GENETYKA MOLEKULARNA

Ewa Bartnik Mieczysaw Chory Magdalena Fikus Wacaw Gajewski Witold Jachymczyk Andrzej Jerzmanowski Halina Krzanowska Barbara Lipiska Wodzimierz Ostoja-Zagrski Krzysztof Staro Piotr Stpie Stanisaw Szala Alina Taylor Karol Taylor Piotr Wgleski

Uniwersytet Warszawski Instytut Onkologii Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Uniwersytet Warszawski Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Uniwersytet Warszawski Uniwersytet Jagielloski Uniwersytet Gdaski Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Uniwersytet Warszawski Uniwersytet Warszawski Instytut Onkologii Uniwersytet Gdaski Uniwersytet Gdaski Uniwersytet Warszawski

Okadk i strony tytuowe projektowaa Maryna Winiewska Redaktor Anna Graffstein Redaktor techniczny Jolanta Cibor

5218
577.9A

Tytu dotowany przez Ministra Edukacji Narodowej

Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN Sp. z o.o. Warszawa 1995

ISBN 83-01-11830-X

MOLEKULARNA
Praca zbiorowa pod redakcj

GENETYKA

Piotra Wgleskiego

Wydawnictwo Naukowe PWN Warszawa 1995

PRZEDMOWA

Ksika ta jest pisana z myl o studentach biologii, medycyny i rolnictwa, a take wszystkich tych osobach, ktre ukoczyy studia kilka lub kilkanacie lat temu i chciayby uzupeni swoj wiedz. Genetyka i caa biologia molekularna zmieniy si w ostatnim dziesicioleciu tak bardzo, e wszystkie dostpne polskojzyczne podrczniki stay si nieaktualne. Ostatni podrcznik W. Gajewskiego pt. Genetyka oglna i molekularna pochodzi z roku 1983. Zbiorowe opracowanie Biologia molekularna, wydane przez PWN w roku 1987 ma wiele wad wynikajcych z faktu, e jest to przerbka ksiki pisanej w kocu lat 70., ponadto nie zawiera ono kilku dziaw o ogromnym dla wspczesnej biologii znaczeniu. W tej sytuacji podjcie prac nad napisaniem aktualnego i w miar kompletnego podrcznika genetyki molekularnej wydao si nam nie tylko uzasadnione, ale i konieczne. W ksice tej pominito niemal wszystkie zagadnienia genetyki klasycznej. Jedynie w rozdziale 1 czytelnik znajdzie nawizanie do dowiadcze Mendla i podstawowych zasad analizy genetycznej. Materia ten zamieszczono po to, aby uwiadomi czytelnikowi zwizki pomidzy genetyk klasyczn i molekularn i aby wprowadzi pewne podstawowe terminy dotyczce struktury i funkcjonowania genw. Warto sobie rwnie zdawa spraw z tego, e ksika ta ze wzgldu na swoj niewielk objto, zawiera skrtowe ujcia wikszoci omawianych zagadnie. Kademu z zagadnie, ktrym powicono poszczeglne rozdziay mona by z powodzeniem powici ca ksik i nie byaby ona przesadnie szczegowa. Niektre podrczniki o charakterze oglnym, takie jak na przykad synny Molecular biology of the gene pod redakcj Watsona, s o wiele bardziej rozbudowane i sdz, e powinny znale si na polskim rynku niezalenie od tej ksiki. Jeden z rozdziaw ksiki dotyczy manipulacji wykonywanych na DNA. Jest to ta sfera genetyki molekularnej, w ktrej w ostatnich latach dokona si

najwikszy postp i ktra ma ogromne znaczenie zarwno dla wszystkich innych dziedzin biologii, jak i dla medycyny, biotechnologii i innych dziaw zastosowa praktycznych. Kilka omwionych w tym rozdziale metod i oglny opis zasad techniki rekombinowania i klonowania DNA powinny da czytelnikowi wyobraenie o moliwociach technicznych, ktre otwary si przed wspczesnymi genetykami, ale naley zdawa sobie spraw z tego, e istniej kilkusetstronicowe ksiki zajmujce si na przykad wycznie technik PCR i jej rozmaitymi zastosowaniami. Umiejtno manipulowania genami to jedna z najwaniejszych zdobyczy nauki wieku XX. Z perspektywy kilkuset lat bdzie prawdopodobnie wymieniana jako rwnocenna z umiejtnoci rozbijania atomw. Ju obecnie widzimy jak wielkie konsekwencje ma ona dla rozwoju nauk biologicznych. Nie ma praktycznie adnej dziedziny biologii, wczajc w to takie jej dziay, jak biologia rodowiska czy paleobiologia, ktre pozornie wydawayby si odlege od genetyki molekularnej, w ktrych techniki klonowania genw i manipulowanie nimi nie znalazyby zastosowania. Z miesica na miesic pojawiaj si nowe zastosowania technik inynierii genetycznej. Niektre z nich s omwione w ostatnim rozdziale tej ksiki. Mona mie pewno, e w przyszoci bdzie ich o wiele wicej i e bd miay kapitalne znaczenie, zwaszcza w medycynie i w rolnictwie. Mamy nadziej, e ksika ta pomoe zrozumie najwaniejsze zjawiska i procesy biologiczne, a take ukae przynajmniej niektre sfery zastosowa wspczesnej genetyki molekularnej. Prof. dr hab. Piotr Wgleski

SPIS TRECI

1. Podstawowe koncepcje genetyczne i wybrane metody analizy genetycznej Piotr Wgleski 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. Dziedziczenie ma charakter jednostkowy Geny mieszcz si w chromosomach Geny zajmuj stae miejsca-w chromosomach i mog rekombinowa Materiaem genetycznym jest D N A Geny odpowiadaj za syntez biaek Rekombinacja moe zachodzi rwnie i wewntrz genu Mutacje w rnych genach uzupeniaj si (komplementuj), a w jednym (na og) nie 1.8. Analiza genetyczna bakterii * 1.8.1. Koniugacja 1.8.2. Transformacja 1.8.3. Transdukcja 1.9. Nie wszystkie geny lokuj si w chromosomach

15 15 19 21 23 24 25 26 29 30 33 33 35 37 37 44 44 45 48 49 52 53 54 57 59 59 60

2. DNA budowa i waciwoci Andrzej Jerzmanowski 2.1. Wiele cech strukturalnych czsteczki D N A wynika z waciwoci zasad 2.2. Lokalna sekwencja zasad w D N A wywiera silny wpyw na konformacj i waciwoci podwjnego heliksu 2.3. Na powierzchni podwjnego heliksu wystpuj dwie bruzdy 2.4. Parametry suce do opisu lokalnej struktury podwjnego heliksu . . \ 2.5. Struktura fragmentw D N A zawierajcych sekwencje bogate w AT 2.6. Lokalne sekwencje okrelaj podatno na rozkrcenie i zginanie 2.7. Architektura D N A a inicjacja transkrypcji . ? 2.8. Ptle w D N A 2.9. Superhelikalne formy DNA 2.10. Solenoidowe (toroidalne) i plektonemiczne (przeplecione) superzwinicie DNA 3. Replikacja DNA Witold Jachymczyk 3.1. Podstawowe reguy procesu replikacji D N A 3.1.1. Replikacja jest procesem semikonserwatywnym

3.1.2. Inicjacja replikacji zachodzi w cile okrelonych sekwencjach nukleotydw zgromadzonych w specyficznych miejscach chromosomu, zwanych origin" 3.1.3. Replikon jednostka replikacji 3.1.4. Replikacja DNA jest inicjowana przez krtkie odcinki RNA suce jako startery dla polimerazy DNA 3.1.5. Replikacja DNA sterowana jest przez due, wieloenzymatyczne kompleksy 3.1.6. Struktura chromosomw wywiera wpyw na proces replikacji 3.1.7. Replikacja D N A jest cile zwizana z procesem transkrypcji 3.1.8. Terminacja replikacji moe by zapisana w sekwencji genomu 3.2. Inicjacja procesu replikacji DNA 3.2.1. Inicjacja replikacji w dwuniciowej czsteczce bakteryjnego D N A 3.2.2. Inicjacja replikacji DNA bakteriofaga X 3.2.3. Inicjacja replikacji przez polimeraz RNA formowanie ptli D i R . . 3.2.4. Inicjacja replikacji w jednoniciowej czsteczce DNA 3.2.5. Budowa primosomu 3.2.6. Rwnocenno obu typw primosomw 3.2.7. Inicjacja replikacji DNA przez nacinanie jednej z nici w kolistym dwuniciowym genomie. Replikacja typu obracajcego si koa 3.2.8. Inicjacja replikonw liniowych. Starterowy RNA moe by zastpowany przez czsteczki biakowe 3.2.9. Inicjacja replikacji DNA w komrkach eukariontw 3.2.10. Incjacja replikacji D N A w komrkach drody. Sekwencje ARS 3.2.11. Inicjacja replikacji DNA w komrkach wyszych eukariontw 3.3. ElongacjaDNA . . . 3.3.1. Polimerazy D N A 3.3.2. Bakteryjne polimerazy DNA 3.3.3. Asymetryczna budowa holoenzymu polimerazy III D N A 3.3.4. Polimerazy DNA komrek eukariotycznych 3.3.5. Budowa eukariotycznych wideek replikacyjnych 3.3.6. Udzia histonw w replikacji . .<. . . 3.3.7. Biaka wspomagajce replikacj 3.4. Terminacja replikacji 4. Fizyczna organizacja genomu Krzysztof Staro 4.1. 4.2. 4.3. 4.3. 4.5. 4.6. 4.7. 4.8. 4.9. 4.10. 4.11. 4.12. 4.13. 4.14. 4.15. 4.16. 4.17. 4.18. 4.19. Genom wiroidw Genom wirusw Napicie torsyjne w genomie bakteryjnym Biaka genomu bakteryjnego Histony Biaka niehistonowe Nukleosom Lokalizacja nukleosomw w stosunku do sekwencji nukleotydw Wkno chromotypowe Domeny chromotypowe . Centromer Sekwencje telomerowe Architektura jdra interfazowego Odtwarzanie jdra chromatyny Euchromatyna i heterochromatyna Chromatyna aktywna transkrypcyjnie . . . Modyfikacje biaek i D N A w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie Miejsca nadwraliwe na nukleazy Nietypowe konformacje D N A w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie

61 62 64 64 64 65 65 66 67 71 73 76 76 79 80 81 84 87 88 89 90 91 95 97 99 100 101 105 110 111 111 113 117 118 118 119 121 123 125 126 126 126 127 127 128 130 130 131

5. Kod genetyczny i biosynteza biaek Wodzimierz Zagrski-Ostoja 5.1. 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9. 5.10. 5.11. 5.12. 5.13. 5.14. 5.15. 5.16. 5.17. Czsteczka adaptorowa, pojcie antykodonu Schemat translacji Struktura rybosomu Rybosomowe kwasy rybonukleinowe (rRNA) Biaka rybosomowe Odstpstwa od kodu uniwersalnego Zapis w mRNA moe si rni od zapisu w DNA . . Redagowanie moe wprowadzi dodatkowy kodon terminalny Redagowanie moe kreowa kodon inicjacyjny Redagowanie moe przywrci tre kodu uniwersalnego Redagowanie moe nada sens informacji, kreujc otwarte ramki odczytu w rezultacie licznych rozrzuconych insercji Redagowanie moe nada sens informacji na skutek blokowania insercji urydyn i delecji urydyn Transferowy RNA (tRNA) . Swoisto aminoacylacji tRNA Supresorowe tRNA Swoisto aminoacylacji moe by okrelona przez nietypow par zasad umieszczon w ramieniu aminokwasowym . Supresja moe zachodzi w wyniku omyek" rybosomw. Dwuznaczno translacji

134 136 137 141 142 143 144 146 146 147 147 148 148 149 150 151 152 152 156 157 159 160 161 161 165 168 169 171 173 178 181 182 183 188 190 193 193 194 196 198 201 201 206 208 210 215

6. Rekombinowanie i klonowanie DNA Piotr Wgleski, Magdalena Fikus 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. Wyodrbnianie i powielanie genw Enzymy restrykcyjne Mapy restrykcyjne Wektory .. 6.4.1. Bakteryjne wektory plazmidowe 6.4.2. Wektory pochodne bakteriofagw 6.4.3. Wektory drodowe 6.4.4. Wektory stosowane dla wszystkich eukariontw 6.5. Wprowadzanie DNA do komrki i caych organizmw 6.6. Identyfikacja zrekombinowanych genw 6.7. Charakterystyka sklonowanych genw sekwencjonowanie D N A 6.8. Wykrywanie sekwencji.DNA wicych biaka 6.9. Powielanie genw bez ich klonowania: technika PCR 6.10. Ukierunkowana mutageneza 6.11. Wdrwki i skoki po chromosomach . 6.12. Komputerowa analiza genw

7. Struktura i dziaanie genw prokariotycznych Karol Taylor, Alina Taylor 7.1. 7.2. 7.3. 7.4. 7.5. 7.6. 7.7. 7.8. 7.9. 7.10. Transkrypcja Polimeraza RNA . Promotory Czynniki sigma (er) Indukcja i represja Indukcja operonu laktozowego Represja operonu biosyntezy tryptofanu Represja kataboliczna Regulacja azotowa i enhancery Terminatory ^

7.11. Atenuacja 7.12. Antyterminacja 7.13. Uwagi kocowe 8. Struktura i dziaanie genw eukariotycznych Ewa Bartnik 8.1. W komrkach Eukaryota trzy rne rodzaje polimeraz RNA przeprowadzaj transkrypcj 8.2. Polimerazy RNA wi si z DNA tylko w obecnoci dodatkowych czynnikw transkrypcyjnych 8.3. Polimeraza I odpowiedzialna jest za syntez trzech klas rRNA 8.4. Polimeraza III RNA syntetyzuje wiele klas maych RNA 8.5. Geny kodujce biaka s transkrybowane przez polimeraz II 8.6. Promotory dla polimerazy II skadaj si z wielu sekwencji, z ktrymi wi si czynniki transkrypcyjne 8.7. Sekwencje wzmacniajce transkrypcj, podobnie jak promotory, wi czynniki transkrypcyjne, ale w odrnieniu od promotorw wpywaj na ekspresj niezalenie od swojego pooenia i orientacji wzgldem genu 8.8. Czynnikami transkrypcyjnymi mog by biaka o rnej budowie 8.9. Regulacja niektrych genw zostaa ju dobrze poznana 8.10. Niektre geny nie podlegaj regulacji . 8.11. Geny eukariotyczne s najczciej niecige 8.12. Mechanizmy wycinania intronw 8.13. Regulacja ekspresji genw u Eukaryota odbywa si te po transkrypcji 8.14. W pewnych ukadach transkrypt nie jest kolinearny z genem redagowanie RNA (editing) 8.15. Regulacja przez wybr miejsca terminacji transkrypcji 8.16. Regulacja przez wybr jednej z drg skadania transkryptu 8.17. Regulacja eksportu mRNA do cytoplazmy 8.18. Regulacja stabilnoci mRNA 8.19. Regulacja stabilnoci biaek 8.20. Biaka towarzyszce 9. Mutageneza, reperacja i rekombinacja DNA Wacaw Gajewski 9.1. Mutageneza i reperacja DNA 9.2. Mutageneza samorzutna (spontaniczna) 9.3. Polimeraza DNA III E. coli w trakcie replikacji dokonuje korekty mylnie wczonych zasad 9.4. Poreplikacyjna naprawa przez wycinanie niewaciwie sparowanych zasad . . . . 9.5. W czasie replikacji DNA mog powstawa delecje bd addycje nukleotydw . 9.6. Modyfikacje zasad w DNA mog by rdem mutacji samorzutnych 9.7. Gorce miejsca mutacji w genach 9.8. Mutacje indukowane 9.9. Mutageny chemiczne wywouj rnego typu uszkodzenia DNA 9.10. Rekombinacja D N A * 9.11. Rekombinacja homologiczna (uprawniona) zachodzi midzy homologicznymi czsteczkami DNA . . . 9.12. Biako RecA u E. coli dopasowuje do siebie komplementarne jednoniciowe DNA pochodzce z odrbnych czsteczek D N A 9.13. Heterodupleksy powstajce w procesie rekombinacji s przyczyn zjawiska konwersji genw 9.14. Udzia rekombinacji w procesach reperacji DNA 9.15. Mutageniczny system SOS naprawy D N A u E. coli 9.16. Rekombinacja moe zachodzi take midzy niehomologicznymi czsteczkami DNA

220 222 224 226 227 227 228 228 230 230

231 232 234 235 235 236 239 240 243 245 245 246 246 247 248 250 251 252 252 254 255 256 257 259 261 261 263 264 267 268 269

9.17. 9.18. 9.19. 9.20. 9.21. 9.22.

Ruchome elementy genetyczne, czyli transpozony * Transpozony bakteryjne Bardziej zoone bakteryjne transpozony typu Tn Niektre transpozony maj waciwoci zblione do retrowirusw Integracja retrowirusw do chromosomw gospodarza Retrotranspozony Ty u drody maj wiele wsplnych waciwoci z retrowirusami 9.23. Wykorzystanie transpozonw w genetyce molekularnej

270 272 273 276 276 278 279 280 280 281 283 284 284 285 2$6 290 290 291 293 294 296 296 299 301 303 306 307 308 309

10. Geny a rnicowanie si i rozwj Halina Krzanowska 10.1. Zjawisko rnicowania si (dyferencjacji) 10.1.1. Komrki zrnicowane zawieraj (na og) peen zestaw informacji genetycznej 10.1.2. W niektrych tylko przypadkach rnicowanie jest zwizane z ilociowymi zmianami materiau genetycznego 10.1.3. Wzorzec ekspresji genw zmienia si w czasie rozwoju i jest specyficzny tkankowo 10.1.4. Stan aktywnoci chromatyny przenosi si na komrki potomne i jest jednym z elementw pamici ^komrkowej 10.1.5. Determinacj rozwojow blastomerw wyznacza polarno skadnikw jaja oraz (lub) oddziaywania midzykomrkowe 10.1.6. Rozwj ssakw wymaga obecnoci genomu przekazanego przez matk i ojca 10.1.7. Ujawnienie si niektrych chorb czowieka moe by wywoane imprintingiem genomu rodzicielskiego 10.2. Genetyczna kontrola morfogenezy 10.2.1. Losy linii komrkowych u nicienia Caenorhabditis elegans s wyznaczane przez geny kontrolujce rozwj 10.2.2. Geny kierujce rozwojem Drosophila < 10.2.3. Uksztatowaniem postaci Drosophila wzdu osi przednio-tylnej zawiaduje hierarchiczny ukad genw regulatorowych 10.2.4. Geny polarnoci jaja wyznaczaj przedni i tylny biegun zarodka 10.2.5. Geny segmentacji wyznaczaj granice 14 parasegmentw 10.2.6. Geny homeotyczne kompleksu Antennapedia i bithorax decyduj o zrnicowaniu parasegmentw na gowowe, tuowiowe i odwokowe 10.2.7. Wiele genw kierujcych rozwojem zawiera sekwencj, zwan homeoboksem, kodujc biako o charakterze czynnika transkrypcyjnego 10.2.8. Sekwencja homeoboksu wystpuje w genach kierujcych rozwojem u zwierzt bezkrgowych i krgowcw 10.2.9. Sekwencje homeoboksu tworz konserwatywn ewolucyjnie rodzin . . 10.3. Kontrola genetyczna determinacji pci u zwierzt 10.4. Determinacja pci u D. melanogaster 10.4.1. Pe u Drosophila jest zdeterminowana stosunkiem liczby chromosomw X do liczby autosomw 10.4.2. Mechanizm kompensacyjny podwysza aktywno chromosomu X u samcw Drosophila do poziomu odpowiadajcego dwu chromosomom X u samic 10.4.3. Aktywny stan nadrzdnego genu Sxl uruchamia kaskad genw regulatorowych, prowadzcych rozwj w kierunku eskim 10.4.4. O pci somatycznej Drosophila decyduje rony sposb obrbki transkryptw genw regulatorowych 10.4.5. Na determinacj pciow komrek rozrodczych wpywa aktywn genu Sxl oraz rodowisko komrek somatycznych

310 311 312 313

10.5. Determinacja pci u ssakw 10.5.1. Mechanizm kompensacyjny u samic ssakw polega na inaktywacji jednego z dwu chromosomw X 10.5.2. Pe msk ssakw determinuje obecno chromosomu Y w komrkach somatycznych gonady 10.5.3. Jak poszukiwano genu determinujcego pe msk u ssakw 10.5.4. Na determinacj pci ssakw wpywaj take geny pooone w innych chromosomach 11. Molekularne podstawy procesw odpornociowych Barbara Lipiska 11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. 11.7. 11.8. 11.9. 11.10. 11.11. 11.12. 11.13. 11.14. 11.15. 11.16. 11.17. 11.18. 11.19. 11.20. 11.21. 11.22. 11.23. 11.24. 11.25. 11.26. 11.27. 11.28. Antygeny wywouj odpowied immunologiczn humoraln i komrkow . . Przeciwciaa wi si z determinantami antygenowymi Przeciwciaa dziel si na klasy penice rne funkcje Przeciwciaa s wytwarzane przez limfocyty B Odpowiednie przeciwciaa produkowane s dziki selekcji okrelonych klonw limfocytw B System odpornociowy ma pami immunologiczn Limfocyty T s podstaw odpowiedzi komrkowej i niezbdnym elementem odpowiedzi humoralnej Makrofagi s wanymi komrkami wspomagajcymi odpowied immunologiczn Komrki ukadu immunologicznego kr po caym organizmie Przeciwciaa maj wsplny plan budowy, lecz s bardzo rnorodne Umiemy wytwarza przeciwciaa monoklonalne S dwa zasadnicze mechanizmy prowadzce do rnorodnoci przeciwcia . . Geny immunoglobulin ulegaj somatycznej rekombinacji Regulacja transkrypcji genw immunoglobulin Limfocyty T maj receptory TCR Receptory komrek T wi antygeny prezentowane na powierzchni komrki *..... Biaka MHC uczestnicz w odrzucaniu przeszczepw Biaka MHC uczestnicz w stymulacji syntezy immunoglobulin Biaka MHC s polimorficzne i nale do superrodziny immunoglobulin . . . Geny MHC maj bardzo wiele alleli Edukacja grasicowa uczy komrki T reagowa z obcymi biakami i tolerowa wasne Odpowied immunologiczna zalena od antygenu Antygeny stymulujce syntez przeciwcia niezalenie od komrek T Zaktywowana komrka B wydziela przeciwciaa Zaktywowany limfocyt B wytwarza wtrne przeciwciaa Geny immunoglobulin ulegaj somatycznym mutacjom Tolerancja komrek B wobec wasnych antygenw organizmu Wirus HIV wywouje AIDS

313 313 315 316 320 322 323 324 326 328 329 332 333 334 335 336 342 344 344 354 355 360 364 365 366 369 370 372 376 376 379 380 381 382 385 385 386 387 388

12. Udzia genw w procesie nowotworzenia Mieczysaw Chory, Stanisaw Szala 12.1. Komrki nowotworowe rni si od komrek prawidowych wieloma cechami biologicznymi. 12.2. Proces nowotworowy rozwija si w cigu dugiego czasu i jest procesem wieloetapowym obejmujcym faz inicjacji, promocji i progresji 12.3. W fazie progresji postpuje proces utraty kontroli nad podziaami komrek nowotworowych 12.4. Nowotwory zoliwe u czowieka s skutkiem dziaania wielu czynnikw etiologicznych

12.5. Immortalizacja komrek jest pierwszym zdarzeniem w procesie nowotworzenia in vitro, ale nie jest jednoznaczna z transformacj nowotworow 12.6. Nowotwory u ludzi mog si rozwija na tle wrodzonych predyspozycji, ale stanowi one may odsetek wszystkich nowotworw 12.7. Molekularnym podoem procesu nowotworowego s mutacje genetyczne komrek samatycznych 12.8. Wirusy onkogenne typu RNA nalece do grupy retrowirusw . 12.9. Wirusy typu RNA przechodz zoony cykl yciowy w zainfekowanej komrce . . 12.10. Retrowirusy o ostrym dziaaniu onkogennyn zawieraj gen transformujcy (onkogen wirusowy v-onc) 12.11. Ostre wirusy onkogenne s zwykle niezdolne do replikacji wskutek utraty czci genomu i wymagaj obecnoci wirusw wspomagajcych 12.12. Wystpujce w ostrych retrowirusach geny transformujce (geny v-onc) pochodz z komrek eukariotycznych 12.13. Komrkowe protoonkogeny s przeksztacane w onkogeny w wyniku rnych mutacji 12.14. Biaka kodowane przez protoonkogeny speniaj kluczowe funkcje biologiczne w komrce 12.15. Niektre protoonkogeny koduj biaka speniajce funkcj receptorw i majce swoist aktywno fosfokinaz 12.16. Protoonkogeny z rodziny ras koduj biako o aktywnoci GTPazy 12.17. Niektre czynniki transkrypcyjne s produktami protoonkogenw 12.18. Produkty biakowe protoonkogenw bior udzia w transmisji sygnau do komrki 12.19. Wzrost i rnicowanie komrek s w stanie wzajemnej rwnowagi 12.20. Geny supresorowe transformacji nowotworowej 12.21. W nastpstwie pre- lub postzygotycznej mutacji genu supresorowego Rb rozwija si siatkwczak (retinoblastoma) oka 12.22. Mutacje genu supresorowego p53 towarzysz wielu typom nowotworw zoliwych 12.23. Ostatnio wykryto nowe geny supresorowe majce udzia w procesie nowotworowym . . 12.24. W procesie nowotworzenia bior udzia nie tylko onkogeny i geny supresorowe 12.25. Niektre geny bior udzia w progresji procesu nowotworowego i przerzutowaniu 12.26. Procesowi postpujcego zoliwienia komrek towarzyszy postpujca destabilizacja genomu . . . 12.27. Mechanizmy selekcji i adaptacji prowadz do rozwoju klonw komrek nowotworowych o duej autonomii wzrostu 13. Molekularne podstawy ewolucji Piotr Stpie 13.1. ycie na Ziemi mogo powsta ok. 3 mld lat temu 13.2. ycie powstao dziki katalitycznym waciwciom replikujcych si czsteczek RNA 13.3. Biaka okazay si lepszymi katalizatorami ni RNA 13.4. Kod genetyczny jest na og identyczny w caym wiecie oywionym 13.5. Progenota: praprzodek organizmw ywych mia genom zony z D N A . . . . 13.6. Historia ewolucji jest zapisana w sekwencji nukleotydowej genw 13.7. Mitochondria i chloroplasty s pochodzenia endosymbiotycznego 13.8. Biaka o nowych funkcjach powstay dziki duplikacjom genw lub dziki tasowaniu egzonw

389 390 391 392 392 394 394 395 396 396 398 399 399 400 402 403 404 * 405 406 407 408 409 410 412 413 414 417 418 419 420 423 426

13.9. 13.10. 13.11. 13.12. 13.13. 13.14. 13.15. 13.16. 13.17.

Ewolucji ycia na Ziemi wystarczyo niewiele egzonw Czy introny pojawiy si wczenie czy pno w ewolucji? Geny nalece do rodzin wielogenowych ewoluuj razem Cz D N A w genomach nie ulega ekspresji Geny powstajce przez odwrotn transkrypcj mog peni wan rol w ewolucji . Genomy mog by kolonizowane przez pasoytniczy, samolubny D N A .', . . Czy rzeczywicie pochodzimy od jednej pramatki Ewy? !. . . . . Czy symbioza i horyzontalny transfer genw mog by motorem ewolucji? . . Podsumowanie

428 429 430 432 433 434 435 436 436 438 438 438 439 440 442 444 444 444 444 448 450 453 456 457 457 460 462 464 465 466 468 470 471 472 475

14. Nowy wspaniay wiat biotechnologii Magdalena Fikus 14.1. Wprowadzenie do zagadnie wspczesnej biotechnologii 14.1.1. Zakres stosowania technik rekombinacji D N A in vitro w projektach biotechnologicznych. Sprzenie nauki z technik 14.1.2. Czynniki warunkujce sukces projektu biotechnologicznego 14.1.3. Rozwj firm biotechnologicznych 14.1.4. Wybr organizmw gospodarzy do klonowania genw 14.2. Biotechnologia w przemyle farmaceutycznym i w medycynie 14.2.1. Kierunki rozwoju biotechnologii medycznej 14.2.2. Profilaktyka i diagnostyka 14.2.2.1. Szczepionki 14.2.2.2. Testy diagnostyczne 14.2.3. Somatyczna terapia genowa 14.2.4. Nowe leki / 14.3. Organizmy transgeniczne 14.3.1. Transgeniczne roliny 14.3.1.1. Plazmidy Agrobacterium jako wektory D N A dla rolin dwuliciennych 14.3.1.2. Bezwektorowa transfekcja rolin i komrek rolinnych 14.3.1.3. Celowo konstrukcji rolin transgenicznych 14.3.1.4. Perspektywy zastosowa transgenicznych rolin 14.3.2. Transgeniczne zwierzta 14.3.2.1. Transgeniczne myszy jako model modyfikacji genotypu do celw biotechnologicznych 14.3.2.2. Transgenizacja zwierzt hodowlanych 14.4. Metody rekombinacji D N A in vitro zastosowane do produkcji zwizkw chemicznych 14.5. Postp nauki i techniki w rozwoju biotechnologii 14.6. Bezpieczestwo biotechnologii dla ekosfery i czowieka Skorowidz

1. PODSTAWOWE KONCEPCJE GENETYCZNE I WYBRANE METODY ANALIZY GENETYCZNEJ

Fascynacja wspczesnymi technikami genetyki molekularnej i atwo, z jak moemy dzi wnika w struktur i mechanizm dziaania genw, nie powinny prowadzi do lekcewaenia metod klasycznej analizy genetycznej. Wikszo podstawowych koncepcji genetycznych powstaa, jeli jeszcze nie przed odkryciem roli DNA w dziedziczeniu, to w kadym razie przed wprowadzeniem w uycie technik inynierii genetycznej. Co wicej, rozwizywanie wielu problemw z dziedziny genetyki molekularnej jest z reguy poprzedzone (a czsto nawet zalene) od uzyskania wielu informacji dotyczcych lokalizacji badanych genw, ich wspdziaania z innymi genami itp. Informacje te w wielu przypadkach mona uzyska duo szybciej (i taniej) stosujc klasyczne metody genetyczne ni nawet najbardziej wyrafinowane metody genetyki molekularnej. Rozdzia ten zawiera krtkie omwienie podstawowych koncepcji genetyki klasycznej oraz metod analizy genetycznej wyszych organizmw, bakterii i wirusw. Przedstawione w nim rwnie bd podstawowe zasady dziaania genw, ktre znacznie dokadniej zostan omwione w dalszych rozdziaach.

1.1. Dziedziczenie ma charakter jednostkowy Podobiestwo potomstwa do rodzicw jest zjawiskiem oczywistym, obserwowanym od niepamitnych czasw. Przy czym nie chodzi tu jedynie o podobiestwo niektrych cech, jak ksztat nosa czy kolor oczu, ale o podobiestwo wszystkich zasadniczych cech gatunku: potomek czowieka jest czowiekiem, potomek kota jest kotem itd. Poznanie zjawiska dziedziczenia byo kluczem do zrozumienia podstawowych zasad powstawania i funkcjonowania ywych organizmw. Naleao bowiem ustali nie tylko w jaki sposb cechy organizmw s przekazywane z pokolenia na pokolenie, ale rwnie natur samych

determinantw cech, sposb ich funkcjonowania, zakres i przyczyny ich zmiennoci. Pierwszy krok na. drodze do poznania tych zagadnie postawi w roku 1865 Grzegorz Mendel, publikujc rezultaty swoich dowiadcze nad dziedziczeniem wybranych cech grochu. Mendel krzyowa ze sob roliny o atwych do wyrnienia cechach, takich jak barwa kwiatw, barwa czy ksztat nasion, przy czym byy to cechy utrzymujce si z pokolenia na pokolenie w przypadku krzyowania wsobnego. Zaobserwowa, e w potomstwie (F x ) krzywki osobnikw rnicych si jedn cech otrzymuje si osobniki jednakowe, wykazujce cech jednego z rodzicw. Cech t okrela si jako dominujc, podczas gdy cech nie ujawniajc si w pokoleniu F x okrela si jako recesywn. W drugim pokoleniu (F2), otrzymanym ze skrzyowania osobnikw F x powstaj osobniki dominujce i recesywne w stosunku 3 :1 (rys. 1.1).

gamety

Rys. 1.1. Dziedziczenie jednej cechy. Skrzyowano dwie roliny homozygotyczne, jedn o kwiatach czerwonych (cecha dominujca) i drug o kwiatach biaych (cecha recesywn). Wszystkie osobniki potomne (Fj) s heterozygotami o kwiatach czerwonych. Po skrzyowaniu ze sob osobnikw otrzymujemy pokolenie F 2 , w ktrym wystpuj osobniki o kwiatach czerwonych i biaych w proporcji 3:1

W przypadku krzyowania osobnikw rnicych si dwoma cechami Mendel obserwowa jednolite pod wzgldem obu cech pokolenie F t i pojawienie si w pokoleniu F 2 osobnikw o obu cechach dominujcych, jednej lub

rodzice AABB

m
aabb

I
gamety

gamety

Rys. 1.2. Dziedziczenie dwch cech. Skrzyowano roliny o nasionach tych i gadkich (cechy dominujce) z rolinami o nasionach zielonych i pomarszczonych (cechy recesywne). Otrzymano jednolite fenotypowo pokolenie F l s w ktrym wszystkie osobniki s podwjnymi heterozygotami. Po skrzyowaniu osobnikw t ze sob otrzymujemy pokolenie F 2 , w ktrym wystpuj cztery klasy fenotypowe w stosunku 9:3:3:1. Wynik taki wskazuje na niezalene dziedziczenie si dwch par alleli

drugiej cesze dominujcej i obu cechach recesywnych w proporcji, jak 9 : 3 : 3 : 1 (rys. 1.2). Obserwowan w tych krzywkach segregacj cech Mendel interpretowa nastpujco: 1) Cechy zalene s od zawizkw dziedzicznoci" (ktre obecnie nazywamy genami). ^ada cecha jest determinowana przez dwa geny. Geny determinujce ^ okrelamy obecnie terminem allele".

SM

rodzice

Aa gamety

aa

potomstwo

Aa

aa

Rys. 1.3. Jednopunktowa krzywka wsteczna (testowa). Osobnika heterozygotycznego skrzyowano z osobnikiem homozygotycznym recesywnym. W potomstwie otrzymuje si osobniki o cechach dominujcych i recesywnych w proporcji 1:1

3) Gamety zawieraj tylko jeden allel z danej pary, przy czym segregacja alleli do gamet odbywa si losowo, a zatem czstoci gamet z jednym i drugim allelem s sobie rwne. 4) Geny warunkujce rne cechy segreguj niezalenie od siebie i jest kwesti przypadku, ktry allel z pary warunkujcej jedn cech znajdzie si w gamecie z jednym bd drugim allelem z pary alleli warunkujcej drug cech. Z wymienionych punktw, punkt 2) i 4) znane s jako I i II prawa Mendla, tzw. prawo czystoci gamet i prawo niezalenej segregacji cech. Osobniki majce dwa identyczne allele genu warunkujcego dan cech okrela si jako homozygoty, a osobniki majce dwa rne allele jako heterozygoty. W krzywkach Mendla osobniki pokolenia rodzicielskiego byy homozygotami, a osobniki pokolenia heterozygotami. O heterozygotycznoci tych osobnikw mona si najatwiej przekona wykonujc krzywk wsteczn, polegajc na skrzyowaniu ich z recesywn form rodzicielsk. W potomstwie takiej krzywki otrzymamy heterozygoty i homozygoty w stosunku 1:1 (rys. 1.3). Gwnym osigniciem Mendla byo wykazanie istnienia jednostek (zawizkw") dziedzicznoci, ktre zgodnie z okrelonymi reguami s przekazywane za porednictwem gamet z pokolenia na pokolenie. Odkrycie to stworzyo racjonalne podstawy genetyce, nauce o dziedzicznoci.

1.2. Geny mieszcz si w chromosomach Prace Mendla pozostaway niezauwaone do roku 1900, kiedy to trzej uczeni E. Correns, W. Tschermak i H. de Vries ponownie odkryli" prawa Mendla. Z pocztkiem wieku XX nagromadzono ju na tyle duo danych na temat przebiegu mejozy i powstawania gamet, e zbieno midzy zachowaniem si postulowanych przez Mendla czynnikw dziedzicznoci a zachowaniem si chromosomw w czasie mejozy staa si oczywista. Udowodnienie, e geny rzeczywicie mieszcz si w chromosomach, byo zasug T. Morgana, ktry uznawany jest za twrc chromosomowej teorii dziedzicznoci. Obiektem prac Morgana i jego wsppracownikw bya muszka owocowa Drosophila melanogaster. Miaa ona liczne zalety, jako obiekt prac genetycznych, takie jak: krtki (10 dni) cykl yciowy, stosunkowo dua liczba potomstwa uzyskiwanego z jednej pary osobnikw i naturalnie wystpujca zmienno dziedziczna, co byo w owym czasie istotne, gdy nie znane jeszcze byy sposoby indukowania mutacji. Co wicej, D. melanogaster ma tylko cztery, atwo wyrnialne pary chromosomw (wrd nich jedn par, tzw. chromosomw pci: XX u samic i XY u samcw). W komrkach gruczow liniankowych wystpuj u D. melanogaster chromosomy politeniczne, zwane chromosomami olbrzymimi (rys. 1.4), ktre powstaj przez wielokrotne podziay chromatyd, po ktrych nie nastpuje ich rozejcie si. Obecno tych chromosomw umoliwia u D. melanogaster atwe ledzenie, za pomoc mikroskopu optycznego, zmian w strukturze chromosomw. Waciwoci te spowodoway, e D. melanogaster przez dugie lata pozostawaa obiektem numer jeden w badaniach genetycznych, a i obecnie wykorzystywana jest z powodzeniem do prac nad genetyczn regulacj procesw rozwoju i rnicowania si organizmw (p. rozdz. 10). Krzyujc midzy sob rozmaite mutanty D. melanogaster Morgan wykaza, e niektre geny nie s przekazywane niezalenie od siebie, a wic segreguj niezgodnie z II prawem Mendla. Geny takie okrelamy nazw genw sprzonych. Morgan ustali, e geny sprzone to geny mieszczce si w jednym chromosomie. Okazao si, e u D. melanogaster wystpuj 4 grupy genw sprzonych, a wic tyle ile wystpuje par chromosomw. Geny nalece do jednej z tych grup wykazyway szczeglny charakter dziedziczenia, polegajcy na tym, e u samcw ujawniay si cechy warunkowane przez geny recesywne przekazywane przez matk. Morgan prawidowo zinterpretowa ten fakt, zakadajc e s to geny mieszczce si w chromosomie X i e chromosom Y jest genetycznie pusty". Morgan, badajc dziedziczenie si cech u osobnikw charakteryzujcych si anomaliami chromosomowymi (np. majcych poczone ze sob chromosomy X) wykaza, e sposb przekazywania okrelonych genw w krzywkach takich osobnikw jest zgodny ze sposobem przekazywania chromosomw. Pniej udao si skorelowa wiele aberracji

Rys. 1.4. Chromosomy olbrzymie (politenicznfc) D. melanogaster (wg B.P. Kaufmana, Intern. Rev. Cyt., 9, 77, 1960)

chromosomowych (widocznych przy obserwacji chromosomw olbrzymich), polegajcych na wypadniciu (delecji) lub przemieszczeniu (translokacji) fragmentw chromosomw z wystpieniem okrelonych mutacji, co pozwolio na przypisanie poszczeglnych genw nie tylko do chromosomw pci, lecz rwnie do autosomw.

1.3. Geny zajmuj stae miejsca w chromosomach i mog rekombinowa To, e dwa geny znajduj si w jednym chromosomie nie oznacza, e zawsze przekazywane s razem. W krzywkach testowych (krzywka heterozygoty z homozygot recesywn) obserwuje si pojawianie si rekombinantw, czyli osobnikw majcych inny ni rodzicielski ukad alleli w chromosomach (rys. 1.5). Morgan zaobserwowa, e czsto, z jak pojawiaj si rekombinanA B
v

gamety

gamety

gamety o rodzicielskim ukadzie alleli

A B a b a a a a A b b B b b

a a A

b B b

osobniki typu rodzicielskiego

gamety zrekombinowane

rekombinanty

Rys. 1.5. Krzywka testowa za pomoc ktrej ustala si sprzenie dwch genw. Genotypy rodzicw i potomstwa zapisano w formie uamkw, co lepiej uwidacznia, ktre allele znajdoway w jednym, a ktre w dwch rnych chromosomach. Osobniki heterozygotyczne wytwarzaj cztery rodzaje gamet. Procent gamet zrekombinowanych jest tym mniejszy im bliej na chromosomie znajduj si loci badanych genw. Gamety zrekombinowane powstaj w wyniku crossing-over (p. rys. 1.6)

ty, jest staa dla danej pary genw, co wskazywao, e geny zajmuj na chromosomie okrelone, stae miejsca (loci). Pojawianie si rekombinantw jest wynikiem pkania chromatyd chromosomw homologicznych i ich ponownego (b)
A B

(c)
A B b B A \ / b

(d)
A
-^ e- A

B b

A a

b B B

Tj

a / \ B

-e-

Rys. 1.6. Uproszczony schemat crossing-over. W profazie I podziau mejotycznego chromosomy homologiczne (kady zoony z dwch chromatyd) ukadaj si obok siebie (a). Moe doj do pknicia i poczenia na krzy" chromatyd nalecych do dwch rnych chromosomw (b). W I podziale chromosomy rozchodz si (c) a w II podziale pkaj centromery i rozchodz si chromatydy (d), kada z nich trafia do innej gamety

czenia si w nowym ukadzie (rys. 1.6). Proces ten okrelamy nazw crossing-over. Morgan zaoy rwnie, e czsto crossing-over jest funkcj odlegoci pomidzy loci genw na chromosomie: im dalej od siebie s pooone, tym wiksza szansa na zajcie crossing-over pomidzy nimi. Suszno zaoe Morgana zostaa potwierdzona w caej rozcigoci. Dla wszystkich organizmw, bdcych przedmiotem intensywnych prac genetycznych, oraz dla wielu organizmw wanych z punktu widzenia uytkowego, sporzdzono dokadne mapy genetyczne poszczeglnych chromosomw. Mapy te obrazuj kolejno uoenia genw na chromosomie oraz odlegoci midzy genami wyraone w jednostkach rekombinacji (procentach crossing-over). W celu sporzdzenia takiej mapy wykonuje si serie krzywek testowych (o mapowaniu genw u bakterii bdzie mowa dalej), zwykle krzywek trzylub wicej punktowych, tzn. takich, w ktrych bada si jednoczenie segregacj trzech lub wicej genw. Przykadowa analiza krzywki trzypunktowej jest podana na rysunku 1.7.
A B C a b c

gamety

\
a gamety bez c/o A a A a B C b b c c A a a a A a a a A a a a A a a a

c osobniki typu rodzicielskiego

B C b c b b b b B b B b b b b b B b c c c c C c c c C c C c c c

gamety po c/o w I obszarze

B C

rekombinanty po c/o w I obszarze

gamety po c/o w II obszarze

A a

b C

rekombinanty po c/o w II obszarze

gamety po podwjnym c/o

A a

b B

C c

c/o

rekombinanty po podwjnym

Rys. 1.7. Krzywka testowa trzypunktowa. W wyniku krzywki powstaje 8 klas potomstwa, wszystkie rozrnialne na podstawie fenotypw. O ile wszystkie trzy geny s sprzone, to klasy rekombinantw bd mniej liczne ni klasy typu rodzicielskiego. Najmniej liczne bd klasy powstae w wyniku podwjnego crossing-over (c/o), gdy prawdopodobiestwo zajcia podwjnego c/o rwna si iloczynowi prawdopodobiestw zajcia pojedynczych c/o. Poniewa w wyniku podwjnego c/o jedynie gen rodkowy zmienia swoj pozycj wzgldem pozostaych genw, to liczebno klas daje nam informacj nie tylko o odlegociach pomidzy genami, ale rwnie o ich wzajemnym pooeniu na chromosomie. Odlegoci midzy genami wyraane s w jednostkach rekombinacji, przy czym jedna jednostka odpowiada jednemu procentowi rekombinacji

Mechanizm molekularny procesu crossing-over nie by oczywicie znany w czasach Morgana. Dowodem cytologicznym na wystpowanie tego procesu byo wystpowanie pocze midzy chromatydami (chiazm) obserwowane w profazie podziaw mejotycznych. Molekularna strona procesu rekombinacji zostanie omwiona w rozdziale 9. Tam te zajmiemy si wyjtkami od regu nakrelonych przez Morgana, zwizanych z wystpowaniem ruchomych elementw genetycznych, ktrych obecno zmusza nas do modyfikacji pogldw na temat staoci miejsc zajmowanych przez geny w chromosomach.

1.4. Materiaem genetycznym jest DNA Kluczowym momentem dla rozwoju genetyki i caej biologii byo odkrycie, e materiaem genetycznym jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA). Dowiadczenia, ktre doprowadziy do tego stwierdzenia maj obecnie warto jedynie historyczn i nie bd tutaj szczegowo omawiane. Przypomnimy tylko, e w roku 1928 F. Griffith wykona dowiadczenie nad transformacj bakterii, wykazujc, e jaki czynnik z zabitych bakterii moe zosta przekazany bakteriom ywym, w wyniku czego te ostatnie mog by genetycznie zmodyfikowane, nabywajc niektre cechy bakterii zabitych. W roku 1944 O. T. Avery, C. M. MacLeod i M. MacCarty ustalili, e zwizkiem chemicznym odpowiedzialnym za przekazywanie cech u bakterii w wyniku transformacji jest DNA. Wykonane przez nich dowiadczenie polegao na transformowaniu bakterii poszczeglnymi frakcjami uzyskanymi z bakterii zabitych i wykazaniu, e jedynie frakcja zawierajca DNA moe zmieni genetyczne waciwoci transformowanych komrek. Inne klasyczne dowiadczenie ukazujce rol DNA w dziedziczeniu zostao wykonane przez A. D. Hershey'a i M. Chase w roku 1952. Wykazali oni, e w czasie infekcji komrki bakteryjnej przez bakteriofagi (wirusy bakteryjne) do wntrza komrki wnika jedynie DNA, natomiast paszcz biakowy bakteriofaga pozostaje na zewntrz. Dowiadczenie to polegao na wyznakowaniu bakteriofagowych DNA i biaek odpowiednio za pomoc fosforu 32 P i siarki 35 S oraz przeledzeniu losw radioaktywnego pitna po infekcji. Dowiadczenie to wykazao, e caa informacja niezbdna do odtworzenia si bakteriofaga w komrce i przejcia przez niego penego cyklu yciowego jest zawarta w DNA. W roku 1953 J. D. Watson i F. Crick zaproponowali model struktury DNA i wynikajcy z niego sposb replikacji czsteczek tego zwizku (p. rozdz. 3). Zdolno do wytwarzania w procesie replikacji kopii czsteczek DNA jest jedn z dwch podstawowych waciwoci, jakie musi spenia zwizek chemiczny bdcy nonikiem informacji genetycznej. Drug waciwoci tego zwizku musi by zdolno do kierowania syntez i wyznaczania pierwszorzdowej struktury biaek, od ktrych zale wszelkie waciwoci ywego organizmu.

1.5. Geny odpowiadaj za syntez biaek W latach 40. wprowadzono do bada genetycznych tzw. mutanty pokarmowe (inaczej: auksotroficzne). S to mutanty, ktre w wyniku uszkodzenia okrelonego genu utraciy zdolno do syntezy jakiego zwizku chemicznego (np. aminokwasu). Mutanty takie mona atwo otrzyma u mikroorganizmw, takich jak bakterie lub grzyby, ktrych hodowle prowadzi si na prostych,
pirofosforylaza
PR-ATP

PR-AMP pirofosfohydrolaza PP PP

PR-AMP hydrolaza

<D

N^NPRPP
H 2 N=

N^N-RP

izomeraza PP + N^NRP

N^NRP

- - N oJ
I ATP| + |PRPP| MG

H2N-C=0
HC

r \

HC 1 HCOH I i 0 HCOH |

I
+H20

fjlHCH HCHCOH HCOH HC-

H2N-C=0 / N rsiHCH HCH

HCOH HCOH HC

H
HCOH HCOH
CH2OP

H C

'

CH20P fosforybozylo-ATP

CH20P fosforybozylo-AMP

CH20P fosforybozyloformimino-AIC-R-P

fosforybozyloformimino-AIC-R-P @ +glutamina

amidotransferaza

cyklaza

I
(AIC-R-P)

rybotyd aminoimidazolokarboksamidu

N^NRP
NH2

H2N-C=O

dehydrogenaza HOL HCN \

CN CH2 HCNH2 COOH

fosfataza HP

CH

H HCN

CH
CN

transaminaza dehydrataza + IAP IGP H H HCN^ HCN HCN \ II \ CH CH CH

<D

CN

glutaminian

CN

CH2 HCNH2 CH2OP

CH2 HCNH 2 CH 2 OP

I c=o
CH20P imidazoloacetolofosforan (IAP)

H L 2

<

-SH Mn 2 "

CN HC0H2 HCOH CH2OP

L-histydyna

L-histydynol (HOL)

L-histydynolofosforan (HP)

imidazologlierolofosforan (IGP)

Rys. 1.8. Droga biosyntezy histydyny u Salmonella typhimurium. Literami oznaczono geny odpowiedzialne za syntez poszczeglnych enzymw

cndmcznic zdefiniowanych poywkach. Mutanty te mona utrzyma przy i>du dodajc do poywki skadnik, ktrego nie potrafi wytwarza. Analiza zaztantw pokarmowych pozwala na znacznie atwiejsze, ni w przypadku zzrtantw morfologicznych, zademonstrowanie zalenoci midzy genem, biaiem a cech organizmu. Mona bowiem ustali, e fenotyp mutanta (wymagacie jakiego skadnika wzrostowego lub niezdolno do wykorzystywania jakiego skadnika do wzrostu) wynika bezporednio z braku lub niefunkcjonax>ei okrelonego enzymu. Przykad zalenoci midzy genami a enzymami ca konkretnego szlaku metabolicznego jest przedstawiony na rysunku 1.8. W latach 50. pogld, e geny s odcinkami DNA determinujcymi pierwszorzdow struktur biaek, zacz zyskiwa mocne poparcie eksperymentalnie. Prace V. M. Ingrama na hemoglobinach wykazay, e mutacje wywoujce tzw. anemi sierpowat powoduj zamian okrelonych aminokwasw w acuchu /?-globiny. Dane tego typu uzyskano pniej dla dziesitkw innych genw i biaek. Poznanie przebiegu biosyntezy biaek, a w szczeglnoci roli mRNA w tym procesie, doprowadzio do sformuowania tzw. centralnego dogmatu genetycznego, mwicego e przepyw informacji genetycznej odbywa si nastpujco:
replikacja DNA
transkrypcja RKJA translacja

biako

Dogmat ten obowizuje do dzi, aczkolwiek naley pamita o kilku uzupenieniach i ucileniach. Po pierwsze, informacja genetyczna u wielu wirusw zawarta jest w RNA a nie w DNA. Po drugie, RNA moe wt niektrych przypadkach suy jako matryca do syntezy DNA (p. rozdz. 4). Wreszcie, finalnym produktem wielu genw jest RNA (np. RNA rybosomalny i transferowy), nie podlegajcy translacji. 1.6. Rekombinacja moe zachodzi rwnie i wewntrz genu W pocztkowym okresie rozwoju genetyki klasycznej geny wyobraano sobie jako koraliki na sznurku. Kady z nich by w pewnym sensie jednostk mutacji, rekombinacji i funkcji. Wkrtce okazao si jednak, e dany gen moe mutowa na wiele rnych sposobw (mwiono wtedy o allelach wielokrotnych, ktrych najbardziej znanym przykadem bya seria alleli genu w u Drosophila, warunkujcych rn barw oka), a take, e rekombinacja moe zachodzi w obrbie genu. Obecnie, gdy wiemy e gen jest odcinkiem DNA zoonym z kilku tysicy nukleotydw i e chromosom zawiera jedn, cig ni DNA, jest to dla nas oczywiste. Mutacji moe bowiem ulega dowolny nukleotyd w obrbie genu, a rekombinacja moe zachodzi na identycznej zasadzie zarwno wewntrz

genw, jak i midzy nimi. Jeeli skrzyujemy ze sob mutanty alleliczne, to moemy z pewn czstoci (rzdu uamkw procenta) otrzyma rekombinanty typu dzikiego. Stanowi one poow wszystkich rekombinantw, druga poowa to rekombinanty majce dany gen zmutowany w dwch miejscach. Na podstawie czstoci rekombinacji midzy poszczeglnymi mutacjami w danym genie sporzdza si mapy genetyczne genw, tak samo jak mapy genetyczne chromosomw. 1.7. Mutacje w rnych genach uzupeniaj si (komplementuj), a w jednym (na og) nie Jeeli mamy do czynienia z mutacjami mapujcymi si na rnych chromosomach lub lecymi daleko od siebie na jednym chromosomie, to nie ma wtpliwoci, e s to mutacje rnych genw, nawet jeeli efekty fenotypowe tych mutacji s takie same. Jeeli natomiast dwa geny zwizane np. z syntez jednego aminokwasu le obok siebie na chromosomie, to test rekombinacji nie pozwoli nam na ustalenie czy dane dwie mutacje zaszy w jednym czy te w dwch rnych genach. Jednoznaczn (na og) odpowied otrzymamy natomiast stosujc test na komplementacj (inaczej: test na alleliczno). Test ten w przypadku organizmw diploidalnych polega na otrzymaniu osobnika heterozygotycznego, u ktrego wystpuj jednoczenie oba zmutowane allele. Jeeli mutacje dotycz rnych genw (i s recesywne), to osobnik taki bdzie mia dziki fenotyp, jeeli obie mutacje zaszy w tym samym genie, to osobnik
mutacje w dwch genach gen A gen B mutacje w jednym genie" gen A gen B

trans

Rys. 1.9. Test na alleliczno. Jeeli mutacje zaszy w dwch genach, to heterozygota niezalenie od tego czy mutacje znajduj si w ukadzie cis czy te trans bdzie miaa fenotyp nie zmutowany (dziki). Dziki fenotyp heterozygoty wiadczy wic o komplementowaniu (wzajemnym uzupenianiu si) dwch mutacji, a zatem o nieallelicznoci zmutowanych genw. Jeeli mutacje zaszy w tym samym genie, to heterozygota majca mutacje w ukadzie cis bdzie miaa fenotyp dziki (jeden allel genu A jest zmieniony w dwch miejscach, a drugi jest nie zmutowany), podczas gdy heterozygota w ukadzie trans bdzie mutantem (oba allele genu A zmutowane). Taki wynik testu wiadczy o braku komplementacji

bdzie mia fenotyp mutanta. W tej drugiej sytuacji nie wystpuje bowiem dziki allel zmutowanego genu, ktry mgby wytwarza funkcjonalne czsteczki zakodowanego w nim biaka. Obie omwione sytuacje s przedstawione schematycznie na rysunku 1.9. Wykonanie testu na komplementacj jest take moliwe w przypadku organizmw, u ktrych dominuje faza haploidalna, pod warunkiem e mona u nich uzyska stabilne formy diploidalne (lub heterokariony). W przypadku bakterii test na komplementacj mona przeprowadzi w ukadzie, w ktrym jeden zmutowany allel znajduje si w chromosomie bakteryjnym, a drugi jest wprowadzony do komrki na plazmidzie lub za porednictwem bakteriofaga. W przypadku wirusw test na komplementacj przeprowadza si infekujc komrki jednoczenie dwoma zmutowanymi wirusami. Jeeli mutacje dotycz ronych, nieallelicznych genw, wirusy bd mogy przej peny cykl yciowy w zainfekowanej komrce. Klasycznym przykadem bada nad rekombinacj i komplementacj wewntrzgenow s prace S. Benzera nad mutantami rll u bakteriofaga T4. Mutanty r//, w przeciwiestwie do fagw typu dzikiego, nie s zdolne do namnaania si w komrkach szczepu K Escherichia coli, mog natomiast namnaa si w szczepie B, dajc ysinki o innej morfologii ni ysinki typu dzikiego. Benzer otrzyma kilka tysicy mutantw rll i na podstawie wynikw krzywek midzy nimi sporzdzi dokadn map genetyczn regionu fagowego chromosomu, w ktrym lokoway si mutacje rll. atwo, z jak mona wykrywa rekombinanty typu dzikiego (jedynie one mog namnoy si w szczepie K), umoliwia mu badanie rekombinacji zachodzcej z czstoci nisz nawet ni 0,001%. Map genetyczn caego obszaru przedstawion na rysunku 1.10. Na mapie tej naniesiono pozycje wszystkich mutacji punktowych. Jak wida, wiele z nich nie rekombinowao midzy sob, mona byo wic przyj, e w tych przypadkach mutacje zaszy dokadnie w tym samym miejscu czsteczki DNA. Obszar rll liczy sobie 6 jednostek mapowych. Czy zawiera on jeden, czy te wicej genw? Odpowied na to pytanie mona uzyska wykonujc test na komplementacj, polegajcy na infekowaniu komrek szczepu K jednoczenie dwoma mutantami rll. Pojawienie si ysinek typu dzikiego (ze znacznie wiksz czstoci ni wynikaoby to z zajcia rekombinacji) dowodzioby, e komplementacja zachodzi, a wic mamy do czynienia z mutacjami rnych genw. Test na komplementacj pozwoli na podzielenie mutantw rll na dwie grupy, A i B. Mutanty A nie komplementoway ze sob a komplementoway z mutantami B, podobnie jak mutanty B, ktre nie komplementoway ze sob a komplementoway z mutantami A. Mutanty A i B lokuj si w dwch rnych, ssiadujcych ze sob, odcinkach obszaru rll (p. rys. 1.10). Mamy wic w tym przypadku do czynienia z dwoma odrbnymi genami. Benzer wprowadzi termin cistron" jako synonim pojcia genu rozumianego jako jednostka funkcji okrelonej na podstawie testw na komplementacj midzy mutacjami w ukadzie cis i trans. Mutacje jednego genu nie komplemen-

HL?JiL j T?TT 1 T?T m i

1 1 ?? 1 1 1 1 1 1- 1 4

- TTT+

TlF.m.P

W* 4

' 'lilJl

**

TT t l t f H

r r 'r r 'r 'rw

Im1mi

y
f +

fj?g|

MfFill i

Rys. 1.10. Mapa genetyczna obszaru rll faga T4. Kady kwadracik oznacza jedn zmapowan w tym obszarze mutacj. Wszystkie mutacje maj identyczny fenotyp: niezdolno do rozwoju faga w komrkach szczepu K E. coli. Podziau caego obszaru na dwa geny A i B dokonano badajc zdolno do komplementacji poszczeglnych par mutantw

tuj w ukadzie trans a komplementuj w ukadzie cis, podczas gdy mutacje dwch rnych genw komplementuj w obu ukadach (p. rys. 1.9). Brak komplementacji midzy mutacjami jednego genu nie jest regu bez wyjtkw, istnieje bowiem zjawisko komplementacji wewntrzgenowej. Zjawisko to dotyczy genw kodujcych biaka, ktre s aktywne w formie multimerw, tj. czsteczek zoonych z dwch lub wicej identycznych podjednostek (polipeptydw). Jeeli w komrce wystpuj dwie kopie genu, z ktrych kada jest zmutowana w innym miejscu, to powstajce biako jest zoone z podjednostek dwch rodzajw, rnicych si midzy sob (i od podjednostek typu dzikiego), np. jednym podstawieniem aminokwasowym. Zdarza si, e w takim przypadku zmiana w jednej podjednostce kompensuje defekt" drugiej podjednostki i powstaje czsteczka o waciwej konformacji, zdolna do speniania swojej funkcji, np. enzymatycznej. Taka kompensacja jest oczywicie niemoliwa, gdy wszystkie podjednostki s zmienione w tej samej pozycji. Komplementacja wewntrzgenowa jest zjawiskiem stosunkowo rzadkim i dotyczy tylko bardzo nielicznych mutacji danego genu.

1.8. Analiza genetyczna bakterii Podstawow metod analizy genetycznej u wyszych organizmw jest krzyowanie i badanie czstoci rekombinacji zachodzcej w czasie mejozy. U bakterii procesy pciowe i wymiana materiau genetycznego midzy osobnikami ma zupenie inny charakter, std te metody analizy genetycznej s cakowicie rne. Z kilku powodw warte s chocia krtkiego omwienia. Przede wszystkim bakterie, a zwaszcza E. coli, stanowi jeden z najwaniejszych obiektw prac genetycznych. Wiele podstawowych koncepcji genetycznych, jak choby rola DNA w dziedziczeniu czy te pierwsze modele regulacji genetycznej, byy wynikiem prac nad bakteriami. Rwnie wakie znaczenie miay prace nad wirusami bakteryjnymi (bakteriofagami), takimi jak 7, lambda (2) i innymi. Znane s trzy systemy wymiany informacji genetycznej midzy bakteriami: koniugacja, transformacja i transdukcja. Kady z nich wystpuje w naturze, aczkolwiek tylko u niektrych rodzajw bakterii i zachodzi jedynie w okrelonych warunkach. Wszystkie rni si od procesw wymiany informacji genetycznej wystpujcych u wyszych organizmw tym, e wkad genetyczny rodzicw nie jest jednakowy. Zwykle tylko niewielka cz materiau genetycznego z jednej komrki (dawcy) zostaje wczona do aparatu genetycznego drugiej komrki (biorcy), tote rekombinanty zachowuj wikszo cech jednego z rodzicw (biorcy). Ponadto, u bakterii nie ma bezporedniego zwizku midzy procesami wymiany informacji genetycznej a procesem rozmnaania si.

1.8.1. K o n i u g a c j a

Materia genetyczny bakterii jest zorganizowany w postaci chromosomu zawierajcego jedn kolist czsteczk DNA, ktra w przypadku E. coli ma dugo 1,3 mm, co odpowiada 4 min par zasad. W czsteczce tej mieszcz si wszystkie lub ogromna wikszo genw bakterii. Niewielka cz (mniej ni 1 %) genw moe znajdowa si w czsteczkach DNA, zwanych plazmidami, replikujcych si niezalenie od chromosomu. Zjawisko wymiany materiau genetycznego midzy komrkami E. coli, zwane koniugacj, zostao wykryte w roku 1946 przez J. Lederberga. Jego pniejsze prace, a take prace innych badaczy, wykazay, e proces wymiany zachodzi jednokierunkowo: geny bakterii, okrelanych jako F + , s przekazywane bakteriom F~, przy czym te ostatnie staj si bakteriami F + . Ustalono, e rnica midzy komrkami F + i F " polega na wystpowaniu w komrkach
geny typu dzikiego

przemieszcza si do komrki biorcy

J przerwanie koniugacji

komrka biorcy jest obecnie o + b c Rys. 1.11. Koniugacja pomidzy bakteriami Hfr i F

F~ plazmidu F. Plazmid ten zawiera okoo trzydziestu genw, wrd ktrych wystpuje grupa genw tra, odpowiedzialnych za wytwarzanie tzw. pili pciowych i przekazywanie (transfer) samego plazmidu oraz fragmentw chromosomu z komrek F + do F " . W sporzdzaniu map genetycznych bakterii najistotniejsz rol odegray tzw. szczepy Hfr (skrt od ang. high freuency of recombination). W szczepach tych plazmid F jest zintegrowany z chromosomem bakterii. Mechanizm integracji jest podobny do obserwowanego w przypadku rekombinacji faga 1 z chromosomem E. coli. W przypadku koniugacji komrek F + z komrkami F " z niewielk czstoci dochodzi do przekazania fragmentu chromosomu bakteryjnego, natomiast w przypadku koniugacji Hfr z F~ w zasadzie zawsze omrka biorcy uzyskuje jaki fragment chromosomu dawcy. Dzieje si tak dlatego, e chromosom bakteryjny pka tu obok miejsca integracji plazmidu F i jest sukcesywnie przekazywany do komrki biorcy (rys. 1.11). Dugo przekazanego fragmentu chromosomu jest zalena od czasu trwania poczenia niedzy par koniugujcych ze sob komrek. Zwykle komrki te rozczaj si

thr

Rys. 1.12. Mapowanie genw za pomoc koniugacji przerywanej. Bakterie uytego szczepu Hfr (dawca) miay dzikie allele genw thr, lac, gal i trp. Bakterie F~ miay mutacje w tych genach i byy oporne na streptomycyn, podczas gdy szczep Hfr by wraliwy na ten antybiotyk. Koniugacj przerywano po okrelonym czasie i prbki bakterii wysiewano na poywk zawierajc streptomycyn (aby nie wyrosy bakterie Hfr) i odpowiednie uzupenienia pokarmowe (aby sprawdzi czy pojawiy si bakterie szczepu biorcy, ktre uzyskay poszczeglne dzikie allele genw ze szczepu dawcy). Wykres obrazuje kinetyk pojawiania si poszczeglnych rekombinantw. Na podstawie takiego wykresu mona zaznaczy pooenie badanych genw na kolistej mapie genetycznej E. coli. Jednostk odlegoci pomidzy genami s w tym przypadku minuty

zanim dojdzie do przekazania caego chromosomu, do czego niezbdna jest koniugacja trwajca 90 min. Proces przekazywania chromosomu bakteryjnego zosta wykorzystany do mapowania genw E. coli. Przeprowadza si koniugacj midzy danym szczepem Hfr (rne szczepy Hfr maj odmienne, ale okrelone miejsca integracji plazmidu F) i szczepem F~, przerywajc j po okrelonym czasie i ustalajc, ktre z genw Hfr zostay przeniesione do komrek biorcw. Przykad mapowania genw za pomoc techniki przerywanej koniugacji jest przedstawiony na rysunku 1.12. W wyniku dowiadcze tego typu uzyskuje si informacje o wzajemnym pooeniu genw na chromosomie bakteryjnym i o odlegociach midzy genami, przy czym te ostatnie s wyraone w minutach. Przeniesienie fragmentu chromosomu z komrki Hfr do komrki F " nie oznacza jeszcze tego, e w komrce F~ bd ulegay ekspresji wprowadzone do niej w tym fragmencie chromosomu geny i e komrka nabdzie warunkowane przez te geny cechy fenotypowe. Aby to si stao, wprowadzony fragment chromosomu musi zintegrowa si z chromosomem bakterii, zastpujc odpowiedni fragment homologiczny (rys. 1.13).

nS-EZSFGS
V
infekcja komrki dawcy (a+)

/t

/3:ITTT

s 7\

, /TT
V

k\

replikacja DNA faga i rozpad chromosomu bakteryjnego

powstanie dojrzaych czstek fagowych, niektre z nich maj fragment DNA bakterii zamiast wasnego DNA

infekcja komrki biorcy (a" fagiem przenoszcym bakteryjny DNA

w wyniku podwjnego crossing-over fragment DNA z genem a + zostaje wczony do chromosomu biorcy Rys. 1.13. Transdukcja oglna

komrka biorcy staje si a+

1.8.2. Transformacja

Transformacja polega na pobieraniu przez komrki bakteryjne nagiego" DNA z podoa. Niektre gatunki bakterii nalece do rodzajw BaciUus i Haemophilus maj zdolno wydajnego pobierania DNA. Inne, do ktrych naley E. coli, mona transformowa w warunkach laboratoryjnych, poddajc ich komrki odpowiednim zabiegom zmieniajcym waciwoci bon komrkowych i doprowadzajcych komrki do stanu tzw. kompetencji. Zjawisko transformacji wykorzystuje si do badania sprze midzy genami przez ustalanie czstoci kotransformacji dwch genw. Im bliej siebie pooone s geny, tym wiksza szansa na przeniesienie ich do komrki biorcy w jednym fragmencie DNA i ich integracj z chromosomem w wyniku podwjnego crossing-over.
1.8.3. Transdukcja

Transdukcja polega na wymianie DNA midzy bakteriami za porednictwem wirusw bakteryjnych (inaczej: bakteriofagw lub fagw). Wyrniamy dwa typy transdukcji, ogln i ograniczon. Przykadami fagw wywoujcych transdukcj ogln s fag Salmonella typhimurium P22 i fag E. coli PL W czasie namnaania si fagw w komrkach bakterii wytwarzane s oddzielnie czsteczki DNA i otoczki biakowe, ktre cz si ze sob w kocowym stadium cyklu rozwojowego faga. Jednoczenie dochodzi do fragmentacji chromosomu bakteryjnego. Fragment chromosomu moe by zapakowany" w otoczk biakow zamiast lub razem z czsteczk DNA, stanowic genom faga. Czstka fagowa zawierajca DNA bakteryjny nadal ma waciwoci infekcyjne i moe przenie DNA do nastpnej komrki, w ktrej zostaje on wczony do genomu w wyniku crossing-over (rys. 1.13). Wielko fragmentu DNA przenoszonego przez faga P22 wynosi nie wicej ni 40 tysicy par zasad, co odpowiada wielkoci genomu faga. Stanowi to ok. 1% genomu bakteryjnego. Kotransdukcja, czyli jednoczesne przeniesienie z komrki dawcy do komrki biorcy dwch lub wicej genw, wiadczy wic o ich bardzo bliskim sprzeniu. Mapowanie genw za pomoc transdukcji nie moe wic suy do sporzdzania oglnej mapy genomu bakteryjnego, natomiast znakomicie nadaje si do ustalania sprze midzy genami znajdujcymi si w bliskim ssiedztwie. Za pomoc faga P22 mona przenie z komrki dawcy do komrki biorcy dowolny fragment chromosomu bakteryjnego, std te w takich przypadkach mwimy o transdukcji oglnej. Z inn sytuacj mamy do czynienia w przypadku fagw, ktre maj zdolno wczania si w cile okrelone miejsce chromosomu bakteryjnego. Najlepiej znanym przykadem takiego faga jest rozwijajcy si w komrkach E. coli fag X. Fag X naley do grupy tzw. agodnych fagw, co oznacza, e oprcz cyklu litycznego polegajcego na namnoeniu si czstek fagowych i zniszczczeniu komrki, moe zachodzi cykl lizogeniczny, w ktrym DNA faga integruje si

z chromosomem bakterii i w postaci tzw. profaga jest powielany zgodnie z cyklem podziaowym chromosomu gospodarza. Integracja zachodzi preferencyjnie w okrelonym miejscu chromosomu bakteryjnego, w pobliu genu gal Proces wycinania si profaga z chromosomu nastpuje z pewn czstoci, ktr mona znacznie podwyszy dziaajc na komrki okrelonymi czynnikami, np. promieniowaniem UV. Proces ten moe przebiega nieprecyzyjnie, w tym sensie, e wyciciu podlega DNA profaga wraz z ssiadujcym fragmentem chromosomu. Nastpuje normalny cykl lityczny, w wyniku ktrego powstaj czstki fagowe zawierajce w swoim genomie okrelony gen bakteryjny. Gen ten moe by przeniesiony do kolejnej komrki, do ktrej wniknie fag i moe zosta wczony do jej genomu razem z genomem faga (rys. 1.14). Mechanizm rekombinacji midzy genomem faga a genomem bakterii zostanie szczegowo omwiony w rozdziale 7.

(b)

,1.

(e)

Rys. 1.14. Transdukcja ograniczona, (a) i (b) Fag X rekombinuje z chromosomem bakterii obok locus genu gal. (c) Fag X wyrekombinowuje nieprawidowo, czego rezultatem jest powstanie defektywnego faga zawierajcego zamiast czci swoich genw fragment chromosomu bakterii z genem gal. (d) i (e) Defektywny fag integruje z chromosomem bakteryjnym na zasadzie rekombinacji pomidzy przenoszonym przez siebie a obecnym w chromosomie genem gal

W wyniku transdukcji ograniczonej przenoszone s geny znajdujce si obok miejsca integracji faga. Jak wspomniano wyej, preferencyjne miejsce integracji faga X jest pooone obok genu gal. Miejsce to mona usun przez mutacje i wtedy fag integruje si w innych miejscach, co pozwala na transdukowanie rwnie innych ni gal genw E. coli. Podobnie jak w przypadku transdukcji oglnej, w czasie transdukcji ograniczonej przenoszone s stosunkowo niewielkie fragmenty genomu bakteryjnego, a zatem kotransdukcja dwch genw wiadczy o ich bliskim pooeniu na chromosomie. Warto zdawa sobie spraw z tego, e zanim powstay techniki inynierii genetycznej, uzyskiwanie fagw przenoszcych okrelone geny bakterii byo jedyn drog wiodc do wyodrbniania genw-i do dzi stanowi dogodn metod konstruowania szczepw bakteryjnych o danym genotypie.

1.9. Nie wszystkie geny lokuj si w chromosomach W czasach rozwoju genetyki klasycznej genetycy zaobserwowali wiele przypadkw dziedziczenia si cech niezgodnie z prawami Mendla i zasadami teorii chromosomowej. Zjawisko to okrelano nazw dziedziczenia cytoplazmatycznego, z tego wzgldu, te niektre cechy byy przekazywane w linii matczynej. Wykrycie obecnoci DNA w mitochondriach i chloroplastach pozwolio na pene wyjanienie caego problemu. W organellach tych znajduj si czsteczki DNA majce zdolno samodzielnej replikacji, niezalenej od replikacji DNA chromosomalnego. W komrkach wystpuje wiele mitochondriw, z ktrych kade ma swj wasny aparat genetyczny w formie kolistej (na og) czsteczki DNA (mtDNA). Wielko czsteczek mtDNA waha si znacznie u rnych organizmw (np. 16,6 tysicy par zasad u czowieka, 84 tysicy par zasad u drody, 570 tysicy par zasad u kukurydzy), ale rnice w wielkoci wynikaj raczej z obecnoci powtarzajcych si sekwencji DNA i sekwencji niekodujcych ni z liczby genw. W mtDNA wystpuj bowiem geny kodujce mitochondrialne tRNA i rRNA oraz niektre podjednostki enzymw acucha oddechowego. DNA chloroplastowy (ctDNA) ma wielko 140195 tysicy par zasad w zalenoci od gatunku i zawiera geny kodujce chloroplastowy rRNA, tRNA i geny dla ok. 50 biaek, w tym niektrych biaek aparatu fotosyntetycznego. Segregacja organelli w czasie podziaw komrkowych jest losowa, nie ma mechanizmw zapewniajcych ich precyzyjny rozdzia, takich jak mitoza czy mejoza, prowadzce zawsze do rozdzielenia chromosomw. W czasie zapodnienia udzia gamet mskiej i eskiej, jako dostarczycieli cytoplazmy wraz z organellami, jest u wielu gatunkw niejednakowy, czsto caa cytoplazma pochodzi wycznie z komrki jajowej. Zdarza si te, e organellarny DNA wniesiony przez jedn z gamet ulega degradacji w zygocie. Taka sytuacja ma miejsce np. w przypadku ctDNA u glonu Chlamydomonas. Z tych powodw

dziedziczenie cech warunkowanych przez geny mieszczce si w organellarnym DNA nie ma mendlowskiego charakteru; nie obserwuje si charakterystycznych stosunkw liczbowych poszczeglnych fenotypw w pokoleniach Ft czy F 2 , a fenotypy potomstwa s rne w krzywkach odwrotnych. Krzywkami odwrotnymi nazywamy np. krzywki Q a x < 5 + a i Q + a x < 5 a . Zjawisko dziedziczenia si cech zalenych od genw nie znajdujcych si w chromosomach nazywa si obecnie dziedziczeniem pozachromosomalnym lub pozajdrowym. Obejmuje ono nie tylko przypadki genw lokujcych si w organellarnym DNA. Zarwno u eukariontw, jak i u prokariontw wystpuj czsteczki pozachromosomalnego DNA, zwane plazmidami. Powyej wspomniano o plazmidach determinujcych pe bakterii. Inne plazmidy bakteryjne determinuj takie cechy, jak oporno na czynniki antybakteryjne, enzymy degradujce niektre zwizki organiczne itp. Wszystkie plazmidy s kolistymi czsteczkami DNA zoonymi z kilku do kilkuset tysicy par zasad. W komrce wystpuje okrelona liczba kopii plazmidw (od jednej do kilkudziesiciu), zalena od mechanizmw kontrolujcych ich replikacj. Niektre z tych mechanizmw bd omwione w rozdziale 3. Spord plazmidw eukariotycznych najbardziej znany jest plazmid 2\i opisany u Saccharomyces cerevisiae. Plazmid ten, podobnie jak niektre plazmidy E. coli, odgrywa wan rol jako wektor stosowany w inynierii genetycznej (p. rozdz. 6).

2. DNA BUDOWA I WACIWOCI

DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) zajmuje wyjtkow pozycj wrd czsteczek chemicznych tworzcych materi oywion. W postaci liniowej sekwencji zasad zapisana jest w DNA informacja o budowie czsteczek biaek 1 RNA, ktre z kolei determinuj kompletn struktur i wszystkie funkcje komrek oraz caych organizmw. Jednoczenie, szczeglna budowa czsteczki DNA umoliwia precyzyjne powielanie informacji genetycznej, bez ktrego nie byoby moliwe rozmnaanie si organizmw i dziedziczenie cech, a zatem i proces ewolucji na Ziemi. 2.1. Wiele cech strukturalnych czsteczki DNA wynika z waciwoci zasad Czsteczka DNA ma posta dugiego, nierozgazionego podwjnego heliksu, ktry tworz dwa uoone przeciwrwnolegle i owijajce si wok siebie acuchy polinukleotydowe. Zbudowane s one z jednostek, zwanych deoksyrybonukleotydami. W skad kadego deoksyrybonukleotydu wchodzi jedna z czterech zasad azotowych wystpujcych w DNA (rys. 2.1), tj. adenina, tymina, guanina lub cytozyna, poczona wizaniem N-glikozydowym z piercieniem pentozowym cukru (2-deoksyrybozy), do ktrego przyczona jest take reszta fosforanowa. W acuchu polinukleotydowym deoksyrybonukleotydy poczone s ze sob wizaniami fosfodiestrowymi, wystpujcymi midzy atomem wgla 5' jednej reszty cukrowej a atomem wgla 3' reszty cukrowej, ktra z ni ssiaduje (rys. 2.2). Nierozpuszczalno zasad azotowych w wodzie o obojtnym pH, a jednoczenie dobra rozpuszczalno w tych warunkach deoksyrybozy z przyczon reszt fosforanow wymuszaj okrelon konformacj duych czsteczek

tymina (T)
H

adenina (A)
H

c,
HC

o
NH

V
N^S'
H^N' /
-N cukier guanina (G) Rys. 2.1. Zasady azotowe wystpujce w DNA

r \

C H

/w ^
cukier O cytozyna (C)
H H

I ,CC /

NH

// HC
\

\N
/

N I k N II ^ Y> - H
cukier

NC

/ cukier

\ O

DNA. Aby czsteczki takie mogy by stabilne w obojtnych roztworach wodnych, musz one utworzy cile upakowan struktur, wewntrz ktrej znale si powinny wszystkie elementy nierozpuszczalne w wodzie, tj. zasady, na zewntrz za elementy rozpuszczalne w wodzie, tj. czsteczki cukru _\ 0
0P0CH2 I 0 koniec 5' 0 I 0==po CH 2 o, o
H

zasada

wizanie 3 -fosfodiestrowe zasada

H

0 wH
0P0CH2
I o 1 zasada
H HC

wizanie 5 -fosfodiestrowe
OH H

koniec 3'

0=POCH2

zasada

OH H

Rys. 2.2. Deoksyrybonukleotyd i fragment acucha polinukleotydowego

i reszty fosforanowe. Badania krystalograficzne wkien DNA wykazay, e s o t n i e przyjmuj one tego typu struktur. W fizjologicznej sile jonowej struktura ta ma posta regularnego heliksu o rednicy 2 nm i dugoci skoku 3,4 nm. Heliks DNA mona porwna do skrconej spiralnie drabiny, ktrej szczeble (hydrofobowe wntrze) tworz oddziaujce ze sob zasady, natomist pionowe listwy (polarne krawdzie) stanowi poczone wizaniami fosfodiestrowymi czsteczki deoksyrybzy. Konieczno spiralnego skrcenia caej struktur}' staje si oczywista, gdy porwna si wymiary poszczeglnych elementw

Sjs. 2.3. Drabina DNA utworzona przez dwa acuchy polinukleotydowe; zaznaczono wymiary poszczeglnych elementw

deoksyrybonukleotydw (rys. 2.3). Odlego midzy ssiadujcymi czsteczkami pentozy wynosi 0,6 nm natomist grubo paskich piercieni zasad 0,33 nm. Gdyby dwa acuchy polinukleotydowe tworzyy prost drabin, midzy ssiadujcymi w warstwach piercieniami zasad istniaaby pusta szczelina o gruboci 0,27 nm. Poniewa przestrzeni tej, ze wzgldu na silnie hydrofobowy charakter zasad, nie mog zaj czsteczki wody, musi ona by zlikwidowana lub wypeniona przez jak inn czsteczk o waciwociach hydrofobowych (np. czsteczk bromku etydyny), aby caa struktura bya stabilna. Skrcenie w stosunku do siebie (wok osi pionowej) warstw utworzonych przez paszczyzny zasad powoduje, e puste szczeliny midzy nimi zostaj zlikwidowane (rys. 2.4). W hipotetycznym heliksie zbudowanym tak, by midzy paszczyznami zasad nie wystpoway szczeliny, kt skrcenia ssiadujcych warstw wynosi 32,3, co stanowi 1/11 penego obrotu (360/32,3). Na jeden peny obrt heliksu powinno zatem przypada 11 par zasad. Warto ta jest zgodna z danymi dowiadczalnymi, uzyskanymi dla rnych form podwjnego heliksu DNA (formy te opisane s bardziej szczegowo w dalszej czci rozdziau).

Rys. 2.4. Uoenie zasad w warstwach w prostej i spiralnie skrconej drabinie. Skrcenie wok osi pionowej powoduje likwidacj szczeliny midzy warstwami

Liczba par zasad przypadajca na jeden peny obrt heliksu wynosi 10,5 dla formy B, 11 dla formy A i 12 dla formy Z. W jaki sposb wyznacza si tak dokadnie te wartoci? Dane o wymiarach podwjnego heliksu DNA pochodz z jednej strony z bada krystalograficznych, z drugiej za, z analizy sposobu przecinania DNA w roztworze przez nukleazy bd zwizki generujce wolne rodniki oraz, w przypadku kolistych czsteczek DNA, z analizy topoizomerw. Badania krystalograficzne wykonuje si obecnie nie na populacjach heterogennych czsteczek DNA, jak w latach 50. i 60., lecz na homogennych pod wzgldem wielkoci i sekwencji oligonukleotydach. Wyniki tych bada wskazuj, e oligonukleotydy zawierajce rne sekwencje zasad maj w wikszoci struktur zblion do formy B DNA (10,5 par zasad na skrt). Silny wpyw na struktur DNA maj warunki krystalizacji. Odwodnienie wkna powoduje, e DNA przyjmuje struktur typu A (11 par zasad na skrt). Form Z (heliks lewoskrtny 12 par zasad na skrt) przyjmuj w roztworze o wysokiej sile jonowej charakterystyczne sekwencje zoone z naprzemiennie wystpujcych po sobie G i C. Badanie struktury DNA w roztworze wodnym (w warunkach fizjologicznych) za pomoc analizy wzoru przecinania wymaga uprzedniego unieruchomienia czsteczki DNA na paskiej powierzchni. Czsteczki DNA ulegaj atwo adsorpcji, np. na powierzchni krysztaw fosforanu wapnia. Adsorpcja powoduje, e jedna strona podwjnego heliksu jest niedostpna dla czynnikw dziaajcych w roztworze, druga za pozostaje eksponowana. Maksymalnie eksponowane miejsca podwjnego heliksu s najbardziej naraone na przecinanie. Ze wzgldu na periodyczn struktur DNA, miejsca takie powtarzaj si co peen obrt spirali. Ich rozkad wyznacza zatem dugo skoku podwjnego heliksu. Do przecinania DNA zaadsobowanego na staych powierzchniach stosuje si czsto enzym DNaz I (stosunkowo mao specyficzny w stosunku do sekwencji zasad) lub kompleksy elaza z EDTA. Te ostatnie redukuj nadtlenek wodoru, uwalniajc silnie reaktywne rodniki hydroksylowe, ktre

DNaza I lub rodniki hydroksylowe (preferencyjne miejsca cicia)

Rys. 2.5. Wyznaczanie skoku podwjnego heliksu DNA za pomoc analizy produktw powstajcych w wyniku dziaania DNazy I lub rodnikw hydroksylowych. (a) Unieruchomienie czsteczki DNA na paskiej powierzchni (np. na krysztaach fosforanu wapniowego) powoduje, e na atak nukleazy lub wolnych rodnikw najbardziej naraone s maksymalnie eksponowane miejsca znajdujce si po jednej stronie heliksu. (b) Analiz produktw degradacji D N A (po ich uprzedniej denaturacji) przeprowadza si za pomoc elektroforezy w elu poliakrylamidowym. Odlegoci midzy najsilniejszymi prkami wyznaczaj skok podwjnego heliksu

W7/. j - start

(b)
liczba par zasad na skok heliksu kierunek elektroforezy

pierwsza para p L zasad

powoduj rozpad wiza w piercieniach pentozowych deoksyrybonukleotydw. Produkty powstae po dziaaniu DNazy I lub rodnikw hydroksylowych na DNA denaturuje si i rozdziela za pomoc elektroforezy w elu poliakrylamidowym. Odlegoci midzy najbardziej intensywnymi prkami odpowiadaj skokowi podwjnego heliksu (rys. 2.5). Za pomoc tej samej metody mona wyznaczy skok podwjnego heliksu w czsteczce DNA oddziaujcej z innymi powierzchniami, np. z powierzchni histonowej czstki rdzeniowej w nukleosomie. Niezalena metoda pomiaru skoku podwjnego heliksu opiera si na analizie liczby topoizomerw zamknitych (kolistych) czsteczek DNA o okrelonej dugoci. Metoda ta zostanie bliej opisana w dalszej czci rozdziau. Pomiary wykonane dla DNA w roztworze wskazuj, e i w tych warunkach na peny skok heliksu przypada okoo 10,5 par zasad. Szkielet fosforanowo-cukrowy DNA jest elastyczny. Zawdzicza to swobodzie rotacji podstawnika cukrowego wok wizania PO (rys. 2.6). Wan konsekwencj tej cechy szkieletu jest moliwo zmiany stopnia skrcenia podwjnego heliksu DNA. Na przykad, zmiana taka ma miejsce w wyniku oddziaywania DNA z bromkiem etydyny. Czsteczki tej substancji s silnie hydrofobowe, maj przy tym wymiary zblione do wymiarw pary komplementarnych zasad, a wnikajc midzy warstwy zasad wymuszaj utworzenie midzy nimi szczeliny (o ktrej wspomniano wyej), a co za tym idzie rozkrcenie podwjnego heliksu. Po interkalacji bromku etydyny czsteczka

Rys. 2.6. Szkielet fosfocukrowy jest elastyczny, poniewa podstawniki cukrowe maj swobod rotacji wok wizania OP

DNA przyjmuje posta niemal prostej drabiny. Ze wzgldu na ten charakterystyczny efekt, bromek etydyny jest wanym narzdziem do badania zmian struktury DNA zwizanych z rozkrcaniem" podwjnego heliksu. Naturalne heliksy DNA s prawoskrtne; acuchy polinukleotydowe, wyduajc si, okrcaj si wok siebie w kierunku zgodnym z ruchem wskazwek zegara. Prawoskrtno podwjnego heliksu DNA jest konsekwencj wielkoci i przestrzennego uoenia atomw w deoksyrybonukleotydach. Tylko prawoskrtno umoliwia powstanie stabilnej, regularnej struktury przestrzennej DNA (mona to wykaza prbujc zbudowa heliks lewoskrtny za pomoc czaszowych modeli deoksyrybonukleotydw). Nie oznacza to jednak, e nie mog istnie lewoskrtne heliksy DNA. Udaje si je otrzyma sztucznie dla krtkich odcinkw DNA o charakterystycznych sekwencjach zasad. Tego rodzaju struktur jest DNA w formie Z. Ma on posta lewoskrtnego heliksu o skoku liczcym 12 par zasad. Jak wykazuj badania krystalograficzne DNA w formie Z, lewoskrtny heliks jest struktur znacznie mniej regularn ni heliks prawoskrtny. Struktur podwjnego heliksu DNA utrzymuj oddziaywania midzy zasadami. W naturalnie wystpujcym DNA s to oddziaywania midzy A i T oraz midzy-G i C. Wymienione zasady tworz pary AT i GC, zwane parami Watsona-Cricka. Ze wzgldu na to, e cztery moliwe formy par Watsona-Cricka (AT, TA, GC i CG) maj identyczne wymiary, poczynione pierwotnie przez Watsona i Cricka zaoenie, e pary takie wystpuj w DNA dobrze pasowao do "danych strukturalnych wskazujcych na jednolit rednic podwjnego heliksu. Na istnienie par Watsona-Cricka wskazyway take dane o identycznej zawartoci adeniny i tyminy oraz guaniny i cytozyny w DNA z rnych organizmw. Charakterystyczne uoenie zasad w parach typu Watsona-Cricka (np. 2.7(a)) nie jest jednak jedynym, jakie moe wystpowa midzy oddziaujcymi ze sob A i T oraz G i C. Na rysunku 2.7(b) przedstawiono oddziaywania wystpujce w parach typu Hoogsteena (Karst Hoogsteen by pierwszym, ktry wykaza, e w krysztaach zoonych

[Cj

CH

(b)

cukier cukier A
H

cukier

T
H H

T
H

cukier cukier O cukier C

Jim. 2.7. Pary typu Watsona-Cricka (a) i typu Hoogsteena (b). Kropkami zaznaczono wizania waorowe midzy atomami wodoru obdarzonymi czstkowym adunkiem dodatnim ( + ) , a atomami tlenu lub azotu obdarzonymi czstkowym adunkiem ujemnym ()

z adeniny i tyminy wygld pary AT jest inny ni przewidywali Watson i Criek). Badania strukturalne naturalnych czsteczek DNA wykazay, e wySEpej w nich wycznie pary typu Watsona-Cricka. Skoro mog istnie ifternatywne formy par AT i GC, dlaczego nie wystpuj one w naturalnych DNA? Gwn przyczyn jest niestabilno pary GC typu Hoogstea a w fizjologicznym pH. Utworzenie tej pary wymaga protonacji jednego z atomw azotu cytozyny, co jest moliwe dopiero po obnieniu pH do 4-5. ftra ta ma przy tym tylko dwa wizania wodorowe, jest wic mniej stabilna od pary GC typu Watsona-Cricka. Oddziaywania typu Hoogsteena, aaimo e najprawdopodobniej nie wystpuj w podwjnym heliksie DNA, odgrywaj bardzo wan rol przy tworzeniu tzw. potrjnego heliksu, sEmktury, w ktrej do fragmentu podwjnego heliksu DNA przyczony jest, omplementarny do jednej z nici, trzeci acuch polinukleotydowy. Oddziauje on z podwjnym heliksem DNA, tworzc pary typu Hoogsteena. Szmczne indukowanie struktury potrjnego heliksu w okrelonych rejonach DNA za pomoc syntetycznych, komplementarnych do wybranych sekwencji, s m d jest obiecujc metod selektywnej ingerencji w ekspresj aparatu genetycznego. Oddziaywania typu Hoogsteena wystpuj take w kompleksach midzy DNA a wieloma lekami o dziaaniu przeciwnowotworowym. Wiedza o potencjalnych moliwociach powstawania par typu Hoogsteena w rnych rejonach DNA ma kapitalne znaczenie dla opracowania lekw, oddziaujcych w cile okrelonym miejscu genomu.

Oprcz oddziaywa typu Hoogsteena oraz wystpujcych w parach typu Watsona-Cricka moliwe s take oddziaywania prowadzce do powstania par nietypowych, np. GT lub AC. Wystpuj one np. w kompleksach midzy zasadami w mRNA a trzeci zasad antykodonu w tRNA. Zjawisko to warunkuje wystpujcy w procesie translacji efekt tolerancji w trzeciej zasadzie kodonu. Teoretycznie takie nietypowe pary mogyby istnie take w DNA. Powoduj one jednak wyrane zaburzenie regularnej struktury podwjnego heliksu; s w zwizku z tym atwe do wykrycia przez komrkowe systemy naprawcze, ktre potrafi je wydajnie usuwa.

2.2. Lokalna sekwencja zasad w DNA wywiera silny wpyw na konformacj i waciwoci podwjnego heliksu Jednym z podstawowych celw bada strukturalnych nad DNA i kompleksami DNA z rnymi Ugandami jest wyjanienie na poziomie molekularnym podoa specyficznoci oddziaywa DNA z innymi makroczsteczkami, przede wszystkim biakami. Wiemy, e lokalne sekwencje zasad w DNA determinuj specyficzno oddziaywa z takimi biakami, jak represory i aktywatory transkrypcji, polimerazy RNA, nukleazy (np. nukleazy restrykcyjne), a nawet kompleksy histonw w nukleosomach. Co jednak fizycznie okrela specyficzna sekwencja zasad: uoenie w odpowiednim porzdku miejsc wizania dla reszt aminokwasowych, lokaln geometri podwjnego heliksu, czy elastyczno umoliwiajc dostosowanie si do krzywizny powierzchni biaka? 2.3. Na powierzchni podwjnego heliksu wystpuj dwie bruzdy Na powierzchni podwjnego heliksu DNA przebiegaj, owijajc si spiralnie wok podunej osi, dwie rwnolege bruzdy (rowki). W przypadku DNA w formie B jedna z bruzd, o rednicy okoo 2,2 nm, nazywana jest wiksz druga za, o rednicy okoo 1,2 nm mniejsz. Asymetria bruzd wynika z faktu, e piercienie pentozowe cukrw le bliej jednego z dwch duszych brzegw kadej z komplementarnych par zasaci (rys. 2.8). Brzeg bliszy czsteczkom cukrw tworzy dno mniejszej bruzdy, brzeg przeciwny stanowi dno wikszej bruzdy. Naley jednak pamita o tym, e geometria bruzd zaley od formy, jak przyjmuje podwjny heliks. Na przykad w przypadku podwjnego heliksu w formie A, obie bruzdy maj identyczne wymiary. Bruzdy s tymi obszarami w czsteczce DNA, przez ktre inne czsteczki mog uzyska dostp do wntrza podwjnego heliksu. Wymiary i geometria bruzd stanowi wic bardzo wany element rozpoznawczy dla czcych si z DNA ligandw. W dalszej czci opisane zostan czynniki, od ktrych zaley lokalna geometria bruzd.

(nl

strona wikszej bruzdy

(b)
2,2 nm wiksza bruzda skok heliksu 3,A nm (0,5 par zasad) 1,2 nm mniejsza bruzda

2 nm Sys. 2.8. Mniejsza i wiksza bruzda na powierzchni DNA. (a) Asymetria uoenia czsteczek eiirw w stosunku do krawdzi zasad jest przyczyn rnych wymiarw bruzd, (b) Bruzdy w DNA w formie B schemat

2.4. Parametry suce do opisu lokalnej struktury podwjnego heliksu W odrnieniu od czsteczek biaka, ktre w zalenoci od sekwencji aminokwasw mog przyjmowa rne formy przestrzenne, generalny typ struktury przestrzennej DNA, podwjny heliks, jest taki sam bez wzgldu na sekwencj zasad. Tylko bardzo dokadne badania, a w szczeglnoci analiza rentgenowska fragmentw DNA o okrelonej sekwencji, ujawniaj w strukturze podwjnego heliksu zakcenia i odstpstwa od regularnoci, wynikajce z cech lokalnego ukadu zasad. Najwaniesz z tych cech jest sposb oddziaywania ssiadujcych warstw zasad (ang. stacking). Drew i Calladine (Cambridge, Anglia) zaproponowali metod cisego opisu lokalnej struktury podwjnego heliksu za pomoc niewielkiej liczby parametrw, okrelajcych relacje ssiadujcych warstw zasad. Na rysunku 2.9. pokazano, jakie parametry opisuj wzajemne uoenie dwch prostopadociennych blokw wyobraajcych ssiadujce warstwy zasad w podwjnym heliksie DNA. T (ang. twist) okrela kt skrcenia

(b) R
(obrt) Rys. 2.9. Podstawowe parametry okrelajce uoenie wzgldem siebie ssiadujcych warstw zasad w podwjnym heliksie D N A

(C)

(przesunicie)

w stosunku do siebie paszczyzn wok podunej osi heliksu. R (ang. roli) okrela kt rozchylenia ssiadujcych paszczyzn wzgldem osi podunej, natomiast S (ang. slide) wskazuje wielko przesunicia w stosunku do siebie, wzgldem osi podunej, paszczyzn zasad w warstwach. W czsteczce DNA w formie B kt T wynosi okoo 34, wiadomo jednak, e jest to warto uredniona dla caej czsteczki. Lokalnie kt T moe przybiera inne wartoci. W idealnej, prostej czsteczce w formie B warto R powinna by bliska 0, wiadomo jednak, e lokalnie moe ona wynosi od +20 do 10 (znak + " oznacza, e zasady rozchylaj si w kierunku mniejszej bruzdy, znak " oznacza, e rozchylaj si w kierunku wikszej bruzdy). Wielko przesunicia (S) jest silnie ograniczona przez acuch fosforanowo-cukrowy i moe wynosi od +0,2 nm do 0,1 nm (znak + " oznacza w tym przypadku przesunicie grnej warstwy w prawo w stosunku do dolnej, patrzc od strony mniejszej bruzdy). Do podanego opisu, ktry traktuje pary zasad jak sztywne jednolite bloki, naley doda jeszcze jedn istotn cech zasad w komplementarnej parze. Jest ni moliwo wystpowania w pojedynczej parze skrcenia migowego (ang. propeller-twist) paszczyzn zasad w stosunku do siebie (ryc. 2.10). Przyczyn skrcenia migowego zasad w pojedynczej parze jest denie do maksymalnie

Rys. 2.10. Skrcenie migowe zasad w pojedynczej parze

silnych oddziaywa hydrofobowych w ssiadujcych warstwach. Skrcenie to (w DNA moe ono wynosi 10 20) jest przyczyn lekkiego odksztacenia wiza wodorowych czcych zasady. Zaproponowana przez Drewa i Calladine'a metoda precyzyjnego opisu struktury DNA, oparta na geometrycznej analizie oddziaywania midzy ssiadujcymi warstwami zasad, nie pozwala na przewidywanie struktury duych fragmentw DNA na podstawie znajomoci ich sekwencji. Mimo i warstwy utworzone przez konkretne pary, a wic np: AT AT GC GC AT TA CG GC itd.

rni si wartociami R, T i S, a take stopniem skrcenia migowego w poszczeglnych parach, dane rentgenograflczne, pochodzce z analizy dwuniciowych oligodeoksynukleotydw o rnych sekwencjach, wskazuj, e dla kadego typu ssiedztwa zasad w warstwach (a wic, czytajc wzdu jednej nici: GC, CG, GG, CC, AA, AT itd.) istnieje nie jedna, a cay zakres konfiguracji (okrelonych parametrami T, R i S), ktre mog one przyjmowa. Rzeczywista konfiguracja dwch ssiadujcych warstw zaley przede wszystkim od kontekstu sekwencyjnego, w ktrym te warstwy si znajduj. Tym niemniej, posugiwanie si, w celu opisu struktury DNA, parametrami wyznaczajcymi cile relacje midzy ssiadujcymi warstwami zasad, daje dobre (a)
11

(b)

(c)

(d)

R = 0, S=0nm

R0, S =s0,2nm

R=12, S=0 nm

R=12, S = 0,2 nm

Rys. 2.11. Zaleno oglnej konformacji D N A od oddziaywa ssiadujcych warstw zasad. Jeden peny skok podwjnego heliksu dla DNA o staym T = 36 i zmiennych wartociach R i S: (a) odpowiada DNA w formie B, (d) odpowiada DNA w formie A, (b) i (c) stanowi struktury porednie midzy form A i form B. Struktury (b) i (c) wykryto za pomoc analizy rentgenowskiej w naturalnym D N A (wg Calladine C.R. i Drew H. R., za pozwoleniem)

wyobraenie o tym, jak bardzo na lokaln struktur DNA moe wpywa nawet niewielka, lecz powtarzajca si zmiana w oddziaywaniach midzy kolejnymi warstwami. Ilustruje to rysunek (rys. 2.11) przedstawiajcy fragmenty czterech czsteczek DNA (kady o dugoci odpowiadajcej jednemu penemu skokowi heliksu), w ktrych, przy niezmiennym kcie skrcenia midzy warstwami zasad (T = 36), zmieniano kt obrotu R (0-12) i przesunicie S (0 0,2 nm). 2.5. Struktura fragmentw DNA zawierajcych sekwencje bogate w AT Wpyw lokalnej sekwencji na konformacj DNA ujawnia si najwyraniej w przypadku sekwencji bogatych w AT. Analiza krystalograficzna fragmentw DNA o sekwencji d(AAAAAA)d(TTTTTT) wykazuje istnienie silnego skrcenia migowego zasad w parze AT, daleko posunite zwenie mniejszej bruzdy oraz wystpowanie dodatkowego, nietypowego wizania wodorowego midzy zasadami w ssiadujcych warstwach (rys. 2.12).
strona wikszej bruzdy ty mina

-rr*

a c l e n

'

n a

tymina

adenina

Rys. 2.12. Szczeglne cechy ssiadujcych warstw A-T. Widoczne jest silne skrcenie migowe zasad oraz dodatkowe, nietypowe wizanie wodorowe midzy N + adeniny i O" tyminy czce od strony wikszej bruzdy zasady w ssiadujcych warstwach

Konsekwencj istnienia dodatkowego midzywarstwowego wizania wodorowego jest prosty przebieg i znaczna sztywno fragmentw oligo(dA)oligo(dT). Rozkad oddziaywa hydrofobowych midzy warstwami zasad w homopolimerze oligo(dA)oligo(dT) umoliwia cile uporzdkowane uoenie wzdu szkieletu DNA czsteczek wody (co najmniej 2 na kad par nukleotydw). Prowadzi to do wytworzenia krgosupa hydratacyjnego" dodatkowo zwikszajcego sztywno czsteczki. Ma to bardzo powane konsekwencje biologiczne. Na przykad, dugie homopolimery opisanego typu nie mog tworzy nukleosomw, poniewa brak im dostatecznej elastycznoci niezbdnej do owinicia si wok biakowego oktameru, tworzcego rdze tej struktury. Umieszczenie w cigu oligo(dA)oligo(dT) pary GC prowadzi do zaburzenia sztywnoci caego fragmentu i lokalnego rozszerzenia mniejszej bruzdy.

Zupenie odmienne pod wzgldem waciwoci od homopolimerw oligo(dA)oligo(dT) s fragmenty oligo[d(A-T)], tj. fragmenty o sekwencji: ATATATATA TATATATAT ,

gdzie w ssiadujcych warstwach le nad sob na przemian maa pirymidyna (T) i dua puryna (A). Midzy takim warstwami nie dochodzi do maksymalnie silnych oddziaywa hydrofobowych (pocignoby to za sob powane odksztacenie podwjnego heliksu) i usztywnienia struktury. Fragmenty oligo[d(AT)] s w zwizku z tym bardzo elastyczne. cf 2.6. Lokalne sekwencje okrelaj podatno DNA na rozkrcanie i zginanie Lokalne rozkrcenie i denaturacja podwjnego heliksu jest niezbdnym pocztkowym etapem najwaniejszych procesw, w ktrych bierze udzia DNA, tj. replikacji i transkrypcji. Analiza oddziaywa midzy ssiadujcymi warstwami w rnych ukadach zasad pozwala do atwo zidentyfikowa sekwencj, ktrej podatno na rozkrcanie bdzie najwiksza. Powinna ona zawiera raczej pary AT ni GC, poniewa poczone dwoma wizaniami wodorowymi AT s bardziej podatne na denaturacj ni poczone trzema wizaniami GC. Lece naprzemiennie puryna i pirymidyna, tj. ukad: T AT AT ATATA odznaczaj si najnisz spord wszystkich sekwencji stabilnoci, wynikajc z oddziaywania paszczyzn zasad w warstwach (bezporednio nad sob znajduje si tu najmniejsza powierzchnia zasad). W warstwach, w ktrych w jednym acuchu bezporednio nad sob le puryna (adenina) i pirymidyna (tymina) moe w zwizku z tym dochodzi do zmniejszenia kta skrcenia nawet do wartoci T = 28. W porwnaniu z reszt DNA, dla ktrego T = 34, jest to struktura ju czciowo rozkrcona. Do jej dalszego rozkrcenia potrzebna jest zatem odpowiednio nisza energia. W rejonach promotorowych wielu genw (szczeglnie u bakterii) wystpuje charakterystyczna sekwencja skadajca si z cigu uoonych naprzemiennie puryn i pirymidyn, gdzie puryn jest adenina, a pirymidyn tymina. Jest to tzw. kaseta TATA" (ang. TATA-box). Zgodnie z przedstawion analiz waciwoci tego typu sekwencji, wyrnia bdzie si ona spord innych w DNA zwikszon podatnoci na rozkrcanie i denaturacj. Nie wiadomo jeszcze jaka jest dokadnie rola kasety TATA w inicjacji transkrypcji (sekwencja TATA nie wystpuje w promotorach wielu genw eukriotycznych), jest jednak wysoce prawdopodobne, e kluczowe znaczenie ma wanie jej podatno na rozkrcanie i denaturacj.

l i iill

Z punktu widzenia funkcji biologicznych rwnie istotna, jak podatno na rozkrcanie, jest naturalna skonno pewnych fragmentw DNA do zaginania si (ang. bending). Wystpowanie zagi w czsteczkach DNA jest zjawiskiem powszechnym. Istnienie zagitych odcinkw DNA wykazano w genomach wirusw, bakterii i wszystkich badanych pod tym wzgldem przedstawicieli eukariontw. Rozrnienie midzy podatnoci na zaginanie w okrelon stron (np. w wyniku oddziaywania z czsteczk biaka) a naturalnie wystpujcym zagiciem, cechujcym pewne czsteczki DNA w roztworze, bywa w literaturze do pynne. Odkrycie (pod koniec lat 70.) naturalnie zagitych czsteczek DNA nastpio w wyniku badania przyczyn powodujcych niezrozumiae spowalnianie tempa migracji pewnych fragmentw DNA w trakcie elektroforezy w elu poliakrylamidowym. Okazao si, e niektre czsteczki DNA, np. takie, ktre zawieray bakteryjny rejon att (miejsce integracji bakteriofaga X), a take fragmenty restrykcyjne otrzymane po trawieniu minikek mitochondrialnego DNA z Trypanosoma (DNA kinetoplastowy) wykazuj zagicie osi heliksu, ktre jest naturaln waciwoci DNA (nie wynika z oddziaywania z innymi ligandami). Zaginanie si DNA wzdu osi podunej umoliwia jego oddziaywania z wieloma rnymi powierzchniami biakowymi. Klasycznym przykadem kompleksu, ktrego powstaniu sprzyja naturalne zagicie DNA, jest nukleosom. W nukleosomie, ktry jest podstawow jednostk strukturaln chromosomw eukariotycznych, wok zbudowanej z biaek histonowych czstki rdzeniowej owinite s w postaci lewoskrtnego superheliksu (superhelikalne formy DNA opisane s w dalszej czci rozdziau) niemal dwa pene zwoje DNA. Dugo DNA stanowicego jeden zwj wynosi 80 par zasad. Klug i wsppracownicy (Cambridge, Anglia), na podstawie analizy sekwencji kilkuset fragmentw DNA wyizolowanych z oczyszczonych pojedynczych nukleosomw, stwierdzili wystpowanie w nich charakterystycznych preferencji dotyczcych periodycznoci rozmieszczenia okrelonych motyww sekwencyjnych. I tak, motyw: AA TT (ktry zapisywa bdziemy jako AA/TT) rozmieszczony jest preferencyjnie z periodycznoci odpowiadajc skokowi podwjnej spirali w taki sposb, e mniejsza bruzda skierowana jest do wewntrz superheliksu, w stron powierzchni czstki rdzeniowej. Z identyczn preferencj co do periodycznoci, lecz przesunite o 5 par zasad w stosunku do miejsc zajmowanych przez AA/TT i z mniejsz bruzd skierowan na zewntrz, wystpuj dwunukleotydy GC. Wzr rozmieszczenia motyww AA/TT (charakteryzujcych si zwon mniejsz bruzd) i GC powtarza si zatem periodycznie co jeden skok podwjnego heliksu (w nuklesomowym DNA odpowiada to ok. 10,2 par zasad). Ze wzgldu na charak-

terystyczn geometri odcinkw oligo(dA)oligo(dT) rozmieszczenie ich w postaci krtkich sekwencji (4-6 par zasad) w fazie odpowiadajcej skokowi heliksu powoduje zaginanie si DNA w jedn stron. Efekt ten zwizany jest z powtarzajcym si w fazie zweniem mniejszej bruzdy. Tego rodzaju preferencyjne rozmieszczenie motyww sekwencyjnych w DNA jest prawdopodobnie gwnym czynnikiem wyznaczajcym pooenie czstki rdzeniowej w stosunku do sekwencji DNA, czyli tzw. pozycjonowanie nukleosomw. Nukleosomy ukadaj si wic tak, by dopasowa si do mechanicznych waciwoci DNA, a nie do specyficznych sekwencji zasad. Waciwoci mechaniczne podwjnego heliksu determinowane s oczywicie przez okrelone rozmieszczenie zasad. Jest to zatem jeszcze jeden element, ktry naley bra pod uwag w rozpatrywaniu sposobw i kierunkw ewolucji sekwencji DNA. Zaginanie DNA wystpuje take w przypadku jego oddziaywania z biakami innymi ni histony. Jednym z lepiej poznanych przykadw jest tworzenie kompleksu midzy DNA a fagowym biakiem 434" (zwanym te represorem 434), penicym funkcj represora transkrypcji. Sekwencja DNA, ktr rozpo-

Rys. 2.13. Wizanie represora 434 z sekwencj rozpoznajc obejmuje dwa etapy: docking i sondowanie charakterystycznych sekwencji w celu wytworzenia wiza wodorowych midzy resztami argininy a atomami azotu i tlenu w guaninie

znaje represor 434 liczy 14 par zasad i zawiera sekwencj A ATT. Sekwencja ta dziaa podobnie, jak analogiczna sekwencja w DNA nukleosomowym; umoliwia zaginanie si DNA wok czsteczki biaka represora 434. Zmiana tej sekwencji na tak, ktra nie wykazuje szczeglnej podatnoci na zaginanie, np. na sekwencj GGCC, powoduje ok. 300-krotne zmniejszenie powinowactwa represora do caego rozpoznawanego fragmentu DNA. Dopiero po wygiciu rozpoznawanego odcinka DNA, odpowiednie domeny biaka represora mog wyprbowywa" charakterystyczne sekwencje DNA rozmieszczone po obu stronach wygicia (rys. 2.13). W wielu przypadkach rozpoznawanie przez biako (lub innego rodzaju ligand) specyficznej sekwencji DNA przebiega w podobnym do opisanego wyej, dwustopniowym procesie. Najpierw dochodzi do rozpoznania oglnej geometrii DNA (okrelonej np. przez charakterystyczne wygicie) i chwilowego zakotwiczenia ligandu (ang. docking), pniej za nastpuje waciwe sondowanie" ukadu zasad na dnie mniejszej lub wikszej bruzdy. Rozpoznawana sekwencja DNA musi zatem zawiera zarwno informacj geometryczn umoliwiajc docking, jak i odpowiedni ukad zasad odpowiadajcy charakterystycznemu uoeniu podstawnikw w Ugandzie. Ciekawe, e w przypadku wizania si z DNA niektrych specyficznie z nim oddziaujcych biaek (np. represora tryptofanowego z E. coli, ktry czy si z liczcym 186 par zasad odcinkiem operatorowym) w ogle nie dochodzi do tworzenia* wiza wodorowych midzy zasadami a aminokwasami. Specyficzno wizania dimerycznego represora tryptofanowego zaley w caoci od zdolnoci operatora do przyjmowania oglnej konformacji, ktra umoliwia optymalny kontakt z ligandem.

2.7. Architektura DNA a inicjacja transkrypcji Wiele biaek funkcjonujcych jako tzw. czynniki transkrypcyjne (p. rozdz. 8) nie oddziauje ze specyficznymi sekwencjami (np. w rejonie promotora transkrypcji), lecz wywiera efekt przez kontrol konformacji DNA. Biaka te powoduj, e konkretny rejon DNA przybiera okrelon form przestrzenn (architektur), co umoliwia dopiero doczenie innych skadnikw kompleksu transkrypcyjnego. Dobrym przykadem, ilustrujcym dziaanie tego typu architektonicznych" czynnikw transkrypcyjnych, jest dimeryczne biako UBF, czynnik transkrypcyjny specyficzny dla genw kodujcych rRNA duej podjednostki rybosomalnej. Dimer UBF zawiera 10 charakterystycznych domen (tzw. domen HMG) wicych DNA. Kada z domen moe potencjalnie powodowa zagicie heliksu DNA o 130 (jedna domena HMG oddziauje z fragmentem o dugoci 20 par zasad). Rozkad domen w dimerze UBF jest bardzo charakterystyczny i umoliwia wizanie z DNA w taki sposb, e kada z nich oddziauje z rejonami odlegymi o dwa pene skoki heliksu. Poniewa miejsca

wizania w DNA wypadaj w zwizku z tym stale po tej samej stronie heliksu, cay fragment o dugoci ok. 200 par zasad owija si cile wok dimeru UBF. Przypomina to bardzo owinicie DNA wok rdzeniowej czstki nukleosomu. Wymuszenie tego rodzaju architektury DNA suy prawdopodobnie do zblienia i precyzyjnego zorientowania wzgldem siebie (np. co do kierunku przebiegu i stron heliksu) dwch (lub wicej) miejsc wicych inne czynniki transkrypcyjne. W przypadku UBF moe to by czynnik transkrypcyjny, zwany SL1, ktrego dwa miejsca wice (znajduj si one we fragmencie DNA, z ktrym wie si UBF) odlege s od siebie o 120 par zasad. Podobn rol czynnika architektonicznego, determinujcego zdolno do transkrypcji, mog spenia umieszczone w specyficznych miejscach nukleosomy. Na przykad, w rejonie LTR (ang. long terminal repeat) wirusa powodujcego raka sutka u myszy znajduje si specyficznie umiejscowiony nukleosom, ktrego DNA zawiera dwa odlege o 80 par zasad miejsca wizania receptora glukokortykoidw. Miejsca te s zblione i precyzyjnie zorientowane

miejsce wiqqce

Rys. 2.14. Czynniki powodujce zmian architektury DNA. (a) Owinicie D N A wok dimerycznego biaka UBF. (b) Owinicie D N A wok biakowego rdzenia nukleosomu (wg Calladine, Drew, Understanding DNA; The Molecule & How It Works. Academic Press)

w stosunku do siebie na skutek owinicia DNA wok powierzchni nukleosomu. Przypuszcza si, e wanie taka orientacja jest niezbdna do inicjacji przez receptor glukokortykoidw lokalnego rozdysocjowania chromatyny i rozpoczcia transkrypcji. Podobnie, w genie witelogeniny u aby Xenopus laevis pozycjonowany nukleosom umoliwia zblienie rejonw promotorowego oraz enhancerowego i w konsekwencji preinicjacj transkrypcji. Zasad dziaania pozycjonowanych nukleosomw i biaek typu UBF zilustrowano na rysunku 2.14.

2.8. Ptle w DNA W odrnieniu od oddziaywa wymagajcych cisego owinicia DNA wok czsteczki biaka (np. w nukleosomie lub kompleksie z represorem 434) naturalne zagicie, a tym samym charakterystyczne rozmieszczenie sekwencji typu AA/TT, ma znacznie mniejsze (lub adne) znaczenie w przypadku duych ptli, powstajcych na skutek kooperatywnych oddziaywa midzy biakami

(a) biako:

AGtet^O

tetramer

tetramer

(b)

sekwencje wice tetramer

4GPtu >0

(a) + (b)

Rys. 2.15. Tworzenie ptli na skutek kooperatywnego oddziaywania biaek czcych si z odlegymi od siebie rejonami D N A

wicymi si w odlegych od siebie rejonach DNA. Powstawanie tego rodzaju ptli wystpuje np. w przypadku wizania si represora X do lecych zdaa od siebie miejsc operatorowych, w przypadku wielu biaek zwizanych z regulacj transkrypcji u prokariontw (np. represor Lac), a take biaek biorcych udzia w replikacji i rekombinacji DNA (rys. 2.15). Geometria ptli zaley od jej wymiarw (im jest dusza, tym mniejsze zgicie przypada na jedn par nukleotydw), a take od tego, czy miejsce wizania czsteczek biaka znajduje si po tej samej, czy po przeciwnych stronach heliksu. W tym drugim przypadku oprcz zginania DNA potrzebna jest jeszcze zmiana kta skrcenia podwjnego heliksu lub stopnia jego superhelikalnoci.

2.9. Superhelikalne formy DNA Czsteczka DNA, ktrej koce zostay unieruchomione, pod wpywem powstajcych w niej napi torsyjnych moe ulega dodatkowemu (w stosunku do wewntrznego skrcenia podwjnego heliksu) zwiniciu w przestrzeni. W istocie, tylko w praktyce laboratoryjnej mamy do czynienia z niewielkimi

liniowymi czsteczkami DNA o wolnych kocach. Takie czsteczki nie wykazuj oczywicie napi wewntrznych. Te ostatnie, jeli powstaj, s natychmiast neutralizowane przez obrt wolnych kocw czsteczki wok osi podunej heliksu. In vivo DNA rzadko wystpuje w postaci krtkich odcinkw z wolnymi kocami. W komrkach bakterii zarwno gwny chromosomowy DNA, jak i DNA plazmidw nie maj wolnych kocw, ich czsteczki maj form zamknitego koa. W komrkach eukariontw DNA chromosomowy zorganizowany jest w domeny o ksztacie ptli, ktrych podstawy unieruchomione s w macierzy jdrowej. Pojedyncza ptla zachowuje si pod Wpywem napi wewntrznych tak, jak DNA z unieruchomionymi kocami lub DNA kolisty. Przyczyn powstawania napi torsyjnych w czsteczce DNA jest kada zmiana stopnia wewntrznego skrcenia podwjnego heliksu, ktra nie moe by zneutralizowana przez obrt wolnych kocw. W dugich czsteczkach DNA atwo dochodzi do powstania lub utraty kilku skrtw heliksu. Na og jest to uboczny efekt procesw, w ktrych DNA ulega lokalnemu rozpleceniu (np. podczas transkrypcji, replikacji lub naprawy), moe take to wynika z dodania lub wypadnicia nukleosomu. W celu zilustrowania efektw zmiany stopnia skrcenia DNA czsto przytacza si atwe do wykonania dowiadczenie z fragmentem przewodu elektrycznego lub papierowej tamy. Jeeli, unieruchomiwszy jeden z kocw prewodu, skrcimy drugi kilkakrotnie wok osi podunej, a nastpnie poczymy na stae oba koce, to kolisty przewd, zamiast lee pasko na stole, ulegnie zwiniciu w przestrzeni, rwnowac w ten sposb napicie wewntrzne (rys. 2.16).

Rys. 2.16. Fragment przewodu elektrycznego, do ktrego wprowadzono wewntrzne napicie, unieruchamiajc jeden z kocw i kilkakrotnie skrcajc drugi, a nastpnie czc na stae oba koce. Zamknity przewd przyjmuje posta superzwinit, by zrwnoway napicie torsyjne

Zwinite w przestrzeni, koliste czsteczki DNA przyjto nazywa formami superhalikalnymi DNA. Superskrcenie kolistych czsteczek jest waciwoci topologiczn, mona je zatem opisa posugujc si terminami z dziedziny topologii. W odniesieniu do kolistych czsteczek DNA opis taki zastosowali po raz pierwszy matematycy James White i Brock Fuller. Za topologiczn przyjmuje si tak waciwo DNA, ktra (w odrnieniu od waciwoci geometrycznych) nie ulega zmianie pod wpywem odksztace cigych, tj. takich, ktre nie naruszaj integralnoci szkieletu czsteczki. Bd to odksztacenia konformacyjne, powstajce pod wpywem ciepa lub wizania si z bia-

(a)
Tw=0 Wr=0

(b)
Tw=+3 Wr = 0

(c)

(d)
Tw=+2 Wr=+1 Tw=+1 Wr=+2

(e)
Tw = 0 Wr=--3

Lk = 0

V Lk=+3

Rys. 2.17. Waciwoci topologiczne DNA mona opisa za pomoc wielkoci Tw i Wr. (a) Kolista czsteczka D N A w postaci cakowicie zrelaksowanej (a), (b), (c), (d), (e) Formy tej samej czsteczki z rn liczb dodatkowych skrtw

kami i innymi Ugandami. W przeciwiestwie do nich odksztacenia niecige, ktre polegaj na przeciciu jednej lub obu nici DNA, np. na skutek dziaania nukleaz, topoizomeraz, promieni UV itp. zmieniaj topologiczne waciwoci czsteczki. Na rysunku 2.17 zilustrowano sens fizyczny dwch wielkoci charakteryzujcych superhelikalne czsteczki DNA (w rzeczywistoci wielkoci te nadaj si do opisu kadej struktury, ktr mona przedstawi za pomoc poczonej w koo, dwustronnej tamy). Tw, czyli liczba skrtw (ang. twist), wskazuje ile razy tworzcy koo DNA zosta skrcony. Dla DNA, ktry jest rozkrcony w stosunku do czsteczki w stanie zrelaksowanym, Tw ma warto ujemn. Jeeli DNA zosta dodatkowo skrcony w stosunku do formy zrelaksowanej, to charakteryzuje go dodatnia warto Tw. Wr, czyli liczba zwojw (ang. writhe), wskazuje ile razy dana czsteczka DNA krzyuje (przeplata) si ze sob. W przypadku czsteczki DNA, do ktrej, przed poczeniem kocw, nie wprowadzono adnych dodatkowych skrtw (podwjny heliks nie zosta rozkrcony ani dodatkowo skrcony) zarwno warto Tw, jak i Wr wynosi 0 (rys. 2.17(a)). Wprowadzenie kilku dodatkowych skrtw przed zamkniciem czsteczki (w przypadku DNA dodatkowe skrcenie podwjnego heliksu) powoduje zmian Tw. Czsteczka DNA na rysunku 2.17(b) ma Tw = 3 (wprowadzono do niej trzy dodatkowe skrty). Ley ona pasko na powierzchni, a DNA w adnym punkcie nie krzyuje si ze sob. Wr tej czsteczki wynosi zatem 0. Kade skrzyowanie czsteczki odbywa si kosztem zmniejszenia o 1 wartoci Tw (rys. 2.17(c), (d) i (e)). W trakcie przeksztace topologicznych kolistych czsteczek DNA (rys. 2.17) zmianie ulegaj wartoci Tw i Wr, niezmienna pozostaje jednak ich

suma. Wielko ta nosi nazw liczby oplece i wyraana jest symbolem Lk (ang. linking number). Jak wynika z naszej analizy Lk jest niezalena od ksztatu czsteczki i moe si zmieni tylko wtedy, gdy DNA zostanie przecity. Lk jest miar liczby oplece wok siebie dwch nici w podwjnym heliksie DNA. W gruncie rzeczy wskazuje ona o ile wicej lub mniej tych oplece wystpuje w danej czsteczce DNA w stosunku do liczby oplece w tej samej czsteczce w formie cakowicie zrelaksowanej. Lk przyjmuje tylko wartoci cakowite, poniewa przecite nici DNA mog si ze sob powtrnie poczy tylko po wykonaniu cakowitego obrotu. Warto Lk w kolistych czsteczkach DNA mona mierzy dowiadczalnie. Od wielkoci Lk zaley szybko migracji superhelikalnego DNA w trakcie elektroforezy w elu agarozowym. Im wysza warto Lk (niezalenie od znaku), tym szybciej migruje w elu kolista czsteczka DNA. Z tego powodu w preparatach plazmidowego DNA, analizowanych za pomoc elektroforezy w elu agarozowym, prek odpowiadajcy formie superhelikalnej obserwuje si poniej prka odpowiadajcego-czsteczce zrelaksowanej. Jeeli zmierzy si Lk i wyznaczy warto Wr dla czsteczki o znanej liczbie zasad (N) mona poda liczb zasad (h) przypadajc na skok podwjnej spirali: h = N/Lk - Wr lub h = N/Tw.

Jest to jedna z metod wyznaczania liczby par zasad, przypadajcej na jeden skok heliksu DNA. 2.10. Solenoidowe (toroidalne) i plektonemiczne (przeplecione) superzwinicie DNA W czsteczkach DNA superhelikalno moe powstawa z dwch powodw. Moe ona powsta na skutek zmiany liczby skrtw w czsteczce wyjciowej (zwykle jako wynik czciowego rozkrcenia). Liczba superskrtw jest wprost proporcjonalna do zmiany w Lk: (ALk = Lk Lk 0 , gdzie Lk 0 jest wartoci charakteryzujc czsteczk wyjciow). W przypadku, gdy zmiana taka zachodzi w kolistej czsteczce DNA w roztworze, czsteczka ta przybiera posta plektonemicznie superzwinitego (przeplecionego) DNA (rys. 2.18(a)). Drug powszechn przyczyn superhelikalnoci jest owijanie si podwjnego heliksu DNA wok biakowych rdzeni (jak np. w nukleosomie lub kompleksie DNA z biakiem resolwaz) (rys. 2.18*(b)). Samo owinicie DNA wok rdzenia nie powoduje zmiany Lk. In vivo jednak, owijanie si DNA z unieruchomionymi kocami wok biakowych rdzeni powoduje powstanie dodatkowych kompensujcych superskrtw, ktre s nastpnie usuwane przez topoizomerazy, co w rezultacie prowadzi do zmiany Lk. Jakie znaczenie biologiczne ma superhelikalno DNA? Jej rola jest najbardziej istotna w tych procesach, ktrych inicjacja wymaga czciowego rozplecenia podwjnego heliksu DNA, a wic w replikacji i transkrypcji. Z analizy

forma plektonemiczna

forma toroidalna

Rys. 2.18. Plektonemiczne (przeplecione) i solenoidowe (toroidalne) zwinicie DNA. Jako rezultat superzwinicia D N A moe przeplata si wielokrotnie tworzc formy plektonemiczne (a) lub owija si wok sferycznego rdzenia tworzc formy toroidalne (b)

topologicznej zamknitych czsteczek DNA wynika, e zmiany Tw mog by niwelowane przez odpowiednie zmiany Wr. Oznacza to, e czciowo rozkrcona czsteczka DNA (kolista lub o unieruchomionych kocach) przyjmuje korzystniejsz energetycznie form topologiczn o wyszej wartoci Wr (przeplecion lub owinit wok biakowego rdzenia, jak w nukleosomie). W rzeczywistoci moe ona jednak oscylowa midzy form o wysokim Tw i niskim Wr oraz form o niskim Tw i wysokim Wr (Lk nie ulega zmianie). Tego rodzaju oscylacje, w obecnoci odpowiednich czynnikw biakowych, mog uatwia rozpoczynanie procesw replikacji i transkrypcji. Wiele genw ulega wydajnej transkrypcji tylko wtedy, gdy zawierajcy je DNA jest superskrcony (naturalnie wystpujce DNA cechuje superskrcenie ujemne). Wspomniane oscylacje mog take sprzyja powstawaniu szczeglnych struktur DNA (np. struktur krzyowych) w rejonach, w ktrych wystpuj odpowiednie sekwencje zasad.

3. REPLIKACJA DNA

Replikacja DNA jest procesem zapewniajcym przekazywanie informacji genetycznej z komrek rodzicielskich do komrek potomnych w sposb prawie doskonay. Doskonao ta jest osigana nie tylko dziki bardzo precyzyjnemu mechanizmowi polimeryzacji nowych acuchw DNA, lecz take dziki udziaowi systemw ochronnych, zdolnych do wykrywania i naprawy wszelkiego typu bdw i uszkodze w DNA, powstaych albo podczas replikacji, bd w czsteczce ju zreplikowanej. Oba systemy syntezy i naprawy DNA s zdolne do odrniania wasnych nici DNA od nici obcych, nici uszkodzonych od nici prawidowych oraz nici rodzicielskich od nowo zsyntetyzowanych i do natychmiastowego wczania dziaa niezbdnych do zachowania niezmienionej budowy wasnego DNA. Dziki tym systemom bdy powodujce powstawanie mutacji pojawiaj si w ywych organizmach niezmiernie rzadko, rednio raz na 109-1010 prawidowo wczonych nukleotydw. Chocia podstawowy mechanizm replikacji zosta niejako intuicyjnie przewidziany w roku 1953 przez Watsona i Cricka, w stwierdzeniu: kady acuch DNA suy jako matryca do budowy nowego, identycznego acucha DNA", poznawanie szczegw tego mechanizmu zajo wiele lat i do dzisiaj nie zostao zakoczone. Przybywaj stale liczne nowe, wane informacje, ktre skadaj si na coraz doskonalszy obraz procesu przekazywania informacji genetycznej. Z koniecznoci wic informacje o przebiegu procesu replikacji DNA przedstawione w niniejszym rozdziale zostay ograniczone tylko do wiadomoci wedug oceny autora najwaniejszych. 3.1. Podstawowe reguy procesu replikacji DNA Jednym z najbardziej fascynujcych odkry wspczesnej biologii jest stwierdzenie uniwersalnoci podstawowych procesw biochemicznych zachodzcych w ywych komrkach. Dotyczy to zarwno biosyntezy podstawowych

cegieek budulcowych wszystkich organizmw, jak: aminokwasy, cukry, kwasy tuszczowe czy nukleotydy, jak i budowania z tych cegieek biaek, skrobi, tuszczw czy kwasw nukleinowych. W replikacji DNA procesy zachowane w cigu ewolucyjnym i wsplne dla wszystkich komrek daj si uj w nastpujce reguy.
3.1.1. Replikacja jest procesem semikonserwatywnym

Synteza nowych nici DNA moe zachodzi tylko z udziaem nici rodzicielskich sucych jako matryce. S one dokadnie kopiowane, dajc w efekcie dwie identyczne, nowe czsteczki dwuniciowego DNA, z ktrych kada zawiera jedn ni pierwotn i jedn nowo zsyntetyzowan (rys. 3.1).

Rys. 3.1. Model replikacji dwuniciowej czsteczki DNA, zaproponowany w roku 1953 przez Watsona i Cricka

Rozdzielajce si w miejscu syntezy acuchy matrycowego DNA tworz wideki replikacyjne". Poniewa wszystkie polimerazy DNA katalizuj doczanie pojedynczych trifosforanw nukleotydowych tylko do wolnej grupy 3'-OH, synteza DNA moe przebiega tylko w jednym kierunku od koca 5' do 3'. Poniewa obie nici matrycowe, zorientowane wzgldem siebie w przeciwnych kierunkach (p. budowa DNA), s kopiowane w obrbie tych samych wideek jednoczenie, tylko jedna z powstajcych nowych nici

Rys. 3.2. Budowa wideek replikacyjnych

DNA moe by wyduana w sposb cigy, zgodnie z kierunkiem przesuwania si wideek. Druga musi by syntetyzowana w kierunku przeciwnym do ruchu wideek, w postaci krtkich fragmentw (fragmentw Okazaki, nazwanych tak na cze ich odkrywcy Reiji Okazaki) czonych nastpnie w jedn cig ni. Wideki replikacyjne maj wic struktur asymetryczn (rys. 3.2). Ni syntetyzowana w sposb cigy w kierunku ruchu wideek nosi nazw nici prowadzcej (ang. leading strand), a ni syntetyzowana w sposb niecigy nici opnionej (ang. lagging strand). O prawdziwoci takiej struktury wideek replikacyjnych wiadcz ich obrazy uzyskane w nowoczesnych mikroskopach elektronowych. Na zdjciach wida jednoniciowe regiony DNA, zawsze po jednej stronie wideek. Jeli wideki replikacyjne poruszaj si jednoczenie w obu kierunkach, kada z nici rodzicielskiego DNA jest jednoczenie matryc dla syntezy nici prowadzcej (w jednym kierunku) i nici opnionej (w kierunku przeciwnym).
3.1.2. Inicjacja replikacji zachodzi w cile okrelonych sekwencjach nukleotydw zgromadzonych w specyficznych miejscach chromosomu, zwanych origin"

W organizmach tak ewolucyjnie odlegych, jak bakterie i ssaki, podstawowe etapy procesu replikacji przebiegaj w sposb bardzo podobny. W cile okrelonym miejscu (lub miejscach) genomu nici DNA rozdzielaj si tworzc oczko" lub wideki" replikacyjne. Miejsce to zawiera specyficzne sekwencje, z ktrych jedne su do wizania biaek inicjatorowych, w obrbie innych nici rozdzielaj si umoliwiajc rozpoczcie replikacji, a jeszcze inne su do przyczenia biaek wspomagajcych proces replikacji. Bez wzgldu na to, czy komrka ma tylko jeden chromosom, czy te ma ich wiele, DNA ulega

replikacji zawsze tylko raz na kady cykl podziaowy. Inicjacja replikacji jest wic sygnaem, od ktrego rozpoczyna si podzia komrki i z tego wzgldu podlega bardzo cisej i precyzyjnej kontroli. Przyjo si nazywa miejsca inicjacji replikacji angielskim terminem origin" (ori).
3.1.3. Replikon jednostka replikacji

Za jednostk replikacji (replikon) przyjto uwaa odcinek DNA, zawierajcy miejsce inicjacji replikacji oraz wszystkie sekwencje fizycznie do niego przylegajce, ktre s pod jego kontrol i replikuj si razem z nim. Replikon moe te zawiera sygnay koczce replikacj (rys. 3.3). Poniewa replikacja
ori C

kierunki ruchu wideek replikacyjnych

Rys. 3.3. Model replikonu E. coli. Specyficzne miejsce inicjacji replikacji DNA oznaczone jest symbolem ori C. Miejsca terminacji replikacji, oznaczone literami T1 i T 2 , znajduj si po przeciwnej stronie genomu, poza rzeczywistym miejscem zetknicia si wideek stop" dla wideek nr 1 stop" dla wideek nr 2

miejsce zetknicia si wideek

jest kontrolowana tylko na poziomie inicjacji, raz rozpoczta przebiega a do zakoczenia syntezy caego replikonu. W bakteriach replikon obejmuje cay chromosom, std te pojedyncze miejsce inicjacji kontroluje replikacj caego genomu, wczajc ten proces tylko jeden raz na kady cykl podziau komrkowego. W chromosomach organizmw eukariotycznych replikacja rozpoczyna si jednoczenie w wielu miejscach inicjacji rozmieszczonych wzdu chromosomowego DNA (rys. 3.4); komrki tych organizmw maj wic bardzo wiele replikonw w kadym chromosomie. Replikony te s relatywnie mae, a szybko syntezy DNA w chromosomach eukariontw jest mniejsza o jeden do dwch rzdw wielkoci w porwnaniu do bakterii (tab. 3.1). Mimo to szybko replikacji caego genomu eukariotycznego wielokrotnie przewysza szybko replikacji genomu bakteryjnego. Dzieje si tak dziki jednoczesnemu wczaniu bardzo wielu replikonw. Na przykad w komrkach embrionalnych Drosophila czas replikacji caego genomu wynosi 3 min, przy szybkoci syntezy

j-U H U II H i l U U I I " H u H U H H h H U

I T T T

5'

y u y

U W u H U H H wH U I U B"T 5'
rednia dugo replikonu

1 n n y u II B I
3' 5'

replikony poczone

y i u y y u w

an n j

m fi M n f i , 53:

Rys. 3.4. Eukariotyczny DNA zawiera wiele replikonw, ktre mog ulega aktywacji w rnym czasie

Tabela 3.1. Charakterystyka replikonw eukariotycznych

Organizm Bakterie {E. coli) Drode (S. cerevisiae) Owady (D. melanogaster) Pazy (X. laeris) Ssaki (M. musculus) Roliny (V.faba) Roliny (P. sativum)

Liczba replikonw na genom 1 500 500 000 000 000 000

rednia wielko replikonu (Kb) 4 700 40 40 65-300 150 300 65-450

Szybko replikacji (nukl./min) 50 000 3 600 2 600 500 2 200

-

3 15 25 35 22

DNA ok. 20-krotnie mniejszej ni w komrkach bakterii i dugoci DNA 40-krotnie wikszej, podczas gdy czas replikacji genomu bakteryjnego wynosi 40 min. Wielko replikonw eukariotycznych moe si zmienia w zalenoci od tego czy replikacja DNA zachodzi w komrkach embrionalnych, czy w dojrzaych komrkach somatycznych. wiadczy to, e replikony eukariotyczne nie maj wbudowanych sygnaw koca replikacji. Wydaje si, e miejsca inicjacji, aktywne w czasie rozwoju embrionalnego, staj si nieaktywne w pniejszych fazach rozwoju, co wydatnie zwiksza wielko replikonw, zwalniajc jednoczenie szybko replikacji. Poniewa w cyklu komrkowym

kady replikon moe ulega aktywacji tylko jeden raz, a wiadomo, e nie wszystkie replikony s aktywowane jednoczenie, powstaje problem w jaki sposb replikony ju zreplikowane s odrniane od tych, ktre dopiero czekaj na swoj kolej. Prby wytumaczenia mechanizmw regulacji kolejnoci wczania replikonw znajduj si jeszcze w stadium hipotez.

3.1.4. Replikacja DNA jest inicjowana przez krtkie odcinki RNA suce jako startery dla polimerazy DNA

Polimerazy DNA nie mog rozpoczyna syntezy nowych acuchw DNA, mog je tylko wydua. Dlatego synteza DNA zaczyna si od budowania krtkich odcinkw RNA o wolnych grupach kocowych 3'-OH (starterw), do ktrych polimerazy DNA doczaj kolejne trifosfonukleotydy. Poza nielicznymi wyjtkami za syntez tych odcinkw RNA odpowiedzialne s wyspecjalizowane enzymy primazy. Synteza starterw jest niezbdna zarwno w rozpoczynaniu nowej rundy replikacyjnej w miejscu inicjacji, jak i w syntezie fragmentw Okazaki. Przed poczeniem fragmentw w jedn cig ni startery s wycinane i usuwane, a powstae przerwy uzupeniane. Replikacja nie zawsze rozpoczyna si od starterowego RNA. Moe rozpoczyna si przez kowalencyjne doczanie nukleotydw do wolnej grupy 3'-OH w miejscu przecicia jednej z nici dupleksu lub przez wyduanie jednoniciowego koca DNA zwinitego w form szpilki do wosw", moe te rozpoczyna si od terminalnego biaka, z wykorzystaniem do inicjacji grupy OH jednego z aminokwasw.
3.1.5. Replikacja DNA sterowana jest przez due, wieloenzymatyczne kompleksy

W obrbie wideek replikacyjnych, oprcz polimerazy DNA i primazy, wspdziaa jednoczenie wiele biaek zapewniajcych pynny przebieg replikacji. Tworz due kompleksy, dla ktrych przyjto nazw replizomu, podobnie jak dla kompleksu inicjacyjnego primozomu.

3.1.6. Struktura chromosomw wywiera wpyw na proces replikacji

Ksztat czsteczki DNA czy jest kolista czy liniowa, jedno- czy dwuniciowa decyduje o mechanizmie jej replikacji. Szczeglnie istotny wpyw na proces replikacji ma konformacja chromosomw, a mianowicie ich stan zwinicia superhelikoidalnego, struktura dwuniciowego heliksu, podatno na zginanie oraz atwo rozdzielania nici podwjnego heliksu w miejscach inicjacji. Zaley to od wielu czynnikw, ktre wywierajc wpyw na replikacj, nie zawsze musz bra w niej bezporedni udzia.

3.1.7. Replikacja DNA jest cile zwizana z procesem transkrypcji

Zwizki midzy obu tymi procesami wyraaj si nie tylko przez syntez starterowego RNA. Transkrypcja okazaa si niezbdna take do aktywowania miejsc inicjacji replikacji DNA, zarwno w komrkach bakterii, jak i w komrkach eukariontw. Aktywowanie to moe by realizowane bd przez transkrypcj obszaru inicjacji replikacji, bd te obszarw ssiednich, nieraz odlegych od miejsca inicjacji. W komrkach eukariontw obszary inicjacji aktywowane s przez faktory transkrypcyjne, te same, ktre aktywuj sekwencje promotorowe transkrypcji. Faktory te, czc si ze specyficznymi sekwencjami DNA wewntrz obszarw inicjacji lub w ich bezporednim ssiedztwie, uatwiaj wizanie si biaek inicjatorowych do sekwencji ori albo aktywuj utworzony wczeniej kompleks inicjacyjny.
3.1.8. Terminacja replikacji moe by zapisana w sekwencji genomu

W DNA komrek bakterii oraz niektrych plazmidw miejsce zakoczenia replikacji jest zdefiniowane przez specyficzne-sekwencje ter (terminus), w ktrych wideki replikacyjne ulegaj zatrzymaniu. W DNA komrek eukariontw sekwencje te nie wystpuj, a replikacja ulega zakoczeniu w momencie zetknicia si wideek replikacyjnych podajcych ku sobie z przeciwnych kierunkw. Wideki replikacyjne przyjmuj rozmaite ksztaty. 1. Replikacyjne oczko" lub forma theta (0). Jeeli replikacja DNA rozpoczyna si wewntrz dwuniciowej struktury chromosomw liniowych lub kolistych, wideki replikacyjne tworz charakterystyczn struktur oczka replikacyjnego", powikszajcego si w miar oddalania si wideek. Gdy chromosom jest kolisty, powikszajce si oczko" przyjmuje charakterystyczn form przypominajc greck liter 9. (rys. 3.5(a)). Std replikacj kolistych czsteczek dwuniciowego DNA okrela si czsto replikacj typu 0. 2. Replikacja wg modelu obracajcego si koa. Jeeli w kolistej czsteczce DNA replikacji podlega tylko jedna z dwch nici dupleksu, to synteza rozpoczyna si od przecicia jednej nici. Wolna grupa 3'-OH utworzona w miejscu przecicia staje si miejscem startu syntezy DNA, skd polimeraza DNA wydua przecit ni, wdrujc po kolistej drugiej nici matrycy jak po obwodzie koa. Poniewa powstajca coraz dusza czsteczka jednoniciowego DNA jest poczona kowalencyjnie z nici macierzyst, moe ona zawiera wiele powtrze replikowanego genomu. Mechanizm ten moe take prowadzi do utworzenia czsteczki dwuniciowego DNA, jeli powstajca pojedyncza ni stanie si matryc dla nici komplementarnej, syntetyzowanej przez fragmenty Okazaki. Ten typ replikacji nosi take nazw replikacji typu sigma (c) (rys. 3.5(b)). 3. Replikacja wg modelu przemieszczajcej si ptli (D loop, R loop). Ten mechanizm replikacji jest inicjowany bezporednio przez transkrypcj. Wystpuje powszechnie podczas replikacji mitochondrialnego DNA. Transkrypcja

o .

O
Rys. 3.5. Rne formy wideek replikacyjnych. (a) Forma powikszajcego si oczka", ktre w kolistym chromosomie przybiera ksztat litery 0. (b) Forma a lub forma obracajcego si koa" prowadzi do powstawania bardzo dugich czsteczek DNA, jedno- lub dwuniciowych, bdcych wielokrotnym powieleniem genomu matrycy, (c) Forma powikszajcej si ptli (D-loop, R-loop) jest typow form replikacji DNA, inicjowanej przez polimerazy RNA. W tym typie replikacji miejsca inicjacji replikacji kadej z nici s przestrzennie rozdzielone

przechodzca przez mitochondrialne ori odsuwa jedn ni tworzc ptl. Specyficzne przecicie nici RNA z wytworzeniem wolnej grupy 3'-OH umoliwia doczenie si polimerazy DNA i wyduanie startera, czemu towarzyszy poszerzanie si ptli. Mechanizm ten powoduje asymetryczn replikacj DNA. Najpierw synteza DNA przebiega tylko na jednej matrycy, dopiero potem rozpoczyna si na matrycy drugiej (rys. 3.5(c)). Wedug podobnego mechanizmu przebiega replikacja plazmidu ColEL

3.2. Inicjacja procesu replikacji DNA Inicjacja replikacji DNA w miejscu ori rozpoczyna si zawsze przez przyczenie si biaek inicjatorowych do specyficznych sekwencji DNA wewntrz tego miejsca. Przyczone biaka powoduj zmiany w strukturze DNA uatwiajce otwarcie si oczka" oraz reguluj doczanie si biaek replikacyjnych niezbdnych do rozpoczcia syntezy DNA. Jakiekolwiek zaburzenia procesu replikacji DNA maj zawsze fatalne nastpstwa dla komrek. Dlatego wszystkie mutanty replikacyjne s zawsze

mutantami warunkowo letalnymi, zwykle wraliwymi na temperatur, to znaczy zdolnymi do replikacji, a wic i do wzrostu tylko w okrelonej temperaturze, zwanej permisyjn. Zwikszenie tej temperatury powyej pewnej granicy powoduje mier komrki s to warunki restrykcyjne. W komrkach E. coli mutanty takie zostay oznaczone symbolem dna i w zalenoci od zachowa w warunkach restrykcyjnych dziel si na dwie klasy: (a) mutanty slow-stop", wolno reagujce na warunki restrykcyjne, zdolne do zakoczenia rozpocztego cyklu replikacyjnego, lecz niezdolne do rozpoczcia nowego. Zawieraj defekty w biakach odpowiedzialnych za inicjacj replikacji DNA; (b) mutanty quick-stop", natychmiast odpowiadajce zahamowaniem replikacji po przeniesieniu do warunkw restrykcyjnych. S to mutanty elongacyjne. Poniewa niektre enzymy, np. helikazy uczestnicz zarwno w inicjacji, jak i w elongacji replikacji, fenotyp quick-stop" moe dotyczy take inicjacji. Zaburzenia w syntezie prekursorw syntezy DNA powoduj rwnie natychmiastowe zatrzymanie procesu replikacji. Obecnie poznane s praktycznie wszystkie enzymy replikacji DNA w komrkach E. coli oraz ich geny, co pozwala sdzi, e mechanizm replikacji DNA w tym organizmie zosta cakowicie wyjaniony.
3.2.1. Inicjacja replikacji w dwuniciowej czsteczce bakteryjnego DNA

Najlepiej poznanym przykadem tego typu inicjacji jest inicjacja replikacji w chromosomie bakterii E. coli. W chromosomie tym jest tylko jedno miejsce inicjacji, pooone na 84 min mapy genetycznej i nosi nazw ori C. Obejmuje 245 par zasad o bardzo charakterystycznej strukturze, typowej dla caej rodziny Enterobacteriaceae (rys. 3.6.). Wystpuj w niej cztery 9-nukleotydowe fragmenty o identycznej sekwencji nukleotydw: TTATNCANA, ktre s uoone po dwa, przeciwstawnie do siebie (<>), oraz trzy fragmenty 13-nukleotydowe, o sekwencji: GATCTNTTNTTTT, uszeregowane tandemowo, jeden za drugim (->->->). Towarzyszy im dodatkowo sekwencja zbudowana tylko z par AT. Fragmenty DNA znajdujce si midzy tymi sekwencjami maj tylko cile okrelone dugoci przy do dowolnym skadzie nukleotydowym, jednak w caym odcinku oriC liczba par AT znacznie przewysza liczb par GC. Rozpoczcie cyklu replikacyjnego przebiega przez wiele etapw. 1. Aktywowanie oriC. Miejsce inicjacji replikacji DNA najpierw ulega aktywowaniu przez transkrypcj. Bakteryjne oriC otaczaj z obu stron dwa promotory, z ktrych waniejszy gidA steruje syntez RNA w lewo od

13-mery plazmidy DnaA DnaA AGATCC^ \ / - V i - l ^ l biako PI, rep A W P1

TTTTT^ADnaA DnaA \ /

biako F

bakteriofagi typu k

Rys. 3.6. Budowy miejsc inicjacji replikacji ori w D N A bakterii niektrych plazmidw i bakteriofagw wykazuj due podobiestwa strukturalne. Wszdzie mona wyrni region rozpoznawany przez biako inicjatorowe i region bogaty w pary AT, ktry jako pierwszy ulega denaturacji (wg A. Kornberg, DNA Replication. 1992)

oriC. Transkrypcja, nie przechodzc przez miejsce inicjacji, powoduje jego aktywacj przez zwinicie caego odcinka DNA w dodatkowe lewoskrtne superzwoje, niezbdne do otwarcia dwuniciowej struktury heliksu. 2. 9-nukleotydowe sekwencje s miejscem wizania specyficznego biaka inicjatorowego, produktu genu dnaA. Biako to, o masie 52 000 Da, rozpoznaje te sekwencje i docza si do nich w sposb kooperatywny, czc si nie tylko z DNA, ale i ze sob, tworzy duy agregat liczcy 10-20 dimerowych czsteczek biaka. Jest to tzw. kompleks zamknity. W obecnoci ATP oraz wspomagajcych biaek chromatyny bakteryjnej FIS i IHF oraz HU, DNA ulega silnemu zginaniu, owijajc si wok biaek DnaA. Powstae w czsteczce DNA silne naprenia powoduj zrywanie wiza wodorowych w obszarze odcinkw 13-nukleotydowych, kolejno, poczwszy od odcinka pooonego najbliej kompleksu. Biako DnaA wykazuje aktywno ATPazy i wykorzystuje energi ATP do dalszego rozdzielania nici, zapocztkowanego przez powstae w DNA napicia. Tworzy si kompleks otwarty. Rola obecnych w kompleksie biaek HU nie jest w peni ustalona.

3. Do kompleksu otwartego przycza si helikaza replikacyjna, produkt genu dnaB. Helikaza wystpuje w cytoplazmie w poczeniu z innym biakiem replikacyjnym, produktem genu dnaC, w formie heksameru (DnaB)6 (DnaC)6, o masie 480 000 Da. DnaC suy do wprowadzenia helikazy do kompleksu otwartego, w ktrym reaguje z DnaA, uwalniajc aktywn form helikazy (DnaB)6. Helikaza rozwija dalej nici DNA w obie strony, wypierajc niepotrzebne ju biako DnaA, a rozdzielone nici s stabilizowane biakami SSB. Tworzy si oczko" replikacyjne o wielkoci 45-60 par zasad, przygotowane do wczenia w proces inicjacji primazy, produktu genu dnaG, ktry katalizuje syntez starterowego RNA. Synteza ta koczy etap inicjacji, rozpoczynajc proces elongacji (rys. 3.7). Kluczow rol w procesie inicjacji odgrywa inicjatorowe biako DnaA. Poza otwarciem wideek, jego obecno decyduje o wczeniu w proces inicjacji helikazy DnaB, zawsze jednak w asycie biaek
A/T 313-mery

Ri
IHF

R2
FIS DnaA (10-20) ATP IHF FIS HU

R *

38 C 2(DnaBDnaC)

<
DnaA

t>

Rys. 3.7. Inicjacja replikacji D N A w komrkach E. coli. W wyniku oddziaywania biaka inicjacyjnego DnaA oraz biaek chromatyny bakteryjnej IHF i FIS na struktur obszaru ori nastpuje rozdzielenie si nici DNA w obrbie sekwencji 13-merowych i otwarcie pierwszych wideek replikacyjnych (wg B. Woelker & W. Messer, Nuci. Acid Res21: 5025-5033, 1993

DnaC. Z kolei helikaza DnaB, oprcz rozwijania nici heliksu, jest odpowiedzialna za doczanie si primazy DnaG, zarwno w oriC, jak i w inicjacji fragmentw Okazaki. Primaza jest cile wyspecjalizowanym enzymem o masie 60 000 Da, sucym wycznie do budowy starterowego RNA, w ktrym dwa pierwsze nukleotydy s zawsze purynami i ktrego dugo w warunkach in vivo wynosi zwykle I + 1 par nukleotydw. Biaka uczestniczce w inicjacji replikacji genomu E. coli przedstawione s w tabeli 3.2.
Tabela 3.2. Biaka primosomw E coli Gen dnaA dnaB dnaC dnaG dnaT ssb priA priB priC rep Funkcja biako inicjatorowe helikaza replikacyjna 5' 3' wspdziaa z DnaB primaza; synteza starterowego RNA biako i"; budowa kompleksu preinicjacyjnego ochrona i stabilizacja jednoniciowego D N A biako ,,n'"; helikaza inicjacyjna 3' 5'; usuwa SSB z DNA biako n"; budowa kompleksu preinicjacyjnego biako n""; budowa kompleksu preinicjacyjnego helikaza Wielko czsteczki 52 000 330 000 174 000 60 000 66 000 (monomer) (heksamer) (heksamer) (monomer) (trimer) Liczba czsteczek na komrk 200 20 20 75 50 200 50 ?
?

18 900 (monomer) 76 000 (monomer) 11 500 (monomer) 23 000 (monomer) 66 000 (monomer)

50

Regulacja procesu inicjacji replikacji, a wic i caej replikacji, realizowana jest w komrkach bakterii na dwa sposoby. Po pierwsze istnieje cisa zaleno midzy replikacj i mas komrki. Wydaje si, e sygnaem do startu replikacji jest nagromadzenie si w komrce biaka inicjatora. Jeli jego ilo przekroczy wielko krytyczn, to replikacja si rozpoczyna. Rol t najlepiej spenia biako DnaA. Jego nadprodukcja wywoana metodami inynierii genetycznej powoduje stae inicjowanie replikacji w komrkach, co prowadzi do ich mierci. Ponadto biako DnaA wykazuje powinowactwo do bon komrkowych, stanowic cznik midzy inicjacj replikacji i podziaem komrkowym. Po drugie w sekwencji oriC stwierdza si obecno sygnaw sterujcych inicjacj bezporednio, dziki moliwoci rozrnienia DNA zreplikowanego od nie zreplikowianego. Sygnaami tymi s sekwencje: G A T C C T A * G ktre s specyficznie metylowane przez metylaz Dam, metylujc w nich adenin w pozycji N-6. Sekwencji tych jest w obszarze oriC a 11. Przed

Me

Me ' G A T C C T A G Me

metylaza Oam

Me G A T C C T A G Me ori C cakowicie zmetylowany (aktywny)

Me orf C cakowicie zmetylowany (aktywny) ori C semi zmetylowany (nie aktywny)

Rys. 3.8. Sygnay regulacji replikacji D N A mog by wbudowane w struktur DNA

replikacj obecne w obu niciach sekwencje s zmetylowane. Replikacja wprowadzajc nie zmetylowane zasady do nici potomnych powoduje, e powstaje sytuacja, w ktrej wszystkie zasady jednej nici s zmetylowane, a drugiej wolne. Poniewa inicjacja wymaga obecnoci cakowicie zmetylowanego DNA w obszarze oriC, ulega wic zahamowaniu, a do czasu wstawienia brakujcych grup metylowych do DNA (rys. 3.8).
3.2.2. Inicjacja replikacji DNA bakteriofaga X

Inicjacja replikacji DNA faga X, podobnie jak inicjacja replikacji bakteryjnego DNA, wymaga rwnie aktywowania specyficznego miejsca inicjacji oriX za pomoc transkrypcji. Aktywowanie to spenia jeszcze dodatkow rol dostarcza biaka inicjatorowego X O, niezbdnego do rozpoczcia replikacji. Obraz regionu ori il przedstawiony jest na rysunku 3.9. Znajduje si wewntrz genu biaka X O, ktry wsplnie z drugim biakiem replikacyjnym X P tworz jeden operon. Inicjacja replikacji wymaga, oprcz udziau biaek fagowych X O i X P, take udziau wielu biaek bakteryjnych. Budowa ori)l jest podobna

RNA transkrypcja

inicjacja replikacji DNA

Rys. 3.9. Inicjacja replikacji faga A wymaga aktywacji obszaru ori A przez transkrypcj, rozpoczynajc si z wczesnego promotora Pr

dimery biaka O

oo

Rys. 3.10. Schemat inicjacji replikacji D N A bakteriofaga X. Inicjacja replikacji X D N A sterowana jest przez fagowe biako inicjacyjne X O. Bakteryjna helikaza DnaB wprowadzana jest w obszar ori X jako kompleks z fagowym biakiem X P. Do uwalniania helikazy z kompleksu niezbdny jest udzia bakteryjnych biaek szoku cieplnego DnaK, DnaJ i GrpE

do budowy oriC (rys. 3.10). Po prawej stronie, w obszarze 49 par zasad znajduj si trzy 11-nukleotydowe sekwencje bogate w pary AT odpowiedniki bakteryjnych sekwencji 13-nukleotydowych. Miejsce wizania biaka X O znajduje si po lewej stronie, gdzie wystpuj cztery 18-nukleotydowe sekwencje uoone parami, przeciwstawnie do siebie jak w oriC. Wi one biako X O w formie dimerw, co powoduje wygicie DNA i zerwanie wiza wodorowych w obszarze sekwencji 18-nukleotydowych. Biako X P, podobnie jak bakteryjne biako DnaC, wprowadza do otwartego oczka" helikaz bakteryjn biako DnaB. Poniewa fagowe biako X P wie bardzo silnie DnaB, wczona do wideek helikaza pozostaje w kompleksie z biakiem X P i jest nieaktywna. Do aktywacji wymaga udziau trzech biaek bakteryjnych: DnaJ, DnaK i GrpE. S to biaka szoku cieplnego, ktre w normalnych warunkach nie bior udziau w replikacji bakteryjnego DNA, jednak okazay si niezbdne do zachowania aktywnoci DnaA w podwyszonej temperaturze, oraz przy replikacji DNA faga X i niektrych plazmidw. Uwalniaj one

helikaz DnaB od biaka X P, przywracajc jej aktywno potrzebn zarwno do rozwijania podwjnego heliksu, jak i do wczania primazy w obrb wideek.
3.2.3. Inicjacja replikacji przez polimeraz RNA formowanie ptli D i R

W omwionych dotd przykadach, udzia transkrypcji w inicjacji replikacji ogranicza si tylko do aktywowania obszaru inicjacji. Moe ona jednak bra bezporedni udzia, inicjujc replikacj przez syntez starterw, zarwno w komrkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych. Przykadem takiego mechanizmu inicjacji w komrkach bakterii jest replikacja plazmidu ColE 1, ktrego liczba w komrce utrzymywana jest na staym poziomie 20 kopii. Replikacja rozpoczyna si od syntezy czsteczki RNA (RNA II), w odlegoci 555 par zasad powyej miejsca startu syntezy DNA i przebiega przez ori plazmidu. Ni DNA nie bdca matryc jest odsuwana, tworzc powikszajc si ptl, nazwan ptl R. W obrbie ori, powstajcy acuch RNA powizany wizaniami wodorowymi ze swoj matryc, ulega przeciciu przez RNaz H specyficzny enzym hydrolizujcy tylko czsteczki hybrydowe RNA-DNA co powoduje wytworzenie wolnej grupy 3'-OH, od ktrej rozpoczyna si synteza nici prowadzcej DNA, katalizowana wyjtkowo przez bakteryjn polimeraz I DNA. Dopiero po zsyntetyzowaniu acucha DNA o dugoci ok. 100 nukleotydw, polimeraza I zostaje zastpiona przez waciw replikaz holoenzym polimerazy III DNA (p. elongacja). W tym miejscu rozpoczyna si take synteza nici opnionej. Kontrola replikacji tego plazmidu te jest realizowana za pomoc transkrypcji. Na komplementarnej matrycy DNA jest syntetyzowana inna czsteczka RNA (RNA I) o dugoci 108 nukleotydw. Poniewa jest ona take komplementarna do starterowego RNA, moe tworzy z nim struktur dwuniciow. Wytworzenie tej struktury (rys. 3.11) zapobiega hydrolizie starterowego RNA przez RNaz H, a tym samym replikacji DNA. Hamujce dziaanie RNA I jest wspomagane przez biako Rom, ktrego gen znajduje si tu poniej miejsca startu replikacji. W ten sposb starterowy RNA (RNA II) jest regulatorem pozytywnym replikacji, a RNA I i biako Rom s regulatorami negatywnymi. Przykadem podobnego mechanizmu inicjacji, zaobserwowanego w komrkach eukariontw, jest mechanizm inicjacji replikacji mitochondrialnego DNA (mt DNA). Synteza DNA w mitochondriach achodzi w cigu caego cyklu komrkowego, podwajajc ilo mt DNA w tym samym tempie, w jakim nastpuje podzia komrek. W komrkach ssakw genom mitochondrialny zbudowany jest z kolistej, dwuniciowej czsteczki DNA, zwinitej w ujemne superzwoje. Replikacja obu nici DNA zachodzi w sposb asynchroniczny. Kada z nici DNA ma swoje miejsce inicjacji, ktrych aktywacja zachodzi oddzielnie. Replikacja zaczyna si od nici H, ktrej ori znajduje si w jedynym nie kodujcym obszarze mt DNA, w ktrym, poza ori H, stwierdzono take

miejsce inicjacji startera RNA

y transkrypcja

transkrypcja przechodzi przez ori

RNA n-555 zasad

RNaza H przecina RNA zostawiajc 'koniec 3'-OH

y
replikacja Poll, PolU ONA

inhibicja replikacji

RNaza H nie moe przeci RNA

5 Z W
Rys. 3.11. Synteza D N A plazmidu Col El jest inicjowana i regulowana przez RNA

wystpowanie sygnaw startu transkrypcji. Inicjacja rozpoczyna si od syntezy RNA z promotora nici L, pooonego ok. 100 par zasad powyej ori H. Powstajca czsteczka RNA hybrydyzuje z nici H, odsuwajc ni L, co w mikroskopie elektronowym twory obraz przesuwajcej si ptli, czyli ptli D (ang. displacement loop). W obrbie ori H hybrydowa czsteczka RNA-DNA ulega bardzo precyzyjnemu przeciciu, stajc si starterem dla mitochondrialnej polimerazy DNA. Przecicie jest katalizowane przez enzym zawierajcy 136-nukleotydowy odcinek RNA, identyczny u wszystkich gatunkw ssakw. Mitochondrialna polimeraza DNA (polimeraza y) katalizuje syntez DNA z szybkoci ok. 10 nukleotydw/s. Gdy okoo 70% nici H ulegnie replikacji, wideki odsaniaj ori nici L. Jest to 30-nukleotydowa

mt. ori L primaza

Rys. 3.12. Schemat asymetrycznej replikacji mitochondrialnego DNA. Do aktywacji inicjacji replikacji nici H potrzebny jest udzia mitochondrialnej polimerazy RNA, specyficznej mitochondrialnej endonukleazy oraz promotora transkrypcji. Replikacja nici L rozpoczyna si po odsoniciu sekwencji rozpoznawanej przez primaz. Startery obu nici wyduane s przez mitochondrialn polimeraz y D N A (wg Chang, Clayton; 1989, Celi 56:131 zmodyf.)

sekwencja, przyjmujca automatycznie struktur szpilki do wosw". Jest ona rozpoznawana przez primaz, co staje si sygnaem do startu syntezy nici L. Przebieg syntezy mt DNA przedstawia rysunek 3.12.

3.2.4. Inicjacja replikacji w jednoniciowej czsteczce DNA

Genomy wielu bakteriofagw zbudowane s z jednoniciowego, kolistego DNA, ktry oznacza si znakiem (-f). Replikacja ich genomw przebiega w dwch etapach. W etapie pierwszym ni ( + ) zostaje przeksztacona w kolist czsteczk dwuniciow po dosyntetyzowaniu nici komplementarnej ( ). Czsteczka ta nosi nazw formy replikacyjnej (RF). W etapie drugim syntetyzowane s due iloci nici (+), dla ktrych matryc jest wanie forma replikacyjna. Proces syntezy formy RF w bardzo prostych genomach fagw M13 czy G4 przebiega w sposb nastpujcy. Ni ( + ) zawiera swoist sekwencj zasad atwo tworzc struktur szpilki do wosw". Jest to miejsce inicjacji {ori). Po wnikniciu do komrki bakterii ni ( + ) zostaje pokryta biakami SSB, stabilizujcymi jednoniciow struktur DNA. Tylko odcinek o strukturze szpilki do wosw" pozostaje od nich wolny. Moe si wic do niego doczy polimeraza RNA lub primaza i rozpocz syntez startera. Enzymy te rozwijajc struktur szpilki do wosw" i wykorzystujc odcinek DNA wolny od biaek SSB syntetyzuj startery zwykle o dugoci 11 + 1 nukleotydw. Po zetkniciu si z biakami SSB enzymy odrywaj si od matrycy, pozostawiajc na niej starter z woln grup 3'-OH, co umoliwia doczenie si polimerazy DNA III. Rozpoczyna si proces syntezy DNA, przebiegajcy dookoa matrycy a do kontaktu z pocztkiem starterowego RNA. Za jego usunicie i dosyntetyzowanie brakujcego odcinka DNA odpowiada polimeraza DNA I. Powstajca zrelaksowana forma czsteczki RF nosi nazw RF II. Ligacja ostatniej przerwy i zwinicie czsteczki w ujemne superzwoje przeksztaca RF II w form RF I, gotow do syntezy nowych czsteczek fagowego genomu (rys. 3.13). Jeli w warunkach in vitro matryca zostanie pozbawiona biaek SSB, inicjacja replikacji zachodzi w sposb niespecyficzny, tylko z udziaem primazy i helikazy DnaB. Primaza rozpoznaje w tych warunkach sekwencj: A A A C G T C ... pA G ... '

P ktra nie musi wystpowa w formie szpilki. Powstajce w tych warunkach startery charakteryzuj si bardzo zrnicowan dugoci.
3.2.5. Budowa primosomu

Inicjacja replikacji na jednoniciowej matrycy DNA przez sam primaz jest niemoliwa, jeli matryca pokryta jest biakami SSB stabilizujcymi t struktur. W takim przypadku proces inicjacji staje si bardziej zoony i wymaga udziau wielu biaek bakteryjnych tworzcych razem duy kompleks inicjacyjny, nazwany primosomem. Przykadem moe by inicjacja formy replikacyjnej faga <PX 174. Miejsce inicjacji replikacji tego faga obejmuje odcinek DNA

polimeraza

<t>xm

RFI

primaza starter

Rys. 3.13. Przeksztacenie fagowego jednoniciowego D N A w dwuniciow form replikacyjn (RF) moe by inicjowane przez polimeraz RNA (A/73), primaz (G4) lub przez bakteryjny kompleks inicjacyjny primosom (<PX 174). Inicjacja replikacji zachodzi w sposb niespecyficzny, bez udziau biaek SSB, przy udziale DnaB i primazy bakteryjnej

PAS

Rys. 3.14. Rola primosomu w inicjacji fragmentw Okazaki

o dugoci 55 nukleotydw, o strukturze szpilki do wosw", ktry nazwano PAS (ang. primosome assembly site). Miejsce to jest rozpoznawane przez cztery biaka primosomu produkty genw priA, priB, priC i dnaT. Biako PriA, o dawnej nazwie n', jest helikaz o kierunku dziaania 3' 5'. Rozpoznaje sekwencj PAS i czy si z ni jako pierwsze; do niego doczaj si pozostae biaka kompleksu oraz gwna helikaza replikacyjna (DnaB)6. Przyczenie si primazy DnaG koczy formowanie primosomu. Dziki obecnoci dwch helikaz PriA i DnaB primosom moe porusza si po jednoniciowej matrycy DNA w obu kierunkach 3' 5' i 5' 3'. Usuwa take z matrycy biaka SSB, przygotowujc j do replikacji. Sekwericje PAS wystpuj zarwno w DNA bakteryjnym, jak i w DNA plazmidw i bakteriofagw. atwo przemieszczania si primosomw wzdu jednoniciowych matryc sugeruje ich zaangaowanie w syntez fragmentw Okazaki. Po zakoczeniu kolejnej inicjacji fragmentu, primosom moe bez rozpadu przesuwa si do miejsca startu nastpnego fragmentu. Zaptlenie matrycy syntezy nici opnionej sprawia, e primosom, poruszajc si zgodnie z ruchem wideek, bdzie inicjowa syntez DNA na nici zorientowanej w kierunku przeciwnym do ruchu wideek (rys. 3.14).

3.2.6. Rwnocenno obu typw primosomw

Inicjacja replikacji DNA w komrkach bakterii zaley wic od obecnoci dwch typw sekwencji: 9-nukleotydowych rozpoznawanych przez biako DnaA oraz sekwencji PAS rozpoznawanej przez biaka PriA, PriB i PriC. Ostatnio udao si wykaza, e oba rodzaje inicjacji mog si wzajemnie zastpowa bez adnej szkody dla replikowanego DNA. Metodami inynierii genetycznej wprowadzono do DNA plazmidu pBR 322, w miejscu inicjacji nici opnionej, sekwencj PAS i dwie przeciwstawnie uszeregowane sekwencje T T A T N C A N A wice biako DnaA. Jak wiadomo, replikacja nici cigej jest w tym plazmidzie inicjowana przez polimeraz RNA i w pocztkowym okresie prowadzona jest tylko na jednej nici przez polimeraz I DNA, a do odsonicia miejsca inicjacji na odsuwanej nici drugiej. Wtedy rozpoczyna

DnaB

Rys. 3.15. Schemat inicjacji syntezy nici opnionej DNA w plazmidzie pBR 322, obrazujcy rwnocenno drogi inicjacji replikacji zalenej od PriA i od DnaA

si synteza DNA na nici opnionej oraz wymiana polimerazy I DNA na polimeraz III na nici cigej. Okazao si, e synteza nici opnionej rozpoczyna si rwnie wydajnie z sekwencji PAS, jak i z sekwencji DnaA. W przypadku braku bd to biaka DnaA, bd te DnaT nie zaobserwowano adnego zmniejszenia wydajnoci replikacji. Wydaje si, e rwnie w replikacji bakteryjnego DNA oba typy primosomw mog inicjowa syntez fragmentw Okazaki, podwjnie zabezpieczajc prawidowy przebieg replikacji (rys. 3.15).

3.2.7. Inicjacja replikacji DNA przez nacinanie jednej z nici w kolistym dwuniciowym genomie. Replikacja typu obracajcego si koa

Badanie replikacji faga 0X174, poza poznaniem mechanizmu inicjacji fragmentw Okazaki, doprowadzio take do odkrycia innego mechanizmu rozpoczynania syntezy DNA przez nacinanie matrycy. Synteza wielu jednoniciowych kolistych czsteczek DNA (nici +), stanowicych genomy fagowe, rozpoczyna si przez nacicie dwuniciowej formy RF w miejscu inicjacji. Wolna grupa 3'-OH, powstaa na kocu przecitej nici rodzicielskiej, staje si pocztkiem syntezy nowych czsteczek genomowego DNA, bez koniecznoci syntezy starterw. Proces ten nie wymaga aktywacji przez transkrypcj, a do jego przebiegu wystarcza udzia jednego biaka fagowego specyficznej endonukleazy kodowanej przez gen A, bakteryjnej helikazy Rep, biaek SSB wicych jednoniciowy DNA i polimerazy DNA III, a wic znacznie mniejszej liczby enzymw ni omwione wczeniej mechanizmy replikacji. Biako A o masie 60 000 Da jest zdolne do cicia i czenia nici DNA bez straty energii. Przecina ni ( + ) dwuniciowej formy replikacyjnej genomu 0X174 zwinitej tylko w struktur superhelikoidaln (RFI), rozpoznajc w niej 4-nukleotydow sekwencj inicjacyjn T G A T. Cicie nastpuje midzy dwiema zasadami purynowymi G i A, z wytworzeniem wolnej grupy 3'-OH przy reszcie guaninowej. Rwnoczenie czsteczka biaka wie si kowalencyjnie z adenin, przez uwolnion reszt fosforanow. W obecnoci helikazy Rep i z udziaem ATP, posuwa si wzdu matrycy wok czsteczki DNA, coraz bardziej odsuwajc ni (+). Polimeraza DNA III wykorzystuje wolny koniec 3'-OH do wyduania acucha (+). Po ponownym dojciu do miejsca inicjacji, biako A nacina je powtrnie, przemieszczajc si na nowo utworzony koniec 5'-P, czemu towarzyszy ligowanie nici uwolnionej. Ligacja zachodzi kosztem energii uwolnionej w czasie przecinania nowej nici DNA (rys. 3.16). Jeli syntetyzowana ni nie ulega przecinaniu, to tworzy si duga, jedno- lub dwuniciowa czsteczka DNA, zbudowana z poczonych ze sob tandemowo wielu genomw danego faga, ktre pniej musz by odpowiednio pocite. Podczas syntezy dwuniciowego DNA ni uzupeniajca tworzy si oczywicie przez syntez fragmentw Okazaki.

RFI
faga <PXVU

biako rep Rys. 3.16. Synteza nici prowadzcej w kolistym genomie faga 0X174 moe by inicjowana przez przecicie jednej nici formy RF w miejscu ori, z wytworzeniem wolnej grupy 3'-OH, sucej jako starter. Nacinajce biako A pozostaje przy kocu 5'-P. Po zakoczeniu kadego penego obrotu, biako A nacina kolejn ni DNA w miejscu ori i przenosi si na nowy koniec 5'-P, zamykajc jednoczenie uwolnion ni ( + ) w form kolist

3.2.8. Inicjacja replikonw liniowych. Starterowy RNA moe by zastpowany przez czsteczki biakowe

Zdolno wszystkich polimeraz DNA do prowadzenia syntezy tylko w kierunku 5' 3' stwarza trudnoci przy syntezie zakocze czsteczek liniowych. Poniewa polimerazy DNA nie maj moliwoci uzupenienia brakw powstaych w sekwencjach acuchw po usuniciu starterw na obu kocach 5',

w kadym cyklu replikacyjnym nastpowaoby skracanie czsteczek DNA, co oczywicie jest niemoliwe. Problemy te s rozwizywane w rny sposb przez rne typy komrek. W komrkach bakterii, w czasie syntezy dwuniciowych liniowych genomw, np. faga najpierw powstaj dugie struktury zawierajce wiele czsteczek fagowego DNA, poczonych tandemowo w jedn dug ni. S one nastpnie przecinane na poszczeglne genomy. Niepene czsteczki kocowe mog by degradowane, podczas gdy wszystkie pozostae s prawidowymi genomami faga. W mitochondrialnym, liniowym genomie Paramecium koce replikonw tworz struktury szpilki do wosw", co praktycznie likwiduje wolne koce DNA. Chromosomy organizmw wyszych maj na swych kocach specyficzne struktury ochronne, nazwane telomerami. Bdzie 0 nich mowa w dalszej czci rozdziau. Niektre wirusy eukariotyczne oraz bakteriofagi o chromosomach linearnych wyksztaciy zupenie odmienny sposb inicjacji replikacji, ktry pozwala na ominicie wspomnianej trudnoci. Czynnikami inicjujcymi i jednoczenie starterami replikacji staj si czsteczki biaka, ktre dostarczaj wolne grupy OH, umoliwiajce rozpoczcie replikacji przez polimeraz DNA. Dawcami tych grup s aminokwasy: seryna, treonina lub tyrozyna. Biaka inicjujce ten typ replikacji zostaj na stae zwizane z acuchem DNA, ktrego syntez zainicjoway. Przykadem tak zorganizowanej replikacji DNA jest replikacja adenowirusa. Genom adenowirusa jest zbudowany z jednej duej liniowej czsteczki dwuniciowego DNA, w ktrej 55-kocowe nukleotydy (s nimi cytozyny) zwizane s wizaniami kowalencyjnymi, przez reszty seryny, z czsteczkami biaek o masie 55 000 Da (rys. 3.17). Replikacja DNA adenowirusa przebiega w sposb nastpujcy. Obszar inicjacji o dugoci 51 nukleotydw zawiera trzy domeny. Do domeny pierwszej (od 1. do 18. nukleotydu), zaczynajcej si sekwencj: 3'-OHGpTpApGpTp ... docza si wirusowe biako inicjacyjne o masie 80 000 Da. Domena ta jest take miejscem doczenia wirusowej polimerazy DNA. Do domeny drugiej 1 trzeciej doczaj si biaka jdrowe NFI i NFIII, bdce w rzeczywistoci aktywatorami (promotorami) transkrypcji. Czynniki te zwikszaj wydajno replikacji ok. 50-krotnie. Oba czynniki wymagaj uprzedniej aktywacji przez fosforylacj w sposb typowy dla eukariontw. Wirusowa polimeraza DNA rozpoznaje te trzy biaka i katalizuje reakcj polimeryzacji, doczajc do cytozyny kowalencyjnie zwizanej*z biakiem 80 kDa pierwszy nukleotyd adenin. Ni komplementarna wirusowego DNA, zwizana z biakiem 55 kDa, zostaje odsunita i natychmiast pokryta wirusowym biakiem SSB, a utworzony kompleks replikacyjny docza kolejne nukleotydy, zgodnie z sekwencj matrycy. Po zakoczeniu replikacji polimeraza DNA zelizguje si z matrycy, a inicjacyjne biako 80 kDa ulega czciowej proteolizie, przeksztacajc si w trwale zwizane z DNA biako 55 kDa. Ni komplementarna syntetyzowana jest niezalenie, dokadnie wedug tego samego mechanizmu.

Illdlktl 55 kDa 5' 3' polimeraza DNA

'

7
-C-OH
w

inicjacja

S e r - C - -OH G- -pT-pApG-pT

biako 55 kDa biako 80 kDa ATP, dNTP -wirusowa polimeraza DNA aktywatory komrkowe NFI, NFIII helikaza, topoizomeraza NFII

11111111 II 111111II I I . <i

elongacja nici DNA rozdzielaj si

25 kDa

55 kDa

r Pot VDNA.

terminacja

polimeraza DNA zelizguje si z matrycy

I 1 11I I I IT TT
Rys. 3.17. Schemat inicjacji replikonw linearnych. Replikacja genomu adenowirusa jest inicjowana przez wirusowe biako 80 kDa, niezalenie od siebie na dwch kocach wirusowego DNA. Biako wie kowalencyjnie cytozyn, ktra staje si starterem dla wirusowej polimerazy DNA. Synteza DNA wymaga obecnoci komrkowych czynnikw transkrypcyjnych NFI i NFIII aktywowanych przez fosforylacj

W komrkach bakterii take stwierdzono wystpowanie tego typu mechanizmu. Replikacja linearnego genomu faga <P29 zachodzi w sposb zaskakujco podobny do replikacji adenowirusa, z udziaem fagowego biaka terminalnego o masie 31 kDa, inicjujcego replikacj obu nici DNA przez grup OH seryny. Podobnie jak w przypadku adenowirusa, replikacja wymaga obecnoci fagowej polimerazy DNA oraz fagowych biaek wicych jednoniciowe DNA (biaek SSB). Do bardziej interesujcych przykadw, ilustrujcych podobne mechanizmy inicjacji, naley replikacja genomu wirusa Polio zbudowanego z jednoniciowego RNA, gdzie do koca 5' czsteczki wirusowego RNA docza si peptyd zbudowany z 22 aminokwasw, penicy funkcj biaka inicjatorowego dla polimerazy RNA.
3.2.9. Inicjacja replikacji DNA w komrkach eukariontw

Ze wzgldu na wielko genomw eukariotycznych oraz ich zoon struktur, proces inicjacji replikacji DNA w tych organizmach jest poznany w mniejszym stopniu. Jednak te dane, ktre udao si uzyska, wskazuj, e podstawowy mechanizm inicjacji jest podobny do mechanizmw wystpujcych w bakteriach. Dotyczy to zarwno replikacji w komrkach eukariotycznych prostych genomw, np. replikacji wirusa SV40, jak i replikacji znacznie bardziej skomplikowanych genomw drody. Schematyczny obraz miejsca inicjacji replikacji eukariotycznego DNA przedstawia rysunek 3.18. Pooone w centrum schematu sekwencje rozpoznawane przez biaka inicjacyjne nosz nazw ORE (ang. origin recognition element). Ssiaduj z nimi sekwencje ulegajce rozwijaniu w ,,oczko" replikacyjne o nazwie DUE (ang. DNA unwinbiaka replikacyjne

czynniki transkrypcyjne

biaka

}. J

czynniki transkrypcyjne

XXX| W S P |xxxxxm
L

inicjacyjne

|p[ws]xxxxxl W S P [XXX
1

- rdze miejsce inicjacji

Rys. 3.18. Schemat budowy miejsca inicjacji replikacji D N A w komrkach prostych eukariontw. Miejsce inicjacji zawiera rdze obejmujcy sekwencje DNA, rozpoznawane przez biaka inicjacyjne (ORE) oraz sekwencje ulegajce rozwijaniu (AT i DUE). Otaczaj je sekwencje wspomagajce (WSP), bdce miejscami doczania czynnikw transkrypcyjnych (wg DePampilis 1993. Curr. Biol. 5: 434 zmodyf.)

ding element), przy czym niektre z nich mog by szczeglnie bogate w pary AT. Stanowi one podstawowe sekwencje miejsca inicjacji. W odrnieniu od komrek bakteryjnych, sekwencjom tym zawsze towarzysz sekwencje wspomagajce, bdce miejscami wizania biaek aktywujcych transkrypcj. W procesie inicjacji replikacji DNA w komrkach eukariotycznych, biaka inicjujce wspdziaaj wic nie tylko z sekwencjami inicjatorowymi w DNA i biakami replikacyjnymi, jak helikazy, primazy czy polimerazy DNA, lecz rwnie z biakami transkrypcji, ktrych wpyw na replikacj przypomina dziaanie enhancerw. Przykadem moe by replikacja genomu wirusa SV40 w zakaonych komrkach zwierzcych. Wirus ten naley do rodziny wirusw Papova o chromosomie zbudowanym z kolistej, dwuniciowej czsteczki DNA o wielkoci okoo 5000 par zasad. Replikacja wirusowego DNA zaley prawie cakowicie od aparatu enzymatycznego komrki gospodarza. Miejsce inicjacji replikacji znajduje si w nie kodujcym obszarze ok. 450 par zasad, zawierajcym take sygnay regulacji transkrypcji. Minimalny obszar ori obejmuje 64 pary nukleotydowe o dosy skomplikowanej strukturze. Wyrnia si w nim 3 regiony wice biako inicjatorowe, ktrym jest antygen T, jedyne biako wirusowe biorce udzia w replikacji. Regiony te zawieraj po cztery sekwencje G A G G C
-GAGGCWSP

T T
A/T -III-

IZE
21 21 72

WSP

|I oi > l 21 ' 21 ' no 72

Rys. 3.19. Budowa miejsca inicjacji replikacji wirusa SV 40. Wyrnia si w nim 3 regiony wizania biaka inicjatorowego antygenu T, doczajcego si w formie heksamerw. Otoczone s przez 72-nukleotydowe obszary wspomagajce replikacj, wice faktory transkrypcyjne (WSP). Obszary EP i AT s miejscami rozwijania nici matrycy. Antygen T pozostaje zwizany z DNA, dziaajc w czasie elongacji jako helikaza. We wczesnym etapie infekcji miejsce inicjacji jest obszarem promotorowym do syntezy mRNA dla biaek wirusowych. Doczenie si antygenu T blokuje transkrypcj, jednoczenie rozpoczynajc replikacj

uszeregowane po dwie, przeciwstawnie do siebie (-><-), co tworzy struktury palindromowe. Region centralny zawiera dodatkowo po prawej stronie odcinek 17-nukleotydowy zbudowany z par AT, a po lewej odcinek 15-nukleotydowy, w ktrym na jednej nici wystpuj tylko puryny, a na drugiej pirymidyny. S to miejsca rozdzielania si nici. Po prawej stronie sekwencji ori znajduj si dwie sekwencje wice promotory wczesnej transkrypcji i dwie sekwencje enhancerowe (rys. 3.19). Po wnikniciu wirusowego DNA do komrki promotory te su do syntezy mRNA dla antygenu T. Dopiero po wyprodukowaniu duej iloci antygenu T replikacja moe si rozpocz, a przyczenie si antygenu T do sekwencji ori powoduje zablokowanie transkrypcji. Antygen T wie si z DNA w formie heksameru. Jego aktywno replikacyjna regulowana jest w sposb waciwy tylko dla eukariontw przez wybircz fosforylacj. Miejscem wizania si antygenu T z DNA jest odcinek peptydowy, znajdujcy si przy kocu aminowym czsteczki biaka (N), gdzie wystpuj reszty seryny i treoniny. W pobliu koa karboksylowego (C), odpowiedzialnego za przyczanie biaek replikacyjnych komrki gospodarza, stwierdza si rwnie obecno seryny i treoniny. rodek czsteczki antygenu T wie ATP. Ufosforylowanie reszt serynowych czyni to biako nieaktywnym w procesie inicjacji, natomiast fosforylacja reszt treoninowych aktywuje je. Fosforylacja i defosforylacja katalizowana jest przez kinazy i fosfatazy cyklu komrkowego, co cile wie ten proces z podziaem komrki. Schemat regulacji aktywnoci antygenu T przedstawia rysunek 3.20.
replikacja DNA replikacja DNA *

kinaza cyklu komrkowego (cdc2, P34) \ + fosfataza serynowa kinaza kazeinowa

Rys. 3.20. Schemat regulacji aktywnoci antygenu T przez fosforylacj seryny i treoniny

Antygen T peni centraln rol w replikacji wirusowego DNA. Poza aktywowaniem miejsca inicjacji bierze udzia w rozwijaniu nici DNA jako helikaza, steruje te przyczeniem komrkowej polimerazy DNA cc (z primaz)

do utworzonych wideek replikacyjnych. Sekwencje promotorowe odgrywaj rwnie bardzo wan rol w replikacji doczone do nich biaka promotorowe zwikszaj wydajno replikacji w komrkach a stukrotnie.
3.2.10. Inicjacja replikacji DNA w komrkach drody. Sekwencje ARS

Mechanizm inicjacji replikacji chromosomalnego DNA zosta zbadany tylko w komrkach drody, dziki wystpowaniu w nich plazmidw o autonomicznej replikacji DNA. Sekwencje inicjacyjne replikacji ori zostay najpierw wykryte w genomach tych plazmidw; std pochodzi ich nazwa ARS (ang. autonomously replicating seuences). Potem stwierdzono ich obecno w DNA chromosomalnym, gdzie wystpuj w tej samej liczbie co replikony oznaczone metodami autoradiograficznymi (400-500 sztuk). Sekwencje ARS zbudowane s w sposb nastpujcy. Obejmuj odcinek DNA o dugoci 100-200 par nukleotydw, umiejscowiony zawsze w nie kodujcych przestrzeniach midzygenowych. Wyrnia si w-nim 11-nukleotydowy odcinek DNA o cile zachowawczej sekwencji, identycznej dla wszystkich ARS:
A

/T TT TA

T A A

/c

TTT

A A

Jest to domena A, w ktrej kada zmiana nukleotydu powoduje inaktywacj ARS. Towarzysz jej trzy dodatkowe domeny, oznaczone B1? B2 i B3. S to rwnie krtkie sekwencje bogate w pary AT, lecz nie maj ju tak cile zachowawczej sekwencji. Zamiany pojedynczych nukleotydw oraz niewielkie insercje lub delecje nie maj wikszego wpywu na aktywno ARS, natomiast usytuowanie domen B wzgldem domeny A oraz orientacja nukleotydw we wszystkich domenach musz by zachowane. Rola poszczeglnych domen zostaa wyjaniona dopiero niedawno, po odkryciu biaek inicjujcych replikacj DNA. Drodowe biaka inicjujce tworz kompleks zbudowany z 6 (lub 8) rnych polipeptydw o nazwie ORC (ang. origin recognition complex). Kompleks ten wie si z domen A oraz B1? usytuowan w odlegoci 12 par zasad od domeny A, po stronie 3' acucha DNA. Przyczenie si biaek ORC do sekwencji^ ARS powoduje owijanie si nici DNA wok kompleksu, poczone z silnym jej zginaniem. Powstae naprenia rozdzielaj nici DNA w obszarze B2 miejscu otwarcia wideek. Pooona dalej domena B3 jest miejscem, w ktrym ulega przyczeniu aktywator transkrypcji ABF1. W niektrych obszarach ARS podobne miejsca aktywacji wystpuj po obu stronach sekwencji ori. Doczenie si aktywatora (lub aktywatorw) zwiksza wydajno replikacji nawet 1000-krotnie, przy czym dla procesu replikacji istotna jest sama ich obecno; rodzaj promotora odgrywa mniejsz rol, na przykad wymiana promotora ABF1 na promotor GAL4 nie powoduje adnych rnic w wydajnoci replikacji. Izolowanie sekwencji ARS razem z towarzyszcymi im biakami wykazao, e zarwno biaka ORC, jak i aktywatory transkrypcji doczaj si do DNA jeszcze przed replikacj w fazie Gv Aktywacja pow-

 A AT T T A T A T T T T,

biaka inicjacji replikacji (ORC) czynniki transkrypcyjne (TF)

TF~~) B < miejsce rozwijania nici DNA

C
BI

ORC A C

Rys. 3.21. Schemat struktury obszaru inicjacyjnego ARS w genomie drodowym

staych kompleksw zachodzi na przeomie fazy G1 i S, przez specyficzn wielostopniow fosforylacj katalizowan przez system kinaz cyklu komrkowego. Struktura obszaru ARS przedstawiona jest na rysunku 3.21.
3.2.11. Inicjacja replikacji DNA w komrkach wyszych eukariontw

W DNA komrek wyszych eukariontw nie udao si wykry sekwencji DNA, ktre odpowiadayby sekwencjom ARS. Dokadne badania replikacji DNA zachodzcej w obrbie wybranych genw o znanej sekwencji, jak np. w genie reduktazy dihydrofolianowej czy deaminazy adenozyny wykazay, e inicjacja replikacji DNA podlega tym samym zasadom co w prostych organizmach jednokomrkowych, jest jednak regulowana w inny sposb. W typowym chromosomie eukariotycznym wystpuj nie tyle miejsca inicjacji co strefy inicjacyjne o dugoci do 10 000 par zasad. Wystpuj one zawsze w obszarach midzygenowych. Replikacja rozpoczyna si wewntrz kadej strefy, zawsze w jednym krtkim odcinku DNA o wielkoci 200-500 par nukleotydw, chocia odcinki te mog wystpowa w rnych miejscach strefy, podczas rnych rund replikacyjnych. Jeli jednak tak stref, po wyciciu z chromosomu, podda si replikacji in vitro, to wytworzy si na niej cay szereg oczek replikacyjnych rwnoczenie. wiadcy to, e kada strefa zawiera wiele potencjalnych miejsc inicjacji znajdujcych si pod cis kontrol biaek struktury chromatyny i biaek szkieletowych macierzy jdrowej (matriks). Wydaje si, e biaka struktury chromatyny uniemoliwiaj dostp biaek inicjacyjnych do DNA, s wic represorami replikacji, natomiast biaka struktur jdrowych promuj ekspozycj wybranego miejsca DNA przez rozlunienie struktury chromatyny w tym obszarze. Umoliwia to przyczenie si biaek inicjacyjnych i otwarcie oczka" replikacyjnego. Faktory transkrypcyj-

potencjalne miejsca inicjacji

gen

gen

midzygenowa strefa inicjacji replikacji DNA

biaka chromosornalne powoduj represj miejsc ori nukleosomy

oczko replikacyjne jdro

biaka struktur jdra aktywuj jedno miejsce ori pozostawiajc inne w stanie nieaktywnym

biaka matriks Rys. 3.22. Schemat aktywowania miejsc inicjacji replikacji DNA w genomach wyszych eukariontw przez biaka chromatyny i macierzy jdrowej (matriks). Biaka chromatynowe i nie zidentyfikowane dotd biakowe skadniki jdrowego matriks powoduj represj potencjalnych miejsc ori z jednoczesnym zaktywowaniem jednego z nich (w centrum rys.). W miejscu tym rozpoczyna si dwukierunkowa replikacja caego replikonu (wg DePampilis 1993, Curr. Biol. 5: 434 zmodyf.)

ne, oprcz aktywowania wideek replikacyjnych, mog take peni rol czego w rodzaju czynnika licencyjnego dla transkrypcji. Ich obecno w DNA wskazywaaby miejsce rozwijania struktury chromatyny przez czynniki jdrowe. Po odpadniciu podczas przejcia wideek replikacyjnych, ich brak stanowiby gwarancj, e replikacja danego replikonu nie powtrzy si podczas tego samego cyklu podziaowego komrki (rys. 3.22). 3.3. Elongacja DNA Elongacja, podobnie jak inicjacja, wymaga udziau wielu biaek enzymatycznych potrzebnych do syntezy nowych czsteczek DNA. Nie wystarcza do tego tylko aktywno polimerazy DNA; potrzebna jest aktywno topoizomerazy i helikazy do rozwijania i rozdzielania acuchw matrycy, biaek SSB do utrwalania struktury matryc w obrbie wideek, wreszcie primazy do syntezy

starterowego RNA podczas syntezy fragmentw Okazaki na matrycy nici opnionej. Enzymy te tworz kompleks, ktry powstaje na pocztku replikacji i rozpada si po jej zakoczeniu; moe istnie tylko w asocjacji ze struktur wideek replikacyjnych. Kompleks ten zosta nazwany replisomem". Aeby wyrni te polimerazy, ktre uczestnicz w syntezie DNA jako skadniki kompleksu replikacyjnego, nazywa si je replikazami DNA.
3.3.1. Polimerazy DNA

Wszystkie polimerazy DNA, zarwno te bdce replikazami, jak i takie, ktrych rola w metabolizmie komrek nie zostaa ustalona, prokariotyczne i eukariotyczne, katalizuj reakcj wyduania syntetyzowanego acucha DNA przez kolejne doczanie nukleotydw do wolnej grupy 3'-OH tak, e wybr substratu jednego z czterech trifosforanw deoksyrybonukleotydw zaley zarwno od matrycy, jak i od enzymu, a kierunek syntezy jest zawsze taki sam 5' -> 3'.

Tabela 3.3. W komrkach E coli wystpuj trzy polimerazy DNA

Waciwoci Wielko Budowa Liczba czsteczek na komrk Aktywno: polimeryzacji 5' 3' egzonukleazy 3' -+5' egzonukleazy 5' 3' Aktywno wzgldna (w stosunku do Pol. I) Geny struktury

Polimeraza DNA I 109 000 monomer 400

Polimeraza DNA II 120 000 monomer -40

Polimeraza DNA III >250 000 heteromultimer 10-20 i

+ + +
(1) polA

+
-

+
-

0,05 polB

Fenotypy mutacji

naprawa DNA, spadek ywotnoci tylko po uszkodzeniu egzonukleazy 5' y

naprawa DNA, brak efektw mutacji

15 polC (<dnaE), dnaN, dnaX, dnaQ zahamowanie replikacji; mutanty tylko warunkowo letalne

Matryce: dwuniciowe z pkniciami dwuniciowe z duymi przerwami1 jednoniciowe ze starterem Wierno replikacji: w obecnoci domeny kontrolnej przy braku domeny kontrolnej

+ + +
5 x 107 105

+
-

+ +
5 x 109 7 x 106

1 bd na 10" prawidowo wczonych zasad ? ?

Polimerazy DNA nie wykazuj adnej specyficznoci w stosunku do kopiowanych matryc; nie rozrniaj wic sekwencji zasad w acuchu matrycowym. Rni si midzy sob budow, szybkoci katalizy, procesywnoci, czyli zdolnoci do wielokrotnego powtarzania reakcji polimeryzacji bez odczania si od ukadu matryca-starter, obecnoci lub brakiem wspdziaajcych podjednostek biakowych czy aktywnoci nukleolitycznych, wreszcie wymaganiami w stosunku do struktury matryc, ktre mog wykorzystywa. Polimerazy osigaj niezwyk dokadno w procesie polimeryzacji, dziki dwm etapom kontroli. O wyborze doczanego nukleotydu decyduje matryca, ktrej zasady mog tworzy wizania wodorowe z zasadami doczanymi przez polimeraz, a enzym rozpoznaje wczenie waciwej zasady jako przyjcie prawidowej struktury przestrzennej przez utworzon par zasad. Struktura ta jest jeszcze kontrolowana przez towarzyszc polimerazie egzonukleaz 3' 5', zwan egzonukleaz sprawdzajc. Jeli wystpi nieregularno, ostatnia zasada zostaje odczona jako monofosforan; nie moe wic dalej bra udziau w reakcji, robic miejsce dla trifsforanu waciwego nukleotydu. Aktywno sprawdzajca wystpuje we wszystkich polimerazach bakteryjnych oraz w tych polimerazach eukariotycznych, ktre s replikazami. Wpyw aktywnoci sprawdzajcej na dokadno replikacji jest bardzo duy, zwiksza j a o trzy rzdy wielkoci (p. tab. 3.3).
3.3.2. Bakteryjne polimerazy DNA

W komrkach bakterii stwierdzono obecno trzech polimeraz DNA (tab. 3.4). Polimeraza DNA I zostaa odkryta najwczeniej, jest take najlepiej zbadana. Zbudowana jest z jednego acucha peptydowego o 911 resztach aminokwasowych i masie rwnej 109 000 Da. Wystpuje w komrkach jako
Tabelala 3.4. Porwnanie waciwoci egzonukleaz 3' -> 5' i 5' 3' polimerazy I DNA

Waciwoci Kocowe nukleotydy substratu

3'-* 5' specyficzna rozpoznaje tylko nukleotydy z grup 3'-OH jednoniciowy DNA lub niesparowane koce dupleksu brak tylko mononukleotydy inhibicja kontrola dokadnoci replikacji

5' 3' niespecyficzna rozpoznaje mono-, di-, trifosforany 5'-P w DNA lub RNA sparowane koce dupleksu, regiony dwuniciowe obok ptli D wycina do 8 nukleotydw od koca 5' dupleksu mononukleotydy (80%) i oligonukleotydy (20%) stymulacja 10-krotna wycinanie starterw RNA, naprawa DNA

Struktura drugorzdowa substratu Aktywno endonukleazy Produkty hydrolizy Wpyw konkurencyjnej aktywnoci polimeryzacyjnej Proponowana funkcja

monomer i w tej formie bierze udzia w reakcji polimeryzacji DNA. W centrum aktywnym zawiera jeden atom cynku, jest wic metaloproteidem. W temperaturze 37C szybko polimeryzacji wynosi 670 nukleotydw/min na 1 czsteczk enzymu. W komrkach E. coli wystpuje w iloci ok. 400 czsteczek na komrk. Poniewa enzym ten odgrywa du rol w inynierii genetycznej, przez wprowadzenie genu tej polimerazy do komrek za pomoc litycznej formy faga A, udao si otrzyma komrki produkujce stukrotnie wiksze iloci tego enzymu (do 40 000 czsteczek/komrk). Polimeraza I, mimo prostej budowy, jest enzymem wielofunkcyjnym. Poza aktywnoci polimeryzacyjn ma dwie aktywnoci egzonukleolityczne o kierunkach dziaania 3' 5' i 5' 3'. Za pomoc agodnego trawienia trypsyn enzym mona rozdzieli na dwa fragmenty. Fragment wikszy, o nazwie fragmentu Klenowa i masie 68 000 Da, zawiera aktywnoci polimerazy i egzonukleazy 3' 5'. Aktywnoci te s przestrzennie rozdzielone. Rejon o aktywnoci polimeryzacyjnej, umieszczony przy kocu C peptydu znajduje si w odlegoci ok. 3 nm od rejonu o aktywnoci egzonukleazy sprawdzajcej 3' 5', co wiadczy, e procesy przyczania nukleotydu do acucha DNA i jego ewentualnej eliminacji w wyniku kontroli s przestrzennie rozdzielone. Fragment mniejszy (35 000 Da) zachowuje tylko aktywno egzonukleazy 5' 3'. Zmieszanie w roztworze obu fragmentw przywraca polimerazie I pen aktywno pierwotn; musz wic do siebie przylega i trzyma si razem mimo braku czcego je wizania chemicznego. Wydaje si, e obecna posta polimerazy I powstaa w wyniku ewolucji z dwch odrbnych biaek, kodowanych przez dwa rne geny. Egzonukleaza 5' 3' nie wykazuje specyficznoci substratowej, hydrolizuje zarwno DNA, jak i RNA, odcinajc jednorazowo od jednego do kilku nukleotydw. Jej brak powoduje zaburzenia we wzrocie bakterii, czego nie obserwuje si przy braku fragmentu Klenowa. Porwnanie waciwoci egzonukleaz 3' 5' i 5' 3' polimerazy I DNA przedstawione s w tabeli 3.4. Rol polimerazy I DNA jest usuwanie odcinkw starterowych z fragmentw Okazaki oraz wycinanie uszkodzonych odcinkw DNA w procesie naprawy. Polimeraza I DNA ma zdolno do rozpoczynania replikacji w ukadach in vitro z dwuniciowych matryc zawierajcych tylko jedn przerw w acuchu DNA. Enzym, wykorzystujc wolny koniec 3'-OH w miejscu pknicia, syntetyzuje now ni, zastpujc ni istniejc w dupleksie. Waciwo ta jest wykorzystywana do specyficznego znakowania syntetyzowanej nici i nosi nazw nick translation". Schemat tej reakcji przedstawia rysunek 3.23. W komrkach bakterii polimeraza ta nie bierze udziau w elongacji acuchw DNA, nie jest wic replikaz. Polimeraza DNA II take zbudowana jest z jednego acucha peptydowego o masie 120 000 Da. Wystpuje w liczbie ok. 40 czsteczek na komrk. Zawiera tylko jedn aktywno egzonukleolityczn 3' 5'. Jej roli w metabolizmie DNA nie udao si ustali, gdy mutanty polB, pozbawione genu tej polimerazy, nie wykazuj adnych zmian fenotypowych. Moe stanowi alternatywn drog uzupeniania luk w nici niecigej, z udziaem RNazy H wycinajcej startery, lub bierze udzia w naprawie DNA. In vitro polimeraza ta

Pol I

PoK/5)"^

5' 3'~

<E>
" znakowane dNTP

.3'
5'

Rys. 3.23. Schemat reakcji nick translation"

.3' '5'
- ligaza Poi ^ Pol (0) 3' 3'"

l l l l l l

Tabela 3.5. Podjednostki holoenzymu polimerazy DNA III z komrek E coli Nazwa podjednostki a

Masa (Da) 132 000 27 500

Gen struktury pollC 0dnaE) dnaQ (mutD)

Funkcja aktywno polimeryzacyjna kontrola wiernoci; aktywna wraz z podjednostk a . aktywator podjednostki a procesywno procesywno, wspdziaanie z kompleksem pol. III w syntezie nici opnionej wizanie enzymu ze starterem-matryc

Nazwy alternatywne
l-H

N ^ < U N U "d > o C U

IH

C 3 t-i O O*

* H H O j N C ,< J h D fi C "o

e i y s < 5 ' X P

10 000 , 71 47 35 33 15 12 000 500 000 000 000 000

? dnaX dnaX ? ? ? ? dnaN

C / 3

N d < L ) o

U (> o M

40 600

wymaga, jako matrycy, dwuniciowego DNA zawierajcego due luki w jednej z nici. Wymaga obecnoci biaek SSB i udziau ATP. Polimeraza DNA III jest waciw replikaz DNA w komrkach bakterii. Wystpuje w liczbie 10-20 czsteczek na komrk, jednake szybki obrt czsteczek enzymu w czasie replikacji sprawia, e rzeczywista jej aktywno jest 15 razy wiksza ni aktywno polimerazy I i a 300 razy wiksza ni aktywno polimerazy II. Form aktywn enzymu jest multimeryczny kompleks, zwany holoenzymem polimerazy III DNA. Skad holoenzymu przedstawia tabela 3.5. Najwiksz podjednostk majc aktywno polimeryzujc DNA jest podjednostk a, o masie 130 000 Da. Kodowana jest przez gen polC (idnaE). Z komrek bakterii podjednostk a wydziela si razem z podjednostkami s i 0, ktre razem stanowi jednostk podstawow (rdze) enzymu. Podjednostk s jest egzonukleaz sprawdzajc o kierunku dziaania 3' - 5'. Jest kodowana przez gen dnaQ. Oczyszczona do homogennoci jest bardzo mao aktywna, ale po poczeniu si z podjednostk a jej aktywno nukleolityczna wzrasta wielokrotnie. Obecno jej jest niezbdna do zachowania dokadnoci replikacji. Rola niewielkiej pojednostki 0, o masie 10 000 Da nie zostaa wyjaniona; nieznany jest rwnie jej gen. Rdze enzymu wykazuje nisk aktywno polimeryzacyjn i bardzo nisk procesywno. Ta forma enzymu odcza si od^ matrycy po doczeniu jednego lub najwyej kilku nukleotydw. Dodanie do rdzenia podjednostki T, kodowanej wsplnie z podjednostk y przez gen dnaX, powoduje dimeryzacj enzymu. Pol IIF moe ju replikowa naturalne matryce, np. DNA fagowe, a jego aktywno wzrasta a 40-krotnie. Jednoczenie wzrasta procesywno enzymu (tab. 3.6). Podjednostk T jest ATPaz zalen od jednoniciowego DNA i ma waciwo porzdkowania struktury jednoniciowego DNA, np. rozwijania struktury szpilki do wosw".
Tabela 3.6. Procesywno polimerazy III DNA wzrasta wraz ze wzrostem liczby podjednostek

Skad (a, , 0) (a, s, 02)T2 (a, e, 0)2i2y2(S, S', x, (a, , 0 ) 2 T 2 y 2 ( < ^ X, ^2(^2)2

Nazwa rdze polimerazy III polimeraza IIF polimeraza III* holoenzym

Procesywno (liczba doczonych nukleotydw/dysocjacj) 1-10 ( - ) 60 (spermidyna) 200 (SSB) 105 (SSB)

Kolejna, jeszcze wiksza, chocia wci niekompletna forma enzymu nosi nazw polimerazy III*. Zawiera dwie dalsze podjednostki y i <5, doczone w formie dimeru. Podjednostki y i z powstaj ze wsplnego mRNA w wyniku wykorzystania przez rybosomy specyficznej mutacji typu frameshift do wczeniejszej terminacji translacji. Miejsce to charakteryzuje si specyficznym ukadem 6 kolejnych nukleotydw adeninowych poprzedzajcych trwa struktur szpilki do wosw". W takich miejscach rybosomy zatrzymuj si i atwo mog zmieni faz odczytu, trafiajc na sygna stop (UGA), co powoduje

p
gpt r

dna* m .
v

orf

CD

>
>

O o

o o
O CD

o O <

o o
CD CD O O

OO
\ mRNA . . . A C C/A A A G C Liz Ala zmiana fazy (-1) Liz Liz Glu STOP Rys. 3.24. Struktura mRNA genu dnaX kodujcego podjednostki T i y holoenzymu polimerazy III DNA. Sekwencja zasad 1420-1436 umoliwiajca zmian fazy odczytu
/

o o

Liz

6 A G U,,G Liz Ser Glu

< 3 V f ^G

A A UA A . . .

przedwczesn terminacj i w efekcie syntez krtszej podjednostki y zamiast duszej T (rys. 3.24). Podjednostkom y2, 2 towarzyszy podjednostk 8' (izo 8) oraz dwie mae podjednostki x i Doczenie si kolejnej podjednostki j?, produktu genu dnaN, przeksztaca polimeraz III* w struktur waciw dla replikazy holoenzym polimerazy III. Podjednostk fi wystpuje w komrce w duym nadmiarze w porwnaniu do innych podjednostek. Jej rola polega na rozpoznaniu struktury starter-matryca, z ktr si wie. Do niej doczaj si pozostae skadniki holoenzymu. Bierze take udzia w przemieszczaniu si holoenzymu na nowe miejsce matrycy. Formowanie si holoenzymu jest procesem stosunkowo powolnym, in vitro tysickrotnie wolniejszym od reakcji polimeryzacji, a ponadto wymaga dopywu energii w postaci ATP. Jednak utworzony kompleks staje si trway, wykazuje procesywno praktycznie nieograniczon, a po dotarciu do koca 5'-P nowego startera moe bez oddysocjowania przesun si bardzo szybko na jego koniec 3'-OH, do doczonej tam wczeniej podjednostki /?.
3.3.3. Asymetryczna budowa holoenzymu polimerazy III DNA

Wystpowanie holoenzymu polimerazy III DNA w formie dimeru nasuno przypuszczenie, e katalizowanie syntezy obu nici DNA, prowadzcej i opnionej, moe zachodzi w obrbie jednego kompleksu enzymatycznego. Stao

si to tym bardziej prawdopodobne po stwierdzeniu zwijania jednoniciowego DNA w ptl w miejscu inicjacji syntezy starterw, co zmienia kierunek przesuwania si matrycowej nici DNA wzgldem polimerazy o 180. Trudniejsz kwesti do zrozumienia bya konieczno zmiany procesywnoci polimerazy DNA w obrbie jednego kompleksu. Pytanie w jaki sposb ten sam kompleks polimerazy DNA jednoczenie zachowuje bardzo wysok procesywno konieczn podczas syntezy nici prowadzcej oraz traci j podczas przechodzenia z jednego startera na drugi w czasie syntezy kolejnych fragmentw Okazaki znalazo wyjanienie dopiero niedawno. Okazao si, e dimer holoenzymu polimerazy III DNA nie jest identyczny w swoich obu czciach, rnic si skadem podjednostek (rys. 3.25).
3'

Rys. 3.25. Hipotetyczny obraz asymetrycznej struktury dimeru holoenzymu polimerazy III DNA w obszarze wideek replikacyjnych (wg A. Kornberga, DNA Replication. 1992)

Kolejno powstawania dimeru jest nastpujca. Jako pierwsze wi si z DNA podjednostki /J2, rozpoznajc ukad starter-matryca. Nastpnie, z udziaem A T P , doczaj si podjednostki T 2 ^ ( A T P ) 2 lub b2y2 ( A T P ) 2 kierujce przyczeniem si rdzenia enzymu, czyli trimeru katalitycznego (a, e, 0), czemu towarzyszy odczenie si 2 czsteczek ADP. Obecno podjednostki T zapewnia holoenzymowi wysok procesywno, a podjednostek b2 y2 oraz (<5',

*A)2 zdolno do przyczenia helikazy PriA oraz znacznie mniejsz procesywno, umoliwiajc przeskok z jednej matrycy na drug. W ten sposb za syntez nici prowadzcej odpowiada jedna cz dimeru z podjednostk T2, a za syntez nici opnionej cz druga z podjednostkami d2 y2 oraz (i5', x, *A)2- Podjednostka /? charakteryzuje si zdolnoci do lizgania si wzdu dwuniciowego DNA oraz do silnego wizania si z jednoniciowym DNA. Moe wic atwo odcza si od ju zsyntetyzowanego DNA i przycza si do jednoniciowej matrycy tu za nowym starterem, uatwiajc przesunicie si kompleksu polimerazy DNA na nowe miejsce syntezy. W ten sposb poowa dimeru z podjednostk T bdzie stale zwizana z matryc nici prowadzcej, podczas gdy druga poowa bdzie w sposb periodyczny odcza si od matrycy, eby przeskoczy kolejny starter, nie powodujc przy tym rozpadu kompleksu replikacyjnego.
3.3.4. Polimerazy DNA komrek eukariotycznych

Elongacja DNA w komrkach eukariotycznych, rnic si tylko w szczegach, podlega tym samym zasadom co omwiona wyej elongacja DNA komrek bakteryjnych. Synteza starterw katalizowana jest tylko przez eukariotyczne primazy, wystpujce z reguy w kompleksach z polimeraz DNA a. Jedynym znanym wyjtkiem jest omwiona wczeniej inicjacja replikacji DNA mitochondrialnego. Startery RNA maj zawsze tak sam dugo 10 nukleotydw, natomiast dowoln sekwencj, co wskazuje, e miejsca syntezy starterw nie s okrelane przez sekwencje matrycy. Fragmenty Okazaki s krtkie, zwykle nie przekraczaj odlegoci dzielcej nukleosomy. Komrki eukariotyczne, podobnie jak komrki bakteryjne, zawieraj po kilka rodzajw polimeraz DNA, z ktrych tylko tzw. polimerazy klasy a s rzeczywistymi replikazami DNA. Oprcz nich, w komrkach wystpuj specyficzne polimerazy DNA organelli komrkowych mitochondriw i chloroplastw oraz polimerazy DNA zaangaowane w napraw DNA. Podstawowe waciwoci polimeraz eukariotycznych przedstawia tabela 3.7. W skad polimeraz, stanowicych rzeczywiste replikazy DNA, wchodz trzy odrbne enzymy; wszystkie s niezbdne w replikacji jdrowego DNA. Najdawniej odkryt i do niedawna uwaan za jedyn replikaz jest polimeraza DNA a. Polimeraza ta nie ma aktywnoci egzonukleazy sprawdzajcej 3' 5', natomiast zawsze towarzysz jej dwie podjednostki zawierajce aktywno primazy. Obecnie uwaa si, e rola polimerazy u ogranicza si do syntezy starterw i towarzyszcych im krtkich odcinkw DNA, ktre s nastpnie wycinane razem z RNA. W komrkach drody polimeraza ta jest kodowana przez gen PO LI (CDC17), a dwie podjednostki primazy przez geny RP11 i RP12. Drug w kolejnoci odkrycia jest polimeraza DNA < 5 . Polimeraza ta wykazuje charakterystyczn zaleno aktywnoci od obecnoci specyficznego czynnika podziaw komrkowych biaka PCNA (ang. proliferating celi

Miejsce dziaania Nazwa dawniejsza Geny drodowe Funkcja

Wielko (kDa) Podjednostki katalityczne towarzyszce Procesywno Aktywno egzonukleazy 3' -> 5' Aktywno primazy Wierno replikacji Polarno helikazy/ ATPazy stymulujcej aktywno

a jdro a POL1 (iCDC17) replikacja, synteza starterw >250 165-180 70, 58, 48 niska

S jdro 5, S, POL3 (CDC2) replikacja

Polimerazy DNA s P jdro jdro <5, 529 Sil P POL2 POLX* replikacja naprawa DNA 40 (60) 40 (60)** brak niska

y mitochondria y MIPl replikacja mitochondrialnego DNA 160-300 125 35, 47 wysoka

170 125 48 zalena od PCNA obecna brak wysoka 5'->3'

256 215 55 wysoka

brak obecna wysoka 3' -> 5'

obecna brak wysoka 3' 5'

brak brak niska

-

obecna brak wysoka

-

* Nazwa tymczasowa nowo odkrytego genu. ** Masa drodowej polimerazy /? DNA.

nuclear antigen). Zaley od niego take procesywno enzymu. Polimeraza ta zbudowana jest z dwch podjednostek o masach 125 000 i, 48 000 Da. Podjednostk wiksza wykazuje oprcz aktywnoci syntetyzujcej DNA, take aktywno egzonukleazy sprawdzajcej 3' 5'. W komrkach drody kodowana jest przez gen POL3 (CDC2). Trzeci polimeraz replikacyjn jest polimeraza DNA s. Jej aktywno rwnie zaley od obecnoci PCNA, chocia charakteryzuje si wysok procesywnoci take przy braku tego antygenu. W jej skad, podobnie jak w przypadku dwch pozostaych poiimeraz DNA, wchodzi wiele podjednostek biakowych, z ktrych najwiksza zawiera oprcz aktywnoci syntetyzujcej DNA, take aktywno egzonukleazy sprawdzajcej 3' 5'. Wszystkie trzy polimerazy DNA maj wsplne sekwencje aminokwasowe centrw katalitycznych duych podjednostek, dlatego nosz nazw poiimeraz klasy a. W komrkach proliferujcych ich aktywnoci wzrastaj rwnomiernie, a brak ktregokolwiek z tych enzymw jest dla komrek letalny. Wystpuj powszechnie we wszystkich organizmach eukariotycznych. W komrkach eukariotycznych wykryto jeszcze inne polimerazy DNA. Nale do nich polimeraza DNA /? i y. Polimeraza DNA /? jest najmniejsz ze wszystkich poiimeraz eukariotycznych, o masie czsteczkowej ok. 40 000 Da. Nie zawiera egzonukleolitycznej aktywnoci sprawdzajcej 3' 5', a jej aktywno nie podlega zmianom w zalenoci od cyklu podziaowego komrki. W obecnoci DNazy V, z ktr tworzy

wsplne kompleksy, jest zdolna do reakcji nick translation" z podobn wydajnoci jak polimeraza I DNA z komrek E. coli. Ostatnio wykryto j rwnie w drodach; dotychczas wydawao si, e s one pozbawione tej polimerazy. Przypisuje si jej rol w naprawie DNA. Polimeraza DNA y zbudowana jest, podobnie jak polimeraza /?, z jednego polipeptydu. Odpowiada za replikacj DNA mitochondrialnego i chloroplastowego wg odrbnego mechanizmu omwionego wczeniej. W komrkach drody ostatnio wykryto jeszcze inn polimeraz DNA, produkt genu REV3, odpowiedzialn za tzw. napraw mutagenn. Jej brak nie powoduje efektw letalnych, nie bierze wic udziau w replikacji DNA. Przypisuje si jej rwnie rol w naprawie DNA. W komrkach innych eukariontw podobnej polimerazy jeszcze nie znaleziono.
3.3.5. Budowa eukariotycznych wideek replikacyjnych

W replikacj genomw eukariotycznych zaangaowane s wszystkie trzy replikazy DNA, a, < 5 , i s. Mog one wsplnie utworzy asymetryczny kompleks replikacyjny (replisom), w ktrym polimeraza a rozpoczyna replikacj w miejscu inicjacji przez syntez startera nici cigej i krtkiego odcinka DNA z nim zwizanego. Nastpnie za replikacj tej nici odpowiada polimeraza e (lub 5?). Replikacj nici opnionej rwnie rozpoczyna polimeraza a, odpowiadajc za syntez starterw dla fragmentw Okazaki. Wyduanie tych fragmentw
Pol Msynteza DNAJ starterw

'

* ^

Pol 6 (pol ?)

-N^

nici synteza prowadzcych

_ . , , Pol e (pol ?) x

synteza nici opnionych

. f \

u < ^

> - y

Pol p (?)

wycinanie starterw ^ i synteza uzupeniajca

Rys. 3.26. Prawdopodobne funkcje eukariotycznych polimeraz DNA w procesie replikacji

najprawdopodobniej katalizowane jest przez polimeraz 5 ze wzldu na moliwo regulowania jej procesywnoci za pomoc PCNA. Oprcz PCNA w replikacji uczestnicz take inne biaka wspomagajce, wrd nich stosunkowo dobrze poznany aktywator replikacji Al. Proponowany udzia poszczeglnych polimeraz w replikacji przedstawia rysunek 3.26.
3.3.6. Udzia histonw w replikacji

DNA w komrkach eukariotycznych przyjmuje zawsze struktur nukleosomow, zarwno w obszarach nie zreplikowanych, jak i w obrbie replikujcego si oczka". Zahamowanie syntezy histonw powoduje zawsze zahamowanie replikacji. Poniewa w czasie replikacji ilo DNA ulega podwojeniu, ilo histonw rwnie musi ulega podwojeniu. Sposb podziau histonw midzy powstajce czsteczki DNA by dugo nieznany. Dzisiaj przyjmuje si, e w obrbie wideek histony ulegaj dysocjacji i tworz wspln pul z histonami nowo* zsyntetyzowanymi. Po przejciu wideek doczaj si do obu nici zsyntetyzowanego DNA w sposb dowolny, bez rozrniania histonw starych od nowych, tworzc struktur, w ktrej pierwszy nukleosom na nici wyprzedzajcej powstaje w odlegoci ok. 110-125 nukleotydw od pocztku wideek, a. na nici opnionej : ok. 350 nukleotydw, przy czym odstpy midzy nukleosomami s wiksze ni w niciach nie zreplikowanych. Moe to stanowi jeden z sygnaw zabezpieczajcych dane fragmenty DNA przed przedwczesn powtrn replikacj. Struktur pierwotn nukleosomy osigaj dopiero w odlegoci ok. 40 000 nukleotydw od pocztku wideek (rys. 3.27).

replisom

par zasad

5-40x103 par zasad

Rys. 3.27. Schemat budowy wideek replikacyjnych w chromosomach komrek eukariotycznych

100

3.3.7. Biaka wspomagajce replikacj

1) Ligazy polinukleotydowe. Ligazy katalizuj syntez wizania fosfodiestrowego midzy ssiadujcymi resztami 3'-OH i 5'-P nukleotydw poczonych wizaniami wodorowymi z matrycow nici DNA. W czasie replikacji cz fragmenty Okazaki w jedn dug ni. Ligazy bakteryjne wymagaj obecnoci NAD jako koenzymu i rda energii. Ligazy wszystkich eukariontw oraz bakteriofagw T4 i T7 wykorzystuj do tego celu ATP. Reakcja przebiega trjstopniowo: (a) aktywowanie enzymu przez utworzenie wizania midzy NAD lub ATP z reszt aminow s lizyny obecn w czsteczce enzymu. Uwalnia si NMP lub pirofosforan; (b) doczenie zaktywowanego enzymu do koca 5'-P acucha DNA w miejscu jego przerwania; (c) wytworzenie wizania fosfodiestrowego midzy kocem 3'-OH i zaktywowanym kocem 5'-P z uwolnieniem enzymu i AMP (rys. 3.28).
i i ElizNH2 + ATP lub NAD ^ Eliz(+)NH AMP("> + P P lub NMP

(b)
ElizNH2AMP + [ -1-^J-OH j RJ ["" L >. . I - L - N J - O H PvJ I
+ L E

"~ l l Z

I 0 I

AMP

(c)

n i

i r
AMP
(-)

^ i

i o i r

+ H(+) + AMP

-UJ.0H p j L 0 1

-L-J-o-f-aJL o H

Rys. 3.28. Schemat dziaania ligazy. czenie przerw w acuchach D N A wymaga udziau ATP (ligazy eukariotyczne) lub N A D (ligazy bakteryjne), (a), (b), (c) kolejne etapy reakcji

Ligazy bakteryjne i fagowe zbudowane s z jednego acucha peptydowego i maj charakterystyczny, wyduony ksztat czsteczki.* W ligazowych mutantach termo wraliwych, w temperaturze restrykcyjnej, nagromadzaj si liczne, krtkie fragmenty DNA, co wiadczy, e brak ligazy nie blokuje replikacji. W komrkach bakterii liczba czsteczek ligazy odpowiada liczbie czsteczek polimerazy I DNA, co sugeruje cise wspdziaanie tych enzymw w replikacji. W komrkach eukariontw wystpuj co najmiej dwie ligazy rnice si wielkoci, lecz o takiej samej funkcji. W komrkach drody znany jest gen kodujcy ligaz I ( CDC9).

"3'

Rys. 3.29. Schemat przemieszczania si biaek SSB w obszarze wideek replikacyjnych

2. Biaka stabilizujce jednoniciow struktur DNA. Biaka te SSB (ang. single-strand binding proteins) wykazuj silne powinowactwo do jednoniciowego DNA. Wi si z DNA w stosunku stechiometrycznym i wspdziaaj ze sob tak, e pokrywaj cay obszar szkieletu fosfocukrowego acucha, pozostawiajc zasady sterczce na zewnrz. W czasie replikacji ulegaj przemieszczaniu z jednych odcinkw matrycy na inne, co zwiksza stopie ich wykorzystania (rys. 3.29). Charakteryzuj si du specyficznoci oraz zdolnoci do wspdziaania z innymi biakami, co czyni je niezbdnymi we wszystkich procesach metabolizmu DNA. Biaka SSB komrek E. coli wystpuj w formie tetramerw o bardzo trwaej strukturze, z ktrych kady pokrywa 36-nukleotydowy odcinek DNA o dowolnej sekwencji. Biaka SSB komrek ludzkich (RF-A) i innych eukariontw zbudowane s z trzech podjednostek. Eukariotyczne biaka SSB wspdziaaj z polimerazami DNA, zwikszajc aktywno inicjacyjn polimerazy DNA a oraz procesywno polimeraz i e. Wiele bakteriofagw i wirusw zawiera geny swoistych biaek SSB, niezbdnych w replikacji ich genomw. 3. Helikazy biaka rozwijajce podwjny heliks DNA. Helikazy wykorzystuj energi hydrolizy ATP do zmiany ksztatu swojej czsteczki, podobnie jak biaka miniowe, co umoliwia im wykonywanie pracy mechanicznej. Mog posuwa si wzdu dwuniciowego DNA, rozdzielajc nici i poszerzajc wideki replikacyjne, lub wzdu jednoniciowej matrycy, umoliwiajc polimeryzacj DNA (np. biako PriA primosomu). Enzymy te nale do duej grupy ATPaz, ktrych zmiany konformacyjne, zalene od energii pobieranej przy hydrolizie ATP, maj ogromne znaczenie w przenoszeniu energii we wszystkich systemach biologicznych. Helikazy maj okrelony kierunek dziaania: cz si w sposb specyficzny z jednym ramieniem wideek, dziaajc albo w kierunku 5' 3' albo 3' -> 5'. In vivo oba typy helikaz wspdziaaj ze sob, zapewniajc pynny ruch wideek do przodu.

4. Topoizomerazy relaksuj skrcenie podwjnego heliksu. Schematyczny, paski obraz wideek replikacyjnych nie uwzgldnia skrcenia nici wzdu osi heliksu. W rzeczywistoci rozczenie nici DNA musi spowodowa jeden peny obrt podwjnej nici DNA na kade 10 rozczonych par zasad. Zapewnienie cigego ruchu wideek replikacyjnych spowodowaoby obracanie si caego chromosomu z wielk szybkoci. W rzeczywistoci obroty chromosomw sterowane s przez enzymy dziaajce jak odwracalne nukleazy". Przez nacinanie i czenie nici DNA umoliwiaj one obroty tylko niewielkich odcinkw chromosomu. Kada reakcja nacinania i czenia pozwala na jeden swobodny obrt. Topoizomerazy dzieli si na dwie grupy: (I) enzymy nacinajce tylko jedn ni podwjnego heliksu; (II) enzymy nacinajce obie nici DNA jednoczenie. Najlepiej poznanym enzymem grupy (I) jest topoizomeraza E. coli, produkt genu top A. Enzym reaguje z DNA zwinitym w zwoje ujemne, tworzc kompleks z DNA, w ktrym jedna ni ulega przeciciu, a enzym przez reszt tyrozynow wie si z woln grup fosforanow 5'-P wizaniem wysokoenergetycznym. Druga ni DNA ulega stabilizacji przez reszt czsteczki biakowej enzymu. Po kontrolowanym obrocie przecitej nici, relaksujcym

oooooc
enzym wiqze si z rozdzielonymi acuchami DNA 3' 5'

OOOOOC
Rys. 3.30. Schemat dziaania topoizomerazy I. Enzym katalizuje reakcj relaksowania zwojw podwjnego heliksu tu przed otwartymi widekami replikacyjnymi jeden acuch ulega przeciciu, a wolne koce zostaj utrwalone przez enzym

5'

ooooc
drugi acuch zostaje przesunity przez przerw, a pknicie-zespolone

dupleks, nastpuje odtworzenie wizania fosfodiestrowego w DNA i uwolnienie enzymu. Enzym wie si tylko do miejsc o ju rozdzielonych acuchach, musi wic dziaa bardzo blisko wideek replikacyjnych (rys. 3.30). Poniewa w czasie obrotu ni nie przecita ulega przesuniciu przez powsta przerw na drugiej nici, enzym moe czy ze sob kolisty DNA w struktury zaplecione na ksztat ogniw acucha. Rola takich struktur DNA w komrce jest nieznana. Topoizomerazy grupy (I) komrek eukariotycznych mog reagowa zarwno z dupleksem DNA zwinitym w zwoje o kierunku ujemnym, jak i dodatnim. Ich dziaanie relaksujce jest odmienne. Zamiast przesuwania nici nie rozcitej przez utworzon przerw, enzym uatwia obrt nici przecitej wok nici komplementarnej, a nastpnie dokonuje ligacji powstaej przerwy.
gyraza gyraza

stabilizacja dodatniego zespolenie superskrtu podwjnej nici DNA zerwanie dwuniciowej struktury DNA Rys. 3.31. Schemat dziaania gyrazy w procesie zmiany kierunku skrtu superheliksu

Topoizomerazy grupy (II) mog nie tylko powodowa relaksacj skrce dodatnich i ujemnych w DNA, lecz mog take powodowa powstawanie nowych skrce lub zmienia np. skrcenia dodatnie w ujemne. Przykadem takiego dziaania moe by zmiana kierunku skrtu superspirali przez topoizomeraz E. coli gyraz, w czsteczce kolistego DNA (rys. 3.31). Reakcja wymaga dopywu energii w postaci ATP, a jej szybko wynosi ok. 100 zwojw/min na jedn czsteczk enzymu. Gyraza jest tetramerem zbudowanym z dwch dimerowych podjednostek a 2 , jS2- k h charakterystyka przedstawiona jest w tabeli 3.8. Enzym rozpoznaje w DNA konfiguracj skrzyowanych nici, nie wykazujc specyficznoci do zasad. Inhibicja aktywnoci gyrazy przez antybiotyki powoduje zahamowanie replikacji, co wiadczy o jej niezbdnoci w zapewnieniu swobodnego ruchu wideek. Mechanizm dziaania gyrazy jest podobny do dziaania topoizomeraz grupy (I). Podjednostki a tetrameru przecinaj nici DNA z zachowaniem energii wiza w formie wysokoenergetycznych pocze fosfotyrozynowych. Podjednostki /? powoduj zmiany topologiczne w DNA z udziaem ATP. Gyraza katalizuje nastpujce reakcje:

Waciwoci a Wielko Da Gen struktury Inhibitory aktywnoci Aktywno przecinania i czenia DNA Aktywno ATPazy

Podjednostka 105 000 gyr A (nalA) kwas nalidyksynowy (NAL) kwas oksolinowy (OXO) + P 95 000 gyrB (cou) kumermycyna (COU) nowobiocyna (NOV)

(a) zwijanie koowych, zrelaksowanych czsteczek DNA w superheliksy 0 ujemnym kierunku skrtw; udzia bior obie podjednostki; (b) relaksowanie superspirali DNA; udzia bierze tylko podjednostka a 2 , a wic reakcja nie wymaga dopywu energii z hydrolizy ATP; (c) hydroliza ATP w obecnoci DNA; reakcja wie si z procesem zwijania DNA w superheliks i jest katalizowana przez pojednostki /?2; (d) zaplatanie dwuniciowych kolistych czsteczek DNA jak ogniwa acucha (katenacja) i rozplatanie katenatw w obecnoci ATP; udzia bior obie podjednostki.

3.4. Terminacja replikacji Kocowy etap replikacji wymaga poczenia powstaego DNA w kompletne chromosomy i rozdzielenia ich midzy komrki potomne. Mechanizm rozdziau chromosomw eukariotycznych nie zosta jeszcze w peni wyjaniony, 1 nie bdziemy si nim tu zajmowa. Terminacja replikacji w komrkach bakterii znajduje si pod kontrol specyficznego mechanizmu. Miejsce terminacji w kolistym chromosomie bakteryjnym znajduje si dokadnie naprzeciwko miejsca inicjacji (oriC) i obejmuje obszar 800 par zasad. Wystpuj tam 4 sekwencje nukleotydowe, nazwane ter, po dwie na kadym ramieniu chromosomu, uoone w ten sposb, e sekwencje nukleotydowe jednego ramienia s dokadnie przeciwstawne sekwencjom ramienia drugiego i znajduj si w tej samej odlegoci od osi symetrii. Sekwencje te, o dopuszczalnych tylko bardzo niewielkich zmianach w skadzie nukleotydw, s miejscami wizania biaka terminacyjnego, produktu genu tus, ktre jest supresorem replikacji. Hamujce dziaanie miejsc ter przedstawia rysunek 3*32. Wideki poruszajce si zgodnie z ruchem wskazwek zegara przelizguj si swobodnie przez miejsca terD i terA, a s zatrzymywane przez terC i terB. Natomiast wideki poruszajce si w kierunku przeciwnym przelizguj si przez terB i terC, a s zatrzymywane przez terA i terD. W ten sposb, jeli ruch wideek jakiegokolwiek ramienia zostanie opniony, terminacja i tak zakoczy si zawsze w obszarze terminalnym. Gen kodujcy biako tus o masie 36 000 Da jest oddalony tylko o 10 par zasad od miejsca terB, co wiadczy o jego autore-

tus

ter A - A A T T A ter B ter C ter D - C TA A

TA

TGTTGTAACTA AAC T TGTTGTAACTA TGTTGTAACTA TGTTGTAACTA TA TG

plazmidy maj po dwie sekwencje ter R6K ter 1 ter 2 C T A T T GA GT GT T G T A A C T A C T A G G T GTT GT AA CTA R100 ter 1 ter 2 G G T G TT GT A A CT A T GT T G T A A CT A

Rys. 3.32. Budowa obszaru terminacji replikacji D N A w replikonie E. coli

gulacji, gdy przyczenie si czsteczki biaka do tego miejsca hamuje transkrypcj genu tus. Biako tus jest inhibitorem helikazy DnaB o kierunku dziaania 5' 3', zgodnym z ruchem wideek. Helikazy o kierunku dziaania 3' 5', przeciwnym do ruchu wideek s hamowane bardzo sabo. Podobne systemy terminacji wykryto u Bacillus subtilis oraz w niektrych plazmidach bakteryjnych-w ktrych wystpuj zwykle tylko dwie sekwencje terminalne. W komrkach eukariontw replikony, ktrych jest wiele w kadym chromosomie, nie maj sekwencji terminalnych ani adnych systemw sucych do regulowania terminacji. Replikacja kadego replikonu koczy si w momencie fizycznego zetknicia si wideek podajcych ku sobie z przeciwnych kierunkw. Inaczej jednak wyglda sytuacja z zakoczeniem syntezy chromosomw. W odrnieniu od kolistych chromosomw bakteryjnych, chromosomy eukariotyczne zbudowane s z liniowych czsteczek DNA, zakoczonych bardzo charakterystycznymi sekwencjami nukleotydowymi, nazwanymi telomerami.

S to krtkie, wielokrotnie powtarzajce si odcinki DNA o sekwencji dajcej si uj wsplnym wzorem:

VC

(1-8)

(0-1)

(0-4)

'

wystpujce we wszystkich organizmach (tab. 3.9). Charakterystyczn cech indywidualnych telomerw jest ich zmienno. Chocia liczba powtarzajcych
Tabela 3.9. Sekwencje nukleotydowe powtarzajcych odcinkw telomerowego DNA Nazwa gatunku Tetrahymena, Paramecium Stylonychia, Oxytricha Trypanosoma Physarum Saccharomyces Arabidopsis Homo sapiens Sekwencje powtarzalnych odcinkw DNA (5' -> 3') C C C C A AC C C C A A. . . C C C C A A A AC C C C A A A A. . C C C T AC C C T A. . . C C C T AC C C T A. . . C(2-3) A (C A) ( 1 _ 3 ) . . . ,C (3) T A (3) . . . C(3) T A(3)

Przedstawione sekwencje dotycz nici komplementarnych telomerw, mierzonych od koca chromosomu, w kierunku jego rodka.

si odcinkw w rnych chromosomach tego samego gatunku jest rna, a nawet w obrbie tych samych chromosomw moe si rni w zalenoci od warunkw wzrostu komrek, to rednia dugo telomerw w danym organizmie jest utrzymywana na staym poziomie, co wiadczy, e znajduj si one pod kontrol genetyczn, ktra zabezpiecza organizm przed ich nadmiernym wyduaniem lub skracaniem. Poniewa obecno telomerw w chromosomach jest niezbdna, przypisuje si im nastpujce funkcje: (a) udzia w terminacji replikacji chromosomalnego DNA, co zapewnia utrzymanie niezmiennej dugoci waciwych genomw. Bez nich chromosomy ulegayby skracaniu przy kadym nowym cyklu replikacyjnym o odcinki rwne dugoci kocowych starterw RNA, niemoliwych do uzupenienia przez polimerazy DNA (rys. 3.33). (b) stabilizacja i ochrona chromosomalnego DNA przed dziaaniem nukleaz i przed czeniem si z innymi chromosomami, na co, majc lepkie koce, s szczeglnie naraone. S wic ich swoist ochronn czapeczk. Synteza telomerw zachodzi w sposb zupenie odmienny od syntezy pozostaej czci chromosomalnego DNA. acuchy DNA zakoczone reszt 3'-OH s bogate w guanin. Za ich syntez odpowiada telomeraza, duy nukleoproteid o masie 200 000-500 000 Da, zawierajcy w centrum aktywnym czsteczki biakowej swoist matryc acuch RNA zbudowany z 159 zasad, w ktrym w czci rodkowej znajduje si sekwencja odpowiadajca sekwencji powtarzajcych si odcinkw acucha telomerowego DNA, bogatego w reszty guaninowe. Starterem jest zawsze kocowa sekwencja telomeru pozostaego z poprzedniego cyklu replikacyjnego (rys. 3.34). Enzym docza si do koca chromosomu, wykorzystujc jako miejsce zaczepienia kocow trjk nukleo-

liniowy dwuniciowy DNA

starterowy RNA rozpoczyna syntez nowych nici DNA

5'

; : : ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; : ' ' ::: ':' ' ::' 5/

starterowy RNA ulega wyciciu pozostawiajc przerwy

5'

. . . . . . . . . . . . . .

, 5' przerwy zostaj wypenione z wyjtkiem zakocze nia ^

. 5'
: 1 !

.
: : :

rr 5'
1 ! : 1 1 1 1 ! 1

Rys. 3.33. Polimerazy DNA nie mog wypeni luk powstaych na kocach 5'-liniowych czsteczek DNA

tydw, a nastpnie docza pojedynczo kolejne nukleotydy, a do wypenienia matrycy. Nastpnie ulega translokacji i proces powtarza si. Po odczeniu telomerazy brakujca ni bogata w zasady C i A jest doreplikowywana w sposb semikonserwatywny. Ni ta jest zawsze krtsza od nici bogatej w zasady G i T o odcinek dugoci kilkunastu nukleotydw, ze wzgldu na niemono uzupenienia sekwencji pozostaej po usuniciu ostatniego startera. W nici tej wystpuj jednonukleotydowe luki, ktre nie ulegaj ligacji. Wolny koniec telomeru zawierajcy powtrzenia sekwencji guaninowych ulega zwiniciu w struktur szpilki do wosw", przez wytworzenie nietypowych wiza wodorowych midzy parami GG: ^ 3' -A-A-C-C-C-C-5' l l l l l l * 3'-G-G-G-G-T-T-G-G-G-G x T
x x x x x x x x |

T 5' T T G G G G T T G G G G T T G G G G T T G G G G ^ Struktury te mog tworzy niezwyke, czteroniciowe formy, zwane G-DNA" lub G-kwartet". Jako niedostpne dla nukleaz stanowi doskonae zabez-

(a)
chromosom | p

A I A.

3'

5'
telomeraza
/

matryca RNA

A-A-C-C-C-C-A-A-C C-C-C-C-A-A-C G - G - G - G - T - T - G - G - G - G - T - T - G -- - G - G - G - T - T - G

-GTP, TTP

doczanie pojedynczych nukleotydw

(b)
chromosom gp ^H C-C-C-C-A-A-C G-G-G-G-T-T-G-G-G-G-T-T-G telomeraza

translokacja

(c)
chromosom C G-G-G-G-T-T-G-G-G-G-T-T-G' GTP, TTP telomeraza

doczanie pojedynczych nukleotydw

(d)
chromosom telomeraza

Rys. 3.34. Proces wyduania telomerowych zakocze chromosomw, katalizowany przez telomeraz. (a) Telomeraza rozpoznaje kocow sekwencj chromosomu i przycza si do niej przez hybrydyzacj matrycowego RNA z kocow sekwencj T T G chromosomu, (b) Telomeraza docza kolejno pojedyncze nukleotydy do DNA, zgodnie z sekwencj swojej matrycy, (c) Po wypenieniu matrycy, telomeraza ulega translokacji na now kocow sekwencj T T G. (d) Telomeraza wydua koniec chromosomu o kolejny fragment

pieczenie kocw chromosomw przed degradacj. Chromosomy musz wic zawiera specyficzne miejsca inicjacji (ori) niezbdne do replikacji materiau genetycznego, centromery umoliwiajce ich segregacj oraz telomery zapewniajce im trwao.

4. FIZYCZNA ORGANIZACJA GENOMU

Wielko poszczeglnych genomw rni si znacznie midzy sob (tab. 4.1). Niezalenie od tego, w ogromnej wikszoci przypadkw struktury, w ktrych znajduj si czsteczki kwasw nukleinowych, s o wiele mniejsze
Tabela 4.1. Wielkoci niektrych genomw Gatunek Wiroid PSTV Bakteriofag X174 Bakteriofag X Bacillus subtilis E. coli Drode D. melanogaster Krab Czowiek Trzykrotka
* Liczba nukleotydw RNA. ** Liczba nukleotydw DNA.

Wielko hapliodalnego genomu (pary nukleotydw) 359* 5500** 4,5 x 104 2,0 x 106 4,2 x 106 2,0 x 107 1,4 x 108 1,4 x 109 3,3 x 109 3,0 x 10 10

ni te czsteczki. Czsteczka DNA o wielkoci 5 x 106 par zasad wystpuje w roztworze w postaci swobodnego kbka o rednicy ok. 5 jim. Genom E. coli jest rwnie czsteczk DNA o wielkoci k. 5 x 106 par zasad. Jednake w tym przypadku mieci si ona bez przeszkd w komrce bakteryjnej o objtoci 1000 razy mniejszej ni objto swobodnego kbka. Stopie skondensowania DNA w chromosomie eukariotycznym jest jeszcze wikszy. Czsteczka DNA nie tworzy spontanicznie struktur skondensowanych. Przeciwdziaaj temu gsto rozmieszczone, odpychajce si adunki ujemnych grup fosforanowych. Kondensacja genomowego DNA (rwnie RNA) zachodzi przede wszystkim dziki tworzeniu si kompleksw kwasw nuk-

leinowych z biakami. Pewien udzia w zmniejszaniu" rozmiarw czsteczek DNA ma rwnie powstawanie w nich superheliksu, tzn. wzajemnych owini dwuniciowych acuchw wok siebie w obrbie tej samej czsteczki DNA. Ten ostatni sposb dotyczy kolistych czsteczek DNA oraz tych fragmentw czsteczek liniowych, ktrych koce s unieruchomione. cise upakowanie DNA w kompleksach z biakami strukturalnymi, tak jak ma to miejsce w genomie eukariotycznym, ogranicza dostpno tego DNA dla innych biaek. Sekwencje regulatorowe, ktre musz mie swobod oddziaywania z czynnikami biakowymi, s wic zwykle umieszczone poza kompleksami DNA z biakami strukturalnymi.

4.1. Genom wiroidw Najmniejsze ze znanych genomw to genomy wiroidw, patogenw rolin wyszych. Stanowi je koliste czsteczki jednoniciowego RNA o dugoci kilkuset nukleotydw. Nie s one skompleksowane z biakami strukturalnymi. Czsteczka PSTV (ang. potato spindle tuber viroid) RNA jest zbudowana z 359 nukleotydw. Jest to sekwencja zbyt krtka, aby moga zawiera informacj o budowie biaka strukturalnego o przecitnej wielkoci. Wikszo sekwencji genomu wiroidw ma swoje komplementarne odpowiedniki w tej samej czsteczce RNA. W czsteczce PSTV RNA jest tylko 7 niesparowanych ptli, liczcych po kilka nukleotydw. W efekcie kolista czsteczka jednoniciowego RNA ma na prawie caej swojej dugoci struktur dwuniciow, ktra pozwala jej przybra ksztat zwartej paeczki.

4.2. Genom wirusw Genomy wirusw s czsteczkami RNA lub DNA, ktre mog by jednoniciowe lub dwuniciowe. Charakterystyczn cech strukturaln wirusw jest to, e kwas nukleinowy stanowicy ich genom znajduje si wewntrz kapsydu, czyli otoczki zbudowanej z biaka. Pod koniec lat 50. zwrcono uwag, e ilo informacji zawarta w genomach wikszoci prostych wirusw jest zbyt maa, aby mogy one kodowa biako o masie odpowiadajcej caemu kapsydowi wirusowemu. Byo to podstaw hipotezy, wedug ktrej kwas nukleinowy wirusa jest otoczony przez liczne kopie identycznych podjednostek biakowych, z ktrych kada moe by zbudowana z kilku rodzajw czsteczek biaka. Genom wirusa kodowaby w tym wypadku tylko jedno lub co najwyej kilka biaek strukturalnych. Wspczesna wiedza, oparta na precyzyjnych badaniach strukturalnych, wykorzystujcych metody o rozdzielczoci bliskiej atomowej (techniki dyfrakcyjne, mikroskopia elektronowa), w peni potwierdza opisan koncepcj.

Struktur prostych wirusw daje si sprowadzi do dwch podstawowych typw: helikalnego (wirusy paeczkowate) oraz ikosaedralnego (wirusy sferyczne). Klasycznym przykadem wirusa o strukturze helikalnej jest wirus mozaiki tytoniu TMV (ang. tobacco mosaic virus). Podjednostki biakowe kapsydu wymuszaj na czsteczce RNA genomu TMV helikalne zwinicie dziki swym oddziaywaniom z RNA oraz oddziaywaniom, jakie zachodz midzy samymi podjednostkami biakowymi (rys. 4.1). Oddziaywania te s prawie jednakowe na caej dugoci wirusa. Wyjtkiem s oddziaywania podjednostek zlokalizowanych na pocztku i na kocu czsteczki RNA.

cay wirus = 130 zwojw

Rys. 4.1. Budowa i sposb formowania helikalnego (paeczkowatego) wirusa mozaiki tytoniu (TMV) (wg H. Fraenkel-Conrat, Design and Function of the Threshold of Life. The Viruses, New York Academic Press. 1962)

Kapsydy wirusw ikosaedralnych (sferycznych) s zbudowane z jednakowych podjednostek biakowych, ktrych liczba jest rwna 60 lub niewielkiej wielokrotnoci 60. Sposb uoenia podjednostek biakowych w kapsydzie gwarantuje prawie cakowit rwnocenno oddziaywa midzy poszczeglnymi podjednostkami. Przykady kilku takich rozwiza przedstawione s na rysunku 4.2. W biakach kapsydw wikszoci wirusw ikosaedralnych spotyka si ten sam motyw, zachowany zarwno w ich budowie przestrzennej, jak i w sekwencji nukleotydw genw kodujcych te biaka. Przykadami sferycznych kapsydw s gwki fagw X i T4.

Rys. 4.2. Przykady uoenia podjednostek biakowych (zaznaczone pogrubion lini) w kapsydach wirusw ikosaedralnych (sferycznych) (wg M.G. Rossmann and J.E. Johnson, Annu. Rev. Biochem., 58, 533-573, 1989)

Upakowanie kwasu nukleinowego wewntrz kapsydu wymaga neutralizacji ujemnych adunkw fosforanw, przeciwdziaajcych kondensacji. Czsto czyni to zasadowe odcinki biaek tworzcych kapsyd; u niektrych wirusw (tymiwirusy, pikornawirusy) ujemne adunki fosforanw s neutralizowane przez poliaminy znajdujce si wewntrz kapsydu.

4.3. Napicie torsyjne w genomie bakteryjnym Najpowszechniej spotykan form DNA jest tzw. forma B, w ktrej dwie nici polinukleotydowe oplataj si wzajemnie raz na 10 par zasad. Gdy czsteczka DNA jest kolista lub te gdy jej koce s unieruchomione, liczba wzajemnych oplece moe by wiksza lub mniejsza od tej wartoci. W czsteczce takiej wystpuje wwczas napicie torsyjne, prowadzce do powstania

'i

Rys. 4.3. Przecicie nici polinukleotydowych, rozkrcenie podwjnego heliksu i ponowne poczenie przecitych nici prowadzi do powstania superheliksu w kolistej czsteczce DNA

superheliksu, czyli owinicia wok siebie dwuniciowych acuchw DNA tej samej czsteczki (rys. 4.3). Superheliks ma swoj skrtno: moe by dodatni lub ujemny. Skrtno superheliksu zaley od tego, czy liczba oplece nici polinukleotydowych w kolistej czsteczce DNA zostaa zwikszona, czy te zmniejszona w stosunku do tej, jaka wystpuje w formie B DNA.

Kolista czsteczka DNA chromosomu bakteryjnego jest podzielona na kilkadziesit ptli (domen) o unieruchomionych kocach, doczonych do biakowego szkieletu. Taka struktura zapewnia kadej ptli autonomi topologiczn. Oznacza to, e zmiany w gstoci superheliksu DNA w obrbie ktrejkolwiek ptli nie wpywaj na gsto superheliksu w pozostaych ptlach. Genom E. coli, o wielkoci 4,2 x 106 par zasad, skada si z okoo 40 ptli. Taki domenowy sposb organizacji DNA, jak rwnie wielko ptli genomu bakteryjnego, s podobne do rozwiza spotykanych w genomie eukariotycznym. Jednak w przeciwiestwie do DNA genomu eukariotycznego w DNA bakteryjnym wystpuje napicie torsyjne. Wynika ono z czciowego rozkrcenia podwjnego heliksu bakteryjnego DNA, rednio o jeden obrt na

przejciowo obie nici DNA (wg R.J. Reece and A. Maxwell, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26, 335-345. 1991)

200 par zasad. W rezultacie w bakteryjnym DNA wystpuje superheliks 0 ujemnej skrtnoci. Odpowiedni gsto superheliksu w bakteryjnym DNA utrzymuj dwa rodzaje topoizomeraz. S to enzymy, ktre przejciowo przecinaj jedn lub obie nici DNA, umoliwiajc w ten sposb zmian liczby oplece nici polinukleotydowych wok siebie. Dwie bakteryjne topoizomerazy: topoizomeraza 1 i gyraza dziaaj antagonistycznie. Gyraza wprowadza do czsteczki DNA ujemne skrty superhelikalne (rys. 4.4), zuywajc przy tym ATP; topoizomeraza I relaksuje ujemne skrty superheliksu bez wydatku energii. Ekspresja wielu genw bakteryjnych wymaga utrzymywania napicia torsyjnego w czsteczce DNA i drastycznie spada po jego zrelaksowaniu. Jednym z wyjtkw s geny dwch podjednostek gyrazy, aktywowane wanie przez spadek gstoci

Rys. 4.5. Powstawanie dodatnich i ujemnych skrtw superheliksu podczas transkrypcji. W przypadku jednej czsteczki polimerazy RNA poruszajcej si w kolistej czsteczce DNA: dodatnie i ujemne skrty znosz si wzajemnie (a). Gdy dwie czsteczki polimerazy RNA poruszaj si w przeciwnych kierunkach, potrzebna jest interwencja topoizomerazy (b) (wg H.Y. Wu et al., Celi, 53, 433-440. 1988)

supersheliksu. Jest to element mechanizmu regulacyjnego, ktry zapewnia odpowiedni gsto superheliksu w czsteczce bakteryjnego DNA. Podczas transkrypcji, zachodzcej w czsteczce kolistego DNA (lub w ptli o unieruchomionych kocach), poruszajca si czsteczka polimerazy RNA tworzy przed sob dodatnie, za sob za ujemne skrty superheliksu. Jest to wynik odpowiednio rozplatania i ponownego zaplatania prawoskrtnego podwjnego heliksu DNA przez polimeraz, ktra nie ma moliwoci obrotu wok wasnej osi (rys. 4.5). Bakteryjna topoizomeraza I relaksuje nadmiar ujemnych skrtw superheliksu. Nie ma jednak zdolnoci relaksacji dodatnich skrtw superheliksu, powstajcych przed poruszajc si polimeraz. T rol kompensowania powstajcych dodatnich skrtw superheliksu speniaj wprowadzane przez gyraz ujemne skrty superheliksu, obecne przez cay czas w czsteczce bakteryjnego DNA.

4.4. Biaka genomu bakteryjnego W genomie bakteryjnym brak jest biaek, ktre speniayby takie funkcje, jakie peni histony w genomie eukariotycznym. Jednak niektre biaka bakteryjne wykazuj pewne podobiestwo do histonw nazywane s biakami histonopodobnymi" (ang. histone-like proteins"). Jedno z nich, biako H, jest na tyle podobne do eukariotycznego histonu H2A, e rozpoznaj je przeciwciaa anty-H2A. Zarwno biaka histonopodobne, jak i histony, s biakami o niewielkiej masie czsteczkowej. adne z biaek histonopodobnych nie wystpuje jednak w stosunku do DNA w tak obfitej iloci, jak .histony eukariotyczne. Masy czsteczkowe biaek histonopodobnych oraz ich zawarto w komrce podane s w tabeli 4.2.
Tabela 4.2. Masy czsteczkowe i zawarto niektrych biaek histonopodobnych w komrce bakteryjnej Nazwa biaka HNS HU-1 HU-2 FIS H HLPI Masa czsteczkowa 15 500 9 500 11 200 28 000 17 000 Liczba czsteczek w komrce 20 000 60 000 zmienna 20 0 0 0 - 1 2 0 000 4 000

Biaka HU i HNS nie wykazuj swoistoci sekwencyjnej, podczas gdy biaka IHF i FIS s swoiste w stosunku do sekwencji. Wszystkie biaka histonopodobne maj zdolno organizowania DNA w struktury wyszego rzdu, np. biako HU owija DNA wok siebie. Jednak wszystkie te biaka, oprcz deformowania DNA, peni rwnie inne funkcje w genomie bakteryj-

nym. Biako HNS jest represorem transkrypcji dla wielu genw, biako HU stymuluje doczanie represora laktozowego i biaka CAP, biako IHF bierze udzia w integracji faga L Dlatego te wydaje si moliwe, e biaka histonopodobne speniaj w genomie bakteryjnym rol podobn raczej do eukariotycznych czynnikw transkrypcyjnych ni do histonw.

4.5. Histony Podstawow struktur chromosomu eukariotycznego tworzy kompleks DNA z niewielkimi zasadowymi biakami histonami. Pi rodzajw histonw nosi nazwy: HI, H2A, H2B, H3 i H4. Poza histonem HI, ktry peni szczegln funkcj strukturaln, pozostae zbudowane s z nieco ponad 100 aminokwasw. Bliej C-kocowej strony kadego z tych histonw znajduje si wyrane skupisko aminokwasw hydrofobowych, podczas gdy pozostae czci maj charakter polarny i zasadowy. Zobojtnienie dodatnich adunkw w tych rejonach prowadzi do spontanicznego powstania kompleksw, w ktrych czsteczki histonw oddziauj ze sob czciami hydrofobowymi. W warunkach fizjologicznych dodatnie adunki histonw zobojtniane s przez ujemne adunki fosforanw DNA, ktry znajduje si w pobliu. Biakowy kompleks, jaki powstaje wwczas w kilku etapach, jest zbudowany z omiu czsteczek histonw, po dwie z kadego rodzaju H2A, H2B, H3 i H4. Oddziaywania midzy poszczeglnymi histonami s swoiste, powierzchnie za stykajcych si ze sob rejonw hydrofobowych s precyzyjnie dopasowane do siebie, co prawie wyklucza zmienno ewolucyjn sekwencji aminokwasw w tych rejonach acucha polipeptydowego histonw. Dotyczy to w szczeglnoci pary histonw H3H4. Histony te nale do najbardziej stabilnych ewolucyjnie biaek. O wiele bardziej zmienny jest histon HI, pod ktr to nazw kryje si co najmniej kilka wariantw sekwencyjnych tego biaka (m.in. histon H5, Hl). Histony ulegaj kilku modyfikacjom posttranslacyjnym, z ktrych najwaniejsza to fosforylacja grupy OH seryny lub treoniny (histony HI, H3, H2A) oraz acetylacja grupy e-aminowej lizyny. Modyfikacje te zmieniaj sumaryczny adunek czsteczek histonw i wpywaj na ich oddziaywanie z DNA oraz innymi biakami. Inne modyfikacje to: metylacja (doczenie grupy metylowej do s-aminowej grupy lizyny), poli (ADP-rybozylacja) (przeniesienie z NAD + reszt ADP-rybozy tak, e tworz dugie, rozgazione acuchy) i ubikwitynacja (doczenie ubikwityny, tj. polipeptydu zbudowanego z 76 aminokwasw, na s-aminow grup lizyny).

4.6. Biaka niehistonowe W skad chromosomu eukariotycznego wchodzi wiele rnych biaek, ktre nie s histonami. Wszystkie te biaka nazywa si biakami niehistonowymi. Jest to oczywicie bardzo zrnicowana grupa, zarwno pod wzgldem budowy, jak

i funkcji. W jej skad wchodz take biaka strukturalne nie bdce histonami, np. biaka matriks jdrowej lub te tzw. biaka HMG (ang. high mobility group) nazwa nawizuje do zachowania si tych biaek podczas elektroforezy w elu poliakrylamidowym.

4.7. Nukleosom Kompleks eukariotycznego DNA z histonami i biakami niehistonowymi, zawierajcy rwnie pewn ilo RNA (ok. 10%), nazywany jest tradycyjnie chromatyn. Badania prowadzone na pocztku lat 70. wykazay, e chromatyna zbudowana jest z powtarzajcych si podjednostek, nazywanych nukleosomami. Nukleosom zoony jest z 8 czsteczek histonw, po dwie z kadego rodzaju H2A, H2B, H3 i H4, jednej czsteczki histonu HI oraz odcinka DNA o dugoci 165-245 par zasad. Czstk tak mona wyizolowa z chromatyny trawic chromatyn endonukleazami (np. nukleaz z Micrococcus), ktre preferencyjnie przecinaj atwiej dostpne miejsca midzy nukleosomami (rys. 4.6). Dalsze trawienie usuwa z nukleosomu koce DNA o zmiennej dugoci w rnych rodzajach komrek, pozostawiajc bardziej oporn czstk zbudowan z kompletu biaek i odcinka DNA o dugoci 165 par zasad, nazywan chromatosomem. Kolejne przeduenie trawienia DNA chromatosomu prowadzi do powstania jeszcze mniejszej czstki, nazywanej rdzeniem nukleosomu (rys. 4.6). Ta ostatnia czstka ma prawie jednakow struktur u wszystkich eukariontw. Zbudowana jest z oktameru histonw (bez histonu HI) oraz odcinka DNA o dugoci 146 par zasad. Badania krystalograficzne pozwoliy na dokadne odtworzenie struktury tej czstki. Rdze nukleosomu przypomina dysk o rednicy 11 nm i gruboci 5,7 nm. DNA jest owinity na zewntrz oktameru histonowego, tworzc 1,8 obrotu lewoskrtnego superheliksu. DNA nie jest jednakowo zakrzywiony na caej swojej dugoci, lecz zaamany lub te zagity w wielu miejscach. Kolejno histonw kontaktujcych si z DNA na jego drodze wok oktameru jest nastpujca: H2A, H2B, H4, H3, H3, H4, H2B, H2A (rys. 4.7). Centralne uoenie tetrameru H32H42 pozostaje w zgodzie z podstawow rol tych dwch histonw w tworzeniu rdzenia nukleosomu. W nie naruszonym wknie chromatynowym DNA wchodzcy i wychodzcy z rdzenia nukleosomu oraz DNA znajdujcy si w centralnej czci rdzenia tworz kieszonk, ktrej wymiary pasuj bardzo dobrze do rednicy centralnej, globularnej czci histonu HI, zawierajcej aminokwasy hydrofobowe (2,8 nm). Wydaje si, e wanie w tej kieszonce usadawia si na rdzeniu nukleosomu globularna cz histonu HI, tworzc w ten sposb wspomnian wczeniej czstk, nazywan chromatosomem (rys. 4.8). Nukleosom to chromatosom wraz z odcinkiem DNA oddzielajcym chromatosomy na wknie chromatynowym, tzw. cznikiem (linker DNA). Dugo cznika jest zmienna i moe wynosi ok. 0 80 par zasad. Nie jest cakiem

(a)

oktamer histonowy

histon H1

biako niehistonowe

H1

DNA cznikowy wkno chromatynowe delikatne trawienie nukleaz

H1

(b)

dinukleosom

nukleosom elektroforeza DNA W

1000
800

o> E c 3 f

silne trawienie nukleaz

o 600 tn a N ^ A 00 -

200

rdzeh nukleosomu

JJ

SU

11,0 nm

biaka niehistonowe

Rys. 4.6. (a) Trawienie wkna chromatynowego przez nukleaz mikrokokow prowadzi do powstania nukleosomu, chromatosomu i ostatecznie rdzenia nukleosomu. (b) Obraz elektroforetyczny fragmentw D N A wyizolowanego z chromatyny po trawieniu nukleaz mikrokokow. Od dou prki na elektroforogramie odpowiadaj odcinkowi D N A nukleosomu i jego kolejnym wielokrotnociom

jasne, co dokadnie okrela dugo cznika, chocia co najmniej dwa elementy mog wpywa na t warto. Pierwszy to oglnie nierwnomierne uoenie chromatosomw wzdu wkna chromatynowego, zwizane zarwno z drobnymi rnicami w ich skadzie (warianty sekwencyjne histonw, modyfikacje posttranslacyjne), jak i z rnicami w sekwencjach DNA, owijajcych si wok globuli biakowej. Wielko odcinka DNA nukleosomu, wyliczona na pod-

Rys. 4.8. Uoenie histonu HI na rdzeniu nukleosomu. Globularna cz histonu HI (od 40 do 116 aminokwasu) lokuje si na rdzeniu nukleosomu (wg R. Hancock and T. Boulikas, Int. Rev. Cytol., 79, 165-214. 1982)

1 N-koniec

40

116 C-koniec

histon H1

stawie elektroforogramw produktw trawienia nukleaz z Micrococcus (rys. 4.6), to tylko rednia dfa odcinkw mieszczcych si w pewnym zakresie dugoci. Drugi element to rne warianty histonu HI, ktrego oba zasadowe koce wychodz poza chromatosom i oddziauj z DNA cznika (rys. 4.8). 4.8. Lokalizacja nukleosomw w stosunku do sekwencji nukleotydw Nie wszystkie nukleosomy s precyzyjnie ulokowane w stosunku do sekwencji nukleotydw. Oznacza to, e dla dwch komrek tego samego organizmu taki sam odcinek DNA moe by raz nawinity na rdze nukleosomu, w drugim za przypadku moe znajdowa si w czci cznikowej (rys. 4.9). Poniewa dugo odcinka cznikowego nie jest jednakowa we

(a) komrka 1 AB komrka 2 C D E F G H I J KL

(b)
komrka 1

A B

o
C

D E F G H I J K L

komrka 2

Rys. 4.9. Uporzdkowane (a) i przypadkowe (b) uoenie nukleosomw w stosunku do sekwencji nukleotydw w D N A (oznaczonej na rysunku jako cig liter). W pierwszym przypadku takie same sekwencje nukleotydowe znajduj si w rejonach cznikowych we wszystkich komrkach; w drugim taka sama sekwencja wystpuje w jednej komrce w rejonie cznikowym, w drugiej za w obrbie nukleosomu

wszystkich tkankach tego samego organizmu, pozycje nukleosomw musz by rne dla poszczeglnych tkanek. Z tak sytuacj mamy do czynienia w chromatynie szczura czy te muszki owocowej. Z drugiej strony, w makronukleusie Tetrahymena thermophila znaczna cz genomu zawiera nukleosomy precyzyjnie ulokowane w stosunku do sekwencji nukleotydw. Podobnie precyzyjn lokalizacj nukleosomw stwierdzono dla prawie wszystkich genw Saccharomyces cerevisiae. Co okrela pozycj tak umieszczonych nukleosomw? Na podstawie dostpnych obecnie danych mona bra pod uwag kilka przyczyn (rys. 4.10). Po pierwsze doczenie biaka niehistonowego do okrelonej sekwencji uniemoliwia umieszczenie w tym miejscu nukleosomu i okrela dokadnie pozycj, ktr moe zaj pierwszy nukleosom powstajcy w ssiedztwie. Z tak sytuacj mamy do czynienia w przypadku lokalizacji nukleosomw wok centromeru. Po drugie dokadn pozycj nukleosomu mog wyznacza niektre sekwencje. Pooenie nukleosomw ogranicza przede wszystkim zdolno poszczeglnych sekwencji do zaginania si i tendencj do odwracania si ma lub du bruzd w kierunku powierzchni nukleosomu. Niektre sekwencje nie pozostawiaj oktamerom histonowym adnego wyboru co do zajmowanego miejsca, jednoznacznie wyznaczajc ich pozycj. Po trzecie wreszcie fadowanie wkna nukleosomowego w struktury wyszego rzdu nakada wiele ogranicze na pozycje, jakie mog zajmowa nukleosomy. Przykadowo przesunicie nukleosomu wzdu DNA o poow obrotu podwjnego heliksu powoduje obrt nukleosomu o 180 w stosunku do ssiednich. Takie pooenie moe wykluczy udzia nukleosomu w formowaniu regularnego wkna 30 nm.

 ( m i ) (m) ( n )

Rys. 4.10. Podstawowe mechanizmy odpowiedzialne za uporzdkowane uoenie nukleosomw w stosunku do sekwencji nukleotydw w DNA. (a) Oddziaywanie histonyDNA. (b) Biaka flankujce miejsca formowania nukleosomw. (c) Fadowanie wna nukleosomowego w struktury wyszego rzdu (przyjcie przez wkno chromatynowe struktury wyszego rzdu nie zmienia uoenia biaek flankujcych, moe jednak wykluczy niektre pozycje zajmowane dotd przez nukleosomy) (wg F. Thoma, Biochim. Biophys. Acta, 1130, 1 - 1 9 . 1992)

(C)

Nukleosomy niekoniecznie musz by albo precyzyjnie ulokowane na DNA z dokadnoci do jednego nukleotydu, albo rozmieszczone zupenie przypadkowo w stosunku do sekwencji nukleotydw. Dla pewnych rejonw DNA (np. satelitarny DNA, chromosom wirusa SV40) wykazano istnienie kilku nakadajcych si ramek pozycji dla pojedynczego nukleosomu. W kadej z tych ramek pojedynczy nukleosom moe wystpowa z rnym prawdopodobiestwem. Prawdopodobiestwo to moe zmienia si po doczeniu (odczeniu) biaka w bliskim ssiedztwie czy te wraz ze zmian upakowania w struktur wyszego rzdu.

4.9. Wkno chromatynowe Przedstawiony wyej obraz wkna chromatynowego, zbudowanego z uoonych wzdu osi wkna nukleosomw, czsto porwnywany by do sznura koralikw, z tym e DNA nie przechodzi" przez rodek nukleosomw, lecz owija je. W istocie rnic jest wicej. Histon HI spina ze sob odcinek DNA wchodzcy i wychodzcy z nukleosomu, co powoduje, e nie znajduj si one dokadnie naprzeciw siebie po dwch stronach globuli biakowej. W efekcie kolejne nukleosomy uoone s we wknie w sposb zygzakowaty. Opisane wyej wkno chromatynowe nazywane jest czsto wknem 10 nm", gdy

Rys. 4.11. Solenoidalne zwinicie wkna nukleosomowego (wg J. Widom and A. Klug, Celi, 43, 207-213. 1985)

jego rednica zbliona jest do rednicy nukleosomu. W fizjologicznych warunkach jonowych (stenie kationw jednowartociowych powyej 50 mmoli/1, dwuwartociowych ponad 0,2 mmol/1) wkno takie faduje si spontanicznie w grubsze wkno o rednicy ok. 30 nm. Spord kilku modeli opisujcych struktur tego wkna najlepsz zgodno z licznymi danymi dowiadczalnymi wykazuje tzw. model solenoidu (rys, 4.11). W modelu tym wkno 10 nm ulega zaamaniu w miejscach cznikowego DNA, owijajc si wok jednej osi. Dyskowate nukleosomy uoone s swoimi paskimi powierzchniami rwnolegle do osi solenoidu. Krawdzie dyskw tworzcych ssiadujce ze sob skrty stykaj si, dziki czemu skok solenoidu rwny jest rednicy nukleosomu, tzn. 11 nm. Na jeden skrt solenoidu przypada ok. 6-7 nukleosomw. W stabilizacji wkna 30 nm bierze udzia histon HI oraz N-kocowe, zasadowe czci histonw tworzcych rdze nukleosomu. Chromatyna pozbawiona histonu HI nie tworzy wkna 30 nm. To samo odnosi si do chromatyny, z ktrej usunito N-kocowe czci histonw rdzeniowych za pomoc enzymw proteolitycznych. Wkno 30 nm jest natywn form dla wikszej czci chromatyny. Trzeba jednak podkreli, e jego ksztat nie jest na caej dugoci DNA tak idealny, jak przedstawia to model solenoidu. Rnice w dugoci cznikowego DNA dla lecych blisko siebie nukleosomw, rejony pozbawione nukleosomw oraz modyfikacje histonw w obrbie samych nukleosomw mog zakca regularno struktury wkna o rednicy 30 nm. Nie ma jasnoci co do tego, czy istniej regularne struktury wyszego poziomu ni wkno 30 nm. Niektre modele chromosomu zakadaj, e jest to ostatni poziom regularnej organizacji, natomiast wkno 30 nm uoone jest

w jdrze tak, jak spaghetti na talerzu (ang. spaghetti-like model). Inne przyjmuj istnienie do regularnego wkna chromatyny interfazowej o rednicy ok, 240 nm oraz regularnego uoenia tego wkna w skondensowanym chromosomie metafazowym. Przyjcie tych parametrw pozwala wyliczy, e cay diploidalny genom ludzki da si upakowa w objtoci 50-60 jum3. W jdrze o rednicy 5 [im (objto 65,5 jim3) pozostaje wic nieco miejsca na biaka i znaczne iloci syntetyzowanego RNA.

4.10. Domeny chromatynowe Podobnie, jak DNA chromosomu bakteryjnego, DNA eukariotyczny jest zorganizowany w ptle (domeny). Ptle s tworzone przez odcinki wkna chromatynowego o dugoci 20 200 tysicy par zasad, doczone u podstawy do struktury zbudowanej prawie wycznie z biaek, nazywanej matriks jdrow (rys. 4.12). Rejony poczenia DNA z matriks, tzw. MAR (ang. matrix

Rys. 4.12. Wkno chromatynowe czy si z biakami matriks tworzc ptle (domeny) (wg M. Grunstein, Trends Genet., 6, 395-400. 1990)

biako matriks

associated regions), nie s swoiste gatunkowo. S to odcinki o dugoci ponad 250 par zasad, bogate w AT. Znaczn cz biaek tworzcych matriks jdrow w dzielcych si komrkach stanowi topoizomeraza II, ulokowana u podstawy ptli wkna chromatynowego. Umoliwia ona rozdzielenie powstaych po replikacji dwch ptli potomnych oraz zmiany topologii ptli podczas kondensacji mitotycznej chromosomu. W jdrach nie dzielcych si czsto brak jest topoizomerazy II. Struktura ptli jest tam jednak zachowana dziki obecnoci pozostaych biaek matriks jdrowej. Wrd nich wystpuj trzy rodzaje biaek, nazywanych laminami. Podczas kondensacji mitotycznej biaka te s fosforylowane, natomiast tworzona przez nie struktura ulega dezintegracji. Matriks jdrowa przeksztaca si wwczas w biakowy szkielet chromosomu.

(a)

(b)

Rys. 4.13. Przy jednakowej skrtnoci szkieletu chromosomu w obu chromatydach siostrzanych (a) sekwencje homologiczne (zaznaczone strzakami) maj przeciwn polarno. Gdy skrtno jest przeciwna (b) sekwencje homologiczne maj jednakow polarno (wg E. Boy de la Tour and U.K. Laemmli, Celi, 55, 937-944. 1988)

Szkielet ten jest helikalnie zwinity, przy czym skrtno tego zwinicia jest rna dla obu chromatyd siostrzanych. Pozwala to zachowa jednakow polarno dla homologicznych sekwencji znajdujcych si naprzeciw siebie w obu chromatydach (rys. 4.13). 4.11. Centromer Szczeglnym miejscem chromosomu eukariotycznego jest centromer. Do miejsca tego doczona jest swoicie grupa kilku rodzajw biaek. Niektre z nich tworz tzw. kinetochor, do ktrego przyczepione s podczas mitozy i mejozy mikrotubule wrzeciona. W centromerach chromosomw ssakw znajduj si powtarzajce si sekwencje satelitarnego DNA. 4.12. Sekwencje telomerowe Na kocach czsteczek DNA chromosomw eukariotycznych umieszczone s powtrzenia krtkich sekwencji telomerowych. U czowieka jednostk tak stanowi sekwencja CCCTAA. Sekwencje te s dobudowywane do chromosomu za pomoc telomerazy i stanowi zabezpieczenie liniowego DNA chromosomu eukariotycznego przed sukcesywnym skracaniem podczas kolejnych rund replikacji (p. rozdz. 2). 4.13. Architektura jdra interfazowego Prace nad budow jdra interfazowego nie s jeszcze bardzo zaawansowane, pozwalaj jednak sdzi, e poszczeglne chromosomy zajmuj w jd-

rze interfazowym nieprzypadkowe miejsca. Konsekwencj takiego uoenia jest, jak si wydaje, lokalizacja aktywnych genw w ssiedztwie porw jdrowych, ktre w tym przypadku stanowi furtki dla opuszczajcych jdro transkryptw.

4.14. Odtwarzanie struktury chromatyny Histony tworzce macierzyst chromatyn nie ulegaj degradacji podczas replikacji, lecz bior udzia w odtwarzaniu wkna chromatynowego z nici potomnych. Drug poow histonw tworzcych to wkno stanowi nowo zsyntetyzowane biaka. Odtwarzanie rdzenia nukleosomu w fizjologicznej sile jonowej wymaga obecnoci kwanych biaek, zdolnych do zwizania zasadowych histonw i przeniesienia ich na DNA. Biaka takie wystpuj szczeglnie obficie w oocytach Xenopus, skd zostay wyizolowane. Proces odtwarzania rdzenia nukleosomu z ich udziaem przebiega w dwch etapach. W pierwszym biako nazywane NI docza do DNA tetramer histonowy H3 2 H4 2 . W drugim kolejne biako, nukleoplazmina, docza dwie pary histonw H2A i H2B (rys. 4.14).
H3/H4 N1 H2A/H2B nukleoplazmina

DNA

rdzen

nukleosomu

Rys. 4.14. Formowanie si nukleosomu w obecnoci biaka NI i nukleoplazminy (wg R.A. Laskey and G.H. Leno, Trends Genet., 6, 4 0 6 - 4 1 0 . 1990)

Odtworzenie penego nukleosomu o zachowanej dugoci cznika jest procesem bardziej zoonym. Wydaje si, e wymaga ono zmodyfikowanych form histonw, ktre podczas tworzenia si nukleosomu stopniowo ulegaj przeksztaceniu do form znajdowanych w dojrzaej chromatynie. W procesie tym bior udzia rwnie topoizomerazy, ktre usuwaj napicie torsyjne powstae na skutek owijania si DNA wok oktameru histonowego. W warunkach jonowych jdra komrkowego wkno chromatynowe spontanicznie tworzy form wkna 30 nm. Doczenie do matriks jdrowej odbywa si poprzez sekwencje MAR.

4.15. Euchromatyna i heterochromatyna Stopie skondensowania chromatyny mona wyrazi ilociowo przez tzw. wspczynnik upakowania (ang. packing ratio). Okrela on stosunek dugoci wyprostowanej czsteczki DNA do dugoci struktury, w ktrej czsteczka ta

jest upakowana. Wspczynnik upakowania DNA w nukleosomie mona wyliczy i otrzyma si warto ponad 6, przyjmujc: dugo pary zasad 0,34 nm, przecitn dugo owinitego na nukleosomie odcinka DNA 200 par zasad, za rednic nukleosomu 11 nm: 0,34 x 200 TT
= 6 2

' '

Jeeli w podobny sposb liczymy wspczynnik upakowania DNA we wknie 30 nm, gdzie na skok solenoidu odpowiadajcy rednicy nukleosomu przypada 6-7 nukleosomw, to otrzymamy warto ok. 40 (upakowanie DNA w nukleosomie pomnoone przez upakowanie nukleosomw w solenoidzie). Maksymalne upakowanie osiga DNA eukariotyczny w chromosomie metafazowym. Stosunek dugoci DNA zawartego w chromosomie metafazowym czowieka do dugoci tego chromosomu wynosi ok. 8000.1 tak np. najwikszy ludzki chromosom, o dugoci 10 jim, zawiera a 7,3 cm DNA. Podobn warto wspczynnika upakowania mona wyliczy, uwzgldniajc parametry kolejnych hierarchicznych struktur tworzcych chromosom metefazowy. Upakowanie DNA w chromatynie interfazowej nie jest jednolite. Pewne rejony chromatyny, tzw. heterochromatyna, maj wspczynnik upakowania zbliony do tego, jaki istnieje w chromosomie metafazowym. Inne rejony, tzw. euchromatyna, s bardziej rozlunione. To samo wkno chromatynowe moe przechodzi kolejno przez rejony eu- i heterochromatynowe. Sekwencje powtarzajce si wystpuj zwykle w formie heterochromatyny.

4.16. Chromatyna aktywna transkrypcyjnie Na skutek upakowania eukariotycznego DNA w: nukleosomy, wkno chromatynowe i struktury wyszego rzdu, dostpno do DNA jest drastycznie ograniczona. Jednak w rejonach chromatyny zawierajcych geny aktywne transkrypcyjnie upakowanie DNA jest znacznie zredukowane. Rejony chromatyny zawierajce geny aktywne transkrypcyjnie s bardziej wraliwe na trawienie nukleazami ni pozostaa cz chromatyny. Klasyczne dowiadczenie przeprowadzone dla chromatyny kurczt pokazuje, e nadtrawienie nukleazami 10% DNA chromatyny z wtroby oznacza rwnie nadtrawienie 10% genu owoalbuminy, natomiast w tej samej iloci nadtrawionego DNA chromatyny z jajowodw znajduje si a 70% tego genu. Wynika to std, e gen owoalbuminy jest aktywny w jajowodach, lecz nie w wtrobie, struktura aktywnych rejonw chromatyny za jest mniej zwarta. Waciwo ta odnosi si nie tylko do aktualnie transkrybowanych genw, zarwno jeli bierzemy pod uwag czas transkrypcji, jak i pooenie genu. Po pierwsze rozlunienie nie jest bezwzgldnie skorelowane w czasie z transkrypcj, lecz j poprzedza, a czsto pozostaje po zakoczeniu transkrypcji (np. rejon genw globinowych w dojrzaych erytrocytach kurzych). Po drugie rejon rozlunienia rozciga si

zwykle poza obszar genu i najprawdopodobniej dotyczy caej ptli, w obrbie ktrej znajduje si gen. Rozlunienie rejonw aktywnych transkrypcyjnie zwizane jest z utrat ponadnukleosomowych struktur chromatyny. W niektrych przypadkach intensywnie transkrybowanych genw (np. geny rybosomowe, geny biaek szoku cieplnego) powanym zakceniom ulega rwnie struktura nukleosomowa. Do tej pory nie ma jasnoci, czy wie si to z nierwnomiernym uoeniem nukleosomw w aktywnym rejonie (zmienna dugo cznika), rozlunieniem oddziaywa biako-biako i biako-DNA w obrbie nukleosomu, czy te cakowitym pozbawieniem aktywnego odcinka struktury nukleosomowej (oddysocjowanie histonw). Obecno nukleosomw w rejonie transkrypcji stwarza pytanie, w jaki sposb dua, zoona czsteczka, jak jest polimeraza RNA, moe przesun si przez nukleosom, w ktrym DNA cile przylega do rdzenia biakowego. adna z kilku hipotez, jakie sformuowano na ten temat, nie doczekaa si jeszcze potwierdzenia. Hipoteza prezentowana poniej jest najpowaniej brana pod uwag. DNA w nukleosomie tworzy negatywny superheliks, owijajc si wok rdzenia histonowego. Tote histony formujce rdze nukleosomowy maj najwiksze powinowactwo do DNA o negatywnym superheliksie, natomiast niewielkie lub adne do DNA o pozytywnym superheliksie. Z drugiej strony, poruszajca si wzdu zamknitej czsteczki DNA polimeraza RNA rozplata podwjny heliks DNA przed sob i zaplata za sob, generujc w ten sposb pozytywny superheliks przed, negatywny za za rejonem transkrypcji (rys. 4.15). Hipoteza, o ktrej mowa, zakada, e nadmiar pozytywnego superheliksu przed czsteczk polimerazy RNA prowadzi do wyszczepienia nukleosomu, ktry zostaje natychmiast wychwycony przez nadmiar negatywnego superheliksu za czsteczk polimerazy. Efektem takiego procesu byoby pynne przemieszczenie si nukleosomu obok poruszajcej si polimerazy RNA (rys. 4.15).
pozytywny (+)

negatywny () superheliks

Rys. 4.15. Prawdopodobny mechanizm przesuwania si polimerazy RNA wzdu wkna nukleosomowego. Tworzcy si przed polimeraz RNA (POL) dodatni superheliks uatwia wyszczepienie nukleosomu, natomiast powstajcy za polimeraz RNA ujemny superheliks uatwia doczenie wyszczepionej czstki (wg D.J. Clark and G. Felsenfeld, EMBO J., 10, 387-395. 1991)

4.17. Modyfikacje biaek i DNA w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie W rejonach aktywnej transkrypcyjnie chromatyny wystpuj zmiany w oddziaywaniu biaek z DNA; spotyka si rwnie swoiste lub swoicie zmodyfikowane biaka. Dwie zmiany mona bezporednio poczy z rozlunieniem wkna chromatynowego. Pierwsza, to sabsze oddziaywanie histonu HI z pozostaymi skadnikami chromatyny lub jego cakowity brak w rejonach aktywnych. Druga zmiana, to silna acetylacja histonw H3 i H4 w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie, dotyczca ich zasadowych fragmentw N-kocowych. Zarwno histon HI, jak i N-kocowe fragmenty histonw rdzenia nukleosomu s niezbdne do sfadowania si acucha nukleosomw we wkno 30 nm. Zmiany w obrbie histonu HI i acetylacja N-kocw histonw H3 i H4 uniemoliwiaj wytworzenie grubego wkna chromatynowego. Poza wspomnianymi wyej modyfikacjami w rejonach aktywnych spotyka si due iloci dwch rodzajw biaek HMG (biaka HMG 14 i 17), ubikwitynowane formy histonw H2A i H2B oraz niektre inne biaka. Modyfikacje chromatyny w rejonach aktywnych transkrypcyjnie dotycz nie tylko skadnikw biakowych, lecz rwnie DNA. Jednym z czynnikw regulujcych ekspresj genw eukariotycznych jest metylacja cytozyny w pozycji 5'. Zachodzi ona prawie wycznie w sekwencjach zawierajcych dinukleotyd CpG. U wyszych eukariontw DNA w rejonach aktywnych transkrypcyjnie jest w mniejszym stopniu zmetylowany ni DNA chromatyny nieaktywnej. Dotyczy to czasem znacznych obszarw chromatyny: w eskich komrkach somatycznych ssakw DNA aktywnego chromosomu X jest w o wiele mniejszym stopniu zmetylowany ni DNA chromosomu nieaktywnego. Metylacja moe zmienia: powinowactwo DNA do czynnikw transkrypcyjnych, uoenie nukleosomw w danym rejonie oraz oddziaywanie histonu HI z DNA. Wzr metylacji DNA jest dziedziczony i wydaje si, e w liniach komrek somatycznych metylacja odgrywa rol w przekazywaniu informacji o nieaktywnym stanie danego rejonu chromatyny do komrek potomnych. Wzr metylacji zmienia si podczas rnicowania si komrek. Jak ju wspomniano na pocztku, rozlunienie struktury chromatyny nie jest warunkiem wystarczajcym do rozpoczcia transkrypcji. Umoliwia ono jedynie drugi etap aktywacji, polegajcy na rozpoznaniu przez czynniki transkrypcyjne swoich miejsc wizania. 4.18. Miejsca nadwraliwe na nukleazy W chromatynie istnieje niewielka cz genomu jeszcze bardziej wraliwa na nukleazy (mniej wicej dziesiciokrotnie) ni chromatyna aktywna transkrypcyjnie. W odrnieniu od tej ostatniej obszary te nazwano miejscami nadwraliwymi na nukleazy. S one rozmieszczone swoicie w stosunku do

miejsce nadwraliwe na nukleazy

C X X ) o o
Rys. 4.16. Miejsca nadwraliwe na nukleazy s pozbawione nukleosomw

sekwencji nukleotydw i nie wystpuj w nich nukleosomy (rys. 4.16). Miejsca te s swobodnie dostpne dla czynnikw biakowych. Miejsca nadwraliwe nazywane s czsto otwartymi oknami" chromatyny. W miejscach nadwraliwych zlokalizowane s sekwencje promotorowe, enhancery (wzmacniacze), silencery (sekwencje osabiajce transkrypcj), miejsca terminacji transkrypcji, miejsca inicjacji replikacji, miejsca swoistego wizania topoizomeraz i centromery. Upakowanie w nukleosomy i zwinicie w struktury wyszego rzdu zamyka wikszo eukariotycznego DNA w formie niedostpnej dla czynnikw biakowych. Tylko drobna cz DNA znajduje si w miejscach nad wraliwych. W ten sposb, dziki istnieniu miejsc nadwraliwych na nukleazy, ogromny genom eukariotyczny zostaje zredukowany w swojej czci oddziaujcej z biakami do rozmiarw porwnywalnych'z genomem bakteryjnym. Miejsca nadwraliwe maj wielko od ok. 200 do ponad tysica par zasad. Niektre z nich s trwaym elementem chromatyny (miejsca konstytutywne), inne mog by indukowane, np. pod wpywem hormonu. Przykadem tego ostatniego mechanizmu jest powstanie miejsca nadwraliwego w rejonie DNA wirusa MMTV (ang. mouse mammary tumor virus), ktry zawiera miejsce wizania dla receptora glukokortykoidu. Przy braku hormonu miejsce wizania receptora jest zajte przez nukleosom. Po potraktowaniu komrek deksametazonem ten pojedynczy nukleosom ulega selektywnemu wyszczepieniu, odsaniajc miejsce nadwraliwe. Mechanizm usuwania nukleosomu nie polega na prostym oddysocjowaniu go przez kompleks hormon receptor. 4.19. Nietypowe konformacje DNA w chromatynie aktywnej transkrypcyjnie Trzy nietypowe konformacje DNA, rne od podstawowej formy B-DNA, mog istnie w warunkach fizjologicznych dla jdra eukariotycznego: Z-DNA, trjniciowy DNA oraz forma krzyowa DNA (rys. 4.17). Lewoskrtny Z-DNA powstaje w sekwencjach zawierajcych naprzemiennie puryn i pirymidyn; trjniciowy DNA w sekwencjach homopurynowych lub homopirymidynowych, natomiast forma krzyowa DNA w sekwencjach palindromowych. Sekwencje zdolne do tworzenia nietypowych konfromacji DNA wystpuj w genomach eukariotycznych. Sekwencje (TG)n o dugoci wikszej ni 50 nukleotydw, ktre mog formowa Z-DNA, s obecne w genomie ludzkim

Z-DNA

B-DNA

(b)

Rys. 4.17. Nietypowe formy DNA. (a) Porwnanie Z-DNA i podstawowej formy B-DNA. (b) Forma trjniciowa. (c) Forma krzyowa ((b) i (c) wg K. van Holde and J. Zlatanova, BioEssays, 18, 5 9 - 6 8 . 1994)

w liczbie ok. 105 kopii, natomiast nie ma ich prawie w genomach prokariotycznych. Sekwencje zdolne do formowania trjniciowego DNA wystpuj w genomie eukariotycznym przecitnie co 150 tysicy par zasad. Rwnie sekwencje zdolne do przyjcia formy krzyowej zostay zidentyfikowane w wielu genomach eukariotycznych. Obecno sekwencji zdolnych do przyjcia nietypowej struktury DNA nie oznacza, e struktury takie istniej in vivo w genomach eukariotycznych. Mog one atwo powstawa w trakcie wykonywania procedur prowadzcych do ich identyfikacji. Okazao si, e wiele wczeniejszych doniesie, wskazujcych na obecno nietypowych struktur DNA w genomie eukariotycznym, opierao si na artefaktach. Niektre doniesienia zostay jednak pozytywnie zweryfikowane. Wskazuj one na powizanie obecnoci nietypowych struktur DNA z aktywnoci transkrypcyjn chromatyny. Formy Z-DNA zostay np. wykryte w aktywnym transkrypcyjnie makronukleusie Stylonychia mytilus, lecz nie stwierdzono ich obecnoci w mikronukleusie, gdzie transkrypcja nie zachodzi. Wszystkie opisane, nietypowe formy DNA albo utrudniaj, albo wykluczaj umieszczenie nukleosomu w tym miejscu, w ktrym zostay wytworzone. Z drugiej strony powstawanie nietypowych struktur DNA jest silnie stymulowane przez negatywne napicie torsyjne. Napicie takie, bdce skutkiem uwolnienia superheliksu, pojawia si w momencie usunicia nukleosomu. Mona wic powiedzie, e dana sekwencja moe albo przyj nietypow struktur drugorzdow, albo owin si wok rdzenia biakowego nukleosomu i e przejcie strukturalne w obrbie DNA jest rwnoznaczne z decyzj co do obecnoci nukleosomu w danym miejscu. Taki mechanizm powstawania przynajmniej niektrych miejsc nadwraliwych wydaje si zupenie prawdopodobny.

5. KOD GENETYCZNY I BIOSYNTEZA BIAEK

Proces translacji, czyli biosyntezy biaka, jest ostatnim etapem ekspresji informacji genetycznej w komrce. Podczas transkrypcji informacja zawarta w sekwencji nukleotydw w DNA przepisana zostaje w komplementarn do niej sekwencj nukleotydw w informacyjnym RNA (mRNA). W procesie translacji informacja zaszyfrowana w acuchu mRNA jest tumaczona na sekwencj aminokwasw w biaku. Oglny mechanizm biosyntezy biaka opisany jest w kilku dostpnych na rynku polskim podrcznikach. Zesp tych wiadomoci nie uleg istotnemu przeksztaceniu, nie bdzie wic tu powtarzany. Krtki opis tego procesu, kluczowego dla realizacji zapisu genetycznego, posuy wycznie do umiejscowienia nowych zjawisk zwizanych z mechanizmami translacji, zjawisk niejednokrotnie znacznie poszerzajcych nasze rozumienie mechanizmw tego procesu. Z koniecznoci bdzie to przegld selektywny, mechanizmy translacji stanowi wci przedmiot intensywnych bada relacjonowanych w wielu obszernych monografiach, bdcych rdem penej informacji na temat owego wysoce zoonego procesu. Rozwaania nad oglnymi reguami kierujcymi syntez biaek zapocztkowa znany astrofizyk Gamow, ktry zwrci ju w roku 1954 uwag na to, e jeli informacja gentyczna dotyczca syntezy biaek zapisana jest w postaci kolejnoci uoenia zasad w DNA, to alfabet", ktrym ta informacja jest zapisana, czyli kod genetyczny, powinien podlega prostym reguom matematycznym. Po to, by zapisa informacj genetyczn dotyczc uoenia 20 elementw (aminokwasw) w biaku za porednictwem czterech elementw (nukleotydw) trzeba, by poszczeglne litery" (tzw. kodony) tego alfabetu skaday si z trzech nukleotydw, uoonych w dowolnej kolejnoci. Grupujc cztery elementy (zasady) w dowolnej kolejnoci w trjki, uzyskujemy 64 moliwe kombinacje trjek. Jeeli uoymy je w dwjki, to otrzymamy tylko 16 kombinacji a wic mniej ni aminokwasw, ukadajc w czwrki a 256 kombinacji, a wic o wiele za duo. Jak si okazao, ta prosta hipoteza jest

trafna : przyroda wybraa jako swj alfabet" genetyczny moliwie najprostsz wersj zapisu chemicznego, proste permutacje czterech zasad zgrupowanych w trjki. Do tej pory nie wiadomo, jak przebiega odczyt informacji zapisanej owymi trjkami" w DNA. Dowiadczenia Niremberga i Ochoa'y (nagroda Nobla z 1964 r.) doprowadziy do przypisania kadej z tych trjek odpowiedniego aminokwasu w biaku. Okazao si, e np. syntetyczny mRNA poli U (RNA zoony wycznie z nukleotydw urydynowych) w ukadzie bezkomrkowym koduje syntez polifenyloalaniny (polipeptydu zbudowanego Wycznie z fenyloalanin). Tak wic trjka UUU w kodzie genetycznym sygnalizuje, e w polipeptydzie powinna znale si fenyloalanina. Dziki zanalizowaniu syntezy peptydw kodowanych przez rne oligonukleotydy rozszyfrowano wszystkie kodony i uoono tzw. tabel kodu genetycznego (tab. 5.1).
Tabela 5.1. (a). Kod genetyczny I zasada U UUU UUC UAA UUG CUU CUC CUA CUG AUU AU AUA AUG GUU GUC GUA GUG II zasada U F Phe F Phe L Leu L Leu L L L L Leu Leu Leu Leu UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG ACU ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG C S Ser S Ser S Ser S Ser P Pro P Pro P Pro P Pro T Thr T Thr T Thr T Thr A A A A Ala Ala Ala Ala UAU UAC UAA UAG CAU CAC CAA CAG AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG A Y Tyr Y Tyr Ochra Ambei* H H Q Q N N K K D D E E His His Gin Gin Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu UGU UGC UGA UGG CGU CGC CGA CGG AGU AGC AGA AGG GGU GGC GGA GGG G C Cys C Cys Opala W Trp R R R R Arg Arg Arg Arg III zasada U C A G U C A G U C A G U C A G

I Ile I Ile I Ile M Met b V V V V Val Val Val Val

S Ser S Ser S Arg S Arg G G G G Gly Gly Gly Gly

* Kodon terminacyjny. b Kodon inicjacyjny.

Tabela 5.1 (b). Oznaczenia jednoliterowe nazw aminokwasw Ala Ans Arg Asp A C D E A N R D Ala Cys Asp Glu Cys Gin Glu Gly F G H I C Q E G Phe Gly His Ile His Ile Leu Lys K L M N H I L K Lys Leu Met Asn Met Phe Pro Ser M F P S Thr Trp Tyr Val T V W Y T W Y V Thr Val Trp Tyr

P Pro

Q Gin
R Arg S Ser

Naley zwrci uwag na konieczno wystpowania w kodzie genetycznym nie tylko sygnaw (liter) oznaczajcych poszczeglne aminokwasy, ale te i sygnaw przestankowych, oznaczajcych pocztek i koniec danego biaka. Kodony amber, ochr i opal trjki UUA, UAG, UGA s sygnaami terminacyjnymi. Jeeli w mRNA wystpi taki tryplet nukleotydowy, to wtedy aparat biosyntezy biaka koczy syntez danego polipeptydu. Sygnaem rozpoczcia syntezy biaka jest trjka AUG, (a w niektrych przypadkach GUG), oznaczajca metionin. I rzeczywicie synteza wszystkich biaek zaczyna si od metioniny. Nie wszystkie jednak biaka na pocztku zawieraj metionin, bowiem aminokwas ten w wielu biakach po ukoczeniu ich syntezy jest odcinany od powstaego polipeptydu przez specjalne enzymy.

5.1. Czsteczka adaptorowa, pojcie antykodonu Jak wspomniano, mRNA dodany do ekstraktw bezkomrkowych pozbawionych kwasw nukleinowych wywouje w tych ekstraktach biosyntez biaek. Ten proces nosi nazw translacji, w przebiegu ktrej dokonuje si przekad informacji genetycznej z jzyka zasad azotowych na jzyk aminokwasowy jzyk biaek. Badajc mechanizm biosyntezy biaka stwierdzono, e w procesie translacji bior udzia organelle (rednica ok. 20 nm), tzw. rybosomy, obecne we wszystkich komrkach i bdce centrami syntetyzujcymi biaka. Poniewa aminokwasy chemicznie nie s komplementarne w stosunku do zasad azotowych zawartych w mRNA, przez co nie mona dopasowa" czsteczki aminokwasu do kodujcej ten aminokwas trjki zasad, domylano si e w komrkach istniej tzw. czsteczki adaptorowe, ktre jednym swoim kocem rozpoznaj dany aminokwas, a drugim swoisty kodon. I rzeczywicie, w komrkach wykryto swoisty rodzaj czsteczek RNA wicych chemicznie aminokwasy. Taki RNA, zwany transferowym RNA (tRNA), jednym swoim fragmentem, tym gdzie wystpuj niesparowane trzy zasady, tzw. antykodonowe, rozpoznaje trjki kodujce, drugim za wolnym 3'- kocem (CCAOH) moe doczy aminokwas, w wyniku czego powstaje aminoacylo-tRNA. Czsteczki tRNA s stosunkowo niewielkie. Ich masa wynosi ok. 2,5-3 x 104 Da. Skadaj si one z 74 94 nukleotydw. W cytoplazmie kadej komrki znajduje si ok. 50 60 rnych typw tRNA. Wynika z tego, e dla wielu aminokwasw istnieje w komrce kilka odmian tRNA. Rne tRNA, specyficzne dla tego samego aminokwasu, zwane s izoakceptorowymi tRNA. Istnienie izoakceptorowych tRNA wynika std, e wikszo aminokwasw ma wicej ni jeden kodon. Jedna czsteczka tRNA, a cilej mwic jeden antykodon w tRNA, nie wystarczyby do rozpoznania czsto do znacznie rnicych si od siebie kodonw dla tego samego aminokwasu. Rozpoznanie nastpuje w wyniku parowania trzech zasad kodonu z'trzema antykodonami, przy czym parowanie to jest zasadniczo zgodne z reguami Watsona-Cricka, czyli z tworzeniem par AU i GC.

Pewna tolerancja w oddziaywaniu kodon antykodon jest jednak dopuszczalna. Jeli pierwsz (od 5'-koca) zasad w antykodonie jest na przykad inozyna (I), to moe ona oddziaywa z trzema rnymi zasadami (U, C lub A) w kocowej pozycji kodonw. Tego typu nieprecyzyjne" oddziaywanie dozwolone jest tylko w przypadku trzeciej zasady kodonu; zasady: pierwsza i druga mog tworzy z antykodonem wycznie klasyczne pary zasad GC i AU. Reguy tworzenia wizem wodorowych midzy trzeci zasad kodonu i pierwsz zasad antykodonu podaje tak zwana hipoteza tolerancji (ang. wobble hypothesis), zaproponowana przez Cricka (tab. 5.2).
Tabela 5.2. Dozwolone oddziaywania midzy trzeci zasad kodonu a pierwsz zasad antykodonu (hipoteza tolerancji Cricka) Pierwsza zasada antykodonu C A ' U G I Trzecia zasada kodonu G U A lub G U lub C U, C lub A

Reguy te dobrze opisuj sposoby parowania w przypadku kodu uniwersalnego, istniej jednake od nich odstpstwa w przypadku pewnych wariantw kodu swoistych, np. dla systemw mitochondrialnych.

5.2. Schemat translacji W procesie syntezy biaka poszczeglne skadniki reagujce ze sob musz znale si w cile okrelonym pooeniu w stosunku do siebie, by reakcja moga zaj. Na przykad reszty aminokwasowe i aminoacylo-tRNA musz zbliy si do siebie na tak odlego, by midzy grup NH 2 jednej z nich a grup acylow drugiej mogo powsta wizanie peptydowe. Podobnie antykodony tRNA musz rozpoznawa kolejne trjki kodujce w mRNA bardzo precyzyjnie nie omijajc adnej z zasad, ale i adnej nie odczytujc dwa razy. Tylko w ten sposb kod genetyczny odczytywany moe by w fazie" informacja dotyczca sekwencji aminokwasowej podana jest w postaci kolejnych, nie zachodzcych wzajemnie na siebie, trjek zasad azotowych. Tak wysokiej precyzji przebiegu reakcji nie mogoby zapewni jej zachodzenie w roztworze, gdzie czsteczki reagujce zderzaj si ze sob przypadkowo i pod rnymi ktami. Czsteczki biorce udzia w biosyntezie biaka musz wic zosta uporzdkowane przestrzennie i wzajemnie ustawione w jedynych waciwych pozycjach, zapewniajcych zajcie reakcji. Funkcj porzdkujc speniaj rybosomy. Zbudowane s one z dwu podjednostek, zwanych cisz (staa sedymentacji 30S) i lejsz (staa sedymentacji 50S),

atwo dysocjujcych i asocjujcych. Chemicznie podjednostki rybosomowe s tworami nukleoproteinowymi, zbudowanymi z wielu biaek i RNA rybosomowego. Na powierzchni tych organelli znajduj si odpowiednie miejsca wice, dopasowane ksztatem do nici mRNA oraz aminoacylo-tRNA. Rybosomy wi te skadniki na powierzchni, po czym rybosomowa syntetaza peptydyl^-tRNA katalizuje syntez wizania peptydowego midzy dwoma
30S A U G G C U U C U I
2 M g * , 1F-3

U G G C u\u

AA

AAA
2 G T P , M g * IF-1, IF-2

U C U />AA

tworzenie wizania peptydowego i translokacja U C U AA A

rozpoznanie nastpnych kodonw

U L

C Uaa

A.

AAA,

terminacja

Rys. 5.1. Mechanizm syntezy biaka

kolejnymi resztami waciwie wybranych i ustawionych aminoacylo-tRNA. Samo tworzenie wizania peptydowego jest reakcj enzymatyczn fragment powierzchni rybosomu (a waciwie RNA duej podjednostki) ma bowiem waciwoci enzymu, wielokrotnie przypieszajcego zajcie reakcji syntezy wizania peptydowego midzy resztami aminoacylo-tRNA. Po utworzeniu wizania peptydowego, rybosom przesuwa si wzdu nici mRNA o nastpne trzy zasady. Towarzyszy temu odrzucenie zdeacylowanej czsteczki pierwszego

tRNA, przemieszczenie drugiej czsteczki tRNA nioscej na sobie dwupeptyd i doczenie trzeciego w kolejnoci waciwego aminoacylo-tRNA. Przesunicie si rybosomu wzdu nici mRNA jest procesem, w ktrym nastpuje ruch znacznej masy nici mRNA (masa ok. 100 000 1 000 000 Da) w stosunku do rybosomu (masa ok. 2 500000 Da w przypadku rybosomw bakteryjnych, a ok. 4500000 Da w przypadku cytoplazmatycznych rybosomw eukariotycznych). Ruch ten wymaga oczywicie nakadu energii. Wydaje si, e energia czerpana jest z rozkadu GTP. Kolejne fazy procesu translacji w ukadzie bakteryjnym przedstawione s na rysunku 5.1. Faza inicjacji acucha biakowego polega na doczeniu informacyjnego RNA do podjednostki 30S (rys. 5.1). Proces ten wymaga obecnoci Mg 2 + i czynnika inicjacyjnego IF3. Czynniki to biaka biorce udzia w biosyntezie acucha polipeptydowego, doczajce si do rybosomu w okrelonym stadium, lecz nie pozostajce na rybosomie przez cay czas jego dziaania. W przeciwiestwie do czynnikw, biaka strukturalne rybosomu obecne s w czsteczce rybosomowej w cigu caego cyklu biosyntezy biaka. mRNA docza si do rybosomu w ten sposb, e zawarty w nim kodon inicjacyjny (tryplet AUG) umiejscowiony zostaje mniej wicej porodku podjednostki. Po zwizaniu trypletu AUG przez podjednostk zachodzi doczenie pierwszego aminoacylo-tRNA. Doczenie inicjatorowego tRNA uatwione jest przez czynniki IF1 i IF2, oparte jest jednak na rozpoznaniu kodonu AUG przez antykodon eksponowany w tRNA inicjatorowym i parujcym si zgodnie z reguami Watsona-Cricka. Do kompleksu inicjacyjnego docza si nastpnie druga podjednostk rybosomowa 50S. Powstaje w ten sposb czynny rybosom 70S (monosom) i rozpoczyna si faza elongacji rozbita na dwa etapy: rozpoznania kodonw w mRNA i tworzenia wizania peptydowego oraz translokacji (rys. 5.1). Pierwszy etap polega na doczeniu nastpnego aminoacylo-tRNA (tu alanylo-tRNA), okrelonego przez tryplet ssiadujcy z AUG (tu GCU). Reakcja ta jest wspomagana przez faktory elongacyjne T u i T s . Faktory te uatwiaj wizanie si aminoacylo-tRNA z rybosomem. W drugim etapie nastpuje synteza wizania peptydowego midzy dwoma resztami aminokwasowymi zlokalizowanymi na rybosomie. Powstay peptydylo-tRNA ulega przemieszczeniu (translokacji) na rybosomie wraz z nici mRNA. Nowy kodon wchodzi w obrb aktywnego miejsca rybosomu i nastpny aminoacylo-tRNA moe zosta przyczony, podobnie jak to byo z poprzednim. Taki proces powtarza si a do chwili, gdy do miejsca aktywnego w rybosomie przesunie si kodon terminacyjny (tu tryplet UAA). W rezultacie zachodz reakcje, takie jak doczenie czynnikw terminacyjnych (czynnikw biakowych powodujcych uwolnienie polipeptydu), uwolnienie ukoczonego peptydu i dysocjacja kompleksu rybosomowego. Powstay polipeptyd ulega nastpnie modyfikacjom chemicznym, z ktrych najwaniejsz jest proteolityczne obcicie N-formylometioniny i ujawnienie w ten sposb odpowiedniego dla danego biaka

N-kocowego aminokwasu. acuch polipeptydowy ulega rwnoczenie zwiniciu w swoist form przestrzenn aktywnego biaka. Kodony AUG wystpuj nie tylko na pocztku mRNA, ale i w rodku nici mRNA, przy czym s one wwczas sygnaami wskazujcymi nie na rozpoczcie nowego biaka, a na wstawienie w tworzcy si acuch biakowy metioniny. Tak wic, inicjatorowe kodony AUG powinny w jaki sposb rni si od pozostaych wewntrznych kodonw AUG. Wydaje si, e w przypadku bakterii rnica ta dotyczy sekwencji nukleotydowej, poprzedzajcej w mRNA inicjatorowy kodon AUG. Zwykle w mRNA bakteryjnym przed kodonem AUG wystpuje kilka do kilkudziesiciu zasad nie nioscych informacji dotyczcej biosyntezy biaka, lecz swoicie wicych si z bakteryjnym rybosomem inicjujcym w ten sposb, e znajdujcy si za nim kodon AUG zostaje wprowadzony we waciwe miejsce na rybosomie. W przypadku mRNA eukariotycznego sytuacja jest mniej jasna, ale te wydaje si, e nie odczytywany region mRNA, poprzedzajcy inicjatorowy kodon AUG, jest zbudowany w swoisty sposb, bowiem zwykle mRNA eukariotyczny rozpoczyna si 7-metyloguanozyn (struktura cap) rozpoznawan swoicie przez rybosom, powodujc jego zwizanie si z rejonem zawierajcym inicjatorowy kodon AUG. Eukariotyczny system translacji (w cytoplazmie) dziaa zgodnie z reguami dotyczcymi systemw bakteryjnych. Eukariotyczne rybosomy jednake s tworami bardziej zoonymi, o wikszej staej sedymentacji (80S monosom, 40S maa podjednostka, 60S dua podjednostka). Inicjacja kontrolowana jest przez 8-10 czynnikw biakowych i wymaga obecnoci zarwno GTP, jak i ATP. Najwaniejszy w inicjacji eukariotycznej jest koniec 5' mRNA, na ktry naniuj" si kolejno rybosomy, dlatego w systemach eukariotycznych rzadko zachodzi inicjacja wewntrz policistronowych mRNA.

5.3. Struktura rybosomu W zoonym procesie biosyntezy biaka uczestniczy kilkadziesit skadnikw mao- i wielkoczsteczkowych. Musz one ze sob wspdziaa w jednym miejscu i czasie. Miejscem grupujcym skadniki biorce udzia w syntezie polipeptydu s rybosomy organelle o rednicy ok. 2 000 nm, wystpujce w kadej komrce. Rybosom, to czstka rybonukleoproteinowa, zoona z dwu podjednostek. Kada z podjednostek zawiera swoisty RNA oraz swoisty zestaw biaek inkrustujcych w RNA. RNA przybiera okrelon struktur przestrzenn z wielu szpilkami do wosw", powstajcymi wskutek wewntrznego parowania zasad wchodzcych w skad rRNA, i wielu jednoniciowymi ptlami. Na og uwaa si, e okoo 70% czsteczki rRNA wystpuje w postaci odcinkw sparowanych, a 30% w postaci rozrzuconych. W przyblieniu czsteczka rRNA rybosomowego wyglda jak je ze szpilkami skierowanymi na zewntrz. Struktura ta jest inkrustowana biakami (w wikszoci zasadowymi), zajmujcymi okrelone w stosunku do siebie pozycje.

Powstay twr jest do sztywn bry, ktra moe w pewnym zakresie zmienia swoje ksztaty. W czasie translacji elementy rybosomu mog si w stosunku do siebie, w pewnym zakresie, przemieszcza, tym niemniej na powierzchni rybosomu istniej miejsca o swoistym ksztacie, przyjmujce rne czsteczki wspreagujce ze sob w czasie translacji. Ksztat rybosomu ulega nieznacznym zmianom w rnych etapach cyklu syntezy biaka. Niemniej o zasadniczej jednoci ksztatu wiadczy zdolno preparatw rybosomowych do krystalizacji. Analizy rentgenograficzne, wspomagane badaniami immunologicznymi, pozwalaj okreli pozycje poszczeglnych biaek i rRNA w rybosomie. Struktura rybosomw i ich kompleksw z: mRNA, czynnikami inicjacyjnymi i elongacyjnymi oraz tRNA jest przedmiotem intensywnych bada. Wpywa ona bowiem w sposb oczywisty na przebieg odczytu kodu genetycznego.

5.4. Rybosomowe kwasy rybonukleinowe (rRNA) W skad duej i maej podjednostki rybosomowej wchodz swoiste acuchy rRNA, ktrych charakterystyczne cechy przedstawia tabela 5.3.
Tabela 5.3. Wasnoci rRNA RNA maej podjednostki rdo rybosomw dugo (liczba nukleotydw) RNA duej podjednostki wikszy skadnik * dugo (liczba nukleotydw) 3400-4700 2300 2900 2865 3550 1559 1152 mniejszy skadnik S* 5; 5,8 5 5; 4,5 brak 5 brak brak

S*

S* 26-28 23 23 21 26 16 12

Eukaryota, cytosol Prokaryota (E. coli) Eukaryota, chloroplasty Mitochondria: S. cerevisiae kukurydza czowiek Trypanosoma

18 16 16 15 18 12 9

1800 1550 1500 1686 1962 954 597

* S staa sedymentacji, wyraona w svedbergach.

Zgodnie z danymi Brimacombe czsteczki rybosomowego RNA z rnych organizmw tworz podobne struktury przestrzenne. W czsteczkach tych stwierdzono istnienie rejonw o duej i maej zmiennoci. Rejony o maej zmiennoci sekwencji tworz rdze" czsteczki, przyjmujcy identyczny ksztat w rybosomach pochodzcych z rnych organizmw. Rejony o wysokiej zmiennoci, rozrzucone wzdu caej czsteczki, przyjmuj w rybosomach pochodzcych z rnych organizmw struktury o rnych kszta-

tach, ukadajce si wok rdzenia". Wykazano, e czsteczki mitochondrialnego rRNA, pochodzce z rnych organizmw, rwnie zawieraj sekwencje 0 maej i duej zmiennoci. Rybosomy mitochondrialne (mitorybosomy) charakteryzuje nietypowa, w porwnaniu z ich odpowiednikami cytosolowymi i bakteryjnymi, rnorodno wielkoci rRNA. Wielko RNA maej podjednostki mitorybosomu waha si od 600 do 1950 nukleotydw, tzn. od dugoci trzykrotnie mniejszej ni 16S rRNA podjednostki 30S rybosomw bakteryjnych, a do wielkoci przekraczajcej rozmiary 18S rRNA podjednostki 40S rybosomw cytosolowych. Zrnicowanie wielkoci obserwuje si rwnie w grupie rRNA duej podjednostki mitorybosomu. Dugo tych czsteczek waha si od 1150 do 3 550 nukleotydw, tzn. od poowy dugoci 23S rRNA podjednostki 50S rybosomw bakteryjnych, a do wielkoci odpowiadajcej 26S rRNA podjednostki 60S rybosomw cytosolowych. Analiza potencjalnych struktur drugorzdowych rRNA mitorybosomw wykazaa, e krtkie czsteczki kadej z dwu grup rRNA (wchodzcych w skad duej i maej podjednostki mitorybosomu) przyjmuj ksztat odpowiadajcy strukturze rdzenia" czsteczki modelowej rRNA opisanej przez Brimacombe. Dugie czsteczki kadej z dwu klas, oprcz sekwencji wchodzcych w skad rdzenia", zawieraj sekwencje zmienne. Sekwencje te, rne u rnych organizmw, tworz dodatkowe struktury i ukadaj si wok rdzenia". Wrd sekwencji tworzcych rdze struktury przestrzennej rRNA, zarwno maej, jak i duej podjednostki rybosomu, mona wyrni odcinki o najwyszym stopniu homologii i o zachowanej strukturze zarwno pierwszo-, jak 1 drugorzdowej. Te sekwencje uniwersalne wykazuj podobiestwa nawet midzy odlegymi ewolucyjnie organizmami, wystpuj rwnie w obrbie mitochondrialnych rRNA. Dla rnych czsteczek rRNA stopie zgodnoci sekwencji jest najwyszy w rejonie sekwencji uniwersalnych, a znacznie niszy w pozostaych, np. mitochondrialny 18S rRNA pszenicy wykazuje a 87,5% homologii z 16S rRNA E. coli w obszarze sekwencji uniwersalnych, a 60% w pozostaych rejonach. rednia warto homologii sekwencji mitochondrialnego 15S rRNA A. nidulans i 16S rRNA E. coli wynosi 59%, natomiast 68% w rejonie sekwencji uniwersalnych.

5.5. Biaka rybosomowe Skrtowy przegld biaek wchodzcych w skad rybosomw podaj tabele 5.4(a) i 5.4(b). Biaka wchodzce w skad maych podjednostek oznacza si numerem zgodnym z ich ruchliwoci elektroforetyczn oraz prefiksem S (smali). Biaka duej podjednostki oznacza si liter L (large) i odpowiednim numerem.

rdo podjednostek

(S) Staa sedymentacji podjednostek 30 40 40 37 30

Liczba biaek 21 32 31 33 33

Masa czsteczkowa biaek (kDa) rednia 16,0 21,3 23,0 27,3 22,7 min max

Zawarto biaka (% masy rybosomu) 40 50 52 56 68

Prokaryota (E. coli) Eukaryota, cytosol: S. ceremsiae wtroba szczura Eukaryota, mitochondria S. cerevisiae wtroba bydlca

9,0-35,0 11,8-31,0 10,0-38,0 9,5-60,0 10,0-48,0

Tabela 5.4 (b). Biaka wchodzce w skad duych podjednostek rybosomowych (S) Staa sedymentacji podjednostek 50 60 60 50 40 Masa czsteczkowa biaek (kDa) rednia 19,0 21,8 23,9 23,0 21,9 min max 9,6-32,0 10,0-48,4 10,0-54,0 10,0-41,0 8,8-49,0 Zawarto biaka (% masy rybosomu) 33 44 45 40 67

rdo podjednostek

Liczba biaek 34 44 41 38 52

Prokaryota (E. coli) Eukaryota, cytosol: S. cereuisiae wtroba szczura Eukaryota, mitochondria S. ceremsiae wtroba bydlca

5.6. Odstpstwa od kodu uniwersalnego Uniwersalno kodu nie potwierdzia si w peni. Okazao si, e w pewnych (rzadkich) przypadkach istniej odstpstwa od uniwersalnoci. Dotyczy to szczeglnie kodowania syntezy biaek w mitochondriach. Tabela 5.5 podaje stwierdzone odstpstwa.
Tabela 5.5. Kodony mitochondrialne o zmienionym znaczeniu Kod uniwersalny stop arginina izoleucyna leucyna Mitochondria ssacze tryptofan stop metionina leucyna Mitochondria drodowe tryptofan arginina metionina treonina Mitochondria Neurospora i Aspergillus tryptofan arginina izoleucyna leucyna

Kodon UGA AGA AGG AUA CUN

Istotn cech mitochondrialnego systemu translacji jest wystpowanie w mitochondriach znacznie mniejszej liczby izoakceptorowych tRNA ni to ma miejsce w cytoplazmie. Oznacza to, e do odczytu kodu mitochondria dysponuj" znacznie mniejsz liczb antykodonw ni ma to mniejsce w typowych ukadach cytoplazmatycznych. Zgodnie z zaoeniami Cricka, minimalna liczba antykodonw, niezbdnych do odczytu 64-literowego kodu z uwzgldnieniem hipotezy tolerancji (ang. wobble hypothesis) wynosi 32. Tymczasem w mitochondriach drodowych stwierdzono istnienie tylko 27 rnych form tRNA. To oznacza, e w systemach mitochondrialnych pewne antykodony mog odczyta wicej antykodonw ni przewiduj to reguy Cricka, okrelajce mechanizmy odczytu kodu uniwersalnego. Prb zracjonalizowania sytuacji przedstawi Lagerkvist, proponujc uporzdkowanie kodonw i antykodonw uywanych w mitochondriach drodowych w zestawy tak zwanych rodzin (silnych, porednich, sabych) (tab. 5.6).
Tabela 5.6. Kodony i antykodony w kodzie genetycznym mitochondriw drodowych

uuu uuc
UUA UUG

Phe AAG* Leu AAU* 1 Thr II GAU 1 I I

UCU UCC UCA UCG CCU CCC CCA CCG AC U ACC ACA ACG GCU GCC GCA GCG

Sr AG U

UAU UAC UAA UAG

Tyr ! UGU AUG* ; UGC Stop i UGA \ UGG CGU CGC CGA CGG

Cys \ ACG \ Trp ! ACU*\

cuu cuc
CUA CUG \ AUU ^ AUC \ AUA \ AUG GUU GUC GUA GUG

S CAU His \ Pro \ CAC GUG \ GGU Gin \ \ CAA GUU l \ CAG \ Thr \ UGU ? J \ Ala J CGU \ ; AAU AAC AAA AAG GAU GAC GAA GAG

Arg GCA

Ile U AG* Met UAC \ 1 Val I CAU 1 i1 1

Asn S 5 AGU UUG \ 5 AGC Lys \ S AGA uuu; \ AGG Asp ^ GGU CUG ; GGC Glu \ GGA CUU J GGG

Ser \ UCG \ Arg 5 ucu;

Gly CCU

_J

Kodony (5'-3') po lewej, antykodony (3'-5') po prawej stronie kwadratw. Nukleotydy w pozycji chwiejnej9 antykodonu s podkrelone. * t- Nukleotydy zmodyfikowane. Rodziny kodonw: - s i l n y c h , &22221 - mieszanych, i t -sabych.

Zgodnie z propozycj Lagerkvista, do odczytu 64-kodonowego kodu mog wystarczy 23 antykodony, przy zaoeniu, e w obrbie tak zwanych silnych" rodzin, tworzenie wiza wodorowych midzy dwoma pierwszymi zasadami wystarcza do utworzenia dostatecznie stabilnych par midzy kodonem a antykodonem. W silnych" rodzinach trzecia zasada kodonu nie jest wic

swoicie rozpoznawana przez pierwsz zasad antykodonu. Rozchwianie" trzeciej pozycji jest tu wic cakowite. To zaoenie dobrze tumaczy obserwacj, i w mitochondriach drodowych kodony CUN koduj treonin. Treonina kodowana jest rwnie przez kodony ACN, czyli przez 8 kodonw, a nie przez 4, jak w kodzie uniwersalnym. W obrbie pozostaych rodzin zasady parowania Cricka byyby zachowane. W sumie, przy wzrocie rozchwiania, odczyt kodu jest moliwy z uyciem mniejszej ni przewidziana przez Cricka liczby typw tRNA. Z rozwaaniami Lagerkvista nie zgadza si jeden fakt. Mianowicie w mitochondriach drodowych kodon AUA koduje metionin a nie izoleucyn. By moe antykodon tRNA Met w mitochondriach jest swoicie modyfikowany i moe odczytywa kodon AUG i AUA. Propozycj Lagerkvista czsto streszcza si powiedzeniem two out of three", tzn. e dwie spord 3 zasad kodonu (w silnych rodzinach) wystarczaj do odczytu. Nie znaczy to oczywicie, e kod nie jest trjkowy, chocia uwaa si, i to odczytywanie tylko dwu zasad moe by ladem ewolucyjnym po kodzie pierwotniejszym, majcym by moe wanie charakter dwjkowy.

5.7. Zapis w mRNA moe si rni od zapisu w DNA Jednym z paradygmatw biologii molekularnej byo zaoenie, e zapis w mRNA odzwierciedla dokadnie zapis w DNA. Oczywicie wiadomo byo, i pre-mRNA moe ulega rnego rodzaju obrbkom potranskrypcyjnym (cicie i skadanie genowe, modyfikacje kocw 5' i 3', p. rozdz. 8), nie przypuszczano jednak, e sekwencje kodujce mog rwnie ulega zmianom potranskrypcyjnym zmieniajcym sens transkryptw. Istnienie tego procesu, zwanego editing", czyli redagowaniem mRNA, stwierdzono analizujc sekwencje cDNA, otrzymane przez odwrotn transkrypcj rnych mRNA. Okazao si, e sekwencje te, w pewnych przypadkach, nie odpowiadaj sekwencjom genw kodujcych dane mRNA. W niektrych przypadkach w sekwencji pewnej czci populacji transkryptw tego samego genu odkrywane s ramki odczytu, nie stwierdzane w genach kodujcych owe nietypowe mRNA. Takie ramki odczytu powstaj w wyniku insercji lub modyfikacji zasad w pre-mRNA. Geny kodujce mRNA, podlegajce tego typu procesowi, nazwano genami milczcymi (ang. silent genes). S to oczywicie formy genetyczne odmienne od pseudogenw. 5.8. Redagowanie moe wprowadzi dodatkowy kodon terminalny Jednym z biaek zaangaowanych w regulowanie metabolizmu tuszczowcw jest apolipoproteina B. Biako to wystpuje w dwch formach dugiej (100000 Da) i krtkiej (48000 Da). W nabonku jelita cienkiego przewaa

forma duga, a w komrkach wtroby krtka. Gen ApoB w obu tkankach jest identyczny, natomiast mRNA s rne. W nabonku jelita w pozycji 2153 2155 wystpuje kodon CAA (Gin), w komrkach wtroby za kodon ten zostaje zmodyfikowany, stajc si sygnaem stop (UAA ochr). Modyfikacja polega tu na enzymatycznej deaminacji cytozyny, procesie zachodzcym w kompleksie zoonym z biaek komrkowych (wrd nich deaminazy), zwanym edytosomem".

5.9. Redagowanie moe kreowa kodon inicjacyjny Otwarta ramka odczytu genu chloroplastowego Apl2 kukurydzy rozpoczyna si kodonem ACG. W mRNA kodon ten zastpiony jest waciwym kodonem inicjatorowym AUG. Redagowanie polega tu na zamianie C->U, zwizanej najprawdopodobniej z deaminacj cytozyny wystpujcej w pozycji 2 pre-mRNA. 5.10. Redagowanie moe przywrci tre kodu uniwersalnego Na pocztku lat 80. zaproponowano, e w mitochondriach rolinnych, kodon CGG koduje tryptofan, a nie jak w kodzie uniwersalnym arginin. Wynikao to z analizy sekwencji kilku genw mitochondrialnych, ktra sugerowaa, i w pewnych pozycjach kodon CGG oznacza tryptofan, a w pewnych arginin. Tak przynajmniej wynikao z porwnania sekwencji genw i ich produktw biakowych. Sam fakt kodowania przez ten sam kodon dwch rnych aminokwasw by dziwny. Co wicej nie stwierdzono w mitochondriach istnienia tRNA tryptofanowego, mogcego odczytywa swoicie kodon
Tabela 5.7. Zmiany kodonw w genach mitochondriw zarodkw pszenicy Kodon w genie CGG CAC CAT TCA TCG TCT CTC CCG CCA (R) (H) (H) (S) (S) (S) (L) (P) (P) mRNA UGG UAC UAU UUA UUG UUU UUC CUG CUA (W) (Y) 00 (L) (L) (F) (F) (L) (L) Nazwa genu; lokalizacja zmienionego kodonu (jego numer w mRNA) nad 3 (117); cox 2 (51, 87, 129); co* 3 (252); cob (120, 239) cob (100) cob (109) cox 2 (56) rps 12 (24); nad 3 (115) cob (227, 242); co* 2 (26) cob (96) nad 4 (316) cox 3 (255)

Zmienione zasady podkrelono, aminokwasy kodowane oznaczono zapisem jednoliterowym w nawiasach.

CGG. Szczegowa analiza sekwencji mRNA owych kilku genw wykazaa, e tam, gdzie w DNA wystpuje kodon CGG, majcy kodowa w biaku mitochondrialnym arginin, rwnie w mRNA wystpuje kodon CGG. Niektrym kodonom CGG DNA odpowiadaj jednak w mRNA kodony UGG czyli typowe, uniwersalne kodony tryptofanowe. Mechanizm tej zamiany treci wybranych kodonw nie jest znany; mgby on polega na dezaminacji cytozyny prowadzcej do powstania z kodonu CGG kodonu UGG. To zjawisko potranskrypcyjnej zmiany treci kodonw jest w systemie mitochondriw rolinnych rozpowszechnione. Tabela 5.7 podaje wykazane przypadki takiej zamiany.

5.11. Redagowanie moe nada sens informacji, kreujc otwarte ramki odczytu w rezultacie licznych rozrzuconych insercji Gen podjednostki aATPazy mitochondrialnej Physarium polycephalum ma dziwn struktur. Fragmenty tego genu odpowiadaj sekwencjom genw homologicznych z innych organizmw, ale sam gen jest bezsensowny, nie niesie otwartej ramki odczytu i wiele jego odcinkw nie jest kolinearnych z przewidywan sekwencj biaka ATPazy. Okazao si, e w mRNA wystpuj 54 dodatkowe cytozyny, wstawiane co kilkanacie kilkadziesit nukleotydw. Odlegoci midzy miejscami insercji wahaj si od 11 do 52 nukleotydw, rednio wynosz 26 nukleotydw. Mechanizm tego procesu jest nieznany. W rezultacie 54 insercje kreuj pen, otwart ramk odczytu, ktrej tylko lady" zawarte s w genie. Zdumiewajce jest tu ograniczenie redagowania do otwartej ramki odczytu. Czyby proces ten mia charakter ko-translacyjny i uczestniczy w nim rybosom?

5.12; Redagowanie moe nada sens informacji na skutek blokowych insercji urydyn i delecji urydyn Inny mechanizm kreacji otwartej ramki odczytu w produkcie transkrypcji genu, pozornie nie kodujcego biaka, stwierdzono w przypadku syntezy III podjednostki oksydazy cytochromowej Trypanosoma brucei. Mechanizm ten oparty jest na wstawianiu w okrelone miejsce 1-6 urydyn oraz na punktowych delecjach urydyn. Postulowanym rdem urydyn jest transkrypt okrelonego genu, zwany RNA przewodnim" (ang. guide RNA). Na kocu 3' RNA przewodniego wystpuje oligoU by moe na skutek transestryflkacji dostarczajcej wstawianych w mRNA urydyn. Odwrcenie procesu moe by rdem delecji U.

Zmiany zachodzce w wyniku redagowania oczywicie nie zakcaj zasadniczego mechanizmu procesu translacji ani zasad kodowania. Naley pamita, i zapis w DNA nie zawsze musi odzwierciedla dokadnie struktur mRNA. Pewne dziwnoci" kodu, postulowane na podstawie analizy sekwencji genw, mog si okaza tylko hipotezami, bowiem mRNA ulega wielu obrbkom.

5.13. Transferowy RNA (tRNA) Jak wspomniano w omwieniu schematu translacji (p. rys. 5.1) rozpoznanie kolejnych kodonw i usytuowanie kolejnych aminokwasw w tworzcym si acuchu peptydowym dokonuje si w wyniku oddziaywania z mRNA na rybosomie odpowiednich czsteczek transferowego RNA. czenie si odpowiednich aminokwasw ze swoistymi tRNA ma charakter enzymatyczny i katalizowane jest przez enzymy, zwane aminoacylo-tRNA syntetazami. Na rybosomie kolejne aminoacylo-tRNA cz si, przy czym zaktywowane grupy karboksylowe estryfikuj wolne grupy NH 2 . Powstaje w ten sposb acuch polipeptydowy, gdzie aminokwasy poczone s wizaniem peptydowym. Wizanie peptydowe powstaje z wkadem energii, std konieczno zajcia aktywacji. Sekwencje nukleotydowe kilkuset typw tRNA pochodzcych z rnych organizmw s poznane, w wielu przypadkach okrelona te jest ich struktura przestrzenna. Wiadomo, e jednoniciowy acuch tRNA jest swoicie zwinity, tworzc dziki wewntrznym sparowaniom charakterystyczn struktur drugorzdow, zblion do licia koniczyny (p. rys. 5.2). W czsteczkach tRNA wystpuje wiele modyfikowanych zasad modyfikacje te wprowadzane s posttranskrypcyjnie w procesie tzw. dojrzewania czsteczki tRNA. Funkcje tych modyfikacji nie s do koca wyjanione, chocia wiadomo, e modyfikowane zasady wystpujce w ptli antykodonowej mog wpywa na waciwoci kodujce tRNA. W czsteczce wida 4 charakterystyczne ptle, zwane kolejno od koca 5' dihydrourydylow (I), antykodonu (II), zmienn bo w rnych typach tRNA ma rn dugo (III), pseudourydylow lub TWC bo zawiera charakterystyczn zasad W, czyli pseudourudyn (IV). Dwuniciowe fragmenty, na ktrych osadzone s ptle, to tak zwane ramiona. Rami utworzone przez sparowanie odcinkw 5' i 3'-kocowych, to tak zwane rami aminokwasowe, bo na jego kocu (w pozycji 3') umiejscowiona jest grupa OH przyjmujca aminokwas. Struktury pierwszorzdowe i sekwencje antykodonw s oczywicie dla rnych tRNA rne, we wszystkich czynnych czsteczkach tRNA na kocu 3' znajduje si sekwencja CCA Q H - Czsteczka przyjmuje swoist struktur trzeciorzdow ptle I i IV cz si ze sob dodatkowymi

miejsce doczenia aminokwasu A

Rys. 5.2. Alaninowy tRNA drodowy

antykodon

wizaniami wodorowymi, czsteczka zagina si w posta o ksztacie litery L, gdzie rami antykodonowe zajmuje pozycj duszej, a aminokwasowe krtszej kreski. Czsteczki tRNA o swoistych kodonach (np. alaninowym) nios na sobie odpowiedni aminokwas (alanin) i w ten sposb nastpuje odczyt kodu zapisanego w mRNA.

5.14. Swoisto aminoacylacji tRNA Dziaanie czsteczek adaptorowych wyjania wic w jaki sposb zostaje rozwizany problem chemicznej niekomplementarnoci kodonw i aminokwasw, ale stwarza inny problem. Wida wyranie, e proponowany odczyt kodu jest moliwy tylko wtedy, jeli tRNA o odpowiednim antykodonie (np. alaninowym) zostanie naadowany" odpowiednim aminokwasem (alanina). Zapewni to moe tylko wysoka swoisto rozpoznania przez enzym aminoacylujcy, zarwno tylko jednej odpowiedniej klasy tRNA, jak i tylko jednego odpowiedniego aminokwasu. W istocie to wanie na etapie aminoacylacji nastpuje przyporzdkowanie odpowiednich aminokwasw odpowiednim antykodonom, a tym samym kodonom, czyli waciwie to tu nastpuje przeoenie" kodu na jzyk aminokwasowy. Syntetazy katalizuj wic reakcj aktywacji aminokwasu, w wyniku ktrej powstaje reaktywna forma

AMP~ aminokwas i katalizuj przerzucenie z tej formy aminokwasu na 3'-kocow grup OH acucha tRNA. R R I I ATP+NH 2 CH 2 COOH + E E + N H 2 C H 2 C O - AMP+PP f tRNA + EaminoacyloAMP aminoacylo-tRNA + AMP + E

Wiadomo, e w komrkach kademu aminokwasowi odpowiada swoista syntetaza, aminoacylujca wszystkie tRNA izoakceptorowe tego aminokwasu. Syntetazy s organellowo specyficzne; mog wic wykazywa swoisto do organellowych wersji izoakceptorw. Proces aminoacylacji jest obciony pewnym bdem, tote swoiste aminoacylazy mog z pewn czstotliwoci bdnie acylowa, np. odpowiadajcy im tRNA niewaciwym aminokwasem. Enzymy te jednak katalizuj rwnie deacylacj, przy czym hydrolizie ulegaj przede wszystkim produkty bdnej acylacji. W rezultacie acylacja jest rzeczywicie swoista. W istocie struktury przestrzenne rnych tRNA s zblione, musz wic istnie subtelne mechanizmy, dziki ktrym syntetazy rozpoznaj z wysok swoistoci odpowiadajce im tRNA. Ta wysoka swoisto wyboru waciwego tRNA i odpowiadajcego mu aminokwasu to podstawowe zagadnienie w procesie translacji. Na og uwaa si, e rozpoznanie tRNA przez syntetazy moe odbywa si za porednictwem rnorodnych mechanizmw. Punkty kontaktu tRNA z syntetaz s liczne, rozpoznanie moe wic odbywa si w wyniku oddziaywania z caoci" czsteczki tRNA. W niektrych przypadkach jednym z punktw kontaktu jest antykodon moe si wydawa, e wwczas sygnaem decydujcym o swoistoci aminoacylacji tRNA jest wanie trjnukleotydowy kodon. Oczywicie nie moe to by regua generalna przeczy jej generalnoci prosty fakt istnienie tRNA supresorowych. 5.15. Supresorowe tRNA Mutacje punktowe prowadz zwykle do zmian aminokwasowych (neutralnych lub niekorzystnych). Czasem mog doprowadzi do pojawienia si w rejonie kodujcym genu dodatkowego kodonu terminalnego (np. mutacja A U w kodonie glutaminowym AAG kreuje kodon UAG amber). Prowadzi to do przerwania syntezy polipeptydu. Mutant moe ulec tzw. rewersji ekstragenowej, polegajcej na mutacji kompensujcej, ale zlokalizowanej w antykodonie pewnych tRNA. Na przykad t R N A ^ 0 moe zmutowa do tRNAseVc i wtedy kodon terminalny moe zosta odczytany jako seryna. Jak wida, ten nowy tRNA niesie zamiast antykodonu serynowego AGG (parujcego z kodonem serynowym UCC) nowy antykodon AUC. AUC nie odczytuje kodonw serynowych, lecz kodon UAG (amber). Mimo, e w strukturze owego nowego tRNA nastpia zmiana antykodonu na taki, ktry nie

moe bra udziau w odczytywaniu kodonw serynowych, czsteczka tRNA supresorowego w dalszym cigu ulega aminoacylacji seryn. A wic przynajmniej w tym przypadku, to nie tre antykodonu decyduje o swoistoci aminoacylacji. Wida sygnaem swoicie rozpoznawanym przez syntetaz sery now s jakie elementy struktury tRNA Ser lece poza antykodonem. 5.16. Swoisto aminoacylacji moe by okrelona przez nietypow par zasad umieszczon w ramieniu aminokwasowym Poszukiwanie elementw struktury tRNA odpowiedzialnych za swoisto aminoacylacji przeprowadzili Ya-Ming Hou i Schimmel. Analizowali oni efekty zmian struktury trzech tRNA supresorowych E. coli tRNAj A , tRNAcuA? tRNAcuA- Wszystkie trzy tRNA wywouj supresj mutacji amber. Ukad dowiadczalny polega na analizie supresji mutacji amber w E. coli, prowadzcej do auksotrofii tryptofanowej. Wprowadzenie do komrki plazmidu nioscego alaninowy tRNA supresorowy przywracao zdolno wzrostu na poywce bez tryptofanu; plazmidy niosce pozostae supresory nie daway tego efektu. Mutageneza kierunkowa genu tRNA supresorowego wskazaa, e efekt supresji znika, gdy w czsteczce tRNAcuA zostanie naruszona nietypowa para G3: U70, zlokalizowana w ramieniu aminokwasowym. Wiele innych zmian w rnych rejonach czsteczki nie powodowao adnego efektu. Autorzy uznali, e znaczy to, i akurat para G3: U70 moe by odpowiedzialna za swoisto rozpoznania przez syntetaz alaninow. Wprowadzili*wic t par w odpowiednim miejscu pozostaych dwu supresorw, ktre byy przedtem nieaktywne (wstawiaj cystein lub fenyloalanin, a nie alanin). Okazao si, e po takiej modyfikacji oba supresory aktywnie znosz auksotrofl, a w produkcie biakowym znaleziono wstawion alanin. In vitro oba zmodyfikowane w ramieniu akceptorowym tRNA ulegay aminoacylacji alanin (a nie cystein lub fenyloalanin). W sumie okazuje si, e w przypadku syntetazy alanylo-tRNA to para G3:U70 okrela wybr odpowiedniego tRNA, przy czym wybr ten zachodzi w bardzo rnych kontekstach sekwencji otaczajcych. Mamy tu do czynienia z czym w rodzaju drugiego kodu" krtki zapis w sekwencji tRNA okrela rodzaj wicej si z nim syntetazy, a tym samym aminokwasu.

5.17. Supresja moe zachodzi w wyniku omyek" rybosomw. Dwuznaczno translacji Zagadnienie supresji kodonw terminalnych analizowa w latach 60. L. Gorini. Zaobserwowa, e supresja taka (tzw. fenotypowa) moe by zwizana ze zmianami w strukturze rybosomw. Gorini ledzi wpyw streptomycyny na

wzrost bakterii powodujcych niekorzystne mutacje, polegajce na wprowadzeniu dodatkowych przedwczesnych terminacji syntezy okrelonych polipeptydw. Streptomycyna to antybiotyk hamujcy wzrost normalnych bakterii. A tymczasem okazao si, e owe mutanty nie rosnce bez streptomycyny zaczynaj w jej obecnoci rosn. Oczywicie by to saby wzrost, ale wyranie widoczny. Po wycofaniu streptomycyny z poywki, mutanty przestaway rosn, czyli objawiay si znw efekty mutacji wyjciowej. Przeduone hodowle w -obecnoci streptomycyny prowadziy nawet do pojawienia si szczepw streptomycynozalenych. Streptomycyna to antybiotyk wicy si z rybosomami. Na tej podstawie Gorini zaoy, e streptomycyna, wic si z rybosomami, zmienia ich struktur w ten sposb, i zaczynaj one nieco inaczej odczytywa kod. Nastpuje rozlunienie" zasad parowania kodon-antykodon, translacja staje si dwuznaczna" i kodon terminalny moe zosta odczytany z udziaem jednego z naturalnych aminoacylo-tRNA jako znaczcy. Szczepy streptomycynozalene zgodnie z hipotez byyby mutantami, w ktrych zostaa zmieniona struktura rybosomw. Zmiana ta miaaby spowodowa zbyt sztywne" stosowanie zasad parowania. Tak zmienione rybosomy mogyby funkcjonowa tylko po wysyceniu streptomycyn rozluniajc" parowanie. Swoj hipotez Gorini potwierdzi w dowiadczeniach in vitro z uyciem bezkomrkowych systemw translacyjnych. Wykazay one, e streptomycyna (ale i wiele innych czynnikw, np. alkohol) rzeczywicie podnosz dwuznaczno translacji. Dwuznaczno wyraa si w zwikszeniu czstoci bdnego wczania aminokwasw, niezgodnego z sekwencj kodonw w mRNA. Oczywicie zjawisko to dotyczy nie tylko odczytu kodonw terminalnych. I tak, jeli uy jako mRNA polinukleotydu urydylowego (poli U), to w normalnych warunkach syntetyzowana jest polifenyloalanina. W obecnoci streptomycyny powstaje polipeptyd mieszany zawierajcy 95% fenyloalaniny oraz 5% leucyny. Tak wic kodon UUU, normalnie odczytywany jako fenyloalanina, przy podniesionej dwuznacznoci moe kodowa z pewn czstoci leucyn. Rybosomy, izolowane ze szczepw streptomycynozalenych, byy nieaktywne w translacji poli U jeeli do systemu nie dodano streptomycyny. Analiza skadu takich rybosomw wykazaa, e jedno z biaek maej podjednostki rybosomowej S4 ma zmienion struktur w porwnaniu z analogicznym biakiem ze szczepu dzikiego. Wszystkie elementy hipotezy wyjciowej Goriniego zostay wic potwierdzone. W sumie ogranicza si ona do stwierdzenia, i struktura rybosomu w pewnym zakresie decyduje o sposobie parowania kodon-antykodon. Zmiany struktury rybosomu mogyby wic obnia lub podnosi dwuznaczno odczytu. Oczywicie mutacje biaka S4, prowadzce do streptomycynozalenoci (mutacje strA), obniaj dwuznaczno odczytu. Istnieje jednake drugi typ mutacji podnoszcych dwuznaczno. Mutanty takie (zwane ram) zostay zidentyfikowane przez Goriniego i wykazano, i zwizane s one rwnie ze

zmianami w budowie maej podjednostki rybosomowej. Mutacja ram A zlokalizowana jest w genie kodujcym biako S4, ramC w genie biaka S5. Efekt dziaania mutacji ram jest wic przeciwny do efektu dziaania mutacji strA, a analogiczny do dziaania streptomycyny. Za dokadno translacji odpowiadaj dwie grupy biaek maej podjednostki rybosomalnej, ktre maj przeciwny wpyw na dwuznaczno translacji. Do pierwszej grupy nale biaka S4 i S5, a do drugiej S12 i S17. Kontrola translacji przez rybosom odbywa si na poziomie selekcji wizania czsteczek tRNA, w ramach ktrej kompleksy rybosomu z niewaciwymi tRNA ulegaj dysocjacji, natomiast kompleksy z prawidowymi czsteczkami tRNA doprowadzaj do parowania kodon-antykodon. Badania nad kinetyk translacji wykazay, e streptomycyna zwiksza tempo translacji kosztem obnienia jej dokadnoci. W obecnoci antybiotyku rybosom zmienia struktur, co powoduje przypieszenie procesu wizania kodon-antykodon. Odwrotny efekt obserwuje si w mutantach streptomycynoopornych typu strA, gdzie zwikszenie dokadnoci translacji odbywa si kosztem zmniejszenia jej szybkoci. Zaleno dokadnoci translacji od jej szybkoci nie potwierdza si jednak w przypadku mutantw ram, ktre mimo podwyszonego poziomu dwuznacznoci nie wykazuj rnicy w szybkoci translacji w stosunku do szczepu dzikiego. Zapewne selekcja tRNA, kontrolowana przez rybosom, jest procesem przynajmniej dwuetapowym. Etapem pierwszym, warunkujcym szybko, byaby selekcja wstpna, drugi etap za, kontrolowany przez produkt genu ram, stanowioby waciwe parowanie kodon-antykodon, zachodzce z udziaem energii. Na podstawie swoich dowiadcze, zgodnie z ktrymi rybosomy wykazuj pewien naturalny poziom dwuznacznoci, Gorini uzna, e dwuznaczno jest procesem fizjologicznym. Uwaa on (co si zreszt potwierdzio), i prawidowe funkcjonowanie komrki wymaga odczytania z niewielk czstoci pewnych kodonw terminacyjnych. Produktami translacji genw zakoczonych takimi przeciekajcymi" (ang. leaky) kodonami terminalnymi byyby, oprcz waciwie zakoczonych biaek, ich przeduone formy, koczce si na nastpnych czasem do odlegych od pierwszego kodonach terminalnych. Pewien poziom dwuznacznoci translacji obserwuje si rwnie w ukadach eukariotycznych. Zmiany dwuznacznoci zwizane s ze swoistymi zmianami albo w strukturach pewnych biaek rybosomowych, albo w rybosomowym RNA. Zjawisko to wskazuje, e parowanie kodon-antykodon jest kontrolowane przynajmniej w pewnym zakresie przez rybosom. Wida to wyranie w przypadku mitochondrialnych systemw translacyjnych, gdzie obowizuj bardziej lune" zasady parowania kodon-antykodon. Odmiennoci kodu cytoplazmatycznego i mitochondrialnego towarzysz powane odmiennoci w budowie rybosomw i tRNA. Podsumowujc: biosynteza biaka nie jest procesem precyzyjnym. U E. coli czsto bdw w translacji w przeliczeniu na kodon oszacowano na 10" 3 -10" 4 . Warunkiem wczenia kolejnego aminokwasu jest dostateczna

trwao wizania kodon-antykodon. Parowanie kodonu z antykodonem zachodzi w kompleksie o bardzo niskiej trwaoci i niewaciwie sparowane kompleksy s eliminowane. Pierwszorzdne znaczenie w procesie selekcji tRNA ma struktura rybosomu i jest to gwny czynnik decydujcy o czstoci bdw w translacji. W znacznie mniejszym stopniu o poziomie dwuznacznoci decyduj bdy syntetaz aminoacylo-tRNA i polimerazy RNA.

6. REKOMBINOWANIE I KLONOWANIE DNA

Ogromny postp, jaki dokona si w biologii w ostatnich kilkunastu latach, jest w duej mierze wynikiem zastosowania w pracach badawczych nowych technik. Spord nich niewtpliwie najwiksze znaczenie maj techniki rekombinowania i klonowania DNA wprowadzone w poowie lat 70. i stanowice najistotniejszy element wielkiego zbioru, potocznie zwanego inynieri genetyczn". Umoliwiaj one tworzenie nowych kombinacji genw, rwnie i takich, ktre nigdy nie miayby szansy powstania w naturze. Techniki inynierii genetycznej wykorzystano do konstrukcji wielu uytecznch mikroorganizmw oraz do tworzenia nowych odmian rolin i zwierzt hodowlanych. Zagadnieniom tym powicony jest rozdzia 14. Z punktu widzenia nauk podstawowych najwaniejsze konsekwencje opracowania technik inynierii genetycznej wynikaj z wydzielania i charakteryzowania pojedynczych genw. Dziki temu poznano midzy innymi struktur genw wyszych organizmw i uzyskano wiele informacji o ich dziaaniu. W rozdziale tym przedstawione s podstawowe techniki suce do wyodrbniania i powielania genw oraz przenoszenia ich z jednego organizmu do drugiego. Naszym celem nie byo podanie dokadnych przepisw laboratoryjnych. Czytelnik moe je znale w specjalnych pozycjach, z ktrych najbardziej znanym jest podrcznik Molecular Cloning", opracowany przez Frisha, Sambrooka i Maniatisa. Chodzio nam przede wszystkim o przedstawienie zasad najwaniejszych technik oraz schematw typowych dowiadcze wykonywanych obecnie w pracowniach genetycznych. Znajomo tych zasad pozwoli na zrozumienie, w jaki sposb uzyskano wikszo opisanych w pozostaych rozdziaach informacji o budowie i dziaaniu genw.

6.1. Wyodrbnianie i powielanie genw Do czasu wynalezienia metod inynierii genetycznej pewne manipulacje genetyczne, polegajce na wyodrbnianiu genw i ich przenoszeniu z jednej komrki do drugiej, wykonywano jedynie na bakteriach, wykorzystujc tzw. agodne fagi (p. transdukcja). Operacje tego typu miay jednak bardzo ograniczony zasig. W przypadku organizmw eukariotycznych nie znano adnych metod, ktre pozwalayby na wyodrbnianie i charakteryzowanie poszczeglnych genw. Gwna trudno wie si z wielkoci genomw wyszych organizmw i polega na tym, e pojedynczy gen stanowi ich jedn kilku- lub nawet kilkusettysiczn cz i znalezienie go na tak duym genomie jest

Rys. 6.1. Oglny schemat typowego dowiadczenia, ktrego celem jest sklonowanie genu z dowolnego organizmu. Objanienia w tekcie

powanym problemem technicznym. Uniwersalne rozwizanie tego problemu przyniosy metody rekombinowania i klonowania DNA. Podstawowy schemat tych zabiegw jest przedstawiony na rysunku 6.1. Gwne etapy typowego dowiadczenia, w ktrym DNA klonowany jest w mikroorganizmach, to: fragmentowanie oczyszczonego uprzednio DNA organizmu, z ktrego zamierzamy wyodrbni gen, czenie fragmentw DNA z czsteczkami wektorowymi i wprowadzanie zrekombinowanych wektorw do komrek, w ktrych mog si one powiela. Fragmentowanie DNA przeprowadza si wtedy, gdy poszukujemy pojedynczych genw w genomie danego organizmu. Narzdziem, stosowanym w tym przypadku, s na og enzymy restrykcyjne, chocia fragmenty DNA mona uzyska i innymi drogami, np. dziaajc na wielkoczsteczkowy DNA ultradwikami lub przepuszczajc go przez wsk kapilar. Drugi etap to czenie fragmentw DNA, czyli rekombinowanie DNA in vitro. Mona poczy ze sob dowolne czsteczki DNA, a enzymem, ktry wytwarza wizania fosfodiestrowe, jest ligaza DNA. W typowym dowiadczeniu czymy (rekombinujemy) fragmenty genomowego DNA z czsteczkami wektorowymi. Wektory s to niewielkie czsteczki DNA, majce zdolno do samodzielnej replikacji w komrce. Podczony do wektora fragment DNA bdzie po wprowadzeniu zrekombinowanej czsteczki do komrki ulega powielaniu. Ten etap okrela si jako klonowanie DNA. Poszczeglne etapy caej procedury, a take narzdzia (enzymy restrykcyjne i wektory) suce do jej przeprowadzenia, zostan dokadniej omwione w kolejnych punktach tego rozdziau. W tym miejscu konieczne jest jedynie zwrcenie uwagi na to, e wynikiem dowiadczenia przedstawionego na rysunku 6.1 i omwionego powyej jest uzyskanie banku genw (biblioteki genw) danego organizmu. Cay genom organizmu wystpuje w postaci fragmentw DNA podczonych do poszczeglnych czsteczek wektorw. Po wprowadzeniu zrekombinowanych wektorw do komrek, kady fragment genomu ulega oddzielnie powieleniu. Nasz bank genw wystpuje obecnie w postaci klonw komrek (np. bakterii). Po to, aby zidentyfikowa wektor zawierajcy fragment DNA z interesujcym nas genem (lub zidentyfikowa klon komrek, w ktrych ten wektor si znajduje) naley przeprowadzi kolejne dowiadczenia, ktrych przykady podane s w podrozdziale 6.5. Warto rwnie doda, e przedmiotem manipulacji genetycznych s nie tylko geny wyodrbniane z genomw rozmaitych organizmw. Wiele dowiadcze wykonuje si na DNA syntetyzowanym chemicznie lub enzymatycznie. Metody chemicznej syntezy DNA s obecnie na tyle dobrze poznane, e mona byo w duej mierze zautomatyzowa proces syntezy. Istniej urzdzenia do otrzymywania oligonukleotydw o okrelonej sekwencji i dugoci (zwykle 2040 nukleotydw), z ktrych za pomoc ligazy DNA montuje si" dusze fragmenty DNA i kompletne geny kodujce okrelone biaka. W przypadku enzymatycznej syntezy DNA (tzw. cDNA), jako matryc stosuje si najczciej mRNA, ktry polimeraza DNA zalena od RNA

(odwrotna transkryptaza) przepisuje" na jedn, a nastpnie na drug ni DNA. Podobnie, jak DNA pochodzcy z dzielenia genomu na fragmenty, DNA syntetyzowany chemicznie lub enzymatycznie jest podczany do wektorw i powielany w komrkach odpowiednich mikroorganizmw.

6.2. Enzymy restrykcyjne Enzymy restrykcyjne (inaczej: restryktazy) s podstawowym narzdziem inynierii genetycznej. S to enzymy nalece do grupy endonukleaz. Znanych jest kilka rnych klas tych enzymw, przy czym najwiksze znaczenie praktyczne maj enzymy klasy II, ktre rozpoznaj i przecinaj okrelone sekwencje nukleotydowe w czsteczce DNA. Rozpoznawane przez te enzymy sekwencje skadaj si z 4 8 nukleotydw, a miejsce przecicia znajduje si w obrbie rozpoznawanej sekwencji lub w cile okrelonej odlegoci od niej. Enzymy restrykcyjne wystpuj w bakteriach i sinicach. Stanowi element systemu obronnego" tych organizmw, chronicego je przed atakiem wirusw. Dany szczep bakterii ma jednoczenie zdolno wytwarzania enzymu modyfikujcego (metylazy), rozpoznajcego te same sekwencje DNA, co wytwarzana w tym szczepie endonukleaza i zmieniajcego je w taki sposb, aby nie byy przecinane. Dziki temu wasny" DNA nie jest trawiony przez wasne" restryktazy, natomiast obcy", nie zmodyfikowany, podlega degradacji. Znanych jest obecnie kilka tysicy restryktaz, z ktrych kilkaset jest sprzedawane przez firmy zajmujce si handlem odczynnikami chemicznymi. Enzymy te okrela si za pomoc symboli, np. Eco RI oznacza enzym uzyskiwany ze szczepu R bakterii Escherichia coli, a HindIII oznacza enzym ze. szczepu Haemophilus influenzae serotyp d. Liczba rzymska wynika z chronologii izolowania enzymw z tych samych mikroorganizmw.
5' 3' G A A T T C C T T A A G 5'

Rys. 6.2. Przykady sekwencji nukleotydowych rozpoznawanych i przecinanych przez enzymy restrykcyjne. Strzakami zaznaczono miejsca przecicia wiza fosfodiestrowych. Poszczeglne enzymy pozostawiaj po przeciciu koce tpe (np. Hhal) lub lepkie. W przypadku lepkich kocw moe wystawa" koniec 5', a koniec 3' moe by cofnity (np. EcoKl lub NotI) lub.cofnity moe by koniec 5' (np. Hpal). Not I jest przykadem enzymu, ktry trawi D N A na due fragmenty ze wzgldu na dugo (8 nukleotydw) i skad nukleotydw (wycznie pary GC) w rozpoznawanej sekwencji

Eco RI

t
5' 3'

i
G T T A A C C A A T T G t I . G C G C . . C G C G . . , 5' Hpal . . 3' 5' Hhal

5' 3'

t
5' 3' . . G C G G C C G C . . . C G C - C G G C G . . . 3' 5' Not I

Form aktywn enzymw restrykcyjnych klasy II s w wikszoci przypadkw homodimery, kofaktorem restrykcji jest Mg + 2 . Sekwencje nukleotydowe rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne maj najczciej charakter sekwencji palindromowych, tzn. e, jeli s odczytywane z kadej nici w kierunku np. 5' -> 3', to s identyczne. Przecicie wiza fosfodiestrowych dwu nici zachodzi albo dla tej samej pary zasad (wtedy strawiony DNA koczy si tzw. tpymi kocami), albo z przesuniciem o jedn lub dwie pary zasad (strawiony DNA jest zakoczony tzw. lepkimi kocami) (rys. 6.2). Lepkie koce uatwiaj czenie ze sob (ligacj) fragmentw DNA. W czsteczce DNA-o statystycznie losowej sekwencji zasad, zawierajcej 50% par GC, dany tetranukleotyd zdarza si co 259 zasad, heksanukleotyd co 4096 par zasad, a heksanukleotyd skadajcy si tylko z par GC co 65 536 par zasad. Z wylicze tych wynika wniosek praktyczny co do stosowania okrelonych enzymw restrykcyjnych. Jeeli zaley nam na strawieniu DNA na niewiele fragmentw, uyjemy enzymu rozpoznajcego szecionukleotydowe sekwencje, a w szczeglnoci takie, w ktrych wystpuj sekwencje CpG lub GpC, szczeglnie rzadkie w genomach organizmw eukariotycznych.

6.3. Mapy restrykcyjne Jedn z najwaniejszych cech enzymw restrykcyjnych jest powtarzalno fragmentacji czsteczek DNA. Na przykad enzym EcoRl strawi DNA faga X zawsze na 6 fragmentw, a enzym Hindlll zawsze na 8 fragmentw, podczas gdy enzym EcoRY rozpoznajcy czteronukleotydowe sekwencje, strawi ten sam DNA na 22 fragmenty. Liczba fragmentw DNA, uzyskiwanych po trawieniu danym enzymem danej czsteczki DNA, zaley jedynie od liczby sekwencji rozpoznawanych przez enzym, wystpujcych w tej czsteczce DNA. Wielko fragmentw DNA, uzyskiwanych w wyniku trawienia danej czsteczki DNA, jest zalena od odlegoci midzy sekwencjami rozpoznawanymi przez enzym. Fragmenty czsteczek DNA mona atwo rozdzieli, stosujc metod elektroforezy DNA w elach agarozowych lub akrylamidowych. W elach tych fragmenty przesuwaj si z prdkoci, zalen gwnie od ich masy: droga, jak fragment przebywa w elu, jest w okrelonym zakresie odwrotnie proporcjonalna do logarytmu jego masy. Zwykle wielko fragmentw DNA uzyskanych po strawieniu jakiej czsteczki odczytuje si z eli, na ktrych oprcz badanych prbek DNA naniesiono mieszanin fragmentw DNA o znanej wielkoci. Obraz czsteczki DNA, na ktrym zaznaczone s miejsca rozpoznawane przez rne enzymy restrykcyjne z uwzgldnieniem odlegoci midzy nimi wyraonej w nukleotydach, nazywa si map restrykcyjn. Przykadowy rozdzia fragmentw DNA plazmidu i sporzdzon na tej podstawie map restrykcyjn kolistej czsteczki DNA przedstawiono na rysunku 6.3. Mapy restrykcyjne moemy sporzdza dla stosunkowo niewielkich czsteczek DNA,

liczcych nie wicej ni sto kilkadziesit tysicy nukleotydw. W przypadku czsteczek wikszych, liczba fragmentw DNA uzyskiwanych po strawieniu nawet pojedynczym enzymem jest zwykle zbyt dua, aby mona je byo rozdzieli na elu i okreli ich wielko. Analiza restrykcyjna DNA jest zabiegiem, ktry najczciej poprzedza wszelkie badania nad klonowaniem i sekwencjonowaniem fragmentw DNA.

6.4. Wektory Jeeli udaoby si nam wprowadzi do komrki dowolnego organizmu, np. bakterii, niczym nie chroniony fragment obcego DNA, to wkrtce zostaby on zdegradowany do pojedynczych nukleotydw. Wikszo manipulacji genetycznych wykonuje si z zaoeniem, e wprowadzony do komrek gospodarza fragment DNA (gen) bdzie w nich funkcjonowa, tj. replikowa si i podlega ekspresji. Aby to uzyska, fragmenty DNA wprowadza si do komrek za porednictwem wektorw, czsteczek DNA, ktre maj zdolno do autonomicznej replikacji w danym typie komrek i ktre zapewni powielanie wprowadzonego fragmentu DNA, a w wielu przypadkach rwnie i wydajn ekspresj zawartych w nim genw. Nie ma uniwersalnych wektorw do wszystkich rodzajw komrek. Rnice w przebiegu procesw replikacji, transkrypcji i translacji midzy Prokaryota a Eukaryota, a take midzy gatunkami nalecymi do kadej z tych dwch klas organizmw, zmuszaj nas do dobierania wektorw w zalenoci od tego, w jakich komrkach zamierzamy klonowa dany gen. Najistotniejszym elementem wektora, od ktrego zaley jego specyficzno, s sekwencje odpowiedzialne za inicjacj replikacji, tzw. sekwencje ori (ang. origin). Jeeli wektor ma np. suy do namnaania fragmentw DNA w komrkach E. coli i Saccharomyces cerevisiae, to musi zawiera odpowiednie sekwencje ori jednego i drugiego organizmu. Wektory zwykle wyposaane s w tzw. markery, czyli geny odpowiedzialne za atwo wyrnialne cechy fenotypowe, jak np. oporno na antybiotyk czy te zdolno syntezy atwo oznaczalnego enzymu (np. /?-galaktozydaza lub acetylaza chloramfenikolu). Geny markerowe mog pochodzi z dowolnego organizmu, musz by jednak wyposaone w sekwencje warunkujce ich prawidow transkrypcj i translacj w komrkach, do ktrych wprowadzamy dany wektor.
6.4.1. Bakteryjne wektory plazmidowe

Plazmidy s to wystpujce w komrkach bakterii i niektrych innych organizmw koliste czsteczki DNA, replikujce niezalenie od replikacji chromosomw. W latach 70., jako wektor, wykorzystywany by naturalnie

wystpujcy plazmid ColEl, obecnie wszystkie stosowane wektory plazmidowe zoono z fragmentw DNA pochodzcych z rnych rde. Wektory plazmidowe wprowadza si do komrek bakterii, wykorzystujc zjawisko transformacji. Transformacja komrek E. coli, bakterii najczciej stosowanej w eksperymentach genetycznych, wymaga zwikszenia przepuszczalnoci bon komrkowych (komrki traktuje si roztworem chlorku wapnia). 1 (ig DNA plazmidowego wystarcza na stransformowanie 107-108 komrek. W typowym dowiadczeniu transformacji ulega 1 na 106 komrek. Klasycznym wektorem plazmidowym E. coli jest pBR322 (rys. 6.4), plazmid 0 znanej sekwencji 4362 par nukleotydw. Niesie on dwa geny markerowe ampT 1 tetT, warunkujce oporno na ampicylin i tetracyklin. Miejsce startu replikacji (ori) pBR322 pochodzi z plazmidu ColEl i zapewnia obecno kilkudziesiciu kopii plazmidu w komrce. W obrbie DNA plazmidu pBR322 znajduj si pojedyncze miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, jak Eco RI, Barn HI, Pst I i kilka innych. Enzym Pstl przecina DNA plazmidu w obrbie genu ampT. Wprowadzanie w to miejsce fragmentw obcego DNA pozwala na rozrnienie plazmidw zrekombinowanych od nie zrekombinowanych. Pierwsze z nich bd miay uszkodzony gen ampT, a zatem bd nadawa komrce jedynie cech opornoci na tetracyklin, podczas gdy drugie bd nadaway oporno na oba antybiotyki (ampT i tetT). Do szeroko stosowanych wektorw nale plazmidy serii pUC (rys. 6.5). S one pochodnymi plazmidu pBR322, nioscymi tzw. polilinker oraz fragment genu lacZ z E. coli, zawierajcy promotor i sekwencj kodujc N-kocow cz biaka j8-galaktozydazy. C-kocowa cz biaka jest dostarczana" przez defektywny gen, znajdujcy si w chromosomie w szczepie bakterii stosowanym do transformacji. W takim szczepie aktywna /?-galaktozydaza powstaje w wyniku tzw. a-komplementacji. Polilinker, to krtki odcinek DNA, w ktrym wystpuj sekwencje rozpoznawane przez rozmaite enzymy restrykcyjne, co pozwala na czenie z wektorem fragmentw DNA strawionego rnymi enzymami restrykcyjnymi. Kolonie komrek E. coli zawierajcych plazmid pUC maj niebieski kolor, gdy hoduje si je na podou zawierajcym X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-/?-D-galaktozyd). Zabarwienie kolonii wynika z obecnoci /?-galaktozydazy
Rys. 6.3. Przykad analizy restrykcyjnej zrekombinowanego wektora. Na plazmidzie pUC19 w miejscu Eco RI sklonowano fragment DNA. Uzyskany plazmid (pMS02) trawiono trzema enzymami restrykcyjnymi i kombinacjami po dwa enzymy. Produkty trawienia rozdzielono w elu agarozowym (a). Dla porwnania, w tym samym elu rozdzielano DNA faga X trawiony Bst I (standard wielkoci) i wektor pUC19 przecity Eco RI. el wybarwiono bromkiem etydyny i sfotografowano w wietle ultrafioletowym. Jest to standardowy sposb ukazania DNA. Na podstawie obrazu migracji fragmentw DNA w elu uoono map restrykcyjn plazmidu (b). Wartoci liczbowe na mapie plazmidu oznaczaj odlego w tysicach par zasad. Zauwa, e w elektroforezie na elu agarozowym mona rozrnia take formy konformacyjne czsteczek DNA o tej samej wielkoci: cieka nt" to preparat nie trawionego zrekombinowanego plazmidu. Trzy widoczne prki odpowiadaj (od gry) formie kolistej superhelikalnej, formie kolistej zrelaksowanej i formie liniowej

EcoR I 4361 AotU 4284 ' Ssp_l Ear I 4155 co57 I 4048, Xmn I 3961 Hinc II 3905 Scol 3844 Pvu I 3733 P s f I 3607 Ase I 3537 fiso I 3433

Cla I 23 MdsLUI 29 EcoR V 185 M>e I 229 BamH I 375 Ban D 471 Ban H 485 ' Sph I 562 " Eco N I 622 651 I 651 I 651 PshA I 712 EpgJ. 939 -A/ru I 972 BspfA I 1000

HgiE II 3054 Eco 57 I 3000 >4/vyN I 288

Drd I 2575 Aft ID 2473 arl 2351 Xmn I 2029 2064 Wp/E D 2293 Esd3 I 2122 Xca l-Acc I 2244. 0rd I 2175 flsoA I 2225 7?/)111 I 2217 Eco Rl

Pfl M I 1315 asm I 1353 Sty_l 1369 W/M I 1364 Ava I 1425 PpuM I 1480 Msc I 1444 duM I 1480 1650 flspM II 1664 flsoB I 1668
K

Psfl

Sa/I

przecicie plazmidu enzymem Sali, ligacja z fragmentami obcego DNA i transformacja komrek E.coti wraliwych na tetracyklin (tet.) i ampicylin {amp.)

komrki nie stransformowane, wraliwe na tet. i amp.

komrki stransformowane plazmidem nie zrekombinowanym, oporne na tet. i amp.

komrki stransformowane plazmidem zrekombinowanym, oporne na amp. i wraliwe na tet.

w komrkach. Wczenie fragmentu DNA w obrb polilinkera powoduje zablokowanie syntezy N-kocowej czci /J-galaktozydazy i biae zabarwienie kolonii. Dziki temu mona rozrnia komrki zawierajce wektory zrekombinowane od takich, ktre przenosz wektor nie zrekombinowany. Istniej rozmaite wektory plazmidowe, przygotowane do realizacji okrelonych celw klonowania. Czsto konstruuje si tzw. wektory ekspresyjne, pozwalajce na bardzo wydajn syntez biaek kodowanych przez znajdujce si na wektorze geny. Wektory takie nios sekwencje umoliwiajce wydajn transkrypcj i translacj, a take zapewniajce stabilno wytwarzanego biaka. Dziki wektorom ekspresyjnym mona uzyskiwa szczepy bakteryjne, w ktrych biako kodowane przez gen umieszczony na wektorze stanowi ponad 30% biaka bakterii. Tego rodzaju szczepy wykorzystywane s w nowoczesnej biotechnologii (p. rozdz. 14).

6.4.2. Wektory pochodne bakteriofagw

Najczciej stosowanymi wektorami fagowymi w E. coli s pochodne faga X. W stosunku do wektorw plazmidowych wektory fagowe maj pewne zalety. Mona w nich atwiej klonowa wiksze fragmenty DNA, a wydajno infekcji czstkami bakteriofagw jest te wysza ni wydajno transformacji. Genom bakteriofaga X jest dwuniciow czsteczk DNA o znanej sekwencji (48 502 par zasad) mieszczc ok. 40 genw. W dojrzaych czstkach wirusowych DNA ma form liniowej czsteczki zakoczonej 12-nukleotydowymi jednoniciowymi i wzajemnie komplementarnymi lepkimi kocami", nazwanymi cos. Dziki tym kocom DNA fagowy przybiera w komrce bakteryjnej form kolist, koce te s te konieczne do zapakowania" DNA faga w biakow gwk". Czynno pakowania" DNA do gwek" mona wykonywa in vitro. Czsteczka DNA dzikiego typu faga X nie nadaje si wprost do wykorzystania jako wektor, gdy ma zbyt wiele miejsc restrykcyjnych dla poszczeglnych restryktaz, czsto w obrbie genw niezbdnych w cyklu yciowym faga. Z DNA faga X mona jednak usun odcinek stanowicy ok. 30% genomu, pozostawiajc jego lewe" i prawe" ramiona, zawierajce wszystkie geny niezbdne w cyklu litycznym. Poniewa do gwki biakowej faga X nie jest pakowany DNA o dugoci rnicej si o wicej ni 75 105% dugoci DNA faga dzikiego, mona to zjawisko wykorzysta do selekcji zrekombinowanych czsteczek DNA, gdy tylko takie bd infekcyjne.

Rys. 6.4. Szczegowa mapa restrykcyjna plazmidu pBR322. Na mapie nie naniesiono miejsc przecinanych przez enzymy rozpoznajce czteronukleotydowe sekwencje. Podkrelono symbole enzymw przecinajcych czsteczk tylko w jednym miejscu. Liczby oznaczaj numer kolejny nukleotydu liczony od pierwszej reszty T w unikatowej sekwencji Eco RI, obok ktrego dany enzym przecina DNA. U dou: zastosowanie plazmidu pBR322 do klonowania DNA i wyrniania klonw zawierajcych zrekombizowane wektory

Esp3 I 2683 Eco0109 I 2674v l

O L

Esp 3 I 51 0rd I 91 Hg/E n 181 ' A/c/e I 183 Afor I/Kos I 235 Sg/I 245 Fsp I 256 -Pvu I 276 Pvu n 306 BceF I 387 C Poliinker 396-454

Pvu I 2066 /Wa II 2059

Pvu II 628

W I 641
Sgnl 683

Esp I 1919 Ava II 1837 Bgl I 1813 Bpm I 1784' BsrF I 1779 Bsa I 1766 EarnmS I ) HgiE II 1387 Eco57 I 1333 Mme I 1180 AlwN I 1217 ficeF I 1292 < 8 >

7//' I 781 'Aft ffl 806 Drd I 908 Mme I 996 < S >

400 420 440 460 Ec/136 I Xma I Soc 1 Sma I Xba I Pstl Hin III ggtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGAfcCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaotcotggtca EcoR I Kpn I flamH I Sal I Sp/> I Apo I 4ce65 I H/hc II Acc I SspM I Rys. 6.5. Szczegowa mapa restrykcyjna plazmidowego wektora pUC19. Podkrelono symbole enzymw przecinajcych plazmid tylko w jednym miejscu. U dou przedstawiono sekwencj polilinkera z zaznaczonymi miejscami restrykcyjnymi. Pozostae objanienia s w tekcie

Podobnie jak w przypadku wektorw plazmidowych, do wektorw pochodnych faga X wstawiono polilinkery, geny markerowe (np. fragment genu lacZ), silne promotory itp. W laboratorium J. Messinga skonstruowano seri wektorw pochodnych faga MIS. Jest to jeden z niewielkich, nitkowatych fagw E. coli, ktrych genom stanowi jednoniciowa czsteczka DNA. Po wnikniciu DNA do komrki bakteryjnej syntetyzowana jest druga ni, po czym nastpuje replikacja formy dwuniciowej a do osignicia ok. 200 kopii Ml3-DNA na komrk. W tym momencie nastpuje zmiana mechanizmu replikacji i synteza tylko nici

plazmid zawierajcy sekwencje cos z faga A; czna wielko DNA 23 tys. par zasad

obcy DNA

powstaj dugie czsteczki DNA, w ktrych odcinki obcego DNA s przemieszane z odcinkami DNA zawierajcymi sekwencje cos w otoczki pakowane s te fragmenty DNA, ktre zawieraj sekwencje cos przedzielone odcinkiem DNA o wielkoci 23-33 tys. par zasad

infekcja komrki bakteryjnej

Rys. 6.6. Klonowanie DNA za pomoc kosmidw

 + " DNA, pakowanej do otoczek biakowych. Ten szczeglny cykl yciowy faga M13 pozwala na wykorzystanie go jako wektora jednoniciowego DNA, a wic w sytuacjach, gdy celem pracy jest np. sekwencjonowanie DNA lub ukierunkowana mutageneza. Szczeglnym typem wektora s tzw. kosmidy, skonstruowane po raz pierwszy przez B. Hohn i J. Collinsa. Z sekwencjami plazmidu bakteryjnego (ori, gen markerowy) poczyli oni sekwencje cos z faga X. Jeeli liguje si fragmenty DNA z takim plazmidem, to uzyskuje si dugie czsteczki DNA, ktre dziki obecnoci sekwencji cos mog by in vitro zapakowane w otoczki biakowe faga X. Kosmid infekuje komrki E. coli tak jak fag X (rys. 6.6), natomiast jego DNA replikuje si tak jak DNA plazmidu. Jak powiedziano wyej, do gwek fagowych pakowane s czsteczki DNA o okrelonej dugoci (ok. 50 tys. par zasad), std te kosmidy nadaj si do klonowania duych fragmentw DNA (10-40 tys. par zasad). S stosowane w konstruowaniu bankw genw, gdy zaley nam na tym, aby bank skada si ze stosunkowo niewielkiej liczby klonw.
6.4.3. Wektory drodowe

Drode, a zwaszcza gatunek S. cerevisiae, s bardzo czsto wykorzystywane w pracach nad rekombinowaniem i klonowaniem DNA, speniajc wrd organizmw eukariotycznych podobn rol jak E. coli wrd prokariontw. Ich waciwoci genetyczne i fizjologiczne s wietnie poznane. Maj struktury komrkowe (jdro, mitochondria) typowe dla Eukaryota, geny mog zawiera sekwencje intronowe. Proces obrbki mRNA jest zbliony do obserwowanego u wyszych Eukaryota. Biaka podlegaj u drody modyfikacjom potranslacyjnym (mostki SS, glikozylacja). Std te DNA klonuje si wtedy w drodach, kiedy celem dowiadczenia jest uzyskanie ekspresji badanego genu w komrce eukariotycznej i odpowiednio zmodyfikowanych biakowych produktw. A. Hinnen opracowa w.roku 1978 metod transformacji komrek drody. Obecnie istnieje wiele typw dogodnych wektorw drodowych. Mona je klasyfikowa jako wektory replikatywne (YR) lub episomalne (YE). S to czsteczki DNA z sekwencjami startu replikacji, pochodzcymi odpowiednio z chromosomw drody (tzw. sekwencje ars) lub z naturalnie wystpujcego u drody plazmidu, zwanego 2ja. W obu przypadkach wektory wyposaono w geny markerowe suce do selekcji oraz w polilinkery. W drodowych wektorach ekspresyjnych, jako silnych indukowalnych promotorw, uyto promotory drodowych genw, np. xADHI (gen dehydrogenazy alkoholowej) lub GALI (gen kodujcy galaktokinaz). Wektory drodowe konstruuje si bardzo czsto jako wektory bifunkcjonalne (wahadowe), tj. zdolne do replikacji zarwno w komrkach drody, jak i E. coli. Maj one odrbne sekwencje startu replikacji oraz geny markerowe dla kadego z tych organizmw. Pozwala to na przykad na klonowanie genw w E. coli i badanie ich ekspresji w drodach, co jest atwiejsze ni wykonywanie wszystkich etapw dowiadczenia w komrkach drody.

TEL

LEU2 ARS

CEN

1L
obcy DNA (do 500 tys. par zasad)

TEL

Rys. 6.7. Oglny schemat struktury sztucznego chromosomu drodowego YAC. Markerem w tym wektorze jest gen LEU2, kodujcy jeden z enzymw szlaku biosyntezy leucyny. Wektor wyposaony jest w telomery (TEL), centromer (CEN) i sekwencj startu replikacji DNA (ARS)

W ostatnich latach konstruuje si wektory drody, zwane sztucznymi chromosomami YAC (ang. yeast artiflcial chromosome). Su one do klonowania bardzo duych fragmentw DNA (do 5 milionw par zasad). Dziki temu mog by wykorzystane do ustalania map fizycznych duych chromosomw wyszych Eukaryota (np. w projekcie sekwencjonowania i mapowania genomu czowieka). YAC skadaj si z tych samych elementw, ktre zapewniaj replikacj naturalnych" chromosomw i ich segregacj w czasie mitoz, a wic sekwencje ars oraz sekwencje centromerowe i telomerowe, nios te geny markerowe i polilinkery (rys. 6.7).
6.4.4. Wektory stosowane dla wyszych eukariontw

Opanowanie metod wprowadzania obcego DNA do komrek rolinnych lub zwierzcych, a take transformowanie caych organizmw (transgenizacja), byo niezwykle wane ze wzgldw zarwno poznawczych, jak i praktycznych. Manipulacje genetyczne dokonywane na wyszych organizmach s obecnie wykonywane z powodzeniem, aczkolwiek s one technicznie bardziej skomplikowane ni analogiczne dowiadczenia z uyciem drody lub bakterii. W przypadku wyszych eukariontw nie dysponujemy tak znakomitymi wektorami, jak dla drody? tym niemniej wiele skonstruowanych wektorw pozwala na przynajmniej przejciow ekspresj zrekombinowanych z nimi genw. W przypadku rolin wykorzystano pochodne tych nielicznych wirusw rolinnych, ktrych materiaem genetycznym jest DNA. Przykadem takiego wirusa jest wirus mozaiki kalafiora. Jednak najczciej stosowanym wektorem jest pochodzcy z Agrobacterium tumefaciens plazmid Ti. Szczegowo ukad ten zosta omwiony w rozdziale 14. Do komrek zwierzcych DNA wprowadza si za pomoc wektorw bdcych pochodnymi wirusw SV40, papilioma, wirusa kro wianki, bakulo wirusw, adenowirusw i retrowirusw. Zrekombinowany z genomami tych wirusw DNA moe integrowa z genomem komrki gospodarza, co daje pocztek nowej, transfekowanej linii komrkowej lub replikowa poza chromosomem, co zwykle prowadzi po pewnym czasie do lizy komrki. Spord wirusw wymienionych wyej, DNA SV40 by najdawniej wykorzystywany jako wektor. Jest to kolista, dwuniciowa czsteczka DNA (5243 par nukleotydw). W czsteczce tej zakodowane s dwa tzw. biaka wczesne

transfekcja specjalnej

Rys. 6.8. Klonowanie genu w komrkach eukariotycznych w wektorze pochodnym retrowirusa. D N A retrowirusa z wczonym do niego obcym genem wprowadza si do specjalnej linii komrkowej, w ktrej produkt jego transkrypcji jest pakowany w otoczki biakowe. Zwykle linia komrkowa uywana do pakowania ma zintegrowango pro wirusa kodujcego biaka niezbdne do zapakowania RNA, ale niezdolnego do zapakowania wasnego RNA. Czstkami wirusowymi otrzymanymi z komrek pakujcych infekuje si komrki docelowe. Wprowadzony RNA jest w nich przepisywany na DNA i wczany do chromosomu, dajc pocztek transformowanej linii komrkowej

(duy i may antygen T) i trzy biaka pne (VP1, VP2 i VP3), tworzce kapsyd wirusa. W komrkach permisywnych (dla SV40 s nimi komrki nerki mapiej) zachodzi peny cykl yciowy wirusa, obejmujcy transkrypcj i translacj wszystkich genw, replikacj DNA i liz komrki gospodarza. W komrkach niepermisywnych, takich jak komrki gryzoni lub czowieka, cykl ten zatrzymuje si po transkrypcji wczesnych genw i z pewn, do nisk czstoci moe doj do integracji DNA wirusa z genomem gospodarza. W ten sposb powstaje stabilna transformowana linia komrek, majcych wiele cech komrek nowotworowych. W wektorach, bdcych pochodnymi DNA wirusa SV40, wykorzystano 300-nukleotydowy fragment DNA wirusa zawierajcy ori, promotory genw kodujcych antygeny T i sekwencje regulacyjne, odpowiedzialne za aktywacj transkrypcji z tych promotorw przez komrkowe czynniki transkrypcyjne. Uzyskano w ten sposb cytoplazmatyczne plazmidy pozwalajce na otrzymanie tzw. przejciowej ekspresji (ang. transient expression) obcych" genw w wielu rodzajach komrek ssakw. Wrd wektorw eukariotycznych coraz wikszego znaczenia nabieraj wektory wywodzce si z retrowirusw, ktrych wielk zalet jest bardzo wysoka wydajno transfekcji. Z tego wzgldu wektory z tej grupy nadaj si do zastosowania w terapii somatycznej wielu wrodzonych i nabytych schorze (p. rozdz. 14). Genom retrowirusw stanowi jednoniciowa czsteczka RNA, zakoczona tzw. sekwencjami LTR (ang. long terminal repeats), ktra koduje biaka otoczki (gag i env) oraz odwrotn trankryptaz ( pol) , enzym odpowiedzialny za przepisanie" czsteczki RNA na jedno-, a pniej na dwuniciow czsteczk DNA, integrujc z genomem gospodarza. Sekwencje LTR peni funkcje promotorw genw wirusa, s one ponadto niezbdne w integracji DNA wirusa z chromosomem gospodarza. Ze wzgldu na obawy, zwizane ze stosowaniem do klonowania DNA retrowirusw i ich pochodnych (wikszo retrowirusw ma waciwoci onkogeniczne, retro wirusami s take HTLVI, HTLVII i HIV), dowiadczenia z wektorami pochodzenia retrowirusowego prowadzi si w tzw. bezpiecznych ukadach zoonych. Wektor w postaci dwuniciowego DNA skada si z sekwencji LTR oraz tzw. sekwencji psi, warunkujcej pakowanie kwasu nukleinowego do kapsydw. Drugim skadnikiem ukadu jest linia komrek z prowirusem pozbawionym sekwencji psi, kodujcym biaka otoczki wirusa i odwrotn transkryptaz. W takiej komrce transkrypty zrekombinownych z wektorem genw zostan wraz z odwrotn transkryptaz zapakowane w otoczki i bd mogy zakazi" nowe komrki, w ktrych po przepisaniu na DNA zostan wczone do genomu, (rys. 6.8). 6.5. Wprowadzanie DNA do komrek i caych organizmw Zgodnie ze schematem typowego dowiadczenia nad rekombinowaniem i klonowaniem DNA (p. podrozdz. 6.1), fragment DNA poczony z wektorem wprowadza si do komrki, w ktrej ulegnie on powieleniu. Jest to klonowanie

DNA. Wprowadzanie DNA do komrek bakterii odbywa si metod transformacji. Ten sam zabieg w odniesieniu do komrek eukariotycznych okrela si terminem transfekcja", gdy termin transformacja jest tu zarezerwowany dla zjawiska transformacji nowotworowej (p. rozdz. 12). W przypadku bakterii termin transfekcja jest cigle czsto stosowany wtedy, gdy do komrek wprowadzamy DNA bakteriofagw. W warunakach naturalnych transformacji ulegaj tylko nieliczne gatunki bakterii: jest to proces aktywnego pobierania DNA, o charakterze enzymatycznym. Transformowanie E. coli polega na pasywnym przenikaniu DNA przez destabilizowane (najczciej przez inkubacj komrek w niskiej temperaturze w obecnoci CaCl 2 ) bony komrkowe. Komrki, do ktrych moe wnikn obcy DNA okrela si jako kompetentne; wydajno ich transformacji wynosi 108 komrek z 1 [ig transformujcego DNA. Transfekcji komrek zwierzcych dokonuje si rozmaitymi metodami: wprowadzajc DNA w obecnoci fosforanu wapnia lub dekstranu, a take wykorzystujc zjawisko elektroporacji, polegajce na odwracalnej destabilizacji bony komrkowej pod wpywem wysokonapiciowych pl elektrycznych z utworzeniem w niej porw. Jeszcze inna jest metoda bombardowania komrek kulkami ze zota lub wolframu opaszczonych przez DNA i rozpdzonych w polu elektrycznym. Metoda mikroiniekcji DNA suy w szczeglnoci do wprowadzania DNA do zarodkw zwierzt, w celu otrzymania zwierzt transgenicznych (p. rozdz. 14). W przypadku komrek rolinnych dodatkow przeszkod, ktr naley pokona przy wprowadzaniu do nich DNA, jest ciana komrkowa. Std te transfekcje komrek rolinnych, dokonywane za pomoc jednej z wyej wymienionych metod, naley poprzedzi etapem protoplastyzacji, polegajcym na czciowym usuniciu cian komrkowych. Po dokonaniu transfekcji protoplasty regeneruj cian komrkow. Warto przy tym nadmieni, e w odpowiednich warunkach z pojedynczych protoplastw moemy uzyska cae roliny (p. rozdz. 14). Podczenie DNA do wektora nie jest warunkiem koniecznym do transfekcji kompetentnych komrek zwierzcych czy te rolinnych. Komrki pobieraj kady DNA, zarwno w formie kolistej, jak i liniowej, mao- i wielkoczsteczkowy. Warunkiem uzyskania stabilnej modyfikacji biorcy jest wczenie rekombinowanego DNA do chromosomw gospodarza. Losy DNA zale midzy innymi od gatunku, z ktrego pochodz komrki biorcy. Na przykad w komrkach mysich DNA moe ulec klasycznej homologicznej rekombinacji. W komrkach innych gatunkw zazwyczaj dochodzi do rekombinacji midzy niehomologicznymi czsteczkami DNA, a jej mechanizm nie jest jeszcze dobrze poznany. Wiadomo, e po wnikniciu do komrki czsteczki DNA mog poczy si ze sob w wielokopiowe tandemy, tworzc wielkoczsteczkowy transgenom", ktry nastpnie rekombinuje z jednym z chromosomw gospodarza.

6.6. Identyfikacja zrekombinowanych genw Jeeli celem naszych dowiadcze jest wyodrbnienie pojedynczego, konkretnego genu z jakiego organizmu, to po utworzeniu banku genw tego organizmu i transformowaniu nim komrek bakterii lub drody naley zidentyfikowa klon komrek, w ktrym ten gen si znajduje, po czym naley z komrek klonu wyodrbni DNA i poszukiwany gen. Stosunkowo najatwiej zidentyfikowa klon zawierajcy dany gen, jeeli dziki swojej ekspresji powoduje zmiany morfologiczne lub fizjologiczne transformowanych (lub transfekowanych) komrek. Na przykad, gdybymy klonowali gen kodujcy jS-galaktozydaz, to po transformowaniu komrek E. coli bankiem genw, wysielibymy je na podoe zawierajce X-gal, zwizek powodujcy niebieskie zabarwienie kolonii wytwarzajcych ten enzym. Jeeli do transformacji uyjemy komrek nie wytwarzajcych /?-galaktozydazy (lac~), to jedynie klony komrek, do ktrych trafi wektor z poszukiwanym genem, wybarwi si na niebiesko. W niektrych przypadkach moemy tak selekcjonowa komrki transformowane bankiem genw, aby przeyy wycznie te, ktre zawieraj poszukiwany przez nas gen. Na przykad, aby sklonowa gen odpowiedzialny za syntez jednego z enzymw szlaku biosyntezy argininy u drody, naley transformowa szczep drody arg~ i wysiewa komrki po transformacji na poywk bez argininy. Na takim podou wyrosn jedynie kolonie komrek, w ktrych pojawi si i uleg ekspresji gen kodujcy odpowiedni enzym szlaku biosyntezy argininy. Uzyskania ekspresji klonowanego genu moemy oczekiwa zawsze, gdy klonujemy geny w ukadzie homologicznym (tj. geny S. cerevisiae w komrkach S. cerevisiae czy te geny E. coli w komrkach E. coli). Czasami udaje si uzyska ekspresj genw w ukadach heterologicznych, pierwsze geny drody sklonowano po ich ekspresji w komrkach E. coli. W komrkach prokariotycznych nie moemy jednak uzyska ekspresji wikszoci genw organizmw eukariotycznych ze wzgldu na to, e maj introny. Oczywicie moliwa jest ekspresja cDNA, a wic genw syntetyzowanych na matrycy dojrzaego mRNA, bez intronw. W takim przypadku ekspresja genu bdzie zaleaa jedynie od tego, czy w wektorze uytym do klonowania znajduj si odpowiednie prokariotyczne sekwencje regulujce prawidow transkrypcj i translacj klonowanego genu. W przypadkach braku ekspresji genu w komrce biorcy moemy go wykry stosujc technik hybrydyzacji kwasw nukleinowych. Wykorzystano w nich zjawisko powstawania stabilnych struktur dwuniciowych z czsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydw. Stabilne struktury dwuniciowe powstaj ju wtedy, gdy istniej kilkunastonukleotydowe odcinki o komplemetarnym ukadzie par zasad. Kompleks taki charakteryzuje si specyficzn temperatur przejcia", powyej ktrej ulega dysocjacji. W dowiadczeniach, w ktrych przeprowadzamy hybrydyzacj dwch czsteczek o komplementarnych sekwencjach nukleotydowych, jedna z nich

jest wyznakowana i spenia rol tzw. sondy molekularnej. Do znakowania kwasw nukleinowych najczciej wykorzystuje si izotopy, wprowadzajc 32 P lub 35 S w miejsce nieradioaktywnych atomw fosforu. Znakowania DNA mona dokona kinaz polinukleotydow, ktra przenosi grup fosforanow z pozycji y ATP na kocow grup 5'OH nici DNA lub RNA (rys. 6.9).
alkaliczna
, , fosfataza , . nU

kinaza
polinukleotydow
r

_/

5 pCpGpC

3'

5'

CpGpC

3'

[y"p]dATP

5 ' *pCpGpC

3 ' + ADP

Rys. 6.9. Enzymatyczne znakowanie koca 5' DNA

Inna metoda polega na wytworzeniu za pomoc endonukleazy przerw w dwuniciowej czsteczce DNA, a nastpnie wypenieniu ich (ang. nick translation") trifosforanami nukleotydw podstawionymi w pozycji a 32 P lub 35 S (rys. 6.10). Reakcj t prowadzi polimeraza I DNA lub tzw. fragment Klenowa polimerazy I. Jeeli zastosuje si t metod, to mona uzyska czsteczki DNA o aktywnoci specyficznej, wynoszcej 108 cpm/(ig. Sondy 0 jeszcze wyszej aktywnoci specyficznej (109 cpm/^ig) moemy otrzymywa w postaci jednoniciowych fragmentw czsteczek DNA lub RNA syntetyzowanych in vitro z uyciem radioaktywnych nukleotydw. Sondy molekularne mog by rwnie znakowane nieradioaktywnie, na przykad przez doczenie do czsteczki DNA atwo dajcego si oznaczy enzymu, biotyny lub zwizkw fluoryzujcych. Technik hybrydyzacji DNA w celu identyfikacji okrelonego fragmentu DNA zastosowa po raz pierwszy E. Southern w roku 1975. Polegaa ona na rozdzielaniu fragmentw restrykcyjnych DNA w elu agarozowym i po ich denaturacji in situ przeniesieniu na bibu nitrocelulozow (rys. 6.11). Zwizany z bibu DNA hybrydyzuje z wyznakowanym, komplementarnym do niego fragmentem DNA. Po odpukaniu nie zwizanego DNA i wysuszeniu bibuy wykonuje si jej autoradiografi, tzn. przykada si do niej klisz fotograficzn w celu zidentyfikowania pozycji zajmowanej przez radioaktywny fragment. Za pomoc takiej metody i stosujc sond molekularn o wysokiej aktywnoci specyficznej moemy wykrywa nawet bardzo mae iloci (poniej 1 pg) DNA. Sonda nie musi by w peni komplementarna do poszukiwanej sekwencji i mimo to hybrydyzowa z ni, aczkolwiek z mniejsz wydajnoci, a utworzony kompleks jest mniej trway. Specyficzno hybrydyzacji zaley od kilku parametrw: sekwencji i skadu nukleotydw, siy jonowej stosowanych buforw i temperatury. Jeeli operujemy tymi parametrami, to moemy uzyskiwa hybrydyzacj czsteczek, ktrych homologia nie przekracza 50% nukleotydw. Dziki temu udaje si na przykad wykrywa homologiczne geny u odlegych ewolucyjnie gatunkw (p. rozdz. 13). W zalenoci od potrzeb stosuje si rne warianty techniki hybrydyzacji kwasw nukleinowych. Terminem northern" okrelono technik, analogiczn do opisanego wyej wariantu southern", polegajc na hybrydyzacji rozdzielonych w elu czsteczek RNA z sond w postaci fragmentu DNA.

DNaza

DNaza

3,

,p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p\p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p^p;

DNaza

polimeraza I
A

polimeraza I
A

^mnmmmrmmnmmnnm
P

3'

PI P

PI PI P P

p
V

pi p

p' p

pi p

p ' p"1 p

p'

polimeraza I Rys. 6.10. Znakowanie D N A metod translacja w przerwie" (ang. nick translation). DNaza trzustkowa przecina czsteczk DNA pewn, ograniczon liczb razy. Polimeraza I D N A rozpoznaje uszkodzone miejsca, degraduje krtki odcinek nici w kierunku 5' 3' i jednoczenie do koca 3' dodaje komplementarne do drugiej nici nukleotydy. Jeeli w reakcji uyjemy radioaktywnych nukleotydw, to zostan one uyte do wypenienia luk i caa czsteczka DNA stanie si radioaktywna

DNA

roztwr przechodzi przez el i filtr, DNA zatrzymuje si na filtrze rczniki papierowe gbka

elektroforeza

filtr nitrocelulozowy

filtr

DNA zwizany z filtrem filtr umieszcza si w roztworze z radio aktywn sond

usunicie nie zwizanej sondy

sonda zhybrydyzowaa z DNA o komplementarnej sekwencji

Rys. 6.11. Hybrydyzacja metod Southerna

filtr przykada si do kliszy rentgenowskiej

autoradiogram

Technika ta jest bardzo przydatna w analizowaniu mRNA i ocenianiu poziomu ekspresji poszczeglnych genw. W przypadku identyfikacji genw w bankach genowych stosuje si wariant, zwany hybrydyzacj kolonijn. Po transformacji komrek bakteryjnych bankiem plazmidowym wysiewa si je na pytki, a nastpnie replikuje uzyskane

kolonie na filtr bibuowy lub nylonowy. Po wykonaniu kilku prostych zabiegw przytwierdzajcych bakterie do bibuy, powodujcych liz bakterii i denaturacj DNA in situ, filtr z koloniami poddaje si hybrydyzacji, a nastpnie autoradiografii. Analogiczn technik w stosunku do opisanej wyej jest hybrydyzacja ysinkowa, w ktrej na bibu przenosi si bakterie transfekowane bankiem fagowym wraz z ysinkami spowodowanymi przez bakteriofagi (rys. 6.12). Sondy molekularne stosowane w hybrydyzacji uzyskuje si w rozmaity sposb. Jeeli znana jest sekwencja aminokwasowa biaka kodowanego przez poszukiwany przez nas gen, to mona chemicznie zsyntetyzowa oligonukleotyd o sekwencji komplementarnej do odcinka DNA kodujcego fragment biaka. Poniewa kod genetyczny jest zdegenerowany, musimy w praktyce syntetyzowa rodzin" oligonukleotydw, z ktrych tylko pewna cz bdzie idealnie komplementarna do poszukiwanej sekwencji. O ile jest to moliwe, wybiera si fragment czsteczki biaka, skadajcy si z aminokwasw kodowanych przez ma liczb kodonw. Sondami molekularnymi mog by rwnie czsteczki RNA. Stosuje si je w sytuacjach, gdy dana klasa RNA stanowi na tyle du cz RNA komrkowego, e mona j wyodrbni i oczyci. Przykadami takich RNA, ktre posuyy do zidentyfikowania kodujcych je genw mog by preparaty rybosomalnego RNA, czy te np. mRNA jS-globiny izolowany z retikulocytw. Technik hybrydyzacji stosuje si te wtedy, gdy zamierzamy wyodrbni gen z jakiego organizmu i dysponujemy ju homologicznym genem pochodzcym z innego, moliwie blisko spokrewnionego gatunku. Jeeli mamy sklonowane geny myszy, to moemy na og z powodzeniem uy ich jako sond molekularnych do zidentyfikowania analogicznych genw czowieka. W przypadku genw silnie konserwowanych w trakcie ewolucji, mona jako sond uy genw z gatunkw nawet tak odlegych, jak czowiek i drode. 6.7. Charakterystyka sklonowanych genw sekwencjonowanie DNA Sklonowanie danego genu nie jest celem samym w sobie; stanowi punkt wyjcia do badania jego budowy, zasad funkcjonowania, sposobu regulacji ekspresji itd. Bardzo duo informacji o genie niesie jego sekwencja nukleotydowa. Obecnie powszechnie stosowane s dwie' metody sekwencjonowania DNA. Pierwsza, opracowana przez Maxama i Gilberta, polega na degradacji wyznakowanych na kocu 5' czsteczek DNA odczynnikami atakujcymi specyficznie wizania fosfodiestrowe za nukleotydem odpowiadajcym okrelonej zasadzie azotowej. Warunki reakcji s tak ustalone, e w poszczeglnych czsteczkach zostaje przecite tylko jedno lub dwa wizania, przez co otrzymuje si zbir fragmentw DNA o rnej dugoci. Fragmenty uzyskane z czterech prowadzonych rwnolegle reakcji chemicznych rozdzielane s w elach ak-

rozdzielanie nici

"I

wydzielona jedna ni DNA

w czterech niezalenych reakcjach ni DNA jest trawiona losowo w miejscach, w ktrych wystpuj wskazane nukleotydy

powstae po trawieniu fragmenty rozdziela si elektroforetycznie, a nastpnie otrzymuje si autoradiogram elu

A+G

T+C

sekwencja
T

G A C G C T G A T prki widoczne na autoradiogramie odpowiadaj fragmentom DNA,posiadaj znakowany fosfor na kocu 5' i okrelon zasad na kocu 3'

Rys. 6,13. Sekwencjonowanie DNA metod Maxama i Gilberta

rylamidowych i poddawane autoradiografii. Na autoradiogramie widoczne s tylko prki, odpowiadajce fragmentom zaczynajcym si od wyznakowanego koca 5' uoone w postaci drabinki", ktrej kady kolejny szczebel" odpowiada fragmentom rnicym si od otaczajcych go o jeden nukleotyd (rys. 6.13). Drug, czciej obecnie stosowan metod sekwencjonowania DNA, opracowa zesp F. Sangera. Metoda ta nie polega na analizowaniu produktw chemicznej degradacji czsteczek DNA, lecz produktw syntezy in vitro DNA

na jednoniciowej matrycy, poczwszy od przygotowanego oligonukleotydowego startera, komplementarnego do koca 3' matrycy. W skad czterech mieszanin reakcyjnych wchodz cztery rne dideoksytrifosforany nukleotydw, powodujce terminacj syntezy w pozycji, w ktrej zostan wczone do rosncej nici. Dodaje si je w takim steniu, aby byy wczane do syntetyzowanej nici stosunkowo rzadko, tak aby w kadej mieszaninie reakcyjnej powstawa peen zestaw fragmentw DNA o rnej dugoci, koczcych si odpowiednim nukleotydem (rys. 6.14). Zarwno metoda Maxama i Gilberta, jak i metoda Sangera pozwalaj na odczytanie sekwencji 400 700 nukleotydw w jednym dowiadczeniu. Nie trzeba dodawa, e sekwencjonowanie DNA jest moliwe jedynie wtedy, gdy
-ni DNA

i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i l I I I

C A G G T C A T T C T A G G C T A C T , T C C G A T G A radioaktywny starter synteza DNA za pomoc polimerazy I w obecnoci czterech deoksyrybonukleotydw jednego dideoksyrybonukleotydu ddATP ddTTP ddCTP ddGTP

\
y w, l

H
U l I

f
s

1 I I I C C

I TTT C

I I T

I I I I I I

l|

i i i i i i i t >0 ' I ' I I ' ' I I ' ' 'O

synteza koczy si w jednym z miejsc naprzeciwko C

synteza nici koczy sie losowo po wczeniu dideoksyrybonukleotydu

elektroforetyczny rozdzia fragmentw DNA w elu akrylamidowym i autoradiografia

A T C G G T A A T C

odczytana sekwencja

Rys. 6.14. Sekwencjonowanie DNA metod Sangera

dysponujemy wyodrbnionymi fragmentami DNA, a wic po ich uprzednim sklonowaniu i ustaleniu mapy restrykcyjnej. Techniki sekwencjonowania DNA zostay w ostatnich latach na tyle udoskonalone i w czci zautomatyzowane, e stao si moliwe podjcie projektw sekwencjonowania caych genomw. Do ustalenia penej sekwencji wybrano genomy takich organizmw modelowych, jak E. coli (ten projekt w poowie roku 1994 by ju niemal zakoczony), drode S. cerevisiae, nicie Cenorhabditis elegans, rolina Arabidopsis thaliana, mysz oraz czowiek. Ten ostatni projekt jest najbardziej ambitny (i kosztowny) ze wzgldu na wielko ludzkiego genomu, bdzie on jednak ukoczony zapewne jeszcze w tym wieku. 6.8. Wykrywanie sekwencji DNA wicych biaka Poznanie sekwencji nukleotydowej odcinka DNA pozwala na stwierdzenie czy mieci si w nim tzw. otwarta ramka odczytu, czyli sekwencja potencjalnie kodujca jakie biako. Moemy te ustali, czy w badanym fragmencie DNA
DNA + biako DNA

trawienie DNaz

.1111111111
rozdzia fragmentw DNA w elu akrylamidowym i autoradiografia Rys. 6.15. Zasada techniki odcisk stopy". Wyznakowane na kocach 5' fragmenty D N A trawi si DNaz w takich warunkach, aby przecinaa ona w pojedynczym fragmencie tylko nieliczne wizania fosfodiestrowe. Poszczeglne fragmenty s przecinane losowo w rozmaitych miejscach. Produkty trawienia DNaz s rozdzielane w elu akrylamidowym, ktry poddawany jest autoradiografli. Na autoradiogramie widoczne bd jedynie fragmenty wyznakowane, a wic te, ktre maj oryginalny" koniec 5'. Jeeli przez biako poddany trawieniu fragment D N A mia np. 1000 nukleotydw, to na autoradiogramie powinno by widocznych 1000 prkw, odpowiadajcych fragmentom o dugoci 1000,999,998... itd. nukleo- f tydw. Jeeli trawienie przeprowadzano w obecnoci biaka wicego si z okrelon sekwencj DNA, to wizania fosfodiestrowe w obrbie tej sekwencji bd chronione przed dziaaniem DNazy, a zatem niektre produkty trawienia nie pojawi si. Po lewej stronie schemat dowiadczenia. Po prawej stronie autoradiogram elu. cieki 1 i 2 przedstawiaj produkty reakcji sekwencjonowania DNA, odpowiednio dla nukleotydw A i G (cieka 1) oraz C i T (cieka 2). W obu ciekach cznie znajduj si wic wszystkie moliwe produkty trawienia wyjciowego fragmentu. cieka 3 przedstawia wynik trawienia tego samego fragmentu DNA, w obecnoci biaka wicego si ze znajdujc si w tym

fragmencie sekwencj nukleotydow

znajduj si pewne charakterystyczne sekwencje, np. sekwencje stykowe intron-egzon, sekwencje wice znane biaka regulacyjne, sekwencje terminacyjne itp. W ostatnich latach szczeglnie istotne stao si identyfikowanie sekwencji odpowiedzialnych za regulacj ekspresji genw. Wiadomo (p. rozdz. 7 i 8), e aktywacja bd hamowanie transkrypcji odbywa si za porednictwem biaek wicych si z DNA i oddziaywajcych z polimeraz RNA lub innymi biakami kompleksu transkrypcyjnego. Opracowano wiele metod pozwalajcych na wykrywanie sekwencji wicych biaka. Po to, aby przekona si czy w danym fragmencie DNA znajduje si taka sekwencja, wykonuje si tzw. test spowolnienia migracji w elu (ang. gel shift lub gel retardation assay), polegajacy na poddawaniu elektroforezie fragmentw DNA w obecnoci i przy braku biaka. Jeeli dany fragment DNA wdruje wolniej w obecnoci biaka, to mona zaoy, ze jest to spowodowane zwizaniem si biaka z tym wanie fragmentem DNA. Inna metoda, zwana technik odcisku stopy (ang. footprint), pozwala na ustalenie nie tylko faktu wizania biaka z danym fragmentem DNA, lecz rwnie okrelenie sekwencji, z ktr to biako si czy. Metoda polega na sekwencjonowaniu DNA w obecnoci biaka wicego si z nim. Biako chroni przed degradacj DNA dokadnie w obszarze sekwencji wicych, co atwo zaobserwowa na autoradiogramie elu sekwencyjnego (rys. 6.15). 6.9. Powielanie genw bez ich klonowania: technika PCR W poowie lat 80. opracowano technik, ktra pozwala na powielenie dowolnej sekwencji DNA o dugoci od kilkuset do kilku tysicy nukleotydw. Technika ta jest okrelana skrtem PCR (ang. polymerase chain reaction) reakcja acuchowa polimerazy i polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z wykorzystaniem starterw flankujcych okrelony odcinek DNA (rys. 6.16). Warunkiem dokonania takiej syntezy jest znajomo sekwencji otaczajcej powielany fragment, tak aby mona byo syntetyzowa komplementarne startery o dugoci ok. 20 nukleotydw. Kady cykl reakcji skada si z trzech etapw: termicznej denaturacji powielanego DNA (temperatura ok. 90 C), asocjacji starterw z matryc w temperaturze obnionej do 40 60C i polimeryzacji DNA w temperaturze 72C. Wszystkie cykle reakcji zachodz w jednej probwce eppendorfa, do ktrej oprcz matrycy i trifosforanw nukleotydw, dodajemy nadmiar starterw (po to, aby zapobiec renaturacji matrycowego DNA) oraz termostabiln polimeraz DNA wydzielon z termofilnych bakterii. W pierwszym cyklu reakcji syntetyzowane s odcinki DNA, o rnej dugoci. Stopniowo w mieszaninie zaczynaj przewaa fragmenty powielanego DNA, ograniczone starterami i w praktyce kocowy produkt reakcji jest niemal jednorodny. Liczba syntetyzowanych frag-

denaturacja DNA (1min, 90C)

dodanie nadmiaru starterw i renaturac (2 min w obnionej temperaturze) 5'-

5' synteza nowych nici DNA (1,5 min, 72C) 5'3'" 5'3'3' 5'

i' kolejny cykl

Rys. 6.16. Schemat reakcji PCR. W trakcie wielokrotnie powtarzanych cykli reakcji obecna jest stale termostabilna polimeraza D N A oraz startery w tak duym nadmiarze molowym, e przy reasocjacji pojedynczych nici one, a nie syntetyzowane acuchy, bd czyy si z komplementarnymi sekwencjami

mentw narasta wykadniczo jak 2n, gdzie n oznacza liczb cykli. Po 30 40 cyklach uzyskuje si powielenie fragmentu DNA kilka milionw razy. Metoda PCR znalaza ogromnie duo zastosowa, w tym tak spektakularne, jak namnaanie fragmentw DNA z mumii egipskich czy te ze szcztkw wymarych organizmw zachowanych w lodowcach, czy te zatopionych w bursztynie. Jest te powszechnie stosowana w diagnostyce chorb dziedzicznych, w sdownictwie przy ustalaniu ojcostwa, w kryminalistyce do ustalania pochodzenia ladw krwi, wosw itp. We wszystkich tych przypadkach posugujemy si technik PCR do powielenia okrelonego fragmentu DNA w sytuacjach, gdy dysponujemy znikomymi ilociami DNA matrycowego. Po powieleniu DNA jest poddawany analizie restrykcyjnej, hybrydyzacyjnej i jest sekwencjonowany.

6.10. Ukierunkowana mutageneza Aby pozna funkcj spenian przez dany gen w komrce lub caym organizmie, a take funkcje poszczeglnych sekwencji nukleotydowych w regulacji dziaania samych genw, opracowano techniki umoliwiajce wprowadza-

nie precyzyjnych zmian w okrelonych pozycjach nici DNA. Technik tych, okrelanych wspln nazw ukierunkowana mutageneza", jest znanych bardzo wiele, ograniczymy si tylko do podania kilku charakterystycznych przykadw. W pracach nad rekombinowaniem i klonowaniem DNA wyodrbnia si czasem geny, ktrych funkcja nie jest znana. Ich rol mona pozna, badajc efekt zastpienia w organizmie genu dzikiego przez gen zmutowany. Procedur mutowania konkretnych genw stosuje si z powodzeniem w mikroorganizmach, a ostatnio rwnie i w organizmach wyszych. Polega ona na transformowaniu komrek przez DNA badanego genu, po wprowadzeniu do niego fragmentu obcej sekwencji. Jeeli gen ten zostanie wczony do chromosomu gospodarza w wyniku klasycznej rekombinacji (konieczne jest zajcie podwjnego crossing-over), to dziki gen zostanie zastpiony przez gen zmutowany (rys. 6.17). Procedur t okrela si nazw rozbicie genu" (ang. gene disruption). Czsto jako obcy DNA wstawiany w rodek sekwencji genu stosuje si inny gen, bdcy jednoczenie markerem selekcyjnym, pozwalajcym na wyrnienie komrek, ktre pobray DNA. W przypadku organizmw wielokomrplazmid ze sklonowanym genem X

usunicie fragmentu genu X wstawienie genu markerowego

transformacja komrek

~
rekombinacja (podwjny crossing-over) ze znajdujcym si na chromosomie genem X

rozbicie genu X z jednoczesnym wprowadzeniem w jego locus genu markerowego Rys. 6.17. Schemat procedury wyczania aktywnoci okrelonego genu. Dowiadczenia tego typu okrela si terminem rozbicie genu lub knock-out genowy

kowych dokonuje si tego typu operacji na komrkach linii pciowych lub wczesnych zarodkw, po to, aby otrzyma cay, zmutowany organizm. W ten sposb skonstruowano midzy innymi szczepy transgenicznych myszy, u ktrych zmutowano odpowiedniki tych genw, ktrych mutacje u czowieka s powodem chorb dziedzicznych. Dziki temu otrzymano znakomite modele do testowania nowych metod leczenia tych schorze (p. rozdz. 14). Sekwencje nukleotydowe odpowiedzialne za regulacj ekspresji s pooone z reguy powyej miejsca startu transkrypcji, czsto w znacznej od niego odlegoci. Po to, aby ustali ich rodzaj i dokadne miejsce pooenia konieczne jest przeprowadzenie ich szczegowej analizy funkcjonalnej. Polega ona na wytwarzaniu delecji odcinkw DNA, poprzedzajcych miejsce startu transkrypcji i na wprowadzaniu punktowych zmian w sekwencjach, ktre podejrzewamy o spenianie istotnej roli w regulacji dziaania genu. Wszelkie te manipulacje wykonuje si oczywicie na sklonowanym wraz z otaczajcymi sekwencjami genie, a ich efekt sprawdza si po wprowadzeniu przeksztaconych genw do komrki.
delecja

Delecje uzyskuje si dziaajc na DNA endo- lub egzonukleazami. Niewielkie delecje mona uzyska, stosujc enzymy restrykcyjne wytwarzajce lepkie koce i egzonukleaz atakujc pojedyncze nici DA. Wystarczy przeci DNA, strawi egzonukleaz i zligowa nowo powstae, tpe koce (rys. 6.18). W podobny sposb moemy wprowadza do DNA krtkie addycje, wypeniajc lepkie koce za pomoc polimerazy DNA i ligujc takie fragmenty. Do wytwarzania duszych delecji su egzonukleazy, takie jak BAL 31 (5', 3' egzonukleaza) lub egzonukleaza III z E. coli (3' egzonukleaza) w poczeniu z nukleaz SI (endonukleaza jednoniciowego DNA). Znajdujcy si na plazmidzie gen przecinamy enzymem restrykcyjnym w pozycji, od ktrej

plazmid ze sklonowanym genem trawimy dwoma enzymami restrykcyjnymi, z ktrych jeden (np, Sph I) pozostawia lepkie koce wraliwe na egzonukleaz III, a drugi (np. Barn HI) koce niewraliwe

^mm dziaajc egzonukleaz III duej lub krcej usuwamy mniejsze lub wiksze odcinki jednej nici od koca 3' zmm

dziaajc nukleaz Si usuwamy pojedyncze nici

ligujemy tpe koce i utrzymujemy plazmidy zawierajce geny z delecjami

Rys. 6.19. Wytwarzanie serii delecji genowych. Procedura czsto stosowana do analizy sekwencji regulacyjnych i promotorw

zamierzamy generowa seri delecji i trawimy egzonukleaz, przerywajc reakcj po rnym czasie. Nastpnie inn nukleaz usuwamy pozostajc pojedyncz ni, a nadtrawiony gen ligujemy tak, jak pokazano na rysunku 6.19. Egzonukleaza III nie trawi 3'-kocw nici cofnitych" w stosunku do kocw 5'. Mona wic tak dobra enzymy restrykcyjne, aby w pobliu miejsca, od ktrego generujemy delecje znajdoway si dwa miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne: jedno (bliej), ktrego przecicie pozostawi tpy koniec, a drugie (nieco dalej), ktrego przecicie pozostawi koniec niewraliwy na dziaanie egzonukleazy. Po przeciciu DNA oboma enzymami powstanie czsteczka liniowa, w ktrej bdziemy mogli wytwarza delecje tylko od jednej strony i po zakoczeniu reakcji odtworzy kolist czsteczk wektora przez dodanie ligazy DNA. Jeeli dysponujemy seriami delecji obejmujcych rne obszary promotora, to moemy okreli, gdzie zlokalizowane s sekwencje odpowiedzialne za regulacj dziaania genu.

Opracowano wiele technik, sucych do usuwania lub zamieniania pojedynczych oligonukleotydw (sterowana mutageneza punktowa). Jedna z najczciej stosowanych technik polega na syntetyzowaniu oligonukleotydu, rnicego si np. jednym nukleotydem od sekwencji typu dzikiego, hybrydyzacji tego oligonukleotydu ze sklonowanym na jednoniciowym wektorze M13 dzikim genem i enzymatycznym dosyntetyzowaniu in vitro drugiej nici, przy czym oligonukleotyd spenia rol startra. Po zakoczeniu syntezy powstanie czsteczka, ktra w czasie replikacji (in vivo) da potomne dwuniciowe czsteczki typu dzikiego i mutanta w proporcji 1:1 (rys. 6.20). Opisana metoda pozwala na dodanie, ujcie lub zamian dowolnego nukleotydu w kadej czsteczce DNA o znanej sekwencji. Moemy dziki niej

gen sklonowany na plazmidzie

uzyskujemy DNA w formie jednoniciowej

hybrydyzujemy z oligonukleotydem, ktrego sekwencja rni si w jednej pozycji od odpowiadajcej jej sekwencji genu

dosyntetyzowujemy drug ni, oligonukleotyd suy jako starter

transformujemy E.coli i izolujemy namnoone plazmidy: poowa czsteczek bdzie mutantami, a poowa dzikimi mutant dziki

Rys. 6.20. Wprowadzenie okrelonej zmiany sekwencji nukleotydowej (mutacji punktowej) w sklonowanym genie z uyciem syntetycznego oligonukleotydu jako mutatora i startera polimeryzacji

wprowadza zmiany w sekwencji kodujcej genu, w wyniku czego wytwarzane przez ten gen biako bdzie miao zamienione zgodnie z nasz wol wybrane aminokwasy^Technika ta znalaza wiele zastosowa w biotechnologii.

6.11. Wdrwki i skoki po chromosomach Wikszo wektorw stosowanych do klonowania DNA ma stosunkowo ma pojemno"; mona w nich powiela fragmenty DNA o dugoci nie przekraczajcej kilku lub kilkunastu tysicy par nukleotydw. Wyjtek stanowi wspomniane kosmidy i wektory YAC, w ktrych moemy klonowa fragmenty DNA o dugoci kilkudziesiciu do kilku milionw tysicy par nukleotydw. Trzeba mie jednak na uwadze to, e dugo niektrych genw eukariotycznych (wraz z intronami) osiga nawet kilkaset tysicy par nukleotydw, a mog si take zdarzy dowiadczenia, w ktrych klonuje si obszar genomu o dugoci milionw par zasad. W takich przypadkach stosuje si techniki wdrwki po chromosomie (ang. chromosome walking) lub skokw po chromosomie (ang. chromosome jumping), ktre umoliwiaj klonowanie fragmentw DNA, znajdujcych si obok siebie lub w pewnym oddaleniu na tym samym chromosomie. Punktem wyjcia dla zastosowania obu technik jest posiadanie sondy molekularnej, przynajmniej do fragmentu poszukiwanego genu lub do genu pooonego w bezporednim ssiedztwie.
chromosomowy DNA

j/

genomowy DNA pierwszy sklonowany na fagu A fragment DNA

DNA

koniec pierwszego fragmentu suy jako sonda do identyfikacji drugiego klonu H H drugi sklonowany fragment DNA koniec drugiego fragmentu suy jako sonda do identyfikacji trzeciego klonu trzeci fragment itd. Rys. 6.21. Wdrwka po chromosomie

Technika wdrwki po chromosomie (rys. 6.21) polega na wyszukaniu w banku genw klonu nioscego fragment DNA, ktry hybrydyzuje z sond, a nastpnie uyciu skrajnego odcinka tego fragmentu jako sondy do ziden-

wysokoczsteczkowy DNA trawimy czciowo enzymem restrykcyjnym na fragmenty -150 tys. par zasad

z plazmidu wycinamy odcinek DNA zawierajcy sklonowany uprzednio gen supresorowy dla mutacji nonsens

ligacja przy bardzo niskich steniach DNA

czsteczki trawimy enzymem restrykcyjnym, ktry nie przecina sekwencji genu supresrowego

fragmenty DNA klonujemy na wektorze fagowym i transfekujemy komrki E.coli szczepu su"; ysin ki otrzymamy tylko w przypadku fagw, ktre przenosz gen supresorowy fragment hybrydyzujcy z sond fragment odlegy za pomoc sondy wykrywamy fagi, ktre zawieraj fragmenty DNA hybrydyzujce z sonda oraz fragmenty pooone daleko na chromosomie

Rys. 6.22. Skoki po chromosomie

tyfikowania kolejnego, przylegego do odcinka chromosomu. Zabieg ten powtarza si do momentu uzyskania fragmentw DNA, obejmujcych cay interesujcy nas obszar chromosomu. Technika skokw po chromosomie jest nieco bardziej skomplikowana. Polega na wytworzeniu w pierwszym etapie kolistych czsteczek DNA, zoonych z sekwencji genu selekcyjnego (np. supresora mutacji typu nonsens) i duych (ok. 150 tysicy par nukleotydw) fragmentw chromosomalnego DNA. Po strawieniu tych czsteczek enzymem restrykcyjnym, nie naruszajcym genu selekcyjnego, z obu stron genu selekcyjnego pozostan dusze lub krtsze fragmenty chromosomu, zalenie od odlegoci midzy kocem genu selekcyjnego a pierwszym miejscem rozpoznawanym w danym fragmencie przez uyt restryktaz. Zwykle bd one miay kilka tysicy par nukleotydw dugoci, a odcinek, ktry w chromosomie lea midzy nimi (ponad 100 tysicy par nukleotydw), zostanie wyeliminowany z dalszej procedury. Uzyskane fragmenty klonuje si w wektorze fagowym z mutacj nonsens i transfekuje komrki bakterii, wykrywajc metod hybrydyzacji ysinkowej klon zawierajcy fragment DNA hybrydyzujcy do sondy molekularnej oraz fragment DNA pochodzcy z tego samego chromosomu, odlegy o ponad 100 tysicy par nukleotydw od odcinka hybrydyzujcego z sond (rys. 6.22). Opisan metod posuono si midzy innymi do sklonowania genu czowieka, ktrego mutacje s przyczyn mukowiscydozy (p. rozdz. 14).

6.12. Komputerowa analiza genw W pracach nad rekombinowaniem i klonowaniem DNA komputer sta si niezbdny, przynajmniej w dwch etapach: planowania eksperymentw i analizy sekwencji genw oraz kodowanych przez nie biaek. Przed przystpieniem do waciwego dowiadczenia czsto wykonuje si tzw. klonowanie komputerowe. Sekwencje wektorw i innych fragmentw DNA, ktre zamierzamy poczy ze sob, wpisuje si w pami komputera i analizuje za pomoc odpowiednich programw, dziki ktrym mona dobra waciwe enzymy restrykcyjne, czsteczki adaptorowe itd. Jeeli planujemy syntez oligonukleotydw, ktre bd suy np. jako startery do syntezy fragmentu DNA technik PCR lub z ktrych skadany bdzie gen, to musimy wykona analiz, ktra pozwala nam na okrelenie waciwej temperatury reasocjacji acuchw DNA i wykae czy projektowane oligonukleotydy nie bd np. hybrydyzoway same ze sob lub asocjoway w niewaciwej kolejnoci. Po sklonowaniu fragmentu DNA uywa si programw komputerowych, ktre wyszukuj w tej sekwencji otwarte ramki odczytu, charakterystyczne sekwencje nukleotydowe, sporzdzaj mapy restrykcyjne i porwnuj uzyskane sekwencje z przechowywanymi w bankach informacji sekwencjami uprzednio poznanych genw i biaek. Jeeli dysponujemy komputerem podczonym do

sieci INTERNET, to moemy z dowolnego miejsca na ziemi przesa badan przez siebie sekwencj DNA do banku danych i uzyska odpowied na pytanie, czy identyczna lub podobna sekwencja nukleotydowa (lub aminokwasowa) bya ju kiedykolwiek opisana i czyjej pochodzenie oraz funkcja jest znana. Ta rutynowa procedura przynosi czasem sensacyjne odkrycia, na przykad pierwszy przypadek przypisania onkogenowi okrelonej funkcji fizjologicznej: okazao si, e onkogen v-sis ma sekwencj homologiczn do genu kodujcego czynnik wzrostowy pytek krwi, PDGF. Analiza komputerowa umoliwia badania ewolucji genw i molekularnych pokrewiestw midzy organizmami. Zagadnienia te s omwione szczegowo w rozdziale 13. Analiza komputerowa oddaje rwnie nieocenione usugi w pracach nad przestrzenn struktur DNA, biaek, kompleksw DNAbiako, jak te i innych zwizkw chemicznych o podobnej zoonoci.

7. STRUKTURA I DZIAANIE GENW PROKARIOTYCZNYCH

Do czasu, gdy techniki inynierii genetycznej umoliwiy wniknicie w struktur genw eukariotycznych, wikszo informacji o budowie i dziaaniu genw pochodzia z prac nad organizmami prokariotycznymi. Wyniki tych prac, a zwaszcza bada nad genami bakterii E. coli i faga X, doprowadziy ju na pocztku lat 60. do sformuowania podstawowych zasad regulacji dziaania genw, ktre do dzi, aczkolwiek powanie rozszerzone i uzupenione, s w peni akceptowane. U Prokaryota mamy do czynienia niemal wycznie z genami cigymi, tj. nie zawierajcymi intronw, charakterystycznych dla wikszoci genw Eukaryota (p. rozdz. 8). Prosta budowa genw nie oznacza jednak, by mechanizmy dziaania genw i regulacja ich funkcji byy proste i zuniformizowane. Przeciwnie, u Prokaryota spotykamy si z bardzo wieloma sposobami regulacji dziaania genw, czsto wyjtkowo zoonych i wyrafinowanych. Wystarczy zapozna si z systemami regulacji genetycznej, niezbdnymi do wczania w odpowiednim czasie i na waciwym poziomie kilkudziesiciu genw faga X, aby zda sobie spraw i jednoczenie mie przedsmak tego, z czym spotkamy si badajc mechanizmy regulacji dziaania genw w procesie rozwoju i rnicowania wyszych organizmw (p. rozdz. 9). W tym rozdziale omwimy oglne zasady transkrypcji genw prokariotyznych oraz najbardziej charakterystyczne przykady rnych mechanizmw regulacji tego procesu.

7.1. Transkrypcja Transkrypcja jest pierwszym etapem ekspresji genw. Proces ten katalizowany jest przez polimeraz RNA, ktra wie si z dwuniciowym DNA na pocztku genu i przesuwajc si wzdu niego syntetyzuje RNA komplementarny do jednej z dwu nici DNA. Specyficzne biaka regulacyjne

determinuj, czy okrelony gen moe, czy nie moe ulec transkrypcji. Transkrypcj przyjto dzieli na trzy etapy: inicjacj, elongacj i terminacj. Inicjacja rozpoczyna si od zwizania polimerazy RNA z okrelon sekwencj nukleotydow DNA, zwan promotorem. Aby mogo doj do zapocztkowania syntezy RNA na matrycy jednej z dwu nici DNA, nici te musz ulec przejciowemu rozdzieleniu; dochodzi do miejscowego rozlunienia heliksu (topnienia) DNA. Waciwa inicjacja moe by poprzedzona inicjacjami poronnymi, w ktrych enzym, nie przesuwajc si wzdu DNA, syntetyzuje krtkie transkrypty skadajce si z kilku nukleotydw. Miejsce, od ktrego rozpoczyna si synteza RNA nazywa si miejscem startu, a odpowiedni par nukleotydow oznacza si liczb +1. Elongacja jest etapem, w ktrym polimeraza RNA, przesuwajc si wzdu DNA i wywoujc miejscowe jego topnienie, przedua koniec 3' acucha RNA. Substratem s rybonukleozydotrifosforany: ATP, GTP, UTP i CTP. Reszty monofosforanw (nukleotydy) ulegaj wczeniu do acucha RNA z wytworzeniem wiza 3' 5'-fosfodiestrowych. Uwolniony pirofosforan ulega hydrolizie do fosforanu. Cay proces jest egzoergiczny. W trakcie elongacji powstaje przejciowo struktura hybrydowa DNA-RNA. Ta sama czsteczka enzymu syntetyzuje acuch RNA od pocztku (inicjacja) do koca (terminacja). Taki typ reakcji nazywamy procesywnym. Terminacja zachodzi w cile okrelonym miejscu DNA, zwanym terminatorem, gdzie kompleks polimeraza RNA-DNA-RNA ulega dysocjacji.

7.2. Polimeraza RNA Polimeraza RNA skada si z czci rdzeniowej, kontrolujcej tworzenie waciwych par midzy nukleotydami matrycowej nici DNA a substratowymi rybonukleozydotrifosforanami i wytwarzajcej wizania fosfodiestrowe. Rdze (ang. core) wystarcza do elongacji; w inicjacji i terminacji niezbdne jest wspdziaanie biaek pomocniczych. Niektre z nich s niezbdne zawsze, niektre za jedynie przy transkrypcji okrelonych genw. , Najlepiej poznana polimeraza RNA E. coli zawiera rdze skadajcy si z trzech rodzajw podjednostek: a (40 kDa), /J (155 kDa) i /?'(160 kDa), kodowanych odpowiednio przez geny: rpoA, rpoB i rpoC i wystpujcych w stosunku 2:1:1. Przewaajca forma komrkowej polimerazy RNA zwizana jest z podjednostk a o masie 70 kDa, kodowan przez gen rpoD. Podjednostk ta, zwana GT70, nadaje enzymowi zdolno rozpoznawania wikszoci promotorw E. coli, a wic kompletny enzym, cc2ffl,o10 (holoenzym E-(j70), zdolny do swoistej inicjacji transkrypcji, jest du czsteczk o masie zblionej do 500 kDa. W komrce E. coli wystpuje ok. 7000 czsteczek polimerazy RNA, z czego 2000 5000 czsteczek, zalenie od aktualnych warunkw fizjologicznych, jest zaangaowanych w procesie transkrypcji. Tak wysokie stenie

enzymu wynika z jego podstawowej roli w ekspresji wszystkich, bez wyjtku, genw komrki. Polimeraza RNA przesuwa si wzdu DNA z nierwnomiern szybkoci; szybko rednia odpowiada wczaniu ok. 40 nukleotydw na sekund w temperaturze 37C. Proces ten jest wic znacznie wolniejszy od przesuwania si polimerazy DNA, czy wideek replikacyjnych. Efektywno transkrypcji genu w znacznej mierze zaley od czstoci inicjacji transkrypcji z promotora tego genu. W optymalnych warunkach inicjacja moe zachodzi co sekund. Polimeraza RNA moe wytwarza sabe wizania z dowoln sekwencj DNA; znajduje ona swoisty dla niej promotor przez kombinacj lizgania si wzdu DNA i przemieszczania si z innych miejsc DNA, dziki zdolnoci DNA do wytwarzania ptli a nie przez swobodn dyfuzj. Polimeraza RNA ma struktur wyduon. Pokrywa 77 80 par zasad DNA podczas inicjacji. Nieco zmienia swoj konformacj na pocztku elongacji (pokrywa ok. 60 par zasad) i znacznie bardziej w trakcie tego procesu, kiedy pokrywa tylko ok. 30 par zasad. Fragment DNA, ktry ulega miejscowemu topnieniu jest nie duszy ni 17 par zasad. Powstajcy w jego obrbie fragment, ktry tworzy struktur hybrydow z RNA jest nie duszy ni 12 par zasad (rys. 7.1). Jak si wydaje, kada z podjednostek polimerazy RNA spenia okrelone funkcje. Jak ju wspomniano, podjednostka cr nadaje enzymowi zdolno rozpoznawania okrelonych promotorw. Izolowana podjednostka nie wykazuje duego powinowactwa do DNA, natomiast po zwizaniu z rdzeniem polimerazy RNA podjednostka cr zmienia waciwoci enzymu; traci on zdolno sabego wizania si z dowolnym miejscem DNA i wytwarza trway kompleks z promotorem. Wkrtce po inicjacji, po syntezie 8 9-nukleotydowego transkryptu, podjednostka cr oddysocjowuje od rdzenia enzymu. Sdzc z lokalizacji mutacji, nadajcych bakteriom odporno na antybiotyk, podjednostka /? jest miejscem oddziaywania dwu antybiotykw. Jednym jest ryfampicyna, ktra uniemoliwia inicjacj, dziaajc przed wytworzeniem si pierwszego wizania fosfodiestrowego. Drugim jest streptolidygina, hamujca elongacj. Podjednostka fi wie niektre analogi rybonukleozydotrifosforanw. Wszystko to sugeruje, e podjednostka ta jest zaangaowana w wizanie substratw reakcji. Heparyna jest polianionem, ktry wie si z podjednostk /?' i hamuje transkrypcj in vitro. Heparyna wspzawodniczy z DNA w wizaniu si z polimeraz RNA, std sugestia, e podjednostka /?' jest odpowiedzialna za wizanie si enzymu z DNA. Podjednostka a jest odpowiedzialna za monta rdzenia enzymu. Odgrywa ona rwnie istotn rol w oddziaywaniach polimerazy RNA z biakami aktywujcymi transkrypcj operonu fermentacji arabinozy, melibiozy, syntezy cysteiny oraz z biakiem CII faga A, ktre aktywuje transkrypcj zachodzc z promotorw pRE i pv Wydaje si, e zoona struktura bakteryjnej polimerazy RNA umoliwia jej wspdziaanie z rnymi maoczsteczkowymi efektorami bd biakami

Rys. 7.1. Zmiany polimerazy RNA przy przejciu od inicjacji transkrypcji do etapu elongacyjnego. (a) Holoenzym E-<r70 pocztkowo kontaktuje si z rejonem od 55 do +20; powstaj transkrypty poronne, (b) Syntezie 10-nukleotydowego transkryptu towarzyszy dysocjacja podjednostki a 10 ; enzym traci kontakt z rejonem od 35 do 55. (c) Po wcieleniu 15 20 nukleotydw do RNA enzym zmienia swoj konformacj jeszcze bardziej, pokrywajc jedynie 3040 par zasad

regulacyjnymi, co zapewnia funkcjonowanie tego enzymu w rnych warunkach fizjologicznych. Polimeraza RNA, kodowana przez faga T3 lub 77, zbudowana jest z jednego acucha polipeptydowego. Enzym ten syntetyzuje RNA z szybkoci ok. 200 nukleotydw na sekund w temperaturze 37C, lecz rozpoznaje jedynie promotory fagowe, Cakowicie odmienne w swojej sekwencji nukleotydowej od promotorw gospodarza. Ta fagowa polimeraza RNA jest zaprogramowana do wykonania jednego tylko zadania, ktrym jest reprodukcja faga. Ukad ten wykorzystano w inynierii genetycznej, konstruujc bakterie zawierajce gen polimerazy RNA faga 77 pod kontrol promotora o regulowanej aktywnoci i wprowadzajc do komrek plazmid z klonowanym genem pod kontrol promotora 77. Po indukcji polimerazy RNA faga 77 uzyskuje si

z du wydajnoci biako kodowane przez gen klonowany. Polimeraza RNA faga 77 jest niewraliwa na ryfampicyn. Dodanie tego antybiotyku hamuje dziaanie polimerazy E. coli. Dziki temu uzyskuje si wycznie ekspresj genu klonowanego.

7.3. Promotory Promotory polimerazy E-cr70 wykazuj podobiestwo sekwencji nukleotydowej, lecz nie na caej dugoci. Istotne s dwa heksamery; rodek pierwszego z nich znajduje si zazwyczaj w pobliu pozycji -10 i std jego nazwa, oprcz synonimowych nazw sekwencja Pribnowa" od nazwiska odkrywcy lub sekwencja TATAAT". rodek drugiego z nich znajduje si w pobliu pozycji -35. Oprcz tych dwu sekwencji, istotn cz skadow sygnau rozpoznawanego przez polimeraz RNA stanowi dugo oddzielajcego je fragmentu DNA (16 19 par zasad) (rys. 7.2).
-35 16-19 par zasad -10 5-9 par +1 zasad

82 T 8A S 78 A 6 5 C 5 4 Q 4 5

80A95^5

60Q50T96

Rys. 7.2. Typowy promotor polimerazy RNA z podjednostk cr70 (E-cr70) skada si z dwu sekwencji heksamerowych, 10 i 35 i dwu fragmentw D N A o dowolnej sekwencji nukleotydowej. Jeden z nich (1619 par zasad, ang. spacer) oddziela te fragmenty od siebie, a drugi (5 9 par zasad, ang. discriminator) oddziela heksamer 10 od miejsca startu + 1 . Przedstawiona jest sekwencja najwyszej zgodnoci (ang. consensus) obu heksamerw. Poszczeglne nukleotydy wystpuj w nich z czstoci 4596%; due litery stosuje si do oznaczania nukleotydw wystpujcych z czstoci wysz ni 54%

Heksamery niektrych promotorw nie wykazuj podobiestwa do sekwencji kanonicznej; z reguy promotory te wymagaj do rozpoznania przez polimeraz E-a 10 wspdziaania biaek pomocniczych. Analiza efektw mutacji promotorowych sugeruje, e heksamer 35 jest pierwszym sygnaem rozpoznawanym przez polimeraz RNA; enzym ten najpierw wie si z t sekwencj, a dopiero pniej z sekwencj 10. Natomiast funkcj heksameru 10 jest umoliwienie przejcia promotor-polimeraza RNA ze stanu zamknitego w stan otwarty, w ktrym komplementarne nici DNA s od siebie rozdzielone na dugoci kilkunastu nukleotydw. Warto zwrci uwag, e heksamer 10 zbudowany jest zazwyczaj wycznie z par AT, ktre wymagaj dostarczenia mniejszej iloci energii do ich rozdzielenia, ni pary GC. Rozwinity rejon DNA kompleksu otwartego mona zidentyfikowa badajc dostpno zasad dla odczynnikw chemicznych. Dowiadczenia, polegajce na metylacji reszt adeniny i cytozyny, wykazay, e rejon otwarty znajduje si midzy 9 i +3, a wic sekwencja w bezporednim ssiedztwie miejsca startu ma wpyw na inicjacj. Z kolei rejon ulegajcy najwczeniejszej

transkrypcji (od -hi do +30) wpywa na szybko opuszczania promotora przez polimeraz RNA, umoliwiajc inicjacj transkrypcji przez nastpn czsteczk polimerazy RNA. Powinowactwo polimerazy do promotora, atwo przechodzenia w stan kompleksu otwartego i szybko opuszczania promotora przez enzym stanowi o sile" promotora. Tylko silne promotory, zapewniajce du efektywno ekspresji, wykorzystywane s w inynierii genetycznej. Znaczenie rozdzielania komplementarnych nici DNA w inicjacji transkrypcji uwidacznia si w badaniu wpywu superhelikalnoci DNA na ten proces. Negatywnie superhelikalny DNA wymaga mniej energii do miejscowego stopienia DNA w kompleksie inicjacyjnym, co jest prawdopodobnie przyczyn tego, e in vitro DNA taki jest bardziej efektywn matryc od tego samego DNA w stanie zrelaksowanym. Ujemna superhelikalno DNA in vivo w wyniku dziaania gyrazy na og stymuluje transkrypcj. Dotyczy to.m.in. genu kodujcego topoizomeraz I enzym zmniejszajcy superhelikalno wywoywan przez gyraz. Do wyjtkw nale promotory genw kodujcych podjednostki gyrazy, ktre ulegaj osabieniu przy wzrocie ujemnej superhelikalnoci. Wystpuje tu zatem regulacja stopnia superhelikalnoci DNA przez ujemne sprzenie zwrotne. Rola dyskryminatora, sekwencji midzy heksamerem 10 a miejscem startu, wysza na jaw w badaniach nad odpowiedzi cis (ang. stringent) E. coli. Odpowied ta pozwala komrce bakteryjnej na zmian metabolizmu w czasie godu aminokwasowego z nieproduktywnego wytwarzania rybosomw na wytwarzanie enzymw syntezy aminokwasw. Bezporedni odpowiedzi komrki na gd aminokwasowy jest synteza 5'difosforanu 3'difosforanu guanozyny, ppGpp (rys. 7.3), alarmonu informujcego komrk o go-

-P-

Rys. 7.3. Czsteczka ppGpp, 5'difosforanu 3'difosforanu guanozyny, alarmonu godu aminokwasowego E. coli

0"

dzie aminokwasowym. Ten maoczsteczkowy efektor wie si z polimeraz RNA, zmieniajc jej powinowactwo do wikszoci promotorw. Transkrypcja genw kodujcych rRNA, tRNA i biaka rybosomalne ulega zahamowaniu, a transkrypcja operonw syntezy aminokwasw aktywacji. Okazao si, e promotory ulegajce represji przez ppGpp s bogatsze w pary GC, a te ulegajce aktywacji bogatsze w pary AT w rejonie dyskryminatora. Istotne znaczenie maj tu rwnie zmiany sekwencji nukleotydowej 10.

7.4. Czynniki sigma Drastyczna zmiana stylu ycia, zachodzca przy przejciu bakterii Bacillus subtilis od fazy wegetatywnej do sporulacji po wyczerpaniu substancji odywczych rodowiska, wymaga ekspresji odmiennego zespou genw. Od dawna wiadomo byo, e u podstaw molekularnych tej zmiany ley zastpienie standardowej podjednostki <r43 (analogu a10 E. coli) podjednostkami specyficznymi dla poszczeglnych faz sporulacji. Zjawisko to budzi due zainteresowanie ze wzgldu na pewne analogie do procesu rnicowania si komrek eukariotycznych. Najlepiej zbadanym ukadem modelowym jest tu bakteriofag SPOl atakujcy B. subtilis. W cyklu infekcyjnym tego faga ekspresja genw zachodzi w trzech etapach. Bezporednio po zakaeniu geny wczesne faga ulegaj transkrypcji przez polimeraz RNA gospodarza, a2j8/?'<743; wrd nich znajduje si gen 28, kodujcy fagow podjednostk o o masie czsteczkowej 26 kDa. Podjednostka a 2 6 zastpuje podjednostk <r43, w wyniku czego geny fagowe okresu poredniego ulegaj transkrypcji. Wrd genw tych znajduj si geny 33 i 34, kodujce biaka o masie odpowiednio: 13 kDa i 24 kDa, ktre wsplnie zastpuj podjednostk a 2 6 . Polimeraza E-<r13,24 jest zdolna do inicjacji transkrypcji z promotorw genw pnych. W cyklu rozwojowym faga SPOl wystpuje wic kaskada transkrypcji od wczesnych przez porednie do pnych genw, wynikajca z regulacji inicjacji transkrypcji. Podobny efekt kocowy, lecz uzyskany przez regulacj terminacji transkrypcji, wystpuje w cyklu rozwojowym faga k E. coli. W standardowych warunkach wzrostu za ponad 90% aktywnoci polimerazy RNA w komrce E. coli odpowiada E-<r70. Alternatywne podjednostki a, wystpujce w niewielkich steniach, kontroluj ekspresj genw nalecych do dwu zasadniczych klas. Jedna z nich zawiera geny umoliwiajce komrce odpowiednie reagowanie na sytuacje stresowe i(lub) zmiany rodowiska, takie jak: szok cieplny, szok chemiczny i godzenie. Geny drugiej klasy maj funkcje zwizane z procesami rozwoju, np. z wytwarzaniem rzsek czy przejciem do stacjonarnej fazy wzrostu. W okrelonych warunkach dochodzi do znacznego zwikszenia udziau okrelonej podjednostki a w aktywnoci polimerazy RNA w komrce przez przypieszenie syntezy tej podjednostki i(lub) zahamowanie jej rozpadu. Bakterie E. coli dysponuj mechanizmem ochronnym (odpowied stresowa), umoliwiajcym przeycie w warunkach gwatownego podwyszenia temperatury szoku cieplnego. Odpowied stresowa, naleca do typu kontroli nadrzdnych, polega na szybkiej indukcji syntezy biaek stresowych, speniajcych rne funkcje ochronne, m.in. renaturacj lub proteoliz zdenaturowanych termicznie biaek komrkowych. Geny regulonu stresu cieplnego (jest ich ok. 20) maj promotory rnice si sekwencj od promotorw rozpoznawanych przez E-<r70. Te wanie promotory s rozpoznawane specyficznie przez polimeraz RNA, zawierajc podjednostk a 3 2 , kodowan przez gen rpoH (ang. heat shock). Podjednostka a32 w warunkach standardowych

ulega szybkiej proteolizie. Podwyszenie temperatury o 10C wywouje przejciow jej stabilizacj, by moe przez okresowe zahamowanie aktywnoci swoistej proteazy lub nasycenie substratowe tego enzymu. Efektem tego procesu jest znaczne zwikszenie transkrypcji genw regulonu w czasie 14-20 min po pojawieniu si bodca. Odpowied stresowa zalena od cr32 moe by wywoana przez inne czynniki, jak: dziaanie etanolu, odczynnikw utleniajcych, promieniowania UV lub zakaenie fagowe. Niedawno odkryto drug podjednostk a uczestniczc w odpowiedzi stresowej, <J24, dziaajc w temperaturze przewyszajcej 4 2 C . Do tej pory zidentyfikowano tylko dwa geny z promotorami rozpoznawanymi przez E-cr24: htrA, kodujcy proteaz i rpoH, kodujcy a 3 2 . O zoonoci regulacji ekspresji genu rpoH wiadczy fakt, e ma on cztery promotory; dwa z nich s rozpoznawane przez E-a 70 . Polimeraza E-<r28 zawiera podjednostk a kodowan prawdopodobnie przez gen flal. Wspdziaajc z biakiem FlbB transkrybuje ona geny odpowiedzialne za powstawanie rzsek i za chemotaksj. Ekspresja genu flbB znajduje si pod kontrol kataboliczn, zatem nie moe zachodzi w obecnoci glukozy. Operon zawierajcy geny flbB i flal odgrywa gwn rol w kaskadzie transkrypcji genw rzskowych. Du uwag skupia wykryta niedawno podjednostk kodowana przez gen rpoS (katF) E. coli, uczestniczca w indukcji genw determinujcych przejcie do stacjonarnej fazy wzrostu. Komrki przy przejciu do fazy stacjonarnej staj si mniej wraliwe na podwyszon temperatur, H 2 0 2 lub wysok osmolarno rodowiska. Komrki te zaczynaj syntetyzowa glikogen jako materia zapasowy i mimo e oglna synteza biaka zostaje zredukowana dochodzi w nich do indukcji syntezy 30 50 biaek, m.in. katalazy HPII (ikatE), egzonukleazy III (pcthD) i kwanej fosfatazy (appA). Jak si wydaje, w ekspresji tych genw bierze udzia podjednostk cr, kodowana przez rpoS. Najlepiej zbadany jest udzia tej podjednostki w transkrypcji genu boi A. Produkt tego genu bierze udzia w procesach morfogenetycznych E. coli, rwnie w podziale komrkowym. O ile komrki typu dzikiego, przechodzc do fazy stacjonarnej, zmieniaj ksztat z paeczkowatego w kulisty, mutanty bolA pozostaj paeczkami. W promotorze genu boiA heksamer 35 wykazuje podobiestwo do analogicznego heksameru promotora E -<J 70 , heksamer 10 ma natomiast cakowicie odmienn sekwencj. Do lepiej zbadanych podjednostek naley cr54, kodowana przez gen rpoN (glnF, ntrA), funkcjonujca w asymilacji N H 3 przy niskim jego steniu, w bakteriach E. coli i S. typhimurium (p. podrozdz. Regulacja azotowa"). Ta sama podjednostk funkcjonuje w bakteriach wielu innych gatunkw, m.in. w wizaniu azotu atmosferycznego przez Klebsiella pneumoniae, w wytwarzaniu biaek wirulencji patogena rolin Pseudomonas syringae, w wykorzystaniu molekularnego wodoru jako rda energii przez Alcaligenes eutrophus. Ciekawe, e we wszystkich tych przypadkach transkrypcja przez E-a 5 4 wymaga

obecnoci sekwencji wzmacniajcej ekspresj (ang. enhancer) i wicego si z ni aktywatora: NtrC, NifA lub podobnego do nich biaka, a nieraz take biaka IHF, wywoujcego zginanie dwuniciowej czsteczki DNA. Porwnanie sekwencji aminokwasowej podjednostek o E. coli i B. subtilis wykazuje istnienie charakterystycznych obszarw homologii. W najbardziej zblionych (i najwikszych) podjednostkach cr70 E. coli i o43 B. subtilis wystpuj cztery obszary homologii, oznaczone numerami od 1 do 4.
Tabela 7.1. Porwnanie struktury promotorw E. coli rozpoznawanych przez polimeraz RNA zwizan z rnymi podjednostkami <r. W pierwszej kolumnie nazwy genw kodujcych te podjednostki, w drugiej nazwy samych podjednostek cr. Dalej: sekwencje nukleotydowe w pozycji -35, liczba nukleotydw fragmentu (spacer) oddzielajcego t sekwencj od sekwencji - 1 0 i sekwencja nukleotydowa w tej pozycji. Wyjtkowo dla cr54 pozycja 27 zastpuje pozycj -35. N nukleotyd dowolny, Y pirymidynowy, a R purynowy. W tabeli uwzgldniono rwnie nazewnictwo podjednostek o zwizane z ich wykorzystaniem: cr" (heat shock), <rF (flagella and chemotaxis), crs (stationary phase), <rN (nitrogen regulation). Podjednostki <7 i <rE nazwy swe w tym systemie wziy od nazw odpowiednich genw, rpoD i rpoE -35 TTGACA TNTCNCCCTTGAA GAACTT TAAA CTGCAA -27 CTGGYAYR -10 TATAAT CCCCATTTA TCTGA GCCGATAA CGGCNAGTA -10 TTGCA

rpoD rpoH (htpR) rpoE rpoF (flall) rpoS (katF) rpoN (glnFntrA)

O10 ( O <T32 (<7")

"(O*) <754 ( O

N17 N_U N16 N1S N 16-20 N4

W pozostaych, mniejszych podjednostkach, wystpuj trzy lub% mniej obszarw homologii, co wiadczy o wsplnym pochodzeniu ewolucyjnym tych biaek. Cakowicie odmienna jest natomiast sekwencja aminokwasowa podjednostki o54 E. coli. Zgodnie z tym promotor rozpoznawany przez E-cr54 ma cakowicie odmienn struktur i sekwencj riUkleotydow (tab. 7.1).

7.5. Indukcja i represja Organizmy jednokomrkowe musz szybko reagowa na zmiany rodowiska: przeywalno zaley od zdolnoci adaptacji metabolizmu do tego substratu, ktry si w bezporednim ssiedztwie pojawi. W staej konkurencji, wiksz szans na przeycie bd miay te organizmy, ktre ewolucyjnie wyksztaciy oszczdne mechanizmy gospodarki materiaowej i energetycznej. A wic tylko te enzymy powinny by syntetyzowane, ktre w danym momencie s rzeczywicie potrzebne. Synteza enzymw okrelonego szlaku metabolicznego powinna by zatem rwnoczenie i szybko wczana i wyczana. Przedstawione zaoenia speniane s zarwno w katabolizmie, gdzie modelowym szlakiem jest fermentacja wglowodanu, m.in. laktozy, jak i w anaboliz-

mie, gdzie modelowym szlakiem jest biosynteza aminokwasu, np. tryptofanu. W obu przypadkach geny okrelonego szlaku metabolicznego wystpuj obok siebie tworzc operon, w ktrym podlegaj one wsplnemu mechanizmowi kontroli. Regulacja operonu zachodzi przez oddziaywanie regulatorowej makroczsteczki z sekwencj DNA pooon w pobliu promotora. Transkrypcji ulegaj kolejno wszystkie geny operonu, co zapewnia ich skoordynowan ekspresj. Policistronowe transkrypty operonw s szybko degradowane przez nukleazy, co umoliwia szybkie zakoczenie syntezy enzymw danego szlaku metabolicznego, gdy ju nie s one komrce potrzebne. Twrcami koncepcji operonu byli Jacues Monod i Franois Jacob, ktrzy pracowali w tym samym czasie w Instytucie Pasteura w Paryu, pierwszy nad indukcj operonu laktozowego, a drugi nad indukcj profaga X w bakteriach lizogennych. Monod i Jacob, a take Andre Lwoff (badania nad lizogenizacj), uzyskali nagrod Nobla w zakresie medycyny i fizjologii w roku 1965.

7.6. Indukcja operonu laktozowego Synteza enzymw w odpowiedzi na pojawienie si specyficznego substratu, to indukcja. Ten typ regulacji jest szeroko rozpowszechniony wrd bakterii; wystpuje rwnie u niszych eukariontw, takich jak drode. Fermentacja laktozy (rys. 7.4) przez E. coli stanowi modelowy przykad procesu regulowanego za pomoc mechanizmu indukcji.

epimeryzacja Rys. 7.4. Fermentacja laktozy rozpoczyna si od hydrolizy wizania /?-galaktozydowego. W powstajcej czsteczce galaktozy (Gal) nastpuje inwersja grupy hydroksylowej przy wglu c 4 (epimeryzacja), dziki ktrej zostaje ona przeksztacona w glukoz (Gic). Obie czsteczki glukozy ulegaj dalszym przemianom w szlaku glikolitycznym, ktrego pierwszym ogniwem jest glukozo-6-fosforan *

Operon laktozowy (operon lac, rys. 7.5) skada si z trzech genw strukturalnych: lacZ (/?-galaktozydaza), lacY (/?-galaktozydopermeaza) i lacA (transacetylaza galaktozydowa). Permeaza /J-galaktozydw jest biakiem bonowym, odpowiedzialnym za transport jS-galaktozydw ze rodowiska przez bakteryjn bon komrkow do wntrza komrki. Fizjologiczna rola transacetylazy nie jest znana. Regulatorow makroczsteczk dla operonu lac jest

operon laktozowy

(a)

lacl

p o

lacZ

lacY

lacA

(b)

induktor l * U T O Rys. 7.5. Struktura i funkcjonowanie genw odpowiedzialnych za fermentacj laktozy. Gen lacl, determinujcy konstytutywn syntez represora Lac ma wasny promotor i terminator transkrypcji. Geny strukturalne lacZ, lacYi lacA, ktre koduj, odpowiednio /?-galaktozydaz, /?-galaktozydopermeaz i transacetylaz galaktozydw, tworz wraz z promotorem i operatorem operon lac. (a) Represor Lac wie si z operatorem, uniemoliwiajc transkrypcj operonu lac. (b) Represor Lac, wic induktor, ktrym jest /?-galaktozyd, zmienia swoj konformacj i traci powinowactwo do operatora, co umoliwia transkrypcj operonu lac

biako represorowe, kodowane przez gen lacl. Ge ten, zlokalizowany w pobliu operonu lac, jest transkrybowany stale (w sposb konstytutywny) z nisk efektywnoci. Represor Lac wie si z operatorem sekwencj DNA zachodzc z jednej strony na sekwencj promotora, a z drugiej obejmujc ponad 20 par zasad genu lacZ. Biako represora skada si z czterech identycznych podjednostek; kada z nich ma miejsce wice sekwencj operatorow oraz miejsce wice induktor. Induktorem moe by laktoza lub inny /?-galaktozyd. Represor Lac moe wiza si z operatorem" jedynie pod nieobecno induktora. Ta substancja maoczsteczkowa, wic si kooperatywnie z tetramerowym represorem, wywouje w nim allosteryczn zmian konformacji, prowadzc do utraty powinowactwa do operatora. Wizanie represora z operatorem uzalenione jest wic od maych zmian stenia efektora allosterycznego jS-galaktozydu. W badaniach indukcji i w jej wykorzystaniu w inynierii genetycznej wan rol odgrywaj induktory bezinteresowne" (ang. gratuitous inducers) czsteczki podobne do laktozy na tyle, e wi si z represorem Lac i wywouj indukcj, ale na tyle rne, e nie s ju hydrolizowane przez /?-galaktozydaz. A wic induktory bezinteresowne nie s metabolizowane i pozostaj w komrce w staym steniu. Pitnowany izotopowa izopropylotiogalaktozyd, IPTG (rys. 7.6), bezinteresowny" induktor operonu lac zosta wykorzystany wpreCH,0H CH SCH qH Rys. 7.6. Czsteczka IPTG, izopropylotiogalaktozydu, najczciej stosowanego induktora bezinteresownego, ktry wic si z represorem Lac wywouje indukcj, lecz nie ulega hydrolizie przez /?-galaktozydaz

paratywnej izolacji pierwszego biaka represorowego, represora Lac, przez Waltera Gilberta na Uniwersytecie Harvarda. Nagrod Nobla w zakresie chemii uzyska Gilbert, a take Frederick Sanger i Paul Berg pniej, w roku 1980, za opracowanie metody sekwencjonowania DNA. Jeeli komrka E. coli ronie przy braku laktozy lub innego /?-galaktozydu, to zawiera zaledwie kilka czsteczek /?-galaktozydazy. ladowa ekspresja operonu lac w stanie represji umoliwia transport pierwszych czsteczek laktozy ze rodowiska do wntrza komrki. Fizjologicznym induktorem jest izomer laktozy allolaktoza, ktra powstaje z laktozy w wyniku transglikozylacji. Ju po 2 3 min od pojawienia si laktozy w rodowisku stenie /J-galaktozydazy w cytoplazmie i permeazy w bonie komrkowej zaczyna rosn; zwiksza si zatem transport laktozy (dodatnie sprzenie zwrotne). Stenie /?-galaktozydazy osiga szybko warto ok. 5000 czsteczek na komrk. Nietrwao mRNA lac jest przyczyn, z powodu ktrej synteza enzymw operonu lac po usuniciu induktora ustaje bardzo szybko. Represor Lac spenia dwie funkcje: wie si z operatorem i wie si z induktorem. W zwizku z tym istniej dwie klasy mutacji genu lacL Pierwsza klasa, wywouje utrat zdolnoci wizania si represora Lac z operatorem, co doprowadza do konstytutywnej (bez udziau induktora) syntezy enzymw operonu lac. Jeeli w komrce czciowo diploidalnej zawierajcej dwa operony lac (np. jeden z nich w chromosomie, a drugi w plazmidzie) wystpuj dwa allele genu lacl, lacl+ i lacl", to nie zmutowany allel lacl+ obsuguje oba operony lac: oba podlegaj normalnej regulacji (rys. 7.7(a)). Represor Lac obsuguje zatem rwnie operon lac, znajdujcy si w innej czsteczce DNA: dziaa w trans". Mutacja lacl" jest recesywna, a jej komplementacja przez allel nie zmutowany wiadczy, e represor Lac jest wzgldnie trway i zdolny do dyfuzji. Druga klasa mutacji (nie przedstawiona na rys. 7.7), lacls, wywouje utrat zdolnoci wizania si represora Lac z induktorem. Tak zmieniony represor Lac, pomimo obecnoci induktora, jest stale zwizany z operatorem, nie
(a) P lacl p o lacZ lacl p o lacZ

* ^
(b) P loci

^ A A ^
'

I
J

J
p o lacZ

p oc

lacZ

lacl

*l
'wbf

l J
'

'TnnRMH H h

Rys. 7.7. Mutacje blokujce wizanie represora Lac z operatorem, lacl~ (a) i oc (b), wykazuj identyczny efekt fenotypowy konstytutywn syntez enzymw operonu lac, zachowuj si jednak rnie w tecie komplementacji. Objanienia s w tekcie

zezwalajc na indukcj operonu lac. Jeeli w komrce czciowo diploidalnej zawierajcej dwa operony lac wystpuj dwa allele genu lacl, lacl+ i lacl8, to zmieniony represor Lac blokuje oba operony. A zatem w tecie komplementacji dominujcy efekt mutacji lacls przejawia si w trans". Utrata zdolnoci wizania si represora z operatorem moe wynika z mutacji operatora; jej efektem jest konstytutywna ekspresja operonu lac, std jej nazwa oc (ang. constitutive). W komrce czciowo diploidalnej zawierajcej dwa operony lac z operatorami, odpowiednio, o+ i oc, operony te zachowuj si niezalenie od siebie (rys. 7.7(b)). Ekspresja pierwszego podlega normalnej regulacji, a ekspresja drugiego jest konstytutywna. A zatem efekt mutacji oc przejawia si w cis": dotyczy jedynie operonu, ktrego czci skadow jest zmutowany operator. Obecno represora w miejscu operatorowym, stanowic zawad przestrzenn, moe w niektrych przypadkach zablokowa wizanie polimerazy RNA przez promotor. W przypadku operonu lac okazao si jednak, e oba te biaka mog si wiza z odpowiadajcymi im sekwencjami rwnoczenie (rys. 7.8). Obecno represora Lac stymuluje nawet wizanie polimerazy RNA
rozwijanie

-50

-40

-30

-20

-10

+1

+10

+20

Rys. 7.8. Rejon promotorowo-operatorowy lac, z zaznaczonymi miejscami wizania represora Lac przez operator i polimerazy RNA przez promotor. Kompleks represoroperator stymuluje wizanie polimerazy RNA. Po usuniciu represora w trakcie indukcji sekwencja DNA zaznaczona na rysunku moe ulec rozwiniciu zamknity" kompleks promotorpolimeraza RNA przechodzi w kompleks otwarty"

z promotorem lac. Represor jednak nie pozwala na rozwinicie dwuniciowej struktury DNA utworzenie otwartego" kompleksu promotorpolimeraza RNA. Represor Lac zwizany z operatorem umoliwia przechowywanie polimerazy RNA w miejscu promotorowym. Po usuniciu kompleksu represorinduktor z operatora nie trzeba czeka, a polimeraza RNA znajdzie promotor, gdy ju jest tam obecna. Zamknity" kompleks promotor polimeraza RNA bardzo szybko przeksztaca si w kompleks otwarty" wstp do inicjacji transkrypcji. Operator lac ma cech wspln dla wielu miejsc rozpoznawanych przez biaka regulatorowe wykazuje sekwencj palindromow. Sekwencja nukleotydowa jednego ramienia po obrceniu o 180 jest w znacznej mierze powtrzeniem sekwencji ramienia drugiego (rys. 7.9). Mutacje punktowe oc pozwoliy na identyfikacj tych par zasad, ktre decyduj o wizaniu represora

-5

+1

+5

+10

+15

+20

+25

T-G-T-G-T-G-G-A-A-T-T-G-T-G-A-G-C-G~G-A-T-A-A-C-A-A-T-T-T~C-A-C-A-C-A A-C-A-C-A-C-C-T-T-A-A-C-A-C-T-C-G-C-C-T-A-T-T-G-T-T-A-A-A-G-T-G-T-G-T

pppA-A-U +40 +45

A-U-G-A-C-C

f Met-Thr Rys. 7.9. Sekwencja operatora lac. Dwa, prawie identyczne ramiona palindromu zaznaczone s strzakami, a jego rodek gwiazdk. Transkrypcja rozpoczyna si w + 1 , natomiast kodon inicjacji translacji (w tym przypadku syntezy /?-galaktozydazy) AUG kodujcy metionin w pozycji inicjatorowej (formylometionin), jest zawarty od + 3 9 do + 4 1

Lac, a delecje z lewej i z prawej strony zdefinioway oba koce sekwencji operatorowej. Chemiczna reakcja' metylacji DNA, gwnie reszt adeniny i cytozyny, pozwolia zbada, ktre fragmenty DNA s chronione przez zwizany z operatorem lac represor. Te rne podejcia eksperymentalne doprowadziy do oglnego wniosku, e stosunkowo maa liczba kontaktw midzy resztami aminokwasowymi represora i nukleotydami operatora jest odpowiedzialna za niezwykle specyficzn asocjacj operatora z represorem. O istotnej roli sekwencji palindromowej wiadcz mutacje zwikszajce jej symetri; powinowactwo operatora do represora moe w tych przypadkach wzrosn a dziesiciokrotnie. Najprawdopodobniej kade z dwu prawie identycznych ramion palindromu wie dimer represora; w ten sposb z caym palindromem zwizany jest tetramer.

7.7. Represja operonu biosyntezy tryptofanu Zahamowanie syntezy enzymw szlaku biosyntetycznego w odpowiedzi na nadmiar kocowego produktu tego szlaku nazywamy represj. Kocowy produkt danego szlaku moe pojawi sie w komrce w nadmiarze bd w wyniku mniejszego na niego zapotrzebowania, bd na skutek przypadkowego pojawienia si go w rodowisku. Jednym z lepiej zbadanych pod tym wzgldem szlakw jest synteza tryptofanu, gdzie dodatkowym mechanizmem regulujcym transkrypcj jest atenuacja. Mechanizm ten, wraz ze schematem caego szlaku metabolicznego (rys. 7.27) zostanie przedstawiony pniej, teraz natomiast zajmiemy si rnymi aspektami represji operonu biosyntezy tryptofanu (operonu trp). W odrnieniu od represora Lac, biako represorowe Trp syntetyzowane jest w formie nieaktywnej, zwanej aporepresorem; do jego aktywacji niezbdny jest maoczsteczkowy korepresor tryptofan. W efekcie nadmiar tryptofanu blokuje ekspresj operonu trp hamuje syntez enzymw katalizujcych

po trpR

o P

trpE

trpO

trpC

trpB

trpA

nm^-

nsw^

nnnn
TRYPTOFAN

Rys. 7.10. Represja syntezy enzymw operonu tryptofanowego (kodowanych przez geny trpE, D, C, B, A) wywoana nadmiarem tryptofanu kocowego produktu szlaku biosyntezy. Gen trpR determinujcy syntez represora jest oddalony od operonu trp. Operator trp znajduje si wewntrz sekwencji promotora trp. Represor zaktywowany przez tryptofan wie si z operatorem, uniemoliwiajc transkrypcj operonu

syntez tryptofanu, co stanowi przykad ujemnego sprzenia zwrotnego (rys. 7.10). W odrnieniu od represora Lac, ktry dziaa jedynie na operator operonu laktozowego, represor Trp moe wiza si z trzema rozproszonymi po genomie E. coli operatorami, kontrolujc w ten sposb trzy nie zwizane ze sob geny lub zespoy genw. Oprcz operonu trp jest to gen aroH, kodujcy jeden z trzech enzymw pocztkowego etapu szlaku biosyntezy aminokwasw aromatycznych. Trzecim jest gen trpR, represor Trp bowiem
aroH AAT G - T A - CT A- 6 A- GAA- CTA- GT G - C
*

T TACATGATCT CTT G - AT CA CG

trp

A-T-C-G-A-A-C-T-A-G-T-T-A-A-C-T-A-G-T-A-C
*

T-A-G-C-T-T-G-A-T-C-A-A-T-T-G-A-T-C-A-T-G

trpR

A-T-C-G-T-A- C-T- C-T-T-T-A- G-C-G-A- G-T-A- C

*

T-A-G-C-A-T-G-A-G-A-A-A-T-C-G-C-T-C-A-T-G

Rys. 7.11. Sekwencja trzech operatorw rozpoznawanych przez represor Trp. Pionowymi liniami wskazano podobiestwa sekwencji, strzakami zaznaczono ramiona sekwencji palindromowej

reguluje wasn syntez: gdy znajduje si w nadmiarze hamuje, wic si z operatorem, transkrypcj wasnego genu. Ta autoregulacja jest kolejnym przykadem ujemnego sprzenia zwrotnego. Wymienione trzy operatory wykazuj podobiestwo sekwencji i podobn, lecz nieidntyczn symetri palindromw (rys. 7.11). Widocznie s to cechy wystarczajce do wy-

tworzenia specyficznych oddziaywa midz biakiem represorowym a sekwencj operatora. Wymienione operatory mieszcz si wewntrz odpowiadajcych im promotorw (trp, aroH) bd daleko na zachodz (trpK)\ mona wic przypuszcza, e w tych przypadkach wizanie represora uniemoliwia dostp polimerazy RNA do promotora. Naley tu jednak wspomnie, e w innych operonach znane s przypadki lokalizacji operatorw w duej odlegoci od promotora. Bywa i tak, e do represji niezbdne jest wspdziaanie dwu (i wicej) operatorw, niekoniecznie pooonych obok siebie: represory zwizane z tymi operatorami musz oddziaywa na siebie bezporednio. Gdy operatory oddalone s od siebie, fragment DNA, znajdujcy sie midzy nimi, tworzy ptl. Indukcja operonu laktozowego i represja operonu tryptofanu s przykadami kontroli (regulacji) negatywnej. Geny pod kontrol negatywn ulegaj ekspresji, pki nie zostan wyczone przez biako represorowe. Generalnie: biako represorowe albo wie si z DNA, by uniemoliwi polimerazie RNA inicjacj transkrypcji, albo wie si z mRNA, by uniemoliwi rybosomowi inicjacj translacji. Operony pod kontrol negatywn dzielimy na te, ktre ulegaj indukcji i na te, ktre ulegaj represji w zalenoci od ich odpowiedzi na maoczsteczkowe efektory: induktory i korepresory. Geny znajdujce si pod kontrol pozytywn ulegaj ekspresji dopiero pod wpywem dziaania aktywnego biaka regulatorowego, ktre moe wiza si z DNA lub z polimeraz RNA. Jako przykad regulatorw pozytywnych mog suy podjednostki o, decydujce o selekcji promotorw przez polimeraz RNA, oraz biaka antyterminacyjne, zmieniajce zdolno rozpoznawania terminatorw transkrypcji przez ten enzym. Przykadem regulacji pozytywnej jest rwnie aktywacja kompleksu promotor-polimeraza RNA operonw katabolicznych, zwizana z tzw. represj glukozow lub kataboliczn.

7.8. Represja kataboliczna Przedstawiony uprzednio model indukcji operonu laktozowego (rys. 7.5) wyjania zachowanie si komrek E. coli, gdy rdem wgla jest laktoza zamiast rda standardowego, jakim jest glukoza. Jeeli jednak laktoza wystpuje obok glukozy, to do indukcji /J-galaktozydazy dochodzi dopiero po wyczerpaniu caej glukozy z poywki (rys. 7.12(a)). A wic istnieje jaki mechanizm, dziki ktremu glukoza nie dopuszcza do indukcji operonu lac przez /J-galaktozyd; std nazwa represja glukozowa. Represji glukozowej podlega, oprcz operonu lac, wiele innych operonw katabolicznych, np. operony galaktozy czy arabinozy. Std oglna nazwa opisanego zjawiska represja kataboliczna. Okazao si, e do indukcji, oprcz induktora /J-galaktozydu, niezbdny jest cAMP (rys. 7.12(b)), ktrego stenie w komrce wzrasta, gdy brak glukozy doprowadza do stanu godu wglowego. By moe, aktywacja zwiza-

laktoza Rys. 7.12. Represja glukozowa, (a) Glukoza nie dopuszcza do indukcji /?-galaktozydazy. Po wyczerpaniu glukozy z poywki wzrost bakterii (mierzony jako przyrost absorbancji A) zostaje na krtko zahamowany. Dopiero teraz dochodzi do indukcji /?-galaktozydazy. Po adaptacji bakterii do nowego rda wgla zwiksza si znw szybko wzrostu, (b) Pomimo rwnoczesnej obecnoci glukozy i laktozy w poywce dodanie cyklicznego AMP (10~ 2 10" 3 M) wywouje indukcj jft-galaktozydazy, co "wskazuje, e cAMP jest efektorem represji glukozowej

nej z bon komrkow cyklazy adenylowej wywoana jest ustaniem transportu glukozy do wntrza komrki. Enzym ten, kodowany przez gen cya,, katalizuje powstawanie cyklicznego AMP z ATP (rys. 7.13).
0 0 0

Rys. 7.13. Katalizowane przez cyklaz adenylow przeksztacanie ATP w cykliczny AMP, alarmon godu wglowego

cAMP naley do klasy alarmonw sygnaw alarmowych dla komrki. Pojcie to wprowadzi do biologii molekularnej Bruce Ames z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley. Jednym z pierwszych poznanych alarmonw jest ppGpp, informujcy komrk o stanie godu aminokwasowego. Cykliczny AMP jest alarmonem godu wglowego. Czsteczka ta aktywuje biako regulatorowe, znane jako CAP (ang. catabolite activator protein) lub CRP (ang. cyclic AMP receptor protein), kodowane przez gen crp. Oczywicie mutanty cya i crp wyamuj si spod represji katabolicznej. Biako CAP skada si z dwu identycznych podjednostek; po zwizaniu czsteczki cAMP przycza si do swoistej sekwencji palindromowej w pobliu promotora (operon lac), zachodzc na (operon gal) lub w pewnym oddaleniu od promotora (w kierunku przeciwnym transkrypcji, operon ara). W pierwszych dwu przypadkach CAP moe kontaktowa si bezporednio z polimeraz RNA, zwizan z promotorem, w ostatnim do kontaktu dochodzi moe przez dodatkowe biako regulatorowe.

Promotory zalene od CAP wykazuj liczne odstpstwa od kanonicznej sekwencji silnego promotora E. coli. aden z nich nie zawiera sekwencji 35 zblionej do sekwencji najwyszej zgodnoci, a u niektrych to dotyczy rwnie sekwencji 10. Obecno CAP zwiksza zdolno polimerazy RNA do inicjacji transkrypcji z tych uomnych promotorw. Istniej dwa modele funkcjonowania CAP. Wedug jednego z nich biako to stwarza dodatkowe miejsce wizania polimerazy RNA: enzym ten wizaby si wic i z sekwencj promotorow, i z biakiem CAP. Drugi model zakada, e CAP dziaa wycznie na skutek wizania si z DNA. By moe w promotorach zalenych od CAP sama polimeraza RNA nie jest zdolna do rozwinicia dwuniciowej struktury DNA i wytworzenia kompleksu otwartego. Za tym modelem przemawiaj dowiadczenia wykazujce, e CAP powoduje silne zagicie DNA w miejscu wizania. Zagiciu DNA z reguy towarzyszy pewne rozwinicie struktury dwuniciowej, ktre moe si przenosi wzdu czsteczki DNA. Operon laktozowy, podobnie jak inne operony kataboliczne, podlega rwnoczenie regulacji negatywnej przez oddziaywanie represor operator i regulacji pozytywnej przez oddziaywanie CAP z kompleksem promotor-polimeraza RNA. Alarmon godu wglowego stawia w stan pogotowia wszystkie operony kataboliczne. Jeeli w rodowisku pojawi si okrelone rdo wgla (np. laktoza), to swoisty dla niego operon (w tym przypadku lac) ulega indukcji (rys. 7.14). Wykorzystanie rde wgla i energii ze rodowiska jest procesem o niezwykle zoonej regulacji, skadajcej si z wielu mechanizmw, poza represj
operon X (a) glukoza + cAMP(b) glukozaCAMP + aktywacja przez CAP (c) glukoza cAMP + laktoza + P P o Roperon Y p o P R operon lac p o p R

R C

R C

P R

R C

R C

zniesienie represji lac, inicjacja transkrypcji lac: Rys. 7.14. Funkcjonowanie dwu nakadajcych si na siebie regulacji operonw katabolicznych: pozytywnej (CAP) o maej swoistoci i wybitnie swoistej regulacji negatywnej (represor Lac) w warunkach zblionych do panujcych w rodowisku naturalnym. P polimeraza RNA; R represor; C aktywne biako CAP; p promotor; o operator, (a) W obecnoci glukozy operony kataboliczne X, Y i lac nie funkcjonuj. Operatory zablokowane s swoistymi dla nich represorami; przyjto, e tak, jak w przypadku operonu lac, z promotorami operonw Xi Yzwizane s czsteczki polimerazy RNA. (b) Po wyczerpaniu glukozy w komrce pojawia si cAMP; zaktywowane biako CAP wie si ze swoist sekwencj (w przedstawionych przypadkach w pobliu promotora), stawiajc wszystkie operony w stan pogotowia, (c) W rodowisku pojawia si laktoza; dochodzi do inaktywacji represora lac i inicjacji transkrypcji wycznie w operonie lac

kataboliczn i funkcjonowaniem systemu cAMP-CAP. Przykadowo, efekt glukozowy hamujce dziaanie glukozy na indukowan syntez enzymw katabolicznych funkcjonuje nie tylko przez zmniejszanie stenia cAMP. Jednym z lepiej poznanych mechanizmw jest wykluczanie induktora mechanizm, poprzez ktry glukoza nie dopuszcza do wejcia induktora do komrki. Polega on na przejciowej inaktywacji permeaz przez biako bonowe III Glc przenonik fosforanw w systemie pobierania i fosforylacji glukozy. Przy braku glikozy biako to wystpuje w formie ufosforylowanej, ktra nie przeszkadza w funkcjonowaniu permeaz. Zachowanie si operonw regulonu cAMP-CAP nie moe by w peni wyjanione zmianami stenia cAMP. Poza tym znane s operony podlegajce katabolicznej represji, lecz nie podlegajce regulacji przez cAMP-CAP. A wic stosunkowo dobrze poznany regulon cAMP-CAP moe by czci skadow nadrzdnego systemu regulacyjnego Cer (ang. carbon and energy), wykorzystania wgla i energii, kontrolujcego ekspresj genw (operonw, regulonw) wielu szlakw metabolicznych.

7.9. Regulacja azotowa i enhancery Enterobakterie, ktrych najlepiej poznanymi przedstawicielami s E. coli i S. typhimurium, mog do swojego wzrostu wykorzystywa rne organiczne lub nieorganiczne rda azotu. Amoniak, wnioskujc z szybkoci wzrostu, jest preferowanym rdem azotu, podobnie jak glukoza jest preferowanym rdem wgla i energii. Bakterie te mog asymilowa azot z amoniaku w wyniku redukcyjnej aminacji 2-ketoglutaranu, katalizowanej przez dehydrogenaz glutaminianu (rys. 7.15(a)). Reakcja ta jest jednak nieefektywna (Km dla NH 3 ok. 1 mM), przy niskim steniu NH 3 . Asymilacja azotu wymaga wic zwikszenia ekspresji wielu operonw metabolizmu azotowego, zwanych operonami ntr (ang. nitrow i * '

2-ketoglutaran + NADPH +NH3

dehydrogenaza glutaminianu

glutaminian + NADP+

biaka, puryny, pirymidyny itd.

Rys. 7.15. Asymilacja N H 3 zachodzca przy jego wysokich (a) i niskich (b), (c) steniach

gen-regulated). Biakowe produkty tych operonw uatwiaj najpierw asymilacj, przy niskich steniach NH 3 , opisanym szlakiem z udziaem syntetazy glutaminy i syntazy glutaminianu (rys. 7.15(b)), a potem umoliwiaj wykorzystanie alternatywnych rde azotu. Jeeli amoniaku jest po dostatkiem, zarwno reakcja (a), jak i reakcja (c) prowadz do powstania glutaminianu. Przy niskich steniach NH 3 reakcja (a) nie moe zachodzi: syntetaza glutaminy (b) jest jedynym enzymem przyczyniajcym si do asymilacji amoniaku, a syntaza glutaminianu (c) jedynym enzymem powodujcym wytwarzanie glutaminianu. Jeeli wzrost komrek jest ograniczony dostpnoci NH 3 , syntetaza glutaminy, kodowana przez gen gin A, peni dwie funkcje: syntezy glutaminy i asymilacji NH 3 . Jeeli stenie NH 3 spada poniej 1 mmol/dm3, wzrasta stenie 2-ketoglutaranu, bo reakcja (a) nie zachodzi, a obnia si stenie glutaminy, ze wzgldu na jej ma poda w reakcji (b) i znaczne zuycie w reakcji (c). Stanowi to sygna uruchamiajcy kaskad enzymatyczn (rys. 7.16), ktrej efektem jest

(aktywny)

(nieaktywny)

ADP

NtrB kinaza

ATP

Rys. 7.16. Stosunek ste 2-ketoglutaran/glutamina reguluje aktywno biaka NtrC, ktre w formie fosforylowanej NtrC-P aktywuje transkrypcj genu syntetazy glutaminy, ginA. Przy wysokim steniu 2-ketoglutaranu kinaza NtrB fosforyluje NtrC. Przy wysokim steniu glutaminy biako NtrC-P ulega inaktywacji pod wpywem fosfatazy P n -NtrB

aktywacja, przez fosforylacj, biaka NtrC (zwanego te NRI? kodowanego przez ntrC = glnG), ktre z kolei aktywuje transkrypcj genu syntetazy glutaminy gin A. 2-ketoglutaran aktywuje urydylotransferaz (kodowan przez glnD), przenoszc reszty urydylowe na biako P n (produkt genu glnB) i powoduje jego dysocjacj od enzymu NtrB. Proces ten wyzwala aktywno kinazy NtrB, fosforylujcej (i przez to aktywujcej) biako NtrC. Jeeli stenie NH 3 w rodowisku wzrasta, stosunek 2-ketoglutaran/glutamina zmienia si na korzy glutaminy, co wywouje usunicie reszt urydylowych z biaka P n i wytworzenie kompleksu P n -NtrB o aktywnoci fosfatazy, przeksztacajcej NtrC-P w nieaktywne biako NtrC (rys. 7.16). Niezalenie od aktywacji transkrypcji genu syntetazy glutaminy, gin A, przez Ntrc-P, ktra zostanie opisana pniej, dochodzi do aktywacji samej

syntetazy. Enzym ten skada si z 12 identycznych podjednostek, z ktrych kada moe by adenylowana; adenylacja inaktywuje syntetaz glutaminy. Aktywacja/inaktywacja syntetazy glutaminy katalizowana jest przez adenylotransferaz, ktrej aktywno z kolei jest regulowana przez biako P n . Powstajce przy wysokim steniu 2-ketoglutaranu biako P n -UMP (rys. 7.16) stymuluje reakcj prowadzc do aktywnej formy syntetazy glutaminy nie zawierajcej grup adenylowych, a biako P n stymuluje inaktywacj tego enzymu (rys. 7.17).
Pn - UMP syntetaza ^ glutaminy - AMP (nieaktywna) ^ transferaza syntetaza glutaminy + AMP faktywna) ATP Rys. 7.17. Zmiany aktywnoci adenylotransferazy pod wpywem P n UMP, bd P n . W pierwszym przypadku nastpuje aktywacja, w drugim inaktywacja syntetazy glutaminy, enzymu skadajcego si z 12 identycznych podjednostek, z ktrych kada moe ulec adenylacji

Biako NtrC-P aktywuje transkrypcj z promotorw ntr, katalizowan przez polimeraz RNA zawierajc podjednostk <754 (gen rpoN = = glnF = ntrA). Promotory ntr wykazuj cakowicie odmienn struktur od pozostaych promotorw E. coli (tab. 7.1). Niewielka z pocztku liczba czsteczek NtrC-P w komrce wystarcza jedynie do aktywacji transkrypcji operonu glnALG, ktry wyrnia si du liczb sekwencji wicych NtrC-P, enhancerw (funkcjonowanie enhancerw sekwencji wzmacniajcych transkrypcj zostanie opisane pniej). Nastpuje wzrost poziomu syntetazy glutaminy (ginA) oraz biaek NtrB (glnL) i NtrC (glnG). Jeeli komrkowe stenie NtrC staje si wysokie, aktywacji mog ulec promotory ntr zawierajce tylko jedn sekwencj enhancerow. Wan grup operonw nalecych do regulonu ntr s operony systemu Nif (ang. nitrogen fixation), odpowiedzialne za wizanie azotu czsteczkowego (atmosferycznego). Operony nif wystpuj u bakterii wolno yjcych, takich jak pokrewna E. coli bakteria K. pneumoniae, symbiotycznych (Rhizobium sp.) oraz asocjacyjnych (np. Azospirillum sp.). System Nif skada si z 7 operonw, ktrych geny koduj enzymy wizania azotu i z operonu nif LA, ktrego geny
NtrC - P G-C-A-C-N-N-N-N-N-T-G-G-T-G-C C- G - T - G- N- N-N- N- N-A- C- C - A - C- G NifA T-G-T-N-N-N-N-T-N-N-N-N-N-A-C-A A-C-A-N-N-N-N-A-N-N-N-N-N-T-G-T

Rys. 7.18. Sekwencje nukleotydowe (enhancery) wice biaka NtrC P i NifA, aktywujce transkrypcj w metabolizmie azotu. Strzakami zaznaczono ramiona sekwencji palindromowej

reguluj transkrypcj tych 7 operonw. Transkrypcja operonu nifLA jest aktywowana przez biako NtrC-P, z kolei produkt genu nifA aktywuje transkrypcj innych operonw nif. Produkt genu nifL inaktywuje biako regulatorowe NifA w odpowiedzi na obecno tlenu i amoniaku, sprawiajc, e 7 operonw nif moe ulega transkrypcji tylko w warunkach anaerobiozy i przy braku amoniaku. Biako NifA spenia podobn rol co NtrC, a sekwencje nukleotydowe wice to biako peni rol enhancerw (rys. 7.18). Jedynie centralne domeny tych dwu biaek wykazuj podobiestwo sekwencji aminokwasowej. Przypuszcza si, e jest to zwizane z ich oddziaywaniem z podjednostk o*54; dla NtrC-P wykazano, e domena ta jest odpowiedzialna rwnie za wizanie ATP i aktywno ATPazy. Enhancery transkrypcji, wykryte najpierw w organizmach eukariotycznych, zdefiniowano pierwotnie jako sekwencje DNA zlokalizowane w duej odlegoci od regulowanego promotora w kierunku zgodnym z transkrypcj lub przeciwnym, w dowolnej orientacji, funkcjonujce w cis". Obecnie wiadomo, e s to miejsca wice biaka regulujce pozytywnie lub negatywnie transkrypcj, ktre mog dziaa na promotor zlokalizowany w innej czsteczce DNA, a wic w trans". Dziaanie enhancerw bakteryjnych zostao dobrze poznane dziki badaniom, w ktrych stosowano oczyszczone biaka i cile zdefiniowany DNA substratowy. Najlepiej zbadany jest ukad aktywacji transkrypcji genu glnA, ktry koduje syntetaz glutaminy, przez NtrC-P (rys. 7.19).
-140 NtrCP -108 NtrCP ATP p- ADP + Pj * glnA ^ ^ E
+1 glnA

Rys. 7.19. Promotor (p) polimerazy RNA E-<r54 S. typhimurium dla genu syntetazy glutaminy, glnA, poprzedzony jest dwoma enhancerami, 108 i 140, wicymi biako NtrC-P. Wytworzenie otwartego kompleksu promotorpolimeraza RNA wymaga zmiany konformacyjnej tego enzymu (kosztem hydrolizy ATP) wywoanej bezporednim oddziaywaniem NtrC-P

Najpierw wykazano, e biako NtrC-P moe aktywowa transkrypcj, gdy sekwencja enhancerowa zostaa umieszczona, metodami inynierii genetycznej, w odlegoci kilku tysicy par zasad od promotora glnA w kierunku zgodnym lub niezgodnym z kierunkiem transkrypcji. Nastpnie uywajc oczyszczonych biaek, NtrC-P i polimerazy RNA z podjednostk a 5 4 , wykazano, e NtrC-P moe aktywowa transkrypcj, gdy enhancer znajduje si na jednej (kolistej) czsteczce DNA, a promotor glnA na drugiej, jeli tylko te dwie koliste czsteczki DNA s utrzymywane w bliskoci przez katenacj (rys. 7.20), a wic tak jak dwa ogniwa acucha. Dowiadczenie to wykluczyo moliwo przeno-

p glnA t

Rys. 7.20. Katenat (dwa kka acucha), skadajcy si z plazmidu zawierajcego enhancer wicy biako NtrC i z plazmidu zawierajcego gen syntetazy glutaminy glnA, wraz z promotorem (p) i terminatorem (f) transkrypcji. W ukadzie tym dochodzi do aktywacji transkrypcji genu glnA przez biako NtrC. Po dekatenacji (rozdzieleniu dwch ogniw acucha) aktywacja staje si niemoliwa

szenia si zmian strukturalnych wzdu DNA od enhancera do promotora. Wyniki te wiadcz, e istotne jest tu utrzymywanie kompleksu enhancer-NtrC przez kompleks promotor polimeraza RNA na postronku" (ang. tether), ktrym jest dugi fragment DNA dzielcy te miejsca. Mechanizm ten zwiksza czsto interakcji midzy NtrC i polimeraz. Biako NtrC kontaktuje si z polimeraz bezporednio ze swojego odlegego miejsca enhancerowego, tworzc widoczn w mikroskopie elektronowym ptl DNA, i wywouje przejcie kompleksu promotor-polimeraza RNA z formy zamknitej do otwartej z rwnoczesn hydroliz ATP. Nieaktywne biako NtrC, chocia wie si z enhancerem, nie ma aktywnoci ATPazy i dopiero jego fosforylacja (do NtrC-P) aktywno t wyzwala. Homolog NtrC, biako NifA, katalizuje wytwarzanie kompleksu otwartego m.in. w promotorze nifHDK Klebsiella pneumoniae, kodujcego nitrogenaz, kompleks enzymatyczny katalizujcy wizanie i redukcj N 2 do NH 3 . W tym przypadku enhancer musi by umieszczony przed promotorem; midzy tymi dwoma sekwencjami wystpuje sekwencja wica IHF (ang. integration host factor), biako wywoujce silne zagicie podwjnej nici DNA (rys. 7.21). Zgicie DNA, wywoane wizaniem IHF, zwiksza stenie NifA w pobliu promotora.
-132

-70

43 IHF

+1

ntfH

NifA

nifH

Rys. 7.21. Promotor (p) polimerazy RNA E-cr54 Klebsiella pneumoniae dla operonu nifHDK, kodujcego nitrogenaz, poprzedzony jest enhancerem w pozycji 132, wicym biako NifA. Midzy promotorem i enhancerem znajduje si sekwencja (od 43 do 70) wica biako IHF, ktre wywouje zagicie dwuniciowego DNA, co uatwia bezporedni kontakt NifA-polimeraza RNA. Efektem tego oddziaywania jest wytworzenie otwartego kompleksu promotor-polimeraza RNA

Chocia podjednostk a 5 4 zostaa wykryta jako czynnik niezbdny do transkrypcji genw ntr, wiadomo obecnie, e jest take wykorzystywana do transkrypcji genw speniajcych rnorakie funkcje w wielu gatunkach bakterii. W kadym z tych przypadkw wykryto zaleno transkrypcji od biaka aktywatorowego, dziaajcego podobnie jak NtrC, czy NifA. Kade z nich umoliwia transkrypcj w odpowiedzi na okrelony sygna fizjologiczny lub rodowiskowy. Wszystkie te aktywatory maj domen homologiczn do centralnej domeny biaka NtrC (oddziaywanie z a 5 4 , wizanie ATP), a wic prawdopodobnie aktywno ATPazy jest istotna dla ich funkcjonowania. W wielu przypadkach istotn rol odgrywa biako IHF.

7-10- Terminatory Terminacja transkrypcji zachodzi w cile zdefiniowanym miejscu DNA, zwanym terminatorem (rys. 7.22). Uczestnicz w niej specyficzne biaka, jak NusA i Rho. Polimeraza RNA (a2/J/TNusA) przestaje przesuwa si wzdu DNA i przycza nukleotydy do wyduanego koca 3'. Dysocjacji kompleksu DNA-RNA polimeraza RNA towarzyszy przywrcenie pierwotnej struktury DNA.

Rys. 7.22. (a) Polimeraza RNA (zaciemniony owal) przesuwa si z lewa na prawo wzdu dwuniciowego DNA, wywoujc przejciowe rozplecenie heliksu (topnienie) w miejscu syntezy RNA (linia falista), (b) Po osigniciu sekwencji terminatorowej (t) nastpuje dysocjacja kompleksu DNA-RNA-polimeraza RNA

Ze wzgldu na moliwo dziaania rybonukleaz koniec 3' wyizolowanego z komrki RNA nie zawsze jest efektem terminacji. Ustalenie miejsca inicjacji transkrypcji jest atwiejsze, poniewa wystpuje tam naturalny wyznacznik reszta trifosforanowa na kocu 5'. W celu ustalenia miejsca terminacji niezbdna jest rekonstrukcja tego procesu in vitro z elementw moliwie jak najlepiej oczyszczonych od nukleaz. Oparcie si wycznie na wynikach dowiadcze in vitro moe jednak doprowadzi do faszywych wnioskw, ze wzgldu na trudno odtworzenia rodowiska wewntrzkomrkowego; na terminacj in vitro wywiera wpyw wiele czynnikw, a z nich najwaniejszym jest sia jonowa buforu. Dopiero gdy oba kierunki dowiadczalne doprowadzaj do tego samego wyniku, mona z du doz prawdopodobiestwa okreli miejsce terminacji transkrypcji. Terminatory transkrypcji peni trzy wane funkcje w ekspresji genw.

1) Stanowi sygna, ktry wyznacza koniec jednostki transkrypcyjnej genu, czy zespou genw. Terminatory operonw s istotnymi elementami organizacji genw, poniewa pozwalaj na cakowicie niezalen ekspresj ssiadujcych ze sob fragmentw DNA. 2) Mog wystpowa midzy genami znajdujcymi si pod kontrol tego samego promotora, gdzie su do regulacji poziomu ekspresji genw wewntrz operonu. Terminatory w rejonie midzy promotorem a pierwszym genem operonu su do regulacji poziomu ekspresji caego operonu (atenuacja). 3) Mog wystpowa rwnie wewntrz genw. Terminatory wewntrzgenowe funkcjonuj jedynie wtedy, gdy znika sprzenie midzy translacj a transkrypcj w wyniku zmiany mutacyjnej genu, bd w wyniku stresu metabolicznego, jakim jest np. gd aminokwasowy. Terminatory te przerywaj syntez mRNA, ktry nie moe ju by wykorzystany w translacji. W bakteriach E. coli wystpuj dwa molekularne mechanizmy terminacji transkrypcji. W jednym z nich czsteczka RNA uwalnia si spontanicznie, gdy polimeraza RNA dotrze do okrelonej sekwencji nukleotydowej, w drugim niezbdne jest dziaanie czynnika uwalniajcego RNA biaka Rho. Transkrypcja jest reakcj niezwykle procesywn polimeraza RNA wraz ze wieo zsyntetyzowanym fragmentem RNA jest bardzo stabilnie zwizana z matrycowym DNA. Jednak w przypadku niektrych sekwencji nukleotydowych stabilno ta zostaje zmniejszona do poziomu, w ktrym kompleks ten ulega rozpadowi. Te samodzielnie dziaajce terminatory skadaj si z ok. 40 par zasad DNA. Na pocztku wystpuje fragment bogaty w pary GC, stanowicy element sekwencji palindromowej, a przy kocu ok. 6 reszt deoksyadenozyny w acuchu transkrybowanym (rys. 7.23). Uwolnienie RNA nastpuje w momencie, gdy transkrypcja dobiega koca tej sekwencji. Kocowa sekwencja nukleotydow RNA moe wytwarza struktur szpilki do wosw" (ang. hairpin). Mutacje punktowe i delecyjne, zmieniajce struktur terminatora, wpywaj na jego funkcjonowanie, co wiadczy o tym, e oba elementy: wytwarzanie struktury szpilki do wosw" przez RNA oraz kocowa sekwencja poli-U odgrywaj istotn rol w terminacji. Uwolnienie transkryptu z powstajcego hybrydu DNA-RNA polega prawdopodobnie na konkurencji energetycznie korzystniejszej struktury RNA-RNA, tworzcej si w postaci szpilki do wosw" (rys. 7.23 i rys. 7.24(b)). Jednoczenie wystpuje tendencja do odtworzenia wyjciowej struktury DNA wewntrz kompleksu przez reasocjacj komplementarnych nici DNA. By moe, te wanie procesy wywouj zwolnienie biegu, a nawet zatrzymanie si polimerazy RNA. Czas trwania tego spoczynku wynosi ok. 60 s w przypadku typowego terminatora. Zatrzymanie si polimerazy RNA umoliwia terminacj, dla ktrej istotnym sygnaem jest acuch reszt urydynowych. Spord wszystkich hybrydw RNA-DNA, hybryd skadajcy si z par rUdA wymaga najmniej energii do dysocjacji na acuchy skadowe. A zatem bogate w pary AT rejony DNA odgrywaj istotn rol nie tylko w inicjacji transkrypcji, lecz i w jej terminacji niezalenej

5' 3'

-N-N-A-A-G-C-G-C-C-G-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-C-T-T-T-T-T-T-N-N*

3' DNA 5'

-N-N-T-T-C-G-C-G-G-C-N-N-N-N-G-G-C-C-G-C-G-A-A-A-A-A-A-N-N-

5f

-N-N-A-A-G-C-G-C-C-G-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-C-U-U-U-U-U-U-OH

3' RNA

N C GC CG CG GC CG GC A U A U 5' - N - N U-U-U-U-OH 3'

Rys. 7.23. Struktura terminatora transkrypcji niezalenego od czynnika Rho. Po fragmencie bogatym w pary GC (podkrelenie lini przerywan) nastpuje 6 reszt deoksyadenozyny (podkrelenie lini kropkowan) w transkrybowanym acuchu DNA. Oba te fragmenty stanowi ramiona sekwencji palindromowej (strzaki); jej rodek zaznaczono gwiazdk. Poniej przedstawiono transkrypt po terminacji, z woln grup hydroksylow w pozycji 3'. RNA ten wykazuje siln tendencj do wytwarzania struktury drugorzdowej w postaci szpilki do wosw". rodek ptli odpowiada rodkowi sekwencji palindromowej

od biaka Rho. By moe, zmiany kompleksu wywoane reasocjacj komplementarnych nici DNA, przedstawione na rysunku 7.24, odgrywaj rwnie rol w jego rozpadzie. Samodzielnie dziaajce (niezalene od Rho) terminatory wystpuj na kocach jednostek transkrypcji, w miejscach kontrolnych midzy genami i w wikszoci atenuatorw; jest wic oczywiste, e wystarczaj do penienia tej funkcji. Tym niemniej, u E. coli wystpuj take terminatory wymagajce

Rys. 7.24. Struktura kompleksu DNA-RNA-polimeraza RNA tu przed terminacj (a) i w trakcie terminacji (b). Wytwarzanie energetycznie preferowanej struktury R N A - R N A , szpilki do wosw", sprzyja reasocjacji komplementarnych nici D N A (strzaki). Pozostajcy krtki hybryd, skadajcy si z par rU-dA atwo ulega dysocjacji

wspdziaania biaka Rho. Mona je znale tam, gdzie wystpuj terminatory niezalene od Rho, ale jak si wydaje funkcjonuj one przede wszystkim jako terminatory wewntrzgenowe. Biako Rho, zbudowane z 6 identycznych podjednostek, przypomina swoj budow piercie skadajcy si z 3 dimerw. Bierze ono udzia w terminacji przez wspdziaanie ze wieo zsyntetyzowanym RNA w reakcji napdzanej przez hydroliz ATP. Biako Rho wie si ze specyficznym miejscem RNA, zwanym rut (ang. rho utilisation), w ktrym rozpoczyna ono swoj translokacj wzdu RNA w kierunku koca 3' (rys. 7.25). W ostatecznym efekcie dziaanie biaka Rho usuwa polimeraz RNA (prawdopodobnie przez zmian jej konformacji) z miejsca przez ni zajmowanego w kompleksie z DNA, uniemoliwiajc dalsz elongacj RNA. W warunkach in vitro biako Rho tworzy z polimeraz RNA kompleks, ktry, jak si wydaje, nie jest artefaktem. Fenotyp odpowiadajcy pewnym mutacjom missense w genie rho ulega supresji (powraca do stanu pierwotnego) przez niektre mutacje genu rpoB, kodujcego podjednostk /} polimerazy RNA. Sugeruje to powstawanie kompleksu skadajcego si z obu tych biaek in vivo: w wyniku ich wzajemnych oddziaywa allosterycznych dochodzi do przywrcenia naturalnej konformacji biaka Rho. Miejsca rut nie wykazuj podobiestwa sekwencji, s natomiast bogate w reszty cytydyny, a ubogie w reszty guanozyny, co decyduje o braku struktur drugorzdowych. W normalnych warunkach szybko

Rys. 7.25. Hipotetyczny mechanizm dziaania biaka Rho, ATPazy zalenej od RNA, biorcej udzia w terminacji transkrypcji. Rybosomy (nie uwidocznione na schemacie) przyczaj si do mRNA w miejscu rbs (ang. ribosome binding site) i, przemieszczajc si w kierunku 5'->3' (gruba strzaka), rozpoczynaj syntez acucha polipeptydowego od kodonu start!" (AUG; formylometionina). Na rysunku zaznaczono przeduajce si acuchy polipeptydowe zwizane z czsteczkami tRNA. Do terminacji translacji i do dysocjacji rybosomw dochodzi przy kodonie stop!" (UAG; amber). Biako Rho ma wic dostp do mRNA dopiero na odcinku od UAG do koca 3'. Wie si ono z miejscem rut i, wykorzystujc energi hydrolizy ATP, przesuwa si w kierunku 5'->3', by moe przez obrt piercienia i nawijanie" RNA. Biako Rho, po dotarciu do polimerazy RNA, zmienia jej konformacj, doprowadzajc do terminacji transkrypcji

translacji odpowiada cile szybkoci elongacji transkryptu, w zwizku z tym polimeraza RNA jest oddzielona od najbliszego rybosomu bardzo krtkim odcinkiem RNA Warunki przestrzenne uniemoliwiaj wic dostp heksameru Rho do miejsca rut. Przesuwanie si rybosomu wzdu RNA moe zosta zahamowane w wyniku pojawienia si kodonu terminacji translacji (np. kodonu amber UAG) lub ze wzgldu na brak aminoacylo-tRNA, odpowiadajcego kolejnemu kodonowi (gd aminokwasowy). W tych warunkach odcinek RNA dzielcy zatrzymany w swoim biegu rybosom od kontynuujcej swj bieg polimerazy RNA ulega przedueniu, zezwalajc na wejcie do akcji biaka Rho (rys. 7.25). Dziaanie biaka Rho jest wic uzalenione od dostpnoci fragmentu RNA zawierajcego miejsce rut, nie zajtego przez rybosomy. To wyjania moliwo wspdziaania biaka Rho z terminatorami znajdujcymi si na kocu operonw (sekwencja wolna od rybosomw), a take niefunkcjonalno terminatorw wewntrzgenowych, ktre podczas normalnej translacji zajte s przez rybosomy. Naley podkreli, e wrd zalenych od Rho terminatorw (a) (b)
mut

u
/

osw

nm^

nm^ \

^rcy

polimeraza RNA

polimeraza RNA

Rys. 7.26. Polarno mutacji wywoana obecnoci wewntrzgenowego, zalenego od Rho terminatora, (a) Polimeraza RNA, po zwizaniu si z promotorem p, transkrybuje geny operonu X, Y i Z, po czym odcza si, gdy osignie terminator t. Wewntrzgenowy terminator tQ nie funkcjonuje, gdy pierwszy rybosom przesuwa si wzdu mRNA tu za polimeraz RNA: brak wolnego od rybosomw fragmentu RNA, niezbdnego do funkcjonowania biaka Rho. W wyniku translacji powstaj biaka (przedstawione jako spiralki) kodowane przez wyej wymienione geny. (b) Rybosomy zatrzymuj si na nonsensownym kodonie amber, powstaym w wyniku mutagenezy w miejscu zaznaczonym mut; pojawia si wic wolny od rybosomw fragment mRNA, zdolny do przyczenia biaka Rho. Biako to dogania" polimeraz RNA, wywoujc dysocjacj kompleksu DNA-RNA-polimeraza RNA w miejscu t0. W wyniku translacji powstaje jedynie N-terminalny fragment biaka determinowanego przez gen X, ktry najczciej ulega degradacji

nie znaleziono adnego podobiestwa sekwencji, ani nawet sekwencji bogatych w pary AT, co rni te terminatory od terminatorw niezalenych od Rho. Wystpowanie terminatorw wewntrzgenowych tumaczy znane od dawna zjawisko polarnoci mutacji. Ot zdarza si od czasu do czasu, e mutacja nonsensowna w jednym z genw operonu nie tylko unieczynnia ten gen, lecz rwnie uniemoliwia lub zmniejsza ekspresj tych genw operonu, ktre s pooone dalej, zgodnie z kierunkiem transkrypcji (ang. downstream). Dzieje si to wtedy, gdy mutacja ta pojawia si w odpowiedniej odlegoci przed wewntrzgenowym terminatorem (rys. 7.26). Rybosom zatrzymuje si wtedy

na nonsensownym kodonie RNA, wskutek czego pojawia si wolny od rybosomw RNA, umoliwiajcy przyczenie biaka Rho i przedwczesn terminacj transkrypcji.

7.11. Atenuacja Terminatory transkrypcji, niezalenie od tego, czy wymagaj wspdziaania Rho, czy nie, wykazuj rny stopie efektywnoci. Jedynie w przypadku niezalenych od Rho terminatorw mona to tumaczy odstpstwami od kanonicznej sekwencji nukleotydowej silnego" (efektywnego) terminatora. Istniej terminatory, ktrych efektywno jest regulowana w zalenoci od potrzeb komrki bakteryjnej (atenuacja) czy programu rozwoju wirusa bakteryjnego (antyterminacja). W obu przypadkach zmniejszenie efektywnoci terminacji umoliwia transkrypcj genw pooonych za terminatorem, zgodnie z kierunkiem biegu polimerazy RNA. A wic kontrola ekspresji genw odbywa si moe nie tylko przez inicjacj transkrypcji, lecz rwnie na etapie jej terminacji. Wiele operonw biosyntezy aminokwasw podlega regulacji przez atenuacj, mechanizm, ktry uzalenia syntez aminokwasu od zniesienia sygnau terminacji dla polimerazy RNA. Niezaleny od Rho terminator, zwany atenuatorem, znajduje si midzy promotorem a zespoem genw kodujcych enzymy szlaku biosyntezy aminokwasu (rys. 7.27). Istot tego mechanizmu kontrolnego jest dostosowanie syntezy aminokwasu do wewntrzkomrkowego stetrpL P o trpE trpD trpC trpB trp A

nmw

nsmiF

11

syntetaza antranilowa

11 i syntetaza syntetaza tryptofanowa indologlicerofosforanu

nmw

nmw

nm^

/ kwas choryzmowy

\ kwas antranilowy

\ / \ fosfory bo- -+DRP-- indolozyloantragliceronilan fosforan

tryptofan

Rys. 7.27. Operon biosyntezy tryptofanu, skadajcy si z 5 genw strukturalnych: trpE, trpD, trpC, trpB, trpA, determinujcych syntez 3 syntetaz: antranilowej, indologlicerofosforanu i tryptofanowej. Przy zapotrzebowaniu na tryptofan polimeraza RNA transkrybuje cay operon, od promotora p do terminatora t. Natomiast przy nadmiarze tryptofanu dochodzi do przedwczesnej terminacji (atenuacji) w warunkowym" terminatorze, czyli atenuatorze a. Cz operonu zawarta midzy promotorem a pierwszym genem strukturalnym, zawierajca atenuator, to rejon liderowy (ang. leader), trpL

nia aminoacylo-tRNA: gdy aminoacylo-tRNA jest dostpny, synteza ulega zahamowaniu, lecz gdy aminoacylo-tRNA zostanie zuyty, synteza aminokwasu bdzie wznowiona. Rozwizanie zagadki molekularnego mechanizmu atenuacji jest w duej mierze zasug Charlesa Yanofsky'ego z Uniwersytetu Stanforda. Punktem wyjcia bya obserwacja, e w tzw. rejonie liderowym, zawartym midzy promotorem a pierwszym genem strukturalnym kadego operonu, wystpuj tandemowo co najmniej dwa kodony dla tego aminokwasu, ktrego syntezie dany operon suy. A wic w rejonie liderowym operonu syntezy tryptofanu trpL wystpuj obok siebie dwa kodony tryptofanowe UGG. W rejonie wiodcym operonu histydyny jest a siedem kodonw histydyny. Wysunito wic hipotez, e mRNA rejonu liderowego ulega translacji i e gdy brak tryptofanylo-tRNA zatrzymanie rybosomu na kodonach tryptofanowych pozwala tej czci mRNA, ktra si przed nim znajduje, na wytworzenie struktury drugorzdowej uniemoliwiajcej powstanie szpilki do wosw" sygnau tehninacji transkrypcji. Analiza sekwencji nukleotydowej rejonu trpL wykazaa moliwo utworzenia dwu rodzajw struktur drugorzdowych przez odpowiadajcy temu rejonowi mRNA (rys. 7.28).
(n\ rybosom'% nadmiar tryptofanu sygna terminacji: TAK transkrypcja operonu: NIE *

brak tryptofanu sygna terminacji: NIE transkrypcja operonu: TAK Rys. 7.28. Struktury drugorzdowe rejonu liderowego operonu syntezy tryptofanu. W rejonie tym mona wyrni cztery sekwencje, oznaczone numerami od 1 do 4. O wytworzenie struktury dwuniciowej z sekwencj nr 3 konkuruj sekwencje nr 2 i nr 4. (a) Kombinacja 34 wytwarza struktur szpilki do wosw", ktra jest sygnaem terminacji transkrypcji. Do wytworzenia tej struktury doj moe tylko wtedy, gdy sekwencja nr 2 zostaje zablokowana przez rybosom. Dzieje si tak, gdy tryptofan wystpuje w nadmiarze, (b) Gdy rybosom zostaje zatrzymany na kodonach tryptofanowych (ze wzgldu na brak tryptofanylo-tRNA), sekwencja nr 2 wygrywa we wspzawodnictwie o sekwencj nr 3, uniemoliwiajc wytworzenie sygnau terminacji. Nastpuje ekspresja genw operonu tryptofanu

Do tej pory nie udao si wykry postulowanego peptydu liderowego"; by moe jest on wyjtkowo niestabilny. Analiza mutantw trpL (uzyskanych przez mutagenez ukierunkowan) o zmienionych moliwociach tworzenia struktur drugorzdowych dowodzi jednak susznoci przedstawionej hipotezy. A zatem atenuator, w odrnieniu od innych terminatorw, jest elementem regulacji

transkrypcji, a atenuacja mechanizmem opartym na przedwczesnej terminacji transkrypcji, ktry pozwala na dostosowanie niektrych procesw biosyntezy do potrzeb komrki.
Tabela 7.2. Efektywno regulacji ekspresji operonu syntezy tryptofanu, mierzona stopniem zmniejszenia transkrypcji tego operonu. Jako ukad odniesienia przyjto maksymaln transkrypcj operonu trp przy cakowitym braku tryptofanu w rodowisku System regulacji ekspresji operonu trp 1 2 1x 2 Regulacja inicjacji transkrypcji przez represj Regulacja przedwczesnej terminacji transkrypcji Efektywno 70 x 8-10 x 560-700 x

W ekspresji operonu syntezy tryptofanu atenuacja nakada si na regulacj inicjacji transkrypcji opart na represji. Nadmiar tryptofanu, kocowego produktu szlaku metabolicznego, aktywuje swoiste dla niego biako represorowe, ktre, wic si z sekwencj operatora (wewntrz promotora trp), blokuje inicjacj transkrypcji. Jest to wic przykad regulacji w wyniku ujemnego sprzenia zwrotnego. Z kadym z tych mechanizmw zwizana jest okrelona efektywno dziaania; ich wsppraca doprowadza do bardzo wysokiej efektywnoci (tab. 7.2).

7.12. Antyterminacja Moliwo zniesienia sygnau terminacji transkrypcji zezwala niektrym fagom w trakcie ich wewntrzkomrkowego rozwoju na przejcie od ekspresji jednego rejonu do ekspresji nastpnego rejonu DNA. Mechanizm tego procesu, cakowicie rny od atenuacji, nosi nazw anty terminacji. Jak to opisano wczeniej, niektre fagi do tego samego celu wykorzystuj kontrol na poziomie inicjacji transkrypcji: kodowane przez faga biaka, nowa polimeraza RNA lub nowe podjednostki a su do rozpoznawania pniejszych" fagowych promotorw, rnicych si od promotorw wczeniejszych". Antyterminacja wymaga okrelonej organizacji genw: wczesne geny wystpuj w bezporednim ssiedztwie genw, ktrych ekspresja zachodzi pniej i s od nich odgrodzone terminatorem. Zniesienie terminacji transkrypcji powoduje, e polimeraza RNA rozpoczynajca transkrypcj w promotorze genw wczesnych kontynuuje j w rejonie genw eksprymowanych pniej. Natomiast regulacja transkrypcji na poziomie inicjacji nie wymaga wystpowania rejonu genw pniejszych w tandemie z rejonem genw wczeniejszych. Najlepiej poznano mechanizm antyterminacji w rozwoju faga L Oglny przebieg jest taki, jak dla innych fagw: polimeraza RNA gospodarza transkrybuje wczesne geny, a jedno z biaek determinowanych przez ten rejon umoliwia transkrypcj nastpnego zespou genw fagowych. U faga k geny

transkrybowane bezporednio po zakaeniu nazywane s najwczeniejszymi (ang. immediate-early), kolejne geny wczesnymi (ang. early), a te transkrybowane na kocu pnymi (ang. late). Przejcie od pierwszego do drugiego etapu wymaga biaka N, kodowanego przez jeden z fagowych genw najwczeniejszych, a przejcie od drugiego do trzeciego etapu biaka Q, kodowanego porzez jeden z fagowych genw wczesnych. Wystpuje tu wic kaskada ekspresji genw, chyba pierwsza tak dobrze zbadana w historii genetyki molekularnej. Kade z tych biaek regulatorowych N i Q funkcjonuje w swoistej dla antyterminacji, stanowic element kontroli pozytywnej: ich mutacyjna inaktywacja blokuje przejcie od wczeniejszego do pniejszego etapu transkrypcji; s to oczywicie mutacje letalne dla faga. Poniej przedstawiono mechanizm antyterminacji. Geny rejonu najwczeniejszego N i ero oddzielone s od rejonw wczesnych zalenymi od Rho
/

^-nmw ^
N

.
PL

PR

E R O

FR1

Rys. 7.29. Transkrypcja rejonu najwczeniejszego faga X. Ni DNA faga X transkrybowana w lewo nazywa si /, w prawo r. Pozostae objanienia s w tekcie

terminatorami. Polimeraza RNA E. coli wie si z dwoma promotorami, pL i pR (ang. Left i Right) i transkrybuje geny N i ero, a do terminatorw, odpowiednio tL1 i tR1. Biako N dziaa tak, e polimeraza RNA ju nie rozpoznaje sygnaw terminacji w miejscach tL1 i f R1 (rys. 7.29). Wkrtce po inicjacji transkrypcji podjednostka cr70 spontanicznie oddysocjowuje od polimerazy RNA E. coli. Enzym ten w trakcie elongacji wie biako NusA, niezbdne dla terminacji, a take dla przyczania biaek antyterminacyjnych. Powstanie kompleksu antyterminacyjnego zawierajcego biako

Rys. 7.30. Przeksztacanie kompleksu elongacyjno-terminacyjnego a2/?/?'NusA w kompleks elongacyjno-antyterminacyjny podczas najwczeniejszej" transkrypcji DNA faga X. Proces moe zaj dopiero po transkrypcji sekwencji nut; istotn rol w przyczaniu fagowego biaka N i bakteryjnych biaek NusB, NusG i SIO odgrywa mRNA nut o strukturze szpilki do wosw"

N moe nastpi dopiero po transkrypcji miejsca nut (ang. N utilisation), zawierajcego sekwencj palindromow. Wszystko wskazuje na to, e fragment nut mRNA, tworzcy struktur szpilki do wosw" odgrywa zasadnicz rol w tym procesie. Po zwizaniu fagowego biaka N i mRNA nut, z polimeraz RNA wi si bakteryjne biaka: NusB? NusG i SIO; ostatnie zaliczane jest do biaek rybosomalnych (rys. 7.30). Kompleks polimerazy RNA z wymienionymi picioma biakami elongacji transkrypcji jest niewraliwy na dziaanie biaka Rho i nie zatrzymuje si na zalenych od Rho terminatorach; tak dochodzi do transkrypcji rejonu wczesnego. W obecnoci fagowego biaka antyterminatorowego N terminacja transkrypcji w zalenych od Rho terminatorach bakteryjnych zachodzi normalnie. Jednak, jeeli gen bakteryjny z zalenym od Rho terminatorem zostanie wczony metodami inynierii genetycznej do rejonu wczesnej transkrypcji faga A, to biako N wywoa antyterminacj. Najprawdopodobniej brak odpowiednio zlokalizowanych miejsc nut w chromosomie bakteryjnym jest przyczyn niezachodzenia N-antyterminaji. Biako N jest niestabilne (czas poowicznego rozpadu wynosi 5 min), lecz nie przeszkadzao w jego funkcjonowaniu, poniewa transkrypcja i translacja genu N zachodzi tu przed jego dziaaniem w cis" po transkrypcji miejsca nut. Transkrypcja z wczesnych promotorw pL i pR jest zbdna, a nawet szkodliwa w pniejszym okresie rozwoju faga X\ m.in. wtedy powinien powsta nowy kompleks antyterminacyjny, zawierajcy biako Q. W tym aspekcie niestabilno biaka N jest uzasadniona.

7.13. Uwagi kocowe W przedstawionym opisie struktury i funkcjonowania genw organizmw prokariotycznych zajto si przede wszystkim transkrypcj DNA i regulacj tego procesu, kluczowego dla przekazywania informacji genetycznej od DNA do biaka. Naley jednak wspomnie o tym, e transkrypcja bierze udzia w regulacji dwu pozostaych wielkich" procesw biologii molekularnej replikacji DNA i translacji u tych jednokomrkowych organizmw. Transkrypcja rozplata heliks DNA E. coli w celu umieszczenia biakowego kompleksu replikacyjnego midzy komplementarnymi nimi DNA w miejscu inicjacji replikacji. By moe, to wanie ta n transkrypcyjna aktywacja ori replikacji" poredniczy w przekazywaniu nie zdefiniowanego jeszcze sygnau inicjacji replikacji, ktry powstaje na okrelonym etapie cyklu komrkowego. W regulacji translacji z kolei istotn rol odgrywa niekiedy antisense RNA", ktry, wytwarzajc struktur drugorzdow z komplementarnym fragmentem mRNA, uniemoliwia funkcjonowanie tego mRNA w translacji. Podane przykady powizania transkrypcji z replikacj i translacj s dogodnym modelem do badania analogicznych procesw zachodzcych w organizmach -eukariotycznych. W miar postpu bada coraz czciej zdarza si, e zjawiska

zarezerwowane" dla eukariontw mona wykry u prokariontw. W tym kontekcie naley wymieni obecno intronu w genie syntetazy tymidylanowej faga T4 i jego wycinanie w komrce E. coli, a take syntez DNA na matrycy RNA (odwrotna transkrypcja) prowadzc do powstawania msDNA (ang. multicopy single stranded) u Myxococcus xanthus i E. coli. W celu zapoznania si z tymi problemami, a take pogbienia i uaktualnienia wiedzy zawartej w poszczeglnych podrozdziaach odsyamy czytelnika do drugiego wydania monografii Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology", F.C. Neidhardt, J. Ingraham, K.B. Low, B. Magasanik, M. Schaechter, H. Umbarger, ASM, Washington, D.C.

8. STRUKTURA I DZIAANIE GENW EUKARIOTYCZNYCH

U Eukaryota regulacja dziaania genw rni si pod dwoma podstawowymi wzgldami od regulacji dziaania genw u bakterii. Po pierwsze, Eukaryota maj jdro komrkowe, co, powodujc oddzielenie procesu transkrypcji i translacji, wprowadza dodatkowe moliwoci regulacji dziaania genw, np. przez regulacj eksportu mRNA z jdra. Po drugie, wikszo Eukaryota to organizmy wielokomrkowe, u ktrych dla danej komrki nie jest konieczne wczanie wszystkich moliwych genw. Niektre musz by czynne zawsze, inne tylko w danym momencie ycia komrki (np. w konkretnym stadium rozwoju), jeszcze inne musz by wczane zawsze po zadziaaniu odpowiedniego bodca, np. hormonu czy szoku cieplnego. Co wicej, w trakcie rozwoju pewne geny s wyczane w sposb nieodwracalny. Dotychczas nie bardzo wiadomo, jak komrki eukariotyczne daj sobie z tym rad. Na pewno due znaczenie ma struktura chromatyny, omwiona w rozdziale 3. W tym rozdziale omwione bd poziomy, na ktrych moe by regulowane dziaanie genw, z wyjtkiem translacji, ktra jest omwiona w rozdziale 5. Pierwszym etapem w ekspresji genu jest transkrypcja. U Eukaryota istniej trzy polimerazy RNA, odpowiedzialne za syntez stabilnych klas RNA (polimeraza I i III) oraz za syntez czsteczek RNA kodujcych biaka (polimeraza II). Podstawowym problemem jest wizanie polimerazy z DNA, adna z eukariotycznych poiimeraz sama z DNA si nie wie i potrzebne s dodatkowe czynniki biakowe, zwane czynnikami transkrypcyjnymi, ktre umoliwiaj polimerazie zwizanie si z DNA i rozpoczcie transkrypcji. Caa istota regulacji dziaania genu opiera si na obecnoci i interakcjach tych czynnikw transkrypcyjnych. Ich obecno i aktywno zaley od stanu fizjologicznego komrki, od jej otoczenia, od jej przeszoci i od wielu innych parametrw, tak e podjcie decyzji wczy gen" czy wyczy gen" nie jest spraw atw. Po zajciu transkrypcji RNA ulega przemianom. W wikszoci genw kodujcych biaka, a take w wielu genach kodujcych stabilne klasy RNA

(tRNA) u Eukaryota obszary kodujce produkt genu przerywane s przez sekwencje niekodujce introny, ktre s usuwane w procesie skadania transkryptu. Geny takie, zwane genami niecigymi, z bardzo nielicznymi wyjtkami nie wystpuj u bakterii. Usuwanie intronw to kolejny etap regulacji dziaania genu, poniewa dla niektrych transkryptw istnieje moliwo wytworzenia kilku rodzajw mRNA. Regulowane s take dalsze etapy wychodzenie transkryptu z jdra do cytoplazmy, jego stabilno, translacja i stabilno ostatecznego produktu biaka. 8.1. W komrkach Eukaryota trzy rne rodzaje polimeraz RNA przeprowadzaj transkrypcj W odrnieniu od bakterii, u ktrych wystpuje jedna polimeraza RNA, przeprowadzajca transkrypcj wszystkich genw (chocia nie zawsze z t sam podjednostk cr), w komrkach eukariontw obecne s trzy rne polimerazy RNA, zwane I, II i III. Transkrybuj one odrbne klasy genw, a rozrniane s na podstawie wraliwoci na trucizn oe-amanityn (tab. 8.1). Najbardziej wraliwa jest polimeraza II, najmniej I, a polimeraza III wykazuje waciwoci porednie.
Tabela 8.1. Polimerazy RNA u Eukaryota

Nazwa Polimeraza I Polimeraza II Polimeraza III

Produkty transkrypcji 5.8S,18S i 26S rRNA biaka, snRNA 5S rRNA, tRNA, snRNA 7SL RNA

Wraliwo na a-amanityn

+
+

Dotychczas nie jest ustalona dokadna budowa polimeraz eukariotycznych. Kada skada si z dwch duych podjednostek (masa powyej 100 kDa) i ok. 8 mniejszych; due podjednostki s odrbne dla kadego rodzaju polimerazy, natomiast cz maych jest wsplna dla pewnych klas. Najwiksza podjednostka polimeraz ma homologi do podjednostki ^'-polimerazy bakteryjnej. W polimerazie II na C-kocu najwikszego biaka znajduje si sekwencja heptapeptydu SerProSerTyrSerProTre powtrzona kilkadziesit razy (np. 26 razy u drody Saccharomyces cerevisiae, 40 razy u Drosophila melanogaster), ktra jest niezbdna dla dziaania enzymu. 8.2. Polimerazy RNA wi si z DNA tylko w obecnoci dodatkowych czynnikw transkrypcyjnych Wspln cech dla wszystkich trzech polimeraz Eukaryota jest to, e adna z nich nie potrafi czy si z DNA sama, wszystkie wymagaj do tego dodatkowych czynnikw, zwanych czynnikami transkrypcyjnymi. Czynniki te

nosz rne nazwy, ale na og stosowana jest ujednolicona nomenklatura, gdzie kady czynnik oznacza si symbolem TF (ang. transcription factor), nastpnie jest liczba I, II lub III, mwica, z ktr polimeraz czynnik ten wspdziaa i dua litera (A, B, C itp.) okrelajca dany czynnik. Na przykad TFIID to czynnik transkrypcyjny dla polimerazy II, a TFIIIA to czynnik transkrypcyjny dla polimerazy III, ktry bierze udzia wycznie w transkrypcji genw kodujcych 5S rRNA. Ostatnio nazewnictwo czynnikw transkrypcyjnych ulega pewnej komplikacji, poniewa okazao si, e wikszo czynnikw z grupy IIF skada si z wielu biaek, ktre w miar jak zostaj uzyskiwane w formie czystej otrzymuj wasne nazwy. 8.3. Polimeraza I odpowiedzialna jest za syntez trzech klas rRNA W skad rybosomw Eukaryota wchodz 4 klasy rRNA 26S, 18S, 5.8S i 5S rRNA. Geny kodujce 5S rRNA transkrybowane s przez polimeraz III, natomiast geny kodujce trzy pozostae klasy rRNA tworz wspln jednostk transkrypcyjn, zbudowan tak jak to przedstawiono na rysunku 8.1. U wikszoci Eukaryota jednostki te s tandemowo powtrzone w genomie. Obszar inicjacji
ETS 18$ | ITS1 | 5.8S | ITS2 | 26S | NTS |

Rys. 8.1. Organizacja genw rRNA tzw. jednostka powtarzajca si, zoona z sekwencji odpowiadajcych 18S, 5.8S i 26S rRNA. Pierwotny transkrypt zawiera sekwencje poprzedzajce gen 18S rRNA, krtki odcinek za 3'-kocem genu 26S rRNA i oczywicie sekwencje trzech rRNA oraz dwie krtkie sekwencje pooone midzy nimi (ITS i 1TS2). Cz jednostki powtarzajcej nie ulega transkrypcji (NTS). Pierwotny transkrypt jest przerabiany na trzy dojrzae w jderku

transkrypcji poprzedza sekwencj genu 18S rRNA. Produktem transkrypcji jest czsteczka zwana pre-rRNA, zawierajca trzy klasy rRNA poczone ze sob we wsplnym transkrypcie, z ktrego nastpnie s odcinane fragmenty pooone przed kocem 5' 18S rRNA i za kocem 3' 26S rRNA oraz wycinane s regiony pooone midzy sekwencjami poszczeglnych rRNA. Proces ten zachodzi w jderku i bierze w nim udzia kompleks enzymw oraz kwas rybonukleinowy tzw. U3 snRNA. U niektrych organizmw (Tetrahymena, Physarum) w genach kodujcych 26S rRNA obecne s introny, ktre musz ulec wyciciu. 8.4. Polimeraza III RNA syntetyzuje wiele klas maych RNA Polimeraza III odpowiedzialna jest za transkrypcj wielu genw, ktrych produktami s mae czsteczki RNA. S to m. in. geny kodujce tRNA (ok. 75 nukleotydw), 5S rRNA (120 nukleotydw) i wiele innych RNA, w tym rwnie kodowanych przez niektre wirusy.

tDNA 5S DNA+1

RR Y H N

RY

+18 G

--N33-43-

+53 +61 GTTCRANNCA

TTT

+50

p i/ ri GTCGGGCCTGGTTAGTACTTGGA A ri AOo AH r W L /W o n +83

+60

Rys. 8.2. Sekwencje zachowawcze w obrbie promotora genw 5S rRNA i tRNA. Zaznaczono homologi midzy pierwszym blokiem promotora genw tRNA i promotorem genw 5S rRNA. R puryna, Y pirymidyna, N dowolny nukleotyd. + 1 oznacza pierwszy nukleotyd transkryptu

Sensacj byo stwierdzenie, e promotor polimerazy III jest dla#genw 5S rRNA i tRNA pooony w orodku samego genu (rys. 8.2). Dla genu 5S by to obszar od 50 do 80 nukleotydu, a dla genw tRNA dwa obszary od 9 do 20 i od 50 do 70 nukleotydu. W przypadku genw tRNA odlego midzy dwoma blokami moga by zmieniana o ok. 30 nukleotydw bez wpywu na transkrypcj, a dwa konserwowane bloki odpowiaday konserwowanym ptlom tRNA (rys. 8.3).

"- p - JS|4 H
"0P = 0 I 0 1 "0P = 0 I 0 1 ch 2 .n. O H O H

Rys. 8.3. Struktura czapeczki na 5'-kocu eukariotycznych mRNA i hnRNA. Kocowy nukleozyd poczony jest z 5'-kocem mRNA za pomoc wizania 5'5'. Ryboza nastpnego nukleozydu, a czasem take i drugiego, ulega metylacji

H 0 (CH3) I "0P = 0 I 0 1 CH2 n

0 0(CH3) 1 -P=0

Do transkrypcji genw tRNA niezbdne s dwa czynniki transkrypcyjne TFIIIB i TFIIIC, do syntezy 5S rRNA wymagany jest dodatkowo czynnik TFIIIA. Polimeraza III odpowiedzialna jest take za syntez innych maych czsteczek RNA, w tym U6 snRNA, ktry bierze udzia w procesie wycinania intronw. Promotor dla genw U6 snRNA ma inn budow ni wyej opisane promotory dla polimerazy III. Pooony jest w kierunku 5' genu i nie obejmuje sekwencji kodujcych. 8.5. Geny kodujce biaka s transkrybowane przez polimeraz II Przypuszcza si, e w genomach ssakw jest ok. 50 000 genw, olbrzymia wikszo z nich koduje biaka. S one transkrybowane przez polimeraz II, ktra rwnie jest odpowiedzialna za syntez wielu maych RNA i snRNA, wchodzcych w skad kompleksu, ktry usuwa introny z pierwotnych transkryptw. Charakterystyczn struktur dla wszystkich transkryptw syntetyzowanych przez polimeraz II jest tzw. czapeczka (cap), czyli guanozynotrifosforan (GTP) przyczony na kocu 5' powstajcego RNA za pomoc wizania 5'5'. Tylko niektre klasy RNA, syntetyzowane przez inne polimerazy, maj czapeczk (np. U6 snRNA); ma ona jednak inn budow. Polimeraza II do rozpoczcia transkrypcji wymaga dwch grup czynnikw. Pierwsza grupa to czynniki TFII (A, B, D, E i F), wiele z tych czynnikw skada si z biaek i wspdziaa jeszcze z dodatkowymi biakami. Geny kodujce wiele skadnikw tych czynnikw zostay ju sklonowane i niektre wykazuj podobiestwo do bakteryjnego czynnika cr. Czynniki te s niezbdne do zwizania polimerazy RNA, ale wydaje si, e nie reguluj aktywnoci genw. Funkcje regulatorowe peni druga, bardzo dua grupa czynnikw, ktra bdzie omwiona poniej. 8.6. Promotory dla polimerazy II skadaj si z wielu sekwencji, z ktrymi wi si czynniki transkrypcyjne Promotor dla polimerazy II to przylegajcy do miejsca startu transkrypcji obszar regulatorowy, wicy rne czynniki transkrypcyjne. Obejmuje on od kilkudziesiciu do ok. 200 nukleotydw, a z sekwencjami mog wiza si rne czynniki. W regionie tym poza sekwencj TATA ( 30) do czsto wystpuje w 80 sekwencja CAAT. Na transkrypcj wpywaj take inne obszary, pooone poza obszarem promotora, zwane sekwencjami wzmacniajcymi (enhancerami). Dla wikszoci genw do przyczenia polimerazy II do DNA konieczna jest sekwencja TATA, pooona w pozycji 30 w stosunku do pierwszego

nukleotydu transkrybowanego przez t polimeraz. Z sekwencj t wie si czynnik TFIID (a dokadnie jego skadnik TBP TATA binding protein), przy czym wizanie zachodzi jedynie w obecnoci czynnika TFIIA. Po przyczeniu TFIID kolejno wi si TFIIB, sama polimeraza, a nastpnie czynniki TFIIE i TFIIF (rys. 8.4). (a)
sekwencja TATA start transkrypcji

(b)

Rys. 8.4. Czynniki transkrypcyjne biorce udzia w wizaniu polimerazy II. (a) Odsonity promotor, (b) Kompleks transkrypcyjny powstajcy po zawizaniu kolejno czynnika transkrypcyjnego TFIIA (A), TFIID (D), TFIIB (B), polimerazy RNA (pol II) i czynnikw TFIIE (E) i TFIIF (F)

Niedawno wykryto, e TBP jest wsplnym elementem dla wszystkich trzech rodzajw poiimeraz RNA i mimo swojej nazwy jest take konieczny do inicjacji transkrypcji z promotorw, w ktrych nie wystpuje sekwencja TATA. Regulacja dziaania genu polega na przyczaniu si do jego obszarw regulatorowych odpowiednich biaek. To, czy dane biaka przycz si, zaley od ich obecnoci w danej tkance i od obecnoci aktywatorw oraz inhibitorw, ktre wpywaj na dziaanie tych czynnikw.

8.7. Sekwencje wzmacniajce transkrypcj, podobnie jak promotory, wi czynniki transkrypcyjne, ale w odrnieniu od promotorw wpywaj na ekspresj niezalenie od swojego pooenia i orientacji wzgldem genu Regulacja dziaania genw wymaga kooperacji dwch obszarw promotorw, wicych czynniki transkrypcyjne, oraz obszarw, zwanych sekwencjami wzmacniajcymi transkrypcj. Niektre czynniki wizane przez sekwencje w enhancerach mog by takie same, jak czynniki wice si w promotorach, chocia nie dotyczy to czynnikw z grupy TFII. Natomiast o ile promotor musi przylega do transkrybowanej sekwencji, o tyle sekwencja wzmacniajca moe lee par tysicy par zasad przed genem, za genem, czy nawet w obrbie genu w jego intronie. Co wicej, jeli eksperymentalnie odwrci si sekwencj wzmacniajc o 180 w stosunku do genu, nie traci ona swojej funkcji.

Proponowano kilka mechanizmw dziaania tych sekwencji, obecnie uwaa si, e zachodz bezporednie interakcje midzy czynnikami transkrypcyjnymi zwizanymi z ehancerem i czynnikami transkrypcyjnymi zwizanymi z promotorem; w wyniku tych interakcji polimeraza rozpoczyna transkrypcj danego genu. Warto moe doda, e oprcz sekwencji wzmacniajcych transkrypcj znane s te sekwencje osabiajce transkrypcj (ang. silencer), ktre te mog by pooone daleko od genu. 8.8. Czynnikami transkrypcyjnymi mog by biaka o rnej budowie Struktura wielu czynnikw transkrypcyjnych jest ju dokadnie poznana. Kade z tych biaek zawiera co najmniej dwie odrbne domeny jedna suy do wizania si z DNA, a druga, zwana obszarem lub domen aktywujc, suy do interakcji z innymi elementami aparatu transkrypcyjnego (polimeraz czy innymi czynnnikami transkrypcyjnymi). Obszary te oddzielono od siebie dowiadczalnie, konstruujc zrekombinowane biaka zawierajce domen wic i domen aktywujc z rnych czynnikw transkrypcyjnych i stwierdzono, e dany obszar wicy DNA moe wspdziaa z rnymi obszarami aktywujcym. Zagadnienie to bdzie dokadniej omwione w podrozdziale 8.9, na przykadzie czynnika transkrypcyjnego drody, zwanego GAL. W wielu znanych czynnikach transkrypcyjnych obszar aktywujcy jest tzw. amfipatycznym kwanym heliksem, tzn. jest to obszar zawierajcy kwasowe aminokwasy, ktre w a-heliksie pooone s po jednej stronie. Wydaje si, e obszar ten nie ma jakiej specyficznej sekwencji; wany jest kwasowy charakter. Inne obszary aktywujce zawieraj sekwencje poliglutaminowe lub poliprolinowe. Przypuszcza si, e kwasowe obszary aktywujce mog oddziaywa z zawierajcym powtrzony heptapeptyd C-kocem najwikszej podjednostki polimerazy II lub z histonami, albo z czynnikiem TBP.

Rys. 8.5. Budowa biaka typu heliks-skrt-heliks (wg D. Voet i J.G. Voet, Biochemistry. John Wiley, 1990 zmodyf.)

Czynniki transkrypcyjne klasyfikuje si na podstawie budowy domeny wicej DNA. Jedn grup stanowi biaka o strukturze heliks-skrt-heliks (rys. 8.5). Wikszo biaek regulatorowych u bakterii ma wanie tak struktur, a u Eukaryota wystpuje on m.in. wrd biaek z tzw. domen homeotyczn, obecn m.in. w wielu produktach genw zwizanych z regulacj rozwoju u Drosophila, a take w innych biakach eukariotycznych z tzw. grupy POU (skrt od pit, oct, unc p. niej). Domena homeotyczn skada si z 60 aminokasw i jest silnie konserwowana. Biaka z grupy POU zawieraj dodatkow niezbdn do wizania DNA domen 75 aminokwasw. Do biaek z grupy POU nale biaka: OCT1, OCT2, UNC86 i PIT1 penice funkcje regulatorw transkrypcji u rnych organizmw eukariotycznych, od nicieni do ssakw.

Rys. 8.6. Palec cynkowy. Zaznaczono konserwowane aminokwasy. H histydyna. C cysteina, A asparagina, T tyrozyna, F fenyloalanina, L leucyna (wg D. Voet i J.G. Voet, Biochemistry. John Wiley, 1990 - zmodyf.)

Inn grup stanowi biaka zawierajce tzw. palce cynkowe, oglny schemat ich budowy przedstawiono na rysunku 8.6. Pierwszym zbadanym biakiem tego typu by czynnik transkrypcyjny dla polimerazy III RNA, zwany TFIIIA. Specyficzny dla tych biaek ukad cystein i histydyn pozwala na wytworzenie palcw wicych jony cynku. Do grupy tej nale m.in. biaka SP1 i Kruppel. Znane s te biaka o palcach cynkowych zawierajcych tylko cystein, np. GATA1 specyficzny czynnik transkrypcyjny erytroblastw oraz areA, zwizany z regulacj metabolizmu azotowego u grzyba Aspergillus nidulans. Nastpne dwie grupy czynnikw transkrypcyjnych stanowi biaka wice si z DNA tylko w formie dimerw. Fakt ten ma due znaczenie dla regulacji dziaania genw, poniewa mog powstawa rne rodzaje homodimerw i heterodimerw, co powoduje, e z danej grupy np. czterech mogcych tworzy dimery czynnikw moe powsta 10 rnych dimerw. Sam obszar wicy jest zasadowy, ale monomeryczne biaka nie wi si z DNA. Do pierwszej grupy nale czynniki transkrypcyjne fos i jun (analogi czynnika AP1, oba wykryte jako onkogeny retrowirusw) i biako regulatorowe biosyntezy aminokwasw u drody GCN4; czynniki te zawieraj tzw. suwaki leucynowe (ang. leucine zippers) (rys. 8.7.) W biaku wystpuj w regularnych odstpach leucyny,

Rys. 8.7. Suwak leucynowy utworzony przez dwa a-heliksy (wg D. Voet i J.G. Voet, Biochemistry. John Wiley, 1990 zmodyf.)

ktrych hydrofobowe reszty tworz szczebelki, a dwa monomery cz si ze sob za pomoc tych szczebelkw. Druga grupa te zawiera biaka z obszarami niezbdnymi do dimeryzacji, zoonymi ze struktury dwu heliksw oddzielonych przez ptle, zwane HLH (ang. helix-loop-helix heliks-ptla-heliks). Do grupy tej nale: biako myoD odpowiedzialne za rnicowanie si mini i biaka zwizane z rnicowaniem si ukadu nerwowego u Drosophila. Niektre biaka aktywujce transkrypcj cz si nie z DNA, lecz z innymi biakami. Najbardziej znanym biakiem jest czynnik El A z adenowirusa, ktry m.in. czy si z czynnikiem TBP.

8.9. Regulacja niektrych genw zostaa ju dobrze poznana Do zrozumienia mechanizmw regulacji genw u organizmw eukariotycznych szczeglnie duo wniosy prace Struhla i Ptashnego dotyczce systemu regulacji katabolizmu galaktozy i biosyntezy aminokwasw u drody.

(b)

galaktoza

Rys. 8.8. Regulacja katabolizmu galaktozy u S. cerevisiae na przykadzie jednego z genw, gallO. Przy braku galaktozy do aktywatora GAL4 przycza si biako GAL80 hamujce jego dziaanie. Obecno galaktozy powoduje odczenie GAL80 od GAL4 i aktywacj transkrypcji gallO

GALA gal 10 mRNA

Ekspresja genw kodujcych enzymy rozkadajce galaktoz podlega kontroli dwch genw regulatorw GAL4 i GAL80. Produktem genu GAL4 jest klasyczny" aktywator transkrypcji wicy si z tzw. sekwencj UAS (ang. upstream activating seuence). Produktem genu GAL80 jest biako, ktre wie si z aktywatorem, umoliwiajc jego dziaanie. Galaktoza, bdca induktorem tego systemu, uniemoliwia zwizanie biaka GAL80 z aktywnym GAL4, co powoduje przyczenie biaka GAL4 do UAS i pozwala na rozpoczcie transkrypcji (rys. 8.8). Analiza mutacji w obrbie genu GAL4 pozwolia na zlokalizowanie trzech domen w kodowanym przez ten gen biaku, ktre odpowiadaj za wizanie si z DNA, wizanie z biakiem GAL80 i aktywacj transkrypcji. Za pomoc technik inynierii genetycznej skonstruowano wiele genw hybrydowych, w ktrych fragmenty kodujce poszczeglne domeny zastpiono fragmentami pochodzcymi z innych genw. Na przykad obszar wicy DNA w biaku GAL4 zastpowano odpowiedni domen z represora LexA* z E. coli, a UAS przez miejsce wizania LexA. Biako hybrydowe LexA-GA14 byo zdolne do aktywacji transkrypcji genu lecego przy miejscu wizania LexA. To znaczy, e do dziaania domeny aktywujcej biaka niezbdne jest zwizanie aktywatora transkrypcji z DNA, ale nie musi to by zwizane z konkretn sekwencj, skoro obszar wicy moe by zastpiony przez zupenie inny.

8.10. Niektre geny nie podlegaj regulacji Dotychczas opisywano tutaj geny, do dziaania ktrych niezbdne s kompleksy biaek regulatorowych i ktrych promotory obejmuj sekwencj ponad 100 nukleotydw; nieomal zawsze zawieraj one sekwencj TATA w pozycji 30. Istnieje jednak klasa genw, okrelana terminem angielskim housekeeping genes", oznaczajcym geny niezbdne do utrzymania metabolizmu komrkowego, ktrych ekspresja nie podlega regulacji. Do transkrypcji tych genw potrzebna jest tylko bardzo krtka sekwencja (ok. 30 par zasad), przylegajca do miejsca startu transkrypcji, zazwyczaj bogata w GC i zwierajca miejsca wizania dla czynnika transkrypcyjnego SP1. W genach tych nie wystpuje sekwencja TATA. Do grupy tej nale m.in. geny kodujce biaka rybosomalne, enzymy cyklu Krebsa itp.

8.11. Geny eukariotyczne s najczciej niecige Na pocztku lat 70. wiadomo byo, e w jdrze obecne s due czsteczki RNA, zwane hnRNA (ang. heterogeneous nuclear RNA heterogenny jdrowy RNA), niestabilne i zawierajce sekwencje nieobecne w cytoplaz1

Produkt genu lexA jest represorem wielu genw u E. coli.

matycznym RNA. Podejrzewano, e s one prekursorami mRNA, lecz zaleno midzy hnRNA i mRNA zrozumiano dopiero po wykryciu zjawiska niecigoci genw. Zjawisko to wykryto w poowie lat 70. u adenowirusw; wkrtce okazao si, e jest ono raczej regu ni wyjtkiem u wszystkich eukariontw. Polega ono na obecnoci w obrbie genw tzw. intronw, czyli sekwencji, ktre nie koduj ostatecznego produktu genu i s jak gdyby wtrtami w sekwencji kodujcej. Niektre introny w genach kodujcych biaka obecne s w obszarze przed sekwencj N-koca biaka. Sekwencje kodujce nazwano egzonami. Introny wystpuj zarwno w genach kodujcych biaka, jak i w genach kodujcych tRNA oraz rRNA, zarwno w genomach jdrowych, jak w organellach. Aby powsta funkcjonalny produkt genu (w postaci dojrzaej czsteczki tRNA, rRNA czy mRNA), konieczne jest wycicie intronw z pierwotnego transkryptu genu i poczenie ze sob egzonw. Proces ten okrela si jako skadanie RNA (ang. splicing).

8.12. Mechanizmy wycinania intronw Istnieje kilka rnych mechanizmw wycinania intronw z pierwotnych powstajcych transkryptw. W genach tRNA introny wystpuj zawsze o jeden nukleotyd za antykodonem i s do krtkie 19-60 nukleotydw. Mechanizm ich usuwania z transkryptu zosta przedstawiony na rysunku 8.9. U ssakw reakcja przeprowadzana jest przez dwa enzymy, jeden z nich rozszczepia wizania midzy egzonami i intronem, drugi za czy ze sob dwa egzony. Dla tzw. intronw grupy I obecnych w niektrych genach 26S rRNA i w wielu genach mitochondrialnych charakterystyczna jest skomplikowana drugorzdowa struktura, ktra powoduje do bliskie pooenie obu stykw intron-egzon. T. Cech i jego wsppracownicy wykazali, e do usunicia in vitro jednego z intronw, w genie kodujcym 26S rRNA u Tetrahymena termophila, nie s potrzebne jakiekolwiek biaka. Schemat samowycinania tego intronu przedstawiony jest na rysunku 8.10 (a). W podobny sposb ulega wycinaniu wiele intronw obecnych w genach mitochondrialnych. Wydaje si, e mimo i in vitro proces ten przebiega bez udziau biaek, in vivo w proces ten zaangaowane s biaka przypieszajce reakcj. Inne introny, tzw. klasy II, spotykane w genach mitochondrialnych, s take zdolne do samowycinania, ale wedug nieco innego schematu (rys. 8.10 (b), podobnego do wycinania intronw z transkryptw genw jdrowych kodujcych biaka. W obu przypadkach powstaje wizanie 2'5' midzy ostatnim 5'-terminalnym nukleotydem intronu i tzw. miejscem rozgazienia w intronie (rys. 8.10 (b) i 8.11). Wycinanie intronw klasy II nie wymaga in mtro ani ATP, ani adnych biaek. Introny II grupy maj, podobnie jak introny grupy I, silnie konserwowan struktur drugorzdow.

egzon 1

intron

egzon 2 endonukleaza

fosfataza egzon 1 I PH I |t egzon 2

Rys. 8.9. Wycinanie intronw z pierwotnych transkryptw genw tRNA. Pierwszy etap polegajcy na przeciciu obu stykw intron-egzon przebiega tak samo u rolin, drody i zwierzt. Taki sam jest te ostateczny wynik, natomiast o ile u zwierzt nastpuje prosta jednoetapowa religacja obu egzonw, o tyle u rolin i drody proces ten przebiega w kilku etapach i wymaga dodatkowo energii z ATP

Wyciananie intronw z hnRNA przebiega wedug schematu podanego na rysunku 8.12, z udziaem wielu maych RNA z grupy snRNA (mae jdrowe RNA) i wielu biaek; RNA wraz z biakami tworz tzw. spliceosom. Wsplne dla wszystkich Eukaryota jest zachowanie staych zczy intron-egzon. Zcze lewe (tzw. donorowe) rozpoznawane jest przez Ul snRNA, miejsce rozgazienia przez U2 snRNA. W procesie bierze jeszcze udzia kompleks U4/U6 snRNA i U5 snRNA. U wszystkich eukariontw przebieg tego procesu jest podobny nastpuje pknicie wizania na styku lewy egzon-intron, nastp-

GOH

(a)

5'l

UID^ Ulp"-^

3'

etap 1

5>CZ=ulg?i

-pG

etap 2

-pG

("OH

5'C

(b)

5'egzon

3 ; egzon

s
| 5' I 1 ^P1

3'

^bbh*

etap 2

+ lariat

5'L poczone egzony

Rys. 8.10. Samowycinanie si intronw grupy I (a) i II (b). W przypadku intronw grupy I potrzebna jest guanozyna lub GTP i w wyniku reakcji uwalniany jest intron w formie liniowej. W przypadku intronw grupy II nie jest konieczna obecno dodatkowych czynnikw i intron uwalniany jest w formie lassa (lariatu), w ktrym zaznaczona na rysunku adenozyna wytwarza oprcz normalnych wiza dodatkowe wizanie 2'5' z pierwszym nukleotydem intronu

5' punkt styku

AAGUAGU

3' punkt styku (Y)n NYAGJG UNCURAC (ssaki) UACUAAC [S. cerevisiae) punkt rozgazienia

Rys. 8.11. Konserwowane sekwencje na stykach intron-egzon, w obrbie intronu u ssakw oraz u drody S. cerevisiae. Nukleotydy szczeglnie silnie konserwowane podkrelono. Odcinek polipyrymidynowy pooony w pobliu prawego zcza intron-egzon skadajcy si z kilkunastu pirymidyn wystpuje tylko u ssakw R puryna; Y pirymidyna; N dowolna zasada

E1

GU

AG

C U

c i c i e
5'| Rys. 8.12. Wycinanie intronu z pre-mRNA. W pierwszym etapie zachodzi (w spliceosomie) przecicie lewego zcza egzon-intron oraz przyczenie 5'-koca intronu do punktu rozgazienia, ktrym jest zawsze A. W drugim etapie nastpuje przecicie drugiego zcza egzon-intron, uwolnienie intronu i poczenie ze sob dwch egzonw E1 h-OH

nie wolny 5'-koniec intronu (nukleotyd G) tworzy wizanie 2'5' z adenin w miejscu rozgazienia, a nastpnie zachodzi pknicie na drugim styku intron-egzon poczone z ligacj obu egzonw. Tworzenie kompleksu przedstawiono na rysunku 8.13. 8.13. Regulacja ekspresji genw u Eukaryota odbywa si te po transkrypcji Wydaje si, e olbrzymia wikszo genw u Eukaryota jest regulowana na poziomie transkrypcji, ale istniej te inne poziomy regulacji dziaania genw. S to: wybr jednego z kilku miejsc terminacji transkrypcji, tzw. alternatywny

Rys. 8.13. Wytwarzanie spliceosomu. Zaznaczono konserwowane nukleotydy na obu kocach intronu i miejsce rozgazienia. Jako pierwszy przycza si kompleks U l snRNP (tzn. kompleks U l snRNA-biaka) (a), jako drugi U2 snRNP (b), potem kompleks U4/U5/U6 snRNP (c). Nastpnie U4 snRNA, ktry jest poczony wizaniami wodorowymi zU6 snRNA odcza si od U6 snRNA, pozostajc przyczony do spliceosomu, ktry w tym momencie (d) jest zdolny do wycicia intronu i religacji egzonw

splicing, czyli rne wycinanie intronw z gotowego transkryptu, zmiany sekwencji transkryptu (tzw. editing, czyli redagowanie), regulacja transportu mRNA z jdra i jego stabilnoci oraz regulacja stabilnoci biaek. 8.14. W pewnych ukadach transkrypt nie jest kolinearny z genem redagowanie RNA (editing) Dla wielu genw wykryto w cigu ostatnich paru lat zadziwiajce zjawisko, ktre polega na tym, e sekwencje transkryptu tych genw nie s w peni kolinearne z odpowiednimi genami, lecz zawieraj bd punktowe mutacje, bd cakiem rozlege delecje i addycje pojedynczych nukleotydw. Przykady genw, dla ktrych wykryto to zjawisko podano w tabeli 8.2. Zjawisko to okrela si terminem redagowanie transkryptw (ang. editing).
Tabela 8.2. Znane przypadki redagowania transkryptw Typ redagowania Insercja i delecja jednego lub wicej U Zamiana C Zamiana A U G Wystpowanie mitochondrialne mRNA u pierwotniakw i Leishmania Trypanosoma

mRNA apolipoprotein B u ssakw, mRNA mitochondrialne rolin mRNA receptora kwasu glutaminowego w mzgu mRNA mitochondrialnego genu kodujcego podjednostk a syntazy ATP u Physarum niektre geny paramyksowirusw

Dodanie dodatkowych C Dodanie dodatkowych G

Znane s dotychczas dwa przypadki redagowania transkryptw genw jdrowych, reszta dotyczy genw mitochondrialnych lub wirusowych. Pierwszy przypadek dotyczy genu kodujcego apolipoprotein B u ssakw; gen ten koduje dwa polipeptydy, duszy o wielkoci 512 kDa wystpuje w wtrobie, krtszy o wielkoci 242 kDa w jelicrie. Sekwencja jelitowego mRNA zawiera w pozycji kodonu 2153 trjk nonsensown UAA, w mRNA w wtrobie w tej samej pozycji znajduje si CAA (glutamina). Kodon CAA obecny jest w tej pozycji take w samym genie. W wyniku mechanizmw posttranskrypcyjnych w jelicie specyficzna trjka CAA w pozycji 2153 ulega deaminacji, dajc kodon nonsensowny UAA i powodujc powstanie krtszego polipeptydu. Drugi przypadek dotyczy receptora kwasu glutaminowego w kanaach glutaminowych kor^rek mzgu. W genach wystpuje trjka CAG (glutamina), natomiast w niektrych mRNA w analogicznej pozycji znajduje si trjka CGG (arginina). Mechanizm wprowadzania tej zmiany jest na pewno posttranskrypcyjny, ale zupenie nie jest znany. U niektrych wirusw, m.in. u paramyksowirusa, przy transkrypcji niektrych genw polimeraza RNA zaczyna si jka (ang. polymerase stuttering) i wprowadza w konkretnym miejscu dodatkowe nukleotydy G (1 lub 2 u dwch rnych wirusw), co w efekcie powoduje powstawanie dwch biaek. Mechanizm tego zjawiska nie jest dotychczas poznany, ale jego skutkiem jest zwikszenie liczby biaek kodowanych przez genom wirusa. Wszystkie pozostae przypadki redagowania zachodz w mitochondriach. W mitochondriach ssakw geny upakowane s tak ciasno, e czasami nie s zakoczone kodonem stop, tylko na kocu mRNA wystpuje pojedynczy U; dopiero w wyniku poliadenylacji powstaje nie zakodowany w genomie kodon stop UAA. Przez jaki czas wydawao si, e w mitochondriach rolinnych istnieje odstpstwo od uniwersalnego kodu genetycznego. Sdzono, e w wielu biakach mitochondrialnych kodon CGG (arginina) powodowa wczanie do biaek tryptofanu. Okazao si, e w wyniku posttranskrypcyjnych modyfikacji niektre kodony CGG s zamieniane na normalne kodony tryptofanowe UGG. U luzowca Physarum w transkrypcie mitochondrialnego genu kodujcego podjednostk a syntazy ATP w 54 miejscach wczana jest nie kodowana w genie mitochondrialnym cy ty dyna. Najbardziej rozbudowany i zadziwiajcy jest system redagowania transkryptw genw mitochondrialnych u pierwotniakw Trypanosoma i Leishmania. U organizmw tych mitochondrialny DNA obecny jest w formie dwch rodzajw kolistych czsteczek maksi" i mini" rnicych si wielkoci (ang. maxicircles i minicircles). Due czsteczki s jednorodne, jest ich 20-50 kopii w jednym mitochondrium komrki, pooonym przy podstawie jedynej wystpujcej w komrce wici. Wystpuje ok. 10 000 minikek; s one mniej lub bardziej jednorodne i tworz co w rodzaju sieci. Geny mitochondrialne znajduj si na maksi kkach, ale dla niektrych genw konieczne jest redagowanie transkryptw po to, by powsta mRNA kodujcy syntez danego

biaka mitochondrialnego. Zakres redagowania moe by rny dla rnych transkryptw. Na przykad u Trypanosoma brucei w transkrypcie genu kodujcego II podjednostk oksydazy cytochromowej dodawane s posttranskrypcyjnie 4 urydyny, a w transkrypcie genu kodujcego III podjednostk oksydazy cytochromowej musi by dodanych 398 reszt urydyny w 158 rnych miejscach oraz 19 reszt urydyny w 9 miejscach musi ulec delecji.
pre mRNA 5'
AU

5' gRNA

endonukleaza

COH P

I f l l l l l Rys. 8.14. Jeden z proponowanych modeli redagowania, zakadajcy istnienie kompleksu enzymatycznego endonukleazy, terminalnej urydylotransferazy (TUTazy) i ligazy

terminalna u rydy lotransf eraza

-uTP - PPi

CU<H P t I 1 . . . 1
;AU-

ligaza ^

ATP AMP+PPi

Cup | M I I I I I -AU -

Poniewa redagowanie tych transkryptw zachodzi w sposb powtarzalny, postuluje si istnienie mechanizmu odpowiedzialnego za precyzyjne modyfikowanie RNA. Zarwno na duych, jak i na maych czsteczkach mitochondrialnego DNA obecne s sekwencje transkrybowane na krtkie RNA (ang. guide RNA), ktre su jako wyznaczniki miejsc redagowanych, do ktrych s czciowo komplementarne. Mechanizm tych reakcji nie jest w peni poznany, przez analogi z rybosomem i spliceosomem mwi si o edytosomie zawierajcym wiele aktywnoci enzymatycznych: endonukleaz, terminaln urydylotransferaz, ligaz RNA oraz 3'-egzonukleaz suc do wycinania urydyny w prekursorze mRNA (rys. 8.14). Ostatnio Cech zaproponowa znacznie prostszy mechanizm redagowania, zbliony do wycinania intronw grupy I, tzn. za pomoc reakcji transestryflkacji (rys. 8.15). Dodawanie urydyny pochodzcej z obecnej na 3'-kocu gRNA sekwencji poliU nie wymaga adnych dodatkowych czynnikw ani energii (rys. 8.15 (a)), natomiast usuwanie urydyny przypomina reakcj wycinania intronu, usunite U przycza si do sekwencji na 3'-kocu gRNA (rys. 8.15 (b)).

(a)
pre-mRNA

OH CpA l l l l l l l l * A U- gRNA

(b)

OH -AU pU I M M UA M

<4'jo ^ TUpA
"COH I I I I I I I I

V,PV M M M
/U A

AU

OH-

. Qy p M M M M I .GA U

ApU I M I M M I .U A

Rys. 8.15. Model redagowania wedug Cecha, dodawanie U (a) jest reakcj transestryfikacji, usuwanie U (b) reakcj typu skadanie z usuwaniem miniintronu

8.15. Regulacja przez wybr miejsca terminacji transkrypcji Wikszo transkryptw synetyzowanych przez polimeraz II ma na swoim 3'-kocu sekwencj poli A, ktra nie jest zakodowana w samym genie, lecz jest dodawana posttranskrypcyjnie. Sekwencje nukleotydowe poprzedzajce tzw. miejsce poliadenylacji, czyli dodawania poliA s przedstawione w tabeli 8.3. U zwierzt sekwencja AAUAAA znajduje si na 10-30 nukleotydw przed miejscem poliadenylacji, a za samym miejscem znajduje si kilka powtrze GU lub U. Niektre geny maj wicej ni jedno miejsce poliadenylacji i wybr
Tabela 8.3. Sygnay poliadenylacji u Eukaryota Organizm Drode (S. cerevisiae) Sekwencja najwyszej zgodnoci UAGUAUGUUUUlOn! UAC AUA 1 OOn! !50nUAUAUA U U A G U A U G U A U U U G U A 13nAAUAAA 14n! AUA AA1030n!1 On(GU) (lub) (U)J

Roliny Ssaki

Wykrzyknik oznacza miejsce poliadenylacji; dla drody podano kilka sekwencji wanych dla poliadenylacji. Sekwencja rolinna, w odrnieniu od sekwencji przedstawionych dla S. cerevisiae i ssakw, nie jest sekwencj najwyszej zgodnoci, ale najlepiej poznanym sygnaem poliadenylacji mRNA wirusa mozaiki kalafiora; n nukleotydy.

tego miejsca moe determinowa rodzaj powstajcego transkryptu. Z tak sytuacj mamy na przykad do czynienia w genach kodujcych ciki acuch immunoglobuliny, gdzie miejsce terminacji transkrypcji i zwizane z nim miejsce poliadenylacji decyduj o tym, czy powstanie przeciwciao rozpuszczalne, czy zwizane z bon (rys. 8.16). Warto moe zaznaczy, e nie jest jasne, jaki dokadnie jest sygna terminacji transkrypcji dla wikszoci genw, a w kadym razie dla genw, ktrych transkrypty ulegaj poliadenylacji. Wiadomo, e sekwencja AAUAAA lub odpowiednie inne sekwencje u drody i rolin s rozpoznawane przez endonukleaz i nastpnie enzym polimeraza poliA dodaje kilkadziesit do kilkuset adenin. Enzym ten wymaga kolejno dwch czynnikw warunkujcych jego specyficzno: czynnika zwanego CPF

E1

E2

E3

H U

mRNA forma rozpuszczalna

forma osadzona w bonie Rys. 8.16. To, czy powstanie rozpuszczalna, czy osadzona w bonie komrkowej forma przeciwciaa zaley od transkrypcji acucha cikiego mu (pt): s dwa moliwe miejsca poliadenylacji, nie jest jasne co powoduje wybr jednego z nich. Przy wyborze pierwszego miejsca powstaje rozpuszczalna, przy wyborze drugiego miejsca osadzona w bonie forma. Przy wyborze drugiego miejsca zaznaczony kolorem czarnym egzon specyficzny dla formy rozpuszczalnej ulega wyciciu w czasie skadania; a egzon specyficzny dla formy rozpuszczalnej, b egzony specyficzne dla formy osadzonej w bonie

(ang. cleavage and polyadenylation factor czynnik potrzebny do cicia i poliadenylacji), niezbdnego dla dodania pierwszych 10 adenin, oraz tzw. czynnika wicego poliA, ktry jest wymagany do syntezy reszty acucha poliA. Dobrze poznany jest mechanizm^terminacji transkrypcji genu kodujcego histon H3 u jeowca, jednego z nielicznych genw eukariotycznych, ktre nie maj transkryptw zakoczonych poliA. Do terminacji transkrypcji niezbdny jest jeden z snRNA, tzw. U7 o dugoci 57 nukleotydw, ktry jest komplementarny do obszaru terminacji transkrypcji histonu H3. Mutacje zaburzajce komplementarno midzy dwoma rodzajami RNA powoduj powstanie nieprawidowych 3'-kocw mRNA dla histonu H3. Tak wic przyczenie tego snRNA jest warunkiem prawidowej terminacji transkrypcji.

8.16. Regulacja przez wybr jednej z drg skadania transkryptu W rozdziale 13 przedstawiono pogld na pochodzenie i rol intronw. Jedn z korzyci ewolucyjnych ich obecnoci jest moliwo uzyskiwania wicej ni jednego produktu kocowego z danego obszaru kodujcego, poniewa dla niektrych genw istnieje kilka moliwoci skadania pierwotnego transkryptu (ang. alternative splicing). W wyniku czenia ze sob rnych egzonw danego genu powstaje wicej ni jeden rodzaj mRNA. Mechanizm, ktry powoduje wybr jednej z kilku moliwoci nie jest jeszcze poznany. Przykad takiego zjawiska podano na rysunku 8.17.
5'NT gen 3'NT 3'NT

minie prkowane

misnie gadkie mioblasty fibroblasty hepatoma mzg Rys. 8.17. Alternatywny splicing pokazany na przykadzie genu kodujcego a-tropomiozyn u szczura. Egzony czarne, introny biae, 5' NT i 3' NT obszary nie ulegajce translacji

8.17. Regulacja eksportu mRNA do cytoplazmy W jdrze komrkowym w danym momencie znajduj si dziesitki tysicy rnych transkryptw, w tym transkrypty zawierajce jeden lub wicej intronw, ktre nie powinny znale si w cytoplazmie. Mechanizmy zatrzymujce takie transkrypty w jdrze nie s dobrze poznane, ale wiadomo, e np. u retrowirusw mog istnie specjalne mechanizmy pozwalajce na transport z jdra transkryptw odpowiadajcych caemu genomowi wirusa, tzn. zawierajcych introny. Wiadomo te, e dla nielicznych genw wyszych Eukaryota, nie posiadajcych intronw, warunkiem prawidowego eksportu z jdra jest interakcja z generujcym dojrzay 3'-koniec transkryptu ukadem, tzn. w zalenoci od sytuacji bd z kompleksem przeprowadzajcym poliadenylacj, bd, jak to ma np. miejsce w przypadku histonw, z U7 snRNA i odpowiednimi enzymami.

8.18. Regulacja stabilnoci mRNA Stabilno mRNA jest bardzo istotna dla regulacji ekspresji genw od tego jak dugo dany mRNA moe by matryc dla syntezy biaek zaley jak dugo utrzyma si efekt wczenia danego genu. Okres ptrwania mRNA eukariotycznych zawiera si w bardzo szerokich granicach od bardzo krtkich minuty (wiele mRNA dla protoonkogenw czy innych biaek zwizanych z regulacj) do bardzo dugich (mRNA dla /J-globiny wiele dni). Wiadomo, e na stabilno mRNA ma wpyw obecno sekwencji bogatych w AU na 3'-kocu mRNA w obszarze nie ulegajcym translacji. Wystpuje ona w mRNA dla wielu protoonkogenw. Natomiast u zwierzt w mRNA dla histonw, ktre s intensywnie produkowane w fazie S, na obszarze 3'-koca obecna jest sekwencja warunkujca zaleno stabilnoci mRNA od cyklu komrkowego. Okres ptrwania tych mRNA waha si od 1 h w komrkach z fazy S do 12 min w innych fazach. Przeniesienie tej sekwencji na inny mRNA powoduje, e jego stabilno staje si zalena od fazy cyklu komrkowego. Bardzo dobrze zbadany, chocia by moe unikatowy, jest mechanizm regulujcy stabilno mRNA dla /f-tubuliny. Ulegajcy translacji mRNA dla tego biaka jest degradowany w obecnoci jS-tubuliny. Efekt ten jest zaleny od czterech pierwszych aminokwasw N-kocowych biaka /J-tubuliny. mRNA sztucznie wytworzonych genw majcych na N-kocu biaka 4 N-kocowe aminokwasy /J-tubuliny (MetArgGluIle) rwnie ulegaj degradacji w czasie translacji w obecnoci wolnej /J-tubuliny. Przypuszcza si, e biako zawierajce tak N-kocow sekwencj aktywuje naukleazy i'jednoczenie wyznacza jako obiekt degradacji mRNA, na ktrym biako jest syntetyzowane.

8.19. Regulacja stabilnoci biaek W badaniach nad stabilnoci biaek poczyniono olbrzymie postpy w cigu ostatnich lat. Wydaje si, e istotn rol odgrywa aminokwas obecny na N-kocu w dojrzaym biaku. Oczywicie, pierwszym aminokwasem jest zawsze metionina, ale liczne mechanizmy posttranslacyjne zmieniaj ten koniec. Mona doprowadzi do powstawania in vivo danego biaka o rnych N-kocach. U drody obecno argininy na N-kocu powoduje, e okres ptrwania biaka wynosi 2 min, natomiast obecno waliny daje biako o okresie ptrwania mierzonym ju w godzinach. N-koniec biaka moe by dodatkowo modyfikowany istnieje enzym, ktry przenosi arginin z arginylo-tRNA na N-koniec biaek. Znane s take deamidazy specyficzne dla N-kocowej glutaminy i asparaginy. Degradacja biaek jest procesem aktywnym, bierze w nim udzia mae, niesychanie silne konserwowane wrd Eukaryota, 76-aminokwasowe biako zwane ubikwityn. Nie tylko sekwencja, ale i sam ukad genw kodujcych

ubikwityn jest zachowany. Spotykane s dwa rodzaje genw kodujcych poliubikwityn: po pierwsze 6 kolejno powtrzonych sekwencji kodujcych ubikwityn, po drugie geny w formie fuzji dwa geny s poczone, kady z innym genem kodujcym biako wchodzce w skad rybosomu. Przyczenie ubikwityny w wyniku kilku etapw przenoszenia tego biaka przez odpowiednie enzymy powoduje degradacj biaka, do ktrego jest ona przyczona. Proces ten jest zaleny od ATP. Konieczne jest przyczenie nie jednej ubikwityny, ale caego kompleksu, tzn. do lizyny biaka przyczana jest ubikwityna, do niej nastpna itp. Za ostateczn degradacj odpowiedzialna jest dua struktura, zwana proteosomem. Ubikwityna jest bardzo istotna dla prawidowego funkcjonowania komrki; drode pozbawione genu poliubikwitynowego s wraliwe na stresy (temperatur itp.), co wynika z niezdolnoci do degradowania biaek o nieprawidowej strukturze, powstajcych np. w wyniku szoku cieplnego.

8.20. Biaka towarzyszce Przez wiele lat uwaano, e biaka przyjmuj swoj prawidow struktur przestrzenn w sposb spontaniczny. Obecnie wiadomo, e proces ten moe by wspomagany przez spotykane w caym wiecie oywionym biaka, zwane biakami towarzyszcymi (ang. chaperone przyzwoitka). S one obecne u bakterii, w cytoplazmie, jdrze, chloroplastach i mitochondriach. Potrzebne s do tworzenia prawidowej struktury oktamerw histonowych, do przenoszenia biaek przez bony mitochondrialne i do przywracania im waciwej konformacji wewntrz mitochondriw. S one take konieczne do powstawania karboksylazy rybulozobisfosforanu. Enzym ten skada si z duych podjednostek kodowanych w genomie chloroplastu i maych kodowanych w jdrze, a ulegajcych translacji w cytoplazmie. W chloroplastach obecne jest specjalne biako powodujce powstanie waciwej konformacji tego enzymu. Wiele z biaek towarzyszcych naley do tzw. grupy biaek szoku cieplnego, tzn. ich synteza jest indukowana przez podwyszon temperatur.

9. MUTAGENEZA, REPERACJA I REKOMBINACJA DNA

U E. coli czsto samorzutnie powstajcych zmian w sekwencji nukleotydw w DNA wynosi okoo 1 x 10" 9 w przeliczeniu na jedn par nukleotydw i jeden cykl replikacyjny (czyli pojedyncze miejsce w DNA E. coli mutuje raz na 109 cykli replikacyjnych). Ten zaskakujco wysoki poziom wiernoci replikacji DNA nie wynika z bezbdnoci polimerazy DNA III przeprowadzajcej replikacj. Enzym ten wcza bdne nukleotydy do nowo syntetyzowanych acuchw DNA z czstoci okoo 5 rzdw wielkoci wysz. Obserwowany wysoki stopie staoci DNA, a wic i informacji genetycznej przekazywanej do komrek potomnych, a przez gamety do potomnych organizmw wielokomrkowych, jest wynikiem funkcjonowania w czasie replikacji DNA licznych, enzymatycznych ukadw korektorskich, a take mechanizmw reperacyjnych dziaajcych w okresach midzypodziaowych. Mutacje w DNA mog powstawa nie tylko w wyniku bdw w procesie replikacji, ale take na skutek dziaania rnych czynnikw chemicznych lub fizycznych powstajcych zarwno w wyniku przemian metabolicznych zachodzcych w komrkach, jak i docierajcych z zewntrz komrek. Powstajce w wyniku dziaania tych procesw zmiany w strukturze DNA mog wywoywa rnego typu mutacje bd te zaburza replikacj DNA i powodowa mier komrek. Uszkodzenia DNA mog by tak liczne, e bez ich natychmiastowej reperacji organizmy nie mogyby egzystowa. W rnych organizmach prokariotycznych i eukariotycznych wystpuj setki odrbnych genw i kodowanych przez nie biaek reperujcych uszkodzenia w DNA. Ich dziaalno prowadzi do utrzymania wzgldnej staoci sekwencji nukletydowych czsteczek DNA (tab. 9.1). Z drugiej jednak strony pewien poziom powstawania i utrwalania si mutacji by i jest koniecznym warunkiem utrzymywania si zmiennoci dziedzicznej organizmw jako podstawowego motoru ewolucji. Nad ustaleniem optymalnego kompromisu midzy tymi przeciwstawnymi procesami czuwaj

Symbol genu uvrA uvrB uvrC uvrD phr

Efekt mutacji in vivo

Produkt genu podjednostk endonukleazy o aktywnoci ATPazy podjednostak endonukleazy UV podjednostk endonukleazy UV helikaza DNA II fotoliza DNA

Funkcja rozpoznawanie dimerw pirymidynowych nacinanie DNA po obu stronach dimeru nacinanie DNA po obu stronach dimeru rozwijanie heliksu wycitego fragmentu DNA zalena od wiata monomeryzacja dimerw

zwikszona wraliwo na UV

brak fotoreaktywacji po napromieniowaniu UV, efekt mutagenny

mutH

mutL mutS mutU (uvrD) recA

efekt mutatorowy (zwikszona czsto mutacji)

zesp enzymw rozpoznajcych i wycinajcych niewaciwie wczon zasad do DNA

wycinanie z acucha DNA niewaciwie wczonej zasady

helikaza II niezdolno do rekombinacji DNA biako RecA

rozwijanie heliksu wycitego fragmentu DNA rekombinacja homologiczna DNA, indukcja reakcji SOS wspomaganie procesu czenia biaka RecA z wolnymi kocami DNA i jednoniciowymi odcinkami DNA umoliwianie obcionej bdami replikacji DNA w systemie SOS wycinanie niewaciwych zasad z DNA i wytwarzanie miejsc AP

recB recC recD

obniony poziom rekombinacji

endonukleaza nacinajca DNA przy sekwencji chi (GCTGGTGG)

umuC umuD

ung tag

zwikszona wraliwo na UV i mniejsza liczba mutantw efekt mutatorowy i zwikszona wraliwo na niektre mutageny chemiczne zwikszona wraliwo na pewne mutageny chemiczne

? ?

glikozydaza uracylo-DNA 3-metyloadeninoglikozydaza

nth

endonukleaza II AP

nacinanie DNA przy miejscach AP

rne ukady enzymatyczne wspdziaajce z DNA. Midzy czsteczkami DNA zachodzi proces wymiany odcinkw o przynajmniej czciowo homologicznej sekwencji nukleotydowej, czyli tak zwany proces rekombinacji genetycznej. Rekombinacja genetyczna wystpuje zarwno midzy czsteczkami DNA wirusw, bakterii, jak i midzy chromosomami organizmw eukariotycznych. Rekombinacja midzy chromosomami w czasie mejozy jest podstawowym mechanizmem prowadzcym do rnorodnoci genetycznej wytwarzanych gamet rozmnaajcych si pciowo. Procesy rekombinacyjne odgrywaj rwnie istotn rol w czasie reperacji uszkodze w DNA, szczeglnie gdy liczba zmian i uszkodze w DNA jest tak dua, e rne systemy reperacyjne dziaajce w komrkach nie s w stanie ich zreperowa. Wtedy jedynym sposobem uratowania i przekazania informacji genetycznej staje si rekombinacja z nie uszkodzonym fragmentem drugiej homologicznej czsteczki DNA. Niektre z tych procesw zostan przedstawione na przykadzie organizmw prokariotycznych, a przede wszystkim E. coli. Analogiczne mechanizmy wystpuj u organizmw eukariotycznych, jak: grzyby, D. melanogaster czy ssaki, chocia zwykle s one znacznie mniej poznane, zwaszcza na poziomie molekularnym. Wreszcie istotn rol w wytwarzaniu duych zmian w strukturze DNA mog odgrywa stosunkowo niedawno poznane i obecnie intensywnie badane ruchome elementy genetyczne, czyli transpozony. Zmieniajc swoje pooenie w DNA w wyniku procesu, zwanego transpozycj, mog powodowa istotne zmiany w strukturze genomw rnych organizmw.

9.1. Mutageneza i reperacja DNA Wszelkie zmiany strukturalne w DNA, jak na przykad powstawanie, w wyniku bdw w replikacji, niekomplementarnych par zasad, czy powstawanie pod wpywem promieniowania UV dimerw pirymidynowych i innych uszkodze DNA stanowi jedynie zmiany premutacyjne, ktre, jeeli nie zostan usunite w procesach reperacji, mog doprowadzi do zmian mutacyjnych po nastpnych cyklach replikacyjnych DNA. Mutacjami utrwalonymi, dziedzicznie przekazywanymi, bd jedynie zmiany w DNA majcym inn ni wyjciowa sekwencj par nukleotydowych GC bd AT normalnych skadnikw heliksu DNA. Zamiany mutacyjne w DNA mog mie bardzo rny charakter. Najprostsz zmian jest zamiana w heliksie jednej pary zasad w drug. Takie mutacje nazywamy punktowymi. Mutacje punktowe mog z czstoci zblion do mutacji wyjciowej mutowa wstecznie, czyli rewertowa do wyjciowego, nie zmutowanego ukadu nukleotydw w DNA. Inne zmiany mutacyjne w DNA mog polega na przykad na wypadniciu (delecji) pary zasad lub odwrotnie na wstawieniu dodatkowej pary zasad, czyli

insercji. Tego typu mutacje bd rewfertowa znacznie rzadziej ni zmiany pojedynczych par zasad. Mutacje w skadzie nukleotydowym DNA mog mie bardzo rne efekty fenotypowe. Mutacje punktowe mog powodowa zamian jednego kodonu w drugi, ktry wyznacza inny aminokwas. Pojedyncza substytucja aminokwasowa w biaku kodowanym przez gen, w ktrym zasza mutacja punktowa, moe cakowicie znosi aktywno enzymatyczn biaka lub tylko j modyfikowa, zalenie od rodzaju substytucji aminokwasowej i jej pooenia w peptydzie. Mutacja zamieniajca jeden kodon na drugi synonimowy kodon wyznaczajcy ten sam aminokwas nie bdzie miaa oczywicie adnego wpywu na waciwoci biaka. Mutacje, polegajce na wstawieniu bd wypadniciu nukleotydw, mog powodowa bardzo drastyczne zmiany w kodowanych przez tak zmutowane geny biakach, w wyniku zmiany fazy odczytu w trakcie translacji. Oczywicie due zmiany w sekwencji nukleotydowej DNA, jak na przykad dugie delecje obejmujce liczne pary nukleotydw cakowicie eliminuj ekspresj rnych genw. ' 9.2. Mutageneza samorzutna (spontaniczna) Jest to proces powstawania mutacji, zwykle punktowych, wynikajcy ze zmiany jednej zasady bez udziau zewntrznych czynnikw fizycznych bd chemicznych. Mutacje spontaniczne s najczciej wynikiem bdw popenianych w czasie replikacji DNA, bd te w wyniku samorzutnych modyfikacji chemicznych zachodzcych w zasadach wystpujcych w DNA. Jeli w czasie replikacji DNA polimeraza DNA III wczy do nowo syntetyzowanego acucha DNA nukleotyd z niekomplementarn zasad do zasady wystpujcej w acuchu matrycowym, to powstaje para zasad niewaciwie poczonych (na przykad w nowo syntetyzowanym acuchu na przeciw G w matrycy wystpuje A). Jeeli para taka nie zostanie skorygowana przed nastpnym cyklem replikacyjnym, to jedna z pochodnych czsteczek DNA bdzie miaa po replikacji par GC jak w typie standardowym, a druga z pochodnych czsteczek DNA par AT. Powstanie wtedy mutacja punktowa typu tranzycji, gdzie jedna puryna zostaa zastpiona przez drug puryn i odpowiednio jedna pirymidyna przez drug pirymidyn (rys. 9.1).
5 ' A G T A A C G C 3 ' T G S A T T G C 5 ' A C G T A A C G 3 ' T G C A C T G C 3' replikacja 5' 3 ' T C G C A C T G 5 ' A C G T S A C G 5' 3' 3' 5'

Rys. 9.1. Powstawanie mutacji w wyniku niewaciwie wczonej zasady w trakcie replikacji DNA. Wczona mylnie zasada C (czerwona) naprzeciw A w acuchu matrycowym powoduje powstanie mutacji punktowej typu transwersji (AT GC)

Jeeli zamiast puryny zostanie mylnie wczona pirymidyna lub zamiast pirymidyny puryna, to powstan mutacje punktowe typu transwersji, jak na przykad GC TA czy GC CG. rednia czsto mutacji spontanicznych w jednym cyklu replikacji w przeliczeniu na jedn par nukleotydw wynosi okoo 10~9. Jednak czsto mutacji rnych par zasad w tym samym genie zawiera si w do szerokich granicach. Niektre miejsca w genie mutuj z czstoci wielokrotnie wysz ni pozostae. S to tak zwane gorce miejsca. 9.3. Polimeraza DNA III E coli w trakcie replikacji dokonuje korekty mylnie wczonych zasad W czasie replikacji DNA u E. coli poziom bdnie wczanych nukleotydw do nowo syntetyzowanego acucha wynosi 10" 4 na jedn par nukleotydw. Polimeraza DNA III nie jest w stanie rozrni zmian tautomerycznych zachodzcych w zasadach. Liczba bdnie wczanych zasad w czasie replikacji byaby wielokrotnie wysza, gdyby bdnie wczane zasady nie byy natychmiast w trakcie replikacji wycinane. Tak zdolno korektorsk polimeraza DNA III zawdzicza aktywnoci podjednostki E. Podjednostk ta ma waciwoci egzonukleazy dziaajcej w kierunku 3' 5'. Jeeli podjednostk a polimerazy DNA III wcza niewaciw zasad, to enzym zatrzymuje si na replikowanej nici DNA, podjednostk E wycina mylnie wczon zasad, a nastpnie podjednostk a ponownie wcza w to miejsce ju waciw zasad. Dziki tym korektorskim waciwociom polimerazy DNA III, olbrzymia wikszo niewaciwie wczonych zasad zostaje w czasie replikacji skorygowana. Podjednostk E polimerazy DNA III w E. coli jest kodowana przez gen mutD. Mutacje w tym genie, powodujce utrat waciwoci egzonukleolitycznych podjednostki E, wywouj blisko 1000-krotne podwyszenie poziomu mutacji spontanicznych. Mutacje tego typu okrela si jako mutatorowe. Mutacje wielu genw kodujcych biaka, ktre bior udzia w rnych mechanizmach usuwania bdw i uszkodze w DNA wykazuj rwnie efekty mutatorowe, podwyszajce poziom powstajcych mutacji. S te znane mutacje niektrych z tych genw, ktre obniaj poziom mutacji spontanicznych (mutacje antymutatorowe), co wskazywaoby, e enzymy kodowane przez geny typu dzikiego nie s maksymalnie efektywne. Mona zakada, e pewien niewielki poziom powstajcych mutacji ze wzgldw ewolucyjnych jest selektywnie korzystny. Mimo waciwoci korektorskich "polimerazy DNA III nie wszystkie niewaciwie sparowane zasady zostaj usunite w trakcie replikacji DNA. 9.4. Poreplikacyjna naprawa przez wycinanie niewaciwie sparowanych zasad Jeli w czasie replikacji DNA wczone zasady nie zostan usunite w wyniku egzonukleolitycznej dziaalnoci polimerazy DNA III, to w powstajcym nowo syntetyzowanym heliksie DNA bd wystpowa pary niekom-

plementarnych zasad. Pojawiaj si one z czstoci okoo 1 x 10 ~ 8 replikowanych zasad. Mog one by rdem przyszych mutacji punktowych, o ile nie zostan rozpoznane i usunite przez odpowiednie enzymy reperujce. W genomie E. coli wystpuje wiele genw, jak na przykad mutH, mut U czy mutS kodujcych biaka, tworzce kompleks enzymatyczny rozpoznajcy w DNA niewaciwie sparowane zasady. Kompleks ten rozpoznaje zapewne zmiany konformacyjne heliksu DNA, wynikajce z obecnoci niewaciwie sparowanych zasad. U E. coli wystpuj trzy odrbne zespoy enzymatyczne wycinajce niewaciwie wczon w czasie replikacji zasad. Jeden rozpoznaje wszelkie niewaciwie sparowane zasady i wycina z nowo syntetyzowanej nici odcinek o dugoci do 1000 i wicej nukleotydw. Drugi rozpoznaje okrelone niewaciwie sparowane zasady, jak na przykad GA i wycina je wraz z kilku ssiadujcymi nukleotydami. Wreszcie trzeci system reperacji przez wycinanie rozpoznaje niewaciwie sparowane zasady GT, powstajce w wyniku spontanicznej deaminacji 5-metylocytozyny wraz z nielicznymi ssiednimi nukleotydami. Powstajce w DNA luki w nowo syntetyzowanym acuchu s nastpnie uzupeniane przez polimeraz DNA, ktra wczajc waciwy nukleotyd likwiduje bd replikacyjny. W ostatnim etapie procesu naprawy ligaza DNA czy kowalentnie nowo syntetyzowany fragment DNA z reszt acucha DNA (rys. 9.2). (a)
5/

G A*T C C T A* G A*T C

A T 'AN

3' 5' 3'

3' (b)
5'

(C)

5' 3'

G A*T C CTAG G A*T C CTA G G A* T C C T A* G

A A T A T

3' 5' 3' 5' 3' 5'

(d)

5>

3'

(e)

5' 3'

Rys. 9.2. Reperacja niewaciwie wczonej zasady przez jej wycicie i resyntez brakujcego odcinka, (a) DNA przed rekombinacj, (b) DNA w trakcie replikacji z jeszcze nie zmetylowan adenin w sekwencji CTAG i z mylnie wczonym nukleotydem (C zamiast T) w nowo syntetyzowanym acuchu DNA. Kompleks enzymatyczny zoony z biaek kodowanych przez geny mutH, mutL, mutS i uvrD rozpoznaje nie zmetylowan sekwencj CTAG i niewaciwie sparowan zasad, (c) W wyniku naci i usunicia fragmentu acucha DNA powstaje w nowo syntetyzowanym acuchu DNA luka. (d) W wyniku syntezy reperacyjnej przeprowadzanej przez polimeraz DNA I luka zostaje uzupeniona i zamiast mylnie wczonej zasady C zostaje wczona poprawnie zasada T. (e) Metylaza metyluje adenin w sekwencji CTAG nowo syntetyzowanego acucha DNA

Aby nastpia waciwa naprawa DNA, kompleks enzymatyczny musi rozpozna niewaciwie wczon zasad, czyli odrni nowo syntetyzowany acuch od acucha matrycowego. Takie rozpoznanie jest moliwe jedynie w pierwszych sekundach czy minutach po replikacji DNA. W DNA E. coli GATC wystpuje okoo 1000 czteronukleotydowych sekwencji . Adenina CTAG w tych sekwencjach jest metylowana w pozycji 6 przez specyficzn metylaz kodowan przez gen dam. Bezporednio po replikacji adenina jest ju zmetylowana w acuchu matrycowym, natomiast w acuchu nowo syntetyzowanym jest jeszcze nie zmetylowana. Zesp reperacyjny rozpoznaje nie zmetylowany acuch DNA i nacina go w dwch miejscach: z jednej strony w obrbie zmetylowanej sekwencji GATC (bd CATG), a z drugiej strony w ssiedztwie niewaciwie wczonej zasady. Nastpnie gen mutU (synonim uvrD), kodujcy helikaz II powoduje rozwinicie i usunicie odcinka acucha DNA, a powstajc jednoniciow luk dosyntetyzowuje polimeraza (rys. 9.2). W ten sposb zostaje odtworzona waciwa para zasad. Jeeli po paru minutach adeniny w acuchu nowo syntetyzowanym w czteronukleotydowych sekwencjach zostan zmetylowane, to rozpoznanie niewaciwie wczonej w czasie replikacji zasady staje si niemoliwe. Gdyby system reperujcy usuwa losowo jedn z dwch niewaciwie sparowanych zasad, to naprawa zachodziaby jedynie w 50% wypadkw, natomiast w pozostaych wypadkach nastpowaoby utrwalenie mutacji na skutek wprowadzenia do acucha matrycowego zasady komplementarnej do mylnie wczonej w czasie replikacji DNA zasady. W wyniku opnienia procesu metylacji nowo syntetyzowanego DNA przez metylaz dam wikszo niewaciwie sparowanych zasad zostaje usunita. Oczywicie mutacje w genach mutH, mutL i mutS, powodujce brak i obnienie aktywnoci kodowanych przez nie enzymw, maj waciwoci mutatorowe i podwyszaj poziom spontanicznej mutagenezy. Niewaciwie sparowane zasady w DNA tworz si take w procesie rekombinacji DNA w tak zwanych heterodupleksach powstajcych z powizania dwch acuchw pochodzcych z odrbnych czsteczek DNA. S one usuwane przez omawiany tu mechanizm wycinania i resyntezy. W tym wypadku jednak oba acuchy DNA s zmetylowane i reperacja odbywa si losowo w obu kierunkach. 9.5. W czasie replikacji DNA mog powstawa delecje bd addycje nukleotydw W miejscach, gdzie w DNA wystpuj cigi identycznych zasad, na przykad AAAAA, w czasie replikacji zachodzi tak zwany polizg polimerazy DNA III. Na skutek wyptlenia si jednego czy wicej nukleotydw w acuchu matrycowym bd nowo syntetyzowanym (rys. 9.3) powstaj delecje bd addycje pojedynczych nukleotydw. Mutacje te nie mog by usunite przez

(a)

acuch matrycowy acuch nowo syntetyzowany

5' C C 6 A A A A A C G S , I I I ! I I I I I I I 3 GGC T T T T T G CC A 5' C C G / \ A A C G G , l I i l i i I i i i 3' G G C T T T T G C C

3' , 5'

(W

acuch matrycowy acuch nowo syntetyzowany

3' , 5'

acuch matrycowy acuch nowo syntetyzowany

5' C C G A A A A A C G G I I I I I I I I I I I 3' G G C T ^ ^ T - T T G C C T

3' , 5

Rys. 9.3. Powstawanie w czasie replikajcji D N A delecji bd addycji pojedynczych nukleotydw. (a) Odcinek D N A z 5 kolejnymi parami nukleotydw AT normalnie zreplikowany. (b) W wyniku wyptlenia si nukleotydu A w acuchu matrycowym w nowo syntetyzowanym acuchu D N A zachodzi delecja jednego nukleotydu T. (c) W wyniku wyptlenia si nukleotydu T w acuchu nowo syntetyzowanym powstaje addycja jednego nukleotydu T

korekcyjne dziaanie polimerazy DNA i wywouj zmiany ramki odczytu w czasie translacji, powodujc z reguy utrat aktywnoci kodowanego enzymu. 9.6. Modyfikacje zasad w DNA mog by rdem mutacji samorzutnych W DNA mog zachodzi samorzutnie (bez udziau mutagenw) rne modyfikacje chemiczne zasad purynowych bd pirymidynowych. Na przykad cytozyna moe podlega deaminacji i powstaje wtedy czsteczka uracylu. Czsteczki cytozyny mog by take w DNA metylowane w pozycji 5 i powstaje wtedy 5-metylocytozyna. 5-metylocytozyna w acuchu matrycowym w czasie replikacji DNA powoduje wczenie guaniny w nowo syntetyzowanym acuchu i nie stanowi rda mutacji. 5-metylocytozyna podlega samorzutnej deaminacji i powstaje z niej czsteczka tyminy (rys. 9.4). W wypadku deaminacji cytozyny powstajcy uracyl jest zasad obc dla DNA. W komrkach E. coli wystpuje specyficzna glikozylaza uracylowa DNA, ktra wycina z DNA uracyl hydrolizujc wizanie N-glikozydowe midzy deoksyryboz a uracylem. Powstaje wtedy w DNA dziura", zwana miejscem AP (apurynowym bd apirymidynowym). Miejsca AP w DNA s rozpoznawane przez specyficzne endonukleazy, ktre przecinaj acuch DNA obok miejsca AP i powoduj jego wycicie wraz z kilku ssiednimi nukleotydami. Powstajca luka w acuchu DNA zostaje nastpnie wypeniona przez polimeraz DNA I przy uyciu jako matrycy drugiego nieuszkodzonego acucha. Poniewa proces reperacji przez wycinanie i resyntez jest w zasadzie bezbdny, deaminacja cytozyny nie zwiksza istotnie poziomu mutacji spontanicznych.

NH2

H-T \
\ , 3 2 /

"

H_/
\

5 6
3

/
/

>n_h
2

/ A
cytozyna
CH, NH 2

uracyl
CH 3 O

cc
Z' 5 6

/
deaminacja / /

cc
5 6

/
\

HZ U

1N

HCA

1 NH

V V

W
tymina

5-metylocytozyna

Rys. 9.4. Wystpowanie w D N A 5-metylocytozyny zamiast cytozyny powoduje powstawanie gorcych miejsc mutacji. Samorzutna deaminacja cytozyny powoduje powstawanie uracylu, ktry wycinany jest z D N A przez specyficzn uracylo-DNA-glikozydaz. Powstajce miejsce apurynowe (AP) jest nastpnie reperowane w zasadzie bezbdnie przez wycinanie i syntez brakujcego odcinka DNA. Samorzutna deaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania tyminy, ktra jako naturalny skadnik D N A nie jest wycinana i wobec tego przy nastpnej replikacji D N A powoduje powstanie tranzycji typu GC AT

Jeli jednak deaminacji podlega 5-metylocytozyna, to powstaje czsteczka tyminy. Tymina jest normalnym skadnikiem DNA i nie jest rozpoznawana przez ukady reperujce DNA. Po nastpnej replikacji DNA zamiast pierwotnej pary GC powstanie para AT, a wic zajdzie tranzycja typu GC AT (rys. 9.4).

9.7. Gorce miejsca mutacji w genach Dla kilku dokadnie zbadanych genw wykazano, e wikszo samorzutnych mutacji powstaje w kilku charakterystycznych miejscach dla danego genu, zwanych gorcymi miejscami (ang. hot spots). Na przykad w genie r11 faga T4 gorce miejsca na mapie genu odpowiadaj miejscom w DNA genu, gdzie wystpuj obok siebie cztery adeniny. W takich miejscach powstaj czsto addycje bd delecje pojedynczych nukleotydw. Poniewa takie mutacje s niereperowalne, czsto ich pojawiania si jest znacznie wysza od mutacji innego typu. Drugim przykadem moe by wystpowanie w genie lacl kodujcym represor operonu laktozowego E. coli trzech miejsc, w ktrych z du czstoci wystpuj mutacje punktowe typu tranzycji GC AT (rys. 9.5). Gorce miejsca wystpowania tych tranzycji odpowiadaj dokadnie miejscom pooenia w DNA genu lacl trzech zasad 5-metylocytozynowych, ktre, jak mwilimy, samorzutnie na drodze deaminacji mog przechodzi w tymin.

5-mc

5-mc

5-mc

50

J_I

l i 100 150 200 250 300 pooenie aminokwasu w peptydzie represora lac

350

Rys. 9.5. Rozmieszczenie gorcych miejsc tranzycji GC.-> AT w genie lacl kodujcym biako represora operonu laktozowego E. coli. Trzy wyrane gorce miejsca mutacji GC - AT, powodujce zmiany w skadzie aminokwasowym represora operonu laktozowewgo E. coli, odpowiadaj dokadnie pooeniu w genie lacl trzech 5-metylocytozyn (5-mc)

9.8. Mutacje indukowane W wyniku wysokiej efektywnoci procesw reperacyjnych wikszo spontanicznie zachodzcych zmian w DNA w czasie i po replikacji DNA jest usuwana i poziom mutacji spontanicznych jest bardzo niski. Czsto powstawania mutacji mona jednak bardzo istotnie zwikszy dziaajc na komrki, czy cae organizmy, zewntrznymi czynnikami fizycznymi bd chemicznymi wywoujcymi liczne i rnorakie uszkodzenia w DNA. Takie czynniki nazywamy mutagenicznymi lub po prostu mutagenami. Pionierskimi pracami nad mutagenez byy badania H.I. Mullera (1927 r.) nad wpywem promieniowania X na D. melanogaster i Ch. Auerbach (1942 r.) nad mutagenicznymi efektami iperytu. Prowadzone od tego czasu intensywne badania nad indukowaniem mutacji wykazay, e wiele rnych czynnikw fizycznych oraz tysice rnych zwizkw chemicznych dziaaj mutagenicznie na wszelkie organizmy, poczwszy od bakterii, a koczc na czowieku. Najaktywniejszymi mutagenami fizycznymi s: promieniowanie ultrafioletowe o dugoci fali 260 nm oraz rne promieniowania jonizujce, jak promieniowanie X czy y, powstajce w czasie rozpadu pierwiastkw radioaktywnych. Czynniki chemiczne mog modyfikowa rne skadniki DNA, dziaajc na DNA bezporednio lub te w wyniku przeksztace metabolicznych w komrce. W zalenoci od stosowanego mutagenu uszkodzenia w DNA mog polega na pkniciu pojedynczego acucha lub obu acuchw w podwjnym heliksie DNA, usuniciu zasady z nukleotydu, doczeniu nowych grup chemicznych do zasad purynowych bd pirymidynowych, wytwarzaniu wiza kowalencyjnych midzy dwoma zasadami wy-

stpujcymi w jednym acuchu lub midzy zasadami z dwch rnych acuchw heliksu DNA. Jeeli indukowane przez mutageny zmiany w strukturze DNA nie zostan w komrkach zreperowane, to wywouj zaburzenia w replikacji DNA i w rezultacie efekt letalny. W komrkach wszystkich organizmw istniej liczne i rnorodne sposoby usuwania tych uszkodze, o ile nie powstaj one ze zbyt wielk czstoci. Niektre procesy reperacyjne nie s dokadne, co powoduje znaczne zwikszenie poziomu mutacji wrd komrek przeywajcych. Procesy reperacyjne zostay na poziomie molekularnym najlepiej poznane u E. coli i niektrych fagw bakteryjnych, gdzie wyizolowano, sklonowano i zsekwencjonowano liczne geny, ktrych produkty biakowe bior udzia w procesach usuwania rnych typw uszkodze indukowanych przez rne rodzaje mutagenw. Niektre z tych procesw reperacyjnych udao si powtrzy in vitro, uywajc oczyszczonych enzymw reperacyjnych. Przykadem takiego procesu jest reperacja uszkodze DNA, wywoana przez promieniowanie UV o dugoci fali 260 nm. Gwnym uszkodzeniem DNA w wyniku dziaania UV jest powstawanie fotodimerw pirymidyn, na przykad dimerw tymidynowych czy te dimerw tyminy z cytozyn. W wyniku tych fotochemicznych procesw powstaj w acuchu DNA pary ssiadujcych pirymidyn, powizane wizaniami kowalencyjnymi. Dimery pirymidynowe w procesie replikacji zatrzymuj wczanie nukleotydw przez polimeraz DNA III do nowo syntetyzowanego acucha DNA, co powoduje fragmentacj DNA i efekt letalny. Znane s dwa podstawowe procesy reperacji uszkodze wywoanych przez promieniowanie UV. Pierwszy z nich to fotoreaktywacja dokonywana przez enzym fotoliaz, ktra pod wpywem wiata widzialnego z udziaem flawoproteinowych chromoforw (np. FADH 2 ) przeprowadza rozczenie fotodimerw z powrotem na monomery i usuwa pierwotne uszkodzenie DNA. Drugim procesem prowadzcym do usuwania dimerw z DNA jest naprawa przez wycinanie. W tym, nie wymagajcym wiata widzialnego, procesie reperacyjnym zaangaowane s cztery biaka enzymatyczne kodowane przez geny: uvrA, uvrB, uvrC, uvrD. Zostay one wykryte i nazwane uvr (geny opornoci na promieniowanie UV), poniewa mutacje tych genach powoduj istotne obnienia opornoci komrek E. coli na letalne efekty promieniowania UV. Geny te zostay sklonowane, a ich produkty biakowe w peni poznane. Biaka te tworz ukad reperacyjny, zwany endonukleaz UV albo te endonukleaz UYRABCD. W ukadzie tym biako kodowane przez uvrA rozpoznaje w acuchu DNA deformacj strukturaln wywoan obecnoci dimeru. Biaka kodowane przez geny uvrB i uvrC przecinaj acuch DNA w pobliu dimeru w odlegoci 7 nukleotydw od strony 5' i ok. 5 nukleotydw od strony 3'. Biako kodowane przez gen uvrD jest helikaz, ktra powoduje rozkrcenie odcitego 12-nukleotydowego odcinka DNA i jego odczenie od acucha DNA. W ten sposb dimer zostaje wycity wraz z ssiednimi nukleotydami i powstaje luka w jednym z acuchw heliksu DNA.

Nastpnym etapem reperacji przez wycinanie jest synteza brakujcego odcinka nici DNA od koca 5' przez polimeraz DNA I, a po wypenieniu luki na kocu 3' ligacja z udziaem ligazy DNA I. Ukad reperacyjny UVRABCD jest specyficzny w stosunku do dimerw pirymidynowych powstajcych pod wpywem promieniowania UV i oczywicie prowadzi do penej i bezbdnej reperacji o ile drugi acuch DNA, lecy naprzeciw powstajcej luki, jest nie uszkodzony i moe funkcjonowa jako matryca dla polimerazy DNA I. Systemy reperacji dimerw pirymidynowych przez fotoreaktywacj i wycinanie usuwaj dimery z DNA w zasadzie bezbdnie i stanowi podstawow ochron wszelkich organizmw przed mutagenicznym bd letalnym wpywem promieniowania UV wystpujcym w promieniowaniu sonecznym. Choroba ta jest wywoana mutacjami w kilku genach kodujcych biaka biorce udzia w wycinaniu dimerw. U ludzi znana jest choroba dziedziczna, zwana xeroderma pigmentosum, polegajca na nadwraliwoci komrek na promieniowanie UV. U osb chorych w komrkach skry, do ktrych dociera promieniowanie UV dochodzi do uszkodze DNA. Prowadzi to do obumierania komrek, a take zwikszonej zapadalnoci na raka skry. Wynika to z obnionej zdolnoci do wycinania dimerw pirymidynowych z DNA. Nie zreperowane uszkodzenia DNA w komrkach skry powoduj, oprcz efektw letalnych, take rnego typu mutacje genowe i chromosomalne, prowadzce take do powstawania komrek nowotworowych i raka skry. 9.9. Mutageny chemiczne wywouj rnego typu uszkodzenia DNA Znanych jest obecnie tysice zwizkw chemicznych powodujcych rozmaite zmiany w strukturze skadnikw DNA i indukujcych mutacje. Silnymi mutagenami s rne zwizki alkilujce, na przykad powszechnie stosowany w indukowanej mutagenezie metanosulfonian metylowy (MMS) czy metanosulfonian etylowy (EMS). Zwizki te dziaaj na puryny bd pirymidyny, doczajc do rnych pozycji w piercieniach grupy alkilowe. Najczciej alkilacji podlega guanina. Zmodyfikowane zasady mog by wycinane przez odpowiednie endonukleazy albo podlega wycinaniu przez specyficzne glikozylazy DNA, co prowadzi do powstawania miejsc apurynowych bd apirymidynowych, zwanych AP. Miejsca AP rozpoznawane s nastpnie przez endonukleazy AP i reperowane przez wycinanie i resyntez. Innym typem mutagenw chemicznych s analogi zasad, na przykad bromouracyl (BrU) czy 2-aminopuryna (n2Pur). Jeli zostan one wbudowane do nukleotydw, to w procesie replikacji wczane s do nowo syntetyzowanego acucha DNA, bromouracyl na miejsce tyminy, a 2-aminopuryna na miejsce adeniny. Samo wczenie BrU do DNA nie jest mutageniczne ani letalne. Jednak bromouracyl czsto jest przeksztacany w uracyl, ktry, jako

obcy skadnik w DNA, jest nastpnie wycinany przez specyficzn glikozylaz uracylow DNA z wytwarzaniem miejsc AP. Bardzo specyficzn grup chemicznych mutagenw stanowi barwniki akrydynowe, na przykad proflawina czy akryflawina. Zwizki te s paskimi czsteczkami zoonymi z kilku piercieni. Wnikaj one midzy czsteczki puryn i pirymidyn w heliksie DNA. Powoduj wypchnicie zasad w acuchu DNA i wywouj polizg polimerazy DNA w czasie procesu replikacji. Indukuj delecje bd addycje nukleotydw, co prowadzi do mutacji typu zmiana ramki odczytu. Omawiane przykadowo uszkodzenia w DNA, powstajce pod wpywem fizycznych czy chemicznych mutagenw oraz procesy prowadzce do ich reperacji, s najlepiej zbadane w organizmach prokariotycznych. W organizmach eukariotycznych, poczwszy od drody a do czowieka wcznie, procesy reperacji uszkodze DNA s czsto identyczne lub zblione; s one jednak znacznie sabiej poznane. W rodowisku czowieka wystpuj bardzo liczne zwizki naturalne o dziaaniu mutagenicznym, a take liczne zwizki mutageniczne powstajce dziki dziaalnoci przemysowej. Wykrywanie zwizkw mutagenicznych ma istotne znaczenie dla ochrony czowieka przed ich dziaaniem. Znaczenie tych prac zostao istotnie spotgowane, gdy wykazano, e bardzo liczne chemiczne mutageny s take karcinogenami i mog by czynnikiem indukujcym powstawanie raka. Jak obecnie wiadomo, proces powstawania raka jest wynikiem wielu kolejnych mutacji w tej samej komrce, zmieniajcych komrk normaln w komrk nowotworow. Badanie rnych zwizkw chemicznych pod ktem ich waciwoci mutagenicznych i karcinogennych przeprowadza si za pomoc testw wykrywajcych rne rodzaje indukowanych mutacji. Czsto stosowany jest test Amesa wykrywajcy wpyw mutagenicznych zwizkw chemicznych na komrki bakteryjne. W tecie tym bada si czsto rewersji mutanta auksotroficznego Salmonella typhimurium (niezdolnego do syntezy histydyny) do prototrofii. Test jest bardzo czuy, gdy umoliwia wykrywanie nawet pojedynczych rewertantw (zdolnych do wytwarzania kolonii na poywce minimalnej) wrd milionw auksotroficznych komrek bakteryjnych. Bakterie uywane do testu zawieraj take mutacje w genach wpywajcych na przepuszczalno bon bakteryjnych, ktre umoliwiaj wnikania do wntrza komrek testowanych zwizkw chemicznych. Poza tym bakteryjne komrki zawieraj plazmid nioscy geny umuC i umuD, ktre powoduj, i wikszo zmian zachodzcych w DNA prowadzi do powstawania mutacji. Wiele zwizkw chemicznych wywiera efekty mutageniczne, a zwaszcza karcinogenne, w organizmach zwierzcych dopiero w wyniku zmian metabolicznych zachodzcych w wtrobie. Zwizki takie s najpierw aktywowane w wycigu z wtroby i dopiero nastpnie ich efekt mutageniczny jest badany na bakteriach. Testy mutogenicznoci i karcinogennoci zwizkw chemicznych przeprowadza si rwnie na komrkach innych ni bakterie mikroorganizmw oraz na komrkach zwierzcych i na caych organizmach.

9.10. Rekombinacja DNA Rekombinacja, czyli zdolno do wymiany odcinkw midzy homologicznymi czsteczkami DNA jest jedn z podstawowych waciwoci ywych organizmw. Rekombinacja spenia dwie zasadnicze role. Jest podstawowym procesem wymiany genw midzy chromosomami, prowadzcym do zwikszania rnorodnoci genetycznej komrek. Z drugiej za strony rekombinacja umoliwia przeycie organizmw w sytuacjach, gdy na skutek licznych uszkodze w obu acuchach heliksu DNA ich reperacja przez wycinanie i resyntez staje si niemoliwa ze wzgldu na brak nie uszkodzonej matrycy. Wtedy rekombinacja z drug, nie uszkodzon czsteczk DNA staje si jedyn moliwoci przeycia komrki. Oprcz rekombinacji midzy czsteczkami DNA o komplementarnych sekwencjach nukleotydowych, zwanej rekombinacj uprawnion, znany jest take proces rekombinacji nieuprawnionej, gdy rekombinujce czsteczki maj niekomplementarne sekwencje nukleotydowe. W rekombinacji nieuprawnionej bior udzia odrbne, specyficzne enzymy rozpoznajce krtkie, sygnalne sekwencje w obu rekombinujcych czsteczkach.

9.11. Rekombinacja homologiczna (uprawniona) zachodzi midzy homologicznymi czsteczkami DNA Zjawisko crossing-over, czyli wzajemna wymiana odcinkw midzy homologicznymi czsteczkami DNA wirusw czy bakterii, a take midzy homologicznymi chromosomami organizmw eukariotycznych, wystpuje z reguy w mejozie, ale take, chocia rzadziej, w komrkach somatycznych diploidalnych organizmw eukariotycznych. Efekty genetyczne crosssing-over w mejozie u D. melanogaster zostay opisane ju w latach 30. przez Th. Morgana i jego wsppracownikw. Morgan zakada, e w czasie mejozy nastpuje pkanie i wymiana odcinkw chromosomw homologicznych (crossing-over). Tego rodzaju interpretacja bya jednak czysto formalna; wyjaniaa wyniki dowiadcze genetycznych. Trzeba jednak pamita, e czsteczki DNA w postaci podwjnych heliksw nie maj adnych moliwoci rozpoznawania komplementarnych sekwencji nukleotydowych. Crossing-over za zachodzi midzy homologicznymi czsteczkami DNA, dokadnie midzy tymi samymi parami zasad w obu rekombinujcych heliksach. Tak wic w celu wyjanienia molekularnych podstaw procesu rekombinacji trzeba zaoy, e w rekombinujcych czsteczkach DNA musz zachodzi pknicia acuchw DNA. Porednio wiadczya o tym obserwacja, e czsto rekombinacji midzy czsteczkami DNA, na przykad fagw, jest znacznie zwikszona przez dziaanie mutagenw fizycznych bd chemicznych, ktre indukuj pknicia acuchw DNA czy te wytwarzanie luk w pojedynczych acuchach. Jednak

(a)

5' 3'

c/O i

3' 5'

5'

c/O (b) 3' 3'

3'

3' c/0

5'

X
przesuwanie si rozgazienia c/O

5'

(c)

3' 3'

x
heterodupleks 5'

5' 5'

(d)

5' 3'

3' 5'

(e)
5' 3' 3' 5'

przecicie w b i d c/O

przecicie w a i c (f)

3' 5' 5' 3' c/0 i heterodupleks

5' 3' 3' 5' heterodupleks

3' 5' 5' 3'

nawet tak uszkodzone czsteczki DNA nie rekombinuj samorzutnie midzy sob. W procesie rekombinacji homologicznej bior udzia liczne ukady enzymatyczne przeprowadzajce wymian odcinkw midzy czsteczkami DNA. Bliej zostay one poznane gwnie u E. coli, natomiast u organizmw eukariotycznych s one zapewne analogiczne, lecz bliej nie znane. 9.12. Biako RecA u E. coli dopasowuje do siebie komplementarne jednoniciowe DNA pochodzce z odrbnych czsteczek DNA U bakterii, w zasadzie haploidalnych, rekombinacja zachodzi w trakcie koniugacji po wprowadzeniu DNA z jednej komrki do drugiej, a take w procesach transformacji i transdukcji. Poza tym w komrkach bakterii moe take czasem wystpowa wicej ni jeden chromosom bakteryjny. Enzymem przeprowadzajcym rekombinacj w komrkach E. coli jest biako kodowane przez gen RecA. Brak aktywnoci tego biaka powoduje cakowit niezdolno komrek E. coli do rekombinacji. Biako RecA ma waciwo wizania si z jednoniciowym DNA w sposb niezaleny od sekwencji nukleotydowej w iloci jeden polipeptyd na 5 nukleotydw. Kompleks DNA-biako RecA atakuje dwuniciowy heliks drugiej czsteczki DNA w rnych losowych miejscach, powodujc lokalne rozplecenia obu nici heliksu. Jeli w ktrym z zaatakowanych miejsc napotka sekwencj komplementarn, to inicjuje powstawanie mieszacowego DNA przez czenie zasad atakujcej nici z komplementarnymi zasadami w atakowanym heliksie DNA. Tak wic biako RecA bierze czynny udzia w odnajdywaniu komplementarnych sekwencji midzy rekombinujcymi czsteczkami DNA. Biako RecA ma rwnie waciwoci ATPazy; w momencie odnalezienia sekwencji komplementarnej powoduje dalsze rozkrcanie heliksu i wyduanie powstajcego mieszacowego DNA.

Rys. 9.6. Rekombinacja midzy homologicznymi czsteczkami DNA oznaczonymi kolorem czerwonym i czarnym, (a) Dwie homologiczne czsteczki przed rekombinacj, (b) W wyniku rekombinacji przy udziale biaka recA powstaje ich krzyowe poczenie powizane z wymian odcinkw koniugujcych czsteczek, okrelane jako crossing-over (c/o), (c) W wyniku procesu, zwanego przesuwaniem si rozgazienia, ktry rwnie zachodzi przy udziale biaka RecA, nastpuje wytwarzanie odcinkw mieszacowego DNA, zwanych heterodupleksami. (d) Jako produkt przejciowy rekombinacji powstaje figura krzyowa czca obie rekombinujce czsteczki, zwana figur Hollidaya. Figura Hollidaya ulega nastpnie przeciciu w miejscu skrzyowania przez specyficzne endonukleazy i powstajce wolne koce cz si w miejscach oznaczonych strzakami a, b, c, d. (e) Jeeli przecicia i ponowne poczenia nastpi w miejscach b oraz d, to powstan dwie zrekombinowane czsteczki DNA z wymian odcinkw w miejscu crossing-over oraz z ssiadujcym obszarem heterodupleksu. (f) Jeeli przecicia i ponowne poczenia nastpi w miejscach a oraz c, to powstan dwie czsteczki DNA zawierajce jedynie obszar heterodupleksu

Po odnalezieniu si, z udziaem biaka RecA, miejsc komplementarnych midzy rekombinujcymi czsteczkami DNA powstaje przejciowy produkt wymiany nici midzy rekombinujcymi, homologicznymi czsteczkami DNA. W wyniku przecinania i ponownego czenia si nici na krzy powstaje figura krzyowa (tzw. struktura Hollidaya). Miejsce skrzyowania si nici przesuwa si (ang. branch migration), powstaje odcinek mieszacowego DNA (heterodupleks) o dugoci kilku tysicy par nukleotydw (rys. 9.6). Figura Hollidaya zostaje nastpnie przecita, co prowadzi do powstania dwch oddzielnych zrekombinowanych czsteczek DNA. W procesie tym bior udzia bliej nie znane endonukleazy. W zalenoci, ktre z dwch acuchw zostan przecite, mog powsta czsteczki nie zrekombinowane, zawierajce jedynie odcinek mieszacowego DNA (heterodupleks) bd te nastpi waciwy crossing-over i powstan zrekombinowane czsteczki z wymienionymi odcinkami DNA oraz z odcinkiem mieszacowym DNA. W procesie rekombinacji genetycznej, oprcz biaka RecA, odgrywajcego podstawow rol w dopasowywaniu komplementarnych sekwencji midzy rekombinujcymi czsteczkami DNA, bierze udzia wiele innych enzymw kodowanych przez odrbne geny. U E. coli geny recB, recC i recD koduj biaka o waciwociach endonukleolitycznych, ktre rozpoznaj w DNA sekwencje 8-nukleotydowe GCTGCTGG (jest ich ok. 1000 w genomie E. coli) i nacinaj w tym miejscu jeden z acuchw DNA stwarzajc obszar jednoniciowy, do ktrego moe doczy si biako RecA. Mutacje w tych genach zmniejszaj czsto rekombinacji niemal stokrotnie. Poza tym w procesie rekombinacji bierze udzia wiele innych enzymw typu endonukleaz, a take polimeraza DNA I oraz ligaza DNA reperujce jednoniciowe odcinki w DNA, ktre powstaj w wyniku wycinania odcinkw acucha DNA przez kompleks RecBCD. Wikszo omawianych tu etapw procesu rekombinacji homologicznej u E. coli zostaa ostatnio przeprowadzona w ukadach in vitro, a powstajce w tych warunkach charakterystyczne struktury Hollidaya byy uwidocznione na zdjciach z mikroskopu elektronowego.

9.13. Heterodupleksy powstajce w procesie rekombinacji s przyczyn zjawiska konwersji genw Jeli w procesie rekombinacji bior udzia czsteczki DNA rnice si jedn czy kilku mutacjami punktowymi w pobliu miejsca crossing-over, to w powstajcym odcinku mieszacowego DNA heterodupleksu wystpowa bd pary niewaciwie sparowanych zasad, odpowiadajce miejscom mutacji punktowych. Takie niekomplementarne pary zasad mog by nastpnie reperowane przez losowe wycinanie jednej z dwch niewaciwie sparowanych zasad w opisanym wyej procesie wycinania i resyntezy.

Proces ten mona dokadnie przeledzi u niektrych grzybw z grupy workowcw (.Ascomycetes), na przykad u drody, u ktrych w wyniku mejozy powstaj cztery produkty (tetrada) w postaci spor w jednym worku (ascu). Jeeli zanalizujemy skad genetyczny poszczeglnych spor tetrady, to stwierdzimy, e segregacja alleli genw flankujcych miejsce zajcia crossing-over jest z reguy symetryczna. To znaczy, e allele genw + (typu dzikiego) i m (typu

(a)
0

A A a 0 a

+ + m1 mi

+ + rri2 m2

B B b b

(b)
0

A A a 0 a

c/0

Ti + m1 +

m2
+

b b B B

m2 +

(c)

A a

Ti m1 Ti +

+ + T2 +

b b B B

()
(d)
(a)
(b) (c) (d)

obszar heterodupleks u A m-i + b A m1 + b a mi + B a + + B

Rys. 9.7. Konwersja genw jest wynikiem reperacji niewaciwie sparowanych zasad w heterodupleksie. (a) Dwie czsteczki DNA oznaczone kolorem czarnym i czerwonym o markerach genetycznych A + m l + m2B i aml m2 b. (b) W wyniku rekombinacji i crossing-over (c/o) markery zewntrzne A i a oraz B i b ulegn rekombinacji. Markery + i ml oraz + i m2 znajd si w powstajcym heterodupleksie i wobec tego w ich loci wystpowa bd pary niewaciwie poczonych zasad, (c) W wyniku naprawy niewaciwie sparowanych zasad w heterodupleksie w locus ml zasza konwersja H ml, a w drugim locus w kierunku odwrotnym m2- + .*(d) Po drugim podziale mejotycznym w worku powstan cztery spory o nastpujcych genotypach: spora spora spora spora 1 Aml + b 2 A m ^ b 3 a m l + m2 B 4 a + + B

A wic lece poza heterodupleksem markery A i a oraz B i b bd segregoway w stosunku normalnym 2:2, natomiast allele ml i + m l czy m2 i + m 2 bd segregoway w stosunku 3ml: 1 + ml bd lm2:3 + m2

(a)

5' 3' 3' 5'

3' 5 3' 5'

(b)

5' 3' 3' 5'

3' 5' 3' 5'

zmutowanego) segreguj w stosunku 2-f \2m. Jeli jednak zanalizujemy segregacje alleli lecych blisko siebie w obrbie wytworzonego heterodupleksu, to stwierdzimy, e mog one segregowa asymetrycznie, tworzc worki typu 3+ : lm lub 1 + : 3m. Zjawisko to zostao nazwane konwersj genw. Podczas crossing-over zjawisko konwersji genw zachodzi tylko na niewielkim odcinku DNA, w ktrym w wyniku koniugacji powsta heterodupleks. Allele genw, lece poza obszarem heterodupleksu, segreguj z reguy symetrycznie. Zjawisko konwersji genw jest w rzeczywistoci wynikiem reperacji niewaciwie sparowanych zasad w obszarze heterodupleksu. Poniewa obie nici DNA s ju zmetylowane, wycinanie jednej zasady z niewaciwie sparowanej pary zasad jest losowe i powoduje konwersj alleli w obu kierunkach, mniej wicej z jednakow czstoci. To te konwersje typu m -> + czy H> m powoduj w tetradach asymetryczne segregacje 3 + :lm czy 1 + :3m (rys. 9.7). Tak wic wzajemnej symetrycznej segregacji alleli lecych poza heterodupleksem towarzyszy moe zjawisko konwersji genw w wyniku procesw reperacyjnych zachodzcych w heterodupleksie. To wskazuje, e w procesie crossing-over u organizmw eukriotycznych mamy doczynienia z mechanizmami podobnymi do obserwowanych u E. coli z tym, e dotychczas ich podstawy molekularne nie s jeszcze w peni wyjanione. 9.14. Udzia rekombinacji w procesach reperacji DNA Jeli powstajce po napromieniowaniu UV fotodimery pirymidynowe s bardzo liczne, to omawiane poprzednio mechanizmy: naprawa przez fotoreaktywacj czy te wycinanie i reperacja luk powstajcych w DNA, nie s w stanie usun wszystkich uszkodze. Jeeli uszkodzony DNA wchodzi w nastpny cykl replikacyjny, polimeraza DNA III dochodzc do miejsca, w ktrym w acuchu matrycowym znajduje si fotodimer, przerywa replikacj i rozpo-

Rys. 9.8. Postreplikacyjna naprawa przez rekombinacj, (a) W czsteczce oznaczonej kolorem czerwonym na skutek obecnoci nie zreperowanego dimeru pirymidynowego w czasie replikacji powstaje luka w nowo syntetyzowanej nici. Druga homologiczna oznaczona kolorem czarnym czsteczka jest nie uszkodzona i normalnie zreplikowana. (b) Znajdujcy si naprzeciw powstaej luki jednoniciowy DNA czy si z biakiem RecA. (c) Powizane z jednoniciowym DNA biako RecA atakuje homologiczn czsteczk, powodujc lokalne rozplecenie heliksu i wytworzenie heterodupleksu. Jednoczenie nukleazy powoduj nacicie nici docelowej (czarnej). Jeeli obie homologiczne nici maj wolne koce, to nastpuje rekombinacja typu crossing-over i wytwarzanie heterodupleksu w wyniku przesuwania rozgazienia przy udziale biaka RecA. (d) Powstaje figura krzyowa Hollidaya, w ktrej naprzeciw dimeru pirymidynowego w nici oznaczonej kolorem czerwonym jest nie uszkodzony odcinek nici oznaczonej kolorem czarnym. Rwnie luka w drugiej nici czerwonej bdzie poczona z odcinkiem nici oznaczonej kolorem czarnym, (e) Powstajce po przeciciu figury Hollidaya dwie zrekombinowane czsteczki DNA mog ju by zreperowane przez wycicie dimeru i syntez brakujcego odcinka w drugiej nici przeprowadzan przez polimeraz DNA I przy wykorzystaniu matrycy z drugiej nici homologicznej

czyna j dalej (na przykad od miejsca startu nastpnego fragmentu Okazaki) pozostawiajc luk w nowo syntetyzowanym acuchu DNA. W wyniku niecigoci replikacji DNA zostaje pofragmentowany, co prowadzi ostatecznie do mierci komrki. W tej sytuacji jedynym wyjciem prowadzcym do zreperowania uszkodzonej czstki DNA jest rekombinacja z drugim nie uszkodzonym heliksem DNA (rys. 9.8). W komrkach mutantw E. coli Reca~, UVR ABCD" niezdolnych do rekombinacji i reperacji przez wycinanie dimerw po napromieniowaniu UV, replikacja DNA prowadzi do powstawania fragmentw DNA o dugociach odpowiadajcych odlegociom midzy dimerami wytworzonymi w DNA. W takich mutantach obecno dwuch-trzech dimerw w czsteczce DNA jest ju letalna, podczas gdy w szczepie dzikim komrka potrafi usun okoo 50 dimerw pirymidynowych. Rwnie podwjne pknicia w obu acuchach heliksu wywoywane promieniowaniem jonizujcym czy niektrymi mutagenami chemicznymi s reperowane podczas rekombinacji z drugim nie uszkodzonym homologicznym dupleksem DNA. Powstajce na kocach podwjnego pknicia odcinki jednoniciowe po wejciu w kontakt z biakiem RecA mog nastpnie atakowa drug homologiczn czsteczk DNA i w wyniku dwch crossing-over restytuowa dwa normalne dupleksy DNA, po wypenieniu powstajcych luk przez polimeraz DNA I i ligacj przez DNA ligaz. 9.15. Mutageniczny system SOS naprawy DNA u E coli Dotychczas omawiane procesy reperacji uszkodze w DNA byy przeprowadzane przez enzymy produkowane konstytutywnie w komrkach E. coli. Ich aktywno w komrkach utrzymuje si na okrelonym poziomie i mog one zreperowa tylko ograniczon liczb uszkodze w DNA w okresie midzypodziaowym komrek. Jeli jednak pod wpywem mutagenu powstan bardzo liczne uszkodzenia DNA tak, i systemy reperacyjne nie s w stanie ich w peni eliminowa, to w DNA powstaj liczne pknicia i nastpuje fragmentacja czsteczek DNA. W tej krytycznej sytuacji nastpuje indukcja systemu, zwanego SOS. Indukcja dotyczy kilkunastu rnych genw biorcych udzia w rekombinacji i reperacji DNA. Wrd indukowanych genw jest te gen recA. U E. coli wystpuje gen LexA kodujcy biako represorowe, ktre hamuje nie tylko produkcj samego represora LexA, ale take biaka RecA i kilkunastu innych biaek zwizanych z rekombinacj i reperacj DNA, wic si z okrelon sekwencj sygnaow w obszarach promotorowych genw kodujcych te biaka. Indukcja wynika z inaktywacji represora LexA na skutek proteolitycznego przecicia tego polipeptydu. Przecicia dokonuje kompleks biaka RecA z jednoniciowymi fragmentami DNA, powstajcy w momencie zahamowania replikacji DNA i jego zaczynajcej si degradacji. W wyniku proteolizy represora nastpuje derepresja genu RecA i gwatowny wzrost iloci biaka

RecA w komrce. Jednoczenie indukcji podlega ekspresja innych genw reprymowanych przez represor LexA, jak na przykad uvrA, uvrB, uvrC, uvrD oraz innych genw o bliej nieznanych funkcjach, jak umuC, umuD. By moe geny umuC i umuD koduj biaka, ktre nadaj polimerazie DNA nowe waciwoci losowego wczania zasad do nowo syntetyzowanego acucha DNA, gdy w acuchu matrycowym wystpuje luka czy na przykad dimery pirymidynowe. Reakcja SOS zwiksza istotnie przeywalno komrek po dziaaniu mutagenu w wyniku wzmoonej rekombinacji, a take wypeniania luk wystpujcych w DNA mimo braku nie uszkodzonej matrycy. Oczywicie taki proces reperacji DNA powoduje istotny wzrost czstoci mutacji w wyniku losowego wczania zasad i kontynuacji syntezy DNA mimo braku waciwej matrycy. Do tej pory system reperacji SOS zosta opisany jedynie u bakterii. 9.16. Rekombinacja moe zachodzi take midzy niehomologicznymi czsteczkami DNA Rekombinacja oglna, czyli homologiczna, moe zachodzi w dowolnym miejscu midzy dwiema czsteczkami DNA o homologicznych sekwencjach nukleotydowych. Szczeglnym przypadkiem rekombinacji jest tzw. rekombinacja zlokalizowana, w ktrej bior udzia czsteczki o rnych sekwencjach nukleotydowych, majce jedynie niewielkie odcinki homologiczne, midzy ktrymi zachodzi rekombinacja. Jednym z dobrze poznanych przykadw takiej rekombinacji jest integracja DNA faga X w postaci profaga do chromosomu E. coli. Bakterie zawierajce profaga zwane s lizogenicznymi. W bakteriach lizogenicznych istniejcy w ich genomie profag X moe zosta w procesie odwrotnym do jego integracji wycity z chromosomu i jako niezaleny fag moe rozpoczyna cykl lityczny (rys. 9.9). Rekombinacja zachodzi midzy specyficznymi miejscami przyczepu, zwanymi attB w DNA bakterii i attP w DNA faga. Miejsca attB i attP maj wspln, homologiczn 15-nukleotydow sekwencj, zwan O, ktra jest oflankowana po obu stronach sekwencjami B i B1 u bakterii i P oraz P1 u faga. W procesie integracji kolistej czsteczki faga do chromosomu bakteryjnego bior udzia dwa enzymy. Jeden, zwany integraz, jest kodowany przez fagowy gen int, a drugi, zwany IHF, jest kodowany przez gen bakteryjny. Integraza fagowa wspomagana przez biako IHF wice si z obszarami flankujcymi B i P, przecina sekwencje O faga i bakterii w dwch miejscach, przesunitych w stosunku do siebie o 7 nukleotydw. Powstajce wolne koce DNA fagowego i bakteryjnego s nastpnie czone ze sob. W ten sposb kolista czsteczka DNA faga zostaje precyzyjnie zintegrowana w postaci liniowego profaga w miejscu attB chromosomu E. coli. Tak wic w odrnieniu od rekombinacji oglnej, rekombinacja zlokalizowana zachodzi w cile okrelonym obszarze DNA rozpoznawanym przez specyficzne enzymy. Wycinanie

DNA bakteryjny. integracja

att B Int JHF

wycicie profaga A BO P' att L

Int Xis JHF POB' profag att R

Rys. 9.9. Wczanie (integracja) i wycinanie DNA faga lambda (A) z DNA chromosomu E. coli. Kolista czsteczka faga ma miejsce przyczepu attP zoone z odcinkw POP'. W DNA E. coli wystpuje analogiczne miejsce attB o strukturze BOB'. Oba miejsca przyczepu maj wspln 15-nukleotydow sekwencj rdzeniow O. Enzymy Int i IHF przeprowadzaj zlokalizowan rekombinacj wyniku dwch przesunitych naci w obszarach O fagowym i bakteryjnym. Po poczeniu krzyowym wolnych kocw nacitych nici zachodzi integracja D N A fagowego do DNA bakteryjnego w postaci liniowej struktury profaga X. Przeciwny proces wycinania profaga X z DNA bakterii przeprowadzaj trzy enzymy Int, Xis i IHF

profaga z DNA E. coli odbywa si w analogiczny sposb, z tym, e oprcz dwch enzymw biorcych udzia w integracji profaga bierze take udzia enzym kodowany przez fagowy gen iw.

9.17. Ruchome elementy genetyczne, czyli transpozony Genomy rnych organizmw wykazuj znaczny stopie staoci, co umoliwia ustalenie map genetycznych obrazujcych pozycje genw w chromosomach. Nawet odrbne, ale pokrewne gatunki, jak na przykad E. coli i S. typhimurium maj bardzo zblione ukady liniowe genw utrzymujce si od czasu ich niezalenej ewolucji od wsplnego przodka. Istotne ewolucyjne zmiany w strukturze genomw wymagaj dugiego czasu. Wykryto jednak u wielu ronych organizmw wystpowanie elementw genetycznych zdolnych do zmiany miejsca pooenia w genomie, ktre oglnie nazywa si trans-

pozonami. S to odcinki DNA zoone z setek czy tysicy par nukleotydw, ktre ulegaj przemieszczaniu si, czyli transpozycji, i mog wywoywa due zmiany w strukturze genomw, jak na przykad inwersje, delecje czy duplikacje duych fragmentw DNA. Proces transpozycji zwizany z wycinaniem i integracj transpozonw jest wynikiem rekombinacji midzy niehomologicznymi sekwencjami wystpujcymi w transpozonach i miejscach ich integracji

Tabela 9.2. Niektre transpozony bakteryjne i organizmw eukariotycznych Liczba par zasad Liczba par Gatunek, w sekwencjach zasad Liczba par w ktrym wystpuje terminalnych w sekwencji zasad transpozon p prostych, docelowej o odwrconych 768 1327 4957 23a 41o 38o E. coli. K12 E. coli K12 E. coli 9 5 5

Symbol elementu

Uwagi

IS1 IS2 Tn3

koduje transpozaz koduje transpozaz zawiera gen opornoci na ampicylin zawiera gen opornoci na kanamycyn zawiera gen opornoci na chloramfenikol powoduje * pkanie chromosomw jako niekompletny element

Tn5

5700

IS50O (1531 par E. coli, plazmid R zasad) ISlp E. coli, plazmid R

Tn9

2500

AC

4563

llo

kukurydza

Tcl P

1610 2900

54o 31o

Caenorhabditis elegans D. melanogaster

2 (TA) 8 wywouje zaburzenia linii komrek pciowych

retrotranspozony Ty 5600 250p 05) drode 5 transpozycja przez mRNA i odwrotn transkrypcj na DNA transpozycja przez mRNA i odwrotn transkrypcj na DNA

copia

5000

300p

D. melanogaster

4-5

w DNA. Tak rekombinacj nazywa si rekombinacj nieuprawnion. Jest ona sterowana przez specyficzne enzymy transpozazy. W genomach rnych organizmw wykryto dziesitki rnych rodzajw transpozonw, rnicych si struktur genetyczn (tab. 9.2). W komrkach transpozony jednego typu mog wystpowa w ronej liczbie kopii od kilku do kilkunastu. Midzy homologicznymi sekwencjami tych samych transpozonw znajdujcych si w genomie w rnych pooeniach mog zachodzi rekombinacje homologiczne typu crossing-over, prowadzce do znacznych zmian w strukturze genomu. Transpozony mogy odgrywa istotn rol w rnicowaniu struktury genomw, jako jeden z czynnikw ewolucji nowych gatunkw. Transpozony zostay wykryte po raz pierwszy metodami genetycznymi w kukurydzy przez Barbar McClintok w latach 50. Dopiero jednak wykrycie transpozonw u bakterii w kilkanacie lat pniej doprowadzio do poznania zarwno ich struktury molekularnej, jak i przebiegu procesu transpozycji.

9.18. Transpozony bakteryjne U bakterii wystpuje wiele transpozonw o stosunkowo prostej strukturze, nazwanych sekwencjami insercyjnymi IS. Oznacza si je symbolami IS1, IS2 itd. w zalenoci od kolejnoci ich wykrywania. Wspln waciwoci sekwencji IS jest wystpowanie na ich obu kocach powtrzonych identycznych lub prawie identycznych sekwencji o odwrconych polarnociach, zwanych terminalnymi odwrconymi powtrzeniami. Na przykad, IS2 zoona jest z 1327 par nukleotydw i na kocach ma terminalne, odwrcone powtrzenia, zoone z 41 par nukleotydw. Odcinek DNA lecy midzy terminalnymi powtrzeniami zawiera sekwencj kodujc polipeptyd transpozazy IS2, specyficznego enzymu przeprowadzajcego transpozycj IS2. Transpozaza rozpoznaje obie terminalne sekwencje IS2 oraz krtk sekwencj zoon z 5 nukleotydw w chromosomie bakteryjnym. Nastpnie transpozaza nacina obie nici DNA na obu kocach IS2 oraz w sekwencji docelowej, przy czym w tym wypadku nacicia s w obu niciach DNA przesunite o 5 par nukleotydw. Po poczeniu wolnych kocw acuchw DNA z przesunitymi naciciami w sekwencji docelowej nastpuje transpozycja IS2 do nowego miejsca w genomie. Z procesem transpozycji IS2 jest powizana zawsze duplikacja 5-nukletydowej sekwencji docelowej. Po transpozycji IS2 w jej nowym pooeniu jest oflankowana rozpoznawan sekwencj docelow, ktra przed insercj IS2 wystpowaa tylko w jednej kopii. Proces ten jest oczywicie wynikiem dosyntetyzowania brakujcych 5-nukleotydowych sekwencji po obu stronach IS2 przez polimeraz DNA. Jest to waciwo oglna wszelkich transpozonw, i przesunite o kilka (5-7) nukleotydw nacicia w rozpoznawanych przez transpozaz sekwencjach docelowych w DNA biorcy zostaj w wyniku transpozycji zreplikowane i flankuj transpozon wczony w nowym pooeniu w DNA biorcy. Ruchome elementy

typu IS mog by wczane w bardzo rne miejsca chromosomu E. coli, chocia czsto wystpuj gorce miejsca", w ktrych s one wczane z du czstoci. Na przykad IS2 jest czsto wczana do operonu gal E. coli w pozycji promotorowo-operatorowej i powoduje wystpowanie fenotypu gal~, a wic mutanta niezdolnego do wzrostu na galaktozie. Mutanty wywoane insercj transpozonu s nietrwae i rewertuj z czstoci znacznie wysz ni mutacje punktowe, w wyniku czstego wycinania i transpozycji IS2 w inne miejsca genomu.

9.19. Bardziej zoone bakteryjne transpozony typu Tn Transpozony typu Tn s dusze od IS; na kocach maj odwrcone cae jednostki IS lub wasne specyficzne terminalne powtrzenia o tej samej lub odwrotnej polarnoci. W czci rodkowej midzy terminalnymi powtrzeniami wystpuj geny kodujce enzymy, ktre przeprowadzaj transpozycj, a take inne geny nie zwizane z transpozycj. Najlepiej zostay poznane transpozony E. coli, przenoszce geny opornoci na rne antybiotyki, jak: penicylina, ampicylina, tetracyklina itp. Jednostki Tn wystpuj czsto w plazmidach, ktre nadaj bakteriom oporno na rne antybiotyki. W wyniku transpozycji mog one by przenoszone take do chromosomw bakteryjnych. Przykadem transpozonu o stosunkowo prostej budowie moe by Tn3. Skada si on z obszaru centralnego o dugoci ok. 5000 par nukleotydw i ma na obu kocach powtrzone i odwrcone sekwencje terminalne zoone z 38
IS tnpA IRS tnpB ampr IS

38

3066

19

558

861

38

Rys. 9.10 Struktura transpozonu Tn3. Czerwonym kolorem jest oznaczony DNA bakterii. Picionukleotydowa sekwencja docelowa rozpoznawana przez transpozaz Tn3 flankuje z obu stron wczony do DNA bakterii transpozon Tn3. Na obu kocach transpozonu Tn3 znajduj si powtrzone i odwrcone sekwencje IS zoone z 38 par zasad. Wewntrz transpozonu znajduj si trzy geny tnpA, tnpBiampr kodujce odpowiednio transpozaz, represor transpozazy z jednoczesn aktywnoci resolwazy oraz /Maktamaz nadajc bakterii oporno na /Maktamowe antybiotyki, jak na przykad ampicylina. Strzaki oznaczaj kierunek transkrypcji. Liczby oznaczaj dugo odcinkw w parach nukleotydw. Wewntrzny odcinek nie kodujcy, zwany IRS (wewntrzny odcinek resolucji), obejmuje 19 par zasad midzy genami tnpA i tnpB

par nukleotydw. W czci centralnej wystpuj trzy geny tnpA, tnpB i ampR (rys. 9.10). Gen tnpA koduje transpozaz, gen tnpR koduje biako o podwjnej funkcji represora transkrypcji genu tnpA oraz tak zwanej resolwazy, biorcej udzia w procesie transpozycji i wreszcie gen ampR koduje /Maktamaz, nadajc bakterii oporno na ampicylin. Transpozaza rozpoznaje odwrcone

=^mtmsmfmsfffft(fi

Rys. 9.11. Efekty rekombinacji homologicznej midzy transpozonami. (a) Wzajemna homologiczna rekombinacja midzy prostymi powtrzeniami prowadzi do wycicia (delecji) odcinka DNA lecego midzy powtrzeniami. Wycity odcinek tworzy struktur kolist z jednym powtrzeniem, (b) Rekombinacja wzajemna midzy dwoma homologicznymi sekwencjami o rnej orientacji powoduje odwrcenie (inwersj) odcinka D N A lecego midzy nimi

sekwencje terminalne Tn3 oraz 5-nukleotydow sekwencj docelow w miejscu, w ktrym zachodzi transpozycja. W czasie transpozycji 5-nukleotydowa sekwencja zostaje nacita oraz nastpnie zreplikowana i flankuje Tn3 w jego nowym pooeniu w genomie bakterii. Produkt genu tnR, jako represor transkrypcji, wie si z 19-nukleotydowym odcinkiem res lecym midzy genami tnpA oraz tnpR i blokuje transkrypcj obu genw, ktrych promotory znajduj si po prawej i lewej stronie obszaru res. W wyniku blokady obu promotorw poziom biaek kodowanych przez oba geny jest niski, co ogranicza czsto transpozycji Tn3. Transpozycja Tn3 w inne miejsce w tym samym chromosomie lub do odrbnej czsteczki DNA (na przykad plazmidowej) zachodzi w analogiczny sposb, jak przy transpozycji IS2. Transpozycja polega albo na wyciciu transpozonu z jednej pozycji w DNA i integracji w nowym pooeniu, w ktrym transpozaza rozpoznaje specyficzn 5-nukleotydow sekwencj docelow, albo te na zreplikowaniu caego transpozonu i wtedy tylko jego nowa kopia zostaje wczona w nowym pooeniu.

Bdzie to wtedy transpozycja replikatywna, w ktrej liczba kopii transpozonu w komrce wzrasta. Midzy dwoma transpozonami o tej samej sekwencji nukleotydowej mog zachodzi rekombinacje homologiczne typu crossing-over. Jeli dwa transpozony s zintegrowne w tej samej czsteczce DNA w jednakowej orientacji, to proces rekombinacji prowadzi do delecji odcinka DNA oddzielajcego dwa transpozony (rys. 9.11). W przypadku rekombinacji midzy transpozonami wczonymi do chromosomu w odwrotnej orientacji dochodzi do inwersji obszaru DNA lecego midzy dwoma transpozonami. Jeli transpozycja zachodzi midzy dwoma kolistymi transpozonami, to nastpuje fuzja obu czsteczek i wytworzenie tak zwanego kointegratu.

Rys. 9.12. Transpozycja Tn3 midzy dwoma replikonami zwizana z replikacj caego transpozonu. W wyniku replikacyjnej transpozycji Tn3 z jednego replikonu do drugiego powstaje, jako forma przejciowa, kointegrat z poczonych razem dwch replikonw. Po rekombinacji zachodzcej w kointegracie midzy dwoma Tn3 nastpuje ich rozdzia z udziaem resolwazy kodowanej przez gen tnpR, rozpoznajcej przesunite miejsce naci w rejonie IRS

Zarwno konserwatywna, jak i replikatywna transpozycja mog by inicjowane w podobny sposb. Pierwszym etapem jest spowodowanie przez transpozaz czterech jednoniciowych naci zarwno w DNA dawcy transpozonu, jak i w DNA biorcy (sekwencji docelowej transpozycji). S to dwa nacicia na obu kocach transpozonu oraz dwa nacicia przesunite o 5 czy 9 nukleotydw w miejscu docelowym transpozycji. Po krzyowym poczeniu powstaych wolnych kocw w DNA integracja jest zawsze zwizana z doreplikowaniem 5-9-nukleotydowych odcinkw midzy przesunitymi miejscami naci w sekwencji docelowej (w przypadku prostego wycicia transpozonu) lub te replikacja obejmuje cay transpozon (w przypadku replikatywnej transpozycji). W przypadku replikatywnej transpozycji midzy dwoma kolistymi replikonami nastpuje wytworzenie kointegratu czcego DNA obu replikonw (rys. 9.12). Kointegrat jest etapem przejciowym zachodzcej transpozycji. Po jego powstaniu zachodzi rozdzielenie poczonych replikonw w procesie zwanym resolucj. Proces ten polega na homologicznej rekombinacji midzy dwoma 19-nukleotydowymi sekwencjami res, wystpujcymi w transpozonie Tn3 midzy genami tnpA i tnpR. Rekombinacji dokonuje biako kodowane przez gen tnpR, ktre oprcz waciwoci represorowych ma waciwoci specyficznej endonukleazy przecinajcej sekwencj res. W ten sposb poczone w kointegracie dwa replikony zostaj rozdzielone i oba maj po jednej kopii transpozonu, bez wycicia transpozonu z jego poprzedniego miejsca w czsteczce DNA dawcy. 9.20. Niektre transpozony maj waciwoci zblione do retrowirusw W organizmach eukariotycznych wykryto transpozony o strukturze i sposobie przemieszczania si podobnym do transpozonw bakteryjnych. Ponadto w organizmach eukariotycznych opisano odrbny typ transpozonw, nazywanych retrotranspozonami. Retrotranspozony, podobnie jak retrowirusy, przechodz w cyklu transpozycji przez RNA, ktry nastpnie w wyniku dziaania odwrotnej transkryptazy jest przepisany na DNA. Maj one na obu kocach powtrzone sekwencje terminalne, ktre umoliwiaj ich integracj w rnych miejscach DNA. Retrotranspozony maj niektre geny zblione do genw retrowirusw, jak na przykad gen kodujcy biaka odwrotnej transkryptazy. Od retrowirusw rni si przede wszystkim tym, e nigdy nie wystpuj poza komrk jako infektywne czstki wirusowe. 9.21. Integracja retrowirusw do chromosomw gospodarza Genom retrowirusw skada si z acuchw RNA majcych dugie terminale powtrzenia (LTR). Po przeprowadzeniu za pomoc odwrotnej transkryptazy zostaje on wczony do chromosomu gospodarza jako liniowy

RNA

LTR odwrotna transkrypcja

LTR

DNA wirusowy

LTR 1 1 gag

' pol pol

LTR env | |

cyrkularyzacja

l JTTRJSE
DNA gospodarza.

integracja prowirusa LTR 909 pol LTR

Rys. 9.13. Integracja D N A retro wirusowa do DNA gospodarza. Genom wirusa w postaci czsteczki RNA z dwoma dugimi, terminalnymi powtrzeniami (LTR) zostaje najpierw przeprowadzony w dwuniciow czsteczk D N A w wyniku dziaania odwrotnej transkryptazy kodowanej przez wirusowy gen pol. Wirusowa czsteczka D N A zostaje nastpnie przeprowadzona w form kolist przez poczenie obszarw LTR. W kolejnym etapie procesu integracji enzym, zwany integraz, kodowany rwnie przez wirusowy gen pol dokonuje przesunitych naci w rejonach LTR DNA wirusowego i w miejscu integracji z D N A gospodarza. Wolne koce D N A wirusowego i gospodarza zostaj ze sob poczone, co prowadzi do wczenie liniowego prowirusa do D N A gospodarza. W trakcie integracji 5-nukleotydowa sekwencja w D N A gospodarza zostaje zreplikowana i flankuje D N A wczonego prowirusa

prowirus. Prowirus zawiera trzy podstawowe geny: gag kodujcy biakow cz tworzc nukleoproteinowy rdze wirusa, pol kodujcy biako, ktre ma waciwoci odwrotnej transkryptazy, a take waciwoci proteazy, RNazy oraz integrazy i wreszcie trzeci gen env kodujcy biaka okrywy wirusa (rys. 9.13). Integracja prowirusa jest zawsze zwizana z duplikacj 5-6-nukleotydowej sekwencji docelowej w DNA gospodarza, flankujcej prowirusa wczonego do DNA. DNA prowirusa jest nastpnie transkrybowany z promotorw wystpujcych w LTR. Powstajcy RNA suy jako matryca w syntezie

biaek wirusowych bd te wchodzi w skad potomnych czstek wirusa. Retrowirusy w postaci prowirusw wystpuj w DNA ssakw czsto w wielu kopiach w rnych pozycjach genomu. Prowirusy mog by wycinane z DNA gospodarza, podobnie jak w przypadku transpozonw bakteryjnych. Przy wycinaniu mog utraci cz wasnego DNA i wczy odcinek DNA gospodarza, ktry znajdowa si w pobliu miejsca ich integracji. 9.22. Retrotranspozony Ty u drody maj wiele wsplnych waciwoci z retrowirusami U drody wystpuje kilka pokrewnych typw retrotranspozonw oznaczonych symbolem Ty. S to elementy o dugoci ok. 5600 par nukleotydw, majce na obu kocach proste, terminalne powtrzenia o dugoci 250 par zasad, oznaczone jako <5. W czci centralnej Ty znajduj si sekwencje homologiczne do retrowirusowych genw gag i pol, brak za homologa wirusowego genu env. Powstajce po transkrypcji Ty liczne czsteczki mRNA wytwarzaj w komrkach drody czstki nukleoproteinowe podobne do wirusw (VLP). Zawieraj transkrypty RNA powizane z biakowymi produktami genu gag. Biako kodowane przez gen pol retrotranspozonu Ty, podobnie jak u retrowirusw, ma waciwoci odwrotnej transkryptazy, proteazy, integrazy i RNazy. Powstajce w wyniku dziaania odwrotnej transkryptazy dwuniciowe acuchy DNA s nastpnie integrowane do chromosomw drody z jednoczesn duplikacj 5-nukleotydowej sekwencji docelowej. Mechanizmy integracji elementw Ty s zblione do opisanych dla transpozonw bakteryjnych, z t jednak rnic, e replikacja retrotranspozonw odbywa si z udziaem odwrotnej transkrypcji mRNA. Efekty fenotypowe insercji Ty s takie same, jak transpozonw bakteryjnych. Wycinanie retrotranspozonw Ty z DNA drody odbywa si najczciej przez homologiczn rekombinacj midzy terminalnymi powtrzeniami <5. Najczciej wycicie jest niekompletne i w miejscu retrotranspozonu Ty pozostaje pojedyncza kopia < 5 . Takich pojedynczych kopii S moe by w pojedynczym genomie drody do kilkuset i s one wiadkami dawnych miejsc integracji elementw Ty. Nie jest jasne, jakie jest filogentyczne powizanie midzy retrowirusami a retrotranspozonami. Analogiczne do Ty retrotranspozony zostay wykryte w wielu innych organizmach eukariotycznych, jak na przykad elementy copia u D. melanogaster, elementy TAP u gryzoni czy element cial u rolin. Wszystkie te elementy maj geny czciowo homologiczne z genami pol i gag retrowirusw. 9.23. Wykorzystanie transpozonw w genetyce molekularnej Z transpozonw mona wycina znajdujce si w nich geny i wprowadza w zamian dowolne inne geny. Jeeli pozostan terminalne powtrzenia, to bd

one rozpoznawane przez specyficzne dla danego transpozonu transpozazy, ktre bd je integrowa w rne miejsca genomu komrki. Jeli z transpozonu zostay wycite geny kodujce transpozaz czy inne enzymy biorce udzia w integracji transpozonw, to takie jednostki trac zdolno do integracji. Jeli jednak w komrce bd si znajdowa inne kopie nie zmodyfikowanych transpozonw, to produkowane przez nie enzymy bd uczynnia nieaktywny transpozon. Transpozony z wprowadzonymi do nich genami wykorzystuje si obecnie do otrzymywania organizmw transgenicznych, gdy maj one zdolno aktywnej integracji do genomu gospodarza. U D. melanogaster w celu otrzymania osobnikw transgenicznych uywa si jako wektora transpozonu P. Rne rodzaje transpozonw s take obecnie wykorzystywane do wykrywania i lokalizacji genw w chromosomach. Jeeli mutacja w nie zidentyfikowanym genie jest wynikiem insercji transpozonu w obrbie czy w pobliu badanego genu, to jego identyfikacja przez hybrydyzacj z radiaktywn sond transpozonow jest stosunkowo prota. Sond tak mona wykorzysta albo do przeszukiwania banku genowego, albo te jak u D. melanogaster i u krgowcw do hybrydyzacji in situ z caymi chromosomami.

10. GENY A RNICOWANIE SI I ROZWJ

Jednym z podstawowych problemw biologii jest wyjanienie mechanizmw, ktre powoduj, e z pojedynczej zapodnionej komrki jajowej powstaje skomplikowany organizm, zoony z wyspecjalizowanych narzdw i tkanek, uporzdkowanych i funkcjonujcych wedug odziedziczonego planu. Zagadnienie to, od dawna stanowice przedmiot bada embriologii, przez dugi czas nie podlegao analizie genetycznej, tote genetyka rozwoju jest wci jeszcze najmniej poznanym dziaem nauki o dziedzicznoci. Dopiero ostatnie lata przyniosy zasadniczy postp w tej dziedzinie, dziki rewelacyjnym odkryciom dokonywanym podczas bada nad genami kierujcymi rozwojem muszki owocowej. Badania te otworzyy zupenie nowe moliwoci analizy genetycznej rozwoju dziki bezporedniej identyfikacji konserwatywnych ewolucyjnie genw, wpywajcych na ksztatowanie postaci osobnika. Niniejszy rozdzia powicony jest omwieniu wybranych przykadw tych osigni genetyki rozwoju zwierzt. Najpierw jednak przedstawione zostan podstawowe zagadnienia z zakresu rnicowania si komrek i ich losw w rozwoju osobniczym.

10.1. Zjawisko rnicowania si (dyferencjacji) Zapodniona komrka jajowa jest totipotencjalna, co oznacza, e ma ona nieograniczone w ramach waciwych dla danego gatunku moliwoci rozwojowe, gdy daje pocztek wszystkim komrkom organizmu. Dopiero w trakcie kolejnych podziaw zygoty wyodrbniaj si, grupy komrek, z ktrych powstan tkanki o specyficznych waciwociach: nabonkowe, nerwowe, miniowe itp., czemu towarzyszy stopniowe zmniejszenie ich dalszych moliwoci rozwojowych. Zjawisko to nosi nazw rnicowania si (dyferencjacji) komrek. Komrki zrnicowane maj najczciej charakterystyczn struktur, ksztaty i sposb funkcjonowania; zwykle syntetyzuj specyfi-

czne dla siebie biaka strukturalne lub wydzielnicze, a take biaka enzymatyczne, warunkujce specyficzny dla danego typu rnicowania cig przemian metabolicznych. Zrnicowanie mona wic obserwowa na rnych poziomach organizacji, jako: biochemiczne, cytologiczne, morfologiczne czy fizjologiczne, ale u podstaw wszystkich tych procesw le zmiany w stanie aktywnoci odpowiednich genw. Zmiany te decyduj o skierowaniu komrek na okrelon drog rozwojow, a wic o ich determinacji rozwojowej, czasem na dugo przedtem zanim ujawni si fenotypowo. Zrnicowanie komrek zwierzcych jest zwykle nieodwracalne komrki potomne albo zachowuj ten sam poziom zrnicowania, co komrki wyjciowe, albo ulegaj jeszcze dalej posunitej specjalizacji i tylko w wyjtkowych warunkach (np. w wyniku uszkodze tkanki lub w hodowli in vitr) moe doj do ich czciowego odrnicowania.
10.1.1. Komrki zrnicowane zawieraj (na og) peen zestaw informacji genetycznej

Nieodwracalno rnic midzy typami komrek zwierzcych moe sugerowa, e rnicowanie jest zwizane z selektywn eliminacj genw nie ulegajcych ekspresji w danej tkance. Wydawao si, e taki pogld potwierdzaj obserwacje tzw. diminucji chromatyny, polegajcej na eliminacji fragmentw chromosomw w dzielcych si komrkach zarodka, z wyjtkiem tych komrek, ktre tworz lini pciow. Jednak zjawisko to, opisane po raz pierwszy przeszo sto lat temu (w 1887 r.) przez T. Boveriego u glisty, zostao potem stwierdzone tylko u kilku jeszcze gatunkw zwierzt spord skorupiakw i muchwek). Ponadto okazao si, e eliminowane fragmenty chromosomw s zbudowane przede wszystkim z blokw heterochromatynowych, ktrych DNA nie ulega transkrypcji, a wic przypuszczalnie nie niesie informacji genetycznej. Tylko u pewnych muchwek (z rodziny Cecidomyidae) eliminowane s w linii somatycznej cae chromosomy, ktrych obecno jest konieczna w linii pciowej do normalnego przebiegu gametogenezy. Zjawisko eliminacji chromatyny wystpuje take w trakcie rozwoju makronukleusa u orzskw. Jeeli pominiemy te raczej wyjtkowe przypadki, u wikszoci badanych gatunkw mona wykaza nie tylko obecno wszystkich chromosomw w poszczeglnych tkankach, ale take taki sam wzr ich prkowania, co wskazuje na brak wikszych rnic. Stopniowo gromadziy si dowody wiadczce, i komrki zrnicowane nie trac informacji genetycznej. Chyba najbardziej przekonujce byy dowiadczenia J.B. Gurdona nad rozwojem ab z komrek jajowych, w ktrych niszczono wasne jdro, a na jego miejsce wprowadzano jdro wyizolowane z komrki w peni zrnicowanej (rys. 10.1). Okazao si, i np. jdro z komrki jelita kijanki po wprowadzeniu do bezjdrzastej komrki jajowej moe pokierowa penym rozwojem osobnika, a do osignicia postaci dorosej. Powodzenie tych dowiadcze zmniejszao si jednak w miar zaawansowania

komrka jajowa jelito

Rys. 10.1. Klonowanie u ab. Po zniszczeniu jdra komrki jajowej promieniami UV i wprowadzeniu jdra z jelita kijanki nastpi normalny rozwj osobnika

rozwoju osobnika, z ktrego tkanek pobierano jdro, np. jdra z komrek skry dorosej aby po wprowadzeniu do oocytu doprowadzay rozwj w najlepszym razie do stadium nie pobierajcej pokarmu kijanki. Wci nie wiadomo, czy ograniczenia te wynikaj z nieodwracalnego zablokowania informacji genetycznej z wiekiem (by moe nawet utraty jakich wanych sekwencji DNA), czy te z przeszkd natury technicznej. Niewtpliwie jednak opisane wyniki uzasadniaj wniosek, i zrnicowana komrka nie traci zestawu genw potrzebnych do wytworzenia rnych tkanek, mimo i w normalnych warunkach geny te nie ulegayby nigdy ekspresji w tej komrce. Jednak u zwierzt wyszych do pomylnego przebiegu takich dowiadcze konieczne jest, jak si wydaje, rodowisko cytoplazmatyczne komrki jajowej, gdy nie udao si doprowadzi do rozwoju osobnika z adnej zrnicowanej komrki somatycznej. Jest to natomiast moliwe u rolin, u ktrych stosunkowo atwo dochodzi do odrnicowania tkanek in vitro, po czym z pojedynczej komrki somatycznej mona wyhodowa now rolin. Za zachowaniem penej informacji genetycznej w zrnicowanych tkankach przemawiaj rwnie wyniki uzyskane po zastosowaniu technik molekularnych, gdy ani hybrydyzacja kwasw nukleinowych ani rozkad dugoci fragmentw citych enzymami restrykcyjnymi nie wykazuj na og rnic midzy prbkami DNA, wyizolowanymi z rozmaitych tkanek tego samego osobnika. Podobnie, obce fragmenty DNA wprowadzone do jdra zapodnionej komrki jajowej i wczone w jej chromosomy, mona potem wykry we wszystkich badanych tkankach.

10.1.2. W niektrych tyiko przypadkach rnicowanie jest zwizane z ilociowymi zmianami materiau genetycznego

W niektrych tkankach bardzo aktywnych metabolicznie nastpuje zwielokrotnienie zawartoci DNA. Moe ono polega na zwielokrotnieniu liczby chromosomw, jak w wtrobie ssakw, gdzie oprcz diploidalnych wystpuj komrki tetra- i oktoploidalne, powstae na skutek niewystpowania cytokinezy po podziale jdra. W innych tkankach, np. w komrkach gruczow linowych u muchwek, w wyniku endomitozy powstaj chromosomy politeniczne, ktre wobec zwielokrotnionej liczby genw umoliwiaj wyprodukowanie w krtkim czasie wielkiej iloci wydzieliny biakowej potrzebnej do przepoczwarczenia. Moe si dzia przeciwnie w erytrocytach ssakw dochodzi do cakowitej eliminacji jdra, a synteza globin odbywa si na matrycach zdeponowanego w cytoplazmie mRNA; dziki temu przystosowaniu rozmiary erytrocytw s niewielkie, a transport tlenu sprawniejszy. Zdarzaj si te przypadki selektywnego powielania lub utraty pewnych tylko odcinkw DNA. I tak, w komrkach folikularnych jajnika Drosophila, geny kodujce biako chorionu (zewntrznej osony jaja) ulegaj wybirczej amplifikacji, gdy zawierajce te geny odcinki DNA przechodz przez dodatkowe cykle replikacji. Dziki temu w cigu kilku zaledwie godzin syntetyzowane s olbrzymie iloci biaek chorionu potrzebne do produkcji oocytw. Z kolei w rosncych oocytach pazw, a take niektrych owadw, miczakw, skorupiakw i szkarupni zachodzi wielokrotna ampliflkacja genw kodujcych rRNA. Najpierw zostaje skopiowany i wycity odcinek DNA kodujcy 28S, 18S i 5,8S rRNA wraz z przerywnikami. Kopia ta nastpnie odcza si od chromosomu, ulega cyrkularyzacji i wielokrotnie si replikuje. Powstaj dodatkowe jderka, gdzie produkowane s ogromne iloci rRNA, potrzebnego potem po zapodnieniu jaja do syntezy biaek w okresie bruzdkowania. Szacuje si, e 75% caej zawartoci DNA w oocycie aby stanowi wanie te amplifikowane pozachromosomowe kopie kodujce rRNA. Natomiast w chromosomach olbrzymich w liniankach muchwek zachodzi proces odwrotny do wybirczej amplifikacji, gdy pewne odcinki, np. w okolicy centromerw, nie ulegaj replikacji podczas politenizacji reszty chromosomu. O diminucji chromatyny bya ju mowa (p. s. 281). Wreszcie, w niektrych specjalnych przypadkach rnicowanie si moe by zwizane z wycinaniem pewnych fragmentw DNA, jak to si dzieje w komrkach ukadu immunologicznego. S to jednak wszystko sytuacje raczej wyjtkowe. Na og zrnicowanie komrek nie wynika ze zmian zawartoci materiau genetycznego, lecz z selektywnej ekspresji genw.

10.1.3. Wzorzec ekspresji genw zmienia si w czasie rozwoju i jest specyficzny tkankowo

Na selektywn aktywno genw w trakcie rozwoju i rnicowania komrek wskazyway od dawna obserwacje chromosomw politenicznych w liniankach muchwek. W chromosomach tych daje si zauway rozdcia niektrych prkw, tzw. pufy, ktre s miejscem silnej despiralizacji chromatyny i bardzo aktywnej syntezy RNA, co wiadczy o aktywnoci transkrypcyjnej zlokalizowanych tam genw. W okresie poprzedzajcym przepoczwarczenie lub pod / wpywem podawania hormonu steroidowego ekdysonu, pufy te pojawiaj si w okrelonej kolejnoci w pewnych prkach, po czym zanikaj, a w innych miejscach powstaj nowe; w lad za tym nastpuje synteza coraz to nowych frakcji biaek wydzielniczych. Nowsze badania, polegajce m.in. na blokowaniu transkrypcji lub translacji oraz na identyfikowaniu w komrkach specyficznych transkryptw RNA i specyficznych biaek, pozwalaj bezporednio analizowa zmieniajc si w miar rozwoju ekspresj genw w rnych tkankach. U wikszoci zwierzt (wyjtek stanowi ssaki p. s. 286), we wczesnym okresie bruzdkowania komrki dziel si bardzo szybko (np. u paza Xenopus co 30 min); geny zygoty s jeszcze nieczynne transkrypcyjnie, a synteza biaek odbywa si na matrycach mRNA zsyntetyzowanych jeszcze w organizmie matki i zdeponowanych w cytoplazmie komrki jajowej. Poniewa zawarto jaja jest rozmieszczona nierwnomiernie, w czasie bruzdkowania do poszczeglnych blastomerw trafia cytoplazma o rnym skadzie, m.in. z rnymi czsteczkami mRNA. W rezultacie synteza biaek przebiega od pocztku w sposb zrnicowany, mimo i wszystkie komrki otrzymuj tak sam informacj genetyczn zawart w jdrze. Co wicej, wrd zdeponowanych lub nowo zsyntetyzowanych biaek znajduj si czsteczki specyficznych induktorw lub represorw, uruchamiajcych potem wybircz aktywno wasnych genw zarodka w poszczeglnych komrkach. Aktywacja nadrzdnych genw regulatorowych decyduje z kolei o uruchamianiu nastpnych. W ten sposb niewielkie pocztkowo rnice midzy komrkami lawinowo narastaj w miar rozwoju zarodka. Poszczeglne geny s wczane w rnych stadiach, w zalenoci od rodzaju tkanki. Ekspresja ta moe by regulowana na rozmaitych poziomach, poczwszy od aktywacji struktury chromatyny, poprzez transkrypcj, alternatywn obrbk pierwotnych transkryptw RNA, regulacj dotyczc czasu i tempa translacji, a do modyfikacji potranslacyjnej acuchw polipeptydowych. Jednak zasadnicza regulacja odbywa si na poziomie transkrypcji.
10.1.4. Stan aktywnoci chromatyny przenosi si na komrki potomne i jest jednym z elementw pamici komrkowej

Podstawowym warunkiem transkrypcji jest aktywny stan chromatyny, gdy wtedy dopiero mog zosta przyczone czynniki transkrypcyjne, polimerazy RNA itd. Na og stale aktywna jest chromatyna mieszczca geny warunkujce

podstawowe funkcje komrki (ang. housekeeping), ktre koduj biaka niezbdne w kadej typowej komrce (np. histony, elementy cytoszkieletu, enzymy metabolizmu podstawowego itp.) i s czynne, przynajmniej okresowo, w wikszoci tkanek. Natomiast chromatyna, mieszczca geny kodujce biaka specjalistyczne, przechodzi w stan aktywny tylko w tych tkankach, w ktrych geny te bd potem ulega ekspresji (np. kodujce insulin w trzustce, globiny w erytroblastach itp.). W pozostaych tkankach te fragmenty chromatyny nie bywaj nigdy uaktywniane, a zawarte w nich geny mog zosta trwale zablokowane, co u krgowcw wie si z metylacj sekwencji CpG (ang. CpG islands) w rejonie promotorw. W skrajnych przypadkach unieczynnienie moe dotyczy caego chromosomu, jak to si dzieje z chromosomem X u samic ssakw (p. s. 313). Zrnicowany stan aktywnoci chromatyny, dziedziczony przez komrki potomne, jest jednym z czynnikw decydujcych o determinacji rozwojowej danej linii komrkowej. Jest to pewnego rodzaju pami" komrkowa zwizana ze struktur chromatyny. Innym elementem pamici mog by zdeponowane w cytoplazmie czynniki indukujce lub hamujce aktywno specyficznych genw, przekazywane komrkom potomnym w danej linii.
10.1.5. Determinacj rozwojow blastomerw wyznacza polarno skadnikw jaja oraz (lub) oddziaywania midzykomrkowe

Jak ju wspomniano, przyczyn powstawania pierwszych rnic midzy blastomerami jest u wikszoci zwierzt nierwnomierny rozkad zawartoci jaja. Komrka jajowa jest najczciej spolaryzowana, gdy materiay zapasowe zgrupowane s zwykle na jednym biegunie, a rozmieszczenie innych skadnikw te nie jest homogeniczne. W niektrych grupach, jak: nicienie, piercienice, miczaki, achwy i wikszo stawonogw (m.in. u Drosophila, p. s. 296) o tzw. rozwoju mozaikowym, sposb rozmieszczenia skadnikw jaja ma decydujce znaczenie dla determinacji rozwojowej poszczeglnych blastomerw. Na przykad u achwy Styela, przeszczepiajc okrelone czci jaja (ktre da si rozpozna po specyficznej pigmentacji), mona z gry przewidzie, jakie powstan z nich struktury. Jednak nawet u takich gatunkw daje si wykry pewne zmiany wynikajce ze wzajemnych oddziaywa komrkowych. W innych grupach, jak jeowce i krgowce, rozwj ma charakter regulacyjny, a rnice midzy biegunami komrki jajowej wpywaj tylko na pocztkowe fazy rnicowania, po czym decydujc rol zaczynaj odgrywa oddziaywania wzajemne midzy komrkami. Na przykad wytworzenie mezodermy wymaga wspdziaania komrek ekto- i endodermy, z kolei komrki mezodermy indukuj potem w ektodermie powstanie tkanki nerwowej itd. Oddziaywania te nosz nazw indukcji. Prowadzone s intensywne badania nad identyfikacj czynnikw wywoujcych specyficzne indukcje, zwanych

morfogenami. Wydaje si, e niektre z nich mog nalee do grupy czynnikw wzrostowych, np. indukcj mezodermaln mona zastpi stosujc czynnik wzrostu fibroblastw FGF (ang. fibroblast growth factor). Innym poznanym morfogenem jest kwas retinowy, ktrego gradient stenia odgrywa rol w procesie formowania si koczyny ptakw i ssakw. Regulacja rozwoju ssakw przebiega nieco odmiennie ni innych zwierzt. Specyficzny sposb odywiania zarodka przez oysko doprowadzi w tej grupie do daleko idcych przystosowa: komrki jajowe s niewielkie, pozbawione tka, nie wykazuj polarnoci, a tempo podziaw jest powolne (podobne jak w komrkach somatycznych); ju od stadium 2 blastomerw rozpoczyna si transkrypcja wasnych genw zarodka. Pocztkowo a do stadium 8-komrkowego blastomery s totipotencjalne, gdy jak to wykaza dowiadczalnie A.K. Tarkowski po rozdzieleniu kady z nich moe si rozwin w normalnego osobnika. Jednake w stadium 8-komrkowym kady blastomer wykazuje ju polarno, gdy tylko od wewntrznej strony kontaktuje si z ssiednimi blastomerami tworzc cise poczenia, natomiast druga strona, skierowana na zewntrz i pokryta kosmkami, jest wystawiona na dziaanie otaczajcego rodowiska. Polarno t mona uwidoczni barwic elementy cytoszkieletu. Kolejny podzia oddzieli ju komrki zewntrzne, z ktrych powstanie trofoblast, a nastpnie tkanki pozazarodkowe (niektre bony podowe, oysko) od komrek wewntrznych, ktre utworz wze zarodkowy, a nastpnie wezm udzia w formowaniu waciwego zarodka. Od tego etapu rozwoju rozkad skadnikw zarwno dopywajcych ze rodowiska macicy, jak i wytwarzanych przez sam zarodek, staje si nierwnomierny. Wydaje si, e u ssakw dopiero kontakty midzy blastomerami decyduj 0 powstaniu rnic pomidzy komrkami, a ich wzajemne oddziaywania odgrywaj potem zasadnicz rol w ukierunkowaniu dalszego rozwoju. Jednak 1 u ssakw nie da si wykluczy wystpowania jakiego zacztkowego zrnicowania struktury oocytu, ktre zwikszaoby potem prawdopodobiestwo okrelonych blastomerw do zajmowania w zarodku pozycji centralnej. Zrnicowanie to jednak nie mogoby mie znaczenia decydujcego, ze wzgldu na wysokie zdolnoci regulacyjne zarodka.
10.1.6. Rozwj ssakw wymaga obecnoci genomu przekazanego przez matk i ojca

Partenogeneza, czyli rozwj niezapodnionego jaja bez udziau plemnika, jest szeroko rozpowszechniona w wiecie zwierzt. Zjawisko to, zachodzce spontanicznie lub wywoywane sztucznie, prowadzi zwykle do normalnego rozwoju osobniczego. Jednake u ssakw nie udao si uzyska normalnych osobnikw urodzonych w wyniku partenogenezy: wprawdzie atwo pobudzi jajo do podziaw i rozwoju dziaajc rnymi czynnikami, jak: szok elektryczny, termiczny lub chemiczny, jednak zarodki takie nie przeywaj duej ni do poowy okresu podowego. Przyczyn tych niepowodze wyjaniy badania,

polegajce na mikrochirurgicznej wymianie przedjdrzy w zapodnionym jaju myszy. Po wnikniciu plemnika do komrki jajowej, jego jdro przeksztaca si w przedjdrze mskie, a jednoczenie z chromosomw jaja powstaje przedjdrze eskie, przy czym przez pewien czas oba przedjdrza mona od siebie odrni. W tym stadium usuwano mikropipetk jedno z przedjdrzy, a na to miejsce wprowadzano przedjdrze mskie lub eskie, uzyskane od innej zygoty (rys. 10.2). Tak operowane zarodki przenoszono do macicy zastpczych matek i analizowano ich rozwj. Wyniki tych dowiadcze byy jednoznaczne: tylko zarodki zawierajce zarwno przedjdrze eskie, jak i mskie rozwijay si normalnie, pozostae zamieray zwykle po kilku podziaach. Jeeli jednak udao im si przey nieco duej, to wykazyway charakterystyczne rnice: zarodki gynogenetyczne, czyli powstae z obu przedjdrzy eskich, charakteryzoway si niedorozwojem struktur pozazarodkowych (trofoblastu), co prawdopodobnie wtrnie powoduje mier podu z powodu niedoywienia; natomiast zarodki androgenetycne, czyli otrzymane z jaj o obu przedjdrzach mskich, miay dobrze rozwinity trofoblast, ale upoledzone struktury wa-

Rys. 10.2. Schemat dowiadczenia polegajcego na wymianie przedjdrzy w zapodnionych komrkach jajowych myszy. Przedjdrza eskie biae, mskie czarne. W porwnaniu z rozwojem normalnym (N) w rozwoju gynogenetycznym (G) dwa przedjdrza eskie wystpuje redukcja trofoblastu, w rozwoju androgenetycznym za (A) dwa przedjdrza mskie upoledzony jest sam zarodek (czciowo wg Howlett i wsp., 1989 zmodyf.)

ciwego zarodka (rys. 10.2). Wyniki te wiadczyy wyranie o tym, e do normalnego rozwoju zarodka ssaka konieczna jest obecno zarwno genomu eskiego, jak i mskiego, z czego z kolei wynika, e genomy rodzicielskie nie s rwnowartociowe, lecz musz by w jaki sposb naznaczone czy napitnowane. Zjawisko to okrela si jako imprinting genomu rodzicielskiego. Do podobnych wnioskw prowadziy badania potomstwa heterozygotycznych nosicieli pewnych translokacji chromosomowych u myszy. Wskutek, nieprawidowego rozchodzenia si chromosomw w mej ozie otrzymywano osobniki, u ktrych pewne odcinki obu homologicznych chromosomw pochodziy tylko od jednego lub tylko od drugiego z rodzicw. Osobniki takie byy fenotypowo nienormalne, mimo i miay dwa kompletne garnitury chromosomowe. Badania te wykazay, e do normalnego rozwoju niezbdne jest posiadanie pewnych konkretnych odcinkw chromosomowych pochodzenia matczynego (znajdujcych si np. w chromosomach 7 i 17) oraz innych odcinkw pochodzenia ojcowskiego (np. w chromosomach 6 i 8). Takie efekty, odnoszce si do fragmentw szeciu par chromosomw, sugeruj, e okoo jedna sma genomu myszy moe podlega zrnicowanemu imprintingowi rodzicielskiemu: geny zawarte w jednych fragmentach s nieaktywne, jeeli pochodz od matki, w innych jeeli pochodz od ojca. Nie wiadomo jeszcze, na czym polega modyfikacja chromatyny powodujca imprinting. Aby sprawdzi hipotez, e ma to zwizek z metylacj DNA, posuono si myszami transgenicznymi otrzymanymi z takich zygot, do ktrych wprowadzono mikrochirurgicznie obce geny. Jeeli geny te wczyy si do genomu, to byy potem normalnie dziedziczone i suyy jako markery do analizy metylacji ssiadujcych z nimi odcinkw chromosomowych. Zastosowanie trawienia enzymem restrykcyjnym Hpall, ktry rozpoznaje nie metylo-

DNA potomstwa -3,9 Rys. 10.3. Metylacja wprowadzonego genu w kolejnych pokoleniach myszy transgenicznych zmienia si zalenie od tego, czy zosta on przekazany przez ojca czy przez matk (osobniki transgeniczne zaznaczone czarnymi symbolami). Na elektroforegramie D N A trawionego enzymem restrykcyjnym Hpall sekwencja genu przekazywana przez ojca jest nie metylowana i wystpuje w innej frakcji (3,9) ni sekwencja metylowana przekazywana przez matk (wg Howlett i wsp., 1989 zmodyf.)

wan sekwencj CCGG (natomiast nie rozpoznaje jej, gdy rodkowa cytozyna zawiera grup metylow), umoliwio wykazanie, e sekwencje obcego genu byy u zarodkw metylowane lub nie, zalenie od tego, czy zostay przekazane przez ojca czy przez matk (rys. 10.3). Wydaje si wic, e imprinting ma zwizek ze zrnicowan metylacj, a zatem inaktyw^cf odcinkw DNA, jednak nie wiadomo, czy metylacja ta stanowi pierwotn przyczyn imprintingu, czy jest tylko zjawiskiem towarzyszcym.
metylacja nowych miejsc

P mx

M m \ zygota

(oo>

dorosy osobnik

^metylowane sekwencje ^ n i e metylowane

domeny z imprintingiem

Rys. 10.4. Schemat imprintingu genomowego u myszy. W rnych stadiach rozwoju myszy pokazano stan metylacji pary chromosomw homologicznych (P przekazany przez ojca, M przez matk), zawierajcych dwie domeny podlegajce zrnicowanemu imprintingowi zalenie od pci (wg Howlett i wsp., 1989 zmodyf.)

Na podstawie dotychczasowych danych wydaje si prawdopodobny model (rys. 10.4) zakadajcy, e rnice w genomach rodzicielskich powstaj w czasie gametogenezy jako specyficzne dla linii pciowej modyfikacje DNA w pewnych okrelonych odcinkach chromosomw. Imprinting ten jest przekazywany przez gamety do zygoty, gdzie utrzymuje si przez cay okres rozwoju zarodkowego, a prawdopodobnie nawet do koca ycia, ale tylko w komrkach somatycznych. Natomiast w komrkach linii pciowej imprinting odziedziczony po rodzicach zostaje w ktrym momencie wymazany a wprowadzony nowy, ktrego specyfika zaley od pci.

10.1.7. Ujawnienie si niektrych chorb czowieka moe by wywoane imprintingiem genomu rodzicielskiego

Wprawdzie wystpowanie imprintingu genomu wykazano dowiadczalnie tylko u myszy, ale analiza niektrych zaburze genetycznych u czowieka sugeruje, e zjawisko to moe odgrywa rol w ujawnianiu si chorb wywoanych tymi zaburzeniami. Przykad stanowi zesp chorobowy Pradel-Williego, choroba charakteryzujca si opnieniem umysowym, skrajn otyoci, niskim wzrostem oraz nieproporcjonalnie maymi stopami i domi. Analiza genetyczna pacjentw i ich rodzin wykazaa, e chorzy otrzymali obie kopie chromosomu 15 od matki, a adnej od ojca (podobnie jak w opisanym poprzednio przypadku myszy z translokacjami). Imprinting genomu rodzicielskiego moe mie take wpyw na ujawnianie si pewnych nowotworw wieku dziecicego, jak embrionalny nowotwr mini (rhabdosarcoma), nowotwr Wilmsa atakujcy nerki lub pewna forma raka koci (<osteosarcoma). Wiadomo, e w genomie czowieka wystpuj tzw. antyonkogeny, czyli geny penice funkcj supresorw nowotworw. Jednym z takich antyonkogenw jest gen Rd w 11 chromosomie. Nowotwr moe wystpi dopiero wtedy, jeeli obie kopie genu Rd zostan unieczynnione, co wymaga dwu niezalenych mutacji, a wic zdarza si rzadko. Natomiast jeeli jedna kopia genu Rd jest ju odziedziczona w formie niefunkcjonalnej, to wystarczy potem tylko jedna mutacja somatyczna, eby mg powsta nowotwr. Poniewa stwierdzono, e w komrkach omawianych nowotworw pierwsza inaktywacja najczciej dotyczy genu Rd przekazanego przez ojca, istnieje powane podejrzenie, e jest to spowodowane imprintingiem tego genu w organizmie ojcowskim. Imprinting jest te przypuszczalnie odpowiedzialny za wczesne, w wieku dziecicym, ujawnienie si choroby Huntingtona, ktra normalnie wystpuje dopiero w wieku rednim.

10.2. Genetyczna kontrola morfogenezy Poniewa ksztatowanie postaci osobnika, czyli morfogeneza, odbywa si wedug wzorw odziedziczonych po rodzicach, musz istnie odpowiedzialne za to geny. Klasyczna metoda badania roli genw polega na analizie zmian spowodowanych mutacjami. Po czym wic mona pozna geny kontrolujce morfogenez? Ich mutacje powinny zaburza plan budowy osobnika, powodujc na przykad, e prawidowo zrnicowane komrki lub narzdy pojawi si w nietypowym miejscu, liczbie czy stadium rozwoju, albo te nie wyksztac si wcale. Rzeczywicie tego typu mutanty udao si zidentyfikowa u gatunkw o cile zdeterminowanym rozwoju mozaikowym, od ktrego odstpstwa atwo daje si interpretowa. Klasycznym obiektem tych bada jest malutki nicie Caenorhabditis elegans oraz muszka Drosophila melanogaster. Identyfikacja genw wyznaczajcych rozwj D. melanogaster doprowadzia do odkrycia

konserwatywnej ewolucyjnie rodziny genw regulatorowych, biorcych udzia w kierowaniu rozwojem rnych organizmw zwierzcych, zarwno bezkrgowcw, jak i krgowcw.
10.2.1. Losy linii komrkowych u nicienia Caenrhabditis e/egans s wyznaczane przez geny kontrolujce rozwj

C. elegans, nicie o dugoci zaledwie 1,2 mm, ma prost budow dwubocznie symetryczn, o wyrnionym przednim i tylnym kocu (rys. 10.5). Ciao skada si z 1000 komrek somatycznych, zorganizowanych w typowe tkanki, oraz 1000 2000 komrek pciowych. Wystpuj osobniki dwu pci: nieliczne samce oraz przewaajce w populacji samice hermafrodytyczne, ktre produkuj oprcz jaj pewn liczb plemnikw i mog si rozmnaa przez samozapodnienie, co pozwala otrzyma homozygoty cenne dla bada genetycznych.
1,2 mm

Rys. 10.5. Budowa nicienia Caenrhabditis elegans

Rozwj trwa tylko 3 dni. Ju po pierwszych podziaach zapodnionej komrki jajowej powstaje 6 komrek, ktre dadz pocztek szeciu gwnym liniom komrkowym. W wyniku dalszych szybkich podziaw powstaje zarodek, ktry po osigniciu 558 komrek opuszcza osony jajowe, a nastpnie przechodzi przez 4 stadia larwalne, przegrodzone wylinkami. Przezroczyste ciao umoliwia ledzenie podziaw i migracji komrek, tote cay rozwj zosta dokadnie opisany. Jest on niemal niezmienny, tak e mona przewidzie los kadej komrki. Cay genom zawierajcy okoo 3000 genw (w 6 parach chromosomw) zosta sklonowany. Zawarto DNA w haploidalnym genomie wynosi 80 x 106 par zasad (38 x mniej ni u czowieka). Wrd 800 genw zidentyfikowanych dziki mutacjom, znajduj si geny kontrolujce rozwj. Ich mutacje powoduj zmiany determinacji losw komrek w poszczeglnych liniach (rys. 10.6), np. komrka rnicuje si w innym kierunku ni normalnie lub te komrka potomna, ktra powinna zrnicowa si definitywnie i zaprzesta dalszych podziaw, zachowuje si jak komrka wyjciowa. Na przykad u mutanta unc-86 powstaje w ten sposb wiele neuronw dopaminergicznych zamiast tylko jednego wystpujcego normalnie (rys. 10.7).

normalny program

B B

Rys. 10.6. Cztery typy zmian w liniach komrkowych wywoanych modyfikacjami programu podziaw. A, B, C, D przedstawiaj rne typy komrek, powstae z jednej wyjciowej (z Wilkinsa, 1986 zmodyf.)

typ dziki

mutant unc-86

Rys. 10.7. Zmiana programu podziaw komrkowych u mutanta unc-86 C. elegans, prowadzca do powstania zamiast jednego neuronu (N) kilku neuronw dopaminergicznych (D). Kreska oznacza zaprogramowan mier komrki (z Wilkinsa, 1986 zmodyf.)

Inne mutacje, tzw. heterochroniczne, powoduj, e pewne zestawy komrek zachowuj si w sposb charakterystyczny dla innego stadium. Na przykad rola genu lin-14 polega na utrzymywaniu komrek w stanie typowym dla formy niedojrzaej, a normalny rozwj wymaga stopniowej redukcji poziomu biaka kodowanego przez gen lin-14, w miar jak zwierz dojrzewa. U mutantw o zwikszonej aktywnoci tego genu, po kolejnych wylinkach nastpuj stadia takie same jak poprzednio, wskutek czego ciao okrywa wci niedojrzaa kutykula. Natomiast mutanty z niefunkcjonalnym genem lin-14 dojrzewaj przedwczenie, opuszczajc wiele stadiw rozwojowych, co powoduje, e osobnik dorosy ma mao komrek. Analiza mutacji rozwojowych wskazuje, e istniej geny decydujce o programie podziaw komrkowych, tzn. o tym, czy i w jaki sposb komrka ma si podzieli. Mona wyrni dwa zasadnicze typy podziaw: a) symetryczny (proliferacja), w ktrym komrki potomne s takie same jak wyjciowa;

b) niesymetryczny, powodujcy powstawanie rnic midzy komrkami potomnymi i nowych typw komrkowych. Pokazane na rysunku 10.6 modele odnosz si wanie do modyfikacji, podziaw niesymetrycznych i przedstawiaj zmiany programu genetycznego wywoane mutacjami genw sterujcych podziaami. Kombinacja takich prostych zapisw genetycznych, dziaajcych w rnych tkankach, moe doprowadzi do powstania skomplikowanych programw rozwojowych, skadajcych si z sekwencji podziaw symetrycznych i niesymetrycznych. Scharakteryzowanie genw i ich produktw, decydujcych o wyborze drogi rozwojowej komrek C. elegans, bdzie miao zasadnicze znaczenie ze wzgldu na analogi z innymi zwierztami. Na przykad wrd tkanek ssakw mona wyrni takie, jak komrki nerwowe, minia sercowego i soczewki oka, ktre po osigniciu kocowego zrnicowania zaprzestaj ju dalszych podziaw do koca ycia zwierzcia. W innych tkankach komrki zrnicowane proliferuj take w wieku dorosym przez podziay symetryczne (np. hepatocyty w wtrobie). S wreszcie i takie tkanki, w ktrych w toku kolejnych podziaw niesymetrycznych wyodrbniaj si pokolenia komrek kracowo zrnicowanych, a jednoczenie stale utrzymuje si rezerwuar komrek pluripotencjalnych, tzw. komrek pnia (ang. stem cells), o wielostronnych wci moliwociach rozwojowych. Przykadem s komrki pnia w szpiku kostnym, ktre sukcesywnie daj pocztek rnym typom zrnicowanych komrek krwi, jak erytrocyty, limfocyty itd. Badania nad nicieniem mog si wic przyczyni do zrozumienia mechanizmw genetycznych rzdzcych wyborem drg rozwojowych przez komrki w warunkach prawidowych i patologicznych, np. w przypadku nowotworw.
10.2.2 Geny kierujce rozwojem Drosophila

Muszka owocowa D. melanogaster, ktra odegraa tak istotn rol w badaniach genetyki klasycznej, okazaa si rwnie bardzo dogodnym obiektem do analizy genw kontrolujcych rozwj i decydujcych o ksztatowaniu postaci. Punktem wyjcia byo odkrycie specjalnego typu mutacji, tzw. homeotycznych, ktre zaburzaj plan budowy organizmu i powoduj, e struktura typowa dla jednej okolicy ciaa wyksztaca si w zupenie innym miejscu. I tak, mutacja Antennapedia (Antp) powoduje, e zamiast czuka na gowie wyrasta odne, a mutacja bithorax (bx) wywouje zamian czci segmentu odwokowego na tuowiowy, wskutek czego zamiast przezmianek wyrasta druga para skrzyde. Stopniowo poznawano take inne mutacje rozwojowe, ktre zaburzay symetri ciaa, redukoway liczb segmentw lub sposb ich wyksztacenia itp. Analiza tych mutacji pozwolia zidentyfikowa okoo 100 tego typu genw, w tym okoo 20 wpywajcych na wyznaczenie symetrii grzbieto-brzusznej i okoo 50 genw wyznaczajcych pozycj na osi przednio-tylnej. Zajmiemy si tutaj tylko tymi ostatnimi, poniewa zostay one najlepiej poznane; wiele z nich

ju sklonowano i zidentyfikowano kodowane przez nie biaka. Co wicej, zbadano te wzory ekspresji tych genw w kolejnych stadiach rozwojowych u form dzikich i mutantw, lokalizujc na przekrojach histologicznych przez ciao zarodka transkrypty mRNA, metod hybrydyzacji in situ (stosujc znakowane radioaktywnie sondy cDNA odpowiednich genw lub antysensowne nici RNA) albo te wykrywajc za pomoc specyficznych przeciwcia rozmieszczenie kodowanych przez te geny biaek. Dziki poczeniu bada genetycznych i molekularnych zaczyna si ju wyania obraz dziaania tych genw w rozwoju.
10.2.3. Uksztatowaniem postaci Drosophila wzdu osi przednio-tylnej zawiaduje hierarchiczny ukad genw regulatorowych

Rozwj muszki owocowej przebiega bardzo szybko. Po zapodnieniu jdra zygoty dziel si co ok. 10 min, po czym jdra potomne otoczone cytoplazm wdruj ku obwodowi jaja (rys. 10.8), tworzc po 2,5 h od zapodnienia syncytialn blastoderm, ktra nastpnie, po utworzeniu bon komrkowych, przeksztaca si w jednowarstwow blastoderm komrkow, w rodku wypenion tkiem. W 3,5 h po zapodnieniu rozpoczyna si gastrulacja i ruchy komrkowe doprowadzajce do powstania larwy, ktra po 20 h wylga si z jaja, a nastpnie przechodzi przez 3 stadia larwalne. Po 5 dniach powstaje poczwarka, a po 9 dniach posta dorosa. Plan budowy osobnika zostaje zdeterminowany ju pierwszego dnia rozwoju, w stadium blastodermy, gdy wtedy uaktywniaj si geny wyznaczajce pozycj i organizacj przyszych segmentw ciaa.

blastoderma syncytialna

blastoderma komrkowa

Rys. 10.8. Bruzdkowanie komrki jajowej D. melanogaster (wg Wilkinsa, 1986 zmodyf.)

Analiza ekspresji u form dzikich i mutantw wykazaa, e geny te wystpuj w 5 grupach, tworzcych hierarchiczny ukad regulacyjny (rys. 10.9), w ktrym geny wyszej kategorii decyduj o aktywnoci genw podrzdnych (ale nie na odwrt), natomiast geny w obrbie tej samej grupy mog nawzajem wpywa

godziny rozwoju bcd

ekspresja genw

polarnoci jaja

segmentacji I (gap genes)

segmentacji II (pair rule genes) ftz segmentacji III (polarnoci segmentw)

10

homeotycznych

anennapedia

urabihorax

Rys. 10.9. Hierarchia genw regulatorowych uruchamianych w pierwszych godzinach (Oh lOh) rozwoju zarodka D. melanogaster. Zaznaczono rozkad transkryptw RNA lub biaek kodowanych przez niektre geny; j jdro (czciowo wg Biggin i Tjian, 1989 zmodyf.)

na swoj aktywno. Nadrzdn pozycj zajmuj geny polarnoci jaja, ktre decyduj o orientacji przedniej i tylnej czci ciaa, nastpne 3 kategorie stanowi geny segmentacji, ktre wyznaczaj podzia ciaa na segmenty, na dole hierarchii za wystpuje kategoria genw homeotycznych, ktre decyduj o prawidowym zrnicowaniu kadego segmentu, zgodnie z jego pozycj wzdu osi przednio-tylnej (niektre zaburzenia funkcji tych wanie genw objawiaj si jako mutacje homeotyczne, std nazwa). Jak si okazao, geny te (a przynajmniej wikszo z nich) koduj biaka typu regulatorowego, ktrych struktura wskazuje, e mog si wiza ze specyficznymi sekwencjami DNA i jako czynniki transkrypcyjne wpywa na aktywno innych, albo take i wasnych, genw. W niektrych przypadkach wykazano aktywno tych biaek w ukadach transkrypcyjnych in vitro, a take in vivo.

10.2.4. Geny polarnoci jaja wyznaczaj przedni i tylny biegun zarodka

Geny polarnoci jaja (ang. egg polarity genes) powoduj tzw. efekt mateczny, gdy ich produkty zostaj zdeponowane w oocycie jeszcze pod kontrol genotypu osobnika matecznego. Do zilustrowania dziaania genw tej kategorii posuy gen bicoid (bcd) wyznaczajcy przedni koniec ciaa (rys. 10.9): zarodki mutantw s pozbawione gowy i struktur tuowiowych, ale mona temu zapobiec przeszczepiajc cytoplazm z przedniej czci jaj typu dzikiego. Jak wykazano metod hybrydyzacji in situ, czsteczki mRNA genu bicoid s syntetyzowane w organizmie matki, w komrkach odywczych jajnika, skd przechodz do oocytu, gdzie od razu zostaj zakotwiczone (prawdopodobnie przez elementy cytoszkieletu), wyznaczajc w ten sposb przedni cz jaja. Zaraz po zapodnieniu na matrycach mRNA zostaje zsyntetyzowane biako genu bicoid, ktre rozprzestrzenia si, sigajc do poowy dugoci jaja, i tworzy gradient stenia, malejcy ku tyowi. Produkt genu bicoid zachowuje si jak typowy morfogen, tzn. substancja wywoujca specyficzn indukcj, gdy cytoplazma zawierajca biako tego genu po wprowadzeniu w dowoln okolic mutanta bicoid indukuje w miejscu iniekcji powstanie struktur charakterystycznych dla przedniej czci ciaa. W tym samym czasie translacji ulegaj te transkrypty innych genw polarnoci, wyznaczajcych tylny koniec jaja i niezbdnych do uformowania potem segmentw odwokowych. Z tej grupy najwaniejsz rol odgrywa gen nanos (nos). Syncytialna blastoderma w stadium, w ktrym powstaje, zawiera ju przynajmniej dwa przeciwstawne gradienty produktw kodowanych przez geny polarnoci jaja: bicoid i nanos. Dostarczaj one wstpnych sygnaw pozycyjnych, ktre wpywaj nastpnie na aktywno niej pooonych w hierarchii genw segmentacji i zawaj ich ekspresj do konkretnych regionw. Niektre z tych zalenoci udao si ju sprecyzowa: biako genu bicoid, tworzce gradient w przedniej czci jaja, jest czynnikiem transkrypcyjnym, ktry wie si specyficznie z sekwencj regulatorow promotora genu segmentacji hunchback (hb) (rys. 10.9), aktywujc jego transkrypcj, co wykazano w ukadzie transkrypcyjnym in vitro. Natomiast rola biaka genu nanos, tworzcego gradient w tylnej czci jaja, polega na destabilizacji w tym regionie matecznych transkryptw genu hunchback zdeponowanych w oocycie jeszcze w jajniku matki. Dziki gradientowi morfogenu nanos, transkrypty te, ktre s represorami uniemoliwiajcymi wyksztacenie struktur odwokowych, zostan ograniczone tylko do przedniej czci jaja.
10.2.5. Geny segmentacji wyznaczaj granice 14 parasegmentw

Geny segmentacji, uaktywniajce si w zarodku, dziel si na 3 kategorie. Pierwsz w szeregu hierarchicznym stanowi 3 geny, ktrych transkrypcja przypada jeszcze na okres syncytialnej blastodermy. Ich mutacje powoduj

hatry even-skipped paired fushi-tarazu engraited

I I I I

c) i: ! ijzzj I
I I I I I

izn
I I I I I

geny segmentacji

parasegmenty

| P1 | P2 | P3 | PU j P5 j P6 | P7 | P8 | P9 |P10|P11 |P12|P13|PK |

| Mn | Mx | La | T1 | T2 | T3 | A1 | A2 ) A3 | AA | A5 | A6 | A7 | A8 | A9/10

segmenty

GOWA Rys. 10.10. Zrnicowana ekspresja genw segmentacji II grupy, a nastpnie genu engrailed, prowadzi do podziau zarodka D. melanogaster na 14 parasegmentw, z ktrych powstan pniej definitywne segmenty (por. rys. 10.9) (wg Alberts i wsp., 1989 zmodyf.)

brak wielkich partii ciaa (ang. gap genes) i wczesn letalno. Do tej grupy naley wspomniany poprzednio gen hunchback, uaktywniany za porednictwem genu bicoid w przedniej czci ciaa, oraz gen knirps (kni) aktywny w tylnej czci, gdy tylko tam nie jest reprymowany przez mateczne transkrypty hunchback. Ekspresja trzeciego genu, Kruppel (Kr), zachodzi tylko w rodkowej czci, gdy zarwno w przedniej, jak i w tylnej czci jego transkrypcja jest hamowana przez zlokalizowane tam biaka odpowiednich genw polarnoci jaja. Dziki wzajemnym skomplikowanym i sabo jeszcze poznanym oddziaywaniom, geny tej grupy s odpowiedzialne za wyznaczenie duych stref ciaa (rys. 10.9), w obrbie ktrych bd dziaay geny segmentacji niszej rangi. Do drugiej kategorii genw segmentacji naley 8 genw o bardziej lokalnym dziaaniu, wyznaczajcych regiony tzw. parasegmentw (s to zacztki segmen-

Rys. 10.11. Model powstawania nowego wzoru ekspresji, (a) Dwa biaka regulatorowe (1,2), rozmieszczone dyfuzyjnie w 5 komrkach, cz si z promotorem (p). (b) Synergistyczne dziaanie biaek 1 i 2 uruchamia ekspresj genu tylko w rodkowej komrce (wg Biggin i Tjian, 1989 zmodyf.)

tacji przesunite o p szerokoci w stosunku do definitywnych segmentw, jak ukazano na rys. 10.10). Ekspresja tych genw zbiega si w czasie z celularyzacj, polegajc na przeksztaceniu blastodermy syncytialnej w komrkow. Mutacje tych genw powoduj brak co drugiego parasegmentu, np. mutanty genu fushi tarazu (po japosku: mao segmentw,/fz) nie maj parasegmentw nieparzystych, natomiast mutantom even-skipped (eve) brak parasegmentw parzystych (std ang. nazwa caej tej kategorii genw pair-rule genes). Analiza ekspresji tych genw wykazaa, e kady z nich jest aktywny tylko w tych partiach ciaa, ktrych brakuje u odpowiednich mutantw, jednak pocztkowe rozmieszczenie mRNA tylko w przyblieniu odpowiada definitywnej lokalizacji, ktra ustala si dopiero pod wpywem dziaania zsyntetyzowanych biaek, regulujcych nawzajem ekspresj wasnych genw. Rysunek 10.11 pokazuje, w jaki sposb dyfuzyjne rozprzestrzenianie si czsteczek regulatorowych moe doprowadzi do powstania ostrych granic midzy strefami. Geny tej kategorii wywieraj efekt lokalny tylko na te komrki, w ktrych nastpia transkrypcja. Wsplne dziaanie genw pierwszej i drugiej kategorii doprowadza do podziau blastodermy zarodka na strefy odpowiadajce przyszym 14 parasegmentom. Trzeci kategori genw segmentacji stanowi 10 genw polarnoci segmentw (ang. segment polarity genes), ktre wyznaczaj okrelon cz kadego segmentu, np. mRNA genu engrailed (en) wykrywalny jest w formie 14 prkw (kady o szerokoci jednej komrki), zlokalizowanych w przedniej wiartce poszczeglnych parasegmentw (rys. 10.10), natomiast mRNA genu wingless (wg) w wiartce tylnej. U mutantw ta cz kadego parasegmentu zbudowana jest nietypowo, jako lustrzane odbicie czci pozostaej. Dopiero aktywno genw polarnoci segmentw doprowadza do wytworzenia ostrych granic midzy parasegmentami (rys. 10.9). Kolejna ekspresja przytoczonych do tej pory kategorii genw stwarza wic coraz dokadniejsz mozaik sygnaw pozycyjnych, wyposaajc kad komrk w zestaw informacji precyzujcych jej lokalizacj w zarodku. Wprawdzie wzr ekspresji genw polarnoci jaja oraz dwch pierwszych grup genw

segmentacji jest przemijajcy i zanika po gastrulacji, ale w komrkach pozostaje trway lad: jest nim trwaa aktywacja odpowiednich genw polarnoci segmentw i genw homeotycznych.
10.2.6. Geny homeotyczne kompleksu Antennapedia i bithorax decyduj o zrnicowaniu parasegmentw na gowowe, tuowiowe i odwokowe

Gwne geny homeotyczne (ang. homeotic genes lub homeotic selector genes) wystpuj w prawym ramieniu trzeciego chromosomu w postaci dwu kompleksw genw sprzonych, z ktrych kompleks Antennapedia (ANT-C) wyznacza rnice midzy segmentem gowowym a trzema segmentami tuowia, natomiast kompleks bithorax (BX-C) rnice midzy segmentami tuowia a odwoka. Na przykad larwy z cakowit delecj kompleksu BX-C maj gow i przedni cz tuowia normalne, ale poczwszy od parasegmentu P-4 (p. rys. 10.10), wszystkie nastpne s jednakowe, zbudowane tak samo jak P-4. Oba kompleksy zostay sklonowane i zbadano ich ekspresj. Rozpoczyna si ona bezporednio przed celularyzacj blastodermy i pocztkowo jest do rozlega, tworzc zachodzce na siebie strefy. Ekspresj t kieruje skomplikowana kombinacja biaek kodowanych zarwno przez geny polarnoci jaja, jak i przez geny segmentacji. W miar jak przybywa tych biaek wskutek aktywowania kolejnych grup genw segmentacji, ekspresja genw homeotycznych staje si coraz bardziej precyzyjna. Regulacja ekspresji genw w obu kompleksach jest bardzo zoona, na co wskazuje niezwykle dugi cig sekwencji regulatorowych, np. w kompleksie BX-C sekwencje kodujce biaka maj dugo tylko 20 000 nukleotydw, natomiast sekwencje regulatorowe a 300 000. Ponadto kompleks ten, skadajcy si tylko z trzech jednostek transkrypcji, decyduje o wyksztaceniu a 9 parasegmentw. Pierwotne transkrypty s poddawane obrbce w rny sposb w zalenoci od czasu i miejsca, w ktrym nastpuje transkrypcja. A co najbardziej zadziwiajce, poszczeglne geny obu kompleksw s uoone w chromosomie w takiej samej kolejnoci jak parasegmenty, ktrych specjalizacj wyznaczaj (rys. 10.12). Mechanizm tych zalenoci mona sobie wyobrazi nastpujco. W kompleksie BX-C znajduj si trzy geny (Ubx, abd-A i Abd-B, p. rys. 10.12) i 9 regionw regulatorowych (enhancerw), rwnie uoonych w takiej samej kolejnoci (od abx\bx do iab-8), jak regulowane przez nie parasegmenty. Przypuszczalnie pocztkowo chfomatyna tego kompleksu jest skondensowana (lub w jaki inny sposb zablokowana) we wszystkich komrkach. Stopniowo w komrkach kolejnych .parasegmentw (od przodu ku tyowi) coraz to dalsze odcinki chromatyny przechodz w stan aktywny, udostpniajc kolejne regiony regulatorowe; i tak w parasegmencie 5 odsonity bdzie odcinek abxjbx, w parasegmencie 6 odcinek bxdjpbx, a w parasegmencie 7 odcinek iab-2. Przyczajce si do tych odcinkw regulatorowych odpowiednie czynniki transkrypcyjne umoliwiaj rozpoczcie transkrypcji coraz dalej pooonych

(a)

parasegmenty sekwencje regulatorowe geny Ubx . abx/bx

10

11

12
i

13

*/ bxd/pbx

. i fQb-3. , iab-5. , iab-7 tab-2 iab-4 iab-6 i i i i i j j i

iab-8

Y/M
abd-A

Abd-B

(b)
chromatyna zablokowana
P5

v / / / / m m / / A

/ l \

P6

P7

Rys. 10.12. Organizacja kompleksu bithorax (BX-C) u D. melanogaster. (a) O specyficznym rnicowaniu si poszczeglnych parasegmentw decyduj regiony regulatorowe ( abx/bx iab-8) kierujce ekspresj trzech genw (Ubx, abd-A, Abd-B). (b) W komrkach nastpujcych po sobie parasegmentw (P5P7) odsaniaj si coraz dalsze odcinki chromatyny, udostpniajc kolejne regiony regulatorowe; przyczajce si do nich czynniki transkrypcyjne uruchamiaj transkrypcj i wpywaj na sposb obrbki RNA, wskutek czego zmienia si repertuar produkowanych biaek (wg Alberts i wsp., 1989 zmodyf.)

genw. Jednoczenie czynniki te musz mie wpyw na alternatywne sposoby obrbki pierwotnego transkryptu, wskutek czego na matrycy trzech tylko genw powstaje wiele rnych czsteczek mRNA i biaek. Midzy poszczeglnymi genami homeotycznymi zachodzi interakcja, gdy produkt kolejno uruchamianego genu powoduje represj genu poprzedniego.

Opisany powyej mechanizm powoduje, e repertuar zsyntetyzowanych biaek regulatorowych zmienia si w komrkach kolejnych parasegmentw i wywouje w pamici komrkowej trway lad, zachowany nie tylko w komrkach larwy, ale take w komrkach tarcz imaginalnych stanowicych zawizki, z ktrych powstaje w czasie przeobraenia ciao dorosego owada. W dowiadczeniach transplantacyjnych wykazano bowiem, e tarcze te rozwijaj si autonomicznie, zgodnie z wasnym pochodzeniem, bez wzgldu na to, w jakie miejsce zostan wszczepione. Analiza mutantw wskazuje, e jednym z elementw tej pamici jest staa aktywno genu Ultrabithorax, utrzymywana przez produkt wasnego genu na zasadzie dodatniego sprzenia zwrotnego.
10.2.7. Wiele genw kierujcych rozwojem zawiera sekwencj, zwan homeoboksem, kodujc biako o charakterze czynnika transkrypcyjnego

Klonowanie genw homeotycznych kompleksu ANT-C i BX-C wykazao, e wszystkie one zawieraj sekwencj dugoci 180 nukleotydw o bardzo wysokim stopniu homologii. Sekwencja ta, odkryta w roku 1984 i nazwana homeoboksem (ang. homeobox), zostaa potem znaleziona rwnie w genach polarnoci jaja i w wielu genach segmentacji, a take w niektrych genach wyznaczajcych o grzbieto-brzuszn. Homeoboks koduje domen biakow, zwan homeodomen, o dugoci 60 aminokwasw, zoon z trzech fragmentw a-helikalnych (rys. 10.13), tworzcych struktur typu heliks-skrt-he-

<x-heliks 1

a-heliks 2

a-heliks 3

l 1 I 1 l 1 RKRGRTTYTRYQTL ELEKEFHFNRY LTRRRR1EIAHALCLTERQIKIWFQNRRMKWKKEN

I
Deformed PaA P5A Hox-2.6 Anp
a

I
Y Y

I
V

I
T-V-S S

I
DDH

H-I a-V

_a Hox-2.3 Abd-B VRKK-KPSKF SRKK-CPK Hox-2.5

:

LA-VSKQK-W-L-RN-Q LM DH-V-RL-N-S

V V

KNS ML~

Rys. 10.13. Sekwencje aminokwasw (oznaczenia jednoliterowe, p. tab. 5.1(b)) homeodomeny w odpowiadajcych sobie genach u D. melanogaster {Deformed, Antp, Abd-B) i myszy (.Hox-2.6, Hox-2.3, Hox-2.5). Kreski oznaczaj aminokwasy zgodne z sekwencj najwyszej zgodnoci (u gry). Zaznaczono fragmenty tworzce trzy a-heliksy, z ktrych trzecia decyduje o specyficznoci wizania z DNA (wg Scientific American, July 1990)

liks" (ang. helix-turn-helix). Podobna struktura wystpuje w biakowym regulatorze transkrypcji w systemie MAT u drody, co od razu wskazywao na zdolno homeodomeny do wizania si ze specyficznymi sekwencjami DNA. Obecnie wiadomo, e homeodomena gra rol czynnika transkrypcyjnego, co w odniesieniu do niektrych genw ju zostao wykazane eksperymentalnie in vitro lub in vivo. Badania rentgenograficzne doprowadziy do wyznaczenia dokadnej struktury homeodomeny genu engrailed oraz sposobu jej wizania si z sekwencj TAATX w DNA. Biaka zawierajce homeodomen bior udzia w skomplikowanych oddziaywaniach, w rny sposb regulujc powizane ze sob funkcjonalnie zespoy genw. Na przykad promotor genu Ubx ma wiele sekwencji regulatorowych, z ktrych jedna jest rozpoznawana przez homeodomen kodowan przez gen ftz, druga przez homeodomen genu Abd B, a trzecia przez homeodomen genu en\ doczenie pierwszej z nich do promotora Ubx powoduje aktywacj tego genu, natomiast doczenie dwu pozostaych jego represj. Jednoczenie w tych samych komrkach promotor genu ftz, rwnie aktywowany przez biako genu ftz, nie jest wcale regulowany ani przez biako genu Abd B ani en. Jeeli promotor ma wiele elementw rozpoznawanych przez homeodomeny i przycza rne z nich, to mog one dziaa antagonistycznie lub synergistycznie. W ten sposb niewielka liczba biaek regulatorowych, dziaajc w rnych kombinacjach, moe kontrolowa w sposb specyficzny aktywno wielu genw. Niektre geny kierujce rozwojem Drosophila, ale nie zawierajce homeoboksu, koduj inne domeny biakowe zdolne do specyficznego wizania si z DNA. Na przykad w pierwszej kategorii genw segmentacji (ang. gap genes) wykryto obecno fragmentu kodujcego domeny biakowe typu palcw cynkowych (ang. zinc fingers), jakie wystpuj np. w czynniku transkrypcyjnym TFIIIA u paza Xenopus. Opisano rwnie wystpujc w niektrych genach segmentacji sekwencj nazwan Pax (ang. paired box), ktra prawdopodobnie take odgrywa rol regulatorow, gdy kodowana przez ni domena biakowa zawiera motyw czcy si z DNA. Powysze dane, a take fakt, e biaka kodowane przez geny kierujce rozwojem Drosophila znajduj si na terenie jdra, nie pozostawiaj wtpliwoci, e mamy do czynienia z biakami regulatorowymi, wicymi si ze specyficznymi sekwencjami DNA i wpywajcymi na transkrypcj odpowiednich genw. To tumaczy zarwno hierarchiczne zalenoci midzy tymi genami, jak i autoregulacj, jeeli sekw.encja regulatorowa danego genu jest rozpoznawana przez jego wasny produkt. Dziaanie genw kierujcych uksztatowaniem ciaa u Drosophila zostao tu przedstawione w sposb schematyczny i niezmiernie uproszczony, na kilku tylko przykadach. Chocia postp w wyjanianiu tych zjawisk jest w ostatnich latach bardzo szybki, jednak do poznania mechanizmw genetycznych kierujcych rozwojem Drosophila wci jeszcze daleko.

10.2.8. Sekwencja homeoboksu wystpuje w genach kierujcych rozwojem u zwierzt bezkrgowych i krgowcw

Odkrycie sekwencji homeoboksu w genach kierujcych rozwojem Drosophila od razu nasuno przypuszczenie, e sekwencja ta moe odgrywa rol take u innych organizmw. Rzeczywisto przesza jednak najmielsze oczekiwania! Posugujc si t sekwencj jako sond do hybrydyzacji DNA bankw genomowych rnych zwierzt, stwierdzono obecno homeoboksu w genach wielu bardzo odlegych od siebie ewolucyjnie grup, m.in. u nicienia C. elegans, u piercienic, jeowcw, prymitywnych strunowcw i krgowcw (w tym u aby, kury, myszy i czowieka). W wielu przypadkach wykazano, e ekspresja genw z homeoboksem wystpuje ju we wczesnym okresie zarodkowym i ma specyficzn lokalizacj, co wskazuje na ich udzia w wyznaczaniu planu budowy organizmu. Geny zawierajce homeoboks zostay do dobrze zbadane u czowieka i u myszy, u ktrych nazwano je genami Hox. U obu tych gatunkw zidentyfikowano ju okoo 30 rnych genw Hox, ktre wystpuj w 4 grupach sprze jako kompleksy HOX (rys. 10.14). Uoenie genw w kadym z tych kompleksw wykazuje bardzo due podobiestwo do poczonych kompleksw ANT-C + BX-C u Drosophila, tzn. najbardziej homologiczne w stosunku do siebie geny, tworzce tzw. podrodziny, wystpuj w tej samej kolejnoci (rys. 10.14). A wic geny zajmujce t sam pozycj w rnych kompleksach s bardziej do siebie podobne ni geny ssiadujce w jednym kompleksie. Homologia tych genw dotyczy gwnie sekwencji, ktra koduje homeodomen, a zwaszcza jej fragment skadajcy si z 12 aminokwasw, biorcych bezporedni udzia w wizaniu homeodomeny z DNA (rys. 10.13). Prawdopodobnie w linii prowadzcej do strunowcw nastpia kilkakrotna duplikacja caego ukadu, ktry u bezkrgowcw wystpuje w genomie pojedynczo. Co wicej, okazao si, e podobnie jak u Drosophila istnieje cisy zwizek midzy kolejnoci uoenia genw w chromosomie a miejscem ich aktywnoci w osobniku! Geny usytuowane najbliej koca 5' decyduj o rozmieszczeniu narzdw pooonych najbardziej ku tyowi. Zwaszcza przednia (w kierunku od gowy do ogona) granica ekspresji poszczeglnych genw Hox w ukadzie nerwowym oraz w odcinkach sklerotomu (zacztki krgw) zarodka myszy jest bardzo wyrana i odpowiada kolejnoci tych genw w chromosomie (rys. 10.14). Na podstawie dotychczasowych danych mona sprecyzowa dwa wnioski oglne dotyczce genw Hox: a) przednia granica ekspresji genu (na przednio-tylnej osi ciaa) zaley od jego pozycji w kompleksie; b) geny wykazujce ekspresj w tym samym regionie pochodz z tej samej podrodziny.

Abd-B

Abd-A

Ubx

Antp

Ser

Dfd

pb

lab

mysz (15) HOC-3

Rys. 10.14. Podobiestwo ukadu genw kierujcych rozwojem u D. melanogaster (kompleks BX-C i ANT-C) oraz u myszy (4 kompleksy HOX, liczby w nawiasach oznaczaj numer chromosomu). Pozycja genu w kadym kompleksie decyduje o miejscu jego ekspresji wzdu osi przednio-tylnej zwierzcia. Odpowiadajce sobie geny w poszczeglnych kompleksach znaczono tym samym rodzajem cieniowania; strzaki wskazuj miejsca ich ekspresji (u D. melanogaster na integumencie, u myszy w cewce nerwowej i zawizkach krgw) za (wg Duboule i wsp., 1990, zmienione; geny kompleksu HOX-3 i 4 wg Krumlauf, 1992)

Hox-1,5

Hox-1,5

Rys. 10.15. Schemat wprowadzania genu Hox-1.5~ do myszy. W hodowli totipotencjalnych komrek pochodzcych od myszy pigmentowanej wymieniono przez homologiczn rekombinacj aktywny gen Hox-1.5 na gen Hox-1.5~, niefunkcjonalny wskutek wczonej w jego cig sekwencji kodujcej neomycyn (neo). Komrki te, po wprowadzeniu do blastocysty o genotypie albinotycznym, wziy udzia w utworzeniu rnych tkanek i narzdw chimery; ciemne partie sierci zawieraj gen Hox-1.5~

Geny Hox wykazuj podobiestwo do genw homeotycznych u Drosophila nie tylko pod wzgldem struktury; zachoway one take swoje pierwotne funkcje: po wprowadzeniu do organizmu Drosophila genu myszy odpowiadajcego genowi Antennapedia i spowodowaniu jego nadmiernej ekspresji uzyskano muchy z odnami zamiast czukw, podobnie jak przy nadmiernej ekspresji wasnego genu. Chocia wci jeszcze nie jest wyjaniona funkcja tych genw u krgowcw, nie ulega wtpliwoci, e graj one rol w rnicowaniu si narzdw osobnika. Dowiody tego bezporednio badania nad dziaaniem genu Hox-1.5 u myszy, w ktrych wykorzystano wiele rozwinitych ostatnio technik z zakresu inynierii genetycznej. Przez homologiczn rekombinacj w totipotencjalnych komrkach embrionalnych myszy tzw. komrkach pnia (ang. stem cells) hodowanych in vitro wymieniono normalny gen Hox-1.5 na gen nieaktywny (.Hox-1.5~), ktrego cigo zostaa przerwana przez wstawienie sekwencji powodujcej oporno na neomycyn (umoliwiajcej selekcj stransformowanych komrek). Komrki zawierajce ten zmutowany gen wprowadzono do blastocyst myszy, uzyskujc chimery (rys. 10.15), w ktrych pewne tkanki

pochodziy od blastocysty, inne za od komrek ze zmutowanym genem. W niektrych przypadkach te ostatnie day te pocztek komrkom linii pciowej, dziki czemu uzyskano heterozygoty przekazujce gen zmutowany do gamet. Osobniki te byy normalne, ale powstajce w ich potomstwie homozygoty Hox-l.5~jHox-l.5~ giny zaraz po urodzeniu, wykazujc niedorozwj narzdw pochodzcych z ukw i kieszonek skrzelowych (m.in. brak grasicy i przytarczycy, maa tarczyca, nienormalnoci chrzstek, a ponadto defekty sercowo-naczyniowe). Normalny gen Hox-1.5 rozpoczyna ekspresj jako jeden z najwczeniej dziaajcych genw Hox, ju w przedsomitowej mezodermie i ektodermie przedniej czci ciaa 7 8-dniowych zarodkw myszy. Wprawdzie braki narzdw u homozygotycznych mutantw nie byy tak wielkie jakby to wynikao z wzoru ekspresji genu Hox-1.5 u normalnych zarodkw, jednak wyniki te wyranie wskazuj, e gen ten jest niezbdny do ycia i e bierze udzia w kontroli powstawania okrelonych narzdw. Ponadto wyniki te wiadcz o tym, e homologiczne do genu Hox-1.5 geny z tej samej podrodziny w pozostaych kompleksach HOX (p. rys. 10.14; biae kka w kompleksach Hox-l, Hox-2 i Hox-4) s jednak funkcjonalnie zrnicowane, gdy nie mog go zastpi u homozygotycznych mutantw. Wykryto jeszcze inne bardzo interesujce zjawisko: pewne geny Hox, ktrych ekspresja pojawia si najpierw w narzdach osiowych (system nerwowy, zawizki krgw), wykazuj potem ekspresj rwnie w narzdach obwodowych, np. koczynach, i to take w sposb uporzdkowany, tzn. ukadowi przednio-tylnemu w narzdach osiowych odpowiada ukad proksymalno-dystalny w koczynach. Jest to zadziwiajca ekonomia, dziki ktrej ten sam system regulacyjny zostaje zastosowany wielokrotnie i w podobny sposb w rnych etapach rozwoju. Naley wreszcie podkreli wielkie znaczenie metodologiczne odkrycia sekwencji homeoboksu. Poniewa u ssakw nie pojawiaj si mutanty homeotyczne (albo s letalne, albo ich wystpowaniu zapobiegaj due zdolnoci regulacyjne), nie mona byo metodami klasycznymi wyszuka genw kierujcych rozwojem. Na ich lad naprowadzia dopiero sekwencja homeoboksu zidentyfikowana najpierw dziki mutantom homeotycznym u Drosophila. By to przeom, ktry zapocztkowa szybki postp genetyki rozwoju.
10.2.9. Sekwencje homeoboksu tworz konserwatywn ewolucyjnie rodzin

Geny zawierajce sekwencj homeoboksu tworz du rodzin genw kierujcych rozwojem i rozpowszechnionych w rnych grupach zwierzt. Okazao si, e rodzina ta ma jeszcze szerszy zasig. W roku 1991 zidentyfikowano bowiem biako zawierajce homeodomen, kodowane przez gen Knotted-1 (.Knl) u kukurydzy! Wydaje si, e gen ten reguluje procesy roz-

wojowe, poniewa jego mutacje powoduj nieprawidowy rozwj uytkowania lici i powstawania na nich wybrzusze lub wzw (std nazwa genu). Homeodomena kodowana przez gen Knl wykazuje najwiksze podobiestwo (ok. 35% homologii) do homeodomeny kodowanej przez jeden z genw czowieka oraz do biaka genu MAT Pi u drody. Te podobiestwa sugeruj, e prototyp sekwencji homeoboksu wywodzi si od przodka yjcego przed rozdzieleniem si krlestw rolin, zwierzt i grzybw, czyli jeszcze przed ewolucj organizmw wielokomrkowych. Poniewa we wszystkich przypadkach chodzi o geny wyznaczajce dalsze losy komrek, mona std wysnu wniosek, e rozwj wielokomrkowca jest regulowany za pomoc modyfikacji mechanizmw, ktre decyduj o losach komrek, take u jednokomrkowcw. Jednak tylko u zwierzt geny z sekwencj homeoboksu wystpuj w formie kompleksu genw sprzonych, ktrych kolejno uoenia w chromosomie koreluje z wzorem ich ekspresji komrkowej wzdu osi przednio-tylnej organizmu (p. rys. 10.14). Hierarchiczny ukad genw o wysokim stopniu homologii (p. rys. 10.13), zawierajcych homeoboks i kierujcych rozwojem Drosophila, pozwala sdzi, e geny te powstaway w ewolucji przez kolejne duplikacje. Przypuszczenie, e w filogenezie jako pierwsze wyksztaciy si geny polarnoci jaja, ktre wyznaczyy przedni i tylny biegun prymitywnych organizmw, wydaje si logiczne. Nastpnie powstanie genw segmentacji umoliwio podzia ciaa na jednakowe odcinki (jak u piercienic), a dopiero ewolucja genw homeotycznych doprowadzia do zrnicowania ciaa na gow, tuw i odwok. Hipotez t bdzie mona zweryfikowa dopiero po dokadnym zbadaniu genw kierujcych rozwojem w innych grupach. Natomiast ewolucji strunowcw towarzyszyy (lub j poprzedziy) kilkakrotne duplikacje ju nie tylko pojedynczych genw, ale caego kompleksu HOX. By moe, i dopiero zwielokrotniony repertuar informacji pozycyjnych i regulacyjnych umoliwi wyksztacenie tak skomplikowanych organizmw jak krgowce. W tych rozwaaniach wzite byy pod uwag tylko geny z sekwencj homeoboksu. Trzeba pamita, e oprcz nich rol regulatorow w rozwoju odgrywaj take sekwencje kodujce domeny palcw cynkowych oraz z pewnoci wiele innych (p. s. 302).

10.3. Kontrola genetyczna determinacji pci u zwierzt U wszystkich gatunkw rozdzielnopciowych wynik kocowy determinacji pci jest w zasadzie taki sam, tzn. w prawidowych warunkach kady osobnik zostaje zrnicowany jako samica lub samiec, natomiast mechanizmy prowadzce do osignicia tego stanu mog by rne. Zasadnicze elementy genetycznej kontroli determinacji pci i rnicowania si pciowego osobnika mona przedstawi w trzech etapach. Pierwszy etap stanowi sygna wywoawczy, ktry dziaa jak przecznik" nastawiajcy rozwj organizmu wedug typu es-

kiego lub mskiego. Sygnaem tym moe by czynnik rodowiskowy (np. u wi jest nim temperatura otoczenia) lub genetyczny, jak obecno pewnych chromosomw (genw) albo wzajemne stosunki midzy nimi, np. stosunek liczby chromosomw X do liczby autosomw u Drosophila, u ssakw za obecno chromosomu Y. Etap drugi to uruchomienie tzw. kaskady genw regulatorowych biorcych udzia w determinacji pci, z ktrych kady aktywuje lub hamuje dziaalno nastpnego z serii. I dopiero ostatni z nich oddziauje na geny odpowiedzialne bezporednio za zrnicowanie si narzdw i struktur pciowych, co stanowi etap trzeci. U wielu gatunkw zrnicowanie w kierunku jednej pci (podstawowej) moe przebiega niejako samorzutnie, natomiast rozwj w kierunku pci przeciwnej (dominujcej) zostaje narzucony tylko w razie uruchomienia sygnau wywoawczego. Na przykad u ssakw pci podstawow jest pe eska, wyksztacenie pci mskiej za wymaga sygnau pochodzcego z chromosomu Y, natomiast u Drosophila podstawowa jest pe mska. Badania nad determinacj pci i rnicowaniem si cech pciowych dotycz wielu wanych problemw biologicznych o oglnym znaczeniu, jak precyzyjna kontrola ekspresji genw, autoregulacja, mierzenie wartoci progowych, interakcje i koordynacje komrkowe. Dopiero od niedawna zaczynamy poznawa molekularne mechanizmy lece u podstaw tych procesw. Zostay one najlepiej zbadane u Caenorhabditis elegans i u Z), melanogaster, przy czym okazuje si, i mimo pozornego podobiestwa przebiegu tych procesw u obu gatunkw, szczegowe mechanizmy molekularne mog by odmienne. Tutaj ograniczymy si do omwienia mechanizmw determinacji pci u Drosophila, a nastpnie przedstawimy nowe osignicia dotyczce ssakw, gdy w tej grupie poczyniono w ostatnich latach bardzo due postpy.

10.4. Determinacja pci u D. melanogaster Znaczny postp osignity ostatnio w zrozumieniu mechanizmw determinacji pci u D. melanogaster wynika z poczenia bada genetycznych i molekularnych. Wyprodukowanie rnych mutantw o fenotypie wskazujcym na zaburzenia, determinacji pci umoliwio poznanie najwaniejszych genw regulatorowych, z ktrych wiele ju sklonowano, a nawet posuono si nimi do uzyskania osobnikw transgenicznych. Kaskad waniejszych z tych genw przedstawia rysunek 10.16(a). Od sygnau wywoawczego (stosunek X/A) prowadzi droga do nadrzdnego genu regulatorowego Sxl (Sex lethal), ktry warunkuje trzy procesy: a) regulacj aktywnoci genw sprzonych z chromosomem X, czyli mechanizm kompensacyjny (ang. dosage compensation), dziki ktremu aktywno genw w jednym chromosomie X u samca zostaje podwyszona do poziomu odpowiadajcego cznej ekspresji genw z obu chromosomw X u samicy;

Rys. 10.16 (a) Kaskada genw regulatorowych biorcych udzia w determinacji pci u D. melanogaster: (b) Mechanizm determinacji pci somatycznej (wg Hodgkina, 1990 zmodyf.)

b) determinacj pci somatycznej (dymorfizm pciowy komrek somatycznych); c) determinacj pciow komrek rozrodczych (zrnicowanie na jaja lub plemniki). Jak wynika ze schematu, te trzy procesy przebiegaj u Drosophila w zasadzie niezalenie, jakkolwiek s regulowane przez ten sam sygna wywoawczy i nadrzdny gen regulatorowy. Etapy te omwione zostan kolejno.
10.4.1. Pe u Drosophila jest zdeterminowana stosunkiem liczby chromosomw X do liczby autosomw

U D. melanogaster samice maj dwa chromosomy X, samce za jeden chromosom X i jeden Y. Determinacja pci nie zaley jednak ani od obecnoci chromosomu Y, ani od liczby chromosomw X, lecz od stosunku liczby chromosomw X do liczby zespow autosomw, czyli stosunku X/A (gdzie A oznacza haploidalny zesp skadajcy si z trzech autosomw). Wyjaniy to ju klasyczne badania przeprowadzone jeszcze w latach 20. przez C.B. Bridgesa. U normalnego samca stosunek X/A wynosi 0,5, u normalnej za samicy 1,0. Bridges w odpowiednio dobranych krzywkach osobnikw o rnej ploidalnoci otrzyma stosunki zarwno bardziej skrajne, jak i porednie (tab. 10.1). Okazao si, e wystpuj tu pewne wartoci progowe: przy stosunku porednim 0,67 powstaj interseksy, tzn. osobniki skadajce si z mieszaniny komrek typu mskiego i typu eskiego, powyej wartoci 0,67 rnicuj si samice, a poniej samce, z tym jednak, e stosunki wysze ni 1,50 oraz nisze ni 0,33 prowadz do letalnoci.

Genotyp AA XXX AAA XXX AA XX AAA XX AA X AAA X

Liczba X A 3 3 2 2 1 1 2 3 2 3 2 3

Stosunek X/A 1,5 1 1 0,67 0,5 0,33

Fenotyp

samica interseks samiec

Uwagi: X oznacza jeden chromosom X, A haploidalny zesp autosomw.

W jaki sposb komrki mierz stosunek X/A, tego jeszcze dokadnie nie wiadomo; w kadym razie odbywa si to nie na poziomie caego organizmu, lecz autonomicznie komrkowo. Panuje pogld, e w chromosomie X znajduje si wiele czynnikw (numeratorw), ktre zwikszaj ten stosunek, a po przekroczeniu wartoci progowej powoduj feminizacj. Przekonuj o tym badania duplikacji odcinkw chromosomu X, ktre nie maj wprawdzie wpywu u normalnego samca (IX, 2A), ale prowadz do istotnej feminizacji interseksa (2X, 3A). Dziki temu wyznaczono regiony chromosomu X, w ktrych czynniki te s zawarte, a dwa z nich udao si nawet czciowo zdefiniowa na poziomie molekularnym; s to lece w chromosomie X geny sis-a i sis-b (,sisterless), ktrych sekwencje wskazuj, e powinny one kodowa biaka 0 charakterze czynnikw transkrypcyjnych, aktywujcych nadrzdny gen regulatorowy Sxl (rys. 10.16(a)). Mona przypuszcza, i pozostae, nie wykryte do tej pory, elementy numeratorowe rwnie koduj czynniki transkrypcyjne, ktre zostaj zsyntetyzowane jeszcze przed ustaleniem mechanizmu kompensacyjnego. Wyszy poziom tych czynnikw u zarodkw XX ni u zarodkw XY moe wystarczy do uaktywnienia embrionalnej transkrypcji genu Sxl 1 skierowania rozwoju na drog pci eskiej. We wczesnej fazie kontroli genu Sxl bior take udzia inne geny, jak da (daughterless) i snf (sans-fille). Nie wiemy natomiast, jaki charakter maj czynniki autosomowe odgrywajce rol w stosunku X/A.
10.4.2. Mechanizm kompensacyjny podwysza aktywno chromosomu X u samcw Drosophila do poziomu odpowiadajcego dwu chromosomom X u samic

U Drosophila chromosom X zawiera, oprcz czynnikw zaangaowanych w determinacj pci, okoo 1000 genw (20% genomu) penicych inne wane funkcje nie zwizane z pci. Poniewa samica XX ma tych genw dwa razy wicej ni samiec XY, przy jednakowej liczbie genw autosomowych, konieczny jest mechanizm kompensacyjny, zapobiegajcy skutkom tej dysproporcji. Gdy zmierzono wczanie znakowanej trytem urydyny do politenicznych chromosomw X, stwierdzono, e mechanizm ten u Drosophila polega na

dwukrotnie wyszym poziomie transkrypcji genw w chromosomie X u samcw ni u samic. W chromosomie X wystpuje wiele sekwencji wzmacniajcych, dziaajcych w pozycji cis na kady gen, jaki si znajdzie w ich ssiedztwie, co wykazano na samcach transgenicznych, u ktrych obce geny wczone do chromosomu X przejawiay dwukrotnie wysz aktywno ni takie same geny wczone do autosomw. Oprcz tego w skad mechanizmu kompensacyjnego wchodzi wiele czynnikw dziaajcych w pozycji trans, stanowicych produkty genw mle (maleless) oraz msl-1, -2, -3 (mae specific lethal). Mutacje ktregokolwiek z tych genw (zestaw MSL, p. rys. 10.16(a)) nie maj wpywu na osobniki XX, ale s letalne dla osobnikw XY, z powodu zbyt niskiego poziomu transkrypcji genw w chromosomie X. Geny te nie maj wpywu na fenotyp pciowy. Nie wiadomo, w jaki sposb mechanizm kompensacyjny jest kontrolowany przez nadrzdny gen regulatorowy Sxl (rys. 10.16(a)). Powinna to by kontrola negatywna, gdy gen Sxl jest aktywny tylko u samic, natomiast mechanizm kompensacyjny dziaa tylko u samcw. Kompensacja aktywnoci chromosomw X przebiega rnie u poszczeglnych gatunkw, np. u C. elegans, gdzie wystpuj dwie pcie: hermafrodytyczne osobniki XX i samce XO, wydaje si, e kompensacja polega na redukcji poziopiu transkryptw u osobnikw XX. Jeszcze inaczej jest u ssakw, u ktrych u osobnikw XX jeden z dwu chromosomw X staje si skondensowany i nieaktywny (s. 313).
10.4.3. Aktywny stan nadrzdnego genu Sx uruchamia kaskad genw regulatorowych, prowadzcych rozwj w kierunku eskim

U samic gen Sxl dziaa jako autoaktywator oraz nadrzdny regulator rnicowania si pci somatycznej i komrek rozrodczych (rys. 10.16), natomiast u samcw nie ma on adnej funkcji. Wprawdzie w okresie postembrionalnym transkrypcja genu Sxl zachodzi u obu pci, jednak u samcw wszystkie transkrypty maj w obrbie jednego z egzonw kodon stop, z czego wynika, i koduj one niekompletne, zatem niefunkcjonalne produkty. Natomiast u samic wskutek innego sposobu obrbki mRNA kodon stop jest usuwany, wobec czego powstaje biako funkcjonalne. Zawiera ono motyw znajdywany w wielu biakach wicych si z RNA, tote moe bra udzia w obrbce transkryptw zarwno wasnego genu Sxl (pozytywna autoregulacja), jak i kolejnego w kaskadzie genu tra (transformer), (p. rys. 10.16(b)), powodujc powstawanie funkcjonalnych produktw tych genw. Przypuszczalnie aktywny stan genu Sxl zostaje zapocztkowany w okresie embrionalnym dziki transkrypcji ze specjalnego promotora, uruchamianego tylko u zarodkw samic, przez produkty genw sis aktywowanych w obu chromosomach X (jeszcze przed ustaleniem mechanizmu kompensacyjnego). W ten sposb powstaje po raz pierwszy aktywne biako genu Sxl. W dalszym rozwoju, zarwno u samic, jak i u samcw zachodzi identyczna transkrypcja

genu Sxl, teraz ju z konstytutywnego promotora, jednake tylko u samic transkrypty te bd podlegay prawidowej obrbce dziki obecnoci uprzednio zsyntetyzowanego aktywnego biaka Sxl. Gen Sxl bdzie wic u samic aktywny, nawet po zaniku wyzwalajcego sygnau X/A. Podany mechanizm pozwala wytumaczy stabilno opisanego systemu. Wyobramy sobie bowiem, co by si dziao, gdyby funkcjonowanie genu Sxl musiao by stale regulowane przez wyzwalajcy sygna X/A: np. u zarodka 0 chromosomach XY gen Sxl zostaby pocztkowo wprowadzony w stan niefunkcjonalny, skoro jednak wczyby si mechanizm kompensacyjny, powodujc podwyszenie transkrypcji genw zawartych w chromosomie X do takiego samego poziomu jak u osobnikw o dwu chromosomach X, to nastpiby pozorny wzrost stosunku X/A, co przestawioby gen Sxl w stan funkcjonalny, zacierajc rnice midzy pciami.
10.4.4. O pci somatycznej Drosophila decyduje rny sposb obrbki transkryptw genw regulatorowych

Najlepiej zosta poznany mechanizm decydujcy o wyksztaceniu pci somatycznej, co dotyczy dymorfizmu pciowego pod wzgldem budowy wewntrznych i zewntrznych narzdw pciowych, ponadto ksztatu i barwy odwoka (zaokrglony i silniej pigmentowany u samcw, ostro zakoczony 1 wikszy u samic) oraz wystpowania na odnu samcw grzebyka pciowego utworzonego ze zmodyfikowanych szczecinek. Interseksy s mozaikami pod wzgldem tych struktur, gdy poszczeglne komrki mog by zrnicowane w typie" mskim lub eskim. Determinacj pci somatycznej zawiaduj 4 gwne geny regulatorowe (rys. 10.16(a),(b)): tra (transformer), tra-2, ix (intersex) i dsx (idoublesex), podlegajce nadrzdnemu genowi Sxl. Geny te nie maj jednak wpywu na rnicowanie si komrek rozrodczych. Kontrola determinacji pci somatycznej polega na zrnicowanej obrbce transkryptw. Jak wyjaniono poprzednio, u samic obrbka transkryptu Sxl prowadzi do wytworzenia funkcjonalnego produktu, ktry powoduje powstanie rwnie funkcjonalnego biaka genu tra, a to z kolei decyduje o determinacji pci somatycznej w kierunku eskim. Przekonano si bowiem, e transgeniczne osobniki XY, ktrym wprowadzono sekwencje cDNA komplementarne do transkryptw tra typu eskiego, staway si fenotypowo samicami. U normalnych samcw natomiast, z powodu braku funkcjonalnego biaka Sxl, w czasie obrbki transkryptu tra zostaje z niego wycita duga otwarta ramka odczytu (ORF), powodujc, e produkt ten jest niefunkcjonalny. Biaka genw tra oraz tra-2 rwnie zawieraj charakterystyczne sekwencje wystpujce w domenach wicych si z RNA, co wskazuje na ich rol w regulacji obrbki mRNA. Ich genem docelowym jest gen dsx, ktry rwnie wykazuje zalene od pci rnice w strukturze mRNA, jednak w tym przypadku zarwno produkt eski (powstay pod kontrol biaka tra), jak i produkt mski (bez udziau biaka tra) s funkcjonalne i decyduj o dalszym r-

nicowaniu si cech somatycznych (rys. 10.16(b)). Poniewa mutacje zerowe genu dsx powoduj interseksualizm somy zarwno u osobnikw XX, jak i u XY, naley przypuszcza, i gen ten ma podwjn rol: u osobnikw XX powoduje rnicowanie si w kierunku eskim i hamuje rozwj w kierunku mskim, natomiast u osobnikw XY odwrotnie. Gen ix (intersex) jest niezbdny do normalnego funkcjonowania genu dsx u samic, ale nie wiadomo jeszcze, w jaki sposb jest regulowany; u samcw nie ma on znaczenia.
10.4.5. Na determinacj pciow komrek rozrodczych wpywa aktywno genu Sxl oraz rodowisko komrek somatycznych

Wprawdzie poznano wiele genw koniecznych do prawidowego rnicowania si oocytw i plemnikw, jednak jak wynika z rysunku 10.16(a) sam mechanizm determinujcy pe komrek rozrodczych nie zosta jeszcze poznany. Wiadomo, e aktywno nadrzdnego genu Sxl nie jest potrzebna do uruchomienia spermatogenezy, natomiast jest konieczna dla oogenezy, jakkolwiek nie znamy genu docelowego. Geny regulatorowe determinujce pe somatyczn nie maj bezporedniego wpywu na determinacj rozwojow komrek rozrodczych, ktre musz by regulowane przez odrbny mechanizm. Jednake nie s one cakowicie niezalene od somy, gdy wykazano, e komrki rozrodcze XX po przeszczepieniu do mskiego rodowiska somatycznego mog wej na drog spermatogenezy. Co prawda, nie doprowadzi to jednak do wytworzenia normalnych plemnikw, gdy proces ten wymaga m.in. aktywnoci genw zlokalizowanych w chromosomie Y. Wpyw komrek somy na los komrek rozrodczych stwierdzono take u ssakw (p. s. 316). 10.5. Determinacja pci u ssakw U ssakw, podobnie jak u Drosophila, osobniki XX s samicami a XY samcami, jednak zarwno mechanizm kompensacyjny, jak i mechanizm determinacji pci s odmienne, gdy pierwszy z nich jest determinowany liczb chromosomw X, a drugi obecnoci chromosomu Y. Ponadto, w przeciwiestwie do muszki owocowej, u ktrej procesy te s regulowane w znacznym stopniu autonomicznie przez poszczeglne komrki, u ssakw, wskutek integrujcej roli ukadu hormonalnego, determinacja pci somatycznej caego osobnika jest uzaleniona od kierunku rnicowania si jego gonad.
10.5.1. Mechanizm kompensacyjny u samic ssakw polega na inaktywacji jednego z dwu chromosomw X

U samic ssakw we wczesnym okresie zarodkowym we wszystkich komrkach blastocysty nastpuje kondensacja i w konsekwencji inaktywacja jednego z dwu chromosomw X, ktry w jdrze interfazowym jest widoczny

(a)
Mo

(b)

(c)

Rys. 10.17. Inaktywacja chromosomu X u samicy myszy heterozygotycznej pod wzgldem allelu Mo (Mottled) powodujcego rozjanienie sierci, (a) Zapodniona komrka jajowa z dwoma chromosomami X (czarny z allelem + , jasny z allelem Mo), (b) Fragment wczesnego zarodka w poszczeglnych komrkach jeden z dwch chromosomw X ulega inaktywacji (przedstawiony jako kulisty), (c) Klony komrek powstae w wyniku podziaw maj ten sam chromosom nieaktywny co komrka wyjciowa, tote sier dorosej myszy skada si z plam ciemnych (czynny allel + ) i jasnych (czynny allel Mo)

jako grudka chromatyny, tzw. ciako Barra (zwane te ciakiem X lub chromatyn pciow). Poniewa proces ten zachodzi w sposb losowy, w jednych komrkach inaktywacji ulega jeden, w innych drugi z chromosomw X (rys. 10.17). Stan ten przenosi si na komrki potomne, tote organizm heterozygotycznej samicy skada si z dwu klonw komrkowych, w ktrych czynne s allele jednego lub drugiego chromosomu. Inaktywacja obejmuje niemal cay chromosom X, powodujc, e ekspresja genw sprzonych z tym chromosomem u samca i samicy jest jednakowa, mimo rnej liczby tych chromosomw. U osobnikw aneuploidalnych, posiadajcych wicej ni jeden chromosom X (XXY, XXXY), wszystkie z wyjtkiem jednego ulegaj inaktywacji, natomiast proces ten nie zachodzi u osobnikw XO. Mechanizm inaktywacji nie jest jeszcze w peni poznany, wiadomo jednak, i towarzyszy mu metylacja DNA chromosomu. Mechanizm kompensacyjny nie dotyczy jednak komrek rozrodczych, bowiem w oocytach w trakcie profazy mejotycznej nastpuje reaktywacja nieczynnego poprzednio-chromosomu X. Co wicej, wydaje si, e aktywno obu chromosomw X jest niezbdna do normalnego przebiegu oogenezy. Brak jednego chromosomu X u kobiet z zespoem Turnera (XO) powoduje bezpodno, natomiast u myszy XO znaczne skrcenie okresu rozrodczego wskutek zamierania oocytw. Natomiast u osobnikw pci mskiej obecno drugiego chromosomu X uniemoliwia normalny przebieg spermatogenezy, powodujc zamieranie spermatogoniw wkrtce po urodzeniu. Dlatego mczyni z zespoem Klinefeltera (XXY) s niepodni.

10.5.2. Pe msk ssakw determinuje obecno chromosomu Y w komrkach somatycznych gonady

W roku 1959 wykazano, e w przeciwiestwie do muszki owocowej, u czowieka osobnicy XXY s pci mskiej, natomiast XO pci eskiej. Poniewa to samo stwierdzono take u myszy i innych gatunkw ssakw, stao si oczywiste, e w chromosomie Y musi si mieci jaki czynnik, ktry odgrywa kluczow rol w determinacji pci mskiej u ssakw. Czynnik ten zosta u czowieka nazwany TDF (ang. testis determining factor), a u myszy Tdy (testis determining gene on the Y). O pci ssaka decyduje kierunek zrnicowania si gonady. We wczesnym okresie zarodkowym powstaje ona z zawizka utworzonego przez komrki somatyczne, do ktrego przemieszczaj si komrki prapciowe (rys. 10.18) i tylko te ostatnie dadz pocztek wszystkim komrkom rozrodczym: jajom lub plemnikom. Pocztkowo gonada jest jednakowa u obu pci, natomiast o jej zrnicowaniu si w gonad msk, czyli jdro, decyduje kierunek rozwoju linii komrek somatycznych typu podporowego. Jeeli komrki te zawieraj chromosom Y, to przeksztacaj si w komrki Sertoliego, indukujc rozwj embrionalnego zawizka gonady w jdro: komrki prapciowe rnicuj si wtedy w spermatogonia, komrki sterydogenne za w komrki Leydiga produkujce hormon pciowy mski, testosteron, odpowiedzialny za zapocztkowanie wielu dalszych procesw zwizanych z wyksztaceniem cech mskich osobnika. Natomiast w przypadku braku chromosomu Y gonada rnicuje si jako jajnik, co prowadzi do wyksztacenia pci eskiej, ktra u ssakw jest pci
komrki prapciowe zawiqzek gonady komrki somatyczne

komrki Leydiga komrki folikularne pcherzyk jajnikowy komrka Sertoliego spermatogeneza

fragment kanalika nasiennego w jqdrze Rys. 10.18. Schemat rnicowania si gonady ssakw z jednakowego zawizka u obu pci. Komrki linii pciowej (rozrodcze) zaznaczone grub kresk. Warunkiem zrnicowania gonady w jdro jest obecno chromosomu Y w komrkach somatycznych embrionalnego zawizka

podstawow. W tym przypadku komrki prapciowe staj si oocytami, ktre ju w okresie zarodkowym wchodz w profaz mejotyczn, a otaczajce je komrki podporowe przeksztacaj si w komrki pcherzykowe (folikularne); komrki sterydogenne za bior udzia w tworzeniu torebki pcherzykw jajnikowych i produkuj hormony pciowe eskie. Skad chromosomowy samych komrek prapciowych nie ma wpywu na determinacj pci, o czym mona si byo przekona badajc rozwj chimer, powstaych ze zczenia zarodkw XX i XY o odpowiednich genotypach markerowych. Pe takiej chimery zaley od proporcji komrek podporowych XX i XY, ktre znalazy si w zawizku gonady. Tylko przy bardzo znacznej przewadze komponentu XX utworzy si jajnik, a wtedy zarwno komrki prapciowe XX, jak i XY wejd w profaz mejotyczn jeszcze w okresie zarodkowym, stajc si oocytami. Z komrek XY mog czasem u myszy powsta zdolne do zapodnienia komrki jajowe, chocia brak drugiego chromosomu X powoduje zwykle wczesn degeneracj takich oocytw (podobnie jak u samic XO). Jeeli natomiast zarodkowa gonada chimery XX/XY zrnicuje si w jdro, to komrki prapciowe zarwno XY, jak i XX przeksztacaj si w prespermatogonia, jednake te ostatnie obumieraj w jdrze jeszcze przed urodzeniem osobnika, gdy obecno dwu chromosomw X jest dla nich letalna. Tylko komrki XY podlegaj spermatogenezie, zwaszcza e do normalnego przebiegu tego procesu niezbdny jest inny jeszcze gen w chromosomie Y (rny od genu TDF lub Tdy).
10.5.3. Jak poszukiwano genu determinujcego pe msk ssakw

Poszukiwania genu determinujcego pe msk ssakw przypominaj rozwizywanie fascynujcej zagadki kryminalnej: kolejno stawiane hipotezy musiay by odrzucane w wietle nowo odkrywanych faktw, a wreszcie rok 1990 przynis, jak si wydaje, rozstrzygnicie tego problemu, do czego przyczyniy si przede wszystkim badania dotyczce czowieka i myszy laboratoryjnej. Punktem wyjcia w tych poszukiwaniach byy nienormalnoci chromosomowe, powodujce wyksztacenie pci eskiej u osobnikw z niekompletnym chromosomem Y lub pci mskiej mimo braku tego chromosomu na preparatach cytologicznych. Nienormalnoci te, jak si pniej okazao, powstaj najczciej wskutek nietypowego przebiegu crossing-over midzy chromosomami X i Y podczas profazy mejotycznej w procesie spermatogenezy. Chromosomy X i Y koniuguj ze sob terminalnie, tz. na bardzo niewielkim kocowym odcinku (rys. 10.19), w ktrym s homologiczne. Odcinek ten okrelany bywa jako region pseudoautosomowy, gdy zlokalizowane w nim sekwencje DNA maj swoje odpowiedniki zarwno w chromosomie X, jak i w Y, tote dziedzicz si podobnie jak geny autosomowe, a nie jak geny sprzone z pci.

czowiek

mysz

mysz Sxr

XSxr

Rys. 10.19. Schemat koniugacji chromosomw XY u czowieka, myszy normalnej i myszy Sxr. Wyrysowano obie chromatydy kadego chromosomu; region pseudoautosomowy, w ktrym zachodzi crossing-over (x) zaznaczono lini przerywan, puste kko oznacza centromer, ciemne kka geny TDF/Tdy. U myszy Sxr chromosom Y ma drug kopi genu Tdy na dystalnym kocu dugiego ramienia. W wyniku crossing-over kopia ta (czyli fragment Sxr) zostaje przeniesiona z jednej chromatydy Y na jedn chromatyd X (czciowo wg McLaren, Trends Genet., 4, 1988, 153-157)

U czowieka gen TDF mieci si w krtkim ramieniu chromosomu Y, w pobliu regionu pseudoautosomowego, o czym przekonano si analizujc pe osobnikw z delecjami tego chromosomu. Jest to lokalizacja bardzo niefortunna, gdy przy zdarzajcym si czasem gbokim" crossing-over, wykraczajcym poza region homologii, gen ten moe zosta przeniesiony na chromosom X. Jeeli plemnik z takim chromosomem zapodni jajo z normalnym chromosomem X, to powstanie osobnik o kariotypie XX, ale majcy gen TDF i wobec tego bdzie pci mskiej (oczywicie niepodny ze wzgldu na obecno dwu chromosomw X). Natomiast po zapodnieniu jaja plemnikiem z chromosomem Y pozbawionym czynnika TDF, powstanie osobnik o kariotypie XY, ale pci eskiej (rwnie niepodny ze wzgldu na brak drugiego chromosomu X). Inaczej jest u myszy laboratoryjnej, u ktrej region pseudoautosomowy mieci si na innym kocu chromosomu Y ni determinujcy pe gen Tdy (rys. 10.19), tote w normalnych warunkach nawet gboki crossing-over nie powoduje zaburze w determinacji pci. W roku 1971 odkryto jednak samca, ktry by nosicielem nieokrelonego pocztkowo czynnika zmiany pci", nazwanego Sxr (ang. sex-reversion), gdy spord potomstwa XX poow stanowiy samce. Poniewa czynnik Sxr dziedziczy si jak dominujcy gen autosomowy, podejrzewano, e moe to by fragment chromosomu Y przeniesiony do ktrego z autosomw, jednak poszukiwania tego fragmentu nie daway wynikw.

Dopiero w roku 1982 po zastosowaniu sond DNA o sekwencjach ssiadujcych z odcinkiem determinujcym pe, ustalono metod hybrydyzacji in situ na preparatach chromosomowych, i samiec XY Sxr ma w chromosomie Y dwa fragmenty zawierajce locus Tdy: jeden o normalnej lokalizacji, drugi fragment za (czyli czynnik Sxr), powstay prawdopodobnie w wyniku zaszej poprzednio duplikacji, umieszczony jest na kocu regionu pseudoautosomowego. W czasie koniugacji czynnik Sxr jednej z chromatyd chromosomu Y jest regularnie przenoszony w wyniku crossing-over na chromatyd chromosomu X, tote samiec taki produkuje plemniki: Y, YSxr, X i XSxr (rys. 10.19), a w potomstwie powstaj odpowiednio: normalne samce XY, samce XY Sxr nosiciele czynnika Sxr, normalne samice XX oraz niepodne samce XXSxr. Wyjanienie, i czynnik Sxr jest niewielkim fragmentem chromosomu Y wystarczajcym do determinacji pci mskiej, stao si bardzo pomocne w dalszych badaniach nad identyfikacj genu Tdy. W owym czasie (od 1975 r.) panowaa powszechnie bardzo atrakcyjna, jak si pocztkowo wydawao, hipoteza, i gen TDFjTdy (tak si go czsto okrela ze wzgldu na odmienne nazewnictwo u czowieka i u myszy) jest rwnoznaczny z genem kodujcym antygen zgodnoci tkankowej H-Y, ktry powoduje odrzucanie przeszczepu tkanek samca przez samic, nawet w obrbie jednego szczepu wsobnego, a wic przy cakowitej zgodnoci wszystkich innych genw. Fakt, e myszy XXSxr byy dodatnie pod wzgldem antygenu H-Y zdawa si t hipotez popiera. O jej definitywnym odrzuceniu zadecydowao dopiero w roku 1984 zidentyfikowanie zmutowanego czynnika, nazwanego Sxrb, ktrego obecno powodowaa, e osobniki XXSxrb byy wprawdzie samcami, ale nie produkoway antygenu H-Y. Stao si wic oczywiste, e gen kodujcy H-Y jest innym genem ni Tdy, jakkolwiek s one blisko sprzone, gdy oba mieszcz si w obrbie nie zmutowanego fragmentu Sxr (nazywanego obecnie Sxra). Nastpny etap w poszukiwaniach genu determinujcego pe msk pochodzi z bada nad czowiekiem. Jeeli zanalizuje si nienormalnoci spowodowane gbokim" crossing-over, a take rnymi delecjami lub translokacjami, to mona okreli minimalny region chromosomu Y, ktry musi by obecny u mczyzn o kariotypie XX, ale ktrego nie moe mie osobnik pci eskiej o kariotypie XY. W tym czasie dysponowano ju wieloma sondami DNA specyficznymi dla chromosomu Y, bya te znana lokalizacja odpowiadajcych im regionw na mapie restrykcyjnej tego chromosomu. Przez stosowanie 135 sond DNA wyznaczajcych rne regiony chromosomu Y oraz metody kroczenia wzdu chromosomu (chromosome walking) okrelono, i gen TDF musi si u czowieka mieci w krtkim ramieniu chromosomu Y, w obrbie sekwencji DNA o dugoci 280 000 nukleotydw, przylegej do regionu pseudoautosomowego (rys. 10.20(a)). Kiedy w roku 1987 zosta tam zidentyfikowany gen kodujcy biako o charakterze czynnika transkrypcyjnego (o 13 palcach cynkowych" typu CysCys/HisHis), nazwany ZFY (ang. zinc finger of the Y chromosome), wydawao si, e jest to ju poszukiwany gen TDF.

Y ' > T 280000 par zasad ]

(a)

JX
/ 60000 par~"zasad-T-. /'' 35 000 par^zasad

(b)

I
SRY pY 53.3 ZFY

(c)

I
(dl
!_

I I I I
240 par zasad

i n

ORF

Rys. 10.20. Lokalizacja genu determinujcego pe u czowieka, (a) Schemat chromosomu Y, Yp rami krtkie, Yq rami dugie, kreskowany region pseudoautosomowy. (b) Mapa fragmentu 280 000 par zasad z genami ZFY i SRY (c) Mapa odcinka 35 000 par zasad (kolorem czarnym zaznaczono sondy uyte do bada; w obrbie sondy pY 53.3 mieci si gen SRY). (d) Diagram sondy pY 53.3, w ktrej wystpuje otwarta ramka odczytu (ORF), a w jej obrbie czarno zamalowany fragment kodujcy 80-aminokwasow domen, majc zdolno czenia si z DNA ((a) i (b) wg McLaren, 1988 zmodyf.; (c) i (d) wg Sinclair i wsp., 1990 zmodyf.)

Gen ZFY zosta znaleziony w chromosomie Y u wszystkich badanych ssakw (ma on jednak take niemal identyczne odpowiedniki w chromosomie X). U myszy, u ktrej gen ten jest podwojony ( Z f y - 1 i Zfy-2), stwierdzono jego wystpowanie zarwno u samcw XXSxra, jak i u XXSxrb, co popierao hipotez, e moe on by odpowiedzialny za determinacj pci mskiej. Trafno tej hipotezy staa si jednak wtpliwa, gdy wykazano obecno genu Zfy u samicy myszy XY o zmutowanym chromosomie Y z niefunkcjonalnym czynnikiem determinacji pci mskiej. S podstawy do przypuszcze, e jeden z genw Zfy moe odgrywa rol w procesie spermatogenezy, poniewa wykazano jego ekspresj w komrkach rozrodczych jdra. W roku 1989 hipoteza o roli ZFY, jako genu determinujcego pe u czowieka, rwnie zostaa obalona, gdy wykazano brak tego genu u trzech mczyzn o kariotypie XX. Zidentyfikowano u nich natomiast w chromosomie X fragment o dugoci 60 000 nukleotydw, pochodzcy z odcinka chromosomu Y bezporednio przylegego do regionu pseudoautosomowego (rys. 10.20(b)). Tam wic naleao poszukiwa waciwego genu TDF. W rok pniej, po znalezieniu nastpnych markerw DNA, region poszukiwa zosta zawony do 35 000 nukleotydw (rys. 10.20(c)). I wreszcie w odcinku tym, oprcz wielu powtarzalnych sekwencji DNA, bardzo blisko regionu pseudoautosomowego znaleziono sekwencj, ktra jak to do tej pory spenia wszystkie, warunki aby uzna j za poszukiwany gen TDFjTdy. Jest to sekwencja

nazwana u czowieka SRY(ang. sex-determining region of the Y chromosome), obejmujca otwart ramk odczytu, ktra koduje biako zawierajce bardzo konserwatywn domen zoon z 80 aminokwasw. Domena ta jest homologiczna do domeny biaka Mc, biorcego udzia w wyznaczaniu typu koniugacyjnego u drody Schizosaccharomyces pombe i majcej zdolno wizania si ze specyficzn sekwencj DNA. Na tej podstawie mona sdzi, i gen SRY jest genem regulatorowym, ktrego produkt kontroluje aktywno innych genw biorcych udzia w determinacji pci. Opisano ju przypadek kobiety o kariotypie XY, u ktrej wanie w obrbie genu SR Y zidentyfikowano delecj 4 zasad, co prawdopodobnie stao si przyczyn utraty funkcji genu wskutek zmiany fazy odczytu (u ojca tej kobiety gen SRY by nie zmutowany). Gen SRY jest konserwatywny ewolucyjnie, wystpuje w chromosomie Y u wszystkich zbadanych do tej pory ssakw. U myszy, gdzie ma on symbol Sry, wykazano jego obecno zarwno u normalnych samcw XY, jak i u samcw XXSxra oraz XXSxrb, natomiast brak go byo nie tylko u normalnych samic XX, ale take u wspomnianej poprzednio samicy ze zmutowanym chromosomem Y. Co wicej, analizujc za pomoc hybrydyzacji in situ komplementarne do sekwencji Sry czsteczki mRNA, wykazano, i ekspresja tego genu nastpuje w komrkach somatycznych zawizka gonady w 11,5 dniu ycia podowego myszy, czyli w okresie bezporednio poprzedzajcym rnicowanie si pciowe gonady. A wic zarwno czas, jak i miejsce ekspresji wskazuje na rol Sry w determinacji pci mskiej. Wreszcie rok 1991 przynis bezporednie potwierdzenie tosamoci determinujcego pe genu Tdy i genu Sry: po wprowadzeniu genu Sry do przedjdrza zapodnionych jaj myszy, uzyskano wiele zwierzt transgenicznych, a wrd nich trzy samce o kariotypie XX. Wprawdzie nie wszystkie osobniki XX majce kopie Sry byy samcami, ale fakt uzyskania osobnikw pozytywnych wydaje si dowodem wystarczajcym, aby uzna ten gen za determinujcy pe msk.
10.5.4. Na determinacj pci ssakw wpywaj take geny pooone w innych chromosomach

Identyfikacja genu TDF/Tdy to dopiero pocztek bada nad determinacj pci ssakw. Wiadomo bowiem, e gen ten musi wspdziaa z wieloma innymi, tworzc prawdopodobnie kaskad regulatorow", jak u muszki owocowej. Wskazuj na to przypadki, w ktrych mimo obecnoci normalnego chromosomu Y, pe mska nie zostaje wyksztacona. Do tej pory poznano zaledwie kilka z tych genw, ktre mog by zlokalizowane zarwno w chromosomie X, jak i w autosomach. U lemingw (Myopus schisticolor) wystpuj dwa rodzaje chromosomw X: normalny oraz krtszy (prawdopodobnie z delecj wskutek strukturalnej zmiany krtkiego ramienia) oznaczony X*. Samcami s tylko osobniki XY, natomiast zarwno XX, XX*, jak i X*Y s samicami. Wynika z tego, e

w normalnym chromosomie X musi wystpowa gen, ktry jest niezbdny do wyksztacenia pci samca. Natomiast u myszy wykryto geny autosomowe, ktrych obecno jest konieczna do zrnicowania si gonady mskiej. Okazao si bowiem, i po skrzyowaniu myszy majcych chromosom Y z podgatunku Mus musculus domesticus (Ydo) z myszami szczepu laboratoryjnego C57BL/6J (genotyp M. m. musculus) rodz si osobniki XY, bdce samicami lub hermafrodytami, ktre maj jajnik oraz ovotestis (narzd skadajcy si zarwno z tkanek typowych dla jdra, jak i tkanek jajnikowych). Analiza rnych krzywek wykazaa, e w jednym z autosomw znajduje si locus Tda-1 (testis determination autosomal-1), ktrego allel wystpujcy w szczepie C57BL/6J nie wsppracuje prawidowo z chromosomem Y do . W innych krzywkach zidentyfikowano jeszcze dwa inne loci w podobny sposb wpywajce na determinacj pci. Oprcz tych genw zaangaowanych bezporednio w determinacj pci, rwnie geny jeszcze niszego rzdu", kierujce rnicowaniem si narzdw rozrodczych i drugo- oraz trzeciorzdowych cech pciowych, mog powodowa odwrcenie pci". Zasadnicz rol odgrywa w tym ukad hormonalny, ktrego funkcjonowanie moe by upoledzone genetycznie. Na przykad zarwno u ludzi, jak i u myszy, osobniki XY, bdce nosicielami sprzonej z chromosomem X mutacji Tfm (ang. testicular feminization), tzw. zespou feminizujcych jder, maj fenotyp eski, mimo posiadania jder. Mutacja ta powoduje bowiem produkcj defektywnego receptora dla testosteronu, wskutek czego mimo i hormon ten jest syntetyzowany w normalnych ilociach mskie cechy pciowe zalene od testosteronu nie mog si rozwin. Wyksztacenie prawidowej pci wymaga wic precyzyjnie regulowanej aktywnoci wielu genw, z ktrych zaledwie kilka udao si zidentyfikowa. Mutacja ktregokolwiek z nich moe prowadzi do zaburze determinacji pci.

11. MOLEKULARNE PODSTAWY PROCESW ODPORNOCIOWYCH

Ukad immunologiczny krgowcw jest skomplikowanym zespoem rodkw, ktre su organizmowi do obrony przed atakujcymi go nieustannie mikroorganizmami: bakteriami, grzybami i wirusami. System ten funkcjonuje dziki procesowi zapamitywania i uczenia si: w przypadku pierwszego napotkania patogennego mikroorganizmu, czsto nastpuj objawy chorobowe, a ukad immunologiczny zwalcza infekcj; w przypadku ponownego napotkania tego samego patogenu albo objawy choroby nie pojawiaj si wcale, albo s znacznie sabsze ukad immunologiczny neutralizuje organizm patogenny bardzo szybko. Szybkie zwalczenie patogenu nastpuje dziki temu, e system immunologiczny zapamita dany mikroorganizm jako czynnik obcy i przy ponownej infekcji rozpozna go i zniszczy znacznie szybciej. System immunologiczny ma wysok zdolno rozpoznawania obcych czynnikw inwazyjnych, a take odrniania ich od normalnych elementw wasnego organizmu. Pierwszym etapem zwalczania obcego elementu jest jego rozpoznanie nastpnym etapem jest jego zniszczenie. Etap pierwszy jest specyficzny, skierowany wobec okrelonego, indywidualnego celu, natomiast etap drugi odpowiedzi immunologicznej jest niespecyficzny, wsplny dla rnych elementw inwazyjnych. Funkcje ukadu immunologicznego zwizane z niespecyficzn faz odpowiedzi okrelane s jako funkcje efektorowe. Niniejszy rozdzia zawiera odpowied na kilka pyta, zasadniczych dla zrozumienia funkcjonowania ukadu immunologicznego. Jak ukad w sposb specyficzny rozpoznaje obce, tak bardzo zrnicowane czynniki patogenne? Jak odrnia wasne elementy, ktrych nie uszkadza, od elementw obcych, ktre niszczy? Jaki jest mechanizm uczenia si, pozwalajcy na sprawn eliminacj ju raz zwalczanego patogenu? Najdokadniej zostan omwione sprawy, ktre zostay najlepiej poznane na poziomie molekularnym: zdolno do rozpoznawania elementw obcych, ktra wie si z wytwarzaniem ogromnie zrnicowanych przeciwcia dziki unikatowym procesom przegrupowa (rekombinacji) DNA. Zostan

omwione mechanizmy prowadzce do wytwarzania rnych klas przeciwcia. Opisana zostanie rola limfocytw T, mechanizmy prowadzce do syntezy ich specyficznych receptorw powierzchniowych, po czym zostanie rozpatrzona interakcja limfocytw T oraz limfocytw B w procesie produkcji przeciwcia. Przedstawiony zostanie model tumaczcy zjawisko autotolerancji limfocytw T. Opisana bdzie rola biaek gwnego kompleksu zgodnoci tkankowej (czyli MHC) w specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Omwiony bdzie mechanizm wywoywania syndromu AIDS przez wirus HIV. 11.1. Antygeny wywouj odpowied immunologiczn humoraln i komrkow Wtargnicie obcych substancji lub organizmw do ustroju wywouje u krgowcw zoony system reakcji obronnych, okrelanych jako odpowied immunologiczna. Odpowied immunologiczn mona podzieli na dwa zasadnicze typy: odpowied humoraln oraz odpowied komrkow. Odpowied humoralna zaley od obecnoci substancji rozpuszczonych we krwi, okrelanych mianem immunoglobulin lub przeciwcia. Immunoglobuliny (Ig) s zoon grup biaek, stanowic ok. 20% biaek krwi. W komrkowej odpowiedzi immunologicznej specyficzne rozpoznanie odbywa si dziki wyspecjalizowanym komrkom (limfocytom), majcym na swojej powierzchni biaka silnie zwizane z bon, zdolne do podobnej reakcji jak przeciwciaa rozpuszczone we krwi. Wspomniane typy odpowiedzi immunologicznej s uwarunkowane dziaaniem rnych klas limfocytw: limfocyty B, odpowiednio stymulowane, produkuj przeciwciaa; limfocyty T odpowiedzialne s za komrkow odpowied immunologiczn. Odpowied humoralna jest podstawowym mechanizmem obronnym przeciwko zewntrzkomrkowym mikroorganizmom i toksynom, poniewa przeciwciaa mog si z nimi zwiza i przyczyni do ich destrukcji. Natomiast wewntrzkomrkowe mikroorganizmy (wirusy i niektre bakterie), nieosigalne dla krcych we krwi przeciwcia, s zwalczane w procesie komrkowej odpowiedzi immunologicznej, prowadzcej do zniszczenia zainfekowanej komrki. W obu typach odpowiedzi bardzo istotn rol odgrywaj cytokiny (czsto okrelane jako limfokiny, poniewa wydzielane s gwnie przez limfocyty) substancje biakowe stymulujce odporno zarwno humoraln, jak i komrkow. Stymuluj one take wytwarzanie komrek fagocytarnych (m. in. makrofagw), wchaniajcych i degradujcych zarwno patogeny, jak i resztki komrek wasnych. Wtargnicie do organizmu niemal kadej obcej makroczsteczki wywouje wytwarzanie zarwno przeciwcia, jak i komrek odpornociowych, specyficznie wicych t substancj. Substancja, ktra wywouje wytwarzanie specyficznych przeciwcia i komrek odpornociowych lub wie si z przeciwciaem czy komrk odpornociow, okrelana jest mianem antygenu (rys. 11.1).

odpowied humoralna
przeciwciaa czynniki patogenne: wirusy bakterie grzyby obce biaka jcytokiny wirusy limfocyt TH jcytokiny limfocyt B wizanie

liza komrki

limfocyt Tc

aktywny limfocyt Tc

odpowied komrkowa

komrka zainfekowana wirusem

Rys. 11.1. Odpowied immunologiczna humoralna i komrkowa. W efekcie oddziaywania patogenu z komrkami B dochodzi do ich proliferacji i rnicowania przeksztacaj si one w komrki plazmatyczne, wydzielajce przeciwciaa, ktre wi si z patogenem. Jest to odpowied humoralna. Oddziaywanie patogenu z komrkami T prowadzi do ich aktywacji. Limfocyty T cytotoksyczne (T c ), ktre wi si z komrk organizmu zaatakowan przez patogen, powoduj liz tej komrki. Limfocyty T-pomocnicze (TH) wydzielaj cytokiny stymulujce zarwno odpowied humoraln, jak i komrkow (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

11.2. Przeciwciaa wi si z determinantami antygenowymi Przeciwciaa wi si z okrelonymi miejscami antygenu, z tzw. determinantami. Czsteczka przeciwciaa moe zwiza na og dwie determinanty. Jeli antygen jest poliwalentny, tzn. ma wiele determinant (np. czsteczka wirusa), przeciwciaa mog tworzy z antygenem agregaty (rys. 11.2). Przez zwizanie niewielkiej czsteczki na powierzchni biaka mona stworzy now determinant antygenow. Tak ma czsteczk, bardzo czsto stosowan w immunologii, jest dinitrofenol (DNP). DNP sprzony z albumin surowicy bydlcej, wstrzyknity myszy, spowoduje wytworzenie przeciwcia reagujcych specyficznie z reszt dinitrofenolow. Przeciwciaa te bd reagoway te z innym biakiem nioscym reszt dinitrofenolow (rys. 11.2(c)). W tym ukadzie DNP lub jaka inna maa czsteczka, zwizana z biakiem, zdolna do indukcji specyficznych przeciwcia, okrelana jest mianem haptenu. Gdy zbada si hapteny, atwo mona zademonstrowa niezwykle wysok specyficzno przeciwcia: ot wystarczy zmieni w niewielkim stopniu hapten, aby drastycznie obniy zdolno jego wizania przez specyficzne przeciwciaa.

(a)

determina antygen (z jedn determinant) wizanie antygenu z przeciwciaem wizanie poliwalentnego antygenu przez przeciwciaa

(c

nonik biakowy hapten

reszta DNP

Rys. 11.2. Wizanie determinant antygenowych przez przeciwciaa, (a) Przeciwciao moe zwiza dwie determinanty, (b) Wirusy s antygenami poliwalentnymi. (c) Hapten zwizany z czsteczk biaka. Przykadem haptenu jest dinitrofenol zwizany kowalencyjnie z biakiem

I tak, przeciwciaa przeciw DNP sabo reaguj z trinitrofenolem. Jeli haptenem jest krtki peptyd, to wystarczy zmiana jednego aminokwasu, aby bardzo obniy jego zdolno do reagowania z przeciwciaem. Wysoka specyficzno przeciwcia, czyli zdolno do silnego wizania cile okrelonych determinant, jest kluczow cech tych biaek. Cecha ta ma swoje podoe w strukturze czsteczek przeciwcia. Czsteczki te zbudowane s z dwch czci: z wysoce zmiennej domeny wicej antygen oraz z domeny, ktra jest mao zmienna, tzn. identyczna u wielu przeciwcia (rys. 11.3). Ta staa domena okrelana jest rwnie jako domena efektorowa, decydujca o tym, co nastpi po zwizaniu antygenu z czci zmienn przeciwciaa. Domena efektorowa sygnalizuje zapocztkowanie takich procesw, jak np. fagocytoza, zmierzajca do usunicia antygenu z ustroju, czy cytoliza, powodujca zniszczenie inwazyjnej komrki bakteryjnej. Domena staa jest take zaangaowana w proces transportu przeciwcia ma m. in. sygnay decydujce o tym, czy przeciwciao bdzie zwizane z bon komrki B, czy wydzielone do pynw ustrojowych. Struktura przeciwcia wynika ze struktury genw je kodujcych: ot istnieje ogromna rnorodno genw kodujcych czci zmienne acuchw H i L; geny te mog zosta poczone z ktrymkolwiek z niewielu genw determinujcych czci stae acuchw.

domeny wiqqce antygen

Rys. 11.3. Schemat czsteczki immunoglobuliny. Ig zawiera dwa acuchy lekkie (L) i dwa acuchy cikie (H). N-terminalne, zmienne czci acuchw (poliniowane i zakratkowane) H i L tworz domen zmienn, wic antygen. C-terminalne, stae czci acuchw H tworz domen efektorow (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientiflc American Books, New York 1990 zmodyf.)

11.3. Przeciwciaa dziel si na klasy penice rne funkcje Pomimo wsplnego planu budowy, przeciwciaa (Ig) peni rne funkcje efektorowe, rni si struktur i, w zwizku z tym, mona je podzieli na kilka klas. Podstawowe klasy przeciwcia czowieka to: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. O czsteczkach nalecych do tej samej klasy mwimy, e maj ten sam izotyp. Klasy IgA i IgG mona podzieli na podklasy, okrelane jako: IgAl i IgA2 oraz IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. Modelem badawczym w immunologii s myszy, u ktrych podzia na gwne klasy przeciwcia jest taki, jak u czowieka, lecz izotyp IgG ma podtypy: IgGl, Ig2a, Ig2b, IgG3. acuchy cikie (H) przeciwcia nalecych do jednego izotypu lub podtypu maj due rejony o identycznej sekwencji aminokwasowej, rni si natomiast od acuchw cikich innego izotypu. acuchy H okrela si greck liter alfabetu, odpowiadajc danemu izotypowi i tak: przeciwciaa IgAl maj acuchy H typu al, IgGl acuchy yl itd. (tab. 11.1). acuchy lekkie (L) mog nalee do jednego z dwu typw: kappa (x) bd lambda (A), lecz nie decyduj o przynalenoci Ig do okrelonej klasy.

Klasa IgA IgD IgE IgG

Podklasa IgAl IgA2 brak brak IgGl IgG2 IgG3 IgG4 brak

Typ acucha H al a2 3

Stenie w surowicy (mg/ml) 3 0,5 0,03 0,0003 9 3 1 0,5 1,5

Forma* wydzielana 1,2,3

Masa formy wydzielanej (kDa) 150,300,400 180 190 150

1 1

y\ y2 y3 y H

IgM

950

* Liczba podjednostek 4-acuchowych w czsteczce wydzielanej z komrki B.

Przeciwciaa typu IgM s tzw. przeciwciaami wczesnymi, syntetyzowanymi na pocztku odpowiedzi immunologicznej. Czsteczki wydzielane z komrki B maj struktur pentameryczn, tzn. zbudowane s z 5 podjednostek o klasycznej strukturze Ig, czyli zawierajcych 4 acuchy: 2L + 2H. Struktura ta jest stabilizowana mostkami dwusiarczkowymi i ponadto dodatkowym acuchem J (rys. 11.4).

Rys. 11.4. Schemat pentamerycznej czsteczki IgM. IgM jest zoona z piciu identycznych podjednostek, z ktrych kada zbudowana jest z 4 acuchw. Dodatkowy acuch J inicjuje polimeryzacj podjednostek i uczestniczy w utrzymywaniu struktury oligomeru. Linie przerywane oznaczaj mostki SS (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

Pentamery IgM maj a 10 miejsc wizania antygenu bardzo efektywnie wi si np. z czstkami wirusw, ktre maj na swojej powierzchni wiele identycznych determinant antygenowych. IgM, po zwizaniu z antygenem, aktywuje system dopeniacza. System dopeniacza jest zespoem biaek, ktre wywouj liz komrek (np. bakteryjnych), na powierzchni ktrych zwizane s przeciwciaa. IgM rwnie aktywuje makrofagi, komrki wyspecjalizowane w fagocytozie.

Przeciwciaa typu IgD wystpuj na powierzchni bardzo wielu komrek B, natomiast pyny ustrojowe zawieraj zaledwie ladowe iloci tych przeciwcia. Funkcja IgD jest bardzo sabo poznana. Przeciwciaa typu IgG s gwn klas immunoglobulin pod wpywem kontaktu z antygenem, zwaszcza jeli jest to kontakt wielokrotny, komrki B produkuj znaczne iloci IgG. Przeciwciaa te, podobnie jak IgM, aktywuj system dopeniacza i stymuluj makrofagi. IgG matki, dziki systemowi transportujcemu, przenikaj przez oysko do krwiobiegu podu: IgG wi si z receptorami w bonie komrkowej oyska po stronie matki i s przenoszone przez te receptory na stron podu. Noworodek, ktry nie ma jeszcze wyksztaconego wasnego systemu odpornociowego, uzyskuje odporno dziki temu, e organizm matki wydziela IgG do mleka, a jelito noworodka wchania przeciwciaa dziki specyficznym receptorom transportujcym IgG do krwiobiegu. Za wizanie si ze specyficznymi receptorami odpowiedzialna jest cz efektorowa czsteczki Ig. IgE s odpowiedzialne za zjawisko nadwraliwoci typu wczesnego (ang. immediate hypersensitivity), wystpujce po kilku minutach po zetkniciu si z antygenem. Komrki tuczne i bazofile maj w bonie receptory wice tak silnie efektorow cz IgE, e przeciwciaa te mog by zwizane z powierzchni komrek nawet wtedy, kiedy uprzednio nie zwizay antygenu. Pojawienie si antygenu powoduje natychmiastow agregacj monomerw IgE na powierzchni komrek, co jest z kolei sygnaem do uwalniania z tych komrek zwizkw o charakterze zapalnym (m.in. histaminy). Konsekwencj jest pojawienie si reakcji alergicznych, jak katar sienny, astma i pokrzywka. IgA s immunoglobulinami odgrywajcymi stosunkowo ma rol w pynach ustrojowych, natomiast peni zasadnicz rol w wydzielinach luzowych, jako pierwsza bariera przeciwko inwazji mikroorganizmw. Przeciwciaa te s selektywnie transportowane poprzez komrki nabonka do wiata narzdw powleczonych luzem, np. do jelit i puc. Transport odbywa si dziki receptorom wicym IgA po stronie graniczcej z naczyniami krwiononymi i przenoszcym je do wiata narzdu.

11.4. Przeciwciaa s wytwarzane przez limfocyty B Przeciwciaa (Ig), s syntetyzowane wycznie przez limfocyty B (komrki B). Limfocyty B powstaj z komrek szpiku kostnego w wieloetapowym procesie dojrzewania i rnicowania. Dojrzay limfocyt B ma na powierzchni bony przeciwciaa typu IgM lub IgM i IgD. Przeciwciaa te su jako receptory antygenw zwizanie antygenu jest sygnaem do proliferacji i rnicowania si komrki, prowadzcego do wytworzenia komrek plazmatycznych wydzielajcych przeciwciaa na zewntrz (rys. 11.5).

etap Hrir7o\Ainnin uujr ^ewania zaleno

komrka komrka Pn'a pre-B ,

niedojrzaa komrka B

dojrzaa komrka B

zaktywowana komrka B

komrka plazmatyczna wydzielajca Ig

fa2a

niezalezna

faza indukowana przez antygen

od antygenu
lokalizacja szpik kostny

anatomiczna rodzaj produkowanych Ig

brak

tylko cytoplazmatyczne ll nie reaguje na antygen

bonowe IgM, IgD

u k a d obwodowy

bonowe IgM {lekki acuch x lub A)

sabe wydzielanie Ig, przeczanie izotypw wczesna odpowied na antygen

intensywne wydzielanie Ig, mao bonowych

ig
ustabilizowana synteza pierwotnych lub wtrnych Ig

funkcja

prekursor

wie antygen

Rys. 11.5. Kolejne etapy dojrzewania i rnicowania limfocytw (komrek) B (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

11.5. Odpowiednie przeciwciaa produkowane s dziki selekcji okrelonych klonw limfocytw B Organizm wytwarza Ig zdolne do zwizania kadego antygenu nawet takiego, z jakim ani w filogenezie, ani w ontogenezie organizm si nie spotka. Wytwarzane s Ig wice przerne antygeny skonstruowane przez czowieka (choby biaka sprzgane z rnymi haptenami). Tak wic nie sposb wytumaczy rnorodno Ig adaptacj ewolucyjn. Liczb rodzajw rnych przeciwcia, jakie dany organizm wytwarza, ocenia si na ponad 109. Gdyby kade miao by kodowane przez indywidualny gen, a raczej dwa geny (kada czsteczka Ig zoona jest z'dwu acuchw), to ponad poowa genomu zdolnego do kodowania biaek musiaaby by zaangaowana w tworzenie Ig. W rzeczywistoci tak nie jest limfocyty B maj niezwykle efektywny mechanizm genetyczny wytwarzania olbrzymiej liczby Ig, wykorzystujc stosunkowo niewielk pul genw. Izolacja genw Ig, analiza ich ekspresji i regulacji, rwnolegle z badaniem struktury przeciwcia, pozwoliy wyjani mechanizm wytwarzania niezwykle zrnicowanych Ig. Przez dugie lata by to jednak problem nie rozwizany i immunolodzy dzielili si na dwa gwne

obozy: zwolennikw teorii instrukcyjnej oraz selekcyjnej. Wedug teorii instrukcyjnej wszystkie czsteczki Ig miay t sam budow, bardzo plastyczn i mogy by indukowane przez antygen do przybrania ksztatu umoliwiajcego zwizanie tego' antygenu. Tak wic, po pierwszym spotkaniu z antygenem, przeciwciao umiaoby" rozpozna nastpn czsteczk antygenu. To tumaczyoby rnorodno przeciwcia i zdolno ukadu immunologicznego do zapamitywania oraz uczenia si. Teoria ta jest zupenie nieprawdziwa w obliczu wspczesnej wiedzy i przesza do historii. Teoria selekcyjna zakadaa, e organizm niezalenie od antygenu produkuje szerokie spektrum przeciwcia, a antygen wie si z tym, ktre pasuje", czyli jest w stanie rozpozna dany antygen. Antygeny dokonuj wic selekcji, wyboru w puli preegzystujcych Ig. Teori selekcyjn rozwin Sir MacFarlane Burnet, tworzc teori klonalnej selekcji w produkcji przeciwcia. Teoria ta zakadaa, e: (a) organizm stale wytwarza limfocyty B majce na swojej powierzchni immunoglobuliny;
antygen z determinantami klony komrek plazmatycznych

dojrzae komrki B

J&
^ O - t U

sekrecja & przeciwcia < anty-B

O C ^ ^ C s H O
komrka pnia sekrecja -^r > przeciwcia 7 anty-E

sekrecja Jprzeciwcia anty-H -^

faza niezalena od antygenu

faza zalena od antygenu

Rys. 11.6. Zasada klonalnej selekcji w produkcji przeciwcia. Komrki B dojrzewaj i produkuj przeciwciaa zakotwiczone na ich powierzchni. Zwizanie okrelonej determinanty antygenowej przez przeciwciao decyduje o selekcji, czyli wyborze danego typu komrki B. Wybrana komrka ulega amplifikacji jej potomstwo stanowi klon komrek wydzielajcych Ig rozpoznajc dan determinant (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

(b) wszystkie Ig wytwarzane przez jedn komrk maj identyczn zdolno wizania antygenu; (c) tylko niewielka populacja limfocytw B wytwarza Ig rozpoznajce okrelon determinant antygenow. Zgodnie z teori, organizm ma bardzo niewielk pul limfocytw B z Ig powierzchniowymi zdolnymi zwiza okrelony antygen. Kiedy organizm zetknie si z antygenem, tylko te komrki B, ktre maj na swojej powierzchni odpowiednie Ig zwi antygen. Ta reakcja wyzwoli proces polegajcy na tym, e komrka B zacznie si dzieli, produkujc komrki potomne, ktre na dalszym etapie dojrzewania zaczn wydziela przeciwciaa o tej samej specyficznoci wobec antygenu (rys. 11.6). Potomstwo jednej komrki okrela si jako klon jest to grupa komrek B wydzielajcych Ig o takiej samej specyficznoci antygenowej. Std te pochodzi nazwa selekcji klonalnej. Teoria ta zostaa tak gruntownie zweryfikowana, e stanowi podstaw caej wspczesnej immunologii. Jak ju podkrelono, proces wytwarzania klonw komrek plazmatycznych wydzielajcych Ig dzieli si na dwie fazy: pierwsz, niezalen od antygenu i drug, ktra zaczyna si tylko wtedy, jeeli dana komrka B zwie si z antygenem (rys. 11.5, 11.6). Wszystkie komrki B powstaj w szpiku kostnym z komrek pnia (ang. stem cells), niezdolnych do wytwarzania Ig. W procesie dojrzewania, komrki macierzyste przeksztacaj si w prelimfocyty B, ktre wytwarzaj cikie acuchy typu |i. Brak jeszcze acuchw lekkich, a wic i kompletnych Ig i co za tym idzie zdolnoci do wizania antygenu. Nastpnie dochodzi do syntezy acuchw lekkich (% lub X), ktre cz si z acuchami cikimi i na powierzchni komrki pojawiaj si przeciwciaa typu IgM, stanowice receptory dla antygenu. Komrki B wdruj ze szpiku do systemu krwiononego i obwodowego limfatycznego, gdzie dalej dojrzewaj. W dojrzaych komrkach B zachodzi synteza zarwno cikich acuchw |i, jak i 5, co daje w efekcie czsteczki IgM i IgD zakotwiczone w bonie. Obie klasy Ig maj takie same rejony zmienne, czyli t sam specyficzno wobec antygenu. Niektre dojrzae komrki B maj jedynie klas IgM. Dojrzae komrki B s gotowe do stymulacji antygenem (oraz innymi czynnikami wspomagajcymi). Przy braku antygenu komrka B ginie po 3-4 dniach, natomiast jeli zwie si z antygenem, stanie si zaktywowanym limfocytem B, ktry ulega podziaom i rnicowaniu si, produkujc coraz mniej zwizanych z bon Ig, a coraz wicej Ig wydzielanych na zewntrz. W niektrych komrkach potomnych dochodzi do przeczenia syntezy danego typu acucha H na inny typ czyli komrka zaczyna produkowa J , czy <5, tzn. y, a lub s. Z tym wie si produkcja przeciwcia acuchy inne ni J klasy IgG, IgA lub IgE wci o tej samej specyficznoci wobec antygeu, jak miay IgM i IgD macierzystej komrki B. Jest to zjawisko przeczania izotypw. Komrka B intensywnie wydzielajca Ig okrelana jest jako komrka plazmatyczna.

11.6. System odpornociowy ma pami immunologicz Niewielka liczba komrek B zaktywowanych przez zwizanie antygenu nie wydziela Ig, lecz pozostaje jako komrki pamici immunologicznej z membranowymi Ig. Komrki pamici trwaj latami (a nawet przez cae ycie osobnika), kr we krwi, limfie i gruczoach limfatycznych, nie ulegajc proliferacji. Stymulacja komrek pamici przez antygen prowadzi do gwatownej odpowiedzi immunologicznej, tzn. do szybkiej syntezy znacznej iloci przeciwcia, gwnie klasy IgG i IgA (rys. 11.7). Komrki pamici na og

antygenu A

pierwsze podanie antygenu B

Rys. 11.7. Pierwotna i wtrna odpowied immunologiczna. W czasie 0 mysz zaszczepiono antygenem A, po czym mierzono stenie specyficznych przeciwcia anty-A we krwi. Po 4 tygodniach, kiedy obniya si ilo anty-A, bdcych efektem pierwotnej odpowiedzi immunologicznej, zwierz zaszczepiono mieszanin antygenu A i nowego antygenu B. Wtrna odpowied immunologiczna na antygen A bya szybsza i silniejsza od pierwotnej. Antygen B wywoa reakcj typow dla odpowiedzi pienvotnej. wiadczy to, e wtrna odpowied immunologiczna jest zjawiskiem specyficznym wobec antygenu (a nie generalnym zjawiskiem). W pierwotnej odpowiedzi dominuj IgM, natomiast we wtrnej IgG i IgA (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnel, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

wytwarzaj Ig o wyszym powinowactwie do antygenu w porwnaniu do Ig znajdujcych si w bonie komrki macierzystej przed stymulacj antygenem. Jest to zjawisko dojrzewania powinowactwa przeciwcia do antygenu, ktre ma swoje podoe w somatycznych mutacjah genw Ig, co bdzie omwione pniej. Pami immunologiczna powoduje to, e organizm atwiej zwalcza ju raz napotkany antygen ponowne zakaenie tak sam bakteri lub wirusem zastaje organizm przygotowany do obrony.

11.7. Limfocyty T s podstaw odpowiedzi komrkowej i niezbdnym elementem odpowiedzi humoralnej Omawiane do tej pory limfocyty B maj zdolno wytwarzania specyficznych przeciwcia umieszczonych w bonie oraz wydzielanych na zewntrz komrki po zetkniciu z antygenem. Limfocyty T za maj na swojej powierzchni czsteczki o strukturze zblionej do przeciwcia, zdolne do wizania antygenu, nazywane receptorami komrek T (TCR), nie s jednak zdolne do wydzielania tych czsteczek na zewntrz. Ponadto, w odrnieniu od przeciwcia powierzchniowych limfocytw B, receptory TCR nie wi rozpuszczonych antygenw cz si tylko z antygenami na powierzchni innych komrek. Limfocyty T zawdziczaj swoj nazw temu, e przechodz etap dojrzewania w grasicy (ang. thymus), co bdzie omwione dokadnie dalej. Istniej dwie klasy limfocytw T: limfocyty cytolityczne (T c ) oraz limfocyty pomocnicze (TH) (ang. helper). Limfocyty T c wi komrki, na ktrych powierzchni znajduj si obce antygeny i powoduj liz tych komrek. Klasycznym przykadem moe by komrka zaatakowana przez wirus zostanie ona rozpoznana przez receptory TCR na powierzchni limfocytu T c , zwizana z limfocytem i zlizowana. Zwizanie TCR z antygenem staje si bodcem do proliferacji limfocytu w efekcie otrzymuje si klon komrek T c , rozpoznajcych komrki zaatakowane przez dany wirus. Dziaanie jest podobne jak w przypadku przeciwcia, tzn. prowadzi do zniszczenia niepodanych substancji. Rnic stanowi to, e limfocyty T c nie wi antygenu rozpuszczonego, lecz umieszczony na powierzchni komrek; antygen ten pochodzi z rozpadu obcych biaek wytwarzanych w komrce i, ponadto, musi by zwizany z biakiem powierzchniowym MHC klasy I (czyli odpowiednio zaprezentowany" receptorom TCR) (rys. 11.8). Limfocyty drugiego typu, czyli TH, dziaaj w ten sposb, e rozpoznaj obce antygeny znajdujce si na powierzchni komrek, przy czym antygeny te s produktem rozpadu obcych czstek degradowanych przez dan komrk. I w tym przypadku antygen musi by w kompleksie z biakami powierzchniowymi MHC (klasy II), czyli musi by zaprezentowany" receptorom TCR. Interakcja limfocytw TH z antygenem powoduje sekrecj cytokin, czynnikw niezwykle istotnych w odpowiedzi immunologicznej stymuluj one m.in. limfocyty B do sekrecji przeciwcia. Bez tej stymulacji poczenie antygenu z limfocytem B nie jest wystarczajcym bodcem do proliferacji komrki B i wydzielania przeciwcia; wrcz przeciwnie: zwizanie antygenu bez stymulacji T h moe prowadzi do paraliu komrki B. Cytokiny wydzielane przez T H stymuluj rwnie limfocyty T c i makrofagi wida wic, e limfocyty pomocnicze bior udzia w wikszoci reakcji immunologicznych. Jak istotna jest ich rola, wida w przypadku zakae wirusem HIV, atakujcym wanie limfocyty TH. Zniszczenie komrek T-pomocniczych prowadzi do syndromu AIDS, czyli zaamania systemu obrony immunologicznej.

receptory TCR koreceptor CD4 antygen biako MHC klasy I koreceptor CD8

Rys. 11.8. Limfocyty T c i TH maj receptory TCR, ktre wi si odpowiednio z antygenami prezentowanymi na powierzchni komrek przez biaka MHC klasy II i MHC klasy I. Biaka CD4 i CD8 peni rol koreceptorw. Antygenami s fragmenty obcych biaek (wg H. Boehmer, P. Kisielw, Scientiflc American, p. 50 59. October 1991 zmodyf.)

Jak rozrnia si poszczeglne klasy limfocytw, ktre morfologicznie s identyczne? Ot posiadaj one specyficzne biaka powierzchniowe, ktre maj waciwoci antygenowe i mona je identyfikowa w reakcjach immunologicznych. Biako powierzchniowe specyficzne dla limfocytw B, to np. biako B-220, natomiast wszystkie limfocyty T maj biako Thy-1; limfocyty T c nios na powierzchni biako CD8, natomiast limfocyty TH biako CD4 (rys. 11.8). 11.8. Makrofagi s wanymi komrkami wspomagajcymi odpowied immunologiczn Oprcz limfocytw B i T, makrofagi odgrywaj bardzo istotn rol w odpowiedzi immunologicznej. Powstaj, jak limfocyty, w szpiku kostnym, skd migruj do tkanek oraz do krwi (we krwi okrela si je mianem monocytw). Komrki te s wyspecjalizowane w fagocytozie, czyli wchanianiu obcych czstek, a wic bakterii, makroczsteczek, a take resztek wasnych, obumarych komrek. Wchonite substancje s degradowane wewntrz przez lizosomalne enzymy. Peptydy, bdce fragmentami zdegradowanych biaek (antygenw), wi si wewntrz makrofagw z biakami MHC klasy II, ktre migruj na powierzchni i prezentuj fragmenty antygenw limfocytom T h (rys. 11.8). Wasne antygeny s ignorowane, natomiast obce stymuluj limfocyty T H do wzrostu, rozmnaania si H i sekrecji cytokin. Cytokiny s absolutnie niezbdne w stymulacji limfocytw B do sekrecji przeciwcia.

11.9. Komrki ukadu immunologicznego kr po caym organizmie Komrki zaangaowane w odpowied immunologiczn, a wic przede wszystkim limfocyty B i T oraz mononuklearne fagocyty (tzn. monocyty i makrofagi), zwizane s z ukadem limfatycznym. Powstaj one w szpiku kostnym z komrek pnia, skd migruj do obwodowego ukadu limfatycznego; limfocyty T, przed wejciem do obwodu, wdruj do grasicy, w ktrej dochodzi do selekcji, majcej na celu pozostawienie limfocytw rozpoznajcych jedynie obce antygeny, tolerancyjnych wobec wasnych. Obwodowy ukad limfatyczny zoony jest z gruczow limfatycznych oraz systemu naczy. Gruczoy zlokalizowane s w strategicznych" miejscach organizmu, chronic go przed inwazj patogenw. Tak wic znajduj si m. in. w gardle (migdaki), w nosie (adenoidy), w pachach i pachwinach, gdzie filtruj pyny z koczyn, w cianie jelit, gdzie filtruj antygeny dostajce si z pokarmem lub pochodzce od bakterii namnaajcych si w jelitach. Limfa tworzy si z pynu transportowanego przez cianki naczy krwiononych do tkanek i przestrzeni midzytkankowych. Stamtd wpywa do naczy limfatycznych, ktre zebran limf z powrotem wprowadzaj do y systemu krwiononego. Limfocyty stanowi we krwi zaledwie 20-30% jdrzastych komrek, podczas gdy w limfie a 99%. Wdruj pomidzy krwi a limf, przeciskajc si midzy komrkami nabonka naczy krwiononych. Limfocyty wdruj z limf, s filtrowane przez gruczoy limfatyczne i tam okresowo przebywaj. Do gruczow trafiaj rwnie antygeny znajdujce si w limfie. Antygeny rozpuszczone we krwi filtrowane s przez ledzion, ktrej funkcja jest bardzo podobna do funkcji gruczow
TWRCZE NARZDY LIMFATYCZNE OBWODOWY UKAD LIMFATYCZNY krenie komrka pnia szpiku kostnego Unja limfocytw B linia limfocytw T limfocyt B szpik kostny krew^

X
grasica limfocyt T krew, limfa

gruczoy limfatyczne, ledziona, inne tkanki

krenie

Rys. 11.9. Schemat cyrkulacji limfocytw u ssakw. Limfocyty wytwarzane w szpiku kostnym przed zetkniciem si z antygenem dojrzewaj w narzdach limfatycznych, skd przedostaj si do obwodowego systemu limfatycznego, gdzie zachodzi faza odpowiedzi immunologicznej, wywoana obecnoci antygenu (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

limfatycznych. W gruczoach limfatycznych i w ledzionie mononuklearne fagocyty wchaniaj antygeny, degraduj je i prezentuj na swojej powierzchni. Limfocyty B z odpowiednimi przeciwciaami powierzchniowymi oraz limfocyty T z odpowiednimi receptorami wi wolne antygeny lub antygeny prezentowane przez komrki. W efekcie stymulacji antygenem, limfocyty B i limfocyty T ulegaj aktywacji, mno si i dojrzewaj. Zwizanie antygenu prowadzi do selekcji klonalnej, tzn. do wybrania komrek B z odpowiednimi przeciwciaami (Ig) i komrek T z odpowiednimi receptorami (TCR). W gruczoach limfatycznych i ledzionie nastpuje wspdziaanie limfocytw B i T, co jest uatwione przez znaczn koncentracj komrek. W efekcie selekcji klonalnej tworz si dojrzae limfocyty B, czyli komrki plazmatyczne wydzielajce przeciwciaa. Komrki plazmatyczne i przeciwciaa opuszczaj wraz z limf gruczoy i transportowane s do krwi (rys. 11.9). 11.10. Przeciwciaa maj wsplny plan budowy, lecz s bardzo rnorodne Struktura przeciwcia (Ig) bardzo pobienie zostaa omwiona wczeniej. W tej czci zwrcona zostanie uwaga na fakt, e czsteczki przeciwcia, w zasadzie majce bardzo podobn budow, s jednak niesychanie zrnicowane co do zdolnoci do reagowania z antygenami. Dokadne badania nad chemiczn struktur przeciwcia byy utrudnione tak dugo, jak dugo jedynym rdem tych biaek bya krew immunizowanych okrelonym antygenem osobnikw. Krew zawieraa mieszanin rnych rodzajw Ig, z ktrych kada bya produktem jednego klonu komrek B. Problem zosta rozwizany, kiedy okazao si, e komrki szpiczaka (ang. myeloma), nowotworu bdcego efektem transformacji nowotworowej pojedynczej komrki limfoidalnej, intensywnie wydzielaj przeciwciaa stanowi one a do 10% wszystkich biaek produkowanych przez te komrki. Poniewa wszystkie komrki stanowi jeden klon, wytwarzaj tylko jeden rodzaj Ig o na og nie znanej specyficznoci wobec antygenu. Szpiczaki powstaj spontanicznie u ludzi, mog by take indukowane u myszy przez dootrzewnowe wstrzyknicie oleju mineralnego. Pierwsze prace dotyczce sekwencji aminokwasw poszczeglnych acuchw Ig wykonano wanie na przeciwciaach wytwarzanych przez komrki szpiczakw. Nastpna moliwo uzyskiwania homogennych przeciwcia powstaa dziki opracowaniu metody otrzymywania przeciwcia monoklonalnych. Metoda ta polega na uzyskaniu linii komrkowych z pojedynczych komrek B, wytwarzajcych przeciwciaa o okrelonej specyficznoci. Dostpno homogennych przeciwcia i produkujcych je klonw umoliwia nie tylko badania nad struktur przeciwcia, ale rwnie klonowanie i analiz ich genw. Badania nad struktur przeciwcia wykazay, e Ig wszystkich 5 klas (tab. 11.1) maj ten sam oglny plan budowy. Kada czsteczka skada si z dwu identycznych lekkich acuchw (L) o masie ok. 23 kDa oraz z dwu identycznych acuchw

cikich (H), o masie ok. 53 kDa lub wicej. Czsteczka Ig zawiera acuchy lekkie nalece do typu kappa (x) lub lambda (A), nigdy mieszanin tych typw. Rnice midzy klasami Ig wynikaj z rnic midzy acuchami H, poniewa kada klasa charakteryzuje si swoistym typem acucha, okrelanego greck liter odpowiadajc nazwie Ig (tab. 11.1). acuchy H s glikozylowane, przez przyczenie acuchw cukrowych do reszt asparaginy. acuchy s poczone mostkami dwusiarczkowymi: acuch H z L, tworzc monomer, oraz oba acuchy H, dziki czemu dwa monomery tworz dimer, podstawow jednostk struktury. Oba acuchy zbudowane s z serii powtarzajcych si homologicznych jednostek, kada o dugoci ok. 110 reszt aminokwasowych; jednostki te zwijaj si niezalenie, tworzc globularne domeny, okrelane jako motywy immunoglobulinowe (rys. 11.10). Wszystkie domeny, Ig zawieraj

Rys. 11.10. Struktura czsteczki przeciwciaa. Zaznaczono domeny immunoglobulinowe, zawierajce ok. 110 aminokwasw i zwizane mostkiem SS. Domeny rejonw zmiennych obu acuchw VL i VH zawieraj 3 rejony nadzmienne (CDR), warunkujce specyficzn interakcj z antygenem. Pozostae domeny maj stabiln sekwencj (CH1, CH2, CH3 oraz CL). agodne trawienie papain przecina rejon zawiasu, czsteczka rozpada si na dwa elementy Fab (wice antygen) i jeden element F c . VH rejon zmienny acucha cikiego; CH rejon stay acucha cikiego; VL rejon zmienny acucha lekkiego; CL rejon stay acucha lekkiego (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Rys. 11.11. Model domeny zmiennej (VL) oraz domeny staej (CL) lekkiego acucha Ig. Strzaki reprezentuj rejony ^-harmonijki acucha peptydowego, ktrego N- i C-koniec s oznaczone odpowiednio jako N i C. Zakropkowano rejony nadzmienne: CDR1, CDR2 i CDR3 rejonu zmiennego, tworzce ptle, ktre formuj powierzchni acucha L wic antygen. Czarne odcinki symbolizuj mostki SS (wg A.B. Edmundson et al., Biochemistry, 14, 3953-3961,1975 zmodyf.)

dwie warstwy /Miarmonijki z 3 lub 4 pasmami przeciwnie skierowanych acuchw peptydowych. Kada z domen utrzymywana jest przez wewntrzne mostki SS (rys. 11.11). acuch L ma dwie takie domeny, natomiast H cztery lub pi. Wiele innych biaek nalecych do systemu immunologicznego ma podobne motywy budowy std zalicza si je wszystkie do superrodziny Ig, a ich geny do superrodziny genw Ig. Pierwsze dwie N-terminalne domeny acucha L powizane s z dwiema domenami acucha H, tworzc zwart struktur (Fab), ktra wie determinant antygenow. acuchy H maj na og rejon zawiasu, o duej ruchliwoci, umoliwiajcy do swobodne poruszanie si rejonu wicego antygen. W tym rejonie znajduj si reszty cysteinowe, tworzce mostki SS midzy monomerami. Rejon ten jest wraliwy na dziaanie proteaz i, stosujc agodn hydroliz enzymatyczn (np.papain), mona przeci czsteczk Ig na cz F ab , czyli wic antygen, oraz'na cz F c , zawierajc rejon stay czsteczki. N-terminalne domeny obu acuchw (tzn.VH i VL) maj bardzo zmienn sekwencj aminokwasw, w odrnieniu od domen C-terminalnych, charakteryzujcych si stabiln budow. Std te rejon N-terminalny acuchw okrela si mianem rejonu zmiennego V (ang. variable), a rejon C-terminalny mianem rejonu staego C (ang. constant). Obie domeny zmienne (VH i VL) tworz zwart struktur ze szczelin wic determinant antygenow. Zrnicowanie przeciwcia polega na zrnicowaniu rejonw zmiennych (V),

jednostka Fab

jednostka Fab

Rys. 11.12. Model czsteczki IgG, opracowany na podstawie bada krystalograficznych. Model przedstawia atomy jako pieczki" wypeniajce czsteczk wida wyranie, e czsteczka ma ksztat litery Y i zoona jest z czterech acuchw dwu acuchw H (pieczki" zakreskowane) i dwu acuchw L (pieczki" biae). Widoczny jest acuch wglowodanowy (wg E.W. Silverton et al, PNAS 74, 51410, 1977)

cakowicie odpowiedzialnych za wizanie antygenu. Specyficzno Ig wobec antygenu uwarunkowana jest jedynie przez sekwencje aminokwasowe rejonw zmiennych. W reakcji z antygenem konieczna jest obecno obu rejonw (VH i VL) razem tworzcych miejsce wizania. Pozostaa cz czsteczki Ig, zbudowana z rejonw staych (C), nie bierze udziau w wizaniu antygenu. Cz ta odpowiedzialna jest za efektorow funkcj Ig, m.in. wie biako nalece do systemu dopeniacza, przez co system ten ulega aktywacji. Dziki badaniom krysztaw Ig metod dyfrakcji promieni X mona byo okreli z du dokadnoci struktur wielu przeciwcia (rys. 11.12) i kompleksw antygen-przeciwciao. Obrazy uzyskane t metod przedstawiaj szczelin, kiesze lub paszczyzn na powierzchni przeciwciaa, utworzone przez trzy krtkie segmenty polipeptydowe z kadego z acuchw (a wic razem sze) (rys. 11.13)

Rys. 11.13. Czsteczka antygenu umieszczona jest w szczelinie utworzonej przez miejsce wice Ig. Schemat narysowano na podstawie analizy krystalograficznej ludzkiego IgG (biako NEW szpiczaka) wicego y-hydroksylo-witamin K. Antygen kontaktuje si z 10-12 aminokwasami rejonw nadzmiennych (CDR) acuchw lekkich i cikich (oznaczonych jako LI, L3, HI, H2, H3). Liczby okrelaj aminokwasy (liczone od N-koca) kontaktujce si z antygenem (wg I.M. Roitt, J. Brostoff, D.K. Mae, Immunology. Gower Medical Publishing, London New York 1989)

Ptle acucha polipeptydowego kontaktujce si z antygenem, okrelane jako rejony CDR (ang. complementarity determining regions), warunkuj komplementarno przeciwciaa w stosunku do antygenu. S to rejony nadzmienne rejonu zmiennego, tzn. rejony o najwyszej zmiennoci sekwencji aminokwasowych (rys. 11.14). Wizania utrzymujce kompleks antygen-przeciwciao to wizania niekowalencyjne, a wic: wodorowe, elektrostatyczne, oddziaywania hydrofobowe i siy van der Waalsa. Wielokrotno wiza czyni te oddziaywania w sumie bardzo silnymi. Warunkiem silnego zwizania antygenu jest bardzo dobry i bliski kontakt, gdy jest to warunek wytworzenia wiza niekowalencyjnych. Std konieczno komplementarnoci struktur przeciwciaa i antygenu.

aiScuchy cikie
110-1

100-

CDR1

CDR2

CDR3

9080-

7013 60-

c c O l

50N 4030-

10

20

30

40 50 60 70 numer reszty aminokwasowej

kii

i 80
100 110 120

Rys. 11.14. Rejony nadzmienne w acuchach lekkich i cikich czsteczek immunoglobulin. Zmienno okrelono jako liczb rnych aminokwasw znalezionych w danej pozycji acucha polipeptydowego, liczc od N-koca niezalenie zsekwencjonowanych acuchw rnych czsteczek Ig. Najbardziej zmienne reszty aminokwasowe zgrupowane s w trzech rejonach, okrelanych jako CDR1, CDR2 i CDR3 (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

11.11. Umiemy wytwarza przeciwciaa monokionalne Jak wiemy, kady limfocyt B produkuje jeden rodzaj przeciwcia, 0 okrelonej specyficznoci. Tak wic linia komrkowa, czyli klon, pochodzca od jednego limfocytu bdzie wytwarzaa stale jeden i ten sam typ przeciwcia. Niestety, normalna komrka B nie moe y wiecznie. Wyjtkiem s nowotwory typu szpiczaka, czyli komrki B, ktre ulegy transformacji nowotworowej i, w zwizku z tym, zdobyy niemiertelno. Jeli dokona si fuzji komrki B z komrk linii szpiczaka, efektem bdzie komrka niemiertelna, czyli rosnca i ulegajca podziaom w nieskoczono, a ponadto produkujca przeciwciaa o podanej specyficznoci takie, jakie wytwarza limfocyt B. Hybrydowe komrki produkuj wic przeciwciaa monokionalne. Trudno polega na znalezieniu waciwej fuzji komrkowej jest to moliwe dziki zastosowaniu odpowiednio zmutowanych komrek szpiczaka, zdolnych do wzrostu w normalnej poywce, a niezdolnych do wzrostu w podou selekcyjnym. Zdolno do wzrostu w podou selekcyjnym zyskuj tylko te komrki, ktre poczyy si z komrk B. Komrka B dostarcza nie zmutowane geny, defektywne w linii szpiczaka, sama natomiast zyskuje zdolno do nieskoczonych podziaw. Komrki B, ktre nie ulegy fuzji, gin po 1-2 tygodniach hodowli. Tak wic w podou selekcyjnym mog rosn jedynie hybrydy. Defekt w linii komrkowej szpiczaka polega na mutacji uniemoliwiajcej syntez DNA w podou selekcyjnym. Ot podoe selekcyjne zawiera aminopteryn, ktra blokuje syntez nukleotydw de novo. Synteza nukleotydw purynowych i tymidylanu de novo przebiega wieloetapowo jeden z etapw wymaga aktywnego kwasu tetrahydrofoliowego jako dawcy reszty metylowej lub formylowej. Aminopteryna hamuje reaktywacj kwasu tetrahydrofoliowego, tym samym hamujc wytwarzanie zarwno puryn, jak i tymidylanu. Efektem jest zahamowanie syntezy DNA. Normalne komrki traktowane aminopteryn mog sobie poradzi, stosujc rezerwowy szlak resyntezy nukleotydw, gdzie puryny s syntetyzowane z dostarczanej do poywki hipoksantyny, dziki funkcjonowaniu enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantynowej (HGPRT). Tymidylan za jest tworzony z dostarczanej w poywce tymidyny, dziki dziaaniu kinazy tymidylanowej (TK). Zmutowane komrki szpiczaka (TK~ lub HGPRT") nie mog korzysta ze szlaku resyntezy, nie s wic w stanie rosn w obecnoci aminopteryny, w poywce zawierajcej hipoksantyn 1 tymidyn (poywka HAT). Jeli normalna komrka ulegnie fuzji z komrk TK~ lub HGPRT", to stanie si rdem brakujcego enzymu(w), tak wic hybrydy produkuj DNA i rosn w poywce HAT. Oczywicie, rne klony hybrydowe produkuj rne przeciwciaa, specyficzne wobec rnych determinant antygenu uytego do immunizacji. Klony hybrydowe produkujce przeciwciaa o podanej specyficznoci s rdem przeciwcia monoklonalnych, ktre mona produkowa w hodowli tkankowej lub te in i)ivo,

izolacja komrek ledziony myszy immunizowanej antygenem X:

mieszanina komrek ledziony niektre wytwarzaj przeciwciaa anty-X

zmutowane komrki linii szpiczaka, niezdolne do wzrostu w poywce HAT

mieszanina komrek, ktre ulegy, bd nie ulegy fuzji SELEKCJA IN VITRO W PODOU HAT rosn tylko klony hybrydowe

hodowla w studzienkach zawierajcych potomstwo jednej komrki

testowanie na obecno przeciwcia anty-X

HODOWLA POZYTYWNYCH KLONW

KLON HYBRYDOWY PRODUKUJCY PRZECIWCIAA ANTY-X Rys. 11.15. Wytwarzanie przeciwcia monoklonalnych. Objanienia s w tekcie (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

wstrzykujc myszy hybrydowe komrki, ktre indukuj powstawanie guzw nowotworowych, wytwarzajcych znaczne iloci przeciwcia (rys. 11.15). D fuzji najczciej uywane s komrki szpiczaka niezdolne do wytwarzania wasnych przeciwcia.

11.12. S dwa zasadnicze mechanizmy prowadzce do rnorodnoci przeciwcia Jak wynika z dyskusji nad budow przeciwcia, ich zrnicowanie, a wic i zdolno do wizania rnych antygenw, wynika z rnorodnoci czci zmiennych (V) acuchw Ig. Jak pogodzi ogromn zmienno jednej czci polipeptydu z du stabilnoci pozostaej czci? Mona sobie wyobrazi dwa mechanizmy tumaczce to zjawisko: (a) istnieje jeden gen kodujcy cay acuch polipeptydowy Ig i gen ten ulega bardzo czstym mutacjom, lecz tylko w czci V. W efekcie tych mutacji uzyskuje si zrnicowan populacj komrek B; (b) istnieje dua liczba genw kodujcych rejony zmienne V i kady z nich moe poczy si z pojedynczym genem kodujcym rejon stay. Okazao si, e oba te mechanizmy, tzn. somatycznych mutacji (a) i somatycznych rekombinacji (b) s wykorzystywane w tworzeniu rnorodnych Ig. Jako pierwsza zostaa udowodniona eksperymentalnie hipoteza somatycznej rekombinacji, tumaczca powstanie rnorodnych Ig przegrupowaniami w DNA kodujcym Ig. 11.13. Geny immunoglobulin ulegaj somatycznej rekombinacji Dreyer i Bennett postulowali w roku 1965, e kady acuch Ig jest kodowany przez co najmniej dwa geny, jeden zmienny, a drugi stay, ktre cz si bd na poziomie DNA, bd te mRNA. Dowd na to, e DNA rzeczywicie ulega przegrupowaniu w czasie dojrzewania komrek B, przedstawiono ponad 10 lat pniej. Porwnano DNA z tkanki embrionalnej myszy, nie wytwarzajcej przeciwcia i DNA z komrek szpiczaka myszy, produkujcych przeciwciaa. Dowiadczenia wykazay, e specyficzne sekwencje kodujce rejony V i C w komrkach szpiczaka znajdoway si w tym samym fragmencie restrykcyjnym DNA, natomiast te same sekwencje wystpoway w dwu rnych fragmentach restrykcyjnych DNA komrek embrionalnych. wiadczy to o przegrupowaniu sekwencji kodujcych czsteczki Ig w trakcie rnicowania komrek B (rys. 11.16). Tak wic, dojrzewaniu limfocytw B towarzyszy przegrupowanie w DNA kodujcym immunoglobuliny. Polega ono na zblieniu, w procesie somatycznej rekombinacji, rejonw DNA kodujcych cz sta (C) i cz zmienn (V) acucha Ig. Organizacja genw Ig w linii zarodkowej (i w komrkach somatycznych rnych od tkanki limfoidalnej) jest zasadniczo podobna u badanych gatunkw. Geny kodujce dwa acuchy lekkie, x i A, oraz pojedynczy locus zawierajcy rne geny acuchw cikich, s zlokalizowane w rnych chromosomach (odpowiednio w chromosomie 2, 22 i 14 u czowieka). Kady zestaw ma podobn podstawow organizacj. Najdokadniej poznano struk-

sonda DNA Cx DNA DNA

sonda DNA Vx DNA DNA

Rys. 11.16. Przegrupowania wewntrz genu acucha x w komrkach B. D N A izolowany z komrek szpiczaka, produkujcych przeciwciaa, oraz z komrek embrionalnych myszy cito enzymami restrykcyjnymi i rozdzielano elektroforetycznie. Po elektroforezie, D N A hybrydyzowano z radioaktywnymi sondami. Lewa cz rysunku przedstawia wynik hybrydyzacji z sond specyficzn wobec rejonu staego genu acucha x (Cx), prawa cz wynik hybrydyzacji z sond specyficzn wobec czci zmiennej (Vx) genu. Wida, e przy zastosowaniu kadej z sond inne fragmenty D N A ulegaj hybrydyzacji w przypadku szpiczaka ni w przypadku komrek embrionalnych. Wida te, e DNA szpiczaka zawiera fragment hybrydyzujcy zarwno z sond Cx, jak \Vx a wic te rejony musz znajdowa si blisko siebie. W przypadku D N A embrionalnego, rejony Cx i Vx znajduj si w rnych fragmentach a wic s dalej od siebie ni w DNA szpiczaka (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

tur loci Ig u myszy (rys. 11.17). Loci acuchw lekkich i cikich zoone s z wielu genw kodujcych rejony V i C polipeptydw, oddzielonych rejonami niekodujcymi. Na kocu 5' kadego locus Ig znajduj si egzony rejonu V (kady ok. 300 par zasad), oddzielone od siebie odcinkami niekodujcymi. Okoo 90 par zasad w kierunku 5' od kadego z egzonw V znajduje si may, (60-90 par zasad) egzon, oznaczany jako L, kodujcy sygna inicjacji translacji oraz peptyd liderowy, czyli N-terminalny odcinek acucha Ig, zoony z 20-30 aminokwasw (umiarkowanie hydrofobowy). Jak wiadomo, sekwencje liderowe s typowe dla biaek wydzielanych oraz dla biaek bon. W omawianym przypadku uczestnicz one w transporcie acuchw Ig do wntrza retikulum endoplazmatycznego, gdzie peptydy liderowe s odcinane. Liczba egzonw V (czsto okrelanych jako geny V1) u myszy waha si od dwu dla acucha k do ok. 1000 dla acuchw cikich, gdzie zajmuj odcinek DNA o znacznej dugoci. U wszystkich - zbadanych gatunkw, geny V (w sensie egzony") tworz rodziny genw, przy czym w obrbie rodziny sekwencje nukleotydowe
Przy opisywaniu loci Ig termin gen" okrela albo DNA kodujcy cay acuch lekki bd ciki Ig, lub te segment D N A kodujcy jedynie czci V lub C; czsto te zamiennie uywa si okrelenia gen" i egzon". Okrelenie gen V" moe oznacza cay rejon DNA kodujcy cz V acucha (jak zostanie wyjanione, odcinek V skada si z egzonu V oraz dodatkowych elementw D i J), bd tylko egzon V. Niestety, terminologia jest niemal tak skomplikowana jak same geny.
1

locus acucha H (chromosom 12) n=2501000

L1 VH1 Ln VHn DH(1-12)

Cm1 Cm2 Cv3

CM4 TM CY

Cr2b 21 15

Cr2a U

CE 12

Ca

H U K U H m d h
locus acucha x (chromosom 6) n=~250 L1 5' VX1 Ln Vxn Jx Cx 3'

'

locus acucha A (chromosom 16)

L2 VX2 JX2 2 L1 VA1 J?3 CA3 JA1 CX1

I1H

K ^ - M h ^ B H

H H

h 3'

Rys. 11.17. Organizacja genw immunoglobulin w linii zarodkowej myszy. Rozmiary egzonw i sekwencji rozdzielajcych nie s narysowane w skali. Liczby napisane kursyw okrelaj w przyblieniu dugo odcinkw DNA (w 1000 par zasad). Gwiazdka oznacza niefunkcjonalny pseudogen. Kady gen CH jest przedstawiony jako pojedynczy prostokt, skada si jednak z wielu egzonw; egzony te przedstawiono jedynie dla CM w tym przypadku wida cztery gwne egzony (C^l-Cf/f) oraz egzony rejonu transmembranowego (TM) i cytoplazmatycznego (CY). Segmenty genw oznaczono nastpujco: L cz kodujca peptyd liderowy; V egzon czci zmiennej; D rejon rnorodnoci; J rejon czcy, C segment kodujcy cz sta. Naley zwrci uwag, i acuch H oraz Lx zawieraj biblioteki rejonw V, zoone z kilkuset uoonych tandemowo egzonw V (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

s identyczne w ponad 80%; midzy rodzinami homlogia wynosi poniej 70%. Uwaa si, e kada rodzina jest efektem duplikacji jednego, wyjciowego genu V. Zoono rodziny okrelona jest liczb genw w tej rodzinie. Na przykad u myszy istnieje co najmniej 9 rodzin genw V acucha H, a kada zoona jest z 2-60 genw. W kierunku 3r od genw V znajduj si geny rejonu C. U myszy i u czowieka locus acucha lekkiego x ma pojedynczy gen C, locus X ma trzy do szeciu, natomiast geny C rejonu C rnych izotypw acucha cikiego uoone s tandemowo w porzdku specyficznym dla gatunku. Kady gen C acucha cikiego zoony jest z 3-4 egzonw (o rozmiarze podobnym do egzonu V), kodujcych rejon C, oraz z mniejszych egzonw kodujcych C-terminalne domeny transmembranowe i cytoplazmatyczne ci-

kich acuchw. Pomidzy genami V i C, oddzielonymi intronami, zlokalizowane s dodatkowe sekwencje (o dugoci 30 50 par zasad), kodujce segmenty czce (J) oraz, tylko w locus acucha H, segmenty rnorodnoci (Z)) (ang. diversity). Segmenty Ji D koduj karboksyterminalne koce rejonw V, w tym trzeci nadzmienny rejon czsteczki (CDR3) (rys. 11.18). Tak wic, w acuchu lekkim (x i X) rejon zmienny kodowany jest przez egzony V i J, a rejon stay przez egzon C (ten ostatni nie ma rejonu transmembranowego ani cytoplazmatycznego). W acuchu cikim rejon zmienny zakodowany jest przez egzony V, D i / . Stay rejon biaka kodowany jest przez liczne egzony C, a w przypadku acuchw zwizanych z bon, rwnie przez egzony kodujce domen transmembranow i cytoplazmatyczn. Kady gen C, nie tylko C^, ma egzony kodujce domen transmembranow i cytoplazmatyczn std kady rodzaj Ig moe wystpowa w wersji zwizanej z bon lub w wersji rozpuszczalnej.

rejon V V DJ ciki acuch typu p NH2 (forma bonowa) 1 i ni i | m ....... 1 1 1 1 11 1

I

rejon C

CH1

Ch2

C3

0,4

TMCY COOH

11 I L J | I

1 r
ss i

ss I s
I

I I I

I I I

ss

s
acuch L 97 110

-L drugi acuch H

224 aminokwas

n 1 lekki acuch NH2

r~i r !_! ! I 1

li . i il i ! |LJ I 1 1 I I

1r
1 1 s s

COOH

| acuch H | Rys. 11.18. Relacje midzy segmentami genw Ig a domenami acucha polipeptydowego. Rejony V i C acucha polipeptydowego s kodowane przez rne segmenty genw. Przerywana linia okrela pooenie nadzmiennych rejonw CDR (czyli determinujcych specyficzno wobec antygenu). W acuchu cikim typu |i, cz transmembranowa i cytoplazmatyczna s kodowane przez oddzielne egzony TM i CY. W acuchu lekkim liczby okrelaj pooenie aminokwasw. Nie pokazano rejonu kodowanego przez segment L, znajdujcy si w pooeniu 5' do segmentu V, poniewa kodowany przez L peptyd liderowy jest odcinany w czasie transportu acucha przez bon retikulum endoplazmatycznego (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Tandemowe uoenie genw V i C w kadym z loci oraz strukturalne homologie midzy nimi pozwalaj przypuszcza, e wszystkie te geny w ewolucji powstay przez wielokrotne duplikacje pierwotnego genu. Kady egzon V i C koduje oddzieln domen w biaku Ig. W procesie dojrzewania limfocytw B dochodzi do somatycznej rekombinacji, prowadzcej do wytworzenia funkcjonalnych genw Ig. Pierwsze przegrupowanie nastpuje w locus acucha cikiego, gdzie dochodzi do poczenia jednego z segmentw D z jednym z segmentw z jednoczesn delecj dzielcego te segmenty DNA (rys. 11.19).

L1 5' DNA' embrionalny

V1

Ln

Vn

01-12

J1-U

C(t

Cd

= 3 - 0 - 3 ' somatyczna rekombinacja (czenie D-J) V1 Ln Vn D1 02 J1 J2- Cd 3'

L1

przegrupowany DNA L1 V1 02 J1 J2-U

somatyczna rekombinacja (czenie V-D-J)

C*
H Z J - 3 ' transkrypcja,

L1 pierwotny transkrypt RNA 5'

V1 D2J

J2-*

C*

L1 V1 D2J1 Cp mRNA 5'

j m
L V DJ C

AAA translacja

3'

syntetyzowany peptyd

modyfikacja biaka: odcicie peptydu liderowego, glikozylacja V DJ C

ciki acuch ji

Rys. 11.19. Kolejne wydarzenia prowadzce do syntezy acucha cikiego Ig typu JI u myszy. W tym przypadku, rejon Fjest kodowany przez egzony: VI, D2 i Jl. Geny CH pooone po stronie 3' od Cs nie s pokazane. Lokalizacja reszty cukrowej jest przybliona; odlegoci nie s przedstawione w skali (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Nastpnie, jeden z wielu genw V czy si z kompleksem Z)/, tworzc gen VDJ. Dopiero po tym etapie moe nastpi transkrypcja genu kodujcego acuch H. W pierwotnym transkrypcie kompleks VDJ jest oddzielony od rejonu C przez intron, ktry ulega wyciciu w procesie skadania mRNA; transkrypt ulega poliadenylacji w miejscu zlokalizowanym 3' od rejonu C. Geny kodujce inne klasy CH take maj miejsca poliadenylacji, ktre mog by wykorzystywane, kiedy te wanie klasy CH ulegaj ekspresji (p. rys. 11.35). Translacja dojrzaego mRNA prowadzi do wytworzenia biaka ktre na pewnym etapie dojrzewania limfocytu B jest jedynym prekursorem Ig. Nastpnie, somatyczna rekombinacja zachodzi w locus acucha lekkiego (x lub X) i przebiega wedug podobnego schematu jak rekombinacja locus acucha H. Jeden z segmentw V jest przyczany do jednego z segmentw J; pierwotny transkrypt zawiera intron dzielcy VJ od C intron ten ulega wyciciu w procesie skadania mRNA. Lekki acuch wie si z uprzednio wytworzonym acuchem cikim w retikulum endoplazmatycznym i tam tworzy si bonowa forma IgM, transportowana nastpnie na powierzchni bony. Synteza acucha \i pociga za sob dodatkowy skutek ot hamuje ona przegrupowania DNA w siostrzanym chromosomie, powodujc tzw. wyczenie alleliczne (ang. allelic exclusion). Geny acucha cikiego chromosomu siostrzanego ulegn przegrupowaniu tylko wtedy, jeli rekombinacja w pierwszym chromosomie nie da funkcjonalnego peptydu (co moe by spowodowane delecj, mutacj lub przesuniciem ramki odczytu w procesie rekombinacji). Tak wic, w danej komrce B tylko jeden allel genu acucha cikiego ulega przegrupowaniu i ekspresji. U myszy transgenicznych, u ktrych przegrupowany gen |i jest wyraany jako transgen, wikszo komrek B zawiera ten gen i produkuje zakodowane w nim biako oraz nie przegrupowuje endogennych loci cikich acuchw. Ten efekt wywouje tylko forma membranowa \i forma wydzielana nie hamuje somatycznej rekombinacji. Mechanizm supresji nie jest jednak poznany. Produkcja peptydu \i ma take inny efekt ot stymuluje rekombinacj w genie acucha lekkiego. Przegrupowanie nastpuje najpierw w locus x jeli jest ono produktywne, tzn. wytwarza si acuch x, to rekombinacja locus X jest zahamowana. Locus X ulega przegrupowaniu tylko wtedy, jeli oba rodzicielskie allele x s nieproduktywne. I, jak w przypadku acucha cikiego, produkcja acucha lekkiego blokuje rekombinacj w allelicznym genie. Efekt zbiorczy jest taki, e dany limfocyt B produkuje acuch albo LX, albo LA i tylko pochodzcy z jednego allelu. Okoo 5% Ig mysich i ok 50% ludzkich ma acuch LA. Zjawisko wyczenia allelicznego powoduje, e okrelona komrka B wytwarza tylko jeden rodzaj czsteczek Ig, z jednym rodzajem acucha L i H, co jest niezwykle istotne z punktu widzenia mechanizmu selekcji klonalnej. Przegrupowanie genw Ig, polegajce na wycinaniu odpowiednich odcinkw DNA pomidzy segmentami genw i czeniu tych segmentw, zachodzi

Rys. 11.20. Sekwencje rozpoznawane przez rekombinazy w procesie somatycznej rekombinacji genw Ig. Konserwatywne sekwencje heptamerw i nonamerw ssiaduj z egzonami Vi J (w loci x i X) oraz z V, D i J (w locus acucha H) i zbliaj egzony. Niekodujcy DNA tworzy ptl i ulega wyciciu. 12 i 23 oznaczaj niekonserwatywne sekwencje rozdzielajce hepta- i nonamer. Rekombinacja zawsze zachodzi midzy DNA z 12-nukleotydowym rejonem a DNA z 23-nukleotydowym rejonem to zapewnia czenie si rnych egzonw (np. Vz J), a nie tych samych (np. VzV) (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular andMolecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

dziki systemowi enzymw okrelanych jako rekombinazy. Rekombinazy s komrkowo specyficzne ich aktywno wystpuje jedynie w limfocytach, we wczesnym stadium rozwoju komrek B. Sdzi si, e rozpoznaj one specyficzne sekwencje znajdujce si w pozycji 3' wobec kadego egzonu V i w pozycji 5' wobec kadego segmentu J oraz po obu stronach segmentw D (rys. 11.20). Te rozpoznawane rejony s zoone z silnie konserwowanych sekwencji 7- lub 9-nukleotydowych, oddzielonych zmienn sekwencj o dugoci 12 lub 23 nukleotydw (oddzielone wic jednym lub dwoma obrotami heliksu DNA). Heptamery i nonamery rozpoznaj komplementarne sekwencje, dziki czemu egzony znajduj si blisko siebie w dogodnej pozycji dla rekombinaz, ktre dokonuj wycicia ptli DNA i poczenia egzonw. Elementy systemu rekombinaz s bardzo sabo poznane. W komrkach zidentyfikowano geny RAGI i RAG2, odpowiedzialne za stymulacj rekombinacji. Aberracje w funkcjonowaniu rekombinaz prowadz do nie wytwarzania Ig oraz receptorw komrek T uwaa si, e tego rodzaju defekt genetyczny jest podoem syndromu SCID (ang. severe combined immmunodeficiency) u myszy. Syndrom ten charakteryzuje si prawie cakowitym brakiem dojrzaych limfocytw B i T. czenie si egzonw jest procesem nieprecyzyjnym, co dodatkowo zwiksza rnorodno Ig. Ot okazao si, e w Ig kodowanych przez ten sam zestaw egzonw F, D i J mog istnie rnice w sekwencji aminokwasw na zczach segmentw. Dzieje si tak dlatego, e rekombinacja na kocach segmentw moe zachodzi w rnych miejscach, z dokadnoci do kilku nukleotydw (rys. 11.21). Nieprecyzyjna rekombinacja moe te prowadzi do wytworzenia niefunkcjonalnego genu przez zmian ramki odczytu (rys. 11.21) jest to cena pacona
sekwencja DNA linii zarodkowej przegrupowany DNA gg aminokwasy

ccc

m 1 V,

T GG

ClT

Pro-Trp

GG c c ClC i 'f/< 1 '//i % f/i

ClC ClC

Pro-Arg Pro-Pro Pro-Pro

c c clc c

% p 9 '/A
t

c c c|c c c c c clc c

'/A % y/ T GG

c|c

'SA

MI I

t g

zmiana ramki odczytu

Rys. 11.21. Tworzenie rnic w strukturze Ig przez nieprecyzyjne czenie segmentw w procesie somatycznej rekombinacji. W czasie czenia egzonw V i J delecji ulegaj rne nukleotydy (zakreskowane), co prowadzi do zrnicowanej sekwencji nukleotydowej i aminokwasowej, moe te nastpi zmiana ramki odczytu i brak syntezy funkcjonalnego acucha. Liczby 95 i 96 oznaczaj kolejne aminokwasy kodowane przez gen V (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

za zwikszenie rnorodnoci Ig. W takiej sytuacji rekombinacji ulega drugi allel genu, a jeli i tu powstanie niefunkcjonalny produkt, to limfocyt prawdopodobnie ginie. Nastpnym mechanizmem zwikszajcym rnorodno Ig w miejscu poczenia segmentw jest zrnicowanie rejonu N (ang. N region diversification). Jest to zjawisko polegajce na tym, e sekwencje kilkunukleotydowe (okrelane jako rejon N), nie zakodowane w DNA, mog by dodawane na zczach rejonw VDJ. Dodawanie nukleotydw jest przypadkowe i katalizowane przez terminaln transferaz deoksyrybonukleotydow polimeraz DNA nie wymagajc matrycy. Tak wic, kompletny rejon zmienny acucha H bdzie si skada z: VHNDNJH. I tu znowu napotykamy niebezpieczestwo zmiany ramki odczytu, wic i utworzenie niefunkcjonalnego genu. W sekwencji NDN moe te powsta kodon terminatorowy w ramce odczytu. Ta moliwo jest zmniejszona przez brak kodonw stop we wszystkich ramkach odczytu wikszoci rejonw D. Rnorodno Ig wytwarzana przez jednostk NDN jest ogromna, ze wzgldu na przypadkowo sekwencji N i moliwo odczytania D w dowolnej ramce odczytu (mimo tej moliwoci, w badanych Ig jedna z ramek odczytu bya preferowana). Znalezione dotychczas segmenty NDN miay dugo do 30 nukleotydw, jest to wic rejon mogcy kodowa a do 10 aminokwasw. Czsteczka Ig ma, jak wiemy, trzy rejony CDR, czyli nadzmienne. Rnorodno biblioteki egzonw V odpowiada za rnorodno wszystkich CDR. Omawiana tutaj rnorodno, wytwarzana na zczach VJ i VDJ, dodatkowo przyczynia si do rnicowania rejonu CDR3 tak wic rnorodno rejonu CDR3 tworzy si rwnie w procesie somatycznym, w komrkach osobnika, a nie tylko w procesie ewolucyjnym, ktry wytworzy zrnicowanie biblioteki V. Wiele razy podkrelana bya moliwo wytworzenia ogromnej rnorodnoci przeciwcia olbrzymiego repertuaru Ig przez jeden organizm. Podsumujmy wic genetyczne mechanizmy prowadzce do wytworzenia tego repertuaru zebrane one zostay w tabeli 11.2.
Tabela 11.2. Mechanizmy przyczyniajce si do rnicowania przeciwcia u myszy H Geny linii zarodkowej segmenty V segmenty J segmenty D Przypadkowe czenie V x J (x D) Poczenie acuchw H x x H x k Potencjalny repertuar ze zmiennoci na zczach 250-1000 4 12 10 000-40 000 X 250 4 0 1000 1 - 4 x 107 5-10 x 104 1091011

JL
2 3 0 6

* Liczby segmentw s przyblione. Mysz jest wyjtkowym gatunkiem ze wzgldu na nisk liczb genw Vx i niewielkie zrnicowanie Ig z acuchami Lk. Poza tym, inne gatunki ssakw (w tym czowiek) s zasadniczo podobne.

Przede wszystkim lekkie i cikie acuchy s kodowane przez wiele genw V,JiD(D tylko w przypadku acuchw H). Wyjtkiem s lekkie acuchy LA u myszy, poniewa locus X zawiera tylko dwa funkcjonalne geny V. Somatyczna rekombinacja DNA Ig, prowadzca do wytworzenia rnych kombinacji segmentw V, J i D, moe potencjalnie prowadzi do uzyskania liczby V x J x D acuchw cikich (czyli u myszy 1 x 10 4 -4 x 104) oraz liczby rwnej V x / acuchw lekkich (czyli dla acuchw Lx u myszy ok. 1 x 103). Nastpnie, rnorodno powstajca na zczach V-J oraz V-D-J w wyniku nieprecyzyjnej rekombinacji zwiksza liczb prawdopodobnych acuchw, zarwno L, jak i H, co najmniej 10-krotnie. Do tego dochodzi wzrost zrnicowania przez dodanie na zczach rejonw N, co w przypadku acuchw cikich zwikszy liczb moliwoci co najmniej 100-krotnie. Bez uwzgldniania rnorodnoci na zczach, zakadajc dowolne poczenie acuchw H i Lx (La stanowi u myszy zaledwie ok. 5%, wic pomijamy je w obliczeniach), uzyskujemy 1-4 x 104 x 103 = 1-4 x 107 moliwoci. Wnoszc poprawk z tytuu nieprecyzyjnej rekombinacji w obu acuchach uzyskujemy 1-4 x 107 x 10 x 10 = 1-4 x 109. Uwzgldniajc rejony N w acuchu cikim uzyskujemy 1-4 x 109 x 100 = 1-4 x 1011, czyli warto ok. 1011. Oczywicie, ocena ta jest przybliona, ale wynika z niej niezbicie olbrzymi potencja repertuaru przeciwcia pojedynczego organizmu. Mysz wytwarza tylko ok. 108 limfocytw dziennie, wic moe ona w cigu caego swojego ycia nie wyprodukowa wszystkich moliwych Ig. Zdolno organizmu do reagowania na kady patogen polega wanie na istnieniu olbrzymiego repertuaru przeciwcia. Omawiana tu rnorodno dotyczy fazy rozwoju limfocytw B niezalenej od antygenu. Ogromne zrnicowanie populacji dziewiczych limfocytw B osigana jest dodatkowo dziki temu, e macierzyste komrki limfocytw B, w trakcie dojrzewania zwizanego z rekombinacj DNA Ig, ulegaj podziaom. We wczesnych fazach rozwoju komrki te dziel si co ok. 12 h. Tak wic komrka, w ktrej ju nastpia rekombinacja rejonu DJH, moe da potomstwo, ktre dokona swoich wasnych, rnych pocze VHDJH. Potomstwo kadej komrki z okrelonym rejonem VHDJH moe dokona niezalenych pocze VKJK. Dojrzay dziewiczy limfocyt B, zawierajcy powierzchniowe przeciwciaa, przestaje si dzieli, opuszcza szpik kostny i kry w ukadzie krwiononym oraz limfatycznym. Teoretycznie wic, kada komrka opuszczajca szpik kostny moe by unikatowa. W rzeczywistoci, wydaje si, e pewne przegrupowania genetyczne s faworyzowane, co ilustruje fakt, e rne osobniki myszy z tej samej linii chowu wsobnego, w odpowiedzi na okrelony hapten, produkuj praktycznie identyczne przeciwciaa. Dojrzae komrki B s gotowe do zwizania najrniejszych determinant antygenowych. Zwizanie antygenu powoduje stymulacj komrki B, prowadzc m.in. do jeszcze wikszego zrnicowania repertuaru Ig. Dzieje si to na skutek somatycznych mutacji zachodzcych przede wszystkim w rejonach V obu przegrupowanych acuchw proces ten zostanie omwiony w dalszej czci rozdziau.

11.14. Regulacja transkrypcji genw immunoglobulin Transkrypcja genw immunoglobulin jest interesujcym zagadnieniem ze wzgldu na to, e zachodzi ona wycznie w jednym rodzaju komrek w linii komrek B. Geny Ig, podobnie jak wikszo genw eukariotycznych, s regulowane przez sekwencje promotorw i wzmacniaczy (enhancerw). Promotory Ig zawieraj klasyczne sekwencje TATA w pozycji 5' wobec kadego z segmentw V. Wikszo genw Ig zawiera konserwatywny oktamer ATGCAAAT (obecny take w innych genach), stymulujcy wybirczo transkrypcj w komrkach limfoidalnych i uwaany za miejsce wice biaka regulatorowe (rys. 11.22). Z ekstraktw jdrowych ssakw wyizolowano 3 biaka wice si in vitro z rejonem oktameru. Jedno z nich (Octl) wystpuje we wszystkich komrkach, dwa pozostae Oct2 (OTF2A) i OTF2B s specyficzne dla limfocytw. Wykazano, e Oct2 syntetyzowane w nielimfoidalnych komrkach (w wyniku manipulacji genetycznych) stymuluje transkrypcj genw reporterowych, ktre maj rejon promotorowy Ig zawierajcy oktamer. Wzmacniacze s take elementami specyficznoci tkankowej funkcjonuj tylko w linii komrek B. Wzmacniacz zlokalizowany jest midzy elementami V a egzonami rejonu C. Ta lokalizacja zapewnia, e rejony V w nie prze-

la usytuowanie promotora i wzmacniacza w genie Ig rejon J, C rejon V C_

v
OCTA

JLl

r\

TATA

wzmacniacz

(b) rejon wzmacniacza acucha cikiego (H)

jiE5

<iE2

7t

ti3

itS

jEA

OCTA

(c) rejon wzmacniacza acucha lekkiego x (L#) ^ *E1 *E2 *E3

x&

Rys. 11.22. Elementy regulujce transkrypcj genw Ig. Elementy o dugoci 6-12 nukleotydw wi specyficzne biaka. Typowe dla promotora s motywy: OCTA i TATA. Wzmacniacze genw kodujcych acuch H i Lx zawieraj wiele rnych motyww. S oznacza rejon silencera (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientiflc American Books, New York 1990 zmodyf.)

grupowanym genie nie s pod jego wpywem, natomiast po przegrupowaniu wszystkie elementy s pod wpywem tego samego wzmacniacza. Wzmacniacz genu kodujcego acuch L% u myszy zawiera 10-nukleotydow sekwencj, ktra wie biako NF-%B sekwencja taka wystpuje rwnie w innych genach, m.in. w genie interleukiny 2. Czynnik NF-xB jest nieaktywny w komrkach pre-B, w ktrych nie ma jeszcze transkrypcji genw x. Przypuszcza si, e NF-xB w takich komrkach wystpuje w cytoplazmie i jest zwizany z inhibitorem. Sdzi si, e aktywacja biakowej kinazy C powoduje fosforylacj inhibitora, ktry odcza si, a NF-xB wdruje do jdra i wie si z rejonem enhancera, stymulujc transkrypcj x. Stwierdzono, e w komrkach szpiczaka, aktywnie produkujcych acuch nie ma aktywnoci czynnika NF-xB sugeruje to, e czynnik ten moe by niezbdny tylko we wczesnym etapie rozwoju komrek B, przy inicjacji transkrypcji x, natomiast nie jest konieczny do podtrzymywania transkrypcji. Miejsce xB jest pozytywnym regulatorem, a elementy E s rejonami wspomagajcymi. Wewntrz wzmacniacza x znajduje si motyw silencera" prawdopodobnie zapobiega on dziaaniu wzmacniacza w komrkach innych ni komrki B. Wzmacniacz genu kodujcego acuch H zawiera wiele motyww wicych rne biaka, m.in. rejon OCTA, taki jak w rejonie promotora. Motywy 7i i /iB s gwnie odpowiedzialne za komrkowo specyficzne dziaanie enhancera. Do motyww E przyczaj si dimery biaka o domenie wicej si z DNA typu heliks-ptla-heliks. Wiedza dotyczca regulacji genw Ig jest bardzo fragmentaryczna, niewtpliwie jednak, ze wzgldu na bardzo intensywne badania prowadzone w tej dziedzinie, najblisza przyszo przyniesie wiele nowych informacji:

11.15. Limfocyty T maj receptory TCR Omwienie limfocytw T jest istotne przed dalszymi rozwaaniami dotyczcymi dojrzewania limfocytw B, konkretnie dotyczcymi tej czci procesu dojrzewania, ktra jest zalena od obecnoci antygenu. Jest to spowodowane faktem, e do powstania dojrzaego limfocytu B, ktry wydziela przeciwciaa, konieczne jest wspdziaanie limfocytw B i T. Limfocyty T maj zdolno rozpoznawania okrelonego antygenu dziki obecnoci na powierzchni komrki biakowych receptorw TCR (ang. T-cell receptor), ktre wykazuj znaczne podobiestwo do przeciwcia. Receptory TCR rni si jednak od przeciwcia w wielu aspektach, przede wszystkim tyjn, e wystpuj jedynie w formie zwizanej z bon komrkow, podczas gdy przeciwciaa mog by albo zwizane z bon, albo mog by wydzielane przez limfocyty na zewntrz. Reakcja wizania antygenu przez TCR rni si take od reakcji antygen-przeciwciao: mianowicie, antygen musi znajdowa si na powierzchni komrki, w kompleksie ze specyficznymi biakami, czyli musi by

specjalnie zaprezentowany". Std wynika, e oddziaywania midzy receptorem TCR a antygenem s zawsze oddziaywaniami midzy komrkami: komrk prezentujc antygen i limfocytem T. Jak wynika z poprzednich rozwaa, istniej dwa zasadnicze typy komrek T: komrki pomocnicze (TH) oraz komrki cytolityczne (Tc). Dojrzae komrki TH i T c maj na swojej powierzchni receptory TCR nalece do tej samej rodziny biaek, ktre s kodowane przez t sam rodzin genw (o przynalenoci do grupy limfocytw TH lub T c decyduj receptory CD4 i CD8, nie TCR). Wikszo TCR zbudowana jest z dwu acuchw polipeptydowych, a i /?, o masie 40-50 kDa, z ktrych kady zawiera rejon zmienny (V) oraz stay (C). acuchy te poczone s mostkami dwusiarczkowymi i wizaniami niekowalencyjnymi; typowy receptor jest glikoprotein o masie ok. 80-90 kDa, zbudowan, jak przeciwciao, z domen majcych struktur motywu immunoglobulinowego (rys. 11.23).
N N

domeny acuchw a i N i C koniec aminowy i karboksylowy polipeptydw; TM hydrofobowy odcinek kotwiczcy TCR w bonie komrkowej; CY rejon cytoplazmatyczny oraz H rejon zawiasu (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Odcinek kotwiczcy TCR w bonie skada si z 20-24 aminkwasw, gwnie hydrofobowych, zawiera take aminokwasy naadowane dodatnio (reszty lizyny i argininy), ktre by moe uczestnicz w interakcjach z ujemnie

naadowanymi resztami znajdujcymi si w transmembranowych partiach polipeptydw CD3. Niewielka cz limfocytw T ma TCR zbudowane z dwu innych acuchw, nazwanych y i < 5 , przy czym aminokwasowa sekwencja acuchw y przypomina sekwencj acuchw /?, a acuchy 5 przypominaj acuchy a. Tak jak i w przypadku dimerw a/?, wikszo informacji dotyczcych struktury dimerw yd zostaa przewidziana na podstawie struktury sklonowanych genw. Bardzo niewiele wiadomo na temat funkcji receptorw yd. Geny kodujce TCR maj organizacj podobn do organizacji genw immunoglobulin, podobna jest take relacja midzy egzonami genw a domelocus acucha /3 TCR myszy (chromosom 6)

HZHZZH

20-30) L1 Ln Vpn "i OfZ LU Vf14 2-3'

loci acuchw a i d TCR myszy (chromosom 14) (n=~ 75) L1 Va1 Ln

Van

Ja[50-100)

i - a - 3'
L1

VD1

Ln

Vdn

D*1

DD2

JD1

J2

Cd

L5 Vd5

locus acucha y TCR myszy (chromosom 13) L 5'

Vy

Vy

Vy

Vy

Jy1

Cy1

Vy

Jy3 Cy3

Cy2

Jy2

Vy

Vy

Jy4

Cy4

3' Rys. 11.24. Organizacja genw TCR w linii zarodkowej myszy. Rozmiary egzonw i intronw nie s narysowane w skali. Wszystkie elementy C s w rzeczywistoci zbudowane z wielu egzonw, co pokazano tylko dla genu C&1. Interesujcy jest fakt lokalizacji genw < 5 wewntrz locus acucha a. * oznacza niefunkcjonalne pseudogeny (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

nami polipeptydw. Funkcjonalne geny TCR, czyli geny zdolne do ekspresji polipeptydw, powstaj w wyniku somatycznych przegrupowa genw linii zarodkowych, podobnie jak geny Ig. Organizacja genw TCR jest zasadniczo podobna u zbadanych dotychczas gatunkw. Istniej biblioteki rejonw V, D, i / , ktrych elementy ulegaj poczeniu i tworz geny receptorw (rys. 11.24). Biblioteki segmentw genw acuchw a, /? i y czowieka zlokalizowane s, odpowiednio, na chromosomie 14, 7q i 7p. Nie stwierdzono wystpowania rejonw D w loci acuchw a oraz y. W locus acucha y wystpuje wiele segmentw Cv rnicych si sekwencj, dugoci i liczb egzonw kodujcych rejon zawiasu w polipeptydzie. Efektem tego jest wystpowanie rnych acuchw y w poszczeglnych komrkach. Na uwag zasuguje fakt zlokalizowania locus acucha < 5 wewntrz locus acucha a, midzy Va a zgrupowaniami JCa. Proces przegrupowa somatycznych, zmierzajcy do wytworzenia funkcjonalnych genw TCR, w ktrych segmenty V9 D, Ji C znajd si blisko siebie, jest zasadniczo podobny do przegrupowa genw Ig (rys. 11.25). Inaczej ni w czeniu genw immunoglobulin, w przegrupowaniu acuchw /? moe zachodzi albo czenie D i / , po czym V czy si z DJ, albo V czy si bezporednio z J (wtedy acuch /? nie ma elementu D). czenie segmentw, z udziaem rekombinaz, jest sterowane, tak jak i w przypadku genw Ig, przez sekwencje heptamerw i nonamerw. Na podobiestwo mechanizmw rekombinacji wskazuje m.in. fakt, e geny TCR z linii zarodkowej, po transfekcji do niedojrzaych komrek B, ulegay efektywnemu przegrupowaniu. Gen po rekombinacji jest transkrybowany, a pierwotny transkrypt ulega skadaniu. Na tym etapie dokonywany jest wybr jednego z dwu genw Cfi. Sdzi si, e wybr Cfi jest przypadkowy i e nigdy nie dochodzi w jednej komrce T do uruchomienia ekspresji drugiego genu. Jako pierwszy ulega przegrupowaniu locus /? funkcjonalne przegrupowanie i, przypuszczalnie, ekspresja locus /? stymuluje przegrupowania locus a. W danej komrce T tylko jeden z dwu alleli a i /? ulega funkcjonalnemu przegrupowaniu i ekspresji mamy tu, tak jak w przypadku Ig, do czynienia z wyczaniem allelicznym. Dziki temu, dana komrka T ma tylko jeden rodzaj receptorw TCR, co jest bardzo istotne w selekcji odpowiednich klonw komrek T w odpowiedzi immunologicznej. Rnorodno receptorw T, podobnie jak immunoglobulin, jest wynikiem dziaania mechanizmw podobnych do tych, ktre decyduj o rnorodnoci Ig. Mechanizmy te s nastpujce: (a) dua ilo segmentw V, D, J; (b) losowe czenie rnych segmentw V, D, /; (c) zmienno na zczach (tu zalicza si: zmienno rejonu N, wynikajc z przypadkowego dodawania nukleotydw na zczach; nieprecyzyjno wizania Vz Joraz JzD oraz fakt, e wiele segmentw D moe ulega translacji we wszystkich trzech ramkach odczytu to ostatnie bardzo rzadko zdarza si w Ig);

embrionalny DNA L1 V1 Ln Vn D1 C1 D2 C2 L14 Vp14

somatyczna rekombinacja: czenie D-J

L1

V1

Ln

Vn

D1J j

J1

C1

D2

C2

L14 Vp14

somatyczna rekombinacja: czenie V-D-J J1 C1 D2 C2 L14 Vfi14 3' | transkrypcja C2 L14 Vp14

przegrupowany DNA L1 V D1J

L1

V D1J

J1

C1 D2

hm-3'
| L1 V mRNA skadanie RNA DJC1

* w m
L V D j l C

i *
,r mlaC,

syntetyzowany peptyd

V DJ acuch 0 TCR

odcicie peptydu liderowego i glikozylacja

Rys. 11.25. Kolejno wydarze prowadzcych do syntezy acucha fi receptora TCR myszy. DNA ulega rekombinacji oraz transkrypcji; pierwotny transkrypt jest skadany, nastpnie zachodzi translacja i modyfikacja (odcicie peptydu liderowego, glikozylacja) acucha polipeptydowego. W podanym przykadzie rejon Fjest kodowany przez egzony VI, Dl i trzeci egzon zgrupowania J1; rejon C jest kodowany przez CL Kady gen C skada si z wielu egzonw, co nie zostao uwidocznione na rysunku. Nie wykorzystane segmenty V i J, zlokalizowane midzy przegrupowanymi genami V i J, ulegaj delecji. W podanym przypadku najpierw dochodzi do poczenia DJ, a nastpnie V czy si z DJ. W przypadku acuchw /? TCR moliwe jest take bezporednie czenia V-J (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

(d) czenie acuchw w dimery pomnaajce rnorodno wytworzon dla kadego acucha osobno. Mechanizmy s podobne, udzia ich jest jednak niejednakowy w zwikszaniu rnorodnoci TCR i Ig (tab. 11.3). Generalnie rzecz biorc, w przypadku TCR wiksz rol odgrywa zmienno na zczach i, mimo mniejszej liczby genw V TCR ni V Ig, ocenia si, e liczba moliwych

Tabela 11.3. Mechanizmy wytwarzania rnorodnoci genw receptorw komrek T (TCR) oraz immunoglobulin (Ig) Mechanizm Zmienne segmenty ( V ) Segmenty rnicujce (D) Czytanie D w 3 RO Zmienno rejonu N Segmenty czce (J) Liczba kombinacji segmentw zmiennych Potencjalna liczba moliwych wersji ig acuch ciki 250-1000 12 rzadko V-D, D-J 4 62500-250000 -1011 TCRajff TCR yd

X
250 0
-

a 75 0
-

P
25 2 czsto V-D, D-J 12 1875 ~ 10 16

y
i 0
-

10 2 czsto V-D1, D1-D2, Dl-J 2 70 ~10 1 8

brak 4

V-J 5

V-J 2

Mechanizmy prowadzce do zmiennoci TCR i Ig zostay omwione w tekcie. Loci TCR maj mniej segmentw V ni loci Ig, lecz wiksz potencjalnie moliwo rnicowania w czeniu segmentw. W tabeli nie uwzgldniono mutacji somatycznych, zachodzcych w genach Ig, lecz nie w genach TCR. RO ramka odczytu.

TCR jest wiksza ni Ig o okoo 1016 dla TCRajS (tab. 11.3). Niewielka liczba segmentw V genw y i < 5 sugeruje ograniczon zmienno receptorw yd. Jednake istnieje tu ogromna zmienno zachodzca przy czeniu, wynikajca gwnie z wyjtkowego faktu, e w jednym genie < 5 moe doj do wczenia albo jednego, albo obu segmentw D. Inaczej ni w przypadku genw Ig, geny TCR raz przegrupowane nie ulegaj dalszym przemianom. Nie ma tu zjawiska przeczania izotypw, nie stwierdzono te somatycznych mutacji w genach TCR. W efekcie, nie ma zmiany powinowactwa TCR do antygenu w czasie odpowiedzi immunologicznej. Ma to gboki sens biologiczny, co zostanie wyjanione przy okazji omawiania selekcji limfocytw T w grasicy. 11.16. Receptory komrek T wi antygeny prezentowane na powierzchni komrki Receptory komrek T, podobnie jak przeciwciaa, rozpoznaj obce antygeny, jednoczenie wykazujc tolerancj wobec antygenw wasnych. Istnieje jednak fundamentalna rnica w mechanizmie rozpoznawania antygenu przez receptory komrek T (TCR) i przez przeciwciaa. W przypadku TCR obcy antygen musi by zaprezentowany komrce T jako kompleks ze specyficznym biakiem wasnym. Komrka T widzi" antygen jedynie wtedy, gdy jest on powizany z okrelonym typem biaek

Rys. 11.26. Mechanizm restrykcji cytolitycznej aktywnoci limfocytw T c przez biaka MHC klasy I. Limfocyty cytolityczne T c pochodz ze zwierzt linii A, zakaonych wirusem. Te limfocyty spowoduj mier wasnych komrek, zainfekowanych wirusem. Nios one na powierzchni kompleks zawierajcy peptyd pochodzenia wirusowego oraz biako MHC I z linii genetycznej wasnej, czyli A. Limfocyty nie spowoduj lizy komrek obcych, zainfekowanych, lecz nioscych na swojej powierzchni inne biako MHC I biako linii genetycznej B. TCR do rozpoznania komrki ofiary" i zwizania si z ni wymagaj jednoczesnej obecnoci antygenu obcego i wasnego biaka MHC. Z tego wzgldu limfocyty T c nie zniszcz zainfekowanych komrek obcych, nioscych MHC typu B, ani nie zainfekowanych komrek wasnych, ktre maj odpowiednie biako MHC, lecz pozbawione s wirusowego antygenu (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

powierzchniowych komrki gospodarza. Zasada ta odnosi si do obu typw limfocytw T, zarwno pomocniczych (TH), jak i do cytolitycznych (T c ). Decydujcy eksperyment prowadzcy do wykrycia tego zjawiska wykonano w roku 1974, badajc liz komrek zainfekowanch wirusem, powodowan przez limfocyty T. Myszy pochodzce z chowu wsobnego zainfekowano wirusem, nastpnie wyizolowano limfocyty T i badano in vitro ich zdolno do lizowania komrek fibroblastw mysich, zainfekowanych uprzednio tym samym wirusem. Kiedy fibroblasty pochodziy z tej samej myszy, limfocyty T c rozpoznaway je i zabijay. Ku zdziwieniu badaczy okazao si, e limfocyty T c nie uszkadzay fibroblastw zainfekowanych wirusem, lecz pochodzce z myszy z innej linii chowu wsobnego, czyli genetycznie rnych. Ponadto, limfocyty T c nie lizoway obcych, nie zakaonych fibroblastw ani fibroblastw zakaonych innym wirusem. Wida std, e receptory limfocytw T c rozpoznaj jednoczenie i rodzaj komrki, i typ wirusa. Wymagaj jednoczesnej obecnoci obcego antygenu i jakiego wasnego biaka. Okazao si, e tymi wasnymi biakami powierzchniowymi s biaka MHC, czyli biaka gwnego ukadu zgodnoci tkankowej. Biaka MHC rozpoznawane przez limfocyty T c nale do MHC klasy I (rys. 11.26). Poniewa biaka MHC I wystpuj na powierzchni wszystkich typw komrek, sdzi si, e limfocyty T c s zdolne do wyeliminowania wasnej komrki kadego typu, zaatakowanej przez wirus. Zaktywowane przez zwizanie antygenu limfocyty T c wydzielaj biaka, ktre polimeryzuj i tworz niespecyficzne kanay jonowe w bonie, co powoduje depolaryzacj komrki, niszczy jej rwnowag jonow i osmotyczn. Zaatakowana komrka najpierw pcznieje, po czym ulega lizie. Dodatkowy mechanizm niszczenia polega na wydzielaniu przez zaktywowany limfocyt T c biakowej toksyny (limfotoksyny LT lub podobnej), ktra aktywuje enzymy zaatakowanej komrki enzymy te tn DNA, co w efekcie daje fragmentacj jdra komrkowego. Jeden limfocyt T c moe zniszczy wiele komrek. Receptory limfocytw pomocniczych T H rwnie rozpoznaj jedynie antygen obcy poczony z wasnym biakiem MHC w tym przypadku z biakiem MHC nalecym do klasy II (rys. 11.8). Biaka MHC II, inaczej ni MHC I, wystpuj na powierzchni tylko niektrych komrek, gwnie makrofagw i limfocytw B. Restrykcja limfocytw T przez biaka MHC zapewnia, e limfocyty bd dziaay jedynie na powierzchni docelowych komrek, a ich receptory (TCR) nie ulegn zaklejeniu", przez antygeny rozpuszczone w pynach ustrojowych. Jeeli porwnamy kompleksy receptorw komrek T H i T c z antygenami, to widzimy, e w obu przypadkach rzeczywistym antygenem rozpoznawanym przez TCR jest kompleks antygenu obcego z odpowiednim biakiem MHC, tzn. z MHC I w przypadku limfocytw T c i z MHC II w przypadku limfocytw TH. Obcy antygen nie jest caym biakiem, lecz jego fragmentem peptydem powstajcym w efekcie degradacji obcego biaka. Aby antygen obcy mg by rozpoznany przez TCR, biako musi ulec czciowej proteolizie, peptyd tworzy

bardzo trway kompleks z biakiem MHC znajdujcym si wewntrz komrki, a nastpnie kompleks MHC-peptyd przemieszcza si na powierzchni komrki i w ten sposb peptyd zwizany z MHC jest prezentowany receptorom limfocytw T (rys. 11.27).
komrka prezentujca antygen

Rys. 11.27. Wizanie antygenu przez receptor limfocytu T (TCR). TCR wie si z antygenem prezentowanym przez biako MHC klasy I lub II na powierzchni komrki. Limfocyty T H , majce receptory CD4, wi si z antygenem prezentowanym przez MHC II. Limfocyty T c z receptorami CD8 wi si z antygenem prezentowanym przez MHC I. Kompleks biaek CD3, cile zwizanych z TCR, bierze udzia w przekazywaniu do wntrza komrki sygnau o zwizaniu antygenu. W przekazywaniu sygnau uczestniczy m.in. kinaza tyrozynowa lek (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

Istnieje zasadnicza rnica midzy kompleksami tworzonymi przez biaka MHC I i MHC II z peptydami. Mianowicie, MHC I wi peptydy pochodzce z biaek wytwarzanych wewntrz komrki, a MHC II wi peptydy pochodzce z degradacji biaek zewntrzkomrkowych. Tak wic peptydy pochodzce z biaek wirusowych, produkowanych w zaatakowanej przez wirus komrce, s prezentowane przez biaka MHC I, podczas gdy makrofagi wchaniaj bakterie, trawi ich biaka i prezentuj na powierzchni w kompleksie z biakiem MHC II. Limfocyty B take prezentuj antygeny zwizane z MHC II. Limfocyty T H rozpoznaj peptydy w kompleksie z MHC II, ulegaj aktywacji i stymuluj limfocyty B do wydzielania przeciwcia. Dlaczego limfocyty T H wybieraj kompleksy antygen-MHC II, a limfocyty T c wybieraj kompleksy antygen-MHC I prezentowane przez komrki? Jak wspomniano uprzednio, komrki TH i T c maj na swojej powierzchni odpowiednio receptory CD4 i CD8, ktre uczestnicz w wizaniu przez TCR kompleksu antygen-MHC, przy czym CD4 wi si z kompleksem zawierajcym MHC II, a CD8 wi si z kompleksem zawierajcym MHC I (rys. 11.8.).

Limfocyty T rozpoznaj inne formy antygenw ni limfocyty B i wydzielane immunoglobuliny. Ot, limfocyty T rozpoznaj tylko antygeny biakowe, podczas gdy limfocyty B mog rozpoznawa specyficznie biaka, kwasy nukleinowe, polisacharydy, lipidy i mae zwizki chemiczne. Ponadto, limfocyty B mog rozpoznawa determinanty antygenowe z uwzgldnieniem ich konformacji czyli determinanty istniejce w biaku o natywnej strukturze lub determinanty uwidaczniane przez proces denaturacji czy te proteolizy biaek. Inaczej dzieje si w przypadku limfocytw T, ktre rozpoznaj liniowe determinanty, zdefiniowane przez sekwencj aminokwasw.

11.17. Biaka MHC uczestnicz w odrzucaniu przeszczepw Biaka i geny MHC zidentyfikowano po raz pierwszy nie w badaniach nad reakcj receptorw limfocytw T z prezentowanymi przez komrki antygenami, lecz w trakcie bada nad przeszczepianiem tkanek w latach 40. Od dawna wiedziano, e jeli przeszczepi si skr lub narzd myszy pochodzcej z linii chowu wsobnego innemu osobnikowi z tej samej linii, czyli genetycznie identycznemu, przeszczep przyjmie si, natomiast jeli biorc bdzie zwierz z innej linii, genetycznie rne, przeszczep zostanie odrzucony. W eksperymentach zmierzajcych do ustalenia, ktre geny s odpowiedzialne za odrzucanie przeszczepw, zmniejszano stopniowo, przez krzyowanie, rnice genetyczne midzy zwierzciem dawc a zwierzciem biorc, a do uzyskania zwierzt rnicych si tylko jednym rejonem genetycznym, tym wanie, ktry powodowa odrzucenie przeszczepu. W ten sposb zidentyfikowano kilka kompleksw genw przyczyniajcych si do odrzucania przeszczepw. Badania skoncentroway si na tym kompleksie, ktry powodowa szczeglnie szybkie odrzucanie i ktremu nadano nazw gwnego kompleksu zgodnoci tkankowej. Kompleks ten oznacza si skrtem MHC (ang. major histocompatibility complex). Kompleks ten skada si z wielu genw (rys. 11.28), z ktrych cz bierze udzia w procesie odrzucania przeszczepw a cz nie. Co warunkuje zdolno biaek MHC do odrzucania przeszczepw? Ot okazao si, e geny, a co za tym idzie, biaka MHC s w wysokim stopniu polimorficzne tzn. w obrbie gatunku wystpuje bardzo wiele alleli genw MHC (praktycznie kady osobnik w obrbie jednego gatunku ma geny lub biaka MHC rne od MHC innego osobnika, z wyjtkiem zwierzt pochodzcych z jednej linibchowu wsobnego oraz identycznych blinit). Kady osobnik ma dwa allele kompleksu MHC i oba ulegaj ekspresji (nie zachodzi tutaj, jak przy ekspresji genw Ig lub TCR, wyczanie alleliczne). Kady osobnik ma wic tosamo, zdefiniowan przez wasny zestaw biaek MHC ulokowanych na powierzchni komrek. Limfocyty cytolityczne T c odrniaj tkank wasn od cudzej, poniewa ich receptory TCR mog wiza si z obcymi biakami MHC, a wykazuj tolerancj wobec wasnych MHC. Komrki T c , wic si z obcymi MHC na powierzchni obcych komrek,

LOCUS MHC CZOWIEKA KLASA II DP DZ DO DX DO DR biako dopeniacza cytokiny TNF LT KLASA I B C A

fi a fi a

a fi fi a fi a fi fi fi a 1000 tys. par zasad LOCUS MHC MYSZY (podobne do klasy I)

KLASA I

] I I-A

KLASA II

K2 K

I-E

i
a

i cytokiny i KLASA I i biaka | dopeniacza | I-E ! TNF LT ! D L

fi 100 tys. par zasad

fi

fi

fi

fi

centromer

telomer

Rys. 11.28. Zesp genw MHC czowieka i myszy. Kompleksy maj podobn organizacj: zawieraj geny: MHC klasy I, MHC klasy II, geny kodujce biaka systemu dopeniacza i geny cytokin. Oprcz locus MHC II (DP, DQ, DR), rejon klasy II zawiera geny DZ, DO i DX, mogce by pseudogenami, ew. kodujce nie zidentyfikowane biaka. Rejon klasy I, oprcz locus MHC I (A, B, C), zawiera geny podobne, z ktrych cz to pseudogeny, a cz koduje niepolimorficzne biaka o nie znanej funkcji. Liczba genw a i fi w poszczeglnych loci ludzkiego MHC II zmienia si w zalenoci od rodzaju allelu. Kady gen a lub fi skada si z wielu egzonw, co nie zostao tu zaznaczone (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

powoduj liz tych komrek i, tym samym, odrzucenie przeszczepu. Proces edukacji grasicowej", prowadzcy do wytworzenia tolerancji wobec wasnych komrek, bdzie omwiony w dalszej czci rozdziau. Biaka, ktre decyduj 0 rozpoznawaniu komrek przez T c jako wasne lub obce, nale do klasy 1 MHC. Jak wspomniano poprzednio, limfocyt T c nie wie wasnych MHC I i nie lizuje wasnych komrek. Jednake komrki T c zwi si z wasnym MHC I, jeli biako to wystpi w kompleksie z obcym antygenem dziki temu wasne komrki nie ulegaj lizie, ale te same komrki zakaone wirusem s niszczone (rys. 11.26). 11.18. Biaka MHC uczestnicz w stymulacji syntezy immunoglobulin Chocia rola MHC w odrzucaniu przeszczepw wzbudzia wiele zainteresowania, znacznie pniej (w latach 60.) ustalono, e ten rejon genetyczny jest istotny w procesie fizjologicznej odpowiedzi immunologicznej. Wykazano

mianowicie, e myszy i winki morskie z niektrych linii chowu wsobnego nie byy w stanie wytworzy przeciwcia przeciwko prostym polipeptydowym antygenom; okazao si, e ten defekt odpowiedzi immunologicznej spowodowany by przez geny mapujce si w rejonie MHC, ktrym nadano nazw Ir (ang. immune response). Dalsze badania wykazay, e s to geny kodujce biaka MHC klasy II. Jak ju wspomniano poprzednio, s to biaka wystpujce na powierzchni niektrych typw komrek, gwnie limfocytw B oraz makrofagw i prezentujce antygen receptorom limfocytw T pomocniczych (T h ). Receptory TCR komrek TH rozpoznaj obcy antygen jedynie jako element kompleksu antygen-wasne biako MHC II. Rozpoznanie obcego antygenu w kompleksie z biakiem MHC II jest warunkiem wypenienia przez limfocyt TH jego funkcji, tzn. wspomagania limfocytw B w produkcji przeciwcia (proces opisany w dalszej czci rozdz.). Niektre biaka MHC II nie mog wiza pewnych antygenw lub wi je sabo i to moe by przyczyn braku stymulacji limfocytw wspomagajcych. W rezultacie antygeny te nie powoduj normalnej odpowiedzi immunologicznej mamy wtedy do czynienia z fenotypem Ir". 11.19. Biaka MHC s polimorficzne i nale do superrodziny immunoglobulin Stwierdzono, e wszystkie biaka klasy MHC I s dimerami zbudowanymi z wysoce polimorflcznego polipeptydu, acucha a (o masie ok. 44 kDa u czowieka) oraz ze staego polipeptydu, tzw. /J2-mikroglobuliny (ok. 12 kDa). acuch a jest kodowany przez rejon MHC, natomiast locus mikroglobuliny znajduje si poza rejonem MHC. Na podstawie sekwencji aminokwasowej wielu czsteczek MHC I i bada struktury krystalicznej kilku rodzajw MHC I, ustalono, e czsteczki te skadaj si z czterech rejonw: amino-terminalnego, wicego peptydowy antygen; zewntrzkomrkowego, o strukturze podobnej do struktury immunoglobulin; z czci transmembranowej i czci cytoplazmatycznej, C-terminalnej (rys. 11.29). Cz wica peptyd zoona jest z dwu homologicznych fragmentw (al i a2), ktre tworz bardzo charakterystyczn struktur (rys. 11.30). Jest to szczelina o rozmiarach ok. 2,5 nm x 1,0 nm x 1,1 nm, teoretycznie pozwalajcych zwiza peptyd z 10-20 aminokwasw, zalenie od konformacji. Istotne jest, e miejsce to jest zbyt mae, by zwiza cae biako, znacznie mniejsze od analogicznego miejsca immunoglobulin. Z porwnania sekwencji rnych biaek MHC wynika, e ta wanie cz jest najbardziej zmienna u rnych form allelicznych. Tak wic polimorfizm biaek MHC I tworzy podstaw do wytwarzania wielu rnych miejsc wizania antygenu. Rnorodno biaek MHC wynika jedynie z ich polimorficznoci, tzn. istnienia wielu alleli genw MHC w obrbie gatunku, nie jest natomiast wynikiem genetycznych przegrupowa somatycznych, jak ma to miejsce w przypadku Ig czy TCR.

BIAKO MHC KLASY I

BIAKO MHC KLASY II

REJON WICY PEPTYD

p ^

- 3 0 reszt aminokwasowych

REJON CYTO PLAZM ATYCZNY

C
SS miejsce wizania reszty wglowodanowej mostki dwusiarczkowe

Rys: 11.29. Schemat czsteczki biaka MHC klasy I i MHC klasy II. Rne rejony nie s narysowane w skali. N i C oznaczaj odpowiednio konic aminowy i karboksylowy acuchw polipeptydowych (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Rys. 11.30. Schemat struktury szczeliny wicej peptyd (antygen) biaka MHC I. (a) Widok caej czsteczki z boku. (b) Widok z gry na szczelin wic peptyd. Strzaki reprezentuj rejony ^-harmonijki; zwoje a spiral; ciemna kreska wizanie dwusiarczkowe (wg P.J. Bjorkman et. al, Natur, 329, 506-512, 1987, zmodyf.)

Cz MHC I podobna strukturalnie do immunoglobulin jest zoona z fragmentu a3 peptydu a, o sekwencji bardzo mao zmiennej w obrbie MHC i homologicznej do staego rejonu immunoglobulin, oraz z /J-mikroglobuliny, ktrej sekwencja rwnie jest homologiczna do rejonu staego Ig (rys. 11.29). Z bada nad zmutowanymi biakami MHC wynika, e ten stay rejon odpowiada za interakcj biaek MHC I z receptorem CD8, czyli za specyficzn interakcj komrek Tcytolitycznych z biakami MHC I. Biaka MHC II zbudowane s z dwu niekowalencyjnie poczonych polipeptydw a (32-34 kDa) i /? (29-32 kDa), przy czym oba acuchy s polimorflczne i kodowane przez rne geny kompleksu MHC (rys. 11.29). Czsteczki MHC II maj plan budowy podobny do biaek MHC I. Inaczej jednak ni w MHC I, rejon wicy peptyd skada si z elementw obu acuchw (segmenty al i /Jl). S to najbardziej polimorflczne rejony acuchw, tworzce specyficzn szczelin, bardzo przypominajc szczelin czsteczek MHC I. Rejon o budowie zblionej do immunoglobulin jest zasadniczo niezmienny w obrbie alleli okrelonej klasy genw MHC II. Sdzi si, e ta niepolimorficzna domena biaek MHC II jest odpowiedzialna za wizanie receptorw CD4 i std powinowactwo limfocytw TCD4 + (czyli pomocniczych) do biaek MHC II prezentujcych obcy antygen (rys. 11.8). Biaka MHC, ze wzgldu na podobiestwo struktury tych biaek oraz homologie na poziomie genw, zalicza si do superrodziny immunoglobulin.

11.20. Geny MHC maj bardzo wiele alleli Biaka MHC kodowane s przez kompleks genw MHC. Kompleksy tych genw u myszy nosz nazw H-2, a u czowieka HLA (ang. human leukocyte antigen). U ludzi MHC ulokowany jest w chromosomie 6, natomiast /}2-mikroglobulina zakodowana jest w chromosomie 15. Rejon MHC czowieka jest bardzo duy, obejmuje ok. 3,5 min par zasad, czyli ok. 4 cM (rys. 11.28). Geny klasy II obejmuj loci DP, DQ i DR, geny klasy I loci A, B i C. Naley zwrci uwag na fakt, e niektre loci klasy II zawieraj wicej ni jeden gen kodujcy acuch /?, lecz na og jeden acuch a. To zwiksza liczb rodzajw biaek MHC produkowanych przez komrk. W przypadku klasy I, heterozygotyczny osobnik ma 6 rnych polimorficznych alleli (trzy od kadego z rodzicw) i komrka produkuje 6 rodzajw czsteczek MHC I. W przypadku klasy II, mimo e osobnik dziedziczy tylko 6 rnych polimorficznych loci, komrka moe produkowa znacznie wicej rodzajw dimerw MHC II: ekspresji mog ulega rne geny /? w obrbie tego samego locus, ponadto mog tworzy si heterodimery z acucha a, pochodzcego z jednego allelu i z acucha /? z drugiego allelu. Zazwyczaj komrka jednego osobnika moe wytwarza 10-20 rnych czsteczek MHC II zalenie od odziedziczonych alleli. Geny MHC s najbardziej polimorflczne pord dotychczas

analizowanych. W przypadku niektrych loci MHC czowieka zidentyfikowano ponad 40 alleli. Czemu suy polimorficzno genw i biaek MHC? Uwaa si, e polimorfizm ten wytworzy si ewolucyjnie, w efekcie pozytywnej selekcji, dziki ktrej osobniki danego gatunku wytwarzaj rne biaka MHC, zdolne do wizania bardzo wielu rnych peptydw. Gdyby liczba typw MHC w populacji bya niska, mona sobie wyobrazi, e mikroorganizmy imitowayby swoje antygeny tak dugo, a powstayby struktury nie mogce wiza si z adnymi MHC. W efekcie mikroorganizmy uniknyby specyficznej odpowiedzi immunologicznej. Rejon MHC, poza genami klasy I i klasy II, zawiera geny kodujce biaka systemu dopeniacza, a take rejon kodujcy cytokiny: (TNF) i limfotoksyn (LT). 11.21. Edukacja grasicowa uczy komrki T reagowa z obcymi biakami i tolerowa wasne Receptory komrek T (TCR) s wytwarzane w sposb przypadkowy, bez wzgldu na to, jakie czsteczki MHC i jakie peptydy znajduj si w organizmie atwo wic sobie wyobrazi, e cz z nich bdzie uyteczna, cz bezuyteczna, a cz wrcz szkodliwa. Uyteczne to te, ktre mog wzi udzia w obronie organizmu, rozpoznajc obce peptydy prezentowane przez wasne MHC. Bezuyteczne to te, ktre nie potrafi rozpozna adnych peptydw prezentowanych przez wasne MHC. Szkodliwe receptory to takie, ktre mogyby zwiza si z wasnymi peptydami prezentowanymi przez wasne MHC. Prekursory komrek T powstaj w szpiku kostnym, migruj do grasicy, tu dochodzi do ekspresji receptorw na ich powierzchni, tu te nastpuje selekcja, eliminujca szkodliwe i bezuyteczne limfocyty, stymulujca rozwj uytecznych. Proces selekcji jest bardzo surowy ok. 95% modych tymocytw ginie w grasicy, poniewa nie potrafi rozpozna wasnych czsteczek MHC (selekcja pozytywna) lub te wi je bardzo mocno, z wasnym peptydem w miejscu wicym (selekcja negatywna). Ta ostatnia selekcja jest podstaw autotoleracji komrki T musz wykazywa tolerancj wobec wasnych antygenw (rys. 11.31). Istotn rol w dojrzewaniu komrek T odgrywaj komrki nabonka grasicy. Hipoteza tumaczca mechanizm selekcji pozytywnej zakada, e jeli receptor TCR dojrzewajcego tymocytu zwie si z biakiem MHC na powierzchni nabonka grasicy, nawet sabo, wtedy ten tymocyt przeyje i osignie dojrzao. Std specyficzno limfocytw do wasnych MHC. Te same komrki T, ktre zwizay si sabo z wasnymi MHC w grasicy, mog by zdolne, po przedostaniu si do ukadu obwodowego, do silnego zwizania obcego antygenu w kompleksie z wasnym MHC.

niedojrzae prekursory CD4+CD8+ limfocytw T

sabe wizanie, limfocyty uyteczne

silne wizanie, limfocyty szkodliwe brak wizania, limfocyty bezuyteczne antygen wasny

komrki przeywaj i dojrzewaj biako MHC klasy II CD 8 mier komrek, selekcja negatywna mier komrek limfocyt Tc CD8+ limfocyt TH CD4+ biako MHC klasy I

Rys. 11.31. Model selekcji limfocytw T w grasicy. Niedojrzae tymocyty, oprcz receptorw TCR, maj jednoczenie oba typy koreceptorw CD4 i CD8. W efekcie selekcji przeywaj jedynie uyteczne limfocyty, ktre, zalenie od procesw zachodzcych w grasicy, przestaj syntetyzowa jeden z typw koreceptorw i staj si limfocytami TH lub T c . Gin limfocyty, ktrych TCR niezdolne s do rozpoznania wasnych MHC I lub MHC II. Szkodliwe limfocyty, ktrych TCR mog rozpozna wasny antygen poczony z wasnym MHC I lub MHC II s eliminowane (selekcja negatywna). Proliferacji ulegaj uyteczne limfocyty, zdolne do rozpoznania antygenw zwizanych z MHC, lecz nie wasnych antygenw (wg H. Boehmer, P. Kisielw, Scientific American, p. 50 59 October 1991 zmodyf.)

Przypuszcza si, e w przypadku negatywnej selekcji delecji ulegaj klony, ktrych receptory TCR silnie wi si z wasnym antygenem prezentowanym przez komrki grasicy, gwnie makrofagi. Jednym z fundamentalnych dowiadcze, ktre przekonao badaczy o istnieniu zjawiska klonalnej delecji, by eksperyment przeprowadzony na transgenicznych myszach. Ot, uyto mutanty myszy niezdolne do prawidowego przegrupowania genw receptorw T, a tym samym do produkcji wasnych receptorw T (myszy SCID ang. severe combined immunodefficiency syndrome zoony ciki zesp niedoboru odpornoci). Do komrek myszy SCID wprowadzono funkcjonalne geny a i /? TCR, przy czym wybrano TCR wicy peptyd HY peptyd ten jest produkowany tylko w komrkach samcw mysich. Otrzymane myszy transgeniczne produkoway tylko jeden rodzaj limfocytw T limfocyty z transgenicznym TCR. Transgeniczny TCR

rozpoznawa peptyd HY w kompleksie z okrelonym biakiem MHC I MHC D*. Peptyd HY jest de facto antygenem obcym dla samic mysich, a wasnym dla samcw. Teoretycznie wic, limfocyty z transgenicznym TCR byyby szkodliwe dla samcw majcych MHC I D 5 , bo wizayby wasny antygen prezentowany przez wasne MHC, a nieszkodliwe dla samic, ktre nie produkuj HY. Do pozytywnej selekcji niezbdna byaby obecno MHC I D b , bo tylko to biako MHC moe by rozpoznane przez badany TCR. Badano wytwarzanie limfocytw z transgenicznym TCR u rnych myszy i rzeczywicie przewidywania okazay si suszne. Myszy nie majce MHC I D 5 nie wytwarzay dojrzaych limfocytw z transgenicznym TCR dziaao tu sito pozytywnej selekcji; samce myszy nie produkoway dojrzaych limfocytw dziaaa selekcja negatywna; samice wytwarzay dojrzae limfocyty dziaaa selekcja pozytywna, a nie byo negatywnej (tab. 11.4).
Tabela 11.4. Badanie selekcji limfocytw w grasicy uywajc myszy transgenicznych

Specyficzno transgenicznych TCR Antygen HY/MHC Db Antygen HY/MHC D b Antygen HY/MHC D b

Allel MHC D Db Db Db~

Ekspresja antygenu samce/H Y + samice/HY~ samice/H Y~

Selekcja pozytywna negatywana tak tak nie tak nie nie

Dojrzae limfocyty T wytwarzajce TCR nie tak nie

Myszy transgeniczne produkuj TCR specyficzne wobec antygenu HY prezentowanego przez biako MHC I kodowane przez allel MHC I Db. Antygen HY jest dla samic myszy antygenem obcym, a dla samcw wasnym. Limfocyty T, wytwarzajce transgeniczne TCR, dojrzewaj u samic majcych MHC Db, a nie dojrzewaj u samcw (w rezultacie negatywnej selekcji przez rozpoznanie wasnego antygenu) ani u samic nie majcych biaka MHC Db (w efekcie braku pozytywnej selekcji wybierajcej limfocyty rozpoznajce MHC Db).

Wyselekcjonowane limfocyty opuszczaj grasic, a ich receptory (TCR) nie ulegaj zmianom w wyniku mutacji somatycznych, jak to si dzieje u limfocytw B ma to sens biologiczny, poniewa nie kontrolowane zmiany mogyby spowodowa powstanie receptorw nie tolerancyjnych wobec wasnych czsteczek.

11.22. Odpowied immunologiczna zalena od antygenu Komrki T H , w odpowiedzi na zwizanie z antygenem, wydzielaj cytokiny, substancje biakowe zwane te limfokinami lub interleukinami, ktre stymuluj wzrost i dojrzewanie zarwno komrek T, jak i B. Poznano do tej pory wiele cytokin i lista nie jest zamknita (tab. 11.5). Wydzielanie cytokin jest krtkie i przejciowe, zwizane z przejciow stymulacj syntezy nietrwaego mRNA cytokiny.

Cytokina Interleukina 2 (IL-2) Interferon y (IFN-y)

Komrka wytwarzajca komrki T

Komrka docelowa komrki T komrki B makrofagi wszystkie komrki komrki T komrki B

Wpyw na komrk docelow wzrost, produkcja cytokin wzrost, aktywacja wydzielania przeciwcia aktywacja stymulacja syntezy biaek MHC I i MHC II stymulacja dojrzewania T c stymulacja wydzielania przeciwcia hamuje rozwj wirusw hamuje proliferacj wzmaga ekspresj MHC I wzrost wzrost, aktywacja, przeczanie izotypu do IgE ekspresja FceRIIb rnicowanie komrek krwi

komrki T

Interferon typu I (IFN-a, IFN-0) Interleukina 4 (IL-4)

makrofagi (a) fibroblasty (/?) komrki TCD4 +

wszystkie komrki

komrki T komrki B makrofagi, komrki B

Interleukina 3 (IL-3) GM-CSF

komrki T komrki T, makrofagi

niedojrzae komrki szpiku prekursory leukocytw i in. komrek krwi

stymulacja wzrostu i rnicowania granulocytw i makrofagw gwny czynnik wzrostowy rne efekty wzrost i rnicowanie limfocytw B kostymulacja aktywacja w procesach zapalnych wywoywanie gorczki przez stymulacj syntezy prostaglandyn aktywacja w procesach zapalnych

Interleukina 6 (IL-6) Interleukina 7 (IL-7) TNF

makrofagi, komrki T, inne komrki fibroblasty, komrki szpiku makrofagi, komrki T

zaktywowane komrki B, inne komrki komrki pre-B komrki T i B neutrofile i komrki nabonka komrki podwzgrza neutrofile, komrki nabonka

Limfotoksyna

komrki T

Cytokiny, jak inne polipeptydowe hormony, dziaaj przez zwizanie si ze specyficznymi receptorami na powierzchni docelowych komrek. Spoczynkowe komrki B i T maj niewielk liczb tych receptorw ich synteza jest indukowana przez zwizanie antygenu, a take przez same cytokiny.

Ten sam biegun komrki T, ktry uczestniczy w wizaniu docelowej komrki, wydziela cytokiny. W ten sposb limfocyty TH gwnie stymuluj komrki, ktre prezentuj rozpoznawane antygeny; bardzo istotna jest te autostymulacja tzn. wydzielane przez limfocyt limfokiny dziaaj na produkujc je komrk, powodujc jej wzrost i podziay (czyli proliferacj) oraz syntez receptorw. Oczywicie stymulacja przez cytokiny dotyczy take innych komrek: np. aktywacji ulegaj limfocyty T c i makrofagi. Spotkanie limfocytu B z antygenem wywouje wiele zjawisk, m.in. proliferacj limfocytu, produkcj i wydzielanie przeciwcia, mutacje somatyczne, wytwarzanie komrek pamici immunologicznej. Limfocyt B, wytworzony w szpiku kostnym, dostaje si do obwodu i yje tam zaledwie przez kilka dni, o ile nie dojdzie do interakcji jego przeciwcia powierzchniowych z antygenem. Antygeny, ktre wzbudzaj najsilniejsz odpowied immunologiczn, s poliwalentne, tzn. maj wiele determinant antygenowych w swojej strukturze, dziki czemu wiele przeciwcia na powierzchni jednej komrki B moe zwiza si z jedn czsteczk antygenu. Na powierzchni limfocytu tworzy si czapeczka zoona z przeciwcia usieciowanych antygenem, zlokalizowanych na biegunie komrki. Migracja przeciwcia jest moliwa dziki pynnoci bony lipidowo-biakowej, w ktrej zakotwiczone s przeciwciaa. Pocztkowo tworz si zgrupowania przeciwcia, ktre nastpnie zbieraj si przy biegunie limfocytu, tworzc czapeczk. Czapeczka, czyli kompleksy Ig i antygenu, jest wprowadzana do wntrza komrki w wyniku endocytozy. Jeli antygen jest biakiem, ulega degradacji do peptydw, po czym peptydy s prezentowane na powierzchni przez biaka MHC II. Mechanizm ten bardzo przypomina dziaanie makrofagw, rnica jednak istnieje i to zasadnicza: makrofagi wchaniaj, degraduj i prezentuj wszystkie antygeny bez wyboru; komrki B prezentuj tylko peptydy pochodzce ze specyficznie zwizanych przez wasny typ Ig antygenw. Aktywacja komrek B wymaga kooperacji limfocytu pomocniczego TH. Komrki TH maj receptory (TCR) rozpoznajce na og inne rejony antygenu ni limfocyty B. Jak ju wyjaniono, komrki T H rozpoznaj peptydy pochodzce z degradacji biaka antygenowego. Antygen jest degradowany przez makrofagi do peptydw, prezentowanych nastpnie na ich powierzchni w kompleksie z biakiem MHC II. Kompleks ten jest rozpoznawany przez TCR komrek TH. Po zwizaniu antygenu nastpuje aktywacja limfocytu T H i jego proliferacja (pod wpywem wydzielanych cytokin, gwnie interleukiny 2), co daje w wyniku klon limfocytw T H rozpoznajcych okrelony peptyd. Komrka B, prezentujca peptyd w kompleksie z MHC II, zostanie rozpoznana przez taki limfocyt TH, ktrego receptory TCR s zdolne do zwizania tego wanie peptydu w kompleksie z MHC II. Limfocyt TH, w efekcie zwizania z komrk B, ulegnie aktywacji, zacznie produkowa cytokiny (gwnie IL-2), ktre wywoaj wzrost i rnicowanie komrki B. W efekcie dziaania cytokin dochodzi do proliferacji okrelonego klonu komrek B, do produkcji i wydzielania przeciwcia.

antygen ulega zwizaniu przez powierzchniowe przeciwciaa antygen jest degradowany w komrce B ANTYGEN k (biako) antygen < ulega wchoniciu przez makrofagi makrofag degraduje antygen przeciwciaa wi antygen

limfocyt TH wie kompleks peptyd-MHC U i wydziela cytokiny komrka B prezentuje peptyd w kompleksie z MHC I I

komrka B, stymulowana przez cytokiny, tworzy klon KLON LIMFOCYTW B WYDZIELAJCYCH PRZECIWCIAA

biako MHC makrofag prezentuje peptyd w kompleksie z MHC n

receptor TCR cytokiny stymuluj proliferacj komrki TH LIMFOCYT T h rozpoznaje peptyd w kompleksie z MHC I I i wydziela cytokiny

KLON KOMOREK TH z receptorami TCR rozpoznajcymi peptyd-MHCII

Rys. 11.32. Aktywacja komrek B z udziaem komrek T-pomocniczych. Antygen biakowy wnikajcy do ustroju jest rozpoznawany przez dziewicze komrki B majce specyficzny rodzaj przeciwcia. Kompleks Ig-antygen wnika do wntrza, ulega degradacji; peptydy s prezentowane w kompleksie z MHC II na powierzchni limfocytu B. Komrki makrofagw take wchaniaj antygen, degraduj go i prezentuj na powierzchni w kompleksie z MHC II. Komrki pomocnicze TH z receptorami TCR specyficznymi wobec kompleksu peptyd-MHC wi kompleks prezentowany przez makrofaga, co powoduje uaktywnienie komrki TH, produkcj cytokin i receptorw cytokin na powierzchni, przy czym najsilniejszej stymulacji ulega synteza interleukiny 2 (IL2). Pod wpywem cytokin (gwnie IL2) komrki T ulegaj proliferacji. Klon ten rozpoznaje identyczny peptyd prezentowany przez MHC II na powierzchni limfocytw B. Zwizanie limfocytu TH z komrk B powoduje aktywacj komrki T, produkcj cytokin, ktre powoduj proliferacj klonu komrek B i ich dojrzewanie. W efekcie powstaje klon komrek plazmatycznych wydzielajcych przeciwciaa (wg Molecular Celi Biology, ed. Darnell, Lodish, Baltimore, Scientific American Books, New York 1990 zmodyf.)

Wydzielanie przeciwcia wymaga wic kooperacji specyficznych komrek B ze specyficznymi komrkami T H (rys. 11.32). Uwaa si, e zwizanie antygenu jest momentem inicjujcym aktywacj limfocytu B: w efekcie dziaania nie wyjanionego mechanizmu spoczynkowa komrka B wchodzi w cykl komrkowy (przechodzi z fazy G 0 do fazy Gt) i nastpuje wzrost syntezy receptorw cytokin jest to stan gotowoci do

odebrania sygnaw pochodzcych od komrki TH. Gwn rol odgrywaj tu interleukiny: 2, 4, 5 i 6. W opisanym procesie jeden antygen biakowy jest rozpoznawany przez dwa rodzaje komrek: B i TH i tylko komrki specyficzne wobec antygenu ulegaj aktywacji oraz proliferacji. Jak istotn rol w prezentowaniu antygenu odgrywaj makrofagi? Sdzi si, e niezbdne s przede wszystkim w pierwotnej odpowiedzi immunologicznej, kiedy organizm styka si z biakowym antygenem po raz pierwszy i kiedy liczba komrek B zdolnych do rozpoznania antygenu jest bardzo maa wtedy do aktywacji komrek TH potrzebne s makrofagi. We wtrnej odpowiedzi immunologicznej, kiedy istniej powikszone pule klonw komrek B, mog one by gwnymi komrkami prezentujcymi antygen. 11.23. Antygeny stymulujce syntez przeciwcia niezalenie od komrek T Omwiony proces stymulacji produkcji przeciwcia przez limfocyty B wymaga uczestnictwa komrek T-pomocniczych (TH). Jest to proces typowy dla antygenw biakowych. Stwierdzono, e pewna grupa antygenw stymulowaa syntez specyficznych przeciwcia u pozbawionych grasicy (a wic i komrek T) myszy. Naley tu m.in. lipopolisacharyd (LPS), skadnik bon bakterii gramujemnych. Sdzi si, e samo zwizanie LPS z komrk B wystarcza do jej aktywacji, z pominiciem cytokin. Rwnie wiele polisacharydw (dekstrany, polisacharydy pneumokokw) dawao podobny efekt. Mechanizm indukcji nie jest znany. Praktyczne znaczenie tego zjawiska jest due, poniewa polisacharydy stanowi istotny element bakteryjnych cian komrkowych. 11.24. Zaktywowana komrka B wydziela przeciwciaa Efektem aktywacji komrki B jest ogromna intensyfikacja syntezy przeciwcia, przy czym stwierdzono, e nie dochodzi tu do znacznego wzmoenia syntezy specyficznego dla immunoglobulin mRNA, natomiast znacznie wzrasta stabilno tego mRNA. W regulacji Ig istotna jest take kontrola na poziomie translacji. Mechanizm tych regulacji jest jeszcze sabo poznany. Finalnym efektem dojrzewania komrki B jest komrka plazmatyczna, zawierajca wicej cytoplazmy i retikulum endoplazmatycznego (siateczki rdplazmatycznej) ni komrka macierzysta, wyspecjalizowana w sekrecji biaek, z duym aparatem Golgiego taka komrka wydziela Ig, ktre stanowi mog do 10% wszystkich biaek syntetyzowanych przez komrk. Komrka plazmatyczna traci zdolno do proliferacji, nie ulega dalszym podziaom i ginie po wielu dniach produkcji przeciwcia. Wydzielanie Ig wie si z faktem, e w zaktywowanej komrce B dochodzi do syntezy zmienionego acucha cikiego (H). Ig znajdujca si na powierz-

chni nie zaktywowanej komrki B to zwizana z bon immunoglobulina typu IgM. Zwizana z bon IgM jest klasycznym monomerem (zoonym z dwu acuchw H i dwu L), w odrnieniu od wydzielanej IgM, ktra jest pentamerem. IgM jest zakotwiczona w bonie przez hydrofobowe rejony obu acuchw H, znajdujce si na C-kocu. Gen kodujcy acuch H IgM zawiera osiem egzonw: egzon peptydu liderowego, egzon rejonu V, cztery egzony kodujce cztery domeny rejonu staego i dwa egzony rejonu transmembranowego oraz cytoplazmatycznego (rys. 11.33).

Rys. 11.33. Ekspresja formy wydzielanej oraz membranowej acucha H immunoglobuliny IgM. Alternatywne skadanie pierwotnego transkryptu powoduje wytworzenia mRNA formy wydzielanej (pis) lub membranowej (jum) acucha \i. Przerywane linie wskazuj te segmenty, ktre zostan poczone przy skadaniu RNA. TM i CY oznaczaj segmenty transmembranowy i cytoplazmatyczny, odpowiednio: CJ.-C^ s czterema egzonami genu (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. SaundersCo., Philadelphia 1991 zmodyf.)

Czsteczka mRNA kodujca acuch H formy bonowej (jum) jest poliadenylowana za ostatnim egzonem. W efekcie skadania mRNA i translacji otrzymuje si biako jum. Koniec C-terminalny wydzielanej formy acucha H (jus) jest kodowany przez segment DNA bezporednio za egzonem szstym. Czsteczka mRNA formy n s ulega poliadenylacji tu za rejonem kodujcym C-koniec acucha ju5, a egzony kodujce C-koniec formy fim ulegaj odciciu. W efekcie tego procesu, oba typy mRNA rni si kocami 3', a wic koduj rne C-koce acucha H IgM. Struktura kocw C-terminalnych w peni zgadza sie z rnym zachowaniem si acuchw fxm i fxs. Koniec fxm zawiera cig 26 niepolarnych aminokwasw, ograniczony z obu stron grupami naadowanych aminokwasw, co tworzy klasyczn domen transmembranow. Forma wydzielana nie ma domeny transmembranowej, natomiast zawiera reszt cysteiny, uczestniczc w tworzeniu mostka dwusiarczkowego, ktry wie monomery (kady zoony z czterech acuchw) w pentamery. Forma ta ma take miejsce glikozylacji, co przypuszczalnie czyni czsteczk Ig lepiej rozpuszczaln. Tak wic,

dziki alternatywnej poliadenylacji mRNA, kada komrka B moe syntetyzowa zarwno form membranow, jak i wydzielan IgM. W miar postpowania procesu rnicowania limfocytu wzrasta ilo formy wydzielanej. Wszystkie inne geny CH zawieraj podobne egzony kodujce cz transmembranow tak wic acuchy cikie wszystkich typw Ig mog ulega ekspresji jako forma zwizana z bon bd wydzielana, chocia IgD rzadko wystpuje w formie wydzielanej. Poniewa mRNA acuchw \im i \is rni si miejscem poliadenylacji, przypuszcza sie, e kontrola poliadenylacji moe by odpowiedzialna za przejcie z formy membranowej w form wydzielan, mechanizm ten jednak nie jest wyjaniony. Synteza acuchw H przeciwcia w wyniku alternatywnego wykorzystania tej samej sekwencji DNA zapewnia identyczno rejonw zmiennych (V) przeciwcia membranowych i wydzielanych oraz jest tym samym kluczowym mechanizmem umoliwiajcym funkcjonowanie mechanizmu selekcji klonalnej.
D
ji mRNA skadanie RNA miejsca poliadenylacji

C?
AAA

ciki acuch (t

pierwotny transkrypt RNA

d mRNA

ciki aiScuch 6

Rys. 11.34. Koekspresja IgM i IgD w limfocytach B. Alternatywne przeksztacanie pierwotnego transkryptu prowadzi do wytworzenia fi lub mRNA. Przerywane linie wskazuj te segmenty acucha H, ktre ulegaj poczeniu w procesie skadania mRNA

Opisany mechanizm, polegajcy na wykorzystaniu alternatywnego przeksztacania transkryptu, nie jest ograniczony jedynie do przejcia Ig z formy membranowej do wydzielanej. Istniej dwa rodzaje dziewiczych komrek B: jedne zawieraj zwizane z bon IgM, inne posiadaj IgM oraz IgD. Oba typy przeciwcia rni si tylko rejonami staymi (C) acuchw cikich. Czsteczki mRNA IgM i IgD tworz si przez alternatywn poliadenylacj pierwotnego transkryptu (rys. 11.34).

11.25. Zaktywowany limfocyt B wytwarza wtrne przeciwciaa W efekcie stymulacji przez antygen, zaktywowane komrki B, ktre dotychczas wytwarzay tylko IgM lub IgM i IgD, rozpoczynaj syntez wtrnych przeciwcia, tzn. IgG, IgE lub IgA, rnicych si od pierwotnych jedynie struktur acuchw cikich. W procesie tym, okrelanym jako przeczanie izotypw, dochodzi wic tylko do przeczenia syntezy acuchw H jednego typu na syntez acuchw H innego typu. W przejciu do syntezy wtrnych Ig naley rozway proces rekombinacji DNA, prowadzcy do przegrupowa w genie acucha H. W kierunku 3' od rejonu VDJ znajduj si kolejno segmenty kodujce rejony stae ( Q rnych typw immunoglobulin: Cfi, Cy, Cs i Ca (rys. 11.17 i 11.35). Tak wic, jeli delecji ulegn egzony od Cfi do Cy, rejon VDJ poczy si z Cs i syntetyzowane bd acuchy IgE. Uwaa si, e rekombinacja DNA odbywa si w specyficznych rejonach, znajdujcych si w intronach, w pobliu koca 5' kadego (z wyjtkiem C<5) segmentu C. Rejony te zawieraj liczne powtrzenia krtkich sekwencji, mogcych rekombinowa midzy sob. Efektem rekombinacji jest delecja odcinkw DNA i poczenie rejonu VDJ z okrelonym rejonem C. Dalszym etapem bdzie powstanie mRNA, ktry ulegnie poliadenylacji za przyczonym rejonem C (rys. 11.35). Omwiony model nie tumaczy jednak jednoczesnego wytwarzania rnych typw acuchw cikich przez jedn komrk B, co obserwuje si czsto u zwierzt oraz w hodowlach stymulowanych antygenem. Sdzi si, e oprcz
przegrupowany DNA w komrce produkujcej IgM

DJ

delecja genw C i czenie segmentw

przegrupowany DNA w komrce produkujcej IgE

V Dj\

CE

L
pierwotny transkrypt RNA

|
I

transkrypcja

skadanie RNA

L
mRNA C

V DJ

Cs

H
ciki acuch typu s

AAA

Rys. 11.35. Przeczanie izotypw: przejcie od syntezy pierwotnych przeciwcia (IgM) do syntezy wtrnych przeciwcia (IgE). Przegrupowaniu ulega gen acucha H. Przed segmentami C znajduj si rejony ulegajce rekombinacji ( ) (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

mechanizmu polegajcego na rekombinacji DNA, funkcjonuje take alternatywne przeksztacanie mRNA acuchw cikich, podobnie jak w procesie umoliwiajcym jednoczesn produkcj IgM i IgD, a take form membranowych i wydzielanych przeciwcia. Zmiana typw przeciwcia, syntetyzowanych przez jedn komrk B sprawia, e zaktywowana komrka kolejno wytwarza IgM lub IgM i IgD, a nastpnie dominowa zaczynaj przeciwciaa wtrne, a wic IgG, IgE lub IgA. Co jest niezwykle istotne z punktu widzenia selekcji klonalnej, wszystkie klasy przeciwcia produkowane przez dan komrk B maj te same rejony zmienne (F), czyli t sam specyficzno wobec antygenu. Przeczanie syntezy acuchw cikich nie jest procesem przypadkowym, lecz regulowanym przez komrki wspomagajce TH i wytwarzane przez nie cytokiny. I tak np. produkcja IgE jest stymulowana przez interleukin-4 (IL-4). Podobnie y-interferon (IFN-y) indukuje syntez Ig2a u myszy. Przypuszcza si, e cytokiny specyficznie zmieniaj struktur chromatyny tak, e rejony, w ktrych ma zaj rekombinacja oraz okrelone rejony CH staj si dostpne dla czynnikw regulujcych rekombinacj i transkrypcj. Kierunek przeczania syntezy (do y, e lub a) zaley przede wszystkim od rodzaju antygenu: pasoyty skry indukuj IgE, podczas gdy pasoyty jelitowe indukuj IgA. Rodzaj syntetyzowanych limfokin zaley przypuszczalnie od rodzaju patogenu.

11.26. Geny immunoglobulin ulegaj somatycznym mutacjom Rejon zmienny (V) przeciwcia, powstajcy w efekcie procesu rekombinacji elementw V9 D i jest stabilny tylko do momentu aktywacji limfocytu B. Zwizanie antygenu i obecno komrek T indukuje proces mutacji somatycznych, wystpujcych przede wszystkim w rejonie V9 co prowadzi do jeszcze wikszego zrnicowania rejonw zmiennych przeciwcia. Niektre z tych mutacji daj w efekcie receptory (tzn. przeciwciaa zwizane z bon) o zwikszonym powinowactwie wobec antygenu. Komrki B produkujce takie receptory s preferencyjnie stymulowane przez antygen i komrki T H do proliferacji, rnicowania si i wydzielania przeciwcia. W efekcie tego procesu, w trakcie odpowiedzi immunologicznej pojawiaj si w obiegu przeciwciaa o coraz wikszym powinowactwie do antygenu, co zapewnia skuteczniejsz obron przed patogenami. Omawiane mutacje s mutacjami punktowymi, wystpujcymi z czstotliwoci co najmniej jedna mutacja na rejon V na jedno pokolenie komrkowe, co odpowiada 10 _ 3 -10~ 4 na zasad na pokolenie. Jest to czsto 106 razy wysza ni w przypadku mutacji spontanicznych w innych genach. Mutacje te wystpuj w obu acuchach, praktycznie jedynie w sekwencjach tworzcych rejon V i w najbliszym ssiedztwie. Najwysza czsto dotyczy rejonw nadzmiennych CDR, czyli odpowiedzialnych za wizanie antygenu.

Mutacje te zostaj zachowane w komrkach pamici immunologicznej, tak wic wtrna odpowied immunologiczna zawiera przeciwciaa o wyszym powinowactwie wobec antygenu ni odpowied pierwotna. Nie jest wyjaniony mechanizm, ktry doprowadza do wysokiej czstoci mutacji w tak cile okrelonym rejonie genu. Badania nad myszami transgenicznymi, ktrym wszczepiano rne fragmenty genw Ig, sugeruj, e nawet odlege od rejonu V sekwencje (m.in. rejon pooony w kierunku 3' od genu CK acucha lekkiego) bior udzia w regulacji omawianej mutagenezy. 11.27. Tolerancja komrek B wobec wasnych antygenw organizmu Nadal nie jest w peni zrozumiae, dlaczego komrki B nie produkuj przeciwcia skierowanych przeciwko wasnym antygenom organizmu. Autotolerancja komrek B jest wynikiem dwu zjawisk: (a) delecji klonalnej, czyli mierci niedojrzaych limfocytw, ktre reaguj z wasnymi antygenami; (b) anergii, czyli funkcjonalnej inaktywacji limfocytw, ktre rozpoznay wasny antygen. Klonalna delecja limfocytw B zostaa zademonstrowana w eksperymentach z myszami transgenicznymi, u ktrych nastpowaa ekspresja genw kodujcych przeciwciaa specyficzne wobec biaka MHC I typu H-2Kfc. W przypadku, gdy transgeny ulegay ekspresji u takich myszy, ktre nie wytwarzay biaka MHC typu H-2Kfc, wikszo obwodowych limfocytw B wytwarzaa transgeniczne przeciwciaa (przegrupowanie wasnych, endogennych genw Ig byo blokowane przez wyczenie alleliczne). Jednake, gdy transgeny ulegay ekspresji u myszy majcych MHC H-2K*, peryferyjna tkanka limfatyczna zawieraa obnion liczb limfocytw B i aden z przeywajcych limfocytw B nie wytwarza transgenicznych przeciwcia. Tak wic, interakcja rozwijajcych si komrek B, specyficznych wobec wasnego biaka MHC, z wasnym MHC, prowadzi do delecji tych klonw B. Uwaa si jednak, e delecja klonalna nie jest gwnym mechanizmem autotolerancji limfocytw B gwn rol odgrywa tu anergia klonw rozpoznajcych wasny antygen. Istotno anergii klonw zademonstrowano w przekonywajcych dowiadczeniach z myszami transgenicznymi. Skonstruowano dwa rodzaje myszy: jeden, produkujcy lizozym jaja kurzego oraz drugi, produkujcy przeciwciaa przeciwko lizozymowi, dziki obecnoci transgenw kodujcych odpowiednie acuchy H i L. Po skrzyowaniu obu rodzajw myszy otrzymano potomstwo, ktre jednoczenie produkowao lizozym i miao geny kodujce przeciwciaa przeciw lizozymowi, wykazywao jednak tolerancj wobec lizozymu. Lizozym by traktowany jako biako wasne. W pokoleniu F x nie wykrywano przeciwcia przeciw lizozymowi, nawet po immunizacji lizozymem, mimo e wszystkie komrki B miay geny kodujce te przeciwciaa. Stwierdzono, e wytwarzana

bya bardzo niewielka liczba tych przeciwcia, jedynie w formie zwizanej z bon. Tak wic, autoreagujce limfocyty nie s eliminowane, lecz zablokowana jest ich aktywacja ulegaj anergii. Molekularne podoe autotolerancji jest nadal bardzo sabo poznane. 11.28. Wirus HIV wywouje AIDS AIDS (ang. auired immunodeficiency syndrome) zosta opisany na pocztku lat 80., jako zesp bardzo zrnicowanych objaww klinicznych spowodowanych zaamaniem systemu odpornociowego w efekcie zakaenia wirusem HIV (ang. human immunodeficiency virus). HIV infekuje limfocyty T majce receptory CD4 (czyli limfocyty pomocnicze TH) oraz makrofagi. Poniewa komrki te s absolutnie niezbdne w odpowiedzi immunologicznej, efekty zakaenia s dramatyczne i prowadz do mierci zainfekowanej osoby. Wirus HIV naley do grupy retrowirusw jego wirion zawiera dwie identyczne nici RNA (kada ma 9,2-9,7 tysicy par zasad), upakowane w biakowym kapsydzie otoczonym membranow otoczk. Otoczka membranowa pochodzi z komrki gospodarza, zawiera jednak kodowane przez wirus glikoproteiny: gp 120 i gp 41 (rys. 11.36(a)). Infekujcy wirus wie si z bon atakowanej komrki dziki interakcji gpl20 z receptorem CD4, po czym nastpuje fuzja otoczki wirionu z bon komrkow, co powoduje wniknicie genomu wirusa do wntrza. Odwrotna transkryptaza syntetyzuje dwuniciowy DNA na matrycy RNA, a integraza integruje DNA do chromosomu gospodarza wirus wchodzi w faz prowirusa. Prowirus moe by nieaktywny transkrypcyjnie przez miesice i lata mamy wtedy do czynienia z faz ukryt rozwoju wirusa. Geny prowirusa mog ulega transkrypcji, ktra jest kontrolowana przez sekwencje LTR (LTR zawiera promotor i enhancery) i stymulowana prawdopodobnie przez zwizanie antygenu do receptorw TCR limfocytu T oraz przez cytokiny. Jak wida, rozwj wirusa jest stymulowany przez te same czynniki (tzn. antygen i cytokiny), ktre powoduj fizjologiczn proliferacj komrek T w normalnej odpowiedzi immunologicznej, czyli infekcja wywoujca reakcj obronn organizmu moe pobudza namnaanie wirusa HIV i jego wyjcie z fazy ukrytej. Sdzi si, e stymulacja TCR i cytokiny powoduj indukcj biaek regulatorowych, ktre nastpnie wi si z sekwencjami w LTR. W wyniku stymulacji transkrypcji DNA prowirusa, syntetyzowane s biaka wirusowe oraz czsteczki RNA penej dugoci (genomowe), po czym dochodzi do zapakowania RNA i czsteczek polimerazy w kapsydy biakowe. Te czstki nukleoproteinowe s nastpnie otaczane bon komrkow inkrustowan biakami wirusa i wypczkowuj z komrki. Produkcja wirusa powoduje liz komrki (np. rys. 11.37). Wpyw wirusa HIV na organizm jest wikszy ni wynika to z liczby zainfekowanych produktywnie limfocytw T. Limfocyty, ktre nie ulegy lizie, te nie funkcjonuj normalnie.

(b)

Rys. 11.36 (a). Budowa wirusa HIV-1. Wirus zawiera dwie nici RNA (nici+) powizane z odwrotn transkryptaz, umieszczone w kapsydzie z biaek p24 i pl7, osonitym otoczk membranow z wirusowymi biakami gp 41 i gpl20. (b) Geny wirusa HIV. Genom HIV ma elementy typowe dla retrowirusw: gag kodujcy biaka kapsydu; env kodujcy biaka otoczki; pol kodujcy odwrotn transkryptaz, integraz i proteaz enzymy konieczne w rozwoju wirusa. Dodatkowo ma co najmniej sze innych genw (vpr, vif, tat, rev, nef, vpu), regulujcych rozwj wirusa. Genom oflankowany jest typowymi dla retrowirusw sekwencjami LTR. Zakreskowane i pokratkowane segmenty, oznaczone strzakami to elementy niecigych genw, ktre cz si w procesie skadania mRNA (wg R.C. Galio, Scientific American, 1987 zmodyf.)

Makrofagi ulegaj infekcji albo ze wzgldu na posiadane przez nie receptory CD4 (maj ich mniej ni limfocyty T), albo m.in. w wyniku fagocytozy zainfekowanych wirusem komrek. Makrofagi nie ulegaj lizie pod wpywem HIV, stanowi wic jego gwny skad. Zainfekowane makrofagi nie mog peni swojej normalnej funkcji immunologicznej. Midzy innymi uwaa si, e upoledzona jest ich zdolno do prezentacji antygenu ze wzgldu na obnienie iloci biaek MHC klasy II. Dlaczego odpowied immunologiczna nie wystarcza do ochrony organizmu przed wirusem HIV? Po pierwsze, wirus niszczy lub inaktywuje komrki

gp120 wie si z CD4 wirus wnika do komrki otoczka usunita odwrotna transkryptaza DNA prowirusa zintegrowany DNA prowirusa

pczkowanie dojrzaych wirusw

^ ^

faza produktywna rozwoju wirusa

skadanie wirionw

synteza biaek wirusa liza komrki mRNA wirusa

aktywacja produkcji wirusa (stymulacja TCR, cytokiny)

Rys. 11.37. Cykl rozwojowy wirusa HIV. Schematycznie przedstawiono fazy infekcji ukrytej i produktywnej (wg A.K. Abbas, A.H. Lichtman, J.S. Pober, Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Co., Philadelphia 1991 zmodyf.)

niezbdne w tej odpowiedzi. Po drugie, HIV wykazuje bardzo wysok czsto mutacji punktowych, insercji i delecji, a take rekombinacji midzy szczepami. To wywouje jego zmienno antygenow, utrudniajc ochron. Ponadto odpowied immunologiczna przeciw wirusowi moe niszczy wasne, nie tylko zainfekowane komrki. Do tej pory nie udao si uzyska skutecznej szczepionki. Niestety, okazao si, e najbardziej immunogenne elementy czsteczki s funkcjonalnie mao istotne (przeciwciaa nie hamuj rozwoju wirusa) i ponadto bardzo zmienne.

12. UDZIA GENW W PROCESIE NOWOTWORZENIA

Nowotwory zoliwe mona zaliczy do swoistego rodzaju choroby genetycznej. W historii nowotworw od momentu zapocztkowania do kocowej fazy progresji wystpuje gbokie rozchwianie genomu i pojawiaj si mutacje w wielu genach. Proces nowotworowy ma wieloletni przebieg, a jego faza kliniczna moe mie niekiedy gwatowny przebieg. Etiologia chorb nowotworowych jest zoona. Szacuje si, e ok. 70-80% wszystkich nowotworw powstaje w wyniku dziaania na organizm wielu czynnikw rodowiskowych (w tym rwnie nawykw, takich jak np. palenie tytoniu). Nowotwory zoliwe pojawiaj si w kadej grupie wiekowej. Najczciej jednak dotycz ludzi starszych (powyej 30-40 lat ycia). W tym rozdziale omwimy wybrane grupy genw, ktrych udzia w powstaniu i rozwoju nowotworw wydaje si istotny. Zdajemy sobie spraw, e przy szybkim postpie wiedzy, omwienie to jest wycinkowe i nie zamknite, ale wskazuje kierunek i hierarchi bada prowadzonych w tej dziedzinie. 12.1. Komrki nowotworowe rni si od komrek prawidowych wieloma cechami biologicznymi Nowotwr zoliwy jest populacj zmienionych komrek somatycznych w wielokomrkowym organizmie i wykazuje charakterystyczne cechy biologiczne, takie jak: (a) niekontrolowane i nadmierne namnaanie nienormalnych odmian wasnych komrek organizmu poczone z utrat funkcjonalnej specjalizacji; (b) narastajce zezoliwienie odrnicowanych" komrek, objawiajce si zdolnoci do infiltracji i niszczenia ssiednich prawidowych tkanek;

(c) zdolno do tworzenia przerzutw do tkanek i narzdw odlegych od ogniska pierwotnego; (d) nieodwracalno procesu nowotworowego. Cechy te odnosz si do procesu nowotworowego w peni jego rozwoju w zaawansowanej, dostrzegalnej klinicznie fazie. Pocztkowe fazy rozwoju nowotworu przebiegaj jednak w sposb skryty, niedostpny dla obserwacji klinicznej i zajmuj zwykle dugi czas (okres utajenia). 12.2. Proces nowotworowy rozwija si w cigu dugiego czasu i jest procesem wieloetapowym obejmujcym faz inicjacji, promocji i progresji Niekiedy udaje si okreli czas utajenia, zwaszcza jeli zachodzi wyrany zwizek midzy pojawieniem si nowotworu a jednorazow lub ostatni ekspozycj na znany czynnik rakotwrczy (napromieniowanie, kontakt z czynnikiem chemicznym). U czowieka czas utajenia zawiera si w granicach od kilku lat (np. biaaczki u ludzi napromieniowanych w czasie wybuchu bomb atomowych) do 20-30 lat (nowotwory u ludzi eksponowanych na chemiczne czynniki rakotwrcze). Proces powstawania nowotworu zoliwego jest procesem dugotrwaym i wieloetapowym. Koncepcja wieloetapowego rozwoju nowotworu oparta jest na badaniach nad chemiczn indukcj raka skry u myszy i rakowacenia brodawczakw skry u krlika. Postuluje si, e pierwsz faz w naturalnym rozwoju nowotworu zoliwego jest inicjacja (zapocztkowanie). U myszy i krlikw faz inicjacji mona indukowa dziaajc na skr chemicznymi czynnikami rakotwrczymi. Faza ta odnosi si do pojedynczej komrki, ktra zostaje trwale zmieniona przez czynnik rakotwrczy. Komrka zachowuje pitno tej zmiany, moe pozosta przez dugi czas w stanie upienia" Zmiany te maj charakter zmian nieodwracalnych, przekazywanych komrkom potomnym. Natura tych zmian nie jest w peni poznana. Sdzi si, e polegaj one gwnie na indukowaniu przez czynnik rakotwrczy mutacji, ktra powoduje, e komrka dzieli si w sposb nie kontrolowany i jednoczenie ogranicza zdolno do realizacji programu rnicowania. Morfologicznym przejawem fazy inicjacji mog by tzw. stany przedrakowe (hiperplazja, czyli rozrost, tj. powikszenie masy tkanki wskutek zwikszenia liczby komrek) i dysplazja, czyli nieprawidowo w budowie tkanki. Morfologicznie faza ta ujawnia si w postaci wybujaych naroli skry, zwanych brodawczakami. Tylko niektre z komrek dysplastycznych nosz pitno inicjacji. Tak zmieniona komrka moe wej w kolejn faz promocji. W modelowym systemie indukcji raka skry u myszy czynnikiem promocyjnym by olej krotonowy, a cile mwic zawarte w nim estry forbolu. W fazie promocji komrka z pitnem inicjacji zostaje pobudzona do podziaw. Jednoczenie pojawiaj si pierwsze cechy zoliwego" fenotypu:

zwikszona ruchliwo komrek, utrata funkcjonalnej cznoci z ssiednimi komrkami prawidowymi, inwazyjno (naciekanie ssiednich zorganizowanych tkanek) i utrata swoistych funkcji enzymatycznych. Do tej pory nie wiadomo, czy na etapie promocji mamy do czynienia z wieloma nowymi mutacjami, czy te obserwowane zmiany fenotypowe s spowodowane mechanizmami epigenetycznymi. W fazie promocji czasem pojawiaj si zmiany w strukturze i liczbie chromosomw. W fazie promocji niektre cechy fenotypowe (np. zahamowanie rnicowania i inwazyjno) mog zosta odwrcone. Fakt ten wykorzystuje si nawet w praktyce, stosujc np. w zmianach przedrakowych, takich jak rogowacenie biae luzwek, rne czynniki antypromocyjne: retinoidy, niektre hormony, cykliczne nukleotydy i inne. Chocia w procesie powstawania nowotworw przejcia midzy poszczeglnymi fazami s pynne, wielostopniowy charakter rozwoju nowotworw w wielu typach nowotworw zoliwych jest wyranie widoczny. Kocow faz rozwoju nowotworu zoliwego jest progresja. Termin ten okrela postpujce i nasilajce si zezoliwienie" komrek. Komrki nowotworowe przechodz w faz coraz to intensywniejszego wzrostu (podziaw).

12.3. W fazie progresji postpuje proces utraty kontroli nad podziaami komrek nowotworowych W fazie progresji wzrost komrek staje si autonomiczny, to jest niezaleny od regulacji hormonalnej i od czynnikw wzrostowych i innych regulatorowych sygnaw wytworzonych przez inne komrki. Niektre komrki nowotworw (zwaszcza guzw litych) zaczynaj wytwarza czynniki angiogenne, niezbdne do tworzenia si sieci naczy krwiononych. Proces unaczynienia (angiogeneza) odgrywa wan rol we wzrocie nowotworw: nie majce odpowiedniego unaczynienia nowotwory osigaj wielko zaledwie kilku milimetrw szeciennych i czsto gin. Komrki nowotworowe zaczynaj wydziela czynniki wzrostowe, ktre dziaaj autokrynnie, prowadzc do jeszcze bardziej .intensywnego namnaania si. Geny kodujce enzymy proteolityczne (np. kolageneza IV) ulegaj ekspresji. Ekspresja nowych antygenw na powierzchni komrek rakowych indukuje wiele oddziaywa ze strony systemu obronnego gospodarza. Sekrecja czynnikw peptydowych przez komrki nowotworowe pobudza ssiadujce komrki prawidowe do wydzielania swoistych peptydw (ang. scatter factor), ktre kolei potguj mobilno i inwazyjno komrek nowotworu. W fazie progresji powstaj liczne mutacje i aberracje chromosomalne. Pojawia si aneuploidia. Rozchwianie i dezorganizacja genomu komrek nowotworowych jest w tym okresie wyrana. W fazie tej przejawia si dziaanie selekcji, prowadzce do powstawania klonw najbardziej przystosowanych do autonomicznego wzrostu. Ostatni faz w rozwoju nowotworw zoliwych jest faza tworzenia przerzutw (metastaz). Komrki nowotworowe odrywaj si od gwnej masy

nowotworu i przenikaj do ukadu naczy krwiononych lub limfatycznych. Krce w krwiobiegu komrki zasiedlaj inne tkanki oraz narzdy i tworz nowe skupiska komrek nowotworowych, zwane przerzutami. Nieodwracalno procesu nowotworowego i fakt, e z komrki nowotworowej po podziale powstaj zawsze dwie potomne komrki nowotworowe wskazuje, e istota procesu rakowacenia polega na trwaym uszkodzeniu informacji genetycznej.

12.4. Nowotwory zoliwe u czowieka s skutkiem dziaania wielu czynnikw etiologicznych Dowiadczenia na zwierzcych modelach wskazuj, e wiele rnorodnych czynnikw moe indukowa nowotwory zoliwe i pobudza promocj oraz progresj procesu nowotworowego. Czynniki inicjujce nazywamy oglnie czynnikami rakotwrczymi lub kancerogennymi, a te ktre pobudzaj promocj promotorami. Problematyka dowiadczalnej kancerogenezy jest niezwykle zoona, a efektywno procesu zaley od wielu elementw, nie tylko takich, jak rodzaj czynnika rakotwrczego, ale rwnie gatunek zwierzcia uytego do dowiadczenia, tkanka lub narzd docelowy, aktywno enzymatyczna gospodarza (np. zdolno do metabolizowania i wydalania chemicznego kancerogenu, zdolno reperacji uszkodze materiau genetycznego itd.), wspdziaanie czynnika rakotwrczego z innymi czynnikami takimi, jak mitogeny, promotory itp. Efekt zaley rwnie od drogi wprowadzenia czynnika rakotwrczego, czasu i rytmu podawania, dawki i wielu innych parametrw. Ostatecznym sprawdzianem czy okrelony zwizek chemiczny, promieniowanie jonizujce lub zakaenie wirusowe moe by zaliczone do kategorii czynnikw rakotwrczych u ludzi s obserwacja kliniczna i badania epidemiologiczne populacji ludzi eksponowanych w naturalnych warunkach na okrelone czynniki szkodliwe. Wiele obserwacji wskazuje na zoon etiologi chorb nowotworowych. W powstawaniu nowotworw u ludzi odgrywaj rol: (a) czynniki rodowiskowe (naraenie na czynniki rakotwrcze zwizane z wykonywaniem zawodu, palenie tytoniu, skaenie rodowiska zwizkami chemicznymi, skaenie ywnoci, dieta); (b) infekcje niektrymi wirusami, np. wirusem Epsteina-Barr, wirusami grupy brodawczakw (ang. papilloma), wirusami zapalenia wtroby oraz wirusem biaaczki limfocytw T typu 1 (ang. human T celi leukemia virus type 1, TLV-1); (c) dysfunkcje hormonalne; (d) predyspozycje genetyczne. Przypuszcza si, e czynniki rodowiskowe przyczyniaj si si do powstawania ok. 80% oglnej liczby przypadkw nowotworw, infekcje wirusowe do ok. 20%, a predyspozycje genetyczne, do 1-2%.

Wrd zwierzt (gryzonie, ptaki, naczelne) wystpuj nowotwory zwizane niewtpliwie z zakaeniem wirusami, gwnie typu RNA (retrowirusami). U zwierzt wyrnia si dwie podstawowe grupy wirusw onkogennych: wirusy agodne indukujce nowotwory, zwykle biaaczki u mniejszoci zakaonych zwierzt i po bardzo dugim okresie utajnienia, oraz wirusy ostre wywoujce nowotwory zoliwe (misaki, raki) u wikszoci zakaonych zwierzt i po krtkim okresie utajenia. U ludzi infekcje wirusem Epsteina-Barr (nalecym do grupy herpeswirusw) prowadz do powstawania nowotworw typu choniakw (np. choniak Burkitta). Wirusy nalece do grupy papilloma sprzyjaj powstawaniu niektrych nowotworw zewntrznych narzdw pciowych, a ludzki wirus zapalenia wtroby HBV (ang. hepatitis B virus) sprzyja powstawaniu rakw wtroby. Wirus biaaczki limfocytw T typ 1, HTLV-1, jest przyczyn biaaczek u mieszkacw niektrych regionw Japonii oraz Ameryki rodkowej. Wirusy opryszczki zwykej (HSV II) podejrzewa si o udzia w powstawaniu raka szyjki macicy, a niektre adenowirusy mog przyczynia si do powstawania nowotworw nosogardzieli. 12.5. Immortalizacja komrek jest pierwszym zdarzeniem w procesie nowotworzenia in vitro, ale nie jest jednoznaczna z transformacj nowotworow Infekcje wirusami zawierajcymi DNA, jako materia genetyczny, a wic wirusem Epsteina-Barr, brodawczakw czy HBV, nie s bezporedni przyczyn nowotworw. Wiele danych wskazuje, e to raczej przebyte infekcje sprzyjaj powstawaniu nowotworw. Materia genetyczny wirusw Epsteina-Barr i brodawczakw (ale nie HBV) zawiera geny, ktrych biakowe produkty mog prowadzi jedynie do immortalizacji komrek, ale nie do transformacji nowotworowej. Immortalizacja polega na zdolnoci komrek do nieograniczonego wzrostu w warunkach hodowli pozaustrojowej. Prawidowe komrki przeniesione do kultur dziel si i daj ok. 20-50 generacji, a nastpnie gin. Wrd prawidowych komrek hodowlanych w kulturze moe pojawi si linia komrek o nieograniczonym potencjale przeywania, jeeli zostan zapewnione odpowiednie warunki wzrostu. Cech t nazywamy niemiertelnoci komrek. Cecha ta powstaje w wyniku mutacji genw kontrolujcych liczb podziaw komrkowych (ang. senescence genes). Komrki trac zdolno do kontrolowania liczby podziaw i zaczynaj si dzieli w sposb nieograniczony. Staj si niemiertelne", ale nie maj cech komrek nowotworowych. Sdzi si, e komrki prawidowe maj genetycznie zaprogramowany kres swojej egzystencji. Taki program mierci komrkowej (apoptoza) ulega zaburzeniu we wczesnych okresach procesu rakowacenia (w fazie inicjacji?). Transformacja nowotworowa jest procesem trwaego przeksztacenia komrki prawidowej w komrk nowotworow, czyli jest to zezo-

liwienie" (zrakowacenie) komrki prawidowej. Transformowane nowotworowo komrki maj zmieniony typ wzrostu w hodowlach komrkowych, a przeszczepione na myszy bezgrasiczne daj wzrost typowy dla komrek nowotworowych. Oba pojcia immortalizacja" i transformacja nowotworowa" znacz wic co innego. Znamy nowotwory, ktre prawie zawsze s immortalizowane (np. u gryzoni), oraz nowotwory, ktre nie s immortalizowane (niektre nowotwory u ludzi). Znamy rwnie komrki, ktre s immortalizowane, ale nie maj cech komrek nowotworowych. Infekcje wirusami zawierajcymi DNA, a wic wirusami Epsteina-Barr, papilloma, HBV i innymi prowadz czsto do zwikszonej destabilizacji aparatu genetycznego (genomu) gospodarza, stanu, ktry odgrywa wan rol w powstawaniu nowotworw (bdzie o nim mowa w dalszej czci rozdziau). Wirus HTLV-1, ktrego aparat genetyczny zawiera RNA, jest jedynym, do tej pory poznanym ludzkim wirusem onkogennym, wirusem wywoujcym nowotwory (w tym przypadku biaaczki). 12.6. Nowotwory u ludzi mog si rozwija na tle wrodzonych predyspozycji, ale stanowi one may odsetek wszystkich nowotworw Pojcie predyspozycji genetycznych okrela stan zwikszonego ryzyka zapadania na chorob nowotworow. Jeli przyjmiemy, e ryzyko u zdrowych osobnikw wynosi 1:1000, to u osb z predyspozycj" ryzyko wynosi 1:10. Predyspozycje genetyczne s dziedziczne, innymi sowy s przekazywane potomstwu. Naley do nich zaliczy: (a) zesp predyspozycji do zapadania na niektre choroby nowotworowe wystpujce w rodzinach, a wic nowotwory, takie jak siatkwczak oka (retinoblastoma), gruczolakowato (polipowato) rodzinna jelita grubego, gruczolakowato mnoga wewntrzwydzielnicza, guz Wilmsa; (b) zesp predyspozycji, zwany umownie zespoem Li-Fraumeni (w tym przypadku predyspozycje s sabiej zaznaczone ni w przypadku pierwszym); w rodzinach, w ktrych wystpuje zesp Li-Fraumeni obserwuje si zwikszon skonno do zapadania na niektre nowotwory, w tym na raka sutka u kobiet; (c) dziedziczny zesp predyspozycji, okrelony jako zesp wpywajcy na metabolizm zwizkw rakotwrczych, dotyczy uszkodze enzymw biorcych udzia w metabolizmie zwizkw rakotwrczych; (d) zesp defektywnej reperacji uszkodze materiau genetycznego; naley do nich np. xeroderma pigmentosum, ataxia-telangiectasia\ chorzy z tymi defektami genetycznymi wykazuj zwikszon skonno do zapadania na choroby nowotworowe. Konstytucja genetyczna (ang. genetic make-up) odgrywa prawdopodobnie istotn rol w indywidualnej wraliwoci" na proces nowotworowy. U ludzi

znamy niewiele cech genetycznie uwarunkowanych, ktre odpowiadaj za osobnicz podatno lub oporno na indukcj procesu nowotworowego. U zwierzt dowiadczalnych, zwaszcza u myszy, konstytucja genetyczna i genetyczne rnice midzyszczepowe s od dawna znane jako czynniki wpywajce w sposb zdecydowany na indukcj i przebieg procesu nowotworowego. U ludzi nowotwory uwarunkowane predyspozycj genetyczn stanowi niewielki odsetek (kilka procent) wszystkich nowotworw zoliwych.

12.7. Molekularnym podoem procesu nowotworowego s mutacje genetyczne komrek somatycznych Czynniki kancerogenne, zdolne do indukowania nowotworw i to zarwno czynniki fizyczne (np. promieniowanie ultrafioletowe, rentgenowskie), jak i chemiczne (rnego typu zwizki chemiczne) czy te biologiczne (wirusy onkogenne typu DNA lub RNA, czyli retrowirusy) cechuje zdolno do oddziaywania i swoistego modyfikowania materiau genetycznego komrki. Badania dowiadczalne, obserwacje kliniczne i epidemiologiczne dowodz, e nowotwory s wynikiem zmian mutacyjnych pewnych grup genw. Fenotyp nowotworowy, czyli zesp charakterystycznych cech strukturalno-funkcjonalnych komrek nowotworowych, powstaje i uwidacznia si w wyniku dwch rnych typw mutacji: mutacji o charakterze dominujcym i mutacji o charakterze recesywnym. Geny, ktrych dominujce mutacje prowadz do nowotworzenia, identyfikuje si w tecie transformacji nowotworowej. Wyizolowany z nowotworu ludzkiego DNA wprowadza si do nienowotworowych, immortalizowanych komrek mysich (np. linia NIH 3T3) i obserwuje si pojawianie ognisk (foci) zoonych z komrek, ktre maj zdolno do tworzenia nowotworw po przeszczepieniu na myszy bezgrasiczne tzw. myszy nagie (ang. nude). U takich zwierzt ze zniesion odpornoci komrkow przeszczepiona obcogatunkowa tkanka nowotworowa rozrasta si w sposb autonomiczny, agresywny i doprowadza do mierci gospodarza. Inny, niezwykle wany sposb identyfikacji genw dominujcych polega na analizie genw przenoszonych za porednictwem wirusw onkogennych typu RNA retrowirusw u gryzoni i ptakw. Udzia mutacji o charakterze recesywnym w powstawaniu nowotworw ujawniono po raz pierwszy w badaniach, w ktrych przeprowadzono fuzj (hybrydyzacj) komrek prawidowych z komrkami nowotworowymi. Zaobserwowano wwczas wyran rewersj fenotypu nowotworowego u powstaej hybrydy komrkowej. Wprowadzenie do komrki nowotworowej nie zmutowanych genw komrki prawidowej powodowao wyran supresj fenotypu nowotworowego: zmutowane geny komrki nowotworowej nie byy w stanie

ujawni swoich aktywnoci. Geny, ktrych mutacje recesywne prowadz do nowotworzenia, nazwano rwnie genami supresorowymi transformacji nowotworowej lub antyonkogenami. Wprowadzone do ludzkich komrek nowotworowych prawidowe, nie zmutowane geny supresorowe likwiduj skutki innych mutacji prowadzcych do powstania transformacji nowotworowej. W przeciwiestwie do identyfikacji genw dominujcych biorcych udzia w nowotworzeniu, identyfikacja genw recesywnych przysparza wicej trudnoci. Opiera si ona przede wszystkim na zaoeniu, e domniemany gen recesywny znajduje si w tym miejscu chromosomu, ktre podczas nowotworzenia ulega uszkodzeniu, np. delecji, dalej na skomplikowanym mapowaniu fragmentw DNA ulegajcych uszkodzeniom oraz na tecie rewersji fenotypu nowotworowego po wprowadzeniu do komrek nowotworowych analizowanego fragmentu DNA.

12.8. Wirusy onkogenne typu RNA nalece do grupy retrowirusw Wszystkie wirusy typu RNA majce potencja onkogenny s retrowirusami. Genom (RNA) tych wirusw w cyklu yciowym ulega przepisaniu (retranskrypcji) na dwuniciowy DNA, ktry zostaje nastpnie wczony w wyniku rekombinacji do genomu zakaonej komrki. Zintegrowany genom retrowirusa w postaci DNA nazywamy prowirusem. Prowirusowy DNA replikuje si razem z DNA komrki. Krtkie omwienie biologii retrowirusw onkogennych jest pomocne w zrozumieniu roli komrkowych genw one (c-onc) w kancerogenezie. 12.9. Wirusy typu RNA przechodz zoony cykl yciowy w zainfekowanej komrce Po wnikniciu czsteczki retrowirusa do komrki nastpuje usunicie otoczki wirusa i uwolnienie wirusowego RNA. Kodowana przez RNA wirusa RNA-zalena polimeraza DNA (rewertaza) kopiuje jednoniciowe czsteczki RNA wirusa na dwuniciowy prowirusowy DNA. Swoiste sekwencje na obu kocach czsteczki RNA wirusa s absolutnie niezbdne do skutecznego i wiernego odtworzenia caego genomu wirusa w postaci DNA. Sekwencje te przyjmuj posta 2 identycznych blokw, zwanych LTR, flankujcych prowirusa. Zsyntetyzowany prowirusowy DNA wchodzi do jdra komrki i integruje si z chromosomalnym DNA. Geny zintegrowanego prowirusa ulegaj transkrypcji i translacji. W cytoplazmie zakaonej komrki gromadz si ostatecznie wszystkie komponenty, umoliwiajce wytworzenie potomnych wirionw retrowirusa (rys. 12.1).

koniec 5' RU gag pol

koniec 3'

RU3
RNA wirusa

(a)

inicjacja transkrypcji pojedynczego pasma DNA [ ( - ) DNA] za pomoc tRNA jako startera i RNA-zalenej polimerazy DNA cyktizacja czsteczki wirusowego RNA, synteza ( - ) DNA na caej dugoci matrycy inicjacja syntezy drugiego pasma DNA [(+) DNA]

(b) (c)

(d)

cyklizacja pasma () DNA i ukoczenie syntezy komplementarnego (+) DNA, wytworzenie sekwencji LTR

LTR I 1 URUs gag 1 = pol I

LTR 1 U3RU5 2 - W - - ! replika genomu wirusa w postaci DNA

mm

i
cyklizacja

integracja (prowirus) DNA komrkowy

LTR

909

pol transkrypcja

LTR

potomne genomy RNA 1 l

informacyjne RNA dla biaek gag, pol, env translacja

potomne wiriony

biaka gag, pol, env

Rys. 12.1. Schemat cyklu yciowego retrowirusw. Wstpne etapy oznaczone symbolami (a)-(d) do momentu cyklizacji zachodz w cytoplazmie komrki zakaonej. Replika retro wirusa w postaci cyklicznego, dwupasmowego DNA przemieszcza si do jdra komrki, ktra ulega integracji z chromosomalnym DNA przyjmujc form prowirusa. Transkrypty prowirusa stanowi z jednej strony genomowe czsteczki RNA dla potomnych wirionw, a z drugiej su jako mRNA do transkrypcji biaek niezbdnych do odtworzenia potomnych wirionw (wg M. Chory, Wspczesne pogldy na powstawanie nowotworw ukadu krwiotwrczego", w: Hematologia kliniczna, red. K. Janicki, PZWL, Warszawa 1991, t. 1, s. 303 za zgod)

12.10. Retrowirusy o ostrym dziaaniu onkogennym zawieraj gen transformujcy (onkogen wirusowy v-on) Wystpujce u zwierzt retrowirusy onkogenne to gwnie: (a) agodne wirusy transformujce; (b) ostre wirusy transformujce. agodne retrowirusy transformujce s prototypem wirusw ostrych. Ich genom stanowi maa czsteczka RNA, zwykle zawierajca poniej 9000 nukleotydw. Kady wirion zawiera dwie kopie RNA zczone u kocw 5' wizaniami wodorowymi. Genom agodnego, zdolnego do replikacji wirusa zawiera trzy geny: gag, pol oraz env i jest ograniczony od koca 5' i 3' swoistymi sekwencjami nie kodujcymi (w fazie prowirusa sekwencje te oznaczone s symbolem LTR; ang. long terminal repeats) (rys. 12.1). Geny gag i env koduj biaka strukturalne i otoczkowe wirionu, gen pol koduje RNA-zalen polimeraz DNA (odwrotn transkryptaz) enzym niezbdny do przepisania RNA wirusa na DNA prowirusa. Sekwencje flankujce s niezbdne do syntezy DNA prowirusa. agodne wirusy transformujce nie zawieraj genu one. Ich efekt transformujcy wywoany jest mechanizmem insercji promotora".

12.11. Ostre wirusy onkogenne s zwykle niezdolne do replikacji wskutek utraty czci genomu i wymagaj obecnoci wirusw wspomagajcych Prototypowym i jedynym zdolnym do replikacji ostrym retrowirusem transformujcym jest wirus misaka Rousa (RSV). Wirus ten, oprcz trzech wspomnianych wyej genw, zawiera transformujcy onkogen o symbolu v-src zlokalizowany midzy genem env i swoist sekwencj LTR koca 3'. Gen v-src jest odpowiedzialny za indukcj misakw u ptakw. Komrki misaka powstaj wskutek transformacji nowotworowej prawidowych fibroblastw. Mutacja genu v-src znosi zdolno wirusa RSV do indukcji misakw. Pozostae ostre wirusy transformujce s niezdolne do replikacji wskutek utraty w caoci lub czci wasnych" genw. Wirusy tej klasy wymagaj do przeniesienia infekcji z komrki do komrki i przejcia swojego cyklu yciowego obecnoci wirusw wspomagajcych" (ang. helper viruses), dysponujcych penym zestawem trzech genw niezbdnych do wejcia w faz prowirusa i syntezy biaek stanowicych skadowe czci wirionu. Schemat organizacji agodnych" retrowirusw, ostrego" kompetentnego do replikacji retrowirusa RSV oraz innych ostrych", ale niekompetentnych do replikacji retrowirusw pokazuje rysunek 12.2.

prowirus
5

(a)

ALV

y
LTR

gag

pol
~

env

^ LIR

komrkowy DNA

(b) RSV

gag

pol

env

src

L.TR

Agag (c) MC29 :

myc

Aenv

Agag AEV gag AMV

erb A

erbB

Aenv

pol

myb

Agag AbMu LV .. I 1 gag HTLV L J

abl pol

Aenv I env x r-r " "

t = = =

Rys. 12.2. Schemat organizacji agodnego" (a) i ostrego" (b) wirusa transformujcego oraz kilku ostrych wirusw transformujcych, defektywnych pod wzgldem zdolnoci do replikacji (c). Utrata zdolnoci do replikacji powstaje na skutek utraty jednego z genw wasnych (por. np. AMV i ALV) lub czciowej jego (ich) delecji (A) (por. up. MC29 i ALV) (wg M. Chory, Wspczesne pogldy na powstawanie nowotworw ukadu krwiotwrczego", w: Hematologia kliniczna, red. K. Janicki, PZWL, Warszawa 1991, t. 1, s. 304 za zgod)

12.12. Wystpujce w ostrych retrowirusach geny transformujce (geny v-onc) pochodz z komrek eukariotycznych Transformujce onkogeny wystpujce w genomie ostrych onkogennych retrowirusw (czyli geny v-onc) nie s konieczne do replikacji i cyklu yciowego wirusa. S one niezbdne do transformacji nowotworowej zakaonej, kompetentnej komrki zwierzcej. Genom retrowirusw zawiera zwykle jeden gen transformujcy, rzadziej dwa. Kady gen v-onc indukuje zwykle jeden typ nowotworu, chocia znane s przykady indukcji dwch lub wicej typw nowotworw. W kocu lat 70. Bishop i Varmus wykazali, e radioaktywna sonda genu v-src hybrydyzowaa z DNA nie zakaonych wirusem RSV komrek kurczcia. Analogiczne dowiadczenia wykonano z zastosowaniem sond innych onkogenw znalezionych w ostrych retrowirusach i DNA izolowanych z rnych, nie zakaonych komrek wielu gatunkw zwierzt. Okazao si, e wszystkie prawidowe DNA zawieray sekwencje homologiczne do wirusowych genw one. Te komrkowe homologi v-onc nazwano protoonkogenami lub komrkowymi genami one (c-onc). Na podstawie tych bada

wysunito hipotez, e agodne retrowirusy w trakcie zakaenia komrek eukariotycznych pobray w wyniku transdukcji komrkowe geny one, co nadao tym wirusom silny potencja transformacyjny. Geny c-onc, ktre ulegy transdukcji, akumuluj pewne zmiany strukturalne, ktre odpowiadaj za efekt transformacyjny. Ponadto sekwencje one wprowadzone w genom retrowirusa znajduj si pod wpywem aktywnych sekwencji promotorowych zlokalizowanych we fragmentach LTR prowirusa. W procesie infekcji sekwencje v-onc ulegaj silnej ekspresji, dajc duy nadmiar biaek onkogennych. 12.13. Komrkowe protoonkogeny s przeksztacane w onkogeny w wyniku rnych mutacji Do tej pory w organizmach eukariotycznych zidentyfikowano ok. stu protoonkogenw {c-onc). Zmutowane formy tych genw onkogeny (geny transformacyjne) bior udzia w procesie nowotworzenia. Protoonkogeny wystpujce w komrkach eukariotycznych oznaczamy symbolem c-onc, w odrnieniu od onkogenw wystpujcych w retrowirusach (v-onc). Przejcie protoonkogenu w onkogen polega najczciej na rnych formach mutacji zmieniajcych struktur kodowanego biaka, a zatem i jego swoist aktywno bd te zmieniajcych ilo biaka prawidowego lub jego ekspresj w nieodpowiednim miejscu i czasie. Aktywacja protoonkogenu nie zawsze jest spowodowana mutacj (np. mutacj punktow) zmieniajc struktur kodowanego biaka. Aktywacja protoonkogenu wie si niekiedy z procesem translokacji protoonkogenu w miejsca, w ktrych znajduj si sekwencje DNA wzmacniajce transkrypcje genw (ang. enhancer). Przykadem moe by przeniesienie protoonkogenu c-myc w ssiedztwo genw kodujcych ciki acuch immunoglobuliny. Translokacj tak stwierdza si w przypadku choniakw Burkitta. Aktywacja protoonkogenu moe zaj przez zwielokrotnienie liczby kopii genu (amplifikacja genu). W obu ostatnich przypadkach produkt genu jest prawidowy, ale ilo produktu (biaka) dramatycznie zwiksza si. Wydaje si, e aktywacja protoonkogenw jest niezwykle swoista dla poszczeglnych genw oraz kodowanych przez nie biaek oraz, e niektre geny aktywowane s. wycznie w wyniku mutacji punktowych, inne za porednictwem translokacji, a jeszcze inne przez amplifikacj lub fuzj z okrelonymi genami.

12.14. Biaka kodowane przez protoonkogeny speniaj kluczowe funkcje biologiczne w komrce W tabeli 12.1 podano najwaniejsze grupy onkogenw oraz kodowanych przez nie biaek. Wrd nich do najlepiej zbadanych nale geny kodujce czynniki wzrostowe, receptory czynnikw wzrostowych, enzymy typu kinaz,

1. Czynniki wzrostu: Sis acuch /? pytkowego czynnika wzrostu PDGF Hst, Int-2 biaka podobne do czynnika wzrostu fibroblastw FGF Int-1 czynnik wzrostu? 2. Receptory oraz biaka wykazujce aktywno kinazy tyrozynowej: Src zwizane z bonami komrkowymi, niereceptorowe biaka o aktywnoci kinazy tyrozynowej Erb B skrcony receptor EGF z aktywnoci kinazy tyrozynowej Neu biako majce charakter receptora z aktywnoci kinazy tyrozynowej Fms mutant receptora CSF-1 z aktywnoci kinazy tyrozynowej Abl kinaza tyrozynowa 3. Receptory nie wykazujce aktywnoci kinazowej: Mas receptor angiotensyny 4. Biaka G biaka wice GTP, wykazujce aktywno GTPazow, zwizane z bonami komrkowymi: H-Ras ] K-Ras > biaka zwizane z bonami, wice GTP i wykazujce aktywno GTPazy N-Ras J 5. Biaka cytoplazmatyczne wykazujce aktywno kinazy serynowo-treoninowej: Pim-11 Mos > cytoplazmatyczne biaka o aktywnoci kinazy serynowej Raf

6. Regulatory cytoplazmatyczne: Crk SH-2/3 biako wice si do biaek zawierajcych fosfotyrozyn 7. Jdrowe czynniki transkrypcyjne: Myc ] Myb > biaka wice si ze swoistymi sekwencjami DNA Fos Jun biako wchodzce w skad czynnika transkrypcyjnego AP-1 Erb A recesywnie dominujcy mutant receptora tyroksyny (t3) Rei recesywnie dominujcy mutant biaka NF-xB Ets biako wice si z DNA Ski czynnik transkrypcyjny Pbx biako chimeryczne E2A homeobox Scl czynnik transkrypcyjny ? Lyl-1 czynnik transkrypcyjny ? Myl/RARa czynnik transkrypcyjny ?

8. Biaka nie sklasyfikowane (rne): Dbl-C cytoplazmatyczne biako szkieletowe ? Bcl-2 biako mieszczce-si w bonie plazmatycznej ?

geny kodujce biaka wice GTP i wykazujce aktywno GTPazow oraz geny kodujce biaka, ktre bior udzia w regulacji transkrypcji. Biaka kodowane przez protoonkogeny maj wiele funkcji, z ktrych wymienimy trzy gwne funkcje biologiczne. 1) Biaka one o funkcji receptorw oraz wykazujce aktywno fosfokinazow. Fosforylacja biaek zachodzi pod wpywem dwch typw kinaz: swois-

tych dla seryny lub treoniny oraz swoistych dla tyrozyny. Biaka one kodujce receptory czynnikw wzrostowych ulegaj autofosforylacji po zwizaniu receptora z czynnikiem wzrostowym. Fosforylacja dotyczy reszt tyrozynowych w wewntrzkomrkowej (podbonowej) czci czsteczki receptora. Inne biaka one wykazuj aktywno kinazow w stosunku do biaek cytoplazmatycznych i jdrowych. 2) Biaka G biorce udzia w transmisji sygnau. Najlepiej poznanym biakiem jest biako Ras, wice GTP i hydrolizujce GTP do GDP w obecnoci biaka GAP (ang. GTPase activating protein). Mutanty p21ras nie s w stanie hydrolizowa GTP do GDP. Przypuszcza si, e hydroliza GTP do GDP odgrywa wan rol w transmisji sygnau mitogennego i proliferacji komrek. 3) Regulacja transkrypcji genw. Najlepiej poznano klasyczne czynniki transkrypcyjne typu Rei, Jun, Fos, Myc. Czynniki transkrypcyjne Myc i Fos mog bra udzia w replikacji DNA. Stosunkowo dobrze poznano heterodimer Jun-Fos majcy funkcj plejotropowego aktywatora transkrypcji. 12.15. Niektre protoonkogeny koduj biaka speniajce funkcj receptorw i majce swoist aktywno fosfokinaz Ze wzgldu na lokalizacj w komrce kinazy tyrozynowe, biorce udzia w fosforylacji biaek, mona podzieli na trzy kategorie: 1) Kinazy, ktre znajduj si w bonach komrkowych. Zawieraj du cz zewntrzkomrkow, domen transmembranow oraz domen wewntrzkomrkow. S to typowe receptory czynnikw wzrostu, np. receptor dla pytkowego czynnika wzrostu PDGF, (ang. platelet derived growth factor), EGF, GF itp. 2) Kinazy, ktre mieszcz si na terenie cytoplazmy, zwizane z bonami (np. kinaza Src). 3) Kinazy wystpujce na terenie jdra komrkowego (kinaza Abl). Do grupy kinaz serynowo-treoninowych zalicza si cztery kinazy odgrywajce wan rol w proliferacji komrkowej: Mos, Raf, kinaz biakow C (PKC, ang. protein kinase C) oraz biakow kinaz stanowic skadnik czynnika MPF (ang. maturation-mitosis promoting factor), ktrej odpowiednik u drody nosi nazw cdc2/CDC28 i fosforyluje cykliny. Kinaza kodowana przez gen c-raf bierze udzia w przekazywaniu sygnau mitogennego od receptora bonowego do jdra i fosforyluje niektre czynniki transkrypcyjne. Biakowa kinaza C (PKC) jest enzymem, w ktrego aktywacji wan rol odgrywaj metabolity hydrolizy fosfatydyloinozytolu 4,5-difosforanu. PKC jest enzymem aktywowanym rwnie przez wiele czynnikw, zwanych czynnikami promujcymi transformacj nowotworow, np. estrami forbolu.

Fosforylacja, w ktrej bior udzia kinazy typu cdc2 w kompleksie z rnymi cyklinami odgrywa wan rol w procesach mitozy. Sdzi si, e bior one bezporedni udzia w przejciu komrek z fazy G1 do S i z G2 do M. Podczas cyklu mitotycznego kompleksy kinaza cyklina fosforyluj p53 oraz kinazy kodowane przez geny c-src i c-abl. Funkcjonalne konsekwencje takich fosforylacji nie s jednak w peni znane. 12.16. Protoonkogeny z rodziny ras koduj biako o aktywnoci GTPazy Dwa rodzaje GTPaz bior udzia w proliferacji komrkowej: (a) biako G skadajce si z trzech rnych podjednostek; (b) monomeryczne biako Ras (oraz biaka kodowane przez rodzin genw podobnych do ras). W wyniku hydrolizy GTP do GDP aktywowane zostaj dwa biaka: cyklaza adenylowa i fosfodiesteraza. Do tej pory nie zostao jednak poznane biako, ktre zostaje pobudzone (biako efektorowe") w wyniku hydrolizy GTP przez biaka Ras. Niemniej jednak biako Ras odgrywa wan rol w transformacji nowotworowej. Inaktywacja biaka Ras przez przeciwciaa hamuje mitogenn aktywno innych onkogenw oraz ich waciwoci transformacyjne. Sugeruje to, e w cigu reakcji biochemicznych, ktre bior udzia w przekazywaniu sygnaw mitogennych Ras ley poniej kinaz tyrozynowych, ale powyej lub obok Raf (kinazy serynowo-treoninowej). Biako GAP (ang. GTPase activating protein) wzmaga aktywno GTPazow biaka Ras i porednio wpywa na proliferacj komrkow. 12.17. Niektre czynniki transkrypcyjne s produktami protoonkogenw Wrd czynnikw transkrypcyjnych stosunkowo najlepiej poznane s biaka transkrypcyjne Jun i Fos, ktre jako heterodimer Jun-Fos tworz czynnik AP-1. Czynnik AP-1 rozpoznaje krtk sekwencj TGACT(C/A)A, ktra znajduje si w promotorach i sekwencjach wzmacniajcych wielu genw. AP-1 odgrywa rol w indukcji transkrypcji przez estry forbolu (substancje promujce transformacj nowotworow). Czynnik transkrypcyjny NF-xB skada si z dwch podjednostek 65kDa i 50kDa, z ktrych mniejsza jest homologiczna do biaka Rei (kodowanego przez onkogen c-rel). Zdolno wizania si z DNA wykazuje jednostka mniejsza. NF-xB w postaci nieaktywnej znajduje si w cytosolu. Sdzi si, e obie jednostki 65kDa i 50kDa wi dodatkowo biako IxB, o charakterze inhibitora. Po fosforylacji biaka IxB nastpuje dysocjacja ufosforylowanego inhibitora i biako NF-kB przemieszcza si do jdra, wic si z okrelonymi promotorami. Do swoistych czynnikw transkrypcji zalicza si take ErbA biako stanowice receptor hormonu tyroksyny. Receptor ten, znajdujcy si zawsze

w jdrze, po zwizaniu hormonu przycza si do DNA w cile okrelonych miejscach, w promotorach zawierajcych miejsce TRE (ang. thyroid hormone response element). Biakami majcymi wszelkie waciwoci czynnikw transkrypcyjnych s Myc i Myb. Sdzi si, e biako Myc dopiero po utworzeniu heterodimeru z biakiem Max staje si waciwym czynnikiem transkrypcyjnym. Biako Max jest ma czsteczk wykazujc homologi z C-terminalnym odcinkiem biaka Myc. Region homologii obu biaek ma charakterystyczn organizacj (motyw) w sekwencji aminokwasw: 5' region zasadowy heliks-skrt-heliks suwak leucynowy 3'. Struktura ta umoliwia prawdopodobnie wizanie si Myc/Max z DNA. 12.18. Produkty biakowe protoonkogenw bior udzia w transmisji sygnau do komrki Kilka nowych genw, ktre koduj biaka majce waciwoci czynnikw transkrypcyjnych odkryto analizujc sekwencje DNA, ktre podczas powstawania biaaczek ulegay translokacji w poblie genu kodujcego receptory dla limfocytw T. S to geny o symbolu scl, lyl-1. W rzadko spotykanej biaaczce pre B-ALL (ang. pre B-acute lymphoblastic leukaemia) stwierdzono obecno translokacji (1:19), w wyniku ktrej powstawao fuzyjne (chimeryczne) biako (pbx) o cechach czynnika transkrypcyjnego. Cz N-kocowa biaka skadaa si z biaka E2A, cz C-kocowa z homeodomeny genu o symbolu prL W ostrej biaaczce promielocytarnej zidentyfikowano translokacj t(15:17), w wyniku ktrej powstaje nowy gen fuzyjny (;myl/RARa), skadajcy si z czci receptora dla kwasu retinowego a(RARA) oraz genu mieszczcego si w chromosomie 15. Kodowane przez wymienione grupy onkogenw biaka bior udzia w procesach regulacji podziaw komrkowych. Kodowane przez prawidowe geny biaka bior udzia w transmisji sygnau mitotycznego od receptora czynnika wzrostowego, mieszczcego si w bonie komrkowej, poprzez cytoplazm do jdra komrkowego, gdzie nastpuje aktywacja biaek regulacyjnych odgrywajcych rol w transkrypcji genw cyklu komrkowego (rys( 12.3). Przypuszcza si, e rozregulowanie podziaw komrkowych podczas nowotworzenia polega gwnie na prowokowaniu" komrki przez zmutowane biaka do staych podziaw. Komrki nowotworowe nie reaguj na zewntrzkomrkowe sygnay regulujce jej podziay, ani na sygnay do rnicowania si. Nie reaguj zarwno na sygnay pozytywne, jak i na negatywne. Wchodz jednak w podziay mitotyczne w wyniku faszywych" sygnaw mitogennych wytworzonych przez zmutowane geny. Szczegowe badania wykazuj jak zoona jest droga recepcji i przekazywania sygnau mitogennego (rys. 12.4). Zwizanie przez receptor sygnau mitogennego (w tym przypadku pytkowego czynnika wzrostu PDGF)

cytoplazma

jdro komrkowe

pozakomrkowe czynniki wzrostu

wewntrzkomrkowa transmisja sygnau (kinazy 1 biakowe: Raf, Src, Lek, Mos itd.)

*4>

V:

biaka regulatorowe (czynniki transkrypcyjne: np. Fos, Jun, Myc itd., receptory hormonw: ErbA)

aktywacja genw, ktrych produkty biakowe bior udzia w podziaach komrkowych

r \

y
j

Rys. 12.3. Rozmieszczenie i wystpowanie na terenie komrek biaek kodowanych przez niektre protoonkogeny. Pokazano tylko najbardziej znane biaka i tylko te, ktre bior udzia w transmisji sygnau zwizanego z podziaami komrkowymi. Strzaki wskazuj kierunek przesyania sygnau (wg S. Szala, Nowotwory i geny, Kosmos, 40, 1991, 311-317 za zgod)

bona komrkowa

T>(T
6DP

c^p
GTP

a
fosforylacja "3 1 kinaza y fosforylacja fosfatydyloinazytoli
PI

transkrypcja

Rei Jun (NF-*B)

/ /

Fos

ErbA

Rys. 12.4. Aktywny" kompleks receptora czynnika wzrostu i transmisja sygnau mitogennego. Strzaki wskazuj kierunek prawdopodobnych reakcji biochemicznych. PDGF pytkowy czynnik wzrostu; PDGF.R receptor PDGF; Raf kinaza serynowo-treoninowa; Ras biako o aktywnoci GTPazowej; PLCy fosfolipaza Cy; PI-3 kinaza 3-kinaza fosfatydyloinozytolu; GTP biako aktywujce GTPaz; DAG diacyloglicerol; PKC kinaza biakowa C; IP3 1,4,5-trifosforan inozytolu; Rei, Jun, Fos, ErbA czynniki transkrypcyjne kodowane przez protoonkogeny

pociga za sob wiele reakcji. Dimeryczny receptor ze zwizanym czynnikiem wzrostu przycza wiele biaek, tworzc swojego rodzaju kompleks aktywny". W skad tego kompleksu wchodzi enzymatyczne biako Raf (o aktywnoci swoistej kinazy serynowo-treoninowej), fosfolipaza Cy (PCLy) biorca udzia w metabolizmie fosfatydyloinozytolu, kinaza fosfatydyloinozytolu (kinaza PI-3) oraz biako GAP (biako aktywujce GTPazow funkcj biaka Ras). Kompleks aktywny" receptora inicjuje wiele reakcji: (a) reakcj zwizan z aktywacj biaka Ras; (b) reakcj fosforylacji inozytolu; (c) reakcj aktywacji kinazy C, biorcej udzia m.in. w fosforylacji czynnika transkrypcyjnego, ktry naley do rodziny onkogenw Rei (NF-IxB); (d) bezporedniej fosforylacji jednego z czynnikw transkrypcyjnych Jun przez kinaz Raf. Kocowym etapem transmisji sygnau mitogennego jest aktywacja czynnikw transkrypcyjnych. Czynniki te maj dziaanie plejotropowe i bior udzia w regulacji transkrypcji genw, ktrych produkty s niezbdne do procesw podziau i namnaania. 12.19. Wzrost i rnicowanie komrek s w stanie wzajemnej rwnowagi Wiele bada wskazuje jak wan i zoon rol odgrywaj czynniki wzrostowe w regulacji proliferacji komrek i w ich rnicowaniu. W wikszoci przypadkw czynniki wzrostowe wykazuj du swoisto tkankow, ale ich wizanie i reakcje, jakie prowokuj w komrkach zale od tzw. kontekstu metabolicznego, w jakim znajduj si komrki (ta sama komrka, bdca w rnej fazie swojego ycia moe w rny sposb reagowa na dany czynnik wzrostowy). Niektre czynniki wzrostowe s wielofunkcyjne: w zalenoci od typu komrek mog bd hamowa wzrost komrek, bd stymulowa ich podziay. Szczeglnie interesujca wydaje si rola czynnikw wzrostu w procesach rnicowania komrkowego. Mona przytoczy dane, ktre wskazuj, e czynniki wzrostowe (ich kombinacje, czas pojawienia si itd.) determinuj okrelon liczb podziaw komrkowych (swojego rodzaju zegar mitotyczny), po przejciu ktrych komrki ulegaj kocowemu zrnicowaniu. Wydaje si, e liczba podziaw komrkowych zaley od puli dostpnych czynnikw wzrostowych oraz ich stopnia wyczerpywania (zaniku). Zmniejszanie si potencjau proliferacyjnego komrek powoduje ich rnicowanie. Cakowity brak czynnikw wzrostowych prowadzi do kontrolowanej samodestrukcji komrek (iapoptosis). Warto doda, e jeden z onkogenw bcl-2 moe odgrywa wan rol w zahamowaniu kontrolowanej samodestrukcji komrek. W niektrych typach choniakw bcl-2 ulega translokacji w poblie genu cikiego acucha immunoglobuliny i ulega cigej transkrypcyji. Sdzi si, e wzmoona synteza biaek Bcl-2 zapobiega programowanej mierci komrek B (limfocytw B).

Bcl-2 dziaa wic nie tyle jak czynnik zmuszajcy komrki B do podziaw, co raczej jako swoisty czynnik immortalizujcy komrki B. W procesie nowotworzenia dochodzi do zaburzenia subtelnej rwnowagi midzy proliferacj a rnicowaniem. W procesach nowotworzenia komrki dziel si w sposb nie kontrolowany i nie osigaj stanu finalnego zrnicowania funkcjonalnego. Wydaje si zatem, e komrki nowotworu zaczynaj produkowa, wytwarza wasne czynniki wzrostowe i w ten sposb coraz bardziej autonomizuj wasne podziay komrkowe (tzw. autokrynna regulacja wzrostu). Z drugiej strony wiele mutantw biakowych, odgrywajcych rol w transmisji sygnau mitogennego, sprzyja powstawaniu faszywych" sygnaw mitogennych prowokujcych komrki nowotworu do staych, permanentnych podziaw komrkowych. 12.20. Geny supresorowe transformacji nowotworowej Do grupy genw supresorowych transformacji nowotworowej zalicza si te geny, ktrych biakowe produkty mog hamowa powstawanie fenotypu nowotworowego. Mutacje genw supresorowych (czsto typu delecji) s zwizane z pojawianiem si fenotypu nowotworowego i wystpuj w wielu rodzajach nowotworw zoliwych. Punktem wyjcia do identyfikacji tych genw byy dowiadczenia nad hybrydyzacj komrek somatycznych prawidowych z komrkami nowotworowymi. Prowadzono hybrydyzacj komrek nowotworowych z komrkami prawidowymi tego samego (np. mysz x mysz) lub rnych gatunkw (np. mysz x czowiek). Gwnym efektem fuzji komrkowych byo stumienie fenotypu nowotworowego. Wprowadzenie do komrek nowotworowych pojedynczych (zwykle obcogatunkowych) chromosomw pozwolio nastpnie na wskazanie tych chromosomw, ktre byy odpowiedzialne za efekt supresyjny. Genetyczna analiza populacyjna nowotworw dziedzicznych, zwaszcza dwch postaci retinoblastoma u dzieci (dwu- i jednostronny nowotwr gaki ocznej siatkwczak) wykonana przez Knudsona przyczynia si do sformuowania hipotezy o dwustopniowej mutacji w obrbie tego samego locus (Rb) majcego funkcje supresorowe. Analogiczne analizy populacyjne w przypadku innych nowotworw uwarunkowanych dziedzicznie (guz Wilmsa, niektre postacie raka sutka) potwierdziy hipotez o genach supresorowych. Wyniki analizy cytogenetycznej, a nastpnie analizy molekularnej loci w przypadku nowotworw wystpujcych w rodzinach o wyranej predyspozycji genetycznej potwierdziy hipotez dwustopniowej mutacji. Predyspozycja polega na dziedzicznym przekazaniu mutacji w obrbie pojedynczego allelu (np. w locus Rb w przypadku siatkwczaka). W komrkach somatycznych potomka mamy wic stan heterozygotycznoci. Proces nowotworowy moe pojawi si, gdy nastpi eliminacja funkcji pozostaego, normalnego allelu, czyli zajdzie utrata heterozygotycznoci (ang. LOH loss of heterozygozity). Utrata heterozygotycznoci moe zaj w wyniku nondysjunkcji (powstaje wwczas stan

Tabela 12.2. Niektre z lepiej poznanych genw supresorowych odgrywajcych rol w powstawaniu nowotworw u ludzi

Symbol genu Rbl

p53

WT1 DCC MCC APC MEN-1 NFI PTPy LCFS2 BRCA1 VHL

Miejsce w chromosomie Typ nowotworu (locus) 13ql4 siatkwczak (retinoblastoma), kostniakomisak (osteosarkoma), rak sutka, pcherza, puc gwiadziak (astrocytoma), 17ql213.3 rak sutka, okrnicy, puc, kostniakomisak (osteosarkoma) guz Wilmsa (nerki) u dzieci llpl3 rak okrnicy 18q21 rak okrnicy 5q21 rak okrnicy 5q21 nowotwory przytarczyc, trzustki, llql3 przysadki i nadnerczy neurofibromatoza, typ 1 17ql 1.2 rak puca, rak nerki 3p21 2 rak okrnicy rak sutka, rak jajnika 17q21 rak nerki, naczyniak podowy, 3p25 barwiak nadnerczowy

hemizygotycznoci), nondysjunkcji i duplikacji, rekombinacji mitotycznej albo miejscowej aberracji. Te dowiadczenia pozwoliy ujawni grup genw supresorowych u ludzi (tab. 12.2). Mutacje w tych genach zwizane s z wystpowaniem rnych typw nowotworw. 12.21. W nastpstwie pre- lub postzygotycznej mutacji genu supresorowego Rb rozwija si siatkwczak (retinoblastoma) oka Z grupy genw supresorowych najlepiej poznany jest gen o symbolu Rb, ktrego mutacje i delecje odpowiedzialne s za nowotwr siatkwki oka (siatkwczak retinoblastoma) u dzieci. Nowotwr obu gaek ocznych, czsto wieloogniskowy, jest zawsze nowotworem dziedzicznym, wystpujcym we wczesnym okresie dziecistwa. Predysponowane s te dzieci, ktrym przekazano dziedzicznie jeden zmutowany allel genu Rb (mutacja prezy go tyczna). Do powstania nowotworu niezbdna jest utrata funkcji drugiego allelu Rb, np. przez nastpn mutacj w drugim allelu Rb lub jego delecj. Rzadziej wystpujc postaci siatkwczaka jest guz jednostronny, rozwijajcy si u dzieci starszych. Guz ten powstaje rwnie w wyniku dwch mutacji w obu allelach Rb, ale mutacje te maj miejsce ju w yciu osobniczym (mutacje pozygotyczne). Retinoblastoma jest chorob recesywn. Tak dugo, jak jeden z alleli genu Rb jest nie uszkodzony, choroba nie pojawia si. Gen Rb zlokalizowany jest w chromosomie 13 (13ql4). W warunkach eksperymentalnych produkt biakowy genu Rb w specyficzny

sposb wie si z biakami transformacyjnymi niektrych wirusw onkogennych (np. z duym antygenem T wirusa SV40, biakiem EIA adenowirusa, biakiem E7 brodawczaka HPV). Przypuszcza si, e produkt genu Rb bierze udzia w regulacji podziaw komrki, a jego mutacje czy te delecja powoduj, e produkty biakowe zmutowanych genw one biaka transformacyjne" zaczynaj ujawnia swoj aktywno, doprowadzajc do niekontrolowanych podziaw komrkowych. Biako Rb o masie czsteczkowej 105 kDa znajduje si w jdrze komrkowym i ulega fosforylacji i defosforylacji. Stan fosforylacji biaka Rb jest precyzyjnie kontrolowany podczas cyklu yciowego komrki: w fazie S biako jest fosforylowane, a defosforylowane podczas mitozy i wejcia w G v Wydaje si wic, e defosforylowana posta biaka Rb hamuje proliferacj komrkow. W fosforylacji biaka Rb w fazie G 1 /S bior udzia kinazy cdc2. Interesujce, e jeden z czynnikw wzrostowych TGF/? (dziaajcy na niektre komrki, np. komrki nabonkowe, jako inhibitor wzrostu hamuje fosforylacj biaka Rb w pnej fazie Gv Biako Rb hamuje rwnie aktywacj czynnika transkrypcyjnego Fos. Mutacje i gbsze zmiany strukturalne genu Rb spostrzegano take w kostniakomisaku, raku sutka i innych nowotworach. Prawidowy gen Rb wprowadzony do komrek siatkwczaka i kostaniakomisaka powoduje supresj fenotypu nowotworowego. 12.22. Mutacje genu supresorowego p53 towarzysz wielu typom nowotworw zoliwych Do grupy genw supresorowych naley zaliczy rwnie gen o symbolu p53. Prawidowy gen p53 ma waciwoci supresorowe zblione do genu Rb. W warunkach dowiadczalnych blokuje aktywno biaek transformacyjnych wirusw onkogennych (np. duego antygenu T wirusa SV40). Przewaajca cz nowotworw u ludzi cechuje si mutacjami w genie p53. Zmutowany gen p53 wystpuje te u czonkw rodzin opisanych jako rodziny Li-Fraumeni" (o rodzinach tych wspomniano przy omawianiu predyspozycji genetycznych do zapadania na choroby nowotworowe). Obecno zmutowanego genu p53 u czonkw tych rodzin moe wic tumaczy zwikszon predyspozycj do zapadania na choroby nowotworowe (wystpuje tu podobiestwo do predyspozycji do zapadania na siatkwczaka zwizanej z obecnoci zmutowanego genu Rb). Gen p53 zlokalizowany jest u czowieka w krtkim ramieniu chromosomu 17. Utrat fragmentu chromosomu 17 spostrzegano czsto w rnych typach nowotworw u ludzi (rak sutka, puc, jelita grubego, gwiadziak i chroniczna biaaczka mielocytarna. Biako p53 jest fosfoprotein wystpujc w jdrze komrkowym. Mimo i sugeruje si jego rol w regulacji proliferacji komrkowej, funkcje biochemiczne tego biaka nie s w peni poznane. Pewne dane strukturalne

sugeruj, e jest ono by moe czynnikiem transkrypcyjnym (lub najoglniej: biakiem biorcym udzia w regulacji transkrypcji). Tylko zmutowany gen p53 wykazuje aktywno transformujc po transfekcji i moe komplementowa aktywno genu c-ras. Dziki gen p53 nie ma tych waciwoci. Nie zmutowany p53 znosi transformacj nowotworow spowodowan transfekcj onkogenami ras i myc. By moe, e p53 kontroluje ekspresj genw hamujcych proliferacj komrkow. Istniej dane, e p53 moe odgrywa pewn rol w regulacji replikacji DNA kontrolujc np. oddziaywanie polimerazy DNA a z innymi komponentami tzw. kompleksu replikacyjnego podczas replikacji. 12.23. Ostatnio wykryto nowe geny supresorowe majce udzia w procesie nowotworowym Gen wyizolowany z guza Wilmsa, nowotworu nerki u dzieci, ma charakter genu supresorowego. Gen ten, o nazwie WT, koduje biako majce wszelkie cechy strukturalne biaka biorcego udzia w regulacji transkrypcji innych genw. Gen ulega silnej ekspresji w wtrobie embrionalnej. Przypuszcza si, e jego produkt biakowy jest niezbdny w rnicowaniu nefroblastw do nefronw. Gen supresorowy o symbolu DCC (ang. deleted in colorectal carcinoma) zidentyfikowano w raku okrnicy i odbytu. Gen ten koduje biako (liczce 750 aminokwasw) zblione swoimi waciwociami do biaek adhezyjnych. Dane cytogenetyczne wskazuj, e mutacje genu MCC (ang. mutated in colorectal cancer) s odpowiedzialne za powstawanie polipowatoci jelita grubego u niektrych rodzin. Gen ten, zlokalizowany w chromosomie 5q21, koduje biako liczce 829 aminokwasw. Biakowy produkt tego genu moe wiza si z biakiem G i hamowa w ten sposb jego aktywno. W locus 5q21 znajduje si rwnie gen, zwany APC (ang. adenomatous polyposis coli), ktry odgrywa wan rol w powstawaniu polipowatoci o podou rodzinnym. Gen ten koduje wielk czsteczk biakow liczc 2843 aminokwasy. Gen NFI (ang. neurofibromatosis type 1) koduje biako liczce 2485 aminokwasw. Biako to zawiera region liczcy ok. 350 aminokwasw, wykazujcy wysok homologi do katalitycznej domeny biaka GAP, aktywujcego funkcj GTPazow biaka Ras. Wzajemne relacje obu biaek NFI i GAP nie s jednak znane. Nie wyklucza si jednak moliwoci, e NFI jest efektorem reakcji pobudzonego biaka Ras i bierze udzia w transmisji sygnaw rnicowania i zahamowania proliferacji. W locus 3p21 chromosomu 3, ktry czsto ulega delecji w rakach puc i nerek, znajduje si gen kodujcy biako defosforylujce reszty tyrozynowe (ang. protein-tyrosine phosphatase y PTPy). PTPy jest biakiem o stosunkowo duej masie, mieszczcym si w bonie komrkowej. Jego aktywno enzymatyczna wie si z regulacj procesw fosforylacji w transmisji sygnaw mitogennych. Geny kodujce tyrozynoswoiste fosfatazy stanowi grup genw wzbudzajcych due zainteresowanie, gdy te swoiste fosfatazy mog mie kluczowe funkcje w procesie onkogenezy.

Geny supresorowe procesu nowotworowego zidentyfikowano take u D. melanogaster. Homozygotyczne mutacje w obrbie jednego z tych genw l(2)gl (lethal(2)giant larvae) indukuj pojawienie si m.in. rozrostw nowotworowych w obrbie orodkw wzrokowych mzgu larwy. W tzw. zespole von Hippela-Lindau (nowotwory wieku dziecicego wystpujce rodzinnie, np. naczyniak podowy, barwiak nadnerczowy) oraz w raku nerek zidentyfikowano gen supresorowy VHL (ang. von Hippel-Lindau), ktry koduje biako powierzchniowe biorce udzia w adhezji komrek. W zespole Lyncha (niektre nowotwory wystpujce rodzinnie, w tym take nowotwory okrnicy) stwierdzono wystpowanie genu supresorowego zlokalizowanego w chromosomie 2 (gen LCFS2, ang. lynch cancer family syndrome type 2). Gen ten prawdopodobnie koduje biako, ktre wpywa na rearanacj tzw. krtkich sekwencji mikrosatelitarnych oraz destabilizacj genomu. Przypuszcza si, e w ten sposb gen LCFS2 wpywa na szybko pojawienia si mutacji w genach APC, p53 i DCC, a tym samym na tworzenie si polipw i ich nowotworowej transformacji. 12.24. W procesie nowotworzenia bior udzia nie tylko onkogeny i geny supresorowe W zoonym i wieloetapowym procesie nowotworzenia, oprcz genw zwanych onkogenami i genw supresorowych, bierze udzia rwnie wiele innych genw (tab. 12.3).
Tabela 12.3. Geny, ktrych zmutowane formy odgrywaj rol w nowotworzeniu

Rodzaj genw Onkogeny

Funkcja w komrkach prawidowych

Rodzaj mutacji

Udzia w nowotworzeniu nie kontrolowana proliferacja, zahamowanie rnicowania staa proliferacja wzrost unaczynienia inwazyjno, komrek ruchliwo

proliferacja komrko- dominujcy wa, programowana samodestrukcja (<apoptosis) recesywna recesywna

Supresory transformacji proliferacja nowotworowej Geny zwizane z angioge- unaczynienie nez

Geny zwizane z inwazyj- adhezja komrek, ko- dominujca noci munikacja midzykomrkowa Geny zwizane z przerzu- komunikacja midzy- recesywna towaniem komrkowa

zmniejszenie reaktywnoci na sygnay midzykomrkowe, autonomizacja komrek zmniejszenie kontroli immunologicznej ?

kontrola immunologi- recesywna czna ? Antygeny powierzchniowe dominujca

Geny MHC

W trakcie nowotworzenia, w komrce, w ktrej zostaa zainicjowana transformacja nowotworowa, w wyniku rnych zmian mutacyjnych, dochodzi do ujawnienia bd te wzrostu aktywnoci genw biorcych udzia w produkcji czynnikw angiogenetycznych, uatwiajcych unaczynienie nowotworu. Mog te by uszkodzone recesywne geny kodujce inhibitory angiogenezy. Proces unaczynienia moe by inicjowany wycznie przez komrki nowotworw zoliwych, a nie przez komrki nowotworw agodnych, ktre takich waciwoci nie maj. 12.25. Niektre geny bior udzia w progresji procesu nowotworowego i przerzutowaniu Progresja procesu rakowacenia wie si z mutacj i uaktywnieniem genu kodujcego kolagenaz IV, enzymu proteolitycznego, biorcego udzia w degradacji bony podstawowej nabonkw oraz macierzy zewntrzkomrkowej. W komrkach nowotworw zoliwych obserwuje si rwnie zwikszon aktywno genw kodujcych inne enzymy proteolityczne. Powstawanie komrek majcych zdolnoci do tworzenia przerzutw wie si z mutacjami recesywnymi genw, okrelanych niekiedy jako geny supresorowe przerzutowania. O obecnoci takiego genu (czy te genw) wiadcz dane pochodzce z hybrydyzacji komrek prawidowych oraz komrek nowotworu zoliwego dajcego przerzuty. Powstay hybryd komrkowy mia cechy nowotworu zoliwego, ale nie dawa przerzutw. Stosunkowo dobrze przebadanym genem przerzutowania jest gen o symbolu nm23. Wydaje si, e gen ten, wykazujcy znaczn homologi do genu kodujcego kinaz nukleotydu difosforanu, ma wszelkie cechy genu supresorowego przerzutowania. Jest nieaktywny w komrkach przerzutujcych. Natomiast wystpuje i jest aktywny w komrkach nowotworw zoliwych, nie dajcych przerzutw. Wydaje si, e kinazy NDP bior udzia w tworzeniu agregatw mikrotubul oraz w transmisji sygnau z udziaem biaek G. Moliwe, e dziki specjalnej strukturze (suwak leucynowy) wystpujcej w biaku kodowanym przez gen nm23, dziaa on take jako czynnik transkrypcyjny. Gen nm23 wprowadzony do komrek nowotworu dajcego przerzuty powoduje zniesienie niektrych waciwoci komrek przerzutujcych: zdolnoci tworzenia przerzutw oraz reaktywnoci na czynnik wzrostowy typu TGF/J. W komrkach nowotworowych obserwuje si rwnie mutacje recesywne genw warunkujcych sta liczb podziaw komrkowych (ang. senescence genes). U czowieka geny te s zlokalizowane w chromosomie 1. Mutacje tych genw prowadz do powstania stanu tzw. immortalizacji, czyli zdolnoci komrek do nieograniczonej liczby podziaw komrkowych, czego wynikiem jest nieograniczony wzrost komrek w hodowli. W komrkach nowotworowych, zwaszcza tych dajcych przerzuty, spostrzega si take defekty genetyczne prowadzce do zmniejszonej ekspresji

genw klasy I zgodnoci tkankowej (ang. MHC class I). Klasa tych antygenw odgrywa wan rol w rozpoznaniu obcych antygenw przez cytotoksyczne limfocyty T. Przypuszcza si, e defekty genetyczne tej klasy genw odpowiedzialne s midzy innymi za wymykanie si komrek nowotworowych spod kontroli immunologicznej organizmu gospodarza. Komrka nowotworowa indukuje odczyny ze strony ssiadujcych komrek oraz tkanek prawidowych i chocia odczyny te nie s w peni poznane, z pewnoci maj one fundamentalne znaczenie dla progresji nowotworw. Na przykad warto wspomnie o indukcji w fibroblastach znajdujcych si w otoczeniu komrki rakowej tzw. czynnika rozpraszania (ang. scatter factor), ktry jest identyczny z czynnikiem wzrostu hepatocytw. Czynnik rozpraszania wpywa na zmian fenotypu komrek rakowych: te ostatnie staj si bardziej ruchliwe, tj. przyjmuj fenotyp inwazyjny". Komrka nowotworowa reaguje na obecno czynnika rozpraszania ekspresj powierzchniowego receptora dla tego czynnika kodowanego przez onkogen c-met. 12.26. Procesowi postpujcego zoliwienia komrek towarzyszy postpujca destabilizacja genomu Powstawanie nowotworu jest zoonym procesem wykazujcym zadziwiajc kierunkowo i sekwencj niektrych zdarze: od komrki, w ktrej zaszed proces inicjacji (uchwytny jedynie na poziomie molekularnym) poprzez promocj, gdzie nastpuj dalsze mutacje, a do stopniowego pojawiania si cech zezoliwienia" i przerzutowania. Pochodzce z rnych tkanek i narzdw nowotwory wykazuj podobne tendencje: postpujce zezoliwienie. Zjawisko progresji ma swoje odzwierciedlenie w stopniowym pojawianiu si w komrce nowotworowej coraz wikszej liczby zmutowanych genw, innymi sowy: kumulacji w komrkach nowotworowych coraz to wikszej liczby mutacji. Zdarzenia te doprowadzaj w kocu do destabilizacji (rozchwiania") funkcji genomu. Proces nowotworzenia zostaje zainicjowany najczciej w pojedynczej komrce. rda mutacji nie s w peni poznane. Indukowa mutacje mog czynniki mutagenne (zewntrzkomrkowe) lub powstajce wewntrz organizmu, a take bdne reperacje mutacji, bdy w replikacji DNA, nieprawidowe i niehomologiczne rekombinacje. Niewykluczone, e niektre mutacje maj charakter epigenetyczny, zmieniaj nie tyle tre informacji genetycznej, co raczej sposoby jej regulacji (np. zmiany w metylacji DNA). Cz mutacji moe mie charakter mutacji spontanicznych spowodowanych tautomerycznymi przeksztaceniami w strukturze nukleotydw. Zjawiska epigenetyczne odgrywaj powan rol w ojcowskim przekazywaniu cech predyspozycji do zapadania na choroby nowotworowe. Ten proces niemendlowskiego dziedziczenia cech w jzyku angielskim nosi nazw imprinting" (p. rozdz. 10). By moe, e w niektrych przypadkach dochodzi, w wy-

niku zdarze epigenetycznych, do inaktywacji genw recesywnych odpowiedzialnych za kontrol procesw proliferacji: komrki dziel si i trac zdolno do prawidowego reagowania na okrelone sygnay rnicowania komrkowego. Bardzo prawdopodobne, e we wczesnych okresach rozwoju nowotworu dochodzi do mutacji i utraty funkcji przez geny supresorowe, gdy mutacje genu p53 spostrzega si te we wczesnych etapach rozwoju wielu typw nowotworw. W miar progresji procesu nowotworowego w komrkach transformowanych pojawiaj si zmiany na poziomie chromosomalnym, rearanacja chromosomw, a take zaburzenie liczby chromosomw (aneuploidia). Przyczyny aneuploidii nie s w peni jasne. Niewykluczone, e w powstawaniu aneuploidii bior udzia mutacje recesywne genw kontrolujcych precyzj i dokadno podziaw mitotycznych komrki. W komrce w wyniku nieprawidowych podziaw dochodzi do niewaciwego rozkadu chromosomw. Zamiast 23 par, typowej diploidalnej liczby chromosomw u ludzi, obserwuje si zwikszon lub zmniejszon liczb chromosomw. Ponadto w komrce nowotworowej pojawiaj si aberracje chromosomowe. Loci objte aberracjami przestaj spenia prawidowe funkcje. Dochodzi do przemieszcze genw z jednych do innych chromosomw (translokacja), do utraty sekwencji nukleotydowych w obrbie genw i ich regionw regulatorowych (delecje), czenia si genw lub innych fragmentw (fuzje) w nowe, hybrydowe geny, ktrych produkty biakowe nie speniaj okrelonych, prawidowych funkcji. Niestabilno genomu prowadzi wic do pojawienia si w rnych komrkach coraz wikszej liczby zmutowanych genw. Powstajce w wyniku podziaw komrkowych subpopulacje komrkowe rni si bd midzy sob kombinacjami zmutowanych genw. 12.27. Mechanizmy selekcji i adaptacji prowadz do rozwoju klonw komrek nowotworowych o duej autonomii wzrostu Przewaga jednej subpopulacji komrek nad innymi bdzie zaleaa od wartoci adaptacyjnej, jak zmutowane geny bd wnosiy do komrek. Subpopulacje komrkowe s bowiem przedmiotem ostrej selekcji. Pozytywn warto adaptacyjn bd miay te mutacje czy te kombinacje mutacji, ktre prowadzi bd do coraz wikszej autonomii komrek, narastajcej inwazyjnoci i zdolnoci tworzenia przerzutw. Na rysunku 12.5 pokazano w bardzo uproszczony sposb swoist ewolucj rnych subpopulacji komrkowych podczas nowotworzenia. Powstae w wyniku zmian mutacyjnych subpopulacje komrkowe s potomstwem jednej komrki (monokionalne pochodzenie nowotworw), w ktrej by zainicjowany proces zezoliwienia (transformacji). Subpopulacje te rni si midzy sob wieloma cechami biologicznymi. Komrki z mutacjami o maej wartoci przystosowawczej bd eliminowane przez mechanizmy selekcji. Du warto adaptacyjn bd miay natomiast te

(a) komrki prawidowe

(b) komrki euploidalne (c) inicjacja

Rys. 12.5. Hipotetyczne rodzaje powstajcych subpopulacji komrkowych podczas nowotworzenia. N komrki normalne; T x komrki nowotworu agodnego; T 2 , T 3 , T 4 komrki nowotworu zoliwego; T 5 komrki przerzutw. Powstajce mutacje letalne oznaczono czarnym kkiem (wg S. Szala, Nowotwory i geny, Kosmos, 40, 1991, 311-317 za zgod)

warianty komrkowe, ktre uciekaj" spod nadzoru immunologicznego gospodarza, oglnoustrojowej kontroli hormonalnej lub kontroli innych sygnaw" wytwarzanych przez komrki prawidowe. Du warto adaptacyjn bd miay te te warianty, w ktrych podziay komrkowe nie podlegaj kontroli oraz te, ktre bd w stanie wytworzy naczynia krwionone lub wydziela biaka proteolityczne warunkujce inwazj komrek nowotworowych. W procesie progresji nowotworu zoliwego, czyli w procesie swoistej ewolucji komrek nowotworowych, obserwuje si wic tendencj do powstawania subpopulacji o okrelonych waciwociach biologicznych. Rne kombinacje zmutowanych genw, w tym protoonkogenw oraz genw supresorowych, bd prowadzi do powstania tego samego fenotypu nowotworowego i to niezalenie od tego z jakich tkanek i narzdw wywodzi si bd nowotwory. Choroba nowotworowa jest wic swojego rodzaju chorob genetyczn, w ktrej powstaniu i przebiegu bierze udzia wiele rnych zmutowanych genw.

13. MOLEKULARNE PODSTAWY EWOLUCJI

ycie rodzi si wszdzie tak samo. Pierwej w niebywale powolnym rozwoju ocean musi przybrzenie skisn w kisielkowat chlustw i ciche fale sulaj j przez wieki, a to i tysiclecia, nim z tego misiwa wyoni si kurczliwa mlazgro, ktra po niezliczonych pokrtnych przygodach dociapka si tam, gdzie jej misz zwapnieje w jaki stelayk.
Stanisaw Lem, Wizja lokalna, 1983

Rozdzia ten przedstawia hipotezy i spekulacje na temat ewolucji wiata oywionego, ktre wywodz si z osigni wspczesnej biologii molekularnej dokonanych do koca roku 1991. Pominite s natomiast wszystkie zagadnienia ewolucyjne pochodzce z innych dziedzin biologii na przykad paleontologii, teorii doboru, genetyki populacji itp. Ewolucja ycia na Ziemi jest faktem uznanym przez ca wspczesn biologi. Jednoczenie jednak ogromna liczba problemw pozostanie nie wyjaniona; co wicej, by moe nie zostanie wyjaniona nigdy. Dzieje si tak nie tylko dlatego, e nauka nie osigna jeszcze dostatecznego stopnia rozwoju, ale rwnie dlatego, e ewolucja rozpocza si zapewne 3-4 mld lat temu i warunki panujce wwczas na Ziemi nie s dokadnie znane. Brak dajcych si analizowa biochemicznie reliktw wczesnych faz ewolucji oraz niemono dowiadczalnego modelowania procesw, ktre trway miliardy lat, wymusza konieczno obracania si w krgu hipotez. Z drugiej jednak strony biologia molekularna dostarczya metod badawczych oraz danych o niebywaym znaczeniu dla rozwoju nauki o ewolucji. Szczeglny przeom spowodowaa moliwo porwnywania sekwencji nukleotydowej genw rnych organizmw yjcych obecnie, a nawet genw izolowanych ze szcztkw kopalnych. Wyniki tych bada potwierdziy fakt jednoci wiata oywionego; stosowanie praktycznie jednakowych zasad zapisu i odczytywania informacji genetycznej u wszystkich organizmw z wirusami wcznie wiadczy dobitnie o ich pochodzeniu od wsplnego praprzodka tzw. progenoty. Ponadto ustalenie zasad kodowania informacji genetycznej wyraonych skrtowo jako centralny dogmat biologii molekularnej": DNA RNA biako

doprowadzio do uznania nadrzdnoci genotypu w procesie ewolucji. Tak wic wedug wspczesnego neodarwinizmu organizmy ywe s skomplikowanymi

ukadami zapewniajcymi replikacj genomw. W tym sensie funkcja biologiczna organizmu czowieka nie rni si zasadniczo od np. otoczki wirusa obie struktury su ochronie, replikacji i propagacji genw. Szczeglnie udane" zespoy genw osigaj sukces ewolucyjny dziki interakcji kodowanych przez nie fenotypw z otoczeniem. Masowa produkcja kolejnych, zmodyfikowanych genotypw, jak i ich selekcja dziki doborowi naturalnemu dziaajcemu na fenotypy, stanowi mechanizm ewoluowania nowych organizmw. Odgadywanie drg ewolucji po ladach, jaki ten proces pozostawi w sekwencjach DNA rnych organizmw jest fascynujc przygod intelektualn. Cigle jeszcze za mao wiemy o molekularnych mechanizmach procesw morfogenezy, behawioru i embriogenezy. Poniewa rnice midzy gatunkami s gwnie zwizane z tymi wanie procesami, postp w badaniach nad ewolucj bdzie zalea od postpu w rozumieniu tych zjawisk. 13.1. ycie na Ziemi mogo powsta okoo 3 mld lat temu Nasza planeta zostaa uksztatowana ok. 4,5 mld lat temu i wydaje si, e ycie na niej powstao ok. 3 mld lat temu. Sugeruj to badania nad mikroskamielinami: analiza mikroskopowa ska osadowych, ktre powstay 3 mld lat ujawnia istnienie pcherzykowatych tworw, ktre mog by pozostaociami pierwotnych komrek. Poniewa warunki panujce na powierzchni Ziemi 3-4 mld lat temu nie s dokadnie znane, wspczesne pogldy na pierwsze fazy ewolucji opieraj si na spekulacjach. Jest jednak jasne, e ewolucja ycia rozpocza si na dugo zanim powstay pierwsze organizmy. Za pocztek tego acucha zjawisk, mona uwaa powstanie tak zwanego bulionu pierwotnego w wyniku rozpuszczania si w wodzie zwizkw organicznych. Zwizki te powstaway na skutek reagowania ze sob skadnikw atmosfery ziemskiej pod wpywem wyadowa elektrycznych oraz promieni UV. Koncepcj powstania ycia przez zagszczenie si bulionu pierwotnego w tak zwane koacerwaty sformuowa Oparin w roku 1938, natomiast w roku 1953 Miller (Stany Zjednoczone) udowodni, e prebiotyczna synteza zwizkw organicznych daje si powtrzy dowiadczalnie. W kolbie zawierajcej mieszanin metanu, amoniaku i wodoru oraz wod przeprowadzono silne wyadowania elektryczne, nastpnie skroplone produkty reakcji byy wprowadzane do wody, skd przez odparowywanie powracay do kolby reakcyjnej. Po kilku dniach takiego krenia atmosferycznego" okazao si, e nastpia synteza dziesiciu rnych aminokwasw, ponadto w kolbie stwierdzono obecno aldehydw i cyjanowodoru. Opisane dowiadczenie zapocztkowao seri bada nad abiotyczn syntez zwizkw organicznych, midzy innymi stwierdzono, e polimeryzacja cyjanowodoru moe doprowadzi do powstania adeniny i uracylu, kondensacja formaldehydu za prowadzi do powstania cukrw, midzy innymi rybozy.

Tak wic okazao si, e podstawowe elementy, z jakich skadaj si biaka i kwasy nukleinowe mogy powszechnie wystpowa na Ziemi 3-4 mld lat temu. Pocztki ycia musiay jednak wymaga kondensacji podstawowych elementw w polimery jak biaka i kwasy nukleinowe. Polimery takie powstaj przez usunicie wody w trakcie syntezy wizania peptydowego biaek lub syntezy wizania fosfodiestrowego kwasw nukleinowych. Tymczasem rodowisko wodne i podwyszona temperatura sprzyjay hydrolizie a nie polimeryzacji. Z tego powodu wydaje si, e powstanie ycia w rodowisku prebiotycznym wymagao spenienia dodatkowego warunku ochrony przed hydroliz nowo powstaych polimerw organicznych. Ochrona taka powodowaaby zmniejszenie efektywnego stenia wody, na przykad przez uwodnienie obecnych w rodowisku polarnych czsteczek polifosforanw. Niektre modele powstania ycia zakadaj udzia powierzchni mineraw w procesach kondensacji postuluje si udzia pirytw lub szka bazaltowego. Takie powierzchnie stanowiyby rodowisko umoliwiajce lokalny wzrost stenia reagujcych monomerw, umoliwiayby wzajemne reakcje powstajcych kompleksw czsteczek, peniyby rol katalizatora oraz chroniyby przed aktywnoci hydrolityczn wody.

13.2. ycie powstao dziki katalitycznym waciwociom replikujcych si czsteczek RNA Obecno i ciga synteza de novo nawet najbardziej zoonych czsteczek organicznych nie oznacza, e mamy do czynienia z ukadem ywym. Wyznaczenie granicy, od jakiej moemy uzna hipotetyczny praorganizm za ywy, jest dyskusyjne, wydaje si jednak e ukad taki musi wykazywa trzy podstawowe cechy: (a) wasny metabolizm; (b) zdolno do replikacji, czyli powielania si i przekazania swoich cech organizmom potomnym; (c) podleganie ewolucji. Przez dugi czas pogodzenie tych trzech postulatw z teori Oparina byo niemoliwe z powodu wystpienia paradoksu typu co byo wczeniej kura czy jajko". Wydawao si bowiem, e jedynie biaka peni rol biokatalizatorw i dlatego postulowano ich pierwotn rol w powstawaniu ycia. Z kolei wiadomo, e a informacja o strukturze biaek jest zakodowana w kwasach nukleinowych i e odwrotny przepyw informacji tj. od biaek do kwasw nukleinowych jest niemoliwy. Tak wic, jeeli pierwszy genom mia si replikowa, to w jaki sposb mogo si to odby bez udziau biaek. Jeli za pocztkiem ycia miay by biaka o okrelonych waciwociach katalitycznych, to w jaki sposb informacja o ich sekwencji moga si dziedziczy. Problem co byo pierwsze biako czy kwas nukleoinowy zosta rozwizany w roku 1981, kiedy T. Cech (Stany Zjednoczone) odkry, e RNA

moe peni rol katalityczn. Przedmiotem bada Cecha by intron w rybosomalnym RNA orzska Tetrahymena. Okazao si, intron ten in mtro jest zdolny do precyzyjnego wycinania si z prekursora bez udziau jakichkolwiek biaek. Intensywne badania nad katalitycznymi funkcjami RNA, prowadzone w cigu ostatnich dziesiciu lat, udowodniy, e czsteczki RNA, zwane rybozymami, zdolne s do przeprowadzania in vitro reakcji transestryfikacji oraz hydrolizy wiza fosfodiestrowych w RNA. Dokadniejszy opis tych reakcji czytelnik znajdzie w rozdziale 8 tej ksiki. Innymi przykadami katalizy z udziaem RNA s: enzym RNaza P, ktry bierze udzia w dojrzewaniu tRNA i jest zoony z biaka oraz czsteczki RNA, ktra jest niezbdna do aktywnoci enzymatycznej; mae czsteczki RNA (snRNA) s skadnikami spliceosomu, czyli kompleksu przeprowadzajcego wycinanie intronw. Wydaje si, e rybosomalny RNA peni funkcje transferazy peptydylowej w procesie translacji; wykazano te udzia RNA jako czynnika transkrypcyjnego dla polimerazy RNA III u owadw (tab. 13.1).
Tabela 13.1. Funkcje biologiczne czsteczek RNA

RNA mRNA rRNA

Funkcja przekazywanie informacji okrelajcej kolejno czenia aminokwasw w biosyntezie biaka 1. udzia w strukturze rybosomu 2. aktywno transferazy peptydylowej (?) 3. translokacja peptydylo-tRNA czsteczki adaptorowe przenoszce aminokwasy w biosyntezie biaek i w innych szlakach anabolicznych wycinanie intronw dojrzewanie rRNA (?) obrbka koca 3' mRNA histonowego obrbka i poliadenylacja 3'-kocw pre-mRNA komponenta katalityczna RNazy P biorcej udzia w obrbce tRNA matryca do syntezy telomerw skadnik kompleksu rozpoznajcy sygna w procesie translokacji biaek przez bony czsteczki RNA inicjujce replikacj DNA prokariotyczny RNA zdolny do regulacji wydajnoci translacji czynnik regulujcy transkrypcj przez PolIII u owadw

tRNA Ul, U2, U4/U6 i U5 snRNA U3 snRNA U7 snRNA U l i snRNA Ml RNA RNA telomerazy 7S RNA primery RNA micF TFIIIR

Za odkrycie katalizy opartej na RNA badacze Cech i Altman (Stany Zjednoczone) otrzymali nagrod Nobla w roku 1990. Chemiczne waciwoci RNA, jego zdolno do przybierania skomplikowanych struktur drugo- i trzeciorzdowych oraz moliwoci modyfikacji zasad

w czsteczce wiadcz o teoretycznie nieograniczonym potencjale katalitycznym RNA. Co wicej, waciwoci katalityczne wykazuj stosunkowo krtkie czsteczki RNA: np. rybozym skonstruowany in vitro przez J. Szostaka (Stany Zjednoczone) z czci intronu faga T4 jest zdolny do syntezy komplementarnej nici RNA, uywajc oligonukleotydw jako substratw. Sam rybozym skada si z trzech odcinkw RNA o dugoci 59, 75 i 43 nukleotydw i stanowi rodzaj prymitywnej replikazy RNA. Opisane odkrycia spowodoway przeom w wyobraeniach na temat pierwotnej fazy ewolucji biosfery. Uwaa si obecnie, e pierwszymi replikujcymi si czsteczkami byy replikazy RNA, to jest spontanicznie powstae acuchy rybonukleotydw, ktre wykorzystyway obecnie w pierwotnym bulionie" rybonukleotydy do syntezy komplementarnych replikaz. Stanowiy one zarwno materia genetyczny, jak i enzym katalizujcy wasn replikacj. Powielanie si tych czsteczek nastpowao oczywicie z bdami replikacyjnymi, spowodowanymi gwnie brakiem mechanizmw korekcyjnych oraz niedoskonaoci pierwotnych rybozymw. Na skutek tego potomne czsteczki reprezentoway szerokie spektrum aktywnoci, niektre replikoway si szybciej, inne miay zmienione optima pH czy stenia soli, jeszcze inne mogy naby zdolno hydrolizowania obcych" czsteczek RNA i zuywania powstaych w ten sposb nukleotydw do wasnej replikacji. Dobr naturalny mg wic dziaa ju od chwili powstania pierwszych rybozymw, selekcjonujc czsteczki najlepiej przeywajce i efektywnie replikujce si. T pocztkow, hipotetyczn faz ewolucji, nazwano wiatem RNA". Wydaje si mao prawdopodobne, aby pozostay jakie kopalne lady tego wiata, gdy RNA atwo ulega hydrolizie, ponadto czsteczki RNA s dobr poywk dla wikszoci mikroorganizmw. Przyjmuje si jednak, e wymienione reakcje, w ktrych uczestnicz czsteczki RNA stanowi relikt wiata RNA". Za uznaniem RNA, a nie DNA za pierwotny nonik procesw yciowych przemawia fakt, e synteza deoksynukleotydw in vivo odbywa si na skutek redukcji wczeniej powstaych rybonukleotydw, a tymina zasada wystpujca jedynie w DNA powstaje w wyniku metylacji zasady specyficznej dla RNA, to jest uracylu. Co wicej, w procesie replikacji DNA niezbdne s krtkie odcinki RNA suce jako primery, podczas gdy polimerazy RNA s w stanie inicjowa syntez komplementarnej nici RNA bez udziau starterw. Tak wic DNA moe by uznany za modyfikacj RNA, ktra wyewoluowaa pniej i ktra ze wzgldu na wiksz stabilno chemiczn lepiej nadawaa si do przechowywania informacji genetycznej. wiat RNA skada si wic z replikujcych si czsteczek RNA, ktre speniay rol zarwno replikatora, jak i materiau genetycznego czyli fenotypu i genotypu zarazem. Jednake prawdziwe przypieszenie ewolucji nastpio z chwil wytworzenia cakiem nowego systemu katalizy: a mianowicie ukadw opartych na biakach.

13.3. Biaka okazay si lepszymi katalizatorami ni RNA Poniewa biaka nie maj zdolnoci do replikacji, nie istnieje mechanizm, w ktrym dobr naturalny mgby dziaa na polipeptydy nie kodowane przez genom. Innymi sowy, poniewa cechy nabyte nie podlegaj dziedziczeniu, wszystkie spontaniczne poczenia aminokwasw, nawet bardzo aktywne katalitycznie, nie mogy peni adnej roli w ewolucji, gdy informacja o ich sekwencji nie moga by przekazana potomstwu. Aby mogo doj do katalizy zalenej od biaek, konieczne byo utworzenie zalenoci midzy sekwencj nukleotydw w prymitywnym genomie RNA a sekwencj oligopeptydu zdolnego do jakiej metabolicznej funkcji. Obecny system odczytywania informacji genetycznej jest bardzo skomplikowany: za specyficzne rozpoznanie aminokwasu i powizanie go z tRNA o waciwym antykodonie odpowiedzialne s syntetazy aminoacylo-tRNA, natomiast sama synteza polipeptydu wymaga zoonego kompleksu rybosom-mRNA, czynnikw translacyjnych oraz penego zestawu aminoacylo-tRNA. W jaki sposb odbya si wic ewolucja kodu genetycznego i powizanego z nim aparatu translacyjnego? W ostatnich latach zaproponowano model etykiety genomowej" (ang. genomie tag), ktry zakada, e pojawienie si procesu translacji odbyo si dziki wykorzystaniu w ewolucji kocowych odcinkw genomw RNA. Autorzy tego modelu: Weiner i Maizels (Stany Zjednoczone) zwrcili uwag, e jednoniciowe wirusy RNA, atakujce roliny i bakterie, zawieraj na 3'-kocach swoich genomw tzw. etykietk" w postaci struktury przypominajcej tRNA. Etykietki uwaane s za molekularn skamielin" pochodzc z wczesnych etapw ewolucji wiata RNA. Mog by jednak rozpoznawane in vitro przez enzymy wspczesnego metabolizmu RNA: np. przez nukleotydylotransferaz tRNA (tj. enzym tworzcy sekwencje CCA na 3'-kocu tRNA), enzymy aminoacylujce tRNA i inne. Wydaje si, e funkcj etykietki jest wskazywanie koca 3' genomu RNA dla replikacji oraz umoliwienie rozrnienia RNA matrycowego zawierajcego etykietk od innych czsteczek RNA. Powstanie znakowanych kocw RNA we wczesnej fazie ewolucji uatwio replikacj genomw RNA, a jednoczenie mogo sta si zacztkiem powstawania procesu translacji. Jeli bowiem zaoymy, e przyczenie aminokwasu do struktury etykietki miao pozytywny wpyw na replikacj, to oznacza, e czsteczki przypominajce aminoacylo-tRNA * byy obecne w wiecie RNA i mogy zosta wykorzystane do syntezy peptydw. W ten sposb translacja i kataliza oparta na biakach powstay przez przywaszczenie" elementw pierwotnie sucych replikacji RNA. Na zwizki midzy replikacj a translacj wskazuje midzy innymi fakt, e replikaza bakteriofaga QP jest tetramerem skadajcym si z biaka fagowego oraz trzech biaek gospodarza. Wszystkie trzy: biako rybosomalne SI i faktory elongacyjne Tu oraz Ts s skadnikami aparatu translacyjnego. Zgodnie

z modelem etykietki genomowej to nie bakteriofag Q/3 wykorzystuje faktory translacyjne do wasnej replikacji, ale aparat translacyjny bakterii pochodzi od wczeniejszych ewolucyjnie czynnikw replikacyjnych RNA. Pierwotne polipeptydy prawdopodobnie nie byy optymalnymi katalizatorami i nie mogy w peni zastpi rybozymw, gdy byy stosunkowo krtkie i skaday si z niewielu rnych aminokwasw. Wydaje si wic, e rybozymy pocztkowo wyewoluoway w enzymy typu RNP (rybonukleoproteiny) i dopiero w pniejszych stadiach ewolucji doszo do wykorzystania potencjau katalitycznego samych biaek. Warto zauway, e do dzisiaj wiele procesw jest katalizowanych przez kompleksy RNA z biakami (p. tab. 13.1), natomiast ponad poowa znanych enzymw zalena jest od niebiakowych kofaktorw wrd ktrych szczeglnie liczne s nukleotydy lub ich pochodne. 13.4. Kod genetyczny jest na og identyczny w caym wiecie oywionym Porwnywanie sekwencji zasad w genach oraz sekwencji aminokwasw w odpowiadajcych im biakach ujawnio, e prawie we wszystkich badanych organizmach ywych zasady kodowania informacji genetycznej s jednakowe: to znaczy zawsze tej samej trjce zasad odpowiada ten sam aminokwas. Uniwersalno kodu genetycznego, czyli stosowanie tych samych zasad kodowania u bakterii czy u czowieka wiadczy o tym, e kod genetyczny w znanej nam postaci musia wyewoluowa bardzo wczenie, jeszcze przed rozejciem si prokariontw, eukariontw i archebakterii. Koncepcje dotyczce ewolucji samego kodu genetycznego maj oczywicie charakter spekulacji. Moliwe, e pocztkowo jeden kodon oznacza kilka aminokwasw lub te, e pocztkowe prymitywne kodony byy zoone z tylko dwch zasad. Nie jest te jasne, czy istniay chemiczne podstawy wykorzystywania konkretnych sekwencji RNA do kodowania okrelonych aminokwasw, czy te zwizki takie byy czysto przypadkowe. Jest jednak oczywiste, e osignwszy pewn sprawno dziaania, kod genetyczny musia zosta zamroony" ewolucyjnie w swojej formie, gdy wszelkie zmiany zasad kodowania powodowayby lawin mutacji typu missens w rozmaitych biakach i co za tym idzie zmniejszenie sprawnoci ewolucyjnej pierwotnego organizmu. Istniej jednak odstpstwa od zasady uniwersalnoci kodu genetycznego, gwnie w genomach mitochondrialnych oraz w genomach jdrowych orzskw i u Mycoplasma\iab. 13.2) Co wicej, w mitochondriach inne s take zasady odczytywania sekwencji w mRNA przez tRNA: liczba rodzajw tRNA jest niewielka i najczciej rozpoznawane s tylko dwie pierwsze zasady antykodonu. Trudno jest osdzi, czy takie uproszczone zasady odczytywania kodu genetycznego oraz odstpstwa od uniwersalnego kodu stanowi relikt wczesnej fazy ewolucji, czy te powstay znacznie pniej i maj charakter przystosowania do translacji bardzo maej iloci biaek. Pewnym argumentem na korzy pierwszej hipotezy jest stosowanie kodonu UGA jako kodujcego

Tabela 13.2. Rnice midzy uniwersalnym kodem genetycznym a kodami w mitochondriach oraz u Mycoplasma i Paramecium

Organizm Wikszo organizmw Ssaki Ssaki Drosophila Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces ceremsiae Drosophila Organizm Mycoplasma Paramecium

Kodon UGA AGA, AGG AUA AUA AUA CUA AGA Kodon UGA UAA VAG

Znaczenie w mitochondriach Trp STOP Met (inicjacja) Met (inicjacja) Met (elongacja) Thr Ser Znaczenie Trp Glu Glu

Znaczenie w kodzie uniwersalnym STOP Arg Ileu Ileu Ileu Leu Arg Znaczenie w kodzie uniwersalnym STOP STOP STOP

tryptofan w mitochondriach, Mycoplasma i u orzskw. By moe taki wanie kod by uywany przez grup organizmw, ktra dokonaa inwazji symbiotycznej przodkw eukariontw. 13.5. Progenota: praprzodek organizmw ywych mia genom zoony z DNA Trudno jest okreli, kiedy DNA sta si materiaem genetycznym. DNA jest bardziej stabilny chemicznie od RNA i nie podlega tak atwo hydrolizie. Niewykluczone, e aden organizm o stopniu komplikacji lub tempie wzrostu obecnych organizmw nie mg mie genomu zoonego z RNA, gdy powstrzymywanie rozpadu i naprawa uszkodze takiego genomu pochaniayby zbyt wiele energii. Powstanie genomw z DNA byo wic istotnym krokiem na drodze ewolucji. Poniewa wszystkie obecne organizmy ywe syntetyzuj prekursory DNA, redukujc grupy 2'-OH difosforanw rybonukleotydw, powstanie enzymu katalizujcego t reakcj, czyli reduktazy rybonukleotydodifosforanw byo kluczowym wydarzeniem prowadzcym do ewolucji wiata opartego na DNA. Konwersja genomw RNA do DNA wymagaa take dodatkowych reakcji: poza syntez prekursorw niezbdne byo powstanie replikaz DNA oraz poiimeraz RNA. Na pewnym etapie ewolucji musiay take utworzy si systemy bon biakowo-lipidowych, umoliwiajce kompartmentacj procesw biochemicznych i oddzielajce prymitywny organizm od rodowiska zewntrznego. Wszystkie te przemiany doprowadziy do powstania praprzodka komrki: obonionego ukadu dysponujcego genomem zoonym z DNA, zdolnego do replikacji, transkrypcji i translacji oraz wykazujcego prymitywny metabolizm. Taki hipotetyczny praorganizm zosta nazwany progenot; kolejne etapy ewolucji doprowadzajce do powstanie progenoty ilustruje rysunek 13.1.

bulion pierwotny kondensacja rybonukleotydw | powstanie RNA reakcje katalizowane przez RNA: synteza RNA specyficzne cicie RNA splicing utworzenie mechanizmw translacji tRNA, mRNA, rRNA, kod genetyczny, synteza biaek

utworzenie genomw z RNA odwrotna transkrypcja

Rys. 13.1. Schemat przedstawiajcy hipotetyczne wczesne fazy ewolucji (wg J.E. Darnell i W.F. Doolittle, PNAS 83, 1986, 1271)

13.6. Historia ewolucji jest zapisana w sekwencji nukleotydowej genw W kocu lat 70. W. Gilbert (Stany Zjednoczone) i F. Sanger (Anglia) opracowali metody szybkiego ustalania sekwencji nukleotydw w DNA, za co otrzymali nagrod Nobla. Dziki tym metodom stao si moliwe porwnywanie sekwencji genw kodujcych te same biaka u rnych organizmw, a co za tym idzie ledzenie zmian ewolucyjnych na poziomie DNA. Moliwe take stao si ustalenie, czy jaka domena lub motyw powtarza si w biakach penicych rne funkcje. Szybki postp bada w tej dziedzinie spowodowa, e na pocztku lat 90. znanych byo ok. 30 000 sekwencji nukleotydowych rnych genw. Te sekwencje umieszczone w komputerowych bazach danych

mona podda analizie. W ostatnich latach planuje si take uzyskanie penej sekwencji nukleotydowej genomu czowieka (program HUGO, czyli Huma Genome Project, gwnie finansowany przez Stany Zjednoczone, zakadajcy ustalenie sekwencji trzech miliardw par zasad) oraz sekwencjonowanie genomu drody (finansowane przez EWG). Zakoczenie tych prac jest spodziewane na pocztku wieku XXI. Badania porwnawcze nad sekwencjami DNA wykazay, e niektre geny ewoluuj bardzo powoli, to jest rzadko akumuluj substytucje nukleotydowe i w efekcie sekwencje tych genw mao si rni od siebie, nawet w przypadku porwnywania genw z organizmw bardzo odlegych filogenetycznie. Do takich genw nale midzy innymi geny kodujce cytochrom c, histony czy rybosomalny RNA. Poniewa wystpuj one w ogromnej wikszoci lub u wszystkich organizmw ywych, przyjmuje si, e powstay one bardzo wczenie w ewolucji. Stanowi one rodzaj molekularnych skamienielin" i analiza zmian w ich sekwencjach doskonale si nadaje do ledzenia gwnych trendw w ewolucji wiata oywionego. W przeciwiestwie do nich, pseudogeny, introny, odcinki midzygenowe oraz genomy mitochondrialne maj do szybkie tempo ewolucji i analiza ich sekwencji jest przydatna w badaniach nad filogenez gatunkw bliej spokrewnionych. Jeeli zaoymy, e czsto mutacji w czasie ewolucji jest wartoci sta dla danego genu, to liczba rnic w sekwencji nukleotydowej dwch homologicznych genw bdzie wprost proporcjonalna do czasu, jaki upyn od rozdzielenia si badanych gatunkw w filogenezie. Istnienie tego zegara molekularnego" pozwala na konstrukcj drzew genealogicznych organizmw ywych przez porwnywanie danych z sekwencji DNA z danymi paleontologicznymi. Bardzo uytecznym genem w ledzeniu ewolucji okaza si gen kodujcy 16SrRNA. Wystpuje on bowiem u wszystkich organizmw, ewoluowa bardzo powoli i daje si atwo klonowa in vitro. Rysunek 13.2 przedstawia drzewo genealogiczne organizmw ywych, skonstruowane na podstawie analizy sekwencji 16SrRNA. Warto zauway, e zgodnie z t analiz Archaebacteria tworz odrbne krlestwo, cakowicie rne od Eubacteria i Eukaryota. Jest to zgodne z wynikami innych bada, np. u Archaebacteria wykryto obecno intronw w niektrych genach. Z tych powodw niektrzy badacze sugeruj zastpienie nazwy Archaebacteria nazw Archaea, aby podkreli odrbno filogenetyczn tych organizmw od bakterii. Wydaje si, e rne tempa akumulowania substytucji nukleotydowych w genach odzwierciedlaj rnice w presji doboru naturalnego. Poniewa pseudogeny s genami, ktre utraciy zdolno kodowania funkcjonalnych biaek, losowe zmiany w ich sekwencji nie wpywaj na fenotyp, nie podlegaj presji doboru i akumuluj si z maksymaln czstoci, bdc wypadkow losowych bdw w replikacji DNA czy te dziaania naturalnych czynnikw mutagennych. Podobnie zachowuj si introny oraz obszary midzy genami. Inaczej dzieje si w przypadku genw kodujcych metabolicznie czynne

ARCHAEBACTERIA Halobacerium Haiococcus Sulfoboius termoacidofile Thermoproteus enax, Methanobacterium Methanococcus formicicum vanietii > - metanogeny sotfafaricus volcanii morrhuae hungafef

Methanospirillum

halofile

Homo sapiens Xenopus laevis

Flavobacterium Pseudomonas Escherichia Agrobacterium

heparinum estosteroni

Zea mays Saccharomyces cerevisiae Oxytrichia Dictyosteium nova discoideum brucei Zea mays chloroplast Anacystis Bacillus subtilis

coli tumefaciens

\ mitochondria Zea mays 7 nidulans

Trypanosoma

EUKARYOTA

EUBACTERIA

Rys. 13.2. Drzewo genealogiczne skonstruowane na podstawie sekwencji genw kodujcych 16SrRNA

produkty: substytucje nukleotydowe mog mie istotne znaczenie dla funkcji tak wic eliminacja lub utrwalenie tych zmian s wynikiem doboru naturalnego. Przeprowadzone ostatnio badania z zastosowaniem mutagenezy in vitro sugeruj, e tylko sekwencje kodujce aminokwasy, wystpujce w centrach aktywnych lub majce znaczenie dla konformacji czsteczki, musz by zachowane. Pozostae aminokwasy mog ulega wymianie na inne wskutek mutacji i te pozycje w biaku, dla ktrych taka zmiana nie powoduje rnic w aktywnoci, mog stanowi ponad 50% wszystkich aminokwasw. 13.7. Mitochondria i chloroplasty s pochodzenia endosymbiotycznego Mitochondria i chloroplasty zawieraj po kilkadziesit niewielkich, najczciej kolistych czsteczek DNA. DNA mitochondrialny (mtDNA) koduje u wszystkich organizmw eukariotycznych podobny zestaw 10-20 polipeptydw, ktre s niezbdne w procesie oddychania tlenowego. Pozostae ok. 95% biaek, z jakich skada si mitochondrium, jest kodowane przez genom jdrowy. Z kolei genomy chloroplastowe (ctDNA) koduj 60-100 biaek, natomiast pozostae 80-90% biaek chloroplastu kodowane jest przez DNA jdrowy. Zarwno mtDNA, jak i ctDNA > koduj jeszcze zestawy rRNA i tRNA, niezbdne do translacji mitochondrialnego i chloroplastowego mRNA. Obecnie przyjmuje si, e zarwno chloroplasty, jak i mitochondria powstay w wyniku symbiozy organizmw bdcych przodkami eukariontw z organizmami zblionymi do obecnych cyjanobakterii (ct) i bakterii purpurowych (mt). Szacuje si, e symbioza taka zostaa utworzona ok. 1 mld lat temu. Funkcje metaboliczne, ktrych dostarczyy symbionty, to jest oddychanie tlenowe i fotosynteza, stay si z czasem niezbdne dla organizmw gospodarza, natomiast wikszo genw kodujcych biaka uczestniczce w tych procesach przemiecia si do jdra komrkowego. Rwnoczenie postpowa proces delecji wikszoci genw u symbiontw i w efekcie tych przemian symbionty przeksztaciy si w organelle komrkowe. Dowodw na hipotez endosymbiotyczn dostarczya przede wszystkim analiza sekwencji genw mitochondrialnych i chloroplastowych. Midzy innymi stwierdzono, e promotory genw chloroplastowych maj obszary 35 i 10 bardzo podobne do typowych promotorw prokariotycznych. 35 E. coli (sekwencja najwyszej zgodnoci) tRNA-2 metioninowy z ctDNA szpiku TCTTGACAT TATTGCTTA -10 TATAA TATAA

Rybosomy chloroplastowe s podobne do rybosomw prokariotycznych. Zachodzca na nich translacja jest wraliwa na chloramfenikol podobnie jak

u E. coli. Rybosomalny RNA chloroplastw zawiera sekwencje wysoce homologiczne do rRNA z E. coli, natomiast niektre chloroplastowe biaka rybosomalne reaguj z przeciwciaami specyficznymi dla biaek rybosomalnych E. coli. Porwnania sekwencji genomw mitochondrialnych i prokariotycznych dostarczaj mniej informacji z powodu znacznej rnorodnoci mtDNA. Jednake dokadna analiza genw kodujcych rRNA wykazaa istotne homologie z genami rRNA wspczesnych fotosyntetyzujcych bakterii purpurowych typu a. Do grupy tej nale bakterie, ktre wyrniaj si funkcjonalnymi oddziaywaniami z rolinami wyszymi, jak Agrobacterium i Rhizobium. Ewolucyjne przeksztacenie si genomw prokariontw w obecnie istniejce DNA organelli musiao polega midzy innymi na przemieszczaniu si odcinkw DNA. Wiele faktw wskazuje na to, e taka wymiana genw midzy genomami jdrowymi a chloroplastowymi i mitochondrialnymi zachodzia w przeszoci i cigle jeszcze zachodzi. W rnych organizmach ten sam gen moe by kodowany przez genom jdrowy lub mitochondrialny. Na przykad podjednostka 9 kompleksu ATPazy jest kodowana przez mtDNA u Succharomyces cerevisiae, ale u innych grzybw i u czowieka jest kodowana przez genom jdrowy. Z kolei podstawowy enzym fotosyntezy: karboksylaza rybulozo-l,5-difosforanu skada si z omiu duych jednakowych podjednostek rbc-L oraz z omiu jednakowych maych podjednostek rbc-S. U wikszoci fotosyntetyzujcych eukariontw podjednostka rbc-L jest kodowana przez genom chloroplastowy, rbc-S za przez genom jdrowy. Jednake u jednokomrkowca Cyanophora paradoxa oba biaka kodowane s przez genom prymitywnego chloroplastu tzw. cyjanelli. Fakt ten sugeruje, e w trakcie ewolucji chloroplastw gen kodujcy rbc-S przenis si z organelli do jdra komrkowego. Dodatkowym dowodem na wymian DNA midzy jdrem i organellami jest homologia niektrych sekwencji DNA chloroplastowego szpinaku z sekwencjami w genomie jdrowym szpinaku. Udao si take wykaza hybrydyzacj fragmentw mtDNA z genomami jdrowymi u drody, rozgwiazdy i szczura. Ostatnio udao si wykaza dowiadczalnie, e DNA moe przenosi si z mitchondriw do jdra: do mitochondriw szczepu drody S. cerevisiae, ktry wymaga do wzrostu uracylu, wprowadzono skonstruowane in miro genomy mitochondrialne, zawierajce jdrowy gen URA3. Gen ten nie moe ulega ekspresji w mitochondriach ze wzgldu na rnice w kodzie genetycznym oraz rne sygnay umoliwiajce transkrypcj i translacj. Jednake stwierdzono przechodzenie tego genu do jdra z niewielk czstoci, czego rezultatem jest wzrost komrek na poywce bez uracylu. Badania molekularne potwierdziy fakt transferu genu URA3 do jdra komrkowego. Tak wic mechanizmy, ktre doprowadziy do przeniesienia wikszoci DNA prasymbiontw do eukariotycznego genomu jdrowego nadal istniej i mog funkcjonowa u obecnych eukariontw.

Genomy mitochondrialne i chloroplastowe pochodz od dwch niezalenych linii prokariotycznych praprzodkw. W historii ewolucji musiay wic nastpi dwie inwazje czy te symbiozy: symbioza promitochondriw z proeukariontem i symbioza prochloroplastw z proeukariontem. Rysunek 13.3 przedstawia hipotetyczny cig zdarze w ewolucji genomw organellarnych.
Eukaryota

Rys. 13.3. Ewolucyjne drzewo genealogiczne przedstawiajce dwie inwazje endosymbiontw prowadzce do powstania organizmw eukariotycznych

Jaki jest sens biologiczny istnienia genomw chloroplastowych i mitochondrialnych? Dlaczego komrki utrzymuj tak kosztowne energetycznie odrbne systemy replikacji, transkrypcji i translacji genw organellarnych, ktre koduj tak niewielk liczb biaek? Odpowied na te pytania nie jest znana. Jest moliwe, e genomy mitochondrialne i chloroplastowe stanowi lepy zauek ewolucji". Poniewa niektre biaka uczestniczce w fotosyntezie i oddychaniu nie mog przechodzi przez bony organelli, musz by syntetyzowane od wewntrz. Wydaje si, e mRNA i tRNA take nie mog by transportowane do wntrza organelli i dlatego redukcja genomw i przenoszenie si genw z organelli do jdra musiay si w pewnym miejscu zatrzyma. W wiecie eukariontw zachowa si relikt wczesnej inwazji organizmw symbiotycznych.

13.8. Biaka o nowych funkcjach powstay dziki duplikacjom genw lub dziki tasowaniu egzonw Za jeden z mechanizmw powstawania genw kodujcych biaka o nowych lub zmodyfikowanych funkcjach uwaa si duplikacje genw struktury, doprowadzajc do powstawania dodatkowej kopii genu kodujcego dane biako. Taka dodatkowa kopia moe akumulowa mutacje, podczas gdy orygina" funkcjonuje bez zmian. Z czasem proces ten doprowadza do wytworzenia nowego genu. Powstawanie genw o nowych funkcjach w wyniku duplikacji daje si przeledzi na przykadzie rodziny /J-globin u ssakw. Polipeptydy /?-globin tworz kompleks z a-globin oraz hemem i w ten sposb powstaje hemoglobina tetramerowe biako odpowiedzialne za przenoszenie tlenu. U czowieka jeden gen koduje polipeptyd /J-globiny wystpujcy w okresie embrionalnym (e), dwa inne geny koduj /J-globiny podowe (G-y A-y) oraz dwa geny /} i < 5 koduj /J-globiny osobnikw dojrzaych. Z kolei u kz wystpuje a pi genw embrionalnych, u krlika i u kozy za wystpuje po jednym genie osobnikw dojrzaych. Opisane geny powstay prawdopodobnie w wyniku duplikacji genu kodujcego mioglobin. Kolejne duplikacje i zmiany w sekwencji doprowadziy do powstania dwch rodzin genowych: a- i /J-globin, uczestniczcych w wytwarzaniu rnych form hemoglobiny w kolejnych stadiach rozwoju ssakw (rys. 13.4).
10 20 30 40 50 60 70 tys. par zasad 1 1 1 1 1 1 1 pny embrionalny wczesny embrionalny | | pseudogen dojrzay - D mysz y$hO fihl fih2 $h3 fil 2 pseudogen embrionalny podowy | dojrzay 1 czowiek Gy Gy fil < 5 fi pseudogen embrionalny | dojrzay krlik pseudogen & W2 & I wczesny pseudogen pseudogen embrionalny | dojrzay embrionalny | dojrzay embrionalny | podowy I pC pA pF eI eII em eIVyflZ eV eVI yfl? 0 ~T

koza

Rys. 13.4. Duplikacje genw w rodzinie /?-globin u ssakw

Opisany powyej model ewoluowania genw nie mg jednak wyjani wielu danych uzyskiwanych z sekwencjonowania biaek lub genw kodujcych biaka. Dlatego te w roku 1977 W. Gilbert (Stany Zjednoczone) postawi hipotez, e poszczeglne egzony w genach reprezentuj domeny biakowe, to jest fragmenty biaek, ktre s odpowiedzialne za okrelone funkcje: na przykad za wizanie jonw czy aktywno enzymatyczn. Co wicej Gilbert

postulowa, e poszczeglne egzony z rnych genw mogy si ze sob czy w rnych kombinacjach w trakcie ewolucji. Introny znajdujce si midzy egzonami kodujcymi poszczeglne domeny biaek stanowiyby miejsca wczenia lub usuwania kolejnych egzonw, dziki czemu faza odczytu polipeptydu, kodowanego przez kilka egzonw pochodzcych z rnych rde, nie ulegaaby zmianie. W ten sposb nowe geny powstaj dziki kombinacji egzonw pochodzcych z innych genw. Powysza hipoteza Gilberta nosi nazw tasowania egzonw" (ang. exon shuffling). Rodzina proteaz serynowych stanowi przykad genw, w ktrych introny przedzielaj egzony kodujce poszczeglne domeny biakowe. Dotychczas zsekwencjonowano ponad 10 genw tej rodziny, midzy innymi ludzkie czynniki krzepliwoci krwi IX i X, ludzk trombin, ludzki aktywator plazminogenu (TPA), urokinaz wini, fibronektyn i inne. Wszystkie te biaka maj domen odpowiedzialn za hydroliz wizania peptydowego. Domeny o innych funkcjach kodowane s przez odrbne egzony i w zalenoci od biaka stanowi one peptydy sygnaowe, rejony wice jony wapnia, czy te rejony homologiczne do epidermalnego czynnika wzrostu (EGF) (rys. 13.5).
proteaza protrombina

plazminogen tkankowy aktywator plazminogenu

<ske>:
Fnll tv Fnl > v
N

urokinaza czynnik IX (X) biako C(Z)

Pro czynnik XII Fnl biako pynu nasiennego biako S

o ^ o ^ S y y n Fnll Fnl Fnlll

Rys. 13.5. Diagram przedstawiajcy uoenie domen biakowych w rodzinie proteaz serynowych Ca domena wica wap; K domena kringle"; EGF-A domena epidermalnego czynnika wzrostu A; EGF-B domena epidermalnego czynnika wzrostu B; Fn domena fibronektyny (typ I, II lub III); proteaza domena katalityczna proteazy serynowej; pro obszar bogaty w prolin .

Analiza sekwencji genw z rodziny proteaz serynowych sugeruje wic, e w trakcie ewolucji egzony kodujce domeny o rnych funkcjach zostay przyczone do egzonw kodujcych proteolityczne centrum aktywne. W trak-

cie tego procesu niektre egzony ulegy duplikacji i wystpuj w biaku obok siebie. Tak wic tasowanie egzonw doprowadzio do powstania biaek o rnych funkcjach. Mocnym dowodem na hipotez tasowania egzonw jest wystpowanie wyej wspomnianego egzonu kodujcego rejon homologiczny do EGF w biakach nie nalecych do spokrewnionych rodzin. Egzon ten wystpuje bowiem w epidermalnym czynniku wzrostu (EGF) i czynnikach krzepliwoci krwi IX i X, ale take w receptorze lipoproteiny niskiej gstoci (LDL receptor). Rozprzestrzenianie si tego egzonu musiao nastpi w ewolucji stosunkowo niedawno, gdy wszystkie te biaka s charakterystyczne wycznie dla krgowcw. Kolejnego dowodu na tasowanie egzonw dostarczya analiza sekwencji trzech enzymw: ludzkiej kinazy glicerofosforanowej (PGK), dehydrogenazy alkoholowej kukurydzy (ADH) oraz dehydrogenazy 3-fosfoglicerynianu (GAPDH) kurczcia. Wszystkie te enzymy maj podobne domeny wice nukleotydy oraz zupenie niepodobne do siebie domeny katalityczne. Kada z domen wicych nukleotydy jest kodowana przez 5 egzonw, identycznie wzgldem siebie uoonych.

13.9. Ewolucji na Ziemi wystarczyo niewiele egzonw Hipoteza tasowania egzonw zakada, e zoona budowa biaek jest wynikiem czenia egzonw pochodzcych z rnych genw. W ten sposb biaka uzyskuj nowe funkcje, niejako przejmujc je od innych biaek. Ma to zasadnicze znaczenie dla tempa ewolucji, ktra w ten sposb korzysta z cegieek" czy te podzespow", czyli ju wczeniej wyewoluowanych i funkcjonalnych domen biakowych. Autorzy hipotezy tasowania egzonw W. Gilbert i wsppracownicy usiowali oszacowa liczb wszystkich istniejcych egzonw, to znaczy odpowiedzie na pytanie, jak wiele rnych egzonw byo niezbdnych do wytworzenia przez ewolucj istniejcej obecnie rnorodnoci biaek w wiecie oywionym. Sdzc po olbrzymiej liczbie gatunkw i jak si wydaje odpowiadajcej im rnorodnoci biaek wydawaoby si, e liczba egzonw musi by astronomiczna. Gilbert uzyska jednak zupenie przeciwny wynik. Przyjta metoda polegaa na analizie statystycznej zbioru wszystkich znanych sekwencji kodujcych biaka, tj. ok. 20 000 sekwencji DNA. W zalenoci od przyjtego modelu matematycznego, Gilbert oszacowa liczb wszystkich wystpujcych obecnie egzonw na 1000-7000. Jest ona zaskakujco maa w porwnaniu z liczb wszystkich moliwych sekwencji peptydu o dugoci 40 aminokwasw, ktra wynosi 1052 lub te z liczb przeciwcia, wystarczajc do wystpienia sekwencji specyficznej dla dowolnego antygenu, ktra u myszy wynosi ok. 108. Metoda zastosowana przez Gilberta spotkaa si z krytyczn ocen wielu badaczy i nie jest wykluczone, e liczba egzonw jest wiksza ni

7000. Niezalenie jednak od precyzji, z jak bdzie mona dokona obliczenia tej wartoci wydaje si, e liczba elementw budulcowych" wykorzystanych przez ewolucj jest niezwykle maa w porwnaniu z moliwociami wynikajcymi z kombinacji 20 aminokwasw. Ewolucja odbywaa si w sposb przypieszony przez wykorzystanie podzespow" w postaci egzonw kodujcych funkcjonalne domeny biakowe. Tak wic biako o dugoci 200 aminokwasw mogo powsta przez tasowanie piciu egzonw, kady o dugoci 40 aminokwasw (25 000 moliwych kombinacji), a nie w wyniku pojedynczych substytucji nukleotydowych (202O kombinacji). Drugim istotnym wnioskiem wynikajcym z faktu istnienia stosunkowo niewielkiej liczby egzonw jest to, e obecnie wystpujca rnorodno biaek odzwierciedla jedynie ma czstk wszystkich teoretycznie moliwych rozwiza ewolucyjnych. Stao si tak dlatego, e ewolucja jest procesem utrwalajcym zmiany, ktre zaszy w trakcie jej przebiegu. Powstawanie i utrwalanie nowych sekwencji aminokwasw jest zawone na skutek ewolucyjnego sukcesu kombinacji ju uprzednio powstaych. Tak wic powstanie okrelonego zestawu egzonw w pocztkach ewolucji mogo zdeterminowa jej dalszy bieg: rnorodno biaek bya kreowana z pocztkowego" zestawu egzonw, nie za kreowana de novo z puli losowych kombinacji. Najnowsze techniki biologii molekularnej potwierdzaj powysz tez, moliwe jest bowiem syntetyzowanie odcinkw DNA lub RNA o losowej sekwencji, a nastpnie ze zbioru 108 takich czsteczek mona selekcjonowa i namnaa (za pomoc reakcji PCR, czyli reakcji acuchowej polimerazy) czsteczki wykazujce specyficzne waciwoci katalityczne. W ten sposb uzyskano rybozymy i czsteczki biaka o niespotykanych w przyrodzie waciwociach, np. zdolne do wizania pewnych barwnikw czy te majce zdolno specyficznego cicia genomw wirusowych, np. wirusa HIV. Z kolei wyselekcjonowane w ten sposb czsteczki, o waciwociach naturalnie" wytworzonych przez ewolucj, maj sekwencje biaek czy RNA zupenie niepodobne do sekwencji wystpujcych w przyrodzie. Fakty te potwierdzaj wnioski Gilberta o ograniczonej historycznie rnorodnoci rozwiza ewolucyjnych i wiadcz o istnieniu rnorodnoci czynnych katalitycznie sekwencji, z ktrych ewolucja nie skorzystaa. Praktyczne wykorzystanie tego potencjau moe przynie ogromne korzyci w biotechnologii i w medycynie.

13.10. Czy introny pojawiy si wczenie czy pno w ewolucji? Genomy rnych organizmw zawieraj niejednakowe liczby intronw. Na przykad genom ludzki zawiera ich bardzo duo, do kilkudziesiciu intronw na jeden gen, genom drody Saccharomyces cerevisiae ma ich bardzo niewiele, natomiast genom E. coli nie zawiera ich wcale. Zupenie odwrotnie dzieje si

w genomach mitochondrialnych: mtDNA ludzkie nie zawiera w ogle intronw, podczas gdy s one liczne w mtDNA drody. Fakt ten nasuwa wiele pyta: przede wszystkim czy introny speniaj jak funkcj, czy stanowi warto w doborze naturalnym oraz czy istniay od samego pocztku ewolucji, czy te pojawiy si w pewnym jej momencie, np. w trakcie lub po oddzieleniu si eukariontw od prymitywnego przodka tzw. progenoty. Wspczeni badacze nie udzielaj zgodnych odpowiedzi na te pytania. Cz genetykw faworyzuje hipotez o pojawieniu si intronw stosunkowo pno w ewolucji, ju po powstaniu progenoty. Wedug tych pogldw progenota zawieraa geny cige, pozbawione intronw. Introny pojawiy si jako rodzaj inwazyjnych transpozonw, obdarzonych moliwoci samowycinania si na poziomie RNA. Ich wczenie si w genom nie powodowao skutkw w doborze naturalnym i w tym sensie introny te byyby typowym przykadem samolubnego DNA", to znaczy sekwencji wczonej w genom i korzystajcej z aparatu replikacyjnego tego genomu, bez wywoywania efektw fenotypowych. Chocia insercja intronw nie powodowaa natychmiastowych skutkw, na dusz met okazaa si mechanizmem przypieszajcym ewolucj przez umoliwienie tasowania egzonw. Niektre cechy intronw mitochondrialnych stanowi poparcie dla przedstawionych tez. Na przykad pewne introny mtDNA drody koduj enzymy suce do ich wycinania tzw. maturazy. Inne introny mitochondrialne drody maj zdolno do przenoszenia si z genomu zawierajcego intron do okrelonego miejsca w genomie bez intronu. Intron co z genu kodujcego duy mt rRNA drody koduje endonukleaz, ktra uczestniczy w procesie takiego przenoszenia si (ang. intron homing). Ostatnio udao si wykry w genomie mitochondrialnym rzodkiewnika (Arabidopsis) ukad jednego intronu w drugim tzw. twintron, czyli intron bliniaczy i uwaa si ten fakt za dowd na inwazyjno intronw. Z kolei zwolennicy teori o wczesnej obecnoci intronw w ewolucji zakadaj, e introny powstay rwnoczenie z egzonami jeszcze w czasie trwania wiata RNA, a wic przed powstaniem pregenoty. Umoliwiy w ten sposb tasowanie egzonw jako przypieszon drog ewolucji". Wedug zwolennikw tej koncepcji, wprowadzenie intronw do istniejcych ju uprzednio genw musiaoby si wiza z obnieniem sprawnoci ewolucyjnej organizmw. Zgodnie z teori wczesn" introny mog by gubione" przez genomy i std bakterie pozbyy si ich cakowicie, gdy dla szybko rozmnaajcych si organizmw jednokomrkowych stanowio to element przewagi selekcyjnej. 13.11. Geny nalece do rodzin wielogenowych ewoluuj razem Niektre geny powtrzone s w genomie wiele razy i tworz tak zwane rodziny wielogenowe. Najbardziej charakterystycznym przykadem jest rodzina genw kodujcych rybosomalne RNA, wystpujca powszechnie u eukarion-

tw. Na przykad u grzyba strzpkowego Aspergillus nidulans geny kodujce 18SrRNA, 5.8SrRNA i 26SrRNA le obok siebie i ukad ten powtrzony jest kilkaset razy na jednym odcinku chromosomu (ang. tandem repeats). Z kolei geny kodujce 5SrRNA u Aspergillus take s powtrzone kilkaset razy w genomie, wystpuj jednak pojedynczo na rnych chromosomach i tworz tak zwan rodzin rozproszon. Analiza sekwencji nukleotydowych genw nalecych do rodzin wielogenowych ujawnia nieoczekiwany fakt: wszystkie geny powtrzone obok siebie s jednakowe w obrbie jednego gatunku, ale mog rni si znacznie od analogicznych odcinkw DNA innego, blisko spokrewnionego gatunku. Co wicej, zaleno ta zachodzi take dla tych odcinkw DNA, ktre nie koduj adnych produktw: na przykad w rodzinie powtarzajcych si sekwencji DNA, kodujcych przerywniki (ang. spacers) midzy genami 18SrRNA i 28SrRNA u Xenopus laevis i Xenopus mulleri, sekwencje przerywnikw s praktycznie identyczne wewntrzgatunkowo, ale rni si ok. 10% pomidzy tymi dwoma gatunkami. Fakt ten oznacza, e powtrzone geny w obrbie gatunku ewoluuj wsplnie i utrzymuj homogenno sekwencji. Mutacja w jednym elemencie rodziny wielogenowej albo ulega eliminacji, albo utrwala si wskutek rozprzestrzeniania si na wszystkie geny tworzce rodzin genow. Proces ten nazywany jest ewolucj zespoow (ang. concerted evolution). Ewolucja zespoowa zachodzi niezalenie od faktu, czy dana rodzina genw lub sekwencji koduje jakie czynne fenotypowo produkty, ponadto wystpuje take w przypadku rozproszonych rodzin genowych. Na przykad u Aspergillus nidulans ewolucji zespoowej podlegaj nie tylko rozproszone geny kodujce 5SrRNA, ale take rozproszone fragmenty pseudogenw 5SrRNA. <
1 2 1 3 2

U
X

Rys. 13.6. Model ewolucji zespoowej (ewolucji przebiegajcej zgodnie) przez nierwny crossing-over. Numery przedstawiaj kolejne elementy powtrzonych odcinkw DNA

U
I1 I
1 4 4 A 5

U I

5 |

x
1 l U l A | U | A l~5~|

Przypuszcza si, e za ewolucj zespoow odpowiedzialna jest konwersja genw lub niewzajemny crossing-over. Schemat przedstawiajcy homogenizacj sekwencji rodziny genowej przez niewzajemny crossing-over pokazany jest na rysunku 13.6. Za mechanizmem tym przemawia fakt, e liczba powtarzajcych si jednostek w rodzinach wielogenowych moe by rna, nawet w obrbie tego samego gatunku. Liczby kopii genw kodujcych rybosomalne RNA oszacowane na podstawie kinetyki reasocjacji DNA wynosz: u kukurydzy 3100-9400, u Drosophila 100-230, u czowieka za 50-190.

13.12. Cz DNA w genomach nie ulega ekspresji W trakcie ok. 3 mld lat ewolucji od najprostszych organizmw do obecnych ssakw i rolin zawarto DNA w genomach wzrosa ok. 1000 razy. Pocztkowo uwaano, e wzrost zawartoci DNA jest odzwierciedleniem wzrostu skomplikowania, gdy nowe cechy metaboliczne i rozwojowe musz by kodowane przez nowe geny, ktre nie maj odpowiednikw u prostszych ewolucyjnie organizmw. Na przykad geny kodujce fibrynogen, haptoglobin czy immunoglobuliny s znane wycznie u krgowcw. Jednake okazao si, e ilo DNA w genomie czsto jest zupenie nie skorelowana z pozycj organizmu na drabinie ewolucyjnej". Fakt ten znany jest jako paradoks zawartoci DNA (ang. C-value paradox). Na przykad wiele gatunkw pazw zawiera wicej DNA ni ssaki, a pewien gatunek ryby pucodysznej zawiera 40 razy wicej DNA ni czowiek. Analiza molekularna genomw eukariotycznych wykazaa, e ich wiksza cz zoona jest z sekwencji nie kodujcych: gwnie obszarw wewntrz intronw oraz z midzygenowych sekwencji powtarzajcych si. Procentowa zawarto sekwencji repetetywnych w genomach jest rna, u niszych eukariontw dochodzi do 10-20%, u zwierzt do 50% a u niektrych rolin osiga warto 80%. Dane te pochodz z eksperymentw, w ktrych DNA jest losowo pofragmentowany na krtkie odcinki, a nastpnie denaturowany i renaturowany. ledzenie tempa renaturacji przez pomiary absorpcji w UV pozwala na oszacowanie zawartoci sekwencji powtarzajcych si, gdy renaturuj one szybciej. I tak stwierdzono, e u myszy ok. 10% DNA zbudowane jest z sekwencji repetetywnych, czyli powtarzajcych si wielokrotnie w genomie: wystpuje tam ok. 1 000 000 kopii prawie identycznej sekwencji DNA o dugoci 234 par zasad; ok. 20% DNA skada si z rnych sekwencji powtrzonych 100-100 000 razy oraz ok. 70% DNA stanowi geny wystpujce rednio w jednej kopii na haploidalny zestaw chromosomw. Frakcja DNA repetetywnego nazywana jest DNA satelitarnym, gdy w trakcie wirowania preparatw DNA w gradiencie gstoci chlorku cezu tworzy ona odrbny prek. Powtarzajca si sekwencja 234 par zasad tworzca DNA satelitarny myszy skada si z krtszych, homologicznych do siebie podjednostek i wydaje si, e pochodzi ona od podstawowej sekwencji o dugoci 9 par zasad.

W genomie czowieka wystpuje klasa powtarzajcych si sekwencji DNA, zwana rodzin Alu. Nazwa ta pochodzi std, e w obrbie sekwencji Alu wystpuje miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Alul. Sekwencje Alu maj ok. 300 par zasad; s one powtrzone ok. 300 000 razy i s rozproszone w genomie. Niektre z nich wystpuj nawet wewntrz intronw, natomiast rednia odlego midzy kolejnymi sekwencjami Alu wynosi ok. 6000 par zasad. Wydaje si, e sekwencje Alu nie peni adnych funkcji; maj jednak zdolno do rozprzestrzeniania si, poniewa zawieraj wewntrzny promotor i mog by transkrybowane przez polimeraz RNA III. Transkrypty Alu s w stanie wcza si w rne miejsca genomu korzystajc z procesu retrotranspozycji, to jest zjawiska polegajcego na odwrotnej transkrypcji RNA w DNA i integracji powstaego DNA do chromosomw. Taki proces reintegracji sekwencji do genomw moe w istotny sposb wpywa na zawarto DNA w genomach. Zjawisko to jest do czste, na przykad genom myszy zawiera wiele pseudogenw globinowych, niektre z nich nie zawieraj intronw i std wydaje si, e powstay na drodze retrotranspozycji. Proces wypompowywania" pseudogenw z pojedynczego, transkrybowanego locus przyrwnywano do wypywu lawy z wulkanu i std nazwano go modelem Wezuwiusza. Wczanie si bezintronowych genw do chromosomu po odwrotnej transkrypcji ich dojrzaego mRNA stanowi prost drog precyzyjnego pozbywania si intronw na poziomie DNA. Geny Saccharomyces cerevisiae bardzo rzadko zawieraj introny, to samo dotyczy genomw prokariotycznych. Jest wic moliwe, e w trakcie ewolucji organizmy te pozbyy si intronw w opisany powyej sposb, poniewa dobr naturalny faworyzowa ograniczanie iloci DNA w genomie. 13.13. Geny powstajce przez odwrotn transkrypcj mog peni wan rol w ewolucji Ostatnio wykazano, e niektre geny powstae w wyniku retrotranspozycji, czyli tak zwane retrotranspozony, peni funkcje w metabolizmie komrek. Fakt ten oznacza, e zjawisko retrotranspozycji moe nie tylko prowadzi do zamiecania" genomw, ale moe by uwaane za istotn drog w ewolucji nowych genw. Wydaje si, e gen kodujcy insulin (typl) u szczura jest retrotranspozonem, ktry powsta w wyniku niekompletnego skadania pierwotnego transkryptu. Kolejnym przykadem s geny kodujce kinaz fosfoglicerynianu (.Pgk-1) i dehydrogenaz pirogronianu (.Pdha-1) u myszy i u czowieka. Oba geny s pooone na chromosomie X, ulegaj ekspresji w komrkach somatycznych i kady z nich zawiera 10 intronw. Istniej jednak autosomalne geny Pgk-2 i Pdha-2, kodujce wspomniane enzymy, ktre ulegaj ekspresji wycznie w gonadach mskich i wykazuj charakterystyczne cechy retrotranspozonw. W innym przypadku retrotranspozony peni funkcj

regulacyjn w stosunku do istniejcego uprzednio genu: zmodyfikowane koce 3' pseudogenu y-aktyny su jako rejony promotorowe ludzkich genw kodujcych amylazy liniankowe. Przedstawione przykady sugeruj, e retrotranspozony i nieaktywne retropseudogeny mog peni istotn rol w ewolucji, stanowic rodzaj rezerwuaru sekwencji, uywanych do tworzenia nowych genw. 13.14. Genomy mog by kolonizowane przez pasoytniczy, samolubny DNA Jak opisano w poprzednim rozdziale, genomy organizmw ywych zawieraj niekiedy bardzo due iloci sekwencji, ktre prawdopodobnie nie peni adnej funkcji. Sekwencje przerywnikowe midzy genami, repetetywny DNA, introny, transpozony i pseudogeny mog stanowi ponad poow cakowitej iloci DNA w genomie i bywaj nazywane mieciami molekularnymi (ang. junk DNA). W celu wyjanienia faktu utrzymywania si tych sekwencji w genomach L. Orgel, F. Crick, C. Sapienza i W. Doolittle sformuowali hipotez samolubnego DNA (ang. selfish DNA). Zakada ona, e istniej sekwencje DNA, ktre s lub byy zdolne do rozprzestrzeniania si w genomach. Sekwencje te stanowi rodzaj pasoytw molekularnych, ktre namnaaj si kosztem aparatu replikacyjnego komrek. Samolubny DNA, nie kodujc adnej funkcji, jest pasywnym pasaerem bez biletu" w ewolucji. Powstaje pytanie, dlaczego dobr naturalny nie jest w stanie eliminowa takiego DNA u wielu gatunkw. By moe, e u szybko dzielcych si jednokomrkowcw, jak bakterie i drode, zwikszanie iloci DNA jest poddane bliej jeszcze nie znanym ograniczeniom i dlatego mieci molekularne s eliminowane. Z drugiej strony, odrnienie wasnego" DNA komrki od rozprzestrzeniajcego si transpozonu czy sekwencji Alu wydaje si biochemicznie niemoliwe, natomiast insercja w obrbie intronu czy te odcinka midzy genami ma najczciej charakter neutralny pod wzgldem doboru. Std te jedynym ograniczeniem ekspansji DNA mieciowego wydaje si koszt energetyczny utrzymania zwikszonego genomu. Wysze eukarionty wykazuj jednak zadziwiajc tolerancj na samolubny DNA u rolin zawarto sekwencji nie kodujcych czsto dochodzi do 80% cakowitej iloci DNA. Znany ewolucjonista R. Dawkins (Anglia), ktry jest twrc sformuowania samolubny gen", uwaa, e paradoks zawartoci DNA jest pozorny. DNA nie istnieje bowiem po to, aby sprawowa nadzr" nad metabolizmem komrki i dziedziczeniem jej cech. W istocie jest odwrotnie jedyn funkcj DNA jest jego przeycie i replikowanie si, natomiast metabolizm, struktury komrkowe i cae organizmy ywe s jedynie rodkami do tego celu, wytworzonymi przez ewoluujcy DNA. W tym sensie wszystkie geny s samolubne" zarwno te, ktre koduj jakie funkcje, jak i te, ktre s w stanie

wykorzysta genomy jako wehikuy, nie dostarczajc w zamian nic. Geny kodujce produkty podlegaj selekcji przez fenotypy organizmw, mutacja w danym genie prowadzi zatem do zmian czstoci wystpowania tego genu w stosunku do nie zmutowanych alleli. Z kolei mieci molekularne nie ulegaj wprawdzie ekspresji fenotypowej, ale mog podlega selekcji wewntrzgenomowej to znaczy zmienia swoj czsto wystpowania w obrbie genomu. Selekcja wewntrzgenomowa moe wic doprowadzi do wzrostu liczby pewnych typw sekwencji DNA, ktre s w stanie szczeglnie efektywnie zamieca chromosomy. Poniewa rozprzestrzenianie wewntrzgenomowe jest podobne do dziaania wirua, Orgel i Crick nazwali ten proces rakiem genomw". 13.15. Czy rzeczywicie pochodzimy od jednej pramatki Ewy? Pochodzenie i ewolucja gatunku Homo sapiens jest jednym z najbardziej fascynujcych problemw biologii. Nowe techniki biologii molekularnej i sekwencjonowanie caych genomw z pewnoci dostarcz ogromn liczb danych na temat ewolucji genw u naczelnych. Wiele dotychczasowych bada nad ewolucj molekularn czowieka opierao si na ustaleniu polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP) mitochondrialnego DNA. Na podstawie tych bada wysunito hipotez, e wszyscy pochodzimy od jednej pramatki tzw. mitochondrialnej Ewy. Hipoteza ta wzbudzia wiele sprzeciww, zarwno ze strony antropologw i archeologw, jak i ostatnio genetykw. Podstaw hipotezy o istnieniu pramatki Ewy stanowi badania nad ewolucj mtDNA. U ssakw mtDNA ewoluuje ok. 10 razy szybciej ni geny jdrowe. Spowodowane jest to brakiem mechanizmw naprawy poreplikacyjnej w mitochondriach oraz wiksz tolerancj na substytucje nukleotydowe w trzeciej pozycji kodonw. Poniewa zegar molekularny" w mtDNA porusza si szybciej ni w genomie jdrowym, analiza mtDNA moe by rdem informacji o ewolucji gatunkw rozdzielonych stosunkowo niedawno. Co wicej, wydawao si, e mitochondria plemnikw nie wnikaj do komrki jajowej w trakcie zapodnienia, tak wic mtDNA stanowioby czyst lini matczyn a nie wynik rekombinacji genomw obojga rodzicw. A. Wilson i wsppracownicy (Stany Zjednoczone), wychodzc z tych zaoe poddali analizie restrykcyjnej prbki mtDNA, reprezentujce 147 osb rnych ras, i na tej podstawie skonstruowali drzewo genealogiczne mtDNA. Uzyskane wyniki sugeroway, e najstarsz ras jest rasa czarna, gdy w jej obrbie zmienno mtDNA jest najwiksza oraz e wszystkie wystpujce obecnie genomy mitochondrialne daj si wyprowadzi z jednego pierwotnego genomu, czyli od jednej hipotetycznej pramatki Ewy", ktra ya w Afryce ok. 200 000 lat temu.

Jednake w roku 1991 udowodniono dowiadczalnie, e u gryzoni mtDNA moe si dziedziczy po samcach. Tak wic podstawowe zaoenie, na ktrym opiera si teoria pramatki Ewy" ulego zmianie, co w efekcie podwaa konkluzje tej teorii. Co wicej, poddano krytyce sam metod konstrukcji drzewa genealogicznego. By moe, e dokadniejsze dane na temat ewolucji czowieka bdzie mona uzyska z sekwencjonowania okrelonych genw, np. genu na chromosomie Y, ktry warunkuje rozwinicie si cech mskich. Trudnoci moe jednak nastrczy stosunkowo krtki czas, jaki upyn od ewolucji naczelnych. Wydaje si, e wikszo genw jdrowych ewoluuje zbyt wolno, aby mogy stanowi dobry zegar ewolucyjny". I tak analizowane ostatnio odcinki ludzkiego chromosomu Y o dugoci 800 par zasad nie wykazay adnych rnic w sekwencji u osobnikw nalecych do 16 rnych ras. Ustalenie optymalnych fragmentw genomu do takiej analizy bdzie wic niezbdne do dalszych bada nad ewolucj czowieka i do rozstrzygnicia problemu pramatki Ewy". 13.16. Czy symbioza i horyzontalny transfer genw mog by motorem ewolucji? Niektrzy badacze postuluj, e za ewolucj gatunkw s odpowiedzialne mechanizmy inne ni neodarwinowskie, to jest mutacje, duplikacje czy tasowanie odcinkw DNA w obrbie jednego gatunku. Lynn Margulis (Stany Zjednoczone), ktra jest autork teorii o endosymbiotycznym pochodzeniu mitochondriw i chloroplastw, sugeruje, e motorem ewolucji gatunkw jest symbioza. Caa biosfera byaby wic jednym ywym organizmem: Gaj (czyli matk Ziemi z mitologii greckiej). Hipoteza Gai jest do kontrowersyjna i nie opiera si na konkretnych modelach molekularnych, korzysta natomiast z faktu, e biologia nie jest jeszcze w stanie odpowiedzie na pytanie, jakie konkretnie rnice w genomach wiadcz o odrbnoci gatunkw oraz w jaki sposb do takiego wyodrbnienia dochodzi. Pewn przesank dla hipotezy Gai jest stwierdzony fakt horyzontalnego transferu genw, to jest przekraczania przez DNA barier midzy genomami jdrowymi i organellarnymi oraz midzy rnymi gatunkami. Taki transfer genw znany by od dawna u prokariontw, gdzie przenoszenie genw w postaci fragmentw chromosomw, na fagach czy plazmidach i episomach jest zjawiskiem powszechnym. Lata 80. ujawniy jednak wiele przykadw swobodnego DNA" (ang. promiscuous DNA), czyli DNA przenoszcego si midzy rnymi genomami. I tak gen kodujcy dysmutaz nadtlenkw uleg przeniesieniu z genomu ryby do bakterii Photobacter leiognathi, gen kodujcy histon H3 uleg wymianie midzy bardzo daleko spokrewnionymi gatunkami jeowcw. Znaleziono take odcinek DNA chloroplast owego o dugoci 12 tysicy par zasad, ktry zosta wczony do genomu mitochondrialnego kukurydzy. Z kolei w genomach jdrowych wielu organizmw znaleziono odcinki DNA mitochondrialnego.

Mimo stwierdzenia tych faktw, nie jest jeszcze jasne, czy horyzontalny transfer genw jest zjawiskiem wyjtkowym, czy te ma charakter uniwersalny i stanowi istotny czynnik w ewolucji. 13.17. Podsumowanie Ewolucja ycia na Ziemi trwa okoo 3 do 4 mld lat, jest wic procesem, ktry nie daje si modelowa dowiadczalnie. Przedstawione w tym rozdziale hipotezy opieraj si jednak na dobrze udokumentowanych faktach z dziedziny biologii molekularnej. W ostatnich latach najwiksze znaczenie dla bada nad ewolucj miao ustalenie i porwnywanie sekwencji nukleotydowej genw oraz odkrycie, e RNA moe mie waciwoci katalityczne. Za pocztek procesw yciowych mona uzna powstawanie czsteczek RNA zdolnych do katalizy reakcji biochemicznych oraz wasnej replikacji. Czsteczki te stanowiy wic jednoczenie genotyp i fenotyp. Ich dalsza ewolucja doprowadzia do wytworzenia metabolizmu opartego na katalizie biakowej oraz do wytworzenia stabilnych genomw w postaci dwuniciowego DNA. Powstay w ten sposb praorganizm, zwany progenot, by przodkiem wszystkich yjcych obecnie organizmw wiadczy o tym jednolito zasad kodowania informacji genetycznej. W wielu przypadkach obecna struktura genomw odzwierciedla ewolucyjn drog ich powstawania: i tak genomy mitochondrialne i chloroplastowe s reliktami organizmw, ktre dokonay inwazji symbiotycznej do komrek przodkw eukariontw. Ewoluujce geny wytwarzay kolejne, coraz doskonalsze i bardziej skomplikowane fenotypy, konkurujce ze sob w procesie doboru naturalnego i suce dalszej replikacji oraz ekspansji ich genotypw. Nowe geny powstaway nie tylko przez mutacje, ale przede wszystkim w wyniku tasowania egzonw, to jest skadania nowych genw z czci, bdcych egzonami kodujcymi domeny biakowe o specyficznych funkcjach. Wiele genomw zawiera sekwencje DNA, ktre zapewne nie peni adnej funkcji i stanowi rodzaj pasoytniczego, samolubnego DNA. Dalsze badania porwnawcze nad sekwencjami DNA oraz odkrywanie molekularnych podstaw procesw biologicznych bd w stanie poszerzy nasz wiedz o przebiegu oraz mechanizmach ewolucji.

14. NOWY WSPANIAY WIAT BIOTECHNOLOGII

Metody rekombinacji DNA in vitro zastosowano do genetycznych modyfikacji organizmw wykorzystywanych w celach biotechnologicznych. Technologie suce do wytwarzania uytecznych ywych organizmw lub substancji pochodzcych z organizmw i(lub) ich czci definiowane s jako biotechnologiczne. Dziaalno taka zawsze towarzyszya spoecznociom ludzkim. Dziki nowym metodom genetycznym powstay jednak nowe moliwoci wiadomych modyfikacji genotypw i tworzenia nowych kombinacji genw. W tym rozdziale zostan podane przykady jedynie tych osigni inynierii genetycznej prowadzcych do konstrukcji nowych genotypw ywych organizmw, ktre mog by lub ju s wykorzystane w technologiach przemysowych. Uczeni, ktrzy opublikowali w roku 1974 w czasopimie Science owiadczenie na temat bezpiecznego stosowania technik rekombinacji DNA in vitro, zwrcili uwag zarwno na towarzyszce temu zagroenia, jak i na potencjalne korzyci dla bada podstawowych i stosowanych. Formuowane wwczas optymistyczne nadzieje nie straciy na aktualnoci, a skonkretyzowane w postaci szczegowych wynikw przyniosy wiele poytku.

14.1. Wprowadzenie do zagadnie wspczesnej biotechnologii

14.1.1. Zakres stosowania technik rekombinacji DNA in vitro w projektach biotechnologicznych. Sprzenie nauki z technik

Biotechnologicznymi celami osiganymi w badaniach metodami rekombinacji in vitro mog by:

(a) klonowanie i ekspresja genw kodujcych okrelone biaka; (b) optymalizacja poziomu ekspresji okrelonego genu kodujcego dane biako. Poziom ten zaley m.in. od rodzaju uytego wektora i gospodarza oraz od nukleotydowych sekwencji regulacyjnych towarzyszcych genowi; (c) zamierzone modyfikacje sekwencji nukleotydowych kodujcych dane biako: ekspresja tak zmutowanych genw prowadzi do syntezy rodzin biaek, zwanych muteinami, czsto o nowych waciwociach; ich badania stanowi przedmiot zainteresowa inynierii biakowej; (d) utworzenie wyszych organizmw transgenicznych, nosicieli heterologicznych genw we wszystkich komrkach, rwnie rozrodczych; (e) somatyczna terapia genowa dojrzaych osobnikw; (f) diagnostyka genowa, zwizana z oznaczaniem sekwencji nukleotydw pojedynczych genw, duych fragmentw i penych genomw. Organizmy modyfikowane metodami rekombinacji DNA in vitro znalazy zastosowanie w praktyce medycznej i rolniczej, w licznych technologiach przemysw: farmaceutycznego, chemicznego, przetwrczego, wydobywczego, w rnego typu analityce i wreszcie w ochronie rodowiska naturalnego. Rekombinacja DNA in vitro jest jedn z licznych metod realizacji celw biotechnologicznych. Jej optymalne wykorzystanie zaley od osigni wielu gazi nauki, takich jak mikrobiologia, biochemia, biologia komrki, chemia, informatyka, fizyka, a take ekonomia. Rachunek ekonomiczny projektu powinien uwzgldnia trwao genetyczn produkcyjnego szczepu, wydajno procesu w skali produkcyjnej, koszt surowcw, energochonno, koszt uzyskania tego samego produktu metodami tradycyjnymi, chonno rynku itp.
14.1.2. Czynniki warunkujce sukces projektu biotechnologicznego

Projekt programu biotechnologicznego powinien wynika z podstawowej wiedzy o mechanizmach ekspresji genw: znajomoci struktury genomu dawcy i biorcy DNA (geny podzielone u Eukaryota, ukady operonw u Prokaryota, czstotliwo uywania kodonw itp), znajomoci sekwencji DNA regulujcych transkrypcj i translacj, znajomoci potranslacyjnych modyfikacji pierwotnego produktu translacji (skracanie, specyficzna glikozylacja, fosforylacja, acylacja itp.). Cel dowiadczenia decyduje o wyborze postpowania w konstruowaniu nowych kombinacji genw. Naley zmierza do jak najlepszego dostosowania konstrukcji klonowanych heterologicznych sekwencji DNA do cech genetycznych biorcy. Jest to warunek konieczny, ale nie wystarczajcy, do osignicia pomylnego wyniku kocowego. Decyduj o nim rwnie nieprzewidywalne a priori w wikszoci przypadkw: stabilno strukturalna zrekombinowanego DNA, stabilno segregacyjna wektora, warunki hodowli, stabilno odpowiedniego mRNA, poziom ekspresji klonowanego genu, czuo metody wykrywania poszukiwanego produktu (biaka) i formy jego gromadzenia przez komrk biorc.

Potencjalne szczepy produkcyjne mikroorgamizmw, skonstruowane metodami rekombinacji DNA in vitro i charakteryzujce si du liczb kopii wektora oraz wysokim poziomem ekspresji klonowanego genu, mog by atwo zdominowane w warunkach przemysowych przez szczepy dzikie, ze wzgldu na zazwyczaj przeduony czas generacji modyfikowanego genetycznie szczepu. Zrekombinowany DNA ulega czsto delecjom, przegrupowaniom wewntrzwektorowym, moe te ulec rekombinacji z genomem gospodarza. Wydajno kocowa produkcji zaley od skadu poywki hodowlanej (obecno czynnikw selekcyjnych), pH, temperatury, sposobu hodowli (np. unieruchomienie komrek). Uzyskiwane biako moe by zdenaturowane (ciaka inkluzyjne w E. coli) albo ulega nie zaplanowanej proteolizie. Wydajno ekspresji i trwao kocowego produktu biakowego mona zwikszy klonujc odpowiedni gen w wektorze sekrecyjnym lub dokonujc fuzji klonowanego genu z fragmentem genu biorcy (wynikiem ekspresji jest fuzyjne biako). Ten ostatni, czsto bardzo skuteczny, sposb stabilizacji zrekombinowanych biaek wprowadza nowe utrudnienie techniczne, przeduajc procedur ich wyodrbniania o etap usunicia fragmentu polipeptydowego pochodzcego od biorcy.
14.1.3. Rozwj firm biotechnologicznych

Rozwj wspczesnej biotechnologii, zapocztkowany w Stanach Zjednoczonych, rozpocz si od tworzenia maych firm biotechnologicznych. Zakadali je zazwyczaj pracownicy uniwersytetw, ktrzy wczeniej ju nauczyli si stosowa w dowiadczeniach metody rekombinacji DNA in vitro. Firmy rozpoczynay dziaalno od rozeznania potrzeb rynkowych. Po podjciu decyzji o profilu produkcji organizowano laboratorium. Jak w kadym konkurencyjnym przemyle wyniki pracy s w firmach biotechnologicznych tajne (do momentu uzyskania patentu), a firmie przede wszystkim zaley na szybkim tempie osignicia kocowego produktu handlowego, a nie na wyjanianiu mechanizmw jego powstawania. W miar rozwoju biotechnologii mae firmy byy wchaniane przez wielkie koncerny, bd te podpisyway z nimi umowy o przekazaniu technologii gotowej do wdroenia. W roku 1991 w Stanach Zjednoczonych dziaay 742 firmy biotechnologiczne. Byy to: (a) firmy prywatne (59%); (b) spki akcyjne (19,5%); (c) pododdziay duych korporacji (18,5%). Na czele listy spek akcyjnych znajdoway si: Amgen, Centocor, Chiron i Genentech. W sumie firmy biotechnologiczne w Stanach Zjednoczonych zatrudniay wwczas 73 tys. pracownikw, wydaway na badania 3,6 mld $ rocznie, ich dochd wynosi 12 mld $. Najszybciej rosa liczba oddziaw duych koncernw przemysowych.

Nowoczesn biotechnologi farmaceutyczn, wytwarzaniem lekw i medycznych zestaww diagnostycznych zajmowao si w roku 1991 w Stanach Zjednoczonych 363 firm. Przemys farmaceutyczny naley do bardzo dochodowych, chocia uzyskanie nowego leku trwa dugo (ok. 12 15 lat) i jest kosztowne (ok. 250 min $). Kady produkt musi by przebadany pod ktem bezpieczestwa, wymaga bada przedklinicznych na komrkach i zwierztach oraz trzech faz bada klinicznych. Do amerykaskiej agencji zatwierdzajcej nowe leki FDA w roku 1986 zgoszono 100 lekw biotechnologicznych i 150 uzyskanych innymi technologiami; w roku 1991 liczby te wynosiy odpowiednio 300 i 230. W roku 1993 40 preparatw przeciwcia monoklonalnych i 150 biaek przechodzio fazy bada klinicznych, 100 z tych biaek nie byo stosowanych przedtem w terapiach chorb czowieka. Budet federalny na rozwj biotechnologii w roku 1993 w Stanach Zjednoczonych przewidywa 3 125 min $ na dziedziny szeroko pojtej ochrony zdrowia i 900 min $ na pozostae. Do tego czasu na rynek wprowadzono kilkadziesit lekw pochodzenia rekombinacyjnego (m.in. hormon wzrostu, y, erytropoetyn, czynniki stymulujce wzrost insulin, interferony a, kolonii) i monoklonalnych przeciwcia, a kilkaset byo w rnych fazach prb klinicznych. W przodujcej firmie badawczo-rozwojowej Genentechu dochody ze sprzeday t-PA wynosiy 1/3 caoci, firma Amgen w roku 1993 sprzedaa dwa leki uzyskane w wyniku rekombinowania DNA (erytropoetyn i czynnik stymulujcy wzrost kolonii granulocytw) za 1,2 mld $. Kilka tego typu firm (Biogen, Genzyme, Chiron, Amgen) utrzymywao si ju z wasnej produkcji. W dalszej kolejnoci na licie biotechnologicznych przedsibiorstw w Stanach Zjednoczonych w roku'1991 znalazy si firmy pracujce na rzecz rolnictwa (127), odczynnikw i wyposaenia (88), wreszcie ochrony rodowiska (29). Wrd najbardziej dochodowych produktw krloway: ludzka insulina wytwarzana przez mikroorganizmy (Humulina, 450 min $), tkankowy aktywator plazminogenu (t-PA, lek trombolityczny stosowany przy zatorach naczy krwiononych) i erytropoetyna (hormon biakowy wytwarzany w nerkach, pierwotny regulator erytropoezy u ssakw, stymulujcy podziay i rnicowanie komrek erytroidalnych, 200 300 min $). Ostatnie lata przyniosy jednak wyrany spadek dynamiki przyrostu liczby firm. Podczas gdy w najbardziej korzystnym roku 1987 zaoono w Stanach Zjednoczonych 91 nowych firm, w roku 1991 powstao tylko dwie. Biotechnologiczny kapita amerykaski uczestniczy w przedsiwziciach midzynarodowych: w latach 1985 1989 firmy japosko-amerykaskie wytwarzajce leki stanowiy 13,5% amerykaskiego zaangaowania finansowego, amerykasko-europejskie 23,9%. 70% firm utrzymywao stosunki finansowe z amerykaskimi uniwersytetami, 40% z uniwersytetami w Europie i tylko 12% z japoskimi uczelniami.

14.1.4. Wybr organizmw gospodarzy do klonowania genw

Geny mona klonowa w mikroorganizmach (bakterie i nisze Eukaryota) oraz w komrkach eukariotycznych. Najlepiej poznanym gospodarzem zrekombinowanego DNA jest E. coli ze wzgldu na dobr znajomo jej cech genetycznych, biochemicznych, dostpno duych kolekcji mutantw i krtki czas generacji. Uywane w laboratoriach szczepy E. coli K12 nie s chorobotwrcze dla ludzi oraz nie zasiedlaj ich przewodu pokarmowego. Klonowanie genw do celw biotechnologicznych jest moliwe rwnie w komrkach Bacillus subtilis, a wydawao si szczeglnie korzystne ze wzgldu na zdolno biorcy do wydzielania do podoa biaek w natywnej formie. Niestety plazmidowe wektory s w wikszoci niestabilne w komrkach B. subtilis, a biaka po sekrecji s w duej mierze trawione przez proteazy, rwnie wydzielane do podoa. W ostatnich latach opracowano take systemy klonowania obcych biaek w prokariontach z rodzajw Brevibacteriumy Clostridium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Zymomonas i Streptomyces. Saccharomyces cerevisiae, jako gospodarz klonowanych genw, czy w sobie zalety ukadw bakteryjnych i eukariotycznych. Jest to dobrze scharakteryzowany metodami fizjologicznymi i genetycznymi mikroorganizm eukariotyczny. Hodowany by w okrelonych poywkach i na du skal od stuleci dla potrzeb przetwrstwa ywnoci. Komrki S. cerevisiae maj zdolno wydzielania biaek do podoa, a ich wieloskadnikowy ukad sekrecyjny zapewnia m.in. tworzenie mostkw dwusiarczkowych, N- i O-glikozylacj oraz modyfikacje proteolityczne. Wektorami mog by plazmidy zdolne do replikacji nie tylko w drodach, ale take w E. coli. (tzw. wektory wahadowe). Saccharomyces cerevisiae nie wytwarzaj toksyn, a ich hodowle nie ulegaj zakaeniom wirusowym. Pierwszym biakiem sklonowanym z powodzeniem w S. cerevisiae w celach handlowych by ludzki a-interferon (1981 r.). Take w S. cerevisiae uzyskano preparat antygenu powierzchniowego HBsAg uyty do pierwszej licencjonowanej rekombinacyjnej szczepionki przeciw wirusowemu zapaleniu wtroby typu B. Niestety wydajno ekspresji obcych biaek (nawet z genw zaopatrzonych w drodowe silne indukowane promotory) jest niska (1 5% oglnej puli biaek), a autonomiczne plazmidy s niestabilne w przypadku braku presji selekcyjnej. Wzr glikozylacji biaek wytwarzanych przez S. cerevisiae moe by rny od charakterystycznego dla komrek wyszych Eukaryota. Sekrecji podlegaj w zasadzie tylko niewielkie biaka, niektre tylko do przestrzeni peryplazmatycznej. Niektre produkty ekspresji heterologicznych genw s toksyczne dla szczepw S. cerevisiae. Do ekspresji obcych genw stosuje si te inne gatunki drody, ze wzgldu na wieloletni praktyk w ich przemysowym wykorzystywaniu i stabilny genotyp. Perspektywy modyfikacji genetycznych takich drody, jak Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pas-

toris, Yarrovia lipolytica ocenia si pomylnie. Kilkadziesit biaek o znaczeniu handlowym wyprodukowano na skal przemysow w tych drodach (ludzka albumina osocza, EGF, HBsAg, lizozym, streptokinaza, tkankowy aktywator plazminogenu, IL-2, TNF, glukoamylaza, lipaza, oksydaza glukozy, czynnik VIII, hirudyna, dysmutaza nadtlenkowa i in.). W kilku przypadkach stwierdzono, e biosynteza biaek przebiegaa z wysz wydajnoci w tych drodach ni w S. cerevisiae. Wektory plazmidowe s w nich stabilne, czciej dochodzi do wczenia si obcego DNA do genomu, sekrecja biaek do rodowiska zachodzi z wysok wydajnoci. Due nadzieje biotechnologiczne budzi oryginalny ukad ekspresji, wywodzcy si z wektorw, ktre pochodz z bakulowirusw, zakaajcych larwy motyli i muchwek. Biorcami zrekombinowanego DNA s w tym systemie hodowle komrek owadw lub cae larwy. Komrki transfekuje si mieszanin DNA bakulowirusa i wektora nioscego rekombinowany gen. Wektor skonstruowany zosta z sekwencji bakteryjnych {ori i gen opornoci na antybiotyk) oraz kasety ekspresyjnej, na ktr skadaj si polilinker i sekwencje regulacyjne genu polihedryny bakulowirusa (promotor, sekwencje terminatorowe). Wewntrz transfekowanej komrki dochodzi do homologicznej rekombinacji i utworzenia zrekombinowanego wirusa nioscego w miejsce genu polihedryny gen rekombinowany. Wydajno rekombinacji wzrosa 199% po zastosowaniu do transfekcji zlinearyzowanego wektora, nioscego gen, ktry umoliwia selekcj w komrkach owadw. W tak transfekowanych komrkach dochodzi do prawidowych modyfikacji potranslacyjnych klonowanych biaek (proteoliza prebiaek, fosforylacje, glikozylacje, acylacje). Wydajno produkcji obcych biaek jest kilkanacie razy wysza w caych larwach. Biaka te gromadz si w hemolimfie. Opracowanie rnorodnych sposobw transfekcji rnych komrek wyszych Eukaryota umoliwio ich wykorzystanie -do celw biotechnologicznych. W takich komrkach modyfikacje potranslacyjne uzyskiwanego biaka przebiegaj prawidowo, a do wytworzenia jego natywnej formy. Zazwyczaj jednak wydajno produkcji jest niska, a jej koszt wysoki. Std ukady te stosuje si na razie do wytwarzania w skali laboratoryjnej lub ptechnicznej niskotonaowych produktw o wysokiej aktywnoci biologicznej (odczynniki analityczne, diagnostyczne, niektre leki). W stadium opracowa s ukady ekspresji genw zrekombinowanych z wektorami pochodzenia wirusowego (gwnie retro wirusami). W roku 1993 zrekombinowane biaka mona byo wytwarza w tak rnych organizmach, jak: bakterie, grzyby, owady, roliny i ssaki. Jednak w przemyle farmaceutycznym nadal przewaay: E. coli, drode i komrki CHO (linia komrkowa z jajnika chomika). Wynikao to z uprzedniego zaaprobowania tych komrek jako potencjalnych producentw lekw przez odpowiednie komisje, badajce zagroenie wice si z wytwarzaniem i stosowaniem substancji pochodzcych z rekombinacji DNA in vitro.

14.2. Biotechnologia w przemyle farmaceutycznym i w medycynie

14.2.1. Kierunki rozwoju biotechnologii medycznej

Zastosowanie metod rekombinacji DNA w lecznictwie i w farmaceutyce doprowadzio do szybkiego postpu w zakresie: (a) profilaktyki, szczeglnie w odniesieniu do chorb dotychczas trudno uleczalnych lub w ogle nieuleczalnych; (b) lekoterapii zestawami substancji o charakterze biomodulatorw, dobranymi do potrzeb poszczeglnych pacjentw; (c) poszukiwania nowych, skuteczniejszych lekw na schorzenia powodujce najwiksz liczb zgonw (choroby ukadu krenia, nowotwory, niektre choroby o etiologii wirusowej); (d) terapii chorb i niedomaga podeszego wieku; (e) diagnostyki i terapii chorb o podou genetycznym. Warto wiatowej sprzeday lekw oceniano w roku 1990 na 170 mld $, roczn dynamik wzrostu w ostatnich latach na ok. 10%. W tym samym roku 1990 zaledwie 7 lekw sprzedano a za 1 mld dolarw (wszystkie doustne). W pierwszej pidziesitce najlepiej sprzedajcych si lekw dwa byy wytworzone technikami rekombinacji DNA: ludzka insulina (Humulina, 39 miejsce) i erytropoetyna (Epogen, 50 miejsce). Dla porwnania przez ostatnie 25 lat przetestowano pod ktem aktywnoci przeciwnowotworowej 500 tys. zwizkw, 40 z nich wprowadzono do farmakopei, a tylko 10 okazao si czciowo skuteczne. Utrwali si ju pogld, e dalszy rozwj biotechnologii medycznej jest cile sprzony z tempem poznawania ludzkiego genomu. Prace nad ustalaniem map fizycznych i sekwencji nukleotydw w ludzkim genomie s coraz czciej prowadzone w firmach biotechnologicznych: do koca roku 1993 w Stanach Zjednoczonych dziaao ju 14 prywatnych kompanii zaangaowanych w takie badania.
14.2.2. Profilaktyka i diagnostyka 14.2.2.1. Szczepionki

Jako szczepionki wykorzystywano tradycyjnie: (a) preparaty zawierajce ywy organizm patogenny osabiony dziki wielokrotnym pasaom w hodowlach; (b) preparaty zawierajce martwy organizm patogenny; (c) preparaty zawierajce immunogenne epitopy organizmu patogennego. Nie zawsze byy to preparaty w peni bezpieczne: w szczepionkach typu (a) mogo doj do ponownego uaktywnienia si organizmu patogennego, w szczepionkach typu (b) zabicie wszystkich chorobotwrczych osobnikw mogo si nie uda.

Do wytworzenia szczepionek metodami inynierii genetycznej uywa si: organizmw patogennych nieodwracalnie osabionych przez delecje okrelonych genw, wektorw pochodzenia wirusowego zrekombinowanych z genami kodujcymi immunogenne biaka organizmu patogennego, preparatw immunogennych peptydw i biaek uzyskanych metodami inynierii genetycznej lub syntezy chemicznej. Gwnym problemem w konstruowaniu szczepionek zawierajcych antygeny powierzchniowe (zazwyczaj glikoproteiny paszcza wirusw lub ciany komrkowej bakterii), jest waciwa prezentacja antygenu, w formie przypominajcej jego natywn konfiguracj. Ciekawym osigniciem w tej dziedzinie s preparaty szczepionek przeciw HBV, powodujcemu ostre i chroniczne zapalenie wtroby typu B {hepatitis B). Uwaa si, e zapalenie chroniczne moe przeksztaci si w chorob nowotworow. Na wiecie yje ok. 200 min nosicieli HBV. Wirus HBV ma niewielki genom skadajcy si z 3182 nukleotydw (w czci sekwencji dwuniciowy DNA, w czci DNA jednoniciowy) a jego kapsyd zbudowany jest z glikoproteiny HBsAg. Hepatocyty chorego wydzielaj do krwi sferyczne nieinfekcyjne twory, o rednicy 22 nm, zbudowane z HBsAg i lipidw oraz zakane, tzw. czstki Dane'a (10 lo /l ml krwi) 0 rednicy 42 nm, zawierajce DNA wirusa. Do pocztku lat 80. jedyn szczepionk przeciw HBV by preparat inaktywowanych formalin czstek 22 nm. Ilo takiej szczepionki ograniczona jest dostpnoci zainfekowanej surowicy (rda czstek) i koniecznoci zastosowania bardzo rygorystycznych procedur wykluczajcych obecno w szczepionce innych elementw infekcyjnych. Problemy te mona omin konstruujc szczepionk przeciw HBV metodami inynierii genetycznej. Sekwencj kodujc HBsAg, zawart we fragmencie genomu HBV (835 par zasad), zaopatrzono w promotor genu dehydrogenazy alkoholowej ADHI 1 sklonowano w wahadowym wektorze E. coli/S. cerevisiae (rys. 14.1). Nie tylko uzyskano dobry poziom ekspresji genu, ale produkt tej ekspresji mia cechy immunologiczne, fizykochemiczne i strukturalne (obraz w mikroskopie elektronowym) przypominajce czstki 22 nm. Okazao si, e drode tworz due czstki agregaty z synetyzowanego HBsAg, polisacharydw i lipidw. Waciwoci immunogenne takich preparatw ulepszono przez wprowadzenie przed genem kodujcym HBsAg tzw. sekwencji pre-S (koduje 55 aminokwasw wspdziaajcych w rozpoznawaniu hepatocytw przez wirusy). Wydajno syntezy tych biaek w drodach podniesiono 100-krotnie po doczeniu rekombinowanych genw do sekwencji regulatorowych drodowego genu dehydrogenazy aldehydu 3-P-glicerynowego. W latach 19841992 przeprowadzono 122 prby kliniczne obejmujce 14 800 pacjentw zaszczepionych szczepionk, ktra zostaa wyprodukowana z biaka HBsAg, wytworzonego przez zrekombinowane drode. Pacjenci ze wszystkich grup wiekowych tolerowali j bardzo dobrze, wytwarzajc przeciwciaa identyczne jak po szczepieniu czstkami 22 nm. Szczepionka ta, podana

Rys. 14.1. Konstrukcje plazmidw umoliwiajcych ekspresj powierzchniowego antygenu HBV w drodach S. cerevisiae; pMA56 oprcz sekwencji pBR322 (ori) ma drodowy marker selekcyjny (trpl), ori z 2\i DNA i promotor drodowego genu dehydrogenazy alkoholowej, ADHI. Plazmid pMA56 zligowano z fragmentem EcoRI/EcoRI zawierajcym 800 par zasad sekwencji kodujcej HBsAg pochodzcej z plazmidu pHVB i namnoonej w plazmidzie pHBS-5. Uzyskanym plazmidem pHBS-16 transformowano S. cerevisiae. Wydajno wytwarzania HBsAg-25/ig/l. Symbole sekwencji restrykcyjnych: E (Eco RI); H (Hpal); T (TacI)

profilaktycznie przedstawicielom trzech grup podwyszonego ryzyka, wykazaa rwnie pen skuteczno ochronn. Inn strategi postpowania zastosowano w kolejnych prbach konstrukcji innego typu szczepionki przeciw tej samej chorobie. Tym razem gen kodujcy HBsAg wprowadzono do genomu wirusa krowianki. E. Jenner uy 200 lat temu wirusa krowianki jako szczepionki przeciw czarnej ospie. Szczepie takich zaniechano na wniosek wiatowej Organizacji Zdrowia (WHO) w roku 1980 i od tej pory uwaa si, i wirus krowianki jest wirusem laboratoryjnym, niespotykanym w przyrodzie. Ma wielu gospodarzy, atwo hoduje si go in vitro, jego DNA replikuje w cytoplazmie zainfekowanej komrki. Produkty transkrypcji obcych genw doczonych do genomu wirusa krowianki s identyczne z natywnymi; powstajce produkty biaka rekombinacyjne maj natywn struktur i funkcj. Cechy te pozwalaj na uycie wirusa krowianki do wytwarzania ywych, poliwalencyjnych szczepionek dla ludzi i zwierzt. Zasad metody wprowadza-

nia obcych genw do genomu wirusa kro wianki przedstawia rysunek 14.2. Sklonowany w plazmidzie bakteryjnym gen otoczony sekwencjami wirusa krowianki i wprowadzony do komrek zainfekowanych wirusem krowianki ulega homologicznej rekombinacji z DNA wirusa. Rekombinacj steruje si w taki sposb, aby zachodzia w regionach sekwencji nieistotnych dla cyklu ycia wirusa. Dugo takich sekwencji sprawia, i wirus krowianki moe by jednoczenie zrekombinowany z wieloma heterologicznymi genami. Moe te sta si poliwalencyjn szczepionk przeciw kilku patogenom jednoczenie (znany jest np. zestaw genw kodujcych trzy antygeny: hemaglutynin wirusa grypy, HBsAg i glikoprotein D wirusa opryszczki HSV). Szczepionka przeciw hepatitis B bya skuteczna w ochronie szympansw przed wirusowym zapaleniem wtroby, powodujc powstawanie specyficznych przeciwcia.

Rys. 14.2. Sposb wprowadzania obcych genw do wirusa krowianki. Wybrany gen otoczony sekwencjami wirusa krowianki klonuje si np. w plazmidzie pBR322. Takim zrekombinowanym plazmidem transfekuje si komrki rwnolegle zakaone wirusem krowianki. Replikacja DNA wirusa przebiega w cytoplazmie, kontakt DNA wirusa i plazmidu moe zaowocowa homologiczn rekombinacj in vitro. Zapakowanie zrekombinowanego DNA w trakcie biogenezy wirionw daje pokolenie zrekombinowanych wirusw krowianki

Warto rwnie odnotowa prby uzyskania szczepionki przeciw hepatitis B z polipeptydowych fragmentw antygenu HBsAg, np. peptydy 117 137 i 139 147 doczone do odpowiednich nonikw wykazyway aktywno antygenow. W przypadku chorb o etiologii bakteryjnej najczciej jako potencjalne szczepionki badane s syntetyczne polipeptydy, stanowice fragmenty odpowiednich toksyn biakowych: dyfterytu (14 aminokwasw), tca i cholery (12 i 14 aminokwasw). Szczepionki otrzymane technikami rekombinacji DNA s stabilne; ich stosowaniu nie towarzysz niepodane objawy, a proces wytwarzania jest bezpieczny. Metody wytwarzania sprawiaj, i preparaty mona stosunkowo szybko modyfikowa i dostosowywa do ewentualnych zmian cech patogennego organizmu. Wiele produktw stosowanych do wytwarzania podobnych szczepionek moe by te uytych do diagnostyki odpowiednich zakae.
14.2.2.2. Testy diagnostyczne

W ostatnich latach opracowano wiele molekularnych testw diagnostycznych, pozwalajcych na rozpoznanie choroby przed wystpieniem objaww. W diagnostyce chorb genetycznych wykorzystano metody hybrydyzacji specyficznych sond molekularnych do odpowiednich regionw genomu, analiz polimorfizmu restrykcyjnego oraz technik reakcji acuchowej polimerazy (PCR). W roku 1990 analiz schorze o podou genetycznym zajmowao si ju ok. 500 laboratoriw klinicznych w Stanach Zjednoczonych (warto tych usug wyniosa ok. 300 min $), a ich klientami byy w wikszoci wypadkw ciarne kobiety. W celu zilustrowania zagadnienia omwiona zostanie metoda diagnostyki choroby genetycznej fenyloketonurii, wystpujcej z czstotliwoci zalen od pooenia geograficznego, ok. 1 na 5 tys. ywo urodzonych (w Polsce rodzi si rocznie ok. 100 dzieci chorych na fenyloketonuri). Klasyczn fenyloketonuri, chorob autosomaln, recesywn, opisano w roku 1934, jej konsekwencjami biochemicznymi s zaburzenia w przemianie aminokwasw aromatycznych. U chorych w surowicy i w moczu gromadz si metabolity fenyloalaniny, co zwizane jest z niedoborem hydroksylazy fenyloalaninowej (PAH). Gen kodujcy PAH ley na dugim ramieniu chromosomu 12, ulega ekspresji w wtrobie i dlatego nie mona do wykrycia fenyloketonurii zastosowa klasycznych metod diagnostyki prenatalnej (poszukiwanie odpowiednich biaek w hodowlach komrek podu, komrek trofoblastu i komrek z pynu owodniowego). Istnieje prosty i tani test Guthriego stosowany z powodzeniem w pierwszych dniach po urodzeniu, a terapi zachowawcz (dieta uboga w aromatyczne aminokwasy) naley stosowa w tym samym okresie, aby unikn niedorozwoju umysowego wywoanego toksycznymi zwizkami nieodwracalnie uszkadzajcymi tkank mzgow.

Ludzki gen PA H zidentyfikowano w banku ludzkiego cDNA i sklonowano w roku 1983, stosujc jako sond molekularn cDNA homologicznego genu szczura. Gen wystpuje w jednej kopii, koduje PAH, biako skadajce si z 451 aminokwasw. Fragment genomu czowieka odpowiedzialny za syntez PAH skada si z 13 egzonw o dugociach mieszczcych si w przedziale 57 892 par zasad i 12 intronw (124 tysicy par zasad). Peny gen skada si z egzonw o cznej dugoci 2,3 tysicy par zasad i intronw o cznej dugoci 85 tysicy par zasad. W badaniach DNA czonkw rodzin obcionych fenyloketonuri znaleziono polimorfizm restrykcyjny obszaru genu PAH dla omiu enzymw: Mspl, Sphl, HindIII, EcoRV, Xmnl, BhlII, Pvull. Uycie tych enzymw do analizy DNA dziecka w takiej rodzinie pozwala na postawienie diagnozy co do wystpienia fenyloketonurii z 98,5-procentow pewnoci (rys. 14.3). Klasyczna fenyloketonuri, jak wynika z analizy sekwencji genu PAH ludzi zdrowych, chorych i nosicieli, zwizana jest z zamian argininy na tryptofan, wywoana substytucj cytozyny na tymin w egzonie 12.
(Q)

23/19x

a ^ ox
23/19

19*/19X

23/23

23/19"

(b)
tys. par zasad 23 19* Rys. 14.3. Polimorfizm restrykcyjny (enzym: Mspl) genu hydroksylazy fenyloalaninowej (molekularna diagnostyka fenyloketonurii). DNA ojca (O), matki (M), trojga dzieci, z ktrych jedno jest chore (PKU), jedno nosicielem (ZD2), a jedno zdrowe (ZD1) strawiono enzymem Mspl i poddano analizie Southerna z sond molekularn prawidowego cDNA genu PHA czowieka, (a) Rodowd rodziny, (b) Ukad prkw elektroforetycznych hybrydyzujcych z sond. Allel prawidowy 23 tys par zasad, allel zmutowany 19 tys. par zasad PKU
Mspl

ZD1

ZD2

Wiele chorb genetycznych mona ju diagnozowa metodami molekularnymi, niektre stosowane s rutynowo w specjalistycznych poradniach genetycznych (anemia sierpowata, niektre typy talasemii). Diagnostyka molekularna stosowana jest take m.in. w stosunku do: 1) Dystrofii miniowej Duchenne'a (1 na 3,5 tys. ywo urodzonych). Ludzki gen kodujcy glikoprotein, dystrofin, ktrego mutacje odpowiedzialne s za dystrofie miniowe, zlokalizowano w chromosomie X. Jest to najduszy ze znanych w roku 1994 obszarw genw (2,5 min par zasad).

W tecie diagnostycznym wykorzystuje si monokionalne przeciwciaa. Rozwaana jest moliwo terapii tych chorych przez wszczepianie im mioblastw, ktre pochodz od dawcw wykazujcych zgodno tkankow z chorym. Obiecujce s rwnie wyniki leczenia myszy transgenicznych mdx (mutacja w genie dystrofiny na chromosomie X) metod wstrzykiwania do wkien mini szkieletowych wektorw plazmidowych lub adenowirusw nioscych gen kodujcy dystrofin. 2) Mukowiscydozy (najczciej wystpujca w biaej rasie choroba genetyczna, 1 na 2,5 tys. ywo urodzonych, w Polsce rodzi si co roku ok. 250 dzieci z mukowiscydoz). Ludzki gen kodujcy biako CFTR, ktrego uszkodzenie towarzyszy chorobie, sklonowano w roku 1989 i zlokalizowano w chromosomie 7. Obszar genu ma dugo 250 tysicy par zasad; cz kodujca zawarta jest w 27 egzonach. Struktura biaka sugeruje, i kodujcy je gen powsta w wyniku podwojenia sekwencji nukleotydowych. Biako CFTR aktywizuje w sposb zaleny od cAMP kana chlorkowy bony cytoplazmatycznej komrek nabonka. U 75% chorych obserwuje si delecj (oznaczon jako AF508) kodonu fenyloalanionowego w egzonie 10 kodujcym domen CFTR odpowiedzialn za wizania ATP. W sumie w genie CFTR wykryto ponad 300 mutacji, co na razie uniemoliwia w peni wiarygodn molekularn diagnoz; jej niezawodno ocenia si na 80%. W roku 1993 rozpoczto jednoczenie w Stanach Zjednoczonych i w Wielkiej Brytanii leczenie pojedynczych chorych inhalacjami z liposomw lub wektorw, ktre pochodz od adenowirusw, nioscych prawidowy gen CFTR. Sondami molekularnymi mona obecnie diagnozowa choroby zakane wywoane przez mykoplazm, HIV, wirusy opryszczki, wirusy brodawczakw, wirusa zapalenia wtroby, bakterie wytwarzajce biakowe toksyny i in. W wielu testach diagnostycznych wykorzystuje si przeciwciaa monokionalne: do identyfikacji raka puc, raka sutka, raka jelita grubego, gruczolakoraka prostaty i gluczolakoraka jajnikw. Wiele firm biotechnologicznych proponuje zestawy diagnostyczne do oceny stenia cytokin w organizmie pacjenta.
14.2.3. Somatyczna terapia genowa

Diagnostyka chorb dziedzicznych stanowi pierwszy krok na drodze do leczenia przyczynowego tych chorb. Teoretycznie rozwaa mona dwa typy postpowa terapeutycznych. Pierwszy, to wprowadzenie genw do komrek rozrodczych lub zygoty przed pierwszym podziaem (p. podrozdz. 14.3.2). Technika transgenizacji czowieka nie bya dotychczas rozwaana, zarwno ze wzgldu na zawodno, jak i ze wzgldw etycznych. Jednake w roku 1991 w Stanach Zjednoczonych komisja oceniajca projekty genetyczne z punktu widzenia ich zasadnoci i celowoci postanowia zaj si problemem zabiegw na rozrodczych komrkach czowieka. Pniejsze prasowe doniesienia (jesie 1993 r.), w ktrych

przeprowadzono manipulacje in vitro na kilku komrkowych zarodkach ludzkich, nazwane przez dziennikarzy klonowaniem czowieka, unaoczniy konieczno prowadzenia takich dyskusji i kontroli nad projektami podobnych dowiadcze. Drugi typ terapii obejmuje genetyczne modyfikacje komrek somatycznych. Ze wzgldw technicznych na razie w gr wchodzi jedynie terapia chorb jednogenowych, w ktrych poziom ekspresji genu nie jest czynnikiem decydujcym o prawidowym fenotypie. Na prby terapii somatycznej czowieka wydaje si zezwolenia jedynie w przypadkach schorze prowadzcych do nieuniknionego zgonu, ktrych nie potrafi si skutecznie leczy adnymi innymi metodami. Prby terapii komrek somatycznych naley poprzedzi: wydzieleniem prawidowego genu, identyfikacj jego sekwencji regulacyjnych i identyfikacj komrek, w ktrych dziaa oraz wyborem wydajnych i jednoznacznych metod ich transfekcji. Cykl bada na komrkach zwierzcych i zwierztach transgenicznych powinien dostarczy dowodw na to, e wprowadzony prawidowy gen dziaa zgodnie z przewidywaniami i nie narusza metabolizmu komrki biorcy genu oraz caego organizmu. Przyjto powszechnie dwa warianty dalszego postpowania: wczenia dodatkowych kilku kopii prawidowego genu do komrek biorcw lub wymian genu defektywnego na prawidowy. Prawidowy gen mona wprowadzi do organizmu metod ex vivo* lub in vivo. Pierwsza polega na wyodrbnieniu docelowych komrek z organizmu chorego, modyfikacji genetycznej in vitro i powtrnym wprowadzeniu do organizmu tego samego chorego. Druga zakada wprowadzenie genu (ew. z wektorem) wprost do caego organizmu lub jego tkanki (p. prby terapii mukowiscydozy). Zasadnicz trudnoci (dotychczas nie w peni rozwizan) jest znalezienie niezawodnego, powtarzalnego, wydajnego sposobu transfekcji komrek eukariotycznych. Najwiksze nadzieje terapeutyczne wie si z zastosowaniem wektorw, ktre wywodz si z retrowirusw i adenowirusw. Prowadzi si rwnie prby z pochodnymi wirusw opryszczki, krowianki, polio, Sindbis i innych wirusw RNA. Trwaj prby wprowadzania DNA w liposomach i DNA poczonego z substancj rozpoznawan przez receptory na bonie cytoplazmatycznej, przez wstrzyknicie wprost do docelowej tkanki. Kolejn istotn trudnoci napotykan po transfekcji jest charakter ekspresji wprowadzonych genw (przejciowy lub trway, czciej ten pierwszy). Dalszych bada wymagaj prby wprowadzania genw wprost do chorych komrek i tkanek: wtroby, puc, komrek pnia lub do komrek omywanych przez krc krew, ktra mogaby transportowa produkty ekspresji takich genw do caego organizmu. Prby somatycznej terapii genowej ulegaj szybkiej komercjalizacji: w poowie roku 1993 podjo je 14 firm w Stanach Zjednoczonych i kilka w Europie
* Zabieg ex vivo polega na modyfikacji genetycznej komrek pobranych od pacjenta i wprowadzeniu ich z powrotem do jego organizmu.

Zachodniej. Zaproponowano do akceptacji protoky terapii takich chorb genetycznych, jak: mukowiscydoza, insulinozalena cukrzyca, karowato, rozedma puc, dziedziczna hipercholesterolemia, liczne hemoglobinopatie, hemofilie, zesp Gauchera, fenyloketonuria, zesp niedoboru odpornoci, dystrofia miniowa Duchenne'a, zesp Lescha Nyhana, choroba Taya Sachsa; take chorb nabytych: rnych rodzajw raka, chorb ukadu krenia, chorb neurodegeneracyjnych, artretyzmu i AIDS. W roku 1990 w Doradczym Komitecie Do Spraw Rekombinacyjnego DNA Narodowych Instytutw Zdrowia Stanw Zjednoczonych (NIHRAC) zatwierdzono, jako pierwsz terapi genow, prb wyznakowania genetycznego limfocytw wydzielonych z litego guza chorego, tzw. TIL (ang. tumor infiltrating lymphocytes). Wprowadzony do limfocytw marker, gen nadajcy im oporno na neomycyn, pozwoli na ledzenie ich losw po powtrnym wstrzykniciu do chorego dawcy. W nastpnym etapie rozwoju tej samej terapii TIL wyizolowane od 30 pacjentw chorych na czerniaka transfekowano in vitro genami kodujcymi czynnik martwicy nowotworw (TNF) i interleukin 2 (IL-2). Bya to terapia ex vivo\ uzyskano statystycznie istotne zmniejszenie guzw. Historycznie drug terapi genow bya prba leczenia najpierw jednej dziewczynki, a potem szeciorga dzieci chorych na ciki zoony zesp niedoboru odpornoci, zwizany z brakiem deaminazy adenozyny ADA. Do krwiobiegu tych pacjentw w padzierniku roku 1991 wprowadzono limfocyty transfekowane wektorem retrowirusowym z genem ADA. Uzyskano odporno na antygeny, normalizacj krcych w krwi limfocytw i pojawienie si przeciwcia. Poniewa limfocyty yj w krwiobiegu kilka < miesicy, podobny zabieg powtarzano wielokrotnie. Prasa naukowa informowaa w kocu roku 1993, e wszystkie dzieci yj; pierwsza pacjentka posza do normalnej szkoy. Szczeglna uwaga przypisana zastosowaniom terapii genowej w leczeniu chorb nowotworowych jest w peni zrozumiaa. Wydaje si, e najwiksze nadzieje budz metody: (a) pobudzenia odpowiedzi immunologicznej chorego, przez transfekcj TIL genami cytokin; (b) transfekcji komrek nowotworu in vitro genami wybranych cytokin, uniemoliwienie ich dalszej proliferacji przez promieniowanie i wszczepienie podskrne pierwotnemu dawcy, co mona porwna do szczepienia przeciwno wotworowego. Zabieg ten u zwierzt daje obiecujce wyniki. Proponuje si wykonanie podobnych prb z pacjentami majcymi raka sutka, puc, trzustki, gruczou krokowego, nerki i czerniaka. We wszystkich prbach geny bd wprowadzane za porednictwem wektorw pochodnych retrowirusw. W latach 1989 1993 Komitet NIH zatwierdzi 52 protoky terapeutyczne; do prb dopuszczono 100 osb. Z tego 23 prby polegay na wprowadzeniu markera genowego, 29 na waciwej terapii. W roku 1993 zaaprobowano 9 nowych protokw, dotyczcych prb terapii raka jelita grubego, czerniaka,

mukowiscydozy, choroby Gauchera i AIDS. adna prb przeprowadzonych do koca roku 1993 nie daa w peni udanych wynikw. Z terapiami genowymi wie si rwnie problem patentw. Przyjty dotychczas tryb postpowania w Stanach Zjednoczonych dopuszcza patentowanie ludzkich sekwencji genowych wykorzystywanych do testw diagnostycznych lub prb terapii. Co prawda w roku 1991 z NIH zgoszono patent na bank kilkuset sekwencji ludzkiego cDNA, ktrych funkcja nie jest znana, ale Urzd Patentowy Stanw Zjednoczonych nie przyj tego zgoszenia. Wydane do koca roku 1991 w Stanach Zjednoczonych patenty dotyczyy m.in. mukowiscydozy (test na prawidowe i zmutowane sekwencje genu, test na sekwencje regulacyjne genu, linia komrek transfekowana genem), dystrofii miniowej Duchenne'a (test polimorfizmu restrykcyjnego, sonda molekularna), plsawicy Huntingtona (test polimorfizmu restrykcyjnego, sztuczny chromosom drodowy ze zmutowanym genem), a take rnych form postpowania w leczeniu takich chorb, jak: nowotwory, arterioskleroza, genetycznie uwarunkowana hipercholesterolemia i zesp Alzheimera.
14.2.4. Nowe leki

Po wyodrbnieniu kilkunastu genw ludzkich i zwierzcych, kodujcych cytokiny (modelowe prace przeprowadzono na rodzinie genw kodujcych interferony) przystpiono do opracowania technologii wyodrbniania ze zrekombinowanych komrek biaek modulatorw systemu immunologicznego, 0 potenjalnej aktywnoci terapeutycznej. Substancje te s ju dostpne w ilociach gramowych i kilogramowych (np. IFN a-2a). Z bada aktywnoci tych biaek in vitro i in vivo wynika, e skutki ich dziaa s wzajemnie uwarunkowane 1 maj charakter plejotropowy. Z tego wzgldu uwaa si obecnie, i ich terapeutyczne waciwoci bd mogy by w peni wykorzystane dopiero po pogbieniu wiedzy o molekularnych i fizjologicznych mechanizmach regulacji aktywnoci odpowiednich genw i biaek w rnych etapach ycia organizmu, tkanki i komrki. W szeroko zakrojonych systematycznych badaniach dziaania interleukiny 2 (IL2) na nowotwory zwierzt wykazano, i prawdopodobn przyczyn nieskutecznoci przeciwnowotworowej IL2 w prbach klinicznych byy bardzo due dawki (na granicy tolerancji) podawane systemowo. Z kolei wprowadzanie IL2 lokalnie wprost do guzw eksperymentalnie wywoanych u myszy, winki morskiej i byda byo bardzo efektywne, szczeglnie jeeli u zwierzcia rozpoczy si ju naturalne procesy obrony immunologicznej przeciw wywoanemu dowiadczalnie nowotworowi. Z tych i podobnych bada pynie wniosek, i naley dy do uzyskania preparatw zawierajcych cytokininy zmieszane w odpowiednich proporcjach, podawanych chorym jako uzupenienie i wspomoenie dziaania innych lekw. Najwiksze zastosowanie cytokin przewiduje si w kombinowanej chemioterapii chorb nowotworowych i wirusowych.

Duy wysiek woono w otrzymywanie nowych lekw przeciwko chorobom ukadu krenia, bdcych przyczyn najwyszej liczby zgonw, a w szczeglnoci lekw rozpuszczajcych zakrzepy krwi. Po uszkodzeniu naczynia krwiononego rozpoczyna si niezwykle zoony cykl procesw, ktre prowadz do utworzenia skrzepu koczcego krwotok, a nastpnie likwidujcych zakrzep i udraniajcych naczynie. Prawidowy ich przebieg decyduje nierzadko o yciu pacjenta. Ze cianek uszkodzonego naczynia uwalnia si m.in. tzw. tkankowy aktywator plazminogenu (tPA), serynowa proteaza specyficznie przeksztacajca lokalnie plazminogen w plazmin na etapie trombolitycznym (rys. 14.4).

sPA

tPA

PLAZMINOGEN

biaka pijawek o potencjalnych cechach lekw X inhibicja aktywacja enzymatyczna Rys. 14.4. Etapy tworzenia si skrzepu krwi i trombolizy,- na ktre wpywaj aktywatory plazminogenu i niektre biaka liny pijawek

Inne aktywatory plazminogenu u zwierzt poza tPA to: prourokinaza (scuPA), prekursor urokinazy preparowany z moczu i urokinaza, wytwarzana ze scuPA pod dziaaniem proteazy (plazminy). Urokinaza jest trypsynopodobn serynow proteaz, ktra przeksztaca proteolitycznie plazminogen w plazmin. Jako leki w zatorach naczy krwiononych i w zawale minia sercowego od 30 lat stosuje si urokinaz i streptokinaz. Streptokinaza jest biakiem wytwarzanym przez Streptococcus i (podobnie jak urokinaza) przeksztaca

plazminogen w plazmin w caym krwiobiegu, nie tylko lokalnie w uszkodzonych naczyniach; std podawanie tych aktywatorw plazminogenu zwiksza u pacjenta ryzyko uoglnionych krwotokw. Metody inynierii genetycznej okazay si uyteczne do uzyskania w duych ilociach rnych aktywatorw plazminogenu. W firmie Genentech znaleziono lini komrek ludzkich wydajnie syntetyzujcych t-PA. Wydzielono z nich i frakcjonowano poliA-mRNA, a poszczeglne frakcje uyto w tecie translacji in vitro. Produkty takiej translacji powtrnie analizowano metod immunologiczn. Frakcj mRNA kodujc biako strcane przeciwciaami przeciwko t-PA uyto jako matrycy w syntezie cDNA. Pierwsze klonowanie tego cDNA w E. coli doprowadzio do znalezienia klonu z czciow sekwencj kodujc t-PA, ktrego uyto jako sondy molekularnej do dalszego przeszukiwania banku cDNA. Kocowa konstrukcja przeznaczona do ekspresji genu t-PA skada si z promotora, operatora i sekwencji Shine-Dalgarno operonu tryptofanu E. coli doczonych do sekwencji nukleotydowej kodujcej ludzki t-PA. Transformowane tym konstruktem bakterie wytwarzaj 50 80 ng t-PA w jednym litrze hodowli. Ekspresj tego genu badano rwnie w liniach komrek myszy i chomika. W poowie lat 80. rekombinacyjny" t-PA by poddany badaniom klinicznym i jest obecnie stosowany w terapii wielu chorb ukadu krenia. Waciwoci terapeutyczne aktywatorw plazminogenu mona teraz, kiedy sklonowano ich geny, poprawia syntetyzujc muteiny. Warto przeduy czas ptrwania tych biaek w krwiobiegu (dla t-PA wynosi on zaledwie 14 min), zwikszy powinowactwo do flbrynogenu, specyficzno i selektywno dziaania. Czas ptrwania aktywatorw plazminogenu w krwiobiegu ulega wydueniu dla mutein z okrelonymi delecjami i podstawieniami; jest on take duszy dla biaka nieglikozylowanego. Skuteczno dziaania t-PA wzrasta take po sprzgniciu z przeciwciaami monoklonalnymi i gdy si go wprowadzi jako fuzyjne biako kodowane przez fuzyjny gen fragmentu przeciwciaa i fragmentu t-PA. Po zwizaniu t-PA z fibrynogenem wzrasta 1000 razy aktywno t-PA, ale przecicie przez plazmin jednego wizania peptydowego w t-PA (Arg 275 Ile 276) znacznie obnia to powinowactwo. Skonstruowano zatem muteiny, w ktrych Arg 275 zostaa zastpiona po kolei wszystkimi aminokwasami: najkorzystniejsze dla trwaoci t-PA okazao si podstawienie glutamin i izoleucyn. Metodami rekombinacji DNA in vitro syntetyzowano ponad 100 mutein t-PA. Jako leki alternatywne w chorobach ukadu krenia proponuje si take pochodne wielu biaek liny pijawek (antystazyna, hirudyna, heparyna, dekorsyna, hementyna) (rys. 14.4). Gen hirudyny sklonowano w S. cerevisiae i w B. subtilis. Hirudyna jest ma (7 kDa) proteaz specyficznie hydrolizujc fibrynogen. U ludzi i u map nie wywouje reakcji immunologicznej, ani innych skutkw ubocznych, likwiduje w caoci skrzepy krwi w naczyniach. Syntetyzuje si take krtkie (20 aminokwasw) peptydy hirugeny o podobnej do hirudyny aktywnoci.

Do ciekawych prb syntez lekw i lekopodobnych substancji naley przypadek albuminy osocza i hemoglobiny. Alternatywne do rda naturalnego metody uzyskiwania substancji krwiopochodnych s cenione ze wzgldu na bezpieczestwo pacjentw (p. HIV przenoszony drog transfuzji krwi). Ludzka albumina osocza krwi HSA jest biakiem utrzymujcym w surowicy waciwe cinienie osmotyczne, uczestniczy w transporcie czsteczek hydrofobowych, w tym wielu lekw. W lecznictwie stosowana jest po szokach i oparzeniach, w uzupenianiu krwi po zabiegach chirurgicznych oraz w opanowywaniu krwotokw. Roczne wiatowe zapotrzebowanie na HSA wynosi ok. 300 t. Albumin uzyskuje si tradycyjnie od dawcw krwi i z oysk podowych, a koszt produkcji jest niski (2 $/g), std trudno o propozycj ekonomicznie konkurencyjnej technologii wytwarzania HSA. Moe by produkowana w przemysowych szczepach drody Kluyveromyces lactis. Albumina jest w nich wydajnie wytwarzana i wydzielana do podoa w prawidowej formie konformacyjnej. Warto wspomnie, e uprzednie prby klonowania genu w E. coli, B. subtilis i S. cerevisiae zakoczyy si niepowodzeniem ze wzgldu na niski poziom ekspresji i brak sekrecji do podoa. Podanie hemoglobiny moe zastpi w wielu przypadkach transfuzj krwi (wypadki, zabiegi chirurgiczne, przechowywanie narzdw, terapie przeciwno wotworo we). Zapotrzebowanie wiatowe ocenia si w tonach, a alternatywne technologie musz by tanie (ok. 1 $ za 1 g). Prby wytwarzania w E. coli globin wchodzcych w skad hemoglobiny nie day technologicznie obiecujcych wynikw. Biaka identycznie z ludzkimi wytwarzano z niez wydajnoci w S. cerevisiae, ale najbardziej obiecujce wydaje si zastosowanie transgenicznych wi do syntezy. W dowiadczeniu opisanym w roku 1994 wytworzono 1714 zarodkw wi, do ktrych wprowadzono ludzkie geny a-globin i /?-globin zrekombinowane z sekwencjami regulacyjnymi pochodzcymi z genw kodujcych globiny krwi wini. Z 50 zastpczych matek urodzio si w 23 miotach 145 zwierzt, z ktrych 8 byo transgenicznych. Wszystkie wykazyway normalny hematokryt, stenie hemoglobiny i liczb erytrocytw. Wrd kombinacji a-globin i /J-globin nie znaleziono jedynie takiej, ktra skadaaby si z ludzkiej i wiskiej a-globiny. Ekspresja ludzkich globin wahaa si od 1 do 24%. W potomstwie wini wytwarzajcej najwicej hemoglobiny 5 z 12 osobnikw zachowao cechy transgenicznoci oraz matczyny poziom ekspresji transgenw. Stosunek globin oc//? u tych wi wynosi 2,1. Wyhodowanie jednej transgenicznej wini kosztowao w roku 1994 50 tysicy $, w cigu ycia mogaby ona wytworzy 1 kg ludzkiej hemoglobiny. 14.3. Organizmy transgeniczne Nazw t przypisano tym organizmom wyszym, do genomu ktrych wprowadzono nowy, heterologiczny gen, przekazywany nastpnym pokoleniom, zgodnie z prawami genetyki. Techniki uzyskiwania organizmw transgenicznych s rne dla zwierzt i rolin.

14.3.1. Transgeniczne roliny 14.3.1.1. Plazmidy Agrobacterium jako wektory DNA dla rolin dwuliciennych

Poznanie zjawiska transformacji rolin dwuliciennych przez bakterie glebowe z rodziny Rhizobiaceae stao si czynnikiem stymulujcym rozwj biotechnologii rolnej. Ju w latach 20. wykazano, i bakterie te powoduj powstawanie w rolinach dwuliciennych tumorowatych naroli szyjki korzeniowej {Agrobacterium tumefacien) lub tumorowatych korzeni wonikowych {Agrobacterium rhizogenes). Zjawiska te warunkowane s przez due plazmidy Ti (tumor inducing) lub Ri (roots inducing) (150 800 tysicy par zasad). Plazmidy Ti koduj geny odpowiedzialne za syntez pochodnych aminokwasw o cznej nazwie opin (oktopiny, nopaliny i agropiny). Bakterie wykorzystuj te zwizki jako rdo wgla. Poza genami kodujcymi syntazy opin plazmidy Ti nios geny kierujce katabolizmem opin, geny warunkujce koniugacyjny transfer plazmidu, jego replikacj i cech niezgodnoci, okrelajce zasig infekowanych gatunkw oraz geny zwizane z katabolizmem argininy i ornityny. W plazmidach oktopinowym i nopalinowym wystpuj cztery regiony homologii A, B, C i D (stanowice ok. 30% plazmidu) o rnym stopniu zgodnoci sekwencji (30 95%). Region A obejmuje odcinek tzw. T-DNA, dugoci ok. 23 tysicy par zasad. Po zakaeniu fragment T ulega integracji z genomem roliny, przy czym wydaje si, e miejsca integracji maj charakter losowy, a liczba wczanych kopii T-DNA moe by rna. Fragment T koduje dwie klasy genw warunkujcych transformowany fenotyp: zaangaowanych w syntez opin i odpowiedzialnych za biosyntez regulatorw wzrostu rolin. W syntezie opin bior udzia produkty ekspresji genw syntazy nopaliny lub oktopiny, zalenie od typu plazmidu, natomiast w syntezie regulatorw (cytokininy i auksyny) geny kodujce transferaz izopentenylu, monooksygenaz tryptofanow i hydrolaz indoloacetamidu. Na obu kocach fragmentu T le krtkie (24 25 par zasad) niemal identyczne powtarzalne sekwencje i ich .obecno jest konieczna do integracji T-DNA z genomem komrki rolinnej. W procesie przenoszenia T-DNA uczestnicz take geny plazmidowego regionu homologii D (locus vir) i pewne geny chromosomalne bakterii. Proces przeniesienia T-DNA do komrki rolinnej wykazuje podobiestwa do koniugacji. Transfer rozpoczyna si zawsze od prawej granicznej sekwencji i dotyczy jednej nici DNA. Podobiestwo do koniugacji bakteryjnej mona widzie w tworzeniu si na powierzchni bakterii biakowych pili kodowanych przez geny regionu vir. Waciwoci plazmidu Ti pozwoliy na wykorzystanie go jako wektora do wprowadzania obcych genw do rolin dwuliciennych. Stosuje si dwa typy wektorw pochodnych Ti: kointegracyjne i binarne. Wektory kointegracyjne powstaj w wyniku rekombinacji midzy wektorem porednim namnaanym w E. coli i wektorem pomocniczym, pochodzcym z Agrobacterium.

Popularny wektor poredni pMC)N200 ma: ori z plazmidu pBR322, gen markerowy warunkujcy oporno na spektynomycyn lub streptomycyn przydatny do identyfikacji transkoniugantw w bakteriach, kilka miejsc restrykcyjnych do wczania wstawek obcego DNA i praw sekwencj graniczn T-DNA. Zawiera rwnie geny nos i nptll kodujce syntaz nopaliny i fosfotransferaz neomycyny (oporno na neomycyn i kanamycyn), ktre umoliwiaj identyfikacj i selekcj transfekowanych komrek rolinnych. Wektor pomocniczy, np. pTiB6S3 ma lew sekwencj graniczn T-DNA i sekwencje homologiczne do niesionych przez plazmid poredni, ktre umoliwi homologiczn rekombinacj. Po rekombinacji powstaje wektor kointegracyjny zawierajcy obie sekwencje graniczne oraz geny umoliwiajce selekcj transfekowanych komrek rolinnych zawarte w obrbie T-DNA. Rekombinowane geny wczane s zazwyczaj midzy genami nos i nptll (rys. 14.5). Wektory binarne s plazmidami zdolnymi do replikacji zarwno w E. coli, jak i w Agrobacterium, dziki czemu mog by utrzymywane w Agrobacterium
Bom HI LG
1

KanR

Bom HI t - pTiB6SE wektor pomocniczy

wektor poredni

Spc/StrR

LG

Spc/StrR PL

PG
'

Kan"

<
nptll

H I
nos

wektor kointegracyjny

Rys. 14.5. Konstrukcja wektorajcointegracyjnego do transformacji rolin. W ukadzie kointegracyjnym z rozseparowanymi na rnych plazmidach sekwencjami granicznymi, LG i PG, rekombinacja zachodzi przez krtkie sekwencje T-DNA (ST) obecne w obu wektorach. Wektor pomocniczy, pTiB6SE, jest pozbawiony sekwencji onkogennych. Wektor poredni pMON200 skada si z sekwencji pBR322 (ori), regionu nadajcego oporno na streptomycyn i spektynomycyn Spc/StrR, polilinkera do wczania obcych genw PL, genu nptll otoczonego sekwencjami regulacyjnymi genu nos, genu nos i regionu ST. pMC)N200 nie replikuje w A. tumefaciens i moe si w nich utrzyma jedynie po rekombinacji z plazmidem pomocniczym. Znajdujcy si w A. tumefaciens kointegracyjny wektor moe transfekowa zakaone przez te bakterie roliny, wprowadzajc do ich komrek zrekombinowany gen

bez kointegracji do replikonu plazmidu Ti. Omija si wtedy proces rekombinacji, czsto koczcy si niepodanymi zmianami w potencjalnie niestabilnym obcym, wstawianym genie. Jednym skadnikiem ukadu binarnego jest plazmid majcy obie sekwencje graniczne, dominujcy rolinny marker selekcyjny, kilka pojedynczych miejsc restrykcyjnych sucych do wprowadzania obcych genw i gen opornoci na antybiotyk, ktry umoliwia selekcj w bakteriach. Wektory te maj take replikon typu pRK2, pVSl (z plazmidu Pseudomonas), pArA4a (z plazmidu Agrobacterium), umoliwiajce klonowanie genw w rozmaitych bakteriach. Drugim skadnikiem ukadu binarnego jest szczep Agrobacterium z pomocniczym plazmidem Ti dostarczajcym funkcji vir. W tym plazmidzie usuwa si fragment T-DNA, aby uniemoliwi rekombinacj z opisanym wyej wektorem nioscym zrekombinowany DNA. Tym ostatnim transformuje si szczep A. tumefaciens nioscy pomocniczy plazmid. Transformowanymi bakteriami zakaa si komrki rolinne. Poniewa w wektorach pochodnych plazmidw Ti usuwa si geny nadajce po infekcji komrkom rolinnym fenotyp nowotworowy, traci si jednoczenie prosty system selekcyjny zainfekowanych komrek: ich niezaleno od hormonalnych regulatorw wzrostu. W tych ukadach do selekcji wykorzystuje si zatem dominujce geny markerowe. W wikszoci przypadkw korzysta si z fuzji genowej promotora jednej z syntaz opin z genem opornoci na antybiotyk: chloramfenikol ( CAT ), kanamycyn (nptlT), hygromycyn B (<aphll), metotreksat (dhfr). Rnorodno odpowiedzi rnych gatunkw rolin na czynnik selekcyjny sprawia, i istnieje wiele drg uzyskiwania transgenicznych rolin w wyniku infekcji bakteriami A. tumefaciens, nioscymi zrekombinowany wektor. W pierwszych dowiadczeniach uszkadzano odyg wraliwej roliny ig zakaon bakteriami i czekano na rozwinicie si naroli. Po kilku tygodniach wycinano zakaon tkank i przenoszono do sterylnej poywki. W rosncej grupie komrek (kallus) znajdoway si zarwno nietransformowane, jak i transformowane komrki. W roku 1981 opracowano metod transfekcji izolowanych protoplastw i regeneracj z nich rolin w odpowiednim selekcyjnym podou. Metod t mona stosowa do rolin (tyto, petunia), ktrych protoplasty w hodowli ulegaj aktywnym podziaom. Najdogodniejsz wspczesn metod uzyskiwania transgenicznych rolin jest zakaanie wycinkw lici i hodowla w rodowisku stymulujcym selekcj transformowanych pdw, wyrastajcych z pominiciem stadium kallusa. Postpowanie to mona stosowa jedynie w przypadku transfekcji wektorami pozbawionymi genw kodujcych regulatory wzrostu rolin. Kallusy niektrych gatunkw rolin (sonecznik, bawena) udaje si przeksztaci w hodowli w zrnicowane zarodki somatyczne, atwo pobudzane do wytwarzania rolinek (ang. plantlets). Wydaje si, i embriogeneza somatyczna oraz powstawanie pdw rozpoczynaj si od pojedynczej transformowanej komrki lub klonu komrek.

System oparty na transfekcji komrek rolinnych wektorami pochodzcymi z plazmidw Ti stosowany jest take w badaniach sekwencji regulacyjnych genw rolinnych. Do tych sekwencji docza si ktry z wczeniej opisanych genw markerowych (reporterowych) i mierzy si poziom jego ekspresji w zalenoci od stosowanych czynnikw regulujcych aktywno genw rolinnych przez oddziaywanie z promotorem i innymi sekwencjami regulacyjnymi. Za szczeglnie uyteczne geny reporterowe uwaa si gen lux, pochodzcy z bakterii lub robaczkw witojaskich, kodujcy lucyferaz enzym, ktrego jednym z produktw dziaania jest wiato. Aktywno genu mierzy si m.in. przykadajc klisz fotograficzn do zrekombinowanych komrek. Innym czsto uywanym genem reporterowym jest gen kodujcy bakteryjn j8-glukuronidaz, ktrej aktywno mona atwo oznacza ilociowo metodami spektrofotometrycznymi. Test ten mona stosowa rwnie w analizie histologicznej pojedynczych komrek. Badania aktywnoci sekwencji regulacyjnych ujawniy znaczn rnorodno odpowiedzi wykazywanej przez poszczeglne transformowane komrki. Zjawisko to nazwano efektem pozycyjnym i przypisuje si je wpywowi sekwencji genomu rolinnego otaczajcych wstawk obcego genu.
14.3.1.2. Bezwektorowa transfekcja rolin i komrek rolinnych

Opracowanie licznych metod wprowadzania heterologicznych genw do rolin za porednictwem A. tumefaciens byo czynnikiem stymulujcym postp w badaniach alternatywnych drg bezwektorowej transfekcji protoplastw, komrek i tkanek rolin. W serii wczesnych dowiadcze pokazano, i mona dokonywa transfekcji protoplastw petunii i tytoniu oczyszczonym Ti DNA, a take dowolnym fragmentem DNA. Obcy DNA nie wpywa zauwaalnie na rozwj i podno transgenicznych rolin. Inkubacja rolinnych protoplastw z linearyzowanym plazmidowym DNA wyposaonym w marker selekcyjny, w warunkach promujcych pobranie DNA, prowadzi do otrzymania genetycznie transformowanych klonw komrkowych. Czynniki promocyjne mona umownie podzieli na chemiczne i fizyczne. Do czynnikw chemicznych najczciej zalicza si glikol polietylenowy (PEG) w alkalicznym rodowisku lub poli-L-ornityn. Dla tytoniu i petunii uzyskiwano wydajno transformacji 0,1-12%. W dowiadczeniach tych istotnymi zoptymalizowanymi czynnikami s: moment dodawania czynnika chemicznego (po dodaniu DNA), jego stenie, obecno jonw magnezu oraz dodanie nonikowego, eukariotycznego DNA. Czsto stosowanym fizycznym czynnikiem promujcym transfekcj s krtkotrwae wysokonapiciowe impulsy elektryczne (elektroporacja). Czas trwania impulsu i jego natenie (czas rzdu mikro- lub milisekund, impulsy prostoktne lub zanikajce wykadniczo, o nateniach rzdu kilku woltw na centymetr) musz by dobierane eksperymentalnie. W optymalnych warunkach osiga si wysok wydajno transformacji, sigajc 2-8%.

Zamknicie zrekombinowanego DNA w lipidowych pcherzykach (liposomach) zapewnia jego ochron przed nukleazami. W nastpstwie fuzji liposomw z protoplastami mona uzyska transformowane komrki, niestety z nisk wydajnoci. Jest to metoda pracochonna, a wielkoczsteczkowy DNA nie zawsze udaje si waciwie zapakowa do liposomw bez uszkodze. DNA wprowadza si take do protoplastw i komrek rolinnych przez mikroiniekcj. Wysoka wydajno transformacji (ok. 30%) nie rwnoway pracochonnoci tej metody. Metoda tzw. armatki genowej" polega na wstrzeliwaniu drobnych (rednica 0,5 5,0 |im) kuleczek wolframowych opaszczonych DNA. Prby takie wykonywano na zawiesinach komrek, liciach, zarodkach i tkance merystematycznej, uzyskujc 1 10% trwale transformowanych komrek. Nie jest jasne, czy sposb wprowadzenia DNA do komrek rolinnych wpywa na jego pniejszy los. Zazwyczaj wprowadza si do komrki kilkaset tysicy kopii heterologicznego genu, a odnajduje po integracji do genomu kilkadziesit (transformacja w zawiesinie metod chemiczn lub fizyczn) lub kilka (inne metody). Liczb kopii zrekombinowanego genu mona w pewnym stopniu kontrolowa, zmieniajc stosunek liczby komrek (protoplastw) do liczby czsteczek genu, a take stenie nonikowego DNA. Wynik zaley rwnie od gatunku rolin, z ktrego pochodz modyfikowane protoplasty. Informacji o procesie integracji DNA do chromosomu rolinnego dostarczyy gwnie badania transformacji protoplastw tytoniu i dlatego wnioski z nich pynce mog nie mie charakteru uniwersalnego. Prawdopodobnie integracja wynika z niehomologicznej rekombinacji, w miejscach pkni pojedynczych nici DNA. Miejsca integracji w rnych komrkach poddanych transfekcji w tym samym dowiadczeniu s rne i raczej przypadkowe. Zalenie od badanego gatunku roliny wczany DNA podlega (lub nie) rnego typu przegrupowaniom, prawie nigdy nie udaje si zrekombinowa z genomem rolinnym dugich (kilkanacie tysicy par zasad) fragmentw DNA. Z tego powodu znane techniki transfekcji komrek rolinnych nie mog by uyte do wprowadzania funkcjonalnych zespow genw eukariotycznych. W trakcie wielu podziaw komrkowych i w procesach rnicowania, mimo braku presji selekcyjnej, heterologiczne geny raz wbudowane do genomu nie zmieniaj si. Pierwsze transgeniczne roliny (tyto) otrzymano w roku 1984. Pierwsze zezwolenie na wprowadzenie roliny transgenicznej do uprawy polowej (pomidor) wydano w Belgii w roku 1986. Pierwsze transgeniczne roliny na pkach sklepowych (pomidor trway przy przechowywaniu) pojawiy si w lecie w roku 1994 w Stanach Zjednoczonych. Liczba zezwole na upraw polow na wiecie szybko rosa, od 9 w roku 1987, 33 w roku 1988, 65 w roku 1989, 151 w roku 1990, 208 w roku 1991, do 393 w roku 1992. Tylko 10% transgenicznych rolin naley do niejadalnych gatunkw. Do roku 1994 uzyskano transgeniczne odmiany w prawie wszystkich produkcyjnie uytecznych grupach rolin dwuliciennych i niektrych jednoli-

dennych. Dotyczy to niewielu ponad 20 gatunkw rolin, na 11 gatunkw przypada 96% wszystkich prb. Na czele listy znajduje si rzepak (37% dowiadcze), ziemniaki (16%), pomidor (9%), kukurydza (8%), len (6%), soja (5%). Pozostae dowiadczenia wykonano na: ogrku, saacie, grochu, marchwi, kalafiorze, kapucie, selerze, rzodkiewce, truskawkach, chryzantemach, godzikach, lucernie, soneczniku, buraku cukrowym, tytoniu, kiwi, petunii, rzodkiewniku, moreli, jaboni, winoroli, orzechu woskim, ryu, ycie i szparagach. Oprcz genw strukturalnych udao si wyodrbni charakterystyczne sekwencje regulacyjne dla ekspresji transgenw: konstytutywnej i indukowanej, a take wycza ekspresj wybranych genw przez wprowadzanie sekwencji antysensownych. Wyniki uzyskane w kilkuset testach polowych w Stanach Zjednoczonych i w Europie wskazuj na trwao genetyczn heterologicznych genw w polowych uprawach transgenicznych rolin.
14.3.1.3. Celowo konstrukcji rolin transgenicznych

W obecnym stadium rozwoju technik kontrolowanych modyfikacji genetycznych tworzy si tylko roliny z jednym transgenem. W zrealizowanych projektach modyfikowano takie cechy, jak: tolerancja na herbicydy (58%), oporno na choroby wirusowe (15%), oporno na owady szkodniki (10%), jako produktu (8%) i oporno na zakaenia grzybicze (3%). Wrd jakociowych cech produktw rolinnych modyfikowanych przez transgenizacj wystpuje podwyszenie trwaoci przechowywanych pomidorw, podwyszenie tolerancji na zimno i zamarzanie, zmiana spektrum lipidw pod ktem nasycenia kwasw tuszczowych, zmiana proporcji cukru do skrobi w rnych tkankach rolin, zmiany w skadzie aminokwasowym obficie wystpujcych biaek. 1) Roliny uprawne oporne na herbicydy. Cechy te osignito: (a) zwielokrotniajc liczb genw kodujcych enzym inaktywowany przez dany herbicyd; u roliny transgenicznej wystpuje nadprodukcja tego enzymu; (b) wprowadzajc gen kodujcy zmienion form enzymu, oporn na herbicyd; (c) wprowadzajc gen kodujcy enzym, ktry degraduje herbicyd. Stosujc tego typu podejcia otrzymano transgeniczne roliny oporne na atrezyn, bromoksynil, 2,4-D, glifosat, fosfinotrycyn i sulfonylomocznik. Tyto oporny na 2,4-D uzyskano wprowadzajc gen pochodzcy z bakterii glebowych Alcaligenes eutrophus. Gen ten koduje monooksygenaz 2,4-dichlorofenoksyoctanu, degradujc herbicyd 2,4-D. W transgenicznej rolinie zbadano ekspresj genu doczonego do promotorw, konstytutywnego i indukowanego wiatem, uzyskujc w obu przypadkach roliny oporne na wysokie dawki herbicydu. Ochron petunii przed innym herbicydem glifosatem zaburzajcym biosyntez aromatycznych aminokwasw katalizowan przez enzym (EPSP),

zapewniono po wprowadzeniu 15 20 kopii genu kodujcego EPSP. Uzyskano czterokrotne podwyszenie opornoci rolin na glifosat. Mimo i gen kodujcy EPSP znajduje si w DNA chloroplastw, a transgeny w DNA chromosomalnym, to produkt biakowy by przenoszony do chloroplastw. W podobny sposb uzyskano oporn na glifosat odmian transgenicznej soi, roliny 0 duym znaczeniu produkcyjnym (z upraw soi w Stanach Zjednoczonych zbiera si rocznie 60 min t nasion, z ktrych uzyskuje si 6 mld kg oleju 1 25 mld kg dodatkw do pasz i ywnoci). 2) Roliny uprawne oporne na zakaenia wirusami Najpowszechniejsz udan metod uodporniania rolin na wirusy jest transgenizacja genami kodujcymi biako paszcza danego wirusa. W ten sposb podwyszono odpornoci wielu gatunkw rolin m.in. na wirusa mozaiki tytoniowej (TMV), wirusy X i Y ziemniaka (PVX, PVY), wirusa liciozwoju ziemniaka (PLRV), wirusa mozaiki ogrka (CMV), wirusa mozaiki lucerny (AIMV) i wirusa karowatoci orzeszkw ziemnych (PSV). Hipotezy tumaczce to zjawisko zakadaj zablokowanie przez biako paszcza specyficznych wewntrzkomrkowych receptorw usuwania paszcza" z infekcyjnych wirionw, bd te istnienie hipotetycznego stanu dynamicznej rwnowagi midzy procesami opaszczania i usuwania paszcza, ktry swobodne biako paszcza przesuwa w stron pierwszego. Zaskoczeniem dla badaczy byo uzyskanie zwikszonej opornoci na wirusy rolin, do ktrych wprowadzono sekwencje DNA kodujce fragmenty biaek zwizanych z replikacj lub samych replikaz. W takich komrkach, mimo zajcia infekcji, transgeniczne biako powanie upoledza replikacj genomu wirusa. Ochron przed wirusami zapewnia take nadprodukcja wirusowego RNA i antysensownego RNA. By moe jest to skutek blokowania przez komplementarne sekwencje RNA sekwencji kodujcych genw i (lub) translacji waciwego mRNA. Obserwowano tzw. krzyow oporno rolin (rolina zakaona agodnym szczepem wirusa jest oporna na pniejsze zakaenie odmian wirulentn) i osignito zwikszon oporno na wirusy rolin, do ktrych wprowadzono geny kodujce rne biaka agodnych odmian wirusw lub geny kodujce satelitarne RNA. 3) Roliny oporne na owady szkodniki i ich gsienice. Takie roliny mona uzyska ekologicznie czystym" sposobem bd wprowadzajc do rolin gen kodujcy toksyn Bacillus thuringiensis, bd gen kodujcy inhibitor proteaz serynowych. Od roku 1961 stosuje si w agrotechnice ekopestycyd", biako wytwarzane przez Bacillus thuringiensis. Jest to toksyna zabijajca dorose owady i ich gsienice nalece do rodzin: Lepidoptera, Diptera, Coleoptera. Preparaty toksyny z B. thuringiensis nie s trujce dla innych owadw (np. pszcz) i ludzi. Sdzi si, e wraliwe owady maj receptor w bonach komrkowych, poredniczcy w transporcie toksyny do wntrza komrek. W alkalicznym rodowis-

ku ich przewodu pokarmowego wywarzana przez bakterie protoksyna, o masie 130 kDa, ulega ograniczonej proteolizie, z wytworzeniem produktu (70 kDa) paraliujcego owada (gsienic). Niestety dostpne preparaty toksyny s drogie i ulegaj szybkiej degradacji w warunkach naturalnych. eby ograniczy si do jednego przykadu dotyczcego ekonomicznej zasadnoci dalszego ulepszania toksyny jako pestycydu, rozpatrzymy wpyw szkodnikw na uprawy baweny. Roczne zbiory w samych tylko Stanach Zjednoczonych osigaj warto 4 mld $, a straty wynikajce z aktywnoci owadw i nakady na chemiczn ochron oceniane s na 650 min $. W sezonie plantacja baweny musi by opryskana 5 8 razy. W badaniach transgenicznej baweny nioscej gen, ktry koduje toksyn z B. thuringiensis, wykazano wysok skuteczno ochrony przed szkodnikami, dziki ekspresji genu toksyny we wszystkich czciach roliny. Podobnie udan transgenizacj tym samym genem uzyskano w przypadku pomidorw. Ochron przed szkodliwymi owadami daje rwnie wprowadzony do rolin gen kodujcy 80-aminokwasowe biako wyizolowane z nasion krowiego grochu, bdce inhibitorem trypsyny. Biako to nie jest toksyczne dla szczurw i ludzi; chroni skutecznie tyto przed gsienicami Heliothis virescens. 4) Roliny przeznaczone do wysokowydajnej produkcji biaek heterologicznych. Ciekawym przykadem takiego wykorzystania techniki transgenizacji s ziemniaki z genem kodujcym ludzk albumin surowicy (HSA) (p. podrozdz. 14.2.4). Gen HSA uyty do transgenizacji zaopatrzono w sekwencj sygnaow pochodzc z genu pomidora kodujcego biako wydzielane poza komrki. Ludzk albumin wytwarzaj i wydzielaj do przestrzeni midzykomrkowej komrki bulw transgenicznych ziemniakw. Z tych samych bulw mona uzyskiwa skrobi. Obliczono, e po zwikszeniu wydajnoci ekspresji genu albuminy do poziomu 12% biaka w bulwach, z 1 ha upraw ziemniaka mona bdzie uzyska 12 kg albuminy.
14.3.1.4. Perspektywy zastosowa transgenicznych rolin

Mimo tych licznych przykadw uzyskania wartociowych rolin transgeniczych, modyfikacje genetyczne rolin nie s jeszcze zabiegiem rutynowym, poniewa wiedza genetyczna i biochemiczna o wiecie rolinnym jest mniej rozwinita ni o zwierzcym. Nie umiemy w peni sterowa procesami integracji transgenw (rekombinacj) z genomem rolinnym, m.in dlatego, e mao wiadomo o enzymach uczestniczcych w rekombinacji. Brakuje szczegowych danych o stabilnoci genomu rolinnego, o wpywie wzoru metylacji genw na ich aktywno transkrypcyjn, o wpywie warunkw stresowych na modyfikacj genomu. Na te i podobne pytania szuka si na razie odpowiedzi w ukadach modelowych, in vitro i w modelowej rolinie rzodkiewniku (Arabidopsis thaliana). Z bada tych wynika, e rekombinacja w rolinach jest czstym

zjawiskiem, e odgrywaj w niej rol krtkie powtarzajce si sekwencje DNA, e najprawdopodobniej w komrce rolinnej istnieje topologicznie wyrnione centrum rekombinacji". Wanymi elementami przy transgenizacji roliny s sekwencje regulacyjne otaczajce waciwy gen. Stwierdzono, i powinny pochodzi genomw rolin, z wirusw bd bakterii zakaajcych roliny. Znane s konstrukcje, w ktrych zastosowano promotor wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), sekwencje regulacyjne plazmidw A. tumefaciens, sekwencje promotorw genw sterujcych fotosyntez, leghemoglobiny i lecytyny z nasion soi. Ze wzgldu na ograniczon wiedz o pozostaych typach sekwencji regulacyjnych w rolinach (wzmacniajcych i wyciszajcych) mona tylko postulowa wprowadzanie ich w miar poznawania do przyszych konstrukcji ukierunkowanych na regulowan ekspresj transgenw w rolinach. Mona sdzi, i podobnie jak w genotypach zwierzcych powikszy si repertuar poznanych sekwencji regulacyjnych wykazujcych specyficzno tkankow lub o aktywnoci zalenej od stadium rozwoju roliny. Byyby one nieocenione w kontroli skutkw transgenizacji rolin. W dowiadczeniach modelowych z transgenicznym tytoniem uzyskano za pomoc wiata indukcj genu reporterowego wyposaonego w promotory odpowiedzialnych za fotosyntez genw pochodzcych z grochu i pszenicy. Fragmenty DNA zawierajce geny kodujce zapasowe biaka nasion soi i fasoli otoczone wasnymi sekwencjami regulacyjnymi podlegay tkankowo specyficznej ekspresji (w nasionach) po wprowadzeniu do petunii i tytoniu, w dodatku w tym samym momencie rozwoju nasion, co w rolinie dawcy genu. Sdzi si, e szczeglnie przy przenoszeniu genw midzy organizmami jednoi dwuliciennymi ujawnianie pewnych cech zaley od gatunkowo specyficznych czynnikw dziaajcych w konfiguracji trans (np. czynnikw transkrypcyjnych).
14.3.2. Transgeniczne zwierzta

Termin transgeniczne zwierzta" odnosi si do osobnikw majcych heterologiczny/e gen/y trwale wbudowany/e do komrek rozrodczych. Zwierzta takie uzyskuje si obecnie trzema metodami: 1) Przez nastrzyknicie in vitro DNA do jednego z przedjdrzy zapodnionej in vivo komrki jajowej, przed pierwszym podziaem. Jest to postpowanie prawie rutynowe i dajce powtarzalne wyniki. 2) Przez infekcj wczesnego zarodka zrekombinowanym wektorem pochodzenia wirusowego. 3) Przez modyfikacj genetyczn pierwotnych komrek zarodkowych ES (ang. embryo stem) i wprowadzenie ich do zarodka w stadium blastocysty. Ten ostatni zabieg udaje si (1994 r.) tylko w komrkach myszy. Komrki ES s zdolne do rnicowania si we wszystkie typy komrek, a wic dorose myszy pochodzce z tego zabiegu bd skaday si z komrek powstaych

z komrek ES oryginalnego zarodka i z komrek ES z transgenem (genetyczna chimera). Dalsze krzyowanie pozwala uzyska myszy homozygotyczne pod wzgldem transgenu. Metoda ta pozwala na analiz mutacji recesywnych i dominujcych kadego genu.
14.3.2.1. Transgeniczne myszy jako model modyfikacji genotypu do celw biotechnologicznych

Pierwsze doniesienie o udanej prbie transgenizacji zwierzt pojawio si w roku 1980 (mysz z genem hormonu wzrostu szczura) i do tej pory suy jako przykad dowiadczenia modelowego. Od myszy hormonalnie pobudzonych do superowulacji pobiera si po zapodnieniu jednokomrkowe zygoty. Nastpnie ok. 1 pl (pikolitr: 10" 12 1)

Tabela 14.1. Schemat metody konstrukcji zwierzt transgenicznych Stadium rozwoju

in vivo in vitro

Rodzaj zabiegw

wstrzyknicia

decyduje^'

superowutacja

~ zabieg chirurgiczny* -O." ^^ \ . . nastrzyknicie / zebranie zarodkow

-pozyskiwanie zarodkw

^ . . zapodnienie oocytw
t

(OO) v

podziay J ((oj (ojj

nastrzyknicie
genu

integracja DNA (ugodzenia mechaniczne)

if) vifrQ

podziay przed implantacj , , imptantacja rozwj zarodkowy

przeniesienie do zastpczej J matki kontrola implantacji narodziny

^ ekspresja transgenu

-implantacja

dalszy rozwj cechy fenotypowe dojrzao pciowa *

C e testy: na integracj DNA, > y ch | fenotypowe Tyw ^ ^ na ekspresj genu

ocena fenotypu zaplanowanie krzywek

-integracja -ekspresja molekularna i fenotypowa -podno

potomstwo

testy: na integracj DNA, na ekspresj genu

-stabilno integracji i ekspresji

roztworu DNA zawierajcego 200 2000 liniowych kopii transgenu nastrzykuje si do dowolnego przedjdrza zygoty. Po kilku godzinach dzielce si zarodki (50 75% wydajnoci) wprowadza si, te przez zabieg chirurgiczny, do jajowodu zastpczej matki i oczekuje rozwinicia si ciy. Z urodzonego potomstwa (10 25% wydajnoci) 15 37% zwierzt dziedziczy wprowadzony obcy gen. Jeeli wprowadzone geny wczyy si do genomu przed rozpoczciem podziaw zygoty, to we wszystkich komrkach zarodkowych heterologiczny gen bdzie wczony w tej samej pozycji i w tej samej liczbie kopii. Jeeli do integracji dojdzie po pierwszych podziaach, to zarodki bd si skada z komrek rnych genetycznie (genetyczne chimery) (tab. 14.1). Procesy prowadzce do integracji heterologicznego DNA do genomu komrki biorcy nie zostay w peni poznane. Wydaje si, i zachodz one w sposb przypadkowy. W pocztkowym stadium obcy DNA tworzy w jdrze agregaty nie zwizane z chromosomami, w dalszych procesach prowadzcych do integracji znaczn rol przypisuje si takim reakcjom, jak ligacja i rekombinacja oraz fazie cyklu komrkowego. Istnieje jedno lub dwa miejsca integracji; integruje od jednej do kilkuset kopii obcego genu. W przypadku myszy pewien procent transgenw wcza si we waciwej pozycji genomowej w wyniku homologicznej rekombinacji. Ten proces homologicznej wymiany genw (ang. gene targeting) pozwala take na celowe uszkodzenie badanego genu i uzyskanie tzw. znokautowanych transgenicznych myszy. Metoda ta stwarza due moliwoci bada roli wybranych genw w funkcjonowaniu caego organizmu. Stabilno obcego genu po utrwaleniu w genomie bywa rna, a zachodzce czasem przegrupowania sekwencji genowych prawdopodobnie wi si z rodzajem sekwencji DNA komrki otaczajcych heterologiczny gen. Uwaa si, e o poziomie ekspresji transgenu decyduje region genomu, w ktrym doszo do integracji, wzorzec metylacji danego gatunku, trwao danego mRNA, rodzaj otaczajcych sekwencji regulacyjnych (promotor, enhancer), rodzaj czynnikw trans", ktre reguluj transkrypcj i translacj. W niektrych transgenach elementy regulacyjne typu cis " (sekwencje DNA) wystarczaj do osignicia tkankowo specyficznej ekspresji lub ekspresji zalenej od okrelonego induktora. Na przykad specyficzn indukcj cikimi metalami wykazano dla genw doczonych do promotora metalotioneiny, indukcj interferonem dla promotora antygenu MHC-II, promotora genu transferyny przez estrogeny, promotora genu insuliny przez glukoz. W gruczole mlecznym krowy uzyskano ekspresj ludzkiego genu kodujcego oksydaz nadtlenkow po jego poczeniu z promotorem genu kwanego biaka serwatki. Uzyskanie transgenicznych myszy otworzyo wiele moliwoci badawczych ekspresji genw w czasie rozwoju i rnicowania si organizmu, ktrych nie mona uzyska w badaniach pojedynczych komrek po transformacji in vitro. Myszy transgeniczne s wzorcem niektrych chorb genetycznych i nabytych czowieka. Istniej myszy bdce modelami chorb o charakterze dominujcym (np. aniridia, zesp Waardenberga), chorb sprzonych z chromo-

somem X (np. zesp Lescha Nyhana, dystrofia miniowa typu Duchenne'a), chorb o charakterze recesywnym i autosomalnym (np. albinizm, choroba Gauchera, mukowiscydoza, anemia sierpowata, /?-talasemia) i innych (niedobr odpornoci, arterioskleroza, inne choroby ukadu krenia, choroba Alzheimera, nowotwory, takie jak: retinoblastoma i zesp Li Fraumeni oraz zaburzenia neuropsychiatryczne). Duo nowych informacji z zakresu onkogenezy uzyskano w badaniach myszy transgenizowanych protoonkogenami i onkogenami. Nowotwory powstaj w myszach nioscych protoonkogen c-myc, doczony do wirusowego promotora lub enhancera genu immunoglobuliny. Nowotwory trzustki indukowane s przez protoonkogen c-ras z sekwencjami regulacyjnymi genu elastazy szczura. Skrzyowanie dwu szczepw transgenicznych myszy, nioscych osobno c-myc i v-Ha-ras doprowadzio do indukcji licznych nowotworw w potomstwie. Zwierzta transgeniczne modele okrelonych chorb ludzi mog by take uywane w badaniach przesiewowych substancji terapeutycznych, w badaniach toksykologicznych itp.
14.3.2.2. Transgenizacja zwierzt hodowlanych

Udane transgenizacje myszy nasuny sugestie zastosowania tej samej techniki do pozyskania transgenicznych zwierzt o znaczeniu produkcyjnym. Postuluje si ukierunkowanie prac w celu: (a) stymulacji zwikszenia masy ciaa i (lub) wydajnoci mlecznej po transgenizacji zwierzt hodowlanych genami hormonw wzrostu; , (b) modyfikacji genotypu zwierzt przez wpyw na poziom ekspresji ich genw lub wprowadzenie nowych genw z tym samym zamiarem; (c) poprawy zdrowotnoci zwierzt dziki wprowadzeniu genw opornoci lub tolerancji na okrelone choroby. Pierwsze prby transgenizacji zwierzt hodowlanych genem hormonu wzrostu dotyczyy krlikw, owiec, byda, wi, ryb i kurczt. Zabiegi te okazay si moliwe, chocia wydajno bya bardzo niska, a koszt wysoki. Na wyniki kocowe trzeba te dugo czeka. Porwnajmy: kocowa wydajno transgenizacji myszy wynosi 4%, krlikw 3%, wi 1%, a owiec 0,2%. Genetyka molekularna zwierzt gospodarczych praktycznie nie istnieje. Wydajno transgenizacji zaley od wielu etapw caego procesu (tab. 14.1), ktre mog przebiega rnie u rnych gatunkw. Nawet w tych przypadkach, w ktrych udowodniono istnienie transgenu w zwierztach poddanych manipulacji genetycznej, rzadko udaje si zaobserwowa wpyw produktu genu (hormonu wzrostu) na szybko przyrostu masy ciaa; czsto transgeniczne zwierzta s bardziej chorowite, czasem niepodne. Problemy te wymagaj wielu dodatkowych bada biochemicznych, genetycznych i fizjologicznych. Transgeniczne zwierzta gospodarcze s take otrzymywane z myl uzyskania yjcych reaktorw". Punktem wyjciowym byy uprzednio prowadzo-

ne badania nad syntez biaek mleka ssakw, struktur i regulacj ekspresji genw a- i /?-kazein z kilku gatunkw ssakw, genu /Maktoglobuliny owcy, genw kwanego biaka serwatki (WAP) myszy i szczura, a-laktoglobuliny czowieka, byda i szczura. Kontrolowana ekspresja genw kodujcych okrelone typy kazein mogaby doprowadzi do zmian w skadzie biaek mleka. Opisano np. transgeniczne myszy wytwarzajce /Maktoglobulin owcy i czowieka. Wydaje si, e prby uzyskania zwierzt transgeniczych wydzielajcych z mlekiem biaka o znaczeniu farmaceutycznym s atrakcyjne. Surowiec ten moe by uzyskiwany bez zabijania zwierzcia, z wysok wydajnoci i niskim kosztem. Heterologiczne biaka bd zapewne prawidowo modyfikowane potranslacyjnie, a liczba ywych bioreaktorw" moe by praktycznie nieograniczona. W trzech firmach farmaceutycznych w Stanach Zjednoczonych, Wielkiej Brytanii i w Holandi prowadzi si prace nad transgenizacj owiec, kz i byda w celu wytwarzania wanych dla lecznictwa substancji w gruczole mlecznym tych zwierzt (a-l-antytrypsyna, t-PA, laktotransferyna, czynniki krzepliwoci krwi). a-l-antytrypsyna jest glikoprotein surowicy stosowan w leczeniu rozedmy i chorb degeneracyjnych puc. Wydzielana jest z surowicy ludzkiej, gdzie jej stenie wynosi 2 g/l. W Stanach Zjednoczonych ocenia si, i zapotrzebowanie roczne na ten lek wynosi 4 t. Otrzymano kilkaset transgenicznych owiec, do ktrych wprowadzono ludzki gen a-l-antytrypsyny poczony z promotorem /Maktoglobuliny. 5 z nich roso normalnie i wydao potomstwo. Poziom ekspresji a-l-antytrypsyny by rny u poszczeglnych zwierzt, wynosi od kilku do kilkudziesiciu gramw z litra. Biako mona oczyci do 95% homogennoci metodami standardowymi. Jest ono prawidowo glikozylowane. By moe, i nowa technika zaproponowana w roku 1991 przez holenderskich biotechnologw zapowiada przeom w transgenizacji byda, poniewa przeniesiona z laboratorium metodyka transgenizacji myszy jest w przypadku byda zbyt kosztowna: wymaga dwu zabiegw chirurgicznych; czas generacji i ciy krw jest dugi, a cia zazwyczaj pojedyncza. Badacze holenderscy uzyskali oocyty z jajnikw krw po uboju, przeprowadzili w kontrolowanych warunkach zapodnienie in vitro, co pozwolio na uzyskanie duej liczby zygot, a take na ledzenie ich dalszego rozwoju przez ok. 9 dni, czyli do stadium moruli. Zygoty (103) wprowadzono nastpnie do zastpczych matek, a cia rozwina si w 21 przypadkach. Uzyskano 16 zdrowych cielt; u dwojga wykryto wprowadzon 'do zygot konstrukcj genow (ludzki gen laktoferryny, otoczony sekwencjami regulacyjnymi bydlcej aS^kazeiny), u jednego (byczek) bya ona identyczna z uyt do nastrzykni. Wydajno metody jest zatem porwnywalna do klasycznej transgenizacji myszy, a postpowanie atwiejsze, lepiej kontrolowane i tasze. Spektakularnym przykadem uzyskania wartociowych zwierzt transgenicznych s szybko rosnce ryby. Ryby charakteryzuj si korzystnie niskim (1,5) wspczynnikiem konwersji pokarmu (stosunek masy pokarmu do masy ciaa).

Wspczynnik ten dla byda wynosi 12, a dla przemysowych kur 1,7. Dua liczba komrek jajowych ryb, atwo zapodnienia, a take atwo hodowania narybku czyni z nich dogodny obiekt do transgenizacji genem hormonu wzrostu. W pierwszych konstruktach genowych wykorzystano promotory genw wirusa SV40, mysiego genu metalotioneiny oraz genu j8-aktyny karpia i otrzymano transgeniczne karpie, ososie oraz pstrgi. Wprowadzanie obcych genw do ryb mogo jednak spotka si z niechci konsumentw. Z tego powodu zastosowano kaset ekspresyjn skadajc si z cDNA genu hormonu wzrostu ososia otoczonego flankujcymi sekwencjami genomowymi tego samego genu i poprzedzonego promotorem genw AFP pochodzcych z ryb z rodziny wgorzy ko watych (Macrozoarces americanus). Geny AFP koduj biaka obniajce temperatur zamarzania osocza krwi ryb yjcych w bardzo zimnych wodach. Poziom ekspresji tych genw jest regulowany przez temperatur, w lecie ryby wytwarzaj ich mniej, a w zimie wicej. Opisan konstrukcj genow wstrzyknito do 800 komrek jajowych, uzyskujc 80-procentowy poziom wylgania narybku i 20-procentow miertelno po roku hodowli. Po tym czasie zwaono 200 osobnikw i od 50 najciszych pobrano krew oraz uski, przeznaczone do analizy DNA metod PCR. U szeciu ryb wykryto sekwencje obejmujce region promotorowy i fragment genu; kompletny transgen znaleziono u 9 ryb (1,9% wydajnoci transgenizacji). rednia masa ciaa ryb transgenicznych przewyszaa piciokrotnie mas ryb kontrolnych; najciszej trzynastokrotnie. 14.4. Metody rekombinacji DNA in vitro zastosowane do produkcji zwizkw chemicznych W roku 1981 w Raporcie Biura do Spraw Ocen Technologicznych Kongresu Stanw Zjednoczonych napisano: Kocowe efekty biotechnologiczne mog by ogromne, a jedynym czynnikiem ograniczajcym je pozostaje wyobrania biotechnologw". Zdanie to wiadczy o nadmiernym optymizmie autorw, co potwierdzaj losy prognoz wdroe biotechnologicznych metod wytwarzania zwizkw chemicznych o znaczeniu przemysowym. Prognozy te formuowano bez uwzgldniania stopnia doskonaoci uprzednio eksploatowanych technologii, optymalizowanych czsto przez wiele lat. Zakadano rwnie, i biotechnologie nie uzupeni, a cakowicie wypr z przemysu metody klasyczne. Zaoenia tego rodzaju zawyay znacznie ocenian warto rynkow produktw nowej biotechnologii. Nowe technologie zazwyczaj polegaj na ulepszaniu istniejcych procedur, co oczywicie nie wpywa na poda produktw. Metodami rekombinacji DNA najczciej konstruuje si nowe szczepy produkcyjne, co w maym stopniu wpywa na koszt finalnego produktu, skadajcy si w gwnej mierze z kosztw surowcpw, zuytej energii i procedur oczyszczania produktu.

W przemyle chemicznym biotechnologie stosowane s w bardzo wskim zakresie, jedynie do syntezy biokatalizatorw (enzymw) specyficznych procesw, do syntezy biopolimerw dla medycyny i w produkcji opakowa. Rozpatrzmy nowy sposb wytwarzania oksydazy glukozy (otrzymywanej dotychczas z Aspergillus niger). Jest to enzym uywany w przemyle spoywczym do odtleniania napojw, usuwania glukozy z jajecznego proszku, jako naturalny rodek konserwujcy ywno, w bioczujnikach mierzcych w fermentorach stenie glukozy i w zestawach diagnostycznych w analizie medycznej. Do genu A. niger kodujcego oksydaz glukozy doczono regulacyjne sekwencje nukleotydowe (promotor dajcy si indukowa i sekwencje kierujce sekrecj biaka do podoa), potem wprowadzono je do plazmidowego wektora S. cerevisiae i transformowano tym plazmidem drode. Tak zrekombinowany szczep zgodnie z zaoeniami wytwarza i wydziela do podoa oksydaz glukozy z bardzo wysok wydajnoci (3g/l litr hodowli). Jest to chyba jedyny opisany przykad tak wysokiej ekspresji i sekrecji duego biaka (masa ok. 400 000 Da) w S. cervisiae. Ze wzgldu na odmienny wzr glikozylacji ni w enzymie natywnym rekombinacyjna" oksydaza glukozy jest trwalsza i ma szerszy zakres pH optymalnej aktywnoci ni enzym z A. niger.

14.5. Postp nauki i techniki w rozwoju biotechnologii Metody rekombinacji DNA in vitro znalazy bardzo szerokie zastosowanie w opracowywaniu wielu nowych biotechnologii. Dalszy postp w tym zakresie bdzie wymaga ulepszania i poszerzania zestaww odczynnikw i metod badawczych: znajdowania i wyodrbniania trwaych, specyficznie dziaajcych enzymw, rozwoju analizy krystalograficznej, syntezy nowych biopolimerw, metod badania struktur nadmolekularnych. Coraz wiksz rol odgrywa bdzie zapewne inynieria biakowa: projektowanie i synteza mutein. Muteiny umoliwiaj analiz konsekwencji zmian struktury pierwszorzdowej biaek. Ten kierunek rozwoju pociga za sob udoskonalenie przestrzennego programowania czsteczek i rnych typw ich oddziaywa. Mona oczekiwa, i sprzony rozwj inynierii genetycznej i biotechnologii doprowadzi do dalszego pogbienia wiedzy o potranslacyjnych modyfikacjach biaek. By moe uda si uzyska takie mikroorganizmy, ktre byyby zdolne do glikozylacji biaek. Cigle jeszcze nie s rozwizane problemy tolerancji immunologicznej organizmu ludzkiego na obce biaka (potencjalne leki biakowe, muteiny). Wiele procesw o potencjalnym znaczeniu biotechnologicznym wymaga optymalizacji w celu podwyszenia wydajnoci i skrcenia czasu produkcji. Naley opracowa nowe metody wykrywania i ilociowej oceny produktw ekspresji genw w pojedynczych klonach zrekombinowanych komrek (przypieszenie bada przesiewowych). Usprawnieniu produkcji sprzyjaoby take opracowanie jednoznacznych metod kontroli poszczeglnych jej etapw, rzad-

ko dotychczas osigane, skrcenie procesu oczyszczania produktu kocowego, uproszczenie, dzi bardzo kosztownych i czasochonnych, procedur oceny kocowego produktu (np. w Stanach Zjednoczonych przepisy przewiduj 750 rnych bada testujcych kady preparat rekombinacyjnego" ludzkiego hormonu wzrostu). 14.6. Bezpieczestwo biotechnologii dla ekosfery i czowieka Moliwo niekontrolowanego przecieku" genetycznie modyfikowanych organizmw z laboratorium do rodowiska nie budzi wspczenie obaw i emocji, pod warunkiem zachowania w pracy zasad dobrej techniki mikrobiologicznej". Jednake nadal uznaje si, i trudne s do przewidzenia skutki wiadomego wprowadzania transgenicznych organizmw i zrekombinowanych kwasw nukleinowych do rodowiska naturalnego. Takie obawy w rodowiskach pozanaukowych wyraay si niszczeniem poletek z transgenicznymi rolinami (Stany Zjednoczone) i okupacj laboratoriw biologii molekularnej przez agresywne ugrupowania zielonych" (Niemcy). W naukowych gronach stawiane s nadal pytania: (a) czy mona w peni przewidzie skutki rekombinacji rnych fragmentw DNA? (b) czy i jakie s naturalne sposoby przekazywania DNA midzy organizmami, rwnie ewolucyjnie odlegymi? (c) jak trwae s zrekombinowane organizmy w warunkach naturalnych? (d) czy mona i jakim kosztem spowodowa, eby przemys biotechnologiczny sta si szczelny" dla zrekombinowanych organizmw? eby lepiej zrozumie konkretne obawy i zastrzeenia rozpatrzmy dwa potencjalne przykady negatywnego rozwoju sytuacji w wyniku realizacji projektu biotechnologicznego. Pierwszy dotyczyby moliwoci nie kontrolowanego rozprzestrzenienia si w populacji ludzkiej bakterii E. coli majcej gen kodujcy proinsulin. Ot w najkorzystniejszych dla ekspresji pojedynczego genu warunkach jedna bakteria E. coli wytwarza dane biako w iloci odpowiadajcej 30% biaka cakowitego (tj. 106 czsteczek proinsuliny na 1 bakteri). W przewodzie pokarmowym czowieka E. coli stanowi 1% flory bakteryjnej (2 x 109 komrek). Gdyby wszystkie komrki E. coli wytwarzay proinsulin, to na dob powstaoby 0,6 jednostek, podczas gdy zdrowa trzustka produkuje na dob 30 jednostek. Drugi przykad dotyczy konsekwencji spoywania przez ludzi i zwierzta rolin transgenicznych z markerowym genem nptll kodujcym fosfotransferaz neomycyny, ktra nadaje oporno na kanamycyn i neomycyn. Mona zatem zapyta, czy enzym ten jest toksyczny dla zwierzt i ludzi, czy spoywane" geny i enzymy (obecne w transgenicznych rolinach) utrudni terapi tymi antybiotykami chorb dzi nimi leczonych, czy gen w moe by przeniesiony

z roliny do bakterii patogennych dla czowieka lub np. do bakterii glebowych i z jakim skutkiem. Liczne badania przeprowadzone w tym zakresie pozwalaj na udzielenie na wszystkie te pytania odpowiedzi negatywnych. Od wielu lat gen nptll stosowany jest jako gen markerowy w transfekcji komrek zwierzcych oraz ludzkich i nie odnotowano nigdy objaww toksycznych lub jakiegokolwiek wpywu na ich wzrost i podziay. Zarwno DNA, jak i samo biako s szybko trawione w przewodzie pokarmowym. W jelicie cienkim czowieka i w glebie yje wiele niepatogennych mikroorganizmw opornych na neomycyn. Tam, gdzie dziaaj odpowiednie komisje ustanawiajce przepisy bezpiecznej pracy (Stany Zjednoczone, Wielka Brytania, Niemcy, Francja, Belgia, Holandia) przyjto, i decyzje o dopuszczeniu do realizacji projektw wymagajcych uwolnienia zrekombinowanych organizmw lub zrekombinowanego DNA do rodowiska wydawane s dla konkretnych, poszczeglnych przypadkw. Jednoczenie gromadzi si dane o przekazywaniu DNA midzy organizmami i o trwaoci zrekombinowanych organizmw poza laboratorium. W badaniach tych krokiem wstpnym jest opracowanie metod wykrywania zrekombinowanych organizmw, w szczeglnoci mikroorganizmw, w rodowisku naturalnym: wodzie, powietrzu i glebie, gdzie mog si znale bd w wyniku zamierzonych postpowa, bd jako przeciek" z laboratorium lub zakadu przemysowego. Dotychczas stosowane w tym zakresie metody oceniono jako mao czue i mao specyficzne. W oznaczeniach ilociowych i jakociowych mona wykorzysta markery genetyczne typu funkcjonalnego (np. kodujce cechy opornoci na antybiotyki), chromogennego (np. oznacza si barw kolonii w obecnoci chromogennego substratu, powszechnie stosowane jest wykrywanie bakterii nioscych gen xylE, ktry w obecnoci katecholu powoduje wytworzenie tego barwnika), wreszcie mona uy sond molekularnych hybrydyzujcych z jednoznacznymi sekwencjami nukleotydw w zrekombinowanym organizmie (np. unikatowymi sekwencjami rRNA). Geny markerowe powinny by wczone do genomu badanego organizmu, gdy w rodowisku naturalnym nie podlegaj segregacji i stanowi mae obcienie metaboliczne dla komrki gospodarza. W ocenie konsekwencji wprowadzenie do rodowiska zrekombinowanych mikroorganizmw pomogy dane o rozprzestrzenianiu si nowych, nie zrekombinowanych mikroorganizmw uywanych do biologicznej kontroli: chorb rolin, uszkodze przez przymrozki, chorb pochodzenia glebowego, biologicznej kontroli owadw i chwastw, rozszerzenia lub intensyfikacji przyswajania atmosferycznego azotu oraz usuwania przemysowych odpadw. W adnym z badanych przypadkw nie stwierdzono znacznego naruszenia biologicznej rwnowagi w otoczeniu, w ktrym uwalniano mikroorganizm. Nawet w przypadku wysokiego miana nowych mikroorganizmw w rodowisku, obserwowano jego spadek we wszystkich badanych prbach do bardzo niskich wartoci, czsto ju po paru dniach.

W porwnaniu z opisanymi badaniami liczba uwolnionych do rodowiska zrekombinowanych mikroorganizmw jest niska. Na zlecenie odpowiednich kontrolnych instytucji badano zachowanie w rodowisku mikroorganizmw wzbogaconych o plazmid lub mutagenizowanych chemicznie, ktre nie s zrekombinowane, ale atwe do odszukania. Od roku 1986 (pierwszy przypadek) do roku 1991 uwolniono na wiecie mikroorganizmy do rodowiska 27 razy. Ich los by dokadnie monitorowany. Wyniki tych pomiarw upowaniaj do wniosku, e procedura wprowadzania do biosfery zrekombinowanych mikroorganizmw i ich dalsze losy nie stwarzaj zagroe, ale powinny by w przyszoci nadal kontrolowane. Do koca roku 1991 w Stanach Zjednoczonych i w Europie wykonano ok. 400 prb polowych z transgenicznymi organizmami (gwnie rolinami). Rozoono take przynty dla dzikich zwierzt zawierajce rekombinacyjn szczepionk przeciw wcieklinie. W Wielkiej Brytanii dopuszczono po raz pierwszy w produkcji ywnoci ywy, zrekombinowany szczep drody piekarniczych. Prowadzone s intensywne badania bezpieczestwa pracy w przemyle stosujcym zrekombinowane organizmy. Przyjto generaln zasad, e w warunkach przemysowych dopuszczona jest praca z takimi mikroorganizmami, ktre mog wywoywa choroby czowieka, jednake jest mao prawdopodobne, aby samoistnie przenosiy si one do otoczenia. Do tej klasy nale m.in. Staphylococcus aureus, Clostridium, Streptococcus, hepatitis A, B, Toxoplasma, Cytomegalovirus, Rubella, wirus Epsteina-Barr. W przemyle biotechnologicznym w Holandii skontrolowano prac fermentorw o pojemnoci od 7 do 3000 tys. litrw. Nie stwierdzono przeciekw mikroorganizmw podczas posieww, w okolicy fermentorw, przy pobieraniu prbek w systemie zamknitym i przy wirowaniu. Filtry powietrza dostpne w handlu uniemoliwiaj uchodzenie mikroorganizmw z gazami wylotowymi przy fermentacji. Dziki wspczesnej biotechnologii opracowano metody diagnostyczne umoliwiajce molekularnie uwiarygodnione poradnictwo genetyczne. Jednoczenie jednak powstaa potencjalna moliwo genetycznej oceny przydatnoci ludzi do wykonywania pewnych zawodw, ktra moe by naduywana przez pracodawcw, firmy ubezpieczeniowe itp. W rolnictwie podwyszanie wydajnoci produkcji prowadzi do upadku drobnych gospodarstw wiejskich, odsunicia ludzi od bezporedniego kontaktu z przyrod i do dalszej industrializacji ycia. Zmianom ulegaj formy pracy ludzkiej: biotechnologie s czsto (nie zawsze) bezpieczniejsze dla zatrudnionych i mniej skaajce rodowisko, za to wymagaj wyszych kwalifikacji zawodowych personelu. Zagospodarowanie lub usunicie typowych biotechnologicznych odpadw produkcyjnych moe by trudne. Kiedy prognozowany, dzi realizowany nowy wspaniay wiat biotechnologii" przechodzi surow prb ycia. Ju obecnie wida, jak nie sprawdzio si wiele wczesnych przewidywa i ile zdarzyo si nieoczekiwanych odkry, skutkujcych rnorodnymi zastosowaniami. Zamiast male ronie liczba fundamentalnych pyta o ist< ' ' ;ady, ktre procesami yciowymi steruj. Przyszo jest w rki ptymistw.

INDEKS

Opracowaa Jadwiga Baj

Gwiazdk oznaczono numery stron, na ktrych hasa znajduj si na rysunku, w podpisie lub w tabeli. Numery stron, na ktrych znajduje si gwny opis, s pogrubione.

aberracje chromosomalne 387, 404 abiotyczna synteza zwizkw organicznych 413 acetylaza chloramfenikolu 161 addycje 185, 240, 254-256, 260 adenina 38*, 42, 49 adenoidy 335 adenowirus(y) 169, 234, 389, 405 , jako wektor 450, 451 - , replikacja 82, 83* adenylotransferaza 212 agregaty 424 Agrobacterium 424, 458, 459 - tumefaciens 169, 422, 457, 460 - rhizogenes 457 agropiny 457 AIDS 333, 382-384, 452 akryflawina 260 aktywator NifA 200 - NtrC 200 - plazminogenu (TPA) 427, 455 - replikacji Al 100 alarmon 197 - godu aminokwasowego 208 - godu wglowego 208, 209 albinizm 468 albumina osocza (HSA) 443, 456, 464 - surowicy bydlcej 324 Alcaligenes eutrophus 199, 462 alkaliczna fosfataza 174

alkilacja 259 allel(e) 17 genw MHC 364, 369 Mo 314 polimorflczne 369 wielokrotne 25 allolaktoza 203 Altman 415 a-amanityna 227 Ames B. 208 amfipatyczny kwany heliks 232 aminoacylo-tRNA 137-140 aminokwasy, oznaczenia jednoliterowe 135* aminopteryna 342 2-aminopuryna (n2Pur) 259 cAMP 207, 208, 450 ampicylina 273 amplifikacja DNA, p. reakcja acuchowa polimerazy (PCR) genu 283, 396 komrek 330 Anacystis nidulans 143, 422* analiza komputerowa genw 190, 191 restrykcyjna 163* analogi zasad 259 anemia sierpowata 25, 449, 468 anergia 381 aneuploidia 387, 410, 411 angiogeneza 387, 407, 408

aniridia 467 antygen 323, 324, 328, 329, 333, 335, 364, 376 - H-Y 318 - MHC-II 467 - poliwalentny 324, 325*, 374 - powierzchniowy Hbs Ag 442, 443, 448 , prezentacja 336 - T 85, 86, 171 antykodon(y) 136, 137, 140, 145, 149-151 - mitochondrialne drody 145* antyonkogeny 290, 392, 403-408, 410, 411 antystazyna 454*, 455 antyterminacja, p. transkrypcja, antyterminacja antytrombina III 454* a-l-anty trypsyna 469 aparat Golgiego 376 apolipopro teina 146 - B 240*, 241 apoptosis, p. apoptoza apoptoza 389, 402, 403, 407 aporepresor 205 Arabidopsis 107, 430, 464 - thaliana 181, 464 Archaea 421 Archaebacteria (p. te archebakterie) 421 archebakterie (p. te Archaebacteria) 418, 422*, 425* armatka genowa 461 arterioskleroza 453, 468 artretyzm 452 Ascomycetes, p. workowce Aspergillus nidulans 233, 431, 471 astma 328 astrocytoma, p. gwiadziak asymilacja NH 3 199, 210 ataxia-telangiectasia 390 atenuacja, p. transkrypcja, atenuacja atenuator(y) 217, 220 ATPaza 148, 248* Auerbach Ch. 257 auksotrofia tryptofanowa 152 auksyny 457 autonomously replicating seuences (ARS, ang.) 87 autoradiografia 174, 178, 180* autoradiogram 176* autoregulacja pozytywna 311 autosomy 20, 308, 310, 317, 321 autotolerancja 370 Avery T. 23 Azospirillum sp. 212 Bacillus 33, 68*

- , fag SPOl 198 , klonowanie 198 , sporulacja 198 - subtilis 422*, 425 , terminacja replikacji 106 - thuringiensis 463 bakterie fotosyntetyzujce purpurowe 423-425 - zielone 425 bakterie gramdodatnie 425* bakteriofag(i) 23, 27, 29, 33, 76 , cykl lityczny 33, 34 cykl lizogeniczny 33, 269, 270 - defektywne 34 - G4 76, 77* - agodne 33, 157 - M13 16, 77*, 166, 168 - PI 3, 68* - P22 33 - QP 418 - SPOl 158 - T3 195 - T4 27, 29, 112, 225 - 77 195 - $29 84 - $X174 76, 77*, 80, 81 - X 29, 31, 33, 50, 68*, 165, 192, 222, 269, 270* - , cykl lityczny 269 - , integracja 118 - , jako wektor 165 , replikacja 7 1 - 7 3 , 82 , transkrypcja 98, 222 bakulowirus 169, 443 bank genw 158, 168, 173, 177, 188, 279, 303 - ludzkiego cDNA 449 barwniki akrydynowe 260 bazofile 328 bending (ang), p. DNA, zaginanie Bennett 344 Benzer S. 27 Berg P. 203 biaaczki 386, 389, 390, 400 - chroniczna mielocytarna 406 - ostra promielocytarna 400 - pre B-ALL 400 biako(a), acylacja 439, 443 - antyterminacyjne 207 - CAP 118, 208, 209 - chorionu 283 - CRP 208 - env 393* , fosforylacja 439, 443 - fuzyjne 440, 455

biako(a) G 397, 398, 406, 408 - gag 393* - GAP 398, 399, 402, 406 - , glikozylacja 169, 439, 443 - heterologiczne 464 - histonopodobne 117, 118 - HIV 383 - IHF 118, 200, 269, 270* - jdrowe 82, 83* - kodowane przez protoonkogeny 397 402, 406 - macierzy jdrowej 88, 89*, 119 - MHC 333, 334 - , mostki SS 168 - NF1 406 - niehistonowe 118-120, 122 - one 397 - PCNA 97, 100 - pol 393* - promotorowe 87 , proteoliza 443 - Ras 397-399, 401*, 402, 406 - RecA 249*, 263, 264, 267*, 268 , regulacja stabilnoci 246, 247 - regulatorowe 295, 302 - rybosomalne 144* - SSB 82, 84, 90, 94, 102 - stresowe 72, 198, 247 - struktury chromatyny 88, 89* - szoku cieplnego 247 - towarzyszce 247 - typu heliks-skrt-heliks 232*, 233 - zrekombinowane 443 biblioteka genw, p. bank genw bioczujniki 471 biokatalizatory 471 biomodulatory 444 biopolimery 471 biotechnologia 429 , bezpieczestwo 472 474 - medyczna 444 biotyna 174 Bishop J.M. 395 blastocysta 305*, 306, 465 blastoderma 294 - syncytialna 296, 298 - komrkowa 298 blastomery 284 , determinacja rozwojowa 285, 286 blinita 364 Boveri T. 281 branch migration (ang.), p. przesuwanie rozgazienia

Brevibacterium 442 Bridges C.B. 309 Brimacombe 142 brodawczak HPV 405 skry 386 bromek etydyny 39, 41, 163 5-bromo-4-chloro-3-indolylo-/?-D-galaktozyd, p. X-gal bromoksynil 462 bromouracyl (BrUra) 259 bruzdkowanie 284, 294 bulion pierwotny 413, 416, 420* Caenorhabditis elegans 290, 291, 303, 308, 311 , budowa 291 gen lin-14 292 genom 291 , mutant unc-86 291 - , rozwj 291-293 , sekwencjonowanie 181 , transpozony 271* Calladine C.R. 45, 47 cap (ang.), p. czapeczka CAP, p. biako CAP catabolite activator protein (ang.), p. biako CAP Cech T. 236, 414, 415 , model redagowania 242, 243 cecha dominujca 16, 17* recesywna 16, 17* celularyzacja 98 centralny dogmat genetyczny 25, 412 centromer 21, 109, 122, 126, 131, 169, 283, 365 chaperone (ang.), p. biaka towarzyszce Chase M. 23 chemioterapia 453 chiazmy 23 chimera 305*, 306 genetyczna 466 Chlamydomonas 35 chloramfenikol 271, 423, 459 chloroplasty, pochodzenie endosymbiotyczne 423-425, 436 - , rRNA 142 choniak 389, 403 Burkitta 389, 396 choroba(y) Alzheimera, p. zesp Alzheimera autosomalne 448, 468 Gauchera 468 genetyczne 448, 449 , diagnostyka 183, 444 jednogenowe 451 o charakterze dominujcym 467

choroba(y) genetyczne o charakterze recesywnym 468 , terapia 444 Huntingtona p. plsawica Huntingtona nowotworowe (p. te nowotwory, raki) 445, 453 TayaSachsa 452 ukadu krenia 454, 455, 468 wirusowe 453 zakane 450 chw wsobny 353, 362, 364, 366 chromatosom 119 121 chromatydy 19, 21 siostrzane 126* chromatyna 53, 119, 120, 127, 285, 299, 300*, 380 aktywna transkrypcyjnie 128, 129 , despiralizacja 284 interfazowa 125 , miejsca nadwraliwe na nukleazy 130, 131 muszki owocowej 122 pciowa 314 , stan aktywny 284 - , wkno 123 - 1 2 5 , 130 , model solenoidu 124 10 nm 123, 124, 39 nm 124, 128, 130 chromofor flawoproteinowy 259 chromosom(y) 19, 290, 307, 344, 369, 405, 406, 408, 448 , aberracje 19, 20 bakteryjny 30, 62, 115 eukariotyczne 106, 118, 126 homologiczne 21, 261, 289 olbrzymie 283 metafazowy 125, 128 politeniczne 19, 20*, 283, 284, 310 X 130, 285, 308-311, 314, 318, 320, 449,468 Y 308, 309, 313, 315-319, 435, 436 chromosome jumping (ang.), p. skoki po chromosomie chromosome walking (ang.), p. kroczenie wzdu chromosomu oraz wdrwka po chromosomie chromosomowa teoria dziedzicznoci 19 ciaka inkluzyjne 440 ciako Barra 314 cisp. ukad cis cistron 27 Clostridium 442, 474 Collins J. 168 concerted evolution (ang.), p. ewolucja zespoowa

consensus 196 Correns E. 16 cos, p. sekwencje cos CpG islands (ang), p. sekwencje CpG Crick F. 23, 59, 60*, 137, 145, 434, 435 crossing-over 21, 22, 33, 184, 261, 263*-265, 272, 275, 316-318 niewzajemny 432 CRP, p. biaka CRP cukrzyca insulino-zalena 451 C-value paradox (ang.), p. paradoks zawartoci DNA Cyanophora paradoxa 424 cyclic AMP receptor protein (ang.), p. biako CRP cyjanelle 424 cyjanobakterie 423, 425* cyklaza adenylowa 207, 399 cykliny 398, 399 cytochrom c 421 cytokineza 283 cytokininy 457 cytokiny (p. te limfokiny, interleukiny) 323, 324*, 333, 334, 372-375, 382, 450, 453 - , geny 365*, 370 - , GM-CSF 373 - , TNF 373, 443 cytoliza 325 Cytomegalovirus 474 cytozyna 38*, 42 < czapeczka 229* czarna ospa 446 czas utajenia 386 czsteczki adaptatorowe 136 czstki Dane'a 445 - nukleoproteinowe (VLP) 278 czerniak 452 czowiek 303, 314, 315, 318 - , geny rRNA 432 - , mt rRNA 142 , sekwencjonowanie genomu 181 czynnik AP-1 399 - CPF 244 - E1A 234 - inicjacyjne IF1, IF2, IF3 140 kancerogenne (p. te kancerogeny i karcinogeny) 388, 391 - krzepliwoci krwi 427, 428, 469 martwicy nowotworw (TNF) 452 - MPF 398 mutagenne 409 rakotwrcze, p. czynniki kancerogenne rozprzestrzeniania 387, 409

czynnik sigma 193, 198-200, 230 - stymulujce wzrost kolonii 441 - TBT 232, 234 - TDF 315 - Tdy 315 - terminacyjne 140 - TFIIIR 415* eukariotyczne 226, 227, 228, 230, 232-234

kodowane przez protoonkogeny 397 - 3 9 9 , 401*, 402, 408 prokariotyczne 52, 53, 295, 296, 299, 415, 465 VIII 443 epidermalny (EGF) 427, 428 fibroblastw (FGH) 286 hepatocytw 409 pytek krwi 191 TGFp 408 Xa 454

2,4 D 462 Dawkins R. 434 dehydrogenaza alkoholowa kukurydzy 428 - 3-fosfoglicerynianu (GAPDH) 428 dekorsyna 454*, 455 deksametazol 131 dekstran 376 delecja(e) 20, 240, 250, 254-256, 260, 271, 274*, 275, 299, 317, 318, 379, 384, 403, 404, 410, 440 - AF 508 450 - klonalna 371, 381, - urydyn 148 , wytwarzanie 185, 186* deoksyrybonukleotydy 37 39 2-deoksyryboza 37 determinacja pci 307 - 321 - czowieka 319, 320 - Drosophila 308-313 - ssakw 313-321 , zaburzenia 321 determinanty antygenowe 324, 325*, 327, 330*, 338, 342, 364, 374 deaminaza adenozyny (ADA) 452 diagnostyka chorb genetycznych 448, 449 - zakanych 450 - genowa 439 - prenatalna 448 Dictyostelium discoideum 422* dimery pirymidynowe 258, 259 diminucja chromatyny 281, 283 dinitrofenol 324, 325

discriminator (ang.), p. dyskryminator displacement loop (ang.), p. ptla D dugie terminalne powtrzenia (LTR) 276, 277* DNA, analiza rentgenowska 45, 47 - , cDNA 146, 158, 173, 449, 455 - chloroplastowy (ct DNA) 35, 423, 424 , denaturacja 49 - domena(y) 115, 125, 126 biakowa 426-429 efektorowa 325, 326* homeotyczn 233 B 44, 46, 113, 131, 132* krzyowa 131 133 plektonemiczna (przepleciona) 57, 58 solenoidowa (toroidalna) 57, 58 trjniciowa 131 133 Z 40, 42, 131-133 , G-DNA 108 jdrowy 423 kinetoplastowy 50 , konformacja 47, 48, 52 - mitochondrialny (mtDNA) 35, 50, 7 3 - 7 5 , 423, 424, 430 - , msDNA 225 - , ni H i L 73 - 75* - , ptle 53, 54, 55, 73, 74, 214 , rozkrcanie 49 samolubny 430, 434 - satelitarny 123, 126, 432 , struktura typu A 40, 47* , struktury krzyowe 58 swobodny 36 - , T-DNA 457, 458 unwinding element (ang.), p. sekwencje DUE , waciwoci topologiczne 55, 56* - , zginanie 4 9 - 5 3 , 68, 122, 209, 214 , zrelaksowanie 116 DNaza 175* - I 40, 41* - V98 DNP p. dinitrofenol dobr naturalny 413, 421, 430 Doolittle W. 434 dopeniacz, p. system dopeniacza dosage compensation (ang.), p. mechanizm kompensacji Drew H.R. 45, 47 Dreyer 344 Drosophila 234, 285, 290, 304*, 305, 307, 308 , chromosomy olbrzymie 19 , politeniczne 19

Drosophila determinacja pci 308 313 , geny kierujce rozwojem 293 303 melanogaster 19, 25, 62, 63*, 279, 283, 302 , geny supresorowe procesu nowotworowego 407 , polimeraza RNA 227 , transpozony 271* , rozwj 294 rRNA 432 drode 265 piekarnicze, szczep zrekombinowany 474 , plazmidy 87 , poliubikwityna 247 , retrotranspozony 278 , szok cieplny 247 , transpozony 271* drzewo genealogiczne 421, 425 na podstawie sekwencji 16S rRNA 421, 422* , mtDNA czowieka 435 duplikacje 271, 307, 310, 346, 348, 404, 426, 436 , w rodzinie globin ssakw 426* dyferencjacja, p. rnicowanie si dymorfizm pciowy 309, 312 dysfunkcje hormonalne 388 dyskryminator 196*, 197 dysmutaza nadtlenkowa 443 dystrofia miniowa Duchenne'a 449, 452, 468 dystrofma 449, 450 dziedziczenie cytoplazmatyczne 35 niemendlowskie 409 pozachromosomalne (pozajdrowe) 36 editing (ang.), p. mRNA, redagowanie edukacja grasicowa 365, 370 edytosom 142, 147 efekt letalny 258 mateczny 296 mutagenny 249* mutatorowy 249*, 254 pozycyjny 460 EGF 443 egg polarity genes (ang.), p. geny polarnoci jaja egzonukleaza(y) 91*, 185, 249*, 252 III z E. coli 185, 186*, 199 3' 242
egzony 236, 240, 245, 345, 346, 426-428,

449, 450 - , tasowanie 427, 428, 430, 437 ekdyson 84

ekopestycyd 463 ekspresja genu 173, 439 ektoderma 285, 306 elektroforeza w elu agarozowym 57, 160, 176* poliakrylamidowym 41*, 50, 160, 178-182 elektroporacja 172, 460 embrionalny nowotwr mini 290 endocytoza 374 endoderma 285 endomitoza 283 endonukleaza 91*, 119, 185, 242, 249* - AP 259 - UV (UVRABCD) 258, 259 endosymbionty 425 enhancer(y) (wzmacniacz(e)) 131, 200, 210, 212, 213, 214, 230, 231, 232, 299, 396 Enterobacteriaceae 67 enzymy lizosomalne 334 - reperujce 253 - restrykcyjne 157*, 158, 159, 160, 163*, 185, 189* epitopy immunogenne 444 erytrocyty 283, 293 erytropoetyna 441, 444 Escherichia coli 29, 30, 32, 33, 52, 62, 63*, 422*, 429, 457, 458 , asymilacja NH 3 210 , primosomw 70 , rybosomalne 144 - , - SSB 102 , bdy translacji 154, 155 , czynniki sigma 199 , genom 110, 115 , klonowanie 442, 472 - , oriC 6 7 - 6 9 , 71* - , replikacja DNA 67-71, 105, 106 , sekwencjonowanie 181 - , system SOS 268 , topoizomeraza 103 , transkrypcja 216 , transpozony 271* estrogeny 467 estry forbolu 386, 398 etykieta genomowa 417, 418 Eubacteria 421, 422*, 425* euchromatyna 127, 128 eukarionty (p. te Eukaryota) 430 , ewolucja 420* Eukaryota (p. te eukarionty) 192, 226, 237, 421, 425*, 439 ewolucja genw 191

ewolucja genw organellarnych 425 mtDNA 435 , lepy zauek 425 zespoowa 431 exon shuffling (ang.), p. tasowanie egzonw F" 30*, 31* F + 30* fagi, p. bakteriofagi fagocytoza 325, 327, 334, 383 fagocyty mononuklearne 335, 336 faktory elongacyjne 140, 417 fasola 465 faza S 405 G1 87, 405 fenotyp 26 , nowotworowy 391, 403 fenyloketonuri 448, 449, 452 , diagnostyka molekularna 449* fermentory 474 fibroblasty 362 fibronektyna 427 fibryna 454* fibrynogen 454*, 455 figura Hollidaya 263*, 264, 267* krzyowa 264 filtr nitrocelulozowy 176*, 177* firmy biotechnologiczne 440 , Amgen 440, 441 , Biogen 441 , Centocor 440 , Chiron 440, 441 , Genentech 440, 441 , Genzyme 441 Flavobacterium heparinum 422* footprint (ang.), p. technika odcisku stopy forma replikacyjna (RF) 76 formylometionina 205* fosfinotrycyna 462 fosfodiesteraza 399 fosforybozylotransferaza hipoksantynowa (HGPRT) 342 fosfotransferaza neomycyny 458, 472 fotodimery pirymidyn 258, 267 fotoliaza D N A 249*, 258 fotoreaktywacja 249, 267 fotosynteza 423, 425 fragment Klenowa 92, 174 fragmenty Okazaki 64,65, 70,78, 80, 90, 92,96, 97, 99,101, 267 Fuller B. 55 fuzja genw 396, 410, 440 komrkowa 403

galaktoza 234, 235 0-galaktozyd 2 0 1 - 2 0 3 0-galaktozydaza 161, 163, 165, 173, 201 - 2 0 3 , 208* /?-galaktozydopermeaza 201, 203 gametogeneza 289 gamety 18 Gamow 134 gap genes (ang.) 302 gel shift (ang.), p. test spowolnienia migracji w elu gen(y) A 80 - abd-A 299, 300* - Abd-B 2 9 9 - 3 0 2 - ADA 452 - ADHI 168 - AFP 470 - ampR 274 - Antp 301 - APC 404, 406 - aphll 459 - Apl2 141 - appA 199 - aroH 206, 207 - autosomowe 316, 321 - bcd (bicoid) 296, 297 - biaek szoku cieplnego 129 - bolA 199 - BRCA1 404 - CDC2, CDC9, CDC17 97, 98*, 101 - cige 192 - c-onc, p. protoonkogeny - ero 223 - crp 208 - cya 208 - da 310 - dam 254 - DCC 406 - Deformed 301, 305 - dhfr 459 - dnaA, dnaB, dnaC, dnaG, dnaT 68, 70*, 90*, 93-95* - dsx 312, 313 - dysmutazy nadtlenkowej 436 - en (engrailed) 297*, 298, 302 - env 171, 277, 393*, 394 - eve (even-skipped) 297, 298 - flal 199, 200 - flbB 199 - ftz (fushi tarazu) 297, 298 - fuzyjny 400 - gag 171, 277, 278, 393, 394 - gal 34, 35

gen(y) GAL4, GALIO, GAL80 234*, 235 - GALI 168 - glnA, glnD, glnF 199, 211-213 - hairy 297* - hb (hunchback) 296, 297 - histonu H3 436 - heterologiczne 442, 461 - homeotyczne 295, 299, 300, 305, 307 - homologiczne 174, 178 - hormonu wzrostu 468 - housekeeping 235, 285 - Hox-1.5, Hox-2, Hox-2.3, Hox-2.5 301, 303, 305, 306 - htrA 199 , identyfikacja 279 - immunoglobulin, p. immunoglobuliny, geny - int 269 - Ir 366 - ix 313 - jdrowe 436 - katE, katF 199, 200 - a i fi kazeiny 469 - Knl (Knotted-l) 306, 307 - kni (knirps) 297 - konserwowane 178 - kontrolujce liczb podziaw komrek 389
konwersja 264267, 432

- Kr (Kruppel) 297 - kwanego biaka serwatki 467 - lacA, lacl, lacY, lacZ 201-203, 256 - /Maktoglobuliny 469 - LCFS2 404 - LEU2 169* - lin-14 292 - , lokalizacja 279 - lux 460 - markerowe, p. geny reporterowe - MAT Pi 307 - MCC 404, 406 - MEN-1 404 - milczce 146 - MIPI98* - mitochondrialne 236, 241 - w / e 311 - msl-1, msl-2, 311 - mutD, mutH, mutL, mutS, mutU 93*, 249*, 252-254 - iV 223, 224 - <?/383* 404, 406 - niecige 227, 383* - nifL 213 - nm23 408

nos (nanos) 296, 458 nptll 45%, 459, 472, 473 /it 249* ntr A, ntrC 199, 200, 211, 212 one 392, 394, p. te onkogeny i protoonkogeny p53 404 - 406, 410 paired 297* Pdha-1, Pdha-2 433 Pgk-1, Pgk-2 433 phr 249* podzielone 439 pol 171, 277, 278, 393*, 394 Poll, Pol2, Pol3, PolX 91, 98* polA, polB, polC 90*, 9 2 - 9 4 polarnoci jaja 295, 296, 299, 301, 307 polarnoci segmentw 298, 307 polihedryny 443 priA, priB, priC 70* PTPy 404 RAGI, RAG2 351 Rb 404, 405 recA, recB, recC, recD 249*, 263, 264 Rd 290 recesywne 19 regulatorowe 284, 294, 295* rep 70* reporterowe 354, 459, 460, 456 rev 383* REV3 99 rho'218 rRNA 229, 236, 431, 432 tRNA 229, 237* RP11, RP12 91 rpoA, rpoB, rpoC, rpoD, rpoF, rpoH, rpoN 193, 198-200, 212, 218 rybosomowe 129
segmentacji 295, 296-299, 301

- sis-a, sis-b 310, 311 - snf 310 - sprzone 19, 21*, 299, 307 z pci 316 - SRY 320 - ssb 70* - supresorowy 189 - przerzutowania 408 transformacji nowotworowej, p. antyonkogeny - Sxl 308, 310, 311, 312 - tat 383* - TDF 311, 318 - tnpA, tnpB, tnpR 273-276 - topA 103

gen(y) tra (E. coli) 31 - tra tDrosophila) 311, 312 , transfer horyzontalny 436 - transferyny 467 - transformujce (v-onc), p. onkogeny - a-tropomiozyny 245 - trpA, trpB, trpC, trpD, trpE 206*, 207, 220* - tus 105 - Ubx 2 9 9 - 3 0 2 - umuC, umuD 269 - wwc-S 291, 292 - ung 249* - w/?r 383* - uvrA, trorB, wurC, uvrD 249*, 253*, 258, 269 - wg- (wingless) 298, 302 - witelogeniny 53 - WT 404, 406 - F//L 404 - wy383* - vpu 383* , wymiana homologiczna 467 - xis 270 - xthD 199 - ZFY 318, 319 gene disruption (ang.), p. rozbicie genu gene targeting (ang.), p. homologiczna wymiana genw genetic make-up (ang.), p. konstytucja genetyczna genetyka klasyczna 15 genom(y) bakteryjny, napicia torsyjne 113 117 - E. coli 110 - mitochondrialny 418, 421 , wielko 110* - wiroidw 111 - wirusw 111 113 genomie tag (ang.), p. etykieta genomowa Gilbert W. 203, 420, 426, 429 , hipoteza tasowania egzonw 427, 428 G-kwartet 107 glifosfat 462 glikol polietylenowy (PEG) 460 glikoproteina(y) 382 - D wirusa opryszczki HSV 447 - HBsAg 445, 447 glikozylacja biaek 442, 443, 471 glikozylaza uracylowa DNA 249*, 255, 256, 260 glista 281 globina(y) 285 - a 426, 456

fi 25, 426, 456 podowe 426 glukoamylaza 443 /?-glukuronidaza 460 godzenie 198 gd aminokwasowy 197, 208, 216, 219 wglowy 207, 208 gwny ukad zgodnoci tkankowej (MHC) 364 , biaka 362, 3 6 4 - 3 7 0 , klasy I 361* 363, 365*-369, 372-375, 381 , klasy II 362, 263, 365*-369, 372-375 , geny 364-366, 369, 370 , udzia w nowotworzeniu 407, 409 GM-CSF, p. cytokiny gorce miejsca 256, 273 Gorini L. 152, 153 granulocyty 373 gratuitous inducer (ang.), p. induktor bezinteresowny Griffith F. 23 gruczolakorak prostaty 450 jajnikw 450 gruczolakorakowato mnoga wewntrzwydzielnicza 390 rodzinna jelita grubego 390 gruczoy limfatyczne 335, 336 guanina 38*, 42 guanozynotrifosforan (GTP) (p. te czapeczka) 230 guide RNA (ang.), p. RNA przewodni Gurdon J.B. 281 guz lity 387 nowotworowy 343 Wilmsa 390, 403, 404, 406 gwiadziak 404, 406 gyraza 115*-117, 197, 104-105 Haemophilus 33 Halobacterium volcani 422* Halococcus morrhuae 422* halofile 422*, 425* Hansenula polymorpha 442 hapten 324, 325*, 329, 353 heat shock (ang.), p. szok cieplny helikaza(y) 70*, 86, 102, 106, 258 DnaB 69, 72*, 76, 106 PriA 97 Rep 80 replikacyjna 69, 85 heliks podwjny 37, 39, 45 , badania krystalograficzne 39, 40

heliks podwjny, bruzda 44, 45*, 48, 50 - , kt skrcenia 39 - , prawoskrtno 42 , skok 4042, 45*, 50, 57 - potrjny 43 a-heliks 301 helix turnhelix (ang.), p. struktura heliks skrt heliks helper yiruses (ang.), p. wirusy wspomagajce hem 426 hemaglutynina wirusa grypy 447 hementyna 454*, 455 hemofilia 452 hemoglobina 25, 426, 456 hemoglobinopatie 452 heparyna 194, 454*, 455 hepatitis B, p. zapalenie wtroby typu B hepatocyty 445 hermafrodyta 321 Hershey A.D. 23 heterochromatyna 127, 128, 281 heterodupleks 254, 262*-264, 267 heterokarion 27 heterozygota 16 18, 21 Hfr 30*, 31 high mobility group (ang.), p. biaka HMG Hinnen A. 168 hipercholesterolemia 452, 453 hiperplazja 386 hipoksantyna 342 hipoteza endosymbiotyczna 423 - Gai 436 - tolerancji 137, 145 hirudyna 443, 454*, 455 hirugeny 455 histamina 328 histon(y) 41, 44, 50, 118, 119, 121, 122, 127, 129, 130, 232, 245, 421 , acetylacja 130 - HI 118 -121*, 123, 130 - Hl 118 - H2A 117-119, 121*, 127, 130 - H2B 118, 119, 121*, 127, 130, 244 - H4 118, 119, 121*, 127, 130 - H5 118 , udzia w replikacji 100 histone-like proteins (ang.), p. biaka histonopodobne histydyna, biosynteza 24* HLA 369 Hohn B. 168 Holliday R. 263 homeoboks 301-303, 306, 307

homeodomena 301-303, 306, 307 homeotic genes (ang.), p. geny homeotyczne homeotic selector genes (ang.), p. geny homeotyczne homologiczna wymiana genw 467 Homo sapiens (p. te czowiek) 422* - , ewolucja 107 - , telomery 435, 436 homozygota 18, 21, 291 hormon wzrostu 441 hot spots (ang.), p. gorce miejsca housekeeping genes (ang.) 235, 285 human leukocyte antigen (ang.), p. HLA hybrydyzacja 173 - in situ 279, 294, 318, 320 - kolonijna 177, 178 - ysinkowa 177*, 190 , technika northern" 174 , technika southern" 174, 176* hydroksylaza fenyloalaninowa (PAH) 448 - indoloacetamidu 457 hygromycyna 459 IFN-a 373 IFNa-2a 453 IFN-0 373 IFN-y 373, 380 IFN-0 373 IFN-y 373, 380 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, p. immunoglobuliny immediate hypersensitivity (ang.), p. nadwraliwo typu wczesnego immortalizacja komrek 389, 403, 408 immunoglobuliny (Ig, p. te przeciwciaa) 323, 329, 330 , budowa 326* , geny 244, 344 , , mutacje somatyczne 332, 344, 353 , , organizacja 344353, 380 , , regulacja transkrypcji 354, 355 , , rekombinacje somatyczne 344, 348 351 - IgA 326 - 3 2 8 , 331, 332, 379, 380 - IgD 326-328, 331, 378, 380 - IgE 326-328, 331, 379, 380 - IgG 326-328, 331, 332, 379, 380 - , model czsteczki 339* - IgM 326 - 3 2 8 , 331, 332, 377-380 - , schemat czsteczki 327* - , klasy 326, 327* , superrodziny 366, 369 , rda rnorodnoci 352, 360 implantacja 466 imprinting 288, 289, 409

imprinting genomowy u myszy 289* - genomu rodzicielskiego 288, 290 indukcja 200, 201 , operon laktozowy 201 205 - rnicowania 285 - mezodermalna 286 induktor 202, 284 - bezinteresowny 202 Ingram V.M. 25 inhibitor proteaz serynowych 463 insercja 251, 384 - faga JL 269 - urydyn 148 , wytwarzanie 185 insulina 285, 441 integraza 277, 278, 382 interferon 453, 467 - a 441, 442 - 0 441 - y 441 interleukina(y) 372 - IL-2 373 - 3 7 6 , 443, 452, 453 - IL-3 373 - IL-4 373, 376, 380 - IL-5 376 - IL-6 373, 376 - IL-7 373 interseks 309, 310*, 312 interseksualizm 313 intron(y) 173, 188, 225, 227, 228, 230, 231, 236, 349, 429, 430, 432 - 4 3 4 , Arabidopsis 430 - bliniaczy 430 , drode 430 , fag T4 416 , genom ludzki 429 - , grupy 236, 238* , pochodzenie 430 , Tetrahymena 415
- , wycinanie 236 239, 415

jajnik 315, 316, 321 jajo, polarno skadnikw 285 jderko 228, 283 jderko 228, 283 jdro 245, 424 , eliminacja 283 interfazowe 126, 127, 313 Jenner E. 446 jeowiec 244, 285, 303, 436 junk DNA (ang.), p. mieci molekularne kallus 459 kana chlorkowy bony cytoplazmatycznej 450 jonowy 362 kanamycyna 271, 458, 472 kancerogen(y) (p. te karcinogeny) 388 kancerogeneza 388, 392 kanoniczna sekwencja nukleotydow 220 kapsyd 111-113* wirusa HIV 382, 383* karboksylaza rybulozobisfosforanu (karboksylaza rybulozo-l,5-difosforanu) 247, 424 karcinogeny 260 kariotyp 317, 320 karowato 451 kaseta ekspresyjna 443 kaskada ekspresji genw 223 regulatorowych 308, 309*, 311 enzymatyczna 211 transkrypcji 198 genw rzskowych 199 katalaza 199 katar sienny 328 katechol 473 katenacja 105, 213 katenat 214 kinaza(y) biakowe C 398, 402 glicerofosforanowa (PGK) 428 polinukleotydowa 174 serynowa 397 serynowo-treoninowe 397, 398, 402 tymidylanowa (TK) 342 tyrozynowa 363, 397, 398 kinetochor 126 Klebsiella pneumoniae 199, 212, 214, klonowanie DNA 157*, 158, 439 komputerowe 190 w komrkach eukariotycznych 170* za pomoc kosmidw 167 Klug A. 50 Kluyveromyces lactis 442, 456 knock-out genowy, p. rozbicie genu Knudson 403

- co 430 intron homing (ang.) 430 inwazyjno, p. komrki nowotworowe inwersja 271, 274* inynieria biakowa 471 - genetyczna 36, 156, 197 iperyt 257 IPTG, p. izopropylotiogalaktozyd IRS, p. wewntrzny odcinek resolucji izopropylotiogalaktozyd 202 izotyp 326 Jacob F. 201

koacerwaty 413 kod genetyczny 135* ewolucja 418 , uniwersalno 147, 148, 418 , - , odstpstwa 144-146, 418 kodon(y) 134, 137, 150 amber 136, 151, 152 inicjacyjny 135*, 140, 141 mitochondrialne 144*, 145* nonsensowny 241 ochr 136, 147 opal 136 terminacyjny 135*, 140, 219 przeciekajcy" 154 kointegracja 459 kointegrat 275, 276 kolagenaza IV 387 komrki B, p. limfocyty B fagocytarne 323 folikularne, p. komrki pcherzykowe hybrydowe 342 Leydiga 315 , inwazyjno 387, 407, 410 , mobilno 387 odpornociowe 323 pcherzykowe 315*, 316 plazmatyczne 324, 328, 330*, 331, 336, 376 pnia 293, 305, 331 prapciowe 315, 316 Sertoliego 315 sterydogenne 316 T, p. limfocyty T tuczne 328 komrkowe geny one, p. protoonkogeny kompartmentacja 419 kompetencja 33 kompleks Antennapedia (ANT-C) 299, 301, 304* antygenprzeciwciao 340 bithorax (BX-C) 299-301, 304* HOX 303, 304*, 306 ORC 87 Rec BCD 264 rybosomowy 140 komplementacja 26*, 27 wewntrzgenowa 29 a 163 koniugacja bakteryjna 29, 3032, 263, 457 przerywana 31*, 32 chromosomw 317 konstytucja genetyczna 390 kontrola negatywna 207, 209

pozytywna 209, 223 kontrolowana samodestrukcja komrek, p. apoptoza konwersja genw, p. gen(y) kosmidy 167*, 168, 188 kostniakomisak 290, 404, 405 kotransdukcja 33, 35 kotransformacja 33 krgowce 285, 303 kroczenie wzdu chromosomu (p. te wdrwka po chrompsomie) 318 kryminalistyka 183 krzyowa oporno rolin 463 krzyowanie wsobne 16 krzywka odwrotne 36 testowa 21, 22 trzypunktowa 22 wsteczna 18 kukurydza 306 - , rRNA 142, 432 - , transpozony 271, 272 kura 303 kumermycyna 105* kwas nalidyksynowy (NAL) 105* oksolinowy (OXO) 105* retinowy 286 tetrahydrofoliowy 342 kwana fosfataza 199 Lactobacillus 442 Lagerkvist 145, 146 lagging strand (ang,), p. wideki replikacyjne, ni opniona /Maktamaza 273 laktotransferyna 469 laktoza 201-203 laminy 125 lariat 238* leading strand (ang.), p. wideki replikacyjne, ni prowadzca Lederberg J. 30 Leishmania 240*, 241 leki 453 - 4 5 6 . pochodzenia rekombinacyjnego 441 przeciwnowotworowe 43 leming 320 lepkie koce 159*, 160, 185 cos 165 leucine zippers (ang.), p. suwaki leucynowe leukocyty 373* ligacja 157, 185, 189* ligaza(y) DNA 100, 158, 253, 268, bakteryjne 101, 264

ligaza(y) DNA eukariotyczne 101 fagw T4 i 77 101 polinukleotydowe 101 RNA 242 limfocyty 323, 292, 335 B 323, 324*, 328, 330, 331, 333, 335*, 351, 353, 354, 362, 364, 366, 372, 373*, 374, 403 , aktywacja 375*, 376 , autotolerancja 381, 382 , czapeczka 374 , dojrzewanie i rnicowanie 329*, 344, 348 , proliferacja 374 T 323, 324*, 333, 335*, 351, 355-364, 372, 373*, 375, 382 pomocnicze (TH) 324*, 333, 334*, 356, 362, 366 , autostymulacja 374 , funkcje 366 cytolityczne (T c ) 333, 334*, 356, 362, 364 , aktywacja 374 , prekurSory_370 , selekcja w grasicy 371 limfokiny 323, 372, 380 limfotoksyna LT 362, 373 - , geny 370 linker DNA (ang.), p. cznik lipopolisacharyd (LPS) 376 liposomy 450, 451, 461 liza 324*, 327, 333, 361, 362 lizozym 381, 443 locus vir 457 long terminal repeats (ang.), p. sekwencje LTR loss of heterozygozity (ang.), p. utrata heterozygotycznoci LPS, p. lipopolisacharyd LTR, p. sekwencje LTR oraz p. dugie terminalne powtrzenia lucyferaza 460 Lwoff A. 201 acuchy przeciwcia lekkie (L) 325, 326, 336, 338, 347*, 349 typu X 331, 337, 344, 349 typu x 331, 337, 344, 345*, 349 cikie (H) 325, 326, 337, 338, 347*, 349, 376 J 327 , domeny stae i zmienne 337*, 338 , przegrupowania genu 379 - - , rejon nadzmienny (CDR) 337*, 340*, 341* , synteza 348*

typu a, S, e, y, ju 331 , typy 327*, 379 cznik 119, 121, 124 oysko 286 ysinki 177, 189 MacCarty M. 23 MacFarlane Burnet F. 330 MacLeod C.M. 23 Maizels 417 makrofagi 323, 327, 328, 333, 334, 335, 362, 363, 366, 373, 375, 376 , aktywacja 374 makronukleus 122, 281 mapa genetyczna 22, 31, 67 - restrykcyjna 160, 161, 163*, 190 pBR322 165* pUC19 166* mapowanie genw 31*33 MAR (ang. matrix associated regions) 125, 127 Margulis L. 436 marker 161 - selekcyjny 184 matriks jdrowa 125, 127 maturaza 430 maxicircles (ang.) 241 minicircles (ang.) 241 McClintok B. 272 mechanizm(y) epigenetyczne 387 - insercji promotora 394 < - kompensacyjny 308, 310, 311, 313 - neodarwinowskie 436 mejoza 23, 126, 250, 261 Mendel G. 16, 19 , prawo I 18, 35 - II 18, 19, 35 Messing J. 166 metalotioneina 467 metanogeny 422*, 425* metanosulfonian etylowy (EMS) 259 - metylowy (MMS) 259 metastaza, p. przerzut Methanobacterium formicum 422* Methanococcus vanielii 422* Methanospirillum hungatei 422* metotreksat 459 metylacja cytozyny 130 - DNA 130, 205, 288, 289, 314 - histonw 118 metylaza(y) 159, 253*, 254 - Dam 70, 71* 3-metyloadeninoglikozydaza 249* 5-metylocytozyna 255, 256*

7-metyloguanozyna 141 mezoderma 285, 306 MHC, p. gwny ukad zgodnoci tkankowej micF, p. RNA miejsca AP 255, 259, 260 - attB 269, 270* - attP 269, 270* - nut 223*, 224 - rbs 218* - restrykcyjne 459 - rut 218, 219 miczaki 283, 285 misaki 389 migdaki 335 /?-mikroglobulina 369 mikroiniekcje 461 - DNA 172 mikroskamieliny 413 mikro tubule 126 Miller 413 mioblasty 450 mitochondria, pochodzenie endosymbiotyczne
4 2 3 - 4 2 5 , 436

- redagowanie RNA 241 - , rRNA 142 mitochondrialna Ewa 435 mitogen 388 mitorybosomy 143 mitoza 126 mobilno, p. komrki nowotworowe model solenoidu 124 - Wezuwiusza 433 modulator(y) systemu immunologicznego 453 modyfikacje potranslacyjne biaek 439, 443 molekularne skamieliny 417, 421 monocyty 334, 335 Monod J. 201 monooksygenaza 2,4-dichlorofenoksyoctanu 462 - tryptofanowa 457 monosom 140, 141 morfogen(y) 286, 296 morfogeneza, kontrola genetyczna 290 Morgan T. 19, 21, 22, 261 motywy immunoglobulinowe 337 mouse mammary tumor virus (ang.), p. wirus MMTV muchwki 281, 283 mukowiscydoza 190, 540, 451, 452, 468 Muller H.J. 257 Mus musculus 63* muszka owocowa, p. Drosophila melanogaster mutacja(e) 20, 25, 59, 436

Antennapedia (Antp) 293 antymutatorowe 252 bithorax (bx) 293 chromosomalne 387 - , czsto 248, 269 delecyjne 216 heterochroniczne 292 homeotyczne 293 indukowane 257-259 missens 218, 418 mutatorowe 252 nonsens 189*, 190, 219 , polarno 219* prezygotyczna 404 punktowe 151, 216, 240, 250-253, 264, 380, 384, 396 rozwojowe 202, 293 somatyczne genw immunoglobulin, p. immunoglobuliny, geny spontaniczne 255, 380, 409 w procesie nowotworzenia 391 wsteczne 250 mutagen(y) 257 chemiczne 259, 260 fizyczne 257 mutanty alleliczne 26 auksotroficzne, p. pokarmowe dna 67 homeotyczne 306 homozygotyczne 306 pokarmowe 24, 260 quick stop" 67 slow stop" 67 muteiny 439, 455, 471 mutageneza 381 indukowana 259 in vitro 423 kierunkowa, p. ukierunkowana spontaniczna 251, 252 sterowana 187 ukierunkowana 152, 221, 168, 183188 mutator 187* Mycoplasma 418, 419* myeloma, p. szpiczak Myopus schisticolor 320 mysz(y) 303-305, 315, bezgrasicza 391 , genom 433 naga, p. mysz bezgrasicza , sekwencjonowanie 181 transgeniczne 185, 288, 341, 371, 372*, 381, 450, 466 znokautowane 467

Myxococcus xanthus 225 nadwraliwo typu wczesnego 328 napicia torsyjne 113-117, 127, 133 naprawa DNA (p. te reperacja) 55, 92, 99 mutagenna 99 poreplikacyjna 435 neodarwinizm 412, 413 neomycyna 305, 458, 472 neuroflbromatoza 404 neurony dopaminergiczne 291, 292* neutrofile 373* nici cofnite" 186 nicienie 285 nick translation (ang.) 92, 93*, 99, 174, 175* ni opniona 97 prowadzca 97 niedobr immunologiczny ciki zoony (SCID) 371 odpornoci 468 niemiertelno komrki 389 Niremberg M.W. 135 nitrogenaza 214 nondysjunkcja 404 nopaliny 457, 558 northern, p. hybrydyzacja nosiciel HBV 445 nowobiocyna 105* nowotwr(y) (p. te raki) 389, 390, 468 - , etiologia 388, 389 nadnerczy 404 nerki 406 nosogardzieli 389 przysadki 404 przytarczyc 404 trzustki 404 Wilmsa 290 zoliwe 385, 403, 406 , cechy charakterystyczne 385 nukleaza(y) 44, 56, 108, 128, 461 Micococcus 119, 121 restrykcyjne 44 SI 185, 186* nukleoplazmina 127 nukleosom 41, 44, 48, 50, 53, 55, 57, 97, 100,
119123, 129

oczko" replikacyjne (p. te wideki replikacyjne) 61, 65, 66* odcisk stopy, p. technika odcisk stopy" oddychanie tlenowe 423, 425 odpowied immunologiczna 323, 365, 372, 380 humoralna 323, 324*, 333 komrkowa 323, 324*, 333 pierwotna 323, 324*, 333 wtrna 332*, 376, 381 - stresowa 198, 199 cisa 197 odrnicowanie tkanek 282 odwrotna transkrypcja 225, 271*, 277*, 420* mRNA 278 - transkryptaza 159,171, 276-278, 382-384, 392, 394 odwrcone powtrzenia 272 oksydaza glukozy 443, 471 nadtlenkowa 467 oktopiny 457 olej krotonowy 386 onkogen(y) (v-onc) 191, 395, 396 - bcl-2 402, 403 myc 406 - ras 406 retrowirusw 233 v-scr 394 onkogeneza 468 oocyt 283, 286, 296, 315, 316, 446, 469 oogeneza 313, 314 Oparin A. 413 teoria 414 operon(y) 439, - ara 208 biosyntezy cysteiny 194 - biosyntezy tryptofanu 205207, 220*, 445, fermentacji arabinozy 194 fermentacji melibiozy 194 - gal 208, 273 - glnALG 212 kataboliczne 209
laktozowy 201-205, 208, 256

, formowanie 127* , pozycjonowanie 51, 53 - , rdze 119-121, 129* S. cerevisiae 122 numeratory 310 Ochoa S. 135

- m/212-214 - ntr 210 trp, p. operon biosyntezy tryptofanu opiny 457 organelle komrkowe 423 organizmy transgeniczne 279, 439, 456 Orgel L. 434, 435 oriH 73, 74 ori wirusw Papova 85 origin recognition complex (ORC) (ang.), p. kompleks ORC

origin recognition element (ang.), p. sekwencje ORE orzski 281, 415 , odstpstwa od uniwersalnoci kodu 418,419 osobniki aneuploidalne 314 - transgeniczne 312 osteosarkoma (osteosarcoma), p. kostniakomisak - faga A 167*, 168 - wirusa HIV 382, 283* otwarte okna" chromatyny, p. chromatyna, miejsca nadwraliwe na nukleazy ovotestis 321 owady 283 Oxytricha nova 107, 422* packing ratio (ang.), p. wspczynnik upakowania pair-rule genes (ang.). 298 palce cynkowe 233*, 302, 307, 318 pami immunologiczna 332, 381 papaina 227* papilloma (ang.), p. brodawczak paradoks zawartoci DNA 432 paradygmat biologii molekularnej 146 Paramecium 82, 107, 419* paramyksowirus 241 parasegment(y) 297-300 partenogeneza 286 pary typu Hoogsteena 4244 - Watsona-Cricka 4244 pasoyty jelitowe 380 - skry 380 patenty 453 PCR p. reakcja acuchowa polimerazy penicylina 273 permeaza /?-galaktozydw, p. /?-galaktozydopermeaza pestycydy 464 petunia 459, 460, 465 Photobacter leiognathi 436 Physarum 107, 228, 241 - polycephalum 148 Pichia pastoris 443 pili 457 - pciowe 31 piercienice 285, 303, 307 pierwotne komrki zarodkowe (ES) 465 pikornawirusy 113 Pisum sativum 63* plazmid(y) 27, 30, 36, 65, 157, 161, 273 - pArA4a 459 - pBR322 79, 163, 446*, 447*, 458

- , mapa restrykcyjna 165 - ColEl 66, 73 163 - drody 87 2fi 36

- F68*
, formy 163* - pMA56 446* - pMS02 162*, 163* - pRK2 459 - pTiB6S3 458 - pUC 162, 163 - pVSl 459 - Ri 457 - Ti 457, 459 plazmina 454, 455 plazminogen 454, 455 plsawica Huntingtona 453 pazy 283 pe somatyczna 309, 312, 313 pytki krwi 454* podwzgrze 373* podzia komrkowy niesymetryczny 293 - symetryczny 292 pokolenie Fi 16, 17*, 36, 381 - F 2 16, 36 pokrzywka 328 poliadenylacja 243 245, 349, 378, 379 poliaminy 113 policistron 201 polilinker 163, 165, 166, 168, 169, 443, 458* poli-L-ornityna 460 polimeraza(y) DNA 60, 65, 66, 81, 82, 89, 9 0 - 9 9 , 352 - bakteryjne 90* I 73, 76, 79, 80, 90*, 9 1 - 9 2 , 174, 180*, 195*, 253*, 255, 258, 264, 267, 268 II 90*, 9 2 - 9 3 III 73, 80, 90*, 93*-97, 252, 258, 267, - eukariotyczne 9799 ( X 86, 97, 99, 102, 406 98, 100* 3 97, 99, 100, 102 97, 99, 102 y 74, 98 - termostabilna 182, 183* - zalena od RNA, p. odwrotna transkryptaza polimeraza(y) RNA 44, 66*, 76, 116, 117, 129, 155, 204*, 215, 218, 223, 419 eukariotyczne I 226, 227, 228, 230, II 226, 227, 230, 231, 243 III 226, 227, 2 2 8 - 2 3 0 - czowieka 433

polimeraza(y) RNA eukariotyczne owadw 415 - poliA 244 - prokariotyczna 192, 193196 podjednostki 193-195* faga T3 195 faga 77 195 polimorfizm miejsc restrykcyjnych (RFLP) 435 restrykcyjny 448, 449, 452 polipowato jelita grubego 406 polisacharydy pneumokokw 376 politenizacja 283 poliubikwityna 247 polymerase stuttering (ang.) 241 pory jdrowe 127 polizg polimerazy DNA III 254 praorganizm, p. progenota prawa Mendla, p. Mendel prawo czystoci gamet, p. Mendel niezalenej segregacji cech, p. Mendel prebiaka 443 predyspozycje genetyczne 388, 390 pre-rRNA 228, 239 presja selekcyjna 442 prezentacja antygenu 355, 356, 360, 363, 366, 375, 376, 445 primaza 64, 69, 7 5 * - 7 8 , 85, 90 - DnaG 70 eukariotyczna 97, 100* primosom 64, 76, 77*, 79*, 102 - , biaka 70 primosome assembly site (ang.) 78 proces nowotworowy 386 , indukcja 386, 389, 411 , promocja 386, 411 , progresja 386, 387, 411 zapalny 373* prochloroplasty 425 proeukariont 425 profag 34, 269, 270* profaza mejotyczn 23, 314, 316 proflawina 260 progenota 412, 414, 419, 420*, 425*, 430, 437 progresja, p. proces nowotworowy projekt sekwencjonowania i mapowania genomu czowieka 169 Prokaryota 192, 439 , ewolucja 420* proliferacja komrek 398, 399 proliferating celi nuclear antigen (ang.), p. biako PCNA promieniowanie jonizujce 257 - rentgenowskie (X) 251, 391

ultrafioletowe (UV) 34, 56, 199, 257, 258, 282, 391 promiscuous DNA, p. D N A swobodny promitochondria 425 promotor(y) eukariotyczne 87, 229*, 445 - genw chloroplastowych 423 - prokariotyczne 67, 186, 193-195, 196-198, 200, 209, 423 prostaglandyny 373* proteaza 277, 278 - serynowa 454 - , rodzina 427 proteoliza 440 proteosom 247 protoonkogen(y) (c-onc) 246, 395, 396, 411 , aktywacja 396 - c-abl 399 - c-myc 396, 468 - c-raf 398 - c-ras 406, 468 - c-src 399 , przeksztacanie w onkogeny 396 protoplasty 459461 protoplastyzacja 172 prototoksyna Bacillus thuringiensis 463 protrombina 454* prowirus 170, 171, 276, 278, 382, 384*, 392, 393*-395 przeciwciaa (p. te immunoglobuliny) 323, 324*, 325*, 366 , dojrzewanie powinowactwa 332 , domeny 347 klasy 327* , mechanizmy wytwarzania 330 - membranowe 380
- monoklonalne 336, 342-343, 441, 450, 455

- , wytwarzanie 343* - , struktura 336, 337*, 380 - , rejony nadzmienne 337*, 347, 352, 380 - , rejony zmienne 337*, 340, 344, 380 - transgeniczne 381 - wczesne 327 , wizanie determinant antygenowych 325* - wtrne 379, 380 - , wydzielanie 376, 380 przedjdrze 287, 288, 465, 467 przegrupowania wewntrzgenowe 440 przeczanie izotypw 360, 379 przerywniki 196*, 431, 434 przerzuty 386-388, 4 0 7 - 4 1 0 przestrze peryplazmatyczna 442 przesuwanie rozgazienia 264 przeszczepy, odrzucanie 364, 365

pseudogeny 146, 365, 421, 434, y-aktyny 433 globinowe 433 5S rRNA 431 Pseudomonas 442, 459 syringae 199 testosteroni 422* PSTV, p. wiroid PSTV pszenica 143 ptaki 286 Ptashne 234 pufy 284 rak genomw 435 rak(i) 389, 452 gruczou krokowego 452 jajnika 404 jelita grubego 404 koci 290 nerek 404, 407 odbytu 406 okrnicy 404, 406 pcherza 404 puc 404, 406, 407, 450, 452 skry 259, 386 sutka 390, 403-406, 450 szyjki macicy 389 trzustki 452 wtroby 389 ramka odczytu 146 otwarta 147, 148, 181, 190, 312, 320 - , zmiana 95, 251, 260, 349, 351, 359 reakcja acuchowa polimerazy (PCR) 182, 183, 190, 429, 448 reakcja SOS 249* transestryflkacji, p. redagowanie, modele rearanacje chromosomw 410 receptor(y) CD4 356, 363, 369, 371*, 382, 283 CD8 356, 363, 369, 371* czynnikw wzrostu 398 glukokortykoidw 53 lipoproteiny niskiej gstoci 428 TCR 333, 336, 355-364, 366, 370, 371, 374, 382 , budowa 356*, 357 , organizacja genw 357*, 358 , rda rnorodnoci 358 360 tyroksyny 400 redagowanie transkryptw 146148, 240 243 , modele 242, 243 region pseudoautosomowy 316, 317*, 319 regiony regulatorowe 300* regulacja autokrynna wzrostu 403

azotowa 210-215 katabolizmu galaktozy 234 negatywna, p. kontrola negatywna podziaw komrkowych 400 rozwoju ssakw 280 regulator pozytywny 207 regulon cAMP-CAP 210 ntr 212 stresu cieplnego 198 reguy Watsona-Cricka 136, 140 rekombinacja 25, 249, 250, 261, 351 homologiczna (uprawniona) 172,

249,

261-263, 272, 274*, 275, 278, 305, 447,

458, 467 in vitro 438, 440 , jednostki 22 nieuprawniona 272 somatyczna genw immunoglobulin, p. immunoglobuliny, geny , udzia w reperacji 267, 268 u rolin 464, 465 wewntrzgenowa 25, 27 wzajemna 274* zlokalizowana 269 rekombinazy 350*, 351, 358 reperacja przez rekombinacj 267, 268 przez wycinanie 253, 255, 258, 259, 265, 267 - , system SOS 268, 269 replikacja DNA 25, 55, 58 adenowirusa 82 asymetryczna 66 , biaka inicjatorowe 61 ,wspomagajce 101 105 , elongacja 89 - , inicjacja 62, 65, 66, 68*, 131 ,eukariotyczna 84*, 88 , faga X 7 1 - 7 3 , mitochondrialny DNA 65, 66 , model obracajcego si koa 65, 66* , model przemieszczajcej si ptli (typ <9) 65, 66* , model Watsona i Cricka 60 , mutanty 66, 67 origin" 61, 62*, 6 5 - 6 7 , 109 plazmidu ColEl 66 , startery 82 - , terminacja 62*, 65, 105-109 replikacja wirusa Polio 84 wirusa SV40 84 replikaza(y) DNA 90, 91, 97, 417, 419 replikon(y) 62, 459 liniowe 81, 84 , wielko 63

replisom 64, 90, 99, 100 represja 200, 201 - glukozowa, p. represja kataboliczna - kataboliczna 207 - 210 - operonu biosyntezy tryptofanu 205 207 represor 5 1 - 5 3 , 207, 284, 434 - laktozowy (Lac) 118, 202-204 - LexA 268 - tryptofanowy 52, 205 - k 54 resolucja 276 - , odcinek 273* resolwaza 57, 273, 275 restrykcja cytolityczna 361 restryktazy, p. enzymy restrykcyjne retardation assay (ang.), p. -test spowolnienia migracji w elu retikulum endoplazmatyczne (siateczka rdplazmatyczna) 376 retinoblastoma, p. siatkwczak oka retinoidy 387 retropseudogeny 433 retrotranspozon(y) 271*, 276, 433 - dal 279 - copia 271*, 278 - TAP 279 - Ty 271*, 278, 279 retrotranspozycja 433 retrowirusy 169, 245, 276-278, 382, 389, 391, 392 - , cykl yciowy 392, 393* - HTLVI, HTLVII, HIV 171 - , integracja DNA 277* , jako wektory 443, 451, 452 - onkogenne 394 rewersja ekstragenowa 151 rewertaza, p. odwrotna transkryptaza rhabdosarcoma 290 Rhizobiaceae 457 Rhizobium 212, 424, 457 ribosome binding site (ang.), p. miejsce rbs RNA 119, 414 - I i II 73 - antysensowny 224, 294, 463 - eukariotyczny 141 , funkcje biologiczne 415* , katalityczne 415 - hn 235, 237 , mRNA 134,415* , , obrbka 168 , , okres ptrwania 246 , pre mRNA 146, 147 , , redagowanie 146, 147148

- , - , skadanie 349, 359*, 377*-379* - , - snRNA 228, 230, 237, 244, 415 , , stabilno 246 - , - starterowy 64, 69, 70, 92, 97, 107 , rRNA 25, 141, 142-143, 228, 415*, 421, 422 , , organizacja genw 228* - , tRNA 25, 136, 149-155 , , aminoacylacja 150 , , dojrzewanie 149 , eukariotyczny 227 , izoakceptorowy 136, 145 -, ptle 149 , , ramiona 149, 152 , , struktura trzeciorzdowa 149 , supresorowy 151, 152 RNaza 277, 278 H 73, 74, 92 P 415 rodniki hydroksylowe 40, 41* rodzina(y) Alu 433 genw 346 LiFraumeni 405 wielogenowe 430432 rogowacenie biae luzwek 387 roliny, odrnicowanie tkanek 282 , poliadenylacja 243
transgeniczne 457465, 472

, oporno na choroby wirusowe 463 , oporno na owady 463, 464 , przykady 462 , tolerancja na herbicydy 462 rozbicie genu 184 rozedma puc 452 rozrost, p. hiperplazja rozwj mozaikowy 285 rnicowanie 280, 281 komrkowe 402 Rubella 474 ruchome elementy, p. transpozony rybonukleaza 215 rybonukleoproteiny (RNP) 418 rybosomy 136, 153 - , biaka 143, 144 chloroplastowe 423, 424 eukariotyczne 141 - , podjednostki 137, 140 prokariotyczne 423, 424 - , struktura 141, 142 rybosomowa syntetaza peptydylo-tRNA 138 rybozylacja histonw 118 rybozymy 415, 416, 418, 429 ryby transgeniczne 469, 470

ryfampicyna 196 rzodkiewnik, p. Arabidopsis Saccharomyces cerevisiae 36, 63, 419*, 422, 429, 442, 443, 445, 471 , biaka rybosomalne 144* , introny 433 , nukleosomy 122 , poliadenylacja 242 , rRNA mitochondrialny 142 , sekwencjonowanie 181 , telomery 107 Salmonella typhimurium, asymilacja NH 3 199, 210 , biosynteza histydyny 24* , test Amesa 260 Sanger F. 203, 420 Sapienza C. 434 Schimmel 152 Schizosaccharomyces pombe 320, 442 SCID, p. niedobr immunologiczny ciki zoony sekrecja biaek 443 sekwencja(e) Alu 433, 434 antysensowne 462 ARS 87, 88* cos 165, 167*, 168 CpG 285 DUE 84 enhancer owe (p. te enhancery) 85 insercyjne (IS) 272, 273 intronowe 168 kanoniczna 196, 209 LTR 171, 382, 383*, 392-394, 396 najwyszej zgodnoci 196 ORE 84 ori 161, 168 osabiajce transkrypcj p. silencery palindromowa 131, 160, 204-206, 208, 212*, 216 Pax 302 powtarzajce si 432, 457, 465 Pribnowa 196 promotorowe 131 przerywnikowe p. przerywniki regulatorowe 299 res 276 ShineDalgarno 455 stykowe intronegzon 182 TATA 49, 230, 231*, 235, 254 TATAAT, p. sekwencja Pribnowa telomerowe, p. telomery ter 105

UAS 235 uniwersalne rRNA 143 wspomagajce 84*, 85 wica IHF 214 wice biaka 181 182 sekwencjonowanie DNA 168, 178, 203, 420, 435 genomu czowieka 421 genomu drody 421 , metoda Maxama i Gilberta 178 , metoda Sangera 179, 180 selekcja klonalna w produkcji przeciwcia 330, 331, 336, 349, 378 wewntrzgenomowa 434 selfish DNA (ang.), p. DNA samolubny senescence genes (ang.), p. geny kontrolujce liczb podziaw komrek Serratia 442 seryna 82 siatkwczak oka 390, 403-406, 468 silencer(y) (sekwencje osabiajce transkrypcj) 131, 232, 354*, 355 single strand binding proteins (ang.), p. biaka SSB sklerotom 303 skadanie genw 415 RNA 236 transkryptu 227 skoki po chromosomie 188 skorupiaki 281, 283 skrzep krwi 454*, 455 soja 463, 465 solenoid 124, 128 sonda molekularna 174, 178, 188, 190, 448, 452, 473 , cDNA 294 , hybrydyzacja 303 transpozonowa 279 SOS, p. reakcja SOS, reperacja SOS i system SOS Southern E. 174 southern, p. hybrydyzacja spacers (ang.), p. przerywniki spaghetti-like model (ang.) 125 spektynomycyna 458 spermatogeneza 313 316 spermatogonia 315 spirochety 425* spliceosom 237, 239*, 240*, 415 splicing (ang.), p. skadanie RNA alternatywny 240, 245 sporulacja 198 sprzenie midzy genami 33

sprzenie zwrotne dodatnie 203, 301 ujemne 206 ssaki 243, 286, 308, 419* stacking (ang.) 45 stany przedrakowe 386 Staphylococcus aureus 474 starter(y) 182, 183* stawonogi 285 Streptococcus 454, 474 streptokinaza 443, 454 streptolydigina 194 Streptomyces 442 streptomycyna 152, 153, 458 stres cieplny, p. szok cieplny Struhl K. 234 struktura cap 141 heliks-skrt-heliks 301, 355, 400 licia koniczyny 149 palindromowa 86 szpilki do wosw" 64, 75, 76, 78, 82, 108, 141, 216, 217*, 221, 223* strunowce 303 Styela 285 Stylonychia 107 mytilus 133 substytucje nukleotydowe 421, 423, 435 Sulfolobus sulfataricus 422* sulfometylomocznik 462 superheliks DNA 54, 56, 57, 104, 111, 114*, 115, 197 dodatni 114, 129 lewoskrtny 50, 68 , liczba oplece (Lk) 57, 58 - , - skrtw (Tw) 5 6 - 5 8 - , - zwojw (Wr) 56, 58 , relaksowanie 105 , skrty ujemne 115*, 116 ujemny 114, 129 superowulacja 466 supresja 218, 349 fenotypowa 152 supresor 190 nowotworw 290 suwaki leucynowe 233, 234*, 400, 408 symbionty 423 syndrom SCID 351 syntaza glutaminianu 211 syntetaza aminoacylo-tRNA 149, 151, 155 antranilowa 220* glutaminy 211-213* indologlicerofosforanu 220 tryptofanowa 220 tymidylanowa 225

system dopeniacza 327, 328, 340 , geny 365*, 370 MAT 302 Nif 212 regulacyjny Cer 210 SOS (p. te reakcja SOS i reperacja SOS) 268, 269 szczepionka 444 448 poliwalencyjna 446, 447 przeciw HIV 384 przeciw wirusowemu zapaleniu wtroby 445-448 _ _ _ _ _ rekombinacyjna 442 przeciw wcieklinie 474 szkarupnie 283 szok chemiczny 198 cieplny 198, 199 Szostak J. 416 szpiczak 336, 344, 345*, 355 szpik kostny 293, 324, 328, 342, 353, 370, 373*, 374 sztuczny chromosom drodowy (YAC) 169, 453 mieci molekularne 434 winie transgeniczne 456 talasemia 449, 468 tandem repeats (ang.) 431 tarcza imaginalna 301 Tarkowski A.K. 286 TATA box (ang.), p. sekwencja TATA TBP (ang. TATA binding protein) 231 technika PCR, p. reakcja acuchowa polimerazy odcisk stopy" 181
telomer(y) 82, 106-109, 126, 169, 365

, funkcje 107 telomeraza 107-109*, 126, 415* terapia chorb 441 ex vivo 452 genowa, somatyczna 171, 439, 450453 terminalna urydylotransferaza 242 terminalne powtrzenia < 5 278 terminator(y) transkrypcji 215, 216, 220, 223 operonw 216 , struktura 217* wewntrzgenowe 216, 218, 219 termoacidofile 422*, 425* test(y) Amesa 260 diagnostyczne, molekularne 448 450 Guthriego 448 komplementacji 203, 204

test(y) na alleliczno (na komplementacj) 26, 27 rewersji fenotypu nowotworowego 392 spowolnienia migracji w elu 182 testosteron 315, 321 tetracyklina 273 Tetrahymena 107, 228, 415 thermophila 122, 236 tpe koce 159*, 160 Thermoproteus tenax 422* tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) 449, 454, 455, 469 TNF, p. cytokiny toksyna(y) biakowe 450 cholery 448 dyfterytu 448 tca 448 topnienie DNA 193 topoizomeraza(y) 41, 56, 89, 103-105, 127, 131 I 116, 117, 197 II 125 NFII 83* torebka pcherzykw jajnikowych 315*, 316 Toxoplasma 474 t-PA, p. tkankowy aktywator plazminogenu trans", p. ukad trans transacetylaza galaktozydowa 201
transdukcja 29, 3 3 - 3 5 , 157, 263, 396

- , atenuacja 205, 216, 2 2 0 - 2 2 2

, elongacja 193, 195* - , inicjacja 49, 52, 193-195*, 197, 207, 216, 222 - ,poronna 193 , preinicjacja 53 - prokariotyczna 192, 197 , represory 44, 117 , sekwencje promotorowe 65 - , terminacja 131, 193, 215, 216, 221, 244
translacja 134, 137141

- bakteryjna 138*, 139* , czsto bdw 154, 155 , dwuznaczno 152155 - eukariotyczna 141 , inicjacja 141, 205, 207, 345 translokacja(e) 20, 318, 396, 400, 403, 410 - chromosomowe 288, 290 transmisja sygnau mitogennego 398, 401*, 407 transpozaza 271-273*, 279
transpozon(y) 23, 250, 2 7 0 - 2 7 6 , 434

oglna 32* ograniczona 33, 34*, 35 transfekcja 170*, 172, 406, 447*, 451, 452 rolin 4 6 0 - 4 6 2 transfer koniugacyjny plazmidu 457 transferaza deoksyrybonukleotydowa 352 izopentylu 457 peptydy Iowa 415 transformacja 157 bakteryjna 23, 29, 33, 163, 172, 263 drody 168 nowotworowa 342, 389, 390, 395, 406, 408, 410 rolin 458 transgen(y) 349, 456, 462, 467 , poziom ekspresji 467 transgenizacja 169 zwierzt hodowlanych 468470 transgenom 172 transient expression (ang.), p. przejciowa ekspresja transkoniuganty 458 transkrypcja 55, 58, 65 , aktywatory 44, 82 , antyterminacja 220, 222224

- bakteryjne 2 7 2 - 2 7 6 - typu Tn 2 7 3 - 2 7 6 transpozycja 250, 251, 256, 271, 274 - replikatywna 276 transwersja 251*, 252 treonina 82 trinitrofenol 325 trofoblast 286, 287 trombina 427, 454* tromboliza 454* Trypanosoma 50 - brucei 148, 422* - , redagowanie RNA 148, 240*, 241 , rRNA mitochondrialny 142 , telomery 107 tryplet, p. kodon Tschermak W. 19 /?-tubulina 246 TUTaza, p. terminalna urydylotransferaza twintron (ang.), p. intron bliniaczy tymina 38*, 42, 49 tymiwirusy 113 tymocyty 370 tymozyna 82 tyto 4 5 9 - 4 6 1 , 465 ubikwitynacja histonw 118, 246 ukad limfatyczny 335 - cis 26, 27, 204, 213, 224 - trans 26, 27, 203, 204, 213 unikatowe sekwencje rRNA 473 urokinaza wini 427, 454

urydylotransferaza 211 ustalanie ojcostwa 183 utrata heterozygotycznoci 404 Varmus H.E.. 395 de Vries H. 19 Vicia faba 63* VLP 278 Watson J.D. 23, 59, 60 Weiner 417 wektor(y) 36, 157, 158, 161, 440, 442, 443, 451 bakteryjne 161 165 bifunkcjonalny 168 binarny 457, 458 drodowe 168, 169 ekspresyjne 165 kointegracyjne 457, 458* plazmidowe 161 165 pochodne bakteriofagw 165168, 189*, 190 pomocniczy 457, 458 poredni 458 retro wirusowy 170*, 171 sekrecyjny 440 wahadowe 442, 445 wyszych eukariontw 169 171 zrekombinowany 165 wdrwka po chromosomie 188 wze zarodkowy 286 White J. 55 wizanie fosfodiestrowe 37, 38* peptydowe 138*, 139, 149 wideki replikacyjne 60-62*, 69*, 8 7 - 8 9 , 103, 104 , formy 65, 66* , ni opniona i prowadzca 61 , przemieszczanie si biaek SSB 102 , schemat budowy 100 Wilson A. 435 wirion 382, 384*, 392, 447* wiroid PSTV 111 wirus(y) bakteryjne, p. bakteriofagi biaaczki limfocytw T (TLV1) 388-390 Epsteina-Barr 388-390, 474 grupy brodawczakw 388 390, 450 HIV 333, 382-384, 450, karowatoci orzeszkw ziemnych (PSV) 463 krowianki 169, 446, 447, 451 misaka Rousa (RSV) 394 MMTV 131

mozaiki kalafiora 169, 243 lucerny (AIMV) 463 tytoniu (TMV) 112,463 onkogenne (transformujce) 389, 390, 394, 495* opryszczki 389, 451 paeczko wate 112 papilioma 169 Papova 85 polio 451 PSTV 111 sferyczne 112, 113 SV40 84, 85*, 123, 169, 405 wspomagajce 394 X i Y ziemniaka (PVX, PVY) 463 -zapalenia wtroby HBV 388-390, 445, 450 wkno chromatynowe, p. chromatyna wobble hypothesis (ang.), p. hipoteza tolerancji workowce 265 wraliwo na UV 249 wspczynnik upakowania 127, 128 wyczenie alleliczne 349, 358, 364, 381 wzmacniacz (p. te enhancer) 354, 355 Xenopus 284, 302 laems 53, 63*, 127, 422* xeroderma pigmentosum 259, 390 X-gal 163, 173 YAC, p. sztuczny chromosom drodowy Ya-Ming Hou 152 Yanofsky Ch. 221 Yarroma lipolytica 443 yeast artificial chromosome, p. sztuczny chromosom drodowy zapalenie wtroby typu B 445 zapodnienie in vitro 469 zarodek 298 androgenetyczny 287 gynogenetyczny 287 ssaka 288 zasady azotowe 37, 38* zawa minia sercowego 454 Zea mays 422* zegar molekularny 421, 435 zesp Alzheimera 453, 468 chorobowy PradelWilliego 290 feminizujcych jder 321 Klinefeltera 314 Lescha Nyhana 452, 468 Li-Fraumeni 390, 468

zesp niedoboru odpornoci 452 Turnera 314 Waardenberga 467 ziemniak 464 zinc fingers (ang.), p. palce cynkowe zcza intron-egzon 237, 239* zmiana ramki odczytu, p. ramka odczytu zmiany premutacyjne 250 zmienno antygenowa 384

zrakowacenie komrki, p. transformacja tworowa zwizki fluoryzujce 174 zwielokrotnienia zawartoci DNA 283 zwierzta transgeniczne 451, 465470 Zymomonas 442 aba 281, 282, 303 achwy 285