Crecimiento Microbiano

La clula bacteriana es esencialmente una maquinaria de sntesis capaz de duplicarse a s misma. El proceso de sntesis para el crecimiento bacteriano involucra unas 2000 reacciones qumicas de una amplia variedad. Una vez sintetizados los polmeros, el crecimiento contina con el ensamblaje y formacin de nuevas estructuras celulares que finalizan con la divisin en dos clulas hijas. En un medio apropiado fsica y nutricionalmente, un cultivo se reproduce continuamente como clulas vegetativas, los nutrientes absorbidos y metabolizados permiten crecer al microorganismo.

Un experimento de crecimiento hipottico empezando con una simple clula, teniendo un tiempo de generacin se presenta en la siguiente tabla:

II.- CONCEPTOS BASICOS

a) Crecimiento

Es definido como un incremento ordenado de todos los constituyentes y estructura celular. En muchos microorganismos, este incremento contina hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas: Fisin binaria El crecimiento microbiano conlleva usualmente a un incremento en el nmero de clulas. Es importante distinguir entre el crecimiento individual de clulas y el crecimiento de poblaciones de clulas: Crecimiento individual

Es el incremento en el tamao y peso y es usualmente un preludio a la divisin celular Es el incremento en el nmero de clulas como una consecuencia del crecimiento y divisin celular

Crecimiento poblacional

b) Tasa de crecimiento

Es el cambio del nmero de clulas o masa por unidad de tiempo Intervalo para la formacin de dos clulas provenientes de una. Tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Se puede definir tambin como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de divisin.

c) Generacin d) Tiempo de generacin

III.- FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO

Factores externos
Condiciones

ambientales: pH, T, Aw, O2, CO2 Condiciones nutricionales metablica

Factores internos
Capacidad

IV.- MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el peso de la masa de las clulas. Existen varios mtodos para contar las clulas o estimar la masa de stas. A) Recuento de clulas
1)

Conteo de clulas al microscopio Se emplea un dispositivo graduado con 25 cuadrados cuyo volumen y rea es conocido. Ej.: Cmara de Petroff-Hausser, cmara de Neubauer, hemocitmetro

Limitaciones: - Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras - No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bact/ml para que sean observadas al microscopio - No distinguen clulas vivas de muertas

2) Conteo de clulas viables Una clula viable es definida como aquella que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. El conteo en placas es el mtodo ms utilizado. Pueden ser:
Diseminacin

en placa (siembra en placa por

extensin). Se asume que cada colonia surgi de una simple clula, contando el nmero de colonias uno puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra. Mtodo de vaciado en placa.-

B) Medida de la masa celular

En

muchos estudios es necesario determinar el peso de las clulas ms que el nmero. 1) Peso seco

Se determina el peso seco o peso hmedo de una alcuota de la poblacin separada por centrifugacin. El peso seco es por lo general el 20-25 % del peso hmedo.

2)

Turbidimetra
A travs de un colormetro o espectrofotmetro midiendo la turbidez en unidades de absorbancia. Debe prepararse curva estndar para cada organismo estudiado

V.- CICLO DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL

Si analizamos el crecimiento microbiano en el tiempo, ste describe una tpica curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles. La curva de crecimiento puede dividirse en diversas fases: fase lag, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.

b) Fase exponencial Es una consecuencia del hecho de que cada clula se divide para formar dos clulas, cada una de las cuales tambin se divide para formar dos clulas ms y as sucesivamente. La mayor parte de los organismos unicelulares crecen exponencialmente. La velocidad de crecimiento exponencial vara mucho de un organismo a otro. En general, las bacterias crecen con mayor rapidez que los organismos eucariotas y los eucariotas pequeos se desarrollan ms aprisa que los grandes Cada clula que se divide en dos. La tasa de crecimiento es exponencial.

a) Fase lag o de retraso Cuando una poblacin microbiana es inoculada en medio fresco, el crecimiento generalmente no principia de inmediato sino despus de un cierto tiempo, llamado fase lag que puede ser breve o largo, dependiendo de las condiciones. Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo las mismas condiciones de crecimiento no se observa la fase lag y el crecimiento exponencial contina a la misma velocidad. Sin embargo, si el inculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase lag, an cuando las clulas del inculo estn vivas. Esto se debe a que las clulas generalmente agotan diferentes coenzimas esenciales u otros constituyentes celulares y se requiere de cierto tiempo para su resntesis. Un retraso tambin se presenta cuando el inculo est formado por clulas daadas (pero, no muertas) por tratamientos con calor, radiacin o sustancias qumicas, debido al tiempo necesario para que las clulas puedan reparar dicho dao. Tambin se observa cuando una poblacin se transfiere de un medio de cultivo rico a uno pobre. Esto sucede debido a que para que contine el crecimiento en un medio de cultivo en particular, es necesario que las clulas tengan un complemento ntegro de enzimas para la sntesis de los metabolitos esenciales que no estn presentes en dicho medio. Cuando se les transfiere a un medio diferente, se requiere cierto tiempo para la sntesis de nuevas enzimas Es una fase de preparacin y adaptacin al medio, su duracin depende del medio de cultivo y el estado fisiolgico de las clulas vivas

c) Fase estacionaria El crecimiento exponencial se detiene, los nutrientes indispensables se agotan, no hay incremento o decremento en el nmero de clulas o masa, hay limitacin de nutrientes y acumulacin de sustancias txicas. Los microorganismos son fisiolgicamente activos y viables. En un sistema cerrado no se puede llevar a cabo indefinidamente el crecimiento exponencial

d) Fase de muerte Si la incubacin contina despus que una poblacin alcanza la fase estacionaria, las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo ms probable es que mueran. Si esto ltimo sucede, la poblacin se encuentra en la fase de muerte. Durante esta fase, el conteo microscpico directo puede permanecer constante pero la viabilidad disminuye lentamente. En algunos casos, la muerte se acompaa por lisis celular, dando lugar a una disminucin del conteo de viabilidad.

Factores Ambientales que afectan el crecimiento, desarrollo y reproduccin de microorganismos.

Los m.o estn continuamente afectados por su ambiente, ya que este ejerce una influencia en su desarrollo al igual que sobre las dems formas de vida.

Los factores del medio se pueden clasificar en tres grupos:

Fisicos.- Temperaturas, presiones externas,
humedad

Quimicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos,

presencia de productos toxicos.

Biolgicos.- Las interacciones microbianas entre las coexistentes.

Concentraciones de Iones Hidrogeno (pH)

Cada m.o tiene un pH mnimo, un pH ptimo y un pH mximo de crecimiento. La concentracin de iones hidrgeno del medio afecta directamente a los m.o y enzimas, e influye tambin en la disociacin y solubilidad de molculas que requieren.

El grado de acidez de un material y su pH no son equivalentes. La acidez expresa el potencial de los cidos presentes para liberar hidrogeniones. El pH mide la concentracin actual de H en la solucin. Y es esta la que permite o no el funcionamiento de las enzimas vitales de los m.o.

Tambin es conveniente conocer el cido responsable de un determinado pH, ya que algunos cidos sobre todo los orgnicos, tienen un poder inhibidor mayor que otros. Ac benzoico, actico, ctrico, lctico, propinico y srbico.

Temperatura
Todos los m.o tienen una temperatura optima de crecimiento que los caracteriza, en la cual muestran las tazas mas elevadas de crecimiento. Tambin hay lmites de temperatura, la temperatura mnima en las que son metablicamente inactivos y una temperatura arriba de la cual el carecimiento ya no es posible llamada temperatura mxima.

De acuerdo a su temperatura ptima de crecimiento, los m.o se dividen en:

Psicrfilos(<00C-200C) Mesfilos (20-400C) Termfilos(40-800C) Hipertemfilos(80-1100C)

Se cree que la destruccin de los m.o por el calor es consecuencia de la desnaturalizacin de sus protenas y sobre todo de la inactivacion de las enzimas que necesitan para desarrollar sus actividades metablicas. Tanto las clulas como las esporas de los m.o difieren mucho en cuanto a su resistencia a las temperaturas elevadas

La ausencia de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reduccin de la velocidad de crecimiento y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos (algo parecido a la precipitacin del aceite a bajas temperaturas) impidiendo el funcionamiento de la membrana celular. La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de protenas y a las alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas.

Es importante tener en cuenta que a temperaturas muy bajas, el metabolismo celular es muy bajo y las clulas paran de crecer; aunque no tienen porqu comenzar a morir. Sin embargo, cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro.

Los principales factores que influyen en la termorresistencia de los m.o son los sig.
La relacin tiempo- temperatura La concentracin inicial de esporas (o clulas vegetativas) Los antecedentes de las clulas vegetativas o de las esporas El medio de cultivo La temperatura de incubacin La fase de crecimiento o edad La desecacin.

La composicin del sustrato en el cual se encuentran las clulas vegetativas o las esporas, al someterlas a tratamiento trmico.
La humedad La concentracin de iones hidrogeno.

Actividad de Agua

El agua es el solvente en donde ocurren las reacciones qumicas y enzimticas de la clula y es indispensable para el desarrollo de los microorganismos

El agua liquida es esencial para todos los procesos bioqumicos. Para los m.o un factor crtico es la disponibilidad de agua lquida mas que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la actividad de agua (aw)

Cada vez que se disuelven sustancias en el agua pura se disminuye la cantidad disponible o agua libre. La actividad de agua en trminos termodinmicos proporciona una medida de agua libre

La actividad de agua (aw ) del medio representa la fraccin molar de las molculas de agua totales que estn disponibles. El valor mnimo de aw en el cual las bacterias pueden crecer vara ampliamente, pero el valor ptimo para muchas especies es mayor a 0.99. Algunas bacterias halfilas (bacterias que se desarrollan en altas concentraciones de sal) crecen mejor con aw = 0.80.

Variaciones en la actividad de agua puede afectar la tasa de crecimiento, la composicin celular y la actividad metablica de la bacteria, debido a que si no disponen de suficiente cantidad de agua libre (no asociada a solutos, etc) en el medio necesitaran realizar ms trabajo para obtenerla y disminuir el rendimiento del crecimiento.

Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura (P0):

El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible metablicamente.

El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa (HR) de la siguiente forma:

Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua menor que la que necesita, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada.

La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad e agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw>0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw>0.80. como puede verse, los hongos filamentosos son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor (muco ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias

Existen microorganismos extremadamente tolerantes a las actividades muy bajas (toleran valores de aw=0.60). Algunos de estos microorganismos pertenecen al grupo de las Arqueas y pueden observarse en las salinas de desecacin formando manchas coloreadas en los depsitos de sal.

La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene importancia aplicada en industria alimentara. La utilizacin de almbares, salmueras y salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano

Los factores que es posible que influyan sobre las necesidades de aw de los m.o son los siguientes:
1. 2. 3. 4. 5. 6.

Tipo de soluto utilizado para reducir la aw. Valor nutritivo del medio de cultivo. Temperatura. Aporte de oxgeno. pH. Inhibidores

Humedad: los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio de transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son movilizados hasta el interior de las clulas. Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir la concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin de la tcnica.

CONCENTRACION DE NUTRIENTES

La concentracin de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento como al rendimiento del crecimiento de un microorganismo. A concentraciones muy bajas de nutrientes, la velocidad de crecimiento se reduce, mientras que a niveles moderados y altos de nutrientes llega a ser mxima. Si la concentracin aumenta an ms la tasa de crecimiento no se modifica La dependencia de la tasa de crecimiento con la concentracin de nutrientes fue descrita por J. Monod en 1950 y recuerda la cintica enzimtica establecida por la ecuacin de Michaelis & Menten. La concentracin de nutrientes afecta la tasa de crecimiento microbiano y el rendimiento en masa de los microorganismos. A una tasa mxima de crecimiento, el incremento en la concentracin de nutrientes da lugar a un aumento en la biomasa total a cosechar.

oxigeno

El oxgeno es un componente universal de las clulas y es suministrado siempre en grandes cantidades por el agua (H2O). Sin embargo, los procariotas muestran un amplio rango de respuestas al oxgeno molecular (O2). Aerobios obligados

Requieren oxgeno para su crecimiento, ellos usan el O2 como un aceptor final de electrones en la respiracin. No requiere O2, no necesitan el O2 como un nutriente. De hecho, el oxgeno es una sustancia txica, el cual mata o inhibe su crecimiento. Los procariotas anaerobios obligados pueden vivir por fermentacin, respiracin anaerbica, fotosntesis bacteriana, o el primitivo proceso de la metanognesis. Son organismos que pueden cambiar entre tipo de metabolismo aerbico y anaerbico. Bajo condiciones anaerbicas ellos crecen por fermentacin o respiracin anaerbica, pero en presencia de oxgeno ellos cambian a respiracin aerbica. Son bacterias con un tipo de metabolismo exclusivamente anaerbico (fermentativo), pero ellos son insensibles a la presencia de O2. Ellos viven solamente por fermentacin sin importar si el oxgeno est o no presente en su entorno.

Anaerobios obligados, o estrictos

Anaerobios facultativos

Anaerobios aerotolerantes

Luz