Egzamin: 01-02-2006 s.

220, A3 podzia na grupy: 8:15 10:00 nazwiska od A do L 10:15 12:00 nazwiska od do MIKROBIOLOGIA PRZEMYSOWA WYKAD [2005] Dr Rucka Niniejszy dokument sporzdzony zosta dziki wkadowi pracy jednej osoby koleanki z roku, Madzialenki za co wszyscy serdecznie jej dzikujemy. Oby kademu tak chciao si chcie, wtedy wszystkim byoby atwiej 12-10-2005

Wykad 2
Woda jako element podoa, jest tem poywki, rodowiskiem Jako wody jest bardzo istotna. W procesach przemysowych uywa si gwnie wod wodocigow, sterylizuje si ju wszystko razem w reaktorze. Obecno zwizkw elaza moe wpywa niekorzystnie na produkcj np. antybiotykw, kwasu cytrynowego. Dlatego naley na bieco kontrolowa wod do celw mikrobiologicznych. Woda powinna by filtrowana. Woda medium do chodzenia w trakcie procesu, do mycia jest to woda gorszej jakoci Wiele zakadw produkcyjnych ma wasne ujcie wody np. odwierty, powierzchniowe. W zalenoci od tego, skd pochodzi, naley j uzdatni. Plusem jest to, e zakad moe kontrolowa stan tej wody. Bardzo czsto browary maj wasne ujcia wody. skad podoa: 1. woda 2. rdo wgla 3. rdo azotu 4. inne skadniki: fosfor, witaminy, prekursory (w zalenoci od mikroorganizmu) rdo wgla gwny skadnik podoa, potrzebny do biosyntezy, rdo energii dla mikroorganizmw, aby obniy koszty szuka si tanich i efektywnych rde, gwnie uywa si wglowodanw, zaczyna si wykorzystywa wglowodory np. pozostao po destylacji ropy naftowej wglowodany: 1. Monosacharydy - glukoza skadnik pod mikrobiologicznych, najczciej w laboratoriach jako monosacharyd, do rzadko wystpuje w naturze (np. w winogronach), najszybciej

przyswajana, w przemyle uywa si glukozy pochodzcej z hydrolizy skrobi (procesy chemiczno-enzymatyczne), powstaje syrop glukozowy Podczas sterylizacji glukoza moe wchodzi w reakcj z aminokwasami z podoa, dlatego podoe i glukoz sterylizuje si osobno {rysunek krzywa diauksji gdy w podou s dwa rda wgla} 2. Oligosacharydy - laktoza powszechna w przyrodzie w mleku od 3 do 8 %, przemysowo otrzymywana przez odparowanie serwatki, nie wszystkie mikroorganizmy rozkadaj laktoz - sacharoza w owocach, burakach cukrowych, trzcinie cukrowej Melasa zawiera niewykrystalizowane cukry po produkcji cukru, produkt uboczny, zawiera rwnie inne skadniki, doskonae rdo wgla do pod mikrobiologicznych, poniewa jest produktem naturalnym, wic jej skad moe si waha, moe rwnie zawiera mikroorganizmy (zakaona!), wymaga wstpnej analizy

3. Polisacharydy - skrobia skadnik energetyczny skadowany u rolin w bulwach, jest nierozpuszczalna, trzeba j chemicznie modyfikowa, eby mona j byo rozpuci, wikszo organizmw przyswaja skrobi - celuloza bardzo rozpowszechniona, skadnik ciany komrkowej rolin, jednak niewiele organizmw j przyswaja, dlatego wymaga wstpnej obrbki rdo azotu mog by w dwch postaciach: nieorganiczne sole lub rdo organiczne Sole azotu np. nawozy mineralne, mocznik, sole amonowe Organiczny atwiej przyswajalny, wykorzystuje si produkty uboczne przemysu spoywczego np. syrop kukurydziany, syrop ziemniaczany w postaci aminokwasw - ekstrakt drodowy liza komrek drody w 50C, ogrzewanie do 75C, plazmoliza, filtracja, wirowanie, zawiera witaminy, aminokwasy

19-10-2005

Wykad 3
ZASZCZEPY MIKROBIOLOGICZNE

Charakterystyka wzrostu mikroorganizmw: - bakterie podzia - drode pczkowanie - grzyby plecha Pomiary iloci komrek: - stenie komrek - stenie masy komrek S to dwa zasadniczo rnice si parametry np. zaraz po podziale komrki bakteryjnej mam dwie komrki, ale s jeszcze mae i ich masa si nie zmienia, jest jak masa jednej komrki. W praktyce mierzy si zarwno mas i ilo komrek. Pobieramy prbk o znanej objtoci, robi si posiew i zlicza si liczb komrek lub liczymy komrki pod mikroskopem Obecnie mona automatycznie zlicza liczb komrek, jednak automat nie rozrnia komrek martwych i ywych Pomiar przez posiew jest jednak dugotrway (24-48h), co jest problemem, gdy chcemy na bieco kontrolowa hodowl Pomiar masy mierzymy komrki ywe i martwe pozostaoci komrek, ale s to pomiary szybkie Wprost oddziela si na sczkach mikroorganizmy (lub przez wirowanie) od pynu pohodowlanego, prbk suszymy i waymy Pomiar turbidometryczny mierzymy rozpraszanie wiata Moemy robi rwnie pomiary niebezporednie mierzc jaki skadnik np. wydzielany przez komrki CO2. Trzeba wyznaczy wspczynnik opisujcy zaleno midzy mas (iloci) komrek a mierzonym skadnikiem. Jednak ilo pewnych skadnikw moe zalee od warunkw fizjologicznych, a masa si nie zmienia. Mona mierzy rwnie: biaka, ATP, kwasy nukleinowe. !!! Problem jest z grzybami, gdy one nie rosn w postaci pojedynczych komrek tylko w koloniach, dlatego nie wiadomo, co mierzy. Dobry zaszczep mikrobiologiczny 1. 2. 3. 4. Zawiera ywe i aktywne komrki Jest dostpny w duych ilociach Wolny od zanieczyszcze Jego komrki musz mie zachowan zdolno do wytwarzania interesujcego nas produktu

Dlaczego ywe i aktywne komrki? Dymy do tego, aby skraca do minimum faz adaptacyjn hodowli. Podoe do hodowli inokulum rni si od podoa produkcyjnego. Podoe takie ma taki skad, aby komrki

mnoyy si jak najszybciej, natomiast podoe produkcyjne ma taki skad, aby powstao jak najwicej podanego produktu Czemu skracamy okres adaptacyjny: Ekonomia jest to czas, gdy nic si nie produkuje Jest to czas, w ktrym najatwiej o zakaenie hodowli Staramy si rwnie, aby podoa nie rniy si drastycznie. Wane jest rwnie, aby zaszczepu byo duo, jest to okoo 3% objtoci hodowli. Hodowla inokulum jest procesem wieloetapowym: - Bakterie przechowywane s na skosach - Hodowla w poywce pynnej w kolbach (max. 0,5 litra) - Hodowla w mini-reaktorach przelewamy cao kolb (kilkadziesit litrw) - Przenosimy zaszczep do reaktora produkcyjnego Po drodze sprawdzamy czysto hodowli, oraz czy nasze komrki nadal potrafi produkowa oczekiwany produkt tzn. jak si komrki zestresuj, to zapomn, czego je nauczylimy Gdy uywamy drody czsto jest tak, e jako zaszczepu uywamy organizmw z poprzedniej szary np. w produkcji piwa drode osadzaj si, osad taki przemywamy wod, antybiotykami, filtrujemy i mona je ponownie uy. Istnieje jednak niebezpieczestwo degeneracji komrek np. wytwarzaj jaki produkt uboczny, dlatego tego samego zaszczepu uywamy okoo 5 razy i dajemy nowy zaszczep (nowe zastpy dzielnych drody gotowych, by zmierzy si z chmielem i jczmieniem). Inokulum do procesw grzybowych W wikszoci wypadkw uywamy spor do inokulum. 1. Doprowadzamy grzyby do sporulacji przez ustalenie odpowiednich warunkw np. ograniczamy dostp rde azotu, jako podoa uywamy np. zmielon kukurydz, kromki chleba, w warunkach wysokiej wilgotnoci 2. Zbieramy spory, liczymy i moemy dalej postpowa na dwa sposoby: - Uywamy spor do zasiewu wydua si faza adaptacyjna, nie potrzeba dodatkowej instalacji - Skiekowujemy spory w osobnej instalacji, dopiero potem zaszczepiamy w reaktorze produkcyjnym Gdy mamy grzyby niesporulujce: - homogenizacja grzybni - zaszczepiamy reaktor Wzrost grzybw moe mie charakter rozproszony lub w agregatach.

26-10-2005

Wykad 4
Skd moemy otrzymywa zaszczepy? - Z komrek macierzystych, w wikszoci krajw s przedmiotem opatentowanym - Zakupienie z kolekcji szczepw - Wyizolowanie szczepw ze rodowiska duga droga - Kradzie szczepw Przechowywanie szczepw Musimy je przechowywa tak, aby nie ulegy zmianom genetycznym, aby nie doszo do zakaenia, musz zachowa ywotno i praktyczno 1. Obnianie temperatury spowolnienie procesw metabolicznych lub ich cakowite zahamowanie Na skosach agarowych, w lodwce w temperaturze 5-10C, mona je przechowywa maksymalnie p roku W ciekym azocie (<150C) mona przechowywa do kilkudziesiciu lat, komrki musz by odpowiednio przygotowane, zawiesza si je w glicerolu, zamyka w ampukach, poddaje powolnemu zamraaniu, wysokie koszty przechowywania Do biecego uytku przechowujemy bakterie na skosach w lodwce, ale zawsze przechowujemy elazn rezerw komrek trzymanych w inny sposb np. w ciekym azocie 2. Odwadnianie komrek powoduje to spowolnienie procesw metabolicznych Posiew na podoe stae np. gleba, produkty spoywcze, doprowadza si do wzrostu i powoli suszy (w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni), pozwala przechowywa szczepy przez dugi czas (kilkadziesit lat), gwnie przechowuje si w ten sposb grzyby promieniowce Liofilizacja odwadnia si komrki w obnionej temperaturze, zamraa si komrki w pynnym podou, nastpnie odpompowuje si powietrze, obnia si cinienie, co powoduje, e ld przechodzi ze stanu staego w par, podoe zawiera czynniki chronice np. mleko, surowica, glutaminian sodu, ampuki z takimi zliofilizowanymi komrkami mona przechowywa minimum 10 lat, nie trzeba utrzymywa niskiej temperatury, przy zamraaniu komrki mog ulec zniszczeniu i nie wszystkie komrki mog by zliofilizowane

BIOSYNTEZA METABOLITW Podzia metabolitw: - pierwotne zwizki niskoczsteczkowe, s konieczne do wzrostu komrek, np. aminokwasy, monosacharydy - wtrne czsto zwizki wielkoczsteczkowe, ich synteza zachodzi pniej podczas wzrostu hodowli, nie s potrzebne do wzrostu komrki, s wane z punktu widzenia przeycia producenta

Jeli chcemy otrzymywa metabolity pierwotne, musimy utrzymywa hodowl (cig) na etapie wzrostu logarytmicznego, gdy chcemy metabolity wtrne etap fazy stacjonarnej. Jak przekona komrk, aby produkowaa dany produkt? Kady organizm ma mechanizm kontroli np. Sprzenie zwrotne kocowy produkt szlaku metabolicznego hamuje cay szlak np.: Jako inhibitor pierwszego enzymu ze szlaku gdy stenie produktu kocowego dojdzie do pewnego poziomu, zachodzi inhibicja enzymu, gdy wyczerpuje si produkt, cykl rusza od nowa Produkt moe te by represorem genu kodujcego enzym, enzym w ogle nie powstaje wiksza oszczdno. By komrka nadprodukowaa dany produkt, trzeba omin system kontroli: Utrzymujemy stenie produktu kocowego na niskim poziomie przez zwikszenie przepuszczalnoci bony np. dodajemy do podoa antybiotyki uszkadzajce bon lub otrzymujemy szczep mutantw, ktre nie wytwarzaj bony, w ten sposb produkujemy kwas glutaminowy, ten sposb dodatkowo pozwala na atwiejsze uzyskanie produktu z komrki Wprowadza si zmiany genetyczne, ktre sprawiajce, e organizm wytwarza enzym niewraliwy na sprzenie zwrotne, wtedy szlak metaboliczny dziaa niezalenie od stenia produktu kocowego, ten sposb jest trudniejszy do wykonania

09-11-2005

Wykad 5
Podstawowy szlak regulacji metabolizmu to sprzenie zwrotne. Enzym, ktrego synteza jest regulowana przy udziale kocowego produktu szlaku metabolicznego (mechanizm represji) nazywamy enzymem represyjnym. Represorem mog te by produkty porednie w szlaku metabolicznym. Znajomo mechanizmu regulacji jest bardzo wana, gdy chcemy otrzymywa produkt kocowy lub sam enzym. Przykady omijania: Komrki mutujemy tak, aby nie wytwarzay biotyny (ktra jest skadnikiem bony komrkowej), zwiksza si przepuszczalno bony komrkowej , taka komrka nie zatrzymuje produktu kocowego, nie nastpuje sprzenie zwrotne, komrka jest nadproducentem

 Dodanie antybiotyku penicyliny, ktra uszkadza cian komrkow, prze to zwiksza si przepuszczalno komrki Represja kataboliczna przy danym rodowisku, komrka nie produkuje danego enzymu, dopiero zmiana w rodowisku prowadzi do uruchomienia jakiego szlaku metabolicznego, moe to by np. ubytek okrelonego rda wgla. Niektre komrki mog by wraliwe na wasny antybiotyk, zwaszcza w fazie wzrostu logarytmicznego, gdzie przewaaj mode, szybko dzielce si komrki. Natomiast w fazie stacjonarnej przewaaj dojrzae komrki, bardziej odporne na wasny antybiotyk. W tej fazie mona sobie pozwoli na produkcj antybiotyku. Moe on eliminowa szczepy konkurenckie, ktre zaczynaj si namnaa. Komrka zaczyna produkowa antybiotyk gdy zabraknie jakiego skadnika np. rda wgla, azotu czy fosforu. Odpowiednio dobierajc skad podoa, moemy sterowa produkcj antybiotykw. Obecno jakich zwizkw w podou moe indukowa jaki szlak metaboliczny. Zwizki te nazywamy induktorami. Produkcja wielu antybiotykw rwnie dziaa na zasadzie sprzenia zwrotnego np. penicyliny, chloramfenikolu. Jeeli mamy komrki zmutowane tak, aby nadprodukoway jaki zwizek (np. nie produkuj biotyny) otrzymujemy produkcj metabolitu nawet 1000-krotnie wiksz, musimy jednak zachowa idealne warunki sterylne, poniewa w przypadku, gdy dojdzie do zakaenia jakim dzikim szczepem, bdzie on lepiej przystosowany i wyprze nasz szczep producencki.

IZOLACJA SZCZEPW UYTECZNYCH PRZEMYSOWO Gdy pobieramy szczep ze rodowiska, musimy go sobie wyizolowa. Jakie kryteria musi spenia ten szczep? 1. Czy szczep produkuje interesujcy nas metabolit? - Musimy zastanowi si, gdzie, w jakim rodowisku, bdzie najwiksza szansa na znalezienie organizmu o interesujcych nas waciwociach - Czsto poszukuje si organizmw ekstremofilnych, produkuj one enzymy, ktre s przystosowane do katalizowania reakcji w warunkach ekstremalnych np. odporne na bardzo wysokie temperatury, rne zakresy pH, zasolenie, dziki uyciu takich enzymw nie musimy zapewnia komrkom cieplarnianych warunkw Aby wyizolowa interesujcy nas szczep z duej iloci mikroorganizmw, uywamy testw przesiewowych (screeningowych). Test przesiewowy musi by prosty i tani, aby pozwoli na szybkie przesiewanie duej iloci komrek. Przykad: - Poszukujemy enzymw proteolitycznych

- Posiewamy mikroorganizmy na podoe zawierajce biako, zazwyczaj kazeina, biako mleka - Na podou rosn sobie rne szczepy - Po 48h wlewamy na pytk kwas trjchlorooctowy, powoduje on wytrcanie (koagulacj) biaka - W miejscach, gdzie kolonia nie rozkada biaka, otrzymujemy mtny placek wok kolonii, wok tych, ktre rozkadaj biako, pojawia si rozjanienie - Teraz ju mona atwo wyizolowa kolonie produkujce enzymy proteolityczne. Gdy nie mamy testu przesiewowego, mona bra pod uwag grup taksonomiczn. Izolujemy dan grup np. Streptomyces, gdy szukamy jakiego antybiotyku, i dopiero w tej grupie szukamy konkretnego szczepu. Po przesiewach nadal mamy bardzo duo organizmw producenckich. Do selekcji uywamy kolejnych kryteriw. 2. Wymagania ywieniowe szukamy szczepu, ktry poywia si na tanim rdle wgla, posiewamy komrki na okrelone podoa z rnymi rdami wgla, sprawdzamy, czy szybko si mno i czy produkuj nasz zwizek, odrzucamy organizmy, ktre wymagaj drogich rde wgla, wybieramy te, ktre wymagaj tanich. 3. Optymalna temperatura wzrostu zazwyczaj wybieramy te, dla ktrych optimum temperatury jest powyej 40C, w produkcji przemysowej atwiej jest podgrza ni ochodzi, izolacja jest bardzo prosta, prowadzimy hodowl w danej temperaturze, sprawdzamy, ktre si szybciej mno, produkuj wicej metabolitu 4. Czy organizm bdzie mona hodowa w urzdzeniach, ktre ju posiadamy? Np. jeli mamy aparatur tlenow, nie szukamy beztlenowcw, mona przetestowa efektywno organizmw stosujc rne rodzaje mieszania, natleniania, itp

16-11-2005

Wykad 6
TECHNOLOGIE CIEKW I stopie oczyszczania ciekw oczyszczanie mechaniczne np. kraty ciek wszystko, co pynie, i nie moe by ponownie wykorzystane w procesie technologicznym - moe to by rwnie woda, ktra bya uywana do chodzenia, bo jest podgrzana, wysza temperatura zmniejsza rozpuszczalno gazw - cieki bytowe i przemysowe II stopie oczyszczania ciekw oczyszczanie biologiczne

Oczyszczanie biologiczne mona przeprowadza, gdy cieki zawieraj substancje mogca stanowi poywk dla mikroorganizmw, np. cieki pochodzce z przemysu spoywczego, chemicznego Komory osadu czynnego reaktory z cakowitym przemieszaniem, ciek przygotowujemy tak, aby pH byo obojtne, musi by odpowiednia ilo pierwiastkw podstawowych, niekiedy nawet dodajemy okrelone zwizki, np. z azotem, aby mikroorganizmy mogy si rozwija reaktor mieszalnikowy osadnik wtrny osadza si osad czynny Zooglea paeczka tlenowa, gramujemna, ma otoczk luzow, wydziela egzoenzymy, ktre rozkadaj zwizki wielkoczsteczkowe Sorbcja enzymatyczny rozkad wchanianie Gdy ciek jest za bardzo stony, mamy za mao zooglei, a wicej S. natans wskanik wd zanieczyszczonych Jest to bakteria nitkowata, luzowata, zmienia waciwoci sedymentacyjne osadu czynnego, bo one flokuj, pywaj na powierzchni, osad puchnie i wypywa z osadnika III stopie oczyszczania ze cieku usunita jest biomasa, ale pozostaj zwizki nierozkadalne przez osad czynny

23-11-2005

Wykad 7
BZT5 biologiczne zapotrzebowanie tlenu Pozwala okreli mikrobiologicznych. zanieczyszczenie ciekw, rwnie wydajno oczyszczalni

Usuwanie zwizkw azotu W ciekach azot zawarty jest w biaku. Jakim procesom podlega biako: Rozkad proteolityczny przy udziale egzogennych proteaz, powstaj polipeptydy peptydy aminokwasy Stopie hydrolizy zaley od charakteru biaka, wikszo enzymw jest specyficzna do wiza przy konkretnych aminokwasach, cz peptydw jest wbudowana w komrk Dezaminacja aminokwasw zazwyczaj na drodze tlenowej, powstaj ketokwasy, oddziela si zwizek azotu, dezaminacji moe ulega rwnie mocznik wystpujcy w ciekach, za pomoc ureazy ulega rozkadowi do amoniaku Amoniak rozpuszcza si w wodzie, powstaje zasada amonowa NH4(OH)

organizmy nitryfikacyjne: Nitrosomonas: NH3 NO2 w warunkach tlenowych (I stopie nitryfikacji) Nitrobacter: NO2 NO3 warunki tlenowe (II stopie nitryfikacji) Nitrosomonas i Nitrobacter s chemoautotrofami tzn. uzyskuj energi z utleniania zwizkw nieorganicznych organizmy denitryfikacyjne warunki beztlenowe NOx N2 Proces ten jest hamowany obecnoci tlenu, organizmy denitryfikacyjne s wzgldnymi beztlenowcami i w warunkach beztlenowych wykorzystuj tlen ze zwizkw azotu, proces ten jest bardzo wydajny ZOA BIOLOGICZNE Jest to kolejna metoda biologicznego oczyszczania ciekw. W kolumnie umieszcza si pki z porowatym wypenieniem, aby zwikszy powierzchni, nad podoami kry rami i rozdeszcza cieki. Podczas omywania przez cieki na powierzchni wypenienia tworzy si film biologiczny. Tlen jest dostarczany od dou, z powodu efektu efektu kominowego. Z powodu dziaalnoci biologicznej powietrze nagrzewa si i idzie do gry, wcigajc od dou chodniejsze powietrz. W takich zoach organizmy s immobilizowane: Zalet jest fakt, e w odcieku nie ma mikroorganizmw, nie musimy oddziela biomasy od oczyszczonego cieku. W praktyce nie jest tak atwo. W zou, ktre duej pracuje, nastpuje odpadanie mikroorganizmw od elementw wypenienia, dzieje si tak, gdy komrki znajdujce si na samej powierzchni wypenienia obumieraj, gdy zwiksza si miszo biomasy, nie dociera do nich tlen ani skadniki odywcze Zoa biologiczne maj charakter tokowy, po drodze zmienia si stenie skadnikw, ubywa zwizkw stanowicych poywk, przybywa metabolitw, w przypadku dostania si do zoa jakiej toksyny, mona przyj, e cae jej stenie zatrzyma si na 1-2 grnych pkach Wad jest nisza efektywno okoo 75-80% BZT5 (komory osadu czynnego powyej 90%) Na zou biologicznym muchwki skadaj larwy, ktre poeraj film biologiczny. Gdy larwy przeistocz si w posta doros, a wraz z mini (jako ich cz) zoe biologiczne. Co si dzieje z osadami po oczyszczaniu? Mona ich uy jako nawz (po przegotowaniu), ale mog w nim przey larwy, cysty organizmw pasoytniczych, osad taki moe zawiera rwnie zwizki nierozkadalne np. metale cikie zaabsorbowane na biomasie, mona uywa w miejscach, gdzie nie ma upraw uytkowych, tylko np. ziele rekreacyjna Kompostowanie w warunkach beztlenowych, rozkadane s zwizki zawarte w komrkach, zmniejsza si objto biomasy Wylewanie na polach irygacyjnych, jest dobry dostp tlenu, rozwijaj si organizmy najlepiej przystosowane, cz biomasy ulatnia si do atmosfery

Wszystkie te metody s jednak do powolne, oczyszczalnie staraj si zmniejszy objto osadw.

BIOTECHNOLOGIA PRZEMYSU MLECZARSKIEGO Podzia produktw fermentacji mlekowej: Powstae z dziaalnoci bakterii mezofilnych kwasu mlekowego: Twarg mietana Malanka Zsiade mleko S to produkty rodzimie dla naszej szerokoci geograficznej Powstae po fermentacji szczepami termofilnymi kwasu mlekowego: Jogurt pochodzi z basenu Morza Czarnego np. Bugaria Powstae z dziaalnoci bakterii kwasu mlekowego przy wspdziaaniu innych mikroorganizmw np. drody Kefir Skd przemys mleczarski bierze zaszczepy? Rozwina si brana produkcji szczepionek dla przemysu mleczarskiego. Domowym sposobem wykorzystuje si bakterie natywne, wystpujce naturalnie w mleku. Mleko musi by niepasteryzowane! Szczepionki wytwarzane s do konkretnego produktu: dla mietany Streptococcus lactis i cremonis dla kefirku Streptococcus lactis i cremonis, Lactobacillus, drode Pluiveromyces fragilis dla jogurciku Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus Czsto firmy dostosowuj szczepionki do skadu mleka np. zale od pory roku.

30-11-2005

Wykad 8
Dziaalno bakterii mlekowych powoduje zakwaszenie rodowiska (powstaj kwasy), wytrca si kazeina, wytwarza si ukad koloidowy i powstaj micele. Kazeina, ktra si wytrca, jest biakiem nierozpuszczalnym w wodzie i tworzy si skrzep kazeinowy.

Podpuszczka (renina) enzym wystpujcy w odkach modych ssakw, rozkada kazein, pocztkowo otrzymywano go z odkw cielt, jagnit, teraz mona uywa enzymu pochodzenia mikrobiologicznego Po usuniciu skrzepu pozostaje serwatka, tuszcz i biako s w skrzepie. Ze skrzepu biaka z tuszczem powstaj sery dojrzewajce (te), ale nie s kwane, gdy nie wystpuje zakwaszenie mleka. Mikroorganizmy bior czynny udzia w wytwarzaniu serw pleniowych. Sery te powstaj rwnie z niezakwaszonego mleka. Dojrzeway w grotach, jaskiniach, gdzie na serze dojrzeway rne grzyby wytwarzajce proteazy, lipazy. W tej chwili w produkcji przemysowej sztucznie zaszczepia si grzyby na skrzep kazeinowy. Wszystkie inne produkty mleczne np. twarg, s to produkty fermentowane (zakwaszenie mleka) - Sery oddziela si skrzep od serwatki - Napoje mleczne skrzep pozostaje w serwatce Metoda zbiornikowa pasteryzacja, ujednolicenie skadu (dodanie mleka w proszku), umieszcza si w duym zbiorniku, podaje si zaszczep, nastpuje inkubacja, mleko fermentuje, po tym czasie rozlewa si do pojemnikw Fermentacja w opakowaniach wyrwnanie skadu, pasteryzacja, homogenizacja, oddaje si szczepionk i rozlewa do opakowa, w opakowaniach nastpuje fermentacja w termostatowanych pomieszczeniach Szczepionki mleczarskie rni si skadem, w zalenoci od produktu. Hodowane s na mleku w proszku, jest to hodowla okresowa, zatrzymywana na pocztku fazy stacjonarnej, sporzdza si szczepionk Formy szczepionek: Pynne bezporednio po przerwaniu hodowli przewiezione do producenta, jeli zakad mleczarski sam produkuje szczepionki przenosi si je bezporednio, w praktyce jest to najmniej przydatna forma, bo nie mona jej przechowywa Stae: Liofilizowane szczepionka sublimowana, suszona itd., hodowl przeprowadza si tak samo, po przerwaniu hodowli dodaje si czynnik kriochronny, umieszcza w liofilizatorze, taka szczepionka moe by przechowywana ok. 6 m-cy Suszenie rozpyowe zawiesin przepuszcza si przez mae dysze przy duym przepywie powietrza, zawiesina jest w maych kroplach, ktre szybko odparowuje, powstaje py mikroorganizmw, taka szczepionka jest rwnomierna, czstki s rwnej wielkoci (bo w liofilizacji otrzymuje si grud, ktr trzeba rozdrobi, jest ona niejednolita) Koncentraty pynne szczepionki o duym steniu bakterii, hodowane s na bardzo bogatym podou

SELEKCJA MIKROORGANIZMW Najczciej izolujemy mikroorganizmy z gleby, ktra jest bardzo bogata w mikroby. Selekcja czsto jest powizana z ulepszeniami: mutacje genetyczne zmiany w rodowisku (manipulacje warunkami hodowli) doprowadza si do optymalizacji hodowli, to jest ju puap moliwoci, dalej trzeba ju wprowadzi zmiany genetyczne w organizmach Mutagenizacj mona przeprowadzi przez: - Promieniowanie UV miertelno organizmw wynosi ok. 90% - Mutagen chemiczny etylenoimina Stosuje si na przemian czynnik chemiczny i promieniowanie Po mutagenizacji prowadzi si hodowl, otrzymujemy organizmy o zmienionym genotypie. Czsto otrzymujemy organizmy zdolne do nadprodukcji (auksotrofy), ale s upoledzone w innym miejscu szlaku metabolicznego. Aby oddzieli auksotrofy od prototrofw musimy przeprowadzi selekcj. Wysiewamy mieszank po mutagenizacji na podoe minimalne z antybiotykiem, tylko prototrofy si rozwijaj, ale antybiotyk powoduje mier tych komrek, auksotrofy nie rosn, antybiotyk nie dziaa na te komrki. Hodowla jest przenoszona na podoa pene, auksotrofy, ktre ostay si dziaaniu antybiotykw, mog si rozwija, jako antybiotyku najczciej uywa si penicylin czynnik zabijajcy rosnce komrki. Po hodowli mona wysia auksotrofy na podo minimalne, one oczywicie nie wyrosn, ale pozwala to upewni si, e w hodowli nie ma ju prototrofw Jak ustalamy wymagania ywieniowe auksotrofw? Wysianie na podoe minimalne z hydrolizatem kazeiny (rdo aminokwasw), jeli nasze auksotrofy rosn, to wiemy, e wymagaj aminokwasw, sprawdzamy jakich Podoe minimalme z witaminami tak samo Podoa z hydrolizatami RNA (mog by drodowe), jeli auksotrofy rosn, to znaczy, e naley im dostarczy zasady, lub cae nukleotydy

14-12-2005

Wykad 9
Selekcja mutantw indukcyjnych z nadprodukcj enzymw o znaczeniu przemysowym. Podzia enzymw: anaboliczne (biosyntezy)

 kataboliczne (rozkadu) enzymy biosyntezy: regulowane za pomoc sprzenia zwrotnego mutanty zdolne do ich nadprodukcji nie produkuj represora lub nie jest on przez nie rozpoznawany enzymy kataboliczne: ich produkcja moe by kontrolowana przez trzy mechanizmy: 1.indukcj polega na tym, e mikroorganizm produkuje enzym tylko w obecnoci induktora, najczciej substratu 2. sprzenie zwrotne synteza enzymu jest kontrolowana przez produkty reakcji rozkadu albo przez analogi tych zwizkw 3. represj kataboliczn synteza enzymu jest hamowana, gdy w rodowisku jest dostpne atwo przyswajalne rdo wgla Aby kontrolowa produkcj enzymu mona manipulowa skadem podoa: - enzym indukcyjny w podou powinien by induktor - nie moe by represora ani atwo przyswajalnego rda wgla, jednak efektywniejsze jest izolowanie mutantw z nadprodukcj enzymu - poszukuje si mutantw, ktre zamieniaj enzym indukcyjny na konstytutywny hodowla w chemostacie w warunkach, w ktrych induktor jest czynnikiem ograniczajcym o steniu poniej indukcji np. izolacja Escherichia coli z B-galaktozydaz jako enzymem konstytutywnym, induktorem bya laktoza o niskim steniu, ktre nie gwarantowao indukcji, przey mogy tylko te organizmy, ktre produkoway enzym konstytutywny przenoszenie populacji mikroorganizmw z podoa bez induktora na podoe z induktorem, lag-faza organizmw z enzymem indukowanym wykorzystanie podoa z zasadniczym rdem wgla jako substratem, ktry jest zym induktorem, przeywaj organizmy, dla ktrych to rdo wgla nie jest induktorem stosowanie substratw chromogenowych (substrat, ktry w wyniku reakcji zmienia barw) na podou staym, w wyniku reakcji enzym powoduje zmian koloru substratu, substrat chromogenowy nie moe by induktorem np. E. Coli na podou z glicerolem, wyrosy kolonie spryskiwano nitrofenylogalaktozydem, kolonie, ktre produkoway B-galaktozydaz barwiy si na to (nitrofenylogalaktozyd jest substratem dla galaktozydazy, odczepia si nitrofenol) - izolacja mutantw produkujcych enzym w obecnoci represora (niewraliwych na sprzenie zwrotne) gwnie Bacillusy produkujce proteazy aminokwasy s represorami, ale take hamuj sporulacj izoluj si szczepy zdolne do sporulacji w obecnoci aminokwasw - izolacja mutantw odpornych na represj kataboliczn:

 poszukiwanie rewertantw wrd mutantw, ktre utraciy zdolno syntezy danego enzymu hodowla w chmostacie mieszaniny po mutagenizacji w obecnoci substratu dla danego enzymu i represora katabolicznego (np. laktoza jako substrat, glukoza jako represor), nastpi dominacja organizmw, ktre mog wykorzystywa oba rda wgla Selekcja mikroorganizmw z nadprodukcj metabolitw wtrnych - trudna, bo nie do koca s poznane mechanizmy produkcji tych metabolitw - metody izolacji bazuj na eksperymentach - wykorzystuje si izolacj mutantw auksotroficznych, wrd ktrych poszukuje si organizmw z nadprodukcj metabolitw wtrnych np. antybiotykw Ulepszanie szczepw - hybrydyzacja (krzyowanie szczepw) wykorzystywana po mutagenizacji, manipulujc na zmian mutagenizacj i skadem podoa mona otrzyma organizmy o maksymalnej wydajnoci, krzyujc szczepy z rnych linii otrzymujemy nowe kombinacje genw - konstruowanie sztucznych kombinacji genw metodami inynierii genetycznej - mona uzyska organizmy, ktre efektywniej przeksztacaj substrat w produkt, organizmy o zmienionych wymaganiach ywieniowych lub zmienionej morfologii wzrostu - w wyniku manipulacji genetycznych mog powstawa sabe szczepy, ktre bd wypierane przez szczepy dzikie, natomiast po hybrydyzacji powstaj szczepy silniejsze - hybrydyzacja wystpuje naturalnie w rodowisku np. w komrkach somatycznych grzybw - fuzja protoplastw (osobniki pozbawione ciany komrkowej, ktra jest barier dla hybrydyzacji), w wyniku hapliodyzacji dochodzi do podziau cech i wytworzenia naturalnych szczepw o korzystnych cechach (wymagania ywieniowe, morfologia wzrostu, efektywno przeksztacania substratu.

11-01-2005

Wykad 10
IMMOBILIZACJA - unieruchomienie, ograniczenie ruchliwoci katalizatora (enzymy, komrki, organella) - enzymy trzeba wyizolowa i oczyci Po co si to robi? Jest to opacalne, gdy rozwizuje problemy produkcji cigej Moe by wiksze upakowanie katalizatora w reaktorze Omijamy problem usunicia katalizatora z produktu Wiksza stabilno, trwalsza struktura biakowa Wady: Wiksze koszty inwestycyjne Szybko reakcji wolniejsza ograniczenia dyfuzji

 Cz katalizatora moe ulec dezaktywacji Dyfuzja proces wolny, szybko transportu wywoana gradientem ste

1. Fizyczne metody immobilizacji Sorpcja (ad-, ab-) katalizator jest zwizany z powierzchni jakiego nonika oddziaywaniami: - Elektrostatycznymi - Oddziaywaniami Van der Waalsa - Hydrofobowymi Ograniczony ruch w przestrzeni komrek, ale nie unieruchamiamy na adnym noniku w odpywie jest membrana pprzepuszczalna, ktra nie zatrzymuje produktu, a zatrzymuje katalizator, mankamentem jest niedoskonao membran, bardzo szybko ulegaj zatkaniu, co sprawia, e s mao wydajne Jak zwikszy wydajno: - Zwikszenie powierzchni membrany - Mieszanie, eby oderwa czstki osadzone na membranie Zwinita membrana jest porowata, pory s asymetryczne rozszerzaj si na zewntrz, z takich kapilar tworzy si tzw. moduy Modu membranowy rura zamknita z kadej strony dnami sitowymi, ktre daj dostp do wiata kapilar, takie moduy su te do hodowli tkankowych, mikrorurki peni rol naczy krwiononych, ktre dostarczaj zwizki odywcze, a odbieraj metabolity Mikrokapsukowanie zamyka si komrki w niewielkich przestrzeniach za pomoc jakiego polimeru np. membrany z nylonu (poliamidy), taka membrana ma odpowiednie pory zapewniajce kontakt z otoczeniem, aby pobiera zwizki odywcze i oddawa metabolity, takie mikrokapsuki mona wykorzystywa jako sztuczne organy Unieruchamianie w elach komrki s zawieszone w roztworze wodnym, wkraplamy polimer, ktry w tych warunkach polimeryzuj, np. agaroza polimeryzuje w obecnoci jonw wapniowych, otrzymujemy komrki tkwice w elu puapkowanie w sieci polimerowej, mankamentem tej metody jest to, e dyfuzja substratw i produktw jest utrudniona

2. Chemiczne metody immobilizacji Cechy nonika: Trway mechanicznie, chemicznie i biologicznie, tzn. nie moe ulec sprasowaniu (np. w kolumnie), nie zmienia waciwoci chemicznych, odporny na zjedzenie Posiada odpowiednio rozwinit powierzchni, eby by wikszy stopie upakowania Posiada grupy funkcyjne, aby umoliwi tworzenie wiza z katalizatorem Noniki syntetyczne:

ceramiczne lub szklane mikrokulki drogie! materiay polimerowe: polistyren, poliamid, mog by mikrokulki, piercionki, dyski (jak czerwone krwinki) Chemiczne wizania s zazwyczaj trwalsze ni fizyczne, ale immobilizacja taka jest bardziej skomplikowana. Noniki naturalne: agarozowe celulozowe atwo przeprowadzi z nimi reakcje wizania chemicznego, s tasze ni noniki syntetyczne i atwo dostpne, ale z drugiej strony s nietrwae podatne no rozkad biologiczny (mikroorganizmy go zaatakuj i zjedz) 3. Immobilizacja poprzez wizania jonowe wykorzystuje si ronego rodzaju jonowymieniacze, doprowadza si do wytworzenia wiza jonowych midzy katalizatorem a nonikiem, s mniej trwae ni wizania chemiczne, ich trwao zaley od warunkw w reaktorze: pH, sia jonowa

18-01-2006

Wykad 11
Zastosowanie komrek immobilizowanych w przemyle: 1. Produkcja aminokwasw koniec lat 70-tych a Japonii, technologia rozdziau mieszanin racemicznych przy pomocy immobilizowanych komrek Podczas produkcji powstaje racemat, zawierajcy formy L i D, potrzebna nam jest tylko forma L, jako wystpujca naturalnie. Chemiczne metody rozdzielania s bardzo trudne. Immobilizowane komrki E. Coli w kolumnie jonowymiennej zwizane wizaniami jonowymi w odpowiednim pH. Przez kolumn przepuszczano racemat Nacylo(L,D)aminokwasw. Komrki byy rdem acylazy, ktra odszczepiaa grup acylow tylko od formy D. Okres ptrwania (czas, po ktrym aktywno enzymu spada o poow) wynosi 62h, czas przebywania 0,5h. W ten sposb produkowano lizyn, kwas aspartylowy 2. Przemys cukrowy w burakach s rne cukry np. rafinoza, ktra przeszkadza w krystalizacji sacharozy. Grzyby w postaci suszonej grzybni s rdem enzymu rafinazy. Grzyby s immobilizowane, przepuszcza si sok buraczany, usuwana jest rafinoza. Immobilizacja polega na tym, e komrki s zbite w jedn mas. 3. Immobilizacja laktazy niektre niemowlta maj wrodzon wad nie rozkadaj laktozy, cukru wystpujcego w mleku. Do produkcji mleka bez laktozy wykorzystuje si drode immobilizowane we wknach celulozowych (octan celulozy). Podczas polimeryzacji komrki drody byy puapkowane we wkienku. Drode byy rdem

laktazy, musiay by zmodyfikowane, bo normalnie drode nie produkuj laktazy. Mleko filtrowano przez te rurki, w tym czasie laktoza bya rozkadana. W tych procesach enzymy pochodziy z martwych komrek. Nie trzeba ich karmi, nie namnaaj si, wic atwiej jest operowa takim reaktorem. ywe komrki immobilizowane nastrczaj duo trudnoci m.in. dostarczanie tlenu, wzrost (rozsadzayby rurki). Na granulkach rozrastajce si komrki szybko by zatkay kolumn. Stosujc ywe immobilizowane komrki trzeba je utrzymywa na staym poziomie, nie dopuszczajc do ich rozrostu, tzn. cile kontrolowa ilo dostarczanego rda wgla. Jeli zastosuje si martwe komrki, to po wyczerpaniu si enzymu jest koniec reakcji, trzeb je wyrzuci. 4. Produkcja antybiotykw m. in. penicyliny, komrki s immobilizowane na Cefadeksie (cefadex?), okres ptrwania wynosi 100 dni 5. Produkcja akrylamidu immobilizowana hydrataza nitrylowa z Rhodococcus immobilizowanego na elu

TYPY HODOWLI 1. Hodowla na podoach ciekych hodowla wgbna mikroorganizmy rosn w caej objtoci podo ten typ przewaa hodowla powierzchniowa na powierzchni poywki tworzy si kouch z mikroorganizmw hodowla z unieruchomionym materiaem biologicznym Hodowle wgbne s teraz najpopularniejsze: S dobre systemy napowietrzania i jest wszdzie dostpny tlen Dobre systemy mieszania, np. agodne mieszanie w przypadku wraliwych mechanicznie komrek Nowe szczepy, ktre mog y w caej objtoci 2. Hodowla na podoach staych Stosowane gwnie dla grzybw: strzpkowce, promieniowce. S to hodowle bardzo proste, Cae pomieszczenie jest termostatowane (odpowiednia wilgotno), na paletach z podoem rozpyla si spory lub strzpki grzybw Podoa: ziarna zb, pokruszone pieczywo, wysodki pozostao po produkcji cukru z burakw, otrby Hodowle takie s bardzo atwe, otrzymuje si produkty o wysokim steniu, s due wydajnoci, wykorzystuje si surowce odpadowe (tanie podoe). Problemem moe by nierwnomierna temperatura. Mikroorganizmy produkuj ciepo, ktre trzeba jako odprowadzi, eby si mikroby nie przegrzay, dlatego warstwa podoa musi by moliwie najciesza.

25-01-2006

Wykad 12
Szybko wzrostu: S * max = KS + S

Gdzie KS jest to staa zuywania substratu, jest miar powinowactwa mikroorganizmw do substratu, im wiksze powinowactwo, tym nisza KS Produktywno hodowli okresowych: dp = QP * x dt
Gdzie dp/dt to szybko tworzenia produktu, QP specyficzna szybko tworzenia produktu, x biomasa Wraz ze wzrostem szybkoci wzrostu, wzrasta szybko tworzenia produktu. Specyficzna szybko tworzenia produktu moe, ale nie musi, by zwizana ze specyficzn szybkoci wzrostu Przy hodowlach okresowych tworzenie metabolitw wtrnych polega na tym, e staramy si skraca faz wzrostu wykadniczego. Dla metabolitw pierwotnych staramy si wydua faz wykadnicz. Hodowla okresowa Zalety: - Nie wymagaj skomplikowanego oprzyrzdowania tania - atwo utrzyma (atwiej ni w cigych) jaowo hodowli - Odnawialno inokulum odzyskuje si komrki Wady: - Niska produktywno dosy dugi czas jaowy, sama hodowla trwa krtko, ale na czas oglny skada si czas hodowli i czas jaowy: tc = th + tj Stosunek tj/th jest bardzo niekorzystny np. 1, produktywno nisza ni w hodowli cigej - Hodowle okresowe pracuj z niejednakow szybkoci, gdy zmienia si stenie substratu - Nie ma moliwoci regulacji stenia substratu Hodowla pokresowa okresowa ze staym dostarczaniem substratu, jest dopyw substratu, nie ma odpywu, zmienia si objto reaktora, w takiej hodowli moemy zmienia stenie substratu i utrzymywa je na staym poziomie, natenie dopywu poywki zwiksza si, gdy przyrasta biomasa, dozowanie moe by skokowe (czciej) lub cige, moe te by okresowy odpyw, kiedy objto reaktora dojdzie do jakiej wartoci maksymalnej

Zalety: - Dua elastyczno hodowli mona zmienia rne parametry - Mona kontrolowa poziom substratu - Bardzo prosta jest automatyzacja tzn. jaki czujnik stenia poczony z pomp toczc substrat, jeli jest sygna od czujnika, e jest za niski poziom substratu, wcza si pompa Wady: - Sterylno poywki moe dochodzi do zakaenia hodowli - Czsto nastpuje degeneracja mikroorganizmw mog powrci do cech rodzicielskich i wypiera komrki zmutowane mniejsza produktywno Hodowla ciga w reaktorach przepywowych jest cige zasilanie i cigy odpyw, stosowana tam, gdzie potrzebna jest bardzo cisa kontrola stenia substratu, zwaszcza gdy wysoki poziom substratu hamuje produktywno komrek. Hodowle te nadaj si najlepiej do otrzymywania biomasy i metabolitw pierwotnych, gorzej z produkcj metabolitw wtrnych. Nie nadaj si do niej organizmy o nieduej szybkoci wzrostu, s wypierane przez szybko rosnce komrki, cigle nam wypywaj z reaktora, wic musz si szybko mnoy, aby ich ilo w reaktorze bya wystarczajca Zalety: - Wysoka produktywno - Mona atwo zautomatyzowa - Mona atwo kontrolowa i regulowa na bieco parametry hodowli: stenie substratu, pH Wady: - Wysokie koszty inwestycyjne - S bardzo wraliwe na zakaenie przez dopyw tlenu, poywki, czynnikw stabilizujcych pH, trudno zachowa sterylno hodowli METODY BEZTLENOWE Przewanie produkuje si z wykorzystaniem organizmw tlenowych, produkcja beztlenowa jest trudniejsza Zastosowanie metod beztlenowych: 1. oczyszczanie ciekw fermentacja osadw ciekowych produkcja biogazw - fermentacja ze zwizkw wielkoczsteczkowych powstaj niskoczteczkowe kwasy organiczne, zakwasza si rodowisko i warunki s beztlenowe - fermentacja metanowa powstaje metan i wydziela si wodr w warunkach beztlenowych biogaz jest dobrym paliwem, ktre jest uywane zazwyczaj na miejscu przy oczyszczalni ciekw, przeksztacana w energi elektryczn, ktra jest zuywana przez oczyszczalni na wasne potrzeby 2. produkcja etanolu w gorzelniach w warunkach beztlenowych

3. fermentacja acetonowo-butanolowa Clostridium acetobutyricum bezwzgldny beztlenowiec, ale wzrost tej bakterii jest zahamowany ju przy 2,5% steniu tych rozpuszczalnikw trzeba je odprowadza z reaktora KONIEC