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Laboratorio de Bioqumica Reporte de la Prctica #1 PROPIEDADES QUIMICAS E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS 2 semestre Q.F.

B PROPIEDADES QUIMICAS E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS OBJETIVO El propsito de esta prctica es identificar algunos aminocidos que presentan grupos caractersticos en las cadenas laterales utilizando ensayos cualitativos y especficos para cada funcin , as como la explicacin de los fundamentos de las reacciones que se van a efectuar. INTRODUCCIN El carcter nico de cada a aminocido se debe a la estructura del grupo R. En los poli pptidos los grupos R de los aminocidos a menudo se denominan cadenas laterales y pueden variar desde un tomo de hidrgeno, hasta estructuras complejas como el grupo guanidina. Los aminocidos se pueden clasificar segn diversos criterios. Con fines analticos, y limitndonos a los grupos representativos que se tratan en esta prctica, distinguiremos: Aminocidos con un anillo fenlico: Fenilalanina y tirosina. Aminocido que contienen azufre:Cistina, Cistena, Metionina. Aminocido con un grupo guanidnico: Arginina, creatina Aminocidos derivados del indol: Triptfano. Debe verificarse la identificacin haciendo uso de la cromatografa de aminocidos es la ninhidrina, que da color con todos los aminocidos y el color sirve de indicador sobre el aminocido presente (as la prolina e hidroxiprolina dan color amarillo, la asparagina da color caf y los dems dan tonos azul violeta). La reaccin de Ehrlich, que se efecta tambin en esta prctica, es positiva para la histidina y tirosina, aminocido que no pertenecen a un mismo grupo qumico. FUNDAMENTO TERICO Los aminocidos tienen un papel primordial en la formacin de los seres vivos, puesto que constituyen los bloques fundamentales con que se forman las protenas. Entre las principales reacciones de identificacin de los aminocidos se encuentran las siguientes: Reaccin con la ninhidrina

El grupo alfa-amino de los aminocidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayora de los aminocidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y caf para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reaccin tambin identifica los grupos alfa-amino libres presentes en pptidos y protenas. Reaccin de Milln El anillo fenlico tiene un comportamiento caracterstico frente a las sales de Mercurio a pH cido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenlico de la tirosina y las protenas que la contienen. Reaccin Xantoprotica Los anillos aromticos presentes en algunos aminocidos reaccionan con cido ntrico concentrado formando nitroderivados de color amarillo o anaranjado por lo cual esta reaccin permite reconocer la presencia de Tirosina, Fenilalanina y Triptfano. Reaccin de Sakaguchi El grupo guanidinio presente en la cadena lateral de la Arginina reacciona con soluciones de alfanaftol en presencia de Bromo en medio alcalino formando complejos coloreados rosados o rojos. Reaccin de Ehrlich La presencia de anillos aromticos fenlicos o nitrogenados en la cadena lateral de los aminocidos se puede identificar mediante la reaccin con cido sulfanlico y nitrito de Sodio por formacin de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo as detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando pptidos y protenas. Reaccin de Hopkins Cole El anillo indlico presente en la cadena lateral de los alfa-aminocidos libres o haciendo parte de pptidos y protenas se puede reconocer mediante reaccin con el cido glioxlico a pH cido, puesto que forma complejos de coloracin violeta o amarillo violeta, permitiendo as identificar al triptfano. Reaccin de Sullivan o de aminocidos Azufrados Los Aminocidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formacin de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman

cuando reacciona con acetato de Plomo en medio alcalino.

MATERIALES Y REACTIVOS Las soluciones estn propuestas para cada grupo de trabajo en el laboratorio, por ejemplo 10 ml de ninhidrina para un grupo, si el curso es de 4 grupos se requieren mximo 40 ml de ninhidrina. Materiales 40 Tubos de ensayo de 5ml Pipeta automatica de 1000 microlitros Pipeta automatica de 200 microlitros Puntillas azules Puntillas amarillas 2 Pipetas graduadas de 1 ml. 2 Pipetas graduadas de 2 ml. 2 Pipetas graduadas de 5 ml. 2 Vasos de precipitados de 250 ml. 1 Vasos de precipitados de 600 ml. 1 Embudo de filtracin 1 Erlenmeyer de 125 ml. 1 Gradilla para tubo de ensayo 1 Pinza metlica para tubo de ensayo Mechero Bunsen Placa refractaria REACTIVOS Reactivos por cada grupo de trabajo: 10 ml de cido sulfrico concentrado 12 ml de cido ntrico concentrado 10 ml de cido actico concentrado Se requiere la preparacin de los siguientes reactivos: 10 ml de Reactivo de ninhidrina: disolver 100 mg. de ninhidrina en 10 ml. de etanol a 95% y completar a 100 ml con agua destilada 10 ml de Reactivo de Millon: .disolver 1 g de mercurio en 1 ml. De cido ntrico concentrado, calentar suavemente, dejar enfriar y completar a 60 ml con agua 5 ml de Reactivo de Sakaguchi: cuidadosamente disolver 2 g. De bromo en 100 ml. De NaOH al 5% (realizarlo en campana de extraccin de gases muy toxico) 10 ml de Reactivo de Hopkins cole: cido actico impurificado con trazas de cido

glioxlico Soluciones 30 ml de Hidrxido de sodio 40%. 20 ml de Hidrxido de sodio 10 %. 10 ml de Hidrxido de amonio 10% 20 ml de cido clorhdrico 2%. 20 ml de Acetato de plomo 10%. 20 ml de Sulfato de cobre 0.5%. 10 ml de Nitrito de sodio 0.5% (fresco). 10 ml de cido sulfanlico 0.5% en HCl. 50 ml de Alfa-naftol 0.15%. 15 ml de Soluciones al 0.1% en agua acidulada (Agua acidulada con 1,5 mL de HNO3 concentrado ultra puro por cada litro de agua ultra pura) de los siguientes aminocidos Cistena metionina. Glutamina asparragina. Lisina ornitina. Tirosina. Fenil-alanina. Prolina. Arginina. Histidina. Triptfano. Alanina. Albmina de huevo: separar la clara de un huevo y diluir en relacin 1: 10 con agua destilada (al momento de la prctica) Harina de trigo: dispersar 10 g. de harina de trigo en 100 ml. de agua caliente y filtrar a travs de gasa doble (al momento de la practica) No olvide pedir al profesor la muestra problema que va a analizar Para prevenir la contaminacin de los reactivos: las soluciones que no estn en frasco gotero deben tener una pipeta exclusiva y el equipo encargado de preparar los reactivos debe estar pendiente, que las pipetas no sean intercambiadas durante al prctica CUESTIONARIO 1. Escriba la reaccin completa que se realiza entre un alfa-aminocido y la ninhidrina. La reaccin ocurre en dos pasos. Durante la primera reaccin, se consumen dos equivalentes de Ninhidrina por cada aminocido. En el primer paso de la reaccin el aminocido se oxida, descarboxilndose y liberando amoniaco, mientras que uno de los equivalentes de Ninhidrina se reduce a Hidrindantina En el segundo paso la Hidrindantina formada y otro equivalente de Ninhidrina, reaccionan con el amoniaco, todos los aminoacidos forman un complejo de color prpura (Prpura de Ruhemann), excepto la Prolina que produce un compuesto color amarillo.

2. Consulte la reaccin mediante la cual se puede preparar cido glioxilico (reactivo de Hopkins-Cole) a partir de cido oxlico. Es una solucin del aldehdo( HOOC- HC=O)del cido oxlico(HOOC-COOH )que queda estabilizado despus de la oxidacin del magnesio, en medio cido, por ejemplo cido actico(CH3COOH). Sirve para identificar el Triptfano y las proteinas que lo contienen. Resulta que da positivo cuando se forma en el tubo de ensayo un anillo rojo -violeta( color del alfa-iminoglioaxil-beta-indolproponico ). REACCIONES INVOLUCRADAS: Mg + 2CH3COOH --> Mg(CH3COO)2 + 2H(+) + 2e(-): Semireaccin de Oxidacin del Mg. HOOC-COOH + 2H(+) + 2e(-) --> HOOC- HC=O + H2O Semireaccin de Reduccin del c. oxlico ---------------------------------------- Mg + HOOC-COOH + 2CH3COOH ----> Mg(CH3COO)2 + HOOC- HC=O + H2O PREPARACIN DEL REACTIVO DE HOPKINS COLE : Colocar 10 gr de magnesio en polvo en un matraz erlenmeyer de 1 lt, agregue unos 200ml de agua destilada , 10ml de cido actico glacial y agitar a manera de remolino. Tenga a la mano,preparada una solucin fra de cido oxlico 45 g en 400 ml de agua y poco a poco agitando y enfriando externamente el erlenmeyer con el magnesio y cido actico, dentro de un recipiente mayor con agua, agregar la solucin del cido oxlico, sobre el magnesio. 3. Escriba las frmulas de los aminocidos identificados en su problema. 4. Como se realiza la reaccin de Sullivan para identificacin de la Cys. 5. Escriba las estructuras de los aminocidos que analiz en cada prueba e identifique el grupo que estaba reaccionando o el responsable de la coloracin positiva del ensayo. OBSERVACIONES Durante la Practica #1 notamos que 2 de las pruebas de identificacin de aminocidos no podran llevarse acabo por falta de reactivos las cuales fueron la reaccin de SAKAGUCHI y la de HOPKINS COLE. Reaccin de Ninhidrina. Se colocaron solo 4 de los 5 tubos de los cuales fueron Alanina, albumina de huevo, protena de trigo, y el blanco a cada uno se les agrego un mililitro de Ninhidrina y se llevo a calentar al retirarlos vimos un cambio de coloracin en el tubo de la albumina de huevo el cual cambio a color azul-violeta que nos indica que es un aminocido alfa. Reaccin de Milln

En la prueba de Milln se rotularon solo 5 tubos los cuales fueron fenilalanina , la tirosina, albumina de hueva, protena de trigo y el blanco. En esta observamos que el cambio de coloracin despus de colocar 1ml. De reactivo de milln y de haber calentado los tubos en la tirosina que tomo un color entre rojiso-rosado lo cual nos indica y presencia del mercurio en la tirosina. Reaccin Xantoprotico. Fue igual que en el ensayo de milln solo que en esta ocasin agregamos 2ml. De acido ntrico concentrado y se calentaron hasta ver cambio de coloracin y a amarillo que indica la presencia de aminocidos de la seria de aromticos, en este caso la tirosina fue muy particular ya que solo tomaba color amarillo al momento de colocar el Hidrxido de Sodio al 40% para despus regresar a la normalidad despus la albumina de huevo demostr contener aminocidos del tipo aromtico y la protena de trigo mostro el cambio naranja hasta el final. Reaccin de Ehlrich Rotulamos 4 de los 5 tubos de ensaye: blanco, triptfano, albumina de huevo, harina de trigo. Le agregamos a cada uno 1ml, de 1 mL de cido sulfanilico 0.5% y 1 ml, despus lo dejamos reposar por 15 minutos, y al final le agregamos 1ml,de la solucin que le corresponda en cada tubo de ensaye. Mezclamos y a cada tubo le agregamos 0.5 ml. de NH4OH 10%. Observamos que casi todas presentaron un color amarillo, y anaranjado.

Reaccin de Sullivan o de aminocidos Azufrados En cuatro tubos de ensaye: agua destilada, protena de trigo, albumina de huevo y cistena, agregamos 2ml, de cada solucin correspondiente. Despus agregamos 2 mL. de NaOH 10% y 0.5 mL. de acetato de Plomo al 10%. Lo calentamos por 5 minutos en bao maria, y observamos que la albumina presento un color poco gris y esto nos indica que presenta aminocidos de azufrato . Conclusiones En la prueba#1 la Albumina del Huevo resulto contener aminocidos del tipo alfa. En la prueba#2 la Tirosina mostro contener mercurio. En la prueba#3 La protena de trigo mostro que contena aminocidos del tipo aromtico y comprobado mientras la tirosina y la albumina de huego solo llegaron a tener coloracin amarilla al final. BIBLIOGRAFA BOHINSKI. 1991 Bioqumica. 5ed., Pearson. Mxico. Conn, Stumpf.- 1976 Fundamentos de Bioqumica Ed. Interamericana pag. 60-62 Fesenden and fesenden. 2002. Qumica orgnica. Interamericana. Mxico

Mathews Van Holde. 2004 Bioqumica. 3 Ed Pearson. Espaa Strayes, L. Bioqumica, Ed. Interamerican

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