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Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443 Lima, Per, 1997

Diseo e impresin : Art. Lautrec S.R.Ltda.

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA

COMIT DE REDACCIN: Blgo. Elizabeth Luz Snchez Roman Dr. Csar Nquira Velarde Blga. Sonia Gutierrez Gonzles Blgo. Eduardo Ayala Sulca Tec. Lab. Sonia Medina Alvarez

COMIT EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas Dr. Csar Cabezas Snchez Dr. Carlos Carrillo Parodi Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. Csar Cabezas Snchez Director General

PERFIL DE LOS AUTORES

Blga. M.Sc. Elizabeth Luz Snchez Roman Bilogo-Microbiolgo, Maestro en Ciencias Jefe de Divisin de Parasitologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Dr. Csar Nquira Velarde Mdico, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento de Microbiologa Mdica, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Miembro, Instituto de Medicina Tropical D.A. Carrin Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Jefe de Laboratorio de Zoonosis, Divisin de Parasitologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Blga. Sonia Gutirrez Gonzales Biloga asistente, Laboratorio de Zoonosis, Divisin de Parasitologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Blgo. Eduardo Ayala Sulca Bilogo asistente, Laboratorio de Zoonosis, Divisin de Parasitologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Tc. Lab. Sonia Medina Alvarez Tcnico de Laboratorio I, Laboratorio de Zoonosis, Divisin de Parasitologa, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA.

PERFIL DE LOS EDITORES

Dr. Alfonso Zavaleta Martnez-Vargas Mdico Cirujano, Doctor en Farmacologa Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Profesor Principal, Seccin Farmacologa, Departamento Acadmico de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Csar Cabezas Snchez Mdico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica, INS, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Mdico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Acadmico de Microbiologa, Facultad de Ciencias y Filosofa, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Mdico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Garanta de la Calidad y Certificacin, Centro Nacional de Control de Calidad, INS, MINSA Investigador, Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

La edicin de este Manual se efectu en el marco del Convenio de Cooperacin suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia. El Comit Editor agradece al Dr. Jorge Barnaby Rodrguez, por la revisin y los comentarios efectuados a esta obra.

INDICE
Presentacin......................................................................................................................................................... 7 Resolucin Jefatural............................................................................................................................................ 8 CAPITULO I Introduccin......................................................................................................................................................... 9 CAPITULO II Mtodos seroinmunolgicos para el diagnstico de la hidatidosis humana .............................................................................................................................................. 14 CAPITULO III Prueba de doble difusin arco 5 (DD5)................................................................................................................ 15 CAPITULO IV Prueba de inmunoblot...........................................................................................................................................19 CAPITULO V Obtencin de muestra de suero.............................................................................................................................25 CAPITULO VI Conservacin y envo de muestras de suero.........................................................................................................28 CAPITULO VII Bioseguridad.........................................................................................................................................................30 CAPITULO VIII Referencias Bibliogrficas................................................................................................................................... 32 CAPITULO IX ANEXOS.............................................................................................................................................................. 34 Anexo 1 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones para la prueba de DD5 .........................................................................................................................................35 Anexo 2 : Materiales, equipos, reactivos y soluciones para la prueba de inmunoblot ...............................................................................................................................39 Anexo 3 : Materiales para obtencin de muestras de sangre venosa ...................................................................43 CAPITULO X Glosario.................................................................................................................................................................44

PRESENTACIN

Las referencias histricas describen que el parsito Equinococcus granulosus fue introducido en la poca de la Colonia, pero es en este siglo que la enfermedad es considerada como un problema emergente de Salud Pblica. La relacin epidemiolgica hombre -perro- ganado (Bovino, Caprino, Ovino) no ha podido ser rota hasta la fecha en todo el territorio nacional. Se han intentado tratamientos a humanos y perros; se ha controlado los animales beneficiados; se ha capacitado a personal de Salud, escolares y comunidad; se ha evaluado el impacto econmico negativo de por lo menos US$ 1'000,000 por ao; se han ejecutado estudios, investigaciones e intervenciones integrales en reas puntuales. Pese al desarrollo de diferentes mtodos diagnsticos utilizados y fuentes de informacin (necropsias, hallazgos operatorios, radiologa, serologa) no existe an un programa multisectorial, multidisciplinario y a nivel nacional que permita el abordaje exitoso de esta patologa. No basta con matar al perro, es necesario que el personal de salud y de otras reas tcnicas trabaje en conjunto estrategias de mediano y largo plazo para limitar, eliminar o erradicar un problema endmico que a todas luces puede seguir avanzando en territorio y numero de personas y animales infestados. El Instituto Nacional de Salud, dentro de la poltica sectorial presenta el Manual de Procedimientos Tcnicos para el Diagnstico Serolgico de la Hidatidosis Humana, para su utilizacin en los laboratorios de diagnstico y referencia a nivel nacional y como parte de las labores de difusin tcnica de la Red Nacional de Laboratorios de Salud.

EL COMITE EDITOR

CAPITULO I

INTRODUCCION

La hidatidosis es una zoonosis parasitaria, que tiene como agentc etiolgico la forma larvaria de helmintos de la Clase Cestoda, Gnero Echinococcus (Rudolphi, 1801). Cuatro especies del Gnero Echinococcus pueden infectar al hombre: E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthus y E. vogeli. De estas, la especie E. granulosus, es la de mayor importancia desde el punto de vista de la salud pblica y de la produccin animal. La hidatidosis causada por E. granulosus, es una de las zoonosis ms difundidas y conocidas mundialmente, existiendo en tasas variables en todos los continentes. En Amrica del Sur la infeccin incide, preferentemente, en los pases ganaderos, sobre todo con crianza de ovinos, principalmente en las reas rurales del Uruguay, Argentina, Chile, sur del Brasil, Bolivia y Per. En el Per, la hidatidosis est ampliamente difundida en ambientes rurales de la Sierra y tambin en zonas urbanas de Arequipa y Lima, debido a la presencia de perros infectados que son trados de las zonas endmicas a las ciudades o al deficiente control veterinario de los camales. En la mayora de los casos de infeccin humana, el desarrollo del quiste hidatdico es asintomtico. La infeccin humana se produce por la ingesta de los huevos de E. granulosus, que generalmente se da en la infancia y la sintomatologa ir a manifestarse tardamente, esto es, en la edad adulta, cuando el quiste hidatdico haya alcanzado un tamao mayor. Las manifestaciones clnicas de la hidatidosis se relacionan con el estado fsico del quiste e integridad de sus membranas, as como con la localizacin y tamao del quiste. Generalmente el crecimiento del quiste se manifiesta como masa que causa deformacin de los rganos y alteraciones funcionales de los mismos. En casos de localizacin pulmonar, los signos y sntomas frecuentemente incluyen tos, dolor torxico, hemoptisis y/o disnea. Cuando la localizacin es heptica o abdominal puede haber dolor, masas palpables, ictericia, hepatomegalia y/o esplenomegalia. Los casos de localizacin sea producen destruccin de trabculas, necrosis y fractura expontnea. El pronstico se agrava cuando la localizacin es en rganos vitales como el sistema nervioso central, el corazn y los riones. La hidatidosis es una de las pocas infecciones parasitarias humanas, cuyo diagnstico de laboratorio es principalmente inmunoserolgico. Sin embargo, cuando la sintomatologa lo indica, son utilizados exmenes microscpicos dirigidos a la bsqueda de esclices en la orina, o esclices y/o fragmentos de membrana en la expectoracin brnquica as como en lquidos pleurales y abdominales. Es importante sealar que est contraindicada la puncin del quiste, por ser una conducta inductora de choque anafilctico con riesgo de vida para el paciente y de causar diseminacin hidatdica de consecuencias impredecibles. El inmunodiagnstico de la hidatidosis humana es de gran importancia, pues complementa el diagnstico clnico en pacientes que presentan manifestaciones o imgenes compatibles con el quiste hidatdico y consiste en la deteccin de anticuerpos circulantes, antgenos circulantes o clulas sensibilizadas contra los antgenos del quiste hidatdico. CARACTERISTICAS DEL AGENTE ETIOLOGICO EL VERME ADULTO de E. granulosus es el ms pequeo de los cstodes conocidos, pues mide de 3 a 6 mm de longitud. Su cuerpo est dividido en tres partes principales: el escolex, que tiene forma globosa, con 4 ventosas y un rostelo armado de dos hileras de ganchos, el cuello o regin proglotidognica es delgado y corto; y la estrbila, formada por 3 4 progltides, de las cuales la ltima es grvida.

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LA HIDATIDE, es la larva propiamente dicha. Est formada por dos membranas denominadas laminar y germinativa y por el lquido hidatdico.

a. La membrana laminar es la ms externa y acelular, y est formada por un gran nmero de lminas
concntricas. Su consistencia es frgi1, rompindose fcilmente a la menor presin.

b. La membrana germinativa es la responsable de la proliferacin del parsito y de la regulacin del

movimiento de macromolculas del lquido hidatdico por la membrana laminar. A partir de esta membrana son formadas las vesculas prolgeras que generalmente presentan forma esfrica y visibles, como granos de arena, miden de 250 a 500 m. A su vez, a partir de la membrana germinativa de las vesculas prolgeras se originan los Protoesclices, que vistos al microscopio son pequeas cabezas invaginadas, de modo que el rostelo y los ganchos quedan protegidos, en las que la corona de ganchos y los dos pares de ventosas son claramente visibles.

c. El lquido hidatdico, elaborado por la membrana germinativa, es cristalino e incoloro, ocupa los espacios
intersticiales y baa las membrana germinativa. Tiene composicin qumica variable conteniendo sales y sustancias proteolticas y glicolticas. Es txico para el organismo parasitado siendo capaz de sensibilizarlo y consecuentemente provocar la formacin de anticuerpos especficos.

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El E. granulosus es un parsito de ciclo de vida heteroxnico. La forma adulta se desarrolla y se torna sexualmente madura, en un hospedero definitivo (perro), la forma larvaria o qustica tiene lugar en los hospederos intermediarios (ovinos, bovinos, equinos entre otros), incluyendo el hombre.

En el hospedero definitivo, el verme adulto se encuentra fijo a las vellosidades de la mucosa del intestino delgado. Las progltides grvidas, conteniendo varias centenas de huevos, son eliminadas con las heces del animal a medida que se desprenden de la estrbila. Los huevos conteniendo la oncsfera (o embrin hexacanto), son ingeridos por los hospederos intermediarios a travs de la vegetacin, a partir del suelo contaminado. Cuando la oncsfera es liberada en el intestino delgado de este hospedero, atraviesa las paredes del intestino y penetra en los vasos sanguneos y linfticos, mediante los cuales es llevada a los tejidos del organismo. En el hgado o en los pulmones, rganos donde preferentemente se localizan los embriones, la gran mayora es destruida por la respuesta inmune del hospedero. Aquellos que sobreviven evolucionan como una pequea vescula llena de lquido incoloro cercado por clulas mononucleares del hospedero. Esta vescula es la que al

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enquistarse en los tejidos del hospedero intermediario, ir a representar el inicio de la fase larvaria del parsito y finalmente al quiste hidatdico, al formarse la membrana adventicia por la fibrosis alrededor de la hidtide o larva. Si las vsceras del hospedero intermediario, conteniendo quistes hidatdicos fueran devoradas por los perros, los esclisis se desarrollarn en su intestino dando origen a la forma adulta de E. granulosus. El hombre es un hospedero intermediario accidental y no cumple ningn papel en el ciclo evolutivo, sin embargo, es el principal responsable en perpetuar la infeccin, ya que alimenta a los perros por costumbre o por necesidad, con vsceras portadoras de quistes.

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CAPITULO II
METODOS INMUNOLOGICOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA HIDATIDOSIS HUMANA

Los mtodos ms utilizados para el diagnstico de la hidatidosis humana son: Hemaglutinacin indirecta (HAI), Aglutinacin de Ltex (AL), Doble difusin arco 5 (DD5), Inmunoelectroforesis (lEF) e Inmunoensayo (ELISA), (8, 13). Los mtodos de DD5 e IEF son considerados de referencia en las reas endmicas de los pases de Amrica del Sur, y estn siendo utilizados en el Laboratorio de Zoonosis de la Divisin de Parasitologa del Centro Nacional de Laboratorios de Referencia. El empleo del mtodo de ELISA presenta un amplio potencial para la deteccin de portadores asintomticos en los que se confirmara el diagnstico inmunolgico con la prueba de DD5 e Inmunoblot. Recientemente, est siendo utilizado el mtodo de Inmunoblot o Western Blotting para el inmunodiagnstico de la hidatidosis humana ofreciendo alta sensibilidad y especificidad con respecto a las anteriormente mencionadas (5). Los resultados de los estudios realizados hasta el momento en las diferentes reas geogrficas, empleando la tcnica de Inmunoblot en el diagnstico de la hidatidosis humana, muestran antgenos especficos para E. granulosus con masas relativas variadas (6, 11, 13). El patrn de reactividad positivo de los pacientes hidatdicos en reas endmicas de nuestro pas est condicionada al reconocimiento de bandas de Mr entre 21 y 31 kDa (12). Coincidentemente, estas bandas incluyen pptidos de los dos mayores componentes antignicos del lquido de quiste hidatidico de E. granulosus: el antgeno B y el antgeno 5. Este ltimo es el mismo usado en la prueba de DD5, ampliamente conocida.

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CAPITULO III
PRUEBA DE DOBLE DIFUSION DEL ARCO 5 (DD5)

Es una reaccin de precipitacin antgeno-anticuerpo en un medio semislido, que consiste en detectar, en el suero de un paciente, anticuerpos contra el antgeno del arco 5 (detectada por IEF), mediante la identidad inmunolgica con un suero control positivo. 3.1 PROCEDIMIENTO: 3.1.1. 3.1.2. Utilizar lminas portaobjeto de 2,5 x 7,5 cm sumergidas en alcohol, limpias y secas. Rotular en un extremo de las lminas con lpiz punta de diamante, el nmero y fecha correspondiente.

3.1.3.

Sobre una superficie nivelada, colocar en la lmina con ayuda de una pipeta, 3,5 mL del gel (Anexo I, 4.3) licuado en Bao Mara. (Foto 1).

3.1.4. 3.1.5. 3.1.6.

Dejar solidificar el gel a temperatura ambiente durante 10 minutos. Colocar la lmina en cmara hmeda y dejar enfriar por 15 minutos a 4C. Retirar la lmina de la cmara hmeda y colocarla sobre el diagrama de corte correspondiente (Anexo I, Figuras 1 y 2).

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3.1.7.

Cortar en el gel los orificios, utilizando los sacabocados con los dimetros correspondientes para los dos sueros problema (10 mm), el suero control.positivo (6 mm) y el antgeno (1 mm), segn el diagrama (Figura 2). Retirar los geles cortados con una esptula fina procurando evitar daar los bordes de los orificios. (Foto 2). Colocar la lmina en cmara hmeda. Llenar los orificios respectivos: suero problema (150 L), suero control positivo (50 L) y el antgeno (3 L), utilizando pipetas Pasteur. (Foto 3). No debe haber burbujas en su interior y el nivel superior debe ser convexo respecto a la superficie del agar (Anexo I, Figuras 3 y 4).

3.1.8. 3.1.9.

3.1.10. En el caso del orificio del antgeno, llenar con una pipeta Pasteur adaptado para el dimetro ( 1mm) la que debe entrar holgadamente en el orificio (sin deformarlo ni agrandarlo). Introducir verticalmente en el orificio el extremo capilar hasta tocar la superficie del portaobjeto, dejar escurrir lentamente el antgeno, a medida que se retira la pipeta.

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3.1.11. Dejar difundir el antgeno y los anticuerpos en el agar de la lmina a temperatura ambiente durante 40 - 48 horas. 3.1.12. Finalizada la difusin, sumergir la lmina en Solucin Salina Tamponada (SST), pH 7,4 (Anexo I, 4.1), a temperatura ambiente por 36 horas. Durante este perodo, se cambiar 5 veces la solucin de lavado (SST). En los dos primeros lavados, eliminar de los orificios los posibles precipitados que pudiesen haber. Para lo cual con ayuda de una pizeta se rociar con SST a presin moderada. 3.1.13. Concluido el lavado, sumergir la lmina en agua destilada por 10 minutos. 3.1.14. Luego envolver la lmina en papel filtro Watman N 1 previamente humedecido en agua destilada. 3.1.15. Dejarla secar en estufa a 37C x 18 horas. 3.1.16. Retirar cuidadosamente el papel que envuelve a la lmina humedecindolo con agua destilada, en caso necesario. 3.1.17. Sumergir en solucin colorante (Anexo I, 4.4) durante 15-20 minutos, y observar si hay la banda de precipitacin entre antgeno y suero control; de no haberla, dejar la lmina ms tiempo en la solucin y continuar este paso. 3.1.18. Escurrir la lmina, enjuagar con agua de cao y volver a escurrir. 3.1.19. Sumergir en solucin decolorante (Anexo I, 4.5) durante 20 - 30 minutos, hasta obtener una decoloracin satisfactoria en la lmina y apreciar claramente la banda entre el antgeno y el suero control.

3.2 LECTURA E INTERPRETACION La lectura consiste en observar el nmero de bandas de precipitacin entre los orificios del suero problema y el antgeno. Verificar si alguna de ellas presenta identidad con la banda formada entre el orificio del antgeno y el suero control positivo. (Foto 4). La prueba se considera vlida cuando se observa la banda de precipitacin entre el antgeno y el suero control positivo; en caso contrario, la prueba carece de valor y debe repetirse el ensayo.

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3.3 INFORME DE RESULTADOS Informar la presencia (positivo) o ausencia (negativo) del Arco 5 y el nmero total de bandas observadas: a) Positivo. b) Negativo. Anotar la siguiente observacin: El resultado negativo no siempre indica ausencia de quiste hidatdico, pues esto puede ocurrir en caso de quiste ntegro (hialino) y calcificado.

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CAPITULO IV
PRUEBA DE INMUNOBLOT

FUNDAMENTO Este mtodo permite observar la reaccin de los anticuerpos presentes en el suero de un paciente frente a protenas antignicas del lquido hidatdico. Las protenas son separadas por electroforesis y despus transferidas a una membrana de nitrocelulosa. La membrana es entonces incubada con el suero problema y luego con AntiIgG humano marcado con una enzima. Si el suero tiene anticuerpos, al agregar un substrato cromgeno adecuado, se origina un producto insoluble que precipita formando bandas en las zonas de protenas antignicas. 4.1 PROCEDIMIENTO 4.1.1. ETAPA I: Separacin de las protenas del antgeno por electroforesis en gel de poliacrilamida conteniendo dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). La separacin de las protenas, componentes antignicos por SDS-PAGE es realizada siguiendo la metodologa descrita por Tsang et al. (1983-1986), empleando un sistema discontinuo en el gel de separacin y en el gel de empaquetamiento. Un sistema vertical (Mini-Protean II electroforesis Cel, BIORAD) resulta apropiado para realizar la separacin de las protenas. (Foto 5).

4.1.1.1 Antgeno El antgeno total del lquido hidatdico de ovino (ATLH-O), liofilizado, es suspendido en un buffer Tris/HCl 0,05 M; pH 8,0 (Anexo II, 3.1) en concentracin de 50 mg/mL y centrifugado a 3500 rpm por 30 minutos. El sobrenadante es conservado entre -40C y-70C hasta el momento de su uso. 4.1.1.2 Tratamiento del antgeno El ATLH-O es diluido volumen a volumen, con una solucin de tratamiento de muestra (Anexo II, 3.2). El antgeno es entonces sometido en Bao Mara a 100C por 5 minutos. Luego se adiciona un colorante marcador de corrida (Anexo II, 3.3) a razn de 1 L por cada 30 L de muestra (Laemmli, 1970). 4.1.1.3 Preparacin del gel de separacin o de corrida para el modelo MiniProtean II, BIO-RAD. - Usar 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor y 2 espaciadores de plstico de 0,75 mm de espesor. - Limpiar las placas de vidrio con alcohol y secarlas. - Montar las placas, empleando los espaciadores untados con una capa fina de vaselina neutra para unir las placas.

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Preparar el gel en la concentracin de 15% segn la formula del Anexo II, 3.10 Encajar las placas en un soporte. Con auxilio de una jeringa colocar el gel en el espacio de las placas montadas hasta 65 mm de altura e inmediatamente completar con agua destilada. Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.

4.1.1.4 Aplicacin del gel de empaquetamiento - Eliminar el agua destilada de la parte superior del gel, con ayuda de una jeringa. - Secar con papel filtro la superficie del gel de separacin. - Preparar el gel de empaquetamiento como se indica (Anexo II, 3.10). - Colocar el gel de empaquetamiento preparado sobre el gel de separacin e inmediatamente insertar un peine preparativo de 0,75 mm de espesor, dejando un espacio entre el fondo del peine y el gel de separacin. (Foto 6). - Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 30 minutos.

4.1.1.5 Preparacin de la electroforesis - Retirar el peine y lavar las cavidades que deja con Buffer Tris-Glicina-SDS o de corrida (Anexo II, 3.9). - Aplicar en la cavidad del gel de empaquetamiento 40 L de suspensin de antgeno en una concentracin 4 g/L de protenas. - En las cavidades del extremo derecho de este gel, colocar 5 L de protenas de peso molecular patrn y 3 uL de peso molecular patrn preteido. - Adicionar aproximadamente 200 mL buffer de corrida en el recipiente superior y 300 mL del mismo buffer en el recipiente inferior de la cubeta, para iniciar la corrida electrofortica. (Foto 7).

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4.1.1.6 Corrida electrofortica - Conectar los terminales elctricos en la fuente de poder. La electroforesis se efecta a 15 mA por gel. - Prestar atencin al colorante marcador de corrida. - Cuando los complejos SDS-protenas entran uniformemente en el gel de separacin o de corrida, la corriente es aumentada a 30 mA por gel. - Desconectar el sistema cuando el colorante marcador de corrida alcanza la base del gel de separacin. 4.1.2 ETAPA II: Transferencia de protenas del gel de poliacrilamida a la membrana de nitrocelulosa. Las protenas son transferidas electroforticamente del gel para la membrana de nitrocelulosa con poros de 0,22 m, empleando un recipiente de electroforesis. (Foto 9).

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4.1.2.1 Preparacin de la transferencia En un recipiente conteniendo buffer de transferencia (Anexo II, 4.1) se coloca, el gel sobre una membrana de nitrocelulosa. Estos a su vez, se colocan entre dos hojas de papel filtro embebidas en el mismo buffer. El conjunto de gel, nitrocelulosa y papel de filtro se coloca entre dos esponjas de 3 mm de espesor y a su vez todo este conjunto queda empacado en una pieza plstica con perforaciones en ambos lados. Enseguida, este conjunto, se encaja en una cmara de transferencia, con el gel colocado hacia el ctodo y la membrana de nitrocelulosa hacia el nodo.

4.1.2.2 Electrotransferencia La electrotransferencia se efecta a una corriente, variando de 1,5 amperios a 10C al inicio hasta 2,05 amperios a 35C al final del proceso, manteniendo el voltaje constante de 55 voltios por una hora. (Foto 10).

Finalizada la electrotransferencia, retirar la membrana de nitrocelulosa y lavar 5 veces por 5 minutos cada una, con buffer fosfato salino (PBS) 0,01M pH 7,2 (Anexo II, 4.2) conteniendo 0,3% de tween 20 (PBS-T) (Anexo II, 5.3) y 1 vez ms con PBS sin tween. Cortar la tira de nitrocelulosa que contiene los patrones de peso molecular y colorear con solucin al 1% de tinta China. A continuacin cortar la membrana de nitrocelulosa conteniendo las protenas del antgeno, en tiras de 3 mm de ancho y guardar a -20C entre hojas de papel filtro humedecidos en PBS hasta el momento de su uso.

4.1.3 ETAPA III: Reaccin inmunoenzimtica Emplear placas de plstico divididas en compartimentos. Colocar tiras de nitrocelulosa conteniendo el antgeno hidatdico en los compartimentos de las placas. (Foto 11).

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Incubar las tiras con PBS-T conteniendo 5% de leche descremada (PBS-TL) (Anexo) por 30 minutos a temperatura ambiente y agitando. Descartar el PBS-TL y colocar los sueros problemas diluidos a 1:100 en PBS-TL e incubar por 1 hora. Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una, con PBS-T. Adicionar una solucin de anti-IgG humano marcado con peroxidasa diluido a 1:1000 en PBS-TL e incubar por 1 hora. Lavar las tiras 5 veces por 5 minutos cada una con PBS-T y 1 vez ms con PBS slo. Revelar la reaccin adicionando una solucin conteniendo 5 mg de Diamino bencidina (DAB) 10L de H2O2 (30%) por cada 10 mL de PBS. Luego de visualizar las bandas, lavar las tiras varias veces con agua deionizada. Dejar secar las tiras a temperatura ambiente en la oscuridad.

4.2 Lectura e interpretacin de resultados Consiste en visualizar en las tiras de nitrocelulosa, la presencia o ausencia de bandas de precipitacin. En caso de presencia de bandas anotar sus respectivas masas relalivas (Mr) expresados en unidades de kilodaltons (kDa). (Foto 12).

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4.3 Informe de resultados El criterio de positividad para el diagnstico de la hidatidosis humana, empleando antgeno hidatdico preparado en el INS, est condicionado al reconocimiento de uno o ms pptidos antignicos de Mr entre 21 y 31 kDa por anticuerpos presentes en el suero del paciente.

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CAPITULO V

OBTENCION DE LA MUESTRA DE SUERO SANGUINEO

El suero sanguneo es el material que se solicita para el examen serolgico de la hidatidosis humana, la cual se obtiene de sangre venosa siguiendo el procedimiento que a continuacin se indica. 1. 2. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesita para obtener la muestra (Anexo III). Si el paciente se encuentra en el laboratorio, haga que se siente de manera que el brazo quede colocado, paralelamente, a la mesa de trabajo donde se har la extraccin de sangre. Ponga el brazo del paciente sobre la mesa de trabajo apoyndolo en un pequeo cojn bajo el codo, con la palma de la mano vuelta hacia arriba.

3. 4.

Si el paciente se encuentra en cama extienda el brazo del paciente en una posicin descansada. El sitio ms adecuado para la extraccin de sangre es la vena que se encuentra en el pliegue anterior del codo, en el punto donde es ms gruesa y visible.

5.

Coloque la ligadura alrededor del brazo y sujete firmemente los extremos.

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6.

Con la mano izquierda, tire del extremo de la ligadura cruzndola y a continuacin introduzca este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura. De acuerdo a la Figura, la ligadura se deber ajustar slo lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarlo tanto que reduzca el paso de sangre por las arterias.

7. 8. 9.

Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas. Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en que introducir la aguja. Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de algodn embebido en alcohol yodado.

10. Usando guantes, tomar la jeringa con la mano derecha, colocando la yema del dedo ndice sobre la base de la aguja. 11. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba; introduzca la aguja en el centro de la vena, sin titubeos, 1-1,5 cm aproximadamente.

12. Con la mano izquierda tire hacia atrs el mbolo de la jeringa. muy lentamente. Deber entrar la sangre en la jeringa, hasta completar 5 mL; si no entra la sangre intntelo nuevamente.

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13. Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.

14. Aplicar un pedazo de algodn seco sobre la zona por donde se punz la piel. Saque la aguja con un movimiento rpido. 15. Pedir al paciente que presione, firmemente, el algodn durante tres minutos, con el brazo extendido. 16. Luego de extrada la sangre por puncin venosa, retire la aguja de la jeringa y colquela en un depsito de metal (para autoclavar y eliminar); vierta, lentamente, la sangre en un tubo de prueba sin anticoagulante y tpelo. Deje reposar el tubo con la sangre en posicin vertical, en una gradilla, por un lapso de 30 minutos a 2 horas, centrifugar la sangre de 2000 a 2500 rpm durante 5 minutos. Si no dispone de centrfuga, la sangre se puede dejar varias horas en la refrigeradora; el suero se separar del cogulo. 17. Destapar el tubo y aspirar el suero con una pipeta de Pasteur. 18. Depositar el suero en un tubo limpio y seco, as estar listo para realizar la prueba. 19. Si se remitiese la muestra a otro laboratorio, coloque el suero en viales de plstico con tapa o en frasco de Weathon o de tipo penicilina, estril, de 5 mL de capacidad, colocando inmediatamente la tapa y sellando con papel parafinado o cera. 20. Rotular y codificar el frasco de inmediato.

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CAPITULO VI
CONSERVACION Y ENVIO DE MUESTRAS DE SUERO

Las muestras contenidas en viales o frasquitos pueden conservarse en refrigeracin (4C) por perodo de tiempo cortos (hasta 1 da) y deben congelarse (freezer a 0C) si se requiere conservarlas por mayor tiempo y si se cuenta con el equipo necesario a -20C. Cuando las muestra no pueden ser procesadas en el mismo laboratorio o cuando se desea una confirmacin del diagnstico, stas deben ser enviadas a otro laboratorio. Para efectuar el envo de las muestras de suero se deben seguir los siguientes pasos: Colocar los frasquitos con las muestras de suero, rotulados apropiadamente, en una bolsa plstica y luego acondicionarlas en un contenedor secundario (recipiente de plstico) rodeado de hielo seco o cubos de hielo. El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnopor u otro material que conserve temperaturas bajas. Se debe adjuntar la ficha epidemiolgica envuelta en una bolsa plstica o mica, cuidando que no se moje el papel. Cerrar y sellar hermticamente la caja trmica. Rotular la caja trmica con los siguientes datos en caso de ser enviado al Laboratorio de Referencia Nacional:

URGENTE INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL Jr. Cpac Yupanqui 1400 Jess Mara Lima Telfono: 471-9920; Fax: 471-2529 contiene MATERIAL BIOLOGICO PERECIBLE

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CAPITULO VII
BIOSEGURIDAD

Es un conjunto de medidas preventivas destinados a proteger la salud y la seguridad del personal, durante su trabajo, en los laboratorios donde se manipulan productos biolgicos. El suero sanguneo, y en ocasiones lquido cefalorraqudeo, son los productos biolgicos principales que se procesan en las pruebas de diagnstico inmunolgico de la Hidatidosis humana. Los laboratorios donde se realizan las pruebas, deben ser de nivel de bioseguridad 2, esto implica las siguientes medidas: 1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la Hepatitis B. Al momento de extraer la sangre debe vestir mandil, amarrarse el cabello largo o usar gorro y evitar tener brazaletes y collares. Usar guantes, jeringas y agujas descartables o vacutainers. Nunca utilizar slo la aguja para la extraccin de sangre, evitar pipetear fluidos.

1.1 Manipulacin y eliminacin de sangre y sus productos La extraccin, centrifugacin y separacin de suero, deben hacerse usando guantes descartables. Las agujas usadas, no deben devolverse al capuchn de plstico, sino colocarlas en leja para luego cremarlas juntamente con las jeringas usadas. Estas deben colocarse en un recipiente metlico o recipiente que resista la esterilizacin en autoclave, antes de eliminarlas. El operador es el responsable de desinfectar el rea de trabajo antes y despus de cada sesin de trabajo con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejndolos actuar durante 30 minutos. Durante este proceso no comer. El cogulo y suero innecesarios, deben eliminarse a un recipiente con desinfectante, leja por ejemplo. Los tubos de prueba, pipetas y lminas de microscopio pueden decontaminarse sumergindolas en mezcla sulfocrmica o leja antes de lavarlas.

2. DEL AMBIENTE DE LABORATORIO Las paredes y pisos deben ser lisos, de preferencia paredes enchapadas con maylica y pisos de marmolina o cemento, que facilitan la limpieza con soluciones desinfectantes. Los pisos deben limpiarse todos los das con soluciones desinfectantes (pinosan, cresol, entre otros). No se debe barrer en seco ni encerar. Al sistema de desage, slo se debe eliminar los agentes biolgicos o qumicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados. El ambiente debe ser amplio, con suficiente iluminacin, adecuadamente ventilacin y que los servicios de agua, luz y gas funcionen satisfactoriamente. Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material slido, con superficies lisas, impermeables y resistentes a las sustancias corrosivas y de fcil limpieza.

3. ACCIDENTES 3.1 Inoculacin accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeas La persona accidentada debe lavarse las zonas afectadas y concurrir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado del problema. 3.2 Ingestin de material posiblemente peligroso

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La persona acudir inmediatamente al servicio mdico ms cercano para el tratamento adecuado. 3.3 Contacto con material sospechoso de poder contener virus de la hepatitis B o virus de la inmunodeficiencia humana, dengue, fiebre amarilla, influenza etc. Se debe lavar la zona afectada con agua y jabn, favoreciendo el sangrado de la lesin, si es necesario, se cubre la herida con un apsito. Se concurrir al servicio mdico ms cercano para determinar la gravedad y la posible contaminacin con sangre. Se informar del accidente a las autoridades competentes. Se tomar una muestra inicial de sangre del trabajador que ser examinada serolgicamente para Hepatitis B, VIH, dengue y fiebre amarilla entre otros. Se debe examinar, de la misma manera, una muestra del material con que se contamin el personal. Si la serologa de VIH del trabajador es negativa, este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. La continuidad de la serologa negativa indica que el trabajador no se ha contaminado.

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CAPITULO VIII
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1.

CENTRO PANAMERICANO DE ZOONOSIS. 1979. Prueba de doble difusin arco 5 para el diagnstico de la hidatidosis humana. (Nota Tcnica N22). Buenos Aires, Ramos Meja. COLTORTI E. & VARELA-DIAZ V. 1978. Inmunologa e inmunodiagnstico de la hidatidosis humana. Med. Argent. 1a. Serie. (6):135-147. GOMES DE MORAES RUY. 1971. Parasitologa Mdica. Rio de Janeiro, Atheneu. 219 p. KAGAN I. 1968. A review of serological tests for the diagnosis of hydatid disease. Bull. WHO 39: 25-37. LAEMMLI U. 1970. Cleavage of estructural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680- 685. MADDISON S., SLEMENDA S., SCHANTZ P., FRIED J., WILSON M. & TSANG V. 1989. A specific diagnostic antigen of Echinococcus granulosus with an apparent molecular weight of 8 kDa. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40 (4): 377-383. NAQUIRA, C.; BULLON, F; BALVIN, G.; REYES, N. & SANCHEZ, E. 1989. Epidemiologa de la hidatidosis en el Per. En: Anales del seminario nacional de zoonosis y enfermedades de alimentacin alimentaria, Ministerio de Salud. 122-134. NOBLE, E. & NOBLE, G. 1965. Parasitologa: Biologa de los Parsitos animales. 2ed. Mexico: Interamericana. 258-262. ORGANIZACION PANAMERICANA DE LA SALUD. 1986. Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Washington, OPS. (Publicacin Cientfica 503).

2.

3. 4. 5.

6.

7.

8.

9.

10. PEREZ FONTANA V. 1944. Tratado de la hidatidosis. En: Arch. Inter. Hidatid. Vol 1, Fasc. 1. Imprenta Nacionales, Uruguay. 174 p. 11. PLANCHART S., BOTTO C., ALARCON DE NOYA B., BONIFACINO R., VIVAS L., SPENCER L. & VIVAS S. 1994. Evaluation of the double diffusion, enzyme immunoassay and inmunoblotting techniques, for the diagnosis of human hydatid disease in tropical areas. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 36 (3):205210. 12. SANCHEZ E. 1995. Determinacao de antigenos relevantes da forma larvar do Echinococcus granulosus: Padronizacao e aplicafao do Immunoblot no diagnostico da hidatidose humana. Instituto Oswaldo CruzFIOCRUZ. Rio de Janeiro. Tese de Mestra. 13. SHAMBESH M., GRAING P., GUSBI A., ECHTUISH E. & WEN H. 1995. Immunoblot evaluation of the 100 and 130 kDa antigens in camel hydatid cyst fluid for the serodignosis of human cyst echinococosis in Libya. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 89: 276-279. 14. TSANG V., HANCOCK K., WILSON, M., PALMER, D., WHALEY S., McDOUGAL J. & KENNEDY S. 1986. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecnique (western blot) for human T-Iymphotropic virus type III/lymphadenopathy- associated virus (HTLV-III/LAV) antibodies. Immunology series No.15 procedual guide. 1-25. 15. TSANG V., PERALTA M & SIMONS R. 1983. Enzyme-linked inmunoelectrotransfer blot tecniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies separated by gel electrophoresis. Met. Enzymol. 92: 377-391.

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16. VARELA-DIAZ V. & COLTORTI E. 1974. Tcnicas para el diagnstico inmunolgico de la hidatidosis humana. Centro Panamericano de Zoonosis, OPS/OMS (Monog. Cient. Tec. 7), Ramos Mejia, Provincia de Bs. As., Argentina. 17. VARELA-DIAZ, V., GUARNERA E. & COLTORTI E. 1986. Ventajas y limitaciones de los mtodos inmunolgicos y de deteccin por imgenes para el diagnstico de la hidatidosis. Bol. Of. Sanit. Panam. 100(4): 369-383. 18. VARELA-DIAZ, V., GUISANTES J., RICARDES, M., YARZABAL L. & COLTORTI E. 1975. Evaluation of whole and purified hydatid fIuid antigens in the diagnosis of human hydatidosis by the immunoelectrophoresis test. Am. J. Trop. Med. Hyg. 24: 304-311.

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CAPITULO IX

ANEXOS

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ANEXO I

MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLUCIONES PARA DD5

1. MATERIALES Y EQUIPOS Lminas portaobjeto Tubos de ensayo de 16 x 125 mm, tapa rosca Pipetas Pasteur Pipeta de 5 mL Placas petri 100 x 15 mm. Tubos de vidrio en U por 5 mm de dimetro Beaker de 1 L. Frasco Coplin Frasco de vidrio de boca ancha con tapa de 100 x 80 mm aproximadamente Lpiz con punta de diamante Papel filtro (Whatman N 1) Pizeta de 500 mL Guantes de ltex Bulbo para pipetas Sacabocados para corte de 1, 6 y 10 mm de dimetro Diagrama para corte (DD5) Reloj de laboratorio Refrigeradora Estufa Balanza Potencimetro

2. REACTIVOS Y SOLUCIONES Antgeno Hidatdico Suero problema Suero control positivo a antgeno del Arco 5 Agar Noble (Difco) Alcohol Etlico 95 Merthiolate en polvo Cloruro de Sodio Fosfato dibsico de potasio Fosfato monobsico de potasio Colorante amido Schwarz (negro amido) Acido actico glacial Agua destilada Leja

3. PREPARACION DE ANTIGENO HIDATIDICO

El antgeno del arco 5 se encuentra en el lquido hidatdico. 3.1 Obtencin del lquido Hidatdico: El lquido extrado aspticamente (con jeringa) de quistes hidatdicos de animales, se deja decantar en probeta para permitir la sedimentacin de arenilla hidatdica y posibles restos de membranas que hayan sido arrastrados en la aspiracin. Una vez sedimentados los elementos ms gruesos, el sobrenadante se transfiere a frascos para centrifugar a 2500 rpm durante 30 minutos. El lquido sobrenadante se congela

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inmediatamente. 3.2. Dilisis y Liofilizacin: El lquido hidatdico descongelado, se transfiere a una bolsa de dilisis y se dializa a 4C contra un volumen 25 veces mayor de agua destilada. Conviene dializar no menos de un litro de lquido hidatdico proveniente de varios quistes. El agua contra la cual se dializa dicho lquido se cambia cuatro veces, a intervalos de 24 horas. En consecuencia, la dilisis completa requiere cuatro das, y la relacin entre el volumen de agua empleada y el volumen de lquido hidatdico dializado es de 100 a 1. Despus de dializado, el lquido hidatdico presenta un aspecto opalescente debido a la precipitacin de ciertas fracciones protenicas. El contenido total de la bolsa de dilisis (incluido el precipitado) se trasvasa a frascos de tamao adecuado para su liofilizacin (ejemplo frascos tipo penicilina). Es conveniente llenar los frascos solamente hasta un cuarto de su capacidad, para facilitar la congelacin del lquido sobre las paredes lo que se consigue realizando la congelacin mediante rotacin del frasco en un bao de mezcla refrigerante (hielo seco- alcohol) o mantenindolos a -80C. Despus de congelado el lquido hidatdico, se procede a su liofilizacin, tomando las precauciones necesarias para que durante este proceso la temperatura externa no exceda de los 20C. El lquido hidatdico liofilizado que contiene el antgeno del arco 5, deber guardarse en frascos perfectamente cerrados en un lugar seco y fresco hasta el momento de su empleo. 3.3 Control de Calidad del Antgeno Producido El antgeno del lquido hidatdico obtenido segn el procedimiento que se ha indicado, se controla mediante la prueba de inmunoelectroforesis para buscar la presencia del Arco 5; para ello, se comparan el antgeno producido y uno de referencia, frente a un suero positivo. El antgeno producido se considera satisfactorio cuando se verifica la formacin de la banda del arco 5 y de no menos de otras cinco bandas. La banda de precipitacin correspondiente al arco 5 debe ser bien definida y su morfologa y ubicacin debe estar una imagen en espejo de la morfologa y ubicacin del arco 5, resultante de la interaccin del suero y antgeno de referencia. (Foto 13).

4. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA DD5

4.1 Solucin Salina Tamponada (Sst) 0,1M - pH 7,4 Solucin Fisiolgica (NaCl 0,85 gr%) ................................................ 900 mL Fosfato de potasio dibsico (K2HPO4) 0,1 M .................................... 100 mL Ajustar pH 7,4 con solucin KH2PO4 0,1 M. 4.2 Preparacin de Solucin Antignica Pesar 50 g de antgeno hidatdico liofilizado y disolver en 1 mL de SST 0,1 M, pH 7,4. Esta solucin puede ser conservada en congelacin a -20C o a 4C hasta 10 das.

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4.3 Preparacin del Agar Noble Pesar 1,2 gr. de Agar Noble (Difco o similar) y disolver en 100 mL de SST 0,1 M, pH 7,4 adicionada de un conservador (10 mg de merthiolate). 4.4 Solucin Colorante Amido Schwarz (Negro Amido) ................................................ 0,1 g Acido actico glacial ................................................................ 20,0 mL Agua destilada c.s.p. ............................................................. 1000,0 mL Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo perfectamente cerrado. 4.5 Solucin Decolorante Alcohol etlico de 95 ............................................................ 400,0 mL Acido actico glacial .............................................................. 100,0 mL Agua destilada c.s.p .............................................................. 1000,0 mL Conservar a temperatura ambiente en frasco perfectamente cerrado.

DIAGRAMA PARA EL CORTE DEL AGAR EN LA PRUEBA DE DOBLE DIFUSION ARCO 5

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ANEXO II

MATERIALES, EQUIPOS, REACTIVOS Y SOLUCIONES PARA INMUNOBLOT

1. MATERIALES Y EQUIPOS 2 placas de vidrio de 73 mm de alto x 102 mm de ancho x 1 mm de espesor. 2 espaciadores de plstico de 0,75 rnm de espesor. Jeringas de 5 mL. Peines separadores de especmenes. Nitrocelulosa con poros de 0,22 m. Esponjas de 3 mm de espesor. Papel filtro (Blotting paper). Placas de plstico divididas en compartimentos (Mini-Incubation Trays). Un sistema vertical Tipo Mini-Protean II electrophoretic cell, BIO-RAD. Mini-Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cells Tipo BIO-RAD-USA.

2. REACTIVOS Y SOLUClONES Antgeno de lquido hidatdico de ovino (ATLH-O) liofilizado. Suero problema. Sueros control positivo. Sueros control negativo. Anti- IgG humano marcado con peroxidasa. Tris o Trizma base. 2-mercaptoetanol. Azul de bromofenol. Peso molecular estndar. Acrilamida. Bis-acrilamida. Temed. Dodecil sulfato de sodio (SDS). Metanol. Alcohol etlico. Diamino-bencidina (DAB). Perxido de hidrgeno (30%). Fosfato de sodio dibsico. Fosfato de sodio monobsico. Tween 20. Leche descremada. Coomassie blue R-250. Solucin decolorante.

3. PREPARACION BUFFER Y SOLUCIONES PARA SDS-PAGE 3.1 Buffer Tris/HCl 0,05M, pH 8,0 Tris .................................................................................................. 0,6 g NaCl ................................................................................................ 0,6 g Agua destilada q.s.p .................................................................... 100,0 mL Ajustar pH 8,0 con HCl concentrado.

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3.2 Solucin de tratamiento de muestra Tris/HCl 0,5 M pH 6,80 .................................................................... 95 mL 2 mercapto-etanol ........................................................................... 0,05 g SDS .................................................................................................. 0,02 g 3.3 Solucin colorante marcador de corrida Azul de bromofenol ....................................................................... 0,05 g Glicerol .......................................................................................... 8,00 mL Tris/HCl 0,5 M pH 8,0 ................................................................... 1,00 mL Agua deionizada .............................................................................. 1,00 mL Diluir la muestra 1:2 en el tampn de tratamiento, hervir por 10 minutos. Adicionar solucin marcador de corrida 3 L por cada 100 L de la muestra. 3.4 Solucin stock de poliacrilamida Acrilamida ...................................................................................... 14,6 g N N bis-acrilamida .......................................................................... 0,4 g Agua deionizada q.s.p ..................................................................... 50,0 mL Pesar en tubo de plstico, disolverlos en agua caliente, esperar hasta que se enfre y completar el volumen. Conservar a 4C. 3.5 Buffer de gel de empaquetamiento 0,5 M, pH 6,8 Tris 0,5 M ............................................................................................ 6,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL 3.6 Buffer de gel de separacin o de corrida 1,5 M, pH 8 Tris 1,5 M .......................................................................................... 18,15 g Agua deionizada .............................................................................. 100,00 mL 3.7 Solucin de persulfato de amonio (APS) a 10% Persulfato de amonio ........................................................................ 10,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL Alcuotar y conservar a -20C. 3.8 Solucin de Dodecil sulfato de sodio (SDS) a 10% SDS (95%) ........................................................................................ 10,0 g Agua deionizada .............................................................................. 100,0 mL Conservar a 40C o a temperatura ambiente. 3.9 Buffer de corrida (superior/inferior) Tris 0,05M Tris Trizma base ............................................................................... 30,0 g Glicina 0,192 M .................................................................................. 14,4 g SDS a 10% ........................................................................................... 10,0 mL Agua deionizada ............................................................................... 1000,0 mL 3.10 Frmula de concentracin de gel de empaquetamiento y de separacin o de corrida al 12% y 15%

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4. PREPARACION DE BUFFER Y SOLUCIONES PARA LA TRANSFERENCIA 4.1 Buffer de transferencia Tris 0,5 M Tris Trizma base ............................................................................... 102,8 g Metanol ................................................................................................ 400,0 mL Agua deionizada ................................................................................ 2000,0 mL Ajustar pH 9,18 con HCl concentrado 4.2 Buffer fosfato salino 0,01 M, pH 7.2 (PBS) Preparar 2 soluciones como sigue: A. NaH2PO4.H2O (fosfato monobsico de sodio) ............................... 1,37 g NaCl ................................................................................................... 8,76 g Agua deionizada q.s.p ................................................................. 1000,00 mL B. Na2PO4.7H2O .................................................................................. 2,68 g NaCl ................................................................................................... 8,76 g Agua deionizada .......................................................................... 1000,00 mL Mezclar las soluciones A y B (aproximadamente 5 partes de A para 6 partes de B). Ajustar el pH 7,2. 5. PREPARACION DE SOLUCIONES PARA REACCION INMUNOENZIMATICA 5.1 Conjugado anti-IgG humano diluido a 1:1000 en PBS-TL 5.2 Sueros controles negativo, positivo y suero problema diluidos a 1:100 en PBS-TL 5.3 PBS-T PBS 0.01 M Ph 7,2 ............................................................................... 100,0 mL Tween ......................................................................................................... 3,0 mL 5.4 PBS-TL PBS ........................................................................................................ 100,0 mL Leche descremada ...................................................................................... 5,0 g

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5.5 Solucin reveladora 3,3 diaminobenzidina tetracloridrato ...................................................... 5,0 mg PBS 0,01 M pH 7,2 .................................................................................. 10,0 mL H2O2 (30 volmenes) ................................................................................ 10,0 L

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ANEXO III

MATERIALES PARA OBTENCION DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA

Segn el procedimiento que emplee: Tubos vacutainer estriles. Jeringa descartable de 5 mL.

Agujas descartables 20 x 1G. Ligaduras de 2,5 mm de dimetro. Algodn. Alcohol yodado. Depsito de metal (tarros) para descartar las agujas. Frasco de vidrio de boca ancha (para colocar jeringas en solucin de leja). Leja al 3-5%. Gradillas. Mascarillas (opcional). Guantes. Cuaderno de registro.

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CAPITULO X
GLOSARIO

Antgeno: Sustancia extraa al organismo que induce la respuesta del sistema inmune. Anticuerpo: Protenas (inmunoglobulinas) producidas por el organismo, en respuesta al ingreso de una sustancia extraa (antgeno). Dilucin: Mezcla de una sustancia con una o ms partes de otra (diluyente) que no altere las caractersticas de la primera y que reduzca su concentracin.. Enfermedad: Proceso mrbido con sntomas definidos que afecta a todo el organismo o parte del mismo. Enzima: Protena que acta como catalizador orgnico sobre un substrato especfico. Embrin hexacanto: Embrin de tenia con seis ganchos (oncsfera). Estrbilo: Toda la cadena de progltides de la tenia. Esclex: Cabeza de una tenia; puede adherirse a la pared intestinal mediante ventosas o ganchos. Helminto: Gusano que puede ser nemtodo, cstodo o tremtodo. Hospedero: Organismo en el cual vive un parsito. Hospedero intermediario: Ser que se requiere en el ciclo vital, en el cual debe verificarse el desarrollo larval esencial antes de que un parsito infecte a su hospedero definitivo o a hospederos intermediarios adicionales. Infeccin: Penetracin y multiplicacin de un microorganismo en un hospedero, independientemente de la presentacin de sntomas y/o patologa. Inmunoglobulinas: Protena con actividad de anticuerpo especfica, responsable de la inmunidad humoral; hay cinco clases distintas IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. Progltide: Segmento de la tenia que contiene los sistemas reproductores masculino y femenino; pueden ser inmaduros, maduros y grvidos. Quiste hidatdico: Estado larval de la tenia del gnero Echinococcus; consiste en una vescula grande que posee 1) una membrana germinal interna desde la cual los escolises y los quiste hijos se desarrollan avanzan para proyectarse en la vescula, 2) una membrana circular y 3) una membrana adventicia. Quiste multilocular: Quistes que contienen muchas vesculas. Quiste unilocular: Quiste que contiene slo una vescula. Ttulo serolgico: La cantidad de suero necesaria para producir una reaccin biolgica con otra sustancia, medida generalmente como la mxima dilucin del suero testigo que an mantiene dicha reactividad. Zoonosis: Enfermedad de animales transmisible a los seres humanos.

Esta publicacin se termin de imprimir en Diciembre de 1997 en los Talleres Grficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la Repblica 731 - Lima 13 Tel/Fax: 423-7616

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