ACARA II PEMBUATAN MEDIA DAN STERILISASI I. TUJUAN a. Mengetahui cara pembuatan media untuk pertumbuhan mikroorganisme. b.

Mengetahui cara sterilisasi media dan peralatan. II. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekulmolekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Pradhika, 2008). Untuk menelaah mikroorganisme di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan mereka. Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrien yang diisyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya (Caray, 2010). Alat-alat yang digunakan dalam perkembangbiakan inipun harus disterilisasikan terlebih dahulu. Hal tersebut dimaksudkan agar tidak ada mikroorganisme lain, yang tidak diinginkan, tumbuh dalam media tersebut, sehingga dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang akan dibiakkan dalam media tersebut (Caray, 2010). Mikroba sama halnya dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan tempat untuk hidup yang digunakan untuk mendapatkan nutrisi bagi pertumbuhannya. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan akan membantu di dalam perbanyakan, kultivasi, isolasi maupun dalam mengidentifikasi mikroba. Mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda. Oleh karena itu sangat penting dilakukan kegiatan pembuatan media dan sterilisasi dalam bidang mikrobiologi yang bertujuan untuk mempermudah pertumbuhan mikroorganisme yang diinginkan sehingga mampu menciptakan suatu bentuk penelitian atau pembelajaran yang berkualitas. Bahan ataupun peralatan yang dipergunakan di dalam mikrobiologi, harus berada keadaan steril. Artinya, pada bahan atau peralatan tersebut tidak terdapat mikroba yang tidak diharapkan kehadirannya, baik akan mengganggu atau merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. B. Dasar Teori Mikroorganisme yang ingin kita tumbuhkan, yang pertama harus dilakukan adalah memahami kebutuhan dasarnya kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan. Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling. Air sadah umumnya mengandung ion kalsium dan magnesium yang tinggi. Pada 1

medium yang mengandung pepton dan ektrak daging, air dengan kualitas air sadah sudah dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat (Hadioetomo, 1993). Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorgonik ditambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk, 1993). Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh (Caray, 2010). Pada pembuatan media untuk berbagai macam organisme harus menggunakan bahan yang mengandung banyak protein dengan berbagai konsentrasinya sehingga dapat menumbuhkan bakteri (Stanier, 2001). Komponen anorganik maupun organik merupakan substrat ataupun medium yang baik bagi kehidupan mikroorganisme. Mikroorganisme penghuni tanah merupakan campuran populasi dari protozoa (amoeba, flagellata, cilliata), bakteri (clostridium, rhizobium), alga (ganggang) seperti alga biru, hijau, dan jamur terutama jamur bertingkat rendah seperti jamur lendir, berbagai ragi, dan berbagai phyromycetes dan ascomycetes (Dwijoseputro, 1994). Mikroorganisme memerlukan berbagai jenis makanan untuk pertumbuhanya seperti senyawa karbon, phosphate, dan lain-lain. Mikroorganisme mengambil energi serta bahan makanan untuk pertumbuhan mereka dengan cara yang tidak sama (Lestari, 2009). Macam-Macam media pertumbuhan: 1. Medium berdasarkan sifat fisik a. Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat. b. Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. c. Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth). 2. Medium berdasarkan komposisi a. Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar. b. Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa, dan ekstrak kentang. 2

c. Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract. 3. Medium berdasarkan tujuan a. Media untuk isolasi Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar. b. Media selektif/penghambat Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. c. Media diperkaya (enrichment) Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll. d. Media untuk peremajaan kultur Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur. e. Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik. Media ini digunakan untuk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon. f. Media untuk karakterisasi bakteri Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar. g. Media diferensial Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni, dan perubahan warna media di sekeliling koloni (Pradhika, 2008). Media yang umum digunakan untuk kultur mikroalga adalah media sintetik dan alami. Media sintetik terdiri dari senyawa-senyawa kimia yang komposisi dan jumlahnya telah ditentukan. Medium Basal Bold (MBB) merupakan media sintetik yang umum digunakan dalam kultur mikroalga Chlorophyta. Sedangkan media alami dibuat dari bahan-bahan alami, seperti air kelapa. Media alami juga dapat diperoleh dari limbah pembuatan produk tertentu, seperti limbah pengolahan produk kacang kedelai, limbah minuman teh, limbah cair tahu, dan tapioka 3

(Prihantini. dkk, 2007). Ekstrak Tauge merupakan salah satu sumber media alami yang dapat digunakan untuk media pertumbuhan mikroalga. Media tersebut mengandung unsur makro dan mikro, vitamin, mineral serta asam amino yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroalga (Prihantini. dkk, 2005). Alat yang akan digunakan dalam suatu penelitian atau praktikum harus disterilisasi terlebih dahulu untuk membebaskan semua bahan dan peralatan tersebut dari semua bentuk kehidupan. Sterilisasi merupakan suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda. Proses sterilisasi dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu penggunaan panas (pemijaran dan udara panas); penyaringan; penggunaan bahan kimia (etilena oksida, asam perasetat, formaldehida, dan glutaraldehida alkalin) (Hadioetomo, 1993). Beberapa cara untuk mensterilkan medium: 1. Dalam abad 18 orang mensterilkan medium cukup dengan mendidihkan medium tersebut selama beberapa jam. Dengan jalan ini maka matilah semua benih kehidupan. Cara yang demikian ini dilakukan oleh Spallanzani (17291799) untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis. 2. Tyndallisasi. Metode ini berupa mendidihkan medium dengan uap untuk beberapa menit saja. Sehabis didiamkan satu hari, spora-spora sempat tumbuh menjadi bakteri vegetatif, maka medium tersebut dididihkan lagi selama beberapa menit. Akhirnya pada hari ketiga, medium tersebut dididihkan sekali lagi. Dengan jalan demikian ini diperolehlah medium yang steril, dan lagi pula, zat-zat organik yang terkandung di dalamnya tidak mengalami banyak perubahan seperti halnya pada (a). 3. Dengan autoklaf, yaitu alat serupa tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan di dalam autoklaf ini selama 15 sampai 20 menit; hal ini bergantung kepada banyak sedikitnya barang yang perlu disterilkan. 4. Dengan penyaringan (filtrasi). Medium disaring dengan saringan porselin atau dengan tanah diatom. Dengan jalan ini, maka zat-zat organik tidak akan mengalami penguraian sama sekali. Hanya sayang, virus tak dapat terpisah dengan penyaringan, medium masih perlu dipanasi dalam autoklaf, meskipun tidak selama 15 menit dengan temperatur 121oC. Penyaringan dapat dilakukan juga dengan saringan yang dibuat dari asbes. Saringan ini lebih murah dan lebih mudah penggunaannya daripada saringan porselin (Mya, 2010). Sterilisasi yang umum dilakukan dapat berupa: 1. Sterilisasi secara fisik (pemanasan, penggunaan sinar gelombang pendek yang dapat dilakukan selama senyawa kimia yang akan disterilkan tidak akan berubah atau terurai akibat temperatur atau tekanan tinggi). Dengan udara panas, dipergunakan alat bejana/ruang panas (oven dengan temperatur 170o -180oC dan waktu yang digunakan adalah 2 jam yang umumnya untuk peralatan gelas). 2. Sterilisasi secara kimia (misalnya dengan penggunaan disinfektan, larutan alkohol, larutan formalin). 3. Sterilisasi secara mekanik, digunakan untuk beberapa bahan yang akibat pemanasan tinggi atau tekanan tinggi akan mengalami perubahan, misalnya adalah dengan saringan/filter. Sistem kerja filter, seperti pada saringan lain

adalah melakukan seleksi terhadap partikel-partikel yang lewat (dalam hal ini adalah mikroba) (Suriawiria, 2005). Autoklaf digunakan sebagai alat sterilisasi uap dengan tekanan tinggi. Penggunaan autoklaf untuk sterilisasi, tutupnya jangan diletakkan sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0 serta dilakukan pendinginan sedikit demi sedikit. Medium yang mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril (Dwidjoseputro, 1994). III. METODE A. Alat dan Bahan 1. Alat dan Bahan Pembuatan Media a. Alat o Pisau tajam 1 buah o Baskom 1 buah o Kompor 1 buah o Panci 1 buah o Pengaduk 1 buah o Corong plastik 1 buah o Botol kaca 6 buah (@ media 3 botol) b. Bahan o Agar-agar tanpa warna 30 gram (@ media 15 gram) o Kentang 200 gram o Air atau akuades 2 liter (@ media 1 Liter) o Sukrosa atau gula pasir 100 gram (@ media 15 gram) o Tauge 200 gram 2. Alat dan Bahan Sterilisasi a. Alat o Pembakar spirtus (bunsen burner) 1 buah o Jarum ose 1 buah o Cawan petri 2 buah o Tabung reaksi 2 buah o Kertas 2 lembar o Kapas penyumbat 2 gulung kecil o Autoklaf 1 set o Botol semprot 1 buah b. Bahan Alkohol 70% secukupnya B. Cara Kerja 1. Pembuatan Media PDA (Potato Dextrose Agar) a. 200 gram kentang dikupas, dipotong dadu kecil, dan dicuci bersih. b. 1 liter air atau akuades dimasukkan ke dalam panci rebus.

c. Hasil kupasan dan potongan dadu pada langkah 1 dimasukkan ke dalam panci rebus kemudian kompor dinyalakan. Kentang direbus sampai air atau akuades di dalamnya mendidih. d. Setelah mendidih, potongan kentang diambil dari didihan air (sari kentang tetap berada di dalam panci). e. 50 gram gula pasir dan 15 gram agar-agar tanpa warna ditambahkan ke dalam sari kentang. Campuran di dalam panci rebus diaduk terus hingga mendidih lagi. f. Setelah mendidih, campuran dalam panci rebus ditambah air atau akuades sampai volumenya tepat 1 liter kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca dengan bantuan corong plastik. 2. Pembuatan Media TEA (Tauge Extract Agar) a. 200 gram tauge dicuci bersih. b. Tauge yang telah dicuci dimasukkan ke dalam 1 liter air atau akuades dalam panci rebus. c. Tauge direbus sampai air atau akuades di dalamnya mendidih. d. Setelah mendidih, tauge diambil dari didihan air (sari tauge tetap berada di dalam panci). e. 50 gram gula pasir dan 15 gram agar-agar tanpa warna ditambahkan ke dalam sari tauge. Campuran di dalam panci rebus diaduk terus hingga mendidih lagi. f. Setelah mendidih, campuran dalam panci rebus ditambah air atau akuades sampai volumenya tepat 1 liter kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca dengan bantuan corong plastik. 3. Sterilisasi Kegiatan sterilisasi diawali dengan melakukan sterilisasi terhadap tangan dan beberapa alat yang digunakan. a. Sterilisasi tangan praktikan dilakukan dengan penyemprotan alkohol 70% pada tangan praktikan. Apabila diperlukan, meja kerja praktikan juga disemprot dengan alkohol 70%. b. Sterilisasi cawan petri dilakukan dengan cara cawan petri dibungkus kertas dengan kencang kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf. Sterilisasi cawan petri pada saat akan dimasuki media atau inokulum dilakukan dengan cara cawan petri diputar-putar didekat bunsen burner. c. Sterilisasi jarum ose dilakukan dengan dibakar di atas bunsen burner. d. Sterilisasi tabung reaksi dilakukan dengan cara disumbat menggunakan kapas yang dibentuk gulungan serta mulut tabung reaksi didekatkan dengan bunsen burner ketika akan dimasuki suatu media atau inokulum. Karena tabung reaksi juga merupakan alat gelas, maka sterilisasi juga dapat dilakukan di dalam autoklaf.

Sterilisasi tangan dan meja kerja praktikan

Sterilisasi jarum ose dan tabung reaksi

Sterilisasi cawan petri ketika penuangan media IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Pembuatan Media Pembiakan mikroba dalam laboratorium memerlukan medium yang berisi zat hara serta lingkungan pertumbuhan yang sesuai dengan mikroorganisme. Zat hara yang digunakan oleh mikroorganisme untuk pertumbuhan, sintesis sel, keperluan energi dalam metabolisme, dan pergerakan. Lazimnya, medium biakan berisi air, sumber energi, zat hara sebagai sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat, oksigen, hidrogen, serta unsur-unsur sekelumit (trace element). Dalam bahan

dasar medium dapat pula ditambahkan faktor pertumbuhan berupa asam amino, vitamin atau nukleotida. Pada praktikum pembuatan media kali ini, praktikan membuat media PDA (Potato Dextrose Agar) dan TEA (Tauge Extract Agar) sebagai media pertumbuhan bakteri. Langkah pembuatan media dimulai dengan dilakukannya penimbangan terhadap bahan yang dibutuhkan untuk pembuatan media seperti 30 gram agar-agar tanpa warna (setiap media 15 gram), 200 gram kentang, 200 tauge, 2 liter air atau akuades (setiap media 1 liter), dan 100 gram sukrosa atau gula pasir (setiap media 50 gram). Kegiatan penimbangan bahan ini bertujuan agar komposisi penyusun media menunjukkan komposisi yang proporsional sehingga dapat dihasilkan media yang berkualitas dan menghindari keenceran atau terlalu padat media yang dihasilkan. Langkah selanjutnya untuk media PDA, 200 gram kentang dikupas dengan pisau tajam kemudian dipotong dadu kecil. Selanjutnya, potongan kentang dicuci bersih. Kentang digunakan sebagai bahan dasar pembuatan media karena kentang merupakan umbi-umbian yang mengandung banyak karbohidrat dan berfungsi dalam memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat. Langkah selanjutnya untuk media TEA, 200 gram tauge dicuci bersih. Untuk langkah kerja berikutnya, pembuatan media PDA dan TEA memiliki prosedur kerja yang sama. 1 liter air atau akuades dimasukkan ke dalam panci rebus. Air atau akuades merupakan bahan dasar seperti pada kentang. Air atau akuades berfungsi sebagai pelarut. Hasil kupasan dan potongan dadu pada kentang atau hasil cucian dari tauge dimasukkan ke dalam panci rebus kemudian kompor dinyalakan. Kentang atau tauge direbus sampai air atau akuades di dalamnya mendidih. Kentang atau tauge direbus dengan tujuan agar dapat menghasilkan sari dari kentang atau tauge sebagai bahan dasar pembuatan media. Setelah mendidih, potongan kentang atau tauge diambil dari didihan air (sari kentang atau tauge tetap berada di dalam panci). 50 gram sukrosa atau gula pasir dan 15 gram agar-agar tanpa warna ditambahkan ke dalam sari kentang atau tauge. Campuran di dalam panci rebus diaduk terus hingga mendidih lagi. Penambahan sukrosa atau gula pasir berfungsi sebagai pemerkaya pembentukan asam amino dan gas dari karbohidrat sebagaimana fungsi pada penggunaan kentang. Konsentrasi penambahan sukrosa atau gula pasir sesuai teori yang ada, sehubungan dengan analisis fermentasi hanya sekitar 0,5-1%. Dalam praktikum ini, digunakan sukrosa atau gula pasir sebanyak 50 gram. Apabila dihitung dengan analisis perbandingan presentase keseluruhan komposisi media, sukrosa atau glukosa hanya memiliki konsentrasi 1,4% dalam media PDA ini. Jadi konsentrasi bahan ini sudah mendekati kesesuaian dengan teori pada literatur. Penambahan agar berfungsi sebagai pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45oC. Kandungan agar sebagai bahan pemadat dalam medium berkisar antara 1-2%. Pemanasan untuk kedua kalinya bertujuan supaya agar dapat larut dan bercampur merata dengan bahan yang lain, karena dalam suasana dingin agar tidak akan larut. Agar akan larut atau cair pada suhu hampir 100oC dan akan cair apabila kurang lebih 43oC. Setelah mendidih, campuran dalam panci rebus ditambah air atau akuades sampai volume tepat 1 liter kemudian dimasukkan ke dalam botol kaca dengan bantuan corong plastik. Penambahan volume air hingga tepat 1 liter bertujuan

agar uap air yang hilang dapat tergantikan oleh volume air atau akuades yang ditambahkan sehingga tidak mengurangi proporsionalitas komposisi media. Berdasarkan sifat fisik, media PDA dan TEA termasuk media padat karena apabila dilakukan perhitungan terhadap presetase komposisi keseluruhan bahan, media ini mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media yang dihasilkan menjadi padat. Dalam penggunaannya lebih lanjut, agar akan dipanaskan kembali dengan tujuan supaya agar mencair. Berdasarkan komposisinya, media PDA dan TEA termasuk media semi sintesis karena sebagian besar komposisinya diketahui secara pasti sehingga dapat diketahui presentase masing-masing bahan dalam komposisi secara keseluruhan. Sedangkan berdasarkan tujuan, PDA dan TEA termasuk media untuk isolasi yaitu media yang mengandung hampir semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba yang dalam hal ini mikorba di dalam yakult dan yoghurt. 2. Sterilisasi Kegiatan sterilisasi awal yang harus diperhatikan oleh praktikan adalah sterilisasi tangan praktikan. Sterilisasi ini dapat dilakukan dengan penyemprotan secara merata alkohol 70% pada tangan praktikan. Apabila diperlukan, meja kerja praktikan juga disemprot dengan alkohol 70% agar aseptis. Sterilisasi dengan menggunakan alkohol 70% merupakan jenis sterilisasi secara kimiawi. Alkohol mempunyai daya kerja mengkoagulasi protein serta mendenaturasinya. Cairan alkohol yang umum digunakan berkonsentrasi 70% karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif dalam sterilisasi. Menurut Volk dan Wheeler (1993), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri. Sterilisasi cawan petri dapat dilakukan dengan cara cawan petri dibungkus kertas dengan kencang kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf. Autoklaf adalah alat untuk kegiatan sterilisasi berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi yang menggunakan uap air panas bertekanan. Tekanan yang digunakan adalah 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mensterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakannya suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan mendididh pada suhu 1210C. Metode ini hanya berlaku untuk sea level, Jika laboratorium tempat peletakkan autoklaf terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.

Mekanisme kerja autoklaf adalah sebagai berikut. Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap atau udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Protein dapat terdenaturasi karena sebagian besar komponen dari bakteri adalah protein dan protein bersifat tidak tahan panas. Karena sterilisasi ini menggunakan uap air panas sebagai agen pensterilnya sehingga saat alat-alat dikeluarkan dari autoklaf banyak sekali tetesan uap air yang mengenai alat. Oleh karena itu agar sterilisasi yang dilakukan dapat berjalan maksimal, maka seharusnya alat-alat tersebut dimasukan kedalam oven untuk dikeringkan. Cara penggunaan autoklaf antara lain: a. Cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf sebelum dilakukan sterilisasi. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat. b. Peralatan dan bahan dimasukkan ke dalam autoklaf. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir, maka tutup harus dikendorkan. c. Autoklaf ditutup dengan rapat lalu dikencangkan dengan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu. d. Autoklaf dinyalakan dan diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121oC. e. Ditunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan ditunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm. f. Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tekanan dalam kompartemen ditunggu menjadi turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan dikeluarkan isi autoklaf dengan hati-hati. Beberapa media atau bahan yang tidak dapat disterilkan dengan autoklaf antara lain: a. Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim. b. Pelarut organik, seperti fenol. c. Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS. Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat), dan hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan antara lain: a. Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat. b. Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa garam mineral lain. 10

c. d. e. f.

Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar. Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf. Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0. Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum dari total volumenya, sisa ruang dibiarkan kosong. Jika mensterilkan media 1 liter yang ditampung pada erlenmeyer 2 liter maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit. Selain dengan autoklasf, sterilisasi cawan petri sebelum cawan petri dibuka untuk diinokulasi maupun cawan petri ditutup setelah inokulasi, tepi cawan petri dilewatkan di dekat sumber panas (bunsen burner). Jika perlu cawan petri diputarputar agak lama sebelum inokulum atau media dimasukkan ke dalam cawan petri tersebut. Sterilisasi selanjutnya adalah sterilisasi jarum ose, yaitu dengan cara dibakar di atas bunsen burner. Pemanasan sempurna ditandai dengan warna merah membara pada ujung jarum ose. Pemanasan jarum ose dilakukan pada pangkal kawat ose secara perlahan menuju ke ujung kawat jarum ose. Ujung jarum ose yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin terlebih dahulu atau dapat ditempelkan pada tutup cawan bagian dalam untuk mempercepat transfer panas yang terjadi. Tujuan pendinginan jarum ose yaitu supaya mikroba yang kita ambil tidak mati dengan jarum ose yang panas. Sterilisasi tabung reaksi dilakukan dengan cara menyumbat tabung reaksi menggunakan kapas yang dibentuk gulungan kecil (kapas dapat menutupi mulut tabung reaksi secara rapat). Sterilisasi tabung reaksi juga dapat dilakukan dengan mendekatkan mulut tabung reaksi pada sumber panas (bunsen burner) sebelum dan setelah mengambil atau menginokulasikan biakan. Karena tabung reaksi merupakan peralatan gelas, maka dapat pula dilakukan sterilisasi di dalam autoklaf seperti halnya pada cawan petri. Teknik pembakaran langsung merupakan teknik sterilisasi yang tercepat dan 100% efektif. Kelemahan teknik ini adalah terbatas penggunaannya. Prosedur ini sangat efektif membunuh bentuk spora maupun toksin yang dihasilkan oleh bakteri. Peralatan laboratorium yang dapat disterilkan dengan cara pembakaran langsung hanya alat-alat yang terbuat dari logam dan kaca. V. KESIMPULAN 1. Media adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. 2. Media yang digunakan dalam praktikum ini adalah media PDA (Potato Dextrose Agar) dan TEA (Tauge Extract Agar) yang merupakan media padat, semi sintesis, media isolasi dengan bahan dasar kentang atau tauge, air atau akuades, agar tanpa warna, dan sukrosa atau gula pasir. 3. Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada suatu benda. 4. Sterilisasi yang digunakan adalah sterilisasi menggunakan autoklaf (cawan petri dan tabung reaksi (jika perlu)), penyemprotan dengan cairan alkohol 70% (tangan praktikan dan meja kerja), pembakaran di atas sumber panas atau bunsen burner (jarum ose), disumbat dengan menggunakan gulungan kapas (tabung reaksi), dan pendekatan dengan sumber panas (mulut tabung reaksi dan cawan petri).

11

DAFTAR PUSTAKA Caray. 2010. Pembuatan Media Agar dan Sterilisasi. http://makalahdanskripsi.blogspot.com/2008/08/pembuatan-media-agar-dansterilisasi.html. 29 Oktober 2010. Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan. Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: Gramedia. Lestari, Diyah Erlina, dan Setyo. 2009. Pengaruh Bioksida Pengoksidasi terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme pada Air Pendingin Sekunder RSG- Gas. Seminar Nasional V SDM Teknologi Nuklir. Mya, 2010. Laporan Mikrobiologi. http://myaluzzs.wordpress.com/laporan mikrobiolgi. 29 Oktober 2010. Pradhika, E. Indra. 2008. Media Pertumbuhan. http://ekmonsaurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html. 29 Oktober 2010. Prihantini, Nining Betawati, Berta, dan Ratna. 2005. Pertumbuhan Chorella spp. dalam Medium Ekstrak Tauge (MET) dengan Variasi pH Awal. Makara Sains Vol. 9 No. 1. Prihantini, Nining Betawati, Dini, dan Ratna. 2007. Pengaruh Konsentrasi Medium Ekstrak Tauge (MET) terhadap Pertumbuhan Scenedesmus Isolat Subang. Makara Sains Vol. 11 No. 1. Stanier, Y. R. dkk. 2001. The Microbial World. New Jersey: Prenticel Hall. Inc. EigleWood. Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti. Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

12

ACARA III ISOLASI BAKTERI I. TUJUAN Mahasiswa dapat mempelajari cara-cara mengisolasi bakteri dari suatu campuran dengan teknik cawan gores (streak plate) dan cawan tuang (pour plate).

II. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Di dalam laboratorium, populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat, dan kemampuan biokimiawinya (Pradhika, 2008). Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan kompleks. Pada umumnya mikroorganisme dijumpai dalam populasi campuran, jarang sekali dijumpai sebagai spesies tunggal. Untuk meneliti mikroorganisme tersebut diperlukan teknik memisahkan populasi campuran yang rumit itu (biakan campuran) menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni (Pelczar, 1993). Mikrobiologi merupakan ilmu yang mempelajari bentuk, sifat, dan kehidupan jasad hidup mikroba (jasad renik, mikrobia, mikroorganisme). Untuk mempelajari mikroorganisme yang mempunyai ukuran kecil ini diperlukan adanya suatu pengamatan. Pengamatan itu dapat dilakukan dengan pemiaraan (kultur/biakan) mikroorganisme yang berfungsi memudahkan pengamatan (Mya, 2010). Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alatalat yang ada sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benarbenar steril; ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan (Mya, 2010). Dari beberapa penjelasan di atas praktikan menggaris bawahi bahwa kegiatan isolasi bakteri bertujuan untuk menghindarkan media yang berisi biakan atau mikroorganisme yang ditanam mengalami kontaminasi dengan mikroorganisme lain yang tidak diharapan untuk tumbuh. Kegiatan isolasi ini sangat penting dilakukan karena berhubungan dengan objek studi mikrobiologi, di mana dalam suatu pelaksaan kegiatannya selalu berhubungan dengan mikroorganisme tertentu yang kerap kali kita menemukannya dalam bentuk populasi campuran dari beberapa spesies mikroorganisme. B. Dasar Teori Di berbagai lingkungan populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran berbagai macam sel. Karena itu untuk mempelajarinya perlu memisahkan suatu spesies kemudian menumbuhkannya dalam biakan murni. Sehingga dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya. Ada beberapa cara isolasi, yang paling umum digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua teknik tersebut prinsipnya pengenceran campuran mikroorganisme sehingga individu spesies dapat terpisahkan dengan yang lainnya. 13

1. Metode Cawan Gores (streak plate) Metode ini menghemat bahan dan waktu, tetapi diperlukan ketrampilan yang tinggi. Kesalahan yang sering dilakukan dalam metode ini yakni kurang optimal dalam menggunakan permukaan medium dan cenderung memakai inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel. 2. Metode Cawan Tuang (pour plate) Metode ini boros bahan dan waktu, tetapi relatif lebih mudah daripada cawan gores. Prinsip kerja dari metode ini adalah mengencerkan mikroorganisme yang akan ditumbuhkan, dalam medium agar yang telah didinginkan kemudian dituang dalam cawan. 3. Metode Cawan Sebar (spread plate) Suspensi mikroorganisme yang telah diencerkan kemudian dituang di atas agar yang telah padat dalam cawan petri, kemudian disebarkan ke seluruh permukaan agar dengan batang gelas bentuk L (digalsky). Tujuannya mendapatkan koloni bakteri yang terpisah-pisah di seluruh permukaan medium agar (Purwoko. dkk, 2010). Untuk memperhatikan hasil isolasi mikroorganisme yang diinginkan dari habitatnya, hal-hal yang perlu diperhatikan: 1. Keadaan bahan penyakit. 2. Sebelum diisolasi dilakukan disinfetasi permukaan untuk mengurangi kontaminasi. Beberapa bahan yang digunakan adalah HgCl2, C4ClO, dan AgNO3. 3. Suhu yang digunakan selama inkubasi harus diperhatikan. 4. Medium yang digunakan (Nazer, 2010). Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih, dan bebas dingin. Pada waktu melaksanakan inokulasi, meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Pemindahan dengan kawat inokulasi dari platina atau dari nikrom, ujung boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. Setelah pengambilan inokulasi selesai, mulut tabung dipanasi kemudian disumbat kemudian digesekan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, tujuannya membuat suatu sediaan. Medium diletakan terbalik untuk menghindari tetesnya air yang melekat pada dinding dalam tutup cawan, sehingga bakteri yang diinokulasikan dapat menyebarluas ke seluruh permukaan medium. Bakteri yang aerob maupun anaerob dapat tumbuh dan banyaknya koloni mudah dihitung (Nazer, 2010). Pembiakan mikroba juga dapat dilakukan dengan pengenceran yaitu satu macam spesies diencerkan dalam satu tabung tersendiri kemudian diambil untuk diencerkan lagi, dari enceran kedua diambil untuk diencerkan lebih lanjut. Selanjutnya disebarkan pada medium padat, dan akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium (Dwijoseputro, 1994). Inkubasi spesies dilakukan bila isolasi telah selesai yang akan terbentuk massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Tiap koloni yang berlainan dapat mewakili satu jenis mikroorganisme. Dan tiap koloni merupakan biakan murni satu jenis spesies. Bila diperoleh inokulum berdekatan, maka koloni akan tercampur semuanya. Koloni itu bukan biakan murni (Pelczar, 1986). Biakan murni yaitu keturunan dari satu sel tunggal (klon). Isolasi biakan murni dilakukan di atas atau di dalam biakan padat dengan memisahkan satu sel 14

tertentu dari populasi sel dan merupakan koloni yang tumbuh dari sel ini tetap terpisah dari sel atau koloni lain. Jenis bakteri aerob diisolasi dengan perlakuan tuang cawan atau dengan mengoleskan ose kawat platina di atas medium agar jenis bakteri anaerob di suspensi dalam agar cair panas 45oC dan diinkubasi tanpa udara (Dwijoseputro, 1994). III. METODE A. Alat dan Bahan 1. Alat a. Tabung reaksi 2 buah b. Rak tabung reaksi 1 buah c. Gelas beker 2 buah d. Cawan petri 2 buah e. Jarum ose 1 buah f. Bunsen burner 1 buah g. Inkubator 1 set h. Mikropipet 1 buah i. Tip 2 buah j. Kertas 2 lembar k. Kertas label 4 lembar l. Spidol 1 buah 2. Bahan a. Agar petri NA (Nutrient Agar) b. Agar miring NA (Nutrient Agar) c. Yoghurt 2 ml d. Yakult 2 ml B. Cara Kerja 1. Agar petri NA a. Streak plate o Cawan petri yang berisi media NA dibagi menjadi 4 zona atau area. o Pada ose dilakukan sterilisasi lagi yaitu dengan cara dibakar di atas bunsen burner hingga warna merah membara. Dilanjutkan pendinginan sementara jarum ose. Pada saat menunggu proses sterilisasi jarum ose, tidak lupa cawan petri juga diputar-putar di dekat sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam cawan petri. o Jarum ose dicelupkan ke dalam yoghurt kemudian digoreskan dengan tipe gores kuadran pada agar petri NA di dalam cawan petri (jangan sampai melukai media). Pengoresan pada media semaksimal mungkin tidak terputus. o Cawan petri ditutup, diletakkan terbalik untuk dibungkus dengan kertas sampai kencang, dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam.

15

Goresan kuadran yang dilakukan:

b. Pour Plate o Cawan petri steril, media padat yang masih cair (NA) (>45oC), dan inokulum berupa yakult disiapkan. o 1 ml yakult diambil dengan menggunakan mikropipet kemudian diteteskan pada bagian tengah cawan petri. Langkah ini dilakukan dekat dengan sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam cawan petri. o 9 ml media NA ditambahkan ke dalam cawan petri hingga merata. o Supaya media NA dan yakult tercampur, maka cawan petri digoyang dengan arah angka 8. o Campuran media NA dan yakult dibiarkan memadat, setelah memadat cawan petri ditutup, diletakkan terbalik untuk dibungkus dengan kertas sampai kencang, dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. Metode pour plate yang dilakukan:

2. Agar miring NA dengan metode streak plate a. 2 tabung reaksi yang telah berisi media agar miring NA disiapkan. b. Pada ose dilakukan sterilisasi lagi yaitu dengan cara dibakar di atas bunsen burner hingga warna merah membara. Dilanjutkan pendinginan sementara jarum ose. c. Jarum ose dicelupkan ke dalam yoghurt kemudian digoreskan secara zig zag pada agar miring NA dalam tabung reaksi (jangan sampai melukai media). Pengoresan pada media dilakukan dari rapat menuju renggang. Langkah-langkah di atas dilakukan di dekat sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam tabung reaksi (mulut tabung reaksi diarahkan ke sumber panas)

16

d. Hal yang sama juga dilakukan pada yakult dalam tabung reaksi 2. e. Kedua tabung reaksi kembali ditutup dengan sumbat kapas agar tetap steril dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan. f. Kedua tabung reaksi diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil No. Metode Media 1. Streak plate Agar petri NA Agar miring NA Agar miring NA 2. Pour plate Agar petri NA

Inokulum Yoghurt Yoghurt Yakult Yakult

Tumbuh -

Tidak Tumbuh

B. Pembahasan Pada praktikum isolasi bakteri kali ini, praktikan menggunakan dua metode, dua jenis media, dan dua inokulum. Dua metode yang digunakan adalah metode streak plate dan pour plate. Streak plate merupakan metode yang bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Streak plate memiliki tiga tipe yaitu gores sinambung, gores T, dan gores kuadran. Dalam praktikum ini digunakan tipe gores kuadran, dimana area pada cawan petri dibagi menjadi 4 area atau zona. Area pertama merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel mikroorganisme.Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlahnya semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Pour plate merupakan metode yang memerlukan agar belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh di permukaan agar yang kaya oksigen dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Jenis media yang digunakan adalah agar petri NA (berada di dalam cawan petri) dan agar miring NA (di dalam tabung reaksi). Inokulum yang digunakan pada agar petri NA dan agar miring NA adalah yoghurt dan yakult. Dalam praktikum ini, praktikan melakukan empat jenis isolasi bakteri yaitu antara lain: 1. Metode streak plate agar petri NA dengan inokulum yoghurt. 2. Metode streak plate agar miring NA dengan inokulum yoghurt. 3. Metode streak plate agar miring NA dengan inokulum yakult. 4. Metode pour plate agar petri NA dengan inokulum yakult. Untuk Metode streak plate agar petri NA dengan inokulum yoghurt diawali dengan pembagian media petri NA ke dalam 4 area atau zona. Pembagian area ini bertujuan mempermudah melakukan teknik goresan kuadran sehingga dapat dihasilkan goresan yang dapat menumbuhkan bakteri yang diharapkan. Sebelum melakukan teknik gores kuadran, terlebih dahulu pada jarum ose dilakukan sterilisasi dengan cara disemprot dengan alkohol 70% kemudian dibakar di atas 17

bunsen burner hingga warna merah membara. Dilanjutkan dengan pendinginan sementara jarum ose, karena apabila langsung dicelupkan pada inokulum, dikhawatirkan bakteri di dalam inokulum akan mati karena suhu yang terlalu panas. Pada saat menunggu proses sterilisasi jarum ose, tidak lupa cawan petri juga diputar-putar di dekat sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam cawan petri sehingga bakteri yang tumbuh hanya merupakan bakteri yang diharapkan. Selanjutnya, jarum ose yang telah dingin dicelupkan ke dalam yoghurt kemudian digoreskan dengan tipe gores kuadran pada agar petri NA di dalam cawan petri. Perlu diperhatikan bahwa dalam penggoresan diusahakan hati-hati, jangan sampai melukai media karena berakibat tidak baik bagi pertumbuhan bakteri. Pengoresan media juga diusahakan semaksimal mungkin tidak terputus. Setelah semua area atau kuadran selesai digores dengan jarum ose berisi inokulum, cawan petri ditutup, diletakkan terbalik untuk dibungkus dengan kertas sampai kencang, dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. Untuk metode streak plate agar miring NA dengan inokulum yoghurt dan yakult diawali dengan 2 tabung reaksi yang telah berisi media agar miring NA disiapkan. Pada ose dilakukan sterilisasi lagi yaitu dengan cara ose disemprot dengan alkohol 70% kemudian dibakar di atas bunsen burner hingga warna merah membara. Dilanjutkan dengan pendinginan sementara jarum ose supaya bakteri di dalam inokulum yang akan diambil tidak mati karena suhu yang tinggi atau panas. Setelah dingin, jarum ose dicelupkan ke dalam yoghurt kemudian digoreskan secara zig zag pada media agar miring NA dalam tabung reaksi. Ingat, jangan sampai melukai media. Pengoresan pada media dilakukan dari rapat menuju renggang. Langkah-langkah di atas dilakukan di dekat sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam tabung reaksi (mulut tabung reaksi diarahkan ke sumber panas). Langkah yang sama juga dilakukan pada yakult dalam tabung reaksi 2. Setelah semua prosedur dilakukan, kedua tabung reaksi kembali ditutup dengan sumbat kapas agar tetap steril dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan. Selanjutnya kedua tabung reaksi diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. Untuk metode pour plate agar petri NA dengan inokulum yakult agak berbeda dengan prosedur kerja pada metode streak plate. Pada metode streak plate penambahan inokulum dilakukan dengan cara goresan secara zig-zag sedangkan pada metode pour plate penambahan media dilakukan dengan penuangan. Langkah yang dilakukan praktikan antara lain cawan petri steril, media padat yang masih cair (NA) (>45oC), dan inokulum berupa yakult disiapkan. 1 ml yakult diambil dengan menggunakan mikropipet kemudian diteteskan pada bagian tengah cawan petri. Langkah ini dilakukan dekat dengan sumber panas (bunsen burner) agar tidak ada mikroorganisme lain yang ikut masuk ke dalam cawan petri. 9 ml media NA ditambahkan ke dalam cawan petri hingga merata. Supaya media NA dan yakult tercampur, maka cawan petri digoyang dengan arah angka 8 secara teratur sehingga campuran antara media dan inokulum mampu menumbuhkan bakteri di permukaan maupun terbenam di dalam media. Campuran media NA dan yakult dibiarkan memadat supaya pada saat diinkubasi, 18

media tidak hancur karena memang peletakkan cawan petri di dalam inkubator dalam posisi terbalik, setelah memadat cawan petri dibungkus dengan kertas dengan kencang, dan di bagian luar diberi label metode, media, dan inokulum yang digunakan kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 300C selama 48 jam. Setelah proses inkubasi selesai, maka dilakukan pengamatan terhadap isolasi bakteri pada media yang telah disediakan. Keberhasilan dalam pengamatan mikroba ini sangat bergantung pada cara praktikan mensterilkan alat dan komposisi media yang dibuat. Sebab komposisi media juga menentukan tingkat keberhasilan mikroba tersebut tumbuh dalam media. Sehingga kedua hal ini harus benar-benar diperhatikan ketika akan membiakkan mikroba di dalam laboratorium, sebab jika terkontaminasi sedikit saja, maka kemungkinan gagal akan sangat besar. Dari keempat jenis isolasi bakteri, hanya isolasi metode streak plate agar petri NA dengan inokulum yoghurt saja yang ditumbuhi bakteri dan jenis isolasi yang lain tidak. Keberhasilan dalam menumbuhkan bakteri ini disebabkan media yang digunakan mengandung nutrisi dalam jumlah yang proporsional bagi pertumbuhan bakteri, media yang digunakan memiliki kelembaban dan pH yang optimum untuk pertumbuhan bakteri, media yang digunakan mengandung oksigen dalam jumlah yang sesuai, media bersifat steril dan bebas dari mikroorganisme lain (tidak terkontaminasi). Bakteri yang tumbuh berwarna putih dengan bentuk bulat membentuk koloni kecil. Sebaliknya, pada media yang tidak ditumbuhi bakteri kemungkinan disebabkan oleh kurang sterilnya prosedur kerja yang dilakukan oleh praktikan sehingga memungkinkan adanya kontaminasi pada media. Selain itu, media yang tidak ditumbuhi bakteri juga dapat disebabkan karena tumbuhnya mikroba perusak. Pertumbuhan mikroba perusak dapat dicegah dengan pemberian bahan preservasi kimiawi seperti nitrit, boraks, rhadomin ataupun formalin (Suardana, dkk. 2007). Yakult merupakan salah satu inokulum yang berbentuk susu. Susu merupakan media yang sangat baik bagi pertumbuhan bakteri dan dapat menjadi sarana bagi penyebaran bakteri yang membahayakan kesehatan manusia. Karena itu, susu akan mudah tercemar mikroorganisme bila penanganannya tidak memperhatikan aspek kebersihannya (Gustiani, 2009). Menurut literatur yang ada, di dalam produk yakult terdapat bakteri Lactobacillus. Bakteri Lactobacillus juga mampu menghambat pertumbuhan bakteri lain yang merugikan atau pathogen. Bakteri yang terdapat pada produk yakult dan yoghurt dapat dikelompokkan ke dalam bakteri prebiotik. Lactobacillus mempunyai potensi yang besar sebagai produk probiotik karena keunggulannya dibanding bakteri asam laktat lainnya (Hardiningsih, dkk. 2006). Bakteri probiotik menjaga kesehatan usus, membantu penyerapan makanan, produksi vitamin, dan mencegah pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu dapat meningkatkan fungsi sistem kekebalan tubuh, metabolisme kolesterol, karsinogenesis, dan menghambat penuaan. Pemberian suplemen yoghurt selama satu minggu, dapat menurunkan serum kolesterol pada manusia. Yoghurt dan susu menurunkan kolesterol setelah menginduksi hypercholesterolemia kelinci. Yoghurt lebih besar memberi pengaruh daripada susu (Hardiningsih, dkk. 2006).

19

V. KESIMPULAN 1. Metode isolasi bakteri ada tiga yaitu streak plate, pour plate, dan spread plate. Dalam praktikum ini hanya digunakan metode streak plate dan pour plate saja. 2. Metode streak plate adalah metode yang bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Streak plate memiliki tiga tipe yaitu gores sinambung, gores T, dan gores kuadran. Dalam praktikum ini digunakan tipe gores kuadran. 3. Metode pour plate adalah metode yang memerlukan agar belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. 4. Dari hasil pengamatan, jenis isolasi yang ditumbuhi bakteri hanya media dengan metode streak plate agar petri NA dengan inokulum yoghurt. Bakteri yang tumbuh berwarna putih dengan bentuk bulat membentuk koloni kecil. DAFTAR PUSTAKA Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan. Gustiani, Erni. 2009. Pengendalian Cemaran Mikroba pada Bahan Pangan Asal Ternak (Daging dan Susu) Mulai Peternakan sampai Dihidangkan. Jurnal Litbang Pertanian Vol. 28 No. 3. Hardiningsih, Riani, Rostiati, dan Titin. 2006. Isolasi dan Uji Resistansi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. Biodiversitas Vol. 7 No. 1. Mya, 2010. Laporan Mikrobiologi. http://myaluzzs.wordpress.com/laporan mikrobiolgi. 29 Oktober 2010. Nazer. 2010. Cara Pembuatan Media. http://n4zer.wordpress.com/mirobiologipembuatan-media-jenis-jenis-mikroba/ Mikrobiologi. 29 Oktober 2010. Pelczar, Michael dan Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. Pradhika, E. Indra. 2008. Media Pertumbuhan. http://ekmonsaurus.blogspot.com/2008/11/bab-2-media-pertumbuhan.html. 29 Oktober 2010. Purwoko, Tjahjadi. dkk. 2010. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Laboratorium Mikrobiologi UNS. Suardana, I Wayan, I Nyoman, I Nengah, dan Komang. 2007. Isolasi dan Identifikasi Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi sebagai Kandidat Biopreservatif. Jurnal Veteriner Vol. 8 No. 4.

20

LAMPIRAN 1. Jurnal Pembuatan Media dan Sterilisasi: a. Pengaruh Bioksida Pengoksidasi terhadap Pertumbuhan Mikroorganisme pada Air Pendingin Sekunder RSG- Gas. b. Pengaruh Konsentrasi Medium Ekstrak Tauge (MET) terhadap Pertumbuhan Scenedesmus Isolat Subang. c. Pertumbuhan Chorella spp. Dalam Medium Ekstrak Tauge (MET) dengan Variasi pH Awal. 2. Jurnal Isolasi Bakteri: a. Pengendalian Cemaran Mikroba pada Bahan Pangan Asal Ternak (Daging dan Susu) Mulai Peternakan sampai Dihidangkan. b. Isolasi dan Uji Resistansi Beberapa Isolat Lactobacillus pada pH Rendah. c. Isolasi dan Identifikasi Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi sebagai Kandidat Biopreservatif. 3. Laporan sementara Pembuatan Media dan Sterilisasi. 4. Laporan sementara Isolasi Bakteri. 5. Lampiran dokumentasi parktikum.

21

LAMPIRAN DOKUMENTASI PRAKTIKUM

Inkubasi media agar petri dan agar miring ke dalam inkubator

Hasil pengamatan semua media

Metode

streak plate agar miring dengan inokulum yakult

Metode streak plate agar miring dengan inokulum yoghurt

Metode streak plate agar petri dengan inokulum yoghurt

22

Metode pour plate agar petri dengan inokulum yakult

Sampel media yang banyak ditumbuhi bakteri

23