzogennych, tj. metioniny (z niej powstaje cysteina) i fenyloalaniny (z ktrej powstaje tyrozyna). Przy niedostatecznej ich poday, obecno cysteiny i tyrozyny w pokar mach zmniejsza zapotrzebowanie na metionin i fenyl o alanin. Przy dostatecznej poday aminokwasw egzogennych, pozostae aminokwasy (endogen ne), potrzebne do syntezy biaek lub innych procesw metabolicznych, mog powsta drog transaminacji i innych procesw (p. str. 348). Utrzymanie wyrwnanego bilansu biakowego wymaga cigego spoywania biaka (p. rwnie rozdz. 31) Zwierz znajdujce si w stanie rwnowagi metabolicznej wymaga cigego pobierania biaka celem pokrycia biecych strat w zakresie aminokwasw egzogennych i azotu aminowego spowodowanych obrotem metabolicznym. Czowiek traci zwizki azotowe z moczem, kaem, lin, ze zuszczajcym si naskrkiem, wosami i paznokciami. Zapotrzebowanie na biako i aminokwasy egzogenne u czowieka zestawiono w tab. 55-4. Jeli zapotrzebowanie obliczy na podstawie masy ciaa, wwczas u niemowlt i dzieci naley uwzgldni dodatkowe iloci biaka na wzrost. Zapotrzebowanie na biako wzrasta u kobiet ciarnych lub karmicych piersi, u chorych w okresie Tegene-racji tkanek po doznanym urazie, u chorych w okresie rekonwalescencji oraz przy wykonywaniu zwikszonego wysiiku fizycznego. W wikszoci przypadkw spoycie pokarmw, ktrych warto kaloryczna w 12% pokrywana jest przez biaka, naley uwaa za adekwatne. Stopie wykorzystania biaek determinuje wielko zapotrzebowania na ten skadnik pokarmowy Wielko zapotrzebowania na biako determinowana jest 3 czynnikami, tj. jakoci biaka, wartoci kaloryczn spoytych pokarmw oraz aktywnoci fizyczn.
YWIENIE / 725 Tabala 55-4. Szacunkowe zapotrzebowanie na biaka i aminokwasy oraz spoycie u ludzi* Spoycie Zapotrzebowanie (mg/kg (g/etob) masy ciaa/dzien) Niemowlta (4-6 miesicy) Biaka pochodzenia zwierzcego pochodzenia rolinnego Aminokwasy egzogenne Histydyna Izoleucyna Leucyna Uzyna Metionina (i cysteina) Fenyloalanina (i tyrozyna) Treonina Tryptofan Walina (3-4 miesice) 28
70 161 103 58 125 87 17
Dzieci (12-16 lat) 1000
Doroli
800
Doroli (70 kg) zalecana

56
Spoycie w USA przez dorosych 101 71

30
1100
?
28 42 44 22 22 28 3,3 25
10 10 14 12 13 14 7 3,5 10
0,7*3 0,70 0,98 0,84 0,91 0,98 0,49 0,25 0,70
?
5,3 8,2 6,7 2,1 4,7 4,1 1,2 5,7
93
* Dane wzite z pracy Recommended Dietary ASIowances, wyd, 10, Food and Nutrion Board. National Research Council-National Academy of Sciences, 1989. ** Dane wzite; pracy Munro H. N., Crim M.; Theproteinsandamino acid. W: Goodhart R. S.r Shils M. E.: Modern Nutrition in Health and Disease. Wyd. 6, Lea and Febiger, 1980.
Jako biaka. Jako biaka ocenia si porwnujc zawarto aminokwasw egzogennych w spoytych pokarmach z zawartoci tych skadnikw w pokarmach gwarantujcych dobry stan odywiania. Im bardziej podobne s porwnane wartoci, tym wysza jest jako biaka. Jajka i mleko zawieraj biaka o wysokiej jakoci, ktre s w peni wykorzystywane przez ustrj. S biakami referencyjnymi w stosunku do biaek innego pochodzenia przy ocenie wartoci biologicznej tych ostatnich. Biaka zawarte w misie s biakiem o wysokiej jakoci. W odrnieniu od nich wiele biaek zawartych w rolinach uywanych jako gwne artykuy ywnociowe wykazuje wzgldny niedobr okrelonych aminokwasw egzogennych, np.
kukurydza jest uboga w tryptofan i lizyn, pszenica w lizyn, za niektre rodzaje fasoli w metionin. Przy spoywaniu pokarmw mieszanych niedobr okrelonego aminokwasu egzogennego w jednym rodzaju biaka moe by wyrwnywany obfitym wystpowaniem tego aminokwasu w drugim rodzaju biaka. Takie biaka okrela si jako biaka komplementarne (uzupeniajce si), np. rwnoczesne spoywanie biaka pszenicy i fasoli zapewnia zadowalajc jako pobieranych aminokwasw. W takich sytuacjach czna ilo spoywanych biaek musi by wiksza by pokry zapotrzebowanie na ten skadnik pokarmowy. Aminokwasy, nie wykorzystane do syntezy nowych biaek i niepotrzebne do innych biecych syntez, nie s
726 / ROZDZIA 55
magazynowane, lecz s rozkadane, za azot wydalany jest z ustroju pod postaci mocznika lub innych zwizkw.
gia pochodzca z oksydacji tuszczw i wglowodanw wpywa na zapotrzebowanie biakowe, poniewa oszczdza biaka jako rda energii. Aby waciwie i w peni wykorzysta drogocenne biaka wysokiej jakoci i maksymalnie zmniejszy zapotrzebowanie na nie, trzeba podawa niebialkowe rda energii. Wrd nich powinny si znajdowa wglowodany, aby oszczdzi biaka wykorzystywane w procesie glukoneogenezy. Aktywno fizyczna. Aktywno fizyczna wzmaga retencj azotu pochodzcego z roz padu biaek zawartych w pokarmach. Niedoywienie biakowe i kaloryczne s przyczyn uwidu (marazmu) i kwashiorkoru Niedoywienie biakowo -kaloryczne obejmuje wiele zaburze zwizanych z godzeniem i nieprawidowym odywianiem si. Charakteryzuje si ono nie tylko niedoborem biaek, lecz i innych skadnikw pokarmowych, takich jak witaminy i skadniki mineralne. W cikiej postaci wystpuje ono u dzieci w okresie wzrostu, najczciej w gospodarczo zacofanych krajach Azji, Afryki i Ameryki Poudniowej, Wyrnia si dwie ekstremalne postacie niedoywienia biakowo-kaloryczne go: marazm (uwid) i kwashiorknr (p. rozdz. 62). W marazmie stwierdza si oglne wycieczenie spowodowane niedoborem zarwno kalorycznym, jak i biakowym. Kwashiofkor charakteryzuje si
obrzkiem i niedoborem zarwno ilociowym, jak i jakociowym biaek, natomiast pobr ener -
Warto kaloryczna pokarmw. Ener-
tem rozpadu triglicerydw) oraz z aminokwasw glukogennych (w procesie glukoneogenezy). Cho zaleca si pobieranie 50100 g wglowodanw na dob, aby unikn ketozy i zaniku musy miniowej, zrwnowaona dieta powinna zawiera wicej wglowodanw, by zmniejszy ilo tuszczw jako rda energii. Gwne artykuy ywnociowe zawierajce wglowodany opisano w rozdz, 15. WKNA S NIEZBDNE DLA UTRZYMANIA DOBREGO ZDROWIA Przez wkna zawarte w pokarmach naley rozumie skadniki bon komrkowych kom rek rolinnych, ktre nie s rozkadane przez wasne enzymy zwierzt. Do takich skadnikw zalicza si celuloz, hemiceluloz, lignin, gumy, pektyny i pentozany. U zwierzt trawoernych, takich jak przeuwacze, wkna (gwnie celuloza) s gwnym rdem energii po ich rozoeniu przez mikroorganizmy do octanu, pro-pionianu i malanu. Te ostatnie s wchaniane i dostaj si do krenia wrotnego. Fermentacja zachodzca w jelicie grubym moe pokry pewn cz zapotrzebowania energetycznego rwnie u czowieka (ok. 27% przy spoywaniu pokarmw o maej zawartoci wkien). W tym procesie powstaj rwnie gazy, takie jak metan (CH4.), dwutlenek wgla (CO2 ) oraz wodr (H2), U czowieka dua zawarto wkien w pokarmach wywiera korzystny wpyw na konsystencj stolca. Wkna, zatrzymujc wod przy przechodzeniu treci pokarmowej przez jelita, zwikszaj mas kaow i sprawiaj, e ma ona luniejsz konsystencj. Przy spoywaniu pokarmw o duej zawartoci wkien stwierdza si mniej sz czsto wystpowania uchykowatoci jelit, raka jelita grubego,, chorb serca, naczy i cukrzycy. Wkna trudniej rozpuszczalne, takie jak celuloza i lignina, wystpujce w ot rbach pszenicy, wykazuj korzystny wpyw na czynno jelita grubego, natomiast bardziej rozpuszczalne wkna rolin strczkowych i owocw, tj. gumy i pektyny, zmniejszaj stenie cholesterolu we krwi, najpewniej dziki wizaniu kwasw ciowych i cholesterolu zawartego w pokarmach. Ponadto wkna roz puszczalne zwalniaj oprnianie si odka, opniaj wystpowania i zmniejszaj nasilenie wzrostu glikemii poposikowej i, co za tym idzie,
gii moe by wystarczajcy. Czsto spotyka si postacie porednie. ZAPOTRZEBOWANIE NA GLUKOZ MOG POKRYWA RN E POSTACI E WG LOWODANW Liczne tkanki potrzebuj glukozy dla swoich przemian. Nie musi ona by dostarczana jako taka z pokarmami, poniewa moe powsta z rozpadu innych wglowodanw pokarmowych, np. przez trawienie skrobi w przewodzie pokarmowym lub przez konwersj fruktozy lub galaktozy w wtrobie (p. str. 246). Glukoza powstaje rwnie z gliccrolu (bdcego produk-
YWIENIE / 727
zmniejszaj wydzielanie insuliny. To zjawisko jest korzystne dla chorych na cukrzyc oraz chorych przestrzegajcych okrelonej diety, pozwala ono bowiem unikn gwatownego spadku glikemii, pobudzajcego apetyt.
LIPIDY S NIEZBDNE JAKO NONIKI WITAMIN ROZPUSZCZALNYCH W TUSZCZACH ORAZ RDO EGZOGENNYCH KWASW TUSZCZOWYCH
Cho lipidy czsto zapewniaj znaczn cz dobowego zapotrzebowania energetycznego, nie jest to ich istotna funkcja. Oprcz tego, e poprawiaj one smak potraw oraz wywouj uczucie sytoci, speniaj one dwie istotne funkcje w ywieniu ssakw. S nonikiem dla witamin rozpuszczalnych w tuszczach oraz dostarczaj egzogennych, wielo-nienasyconyeh kwasw tuszczowych, ktrych ustrj nie potrafi syntetyzowa. Trzy wielo-nienasycowe kwasy tuszczowe uwaa si za niezbdne w diecie przynajmniej niektrych zwierzt. S to kwas linolowy (OD 6, 18:2), kwas a-linolenowy { 3, 18:3) i kwas arachidonowy (w 6, 20j4), Kwasy te wystpuj w lipidach pokarmw pochodzenia rolinnego i zwierzcego (p. tab. 16-2). Omwienie przemiany tych kwasw p. rwnie rozdz. 25. U czowieka kwas arachidonowy moe powsta z kwasu linolowego, dlatego te przy duej poday tego ostatniego z pokarmami, kwas arachidonowy nic jest niezbdnym skadnikiem pokarmowym. Przedmiotem dyskusji jest, czy kwas a-linolenowy jest rzeczywicie kwasem niezbdnym (egzogennym) u czowieka (p. str. 276). Niedobr kwasu linolowego spotyka si rzadko. Moe on wystpi u dzieci karmionych mlekiem odtuszczonym oraz u chorych, u ktrych stosuje si ywienie doylne pozbawione tuszczw. Podstawow funkcj niezbdnych (egzogennych) kwasw tuszczowych jest to, e s prekursorami leukotrienw, prostaglandyn i trom-boksanw (p. ryc. 25-6) dziaajcych jako hormony miejscowe". Dieta, w ktrej 12% caodobowego zapotrzebowania energetycznego jest pokrywane egzogennym kwasami tuszczowymi, zapobiega wystpieniu klinicznych objaww ich niedobo ru.
W licznych badaniach wykazano wystpowanie dodatniej korelacji midzy czstoci wystpowania choroby wiecowej serca a steniem cholesterolu w surowicy krwi oraz iloci spoywanych tuszczw, w tym szczeglnie nasyconych kwasw tuszczowych (p. rozdz. 28). Ponadto stwierdzono zwizek midzy duym spoyciem tuszczw a wystpowaniem raka piersi i jeiita grubego. Gwnymi rdami nasyco nych kwasw tuszczowych dla czowieka s miso przeuwaczy, przetwory mleczne i utwardzona margaryna. Cholesterol wystpuje tylko w pokarmach pochodzenia zwierzcego, w tym szczeglnie w tku jaa*.
Istnieje pewna zaleno miedzy konsumpcj tuszczw a wystpowaniem niektrych chorb
WITAMINY SPENIAJ RNORODNE FUNKCJE BIOLOGICZNE

Witaminy s organicznymi rodkami odywczymi, niezbdnymi w niewielkich ilociach w rnorodnych procesach biochemicznych, Z reguy zwizki te nie s syntetyzowane przez czowieka, dlatego musz by dostarczane z pokarmami. Zapotrzebowanie dzienne na poszczeglne witaminy u czowieka wyraa si w miligramach, a nawet mikrogramach. Witaminy dzieli si na dwie due grupy, tj. na witaminy rozpuszczanie w wodzie (szczegowo scharakteryzowane w rozdz. 53) oraz witaminy rozpuszczalne w tuszczach (opisane bardziej szczegowo w rozdz. 54). Do witamin rozpuszczalnych w wodzie zalicza si kompleks witamin grupy B (tiamina, rybo-flawina, niacyna, kwas pantotenowy, witamina B6, biotyna, witamina B12 i kwas foliowy) oraz kwas askorbinowy (witamina C). Witaminy rozpuszczalne w wodzie po wchoniciu przez jelita dostaj si do krenia wrotnego. Nadmiar ich jest wydalany z moczem. Wikszo witamin tej grupy nie jest magazynowana w ustroju w wikszych ilociach, co sprawia, e musz one by cigle dostarczane z pokarmami. Wyjtkami od reguy s kwas askorbinowy (zapasy ustrojowe wystarczaj na ok, 3 miesice), kwas foliowy (pewne iloci tej witaminy s magazynowane w wtrobie) oraz witamina B12 (zapasy tej witaminy w wtrobie wystarczaj na pokrycie zapotrzebowania na kilka lat). Nadmierna poda witamin rozpuszczalnych w
728 / ROZDZIA 55
wodzie jest na ogl dobrze tolerowana. Wyjtkami od reguy s niacyna (podana pod postaci kwasu nikotynowego), kwas askorbinowy i pi-rydoksyna (witamina B 6), ktrych nadmiar moe by przyczyn objaww ubocznych. mina A, D, E i K) zawarte s w tuszczach pochodzenia rolinnego i zwierzcego. S one
Witaminy rozpuszczalne w tuszczach (wita-
trawione, nastpnie wchaniane w jelitach oraz wbudowywane do chylomikronw. Te ostatnie, po dostaniu si do krwi drogami limfatycznymi, s czciowo rozkadane przez tkanki obwodowe. Powstae remnanty cnylomikro nowe s wychwytywane przez wtrob. Wtroba jest gwnym magazynem witamin A, D i K za tkanka tuszczowa gwnym magazynem wita-
Tabela 56-5. Zespoy chorobowe podatne na podawanie witamin. Przykady swoistych defektw zaburzonego metabolizmu kofaktorw witaminowych ulegajcych korekcji przy podawaniu zwykle bardzo duych dawek witamin" Witamina Biotyna Witamina B|: Kwas foliowy Niacyna Pirydoksyna (witamina B6) Choroba Kwasica propionowa Acyduria metylomalonowa Upoledzenie wchaniania folianu Choroba Hartnupw Drgawki noworodkw Cystationinuria Homocystynuria Defekt biochemiczny Karboksylaza propionylo-CoA Tworzenie koenzymu kobamidowe-go Transport kwasu foliowego Transport tryptofanu Dekarboksylaza kwasu glutaminowego (?) Cystationinaza Syntaza cystationi nowa
Tiamina
Hiperalaninemia Kwasica mlecza Dehydrogenaza pirogronianowa nowa reaktywna na podanie tiaminy
"Wedug: Herman R. H., Stifel F. B., Greene H. L: Vitamin -deficient state and other related disease. W: Disorders of the Gastrointestinal Tract: Disorders of the Liver. Nutritionai Disorders. Grune and Stratton, 1976. Tabela 55-6. Charakterystyka istotnych" (niezbdnych) ma kro mineraw Funkcje Metaboliz m* Choroba z nie- Choroba lub Nazwa doboru lub obobja w y w yjawy spowowoane nad dowane niemiarem** doborem
1 2 3 4
rda***
5 Objawy toksycznoci spowodo wane nadmiernym wchanianiem Ca z przewodu pokarmowego spowodowane przedawkowaniem witaminy D, nad-czynnoci przy-tarczyc lub hi-perkalcemi idio-patyczn
Wap
Skadnik koci i zbw; regulacja czynnoci nerww i mini
Wchanianie wymaga obecnoci biaka wicego wap. Regulacja przemiany Ca przez parationrton, kal-cytonin, wita min D itd.
U dzieci krzywica. U dorosych osteomalacja. Moe uczestniczy w patoge nezie osteoporo-zy
Produkty mleczne, fasola, jarzyny liciaste
YWIENIE / 729 ad. tab. 55-6

1
3 Nieznana jest kontrola wcha niania z przewodu pokarmowego (wit. D?). Stenia w surowicy s regulo wane resorpcj zwrotn w kanalikach nerkowych Regulowany przez aldosteron
Fosfor
Skadnik koci. zbw, ATP, fosforylowanych metabolitw porednich, kwasw nukleinowych
U dzieci: krzywica. U dorosych: osteomalacja
Niski iloraz Ca:P Pokarmy bojest przyczyn gate w fosfor. wtrnej nad- przyprawy czynnoc przytarczyc i moe by przyczyn utraty masy kostnej
t
Sd
Potas
Gwny kation pynu pozakomrkowego. Uczestniczy w regulacji wolemii, rwno wagi kwas owo zasadowej, czynnoci nerww i mini. Skadnik Na+/K+ ATP-azy Gwny kation pynu rd komrkowego. Udzia w czyn noci nerww. + + mini, Na /K ATP-azy Udzia w przemianie wodnej i elektrolitowej. w powstawaniu kwasu solnego w soku odkowym
Przy normalnej diecie brak objaww. Rne objawy zalene od przyczyny chorobowej lub czynnika wywoujcego niedobr
Nadcinienie t- Sl kuchenna. tnicze (u osb sl dodana do wraliwych na pokarmw sd) **
Chlorki
Magnez
Skadnik koci, kof aktor enzymw {kinaz, itd.)
Take regulowa- Niedobr spony przez aldoste- wodowany choron rob podstawo w lub stosowaniem lekw moczopdnych. Objawy: osabienie lub poraenie mini, spltanie Podawanie pokarmw bezsolnych niemowl tom, wymioty, podawanie lekw moczopd nych, tubulopatie nerkowe Niedobr wtrny spowodowany wadliwym wchanianiem, biegunkami, alkoholizmem
Zatrzymanie Jarzyny, owoczynnoci serca, ce, orzechy mae owrzodzenia jelit
Sl kuchenna
Zanik odruchw Liciaste, zielogbokich, de- ne jarzyny (zapresja oddycha- wierajce chlonia rofil)
* Na ogl wchanianie skadnikw mineralnych wymaga biaek transportowych. Wchanianie rzadko jest cakowite. Wpyw maj tu inne skadniki pokarmowe (np. szczawiany i fitany chelatuj kationy dwuwartociowe). Transport i magazynowanie skadnikw mineralnych take wymagaj swoistych biaek. Wydalane s z kaem (nie wchonite skadniki pokarmowe), moczem, potem lub ci. ** Nadmierny pobr skadnikw pokarmowych wywouje objawy toksyczne. Jeli nie s one specjalnie wymienione w tej rubryce, wwczas charakteryzuj si nudnosctami, biegunkami i drazliwoci. *** Zapotrzebowanie na skadniki mineralne pokrywane jest przez spoywanie odpowiednich iloci produktw zboowych (ziarna zb, niepolerowane), warzyw strczkowych, zielonych i liciastych jarzyn, misa oraz produkt w mlecznych.
730 / ROZDZIA 55
miny E. Witaminy rozpuszczalne w tuszczach nie s wydalane z moczem. Przy nadmiernej ich poday mog wystpi objawy zatrucia (szczeglnie po nadmiernej poday witaminy A i D). W tabeli 55-5 zestawiono choroby spowodowane upoledzonym metabolizmem kofakto-rw witaminowych, podatne na leczenie swoistymi witaminami. Zmniejszona dostpno witamin, spowodowana niedoborami pokarmowymi lub innymi czynnikami, np. zaburzeniami wchaniania jelitowego, jest przyczyn swoistych zespow niedoborowych (p. te rozdz. 53 i 54).
Skadniki mineralne s niezbdne zarwno w czynnociach fizjologicznych, jak i w procesach bioch em iczn ych Skadniki mineralne mona arbitralnie podzieli na: I) makrom moray (niezbdne w ilociach wikszych ni 100 mg/d i 2) mikromineraty (pierwiastki ladowe), na ktre zapotrzebowanie dobowe jest mniejsze ni 100 mg. W tabeli 55-6 zestawiono waciwoci makromineraw, za w tab. 56-7 waciwoci elementw ladowych.
Tabala 55-7. Charakterystyka istotnych" (niezbdnych) mikromineraw (elementw ladowych)

Nazwa Funkcje Metabolizm* Choroba z niedo- Choroba lub obboru lub objaw y jaw y w yw oane spowodowane nadmiarem" niedoborem 4
Objawy nietolerancji gluko zy. Niedob r sp o wo do wany ywieniem pozajelito wym Objawy niedoboru witaminy B12 Niedokrwisto nie-dobarwliwa, mikro-cytam a. Niedobr wywoany wadliwym y wieniem. Zesp Men-kesa U d zieci: m atoect wo. U dorosych: wole i nied oc zyn- no tarczycy, obrzk luzowaty Niedokrwisto sy-deropeniczna, mik-rocytarna Nieznaneuc zowie ka
rda"
1
Chrom
2
Chrom trjwarto ciowy, skadnik czynnika tole rancji glukozy" Potrzebny tylko jako skadnik witami ny B12 Skadnik oksydaz, oksydazy cytochro-mu c, itd. Skadnik "tyroksyny i trijodotyro niny Skad nik e nzym w hemowyc h, hemoglobiny, cytochromw itd. Kofaktor hydrolaz, de-karboksylaz i trans-feraz. Potrzeb ny w syntezie glikoprote-in i proteoglikanw
3
Jak witaminy B 1S Transportowana przez albuminy, zwizana przez cerulopiazmi- n Mag azyno wany w tarczycy jako tyreo-globulina Transportowane przez transfaryny, magazynowanie jako ferrytyna lub hemo-syderyna. Utrata e laza jest spowodowana krwawieniami i zuszczaniem si nabo nk w
Kobalt
Mied Jod elazo Mangan
Rzadko spotykane Pokarm y pochodzenia Choroba W ilsona Nadczynno tar - zwierz cego Sl jodowana, czycy, wole Syderoza, wrodzo - ryby i skorupiaki na morskie hemochfomato-za Inhalacja par m an- elazne ganu wywouje ob - naczynie do jawy psychozy i parki gotowania mi sa nson i zm
YWIENIE / 731
cd. tab. 55-7

Skadnik oksydaz (np. oksydazy ksantyno-wej) Skadnik peroksyda-zy glutationowej Dziaa synergistycz-niez witamin Ejako antyoksydant
Molibden
Objawy niedoboru mog by spowodowane ywieniem pozajelitowym Niewielki niedobr powstaje przy ywieniu potrawami wyrosymi na glebach ubogich w selen. Niedobr jest najczciej spowo dowany ywieniem pozajelitowym i wadliwym ywieniem biakowo -kalorycznym Hipogonadyzm, zaburzenia wzrostu, upoledzone goje-nie si ran, zaburzenia czucia smaku i wchu Niedobr wywoany ywieniem pozajelitowym lub przez acroder-maitis enteropathi-ca Podawany w mega-dawkach wywouje wypada nie wosw, stany zapalne skry, drazliwo
Selen
Cynk Kofaktor licznych enzymw (dehydro-genazy mleczano-wej, fosfatazy zasadowej, anhydrazy wglanowej)
Podranienie przewodu odkowo -jelitow ego, wymioty
Fluor* Zwiksza twardo koci i zbw
Prchnica zbw, Fluoroza zbw osteopcroza?
Woda pitna
" Nadmierny po br mikro elementw wy wo uje o bjawy to ksyczne. Jeli nie s o ne specjalnie wymieniane w tej rubryce, wwczas charakteryzuj si nudnociami, biegunkami i draliwoci " Zapotrzebowanie na mikroelementy pokrywane jest przez spoywanie odpowiedniej iloci produk tw zboowych (ziarna zb niepolerowane), warzyw strczkowych, zielonych i liciastych jarzyn, misa i produktw mlecznych. "* Fluor jest niezbdny dla wzrostu u szczurw. Pomimo, ze nie udowodniono jednoznacznie, ze jest niezbdny rwnie dla czowieka, pierwiastek ten odgrywa okrelon rol w zapobieganiu prchnicy zbw.
ZALECANE NORMY YWIENIOWE

Komisja ywienia i ywnoci Narodowej Rady do Spraw Bada Naukowych (Food and Nutritional Board of the Natiooal Research Council) opublikowaa list dobowego zapo trzebowania na niezbdne skadniki pokarmo we
jako Zalecane Normy ywieniowe (Recom-mended Dietary Allowances) {tab.
powinna zawiera rnorodne potrawy, zapew-
55-8). Normy te dotycz wikszoci osb okrelonej populacji yjcych w zwykych warunkach rodowiskowych. Nie dotycz one zapotrzebowania dla osb wymagajcych uzupeniajcego lub specjalnego ywienia z powodu choroby. Dieta
niajce pokrycie zapotrzebowania na dobrze znane i mniej dokadnie zdefiniowane skadniki pokarmowe. W tabeli 55-8 podane jest dobowe zapotrzebowanie na biaka, 10 witamin i 6 skadnikw mineralnych. Mao jest jeszcze danych, by dokadnie sprecyzowa zapotrzebowanie na pozostae witaminy i skadniki mineralne. Pomimo tego w tab. 55-9 podano zapotrzebowanie na te skadniki, ktre wydaje si by zarwno bezpieczne, jak i wystarczajce. Aby unikn stanw niedoborowych, trzeba pokry zapotrzebowanie na wszystkie niezbdne skadniki pokarmowe. Przyczynami niespe-
732 / ROZDZIA 55 Tabela 55-8. Zalecane normy ywnociowe (poprawki z 198S r). Zabezpieczaj one utrzymame dobrego
Wi ek (lata) Waga W zrost Biaka ( 0) Witaminy rozpuszczalne w t uszczach Wl t. Wi t. D Wit. E A lwV (mg a -TE) W RE) ' 375 7,5 10 3 375 4 6 400 10 10 77 500 10 700 1000 10 10 10 1000 10 10 1000 10 10 1000 10 55
IOOO
Wit. K
kg
ft
cm 13 20 29 44 62 99 14S 160 174 170 101 120 128 138 143

BO71 90 112 132 157 176
cale 24
28
da!
5 10 15 20 30 45 65 70 80 80 45 56 60 65 65
65 65
W r t . C Tiami-n a (mg) (mg)

30 3&
Dzieci
0,0-0,5 0,5-1.0 1-3 4-6 7-10 11-14 15-18 19-24 25-50 51 + 11-14 15-18 19-24 25-50 51 +
69 13 20 28 45 66 72 79 77 46 56 58 63 65
35 44 52 52 69 70 70 68 B2 64 65 64 63
Mczyni
177 176 173 157 163 164 163 160
13 ;A 16 24 28 45 59 56 63 63 46 44 46 50 50
60 65
0,3 0.4 0,7 0,9 1,0 1.3 1,5 1,5 1.5 1,2 1,1 1,1 1,1 1,1 1.0
40 45 45 50 60 60 60 60 60 60 60 60 60
70 35
Kobiety
800 800 800 800 800

800
10 10 10 55
B8 88 8
Kobiety ciarne Kobiety karmice piersi
10 10
10 12
1.5 1,6
1300
* Rwnowanik retinolu 1 rwnowanik retrnolu - 1 v& retinolu lub 6 fig p-karotenu ' Jako chnlekalcyferol. 10 lig cholekalcyferolu = 400 IU witaminy D ** Rwnowanik ot -tokoferolu. 1 mg a-tokoferolu = 1 TE 1 NE (rwnowanik niacyny) jest rwny 1 mg niacyny lub 60 mg tryptofanu zawartego w pokarmach
niania tego warunku s najczciej ignorancja lub ze warunki ekonomiczne. Z drugiej strony wystpuj pewne choroby spoeczne spowodowane nadmiernym spoywaniem niektrych skadnikw pokarmowych. I tak otyo jest najczciej spowodowana nadmiernym poborem pokarmw energetycznych. Sprzyja ona powstawaniu cukrzycy insulinoniezalenej. Nadmierne spoywanie tuszczw, a szczeglnie tuszczw zawierajcych nasycone kwasy tuszczowe, sprzy-
ja powstawaniu miadycy i choroby wiecowej
serca. Rwnie czsto wystpowania raka piersi, jelita grubego i gruczou krokowego wykazuje dodatni korelacj z iloci spoywanych tuszczw. Nadmierne spoywanie soli zwiksza czsto wystpowania wyleww krwi do mzgu i
nadcinienia ttniczego.
Wiele organizacji na caym wiecie zajmowao si badaniem skadu rnorodnych diet i wydawao zalecenia majce na celu popraw od -
Tabela 55-9. Dobowe zapotrzebowanie na wybrane witaminy i skadniki mineralne. Podane iloci s zarwno wystarczajce, jak i bezpieczne.
wnam Wiek (lata) Biony
Pier wiastki ladowe Mi ed* (n9) 0,4-0,6 0.6-0.7 0,7-1.0 1,0-1,5 1,0-2.0 1,5-2,5 Mangan (me) 0,3-0,6 0,6-1,0 1,0-1,5 1,5-2,0 2,0-3.0 2,0-5,0 Fluorki (mg) 0.1-0,5 0,2-1,0 0,5-1.5 1,0-2,5 1,5 2.5 1,5-2,5 Chrom (mg) 0,01-0,04 0,02-0,06 0,02-0,08 0,03-0,12 0,05 0.2 0,05-0,2 M olibden d-9) 15-30 20-40 25-EO 30-75 60-150 75-250
Elektrolity
pannowy (mg)
.
Sd (mg) 115-350 250 750
Potas (mg)
Chl orki ( mg)
Nitimowlta Dzieci
0-0,5 0.5 1
1-3 4-6
10 15 20 25 30
2 3 3 3-4 4-6 47
350-925 276-700 425-1275 400 1200
326 7S 550-1650 S00 1500 450-1350 775-2325 700-2100 modzie 7-10 500 1800 1000-3000 925-2775 > 11 30-100 900-2700 1525-4575 1400-420 4-7 Doroli 30-100 1,5-3,0 2,0-5,0 1,5-4,0 0,05-0,2 75-250 1100-3300 1875-6625 0 1700-510 0 Tir,-3 i 55-9 wzito z: Recommended DietaryAllowances Wyd.iO.Foodand Nutrition Board, National Research Council -Natianal Academy of Science, 1989
YWIENIE / 733 stanu odywienia dla wikszoci zdrowych mieszkacw Stanw Zjednoczonych Ameryki P nocnej
Witaminy rozpuszczalna w wodzie RybOf lawina (mg) 0.4 0,5 0.8 1,1 1,2 1.5 1,8 1.7 1,7 1,4 1,3 1,3 1,3 1,3 1.2 1.6 i.B Niaeyna (mg NE )*" * 5 6 S 12 13 17 20 19 191 B 1 B16 15 15 13 17 20 Wit.B 1t Wi. B, F o lian <ng) l>9) (mg) 0,3 0,6 1,0 1,1 1,4 1,7/' 2, 0 2, 0 2, 0 2, 0 25 35 50 75 0,3 0,5 0.7 1,0 1.4 2,0 2.0 2,0 2.0 2,0 2,0 2.0 2,0 2,0 2,0 2,2 2,6 Wap (mg) 400 600 800 Fosfor (mg) 300 500 800 800 800 1200 1200 1200 800 800 1200 1200 1200 800 800 1200 1200 Skadniki mineralne Magnez (mg) 40 60 80 120 170 270 400 350 350 350 280 300 280 280 280 320 elazo (m 6) 6 10 10 10 10 12 12 10 10 10 15 15 15 1510 ' 30 15 Cynk (mg) 5 B 10 10 10 15 15 15 15 15 12 12 1212 Jod (|.g> 40 50 70 90 120 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 175 200 Selen Cug) 10 15 20 20 30 40 50 70 70 70 45 50 56 55 55 65 75
oo
150 200 200 200 200 150 iao 180 180 180 400 280
aoo
800 1200 1200 1200 800 800 1200 1200 1200 800 800 1200 1200
1 , 4 1, 5 1, 6 1, 6 1, 5 2,2 2,1
(i 12
16 19
3B6
ywiania si czowieka. Zalecenia te mona podsumowa w sposb nastpujcy: 1. Przy wystpowaniu nadwagi naley zmniejsza warto kaloryczn diety, aby osig n prawidow mas ciaa. Naley stopniowo zmniejsza ilo spoywa nych tuszczw zastpujc je wglowodanami. Wikszo wglowodanw naley spoy wa pod postaci wielocukrw, a nie cukrw prostych. Wikszo spoywanych tuszczw po winny stanowi kwasy tuszczowe wielo- i jednonienasycone, natomiast mniejsz cz nasy cone kwasy tuszczowe. Naley zmniejszy spoycie cholesterolu i soli. 6, Naley zwiksza zawarto wkien w diecie.
PIMIENNICTWO
Cummings JH: Dietary Fibr. Brit Med Bul! 1981;37:65. Forbes JM: Metabolic aspects of the regulation of voluntary food intake and appetite. Nutr Res Rev 1988;1:145. Kritchevsky D: Dietary Fiber. Annu Rev Nutr 1988;8:3O1. Nestle M: Nutrition in Clinical Practice. Jones Medical Publications, 1985. Nielsen FH: Nutritional significance of uitratrace elements. Nutr Rev !988;46:337. Olson RE et al (editors): Present Knowedge in Nutrition. 5th ed. The Nutrition Foundation Inc, Washington, DC, 1984. Passmore R, Eastwood MA: Human Nutrition and Dietetics, 8th ed. Churchill Livingstone, 1986, Woo R, Daniets-liush R, Horton, ES: Regulation of energy balance. Annu Rev Nutr 1985;5:411.
56
WPROWADZENIE
Trawienie i wchanianie
Wikszo spoywanych potraw nie moe by wchaniana z przewodu pokarmowego bez uprzedniego trawienia do mniejszych czsteczek. Proces dezintegracji naturalnych rodkw spoywczych do postaci wchanialnych w przewodzie pokarmowym nazywa si trawieniem. Zmiany chemiczne zwizane z trawieniem zachodz w wyniku dziaania enzymw hydro-Htycznych zawartych w sokach trawiennych przewodu pokarmowego, katalizujcych hydroliz biaek do aminokwasw, skrobi do monosacharydw i triacylogliceroli do mo-noacylogliceroli, glicerolu i kwasw tuszczowych. W przebiegu tych procesw trawiennych skadniki mineralne i witaminy zawarte w rodkach spoywczych staj si bardziej przyswajalne. Dokadne omwienie struktury i funkcji hormonw odkowo-jelitowych przedstawiono w rozdz. 52. ZNACZENIE BIOMEDYCZNE Zaburzenia wprocesach trawiennych s przyczyn niektrych stanw chorobowych takich jak owrzodzenie odka spowodowane kwasem solnym soku odkowego albo brak HC] bdcy przyczyn achlorhydrii. Nieprawidowe wydzielanie ci jest przyczyn powstawania kamieni ciowych i moe spowodowa zaburzenia w trawieniu tuszczw. Wadliwe wchanianie skadnikw pokarmowych, spowodowane bardzo licznymi defektami, czsto jest przyczyn niedoborw pokarmowych. I tak np. upoledzone wchanianie witaminy B12 i folianw jest przyczyn niedokrwistoci, wapnia i magnezu tyczki, witaminy D krzywicy
u dzieci i osteomaiacji u dorosych. W zespole wadliwego wchaniania wystpuj ww. i inne jeszcze zaburzenia. Niedobr laktazy jest przyczyn nietolerancji mleka, za zaburzenia wchaniania aminokwasw obojtnych choroby Hartnupw. PROCES TRAWIENIA ROZPOCZYNA SI W JAM IE USTNEJ lina wydzielana przez linianki skada si w 99,5% z wody. Sprawia ona, e pokarmy staj si lepkie i liskie, co jest wane w procesie ucia i poykania. Dodanie wody do suchych pokar mw umoliwia rozpuszczanie niektrych skadnikw pokarmowych i rozpoczcie trawienia przez hydrolazy. Przez ucie pokarmy ulegaj rozdrobnieniu, dziki czemu wzrasta ich roz puszczalno i powierzchnia oraz podatno na dziaanie enzymw. lina jest rwnie pynem, z ktrym s wydalane niektre Jki (np. etanol i morfina), nieorganiczne jony, takie jak K+, Ca2+ , HCOj i rodanki (SCN") oraz jod i im- munoglobuiny (IgA). pH liny wynosi najczciej 6,8, chocia moe by wysze i nisze od pH obojtnego. lina zawiera amylaz i lipaz Amylaza zawarta w linie wykazuje zdolno rozkadania skrobi i gkogenu do maltozy. Proces ten nie ma jednak wikszego znaczenia dla ustroju, poniewa pokarmy przebywaj w jamie ustnej krtko, a amylaza liny ulega inaktywacjj przy pH 4,0 lub niszym, co oznacza, e jest nieczynna w kwanej treci odkowej. U licznych zwierzt amylaza w ogle nie wystpuje w linie. Gruczoy Ebnera, pooone na grzbiecie jzyka, wytwarzaj lipaz ,Jzyko-w".
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 735
TRAWIENIE BIAEK ROZPOCZYNA SI W ODKU Bona luzowa odka wydziela sok odkowy. Jest on pynem przejrzystym o zabar wieniu lekko tawym i pH ok. 1,0, zawierajcym 0,20,5% HC1. Zawarto wody w soku odkowym wynosi 9799%. Pozostae skadniki to: mucyna, sole nieorganiczne, enzymy trawienne (pepsyna yrennina) i lipaza. Kwas solny denaturuje biaka i zabija bakterie rdem kwasu solnego s komrki okadzinowe bony luzowej odka. Jest on wynikiem reakcji przedstawionych na ryc. 56-1. Proces ten jest podobny do transportu chlorkowego opisanego dla krwinek czerwonych. Istnieje rwnie pewne podobiestwo do mechanizmu wydzielania HT przez komrki kanalikw nerkowych, w ktrym rdem jonw H+ jest kwas wglowy (H2CO?) powstay z CO2 i H2O w wyniku dziaania anhydrazy wglanowej. Wydalanie zasadowego moczu po spoyciu pokarmw jest wynikiem powstawania wodorowglanu w procesie wydzielania kwasu solnego. Wydzielanie H+ do wiata odka jest aktywnym procesem, w ktrym uczestniczy bonowa H+/K+-ATP--aza. Enzym ten, w odrnieniu od Na+/K.+--ATP-azy jest niewraliwy na ouabain. Komrki okadzinowe odka zawieraj liczne mito-chondria potrzebne do produkcji ATP napdza-
jcego H+/K+-ATC-az. Jon HCO^ przenika do osocza, za miejsce jego zajmuje Cl . Wydzielanie tego ostatniego do wiata odka jest sprzone z wydzielaniem H+. W nastpstwie kontaktu z kwasem solnym, biaka ulegaj denaturacji, tj. dochodzi do utraty struktury trzeciorzdowej w wyniku rozerwania wiza wodorowych. W wyniku tego procesu acuchy polipeptydowe ulegaj wyprostowaniu" stajc si bardziej dostpne na dziaanie enzymw proteolitycznych (proteaz). Niskie pH treci odkowej wywiera ponadto dziaanie bakteriob jcze na mikroorganizmy zawarte w treci odkowej. Pepsyna rozpoczyna trawienie biaek Trawienie biaek jesti^wn funkcj odka. Pepsyna wytwarzana jest przez komrki gwne pod postaci nieczynnego zymogenu--pepsynogemi. Ten ostatni ulega aktywacji pod wpywem jonw wodorowych. W procesie tym zostaje odszczepiony protekcyjnie dziaajcy polipeptyd odsaniajc aktywn pepsyn. Z kolei aktywna pepsyna szybko aktywuje dalsze czsteczki pepsynogenu (proces ten okrela si jako autokataliz). Pepsyna rozkada zdenatu-rowane biako do proteoz, a nastpnie do peptonw. ktre s duymi polipeptydami. Pepsyna jest endopeptydaz rozkadajc wizanie peptydowe znajdujce si w obrbie gwnej struktury polipeptyd owej, a nie wizania pep-tydu przylegaj cego do C- lub N-kocw. Te
Osocze
Komrki okadzinowe
wiato
odka
cr
Ryc. 56-1. Wytwarzanie kwasu solnego w odku. , H . K -ATP-a;a.
736 / ROZDZIA 56
ostatnie wizania s atakowane przez egzopep-tydazy. Pepsyna hydrolizuje wizania peptydo-we utworzone przez aminokwasy aromatyczne (np. przez tyrozyn) lub dikarboksylowe (np. przez glutaminian). Ren ni na (chymozyna) wywouje koagulacj mleka Enzym ten jest wany dia procesw trwa-wiennych u niemowlt, zapobiega on bowiem szybkiemu przedostawaniu si mleka z odka do jelit. W obecnoci wapnia rennina przeksztaca w sposb nieodwracalny kazein do parakazeiny, na ktr dziaa z kolei pepsyna. Rennina nie wystpuje w odku osb dorosych. Stosuje si j w produkcji sera. Lipazy kontynuuj trawienie triacylogliceroli Temperatura panujca w odku jest istotna dla procesu przeksztacania tuszczw staych, zawartych w pokarmach do postaci pynnej. Temu procesowi towarzyszy powstawanie emulsji tuszczowych. Proces ten wspomagaj ruchy perystaltyczne odka. Sok odkowy zawiera lipaz odkowa"' katalizujc hydroliz tria-cylogliceroli zoonych z kwasw tuszczowych o krtkich lub duszych acuchach. Ponadto lipaza linowa moe kontynuowa swoje dziaanie w odku pomimo niskiegio pH treci odkowej dziki obecnoci emulsji tuszczowych. Poniewa czas przebywania pokarmw w odku wynosi 24 h, moe tu zosta strawione a 30% spoytych triacylogliceroli. Lipaza linowa dziaa silniej na triacyloglicerole zawierajce kwasy tuszczowe o krtszych acuchach i jest bardziej swoista dla wizania estrw w pozycji m-3 ni I. Tuszcze wystpujce w mleku zawieraj kwasy tuszczowe o krtkich lub rednio dugich acuchach, estryfikowane przewanie w pozycji sn-3. Dlatego te wydaje si, e tuszcze zawarte w mleku s szczeglnie dobrym substratem dla lipazy linowej. Uwolnione pod jej wpywem krtkoa-cuchowe kwasy tuszczowe przedostaj si poprzez cian odka do yy wrotnej, podczas gdy dugoacuchowe kwasy tuszczowe rozpuszczaj si w kroplach tuszczowych zawieszonych w treci odkowej i transportowane s do dwunastnicy.
PROCES TRAWIENIA JEST KONTYNUOWANY W JELITACH Zawarto odka, czyli miazga pokarmowa, przedostaje si maymi porcjami w sposb nie-cigy poprzez zastawk" odwiernikow do wiata dwunastnicy. Sekrecja zasadowego soku trzustkowego i zasadowej ci jest przyczyn neutralizacji miazgi odkowej i przesunicia jej pH w kierunku zasadowym. To przesunicie pH w kierunku zasadowym jest niezbdne dla aktywnoci enzymw soku trzustkowego i jelitowego. Rwnoczenie przy takim pH dochodzi do zahamowania aktywnoci pepsyny. tworzy zawiesin, zobojtnia miazg odkow i jest wydzielin, za porednictwem ktrej zostaj wydalone cholesterol i barwniki ciowe Oprcz wielu innych funkcji w poredniej przemianie materii wtroba jest miejscem produkcji ci odgrywajcej wan rol w procesie trawienia pokarmw. Pcherzyk ciowy magazynuje wytwarzan w okresach midzy posikami. W czasie trawienia pokarmw pcherzyk ciowy obkurcza si szybko dostarczajc przez przewd ciowy wsplny, do wiata dwunastnicy. Sok trzustkowy zostaje wymieszany z ci tu przed jego dostaniem si do dwunastnicy. A. Skad ci. Skad ci zawartej w prze wodach ciowych rdwtrobowych rni si od skadu ci w pcherzyku ciowym. Jak wida w tab. 56 -1 ta ostatnia jest bardziej zagszczona. B. Waciwoci ci
ciowych wykazuj zdolno zmniejszania napicia powierzchniowego. Dziki tej waciwoci kwasw ciowych tuszcze ulegaj zawieszeniu (tworz emulsj)^' za kwasy tuszczowe i nierozpuszczalne w wodzie myda rozpuszczeniu. Obecno ci w wietle jelit w istotnym stopniu wspomaga zarwno trawienie, jak i wchanianie tuszczw oraz witamin rozpuszczalnych w tuszczach (witaminy A, D, E i K). W razie upoledzenia trawienia tuszczw rwnie trawienie innych skadnikw pokarmowych zostaje upoledzone; tuszcze bowiem, tworzc warstw na spoytych pokarmach, uniemoliwiaj trawienie ich przez enzymy. W tych warunkach drobnoustroje jelito we, ata-
1. Tworzenie zawiesin. Sole kwasw -
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 737 Tabela 56-1 Skad ci wtrobowej i pcherzy kowej

w t ro b o w a natywna procentowa procentowa zawarzawar to to w stow caej sunku do ci wszystkich skad nik w pche rzykowa procentowa zawar to w c a- lej ci
staych Woda
Skadniki stae Kwasy ciowe Mu cyna i barwiki ciowe Cholesterol Kwasy tuszczo we estryfikowane i nieestryfiko-wan e Sole nieorganiczne Gsto 97,00 2,52 1,93 0,53 0,06 0,14

36,9 21,3
85,92 14,08 9,14 2,98 0,26 0,32
2,4 5,6
0,84
33,3
0,65
1,01 7,1-7,3
1,04 6,9-7,7
PH
kujc nie strawione pokarmy, s przyczyn wystpienia procesw gnilnych i tworzenia si gazw. Zobojtnienie tre ci odko wej. Oprcz zdolnoci tworzenia zawiesin, wy kazujc pH nieco wysze ni 7,0, neutralizuje kwan miazg odkow, przygotowujc j do trawienia w jelicie. Wydalanie cholesterolu. jest wan wydzielin, z ktr wydaiane s nie tylko cholesterol i kwasy ciowe, lecz take liczne leki, toksyny, barwniki ciowe oraz rnorod ne substancje nieorganiczne, takie jak miedz, cynk i rt. Ograniczona rozpuszczalno cho lesterolu w ci jest przyczyn tworze nia si kamieni ciowych. Wolny chole sterol jest praktycznie nierozpuszczalny w wo dzie; dlatego te w ci wystpuje w micelach zoonych z fosfatydylocholiny i soli kwasw ciowych (p. str. 187). W rzeczywistoci rw nie fosfatydylocholina (gwny fosfolipid ci) jest nierozpuszczalna w ci, ulega ona jednak rozpuszczeniu dziki soi om kwasw
47
ciowych tworzc z nimi micele. Tak wic due iloci cholesterolu zawarte w ci czowieka ulegaj solubilizacji dziki rozpuszczalnym w wodzie micelom i transportowi przez drogi ciowe do wiata jelit. Aktualna rozpuszczalno cholesterolu w ci zaley jednak od stosunku stenia soli kwasw ciowych do stenia fosfatydylocholiny i do stenia cholesterolu. Rozpuszczalno ta zaley rwnie od zawartoci wody w ci. Ten fakt jest szczeglnie wany dla rozcieczonej ci wtrobowej. Uywajc ukadu trjktnych wsprzdnych (ryc. 56-2) Redinger i Smali byli w stanie okreli maksymaln rozpuszczalno cholesterolu w ci pcherzykowej. W podanym ukadzie kady punkt (determinowany trzema zmiennymi) znajdujcyî ponad krzyw ABC dotyczy ci przesyconej cholesterolem lub w ktrej dochodzi do wytrcenia tego lipidu. Przyjmuje si, e uchorych z kamic ciow w pewnym okresie ich ycia wytwarzana jest przesycona cholesterolem. W pewnym momencie, pod wpywem sprzyjajcych czynnikw, stanowicych jakby jdro krystalizacyjne (np. infekcja bakteryjna) dochodzi do wytrcenia krysztakw cholesterolu. Jeli tak powstae krysztaki nie zostaj szybko wydzielone z ci do wiata jelita, mog. one rosn, tworzc kamienie ciowe. Kiedy oznaczono aktywno gwnych enzymw syntetyzujcych kwa sy ciowe w wtrobie u chorych z kamic ciow, stwierdzono ma ich aktywno, natomiast zwikszone wytwarzanie cholestero lu przez hepatocyty z nastpczym wzrostem stenia tego lipidu w wtrobie. Wydaje si, e spadek aktywnoci 7a -hydroksylazy jest przyczyn zmniejszenia si pufi kwasw ciowych w kreniu jejitowo -wtrobowym, bdcego dla wtroby sygnaem zapocztkowujcym wzrost syntezy cholesterolu. Skutkiem wzmoonej syntezy cholesterolu przez hepatocyty jest przesycenie ci tym steroidem, ktry nie jest w stanie rozpuci si cakowicie w micelach zoonych z fosfatydylocholiny i soli kwasw ciowych. Podane informacje dotyczce rozpuszczalnoci cholesterolu wykorzystano w prbach klinicznych majcych na celu zapobieganie powstawaniu nowych kamieni ciowych lub rozpuszczanie ju wytworzonych. Kwas chenodeoksy-cholowy wydaje si by lekiem przydatnym w leczeniu zachowawczym bezobjawowych i bezcieniowych kamieni ciowych zlokalizowanych w pcherzyku ciowym. Ten kwas
738 / ROZDZiA 56
60 40
-Procent soli kwasw --------------------------------------------ciowych Ryc. 56-2. Metoda gwnych skadnikw cio wych, cho lestero l) w ukadzie trjktnych K ady w procentac h cznej
Dwie lub wicej faz (krysztaki cholesterolu pyn mioelamy)
prezentacji trzech ci {sole kwasw fos-fatydylo cho lina i wsprzdnych skadnik wyra o ny jest Iloci so li kwas w
cio wych, fosfatydyloc ho liny i cho lestero lu wyrao nej w molach. Linia ABC przedstawia maksymaln rozpuszczalno cholesterolu w roztworach o zmiennej zawartoci soli kwasw cio wych i fosfatydylocholiny. Punkt P oznacza normalny skad ci, przy ktrym zawarto cholesterolu wynosi 5%, fosfatydylocholiny 15% i soli kwasw cio wych 80%. Znajduje si on w obrbie strefy pojedynczej fazy pynu micelarnego. o skadzie wyznaczonym punktami znajduj cymi si po wyej linii AB C zawiera nadmiar cho lesterolu w postaci roztworu przesyconego lub wytrconej (jako krysztaki lub pynne krysztaki). (Wedug: Redinger R. N., Smali D. M.: Bile co mposition, bile salt metabolism, and gallsto nes; A rch. intern. Med. 1972, 130, 620. Copyright 1972, A merican Medical Associatio n, za zgod).
ciowy wywiera bowiem swoiste dziaanie hamujce na reduktaze hydroksymetylogluta-rylo-CoA, przez co zmniejsza syntez cholesterolu w wtrobie.-vi. 5. Przemiana barwnikw cio wych. Powstawanie barwnikw ciowych z hemoglobiny zostao przedstawione w rozdz. 34. Sok trzustkowy zawiera enzymy atakujce wszystkie gwne skadniki pokarmowe Sok trzustkowy jest wodnistym, nielepkim pynem podobnym do liny pod wzgldem zawartoci wody, zawierajcym troch biaka i inne skadniki organiczne i nieorganiczne, w tym gwnie Na + , K+, HCO^" i chlorki oraz mae iloci Ca2 + , Zn2 + , HPOJ" i SO*". pH soku trzustkowego jest zdecydowanie zasadowe, waha si od 7,5 do 8,0 lub jest nawet wysze. Sok trzustkowy zawiera liczne enzymy. Niektre z nich wydzielane s jako zymogeny.
Tryp s yn a, ch ymo t ryp s yn a i el ast aza s endopeptydazami. Aktywno proteoli tyczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnoci 3 endopeptydaz, tj. trypsyny, chymo-trypsyny i elastazy. Dziaaj one na biaka i polipeptydy treci odkowej. W wyniku ich dziaania powstaj polipeptydy i (lub) peptydy. Trypsyna dziaa swoicie na wizania peptydo-we utworzone przez aminokwasy zasadowe, za chymotrypsyna na wizania peptydowe utworzone przez aminokwasj pozbawione adunku elektrycznego (np. aminokwasy aromatyczne). Wbrew swojej nazwie elastaza dziaa na wiele wiza peptydowych utworzonych przez mae aminokwasy, np, glicyn, alanin i seryn. Wszystkie 3 wymienione enzymy sa, wydzielane pod postaci zymogenw. Konwersja trypsyno-genu do trypsyny katalizowana jest przez enzym proteolityczny bony luzowej jelita enteroki-naze. Ta ostatnia, dziaajc na wizanie pep tydowe utworzone przez lizyn odszczepia may polipeptyd od zymogenu. W wyniku tego dzia-
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 739
lania czsteczka trypsyny rozprostowuje si, co jest rwnoznaczne z odsoniciem jej aktywnoci proteolitycznej. Powstaa aktywna posta trypsyny dziaa nie tylko na dalsze czsteczki trypsynogenu, lecz rwnie na inne zymogeny soku trzustkowego, przeksztacajc je w aktywne enzymy. I tak pod jej wpywem chymotryp-synogen ulega przeksztaceniu do chjmotryp-syny, proelastaza do elastazy i prokarboksypep-tydaza do karboksyjpeptydazy.
Karboksypeptydaza jest egzopepty-daz. Powstae pod wpywem
endopeptydaz polipeptydy ulegaj dalszemu rozkadowi hyd-rolitycznemu przez egzopeptydaz karboksype-ptydaz. Enzym ten dziaa na C-kocowe wizania peptydowe uwalniajc pojedyncze amino kwasy. Aktywno amylolityczna soku trzustkowego uwarunkowana jest obecnoci oc-amylazy trzustkowej. Dziaanie jej jest podobne do amylaz y linowej. Rozkada ona skrobi i glikogen do maltozy, maltotriozy (skadajcej si z 3 reszt ot-glukozowych poczonych ze sob wizaniami w pooeniu 1 -4), rozgazionych a-dekst-ryn (rozgazienia uwarunkowane s wizaniami midzy dwoma czsteczkami glukozy w pooeniu 1-^6), nierozgazionych oligosachary-dw4 glukozy.
Amylaza rozkada skrobi i glikogen.
Lipaza rozkada pierwszorzdowe wizanie esterowe triacylogliceroli. Li-
paza trzustkowa dziaa na granicy fazy wodnej i tuszczowej kropelek tuszczowych, utworzonych w przewodzie pokarmowym przez mechaniczne wytrzsanie treci pokarmowej w obecnoci produktw dziaania lipazy linowej i odkowej, soli kwasw ciowych, kolipazy (jest to biako obecne w soku trzustkowym), fosfolipidw i fosfolipazy A2 {wystpujcej rwnie w soku trzustkowym). Zarwno fosfolipa-za Aj, jak i kolipaza wydzielane s w postaci proenzymw (zymogenw). Do ich aktywacji konieczna jest hydroliza swoistego wizania peptydowego przez trypsyn. Aktywno fos folipazy A2 zalena jest od obecnoci jonw wapnia. Ograniczona hydroliza wizania est rowego w pozycji 2 fosfolipidu przez fosfolipaz A2 (p. ryc. 25-5) sprawia, e lipaza zostaje zwizana przez substrat na granicy faz oraz e zachodzi szybka hydroliza triacyloglicerolu. Kolipaza, wic si z faz graniczn zoon z soli kwasw ciowych, triacyloglicerolu i wody, stanowi jakby kotwic wysokiego powinowactwa dla lipazy. W wyniku cakowitej
hydrolizy triacyloglicerolu powstaj glicerol i kwasy tuszczowe. Naley jednak doda, e odszczepienie drugiego i trzeciego kwasu tuszczowego od czsteczki triacyloglicerolu jest coraz trudniejsze. Dziaanie hydrolityczne lipazy trzustkowej jest prawie swoiste dla pierwszo-rzdowych wiza estrowych, tj. dla wizania estrowego w pozycji 1 i 3 triacylogliceroli. W czasie trawienia tuszczw faza wodna lub micelarna" zawiera micele o ksztacie dyskw i liposomy zoone z soli kwasw ciowych nasycone produktami hpolizy (p. ryc. 15-34). Ze wzgldu na trudnoci hydrolizy drugorzc-dowego wizania estrowego w czsteczce triacyloglicerolu, wydaje si, e dochodzi najpierw do odszczepienia kwasw tuszczowych w pozycji 1 i 3 i powstania 2-monoacyl o glicerolu. Poniewa kwas tuszczowy tego ostatniego zwizku zwizany jest z glicerolem drugorzdowym wi zaniem estrowym, musi on ulec, przed ostatecznym odszczepieniem si od glicerolu, izomeracji z wytworzeniem pier wszo rzdowego wizania estrowego. Proces izomeracji jest jednak procesem powolnym. Ten fakt sprawia, e 2-monn-glicerole s gwnymi produktami kocowymi trawienia triacylogliceroli oraz e mniej ni \U spoytych tuszczw jest cakowicie rozkadana do glicerolu i kwasw tuszczowych (ryc. 56-3).
Estry cholesterolowe s rozkadane przez swoist hydrolaz. W warunkach
panujcych w wietle jelita estry cholesterolowe ulegaj rozkadowi przez hydrolaz estrw cholesterolowych (esteraze cholesterolow). Tak wic w jelitach wchaniany jest wolny (nieest-ryfikowany) cholesterol.
Rybonukleaza (RNA-za) i deoksyrybo-nukleaza (DNA-za) warunkuj
trawienie kwasw nukleinowych zawartych w pokarmach (p. rozdz. 38 i 39).
Fosfolipaza A3 katalizuje hydroliz drugorzdowego wizania estrowego glicerolofosfolipidw zarwno pochodze-
nia ciowego, jak i pokarmowego. W wyniku dziaania fosfolipazy A2 powstaj lizofosfolipi-dy. Enzymy soku jelitowego kocz proces trawienia Sok jelitowy, wydzielany przez gruczoy dwunastnicze (Brunnera) i jelitowe (Lieberkuhna), zawiera enzymy trawienne. Wrd nich naley wymieni nastpujce: 1. Aminopeptydaz (Jest to egzopeptydaza atakujca N -kocowe wizania peptydowe po -
740 / ROZDZIA 56
WIAT O JELITA
Absorpcja z micel; z so!i zoonych
ciowych
kwasw
| ---I ----- Aeyl I ----- Aeyl Chyiomlkrony
*-Gliceroi
Ryc. 56-3. Trawienie i wchanianie triacylogliceroli. FA dugoa cuch owe kwasy tuszczowe, (Wedug: Mattson F. H., Volpenheim R. A.: The digestion and absorption of triglycerides; J. Biol. Chem., 1964, 239, 2772 w modyfikacji autora rozdziau). ___
Hpeptydw i oligopeptydw) i dipeptydazy (wykazuj rn swoistogg, niektre z nich znajduj si w obrbie nabonka jelitowego rozkadajc dipeptydy do wolnych aminokwasw). Swoiste disacharydazy i oligosacharydazy, np. a-glukozydaz zwan rwnie maltaz (en zymy te katalizuj odszczepienie pojedynczych reszt cukrowych oligosacharydw i disacharydw wykazujcych wizanie ot (1 - 4) glikozydowe, rozpoczynajc to dziaanie od nieredukujcego koca), izotnaltaz czyb' a -dekstrynaz (hydrolizujc wizania 1 - 6 glikozydowe a dekstryn), p-galaktozydaz czyli laktaz (odszczepia galaktoz od laktozy), sacharaz (hydrolizujc sacharoz) i trehalaz (hydroliujc trehaioze). Fosfataz (usuwajc reszt fosforanow z organicznych zwizkw fosforanowych np. heksozofosforanw, glicerofosforanw i nuk leotydw powstaych w wyniku trawienia kwa-
sw nukleinowych zawartych w pokarmach przez nukleazy), Polinukleotydazy (rozkadajce kwasy nu kleinowe do nukleotydw). Nukleozydazy (okrelane rwnie jako fosforylazy nukleozydowe katalizuj fosforoliz nukleozydow do wolnych zasad purynowych lub pirymidynowych i pentozofosforanw). Fosfolipaz (enzym'ten, zawarty w soku jelitowym, rozkada foslblipidy do glicerolu, kwasw tuszczowych, kwasu fosforowego oraz zasady, takiej jak cholina).
Wikszo produktw trawienia ulega asymilacji
Kocowym skutkiem dziaania opisanych wyej enzymw trawiennych jest rozoenie skadnikw pokarmowych zawartych w poywieniu do postaci, w ktrej mog by wchaniane i przyswajane. Kocowymi produktami tra-
TRAWIENIE 1 WCHANIA NIE / 7* 1
wiema wglowodanw s monosacharydy (gwnie glukoza), biaek ~ aminokwasy, triacylo-gliceroli kwasy tuszczowe, glicerol i mono-glicerole, za kwasw nukleinowych zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i pentozy. Polisacharydy bon komrkowych komrek rolinnych oraz ligniny zawarte w poywieniu
nie s trawione przez enzymy ssakw. Tworz one tzw. wkna pokarmowe i stanowi wikszo nie strawionych resztek pokarmowych. Wkna, oprcz tego e tworz mas kaow, speniaj inne wane funkcje (p. rozdz. 55). W tabeli 56-2 zestawiono waniejsze procesy trawienne.
T abela 56-2. Zestawienie procesw trawiennych Miejsce i bodziec w ydzielan ia Enzym S posb akt yw acj i i optyma lne w arunki dziaania Konieczna obecno chlo rkw, pH S ubstra t
Produkty dziaania
Bfizymu
Siinianki: wydzielaj lin w nastpstwie odruchu wy zwolonego obecnoci po karmu w jamie ustnej Gruczoy jeyka
Arnylaza li nowa
Skrobi, ^gli kogen
Maltoza, 1:6-glukozydy (oligosacharydy) i maltotrioza Kwasy tuszczo we i 2,3-diacyloglicerole
6,6-6,8
Lipaza jzy ko wa" pH 2,0-7,5 optymalne pH 4,0-4,5 Wizanie estrowe pierwszorzedowe w pozycji sn-3, utworzone przez kwasy tuszczowe krtkofacuchowe Biaka
Gruczoy odka: komrki gtwne i okadzinowe wy dzielaj sok odkowy pod wpywem bodca odrucho wego lub gastryny
Pepsyna A (dno odka) Pepsyna B (cz odwiernikowa) Rennina
Konwersja pepsynogenu do aktywnej pepsyny przez kwas solny, pH 1,0-2,0 Do aktywacji potrzebne s Ca1+, pH 4,0 Konwersja irypsynogenu do aktywnej trypsyny przez enterokinaz jefitow przy pH 5,2-6,0. Auto kata lityczna aktywacja przy pH 7,9
Peptydy
Kazeina mleka Biaka Peptydy
Wytrcanie ka zeiny Potipeptydy Di peptydy
Trzustka: obecno kwa nej treci odkowej w wietle dwunastnicy pobudza: 1) wydzielanie sekretyny przez bo n luzow dwu nastnicy, sekretyna z kolei stymuluje wydzielanie soku trzustko wego o raz 2) wy dzielanie cholecystokininy stymulujcej sekrecj enzy mw trzustkowych
Trypsyna
Chymotrypsyna
Wydzielana jako chymotrypsy nogen, Ulega konwersji do aktywnej chymotrypsyny przer trypsyn, pH8,0
Biaka Peptydy
Te same jak przy irypsynie, silniej wytrca kazein mleka
742 / ROZDZIA 56 H tab. 56-2 Miejsce i bodziec w ydzielania Enzym Sposb akt yw acj i i optymalne w arunki dziaania Wydzielana pod postaci proelastazy. ulega aktywacji przez trypsyn Karboksypeptydaza Wydzielana jako prokarboksypeptydaza. aktywowana przez trypsyn pH 7,1 S ubstrat Produkt y dziaania enzymu Biaka Peptydy Poli peptydy Dipeptydy
Elastaza
C- koco we po li peptydy
Niskoczsteczkowe peptydy, wolne aminokwasy Maltoza, 1:6-
Amylaza trzustkowa
Skrobia, glikogen
-glukozydy (oligosacharydy) i maltotrioza Kwasy tuszczo we, monoacyloglicerole, diacyloglicerole, glicerol Nukleotydj' Nukleotydy
Lipaza
Aktywo wa n e przez sole kwasw cio wych, fosfolipidy i kolipaz, pH 8,0
Pierwszorz do we wiza nia estrowe triacylogliceroli Kwasy rybonukleinowe Kwasy deoksyrybonukleinowe Estry cholesterolowe Fosfolipidy
Rybonukleaza Deoksyrybonukleaza Hydrolaza estrw cho les terolo wych Fosfolipaza

Aj
Aktywowana przez sole kwasw cio wych Wydzielana jako proenzym aktywo wany przez trypsyn iCa2+
Wotny cholesterol i kwasy tuszczowe Kwasy tuszczo we, lizofosfolipi-
dy
Tuszcze oraz kwana mia zga pokarmowa po neutralizacji Ko niugaty kwasw cio wych z kwasami tusz czowymi, delikatna zawiesina obojtnych mi ce li zoonych z soli kwasw cio wych i tuszczw oraz li p osom w Peptydy niskoczsteczkowe. Wolne aminokwasy Aminokwasy Fruktoza, gluko za
W troba
pcherzyk
(Sole
kwa-
cio wy. Cho lecysto kinina, hormo n bto ny luzo wej jelita a prawdopodobnie rwnie gastryna i sekrety na, pobudzaj pche rzyk ciowy i wydzielanie ci przez wtrob
sw cio wych i zasady)
Je lit o c ie nk ie. S o k wy twarzany przez gruczoy Brunnera dwunastnicy i gruczoy Lieberkiihna
Aminopeptydaza
N- ko co we po li peptydy
Dipeptydazy Sacharaza pH 5,0-7,0
Dipeptydy Sacharoza
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 743 cd. tab. 56-2 Miejsce i bodziec wydzielania
Enzym
Sposb aktywacji i optymalne warunki dziaania pH 5,8-6,2 pH 5,4-6,0
Substrat
Produkty dziaania enzymu Glukoza Glukoza, galak-toza Glukoza Wolny fosforan
Maltaza Laktaza
Maltoza Laktoza Trehaloza Fosforany organiczne
Trehalaza Fosfataza Izomaltaza lub 1 ^-glukozy daza Polirtukleoty-da za Nukleozyda-z y (fosforyla-zy nukleozy-dow e) pH8,6
1:6 glukozy-dy Glukoza
Kwas nuklei4|A nowy -
Nukleotydy
Nukteozydy Zasady purynopurynowe i we i pirymidyno-we pirymidyno-we, fosforan pen-tozy
W C H A N IA N IE Z P R ZE WO D U
POKARMOWEGO POLEGA NA TRANSPORCIE SKADNIKW POKARMOWYCH DO KRENIA WROTNEGO LUB NACZY LIMFATYCZNYCH Wchanianie pokarmw w odku jest niewielkie, cho moliwa jest absorpcja znacznych ii oci etanolu. Jelito cienkie jest gwnym narzdem trawiennym i wchaniajcym. W trakcie przechodzenia przez nie ok. 90% pokarmw jest wchanianych z wod. W jelicie grubym wchanianie wody jest znaczniejsze, co sprawia, e pierwotnie pynna zawarto jelita cienkiego w okr-nicy nabiera konsystencji staej. Wyrnia si dwa szlaki wchaniania skadnikw pokarmowych z jelita cienkiego, leden z nich prowadzi do krenia wrotnego wtroby, do ktrego dostaj si skadniki pokarmowe rozpuszczalne w wodzie, za drugi szlak przez naczynia limfatyczne i przewd piersiowy do krenia oglnego. Drugim szlakiem transportowane s skadniki pokarmowe rozpuszczalne w tuszczach.
Wglowodany wchaniane s w postaci monosacharyd w Produkty trawienia wglowodanw wchaniane s z jelita czczego do krenia wrotnego w postaci monosacharydw, w tym gwnie heksoz (glukozy, fruktozy, mannozy i galak-tozy) i pentoz (rybozy). Oligosacharydy (produkty hydrolizy skrobi, zawierajce 310 jednostek monosacharydowych) i disacharydy ulegaj dalszej hydrolizie przez odpowiednie enzymy rbka szczoteczkowego bony luzowej jelita cienkiego, w tym rwnie przez amylaz trzustkow adsorbowan przez luzwke jelitow. W wietle jelita stwierdza si tylko niewielk aktywno disacharydazow. Wiksz wykazu j mae wzy71 z rbkiem szczoteczkowym komrek nabonkowych jelita. Wchanianie monosacharydw odbywa si dwoma sposobami drog aktywnego transportu (w obecnoci gradientu ste) oraz dyfuzji prostej. Wchanianie niektrych cukrw odbywa si w jeszcze bardziej zoony sposb. Do aktywnego transportu niezbdna jest nastpujca konfiguracja czsteczki cukru: konfiguracja grupy hydroksylowej przy wglu drugim powinna by identyczna z wystpujc w glukozie, musi by obecny piercie piranozowy oraz przy wglu w pozycji pitej musi wystpowa
744 / ROZDZIA 56 grupa metylowa lub pochodna grupy metylowej (grupa metylowa podstawiona). Wchanianie fruktozy jest wolniejsze od glukozy i galaktozy. i odbywa si na zasadzie dyfuzji prostej zgodnie z gradientem ste. W warunkach fizjologicznych we krwi stwierdza si niewielkie iloci fruktozy oprcz tej, ktra jest pochodzenia pokarmowego. Pompa sodowa nasila aktywne wchaniania glukozy Rbek szczoteczkowy enterocytw zawiera kilka ukadw transportowych. Niektre z nich s podobne do ukadw wystpujcych w rbku szczoteczkowym komrek kanalikowych nei-ronw wyspecjalizowanych w resorpcji zwrot nej rnych aminokwasw i cukrw. Przypuszcza si, e istnieje przenonik wicy w rnych miejscach glukoz i przenoszcy obydwie te substancje przez bon plazmatyczn enterocytw. Zarwno glukoza, jak i Na+ mog by uwalniane do cytoplazmy, umoliwiajc w ten sposb przenonikowi cige powtarzanie swej czynnoci transportowej. Jony Na + transportowane s zgodnie z gradientem ich ste umoliwiajc rwnoczenie przenonikowi transport glukozy w kierunku przeciwnym do gradientu jej ste. Wolna energia potrzebna do transportu aktywnego pochodzi z rozpadu hydrolitycznego ATP wspdziaajcego z pomp sodow wyrzucajc jony Na u na zewntrz komrki. W miejsce jonw Na+ do komrki wchodz jony K+ (p. ryc. 56-4). Aktywny transport glukozy hamuj oiiabaina, bdca glikozydem nasercowym a rwnoczenie inhibitorem pompy sodowejôraz floryzyna, bdca znanym inhibitorem rsbrpcji zwrotnej glukozy w kanalikach nerkowych. Stosunek wchanianego sodu do glukozy moe si zmieni lecz zawsze odpowiada aktywnoci dwch przenonikw pracujcych rwnolegle. Dla jednego z nich stosunek wchanianego Na do glukozy wynosi 1:1, za dla drugiego 3:1. Wystpuje rwnie przenonik glukozy niezaleny od Na+. Proces hydrolizy polisacharydw, oligosa-charydw i disacharydw jest procesem szyb kim. Dlatego te mechanizmy wchaniania glukozy i fruktozy ulegaj szybkiemu nasyceniu. Rzucajcym si w oczy wyjtkiem jest hydroliza laktozy, przebiegajca o poow wolniej ni hydroliza sacharozy. Ten fakt tumaczy, dlaczego hydroliza laktozy nie prowadzi do wysycenia mechanizmw transportowych glukozy i galaktozy.
Biako prze-no Snlka
Glukoza
Rbek szczoteczkowy
Nabonek jelitowy
Da naczy wosowatych
Ryc. 56-4. Tiansportglukozyprzez nabonek jel> towy. Aktywny transport glukozy jest sprzony + + z pomp Na /K (1) lub z ukadem niezalenym od + jonw Na (2). Proces dyfuzji przedstawia szlak (3).
Defekty enzymw uczestniczcych w trawieniu wglowodanw s przyczyn swoistych zaburze Niedobr laktazy. Nietolerancja laktozy, disacharydu wystpujcego w mleku, moe by spowodowana niedoborem laktazy. Zesp niedoboru laktazy naley odrni od zespou nietolerancji mleka spowodowanego nadwra liwoci na biaka zawarte w mleku, w tym zwykle na pMaktoglobulin. Objawy przedmiotowe i podmiotowe wystpujce w wymienionych zespoach s takie same. Wrd tych objaww naley wymieni ble kolkowe brzucha, biegunki i wzdcia. Objawy te spowodowane s z jednej strony obecnoci laktozy w wietle jelita oraz z drugiej za strony fermentacj tego dwucukru przez mikroorganizmy jelitowe. Osmotycznie czynna laktoza, gromadzca si w wietle jelita, jest przyczyn biegunek osmoty-
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 74S
cznych. Ponadto iaktoza nie wchonita przez jelito staje si substratem dla bakteri i jelitowych, W wyniku fermentacji bakteryjnej powstaj gazy oraz metabolity laktozy dranice jelito. Wyrnia si trzy typy niedoboru laktazy: Dziedziczny niedobr laktazy. Ten typ wystpuje wzgldnie rzadko i charakteryzu je si wystpowaniem objaw w nietolerancji laktozy krtko po,, urodzeniu. Po karmieniu dziecka diet bezlalctozow wszystkie objawy nietolerancji znikaj. Cech charakterystyczn tego typu niedoboru jest obecno laktozy w moczu. Laktozuria spowodowana jest uszko dzeniem nabonka jelitowego przez laktoz i wtrnym przedostaniem si tego disacharydu przez uszkodzon bon luzow jelita do krwi. Wtrny niedobr laktazy. Spowodo wany jest pierwotn chorob jelit i wtrnym niedoborem laktazy, przez co dochodzi do upoledzonego trawienia laktozy. Choroba ob jawia si nietolerancj mleka. Jest to typ niedo boru laktazy nierzadko wystpujcy w sprue rodzimej i tropikalnej, kwashiorkor, zapaleniu jelita grubego oraz w zapaleniu odka i jelit. Moe on wystpi rwnie po operacji wykona nej z powodu wrzodu trawiennego. Pierwotny niedobr laktazy. Jest to wzgldnie czsto wystpujcy zesp, szczegl nie wrd populacji kolorowych. Poniewa ob jawy chorobowe tego zespou wystpuj nie w dziecistwie, lecz dopiero u osb dorosych, przyjmuje si, e jest on spowodowany po stpujcym zanikiem aktywnoci laktazowej u osb do tego predysponowanych. powanie dziedzicznego niedoboru zarwno sacharazy, jak i izomaltazy. Te dwa rodzaje niedoboru wystpuj rwnoczenie, poniewa sacharaza i izomaltaza tworz wsplny kompleks enzymatyczny. Objawy niedoboru wymienionych disacharydaz wystpuj ju we wczesnym dziecistwie i s takie same jak w niedoborze laktazy. Disacharyduria. U niekt rych chorych z niedoborem disacharydaz mona stwierdzi wzmoone wydalanie disacharydw z moczu. U takich osb oraz u chorych z chorob jelit (np. sprue) dobowe wydalanie disacharydw z moczem moe wynosi 300 mg lub wicej.
transportowego dla tych cukrw. Poniewa fruktoza nie jest transportowana tym mechanizmem przenonikowym, wchanianie jej jest normalne w tym zespole.
Niedobr sacharazy. Stwierdzono wyst-
Wadliwe wchanianie monosachary-dw. Znany jest wrodzony
zesp w ktrym stwierdza si powolne wchanianie glukozy i ga-laktozy, spowodowane defektem mechanizmu
2-Monoacyloglicerole, kwasy tuszczowe i niewielkie iloci 1-monoacylogiiceroli opuszczaj faz olejow zawiesiny tuszczowej i dy-funduja do miceli mieszanych i liposomw zoonych z soli kwasw ciowych, fosfatydy-locholiny i cholesterolu pochodzenia ciowego (ryc. 56-2). Poniewa micele s rozpuszczalne w wodzie, umoliwiaj one dostanie si produktw trawienia tuszczw do rbka szczoteczkowego komrek bony luzowej jelita, a nastpnie do wntrza enterocytw. Sole kwasw ciowych docieraj do jelita biodrowego, gdzie s wchaniane i przechodz do krenia jelitowo-wtrobowego (p. rozdz. 27). Fosfolipi-dy pochodzenia pokarmowego i ciowego (np. fosfatydylocholina) s rozkadane do kwasw tuszczowych i lizofosfolipidw pod wpywem trzustkowej fosfolipazy A2 i resorbowane przez nabonek jelitowy. Estry cholesterolowe ulegaj hydrolizie pod wpywem hydrolazy estrw cholesterolowych pochodzenia trzustkowego. Uwolniony pod jej wpywem wolny cholesterol wraz z wikszoci cholesterolu zawar tego w ci przedostaje si do rbka szczoteczkowego po uprzednim wnikniciu do miceli. W warunkach fizjologicznych ponad 98% lipidw zawartych w pokarmach jest wchanianych w jelitach. W obrbie ciany jelit 1-monoacyloglicerole ulegaj dalszej hydrolizie do wolnego gticerolu i kwasu tuszczowego pod wpywem lipazy rnicej si od Iipa2y trzustkowej. 2-Mono-acyloglicerole ulegaj rekonwersji do triacylo-gliceroli szlakiem monoacyloglicerolowym (ryc. 56-3). Proces resyntezy triacylogliceroli z kwasw tuszczowych wymaga aktywacji" tych ostatnich. Synteza triacylogliceroli w bonie luzowej jelita przebiega podobnie jak w innych tkankach (p. str. 284). Wchonite lizofosfolipidy oraz wikszo wchonitego cholesterolu jest take reacylowana przez acylo-CoA, w wyniku czego powstaj fosfolipidy i estry cholesterolowe. Uwolniony w wietle jelita w procesie lipolizy glicerol nie ulega reutylizacji, lecz jest bezporednio wchaniany do krenia wrotnego. Na-
Produkty trawienia lipidw wchaniane s z miceli utworzonych przez sole kwasw ciowych
746 / ROZDZIA 56
tomiast glicerol uwolniony w obrbie komrek jelitowych moe bye wykorzystany do resyntezy triacylogliceroli po uprzedniej aktywacji przez ATP do glicerolo-3-fosforanu. Tak wic dugo-acuchowe kwasy tuszczowe wchonite Trtacyloglicerole, powstae w enterocytach, przewanie nie dostaj si do krenia wrot-nego. Wikszo wchonitych lipidw, w tym rwnie tbsfolipidy, estry cholesterolowe, wolny cholesterol i witaminy rozpuszczalne w tuszczach tworz chylomikrony. Te ostatnie tworz limf (tj. pyn o wygldzie mleka), transportowan naczyniami chonnymi jamy brzusznej do przewodu piersiowego, a nastpnie dopiero do krenia systemowego (p. rwnie ryc. 26-3). Wikszo wchonitych kwasw tuszczowych, zoonych z 10 lub wicej atomw wgla, niezalenie od tego, w jakiej postaci zostay reabsorbowane, wystpuje jako estry w limfie przewodu piersiowego. Kwasy tuszczowe krt-koacuchowe, zawierajce mniej ni 1012 atomw wgla, transportowane s krwi yy wrotnej w postaci nieestryfikowanej (jako wolne" kwasy tuszczowe). aden ze steroli pochodzenia rolinnego (czyli fitosteroli) z wyjtkiem aktywowanego crgo-sterolu (czyli prowitaminy D) nie ulega reabsor-pcji w jelitach. Chyluria jest stanem chorobowym charakteryzujcym si wydalaniem przez chorego mlecznego" moczu. Jest ona spowodowana przetok limfatyczn, tj. poczeniem ukadu naczy limfatycznych jelit z ukadem moczowym. Podobn anomSh jest chylothora* charakteryzujcy si gromadzeniem si limfy w jamie opucnowej. Jest on spowodowany nieprawidowym poczeniem naczy limfatycznych jamy brzusznej z jam Opucnow. Dziki .podaniu w pokarmach triacylogliceroli zawierajcych krtkoaricuchowe kwasy tuszczowe
(zoone z mniej ni 12 atomw wgla) w miejsce przez komrki bony jelita mog by uyte do resyntezy triacylogliceroli.
Produktami trawienia biaek ulegajcymi wchanianiu w jelitach s aminokwasy W stanach fizjologicznych biaka pokarmowe zostaj prawie cakowicie rozoone do aminokwasw. Te ostatnie z kolei s szybko wchaniane przez jelito do krenia wrotnego. Moliwa jest jednak hydroliza niektrych produktw trawienia biaek, tj. dipeptydw w ob rbie ciany jelitowej. Naley doda, e karmienie zwierzt penowartociow mieszanin aminokwasw pozwala na normalne podtrzymanie ich ycia. Izomery (L), lecz nie (D) aminokwasw transportowane s aktywnie przez cian jelita od bieguna luminalnego do surowicwkowego. W transporcie tym ma uczestniczy witamina B<j (fosforan pirydoksalu). Aktywny transport L-aminokwasw zaleny jest od dostawy energii, czego dowodem jest fakt, e 2,4-dinitrofe-nol, substancja rozprzgajca fosforylacj oksydacyjn, hamuje ten transport (p. str. 152). Aminokwasy s transportowane przez rbek szczoteczkowy przez liczne przenoniki, z ktrych wiele jest podobnych do przenonika glukozowego zalenego od Na+ (ryc. 56-4). Wrd przenonikw zalenych od Na+ naley wymieni przenonik dla aminokwasw obojtnych, przenonik dla fenyloalaniny lub metioniny oraz swoisty przenonik dla iminokwasw ta kich jak prolina i hydroksyproiina. Scharak teryzowano rwnie przenoniki niezalene od Na + , transportujce aminokwasy lipofilne i obojtne (np. leucyn i fenyloalanin) oraz aminokwasy zasadowe (np. lizyn).
kwasw tuszczowych dugoacuchowych, mona spowodowa zniknicie chylurii. Podobne postpowanie u chorych z chyiothorax jest przyczyn przejanienia si pynu opucnowego. Wymienione zmiany chylurii lub pynu w jamie opucnowej spowodowane s wnikniciem krt-koacuchowych kwasw tuszczowych bezporednio do krenia wrotnego, a nie do chylomi-kronw limfy.
reakcj immunologiczn na niektre spoyte biaka wchaniaj je bez uprzedniego ich trawienia, strawione biaka bowiem nie s immuno-genne. Za moliwoci przenikania niestrawio-nych biaek przez bon luzow jelit przemawia fakt przedostania si przeciwcia zawartych w siarze z przewodu pokamiowego noworodka do krenia. Istnieje coraz wicej dowodw popierajcych hipotez, e sprue rodzima (nietropikalna) spowodowana jest defektem umiejscowionym w samych komrkach bony luzowej jelit, W wyniku tego defektu polipeptydy powstae po trawieniu glutenu (gwnego biaka zawartego w pszenicy) przez pepsyn i trypsyn wywieraj nie tylko miejscowo szkodliwy wpyw na bon luzow jelit, lecz po wchoniciu do krwi s przyczyn powstawania przeciwcia przeciwglu-
Aspekty kliniczne. Chorzy wykazujcy
TRAWIENIE I WCHANIANIE / 747 Tabela 56-3. Miejsce wchaniania poszczegl nych skadnikw pokarmowych Miejsce wchaniania Jelito czc2e Skadnik pokarmowy
Glukoza i inne m onosachar ydy, ni ekt r e di sa charydy M o n oacy 1 og 1 i c ero le. kw asy t uszczow e, gli cer ol, cholester ol A mi nokw asy, pept ydy Wit ami ny, f oiian Elektrolity, elazo. w ap, w oda Kw asy ciow e Witamina B-| 2 Elektrolity W oda
Tabela 56-4. Objawy lub zespoy chorobowe spowodowane wadliwym wchanianiem poszczeglnych skadnikw pokarmowych Objawy lub zesp Wadliwe wchania chorobowy nie skadnika pokarmowego Niedokrwisto Obrzki Tyczka
Osteo poroa
Jelito kret
elazo, witamina B,^ folian Produkty trawienia biaka Wap, magnez, witamina D Wap, produkty trawienia biaek, witamina D ** Laktoza Witamina K Lipidy i witaminy rozpuszczalne w tuszczach Aminokwasy obojtne
v
Nietolerancja mleka
ten owych. Udowodniono, e u chorych na rodzim sprue we krwi krcej bardzo czsto stwierdza si przeciwciaa przeciwglutenowe lub skierowane przeciw frakcjom rozpadu tego biaka. Czynnikiem szkodliwym glutenu jest polipe-ptyd zoony z zaledwie 6 lub 7 aminokwasw. Sprue rodzima u dorosych jest niewtpliwie analogiem celiakii (choroby trzewnej) wystpujcej u dzieci. Dowodzi ona moliwoci przenikania przez bon luzow jelita do krwi fragmentw biakowych wikszych ni aminokwasy. Przenikanie takie zachodzi jednak tylko w okrelonych warunkach chorobowych. W tabeli 56-3 zestawiono miejsce wchaniania niektrych waniejszych skadnikw pokarmowych w jelitach, za w tab. 56-4 objawy lub zespoy chorobowe spowodowane wadliwym ich wchanianiem.
Krwawienia, siniaki, amliwo naczy Stolce tuszczowe (ste-atorrhea) Chorba Hartnupw (de-ekt przenonika jelitowego dla aminokwasw obojtnych)
propionowy i masowy. W wyniku rozkadu bakteryjnego fosfatydylocholiny mog powsta cholina oraz spokrewnione z ni aminy toksyczne (np. neuryna).
0 H3C-N-CH,-CH3OH CHj
Cholina
NC H
Neuryn a
BAKTERIE JELITA GRUBEGO S PRZYCZYN PROCESW GNILNYCH I FERMENTACYJNYCH

Wikszo spoytych pokarmw jest wchaniana w jelicie cienkim. Tutaj te wchania si wikszo wody, co sprawia, e pocztkowo ppynna tre jelitowa przybiera konsystencj bardziej sta. W czasie wchaniania poszczeglnych skadnikw pokarmowych obserwuje sie yw aktywno flory bakteryjnej jelit. Uczestniczy ona w procesach gnilnych i fermentacyjnych, podczas ktrych powstaj m.in. gazy (takie jak dwutlenek wgla, metan, wodr, azot i siarkowodr) oraz kwas octowy, mlekowy,
Wiele aminokwasw ulega dekarboksylacji pod wpywem bakterii jelitowych z wytworzeniem toksycznych amin (tj, ptomain).
DEKAHBOKSYLAZA BAKTERYJNA
R-C-NHj H COj Jedna z ptomain
W wyniku takich reakcji dekarboksylacji powstaj: kadaweryna z lizyny, agmatyna z ar-gininy, tyramina z tyrozyny, putrescyna z or-nityny i histamina z histydyny. Niektre z wy-
748 I ROZDZIA 56
mienionych amin wykazuj silne dziaanie wa-zopresyjne. Tryptofan w wyniku szeregu reakcji jest rdem indolu i metyloindolu (skatolu), tj. substancji odpowiedzialnych za zapach kau.
Indol Skatol CH3
z zaawansowan chorob miszu wtrobowego lub wystpienie u tych chorych krwawienia do wiata przewodu pokarmowego mog by przyczyn zatrucia amoniakiem. Rwnie u takich chorych podawanie neomycyny ma dziaanie lecznicze.
Bakterie jelitowe speniaj rwnie funkcje poyteczne dla czowieka
Aminokwasy zawierajce siark zostaj przeksztacone w merkaptany, takie jak metylo -i etylomerkaptan oraz siarkowodr.
CH3SH CH^SH Etylomerkaptan Metyiomerkaptan !2H] CH3SH -~CH, Mety!omerkaptan Metan 1 siarkowodr
Fiora jelitowa moe stanowi a 25% suchej masy kaowej. U zwierzt trawoernych, u ktrych pokarmy skadaj si gwnie z celulozy, bakterie jelitowe lub wystpujce w waczu odgrywaj istotn rol w procesie trawienia, rozkadaj one bowiem polisacharydy do wchanialnych monosacharydw. Ponadto bakterie te, yjce w symbiozie z gospodarzem, uczestnicz w syntezie aminokwasw egzogennych i witamin. Chocia rola jelitowej flory bakteryjnej u czowieka jest znacznie mniejsza ni u zwierzt trawoernych, niemniej jest ona poyteczna, poniewa wytwarza pewne witaminy, szczeglnie witamin K i B2 oraz niektre inne witaminy grupy B.
PIMIENNICTWO
Brgstrom B: The miceliar hypothesis of fat absorption: Must it be revisited? Scand J Gastroenterol 1985;20;389. Gardncr M; Gastromtestinal absorption of intact proteins. Annu Rev Nurt 1988;8:329. Gargouri Y et al: Kinetic assay of human gastric lipase on short- and long-chain triacyiglycerol emulsions. Gastroenterology 198;91:919. Foltmann B; Gastric proteinases. Essays Biockem 1981;17: Nelson GJ, Ackman RG: Absorption and transport of fat in mammals with emphasis on N-3 poiyun-saturated fatty arids. Lipids 1988:23:1005. Steven BR, Kaunitz JD, Wright EM: Intestinai transport of amino acids and sugars. Annu Rev Pftysiol 1984;4fi:4l7. Tso P: Gastrointestinal digeson and absorption of lipid. Adv Lipid Res 1985;21:143. Wolfe MM, Soli AH; The physiology of gastric acid secretion. New Engi J Med 1988;319:1707,
Jelito grube jest rdem znacznej iloci amoniaku powstajcego w wyniku dziaania bakterii na substraty azotowe. Powstay amoniak dostaje si do krenia wrotnego i nastpnie do wtroby, gdzie jest szybko usuwany z krwi. W chorobach
wtrobydetoksykacyjna rola tego narzdu w stosunku do amoniaku ulega upo ledzeniu, co
jest przyczyn dostania si NH3 do krenia oglnego, w ktrym moe osign stenia toksyczne. Sdzi si, e amoniak uczestniczy w patogenezie piczki wtrobowej u niektrych chorych. Wykazano, e podanie neomycyny, antybiotyku hamujcego rozwj jelitowej flory bakteryjnej, znamiennie obnia stenie we krwi amoniaku pochodzenia jelitowego. Stosowanie diety wysokobiakowej u chorych
Glikoproteiny i proteoglikany
57
problem w nowotworach to przerzuty. Powsta j one wskutek odrywwjia si komrek nowotworowych od tkanek, z ktrych pochodz (np. puc) i dostaj si z krwi do rnych narzdw i tkanek ustroju (np. mzgu), gdzie w warun kach niekontrolowanych rozrastaj si, wywoujc katastrofalne nastpstwa. Onkolodzy sdz, e do powstawania przerzutw przyczyniaj si w znacznej czci zmiany w strukturze ghkokoniugatw powierzchni komrek nowo tworowych. Ponadto niektre choroby (muko-polisacharydozy) s wynikiem zmniejszonej aktywnoci specyficznych enzymw lizosomal-nych, degradujcych poszczeglne typy gliko-zoaminoglikanw; w wyniku spadku ich aktywnoci dochodzi do gromadzenia si jednego lub wicej typw glikozoaminoglikanw, co wywouje rne objawy; przykadem moe by zesp Hurler.
WPROWADZENIE
Glikoproteiny s biakami, w ktrych acuchy oligosacharydowe (glikanowe) przyczone s kowalencyjnie do rdzenia polipep-tydowego, Glikozoaminoglikany s polisacharydami zoonymi z powtarzajcych si jednostek disacha-rydowych. Jednostka disacharydowa skada si z aminocukru (glukozoaminy lub galaktozoa-miny, ktra dodatkowo moe by siarczanowa) oraz kwasu uranowego (gJukuronowego lub idunonowego). W przeszoci glikozoamino-glikany okrelano terminem mukopolisachary-dy". Obecnie wiadomo, e wystpuj one zwykle jako kowalencyjnie zwizane z biakiem i okrelane s terminem proteoglikanw. Gliko-koniugaty lub kompleksy wglowodanowe to dwa zamienne okrelenia, uywane do opisywania makroczsteczek zawierajcych jeden lub wicej acuchw wglowodanowych kowalencyjnie zwizanych z biakiem lub lipidami. Do tej grupy makroczsteczek zalicza si: glikoproteiny, proteoglikany i giikolipidy.
POWSZECHNIE WYSTPUJCYM GLIKOPROTEINOM PRZYPISUJE SI LICZNE FUNKCJE

Glikoproteiny wystpuj w wikszoci organizmw, od bakterii do czowieka. Wchodz take w skad wikszoci wirusw zwierzcych. Nad niektrymi z nich prowadzono intensywne badania, poniewa byy w czci przydatne do ledzenia procesw biosyntezy. Do glikoprotein zaliczanych jest wiele biaek o odmiennych funkcjach (tab. 57-1); zawarto skadnika wglowodanowego waha si od 1% do ponad 85% cakowitej ich masy. Mimo intensywnych bada nad funkcjami glikoprotein wci niejasna jest dokadna rola acuchw oligosacharydowych. Niektre z nich przedstawione s w tab. 57 -2.
Biaka osocza, z wyjtkiem albumin, s gliko-proteinami. Wiele biaek bon komrkowych (p. rozdz. 45) zawiera znaczne iloci wglowodanw. Take niektre substancje grupowe krwi (p. rozdz. 60) s glikoproteinami, podczas gdy inne s glikolipidamt. Niektre hormony (np. gona-dotropina kosmwkowa) to take glikoprotei ny. Nowotwory coraz czciej rozpoznawane s jako zaburzenia wynikajce z nieprawidowej regulacji genetycznej (p. rozdz. 61). Gwny
750 / ROZDZIA 57 Tabea 57-1, Niektre funkcje biaek penione przez glikoproteiny Biaka strukturalne: ciany komrkowej Kolagen, elastyna Fibryny Biaka macierzy koci Substancje o waciwociach smaru i ochronnych: Mucyny Wydzieliny luzowe Biaka transportujce: Witaminy Lipidy Mineray i pierwiastki ladowe Biaka o waciwociach immunologicz nych: Immunoglobuliny Antygeny zgodnoci tkankowej Skadniki dopeniacza Interferony Hormony: Gonadotropina kosmwkowa Tyreotropina (TSH) Enzymy: Proteazy Nukieazy Glikozydazy Hydrolazy Czynniki krzepnicia Substancje uczestniczce w interakcji ko mrek lub procesach rozpoznania biologicz nego: IJJ, Komrka komrka Komrka wirus Komrka bakteria Receptory hormonw Substancje entyzamroeniowe antark-tycznych Lektyny u ryb Tabela 57-2. Niektre funkcje oltgo-sacharydowych glikoprotein* acuchw
Moduluj wasnoci fizykochemiczne, np. rozpuszczalno, lepko, adunek i denaturacj Ochraniaj przed proteoliz zarwno zewntrz-, jak i rdkomrkow Wpywaj na proteolityczn obrbk biaek prekur-sorowych do mniejszych czsteczek Wykazuj aktywno biologiczn, np. hCG Wpywaj na proces wbudowywania do bon, we wntrzkomrkow migracj, przepuszczalno i wydzielanie Wpywaj na rozwj embrionalny i rnicowanie Odpowiedzialne s w duej czci za umiejscowienie si przerzutw nowotworowych * Zaadaptowano z; Schachter H.: Biosynthetic controls that determine the branching and hetero-genity of protein-bound oligosaccharides; Bfo-chem. Celt Bioi 1986, 64, 163.
dw. Konfiguracja przestrzenna cukrw w acuchach oligosacbarydowych zmienia si w zalenoci od rodzaju wiza i moliwoci oddziaywania z innymi makroczsteczkami, znajdujcymi si w ssiedztwie oligosacharydw. Przyjmuje si oglnie, e acuchy oligosacha-rydowe koduj znaczn ilo informacji biologicznej, ktra zaley od skadu cukrowego, ich sekwencji i konfiguracji przestrzennej. Dowo dem na to s niektre leki i toksyny, ktre dziaaj ze specyficznymi acuchami oligosacharydw glikokoniugatw powierzchni komrek {jak np. toksyna cholery oddziauje z gang-liozydami Gml; p. rozdz. 16). Ponadto, reszty mannozo-6-fosforanu skierowuj nowo synte tyzowane enzymy lizosomalne do wntrza lizo-somw (p. poniej).
ACUCHY OLIGOSACHARYDOWE ZAWIERAJ INFORMACJ BIOLOGICZN

Midzy sach ary darni moe by tworzona ogromna liczba wiza glikozyd owych. Na przykad 3 rne heksozy mog czy si ze sob, tworzc ponad 1000 rnych trisachary-
DOSTPNE S TECHNIKI DO WYKRYWANIA, OCZYSZCZANIA I STRUKTURALNEJ ANALIZY GLIKOPROTEIN Wykrywanie

Glikoproteiny mog by wykrywane w rnych zoonych ukadach (np. bon komr kowych) metod elektroforezy elowej w obecnoci SDS (SDS-PAGE; p. rozdz. 3) i wybar-wiane kwasem nad jodowym i odczynnikiem Schiffa (PAS), bowiem PAS wywouje reakcj barwn z grup aldehydow cukrw. Mog by one rwnie wykrywane technik SPS-PAGE-
GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 751
-radioautografii, opartej na pomiarze stopnia wbudowywania si odpowiedniego radioaktywnego cukru do komrek. Oczyszczanie i analiza strukturalna Przed przystpieniem do analizy strukturalnej glikoprotein konieczne jest oddzielenie ich od innych makroczsteczek. Mona to osign stosujc konwencjonalne metody oczyszczania biaek. Najcenniejsz technik stosowan do oczyszczania glikoprotein okazaa si chromatografia powinowactwa, wykorzystujca lektyny do specyficznego wizania si z pewnymi gliko-proteinami (p. poniej). Ich skad wglowodanowy oznacza si nastpnie po hydrolizie kwanej, stosujc chromatografi gazow z detekcj w postaci spektrometrii masowej (GLC-MS). W przeszoci stosowano rne metody pozwalajce okreli szczegow struktur ich acuchw oligosacharydowych. Obecnie sto-
suje si GLC-MS^ poczon z wysokorozdzielcz spektrometri NMR, co umoliwia czsto cakowite oznaczanie struktury (tzn. skadu cukrowego, rodzaj wiza i ich anomerycznej konfiguracji) acuchw glikanowych wikszoci glikokoniugatw. Szczegowe dane dotyczce wiza midzy cukrami w glikoprotei-nach (co wykracza poza zakres tego rozdziau) s bardzo wane w oznaczaniu struktury i funkcji tych makroczsteczek. SIEDEM DOMINUJCYCH CUKRW W LUDZKICH GLIKOPROTEINACH Chocia znanych jest ok. 200 naturalnie wystpujcych monosacharydw, to tylko 7 powszechnie wystpuje w'acuchach oligosacha-rydowych glikoprotein (tab. 57-3). Wikszo tych cukrw omwiono w rozdz. 14. Kwas
Tabela 57-3. Najwaniejsze cukry wystpujce w ludzkich glikoproteinach. Struktury wikszoci wymienionych cukrw s przedstawione w rozdz. 15. Cukier
Typ
Uywany skrt
Gat
Alukleotydowy cukier UDP-Gal
Uwagi
Ga laktoza
Heksoza
Glukoza
Heksoza
Glc
UDP-Glc
Wystpuje w N-wizanych glikopro-teirtach czsto jako przedostatni cukier wizany do NeuAc oraz w rdzeniu trisacharydowym proteoglikanw Wystpuje podczas syntezy N-wizanych glikoprotein, ale nieobecna w dojrzaych glikoproteinach Gwny cukier N-wizanych glikoprotein Wystpuje czsto jako terminalny cukier w 0- i N-wizanych glikoprotei nach. Znane s take inne typy kwasw sjalowych, ale w organizmie ludzkim gwnie wystpuje NeuAc Wystpuje na zewntrz acuchw 0- i N-wizanych glikoprotein, lub te moe by wizana do reszty GIcNAc poiczonej N-glikozydowo z Asn Obecna w 0gliko-proteinach i N-wizanych
Mannoza
Heksoza
Man
GDP-Man CMP-NeuAc
Kwas Kwas sjalowy N-acety-foneur amino-wy
NeuAc
Fukoza
Deoksyheksoza Fuc
GDP-Fuc
N-acetylogala- Aminoheksoza ktozoamina N-acetyloglu- Aminoheksoza kozoamina
GalNAc GIcNAc
UDP-GatNAc UDP-GIcNAc
Cukier poczony jest z azotem Asn acucha polipeptydowego N-wizanych glikoprotein ale moe rwnie wystpowa w innych pozycjach acucha oligosacharydowego tych biaek
752 / ROZDZIA 57
N-acetyloneuraminowy (NeuAc) jest terminalnym cukrem acucha oligosacharydowego i zwykle przyczony jest do reszty galaktozy (Gal) lub N-acety!ogaJaktozoaminy. inne przedstawione w tabeli cukry mona znale w bardziej wewntrznych pozycjach.
nej czsteczki odpowiedniego nukleotydu (np. UMP, GMP lub CMP), powstaego z cukru nukleotydowego. Ten mechanizm zapewnia odpowiednie stenie kadego cukru nukleotydowego wewntrz aparatu Golgiego. UMP jest tworzony z UDP-Gal w poniszej reakcji:
a ALAKTOZYLOTRANSFERAZA
CUKRY NUKLEOTYDOWE DZIAAJ JAKO CUKRY DONOROWE W WIELU REAKCJACH BIOSYNTEZY

Pierwszym odkrytym cukrem nukleotydo-wym bya urydynodifosfoglukoza (UDP-Glc). Typowe cukry nukieotydowe biorce udzia w bi osyntezie glikoprotein s wymienione w tab. 57-3. Nie wiadomo, dlaczego niektre pochodz z UDP, a inne z guanozynotrifosforanu (GTP) lub cytydynomonofosforanu (CMP). Te nukleotydy s wykorzystywane w wielu, ale nie we wszystkich reakcjach glikozylacji zachodzcych w procesie biosyntezy glikoprotein. (p. poniej). Hydrofobowe wizanie midzy grupami fosforanowymi a cukrami jest typowym wizaniem wysokoenergetycznym i ma wysoki potencja przenoszenia, grup. Zaktywci-wane cukry mog by przenoszone do odpowiednich akceptorw pod warunkiem, e dostpne s swoiste transferazy. Cukry nukieotydowe s tworzone w cyto-plazmie z odpowiednich nukleotydw trifos-foranowych. Tworzenie u rydynod i fosforanu galaktozy przebiega w dwch nastpujcych reakcjach.
PIROFOSFORYLAZA u nr-GLUKOZOWA
UDP-Gal biako -. biako-Gal + UDP

NUKUEOZYDO-D1F OSFOFOSFATAZA
UDP-+UMP+P,
EGZOG LI KOZYDAZY I EN DOG LI KOZYDAZY S UYTECZNE W BADANIACH GLIKOPROTEIN

Pewne glikozydazy o okrelonej specyfice okazay si uyteczne w badaniach aspektw funkcjonalnych i strukturalnych glikoprotein (tab. 57-4). Enzymy te dziaaj albo w zewntrzTabela 57-4. Niektre glikozydazy uywane do bada struktury i funkcji glikoprotein. Enzymy rnego pochodzenia s czsto specyficzne dla pewnych typw wiza gtikozydowych, jak te dla ich anomerycznej konfiguracji. Miejsca dziaania en-doglikozydazy F i H pokazane s na ryc. 57-4. F dziaa na wizanie glikozydowe acuchw oli-gosacharydowych typu zarwno wysokomanno-zowego, jak i kompleksowego, podczas gdy H dziaa tylko na typ pierwszy. Enzymy Typ Egzoglikozydaza Egzoglikozydaza Endoglikozydaza Endoglikozydaza
UTP-f Glukozo-1 -fosforan * + pirofosforan

EPIM iRAZA UDP-Glc
UDP-GIC +
Neuraminidaza Galaktozy da za Endogfikozydaza F Endoglikozydaza H
UDP-Glc<->UDP-Gal
Poniewa wikszo reakcji glikozylacji zachodzi wewntrz aparatu Golgiego, systemy przekanikw (permutaz i systemy transportu) transportuj cukry nukieotydowe przez bon aparatu Golgiego. Znane s ukady transpor tujce UDP-Gal, GDP-Man i CMP-MeuAc do cystern aparatu Golgiego. pziaaj one na zasadzie anty portu; tzn. dopywowi jednego cukru nukleotydowego towarzyszy odpyw jed-
nej (egzoglikozydazy), albo w wewntrznej (en-doglikozydazy) pozycji iacucha oligosacharydowego. Przykadami egzoglikozydaz s neuraminidaza i galaktozydaza; uyte po kolei powoduj usunicie kocowej reszty NeuAc oraz przedostatniej reszty Gal z wikszoci glikoprotein. Endoglikozydazy F i H s przykadami drugiej grupy enzymw; enzymy te rozrywaj acuch oligosacharydowy w okrelonych miej-
GLIKOPROTEINY i PROTEOGUKANY / 7S3
scach wystpowania reszt GlcNac, w pobliu tacucha^ polipeptydowego (tzn. w wewntrznych pozycjach) i dlatego te s uyteczne w badaniach strukturalnych duych acuchw oligosacharydowych. Trawienie glikoprotein jedn lub kilkoma z wymienionych glikozydaz wykorzystuje si do bada pewnych procesw biologicznych zwizanych z usuniciem specyficznych cukrw. Dowiadczenia prowadzone przez Ashwella i wsp. na pocztku lat siedemdziesitych wykazay, e odsonicie reszt Gal, na skutek dziaa-' nia neuraminidazy, prowadzi do szybkiego zanikania ceruloplazminy w surowicy. Kolejne prace wykazay, e na powierzchni komrek wtrobowych znajduje si receptor rozpoznaj cy reszt galaktozylow wieJu desjalizowanych biaek osocza (tzn. nie zawierajcych NeuAc), ktry zarazem prowadzi do ich endocytozy. Te prace jasno pokazay, e poszczeglne cukry mog odgrywa gwn rol w spenianiu przynajmniej jednej biologicznej waciwoci (determinuj czas przebywania w krwiobiegu) gwnych glikoprotein.
LEKTYNY MOG BY UYWANE DO OCZYSZCZANIA I BADANIA FUNKCJI GLIKOPROTEIN

Lektyny s biakami pochodzenia rolinnego, ktre wi jeden lub wicej specyficznych cukrw. Ich rola w rolinach jest wci badana. Wiele lektyn zostao oczyszczonych i wicej ni 40 z nich jest dostpna w handlu (tab. 57-5). Lektyny znalazy liczne zastosowanie w badaniach biochemicznych, miedzy innymi:
Tabela 67-5.Trzy iektyny i cukry, z ktrymi one oddziauj. W wikszoci przypadkw lektyny wykazuj specyficzno w stosunku do anornerycznej konfiguracji wizania glikozydowego (a i {'): to nie jest pokazane w tabeli. Lektyna Konkanawalina
1. W oczyszczaniu i analizie glikoprotein. Lektyny, takie jak* konkanawalina A (Con A), mog wiza si kowalencyjnie z podoem obojtnym, takim jak sefaroza. Takie zwizane czsteczki sefaroza-Con A mog by uyteczne do oczyszczania glikoprotein, zawierajcych acuchy oligosacharydowe, reagujce z Con A, Jako narzdzie do bada powierzchni ko mrek. Poniewa lektyny rozpoznaj specyficz ne cukry, wiec mog by uywane do bada oglnych reszt cukrowych znajdujcych si na powierzchni komrek. Lektyn uywano w licz nych badaniach por wnawczych glikoprotein powierzchni komrek nowotworowych i prawi dowych (p. rozdz. 61). Badania te wykazay, e do spowodowania aglutynacji komrek nowo tworowych w porwnaniu z normalnymi po trzebne s mniejsze iloci pewnych lektyn, co sugeruje, e o rganizacja i struktura licznych glikoprotein powierzchni komrek nowotworo wych jest inna ni ta, ktr mona spotka na powierzchni komrek normalnych. Do wytwarzania mutantw komrkowych pozbawionych pewnych enzymw, uczestnicz cych w syntezie oligosacharydw. Okazuje si bowiem, e jeh prowadzi si hodowie tkan kowe komrek ssakw w odpowiednim steniu niektrych lektyn (np. Con A), to wikszo z nich obumiera, a tylko kilka opornych przey wa. Wykryto, e takie komrki czsto pozba wione s pewnych enzymw, ktre uczestnicz w syntezie oligosacharydw. Przypuszcza si wic, e komrki s oporne dlatego, e nie wytwarzaj jednej lub wicej powierzchniowych glikoprotein zdolnych do wizania si z uytymi do tego celu lektyna mi. Uycie takich mutan tw komrkowych ma istotne znaczenie w wy janianiu licznych aspektw biosyntezy gliko protein.
ISTNIEJ 4 GWNE KLASY GLIKOPROTEIN

Na podstawie rodzaju wizania midzy acuchem polipeptydowym a acuchem oligo-sacharydowym glikoproteiny mog by podzielone na 4 klasy: 1) zawierajce wizanie midzy Ser lub Thr a GalNAc (ryc. 57-1), 2) proteo-glikany zawierajce wizanie midzy Ser a Xyi, 3) kolagen zawierajcy wizanie midzy hydro-ksylizyn (Hyl) a Gal i 4) glikoproteiny zawierajce wizanie midzy Asn a GIcNAc. W klasach 1, 2 i 3 odpowiednie aminokwasy
Stosowany skrt Con A

WGA
Cukier Man i Glc Gal i GalNA GIcNAc i NeuAc
Lektyna sojowa
Agtutynina kiekw pszenicy

4S Biochemia
754 / ROZDZIA 57
CH2OH
Wystpowanie i struktura acuchw oligosscharydowych 0- wiza -nych glikoprotein. Wiele

glikoprotein tej klasy wykryto w mucynach. O-glikozydowe wizania wystpuj rwnie w glikoproteinach krcych lub zwizanych z bonami. Ponadto wykazano, e GalNAc jest cukrem najczciej bezporednio wizanym do reszt Ser iub Thr (ryc, 57-1) i zwykle reszta Gal lub NeuAc jest do niej przyczona. Struktury dwch typowych acuchw oHgosacharydowych tej klasy pokazano na ryc. 57-2. Poznano rwnie wiele innych odmian.
sekwencja jest glikozylowana i to, czy do niej dojdzie, zaley od konformacji przestrzennej biaka wystpujcego w siateczce rdplazma-tycznej.
Ryc. 57-1. Wizanie N -acetylogalaktozoaminy do seryny i N-aceiyloglukozoaminy do asparaginy,
NeuAc
2'6
GalNAc
Ser(Thr)
przyczone s do reszt cukrowych przez wizanie O-glikozydowe (tzn. w wizaniu bierze udzia grupa OH ze strony acucha amino kwas owego i reszta cukrowa). Natomiast w czwartej klasie wystpuje wizanie N-glikozy-dowe (tzn. w wizaniu bierze udzia N grupy amidowej asparaginy i reszta cukrowa). Klasy 2 i 3 wystpuj stosunkowo rzadko, dlatego te okrelenia O-wizane glikoproteiny czsto uywa si, podobnie jak tutaj, do opisywania glikoprotein klasy l^JCtasa 4 okrelana jest terminem N-wizane "glikoproteiny. Znane s rwnie inne mniejsze klasy. Liczba acuchw oligosacharydowych przyczonych do jednego acucha polipeptydowego moe zmienia si od 1 do 30 lub wicej, a liczba reszt cukrowych tworzcych jeden acuch oligosacharydowy waha si od 2 lub 3 do bardzo wielu. Ponadto, niektre glikoproteiny zawieraj acuchy oli-gosacharydowe zarwno O-, jak i N-wizane. O-wizane glikoproteiny zawieraj tripeptydow sekwencj Asn-Y-Ser (Thr) Wikszo pocze O-glikozydowych wystpuje przy wolnych grupach OH reszt Ser i Thr polipeptydu z tripeptydow sekwencj Asn-Y--Ser (Thr), gdzie Y jest dowolnym aminokwasem, innym ni asparaginian. Ta specyficzna
GalNAc Ser(Thr)
NeuAc
Ryc. 57-2. Struktury dwch O-wizanych oligo-sacharydw wystpujcych w (A) mucynach li -nianek podszczkowych i (B) fetuinie oraz sjalo-glikoproteinie bfon ludzkich erytrocytw. (Wedug; Lennar W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem)
in. Polipeptydowe acuchy tych i innych glikoprotein s kodowane przei mRNA; poniewa wikszo glikoprotein to integralne biaka bonowe lub biaka sekrecyjne, tote oglnie mona powiedzie, e ulegaj one translacji na polirybosomach zwizanych z bonami (p. rozdz. 40). acuchy oligosacharydowe typu O-glikozydowo wizanych glikoprotein s wytwarzane przez stopniowe dodawanie cukrw pochodzcych z cukrw nukleotydowych, takich jak UDP-GalNAc, UDP-Gal i CMP-NeuAc. Enzymy katalizujce ten typ reakcji s glikozy-iotransferazami glikoproteinowymi zwizanymi
Biosynteza O-wizanych glikoprote -
z bonami. Synteza kadego takiego enzymu jest kontrolowana przez jeden specyficzny gen. Oglnie mona powiedzie, e synteza jednego specyficznego typu wizania wymaga aktywnoci odpowiednio specyficznej transferazy (tzn. obowizuje zaoenie jedno wizanie jedna glikozylotransferaza"). Enzymy katalizujce dodawanie wewntrznych reszt cukrowych znajduj si w siateczce rdplazmatycznej i dodawanie pierwszych cukrw nastpuje podczas translacji (tzn. wystpuje kotranslacyjna modyfikacja biaka). Natomiast enzymy dodajce kocowy cukier (taki jak NeuAc) znajduj si w aparacie Golgiego. N -wizane glikoproteiny zawieraj wizanie Asn -GIcNAc Ta klasa wyrnia si obecnoci wizania Asn-GIcNAc (ryc. 57-1). Jest ona gwn klas glikoprotein, dobrze zbadan, dziki atwej dostpnoci do tkanek, w ktrych wystpuje (np. biaka osocza). Nale do niej zarwno glikoproteiny, bdce integralnymi biakami bonowymi jak te biakami krcymi (osoczowymi). Gwne rnice midzy nimi, jak rwnie poprzednimi klasami, poza rodzajem aminokwasu, do ktrego s przyczone acuchy oligo-
sacharydowe (gwnie Asn zamiast Ser), dotycz ich biosyntezy. struktury. Znane s 3 gwne klasy N-wiza-nych glikoprotein: kompleksowe, hybrydowe i wysokomannozowe (ryc. 57-3). Czci wspln w tej klasie jest pentasacharyd (Man)3 (GlcNAc)2, wyrniony lini przerywan na ryc. 57-3, jak rwnie na ryc. 57-4. Rni si one midzy sob jedynie zewntrznymi rozgazieniami. Obecno wsplnego pentasacha-rydu dowodzi, e wszystkie 3 klasy maj wsplny oglny mechanizm biosyntezy. Glikoproteiny typu kompleksowego zwykle zawieraj kocow reszt NeuAc oraz charakterystyczne re szty Gal i GlcNAc, ktre czsto s skadnikami laktozoaminy (obecno powtarzajcego si fragmentu laktozoaminy (Galp>4GlcNAc P l-3)n jest charakterystyczna dla czwartej klasy glikoprotein, tzw. klasy polUaktozoaminowej; klasa ta jest wana, poniewa do niej nale substancje grupowe krwi I/i. Wikszo oligosacharydw typu kompleksowego zawiera 2, 3 lub 4 zewntrzne rozgazienia (ryc. 57-3), chocia opisano take struktury zawierajce 5 rozgazie. Rozga zienia oligosacharydw s czsto nazywane
Klasy IV-wizanych glikoprotein i ich
Kwas sjalowy a2,3 Iub6
Kwas sjatowy
O2,3lub6
l
6 Man (31,4 aUl
Man
Man
1,2|
GlcNAc Man GtcNAc Man Man Man Man Man Man Man Man Man
aUl
GtcAc Man GlcNAc -
J --------------- -Man i 01,4
.1. 3^
^. 6
a1>X
Man- - GicNAc i01,4
*<?* p
<O3X
X^V6
Man 101,4 GlcNAc |01,4 GlcNAc
GIcNAe I 01,4 Fuc GlcNAc
GlcNAc |01,4 GlcNAc
^ GlcNAc
L ----- ! ------------ 1 --------Asn Hybrydowe Asn Wysoko man noowe
Asn Kompleksowe
Ryc. 57-3. Struktury gwnych typw asparagino-wizanych oligosacharydw. Wyrniony obszar jest rdzeniem pentasacharydowym, powszechnie wystpujcym we wszystkich N-wizanych glikoproteinach. (Wedug: Kornfeld R., Kornfeld S: Assembly f asparagine-linked oligosaccharides^mw. Rev. Biochetn. 1985, 54, 631, za zezwoleniem). ________ - ___________________________________________
\
756 / ROZDZIA 57 Endogllkozydaza F ' 04 04 * Man ------- GIcNAc j- GIcNAc *
Asn M a n-a 3 Enduglikozydaza H Ryc. 57-4. Schematyczny diagram podstawo wego rdzenia peniasacharydowego wszystkich N- wizanych oligosaciarydw, do ktrego mog by przyczone rne acuchy oligosacharydowe. Wskazane s rwnie miejsca dziaania endogliko-zydaz F i H.
Przegld procesw zwizany 2 bio syntez N-wizanych giikoprotein. Le-loir i wsp. opisali wystpowanie
antenami i struktury takie okrela si jako bi -, tri-, tetra- i pentaantenowe. W typie kompleksowym glikoprotein wystpuje ogromna liczba acuchw oligosacharydowych, a struktura przedstawiona na ryc. 57-3 jest jedn z wielu. Inne acuchy kompleksowe mog by zakoczone Gal lub Fuc. acuchy oligosacharydowe typu wysokoman noowego zawieraj dodatkowo 26 reszt Man przyczonych do rdzenia pentasacharydowego. Makroczsteczki typu hybrydowego maj cechy charakterystyczne dla obu t ych typw.
1. Tworzenie i przeniesienie zwiz kw typu oligosacharyd-P-dolichol--poliizoprenol
na polirybosomach zwizanych z bonami. acuchy oligosacharydowe typu kompleksowego powstaj na skutek usunicia reszt Glc i 6 Man, tworzc rdze pentasacharydu (Man)3(GlcNAc)2 (ryc. 57-4). Nastpnie okrelone glikozylotrans-ferazy, zlokalizowane najczciej w aparacie Golgiego, przenosz charakterystyczne dla acucha kompleksowego cukry (GIcNAc, Gal, NeuAc) na odpowiedni akceptor. Natomiast acuchy wysokomannozowe powstaj przez przyczanie reszt Gal lub usuwanie pewnych peryferyjnych reszt Man. Proces, w wyniku ktrego acuchy gikanowe N-wizanych glikoprotein s najpierw czciowo usuwane, a potem przebudowywane, okrela si jako proces przeksztacania (obrbki) oUgosacharydw. Pocztkowe etapy biosyntezy N - i O-wizanych glikoprotein znacznie rni si midzy sob. I tak w biosyntezie N-wizanych glikoprotein uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, natomiast nie uczestniczy on w biosyntezie O-wizanych glikoprotein. W procesie tym mona wyrni dwa etapy: 1) tworzenie i przeniesienie oligosacharydu-P--P-dolicholu, 2) obrbka acuchw oligosa -charydowych.
oligosacharydu zwizanego z difosibdolicholem (aligosachary-do-P-P-DoI), ktry peni gwn rol w biosyntezie N-wizanych glikoprotein. Ogln struktur acucha oligosacharydowe go tego zwizku mona przedstawi nastpujcym wzorem (Glc)3(ManyGJcNAs) rR. gdzie R = P-P-Dol. W pierwszym etapie biosyntezy cukry najpierw przyczone s do difosfodolicholu, a pniej acuchy oligosacharydowe s przenoszone w caoci do odpowiednich reszt Asn, bdcych akceptorami apoglikoprotein podczas syntezy
wystpuje zarwno w tkankach eukariotycznych, jak i u bakterii. Ten nonik prekursorowych jednostek oligosacharydowych bierze udzia w syntezie bon komr kowych bakterii, jak rwnie w biosyntezie N-wizanych glikoprotein. W tkankach euka riotycznych do syntezy wykorzystywany jest dolichol, zwizek nalecy do rodziny poliizo-prenoii. Dolichol, obok gumy, jest najduszym naturalnie wystpujcym wglowodorem: skada si on z 1720 powtarzajcych si pojedynczych podjednostek izoprenoidowych (ryc. 57-5).
i
CH, I HI HO-CH,-CH,-C-CH,- CHi-CH=;C-CHj CH,
I
CH,
I
CH,~ CH =C -C Hj
Ryc. 57-6. Struktura dolicholu. Fosforan w fosforanie dolicholu poczony jest z grup alkoholow, po lewej stronie czsteczki. Fragment objty klamr jest czci izoprenu (n = 17 20 jednostek izoprenoido wych).
W biosyntezie oligosacharydu-P-P-dolicholu bierze udzia fosfodolichol (Dol-P), ktry powstaje w reakcji dolicliotu z ATP (nonik fos foranu), katalizowanej przez kinaz dolicholo-w. GkNAc-difosfo-doUchol (GlcNAc-P-P-Dol) jest gwnym lipidem, speniajcym rol akceptora dla innych cukrw tworzcych oligosacha-ryd-P-P-Dol. Jest on syntetyzowany na bonach szorstkiej siateczki rdpiazmatycznej z Dol -P i UDP-GlcNAc w nastpujcych reakcjach:
Dol-P : UDP-GIcNAc GIcNAc-P-P-Dol+UMP
b. Nastpnie przyczonych zostaje 5 reszt Man, pochodzcych z GDP-Man. c. W kocu przyczone zostaj 4 kolejne reszty Man, pochodzce z Dol -P-Man. DoJ-P-Man powstaje w nastpujcej reakcji:
Dol-P + GDP-Man <-> Dol-P-Man + GDP
Reakcja ta jest pierwszym etapem tworzenia oligosacharydu-P-P-Dol. Kolejne reakcje przedstawione s na ryc. 57 -6. Dalsze etapy tworzenia si oligosacharydu-P--P-dolicholu przebiegaj nastpujco: a. Druga reszta GlcNAc zostaje przeniesiona na pierwsz, przy czym UDP-GlcNAc jest jej nonikiem.
UDPGIcNAc Dol-P >* --------- Tunl kamycyna -UMP
d. Biosyntez oligosacharydu prekursorowego kocz 3 reszty glukozy przeniesione z Dol-P-Glc. Dol-P-Glc powstaje w reakcji podobnej do wyej przedstawionej z l rnic, e Dol -P i UDP-Glc s substratami. Naley zwrci uwag na to, e pierwsze 7 cukr w (2 reszty GlcNAc i 5 reszt Man) pochodzi z cukrw nukleotyd owych, podczas gdy 7 ostatnich cukrw W resziy Man i 3 reszty Glc) jest przenoszonycn^z cukrw dolicholo-wych. Rezultatem powyszych reakcji jest zwizek przedstawiony na ryc. 57-7. Jego wzr sumaryczny mona poda jako (Glc)3(Man)9 (GlcNAc)2-P-P-Dol.
GlcNAc-P-P-Dol UDPGtaNAc UDP
M-M M M-M
M-tG!cNAc)s~P-P-Doi
G-G-G-M-M-M GlcNAc-G l GDP-M M- P- D ol i G- P- D o l GDP" M-GIcNAc-GIcNAc-P-P-Dol

M
,P-Dol
{Ml.-(GlcN Ac),-P-P-Dol P-Dol M-P-Dol M-(GlcNAc)i-P-P-Dol (GOP-M), M-M-M
Ryc. 57-8. Szlak biosyntezy dolicholo-P-P-oligosachsrydu. Rodzaje powstaych specyficznych wiza sa pokazane na ryc. 57-7. Mona zauway, e zewntrzne resay mannozy pochodz z GDP -mannozy, podczas gdy wikszo reszt mannozy i glukozy pochodzi z dolicholo -P-rnannozy i doticholo-P-glukozy. UDP-urydynod(fosforan;Ool dolichol; P fosforan; UMP urydynomonofosforan,GDP guanozynomonofosforan; M mannoza; G glukoza. __________________________________________
758 / ROZDZIA 57
Bi.2 Man Man ^M an
Man
1.3
M a n jS iS iU G lcNA c * G lcNA c -P -P -Do llc ho l

a 1,3
_L2*Ma^ManH*Man
Ryc. 57-7. Struktura do licho lo -P- o ligosacharydu. {Wed ug: Lennarz W, J.; Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).
The Biochemisry of ________
Oligosacharydy zwizane z difosfodolicho-lem s przenoszone w caoci na nowo zsyn-tetyzowane biako zwizane z bon szorstkiej siateczki rdplazmatycznej. by wytworzy N-glikozydowe wizanie z jedn lub kilkoma specyficznymi resztami Asn acucha polipep-tydowego. Reakcja jest katalizowana przez transferaz oligosacharydow", ktra jest enzymem zwizanym z bon wewntrzn siateczki. Transferaza ta moe rozpozna i przenie kady lipid o strukturze R-(GlcNAc)2-P-P-Dol. Glikozylacja zachodzi na resztach Asn tripep-tydowej sekwencji Asn-X-Ser/Tir, gdzie X jest dowolnym aminokwasem, innym ni reszty proiiny i kwasu asp ara gin owego. Uprzywilejowanymi miejscami do glikozylacjijest tripeptyd wykazujcy konformacj przestrzenn p. Tylko ok. \'i reszt Asn ulega glikozylacji i biaka podatne na ten proces mona podzieli na dwie grupy: sekrecyjne i integralne bonowe. Biaka cytoplaz-my stosunkowo rzadko ulegaj glikozylacji. Na ryc. 57-8 przedstawiono reakcj przeniesienia oraz pniejszy proces gliksj^lacji N-wizanych gliko-protein, jak rwnie lokalizacj tych ostatnich w strukturach subkomrkowyci. Drugim produktem reakcji katalizowanej przez transferaz oligosacharydow jest doli-cholo-P-P, ktry pod wpywem fosfatazy ulega konwersji do dolicholo-P, Dolicholo-P moe ponownie suy jako akceptor w syntezie innej cz steczki o I ig osa c h a ry do- P- P-dolich o lu. 2. Przeksztacanie (obrbka) acu chw otigosacharydowych. pokazane s rne typy reakcji biorcych udzia w tym procesie. Reakcj 1 katalizuje transferaza oligosacharydow (p. poniej), W reakcji 2 i 3 kolejno usuwane s: przez glukozydaz I kocowa reszta Glc oraz przez glukozydaz II dwie reszty Glc. W przypadku glikoprotein typu wysoko ma nnozowego proces ten moe by za-
trzymany na tym etapie, lub te mog dodat kowo zosta usunite 4 reszty Man. Natomiast acuchy typu kompleksowego tworzone s w dalszych etapach. Mianowicie 4 zewntrzne reszty Man s usuwane w reakcjach 4 i 5 przez rne mannozydazy. W reakcji 5, katalizowanej przez GlcNAc-transferaz I, reszta GlcNAc jest dodawana do jednej Man. Dziaanie kolejnego enzymu, mannozydazy (ot-mannozydazy II aparatu Golgiego) umoliwia przebieg reakcji 7, w wyniku ktrej dochodzi do redukcji reszt Man w rdzeniu do 3 reszt (ryc. 57-4). Na rycinie 57-8 reakcje I i II przedstawiaj dodatkowy wany szlak metaboliczny przeksztacania oligosacharydw. Przedstawiona jest tutaj synteza jednostek oligosacharydo-wych enzymw Hzosomalnych, ktre po uzyskaniu specyficznego markera kierowane s do lizosomw. W reakcji I reszta GlcNAc-1-P jest przenoszona na grup OH przy wglu 6 jednej lub wicej reszt Man tych enzymw. Reakcja ta, przedstawiona niej, jest katalizowana przez GlcNAc-fosfotransferaz. Nonikiem GlcNAc jest UDP-GlcNAc, za produktem reakcji UMP.
| Glc-NAC-FOSFOTRAMSFERAZA |
UDP-GtellAc+Man-BialkoiGIcNAc-i-P-e-Man-Biako+UMP
W reakcji II reszta GlcNAc jest usuwana pod wpywem fosfodiesterazy, pozostawiajc fosfo-rylowane reszty Man w pozycji 6 Man.
j FOSFODIESTEHAZA | Glc NAc-1 -P-6 -Man- Biako i P-6 -Man- Biako +Glc NAc
a. Wczeniejsza faza. Na rycinie 57-8
Receptor dla Man-6-P zlokalizowany w aparacie Golgiego wie reszt Man-6-P i kieruje j potem do lizosomw. Fibroblasty pochodzce od pacjentw, u ktrych stwierdza si chorob
GUKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 759

SZORSTKIE RETIKULUM S ROD PLAZM ATYCZ NE'
Ryc. 57-8. Schematyczny szlak biosyntezy oligosacharydw. Reakcje s katalizowane przez nastpujce enzymy: 1 oligosaciarylotransferaza, 2 a-glukozydaza I, 3 a-glukozydaza II, 4 ct1,2-mannozydaza, I. N-acetyloglukozoaminylofosfotransferaza, II. N-acetyio-glukozoamino-1-fosfodiestero-s-N-acetyloglukozoaminidaza siateczki rdplazmatycznej, 5 a-mannozydaza I aparatu Golgiego, 6 N-acetyloglukozoaminylotransferaza I, 7 %- ma n noy baza II aparatu Golgiego, 8 N-acetylologlukozoaminylotransferaza II, 9 fu kozy I otr n sfer aza, 10 galaktozylotransferaza, 11 sjalilotransferaza, N-acetyloglukozoamina, O mannoza, A glukoza, A fukoza, gaiaktoza, kwas sjalowy. (Wedug: Kornfeld R.. Kornfeld S.: Assembly of asoaragine-Nnked oligosaccharides; Annu. Rev. Biochem. 1985, 54, 631, za zezwoleniem). ____ ________________________
wtrtw komrkowych (I-cell disease) (p. poniej) maj receptory dla fosfomannoowych oligosacharydw, lecz wykazuj duy niedobr GlcNAc-fbsfotransferazy. b. Pniejsza faza. acuchy oligosacha-rydowe typu kompleksowego tworz si dziki przyczaniu dodatkowych cukrw do jedno stek oligosacharydowych powstaych w reakcji
7. W reakcji 8 druga reszta GlcNAc jest dodawana do zewntrznej reszty Man innych rozgazie biantenowej struktury pokazanej na ryc. 57-8: enzymem katalizujcym ten etap jest GlcNAc-transferaza II. Natomiast w reakcjach 9, 10, i 11 katalizowanych przez fukozylo-, gaiaktozylo- i sjalilotransferazy kolejno dodawane s reszty Fuc, Gal i NeuAc.
760 / ROZDZIA 57
S u bk om orko we miejsca. Gwnymi miejscami, w ktrych zachodzi proces glikozylacji, s siateczka rdplazmatyczna i aparat Golgiego, co pokazano na ryc. 57-8. acuchy oligo-sacharydowe s przyczone w szorstkiej siateczce rdplazmatycznej i jest to zjawisko zarwno ko-, jak i potranslacyjne. W siateczce rdplazmatycznej zachodzi rwnie odcinanie reszt GIc oraz niektrych peryferyjnych reszt Man. Aparat Goigiego skada si ze specyficznych cystern, mianowicie: cis, rodkowych i trans, ktre mog by rozdzielone za pomoc od powiedniego wirowania. Glikoproteiny po wstae w siateczce rdplazmatycznej przenoszone s potem do cystern cis Golgiego. Wiele rnych bada potwierdzio, e enzymy uczestniczce w procesie syntezy glikoprotein wykazuj swoist lokalizacj w cysternach Golgiego. Jak wynika z ryc. 57-8 oc-mannozydaza I aparatu Golgiego (katalizujca reakcje 5) znajduje si gwnie w rejonie cis aparatu Golgiego, podczas gdy GlcNAc-transferaza (katalizujca reakcj 6) okazaa si by obecna w rejonie rodkowym aparatu Golgiego. Natomiast fukozylo-, galak-tozyio- i sjalilotransferazy (katalizujce reakcje 9, 10 i 11) obecne s w rejonie trans aparatu Golgiego. W regulacj procesu glikozylacji glikoprotein wcignitych jest wiele enzymw i kolejno dziaania tych enzymw Jest oczywiste, e glikozylacja glikoprotein jest procesem zoonym, w ktrym bierze udzia wiele enzymw. Udowodniono, e w tym zoonym procesie uczestniczy 7 glikozylotransferaz, ale teoretycznie moe wystpowa wiele innych. Znane s liczne rodzaje innych glikozylotransferaz (np. sjalilotransferazy). Pierwsze etapy biosyntezy N-wizanych glikoprotein (tzn. tworzenie i przenoszenie oligosacharydw) s kont rolowane przez nastpujce czynniki: 1) obecno odpowiednich miejsc akceptorowych na biaku, 2) odpowiednie stenie Dol-P w tkankach i 3) aktywno transferazy oligosachary-dowej. Proces przeksztacania acuchw oligosa-charydowych rwnie podlega kontroli. Tymi czynnikami kontrolujcymi s: 1) aktywno w ko mrkach rnych hydrolaz i transferaz biorcych udzia w syntezie rnych typw acuchw oligosacharydowych (np. typu kompleksowego czy wysokomannozowego); oczywicie, jeli swoista transferaza nie wystpuje
w tkance, to odpowiednie wizanie cukrw nie powstaje; 2) niektre z enzymw mog dziaa dopiero po uprzednim dziaaniu innych en zymw, np. dziaanie GlcNAc -transferazy I (ryc, 57-8) umoliwia nastpn reakcj katalizowan przez oc-mannozydaz II aparatu Golgiego; 3) aktywnoci rnych transfera z zmieniaj si w czasie cyklu yciowego organizmw, co czciowo wyjania fakt tworzenia rnych acuchw oligosacharydowych podczas kolejnych etapw tego cyklu; 4) fakt, e poszczeglne glikozyl o transferazy maj rn wewntrzkomrkow lokalizacj sprawia, e peni one wan rol w regulacji procesw biosyntezy glikoprotein, np. jeli syntetyzujce sie biako ma by integralnym biakiem bonowym siateczki rdplazmatycznej (np. HMG-CoA), to nigdy nie jest transportowane w rejonie aparatu Golgiego, gdzie mogoby napotka enzymy przeksztacajce biaka znajdujce si w tym rejonie; zgodnie z tym nie jest zaskoczeniem, e reduktaza HMG-CoA jest glikoprotein wyso-komannozow; 5) inny wany czynnik to konformacja przestrzenna biaka. Badania biosyntezy glikoprotein przez spokrewnione wirusy wykazay, e zawieraj one rne typy acuchw oligosacharydowych, kiedy byy hodowane w tej samej komrce; ten fakt mona by najlepiej wytumaczy tym, e biaka maj rn konformacj przestrzenn, ktra decyduje o miejscach glikozylacji; 6) profile enzymw uczestniczcych w procesie przeksztacania jednostek oligosacharydowych wykazuj znaczne rnice midzy gatunkowe; jednostki oligosa-charydowe wirusa Sindbis, w zalenoci od komrki gospodarza, w ktrej byy hodowane, mog by typem wysokomannozowym lub kompleksowym; 7) interesujce s rwnie badania aktywnoci enzymw rnych typw komrek nowotworowych; s dowody, e komrki nowotworowe syntetyzuj rne acuchy oligo-sacharydowe (np. czsto maj wicej rozgazie) w porwnaniu do komrek kontrolnych. Interesujca wydaje si korelacja midzy aktywnoci specyficznych enzymw uczestniczcych w przeksztaceniach potranslacyjnych a zdolnoci nowotworw do tworzenia przerzutw (p. rozdz. 61). Wiele substancji hamuje proces glikozyiacji Znane s liczne zwizki, ktre hamuj rne etapy przeksztacania glikoprotein. Przykadami takich zwizkw mog by: tunikamycyna,
GUKOPROTEINy I PROTEOGUKANY / 761 Tabela 57-6. Trzy inhibitory enzymw uczestniczcych . w procesie glikozylacji glikoprotein i miejsca ich dziaania Inhibitor Miejsce dziaania Tunikamycyna Inhibitor enzymu katalizujcego dodawanie reszty GIcNAc do Dolichol-P w pierwszym etapie biosyntezy oligosacharydu-P-P--dolicholu Deoksynojirimycyoa Inhibitor glikozydazy i i II Swainsomria Inhibitor mannozydazy II
deoksynojirimycytia i swainsonina. W tabeli 57-6 przedstawiono dziaanie tych inhibitorw. Zwizki te mog by uywane jako czynniki hamujce rne etapy biosyntezy glikoprotein, jak rwnie do badania skutkw tego hamowania. Na przykad, jeli komrki s hodowane w obecnoci tunikamycyny, to proces syntezy N-wizanych glikoprotein nie nastpi. Dziaanie tych inhibitorw w pewnych przypadkach wzmaga wraliwo biaek na proteoliz. Okazao si, e hamowanie glikozylacji przez rne inhibitory nie wpywa w sposb stay na sekwencj normalnie wydzielanych biaek.
roblastw pochodzcych od pacjentw, u ktrych rozpoznano wymieniona chorob, enzymw lizosomalnych otrzymanych od zdrowych osobnikw wykazao, e komrki maj zdolno wychwytywania egzogennych enzymw lizosomalnych, co dowodzi, e posiadaj nor malne receptory dla enzymw lizosomalnych. Badania te sugeruj, e enzymy lizosomalne chorych z chorob wtrtw komrkowych naj-prawdopodobnej nie maj markera rozpoznajcego, a enzymy lizosomalne zdrowych osob nikw maj go. Fibroblasty pacjentw z chorob wtrtw komrkowych, mimo e maj receptory dla fosfomannozowych oligosacharydw, nie s w stanie umieci tego markera na jednostkach wielomannoowych hydrola2 lizosomalnych, gdy nie maj GlcNAc-fosfotrans-ferazy uczestniczcej w "f^tn procesie. Te badania biochemiczne nie tylko wyjaniy patogenez opisywanej choroby, ale rwnie przyczyniy si do poszerzenia wiedzy na temat transportu nowo syntetyzowanych biaek do specyficznych organelli, w tym przypadku do lizosomw.
PROTEOGLIKANY I GLIKOZOAMINOGLIKANY
Glikozoaminogikany wystpujce w proteoglikanach zbudowane s z powtarzajcych si jednostek disacharydowych
CHOROBA WTRTW KOMRKOWYCH (I -CELL DISEASE) JEST WYNIKIEM NIEMONOCI UMIESZCZENIA ENZYMW L1Z0S0MALNYCH W LIZOSOMACH
Jak to wyjaniono powyej, Man-6-P jest chemicznym markerem kierujcym enzymy li-2osomalne do lizosomw. Badania hodowli fibroblastw pochodzcych od pacjentw, u ktrych rozpoznano chorob wtrtw komrkowych (l-cell disease), wykazay istotn rol tego markera w tym procesie chorobowym. Okazao si bowiem, e fibroblasty zmienione chorobowo maj mae stenie prawie wszystkich enzymw lizosomalnych, a lizosomy gromadz due iloci nie zdegradowanych rnych makroczsteczek. Jednake w surowicy pacjentw z tym schorzeniem stwierdza si znacznie zwikszone stenie tych enzymw, co sugeruje, e enzymy lizosomalne s syntetyzowane, ale nie mog dosta si do wewntrzkomrkowych miejsc przeznaczenia. Dodanie do hodowli fib-
Proteoglikany s biakami zoonymi, zawierajcymi kowalencyjnie przyczone glikozoa-minoglikany (GAG). Biaka kowalencyjnie wice GAG nazywane s rdzeniami biakowymi; wyizolowanie tych makroczsteczek w formie nie zdegradowanej sprawia wiele trudnoci, ale wprowadzenie nowoczesnej techniki inynierii genetycznej do bada nad proteoglikanami do starcza coraz to waniejszych informacji na temat ich struktury. Ilo skadnika cukrowego przypadajca na acuch polipeptydowy w pro teoglikanach jest znacznie wiksza ni w gliko-proteinach, siga a 95% ich cakowitej masy. Znanych jest 7 rodzajw GAG: kwas hialuro -nowy, siarczan chondroityny, siarczan kerata-nu I i II, heparyna, siarczan heparanu i siarczan dermatanu. GAG s nierozgalzionymi polisacharydami zoonymi z powtarzajcych si jednostek disacharydowych, gdzie jednym ze skadnikw jest zawsze aminocukier (std nazwa GAG), tj. D-glukozoamina lub D-galaktozoa-
762 / ROZDZIA 57
mina, drugim za (wyjtkiem jest siarczan kera-tanu) kwas uronowy, tj. kwas D-glukuronowy (GlcUA) lub jego epimer, kwas L-iduronowy (IdUA). Z wyjtkiem kwasu hialuronowego, wszystkie GAG zawieraj grup siarczanow, w postaci albo O-estrowej, albo N-siarczanowej (jak w heparynie i siarczanie heparanu). Kwas hialuronowy jest jedynym wyjtkiem, bowiem brak jednoznacznych dowodw na temat kowalencyjnego poczenia tego kwasu z biakiem, co wynika z powyszej definicji proteoglikanw. W przeszoci napotykano wiele trudnoci zwizanych z wyodrbnieniem tych zoonych makroczsteczek. Jednake s one wanymi skadnikami substancji podstawowej tkanki cznej, penicymi wiele istotnych biologicznych funkcji, co wicej, w rnych stanach chorobowych, w ktrych dochodzi do przebudowy tkanki, zachodz rwnolegle zmiany w proteoglika-nach. Nic dziwnego, e zwizki te s przedmiotem wzrastajcego zainteresowania. Biosynteza proteoglikanw obejmuje przyczenie glikozoaminoglikanw do rdzenia biakowego, wyduenie i zakoczenie acuchw Znane s 3 typy wizania midzy GAG a rdzeniem biakowym. O-gHkozydowe wizanie midzy ksyloz (Xyl) a seryn (Ser), ktre wystpuje tylko i wycznie w proteogtikanach. Powstaje ono przez przeniesienie reszty Xyl z LJDP-ksylozy na Ser. Nastpnie dwie reszty Gal s dodawane do reszty Xyl, tworzc charakterystyczny trisacharyd Gal-Gal-Xyl-Ser: Dalszy wzrost acuchw GAG zachodzi na kocowej reszcie Gal. O-glikozydowe wizanie tworzone midzy GalNAc a Ser (Thr), wystpujce w siarczanie keratanu II. Powstaje ono dziki przeniesieniu GalNAc z UDP-GlcNAc na Ser (lub Thr) acucha poiipeptydowego. N-glikozydowe wizanie midzy GLcNAc a azotem amidowym Asn, ktre jest charak terystyczne dla N-wizanych glik o protein. W syntezie tego wiz ania uczestniczy oligosacharyd-P-P-Dol, co zostao opisane powyej. Synteza rdzenia biakowego, jak te powstawanie niektrych wiza, zachodzi w siateczce rdplazmatycznej. Natomiast wikszo pniejszych etapw biosyntezy acucha GAG i ich modyfikacje nastpuj w aparacie Gol-giego.
cuchw GAG wykorzystywane s odpowiednie cukry nukleotydowe i wysoce specyficzne gliko-zylotransferazy, znajdujce si w aparacie Gol-giego. Obowizuje nadal zasada , jedno wizaniejeden enzym", podobnie jak dla pewnych typw wiza wystpujcych w glikoprotei-nach. Enzymy biorce udzia w procesie wyduania acucha s zdolne do wiernej reprodukcji zoonych GAG.
Wyduanie acucha. Do syntezy a-
Zakoczenie (terminacja) acucho -
wa. Jest ono wynikiem: 1) siarczanowania okrelonych pozycji pewnych cukrw, 2) wyduenia acuchw GAG daleko poza bonami, gdzie zachodzi kataliza.
Przyczenie do rdzenia biakowego.
cuchw GAG, zachodz liczne chemiczne modyfikacje, polegajce na wprowadzeniu grupy siarczanowej do okrelonej pozycji GalNAc oraz na epimeryzacji reszt GlcUA do IdUA. Proces siarczanowania, katalizowany przez odpowiednie sulfotransferazy, przebiega przy udziale 3'-fosfoadenozyno-5'-fosfosiarczanu (PAPS, aktywny siarczan), bdcego nonikiem grupy siarczanowej. Sulfotransferazy znajdujce si w aparacie Golgjego s enzymami wysoce specyficznymi, katalizujcymi siarczanowanie cukrw w rnych pozycjach (np. przy wg \u w pozycji 2, 3, 4 i 6). Epimeryzacj reszt kwasu glukuronowego do iduronowego katalizuj epi-merazy.
Dalsze modyfikacje. Po utworzeniu a-
Poszczeglne rodzaje glikozoaminoglikanw wykazuj subtelne rnice w strukturze oraz charakterystyczne rozmieszczenie Siedem wymienionych wyej GAG rni si midzy sob nastpujcymi waciwociami: skadem aminocukrowym, wystpowaniem kwasu glukuronowego lub iduronowego, typem wizania midzy skadnikami jednostek disa-charydowych, dugoci jaricucha, wystpowaniem lub nie grup siarczanowych, skadem aminokwasowym rdzeni biakowych, typem wizania midzy rdzeniem biakowym a GAG, rozmieszczeniem w poszczeglnych tkankach i strukturach subkomorkowych oraz funkcjami biologicznymi. Poniej omwiono krtko struktur GAG (ryc. 57-9), ich poczenia z rdzeniem bia kowym lub innymi biakami oraz ich' rozmieszczenie w tkankach. Charakterystyczne wa -' ciwoci tych 7 GAG wymienione s w tab. 57-7.
GL1K0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 763 Kwas hialu ronowy Siarczany chondroityny

G , cU A * GalN A c
. Ga , 11 Gat Xy( J L. Ser
4- lub 6-Siarczan Siarczany keratanu 1 i ii

Gl c NAc^ G al ^G lc NA c +
"5-* GlcNAc-* Asn (Siarczan keratanu I)
6-Siarczan
f Heparyna I siarczan heparan u
6-Siarczan ""GalNAc-^-* Thr ISer)[Siarczan | keratanu I!) Gal-NeuAc
6-Siarczan I * W UA GlcN G lcUA -^ GlcNA c -^ G lcUA ^* G af -^ Gal -^ X Y I S er
2-Slarczan Siarczan ermatanu
SO3- or Ac
> IdUA > GalNAc - GlcUA - GalNA c GlcUA * Gal ' Gal ^ Xy1 S er
3-Siarczan 4-Siarczan Ryc. 57-9. Struktury pro teoglikanw i gliko zoaminoglikanw. GlcUA kwas D -glukuro no wy; IdUA kwas L-iduro no wy: GlcN D-gluko zoamina; GaIN D-galaktozoamina; A c acetyl; Gal galaktoza; Xyl ksyloza; Ser L-seryna; T hr L-treonina; Asn asparagina; Man manno za; NeuAc kwas N- acetyloneuraminowy. Przedstawione wzory tych makroczsteczek obrazuj jedynie skad jakociowy, nie odzwierciedlajc w petni ich str uktury. adna z wymienionych struktur nie oddaje wiernie wszystkich moliwoci podstawienia dodatkowej grupy, np. w heparynie wikszo reszt kwasu iduro nowego zawiera w pozycji 2 grup siarczanow, natomiast w siarczanie dermatanu tylko niektre reszty^ t ego kwasu s podstawione siarczanem. W siarczanie cho ndroityny, dermatanu, heparanu i heparynie pokazano rwnie charakterystyczny obszar wicy GAG - i z rdzeniem biakowym {-Gal-Gal-Xy)- ). {Wedug; Lennarz W. J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, P lenum Press, 1980, zmodyfikowane, za zezwoleniem).
T abela B7-7. Gwne waciwoci glikozoamino glikanw GAG HA CS KSI KS II Heparyna Cukry GIcNac, GlcUA GalNAc, GlcUA GlcNAc, Gal GlcNAc, Gal GlcN, IdUA Siarczan f lub 6' GalNAc 6' GlcNAc, 6'Gal jak w KS 1 N GlcN, 6rGlcN, 2'ldUA N GlcN, 6'GlcN 4'GalNAc 2'ldUA Wizanie do biaka brak dowodw Xyl-Ser; czy si z HA przez biaka GIcNAc-Asn GalNAc-Thr Ser Wystpowanie Pyn stawowy, ciako szkliste, luna tkanka czna Chrzstka, ko, rogwka Rogwka Luna tkanka czna Mastocyty
Siarczan heparanu Siarczan dermatanu
GlcN, GlcUA GalNAc, idUA (GlcUa)
Xyl-Ser Xyl-Ser
Fibroblasty skry, ciana aorty Powszechnie wystpujcy
764 / ROZDZIA 57
jest nierozgazionym acuchem polisachary-dowym, zoonym z powtarzajcych si jednostek disacharydowych, zawierajcych GlcUA i GlcNAc. W przeciwiestwie do innych GAG nie tworzy on kowalencyjnego wizania z biakami. Wystpuje on w komrkach bakteryj nych, jak rwnie powszechnie w rnych tkankach zwierzcych i ludzkich (np. w pynie stawowym, ciaku szklistym oka i w lunej tkance cznej). Siarczany chondroityny (chondroity-no-4-siarczan i chondroityno-6-siar-czan). Proteoglikany
powstae w wyniku O-glikozydowego wizania Xyl-Ser-O- z siar czanem chondroityny s gwnymi skadnikami
Kwas hialuronowy. Kwas hialuronowy
chrzstki. Jednostki disacharydowe siarczanu chondroityny i kwasu hialuronowego s bardzo podobne, zawieraj GlcUA, z t jednak rnic, e siarczan chondroityny zawiera GaNAc za miast GlcNAc. Ponadto, reszta GalNAc jest podstawiona w pozycji 4 tub 6 siarczanem. W przyblieniu 1 grupa siarczanowa przypada na 1 jednostk disacharydow. Kady acuch tego GAG zoony jest z ok. 40 jednostek disacharydowych, a jego masa wynosi 20 000. Wiele takich acuchw jest przyczonych do pojedynczego acucha polipeptydowego, tworzc proteoglikany o duej masie czsteczkowej (np. w chrzstce nosa masa czsteczkowa proteoglikanu w przyblieniu wynosi 2,5 x 106). Siarczany chondroityny cz si bardzo sil nie z kwasem hialuronowym za porednictwem 2 biaek wicych", ktre wi si hydro-fobowo zarwno z kwasem hialuronowym, jak i rdzeniami biakowymi, tworzc w tkance cznej bardzo due makroczsteczki, nazywa ne agregatami (p. ryc. 57-10 i 57-11).
Ryc. 57-11. Schematyczne przedstawienie agre-
Kwas hialuronowy Siatka wice Siarczan keratanu rczan chondroityny Rdze biakowy
Podjednostk!
Ryo. 57-10. Obraz elektronomikroskopowy agregatu proteoglikanu redniej wielkoci, w ktrym podjednostka (monomer) proteoglikanu i -filamemy rdzenia s znacznie powikszone. {Wedug: Rosen-berg L, Hellman W., Klein-Schmidt A, K.: Electron microscopic studies of proteogiycan aggregates from bovinearticularcartilage; J. Biol. Chem. 1975; 250; 1877, za zezwoleniem).
gatu proteoglikanu. (Wedug: Lennarz W J.: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans; Plenum Press, 1980, za zezwoleniem).
GLIK0PR0TE1NY I PROTEOGLIKANY / 785
stawiono na ryc, 57-9 skadaj si z powtarzajcych jednostek disacharydowych Gal-Gk NAc. Mog one zawiera grup siarczanow w pozycji 6 GlcNAc lub czasem Gal. Typ 1 tego GAG wystpuje przede wszystkim w rogwce, typ II, obok siarczanu chondroityny i kwasu hialuro-nowego, w lunej tkance cznej. Typ I i II rni si sposobem wizania z biakiem (ryc, 57-9). Heparyna. Powtarzajca si jednostka disa-charydowa zoona jest z glukozoaminy (GlcN) i kwasu gtukuronowego lub iduronowego (ryc. 57-12). Wikszo grup aminowych GlcN jest N-siarczanowana, a nieliczne acetylowane. Ponadto, GlcN w pozycji 6 zawiera cstrowo zwizan grup siarczanow. W heparynie ok. 90% kwasu uranowego to IdUA. W pierwszym etapie biosyntezy GAG powstajcy acuch zawiera kwas glukurono-wy, aie w wyniku procesu epimeryzacji z udziaem 5-epimerazy 90% reszt GlcUA zostaje przeksztaconych do reszt IdUA. Czsteczka biaka proteoglikanu heparyny jest wyjtkowa, skada si bowiem wycznie z reszt seryny i glicyny. Przecitnie */a reszt seryny jest poczonych z acuchem GAG, tworzc proteoglikan o masie czsteczkowej 500015 000 lub czasem wikszy. Heparyna wystpuje w 2iarnistociach komrek tucznych, a take w wtrobie, w pucach i skrze. Siarczan heparanu. Wystpuje jako pro teoglikan zarwno na powierzchniach komr* kowych. jak i pozakomrkowo. Zawiera on GlcNAc z mniej licznymi resztami siarczanowymi ni heparyna i w odrnieniu od heparyny gwnym kwasem uranowym jest GlcUA. Reszta GlcNAc moe by podstawiona kilkoma grupami siarczanowymi.
Siarczany keratanu I i II. Jak przed-
puje w tkankach zwierzcych. Strukturalnie jest podobny do siarczanw chondroityny i siar czanu heparanu. Jego struktura jest podobna do siarczanu chondroityny z t jednak rnic, e w miejscu GlcUA zwizanego z GatNAc wizaniem 0 -1,3 znajduje si IdUA zwizany z GlcNAc wizaniem a-1,3. Synteza IdUa odbywa si podobnie jak w heparynie czy siar czanie heparanu, tj. przez 5-epimeryzacj. GlcUA. Poniewa proces ten jest regulowany przez stopie siarczanowania, w przypadku nieca kowitego siarczanowania siarczan dermatanu skada si zarwno z disacharydu: IdUA-Gal-NAc, jak i GlcUA-GalNAc. Niedobory enzymw degradujcych przyczyn mukopolisacharydoz i mukoipidoz
Siarczan dermatanu. Powszechnie wyst-
glikozoaminoglikany glikopyoteiny s Zarwno egzo-, jak i endoglikozydazy
degraduj GAG. Podobnie jak i inne biomak-roezijsteczki, GAG podlegaj procesom metabolicznym, zarwno syntezy, jak i degradacji. Ich ptokres przemiany, w tkankach dojrzaych, jest stosunkowo krtki, rzdu kilku dni do paru tygodni. Poznanie szlaku degradacji glikoprotein, pro-teoglikanw i GAG w znacznym stopniu przyczynio si do wykrycia wrodzonych wad metabolicznych, wynikajcych z niedoboru specyficznych enzymw. Do tych odkry znacznie przyczyniy si badania dotyczce 2 grup cho rb: mukopolisaciarydoz i mukoipidoz. Pocztkowo sdzono, e mukolipidozy s wynikiem tylko zaburze w metabolizmie mukopolisacha-rydw (GAG) lub glikosfingoiipidw, dopki nie wykazano, e rwnie degradacja acuchw oligosacharydowych glikoprotein moe
GlcN
IdUA
GlcN
IdUA
GlcN
GlcUA
GlcNAc
Ryc. 57-12. Struktura heparyny. Fragment polimeru przedstawia charakterystyczne strukturalne cechy typowej heparyny. Jednake na tej rycinie zostaa przedstawiona wybrana sekwencja rnie pod stawionych powtarzajcych si jednostek disacharydowych. Dodatkowo mog rw nie wystpowa w pozycji 3 niesiarczanowane bd siarczanowane reszty glukozoaminy. (Wedug: Undahl U. i wsp.: Structure and biosynthests of heparin like polisaccharides; Ferf. Proc. 1977, 36, 19, za zezwoleniem; zmodyfikowana). _____________________________
766 / ROZDZIA 57
by upoledzona. Wszystkie schorzenia tej grupy, z jednym wyjtkiem, wykazuj wsplne cechy: tj. niedobr aktywnoci enzymu degradujcego (zwykle zlokalizowanego w lizosomach), rezultatem czego jest nagromadzenie si sub-stratu w rnych tkankach. Nagromadzenie si substratu moe by przyczyn powikszenia narzdu, zaburze w strukturze koci, skry, upoledzenia umysowego i innych anomalii zalenych od nasilenia niedoboru enzymu i rozmieszczenia substratw w tkankach. Wyjtkiem jest choroba wtrtw komrkowych, ktra polega na niemonoci umiejscowienia enzymw lizo-smnalnych w lizosomach, co opisano wczeniej w tym rozdziale. Tabela 57-8 przedstawia biochemiczne defekty wystpujce w tych schorzeniach i zwizane z nimi zaburzenia. W wikszoci przedstawionych w tabeli mukolipidoz w moczu stwierdza si wzrost zawartoci frakcji glikoprotein, spowodowany blokiem metabolicznym. Endoglikozydazy, egzoglikozydazy i sulfatazy uczestnicz w procesie degradacji acuchw polisacharydowych GAG. Hialuronidaza jest szeroko rozpowszechnion endoglikozydaz, rozszczepiajc wizanie heksozoamidynowe. Dziaajc na kwas ualuro-nowy generuje ona tetrasacharyd o strukturze (GlcUA-pi,3-GlcNAc-pi,4)2. Ponadto degraduje ona rwnie siarczan chondroityny. Do tej pory nie zostaa opisana jednostka chorobowa spowodowana niedoborem tego enzymu. Tetrasacharyd powstay w wyniku dziaania hialu-ronidazy moe by dalej degradowany przez p-glukuronidaz i p-N-acetyloheksozoaminidaP-glukouronidaza jeSt egzoglikozydaz, ktra usuwa GlcUA i ldUA z nie redukujcego koca tetrasacharydu lub dugich polisacharydw. Substratami dla niej s: siarczan dermatanu, siarczan heparanu, siarczan chondroityny i kwas hialuronowy. Wrodzony niedobr t ego enzymu u ludzi jest przyczyn wydzielania z moczem pierwszych trzech wymienionych GAG, z wyjtkiem kwasu hialuronowego. Przypuszcza si, e tetrasacharyd powstay w wyni ku trawienia kwasu hialuronowego hialuroni-daz jest dalej metabolizowany w innym szlaku. p-D-acetyloheksozoaminida2a jest egzoglikozydaz, obecn w wikszoci tkanek ssakw. Katalizuje ona reakcj hydrol i tycznego od-szczepienia GlcNAc i GalNAc poczonych wizaniem p-gh'kozydowym z nie redukujcym kocem polisacharydw. Substratami dla tego
enzymu s: gangliozydy, siarczany chondro ityny, kwas hialuronowy, siarczan dermatanu i siarczany keratanu I i II. Znane s dwa izoenzymy p-D -acety lohek sozoaminidazy: A i B. lzoenzym A skada si z 2 rnych podjednostek cc i P, natomiast izoenzym B tylko z podjednostki p. Zaburzenia w strukurze tych izoenzymw s przyczyn niektrych schorze, np. w chorobie Taya-Sachsa wadliwa jest podjed-nostka a, wic izoenzym A jest nieaktywny. W chorobie Sandhoffa z kolei wadliwa jest podjednostka p, co wywouje niedobr obu izoenzymw A i B. Oba te schorzenia powoduj zwykle zgon niemowlcia, gdy dochodzi do znacznego gromadzenia gangliozydw GM2 w mzgu. Wymienione choroby s raczej klasyfikowane jako sfingolipidozy (p. tab. 25-1), a nie mukopolisacharydozy, gdy powstaj gwnie w wyniku zaburze procesw degradacji gangliozydw, P-galaktozydaza (egzoglikozydaz) wystpuje w kilku postaciach w tkankach zwierzcych. Siarczan chondroityny i siarczan keratanu zawieraj reszt P-galaktozydow, ktra moe by substratem dla kwanej galaktozydazy. Niedobr kwanej galaktozydazy jest przyczyn gromadzenia si siarczanu keratanu i fragmentw glikoprotein, wcznie z gangliozydami GM, (p. rozdz. 26). oc-L-iduronidaza jest lizosomaln egzoglikozydaz, usuwajc IdUa z nie redukujcego koca acucha polisacharydowego. Niedobr tego enzymu obserwuje si w zespole Hurler. Sulfataza iduronianowa jest specyficznym enzymem katalizujcym odszczepiane grupy siarczanowej w pozycji C2 reszty IdUA na nie redukujcym kocu heparyny, siarczanu heparanu i siarczanu dermatanu. Dziedziczny niedobr tego enzymu stwierdza si w zespole Huntera. Aktywnoci wymienionych enzymw oraz innych przedstawionych w tab. 57-8 mog by oznaczone w fibrobiastaoh skry, leukocytach, komrkach owodni, a czasem rwnie w surowicy. Badania stwierdzajce wzrost iloci GAG w moczu maj rwnie zastosowanie diagnostyczne.
Proteoglikany speniaj liczne funkcja
Oglne uwagi. Jak wykazano powy ej, proteoglikany w znacznym stopniu s zoonymi makroczsteczkami, wystpujcymi we wszystkich tkankach organizmu, gwnie w po-zakomrkowej macierzy lub w substancji pod-
GLIKOPROTEINY 1 PROTEOGLIKANY / 767 T abela 57-8. Bio chemiczne def ekty i diagno styczne testy stosowane w mukopolisacharydozach i mukolipidozach oraz zwizane z nimi zaburzenia * Enzymatyczny defekt
Niedobr a-L-iduronidazy
Nazwa
Stosowane skrty
MPSI
Wykryw ane metabolity w moczu DS, HS
M u kopo 1 i sachary dozy Zespl Hurler, Scheiego Hurler/Scheiego Zesp Huntera Zesp S anfilippo A Zesp Sanfilippo B Zesp Sanfilippo C Zesp Morguio Zesp Morquio podobny Zesp Morteaux-Lamy
MPS II MPS IM A MPS Ml B MPS III C MPS IV MPS VI
Niedobr sulfatazy iduronianowej Niedob r N-sulfatazy HS (sul-famidazy) Niedobr a-N-acetyloglukozo-aminidazy Niedobr acetyl otr nsfe razy Niedobr N -acetylogalaktozb* -6-sulfatazy Niedobr p -galaktozydazy Niedobr N-acetylogalaktozo-amino-4-sulf atazy {ary losu Ifata-zy B) Niedobr fl-glukuro nidazy Niedobr N-acetylog!ukozoami-no-6-sulfat azy
DS, HS HS HS HS KS KS DS (i)
Zespl niedoboru p-glukuro-ntdazy Zespoy dotychczasowo bez imienne
MPS VII MPS VIII
DS, HS ( ) HS, KS
Mukolipidozy i podobne do nich zaburzenia

Sjalidoza Choroba wtrtw ko mrko wych (l-cell disease) ML ! M LII Niedobr sjalidazy (neuramini-dazy) Niedobr N-acetyloglukozoami-nofosfotra nsfe razy (kwane hyd-rolazy wykazuj brak reszt fosfo-mannozowych) Jak w ML 1) ale niedobr jest cako wity Niedobr sulfatazy A i innych enzymw Niedobr a -mannozydazy Niedobr a -L-fukozydazy GF GF
Poltdystrofia pseudohurlerowska Zoony niedobr sulfataz
ML Hl
GF DS, HS
Mannozydaza Fukozydaza
GF GF
MPS mukopolisacha/ydoza; ML mukolipidoza; DS siarczan dermatanu; KS siarczan keratanu; HS siarczan heparanu; GF fragment glikoprotein. * Zmodyfikowano za zgod DiNatale P., Neyfeld E. F.: The biochemicai diagnosis of mucopolisac-charidoses, mucolipidosisand relateddisorders. W. PerspectivesininheritedMetaboiic diseases. Vol2.Barra B i wsp. (red,): Editio nes Ermes Milan 1979), Wikszo ww, enzymw moe by oznaczana w fibroblastach, leukocytach, tkankach, w komrkach pynu o wodniowego oraz surowicy.
768 / ROZDZIA 57
stawowej tkanki cznej. Ponadto, niektre z nich mog czy si z innymi skadnikami macierzy, np. z kolagenem czy elastyn, co jest istotne dla utrzymania waciwej struktury or ganizacji tkanki cznej. Ponadto niektre proteoglikany oddziauj z pewnymi biakami ad-hezyjnymi, takimi jak fibronek tyna czy laminina (p. rozdz. 59). GAG obecne w proteoglikanach s polianionaim. dlatego te wi polikationy i kationy, takie jak Na* i K+. Dziki tym ostatnim dochodzi do hydratacji tkanki cznej i nadania jej odpowiedniego napicia. Przy stosunkowo niskich steniach GAG wykazuj skonnoci do elowania. Ich dugie acuchy polisachary-dowe oraz waciwoci elujce sprawiaj, e dziaaj one w poza komrkowej macierzy jak sito, uniemoliwiajc przedostanie si duych makroczsteczek, natomiast uatwiaj przenikanie maym czsteczkom. Ponadto, dziki swej rozcignitej strukturze i wystpowaniu czsto w postaci wielkoczsteczkowych agregatw pro-teoglikany zajmuj wzgldnie du objto macierzy w stosunku do innych biaek. Niektre funkcje specyficznych GAG i (lub) proteoglikanw. Kwas hialuronowy w szczeglnie duym steniu wystpuje w tkankach embrionalnych. Sdzi si, e peni on wan rol w migracji komrek podczas mor-fogenezy i w procesach naprawczych. Jego zdolno do zatrzymywania wody w pozako-mrkowej macierzy sprawia, e ta ostatnia ulega zwiotczeniu, co moe mie znaczenie dla wymienionych procesw. Due stenie kwasu hialuronowego i siarczanw chondroityny w chrzstce zapewnia tej tkance utrzymanie waciwej sprystoci i wytrzymaoci. Siarczan chondrcityny wystpuje w miejscach wapnienia w kociach rdchrzstnych. Obecno jego stwierdza si rwnie w obrbie neuronw, gdzie moe tworzy rdkomrkowy szkielet umoliwiajcy utrzymanie staego ksztatu tych komrek. Zarwno siarczan keratanu I, jak i siarczan riermatanu wystpuj w rogwce. Umiejscowione s midzy wknami kolagenowymi. Podstawow ich funkcj jest zapewnienie rogwce wysokiej przezroczystoci. W przypadku uszkodzenia powierzchni rogwki stwierdza si zmiany w skadzie proteoglikanw, ktre zanikaj w przypadku wygojenia si wymienionych uszkodze. Siarczan dermatanu obecny w twardwce odpowiedzialny jest za utrzymanie waciwego ksztatu gaek ocznych. Heparyna jest wanym anty koagulantem. -
Udzia w patogenezie wanych cho rb i w procesie starzenia. Kwas hialuro-
czy si ona z IX i X czynnikiem krzepnicia. Najistotniejsze jest jednak jej oddziaywanie z osoczow antytrombin III. Wizanie si heparyny z tym biakiem osoczowym w stosunku 1:1 znacznie przyspiesza zdolno antytrombiny III do inaktywacji proteaz serynowych, w szczeglnoci trombiny. Ponadto, wizanie si heparyny do reszt lizyny antytrombiny III powoduje zmiany konfonnacyjne, ktre sprzyjaj czeniu si z proteazami serynowymi. Heparyna moe rwnie wiza si specyficznie z lipaz lipo-proteinow, obecn w naczyniach wosowatych, przyczyniajc si do uwalniania tego enzymu do krwiobiegu. Pewne proteoglikany (np. siarczan heparanu) wbudowane s w bon plazmatyczn komrek, a ich rdzenie biakowe zapewniaj tym bonom odpowiednie naprenie. Ponadto, na powierzchni komrki mog one dziaa jak receptory i uczestniczy we wzrocie komrek i oddziaywaniach komrka-komrka. W hodowlach komrkowych siarczan heparanu uczestniczy w procesie czenia si komrek do substratw. Te proteoglikany znaleziono rwnie w bonach podstawnych kbuszk w nerkowych,, razem z kolagenem typu IV i laminina (p. rozdz. 59), gdzie determinuj selektywnoc filtracji kbu-szkowej czsteczek zalen od adunku. Obecno proteoglikanw stwierdzono rwnie w wewntrzkomrkowych organellach, jak np. w jdrze komrkowym. Ich funkcja w tej strukturze subkomrkowej nie zostaa jednak wyjaniona. Ich obecno wykazano rwnie w ziarmstociach. spichrzeniowych ab wydziel-niczych, np. w ziarnis teciach chromochlon-nych komrek rdzenia nadnerczy. Przypusz czano, e proteoglikany odgrywaj pewn rol w uwalnianiu zawartoci tych ziarnistoci. Rne Funkcje GAG zestawiono w tab. 57-9.
nowy umoliwia migracj komrek nowotworowych przez macierz pozakomrkow. Komrki nowotworowe mog poWdza fibroblasty do wzmoonej syntezy GAG, co by moe jest powodem ich atwego rozprzestrzeniania si. Ponadto, niektre komrki nowotworowe za wieraj stosunkowo niewielkie iloci siarczanu heparanu, ktry najczciej wystpuje w postaci zwizanej z bon komrkow, co z kolei powoduje zanik zdolnoci adhezyjnych tych komrek. W skad rdbottka (intimy) ciany naczy wchodz: proteogiikany zawierajce kwas bia-(uronowy, siarczan chondroityny, siarczan der-
GLIKOPROTEINY I PROTEOGLIKANY / 769 Tabela 57-9. Niektre funkcje GAG i (lub) proteo-glikanw*. Strukturalne skadniki poza komrkowej (EC) macierzy Specyficzne oddziaywania z kolagenem, elastyn, fibronektyn, laminin i innymi biakami macierzy Jako polianionowe substancje wi polikationy i kationy Uczestnicz w ksztatowaniu charakterystycznego napicia rnych tkanek Dziaaj jak sita w EC macierzy Uatwiaj migracj komrek (HA) Odgrywaj istotn rol w sprystoci i wytrzymaoci chrzstki (HA i CS) Zapewniaj przezroczysto rogwce (KS I i DS) Strukturalna rola w twardwce (DS) Antykoagulacyjne waciwoci (heparyna) Skadniki plazmatycznych bon komrk owych, gdzie mog dziaa jak receptory i uczestniczy w adhezji komrek i oddziaywaniach komrka--komrka (np. HS) Skadniki pcherzykw synaptycznych i innych (HS) Determinuj selektywno filtracji kbuszkowej zalen od adunku (HS) * Stosowane skrty: HA kwas hialuronowy; CS siarczan chondroityny; KS I siarczan keratanu I; DS siarczan dermatanu; HS siarczan heparanu. Buckwalter JA, Rosenber&^C: Electron microscopic studies of cartilage proteoglycans. J Biol Chem 1982;257;9830. DiNatale P, Neufeld EF: The biochemical diagnosis of mucopolysaccharidoses, mucolipidosis and related disorders. In; Perspectives in Inkerited Metabo* lic Diseases. Vol 2. Barra B et al (editors). Editiones Ennes (Milaa), 1979. Hok M et al: Cell-surface glycosaminoglycans, Annu Rev Biochem 1984;53:847. Jagues LB: Heparin: an old drug with a new paradigm. Saence 1979;206:528. Kornfeld R, Kornfeld Sr Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annu Rey Biochem 1985;54:631. Kornfeld S, Sly WS: Lysosomal storage defects. Hosp Prd (Aug) 1985;20:71. Lennarz WJ: The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans. Plenum Press, 1980. Poole AR; Proteoglycans in health and disease: structures and functions. Biockem J 1986;236:1. Poole AR et al: Proteogiycans from bovine nasal cartilage: Immunochemical studies of link protein. J. Biol Chem 198O;255:9295. Schachter H: Biosynthetic controls that determine the branching and heterogeneity of protein-bound oligosacchartdes. Biochem Celi Biol 1986;64:163,
W rnych postaciach zapalenia staww pro-teoglikany mog ' dziaa jak autoantygeny, uczestniczc w patogenezie tych schorze. Wiadomo rwnie, e wraz z wiekiem zmniejsza sie zawarto w chrzstce siarczanu chondroityny. natomiast wzrasta ilo siarczanu ker atanu i kwasu hialuronowego. Zmiany te mog przyczynia si do rozwoju zmian zwyrodnienio wych u ludzi starych. Wraz z wiekiem obserwuje si take zmiany w zawartoci niektrych GAG w skrze, co moe wyjani jej charakterystyczne zmiany starcze. <
PIMIENNICTWO
mataou i siarczan heparanu. Z wymienionych proteoglikanw siarczan dermatanu wie osobowe lipoproteiny niskiej gstoci. Co wicej, jest on gwnym GAG syntetyzowanym przez miocyty naczyniowe. Poniewa s to komrki, ktre w procesie miadycowym bardzo atwo proliferuj, uwaa si, e siarczan dermatanu moe peni istotn rol w rozwoju blaszki
miadycowej.
49 Biochemia
58
Biaka osocza, immunoglobuliny i czynniki krzepnicia

Elizabeth J. Harfenist, PhD, Robert K. Murray. MD PhD
WPROWADZENIE
Krew kry w zamknitym ukadzie naczy krwiononych. Zawiera ona elementy morfoty-czne czerwone i biae krwinki oraz pytki krwi zawieszone w pynnym rodowisku osocza. Jak zostanie to omwione poniej, krew a w szczeglnoci osocze spenia wiele funkcji niezwykle istotnych dla zachowania zdrowia. Faza pynna krwi pozostaa po jej skrzepniciu nosi nazw surowicy. Nie ma ona w swym skadzie czynnikw krzepnicia, w tym fibryno-genu, ktre prawidowo wystpuj w osoczu, lecz zuywaj si podczas procesu krzepnicia. Surowica zawiera pewne produkty degradacji czynnikw krzepnicia, ktre powstaj w tym procesie, a zwykle nie wystpuj w osoczu.
lub mzgowych jest gwn przyczyn zgonw w wielu rejonach wiata. Racjonalne postpowanie w tych stanach patologicznych wymaga zrozumienia podstaw krzepnicia krwi i fib ry nolizy.
KREW SPENIA WIELE FUNKCJI

Funkcje krwi z wyjtkiem swoistych dla elementw komrkowych, jak transport tlenu i odporno komrkowo-zalena speniane s przez osocze i jego skadniki. Zostay one wymienione w tab. 58-1.
T abela 58-1. Gwne f unkcje krwi 1 Oddychanie transport tlenu z puc do tkanek, oraz dwutlenku wgla z tkanek do puc Odyw ianie transpo rt wcho nitych sub stancji odywczych Wydalanie transport zbdnych metaboli t w do nere k, puc, s kry i jelit w ce lu ic h usunicia Utrzymywanie praw ido wej rwno wagi kwa so wo -za sa do we j w o r ga niz mi e Regulacja gospodarki w odnej przez wpyw krwi na wymian wodn midzy pynem tkan ko wym i jego pul krc Regulacja temperatury ustrojow ej poprzez dystrybucj energii cieplnej w organizmie Obrona przed zakaeniem za porednictwem biaych krwinek i krcych przeciwcia Transport hormonw i regulacja metabolizmu 9. Transport metabolitw 10. Krzepnicie
Niezwykle istotna rola jak spenia krew w utrzymaniu homeostazy oraz atwo, z jak moe by ona uzyskiwana do analiz sprawiy, e badania jej skadnikw nabray szczeglnego znaczenia w rozwoju biochemii i biochemii
klinicznej. Hemoglobina, albuminy, immuno-globuliny oraz rne czynniki krzepnicia s jednymi z najczciej badanych
biaek. Zaburzenia w steniu poszczeglnych biaek osocza wystpuj w wielu chorobach i mog by monitorowane metodami elektroforetycznymi. Zmiany aktywnoci pewnych enzymw w osoczu maj przydatno diagnostyczn w wielu stanach patologicznych {p. Dodatek). Zaburzenia krzepnicia stanowi powany problem medyczny, a zakrzepica w naczyniach wiecowych
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 771
Osocze skada si z wody, elektrolitw, metabolitw, skadnikw pokarmowych, biaek i hormonw. Zawarto wody i elektrolitw jest praktycznie taka sama jak we wszystkich pynach pozak om orkowych. Oznaczanie stenia Na, K, Ca i Cl w surowicy oraz cinienia czstkowego dwutlenku wgla i pH krwi (p. Dodatek) oddaj nieocenione usugi w procesie leczenia wielu chorych. Osocze zawiera bardzo zoon mieszanin biaek Stenie biaka cakowitego w osoczu ludzkim wynosi ok. 7075 g/l {7,07,5 g/dl). Stanowi one gwn cz staych skadnikw osocza, BiaJka osocza s bardzo zoon mieszanin, zawierajc nie tylko biaka proste, lecz rwnie zoone, takie jak glikoproteiny i wiele rodzajw lipoprotein. W osoczu krwi czowieka znajduje si tysice przeciwcia, chocia zawarto poszczeglnych ich rodzajw w warunkach prawidowych jest zwykle stosunkowo maa. Wzgldne rozmiary i masy czsteczkowe kilku spord biaek osocza przedstawiono na ryc. 58 -1.
Rozdziau poszczeglnych biaek z mieszaniny dokonuje si czsto za pomoc rnych roz puszczalnikw i (lub) elektrolitw w celu usunicia rnych frakcji biakowych zgodnie z ich charakterystyczn rozpuszczalnoci. Na zasa dzie tej bazuj tzw. metody wysalania, ktre znalazy pewne zastosowanie w oznaczaniu frakcji biakowych w laboratorium klinicznym. Stosujc rne stenia siarczanu sodowego lub siarczanu amonowego mona rozdzieli biaka osocza na 3 gwne grupy fibrynogen, alPowszechnie uywan metod analizy biaek osocza jest elektroforeza. W rnych jej rodzajach stosuje sie odmienne noniki. W laboratoriach klinicznych szeroko stosowany jest octan celulozy, ktry pozwala na rozdzielenie biaek osocza na 5 frakcjialbuminy, alfa2, p i y-glo-buliny (ryc. 58-2). Wybarwione paski octanu celulozy (lub innego nonika) okrela si jako elektroforegram. Stenie kadej spord 5 frakcji mona wygodnie okreli posugujc si densytometrem. Tabela 7 Dodatku przedstawia gwne biaka osocza stwierdzone we frakcjach a,, oc 2 i y. W Dodatku wymieniono take wiele schorze, w ktrych stenia albumin, globulin i fib-rynogenu ulegaj zmianie. Stenie biaka w osoczu jest istotne dla rozmieszczenia pynu midzy krwi a tkankami Osocze krwi zgodnie z definicj jest pynem wewntrznaczyniowym. W czci ttniczej ukadu krenia, wewntrznaczyniowe cinienie hydrostatyczne wytwarzane przez serce i due naczynia jest o 2025 mmHg wysze ni w tkankach. Cinieniu hydrostatycznemu przeciwstawia si wewntrznaczyniowe cinienie koloido-osmotyczne generowane przez biaka osocza. Przeciwdziaa ono nadmiernemu przemieszczaniu pynu z wewntrz do pozanaczyniowej przestrzeni. Gdy stenie biaka w osoczu znacznie si zmniejsza (np, w cikim niedoywieniu biakowym), pyn nie jest wcigany z powrotem do oyska naczyniowego, lecz groma dzi si w przestrzeni pozanaczyniowej, co prowadzi do powstania obrzkw. Spord wielu przyczyn tego stanu jedn jest niedobr biaka. Biaka osocza badano bardzo dokadnie Ze wzgldu na do du atwo uzyskiwania, biaka osocza byy szeroko badane zarwno u ludzi, jak u zwierzt. Istotne informacje
buminy i globuliny.
Albumina 69,000 10 nm
Skaia
+
Hemoglobina 64,450
Na Cl" Glukoza
0,-Globullna 90,000
jr-GlobuNna 156,000
o,-Li po protein a 200,000 /(,-Li po proteina 1,300,000
Fibrynoge n 340,000
Ryc. 58-1. Wzgldne wymiary i masy czsteczkowe biaek krwi (Oncley).
772 / ROZDZIA 58
Ryc. S8-2. Technika elektroforezy strefowej na octanie celulozy: A mat ilo surowicy lub innego pynu nanosi si na pasek z octanu celulozy, B przeprowadzany jest rozdzia elektroforetyczny biaek zawartych w prbce w elektrolitowym rodowisku buforu, C po zabarwieniu rozdzielone pasma biakowe uwidaczniaj si w charakterystycznych dla nich miejscach, D za pomoc pomiarw densytometrycznych rozdzia elektroforetyczny na octanie celulozy przeksztacany jest do diagramu, na ktrym odpowiednie charakterystyczne piki" symbolizuj; albuminy, a.,-globuliny, 0(2-globuliny, (J-globuliny i y-gfobuliny. {Wedug: Stites D. P., Stobo J. D.,Wells J.V.: BasieandC/imca//mmuno/ogy,\/vyd.6rApp\etonand Lange, 1987, za zezwoleniem).
uzyskano na temat biosyntezy, metabolizmu, struktury i funkcji gwnych biatek osocza. Przedmiotem wielu bada byy rwnie zmiany w ich steniu i metabolizmie w wielu stanach chorobowych. W ostatnich latach sklonowano oraz zbadano struktury genw dla wielu biaek osocza. Uzyskanie przeciwcia swoistych dla poszczeglnych biaekôsocza znacznie uatwio ich analiz dziki moliwociom precypitacji oraz wyizolowania czystych biaek ze zoonej mieszaniny wystpujcej w tkankach lub w osoczu. Zastosowanie izotopw promieniotwrczych z kotei pozwolio pozna ich szlaki biosyntezy oraz szybko metabolizmu w osoczu. Na podstawie bada biaek osocza wyania si 6 nastpujcych uoglnie: zowana jest w wtrobie. Stwierdzono to badajc zwierzta po wykonanej dowiadczalnie hepatektomii oraz stosujc perfundowane preparaty wyizolowanej wtroby, jej skrawki, homogenaty iub systemy translacji uywajc mRNA ekstrahowanego z wtroby. y-Globuli-ny syntetyzowane sa przez komrki piazmaty-czne, a pewne biaka osocza jeszcze w innych miejscach, np. w komrkach rdbonka.
1 . Wikszo bia ek osocza syntety-
2. Biaka osocza s syntetyzowane gwnie przez polirybosomy zwizane z bonami. Przed wejciem do osocza przechodz gwnym szlakiem wydzieiniczym komrki, obejmujcym szorstk i gadk siateczk rd-plazmatyczn, aparat Golgiego oraz bony cy-toplazmatyczne. Wikszo spord biaek osocza jest syntetyzowana jako prebiaka majce peptydy sygnaowe na N-kocu (p. rozdz. 43). Podlegaj one nastpnie wielu modyfikacjom potranslacyjnym (proteoliza. glikozylacja, fos-forylacja itd.) podczas transportu przez komrk. Czas przemieszczenia z miejsca syntezy do osocza waha si od 30 min do wielu godzin w zalenoci od rodzaju biaka. 3. P rawie wszystkie biaka osocza s glikoproteinami. Zawieraj one acuchy oligosacharydowe poczone przez atomy N i (lub) O (p. rozdz. 57). Wyjtkiem jest albumina, ktra nie zawiera reszt cukrowych. acuchy oligosacharydowe peni wiele funk cji (p. tab. 57-2). Usunicie kocowej reszty kwasu sjalowego z pewnych biaek osocza (np. ceruloplazminy) poprzez dziaanie neuramini dazy moe znacznie skrci ich okres potrwa nia w osoczu (p. rozdz. 57).
morfizm. Polimorfizm jest cech mendlowsk lub monogenow wystpujc w populacji w co najmniej dwch fenotypach, z czstoci wik sz ni 12% (Vogel i Motulsky, 1986). Sub stancje grupowe krwi ukadu ABO (rozdz. 63) s najlepiej znanym przykadem polimorfizmu u ludzi. Polimorfizm ludzkich biaek osocza stwierdza si w przypadku np. o^-antytrypsyny, haptoglobiny, trans|eryny, ceruloplazminy i immunoglobulin. Forniy polimorficzne tych bia ek najczciej wykrywano po raz pierwszy metod elektroforezy na elu skrobiowym, gdzie kada posta wykazuje charakterystyczn ruchliwo. Analiza polimorfizmu biaek osocza jest przedmiotem bada genetycznych i antropologicznych, a w pewnych przypadkach (np. aran-tytrypsyna, p. niej) wzbudza take zainteresowanie klinicystw. 5. Kade biako osocza ma charakte rystyczny okres ptrwania w ukadzie krenia. Okres ptrwania biaek osocza mo e by oznaczony przez oznakowanie wyizolo wanego, oczyszczonego biaka za pomoc l31 I w warunkach zapobiegajcych jego denaturacji. Izotop ten czy si kowalencyjnie z resztami tyrozyny w czsteczce biaka. Nie zwizany (31I oddziela si nastpnie od znakowanego biaka i okrela jego aktywno waciw (dpm/mg biaka). Znan ilo aktywnego biaka podaje si dorosej osobie, a nastpnie pobiera si prbki krwi w okrelonych odstpach czasu i okrela ich radioaktywno. Uzyskane warto ci wykrela si jako funkcj czasu i oznacza okres ptrwania (czas obnienia radioaktyw noci od wartoci szczytowej do poowy tej wartoci), po odliczeniu czasu koniecznego do zrwnowaenia (wymieszanie si) stenia po dawanego biaka midzy krwi a przestrzeni pozanaczyniow. Okresy ptrwania uzyskane dla albumin i haptoglobin u zdrowych osb dorosych wynosz odpowiednio 20 i 5 dni. W pewnych schorzeniach okres ptrwania bia ek moe si znacznie zmieni. Dla przykadu, w chorobie Crohna {ilettis regionalis) dotyczcej ukadu pokarmowego, 2naczna ilo biaek oso cza, gwnie albumin, moe by bezpowrotnie tracona poprzez wydzielanie do wiata jelita przez zmienion zapalnie bon luzow. Pac jenci dotkn ici tym schorzeniem cechuj si gastroenteropai z utraty biaka, a okres p trwania podanej doylnie jodowanej albuminy moe obniy si do ok. 1 dnia.
4. Wiele biaek osocza wykazuje poli -
6. Stenie niektrych biaek w oso czu wzrasta podczas ostrych stanw zapalnych ub wtrnie w nastpstwie pewnych rodzajw uszkodze tkanek. Do biaek tych, zwanych biakami ostrej fazy (lub reaktantami) zalicza si; biako C-reaktywne (CRP, zwane tak ze wzgldu na reaktywno z polisacharydem pneumokokw), oârttytryp-syn, haptoglobin, ocrkwan glikoprotein oraz fibrynogen. Wzrost stenia tych biaek waha si od 50% do ponad 1000-krotnego w przypadku CRP, Ich poziom jest rwnie zazwyczaj podwyszony podczas przewlekych procesw zapalnych oraz u pacjentw z nowotworami zoliwymi. Uwaa si, e biaka te peni rol w odpowiedzi organizmu na proces zapalny. Dla przykadu biako C-reaktywne moe aktywowa drog\lasyczn dopeniacza, a o^-antytrypsyna zdolna jest do neutralizacji pewnych proteaz uwalnianych podczas ostrego stanu zapalnego. Ostatnio wykonane badania wskazuj, e interleukina 1 (IL-1), polipeptyd uwalniany z jednojdrzastych komrek fagocy-tujcych, jest gwnym, lecz nie jedynym stymulatorem syntezy wikszoci biaek ostrej fazy przez hepatocyty. Inne czsteczki, m.in. IL-6, s rwnie wczone w ten proces i podobnie jak IL-1 wydaj si dziaa na poziomie transkrypcji genu. Nastpne podrozdziay przedstawiaj podstawowe informacje dotyczce 6 spord gwnych biaek ludzkiego osocza wcznie z immunoglobulinami. Lipoproteiny przedstawiono w rozdz. 27. Albumina jest gwnym biakiem ludzkiego osocza Jest to gwne biako ludzkiego osocza (ok. 45 g/1) o masie czsteczkowej ok. 69000. Stanowi ok. 60% wszystkich biaek osocza. Okoo 40% albumin znajduje si w osoczu, pozosta e 60% w przestrzeni poza komrkowej. Wtroba wytwarza ok. 12 g albumin na dob, co stanowi ok. 25% cakowitej syntezy biaek w tym narzdzie, a poow tych, ktre s wydzielane. Pocztkowo albumina syntetyzowana jest jako preprobiako. Peptyd sygnaowy ulega usuniciu podczas przemieszczenia do cystern szorstkiej siateczki rdplazmatycznej, a nastpnie zostaje odcity heksapeptyd na N-kocu pod czas dalszej wdrwki szlakiem wydzielniczym. Synteza albumin zmniejsza si w rnych chorobach, szczeglnie tych, ktre dotycz wtroby (p. Dodatek-Biaka). Osocze pacjentw z cho robami wtroby czsto cechuje si obnionym
774 / ROZDZIA 58
ilorazem stenia albumin do globulin (obniony stosunek A:G). Synteza albumin zmniejsza si stosunkowo wczenie w warunkach wadliwego ywienia biakowego, m.in. w kwashior-kor. Dojrzaa albumina iudzka skada si z 1 a cucha polipeptydowego zbudowanego z 585 reszt ami no kwasowych i zawiera 17 mostkw dwusiarczkowych. Stosujc proteazy mona podzieli albumin na 3 domeny, speniajce odmienne funkcje. Albumina ma ksztat elipsoidalny, co oznacza, e nie zwiksza lepkoci osocza w tak znacznym stopniu jak czsteczki o wyduonym ksztacie, np. fibrynogen. Ze wzgldu na stosunkowo ma mas czstecz kow (ok. 69 000) i due stenie, albumina wydaje si odpowiada za ok. 7580% ci nienia onkotycznego ludzkiego osocza. Badania elektro foretyczne wykazay, e osocze pewnych osb pozbawione jest albuminy, co okrela si terminem analbuminemii. Jedn z przyczyn tego stanu jest mutacja zaburzajca proces przycinania i skadania (splicing"). Osoby z analbumi-nemi cechuj si jedynie umiarkowanego stopnia obrzkami, mimo i albumina jest gwnym czynnikiem decydujcym o cinieniu onkotycz-nym osocza. Uwaa si, e wzrost stenia innych biaek osocza kompensuje skutki braku albumin. Inn istotn funkcj albumin jest ich zdolno do wizania rnych ligandw. Nale do nich wolne kwasy tuszczowe (WKT), wap, pewne hormony steroidowe, bilirubina oraz cz tryptofanu obecnego w osoczu. Ponadto albumina wie ok. 10% miedzi wystpujcej w osoczu, reszta pouczona jest 7 ceruloplaz-min(p. niej). Wiele lekw, m.in. sulfonamidy. penicylina G, dikumarol, aspiryna, zwizanych jest z albumin; ma to istotne implikacje farmakologiczne. Preparaty ludzkiej albuminy stosowane s w leczeniu wstrzsu krwotocznego oraz oparze.
Haptoglobina wie pozakrwinkow hemoglobin, zapobiegajc przedostawaniu si wolnej hemoglobiny do nerek Haptoglobina (Hp) jest osoczow glikoprote-in, ktra wie pozakrwinkow hemoglobin (Hb) w zwarty niekowalencyjny kompleks (Hb- Hp). Hp zawarta w 1 1 moe zwiza 4001 800 mg Hb. Okoo 10% Hb degradowanej kadego dnia uwalniane jest do krenia, std okrelana jest jako pozakrwinkow. Pozostae 90% obecne w starych uszkodzonych krwinkach czerwonych katabolizowane jest w komrkach ukadu histic>cytaniego. Masa czsteczkowa Hb wynosi ok. 65 000, a najprostszej formy polimorficznej Hp (Hp-1-1) u ludzi ok. 90000. Powstay kompleks Hb-Hp osiga mas czsteczkow 155000. Wolna Hb przechodzi przez kbuszki nerkowe i wnika do cewek, gdzie ma skonno do precypitacji (moe to nastpi w nastpstwie masywnego przetoczenia krwi niezgodnej grupowo z przekroczenia pojemnoci wicej Hp wzgldem Hb) (p. ryc. 58-3). Kompleks Hb-Hp jest zbyt duy, by przenika przez kbuszki nerkowe. Funkcja Hp wydaje si polega na zapobieganiu utracie wolnej Hb przez nerki. Chroni ona cenne atomy elaza, obecne w Hb, przed utrat z organizmu. Ludzka Hp wystpuje w trzech formach polimorficznych, znanych jako Hp 1-1, HP 2-1 i Hp 2-2, Hp 1-1 wdruje w elektroforezie na elu skrobiowym jako pojedyncze pasmo, podczas gdy Hp 2-1 i Hp 2-2 wykazuj bardziej zoony profil pasm. Dwa geny, oznaczane jako Hp-1 i Hp-2, koduj te trzy fenotypy, gdzie Hp 2-1 jest fenotypem heterozygotycznym. Nie wykazano istotnych z punktu widzenia funkcji rnic midzy wspomnianymi formami Hp. Stenie Hp w osoczu ludzkim jest zmienne i ma pewn warto diagnostyczn. Mae stenia Hp stwierdza si u pacjentw z niednkr wist oci ami hemolirycznymi. Wyjania to obserwacj,
A. Hb -> Nerka (m. cz. 65 000)
Wydalanie w moczu lub precypitacja w kanalikach nerkowych; elazo jesi tracone z organizmu Kompleks Hp:Hbx -+> Nerka Katabotizowany przez komrki wtroby; elazo jest zatrzymane w ustroju i wtrnie wykorzystywane
B.
Hb
Hp
aOO) j [)Ti. ez. 155 000]
Byc. 53-3. Rne losy wolnej hemoglobiny i kompleksu hemoglobma -haptoglobina.
BIAKA OSOCZA, IMIWJNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 775
e okres ptrwania Hp wynosi ok. 5 dni, podczas gdy w przypadku kompleksu Hb-Hp, szybko usuwanego z osocza przez hepatocyty, nie przekracza 90 min. Gdy Hp zwizana jest z Hb, eliminacja z osocza przebiega 80 razy szybciej ni zwykle. Zgodnie z tym stenie Hp zmniejsza si szybko w sytuacjach, gdy Hb jest stale uwalniana z erytrocytw, co wystpuje w niedokrwistociach hemolitycznych. Hp naley do biaek ostrej azy i jej stenie zwiksza si w wielu stanach zapalnych. Pewne biaka osocza wi hem, lecz nie Hb. Hemopeksyna jest P,-globulin, ktra wie wolny hem. Albumina czy si z methemem (hem elazowy), tworzc methemalbumine, a nastpnie przekazuje methem hemopeksynie. Transferyna, przemieszczajc elazo z prdem krwi do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, odgrywa gwn rol w metabolizmie elaza Transferyna (Tf) jest p,-globulin o masie czsteczkowej ok. 80 000. Jest to glikoproteina syntetyzowana przez wtrob. Wykazano obecno ponad 20 polimorficznych form tego bia ka. Tf odgrywa gwn rol w ustrojowej gospodarce elazem, poniewa transportuje je (2 mole Fe trjwartociowego na 1 mol Tf) w uka-dzig krenia do miejsc, gdzie jest ono potrzebne, m.in. z jelita do szpiku i innych narzdw. elazo jest niezwykle wane dla organizmu ludzkiego, poniewa wchodzi w skad wielu hemoprotein, takich jak hemoglobina, miog-lobina i cytochromy. elazo dostarczane jest w diecie, a jego wchanianie jako elaza dwu-wartociowego jest cile kontrolowane na poziomie bony luzowej jelita, W warunkach prawidowych organizm strzee zawartoci elaza niezwykle gorliwie. Std te jego dobowa utrata u zdrowego dorosego mczyzny wynosi ok. 1 mg i zostaje uzupeniona elazem pokarmowym. Dorose kobiety s bardziej podatne na niedobr elaza w zwizku z moliwoci nadmiernej utraty krwi podczas miesiczki. Zawarto elaza Tf w innych przedziaach organizmu przedstawiono w tab. 58-2. Okofo 20 ml krwinek czerwonych jest poddana procesom katabolicznym, dziennie uwalniajc ok. 25 mg elaza. Wolne elazo jest toksyczne, lecz w powizaniu z Tf jego potencjalna toksyczno zostaje zmniejszona, a ponadto zostaje ono skierowane do miejsc w organizmie, gdzie jest niezbdne- Na powierzchni wielu komrek wystpuj receptory dla Tf. Biako wie
Tabela 58-2. Roz/nieszczenie elaza w organizmie dorosego mczyzny o masie 70 kg Transferyna Hb w erytrocytach Mioglobina i rne enzymy elazo zapasowe (ferrytyna i hemosyderyna) Wchanianie Straty 3-4 mg 2500 mg 300 mg 1000 mg 7 mg/d
1 mg/d W przypadku organizmu dorosej kobiety o zblionej masie ciaa iloci zmagazynowanego elaza s oglnie mniejsze (np.: 100-400 mg), natomiast straty wiksze (np.; 1,6-2,0 mg/d).
si z tymi receptorami i ulega internalizacji na zasadzie endocytozy sterowanej receptorem (por. losy LDL, rozdz. 27). W kwanym pH wewntrz iizosomw nastpuje dysocjacja elaza od biaka. W przeciwiestwie jednak do biakowej czci LDL, apoTf nie ulega de gradacji w obrbie Iizosomw. Pozostaje ono zwizane z receptorem, powraca do bony cyto-plazmatycznej, oddziela si od receptora, przenika nastpnie do osocza, pobiera kolejn porcj elaza i znw dostarcza je do potrzebujcych komrek. bolizm elaza jest szczeglnie wany u kobiet, ze wzgldw wyej przedstawionych. Rwnie w ciy naley uwzgldni zapotrzebowanie elaza wzrastajcego podu. U starszych ludzi odywiajcych si skromnie (herbata, grzanki) moe take doj do niedoboru elaza. Niedo-krwisto z niedoboru elaza zalena od niedostatecznego wchaniania, nieprawidowego wykorzystania lub nadmiernej jego utraty jest jednym z najczciej spotykanych stanw chorobowych obserwowanych w praktyce lekarskiej. Stenie Tf wynosi ok. 3,0 g/l (300 mg/dl). Ta ilo Tf moe wiza ok. 3 mg elaza/l osocza, co okrela si mianem cakowitej zdolnoci wizania elaza przez osocze. Prawidowo, jedynie l /a transferyny jest wysycana elazem. W niedo-krwistoci z niedoboru elaza biako jest w mniejszym stopniu wy sycone elazem, podczas gdy w warunkach spichrzania nadmiaru elaza w organizmie (np. hemochromatoza) znacznie przekracza 1/i. Ferrytyna. Ferrytyna jest kolejnym bia kiem istotnym z punktu widzenia metabolizmu
Problemy metabolizmu elaza. Meta-
776 / ROZDZIA 58
elaza. W warunkach prawidowych gromadzi ono elazo, skd moe ono by pobierane w razie potrzeby. W przypadku nadmiaru elaza (np. hemochromatoza) ustrojowe zapasy elaza znacznie wzrastaj i zdecydowanie wicej ferrytyny stwierdza si w tkankach, gwnie w wtrobie i ledzionie. Ferrytyna zawiera ok. 23% elaza oraz apoferrytyn (cz biakowa nie zawierajca elaza) i ma mas czsteczkow ok. 440 000. Ferrytyna zbudowana jest z 24 podjednostek o masie czsteczkowej i 8 500, ktre otaczaj 30004000 atomw elazo wych wystpujcych w postaci micelarnej. Prawidowo stenie ferrytyny w osoczu krwi jest niskie; u chorych z nadmiarem elaza znacznie wzrasta; stenie ferrytyny w osoczu mona w sposb wygodny oznaczy metodami radio-immunologicznymi. Parametr ten moe by dobrym wskanikiem stanu ustrojowych zapasw elaza. Hemosyderyna. Hemosyderyna jest czs teczk sabo poznan; wydaje si, e moe to by czciowo zdegradowana posta ferrytyny. lecz wci zawierajca elazo. Mona j wykry barwieniami histologicznymi (np, bkitem pruskim) na obecno elaza, a jej obecno dowodzi nadmiernego gromadzenia elaza. tna hemochromatoza jest chorob genetyczn charakteryzujcy si nadmiernym gromadze niem elaza w tkankach, co prowadzi do ich uszkodzenia. Wydaje si, e przyczyna ley w nadmiernym wchanianiu elaza z bony luzowej jeiila, chocia niewiele wiadomo na temat molekularnego podoa tej nieprawid owoci. Narzdami legajcymi uszkodzeniu s najczciej: wtroba, skra i jelita; u chorych rozwija si zwykie marsko wtroby, moe ponadto wystpi nadmierna pigmentacja skry oraz cukrzyca (cukrzyca brzowa). Okresowe upusty krwi (flebotomia) pozwalaj na utrzymanie kontroli nad schorzeniem. Tabela 58-3 przedstawia badania laboratoryjne przydatne w diagnostyce nieprawidowoci w zakresie gospodarki elazem. Patrz rwnie Dodatek elazo, surowica, zdolno wizania elaza. Ceruloplazmina czy si z miedzi i uczestniczy w patogenezie chbroby Wiisona, bdcej stanem zatrucia miedzi Ceruloplazmina jest a^-globulin o masie czsteczkowej ok. 160 000. wystpujcy w osoczu
Tabela 58-3. Wartociowe testy laboratoryjne suce do oceny pacjentw z zaburzeniami metabolizmu elaza Liczba erytrocytw i poziom hemogiobiny Okrelenie stenia elaza w osoczu, cakowitej zdolnoci wizania elaz3 (TiBC) i odsetka wysy-cenia transferyny Okrelenie stenia ferryiyny w osoczu metod radioimmunologicn Barwienie wycinkw tkankowych za pomoc bkitu pruskiego Ocena iloci elaza (|ig/g) w bioptacie tkankowym
Pierwotna hemochromatoza. Pierwo-
w steniu ok. 300 mg/3 (30 mg/dl). Zs wzgldu na zawarto miedzi jej zabarwienie jest niebieskie. Zawiera 90% miedzi zawartej w osoczu. Kada czsteczka ceruloplazminy wie 6 atomw miedzi w sposb bardzo mocny, co sprawia, e pierwiastek ten nie jest atwo wymienialny. Albumina przenosi pozostae 10% miedzi osocza. Sia, z jak albumina wie mied, jest jednak mniejsza w porwnaniu z ceruloplaz-min. W konsekwencji albumina atwiej oddaje mied tkankom ni ceruloplazmina i wydaje si by bardziej istotna w procesie transportu miedzi w organizmie czowieka. Ceruloplazmina wykazuje ponadto aktywno oksydazow, jednak znaczenie tego faktu nie jest jasne. Stenie ceruloplazminy w osoczu zmniejsza si w chorobach wtroby. Ceruloplazmina wykazuje szczeglny zwizek z chorob Wiisona (zwyrodnienie wtrobowo-soczewkowe), chocia wydaje si mao prawdopodobne, aby pierwotny defekt w tym schorzeniu dotyczy nieprawidowoci tego biaka. Choroba Wii sona jest wrodzonym stanem, w ktrym mied nie moe by wydalana z ci, prawdopodobnie z powodu defektu lizosomw niezdolnych do wydalenia miedzi pochodzcej z rozpadu cerulopiazminy (ryc. 58-^j. W konsekwencji mied sukcesywnie gromadzi si w organizmie, szczeglnie w wtrobie, mzgu, nerkach oraz krwinkach czerwonych. Przyczyny choroby naley upatrywa w niezdolnoci organizmu do zachowania zerowego bilansu gospodarki miedzi, prowadzcej do zatrucia tym pierwiastkiem. Wzrost zawartoci miedzi w komrkach wtroby hamuje wizanie si miedzi z apoceruloptez-min, co prowadzi do zmniejszenia' stenia tego biaka w osoczu (poniej 200 mg/I). W. miar gromadzenia miedzi rozwija si niedoicrwis-
____________ BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 777

A. Stan prawido wy: Cu - * Cu + Apoceruloplarnlna - Osoczowa ceruloplazmlna 6. Choroba W llsona: i Spadek wydalania miedzi z ztcl i Gromadzenie miedzi w wtrobie
i
Zahamowani jej wizania si z ap ocenio pla min -> Mata stenie ceruloplazminy w osoczu
Ryc. 58-4. Schematyczne przedstawienie losw miedzi w (a) prawidowej wtrobie i (b) wtrobie pacjenta z chorob îlsona. Wydalanie miedzi do ci jest upoledzone w chorobie Wtlsona na skutek defektu w wydalaniu przez lizosomy miedzi pochodzcej z katabolizmu ceruloplazminy .
to hemolityczna, przewlekle schorzenie wtroby oraz zespl objaww neurologicznych zaleny od gromadzenia si miedzi w zwojach podstawy i innych orodkach mzgu. Czstym objawem klinicznym jest piercie Kaysera-Flei-schera, przybierajcy barw zielon lub zot i wystpujcy u podstawy rogwki, jako wyraz odkadania si miedzi w bonie Descemeta. W przypadku podejrzenia choroby Wilsona konieczna jest biopsja wtroby; warto diagnostyczn ma zawarto miedzi w wtrobie przekraczajca 250 ug/g suchej masy z rwnoczesnym zmniejszeniem stenia ceruloplazminy w osoczu poniej 200 mg/l. Leczenie polega na stosowaniu diety niskomiedziowej i rozwa nym podawaniu D-penicylaminy, ktra chelatu-je mied i prowadzi do jej wydalenia z moczem, a tym samym ustrj pozbawiony jest nadmiaru tego pierwiastka. Mied jest metalem-kofaktorem wielu wanych enzymw, takich jak oksydaza cytochro-mowa, tyrozynaza i miedzi o zalena dysmutaza ponadtlenkowa. W ustroju dorosego czowieka znajduje si 100150 mg miedzi, gwnie w kociach, wtrobie i miniach. Wchanianie miedzi zachodzi w grnym odcinku jelita cienkiego i wynosi 24 mg dziennie. Mied przenoszona jest do wtroby w poczeniu z albumin, wychwytywana przez komrki wtrobowe i czciowo wydalana do ci. Moe rwnie pozosta w wtrobie poczona z ceruloplazmin, syntetyzowan w tym narzdzie. Niedobr miedzi. Niedobr miedzi jest stosunkowo rzadki i powoduje niedokrwisto". Zespl Menkensa (choroba krconych" lub stalowych" wosw) jest innym zaburzeniem w metabolizmie miedzi o charakterze dziedzicznym, zwizanym z chromosomem X. Dotyczy dzieci pici mskiej, prowadzc do fatalnych nastpstw. Chopcy dotknici tym schorzeniem
maj amliwe krcone wosy, cechuj si nieprawidowym rozwojem fizycznym, opnieniem rozwoju umysowego i rozlegymi ttniakami. Wykazano, e u podoa tej patologii ley nieprawidowe wchanianie miedzi w jelicie, chocia biochemiczna natura tego defektu nie zostaa jeszcze poznana. U chorych stwierdza si mae stenie miedzi i ceruloplazminy we krwi. Niedobr y. -antyproteinazy (o^-antytrypsyny) zwizany jest z rozedm puc i pewn postaci choroby wtroby G^-Antyproteinaza, zwana dawniej otj-anty-trypsyn (ctj-AT) jest biakiem o masie czsteczkowej ok. 45 000 stanowicym gwny skadnik frakcji a! globulin osocza. Syntetyzowana jest w wtrobie i peni funkcje najwaniejszego inhibitora proteaz (Pi) w osoczu czowieka. Hamuje aktywno trypsyny, elastazy i pewnych proteaz poprzez tworzenie kompleksw z nimi. Biako to jest wysoce polimorficzne; rozdzia elektroforetyczny pozwala na wyodrbnienie poszczeglnych jej postaci. Gwnym genotypem jest MM, odpowiadajcy fenotypowi PiM. Zainteresowanie kliniczne o^-AT dotyczy dwch aspektw. Niedobr tego biaka odgrywa rol w pewnych przypadkach rozedmy pac (ok. 5%). Dotyczy to gwnie osobnikw z genotypem ZZ, wytwarzajcych PiZ w znacznie mniejszej iloci w porwnaniu z PiM, W przypadku niedoboru otj-AT, wzrost iloci granulocytw w obrbie plu (wystpujcy np. w zapaleniu puc) i wydzielanych przez nie enzymw proteolitycznych nie napotyka bariery antyproteazowej (otA-AT) prowadzc tym samym do uszkodzenia tkanki pucnej, gwnie przez takie proteazy, jak elastaza (ryc. 58-5). Szczeglne zainteresowanie wzbudza metionina
778 / ROZDZIA 58
A-Aktywnaelasta2a + a -AT -> Kompleks nieaktywne] elastazy ->Brak proteolizy w pucach-* Brak uszkodzenia z a,-AT tkanek B. Aktywna elastaza J.iub brak a,-AT->Aktywna elastaza-* Proteollza w pucach-* Uszkodzenie tkanek Ryc. 58- 5. Schemat ilustrujcy (a) prawidow inaktywacj elastyny przez 2, - AT i (b) sytuacj, gdy ilo 3,-AT jest zmniejszona, co prowadzi do proteolizy wskutek dziaania elastazy z nastpczym uszkodzeniem tkanek.
(reszta aminokwasowa w pozycji 358), uczestniczca w wizaniu ctj- AT z proteazami. Palenie tytoniu sprawia, e aminokwas ten zostaje utleniony do sulfotlenku metioniny, co inaktywuje go i tym samym prowadzi do utraty waciwoci antyproteazowych c^-AT. Szczeglne spustoszenie stwierdza si u pacjentw z fenotypem Pi ZZ, ktry odznacza si niskim poziomem e^-AT ju w normalnych warunkach. Dalsze zmniejszanie aktywnoci ot,-AT bdce nastpstwem palenia tytoniu powoduje wzmoon destrukcj proteolityczn tkanki pucnej, przyspieszajc tym samym rozwj rozedmy puc. Doylne podanie a, - AT moe by pomocne w leczeniu pacjentw z rozedm puc zalen od niedoboru c^-AT. Dziki technikom inynierii genetycznej czynione s prby zastpienia metioniny 358 przez aminokwas niepodatny na utlenianie (p. rozdz. 42). Powstae mutanty" o^-AT mogyby wykazywa ochronne dziaanie przed proteazami przez znacznie duszy okres ni natywna a, -AT. Niedobr a,-AT moe by rwnie przyczyn jednego z typw marskoci wtroby (choroba wtroby z niedoboru o^-AT). W tej sytuacji czsteczki a r AT typu ZZ gromadz si w czsteczkach siateczki rdplazmatycznej, prawdopodobnie wsku^ftk niemonoci ich wydzielania przez te komrki. Nie wiadomo dotd, w jaki sposb prowadzi to do powstania marskoci wtroby (w nastpstwie gromadzenia si duych iloci kolagenu bdcego przyczyn wknienia). IMMUNOGLOBULINY OSOCZA ODGRYWAJ WANA ROL W MECHANIZM ACH OBRONNYCH ORGANIZMU Ukad immunologiczny organizmu skada si z 2 gwnych skadnikw, limfocytw B i limfocytw T. Limfocyty B wywodz si gwnie z komrek szpiku kostnego u wyszych zwierzt lub z torebki Fabrycjusza u ptakw. Limfocyty te pochodz z grasicy. Limfocyty B odpowie-
dzialne s za syntez krcych przeciwcia zwanych immunoglobulinami. Limfocyty T zaangaowane s w liczne reakcje immunologiczne typu komrkowego, takie jak odrzucanie przeszczepu, reakcje nadwraliwoci czy obronne przed komrkami nowotworowymi i wirusami. W podrozdziale tym omwiono wycznie immunoglobuliny osocza, ktre powstaj gwnie
w komrkach plazma tycznych, wyspecjalizowa-
nej linii komrkowej wywodzcej si z limfocytw B, ktre syntetyzuj i wydzielaj immunoglobuliny do osocza. Wszystkie immunogobuinv zawieraj co najmniej 2 acuchy lekkie i 2 acuchy cikie Wszystkie czsteczki immunoglobulin skadaj si z 2 identycznych acuchw lekkich (L) o masie czsteczkowej 23 000 i 2 identycznych acuchw cikich (H) o masie czsteczkowej 53 00075 000 poczonych w tetramer (C2H2) przez mostki dwusiarczkowe (ryc. 58-6). W kadym z acuchw mona wyrni swoiste domeny, regiony o strukturalnym i funkcjonalnym znaczeniu. Potowa acucha lekkiego w kierunku koca karboksylowego zwana jest regionem staym (CL), podczas gdy poowa N-ko-cowa okrelana jest jako region zmienny (VL) acucha lekkiego. Okoo J ,U acucha cikiego fragmentu C-kocowego odpowiada regionowi zmiennemu (VH), a pozostae 75% tego acucha okrela si mianem regionw staych (CH-1, CH-2, CH-3) acucha H. Cz czsteczki immunoglobuliny, ktra wie swoisty antygen, utworzona jest* przez fragmenty C-kocowe (regiony zmienne) obydwu acuchw (H i L), tj. domeny VH i VL. Domeny acuchw peptydowych nie wystpuj w formie liniowej, lecz tworz regiony-globularne z odpowiedni struktur drugo- i trzeciorzdow w celu wizania swoistych antygenw. Jak przedstawiono na ryc. 58-6, trawienie czsteczki immunoglobuliny pr2ez papain prowadzi do powstania dwch fragmentw wicych antygen (Fab) i jednego fragmentu zdolnego do krystalizacji (Fc). Miejsce, w ktrym

Fab
Fc
TLJ
Pepsyna apalna CH2
CH3
Ryc. 58-6. Uproszczony model czsteczki ludzkiego przeciwciaa z klasy IgG, prezentujcy czteroiacuchowa, struktur podstawow i domeny. V oznacza region zmienny, C region stay. Strzaka pionowa region zawiasowy. Grube linie oznaczaj mostki dwusiarczkowe. (Wedug: Stites D. P., Stobo J. D Wells J. V., (red): Basie and Clinkai immunology, wyd. 6, Appleton and Lange, 1987). _______
paRaina rozszczepia czsteczk immunoglobu-liny, tzn. przestrze midzy domenami CH-1 i CH-2, nosi nazw regionu zawiasowego. Wszystkie acuchy (eckie s typu kappa lub lambda Na podstawie rnic w strukturze regionw CL (tab. 58-4) acuchy lekkie dzieli si na typ kappa (x) oraz lambda {X). Czsteczka im-miinoglobuliny zawiera 2 acuchy lekkie tego samego typu, nigdy ich kombinacj. U czowieka acuch typu x wystpuje czciej w czsteczkach immunoglobulin ni X. Pi typw acuchw cikich okrela przynaleno immunoglobuliny do okrelonej klasy U czowieka stwierdza si 5 klas acuchw cikich, wyrniajcych si odmienn budow regionw CH (tab. 58-4). acuchy te, oznaczane jako y, a, |i, 5 i e rni si mas czsteczkow, ktra waha si od 50000 do 70000 (tab. 58-4). Chocia zwykle wystpuj 3 domeny CH, acuchy \v i e maj ich po 4. Rodzaj acucha cikiego okrela przynaleno immunoglobuliny do okrelonej klasy, a przez to rodzaj penionej funkcji. Rozrnia si 5 klas immuno-
globulin: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. Jak przedstawiono w tab. 58-4, w obrbie kadej z klas acuchw cikich, na podstawie subtelnych rnic w strukturze regionw CH, mona wyrni podklasy. Nie ma dwch identycznych regionw zmiennych Regiony zmienne w czsteczkach immunoglobulin skadaj si z domen VL i VH i cechuj si znaczn heterogennoci, W rzeczywistoci nie stwierdzono 2 identycznych pod wzgldem sekwencji aminokwasowej regionw zmiennych w czsteczkach immunoglobulin uzyskanych od rnych osb. Zauwaa si jednak pewne podobiestwa w strukturze tych regionw u rnych osb, wrd ktrych na podstawie stopnia homologii sekwencji aminokwasowej mona wyrni 3 gwne grupy: grup VK dla acuchw lekkich typux, grup VL dla acuchw lekkich typu k i grup VH dla acuchw cikich. Mona ponadto wyrni podgrupy w obrbie wymienionych 3 grup. Reasumujc, w obrbie regionw zmiennych wystpuj miejsca wzgldnie niezmienne w poszczeglnych grupach i podgrupach. Porwnujc regiony zmienne w rnych acuchach
780 / ROZDZIA 58 Tabela 58-4. Cecha

7 IgG Klasy, w ktrych dane acuchy wystpuj Podklasy lub 1 2, 3 4 podtvov Gm (1)-{25) Odmiany al-lotypowe
Waciwoci acuchw ludzkich immunogiobulin*

acuchy H
acuchy L
a IgA
IgM
5 IgD
IgE
Y.
Wszystkie klas y
X Wszystkie
Skadnik sekre-c yjny SC IgA
acuch J J IgA, gM
klasy 12 3 4
1 2
1 2
NIW
55 000 70 000 62 000 70 000
23 0 00
Masa czste- 50 00 0" " czkowa (przybliona) Podgrupy regionw V
23 000
70 000
15 000
VHI-VHIV
VKI-VKIV
4 10 15 18 18 0 0 16 8 Wglowodany (przecitny udzia procentowy) 5 5 Ilo 1 7 0 0 1 2 lub 3 i otigosa-chary dw " Wedug: Stattes D. P., Stobo J. D., Wells J. V. (red.); Basie and Clinical Immunology, wyd 6 Appleton and Lange, 1987. * Poprzednio lnv(1)-(3). * 60 000 dla T3. Obszary nadzmienne acucha lekkiego,
Obszary nadzmienne acucha cikiego
lekkich tej samej grupy i podgrupy stwierdza si wystpowanie regionw nadzmiennych porozrzucanych midzy wzgldnie niezmiennymi sekwencjami (determinujcymi przynaleno do podgrupy (ryc. 58-7). acuchy lekkie maj 3 regiony nadzmienne (w VL), a acuchy cikie -4(wVH ). Regiony stae okrelaj funkcje efektorowe immunoglobulin swoiste dla klasy Regiony stale czsteczek immunoglobulin, szczeglnie CH_2 i CH_, (oraz CHA w IgM i IgE), ktre tworz fragmenty Fc, odpowiadaj za funkcje efektorowe rnych czsteczek immunoglobulin, swoiste dla poszczeglnych klas (tab. 58-5). Niektre immuno globu liny, jak IgG, wystpuj jedynie w podstawowej strukturze tetrame-rycznej, podczas gdy inne, jak IgA czy IgM, mog wystpowa jako wysze polimery zoone z 2, 3 (IgA) lub 5 (IgM) jednostek tet-ramerycznych (ryc. 58-8).
Wewntrz- acu chawe wizania __ dwuslarczkowe
Ryc. 58-7. Schematyczny model czsteczki IgG, prezentujcy prawdopodobne pooenie obszarw nadzmiennych w obrbie acuchw cikich i lekkich. (Wedug: Stites D. P Stobo J. D Wells J. W (red): Basie and Clinical immunoiogy, wyd. 6. Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem, zmodyfikowana).
BIAKA OSOCZA, 1MMUNOGLOBINY 1 CZYNNIKI KRZEPNICIA / 781 Tabela 58-5. Waciwoci ludzkich immunoglobulin
IgG IgA a IgM
\i
IgD 8
IgE
Klasa acucha H Podklasa acucha H Typ acucha L Skad czsteczkowy Staa sedymentacji fS) Masa czsteczkowa (przybliona) Ruchliwo elektroforetycz-na (przecitna) Wizanie dopeniacza (klasyczne) Stenie w surowicy (przyblione) mg/i Penetracja przez oysko Aktywno reaginowa Liza anty bakteryjna Aktywno przeciwwirusowa
s
Y. i
y1,72,73,74 xi X
Y^
al, a2 xi X a2L/* lub

7
H1,H2
V. i A
5a L,
19 900 000
6-7 150 000
7-8 180 000
160 000" 400 000*"" Szybka y do|3 0 2000

0
190 000
Szybka 7 do (3
S zyb ka 7
Szybka y
+
10 000
++++ 1200
0
0
30 0 0 ?
0,5
0
+
?
0 +
0 +++
+
++++
?
++ +
* Wedug Stites D.P., Stobo J.D., Welts J.V. (red.): Basie and Ctinicat tmmunology, wyd. 6. Appleton i Lange, 1987. " Dla monornerycznych surowiczych IgA **" acuch J **" Skadnik sekrecyjny SC ***** Dla sekrecyjnej IgA
W limfocycie B lub w komrce plarmatycznej acuchy L i H syntetyzowane s jako oddzielne czsteczki i nastpnie czone w czsteczk immunoglobuliny, ktra wykazuje budow gli-koproteiny (tab. 58-4). acuchy lekkie i cikie s produktami wielu genw Kady acuch lekki jest produktem co naj mniej 3 oddzielnych genw strukturalnych: genu regionu zmiennego (VL), genu regionu czcego (J) (nie majcego zwizku z acuchem J w IgA lub IgM) oraz genu regi onu staego (CV), Kady acuch ciki jest produktem co najmniej 4 rnych genw: genu regionu zmiennego (VH), genu regionu nadzmiennego (rnorodnoci" D), genu regionu czcego (J) oraz genu regionu staego (CH). Nie ma tu zastosowania klasyczna kon cepcja jeden gen jedno biako". Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za tworzenie pojedynczego a-
cucha immunoglobuliny z wielu genw struk turalnych przedstawiono w rozdz. 38 i 41. Rnorodno przeciwcia zaley od rearanacji genw Kady czowiek zdolny jest do wytwarzania przeciwcia skierowanych przeciwko 1 milionowi rnych antygenw. Wydaje si, e powstawanie tak ogromnej liczby rnorodnych przeciwcia zaley od tworzenia kombinacji rnych genw strukturalnych uczestniczcych w syntezie kadego acucha immunoglobuliny oraz od duej czstoci mutacji somatycznych w rea-ranowanych genach VH i VL. Podczas odpowiedzi immunologicznej dochodzi do zmiany klasy tworzonych przeciwcia (elass switching" przeczenie") W wikszoci przypadkw odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego dochodzi do
782 / ROZDZIA 58
Skadnik sekreoyjny
A. IgA w surowicy
C. l(jM (pan ta mer)
B. Sekrecyjna IgA (dimer)
Ryc. 58-8. Wysoce schematyczne przedstawienie polimerycznych ludzkich immunoglobulin, acuchy polipeptydowe s reprezentowane przez grube linie; wizania dwusiarczkowe czce rne acuchy polipeptydowe s przedstawione za pomoc cienkich linii (Wedug: Stites D P., Stobo J D., Weils J. W. (red): Basie and Clinica! Immunology wyd. 6, Appleton and Lange, 1987, za zezwoleniem).
tworzenia przeciwcia o identycznej swoistoci, lecz rnicych si przynalenoci klasow i zjawisko to nastpuje w cisym porzdku chronologicznym w odpowiedzi na podanie immunogenu (immunizujcego antygenu). Je den z typw acucha lekkiego immunoglobuli-ny moe si poczy z antygenowo swoistym acuchem u., tworzc swoist czsteczk IgM. Nastpnie, ten sam antygenowo swoisty acuch lekki czy si z acuchem y o identycznym regionie V, tworzc czsteczk IgG
o identycznej specyficznoci wobec antygenu jak pocztkowo wytwarzana IgM. Ten sam acuch lekki moe rwnie czy si z acuchem cikim a, zawierajcym identyczny region VH, aby utworzy czsteczk IgA cechujc si tak sam swoistoci wobec antygenu. Te 3 klasy (IgM, IgG i IgA) czsteczek immunoglobulin przeciwko temu samemu antygenowi maj identyczn domen zmienn zarwno w acuchu lekkim, jak i cikim. Mwimy wic, e maj one wsplny idiotyp. Rne klasy
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLQBIWV I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 783
izotypw determinowane s przez regiony CH poczone z tym samym swoistym antygenowo regionem VH. Jeden z genetycznych aspektw mechanizm w regulatorowych, odpowiedzialnych za zmian genu kodujcego CH (swit-ching") przedstawiono w rozdz. 41. Przyczyn schorze moe by zarwno nadmierna, jak i niedostateczna synteza tmmunoglobulin Zaburzenia w zakresie immu no globulin obejmuj wzmoon syntez swoistych klas im-m u no globu lin lub nawet swoistych czsteczek immunoglobulin, przy czym to ostatnie zjawisko zachodzi w przypadku klonalnego rozrostu nowotworowego komrek plazma tycznych okrelanego mianem szpiczaka. Hipogamma-globulinemie mog by ograniczone wycznie do jednej klasy immimoglobulin (np. EgA lub IgG) lub mog dotyczy niedostatecznego wytwarzania wszystkich ich klas (IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM). Nieprawidowe stenia immunoglobulin s prawie bez wyjtku spowodowane nieprawidow szybkoci ich syntezy lub wydzielania, indukowan licznymi czynnikami. W HEMOSTAZIE UCZESTNICZ CfANY NACZY. PYTKI KRWI ORAZ CZYNNIKI OSOCZOWE BIORCE UDZIA ZARWNO W KRZEPNICIU KRWI, JAK I W ROZPUSZCZANIU SKRZEPU Cztery etapy hemostazy He most a za jest procesem zatrzymywania krwawienia, ktre nastpuje po naruszeniu integralnoci ciany naczyniowej. Obejmuje ona powstawanie skrzepu i polega na wspdziaaniu elementw ciany naczyniowej, pytek krwi i biaek osocza, ktre powoduje zarwno krzepnicie krwi, jak i li powstaego skrzepu. Istniej cztery etapy hemostazy: Pierwszym z nich jest obfcurczanie si uszkodzonego naczynia, z jednoczesnym zmniej szeniem si przepywu krwi w odcinku dystalnym w stosunku do miejsca uszkodzenia. Na drug faz skada si formowanie lunego, przejciowego czopu pytkowego w miejscu uszkodzenia. Pytki przylegaj do wkien kolagenu w miejscu uszkodzenia ciany naczyniowej i podlegaj aktywacji przez trombin (mechanizm aktywacji pytek opisano po niej), powsta w kaskadowej reakcji krzep -
nicia w tym samym miejscu lub przez ADP uwolniony z innych zaktywowanych ju pytek. Podczas aktywacji pytki zmieniaj swj ksztat i w obecnoci flbrynogenu ulegaj agregacji z utworzeniem czopu pytkowego. Trzeci etap hemostazy polega na utworze niu sieci fibryny lub skrzepu, ktry zatrzymuje w swoim obrbie czop pytkowy (biay skrzep) i (lub) erytrocyty (czerwony skrzep) formujc ostatecznie bardziej trwa skrzepline. W czwartej fazie dochodzi do czciowego lub cakowitego rozpuszczenia skrzepu przez plazmin. W warunkach prawidowej hemosta zy istnieje stabilny, dynamiczny stan rwno wagi, w ktrym skrzepliny s stale tworzone i rozpuszczane. Istniej trzy rodzaje skrzepw Rozrnia si nastpujce rodzaje skrzepw: Biay skrzep zoony z pytek i fibryny jest stosunkowo ubogi w erytrocyty. Powstaje on w miejscu uszkodzenia lub patologicznej zmia ny ciany naczyniowej, szczeglnie w miejscach, gdzie przepyw krwi jest szybki (k-inice). Drugim rodzajem skrzepu jest czerwony skrzep, ktry pocztkowo skada si z krwinek czerwonych i fibryny. Czerwony skrzep mor fologicznie przypomina skrzepline powsta w probwce i moe formowa si in vivo w ob szarach o zwolnionym przepywie krwi lub z jej zastojem, ze wspistniejcym lub nie uszkodze niem naczyniowym, albo te moe on by formowany w miejscu zranienia lub zmiany naczyniowej w poczeniu z tworzcym si pierwotnie czopem pytkowym. Trzecim rodzajem skrzepu s rozsiane zogi fibryny zlokalizowane w bardzo maych naczy niach i kapilarach. Poszczeglne 3 rodzaje skrzepu zawieraj fibryn w zmiennych proporcjach. W pierwszej kolejnoci zostanie przedstawiony proces krzepnicia prowadzcy do powstania fibryny. Nastpnie opisane zostan krtko pewne aspekty udziau pytek i ciany naczy krwiononych w caociowo ujtym procesie krzepnicia. To oddzielenie czynnikw krzep nicia i pytek jest sztuczne, jako e jedne i drugie peni wzajemnie wspzalene i bardzo zblione funkcje w procesie krzepnicia; takie postpowanie jednake uatwia opis caoci toczcych si procesw.
784 / ROZDZIA 58
Wynikiem dziaania zarwno szlaku wewntrzpochodnego, jak i zewntrzpochodnego jest powstanie wknika Dwa szlaki prowadz do uformowania czopu fibrynowego; zewntrzpochodny i wewntrzpochodny. Tworzenie sie czerwonego skrzepu w miejscu o zwolnionym przepywie krwi lub w odpowiedzi na istnienie patologicznej zmiany w obrbie ciany nitczyniowej bez uszkodzenia okolicznych tkanek jest wynikiem aktywacji szlaku wewntrzpochodnego. W powstaniu czopu fibrynowego w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki uczestniczy szlak zewntrz pochodny. Obydwa szlaki zbiegaj si we wsplnym, kocowym etapie obejmujcym aktywacje pro trombiny do trombiny i katalizowane przez powstay enzym rozszczepienia fibrynogenu z utworzeniem czopu fibrynowego. Szlaki zewntrzpo-chodny i wewntrzpochodny, jak rwnie wsplny etap kocowy s skomplikowane i bierze w nich udzia wiele rnych biaek {ryc. 58-9, tab. 58-6). Oglnie, jak przedstawiono w tab. 58-7, biaka te mog by zaklasyfikowane do 4 grup: l)zymogenw, obejmujcych sery nowo --zalene proteazy, ktre ulegaj aktywacji podczas procesu krzepnicia; 2) kofaktorw; 3) fibrynogcnu i 4) transglutamina/y, ktra stabilizuje skrzep fibry no wy. Szlak wewntrzpochodny prowadzi do aktywacji czynnika X Szlak wewntrzpochodny (ryc. 58-9) obejmuje czynniki XII, Xl, IX, VIII i X, jak rwnie
UJEM&fE NAADOWANA POWIERZCHNIA
Tabela 58-6. Numeryczny system nazewnictwa czynnikw krzepnicia krwi. Liczebniki wskazuj kolejno, w jakiej czynniki osoczowe byy od krywane i nie maj zwizku z kolejnoci, w jakiej one dziaaj Czynnik
1 Nazwa(y) zwyczajowa(e)
Fibrynogen \ Czynniki te s zwykle f okrelane za pomoc / w ich nazw zwyczajoch Protrombina j V Fosfolipidy pytkowej
Niesazwyk.
II III
IV V VII
vm
IX
X XI XII
1 le okrelane | jako czynniki Jony wapnia / krzepnicia Proakceleryna, czynnik chwiejny, akcelerator (Ac-)-globuliny Prokonwertyna, akcelerator konwersji protrombiny (SPCA), kotromboplastyna Czynnik antyhemofiiowy A, globulina antyhemofiowa (AHG) Czynnik antyhemolitowy B, czynnik Christmasa, os oczowy skadni ktromboplastyny Czynnik Stuarta-Pro we ra Czynnik poprzedzajcy tromboplas tyn osoczow (PTA) Czynnik Hagemana Czynnik stabilizujcy fibryn (FSF), fibrynoligaza
XIII
Uszka^ "\^_dzenle f^ tka nki g 2 |a k Czynnik tKankowy \
wewntrz-.* pochodny
Szlak
zewntrz-pochodny
x
Kocowy, wsplny etap krzepnicia Fibfynogen
vii
J
u sieciowa rta fibry na
Sponlanlozna 2el flbrynowy Rozpuszczalne monomery flbryny
Ryc. 58-9. Szlaki krzepnicia krwi; wewntrzpochodny i zewntrzpochodny, prowadzce do powstania nierozpuszczalnego skrzepu fibryny. HMK wielkoczsteczkowy kininogen, PL fosfolipidy. "
* Bfadykinlna
Faza kontaktu
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 7SS Tabela 58-7. Funkcje osoczowych czynnik w krzepnicia 1. Zymogeny proteaz serynowych Czynnik XII czy si z odsonitymi czs teczkami kolagenu w miejscu uszkodzenia ciany naczyniowej; aktywowany przez wielkoczsteczkowy kininogen i kalik-retn f Czynnik XI Aktywowany jest przez czynnik Wie Czynnik IX Aktywowany jest przez czynnik Xla w obecnoci jonw wapnia Czynnik VII Aktywowany przez trombin w obecnoci jonw wapnia Czynnik X Uczynniany na powierzchni za-ktywowanych ptytek przez kompleks czynnikw (jony wapnia, czynniki VIMa i tXa), jak rwnie przez czynnik VIla w obecnoci czynnika tkankowego i jonw wapnia Czynnik Uczynniany na powierzchni za-ktywowanych pytek przez kompleks protrombtnowy (jony wapnia, czynnik Va i Xa) (czynniki II, VII, IX i X s zymogenami zawierajcymi reszty karboksy-glutaminianowe) 2. Kota ktry Czynnik V!ll Aktywowany przez trombin, czynnik Vltla jest kofaktorem w reakcji aktywacji czynnika X przez czynnik iXa Czynnik V Aktywowany przez trombin; czynnik Va jest kofaktorem w reakcji aktywacji protrombi-ny przez czynnik Xa
3, Fibrynogen Czynnik I Rozszczepiany przez trombin z utworzeniem skrzepu fibryno-wego
4. Tiolowo-zalena transglutaminaza Czynnik XIII Aktywowany przez trombin w obecnoci jonw wapnia stabilizuje skrzep fibrynowy na zasadzie tworzenia krzyowych wiza kowalencyjnych
prekalikrein, wysokoczsteczkowy kininogen, jony wapnia i fosfolipidy pytek krwi. Ostatecznie doprowadza on do powstania czynnika Xa (wedug przyjtej konwencji zaktywo wane czynniki krzepnicia oznacza si za pomoc przyrostka a"). Szlak ten rozpoczyna si faz kontaktu", w trakcie ktrej prekalikreina, wysokoczstecz-kowy kininogen, czynniki XII i XI s eksponowane na dziaanie ujemnie naadowanej powierzchni aktywujcej. Prawdopodobnie to wanie kolagen, znajdujcy si na odsonitej powierzchni ciany naczynia spenia in vivo rol wspomnianej powierzchni aktywujcej, podczas gdy szko lub kaolin w warunkach laboratoryjnych in vitro stymuluj szlak wewntrz-pochodny. W chwili, gdy czynniki uczestniczce w fazie kontaktu zostanl* zgromadzone na po wierzchni aktywujcej, czynnik XII ulega aktywacji do czynnika XIIa w reakcji proteolizy katalizowanej przez kalikrein. Powstay pod wpywem kalikreiny czynnik XIIa dziaa na prekalikrein uwalniajc kolejne czsteczki kalikreiny, tworzc tym samym ukad wzajemnej, zwrotnej aktywacji. Utworzony czynnik XIIa aktywuje czynnik XI do XIa oraz uwalnia bradykinin (nonapeptyd o dziaaniu rozszerzajcym naczynia krwionone) z wysokoczstecz-kowego kininogenu. Czynnik XIa w obecnoci jonw wapnia aktywuje czynnik IX (masa czsteczkowa 55 000, bdcy zymogenem zawierajcym zalene od obecnoci witaminy K reszty y-karboksyglutaminianowe) do proteazy sery-nowej czynnika IXa. Czynnik ten rozkada wizanie midzy arginm i izoleucyn (Arg-Ile) w czsteczce czynnika X (masa czsteczkowa 56 000), tworzc dwuacuchow proteaz sery-now czynnik Xa. Ostatnia reakcja wymaga do swego przebiegu udziau zespou skadnikw okrelanych cznie jako kompleks aktywny, zlokalizowany na powierzchni zaktywowanych pytek i skadajcy si z jonw wapnia, czynnikw VHIa, IXa i X, Naley nadmieni, i we wszystkich reakcjach, w ktrych bior udzia zymogeny zawierajce reszty Gla na N-kocach czsteczek (c2ynniki II, VII, IX i X) reszty te s miejscami o wysokim powinowactwie dla jonw wapnia. Przed zgromadzeniem czynnikw kompleksu aktywnego na trombocytach, pytki musz ulec aktywacji, aby mogy wyeksponowa kwane (anionowe) fosfolipidy, tj. fosfatydylose-ryn i fosfatydyloinozytol, ktre zwykle znajduj si na wewntrznej powierzchni bony komrkowej nie âktywowanego trombocytu.
50 Biochemia
786 / ROZDZIA 58
Czynnik VIII (masa czsteczkowa 330000) jest glikoprotein nie bdc prekursorem protea-zy, lecz kofaktorem sucym jako receptor dla czynnikw IXa i X na powierzchni pytek krwi. Czynnik. VIII jest aktywowany przez niewielkie iloci trombiny, tworzc czynnik VIIIa, podlegajcy nastpnie unieczynnieniu na drodze dalszego rozszczepienia przez trombin. Szlak zewntrzpochodny rwnie prowadzi do uczynnienia czynnika X, cho w odmienny sposb Czynnik Xa zajmuje w ukadzie krzepnicia miejsce, gdzie zbiegaj si oba szlaki; zewntrzpochodny i wewntrzpochodny (ryc. 58-9), rozpoczynajc wsplny, kocowy etap krzepnicia krwi. Szlak zewntrzpochodny obejmuje czynnik tkankowy, czynnik VII, X i jony wapniowe, prowadzc do powstania czynnika Xa. Szlak ten jest aktywowany w miejscu uszkodzenia tkanki w chwili uwolnienia czynnika tkankowego (obficie wystpujcego w oysku, tkance pucnej i mzgu) (ryc. 58-9), ktry dziaa jako
kofaktor w katalizowanej przez czynnik VIIa reakcji aktywacji czynnika X. Czynnik VIIa
szlaku wewntrzpochodnego zewntrzpochod-nym.
Kocowy wsplny etap krzepnicia obejmuje aktywacje protrombiny do trombiny Podczas kocowego, wsplnego etapu krzepnicia, czynnik Xa, powstajcy zar wno na szlaku wewntrzpochodnym, jak i zewntrz-pochodnym, aktywuje protrombin do trombiny (czynnik Ha), ktra nastpnie przeksztaca fib-rynogen w fibryn (ryc. 58 -9). Aktywacja protrombiny, podobnie jak uczynnienie czynnika X, zachodzi na powierzchni zaktywowanych pytek i wymaga obecnoci
kompleksu protrombinazy skadajcego si z pytkowych, anionowych fosfolipidw, jonw wap nia, czynnika Va, czynnika Xa i protrombiny.
rozszczepia to samo wizanie midzy arginin i izoleucyn (Arg-Ile) w czsteczce czynnika X, ktre jest rozszczepiane przez kompleks aktywnych czynnikw szlaku wewntrzpochod -nego. Czynnik VII (masa czsteczkowa 53 000), bdcy glikoprotein syntetyzowan w wtro bie, zawiera reszty glutaminianowe i jest zymo-genem o stosunkowo wysokiej endogennej ak tywnoci; aktywno ta wzrasta w wyniku konwersji do aktywnej proteazy serynowej, tj. czynnika VIIa, przez trombin lub czynnik Xa. Aktywacja
czynnika X stanowi wane sprzenie
Czynnik V (masa czsteczkowa 330000), glikoprotein pod wieloma wzgldami zbliona do czynnika VIII i ceruloplazminy, jest syntetyzowany w wtrobie, ledzionie i nerkach, i obecny zarwno w pytkach krwi, jak i osoczu. Dziaa on jako kofaktor w sposb podobny do czyn nika VIII w kompleksie aktywnym. PD aktywacji do czynnika Va, zachodzcej pod wpywem niewielkich iloci trombiny, wie si on ze specyficznymi receptorami bony komrkowej pytek (ryc. 58-10), tworzc kompleks z czynnikiem Xa i protrombin. Nastpnie czynnik ten podlega inaktywacji wskutek dalszego dziaania trombiny, tym samym zapewniajc ograniczenie konwersji protrombiny do trombiny. Protrombin (masa czsteczkowa 72 000, ryc. 58-1)) jest jednoacuchow glikoprotein syntetyzowan w wtrobie. Region N -koricowy protrombiny (1 na ryc, 58-11) zawiera 10 reszt
Pretrombina
COO
C32+ Ca2+
Btona Komrkowa pytki
Ryc. 58-10. Schematyczne przedstawienie wizania si czynnikw Va, Xa, jonw wapnia i protrombiny z bon komrkow zaktywownej pytki. Miejsca rozszczepienia czsteczki protrombiny przez czynnik Xa s zaznaczone przez dwie strzaki. Cz czsteczki protrombiny, z ktrej nastpnie powstaje trombina, jest oznaczona jako pretrombina. __________________________________________________
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 787 Gla

1 2 >
A |
rI
-SS
I
B
X. Freromblna (przed rozszczepieniem przez czynnik Xa) Trombina (po rozszczepieniu przez czynnik Xa)
j i
Ryc. 58-11. Schematyczne przedstawienie protrombiny fragment N-kocowy znajduje sie po lewej stronie; obszar 1 zawiera wszystkie 10 reszt y-karboksygIutaminianowych Zaznaczono miejsca, w ktrych czsteczka jest rozszczepiana pod wpywem czynnika Xa, jak rwnie produkty jej degradacji. Pozycja katalitycznie aktywnej seryny oznaczona jest za pomoc trjkcika. acuchy A i B aktywnej trombiny (zacienione) s wzajemnie poczone za pomoc mostkw dwusiarczkowych, ___________________
F-1-2
y-karboksyglutaminianowych (Gla), za sery-nowo-zalene miejsce aktywne tej proteazy (zaznaczone czarnym trjktem), umiejscowione jest na C-kocu czsteczki. Po poczeniu z kompleksem czynnikw Va i Xa na powierzchni pytki, czsteczka protrombiny ulega rozszczepieniu w dwch miejscach przez czynnik Xa, co prowadzi do utworzenia aktywnej, dwuacuchowej czsteczki trombiny, ktra jest nastpnie uwalniana z powierzchni pytki. acuchy A i B trombiny s ze sob poczone wizaniem dwusiarczkowym. Protrombina moe by rwnie uczynniona przez koagulaz gronkowcow na drodze prostej modyfikacji konformacyjnej, nie obejmujcej rozszczepienia czsteczki. Przeksztacenie fibrynogenu do fibryny jest katalizowane przez trombin Fibrynogen (czynnik I, masa czsteczkowa 340000, ryc. 58-9 i tab. 58-7) jest rozpuszczaln
glikoprotein osoczow o dugoci 47,5 nm, ktra skada si z trzech rnicych si midzy sob acuchw polipeptydowyci (A a B p, y)2, kowalencyjnie poczonych ze sob wizaniami dwusiarczkowymi. acuchy B p i y zawieraj przyczony do asparaginy kompleks oligosa-charydowy. Wszystkie 3 acuchy s syntetyzowane w wtrobie; 3 odpowiedzialne za ich syntez geny strukturalne s zlokalizowane na tym samym chromosomie, a ich ekspresja u ludzi podlega koordynacyjnej regulacji. Regiony N-kocowe 6 acuchw s utrzymywane w bliskim wzajemnym ssiedztwie przez pewn liczb wiza dwusiarczkowych, podczas gdy regiony C-kocowe s od siebie znacznie od dalone, wskutek czego czsteczka ma wyduony i asymetryczny ksztat (ryc. 58-12). Odcinki A i B znajdujce si w regionach N-kocowych acuchw A a i B p1, okrelane odpowiednio jako fibrynopeprydy A (FPA) i
fibrynopeptydy
acuch Aa
acuch B/f acuch y
47.5 nm-
Ryc. 58-12. Schematyczne przedstawienie (bez zachowania proporcji) czsteczki fibrynogenu, eks ponujce pary acuchw Aa, Bp i y poczonych przez wizania dwusiarczkowe. FPAfibrynopeptyd A, FPB fibrynopeptyd B. ___________________________________________________________
788 / ROZDZIA 58
B (FFB), maj nadmiar adunkw ujemnych spowodowanych obecnoci reszt asparaginia-nowych i glutaminianowych, jak rwnie nietypowego O-siarczanu tyrozyny w FPB. Wspomniane adunki ujemne maj swj wpyw na rozpuszczalno fibrynogenu w osoczu, jak rwnie zapobiegaj agregacji jego czsteczek dziki elektrostatycznemu odpychaniu. Trombina (masa czsteczkowa 34000) jest proteaza serynow wystpujc w osoczu i hyd-rolizujc 4 wizania arginin a-glicyna (Arg-Gly) zlokalizowane midzy fibrynopep-tydami oraz odcinkami a i (! acuchw AaiB Pfibrynogenu(ryc. 58-13A). Uwolnienie fibrynopeptydw przez trombin wyzwala mo nomery fibryny, majce struktur podjednost-kow (a, p, y)2. Poniewa FPA i FPB zawieraj odpowiednio tylko 16 i 14 reszt aminokwaso-wych, czsteczka fibryny zachowuje 98% reszt obecnych w fibrynogenie. Usunicie fibrynopeptydw odsania miejsca wizce, ktre umoliwiaj czsteczkom monomerw fibryny spontaniczn agregacj w niestabilny kompleks tworzcy z kolei nierozpuszczalny skrzep fibryno-wy. Uformowany, nierozpuszczalny polimer
fibryny zatrzymuje w swoim obrbie pytki, erytrocyty i inne skadniki tworzc biae lub czerwone skrzepy. Utworzony pocztkowy skrzep fibrynowy jest raczej saby i utrzymywany w caoci jedynie przez niekowalencyjne poczenia monomerw fibryny. Trombina, poza konwersj fibrynogenu do fibryny, przeksztaca rwnie czynnik XIII do czynnika XIJIa Czynnik ten jest bardzo swoist transglutami-naz, ktra kowalencyjnie czy czsteczki fibryny na zasadzie tworzenia wiza peptydo-wych midzy grupami y-karboksylowymi y-ka-rboksyglutaminianu i e-aminowymi reszt lizyny (ryc, 58-13B). W ten sposb powstaje bardziej stabilny skrzep fibrynowy o zwikszonej odpornoci na proteoliz. Stenie krcej trombiny wymaga precyzyjnej kontroli wobec moliwoci powstawania gronych zakrzepw W warunkach fizjologicznej hemostazy stenie aktywnej trombiny musi podlega dokadnej kontroli, aby nie tworzyy si grone zakrzepy. Cel ten osigany jest w dwojaki sposb. Trombina kry w postaci nieaktywnego preluirsora
Trombina
Arg * Gly
Flbrynopeptyd (A lub B) acuch fibryny (a lub 0)
Fibryna CH;, CH;> CH;. CHj NH3 Reszta lizyny
N C C H? C H; Fibryna Reszta glutaminy 1
NHJ
Czynnik Xllia (transglutamlnaza)
O II Fibryna CH2 CH2 CH2 CH2 NH C CH2 CHj Fibryna
Ryc. 58-13. Tworzenie si skrzepu fibrynowego: A indukowane przez trombtn rozszczepienie wiza Arg-Gly (arginina-glicyna) acuchw Aa i Bp fibrynogenu z powstaniem fibfynopeptydw (lewostron nie) oraz acuchw cc i p monomerw fibryny (prawostronnej). B usieciowanie czsteczek fibry fty przez aktywowany czynnik XIII (czynnik Xll(a).
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA
/ 789
protrombiny, ktra podlega uczynnieniu na drodze kaskady reakcji enzymatycznych, podczas ktrych nieaktywne zymogeny s przeksztacane do aktywnych enzymw, co w konsekwencji prowadzi do konwersji protrombiny w trom-bin (ryc. 58-9). Na kadym etapie wspomnianej kaskady mechanizm ujemnego sprzenia zwrotnego zapewnia istnienie precyzyjnej rwnowagi midzy aktywacj a hamowaniem. Stenie czynnika XII yv osoczu wynosi ok. 30 ug/ml, natomiast fibrynogenu 3 mg/ml, podczas gdy poziomy innych czynnikw kolejno dziaajcych w kaskadzie wykazuj stay wzrost, co jednoznacznie wskazuje na wystpowanie mechanizmu zwielokrotnienia w obrbie kaskady. Drugi sposb kontroli aktywnoci trombiny polega na unieczynnianiu wszelkich tworzcych si jej czsteczek przez krce inhibitory, z ktrych najwaniejsza jest antytrombina III (p. poniej). Aktywno antytrombiny III, wanego inhibitora trombi ny, zwiksza antykoagulant heparyna W warunkach fizjologicznych w osoczu istniej 4 naturalne inhibitory trombiny. Naj waniejszym z nich jest antytrombina III, ktrej udzia w cakowitej aktywnoci antytrombino-wej wynosi 75%. Antytrombina III moe rwnie hamowa aktywno czynnikw IXa, Xa, Xla i XIIa. a2-Makroglobulina ma najwikszy udzia w pozostaej aktywnoci antytrombino-wej osocza, wraz z kotaktoran heparyny II i 01,-antytrypsyn (oCj-antyproteinaz) wykazujcymi mniejsza aktywno hamujc w warunkach fizjologicznych. Endogenna aktywno antytrombiny III znacznie zwiksza si w obecnoci kwanych proteoglikanw, takich jak heparyna (p. rozdz. 57). Wi si one ze swoistymi miejscami kationowymi w obrbie czsteczki antytrombiny III, indukujc zmian jej konformacji, uatwiajc tym samym jej wizanie si z trombin i innymi substratami. Mechanizm ten ley u podstaw stosowania heparyny w medycynie klinicznej w celu zahamowania krzepnicia. Ponadto heparyna stosowana w maych dawkach ma zdolno wycielania rdbonka naczy krwiononych, przez co prawdopodobnie zmniejsza aktywacj szlaku wewnatrzpochodnego. Antykoagulacyj-ne dziaanie heparyny moe zosta zniesione przez dziaajce przeciwstawnie silnie kationowe polipeptydy, jak pro tam i na, ktra mocno wic si z z heparyn osabia jej czenie si
z antytrombina IHÔsoby z wrodzonymi niedoborami antyirombiny IIJ wykazuj predyspozycje do czstego tworzenia rozlegych zakrzepw, co potwierdza fizjologiczne znaczenie antytrom-biny III oraz wskazuje na fakt, i ukad krzepnicia u ludzi jest w warunkach fizjologicznych ukadem dynamicznym.
Anty koagulanty pochodne kumaryny hamuj zalen od witaminy K karboksylacj czynnikw II, VII, IX oraz X Antykoagulanty kumarynowe (np.: dikuma-roi) s lekami hamujcymi zalen od obecnoci witaminy K karboksylacj reszt glutaminiano-wych do y-karboksyglutaminianowych w regionach N-kocowyeh czymjjkw II, VII, IX i X. Czynniki te, powstajce w wtrobie, do spe nienia swej roli w procesie krzepnicia wymagaj obecnoci jonw wapnia. Te ostatnie zostaj zwizane przez reszty y-karboksyglutaminiano-we, z kolei uzalenione od karboksylacji reszt glutaminianowych wymienionych czynnikw krzepnicia. Pochodne kumaryny hamuj redukcj pochodnych chinonowych witaminy K do aktywnych jej form hydrochinonowych. W tym przypadku podanie witaminy K pozwala omin indukowan kumaryn inhibicj i umoliwia powstanie czynnikw zawierajcych reszty Y-karboksyglutaminianowe. Odwrcenie inhibicji kumarynowej prz ez witamin K trwa 1214 h, podczas gdy wyeliminowanie efektw dziaania heparyny przez pro tamin jest prawie natychmiastowe. Hemofilia A jest spowodowana genetycznie uwarunkowanym niedoborem czynnika VIII U ludzi spotyka si wiele wrodzonych niedoborw w obrbie ukadu krzepnicia. Najbardziej rozpowszechniony jest niedobr czynnika VIII wywoujcy hemofili A. Choroba ta, dziedziczca si z chromosomem X, miaa due znaczenie w historii rodw krlewskich w Europie. Hemofilia B jest spowodowana niedoborem czynnika IX i wykazuje niemale identyczny obraz kliniczny jak hemofilia A. Obydwa stany chorobowe mona jednak zrnicowa za pomoc swoistych testw laboratoryjnych. Gen ludzkiego czynnika VIII, poddany klonowaniu, okaza si by jednym z najwikszych do tej pory poznanych, zawiera bowiem 186 kb i 26 eksonw. Wykryto wiele rozmaitych typw uszkodze, przejawiajcych si zmniejszon ak-
790 / ROZDZIA 58
tywnoci czynnika VIII. Obejmuj one czciowe delecje i punktowe mutacje prowadzce do przedwczesnego zakoczenia tworzenia acucha polipeptydowego. Obecnie moliwa jest diagnostyka prenatalna polegajca na ocenie DNA z pobranych komrek kosmwki. W ostatnich latach leczenie pacjentw z hemofili A obejmowao podawanie krioprecypitatw (wzbogaconych w czynnik VIII) otrzymywanych od indywidualnych dawcw lub liofilizowanych koncentratw czynnika VIII przygotowywanych z puli osocza pochodzcego nawet od 5000 dawcw. W niedalekiej przyszoci czynnik VIII bdzie wytwarzany technik rekombinacji DNA. By moe metoda ta pokryje zapotrzebowanie wszystkich pacjentw z hemofili A. Problem ten nabra znaczenia z chwil pojawienia si u wielu pacjentw z hemofili AIDS jako konsekwencji terapii substytucyjnej z wykorzystaniem koncentratw liofilizowanego czynnika VIII, przygotowanych z wielu prbek osocza; czynnik VIII otrzymany metod rekombinacji DNA jest cakowicie bezpieczny w zastosowaniu klinicznym. Skrzepy fibrynowe s rozpuszczane przez plazmin Jak stwierdzono powyej, ukad krzepnicia prawidowo jest w stanie dynamicznej rwnowagi, w ktrej skrzepy fibryny s stale tworzone i jednoczenie rozpuszczane. Plazmina prote-aza serynowa, odpowiedzialna w gwnej mierze za degradacj fibryny i fibrynogenu, kry w osoczu w formie nieaktywnego zymogenu plazminogenu (masa czsteczkowa 90 000). Jeli nawet niewielki*Uoci plazminy powstaj we krwi krcej, w warunkach fizjologicznych podlegaj one natychmiastowej inaktywacji przez szybko dziaajcy inhibitor plazminy atj-antyplazmin. Plazminogen czy si zarwno z fibrynogenem, jak i fibryn, i w ten sposb zostaje wczony w skfad skrzepu w trakcie jego tworzenia si. Plazmina powstajca w czasie jej zwizania z fibryn jest chroniona przed dziaaniem a2-an ty plazminy i pozostaje aktywna. Rnego rodzaju aktywatory plazminogenu wystpuj w wikszoci tkanek organizmu, rozszczepiajc to samo wizanie w czsteczce plazminogenu midzy arginin i walin (Arg -Val) i tworzc tym samym dwuacuchow proteaz serynowa plazmin (ryc. 58-14) proteaz serynowa uwalnian ze rdbonka naczyniowego do krenia w warunkach uszkoTkankowy aktywator plazminogenu (TPA) jest
Aktywatory pla mtn gen u I-Val i rtiyvai r
PLAZMINOGEN
NH:
\ ---------------------------s -S ' -pArg
coo
I -- SPLAZMINA
Ryc. 58-14. Aktywacja plazminogenu To coo samo wizanie Arg-Val (arginina-walina) jest rozszczepiane przez wszystkie aktywatory plazminogenu, z utworzeniem dwulacuchowej czsteczki plazminy. Trjkcik oznacza reszt serynowa miejsca aktywnego. Dwa acuchy plazminy s poczone ze sob za pomoc mostka dwusiarczkowego.
dzenia tkanki lub stresu, a nastpnie, jeli nie zwie si z fibryn, podlega katalitycznej inak tywacji. Po poczeniu z fibryn TPA rozszczepia plazminogen w obrbie skrzepu z wytworzeniem plazminy, ktra z kolei rozkada fibryn z uwal nianiem rozpuszczalnych produktw jej degra dacji, co ostatecznie prowadzi do rozpuszczenia skrzepu. Zarwno plazmina, jak i aktywator plazminogenu, nie mogc pozosta zwizane z produktami degradacji fibryny, s uwalniane do osocza, gdzie podlegaj unieczynnieniu przez ich naturalne inhibitory. Prourokinaza jest pre kursorem kolejnego aktywatora piazminogenu urokinitzy, ktra nie ma tak duej swoistoci dla fibryny jak poprzedni aktywator. Urokinaza jest wydzielana przez pewne komrki nabon kowe wycielajce przewody wydzielnicze (np. kanaliki nerkowe) i prawdopodobnie bierze udzia w rozpuszczaniu fibryny odkadajcej si w tych przewodach. , TPA otrzymany technik rekombinacji DNA badany jest pod ktem jego przydatnoci w leczeniu zakrzepw wiecowych W chwili obecnej inny aktywator plazminogenu streptokinaza -jest wykorzystywany w lecznictwie jako czynnik fibrynolityczny. Jednake jest on mniej wybirczy ni TPA, .poniewa aktywuje zarwno plazminogen w osoczu (gdzie moe on nastpnie degradowa krcy tlbryno-gen), jak rwnie plazminogen zwizany ze
BIAKA OSOCZA, iMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 791
skrzepem fibrynowym. Ilo plazminy powstaej pod wpywem dawek terapeutycznych streptoki-nazy moe przekroczy zdolno neutralizacji przez krc a 2 -antyplazmin, powodujc w konsekwencji degradacj zarwno fibrynoge-nu, jak i fibryny, z nastpczymi krwawieniami czsto obserwowanymi w trakcie terapii fibry nolitycznej. Istnieje znaczne zainteresowanie wykorzystaniem terapeutycznym TPA otrzymanego metod rekombinacji DNA z racji jego swoistoci dla degradowanej fibryny i moliwoci przywracania dronoci ttnicom wiecowym, objtym uprzednio zakrzepem. Pod warunkiem odpowiednio wczesnego podania (przed wystpieniem nieodwracalnych uszkodze minia sercowego), TPA moe znacznie obniy wspczynnik umieralnoci z powodu uszkodzenia minia sercowego, bdcego konsekwencj za-krzepicy wiecowej. Dotychczas, w wielu prbach klinicznych, TPA wywoywa czasem krwawienia, tak wic pozostaje nadal pytanie, czy okae si on korzystniejszym lekiem w terapii ostrej zakrzepicy wiecowej od o wiele taszej s trep toki nazy. Istnieje kilka stanw patologicznych, midzy innymi choroba nowotworowa i wstrzs, w ktrych obserwuje si wzrost poziomu aktywatorw plazminogenu. Ponadto aktywno anty-plazminy, na ktr skadaj si ar antytrypsyna i otj-antyplazmma moe by zaburzona w pewnych stanach chorobowych, jak chociaby w marskoci wtroby. Poniewa pewne substancje pochodzenia bakteryjnego, jak na przykad streptokinaza, maj zdolno aktywowania plazminogenu, mog one by odpowiedzialne za powstawanie rozlegej skazy krwotocznej obserwowanej czasami u pacjentw z uogl nionymi infekcjami bakteryjnymi. Aktywacja pytek zwizana jest ze stymulacj metabolizmu poi ifosf oi nozytydw Pytki podlegaj kolejno 3 procesom, zapewniajcym cigo hemostazy: 1) adhezji do odsonitych wkien kolagenu w cianie naczyniowej, 2) uwolnieniu zawartoci ich ziarnistoci oraz 3) agregacji. Adhezja pytek do kolagenu odbywa si z udziaem czynnika von Willebranda, gliko-proteiny wydzielanej przez komrki rdbonka do osocza. Biako to dziaa jak most bezpieczestwa" rozpity midzy glikoprotein powierzchni pytek a wknami kolagenu w cianie naczy krwiononych. Czynnik ten zapobiega
wic oderwaniu siiplytek od cian naczy pod wpywem si strzygcych" prdu krwi. Aktywacja pytek. Prawidowe pytki znajduj si w stanie nie pobudzonym. Podczas krzepnicia zaangaowane w ten proces trom-bocyty podlegaj aktywacji. Aktywacja jest zoonym zjawiskiem, ktre obejmuje zmiany ksztatu pytek, zwikszon ich ruchliwo, uwalnianie zawartoci ich ziarnistoci oraz agregacj. Trombina, utworzona w wyniku kaskady krzepnicia, inicjuje aktywacj pytek in vivo na drodze interakcji ze swoim receptorem na powierzchni bony cytoplazmatycznej trombocy-tw (ryc. 58-15). Kolejne zjawiska prowadzce do aktywacji pytek s przykadem sygnalizacji przez Mono w ej, w trakcie ktrej chemiczny sygna zawarty w przestrzeni poza komrkowej powoduje powstanie czsteczek efektorowych we wntrzu komrki. Na przykad trombina dziaa jako pozakomrkowy przekanik chemiczny (stymulant lub agonista). Oddziaywanie trombiny z iej receptorem wzmaga aktywno fosfolipazy C bony komrkowej. Enzym ten hy drolizuj e fosfaty dy loinozy tolo-4,5-bisfosforan (PIPj jest polifosfoinozytydem), prowadzc do powstania 2 wewntrzkomrkowych czste czek efektorowych diacyloglicerolu (DAG) oraz inozytolo-tri fosforanu (IPj). Hydroliza PIP2 uczestniczy rwnie w mechanizmie dziaania wielu hormonw (p. rozdz. 45) i lekw. DAG pobudza kinaz biaek C, ktra z kolei fosforyluje biako pytkowe o masie czsteczkowej 47 000. Fosforylacja tego biaka powoduje uwolnienie zawartoci rnego typu ziarnistoci pytkowych (lizosomy, ziarnistoci gste i ziarnistoci ot). ADP uwolniony z ziarnistoci gstych moe rwnie aktywowa pytki, co przejawia si uczynnieniem dodatkowych krwinek pytkowych w otoczeniu. Ponadto ADP ma zdolno modyfikacji powierzchni pytki, co pozwala czsteczkom fibrynogenu (utworzonym w kaskadzie krzepnicia) na przyczepienie si do kompleksu glikoprotein (GPIIb oraz GPIIIa) na powierzchni trombocytu. Nastpnie czsteczki fibry nogenu cz ze sob ssiadujce pytki tworzc agregat pytkowy. 1P3 powoduje napyw jonw wapniowych do cytoplazmy i wspdziaajc z kalmodulin oraz kinaz lekkich acuchw miozyny prowadzi do fos-forylacji lekkich acuchw miozyny. acuchy te nastpnie wspdziaajc z aktyn powoduj przesunicie i zmiany ksztatu pytki. Aktywacja pytkowej fosfolipazy A2 przez zwikszone stenie jonw wapnia jest przy -
792 / ROZDZIA 58
Prostacyklina ^ I TxAa Trombina ADP Agregacja
I r^
++
Bfona kom rkowa
Fosforylacja Watka o m. ra. 47 000 \ Uwolnienie zawartoci ziarnistoci pytki (lizosomalnych. gstych i cznie z ADP
Fosfarylacja lekkiego aficucha --' Aktyna Aktynomiozyna \ Przesunicie, zmiana ksztatu
Ryc. 58-15. Schematyczne przedstawienie aktywacji pytki. rodowisko zewntrz kom orkowe* biona komrkowa i rodowisko wewntrzkomrkowe s przedstawione kolejno od gry do do u. GP 3 3 gliko-proteina, R\ R , R , R* rne receptory, AC cykaza adenylanowa, PLA S fosfolipaza A2, PL fosfolipidy, PLC - fosfolipaza C, PtPs fosfatydyloinozytofo-4,5 bisfosforan, cAMP cykliczny adenozynomonofosforan, PKC kinaza biaek C, TxA; tromboksan A^, IP3 inozytolo-trifosforan, DAG diacyloglicerol.
czyn uwolnienia kwasu arachidonowego z pytkowych fosfolipidw i powstania tromboksanu Aj (rozdz. 25), ktry z kolei ma zdolno dal szej aktywacji fosfotiâzy C, uatwiajc pytkow agregacj. Uczynnione pytki, poza formowaniem c/opu pytkowego, s niezbdne, dziki swoim fosfolipidom, do aktywacji czynnikw X i II w kaskadzie krzepnicia (ryc. 58-9), ciany naczy krwiononych syntetyzuj prostacyklin oraz inne substancje wpywajce na krzepnicie krwi i tworzenie zakrzepw Komrki rdbonka cian naczy krwiononych wnosz istotny wkad do oglnej regulacji krzepnicia i powstawania zakrzepw. Jak opisano w rozdz. 25, komrki te wytwarzaj pro-stacykliny (PGI2), ktre s silnymi inhibitorami pytkowej agregacji, antagonizujc dziaanie tromboksanw. Prostacykliny dziaaj prawdopodobnie na zasadzie pobudzania aktywno-
ci cyklazy adenylanowej na powierzchni bon pytek. Pojawiajce si w nastpstwie tego zwikszenie stenia wewntrzpytkowego cAMP przeciwdziaa stymulowanemu przez IP3 wzrostowi stenia wewntrzkomrkowych jonw wapnia, i tym samym hamuje aktywacj pytek (ryc. 58-15). Komrki rdbonka speniaj te inne funkcje w regulacji powstawania skrzepu. Na przykad metabolizuj ADP, znoszc jego dziaanie agregujce pytki. Ponadto, wytwarzaj one rwnie siarczan Iieparanu. ktry wie niektre czynniki krzepnicia, a take produkuj aktywatory plazminogenu, ktre mog wspomaga rozpuszczanie skrzepw. Analiza mechanizmw inkorporacji aterogennych lipopro-tein, jak LDL, przez monocyty, komrki rdbonka i miniwki gadkiej ttnic, wraz z precyzyjn ocen mechanizmw powstawania uszkodze wywoywanych przez lipoproteiny w obrbie tych komrek, s przedmiotem intensywnych bada w celu wyjanienia mechanizmw powstawania miadycy (rozdz. 28).
BIAKA OSOCZA, IMMUNOGLOBINY I CZYNNIKI KRZEPNICIA / 793 Tabela 58-8. Gwne cechy hemostazy i krzepnicia Naczynia krwionone, pytki i czynniki osoczowe krzepnicia s cznie zaangaowane w caoci procesu Wewntrzpochodny ukad krzepnicia jest aktywowany przez odsonity kolagen na powierzchni naczy krwiononych Ukad zewntrz pochodny jest aktywowany przez czynnik tkankowy uwotniony w trakcie uszkodzenia tkanki Ukad zewntrzpochodny i wewntrzpochodny prowadz do powstania czynnika Xa, natomiast finalizuj swoje dziaanie w kocowej, wsplnej fazie krzepnicia, w ktrej powstaje fibryna z fi-brynogenu pod dziaaniem trombiny Wiele czynnikw krzepnicia istnieje w postaci zymogenw proteaz serynowych; zymogeny te podlegaj aktywacji na drodze proteotizy. Istniej genetycznie uwarunkowane niedobory lub zmiany struktury czynnikw krzepnicia, manifestujce si wieloma chorobami krwotocznymi, jak chociaby hemofilia A W osoczu wystpuj inhibitory czynnikw krzepnicia (np. antytrombina III), ktre bior udzia w regulacji krzepnicia Wiele kluczowych reakcji w ukadzie krzepnicia odbywa si na powierzchni pytek; pytki podlegaj aktywacji wskutek dziaania trombiny, kolagenu i ADP, a ich agregacja jest zalena od interakcji z fibrynogenem Cao procesw krzepnicia stanowi kaskad, w ramach ktrej nastpuje znaczne zwielokrotnienie dziaania Dla aktywacji czynnikw II, Vii, IX i X konieczna jest zalena od obecnoci witaminy K karboksylacja pewnych reszt glutaminianowych z utworzeniem reszt gamma-karboksyglutaminianowych (Gla); reszty te wi jony wapnia, bdce wanymi uczestnikami procesu krzepnicia ciany naczy krwiononych wytwarzaj prostacy-klin, ktra hamuje aktywacj i agregacj pytek; w cianie naczy krwiononych odbywa si take synteza innych zwizkw, ktre bior udzia w regulacji krzepnicia Skrzepy powstaj z fibryny, wzmacnianej przez formowanie wiza krzyowych, katalizowane przez transglutaminaz, skrzepy fibrynowe s rozpuszczane przez plazmin powstajc z plazmino-genu
LABORATORYJNE TESTY OCENY KRZEPNICIA KRWI

Obecnie dostpnych jest wiele rnorodnych testw laboratoryjnych sucych do oceny 4 etapw hemostazy opisanych powyej. Obej muj one oznaczanie liczby pytek, czasu krwawienia, czasu czciowej tromboplastyny (PTT), czasu protrombinowego (PT), czasu trombinowego, stenia fibrynogenu, trwaoci skrzepu fibrynowego oraz iloci produktw rozpadu fibryny. Szersze informacje na temat wymienionych bada znajdzie Czytelnik w podrcznikach fizjologii lub hematologii. Podstawowe dane dotyczce hemostazy i krzepnicia zebrano w tab. 58-8.
PIMIENNICTWO
Bloorn AL,Thomas DP (edkors): Haemostasis and Thrombosis, 2nd ed. ChurchiU Livingstone, 1987, Colman RW, Hirsh J, Marder VJ, Salzman EW (editors): Hemostasis and Thrombosis, 2nd ed. JB Lippincott Co, 1987. Dugaiczyk A, Law SW, Dennison OE: Nuclcotide seuenee and the encoded amjno acids of human serum albumin raRNA. Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79:71. Gitschier J et al: Characterization of the human factor VIII gene. Namre (London) 1984; 312:326. Handin RI. Chapter 54, Bleeding and thrombosis, p 266, in: Harrison's Principks of Interna! Medicine 11 th ed. Braunwald, E, Isselbachcr, KJ, Petersdorf RG et al (editors). McGraw-Hill, 1987. Mariani G (editor): Pathophysiology ofPlasma Protein Metabolizm, Plenum Press, 1984. McK.ee PA: Hemostasis and disorders of blood coagulation, in; The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed. Stanbury JB et al (editors). McGraw-Hill, 1983. Reed RG, Peters T Jr. Chapter 14, Plasma proteins, pp 435-464, in: Clinicat Biochemistry Reviews, Vol 3. Goldberg DM (editor). John Wiley & Sons, 1982. Ruffner DE, and Dugaiczyk A: Splicing mutation in human hereditary analbuminemia. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85:2125. Stamatoyannopoulos G, Nienhuis AW. Leder P, Majerus PW (editors): The Mo/ecular Basis of Blood Diseases. WB Saunders, 1987, Stites DP, Stobo JD, Wells JV: Basie & Clinkal Immunology, 6th ed. Appleton & Lange, 1987, Vogel F, Motulsky AG. Human Genetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986.
59
Biaka kurczliwe i strukturalne

Victor W. Rodwell, PhD, Robert K. Murray, MD, PhD, Frederick W. Keetey, PhD
WPROWADZENIE
Czsteczki biaek mog peni funkcj nie tylko katalizatorw. W poprzednich rozdzia ach opisano funkcje regulacyjne, przekazywania sygnaw i funkcje rozpoznawcze czsteczek biakowych. Speniaj one rwnie wane funkcje przetwornikw i elementw strukturalnych. W tym rozdziale dokonano przegldu niektrych z tych ostatnich funkcji zalenych od wknistej struktury czsteczek biakowych.
proliny i hydroksylizyny. Takimi wanie zaburzeniami mona tumaczy objawy kliniczne pod postaci osabienia tkanki cznej typo we dla klasycznego szkorbutu (gnilca).
MISIE PRZETWARZA ENERGI CHEMICZN W MECHANICZN

Minie nale do gwnych przetwornikw biochemicznych (maszyn), ktre przetwarzaj energi potencjaln (chemiczn) w kinetyczn (mechaniczn). Minie, najobfitsza tkanka ciaa ludzkiego, stanowi mniej ni 25% masy ciaa przy urodzeniu, wicej ni 40% u modych dorosych i mniej ni 30% w staroci. Efektywny przetwornik chemiezno-mecha-niczny musi spenia kilka warunkw: 1. Musi mie zapewniony stay dopyw energii. W miniach krgowcw energia chemiczna dostarczana jest w postaci ATP i fosfokreatyny. 2. W przypadku minia musi by zapewniony sposb regulacji aktywnoci mechanicznej tj. szybkoci, czasu trwania i siy skurczu. 3. Maszyna musi by podczona do operatora, ktrego rol spenia w ukadach biologicznych sys tem nerwowy. 4. Musiiy zapewniona moliwo powrotu maszyny do jej pierwotnego stanu. Misie jest maszyn cignc, a nie pchajc. Dlatego misie musi mie antagonist w postaci grupy innych mini lub innych si, jak grawitacja lub napicie elementw sprystych. U krgowcw powysze warunki speniane s przez 3 rodzaje mini: minie szkieletowe, misie sercowy i minie gadkie. Zarwno minie szkieletowe, jak i misie sercowy wykazuj w obrazie mikroskopowym poprzeczne pra-
Rozwj naszej wiedzy o molekularnych podstawach gwnych chorb genetycznych biaek strukturalnych nabra nowego rozpdu w 1986 r. wraz z pomylnym klonowaniem genu dystrofii miniowej typu Diu-fcuinc'a. Byo to osignicie wielce obiecujce dla dokadnego rozpoznawania i ewentualnie leczenia tej choroby (p. przypadek nr 6, rozdz. 62). Podczas gdy wiele molekularnych schorze biaek powstaje na skutek mutacji w genach, w ktrych dane biako jest zakodowane (np. hemoglobina), biaka poddane modyfikacji potranslacyjnej dostarczaj dodatkowych moliwoci powstawania chorb z defektu genetycznego. Na przykad wie\e chorb u ludzi wynika z genetycznych defektw w przetwarzaniu prekursorw kolagenu (osteogenesis imperfecta, zesp Ehlersa-Dan-losa i Marfana). Defekty kolagenu mog powstawa rwnie na skutek zahamowania potranslacyjnej modyfikacji przez brak kofaktora, takiego jak kwas askorbinowy (witamina C), niezbdnego dla hydroksylacji zwizanych z biakiem reszt prolilowych i lizylowych do hydroksy-
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 795 kowanie; minie gadkie prkowania nie maj.
Podczas gdy minie szkieletowe s sterowane (kontrolowane) w sposb wiadomy, regulacja czynnoci minia sercowego i mini gadkich
odbywa si niezalenie od naszej woli.
Sarkoplazma komrek miniowych zawiera ATP, fosfokreatyn i enzymy glikolityczne Misie poprzecznie prkowany sktada si z wielojdrzastych komrek (wkien) otoczonych pobudliw na bodce elektryczne bton sarkolemm. Pojedyncze wkno (komrka) miniowe, ktre moe rozciga si na ca dugo minia, zawiera pczki zoone z wielu rwnolegle uoonych miofibryli, zanurzonych w wewntrzkomrkowym pynie, sarkoplazmie. Pyn ten zawiera glikogen, zwizki wysokoenergetyczne ATP i fosfokreatyn oraz enzymy glikolityczne. Sarkomer jest czynnociow jednostk minia Sarkomer wielokrotnie powtarza si wzdu dugiej osi fibrylico 1500 2300 nm(ryc. 59-1).
Ogldajc miofibryje pod mikroskopem mona zaobserwowa naprzemiennie wystpujce ciemne i jasne prki (prki A i prki I). rodek prka A (strefa H) jest janiejszy ni jego reszta. Prek I przedzielony jest w rodku lini Z (ryc. 59-2). Prkowanie mini dowolnych (szkieletowych) i minia sercowego spowodowane jest wysokim stopniem organizacji ich struktury. Wikszo komrek uoonych jest tak, e ich sarkomery tworz rwnolege szeregi (ryc. 59-1). Biakiem grubych filamentw jest miozyna Badanie poprzecznych przekrojw miofibryli za pomoc mikroskopu elektronowego wyka zuje, e kada z nich zbudowana jest z 2 typw podunych filamentw. Jeden z tych typw (grube filamenty) ograniczony do prka A, zawiera gwnie biako miozyn. Filamenty te maj rednice ok. 16 nm i na przekrojach poprzecznych tworz ukad heksagonalny (ryc. 59-2).
Misie
Prek H
Linia Z
Priek A
Prek
Miofjbryla Z - S ar ko m e r-Z
Ryc. 59-1. Struktura minia szkieletowego. (Rycina wykonana przez Sylwi Colard Keene, wedug Bloom W., Fawcett D. W,: A Textbook of Histology, Saunders, 1975, za zezwoleniem).
796 / ROZDZIA 59
Strefa H A. Rozkurczony Prek I
' yy*r* *
A -------
Prek A
, , -a.,-./-.,/.,/, , a^
Linia Z
\'.,Sf>'.*4*S...S*. -S:, *.*/'/ W*/ '//
VA&x&AyZ&ttZZffl%&%&Z69%Pfl&S!g%6i
- 2300 nm
a-Aktyni na Filamenty aktyny; redni ca 6 nm Filament ml ozyny o redni cy 16 nm
Przekroj e poprzeczne B. Skurczony Filament cienki rednica 6 nm
Filamen rednica 16 nm gruby L --------------------------------------------------------------------------1500 nm ---------------- '
Ryc. 59-2. Uoenie filamentw w miniu poprzecznie prkowanym A wrozkurczu, B w skurczu.
Cienkie f ilamenty zawieraj aktyn, tropomiozyn i troponin Filamenty drugiego typu (cienkie) le w prku I, ale rozcigaj si rwnie na prek A, z wyjtkiem jego strefy H (ryc, 59-2). Cienkie filamenty zawieraj biaka aktyn, tropomiozyn i troponine. W obrbie prka A cienkie filameniy uoone s wok fiiamentw grubych tworzc wtrny ukad heksagonalny. Kady z cienkich filamentw ley symetrycznie midzy 3 grubymi, a kady z grubych filamentw otoczony jest przez 6 cienkich (ryc. 59-2). Grube i cienkie filamenty wspdziaaj przez poprzeczne mostki, ktre co 14 nm wystaj z filamentw grubych. Jak to pokazano na ryc. 59-2, mostki poprzeczne l,ub groty strza" lece na 2 kocach filamentw skierowane s przeciwnie. Bieguny filamentu oddzielone s
odcinkiem o dugoci 150 nm (prek M) wol nym od poprzecznych mostkw. Zachodzce na siebie f i lamenty lizgaj si po sobie w czasie skurczu minia W czasie skurczu minia dugo grubych i cienkich filamentw nie-imienia si, natomiast
strefa H i prek I si skracaj. Tak wic ukady zachodzcych na siebie filamentw musz przesu wa si w stosunku do siebie (lizga si po sobie) w czasie skurczu minia. Mostki poprzeczne generuj i podtrzymuj napicie. Napicie gene -
rowane w czasie skurczu minia jest proporcjonalne do stopnia zachodzenia na siebie grubych i cienkich filamentw, a wic do iloci tworzonych mostkw poprzecznych. Kady mostek poprzeczny poczony jest z grubym filaraentem nitkowatym odcinkiem, ktry moe odgina si
BIAKA KURCZLIWE i STRUKTURALNE / 797
od grubego filamentu dostosowujc uoenie mostka do wielkoci przestrzeni miedzy fila-mentami. Gwnymi biakami minia s aktyna i miozyna Masa wieego minia skada si w 70% z wod y i w po nad 20 % z bia ek. Akt yn a i miozyna s dwoma gwnymi biakami mi nia.
Globularny mononjcr aktyny (G-aktyna) ma
powtarzajc sicojtade 35,5 nm. Ani aktyna G, ani F nie maja adnej aktywnoci katalitycznej. Wane funkcje peni (stery dodatkowe biaka W miniu poprzecznie prkowanym znajduj si 4 inne biaka majce may udzia w jego masie, ale penice wane funkcje. Tropomiosy-na jest nitkowat czsteczk skadajc si z 2 acuchw cc i p, przyczon do aktyny F w rowku midzy dwoma polimerami (ryc. 59-3). Troponuozyna wystpuje we wszystkich miniach i strukturach podobnych do mini. Ukad trnponiny wystpuje tylko w miniach poprzecznie prkowanych i skada si z 3 osobnych biaek. Troponina ^fTpT) czy si z tro-
mas czsteczkow 43^000 i stanowi 25% masy biaek minia. W fizjologicznym zakresie siy jonowej i w obecnoci magnezu aktyna G polimeryzuje niekowalencyjnie tworzc nierozpuszczalny, podwjnie spiralny (podwjny heliks) filament zwany aktyna F (ryc. 59-3). Nitka aktyny F ma rednic 67 nm i struktur
Aktyna G
o
Tropom bzy na Troponina
CD
Aktyna F
35.5 nm
Uformowany cienki filament
Ryc. 69-3. Schematyczna prezentacja cienkiego filamentu pokazujca przestrzenn konfiguracj 3 gw nych skadnikw biatkowych: aktyny, tropomiozyny i troponiny. _____________________________
798 / ROZDZIA 59
OD), 0.0
PAPA! NA
| HMM
TRYPSYNA
HMM S-2
LMM
85 nm
Ryc. 59-4. Diagram czsteczki miozyny pokazujcy 2 zwmite ze sob heliksy (cz nitkowata), gwk (G ), lekkie aricuchy (L) i efekt trawienia przez trypsyn i papain. HMM cika meromiozyna; LMM lekka meromiozyna; S-1 podjcinostka 1; S -2 podjednostka 2,
pomiozyn oraz z dwoma pozostaymi skadnikami troponiny (ryc. 59-3). Troponina I (Tpl) hamuje interakcj midzy aktyn F i miozyn, a take czy si z' pozostaymi skadnikami troponiny. Troponina C (TpC) jest biakiem wicym wap o pierwszo- i drugorzdowej strukturze i funkcji analogicznej do szeroko w przyrodzie wystpujcego biaka, kalninduli-ny. Oba te biaka maj mas czsteczkow 17 000 i wi po 4 jony wapnia na czsteczk. Cienki filamcnt minia poprzecznie prkowanego skada si z aktyny F, tropomiozyny i 3 skadnikw troponiny: TpC, Tpl oraz TpT (ryc. 59-3). Ukad trop o mi ozyna-troponina powtarza si co 38,5 nm. Miozyna stanowi 55% masy biaek minia i tworzy grube filamenty. Jest ona asymetrycznym heksaniercm o masie czsteczkowej 450 000. Miozyna ma cz nitkowat, skadajc si z 2 zwinitych ze sob heliksw, z ktrych kady na jednym kocu ma globularn gwk
(ryc. 59-4). Heksamer skada si z jednej pary acuchw cikich (m.cz. 200 000) oraz z 2 par acuchw lekkich (m.cz. 15 00027 000). Miozyna minia szkieletowego hydrolizuje ATP (wykazuje aktywno ATP -azow) i czy si z nierozpuszczaln czsteczk aktyny F. Wiele nauczylimy si dokonujc czciowego trawienia miozyny Trawienie miozyny fcrypsyn powoduje jej rozpad na 2 fragmenty (meromiozyny). Lekka meromiozyna (LMM) skada si z zagregowanych, nierozpuszczalnych nitek tworzcych he-liks ot (ryc. 59-14). LMM nie wykazuje aktywnoci ATP -azowej i nie wie si z aktyn F. Cika meromiozyna (HMM) jest biakiem rozpuszczalnym o masie czsteczkowej 340 000, posiadajcym zarwno fragment wkienkowy, jak i globularny (ryc. 54-14). HMM wykazuje aktywno ATP-azow i wie si z aktyn F. W wyniku trawienia HMM papain powstaj
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 799
Ryc. 59-5, Dekorowanie" filamentw aktyny podjednostkami S -miozyny tworzcymi groty strza" (dziki uprzejmoci Profesor James Spudich, Uniwersytet Stanford). ________ |**_ ________________
2 fragmenty okrelane jako S-l i S-2. Fragment S-2 ma charakter wkienkowy. Nie wykazuje on aktywnoci ATP-azowej, ani te nie wie si z aktyn F. S-l o masie czsteczkowej 115000 wykazuje
aktywno ATP -azow. a przy braku ATP wie si z aktyn F i dekoruje" j grotami strza" danie do nich aktyny F /wiksza j 100 do 200
(ryc. 59- 5). Aczkolwiek zarwno S -l, jak i HMM wykazuj aktywno ATP -azow, dorazy. Jak to bdzie omwione poniej, aktyn F bardzo zwiksza szybko, z jak produkty ATP-azy, ADP i Pi; s od niej odczane. W ten sposb, chocia aktyn F nie wpywa bezporednio na etap samej hydrolizy, dziki zdolnoci
do uatwiania odczania produktw ATP -azy znacznie zwiksza ona cakowit szybko katalizy.
ct-Aktynina jest biakiem linii Z, do ktrego przyczone s koce czsteczek aktyny F cienkich filamentw (ryc. 59-2). Energii do skurczu dostarcza zalena od ATP dysocjacja gwek miozyny od cienkich filamentw
W jaki sposb hydroliza ATP powoduje po wstanie makroskopowego ruchu? Skurcz minia polega na cyklicznym przyczaniu do i odcza niu gwek miozyny od filamentw aktyny F.
wek miozyny z aktyn F. Biochemiczny cykl skurczu minia skada si z 5 etapw (ryc. 59-16): 1) gwka miozyny moe sama hydro-lizowa ATP do ADP + P ; , ale nie moe odczy produktw hydrolizy. W ten sposb sama hydroliza ATP przez gwk miozyny ma charakter raczej stechiometryczny ni katalityczny; 2) gwka miozyny zawierajca ADP i P: moe swobodnie obraca si pod duym ktem, co umoliwia jej odnalezienie aktyny F i zwizanie si z ni pod ktem ok. 90 stopni w stosunku do dugiej osi grubego filamentu; 3) interakcja uatwia odszczepienie ADP i P: od kompleksu aktyna-miozyna; poniewa ustawienie wiza aktomiozyny pod ktem 45 stopni jest konformacj o najwyszej energii, miozyna zmienia swj kt z 90 stopni do ok. 45 stopni przez pociganie aktyny (o 10 15 nm) w kierunku rodka sarkomeru; 4) nowa czsteczka ATP wie si z kompleksem miozyna-aktyn F. Miozyna-ATP ma mae powinowactwo do ak tyny , wobec cze go
gwka miozyn y ( ATP ) 5) oddziela si od niej. Ten ostatni etap decyduje rozkurczu, procesie, ktry w oczywisty sposb zaley od wizania ATP z kompleksem aktyna-
Przyczenie powoduje zmian interakcji ak-tyna-miozyna tak, e fiamenty aktyny i miozyny przesuwaj si w stosunku do siebie. Porednim rdem energii jest hydroliza ATP. Jest ona bardzo przyspieszana przez zwizanie g-
-miozyna. ATP jest ponownie hydrolizowany przez gwk miozyny, bez odszczepienia ADP P, i w ten sposb cykl si powtarza. Jasne jest, e ATP powoduje odszczepienie gwki miozyny od cienkiego filamentu i dostarcza energii skurczu. Wydajno energetyczna tego skurczu wynosi ok. 50%; dla porwnania wydajno silnika spalinowego wynosi mniej ni 20%.
800 / ROZDZIA 59
Ca odgrywa gwn rot w regulacji skurczu mini Powyej zosta opisany oglny mechanizm skurczu mini pochodzcych z rnych rde. Minie pochodzce z rnych organizmw, a w danym organizmie z rnych narzdw, mog mie rne mechanizmy molekularne odpowiedzialne za regulacj ich skurczu i roz-kurczu. We wszystkich ukadach rol gwnego regulatora odgrywa Ca2+. Istniej 2 gwne mechanizmy skurczu mini: oparty na aktynie i oparty na miozynie. W miniach poprzecznie prkowanych wystpuje regulacja oparta na aktynie U krgowcw oparta na aktynie regulacja
wystpuje w miniach szkieletowych i w miniu sercowym, z ktrych oba s poprzecznie pr-
z+
Aktyna
ATP-miozyna
H,0
Aktyn am iozyn a AOP-P,
ADP-P.-miozyna Aktyna
kowane. W opisanym powyej oglnym mechanizmie jedynym czynnikiem ograniczajcym w cyklu skurczu minia moe by ATP. Ukad kurczliwy minia szkieletowego pozostaje zahamowany w spoczynku minia, a jego roz-hamowanie powoduje aktywacj skurczu. Inhibitorem w miniu poprzecznie prkowanym jest ukad troponiny zwizanej z tropomiozyn i aktyn F cienkiego filamentu (ryc. 59-3). W miniu poprzecznie prkowanym regulacja skurczu (lub ATP-azy jako biochemicznego wskanika skurczu) moe si odbywa pod warunkiem obecnoci, wraz z filamentami nk-tyny i miozyny, ukadu tropomiozyn-tropo-nina. Jak to opisano powyej, tropomiozyn ley w rowku aktyny F, a z kompleksem aktyna F-tropomiozyna zwizane s 3 skadniki troponiny TpT, Tpl brz TpC. Tpl zapobiega przyczaniu gwek miozyny do ich miejsc wizania na aktynie F aibo przez zmian kon - formacji aktyny F, albo przez przesunicie tropomiozyny do pozycji, w ktrej blokuje ona bezporednio miejsca wizania gwek miozyny na aktynie F. Oba mechanizmy zapobiegaj aktywacji ATP-azy, ktra zaley od wizania gwek miozyny z aktyn F. Std system Tpl blokuje drugi etap cyklu skurczu przedstawionego na ryc. 59-6. Tumaczy to stan hamowania ukadw kurczliwych w miniu znajdujcym si w stanie spoczynku. Ca2* poredniczy w aktywacji skurczu minia Stenie Ca2 + w sarkoplazmie minia wynosi w spoczynku J0"7 10"8 mol/l. Wap jest
Ryc. 59-6. Hydroliza ATP jest rdem napdu cyklicznego fczenia i rozczania aktyny i miozyny w 5 reakcjach opisanych w tekcie. (Wedug: Stryer L Biochemistry, wyd. 2, Freeman, 1981, za zezwoleniem, zmodyfikowana).
magazynowany w siateczce sarkoplazmatycz-nej, sieci drobnych boniastych pcherzykw, przez aktywny ukad transportujcy wspomagany przez wice Ca2+ biako, kalsekwest-ryne. Komrka miniowa jest otoczona -pobudliw bon, ktra ma poprzeczne kanaliki (T), pozostajce w cisej cznoci z siateczk sar-koplazmatyczn. Gdy bona komrkowa zo staje pobudzona np. przez depolaryzacj Wony post synaptycznej pytki motorycznej, Ca2 + jest gwatownie uwalniany z siateczki sarkoplaz-matycznej do sarkoplazmy. Stenie Ca2 + w sarkoplazmie gwatownie ronie do 10 " 5 mol/l. Miejsca wizania Ca2* na TpC cienkich fila-mentw zostaj przez niego szybko zajte. TpC--4Ca2+ reaguje z Tpl oraz TpT zmieniajc ich interakcj z tropomiozyn. W wyniku tego tropomiozyn po prostu usuwa si z drogi gwek miozyny lub zmienia konformacj aktyny F tak, e gwki miozyny zawierajce ADP i P| mog z ni reagowa rozpoczynajc tym samym cykl skurczu. Rozkurcz zachodzi gtly: 1) stenie Ca2 + w sarkoplazmie spada poniej 10~7 mol/l na skutek ponownego wyapywania go przez ener-gozalen pomp Ca2+ siateczki sarkoplazma-tycznej;2) TpC-4Ca2+traci swjCa2+;3) tro-ponina hamuje dalsz interakcj gwek miozyny z aktyn F oraz 4) gwka miozyny odcza si od aktyny F, co zapocztkowuje rozkurcz. W ten sposb Ca2+
kontroluje (reguluje) skurcz minia poprzez aliosteryczny mechanizm, w ktrym uczestnicz
TpC, Tpl, TpT, tropo miozyn i aktyna F.
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 801 Wap pochodzi z pynu pozakomrkowego
W miniu sercowym pozakomrkowy jest niezbdny dla aktywacji skurczu. Podczas gdy usunicie Ca2 + z pynu pozakomrkowego powoduje natychmiastowe ustanie skurczw izolowanych komrek minia sercowego, misie szkieletowy moe si kurczy bez obecnoci pozakomrkowego Ca2+ w cigu wielu godzin. Utrata ATP z sarjtoplazmy pociga za sob 2 zasadnicze skutki: 1) pompa wapniowa siateczki sarkoplazraatyczncj nie moe utrzymywa ruskiego stenia Ca2* w sarkoplazmie, wobec tego uatwiona jest interakcja gwek miozyny z aktyn F; 2) nie moe zachodzi zalene od ATP odszczepianie gwek miozyny od aktyny F, wobec czego wystpuje sztywno pomiertna {rigor mortis"). Skurcz minia, podlegajcy precyzyjnej regulacji przez ukad nerwowy, polega na delikatnej dynamicznej rwnowadze midzy przyczeniem gwek miozyny do aktyny F i odczaniem ich od niej.
Ca* reguluje skurcz rwnie w miniach gadkich
1
metralnie od sytuacji w miniach poprzecznie prkowanych, gdzie aktomiozyna ma du aktywno ATP-azow. Miozyna minia gadkiego zawiera lekki acuch (lekki acuch P), ktry zapobiega wizaniu gwek miozyny z aktyn F, Fosforylowany lekki acuch pozwala na aktywacj ATP-azy miozyny. Fosforylacja
acucha P zapocztkowuje skurczowy cykl przyczania i odczania (gwek miozyny). Lekki acuch P miozyny jest fosforylowany przez swoj kinaz 2 aktywowan przez 4Ca -kalmoduin
Sarkoplazma mini gadkich zawiera zalen
od wapnia kinaz lekkiego acucha. Aktywacja
kinazy lekkiego acucha zachodzi przez wizanie 4Ca2+ -kahnoduliny z podjednostk kinazy o masie czsteczkowej ffl5 000 (ryc. 59-7). Aktywowana przez 4Ca3+-kalmoduline kinaza fos-foryluje lekki acuch P, co znosi hamowanie interakcji miozyna-aktyn F. Rozpoczyna to cykl skurczu.
Misie gadki rozkurcza si, gdy a+ stenie Ca spada poniej 10'"* mol/l
Podczas gdy wszystkie rodzaje mini zawieraj aktyn, miozyn i tropomiozyne, tylko regulujce skurcz w rnych ukadach kurczliwych musz by rne. Minie gadkie maj struktur molekularn podobn do mini poprzecznie prkowanych, jednake ich sarkomery nie s uporzdkowane w sposb tworzcy poprzeczne prki. Podob nie jak minie szkieletowe, minie gadkie zawieraj czsteczki a-aktyniny i tropomiozy-ny. Nie zawieraj one ukadu troponiny, a ich lekkie acuchy miozyny rni si od lekkich acuchw w miniach poprzecznie prkowanych. Jednake, podobnie
jak w miniach poprzecznie prkowanych, ich skurcz jest regulowany przez Ca 2+ , Skurcz mini gadkich inicjowany jest przez fosforylacj lekkiego acucha P miozyny poprzecznie prkowane minie krgowcw zawieraj ukad troponiny. Tak wic mechanizmy
Gdy miozyna minia gadkiego wie si z aktyn F przy nieobecnoci innych biaek miniowych, takich jak tropomiozyna, aktywno ATP-azowa jest nie wy kry walna. Ta nieobecno aktywnoci ATP-azowej rni si dia31 Biochemia
Rozkurcz minia gadkiego zachodzi, gdy: 1) stenie Ca3+ w sarkoplazmie spada poniej 10~7 mol/l; wap dysocjuje od kahnoduliny, ktra z kolei dysocjuje od kinazy lekkiego acucha miozyny; 2) co powoduje jej inaktywa-cj; 3) adne nowe fosforany nie s przyczane do lekkiego acucha P, a te, ktre ju byy przyczone, s odczane przez stale aktywn, niezalen od wapnia fosfataz lekkiego acucha; 4) defosforylowany lekki acuch miozyny ponownie blokuje wizanie gwek miozyny z akt yn F oraz akt ywno ATP- azo w; 5) gwka miozyny oddziela si od aktyny F w obecnoci ATP, ale nie moe si do niego przyczy w obecnoci defosforylowanego lekkiego acucha P; wobec tego zachodzi rozkurcz. Tabela 59-1 podsumowuje i porwnuje regulacj interakcji aktyn-miozyna (aktywacja ATP-azy miozyny) w miniach poprzecznie prkowanych i gadkich. Kinaza lekkiego acucha miozyny nie jest bezporednio aktywowana przez cAMP. Jed nake kinaza biaek aktywowana przez cAMP (p. rozdz. 45) moe fosforylowa kinaz lekkiego acucha miozyny (ale nie sam lekki acuch). Fosforylowana kinaza lekkiego a cucha miozyny wykazuje znaczco nisze powinowactwo do Ca2+-kalmoduliny, wobec czego
802 / ROZDZIA 59
Kinaza miozynowa (nieaktywna) Kalmodulina T0~ mol/l Ca *, 10~ mol/l Ca
7 I+ ; 1
Ca
2+
Kalmodulina
ATP Ca *' KALMODULiNA KIMAZA MIOZYNOWA (AKTYWNA)

1
pb-Mlozyna (hamuje Interakcje miozyna aktyna)
ADP
H2POf pL rniozyna (nie hamuje interakcji miozyn a aklyna)
Ryc. 59-7. Regulacja skurczu minia gadkiego przez Ca . (Wedug: Adelsiein R. S.; Regulation and kinetics of actin-myosin interaction; Annu. Rev. Biochem 1980, 49, 921).
21
jest mniej wraliwa na aktywacj. W wyniku tego zwikszenie stenia cAMP tumi odpowied skurczow minia gadkiego na dany wzrost stenia Ca2+ w sarkoplazmie. Ten molekularny mechanizm moe tumaczy roz kurczajcy wptyw pobudzenia P-receptorw na misie gadki. Fenotiazyny wi kalmodulin i rozkurczaj minie gadkie Fenotiazyny, bdce szeroko uywanymi lekami antypsychotycznymi, wi si z kalmodulina i zapobiegaj jej wizaniu z enzymami zalenymi od wapnia. Rozkurczaj one rwnie minie gadkie. Minie porzecznie prkowane miczakw, takich jak przegrzebek, wykazuj regulacj skurczu opart na miozynie. Podobnie jak miozyna i aktyna F mini gadkich,'te biaka przegrzeb-ka nie wykazuj aktywnoci ATP-azowej, co
wynika z hamujcych waciwoci regulatorowego" lekkiego acucha miozyny tego gatunku. Usunicie hamowania interakcji aktyna--miozyna przegrzebka zachodzi, gdy Ca2+ wie si bezporednio ze specyficznym miejscem na czsteczce miozyny. Zaleno tej regulacji od Ca2+ nie wymaga kowalencyjnej modyfikacji miozyny ani obecnoci osobnych biaek, jak kalmodulina lub TpC. ,' Fosforylacja odgrywa gwn rol w skurczu minia gadkiego Jak to opisano powyej, fosforylacja lekkiego acucha miozyny minia gadkiego usuwa jego hamujcy wpyw na interakcj miozyny z aktyn F, a tym samym zapocztkowuje skurcz. Fosforan przyczony do lekkiego a cucha miozyny moe chelatowa z Ca2+ zwizanym z kompleksem tropomiozyna-TpC-ak-tyna, co moe prowadzi do zwikszenia szyb-
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURALNE / 803 Tabela 59-1. Interakcje midzy aktyn a miozyn w miniu poprzecznie prkowanym i gadkim* Misie prkowany Biaka filamentw minia Aktyn Miozyna (heksamer) Tropomiozyna Troponina (Tpl, TpT, TpC) Misie gadki i komrki inne ni miniowe Aktyn 1 Miozyna (heksamer) Tropomiozyna Nie
Spontaniczna interakcja aktyny F i sa- Tak mej miozyny {spontaniczna aktywacja ATP-azy miozyr^y przez aktyn F) Inhibitor interakcji aktyny F 2 miozyn Ukad troponiny (Tpl) (inhibitor zalenej od aktyny F ak tywacji ATP-azy) Skurcz aktywowany przez Bezporedni efekt Ca
=+ a+
Niefosforylowany acuch lekki P miozyny Ca + 2 4 Ca "îwizane z kalmoduin Kalmodulina-4Ca aktywuje ki-naz lekkiego acucha fosfory-lujca lekki acuch P miozyny. Fosforylowany acuch P przestaje hamowa interakcj aktyny F z miozyn (umoliwia aktywacj ATP-azy przez aktyn F)
a+ 2
Caa+
4Ca zwizane z TpC TpC-4Ca znosi hamowanie interakcji aktyny F z miozyn (pozwala na aktywacj ATP-azy przez aktyn F)
2+
i+
Efekt Ca zwizanego z biakiem
* acuchy lekkie miozyny mini poprzecznie prkowanych rni si od acuchw lekkich miozyny mini gadkich.
koci tworzenia poprzecznych mostkw miedzy gwkami miozyny i aktyn. Fosforylacja cikich acuchw miozyny jest prawdopodobnie warunkiem ich ukadania si w grube diamenty w miniach szkieletowych, miniach gadkich i w komrkach nie-miniowych. Tpl i peptydowy skadnik pompy wapniowej siateczki sarkopiazmatycznej mog by fosfory-lowane przez kinaz biaek zalen od cAMP. Istnieje pewna korelacja midzy fosforylacja Tpl a zwikszon si skurczu wywoan w miniu sercowym przez katecholaminy. Jednake mechanizm dodatniego efektu inotropowego katecholamin polega przede wszystkim na zwikszonej aktywacji kanaw wapniowych. Zapasy ATP w miniu odnawiane s przez wiele mechanizmw ATP. ktry jest staym rdem energii dla cyklu skurczowego minia, moe by generowany w toku glikolizy, fosforylacji oksydacyjnej, przez fosfokreatyn lub tworzony z 2 czsteczek ADP (ryc. 59-8). Zapasy ATP w miniu
szkieletowym szybko si wyczerpuj i s w stanie dostarczy energi prawdopodobnie na mniej ni 1 s skurczu. W powolnych komrkach mini szkieletowych obfitujcych w zapasy O: w mioglobinie, oksydacyjna fosforylacja jest gwnym rdem regeneracji ATP. Szybkie" komrki mini szkieletowych regeneruj ATP gwnie na drodze glikolizy. Fosforan kreatyny stanowi gwn rezerw energii Fosfagen (fosforan kreatyny) zapobiega gwatownemu wyczerpaniu ATP dostarczajc atwo dostpnego, bogatego energetycznie fosforanu, ktry jest potrzebny do tworzenia ATP z ADP. Fosfokreatyna jest tworzona z ATP i kreatyny w czasie rozkurczu minia, kiedy zapotrzebowanie na ATP nie jest tak due. Fosforylacja kreatyny nastpuje przez fosfokinaz kreatyno-w (CK), enzym specyficzny dla mini. W klinice jej oznaczanie jest wykorzystywane dla rozpoznawania ostrych i przewlekych schorze mini.
804 / ROZDZIA 59
Glikogen minia. Fosfok reatyna
\ FOSFORYLAZA MINIOWA iy
FOSFOKINA2A KREATYNOWA K re aiyna -" ^ ~~" \
,^ - A D P
G l u ko z a " * ~
J GUKOLIZA
|\
TP H^ ^_ S kurc z minia MIO2YNY
FOSFOflYLACJA OKSYDACYJNA AM P -^ ^
ADP + Pj / " Â D P
Ryc. 59-8. rda ATP w sercu
Kl >JAZA LA ADENY-MOWA MINIA
Misie szkieletowy zawiera due zapasy glikogen u Sarkoplazma minia szkieletowego zawiera, due zapasy glikogenu zawartego w granulkach znajdujcych si blisko prka I. Oddzielanie glukozy od glikogenu zaley od specyficznej miniowej fosforylazy glikogenu (p. rozdz. 20). Aby powsta podlegajcy glikolizie glukozo-6--fosforan, fosforylaza b glikogenu w miniu szkieletowym musi by przeksztacona w ak tywn fosforylaz a na drodze fosforylacji przez kinaz fosforylazow b (p. rozdz. 20). Ca2 + uatwia aktywacj kinay fosforylazowej b, rwnie na drodze fosforylacji. Tak wic Ca2+ nie tylko aktywuje skurcz minia, ale rwnie toruje drog produkcji potrzebnej energii. Fosforylaza b nie wystpuje w miniach w chorobie McAr-dla (chorobie spichrzania glikogenu). Misie generuje ATP na drodze fosforyacji oksydacyjnej Synteza ATP na drodze fosbrylacji oksyda cyjnej wymaga dostawy tlenu. Minie o duym zapotrzebowaniu na tlen w wyniku dugo utrzymujcego si skurczu (np. dla utrzymania postawy ciaa), magazynuj tlen w mioglobinie (p. rozdz. 7). Dziki czsteczce hemu, z ktrym tlen si wie, minie zawierajce mioglobin s czerwone. W tabeli 59-2 porwnano niektre waciwoci szybkich (biaych) i powolnych (czerwonych) komrek mini szkieletowych.
Tabela 59-2. Waciwoci szybkich i powolnych mini szkieletowych Minie szybkie Aktywno ATP-azy miozyny Zuycie energii Kolor Mioglobina Szybko skurczu Czas trwania skurczu
Minie powolne Maa Mae Czerwony Obecna Mata Dugi
Dua Due Biay Brak Dua Krtki
Miokinaza przeksztaca adenino -, mono-, di- i trifosforany Enzym miokinaza katalizuje tworzenie jednej czsteczki ATP i jednej czsteczki AMP z dwch czsteczek ADP. Reakcja ta (ryc. 59-8) jest zwizana z hydroliz*ATP przez ATP -az miozyny w czasie skurczu minia. Deaminacja adeniny przez pracujcy misie prowadzi do uwolnienia amoniaku Bezporednim rdem amoniaku w miniu szkieletowym jest AMP deaminowany do IMP przez deaminaz adenylanowa. IMP moe by z powrotem przeksztacany w AMP na-drodze
reakcji z uyciem asparaginianu, katalizowanych przez syntaz adenylosukcynylow i ade-nylosukcynaz (p. rozdz. 36). MINIE SZKIELETOWE STANOWI GWN REZERW BIAKA USTROJU U ludzi biaka mini szkieletowych stanowi gwn nietuszczo* rezerw zmagazynowanej energii. Tumaczy to, szczeglnie u dorosych, bardzo due straty masy miniowej w wyniku dugotrwaego kalorycznego niedoywienia. Badanie rozpadu biaek tkankowych in vivo jest trudne, gdy aminokwasy pochodzce z wewntrzkomrkowego rozpadu biaek mog by w znacznym stopniu uyte do budowy innych biaek w komrce lub przetransportowane do innych narzdw, gdzie zostaj wczone do reakcji anabolicznych. Jednake aktyna i mio-zyna s po ich zsyntetyzowaniu metylowane z utworzeniem peptydyJo-3-metylohistydyny. W czasie wewntrzkomrkowego rozpadu ak tyny i miozyny 3-metylohistydyna jest wydzielana i wydalana z moczem. Wydalanie metylo-wanego aminokwasu stanowi wiarygodny wskanik szybkoci rozpadu biaek miofibrylar-nych u ludzi. W miniach zachodzi aktywna degradacja pewnych aminokwasw i synteza innych. U ssakw misie okazuje si by gwnym miejscem katabolizmu aminokwasw o rozgazionych acuchach. Misie utlenia leucyn do CO 2 i przeksztaca wglowe szkielety asparaginianu, asparaginy, glutaminianu, izoleucyny i waliny w amfiboliczne produkty porednie cyklu kwasw trik ar boksy lo wy ch. Zdolno minia do rozkadania aminokwasw o rozgazionych acuchach wzrasta 35-krotnie w czasie godowania i w cukrzycy. Misie syntetyzuje rwnie i uwalnia due iloci alaniny i glutami ny. Zwizki te s syntetyzowane dziki grupom aminowym uzyskanym z rozpadu aminokwasw o rozgazionych acuchach, a aminowy azot jest przenoszony na ct-ketoglu taran lub pirogronian na drodze transami nacji. Glikoliza egzogennej glukozy dostarcza prawie caego pirogronianu potrzebnego do syntezy alaniny. Reakcje te stanowi tzw. cykl glukozowo-alani-nowy, w ktrym alanina z minia jest uywana w glukoneogenezie wtrobowej dostarczajc jednoczenie do wtroby grupy aminowe usuwane nastpnie jako mocznik.
CYTOSZKIELETY PENI WIELE FUNKCJI KOMRKOWYCH Komrki nieminiowe wykonuj prac mechaniczn, wczajc w to samodzielne przemieszczanie, morfogenez, dzielenie si, wewntrzkomrkowy transport, endocytoz, egzocytoze i zmian ksztatu komrki. Te funkcje komrkowe s penione przez rozleg sie nitkowatych struktur stanowicych cytoszkielet. Cyto-plazma komrkowa nie jest, jak to kiedy mylano, woreczkiem pynu. W zasadzie wszystkie komrki eukariotyczne zawieraj 3 typy struktur nitkowatych: filamenty aktyny (o rednicy 7 9,5 nm), mikroubule (25 nm) i porednie filamenty (1012 nm). Kady z tych typw filamentw rni si biochemicznie i w obrazach elektro nowo-mikroskopowych. Komrki nieminiowe zawieraj aktyn Biako aktyna G izolowane z komrek nie-miniowych ma mas czsteczkow ok. 43 000 i zawiera reszty N-metylhistydylowe. W obecnoci wapnia i chlorku potasu ta aktyna spontanicznie polimeryzuje tworzc podwjne helik-sy filamentw aktyny F, takie, jakie wystpuj w miniach. W komrkach nieminiowych wystpuj co najmniej 2 typy aktyny: aktyna p i aktyna y. Oba typy mog wspistnie w tej samej komrce, a nawet wsppolimeryzowa, tworzc wsplny filament. Aktyna tworzy W cy-toplazmie komrkowej 79,5 nm mikrofila-menty, ktre czsto wystpuj w pczkach tworzcych sie. Pczki mikro filamentw wystpuj wyranie tu pod bon komrki w stanie spoczynku i s okrelane jako wkna napiciowe. Te wkna napiciowe s dekorowane" podjednostkami S-l miozyny, co uwidacznia ich charakter podwjnego heliksu (ryc. 59-9), Wkna napiciowe znikaj, gdy wzrasta ruch liwo komrki lub w czasie zoliwej transformacji komrki przez zwizki chemiczne lub pod wpywem onkogennych wirusw. Mikrowypustki komrkowe zawieraj filamenty aktyny Mikro filamenty s rwnie ciasno upakowane w postaci gstej siatki pod prowadzc krawdzi poruszajcej si komrki (ryc. 59--10), Mikro filamenty aktyn y wystpuj we wszystkich mi kro wy pustkach komrkowych, takich jak filopodia i mikrokosmki. Na przykad mikrokosmki komrek bony luzowej jelit
806 / ROZDZIA 59
Ryc. 59-9. Replika liofilizowanego cytoszkieietu eksponowanego przed zamroeniem na podjednostk 1 (S-1) rniozyny. Prawie wszystkie filamenty w wyduonych pczkach i wiele wplecionych midzy nie filamentw ulego pogrubieniu i przeksztaceniu w podobne do in podwjne heliksy (patrz fragment w kku). Jednake niektre filamenty poruszajce si samodzielnie midzy pczkami, a bdce prawdopodobnie filamentami porednimi, nie przyczyy podjednostki S-1 (strzaka). Powikszenie 70000x, w kku 200 000 x. (Wedug: Heuser J. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biol. 1980, 86, 212, za zezwoleniem).
(enterocytw) zawieraj 2030 mikrofilamen-tw uoonych rwnolegle do ich dugiej osi (ryc. 59-11). W podstawie mikrokosmkw znajduj si filamenty miozyny mogce ciga centrycznie filamenty aktyny wystajce do mik-rokosmka. W procesie skurczu (kosmka) nie zachodz adne zmiany dugoci filamentw aktyny lub miozyny. Musi on by wobec tego powodowany przez przesuwanie si filamentw w stosunku do siebie, jak to ma miejsce w miniu. Podobnie jak w miniu gadkim, aktywa cja interakcji aktyna-miozyna, a tym samym skurczu, zachodzi na drodze fosforylacji lekkiego acucha miozyny. Zarwno aktyna, jak i miozyna znajduj si midzy biegunami wrzecionka a chromosomami oraz wzdu rowka podziau w telofazie mitozy. Mikrofilamenty aktyny s rwnie zwizane z innymi biakami komrek nieminiowych. a-Aktynina znajduje si w tych miejscach bon komrkowych, do ktrych przyczepione s mikrofilamenty, np. w kocach mikrokosmkw. Geodom, rodzaj rusztowania otaczajcego jd -
ra komrek eukariotycznych, skada si z aktyny, a-aktyniny i tropomiozyny. a-Aktynina rozciga si rwnie wzdu samych mikro-filamentw aktyny. Miozyna rwnie moe wystpowa midzy wkienkami aktyny, jednake utworzone przez ni filamenty s krtsze i ciesze ni w miniu i wydaj si odgrywa jak rol w utrzymywaniu wkienkowatego charakteru aktyny. Tropomiozyna uczestniczy w formowaniu ge-odomw otaczajcych jdra komrkowe. Tro pomiozyna uoona wzdu mi kro filamentw aktyny zdaje si odgrywajp rol elementu raczej strukturalnego ni ruchowego. Poza mie ni owa aktyna regulowana jest przez wyspecjalizowane biaka Regulacja czynnoci pozami ni owej aktyny zaley od wielu wyspecjalizowanych biaek. Profilina zapobiega polimeryzacji aktyny G nawet w obecnoci odpowiednich ste magnezu i chlorku potasu. Filamina uatwia tworzenie sieci mikro filamentw aktyny. Tropomiozyna uatwia tworzenie pczkw aktywnych-wkien
Ryc. 59-10. Trzy rednio silnie powikszone obrazy krawdzi prowadzcych lub lameMipo-diw fibroblastw utrwalonych w caoci (A), ekstrahowanych trytonem przed utrwaleniem (8) lub ekstrahowanych trytonem po utrwaleniu (C). W A bona komrkowa jest nienaruszona, a struktury wewntrzne nie s widoczne. W B bona komrkowa zostaa usunita, co uwidocznio lec pod ni pajczyn kdzierzawych" filamentw. W innych dowiadc zeniach te filamenty by)y dekorowane" podjed-nostkami S-1, jednake byy one znacznie bardziej zagszczone i znacznie bardziej intensywnie zachodzify na siebie ni aktyna w innych rejonach komrki. W C bona komrkowa rwnie zostaa usunita, jednake dopiero po utrwaleniu komrki aldehydem. Delikatna siatka lecych pod ni filamentw wyglda po chemicznym utrwaleniu mniej subtelnie. A powikszenie 140 000 x. B i C powikszenie 115000x. (Wedug: Heuser J. E., Kirsch -ner M. W.: Filament organization revealed in platinum replicas oi freeze-dried cytoskeletons; J. Celi Biot. 1980, 86, 212, za zezwoleniem)
SOS / ROZDZIA 59
Linia Z
Filament aktyny
Filament aktyny Mikrokosmek Filament miozyny Misie
Ryc. 59-11. Mikrokosmki s malekimi wyrostkami cytoplazmatycznymi wyrastajcymi z komrek nabonkowych wycieajcych jelito cienkie, a ogromnie powikszajcymi powierzchni absorpcji skadnikw odywczych. Mikrokosmki zawieraj filamenty zarwno aktyny, jak i miozyny. Poniewa mog si one kurczy, stanowi przekonujcy przykad nieminiowego ruchu powodowanego przez lizganie si po sobie filamentw aktyny i miozyny. Jak to pokazano w A, pczki filamentw aktyny wystaj w kadym mikrokosmku ku grze, a filamenty miozyny zlokalizowane s u jego podstawy. W B uoenie filamentw aktyny spowodowane zostao potraktowaniem mikrokosmkw izolowanymi gwkami miozyny, zwanymi cik meromiozyn. Gwki" zachowuj zdolno wizania si zlilamentami aktyny. Gdy gwki" wystpuj w komrkach miniowych, tworz one groty" strza zwizane z filamentami aktyny. Gy gfwki dodano do mikrokosmkw, utworzyy one z aktyn kompleksy, w ktrych groty strza" skierowane by(y od koniuszka kosmka ku jego podstawie. Filamenty aktyny kosmkw s zatem analogiczne do ukadu filamentw aktyny w komrkach miniowych. (Wedug: Lazarides E., Revel J. P.: The molecular basis of celt movement; Set. Arn. {May) 1979; 240, 100, za zezwoleniem). __________
Ryc. 59-12. Pojedyncze komrki hodowli tkankowej. Delikatna pierzasta struktura na dole po stronie prawej stanowi krawd prowadzc lub lamellipodium komrki. Komrk poruszajc si RO podou i rozcigajc swoj krawd prowadzc do uformowania nowych pocze pokazano pod skonym ktem. (Wedug: Lazarides E Revei J. P.: The molecular basis of celi movement; Sci. Am. (May) 197,9; 240, 100, za zezwoleniem)
napiciowych. oc-Aktynina uatwia przyczepianie mikrofilamentw aktyny do bon, podoa i innych organelli komrkowych. Cytochalazy-na, naturalnie wystpujcy peptyd, rozbija mi-krofilamenty i zapobiega ich polimeryzacji. Ta reakcja suy jako diagnostyczny test na obec no lub czynno mikrofilamentw. Aktualny ruch komrki jest kierowany przez
jej krawd prowadzc lub lamellipodiwn, ktra
zawiera palcowate**wyrostki nazywane filopo-diami. Prowadzca krawd przyczepia si do podoa przez filopodia, a nastpnie komrka wydaje si podciga swoj tyln cz. Nastpnie krawd prowadzca odrywa si i odgina z powrotem ponad wierzch komrki, a nowe filopodia przyczepiaj si do podoa (ryc. 59-12). Mikrotubule, integralny skadnik szkieletu komrkowego, skadaj si z kanalikw cyto-plazmatycznych o rednicy 25 nm i nieokrelonej dugoci. Mikrotubule s potrzebne do tworzenia i funkcji wrzerionka mitotycznego i wobec tego s obecne we wszystkich komrkach eukariotycznych, Mikrotubue peni rwnie dodatkowe funkcje. S one odpowiedzialne za -wewntrzkomrkowe przesuwanie endo -i egzocytotycznych pcherzykw. Stanowi one jeden z gwnych komrkowych komponentw rzsek i ilagclii. S one rwnie gwnym skadnikiem biakowym aksonw i dendrylw. w kt -
Mikrotubule zawieraj a- i p-tubulin
rych utrzymuj'one struktur i uczestnicz w aksoplazmatycznym transporcie wzdu wypustek komrkowych. Mikrotubule s cylindrami zbudowanymi z 13 podunie uoonych pro to fi lamentw, z ktrych kady skada sie z drmerw a-tubuliny i | -tubuliny (ryc. 59-13). a-Tubulina (m.cz. 53 000) i p-tubuhna (m.cz. 55 000) s bardzo do siebie podobnymi czsteczkami biakowymi. Dimery tubuliny ukadaj si w protofilamenty, najpierw paszczyznowo, a potem w cylindry, jak to pokazano na ryc. 59-14. Do uoenia tubuliny w mikrotubule potrzebne s 2 czsteczki GTP na jeden dimer. Dwa biaka nazywane biakami o duej masie czsteczkowej (HMW) i biaka Tau uatwiaj formowanie mikrotubul, ale nie s do tego êzbdne. Kalmodulina i fosforylacje mog rwnie peni jakie funkcje w formowaniu mikrotubul. Mikrotuble rosn" w okrelonym kierunku od specyficznych miejsc (centrioJi) komrki. Na kadej chromatydzie chromosomu (p. rozd z. 37) znajduje si kinetochor sucy jako miejsce pocztku wzrostu mikrotubuli. Wiek nieprawi dowoci segregacji chromosomw wynika z nieprawidowej struktury i funkcji kinetocho-ru. Centrosom, znajdujcy si w rodku biegunw mitozy, rwnie moe by orodkiem two rzenia mikrotubuli. Ruch chromosomw w czasie anafazy mitozy zaley od mikrotubuli, jednake jego mechanizm nie zosta jeszcze okrelony.
Ryc. 59-13. Due powikszenie mikrotubuli, ktra zostaa rozamana i gboko wytrawiona po gwatownym zamroeniu. Lewa cze pola pokazuje zewntrzn powierzchni mikrotubuli, na ktrej widoczne s podune prki guzkw lecych 55 nm od siebie. Mog one reprezentowa protofi lamenty mikrotubuli. Po stronie prawej rozamanie spowodowao otwarcie mikrotubuli, co uwidacznia jej wewntrzne ciany. Wykazuj one charakterystyczne skone prki uoone co 40 nm. Siateczkowanie otaczajce mikrotubule jest uwaane za niespolimeryzowan tubulin i biaka zwizane z mikrotubul. (Wedug: HeuzerJ. E., Kirschner M. W.: Filament organization revealed in ptatinum replicas of freeze-dried cytoskeletons; J. Celi BiolA 980, 86, 212, za zezwoleniem). _________________________________
810 / ROZDZIA 59
Hyc. 59-14. W pracowni budowa mikrotubuli rozpoczyna si od 2 globularnych czsteczek biaek, ot-tubuliny i p-tubuliny (w rzeczywistoci s one prawdopodobnie bardziej owalne ni na schemacie). Tubuliny tworz dimery albo podwjne czsteczki. Jeli stenie dimerw jest wystarczajco due, cz si one ze sob tworzc rne struktury porednie, jak podwjne piercienie, spirale i poczone piercienie; zalenie od warunkw, rwnowaga sprzyja tworzeniu izolowanych dimerw lub struktur porednich. Nastpne etapy s dobrze poznane. Wydaje si, e piercienie lubspirate otwieraj si i tworz nitki liniowo uoonych dimerw zwane protof i lamentami. Ukadaj si one bok do boku tworzc pytk (A); czasami koce protof i lamentw zakrzywiaj sie. Gdy pytka staje si dostatecznie szeroka, tworzy ona rurk, jak to pokazano w (B). Rurka jest przeduana przez dodawanie dimerw gwnie do jednego koca (C). (Wedug: Dustin P,: Microtubules; Sci. AmA98Q,243, 67, za zezwoteniem).
Wiele alkaloidw blokuje tworzenie mikrotubul Pewne alkaloidy mog& zapobiega tworzeniu mikrotubul. Nale do nich kolchicyna i jej pochodna demekolcyna (uywana jako lek w dnawym zapaleniu staww), winblastyna (alkaloid Vinca uywany jako lek przeciwrakowy) i gryzeofulwina (czynnik przeciwgrzybiczy). Komrkowe flagelle i rzski s mikrotubuami wyspecjalizowanymi w funkcji ruchu U podstawy flag!li i rzsek komrek euka-riotycznych znajduje si struktura zwana daem podstawowym. Jest ona identyczna z centriolem i suy jako orodek formowania we flagellach i rzskach 9-dubletowego ukadu mikrotubul. Te mikrotubularne struktury s wyspecjalizo wane w funkcji ruchu. Kady skadnik dubletu ma wspln ze swoim partnerem cian skadajc si z 3 protofilamentw, a dubiety s
poczone gitkim biakiem, neksyo Ruch nastpuje na skutek przesuwania si dubletw w stosunku do siebie, co powoduje falowe odksztacenie rzski. Do jednego z dubletw przyczone jest due biako, dyneina, majca ATP-az konieczn dla lizgowego ruchu dubletw mikrotubul. Filamenty porednie rni si od mikrof i lamentw fmikrotubul W komrkach istnieje wkienkowy ukad filamentw o period ycznoci osiowej 21 nm i rednicy 810 nm rnicy si od mikro-filamentw (o rednicy 6 nm) i mikrotubul (o rednicy 23 nm). Istnieje 6 gwnych klas tych filamentw majcych wspln determinant antygenow i majcych rednice o wielkociach porednich pomidzy mikrofilamentami aktyny i mikrotubulami. Kady filament poredni skia-da si z podjednostek rnicych si biochemi-cznie i immunologicznie. Filamenty porednie
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURA LNE / 811 T abela 59-3. K lasy filamentw porednich i ich rozmieszczenie *
Biaka Keratyn a typu 1 i II {tonofilamenty) Desmina Wimentyna f

Neurof i lament Filamenty gleju
Masa czsteczkowa
(tvs.)
40-65 (gwnie biaka 10-20) 50-55 52 200, 1 50, 70 51
rednica (nm) 8 10 10 10 10
Rozmieszczenie Komrki nabonkowe (nigdy pochodzenia mezencfiymalnego) Minie (prki Z) Komrki mezenchymalne i niemeze-nchymalne, tj. minie, komrki gleju, komrki nabonkowe Neurony Komrki gleju
zdaj si stanowi wzgldnie stae skadniki szkieletu komrkowego rie podlegajce szybkiemu tworzeniu i rozpadowi i nie znikajce w czasie mitozy, jak si to dzieje z aktyn i wielu diamentami mikrotubinarnymi. Tabela 59-3 podsumowuje niektre waciwoci i rozmieszczenie filamentw porednich. Istniej 2 typy keratyn, I i II, zawierajce 1020 rnych polipeptytlw rnicych si od siebie i od 4 innych klas biaek filamentw porednich desminy, wimentyny, neurofila-mentu i filamentu gleju. Te ostatnie 4 klasy s w wysokim stopniu homologiczne. Filament keratyny zawiera co najmniej 2 rne polipep-tydy keratynowe, podczas gdy 4 pozostae klasy filamentw porednich s homopolimerami. Kady z filamentw porednich skada si z 4 domen o ksztacie a-heliksu oddzielonych od siebie obszarami o strukturze pofadowanej kartki i oflankowanych z obu kocw domena mi niehelikalnymi. Niehelikalne kocowe do meny s zaangaowane w czenie koniec do koca proto filament w oraz w interakcj bok do boku midzy protofibryami. Koce mikro-fibrylarnych keratyn mog by poczone po przecznymi mostkami dwusiarczkowymi, co powoduje powstanie filamentw nierozpusz czalnych, jak np. w wenie. KOLAGEN JEST NAJBARDZIEJ ROZPOWSZECHNIONYM W WIECIE BIAKIEM ZWIERZCYM Kolagen, gwny skadnik wikszoci tkanek cznych, stanowi ok. 25% biaka ssakw. Zapewnia on zewntrzkomrkowe rusztowanie wszystkich zwierzt metazoalnych i wystpuje w praktycznie kadej tkance. W tkankach ssa -
kw zidentyfikowano ponad 10 rnych typw kolagenu. Chocia mektre z nich stanowi tylko znikomy procent caoci, mog one odgrywa wan rol w ksztatowaniu si fizycznych waciwoci tkanek. Wszystkie typy kolagenu maj struktur potrjnego heliksu. Kada podjednostka polipep-tydowa lub acuch a tworzy lewoskrtny teliks o 3 resztach na jeden skrt fryc. 59-15). Trzy
67 nrn Fibry la
300 nm '
Czsteczka
' \
\ 1.4 om Potrjny acuch a
Sekwencja aminokwasw - G ly - X - Y - G ly - X - Y - G ly - X - Y Ryc. 59-15. Waciwoci mo lekularn ej struktury kolagenu od pierwotnej sekwencji do fibrylli. (We dug: Eyre D. R.: Collagen: Molecular ciiversity in the bo dys pro tein scaffo ld; S c/ence1980, 207, 1315. Copyright 1980 American Assoctation of the Advancement of Science, za zezwoleniem, nieznacznie zmodyfikowana).
812 / ROZDZIA 59
takie acuchy i zostaj nastpnie zwinite w prawoskrtny superhcliksîtry tworzy pae-czkowat czsteczk o rednicy 1,4 nm i o dugoci ok. 30 nm. Uderzajc cech kolagenu jest wystpowanie reszt glicynowych w kadej trzeciej pozycji czci helikalnej acucha a. Jest to potrzebne, poniewa glicyna jest jedynym aminokwasem dostatecznie maym, aby mg si zmieci w ograniczonej przestrzeni centralnego rdzenia potrjnego heliksu. Ta powtarzajca si struktura okrelana jako (Gly-X-Y) jest bezwzgldnym warunkiem formowania potrjnego heliksu. Mimo e X i Y mog by jakimkolwiek aminokwasem, ok. 100 pozycji X jest zajtych przez prolin i ok. 100 pozycji Y przez hydro-ksyproline. Hydroksyprolina jest tworzona przez pptraaslacyjn hydroksylach reszt proli-no^^ckzMdazaiuujcii'w.iiperjt.ydzk. a katalizowan przez enzym hydroksylaze proilow. ktrego kofaktorami s kwas askorbinowy (witamina C) i a-ketoglutaran. Lizynaj^pozycii Y mo-e by potranslacyjnie zmieniana w hydroksyli-zyne dziki dziaaniu hydroksylazy lizylowej, enzymu o podobnych kofaktorach. Niektre z tych hydroksylizyn mog by rwnie modyfikowane przez dodanie galaktozy lub galaktozy-lo-glukozy z utworzeniem wizania O-glikozydo-wego. Jest to miejsce glikozytecji wyjtkowe dla kolagenu. Typy kolagenu tworzce dugie, paeczkowa-te wkienka powstaj przez boczne poczenie jednostk_potrjnego heliksu w taki sposb, e kada z nich jest przesunita w stosunku do ssiadki o nieco mniej ni jedna czwart swojej dugoci (ryc. 59-15). To uoenie jest odpowiedzialne za prkowani tych wkien w tkankach cznych. Wkna kolagenu s dalej stabilizowane przez tworzenie kowalencyjnych mostkw poprzecznych zarwno wewntrz potrjnych heliksw, jak i midzy nimi. Te poprzeczne mostki powstaj dziki dziaaniu oksyjiazx^t lowcj, enzymu zalenego od miedzi, ktry o-ksydacyjnie deaminuje grupy e-aminowe niektrych reszt lizynowych i hydroksylizyno-wych. w wyniku czego powstaj reaktywne aldehydy. Takie aldehydy mog tworzy produkty kondensacji z innymi aldehydami pocho dzcymi z lizyny lub hydroksylizyny lub two rzy zasady Schiffa z grupami s-aminowymi nieutlenionych lizyn lub hydroksylizyn. W wyniku tych reakcji powstaj po dalszych chemicznych przeksztaceniach stabilne kowalencyjne jnostkXj)ojHZzn.e_w*ne dla odpornoci wkien na rozciganie.
Pewne formy kolagenu nie tworz wkien prkowanych (tab. 59-4). Te kolageny charakteryzuje na poziomie molekularnym przerywanie potrjnego heliksu odcinkami biakowymi pozbawionymi sekwencji Gly-X-Y. Odcinki pozbawione sekwencji Gly-X-Y powoduj powstawanie obszarw o strukturze globularnej, rozmieszczonych w strukturze potrjnego heliksu. Najlepiej scharakteryzowanym przyka dem kolagenu o przerywanych potrjnych hei-ksach jest kolagen typu IV, stanowicy wany skadnik bon podstawowych, w ktrych tworzy on drobn siatk. Kolagen przechodzi rozlege potranslacyjne modyfikacje Zanim nowo zsyntetyzowany kolagen stanie si czci dojrzaego pozakomrkowego wkna kolagenowego, musi on przej rozleg modyfikacj potransacyjn (tab. 59-5). Jak wikszo biaek wydzielanych z komrki, kolagen jest syntetyzowany na rybosomach w pre-kursorowej formie preprokolagenu zawierajcego sekwencj sygnaow lub prowadzc (lider) kierujc acuch polipeptydowy do pcherzykowej czci siateczki sarkoplazmatycznej. Po wejciu do siateczki sarkoplazmatycznej ta pro wadzca sekwencja (lider) jest enzymatycznie odszczepiana. W tyme miejscu zachodzi hy-droksylacja reszt proliny i lizyny oraz glikozyla-cja hydroksylizyn czsteczki prokolagenu. Czsteczka prokolagenu zawiera zarwno na N -, jak i C-kocu peptydy wyduajce o m.cz. 2000035000. adnego z nich nie ma w doj rzaym kolagenie. Oba te peptydy wyduajce zawieraj reszty cysteiny. Podczas gdy N-ko-"cowy propeptyd tworzy jedynie rdacucho-we wizania dwusiarczkowe, propeptydy C-~ko-cowe tworz zarwno rd-, jak i midzyan-cuchwe wizania dwusiarczkowe. Tworzenie tych wiza dwusiarczku wy cli pomaga w uoeniu 3 czsteczek kolagenu tak, e tworz potrjny heliks, ktrego zwijanie* rozpoczyna si od C-koca. Po uformowaniu potrjnego heliksu adna dalsza hydroksylacja proliny lub lizyny wicej nie zachodzi. Po wydzieleniu z komrki przez aparat Goi-giego, wyduajce peptydy s usuwane z N-i C-kocw prze2 zewntrzkomrkowe enzymy zwane a mino proteina/ i kar boksy protein az prokoiagenow. Oddzielanie tych peptydw" moe zachodzi w kryptach lub zaamaniach bony komrkowej. Gdy tylko propeptydy zo-staa usunite, potrjne heliksy czsteczek ko -
BIAKA KURCZLIWE I STRUKTURA LNE / 813 Tabela 59-4. Niektre przykady rnych genetycznie kolagen w krgo wcw. U zwierzt wyszych wystpuje co najmniej 10 rnych rodzajw czsteczek zawierajcych 12 rnicych si midzy sob acuchw Typ W z r
czsteczki
[od (1)1,0(2
Natyw n y polimer Wkna
Rozmi eszcze n ie tkankowe Skra, cigna, z -bina, powiezie
Wyrniajce cechy
koci, Mata zawarto hydroksylizyny; mao miejsc glikozylacji hydro ksyl izyny; szerokie wkna
Wkna
Chrzstka, j dro galare- Dua zawarto hydroksylizyny; to wate, notochord, ciao obficie glikozylo wane; wkna szkliste zwykle ciesze ni w typie I Dua zawarto hydroksyproli-ny; niska zawarto riydroksyli -zyny; mao miejsc gltkozylacji hydroksylizyny; midzyartcu- chowjtg wizania dwusiarczkowe midzy Kbuszki nerkowe, tore cysteinami bka soczewki, bona Des-cemeta, bony Bardzo wysoka zawarto hy podstawowe wszystkich droksylizyny; prawie cako wicie komrek nabio nko wych i glikozylowane; niska zawarto alaniny; zachowuje przeduenia rd - bo nko wych prokolagenu Szeroko rozpowszechnione w: Wonie podstawnej naczy Dua zawarto hydroksylizyny; krwiononych i komrek obficie glikozylowane; niska zamini giad -kich; warto alaniny egzoszkielecie fibroblastw i w innych ko mrkach mezenchymal-nych Skra (gwnie podowa), macica, naczynia krwionone; oglnie wkna retikuliny"
[0(1(111)],
Wkna
IV oraz
Drobna siatka
acuchy i 0(3(V); zmienna stechiometria
Drobne wkna
Zmodyfikowane i reprodukowane za pozwoleniem z; Eyre DR; Collagen: Muscle ditfersity in the body's protein scaffold; Science, 1980; 207: 1315. Copyright 1980 by the A merican Associatio n for the Advancement of Science.
Tabela 59-5. Kolejno i miejsce obrbki prekursora fibrylarnego kolagenu O br b ka w ew nt rz k o m rk ow a Oddzielenie peptydw sygnalnych Hydroksylacja reszt Y- prol iowych i niektrych reszt hydroksyl i yowych Formowanie wewntrzacucho wych i ze w natrza cuch owych wiza S -S w peptydach wyduajcych Formo wanie potrjnego heliksu O br bka z ew ntrz k o m r kow a Oddzielenie peptydw wyduajcych od ter minalnych grup amino wych i karbo ksylo wych Uoenie wkien ko lageno wych z przesuni ciem o ', dugo ci Oksydacyjna deaminacja grup s-aminowych reszt lizylo wych i hydro ksylizylo wych do al dehydw T worzenie wewntrz - i midzyacucho wych pocze poprzecznych za porednictwem zasa dy Schiff a i produktw ko ndensacji aldo lo wej
814 / ROZDZIA 59
lagenu, zawierajce ok. 1000 aminokwasw w Jednym acuchu, spontanicznie ukadaj si we wkna kolagenowe. S one dalej stabilizowane przez tworzenie, dziki dziaaniu oksyda-zy lizylowej, zewntrz i
wewntrzaeuchowych mostkw poprzecznych.
Te same komrki, ktre wydzielaj kolagen, wydzielaj, rwnie fibronektyn. wielk gliko-protein wystpujc na powierzchni komrek, w macierzy zewntrzkomorkowej oraz we krwi. Fibronektyna wic si z agregujcymi wknami prokolagenu zmienia kinetyk formowania wkien w macierzy okookomrkowej. Z fi-bronektyn i prokolagenem tej macierzy zwizane s rwnie proteoglikany, takie jak siarczan heparyny i siarczan chondroityny (p. rozdz. 57). Maocz steczko wy kolagen typu IX, pochodzcy z chrzstki, zawiera przyczone do niego acuchy proteoglikanu. Tego rodzaju interakcja moe regulowa tworzenie wkien kolagenowych i okrela ich uoenie w tkankach. Wiele chorb genetycznych wynika z nieprawidowego tworzenia wkien, stabilizacji heliksu lub nieprawidowego tworzenia mostkw poprzecznych kolagenu Choroby wrodzone bdce wynikiem zaburze kolagenu stanowi wzrastajc ilo odmian co najmniej 4 rnych typw zespow:
osteogenesis imperfecta, zesp Mariana, zespou Ehlersa-Danlosa oraz zespou Menkesa (krco -
nake w miar poznawania struktury i funkcji kolagenu stao si jasne, e podobne defekty molekuiarne mog powodowa wystpowanie rnych zespow klinicznych i odwrotnie, te same zespoy mog by wynikiem rnych defektw molekularnych. W zasadzie defekty te
dotycz tworzenia wkien, stabilizacji potrjnego heliksu lub tworzenia mostkw poprze -
cznych kolagenu. Defekty obejmuj mutacje powodujce niewielk lub brak syntezy acuchw prokolagenu, produkcj skrconych wkien prokolagenu, nadmiernie wyduonych wkien prokolagenu oraz defekty poddajcych je obrbce enzymw (tj. hydroksylazy lizynowej lub N-proteinazy pro kolagenowej). Dotychczas rozpoznano tylko defekty czsteczek prokolagenu typu I i III. W zespole Menkesa wystpuj zaburzenia metabolizmu miedzi (p. rozdz. 58), a tym samym wtrnie zaburzenia funkcji ok-sydazy lizynowej i defekty tworzonych przez ni mostkw poprzecznych. W tabeli 59-6 podsumowano gwne cechy 4 powyszych zespow, a ryc. 59-16 pokazuje, jak w trzech z nich zmieniona jest struktura prokolagenu typu I. ELASTYNA NADAJE ROZCIGLIWO I SPRYSTO PUCOM, NACZYNIOM KRWIONONYM 1 POWIZIOWI Elastyna jest biakiem tkanki cznej odpowiedzialnym za rozcigliwo i sprysto tkanek. Chocia nie jest ona tak szeroko rozpowszechniona jak kolagen, wystpuje w duych ilociach w niektrych tkankach, w ktrych te
nych wosw). Kady z tych zespow ma kilka odmian. Pocztkowo choroby te byy definio wane na podstawie podobnych fenotypw. Jed -
Tabela 59-6. Oglne cechy 4 dziedzicznych chorb kolagenu Choroba Osteogenesis imperfecta (r ne typy) Zesp Ehlersa-Danlosa (r ne typy) Zesp Marfana Objawy kliniczne Nadmierna amliwo koci Przyczyny biochemiczne*
Rne nieprawidowoci genw kodujcych prokofagen *1(l) Nadmierna ruchliwo staww, Zmiany genw dla kolagenu ai (III), nienormalnoci skry niedobr N-proteinazy prokolagenu i hydroksylazy lizylowej Zaburzenia w kocu, oczach Mutacja genu dla prokolagenu v 2(1} i ukadzie sercowo-naczyniowym powodujca wyduenie acuchw prokolagenu Krcone wzrostu wosy, opnienia Niedobr oksydazy lizylowej na skutek zaburze metabolizmu miedzi
4. Zesp Menkesa
* Podano tylko niektre najlepiej znane przyczyny tych chorb.

(EDS V I I ) i.ManjM
Ryc. 59-16. Przybliona lokalizacja mutacji w strukturze prokolagenu typu sI. EDS zesp s Ehlersa--Danlosa; MS zesp Marfana; 01 osteogenesis imperfecta. Prol i proa2 , skrcone acuchy x L proa; pro2 , sabo okrelone mutacje zmieniajce struktur acuchw proa; proa2 , wyduone acuchy cx proa; prooc2 , mutacja zmieniajca struktur propeptydw C acuchw proa. (Wedug: Prockup D. J., Kivirik-ko K. L: Heritable diseases of collagen; N. Engl. J. Med. 1984, 311, 376, za>Zezwoleniem).
fizyczne cechy s szczeglnie potrzebne, tj. w pucach, duych naczyniach ttniczych i niektrych sprystych powiziach. W mniejszych ilociach elastyna znajduje si rwnie w skrze, chrzstce ucha i w wielu innych t kankach. W przeciwiestwie do kolagenu, elastyna wydaje si
wystpowa w jednym tylko typie genetycz nym, cho rnicowa obrbka hnKNA elastyny powoduje powstawanie jej odmian (p. rozdz. 39).
wystpuje w wielu odmianach bezadnych zwo jw, ktre pozwalaj tkance na rozciganie i powrt do wyjciowego ksztatu w czasie pe-
nienia jej funkcji fizjologicznych. W tabeli 59-7 podsumowano gwne rnice miedzy kolagenem i elastyn.
Kolagen Elastyna
Elastyna jest syntetyzowana jako rozpuszczalny monomer o m.cz. 70 000, zwany tropoelastyn. Niektre z reszt prolinowych tropoelastyny s hydroksylowane do hydroksyproliny przez hyd-roksylaz prolilow. Hydroksylizyna i glikozy-lowana hydroksylizyna w tropoelastynie nie wystpuj. W przeciwiestwie do kolagenu tropoelastyn nie jest wytwarzana w postaci pro-i nie zawiera peptydw wyduajcych. Ponadto elastyna nie ma powtrze sekwencji Gly-X-Y, struktury potrjnego heiiksu lub reszt wglowodanowych. Po wydzieleniu z komrki pewne reszty lizy-lowe tropoelastyny ulegaj oksydacyjnej deami-nacji do aldehydw przez oksydaze lizylow, enzym zaangaowany w ten proces rwnie i w kolagenie. Jednake gwne poczenia poprzeczne formowane w elastynie s desmozy-nami, ktre powstaj z kondensacji 3 pochodzcych z lizyny aldehydw z nie zmodyfikowan lizyn. Powstaje wwczas wyjtkowe dla elastyny czterofunkcyjne poczenie poprzeczne. W swojej zewntrzkomrkowej, dojrzaej postaci elastyna jest wysoce nierozpuszczalna i sta bilna i wykazuje bardzo may obrt. Elastyna
Wiele rnych typw Jeden typ genetyczny genetycznych Tabela 59-7. Gwne rnice pomidzy kolagenem a elastyrt Potrjny heliks Nie ma potrjnego heiiksu; bezadne zwoje umoliwiajce rozciganie. Powtarzana struktura Brak struktury <Gly-X-Y)n <Gly-X-Y)n Obecno hydroksyli Brak hydroksy lizyny zyny Zawiera wglowodany Wewntrz czsteczko we poprzeczne po czenia aldolowe Nie zawiera wglowodanw Wewntrzczsteczkowe poprzeczne poczenia desmozynowe
Obecno peptydw wyduajcych w czasie Nie ma w czasie biosyntezy peptydw wyduabiosyntezy jcych
816 / ROZDZIA 59
PIMIENNICTWO
Adelstein RS, Eisenberg R: Regulation and kinetics of actino-myosin ATP interaction. Annu Rev Biochem 1980:49:921. Barany M, Barany K: Phosphorylation of the myofibrillar proteins. Annu Rev Physiol 1980;42:275. Caplan A: Cartilage. Sci Am (Oct) 1984;250:84. Eyre DR el al: Cross-linking in collagen and elastin. Annu Rev Biochem 1984:53:717. Fuchs E, Hanukoglu 1: Unraveling the structure of intermediate filaments. Celi 1983:34:332. Hcuser JE, Kirschner MW: Filament organization revealed in platinum replicas of freez-dried cytoskeletons. J Celi Bio, J980;86:212.
Kleinm an HK, Klebe RJ, Martin GR: Role of collagenous rnatrices in the adhesion and growth of cells. J Celi Biol m\WA12. Lazarides E: Intermediate filaments: A chemically heterogeneous. dcvelopmentally regulated class of proteins. Annu Rev Biochem 1981;51:219. Lazarides E, Revel JP: The molecular basis of celi moveraent. Sci am (May) 1979;240:100. Prockop DJ, Kivirikko KI: Heritable diseases ot' collagen. N Engl J Med 1984;311:376. Rosenbloom J: Elastin: relation of protein and gene structure to disease. Lab Invest 1984;5]:605, Sandberg LB, Soskel NT, Leslie JG: Elastin structure, biosynthesis, and relation to disease states, N Engl
--
Metabolizm ksenobiotykw
Robert K. Murray, MD. Phb
WPROWADZENIE
Czowiek jest coraz bardziej naraony na dziaanie zwizkw obcych, egzogennych (ksenobiotykw) takich jak leki, rodki konserwujce pokarmy lub zanieczyszczenia rodowiska zewntrznego itd. Ilustruje to najlepiej nastpujcy cytat Rachela Carsona (y w latach 19071964): Fabryka ycia zostaa skonfrontowana z atakiem chemicznym podobnym do ataku z uyciem nieznanej dotychczas broni lub przez klub jaskiniowcw". Carson by jednym z pierwszych, ktrzy dostrzegli niebezpieczestwo groce bytowi czowieka ze strony rnorodnych zanieczyszcze rodowiska lub wynikajcych z naduycia bogactw ziemskich. Jest to prawdopodobnie najbardziej pilny problem do rozwizania przez wspczesnego czowieka. Nierozwizanie tego problemu w sposb solidny i uczciwy grozi zagad wszelkiej biochemii na ziemi. Poznanie mechanizmu dziaania ksenobiotykw na poziomie komrkowym stanowi podstaw prawidowego przeciwdziaania atakowi chemicznemu.
CZOWIEK STYKA SI Z LICZNYMI KSENOBIOTYKAMI, KTRE MUSZ ULEC PRZEMIANtZANIM ZOSTAN WYDALONE Z USTROJU
Ksenobiotyk (greckie sowo xenos oznacza obcy) jest substancj obc dla czowieka. Wrd gwnych grup ksenobiotykw dajcych znaczenie medyczne wymieni naley leki, kan-cerogeny chemiczne i rne zwizki znajdujce si w otaczajcym nas rodowisku (np. wielo-chlorowcowe pochodne bifenylu PCB, niektre insektycydy itd.) Wikszo wymienionych grup zwizkw ulega przemianie (tj. przeksztaceniom chemicznym) w ustroju czowieka, w tym giwnie w wtrobie. Tylko rzadko ksenobiotyk wydalany jest w postaci niezmienionej. Przemian ksenobiotykw mona podzieli na dwie fazy. W fazie pierwszej gwn reakcj jest hydro-ksylacja katalizowana przez jeden z enzymw zaliczanych do monooksygenaz lub cytochro-mw P-450. Innymi rodzajami reakcji zacho dzcych w fazie pierwszej s redukcja i hydroliza. W fazie drugiej zwizki hydroksyl o wane lub zmienione w inny sposb w fazie pierwszej, ulegaj przeksztaceniu przez swoiste enzymy do rnych metabolitw polarnych poprzez sprzganie z kwasem glukuronowym, siarkowym lub octowym, glutationem lub pewnymi aminokwasami, lub te poprzez merylacj. Gwnym celem obu faz przemiany ksenobiotykw jest zwikszenie ich rozpuszczalnoci w wodzie (czyli zwikszenie ich poiarnoci), dziki czemu uatwione jest ich wydalanie z ustroju. Bardzo silnie hydrofobowe ksenobiotyki mogyby przebywa w tkance tuszczowej nie-ograniczenie dugo, gdyby nie zostay przeksztacone do postaci bardziej polarnych.
Znajomo przemiany ksenobiotykw stanowi podstaw racjonalnej farmakologii, toksykologii, bada nad patomechanizmem powstawa nia nowotworw lub uzalenie od kw. Cech wspln wszystkich wymienionych dziedzin jest podawanie ksenobiotykw lub ekspozycja czowieka na te substancje.
52
ffiocberoia
818 / ROZDZIA 60
W okrelonych przypadkach w wyniku reakcji zachodzcych w fazie pierwszej, pewne kseno-biotyki ulegaj konwersji ze zwizkw biologicznie nieaktywnych do aktywnych. W takich przypadkach pierwotny ksenobiotyk okrelany jest jako prekursor lkowy (pro-fck) lub prokan-cerogen. W innych przypadkach, w dodatkowych reakcjach zachodzcych w fazie pierwszej (np. dalsze hydroksylacje) aktywne zwizki ulegaj konwersji do postaci mniej aktywnych lub nieaktywnych zanim ulegaj procesowi sprzgania. W jeszcze innych przypadkach, w wyniku samego procesu sprzgania aktywne metabolity fazy pierwszej ulegaj przeksztaceniu do zwizkw mniej aktywnych lub nieaktywnych oraz wydalaniu z moczem lub ci. Tylko w bardzo rzadkich przypadkach w wyniku procesu sprzgania aktywno ksenobiotyku moe wzrosn. Pojcie detoksykacja" (odtruwanie) uywane jest czasem dla okrelenia licznych reakcji uczestniczcych w przemianie ksenobiotykw. Jest to termin niewaciwy, poniewa, jak to wykazano wyej, w reakcjach, ktrym poddawane s ksenobiotyki, mog powsta zwizki biologicznie bardziej aktywne, a nawet toksyczne.
wiane enzymy jeden atom tlenu wchodzi do ROH, za drugi do wody (patrz wyej reakcja (1)). Dwoisty los tlenu w tej reakcji t umaczy, dlaczego uczestniczce w niej monooksygenazy okrelano dawniej jako oksydazy o funkcji mieszanej (mixed function oxidases). Reakcj katalizowan przez cytochrom P-450 mona przedstawi nastpujcym rwnaniem:
Posta zredukowana Posta utleniona cytochromu P-450 cytochromu P-450 (2) ROH + HjO RH + Oj
Gwnymi monooksygenazami siateczki rdpiazmatycznej s enzymy grupy cytochromu P-450. Nazwa cytochrom P-450 jest historycznie uzasadniona nastpujcym faktem. Enzym ten odkryto, kiedy preparaty mikro-somw poddanych chemicznej redukcji, a nastpnie ekspozycji na dziaanie tlenku wgla, wykazay szczytow absorpcj wiata przy 450 nm. Enzym ten jest niezwykle wany, wykazano bowiem, e ok. 50% lekw zaywanych przez chorych jest metabolizowanych przez enzymy grupy cytrochromu P-450. Te same enzymy dziaaj na kancerogeny i polutanty.
CYTOCHROM P-450 KATALIZUJE HYDROKSYLACJ KSENOBIOTYKW W PIERWSZEJ FAZIE ICH PRZEMIANY

Hydroksylacja jest gwn reakcj zachodzc w fazie pierwszej. Jest ona katalizowana przez enzymy okrelane jako monooksygenazy lub enzymy grupy cytaphromu P-450. Reakcje katalizowan przez monooksygena-z (lub enzymy grupy cytochromu P-450) przedstawia nastpujce rwnanie.
H ^ ROH + H2O + NAOP (1)
+
RH oznacza szeroki zestaw zwizkw, np. leki, kancerogeny i polutanty (np. PCB) oraz okre lone zwizki endogenne, np. steroidy. W wielu przypadkach nie poznano jeszcze endogennych substratw dla enzymw grupy cytochromu P-450, wydaje si jednak nieprawdopodobne, by enzymy te powstay tylko po to, by reagowa ze zwizkami egzogennymi. W rozdziale tym nie bdzie przedstawiony zoony mechanizm dziaania enzymw tej grupy. Wspomnie jednak trzeba, e w reakcji katalizowanej przez oma -
Wrd nich wymieni naley nastpujce: Podobnie jak hemoglobina, enzymy tej grupy s hemoproteinami. Najwiksze stenia tych enzymw stwier dza si w siateczce rdpiazmatycznej (we frakcji mikrosomalnej) wtroby. W bonach tych en zymy te stanowi w przyblieniu 20% oglnej zawartoci w nich biaka. Enzymy te wystpuj rwnie w innych tkankach. I tak w nadnerczach ich obecno stwierdza si zarwno w mito chondriach, jak i w siateczce rdpiazmatycz nej. Rnorodne hydrolazy wystpujce w tym gruczole odgrywaj wan rol w biosyntezie steroidw (p. rozdz, 49). i W siateczce rdpiazmatycznej hepatocytw stwierdza si co najmniej 6 blisko ze sob spokrewnionych rodzajw cytochromu P-450, odznaczajcych si szerok i nakadajc si na siebie, swoistoci substratow. Dziaaj one na rnorodne leki, kancerogeny i inne ksenobio tyki oprcz endogennych zwizkw (np. okre lone steroidy). W ostatnich latach wyizolowano i szczegowo scharakteryzowano geny koduj ce wymienione rodzaje cytochromu P-450. W reakcjach katalizowanych przez cyto-
Wane cechy enzymw grupy cytrochromu P-450
METABOLIZM KSENOBIOTYKW / 819
chromy P-450 uczestniczy NADPH, a nie NADH. "Enzym redukujcy cytochrom P -450 i wspdziaajcy z NADPH okrelany jest jako reduktaza NADPH: cytochrom P-450. Skadnikami ukadu cytochromu P-450 s rwnie lipidy. Preferowanym lipidem jest fosfatydylochoLina, ktra jest gwnym lipidem bon siateczki endoplazmatycznej. Syntez wikszoci rodzajw cytrochromu P-450 mona indukowa podawaniem okre lonych zwizkw, i tak podawanie fenobarbitalu i wielu innych lekw przez zaledwie 45 dni powoduje przerost siateczki rdplazmatycznej gadkiej oraz 3 4-krotny wzrost iloci cytrochromu P-450. Mechanizm indukcji zosta dogbnie przebadany i polega m.in. na wzro cie transkrypcji mRNA kodujcego cytochrom P-450. Moliwo indukcji tego enzymu ma wane implikacje kliniczne, poniewa stanowi jeden z mechanizmw interakcji zachodzcej midzy lekami. O interakcji mwimy wwczas, kiedy efekty dziaania jednego leku ulegaj zmianie w wyniku uprzedniego lub rwnoczesnego stosowania innego leku. Dla przykadu przyjmij my, e chory pobiera dikumarol w celu zmniejszenia krzepliwoci krwi. Lek ten jest metaboli-zowny przez ukad cytochromu P-450. Nastpnie okazuje si, e chory wymaga stosowania fenobarbitalu z powodu pewnego rodzaju padaczki. Zgodnie z oczekiwaniami po 5 dniach stosowania fenobarbitalu stenie cytochromu P-450 w hepatocytach wzroso 3-4-krotnie, co oznacza, e dikumarol ulega szybciej metaboli-zacji oraz, e zmniejszyo si jego dziaanie przeciwkrzepliwe. Aby wic uzyska waciwy efekt przeciwkrzepliwy dawk podawanego di-kumarolu naley zwikszy. Dalszy problem powstaje wtedy, kiedy pacjent przestaje zaywa fenobarbital, lecz kontynuuje zaywanie dikumarolu w zwikszonej dawce. U takiego chorego mog wystpi objawy skazy krwotocznej spowodowanej przedawkowaniem diku-maroiu i nagym spadkiem stenia cytochromu P-450 (inaktywujcego ten lek). 7. Jeden rodzaj cytochromu P-450 wykazuje maksymaln absorpcj wiata nie przy dugoci 450 nm, lecz 448 nm. Cytochrom ten okrelany jest jako cytochrom P-448. Jest on wzgldnie swoisty dla przemiany policyklicznych aroma tycznych wglowodorw (PAH) i spokrewnio nych z nimi zwizkw. Z tego powodu enzym ten okrelany jest jako hydroksylaza wglowodo rw aromatycznych (AHH aromatic hydro-
carbon hydroxylase). Enzym ten odgrywa wa n rol w przemianie policyklicznych wglowodorw aromatycznych oraz w kancerogen ezie indukowanej przez te zwizki, np. enzym ten uczestniczy w konwersji nieaktywnych PAH (prokancerogenw) wdychiwanych w czasie palenia papierosw do aktywnych kancerogenw (powstajcych przez hydroksylacj prokancerogenw). Palacze wykazuj wysze stenia AHH w niektrych komrkach ni osoby nie palce. W niektrych pracach doniesiono o wystpowaniu wzmoonej aktywnoci AHH w oysku kobiet palcych. Ten fakt moe sprawi, e pody tych kobiet mog by eksponowane na dziaanie zwikszonych iloci PAH (niektre z nich mog by bardzo szkodliwe). PROCESY SPRZGANIA PRZYGOTOWUJ KSENOBIOTYK1 DO WYDALANIA Z USTROJU ODBYWAJCEGO SI W DRUGIEJ FAZIE ICH PRZEMIANY W reakcjach fazy pierwszej ksenobiotyki ulegaj zwykle konwersji do zwizkw bardziej polarnych w wyniku ich hydroksylacji. W reakcjach fazy drugiej hydroksyl owa ne pochodne ulegaj sprzganiu z kwasem glukuronowym, siarczanami lub glutationem. W wyniku tych reakcji zwizki te staj si jeszcze bardziej rozpuszczalne w wodzie i mog ewentualnie zosta wydalone z moczem lub ci. Istnieje co najmniej pi rodzajw reakcji zachodzcych w drugiej fazie przemiany ksenobiotykw Glukuronidacja. Proces ghikuronidacji bilirubiny zosta przedstawiony w rozdziale 34. Reakcje glukuronidacji ksenobiotykw s w zasadzie podobne do podanych dla bilirubiny. Donorem reszty gluktironylowej jest kwas UDP--glukuronowy, za enzymami katalizujcymi reakcje glukuronidacji transferazy glukurony-lowe wystpujce zarwno w siateczce rdplaz-matycznej, jak i w cytoplazmie. Wiek zwizkw, takich jak 2-acetyloaminofluoren (jest to kancerogen), anilina, kwas benzoesowy, mep-robamat, fenol i wiele steroidw wydalanych jest pod postaci glukuronidw. Reszta gluku-ronidowa moe ulec zwizaniu przez tlen, azot lub grup siarkow danego substratu. Glukuronidacja jest prawdopodobnie najczciej spotykan reakcj sprzgania.
820 / ROZDZIA 60
Sprzganie z glutationem. Glutation (y--glutamylo-cysteinylo-glicyna) jest

tripeptydem skadajcym si z kwasu glutaminowego, cys-teiny i glicyny (p. ryc. 4-4). Powszechnie uywanym skrtem dla glutationu jest GSH. Reszta sulfhydrylowa SH cysteiny jest aktywn grup wymienionego peptydu. Liczne potencjalnie toksyczne elektrolitowe kstnobiotyki (jak np. pewne kancerogeny) ulegaj sprzganiu z nukleofi-lowym GSH zgodnie z reakcj
R + GSH-* R S G
Sprzganie z siarczanem (sulfatacja). Niektre alkohole, aminy aromatyczne i fenole ulegaj sprzganiu z siarczanem. Nonikiem reszty siarczanowej jest 3'-fosfoadenozyno-5'--fosfosiarczan (PAPS) (p. rozdz. 26) zwany rwnie aktywnym siarczanem.
mianie ksenobiotykw. Wrd nich wymieni naley nastpujce: Glutation uczestniczy w rozkadzie poten
cjalnie toksycznego nadtlenku wodom. Reakcja
ta jest katalizowana przez peroksydaz glutationow (p. rozdz. 21). Glutation jest wan rodkom orkow substancj redukujc, pozwalajc utrzyma istotne grupy SH enzymw w postaci zreduko wanej. Kiedy GSH dziaa jako substancja redu kujca, jej grupa SH ulega utlenieniu i tworzy wizanie dwusiarczkowe z drug czsteczk glutationu zgodnie z reakcj:
GSH GSH G
-SG
Produkt tej reakcji GSSG jest gluta-tionem utlenionym. Z kolei GSSG moe ulec redukcji do GSH przez reduktaz glutatio-now w reakcji, w ktrej uczestniczy NADPH. Przedstawia j nastpujce rwnanie:
GSSG + NADPH + H+-2GSH + NADP
gdzie R oznacza elektrofilowy ksenobiotyk. Enzymy katalizujce ww. reakcj okrelone s jako S-transferazy glutationowe. Wystpuj one w duych steniach w cytozolu hepatocytw za w mniejszych w innych tkankach. W tkankach czowieka stwierdza si rnorodne S-transferazy glutationowe. Odznaczaj si one odmiennymi swotstociami substratow ymi i mona je rozdzieli metod elektroforetyczn lub innymi technikami. Gdyby potencjalnie toksyczny ksenobiotyk nie uleg sprzganiu z GH, mgby si swobodnie poczy kowa-tencyjnie z DNA, RNA lub biakami komrkowymi, stajc si przyczyn powanego uszkodzenia komrki. GSH jest wic wanym ogniwem mechanizmu obronnego przed okrelonymi zwizkami toksycznymi, np. niektrymi lekami lub kancerogenami. Jeeli stenie GSH w takich narzdach jak wtroba ulega obnieniu (np. przez podanie szczurom pewnych zwizkw wicych GSH), wwczas narzd taki wykazuje zwikszon wraliwo na toksyczne dziaanie rnych zwizkw chemicznych normalnie inaktywowanych przez GSH. Koniugaty glutationowe ulegaj jeszcze dalszym przemianom zanim wydalane s z ustroju. Dochodzi bowiem do odszczepienia przez swoiste enzymy grup glutamylowej i glicynylowej glutationu oraz poczenia grupy aminowej pozostajcej reszty cysteinyowej z grup acety-low (donorem grupy acetylowej jest acetylo--CoA). W wyniku tych reakcji powstaje kwas merkapturowy koniugat -acetylocysteiny. Glutation spenia jeszcze inne wane funkcje w komrkach ludzkich, oprcz udziau w prze -
Reakcja ta jest szczeglnie wana w "krwinkach czerwonych. Jeeli stenie NADPH w tych komrkach jest niskie, jak to ma miejsce przy niedoborze dehydrogenazy G6P (p. rozdz. 21), regeneracja zredukowanego GSH jest niedostateczna. W nastpstwie niskiego stenia GSH w krwinkach czerwonych wzrasta stenie nadtlenkw. Te ostatnie, dziaajc utleniajco na lipidy bon erytrocytarnych, mog spowodowa hemoliz krwinek czerwonych. 3. GSH uczestniczy jako substancja przenonikowa w przezbonowym transporcie amino-
kwasw w nerkach w tzw. cyklu y-glutamylo-wym. Pierwsza reakcja tego cyklu przedstawia si nastpujco:
Aminokwas -GSH - -Glutamylo-pochodna aminokwasu + Cysteiny logi icy na
Reakcja ta jest pomocna w przezbonowym transporcie pewnych aminokwasw. Z kolei aminokwas ulega odszczepieniu od kompleksu z GSH, po czym zachodzi resynt za GSH z cysteinyloglicyny. Enzym, ktry katalizuje ww, reakcj nazywa si 7-glutamylotransferaz (GGT). Enzym ten wystpuje w bonach plaz-matycznych komrek kanaiikowych.nefronw oraz w siateczce plazmatycznej hepatocytw. Oznaczanie tego enzymu ma znaczenie diagnostyczne, ulega on bowiem uwolnieniu z hepato-
METABOLIZM KSENOBIOTYKOW / 821
cytw do krwi w rnych chorobach wtroby i drg ciowych (patrz Dodatek pod has em: y- Gl u tamy 1 o transpep ty daza). Inne reakcje. Wrd innych reakcji fazy drugiej przemiany ksenobiotykw najwaniejsze s reakcje acetyacji i metylacji. Reakcje acetyacji ilustruje rwnanie: X + Acetyf o-Co A -Acety Io-X+Co A gdzie X oznacza ksenobiotyk. Podobnie jak w innych reakcjach acetyacji donorem aktywnego octanu jest acetylo-CoA. Reakcje te s katalizowane przez acetylotransferazy wystpujce w cytoplazmie komrek rnych tkanek, a szczeglnie wtroby. Izottiazyd lek uywany w leczeniu grulicy ulega acetyacji. Poniewa istniej polimorficzne postacie acety-lotransferaz, wrd Judzi wyrnia si osobnikw odznaczajcych nisk lub du wydajnoci procesu acetyacji. W konsekwencji osobnicy o niskiej wydajnoci acetyacji odznaczaj si maym klirensem lekw, takich jak izoniazyd, przez co s bardziej naraeni na toksyczne ich dziaanie. Maa liczba ksenobiotykw ulega metylacji przez metyl o tran sterazy. Donorem grupy metylowej w tych reakcjach jest S-adenozylometioni-na(p. ryc. 31-22).
wic informacja o-zaywaniu przez dan osob zwizkw indukujcych syntez enzymw przemiany ksenobiotykw. Informacja ta jest istotna dla oceny efektw biochemicznych ksenobiotykw. 5. Metabolity niektrych ksenobiotykw mog hamowa aktywno enzymw metabolizujcych te zwizki. Powysze fakty tumacz wystpowanie znacznych rnic gatunkowych lub midzy osobnikami tego samego gatunku w zakresie reakcji na ksenobiotyki (np. na leki i substancje toksyczne lub czynniki rakotwr cze).
REAKCJE NA KSENOBIOTYKI MOG MIE CHARAKTER FARMAKOLOGICZNY, TOKSYCZNY, IMMUNOLOGICZNY I RAKOTWRCZY

W ustroju ksenobiotyki ulegaj przemianie w reakcjach przedstawionych wyej. Jeeli ksenobiotyk jest lekiem, moe on ulec aktywacji w wyniku reakcji fazy pierwszej. Jeeli za lek by farmakologicznie aktywny bez uprzedniej metabolizacji, aktywno jego moe ulec zmniejszeniu lub cakowitemu zniesieniu w nastpst wie reakcji fazy pierwszej. Ocena efektw dziaania lekw jest przedmiotem bada farmakologicznych. Na tym miejscu ma by wyeksponowany fakt, e leki dziaaj za porednictwem mechanizmw biochemicznych. Niektre ksenobiotyki s niezwykle toksyczne nawet przy niskich steniach w pynach ustrojowych (np. cyjanki). Z drugiej strony istnieje kika ksenobiotykw, w tym rwnie lekw, ktre nie s toksyczne nawet wtedy, kiedy podane zostay w duych ilociach. Efekty toksyczne ksenobiotykw s niezwykle rnorodne. Wrd nich omwione zostan bardzo krtko tylko trzy oglne rodzaje toksycznoci zwizane z przemian ksenobiotykw (ryc. 60 -1). Pierwszy z nich to uszkodzenie komrek przez ksenobiotyki. Moe ono by na tyle cikie, e koczy si mierci komrek. Istnieje wiele mechanizmw, za porednictwem ktrych ksenobiotyki uszkadzaj komrki. Wrd nich wymieni naley kowalencyjne wizanie si reaktywnych postaci ksenobiotykw, powstaych w wyniku ich przemiany, z makroczsteczkami komrkowymi. Tymi ostatnimi mog by DNA, RNA i biaka. Jeeli tymi makroczs teczkami s biaka lub enzymy niezwykle wane
NA AKTYWNO ENZYMW PRZEMIANY KSENOBIOTYKW WPYW MAJ WIEK, PE I INNE CZYNNIKI

Rne czynniki wpywaj na aktywno enzymw metabolizujcych ksenobiotyki. Wrd nich wymieni naley nastpujce: Aktywno tych enzymw rni si istot nie u poszczeglnych gatunkw zwierzt. Ozna cza to, e toksyczno lub kancerogenno okrelonego ksenobiotyku u jednego gatunku wcale nie oznacza, e jest rwnie toksyczny lub rakotwrczy u drugiego gatunku. Wystpuj znaczne rnice (genetycznie uwarunkowane) w zakresie aktywnoci wymie nionych enzymw midzy osobnikami tego sa mego gatunku. Aktywno enzymw przemiany ksenobio tykw zalena jest od wieku i pici. Zaywanie rnych ksenobiotykw, takich jak fenobarbital, PCB lub pewne wglowodory, jest przyczyn indukcji enzymw. Wana jest
822 / ROZDZIA 60
Transferaza glutationowa
Ksenobiotyk
Reaktywne metabolity
lub hydrolaza epoksydowe
Nietoksyczne metabolity
Kowalencyjne wizanie si z makroczsteczkami ! Uszkodzenie komrak toksyczne Hapten
. 1
Mutacja
Wytwarzanie przeciwcia
Rak
Immunologiczne uszkodzenie komrek
Ryc. 60-1. Uproszczony schemat przedstawiajcy, w jaki sposb metabolizm ksenobiotyku prowadzi do uszkodzenia toksycznego lub immunologicznego komrek, lub te do powstawania raka. W tych przypadkach konwersj ksenobiotyku do reaktywnego metabolitu katalizuj enzymy grupy cytochromu P-450, za przeksztacenie reaktywnego metabolitu (np. epoksydu) do metabolitu nieaktywnego -S-transferaza glutalionowa aibo hydrolaza epoksydowa.
dla funkcji komrki, decydujcych o jej przeyciu, np. enzymy fosforylacji oksydacyjnej lub biaka regulujce przepuszczalno bony plaz-matycznej, wwczas atwo wytumaczy szybkie wystpienie objaww toksycznych spowodow-nych ksenobiotykiem. Po drugie, reaktywny ksenobiotyk wic si z biakami moe zmieni ich struktur i an-tygenowo. Mwi si wwczas, e ksenobiotyk dziaa jako hapten. Oznacza to, e sam ksenobiotyk, jako maa czsteczka, nie stymuluje powstawania przeciwcia (wicych ten ksenobiotyk). Jeeli jednak wytworzone zostay takie przeciwciaa (dziki poczeniu si ksenobiotyku z biakami), wwczas wi si one ze swoim antygenem. W wyniku rnych mechanizmw immunologicznych zachodzcych pomidzy tymi przeciwciaami a ksenobiotykiem zwiza nym przez makroczsteczki komrkowe, do chodzi do powanych zaburze normalnych procesw biochemicznych komrki. Po trzecie, chemiczne kancerogeny po ich aktywacji mog poczy si z DNA. Uwaa si, e taka reakcja moe mie due znaczenie w kan-cerogenezie chemicznej (p. rozdz. 61). Niektre zwizki chemiczne <np. benzopiren) wymagaj aktywacji przez monooksygenazy siateczki rdplazmatycznej, by stay si substancjami rakotwrczymi (o takich substancjach mwi si,
e s porednio dziaajcymi kancerogenami). Aktywno tych monooksygenaz i innych enzymw przemiany ksenobiotykw wystpujcych w siateczce rdplazmatycznej decyduj o tym, czy takie zwizki staj si kancerogenami czy te ulegaj detoksykacji". Inne zwizki chemiczne (np. substancje alkilujce) mog bezporednio reagowa z DNA, bez uprzedniej aktywacji w obrbie komrki (s to kancerogeny bezporednio dziaajce). Enzym okrelany jako hydrolaza epoksydowa jest przedmiotem zainteresowania ze wzgldu na to, e moe mie dziaanie ochronne w stosunku do niektrych kancerogenw. Produk tami monooksygenaz dziaajcymi na niektre prokancerogeny s epoksydy. Epoksydy s wysoce reaktywne i dlatego wykazuj dziaanie mutagenne i (lub) kancerogenne. Hydrolaza epoksydowa, podobnie jak cytochrom P-450, wystpuje w bonach siateczki rdplazmatycznej. Przeksztaca ona epoksydy do znacznie mniej reaktywnych dihydrodioli. Reakcj t przedstawia nastpujce rwn anie:
H2O -* \/ O Epoksyd
I ICC
I
+
OH OH Dihydrodiol
METABOLIZM KSENOBIOTYKW / 823 Nebert DW, Gonzalez FJ: P450 genes: structure, evolution and regulation. Annu Rev Biochem 1987; Katzung BG (editor): Basie & Clinica} Pharmacoogy. 56:945. 4th cd. Appleton & Lange, 1989. Nebert DW, Gonzalez FJ:P450 genes and evolutionaIClaassen CD, Amdur MO, Doull J (editors): Casoi-etf ry geneties. Hosp Pract (March) 1987; 22:63. & DouWs Toxicology, 3rd ed, Macmillan, 1986. PIMIENNICTWO
61
Rak, onkogeny i czynniki wzrostowe

Robert K. Munay, MD, PhD
WPROWADZENIE
Komrki nowotoworowe cechuj si 3 wa ciwociami: 1) zmniejszon lub nie opanowan kontrol wzrostu; 2) inwazyjnoci wobec tkanek, w ktrych s zlokalizowane oraz 3) rozprzestrzenianiem si i zdolnoci do wywoywania przerzutw w innych czciach organizmu. W tym rozdziale zostan omwione niektre biochemiczne aspekty procesu nowotworowego. Gwnymi kwestiami wymagajcymi wyjanienia w terminach biochemicznych s niekontrolowany wzrost komrek nowotworowych i ich zdolno do inwazji i tworzenia prze rzutw. Prawdopodobnie struktura i waciwo ci regulacyjne genw, kontrolujcych wzrost i interakcje midzy komrkami, nie s normalne w komrkach nowotworowych. Ograniczone s informacje o tym^w jaki sposb jest kon trolowany wzrost komrek, zarwno prawid owych, jak i nowotworowych, a wiedza o specyficznych genach uczestniczcych w regulacji wzrostu jest jeszcze bardzo uboga. Jak dotychczas niewiele wiadomo o biochemicznych podstawach tworzenia przerzutw, dlatego te te mat ten zostanie przedstawiony skrtowo. Przynajmniej niektre typy nowotworw (np. niektre typy biaaczek) mog by traktowane jako przykady nienormalnego rnicowania. Zdumiewajco mato wiadomo o molekularnych podstawach rnicowania. Jednak wielu bada czy tej dziedziny wiedzy przypuszcza, e dalsze badania nad onkogenami i czynnikami wzrostowymi rzuc wiato na natur zaburzonej kontroli wzrostu i rnicowania, a take na oddziaywania midzykomrkowe wywoane przez komrki nowotworowe. Dlatego te oba te tematy bd przedyskutowane w szczegach.
Nowotwory s drug z przyczyn zgonw w USA, po chorobach serca i naczy. Rozwijaj si u ludzi bez wzgldu na ich wiek. Chorob moe by objtych wiele narzdw. Czsto pojawiania si nowotworw ronie z wiekiem tak, e ludzie yjcy duej czciej s. na nie naraeni. Niezalenie od indywidualnych cier pie, ekonomiczne straty ponoszone przez spoeczestwo s ogromne.
W LECZENIU CHORYCH Z NOWOTWORAMI BARDZO WANE S TESTY LABORATORYJNE

Biochemiczne testy laboratoryjne pomagaj w leczeniu chorych na nowotwr. Wiele nowotworw zwizanych jest z nieprawidowym wytwarzaniem enzymw, biaek i hormonw, ktrych stenie mona mierzy w osoczu lub surowicy krwi (p. dyskusja nad rozwojem choroby nowotworowej, poniej). Zwizki te okrela si jako markery nowotworowe. Pomiary ste niektrych markerw nowotworowych s dzi integraln czci leczenia niektrych typw nowotworw (tab. 61 -1). Zastosowanie markerw nowotworowych w diagnostyce i leczeniu nowotworw przedstawiono w tab. 61-2. Z bada nad markerami nowotworowymi wynikaj 3 gwne wnioski (Mclntire, 1984): 1) aden pojedynczy marker nie jest uyteczny w ocenie wszystkich typw nowotworw lub u wszystkich chorych z danym rodzajem nowotworu; dlatego poyteczne jest te oznaczanie wielu markerw nowotworowych; 2) markery
RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 825 Tabela 61-1. Klinicznie uyteczne markery nowotworowe*. Zwizany z nim nowotwr Okrnica, puca, piersi, Antygen rakowo-podowy trzustka (CEA) Wtroba, komrki Ala-fetoproteina (AFP) pciowe Marker Ludzka gonadotropinr kosmwkowa (hCG)' Kalcytonina (CT) Trofoblast, komrki pciowe Tarczyca, rak rdzeniasty
PRZYCZYN NOWOTWORW MOG BY CZYNNIKI FIZYCZNE, CHEMICZNE I BIOLOGICZNE

Czynniki wywoujce nowotwory nale do 3 wielkich grup: energia promieniowania, zwizki chemiczne i wirusy.
Energia promieniowania moe by rakotwrcza

Promieniowanie ultrafioletowe, promieniowanie X i promieniowanie y s mutagenne i rakotwrcze. Promieniowanie ultrafioletowe moe wywoa powstawanie dimerw. Lece blisko siebie zasady azotowe mog na drodze eliminacji by przyczyn powstawania miejsc apurynowych i apiryrnidynowych. Mog nastpi pknicia w pojedynczym lub podwjnym acuchu, a nawet sieciowanie (crosslin-king). Uszkodzenia DNA uwaa si za gwny czynnik w mechanizmie powstawania nowo tworw wywoanych energi promieniowania, ale szczegy nie s jeszcze znane. Mechanizmy naprawy DNA omwiono w rozdz. 38. Niezalenie od bezporednich wpyww na DNA pro mieniowanie X i promieniowanie y mog spowodowa powstawanie wolnych rodnikw w tkankach. Powstajce w wyniku tego od dziaywania wolne rodniki *OH, nadtlenki i inne rodniki mog oddziaywa z DNA i innymi makromolekularni, prowadzc do uszkodze molekularnych i by moe w ten sposb uczestnicz w kancerogenezie wywoanej energi promieniowania.
Kwana fosfataza gruczou krokowego (PAP) Gruczo krokowy * Wedug Mclntire K.R.: Tumor Markers: How useful arethey? Hosp. Pract. (Dec) 1984; 19,55, za zezwoleniem. Tabela 61-Z. Zastosowanie markerw nowotworowych* Wykrywanie: skrining u osb nie wykazujcych objaww Diagnostyka: rozrnianie nowotworw zoli wych od agodnych postaci Monitorowanie: ledzenie skutecznoci leczenia i ocena nawrotu nowotworu Klasyfikacja: wybr terapii i przewidywanie reak cji nowotworu (rokowanie) Stadia: ocena zaawansowania choroby Lokalizacja: scyntygrafia po podaniu znakowanych pierwiastkami radioaktywnymi przeciwcia Leczenie: wprowadzenie cytotoksycznych czynnikw do komrek zawierajcych markery " Wedug Mclntire K.R.; Tumor Markers: How useful arethey?Wosp. Pract. (Dec) 1984,19,55, za zezwoleniem.
Wiele zwizkw chemicznych jest rakotwrczych
s czasami wykrywalne dopiero w zaawansowanych stadiach choroby nowotworowej, a rzadziej w pocztkowych stadiach jej rozwoju, gdzie ich uyteczno byaby wiksza; 3) oceniajc zastosowanie markerw przedstawionych w tab. 61-2 mona stwierdzi, e najbardziej uyteczne s one w monitorowaniu skutecznoci leczenia i przy wczesnym wykrywaniu nawrotw.
Wiele zwizkw chemicznych ma waciwoci rakotwrcze (tab. 61-3); struktur trzech najszerzej badanych pokazano na ryc. 61-1. Wikszo zwizkw ujtych w tab. 61-3 testowano na gryzoniach i innych zwierztach. Jednak wiele substancji chemicznych jest zwizanych z powstawaniem nowotworw u czowieka. Zakada si, e niemal 80% nowotworw u ludzi wywoanych jest czynnikami rodowiskowymi. Naraenie na te zwizki moe by zwizane z charakterem pracy zawodowej (np. benzen,
azbest), diet (np. aflatoksyna Bv ktra jest wytwarzana przez ple Aspergillus favus i czasem znajdowana jako zanieczyszczenie orzeszkw ziemnych lub innych produktw spoywczych), stylem ycia (np. palenie papierosw) lub z innymi drogami (np. niektre substancje
826 / ROZDZIA 61 Tabela 61-3. Wybrane chemiczne Klasa kancerogeny
Zwizek
Poiicykliczne aroBenzo[a]piren, matyczne wglo- dimetylo-benzo-antracen wodory Aromatyczne ami- 2-Acetylami nof I uoren, (MAB) ny N-metylo-4-amino-azobsnzen Nitrozoaminy Rne leki Dimetylonitrozoamina, dietylonitrozoamina Czynniki slkilujce (np. cy-klofosfamid), dietylostilbe-strol
kancerogenem, a kocowy zwizek, ktry reaguje ze skadnikami komrkowymi, np. z DNA, jest ostatecznym kancerogenem. Sekwencja wydarze jest nastpujca:
Prokaneerogen . Bliski kancerogen A > Bliski kancerogen B-*Ostateczny kancerogen
Naturalnie wystDaktynomycyna, pujce zwizki aflatoksyna B, Nieorganiczne Arsen, azbest, beryl, kadm zwizki chrom
lecznicze stosowane w terapii mog by rakotwrcze). W tym rozdziale zostan przedstawione tylko niektre wane uoglnienia, ktre wynikaj z bada nad chemiczn kancerogene-z. Struktura. Rakotwrcze mog by zarwno czsteczki organiczne, jak i nieorganiczne (tab. 61-3). Rozmaito tych zwizkw wskazuje, e nie maj one jednej wsplnej cechy strukturalnej, ktra odpowiedzialna jest za te ich waciwoci. Dziaanie. Najdokadniej zostay zbadane rakotwrcze zwizki organiczne. Niektre, ta kie jak gaz musztardowy i p-propioJakton, oddziauj bezporednio z moleku docelow (bezporednie kancn>geny), inne wymagaj uprzedniego metabhzowania, aby stay si rakotwrcze (prokancerogeny) (p, rozdz. 60). Proces, w ktrym w wyniku jednej lub wielu enzymatycznych reakcji prokancerogeny zamieniaj si w kancerogeny, nosi nazw ak tywacji metabolicznej. Kady zwizek poredni utworzony w wyniku przemian jest bliskim
Prokancerogen sam w sobie nie jest zwizkiem reaktywnym chemicznie, podczas gdy kancerogen ostateczny jest zwykle bardzo reaktywny. Co najmniej 2 reakcje chemiczne s niezbdne w celu przeksztacenia prokanceroge-nu, jakim jest 2-acetylo-amino-fIuoren (2-A-AF), w kancerogen ostateczny, jakim jest siarczanowy ester N-hydroksy-AAF. Wanym uoglnieniem jest, e ostateczny kancerogen jest zwykle zwizkiem elektrofilowym (tzn. czsteczki s ubogie w elektrony), ktry atwo atakuje nukleofilowe (bogate w elektrony) grupy w DNA, RNA i w biakach. nw. Metabolizm pro kancerogen w i innych ksenobiotykw zwizany jest z udziaem mono-oksygenaz i transferaz (p. rozdz. 60). Enzymy odpowiedzialne za metaboliczn aktywacj pro-kancerogenw s z reguy okrelonymi rodzajami cytochromu P-450 zlokalizowanymi w siateczce rdplazmatycznej. S to te same enzymy, ktre uczestnicz w przemianie innych ksenobiotykw, takich jak leki czy zanieczyszczenia rodowiska (np. PCB). Poiicykliczne aromatyczne wglowodory s zwizkami, ktre wzbudzaj due zainteresowanie w chemicznej kan-cerogenezie. Specyficzna monooksygenaza uczestniczca w ich metabolizmie nazywa si cytochromem P-448 lub hydroksylaz aromatycznych wglowodorw. Aktywno enzymw metabolizujcych chemiczne kancerogeny jest uzaleniona od wielu czynnikw, takich jak przynaleno gatunkowa, uwarunkowania ge netyczne, wiek lub pe. Zmiany w aktywnoci tych enzymw pomagaj wyjani wystpowa-
Metabolizm chemicznych kanceroge-
/=V
COCH3
Benzo[i]piren
2 - Acetam in of I u a ren
N-Metyla-4-am i n oazo Den zen
Ryc. 61-1. Struktura trzech wanych stosowanych w dowiadczeniach kancerogenw
RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 827
nie znacznych czasem rnic w aktywnoci kancerogennej wielu zwizkw chemicznych testowanych u rnych gatunkw lub osobnikw tego samego gatunku. Wiele z wyej wymienionych zagadnie jest szczegowo omwionych w rozdz. 60.
kancerogeny s podawane zwierztom lub wprowadzane do kultur komrkowych (co mona wykaza za pomoc radioaktywnych kancerogenw), kancerogeny te lub ich pochodne wi si zwykle kowalencyjnie z komrkowymi makromolekularni, w tym z DNA, RNA i biakami. Chemiczna natura adduktw powstaych przez interakcj ostatecznych kancero-genw z molekuami, z ktrymi docelowo maj si zwiza, zostaa ju wyjaniona. Najwiksze zainteresowania wywoay produkty powstae z udziaem DNA. Wykazano, e kancerogeny oddziauj z purynami i pirymidynami lub z grupami fosfodiestrowymi DNA. Najczciej atakowan czsteczk jest guanina, a rne kancerogeny s doczane do atomw N2, N3, N7, O6 oraz O8 tej zasady azotowej. Uszkodzenia DNA. Kowalencyjne oddziaywania bezporednich lub porednich kan-cerogenw z DNA mog by przyczyn wielu rodzajw uszkodze: wiek z nich moe by naprawionych, jak opisano to w rozdz. 38. Niezalenie od istnienia systemw naprawczych okrelone modyfikacje w DNA spowodowane chemicznymi kancero genami istniej przez stosunkowo dugi czas. Nie mona wykluczy, e te dugo trwajce nie naprawione uszkodzenia odgrywaj szczegln rol w generowaniu mutacji istotnych w procesie kancero-genezy. Mutageny. Wikszo chemicznych kan-cerogenw jest mutagenami. Wykazano to dziki zastosowaniu testu Amesa (p, niej) i innych testw. Na poziomic molekularnym tranzycje, transwersje i inne typy mutacji (p. rozdz. 38 i 40) mona wywoa przez ekspozycj niektrych bakterii na ostateczne kancerogeny. Zaoono, e niektre typy nowotworw spowodowane s mutacjami zachodzcymi w gwnych procesach regulacyjnych w komrkach somatycznych. Bezporednie dowody prawdziwoci tego twierdzenia s dzi dostpne (p. dyskusja o on-kogenach, poniej). Badanie waciwoci rakotwrczych zwizkw chemicznych z uyciem zwierzt jest czasochonne i drogie, dlatego te opracowano testy skriningowe do okrelania potencjalnej rako -
Wizania kowalencyjne. Gdy chemiczne
twrczoci zwizkw chemicznych. Wiele z nich opiera si na wykazaniu waciwoci mutagennych chemicznych kancerogenw.Takie badania s znacznie szybsze i mniej kosztowne ni badania dotyczce wykrywania nowotworw u zwierzt. aden z tych testw nie jest idealny, poniewa ostatecznym dowodem rakotwrczo-ci kadego kancerogenu jest wykazanie, e wywouje on nowotwory u zwierzt. Jedynie test Amesa, oparty na okrelaniu mutagennoci, okaza si przydatny w wykrywaniu potencjal nych kanoerogenw. W tecie tym stosuje si specjalnie skonstruowany szczep Salmonella ty-phimurium, ktry cechuje si obecnoci mutacji (His") w genie, ktry koduje jeden z enzymw biorcych udzia w syntezie histydyny. Dziki temu taki szczep Salmonella nie moe syntetyzowa histydyny, trz%ba j wic dodawa do poywki, aby komrki mogy rosn. Jeeli kancerogen wywoa w miejscu odpowiedzialnym za mutacj His~ kolejn mutacj, to moe ona odtworzy waciw sekwencj zamieniajc to miejsce na His+ . Potomstwo takiej bakterii z mutacj rewersyjn moe teraz syntetyzowa histydyn i rosn na poywce pozbawionej tego aminokwasu. Takie bakterie mona atwo wykry, a ich kolonie policzy na pytkach agarowych. Jednym z prob lemw stosowania bakterii w testach wykrywania mutagennoci zwizkw jest fakt, e nie zawieraj one caego spektrum monooksj genaz, ktre wystpuj u wyszych organizmw. Dlatego te, jeeli jaki zwizek chemiczny wymaga aktywowania, aby naby waciwoci mutagennych lub rakotwrczych, wwczas nie mona tego wykaza przy uyciu wymienionych bakterii. Ames przezwyciy te trudno inkubujc zwizki, ktre miay by testowane w postmitochondrialnym superna-tancie komrek wtroby szczura (tj. we frakcji S-9, ktr otrzymuje si jako supernatant wirujc homogenat komrek wtroby przy 9000 g przez okrelony czas). Frakcja S-9 zawiera wikszo rnych monooksygenaz i innych enzymw potrzebnych do aktywacji potencjalnych muta-genw i kancerogenw. Za pomoc testu Amesa mona zidentyfikowa ok. 90% znanych kancerogenw. Dzi metoda ta naley do rutynowych testw stosowanych do testowania nowo syntetyzowanych zwizkw chemicznych, szczeglnie gdy przewiduje si ich handlowe przeznaczenie lub szerokie zastosowanie w przemyle. Zwizki, ktre daj dodatni reakcje, powinny by poddane
828 / ROZDZIA 61
dalszym testom, w tym testom na rakotwr -czo u zwierzt. Inicjacja i promocja. W niektrych narz dach, takich jak skra czy wtroba, wykazano, e kancerogeneza moe przebiega w co najmniej 2 etapach. Klasycznym przykadem jest skra. Dwie identyczne powierzchnie skry okrelonej grupy myszy powleka si jednokrotnie benzo[s]pirenem. Jeeli te okrelone powierzchnie skry nie s dodatkowo poddane dziaaniu innych czynnikw, nowotwory skry nie rozwijaj si (ryc. 61-2). Jeeli jednak po za -
Nio ma nowotworu
P j _J_
P P 1
Nowotwr
_^ t JL
Czas
Nie ma nowotworu
Ryc. 61-2. Schematyczna prezentacja etapw inicjacji i promocji w chemicznej kancerogenezie skry. A jednorazowa aplikacja inicjatora (np. benzo[a]pirenu) naniesionego na skr okrelonej iiczby myszy. B po naniesieniu inicjatora stosuje si wiele aplikacji promotora {np. oleju krotonowe-go) w okresach np. tygodniowych, C najpierw nanosi sie promotor, a potem inicjator. Niezoliwe nowotwory skry (brodawczaki) mog pojawi si w okresie ok. 100 dni; zoliwe nowotwory (raki) wymagaj rocznego okresu. Wyej opisane dowiadczenie zostao przeprowadzone w wielu innych wariantach, jecnak wszystkie potwierdziy zasadnicz tez inicjacji i promocji. I inicjator, P promotor.
cji. Dlatego benzo[cc]piren nazywany jest czynnikiem inicjujcym; 2) drugie stadium kancerogenezy (trwajce miesice lub lata) jest rezul tatem stosowania oleju krotonowego i nazywane jest promocj; olej krotonowy jest wic czynnikiem promocyjnym lub promotorem. Promotory nie s zdolne do wywoania inicjacji; 3) wikszo kancerogenw moe dziaa zarwno jako czynniki inicjujce, jak i promocyjne. Dua liczba zwizkw chemicznych, wczajc fenobarbital i sacharyn, moe dziaa jako promotory w rnych narzdach. Aktywny skadnik oleju krotonowego jest mieszanin estrw forbou. Najaktywniejszym estrem for-bolu jest octan 12-0-tetradekanoy!oforbolu (TPA), ktry wywouje wiele efektw. Najbardziej interesujcym odkryciem byo wykazanie, e kinaza biaek C moe by receptorem dla TPA. Stymulacja aktywnoci tego enzymu wywoana interakcj z TPA moe spowodowa fosforylacj wielu biaek bonowych, co z kolei moe prowadzi do zmian w transporcie i w i nnych funkcjach komrki. Ta wana obserwacja tumaczy cisy zwizek zachodzcy midzy niektrymi promotorami nowotworowymi a procesami transmembranowej sygnalizacji (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniej). Wiele promotorw nowotworowych dziaa przez wywoanie zmian w ekspresji genowej. Szczegowy mechanizm wyjaniajcy sposb, w jaki promotory wpywaj na transformacj komrki bdcej w stadium inicjacji w komrk nowotworow, nie zosta jeszcze wyjaniony. Gwn ma kro moleku w procesie ka ncerogenezy jest DNA DNA jest krytyczn makromoleku docelow w procesie kancerogenezy. Nastpujce fakty potwierdzaj ten wniosek: 1) komrki nowotworowe rodz komrki nowotworowe, tj. zasadnicze zmiany odpowiedzialne za cechy nowotworowe przekazywane s z komrek matczynych na komrki pptomne; 2) zarwno promieniowanie, jak i chemiczne kancerogeny s zdolne do wywoania zmian mutacyjnych w DNA; 3) wiele komrek nowotworowych ma nieprawidowe chromosomy; 4) dowiadczenia opisujce transfekcj (p. poniej), wskazuj, e oczyszczony DNA z komrek nowotworowych {onkogeny) moe transformowa prawidowe komrki w komrki nowotworowe lub potencjalnie nowotworowe. W kancerogenezie mog jednak take odgrywa role czynniki epjgenety-czne.
stosowaniu benzo[a]pirenu zostanie kilkakrotnie naniesiony na te powierzchni olej krotono-wy, rozwija si stopniowo wiele nowotworw. Naniesienie na skr jedynie oleju krotonowego (tzn. bez uprzedniego naniesienia benzo[a]pire-nu) nie wywouje nowotworw skry. Wykonano wiele innych bada bdcych wariantami tego dowiadczenia i wycignito nastpujce wnioski: I) stadium kancerogenezy wywoane stosowaniem benzo[a]pirenu nazywane jest inicjacj; wydaje si, e jest ona osigana szybko i jest nieodwracalna; przypuszcza sie, e stadium to zwizane jest z nieodwracaln modyfikacj DNA, wywoujc jedn lub wicej muta-
RAK, ONKOGENY 1 CZYNNIKI WZROSTOWE / 829
Onkogenne wirusy zawieraj DNA lub RNA jako swj genom (tab. 61-4). Tu zostanie opisanych jedynie kilka najwaniejszych cech przedstawiciela tych dwch klas.
Tabela 61 -4. Niektre wane wirusy nowotworo we Klasa DNA w ir us y P a po va wirusy Wirus poty oma SV40 wirus Wirus brodawczaka Adenowirusy 72, 18131 Wirus Epstein-Barr, Wirus herpes- simplex yp 2 Wirus hepatitis B
Niektre DNA i RNA wirusy s rakotwrcze
Przedstawiciele
Niektre odmiany adenowirusw s zdolne do transformacji okrelonych komrek zwierzcych. Due zainteresowanie wywoa wirus Eps-teina-Barr, gdy jest on zwizany z choniakiem Burkitta i rakiem jamy nosowo-gardowej u ludzi. Wirus opryszczki (herpes simplex) typu 2 uczestniczy w patogenezie raka szyjki macicy, a wirus zapalenia wtroby (hepatitbi) B moe by odpowiedzialny za niektre przypadki raka wtroby u ludzi. Ze wzgldu na fakt, e wiksza cz wiedzy o onkogenach w ostatnich latach pochodzi z bada nad wirusami RNA, w dalszej dyskusji nad onkogenami czsto bdzie o nich mowa.
Adenowirusy Wirusy herpes Hepadnawirus
RNA wirusy
Retrowirus typ C Wirusy misaka mysiego i biaaczki, wirusy misaka ptasiego i biaaczki, wirusy ludzkiej biaaczki komrekT Wirus no wotwo ru gruczo u piersiowego myszy
W WYNIKU TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ ZACHODZ ZMIANY ZARWNO MORFOLOGICZNE, JAK I BIOCHEMICZNE

Gdy hodowle komrek zakaone s pewnymi onkogennymt wirusami, mog one ulec trans formacji nowotworowej. Najbardziej istotne zmiany morfologiczne i biochemiczne zachodz przy transformacji opisanej w tab, 61-5. Zmiany te obejmuj ksztat komrki, ruchliwo, przy-czepialno do cianek naczynia hodowlanego, wzrost i wiele procesw biochemicznych. S one interpretowane jako zmiany pierwotne powo dujce przeksztacenia ze stanu normalnego do stanu nowotworowego lub jako zmiany wtrne indukowane przez te pierwsze. Waciwo zrwnania transformacji w przyblieniu z nabywaniem cech nowotworowych ma niezwyk wag w badaniach nad nowotworami. Jednak poszukiwanie zmian w komrkach powszechnie uznawanych za transformacje niekoniecznie oznacza, e takie komrki bd wykazyway takie same biologiczne waciwoci jak komrki nowotworowe in vivo; musz one bowiem wywoa nowotwr, gdy zostan wprowadzone do odpowiedniego zwierzcego organizmu biorcy.
Retrowirus typ B
Wirus polyoma i wirusy SV40 odegray wan rol w ksztatowaniu si wspczesnych pogldw na temat wirusowej onkogenezy. Oba s maymi wirusami (zawieraj genom ok. 5 kb), a ich koliste genomy koduj tylko ok. 5-6 biaek. W okrelonych warunkach infekcja odpowiednich komrek tymi wirusami moe prowadzi do transformacji nowotworowej. W procesie tym uczestnicz specyficzne biaka wirusowe. W przypadku SV40 biaka te (czsto nazywane antygenami, poniewa wykryto je metodami immunologicznymi) znane s jako T (due T) oraz t (mae t), a w przypadku wirusa polyoma nazywa si je T, mid -T oraz t. Litera T odnosi si do faktu, e biaka te po raz pierwszy wykryto w nowotworach (tumor). Sposb, w jaki biaka te powoduj transformacj nowotworow, jest stale jeszcze badany; antygeny T wi si silnie z DNA i wywouj zmiany w ekspresji genowej. Biaka te wywieraj wiele kooperatywnych zjawisk, co sugeruje, e zmiany te musz dotyczy wicej ni jednej reakcji lub procesw, aby wywoa transformacj.
ONKOGENY ODGRYWAJ ISTOTN ROL W KANCEROGENEZIE

Onkogeny s genami zdolnymi do wywoania nowotworw. Ich odkrycie wywarto ogromny wpyw na badania podstawowych mechanizmw zwizanych z kancerogenez. Onkogeny pocztkowo uznano za specyficzne geny wiru-
830 / ROZDZIA 61 Tabela 61 -5. Niektre zmiany wykazywane przez komrki w hodowlach sugerujce transformacj nowotworow (np. po infekcji wirusem onkogen-nym). Najwaniejszym testem, dowodzcym ze-ztoliwienia komrek, jest zdolno komrek do wywoania nowotworu w warunkach in vivo Zmiany morfologiczne: transformowane komrki maj czsto znacznie bardziej zaokrglone ksztaty ni komrki kontrolne Zwikszona gsto komrek (utrata zdolnoci do hamowania wzrostu przez kontakt komrek): transformowane komrki czsto tworz wielowars-twy, podczas gdy komrki kontrolne rosn w jednej warstwie Utrata przyczepia)noci: komrki transformowane mog rosn bez przyczepiania si do powierzchni naczynia hodowlanego, a czsto mog rosn w agarze Utrata zdolnoci zahamowania ruchu komrki wywoanego kontaktem z inn komrk: transformowane komrki rosn jedna na drugiej, podczas gdy prawidowe zatrzymuj swj ruch w momencie kontaktu midzy sob Zmiana wielu procesw biochemicznych, w tym nasilenie glikolizy, zmiany na powierzchni komrek (np. zmiany w skadzie glikoprotein lub glikosfingolipidw), a take wydzielanie niektrych protaz Zmiany w strukturach cytoszkieletowych, takich jak filamenty aktyny. Zmniejszone zapotrzebowanie na czynniki wzrostowe i czsto zwikszone wydzielanie pewnych czynnikw wzrostowych do otaczajcego rodowiska
sw wywoujcych .{\pwotwory odpowiedzialnych za proces transformacji (wirusowe onkoge). Onkogeny wirusa misaka Rousa. Analiza onkogenu wirusa misaka Rousa i produktu dziaania tego genu bya szczeglnie wana. Genom tego retrowirusa zawiera 4 geny o nazwach gag, poi, env i src. Zostao to pokazane schematycznie poi poniej.
9*9
env
src
Gen gag koduje grup specyficznych antygenw wirusa, poi jest odpowiedzialny za odwrotn transkryptaz charakterystyczn dla retro -wirusw, za env za okrelone glikoproteiny otoczki wirusa. Wykazano,' e produktem genu src jest kina/a biakowo -tyrozynowa odpowie-
dzialna za transformacj. Odkrycie to miao fundamentalne znaczenie. PozwoJio bowiem na odkrycie specyficznego mechanizmu biochemicznego (tj. nienormalnej fosforylacji szeregu biaek) mogcego wyjani, przynajmniej czciowo, w jaki sposb wirus nowotworowy moe spowodowa efekty plejotropowe w transformacji. Te krytyczne biaka komrkowe, ktrych nienormalna fosforylacja prawdopodobnie prowadzi do transformacji, s stale jeszcze badane. Jednym z nich jest winkulina, biako znalezione w obszarach kontaktu jednej kom rki z drug w foci (w skupiskach komrko wych). Nienormalna fosforylacja win ku liny w foci pomoga wytumaczy zaokrglanie si komrek i ich mniejsz adhezj do podoa i do siebie samych, co obserwuje si w procesie transformacji (tab. 61-5). Niektre enzymy gli-ko liryczne wydaj si by biakami docelowymi dla src kinazy bialkowo-tyrozynowej; wyjania to, dlaczego transformowane komrki czsto wykazuj zwikszon szybko glikolizy. Produkt dziaania src mgby rwnie katalizowa fosforylacj fosfatydyloinozytolu do fosfatydy-loinozytolo mono- i di-fosforanu. Gdy fos-fatydyloinozytolo-4,5-difosforan jest hydrolizo wany przez fosfolipaze C, wyzwalaj si 2 wtrne zwizki: trifosforan inozytolu i diacy-loglicerol (p, rozdz. 45). Pierwszy z tych zwizkw uczestniczy w uwalnianiu wapnia z wewntrzkomrkowych miejsc jego spichrzania (tj. z siateczki rdplazmatycznej). Diacylo-glicerol pobudza aktywno zwizanej z bon plazmatyczn kinazy biaek C, ktra z kolei fosforyluje szereg biaek, z ktrych niektre mo g b y skadnikami po mp jono wych. W szczeglnoci zaproponowano, e agodna alkalizacja komrki wywoana aktywacj sys temu antyportowego Na +/H+ (p. rozdz. 42) moe odgrywa rol w stymulowaniu mitozy. Dlatego te produkt dziaania src moe oddziaywa na du liczb procesw komrkowych przez jego zdolno do fosfory Iowa nia szeregu biaek i enzymw, jak rwnie przez stymulowanie przebiegu syntezy poltfosfoino-zytydw.
Kinazy btakowo -tyrozynowe w komrce normalnej i transformowanej.
Obserwacja, e wirus misaka Rousa zawiera kinaz biakowo-tyrozynowa wpyna znacz nie na badania nad fosforyJacj tyrozyny. Obecnie wiadomo, e szereg normalnych komrek cechuje si aktywnoci kinaz biako w o-tyrozy-nowych. Ilo fosfotyrozyny w wikszoci nor-
malnych komrek jest maa, lecz zwykle zwiksza si w. komrkach transformowanych wirusem onkogennym zawierajcym kinaz bia kowo-tyrozyn ow, chocia jego ilo jest stale jeszcze wzgldnie maa i wynosi ok. I % cakowitej iloci fosfoaminokwasw (przede wszystkim fosfoseryny, fosfotreoniny i fosfotyrozy-ny). Niektre receptory (np. naskrkowego czynnika wzrostowego, insuliny i czynnika wzrostowego pytek krwi), wystpujce zarwno w normalnych,, jak i transformowanych komrkach, wykazuj aktywno kinaz bia kowo-tyrozyn owych, ktra jest stymulowana po interakcji z jej Ugandami (p. dyskusja o czynnikach wzrostowych, poniej). Dlatego aktywnoci kinaz biakowo-tyrozyn owych odgrywaj tak wan rol w normalnych i transformowa nych komrkach. onkogenw wirusa misaka Rousa mona do da ok. 20 nastpnych poznanych onkogenw innych retrowirusw. Prawie poiowa produktw dziaania tych onkogenw wirusowych to kinazy biaek, najczciej typu tyrozynowego. Niektre onkogeny wirusowe wymienione s w tab. 61-6, razem z ich produktami. Podczas gdy niektre z umieszczonych w wykazie koduj, kinazy biaek, pozostae koduj rne inne biaka cechujce si interesujcymi waciwociami biologicznymi. Produkt genu erb-B wiru-
Onkogeny innych retro wiru sw. Do
sa ptasiej erytroblastozy jest skrcon postaci receptora dla naskrkowego czynnika wzros towego, a produkt onkogenu sis wirusa misaka mapy (simian sarcoma virus ssv) jest skrconym acuchem B czynnika wzrostowego pytek krwi. Produkt wirusowego onkogenu (fms) wyizolowanego z jednego z wirusw kociego misaka jest czynnikiem stymulujcym formowanie kolonii przez makrofagi. Z drugiej strony produkt onkogenu myc wykryty w wirusach biaaczki mielocytowej kurczt jest biakiem wicym si z DNA, ktre moe kontrolowa proces mitozy. Produkt onkogenu ras wirusa misaka mysiego wie GTP, ma aktywno GTP-azy i wydaje si by spokrewniony z biakami, ktre reguluj aktywno wanego enzymu bon plazmatycznych jakim jest cyklaza adenylanowa (p. rozd^S). Protoonkogeny. Gwnym problemem podnoszonym przy odkryciu wirusowych onkogenw jest ich pochodzenie. Dziki technice hybrydyzacji kwas w nukleinowych (p. rozdz, 36) wykazano, e normalne komrki maj sekwencje DNA podobne, jeeli nie identyczne, do tych jakie wystpuj w wirusowych onkoge-nach. Widocznie wirusy wbudowywuj geny komrkowe do swoich genomw w czasie przechodzenia przez komrki. Przechowywanie takich genw w ich genomach wskazuje, e musz one wiza si z pewnymi korzyciami dla tak
Tabela 61-6. Wybrane onkogeny retrowirusw Onkogen

abl
Retro wirus Wirus biaaczki mysiej AbeJsona Wirus ptasiej erytroblastozy Wirus kociego misaka Wirus misaka myszy Wirus 29 biaaczki mielocytowej Wirus misaka mapy Wirus misaka Rousa
Pochodzenie Mysz Kurcz

Kot
Produkt onkogenu Kinaza biakowo-tyrozyn owa Skrcony receptor EGF Kinaza biafkowo-tyrozyn owa ? Biako wice DNA Skrcony PDGF Oacuch B) Kinaza biafkowo-tyrozyn owa
Lokalizacja s u
b komo rko wa
Bona plazmatyczna Bona plazmatyczna Bona plazmatyczna Jdro Jdro Bony (wydzielanie?) Bona plazmatyczna
erb-B fes fos myc sis

src
Mysz Kurcz Mapa Kurcz
Tyr-tyrozyna; EGF - naskrkowy czynnik wzrostowy; PDGF - czynnik wzrostowy pytek krwi Wedug Franks L.M., Teich N.M. (red.): Introduction to the Cellularand Motacular Biology of Cancer. Oxford Univ. Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.
S32 / ROZDZIA 61
uksztatowanego wirusa, prawdopodobnie zwizanymi ze zmienionymi waciwociami wzrostu transformowanych komrek. Fakt stwierdzenia sekwencji homologicznych w licznych rodzajach komrek eukariotycznych sugeruje, e byy one wanymi skadnikami normalnych komrek. Dodatkowo czsteczki mRNA i biaka powstae z tych normalnych sekwencji wykryto na rnych etapach ich rozwoju lub ich cyklu yciowego. Takie geny, obecne w normalnych komrkach, zostay uznane za protoonkogeny, przy czym zakada si, e ich produkty odgrywaj wan rol w normalnym rnicowaniu i w innych procesach komrkowych. wych. Dowiadczenia, w ktrych uyto DNA wyizolowanego z nowotworw, take dostarczyy dowodw na istnienie onkogenw. Metoda uyta do wykrywania takich komrkowych onkogenw nosi nazw transferu genu lub trans-fekcji DNA. W metodzie tej wykorzystuje si fakt posiadania przez okrelone geny obecne w nowotworach zdolnoci do transformacji normalnych" komrek w hodowlach. DNA izoluje si z komrek nowotworowych i dodaje do komrek biorcw w hodowli, bdcych czsto linia mysich fibroblastw znanych jako ko mrki linii NIH/3T3. DNA z komrek no wotworowych jest wytrcany fosforanem wap nia (w celu uatwienia endocytozy) i dodany do komrek N1H/3T3 w hodowli komrkowej. Komrki obserwuje si pod mikroskopem przez okres 12 tygodni, tj. czas potrzebny do wytworzenia kolonii komrek transformowanych. Jeeli transformacja zachodzi, komrki NIH/3T3 zmieniaj swj ksztat z paskich do zaokrglonych postaci, ktre rosn w charakterystycznych koloniach. Procedur t powtarza si kilkakrotnie, przy czym uywa si DNA z komrek transformowanych, co prowadzi do zmniejszenia si iloci DNA nie uczestniczcego w transformacji, lecz ktry przeniesiono w wyniku transfekcji. Onkogenny DNA mona identyfikowa (np. metod southern blotting, uywajc odpowiedniej sondy dla danego specyficznego genu p. rozdz. 36). T metod zidentyfikowano w przyblieniu ok, 20 onkogenw, z ktrych wiele odnosi si do onkogenu ras wirusa miesaka mysiego. Takie komrkowe onkogeny s albo identyczne z normalnymi genami, albo wykazuj bardzo niewielkie rnice strukturalne w stosunku do swoich normalnych odpowiednikw (p. niej). W pierwszym
Onkogeny z komrek nowotworo -
przypadku regulacja ich ekspresji moe nie by prawidowa w komrkach nowotworowych. Skrty uywane do okrelenia onko genw komrkowych i wirusowych. Skrty c-onc (cellular oncogene, np. c-ra) uywane s dla zaznaczenia, e onkogen obecny jest w komrce nowotworowej. Potencjalne onko geny, obecne w prawidowych komrkach, tj. ich proto-onkogen mog w sposb prosty by nazwane odpowiednio c-onc protoonkoge-nami (np. c-ras proto-onkogen). Podobnie wi rusowe onkogeny oznaczane s jako \-onc (viral oncogene, np. v-ras), a ich pro to-onkogeny jako v-onc proto-onkogen (np. v-ras proto-onkogen). Protoonkogeny s aktywowane do onkogenw w rny sposb Zostanie tu omwionych 5 mechanizmw, ktre zmieniaj ekspresj lub struktur proto-onkogenw, a tym samym uczestnicz w ich przemianie w onkogeny. Upraszczajc, proces, w ktrym transkrypcja jest wzmoona (od zera lub wzgldnie niewielkiego poziomu), okrelany jest mianem aktywacji. Znajomo mechanizmw zwizanych z aktywacj jest istotna dla zrozumienia wspczesnych pogldw dotyczcych kancerogenezy. Insercja promotora. Niektre retrowiru-sy nie maj onkogenw (np. wirus mapiej biaaczki), ale zdolne s do wywoania nowotworu po duszym czasie miesicach raczej ni dniachw porwnaniu do tych, ktre maj onkogeny. Podobnie jak przy innych retro-wirusach, gdy te wirusy zakaaj komrki, kopia DNA (cDNA) tworzona z ich genomu RNA syntetyz owana jest dziki odwrotnej trans kry ptazie, a cDN A jest wbudowywany do genomu gospodarza. Ten zintegrowany dwu-niciowy cDNA nazywa si prowirusem. Kopie cDNA retrowirusw s oflankowane na obu kocach przez sekwencje nazywane LTR (long terminal repeat), podobnie jak niektre trans-pozony (jumping genes") znalezione w bakteriach i w rolinach (p. rozdz. 39). Sekwencje LTR okazay si istotne w mechanizmie prowi-rusowej intergracji, gdy mog one dziaa jako promotory transkrypcji (p. rozdz. 40). W nastpstwie infekcji limfocytw B kurczt przez pewne wirusy biaaczki ptasiej prowirusy zostaj wbudowane w pobliu genu myc. Gen myc jest aktywowany przez przylegajc powyej niego sekwencj LTR dziaajc jako promotor. W wyniku tej aktywacji dochodzi zarwno do

A
Prowirus LTR myc
LTR
myc
myc mRNA Ryc. 61-3. Schematyczne przedstawienie, w jaki sposb insercja promotora moe aktywowa proto-onkogen. A normalny chromosom kurczcia majcy nieaktywny gen myc. 8 wirus biaaczki ptasiej jest integrowany w chromosomie w postaci prowirusowej, przylegajcej do genu myc. Znajdujca st z jego prawej strony dtuga kocowa powtarzalna sekwencja (LTR long terminal repeat), zawierajca silny promotor, ley bezporednio powyej genu myc i aktywuje ten gen, wynikiem czego jest transkrypcja myc mRNA. Dla uproszczenia, na rycinie jest przedstawiona tylko jedna ni DNA, inne szczegy zostay opuszczone.
myc
myc
LTR
Prcwirus I i LTR
myc mRNA Ryc. 61-4. Schemat pokazujcy, w jaki sposb insercja sekwencji wspomagajcych moe aktywowa protoonkogen. A normalny chromosom kurczcia zawierajcy nieaktywny gen myc. B wirus mapiej biaaczki zosta zintegrowany w chromosomie w jego prowirusowej postaci, przylegajc do genu myc. Jednak w tym przypadku miejsce integracji jest tu poniej genu myc i nie moe ono dziaa jako promotor (fyc. 61 -6), Zamiast tego, okrelona prowirusowa sekwencja dziaa jako czynnik wspomagajcy prowadzc do aktywacji pooonego wyej genu myc i do jego transkrypcji. Dla uproszczenia na rycinie zosta przedstawiony tylko jeden acuch DNA, inne szczegy zostay pominite.
transkrypcji, w ktrej powstaje myc mRNA, jak i do jego translacji z wytworzeniem odpowiedniego produktu (ryc. 61-3). Rezultatem tych procesw jest nowotwr komrek B, chocia dokadna rola produktw genu myc w tym procesie nie jest jasna. Podobne zjawiska zachodz po infekcji rnych komrek innymi retrowirusami. transkrypcj. W niektrych przypadkach prowirus jest wbudowany poniej genu myc, lub te powyej niego, lecz w postaci odwrconej; pomimo tego gen myc zostaje aktywowany (ryc. 61-4). Taka aktywacja nie moe by zwizana z insercja promotora, gdy sekwencja promotora mu si si znajdowa powyej genu, ktrego
53 Biochemia
Insercja sekwencji wzmacniajcych
transkrypcje wzmaga i by ustawiona we wia-ciwym kierunku 5' do V, Zamiast tego, uczestnicz w tym procesie sekwencje wzmacniajce (p. rozdz. 40 i 42) obecne w sekwencjach LTR omawianych retro wirusw. Opisane powyej 2 mechanizmy, insercje promotora i sekwencji wzmacniajcych trans krypcje, dziaaj wsplnie w procesie wirusowej kancerogenezy. Prawdopodobnie bior w niej udzia take inne protoonkogeny ni myc. wspomniano wyej, wiele komrek nowotworowych cechuje si nieprawidowociami chromosomowymi. Jednym z typw zmian chromosomowych w komrkach nowotworowych jest
Transokacje
chromosomalne.
Jak
834 / ROZDZIA 61
translokacja. Podstaw translokacji jest fakt, e fragment jednego chromosomu moe zosta oderwany i potem przyczony do drugiego chromosomu. Jeeli drugi chromosom oddaje materia pierwszemu, jest to translokacja wzajemna (reciprocal). Charakterystyczne transloka-cje stwierdza si w wielu komrkach nowotworowych. Przykadem klinicznie wanej translokacji jest chromosom Philadelphia, ktry stwierdza si w przewlekej biaaczce szpikowej. Translokacja obejmuje tu chromosomy 9 i 22.
Choniak Burkitta jest szybko rosncym nowotworem rozwijajcym si z ludzkich limfocytw B. W niektrych przypadkach tego nowotworu wykryto wzajemn translokacj genw (ryc. 61-5). Wyjania ona mechanizmy aktywacji potencjalnych onkogenw komrkowych. W procesie tym uczestnicz chromosomy 8 i 14. Segment chromosomu 8, ktry odamuje si i przechodzi do chromosomu 14, zawiera gen myc. Jak pokazano na ryc. 61-6, transpozycja przesuwa uprzednio nieaktywny gen myc pod
- - P knic ia
14
14
-Geny cikiego acucha H -Pknicie m yc
Ryc. 61-5. Schemat obustronnej translokacjj wystpujcej w chloniakach Burkitta, Chromosomami uczestniczcymi w tym procesie s chromosomy 8 i 14. Segment znajdujcy si na kocu ramienia q chromosomu 8 odamuje si i przemieszcza do chromosomu 14. Odwrotny proces przemieszcza may fragment z ramienia q chromosomu 14 na chromosom 8. Gen myc zawarty jest w maym fragmencie chromosomu 8, ktry zosta przeniesiony do chromosomu 14; jest on umieszczony bezporednio przy genach przepisujcych cikie iacuchy immunoglobuiin i sam przez to ulega aktywacji, ____________
Geny cikiego acucha H
Geny cikiego acucha H
m yc
mR NA
mRJMA
Ry c . 6 1 -6 . S c he m at p r ze d s ta wi a, w j ak i s p o s b trans lo k ac ja z wi za n a z c h lo ni a kie m B ur kit t a m o e a kt y wo w a p ro to o n ko g e n m y c . A m a y I r ag m e n t c hro m o s o m u 1 4 t u p r ze d t r ans lo k ac j a . P o k a za n y s e g m e nt za w ie r a g e ny ko d u jc e re g io n y c i kic h a c uc h w im m u no g lo b uli n. B w w y ni ku tr a n s lo kac ji up r ze d nio nie ak ty w n y g e n fn y c z n al az s i p o d wp y we m s e k we nc ji ws p o m ag aj c yc h w g e n ie ko d uj c ym c i kie a c uc h y im m u no g lo b ulin i s t a s i p rze z to ak ty wn y, c o p o wo d uje tr a ns kr yp c j . D la up ro s zc z e nia n a ryc i nie zo s ta p r ze d s ta wio ny t yl ko je d e n z d w c h a c uc h w D NA , i n ne s zc ze g y zo s ta y' p o m i ni te .
wpyw sekwencji wzmacniajcych transkrypcj genw kodujcych cikie acuchy immuno-globulin. Taka translokacja powoduje aktywacj transkrypcji genu myc. Widocznie synteza znacznie zwikszonych iloci biaka wicego DNA, kodowanego przez gen myc, napdza" lub zmusza" komrki do przeksztace w kierunku zoliwie ni a, by moe wpywajc na regulacje mitozy. Mechanizm ten jest podobny do insercji sekwencji wzmacniajcych transkrypcj z tym wyjtkiem, e raczej chromosomalna translokacja ni integracja prowirusa sprawia, e protoonkogen (np. myc) dostaje si pod wpywem sekwencji wzmacniajcych transkrypcj. Amplifikacja genu. Amplifikacja niektrych genw (p. rozdz. 39) zostaa wykryta w wielu nowotworach. Jedn z metod stymulacji amplifikacji genw w nowotworach jest podanie leku przeciwnowotworowego meto-treksatu, ktry jest inhibitorem enzymu reduk-tazy dihydrofolianowej. Komrki nowotworo we mog sta si odporne na dziaanie tego leku. Podstaw tego zjawiska jest fakt, e gen reduk-tazy dihydrofolianowej ulega amplifikacji, co powoduje wzrost aktywnoci tego enzymu (a do 400 razy). Te zwielokrotnione kopie genw, ktrych dugo dochodzi nawet do 1000 kb lub wicej mona wykry jako homogennie barwice si regiony w okrelonych chromosomach. Alternatywnie s one wykrywane jako chromo-somopodobne twory okrelane jako chromosomy DM (double-minute), ktre s minichromoso-mami pozbawionymi centromerw. Ta cisa zaleno homogennie barwicych si regionw od obecnoci chromosomw DM jest stale jeszcze przedmiotem bada. Istniej dowody sugerujce, e zwikszone iloci produktw okrelonych onkogenw (takich jak c-ras) wytworzone przez amplifikacj genw mog odgrywa rol w przeksztacaniu komrek nowotworo wych w komrki bardziej zoliwe (p. dyskusja o progresji nowotworw, poniej). Mutacje punktowe. Onkogen v-ras zosta wykryty w pewnych retro wirusach mysich i szczurzych. Jego produkt, biako p21 o m.cz. 21000 jest pokrewne biakom G, ktre moduluj aktywno cyklazy adenylanowej (p. powyej i rozdz. 45) i dlatego odgrywaj gwn rol w odpowiedzi komrkowej na wiele hormonw i lekw. Analiza sekwencji DNA c-ras proto--onkogenu z normalnych komrek ludzkich i z c-ras onkogenu z raka pcherza ludzkiego wykazaa, e rni si one tylko jedn zasad,
co powoduje zmian jednego aminokwasu w pozycji 12 biaka p21. Ten intrygujcy wynik zosta potwierdzony analiz c-ras genw innych ludzkich nowotworw. W kadym przypadku wynik by zgodny; geny izolowane z nowotworw wykazyway tylko jedn mutacj punktow w porwnaniu do c-ras proto-onkogenw z prawidowych komrek. Pozycja mutacji czasem si zmienia, tak e obserwowano rwnie podstawienie innych aminokwasw. Mutacje w biaku p21 wpywaj na jego konformacj i zmniejszaj jego aktywno jako GTP -azy. Mniejsza aktywno GTP-azy moe by spowodowana przewlek stymulacj aktywnoci cyklazy adenylanowej, ktra normalnie jest niewielka, gdy GDP powstaje z GTP (p. rozdz. 45). To pobudzenie aktywnoci cyklazy adenylanowej moe spowodowa wiefe zmian w metabolizmie komrki wywoanych zwikszon iloci cAMP wpywajcego na aktywno wielu zalenych od cAMP kinaz biaek. Te zjawiska mog towarzyszy przechylaniu si rwnowagi metabolizmu komrkowego w kierunku stanu sprzyjajcemu transformacji lub jej podtrzymywaniu. nw. Z 5 mechanizmw opisanych powyej 4 pierwsze (insercja promotora, insercja sekwencji wzmacniajcych transkrypcj, translokacja chromosomu i amplifikacja genowa) wymagaj zwikszenia iloci produktu danego onkogenu, co zwizane jest ze zwikszon transkrypcj, lecz nie jest zwizane ze zmianami w strukturze produktu wytworzonego przez onkogen. Dlatego te, by moe, zwikszona ilo produktu onkogenu moe by wystarczajca do pchnicia komrki w kierunku ze-zoliwienia. Pity mechanizm, mutacja punktowa, wymaga zmiany w strukturze produktu powstaego z onkogenu, lecz niekoniecznie zwizany jest ze zmian iloci tego produktu. Te fakty wskazuj, e obecno strukturalnie nie normalnego biaka penicego funkcj gwnego regulatora w komrce moe by wystarczajc przyczyn przesunicia rwnowagi w kierunku procesu nowotworowego. Oceniajc rol onkogenw w patogenezie nowotworw, naley przypomnie, e onkoge-ny wyizolowano jedynie z ok. 15% ludzkich nowotworw. Jest prawdopodobne, e ich ak tywacja w co najmniej kilku przypadkach moe by jedynie wtrnym zjawiskiem, zwizanym z transformacj, a nie czynnikiem przyczynowym. Ich udzia w chemicznie indukowanych nowotworach dowiadczalnych jest dziedzin,
Uwagi oglne o aktywacji onkoge -
836 / ROZDZIA 61
ktra dopiero si rozwija. Ostatnio wykazano jednak, e aktywacja c-ras w raku gruczou piersiowego szczura wywoanego nitrozomety-iomocznikiem jest zwizana w oczywisty sposb ze swoist mutacj G-*A, co wskazuje, e onkogeny prawdopodobnie uczestnicz w chemicznej kancerogenezie. Poniewa w badaniach tych uyto jedynie pojedynczej dawki nitrozo-metylomocznika (bez adnego promotora) wydaje si, e opisana wyej mutacja moe by
wanym czynnikiem chemicznej kancerogenezy na etapie jej inicjacji. Potwierdzenie prawdopodobnego udziau onkogenw w zjawiskach inicjacji, promocji, progresji nowotworowej i w powstawaniu przerzutw wymaga jeszcze wielu bada. Poniej opisano 3 mechanizmy, za porednict wem ktrych produkty onkogenw mog stymulowa wzrost (ryc. 61-7): 1) mog one dziaa
Mechanizmy dziaania onkogenw.
S1S
Czynnik wzrostowy
Pyn zewn trz ko m rkowy
erb-B
Bona plazm styczna
Dyla pla ma
Prostaglandyny Leukotrieny
Ca1*
DNA
Jdro
Biaka zwizane z DNA
t
myc Ryc. 61-7. Schemat przedstawia mechanizmy, w wyniku dziaania ktrych produkty okrelo nych onkogenw mog zmieni metabolizm komrkowy i tym samym stymulowa wzrost. Cykliczny AM P moe wpywa na wieie procesw komrko wych aktywujc zalene od cAMP kinazy biaek. Kinaza bia kowo- tyrozy nowa i kinaza C biaek mog wpywa na aktywno wielu biaek docelowych. Jony wapnia wywieraj wiele elektw komrkowych podobnie jak prostaglandyny i leukotrieny wytworzone z kwasu arachidonowego. R receptor, G biako G, AC cyklaza adenylanowa, cAMP cykliczny AMP. Pl fosfatydyioinozytol, PKC kinaza C biaek, PTK kinaza biakowo -tyrozynowa, IP a inozytolo--trifosforan, DAG diacyfoglicerol, ER siateczka rdplazmatyczna.
RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 837 na gwne wewntrzkomrkowe szlaki metaboli czne uczestniczce w kontroli wzrostu, uniezale-
niajc je od egzogennego czynnika stymulujcego. Odpowiednimi przykadami (opisanymi powyej) s: produkt src dziaajcy jako kinaza biako w o-tyrozy nowa, produkt rai- dziaajcy jako stymulator aktywnoci cykazy adenylano-wej i produkt myc dziaajcy jako biako wice DNA. Kady z nich moe wpywa na kon-troJ mitozy, za pierwsze dwa przez zjawiska zwizane z fosfory lacj gwnych biaek regulacyjnych; trzeba przyzna, e wiedza o wzrocie komrki jest niedostateczna, szczeglnie w zakresie molekularnych aspektw regulacji mitozy, nawet w komrkach prawidowych; 2) produkty onkogeuw mog
imitowa dziaanie poli -peptydowego czynnika wzrostowego lub 3) imitowa swoisty receptor zwizany z jakim czyn nikiem wzrostowym (p.
POLIPEPTYDpWE CZYNNIKI WZROSTOWE S MITOGENNE

Badania naci czynnikami wzrostowymi nale do jednej z najszybciej rozwijajcych si dziedzin we wspczesnych naukach biomedycznych. Wyizolowano i czciowo scharakteryzowano wiele rnych czynnikw (tab. 61-7). Do niedawna tylko niewielkie iloci wikszoci czynnikw wzrostowych byy dostpne dla bada. Dzi jednak geny dla wikszoci czynnikw wzrostowych zostay sklonowane, potwierdzajc ich rnorodno i umoliwiajc uzyskiwanie ich w ilociach praktycznie uytecznych dziki technice rekombinacji DNA. Znane dzi czynniki wzrostowe dziaaj na wiele rnych rodzajw komrek, n.na komrki krwi, ukad nerwowy, tkanki mezehchymalne i nabonkowe. Wywouj efekt mitogenny w komrkach docelowych, chocia do wykazania takiego dziaania musz by spenione specjalne wa -
poniej). Badane sa take inne mechanizmy pobudzania wzrostu przez onkogeny.
Tabela 61-7. Niektre polipeptydowe czynniki wzrostowe* Czynnik wzrostowy Pochodzenie Naskrkowy czynnik wzrostowy <EGF) Erytro poety na Insulinopodobne czynniki wzrostowe 1 i II (IGF-I i IGF-II) Slinianki myszy Nerka, mocz Surowica
Funkcja Stymuluje wzrost wielu naskrkowych i nabonkowych komrek Reguluje rozwj macierzystych komrek erytrocytw Stymuluj wbudowywanie siarczanu do chrzstki, s mitogenne dla chondrocytw i wywouj insulinopodobne efekty w wielu komrkach Stymuluje produkcj IL-2 Stymuluje wzrost komrek T Tropowe efekty na sympatyczne i niektre sensoryczne neurony Stymuluje wzrost komrek mezyn-chymalnych i glejowych Jest podobny do EGF
lnterleukina-1 (IL-1) lnterleukina-2 (IL-2) Czynnik wzrostowy komrek nerwowych (NGF) Czynnik wzrostowy pytek krwi (POGF) Transformujcy czynnik wzrostowy {TGF-<x) Transformujcy czynnik wzrostowy (TGF-J3)
Pyn po hodowlany (conditioned media) Pyn pohodowlany (conditioned media) Mysie slinianki Pytki krwi Pyn pohodowlany {conditioned media) komrek transformowanych tub nowotworowych Nerka, pytki
Wywiera zarwno stymulujcy, jak i hamujcy wpyw na niektre komrki
* Wedug: Franks L (W., Teich N. M, {red.): tntroduction to the celtuiarandMolecutarBiology otCancst, Oxford Univ, Press, 1986, za zezwoleniem, zmodyfikowane.
838 / ROZDZIA 61
nmki, jak np. pozbawienie komrek w hodowli surowicy, aby stay si spokojne" (nierucho me) przed eksponowaniem ich na czynnik wzrostowy. Czynnik wzrostowy pytek krwi (PDGF) uwolniony z ziarnistoci pytek odgrywa prawdopodobnie rol w normalnym gojeniu si ran. Rne czynniki wzrostowe wydaj si odgrywa gwn rol w regulacji rnicowania si komrek macierzystych ukadu krwiot wrczego w kierunku rnego rodzaju dojrzaych kom rek tego ukadu. Istniej take czynniki hamujce wzrost (np. transformujcy czynnik wzrostowy TGF-P moe hamowa wzrost okrelonych komrek). Dlatego te przewleka ekspozycja na zwikszajce si iloci czynnika wzrostowego lub na malejce iloci czynnika hamujcego wzrost moe zmieni rwnowag wzrostu komrkowego. Czynniki wzrostowe dziaaj endokrynnie, parakrynnie lub autokrynnie Czynniki wzrostowe mog dziaa 3 ogl nymi drogami (p. take rozdz. 44): 1) ich efekty mog by endokrynne, tj. podobne do dziaania hormonw; mog one by syntetyzowane gdziekolwiek w organizmie i przemieszcza si drog krenia do komrek docelowych; 2) mog one by syntetyzowane w okrelonych komrkach, po czym s wydzielane i dziaaj na komrki ssiednie; jednak komrki syntetyzujce takie czynniki wzrostowe nie s przez nie atakowane, poniewa brakuje w nich odpowiednich receptorw; ten rodzaj dziaania nosi nazw para-krynnego; 3) niektre czynniki wzrostowe mog dziaa na te same komrki, ktre je syntetyzuj. Ten trzeci rodzaj dziaania nosi nazw auto-krynnego. Dla przykadu czynnik wzrostowy jest wydzielany, a potem przyczany do tej samej komrki, w ktrej powsta, przy zaoeniu, e posiada ona odpowiednie receptory. Jest rwnie moliwe, e pewna ilo takiego czynnika nie jest w ogle wydzielana, dziaajc bezporednio w obrbie komrki. Czynniki wzrostowe wpywaj na mitoz dziki przezbonowej transdukcji sygnaw Stosunkowo niewiele wiadomo o tym, jak czynniki wzrostowe dziaaj na poziomie molekularnym. Podobnie jak hormony polipeptydo-we (p, rozdz. 45), musz one przekaza posanie poprzez bon plazmatyczn do wntrza komrki (przezbotiowa transdukcja sygnau). W przy-
padku czynnikw wzrostowych posanie to bdzie oddziaywao na jeden lub wicej procesw zwizanych z mitoz. Wikszo czynnikw wzrostowych posiada receptory biakowe o wysokim powinowactwie w bonach plazmatycz-nych komrek odbierajcych posianie. Geny receptorw naskrkowego czynnika wzrostu (EGF) i insuliny zostay sklonowane, opracowano take modele ich struktury. Maj one krtkie segmenty przezbonowe oraz zewntrzne i cyto-plazmatyczne domeny o rnych dugociach. Ugandy wi si do zewntrznych domen. Wiele receptorw (np. dla EGF, insuliny czy PDGF) ma aktywno kinaz biakowo-tyrozyno-wych, przypominajcych produkt genu-src (p. wyej). Ta aktywno kinazy zlokalizowana w cytoplazmatycznych domenach powoduje autofosforylacj biaka receptorowego i take fosforyluje inne biaka docelowe. Kompleksy receptor-ligand ulegaj endocytozie w opasz-czonych pcherzykach (p. receptor LDL, rozdz. 27); nie wyjaniono jeszcze, czy receptory te ponownie wracaj do powierzchni komrki. Szczegowa sekwencja wydarze zwizana z przezbonowym przekazywaniem sygnaw jest stale jeszcze badana i jest rna dla rnych czynnikw. Zostanie ona opisana na przykadzie PDGF. Po ekspozycji komrek na PDGF, pobudzana jest fosfolipaza, po czym nastpuje hydroliza fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosfora-nu z wytworzeniem inozytolo-trisfosforanu i diacyloglicerolu (p, \-src, powyej i ryc. 44-7). Te dwa wtrne przekaniki mog odpowiednio spowodowa wewntrzkomrkowe uwolnienie jonw wapnia i stymulowa aktywno kinazy biaek C przez co oddziauj na wiele reakcji komrkowych. Kolejna hydroliza diacyloglicerolu przez fosfolipaz A2 uwalniajc kwas ara-chidonowy moe rwnie spowodowa produkcj prostaglandyn i leukotrienw, ktre same przez si mog wywoa wiele efektw biologicznych (p. rozdz. 24). Eksponowanie komrek na PDGF moe wywoa szybk (minuty do 1-2 godzin) aktywacj niektrych komrko wych proto-onkogenw (np. c-myc i c-fos). Wydaje si prawdopodobne, e aktywacja genw, niezalenie od tego, czy s to geny normalne czy protoonkogeny, uczestniczy w mechanizmie dziaania wikszoci czynnikw wzrostowych.
RAK, ONKOGENY I CZYNNIK) WZROSTOWE / 839
Istniej rne rodzaje interakcji midzy czynnikami wzrostowymi a onkogenami Produkty rnych onkogenw s albo czyn nikami wzrostowymi, albo czciami receptorw dla czynnikw wzrostowych (tab. 61 -6). acuch B czynnika PDGF zawiera 109 aminokwasw. Wydaje si prawdopodobne, e acuch B jest biologicznie aktywny jako homo-dimer bez udziau acucha A. Odkrycie, e v-sis koduje 100 ze 109 aminokwasw acucha B czynnika PDGF ujawniao wystpowanie bezporedniej zalenoci midzy onkogenami a czynnikami wzrostowymi. To take sugeruje, e autokrynna stymulacja przez PDGF stanowic cigy bodziec mitogenny moe by wanym czynnikiem w mechanizmie transformacji komrek przez v~sis. Rzeczywicie, wiele komrek nowotworowych hodowanych w kulturach, wykazuje zdolno wydzielania czynnikw wzrostowych do otaczajcego je rodo wiska, a take ma receptory dla tych czste czek. Analiza sekwencyjna v-erb-B wykazaa, e koduje on skrcon posta receptora dla EGF, w ktrym znaczna cze zewntrznych domen zostaa pominita, lecz zachowana zostaa aktywno kinazy biakowo-tyrozynowej. Sugeruje to, e nienormalna posta receptora EGF kodowana przez \-erb-B moe by stale aktyw-na} jeli obecna jest w komrkach, symulujc obecno receptora zwizanego ze swoim czynnikiem wzrostowym. Jak w przypadku auto-krynnej stymulacji wywoanej przez czynnik PDGF, moe to stanowi cigy mitogenny sygna przeprowadzajcy" komrk do stanu transformowanego. Transformujcy czynnik wzrostowy (TGF -P) pocztkowo uwaano za pozytywny czynnik wzrostowy, gdy zmusza on fibroblasty do zachowywania si w taki sposb, jak gdyby byy one transformowane. Obecnie wiadomo, e TGF-P hamuje wzrost wikszoci komrek z wyjtkiem fibroblastw. Hamuje on rwnie wzrost komrek nerki mapiej syntetyzujcych ten hormon. TGF-fS moe aktywowa gen sis w fibroblastach. Nie wiadomo jeszcze, w jaki sposb wywouje on efekt hamujcy na inne komrki. Jak zaraz si dowiemy, istniej inne dowody na to, e okrelone geny koduj produkty, ktre opniaj wzrost komrk i oraz, e istniej geny hamujce powstawanie nowotworw. Tak wic kontrola wzrostu komrki jest bardzo zoona. Uczestnicz w niej bowiem
zarwno pozytywny jak i negatywne czynniki regulujce. W PEWNYCH RODZAJACH NOWOTWORW WANA JEST UTRATA GENW HAMUJCYCH WZROST (ANTY- ONKOGENW) Ostatnio uznano, e geny inne ni onkogeny odgrywaj istotn rol w wywoywaniu co naj mniej kilku rodzajw nowotworw. S to geny hamujce wzrost (growth suppresor genes). Geny te dziaaj w odmienny sposb ni onkogeny, gdy utrata tych genw supresorowych powoduje zanik okrelonych mechanizmw kontroli wzrostu. Wanym modelem dla zrozumienia dziaania takich genw jest siatkwczak (reti-noblastoma). Retinoblasty s prekursorami komrek czopkw siatkwki bdcych fotorecep-torowymi komrkami siatkwki. Cytologiczne analizy chromosomw ludzkiego siatkowczaka wykazay, e czsto obserwuje si w nim brak dugiego ramienia chromosomu 13. To sugeru je, e doszo do utraty genu o istotnym znacze niu w tej cz ci chromosomu 13. Gen ten nazywano genem Rb. Przypuszcza si, e pro dukt tego genu wykazuje waciwoci hamowania wzrostu w normalnych komrkach. Wanie tego genu brak w siatkwczaku. Genetyczne badania wykazay, e do tego, aby powsta nowotwr, musz zosta
inaktywowanc obie kopie genu Rb.
Ostatnio okazao si, e by moe istnieje do znaczna liczba genw, ktrych produkty dziaaj jako ujemne regulatory wzrostu komrki i obie kopie tych genw musz by inak-tywowane, aby powsta nowotwr. Takie geny hamujce wzrost nazywa si take anty-onkoge-nami lub genami hamujcymi wzrost nowotworu (tumor-suppressing genes). Utrat anty-onko-genw uznano ju za istotny czynnik w patogenezie jednego z rodzajw nowotworw gruczou piersiowego, nowotworu Wilmsa w nerce i raka drobnokomrkowego puc. Ostatnio udao si sklonowa normalny gen Rb, dziki czemu bdzie moliwa dokadna analiza produktu tego genu. Inne badania sugeruj, e produkt genu Rb zlokalizowany jest w jdrze i e moe on dziaa jako czynnik modulujcy ekspresj genw. Poszukiwanie anty-onkogenw i iden tyfikacja sposobw ich dziaania jest wielkim osigniciem wspczesnych bada nad rakiem. Z terapeutycznego punktu widzenia pojawia si
840 / ROZDZIA 61
podniecajca moliwo, e wprowadzenie normalnych chromosomw kodujcych czynniki hamujce wzrost do okrelonych komrek nowotworowych mogoby skorygowa ich zmienion szybko wzrostu.
Tabela 61-8. Zmiany biochemiczne czsto wykrywane w szybko rosncych komrkach nowotworowych Zwikszona aktywno reduktazy nukleotydowej Zwikszona synteza RNA i DNA Zmniejszony katabolizm pirymidyn Nasilona glikoliza tlenowa i anaerobowa Zmiany w profilach izoenzymw, czsto zblione do profilu podowego Synteza biaek pfodowych (np. antygen rakowo-podowy) Utrata zrnicowanych funkcji biochemicznych (np. zmniejszona synteza wyspecjalizowanych biaek) Nieodpowiednia synteza okrelonych czynnikw wzrostowych i hormonw
ZOSLIWIENIE KOMREK NOWOTWOROWYCH WYDAJE SI POSTPOWA

Jeeli komrka raz stanie si komrk nowotworow, to skad i zachowanie si jej i komrek z niej powstaych nie jest cech sta. Zamiast tego nasila sie tendencja do zloliwienia komrek. Przejawia si to wzrostem liczby nienormalnych kariotypw, nasileniem szybkoci wzrostu, wzrastajc inwazyjnoci i tworzeniem przerzutw. Zjawisko progresji znajduje swoje odbicie w niezwykej niestabilnoci genomu komrek nowotworowych. Moe ono by zwizane z aktywacj dodatkowych onkogenw. Komrki ze zwikszon szybkoci wzrostu korzystaj ze szczeglnych przywilejw. Wane jest rozrnienie profilw biochemicznych komrek, ktre dopiero co zostay transformowane, od tych, ktre cechuje szybki wzrost, a ktre s ju wysoce zoliwymi komrkami nowotworowymi. Pierwsze mog wykazywa kilka rnic w porwnaniu z normalnymi komrkami niezalenie od ich zasadniczych zmian prowadzcych do powstania nowotworu (np. aktywacja jednego lub kilku onkogenw) oraz cechy zwykle zwizane z transformacj (tab. 61-5). Analiza takich komrek moe ujawni gwne biochemiczne zmiany wywoujce transformacj. Biochemiczne profile wysoce ze-zoliwionych komrek mog by cakowicie odmienne od kom rek normalnych. Opisano wiele zmian w profilach enzymatycznych i innych parametrach biochemicznych (tab. 61-8), przy czym niektre z nich s wtrne, 2wizane z szybkim wzrostem, inne za s prawdopodobnie zwizane z niestabilnoci chromosomw. Szybko rosnce komrki wykazuj tendencje do
maksymalizowania procesw anabo licznych
regulacji genw, np. syntetyzuj niektre biaka podowe (niektre z nich mog by uyte jako markery nowotworowe, p. tab. 61-1), czynniki wzrostowe lub hormony. Wydaje si nieprawdopodobne, e analizy takich komrelr mog ujawni pierwotne gwne zmiany odpowiedzialne za transformacj, czciowo dlatego, e s one zamaskowane przez wspwystepujce liczne zmiany wtrne, zwizane z progresj. Pomimo tego jednak, znajomo biochemicznych profilw takich komrek jest niezwykle uyteczna przy wyborze chemioterapii, gdy jest to dokadnie ten typ komrek, ktre chcieliby zwalcza onkolodzy.
NAJBARDZIEJ NIEBEZPIECZN CECH KOMREK NOWOTWOROWYCH JEST ZDOLNO DO TWORZENIA PRZERZUTW

Przerzutami okrela ci rozsianie komrek nowotworowych z miejsca ich pierwotnego powstania do innych tkanek, gdzie mog one rosn jako wtrne nowotwory. Przerzuty s najwikszym problemem w chorobie nowotworowej. Analiza powstawania przerzutw u ludzi jest bardzo zoonym procesem, a wiedza o biochemicznych podstawach tego zjawiska jest bardzo ograniczona. Poniewa proces ten jest wyrazem upoledzonych interakcji midzy komrkami, wiele uwagi powicono badaniu biochemii powierzchni komrek prawidowych
zwizanych ze wzrostem (np. synteza DNA i RNA) i zmniejszania funkcji kata boi icznych (np. katabolizm pirymidyn), a take nie wykazuj swoistych funkcji cechujcych ich normalnych przodkw. Innymi sowami wszystkie procesy toczce si w takich komrkach dotycz prawie wycznie wzrostu. Wykazuj one take zmiany biochemiczne, wiadczce o zmienionej
RAK, ONKOGENY I CZYNNIKI WZROSTOWE / 841 Tabela 61 -9. Niektre zmiany wykryte na powierzchni komrek nowotworowych* Zmiany przepuszczalnoci Zmiany waciwoci transportowych Zmniejszona adhezja Zwikszona zdolno do aglutynacji przez wiele lektyn Zmiany aktywnoci yielu enzymw (np. okrelone proteazy) Zmiany adunku powierzchniowego Pojawienie si nowych antygenw Utrata okrelonych antygenw Zmiany w otigosacharydowych acuchach okre lonych glikoprotein Zmiany w skadnikach glikolipidw * Wedug Robbins J.C., Nicolson G.L.: Surfaces of normal and adepted calls; w: Cancer: A Comp-rehensive Treatise. Vol 4. Becker Ff (red.). Plenum Press, 1975, za zezwoleniem.
nastpstwem zrriian aktywnoci okrelonych glikozylotransferaz glikoproteinowych) mog mie kliniczne znaczenie w pojawianiu si przerzutw. Wyjanienie mechanizmw biochemicznych zwizanych z powstawaniem przerzutw moe by podstaw racjonalnego opracowania skuteczniejszych form terapii przeciw nowotworowej.
PIMIENNICTWO
Barbacid M: Oncogenes and human cancer: Cause or conseuence? Carcinogenesis 1986;7:1037. Bishop JM: The molecular genetics of cancer. Science 1987; 235:305. Croce CM, Klein G: Chromosme translocations and human cancer. Sci Am (March) 1985; 252:54. Darnell J, Lodish H, Baltimore D: Molecular Celi Biology. Scientific American Books, 1986. Feldman M, Eisenbach L: What makes a tumor celi metastatic? Sci Am (Nov) J988;259:60. Franks LM, Teich N: Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. Oxford Univ Press, 1986. Hunter T, Cooper JA: Protein-tyrosine kinases. Annu Rev Biochem 1985;54:897. Massague J: The transforming growth factors. Trends Biochem Sci 1985;10:237. Mclntire KR: Tumor markers: How useful are they? Hosp Prci (Dec) 1984;19:55. Nicolson GL: Celi surface molecules and tumor metastasis: Regulation of raetaslatic phenotypic diversity. Exp Celi Res 1984;150:3. Pitot HC: Fundamentals of Oncology. 3rd ed, Marcel Dekker, 1986. Sporn MB, Roberts AB: Autocrine growth factors and cancer. Natur 1985;3I3:745. Tannock IF, Hill R (editors): The Basie Science of Oncology. Pergamon Press, 1987. Weinberg, RA: Finding the anti-oncogene. Sci Am (Sept) 1988; 259:44.
i nowotworowych. Udokumentowano wystpowanie wielu zmian zachodzcych na powierzchniach komrek nowotworowych (tab. 61-9), chocia nie wszystkie z nich s bezporednio zwizane z procesem powstawania przerzutw. Obecnie prowadzi si wiele prac zmierzaj cych do opracowania odpowiedniego modelu zwierzcego, przydatnego do bada nad zjawiskiem powstawania przerzutw. Wykonano take wiele bada, aby wykaza prawdopodobn rol wielu proteaz (np. kolagenazy typu 4) i wielu glikoprotein i glikosfingolipidw powierzchni komrek w procesie powstawania przerzutw. Dla przykadu, istnieje prawdopodobiestwo, e zmiany w acuchach oligosacha-rydowych glikoprotein komrkowych (bdce
62
WPROWADZENIE
Biochemia a choroby
W rozdziale 1 wyraono opini, e znajomo biochemii jest wana nie tylko dla zrozumienia stanu i podtrzymywania zdrowia, ale rwnie dla zrozumienia skutecznego leczenia chorb. Inaczej mwic, znajomo biochemii oferuje racjonalne podejcie oparte na podstawach dowiadczalnych (a nie na dogmatach) do problemw zdrowia i choroby. W dotychczasowym tekcie niniejszego podrcznika przewijay si liczne zaburzenia biochemiczne bdce przyczyn utraty zdrowia i powstawania choroby. Z koniecznoci pojawiay si one w sposb przypadkowy, a nie uporzdkowany. Celem niniejszego rozdziau s: Ponowne silne podkrelenie znaczenia po trzeby precyzyjnego okrelenia nieprawidowoci biochemicznych prowadzcych do utraty zdro wia lub rozwoju cferoby. Tylko znajomo tych zaburze moe by podstaw racjonalnej terapii. Zwize przedyskutowanie przyczyn cho roby z biochemicznego punktu widzenia oraz podkrelenie, e przyczyny te uszkadzaj struk tur pewnych biologicznie bardzo wanych czs teczek (np. DNA) lub te reakcje biochemiczne i procesy, w ktrych te czsteczki uczestnicz. Przedstawienie kilku wanych zagadnie dotyczcych biochemicznych aspektw chorb w ogle, w tym w szczeglnoci chorb genetycz nie uwarunkowanych. Ilustracja praktycznego zastosowania bio chemii w medycynie przez przedstawienie wy branych historii chorb dotyczcych gwnych kategorii chorb. Wypenianie luki dzielcej nauk bioche mii klasycznej z praktycznym jej wykorzy staniem dla dobra chorych.
WYJA NIENIE PODST AW BIOCHEMICZNYCH STANW ZDROWIA I CHOROBOWYCH STANOWI PODSTAW RACJONALNEJ TERAPII Wyjanienie podstaw biochemicznych sta nw zdrowia i stanw chorobowych jest przewanie podstaw racjonalnego leczenia. Z tekstu niniejszego rozdziau powinno wynika, e utrzymywanie stanu zdrowia zalene jest od dostatecznej poday wody, kalorii, witamin, pewnych skadnikw mineralnych, aminokwasw i kwasw tuszczowych. Dla przykadu naley przypomnie, e poznanie fundamentalnej roli witamin w przemianie materii oraz nastpstw ich niedoboru zapocztkowao racjonaln terapi szkorbutu - witamin C, krzywicy - witamin D, za choroby beri-beri tia-min. Te przykady dobitnie ilustruj, e dla racjonalnej i skutecznej terapii chorb niezbdna jest znajomo przyczyny i mechanizmw ich powstawania. Przyzna jednak trzeba, e do dzisiaj nieznane s przyczyny takich chorb, jak choroba Alzheimera, miadyca i schizofrenia. Dlatego te, w tych stanach chorobowych leczenie jest zwykle objawowe i empiryczne, a wic nie majce na celu korekty wystpujcej anomalii biochemicznej. Dlatego te leczenie tych chorb jest przewanie mao skuteczne. Skutki ekonomiczne i ludzkie takiej niewiedzy s ogromne. Podkreli jednak naley, e nawet znajomo istoty choroby na poziomie molekularnym nie zawsze pozwala na skuteczne jej leczenie albo z powodw technicznych, albo te niemonoci penej korekty wystpujcych anomalii biochemicznych. Przykadem tego jest niedokrwistoc sierpowata. W chorobie tej nie udao si jeszcze
BIOCHEMIA A CHOROBY / 843
skorygowa wystpujcego defektu genetycznego. Szybki postp w zakresie terapii genowej zapewne sprawi, e twierdzenie o nieuleczalno-ci defektu genetycznego warunkujcego niedo-krwisto sierpowat lub inne choroby genetyczne ju niedugo bdzie histori.
ROZPATRUJC CHOROB Z PUNKTU WIDZENIA BIOCHEMICZNEGO NALEY UWZGLDNI SZE ASPEKTW

W tym akapicie przedstawione zostan oglne zagadnienia, ktre s wane przy rozpatrywaniu biochemicznych aspektw chorb. Wiele chorb jest genetycznie uwarunkowanych. Zagadnienie to jest tak wane, e zostanie om wione oddzielnie w dal szej czci rozdziau. W chorobach zaburzon a jest struk cych w ko mrkach, Zagadnienie to jest krtko przedstawione1** tab. 62-1 na podstawie kilku przykadw. Bioczsteczki mog by do tknite pierwotnie lub wtrnie. W chorobach genetycznych pierwotny defekt znajduje si w DNA, za zmiany struktury, funkcji i iloci bioczsteczek s zjawiskami wtrnymi. Zaburzenia biochemi czne bd ce przycz yn choroby mog si ro zwija szybko lub wolno. Niektre choroby roz wijaj si szybko, np. mier moe wystpi w cigu minut lub krcej po masywnej za krzepicy naczy wiecowych (patrz niej przypadek nr 4). Dowodzi to, e niektre tkanki (szczeglnie tkanka mzgowa i misie sercowy) s bardzo wraliwe na brak tlenu i substratw energodajnych (np. glukozy dla tkanki mzgowej). Najlepszym przykadem za lenoci czowieka od tlenu jest fakt, e cyjanek (hamujcy oksydaz cytochromow) zabija go w cigu kilku minut. Masywna utrata wody i elektrolitw wystpujca u chorych zakao nych przecinkowcami cholery (patrz niej przypadek nr 3) zagraa yciu ju w kilka godzin od wystpienia choroby. Oglnie m wic, nage i znaczne zmiany w steniach i rozmieszczeniu pewnych elektrolitw (np. po tasu) s niebezpieczne ze wzgldu na znaczn wraliwo min. minia sercowego na takie zmiany. Rwnie znaczne zmiany pH pynw ustrojowych tolerowane s przez ustrj tylko przez krtki okres. Z drugiej strony potrzebne s lata zanim namagazynowane bioczsteczki (nie rozkadane z powodu braku enzymw izosomalnych) uszkodz czynno okrelonych kom rek i narzdw. Tego przykadem jest wzgldnie wolne nagromadzanie si sfingomieliny w ko mrkach wtroby i ledziony wystpujce w a godnych postaciach choroby Niemanna-Picka.
WSZYSTKIE CHOROBY ODZNACZAJ SI OKRELONYMI ZABURZENIAMI BIOCHEMICZNYMI

W tabeli 1-1 przedstawiono gwne przyczyny chorb. Jak wiemy, ycie na ziemi zalene jest od reakcji biochemicznych. Ustanie tych reakcji prowadzi do mierci. Zdrowie zalene jest od regulacji tysicy reakcji biochemicznych przebiegajcych harmonijnie w komrkach i procesw czuwajcych nad staoci wewntrznego rodowiska (w odniesieniu do stenia H+, molalnoci i skadu elektrolitowego pynw ustrojowych itd.). Choroba charakteryzuje si zaburzeniami elementw strukturalnych (np. sekwencji nukleotydw w nici DNA u chorych z chorobami uwarunkowanymi genetycznie), iloci pewnych bioczsteczek albo te zaburzeniami przebiegu reakcji lub procesw biochemicznych. Zaburzenia te, o charakterze przejciowym lub staym, wywoane s przez czynniki przyczynowe wymienione w tab. 1-1. Prowadz one czsto do powanych zmian rodowiska wewntrznego. Zmianom tym mog przeciwdziaa mechanizmy wyrwnawcze, skuteczne tylko przez okrelony czas. Opisy przypadkw chorobowych podanych w dalszej czci rozdziau ilustruj rne aspekty jednej choroby powstaej pod wpywem jednej z przyczyn wymienionych w tab. 1-1. Powysze spojrzenie na chorob jest z koniecznoci znacznym uproszczeniem. Dopatruje si ono przyczyny choroby w anomaliach strukturalnych i czynnociowych komrek, narzdw i ukadw powstaych w nastpstwie mechanizmw biochemicznych. Chory natomiast przeywa chorob bdc nie tylko wynikiem okrelonych zaburze biochemicznych, lecz odbiciem zmian jego bycia, czynnikw kulturowych i innych. Lekarz musi leczy caego chorego, uwzgldniajc czynniki socjalne, psychologiczne, kulturowe, ekonomiczne i inne. Jego postpowanie powinno by jednak zawsze oparte na rzetelnej wiedzy biochemicznej, fizjologicznej i znajomoci mechanizmw chorobowych.
tura, funkcja lub te ilo wszystkich rodzajw bioczsteczek wystpuj
844 / ROZDZIA 62 Tabela 62-1. Przykady udziau rnych bioczsteczek w patogenezie chorb
B i oczsteczka
DNA RNA Biako Lipidy {GM J
Zmiana dotyczy
Struktury Struktury Struktury {czynnoci} Iloci (wzrost)
Choroba
Hemoglobinopatia HbS Okrelone typy ta ase mi i HbS Choroba Taya-Sachsa
Po dsta wo wa p rz ycz yna Mutacja Mutacja bdca przyczyn wadliwego splicingu" mRNA Mutacja Mutacja bdca przyczyn nieprawidowej heksozoami-nidazy A Mutacja genu kodujcego enzym rozkadajcy glikogen (fosforylaza) Mutacja bdca przyczyn nieprawidowej i d u ron i d azy Mutacja dotyczca biaka bo nowego uczestniczcego w transporcie cr Infekcja Jelita cienkiego przez przecinko wiec cholery
Wielocukier (glikogen) GAG {siarczan der-matanu i heparanu) Chlorki (Cl")
Iloci (wzrost)
Choroba spichrzenia glikogenu Zesp Hurler pocie Mukowiscydoza
Iloci { wzrost) Stenia (wzrost) w
Woda
iloci (spadek)
Cholera
Tabela 62-2- Udziat gwnych organelli rd kom orko wych w rnych chorobach
Organelum
Jdro Mitocho n-dri um
Choroba(y)
Wikszo chorb genetycznych M utacje DNA
Mechanizm
Wiele chorb w tym wrodzona Mutacje mttochondrialne DNA wpywajce na struktur neurooatia nerwu wzro ko we- biaek (np. dehydrogenazy NADH) kodo wanych przez go Lebera i miopatie geno m mitocho ndrialny mito-chondriatne Objawy toksyczne spo wodo - Enzymy siateczki rdplazmatycznej, takie jak cytochrom wane zwizkami chemicznymi P- 450, atakuj rne substancje chemiczne, przekszta np. CCI4 cajc je w postacie toksyczne l-cell" disease Brak fosfotransferazy GIcNAc w aparacie Golgiego jest powodem nieprawido wego transportu enzymw lizosomalnych i wydzielania tych enzymw przez dotknite komrki Zmiany w zakresie oligosacharydw glikoprotein bo n plazmatycznych maj odgrywa wan rol w powstawaniu przerzutw Obnio na aktywno {spowodowana hydrolaz lizosomalnych jest przyczyn rnych bioczsteczek mutacjami) spichrzenia
Siateczka rdplazmatyczna Aparat Gol-giego
Bona plazmatyczna Lizosomy
Przerzuty komrek nowotwo rowych Choroby lizo-somalne spichrzeniowe
Peroksysomy
produkcja pero ksysomw i maa aktywno pew Zesp Zeilwegera (zespl m-zgo wo - wtro bo wo -nerko nych enzymw pero ksysomalnych, np. acylotrartsferazy d i h y d ro ksy a ceto n of o sio ra n o wej wy) i inne
BIOCHEMIA A CHOROB Y
/ 845
4. Choroby mog by spowodowane niedoborem lub nadmiarem pewnych
Powysze przykady uzasadniaj kliniczny podzia chorb na ostre i przewleke.
bioczsteczek. To twierdzenie mona naj lepiej zilustrowa rozpatrujc stany niedoboru i nadmiaru witaminy A (p. rozdz. 54). Niedobr tej witaminy jest przyczyn kurzej lepoty (niedowidzenia nocnego). Z drugiej strony nadmiar witaminy A moe^by przyczyn wystpienia ostrych i przewlekych objaww toksycznych. Podobnie niedobr witaminy D jest przyczyn krzywicy, za jej nadmiar niebezpiecznej hiper-kalcemii. Mwic o niedoborach pokarmowych wskazane jest rozrnienie niedoborw pierwotnych (spowodowanych podawaniem diety niedoborowej) od wtrnych. Przyczynami niedoborw wtrnych mog by: 1) wadliwe wchanianie pokarmw z przewodu pokarmowego, 2) zwikszone zapotrzebowanie, 3) niedostateczne zuytkowanie lub 4) wzmoone wydalanie z ustroju pewnych skadnikw pokarmowych. Liczne choroby lub stany chorobowe mog by
przyczyn jednego lub kilku rodzajw ww. niedoborw pokarmowych. P rawie ka de organellum sutako mo rko we u czes tn i czy w p a to g en ezi e
okrelonej choroby. Twierdzenie to ilust ruje tab. 62-2. W tabeli tej podane s organella komrkowe uczestniczce w patogenezie po szczeglnych chorb. Rne mechanizmy biochemiczne mog by przyczyn podobnych: 1) zmian chorobowych, 2) objaww klinicznych oraz 3) zmian wynikw bada laborato
ryjnych. Ustrj dysponuje raczej ograniczon liczb sposobw reakcji na czynniki patogenne podane w tab. 1-1. Te sposoby reakcji okrela si oglnie jako procesy chorobowe (tab. 62-3). Procesy te mog jedt^k by wywoane przez liczne i rnorodne czynniki chorobotwrcze, np. bardzo liczne i rnorodne rodzaje bakterii i wirusw mog by przyczyn ostrych i prze wlekych stanw zapalnych. Podobnie powik szenie wtroby (hepatomegatia) moe by spo wodowane spichrzeniem glukozyloceramidu,
T abela 62-3. Gwne procesy chorobowe bdce reakcj ustroju na czynniki chorobotwrcze Proces chorobowy Przyczyna choroby Przykadowa choroba Przykadowa biocz -steczka uczestniczca w procesie chorobowym Mediatory zapalenia (prostaglandyny leukotrieny) Etanol Glukozy loceramid Niedostateczna poda skadnikw od ywczych zawartych we krwi elazo
Zmiany zapalne ostre ub przewleke Zm i a ny z wy rod n ie n i o we
Infekcje bakteryjne lub wirusowe Rne czynniki ctiemtczne
Zapalenie plu
Stuszc2enie wtroby Choroba Gauchera Zanik nerki
Powikszenie okrelonego Spichrzanie okrelonego narzdu (np. wtroby) zwizku Zmiany zanikowe (zmniejszenie wielkoci) Niedokrwisto Niedokrwienie narzdu
Niedobr witamin i pierwiastkw ladowych Nawietlania promie niami X Niedostateczna poda krwi Czsto wystpuje po obumarciu komrek Due, miejscowe stenie okrelonego zwizku
Niedokrwisto syderopeniczna Rne biaaczki Zawa minia sercowego Marsko wtroby
Zmiany no wotworowe Obumarcie komrek Wknienie (librosis") Tworzenie si Kamieni
Uszkodzenie przez promienie X DNA Brak tlenu Gromadzenie si kolagenu
Kwas moczowy Tworzenie si kamieni nerkowych u chorych z dn
846 / ROZDZIA 62
lecz znacznie czciej uwarunkowane jest niewydolnoci krenia lub przerzutami nowotwo rowymi. Marsko wtroby moe by spowodowana naduyciem etanolu, spichrzeniem miedzi (choroba Wilsona) lub elaza (hemochromato-za pierwotna lub wtrna) lub te niedoborem otj-antytrypsyny. Ponadto rnorodne wrodzone bdy metaboliczne mog spowodowa niedorozwoje umysowe, za wiele czynnikw moe wywoa ketoz. Innym przykadem tego, e rne zaburzenia biochemiczne mog prowadzi do podobnego efektu kocowego, jest lokalne wytrcanie si okrelonych skadnikw po przekroczeniu ich rozpuszczalnoci w pynach ustrojowych. Przekroczenie punktu rozpuszczalnoci tych skadnikw moe by spowodowane nadmiernym ich wytwarzaniem lub (i) upoledzonym wydalaniem z ustroju. Kocowym efektem wytrcania si pewnych skadnikw moe by np. kamie. Przyczynami kamicy nerkowej mog by: szczawian wapniowy, fosforan magnezowo-amonowy, kwas moczowy i cys-tyna. Powodem wytrcenia si wymienionych zwizkw s jednak odmienne mechanizmy biochemiczne. Reasumujc naley powiedzie, e rnorodne przyczyny biochemiczne mog wywoa podobne zmiany chorobowe (np. marsko wtroby), podobne objawy kliniczne (np. upoledzenie umysowe) lub podobne odchylenia w zakresie bada laboratoryjnych (np. ketoz). Pomimo tego moliwe jest. opierajc si na wywiadach, wynikach badania fizykalnego i wynikach odpowiednich bada laboratoryj nych okrelenie czynnika wywoujcego okrelon chorob lub objaw chorobowy. WCIGU NASTPNEJ DEKADY NAJPEWNIEJ ZOSTANIE WYJANIONE MOLEKULARNE PODOE WIKSZOCI CHORB GENETYCZNYCH Ponad 3000 chorb ma podoe genetyczne. Choroby genetyczne stanowi 10% wszystkich dzieci hospitalizowanych w wielu szpitalach. Rwnie wiele chorb przewlekych wystpujcych u dorosych (np. cukrzyca i miadyca) wykazuje istotny udzia komponentu genetycznego. Wprowadzenie techniki rekombinacji genetycznej oraz metod sekwencjo no wani a DNA zrewolucjonizoway genetyk, w tym genetyk lekarsk w szczeglnoci. Przewiduje si, e dziki tym technikom moliwe bdzie wyja -
nienie do roku 2000 molekularnego podoa wikszoci chorb genetycznych. Gwne klasy chorb genetycznych to zaburzenia chromosomalne, jednogenowe i zaburzenia wieloczynnikowe Choroby genetycznie uwarunkowane mona podzieli na 3 klasy, a mianowicie na: 1) choroby chromosomalne, 2) choroby jednogenowe (dziedziczce si wg praw Mendla) i 3) wieloczynnikowe, w ktrych uczestniczy wiele genw (choroby wielogenowe). Choroby chromosomalne nie zostan omwione szczegowo. S one uwarunkowane brakiem lub nadmiarem chromosomw, delecj czci chromosomu lub translokacj. Najlepiej poznan chorob chromosomaln jest trisomia 21 (zesp Downa). Choroby te mona rozpozna przez badanie kariotypu (okrelenie liczby chromosomw) u chorego. Wykazano, e trans-lokacje chromosomalne odgrywaj wan rol w aktywacji onkogenw (rozdz. 61). Choroby jednogenowe spowodowane s mutacj jednego genu. Mog one dziedziczy si 1) dominujce genem autosomalnym, 2) recesy-wnie genem autosomalnym lub te s 3) sprzone z chromosomem X. Okrelenie dominujco" oznacza, e choroba wystpuje rwnie wwczas, kiedy z pary chromosomw tylko jeden chromosom dotknity jest mutacj (czyli choroba wystpuje nawet u heterozygot). Okrelenie recesywnie" oznacza, e choroba wystpuje tylko u homozygot (obydwa chromosomy jed nej pary musz by dotknite mutacj). Okre lenie sprzony z chromosomem X" oznacza, e mutacja wystpuje na chromosomie pciowym X. Poniewa kobiety posiadaj dwa chromo somy X, mog one by heterozygotami, albo te homozygotami w odniesieniu do zmutowanego genu. Tak wic u kobiet dziedziczenie sprzone z chromosomem X moe mie charakter domi nujcy lub recesywny. Z cfrugiej strony, mczyni posiadaj tylko jeden chromosom X, co oznacza, e zawsze choruj, jeeli mutacja dotyczy tego wanie genu. Kada z wymienionych trzech klas chorb genetycznych dziedziczy si wg wasnego charakterystycznego sposobu dziedziczenia. Na tym miejscu naley sign po podrcznik genetyki lekarskiej, w celu uzys kania szczegowych danych w tym.zakresie. Choroby genetyczne wieloczynnikowe spowodowane s dziaaniem kilku genw. Dziedziczenie tych chorb nie odbywa si wg klasycznych
BIOCHEMIA A CHOROBY / 847 Tabsla 62-4. Przykady wszystkich trzech klas chorb genetycznych Klasa Wada chromosomalna Przykad Trisomia 21 (zesp Downa) Przewleka biaaczka szpikowa H i perchoiesterolemia rodzinna Plsawica Huntingtona Mukowiscydoza Uwagi Czsto wystpowania wrd noworodkw w miar wzrostu wieku matki Obecno chromosomu Philadefphta Dziedziczy si genem autosomalnym jako cecha dominujca, mutacja dotyczy genu kodujcego receptor dla LDL Dziedziczy si genem autosomalnym jako cecha dominujca, rozpoznanie prenatalne wady jest ju moliwe Dziedziczy si genem autosomalnym jako cecha rce-sywna, wikszo chorych wykazuje delecj reszty fenyloalaninowej w biaku bonowym regulujcym transport jonu chlorkowego^
Wada jednogenowa * Wada jednogenowa Wada jednogenowa
Wada jednogenowa
Hemoglobinopatia HbS Dziedziczy si genem autosomalnym jak cecha recesy-wna. Mutacja dotyczy zamiany Gtu na Val w pozycji 6 acucha f) globiny Fenyloketonuria Dystrolia mini typu Duchenne'a Hemofilia Dziedziczy si genem autosomalnym jako cecha rece-sywna. Wada spowodowana jest mutacj genu kodujcego hydroksylaz fenyloalaninow Dziedziczy si genem X; wada dotyczy syntezy dystrofiny
Wada jednogenowa
Wada jednogenowa Wada jednogenowa Wada wielogenowa
Dziedziczy si genem X. Wada dotyczy syntezy czynnika VIII krzepnicia (AHG) Choroba niedokrwien- Podoe genetyczne choroby jest zoone; badania polimorfizmu DNA kodujcego lipoproteiny zapowia na serca daj moliwo wykrywania osobnikw genetycznie predysponowanych Samoistne nadcinienie Sugerowana jest rwnie teoria dopatrujca si przyttnicze czyny choroby w mutacji jednogenowej
Wada wielogenowa
praw Mendla. O tej klasie chorb genetycznych wiadomo mniej ni o chorobach innych klas, chocia odgrywaj one coraz wiksze znaczenie w powstawaniu spoecznych chorb wieka dorosego, do ktrych zalicza si niewydolno naczy wiecowych oraz nadcinienie ttnicze. W tabeli 62-4 podano kilka wanych przykadw chorb genetycznych dla kadej z wymienionych trzech klas. Mutacje genomu mitochondHalnego mog by rwnie przyczyn choroby Ludzki mitochondrialny DNA liczy w przyblieniu 16,5 kilozasad i koduje 13 biaek, przy czym wszystkie one s skadnikami procesu fosforylacji oksydacyjnej. Mitochondrialny DNA rni si od DNA jdrowego trzema cechami: 1) przekazywany jest przez matk,
2) zawiera mao intronw i 3) jego kod genetyczny rni si nieco od kodu DNA jdrowego. Ponadto odznacza si du czstoci wystpowania mutacji oraz polimorfizmem. Stwierdzono, e mutacje mitochondrialnego DNA uczestnicz w patogenezie niektrych miopatii mito-chondrialnych oraz we wrodzonej neuropatii nerwu wzrokowego Lebera (LHON). Miopatie mi-tochondrialne charakteryzuj si osabieniem mini szkieletowych, zmianami biochemicznymi mitochondriw oraz obecnoci w biopta-tach miniowych nierwnych" (poszarpanych) wkien czerwonych (ragged red fi-bers"), za LHON szybko postpujc, obustronn utrat widzenia centralnego, spowodowan zwyrodnieniem siatkwki i nerwu wzrokowego. W miopatiach mitochondrialnych stwierdzono wystpowanie rnych delecji
848 / ROZDZIA 62
w mitochondrialnym DNA. Wykazano rwnie, e przyczyn LHON jest tranzycja G na A w pozycji 11778 getiomu mitochondrialnego, w wyniku ktrej dochodzi do zmiany struktury podjednostki 4 dehydrogenazy NADH. Choroby genetyczne wywouj zmiany wpywajce na struktur DNA, RNA lub biaek oraz na czynno komrek Mutacja genu strukturalnego moe by przyczyn zmiany struktury kodowanego przez niego biaka, niezalenie od tego, czy biakiem tym jest enzym, czy biako pozbawione dziaania
katalitycznego. Jeeli biakiem tym jest enzym, wystpujca mutacja moe by przyczyn wrodzonej wady metabolicznej. Koncepcj wrodzo -
Wzrost kwasu feny-I o p i rog r o n o weg o
E*
Wzrost fenyloalaniny II > Spadek syntezy tyrozyny
nej wady metabolicznej po raz pierwszy zaproponowa angielski klinicysta Sir Archi-bald Garrod w pierwszych latach biecego stulecia, opierajc si na wynikach bada alkap-tonurii, bielactwa (albinizmu), cystynurii i pen-tozurii. Wrodzona wada metaboliczna jest zaburzeniem genetycznym, w ktrym dotknity jest swoisty enzym. Ten ostatni jest przyczyn bloku metabolicznego, ktry moe mie nastpstwa chorobowe. Wyjania to nastpujcy przykad. Ponisze rwnania odzwierciedlaj prawidowy przebieg reakcji enzymatycznej oraz sytuacj wystpujc w bloku metabolicznym:
Z rwnania tego wynika, e chorzy na PKU syntetyzuj mao tyrozyny oraz charakteryzuj si wzrostem stenia w osoczu krwi i w moczu fenyloalaniny i kwasu fenylopirogronowego oraz innych metabolitw fenyloalaniny. Niedobr tyrozyny (jest ona prekursorem melaniny) jest przyczyn jasnej karnacji skry. Dokadny patomechanizm objaww klinicznych wystpujcych w PKU nie jest jasny, chocia przypuszcza si, e jest spowodowany niedoborem tyrozyny, niezbdnej do syntezy biaek i neuro-przekanikw w orodkowym ukadzie nerwowym, lub te hamujcym wpywem wysokich ste fenyloaiartiny na przezbonowy transport innych aminokwasw w neurocytach. Krytycznymi momentami bloku
enzymatycznego s: a) zmiana wydajnoci szlaku metabolicznego spowodowana niedostateczn syntez odpowied niego produktu lub (i) b) nagromadzenie si substratu znajdujcego si przed blokiem Lub niefizjologicznych jego metabolitw oraz c) zmiany regulacji mechanizmu sprzenia zwrotnego (o ile mutacja dotyczy
miejsca allosterycznego enzymu). Wszystkie wymienione skutki bloku enzymatycznego mog mie dziaanie patogen-ne. Wane jest rwnie zrozumienie, dlaczego
niektre wrodzone wady metaboliczne s nie -
Wzrost X, Y Sytuacja Wzrost S I)- Spadek P normalna *V

T E*
Blok
S oznacza substrat, P produkt reakcji katalizowanej przez enzym prawidowy, E, E* enzym zmutowany, za X i Y alternatywne produkty substratu S. Jak wida, blok enzymatyczny moe by przyczyn: 1) zmniejszonej produkcji zwizku P, 2) nagromadzenia si substratu S znajdujcego si przed blokiem oraz 3) wzmoonego wytwarzania i gromadzenia si metabolitw alternatywnych X lub Y substratu S. Wszystkie wymienione trzy skutki bloku enzymatycznego mog mie znaczenie patologiczne. W fenyloketonurii (PKU) (p. rozdz. 32) enzymem zmutowanym (E x) jest hydroksylaza fenyloalaninowa. W wyniku- bloku enzymatycznego dochodzi do zmian metabolicznych przedstawionych niej podanym rwnaniem:
szkodliwe. Dotycz one najczciej kocowych etapw metabolizmu. W tych wadach ani niedobr okrelonego produktu, ani te nagromadzenie si pewnego substratu (prekursora) reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym nie maj szkodliwego wpywu na czynno komrek. Taka sytuacja ma miejsce u chorych z pen-tozuri. Z drugiej strony waciwie nieznane s wrodzone wady cyklu kwasu cytrynowego, odgrywajcego gwn rolAv metabolizmie ustrojowym. Wystpowanie takiej wady mogoby mie zgubny wpyw na komrki i koczy si mierci ju na bardzo wczesnym etapie rozwojowym.
Jeeli mutacja dotyczy genu strukturalnego dla biaka meenzymatycznego, wwczas w wielu
przypadkach syntetyzowane jest biatko zmuto-wane. Zamiana nawet jednego aminokwasu w sekwencji ani i no kwasowej (taka sytuacja zachodzi w hemoglobinopatii HbS) moe mie zgubne skutki chorobowe (p. rozdz. 7). Zmuto-
BIOCHEMIA A CHOROBY / 849 wane biaka mog wykazywa nieprawidow cd. tab. 62-5 Skutki wrodzonych wad meta bo licznych na poziomie komrek lub narzdw Niedobr produkcji reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym (niedobr melani-ny w bielactwie) Nagromadzenie toksycznych prekursorw reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym (np. fenyloaaniny i keto-kwasw pochodnych fenyloaaniny u chorych z PKU) Zaburzona regulacja mechanizmu sprzenia zwrotnego (wzmoona synteza metabolitw szlaku porf irynogenezy u chorych z po-rfiri ostr przerywan) Zmieniona czynno bon (brak receptorw LDL w rodzinnejssjpercholesierolemii, upoledzone wchanianie zwrotne cysty ny w kanalikach nerkowych u chorych na cystynu-ri) Zmienione rozmieszczenie w przedziaach sub kom orkowych (obniona aktywno fo-sfotransferazy Glc-NAc jest przyczyn niewaciwego ukierunkowania sekrecji enzymw lizosomalnych w chorobie I-celi dise-ase" Zmiany architektury komrek i tkanek Zmiany ksztatu komrek (krwinki czerwone ksztatu sierpa w hemoglobin opatii HbS) Zmiany liczby organeli subkomrko-wych (spadek biogenezy peroksysomw w zespole Zeilwegera) Zmieniona ilo poza kom orkowej matrix (zmieniony kolagen w chorobach kolagenowych)
czynno (np. pewne zmutowane hemoglobiny), mog ulec agregacji (np. hemoglobina HbS) lub
te mog przenika bardzo wolno poprzez kom -
rki (np, ar antytrypsyna). Tabela 62-5 przedstawia rne poziomy manifestacji zmian patologicznych wystpujcych w chorobach genetycznych. Pokazane w tabeli poziomy nie wykluczaj si nawzajem, wiadomo bowiem, e wszystkie choroby genetyczne zalene s od zmian strukturalnych DNA.
Tabela 62-6. Poziomy" manifestacji zmian patologicznych w chorobach genetycznych. Wszystkie choroby genetyczne spowodowane s zmianami DNA. Jest jednak poyteczne uwzgldnienie poziomu" manifestacji zmian patologicznych tych chorb. Jak wida w tabeli, niektre choroby przejawiaj si na dwch poziomach i wikszo defektw w zakresie biosyntezy biaek nieenzyma-tycznych wpywa na czynno narzdw. Leczenie chorb genetycznych polega na oddziaywaniu na wymienione poziomy" manifestacji poszczeglnych defektw DNA Zmiany DNA jdrowego (rne rodzaje mutacji). Zmiany DNA mitochondHalnego (rne rodzaje mutacji) RNA Zmieniony splicing" (pewne przypadki talasemii) Biaka a. Zmutowane enzymy: obniona aktyw no enzymatyczna, brak enzymu, wzmo ona aktywno enzymatyczna (rzadko spotykana wada) b. Zmienione biatka nieenzymatyczne; Biaka uczestniczce w transporcie rnych zwizkw (anafbuminemia, hemogobtno-patia HbS) Biaka o dziaaniu ochronnym (agamma-globulinemia, afibrynogenemia) Biaka strukturalne (zmiany strukturalne kolagenu w rnych chorobach tkanki cznej) Hormony biakowe (niedobr tyreoglobuli-ny w pewnych postaciach wola rodzinnego) Biaka kurczliwe (niedobr lub brak dys-trofiny w dystrofii mini typu Duchenne'a-DMD) Biako receptorowe (niedobr lub brak receptorw LDL w rodzinnej hipercholesterole-
W celu uniknicia trwaych szkd niezbdne jest wczesne rozpoznanie pewnych wrodzonych wad metabolicznych Co naley zrobi przy podejrzeniu wystpowania wrodzonej wady metabolicznej? Odpowied na to pytanie jest wana, gdy w niektrych wadach metabolicznych zachodzi konieczno natychmiastowego rozpoczcia leczenia w celu uniknicia trwaych szkd (np. u chorych na PKU lub galaktozemi). W tabeli 62-6 podano kilka p raktycznych wskazwek w tym zakresie. W tabeli 62-7 zestawiono materiay biologiczne, jakie naley bada oraz testy, jakie naley
850 / ROZDZIA 62 Tabela 62-6. Praktyczne wskazwki w rozpoznawaniu wrodzonej wady metabolicznej Zebranie dokadnego wywiadu dotyczcego wystpowania w rodzinie chorb genetycznych Wykonanie testw skriningowych w celu wykrycia patologicznych" skadnikw w pynach ustrojo wych (np. oznaczenie kwasu fenylopirogronowego przy podejrzeniu PKU) Wykluczenie innych przyczyn choroby u noworodka (stany zapalne, choroby sercowo-naczyniowe) Stwierdzenie w wywiadach upoledzonego rozwoju fizycznego i umysowego Stwierdzenie powikszenia niektrych narzdw (np, hepatomegalii w chorobie Gauchera lub Nie-manna-Picka) Obecno niezwykego zapachu powietrza wydechowego lub moczu (np. u chorych z chorob syropu klonowego") Stwierdzenie maego stenia glukozy we krwi (np. u chorych z glikogenoz) Obnione pH krwi (np. spowodowane nagromadzeniem si kwasw organicznych u chorych z chorob syropu klonowego") Tabela 62-7. Gwne testy uywane w diagnos tyce chorb genetycznych Materiay biologiczne poddane badaniom: Osocze, krwinki czerwone, leukocyty, fibroblasty, mocz, bioptaty z dotknitych narzdw, kosmwka (kosmki), komrki owodni Testy oglne; Stenie glukozy we krwi i w moczu, pH krwi, stenie amoniaku we krwi, stenie aminokwasw w osoczu i wydalanie tych zwizkw z moczem, okrelenie kwasw organicznych w moczu, testy barwne na obecno rnych metabolitw we krwi i moczu Testy swoiste: Oznaczanie produktw (mae stenie) lub prekursorw (due stenie) reakcji enzymatycznej (np, fenyloalaniny lub kwasu fenylopirogronowego w PKU) katalizowanej przez zmutowany enzym Oznaczanie aktywnoci zmutowanych enzymw w erytrocytach, krwinkach biaych, lub bioptatach tkankowych Elektroforetyczne badanie biaek (np, dla wykrycia HbS) Analiza metod Southern blotting polimorfizmu dugoci fragmentw restrykcyjnych (restrietion fragment iength polymorphism-RFLP) lub innych anomalii struktury acuchw DNA wywoujcych specyficzne choroby (np, hemoglobinopatta HbS, plsawica Huntingtona, dystrofia mini typu Du-chenne'a itd.) lub sprzonych z tymi chorobami Identyfikacja dotychczas nieznanych metabolitw w moczu i osoczu metod GLC-MS (gazowa wysokosprawna chromatografia cieczowaspektrometria masowa)
wykona u osb, a szczeglnie podw podej rzanych o wrodzon wad metaboliczn. Pobieranie kosmkw kosm wki oraz wykonanie amniocentezy dla zbadania komrek owodni odnosi si tylko do podw. NIEKTRE CHOROBY GENETYCZNE MONA SKUTECZNIE LECZY Oglnie mwic przy leczeniu chorb genetycznych wykorzystuje si jedn z nastpujcych czterech strategii: 1) prbuje si korygowa
skutki metaboliczne danej wady metabolicznej
podajc brakujcy produkt lub ograniczajc dostpno substratu reakcji enzymatycznej katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) podejmuje si prb substytucji lub aktywacji niedoborowego enzymu wzgldnie substytucji brakuj cego biaka, 3) prbuje si wydali z ustroju nagromadzony zwizek lub 4) korygowa wy stpujc anomali genetyczn. W tabeli 62-8
podano przykady dla kadej z wymienionych czterech strategii. Niektre z wymienionych metod s bardzo skuteczne w okrelonych wadach metabolicznych, np. dietetyczne leczenie fenyloketonurii i galaktozemii, leczenie substytucyjne w hemofilii
i agammaglobulinemii lub usuwanie z ustroju nadmiaru eaza u chorych na hemochromatoz przez okresowe upusty krwi. Niestety prby substytucji brakujcego enzymu najczciej zostay uwieczone tylko niewielkim sukcesem. Powodami takiego stanwrzeczy s: a) trudnoci w uzyskaniu dobrego materiau pochodzenia ludzkiego, z ktrego mona by wyizolowa dostateczne iloci brakujcego enzymu (w niektrych wadach do tego celu uywano oyska). trudnoci w dostarczaniu brakujcego en zymu do waciwego narzdu docelowego oraz trudnoci w utrzymywaniu enzymu w stanie aktywnym w okrelonej tkance, jeli jenzym ten ulega szybkiej degradacji. Wymienione trudno ci s szczeglnie due, jeeli narzdem docelo wym dla brakujcego enzymu jest mzg. W tych
BIOCHEMIA A CHOROBY / 8S1 Tabela 62-8. Gwne metody dostpne w leczeniu chorb genetycznych. Podzielono je na 4 klasy: 1) prby korekcji skutkw metabolicznych wystpujcej wady przez podawanie brakujcego produktu lub ograniczenie dostpnoci substratu dla reakcji katalizowanej przez zmutowany enzym, 2) substytucja lub aktywacja brakujcego enzymu lub substytucja brakujcego biaka nieenzymatycznego, 3) usuwanie z ustroju nagromadzonego zwizku lub 4) korekcja anomalii genetycznej. (Wedug Stanbury i wsp.: Matabolic Basis of Inherited Diseases, wyd. 5. McGraw Hill, 1983). Klasa postpowania leczniczego 11 22 33 44 Zasada Substytucja brakujcego produktu Ograniczenie substratu Substytucja zmutowanego biaka Substytucja brakujcego biaka Aktywacja zmutowanego enzymu przez podawanie iloci jego kofaktora
Choroba
Wole rodzinne Fenyloketonuria Choroba Gauchera Hemofilia Acyduria metyiomalonowa
Leczenie lub komentarz Podawanie l-tyroksyny Dieta uboga fenylo-alanin Iniekcje p-glukozydazy Doylne podawanie czynnika VII! (AHG) ^""Podawanie witaminy B12 w
Podawanie Aktywacja zmutowanego enzymu przez Zespl fenobarbitalu Crigglera--Najjara indukcj Transplantacja wtroby Galaktozemia* Zastpienie chorego narzdu bdcego nosicielem wady przez narzd zdrowy Wprowadzenie enzymu do komrek so- Wiele moliwych kan- Metoda ma jak dotychczas charakter eksperymatycznych lub rozrodczych za pored- dydatw mentalny nictwem terapii genowej (np. uywajc wektora retrowirusowego) * Leczeniem pierwszego rzutu jest podawanie niemowltom diety ubogiej w laktoz, jeli rozpoznanie ustalono wczenie.
przypadkach enzym musi by podany w postaci pokonujcej barier krew-mzg. Pomimo licznych prb dostarczania do narzdw docelowych enzymw, DNA lub innych czsteczek w postaci liposomw jak dotychczas nie zanotowano spektakularnych sukcesw. Dziki ogromnym postpom na polu rekombinacji DNA (p. rozdz. 42) strategii czwartej, tj. korekcji anomalii genetycznej powicono wiele prac dowiadczalnych i zasugerowano nowe rozwizania. Ttrupia genowa mogaby polega na: 1) substytucji genowej, 2) korekcji nieprawidowego genu lub 3) wzmocnieniu nieprawidowego genu. Substytucja genowa (1) polegaaby na usuniciu caego zmutowanego genu i wprowadzeniu na jego miejsce genu prawidowego, za korekcja genu na naprawie jedynie zmutowanego odcinka genu. adna z wymienionych dwch metod nie doczekaa si jeszcze praktycznego rozwizania. Metoda trzecia polega na wprowadzeniu do komrki obcego materiau genetycznego w celu wyrwnania niedoboru produktu spowodowa nego genem zmutowanym, np. jest ju moliwe
wprowadzenie normalnego genu do zmutowa-nej komrki (drog transfekcji, mikroiniekcji lub za pomoc wektora wirusowego) oraz spowodowanie jego ekspresji. Naley jednak zauway, e taka komrka zawiera zarwno gen zmutowany, jak i gen obcy. Ponadto obcy gen wprowadzony w przypadkowe miejsce chromosomu moe przerwa (przez mutagenez inser-cyjn) ekspresj pewnych genw gospodarza i nie podlega normalnym mechanizmom regulacyjnym. Uyto wiele pomysowych metod w celu umieszczenia genu we waciwym dla niego miejscu w komrce. Wiele uwagi powicono wektorom retrowirusowym w celu naprawienia wady genetycznej w komrkach szpiku kostnego, tj. w komrkach, z ktrymi atwo manipulowa zarwno in vivo, jak in vitro. Realna jest rwnie metoda ransgeniczna, lecz rwnie w tej metodzie wystpuje problem precyzji in-sercji materiau genetycznego oraz wiek innych problemw technicznych i etycznych. Pomimo tych trudnoci terapia genowa ley w centrum bada medycznych i rokuje szybki postp.
852 / ROZDZtA 62
OPIS PRZYPADKW Wprowadzenie W nastpnych podrozdziaach przedstawiono opis 8 przypadkw, pr2y czym kady z nich dotyczy jednaj z 8 przyczyn chorb wymienionych w tab. 1-1. Przewodni ide tych opisw jest przedstawienie znaczenia znajomoci biochemii dla zrozumienia istoty chorb wystpujcych u przedstawionych chorych. List przyczyn chorb podan w t ab. 1-1 mona b \ rozszerzy np. o przyczyny nowotworowe" lub psychologiczne". Z drugiej strony przyczyn} nowotworw mona by omwi w punkcie ,.przyczyny fizyczne" (np. nowotwory wywoane napromieniowaniem promieniami X), przyczyny biologiczne" (uwzgldniajc rol wirusw onkogennych w patogenezie niektrych nowotworw) iub rwnie w punkcie prz\-czyny chemiczne" (ok. 80% nowotworw wystpujcych u czowieka jest pochodzenia chemicznego"). Ponadto w ostatnich latach wykazano u niektrych chorych genetyczne uwarunkowanie schizofrenii i psychozy maniakalnej, co moe mie znaczenie dla klasyfikacji przyczyn wymienionych chorb. Wikszo opisanych przypadkw dotyczy chorb czsto lub wzgldnie czsto spotykanych. Tylko dwa z nich (przypadek I i 7) dotycz chorb wzgldnie rzadko wystpujcych. Pomimo tego te ostatnie przypadki zostay wczone do niniejszego podrozdziau, poniewa piknie ilustruj a) przyczyn choroby, do ktrej zostay zaszeregowane oraz b) dwa biologiczne zjawiska, tj. znaczenie naprawy DNA i przeciwcia jako mechanizmw ochronnych. Do opisu,kadego przypadku doczono schematyczny diagram podsumowujcy mechanizmy biochemiczne uczestniczce w patogenezie przedstawionych chorb. Przypadek 1. Skra pergaminowa barwnikowa {xeroderma pigmentosum) (ryc. 62-1). Klasyfikacja. Przyczyna fizyczna, ekspozycja na wiato ultrafioletowe. Wywiady i badanie fizyczne. Do Kliniki Dermatologicznej zosta przyjty 12-letni chopiec z powodu guza skry na prawym policzku. Chopiec ten cigle unika ekspozycji na promienie soneczne z powodu tworzenia si pcherzy na skrze. Na skrze stwierdzono nieregularnie rozrzucone obszary przebarwienia i lekkiego zaniku. Uwzgldniajc obecno guza skry w tak modym wieku, unikanie soca w wywiadach oraz wystpowanie ww, pozostaych ago-
Ekspozycja na promienie ultrafioletowe (UV) jeal przyczyn tworzenia si dlmerw tymlny w komrkach skry (keratynocytach)
Dimery tyminy nie ulegaj , wyciciu" lub nateylej naprawie z powodu genetycznie uwarunkowanego defeklu (np. zmutowanej endonukleazy) w zakresie korekcji uszkodze DNA indukowanych promieniami UV
Utrzymywanie si uszkodzonego DNA; jeô replikacja prowadzi do syntezy DNA wykazujcego mutacj
Zmutowany DNA po redniczy w karcynogenezle (by moe przez aktywacj onkogertw)
Powslawanle licznych guzw nowotworowych skry
Ryc. 62-1. Zestawienie mechanizmw uczestni czcych w powstawaniu skry pergaminowej barwnikowej.
dniejszych zmian skrnych, dermatolog postawi wstpn diagnoz xeroderma pigmentosum. Badania laboratoryjne. Badanie histologiczne wycitego guza wykazao obecno raka uskowatego (jest to czsto spotykana posta raka skry u starszych ludzi, a nie u chopca w tak modym wieku). Pobrano fragment skry w celu uzyskania fibroblastw. W laboratorium naukowym szpitaia specjalizujcego si w ra-diobiologii zaoono hodowl fibroblastw chorego dziecka oraz osoby zdrowej w celu okrelenia zawartoci dimerw tyminy po nawietlaniu promieniami UV. Zarwno fibro-blasty chorego, jak i osoby zdrowej poddano dziaaniu wiata UV pobierajc prbki komrek w odstpach 8-godzinnych do 32 godziny po nawietlaniu. Z pobranych prbek zrobiono wycigi DNA oznaczajc w nich zawarto dimerw tyminy. Po 32%odzinach po nawietlaniu w komrkach osoby zdrowej stwierdzono zaledwie 24%, za w komrkach chorego chopca a 95% dimerw powstaych pod wpywem promieni UV. Ten wynik potwierdzi suszno rozpoznania xeroderma pigmentosum. Komentarz. Skra pergaminowa barwni kowa (xeroderma pigmentosum XP) jest wzgldnie rzadk chorob dziedziczc si rece-sywnie genem autosomalnym. Choroba charakteryzuje si upoledzeniem mechanizmw naprawy uszkodze DNA indukowanych promieniami
UV. Gwny defekt DNA indukowany promieniami UV polega na powstawaniu dimerw tyminy. Te ostatnie s wynikiem wiza kowalencyjnych miedzy wglami tyminy w pozycji 5 i 5 oraz 6 i 6 dwch przylegajcych do siebie acuchw DNA. Mog one ulec likwidacji przez endonukleaz. Jedn z przyczyn XP wydaje si by defekt tego enzymu. Szczegowe badania wykazay, e wystpuj rne pod grupy XP oraz, e* nie okrelono dokadnie enzymw uczestniczcych w naprawie DNA uszkodzonego przez promienie UV. W razie nienaprawienia defektu DNA indukowanego przez nawietlanie promieniami UV powstaj mutacje DNA mogce by przyczyn raka skry. U chorych na XP ju od modych lat stwierdza si rne postacie raka skry. Rodzicw chopca pouczono, e dziecko wymaga bdzie monitorowania lekarskiego przez cae ycie z powodu moliwoci tworzenia si nowych rakw skry. Ponadto rodzicom radzono, by dziecko w dalszym cigu unikao soca i stosowao na skr waciwe maci chronice przed dziaaniem promieni sonecznych. Chocia XP jest rzadk chorob, istnienie rnych mechanizmw naprawy uszkodze DNA indukowanych promieniami UV lub czynnikami chemicznymi ma wielkie znaczenie ochronne dla czowieka (chroni przed powstawaniem nowotworw skry). W razie braku takich mechanizmw yciu na ziemskiej planecie grozioby jeszcze wicej ni dotychczas niebezpieczestw. Wykazano bowiem, e chorzy na XP maj
1000-krotnie wiksze prawdopodobiestwo zachorowania na raka skry ni osoby zdrowe. Przypadek 2. Kwashiorkor (ryc.62-2). Klasyfikacja. Przyczyna: wadliwe odywianie, niedobr biaka. Wywiady i badania fizyczne. W jednym z krajw rozwijajcych si do ambulatorium przyszpitalnego matka przyniosa swoj 2-let ni crk. Matka dziecka miaa 4 dzieci, przy czym najmodsze miao roczek i byo karmione piersi. Rodzina ya w zrujnowanym szaasie w odlegoci kilku mil poza miastem, za ojciec dziecka z wielkim trudem tylko okazyjnie zna-laz zatrudnienie. Gwnym poywieniem ro dziny bya kaszka bogatowglowodanowa, na tomiast ubogobiakowa. W cigu ostatnich dwch lat rodzin tylktfcardzo rzadko sta byo na kupno mleka i misa. Matka podawaa, e w czasie ostatniego miesica crka wykazywaa saby apetyt, miaa okresowe biegunki i staa si draliwa i apatyczna. Przy badaniu stwierdzono, e dziecko wyka zuje niedowag i may wzrost w stosunku do swojego wieku. Byo one blade, draliwe i sabe. Obwd ramienia (mierzony w poowie koci ramieniowej) by znacznie obniony, co porednio dowodzio wadliwego ywienia biakowo--kalorycznego (PEM) dziecka. Skra bya uszczca si, za wosy suche i amliwe. Brzuch by wzdty, wtroba za umiarkowanie powikszona. Ponadto stwierdzono uoglnione obrzki. Lekarz dyurny postawi rozpoznanie kwashiorkor i biegunki.
Dieta ubogobiakowa, wysokowglowodanowa
Niedobr aminokwasw
Wystarczajca iio prekursorw syntezy tuszcz w u chorych z niedostateczn syntez biaek
Niedostateczna synteza Hb, tran sfery ny, albumin Stuszczeni wtroby W ystpujca hlpoalbu mlnsmia uczestniczy w powstawaniu __________ obrzkw________
Umiarkowana riepatomegalia
Wodobrzusze
Ryc. 62-2. Mechanizmy uczestniczce w powstawaniu kwaahiorkor.
854 / ROZDZIA 62
ograniczone moliwoci techniczne wykonano tylko kilka bada laboratoryjnych. Stenie Hb wynosio 60 g/l (wartoci prawidowe 130150 g/l), za stenie biaka oglnego 44 g/l (wartoci prawidowe 6080 g/l) i albumin 20 g/l (wartoci prawidowe 3555 g/l). Po siew stolca ujawni obecno bez tlenowca Gram- ujem neLeczenie. W wikszoci przypadkw nie zaleca si leczenia w szpitalu chorych z objawami wadliwego ywienia biako w o-kalory-cznego (PEM) ze wzgldu na ryzyko zakaenia szpitaln flor bakteryjn. Uwzgldniajc jednak oglne osabienie dziecka oraz obecno uoglnionych obrzkw, dziecko przyjto na oddzia. Ze wzgldu na biegunki podano odpowiedni antybiotyk o szerokim widmie dziaania. Rwnoczenie rozpoczto karmienie dziecka maymi, lecz czsto podawanymi dawkami roztworu izotonicznego glukozy z chlorkiem sodowym zawierajcego i inne skadniki minera-jne. Po dwch dniach dziecku podawano w odstpach czterogodzinnych diet wysokokaloryczn opart na mleku z dodatkiem, w okresie pniejszym, preparatu wielowitami nowego i brakujcych skadnikw mineralnych. Stan dziecka uleg staej poprawie i po 10 dniach zostao wypisane ze szpitala. Matk poinfor mowano, by raz w tygodniu zgosia si wraz z dzieckiem do kliniki, gdzie specjalista od ywienia udziela porad, jak poprawi jako diety. W czasie cotygodniowej wizyty dziecko mierzono i waono oraz dokonano pomiaru obwodu ramienia. Ponadto w czasie kadej wizyty matka otrzymywaa bezpatnie kartony z mlekiem sproszkowanym. Dyskusja. Zesp PEM jest najczciej spo tykanym zaburzeniem ywieniowym w wiecie. Oszacowano, e okoo miliard ludzi w wiecie cierpi na PEM o rnym nasileniu. Kwashiorkor znajduje si na jednym kocu tego zespou chorobowego i charakteryzuje si gwnie nie* doywieniem biakowym. Na drugim kocu znajduje si zespl oglnego wyniszczenia (marazm, marasmus) spowodowanego przewanie ywieniem ubogo kalorycznym. Granica midzy kwashiorkor i wyniszczeniem nie jest ostra, bowiem spotykane s postacie porednie okrelane jako kwashiorkor wyniszczajcy. Gwne rnice midzy kwashiorkor i marazmem zostay wypunktowane w tab. 62-9. Objawami gwnymi kwashiorkor s obrzki, hipoalbumi-nemia i stuszczenie wtroby.
Badania laboratoryjne. Ze wzgldu na
Tabela 62-9. Rnice midzy kwashiorkor i marazmem (wyniszczeniem) Kwashiorkor Marazm Obrzki
S
Nie ma
Hipoalbuminemia Jest, moe by Umiarkowaznacznego stop- na nia Stuszczenie w- Jest Nie ma troby Stenie insuliny Due w osoczu Stenie adrena- Prawidowe lub mae liny Zaniki mini Nieobecny lub umiarkowany szkieletowych Zawarto tusz- Zmniejszona czw w ustroju Mae Wysokie Moe by bardzo znaczny Kracowo niska lub brak
Kwashiorkor jest terminem uywanym przez czonkw szczepu Ga w Gawie dla okjelenia choroby wystpujcej u starszego rodzestwa po urodzeniu kolejnego dziecka". Wystpuje ona u dziecka po odstawieniu go od piersi i rozpoczciu karmienia pokarmami ubogobia-kowymi i boga to wglowodanowymi. Zmiany wosw i na skrze oraz stuszczenie wtroby wystpujce u chorych na kwashiorkor spowo dowane s gwnie niedoborem biakowym. U chorych tych stwierdza si czsto niedobory witamin i skadnikw mineralnych. Rwnie hormony s istotnym ogniwem w patogenezie PEM. Dieta wysoko wglowodanw a jest przyczyn wystpowania w kwashiorkor podwyszonego stenia we krwi insuliny, za maego stenia adrenaliny i kortyzolu. W odrnieniu od kwashiorkor w marazmie stwierdza si niskie stenie insuliny i wysokie stenie kortyzolu. Takie zmiany hormonalne sprzyjaj kataboliz-mowi biaek, gwnie mini i s przyczyn znaczniejszych zanikw miniowych u chorych z wyniszczeniem ni z kwashiorkor. Ponadto dziki niskim steniom adrenaliny w kwashiorkor nie dochodzi do tak duej mo bilizacji tuszczw z tkanki tuszczowej jak w marazmie. Dieta ubogobiakowa jest przyczyn spadku syntezy biaek osocza, w tym szczeglnie albumin i transferyny oraz zmniejszonej syntezy hemoglobiny. W nastpstwie niedostatecznej syntezy biaek w wtrobie oraz poday wglowodanw w ilociach wystarczajcych rw-
nie do syntezy lipidw, dochodzi do akumulacji triglicerydw w hepatocytach oraz co za tym idzie, do stuszczenia wtroby. W PEM upoledzona jest rwnie funkcja ukadu immunologicznego, szczeglnie czynno limfocytw T. Ten defekt jest przyczyn duej podatnoci tych chorych na zakaenia (np. wywoujce biegunk). Z kolei infekcje pogarszaj istniejc sytuacje metaboliczn, nasilaj katabolizm ustrojowy (np. wywoujc gorcz k). Rozwojowi kwashiorkor mona cakowicie zapobiec podajc dzieciom jakociowo i ilociowo wywaon diet zawierajc dostateczne iloci biaka i egzogennych aminokwasw. Przypadek 3. Cholera (ryc. 62-3). Klasyfikacja. Przyczyna choroby biologiczna, bakteryjna. studentka, pracujca w jednym z krajw roz wijajcych si, nagle zacza wydala wodniste stolce prawie w sposb cigy. Wkrtce do biegunek doczyy si wymioty, co stao si przyczyn gwatownego pogorszenia oglnego stanu chorej i skierowania jej do miejscowego szpitala wiejskiego. Przy przyjciu chora wykazaa sinic oraz obnion sprysto skry, obnione cinienie ttnicze (70/56 mm Hg, warto normalna 120/80 mm Hg) oraz przyspieszone i sabo napite ttno. Lekarz dyurny rozpozna choler, pobra prbk stolca na posiew i natychmiast rozpocz leczenie. Leczenie. Polegao na doylnym podawaniu roztworu sporzdzonego w szpitalu, a zawierajcego 5 g NaCl, 4 g NaHCO 3 i lg KC1 w jednym litrze apirogennej wody destylowanej. Roztwr ten podawano pocztkowo szybko w iloci 100 ml/kg mc/h do chwili normalizacji cinienia ttniczego i uzyskania dobrze wype nionego ttna. Rwnoczenie chorej podawano tetracyklin. Poczwszy od drugiego dnia chora bya ju zdolna do doustnego pobierania pynu zalecanego przez wiatow Organizacj Zdrowia do nawodnienia (ORS ora rehydration solution). Skada si on z 20 gglukozy, 3,5 g NaCl, 2,5 g NaHCOs i ],5 g KG rozpuszczonych w 1 litrze wody pitnej. Poczwszy od czwartego dnia do chwili przyjcia do szpitala chorej wczono pokarmy stae. Chora szybko wracaa do zdrowia i zostaa wypisana ze szpitala w 7 dniu po przyjciu. Dyskusja. Cholera jest powan chorob zakan wystpujc endemicznie w niektrych krajach Azji i innych czciach globu ziems -
Zakaenie przecinkowcem cholery
Uwalnianie enterotoksyny (zawierajcej podjednostki A ^ i B) do wiata jelita cienkiego
Wizanie si enteraloksyny z gangllozydem GM, za porednictwem swoich podjednostek
Uwalnianie si podjednoelki A, przechodzcej przez btony plazmatyozne enterocytw
Podjednostka A, katalizuje ADP - rybozylacj biaka G, bony plazmatyczne), pKez co biako t o traci swoj aktywnoSt GTP - azow
Wywiady i badanie fizyczne. 21-letnia
Przewleka stymulacja cyklazy a de n/1 an owej
Wzrosl stenia cAMP w enterocyiaeh Wony luzowej
cAMP aktywuj jedn lub wicej cAMP - zalenych kinaz biaek, przez co dochodzi do zmiany funkcji systemw Iran sportowych enterocytw przez fosforylacj pewnych biaek transportowych
Masywna utrata ze stolcem Janw + + Na , Cr, HCO; K I wod y
Ryc. 62-3. Mechanizmy uczestniczce w pato genezie biegunek spowodowanych choler.
kiego. Wywouje j przecinkowiec cholery {Vib-rio cholerne), wydzielajcy enterotoksyn, En-terotoksyna skada si z jednej podjednostki A (zoonej z peptydw Ai i A2 poczonych ze sob wizani em dwu siarczko wym) o raz z 5 podjednostek B. Jej masa czsteczkowa wynosi w przyblieniu 84 000. W jelicie cienkim enterotoksyna wie si za porednictwem podjednostek B z gangliozydem GMr (struktur GMi przedstawia ryc. 15-20), wystpujcym w bonie plazmatycznej enterocytw bony luzowej. Nastpnie odcza si podjednostka A, po czym peptyd A| przenika przez bon plaz-matyczn do jej wewntrznej powierzchni. Peptyd ten katalizuje ADP-rybozylacj (donorem jest NAD) biaka regulatorowego G51 przez co hamuje jego aktywno GTP -azow i utrwala
856 / ROZDZIA 62
jego posta aktywn. W ten sposb cyktaza adenylanowa ulega przewlekej aktywacji (p. rozdz. 46). W wyniku cigej aktywacji cyklazy adenylanowej wzrasta rdkomrkowe stenie cAMP. T en os tatni z kolei a ktywuje kinaz biaek fosforylujc jedn lub wicej biaek bonowych uczestniczcych w transporcie ak tywnym. Konsekwencj wymienionego acu cha zdarze jest zahamowanie wchaniania NaCl przez enterocyty (za porednictwem obojtnego kos ystemu transportuj cego NaCl) oraz wy dzielania jonw Ci do wiata jelita cienkiego. Wymienione zjawiska s przyczyn masywnego wydzielania Na i wody do wiata jelita i wodnis tych s tolcw charakterystycznych dla cholery. Struktura histologiczna jelita cienkiego pozos taje zadziwiajco nienaruszona pomimo s trai nie tylko Na i wody. ale rwnie Cl, HCO^ i K. Utrata tych skadnikw jest przyczyn ogrom nych strat pynw ustrojowych, hipowolemii, kwas icy nieoddec howej i zuboenia us troj u w potas wystpujcy w cikich przy padkach cholery. Wymienione zmiany mog by przy czyna zgonu, jeeli waciwe leczenie substytu cyjne (opisane wyej) nie zostao rozpoczte natychmiast. Wykrycie i atwa dostpno wa ciwych pynw zas tpczych (np. pynu ORS) w bardzo znacznym stopniu p oprawiy wyniki leczenia cholery. Naley zauway, e istotnym skadnikiem pynu ORS jest glukoza. Chocia toksyna choleryczna hamuje wchanianie NaCl przez enterocyty jelitowe, nie ma ona wpywu na dokomr-kowy transport Na uatwiony przez glukoz. Przypa dek 4. Z awa s erca (ryc. 62 -4). Klasyfika cja . Przyczyna choroby brak tlenu, *" > dzia Nagej Pomocy lokalnego szpitala zosta przyjty 46-letni czowiek interesu z powodu trwajcych od dwch godzin silnych blw zamostk owych. Uprzednio chory ten by ju raz hospitalizowany w celu leczenia maego" zawau serca (MI). Pomimo tego nie przesta pali papierosw. Jego cinienie ttnicze wynosio 150/90 mm Hg {dla jego grupy wiekowej normalne cinienie ttnicze wynosi ! 40/80 mm Hg), za jego ttno 60 uderze na minut. Skra chorego bya zlana potem. U pacjenta nie stwierdzono objaww niewydolnoci serca. Podejrzewajc zawa serca choremu podano morfin w celu zmniejszenia blw j stanu lkowego, po czym przeniesiono go na oddzia kardiologiczny, gdzie natychmiast rozpoczto cige monitorowanie EKG.
Zmiany rriiaidzycowe w obrbie naczyri wiecowych (najczciej uwarunkowane wielogenowo)
Powstanie duego zakrzepu w obrbie letnicy wiecowej
Pozbawienie mienia sercowego napywu krwi (niedokrwienie minia sercowego)
Przesunicie przemian w kierunku glikotizy beztlenowej, spadek syntezy ATP, zuboenie puli nukleotydw
Wzrost stenia w kardiocytach MftDH z powodu braku fnsforylacji oksydatywfiej
Gromadzenie si kwasu mlekowego i innych metabolitw powodujcych wzrost molainoci ptynu rd kom orkowego oraz zmian przepuszczalnoci bon komrkowych
Spadek pH w kardiotitlocytach
Narastajca nieskuteczno skurczw minia sercowego
Zaprzestanie kurczenia
SI minia
sercowego
Aktywacja fosfolipaz bon komrkowych, degradacja + biaek przez prateazy, napyw Ca do komrek
mier dotknitych chorob obszarw minia sercowego
Wywiady i badanie fizyczne. Na Od-
Ryc. 62-4. Mechanizmy uczestniczce w powstawaniu ostrego zawau minia sercowego u osb dorosych. Strzaki poniej prostoktw nie zawsze wskazuj na wystpowanie cisego przyczynowego powizania . zjawisk wymienionych w obrbie prostoktw.
Badania laboratoryjne. W pierwszym

EKG stwierdzono uniesienie odcinka ST w pewnych odprowadzeniach oraz inne zmiany wskazujce na obecno przezciennego zawahi przedniej ciany lewej komory serca. Cztery godziny od wystpienia blw, a nastpnie w regularnych odstpach czasowych pobierano prbki krwi do oznaczenia izozymu MB fos-fokinazy kreatynowej (CK). W czwartej godzinie
aktywno tego izozymu bya lekko podwyszona, za w 12 godzinie 4-krotnie wysza ni normalnie. Stenie cholesterolu byo umiarkowanie podwyszone (6,5 mmol/I), za tri-glicerydw normalne. Leczenie. Dyurujcy kardiolog, po uwzgldnieniu wszystkich aspektw choroby, w tym szczeglnie faktu stwierdzenia cech przezcien-nego zawau ciany przedniej minia sercowego w 4 godziny po wystpieniu pierwszych objaww zadecydowa o podawaniu streptokinazy (SK) za porednictwem cewnika do naczy wiecowych. Po 12 godzinach ble w klatce piersiowej zaczy ustpowa i chory czu si coraz lepiej. Dziesi dni pniej pacjent zosta wypisany do domu z zaleceniem dalszego nadzoru przez lekarza domowego i rozpoczcia leczenia obniajcego stenie cholesterolu we krwi (poprzez stosowanie diety ubogiej w nasycone kwasy tuszczowe i inhibitora reduktazy HMG-CoA) oraz zaprzestania palenia papierosw. Dyskusja. Pelnocienny zawa minia ser cowego (MI) spowodowany jest najczciej przez skrzep lin zamykajc lub prawie zamykajc wiato naczynia wiecowego, pooon w bliskim ssiedztwie z blaszk miadycow. Najczciej rozpoznanie mona postawi na pods"tawie wywiadw, wyniku badania EKG oraz seryjnych wynikw oznaczenia izozymu MB fosfokinazy kreatynowej (CK) (p. Dodatek). CeJem leczenia MI jest zapobieganie mierci spowodowanej zaburzeniami rytmu przez podawanie odpowiednich lekw oraz zmniej szenie obszaru objtego zawaem. W opisanym przypadku podjto decyzj podawania strep tokinazy do naczy wiecowych w celu ograniczenia obszaru zawaowego i rozpuszczenia skrzepimy (p. rozdz. 58). Enzym ten jest znacznie taszy od tkankowego aktywatora plaz-minogenu (TPA) wykazujc przy tym prawie tak sam skuteczno jak TPA. Dla terapii dugofalowej przepisano lek obniajcy stenie cholesterolu w osoczu, mianowicie inhibitor reduktazy HMG-CoA. W tym miejscu tylko bardzo krtko omwione zostan przyczyny zmian miadycowych ttnic wiecowych, ktre byy przyczyn powstania skrzepliny zamykajcej wiato naczynia. Po szczegy na ten temat naley sign do podrcznika patologii. Rozwojowi miadycy sprzyjaj wysokie stenia LDL i mae stenia HDL w surowicy, nieznane jeszcze czynniki genetyczne oraz rnorodne czynniki ryzyka,
takie jak nadcinienie ttnicze, due stenie cholesterolu w surowicy oraz palenie papierosw. Opisany w tym podrozdziale chory wykazywa podwyszone stenie cholesterolu oraz by naogowym palaczem. Na pocztku uszkodzeniu ulega bona wewntrzna naczynia (in-tima), w ktrej gromadz si makrofagi, lipo-proteiny osoczowe, glukoza mi nogi i kany i sole wapnia tworzc zmiany okrelane jako pasma tuszczowe (fatty streaks). Na luminalnej powierzchni tych zmian mog si gromadzi pytki krwi i fibryna. Do tych zmian bony wewntrznej naczynia wrastaj monoklonalne miocyty naczyniowe przycigane przez czynniki wzrostowe, uwalniane przez makrofagi i trombocyty. Te ostatnie uwalniaj pytkowy czynnik wzro stowy ". Tak tworzy jsi zmiana naczyniowa okrelana jako blaszka bony wewntrznej (in-timal plaque). Krwotoki do blaszki lub (i) zmiany zapalne sprawiaj, e przerwana zostaje cigo nabonka pokrywajcego blaszk i odsoniciu ulegaj jej skadowe. Do tych ostatnich przylegaj pytki tworzc pocztek skrzepliny (p. rozdz. 58). Jeeli skrzeplina zamyka wiato naczynia w 90%, wwczas ustaje krenie przez do tknite naczynie i krew woniczkowa bardzo szybko zostaje pozbawiona tlenu. Normalna przemiana minia sercowego ma charakter tlenowy i wikszo ATP wytwarzana jest w czasie fosforylacji oksydacyjnej. W razie wystpienia anoksji spowodowanej niedokrwieniem dochodzi do przestawienia si przemiany materii minia sercowego na glikoli* beztlenow. Wytwarza ona zaledwie '/n> ATP powstajcego w procesie fosforylacji oksydacyjnej. W obszarze niedokrwionym dochodzi nie tylko do przestawienia si metabolizmu na glikoliz beztlenow, ale rwnie do spadku substratw energodajnyeh oraz oczyszczania tkanek z kocowych produktw przemiany materii. Z kolei gromadzenie si metabolitw w obrbie komrek jest przyczyn wzrostu molalnoci pynu rd-komrkowego, co prowadzi do obrzku komrek i zmian przepuszczalnoci bon komrkowych. Nastpstwami zawau serca s: utrttta ATP, nagromadzenie si kwasu mlekowego z nastpcz cik kwasic metaboliczn oraz znaczna redukcja siy skurczowej kardiomiocytw. W takich warunkach metabolicznych cakowicie ustaje synteza makroczsteczek i nukleotydw. Gromadzenie si w komrkach mleczanw i jonw H+ hamuje glikoliz na poziomie dziaania dehy-drogenazy gliceroaldehydofosforanowej i jest
852 / ROZDZIA 62
przyczyn niedoboru utlenionej postaci NAD normalnie regenerowanego w procesie fosfory-lacji oksydacyjnej. W miar obnienia si stenia ATP wzrasta przynajmniej na pocztku stenie ADP. Z kolei ADP ulega konwersji do AMP przez miniow kinaz adenylanow, po czym AMP jest przedmiotem dalszego rozkadu do adenozyny przez deaminaz adenozynow. W kocu adenozyna ulega przeksztacaniu do inozyny i innych produktw katabolizmu pu -ryn. Wszystkie wymienione reakcje w bardzo znacznym stopniu zmniejszaj pul mikleotydw adeninowych stanowicych gwny skadnik normalnej przemiany komrkowej. Wykazano, e po cikim niedokrwieniu minia sercowego psa trwajcym 40 minut zawarto w nim ATP spada do 10% v*artod prawidowej. Wyczer panie si puli nukleotydw adeninowych od bywa si w tym samym czasie, w ktrym rozwija si nieodwracalne uszkodzenie komrek, co niekoniecznie oznacza przyczynowy zwizek midzy tymi zjawiskami. W chwili obecnej nie ustalono jeszcze, ktre z zaburze metabolicznych skazuje komrki .na umieranie. Wrd takich zaburze wymienia si wyczerpanie si zasobw ATP, aktywacj rdkomrkowych fos-folipaz (s one przyczyn uszkodzenia bon komrkowych), aktywacj proteaz oraz wzrost rdkomrkowego stenia Ca2 + , Oglnie mwic, im wczeniej podjto prby przywrcenia perfuzji niedokrwionego minia sercowego, tym lepiej. W 6 godzin po niedokrwieniu minia sercowego prawdopodobnie dochodzi do nieodwracalnego jego uszkodzenia. Doda jednak naley, e ju po 1-godzin-nym cakowitym niedpkrwieniu niektre komrki ulegaj nieodwracalnemu uszkodzeniu. Z tego wynika, e rozpoczcie leczenia streptokina-z musi by moliwie wczesne. Przedmiotem duego zainteresowania biochemikw i klinicytw s rwnie zjawiska biochemiczne wystpujce po reperfuzji (spowodowanej np. podaniem streptokinazy) uprzednio medokrwionego obszaru minia sercowego. Reperfuzja moe by rwnie przyczyn mierci komrek spowodowanej tzw, szkod reperfti-zyjn (reperfusion injury). Jak o tym ju wspomniano, niedokrwienie uszkadza bony plazm a-tyczne (bdce miejscem dziaania rnych pomp jonowych), przez co dochodzi do gbokich zmian ich przepuszczalnoci i potencjau bonowego. W nastpstwie tych zmian w czasie reperfuzji nasila si napyw rnych zwizkw do komrek, m.in. jonw Ca2 + . Wzrost rd-
komrkowego stenia Cai+ wywouje spustoszenie i dezorganizacj wntrza komrek poprzez aktywacj lub hamowanie rnych enzymw w sposb nieuporzdkowany. Wiele faktw sugeruje, e w powstawaniu szkody reperfuzyjnej uczestnicz rwnie wolne rodniki, tj. wysoce reaktywne, czciowo zredukowane metabolity tlenu, takie jak rodniki nadtlenkowe (O2) i hydroksylowe (OH). Szczeglnie reaktywne s rodniki OH. Mog je wytwarza komrki minia sercowego lub krce we krwi leukocyty wielojdrzaste (PMNL). Rodniki te uszkadzaj komrki, wywoujc peroksydacj lipidw, przerywajc acuchy DNA i utleniajc grupy SH biaek. Anion nadtlenkowy powstaje przez przeniesienie pojedynczego elektronu na czsteczk O2 zgodnie z rwnaniem:
O2 + e" * O2
Generacja rodnikw O2 nie ma miejsca w reakcjach katalizowanych przez cytochrom P-450, oksydaz ksantynow oraz oksydaz NADPH, wystpujce w leukocytach wielojdrzastych. Enzymdyzmutaza nadtlenkowa (SOD)katalizuje nastpujc reakcj:
O; + O" 2 + 2H + - H 2 O 2 + O 2
Wywiady i badanie fizyczne. Na oddzia

intensywnej opieki lekarskiej przyjty zosta 52-letni chory w piczce. Miesic wczeniej zmara ona chorego. Po jej mierci chory sta si coraz bardziej depresyjny. Przed mierci ony nalea do umiarkowanych alkoholikw. Konsumpcja alkoholu wzrosa jednak znacznie
Jak wida enzym ten likwiduje aniony nadtlenkowe przeksztacajc je do mniej toksycznego nadtlenku wodoru (wody utlenionej). Przeprowadzono dowiadczenia, ktre miay odpowiedzie na pytanie, czy podawanie dysmutazy ponadtlenkowej podczas reperfuzji chroni misie sercowy przed szkod reperfuzyjn. Niestety, wyniki tych bada nie byy jednoznaczne. Tak wic do wyjanienia pozostaje rola anionw ponadtlenkowych w patogenezie szkody reperfuzyjnej. Niemniej przedmiotem wielkiego zainteresowania jest obecnie rola wolnych rodnikw w licznych rodzajach uszkodze komrek oraz w patogeneziechorb. Przypadek 5. Ostre zatrucie etanolem (ryc. 62-5). Klasyfikacja. Przyczyna choroby chemiczna.
Etanol
ADH MEOS Wnika do bon komrkowych Aldehyd octowy
AOH
Zwiksza pynno bon
Tworzy adctukty z biakami i kwasami nukleinowymi
Konwersja do kwasu octowego
Pojawianie si objaww toksycznego dziaania, gwnie ze strony mdzgu
Wzrost stosunku NAD H/N AO Wzrost stosunku mleczan/pirogronian Spadek g i uKaneogenezy Spadek spalania w/asw tuszczowych Hamowanie dehydrogenazy glicei-ofosforanowej prowa dzce do wzrostu glicerofostoranu _________
Konwersja do acelyio-CoA
Wzrost syntezy kwasw tuszczowych
Stu szczeni wtroby
Ryc. 62-5. Mechanizmy uczestniczce w patogenezie toksycznoci etanolowej
w cigu ostatnich kilku tygodni. Ponadto chory odywia! si siabo. Jego crka, matka, wpada w niedziel rano do domu ojca, znajdujc go nieprzytomnego w saloniku na leance. Na stole saloniku znajdoway si dwie puste butelki po whisky. Przy badaniu chorego nie udao si go wybudzi, jego oddechy byy gbokie i gone, za w powietrzu wydechowym czu byo alkohol. Temperatura ciaa wynosia 35,5C (normalna ciepota ciaa mierzona w odbytnicy nie przekracza 37,43C). Rozpoznanie przy przyjciu chorego brzmiao: piczka spowodowana nadmiernym spoyciem etanolu. wynikw bada laboratoryjnych wykonanych we krwi chorego wymieni naley nastpujce: stenie etanolu 108,6 mmol/1 (500 mg/dl), stenie glukozy 2,7 mmoi/1 (norma 3,66,1 mmol/1), stenie mleczanw 8,0 mmol/1 (norma 0,52,2 mmol/1), oraz pH 7,21 (norma 7,40). Wyniki tych bada potwierdziy rozpoznanie ustalone przy przyjciu. Zatruciu etanolem towarzyszya kwasica metaboliczna. Leczenie. Ze wzgldu na wysokie stenie etanolu we krwi oraz piczk leczenie rozpoczto od natychmiastowej hemodializy. Pozwala ona na bezporedni eliminacj etanolu z ustroju, chocia stosowana jest tylko w ci -
Badania laboratoryjne. Wrd wanych
kich zatruciach etanolem. W omawianym przypadku stenie etanolu we krwi szybko spado i jeszcze tego samego dnia chory odzyska wiadomo. Po zakoczeniu hemodializy choremu zastosowano doylny wlew z 5% roztworu glukozy w celu zwalczania wystpujcej u niego hipoglikem. Chory bardzo szybko odzyska zd rowie. Skierowano go jednak na konsultacj psychiatryczn. Dyskusja. Naduywanie alkoholu jest du ym problemem suby zdrowia w wikszoci spoeczestw. Przedstawiony przypadek dotyczy ostrych, toksycznych efektw spoycia nadmiernej iloci alkoholu. Innym problemem, zwizanym z naduywaniem etanolu, ktre wykazuje wiele aspektw biochemicznych, lecz nie bdzie przedmiotem dyskusji, jest poalkoholo-wa marsko wtroby. Rozwija si ona u osb spoywajcych due dawki etanolu (tj. 80 g absolutnego etanolu na dob) przez wicej ni 10 lat. Z biochemicznego punktu widzenia, gwnym problemem, jaki pojawi si u opisanego chorego, bya odpowied na pytanie, w jaki sposb etanol wywouje tak rne efekty toksyczne, jak kwasica mleczanowa i hipoglikemia oraz piczka? Problemem klinicznym byo, jak optymalnie leczy chorego.
860 / ROZDZIA 62
Przemiana etanolu przedstawiona zostaa w rozdz. 27. Odbywa si ona gwnie w wt robie dwoma szlakami, W g wnym szlaku uczestnicz dehydrogenaza alkoholowa i dehyd-rogenaza acetaldehydowa przeksztacajca etanol poprzez aldehyd octowy w kwas octowy. Z kolei ten ostatni ulega konwersji do acetylo--CoA. W obu reakcjach powstaje NADH + i H+. Tak wiec due spoycie alkoholu moe w znacznym stopniu zmieni rdkomdrkowy iloraz NADH/NAD. Ten z kolei moe wpyn na warto K licznych i wanych reakcji metabolicznych, w ktrych uczestnicz te dwa kofaktory. Wysokie stenie NADH sprzyja powstawaniu mleczanu z pirogronianu, co tumaczy obecno kwasicy mleczanowej w zatruciu alkoholowym. Konsekwencj tych reakcji jest spadek stenia pirogronianu (jest on niezbdny w reakcji katalizowanej przez kar-boksylaz pirogronianow) oraz zahamowanie glukoneogenezy. W cikich zatruciach etanolem, w ktrych doszo do wyczerpania si zapasw glikogenu i praktycznie nie zachodzi glikogenoliza, pojawia si hipoglikemia. W drugim szlaku przemiany etanolu uczestniczy mik-rosomalny cytochrom 450 (mikrosomalny ukad utleniania etanolu microsomal ethanol oxidi-zing system MEOS) rwnie wytwarzajcy aldehyd octowy. Aldehyd octowy jest wysoce reaktywnym zwizkiem tworzcym addukty z biakami, kwasami nukleinowymi i innymi czsteczkami. Wydaje si prawdopodobne, e objawy toksyczne etanolu spowodowane s zdolnoci wizania si tego zwizku z innymi czsteczkami. Etanol wykazuje rwnie zdolno wnikania do Manjbiologicznych, wywoujc ich ekspansje oraz zwikszajc ich pynno". Jeeli bony te nale do pobudliwych, etanol zmieni a ich potencja czynnociowy, zaburza i przezbonowy transport oraz wpywa na uwalnianie neuroprzekanikw. Wszystko to dziaa depresyjnie na czynno mzgu. Jeeli wymienione zmiany toksyczne s dostatecznie due, mog one spowodowa piczk, a nawet mier (uwarunkowan poraeniem orodkw oddechowych). Przypadek 6. Dystrofia mini typu Du-chenne'a (ryc. 62-6). Klasyfikacja. Przyczyna genetyczna. Wywiady i badanie fizyczne. Do szpitala dziecicego przyniesiono 4-letniego chopca. Jego matka bya bardzo zmartwiona tym, e dziecko poruszao si dziwnie, czsto przewracao si i miao trudnoci przy chodzeniu po
Delecja czci genu strukturalnego ctyslrofiny, zlokalizowanego w chromosomie X
Obniona synteza mRNA kodujcego dystrofin
Mae stenie lub brak dystrofiny w komrkach miniowych
Zmiany skurczu I rozkurczu komrek miniowych (dokadny mechanizm nie jest znany)
Postpujce osabienie mini szkieletowych, zwykle koczce si zgonem
Ryc. 62-6. Mechanizmy uczestniczce w powstawaniu dystrofii mini typu Duchenne'a.
schodach. Dziecko nie miao rodzestwa, lecz brat matki zmar w 19 roku ycia z powodu dystrofii mini. Przy badaniu lekarz stwierdzi osabienie siy mini i obrczy barkowej"i mied-nicznej oraz lekkie powikszenie mini ydek. Uwzgldniajc osabienie siy miniowej oraz rozmieszczenie dotknitych mini pediatra postawi wstpne rozpoznanie dystrofii mini typu Duchenne'a (dystrophia musculomm m. Duchenne DMD). diagnostyczne. Aktywno fosfokinazy kre-atynowej bya znacznie podwyszona. Wynik badania etektromiograficznego potwierdzi rozpoznanie dystrofii mini, podczas gdy przewodnictwo nerwowe byo prawidowe. W bioptacie z minia ydkowego stwierdzono ogniskow martwic oraz pewne odchylenia wielkoci wkien miniowych. Uywajc sondy cDNA dla dystrofmy wykazano, posugujc si metod Southern blotting, brak genu kodujcego to biako. Ponadto w bioptacie minia wykazano brak dystrofiny uywajc metody elektroforezy dwukierunkowej. Dyskusja. Wywiad rodzinny, typowa topografia osabienia mini, podwyszona aktywno fosfokinazy kreatynowej (CK) w surowicy krwi, wynik badania elektromiograficznego, obecno w bioptacie nieprawidowego genu kodujcego dystrofin wszystko potwierdzio wstpne rozpoznanie DMD postawione przez pediatre.BMD jest cik chorob zwyrodnieniow mini zwizan z chromosomem X.
Badania laboratoryjne i inne testy
Czsto jej wystpowania ocenia si na I przypadek na 3500 ywo urodzonych chopcw. Dotyczy ona chopcw w modym wieku objawiajc si najpierw utrat siy mini pro-ksymalnych (dosiebnych), kaczkowatym chodem, trudnociami w stawaniu oraz w kocu bardzo znacznym osabieniem. Liczne badania pozwoliy zlokalizowa defekt w rodkowym odcinku krtkiego ramienia chromosomu X oraz zidentyfikowa segment DNA, ktry ulega delecji u chorych na DMD. Uywajc metody odwrotnej transkrypcji uzyskano za pomoc transkryptu mRNA, liczcego 14 kilozasad, a kodujcego dystrofine u zdrowych, osb dorosych i u podw, odpowiadajcy mu cDNA. Ten ostatni sklonowa-no i uzyskano biako dystrofin o masie czsteczkowej ok. 400 000, wykazujce ksztat prcikw oraz skadajce si z 3 685 amino kwasw. W bioptatach miniowych pochodzcych od chorych na DMD oraz od szczurw z dystrofi mini sprzon z chromosomem X (mdx), poddanych elektroforezie elowej, nie stwierdzono obecnoci dystrofiny. W celu umiejscowienia dystrofiny w miniach wytworzono przeciwciaa antydystrofinowe. Za ich pomoc wykazano, e dystrofina wystpuje w sarkolemie (bonie komrkowej miocytw) osb zdrowych, za jest nieobecna lub wystpuje w niewielkiej iloci w sarkolemie miocytw chorych na DMD. Niedobr dystrofiny wydaje si rwnie uczestniczy w etiologii dystrofii mini Bec-kera, bdcej inn, agodniejsz postaci dystrofii mini, najpewniej odmian alieliczn DMD. Dystrofina wydaje si posiada 4 domeny, Dwie z nich s podobne do domen wystpujcych w ct-aktyninie i jedna do domeny spekt-ryny. Spektryna jest biakiem bonowym cyto-szkieletu, uatwiajcym krwinkom czerwonym zmian ksztatu przy przechodzeniu przez naczynia wosowate. Per analogiam spekulowano, e dystrofina moe umoliwia komrkom miniowym kurczenie lub rozkurczenie si za porednictwem zmian bonowych, lub te, e moe uczestniczy w stabilizacji sarkolemy (bony plazmatycznej miocytw). Dalsze badania wykazay, e gen kodujcy dystrofine jest najwikszym genem znanym u czowieka. Ten fakt uatwia wyjanienie obserwacji, e u ok. ' < chorych, DMD spowodowana jest nowymi mutacjami. Podjto ju prby wytwarzania dys trofiny technologi rekombinacji DNA w celu ewentualnego podania tego biaka chorym na
DMD. W diagnostyce prenatalnej oznaczanie dystrofiny jest bezcelowe, ekspresja tego biaka wystpuje bowiem tylko w komrkach miniowych, a nie w komrkach owodniowych lub kosmwkowych. Dostpno cDNA kodujce go dystrofm uatwia jednak prenataln diagnostyk DMD w bioptatach kosmwki lub komrkach owodni uzyskanych drog amnio-centezy. Oznaczenie dystrofiny uatwi klasyfikacj rnych postaci DMD na takie, w ktrych dystrofina odgrywa rol oraz inne,w ktrych nie odgrywa adnej roli. Udowodnienie udziau dystrofiny w powstawaniu DMD naley zaliczy do jednego z najwikszych osigni bio- ' logii molekularnej w patologii ludzkiej. Leczenie. Do chwili obecnej nie ma skutecznego leczenia DMD. Stad te terapia tej choroby ma charakter objawowy. Dziecko zachcano do wykonywania wicze i regularnego zgaszania si do specjalistycznej kliniki dla chorych na dystrofi mini celem moliwie szybkiego leczenia powika mogcych pojawi si u takich chorych. Matce poradzono, by signa po porad genetyczn. Naley wyrazi nadziej, e postpy w zakresie przyczyn choroby przyczyni si do bardziej swoistej i skutecznej terapii ju w najbliszej przyszoci. Przypadek 7. Agammaglobulinemia sprz ona z chromosomem X (ryc. 62 -7). Klasyfikacja. Przyczyna immunologiczna, genetyczna. la dziecicego skierowano 3-letniego chopca z powodu podwyszonej temperatury, blw
Wywiady i badanie fizyczne. Do szpita-
Nie poznana jeszcze zmiana DNA w chromosomie X, bdca przyczyn braku lub znacznego upoledzenia transkrypcji kodu dla acuchw H I L immunoglobutin
Brak lub znacznie zmniejszone stenie Irrmunoglobutln w osoczu krcym
Zmniejszona odporno na zakaenia pewnymi rodzajami bakterii
W wywiadach czste wystpowania zakae bakteryjnych
Ryc. 62-7. Mechanizmy uczestniczce w powstawaniu agammaglobulinemii sprzonej z chromosomem X.
862 / ROZDZIA 62
w klatce piersiowej i trudnoci oddychania. Lekarz domowy rozpozna prawidowo zapalenie plu. Poniewa uprzednio u starszego brata dziecka rozpoznano agammaglobulinemi sprzon z chromosomemX, u lekarza kierujcego zrodzia si myl, e wystpujce u modszego brata zapalenie puc mogo by spowodowane brakiem syntezy gammaglobulin. Badania laboratoryjne. Badaniem elektrofor tycznym biaek surowicy wykazano prawidowe stenia albumin i globulin a i P, natomiast ladowe iloci y-globulin. Liczba limfocytw B we krwi bya niezwykle niska (wynosia ok. 1% wartoci prawidowej), natomiast limfocytw T prawidowa. W bioptacie wza limfatycznego wykazano brak komrek plazmatycznych. Inne wskaniki ukadu immunologicznego, np. skadniki dopeniacza, byy prawidowe. W plwocinie wykryto obecno paciorkowca zapalenia puc (Streptococcus pneumoniae). Dyskusja. Zaburzenia ukadu immunologicznego mog dotyczy limfocytw B (wytwarzajcych immunoglobuliny) lub T (warunkujcych odporno komrkowozalen). W tym podrczniku dyskutowano jedynie humoralny ukad immunologiczny (rozdz. 58). Przypadek przedstawiony w tym podrozdziale zademonstrowano ze wzgldu na dramatyczn utrat odpornoci anty bakteryjnej (przeciwko pneu-mokokom) wystpujcej przy bardzo znacznym spadku stenia immunoglobulin osoczowych. Fenotypowo bya to anomalia immunologiczna, chocia jej przyczyn by defekt genetyczny. Wywiady rodzinne, obecno tylko kilku krcych limfocytw B, bardzo znaczna redukcja stenia krcych immunoglobulin we krwi oraz brak komrek plazmatycznych to wszystko potwierdzio rozpoznanie wstpne lekarza domowego, e chodzi o agammaglobuli nemi sprzon z chromosomem X. Agam-maglobulinemia sprzona z chromosomem X dotyczy chopcw w modym wieku (podobnie jak DMD, przypadek 6) i jest raczej bardzo rzadkim schorzeniem, bo stwierdzonym i opisanym u zaledwie 200 chorych. Dokadny charakter defektu nie jest znany, chocia wiadomo, e jest on sprzony z chromosomem X. Chocia we krwi krcej znajdowao si zaledwie kilka limfocytw B, w szpiku kostnym liczba prolim-focytw B (limfoblastw) bya normalna. Jest rzecz interesujc, e po fuzji limfocytw B, pochodzcych od chorych zragammaglobuine-mi, z komrkami szpiczakowymi myszy, po-
wstae komrki hybrydowe wydzielaj acuchy cikie (H) i lekkie (L) ludzkich immunoglobulin. Dowodzi to obecnoci w limfocytach B genw strukturalnych dla acuchw H i L, ktre z jakich powodw nie ulegaj ekspresji. Przypadek 8. Cukrzyca typu I z kwasic ketonow (ryc. 62-8). Klasyfikacja. Przyczyna choroby niedobr hormonu, brak insuliny. Wywiady i badanie fizyczne. Do szpitala dziecicego przyjto 14 -letni dziewczyn w stanie piczki. Matka podawaa, e crka czua si dobrze jeszcze dwa tygodnie przed przyjciem, kiedy to zachorowaa na wrzodzie-jce zapalenie garda i miaa umiarkowan gorczk. Od tego czasu crka stracia apetyt i czua si oglnie le. Kilka dni przed przyjciem skarya si na nadmierne pragnienie oraz potrzeb kilkakrotnego wstawania w nocy, aby odda mocz. Lekarz domowy wyjechaz miasta, za matka ocigaa si z kontaktowaniem si z innym lekarzem. W dniu przyjcia dziecko zaczo wymiotowa, byo pice i trudne do obudzenia. Ten stan by przyczyn zgoszenia si z dzieckiem na oddzia nagych przypadkw chorobowych. Przy badaniu stwierdzono, e dziecko jest odwodnione, wykazuje zimn skr ora2 pogbiony oddech (oddech Kmsmaula). Ponadto powietrze wydechowe miao zapach owocw. Cinienie ttnicze wynosio 90/60, za ttno 115 uderze na minut. Dziecka nie udao si obudzi. Dyurujcy internista rozpozna cukrzyc insulinozalen (cukrzyc typu I) powikan kwasic ketonow ze piczk. Wyniki bada laboratoryjnych zestawiono poniej: A. Badania osocza krwi Glikemia 35 mmol/l (norma: 3,6-6,1 mmol/i) p-Hydroksymalan 13 mmol/l (norma: < 0,25 mmo!/l) Acetooctan 2,8 mmol/l (norma: < 0,2 mmol/l) Wodorowglany 5 mmol/l (norma: 24-28 mmol/l) Mocznik 12 mmol/l (norma: 2,9-8,9 mmol/l) + Stenie H we krwi ttniczej 89 mmol/l {= pH 7,05), (norma 34,7-45,5 nmol/l = pH 7,45-7,35} Potas 5,8 mmol/l (norma: 3,5-5,0 mmol/l) Kreatynina 160 jimol/i (norma 60-132 jimol/l).
8. Mocz
Glukoza + + + + Ciaa ketonowe ++ + +
Wyniki bada laboratoryjnych potwierdziy wic rozpoznanie wstpne.
Genetycznie uwarunkowana podatno na infek^s wirusowe z nastpujcym au o immunologicznym uszkodzeniem komrek 0 wysp trzustki
Zmniejszona synteza Insuliny przez komrki p trzustki
Liczne nastpstwa
Przemiana wglowodanowa Spadek poboru glukozy przez niektre komrki Wzrost glukoneogenezy Wzrost glikogenolizy
Przemiana tuszczowa Wzrost lipolizy Wzrost utleniania kwasw tuszczowych Wzrost produkcji zwizkw ketonowych
Przemiana biakowa Spadek synlezy biaek Wzrost katabolizmu biakowego
Przemiana wodna potasowa i H Spadek napywu K do komrek Utrata wody s powd owa na diurez osmotyczn (glikozuri) Kwasica spowodowana wzmoon produkcj cia ketonowych
+
Ry. 62-8. Mechanizmy uczestniczce w powstawaniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzyce insulinozalen.
Leczenie. W leczeniu kwasicy ketonowej u chorych na cukrzyc (DKA) najwaniejsze

znaczenie ma doylne podawanie insuliny i roz-twofu fizjologicznego chlorku sodu. Chorej podawano doylnie insulin w iloci 10 IU na
godzin wraz z 0,9% roztworem Nad Nie podano natomiast glukozy do chwili obnienia si glikemii poniej 13,8 mmol/1 (250 mg/dl). Podawano rwnie bardzo ostronie chlorek potasu, okrelajc co godzin kaliemi. Stae monitorowanie stenia potasu w osoczu krwi jest niezwykle wane w leczeniu DKA, zaburzenia bowiem bilansu potasowego s gwn przyczyn zgonu u tych chorych. Podawanie wodorowglanu nie jest stosowane rutynowo i zarezerwowane tylko dla przypadkw bardzo cikiej kwasicy ketonowej w przebiegu cukrzycy. Dyskusja. Dotychczas nie wyjaniono do kadnie przyczyny cukrzycy typu I (insulinoza-lenej). Jest ona najprawdopodobniej skutkiem nastpujcego acucha zjawisk. Chorzy z tym typem cukrzycy wykazuj genetycznie uwarunkowan podatno sprzyjajc infekcjom wirusowym. Infekcja oraz wywoana przez ni reakcja zapalna najpewniej zmieniaj antygenowo bon komrek beta wysp trzustkowych inicjujc proces autoimmunologiczny, w ktrym uczestnicz zarwno przeciwciaa cytotoksyczne, jak
i limfocyty T. Proces ten jest przyczyn rozlegej destrukcji komrek p i powstania cukrzycy insulinozalenej. By moe czynnikiem zapocztkowujcym cukrzyc u chorej bya wirusowa infekcja przebyta kilka tygodni wczeniej pod postaci wrzodziejcego zapalenia garda. Znaczna hiperglikemia, glikozuria, ketone-mia i ketonuria potwierdziy rozpoznanie DKA. Niskie pH krwi wiadczyo o cikiej kwasicy spowodowanej wzmoon produkcj kwasu acetooctowego i betahydroksymasowe-go. Niskie stenie wodorowglanw i niskie cinienie czstkowe dwutlenku wgla (pCO2) potwierdziy wystpowanie kwasicy metabolicznej czciowo wyrwnanej oddechowo (hiper-wentylacj). Lekko podwyszone stenia kreatyniny i mocznika w surowicy krwi mogy by spowodowane nieco upoledzon czynnoci nerek (uwarunkowan hipoperfuzj nerek jako nastpstwo hipowolemii), odwodnieniem oraz zwikszonym katabolizmem biaek. W DKA czsto stwierdza si wzrost stenia potasu w osoczu krwi, spowodowany zmniejszonym poborem tego elektrolitu przez komrki (uwarunkowanym brakiem insuliny).
Tak wic obraz kliniczny DKA jest odzwierciedleniem zaburze gospodarki wglowodanowej, tipidowej i biakowej spowodowanych gwa-
townym spadkiem stenia insuliny we krwi.
864 / ROZDZIA 62 Przyczyny zaburze przemiany potasowej, wod nej i jonu H' wystpuj ce w DKA zestawione w ryc. 62-8, Wzrost molalnoci osocza uwarunissue contains 3 other articles on mitochondrial DNA and human diseases.) Jennings RB, Reimer KA: Pathobiology of acute myocardial ischemia. Hosp Praa (Jan) 1989:24:89. Koenig M, Monaco AP. Kunkel LM: The complete seuence of dystrophin predicts a rod -shaped cytoskeletal protein. Celi 1988;53:219. Lieber CS: Biochemical and molecular basis of alcohol-induced injury io iiver and other tissues. New Robbins SL, Kumar V: Basie Palhotogy, 4th ed. WB SaundersCo, 1987. Rubin E, Farber, JL (editors): Pathology, lst ed. JB Lippincolt Co, 1988. Scriver CR, et at (editor): In: The Metabotic Basis of Inherited Disease. 6th cd. McGraw Hill Book Co, 1989. The Merck Manua, 15th ed. Merck, Sharp & Dohme, 19S7. Toru B, Viteri FE: In: Modern Mutrition in Health and Disease. 7th ed, Shils ME, Young VR (editors). Lea & Febiger, 1988. Vogel F, Motulsky AG: Human Cenetics, 2nd ed. Springer-Verlag, 1986. Weatheralt DJ: The New Genetics and Clinica Practke, 2nd ed. Oxford Unrv Press, 1985.
kowany hiperglikemi rwnie uczestniczy w powstawaniu piczki pojawiajcej si w cikiej DKA. Jest jasne, e racjonalne leczenie DKA zaley od dogbnej znajomoci mechanizmw dziaania insuliny.
PIMIENNICTWO
Connor JM, Ferguson-Smith MA: Essential Medical Genecs, 2nd ed. Blackwell Sci Pubi, 1987. Friedmann, T: Progress toward human gene therapy. Science 1989;244;1275. Halliwell B (editor): Oxygen Radicals and Tissue Injury. Proceedings of an Upjohn Symposium, 1988. Harding, AE; The mitochondrial genomebreaking ttemagicdrcle.JVMg//Medl989;320:L341.(.This
Erytrocyty i leukocyty
63
i
WPROWADZENIE
Krew skada si z osocza i rnych rodzajw komrek. Niektre biaka osocza opisane s w rozdz. 58. W niniejszym rozdziale omwione zostan gwnie biochemiczne cechy krwinek czerwonych (ery trocytw) ijednej grupy krwinek biaych (leukocytw), a mianowicie granulocy-tw oboje, tnochonnych (neutrofili). Krwinki biae dziel si na 3 grupy: granulocyty, monocyty i limfocyty. Granulocyty (zwane rwnie leukocytami o wielopostaciowym jdrze, poniewa ich jdro jest wieiopatowe) zawieraj liczne lizosemy i ziarnistoci (pcherzyki wydzielni-cze) i dziel si na 3 klasy. Krwinki nalece do tych klas (granulocyty obojtnochonne neu-trofile, granulocyty zasadochlonne bazofile i granulocyty kwasochlonne eozynofile) rni si midzy sob budow i powinowactwem ziarnistoci do barwnikw. Granulocyty obojt-nochionne fagocytuj bakterie i odgrywaj gwn rol w ostrych procesach zapalnych. Granulocyty zasadocMonne, ktre przypominaj komrki tuczne (mastocyty), zawieraj histamin i heparyn oraz bior udzia w niektrych rodzajach nadwraliwoci. Granulocyty kwaso-chonne uczestnicz w reakcjach alergicznych i odpowiedzi ustroju na zakaenia pasoytnicze. Monocyty s prekursorami makrofagw, ktre podobnie jak granulocyty obojtnochonne bior udzia w fagocytozie. Limfocyty dziel si na limfocyty B i T. Limfocyty B wytwarzaj przeciwciaa (p. rozdz. 58). Limfocyty T odgrywaj rol w rnych formach odpornoci komr-kowozalenej, takich jak zabijanie komrek zakaonych wirusami t niektrych komrek nowotworowych. Szczegy tych zjawisk mo na znale w podrcznikach immunologii. Granulocyty obojtnochonne i limfocyty stanowi
55 Bfodicoiia
dominujce ilociowo grupy krwinek biaych obecnych we krwi w warunkach prawidowych. Udzia pytek krwi w fefzepniciu zosta omwiony w rozdz. 58 i nie bdzie przedstawiony w niniejszym rozdziale. Rnicowanie komrek krwi z komrki pnia (macierzystej komrki multipotencjalnej) jest wanym zagadnieniem, ktre jest tylko skrtowo omwione w niniej szym rozdziale. Bardziej szczegowe przedstawienie moe Czytelnik znale w podrcznikach histologii, biologii komrkowej lub hemato logii.
Komrki krwi s intensywnie badane, poniewa mona je atwo uzyska, peni liczne funkcje biologiczne i bior udzia w wielu procesach chorobowych. Budowa i czynno hemoglobiny (Hb), porfirie, taczka i aspekty gospodarki elazem zostay omwione w poprzednich rozd ziaach. Zmniejszenie liczby krwinek czerwonych i zawartej w nich Hb jest przyczyn niedokrwistoci (anemii): wanej i niejednolitej grupy schorze, przy czym niektre rodzaje niedokrwistoci s czsto spotykane w praktyce klinicznej. Wiele ukadw grupowych krwi obecnych w bonie erytrocytw i innych komrek krwi ma szczeglnie istotne znaczenie w przetaczaniu krwi i przeszczepianiu tkanek. Tabela 63-1 zawiera przyczyny licznych, wanych chorb dotyczcych krwinek czerwonych; niektre z nich s omwione w tym rozdziale, a pozostae przedstawione w innych czciach ksiki. Zapaleniem moe by objty kady narzd organizmu. Granulocyty obojt nochonne odgrywaj gwn rol w ostrym zapaleniu, a inne leukocyty, np. limfocyty od-
866 / ROZDZIA 63 Tabela 63-1. Zestawienie przyczyn wybranych wanych chorb dotyczcych erytrocytw Choroba Wyczna tub gwna przyczyna Niedokrwisto z niedoboru ela- Niedostateczna poda lub nadmierna utrata elaza za Nadmierna poda utleniaczy (rne zwizki chemiczne lub leki) Methemoglobinemia Genetycznie uwarunkowany niedobr ukadu zalenej od NADH reduktazy methemoglobiny Niedokrwisto sierpowata K-Talasemie Zmiana kodonu 6 odpowiedzialnego za syntez acucha p-hemo-globiny, tj. zastpienie trypletu GAG przez GTG, co powoduje zastpienie reszty waliny reszt kwasu glutaminowego Mutacje genw syntezy a-globiny, gwnie nierwnomierne cros-sing-over lub due oderwania, a rzadziej obecno kodu nonsensownego lub mutacje zmiany fazy odczylu Rozliczne mutacje genu syntezy (3-globiny, w tym oderwania, kod nonsensowny, mutacje, zmiany fazy odczytu i inne zmiany budowy genu (np. miejsce splicingu", mutacje genu pro motorw eg o)
p-Talasemie
NiedokrwistOci megaloblastyczne Niedobr witaminy B^ Niedobr kwasu foliowego Dziedziczna sferocytoza Niedobr dehydrogenazy g lukozo - 6 -fosforan u Niedobr kinazy pirogronianowej (PK) Zmniejszone wchanianie witaminy B^ wywoane niedoborem czyn nika wewntrznego wydzielanego przez komrki okadzinowe odka Zmniejszona poda, upoledzone wchanianie lub zwikszone-zapotrzebowanie (np. w ciy) folianw Niedobr ilociowy lub zaburzona budowa spektryny Rnorodne mutacje genu dla G6PD, sprzonego z chromosomem X; najczciej mutacje punktowe Prawdopodobnie rnorodne mutacje genu odpowiadajcego za syntez izoenzymu erytrocytarnego (R) PK
grywaj rol w zapaleniach przewlekych. Biaaczki, okrelane jako zoliwe nowotwory tkanek wytwarzajcych krew, mog dotyczy komrek prckursorowych kadej gwnej grupy krwinek biaych. Najczciej spotykanymi ich rodzajami s ostre i przewleke biaaczki szpikowe, dotyczce komrek prekursorowych granulocytw obojtnochonnych oraz ostre i przewlekle biaaczki iimfatyczne. Zoona chemioterapia oparta na stosowaniu kombinacji rnych czynnikw chemioterapeutycznych, z ktrych kady dziaa na jeden lub wiele biochemicznych punktw uchwytu, jest znacznie skuteczniejsza w leczeniu wielu typw biaaczek. Zrozumienie roli krwinek czerwonych i biaych w stanach zdrowia r choroby wymaga wiedzy o licznych podstawowych aspektach ich metabolizmu.
ERYTROCYT CECHUJE SI UPROSZCZON BUDOW I FUNKCJ Gwne czynnoci erytrocytw s wzgldnie proste i obejmuj dostarczanie tlenu do tkanek i pomocy w wydalaniu dwutlenku wgla oraz protonw wytwarzanych ix metabolizmie tkankowym. Tak wic ma on znacznie uproszczon struktur ni wikszo komrek ludzkiego organizmu, a zbudowany jest z bony komrkowej, ktra otacza roztwr Hb (biako to stanowi 95% wszystkich biaek wewntrzkomrkowych erytrocytu). Erytrocyt nie ma takich organelli komrkowych, jak mitochondria, lizosomy lub aparat Golgiego. Ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak erytrocyty wikszoci zwierzt, pozbawione s jdra komrkowego. Nie s one jednak metaboiieznie obojtne. ATP
ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 867
jest syntetyzowany w procesie glikolizy i stanowi to wany proces, ktry uatwia krwince utrzymanie ksztatu dwuwklsego, a take uatwia regulacj transportu jonw (np. przy udziale Na+/K "-ATP-azy i biaek wymiany anionw, p. dalej) oraz uatwia transport wody z i do komrki. Dwuwklsly ksztat zwiksza stosunek powierzchni do objtoci krwinki i w ten sposb sprzyja wymianie gazw. Krwinka czerwona zawiera skadniki cjjfoszkieletu (p. niej), ktre odgrywaj wan rol w utrzymaniu ksztatu erytrocytu. Okoo 2 min erytrocytw dostaje si do krenia w kadej sekundzie czyzn wynosi 4,66,2 mln/ul (4,66,2 10lz/l), a odpowiednia warto dla kobiet wynosi 4,25,4 mln/ul (4,25,4-1012/0- Cakowita liczba erytrocytw krcych wynosi ok. 2,5 x
1013. Prawidowa zawarto Hb we krwi mczyzn wynosi 1418 g/dl (8,7 11,2 mmol/1), a dla kobiet warto ta wynosi 12 -16 g/dl (7,5 9,5 mmol/1). Warto hematokrytowa, tj. Prawidowa liczba erytrocytw u dorosych, m-
krwinek przez wzrpst wydzielania nowych, modych krwinek do krenia. Erytropoetyna reguluje wytwarzanie erytrocytw Ludzka erytropoetyna (Epo) jest glikoprotei-n zbudowan z 166 reszt aminokwasowych (masa czsteczkowa ok. 34000). Jej stenie w osoczu oznacza si metodami radioimmuno-logicznymi. Jest ona gwnym czynnikiem regulujcym u czowieka tworzenie krwinek czerwonych. Wyodrbniono cDNA kodujcy Epo i okrelono jego sekwencje. Epo jest wytwarza na gwnie przez nerki i uwalniana, w od powiedzi na niedobr tlenu, do strumienia krwi, ktrym dostaje si do szpiku kostnego. Tam dochodzi do oddziaywania Epo z komrkami prekursorowymi krwinek czerwonych przez swoisty receptor. Receptor ten jest biakiem rdbonowym zbudowanym z 2 podjednostek i licznych skadnikw niebiakowych. Moe by on kinaz tyrozynow, ale nie zostao to ostatecznie ustalone. Nie zostay rwnie zidentyfikowane zwizki biorce udzia w dalszym przekazywaniu sygnau receptorowego oraz swoiste geny w komrkach docelowych. Epo dziaa na komrk prekursorow krwinek czerwonych znan jako jednostka erytroidalna rozrastajca si (burst fonning unit - erythroid; BFU-E) powodujc jej proliferacj i rnicowanie. Dodatkowo, Epo dziaa na dalszy prekursor eryt rocytw znany jako jednostka erytroidalna tworzca kolonie (colony forming unit - erythroid; CFU-E) take powodujc jego proliferacj i rnicowanie si. Do tego dziaania Epo wymaga wspdziaania z innymi czynnikami (np. interleukina 3 i podobnymi do insuliny czynnikami wzrostu, p. ryc. 63-1). Uzyskanie cDNA dla Epo umoliwio produkcj znacznych iloci tego hormonu i wykorzystanie go do bada i celw leczniczych. Uprzednio wyodrbniono jedynie bardzo mae iloci tego biaka z moczu. Gwnym zastosowaniem re-kombinowanej Epo (rEpo) jest leczenie niekt-
wzgldny stosunek objtoci krwinek czerwonych do krwi penej wynosi dla mczyzn 4252% (0,420,521/1), a dla kobiet 37-^7% (0,370,47 1/1). Czas ycia prawidowego erytrocytu wynosi 120 dni, co oznacza, e codziennie jest wymieniane nieco mniej ni 1% caej liczby krwinek (200 bln dziennie lub 2 min na sekund). Pojawiajce si w kreniu nowe erytrocyty zawieraj jeszcze rybosomy i skadniki siateczki rdplazmatycznej. Kwas rybo-nukleinowy (RNA) rybosomw mona wykry za pomoc odpowiedniego barwienia (np. bkitem krezolowym), a komrki te okrela si jako retykulocyty. W warunkach prawidowych stanowi one ok. 1% wszystkich erytrocytw. Czas ycia krwinek czerwonych moe ulec dramatycznemu skrceniu w rnych rodzajach niedokrwistori hemolitycznych. Liczba retyku-locytw jest wtedy znacznie zwikszona, poniewa szpik prbuje wyrwna szybki rozpad
Multipotencjalna , komrka pnia '
DFUC
""*
r CrU C
*"
r ^" ""' ____ Dodaa krwinka erytrocytu ^^ czerwona
Ryc. 63-1. Znacznie uproszczony schemat rnicowania si komrek pnia do krwinek czerwonych, BFU-E=burst forming unit - erythroid; CFU-E=colony forming unit - erythroid; Epo=erytropoetyna; GM-CSF=czynnik pobudzajcy granulocyty i makrofagi; IL -3=interleukina 3.
868 / ROZDZIA 63
rych rodzajw niedokrwistoci, takich jak niedo-krwisto spowodowana niewydolnoci nerek.
ERYTROCYT MA WYJTKOWY, ALE WZGLDNIE PROSTY METABOLIZM

W tabeli 63-2 przedstawiono rne aspekty metabolizmu erytrocytu, a wiele z nich omwiono w innych rozdziaach.
WIELE CZYNNIKW WZROSTU REGULUJE WYTWARZANIE LEUKOCYTW

W ostatnich latach wykryto, poza Epo, du liczb hentopoetycznych czynnikw wzrostu. Badania te rozszerzyy wiedz o rnicowaniu si komrek krwi, dostarczyy czynnikw, ktre mog by uyteczne w leczeniu i pomagaj zrozumie nieprawidowy wzrost komrek krwi (np. zachodzcy w biaaczkach). Podobnie jak Epo, wikszo wyodrbnionych czynnikw jest glikoproteinami, s one bardzo aktywne in vivo oraz in vitro, oddziauj z komrkami docelowymi przez swoiste receptory bony komrkowej oraz ukad wewntrzkomrkowego przenoszenia sygnau receptorowego zmieniajc ekspresje genw. Docelowe dziaanie na ekspresj genow powoduje rnicowanie si komrek. Wiele z nich uzyskano drog klonowania, co pozwolio na ich produkcj we wzgldnie duych ilociach. Dwa z tych czynnikw s szczeglnie interesujce; czynnik pobudzajcy tworzenie kolonii granulocytw (granulocyte co-lony-stimulating factor. G-CSF) i czynnik pobudzajcy tworzenie kolonii grsinuloc ytowo-makro-fagowych (granulocyte-macrophage colony-sti-mulating factor; GM-CSF). G-CSF jest wzgld nie swoistym czynnikiem dziaajcym na granu-locyty obojetnochonne. GM-CSF dziaa na rne komrki progenitorowe i pobudza granu-iocyty obojtnochoBe, makrofagi i granulocy-ty kwasochonne. Zmniejszone wytwarzanie granulocytw obojtnochonnych okrela si jako neutropcni. Wystpuje ona szczeglnie czsto u pacjentw leczonych chemioterapeuty-kami lub u osb po przeszczepie szpiku. U takich pacjentw mog wystpowa niebezpieczne zakaenia. G-CSF podaje si takim chorym w celu stymulacji wytwarzania granulocytow obojtni (chonnych. Niektre badania wskazuj, e jest on skuteczny. Jednym z czynnikw wymagajcych rozwaenia jest podawanie G-CSF pacjentom, u ktrych wystpia neu -tropenia spowodowana leczeniem biaaczki. Podawany czynnik G-CSF moe pobudza wzrost komrek biaaczkowych. Ostatnie badania wskazuj, e zjawisko tonie wystpuje, jeeli dawki G-CSF s mae, mimo to nadzr nad chorymi musi by wzmoony.
Stopie wnikania glukozy do erytrocytw jest znacznie wikszy ni wynikaoby to z prostej dyfuzji. Jest to raczej przykad uatwionej dyfuzji (p. rozdz. 43). Swoiste biako biorce udzia w tym procesie nazywane jest przenonikiem glukozy lub permeaz glukozow. Niektre jego waciwoci zestawiono w tab. 63-3. Szczeglnie wany jest proces wnikania glukozy do eryt rocytw, poniewa stanowi gwne rdo energii dla tych komrek. Z tkanek wyodrbniono 5 odmiennych, chocia zblionych do siebie rodzajw biaek przenoszcych glukoz. W przeciwiestwie do biaka z erytrocytw, niektre z nich wykazuj zaleno od insuliny (np. biaka obecne w miniach i tkane? tuszczowej). Szczeglnie te ostatnie budz due zainteresowanie, poniewa upoledzenie przemieszczania tych biaek ze skupisk wewntrzkomrkowych do bony komrkowej komrek mini szkieletowych moe tumaczy mechanizm opornoci na insulin stwierdzany u chorych z cukrzyc niezalen od insuliny (p. rozdz. 52).
Erytrocyt ma w bonie komrkowej ukad przenoszcy glukoz
Dojrzay erytrocyt nie ma zdolnoci syntezy biaek. Czynne w tym procesie s natomiast retykulocyty. Po wejciu do krenia, trac one organelle wewntrzkomrkowe (rybosomy, mi-tochondria itp.) i w cigu 24 h, stajc si modymi erytrocytami, trac zdolno do syntezy biaek. Wycig z retykulocytw krlika (uzyskanych przez podanie zwierzciu fenylo-hydrazyny, ktra powoduje cika niedokrwis-to hcmolityczn, co prowadzi do prawie cakowitego zastpienia erytrocytw przez retykulocyty) jest powszechnie uywany jako ukad syntezy biaek in vitro. Endogenny mRNA, obecny w retykulocytach, zostaje rozoony za pomoc nukleazy, ktrej aktywno jest pniej zahamowana przez dodanie jonw wapniowych. Ukad ten nastpnie jest programowany przez dodanie oczyszczonego mRNA lub wy-
W retykulocytach zachodzi synteza biaek
ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 869 Tabela 63-2. Zestawienie istotnych aspektw metabolizmu erytrocytu . Erytrocyt pozostaje w silnej zalenoci od glukozy jako rda energii; bona komrkowa erytrocytw zawiera biaka transportujce glukoz o wysokim powinowactwie do glukozy Glikoliza, w wyniku ktrej powstaj mleczany, jest rdem powstawania ATP ATP nie powstaje w wyniku losforylacji oksydacyjnej, poniewa erytrocyt nie ma mitochondriw Erytrocyt ma zesp ukadw transportujcych, co pozwala mu utrzymywa rwnowag wodno -elektrolitow Wytwarzanie 2,3-bisfbsfoglicerynianu w reakcjach cile zwizanych z glikoliza jest wanym czynnikiem regulujcym zdolno Hb do przenoszenia tlenu W erytrocycie zachodz przemiany cyklu pentozo-fosforanowego (ok. 5-10% cakowitej iloci wchonitej glukozy jest w ten sposb metabolizowane), ktry wytwarza NADPH. Czst chorob jest niedokrwis-to hemolityczna wywoana niedoborem aktywnoci dehydrogenazy glukoz o -6-fosforanowej W metabolizmie erytrocytu istotn rol odgrywa zredukowany glutation (GSH), czciowo przeciw dziaajcy aktywnoci potencjalnie toksycznych nadtlenkw. Krwinka czerwona moe wytwarza GSH przez redukcj utlenionego glutationu (GSSG), a proces ten wymaga NADPH elazo w Hb musi pozostawa w postaci elazawej; jony elazowe s redukowane do elazawych w wyniku dziaania zalenego od NAOH ukadu reduktazy methemoglobiny przy udziale reduktazy cytochromu t>5 i cytochromu b5 Wytwarzanie glikogenu, kwasw tuszczowych, biaek i kwasw nukleinowych nie zachodzi w krwince czerwonej, cho niektre lipidy (np. cholesterol) obecne w bonie komrkowej erytrocytu mog ulega wymianie z analogicznymi lipidami osocza Erytrocyt zawiera liczne enzymy metabolizmu nukleotydw (np. deaminaz adenozynow, nukleotydaz pirymidynow i kinaz adenylanow); niedobr tych enzymw moe by przyczyn niektrych postaci niedokrwistoci hemolitycznej Kiedy erytrocyt koczy swoje ycie, globina jest rozkadana do aminokwasw, ktre s powtrnie zuywane przez organizm, elazo zostaje uwolnione z hemu i powtrnie zuytkowane, a skadowe czteropirolowe hemu ulegaj przeksztaceniu w bilirubin, ktra jest gwnie wydalana drog jelit za porednictwem ci Tabela 63-3. Niektre waciwoci biaika transportujcego glukoz zawartego w bonie komrkowej erytrocytw Stanowi ok. 2% biaek bony komrkowej krwinki czerwonej Cechuje si swoistoci w stosunku do glukozy i D-heksoz (L-heksozy nie s przenoszone) Przy fizjologicznym steniu glukozy we krwi {ok. 5mmol/l) biako transportujce pracuje w stanie ok. 75% jego Vmajt; moe ulega wysyceniu i moe by hamowane przez niektre analogi strukturalne glukozy Dotychczas wyodrbniono 5 rnych biaek transportujcych glukoz obecnych w tkankach ssakw, biako erytrocytw jest jednym z nich Biako nie jest zalene od insuliny w przeciwiestwie do analogicznych biaek transportujcych obecnych w miniach lub tkance tuszczowej Ustalono peny skad aminokwasowy (492 reszt aminokwasowych) biaka transportujcego Biako ma zdolno przenoszenia glukozy rwnie jeeli jest umieszczone w sztucznych liposomach Szacuje si, e zawiera ono 12 przezbonowych fragmentw o budowie helikalnej Dziaanie biaka transportujcego polega na wytwarzaniu bramkowanych kanaw w bonie komrkowej, ktre umoliwiaj przemieszczanie si glukozy; kanay zale konformacyjnie od obecnoci glukozy i mog zmienia si szybko (ok. 900 razy na sekund)
870 / ROZDZIA 63
cigu z caych komrek zawierajcego mRNA, a radioaktywne biaka s syntetyzowane w obecnoci 3SS-L-metioniny lub innych aminokwasw znakowanych izotopami radioaktywnymi. Wytwarzane w tym ukadzie biaka radioaktywne s rozdzielane za pomoc elektroforezy SDS-PAGE i wykrywane autoradiograficznie. Dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza i glutation chroni krwinki czerwone przed obcieniem i uszkodzeniem tlenowym. W trakcie przemian zarwno w komrkach krwi, jak i w wikszoci innych tkanek powstaje wiele si\nych utleniaczy. Nale do nich anion ponadtlenkowy O?, nadtlenek wodoru (H2O3 ), rodniki nadtlenkowe (ROO") i rodnik hydroksylowy (OH"). Ostatni z nich jest szczeglnie aktywn czsteczk i moe reagowa z biakami, kwasami nukleinowymi, lipidami i innymi czsteczkami, co prowadzi do zmian strukturalnych i uszkodzenia tkanek. Reakcje zestawione w tab. 63-4 odgrywaj istotn rol w wytwarzaniu i unieczynnianiu utleniaczy. Zostan one po kolei omwione. Ponadtlenki (reakcja 1) s wytwarzane w erytrocytach w wyniku autooksydacji Hb do met Hb (ok. 3% Hb w ludzkich erytrocytach ulega autooksydacji w cigu doby). W pozostaych tkankach s one wytwarzane w wyniku dziaania takich enzymw, jak reduktaza cytochromu P-450 i oksydaza ksantynowa. Granulocyty
obojtnochonne pobudzone przez kontakt z bakteriami ulegaj eksplozji oddechowe] (patrz niej) i wytwarzaj ponadtlenki w reakcji katali zowanej przez oksydaz NADPH (reakcja 2). Ponadtlenek samoistnie ulega przeksztaceniu w H2O2 i O2, a reakcja ta moe zosta bardzo przyspieszona w wyniku dziaania enzymu dys-mutazy nadtlenkowej (reakcja 3), Nadtlenek wodoru ulega dalszym przemianom. Enzym katala/a, wystpujcy w wielu rodzajach kom rek, katalizuje rozpad nadtlenku wodoru do H2O i O2 (reakcja 4), Granulocyty obojtnochonne zawieraj wyjtkowy enzym mielo-peroksydaz, dziki ktrej z HZO2 i halogenkw powstaj kwasy podhalogenawe (reakcja 5). To zagadnienie zostanie omwione poniej. Zawierajcy selen enzym peroksydaza glutationowa (p. rozdz. 22) moe f5wn1e"dziaa na zredukowany glutation (GSH) i H2O2, w wyniku czgo po_wstaje utleniony glutation^XGSSG]ULH<>Q (reakcja 6). Wspomniany enzym moe uytkowa take nadtlenki jako substraty. OH' i OH" mog powstawa w nieenzymatycznej reakcji katalizowanej przez jony Fe2+ (reakcja Fentona, reakcja 7). O2 i H2O2 s substratami w
katalizowanej przez elazo reakcji Habera--Weissa (reakcja 8), w wyniku ktrej
rwnie powstaj OH' i OH". Ponadtlenek moe uwal nia jony elazowe z ferrytyny. Tak wic, produkcja OH" moe by jednym z mechanizmw uszkadzajcych tkanki w stanach nadmiaru elaza (np. w hemosyderozie).
Tabela 63-4. Reakcjtnajace znaczenie w (1) Po wstawanie po nadtlenkw (jako produktw rnych reakcji) (2) NADPH-oksydaza
obcieniu tleno wym komrek krwi i tkanek
02 +
B - Cli
+
2O 2 + NA DP H - 20; + NADP< + H
(3) Dysmutaza ponadtlenkowa

(4) Katalaza (5) Mieloperoksydaza (6) Peroksydaza glutationowa (selenozalena) (7) Reakcja Fentona
0i + <
H2O2
32+2H - H 2 O 2 + O 2 -* 2H 2 O + O 2
H2O2 + X - + H + -* HOX + H 2 0 ", (X=CI B r, S CIM -) 2GSH + R-O-OH - GSS G + H 2 O + ROH Fe2+ -+ H 2 O -> Fe 3+ + OH- + OH" O2 + H 2 O 2 -> O 2 + OH - + OH" G6P + NA DP + - 6 -fosfogluko nian + NA DP H + H
+ +
(8) Katalizowana przez elazo reakcja

Ha-bera-Weissa
0) Dehydrogenaza
glukozo-6-fosforano-wa (G6P D)
(10) Reduktaza glutationowa
GSSG + NA DP H + H
-> 2GS H + NA DP +
Zwizki i reakcje chemiczne mogce uwalnia loksyczrie postacie tlenu s okrelane jako pro-utleniacze. Z drugiej strony, zwizki i reakcje chemiczne usuwajce te postacie tlenu, zmiatajce" je, zmniejszajce ich tworzenie lub przeciwdziaajce ich dziaaniu okrelane s jako przeciwu tleni acze (antyoksydanty). Zalicza si do nich takie 2wizki chemiczne, jak NADPH, GSH, kwas askorbinowy i witamin E. W prawidowej komrce wystpuje rwnowaga midzy proutleniaczami a przeciwu tleni aczami. Rwnowaga ta moe by zaburzona na rzecz proutleniaczy, kiedy powstawanie toksycznych postaci tlenu znacznie wzronie (np. po wprowadzeniu niektrych zwizkw chemicznych lub lekw) lub gdy zawarto aniyoksydantw znacznie si zmniejszy (np. po unieczynnieniu enzytnw biorcych udzia w usuwaniu toksycznych postaci tlenu lub w warunkach obnionej zawartoci wymienionych przedwutleniaczy). Stan taki nazywamy obcieniem (stresem) tlenowym i jeeli jest on nasilony lub trwa duej, moe by przyczyn powanych uszkodze komrki. Postacie tlenu s obecnie uwaane za wany czynnik powodujcy uszkodzenie komrek (np, w wyniku podawania rnych trujcych substancji chemicznych lub niedokrwienia) niekiedy prowadzcy do mierci komrki. Porednim dowodem takiego dziaania tlenu jest ochronne oddziaywanie dysmutazy ponadtlenkowej lub katalazy w zapobieganiu uszkodzenia komrek w stanach wyej opisanych. Niedobr dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest czst w niektrych obszarach i wan przyczyn niedokrwistoci hemolttycznej NADPH, ktry powstaje w cyklu pentozowo--fosforanowym w reakcji katalizowanej przez dehydrogennz glukozo-6-fosforattow (tab. 63--4, reakcja 9) enzym, ktrego synteza dziedziczy si w sprzeniu z chromosomem X, odgrywa gwn rol w utrzymaniu rwnowagi czynnikw redukujcych w krwince czerwonej i innych komrkach, takich jak hepatocyty. Poniewa cykl pentozowo-fosforanowy jest wyczn drog powstawania NADPH w erytrocycie, jest ona bardzo podatna na uszkodzenia wywoane przez utleniacze, jeeli dochodzi do upoledzenia cyklu pentozowo-fosforanowego (np. w wyniku niedoboru enzymw). Jedn z funkcji
NADPH,jest, redukowanie GSSG do GSH. Reakcja katalizowana jest przez reduktaz glu-Tationow (reakcja 10). Niedobr aktywnoci dehydrogenazy glukozo-6-fosfo ran owej w wyniku mutacji jest bardzo czsty w niektrych czciach wiata (np. w Afryce rwnikowej, okolicach Morza rdziemnego, niektrych czciach Azji, u Murzynw w Ameryce Pnocnej). Jest on najczciej spotykan enzymopati, czyli chorob spowodowan przez zmiany en zymw. Wykazano ponad 300 genetycznie uwarunkowanych odmian wspomnianego enzymu. Obecno nieprawidowych odmian dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stwierdza si co najmniej u 100 min ludzi. Powoduje to chorob okrelan jako niedokrwisto hemotityczn. Spoywanie bobu (Kica faba) przez osoby z niedoborem aktywnego enzymu powoduje wystpienie napadw niedokrwistoci hemoli-tycznej (najprawdopodobniej dlatego, e bb zawiera silne utleniacze). Ponadto liczne leki (np. przeciwzimniczy lek prymachina Prima-quine) (tzw. niedokrwisto hemolityczna uwarunkowana prymachina) lub sulfonamidy oraz inne czynniki chemiczne (np. naftalen) mog wywoywa napady, poniewa ich zaycie powoduje wytwarzanie H2O2 lub O~^. W warunkach prawidowych H2O2 jest rozkadany przez katalaz i peroksydaz glutationow (tab. 63-4, reakcje 4 i 6). Ostatnia z tych reakcji prowadzi do powstania GSSG. GSH jest regenerowany z GSSG w wyniku dziaania enzymu reduktazy glutationowej, ktrej dziaanie zaley od dostpnoci NADPH (reakcja 10). Krwinki czerwone osb, u ktrych wystpuje niedobr aktywnoci dehydrogenazy glukozo-6-fosforano-wej, nie mog wytwarza dostatecznych iloci NADPH do regeneracji GSH z GSSG. To z kolei upoledza zdolno krwinek do unie-czynniania H2OZ i rodnikw tlenowych. Zwizki te mog powodowa utlenienie krytycznych grup SH w biakach i prawdopodobnie powo dowa peroksydacj Lipidw bony krwinki czerwonej, co prowadzi do lizy krwinek. Utlenienie niektrych grup SH w Hb powoduje wytrcanie si tego biaka wewntrz erytrocytw i tworzenie si ciaek Heinza, ktre stwierdza sie po wybarwieniu na purpurowo za pomoc fioletu krezylowego. Obecno ciaek Heinza wskazuje, e krwinki czerwone znajduj si w stanie obcienia (stresu) tlenowego. Rycina 63-2 zestawia acuch przyczynowy zaburze wystpujcych u chorych na niedokrwisto hemolityczna.
872 / ROZDZIA 63
Mutacje genu kodujcego G6PD
Obniona aktywno G6PD Obniona zawarto& NADPH Obniona regeneracja GSH z GSSG przez reduktaz glutationowa (Ktra wymaga udziatu NADPH)
Utlenianie grup SH Hb (tworzenie ciatek Heinza) i biatek bony w wyniku zmniejszonej zawartoci GSH i wzrosiu zawartoci wewntrzkomrkowych utleniaczy (np. 0 ^, co prowadzi do zm iany struktury ttony I wzrosiu podatnoci na strawienie przez makrotagi (moliwe Jest rwnie uszkodzenie lipidfiw bony przez nadtlenki) Hemoliza
Rvc. 63-2. Podsumowanie prawdopodobnych zjawisk powodujcych niedokrwisto hemolitycz-n w wyniku niedoboru aktywnoci dehydrogena-zy glukozo-6-fosforanowej (G6PD),
Met hemoglobin a nie bierze udziau w przenoszeniu tlenu Jony elazawe z Hb s podatne na utlenienie przez ponadtlenki i inne utleniacze, w wyniku czego powstaje metHb, ktra nie posiada zdolnoci przenoszenia tlenu, W warunkach prawidowych tylko bardzo maa ilo metHb znajduje si we krwi, poniewa krwinka czerwona ma skuteczny ukad redukujcy jony elazowe Fe3 k do elazawych Fe^+ (ukad reduktazy NADH-cytochrom b; met hemoglobina) Ukad ten skada si z NADH (wytwarzanego w procesie glikolizy), flawofstpteiny nazwanej reduk-taz cytochromu b; (zwanej take reduktaz metHb) i cytochromu b;. Jony elazowe Fes + metHb s redukowane do elazawych Fe 2 + w wyniku dziaania zredukowanego cytochromu bj!
na spoyciem licznych lekw lub zwizkw chemicznych. aden z rodzajw met hemoglobinemii nie wystpuje czsto, ale lekarz powinien by wiadomy moliwoci pojawienia si u chorego tego schorzenia. Wrodzona posta met-hemoglobinemii zwykle jest wynikiem niedoboru aktywnoci reduktazy methemoglobinowej, co jest przekazywane jako cecha autosomalna re-cesywna. Niektre rodzaje nieprawidowych hemoglobin (HbM) mog stanowi rzadk przyczyn methemoglobinemii. W HbM mutacje prowadz do zmian w skadzie reszt amino-kwasowych biorcych udzia w poczeniu z he-mem, co zmienia powinowactwo Hb do tlenu i uatwia proces utleniania. Zaycie wielu lekw (np. sulfonamidw) lub substancji chemicznych (np. aniliny) moe stanowi przyczyn nabytej methemoglobinemii. Sinica (niebieskosine zabarwienie skry i bon luzowych spowodowa ne wzrostem zawartoci nieutlenowanej Hb we krwi ttniczej lub w omawianym przypadku wzrostem zawartoci metHb we krwi) jest zwykle dominujcym objawem, a jest ona wyrana, jeeli ponad 10% Hb wystpuje w postaci metHb. Rozpoznanie opiera si na spektro skopowym badaniu krwi, ktre uwidacznia typowe widmo absorpcyjne metHb. Dodatkowo, prbki krwi zawierajcej metHb nie mog by w peni utlenowane przez przepuszczany przez nie tlen, w przeciwiestwie do nieutlenowanej prawidowej krwi. Obecno nieprawidowej Hb mona wykaza za pomoc elektroforezy. W leczeniu lekkich postaci methemoglobinemii wywoanych niedoborem enzymu stosuje si bkit metylenowy lub kwas askorbinowy (czynniki redukujce). Ostra nasilona methemoglobinemia (wywoana spoyciem zwizkw chemicznych) powinna by leczona doylnymi podawaniami bkitu metylenowego. O BONIE LUDZKICH ERYTROCYTW WIADOMO WICEJ NI O BONIE ZEWNTRZNEJ INNYCH KOMREK ORGANIZMU CZOWIEKA Do badania bony krwinek czerwonych stosuje si rne metody biochemiczne (p. rozdz. 43). Naley do nich rozdzia biaek bony za pomoc elektroforezy SDS-PAGE z zastosowaniem swoistych enzymw (proteinazy, glikozy-dazy i in.), aby zlokalizowa biaka i gliko-
Zredukowany cytochrom b; jest nastpnie regenerowany w wyniku dziaania reduktazy cytochromu b ;: Cyt b, ,, + NADH^Cyt b5 M + NAD+ + H
+
Methemoglobinemia moe by wrodzona lub nabyta f Methemoglobinemia moe by podzielona na wrodzon i nabyt. Ta ostatnia jest spowodowa-
ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 873 Tabela 63-5. Zestawienie biochemicznej charakterystyki bony komrkowej krwinek czerwonych Bona jest dwuwarstwowa i skada si w 50% z lipidw i 50% z biaek Gwn grup lipidw stanowi fosiolipidy i cholesterol; gwnymi fosfolipidami s fosfatydylocholina (PC), etanoloamina (PE) i fosfatydyloseryna (PS) oraz sfingomielina (Sph) Fosfolipidy zawierajce cholin: PC i Sph przewaaj w zewntrznej warstwie bony, a fosfolipidy zawierajce aminokwasy (PE i PS) w wewntrznej warstwie bony Glikosfingolipidy (G^Ls) (oboj tne GSLs, gangliozydy i zwizki zoone, w tym zwizki grupowe krwi ABO) stanowi oft. 5-10% wszystkich lipidw Rozdzia za pomoc SDS-PAGE elektroforezy wykazuje, ze bona zawiera ok. 10 gwnych biaek i ponad 100 biaek pomniejszych Gwne biaka bony (w tym spektryna, ankiryna, biako wymiany anionw, aktyna i biako 4.1) zostay intensywnie przebadane; ustalono ich rozmieszczenie (integralne lub peryferyjne biako), budow oraz funkcj Wiele z biaek bony to glikoproteiny (np. glikoferyny) zawierajce acuchy o!?(fbsaciarydowe zwizane za pomoc 0- i (lub) IM-wizania i umieszczone na zewntrznej powierzchni bony
J
proteiny w bonach, a take rne techniki badania zawartoci i rozmieszczenia poszczeglnych lipidw. Stosuje si take techniki morfologiczne (np. mikroskopia elektronowa, mikroskopia elektronowa mroeniowego przeomu struktur biologicznych freeze-fracture elec-tron microscopy) oraz inne metody (np. uycie przeciwcia skierowanych przeciwko okrelonym skadnikom) Rozpad erytrocytw w okrelonych warunkach prowadzi do powstania cieni krwinek o naturalnym ukadzie bony komrkowej. Zmiana warunkw Sizy powoduje powstanie cieni krwinek majcych cytozolow stron? bony umieszczon na zewntrz (odwrcone cienie krwinek). Oba rodzaje cieni s przydatne w analizie rozmieszczenia swoistych biaek i lipidw bony komrkowej. W ostat nich, latach otrzymano cDNA dla wielu biaek bony, co pozwolio na okrelenie ich skadu aminokwasowego i budowy, W sumie znacznie wicej wiadomo o bonie krwinek czerwonych ni o jakiejkolwiek bonie innych komrek organizmu czowieka (tab. 63-5), Za pomoc SDS-PAGE rozdziela si biaka bony erytrocytw Zastosowanie elektroforezy SDS-PAGE pozwala na wyodrbnienie ok. 10 gwnych biaek obecnych w bonie krwinek czerwonych (ryc. 63-3). Wiele z nich okazao si by gliko-proteinami, co wykazano za pomoc reakcji PAS (kwas nadjodowy odczynnik Schiffa)
Spektryna Ankiryna .
Biako wym iany / , a.i anio n w!
, d
7
AKlyna S G9PD 6
iH
z
Glikoforyny
Glob Ina
Barwienie bkitem Coomasste
Barwienie metod PAS
Ryc. 63-3. Diagram gwnych biatek bony ludz kich krwinek czerwonych po rozdziale za pomoc SDS-PAGE. Biaka wybarwiajce si bkitem Co omassie przedstawiaj dwa lewe supki, prawy supek przedstawia biaka wybarwiajce si kwa sem nadjodowym i odczynnikiem Schiffa. (Wed ug: Beck W. S., Tepper R.).: Hemolyticanemiaslll. Membran disorders; w: Beck W. S. (red.): Hematoiogy. The MIT Press 1991, wyd, 5, za zezwole niem). _____________________________
874 / ROZDZIA 63
(p. rozdz. 57). Biaka okrela si zgodnie z szybkoci migracji elektroforetycznej, a najwolniej przesuwajce si (a wic biako o najwikszej masie czsteczkowej) nazwane zostao biakiem pasma I lub spektryn. Wyodrbniono wszystkie gwne biaka, wikszo z nich zostaa zidentyfikowana, a take poczyniono znaczny postp w zrozumieniu ich czynnoci biologicz-
nych (tab. 63-6). Ustalono rwnie skad ami-nokwasowy i sekwencj wielu biaek. Poza tym ustalono, ktre z biaek s integralnymi, a ktre peryferyjnymi biakami bony komrkowej, ktre biaka znajduj si na zewntrznej powierzchni, a ktre s umiejscowione na powierzchni cytoplazmatycznej lub zajmuj ca szeroko bony (ryc. 63 -4). Za pomoc czuych
Tabela 83-6. Gwne biaka bony komrkowej erytrocytu* Biako Numar pasma**
1
Przybliona masa czsteczkowa 240 000 220 000 210 000 195 000 175 000 145 000 100 000 80 000 43 000 35 000 . -29 000 23 000 31 000, 23 000, 28 000
Biako
Spektryn (a) Spektryn (J3) Ankiryna Ankiryna Ankiryna Ankiryna Biako wymiany anionw Nie nazwane Aktyna Dehydrogenaza gliceraldehydo-6-fosforanowa Tropom i ozyna Nie nazwane Glikoforyny A, B, C
integralne {1) lub peryferyjna (P) P P P P P P 1 P P P P P 1
2 2.1 2.2 2.3 2.6 3 4.1 5 6 7 8
* Dane zaadaptowane z pracy: Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membran skeleton: Hereditary spherocytosis and hefeditary elliptocytosis; w. The Metabolic Basis of Inherited Disease, Scriver CR i in. (red.), wydanie 6, McGraw-Hill, 1989. "* Numer pasma odnosi si do szybkoci migracji w elektroforezie SDS -PAGE (p. ryc. 63-3). Glikoforyny s wykrywane za pomoc barwienia metod PAS (kwas nadjodowy odczynnik Schiffa). Liczne inne skadniki pominito w tabeli. Natywna spektryn ma budow x$7
Oddziaywanie spektryny z ankiryna l Wtkiem 3 OddZfatywsme aktyny i spektryny z biakiem 4.1
Zewntrzna strona bony Wewntrzna strona btony
,Glikoforyna Dwuwarstwowa W ana ---------lip Id owa Spektryna
Poczenie czsteczek spektryny
Ryc. 63-4. Diagram oddziaywa biaek cytoszkieietu midzysobizinnymi integralnymi biakami bony krwinki czerwonej. (Wedug: Beck W. S., Tepper R. i: Hemolytic anemias III: Membran disorders; w: Beck W. S. (red): Hematology. The MiT Press 1991, wyd. 5, za zezwoleniem).
metod barwienia lub dwukierunkowej elektroforezy w bonie krwinek czerwonych mona zidentyfikowa wiele pomniejszych skadni kw. Jednym z tych skadnikw jest opisane uprzednio biako przenoszce glukoz. Gwnymi integralnymi biakami bony komrkowej s biaka wymiany anionw i glikoforyny Biako wymiany *anionw (pasmo 3) jest przezbonow glikoprotein. ktrej C-koniec znajduje si na zewntrznej powierzchni bo ny, a N-koniec na powierzchni cytoplazma-tycznej bony. Jest ono przykadem wielokrotnie p rzebiono w ego (multipass) biaka, ktre rozciga si miedzy powierzchniami bony co najmniej 10 razy. Wystpuje ono prawdopo dobnie w postaci dimeru. ktry tworzy kana pozwalajcy na przemieszczenia i wymian chlorkw na wodorowglany. Dwutlenek wgla wytwarzany w tkankach wnika do krwrnek czerwonych w postaci wodorowglanw, ktre ulegaj wymianie na chlorki w pucach, gdzie dwutlenek wgla jest wydalany z powietrzem wydychanym. N-koniec biaka wie wiele innych biaek, w tym Hb, biaka 4.1 i 4.2, ankiryn i wiele enzymw glikolitycznych. Wykazano, e oczyszczone biako pasma 3, dodane do pcherzykw lipidowych in vitro spenia swoj czynno transportow w tym zrekonstruowanym ukadzie. Glikoforyny A, B i C s rwnie biakami przezbonowymi, ale rozcigaj si midzy powierzchniami bony tylko raz (biaka jednokrotnie przezbonowe single-pass). Gwn glikofo-ryn jest glikoforyna A; zbudowana jest z 131 reszt aminokwasowych i silnie glikozylowana (ok. 60% caej masy czsteczkowej stanowi wglowodany). Jej N-koniec zawiera 16 acuchw oligosacharyd owych (15 z nich to O-glikany), ktre s wystawione na zewntrz, ponad powierzchni erytrocytu. W tym biaku zawartych jest ok. 90% kwasw sjalowych bony krwinki czerwonej. Odcinek rdbonowy biaka (23 reszty aminokwasowe) ma struktur heliksu a. Odcinek C- kocowy siga cyt o plazmy i wie biako 4.1, ktre z kolei wie spektryn. Polimorfizm omawianego biaka ley u podstaw systemu grup krwi MN (p. dalej). Glikoforyna A zawiera miejsca wice wirusy grypy oraz zarodce sierpowate (Plasmodium falciparum), pasoyty wywoujce zimnic. Co ciekawe, brak glikoforyny A nie wydaje si zaburza czynnoci erytrocytw.
Spektryna, ankiryna i inne peryferyjne biaka bony wspomagaj utrzymanie ksztatu i elastycznoci erytrocytu Krwinka czerwona musi mie zdolno do przeciskania si przez wskie obszary mikro-kraenia podczas niezliczonych przemieszcze w caym ciele; szczeglnie istotnym w tym aspekcie miejscem s naczynia zatokowe ledziony. Aby krwinka czerwona moga atwo i odwracalnie zmienia swj ksztat, jej bona komrkowa nrasi by pynna i elastyczna; musi take zachowywa ksztat dwuwklsy, poniewa to uatwia wymian gazow. Lipidy bony komrkowej pozwalaj na zachowanie pynnoci bony. Do wewntrznej strony bony komrkowej krwinki czerwonej przyczepione s liczne peryferyjne biaka cytfkieletu (tab. 63-6), ktre odgrywaj wan rol w utrzymywaniu ksztatu dwu wklsego i elastycznoci krwinki. Zostan one poniej omwione. Spektryna jest gwnym biakiem cytoszkiele-tu. Skada si ona z 2 polipeptydw: spektryny 1 (czyli acucha cc) i spektryny 2 (acucha fi). acuchy te, mierzce ok. 100 nm dugoci, s uoone nierwnolegle i luno ze sob skrcone, tworzc dimer. Obydwa acuchy zbudowane s z 106 reszt aminokwasowych skrconych w postaci ot-heliksu i poczone fragmentami nieheliksowymi. Dimer spektryny czy si z innym dimerem spektryny tworzc uporzdko wany liniowy tetramer. Cay ksztat biaka umoliwia jego elastyczno, co z kolei udziela si caej bonie krwinki. W spektrynie zidentyfikowano co najmniej 4 miejsca wice: 1) dla wzajemnego poczenia, 2) dla ankiryny (pasmo 2.1 itp.), 3) dla aktyny (pasmo 5) i 4) dla biaka 4.1. Ankiryna jest biakiem o ksztacie piramidy, ktre wie spektryn, z kolei ankiryna cile czy si z pasmem 3 zabezpieczajc w ten sposb zwizanie spektryny z bon komrkow. Ankiryna jest wraliwa na dziaanie proteolityczne, co jest powodem powstawania pasm 2.2, 2.3 i 2.6, ktre pochodz z pasma 2.1. Aktyna (pasma 5) wystpuje w krwinkach czerwonych w postaci krtkich, podwjnych helikalnych segmentw F-aktyny. Kocowy odcinek spektryny wie si z aktyn. Aktyna wie si take z biakiem 4.1. Biako 4.1 jest biakiem globularnym cile zwizanym z kocowym odcinkiem spektryny w pobliu miejsca, w ktrym spektryna wie aktyn. Tak wic biako 4.1 jest czci trzy-skadnikowego zespou; biako 4.1 spekt-
876 / ROZDZIA 63
ryna-aktyna. Biako 4.1 wie si rwnie z integralnymi biakami: glikoforyn A i C, w ten sposb take wczonymi do wspomnianego zespou biaek. Co wicej, biako 4.1 moe oddziaywa z niektrymi fosfolipidami bony i w ten sposb dochodzi do poczenia dwuwarsNiektre inne biaka (4.9, addukcyna, tropo-miozyna) take bior udzia w strukturach cytoszkieletu. Zaburzenia Moci i struktury spektryn s przyczyn dziedzicznej sferocytozy i eliptocytozy Dziedziczna sferocytoza (HS) jest genetycznie uwarunkowan chorob, przenoszon jako cecha autosomalna dominujca. Dotyczy ona ok. I na 5000 mieszkacw Ameryki Pnocnej. Choroba charakteryzuje si obecnoci we krwi obwodowej sferocytw (kulistych krwinek czerwonych, w ktrych stosunek powierzchni do objtoci jest obniony). Towarzyszy temu nie-dokrwisto hemolityczna i powikszenie ledziony. Sferocyty nie s tak podatne jak krwinki prawidowe na odksztacenia i s niszczone w ledzionie, co znacznie skraca ich czas ycia w kreniu. Dziedziczna sferocytoza moe by wyleczona wyciciem ledziony, poniewa przy braku ledziony sferocyty mog duej pozostawa w kreniu. Sferocyty s znacznie bardziej podatne na
rozpad w warunkach obnionego cinienia osmo-tycznego (osmoliz) ni prawidowe twowe] bony lipidowej z cytoszkieletem.
Mutacje DNA wpywajce na Ilo lub budow spektryny wzgldnie Innych biatek cytoszkieletu (np. ankiryny) Osiabierife oddziaywa pomi dzy peryferyjnymi I integralnymi biakami bony komrkowa) krwinki czerwone]
I
Osfabfenie struktury bony komrkowej krwinki czerwonej Osignicie przez krwink czerwon ksztatlu kulistego i niszczenie takich krwinek w ledzionie Miedokrwisto henno! I tycz na
Ryc. 63-5. Zestawienie przyczyn wywoujcych dziedziczn sferocytoz.
oddziauje. Prowadzi to do osabienia bony i nadaje kulisty ksztat krwinkom. Nieprawidowoci dotyczce innych biaek {np. ankiryny) bior udzia w niektrych postaciach dziedzicznej sferocytozy. uwarunkowan chorob zblion do dziedzicznej sferocytozy, a rnic jest eliptyczny, zbliony do dysku ksztat krwinek czerwonych, ktry mona stwierdzi pod mikroskope m. Przyczyn tego schorzenia jest rwnie nieprawidowo spektryny, a w niektrych przypadkach stwierdza si zaburzenia pasma 4.1. i glikoforyny C. WIELE JEST UKADW KRWI, W TYM UKADY ABO, Rh I MN Poznano co najmniej 21 ukadw grupowych krwi. Najlepiej znane z nich s ukady ABO, Rh (Rhesus) i MN. Okrelenie grupa krwi oznacza system antygenw krwinki czerwonej (substancji grupowych krwi) okrelony przez genetyczny locus ze zmienn liczb alleli (np. antygeny A, B i 0 w ukadzie grupowym ABO). Okrelenie typ krwi (blood type) odnosi si do fenotypu antygenowego zwykle rozpoznawanego przy uyciu waciwych przeciwcia. Do przetaczania krwi niezbdne jest poznanie podstaw ukadw grupowych ABO i Rh. Zainteresowanie grupami krwi dotyczy zagadnie biochemicznych, genetycznych, immunologicznych, antropologicznych, pooniczych, patologicznych i medycz-no-sdowych. W niniejszym opracowaniu krtko omwione zostan gwne cechy ukadu ABO i wspomniana natura biochemiczna ukaDziedziczna eliprocytoza jest genetycznie
krwinki czerwone. Jest to wykorzystywane w tecie opornoci osmotycznej. w ktrym krwinki czerwon e s poddawane iwitro dziaaniu obniajcych si ste chlorku sodowego. Fizjologicznie stenie chlorku sodowego wynosi 0,85 g/dl (0,85%). Kiedy prawidowe krwinki czerwone poddaje si dziaaniu roztworu chlorku sodowego o steniu 0,50 g/dl (0,50%) tylko maa cz krwinek ulega hemolizie, podczas gdy to samo stenie chlorku sodowego powoduje rozpad ok. 50% sferocytw. Wyjania si to faktem, e sferocyty bdce komrkami kulistymi nie maj moliwoci zwikszenia swej objtoci przy wchoniciu pewnej iloci wody, tote ulegaj rozpadowi po poddaniu ich dziaaniu lekko obnionego cinienia osmotycznego. Przyczyn dziedzicznej sferocytozy (ryc. 63--5) jest niedobr ilociowy spektryny lub nieprawidowoci jej budowy,' co prowadzi do upoledzenia zdolnoci wizania do innych biaek, z ktrymi w warunkach prawidowych
dw Rh i MN. Z biochemicznego punktu widzenia istotne jest wyodrbnienie i okrelenie budowy substancji grupowych ABO, okrelenie drg ich biosyntezy i ustalenie charakteru produktw genw A, B i 0. Ukad grupowy ABO ma ogromne znaczenie w przetaczaniu krwi Ukad ABO zosta opisany po raz pierwszy przez Landsteinera^v 1900 r. podczas badania podstaw zgodnoci i niezgodnoci przetaczanej krwi ludzkiej. Bony krwinek czerwonych wikszoci ludzi zawieraj substancje ukadu grup krwi grupy A, B, AB lub 0. Osoby grupy A maj w osoczu krwi przeciwciaa skierowane przeciwko grupie B, tak wic ich osocze aglutynuje (zlepia) krwinki osb grupy B lub AB. Osoby grupy krwi B maj przeciwciaa skierowane przeciwko A w osoczu krwi i one aglutynuj krwinki grupy A i AB. Osoby z grup krwi AB nie maj w osoczu ani przeciwcia anty-A, ani przeciwcia anty-B i s dlatego okrelane jako uniwersalni biorcy. Osoby z grup krwi 0 nie maj w krwinkach czerwonych ani substancji A, ani B i dlatego s okrelane jako uniwersalni dawcy. Wyjanienie tych zjawisk czy si z faktem, e organizm zwykle nie wytwarza przeciwcia przeciwko wasnym skadnikom, tak wic osoby z grup krwi A nie wytwarzaj przeciwcia przeciwko substancji grupowej A, ale wytwarzaj przeciwciaa skierowane przeciwko obcym substancjom grupowym krwi, tj. substancji B prawdopodobnie w wyniku podobiestwa strukturalnego tej substancji do zwizkw obecnych w niektrych mikr oorganizmach, z ktrymi organizm czowieka styka si we wczesnych okresach ycia. Poniewa osoby z grup krwi 0 nie maj w krwinkach ani substancji A, ani B, maj w osoczu przeciwciaa przeciwko obu tym substancjom. Powyszy opis jest uproszczony, poniewa wystpuj dwie podgrupy w ramach grupy A. tj. AA i A2 . Geny odpowiedzialne za wytwarzanie substancji ukadu ABO s zlokalizowane w dugim ramieniu chromosomu 9. Wyrniono trzy al-lele, dwa z nich s rwnocenne (kodominujce) (A i B), a pozostay jest recesywny (0). Daje to ostatecznie cztery moliwe fenotypy: A, B. AB iO.
Substancje grupowe s glikosfingolipidami i glikoproteinami majcymi wsplne acuchy oligosacharydowe Substancje ABO s zoonymi oligosacharydarni obecnymi w wikszoci komrek organizmu i wystpuj w wielu wydzielinach. Oligosacharydy, ktre determinuj swoist natur substancji ABO na powierzchni bon krwinek czerwonych, wystpuj przede wszystkim w postaci gikosfingolipidw, podczas gdy w pynach ustrojowych te same oligosacharydy wystpuj w postaci glikoprotein. Ich obecno w pynach ustrojowych jest zdeterminowana przez gen oznaczony jako Se (od angielskiego sowa sec-retor wydzielacz), ktry koduje swoist transferaz fukozylow (Fuc), wystpujc w narzdach wydzielniczych, takich jak gruczoy wydzielania zewntrznego, ale ktra nie jest czynna w krwinkach czerwonych. Osoby o genotypie SeSe lub Scse wydzielaj antygen A lub B (wzgldnie obydwa), podczas gdy osoby o genotypie sese nie wydzielaj substancji A lub B, ale ich krwinki czerwone maj na swej powierzchni antygeny A i B. Substancja H jest biosyntetycznym prekursorem zarwno substancji A, jaki B Substancje ABO zostay wyodrbnione, okrelono te ich budow. Rycina 63-6 przedstawia uproszczon wersj (tylko nie dajce si zredukowa fragmenty kocowe) substancji ukadu ABO. Naley przede wszystkim zwrci uwag na struktur substancji H, poniewa jest ona prekursorem zarwno substancji A i B, jak i stanowi substancj grupow krwi stwierdzan u osb z grup krwi 0. Substancja H powstaje w wyniku dziaania transferazy fwkozylowej, ktra katalizuje przyczenie fukozy wystpujcej na kocu acucha oligosacharyd owego do reszty galaktozy za pomoc wizania a 1,2 w nastpujcej reakcji:
GDP-Fuc -Gal-cc-R -Fuc-a1F2-Gal-p-R + GDP Prekursor Substancja H
Wymienion transferaz fukozyiow koduje gen H. Allel h w locus H koduje nieaktywn transferaz fukozyiow, tak wic osoby z genotypem hh nie mog wytwarza substancji H. Osoby z genotypem hh maj krwinki czerwone grupy 0, mimo e posiadaj enzymy niezbdne do wytwarzania substancji A lub B (p. niej).
878 / ROZDZIA 63 Fucal -> 2GafB1 - 2GalNAcra R Substancja B GalNAc Substancja A 2GalB! - 3GalNAca R Ryc. 63-6. Schematyczne przedstawienie struktury substancji grupowych krwi H, A i B. Substancja H jest dugim acuchem oligosacharydowym typu kompleksowego, przyczonym do ceramidu, kiedy substancje grupowe s glikosfingolipidami, lub te do acucha polipeptydowego biaek poprzez reszt seryny, jeli substancje grupowe s glikoproteinami Mona zauway, ze struktury substancji grupowych krwi s dwuantenowe; tzn maj 2 rozgazienia, ktre mog si rozwidla (czego nie po kazano) w punkcie poczenia GalNAca-R; na rycinie tej pokazano tylko jedn z moliwoci tego rozwidlenia. Kada z substancji H, A, B zawiera 2 odpowiednio krtkie acuchy oiigosacharydowe, pokazane powyej. Substancja AB zawiera jeden typ acucha A i jeden typ acucha B.
Fucal - 2GalB1 - 3GalNAca R Substancja H (lub O)
GEN A KODUJE TRANSFERAZ GalNAc, GEN B TRANSFERAZ Gal A GEN 0 NIECZYNNY PRODUKT W porwnaniu z substancj H (ryc, 63-6) substancja A zawiera dodatkowo GalNAc, a substancja B zawiera Gal przyczon jak pokazano na rycinie. Przeciwciaa przeciwko A s skierowane przeciwko dodatkowej reszcie GalNAc, ktra znajduje si w substancji A. Przeciwciaa skierowane przeciwko B s skierowane przeciwko dodatkowej reszcie Gal obecnej w substancji B. Reszta cukrowcowa GalNAc jest immunodominujcym ctffcrem (tj. jedynym determinujcym swoisto przeciwcia skierowanych przeciwko substancjom grupowym krwi) dla grupy A, podczas gdy Gal jest immunodominujcym cukrem dla substancji B, W wietle tych stwierdze strukturalnych nie jest zaskakujce, e substancja A moe by syntetyzowana in vitro z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferaz GalNAc, dla ktrej dawc cukru jest UDP-GalNAc, Podobnie substancja grupy krwi B moe by wytworzona z substancji 0 w reakcji katalizowanej przez transferaz Gal z uyciem UDP-Gal. Naley wic przyj, e gen grupy krwi A koduje syntez transferazy GalNAc, ktra przycza reszt GalNAc do substancji 0. Podobnie produktem genu grupy krwi B jest transfera/a Gal przytaczajca Gal do substancji 0. Osoby majce grup krwi AB posiadaj obydwa enzymy i dwa acuchy oligosacharydowe, jeden zako-
czony GalNAc, a drugi Gal (ryc. 63-6). Osoby z grup krwi 0 wytwarzaj jedynie nieaktywne biako enzymatyczne, ktre mona wykry za pomoc metod immunologicznych. Ich substancj grupow krwi w ukadzie ABO jest substancja H. W 1990 r. ustalono za pomoc kodowania i technologii okrelania sekwencji rnice mi dzy produktami glukozylotransferaz, tj. produktami genw A, B i 0. Rnica 4 nukleotydw jest wystarczajca, aby zrnicowa swoisto glukozylotransferazy A i B. Z drugiej strony, allel 0 cechuje si mutacj pojedynczej pary zasad powodujc zmian fazy odczytu oraz produkcj biaka pozbawionego enzymatycznej aktywnoci transferazy. Czynnik Rh (antygen D) jest integralnym biakiem bony komrkowej krwinek czerwonych i moe powodowa powane problemy transfuzjo logiczne Ukad grupowy Rh jest zoony i ani jego genetyczna ani biochemiczna natura nie zostaa w peni poznana. Jest on zdeterminowany przez 3 powizane ze sob geny umiejscowione na chromosomie 1. Produkty tych alleli zostay okrelone jako C lub c, E lub e oraz D lub d, ale biochemicznie produkty te nie zostay zidentyfikowane. Najwiksze znaczenie i zainteresowanie budzi antygen D (Rha), ktry jest nazywany czynnikiem Rh. Jest on integralnym biakiem bony komrkowej krwinek czerwonych o ma -
sie czsteczkowej ok. 30 000. Jego interakcje z fosfolipidami bony mog mie znaczenie dla ;ego antygenowoci. Okoo 15% osb rasy kaukaskiej nie ma tego antygenu i s one okrelane jako Rh-ujemne. Jeeli takiej osobie zostanie przetoczona krew Rh-dodatnia, bdzie wytwarza przeciwciaa skierowane przeciwko antygenowi D {Rh 0). Wane jest wic, aby osoby te otrzymyway transfuzje krwi Rh-ujem-nej, a szczeglnie *jest to istotne dla kobiet w wieku prokreacyjnym, ktre mog zaj w d. Jeeli taka kobieta w wyniku niedopatrzenia otrzyma krew Rh-dodatni, w jej krwi obecne bd przeciwciaa przeciwko antygenowi D (Rho). Z kolei jeeli jej dziecko bdzie Rh-dodatnie przeciwciaa te mog wywoa li krwinek dziecka, co okrelane jest jako hemo-lityezna choroba noworodkw. Po porodzie lub po poronieniu kobieta Rh-ujemna powinna rutynowo otrzyma Rho (D) immunogobuUn, ktra skutecznie przeciwdziaa tworzeniu przeciwcia przez matk skierowanych przeciwko antygenom Rho (D), na ktre bya naraona. Ukad grupowy MNSs dotyczy polimorficznych postaci glikoforyn Ai B Ukad grupowy MN jest rozpoznawany za pomoc przeciwcia skierowanych przeciwko polimorficznym formom glikoforyny A. Na poziomie genowym obecne s dwa rownocenne allele: M i N z trzema moliwymi genotypami M/M, M/N i N/N. Z koiei moliwe s 3 fenotypy: M, MN, N. Chocia glikoforyna A zawiera znaczn ilo wglowodanw, polimorfizm nie dotyczy czci oligosacharydowej, a jedynie reszt aminokwasowych w N-kocu acucha polipeptydowego. Rnice przedstawiaj si nastpujco:
reszta 1 Ser Leu reszta 5 Gly Glu
NIEDOKRWISTOCI HEMOLITYCZNE MOG BY WYW OANE PRZEZ CZYNNIKI WYSTPUJCE NA ZEWNTRZ KOMRKI, W BONIE KOMRKOWEJ I WEWNTRZ ERYTROCYTU Zcwntrzkomrkowe przyczyny niedokrwistoci hemolitycznych obejmuj hipersplenizm, tj. stan, w ktrym ledziona jest powikszona z rnych przyczyn i powoduje niszczenie krwinek czerwonych. Przyczyny immunologiczne (np. reakcje poprzetoczeniowe, obecno w osoczu ciepych lub zimnych przeciwcia, ktre powoduj li krwinek czerwonych i nadwraliwo na dopeniacz \(pwnie zaliczaj si do przyczyn zewntrzkomorkowych, tak jak trucizny uwalniane przez niektre mikroorganizmy, np. bakterie z rodzaju Ciostridium, Niektre we posiadaj w jadzie substancje powodujce li krwinek w wyniku dziaania na bon komrkow (np. przez aktywacj fosfolipaz lub proteinaz). Przyczyny umiejscowione w bonie komrkowej dotycz nieprawidowej budowy biaek. Najwaniejsz przyczyn jest dziedziczna sfero-cytoza i dziedziczna eliptocytoza, gwnie spowodowana przez nieprawidowoci spektryny (p. wyej). Przyczyny niedokrwistoci hemolitycznych zlokalizowane wewntrz erytrocytu obejmuj hemoglobinopatie i enzymopatie. Najwaniejsz hemoglobinopati jest niedokrwisto sierpo wa ta. Najczciej wystpujcymi enzym opatiami s nieprawidowoci cyklu pentozowo-fos-foranowego, szczeglnie glikolizy. Przewaajcy w populacjach niektrych czci wiata niedobr dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej stanowi przyczyn niedokrwistoci hemolitycz-nej (p. wyej). Niedobr kjnazy pirogroniatiowej nie jest czsty, ale jest drugim co do czstoci wystpowania niedoborem enzymatycznym po wodujcym niedokrwisto hemolityczn z powodu upoledzenia glikolizy. Powoduje to zmniejszone tworzenie ATP, co upoledza w rny sposb integralno bony krwinek czerwonych. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwistoci hemolitycznych zestawiono w tab. 63-7.
Ukad Ss jest podklas ukadu grupowego MN i dotyczy polimorfizmu glikoforyny B. Formy S i s rni si jedn reszta amino -kwasow. Ukad MNSs nie ma duego znacze nia w transfuzjologii, ale jest przydatny w badaniach dziedziczenia jako ukad genw cile powizanych na jednym chromosomie.
880 / ROZDZIA 63 Tabea 63-7. Badania laboratoryjne pomocne w rozpoznawaniu niedokrwisto ci hemolitycznej Badania oglne Badania swoiste
Wzrost stenia we Elektroforeza Hb (np. wykrycie HbS), krwi nieskoniugowa-nej oznaczanie aktywno(poredniej) bili ci enzymw krwinki rubiny; czerwonej (np. skrcenie czasu ycia dehyd-rogenazy krwinek czerwonych giukozo-6--fosforano mierzone jako czas wej lub ki-nazy ycia podanych dopirogronianowej); ylnie zmniejszona oporno autologicz-nych osmotyczna (np. w dziekrwinek czerwonych s1 dzicznej sferocytozie), znakowanych Cr; odczyn Coombsa; zimretikulocytoza; ne aglutyniny hemoglobinemia; Bezporedni odczyn Coombsa wykrywa obecmae stenie no przeciwcia na hapto-globiny w krwinkach czerwoosoczu nych podczas gdy poredni odczyn Coomb-sa wykrywa obecno krcych przeciwcia przeciwko antygenom krwinek czerwonych
forylacja oksydacyjna (z powodu wzgldnie maej liczby mitochondriw) oraz wysoka zawarto enzymw lizosomalnych. Wiele z tych enzymw, zestawionych w tab. 63-4, bierze udzia take w tlenowym metabolizmie granulocytw obojtnochonnych (p. ni ej). Tabela 63-9 zestawia czynnoci biologiczne niektrych biaek, ktre s wzgldnie swoiste dla granulo-cytw obojtnochonnych. Granuiocyty obojtnochonne s gwnymi obrocami organizmu przed zakaeniami bakteryjnymi Granuiocyty obojtnochonne s ruchliwymi komrkami ernymi, ktre odgrywaj gwn rol w stanach ostrych zapale. Wniknicie bakterii do tkanek wywouje zesp zjawisk, ktre zbiorczo okrela si jako ostra odpowied zapalna. Naie do nich: 1) wzrost przepuszczalnoci naczy, 2) wnikanie uczynnionych (aktywowanych) granulocytw obojetnochon nych do tkanek, 3) aktywacja pytek krwi, 4) samoistne ustpienie tych zjawisk, jeeli wnikajce mikroorganizmy zostan pokonane^ Wiele czynnikw jest uwalnianych z komrek i biaek osocza podczas ostrego zapalenia, a czynniki te sumarycznie powoduj wzrost
przepuszczalnoci ciany naczyniowej, ktrego
GRANULOCYTY OBOJTNOCHONNE ODZNACZAJ SI AKTYWNYM MET ABOLIZMEM I ZAWIERAJ WIELE WYJTKOWYCH ENZYMW I BIAEK Gwne cechy biochemiczne granulocytw obojtnochonnych zestawiono w tab. 63-8. Dominujcymi w nich zjawiskami s aktywna glikoliza tlenowa, aktywne przemiany cyklu pentozowo-fosforanowego, umiarkowana fosTabela 63-8. Zestawienie gwnych cech biochemicznych granulocytw obojetnochonnych Aktywna glikoliza Aktywny cykl pentozowo-fosforan o wy Umiarkowana fosforylacja oksydacyjna Liczne lizosomy bogate w enzymy degradujce Obecno licznych unikalnych enzymw (np. mie-loperoksydaza i ukad NADPH-oksydazy) oraz biaek Zawieraj CD11/CD18 integryny w bonie cyto-plazmatycznej
wynikiem jest obrzk tkanek (tab. 63-10). W stanach ostrego zapalenia granuiocyty obojtnochonne pochodz z krwi krcej, skd przechodz do tkanek, aby pomc w eliminowaniu obcych mikroorganizmw. Granuiocyty obojtnochonne s przycigane do tkanek przez czynniki chemo taktyczne, do ktrych nale fragmenty dopeniacza C5a, mae peptydy pochodzenia bakteryjnego (np. N-formylo-me-tionylo-leucylo-fenyloalanina) i liczne leuko-trieny. Aby dotrze do tkanek, krcy we krwi granulocyt obojtnochonny musi przenikn przez cian naczynia wosowatego. W tym celu granulocyty ukadaj si wzdu cian naczynia (ulegaj marginalizacji), a*nastpnie przylegaj do komrek rdbonka naczy wosowatych. Integryny porednicz w przyleganiu granulocytw obojetnochonnych do komrek rdbonka Przyleganie granulocytw obojetnochon nych do komrek rdbonka wymaga udziau
swoistych biaek adhezyjnych (integryn) znaj-
dujcych si na powierzchni granulocytw oraz swoistych biaek receptorowych na powierzchni komrek rdbonka.
ERYTROCYTY I LEUKOCYTY / 881 Tabela 63-9. Wybrane wane enzymy i biaka granulocytw obojetnochonnych. Ekspresja tych czsteczek jest badana podczas rnych okresw rnicowania si prawidowych granulocytw obojet nochonnych lub odpowiadajcych im komrek biaaczkowych. W badaniach uywane s wspczesne techniki biologii molekularnej (np. pomiar swoistego mRNA). Dla wikszoci enzymw i biaek wyodrbniono cDNA i okrelono jego sekwencje, a na tej podstawie ustalono sekwencje reszt aminokwasowych biaek, ustalono lokalizacj genu w chromosomie, jego budow i ukad aksonw i intronw. Niektre wane proteazy granulocytw obojetnochonnych zestawiono w tab. 63 -12. Enzym lub biako Mieloperoksydaza (MPO) NADPH-oksydaza Reakcja katalizowana lub czynno biologiczna Komentarz
H2O2 + X (halogenek) + H - HOX + Odpowiedzialna za zielony kolor ropy H2O 2O2 + NADPH - 202+ NADP + H
+ +
Gwny skadnik eksplozji oddechowej. Dziedziczny niedobr moe by< przyczyn nawracajcych zakae
Lizozym
Defenzyny
Laktoferyna
Hydrolizuje wizanie pomidzy kwa- Wystpuje w duych ilociach w sem N-acetylomuramtdowym i mak-rofagach **> N-ace-tylo-D-glukozamin znajdujce si w cianie komrkowej bakterii Zabijaj bakterie przez uszkadzanie ich Zasadowe peptydy antybiotykowe ciany komrkowej zbudowane z 29-30 reszt aminokwasowych Moe hamowa wzrost wielu bakterii przez wizanie elaza oraz bra udzia Biako wice elazo w regulacji proliferacji komrek szpikowych Czsteczki adhezyjne (nat do integryn) Niedobr przyczyn upoledzonej adhezji leukocytw
CD11b/CD,8* Receptory d Fc frag;t mentw lgG
Wie kompleksy antygen-przeciwciao komrek szpikowych i Wie fragmenty Fc immunoglobuliny do limfoidal-nych, nasila fagocytoz i inne IgG formy reakcji komrkowej
* CD-C(US16T of differentiation (antygen rnicowania). Jest to okrelenie ujednoliconego systemu nazewnictwa powierzchniowych markerw leukocytw. Swoiste biaka powierzchniowe (markery), ktre rnicuj poszczeglne linie iub stadia zrnicowania leukocytw i s rozpoznawane za pomoc grupy przeciwcia mOnoklonalnych s zaliczane do antygenw rnicowania. Ukad ten jest szczeglnie pomocny w klasyfikowaniu podtypw limfocytw. Wiele antygenw rnicowania bierze udzia w in terakcjach komrka-komrka, adhezji i przekazywaniu sygnaw przez bony komrkowe. Tabela 63-10. rda wazoaktywnych czsteczek biorcych udzia w ostrym zapaleniu Biaka osocza Granulocyty Komrki tuczne Pytki krwi krwi obojetnochonne Histamina Serotonina Czynnik aktywujcy pytki (PAF) Eikozanoidy (rne prosta-glandyny i ieukotrieny) C3a, C4a C5a ukadu dopeniacza Bradykinina i produkty rozpadu fibryny z ukadu krzepnicia
Intcgryny s nadrodzin biaek powierzchniowych obecnych w rnorodnych komrkach. Bior one udzia w przyleganiu komrek do komrek oraz komrek do skadnikw
substancji pozakomrkowej. Integryny s hete-rodimerami zbudowanymi z poczonych nieko-walencyjnie podjednostek a i p. Podjednostki zawieraj zewntrzkomrkowe, rdbonowe
882 / ROZDZIA 63
i wewntrzkomrkowe segmenty. Zewntr/ko-mrkowe segmenty wi rne iigandy, takie jak biaka substancji po akom orkowej i biaka powierzchni innych komrek. Ligandy te czsto zawieraj sekwencje Arg-Gly-Asp (R-G-D). Wewntrzkomrkowe segmenty wi si do rnych skadnikw cyt o szkieletu, takich jak aktyna lub winkulina. Integryny s biakami, ktre cz skadniki wystpujce na zewntrz komrek ze skadnikami ich wntrza, a przez to pomagaj integrowa odpowied komrki na zmieniajce si warunki otaczajcego rodowiska. Pocztkowo wyrniono 3 podrodziny inte-gryn. Integryny wchodzce w skad poszczeglnych podrodzin rni si podjednostk y., a zawieraj wspln dla kadej podrodziny podjednostk p \ Z czasem wyrniono wicej ni 3 rodzaje podjednostek P, co sprawio, e klasyfikacja integryn staa si bardziej zoona. Niektre integryny swoicie zwizane z czynnoci granulocytw obojtnochlonnych s zestawione w tab. 63-11, Niedobr podjednostki p2 (zwanej take CD18) w LFA-1 i dwch pokrewnych inte-grynach: Mac-] (CDllbCDlS) i pl50.95 (CDllcCD18) stwierdzono w granulocytach obojtnochonnych i makrofagach; powoduje to upoledzenie adhezji (przylegania) leukocytw chorob charakteryzujc si nawracajcymi
zakaeniami bakteryjnymi i grzybicami. Wrd rnych skutkw wymienionego niedoboru, upoledzone jest przyleganie biaych krwinek do komrek rdbonka, tak wic mniejsza liczba granulocytw obojtnochonnych moe wnika do tkanek, aby zwalcza zakaenie. Po przenikniciu przez cian maych naczy, granulocyty obojtnochonne migrujc w kierunku najwikszego stenia czynnikw chemo-taktycznych, napotykaj wnikajce bakterie i prbuj je zaatakowa oraz zniszczy. Granulocyty obojtnochonne musz by w stanie aktywacji, aby uruchomi cig procesw metabolicznych biorcych udzia w fagocytozie i zabijaniu bakterii. Aktywacja granulocytw obojtnochonnych jest podobna do aktywacji pytek krwi i wymaga hydrolizy bisfosforanu f osf atydyloi nozytoi u Mechanizmy biorce udzia w aktywacji pytek krwi s omwione w rozdz. 58 (p. ryc. 58-9). Proces ten obejmuje oddziaywanie bodca (np. trombiny) na receptor, aktywacj biaek G, pobudzenie aktywnoci fosfolipazy C i uwalnianie trifosforanu inozytolu i diacylglicerydu z bisfosforanu fosfatydyloinozytonu. Zwizki te, biorce udzia w przenoszeniu 7/gnau, powoduj wzrost wewntrzkomrki 'ego Ca 2 +
Tabela 63-11. Przykady integryn, ktre odgrywaj wan rol w czynnoci granulocytw chonnych, innych leukocytw oraz obojtno-pytek krwi Integryna Komrka Podjednostki Ugand Czelno VLA-1 VLA-5 VUA-6 LFA-1 (CD11aCD18) Glikoproteina Ifb/llla Leukocyty, inne komrki Leukocyty, inne komrki Leukocyty, inne komrki Leukocyty Pytki krwi
l.Pa
, P,
ae,P,
Kolagen, laminina Fibronektyna Laminina ICAM-1, ICAWI-2
Adhezja komrek do substancji poza kom orkowej Adhezja komrek do substancji poza kom orkowej Adhezja komrek do substancji poza kom orkowej Adnezja krwinek biaych
%, Ps
Fibrynogen.ibronekty- Adhezja i agregacja pytek na. czynnik von Wille krwi branda
LFA-1 lymphocyte funetion-associated antigen 1 (antygen-1 zwizany z czynnoci limfocytw); VLA very late antigen (bardzo pny antygen), CD ciuster of differentiation (antygen rnicowania); ICAM intercellular adhesion molecule (midzykomrkowa czsteczka przylegania). Niedobr LFA -1 i zblionych integryn stwierdzono u chorych z upoledzon adhezja, leukocytw. Niedobr zespou glikoprotein llb/llla wykazano w trombastenii Glanzmanna, chorobie cechujcej si krwawieniami, prawidow liczb pytek krwi, ale nieprawidow kurczliwoci skrzepu Obserwacje te wskazuj jak istotne Jest poznanie adhezyjnych biaek powierzchni komrek w wyjanieniu przyczyn licznych chorb.
i aktywacj kinazy biaek C. Dodatkowo ak tywacja fosfolipazy A2 wytwarza kwas arachi-donowy, ktry jest produktem wyjciowym dla wielu biologicznie czynnych eikozanoidw. Proces aktywacji granulocytw obojetno-chonnych jest wyranie podobny. S one pobudzone przez bakterie, wizanie czynnikw che-motaktycznych lub kompleksy antygen-prze-ciwciao za porednictwem swoistych receptorw. Wytworzony w procesie aktywacji wzrost stenia wewntrzkomrkowych jonw Ca2+ wpywa na wiele procesw zachodzcych w gra-nulocytach obojetnochonnych, takich jak czenie si mikrotubul oraz ukad aktyna-miozy-na. Procesy te bior udzia, odpowiednio, w wydzielaniu zawartoci ziarnistoci oraz w ruchliwoci komrek, co pozwala granulocytom obojtnochonnym odszukiwa mikroorganizmy, ktre wtargny do ustroju. Aktywowane granulocyty obojtnochonne s w tym stanie gotowe, aby zniszczy mikroorganizmy za pomoc mechanizmw, ktre obejmuj produkcj czynnych postaci tlenu. Eksplozja oddechowa komrek fagocytujcych zachodzi przy udziale IMADPH-oksydazy i pomaga zabija bakterie Kiedy granulocyty obojtnochonne lub inne komrki fagocytujce wchon bakterie, wykazuj szybki wzrost zuycia tlenu znany jako eksplozja tlenowa. Zjawisko to odzwierciedla szybkie zuywanie tlenu (nastpujce po 15 60 s) i wytwarzanie duych iloci czynnych pochodnych tlenowych, takich jak O2 , H2O2, OH' i OCI ~ (jon podchlorawy). Niektre z tych produktw s potencjalnymi czynnikami bakteriobjczymi. acuch przenoszenia elektronw odpowiedzialny za wybuch tlenowy zawiera wiele skadnikw, w tym flawoprotein NADPH:O2-oksydoreduktaz (czsto zwan NADPH-oksy-daz) i cvtochrom typu b (nazywany cytochromem bssgz powodu charakterystycznej dugoci spektralnej w odrnieniu od cytoghromu bM5, ktrego potencja oksydoredukcyjny wynosi 245 mV i jest najniszy ze wszystkich cytochromw b, co daje mu zdolno redukowania tlenu do ponad-tlenkw). Ten system katalizuje jednoeektrono-w redukcj tlenu do anionu ponadtlenkowego (p. tab. 63-4 pod NADPH-oksydaza). Oksydo-reduktaza jest redukowana przez NADPH, a cytochrom b wykonuje jednoelektronow redukcj tlenu do postaci ponadtlenkowej.
Ukad ten jest umiejscowiony w bonach pla-matycznych granulocytw obojtnochionnych i innych komrek fagocytujcych. NADPH jest wytwarzany w cyklu pentozowo-fosforanowym, ktrego aktywno wzrasta znacznie podczas fagocytozy. W powyej wymienionej reakcji nastpuje spontaniczne wytwarzanie (w procesie spontanicznej dysmutacji) nadtlenku wodoru z dwch czsteczek ponadtlenku:
+ O 2 ~ + 2H
Oz
Jonponadtlenkowyjest wydalany na zewntrz komrki lub do fagolizosomw, w ktrych znajduj si wchonite bakterie. Zabijanie bakterii w fagolizosomach zaley-od poczonego dziaania podwyszonego pH, jonu ponadtlenkowego i dalszych pochodnych tlenowych (H2O2, OH' i HOC1 czyli kwas podchlorawy, p. niej) oraz dziaania wielu bakteriobjczych peptydw (de-fensyn) i innych biaek (np. katepsyny G i kilku biaek kationowych) obecnych w komrkach fagocytujcych. Kady ponadtlenek, ktry dostanie si do cytozolu komrki fagocytujcej ulega przeksztaceniu w H2O2 w wyniku dziaania dysmutazy ponadtlenkowej, ktra katalizuje t sam reakcj dysmutacji, jaka zachodzi spontanicznie, co opisano powyej. Z kolei H2O2 jest zuywana przez mieloperoksydaz (p. niej) lub zuywana w wyniku dziaania peroksydazy gluta-tionowej lub katalazy. NADPH-oksydaza wystpuje w postaci nieczynnej w spoczynkowych komrkach fagocytujcych i ulega aktywacji po kontakcie rnych ligandw (fragmenty C5a dopeniacza, peptydy chemotaktyczne itp.) z receptorami bony plaz-matycznej. Zjawiska wynike z aktywacji ukadu oksydazy s przedmiotem wielu bada, chocia stale nie s w peni poznane i s zblione do uprzednio opisanego procesu aktywacji granulocytw obojtnochonnych, czego mona oczekiwa wobec faktu, e wybuch oddechowy jest integraln czci procesu aktywacji. W zjawiskach tych bior udzia biaka G, aktywacja fosfolipazy C i tworzenie inozytoio-l,4,5-trisfos-foranu. Ostatni z wymienionych zwizkw bierze udzia w krtkotrwaym wzrocie stenia Ca2~, ktry jest istotnym elementem wywoywania eksplozji oddechowej. Wytwarzany jest rwnie diacyloglycerol, ktry powoduje przemieszczenie kinazy biaek C do bon plazmaty-cznych z cytoplazmy. Tam enzym ten katalizuje fosforylacj rnych biaek, ktre s prawdopo-
884 / R OZDZIA 63
dobnie skadnikami ukadu oksydazy. Powyszy obraz jest bardziej zoony na co wskazuj dane o podwjnej drodze aktywacji take obejmujcej przenoszenie sygnau niezalene od Ca2 + . Dodatkowo wykryto dwa polipeprydy cytoplazmatyczne jako wane skadniki penego ukadu N ADPH-oksydazy. S one wczone do bon plazmatycznych podczas aktywacji i tworz czynny ukad enzymatyczny. Mutacje genw skadnikw ukadu NADPH-oksydazy powod uj przewlek chorob ziarntcz Znaczenie ukadu NADPH-oksydazy jasno zostao ukazane w obserwacjach upoledzonej eksplozji oddechowej, jaka zachodzi w przewlekej chorobie ziarniczej, rzadkim schorzeniu cechujcym si nawracajcymi zakaeniami i uoglnionymi ziarniniakami (przewlekymi zmianami zapalnymi) skry, puc i wzw chonnych. Ziarniniaki s form odgraniczenia bakterii, ktre nie mog by zabite z powodu dziedzicznego niedoboru ukadu NADPH-oksydazy. Wikszo chorych to mczyni, poniewa choroba jest dziedziczona w sprzeniu z chromosomem X. Podstawowymi przyczynami choroby s mutacje genu dla cytochromu b. U innych pacjentw choroba wystpuje w postaci autosomalnej recesywnej, a mutacje dotycz genw warunkujcych budow dwch poli-peptydw biorcych udzia w aktywacji granu locytw obojtnochonnych. Niektrzy pacjenci dobrze reaguj na podawanie y-interferonu, ktry powoduje wzrost iloci cytochromu b przez wpyw na transkrypcj waciwych genw. Prawdo pod o tSrte przyczyny wywoujce przewlek chorob ziarnicz s przedstawione na ryc. 63-7.
Mutacje genw skadnikw biakowych (tj. cytochromu b,,, zwanego take bj,,} i dwcn cytozolowych polipeptydow ukadu NADPH-oksydary
Granulocyty obojetnochonne zawieraj mieloperoksydaz, ktra katalizuje wytwarzanie utleniaczy zawierajcych chlor Enzym mieloneroksydaza, obecny w duych ilociach w zianiistociach granulocytw obojtnochonnych i odpowiedzialny za zielony kolor ropy, dziaa na H2O3 i powoduje powstanie jonu podchlorawego:
H 2O2 + X +_H j ------- ---- z --. HOX +H a O <X = Cl , Br , I lub SCN ; HOCI = kwas podchlorawy)
+
Mieloperoksydaza
H2O; uywany jako substrat reakcji jest wytwarzany przez ukad NADPH-oksydazy. Cl" jest najczciej wykorzystywanym chlorowcem, poniewa jest on obecny w stosunkowo duych steniach w osoczu i pynach ustrojowych. HOCI, czyli czynny skadnik pynnych rodkw wybielajcych stosowanych w gospodarstwie domowym, jest silnym utleniaczem i jest silnie bakteriobjczy. Kiedy zostaje podany do niezmienionych tkanek, jego potencjalnie uszkadzajce dziaanie jest osabione przede wszyst kim przez czenie si z pierwszo rzdowym i i drugorzdowymi aminami obecnymi w granu-locytach obojtnochonnych i tkankach, w wyniku czego powstaj rne produkty poczenia chlorku z azotem (N-Cl). Nale do nich chloraminy, ktre take, chocia sabiej ni uprzednio wymienione substancje, dziaaj bakteriobjczo (np. s stosowane w odkaaniu ran) nie powodujc przy tym uszkodzenia tkanek, Proteinazy granulocytw obojtnochonnych mog powodowa powane uszkodzenia tkanek, jeeli ich dziaanie nie jest kontrolowane Granulocyty obojtnochonne zawieraj liczne proteazy (tab. 63-12), ktre maj zdolno do hydrolizy elastyny, rnych typw kolagenu i innych biaek obecnych w substancji pozako-mrkowej. Dziaanie takie, jeeli nie jest ograniczane, moe powodowa powane uszkodzenia tkanek. Wikszo tych proteaz to enzymy lizosomalne wystpujce w prawidowych gra-nulocytach obojtnochonnych gwnie w po staci nieaktywnej. Mae iloci enzymw s uwalniane do prawidowych tkanek, ale ilo ta znacznie wzrasta w stanach zapalnych. Aktywno elastazy i innych proteaz jest w stanach prawidowych ograniczana przez liczne anty-proteazy (take zestawione w tab. 63-12), ktre
Zmniejszone wytwarzanie jonu po nad tlenkowego i innych aktywnych pochodnych tlenowych
Zmniejszone zabijanie wybranych bakterii
Nawracajce zakaenia i tworzenie w tkankach ziarniniakw w celu ograniczenia bakterii, ktre przeyty
Ryc. 63-7. Uproszczony schemat kolejnoci zja wisk lecych u podstaw przewlekej choroby ziar niczej. _________

Tabela 63-12. Proteazy granulocytw obojtno-chonnych oraz antyproteazy osocza krwi i tkanek Proteazy Antyproteazy Elastaza OCT -Antyproteaz a Kolagenaza elatyn a za tX2-Makroglobulina Wydzielniczy inhibitor leukopro-teaz
Aktywator o, -^ntyc h ym otry psy n a plaz-mmogenu lnhibitor-1 aktywatora plazminogenu Tkankowy inhibitor metaloproteaz Tabela zawiera wybrane wane proteazy granulocytw oboje, tnochlonnych i niektre biaka, ktre hamuj ich dziaanie. Wikszo wymienionych proteaz wystpuje wewntrz granulocytw obojet-nochonnych w postaci prekursorowej. Aktywator plazminogenu nie jest proteaz, ale jest wymieniony, poniewa aktywuje plazmtn, ktra jest protea-z. Wymienione proteazy mog rozkada wiele biaek substancji poza kom orkowej powodujc w ten sposb uszkodzenie tkanek. Sumaryczna rwnowaga proteaz i antyproteaz moe zosta zaburzona w wyniku zmienionej aktywacji prekursorw proteaz lub inaktywacji antyproteaz. Ostatnie z wymienionych zjawisk moe zachodzi na drodze proteolitycznej degradacji antyproteaz lub ich chemicznej modyfikacji, np. palenie tytoniu powoduje utlenianie reszty metioninowej w pozycji 358 w ai-antyproteazie.
chymotrypsyna mog by hydrolizowane przez aktywn elastaz, a ai-antyproteaza moe by hydroiizowana przez aktywn kolagenaz i e-latynaz. W wikszoci przypadkw zostaje ustalona waciwa rwnowaga proteaz i antyproteaz, chocia w takich stanach, jak niedobr ot]-antyproteazy lub nagromadzenia znacznej liczby granulocytw obojetnochonnych w tkankach z powodu niedostatecznego ich odpywu moe doj do znacznego uszkodzenia tkanek w wyniku dziaania nie ograniczan ej aktywnoci proteaz.
i
TECHNOLOGIA REKOMBINACJI DNA MA WYRANY WPYW NA ROZWJ HEMATOLOGII *

Technologia rekombinacji DNA wywiera istotny wpyw na wiele aspektw hematologii. Podstawy etiologiczne talasemii (p. rozdz. 42) i wiele zaburze krzepnicia (p. rozdz. 58) zostao w znacznym stopniu wyjanionych za pomoc klonowania lub okrelania sekwencji. Badania onkogenw i translokacji chromoso -malnych posuny do przodu zrozumienie mechanizmw biaaczek (p rozdz, 61). Jak wspomniano powyej, techniki klonowania dostarczyy leczniczych iloci erytropoetyny i innych czynnikw wzrostowych. Niedobr deatninazy adenozynowej, ktry szczeglnie dotyczy limfocytw, jest pierwsz chorob leczon za pomoc terapii genowej. Podobnie jak inne dziedziny biologii i medycyny, hematologia ulega i ulega bdzie dalszej rewolucji dziki tyra zadziwiajcym technologiom.
wystpuj w osoczu krwi i pozakomrkowym pynie tkankowym. Kada z antyproteaz moe hamowa proteaz lub proteazy przez czenie si z enzymem w niekowalencyjny kompleks. W rozdziale 58 wykazano, e dziedziczny niedobr <Xi-antyproteazy powoduje niekontrolowan aktywno enzymatyczn elastazy, ktra degraduje tkank pucn i w ten sposb staje sie przyczyn rozedmy tego narzdu. a2-Makro-globulina jest wielkoczsteczkowym (masa czsteczkowa ok. 725 000) biakiem osocza krwi, ktre odgrywa istotn rol w ochronie ustroju przed nadmiarem proteaz. Ma ona zdolno czenia si z enzymami i w ten sposb inak-tywuje wiele proteaz. Wzrost iloci utleniaczy zawierajcych chlor, wytwarzanych w stanach zapalnych, zaburza rwnowag proteazy-antyproteazy na korzy enzymw. Przykadowo, wiele proteaz wymienionych w tab. 63-12 jest aktywowanych przez HOC1, podczas gdy liczne antyproteazy s inaktywowane przez ten zwizek. Dodatkowo, tkankowy inhibitor metaloproteaz i ot r anty-
PODSUMOWANIE
Erytrocyt ma prost budow i funkcje. Skada si przede wszystkim ze stonego roztworu hemoglobiny otoczonego przez bon komrkow. Wytwarzanie erytrocytw jest regulowane przez erytropoetyn, natomiast leukocytw przez inne czynniki wzrostowe (np. czynniki pobudzajce tworzenie kolonii granulocytw oraz makrofagw). Erytrocyt zawiera cay ar sena enzymw cytoplazmatycznych, takich jak dysmutaza, kataiaza, peroksydaza glutationo-wa, aby eliminowa silne utleniacze powstajce podczas jego metabolizmu. Genetycznie uwarunkowany niedobr aktywnoci dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, ktra warunkuje pro -
8S6 / ROZDZIA 63
dukcj NADPH, jest wan przyczyn niedo-krwistoci hemolitycznej. Methemoglobina nie ma zdolnoci przenoszenia tlenu. Znane s zarwno dziedziczne, jak i nabyte przyczyny tej choroby. Istotne informacje uzyskano o bia kach i lipidach budujcych bon komrkow erytrocytw. Liczne biaka cy to szkieletu, takie jak spektryna, ankiryna i aktyna, oddziauj ze swoistymi biakami integralnymi bony i pomagaj utrzyma krwince dwuwklesy ksztat i podatno na odksztacenia. Niedobr spektryny powoduje dziedziczn sferocy toze, jedn z istotnych przyczyn niedokrwistoci hemolitycznej. Substancje grupowe ukadu ABO s zoonymi glikosfingo lipidami wystpujcymi w bonie krwinek; immunodominujcym cukrem substancji A jest N-acetylogaiaktozamina, a substancji B galaktoza. Antygeny ukadu Rh s integralnymi biakami Wony komrkowej, a substancje grupowe ukadu MN s polimor-ficznymi postaciami glikoforyuy A. Granulocyty obojtnochlonne odgrywaj gwn rol w mechanizmach obronnych ustroju. Integryny obecne na powierzchni komrek determinuj swoiste oddziaywanie rnych komrek i skadnikw tkankowych. Leukocyty ulegaj aktywacji w wyniku kontaktu z bakteriami oraz dziaania innych bodcw. NADPH-oksydaza odgrywa gwn rol w procesie aktywacji (eksplozja oddechowa). Mutacje enzymw i zwizanych z nimi biaek s przyczyn przewlekej choroby ziarniczej. Proteazy granulocytw obojtnochonnych mog rozkada wiele biaek tkankowych; w warunkach prawidowych s pod kontrol arsenau anty-proteaz. Jednak ten nWfchamzm hamujcy moe by zamany w wielu okolicznociach, co prowadzi do rozlegych uszkodze tkanek. Zastosowanie technologii rekombinacji DNA zrewolucjonizowao badania w hematologii.
PIMIENNICTWO
Baggiolini M, Wymann MP: Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 1990;15:69. Beck WS (editor). Hematoogy, 5th ed. MIT Press, 1991. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley RO: Chapiers 12 and 13 in : Basie Histology, 6th ed. Appleton & Lange, 1989. Krantz SB: Erythropoietin. Blood 1991;77:419. Lienhard GE et al: How cells absorb glucose. Sci Am (Jan) 1991;266:86. Lubbert M, Herrmann F, Koeffler HP: Expression and regulation of myeloid-specific genes in normal and leukemie myeloid cells, Blood 1991;77:909. Lux SE, Becker PS: Disorders of the red celi membran skcleton: Hereditary spherocytosis and here-ditary elliptocytosis. Chapter 95 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Scriver CR et al (editors}. McGraw-Hill, 1989. Luzzato L, Mehta A: Glucose-6-phosphate dehyd-rogenasc deficiency. Chapter 91 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease, 6th ed. Serwer CR et al {editors}. McGraw-Hill, 1989. Rapaport ST: Introduction to Hentatohgy, 2nd ed. Lippincott, 1987. Segal AW: The eleetron transport chain *of the microbicidal oxidase of phagocytic cells and its involvement in the molecularpathology of chroni granulomatous disease. JClin Invest 1989:83:1785. Smith RM, Curnutte JT: Molecular basis of chroni granulomatous disease. Blood 1991;77:673. Spitznagell JK: Antibiotic protcins of huraan neu-trophils. J Clin Imest 1990;86:138I. Weatherall DJ et al: The hemoglobinopathies. Chapter 93 in: The Metaboiic Basis of Inherited Disease. 6th ed. Scriver CR et al (editors). McGraw-Hill, 1989. Yamamoto F et al: Molecular genetic basis of the histoblood group ABO system. Natur 1990;345:229.
Podoe biochemiczne niektrych schorze neuropsychiatrycznych

64
WPROWADZENIE
Rozdzia ten nie stanowi systematycznego opisu takich zagadnie, jak mechanizm neuro-transmisji, cechy neuro transmiter w, waciwoci synaps, ani szczegw, takich jak kanay jonowe w mzgu. Tematy te s dobrze przed stawione w wielu podrcznikach neurofizjologii, biologii molekularnej i neuro farmakologii. Niektre z nich s wymienione w pimiennictwie na kocu tego rozdziau. Zakadamy, e czytelnik ma pewn znajomo podstawowych poj neuro fizjologii i neuro anatomii. Zamiast tego przedyskutujemy 8 schorze {lub grup schorze) neuropsychiatrycznych: miasteni, chorob Huntingtona, udary mzgu, choroby spowodowane mutacjami mitochondrialnego DNA, zesp amliwego chromosomu X i inne schorzenia zwizane z powtrzeniem trypleto-wym, chorob Parkinsona, chorob Alzheimera i schizofreni. Wspczesne osignicia biochemiczne, komrkowe i genetyczne rzuciy na te schorzenia pewne wiato i w niektrych przypadkach stwarzaj szans na nowe sposoby leczenia. Jedne z tych schorze s bardziej pospolite, inne mniej, ale wszystkie daj nam cenny wgld w biochemi mzgu i otwieraj nowe perspektywy.
neuropsychiatryczne s^wane m.in. dlatego, e s czsto przewleke (np. schizofrenia) i wyniszczajce (np. udary, choroba Huntingtona, choroba Alzheimera i schizofrenia), poniewa mog niszczy funkcje intelektualne. Badania neu-robiologiczne nie tylko pozwalaj nam na lepsze zrozumienie naszej wasnej natury, ale take dostarczaj racjonalnej podstawy skutecznej terapii wielu schorze prowadzcych do kompletnego inwalidztwa. Wedug amerykaskiej Narodowej Fundacji Bada Mzgu koszta bezporednie schorze mzgu (choroby psychiatryczne i neurologicz ne, alkoholizm i narkomanie) wynosz ponad 401 mld dolarw rocznie. Koszt jednej tylko choroby, otpienia, czyli demencji (ktrej naj waniejszym przykadem jest choroba Alzheimera), przewysza koszt leczenia raka i choroby wiecowej serca. Koszta bezporednie w wysokoci 401 mld dolarw stanowiy */? cakowi tych wydatkw suby zdrowia w USA w 1991 r. Obliczono te, e koszta porednie (np. utrata zarobkw, system cigania zbrodni) przewy szaj koszta bezporednie. Na kade 100 dolarw wydanych na opiek nad pacjentem z chorob Alzheimera Stany Zjednoczone inwestoway tylko 50 centw na badania nad tym problemem, a w innych krajach nakady na badania s z pewnoci nisze.
Gwne dwa wyzwania, przed ktrymi staje wspczesna biologia to okrelenie mechanizmw zaangaowanych w rozwj i rnicowanie i odkrycie dziaania ukadu nerwowego. Metody badawcze, ktre umoliwia technologia re-kombinowanego DNA, odgrywaj wan rol w obu tych zagadnieniach. Klinicznie choroby
ABY ZROZUMIE MIASTENI, TRZEBA ZROZUMIE ZJAWISKA ZACHODZCE W ZCZU NERW0WO-M1NI0WYM

Miastenia (myasthenia gravis) charakteryzuje
si nawracajcymi epizodami saboci minio-
wej, gwnie dotyczcej mini unerwianych
888 / ROZDZIA 64
przez nerwy czaszkowe. Stan chorego poprawia podawanie lekw, ktre hamuj acetylochoiine-sterazo (patrz niej) i fakt ten jest wykorzystany w rozpoznaniu i leczeniu. W miastenii z powodw, ktre nic s jasne, organizm wytwarza autoprzeci wdaa skierowane przeciw receptorowi cholinergicznemu (AChR) w pytce nerwowo--miniowej; przeciwciaa te powoduj zniszczenie receptorw i prowadz do znacznego zmniejszenia ich liczby. Tak wic, aby zro zumie t chorob, trzeba koniecznie pozna podstawowe fakty dotyczce przekarrictwa ne-rwowo-miniowego. Schemat zcza nerwowo-miniowego i niektrych zachodzcych w nim zjawisk przedstawia ryc. 64-1, Zcze to skada si z pojedynczego zakoczenia nerwowego oddzielonego od obszaru pos[synaptycznego szczelin synaptyczn. Pytka motoryczna jest wyspecjalizowan
czci bony miniowej biorcej udzia w zczu. Wyranie wida fady zcza; zawieraj one duo receptorw cholinergicznych w bezporedniej bliskoci zakoczenia nerwowego. Mona uwaa, e wszystkie zjawiska w zczu zachodz w 6 etapach (ryc. 64-1). 1. Synteza acetyl och o liny zachodzi w cytoplazmie zakoczenia nerwowego, w ktrym znajduje si enzym acetylotransferaza cho li no wa, katalizujca reakcj
Acetyio - Co A :- Chol i na -> Acetylocholina+ + CoA
Zakoczenie nerwowe
Btena presynaptyezna
Ryc. 64-1- Schematyczne przedstawienie niekt rych wydarze w zczu necwowo - minio wym. Cz zako czenia nerwo wego ukazano lec w cisym przyoeniu do minio wej pytki ko cowej. Cay proces, w ktrym acetylocholina pobu dza receptor, moe by traktowany jako zachodz cy w szeciu etapach (patrz tekst). AcCoA acety-loCoA, ACh acetyl och ot i na; AChRs receptory acetylocholino we; Ac octan
Zsyntetyzowana acetylocholina zostaje wbudowana do maych, zwizanych z bon ziarnistoci zwanych pcherzykami synaptycz nymi i w nich skadowana. Szczegy tego proce su nie s dobrze poznane. Uwalnianie acetylocholiny z tych pche rzykw do szczeliny synaptycznej jest nastp nym etapem. Dochodzi do tego w procesie egzocytozy, w ktrym nastpuje fuzja pcherzy ka z bon pre&ynaptyczn. W stanie spoczyn kowym pojedyncze kwanty {ok. 10 000 czs teczek neurotransmitera, prawdopodobnie od powiadajce zawartoci jednego pcherzyka sy naptycznego) s uwamiane spontanicznie, w wyniku czego powstaj niewielkie miniaturo we potencjay pytki kocowej (MEPP). Kiedy zakoczenie nerwowe zostaje zdepoiaryzowane w wyniku dotarcia do impulsu nerwowego, otwieraj si zalene od napicia kanay wap niowe, co pozwala na napyw jonw wapnia z przestrzeni synaptycznej do zakoczenia ner wowego. Te jony wapniowe peni zasadnicz rol w procesie egzocytozy, w ktrym acetylochoiina (zawarto ok. 200 pcherzykw) zo staje uwolniona do przestrzeni synaptycznej. Uwolniona acetyl och oiina szybko dy fun duje przez szczelin synaptyczn do jej recep torw w fadach zcza, iedy dwie czsteczki acetylocholiny pocz si z receptorem, ten ulega zmianie konformacyjnej, otwierajc kana receptorowy pozwalajcy na przepyw jonw przez bon, W wyniku tego dochodzi do na pywu jonu Na+. co prowadzi do depolaryzacji bony miniowej i powstania potencjau pyt kowego. Potencja ten depolaryzuje z kolei ssiedni bon miniow i w ten sposb powstaj i zostaj przenoszone wzdu wkna potencjay czynnociowe, powodujce skurcz mini (p. rozdz. 59). Gdy kana si zamyka, czsteczka acetylocholiny oddysocjowuje i zo-
PODOE BIOCHEMICZNE CHORB NEUROPSYChHATRYCZNYCH / 889
staje zhydrolizowana przez acetyiocholinesteraz, ktra katalizuje reakcj

Acety tocholina HxO-> Octan +- Cholina
Ten wany enzym znajduje si w duych ilociach w bonie podstawnej przestrzeni synaptycznej. 6. Cholina jest odzyskiwana przez zakoczenie nerwowe dzikiunechanizmowi aktywnego transportu, i tam moe by ponownie uyta do syntezy acetylocholiny. Receptor cholinergiczny zcza nerwowo-miniowego jest kanaem jonowym sterowanym przez neurotransmiter Receptor cholinergiczny w zczu nerwowo--miniowym intensywnie badano ze wzgldu na rol, jak gra w przekaznictwie nerwowo--misniowym. Niektre wane waciwoci tego receptora s wyliczone w tab. 64-1. Jak tam
Tabela 64-1. Niektre wasnoci receptora acety-locholinowego zcza nerwowo-miniowego" Receptor w zczu: Jest receptorem nikotynowym {tzn, agonist tego receptora jest nikotyna) Jest bonow glikoprotein o masie czsteczkowej -275 000 Zawiera 5 podjednostek, ma skad Tylko podjednostka a wie acety I ochot i n z duym powinowactwem Dwie czsteczki acetylocholiny musz si zwiza, aby otworzy kana jonowy, ktry umoliwia prze+ + pyw jonw Na i K ; receptor jest wic kanaem jonowym regulowanym (bramkowanym) przez transmiter Jad wa a-bungarotoksyna wie si silnie do podjednostki % i moe by uyta do znakowania receptora albo jako ligand o duym powinowact wie do oczyszczania go Autoprzeciwciata przeciw receptorowi s podejrzane o powodowanie miastenii Wedug: Kandel E.R.. Schwarz J.H., Jessel T.M. (red,): Principles of Neural Scisnce. wyd. 3, Elsevier, 1991. " Przedstawiony skad dotyczy receptora podowego U dorosych pojedyncza podjednostka y jest zastpiona przez podjednostke s Kady typ podjednostki jest kodowany przez osobny gen.
wspomniano, jest on bonow glikoprotein skadajc si z 5 podjednostek, z ktrych 2 (podjednostki a) s identyczne. cDNA dla rnych podjednostek zosta sklonowany i dla kadego z tych cDNA wydedukowano struktur aminokwasow podjednostki. Fakt, e a-bungarotoksyna wie si mocno z tym biakiem zosta wykorzystany w wielu badaniach, takich jak pomiar liczby receptorw w prbkach normalnego i chorego minia (p. niej). Rozmieszczenie biaek w bonie komrkowej przedstawia ryc. 64-2. Jak pokazano, wszystkie 5 podjednostek przechodzi przez bon i bierze udzia w tworzeniu kanau jonowego, W nieobecnoci acetylocholiny kana jest zamknity. Kiedy dwie czsteczki neurotransmitera wi si do receptora, kada dpyednej podjednostki a, biako ulega zmianie konformacyjnej, ktra powoduje otwarcie si kanau na czas ok. jednej milisekundy. W tym czasie napywa do minia Na+ , a wypywa ze K+ . Jak wspomniano wyej, to wanie napyw Na+ powoduje depolaryzacj bony miniowej i generuje potencja pytki kocowej. Poniewa obecno lub nieobecno acetylocholiny powoduje otwieranie i zamykanie kanau, receptor choiinergiczny okrela si jako kana jonowy regulowany (bramkowany") neurotransmiterem (w odrnieniu od dwch innych typw kanaw regulowanych kanaw zalenych od potencjau [napicio-wo-zalenych] oraz regulowanych mechanicznie). W miastenii autoprzeciwciaa uszkadzaj receptory cholinergiczne i zmniejszaj ich liczb Badania elektrofizjologiczne (np. elektromio-grafia) wskazuj, e nienormalno w miastenii dotyczy pytki kocowej, a nie bony presynap-tycznej. W rzeczy samej, w tej chorobie dochodzi do normalnego uwalniania si acetylocholiny. W przeciwiestwie do tego badania, w ktrych uywa si znakowanej bungarotoksyny dla pomiaru liczby receptorw choliner-gicznych w prbkach mini, wykazay silny ich spadek u pacjentw cierpicych na miasteni. Wiele danych sugeruje udzia zaburze ukadu immunologicznego w patogenezie miastenii. Obserwuje si np. czsto hiperpiazj grasicy i tkanek limfoidalnych, nie s te rzadkie guzy grasicy. Okoo 10% pacjentw cierpi na inne schorzenia autoimmunologkzne. Jest interesujce, e niekiedy chorob moe by dotknity pd chorej matki in utero, co sugeruje przenika-
890 / ROZDZIA 64
Acetytocholina nie zwizana: kana zamknity
B, Dwie czsteczki acetytochollny zwizane: kana otwarty
O Na'
;. 64-2. Struktura receptora dla acetylocholiny (ACh) w zczu nerwowo -miniowym. A Trjwymiarowy model nikotynowego, aktywowanego przez acetylochotin, kanau jonowego, oparty na f modelu Karlina i wsp. Kompleks receptor-kana skada si z wielu podjednostek. Po jednej czsteczce acetylocholiny czy si do kadej podjednostki a. przed otwarciem kanau. Wszystkie podjednostki bior udzia w tworzeniu pory. B Kiedy dwie czsteczki acetylocholiny przycz si do czci podjednostek a wystawionych na powierzchni bony, receptor-kana zmienia konformacj otwierajc pory w czci + + receptora zanurzonego w dwuwarstwie lipidowej. Przez otwarty kana przepywaj Na i K zgodnie z ich wasnymi gradientami ste. (Wedug: Kandel E. R., Schwartz J. H,, Jessel T. M. (red.): Principles of Neural Science, wyd. 3. Elsevier, 1991, za zezwoleniem).
nie przez oysko jakiego czynnika, np. auto-przeciwcial. Wiele wyjaniajcym odkryciem byo stwierdzenie, e wstrzykniecie oczyszczonego receptora cholinergicznego (otrzymanego z organu elektrycznego wgorza elektrycznego) krlikom powoduje wystpienie we krwi prze-
ciwcia skierowanych przeciw receptorowi i chorob przypominajc miasteni. Wykazano nastpnie, e auto przeciwciaa skierowane przeciw receptorowi mona wykaza take u czowieka cierpicego na miasteni; s one obecne u prawie 100% pacjentw z cik
PODOE BIOCHEMICZNE CHORB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 891
postaci choroby. Auto przeciwciaa przyczepiaj si do receptorw cholinergicznych w zczu nerwowo-miniowym i uszkadzaj je, co powoduje tzw. li ogniskow (p. ryc. 64-3). Uszkodzone receptory podlegaj endocytozie, ktra przyspiesza ich obrt (tworzenie i ginicie) i zmniejsza liczb. Obecno ukadu dopeniacza (p. rozdz. 58) odgrywa istotn rol w tym typie uszkodze komrkowych. Nie zostao dotd dostatecznie jwyjanione, co jest pierwotn przyczyn powstawania autoprzeciwcia.
Tworzenie przeciwcia przeciw receptorom acetylo-cholinowyrn obecnym w zczu nerwawo-mintowyrn
Uszkodzenie receptorw (lokalna liza) przez aulo- przeciwciata, powodujce usieciowanie i endccytoz
czeniu miastenii,- Di izopropyl ofluorofosforan (DFP) jest przykadem nieodwracalnego inhibi tora cholinesterazy; tworzy on kowalentne wizanie z reszt serynowa. w aktywnym centrum cholinesterazy (zob. omwienie proteaz seryno-wych w rozdz, 10). DFP jest trujcym gazem nerwowym" i jest te uywany jako rodek owadobjczy. Leczc miasteni czsto trzeba dodatkowo stumi nienormaln odpowied immunologiczn powodujc miasteni. Zazwyczaj uywa si w tym celu kortykosteroidw. ale powaniejsze przypadki wymagaj zastosowania cyt o toksycznych lekw immunosupresyjnych, takich jak azatiopryna. Korzystne mog by skutki usunicia grasicy. Plazmafereza moe przejciowo obniy poziom autoptfeeiwci w osoczu. CHOROBA HUNTINGTONA JEST PRZENOSZONA DZIEDZICZNIE
Silne zmniejszenie liczby receptorw
i
I
Choroba Huntingtona, zwana te plsawic Huntingtona, charakteryzuje si krtkimi, mi mowolnymi ruchami (plsawic) i postpujRyc. 64-3. Schemat powstawania miastenii. Po- cym pogarszaniem wyszych czynnoci nerwowody pocztkowego tworzenia przeciwcia skiero- wych. Zaczyna si zazwyczaj midzy 35 a 50 r., wanych przeciw receptorom nie s jasne. nieubaganie si pogbia, i prowadzi do mierci rednio w 15 lat po wystpieniu pierwszych objaww. Choroba jest dziedziczona jako cecha autosomalna dominujca z cakowit penetraInhibitory chotinesterazy zwikszaj cj; zagroonych jest 50% dzieci rodzicw doilo acetylocholiny w zczu nerwowo-miniowym, pozwalajc na tknitych t chorob. Jest ona wyjtkowo stresujca, poniewa do niedawna dzieci tych choleczenie miastenii Leki hamujce acetylocholinesteraz, enzym rych nie mogy przewidzie, czy zostan ni zaangaowany w niszczenie acetylocholiny, sku- dotknite i czy nie przeka jej swojemu potomtecznie zwikszaj stenie tego stwu. Neurony w ciele prkowanym (jdro ogonianeurotransmi-tera przy pytce nerw owo-miniowej i przeduaj czas jego ste i skorupa) s najbardziej dotknite przez dziaania. Leki tego typu s podstaw leczenia chorob Huntingtona. Wiele z nich ginie i zomiastenii. Istniej 2 typy inhibitorw staje czciowo zastpionych przez komrki cholinesterazy: odwracalne i nieodwracalne. glejowe (glejoza). mier komrek dotyka jedne Zarwno krtko dziaajce, jak i stosunkowo typy neuronw bardziej ni inne; interneurony dugo dziaajce inhibitory s uyteczne w zazwyczaj nie s naruszane. Obserwuje si spamiastenii. Te pierwsze znalazy szczeglnie dki poziomu pewnych neurotransmiterow (np. zastosowanie w diagnostyce. Diagnoz stawia kwasu y-aminomasowego [GABA] i acetylosi na podstawie wywiadw, objaww klinicz- choliny), niektrych enzymw zaangaowanych i pewnych testw laboratoryjnych (np. nych w ich syntez (np. dekarboksylazy elektromiografii, pomiaru krcych autoprze- gluta-minianowej i acetyl o transfe razy ciwcia). Test diagnostyczny polega na podaniu cholinowej), niektrych neuropeptydw (np. odpowiedniej ilori krtko dziaajcego substancji P, diolecystokininy i metenkefaliny) i edrofo-niiun (Tensilon). Jeeli pacjent cierpi na pewnych receptorw (np. dopaminowych, miasteni, powinno to spowodowa szybkie, cholinergicznych i serotoninowych). Wykazano cho krtkotrwae, zwikszenie siy mini. rwnie wzrst ste innych przedstawicieli Pirydo-stygmina i neostygmina s skutecznymi, tych 4 klas dhiej dziaajcymi lekami, szeroko uywanymi w leObjawy kliniczne, zwaszcza epizody saboci mini unerwianych przez nerwy czaszkowe
892 / ROZDZIA 64
moleku, np. dopaminy i noradrenaliny, soma-tostatyny i neurotensyny. Te rozmaite zmiany maj prawdopodobnie charakter wtrny, odzwierciedlajcy uszkodzenia komrek i mier komrkow wynik z defektw genetycznych, ale s wane z tego powodu, e stanowi podstaw biochemiczn objaww, na ktre cierpi pacjent. Gen choroby Huntingtona zosta zlokalizowany na krtkim ramieniu chromosomu 4, ale dotychczas nie zosta wyizolowany W 1983 r. Gusella i wsppracownicy opisaii wystpowanie RFLP cile zwizanego z genem odpowiedzialnym za chorob Huntingtona. Bya to jedna z pierwszych prac wykorzystujcych RFLP w badaniach sprze genetycznych i jej sukces da olbrzymi napd do tego typu bada. Badane przypadki obejmoway bardzo rozleg rodzin (ok. 5000 osb) yjc w okolicy jeziora Maracaibo w Wenezueli. Okoo 300 czonkw tej rodziny cierpiao na chorob Huntingtona, Uyto baterii 12 wieo udostpnionych sond DNA. Przy olbrzymim szczciu (jeeli si uwzgldni wzgldnie niewielk liczb sond i rozmiar ludzkiego genomu), stwierdzono, e jedna z tych sond, G8, wykrya dwa pohmorfizmy (RFLP) bardzo cile zwizane z genami kodujcymi chorob Huntingtona (w granicach ok. 35 cM). Te dwa polimorfizmy spowodoway rozpoznanie 4 kombinacji alleli, czyli haploty-pw (A, B, C i D); haplotyp C dla G8 pojawia si u czonkw wenezuelskiej rodziny dotknitych chorob. G8 pochodzi 2 rekombinowanego bakteriofaga z biblioteki genomu ludzkiego. Zastosowanie hybrydyzacji komrek somatycznych oraz hybrydyzacji in situ wykazao, e wykryty locus znajdowa si bardzo blisko koca krtkiego ramienia chromosomu 4. Niestety, sekwencje DNA blisko telomeru przy kocu chromosomu wydaj si zawiera powtrzenia DNA i inne sekwencje trudne do interpretacji. Mimo tego, do koca 1989 r. sklonowano koniec chromosomu 4, w ktrym znajduje si locus choroby Huntingtona. Jed nake, dalsze dowody wykazay wwczas, i& locus ten w rzeczywistoci znajduje si kilka milionw par zasad bardziej proksymalnie (tzn. w kierunku od koca chromosomu) ni pierwotnie sdzono. Nie zosta on nigdy precyzyjnie okrelony w tym sensie, e nie udao si okreli regionu ograniczajcego, definiujcego dystalny koniec genu (w przeciwiestwie do przypadku
genu mukowiscydozy). Tak wic obecnie liczne laboratoria klonuj i sekwencjonuj rejon chromosomu, w ktrym przypuszcza si, e tkwi poszukiwany gen. Powinien on by zidentyfikowany w najbliszej przyszoci. Jeeli uda si te wydedukowac, jakie biako wytwarza normalny gen, powinno to wyjani mechanizm prowadzcy do mierci neuronalnej w ciele prkowanym pacjentw z chorob Huntingtona (patrz niej) i doprowadzi do bardziej racjonalnych metod jej leczenia. Mimo rozczarowania, e gen choroby Huntingtona wci nie zosta zidentyfikowany, opisane wyej badania umoliwiy, przy uyciu odpowiednich sond DNA, informowanie czonkw dotknitych rodzin jeeli zechc to wiedzie czy rozwinie si u nich choroba Huntingtona (testowanie przedobjawowe) i zaoferowa diagnoz prenataln. Obecnie nie ma adnej swoistej terapii choroby Huntingtona, mona tylko suy doradztwem genetycznym, pomoc psychologiczn i leczeniem objawo wym. Ekscytotoksyny mog wywoywa mier neuronw w chorobie Huntingtona przez ich dziaanie na podtyp NMDA receptora glutamin anowego Choroba Huntingtona charakteryzuje si wymieraniem pewnych neuronw (p. wyej). Bez wyjanienia natury produktu genu zaangaowanego w chorobie Huntingtona (enzymu, receptora itp.) trudno o pewno, jak proces t en zachodzi. Jedna z hipotez zakada, e jest on powodowany przez pewne substancje chemiczne (ekscytotoksyny), ktre mog by egzogenne lub endogenne (normalne produkty metaboliczne). Aby w peni zrozumie t koncepcj, trzeba co wiedzie o receptorach glutaminianowych. Glut;) minian i aspara ginian s pobudzajcymi aminokwasami w mzgu; glutaminian moe by odpowiedzialny za ok. ^75% neurotransmisji pobudzajcej w mzgu. Przez stosowanie odpowiednich agonistw i antagonistw podzieio-no receptory giutaminianowe na 5 klas: 1) NMDA (N-metylo-D-asparaginian); 2) AMPA (kwas a-amino-3-hydroksy-5 -metyl o-4-izoksa-zolopropionowy); 3) kainowe (zwizek izolowany z glonw morskich); 4) L-AP+ (syntetyczny agonista) i 5) metabotropowy. Pierwsze 4 receptory s kanaami kationowymi, podczas gdy receptor metabotropowy jest zwizany z wewntrzkomrkowym wytwarzaniem diacy-
loglicerolu i trisfosforanu inozytolu na szlaku polifosfoinozytydowym (p. rozdz. 45). Szczeglnie interesujce byo odkrycie, e iniekcja kwasu kainowego do prkowia szczurw powoduje mier neuronw, ale oszczdza komrki glejowe i aksony. Kwas kainowy dziaa powodujc nadmierne uwalnianie glutami-nianu. Faktycznie, inkubacja neuronw ze stosunkowo niskimi steniami giutaminianu mo e powodowa miejt neuronw: jest to zalene od obecnoci Ca2+ w rodowisku inkubacyj-nym. Iniekcja chinolinianu, metabolitu tryptofa-nu, ktry stymuluje receptor NMDA, rwnie powoduje mier neuronw, oszczdzajc inter-neurony, w podobny sposb jak w chorobie Huntingtona. Tak dziaajce zwizki chemiczne nazywamy ekscy to toksynami. Chocia do chwili identyfikacji produktu wadliwego genu nie mona wyznaczy dokadnie acucha zdarze, szczeglnie zaangaowany w uszkodzenia i mier neuronw obserwowane w chorobie Huntingtona wydaje si by receptor NMDA. Receptor ten (ryc. 64-4) jest zoony, poniewa zawiera co najmniej 5 rnych miejsc wicych (miejsce wice transmiter glutaminian, miejsce regulatoro-
we wice glicyn, zakne od potencjau miejsce wice Mg2 +, miejsce wice fencyklidyn oraz miejsce wice Zn2+). Kana otwiera si, kiedy jest zwizany zagonist, takim jak glutaminian, a po otwarciu zezwala na napyw Ca2 + i Na+ do komrki. Jeeli receptor NMDA jest stymulowany przewlekle (np. w wyniku nadmiaru glutaminianu uwalnianego przez neurony w wyniku depolaryzacji ich bony plaz-matycznej), prowadzi to do akumulacji Ca2 + , ktry w wysokich steniach jest toksyczny dla komrki i moe spowodowa mier komrki w sposb podobny do opisanego dla zawau serca (przypadek 4 w rozdz. 62). Co wicej, napywowi Ca2 + towarzyszy napyw Nar, powodujcy osmotyczne pcznienie i uszkodzenie komrki. Odkrycia te ustaj implikacje terapeutyczne, poniewa dziki nim mona czciowo blokowa receptory NMDA, uywajc lekw takich jak dekstrorfan, zmniejszajc w ten sposb liczb gincych komrek. Receptor NMDA jest interesujcy rwnie z innych wzgldw. Sdzi si, e odgrywa on istotn rol w dugotrwaym wzmocnieniu, co powoduje zwikszon wydajno synaptyczn w hipokampie i innych obszarach mzgu i moe
Bona
Wntrze
^pcpoooo
l '!
:
Otoczenie
' '
OO CC
Ryc. 64-4. Schematyczne przedstawienie receptora NMDA i punktw uchwytu rnych czynnikw na 2+ + receptorze. Receptor NM DA kontrotuje kanai kationowy przepuszczalny dla Ca i Na i jest kontrolowany i + przez Mg w sposb zaleny od potencjau. Przed wjonem jest K . Kana! receptora NMDA jest blokowany przez PCP i MK801, a cay kompleks jest regulowany w dwch miejscach regulatorowych przez, glicyne 2+ iZn . AP5 jest kompetytywnym antagonist w miejscu wizania NMDA. PCP fencyklidyna (Wediug: Cooper J B., Bloom F. ., Roth R. H.: The Biochemical Basis of Neuropharmacology, wyd. 6, Oxford University Press, za zezwo(eniem). ___
894 I ROZDZIA 64
by zwizane ze zjawiskami pamici i uczenia. Uwaa si rwnie, e aktywacja tego receptora moe inicjowa drgawki; ponadto powtarzane drgawki mog wywoa mier neuronw prawdopodobnie zwizan z uwalnianiem ekscytoto-ksyn. Proponowany schemat niektrych wydarze zwizanych z wywoaniem choroby Hun-tingtona przedstawia ryc. 64-5.
Mutacja lub rnulacje jednego genu (genu Huntlngtona) w krtkim ramieniu chromosomu A
Zmiana struktury hipotetycznego produktu biakowego (np, enzymu, blatka strukturalnego, receptora)
Uwolnienie etecytotoksyn [np. nadmiar glutaminlanu) powodujce nadmierne pobudzenie receptora NMD wewntrzkomrkowe nagromadzenie toksycznych iloci C a/ i mier neuronw w przkowlu i gdzie indzie]
Objawy choroby Huntingtona (plsawlca, postpujce pogorszenie stanu neurologicznego)
Ryc. 64-5. Przypuszczalny schemat niektrych zjawisk zaangaowanych w wywoywanie choroby Huntingtona.
EKSCYTOCYNY I INNE MECHANIZM Y BIOCHEMICZNE S ZAANGAOWANE W USZKODZENIA MZGU SPOWODOWANE UDAREM Przy udarze mzgu pojawiaj si lokalne uszkodzenia wywoans,zmniejszonym przepywem krwi. Skutki tego mog by zabjcze (np. trwaa utrata przytomnoci, parali, lepota, utrata mowy), w zalenoci od umiejscowienia i wielkoci dotknitego udarem obszaru. Udary s trzeci gwn przyczyn mierci w USA i dotykaj ok. 500000 Amerykanw rocznie. Podobnie jak w przypadku choroby Alzheime-ra, ekonomiczne koszty zwizane z opiek medyczn nad pacjentami z udarem s olbrzymie. Aby opracowa odpowiednie metody leczenia udarw, trzeba koniecznie zrozumie podstawowe mechanizmy zaangao wane w uszkodzenia okolic mzgu dotknitych udarem. Omwimy tu kilka wanych punktw. Wikszo udarw jest powodowanych za krzepami w ttnicach mzgowych. Zmniejsza to poda tlenu i glukozy, substancji podstawo wych dla przemiany materii w mzgu, bez
ktrych trwae uszkodzenie komrek rozwija si szybko (poniej godziny). Wyrniamy trzy kolejne etapy w rozwoju uszkodzenia mzgu powodowane zakrzepem mzgowym. Indukcja. Niedotlenienie (ischemia) powo duje depolaryzacj Won neuronalnych, powo dujc uwalnianie glutaminianu Podobnie jak w przypadku choroby Huntingtona, powoduje to nadmierne pobudzenie receptorw NMDA na przylegajcych neuronach, prowadzce do nienormalnie wysokiego napywu Ca 2+ i Na+ i wynikajce std uszkodzenie komrki lub jej mier. Co wicej, glutaminian pobudza recep tory AMPA/kainowe (prowadzc do dodat kowego napywu Na + ) i receptory metabotropowe, powodujc wewntrzkomrkowe tworzenie si trisfosforanu inozytolu i diacyloglicerolu. Amplifikacja. Dalsze nagromadzanie si Caz+ w komrce zachodzi przez nastpujce mechanizmy: a) zwikszone stenie wewntrz komrkowego Na + aktywuje transporter Na+ /Ca2+ , b) sterowane potencjaem kanay Ca2+ s aktywowane w wyniku depolaryzacji i c) trisfosforan inozytolu uwalnia Ca2+ z*siateczki rdplazmatycznej do cytoplazmy. Wszyst kie te trzy mechanizmy prowadz do podwy szenia wewntrzkomrkowego poziomu Ca2+, co powoduje dodatkowe uwalnianie si gluta minianu, pobudzajcego w dalszym cigu ssie dnie neurony. Ekspresja. Due stenia wewntrzkom rkowego Ca2 + aktywuj wapni owo-zalene nukleazy, proteazy i fosfolipazy. Degradacja fosfolipidw moe te prowadzi do tworzenia czynnika aktywujcego pytki (PAF) i uwal niania kwasu arachidonowego, ktrego meta bolizm prowadzi do tworzenia eikozanoidow; oba te typy lipidw mog wywoywa skurcz naczy, pogarszajc efekt zakrzepu. W dodatku metabolizm eikozanoidow prowadzi do tworze nia wolnych rodnikw tlenowych, ktre powo duj trwae nadtlenkowe ûszkodzenia lipidw bon neuronalnych. Poniewa glutaminian od grywa pierwszoplanow rol w tej sekwencji wydarze, cay proces nazwano kaskad glutaminianow. Wiele innych czynnikw jest jednak rwnie zaangaowanych w ischemicznym uszkodzeniu mzgu. Leczenie udaru ma na celu ograniczenie uszkodze wywoanych zakrzepem. Wprowa dzono dowiadczalne terapie majce na celu zminimalizowanie efektw biochemicznych kaskady glutaminianowej (tab, 64-2). Podobnie
PODOE BIOCHEMICZNE CHORB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 895 Tabela 64-2. Niektre terapie dowiadczalne testowane w celu ograniczenia kaskady glutaminianowej rozwijajcej si w czasie udaru mzgu. (Trzy etapy kaskady opisano w tekcie).' Etap kaskady Indukcja Problem biochemiczny Nadmierne uwalnianie gl u -tamirtianu Podejcie lecznicze Hamowanie syntezy glutaminianu przez metioninow sulfoksymin. Obnienie temperatury ciaa, jeeli pacjent gorczkuje: obnia to metabolizm mzgu i moe zahamowa uwalnianie glutaminianu Antagonici receptorw NMDA, tacy jak dekstrorfan, CGS 19755 i MK-801
Aktywacja receptorw NMDA Ampliftkacj
1+ Napyw Ca przez kanay Pochodne dihydropirydyny (np. nimodypina) w celu I+ Ca regulowane potenc- zablokowania tych kanaw jaem
a Ekspresja
Tworzenie wolnych rodni- Leki hamujce wolne rodniki (np. 21 -aminosteroidy) kw
Wedug: Zivin J.A., Choi D.W.: Stroke Therapy. Sci. Am. {lipiec) 1991, 26%, 56.
jak w przypadku zakrzepu w ttnicy wiecowej moe przywrci przepyw krwi. Prowadzi si wiele zakrojonych na du skal prb klinicznych z tPA. Do leczenia udaru tPA moe by odpowiedniejsza ni streptokinaza, poniewa ta ostatnia moe atwiej wywoywa krwotoki, ktre mog by katastrofalne dla mzgu. Zapobieganie obejmuje rwnie przeciwdziaanie czynnikom ryzyka, takim jak nadcinienie, cukrzyca, palenie tytoniu i hiperlipidemia. Podawanie maych dawek aspiryny wydaje si zmniejsza ryzyko udaru u pacjentw cierpicych na przejciowe ataki niedotlenienia.
(p. rozdz. 58) wczesne leczenie trombolityczne
Tabela 64-3. Niektre gtwne cechy struktury i funkcji ludzkiego mitochondrialnego DNA* Jest piercieniowy, dwuniciowy i zawiera acuch ciki (H) i lekki (L) Zawiera 16 569 par zasad, ich sekwencja jest w peni poznana Koduje 13 (z oglnej liczby 67) podjednostek biakowych acucha oddechowego; 7 podjednostek dehydrogenazy NADH {kom pleks I) cytochrom b kompleksu III 3 podjednostki oksydazy cytochromowej (kom pleks IV) 2 podjednostki syntazy ATP Koduje duy (16s) i may (12s) mitochondrialny rybosomalny RNA Koduje 22 molekuy mitochondrialnego tRNA Jego kod genetyczny rni si ni eco od kodu standardowego: UGA (standardowy kodon stopu) jest czytany jako Trp AGA i AGG (standardowe kodony dla Arg) s czytane jako kodony stopu Zawiera bardzo niewiele sekwencji nie tumaczo nych Wysoka czstotliwo mutacji (5-10 razy wiksza ni w DNA jdrowym) Porwnania sekwencji mtDNA dostarczaj dowodw O ewolucyjnym pochodzeniu naczelnych i innych gatunkw * Wedug: Harding A.E.: Neurological disease and mitochondrial genes; Trends ^ 14:132
MUTACJE MITOCHONDRIALNEGO DNA POWODUJ PEWNE MIOPATIE SCHORZENIA NEUROLOGICZNE

Mitochondria ludzkie zawieraj 210 kopii niewielkich piercieniowych dwuniciowych moleku DNA, ktre skadaj si na ok. 1% cakowitego DNA w komrce (ryc. 64-6 i tab. 64-3). Istotn cech ludzkiego mitochondrial-nego (mt) DNA jest to, e jest ono dziedziczone na drodze matczynej, niemendlowskiej dziedzicz noci, poniewa wszystkie mitochondria s dostarczane przez jajo w czasie tworzenia zygoty. Std przy chorobach powstaych w wyniku mutacji mtDNA, chora matka teoretycznie powinna przekaza chorob wszystkim dzieciom, ale tylko crki bd dalej przenosiy chorob. Jednake, w niektrych przypadkach (p. niej)
896 / ROZDZIA 64
ubytki w mtDNA mog zachodzi w czasie oogenezy i nie s dziedziczone po matce. Wykazano obecnie, e wiele chorb powstaje w wyniku mutacji mtDNA (tab. 64-4), Jedna ich
Tabela 64-4. Niektre miopatie mitochondrialne i choroby spowodowane mutacjami genw mito-chondrialnych* Kosmate Choroba Mutacja** czerwone wkna
M opat i a oczna KSS MERRF Tak Tak Tak Deleeje Delecje, duplikacje Mutacja punktowa w lizynowym tRNA (pozycja 8344 Mutacja punktowa w leucyrtowym tRNA (pozycja 3423} Mutacja punktowa w reduktazie NADH--CoE Q (pozycja 11 778) Mutacja punktowa w podjednostce 6 hT -ATPazy (pozycja 8993)
C1
- O ,-
CD 75 (U (O
(0 ~O O .
O 3 *~ -* N E
5 fe <> -3; ^r W
S ;-<
^Z
MELAS
Tak
LHON
Nie
> o :-,
a a n c tT^-
Nie Matczyny RP (jedna rodzina)
* Wedug: Harding A. E.: Neurological disease and mrtochondrial genes; Tr&nds Neurosci. 1991,14,132. ** W wymienionych chorobach mog te wystpo wa dalsze mutacje. Wystpowanie mutacji w r nych typach tRNA wydaje si korelowa z proliferacj mitochondriw obserwowan w niektrych z tych chorb, podczas gdy mutacje w enzymach acucha oddechowego nie wykazuj takiej korelacji. Miopatia oczna charakteryzuje si postpujc zewntrzn oftalmoplegi {PEO), ujawniajc si zazwyczaj w dziecistwie. KSSzesp Kearns -Sayre'a, charakteryzuje si PEO, retinopati pigmentow t zaburzeniami przewodnictwa sercowego pojawiajcymi si w dziecistwie. MERRF padaczka miokfonalna z kosmatymi czerwonymi wknami, charakteryzuje si mioklonusem, padaczk i ataksj wystpujcymi w dziecistwie lub w okresie dojrzaoci. MELAS encefa I opatia mitochondrialna z kwasic mleczanow i epizodami udaropodobnymi, charakteryzuje si okresowymi wymiotami, proksymaln saboci koczyn i epizodami przypominajcymi udar; wy stpuje w o kresie po kwitania lub pniej, LHON dziedziczna wzrokowa neuropatra Lebera, charak teryzuje si ostr lub podostr utrat wzroku u m czyzn okoo 20 roku ycia. Matczyny RP matczyne pigmentowe zapalenie siatkwki, pojawio si w jed nej rodzinie wraz z otpieniem, drgawkami, ataksj i saboci miniow.
<
CL'
rs,
CD
-c o
U O. i
w
0=
&5.238S
U>
o o
c O =
U O Z O "S
*Q CC =
grupa skada si z miopatii mitochondrialnych, Tabela 64-5. Testy laboratoryjne suce do rozcharakteryzujcych si obecnoci poznawania chorb powodowanych przez mutacje mitochond-riw o nienormalnym ksztacie i mtDNA wymiarach w miniach szkieletowych. Te Obecno czerwonych kosmatych wkien w prbnienormalne mitochondria powoduj, e wkna kach pobranych z mini (nie w przypadku LHON*) miniowe przybieraj posta kosmatych Badania rnych enzymw acucha oddechoweczerwonych wkien (ragged red fibers), ktre go mona wykry przy biopsji mini barwionych metod Gomo-riego lub innymi technikami. Analiza mtDNA (np. z mini i, w niektrych przypadkach, 2 ieukocytw) Pierwsze 4 jednostki chorobowe, wymienione w dziedziczna wzrokowa neuropatia tabeli 64-4 s przykadami miopatii mitochondrialnych, W miopatii ocznej (ocular miopathy) gwnie dotknite s minie Wiele dalszych punktw dotyczcych chorb odpowiedzialne za ruchy oczu; powoduje to wynikajcych z mutacji mtDNA zasuguje na postpujc zewntrzn oftal-moplegi skomentowanie. %( (progressive external ophthalmople-gia, POE), DNA u pacjentw cierpicych na te cho ktra rwnie wystpuje, wraz z in-inymi roby moe si skada z mieszaniny zmutowa nieprawidowociami, w zespole nego i normalnego DNA (heteroplazmia) lub Kearnsa-Sayre'a. Padaczka mioklonafna z cakowicie zmutowanego DNA (homo plazm i a) kosmatymi 'czerwonymi wknami (myoclonus Ilo zmutowanego DNA w zasadzie jest skore epilepsy with tfSgged red fibers, MERRF) i lowana ze stopniem choroby. encefa I opatia fftitochondrialna z kwasic Wikszo polipeptydw mitochondrial mleczanow i epizodami udaropodobnymi nych (~54/67) jest kodowanych przez geny (mitochondrial encepha-lomyopathy with jdrowe i wobec tego mutacje tych ostatnich lactacidosis and stroke-like episodes, MELAS) *LHON mog rwnie zaburza struktur i mog by klasyfikowane jako encefalomiopatie Lebera funkcje mitochondrialne, poniewa w ich przebiegu mitociondriw. Przy pewnych mzg jest zazwyczaj rwnie powanie schorzeniach dotknity. Dwa inne schorzenia wymienione w (np. LHON) oddziaywania midzy genami tab. 64-4, dziedziczna wzrokowa neuropatia jdrowymi i mitochondrialnymi mog by wa Lebera (Leber's hereditary optic myo-pathy, ne dla okrelenia fenotypu. LHON) i macierzyskie pigmentowe zapalenie W jaki sposb mutacje mitochondrialne siatkwki (maternal retinitis pigmen-tosa) s powoduj swoiste efekty tkankowe? Na przy chorobami wynikajcymi z mutacji mtDNA, ale kad, dlaczego nerw wzrokowy jest tak wybir nie s miopatiami mitochondrial -nymi, czo dotykany przez LHON? Prawdopodobnie poniewa uszkodzenia niekoniecznie dotycz odpowied kryje si w charakterystyce fizjo mini. logicznej zaatakowanej tkanki; mona podej U wielu pacjentw z POE (cznie z cier- rzewa, e aktywno reduktazy NADH-koenpicymi na zesp Kearnsa-Sayre'a) stwierdzo- zymu Q (ktra jest zaburzona w LHON) jest no detecje w mtDNA; u pacjentw z zespoem szczeglnie wana wanie dla tkanki nerwu Kearnsa-Sayre'a stwierdzono rwnie duplika- wzrokowego. Co ciekawe, przewleke podawa cje (podwojenia). Stopie delecji czsto by nie azydku sodowego (ktry hamuje oksydaz skorelo wany z nateniem POE. Delecje te cytochromu c u pewnych ssakw wywouje wydaj si powstawa w czasie oogenezy i std nie neuropati podobn do LHON. s dziedziczone po matce. Co wicej, nie musz Przypuszczano, e anomalie mtDNA wy one wystpowa we wszystkich komrkach, np. stpuj u pewnych pacjentw z chorob Parkinmoe ich nie by w leukocytach. Z drugiej sona i mog przyczynia si do starzenia. strony, pacjenci z zespoami MERRF, MELAS, LHON i z rodzinnym przenoszonym przez matk pigmentowym zapaleniem siatkwki wykazuj specyficzne mutacje punktowe (tab. 64--4). W odrnieniu od delecji, takie mutacje punktowe s zwykle dziedziczone od matki. Testy laboratoryjne wykorzystywane w rozpoznawaniu chorb spowodowanych mutacjami mtDNA s wymienione w tab. 64 -5.
'i
898 / ROZDZIA 64
ZESP AMLIWEGO X, RDZENIOWO OPUSZKOWA ATROFIA MINIOWA I DYST ROFIA MIOTONICZNA S POWODOWANE PRZEZ MUTACJ POWTRZENIA TRYPLETOWEGO Zespl amliwego X jest recesywn chorob zwizan z chromosomem X, charakteryzujc si agodnym lub umiarkowanym niedorozwojem umysowym oraz wielk gow, uszami i jdrami. Wystpuje on u jednego na 1250 mczyzn w Ameryce Pnocnej i odpowiada czciowo za to, e mczyni stanowi wikszy ni kobiety odsetek pacjentw umieszczonych w domach opieki dla niedorozwinitych. Zespl wykazuje pewne niezwykle cechy genetyczne jak na chorob zwizan z chromosomem X, a mianowicie 2050% mczyzn dotknitych t chorob nie wykazuje jej objaww. Ci bezobjawowi nosiciele mog przenie wadliwy gen na swoje crki, ktre rwnie nie wykazuj objaww choroby. Jednake w trzecim pokoleniu zarwno mskie, jak i eskie potomstwo tych crek moe wykazywa objawy choroby. Sugeruje to, e pewne zmiany genu nastpiy u crek, co umoliwio wystpienie choroby u dzieci. Moe to by zwizane ze zwikszeniem wymiaru genu przez mutacj powtrzenia trypletu (patrz niej) lub przez matczyne wdrukowanie genomowe (zdefiniowanie poniej), w ktrym to procesie zachodzi nadmierne metylowanie, powodujce inaktywacj pewnych genw w amliwym odcinku chromosomu X. Po zespole Downa, zesp amliwego X jest gwn przyczyn niedorozwoju umysowegc?<zwizanego ze zidentyfikowan aberracj chromosomow. Cytogenety-cznie zesp ten charakteryzuje przewenie blisko koca dugiego ramienia chromosomu X (Xq27), tak e zakoczenie dugiego ramienia wyglda jak may guzik przyczepiony do reszty chromosomu wsk szypuk. Mona indukowa pojawienie si miejsca amliwego w kulturach leukocytw przez usunicie z poywki kwasu foliowego lub dodanie metotreksatu, ale dokadno wykrywania kobiet-nosicielek jest poniej 30%. amliwe miejsca wystpuj rwnie na innych chromosomach, ale nie powoduj adnych widocznych problemw. Dokadnej lokalizacji genu odpowiedzialnego za zesp amliwego X na chromosomie X (FMR-1) dokonano za pomoc RFLP i hybryd komrek somatycznych, w ktrych indukowano zamanie ludzkiego chromosomu X w am-
liwym miejscu chromosomu. Umoliwio to pozycyjne klonowanie genu. Gen zosta nazwany FMR-1 i zawiera silnie polimorficzne powtrzenia CGC, bdce miejscem zwielokrotnienia trypletu (>200 powtrze u osoby chorej) powodujce amliwo chromosomu. Uwaa si, e ten gen wanie jest odpowiedzialny za zesp amliwego X, ale nie jest to cakiem pewne, poniewa do tej pory nie mona przewidzie jego funkcji z sekwencji aminokwasw. Zidentyfikowanie zaangaowanych biaek i ustalenie, jak zmiany ich funkcji wpywaj na charakterystyk fenotypu, byoby bardzo in teresujce. Metylacja wyspy CpG blisko odcinka promotorowego (metylacja inaktywuje pewne geny) moe pomc w wyjanieniu, dlaczego u osb chorych obserwuje si niski poziom mRNA dla tego genu. Jak wspomniano wyej, istniej pewne dowody na to, e metylacja moe zachodzi na matczynym chromosomie X, w obszarze amliwym X, a to moe wyjani nienormalne dziedziczenie zespou. Jeeli tak jest w istocie, byby to przypadek wdrukowania genomowego (genomic imprinting), zjawiska w ktrym wkad ojca i matki potomstwa jest zrnicowany. Dwie inne choroby neurologiczne s powodowane przez mutacje powtrzenia trypletowe-go. S to rdzeniowo-opuszkowa atrofia miniowa (spina bulbar muscular atrophy, SBM A) i dystrofia miotoniczna (myotonic dystrophy, DM). SBMA jest to zalena od chromosomu X choroba recesywn, charakteryzujca si narastajc saboci miniow koczyn grnych i dolnych. Uszkodzonym genem jest gen receptora androgenowego (AR), a zwielokrotnianym trypletem jest CAG. Receptor androgenowy znajduje si w wysokich steniach w rdzeniowych i opuszkowych motoneuronach, ktre s obiektami zaatakowanymi w SBMA. Przypuszcza si, e defekt receptora androgenowego jest przyczyn saboci miniowej w tym schorzeniu. DM jest chorob dziedziczon przez auto-somalny gen dominujcy i charakteryzuje si miotonia (tzn. zmniejszonym rozkurczem mini po dugotrwaym skurczu) i innymi cechami. Zaangaowany w DM gen zosta nazwany MT-PK (miotoninowa kinaza biaek) i koduje kinaz biaek najprawdopodobniej zaangaowan w przekazywanie sygnaw. W komrkach pacjentw cierpicych na DM obserwo wano nieprawidow fosforylacj biaek. Zwielokrotnionym trypletem jest GCT. Niektre cechy molekularne tych 3 schorze s pod -
PODOE BIOCHEMICZNE CHORB NE UROPS YCHIATRYCZNYCH / 899
Tabela 64-6. Choroba"
Niektre cechy molekularne trzech chorb spowodowanych amplifikacj trypletow Lokalizacja na chro moso m ie Ge n" Zw ie lo kr o tnian y tryp let CAG CGG GCT Liczba try potw Liczba trypietw u o sb no r malzwizanych z nych chorob 11-31 5-54 40-52 >20 0 >10 0
SMBA Xq 11-12 Zesp amli - Xq27 19q13.2-13.3 wego X DM
AR FMR-1 MT-PK
5-30
"Wed ug: Caskey i wsp.: Triplet repeat mutatio ns in human diseases; Science 1992, 256, 784 "S BM A rdzenio wo- o puszko wa atro lia minio wa; DM dystrofia mioto niczna; A R receptor androgeno wy, MT-P K miotonino wa kinaza biaek
sumowane w tab. 64-6. Wszystkie powtrzenia trypletowe wystpujce w tych schorzeniach s bogate w CG i silnie polimorficzne u osobnikw normalnych. Fenotypowo osobnicy normalni bdcy heterozy go turni pod wzgldem tych chorb wykazuj allele premutacyjne, w ktrych ilo powtrze jest znamiennie wiksza ni u osb zdrowych, ale mniejsza ni u chorych. Uycie odpowiednich technik biologii molekularnej (np. Southern blotting, acuchowa reakcja polimerazy [PCR], hybrydyzacja i sondy dla wykrycia zwielokrotnionych sekwencji) uatwia diagnozowanie tych chorb i zastpi techniki cytogenetyczne i inne stosowane do-tycficzas. To poprawi diagnostyk
prenataln oraz identyfikacj bezobjawowych nosicieli, kt rzy mog przenosi choroby na
na jest tylko jedn z przyczyn parkinsonizmu (patrz niej). Gwn cech patologiczn choroby Parkinsona jest degeneracja pigmentowanych komrek
swoje potomstwo. Mechanizmy zaangaowane w zwielokratnia-nie trypietw s obecnie intensywnie badane. Poszukiwania komputerowe wykazay, e powtarzania trypletw s cakiem czste w geno-mie ludzkim. Jest wic zupenie moliwe, e ten nowy typ mutacji okae si przyczyn jeszcze innych chorb.
OBJAWY CHOROBY PARKINSONA ODZWIERCIEDLAJ DEFICYT DOPAMINY W ISTOCIE CZARNEJ I CIELE PRKOWANYM
Choroba Parkinsona charakteryzuje si dreniami, bradykinezj (spowolnieniem i ubogo-ci ruchw), sztywnoci i niestabilnoci postawy. Pojawia si rzadko przed 40 r. Ocenia si, e cierpi na ni 1% osb powyej 50 r., a w Stanach Zjednoczonych jest ni dotknitych ponad milion udzi. Omwiony zespl objaww nazywamy parkinsonizmem. choroba Parkinso-
w istocie czarnej. W warunkach fizjologicznych komrki te syntetyzuj dopamin i wykorzys tuj j jako neurotransmiter, i std nazywane s komrkami dopaminergicznymi. Neurony do-paminergiczne znajduj si w rnych obszarach mzgu, w tym w strukturach nigrostriatal-nych, mezolimbicznych, mezokortykalnych i guzowo-przysadkowych. Rycina 64-7 ilustruje cao procesu, w ktrym dopamina bierze udzia jako neurotransmi ter. Podobnie jak w przypadku acetylocholiny mona go wygodnie podzieli na 6 etapw. Podobny proces jest wczony w dziaanie innych neurotransmiterw (np. noradrenaliny i adrenaliny), chocia czasami niektre etapy istotnie si rni. L Synteza dopaminy, rozpoczynajca si od tyrozyny, obejmuje kilka reakcji enzymatycznych. Reakcj ograniczajc szybko syntezy jest reakcja katalizowana przez hydroksylaz tyrozynow. 2. Magazynowanie dopamin y w pcherzy kach synaptycznych jest nastpnym etapem. Wnikanie do nich dopaminy jest napdzane przez gradient pH powstay w wyniku obecno ci pewnego biaka, wystpujcego w bonie pcherzyka i pompujcego protony do jego wntrza kosztem energii uzyskiwanej z ATP. Uwalnianie dopaminy jest zwizane z egzocytoz. Mechanizm jest podobny do mechaniz mu opisanego dla acetylocholiny. Wizanie dopaminy do receptorw postsynaptycznych jest nastpnym etapem. Amina dochodzi do receptora dyfundujc przez szczeli n synaptyczn. Jak opiszemy pniej w tym rozdziale, istnieje co najmniej 5 klas receptorw
900 / ROZDZIA 64
L-OOPA \/* aromatycznych X aminokwasw
Produkty utleniania dopaminy
Antagonici receptora do parni nowego
Ryc. 64-7. Schematyczny diagram przedstawiajcy uwalnianie dopaminy z neuronu w istocie czarnej i pokazujcy miejsca dziaania lekw, ktre agodz lub wywouj parkinsonizm. Sze etapw wymienionych w tekcie jest umieszczonych na rycinie, ale nie numerowanych. Pokazano rwnie miejsca dziaania lekw uywanych w leczeniu parkinsonizmu (L -dopa, deprenil, amantadyna i agonici receptora dopaminowego, np. bromokryptyna). Oglnie leki te zwikszaj miejscowe stenie dopaminy, przeciw dziaajc skutkom jej maego stenia w parkinsonizmie. Pokazane s rwnie miejsca dziaania niektrych lekw, ktre indukuj parkinsonizm, zmniejszajc stenie dopaminy lub rywalizujc z ni (rezerpina i antagonici receptora dopaminergjcznego, tacy jak liczne neuroleptyki). (Wedug: Sweeney P.: New concepts in Parkinson's disease; Hosp, Pract. (April) 1991, 26, 84, za zezwoleniem).
dopaminowych. Powoduj one swoje efekty dziaajc pobudzajco lub hamujco na cyklaz adenyjanow lub, przynajmniej w jednym wypadku, dziaajc na inny system wtrnych przekanikw (tj. na fbsfolipaz C i cykl polifos-foinozytydw). 5. Wychwyt zwrotny dopaminy (ryc. 64-7) zachodzi w wyniku dziaania transportera o wy-
sokiej aktywnoci, uywajcego ATP, obecnego w bonie pre synaptycznej. Odzyskana tak dopamina moe by z powrotem inkorporowana do pcherzykw synaptycznych i ponownie uyta jako neurotransmiter. 6. Rozkad dopaminy moe zachodzi bd w szczdinie synaptycznej, bd, po wychwycie zwrotnym, wewntrz zakoczenia presynapty-
cznego. Monoaminooksydaza B (MAO-B) znajduje si *na zewntrznej bonie mitochondriw w zakoczeniu presynaptycznym, a take w szczelinie synaptycznej. MAO-B i MAO-A rni si od siebie preferencj do rnych substratw oraz wraliwoci na rne inhibitory. Oba enzymy mog dziaa na dopamin tworzc 3,4-dihydroksyfenyIoacetaldehyd (DOPAC), ten za jest dalej konwertowany do kwasu homo w anilinowego (HVA) dziaaniem katecholo-O-metylotransferazy (COMT) (p. ryc. 50-3). Fakt ten ma istotne znaczenie dla bada nad schizofreni, gdy poziom kwasu homowanilinowego w ptynie mzgowo--rdzeniowym moe by wykorzystany do ledzenia metabolizmu dopaminy w mzgu. De-prenil dziaa jako inhibitor MAO-B, podczas gdy klorgilina jest swoistym inhibitorem enzymu typu A. Rycina 64-7 ukazuje rwnie miejsca dziaania wielu lekw uywanych w terapii parkinsonizmu i wielu (patrz niej) powodujcych parkinsonizm jako niepodany efekt uboczny; kady z 6 etapw omwionych po wyej moe by punktem dziaania rnych lekw. Proces degeneracyjny, o ktrym tu mowa, powoduje znaczny spadek syntezy dopaminy i wynikajcy std spadek jej poziomu w istocie czarnej i ciele prkowanym (jdro ogoniaste i skorupa). Obnienie poziomu dopaminy podnosi stosunek acetylocholina/dopamina w komrkach systemu nigrostriatalnego, poniewa poziomy acetyl och oliny nie s tak silnie naruszone. Tak powstaa nierwnowaga wnosi istotny wkad w rne zaburzenia motoryczne ob serwowane w chorobie Parkinsona, Nie jest jasne, dlaczego komrki dopaminer-giczne w istocie czarnej ulegaj zniszczeniu. Nie ma dowodu na istotny czynnik genetyczny w chorobie Parkinsona. Po czci uszkodzenia komrek mog odzwierciedla proces starzenia, poniewa istota czarna traci ok. 13% swoich komrek w cigu kadego dziesiciolecia, poczwszy od 25 r. Ocenia si, e objawy choroby Parkinsona pojawiaj si wwczas, kiedy po ziom dopaminy w systemie nigrostriatalnym spadnie o 80%. Zakaenia wirusowe mog powodowa parkinsonizm, ale dzisiaj sdzi si, e jest to przyczyna stosunkowo mao wana. Mn2+ powodowa parkinsonizm u grnikw naraonych na wysokie poziomy tego metalu. Leki (np. rezerpina lub neuroleptyki-antypsy-chotyki) s wanymi przyczynami parkinsoniz-mu, ktry moe si cofn przy zaniechaniu
kuracji. Jak pokazano na ryc. 64-7, rezerpina obnia stenie dopaminy przez hamowanie magazynowania dopaminy w zakoczeniach presynaptycznych, a wiele neuroleptykw blokuje receptor dopaminowy. Niezwyka pochodna aminokwasowa, p-N-inetylaniino-1 .-alanina (BMAA), obecna w nasionach sagowcw, moe powodowa parkinsonizm i moe by odpowiedzialna za czste wystpowanie tej choroby na wyspie Guam, ktrej wielu mieszkacw uywa nasion sagowca jako codzienne go poywienia. BMAA jest wic neurotoksyn. W ostatnich latach szczeglnie zainteresowano si 1-metylo--4-fenylo-1,3,4,6-terrahydropirydyn (MPTP) jako przyczyn ostrego parkinsonizmu u narkomanw stosujcych narkotyki doylnie. Zwizek ten jest produktem ubocznym przy syntezie meperydyny (heroiny ulicznej") i skaa preparaty meperydyny syntetyzowane nielegalnie. MPTP jest zmieniana przez monoami-nooksydaz typu B do jonu l-metylo-4-fenylo--pirydoni o nowego (MPP+), ktry jest waciwym czynnikiem neurotoksycznym. MPP+ jest pobierany przez system wychwytu zwrotnego dopaminy komrek dopaminergicznych istoty czarnej i powoduje ich uszkodzenia. Ze wzgldu na swoj natur wolnego rodnika MPP + moe powodowa uszkodzenia oksydacyjne (p. rozdz. 63). Na dodatek sama dopamina moe by te utleniana do potencjalnie szkodliwych rodnikw. Wiedza zdobyta w badaniach tych neuro-toksyn skania do pytania, jak wiele neurotok-syn moe wspuczestniczy w wywoywaniu choroby Parkinsona. L-Dopa przechodzi przez barier krew-mzg i jest przeksztacana w mzgu w dopamin; to stanowi podstaw terapii substytucyjnej w chorobie Parkinsona Kiedy w latach 60 okazao si, e w parkin-sonizmie poziomy dopaminy w systemie nigrostriatalnym s obnione, rozpocza si nowa era leczenia choroby Parkinsona. Wyrnia si 3 rne sposoby leczenia. Terapia antycholintrgjczna bya gwnym leczeniem zanim nie zdobyto wiedzy dotyczcej niskiego poziomu dopaminy, a do dzi dnia jest stosowana przy leczeniu pewnych pacjentw. Podawanie prekursorw dopaminy przy wraca poziom dopaminy do prawie normal nego. Sama dopamina nie przechodzi przez barie r krew-mzg i wobec tego nie moe by efek tywnie uywana. Lekiem z wyboru jest L-dopa
902 / ROZDZIA 64
(L- 3,4-di hydroksy fenyl o alanina), ktra przechodzi przez barier krew-mzg i nastpnie jest przeksztacana w dopamine przez enzym dopa--dekarboksyaz (zwany take dekarboksylaz aromatycznych aminokwas w; ryc. 64-7). Wikszo podawanej L-dopa jest jednake Hekar-boksylowana w tkankach obwodowych i tylko ok. 1% podanej dawki dochodzi do mzgu. Nie mona stosowa wyszych dawek L-dopa, po niewa powoduj one cikie nudnoci i wymioty. Rozwizaniem jest podawanie L-dopa wraz z karbidop, zwizkiem hamujcym aktywno obwodowej dopadekarboksylazy, ale nie prze chodzcym przez barier krew-mzg i wobec tego nie hamujcym przeksztacenia L-dopa w dopamine w mzgu. Dieta wysoko biakowa dostarcza aminokwasw, ktre wspzawodnicz z L-dopa o wychwyt przez komrki bony luzowej jelita; dieta niskobiakowa osabia ten efekt. L-dopa stal si podstaw leczenia pacjentw z chorob Parkinsona od czasu jej wprowadzenia w latach 60. Obecnie rozpoznanie choroby Parkinsona wymaga wykazania korzystnej odpowiedzi na L-dopa, podczas gdy wielu pacjentw z innymi rodzajami parkin-sonizmu nie bardzo reaguje na ten lek. Jednake po upywie ok. 5 lat efekty L -dopa sabn i konieczna jest terapia alternatywna. 3. Agonici receptora dop amin owego po podaniu naladuj efekty dopaminy (ryc. 64-7). Korzystne efekty uzyskiwano po bromokryp-tynie. Inne leki mog by uyteczne w leczeniu choroby Parkinsona, jeeli wpywaj na metabolizm dopaminy lub wywieraj dziaanie ochronne na tkank nerwow Nasza wiedza o obnieniu poziomu dopaminy oraz o mechanizmie uszkadzania istoty czarnej przez neurotoksyny umoliwia wprowadzenie dalszych lekw do leczenia choroby Parkinsona. Lek przeciw wirusowy amantadyna powoduje uwalnianie dopaminy z presynaptycznych zakocze neuronw dopaminergicznych, zwikszajc w ten sposb stenie neurotrans-mitera w szczelinie synaptycznej (ryc. 64-7). Mazindol hamuje wychwyt dopaminy, w ten sposb rwnie zwikszajc stenie dopaminy przy bonie post synaptycznej. Duym zainteresowaniem cieszy si obecnie deprenil (selegili-na). Jego wczeniejsze podawanie zapobiega rozwijaniu si parkinsonizmu u zwierzt po podaniu MPTP, co sugeruje, e deprenil moe
zniszczenia komrki spowodowane uszkodzeniem oksydacyjnym. Zgodnie z tym, prby kliniczne wykazay, e deprenil opnia wystpowanie inwalidztwa w przebiegu choroby Parkinsona. Deprenil hamuje MAO-B (ryc. 64-7) hamujc w ten sposb degradacj dopaminy i zwikszajc jej stenie. Obecnie prowadzi si prby kliniczne z zastosowaniem leprenilu i witaminy E (a-tokoferolu), uytej jako przeciw-utleniaeza. Chirurgiczne sposoby leczenia choroby Parkinsona obejmuj podawanie zmielonych auto-przesz czepw nadnerczowych do jdra ogoniastego lub skorupy; rdze nadnercza syntetyzuje rne katecholaminy, midzy nimi i dopamin. Bada si rwnie implantacje tkanek podowych, zawierajcych embrionalne komrki nigralne. Skuteczno tych dwch sposobw moe by mniejsza ni na to wskazyway pocztkowe wyniki. Inn metod jest wstrzykiwanie flbro-blastw zmodyfikowanych genetycznie tak, e produkuj due iloci hydroksylazy tyrozyno wej, enzymu regulujcego szybko syjitezy na drodze metabolicznej prowadzcej do dopaminy. ODKADANIE SI BIAKA AMYLOIDOWEGO fi JEST ZWIZANE Z WYSTPOWANIEM PEWNYCH PRZYPADKW CHOROBY ALZHEIMERA Choroba Alzheimera jest nieuleczalnym schorzeniem neuropsychiatrycznym, w ktrym
nastpuje postpujce uszkodzenie funkcji po -
mie dziaanie neuroprotekcyjne, zmniejszajc
znawczych, czemu zwykle towarzysz zaburzenia afektu i zachowania. Okoo 2 mn ludzi w USA cierpi na chorob Alzheimera, a jej czsto wystpowania zapewne bdzie si zwiksza, poniewa coraz wicej ludzi yje duej. Niektre przypadki wydaj si mie przyczyny rodzinne (genetyczne), ale wikszo jest sporadyczna. Choroba Alzheimera jest najczstsz przyczyn otpienia (demencji), ktre mona zdefiniowa jako postpujcy spadek sprawnoci intelektualnej powstay z przyczyn organicznych, ktry w istotny sposb zaburza aktywno osobnicz. Choroba Alzaheimera kadzie si olbrzymim ciarem na rodzin chorego i na system opieki zdrowotnej poniewa, wczeniej czy pniej, wikszo pacjentw nie potrafi zadba o siebie. Koszty ekonomiczne choroby
Azheimera w USA ocenia si na ok. 40 mld dolarw rocznie. Zazwycz aj choroba pojawia si powyej 65 r., aie moe te pojawi si nawet niedugo po czterdziestce. Czas przeycia waha si od 2 do 20 lat. Pierwszym objawem jest czsto utrata pamici. Choroba z reguy posuwa si nieubaganie, w stanach kocowych pacjenci s cakowicie niedoni. Zasadniczy obraz patologiczny wskazuje na proces degeneracyjy charakteryzujcy si utrat komrek w pewnych obszarach mzgu (np. w korze i hipokampie). Na poziomie mikroskopowym probierzem choroby Alzheimera s tarczki amytoidowe otoczone przez komrki nerwowe zawierajce spltki neuroflbrylarne (podwjne helikalne filamenty utworzone z hi-perufo sforylowanych form biaek tau, zwizanych z mikrotubulami). Obecnie prowadzi si intensywne badania, aby ustali przyczyn choroby Alzheimera. W ostatnich czasach, jak si wydaje, dokonano znacznego postpu. Zainteresowanie zogniskowao si zwaszcza na biaku amyloidowym P (ApP), gwnym skadniku tarczek obserwowanych w chorobie Alzheimera. Okrelenie amylnid odnosi si do rnorodnej grupy poza-komrkowych zogw biakowych, spotykanych w rozmaitych chorobach. Biaka amylo-idowe barwi si zazwyczaj jodem na niebiesko, jak skrobia, skd pochodzi ich nazwa (amylo-idowy = skrobiopodobny). Jedna z hipotez (hipoteza kaskady amyloidowej) zakada, e odkadanie si ApP jest powodem zmian patologicznych obserwowanych w mzgach ofiar choroby Alzheimera i e inne zmiany, takie jak spltki neuroflbrylarne i zmiany naczyniowe, maj charakter wtrny. ApP pochodzi z wikszego biaka prekur-sorowego, nazwanego prekursorowym biakiem amytoidowym (APP), ktrego gen jest zlokalizowany na chromosomie 21, niedaleko miejsca, ktre jest dotknite przy zespole Downa (triso-mia 21). Te osoby z zespoem Downa, ktre doywaj 50 lat, czsto cierpi na chorob Alzheimera. APP jest biakiem przezbonowym skadaj cym si z ok. 770 aminokwasw, ApP jest peptydem zoonym z 3942 aminokwasw, powstaym z hydrolitycznego rozcicia przy kocu wglowym APP. Tworzy ono nierozpuszczalne zogi pozakomrkowe. Wydaje si, e APP moe by rozcite przez co najmniej 2 rne proteazy. Pierwsza, nazwana sekre-taz, generuje rozpuszczalny fragment zawie-
693
APP
Ryc. 64-8. Diagram hipotezy kaskady amyloidowej. Prekursorowe biako amyloidu (APP) moe by przeksztacone dwoma rnymi sposobami. W pierwszym bierze udzia sekretaza, ktra wytwarza peptydy nie zawierajce caej czsteczki ApP, rozpuszczalne i nie wytrcajce si, a wic nie produkujce amyloidu. W drugiej drodze uczestniczy endosomalna-lizosomatna proteaza (proteazy?} i zostaje wytworzone biako amyloidowe fj {ApP) lub peptydy je zawierajce. Wytrcaj si one tworzc amyloid Przypuszcza si, e prowadzi to do tworzenia si spltkw neurofibrylarnych i mierci komrki. W modelu tym precypitacja amyloidu wyprzedza tworzenie si spltkw i prowadzi do ich powstawania. (Wedug: Hardy J. A., Higgins G. A.,; Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypothesis; cierce 1992, 256, 184. Co-pyright American Association for the Advan-cement Science, 1992, za zezwoleniem).
rajcy tylko cz ApP (ryc. 64-8). Druga, proteaza lizozomalna, tworzy fragment zawierajcy pen sekwencj ApP. Przypuszcza si, e ten wanie fragment strca si poza komrk i prowadzi do powstania spltkw neurofib-rylarnych i innych histopatologicznych obja ww choroby Alzheimera. Mutacje zakoczenia wglowego APP wykryto u niektrych chorych na chorob Alzheimera (np. w kodonie 693 u pacjentw z dziedziczn, wczenie wystpujc form choroby i w kodonie 717 u pacjentw z rodzinn chorob Alzheimera). Sdzi si, e te mutacje powoduj
904/ ROZDZIA 64
tworzenie si fragmentw zawierajcych Obecnie bada si ich znaczenie; mog one np. chroni fragmenty zawierajce ApP przed niszczeniem proteolitycznym, w ten sposb zwikszajc odkadanie APP. Druga cze hipotezy kaskady amyloidowej dotyczcej przyczyn choroby Alzheimera zakada, e ApP lub fragmenty zawierajce APP s porednio lub bezporednio neurotoksyczne. Istniej dowody, e wystawienie neuronw na dziaanie APP moe podnie ich wewntrzkomrkowe stenie Ca2+. Niektre kinazy biaek, cznie z tymi, ktre powoduj fos-forylacj biaek tau, s regulowane przez poziom Ca2 + . Std wzrost poziomu Ca2+ moe prowadzi do hiperfosforylacji biaek tau i tworzenia sparowanych helikalnych diamentw obecnych w spltkach neurofibrylarnych. Rycina 64-9 przedstawia przypuszczalny schemat moliwej sekwencji zdarze w pewnych przypadkach choroby Alzheimera. Wartoci dobrej hipotezy czsto nie jest to, czy jest ona prawdziwa czy nie, ale czy pobudza do dalszych bada. Wydaje si pewne, e ze
Mutacja (w pewnych przypadkach) genu kodujcego APP, zo kalkowanego na chromosomie 21
Proteoiiza APP. prowadzca do powstani a nieprawidowych fraomentow zawierajcych A/(P
Odkadanie si AjSP lub fragmentw zawierajcych AfiP, prowadzca do zwikszenia zawartoci wewntrz 141 - komrkowego Ca w neuronie
Zwikszone stenie Ca powoduje aktywacje klnaz biaek fosforylujcych biako tau zwizane z mikratubuami, co powoduje tworzenie sparowanych helikalnych wkien wystpujcych w spltkach neufofibrylarnyoh
!+
Ryc. 64-9. Przypuszczalny schemat moliwej sekwencji zdarze zwizanych z powstawaniem pewnych przypadkw choroby Alzheimera. Mutacje w genie kodujcym APP stwierdzono tylko w nie wielkiej liczbie przypadkw. Schemat jest zarysem jednego z obecnych kierunkw bada i ulegnie zmianom w miar napywania dalszych wynikw. Rwnie inne mechanizmy prawdopodobnie s odpowiedzialne za wiele przypadkw. Jednake wiarygodne teorie musz wyjania tworzenie tarczek i spltkw neurofibrylarnych. APP prekur-sorowe biako amyloidu, ApT biako amyloido-we p. (Wedug: Hardy J. A., Higgjns G. A.: Alz-heimer's diseaae: The amyloid cascade hypothesis; Science 1992, 256, 184, za zezwoleniem).
wzgldu na rozpowszechnienie i katastrofalne konsekwencje choroby Alzheimera, hipoteza amyloidowa bdzie poddana intensywnemu sprawdzaniu dowiadczalnemu. Gwnym punktem, ktry wci pozostaje do ustalenia, jest pytanie, czy odkadanie si ApP jest czynnikiem pierwotnym w chorobie Alzheimera, czy jest to zjawisko pochodne w stosunku do innych, na razie nie znanych procesw? Istniej i inne hipotezy na temat przyczyn choroby Alzheimera. Proponowano na przykad, e jest ona powodowana przez zakaenie powolnie dziaajcym wirusem, chocia adnego takiego wirusa nie wyizolowano w sposb powtarzalny. Inny kierunek bada wytyczyo odkrycie, e tarczki u pacjentw cierpicych na chorob Alzheimera czsto wykazuj zwikszone stenie glinu. Proponowano wobec tego, e jedn z przyczyn choroby Alzheimera moe by spoywanie zwikszonych iloci glinu w diecie. Tu znw pojawia si pytanie, czy zwikszony wychwyt glinu do tarczek jest zjawiskiem pierwotnym czy wtrnym, to znaczy czy podniesiony poziom glinu moe wywoywa chorob Alzheimera u pewnych osobnikw, czy te zwikszone iloci ginu w tarczkach odzwierciedlaj jego zwikszone pobieranie przez komrki uszkodzone przez jaki inny proces? Odpowied na to pytanie nie jest jasna. Mzgi pacjentw zmarych na chorob Alzheimera czsto wykazuj obnienie aktywnoci acetylo-transferazy cholinowej i poziomu ace ty locho liny Poziomy innych neurotransmiterw s te czsto obnione. Zmiany te wydaj si by wtrne, powodowane uszkodzeniami komrek, a nie pierwotnymi zdarzeniami inicjujcymi rozwj choroby Alzheimera. Istniej wielkie nadzieje, e badania nad mechanizmami zaangaowanymi w powstawanie choroby Alzheimera doprowadz do opracowania lepszych testw diagnostycznych i skutecznej terapii. Na przykad zwizki, ktre mog hamowa tworzenie A0P lub utrzymywa je w formie rozpuszczalnej mog mie znaczenie terapeutyczne. Obecnie ostateczne, pewne rozpoznanie choroby Alzheimera jest moliwe czsto jedynie na sekcji, po znalezieniu charakterystycznych tarczek w preparatach z mzgu. Jeden z testw, obecnie w fazie opracowywania, opiera si na pomiarze iloci APP w pynie ntzgowo-rdzeniowym (CSF) przy uyciu swoistych przeciwcia monoklon alnych. Donoszono bowiem, e poziomy APP s znacznie nisze (okoo trzykrotnie) w CSF pacjentw z chorob
PODOE BIOCHEMICZNE CHORB NEUROPSYCHIATRYCZNYCH / 9OB
Alzheimera ni u osb zdrowych. Obecnie nie istnieje adna swoista terapia choroby Alzhei mera, chocia w kocu moliwa moe si okaza farmakologiczna modyfikacja odkadania App w tkankach. Wykazano, e w niektrych obszarach mzgu pacjentw z chorob Alzheimera wystpuje niedobr mzgowego czynnika wzrostu nerww. Obecnie bada si, czy nie wywiera on korzystnego wpywu u zwierzt z degeneracjami peuronalnymi wywoanymi chirurgicznie. Obecnie opieka nad chorymi na chorob Alzheimera koncentruje si nad leczeniem moliwych komplikacji zdrowotnych i prawidowym odywianiu. Wan rol odgrywa poradnictwo rodzinne, ale pacjenci najczciej znajduj najlepsze warunki w domach opieki.
PRZYCZYNY SCHIZOFRENII MOG BY ZWIZANE Z CZYNNIKAMI GENETYCZNYMI, ROZWOJOWYMI I DOPAMINERGICZNYMI

Schorzenia schizofreniczne s zaburzeniami umysowymi, zazwyczaj charakteryzujcymi si objawami psychotycznymi, odzwierciedlajcymi zaburzenia mylenia, uczu i zachowania. Istotne jest (p. niej) rozrnienie miedzy objawami pozytywnymi" (np. halucynacje, omamy, zachowania dziwaczne) a negatywnymi" (izolacja spoeczna, stpienie emocji ttp.). Istnieje wiele podtypw schizofrenii, np. zdezorganizowana (hebefreniczna), katatoniczna i paranoi-dalna. Dla prostoty bdziemy uywa terminu schizofrenia mwic o caej grupie schorze. Schizofrenia wystpuje na caym wiecie i dotyka ok. 1% populacji pnocnoamerykaskiej. Rozpoczyna si zazwyczaj ok. 45 r., ale czsto wystpuje u nastolatkw i ma tendencj do przebiegu przewlekego. Stanowi ona powany problem medyczny, czsto z niszczcymi konsekwencjami dla ofiar i ich rodzin; nawet obecnie, kiedy istniej wzgldnie skuteczne metody terapii farmakologicznej, schizofrenicy zajmuj ok. 20% wszystkich ek szpitalnych. Przyczyna lub przyczyny schizofrenii s nieznane. Postulowano rne czynniki psychologiczne, spoeczne, rozwojowe, rodowiskowe, anatomiczne, genetyczne, biochemiczne i inne. Rozwaymy tutaj, dlaczego tak trudno jest okreli podstawy genetyczne schizofrenii, wskaemy na strukturalne anomalie mzgu schizofreni-kw, ktre trzeba bra pod uwag, i przedyskutujemy teori dopaminow schizofrenii.
Badania sprzenia genetycznego w schizofrenii s trudne z powodu braku powtarzalnoci wynikw Rnorodne podejcia (np, wywiady rodzinne, analiza pokrewiestwa, badania nad adop towanymi oraz nad blinitami mono- i dizygo-tycznymt) wskazuj na istotny czynnik genetyczny w schizofrenii. Na przykad u dzieci, ktrych oboje rodzice byli schizofrenikami, istnieje 39% prawdopodobiestwa zapadnicia na t chorob. Zgodno miedzy blinitami homozygotycznymi wynosi 47%. Jednake badania te nie odpowiedziay na pytanie, czy schizofrenia jest chorob monogeniczn, poli-geniczn czy wieloczynnikow. Jeeli prawdziwa jest jedna z dwch ostatnich moliwoci, szukanie genetycznych podstaw schizofrenii bdzie oczywicie bardziej zoone. Wysiki zmierzajce do okrelenia sprzenia genw prawdopodobnie zaangaowanych w schizofrenii z okrelonym chromosomem doprowadziy do sprzecznych wynikw. Doniesienie o obecnoci miejsca podatnoci" na schizofreni nie zastao potwierdzone w innych badaniach. Sprzeczne wyniki przyniosy take badania sprze genetycznych innych wanych schorze psychicznych (np. choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa). Niektre moliwe wyjanienia tego stanu rzeczy podaje tab. 64 -7.
Tabela 64-7. Niektre powody trudnoci w lokalizacji genw odpowiedzialnych za schizofreni (wikszo' punktw odnosi si rwnie do innych schorze psychiatrycznych, takich jak choroba afektywna jedno- i dwubiegunowa)* Schizofrenia moe mie kilka przyczyn genetycznych (heterogenno genetyczna) Dla zwikszenia efektywnoci analizy sprze potrzebne s due, wielopokoleniowe rodziny Rozmycie kryteriw diagnostycznych w rnych krajach powoduje, m.in., faszywe diagnozowanie krewnych Stosowanie nieodpowiedniej metodyki statystycznej (np. niewaciwe stosowanie punktw Lod) Uywanie do analizy biochemicznej {np, na dopa-min) prbek pobieranych pomiertnie, zachowanych w rnym stopniu Wczeniejsze leczenia (np. neuroleptykami) moe zmieni profil biochemiczny analizowanych prbek mzgu * Wedug: Barnes D.M.: Troubles encountered in gene linkage land; Science 1989, 243, 313
906 / ROZDZIA 64
Fakt, e choroba pojawia si w rodzinie, nie musi koniecznie oznacza, e ma ona podoe genetyczne. Na przykad za interakcja psychologiczna midzy czonkami rodziny moe doprowadzi do wytworzenia anormalnych wzorcw zachowania. Najlepszym rozwizaniem tych problemw przez analiz sprzeniow jest znalezienie i dogbne przeanalizowanie duych rodzin wielopokoleniowych, u ktrych wystpuje wsplny defekt genetyczny i podobne objawy. W przypadku schizofrenii, dopki nie ustali si jasnych sprze, prawdopodobnie wybierze si do bada i przeanalizuje wiele genw-kandyda-tw (np. kodujcych receptory dopaminowe i enzymy uczestniczce w metabolizmie kate-cholamin), w poszukiwaniu mutacji mogcych odgrywa rol w tej chorobie. W mzgu schizofrenikw mona wykaza anomalie strukturalne prawdopodobnie o naturze rozwojowej Anomalie strukturalne w rodkowym pacie czoowym (zawj przyhipokampalny, hipo-k amp i ciao migdaowate) zaobserwowano w mzgach wielu schizofrenikw. Obszary te s zaangaowane w scalanie i obrbk informacji pyncych z kory asocjacyjnej. Tak na przykad wystpowanie zmienionej orientacji komrek piramidalnych hipokampa moe odzwierciedla wadliwy wzorzec migracji neuronw. Prawdopodobnie obserwowane zjawisko jest wynikiem anomalii genetycznej, ktra dotyczy czsteczek biorcych udzia w migracji lub adhezji komrek. Z kolei zmieniona orientacja komrek moe, jako efekt wtrny, zaburza rne parametry neurochemigne. Przypuszczenie, e mzgi wielu schizofrenikw wykazuj anomalie strukturalne podkrela fakt czstego wystpowania powikszenia komr, chocia stopie tego powikszenia czsto nie jest na tyle znaczny, aby stanowi cech diagnostyczn. Hipoteza dopaminowa schizofrenii zostaa zmodyfikowana na podstawie nowych obserwacji Na brak biochemicznych teorii schizofrenii nie mona si uskara. W rnych okresach za zwizki zaangaowane w etiologii schizofrenii uwaano acetylocholin, kwas y-aminomaso-wy (GABA), noradrenalin, opioidy, peptydy i inne molekuy. Jednake w cigu ostatnich 30 lat najwicej uwagi powicono dopaminie. Byo to uwarunkowane sukcesem wprowadzenia lekw neuroleptycznych (antypsychotykw) we
wczesnych latach 50. do leczenia rnych psychoz, w tym schizofrenii. Zaobserwowano wwczas, e wielu schizofrenikw leczonych neuroleptykami zapada na parkinsonizm. To sugerowao, e neuroleptyki dziaaj obniajc poziom dopaminy (p. omwienie choroby Parkin-sona). Obserwacj t i inne odkrycia potwierdzajce udzia dopaminy w schizofrenii podsumowuje tab. 64-8. Oryginalna hipoteza doTabela 64-8. Obserwacje popierajce dopamino-w hipotez schizofrenii* Leki neuroieptyczne (antypsychotyki) cz sto wywouj parkinsonizm, co sugeruje, e obniaj poziom dopaminy Pierwotnym dziaaniem neuroleptykw zdaje si by obnienie aktywnoci dopaminowej w mezo-limbicznych neuronach dopaminowych Liczne inne leki {np. L-dopa, amfetamina) wpywajce na metaboli2im dopaminy (dopaminomimety-ki) wywouj oznaki i objawy schizofrenii Przewleke podawanie neuroleptykw prowadzi do spadku poziomu kwasu homowanilinowegow pynie mzgowo-rdzeniowym, co oglnie jest skorelowane z pozytywn odpowiedzi na leczenie Sia dziaania antypsychotycznego wikszoci neuroleptykw jest skorelowana z si ich wizania do receptorw D2 Analiza prbek pobranych pomiertnie i uycie przyyciowe tomografii komputerowej wskazuje, e gsto receptorw D2 w mzgu schizofrenikw jest podniesiona Objawy negatywne schizofrenii mog by wiza-ne z nisk aktywnoci dopaminowa w korze przedczotowej * Wedug: Seeman P.; Dopamine receptors and the dopamine hypothests of schizophrenia; Synaps 19877, 1:133 i Davis K.L i wsp.: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualization; Am. J. Psychiatr. 1991, 148:144
paminowa schizofrenii postulowaa, e schizofrenia jest objawem hiperdopamtnergii, gdy, przez porwnanie, choroba Parkinsona jest objawem hipodopaminergii. Obserwacje biochemiczne dotyczce roli dopaminy w schizofrenii mona oglnie podzieli na trzy kategorie. Pomiary iloci dopaminy w prbkach mz gu. Wielu badaczy donioso o wzrostach, ale obserwowano znaczny rozrzut wynikw. Pomiary metabolitw dopaminy w mzgu i pynach ustrojowych. Szczegln uwag zwra-
cano na kwas homowanilinowy, gwny metabolit dopaminy u czowieka. Zwikszenie stenia tego metabolitu obserwowano w pynie mz gowo-rdzeniowym pacjentw cierpicych na schizofreni, a jego ilo zmniejszaa si gdy pacjent reagowa na terapi lekami. Tu jednak rwnie obserwowano znaczny rozrzut wynikw. Najbardziej staym wynikiem bya obserwacja, e ilo receptorw D2 (p. niej) wydaje si by zwikszona w mzgu schizofrenikw, zwaszcza u tych, ktrzy jeszcze nie byli traktowani lekami. Co wicej, badania wykazay, e sia dziaania antjpsychotycznego wikszoci gwnych neuroleptykw jest skorelowana z ich zdolnoD2. Powodami rozrzutw omwionych wyej wynikw moe po czci by uywanie tkanek pobranych pomiertnie oraz fakt, e wikszo schizofrenikw jest leczonych neuroleptykami, ktre same przez si (tzn. niezalenie od schizofrenii) mog zmienia poziom rnych receptorw j enzymw w mzgu. Wyniki uzyskane z receptorami D2 zogniskoway zainteresowanie na receptorach dopaminowych. Gwnie dziki klonowaniu genw wyrniono do dzi 5 klas tych receptorw {tab. 64-9). Wszystkie one s biakami przezbono-wymi, co najmniej niektre s glikoproteinami i wikszo z nich jest zwizana z biakami G. Receptory D2, D3 i D4 wydaj si by wzajemnie podobne. Poza znaczeniem receptora D2 omwionym powyej, najciekawszym odkryciem byo, e receptor D4 wykazuje 5 polimor-ficznych wariantw. Jest to pierwszy z rodziny receptorw katecholaminowych, ktry wykaza zmienno polimorficzn w populacji ludzkiej. Gwnym pytaniem jest, czy moe istnie korelacja midzy jednym z tych wariantw a podatnoci na schizofreni lub na dziaanie lekw? Ju obecnie wiadomo, e nietypowy neurolep-tyk klozapina (ktra nie powoduje parkinsoniz-mu ani pnych dyskinez, powanych niepodanych elektw ubocznych wikszoci neuroleptykw) wykazuje dziesiciokrotnie wiksze powinowactwo do receptora D4 ni do D2. Ze wzgldu na pewne niespjnoci wynikw omwionych powyej, oryginalna hipoteza do-paminowa zostaa przeformuowana tak, e postuluje ona nieprawidow, cho niekoniecznie nadmiern aktywno dopaminergiczn w schizofrenii. W niektrych obszarach mzgu aktywno dopaminergiczna moe by wysoka,
ci do rywalizacji z dopamin in vitro o receptory 3. Pomiary receptorw dopaminowych (D).
Tabela 64-9. Niektre waciwoci receptorw dopaminowych. Czsto donosi si o nowych receptorach, izolowanych z uyciem odpowiednich sond i bibliotek genomowych lub cDNA* Istnieje co najmniej 5 rnych wikszych klas (D1-D5),z pod typami tworzonymi przez alternatywne rozcicia S to biaka bonowe; przynajmniej niektre z nich s glikozyiowane Wikszo ma 7 domen przezbonowych i ptle w cytoplazmie Wikszo jest sprzonych z biakami G Niektre s pozytywnie sprzone z cyklaza. adeny-lanow (np. Dl), co najmni ej jeden (D2) jest sprzony negatywnie Co najmniej jeden podtyp. (wywodzcy si z receptora Dl) jest sprzony Fiosfolipaz C Przynajmniej niektre podtypy s regulowane w drodze fosforylacji Dla wielu neuroleptykw sia ich powinowactwa do receptora D2 odpowiada ich sile w leczeniu schizofrenii Rne receptory wykazuj odmienne rozmieszczenie anatomiczne Receptor D4 wie nietypowy neuroleptyk kiozapi-n z powinowactwem 10 razy wikszym niz receptor D2 Odkryto 5 rnych podtypw receptora D4. Jest to pierwszy przedstawiciel rodziny receptorw katecholaminowych wykazujcy zmienno polimorficzn w populacji ludzkiej * Wedug: Strange P.G.: Interesting times for dopaminereceptors; TrendsNeurosci. 1991,14: 43 i iversen L: Which D4 do you have? Natur 1992, 358, 109
a w innych niska. Pogld ten podtrzymuj obserwacje, e w korze przedczoowej schizofrenikw mona obserwowa obnion aktywno dopaminergiczn, prawdopodobnie skorelowan z negatywnymi objawami tego schorzenia. Inne badania wykazuj, e jeli neurony dopaminowe kory przedczoowej w warunkach fizjologicznych normalnie hamuj aktywno podkorowych neuronw dopaminowych, ob nienie poziomu dopaminy w korze przedczoowej moe doprowadzi do zwikszenia aktywnoci podkorowych neuronw dopaminowych. Naley rwnie pamita, e inne neurotrans-mitery mog take odgrywa rol w schizofrenii, albo same przez si, albo przez interakcj z systemem dopaminergicznym.
908 / ROZDZIA 64
Powysza dyskusja ilustruje fakt, e biochemia schizofrenii jest zoona. Wykazanie ewidentnych mutacji grajcych rol przyczynow w schizofrenii jeeli takie istniej pomogoby wyjani role swoistych biaek (np, receptorw, enzymw) w powstaniu i przebiegu tej choroby.
PODSUMOWANIE
Receptory acetylocholinowe w zczu mi-niowo-nerwowym s kanaami jonowymi regulowanymi (bramkowanymi) przez neurotrans-miter. W miastenii tworz si autoprzeciwciaa przeciw tym receptorom i niszcz wieie z nich. Objawia si to epizodycznymi napadami saboci miniowej. Leki hamujce esteraz cholino-w s skuteczne, ale czsto trzeba zahamowa nieprawidow aktywno immunologiczn stosujc odpowiednie rodki. Gen choroby Huntingtona jest umieszczony na krtkim ramieniu chromosomu 4, ale natura kodowanego przeze produktu nie zostaa jeszcze wyjaniona. Jednake, uywajc odpowiednich sond, mona przewidzie, u ktrych czonkw rodzin, w ktrych wystpuje ta przypado, rozwinie si plsawica. Badania mechanizmu uszkodze i mierci komrkowej w chorobie Huntingtona i udarze mzgu wykazay, e jednym z gwnych czynnikw jest pobudzenie receptorw glutaminia-nowych typu NMDA. Wyjanienie tego i in nych mechanizmw uszkodzenia komrek mzgowych powinno doprowadzi do postpu w leczeniu tych schorze neuropsychiatrycznych, ktrych cech s uszkodzenia komr kowe. Poznano ju sekwencj ludzkiego mtDNA i wiadomo, e jest on odpowiedzialny za kodowanie mitochondrialnych rybosomalnych RNA, mitochondrialnych transferowych RNA i za kodowanie 13 peptydw acucha oddechowego. Opisano rne delecje, multiplikacje i mutacje punktowe mtDNA i wykazano, e powoduj one rne mi opatie i choroby neurologiczne. Choroby mitochondrialne s dziedziczone po matce. Nowe mutacje, polegajce na powtrzeniach obejmujcych trypiety bogate w CG, s przyczyn zespou amliwego chromosomu X, at-rofii rdzeniowo -opuszkowej i dystrofii mio-tonicznej. Uycie technik wykrywajcych takie mutacje uatwi rozpoznawanie tych i pokrewnych schorze. Choroba Parkinsona jest powodowana przez degeneracj komrek istoty czarnej, co powo duje niedobr dopaminy w ukadzie nigro-striatalnym. Skutecznym lekiem jest L-dopa. Korzystnymi wydaj si rwnie leki takie, jak deprenil, ktre maj dziaanie neuroprotekeyj-ne. Tarczki amyloidowe i spltki neuro fibry larne
ZNANE S JU TECHNIKI, ZA POMOC KTRYCH MONA WYJANI PODSTAWY MOLEKULARNE WIELU SCHORZE NEUROPSYCHIATRYCZNYCH
Zastosowanie technologii rekombinowanego DNA umoliwio ustalenie podoa molekularnego kadej choroby o podou genetycznym. Badania nad mukowiscydoz wykazay, e mona z powodzeniem przeszukiwa stosunkowo wielkie obszary DNA, by znale nieprawidowe geny. Prawdopodobnie w tym dziesicioleciu uda sie okreli podstaw molekularn wikszoci schorze neuropsychiatrycznych pochodzenia genetycznego. Ju obecnie poczyniono znaczne postpy co do chorb nie dyskutowanych w tym rozdziale. Wykazano na przykad, e mutacje genu kodujcego rodopsyn s przyczyn barwnikowego zapalenia siatkwki (reti-nitis pigmemosa), stosunkowo czstej choroby powodujcej lepot, a bada si obecnie wiele innych genw podejrzewanych o wywoywanie chorb okulistycznych (np. gen kodujcy biako wice GTP, transducyn, gen kodujcy fosfodiesteraz cGMP oraz peryferyn biako uwaane za konieczne^dja zachowania ksztatu zewntrznego segmentu bon tarczowych prcikw i czopkw). Rozpoczyna si terapia genetyczna chorb neurologicznych. W przypadku guzw mzgu proponuje si wstrzykiwanie do nieoperowal-nych guzw, przy uyciu aparatw stereotak -tycznych pod kontrol MRI (obrazowania przy uyciu rezonansu magnetycznego), fibroblas-tw mysich zawierajcych wektor retrowirusa zawierajcy gen kodujcy kinaz tytnidynow z wirusa opryszczki. Ten retrowirus miaby zaatakowa komrki ssiadujce z guzem, wprowadzi do nich gen kinazy tymidynowej i w ten sposb uczyni te komrki guzowe wraliwymi na lek przeciwwirusowy, gancyk-lowir, ktry nie wpywa na komrki zdrowe. Tego rodzaju podejcie zostao nazwane chirurgi molekularn".
s zasadniczymi cechami choroby Alzheimera. Hipoteza kaskady amyloidowej zakada, e odkadanie biaka amyloidowego % pochodzcego z biaka prekursorowego amyloidu, jest procesem zapocztkowujcym chorob, i e biako amyloidowe | lub jego fragmenty maj waciwoci neurotoksyczne, prowadzce do powstawania spltkw neurofilamentw i in nych objaww. U niektrych pacjentw z chorob Alzheimera wykryto mutacje genw kodujcych biako prekursorowe amyloidu. Potrzebne s jednak dalsze dowody, aby oceni poprawno tej hipotezy. Wprowadzenie lekw neuroleptycznych do Jczenia psychoz doprowadzio do zdobycia dowodw wskazujcych na rol dopaminy w powodowaniu schizofrenii. Liczne informacje popieraj ten pogld, ale dopaminowa hipoteza schizofrenii pozostaje na razie nie dowiedziona. Klonowanie receptorw dopaminowych doprowadzio do wykrycia 5 klas receptorw, wrd ktrych podtyp EW ma wiele odmian polimorficznych.
PIMIENNICTWO
Barnes DM: Troubles encountered in gene linkage land. Science 1989;243:313. [Dyskusja problemu trudnoci powt rzenia danych uzyskanych w pracach na temat sprzenia genetycznego 4 rnych chorb psychicz nych.] Cooper JR, Bioom FE, Roth RH. The Biochemkal Basis of Neuropharrwcoogy, 6th ed. Oxford Univ Press, 1991. Culver KW et ai: In vivo gene transfer wiih retroviral--producer oells for treatment of experimental brain tumors. Science 1992; 256:1550. Davis KL et al: Dopamine in schizophrenia: A review and reconceptualizauon. Am J Psychiatr 1991;]4ffcl474, Ganong WF: Review of Medkai Physiology, 15th ed. Apleton & Lange, 199J. Goldman HH (editor): Reviev of Genera Psychiatry, 3rd ed. Appleton & Lange, 1992. Goldstein M, Deutch AY: Dopaminergjc mechanisms in
the pathogenesis of schizophrenia. Fed Am Soc Exp BiolJ 1992;6:24f3. Gusella JF: Huntington's disease. Chapter 3 in: Advances in Human Genetks, Vol 20. Harris H, Hirschhorn K (edttors). Plenum Press, 1991. Hardy JA, Higgjns GA: Alzheimer's disease: The amyloid cascade hypothes. Science 1992; 25&184. Hoffinan M: Unraveliing the genetics of fragHe X syndrome. Science J991;252:100. Horn JP: The heroic age of neurophysiology. Hosp Pract (My) 1992;27:65. [Pierws zy z serii 6 artykuw na temat podstaw fizjologicznych zaburze przekaznict wa nerwowo- miniowego.] Humphries P, Kenna P, Farear GJ: On the molecular genetics of retinitis pigmeniosa. Science 1992:256:804, Iversen L; Which D4 do you have? Natur 1992;3Sa-!09. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM: Prmcipes ofNeural Science, 3rd ed. Elsevier, 1991. Kapan HI, Sadock BJ êditors): Comprehensive Textbook of Psychiatry. 5thM. Vol 1. Wiltiams & Wilkins, 1989. Levitan IB, Kaczmarek LK: The Neuron: Celt and Mokcular Biohgy. Oxford Univ Press, 1991. Marun J B: Molecular genetic studies in the neuro psychiatric disorders. Trends Neurosci 1989;113O. Marx J: Alzheimer's debat boils over. Science 1992;257:1336. Peariman AL, Collins RC: Neurobioogy of Disease. Oxford Univ Press, 1990. Roberts L: Huntington's gene: So near, yet so far. Science 1990;247:24. Seeman P: Dopamine receptors and the dopamine hypolhesis of schizophienia. Synaps 1987;1:133. Stone R: Molecular surgery" for brain tumors. Science 1992^56:1513. Strauge PG: Interesting times for dopamine receptors. Trends Neurosci 1991; 14:43. Sweeney PJ: New concepts in Parkinson's disease. Hosp Pract (Aprit) 1991:26:84. Van T ol HM et al: Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population. Natur 1992^58:149. Wallace DC: Mitochoudrial DNA mutations and neuiomuscular disease. Trends Genet 1989;5S. Wright AF: New insighfs into genetic cye disease. Trends Genet 1992;&85. Zivi n J A, C hoi DW: Stroke therapy. Sci Am (My) 1991:265:56.
Dodatek1
SKADNIKI CHEMICZNE KRWI I PYNW USTROJOWYCH Znaczenie wartoci liczbowych dla wyraenia wynikw bada laboratoryjnych Wynik wydany przez laboratorium kliniczne, po oznaczeniu stenia lub iloci substancji w okrelonym materiale, jest wartoci najlepsz, moliw do uzyskania przy uyciu okrelonej metody oraz okrelonych odczynnikw i przyrzdw, przez personel techniczny obeznany z obrbk materiahi biologicznego. Dokadno okrela stopie zgodnoci wyni ku otrzymanego z wartoci prawdziw (z wia domym steniem w prbce kontrolnej). Precy zja okrela powtarzalno wyniku analitycz nego i wyraa si rozrzutem wielu wynikw pomiarw otrzymanych w tej samej prbce (w tym samym materiale i t sam metod). Wiary godno jest miar zgodnoci dokadnoci i pre cyzji. ^ Precyzja nie ma charakteru absolutnego, lecz podlega wahaniom, uwarunkowanym zoonoci uytej metody analitycznej, stabilnoci odczynnikw, dokadnoci sporzdzania pierwotnego wzorca, zoonoci aparatury oraz wpraw personelu technicznego. Kade laboratorium powinno zbiera dane dotyczce precyzji (powtarzalnoci), nadajce si do opracowania statystycznego, tj, do obliczania odchylenia standardowego (SD) od redniej, uzyskanej przy powtarzanym oznaczaniu tego samego parametru w tej samej prbce materiau i t sam metod, np. precyzja oznaczania stenia cholesterolu w dobrym laboratorium powinna
* Reprodukcja z: Krupp M.A., Schroeder S.A., Ticrney L.M. Jr: Current Medical Diagnosis and Treatment. Appieton and latige, 1987.
wynosi: warto rednia 0,1293 mmol/l ( 5 mg/dl). 95% granice ufnoci wynosz + 2 SD lub 0,2586 mmol/l (10 mg/dl). Tak wic kad warto naley uwaa za dokadn", jeii wahanie nie przekracza 0,5172 mmol/l ( = 20 mg/dl). Jeeli wynik oznaczenia stenia cholesterolu brzmi 5,17 mmol/l ( = 200 mg/dl), to warto prawdziwa ley midzy 4,91 mmol/l ( = 190 mg/dl) a 5,43 mmol/l (=210 mg/dl). Przy oznaczaniu stenia potasu w surowicy z wariancj 1 SD wynoszc 0,1 mmol/l, wyniki oznacze uzyskane dla tej samej prbki mog si rni o 0,2 mmol/l. Jeeli rednie stenie potasu w danej prbce wynosio 5,5 mmol/l, wartoci mog si waha od 5,3 mmoJ/1 do 5,7 mmol/l. Oznacza to, e jeli wynik wynosi 5,3 mmol/l lub 5,7 mmol/l, to mieci si jeszcze w granicach precyzji metody. Laboratorium powinno dostarczy lekarzowi wartoci zmiennoci dla okrelonego oznaczenia. Pozwalaj one okreli, czy wynik podany rni si znamiennie od drugiego wyniku uzyskanego u tego samego chorego. Interpretacja testw laboratoryjnych Jako wartoci prawidowe okrela si takie, ktre mieszcz si w granicach dwch odchyle standardowych od wartoci redniej ustalonej dla normalnej" populacji. Ten zakres normy obejmuje 95% populacji. Warto prawidowa" zaley od wielu czynnikw. Oznacza to, e wiele czynnikw moe by przyczyn rnych zakresw normy". Ten fakt sprawia, e wartoci mieszczce si w granicach normy w danych warunkach, mog znajdowa si poza granica mi ufnoci 95%, okrelonymi w innych warunkach. Wrd tych czynnikw wymieni naley: wiek,
ras, rodowisko zewntrzne, pozycje ciaa, rytmy dzienno-nocne lub inne zmiany cykliczne, czas jaki upyn po ostatnim posiku (stan na
DODAT EK / 911
Wartoci normalne" lub referencyjne" za lene s od metody oznaczania danego parametru, pracowni. wykonujcej badanie oraz od warunkw pobierania i przechowywania mate-riahi biologicznego przeznaczonego do bada. Zakresy wartoci prawidowych powinny by jasno podane przez poszczeglne laboratoria. Jest to niezbdne dfa prawidowej interpretacji wynikw bada laboratoryjnych. Interpretacj wyniku naley zawsze prze prowadzi w kontekcie ze stanem chorego, np. mae stenie moe by spowodowane niedoborem danej substancji, lub te jej rozcieczeniem (np. mae stenie sodu). Nieprawidowe stenie okrelonej substancji we krwi moe by spowodowane chorob lub podaniem leku. I tak np. podwyszone stenie kwasu moczowego w surowicy moe by spowodowane dn, lecz moe by rwnie wynikiem stosowania hydrochlorotiazydu, lub lekw przeciwnowo-tworowych. Poleca si czytelnikowi zaznajomienie si z list lekw wpywajcych na wynik testw chemicznych. Na wynik testu chemicznego ma wpyw sposb pobierania materiau biologicznego. Wrd przyczyn bdnych wynikw wymieni naley: niedokadne zbieranie dobowego moczu, zmiany stenia okrelonej substancji w przypadkowo zebranych prbkach moczu, hemoliz krwi, dodanie do krwi niewaciwego anty koagulantu lub uycie brudnego szka lub zanieczyszczonej aparatury. Uwaga. W razie otrzymania nieprawidowego wyniku, najpierw naley wykluczy wszystkie moliwe rda bdu mogce warunkowa taki wynik, a dopiero potem przystpi do leczenia opartego na prawidowej interpretacji danej aberracji biochemicznej. Medycyna laboratoryjna jest oddzieln specjalnoci. Naley zasign porady specjalistw tej dziedziny, jeli wynik badania biochemicznego jest albo niezwyky albo wtpliwy. Wpyw posikw i pozycji ciaa n a stenia skadnikw krwi. Posiki. Wikszo wartoci normalnych" ustalono dla prbek pobranych na czczo, tj. 812 godzin po ostatnim posiku. Zezwala si jednak na picie wody z kilkoma wyjtkami. Wyniki kilku testw chemicznych ulegaj zmianie, je li krew pobrano 3 4 godziny po
czczo lub po posiku), rodzaj spoytych pokar mw, leki oraz nasilenie wykonanego wysiku fizycznego.
niadaniu (w porwnaniu z wynikami uzys kanymi na czczo*). Jeeli krew pobrano 3-4 godziny po obiedzie, wzrasta prawdopodobiestwo uzyskania wynikw odbiegajcych od tych, jakie otrzymano w prbkach pobranych na czczo, np. aktywno AspAT moe by wysza o 31%, za dehydrogenazy mkczanowej mniejsza o 5%; mniejsze odchylenia dotycz innych skadnikw krwi. Celem otrzymania wartociowych wynikw oznaczenia triglicery-dw w surowicy zachodzi konieczno wstrzymania si od pokarmw przez 1014 godzin przed pobraniem krwi do bada. Pozycja ciaa. U osoby przebywajcej w pozycji lecej przez kilka godzin objto krcego osocza jest o 1215% wysza ni u osoby chodzcej lub stojcej przez okoo godzin. Z faktu tego^wynika, e wyniki oznacze biochemicznych wykonanych we krwi pobranej u osb lecych przez okoo godzin s okoo 10% nisze ni u osb chodzcych. Porednie wyniki uzyskuje si, jeli krew pobrano od osb siedzcych. Wano testw laboratoryjnych* Warto kliniczna testu biochemicznego zaley od jego swoistoci i czuoci oraz od czstoci wystpowania choroby w populacji, w ktrej jest ten test wykonywany. Czuo okrela czsto wystpowania dodatnich wynikw danego testu u wszystkich osb chorujcych na t sam chorob. Test na fenylo-ketonuri jest wysoce czuy, poniewa wypada on dodatnio u wszystkich chorych dotknitych tym defektem (100% czuo). W odrnieniu od testu na fenyloketonuri oznaczanie antygenu rakowo-podowego (CEA) wykazuje ma czuo, wypada ono bowiem dodatnio tylko u 72% chorych z zaawansowanym rakiem jelita grubego, za zaledwie u 20% chorych z rakiem okrnicy we wczesnym stadium. Czuo testw we wczesnych stadiach rnych chorb jest na og mniejsza ni w stadiach, kiedy choroba jest ju w peni rozwinita.
* Ten akapit jest skrcon wersj artykuu napisa nego przez Krieg A.F., Gambino R., Galen R.S.: Why are dinical laboratory tests perfonned? When are they valid. JAMA 1975, 233, 76. Przedruk z Journal of the American Medical Association. Copyright 1975. American Medical Association. Patrz rwnie: Galen R.S., Gambino S.R.: Beyond Normality: The Predic-tive Value and Efficiency of Medical Diagnosis, Wiley, 1975.
912 / DODATEK
Swoisto oznacza odsetek ujemnych wynikw okrelonego testu wrd populacji nie cierpicej na okrelon chorob. I tak np. test na fenyloketonuri jest wysoce swoisty, bowiem a 99,9% zdrowych osb wykazuje wynik ujemny. W odrnieniu od tego testu test na CEA (w celu wykrycia raka okrnicy) wykazuje zmienn swoisto, mianowicie 3% osb niepalcych wykazuje faszywie dodatni wynik (swoisto testu wynosi 97%), podczas gdy a u 20% palaczy stwierdza si faszywie dodatni test (swoisto testu wynosi wic tylko 80%). Innym przykadem zmiany swoistoci testu indukowanej lekami lub ci jest wystpowanie podwyszonego stenia tyroksyny cakowitej w surowicy (podobnego do wystpujcego w nadczyn-noci tarczycy) u kobiet ciarnych lub zaywajcych doustne leki antykoncepcyjne, pomimo obecnoci eutyreozy. U takich chorych swoisto tego testu jest bardzo niska, w porwnaniu do swoistoci tego samego testu dla populacji kobiet nieciarnych lub nie zaywajcych doustnych lek w antykoncepcyjnych. Warto przepowiadajca dodatniego testu okrela odsetek prawdziwie dodatnich wyni kw w stosunku do sumy prawdziwie dodatnich wynikw i faszywie dodatnich wynikw (inaczej mwic warto ta okrela prawdopodo biestwo wystpowania choroby, jeli test wypada dodatnio) patrz niej wzr. Warto ta jest cile zwizana z czstoci wystpowania choroby. W grupie chorych przebywajcych na oddziale urologicznym czsto wystpowania choroby nerek jest wiksza ni w oglnej populacji, przez co stenie kreatyniny w surowicy bdzie miao wiksz warto przepowiadajc dla wymienionej grupy chorych ni dla oglnej populacji. Definicje wyraono wzorami:
Wyniki prawdziwie dodatnie 'Wyniki faszywie ujemne e+ Wyniki faszywie dodatnie Warto przepowiadajca Wyniki prawdziwie dodatnie Wyniki prawdziwie dodatnie Wyniki faszywia dodatnie
informacja uyteczna" naley rozumie, e wynik testu ma wpyw na rozpoznanie, rokowanie lub leczenie, przyczynia si do lepszego zrozumienia procesu chorobowego oraz chory odnosi inn korzy z wykonania takiego testu. Jednostki Sl {ukad midzynarodowych jednostek Systeme International d'Unites) Midzynarodowa organizacja, okrelona ja* ko Oglna Konferencja Wag i Miar" (Genera Conference of Weights and Measures) opracowaa swoisty system miar. Adaptacj tego ukadu zalecia, tytuem prby, Komisja Iloci i Jednostek" (Commission on Quantities and Units), bdca Sekcj Chemii Klinicznej Midzynarodowej Unii Chemii Teoretycznej i Stosowanej (Section on Clinical Chemistry, International Union of Pure and Applied Chemistry). Jednostki SI uywane s w kilku krajach Europy i naley si liczy z cakowitym przechodzeniem na ten ukad, jeli okae si, e jest uyteczny w rozumieniu mechanizmw fizjologicznych. Dla uytku klinicznego wybrano 8 miereal-nych wasnoci materii. S nimi: dugo jednostk dugoci jest metr (m), masa jednostk masy jest kilogram (kg), ilo substancji jednostk iloci substancji jest mol (mol), czas jednostk czasu jest sekunda (s), temperatura jednostk temperatury jest Kelvin (K), natenie prdu elektrycznego jednostk jest amper (A), natenie wiata jednostk wiata jest kandela (cd), aktywno enzymatyczna jednostk aktywnoci jest katal (kat) (w nawiasach podano autoryzowane skr ty dla podanych jednostek). Pochodnymi wymieni o nych* wasnoci s: stenie masy: kilogram/1 (kg/l), uamek (frakcja) masy: kilogram/kilogram (kg/kg), uamek (frakcja) objtoci: litr/litr (1/1), objto: metr szecienny (m3 ), dla potrzeb klinicznych jednostk objtoci jest litr (1), stenie substancji: mol/litr (mol/l), molalno: mol/kilogram (mol/kg), uamek (frakcja) mola: mol/mol (mol/mol), cinienie: paskal (Pa) = niuton/m2
Przed zleceniem wykonania testu naley si zastanowi, czy jego czuo, swoisto oraz warto przepowiadajca s wystarczajce, by dostarczy uytecznej informacji. Pod pojciem
DODATEK / 913
Nazwy i symbole dla wielokrotnoci liczby 10: Liczba Nazwa 10" tera 9 giga 10 mega I O6 IO3 kilo hekto IO2 10' 1 deka io- decy 10"2 centy 10"3 mili io-6 mikro io- nano piko femto 10" atto Symbol T G
Vi
k h da d
m
u n P f
Okrelenie na", na przykad na sekund", pisze si czsto uywajc ujemnego wykadnika. Tak wiec zamiast na sekund" pisze si 8 1, zamiast na metr kwadratowy" mr1, zamiast na kilogram" kg"1. Przykad: cm/s = cm s~1; g/m2 = g m~ 2 itd. Przewidujc, e ukad SI zostanie zaakceptowany w USA w nastpnych kilku latach, w dalszej czci niniejszego rozdziau wartoci prawidowe dla poszczeglnych parametrw podSno zarwno w jednostkach ukadu SI, jak i tradycyjnych (w nawiasach). Wartoci normalne dla rutynowo oznaczonych parametrw biochemicznych* Czytelnik powinien zasign konsultacji szpitalnego laboratorium biochemicznego, celem uzyskania informacji dotyczcych zalece jakie naley realizowa przy pobieraniu prbek krwi !ub zbieraniu moczu przeznaczonych do bada biochemicznych (naley dowiedzie si, czy do bada potrzebna jest krew cakowita, osocze, surowica lub jakiego antykoagulantu naley uywa itd.). Albuminy Patrz Biaka
Aminotransferazy (aktywnod w surowicy) Normalna aktywno zalena jest od uytej met o d y i wyn osi dl a Asp AT (AS T, SGOT/625 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30C), 1040 IU/1 (przy uyciu SMA i w temperaturze 37C) oraz 041 IU/1 (przy uyciu SMAC i w temp. 37C). Dla A1AT (ALT, SGPT) normalna aktywno wynosi 326 IU/1 (przy oznaczeniu w temp. 30C) oraz od 045 IU/1 (przy uyciu SMAC i w temp. 37C). A. Informacja patofizjologiczna. Aminotransferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT) i alaninowa (A1AT, ALT, SGPT) oraz i dehydrogenaza mleczanowa s enzymami rdkomrkowymi uczestniczcymi w przemianie aminokwasw i wglowodanw. Due stenia tych enzymw wystcpuj|"w miniach szkieleto wych, wtrobie i mzgu. Wzrost aktywnoci tych enzymw w surowicy krwi wskazuje na martwic lub uszkodzenie wymienionych narz dw. B. Interpretacja 1. Aktywno du stwierdza si w zawa le minia sercowego (gwnie Asp AT), ostrym zakanym (wirusowym) zapaleniu wtroby (gwnie A1AT), w marskoci wtroby (wzrost AspAT jest zwykle wyszy ni AJAT) oraz w pierwotnym lub przerzutowym nowotworze wtroby. Wysok aktywno stwierdza si rw nie w wysikach jam surowiczych o etiologii nowotworowej. Wzrost aktywnoci AspAT stwierdza si rwnie w dystrofiach mini, w zapaleniu skry i mini (dermatomyositis) oraz w mioglobimirii napadowej. 2. Ma aktywno aminotransferaz stwierdza si w niedoborze witaminy B6 (spowo dowanym powtarzanymi hemodializami), w niewydolnoci nerek i w ciy. Amoniak (stenie we krwi) Wartoci prawidowe (okrelone metod Co-nwaya) dla krwi cakowitej: 5,965 umol/1 (10 UOug/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Amoniak obecny we krwi pochodzi z dwch gwnych rde: 1) w jelicie grubym w nastpstwie dziaania gnilnego bakterii na podoa azotowe uwolnione zostaj znaczne iloci amoniaku; 2) w procesie przemiany biakowej uwalnia si amoniak. Amoniak dostajcy si do krenia wrotnego lub systemowego ulega szybkiej konwersji do mocznika w wtrobie. W niewydolno-
* Wartoci podane w tym podrozdziale wzito z wielu rde. Mog one ulec zmianie w zalenoci od uytej metody analitycznej i pracowni wykonujcej dane oznaczenie.
Biochemia
914 / DODATEK
ci wtroby stenie amoniaku we krwi moe by wysokie, szczeglnie wtedy, kiedy spoycie biaka jest wysokie lub doszo do krwawienia do wiata przewodu pokarmowego. B. Interpretacja. Stenie amoniaku we krwi jest wysokie u chorych z niewydolnoci wtroby ktb z zespoleniem portokawalnym, szczeglnie wtedy, kiedy spoycie biaka jest wysokie lub doszo do krwawienia do wiata przewodu pokarmowego.
Amylaza (aktywno w surowicy)
Azot mocznikowy i mocznik, stenie we krwi, osoczu lub surowicy
Wartoci prawidowe mog si waha w zalenoci od metody oznaczania enzymu. Wahaj si od 0,8 do 3,2 IU/1 (80180 jednostek Somogyi/dl). Jedna jednostka Somogyi odpowiada iloci enzymu, pod wpywem ktrej powstaje 1 mg cukru redukujcego z rozpadu skrobi przy pH 7,2. A. Informacja patofizjologiczna. W wa runkach fizjologicznych w surowicy krwi obec ne s tylko niewielkie iloci amylazy linowej i trzustkowej o masie czsteczkowej ok. 50000. W stanach zapalnych trzustki lub przy zamkni ciu wiata drg trzustkowych znaczne iloci enzymu dostaj si do krwi, skd wydalane s przez nerki,
B. Interpretacja
Wartoci prawidowe: azot mocznikowy we krwi 2,98,9 mmol/I (825 mg/dl), mocznik we krwi 3,5 9 mmoi/l (21 -53 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Mo cznik, jako produkt kocowy przemiany bia kowej, jest wydalany przez nerki. Stenie mo cznika w przesczu kbuszkowym jest takie samo jak w osoczu krwi. Wchanianie zwrotne mocznika w kanalikach nerkowych jest odwrot nie proporcjonalne do iloci wypywajcego moczu. Ten fakt sprawia, e mocznik jest mniej uytecznym wskanikiem przesczania kbuszkowego od kreatyniny, ktra nie ulega reabsorpcji w kanalikach nerkowych. Stenie azotu mocznikowego we krwi jest proporcjonalne do iloci spoytego biaka i odwrotnie proporcjo nalne do jego wydalania z moczem. 1. Wzrost stenia azotu mocznikowego stwierdza si: a. w niewydolnoci nerek spowodowanej ostrym lub przewlekym stanem zapalnym, ostr niezapaln niewydolnoci (martwica ka nalikw nerkowych) lub obstrukcj drg mo czowych. b. w stanach wzmoonej przemiany azoto wej, ktrej towarzyszy spadek ukrwienia i nie wydolno wydalnicza nerek (stany odwodnie nia, krwawienia do wiata przewodu pokar mowego w tym ostatnim przypadku mamy do czynienia ze wzrostem wchaniania amino kwasw pochodzcych ze strawionych biaek krwi oraz z hipoperfuzj nerek). c. w stanach chorobowych przebiegajcych ze spadkiem ukrwienia nerek (wstrzs, niewy dolno nadnerczy i czasami niewydolno za stoinowa serca). 2. Mae stenia azotu mocznikowego stwierdza si w niewydolnoci wtroby, ner czycy niepowikanej niewydolnoci nerek oraz w wyniszczeniu (kacheksji).
i
B. Interpretacja
stwierdza si w ostrym zapaleniu i w cystach rzekomych trzustki, przy zamkniciu przewo dw trzustkowych przez nowotwr, kamie, zwenie lub skurcz zwieracza (wywoany poda niem morfiny) oraz w wince. Sporadycznie aktywno amylazy moe by podwyszona w niewydolnoci nert!f? kwasicy cukrzycowej i w stanie zapalnym trzustki wywoanym dr cym wrzodem trawiennym odka. Bardzo rzadko poczenie si amylazy z immunoglobulin tworzy kompleks o masie czsteczkowej przynajmniej 160 000 nie ulegajcy przesczeniu w kbuszkach nerkowych. Jest on powodem wzrostu aktywnoci amylazy we krwi (makro amylazemia). Ma aktywno amylazy w surowicy stwierdza si w ostrym i przewlekym zapaleniu wtroby w niewydolnoci trzustki i sporadycz nie w ciy. Amylaz mona rwnie okreli w moczu. Jej aktywno w moczu wzrasta w tych samych stanach chorobowych, w ktrych stwierdza si wzrost aktywnoci tego enzymu w surowicy krwi.
Podwyszon aktywno amylazy
Biaka (stenie w surowicy lub osoczu) w tym rwnie fibrynogen
Wartoci prawidowe: p. niej Interpretacja.
nie biaka determinuje cinienie koloidowo-o-smotyczne (onkotyczne) osocza. Stenie biaka w osoczu zalene jest od stanu odywiania, czynnoci wtroby i nerek, wystpowania chorb, takich jak szpiczak lub wady metaboliczne.
A. Informacja patofizjologiczna. Ste-
DODA TE K / 915
Zmiany stenia poszczeglnych frakcji biakowych mog by swoiste dla okrelonych chorb. B. Interpretacja wicy. Wartoci normalne 60 80 g/l (68 g/dl). Stenie frakcji albumin i globulinowych patrz niej i tab. 1.
Tabela 1. Frakcje elelftroloretyczne biaek surowi cy krwi
Tabela 3. Niektre biaka wystpujce w poszcze glnych frakcjach elektroforeiycznych glo bulin Frakcja globulin 1 a2 P
' !
Biaka zawarte w danej frakcji Globuliny wice tyroksyne, transkortyna, glikoproteina, li-poproteina, antytrypsyna Haptoglobina, glikoproteina, makroglobulina, ceruloplazmina Transferyna, lipoproteina, giiko-proteina yG, yD, yM, yE, yA
1. Cakowite stenie biaka w suro -
ra ' a
Albuminy a,-Globuliny ctj-Gtobuliny P-Globuliny y-Glo buliny
Stanie wyraone w % cakowitego stenia biaka 52-68 2,4-4,4 6,1-10,1 8,5-14,5 10-21
idozie, w ostrych i przewlekych chorobach zakanych, szczeglnie w ziarnicy wenerycznej pachwin, tyfusie, leiszni^niozie, schistosomato-zie i malarii. si w stanach wadliwego odywiania, w agam-maglobulinemii wrodzonej, hipogammaglobu-linemii nabytej i w biaaczce limfatycznej. toci normalne: 26 g/l (= 0,20,6 g/dl). a. Wzmoone stenia fibrynogenu wy stpuj w zapaleniu kebuszkw nerek, nerczycy (czasami) oraz chorobach zakanych. b. Obnione stenia fibrynogenu stwier dza sie w rozlanym wykrzepianiu rdnaczyniowymDIC (moe wystpi przy odklejeniu si oyska, w zatorach spowodowanych pynem owodniowym, w przerzutach rakowych gruczo u krokowego lub innych narzdw, w biaacz ce), w ostrej i przewlekej niewydolnoci wtro by oraz we wrodzonej fibrynogenopenii.
b. Obnione stenie globulin stwierdza
2. Stenie albumin w surowicy lub osoczu .Wartoci prawidowe: 3355 g/l (3,35,5 g/dl). a. Wzrost stenia albumin stwierdza si w stanach odwodnienia, we wstrzsie, w sta nach przebiegajcych z zagszczeniem krwi oraz po doylnym podaniu stonych roztworw albumin. b. Obnione stenie albumin wystpuje w stanach wadliwego ywienia, w zespole wad liwego wchaniania, w ostrym lub przewlekym zapaleniu kebuszkw nerkowych, w zespole nerczycowym, w ostrej lub przewlekej niewy dolnoci wtroby, w chorobach nowotworo wych i biaaczkach. 3. Stenie globulin w suro wi cy lub osoczu krwi. Wartoci prawidowe 20 36 g/l {23,6 g/dl) p. tab. 2, 3.
4. Stenie f ibrynogenu w osoczu. War-
w chorobach wtroby (wirusowe zapalenie wtroby, marsko zanikowa lub ciowa wtroby, hemochromatoza), toczniu trzewnym, szpi-czaku, chorobach limfoproliferacyjnych, sarkoTabela 2. Stenie imm uno glo bulin oznaczo ne metod immunoelektroforezy IgA IgG IgM IgD IgE 0,9-4,5 g/l ( 90-4 50 mg/d l) 7,0- 15 g/l ( 70 0-1 50 0 mg/ dl) 0,4-2,5 g/1 (40-250 mg/dl) 0,003- 0,4 g/l (0, 3-40 mg/d l) 0,00006-0,0016 g/l (0,006 -0,16 mg/dl)
a. Stenia podwyszone stwierdza si
Bilirubina (stenie w surowicy) Wartoci prawidowe: bilirubina cakowita 3,520,4 umol/1 (0,21,2 mg/dl). Bilirubina sprzona (glukuronidy bilirubiny) 1,76,8 umol/1 (0,1-0,4 mg/dl), bilirubina wolna (nie sprzona z kwasem glukuronowym 3,411,9 umol/1 (0,20,7 mg/dl). rubina, powstajca z rozkadu hemoglobiny, ulega w wtrobie sprzeniu z kwasem glukuronowym tworzc diglukuronid. Ten ostatni ulega wydalaniu z ci. Stenie bilirubiny w surowicy wzrasta w niewydolnoci wtroby, przy obstrukcji drg ciowych oraz w razie wystpienia znacznej hemolizy krwinek czerwonych. Tylko rzadko przyczyn hiperbilirubine-mii s anomalie enzymw uczestniczcych
A. Informacja patofizjologiczna. Bili-
916 / DODATEK
w przemianie bilirubiny (np. transferaza gluku-ronylowa). B. Interpretacja 1. Stenie bilirubiny bezporedniej (sprzo nej) i poredniej (wolnej, niesprzonej) wzrasta w ostrym i przewlekym zapaleniu wtroby, w razie zamknicia wiata drg ciowych (przewodzikw ciowych, przewodu wtro bowego lub ciowego wsplnego), w nastpst wie reakcji toksycznych spowodowanych leka mi, chemikaliami lub toksynami oraz w ze spoach Dubina -Johnsona i Rotora. 2. Stenie bilirubiny poredniej wzrasta w niedokrwistociacb bemolitycznych lub w na stpstwie reakcji hemol i tycznych, przy braku lub niedoborze transferazy glukuronylowej wy stpujcej w chorobie Gilberta lub w zespole Criglera-Najjara. 3. Stenie zarwno bilirubiny bezporedniej, jak i cakowitej moe znacznie wzrosn u osb zdrowych i chorych na taczk w nastpstwie godzenia przez 2448 godzin (czasami nawet tylko przez 12 godzin) lub dugotrwaego go dzenia kalorycznego. Ceruloplazmina i mied (w surowicy krwi) Wartoci prawidowe: ceruloplazmina 1,72,9 umol/1 f2543 mg/dl); mied 1631 umol/1 (100200 ng/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Oko o 5% miedzi wystpujcej w surowicy zwizane jest luno z albuminami, za 95% z ceruloplazmin. Ta ostatnia jest oksydaz o zabarwieniu niebieskim, wystpujc w frakcji a2-globulin. W chorobie Wilsona stenie miedzi i aktyw no ceruloplazminy^w surowicy s mae, natomiast wydalanie miedzi z moczem wyso kie. B. Interpretacja 1. Wzrost aktywnoci ceruioplazminy i stenia miedzi w surowicy krwi stwierdza si w ciy, nadczynnoci tarczycy, infekcjach, nie-dokrwistoci aplastycznej, ostrej biaaczce, chorobie Hodgkina, marskoci wtroby oraz u kobiet zaywajcych doustne leki antykoncepcyjne.
Chlorki (stenie w surowicy lub osoczu) Wartoci prawidowe: 96106 mmol/l. A. Informacja patofizjologiczna. Cl jest gwnym nieorganicznym anionem pynu pozakomrkowego. Odgrywa wan rol w utrzymywaniu rwnowagi kwasowo-zasado-wej, chocia nie wykazuje wasnoci buforujcych. Przy utracie chlorkw pod postaci HC1 lub NH4C1 rozwija si zasadowica, natomiast przy zatrzymywaniu Cl" w ustroju lub jego podaniu powstaje kwasica. Chlorki (wraz z so dem) odgrywaj wan roJ w regulacji osmola-inoci (molalnoci) pynw ustrojowych. B. Interpretacja Hiperchloremi stwierdza si w niewy dolnoci nerek (jeeli spoywanie Cl przekracza jego wydalanie), w nerczycy (czasami), kwasicy kanalikowej, w nadczynnoci przytarczyc (cza sami), zespoleniu moczowodowo-esiczym (do chodzi do wchaniania przez jelito chlorkw zawartych w moczu), odwodnieniu (w niedobo rze wody) oraz nadmiernym podawaniu roz tworu soli Fizjologicznej, Hipochloremia wystpuje przy utracie soku odkowego i jelitowego (wymioty, bie gunki, odsysanie soku odkowego lub jelito wego), w niewydolnoci nerek (utrata Cl ~ przez nerki), przy nadmiernym stosowaniu diuretykw, w przewlekej kwasicy oddechowej (spo wodowanej rozedm puc), kwasicy cukrzyco wej, przy nadmiernym poceniu si, w niewydol noci nadnerczy (dochodzi do utraty NaCl przez nerki), nadczynnoci kory nadnerczy (wy woujcej przewlek utrat K"*) oraz w zasadowicy metabolicznej (spowodowanej zaywa niem NaHCOj lub niedoborem K+). Cholesterol (stenie w surowicy lub osoczu) Wartoci prawidowe: 3,97,2 mmol/l ( = 150280 mg/dl), p. tab. 4. A. Informacja patofizjologiczna. St enie cholesterolu w surowicy krwi zaley od wielu procesw metabolicznych, zalenych od czynnikw genetycznych, ywienia, czynnoci narzdw wewntrzwydzielniczych oraz integ ralnoci czynnociowej yciowo wanych narz dw takich jak wtroba i nerki. Przemiana cholesterolu jest cile zwizana z przemian iipidw. B. Interpretacja 1 . Wzrost stania cholesterolu w surowicy krwi stwierdza si w hipercholesterolemii
2Obnienie aktywnoci ceruloplazmi-ny i stenia miedzi w surowicy
stwierdza si w chorobie Wilsona (towarzyszy jej wzmoone wydalanie miedzi z moczem), w zespole wadliwego wchaniania i w nerczycy oraz w niedoborze miedzi, spowodowanyTm cakowitym odywianiem pozajelitowym.
DODATEK / 917 Tabela 4. Stenie w surowicy krwi cholesterolu cakowitego (C), tri gliceryd w (TG), cholesterolu frakcji LDL (lipoproteiny o niskiej gstoci (LDL -C) i HDL (lipoproteiny o wysokiej gstoci) (HDL -C) w populacji USA* C mmol/l HDL-C Wiek TG LDL-C (mg/dl) mmol/l (mg/dl) mmol/l (mg/dl) g/i grna granica kobiety mczyni (mg/dl) wartoci prawidowych
<29
30-39 40-49
>49
3,1,0-6,20 (120-240) 3,62-6,98 (140-270) 3,88-8,01 (150-310) 4,13-8,53 (160-330)
0,1-1,4 (10-140) 0,1-1,4 (10-150) 0,1-1,6 (10-160) 0,1-16 (10-190)
4,40 (170) 4.91 (190) 4,91 (190) 5,43 (210)
1,16+0,31 1,42+0,31 (45 + 12) (5512)
vi,
Wedug Krupp i wsp.: Physician's Handbook. Wyd. 21, Lange, 1985, za zezwoleniem
rodzinnej (xanthomatosis), niedoczynnoci tarczycy, sabo wyrwnanej cukrzycy, zespole ner-czycowym, przewlekym zapaleniu wtroby, marskoci ciowej wtroby, taczce zastoi-nowej, hipoproteinemii (samoistnej, lub spowodowanej zespoem nerczycowym wzgldnie przewlekym zapaleniem wtroby) i w biper-lipidemii (samoistnej; rodzinnej). 2. Spadek stenia cholesterolu w surowicy krwi stwierdza si w ostrym zapaleniu wtroby i w chorobie Gauchera, Moe rwnie wystpowaw nadczynnoci tarczycy, w ostrych infekcjach, niedokrwistoci, wadliwym odywianiu si oraz w niedoborze apolipoproteiny. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) w surowicy, w pynach surowiczych, pynie mzgowo-rdzeniowym lub moczu Wartoci prawidowe mog by rne zalenie od metod oznaczania. Surowica; 55140 IU/1 (aktywno oznaczona w temp. 3Q!1C), 100225 IU/1 (aktywno oznaczona przy uyciu SMA w temp. 3TC) lub 60200 IU/J (aktywno oznaczona przy uyciu SMAC w temp, 37C). Pyn z jam surowiczych: aktywno jest mniejsza ni w surowicy. Pyn mzgowo-rdzeniowy; 1573 jednostek (wg Wrb-lewskiego) lub 6,330 IU/1. Mocz: aktywno jest mniejsza ni 8300 jednostek/8 godzin (Wr-blewski). katalizuje konwersj mleczanu do pirogronianu
(w obecnoci NAD+) i odwrotnie pirogronianu do mleczanu (w obecnoci NADH). Jest enzymem wystpujcym we wszystkich komrkach i pynach ustrojowych. B. Interpretacja Aktywno LDH wzrasta we wszystkich stanach chorobowych przebiegajcych z martwic tkanek, w tym szczeglnie w ostrym uszkodzeniu minia sercowego, krwinek czerwonych, nerek, mini szkieletowych, wtroby, puc i skry. Znaczne wzrosty aktywnoci LDH obserwuje si w niedokrwistociach hemolitycz-nych, w niedokrwistociach spowodowanych niedoborem witaminy B: 2 lub kwasu foliowego oraz w policytemii prawdziwej. Wzrost aktywnoci LDH w pierwszych 34 dniach z nastpczym spadkiem w kolejnych 57 dniach choroby moe by dowodem potwierdzajcym roz poznanie zawaha serca po uprzednim wykluczeniu zawau puc, choroby nowotworowej i niedokrwistoci megalobiastycznej. Chocia aktywno LDH jest podwyszona w ostrej fazie zakanego (wirusowego) zapalenia wtroby, w zapaleniu przewlekrym tego narzdu jest tylko rzadko dua. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) izoenzymy (aktywno w surowicy) Wartoci prawidowe: p. tab. 5 A. Informacja patofizjologiczna. LDH surowicy skada si z 5 izoenzymw bdcych tetramerami zoonymi z dwch rodzajw pod-jednostek - H i M. Poszczeglne izoenzymy
A. Informacja patofizjologiczna. LDH
918 / DODATEK Tabela 5. Izoenzymydehydrogenazy mleczanowej (LDH). Rozdzia elektroforetyczny Udzia procentowy w Izoenzym
oglnej aktywnoci
LDH surowicy (w nawiasach podano zakres waha) Najszybcie j wdrujcy 28 (15-30)

2(a2)
36 (22-55) 23 (15-30) 6 (0-15) 6 (0-15)
3(P) 4(Ti) Najwolniej wdrujcy 5(TI)
rni si midzy sob kinetyk enzymatyczn, ruchliwoci elektroforetyczn, chromatograficznie i immunologicznie. Przy rozdziale elektro-foretycznym ww. izoenzymy wykazuj ruchliwo globulin a]S a2, |3, y1 i y2. Izoenzymy LDH oznacza si zwykle liczbami 1 fizoenzym 0 najwikszej ruchliwoci elektroforetycznej) 2, 3, 4 i 5 (izoenzym o najmniejszej ruchliwoci elektrofor ty cznej). Izoenzym LDH-1 wystpu je w duym steniu w miniu sercowym (jest to tetramer HHHH), w krwinkach czerwonych 1 korze nerek, za izoenzym LDH-5 w miniach szkieletowych (jest to tetramer MMMM) i wt robie. B. Interpretacja. W zawale serca izoenzymy wdrujce z globulinami a s podwyszone, szczeglnie izoenzym LDH-1, co sprawia, e iloraz LDH-l/LDH-2 jest wyszy od jednoci. Podobny wzrost tego izoenzymu obserwuje si w zawale kory nerek oraz w niedo-krwistociach hemolitycznych. Wzgldny wzrost aktywnoci izoenzymw LDH-5 i LDH-4 stwierdza si w ostrym zapaleniu wtroby, w ostrym uszkodzeniu mini szkieletowych, w zapaleniu skry i mini (der-matomyositis) oraz w dystrofiach miniowych. Fibrynogen Patrz Biaka Fosfataza kwana (FK) Wartoci prawidowe mog si rni w zalenoci od metody oznaczania enzymu. Normalna aktywno wynosi 36175 nmol/s/1 lub 0,10,63 jednostek Sigma. fatazy aktywne przy pH 4,9 wystpuj w duych
steniach w gruczole krokowym, krwinkach czerwonych, pytkach krwi, w komrkach siateczko wo-rd bonko wy ch, wtrobie, ledzionie i nerkach. Wiele izoenzymw FK stwierdzono w wymienionych narzdach, komrkach i w surowicy, wykazujcych rn, aktywno wobec rnych sub strato w. B. Interpretacja. U chorych z rakiem stercz aktywno frakcji sterczowej fosfatazy kwanej w surowicy moe by podwyszona, szczeglnie wtedy, kiedy nowotwr siga poza torebk gruczou lub wystpuj przerzuty. Obmacywanie stercz moe by rwnie przyczyn wzrostu (chocia przejciowego) aktywnoci FK w surowicy. Wzrost cakowitej aktywnoci FK w surowicy stwierdza sie w chorobie Gau-chera, w guzach zoliwych koci, w chorobach nerek, miszu wtrobowego i drg ciowych, ukadu siateczkowo-rdbonkowego oraz w chorobach zakrzepowo-zatorowych. Gorczka moe by przyczyn rzekomego wzrostu FK. Fosfataza zasadowa (FZ) (aktywno w surowicy) Wartoci prawidowe zaiene s od metody uytej do oznaczania tego enzymu. Przy uyciu metody Besseya-Lowryego u dzieci wartoci prawidowe wynosz 2,86,7 jednostek, natomiast u dorosych 0,82,3 jednostek. Przy uyciu metody Kinga-Armstronga prawidowa aktywno FZ oznaczona w temp. 30C wynosi 2471 IU/1 (513 jednostek tradycyjnych, przy uyciu SMA i przy temp. 37C 30-85 IU/1, za przy uyciu SMAC i przy temp. 37C 30115 IU/1. A. Informacja patofizjlogiczna. FZ obecna jest w duych steniach w kociach, ci i oysku. Wystpujca we krwi FZ jest mieszanin izoenzymw, dotychczas bliej nie poznanych. Mona je rozdzieli elektroforetycznie. Izoenzym wtrobowy FZ wdruje szyb ciej ni izoenzym kostny i oyskowy. Te dwa ostatnie wykazuj tak sam ruchliwo ele ktroforetyczn. B. Interpretacja Podwyszon aktywno FZ stwierdza si: a. U dzieci (w okresie wzrostu koci), b. W chorobach koci przebiegajcych ze wzmoon aktywnoci osteoblastw (nad czynno przytarczyc, krzywica u dzieci i osteomalacja u dorosych, nowotworowe choroby koci, takie jak: pierwotny misak koci lub przerzuty nowotworowe do koci, choroba Pa-
A. Informacja patofizjlogiczna. Fos-
DODATEK / 919
geta, sarkoidoza Boecka i zwapnienia pozakost-ne wystpujce np. w myositis ossificans). c. W obturacji drg ciowych spowodowa nej kamic, zweniem lub nowotworem. d. W polekowym uszkodzeniu wtroby wy woanym chloropromazyn Jub metylotesto steronem oraz e. W ciy. 2. Obnion aktywno FZ w surowicy obserwuje si w niedpczynnoci tarczycy oraz u dzieci z opnionym wzrostem. Fosfokinaza krsatynowa (CPK, CK) (aktywno w surowicy) Wartoci prawidowe zalene s od metody oznaczania CPK i wahaj si od 10 do 50 IU/1 (przy oznaczaniu enzymu w temp. 37C). B. Informacja patofizjologiczna. CPK katalizuje rozpad fosfokreatyny w obecnoci ADP. Produktami tej reakcji s kreatyna i ATP. Minie szkieletowe i misie sercowy oraz mzg s bogate w CPK. B. Interpretacja Wzmoon aktywno enzymu stwier dza si w uszkodzeniach mini, np. w zawale serca, w urazach mini, w dystrofiach mini, w zapaleniu wielominiowym {poymyositi) i po cikich wiczeniach fizycznych (jogging), w niedoczynnoci tarczycy i zawale mzgu. Po wystpieniu zawau serca obserwuje si szybki wzrost aktywnoci CPK (3 5 godzin od po cztku zawau) utrzymujcy si przez okres krtszy (23 dni) ni wzrost AspAT lub LDH. Niepod wyszon a kty wno CP K stwierdza si w zawale puc i chorobach miszu wtrobowego. Fosfokinaza kreatynowa izoenzymy (a-ktywno w surowicy) Patrz tab. 6. A. Informacja patofizjologiczna. Obec na w surowicy krwi C PK skada si z trzech izoenzymw dajcych si rozdzieli elektroforetycznie. Minie szkieletowe charakteryzuj si izoenzymem MM, misie sercowy izoenzymem MB, za mzg izoenzymem BB. B. Interpretacja. Wzrost aktywnoci izo enzymu CPK-MM stwierdza si w urazach mini szkieletowych przy uszkodzeniu minia sercowego lub mzgu, w chorobach mini (dystrofia mini, niedoczynno tarczycy, za palenie skry i mini, zapalenie wielomi niowe) oraz w rabdomiolizie lub po cikich wiczeniach gimnastycznych. Wzrost aktywno-
Tabeta 6. Izoenzymy kinazy fosfokreatynowej (o-krelone e lekt rof o rety cz n i e) Normalna aktywno Izoenzym wyraona jako % ak tywnoci oglnej CPK (CK) w surowicy Frakcja najszybciej wdrujca Frakcja 1,BB Frakcja 2,MB Najwolniej wdrujca frakcja Frakcja 3,MM 0 0-3 97-100
ci izoenzymu CPK-MB obserwuje si w 24 godzin po wystpieniu zawau minia sercowego. Wzrost taki utrzymuje si do 72 godzin i moe si wyduy w razie rozszerzenia si strefy martwiczej minia sercowego. Wzrost aktywnoci tego izoenzymu stwierdza si te w rozlegej rabdomiolizie lub po urazach mini szkieletowych, w cikich chorobach mini, w zespole Reye'a i gorczce gr skalistych. Aktywno izoenzymu CPK-BB jest czasami podwyszona we wstrzsie, w niektrych rodzajach rakw (szczeglnie w raku owsianokomr-kowym, raku jajnikw, piersi i gruczou krokowego) oraz w zaroniciu drg ciowych. Fosfor nieorganiczny (stenia w surowicy krwi) Wartoci prawid owe: u dzieci 1,32,3 mmol/1 (4,7 mg/dl), u dorosych 11,5 mmol/1 (34,5 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Na stenie fosforu nieorganicznego w surowicy krwi wpyw maj: paraihormon, witamin a D i jej aktywne metabolity, wchanianie fosforanw w jelitach, czynno wydainicza nerek, przemiana kostna i ywienie. B. Interpretacja Wzrost stenia fosforu nieorganicz nego stwierdza si w niewydolnoci nerek, nie doczynnoci przytarczyc i hiperwitaminozie D. Mae stenie fosforanw nieorganicz nych w surowicy stwierdza si w nadczynnoci przytarczyc, hipowitaminzie D (krzywica, osteomalacja) i w zespole wadliwego wchaniania (biegunki), przy zaywaniu zwizkw wi cych fosforany w przewodzie pokarmowym (wodorotlenek glinu), przy godzeniu, w kra cowym wyniszczeniu, w przewlekym alkoholiz mie (szczeglnie przebiegajcym z uszkodz -
920 / DODATEK
niem miszu wtrobowego), w hiperalimen-tacji z uyciem pynw bez- lub ubogofosfora-nowych, przy doylnym podawaniu duych iloci wglowodanw, w tubulopatiach nerkowych, przy stosowaniu diuretykw tiazydo-wych, w zaburzeniach gospodarki kwasowo--zasadowej {w kwasicy cukrzycowej ketonowej szczeglnie w okresie jej cofania si) oraz w hi-pofosfatemii genetycznie uwarunkowanej. Czasami hipofosfatemi stwierdza si w ciy i w niedoczynnoci tarczycy.
Globulina wica tyroksyn (TBG) (stenie w surowicy)
Wartoci prawidowe (okrelone metod radio immunologiczn): 0,020,048 g/l (24.8 mg/di). jest gwnym biakiem transportowym T4 i T3 w osoczu krwi. Zmianom stenia TBG towarzysz rwnolegle zmiany stenia wolnej tyro-ksyny, tak e stenia tej ostatniej s odpowiednie do stanu fizjologicznego ustroju, co zapewnia stan eutyreozy. Wrodzone anomalie w zakresie TBG dziedzicz si najpewniej genem na chromosomie X. Due stenie TBG wystpuje w ciy, w zakanym (wirusowym) zapaleniu wtroby i we wrodzonym wzrocie stenia tego biaka. Obnione stenie TBG stwierdza si w stanach chorobowych przebiegajcych z nis kim steniem biaek (globulin) w surowicy (zesp nerczycowy, marsko wtroby), w ak tywnej akromegalii, w niedoborze estrogenw oraz we wrodzonym<wjedoborze TBG.
Glukoza (stenie w surowicy lub osoczu krwi) B. Interpretacja A. Informacja patofizjologiczna. TBG
przysadki mzgowej w zakresie sekrecji ACTH i hormonu wzrostu i w nadczynnoci glukokor-tykoidowej. Mniej regularnie wzrost stenia glukozy we krwi obserwuje si w guzie chromo-chonnym, w nadczynnoci mineralokortykot-dowej i w chorobach wtroby, 2. Hipoglikemia wystpuje w hiperinsuli-nizmie, niewydolnoci nadnerczy i przysadki gruczoowej oraz w niewydolnoci miszu wtrobowego (w ostrym tym zaniku wtroby). Moe ona mie rwnie charakter czynnociowy (reaktywny) lub by spowodowana lekami o dziaaniu hipoglikemicznym.
Immunoglobuliny
Patrz Biaka
Wartoci prawidowe: p. tab. 7. A. Informacja patof izjologiczna. Kre atyna jest wanym skadnikiem mini, mzgu i krwi. Jej pochodna fosforanowa fosfokreatyna stanowi zwizek fosforanowy o wy sokiej energii. W warunkach fizjologicznych ilo wydaJonej z moczem kreatyny jest niewiel ka, wzrasta ona natomiast w stanach wzmoo nego katabolizmu ustrojowego oraz w dystrofiach mini.
B. Interpretacja
Kreatyna (dobowe wydalanie z moczem)
Wartoci prawidowe oznaczone na czczo: 3,66,1 mmol/1 (65111 mg/dl). Wartoci te dotycz glukozy prawdziwej1" oznaczonej swoist metod enzymatyczn. A. Informacja patof izjologiczna. W wa runkach prawidowych stenie glukozy w su rowicy jest dokadnie regulowane tak, by bya ona dostpna tkankom jako rdo energii oraz by nie ulega wydalaniu z moczem. Zarw no hiper-, jak i hipoglikemia s nieswoistymi objawami zaburzonej przemiany wglowoda nowej. 1. Hiperglikemie stwierdza si w cukrzycy, nad czynnoci tarczycy, w nadczynnoci
B. Interpretacja
Wzrost wydalania kreatyny z moczem stwierdza si w dystrofiach mini (np. w po stpujcej dystrofii mini, miotonii zanikowej, w cikiej miastenii), w zanikach miniowych (spowodowanych np. chorob Heinego i Medina, wystpujcych w stwardnieniu zanikowym bocznym lub zapaleniu mini), w godzeniu i stanach wyniszczenia, w nadczynnoci tar czycy i chorobach przebiegajcych z gorczk. Zmniejszone wydalanie kreatyny z moczem obserwuje si w niedoczynnoci tar czycy, amiotonii wrodzonej i niewydolnoci nerek. >
Kreatynina (stenie w surowicy lub osoczu krwi)
Wartoci prawidowe: 62132 umol/1 (0,71,5 mg/dl). A. Informacja patof izjologiczna. Kreatynina po przesczaniu w klbuszkach nerkowych i wydzielaniu przez kanaliki, nerkowe wydalana jest z moczem. Jej klirens nerkowy jest o ok. 20% wyszy od klirensu inuiiny. Klirens kreatyniny jest wikszy od klirensu
DODATEK / 921 Tabela 7. Dobowe wydalanie z moczem kreatyny i kreatyniny. Wartoci'prawidowe Kreatyna Kreatynina Noworodek Niemowlta 1-7 miesicy Dziecko w wieku 2-3 lat 4-4Vs lat 9-9% lat 11-14 lat Dorosy mczyzna Dorosa kobieta 0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg) 0,061 mmol/kg (8.1 mg/kg) 0,060 mmol/kg (7,9 mg/kg) 0,034 mmol/kg (4,5 mg/kg) 0,019 mmol/kg (2,5 mg/kg) 0,020 mmol/kg (2,7 mg/kg) 0-0,382 mmol (0-50 mg) 0-0,763 mmol (0-100 mg) 0,088 mmol/kg (10 mg/kg) 0,111 mmol/kg 12,8 mg/kg 0,107 mmot/kg (12,1 mg/kg) 0,129 mmol/kg (14,6 mg/kg) 0,160 mmol/kg (18,1 mg/kg) 0,178 mmol/kg (20,1 mg/kg) T221 mmot/kg (25 mg/kg) 0,186 mmol/kg (21 mg/kg)
inulinowego z powodu wydzielania tego metabolitu przez kanaliki nerkowe. Naley wyjani, e reakcji Jaffego (jest ona najczciej uywana do oznaczania kreatyniny) oznacza si oprcz kreatyniny rwnie chromogeny nie bdce kreatynin. Te ostatnie nie s jednak wydaJane z moczem, co sprawia, e ilo kreatyniny wydalanej z moczeni jest przypadkowo o ok. 20% mniejsza od sumy nieswoistych chromogenw i kreatyniny docierajcych do nerek. W ten sposb kJirens nerkowy kreatyniny i inuiiny s wielkociami porwnywalnymi. Dla celw klinicznych khrens nerkowy kreatyniny mona przyj za miar wielkoci przesczania kbuszko-wego, z wyjtkiem przypadkw, w ktrych stwierdza si zaawansowan niewydolno nerek. W tym ostatnim przypadku kJirens kreatyniny jest wyszy od kJirensu inuliny w nastpstwie wydzielania jej przez kanaliki nerkowe, lnulina jest wydalana przez nerki tylko drog przesczania kbuszkowego nawet u chorych z mocznic. B. Interpretacja. Wzrost kreatyninemii stwierdza si w ostrej i przewlekej niewydolnoci nerek, przy obstrukcji drg moczowych lub w uszkodzeniach nerek spowodowanych niektrymi lekami. Niektre substancje (aceto-octan, aceton, {J-hydroksymalan, a-ketogluta-ran, pirogronian, glukoza, bilirubina, hemoglobina, mocznik i kwas moczowy) mog reagowa z zasadowym roztworem pikrynianu (reak-
cja Jaffego) stajc si przyczyn faszywie zawyonych ste kreatyniny. Stenia kreatyniny nisze ni 62 umol/1 (0,7 mg/dl) nie maj adnego znaczenia. Kreatynina (wydalanie z moczem) Patrz tab. 7. Kwas moczowy (stenie w surowicy i w osoczu) Wartoci prawidowe: mczyni 180539 umol/1 (3 9 mg/dl), kobiety 150-450 nmoi/1 (2,57,5 mg/dl). A. Informacja patoftzjofogiczna. Kwas moczowy, jako produkt kocowy przemiany purynowej, wydalany jest przez nerki. Dna jest defektem metabolicznym uwarunkowanym ge netycznie, charakteryzujcym si podwyszo nym steniem kwasu moczowego w surowicy lub osoczu krwi, wzrostem oglnej puli kwasu moczowego w ustroju oraz odkadaniem si tego metabolitu w tkankach. Wzrost stenia kwasu moczowego w surowicy moe by rw nie spowodowany zwikszonym kataboliz mem purynowym (dyskrazje krwi, terapia far makologiczna biaaczek), stosowaniem diuretykw ttazydowych lub niewydolnoci nerek. B. Interpretacja 1. Hiperurykemi stwierdza si w skazie dnawej, w stanach przedrzucawkowych i rzu-
922 / DODATEK
cawkowych, w biaaczkach, policytemii, po chemioterapii lub stosowaniu innych metod leczenia biaaczek, w niewydolnoci nerek, w gliko-genozie typu I, w zespole Lescha-Nyhana (jest spowodowany niedoborem fos fory boy lotrans-ferazy hipoksantynoguaninowej) oraz w zespole Downa. Czsto wystpowania hiperuryke-mii jest wiksza u Filipiczykw ni u biaych. 2. Hipouryke mi stwierdza si sporadycznie w ostrym zapaleniu wtroby, po stosowaniu alopurynolu lub probenecydu. Oznaczanie wydalania kwasu moczowego z moczem ma rwnie warto diagnostyczn w niektrych stanach chorobowych, np. u chorych z dn.
metabolicznych przebiegajcych z kwasic mle-czanow lub [J-hydroksymalanow. Rwnie podawanie salicylanw w dawkach mniejszych ni 23 g/d moe by przyczyn zatrzymywania kwasu moczowego w ustroju.
Lipaza (aktywno w surowicy krwi)

Wartoci prawidowe: 0,21,5 jednostek. krwi krcej stwierdza sie tyiko ma aktywno enzymw lipolitycznych. Aktywno lipa-zy trzustkowej wzrasta w ostrym zapaleniu trzustiki, przy czym wzrost ten utrzymuje si duej ni amylazy. B. Interpretacja. Aktywno lipazy w su rowicy wzrasta w ostrym lub przewlekym, zaostrzonym zapaleniu trzustki oraz przy za mkniciu wiata przewodu trzustkowego przez kamie lub nowotwr.
A. Informacja patofizjologiczna. We
Wartoci prawidowe: 2,13,6 mmol/24 godziny (350600 mg/dobe) u osb przebywajcych na diecie bezpurynowej. Prawidowy iloraz U/Ukiim (U, dobowe wydalanie kwasu moczowego z moczem, Urei dobowe wydalanie kreatyniny z moczem wyraone w mmol) wynosi dla dorosych 0,210,59, maksymalnie 0,75 (u osb bdcych na diecie bezpurynowej). A. Uwaga. Zarwno przed, jak i w czasie zbierania dobowego moczu przeznaczonego do oznaczania kwasu moczowego dieta nie powin na zawiera pokarmw bogato pury nowych. Wykonanie duego wysiku fizycznego moe zwikszy urykozuri. B. I nf ormacja patof i zjo logiczna. Zmiany wydalania kwasu moczowego z mo czem mog by uwarunkowane jego nadprodu kcj (wwczas stwierdza si hiperurykozuri) lub upoledzonym jego wydalaniem z moczem (wwczas stwierdza si hipourykozuri). Hiperurykozuri stwierdza si u ok. 2530% chorych na dn uwarunkowan nad produkcj puryn. Wzmoon syntez zasad pury nowych i zwi kszone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza si w zespoach mieloproliferacyjnych. Hiperurykozuria wyst puje rwnie w zespole Lesha-Nyhana (spowo dowanego niedoborem f osfory boy otr ansferazy hipoksantyno-guaninowej) oraz w niekt rych przypadkach glikogenozy (choroba spichrzeniowa glikogenu). Zmniejszone wydalanie kwasu moczowego z moczem stwierdza si w niewy dolnoci nerek, w niektrych przypadkach gli kogenozy typu I oraz we wszystkich defektach
Kwas moczowy (wydalanie z moczem)
Lipidy
Patrz Cholesterol i Triglicerydy Wartoci prawidowe: 0,751,25 mmol/1 (1,83 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Ma gnez jest elektrolitem gwnie rdkomrko wym. Jego stenie w pynie pozakomrkowym wpywa na pobudliwo i reakcj nerwowo -miniow, Oglnoustrojowy niedobr mag nezu moe przebiega z prawidowym lub nie wiele zmienionym steniem Mg w pynie poza komrkowym. Maym steniom magnezu w surowicy krwi mog towarzyszy: tyczka, oglne osabienie, zaburzenia orientacji i sen no. Hipermagnezemi stwierdza si w nie wydolnoci nerek oraz po nadmiernym poda waniu (pozajelitowym) soli magnezowych. Hipomagnezemia wystpuje u chorych z przewlekymi biegunkami, w godzeniu, w przewlekym alkoholizmie, niewydolnoci wtroby, przy nadmiernym wydalaniu Mg przez nerki uwarunkowanym podawaniem fekw moczopdnych oraz przy niedostatecznej poday Mg chorym ywionym pozajelitowo. Stenie Mg moe by obnione u chorych z hipokalcemi. W ostatnim przypadku hipo magnezemia moe by przyczyn opornoci hipokalcemii na leczenie duymi dawkami wita miny D i soli wapniowych u chorych z niedoczynnoci przytarczyc.
Magnez (stenie w surowicy krwi)
B. Interpretacja
C. Interpretacja
DODATEK / 923
Mied Patrz Ceruloplazmina Mocznik Patrz Azot mocznikowy Potas (stenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartoci prawidowe: 3,55,0 mmol/1 A. Informacja patofizjologiczna. St enie potasu w osoczu jest determinatorem pobudliwoci nerwowo-miniowej i minio wej. Zarwno due, jak i mae stenia K w su rowicy upoledzaj kurczliwo mini. B. Interpretacja Hiperkalemi stwierdza si w niewydol noci nerek (szczeglnie u chorych z hiper katabolizmem biakowym), niewydolnoci nad nerczy (szczeglnie w hipoaldosteronizmie), hipoaldosteronizmie hiporeninowym, u chorych zaywajcych spironolaktony lub leczonych szybkim doylnym wlewem soli potasowych, triamterenem lub fenoformin. Hipokalemi stwierdza si: a. Przy niedostatecznym poborze potasu (np. w godzeniu). b. W upoledzonym wchanianiu K w prze wodzje pokarmowym (biegunki, wymioty, ze sp wadliwego wchaniania, zaywanie ywicy polistyrenowej). c. Przy nadmiernej utracie potasu przez nerki (pierwotny lub wtrny hiperaldosteronizm, po dawanie mineralokortykoidw, zasad o wica metaboliczna, podawanie diuretykw tiazydo wych, tiazydopodobnych i rtciowych, defekty kanalikowe nerek takie jak zespl de Toni -Debre-Fanconiego i kwasica kanalikowa, tera pia antybiotykami wydalanymi przez nerki jako aniony np. karbenicylina i tikarcylina, leczenie fenotiazynami, amfoterycyn B i lekami zawie rajcymi duo sodu, stosowanie tetracyklin rozoonych. d. W nieprawidowej redystrybucji potasu midzy przestrzeni wodn rd- i pozakomrkow. (poraenie okresowe rodzinne, podawa nie testosteronu). Sd (stenie w surowicy lub osoczu krwi)
Wartoci prawidowe: 136 145 mmol/1. A.
Informacja patofizjologiczna. Na 155 mEq kationw wystpujcych w osoczu 140 stanowi j ony Na+. Sd wraz z towarzyszcymi mu anionami tworz wikszo osmotycznie
aktywnych substancji osocza, decydujcych 0 ruchu wody pomidzy przestrzeni poza 1 rdkomrkow. Utrata sodu przez ustrj lub jego wnikanie z przestrzeni wodnej pozakomrkowej do rdkomrkowej s przyczyn zmnie jszenia objtoci pynu pozakom orkowego, co z kolei wpywa na czynno ukadu krenia, nerek i ukadu nerwowego. B. Interpretacja Hipernatremia wystpuje przy niedo borze wody, tj. w stanach odwodnienia, w ura zach lub chorobach orodkowego ukadu ner wowego, w stanach przebiegajcych z nadmier n sekrecj aldosteronu lub kortykosteronu, Hiponatremi stwierdza si w niewydo lnoci nadnerczy, niewydolnoci nerek, szcze glnie przy niedostatecznej poday sodu, w kwasicy kanalikowej, urazach lub oparze niach (dochodzi do przemieszczenia sodu do komrek), przy duych utratach sodu przez przewd pokarmowy (ostre i przewleke bie gunki, przetoki jelitowe, niedrono jelit) oraz przy obfitych potach (jeeli wyrwnanie strat byo niedostateczne). U niektrych chorych z obrzkami sercowo- lub nerkowopochodnymi stenie sodu w osoczu jest niskie, pomimo prawidowej iloci o g Ino u strj owego Na. Ta paradoksalna sytuacja moe by uwarunkowa na zwikszon retencj wody (spowodowan zwikszon sekrecj wazopresyny) lub (i) prze mieszczeniem sodu pozakomrkowego do prze strzeni rdkomrkowej. Hiperglikemia spora dycznie moe by przyczyn przechodzenia wody rdkomrkowej do przestrzeni pozako mrkowej wywoujc hiponatremi z rozcie czenia. W kocu hiponatremia moe by artefaktem (wwczas mwimy o hiponatremii rzekomej) spowodowanej hiperlipemi lub hiperproteine-mi. W tych przypadkach miejsce czci wody zajmuj lipidy lub biaka, przez co dochodzi do rozcieczenia" sodu zawartego w wodzie oso-czowej o warto wynikajc ze wzrostu lipemii czy proteinemii. W tych przypadkach stenie sodu przeliczone na 1000 ml wody jest prawidowe". Przy oznaczaniu sodu jonoselektywn elektrod stenie Na w surowicach hiperlipe-micznych lub hiperproteinemicznych jest prawidowe, podczas gdy jest obnione przy uyciu metody fotometrii pomieniowej. Przy wzrocie glikemii o kade 5,6 mmol/1 (100 mg/dl) powyej 11,1 mmol/1 (200 mg/dl) dochodzi do obnienia si natremii o 1,6 mmol/1. Efekt ten jest nastpstwem przemiesz-
924 / DODAT EK
czenia wody rdkomrkowej do przestrzeni pozakomrk owej. TBG Patrz Globulina wica tyroksyn TIBC cakowita zdolno bia ek surowicy do wizania elaza (total iron binding capacity) i stopie wysycenia transferyny Wartoci prawidowe: 45 73 (imol/l (250410 ng/dl). Saturacja transferyny elazem: 2055%. A. Informacja patofizjologiczna. W surowicy krwi elazo przenoszone jest biakiem zwanym transferyn (lub syderofilin). W warunkach prawidowych zaledwie 3040% cakowitej pojemnoci transferyny do wizania elaza jest wykorzystane (std mwimy o pro cencie wysycenia transferyny elazem). Procent saturacji transferyny oblicza si wg wzoru TIBC xl00. B. Interpretacja wynikw oznacze TIBC Wzrost TIBC stwierdza si w niedo krwistoci syderopenicznej, u kobiet zaywaj cych doustne leki antykoncepcyjne, w pnej ciy i u niemowlt oraz sporadycznie rwnie w zapaleniu wtroby. N i s k i e T I B C o bs e r wu je s i w s tan ac h chorobowych przebiegajcych z hipoproteine mi (nerczyca, godzenie, nowotwory), w prze wlekych stanach zapalnych i w hemochromao zie (indukowanej licznymi trans fuzjami krwi lub talasemi). ** < C. Interpretacja wynikw ozacze odsetka saturacji transferyny elazem. Zwikszon saturacj stwierdza si w stanach chorobowych przebiegajcych z nad miarem elaza w ustroju (zatrucie elazem, niedokrwistoci hemolityczne, talasemi, he mochromatoza, niedobr pirydoksyny, zesp nerczycowy i sporadycznie zapalenie miszu wtrobowego). Obnion saturacj transferyny ela zem obserwuje si w stanach chorobowych przebiegajcych z niedoborem elaza, w prze wlekych infekcjach, w nowotworach i pniej ciy. Transaminazy -r Patrz Aminotransferazy
Transferyn Patrz TIBC Transpeptydaza tub transferaza -glutamylowa (y-GT) (aktywno w surowicy krwi) Wartoci prawidowe (przy oznaczaniu enzymu w temp. 30C): mczyni <30 mli/ml, kobiety <25 mU/ml, modzie <50 mU/ml. A. Informacja patof Izjologiczna. y-GT jest niezwykle czuym wskanikiem choroby wtroby. Aktywno tego enzymu jest czsto podwyszona u osb wykazujcych prawidow aktywno aminotransferaz i fosfatazy zasado wej. Enzym ten uwaa si za bardziej swoisty od wymienionych dwch enzymw w celu wykrywania poalkoholowego uszkodzenia wtroby. y-GT wystpuje w wtrobie, nerkach i trzust ce. Katalizuje ona przemieszczenie N-kocowe-go kwasu glutaminowego z jednego peptydu na drugi peptyd lub na L-aminokwasy. Ulega on indukcji pod wpywem etanolu. B. Interpretacja. Aktywno tego enzymu jest podwyszona w ostrym zakanym (wiruso wym) lub toksycznym uszkodzeniu wtroby, w przewlekym lub podostrym zapaleniu wtro by, marskoci wtroby, w zastoju ci uwarun kowanym przeszkod rd- lub pozawtrobo w drg ciowych, w nowotworach pierwo tnych lub wtrnych wtroby oraz w alkoholo wym uszkodzeniu wtroby. Sporadyczny wzrost aktywnoci y-GT stwierdza si w za stoinowej niewydolnoci krenia i rzadko, w po nekrotycznej fazie zawau minia ser cowego, w zapaleniu i w raku trzustki. Triglicerydy (stenie w sur owicy krwi) Wartoci prawidowe: 1,65 g/l (165 mg/dl), p. rwnie tab. 4. A. Informacja patofizjologiczna. Triglicerydy zawarte w pokarmach ulegaj hydrolizie w wietle jeiita cienkiego, nastpnie wchanianiu i resyntezie przez enterocyty bony luzowej, a w kocu wydzieianiu do naczy iim-fatycznych pod postaci chylomikronw. Triglicerydy zawarte w chylomi kro pach krwi ulegaj klirensowaniu przez lipaze lipoproteinow tkanek (gwnie tkanki tuszczowej). Powstae pod jej wp ywem produkty rozpadu ulegaj wchanianiu przez komrki i magazynowaniu. Wolne kwasy tuszczowe pochodzce gwnie z tkanki tuszczowej s prekursorami endogennych trigHcerydw wytwarzanych przez wt -
DODATEK / 925
rob. W surowicy krwi endogenne triglicerydy transportowane s z frakcj p-lipoprotein, tworzc tzw, lipoproteiny o bardzo niskiej gstoci (VLDL). Do oznaczenia stenia triglicerydw we krwi naley uywa prbki krwi pobranej 1012 godzin po spoyciu ostatniego posiku. B. Interpretacja. Interpretacje stenia triglicerydw, cholesterolu, cholesterolu frakcji lipoproteinowych (frakcji VLDL, LDL i HDL) naley przeprowadzi^cznie. Zaburzenia w relacjach zachodzcych midzy wymienionymi lipidami mog mie charakter pierwotny lub wtrny. 1 . Wzrost stenia triglicerydw stwier dza st w: a. Hiperlipoproteinemiach pierwotnych tj. w hiperlipoproteinemii typu I, hiperbeta -lipoproteinemii typu Ilb, hiperiipoproteinemii typu III (jest to wzrost VLDL o ruchliwoci elektro for ty cznej beta-lipoprotein), hiperlipoprotei nemii typu IV (hiperlipemia endogenna) oraz w hiperlipoproteinemii typu V (hiperlipoproteinemia mieszana). b. Hiperlipoproteinemiach wtrnych wyst pujcych w niedoczynnoci tarczycy, cukrzycy, zespole nerczycowym, przewlekym alkoholiz mie przebiegajcym ze sthiszczeniem wtroby, taczce zastoinowej, u kobiet zaywajcych doustne leki antykoncepcyjne oraz po zadziaa niu stresu. 2. Mae stenie triglicerydw stwierdza si w hipolipoproteinemiach; a. Pierwotnych (choroba wyspy Tanger wy woana niedoborem a -lipoprotein, abetalipoproteinemia oraz kilka rzadkich i sabo po znanych zespow) oraz b. Wtrnych (spowodowanych wadliwym odywianiem si, wadliwym wchanianiem po karmw w jeiitach lub sporadycznie chorob miszu wtrobowego). Trijodotyronina (T 3 ) wychwyt przez biaka surowicy. Okrelenie wychwytu T 3 przez ywic jonowymienn (RT 3U), okrelenie globuliny wicej tyroksy-n TBG Prawidowe wartoci RT3U, wyraajce wychwyt 12S J-T3 przez ywic jonowo wymienn, wahaj si od 25 do 36%. Przez oznaczanie RT3 U dla surowicy badanej oraz dla zlewek surowiczych pochodzcych od osb zdrowych moliwe jest oznaczenie TBG metod poredni. Iloraz zoony z wartoci RT3U oznaczonej dla surowicy badanej do wartoci RT3U zlewek
surowiczych okrelany jest dalej jako iloraz RT3 U". Normaine wartoci dla tego ilorazu wahaj si od 0,85 do 1,15. A. Informacja patofizjologiczna. U chorych na nadc2ynno tarczycy typu T4 liczba miejsc TBG zablokowanych przez endogenn T4 jest wiksza ni u osb zdrowych. W niedoczynnoci tarczycy zachodzi sytuacja odwrotna, tj. liczba miejsc TBG zablokowanych przez ten hormon jest mniejsza ni u ludzi zdrowych. Trijodotyronina znakowana US I, dodana do zawiesiny zoonej z surowicy badanej i ywicy jonowowymiennej {wzgldnie wgla aktywnego lub talku) w pierwszej kolejnoci wysyca wolne jeszcze miejsca wizania na TBG surowicy badanej, za pozostae czsteczki mI-T3 (nie zwizane przez TBj^f) ulegaj zwizaniu przez ywic lub inna substancj wic. Po rozdzieleniu substancji wicej (ywica, talk, wgiel aktywny) od surowicy, oznacza si radioaktywno tej pierwszej wyraajc j w % oglnej radioaktywnoci dodanej do surowicy badanej (jest to tzw. warto RT3 U). Poniewa ywica (lub wgiel, talk itd.) wie U! I-Tj nie wizan z TBG, aktywno tej ywicy jest tym wiksza, im bardziej wysycona jest TBG endogennym hormonem tarczycy (taka sytuacja zachodzi w nadczynnoci tarczycy) i odwrotnie, radioaktywno zwizku wicego ' 25I-T3 jest tym mniejsza, im sabiej wysycona jest TBG hormonami tarczycy. B. Interpretacja 1. Wzrost wartoci RT,U ora2 ilorazu RT3 U stwierdza si przy duym wysyceniu TBG hormonem tarczycy, tj. w nadczynnoci tarczycy, akromegalii, zespole nerczycowym, w cikiej marskoci wtroby oraz we wrodzo nym niedoborze TBG. 2. Zmniejszenie wartoci RTÛ i ilorazu RT3 U stwierdza si przy maym wysyceniu TBG endogennymi hormonami tarczycy, tj. w niedoczynnoci tarczycy, w ciy, u noworod kw, w zakanym (wirusowym) zapaleniu wt roby oraz we wrodzonej nadprodukcji TBG. Tyroksyna (T 4 ) cakowita (TT 4) (stenie w surowicy krwi) Stenie prawidowe oznaczone metod ra-dioimmu no logiczn wynosz; 65156 nrnol/1 (512 ng/dl), za metod radiokompetycyjn 51142 nmol/1 (411 ug/dl). kowite stenie tyroksyny w surowicy krwi niekoniecznie odzwierciedla efekt biologiczny
A. Informacja patofizjologiczna. Ca-
926 / DODATEK
tego hormonu. Stenia tyroksyny mog si zmienia zalenie od zmian stenia biaek transportujcych tyroksyny (globuliny wicej T4 i prealbumin), stanw fizjologicznych (ciy) i chorobowych oraz pod wpywem niektrych lekw. Prawidowa interpretacja oglnego stenia T4 zalena jest od znajomoci stenia biaek transportujcych ten hormon, lub te wychwytu trijodotyroniny (T3) przez erytrocyty lub ywic wymienn (p. niej). Tylko stenia wolnej T4 i T3 s determinantami efektu biologicznego tych hormonw. B. Interpretacja Wzrost TT4 stwierdza si w nadczynno ci tarczycy, w stanach chorobowych przebiega jcych ze wzrostem stenia biaek transpor tujcych dla tego hormonu (TBG) oraz czasami w fazie aktywnej zapalenia tarczycy i akromegalii. Stenie TT^ jest obnione w niedoczynnoci tarczycy (pierwotnej lub wtrnej) oraz w stanach chorobowych przebiegajcych i cha rakteryzujcych si niskimi steniami biaek wicych T4. Tyroksyna wolna (fT 4 ) (stenie w surowicy krwi) Wartoci prawidowe: 0,010,03 nmol/1 (0,82,4 ng/dl). Stenie tyroksyny wolnej mona okreli, znajc stenie cakowite tyroksyny oraz wychwyt T3 przez ywic. A. Informacja patofizjologiczna. Ak tywno metaboliczna T4 zalena jest od ste nia wolnej tyroksyny. Wikszo T4 ulega kon wersji do T3 w tkankach obwodowych (T3 wydzielana jest rwniaj przez tarczyc). Zarw no T4 , jak i T 3 s biologicznie aktywnymi hormonami. B. Interpretacja Podwyszone stenie fT4 stwierdza si w nadczynnoci tarczycy oraz w aktywnej fazie zapalenia tego gruczou. Mae stenia fT4 obserwuje si w nie ci oczy nn oci tarczycy. Wap (stenie w surowicy) Wartoci prawidowe dla stenia wapnia cakowitego: 2,12,6mmol/l (8,410,4mg/dl), dla stenia wapnia zjonizowanego: 1,051,3 mmol/ (4,25,2 mg/dl). A. Informacja patofizjologiczna. Prawidowe stenie wapnia w ..surowicy krwi i innych pynych ustrojowych jest wynikiem precyzyjnej regulacji endokrynnej i nerkowej oraz
zalena od czynnikw odkowo -jelitowych i ywieniowych. Poniewa znaczna cz wapnia w surowicy krwi zwizana jest z biakami, a szczeglnie albuminami, dokadne okrelenie znaczenia klinicznego wyniku kalcemii oglnej nie jest moliwe przed oznaczeniem proteinemii lub albuminemii. B. Interpretacja Hiperkalcemi stwierdza si; w nad czynnoci przytarczyc, w nowotworach zo liwych wydzielajcych PTH-podobn substan cj, przy zatruciu witamin D, w milk -alkali syndrome", w rozlegej osteolizie spowodowa nej szpiczakiem lub przerzutami nowotworowy mi do koci, w chorobie Pageta, w sarkoidozie Boecka, po duszej immobilizacji ciaa oraz w hipokalcjurii rodzinnej. Sporadycznie hiper kalcemi stwierdza si w nadczynnoci tarczycy lub po stosowaniu lekw tiazydowych. Hipokalcemi obserwuje si w niedo czynnoci przytarczyc, w niedoborze witaminy D (u dzieci z krzywic oraz u dorosych z osteomalacj), w niewydolnoci nerek, w hipoproteinemii, w zespole wadliwego wchaniania (sprue, zapalenie jelita krtego, celiakia, niewydolno trzustki), w cikim zapaleniu trzustki przebie gajcym z martwic oraz w rzekomej niedo czynnoci przytarczyc. Diagnostyczn warto ma rwnie oznaczanie kalcjurii przynajmniej w niektrych choro bach, np. w nadczynnoci przytarczyc. Wodorowglany (stenie w surowicy lub osoczu krwi) Wartoci prawidowe: 2428 mmol/1. A. Informacja patofizjologiczna. Wodorowglanowy ukad buforowy jest jednym z najwaniejszych ukadw buforowych ustroju czuwajcych nad normalnym pH pynw ustrojowych. Okrelenie stenia wodorowglanw i pH we krwi ttniczej stanowi podstaw oceny stanu rwnowagi kwasowo-zasadowej. B. Interpretacja t 1. Wzrost stenia HCO~ stwierdza si: a. W zasadowicy metabolicznej (pH krwi jest podwyszone) spowodowanej zaywaniem du ych iloci wodorowglanu sodowego, dugo trwaymi wymiotami lub niedoborem potasu w ustroju. b. W kwasicy oddechowej (pH krwi jest obniona) uwarunkowanej niedostatecznym wydalaniem przez puca dwutlenku wgla, czyli wzrostem pCO2 krwi (rozedma puc, uszkodze nie warstwy surfaktantu pcherzykw puc -
DODATEK / 927
nych, niewydolno krenia przebiegajca z zastojem w phacach, zaburzenia wentylacji puc o rnej etiologii np. po podaniu nadmiernej iloci lekw uspokajajcych lub narkotycznych) lub niedostatecznym oddychaniu sztucznym. a. W kwasicy metabolicznej (pH krwi tt niczej jest obnionej spowodowanej kwasic ketonow u chorych na cukrzyce, kwasic nileczanow, godzeniem, uporczywymi biegunka mi, niewydolnoci nerek, zaywaniem nadmie rnych iloci substancji zakwaszaj cych, zatru ciem metanolem lub salicylanami. b. W zasadowicy oddechowej (pH krwi tt niczej jest podwyszone) spowodowanej hiperwentylacj (pCO2 jest obnione). Wychwyt trijodotyroniny Patrz Trijodotyronina elazo (stenie w surowicy krwi) Wartoci prawidowe: 931,3 u.mol/1. A. Informacja patofizjologiczna. Ste nie elaza w surowicy podlega wahaniom dzienno-nocnym, przy czym najwiksze stenie stwierdza si w godzinach rannych. Dlatego te oznaczanie syderemii naley wykona w prb kach krwi pobranych rano na czczo. Wiele czynnikw wpywa na stenie elaza w surowi cy. Wrd nich wymieni naley: stopie wcha niania Fe przez nabonek jelitowy, 2apasy ela za w jelitach, wtrobie, ledzionie i szpiku kostnym, nasilenie rozpadu lub utraty hemo globiny oraz synteza hemoglobiny de novo. B. Interpretacja Hipersyderemi stwierdza si w hemo chromatozie, hemosyderozie (spowodowanej li cznymi transfuzjami krwi lub podawaniem du ych iloci elaza), w chorobach przebiegaj cych ze wzmoon hemoliz, w niedokrwistod zoliwej i w niedokrwistociach hipoplastycznych. Czsto stenie elaza w surowicy jest podwyszone w wirusowym zapaleniu wtroby. Rzekom hipersyderemi stwierdza si u cho rych u ktrych podawano elazo doylnie 23 miesice przed pobraniem krwi do oznaczania Fe. Htposyderemi stwierdza si w niedo borze elaza, w infekcjach, nerczycy, przewle kej niewydolnoci nerek oraz w okresach wzmoonej hematopoezy (np. po podaniu erytropoetyny).
2. Obnienie stenia HCO~ stwierdza sie:
PRAWIDOWE.WARTOCI BADA LABORATORYJNYCH Skrty: /B/ krew, /P/ osocze, /S/ surowica, /U/ mocz GWNE SKADNIKI CHEMICZNE KRWI, OSOCZA LUB SUROWICY
Aceton i acetooctan: (S) 3-20 mg/l. Adrenalina p. Epinefryna. Albuminy: (S) 35-55 g/l. Aminotransferazy: Amin otr nsferaza asparaginianowa (AspAT, AST, SGOT). Wartoci prawidowe zale od metody oznaczania. ($J 6 25 IU/1 w temp. 3CTC; SMA, 10-40 IU/1 w temp. 37C; SMAC 0-41 IU/I w temp. 37X. Amin otr nsferaza alaninowa (AIAT, ALT, SGPT). Wartoci prawidowe zale od metody oznaczania. (S) 3-26 tU/l w temp. 30C; SMAC 0-45 IU/I w temp. 37C. Amoniak: (B)<65^moi/I (<110ng/dl) (metoda dyfuzyjna). Amylaza: (S) 80-180 jednostek/dl (Somogyi). Wartoci zalene od metody oznaczania. j-Antytrypsyna: (S)>1,80 g/l Azot mocznika: (S lub P) 2,9-8,9 mmol/l (8-25 mg/di) Biaka cakowite: (S) 60-80 g/l (6-8 g/dl) Bilirubina: (S) cakowita 3,5-20,4 umol/l (0,2-1,2 mg/dl), estryfikowana < 7 u.mol/1 (0,4 mg/dl), wolna<12 umol/l (0,7 mg/dl). Ceruloplazmina: (S) 1,7-2,9 umol/l (25-43 mg/dl). Cinienie czsteczkowe dwutlenku wgla we krwi ttniczej: 4,7-6 kPa {35-45 mm Hg) Cinienie czstkowe tlenu p. Tlen. Chlorki: (S lub P) 96-106 mmol/l. Cholesterol cakowity: (S lub P) 3,9-6,85 mmol/l (150-265 mg/dl)(p. Lipidy frakcje). Wartoci zalene od wieku Cholestarol-estry: (S) 65-75% cholesterolu cakowitego. COa cakowity: (S lub P) 24-29 mmol/l. Cynk: (S) 7,65-22,95 u.mol/1 (50-150 ug/dt). Cyjanokobalamina: (S) 148 pmol/l (200 pg/ml). Dwutlensk wgla cakowity p. C0 2 ca kowity, Epinefryna (adrenalina): (P) <550 pmol/l (<100 pg/ml) w pozycji lecej. Ferrytyna: (S) dorose kobi ety 20-120 \ig/\; mczyni 30-300 |j.g/l, dzieci do lat 15, 7-140 ng/l. Fibrynogen: (P) 2-6 g/l (0,2-0,6 g/dl).
928 / DODATEK Fosfataza kwana: (S) 1 - 5 jednostek Kinga--Armstronga = 0,1-0,63 jednostek Besseya--Lowry'ego. Fosfataza zasadowa: (S) Doroli 5-13 jednostek Kinga-Armstronga, 0,8-2,3 jednostek Bess ya -Lowry'ego; SMA 30-85 IU/I w temp. e C 37 C; SMAC 30-115 IU/I w temp. 37 C. Fosfokinaza kreatynowa (CPK, CK): (5) 10-50 IU/I w temp. 37C. Fosfokinaza kreatynowa-izoenzymy p. lab. 6. Fosfor nieorganiczny: (S, na czczo) 1-1.5 mmol/l (3-4,5 mg/dl). Gsto wzgldna: (B) 1,056 (warto zalena od stenia hemoglobiny i biaek osocza krwi). (S) 1,0254-1,0288 {warto zalena od stenia biaka w surowicy). Globuliny: (S) 20-36 g/l (2-3,6 g/dl). Glukoza: (S lub P) 3,6-6,1 mmol/l (65-110 mg/dl). Haptoglobiny: (S) 0,4-1,1 g/l, [3-Karoten: {S na czczo) 0,9-5,58 umol/l {50-300 ug/dl). Kortyzol: (P) 138-650 nmol/l (5 -25 ug/dl) o godzinie smej rano, <275 nmol/l (<10 Ug/dl) o godzinie smej wieczorem. Kwas askorbinowy: (P) 23-85 um ol/l (0,4-1,5 mg/dl). Kwas foliowy: (S) 4,5-45 nmol/l (2-20 mg/ml), w krwinkach czerwonych: > 318 nmol/l (>140ng/ml). Kwas moczowy: (S lub P) mczyni 180-540 umol/l (3-9 mg/dl), kobiety 150-450 umof/l (2,5-7,5 mg/dl). Lipaza: (S) <150 U/l. Lipidy cakowite: (S) 4,5-10 g/l (450-1000 mg/dl). Lipidy, frakcje: (S lub P), podane stenia cholesterol frakcji HDL; >1,04 mmol/l(>40 mg/dl). ** cholesterol frakcji LDL: <4,68 mmol/l (<180 mg/dl) cholesterol frakcji VLDL <1,04 mmol/l (<40 mg/di), w celu przeksztacenia stenia wyraonego w mg/dl na mmol/l, naley warto pierwsz pomnoy przez 0,026. Mied: (S lub P) 16-37 umol/i (100-200jig/6l). Mocznik: p. Azot mocznika. Norepinef ryna (noradrenalina): (P, pozycja leca) <3 nmol/l ( <500 pg/ml). Osmolalno (molalnos): (S) 280-296 mmol/kg H20 (280-296 mosm/kg H2O). PC03 {B, krew ttnicza) p. Cinienie czstkowe dwutlenku wgla we krwi ttniczej. PBOa p. Hen. pH: (B, krew ttnicza) 7,35 -7,45 (45-35 nmol H+/I). Pirogronian: (B) 70-114 umol/t (0,6-1 mg/dt). Potas (S lub P) 3,5-5,0 mmol/l. Saturacja krwi tlenem - p. Tlen. Sd: (S lub P) 136 -145 mmol/l. TIBC{Scako wita zdolno surowicy dowizania Fe) 44,7-73,4 nmol/l (250-410 ng,/dl). Tlen: cakowita pojemno krwi do wizania tlenu (B) 16-24 vot.%. Warto zalena jest od stenia hemoglobiny. Zawarto we krwi ttniczej 15-23 vol.% (warto jest zalena od stenia hemoglobiny). Wysycenie hemoglobiny tlenem w krwi ttniczej, 94-100% cakowitej pojemnoci. Cinienie czstkowe tlenu w krwi ttniczej Pa0 s10,67-13,33 kPa (80-100 mm Hg) na poziomie morza. Warto zalena od wieku. Transferyna: (S) 23-45 umol/1 (200-400 mg/dl). Transferyna (S): % wysycenia elazem, 20-55%. Trfglicerydy: {S) <1,9 mmol/l (<165 mg/dl). Wap: (S) 2,1-2,6 mmol/l (8,5-10,3 mg/dl). Warto zalena od stenia albumin w surowicy. Wap zjonizowany: (S) 1,05-1,3 mmol/l {4,25-5,25 mg/dl). Witamina A: (S) 0,53-2,1 j^mol/t (15 -60 ug/dl). Witamina B ia: (S): >148pmol/t (> 200 pg/ml). Witamina C p. Kwas askorbinowy. Witamina D: (S): cholekalcyferol (wit. D3) 1,3-47 nmol/l (0,5-18 ng/ml), 25-hydroksycholekalcyferol 19,4-137 nmol/i {8-55 ng/ml), 1,25-dihydroksycholekalcyferol62~155pmol/l (26-66 pg/ml), 24,25-dihydroksycholekalcyferol 2,4-12 nmol/l (1-5 ng/ml). Wodorowglany: (S) 24-28 mmol/l. Zdolno wizania elaza przez surowic p. TIBC. elazo: (S) 9-31,3 umol/l (50-175 ug/dl).
Hormony w surowicy lub osoczu krwi

W okrelonych stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niej podanych hormo nw. W sprawie wartoci prawidowych dla tych hormon w naley zasign konsultacji laboratorium szpital neg. Przysadka mzgowa Hormon wzrostu (GH) Hormon tyreotropowy (TSH) Folitropina (hormon pobudzajcy pcherzyki Graafa) (FSH) Lutropina (hormon luteotfopowy) (LH) Kortykotroptna (ACTH) Pro I aktyn a Somatomedyna C {wytwarzana jest przez wtrob i inne tkanki pod wpywem GH) Hormon antydiuretyczny (ADH, wazopresyna)
DODATEK / 929 Nadnercza: Aldosterori (wartoci prawidowe 56 -250pmol/l), stenie wzrasta w pozycji pionowej. Kortyzol Deoksykortyzol Dopamina Epinefryna (adrenalina) Norepinefryna (noradrenalina) Patrz rwnie; Inne testy laboratoryjne Tarczyca: Tyroksyna wolna (fTJ _ Tyroksyna cakowita (TT,) Globulina wica tyroksyne {TBG} Trijodotyronina (T3) Odwrotna trijodotyronina (rT3) Wychwyt trijodotyronin przez ywic (RT3U) Kalcytonina Przytarczyce: Wartoci prawidowe zalene s od rodzaju przeciwcia anty-PTH uyte do oznaczania. Stenie PTH w surowicy wykazuje korelacj ze steniem wapnia w surowicy. Wyspy Langerhansa trzustki: Insulina Peptyd C Glukagon odek: G astry na Nerki: Aktywno reninowa Erytropoetyna Gonady: Testosteron wolny (nie zwizany z biakami trans portowymi) Testosteron cakowity Estradiol (Ej) Progesteron oysko: Estriol (E3) Gonadotropina oyskowa
W sprawie zakresu wartoci prawidowych dla tych zwizkw naley zwrci si do laboratorium szpitalnego. Hormony nadnerczy i ich metabolity
Katechoiaminy 11,17- Hydroksykortykoidy 17-Ketosteroidy Metanefryna Kwas wanilinomigdaowy (VMA) Zawarto tuszczw w kale Ow Porfiryny Kwas delta-amino-lewulinowy Ko pro porfiryny Uroporfiryny Porfobilinogen Urobilinogen Urobilinogen w kale
PIMIENNICTWO
Friedman RB et al: Effects of diseases on dinical laboratory tests. Clin Chem 1980;26(Suppl 4):1D. HanstenPD, Lybecker LA: Drug effects on laboratory tests. In: Basie & Clinicat Pharmacology, 2nd ed. Katzung BG (editor). Lange, 19S4. Lippert H, Lehmann HP: SI Units in Medicine: An Introduction to the International System of Units WitkConversion TablesandNormal Ranges. Urban & Schwarzenberg, 1978. Lundberg GD, Iverson C, Radulescu G (editors): New read this: The SI units are here. (Editorial). JAMA 1986;255:2329. Powsner EK: SI uantities and units for American medicine. JAMA 1984;252;1737. Scully RE et al: Nonnal reference laboratory values: Case records of the Massachusetts Genera Hos pital. N Engt J Med 1986;314:39. Sonnenwirth AC, Jarett L: Gradwohfs Laboratory Metkods and Diagnosis, 8th ed. Vols 1 and 2. Mosby, 1980.
INNE TESTY LABORATORYJNE

W odpowiednich stanach klinicznych zachodzi potrzeba oznaczania niej podanych zwizkw.
Biochemia
Skrty spotykane w biochemii
A (A)
AA
a-AA ACTH Acyl-CoA

ADH ADH AHG Ala AMP Arg Asn Asp ATP BAL
CAMP
CB6 CBZ
CCCP CCK (PZ)

Cer
cGMP
Cl CMP
CoA-SH
0 II
CPK (CK) CRH (CRF)
CRP CTP Cys D
jednostka(i) Angstroma (10~ 10 m, 0,1 nm) aminokwas a-amino kwas hormon a dren o korty kot rop owy, adrenokortykotropina, kortykotr opina pochodna acylowa koenzymu A (np. butyrylo -CoA) dehydrogenaza alkoholowa hormo n antydiuretyczny (wazopresyna) globulina antyhemofilowa (przeciwhemofilowa) alanina adenozynomonofosforan arginina asparagina kwas asparaginowy adenozyn ot r i f osf ora n dimerkaptopropano l (British anti-lewisite) cykliczny 3',5'-adenozyno mo nofosforan, cykliczny AMP globulina wica kortykosteroidy karbobenzoksy m-chlorokarbo nylocyjanofenylo hydrazon cholecystokinina (pankreozymina) ceramid cykliczny 3',5'-guanozyno mo nofosforan, cykliczny GMP iniojcja acucha cytydyno monofosforan, 5'-fosforybozylocytozyna wolny koenzym A. Nukleotyd zawierajcy kwas pantotenowy i uczestniczcy w przemianie kwasw tuszczowych, zwizkw ketonowych, octanu i aminokwasw acetylo- Co A, aktywny octan. Posta, w jakiej octan jest aktywo wa ny, by mg uczestniczy w rnych reakcjach fosfokinaza kreatynowa kortykoliberyna biako C -reaktywne cytydynotrifosforan cysiei na prawoskretny ergokalcyferol cholekalcyferol 1,25-dihydroksycholekalcyferoi deoksyadenozyna deoksycytgzyna deoksygua noyna kwas deoksyrybonukleino wy dinitrofenol
Da( witamina) D3( witamina) 1,25/OH/ a-D3

dA dC
dG
DNA DNP
SKRTY SPOTYKANE W BIOCHEMII / 931 Dopa DPG DPN dT dTMP dUMP E E.C. EDTA Enz Eq eu FAD FADHa FDA FFA Figlu FMN FP FSF FSH FSHRH (FSHRF) g g Gal GalNAc GDP GFR GH GKRH(GHRF) GHRIH GLC Glc GIcNAc GlcUA Gin Olu Gly GMP GnRH GTP Hb hCG hCS HDL H2folate H^folate His
H M G - Co A 3,4-dihydroksyfenyloalanina * difosfoglicerynian (nazwa bardziej prawido wa bisfosfoglicerynian) nukleotyd difosfopirydyno wy (skrt najczciej uywany NAD) deoksytymidyna d eo ksy ty m id y n o mo n of osf of o ra n deoksyurydynomonofosforan enzym (lub Enz) ukad numeracji enzymw ustalo ny przez IUB kwas etylenodiaminotetraoctowy. Odczynnik uywany do chelatowania metali dwu wartocio wych enzym (rwnie uywany skrt E) rwno wanik jednostka enzymatyczna dinukleotyd flawino adenino wy (posta u tlenio na) dinukteotyd flawino adenino wy (posta zreduko wana) Food and Drug Administratio n wolne kwasy tuszczo we kwas formiminoglutamino wy mo no nukleotyd flawino wy flawoproteina czynnik stabilizujcy fibryn folitropina foliliberyna, hormo n uwainiajcy FSH gram (y) przyspieszenie ziemskie (grawitacja) ga laktoza N-acetylogalaktozamina guanozynodifosforan przesczanie kbuszkowe hormon wzrostu somatoliberyna somatostatyna, hormon hamujcy uwalnianie hormonu wzrostu chromatografia gazowo -cieczowa glukoza N-acetyloglukozoamina kwas glukuro no wy glutamina kwas glutamino wy glicyna guanozynomo nofosf o ra n gortadoliberyna g u a noy n ot ri f osf o ra n hemoglobina ludzka go nadotropina kosmwko wa ludzka somatomammotropina kosmwkowa lipoproteiny o wyso kiej gstoci dihydrofolian tetrahydrofolian htstydyna fi-hydro ksy-p-metylo glutarylo -CoA hydroksylizyna hydroksyprolina dehydrogenaza izocytrynianowa lipoproteiny o poredniej gstoci inozynodifosforan czynnik inicjacji (w syntezie biaek) izoteucyna inozynomo nofosoran, rybo nukleotyd hipoksantyny hydrazyd kwasu i zo ni koty nowego (izoniazyd) inozynotrifosforan
ICD IDL IDP IF Ile IMP INH ITP
W) Iinciemia
932 / SKRTY SPOTYKANE W BIOCHEMII ITyr IU IUB ct-KA kcal ex-KG kJ Km L LCAT LDH LDL Leu LH LHRA (LHRF) LLF LTH Lys M MAO NICH MCHC W1CV Met mol MRF MRH MRIH mRNA MSH MW (MAD IUADH + NADP NADPH NDP NeuAc NTP OA OD P; PCV Pho PIH (PIF) PL PLP PPi PRH (PRF) PRIH (PRIF) PRL monojodotyrozyna dijodotyrozyna jednostka (i) midzynarodowa (e) Midzynarodowa Unia Biochemii a-ketokwas kilokaioria a-ketoglutaran kilodzul stenie substratu, przy ktrym reakcja chemiczna wykazuje poow maksymalnej szybkoci (staa Michaeiisa) lewoskrtny acylotransferaza lecytyna-cholesterol dehydrogenaza mleczanowa lipoproteiny o niskiej gstoci leucyna lutropina, hormon luteinizujcy luliberyna, hormon uwalniajcy lutropin czynnik Laki-Lorand hormon luteotropowy lizyna molarny oksydaza monoaminowa rednia zawarto hemoglobiny w krwince czerwonej rednie stenie hemoglobiny w krwince czerwonej rednia objto krwinki czerwonej metionina mol (e) czynnik uwalniajcy melanotropin hormon uwalniajcy melanotropin hormon hamujcy uwalnianie melanotropiny informacyjny RNA hormon melanotropowy, melanotropina masa czsteczkowa dinukleotyd nikotynamidoacfeninowy posta utleniona dinukleotyd nikotynamidoadeninowy posta zredukowana fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego posta utleniona fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego posta zredukowana jakikolwiek difosforan nukleozydu kwas N-acetyloneuraminowy jakikorWiek trifosforan nukleozydu kwas szczawiowooctowy gsto optyczna fosforan nieorganiczny (orto-fosforan) warto hematokrytowa fenyloalanina prolaktostatyna, hormon hamujcy uwalnianie prolaktyny pirydoksal , fosforan pirydoksalu nieorganiczny pirofosforan prolaktoliberyna, hormon uwalniajcy proiaktyn prolaktostatyna, hormon hamujcy uwalnianie prolaktyny prolaktyna prolina 5-fosforybozylo-i -pirofosforan czynnik krzepnicia XI, czynnik przeciwhemofilowy C czynnik krzepnicia IX, czynnik przeciwhemofilowy B krwinka czerwona zalecane normy ywieniowe rwnowaniki retinotu kwas rybonukleinowy
Pro
PRPP PTA PTC RBC RDA RE RNA
SKRT Y SPOT YKANE W BIOCHEMII / 933 RQ rRNA S (S f)u n its SDA SDS Sr S GOT SGPT SH SLR SPCA SRIH (SRIF) sRIMA ST P T3 T4 TEBG TG T hr T LC T mCa T mG TPN T RH (T RF) T ris tRIMA Trp TSH T vr UDP UDP Gal UDP GIc UDP GIcU A UDP GIuc U MP UT P Vma, V al VH D L VMA V ol% wspczynnik oddecho wy -t rybosomalny RNA jednostki flotacji Svedberga dziaanie swoisto dynamiczne sl sodowa siarczanu dodecylu seryna aminotransferaza glutaminowo -szczawiowooctowa aminotransferaza gl utamin owo -pirogronia nowa grupa s u (f hydry I owa Streptococcus actis R czynnik krzepni cia VII somatostatyna, czynnik hamujcy uwalnianie hormo nu wzrostu rozpuszczalny RNA, bardziej uywany termin to tRIMA temperatura standardo wa (273 K) i cinienie standardo we {760 mm Hg) trijodotyro nina tetrajodotyronina, tyroksyna globulina wica hormo ny pcio we (testostero n i estrogeny) triacyloglicerole (dawniej okrelane jako triglicerydy) treonina J^, chromatografia cienko warstwo wa maksymalne wchanianie wapnia przez kanaliki nerko we maksymalne wchanianie glukozy przez kanaliki nerko we nukleotyd trifosfopirydyny (obecnie okrelany jako NA DP) tyreoliberyna, hormo n uwalniajcy tyreotropine Tris/hydroksymetylo/aminometan, substancja czsto uywana jako bufor transferowy RNA (patrz sRNA) tryptofan tyreotropina tyrozyna difosforan urydyny urydynodifosfoga laktoza urydynodifosfoglukoza kwas urydynodifosfoglukuro no wy kwas urydynodifosfogiukuro no wy mo nofosforan urydyny, urydyno -5'-fosforan, kwas urydylo wy urydynotrifosforan maksymalna szybko walina lipoproteiny o bardzo wyso kiej gstoci kwas wanilino migdato wy % objtociowy
SKOROWIDZ / 935
Skorowidz
Abetalipoproteinemia 301, 326 Acanthosis nigricans 582 Acetoacylokoenzym A 299 Aceton 266 stenie we krwi 927 Acetooctan 266, 269, 368 stenie we krwi 927 synteza 270 2-Aoetylaminofluoren 826 Acetylo-(acylo)-tnalonyloenzym 252 Acetylo-CoA patrz: Acetylokoenzym A Acelylocholina 585, 589 Acctylocholinesteraza 888 N-Acetylogalaktozamitia 171,751 N-Acetylogukc-zamina 171, 751 N-Acetyloglukozoamina 751 Acctyloheksozaminy 171 p-iJ-Acetyloheksozoaminidaza 766 Acetylokoenzym A (Acetylo-CoA) 189, 190. 194. 198, 199, 204, 205, 213, 255, 256 powstawanie z aminokwasw 368 Acetylotransferaza dihydrol ipon i a nowa 213, 214 karnitynowa 261 niedobr 767 Achlorhydria 734 ACP 698 ACTH patrz: Kortykotropina Acydemia, izowalerianowa 381, 384 propiomanowa 384 Acyduria 851 argininobursztynianowa 356 di kar boksy Iowa 265 metylom a I on owa 227, 384, 728 orotowa 441 Acyloglicerol(e) 189, 284 kalabolizm 284 Acylotransferaza, 1 -acyloglicerolo-3-fosforanowa 286 acylo-CoA: cholesterol 319 - diacyloglicerolowa 286 glicerolo-3-fosforanowa 286, 310 lecytyna: cholesterol (LCAT) 289, 303, 319, 322 niedobr rodzinny 328 Adenina 416, 419 Adenowirusy 829 Adenozy]o-5r-monofo5foran 430 5-Adenozylometionina 387, 421 Adenozyna 418, 419 konformacje 419 pochodne 420 Adenozyno-5'-di fosforan 421 Adenozyno-3r-fosfo-5'-fosfosiarczan421 Adenozyno-3'-monofosforan 420 Adenozyno- 5 '-monofosforan 421 Adenozyno-5'-trifosforan 421 Adenozynodifosforan (ADP) 135, 151 a kontrola oddychania 152 Adenozynomonofosforan (AMP) 135 Adenozynomonofosforan cykliczny (cAMP) 197,220,421 AdenozynotTifosforan (ATP) 133, 134, 151wytwarzanie 203 rda w sercu 804 Adenylobursztynian 430 ADH patrz: Wazopresyna ADP patrz: Adenozynodi fosforan Adrenalina 220, 231, 237, 259, 397 biosynteza 395 stenie we krwi 927 Aflatoksyna B, 826 Aglikon 166 Aglutynina kiekw pszenicy 753 AHG 784 AHH 819 Akcelerator konwersji protrombiny 784 ds-Akonitan 199-201 Akonitaza 200, 201 Akromegalia 604
Aktyna 797, 805, 875
s-Aktynina 806 Aktywator plazminogenu tkankowy 790 Aktywno optyczna czsteczki 163 Alanina 39, 204 biosynteza 339 transaminacja 363 a-Alanina 386 p-Alanina 43 - biosynteza 386 Albmizm oczno-skmy, tyrozynazo--dodatni 395 tyrozynazo-ujemny 393, 395 Albinoidyzm otzno-skrny 395 Albumma(y) 261, 298, 408, 773 stenie we krwi 915 Albuminemia 774 Aldehyd(y), glicerynowy 161 izomery 162 D-gliterynowy 165 malonowy 184 tuszczowe 178 Aldolaza 209. 210 B247 treoninowa 367 Aldosteron 632, 633 transport w osoczu 635 Aldosteronizm pierwotny 644 Adozy 161 Aifa-fetoproteina 825 Alkaptonuria 370 Alkohole 178 Alkoholizm przewleky 308 Allopurynol 424, 436
Amantadyna 902 Amenorrhoea 605 Amid kwasu nikotynowego 696 Amidoimidazoloka rboksyamidorybozylo-5-fosforan 429 Aminoacydurie 35 Aminocukry 171 metabolizm 249 - synteza 250 Aminoi midazolobursztynylokarboksyamidprybozylo-5-fosforan 427 Aminoitnfcazolokarboksyaraidorybozylo-5-fosforan 427 Amin oimidazolokarboksylo-rybozylo-5-fosfbran 427 Aminoimidazolorybozylo-5-fosforan 427 Aminokwasy) 13, 189, 190, 193, 234 biosynteza 338 - czciowo niezbdne w poywieniu 343 degradacja 344, 345 dysocjacja 37 egzogenne 35, 191, 331, 337 endogenne 191, 204 glukogenne 358 glukoneogeniczny 352 - grupa, a-aminowa 37 -----e-aminowa 37 -----fenolowa 37 -----funkcyjne 36 -----guanidynowa 37 -----imidazolowa 37 -----a-karboksylowa 37 -----nie ct-karboksylowa 37 -----sabokwane 37 sulfhydrylowa 37 katabolizm 347 -----szkieletw wglowych 357 ketogenne 358 konfiguracja bezwzgldna 36 adunek cakowity 37 metabolizm 121, 190, 191 nie a wane dla metabolizmu ssakw 43 niepolame 39 niezbdne 35, 191, 345, 724, 725 oznaczanie ilociowe 44 podstawowe 35 polarne 39 punkt izoelektryczny 37 rozdzielanie 44 rozgazione, katabolizm 378, 380 oksydacyjna dekarboksylacja 378 ------ zaburzenia metabolizmu 383 rozpuszczalno 38 rwnowagi protonowe 36
936 / SKOROWIDZ
Aminokwasy), sekwencja a struktura Haka 66 synteza 191 temperatura topnienia 38 waciwoci a struktura 43 wymiana midzy narzdowa 351 po posiku 353 ----- w stanie poresorpcyjnym 352 z acuchem bocznym, alifatycznym 39 z atomem siarki 40 - zgrup.kwanlubjcgoamid40 -------- hydroksylow 40 -------- zasadow 40 zawierajce, piercie aromatyczny 41 ----- siark, wady metabolizmu 365 znaczenie biomedyczne 35 zjonizowany 36 a-Aminokwasy 347, 348 nie wystpujce w biaikach ale istot ne w metabolizmie 41 L-a-Aminokwasy 36 Aminolipidy 173 y-Aminomalan, metabolizm 396, 397
Aminopeptydaza(y) 345, 739, 742
Aminoproteinaza 812 Aminotransferaza(y) 158, 204, 347, 396 aktywno w surowicy 913, 927 glutamylo-PRPP, regulacja aktyw noci 432 tyrozyna: a-ketoglu taran 368 Aminy 35 aromatyczne 826 Amobarbital 147 Amoniak 344, 346, 349, 748 czsteczka, dipolama 27 tetraedryczna 27 przemiana w wtrobie 351 stenie we krwi 913, 927 tworzenie w nerkach 350 wydalanie 350 zatrucie 349 Amoniako-liaza histydynowa 117, 121 AMP patrz: Adenozynomoiiofosforan Amylaza 734, 739 aktywno w surowicy 914, 927 trzustkowa 742 Amylo-(l-4)-(l-6)-transglukozydaza 219 Amylo-(l-6)-glukozydaza 220 Amyloid 903 Amylopektyna 169 Amylopektynoza 225 Amyloza 169 Anabolizm 132 Anaerobioza 199 Androgeny 585, 588, 630 biosynteza, schemat 655 mechanizm dziaania 657 przemiana i wydalanie 636 rola fizjologiczna 657 synteza 634 Androstendion 630, 632, 656, 660 Androsteron, a stenie potasu 638 mechanizm dziaania 642 Angiotensydaza 637 Angiotensyna II 585, 589, 636
Anhy draa wglanowa 735 Ankiryna 874, 875 Anoksja 199, 200 Anomery 163 Anseryna 3Sfi, 387 Antybiotyki 167 polipeptydowe 51 Antychymoirypsyna at- 885 Antygen, D 878 rakowo-podowy 825 Anty koagulanty kumarynowe 789 Antymycyna A 152 Antyoksydanty 713, 716 ttj-Antyplazmina 790 3,-Antyproteaza 885 Antyproteaza(y) 885 ctj-Antyproteinaza, niedobr 777 Antytrombina III 789 3,- Antytrypsyna, niedobr 777 stenie we krwi 927 Aparat stop-flow 110 Apoenzym 83 Apolipoproteinemia C-II 302 Apolipoproteiny 295 C303 E3O3 Apomioglobina 72 Apoproteiny 295 APP 903 Arabinoza 171, 424 D-Arabinoza 165 Arabinozylocytozyna 424 Arginaza 361 Argimna 40, 204, 343, 355, 361, 397, metabolizm 388 L-Arginina, kalabolizm 360 Argininobursztynaza 355 brak aktywnoci 356 Argininobursztynian 355 Arsenin 201 Askorbinian 244 Asparagina 40, 350 deaminacja 359 Asparaginaza 350 L-Asparaginaza 351 Asparaginian 204, 355 biosynteza 339 transaminacja 359 L-Asparaginian 125 AspAT 913, 927 Aspiryna 895 AST 013, 927 Astma 583 ctj-AT patrz: dj-Antyproteinaza Ataxia teleangiectasia 475 ATP patrz: Adenozynotrifosforan Atraktylozyd 152, 159 Atrotla miniowa rdze i owo-opuszkowa 898 Autoantygeny 769 Autooksydacja lipidw 184 Autoprzeciwciaa 890 Autoradiografia 547 Awidyna 703 Azacytydyna 5-423 Azaguanina 8-423 Azaseryna 430
Azatiopryna 424 5-Azaurydyna 423 6-Azaurydyna 441 Azot, aminokwasowy, katabolizm 347 bilans, dodatni 344 ujemny 344 katabolizm 353 metabolizm 349 mocznikowy 914 stenie we krwi 927 produkty kocowe przemiany 346 Bakterie jelitowe 748 Bakteriofag(i) 464, 547 lambda 513 Barbiturany 152 Barwniki ciowe, krenie jelitowo-- wtrobowe410 w moczu 412 Benzo-a-piren 826 Biaaczka(i) 845, 885 szpikowa, przewleka 847 Bialko(a) 189, 194 4.1 875 a mikrofotografia elektronowa 68 adhezyjne 880 amyliodowe p 902 bon komrkowych 749 erytrocytw 873
ero 525
degradacja 344 --szlaki 346 -------szybko 345 denaturacja 62, 66 funkcje 60 G883 globuiarne 59 grupy modyfikowane 67 hemowe 70 - jako 345, 725 katabolizm 344, 345 klasyfikacja 59 kompleksy wielkoczsteczkowe 66 monomery 66 niehemowe zawierajce elazo 117 okres poowicznego rozpadu 345 oligomery 65 osocza 193, 749 cakowite 771 oznaczanie masy, czsteczkowej 68 pasma I 874 podjednostki 66 pokarmw 190 polimorficzne 773 protomery 66 przemiana, a insulina 681 przenoszce, acyl 252 -----estry cholesterolu 303, 322 -----skwalen i sterole 318 rozpuszczalno 59 sekwencja aminokwasw 65 a struktura drugo- i trzeciorz dowa 66 stenie we krwi 914, 927 struktura, p 64, 65 czwartorzdowa 65, 69
SKOROWIDZ / 937
Biaiko(a), struktura, czynniki stabilizujce 61,'62 -------- badanie 68 ----- drugorzdo wa 65 --------- badanie 67 ----- glob ularna 65 helikalna 62 heliks a 65 - ac ucha pofado wanego 64 pierwszorzdowa 60, 65 --------- oznaczanie 67 ----- tr jwy miaro wa 60? ----- trzeciorzdo wa 65 --------- badanie 67 ----- zakrty (3 65 ---- zwo ju przyp adko wego 65 synteza, elongacja 502, 503 inicjac ja 500 - terminac ja 502, 504 tkanko we 190 warto energetyczna 723 wizania elektrostatyc zne 62 wice, kwasy tuszczowe 261, 299 waciwoci fizyczne 60 - wkienko we 60 wymiana 344 anio n w 874, 875 - zapotrzebo wanie 725, 732 znaczenie b io medyczne 59 elazosiarko we 148, 149 Bib lioteka geno mo wa 536, 547 Bielactwo oczne 395 Bilans azoto wy, dod atni 344 ujemny 344 Bilirubina 407 bezporednia 409. 411 porednia 411 sprzo na 409, 411 stenie we krwi 915, 927 transport 409 wolna 411 wychwytywanie przez wtrob 408 wydzielanie 409 Biliwerdyna IX- 407 Bioenergetyka, znaczenie bio medyczne 131 Biofosfatydyloglicero l 179 Bio mo lekuly, analiza metabo lizmu 22 izo lo wanie 20 metody, o kre lania struktury 21 -----rozdziau 21 Biopolimery, g wne 16, 17 Biotyna 227, 251,702 1,3- Bisfosfogljcerynian 210, 211, 212 2,3- Bisfosfoglicerynian 78 Blotling 537 Blona(y), ko mrko we, budo wa 172 lip idowe 186, 187 mitochond rialne 179 przenoniki 157 r wno waga, elektryc zna 158 osmotyczna 158 -----transport, anio n w 159 ------ katio n w i 60 - ukad y transpo rtujc e 159 przewodzenie bodcw nerwo wych 568 Blona(y), struktura 43 systemy transporto we 565 sztuczne 556 Bonica 507 Bonnik 170 BMAA 901 Bradykimna 51, 881 Brak miesiczki 605 Bro mocyjan 55 Buforo wanie 32 Bufory 31 a- Bungaroto ks yna 889 Bursztynian 107, 199, 201 Cho roba(y), Add isona 609, 643 Alzheimera 902 przyczyny 904 Andersena 225 auto im muno logic zne 889 beri-beri 694 chro moso malne 846 Cori 225 Cro hna 773 F arb era2 9 2 Forb esa 225 G auc hera 292, 845, 851 genetyczne, 848 ----- diagnostyka 92 ----- leczenie 850 ----- testy 850 vo n G ierkego 225, 440 - Gravesa-Basedo wa 582, 618 Hartnupw 377, 387, 698, 728, 734, 747 - hemS Styc zna no worod k w 879 Hersa 225 Hu mingto na 892 jedno geno we 846 - Krabbego 292 miszu wtrobowego 32S moczu o zapachu syropu klonowe go" 383 niedo krwienna serca 325, 727, 847 Niemanna-P ic ka 292 Parkinso na 897, 899 Pomp ego 225 receptoro we 583 Refsuma 265 Sand hoffa 292, 766 - spic hrzania cystyny 366 -----gliko lip id w 284 -----lip idw 293 szero kiego pas ma p 327 Tarui'ego 225 Tay-Sac hsa 292, 766, 844 trzewna 747 - up o led zo nego us uwan ia remna n tw 327 wieco wa 325, 727, 847 W ilsona 388, 776, 846 Wo lmana 327 wtrt w ko mrko wych 761, 767, 844 wymio tna jamajs ka 265 wyspy Tangier 326 ziarnicza przewleka 884 C hro m 730 zapo trzebo wanie 732 Chro mato grafia 21, 44, 52 bibuo wa 44 -----dwuwymiaro wa 46 cieczowa, wysokoci nienio wa w fa zie od wrconej 52 cienko warstwo wa 46, 185, 186 gazowa 751 - gazo wo-c ieczo wa 185 hydrofobo wa 88 jo no wymienna 46, 87 podziao wa 45 powino wactwa 88, 751 z barwnikie m jako ligand em 88
cAMP patrz: Adenozyno mo nofosforan cykliczny CAP 511 CBG 629 CC K p atrz: C ho lec ysto kinina C DP patrz: C yIyd ynod ifos foran CDP-Diacyloglicero lo- iransferaza inozyto lo wa 286 C EA 825 Celiakia 747 Celobioza 168 Celuloza 170 Centro mer 460 Ceramid 181, 293 bios ynteza 290 Cerebrozydy 290 w b onach 551 Cerulop lazmina 776 stenie we krwi 916, 927 cG MF p atrz: G uano zyno -3', 5'-mo nofosforan Chimera 547 Chityna 170, 171 Chlo rki 729 stenie we krwi 916, 927 Chlorofil 398 Chio niak(i), Burkttta 834 Cho lecystokinina 585, 691 Cho lekalcyfero l synteza 714 Cho lera 590, 844, 855 Cho lestaza 328 Cho lestero l 182,183. 189, 190,191,294, 631, 632,634, 660 biosynteza 314, 317 regulac ja 318, 319 r wno waga, w ko mrce 320 w tkankac h 319 stenie we krwi 916, 927 a dieta 325 a leki hipolipemizujace 326 --------a styl yc ia 326 transport 320 odwrcony 322 w b o nac h 552 wydalanie 322 Cho lestero logeneza 190 Cho lestyramina 326 Cho lina 179, 181, 307, 889 Cho ndroityno-4-s iarczan 764 Cho riocarc ino ma 669 Choroba(y), a b iochemia 843
938 / SKOROWIDZ
Chromatydy 460 Chromatyna 456 Chromosom(y), PhiJadelphia 834 politeniczne 459 Chrzstka 764 Chylomikrony 193, 295, 299 katabolizm 301 resztkowe 302 Chyluria 746 Chymotrypsyna 738 dziaanie, etapy reakcji 111 mechanizm U0 system przekazywania adunku 112 Ciako(a) Heiza 871 Ciao(a) ketonowe 190, 191, 194, 260, 266268, 331 utlenianie 334 Cia 664 stenie, hormonw prawidowe 665 Cinienie czsteczkowe dwutlenku w gla we krwi 927 CK. patrz: Fosfokinaza kreatynowa CLIP 607 Clomid 668 CMP patrz: Cytydynomonofosforan CoA patrz: Koenzym A COMT 645 CoQ patrz: Koenzym Q CPK patrz: Fosfokinaza kieatynowa CRBP 712 CRH patrz: Hormon uwalniajcy kor tykotropin Crossing-over 463 CS patrz: Somatomammotropina fcosmwkowa CT patrz: Kalcytonina CTP patrz: Cytydynotrifosforan Cukrzyca 237, 260, 267, 268, 298, 335, a zama 247 niewyrwnana 307 typu I z kwasic ketonow 862 typu II 583 Cyjanki 147, 152 ^ Cyjankobalamina, stenie we krwi 927 Cykl(e), adenozynotrifosforan/adeno-zynod i fosforan 135, 136 alaninowo-glukozowy 235 Cori 234 glukoza-alanina 234, 352 glukoza-kwasy tuszczowe 333 hydroksylacyjny 144 koenzymu Q 155 kwasu cytrynowego 135, 148, 189, 191, 194, 198, 199, 200, 20i, 205, 216, 226, 271 ----- a glikoliza 213 rola w metabolizmie 203 ------- wytwarzanie ATP 203 kwasu mlekowego 235 miesiczkowy 663 mocznikowy 353, 355 nukleotydw purynowych 422 pentozofosforanowy 189. 191, 87i, 883 substratowe 233
678, 726, 734
Cyklaza, adenylanowa 220, 311, 421, 589, 595, 792 ------ w bonach 554 guanylanowa 595 guanylowa 422 Cykloheksymid 506 Cyklooksygenaza 279, 280 Cynk, rola, niedobr 731 stenie we krwi 927 zapotrzebowanie 733 Cystationina 377 Cysteina 40, 204, 369, 388 biosynteza 340 transami nacja wstpna 365 zapotrzebowanie 725 L-Cysleina. katabolizm 364 Cystyna 40, 41, 363 Cystyno-lizynuria 365 Cystynoza 366 Cystynuria 365 Cytarabina 424 Cytochrom(y) 148, 199, 399 aa3 140 b-245 883 b, 144 b-558 883 P-448 819, 826 P-450 139,144,631, 818 jako dehydrogenazy 142 Cytopiazma 194 Cytoszkielet 805 Cytozol 194 Cytozyna416, 419,449 pochodne 423 Cytrulina 42, 355 Cytrulinemia 356 Cytrynian 159, 194, 198, 199,200,201, 204, 205, 258 klomifenn 668 translokacja 256 Cytydyna 418, 419 Cytydynodifosforan (CDP) 286 Cytydynomonofosforan (CMP) 286 Cytydynotrifosforan (CTP) 137, 286 Czsteczka, aktywno optyczna 163 amoniaku, dipolarna 27 tetraedryczna 27 biegunowa 27 asocjacja 28 dipolarna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 ----- tetraedryczna 27 Czenko fosfokreatynowe 136 Czynnik(i), aktywujcy pytki krwi (PAF)284, 287, 881,894 ------- biosynteza 288 antyhemofilowy, A 784 B 784 chemotaktyczne 880 Christmasa 784 Hagematia 784 - krzepnicia krwi 784, 785 lipotropowy 307 poprzedzajcy tromboplastyn osoczow 784 Rh878
Czynnik(i), rho 479 stabilizujcy, fibryn 784 - Stuarta-Prowera 784 ukadu dopeniacza 881 von WiUebranda 791, 882 wewntrzny 704 brak 704 wzrostowe hemopoetyczne 868 fibroblastyczny 585 insulinopodobne 585, 837 polipeptydowe 837 ----- komrek nerwowych 585, 599, 837 ------ naskrkowy 585, 837, 838 nerwowy 585, 837 ----- pochodzenia pytkowego 585, 838 ----- transformujcy 837 nerww 585, 599, 837 DAG patrz: Diacyloglicerol Daktynomycyna 826 DBH645 Deaminacja 190, 191, 193, 203 oksydacyjna 348 Deaminaza. adenozyn owa, niedobr 440, 542, 885 Defenzyny 881,883 Degradacja, Edmana 54 enzymu 119 Dehydrataza, serynowa 121 7-Dehydrochoiesterol 714 Dehydroepiandrosteron (DHEA) 629, 630, 632, 666 Dehydrogenaza(y), acylo-CoA 142, 262, 695 a koenzymy nikotyn oamidowe 141 aldehydowa 140, 695 alkoholowa 117, 308 bursztynianowa 107, 142,201,202, 216 dihydrolipoilowa 696 dihydroorotanowa 434, 435 6-fosfoglukonianowa 241 gliceraldehyd o- 3- fosforanw a 1 57. 209,210, 212, 216 glicerolo-a-fosforanowa 121, 157, 209, 210, 212, 216 glicerolo-3-fosforanowa 157, 229, 595 glukozo-6-fosforanowa 121, 241 niedobr 866, 871 glutaminianowa 338 L-glutaminianowa 349 glutaranowa 216 L{ + )-3-hydroksyacylo-CoA 264 3-hydroksymalanowa 157 15-hydroksyprostaglandynowa 281 3p-hydroksysteroidowa 653 17-fMiydroksysteroidowa 654 1MP 429, 430 ----- regulacja aktywnoci 432 izocytrynianowa 200, 201, 216, 255 jabczanowa 158, 201, 202, 216 dekarboksylujca 255 ot-ketoglutarowa 201, 202
SKOROWIDZ / 939
(>eh v d rogenaza(y), mi Eochondrialna glicerolo-3-fosforanowa 142 mleczanowa 209, 212, 396, 696 - izoenzymy 90, 917 ------ stenie we krwi 917 NADH 142. 150, 696 pirogromanowa 128, 205, 213, 214, 232, 310, 595,685 - regulacja aktywnoci 214. 215, 258 przenoszenie wodoru 141 semialdehydu burszryniauowego 396 sorbitolowa 247 sukcynylowa 695 transport elektronw 141 utlenianie metabolitu 141 - zalene od, NAD 141 NAD+, oznaczanie 86 NADH 142, 150,696 NADP 142 -----ryboflawiny 142 Dekarboksylacja oksydacyjna 200 Dekarbok sy I aza, S- adenozyl ometion i -nowa 390 L-aminokwasw aromatycznych 388 - DOPA 397 - rola 647 L-gLitaminianowa 396 histydynowa 388 a-ketokwasowa 383, 384 omitynowa 390 oro ydy la nowa, niedobr 441 pirpgronianowa 1J 7 uroporfirygenowa 400, 402, 403, 404 Deksametazon 632 Dekstroza 164 Dekstrynoza, graniczna 225 Dekstryny 161, 170 Demekolcyna 810 Denaturacja, biaka 66 DNA 447 enzymu 100 2-Deoksy-D-rybofuranoza 167 Deoksyadenozylokobalamirja 704 Deoksy adenozyna 419 2' -Deo ksyadenozyno- 5 - monofosforan 420 Deoksyadenylan 443 Deoksycukry 167 Deoksycytydylan 443 Deofcsycytydyna 419 Deoksyguanozyna 419 Deoksyguanylan 443 11-Deoksykortykostcron 632 11-Deoksykortyzol 632 Deoksynojirimycyna 761 Deoksynukleotydy 443 Deoksyrybonukeazy 488, 739, 742 Deoksyrybonukleotydy 419 Deoksyryboza lf>6 Depreml 901, 902 Depurynacja DNA 473 A*-Desaluraza 275, 276 Desmina 811 Desmolaza, cholesterolowa, niedobr 644 Desmosterol 318 Detoksykacja 818 DHEA patrz: Dehydroepiandrosteron DHT patrz: Dihydrotestosteron Diacyloglicerol (DAG) 180, 597, 791, 883 Diagnostyka prenatalna 545 hemofilii 790 w chorobie Huntingtona 892 Diazonorleucyna 430 Dietylostylbestrol 667 Difosfohydroksyetylotiamina 214 Difosfotiamina 214 Diglukuronid, bilirubiny 409 Dihydrodiol 822 Dihydrofolian 435 Dihydroksyaceton 161, 164 Di hyd rok syacetono fosforan 157, 210, 286 1,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 24,25-Dihydroksycholekalcyferol 715 3,4-Dihydroksyfenyloalanina 42 Dihydroorotaza 122, 434, 435 Dihydrotestosteron (DHT) 653, 656, 660 Diizopropylofluorofbsforan 891 Dijodotyronina (DIT) 3,5-Dijorozyna 42 Dijodotyrozyna 612, 613 Dikumaroi 719, 789 Dimerkaptol 152 N6-Ne-Dimetyloadenina 416 Di nitrofenol i 52 Dinukleotyd, adenin owy 696 flawinoadcninowy (FAD) 140, 203, 69i flawinowy 695 nikotynoamidoadeninowy (NAD+) 83, 141, 203 Dioksygenaza(y) 144 homogentyzynowa 144 3-hydroksyamranilanowa 144 4-hydroksyfenylopirogronianowa 368 L-tryptofanowa 144 1,2-Dioksygeneza homogentyzynianowa 368, 370 2,3-Dtoksygenaza tryptofknowa 375, 399 Dipalmitoiiofosfatydylocholina287 Dipalmitoilo lecytyna 179 Dipeptydaza(y) 742 aminoacylohistydynowa, niedobr 387 Dipol 27 Disacharyduria 745 Disacharydy 161, 168, 169 Disulfiduria merkaplomleczano-cysteinowa 365 DIT patrz: Dijodotyromna DNA patrz: Kwas deoksyrybonukkotydowy Dolichol 184, 318, 756 biosynteza 316 Dolicholo-P-oligosacharyd 758 Dppa 42 Dopa a- 901 Dopamina 600 Dwutlenek wgla 189, 190, 194. 198, 205 Dyfrakcja, promieniami X 21 Dyfuzja, bierna 563 prosta 743 uatwiona 565 Dyneina 810 Dysbetalipoproteinemia rodzinna 327 Dysgeneza gonad 669 Dyslipoprotcinemie 326 Dysmutaza, ponadtlenkowa 145, 146, 870, 883 Dysocjacja wody 28 Dystrofia, miniowa typu Duchenne'a 794, 847, 860 miotoniczna 898 Dziedziczno 443 Edrofonium 891 Efekt, Bohra 77, 78 buforujcy 33 Pasteura 232 Efektor(y) allosteryczne 123, 125, 196 ujemny 124 EGF 585 Egzocytoza 571 Egzonukleaza 474, 547 Eikozanoidy 174,881, 894 biosynteza 279, 280 Ekscytytotoksyny 892 Eksony484, 491, 530, 547 Eksplozja tlenowa 883 Ekspresja genu 508 Elastaza 738, 885 Eiastyna8I4 a kolagen, rnice 815 Elektroforegram 47 Elektroforeza 21, 771 w elu poliakryloamidowym 53 wysokonapiciowa 47, 52 na sitach molekularnych 53 SDS-PAGE 872 Elektrolity 26 Elektrony przenoszenie 141 przez cytochromy 142 w acuchu oddechowym 142 Eliptocytoza dziedziczna 876 Emulsje 186, 187 Encefalopatia 147 motochondialna 896 Wernickego 694 Endocytoza 569 Endoglikozydaza 752 Endonadtlenek 184 Endonukleaza(y) 488, 531, 547 apirymidynowa 474 apurynowa 474 restrykcyjne 92, 489 Endopeplydazy 345 p-Endorfiny 575, 607 Endorfiny, struktura i funkcja 609 Energia swobodna 131 Enkefaliny 691
940 / SKOROWfDZ
Enolaza 209, 211 Entalpia 132 Enteroglukagon 691 Entropia 131 Etizym(y), aktywno, a jony metali 115, 116, 117 ----- a modulatory 109 ----- a oznaczanie iloci 86 ----- a pH 100 ----- a temperatura 100 ----- hamowanie, kompetycyjne 108 ---------kooperatywne 135 ----- kumulatywne 125 - przez sprzenie zwrotne 121 127 -----------wielowartokiowe 125 inhibitor, allosteryczny 126 zwrotny 124 ----- katalityczna, regulacja 122 ----- regulacja 118 aktywowane przez metale 115 allosteryczne 125 ----- kinetyka wizania substratu 126 wizanie substratu, kooperaty wne 126, 127 analiza ilociowa 86, 87 biosyntezy hemu 404 degradacja 119, 345 regulowanie 121 denaturacja 100 dziaanie mechanizm 84 hydrolityczne, miejsca katalityczne 99 indukcja 118 inhibitory, kompetycyjne 107 ----- niekompetycyjne 107 -------- nieodwracalne 109 ---- odwracalne 109 jako katalizatory kwasowo-zasadowe 114, 115 kinetyka nasycenia substratem 106 klasyfikacja 82 kobal amidowe 117 kompartmentacja 122 kompleksy wielkoczsteifcijowe 123 konstytutywne 120 mechanizm dziaania 110 ----- a dowiadczenia stop-flow 110 ----- a jony metali ! 16. 117 - miejsca aktywne 97 ------- allosteryczne 124, 125 ---- a inhibitory 107 ----- foslbrylacji 137 - katalityczne 97, 99, 125 -------a inhibitory 107 model, indukowanego dopasowa nia si 98 ----- zamka i klucza 98 modyfikacja kowaiencyjn a 196,197 nazewnictwo 82 obrt metaboliczny 120 oczyszczanie 87, 88 odgaziajcy 220 oligomeryczne 90 osocza, analiza ilociowa 91 i ----- niefunkcjonalne 91, 92 ----- wykorzystaniediagnostyczne92 Enzymd1}, powinowactwo do substratu 106 procesw syntez 197 przeksztacajcy angiotensyn 637 reakcja, zastpienia 94 ----- a stenie substratu 101, 103 ----- szybko pocztkowa 103, 104 regulacja, aktywnoci 118 przez modyfikacj kowalencyj n 127, 128 ----- mechanizmy 119 ----- nieprawidowa w komrkach nowotworowych 118 przez efektory allosteryczne 123 ----- przez kationy 123 przez koenzymy 123 przez metabolity 123 ----- przez sprzenie zwrotne 123, 124, 127 przez substraty 123 ----- przez syntez proenzymu 122 regulatorowe 123, 195 restrykcyjne 93 rozgaziajcy 219 rozmieszczenie w komrce 89 rozszczepiajcy cytrynian 122 rwnowaga, dynamiczna 121 sprawno katalityczna 122 stan przejciowy 94, 95 zmiany wolnej energii 95 struktura czwartorzdowa 69 swoisto 85 ----- optyczna 85 synteza 119 derepresja 120 ----- induktory, gratisowe 120 ----- korepresory 112 ----- represja za pomoc, katabolitu 120 ----------- produktu 120 szlaku degradacji 197 wtroby szczura, adaptacja do zmian w rodowisku 121 wizanie substratu 114 zmiana adunku 101 znaczenie biomedyczne 82, 94 Epimeraza 248 urydynodifosfogalaktozowa 290 3-Epimeraza rybulozo- 5-fbsforan owa 241 Epimcry 164 Epinefryna, stenie we krwi 927 Epoksydaza, skwalenowa 317 Epoksydy 822 Ergokalcyferol 714 Ergosterol 183 Ergotioneina 386, 388 Erytrocyt(y), biaka bony 873 budowa i funkcja 866 metabolizm 869 sierpowaty 81 uwalnianie tlenu 213 Erytrokruoryny 399 Erytropoetyna 837, 867, 885 Erytroza 161 D-Erytroza 165 Erytruloza 161 Esteraza cholesterolowa 319 Estradiol 632, 653, 656 rozwj gruczou sutkowego 666 17-P-Estradiol 631, 661, 663 Estriol 632, 666 Estrogeny 585, 588, 660 biosynteza 660 funkcja 664 mechanizm dziaania 668 metabolizm 661 syntetyczne 667 Estron 632, 656 Estry cholesterolu 294, 295 osocza 322 Estryfikacja 190, 308 Etanol 307 zatrucie 858 Etanolamirta 180 Elanoloamina 180 Etiocholanon 632 N-Etylomaleimid 159 17ct-Etynyloestradiol 667 Euchromatyna 459 Eumelaniny 394 FAD patrz: Dinukleotyd flawinoadeninowy Fagi 534 Faza, folikularna. 663, 664 lutealna 663, 664 Fenolaza 140 Fenotiazyny 802 Fenyloalanina 41, 204 hydroksylacja 371 katabolizm szlaki alternatywne 373 zaburzenia 371 metabolity 372 - zapotrzebowanie 725 Fenyloizotiocyjanian 56 Fenyloketonuria 13, 542, 847, 848, 851 klasyczna 371, 372 Feomelaniny 394 Ferrechelataza 400, 401, 403, 404 Ferryna stenie we krwi 927 Ferrytyna 775 FGF 585 Fibronektyna 814, 882 hibryna 787, 790 Fibrynogen 784, 785, 787 -- stenie we krwi 927 Fibrynoligaza 784 Fibrynopeplydy A 787 Filamenty porednie 811 Fi lani i na 806 Filtracja elowa 21, 52, 87 Flawina 695 Flawoproteina{y) 140, 148, 199, 202, 348 przenoszca elektrony 142, 264 Horyzyna 237 Fluor 731 zapotrzebowanie 732 ' Fluorescamina 44 l-Fluoro-2,4-di nitrobenzen 54 Fluorocytrynian 200, 201
9ct-Fluorokortyzol 632 5-Fluorouracyl 423, 436 FMN patrz: Mononukleotyd flawinowy Folacyna 705 Folkropina (FSH) 585, 599, 657, 784 -- dziaanie 606 spermatogeneza 657 'ormamidaza 375 Fo rmyloglicynoatnid orybozy I o- 5-fosforan 427 Fosfagen(y) 135, S03 Fosfataza(y) 740
- biaek 128 biaek-1 220, 221, 223, 224
2,3-bisfo5foglicerynianowa212,213 fosfoprotein 594 2p-fosfoproteinowa 595 kwana, aktywno 918, 928 gruczou krokowego 825 zasadowa aktywno 918, 928 Fosfatydan 286 5-Fosfatydylo-l-pirofosforan(PRPP) Fosfatydylocholiny 179 metabolizm 289 Fosfalydyloetanoloamina 179 3-Fosfatydyloetanoloamina 180 Fosfatydyloglicerol 179 Fosfatydyloinozytol 180 Fosfatydyl o inozy tol o-4.5-bisfosforan 180, 791 Fosfatydyloseryna 180 Fosfodiesterazafy) 220. 422, 593, 685 CAMP421 cyklicznego, 3', 5'-nukleotydu 311 ---- nukleotydu 595 Fosfoenoiopirogronian 194, 204, 211, 212, 226 Fosfofruktokinaza 209, 210, 212, 246 Fosfofruktokinaza-1 232 Fosfofruklokinaza-2 232 Fosfoglicerole biosynteza 286 Fosfoglicerydy 179, 180 2-Fosfoglicerynian 211 3-Fosfoglicerynian 210, 211, 212 Fosfoglukomutaza 217 Fosfohydrolaza fosfatydanowa 286 hosfoinozytydy 594, 596 Fosfokinaza kreatynowa 803, 919, 928 Fosfokreatyna 136 Fosfolipaza(y) 2S7, 289, 740, 742 A, 289 Aj 289, 595, 739 C289 C597 C791
C883
D 289
Fosfolipidy 173, 179,187, 289, 294, 302 glicerolowe biosynteza 287 pytkowe 7S4 w bonach 551 4'-Fosfopanteteina 698 Fosfoproteiny 592 Fosfor 729 nieorganiczny stenie we krwi 919, 928
Fosfor, zapotrzebowanie 733 Fosfbran(y). dinukleotydu nikotyno-amid o-adeni nowego (NADP+) 141, 239,240, 241, 255,696 kreatyny 803 organiczne bogatoenergetyczne 133, 134, 199 ----- energia swobodna hydrolizy 134 ----- maoenergetyczne 134 pirydoksalu 347, 700, 702 5-Fosforybozulo-l-pirofosforan 427 Fosforybozylacja wolnej puryny 430 Fosforybozylotransferaza, adeninowa 430 hipoksantynowo-guaninowa 430, 431,440 orotanowa 434, 435, 436 -----niedobr 441 Fosforylacja, oksydacyjna 135, 147, 151, 191, 199, 803 subsLratowa 216 wielomiejscowa 225 Fosforylaza 685 a 197, 225 b220 glikogenowa 128 nukleozydowa puryn niedobr 440 w miniu 222 Fosfotransferaza 117 Fragmenty Okazaki 468 Frakcja{e), cytoplazmy 20 jdrowa 20 mikrosomalna 20 mitochondrialna 20 wewntrzkomrkowe 20 Frakcjonowanie, subkomrkowe 18 za pomoc soli 21 Fruktokinaza 247 Fruktoza 161, 247 metabolizm 245, 246 nietolerancja wrodzona 247 D-Fruktoza 164, 166 Fruktozo-1,6-bisfosfataza 121, 227, 243, 247 niedobr 237 Fruktozo- 1,6-bisfosforan 210, 227 fruktozo- 2,6- bisfosfataza 232, 685 Fruktozo-2,6-bisfosforan 232, 233 Fruktozo-6-fosforan 210, 227 6-Fruktozo-2-kinaza 685 Fruktozobisfosfataza 121 Fruktozuria samoistna 239, 247 Fruktozydoza 292 FSH patrz: Folitropina Fukoza 751 L-Fukoza 167, 171, 172 Fukozydaza 767 Fumaran 107, 194, 199, 201, 202, 204, 355, 36S Fumaraza 202, 220
J3 a laktoza 161. Ti szlak przemiaay 9BH test tolerancji 14* D-Galaktoza 165, 166 a-D-Galakioza 164 Galaktozamina 167. 250 Galaktozemia(e) 239, 249, Ul Galaktozydaza 752 p-Ga laktozydaza 766 Galaktozydy 167 Galaktozyloceramid 181, 290 Galaktozylotransferaza 554 Gangliozydoza uoglniona 292 Gangliozydy 172, 181, 182, biosynteza 291 w bonach 551 GAP 599, 600 Gastroenteropatia z utraty biaka 773 Gastryna 585, 691 Gemfibrozyl 326 Gen(yjânnplirikacja 835 chimeryczne 523 ekspresja 508 fuzyjne 523, 588 hamujce wzrost nowotworu 839 homologiczne polimorfizm dugoci fragmentw restrykcyjnych 93 indukowatny 510 insuliny 677 mapowanie 541 MT-PK 898 regulacja ekspresji 516, 518 metody 518 Z 512 Genom mitochondriaJny mutacje 847 Gsto wzgldna 928 GH patrz: Hormon wzrostu GHRH patrz: hormon uwalniajcy hormon wzrostu GHRIH patrz: Hormon hamujcy uwalnianie hormonu wzrostu GIP patrz: Peptyd odkowy hamu jmy Giraza bakteryjna 447 GIcNAc-difosfo-dolichol 757 Gliceraldehydo-3-fosforan 210, 211,
239
CAG patrz: Glikozaminoglikany Galactorrhoea 605 Galaktocerebtozyd 181 Galaktokinaza 248
Glicerofosfolipidy 173 Glicerofosforan 194 Glicerol 194, 227, 234, 334 Glicerolo-2,3,-bisfosforan 212 Glicerolo-3-fosforan 157, 308 Glicerolofosfolipidy degradacja 287 Ghcyna 39, 204, 363, 397, 400 biosynteza 339 katabolizm 362 Glicynoami dorybozylo- 5-fosforan427 Glicynuria 362 Glikoforyna(y) 172, 874, 875, 879 Glikogen 161. 169, 170, 189, 191, 194, 207, 219, 227 biosynteza 217, 218 choroby spichrzania 217, 225 metabolizm, regulacja 220, 224 w wtrobie 225 Glikogenogeneza 192, 218, 219 regulacja 220. 224
-l- -.1 Jn I.
942 / SKOROWIDZ
Glikogenoliza 192, 218, 219, 234 enzymy 230 pobudzanie 233 regulacja 220, 224 w miniu 221 w wtrobie 221 Glikogenoza typ I 225 typ II 225 typ III 225 typ IV 225 typ V 225 typ VI 225 typ VII 225 - typ VIII 228 z niedoboru miofosforylazy 225 Glikokaliks 172 Glikokortykoidy a lipoliza 310 Glikokortykosteroidy 237 Glikolipidy 173, 181, 248 choroby spichrzeniowe 284 Glikoliza 135, 189, 191. 207, 208,216, 226, 308 a cykl kwasu cytrynowego 213 enzymy 230 etapy 212 hamowanie 213, 231 pobudzanie 233 regulacja w wtrobie 228, 229, 233 Glikoneoseneza znaczenie biomedycz ne 226 Glikoproteiny 167, 171, 172, 248, 250, 749 degradacja 346 Funkcje 749 glikozydacja 760 klasy 753 Glikosfmgolipidy 173, 181, 250, 290, 291 w bonach 551 Glikozaminoglikany (GAG) 171, 749, 761 waciwoci 763 Glikozuria 237 Glikozydacja giikoprotein 760 Glikozydazy 752 " * * > Glikozydy 165 nasercowe 167 Globina 407 Giobulina(y), antyhemofilowa 784 stenie we krwi 928 wica, hormony pciowe 655 ---- kortykosteroidy 629, 635 ----- testosteron i estrogeny 655 ----- tyroksyn 616 --------- stenie we krwi 920 Glukagon 220. 231, 236, 259, 585. 589, 671, 672 rola 688 sekwencja aminokwasowa 689 synteza 68 Glukany 169 Glukokinaza 208, 209, 212, 217, 234, 236 Glukokortykoidy 585 efekty biologiczne 638 mechanizm dziaania 640 przemiana i wydalanie 635 Glukokortykoidy. regulacja syntezy 636 synteza 634 transport w osoczu 635 Glukoneogencza 192, 303, 204, 234, 331, 704 a insulina 680 enzymy 230 pobudzanie 231 regulacja w wtrobie 228, 229, 233 z biaek 334 D-Glukopiranoza stereoizomery 164 Giukoza 161, 189, 193, 194, 204, 205, 227, 308, 403, 751 a stenie insuliny 677 epimeryzacja 164 izomery 162 metabolizm 191 zwikszony 309 posta, furanozowa 163 pirazonowa 163 prg nerkowy 237 stenie, fizjologiczne we krwi 217 -------- we krwi 920, 928 -------- a hormony przedniego pita przysadki 236 -------- a hormony tarczycy 237 -------- a insulina 236, 677 --------- regulacja 233, 234 tolerancja organizmu 237, 238 transport 568 przez bony 744 utlenianie minimalne 331 zapotrzebowanie 226 rda 234 D-Glukoza 165, 166 2-D-Glukoza 164 Glukozami na 167 Glukozami nogi i kany 250 Glukozany 169 Glukozo fosforany 5 89 Glukozo-6-fosfataza 227, 554 Glukozo-1-fosforan 227 Glukozo-6-fosforan 208, 210, 220, 227, 239 Glukozoamina 250 Glukozuria 237 nerkowa 237 Glukozydy 166 Glukozyloceramid 181, 2.90 G luk uro nia 244 a-D-Glukuronian 165 Glukuronidacja 819 P-Glukuronidaza(y) 410 niedobr 767 Glukuronidy 239 sprzgnite 244 Glutamina 40, 204, 350, 427 biosynteza 339 deaminacja 359 Glutaminaza 350 Glutaminian !58, 204, 347 biosynteza 338 transaminacja 359 -Glutaminian 348 Ghitation 51,870 Godzenie 306 Godzenie, parametry metaboliczne 333 Gnilec 709 GnRH patrz: Hormon uwalniajcy gonadotropin Gonad oliberyna 585, 599, 600 Gonadotropina(y) 606, 663 kosmwkowa (HCG) 575, 585, 589, 575, 585, 589, 599 ----- dziaanie 606 ----- funkcja 664 ----- stenie w ciy 665 Granulocyty 865 obojetnochonne, cechy biochemi czne 880 ----- enzymy i biaka 881 GRH 599 Gruczolak przytarczyc 624 Gruczoi(y), Brunnera 739, 742 Ebnera 734 jzyka 741 -- sutkowy 666 Grupa{y) 143 aminowa 36 a-aminowa 347 - karboksylowa 36 krwi 876 Gryzeofulwina 819 Grzebie nerwowy 574 Guanaza 433 Guanina416, 419, 449 Guanozyna418, 419 pochodne 422 Guanozyno-3', 5r-monofosforan (cGMP) 422 Guanozynotrifosforan 137 Guz chromochlonny 651 Hamowanie kompetycyjne 108 Haptoglobina(y) 774 stenie we krwi 928 HDL patrz: Lipoproteiny o duej gstoci Heksokinaza 136, 195, 208, 209, 212, 217,236 oznaczanie 87 Heksozoaminy 249, 250 Heksozy 161, 171 szlaki przemian 239 znaczenie fizjologiczne 166 Heliks a 62 Hem 70, 398 biosynteza 385, 400, 401 enzymy 404 ----- regulacja 404 katabolizm 407 metabolity 404 ----- zaburzenia 405 Hematokryt 867 Hematyna 403 Hemina 407 Hemochromatoza 846 pierwotna 776 Hemofilia 847,851 A 789 B789
SKOROWIDZ / 943
Hemoglobina(y), 70, 407 a transport dwutlenku wgla 77 A 74, 79 A, 74 F74 funkcje 74 krzywa dysocjacji tlenowej 73 M 79 mutacje 19 podowa 74, 78, 79 podobiestwo do mioglobiny 74 posta R 75. 76 -----T 75, 76 ' -------- stabilizacja 78 powinowactwo do tlenu 74 S79 -----agregacja 80 -----lepkie miejsca 79 utlenowanie 74 -----a zmiany konformacji 75, 76 waciwoci aliostcryczne 74 zwikszenie powinowactwa do tle nu 79 Hemoglobitiopatia(e) 79 HbS 847 Hemoliza 241 Hemopeksyna 775 Hemoproteiny 117, 398 Hemostaza etapy 783 Hemosyderyna 776 Heparyna 171, 302, a 763, 765, 768 jako anty koagulant 789 Hepatocyt szczura 18 Hepat omega lia 845 Heterocbromatyna 459 fakultatywna 459 konstytutywna 459 Hialuronidaza 766 Hiperalaninemia 728 Hiperalfalipoproteinemia rodzinna 328 Hiperamonemia(e) 355 z hiperlizynemi 375 Hipcrargininemia 356, 361 Hiper-p-alanincmia 386 Hiperbilirubinemia niesprzona 411 retencyjna 411 sprzona 411, 412 toksyczna 412 zwrotna 411 Hipercholesterolemia 325 rodzinna 303, 847 typ II 327 Hiperfenyloalaninemie 371, 372 Hiperglikemia 678 Hiperhydroksyprolinemia 367 Hiperkalcemia 926 Hiperkalemia 923 Hiperlipoproteinemia(e) 327 rodzinna, typ II I 327 Hiperlizynemi okresowa, bez hiperamonem ii 375 z hiperamonemi 375 Hipermagnezemia 922 Hipernatremia 923 Hiperoksaluria pierwotna 362 Hiperprolinemie 359 Hipersyderemia 927 Hipertriacyloglicerolemia rodzinna 327 Hiperurykemia 439, 921 Hiperurykozuria 922 tfiperwalinemia 383 Hipobetahpoproteinemia rodzinna 326 Hipoglicyn 265 Hipoglikemia 236, 237, 238, 247 Hipogonadyzm 659 u kobiet, pierwotny 669 wtrny 669 u mczyzn, pierwotny 659 ----- wtrny 659 Hipokalcemia 926 Hipoka letnia 923 Hipoksantyna 416 pochodne 422 Hipoksja 199, 200 Hipolipoproteincraia 326 Hipomagnezemia 922 Hiponatremia 923 Hiposyderemia 927 Hipourykemia(e) 439, 440, 922 Hipuran biosynteza 385, 386 Histamina 385, 881 Histony 456 Histydyna40. 41, 204,343 dekarboksylacja 388 katabolizm 361 zapotrzebowanie 725 Histydynemia 362 HMM 798 Holoenzym 83 Homeostaza 94, 118 fosforanowa rola paratbormonu 623 komrkowa 119 wapniowa rola paralhormonu 623 Homocysteina 377, 41 Homocystynuna(e) 366, 728 Homogentyzynian 368 Homokarnozyna 386, 387 Homoseryna 41, 379 Hormon(y), adrenokortykotropowy patrz: Kortykotropina antydiuretyczny (ADH) patrz: Wazopresyna charakterystyka ukadw 573 i dziaanie 584 gJikoproteinowe 605 gonadalne 652 hamujcy uwalnianie, hormonu wzrostu (GHR1H) 599 -----proiak-tyny (PRIH) 600 jajnikowe 659 rola 662 katecholaminowe 645 kontrola metabolizmu 196 konwersja 575 - kortykotropowy (ACTH) patrz: Kortykotropina kory nadnerczy 629 laktotropowy patrz: Prolaktyna luteinizujcy patrz: Lutropina luteotropowy patrz: Prolaktyna oyskowe 664 narzdy docelowe 576 Hprmonfy), pobudzajcy melanocyty patrz: Melanotropina 609 podstawy klasyfikacji 584 przedniego ptata przysadki a ste nie glukozy we krwi 236 przekaniki dziaania wtrne 2S4 rdzenia nadnerczy 645 receptory 578 tarczycy 612 a lipoliza 310 ----- a stenie glukozy we krwi ----- mechanizm dziaania 617 trzustki 671 tyreotropowy (TRH) p. Hormon uwalniajcy tyreotropin tyreotropowy patrz: Tyreotropina uwalniajcy, gonadotropin (GnRH) 599 ----- hormon wzrostu (GHRH) 599 ----- kortykotropine(CRH)589,599, 600 ------ tyftotropin (TRH) 585, 599, 600 wzrostu (GH) 585, 599, 585, 599 budowa 603 -----dziaanie 603 -----efekty prolaktynopodobne 604 niedobr 542 patofizjologia 604 -----przemiana, elektrolitw 604 ---- lipidw 604 -------- wglowodanw 604 struktura genu 602 synteza 603 -------- biaka 603 ---- -w karowatoci 604 odkowo-jelitowe 671, 690 cechy 690 HVA 901 Hybrydyzacja 541, 547 Hydrataza, akonitowa 200. 201 fumaranowa 202 Hydrataza-A7-enoilo-CoA 264 Hydrokorlyzon 600 3-Hydroksyantranilan 375 p-Hydroksy-p-metyloglutarylo-CoA 3S0 3-Hydroksy-3-metyloglutaryto-CoA 268 25-Hydroksycholekalcyferol 715 Hydroksycynamonian 159 p-Hydroksyfenylopirogroman 368 fS-Hydroksyizobutyrylo-CoA 382 p-Hydroksyizomalan 382 3-Hydroksykinurenina 375 Hydroksykobabmina 704 Hydroksylacja, lekw 144 steroidw 144 w mitochondriach 144 Hydroksylaza(y) 144 fenylo alanin owa 340, 342 tyrozynowa 646, 902 wglowodorw aromatycznych 819, 826 21-Hydroksylaza 633,634 niedobr 644 la-Hydroksylaza 626
----- typ V 327
944 / SKOROWIDZ
7a-Hydroksylaza 323, 324 17a-Hydroksylaza 654 11 p-Hydroksylaza 633, 634 niedobr 644 fi-Hydroksylaza dopaminowa 645 roia 643 Hydroksylizyna 342 Hydroksyloamina 55 D(-)-3-Hydroksymalan 266, 267 5-Hydroksymetylocylozyna 416 Hydroksymetylotransferaza 341 serynowa 362 17-Hydroksyprogcsteron 663 Hydroksyprolina 204 biosynteza 341 katabolizm 367 5-Hydroksytryp tarnina 391 Hydrolaza, fumaryloaretooctanowa 368 giukonolaktonowa 241 Hydroliza, agodna kwana 55 zasadowa peplydu 54 I celi disease patrz: Choroba wtrtw komrkowych p-L-Iduronian 165 a-L-Iduronidaza 766 niedobr 767 IGF 837 I 585, 599, 687, 837 II 585, 599. 687, 837 I i II 837 porwnanie z insulin 687 Iloraz irtsulino-glukagonowy 689 Iminokwasy 41 Immunoglobiilma(y) 778 budowa czsteczki 779 stenie w osoczu 915 waciwoci 780 IMP patrz: In ozynorn on o fosforan Informacja genetyczna 443 Inhibitory). 1, 221 allosteryczny 126 t% cholinesterazy 891 kompelycyjne 107 niekompetycyjne, nieodwracalne 109 i -------- odwracalne 109 zwrotny 124, 125 Inozynomonofosforan (IMP) 427 Inozylolo-l,4,5-tnslbsforan 791, 883 Insulina 223. 236, 237, 238, 259, 310312, 671 czynniki farmakologiczne 677 czynniki hormonalne 677 ekspresja genw 685 gen 677 glukoneogeneza 680 metabolizm 677 niedobr 678 - patofizjologia 687 podziay komrkowe 682 przemiana, biaek 681 * glukozy 680 - tuszczowa 680
G, model czsteczki 779
Insulina, regulacja wydzielania 677 rnice miedzygatunkowe 673 struktura 672 translacja mRNA 685 utylizacja glukozy 679 wytwarzanie 675 znaczenie biomedyczne 672 Integryny 880, 882 Interleukina I i II 837 Introny 462, 484, 530, 547 In uli na 169 Iproniazyd 393 Izocytrynian 199, 200, 201 Izoenzymy 89 rozdzielanie 90 Izoleucyna 39, 204 katabolizm 377, 378, 380 reakcje swoiste 382 zapotrzebowanie 725 Izomaltaza 743 lzoineraza, 3-cis- 2-trans-enoilo-CoA 265 cis, transmaleiloacetooctanowa 368 fosfoheksozowa 209 (bsfotriozowa 209, 210 ksylozowa 117 Izomer(y), konstytucyjne 164 optyczny 163 Izoniazyd 698 Izopentenylopirofosforan 315 I2olopy, cikie 24 radioaktywne 24 trwale 24 w biochemii Izozym 89 Jabczan 158, 15S, 199, 201, 202 Jajniki 659 Jdra 652 nadwzrokowe 609 przykomorowe 609 regulacja hormonalna 657 zesp feminizacji 659 Jdrzaki 669 Jednostki, enzymatyczne 86 SI 912 Jelito, cienkie 741 czcze 747 grube, rak 726 O-Jodobenzen 55 5-Jodo-2-deoksyurydyna 423 5-Jododeoksyurydyna 424 Jodotyrozyny, sprzganie 616 Jodowanie tyrozyny 615 Jod, przemiana w pcherzyku tarczycowym 614 rola, rdla 730 utlenianie 615 zagszczanie w tarczycy 615 zapotrzebowanie 733 Jonofory 160 Jon(y). amonowy 349 karboksylowe 36 metali regulacja aktywnoci enzy mw 123 sodowe 26
Kalcytonina 585, 589, 825 homeostaza wapniowa 628 Kalcytriol 5S5. 624 - biosynteza 626 patofizjologia 627 regulacja syntezy i przemiany 626 wpyw na bon luzow jelita 627 Kalmodutina 221, 595, 798 Kamica, ksantynowa 440 nerkowa 846 Kamienie, moczowe 418 nerkowe 845 ciowe 314, 734 Kancerogeneza 828 inicjator i promotor 828 onkogeny 829 Kancerogeny 822, 825 chemiczne 826 ----- metabolizm 826 Karbamoioasparaginian 125, 434, 435 Karbatnoilofosforan 125, 355, 433 biosynteza 354 Karbamoiotransferaza, asparaginianowa 122, 125.434,435, 436 ornitynowa, niedobr 441 Karbid opa 902 Karboksyklnaza fosFoenolopirogronianowa 203, 227 Karboksyaza acetylo-CoA 128, 251, 252, 310,685, 703 regulacja aktywnoci 258, 2?9 fosfoenolopirogronianowa 204 0-metylokrotonylo-CoA 703 pirogronianowa 117, 204, 226, 231, 232, 595 propionylo-CoA 227 Karboksyna 152 Karboksypeptydazall7, 345, 739, 742 Karboksyproteinaza prokola genowa 812 Kardiolipina 157, 179 biosynteza 287 Karowato, typu 1.armia 604 z niedoboru GH 604 Karnilyna 261, 262 Karnozyna 386, 387 p-Karoten 184, 711, 713 stenie we krwi 928 Karotenoidy, dziaanie przeciwnowotworowe 713 Kaskada glutamin i anowa 895 Katabolizm 132 Kataaza 143, 349, 399, 870 Kataliza enzymatyczna 95 kwasowo-zasadowa 114, 115 oglna 114, 115 -----swoista 114, 115 mechanizm, dziaania 110 -------jony metali 116, 117 wizanie substratu 114 Katecholaminy, a-adrenergiczne 585 P-adrenergiczne 585 klasyfikacja 650 magazynowanie i uwalnianie 648 metabolizacja 648 synteza 649 Katepsyna B i D 622
SKOROWIDZ I 945
Kationy, stenie a aktywno enzy mw 123 Kefalina 179 Keratyna 811 Ketogeneza 190, 260, 266, 334 regulacja 270 w wtrobie 268, 269 a-Ketoglutaran 159, 194, 199202, 204,359, 361, 377 Ketoizomeraza rybozo- 5 -fosforanowa 241 i-Ketokwasy 347. 348 . aminokwasw o rozgazionych acuchach bocznych 342 Ketonemia 267, 270 Ketonuria 267 acuchw rozgazionych 383 nawracajca 384 Ketony 161 Ketoza 267 byda 307 w okresie laktacji 335 godzenie 334 Kinaza 128 adenozynowa 430 adenylanowa 117, 137, 157, 232 niedobr 225 biaek 591. 685 C 791 rodzaje 591 - zalena od, cAMP 197,221,234 niedobr 225, 311 kalmoduliny 223 bialkowo-tyrozynowa 830 deoksycytydynowa 430, 435 difosfonukleozydowa 137, 202 dolicholowa 757 fosfoglicerynianowa 209, 210, 212, 216 ----- fosforylazy 220, 595, 685 Koenzym(y) 83 A <CoA) 203, 698 -----dziaanie 83 ----- synteza 699 klasyfikacja 84 kobamidowe 84 nikotyn amidowe 141 -----mechanizm utleniania i redukcji
142
Q (CoQ) 149 - pochodne nukleotydw 422, 423 Kofeina 311, 417 Kolagen 811, 785 a elastyna, rnice 815 modyfikacje 812 typy 813 Kolagcnaza 885 Kolchicyna 810 Kolestypol 326 Kolipaza 739 Komrka(i), ciaka tego 606 eukariotyczna 18 komunikowanie si 291 Kupfera 622 Uydiga 606, 652, 658 nowotworowe, regulacja enzymaty czna nieprawidowa 118 Sertolego 606, 653 Kompleks, dehydrogenazy pirogroma-nowej 213 enzym-inhibitor 107 enzym-substrat 97 enzymw wielkoczsteczkowy 123 hydroksylazy fenyloalaninowej 340 reduktazy rybonukleotydowej 4.12 syntazy kwasu tuszczowego 252, 253, 259 Konformacja peptydu 51 Konkanawalina 753 A 172 Kontakt midzykomrkowy 291 Konwersja, genu 465 hormonw 575 Koproporfirynogeny 402 Koproporfiryny 399 Koprostanoi 183, 322 Koprosterol 183 Kora nadnerczy, hormony 629 niewydolno wtrna 643 patofizjologia 643 Kortykoliberyna (CRH, CRF) 585, 589, 599, 600 ludzka, struktura 600 owcza, struktura 600 Kortykosteron 630, 632 Kortykotropina (A.CTH) 599, 629 struktura i funkcja 608 Kortyzoi630, 631, 632,656 stenie we krwi 928 Kortyzon 632 Kosmidy 534, 547 Kosyntaza uroporfirynogenowa 403, 404 Kotransport 213 Kotromboplastyna 784 Krasnoludkowato 687
choroby 814
----- a 221 ----- b 128
Krenie wrotne 743 Kreatyna 136 biosynteza 3S6, 396, 397 wydalanie z moczem dobowe 920 Kreatynina, biosynteza 396 stenie we krwi 920 wydalanie 397 z moczem 921 Kretynizm 618 Krew, funkcje 700 przetaczanie 876 ukiad(y) grupowy(e) 876 ----- AB0 877 ----- MNSs 879 Krystalografia 21 rentgenowska 67 Krysztay moczanowe 438 Krzepnicie krwi, czynniki 784, 785 szlak, zewntrzpochodny 786 wewntrzpochodny 784 - tes^laboratoryjne 793 Krztusiec 590 Krzywica 624, 627, 715 typu 11 oporna na witamin D 583 Ksantozynomono fosforan 430 Ksanturenian 375, 377 Ksantyna 416, 418 Ksantynuria 440 Ksantyny metylowane 417 Ksenobiotyki 817 elektrofilowe 820 toksyczno 821 Ksyloza 171 D-Ksyloza 165, 166 D-Ksyluloza 164 L-Ksyluloza 166, 244 Kwas(y), N-acetyloneuraminowy 171, 172,291, 751 acetylosalicylowy 280
p-anfun o benzoesowy 705
gUcerolowa 136. 229, 285, 286, 308 kreatynowa 136, 157 miozyny 595 monofosforanowa swoista 138 nukleozydoinonofosforanowa 430 pirogronianowa 117, 209, 212, 216, 231, 595, 685, 703
niedobr 866, 879
pirydoksalowa 700 reduktazy HMG-CoA 128 -- tymidynowa 435 urydynowo-cytydynowa 435 Kinureninaza 375 Klatryna 319 Klofibrat 326 Klomifen 668 Klon 547 Klonowanie DNA 534 wektory 534 Klozapina 907 Koagulaza gronkowcowa 787 Kobalamina 703, 704 Kobalt 730 Kod genetyczny 491 Kodony nonsensowne 492
2-aminoetylosulfonowy 43 2-amino-4-hydroksymasowy 41 p-am i noizo masowy 43 y-aminotnasowy 43 4-aminomaslowy 43 2-amino-4-merkaptomaslowy 41 3-ammopropionowy 43 2-aminoO-sulfinopropionowy 41 2-amino-5-ureidoamylowy 42 arachidonowy 176, 282, 792, 836 przemiana 281 arachidowy 175 argminobursztynowy 42 askorbinowy 239, 708 ----- niedobr 709 ----- stenie we krwi 928 - asparaginowy 40 behenowy 175 cerebronowy 181 cerwonowy 176 chenodeoksycholwy 323, 737 cholewy 322 cysteinosulfinowy 41 dekanowy 175 deoksyrybonukleinowy (DNA) 456 budowa 443, 444, 448 ----- czsteczka kolista 447
946 / SKOROWIDZ
Kwasfy), deoksyrybonukleinowy (DNA), delecje 544 ----- denaturacja 447 --------- efekt hiperchromiczny 447 ----- depurynacja 473 insercje 544 ----- kancerogeneza 828 Kwasfy), masowy 175 merkapturowy 820 3-metoksy-4-hydroksyniigdak>wy 649 2-metylo-3-aminopropionowy 43 mikofenolowy 430 mirystycowy 175 mocne 29 moczowy 346, 416, 418, 427, 433 stenie we krwi 921, 928 wydalanie z moczem 922 ----- wytwarzanie 426, 427 ----- zaburzenia metabolizmu 440 monoetenowe 174 mrwkowy 175 nadjodowy 750 nerwonowy 176 neuraminowy 171
- nikotynowy 326, 696
naprawa 473 ----- pasmo, kodujce 445 ----- matrycowe 445
---------tpe 532, 547 ----- mitochondrialny 895
- koce, lepkie 532
-------- czsto 462 ---------- dugie, kocowe 462
----- posta, K 446 ----- B 445 -------- silnie skrcona 447 ----- Z 446 ----- rearanacje 544 ----- rekombinacja 529 ----- replikacja 447449, 469 ----- rowki 447 ----- rozwinity 447 ----- sekwencje, powtarzajce 462 ----- ------------- rozproszone 462 ----------- krtkie 463 -------- unikatowe 462 -------- wyciszajce 530 -------- wzmacniajce 522, 530 ---- sekwencjonowanie 539
nukleinowe, trawienie 425 octowy 175,434,435 oktanowy 175 oleinowy 174, 176, 177 palmitynowy 175 pal mi to oleinowy 176 pantotenowy 84, 203, 698 plazmenowy [80 podchlorawy 884 polienowe 174
propionowy 175
superzwoje ujemne 447 synteza 467 ----- temperatura topnienia 447 ----- transkrypcja 447, 448 2,5-diatnivioamylowy 42 dihydroorotowy 434, 435 elaidynowy 176, 177 ertlkowy 176 foliowy 84, 705 niedobr 706, 866 ---stenie we krwi 928 zapotrzebowanie 733^. formitninoglulaminowy 706 fo&fatydowy 179,286 glutaminowy 40, 705 hialuronowy 171, 763, 764 homowanilinowy 901 ikozanowy 175 inozynowy 429 kainowy 893 kapronowy 175 kaprylowy 175 kaprynowy 175 kinurenowy 375 klupanodonowy 176 ksamurenowy 377 laurynowy 175 lignocerynowy 175 linoletiowy 275, 27S a-linolenowy 176, 275, 278 y-linolenowy 176 lino Iowy 176 - niedobr 727 ----- przemiana 277 liponowy 214
retinojowy 712 retinolowy 588, 710 rybonukleinowy (RNA) 476 ----- budowa 448, 449 ----- hydroliza 449 ---- informacyjny (mRNA) 450, 451,486,489,491, 530 ------ jdrowy, drobnoczsteczkowy 450 -------- hetcrogenny 453 -----rybosomalny (rRNA) 450, 454, 487 - splicing 530, 548 ----- synteza 478 -----transkrypcja 480 -----transportujcy (tRNA) 450, 487 ----------- budowa 453 sjalowy(e) 171, 181, 250, 291, 751 sabe 29 solny 735 sprzony z zasad 31 stearynowy 175 timnodonowy 176 - tuszczowe 189, 190, 194, 722 -----aktywacja 261 -----biosynteza 205. 251, 254, 255 -----C a 227 -----Cn 227 -----cis 278 ---- dienowe 176 ----- dugolacuchowe, transport do mitochondrium 262 -----------utlenianie w wtrobie 272 egzogenne 275, 289 metabolizm nieprawidowy 278
K.was(y), tuszczowe, egzogenne, niedobr 278 --------- a prostagtandyny 280 ----- elongacja acucha 257 ----- estryfikacja 270 ----- heksaenowe 176 ----- jednonienasycone 174 --------- w diecie 325 ----- metabolizm 190 ----- monoenowe 176 nasycone 174, 175 ----- nienasycone 176, 275 ---------metabolizm 274 utlenianie 265, 266 ----- p-oksydacja 262264 ----- pentaenowe 176 ----- synteza 191, 203 ----- tettaenowe 176 trans 278 transport 746 we krwi 260 trienowe 176 ------- tworzenie nazw 174 uruchomienie z tkanki tuszczo wej 270 ----- utlenianie 264 ----- wadliwe 265 ----- wielonienasycone 13, 173, 174, 274, 275, 727 -------- biosynteza 276 -------- w diecie 325 -------- peroksydacja mikfosomalna
----- waciwoci, fizjologiczne 177 -------- fizyczne 177

- wolne 174, 260, 331, 294, 298 obrt 299 -------- stenie zwikszone 305 wychwytywanie przez tkan ki 310 tymidylowy 420 UDP-gl u kuro nowy 819 uronowe 171, 762 urydylowy 420 walerianowy 175 wanilino migdaowy 645, 649 ciowe 322 biosynteza 323, 324 degradacja 323 ---- krenie watro bowo-jelitowe 324 wtrne 324 Kwashiorkor 338, 726, 853 Kwasica 26 i
ketonowa 260, 267, S63
266
mleczanowa 147, 207, 214, 728 prioponowa 728
Laktacydoza 237 Laktaza 743 niedobr 744 -----dziedziczny 745 ---- wtrny 745 Lakloferyna 881 Laklogen oyskowy (CS) patrz: Soma-totnammotropina kosmwkowa
SKOROWIDZ / 947
Laktoza 161, 163, 169 synteza 248 Laminina 882 Lanosterol 3J7 Lanosterolocyklaza 2,3-oksydoskwalenowa 317 LCAT patrz: Acylotransferaza lecytyna: cholesterol LDH patrz: Dehydrogenaza rnlec/anowa | LDL patrz: Lipoproteiny o maej gstoci Lecytyna 179 metabolizm 288 Leczenie trombolityczne 895 Lek(i), hipolipemizujce 326 przeciwnowotworowe 425 przeciwtarczycowe 615 Lektyna(y) 172, 753 sojowa 753 Leprechaunizm 687 Leucine zipper" 526 Leucyna 39 katabolizm reakcje swoiste 381 zapotrzebowanie 725 Leukodystrofia metachromatyczna 292 Leukotrien(y) 174, 175, 278, 280, S80 A4 177 biosynteza 282, 28.1 znaczenie 283 LH patrz: Lutropina Liaza 117 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 ATP-cytrynianowa 205, 256 cytrynianowa 128 3-hydroksy-3-melyloglutarylo-CoA 26S Ligacja 547 D-Liksoza 166 Limfocyty 865 Lipaza 284, 736 aktywno we krwi 922, 92 S dziaanie 739, 742
Jzykowa" 734
Lipidy, pochodne 173 prekursory 173 proste 173 stenie we krwi 928 transport 304 w osoczu 294 zoone 173 znaczenie biomedyczne 173 Lipoamid 214 Lipogeneza 190194, 251, 255, 256 enzymy 230 odywianie organizmu 258 pobudzanie 259 regulacja 258 regulacja hormonalna 259 Lipoksygeneza 185 Lipoiza 190, 193, 308, 309 hamowanie 259 regulacja 311 Lipoprotemy 173, 193, 294 o bardzo maej gstoci (VLDL) 194, 295, 299, 300 ----- biosynteza 306 -----katabolizm 301 ----- a skad pokarmw 305 o duej gesloci (HDL) 295, 303 metabolizm 304 o malej gstoci (LDL) 295, 303, 769 ix, niedobr rodzinny 326 osocza 296 298. 320, 321 blok wytwarzania 307 zaburzenia pierwotne 326 resztkowe 302 rozdzia 295 Liposomy 186, 187, 739 Lipotropina (LPH) 585, 589, 599 p 51 ---- struktura i funkcja 609 Lizofosfolipidy 180 Lizolecytyna 180, 289 Lizosomy 346, 563 Lizozym 881 miejsce katalityczne 99 Lizyna 40 katabolizm 373, 374 zapotrzebowanie 725 Locus operatora 512 Lowastatin 326 LPH patrz: Lipotropina Lutropina (LH) 575, 585, 589, 599 dziaanie 606 steroidogeneza 657
aricuch(y), oddechowy, mitochond-rialny, skadniki 148 ----- medoczynnosc 160 ----- zwizki rozprzgajace 152, 156 oligosacharydowe 171
MAB826 Macierz mitochondrialna 157 Magnez 729 stenie we krwi 922 - zapotrzebowanie 733 0,-Makroglobulina 789, 885 Malonian 108 Malonylo-CoA 251, 252, 271 Maltaza 740, 743 Maltotrioza 161 Maltoa^l, 168, 168 Mammotropina p. Prolaktyna Mangan 730 zapotrzebowanie 732 Mannoza 171, 751 D-Mannoza 165, 166 a-D-Mannoza 164 Mannozamina 167, 250 Mannozydaza 767 MAO-A patrz: Monoaminooksygenaza A MAO-B patrz: MonoaminooksygenaMapowanie genw 541 Marazm 131, 726 Markery nowotworowe 824 Marskosc wtroby 307, 778, 845 Matoectwo 618 Mazindol 902 Mechanizm ping-pong" 566 Melanina, biosynteza 393 typu mieszanego 394 Melanoproteina 393 Melanosomy 393 Melanotropina (MSH) 585, 589. 599 a 575 575 struktura i funkcja 609 Melatomna, biosynteza 392, 393 metabolizm 392 Melonian 201 Menachinon 717 Menandion 717 Menopauza 667 3-Merkaptopirogronian 365 6-Merkaptopuryna 423, 430 Meromiozyna cika 798 Mestranol 668 Metabolity, przepyw, regulacja 128 w komrce 118, 119 stenie, a aktywno enzymw 123 w komrce 119 Metabolizm 132 aminokwasw 190 hamowanie przez sprzenie zwrot ne 124 integracja 329 kontrola hormonalna 196
zaB
lipoproteinowa 193, 301, 308, 310, 768 niedobr rodzinny 327 linowa" 736 triacyloglicerolowa 685 wtrobowa uwalniana heparyn 302 wraliwa na hormony 308, 310 odkowa" 736 Lipidoza iaktozydoceramidowa 292 Lipidy 193. 727 amfipatyczne 186, 187, 295 bon 552 choroby spichrzajce 293 chromatografia 185 eterowe biosynteza 288 synteza 286 metabolity, transport 193 metabolizm 122, 191, 173 obojtne 173 osocza 295 peroksydacja 184
acuch (y), oddechowy 141, 142, 147, 199201, 216 ---- hamowanie 152 ----- inhibitory 152 kompleksy lipid owo-bialkowe 150 magazynowanie energii chemi cznej 151 miejsca hamowane przez sub stancje chemiczne 150
948 / SKOROWIDZ
Metabolizm, kwasw tuszczowych 190 nieprawidowoci !18 prawidowy 131 regulacja znaczenie biomedyczne 118 umiejscowienie w komrkach 122 wglowodanw 189 zalenoci midzy tkank tuszczo w, wtrob i tkankami pozawa trobowymi 332 Metaloenzymy 115 Metaloporfiryny 398 Metaloproteiny 368, 375 NJ, N'-Metenylotctrahydrofo[ian427 Methemoglobina 872 Methemoglobinemia 79, 866. 872 Metimazol 615 Metionma 40. 204, 379, 397 katabolizm 377, 378, 380 zapotrzebowanie 725 Metotreksat 435 P- N - M etylami no- L-a I a u ina 901 ot-Metyloacetoacetylo-CoA 383 N-Metyloadenina 416 Metyloakrylilo-CoA 382 N-Metylo-4-aminoazobenzen 826 5-Mety!ocytozyna 416 p-Metyloglutaronylo-CoA 381 f>P-Metytoguanina 416 ot-Metylo-p-hydroksybutyrylo-CoA 383 Metyloko balami na 704 p-Metylokrolonylo-CoA 381 Metylomalonylo-CoA. zaburzenia katabolizmu 384 Melylopentylozy 171 Metylotransferaza guanidynooctanowa396 N- Metylolransferaza, fenyloetano loaminowa 645 rola 647 O-Metylotransferaza katecholowa 0 645 ^ rola 648 Mewalonian. biosynteza 315 Mewastatin 326 Miastenia 887 Miadyca 173, 182, 327, 792 naczy wiecowych 303 ttnic 13, 173, 325 Micela(e) 186. 187, 522 Mied 730 niedobr 777 stenie we krwi 916, 928 zapotrzebowanie 732 zatrucie 776 Mieloperoksydaza 870, 881, 884 Miesiczka, brak 605 Mieszanina racemiczna 163 Minie, gadkie 801 skurcz 802 prkowane 803 szkieletowe 804 Mikrosomy 20 Mineralokortykoidy 585, 630 nadmiar 644 Mineralokortykoidy, przemiana 636 a rwnowaga elektrolitowa 639 synteza 634 regulacja 636 transport jonw 639 w osoczu 635 wydalanie 636 Miofosforylaza niedobr 225 Mioglobina 70, 399 budowa 71 funkcja 71 krzywa dysocjacji tlenowej 73 podobiestwo do hemoglobiny 74 ullenowanie 7] -----zmiana konformacji 72 wizanie tlenu 72 wizanie wgla 72 Miokinaza 137,430,804 Miopatia(e) 147 mitochondriaine 897 niemowlt 160 - oczna 896 Miozyna 795, 798 Mitochondnum 147, 194, 261, 354 gromadzenie kationw 158 rola w metabolizmie 195 ukady, hydroksylacyjne 144 -----transportujce 156 MIT patrz: Monoj odo tyrozyna Mleczan 189. 194, 204, 207, 208, 212, 234 Mlekotok 605 Moczan(y) 418 krysztay 438 pula oglnoustrojowa 438 Mocznik 190. 192, 344, 346, 351, 353, 355, 427 biosynteza 347, 353, 354 - stenie we krwi 914 wytwarzanie 353, 354 Moczwka prosta nerkowopochodna 583 Modulatory, negatywne 109 pozytywne 109 Mola hydatidosa 669 Molibden 731 zapotrzebowanie 732 Monoaminooksygenaza 645 A (MAO-A) 901 B(MAO-B)901 Monocyty 865 Monoetenoidy 174 Monofosforan inozyny (IMP) 429 3-Monojodotyrozyna 42 Monojodotyrozyna (MIT) 612, 613 Mononukleotyd, [lawinowy (FMN) 140, 695 nikotyniami 697 Monooksygenaza(y) 144, 827 monofenolowa 393, 394 3-Monooksygenaza tytorynowa 397 Monosacharydy 161 wchanianie wadliwe 745 Monosjalogangliozyd 182 Mostek, glicerolofosforanowy 157 glicerolofosforanowy 158
budowa bon 155
Mostek, jabiczanowo-asparaginianowy 158 MolyJma 6>J1 Mzg, udar 894 MPTP901 MSH patrz: Melanotropina 3-MSH patrz: Melanotropina a p-MSH patrz: Melanotropina p Mukolipidozy 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydozy 749, 765 testy diagnostyczne 767 Mukopolisacharydy 171, 749 Mukoproteiny 171 Mukowiscydoza 14, 844, 847 Mutacje 495 punktowe 835, 897 sensu 496 - akceptowalne 497 ----- czciowo akceptowalne 497 nie akceptowane 498 supresorowe 498 typu przesunicia ramki 498 Mutageny 827 Mu ta rotacja 163 Mutaza, bisfodlbglicerynianowa 212, 213 fosfogiicerynianowa 209, 211 Myasthenia gravis 583, 887 Naboniak kosmwkowy 669 Nadcinienie ttnicze 847 reninozalene 637 Nadczynno, przytarczyc 623 wtrna tarczycy 618 NAD-kinaza 595 Nadnercza, kora, hormony 629 niewydolno wtrna 643 rdze 397 hormony 645 rozrost wrodzony 644 NAD+ patrz: Dinukleotyd nikotynoamido-adeninowy NADP+ patrz: Fosforan dinukleotydu nikotynoamido-adenin owego Nadtlenek, redukcja 143 wodoru rozkad 143 Naftochinon 717 Neksyna 810 Neomycyna 748 Neostygmina'891 Nerka(i), dysfunkcja 160 zanik 845 Neuraminidaza 752 Neurofizyny 609 Neuropatia nerwu wzrokowego wrodzona Lebera 844, 847, 896 Neuroprzekaniki 385 Neurotensyna 691 Neutropenia 868 NGP 585 Niacyna 141, 203.696
brak 698
zapotrzebowanie 733 Niedobr, desmolazy cholesterolowej 644
SKOROWIDZ / 949
Niedobr. 1 Ip-hydroksylazy 644 Niedoczyrinosc przyiarczyc 624 izekoma 583. 59!, 624 Niedokrwiwosc S45. S65 Faoconiego 475 Nkdokrwiito hemolityczna 207. 214, 239. 867. 871 badania laboratoryjne 880 ------- pizyczyny 879 megatoblaslyczna 706, 866 z niedoboru miedzi 777 z niedoboru elaza 745, 860 u noworodkw 717 sierpowata 70, 544, 866 syderopeniczna 845 zoliwa 704 Niedorozwj umysowy 898 Niedotlenienie 207 tkanek 212 Niedoywienie 726 Nietolerancja, fruktozy wrodzona 247 mleka 734. 747 Nigerycyna 160 Nikotynamid 84, 375 Ninhydryna 44 Nilrozoaminy 826 NMN 697 Noradrenalina 31.1 biosynteza 395 stenie we krwi 928 Norepinefryna patrz: Noradrenalina Noretyndron 668 Normy ywieniowe 731 Northern bot 537, 547 Nukfcazy 488 Nukleoplazmina 458 Nukieosom 457 Nukleotyd(y), adeninowc 133135, 137 fawinowe 141 pirymidynowe 415 biosynteza 433, 434 - regulacja 436, 438 pochodne syntetyczne 423 purynowe, biosynteza, w wtrobie 431 -------- blokada 429 ------- regulacja 431 N uk leotydosacharydy 250 Nukleozydazy 740,743 Nukleozydy41S, 425 Oksydacja kwasw tuszczowych 262, 263 [-Oksydaeja 148, 190. 191, 194 Ôksydacja kwasw tuszczowych 264 Oksydaza(y) 140. 143 aminokwasowa 348 a-aminokwasowa 695 2-aminokwasowa 140, 348 aminowa 392, 393 - cytochromowa 140 flawoproleiny 140 glukozowa 141 L-glukonolaktonowa 244 katecholowa 394 koproporfirynogenowa 400, 403, 404 ksantynowa 122, 140, 433, 695 niedobr 440 lizylowa 815 monoaminowa 645 rola 648 NADPH 870 protoporfirynogenowa401,403,404 zawierajce mied 140 Oksydoreduktaza 140 Oksygenaza(y) 139, 144 hemowa 407, 408 prawdziwe 144 Oksyhemoglobina, uwalnianie tlenu 213 Oksytocyna 585 mechanizm dziaania 610 regulacja sekrecji 610 Oligomery biakowe 65 Oligomycyna 152 Oligonukleotydy 547 Oligosacharydy 161 biosynteza 759 Onkogeny 14, 829, 83! aktywacja 835 z komrek nowotworowych 832 mechanizm dziaania 836 wirusa miesaka Rousa 830 Operon 510 lac 511 Opioidy 585, 589 Organee wewntrzkomrkowe 18, 19 Organizm(y), amonoteliczne 346 autotrofkzne 133 skad chemiczny 16, 17
rodowisko wewn trzne 26
PABA patrz: Kwas p-aminobenzoesowy Padaczka mioklonalna 896 PAF patrz: Czynnik aktywujcy pytki krwi Palec cynkowy" 525 Palindrom 547 PaJmitoilolransferaza kamitynowa 261,
271, 272
niedobr 265 Palmitynian 255 PAP 825 Papovawirusy 829 Parathormon (PTH) 585, 589, 629 patofizjologia 624 regulacja, przemiany 621 sekrecji 623 ----- syntezy 620 rola w homeostazie, fosforanowej 623 - Vspniowej 623 rozpad 622 struktura 620 wytwarzanie ektopowe 624 Parkinsonizm 899 leczenie 900, 906 przyczyny 901 Pasmo Soreta 404 PCR 547 PDGF 585, 838 Pelagra 698 D-Fenicylamina 777 Pentozuria 239 samoistna 244 Peniozy 161, 171 znaczenie fizjologiczne 166 Pepsyna 735 Peptyd(y), aktywne fizjologicznie 51 budowa 49 C 676 homogenne otrzymywanie 55 hydroliza zasadowa 54 insulinopodobne 676 jelitowy wazoaktywny 599. 691 konformacja 51 adunek elektryczny 50 przeduajce 812 rozdzielnie 52 sekwencje nakadajce sie 57 sekwencjonowanie 54 Struktura pierwsôrzdowa 50 a aktywno biologiczna 50 poznanie skadu aminokwasowego 53 sygnaowe 560 synteza metodami automatycznymi 57 znaczenie biomedyczne 49 odkowy hamujcy 691 Peptydaza 345 Peptydylo-3-metylom stydyna 805 Permeaza glukozowa 868 Peroksydacja lipidw 184 Peroksydaza 143 glutationowa 143, 243, 717. 870
ureolityczne 427 ureoteliczne 346 Octan 259 medroksyprogesteronu 668 p-nitrofenylu 110 -----hydroliza, etapy 111 Odczyn Coombsa 880 Odczynnik, Edmana 56 Sangera 54 Schiffa 750 Oddychanie, mitochondrialne, kontro la 151, 153, 205 ------ teoria chemiosmotyczna 156 tkankowe 139 Odywianie prawidowe 131
urykoteliczne 346, 427 Omityna 42, 355
----- fenyloizotiocyjanian 56 ----- peptydw nakadajcych si 56
metabolizm 388 transami nacja 361 Orolacyduria 441 Orotydynomo no fosforan 434, 435 Orotydynuna 441 Osroolalno 928
Osocze 386
Osteogenesis imperfecta 794, 814 Osteomalacja 625, 628, 715, 734

Ostcoporoza 747
Otyo 173, 583 Ouabaina 167
950 / SKOROWIDZ
Peroksydaza, tarczycowa 615 Peroksysomy 143, 264 Pcherzyk ciowy 742 Ptla oksydoredukcyjna przemieszczajca protony 154 pH, a aktywno enzymu 100 definicja 29 znaczenie biomedyczne 26 Piercie Kaysera-Feischera 777 Pierycydyna A 152 Pigmeje 604 PIH 599 Pinocytoza 570 absorpcyjna 570 piynnej fazy 570 Pirofosfataza. nieorganiczna 137, 218, 261 -dimetyloalilu 315 Pirofosforan, farnezylu 315, 318 geranylu 315 Pirofosforylaza ury dyn odi fosfog luk ozy 218 Pirogronian 159, 189, 194. 204, 205, 213, 226, 362, 363 enzymy ulteniania 230 utlenianie 207 stenie we krwi 928 Pirol 70, 398 Pirydoksal 700 Pirydoksamina 700 Pirydoksyna 700 Pirydostygmina 891 Pirymidyny 415 katabolizm 436 ~ nadmiar produktw 440 metabolizm 122 zaburzenia wrodzone 441 pochodne 415 -----syntetyczne 423 postacie tautomeryczne 417 zapotrzebowanie organizmu 425 pI37 Plasmodium falciparum 875 Plazmalogeny 287 biosynteza 288 "^*" Plazmidy 534, 547 Plazmina 790 Plazminogen 790 Plazmogeny 180 Plsawica Humingtona 542, 546, 847, 892 Pl patrz: Somatomamrnotropma kosmwkowa Pyn, pozakomrkowy 26 wewntrzkomrkowy 26 Pytki aktywacja 791 PNMT 645 Poliaminy biosynteza 380, 390 budowa 389 katabolizm 391 prckursory 388 Policytemia 79 Polidystrofia pseudohurlerowska 767 Polienoidy 174 Polimeraza, DNA, a 469 - p 470 Polimeraza, DNA, RNA-zalena 451 - RNA DNA-zalena 477 klasy III 484 mianownictwo 480 Polimorfizm, biaek 773 dugoci fragmentw restrykcyj nych 93 DNA 542 Polinukleotydazy 740 Polipeptyd(y), z licznymi funkcjami ka talitycznymi 429 rola 690 struktura pierwszorzedowa, ozna cza nie 54 trzustkowy 671, 673, 691 wielkoczsteczkowe, rozszczepianie 55 Polipreonidy 183 Polisacharydy 161, 169 - zoone 170, 171 PO MC patrz: Proopiomelanokorty-na Pompa, protonowa w acuchu odde chowym 153 sodowa 744 Ponad tlenki 870 Porfiria(e) 398, 405 -- dziedziczenie 405 leczenie 407 objawy, podstawy biochemiczne 406 Porfiryny, asymetria podstawnika 399 budowa 398 fluorescencja 404 z acuchami bocznymi 299 - pochodne biosynteza 403 spektrofotometria 404 widma absorpcji 404 znaczenie biomedyczne 398 zredukowane 401 Porfobilinogen 402 biosynteza 401 Pord 665 Potas 729 sekrecja aldosteronu 638 stenie we krwi 923, 928 zapotrzebowanie 732 Potencja, oksydoredukcyjny 139 przenoszenia grupy 135 PP patrz; Polipeptyd trzustkowy Prealbumina wica tyroksyn 616 Prednizolon 632 Prednizon 632 Pregnandiol 632 Pregnantriol 632 Pregnenolon 631, 632, 654, 660, 661 Pre-[J-lipoproteiny 295 PRIH patrz: Hormon hamujcy uwal nianie prolaktyny PRL patrz: Prolaktyna Proakceleryna 784 Probiaka 112 Probucol 326 Proces biochemiczny, analiza 23 Proenzym(y) 112 przeksztacenie w enzymy 113 Profilina 806 Progesteron 631, 632, 654, 656, 660 a gruczo sutkowy 666 Progestyny 585, 588, 660 funkcja 664 mechanizm dziaania 668 metabolizm 662 syntetyczne 668 Proinsulina ludzka 674 Prokonwertyna 784 Prolaktostatyna 600 Prolaktyna 585, 599 laktacja 666 owcza 603 patofizjologia 605 rola fizjologiczna 605 synteza 605 Prolina41, 204, 359 biosynteza 339, 341 katabolizm 359, 360 metabolizm 388 Proopiomelanokortyna. 575, 599, 629 Propionian 204, 227. 234 Propylotiouracyl 615 Prostacykliny 174, 281, 792 Prostaglandyna{y) 174, 279-281, 636 E2 175 a kwasy tuszczowe egzogenne 280 Prostanoidy 174, 281 biosynteza 279 Pro tarnina 789 Proteaza(y) 112,884 lizosomalna 903 wewntrzkomrkowe 345 V8 55 Proteoglikany 171, 244, 248 biosynteza 749, 761, 762 funkcje 766 Protoonkogeny 831 aktywacja 832 Protoporfiryna 400 Protoporfirynogen 400 Protrombina 784, 786 Prourokinaza 790 Provera 668 Pro witamina A 184 Prg nerkowy dla glukozy 237 PRPP patrz: 5-Fosforybozylo-l-pirofosforan Prymachina 87! Przemiana materii podstawowa 723 Przenonik(i), energii 133 pirogronianowy 213 Przerzuty 760i 840 Przewody ciowe, niedrono 412 Przysadka mzgowa, ptat, przedni 601 ---------hormony 236 ----- tylny 609 Przy tarczyce, gruczolak 624 - nadczynno 623 -------wtrna 624 niedoczynno 624 ----- rzekoma 583, 591, 624 rozrost 624 Pseudogen 548 Pseudourydyna 420, 436 PTA 784 PTH patrz: Para (hormon
SKOROWIDZ / 951
PUFA patrz: Kwasy tuszczowe wielonienasycoue Puromycyna 506 Puryny 416 kiitiihohziii. zaburzenia 437 metabolizm 122 -----zaburzenia dziedziczne 439 niedobr 440 pochodne 415 syntetyczne 423 postacie tauromeryczne 417 redukcja 433 * zapotrzebowanie organizmu 425 Q 100 Racemaza metylomalonylo-CoA 227 Rak jelita grubego 726 Rakowiak zoliwy 393 Ramka Pribnowa 480 Reakcja(e), anaboiiczne 132 chemiczne, bariera energetyczna 96 czynniki przyspieszajce 96 -----teona kinetyczna (zderze) 96 -----szybko pocztkowa 103, 104 egzoergiczne 132 endoergiczne 132 -----sprzenie z reakcjami egzoer gicznymi 136 enzymatyczne 97 -----hamowanie kompetycyjne 108 inhibitory niekompetycyjne od wracalne 109 ----- kinetyka nasycenia enzymu substratem 106 -----kontrola, allosteryczna 196 -------- hormonalna 196 -----mechanizm 110 -------- dowiadczenia stop-flow 110 -------- a jony metali 116, 117 -----a pH 100 ----- poziom energetyczny 95 -----staa rwnowagi 102 -----stany przejciowe 94, 95 -----szybko, maksymalna 106 -------- pocztkowa 103 regulacja 119 -------- a stenie substratw 101, 103 a temperatura 100 wizanie substratu 114 Fentona 870 Habera-Weissa B70 kataboliczne 132 - nierwnowagi 195 powodujca przepyw 195 zastpienia 94 Receptor{y), ot, 221 acetylooholinowy 582 p-adrenergiczny 650 androgenowy 898 - cholinergiczny 888, 890 - dopaminowy 907 -----agonici 902 EGF 683 Receptor(y), estrogenowe 668 glikokortykoidowy 640 glulamimanowy 892 hepatocytw asjaloglikoproteinowy 346 hormonalne 578 insulinowy 582, 682 kalcytriolowy 627 LD 319, 683 wadliwe 327 progesteronw^ 668 swoisty dla apo E 302 dla transferyny 775 Receptosomy 570 Redukiaza, biliwerdynowa 407 cystynowa 363, 364 cytochromu bs 872 dihydrofolianowa 435 glutationowa 243 HMG-CoA 122, 128 methemoglobinowa 772 rybonukleotydowa kompleks 432 tioredoksynowa 432 Reestryfikacja 309 Rekombinacja, chromosomalna 463 DNA 529 Remnanty 327 chylomikronw 302 Renina 637 uwalnianie 636 Renmas 736 Replikacja DNA 469 Retinal 710 Retinitis pigmentosa 908 Retinoidy dziaanie przeciwnowotworowe 713 Retinol 710 Retrowirusy 829, 831 Retykulocyty 868 RNA patrz: Kwas rybonukleinowy Rodnik(i) wolny(e) 184 ponadilenkowy 145 Rodopsyna 712. 908 Rotenon 152 Rozedma plu 7?7 Roztwr buforowy 32 Rwnanie, Hendersona-Hasselbalcha 31 Hilla 106 Michaeiisa-Menten 104 Rwnowaga, azotowa 344 kwasowo-zasadowa 26, 350 wodna 26 Rwnowaniki redukujce 147, 199, 200, 255 Rybollawina 84, 140, 203, 695 zapotrzebowanie 733 Ryboiiukleaza 488, 739, 742 miejsce katalityczne 99 Rybonukleoproteiny jdrowe maoczsteczkowe 455 Rybonukleotyd(y) 419 purynowe 415 uracylu 449 Rybonukleozydy 418, 419 Rybosomy 194, 195, 454, 492 D-Ryboza 165. 166 Ryboza 161, 239,241, 449 synteza w tkankach 243 Rybozofosforan 189 Rybuloza 161 D-Rybuloza 164, 166
Sacharaza 742 niedobr 745 Sacharoza 161, 168, 169 Sacharydy powierzchni komrki 181 Sarkolemma 795 Sarkomer 795 Sarkoplazma 795 Schizofrenia, przyczyny 905 D-Sedoheptuloza 164 Sekretaza 903 Sekwencjonowanie, biatka 54 DNA 54 Selen 3, 717 jako grupa prostetyczna 143 niedobr 731 rola 731 zapotrzebowanie 733 Semiaidehyd, bursztynianu 396, 397 malonianu 386 metylomalonianu 382 Serotonina 881 biosynteza 391 a rakoiwak zoliwy 393 Seryna40, 180, 204, 387 biosynteza 339, 340 kata boi izm 363 Sferocytoza dziedziczna 866, 876 Slingolipidozy 173,292, 293 Sfingolipidy 284 Sfmgomielma(y) 180, 181 biosynteza 290 w bonach 551 Sfingozyna 180 biosynteza 290 SGOT 927 SGPT 927 SHBG patrz: Globulina wica hormony pciowe Siarczai], choudroityny 171, 763, 764 dermatanu 763, 765, 768 heparanu 763, 765, 792, 844 keracanu 763, 765, 768, 844 w moczu 388 Siarkowodr 152 Siateczka rd plazma tyczn a 194, 195 Siatkwka, zapalenie barwnikowe 908 Sinica 872 Sjalidoza 767 Skaza, krwotoczna 791 -----noworodkw 719 moczanowa 425, 437, 438 Skad chemiczny organizmu 16, 17 Skadniki, mineralne 730 pokarmowe interkonwersja 330 - przeksztacenia wzajemne 329, 330 Skra, pergaminowa barwnikowa 475, 852 synteza witaminy D hit
9S2 / SKOROWIDZ
SkrcaUio optyczna 163 Skrobia 161, 169 Skrzep 883 fibrynowy 788 Sk wale 315 biosynteza 315. 316 Sok, trzustkowy 736, 738 odkowy 735 Sole kwasw ciowych, krenie jelitowo-wtrobowe 322 Somatoliberyna (GHRH) 600 Somatornarnmotropina kosmwkowa 585, 599 stenie w ciy 665 Somatomedyna patrz: 1GF I Somatostatyna (GHRIH) 585. 589, 599.600, 671, 672,689, 691 a hormon wzrostu 689 sekwencja aminokwasw 689 Somatotropina 599 Sonda genetyczna 548
Sorbitol 247
Substrat(y), wizanie, kooperatywne 127 ----- przez enzym 114 Sucho spojwek 710, 713 Sukcynylo-CoA 194, 199201, 204, 400 Suliagalaktozyloceramid 290 Sulfataza, iduronianowa 766 niedobr 293, 767 Sulfatyd 181 SulfogaJaktozyloceratnid 181 Sulfoglikozyloslingolipiu 181 Sulfolipidy 173 Sulfonylomocznik, pochodne 677 Surfaktant pucny 284, 287 Swainsonma 761 Symport 213 Syntaza, ALA 401, 400
ATP 554
Sd, stenie we krwi 923, 928 zapotrzebowanie 732 Spektrofotometria 404 Spektrometria masowa 21 Spektroskopia jdrowego rezonansu magnetycznego 21 Spektryna 874, 875 Sperma to geneza 657 Spermidyna 389, 390 Spermina 389, 390 Spliceosom 485 Splicing RNA 530 Spru rodzima 746 SPRIN 500 Staa, dysocjacji 29. 31 rwnowagi reakcji enzymatycznej 102 sedymentacji 68 Stawy, zapalenie 769 Steroidogeneza 190. 634 Steroidy 182. 190, 191 - - cechy strukturalne 630 konfiguracja 183 konformacje 182 sekrecja 635 - stereoizomery 182 transport w osoczu 635 Sterole w bonach 552 Stiuszczenie wtroby 305, 845 Stolce tuszczowe 710, 747 Strcenie wybircze 87 Streptokinaâ 790 Streptomycyna 167 Stres tlenowy 871 Stwardnienie rozsiane 292 Substancja, H 877 - P 585, 691 Substrat(y), energetyczne kolejno utleniania 333 powinowactwo do enzymu 106 stenie, a aktywno enzymu 123 -----inhibitory kompetycyjne 107 kinetyka nasycenia enzymu 106 ' -----oznaczanie 107 ----a szybko reakcji 101, 103
- ATP bonowa 153, 154 ------- transportujca protony 156 cytrynianowa 200, 201 endoperoksydu prostaglandynyTT? glikogenowa 128,197,219,595,685 a 221 -----b 221 -----w miniu 223 hemowa 401 3-hydroksy- 3-metyloglu ta rylo-Co A 268 3-ketoacylowa 252 kwasu tuszczowego 252 laktozowa 249
porfobilinogenowa 404
Szlak(i). amfiboliczne 188 anaboliczny 188 biosyniezy, nukleotydw pirymidynowych 434 de novo puryn z 5-fosforybozy i ATP 428 2,3-bisfosfoglicerynianowy 212 cyklooksygenazy 279, 280 dihydroksyacetonofosforanowy 285 glicerolofosforanowy 285 kni.aholii.vnc 188 kelogenezy w wtrobie 269 kinureninowo-antranilanowy 375 - kwasu uronowego 244 lipooksygenazy 279, 280, 283 metaboliczne 188 analiza 23 ----- poziomy organizacji 192 ----- przeptyw metabolitw 195 ----- rozgaziona regulacja przez sprzenie zwrotne 124 ------ umiejscowienie w komrce 194 monoacyloglicerolowy 285, 286 pentozofbsforanowy 239, 240, 255 enzymy 230 ----- etap, oksydacyjny 241 -------- nieoksydacyjny 241 ----- a szlak glikolizy 242
poliotowy 247
- przemiany galaktoiy 248 sorbitolowy 247 syntezy kwasw tuszczowych 251 wydalanie azotu u ludzi 353 Szpiczak 783 ledziona 876 lepota kurza 710 lina 734 lininki 741 Talasemie 70, 80, 542. 866, 885 Tarczyca, hormony 237, 612 nadczynno 618 Tautyna 43 TBG patrz: Globulina wica hormony tarczycy TBG patrz: Globulina wica tyro-ksyn TBPA patrz: Prealbumina wica ty-Toksyn TEBG patrz: Globulina wica testosteron i estrogeny
Teobromina 417
spermidynowa 390 sperminowa 390 - tiroporfirynogenowa 402404 Syntetaza, acylo-CoA 137, 227, 261, 286, 309 adenylobursztynianowa 422, 429, 430 ------- regulacja aktywnoci 432 aminoacylo-tRNA 494 argininobursztynianowa, brak ak tywnoci 356 asparaginowa 339 glutaminianowa 339 glutaminowa 350 karbamoilolbsforanowa 354, 433, 434, 436 kwasw tuszczowych 122 PRPP431.436 sukcynylo-CoA 202 tymidylanowa 434, 435 Synteza, biaka 491 elongacja 502, 503 inicjacja 500 DNA 467 peptydw metod automatyczn 57 RNA 478 System cytochromu P-450 139 Szczawiobursztynian 200, 201 Szwawiooctan 158,194,198202, 204, 205, 359 Szkorbut 709, 794
-----terminacja 502, 504
Teofilina 311, 417 Teoria chemiosmotyczna 153, 154 Terapia genowa 851 Termogeneza indukowana przez diet 312, 313 Termogenina 313 Test, Amesa 827 opornoci osmotycznej 876 tolerancji galaklozy 248 tolerancji glukozy 238 Testosteron 631,632, 652,654, 656,660 metabolity 656
SKOROWIDZ / 953
Testosteron, regulacja spermatogcnczy 657 . - szlaki metaboliczne 656 Tetrahydrobiopteryna 341 Tetrahydrofolian 706 3,5,3',5'-Tetrajodotyronina 42 Tetrajodotyronina 599 Tetro2y 161 TGF 837 Tiamina 84, 203. 694 brak 694 zapotrzebowanie 732 TIBC 924 Tioesteraza 255 6-Tioguanina 423 Tiokinaza 261 bursztynianowa 201, 202, 216 Tiolaza 264, 268 Tiomocznik pochodne 615 Tioredoksyna 432 Tiouracyi 615 Tkanka tuszczowa 173 brunatna 312 lipoliza 311 metabolizm 309 Tlenek wgla 147, 152 Tlen, toksyczno 145 Tuszcze, mobilizacja 310 przemiana 680 warto energetyczna 723 waciwe 173 a-Tokofero! 716 Tokoferol 716 Tolerancja glukozy 237, 238 Top,pizomerazy 447 TPA 790 T3 patrz: Trijodotyronina T4 patrz: Tyroksyna Transacylaza, acelylowa 252 -- malonylowa 252 Transaldolaza 241 Transamidynaza arginino-glicynowa 396 Transaminacja 190, 191, 203, 204, 347, 348 Transami n aza(y) 204, 347 alaninowa 347, 348 glutaminjanowa 347, 348 Transferaza, bursztynylo-CoA-acetoacetylo-CoA 268 fukozylowa 877 Gal 878 GalNAc 878 gtukanowa a-(l *4)-a(l 4) 219 glukuronylowa 819 y-glutamylowa aktywno we krwi 924 terminalna 548 tlenu 144 Transferyna 775 stenie we krwi 928 Transglutaminaza tiolowo-zalena 785 Transhydrogenaza 160 Transkarbamoilaza ornitynowa nie dobr 355 Transketolaza 241. 244 Transkobalamina II 704 Transkrypcja 451, 452 RNA 480, 548 -----sygnay terminacji 483 Transkryptaza odwrotna 451, 471, 547 Translacja 452 Translokacja cytrynianu 256 Translokaza karnitynoacylokamitynowa261 Transmetylacja 307 Transpeptydaza aktywno we krwi 924 Transport aktywny 567 Transpozycja 465 Transwersja 495 Tranzycja 495 Trawienie 734 Trehalaza 743 Trehaloza 168, 169 Treonina 40, 204, 387 katabolizm 367 zapotrzebowanie 725 D-Treoza 165 TRH patrz: Hormon uwalniajcy tyreotropin TriacylogliceroKe) 177, 178, 190, 194, 294,295 biosynteza 285, 286 chylomi tronw 301 katabolizm 284 lipoprotein o bardzo maej gstoci 301 magazynowanie 308 transport 299, 300 Triamcynolon 632 Trichochromy 394 Trifosfoadenozyna 133 Trifosfonukleozydy 137 Triglicerydy 178 stenie we krwi 917, 924, 928 3,5,3'-Trijodotyronina 42 Trijodotyronina 575, 585. 599, 612 stenie we krwi 616 wychwyt przez biaka surowicy 925 Trikarboksylany 258 Trio-kinaza 245 Triozofosforan 189, 194 Triozy 161 Trombina 768, 788,791 Tromboksan 174, 175,279281 Aj, 177. 792 Tropomiozyna 784, 797, 806 Troponina 797 C798 I 798 T797 Trypsyna 55, 738 Tryptofan4L 204, 391 absorpcja promieni nadfioletowych 43 katabolizm 375, 376 metabolity 393 zapotrzebowanie 725 Trzustka 741 TSH patrz: Tyreotrapina TS1 612 Tuuikamycyna 760 .Tyglilo-CoA 383 Tymidylan 434, 435, 443 Tymidyna 419 Tymina416, 419 zwizana z rybozomonofosforanem (TMP) 420 Tyreoglobulina, biosynteza 612 hydroliza 613 Tyrcoliberyna. (TRH) patrz: Hormon uwalniajcy tyreotropin Tyreotoksykoza 618 TyTeotropina (TSH) 51, 575, 585, 589, 599, 612 budowa i funkcja 606 Tyroksyna 42, 599 cakowita stenie we krwi 925 stenie we krwi 616 wolna stenie we krwi 926 Tyrozyna 40, 41, 204, 371, 395 biosynteza 340 jofeyanie *" katabolizm 369 transaminacja 368 Tyrozynemia 368 noworodkw 370 Ubichinon 148, 149, 184,318 biosynteza 316 Ubikwityna 346 Uchyikowato jelit 726 Udar mzgu 894 UDP-glukoza 422 JDP-glukuronozyloiransferaza 409, 411,412 UDP-kwas glukuronowy 422 Ukkd(y), dopeniacza 891 oksydoredukcyjne 139 reninowo-angiotensynowy 636 Ultrawirowanie 21 Uracyl386, 416, 419 pochodne 422 Urobilinogen 410 w moczu 413 Urokinaza 790 Uroporfirynogen 400 dekarboksylacja 402 Uroporftryny 399 Urydylilotransferaza. galaktozo-1-fosforanowa 248, 250 glukozo-1-fosforanowa 244 niedobr 249 Urydyna418, 419 Urydynodifosfogalakioza 248 Urydynodifosfoglukoza 24S U rydynod ifosfogiukuronozylotransferaza 409, 411, 412 Urydynodifbsforan 217 Urydynomonofosforan 434, 435 Urydynotri fosforan 137 Utlenianie, aminokwasw 147 biologiczne 139 kwasw tuszczowych 147 pozamitochondrialnego NADH 157 przez dehydrogenazy 141 tkankowe 147 wglowodanw 147
954 / SKOROWIDZ
U tlenowa nie, hemoglobiny 74 hemoglobiny zmiana konformacji 75, 76 mioglobiny 71 miglobiny zmiana konformacji 72 Wirus(y), grypy 875 herpcs 829 misaka, kociego 831 ---- mapy 831 ----- myszy 831 ----- Rousa 830, 831 polyoma 829 - rakotwrcze 829 SV- 40 829 zapalenie wtroby B 829 Witamina, A 710 ----- metabolizm 712 --- niedobr 710 ----- stenie we krwi 928 ----- zapotrzebowanie 732 B 84, 692 B, 203 B 700 ----- niedobr 375, 377, 702 ----- zapotrzebowanie 733 BI 227, 703 niedobr 704, 866 ----- niewydolno przemiany do ko enzymu 384 ------- zapotrzebowanie 733 C 239, 708 Wykres, podwjnych odwrotnoci 105 -----a hamowanie, kompetycyjne 108 niekompetycyjne odwracalne 109 Wyniszczenie 338 Wyspy Langerhansa 671 Xeroderma pigmentosum 475, 852 Xerophtalmia 713 Zaburzenia krzepnicia 8S5 Zama 250 cukrzycowa 247 Zakrzepic 770 Zamek leucynowy" 526 Zanik nerki 845 Zapalenie 865 puc 845 siatkwki barwnikowe 908 staww 769 ----- moczanowe ostre 438 ----- przewleke 438 Zapotrzebowanie energetyczne 723 Zarodce sierpowate 875 Zasada(y), mocne 29 - piryroidynowe 42, 416 purynowe 416, 425 rozpuszczalno 417 sabe 29 sprzona z kwasem 31 Zasadowica 26 Zaniad groniasty 669 Zatrucie, amoniakiem 349 ciaowe u owiec 307, 335 etanolem 858 Zawa serca 845, 856 Zesp, Conna 644 Criglera-Najjara 851 ----- typ,I 412 ---------II 412 Cushinga 644 Downa 846, 847 Dubina-Johnsona 412 Ehlersa-Danlosa 794, 814 ektopowej syntezy hormonw 574 feminizujcych jder 583, 659 Gilberta 412 Huntera 767 Hurler 766, 767, 844 Kearnsaâyre'a 896 amliwego X 898 Lescha-Nyhana 425, 440, 542 Marfana 814 McArdle'a 225 MELAS 160 Menkesa777, 814 Morquio-podobny 767 Morteaux-Lamy 767 mzgowo-wtrobowo-nerkowy 844 nadnerczowo-pciowy 644 - niedoboru a-glukuronidazy 767 policystycznych jajnikw 669 rakowiaka zoliwego 698
VIPpairz: Peptyd jelitowy wazuaktyw-ny VLDL patrz: Lipoproleiny o bardzo malej gstoci VMA patrz: Kwas wanilino migdaowy
Wady metaboliczne wrodzone 14 Walina 39, 204 - katabolizm 377, 378, 380 reakcje swoiste 383 zapotrzebowanie 725 Walinomycyna 160 Wap 728 przemiana 594 rola w miniu 221, 800 stenie we krwi 926, 928 Warfaryna719 Wazopresyna (ADH). 585,629 funkcja 609 mechanizm dziaania 611 patofizjologia 611 regulacja sekrecji 610 Wtroba 742 marsko 198, 778, 845 powikszenie 845 stuszczenie 305, 845 synteza witaminy D 626 zapalenie ostre 198 Wchanianie 734 Western bot 537, 548 Wglowodany 190 magazynowanie w organizmie 217 metabolity, transport 192 metabolizm 121. 189, 191 warto energetyczna 72?** Wizanie(a), amidowe 50 cystynowe 61 disiarczkowe 61 elektrostatyczne 62 fosforanowe bogatoenerEetyczne 135, 147, 202,216 - N-glikozydowe 754 (3-N-glikozydowe 433
O-glikozydowe 166, 754
kowalencyjne 61, 96 peptydowe 47, 48, 61 wodorowe 28, 61 -----w DNA 444 Wielomocz w cukrzycy 678 Wimentyna 811 Winblastyna 810 Winkulina 830 Wirus(y), biaaczki, mysiej Abelsona 831 ------ mielocylowej 831 Epsteina-Barr 829 erytroblastozy ptasiej 83!
D 183, 624,710, 714 ----- niedobr 627, 715 ----- powstawanie 625 ----- stenie we krwi 928 ----- synteza 714 716,902 niedobr 717 ------- zapotrzebowanie 732 K717 ----- niedobr 720 ----- rola 718 ----- zapotrzebowanie 732 rozpuszczalne, w wodzie 693, 722, 727 ---------normy 733 ----- w tuszczach 710, 722, 728 -------- normy 732 WKT patr2: Kwasy tuszczowe wolne Wkna pokarmowe 726, 741 Woda, asocjacja czsteczek 28 czsteczka, dipolarna 27 tetraedryczna 27 dysocjacja 28 jonizowanie 28 regulacja rwnowagi 26 struktura wielkoczsteczkowa 27 znaczenie biomedyczne 26 Wodorowglany, stenie we krwi 926, 928 Wole rodzinne 851 Woski 173 Wspczynnik, przenikarnoci 553 temperatury 100 Wykres, Lineweavera-Burka 105 -----a hamowanie, kompetycyjne 109 niekompetycyjne odwra calne 109
----- niedobr 709 ----- stenie we krwi 928 ----- zapotrzebowanie 732
SKOROWIDZ / 95S
Zesp, Reye'a 441 Richnera-Hanharta 368 Sanfilippo 767 Scheiego 767 Steina-Leventha.la 669 Turnera 669 Zellwegera 265, 844 Ziarniszczaki 669 Zinc fmger" 525 Zcze nerwowo-mimowe S88 Zwizki, glukogenne 234 ketonowe (ciaa ketonowe) 190, 191, 194,260,266,287,268,331 -----utlenianie 334 przeciwutleniajce 185 Zwizki, rozprzegajcc acuch odde chowy 152, 156 Zymogen 112 elatynaza 885 elazo, funkcja 775 hemowe 407 metabolizm 730, 775 zaburzenia 776 nadmiar 870 niedobr 775
stenie we krwi 927
elazoporfiryna 375 409, 736 pcherzykowa 737 - skad 736 wtrobowa 737 taczka{i) 398, 411 analiza biochemiczna 413 cholestatyczna 413
fizjologiczna noworodk w 411
zapotrzebowanie 733 rda 730
hemolityczna 413 mechaniczna 413 niehemolityczna wrodzona 412 samoistna przewleka 412 ywienie 721 normy 731
Biochemia Harpera" to Jeden z najlepszych i najnowoczeniejszych podrcznikw obejmujcy caoksztat przemian zachodzcych w organizmie czowieka, Obecne, trzecie polskie wydanie tej ksiki jest cakowicie zmienione w stosunku do poprzednich wyda. Przedstawiony materia ujto w 7 podstawowych czciach, uwzgldniajc zarwno chemizm; Jak [ przemiany metaboliczne podstawowych substancji niezbdnych do ycia i funkcjonowania kadego organizmu. Gwny nacisk pooono na prawidowe przemiany biochemiczne organizmu, zwracajc jednak uwag na wszelkie skutki patologiczne wynikajce z zaburze lub nieprawidowoci zaistniaych w poszczeglnych szlakach metabolicznych, czyli na biochemiczne podstawy chorb czowieka. Ksika ta ma podwjn warto. Jest niezbdna dla lekarzy oraz studentw w zrozumieniu podstaw zjawisk patologicznych, ale jest take pasjonujc lektur dla wszystkich zainteresowanych zagadnieniami biochemii w medycynie.
Cena z 50000 0,-z 50,tSBN 83-200-1798-X

Biochemia Harpera PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Biochemia Harpera PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BIOCHEMIA HARPERA

a LANGE medical book

Prentice-Hall International Inc.

Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell

Warszawa 1995 Wydawnictwo Lekarskie PZWL

Z oryginau angielskiego Harper's Biochemistry ed. 22

pod red. prof. dra hab. FRANCISZKA KOKOTA Tumaczyli

Przedmowa do wydania polskiego

Prof. dr hub. med. Franciszek Kokot

_ RKM _ DKG _ PAM _ VWR

415 415 425 443 456 476 491 508 529

BIOCHE MIA i M E DYCYNA / 13

Biomolekuy i metody biochemiczne

Potas Siarka Sd Chlor Magnez elazo Mangan

0,01 0.001 0,00006

Gwne biopoinrtery to DNA, RNA, biaka, polisacharydy i zoone lipidy

BIOMOLEKUY I METODY BIOCHEMICZNE / 17

Procent 17,0 13,8

Wglowodany Woda** Skadniki mineralne

Polisacharydy (glikogen) Lipidy

Ryc. 2-1. Schemat komrki wtroby szczura z jej gwnymi organellami.

Peroksysom Cytoszkielet* Cytozol*

BIOMOLEKUY I METODY BIOCHEMICZNE / 21

Wyizolowany, perfundowany narzd Skrawki tkankowe

BIOM OLEK UY I MET ODY BIOCHEMICZNE / 23

STRATEGIE W BADANIU REAKCJI BIOCHEMICZNYCH SA ZOONE I WIELOPOZIOMOWE

BIOMOLEKUY I METODY BIOCHEMICZNE / 25

BIOCHEMIA, PRZEZ LICZNE ODKRYCIA, WSPIERA BIOLOGI KOMRKI I MEDYCYN

POZOSTAO WIELE DO ZBADANIA

Ryc. 3-1. Tetraedryczna struktura wody

= 0,018 x 10 1O" 1S mol/l

mol/l) (55,56 mol/l) =

2,0x10" e 2,0x10~ 7 1,0x10" 6 2,1 x10"

= -l og ( 3, 2 x1 0" *) 4 = -log (3, 2) -log C IO" )

-0,60 + 4,0 = 3,4 i teraz

Sprzona zasada CH3COOCH3NH2

Mona to wyrazi sowami: gdy rodzaj jonw

tj. pK grupy kwasowej jest takim pH, w ktrym

stenia postaci protonowej i niepro tonowej s

pK 4,75 4,34 5,41 3,08 4,74 5,40

Zatem w przypadku zobojtnienia w poowie pH = pK. 2. Kiedystosunek(;A-]/[HA]wynosi 100:1

pH = pK + log 100/1 = pK + 2 3. Kiedy stosunek [A~]/[HA] wynosi 1:10

Po podzieleniu obu stron przez [A~]

Po zlogarytmowaniu obu stron:

[A ] log K + log Po pomnoeniu przez 1

Po podstawieniu zamiast log H+ i log K odpowiednio pH i pK otrzymuje si

Z kolei usuwa si znak minus, odwracajc ostatni czon rwnania:

Ryc. 3-6. Krzywa miareczkowania kwasu typu HA.

Punkt {) wskazuje pK o wartoci 5,0.

CZ I Budowa oraz funkcje biaek i enzymw Aminokwasy

Dwie formy przedstawienia j.-amino-

jedna naadowana, a druga obojtna, wystpuj w rwnowadze protonowej:

* Hydroliza = rozerwanie wizania kowalencyjnego przy udziale czsteczki wody.

Imidazolowa (histydyna) ^-Aminowa s-Aminowa (lizyna) Fenolowa OH (tyrozyna) R- N H + R-NH^

9,8 1,0 10,5 10,1

Sulf hydry Iowa (cystein3)

W mocnym kwasie (pH ponleji); cakowity ladunek= + l

Ryc. 4- 4. Rwno wagi protono we kwasu asparagino wego.

PODZIA AMINOKWASW WYSTPUJCYCH W BIAKACH NA PODSTAWIE WZGLDNEJ POLARNOCI ICH GRUP R

Alanina Izoleucyna Leucyna Metionina Fenyloa Janina Prolina Tryptolan Walina

Aminokwasy z. alifatycznymi acuchami bocznymi

cd. tab. 4-3 Nazwa Symbol Wzr strukturalny

Aminokwasy z acuchem bocznym zawierajcym grupy hydroksylowe (OH)