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Biotecnologa de los Alimentos

BIOTECNOLOGIA APLICADA EN LA ELABORACION DE CHIMBANGO


I. INTRODUCCIN Una bebida fermentada llamada "chimbango" se hizo en el Per, especialmente en la regin de Arequipa, a base de higos secos. Despus de 1830 se empez a destilar alcohola partir de ese mosto. Los siconos que se echaban a perder, servan para cebar cerdos. El hecho de que su produccin sea artesanal nos llev a buscar una receta que se asemeje, mas no se pudo obtener la que se usan en Arequipa, pues estas recetas pasan de generacin en generacin. Los frutos de la higuera son una infrutescencia y que por orden de maduracin, primero aparecen las brevas que son frutos grandes, cuyo desarrollo fisiolgico ocurre posterior a los higos, pero que queda suspendido al llegar el otoo austral y recin fructifican al final de la primavera. Luego, en el verano, salen los higos que son frutos ms pequeos pero igual de carnosos y jugosos como las brevas. Es as, al estado fresco como los higos tienen ms valor comercial. El mercado mundial alcanz en el 2003 los US$ 178 millones con una produccin aproximada de 1.1 millones de toneladas. La tendencia mundial es a incentivar los cultivos de higuera para consumo en fresco en desmedro de los cultivos para la deshidratacin. Los principales mercados compradores de los higos frescos son Francia, Alemania, Italia, EEUU y Reino Unido. El Per ya empez a exportar el 2 % de su produccin nacional que en el 2003 fue de 2 786 TM. Algunos pases europeos como Francia, Holanda, Canad, EEUU fueron nuestro incipiente mercado. En el 2004 Pero export por US$ 398 766. Diez regiones del Per producen higos pero en el 2003 las principales regiones productoras fueron Ica, 929 TM, un 33 %; Arequipa, 526 TM, 19 %; Tacna, 365 TM, 13 %; Lima, 313 TM, l1 %; Ayacucho, 211 TM, 8 %; y Moquegua, 208 TM, 7 %.
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La higuera es una planta tolerante que soporta horas de frio y heladas leves, zonas ridas, veranos secos y clidos; suelos pobres y hasta salinos y requiere de poco fertilizante y agua. El Per posee ventajas naturales para el cultivo de la higuera como las descritas anteriormente pero adems, se produce y cosecha a contra estacin de los pases desarrollados que incrementan su demanda en los meses de su invierno boreal. Los higos poseen azcares como sacarosa, fructuosa y glucosa cuyo contenido vara desde un 20% en los higos frescos hasta un 62% en los secos. Poseen vitaminas A, C y D e incorporan a su composicin una importante diversidad de minerales como hierro, magnesio, potasio, sodio, calcio y silicio.

SACCHAROMYCES CEREVISIAE
En esta prctica se realiz un estudio sobre la cintica de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, en el cual se mantuvieron constantes las condiciones de operacin (temperatura ambiente sin agitacin) para evaluar el cambio de los en el crecimiento de las unidades formadoras de colonias (UFC), as como en los parmetros de pH, degradacin de glucosa y contenido de alcohol con respecto al tiempo. Se realiz una grfica del crecimiento de las UFC con respecto el tiempo, la cual mostr las 4 etapas de crecimiento del microorganismo. El pH del medio obtuvo un valor inicial de 6.11 el cual fue disminuyendo con respecto al tiempo hasta alcanzar el valor mnimo de XXX. No fue posible determinar la cantidad de etanol debido a que no se obtuvieron lecturas claras del refractmetro. Al determinar la cantidad de glucosa del medio durante los diferentes tiempos de crecimiento se obtuvieron valores fuera del rango de la curva de referencia de glucosa.

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Antecedentes

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado por su importancia en la industria panadera y vitivincola, adems de su capacidad de producir etanol a partir de carbohidratos. Al ser incubado, este microorganismo muestra 5 fases de crecimiento bien definidas cuando es cultivado en medios lquidos con glucosa como fuente de carbono: La fase lag.- Es un periodo de adaptacin en el cual la clula se prepara para dividirse. La fase logartmica.- Las clulas alcanzan su mxima velocidad de duplicacin y llevan a cabo un metabolismo fermentativo del que se produce etanol. El cambio diuxico.- Al disminuir la concentracin de glucosa, las clulas atraviesan por el cambio diuxico, un periodo breve de tiempo en el cual no hay divisin, y la clula cambia de un metabolismo fermentativo a uno respiratorio. La fase postdiuxica.- En la fase postdiuxica las clulas usan como fuente de carbono el etanol producido durante la fase logartmica e incrementan su resistencia al estrs gradualmente. La fase estacionaria.- Por ltimo, la fase estacionaria se presenta cuando los nutrientes del medio se han agotado y no hay divisin celular. En esta fase, las clulas acumulan carbohidratos de reserva como trehalosa y glucgeno, alcanzan el mximo nivel de resistencia a estrs y su pared celular se vuelve ms gruesa y resistente a la digestin por liticasa (FolchMallol et al., 2004).

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Materiales y mtodos Material Matraces Erlenmeyer Micro pipetas de 1ml y 10 l Puntas de micro pipeta Tubos de cultivo Tubos Falcn Tubos eppendorf Placa de Neubauer

Reactivos Caldo YPG Reactivo NDS

Cultivo Saccharomyces cerevisiae

Equipo Campana de extraccin Potencimetro Microscopio Espectrofotmetro Refractmetro

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Mtodos Preparacin del medio de cultivo Se prepar un medio de cultivo con glucosa 5 g/L , 5% de extracto de malta y 1% de agar YPG diluidos en 200ml de agua destilada. Activacin de la cepa Saccharomyces cerevisiae Se tomaron 2 azadas de la cepa Saccharomyces cerevisiae con una aza de nicromo previamente esterilizada y se vertieron en 25 ml del medio de cultivo contenidos en un tubo falcn, se mantuvo en agitacin constante durante 24 horas a temperatura ambiente. Inoculacin en los medios de cultivo Se tomaron 2 ml del tubo falcn con la Saccharomyces cerevisiae activa y se vertieron en 250 ml del medio de cultivo contenidos en un matraz Erlenmeyer. Se prepararon 3 matraces los cuales se mantuvieron a temperatura ambiente sin agitacin. Medicin de las UFC Se realizaron las mediciones de las UFC y pH en lapsos de tiempo predeterminados. La medicin de las UFC se realiz empleando una cmara de Neubauer y un microscopio. Cuando la numeracin fue muy grande para contar se realizaron diluciones en caldos peptonados para las lecturas de las UFC. Los lapsos de tiempo y las diluciones realizadas para efectuar la medicin de las UFC se describen en la tabla 2. Se tomaron 100l de la muestra y se colocaron en la cmara de Neubauer para proceder a contar las clulas viables, el nmero de clulas contabilizadas se multiplicaron por el factor de 50,000 para conocer el nmero real de UFC/ml.

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pH Se tomaron 25 ml del medio de cultivo inoculado y se vertieron en un tubo falcn, despus se realiz la medicin del pH utilizando un potencimetro. Alcohol-Glucosa El restante de los 25 ml que se tomaron en el tubo falcn se centrifugaron a 3000 rpm para separar la biomasa del caldo, despus se tomaron muestras de 2 ml por triplicado en tubos eppendorf y se congelaron. Al terminar todas las corridas se descongelaron los tubos eppendorf para proceder con la medicin de Alcohol y Glucosa. Alcohol Para medir el contenido de alcohol se utiliz un refractmetro, sin embargo no se lograron obtener lecturas claras al correr las soluciones de alcohol a concentraciones conocidas, por lo que se opto no evaluar el contenido de alcohol por este mtodo. Glucosa Para medir el contenido de glucosa se utiliz el mtodo espectrofotomtrico DNS. Para realizar la curva de calibracin a partir de una solucin stock de glucosa 40 mM y por dilucin con agua destilada, prepar una gama de soluciones de

distinta concentracin, como se indica en la Tabla 1.

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Reactivo de DNS. Acido 3,5-dinitrosaliclico Se disolvi 1 g de cido 3,5-dinitrosaliclico y 300 g de tartrato sdico potsico en 200 ml de hidrxido sdico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml de agua destilada) y se diluyo hasta 1000 ml con agua destilada. El reactivo se guard en un recipiente oscuro para mantener la estabilidad. Una vez preparado el reactivo y establecida la curva de calibracin de la glucosa se procedi a medir el contenido de glucosa de las muestras. En un tubo de ensaye se agregaron 1 ml de reactivo DNS, 1ml de muestra y 0.8 ml de agua. Los tubos se sometieron a un bao mara a 100C durante 10 minutos seguido por un bao de hielo durante 5 minutos. Despus se procedi a medir la muestra en el espectrofotmetro.

En la determinacin de glucosa, tambin se llev a cabo una prueba para evaluar el efecto de la dilucin de la muestra antes y despus de que esta sea sometida a los tratamientos trmicos.

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Resultados Crecimiento Microbiolgico

Al medir el crecimiento de la se observaron claramente las etapas de crecimiento (Tabla 1). Estas se volvieron an ms fcil de distinguir una vez se graficaron los datos de crecimiento con respecto al tiempo (figura 1).

Tabla

1.

Observaciones

de

crecimiento

microbiolgico en el medio a diferentes tiempos y su efecto en el pH. Tiempo 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Observaciones (UFC/ml) 55x104 185 x10
4

pH 6.11 6.08 6.08 6.07 6.06 6 5.79 5.74 5.63 5.21 5.23 5.3 5.19

162 x104 231 x104 814 x104 680 x104 175 x10
5

342 x105 530 x105 146 x106 147 x106 189 x106 460 x10
5

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200000000 180000000 160000000 140000000 120000000 100000000 80000000 60000000 40000000 20000000 0 0 1 2 3 4 5 6 Tiempo 7 8 9 10 11 12

Figura 1. Crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae. pH Al graficar los datos obtenidos de pH se observ un claro descenso del pH con respecto al tiempo (Figura 2), lo cual indica que adems de la fermentacin de la glucosa para la formacin de alcohol tambin se llevaron a cabo reacciones alternas productoras de cidos orgnicos. Esto concuerda con lo encontrado por Pramanik (2003) quien encontr que a un pH mayor a 5 la Saccharomyces cerevisiae produce subproductos como glicerol y cidos orgnicos.

(UFC/ml)

7 6 5 4 pH 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5 Tiempo 6 7 8 9 10 11 12

Figura 2. Cambios de pH con respecto al tiempo.

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Medicin de glucosa
2 1.5 y = 0.2233x - 0.3084 1 0.5 0 1 -0.5 2 3 4 5 6 7 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 -0.5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2. Comparacin de la curva de calibracin de la glucosa (izquierda) y la curva del consumo de glucosa por la Saccharomyces cerevisiae (derecha). Tanto en la medicin de glucosa como en la de alcohol no se lograron obtener datos claros que den indicacin del metabolismo de la levadura. En el caso del alcohol esto se debi a que no se lograron obtener lecturas claras en el refractmetro sobre soluciones de concentraciones conocidas de etanol. En cuanto a la medicin de glucosa el error de medicin se debi a la alta concentracin de glucosa en el medio, por lo que se recomienda llevar acabo an ms diluciones de la muestra problema para que esta pueda ser corrida de manera adecuada en el espectrofotmetro. Al comparar los dos mtodos de dilucin de muestras para la determinacin de glucosa por el mtodo DNS utilizando una prueba de t se encontr con un nivel de confianza del 95% que no existe diferencia entre los valores obtenidos por los dos mtodos. Adems estos valores obtenidos fueron graficados para comparar la forma de las dos curvas (Figura 3).

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3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 -0.5 -1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dilucin post tratamiento Dilucin pre tratamiento

Figura 3. Comparacin de las curvas de consumo de glucosa por la Saccharomyces cerevisiae. Conclusiones Se encontr que la Saccharomyces cerevisiae presento todas sus etapas de crecimiento al ser incubada en un caldo YPG. Aunque no se logr medir el contenido de alcohol, las muestras presentaron el aroma caracterstico de la fermentacin alcohlica, lo que indica que la levadura si llevo a cabo esta va metablica. Recomendaciones Se recomienda realizar un mayor nmero de diluciones de la muestra problema cuando se va a determinar el contenido de glucosa, ya que los valores obtenidos en esta prctica se encontraban muy por encima o muy por debajo de lo establecido en la curva de calibracin.

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ELABORACION DE CHIMBANGO
II. MATERIALES Y MTODOS 2.1. Materia Prima

El higo (Ficus Carica L.) seco utilizado en la investigacin corresponde a la cosecha 2013 y fue comprado en una cantidad de 5 kg del mercado San Camilo, que indica que la procedencia es de Magollo al lado de la Panamericana Sur. El precio de compra fue de S/. 12.00 nuevos soles/Kg y mostraba condiciones sanitaras calificada de regular. 2.2. Lugar de Ejecucin

Desde el perfil del proyecto, la ejecucin de las diferentes etapas de los procesos de fermentacin y toma de datos, hasta la conservacin y evaluacin final de los productos terminados, fueron realizados en las instalaciones de la Escuela Profesional de Ingeniera en Industrias Alimentaras de la Universidad Nacional de San Agustn de Arequipa.

2.3.

Materiales y Reactivos

o Alcoholmetro graduado de 0 a 100 %vol y escala cartier, calibrado a 20C o Balanza tipo reloj de hasta 10 kg de capacidad. o Balanza de precisin de hasta 160 g de pesada. o Baldes plsticos con tapa para fermentacin cap. 15 L.; o Bureta automtica de 25 ml para titulacin. o Calentador de bao mara de hasta 100C. o Cocinilla elctrica; o Copas de vidrio para cata; o Densmetro graduado de 0 a 30Be.

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o Depsitos de plstico y vidrio o Embudos de plstico y vidrio o Erlemeyers de vidrio de 25, 50,100 y 250 mL, o formatos para evaluacin organolptica, matraces de o vidrio de 100, 250 y 500 mL, o Papel de filtro, o Pipetas graduadas de 1.0, 5.0, 10.0 y 25mL. o pH metro anlogo de 0 a 14 o Probetas graduadas de 50, 100, 250 y 500 Ml. o Refractmetro porttil de 0 a 35 Brix. o Tablas para correccin por temperatura de grado alcohlico o Termmetros de vidrio de 10 a 110C o Vasos de precipitado de 10, 50, 100, 250 y 500 ml o cido ctrico grado alimentario, cido tartrico grado alimentario o Hidrxido de sodio 0.1 N.

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2.4.

Mtodos

Recepcin de materia prima Seleccin y clasificacin Evaluacin Fisicoqumica

Pie de cuba Trozado de higos Remojo en agua

Remojo de higos V 1:2

V 1:3 Adicin de levadura

V 1:4

Adicin de levadura ( rehidratada )

Primera maceracin

Segunda maceracin

Tercera maceracin

Descube

Envasado

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III.

RESULTADOS

3.1.

Materia Prima

Se tom una muestra equivalente al 1% de la materia prima de higos secos, que no tuvieran ningn tipo de dao y fueron sometidos a evaluacin fsico - qumica. 3.2. Pie de cuba

Tomando como base 1 kg de higos secos, previamente recortados sus pednculos y trozados en 4 partes, estos fueron puestos a remojar en 2 L de agua fresca sanitizada con metabisulfito de potasio (20g/100L) y luego de 6 horas recin se inocul levadura seleccionada y re hidratada, variedad saccharomyces cerevisiae en una cantidad de 0.652 g/kg de fruta. El proceso de maceracin - fermentacin tumultuosa incompleta demor 4 das en condiciones ambientales. Se obtuvieron 1.498 L de mosto fermentado y 0.550 Kg de fruta agotada. El mosto posea 22.7 Brix de SS y de pH 4.6. 3.3 Remojo de higos secos y siembra de levaduras Paralelamente al ltimo da de desarrollo del pie decuba, se dio inicio al proceso de pesado y remojo porseparado, de tres muestras de higos secos, sinpednculos y trozados, de 1 kg cada una en diluciones de 2, 3 y 4 L de agua fresca sanitizada, codificadas como V1:2; V 1:3 y V 1:4. Transcurridas 6 horas de remojo, conuna ganancia de peso promedio por el agua de 66.21%, fueron sembradas ciertas dosis del pie de cuba equivalentes a 25, 50 y 75 ml en cada dilucin, comomedio arrancador de la fermentacin. 3.4Maceracin y fermentacin 3.4.1 Primera maceracin fermentacin La fermentacin tumultuosa comenz a hacerse notoria despus de 15 horas. Pareciera que la cepa de levaduras seleccionadas que se adicion con el pie de
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cuba no tuvo el necesario desarrollo y efecto que se buscaba. La densidad en los mostos haba descendido a valores de l.088, 1.057 y 1.051 g/L respectivamente; mientras que el pH se incrementaba a valores superiores a 4.4 por lo que se agreg cido tartrico para bajar el mismo y evitar que las levaduras detengan su actividad o se inicie contaminacin con otros microorganismos indeseables. Tras tres das de fermentacin, fueron retiradas las frutas agotadas y el mosto presentaba valores en densidad de 1.026, 1.018 y 1.014 g/L respectivamente. Valores de pH, nuevamente un poco altos de 4.7; 4.6 y 4.5. La acidez tartrica total fue de 6.22, 6.07 y 5.92 g/L y los volmenes obtenidos fueron de 2.60, 2.60 y 3.5 L para las diluciones V 1:2, V1:3 y V1:4 respectivamente. 3.4.2 Segunda maceracin - fermentacin Los tres mostos obtenidos fueron recargados con 1 kg de nueva fruta seca previamente lavada y cortada en trozos. Por esta razn el proceso de humidificacin y maceracin de las frutas se hizo lenta y tras las siguientes 24 horas las densidades volvieron a subir a valores de 1.105, 1.061 y 1.050 g/L; el pH tambin se elev con cifras de 4.9, 4,8 y 4,7 respectivamente, lo que oblig a la adicin de acido tartrico una vez por da para bajar la acidez por un lado y a mantener abrigadas las muestras debido a las bajas temperaturas ambientales. Al final de los siguientes cinco das de maceracin - fermentacin, los valores de densidad haban descendido a 1.035, 1.046 y 1.030 g/L; el pH mostraba valores de 4.3, 4.2 y 4.3. Se notaban mostos ms aromticos y densos. Los volmenes obtenidos fueron de 1.9, l.85 y 3.25 L respectivamente. La frutaagotada pes 3.7 kg. 3.4.3 Tercera maceracin fermentacin Sobre cada de uno de los mostos obtenidos fueron cargados nuevamente 1Kg de hugos secos previamente lavados y cortados en trozos, sin pednculos. Tras 36 horas de maceracin, y con excepcin de la temperatura de los mostos que ms bien bajaba, todos los valores volvieron a subir. La densidad se registro en 1.115,

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1.130 y 1.077 g/L; los valores de pH estuvieron en 4.5, 4.4 y 4.4. La acidez total tartrica volvi a subir a niveles de 14.25, 18.0 y 15.0 g/L respectivamente. Evidentemente, las levaduras no estn trabajando debido a una saturacin de los azcares disueltos, un pH inadecuado para su desarrollo y por el descenso en las temperaturas de los mostos que estaban alrededor de los 20C. Estas condiciones motivaron que se calentaran los mostos a 33C para mejorar la dilucin de los azcares y reactivar a las levaduras asi como la adicin de crecientes cantidades de cido tartrico para bajar el pH y subir la acidez a niveles convenientes para las levaduras. Recin a las 60 horas se not que haba reiniciado la fermentacin tumultuosa con formacin de sombrero an cuando todos los valores de los parmetros de control se mantuvieron altos, salvo la temperatura. Al final de diez das de maceracin - fermentacin y observando que los parmetros de control no variaban, es decir la fermentacin prosegua muy lentamente y se evidenciaban ligeros cambios en el olor de los mostos, se decidi dar por concluida esta tercera etapa con los siguientes valores final. 3.5 Descube Al trmino de la tercera fermentacin se realiz el la separacin fsica de los vinos obtenidos de los componentes slidos compuestos por trozos de higo, pepitas, tierra, que constituyen las borras o burbas. 3.6 Conservacin A cada chimbango se le aplic 10 g/hl de metabisulfito de potasio como

conservante, y fueron envasados en botellas de vidrio con tapones de corcho, ambos previamente sanitizados. En esta etapa ocurre la fermentacin

complementaria de los vinos; se degradaron los azcares fermentables residuales, se homogenizaron las cualidades organolpticas y el grado alcohlico de los mismos. Las operaciones de trasiego se realizaron a los 8 das de iniciada la conservacin para ir separando al chimbango de sus borras finas y evitar la re fermentacin,

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mejorar su conservacin y ayudar a su clarificacin. Los volmenes de chimbango obtenidos fueron de 0.97, 1.18 y 2.17 L y los rendimientos de 32.3, 29.5 y 43.0 % respectivamente para las diluciones Vl:2, V 1:3 y Vl:4. IV. DISCUSIN 4.1.Materia prima Los frutos se encontraban deshidratados, sucios, mostrando una textura correosa, y una capa blanquecina superficial por efecto de los azcares que migraron del interior. Del anlisis qumico proximal realizado, se encuentran diferencias significativas en los contenidos de agua y carbohidratos respecto de la bibliografa consultada debido probablemente a las diferencias en las condiciones del secado y almacenaje. 4.2 Remojo de los higos secos Tras seis horas de remojo en condiciones ambientales, las tres muestras de higos secos mostraron ganancias de peso promedio de 66.21 %. 4.3 Procesos de maceracin y fermentacin En los tres procesos de maceracin-fermentacin realizados consecutivamente por tres, cinco y diez das no se pudo llegar a degradar todos los azcares presentes en los higos, especialmente en la tercera etapa en que los valores finales de densidad y slidos solubles fueron significativamente altos (Vl:2 =36; Vl:3=32.5; Vl:4=19Bx), a consecuencia de la paralizacin de la actividad fermentativa de las levaduras nativas y de las seleccionadas inoculadas, que

evidentemente no fueron las ms indicadas; por la baja temperatura ambiental del invierno y el exceso de azcares acumulados de las tres recargas de higos secos. No se encontr informacin bibliogrfica sobre procesos similares con la cual comparar resultados.

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5. CONCLUSIONES Los principales valores fisico-qumicos de la materia prima higo seco fueron: humedad, 28.30 %; carbohidratos (azcares), 64.10 %; slidos solubles, 55.0 %; azcares reductores 30.0 %. El uso, segn dosis recomendada, de una cepa de levaduras seleccionadas y deshidratadas, como la sacharomyces no influy como se esperaba, en la fermentacin. El tiempo ptimo de remojo de los higos secos, antes de la maceracin fermentacin, fue de 6 horas con una ganancia promedio de peso del 66.21 %. Se experiment con tres relaciones higo seco: agua que fueron codificados como V 1:2; V 1:3 y V 1:4 Las tres etapas sucesivas y simultneas de maceracin - fermentacin que demoraron 3, 5 y 10 das respectivamente, dieron vinos con contenidos altos de slidos solubles no degradados tales como 36.00/0, 32.5%, 19 % respectivamente. Acideces totales tambin altas, en niveles de 8.62; 8.77 y 7.87 g/L expresados como cido tartrico. Luego del tiempo de conservacin y los trasiegos, de hasta 129 das, los vinos mostraron un grado alcohlico de 8.5; 7.0 y 12.0 % vol respectivamente. Asimismo, persistieron valores altos en slidos solubles residuales 27.8; 32.0 y 16.0 Bx, igual en acidez total, con valores de 41.25; 37.5 y 33.75 mg/L

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Bibliografa

1) Folch-Mallol, J.L. Garay-Arroyo, A. Lledas, F. Covarrubias-Robles, A.A. 2004. La respuesta a estrs en la levadura Saccharomyces cerevisiae Revista latinoamericana de microbiologa. Vol. 46, No. 1-2. January March. 2004. April - June. 2004. pp. 24 46. 2) Pramanik, K. 2003. Parametric Studies on Batch Alcohol Fermentation Using Saccharomyces Yeast Extracted from Toddy. J. Chin. Inst. Chem. Engrs., Vol. 34, No. 4, 487-492, 2003. 3) Colquichagua. Diana; Franco, Ernesto. (1998). Vino de Frutas. Serie de Procesamiento de Alimentos N 6.Intermediate Technology Development Group - ITDG.Lima - Per. Pginas 2-32. 4) De Rivero y Ustereiz, Mariano Eduardo. (1857). Memorias

Ctemiftcas,Agrcolas e Industriales. Tomo II, Bruselas - Blgica. Pgina 229.

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