Uniwersytet Warszawski Wydzia Biologii

Izabela Chojnicka
Nr albumu 217280

Cytotoksyczne i proapoptotyczne dziaanie kwasu oleanolowego oraz jego pochodnych wyizolowanych z buraka wikowego na komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa

Praca magisterska na kierunku Biologia w zakresie Biologia Komrki i Organizmu

Praca wykonana pod kierunkiem Prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej Wydzia Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Warszawa, czerwiec 2008

Owiadczenie kierujcego prac Owiadczam, e niniejsza praca zostaa przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, e spenia ona warunki do przedstawienia jej w postpowaniu o nadanie tytuu zawodowego. Data Podpis kierujcego prac

Owiadczenie autora pracy wiadom odpowiedzialnoci prawnej owiadczam, e niniejsza praca dyplomowa zostaa napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treci uzyskanych w sposb niezgodny z obowizujcymi przepisami. Owiadczam rwnie, e przedstawiona praca nie bya wczeniej przedmiotem procedur zwizanych z uzyskaniem tytuu zawodowego w wyszej uczelni. Owiadczam ponadto, e niniejsza wersja pracy jest identyczna z zaczon wersj elektroniczn. Data Podpis autora pracy

Streszczenie Z korzeni buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta, stosujc rne warunki ekstrakcji i chromatograi (TLC, CC), wyizolowano mieszanin saponin triterpenowych oraz wyodrbniono pojedynczy zwizek, ktry zidentykowano jako triglikozyd kwasu oleanolowego przy uyciu spektrometrii mas. Nastpnie zbadano ich dziaanie cytotoksyczne i proapoptotyczne (cytometria przepywowa), a take monoglukozydu kwasu oleanolowego, wolnego kwasu oleanolowego i wolnego kwasu ursolowego oraz mieszaniny tych ostatnich na ludzkie komrki raka jelita grubego linii DeTa. Najsilniej dziaay w kolejnoci: monoglukozyd kwasu oleanolowego, triglikozyd kwasu oleanolowego i kwas ursolowy, co wskazuje na zaleno badanych waciwoci od struktury zwizku.

Sowa kluczowe Kwas oleanolowy, kwas ursolowy, saponiny, linia komrkowa DeTa, apoptoza, cytotoksyczno

Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus) 13.1. Biologia

Tytu pracy w jzyku angielskim Cytotoxic and apoptogenic eect of oleanolic acid and its derivatives from beet root on human colorectal adenocarcinoma cell line DeTa

Pani prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej za powicony czas, merytoryczn pomoc w trakcie pisania pracy, a take za moliwo szczerej rozmowy, otrzymania rady i wsparcia.

Pani mgr Agnieszce Mroczek za wykonanie analizy MS, jak rwnie za wszechstronn pomoc i tworzenie niepowtarzalnej, koleeskiej atmosfery w czasie pracy.

Prac dedykuj mojej Mamie

Spis treci

Spis treci 1 Wstp 1.1 Rak jelita grubego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Chemoprewencja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3 Saponiny triterpenowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.1 Budowa i waciwoci chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2 Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego w podkrlestwie rolin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych . . . . . . . 2 Zaoenia i cel pracy 3 Materiay i metody

1 3 3 4 6 6 7 8 12 13

3.1 Materia badawczy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.2 Odczynniki chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.3 Ekstrakcja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.3.1 Przygotowanie materiau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.3.2 Ekstrakcja eterem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.3.3 Ekstrakcja metanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.3.4 Ekstrakcja butanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.4 Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1

SPIS TRECI

3.5 Metody chromatograczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.5.1 Chromatograa cienkowarstwowa TLC . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.5.2 Ukady chromatograczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.5.3 Chromatograa kolumnowa CC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.6 Spektrometria mas MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.7 Metody hodowli komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.7.1 Pasa do butelek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.7.2 Pasa na szalki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3.8 Badanie ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.9 Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej . . . . . . . . . . . . . . 19 4 Wyniki 20

4.1 Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.2 Analiza MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.3 Pomiar ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4.4 Analiza cytometryczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 5 Dyskusja Bibliograa Spis symboli i skrtw Spis rysunkw Spis tabel 40 47 55 57 59

Rozdzia 1

Wstp

1.1

Rak jelita grubego

W krajach rozwinitych, wraz ze wzrostem dugoci ycia obywateli, zwiksza si zapadalno na schorzenia, a najbardziej powszechne pord nich s choroby nowotworowe (ok. 77% przypadkw po 55 roku ycia), charakteryzujce si niekontrolowanym namnaaniem komrek, niezalenym od mechanizmw regulujcych podzia. W 2007 roku American Cancer Society zanotowao ok. 1,5 mln nowych przypadkw zachorowa i ponad 0,5 mln zgonw, czyli ponad 1500 osb kadego dnia [61]. Nowotwory dzielimy na agodne i zoliwe, z czego te ostatnie maj zdolno do metastazy, czyli rozprzestrzeniania si po organizmie i kolonizowania tkanek. Do nowotworw zoliwych nale: nowotwr anaplastyczny (typ nowotworu cakowicie niezrnicowanego), misak (nowotwor zoliwy pochodzenia nienabonkowego), potworniak (nowotwr wywodzcy si totipotencjalnych komrek zarodkowych) oraz rak (nowotwr zoliwy wywodzcy si z tkanki nabonkowej). Rak jelita grubego, obejmujcy zmiany nowotworowe w obrbie okrnicy, odbytnicy oraz wyrostka robaczkowego, znajduje si na trzecim miejscu, po raku prostaty, puc i oskrzeli, na licie nowotworw, na ktre zapada ludno krajw rozwinitych i na drugim pod wzgldem miertelnoci wrd pacjentw, rwnie w Polsce. Kadego roku rak jelita grubego jest przyczyn zgonu 655 000 ludzi na wiecie. Najwysza zapadalno wystpuje

Tylko na terenie USA

ROZDZIA 1. WSTP

w Europie Zachodniej, Stanach Zjednoczonych i Kanadzie, natomiast najnisza w krajach Afryki i Azji [40]. Przyczyny zachorowa obejmuj zarwno czynniki genetyczne jak i rodowiskowe. Wrd schorze dziedzicznych, zwizanych z rakiem jelita grubego, do najpowszechniejszych naley rodzinna polipowato gruczolakowata (FAP) czy zesp Lyncha (HNPCC), t.j. dziedziczny rak jelita grubego niezwizany z polipowatoci. Zdecydowanie najwicej zachorowa (65%85%) to tzw. sporadyczny rak jelita grubego, gdzie wystpuj nakadajce si mutacje genw supresorowych, kodujcych biaka takie jak APC, DCC czy p53, ktrych powstanie moe by zwizane z diet ubog w warzywa i owoce, z przewag misa czerwonego, paleniem papierosw, naduywaniem alkoholu czy brakiem wysiku zycznego. Nowotwr jelita moe si rwnie rozwin w wyniku wczeniej przebytych chorb, takich jak wrzodziejce zapalenie jelita grubego czy pojedyncze polipy wystpujce w jego obrbie.

1.2

Chemoprewencja

Leczenie raka jelita grubego obejmuje zabiegi chirurgiczne, a take radio- i chemioterapi, ktre poza wysokim ryzykiem zgonu pacjenta, obciaj go dokuczliwymi i czsto upoledzajcymi samodzielne funkcjonowanie skutkami ubocznymi. Dlatego niezwykle wane jest zapobieganie powstawaniu choroby, a w przypadku jej wystpienia, wczesne wykrycie i zahamowanie na pocztkowym etapie rozwoju, czyli tzw. prewencja [1, 15]. Chemoprewencja to stosowanie farmakologicznych lub naturalnych substancji w celu zapobiegania, zahamowania lub odwrcenia procesu kancerogenezy [6]. Dotychczas opisano wiele zwizkw wykazujcych zdolno zatrzymywania wczesnych etapw powstawania i rozwoju nowotworu, wrd ktrych wystpuj zarwno leki jak i zwizki pochodzenia naturalnego. Do farmaceutykw obniajcych zapadalno i umieralno na raka jelita grubego nale celeksyb, rofekoksyb czy niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. sulindak). Wszystkie one posiadaj wspln cech s inhibitorami cyklooksygenazy 2 (COX-2) . Jednak pomimo korzystnego wpywu rofekoksybu na jelito jego przyjmowanie wizao si z wystpieniem chorb ukadu krenia, gwnie zatorw i atakw serca. W efekcie

Niesteroidowe leki zapalne hamuj obie izoformy enzymu COX: COX-1 i COX-2

ROZDZIA 1. WSTP

w 2004 roku lek wycofano z rynku, a w 2007r. rma Merck musiaa wypaci odszkodowanie w wysokoci 4,85 miliardw dolarw na terenie Stanw Zjednoczonych Ameryki Pnocnej. Zatem leczenie oparte na stosowaniu syntetycznych farmaceutykw moe wiza si z wystpieniem wielu powika i skutkw ubocznych. Dlatego wielu badaczy skupio si na poszukiwaniu naturalnych substancji, ktre mogyby by stosowane zarwno w chemoprewencji jak i wczesnej terapii nowotworowej [45]. Wykazano niewtpliwy wpyw diety na raka jelita grubego w wielu badaniach in vivo zarwno na ludziach jak i zwierztach laboratoryjnych [8, 22, 32, 36, 42, 48, 49, 54, 56]. Stwierdzono, e jadospis powinien zawiera produkty bogate w bonnik, takie jak warzywa, zboa i owoce. Ostatnio testuje si wpyw ekstraktw z wielu rolin na komrki nowotworowe jelita grubego in vitro i in vivo. Jednak nadal niewiele wiadomo, jaki jest dokadny skad podawanych ekstraktw, ani nie znany jest mechanizm dziaania zawartych w nich substancji. Jedn z wielu jarzyn powszechnie spoywanych nie tylko w kulturze sowiaskiej, ale na wszystkich kontynentach, jest burak zwyczajny Beta vulgaris, rolina dwuletnia z rodziny komosowatych Chenopodiaceae. Najpopularniejsze odmiany hodowlane to tzw. bowina, czyli burak liciowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. vulgaris var. cicla) i burak korzeniowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa), w przypadku ktrego wyrniamy buraka wikowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. esculenta), cukrowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. altissima) oraz pastewnego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. rapacea) [64]. Burak wikowy to bogate rdo witamin (A, C, E, witaminy z grupy B tiamina, ryboawina, niacyna, pirydoksyna i kwas foliowy), mineraw i pierwiastkw ladowych. Za oletowo-czerwon barw odpowiedzialne s betaniny, uywane w przemyle spoywczym jako barwnik E162. Do tej pory ukazaa si jedna praca, dokumentujca wystpowanie saponin triterpenowych w buraku wikowym [12], rolinnych metabolitw wtrnych, budzcych obecnie due zainteresowanie ze wzgldu na wykazywany przez nie szereg aktywnoci farmakologicznych. Brakuje jednak informacji na temat ich skadu jakociowego i wykazywanego dziaania.

ROZDZIA 1. WSTP

Rysunek 1: Burak wikowy [58]

1.3
1.3.1

Saponiny triterpenowe
Budowa i waciwoci chemiczne

Saponiny s to glikozydy wystpujce u wielu gatunkw rolin i kilku organizmw morskich [51]. Nazwa pochodzi od charakterystycznej zdolnoci tych zwizkw doobniania napicia powierzchniowego roztworw wodnych z wytworzeniem piany [34], std roliny bogate w saponiny uywane byy dawniej jako substytut myda, jak na przykad mydlnica lekarska Saponaria ocinalis czy mydlany korze Chlorogalum pomeridianum [25]. Saponiny s zbudowane z aglikonu zwanego te sapogenin poczonej wizaniem O-glikozydowym lub estrowo-glikozydowym z czci cukrow, czyli glikonem. Ze wzgldu na budow wyrniamy aglikony sterydowe i aglikony triterpenowe. Sapogeniny sterydowe wystpuj najczciej w formie furostanolowej albo spirostanolowej, natomiast triterpenowe w formie oleananu, ursanu albo lupanu. Sapogeniny triterpenowe to trzydziestowglowe triterpenoidy pentacykliczne, posiadajce w swojej czsteczce pi piercieni skondensowanych, przy czym cztery piercienie s

ROZDZIA 1. WSTP

szecioczonowe, a ostatni szecio- lub picioczonowy. Ich prekursorem jest skwalen zbudowany z szeciu jednostek izoprenoidowych [34]. Z pord triterpenoidw pentacyklicznych najliczniej u rolin wystpuj kwas oleanolowy (kwas 3 -hydroksy-olea-12-en-28-owy) i kwas ursolowy (kwas 3 -hydroksy-urs-12-en-28-owy), rnice si pooeniem grup metylowych przy wglach C-19 i C-20 (Rys. 2). Oba posiadaj grup hydroksylow przy wglu w pozycji 3 i grup karboksylow przy wglu w pozycji 17. Cz cukrowa zbudowana jest z pojedynczej czsteczki cukru bd liniowego lub rozgazionego acucha cukrowego, w ktrego skad mog wchodzi zarwno heksozy jak i pentozy, gwnie: D-glukoza, D-galaktoza, D-ksyloza, L-arabinoza, L-fukoza, D-chinowoza, kwas D-glukuronowy czy kwas D-galaktouronowy [34, 51]. W zalenoci od liczby do czonych reszt cukrowych mamy mono-, di- i tridesmozydy [34, 71]. Obecno cukru w czsteczce zwiksza polarno zwizku, a wic jego rozpuszczalno w wodzie i alkoholu.

(a) Kwas oleanolowy (OA)

(b) Kwas ursolowy (UA)

Rysunek 2: Kwas oleanolowy i kwas ursolowy

1.3.2

Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego w podkrlestwie rolin

Kwas oleanolowy wyizolowano po raz pierwszy w roku 1931 z lici oliwki europejskiej Olea eurepaea [52]. Zarwno wolny kwas jak i jego glikozydowe pochodne znajduj si we wszystkich czciach rolin, to jest w korzeniach, odydze, liciach, kwiatach, owocach i nasionach, jednak ich zawarto i proporcje w rnych organach rni si

ROZDZIA 1. WSTP

u rnych gatunkw [7, 29, 30, 31, 55, 68]. Zwizki te wystpuj powszechnie w klasie dwuliciennych Magnoliopsida, z czego w dwch spord omiu podklas, w podklasach Ranunculidae i Asteridae we wszystkich nadrzdach. Nie wystpuj natomiast wrd przedstawicieli podklas Magnoliidae i Hamamelididae. Z kolei kwas ursolowy wyizolowano po raz pierwszy w roku 1923 z lici mcznicy lekarskiej Arctostaphylos uva-ursi [52]. On i jego pochodne rwnie wystpuj powszechnie w klasie Magnoliopsida, gwnie w podklasach: Hamamelididae, Asteridae, Lamiidae, Rosidae, Dilleniidae. Kwas ursolowy, w przeciwiestwie do kwasu oleanolowego, wystpuje u rolin najczciej w postaci wolnej. 1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych

Proces powstania i rozwoju nowotworu, czyli kancerogeneza obejmuje trzy etapy faz inicjacji, promocji oraz progresji. W fazie inicjacji zdrowa komrka w wyniku mutacji staje si komrk rakow, dzielc si niezalenie od mechanizmw regulujcych podzia. Dochodzi do hiperplazji, czyli rozrostu tkanki, bd dysplazji, czyli nieprawidowoci w jej strukturze. W fazie promocji namnaajce si komrki charakteryzuje zwikszona ruchliwo, utrata penionej funkcji i cznoci z ssiednimi komrkami. W ostatniej fazie progresji nastpuje proces angiogenezy, a zmienione komrki wydzielaj autokrynne czynniki wzrostowe. Dochodzi do licznych aberracji DNA. Komrki przenikaj do naczy krwiononych i limfatycznych, kolonizuj nowe tkanki, tworzc przerzuty [2, 28, 70]. Terapia moe obejmowa oddziaywanie na kadym z tych etapw. Dziaanie przeciwoksydacyjne i przeciwmutagenne Z procesem powstawania nowotworu wie si generowanie wolnych rodnikw, ktre wywouj nieodwracalne zmiany w komrkach ogranizmu poprzez peroksydacj lipidw i destrukcj biaek, co moe zapocztkowa proces kancerogenezy. Znane s m.in. dwie grupy enzymw zwizane z ich genereowaniem w organizmie: cyklooksygenazy (COX) i lipooksygenazy (LOX). Uczestnicz one w przemianach dwudziestowglowych, wielonienasyconych kwasw tuszczowych (gwnie kwasu arachidonowego) do eikozanoidw, zjologicznie i farmakologicznie czynnych zwizkw, do ktrych nale prostaglandyny, tromboksany, leukotrieny i lipoksyny [46]. Niektre z nich to hormony parakrynne, mo-

ROZDZIA 1. WSTP

gce hamowa reakcje odpornociowe organizmu, aktywowa namnaanie komrek oraz indukowa angiogenez, jak to ma miejsce w przypadku raka jelita grubego [35]. W organizmie czowieka wystpuj dwie izoformy enzymu COX, posiadajce odmienne funkcje biologiczne. Stale syntetyzowane biako COX-1 bierze udzia w utrzymywaniu homeostazy. Z kolei enzym COX-2, ktrego ekspresja wystpuje w komrkach transformowanych nowotworowo, w wielu postaciach raka i w procesach zapalnych, pobudza migracj komrek rdbonka, angiogenez a take zapobiega apoptozie [35]. Poniewa regulacja ekspresji cox-2 oraz hamowanie aktywnoci COX-2 jest obiecujcym krokiem w zapobieganiu i leczeniu nowotworw , to chemoprewencyjne Syntetyczne zwizki, bdce skutecznymi inhibitorami cyklooksygenazy 2, w praktyce jako leki wywoyway liczne skutki uboczne [15]. Dlatego wydaje si, e naturalne zwizki hamujce aktywno COX-2 mog by potencjalnymi rodkami chemoprewencyjnymi w terapii przeciwnowotworowej. Kwas ursolowy, kwas oleanolowy oraz jego glikozydowe pochodne wykazuj zdolno do hamowania tranksrypcji genu cox-2 i aktywnoci enzymu COX-2 [63, 65], a take enzymu lipoksygenazy [47, 59, 60] oraz wzrostu wytwarzania peroksydazy glutationowej (GPx) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [62], to jest enzymw rozkadajcych reaktywne formy tlenu [46]. Ponadto kwas oleanolowy poprzez hamowanie kinazy biakowej C (PKC), wpywa na obnienie trankskrypcji protoonkogenw, midzy innymi c-fos, c-myc i c-jun, jak rwnie aktywnoci enzymw takich jak metalotioneina i dekarboksylaza ornitynowa, ktre s charakterystyczne dla pocztkowych etapw rozwoju nowotworu [50, 65]. Dziaanie cytotoksyczne Jeli chemoprewencyjne strategie zawiodz, naley zatrzyma transformacj nowotworow tkanki poprzez zahamowanie proliferacji, bd zaindukowanie apoptozy w zmienionych komrkach. Wiele bada wskazuje na cytotoksyczne waciwoci kwasu oleanolowego i ursolowego, jednak mechanizm ich dziaania nie jest dokadnie poznany [9, 11, 13, 18, 26, 33]. Z drugiej strony brakuje prac opisujcych dziaanie pojedynczych saponin ze wzgldu na trudn procedur oczyszczenia i rodzielania zwizkw triterpenoWykazano, e nadekspresja COX-2 zwizana jest z procesem nowotworzenia w obrbie bony luzowej jelita grubego [69].

ROZDZIA 1. WSTP

10

wych. Na og komrkom podawane s ekstrakty, bdce mieszanin bardzo wielu rnych, czsto niezidentykowanych substancji, przez co trudno stwierdzi, ktra z nich ma wpyw na wywoany efekt. Apoptoza, czyli programowana mier komrkowa, to zachodzcy w zdrowych tkankach proces zapobiegajcy nadmiernemu rozrostowi tkanki, eliminujcy nadliczbowe bd uszkodzone komrki, hamujcy nieprawidow proliferacj oraz bdcy narzdziem walki komrek ukadu immunologicznego z patogenami. Moe by zaindukowany poprzez dwie oddzielne cieki sygnaowe, zewntrz- i wewntrzkomrkow. cieka wewntrzkomrkowa, wywoywana poprzez sygnay uszkodzenia DNA lub aktywowane onkogeny, generuje wzrost przepuszczalnoci bon mitochondrialnych i aktywacj kaskady kaspaz. Natomiast cieka zewntrzkomrkowa inicjowana jest przez receptory mierci na powierzchni plazmalemmy. Receptory te s aktywowane przez ligandy cytokin i biaka powierzchniowe komrek NK oraz cytotoksycznych limfocytw T. Znajdujce si po cytozolowej stronie bony domeny aktywowanych receptorw mierci poczone s z biakami adaptorowymi FADD w kompleksie zwanym DISC, ktry aktywuje kaskad kaspaz samodzielnie lub z wspudziaem cieki wewntrzkomrkowej. Do najwaniejszych regulatorw apoptozy nale inhibitory apoptozy IAP, inaktywujce kaspazy oraz biaka z rodziny BCL2, w ktrej znanych jest ok. 20 biaek znajdujcych si w bonie mitochondrialnej, z ktrych niektre s induktorami apoptozy (gwne biaka BAX i BAK), a inne maj dziaanie antyapoptotyczne. Biaka BAX i BAK porednicz w indukowaniu zmian w strukturze i funkcji mitochondriw. Nastpuje translokacja ADP + Pi i ATP w wewntrznej bonie mitochondrialnej, a czsteczki razem z jonami Ca 2+ uwalniane s do cytoplazmy przez powstae w zewntrznej bonie pory, co prowadzi do zaniku potencjau bonowego. Nastpuje uwolnienie m.in. cytochromu c, biaka SMAC/Diablo oraz indukujcej apoptoz awoproteiny AIF. Osiem czsteczek cytochromu c asocjuje z t sam liczb czsteczek biaka APAF-1, formujc struktur o ksztacie koa, zwan apoptosomem lub koem mierci. Apoptosom aktywuje kaspaz 9, ktra aktywuje kolejne kaspazy, m.in. egzekutorow kaspaz 3, inicjujc zalen od ATP, autokatalityczn proteoliz [2, 14, 39, 57]. Liczne prace omawiaj dziaanie cytotoksyczne i indukowanie apoptozy w komrkach

ROZDZIA 1. WSTP

11

wielu linii nowotworowych przez wolny kwas oleanolowy [3, 4, 27] i ursolowy [5, 10, 15, 37], a take ich glikozydowe pochodne, takie jak -D-glukozyd OA i metylglukuronozyd OA z Viguiera decurrens [41] czy kwas 3 -[(-L-arabinopiranozylo)-oksy]-23-hydroksyolean -12-en-28-owy z Sanguisorba ocinalis L. [43]. Kwas oleanolowy i kwas 2-hydroksy-oleanolowy oraz kwas ursolowy i kwas 2-hydroksy-ursolowy hamoway aktywno polimeraz DNA i oraz topoizomerazy II [44]. Ponadto OA i UA indukoway apoptoz poprzez zatrzymnie komrek w fazie G0/G1 [16, 17, 65], uruchomienie kaskady kaspaz i zaburzenie metabolizmu mitrochondrialnego [5, 10, 23, 27, 37], jednak dokadny mechanizm dziaania tych zwizkw nie jest poznany. Zbadane zostay rwnie wyizolowane z Silene fortunei saponiny triterpenowe, ktre nie wykazuj waciwoci cytotoksycznych, lecz wpywaj na zwikszenie akumulacji w organizmie cis-platyny, leku stosowanego w terapii raka okrnicy, potgujc jego dziaanie [63].

Rozdzia 2

Zaoenia i cel pracy

Rak jelita grubego jest trzecim co do czstoci wystpowania i drugim pod wzgldem miertelnoci typem nowotworu w krajach rozwinitych, a rozwj choroby jest niezwykle uciliwy i nieprzyjemny dla pacjenta. Dlatego te cigle poszukuje si naturalnie wystpujcych w rolinach substancji, ktre mogyby by zastosowane w prewencji choroby, gdy wpyw diety na rozwj raka jelita grubego zosta szeroko udokumentowany. Wydaje si, e takimi zwizkami mogyby by saponiny treiterpenowe, wykazujce liczne waciwoci farmakologiczne, takie jak dziaanie przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe oraz przeciwgrzybicze, pierwotniakobjcze, przeciwzapalne, przeciwnowotworowe jak rwnie oddziaywanie na ukad i mmunologiczny i krwionony [11, 13, 20, 38]. Ostatnio wykazano, e w korzeniu buraka wikowego wystpuj ladowe iloci wolnego kwasu oleanolowego oraz jego glikozydowych pochodnych, przy czym stosunek zawartoci aglikonu do jego formy zwizanej wynosi jak 1:600 [12]. Celem niniejszej pracy byo: 1. Wyizolowanie mieszaniny saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta. 2. Zbadanie dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego wyizolowanych saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i jego izomeru kwasu ursolowego na komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa.

12

Rozdzia 3

Materiay i metody

3.1

Materia badawczy

Materia badawczy stanowiy: 1. Korzenie buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta (Rys. 3), zebrane z pola na terenie powiatu ochowskiego w wojewdztwie mazowieckim w padzierniku 2006 roku. 2. Ludzkie komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa, otrzymane z warszawskiego Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skodowskiej-Curie, a oryginalnie pochodzce z wiedeskiego The Cancer Research Institute [53].

Rysunek 3: Korzenie buraka wikowego

13

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

14

3.2

Odczynniki chemiczne

Skadniki medium, w ktrym hodowano komrki:

X kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy HEPES (rmy GIBCO) X penicylina (rmy SigmaAldrich) X podowa surowica cielca FCS (rmy GIBCO) X RPMI (rmy SigmaAldrich) X streptomycyna (rmy SigmaAldrich)

Inne odczynniki:
X acetylobromoglukoza (rmy Fluka Chemie GmbH) X alkohol butylowy (rmy Chempur, Piekary lskie) X alkohol etylowy (rmy Chempur, Piekary lskie) X alkohol metylowy (rmy Chempur, Piekary lskie) X bkit trypanu (rmy Sigma Aldrich) X chloroform (rmy Chempur, Piekary lskie) X eter dietylowy (rmy Chempur, Piekary lskie) X kwas siarkowy (rmy POCh, Warszawa) X toluen (rmy Chempur, Piekary lskie) X trypsyna (rmy Sigma Aldrich) X wglan kadmu (rmy POCh, Warszawa) X zestaw Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I, zawierajcy aneksyn sprzon

z uorescein, jodek propidyny i bufor do aneksyny (rmy BD Biosciences, NJ USA)

Wzorce:
X kwas oleanolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin) X 3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin) X kwas ursolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin)

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

15

3.3
3.3.1

Ekstrakcja
Przygotowanie materiau

Pokrojone korzenie suszono w temperaturze 50 oC, a nastpnie mielono w mynku do kawy (rmy Moulinex, typ A505). 3.3.2 Ekstrakcja eterem

Rozdrobniony materia (pkt 3.1) umieszczono w gilzie i ekstrahowano eterem etylowym w aparacie Soxhleta w cigu szesnastu godzin. Otrzymane ekstrakty zatano do sucha. 3.3.3 Ekstrakcja metanolem

Pozostay materia po ekstrakcji eterowej (pkt 3.3.2) zalewano w zlewce metanolem i umieszczano w ultrasonikatorze (rmy POLSONIC, typ Sonic 2, moc 250W) w temperaturze 30 oC na 20 minut. Powstay osad odsczano na lejku Buchnera i ekstrahowano w tych samych warunkach szeciokrotnie. Do ekstraktu metanolowego dodawano rwn objeto wody, a nastepnie oddestylowano metanol na wyparce obrotowej (rmy Heidel), pozostawiajc frakcj wodn. 3.3.4 Ekstrakcja butanolem

Frakcj wodn (pkt 3.3.3) ekstrahowano szeciokrotnie n-butanolem. Poczone ekstrakty odparowywano do sucha pod zmniejszonym cinieniem na wyparce obrotowej. 3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE

25 g elu krzemionkowego RP-18 (LiChroprep RP-18, o wielkoci ziaren 40-60 m, rmy Merck) zawieszano w metanolu i wlewano do lejka Schotta o rednicy 6 cm i wysokoci 10 cm. Lejek by umieszczony w kolbie ssawkowej poczonej z pompk (Rys. 4), wytwarzajc podcinienie. Zoe kondycjonowano, przepuszczajc przez nie nastpujce roztwory metanolu w wodzie w objtoci 300 ml:
X 75% metanolu X 50% metanolu

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

16

X 20% metanolu X 10% metanolu X woda

Rysunek 4: Schemat aparatury uytej do SPE

Ekstrakt butanolowy (800 mg) (pkt 3.3.4) rozpuszczono w najmniejszej objtoci wody, naniesiono na zoe i przemywano kolejnymi roztworami (300 ml) metanolu w wodzie: I 100% H2 O II 10% metanolu III 40a% metanolu IV 40b% metanolu V 60% metanolu VI 80% metanolu VII 100% metanol Zebrane frakcje zatano do sucha na wyparce obrotowej.

3.4

Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego

W kolbie trjszyjnej z wkraplaczem, termometrem oraz chodnic Lebiega umieszczono bezwodny toluen (24 ml) z rozpuszczonym kwasem oleanolowym (60 mg) i katalizatorem wglanem kadmu (120 mg) i ogrzewano do wrzenia. W czasie oddestylowywania

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

17

toluenu wkraplano powoli najpierw roztwr rozpuszczonej w 36 ml toluenu acetylobromoglukozy (240 mg), a nastpnie toluen, w celu utrzymania staej objtoci mieszaniny. Syntez prowadzono przez 4 godziny. Nastpnie na sczku karbowanym odsczano katalizator, a przescz zatano do sucha na wyparce obrotowej.

3.5
3.5.1

Metody chromatograczne
Chromatograa cienkowarstwowa TLC

Do analitycznej chromatograi cienkowarstwowej stosowano pytki Kieselgel rmy Merck o gruboci warstwy elu 0,2 mm i wymiarach 20 x 20 cm. Do preparatywnej chromatograi cienkowarstwowej stosowano pytki Kieselgel 60 F254 rmy Merck o gruboci warstwy elu 2 mm i wymiarach 10 x 20 cm. 3.5.2 Ukady chromatograczne

Pytki TLC rozwijano w szczelnych, wysyconych parami rozpuszczalnikw kamerach szklanych w ukadach rozpuszczalnikw: I chloroform : metanol (98 : 2, v/v) II chloroform : metanol (85 : 15, v/v) III chloroform : metanol (60 : 40, v/v) IV chloroform : metanol : woda (60 : 40 : 10, v/v) V chloroform : metanol : woda (50 : 50 : 10, v/v)

Do wywoywania pytek stosowano: A) 50% kwas siarkowy i ogrzewano w temperaturze 120 oC (chromatograa analityczna). B) wod (chromatograa preparatywna). 3.5.3 Chromatograa kolumnowa CC

15 g elu krzemionkowego zawieszano w ukadzie IV (pkt 3.5.2) i wlewano do szklanej kolumny o rednicy 1,5 cm i wysokoci 21 cm. Po ustabilizowaniu si zoa pozostawiano

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

18

0,3 cm mieszaniny rozpuszczalnikw nad jego powierzchni. Frakcj rozpuszczano w niewielkiej objtoci stosowanego ukadu i nanoszono na kolumn. Kolumn rozwijano t sam mieszanin rozpuszczalnikw w przepywie 2,5 ml/ min zbierajc ok. 10 ml frakcje.

3.6

Spektrometria mas MS

Spektroskopia mas zostaa przeprowadzona w Zakadzie Biochemii Instytutu Uprawy, Nawoenia i Gleboznawstwa w Puawach na spektrometrze masowym Thermo Finnigan LCQ Adventage Max.

3.7

Metody hodowli komrek

Komrki hodowano w sterylnych butelkach zamykanych korkiem z ltrem na podou RPMI (pkt 3.2) z dodatkiem 5% FCS, 1% Hepes oraz antybiotykami penicylin i streptomycyn z zawartoci CO2 5%, w temperaturze 37 oC. Co trzeci dzie zbierano zuyte medium znad hodowli i uzupeniano butelki wieym medium (15 ml). 3.7.1 Pasa do butelek

Raz w tygodniu przeprowadzano pasa komrek. Zlewano medium, dodawano 1 ml trypsyny, po czym trypsyn zbierano razem z resztkami medium. Pozostae w butelce komrki inkubowano z 3 ml trypsyny w cigu 5-10 min, po czym dodawano 12 ml medium. Pobierano 3 ml otrzymanej zawiesiny komrek, przenoszono do nowej, sterylnej butelki i dopeniano 12 ml medium. 3.7.2 Pasa na szalki

Otrzyman zawiesin komrek (pkt 3.7.1) rozlewano na szeciodokowe szalki. W kadym doku umieszczano 0,5 ml zawiesiny i dopeniano 4,5 ml medium. Po trzech dniach hodowli do dokw dodawano jeden z badanych zwizkw (Tab. 1) w odpowiednim steniu albo 100M etanolu (kontrola z etanolem) albo niczego nie dodawano (kontrola). Dowiadczenie wykonano w dwch powtrzeniach. Komrki inkubowano 24h.

ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY

19

Tabela 1: Zwizki podawane komrkom Zwizek lub mieszanina zwizkw rozpuszczonych w etanolu OA UA UA + OA Stenie ( M) 25, 50, 100, 150 10, 50, 100 UA10 + OA10 UA10 + OA25 UA10 + OA50 10, 25, 50, 100, 150, 200 50, 100, 150 29, 57, 86, 143, 200

monoglukozyd OA triglikozyd OA mieszanina saponin

3.8

Badanie ywotnoci komrek

Po inkubacji ze zwizkami (pkt 3.7.2) do zawiesiny komrek (30 l) dodawano bkit trypanu (30 l) i umieszczano kilka kropel w komorze B urkera przykrytej szkiekiem nakrywkowym. Pod mikroskopem wietlnym liczono ywe i martwe komrki, a nastpnie wyliczano procent ywych komrek w preparacie.

3.9

Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej

Po zebraniu medium znad hodowli (pkt 3.7.2), dodawano trypsyn (100 l) i usuwano resztki medium. Nastpnie ponownie dodawano trypsyn (500 l) i inkubowano komrki 5-10 min. Gdy komrki odkleiy si od dna szalki, dodawano medium (2,5 ml), wirowano zawiesin (1200 rpm, 8 min., 20 oC) i zlewano supernatant. Komrki zawieszano w buforze do aneksyny, tak by otrzyma stenie ok. 10 mln komrek/1 ml (komrki liczono w komorze B urkera). Nastpnie 100 l zawiesiny komrek umieszczano w probwce, dodawano jodek propidyny (10 l) oraz aneksyn (5 l). Komrki inkubowano w ciemnoci w cigu 15 min i przeprowadzano pomiar w cytometrze przepywowym (FACSCalibur rmy BD Biosciences, NJ USA) maksymalnie w przecigu 60 min od zakoczenia inkubacji komrek z jodkiem propidyny i aneksyn.

Rozdzia 4

Wyniki

4.1

Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych

Z wysuszonych korzeni uzyskano ekstrakt eterowy (pkt 3.3.2) i butanolowy (pkt 3.3.4) wedug schematu przedstawionego na rysunku 5.
        !   '() *)'    +, !  "# $%&    -.


/  0

/  00

/  000 /  01 22 34 22

/  1

/  10 22
TLC

/  100

567 89

: ; %

Rysunek 5: Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego

20

ROZDZIA 4. WYNIKI

21

Frakcja eterowa zawieraa wolny kwas oleanolowy, natomiast frakcja butanolowa jego glikozydowe pochodne. Wstpn analiz ekstraktu butanolowego przeprowadzono technik chromatograi TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie III wobec wzorca 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego. Wykazaa ona obecno zwizkw mogcych by glikozydowymi lub glikozydoestrowymi pochodnymi kwasw triterpenowych lub steroli, widocznych na pytce po wywoaniu (pkt 3.5.2) w postaci pasm o charakterystycznym, oletowo-rowym zabarwieniu. Ekstrakty butanolowe poddano ekstrakcji SPE (pkt 3.3.5). Otrzymane frakcje poddano wstpnej analizie TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie IV wobec wzorca 3-O-monoglkozydu OA. Uzyskany chromatogram przedstawiono na rysunku 6, gdzie pasma o zabarwieniu oletowym, oletowo-rowym i oletowo-niebieskim zostay zaklasykowane jako potencjalne saponiny. Frakcja nr III, frakcje nr IV + V oraz VI + VII (pkt 3.3.5) zostay poddane w celu oczyszczenia chromatograi kolumnowej (pkt 3.5.3), a nastpnie chromatograi cienkowarstwowej (pkt 3.5.1).

Rysunek 6: Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE

W wyniku chromatofrai kolumnowej dla prby nr III zebrano 27 frakcji, dla prb nr IV + V 36 frakcji oraz dla prb nr VI + VII 30 frakcji. Wszystkie frakcje otrzymane

ROZDZIA 4. WYNIKI

22

w wyniku chromatograi kolumnowej wstpnie analizowano technik TLC w ukadzie IV. Frakcje zawierajce saponiny, oczyszczano nastpnie technik TLC w ukadzie V. Zeskrobane do szklanych kolumienek pasma elu z saponinami eluowano dziesiciokrotn objtoci metanolu, po czym powtrnie wykonywano chromatogra TLC w ukadzie IV. Ca procedur powtrzono, uzyskujc z frakcji nr III pojedynczy zwizek, widoczny na rysunku 6 jako najniej umiejscowione pasmo w prbie a po ekstrakcji 40% metanolem. Oczyszczone saponiny pochodzce z frakcji nr IV + V oraz VI + VII, poczono.

4.2

Analiza MS mieszaniny saponin

W celu zidentykowania zwizkw wystpujcych w oczyszczonej mieszaninie saponin poddano je analizie metod spektrometrii masowej (pkt 3.6). W wyniku bezporedniego nastrzyku mieszaniny saponin usyskano widmo MS szeregu jonw molekularnych o masach
g (Rys. 7). molowych od 763 do 1117 mol

Rysunek 7: Widmo MS mieszaniny saponin

W oczyszczonym esktrakcie z B. vulgaris var. esculenta stwierdzono obecno dziewiciu rnych saponin w siedmiu spord nich aglikon stanowi kwas oleanolowy, a w dwch hydroksy-oleanolowy. Natomiast nie stwierdzono obecnoci glikozydw kwasu ursolowego. Czci cukrowe wyizolowanych saponin zawieraj od dwch do czterech reszt

ROZDZIA 4. WYNIKI

23

Rysunek 8: Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu oleanolowego

cukrowych, wrd ktrych wystpuj pentozy, heksozy oraz kwas glukuronowy w rnej liczbie i kombinacjach. Przeprowadzono fragmentacj do minujcego ilociowo w mieszaninie jonu o masie
g (Rys. 8). Analiza wykazaa, e zwizek ten jest triglikozydem kwasu oleanolowego 955,5 mol

(Rys. 8) zawierajcym dwie heksozy i kwas glukuronowy.

4.3

Pomiar ywotnoci komrek

W celu zbadania waciwoci cytotoksycznych zwizkw triterpenowych, to jest kwasu oleanolowego, 3-O-monoglukozydu OA oraz triglikozydu OA, podawano je osobno do hodowli komrek nowotworowych linii DeTa. Po 24-godzinnej inkubacji dodawano bkit trypanu (pkt 3.8), ktry wnika do martwych komrek, barwic je na oletowo-niebieski kolor. Obliczono procent ywych komrek (Tab. 2, 3, 4). Wpyw kwas oleanolowego Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 2 i na rysunku 9.

ROZDZIA 4. WYNIKI

24

Tabela 2: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym Kontrola 95% EtOH 100 M 94% OA 25M 92% OA 50M 96% OA 100M 89% OA 150M 87%

Nie zaobserwowano wpywu etanolu na ywotno komrek, ani znaczcych rnic ywotnoci w prbach z kwasem oleanolowym o wzrastajcym steniu. Przy najwyszych steniach 100 i 150 M liczba martwych komrek jest wiksza zaledwie o ok. 5% w porwnaniu do pozostaych prb.







Rysunek 9: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

K kontrola, EtOH etanol 100 M Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 3 i na rysunku 10. 3-O-monoglukozyd OA hamuje ywotno komrek o 60-80%, jednak nie ma liniowej zalenoci liczby martwych komrek od podanego stenia monoglukozydu. Najwicej martwych komrek wystpio przy steniu 100 i 200 M, najmniej przy steeniu 150 M.

ROZDZIA 4. WYNIKI

25

Tabela 3: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem kwasu oleanolowego Kontrola 95% 0,02 EtOH 100 M 94% 0,06 Mono 50 M 25% 0,01 Mono 100 M 17% 0,06 Mono 150 M 38% 0,06 Mono 200 M 18% 0,01

          

Rysunek 10: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem kwasu oleanolowego

Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci triglikozydu kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 4 i na rysnunku 11.
Tabela 4: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego Kontrola 99% 0,03 EtOH 100 M 91% 0,04 Tri 50 M 79% 0,02 Tri 100 M 69% 0,03 Tri 150 M 77% 0,01

Liczba martwych komrek jest wiksza o ok. 10-20% w przypadku prb z triglikozydem OA ni w kontroli i kontroli z etanolem. Nie obserwuje si jednak liniowej zalenoci liczby martwych komrek od stenia triglikozydu, poniewa najwicej martwych komrek wystpio przy steniu 100 M, natomiast przy steniu 50 i 150 M uzyskane wyniki s praktycznie identyczne.

ROZDZIA 4. WYNIKI

26

        

Rysunek 11: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego

4.4

Analiza cytometryczna

Metoda badania ywotnoci komrek z zastosowaniem bkitu trypanu, w ktrej komrki s liczone pod mikroskopem wietlnym przez czowieka, jest metod niedokadn. Dlatego postanowiono zastosowa bardziej precyzyjn cytometri przepywow, w ktrej jednorazowej analizie zostao poddanych trzydzieci tysicy komrek. Co wicej, analiza cytometryczna pozwala rozrni komrki martwe na komrki apoptotyczne i na komrki nekrotyczne. Jest to moliwe dziki wykorzystaniu faktu, e we wczesnym stadium apoptozy nastpuje przeniesienie umiejscowionej w bonie fosfatydyloseryny ze strony cytozolowej na zewntrz komrki. Do fosfatydyloseryny docza si sprzona z uorescein aneksyna. Do prb dodaje si rwnie barwicy DNA jodek propidyny, ktry wnika przez polunion bon martwych komrek. Rwnoczesne podanie jodku propidyny i aneksyny pozwala na rozrnienie zdrowych komrek, komrek nekrotycznych oraz wczesno i pno-apoptotycznych, co przedstawiono schematycznie na rysunku 12). W lewym dolnym kwadracie lokuj si zdrowe komrki, do ktrych nie wnika jodek propidyny ani nie przycza si aneksyna. W lewym grnym kwadracie znajduj si ab-

ROZDZIA 4. WYNIKI

27

Rysunek 12: Schemat analizy cytometrycznej

sorbujce jodek propidyny komrki nekrotyczne, ktre posiadaj fosfatydyloseryn po cytozolowej stronie bony, w zwizku z czym nie wi aneksyny. Prawy dolny kwadrat zawiera komrki znajdujce si we wczesnej apoptozie wice aneksyn, ktrych plazmalemma jest szczelna i nie przepuszcza do wntrza jodku. W prawym grnym kwadracie znajduj si komrki z rozszczelnion bon w rodkowym i pnym stadium apoptozy, ktre wi aneksyn i absorbuj jodek propidyny. Wpyw kwasu oleanolowego Wyniki analizy cytometrycznej komrek DeTa hodowanych w obecnoci kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 5.
Tabela 5: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym kontrola EtOH 100 M OA 25 M OA OA 150 M 100 M 88,20% 90,00% 86,89% 79,90% 1,03 3,42% 1,53% 3,30% 5,50% 3,41 8,37% 8,48% 9,81% 14,61% 4,44 OA 50 M

ywe nekroza apoptoza

90,35% 0,68 2,34% 0,16 7,32% 0,5

87,00% 3,44 3,55% 0,24 9,46% 3,2

Najwysz warto procentow komrek ywych (Rys. 13) obserwowano w kontroli (90,35%) oraz w hodowli z kwasem oleanolowym w steniu 50 M (90%), Nastnie liczba

ROZDZIA 4. WYNIKI

28

                  

Rysunek 13: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym

          

               

Rysunek 14: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z kwasem oleanolowym

ywych komrek stopniowo malaa przy wzrastajcych steniach, osigajc 79,9% pzy steniu 150 M. Niejednoznaczne s wyniki dla nekrozy (Rys. 14). Najwicej komrek nekrotycznych zaobserwowano w prbie z OA 150 M (5,5%) (bardzo wysoka warto odchylenia standar-

ROZDZIA 4. WYNIKI

29

dowego), a najmniej w prbie OA 50 M (1,53%). Ponadto liczba komrek nekrotycznych nie rosa wraz z steniem podanego kwasu warto dla stenia 25 M kwasu oleanolowego bya zbliona do wartoci dla stenia 100 M i kontroli z etanolem i wysza ni dla stenia 50 M. Przy wzrocie stenia od 50 M do 100 M ronie liczba martwych komrek, najwysza dla stenia 150 M. Liczba komrek apoptotycznych (Rys. 14) w obecnoci kwasu oleanolowego w steniu 25 M i 50 M jest praktycznie identyczna, natomiast ronie przy wyszych steniach OA, osigajc najwysz warto przy steniu 150 M (14,61%). Najmniej komrek apoptotycznych znajduje si w prbie kontrolnej (7,63%). Wystpiy rnice w przypadku kontroli i kontroli z etanolem 100 M warto dla prby z etanolem (9,46%) jest zbliona do prby z OA 100 M (9,81%) i wysza ni dla prb z 25 i 50 M. Nie zaobserwowano znaczcego wpywu etanolu na liczb komrek ywych i komrek martwych ani na proporcje midzy komrkami nekrotycznymi i apoptotycznymi. Wpyw kwasu ursolowego Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DETA hodowanych w obecnoci kwasu ursolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 6.
Tabela 6: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym kontrola ywe nekroza apoptoza 90,76% 0,86 1,85% 0,66 7,40% 0,2 EtOH 100 M 89,62% 0,95 1,29% 0,32 9,05% 1,2 UA 10 M 86,42% 1,57 1,31% 0,23 12,28% 1,33 UA 50 M 66,11% 2,4 7,43% 0,82 26,46% 3,22 UA 100 M 60,72% 16,66% 22,63% 18,72 20,35 1,63

ROZDZIA 4. WYNIKI

30

   

 


       

Rysunek 15: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym


     !" #   " " # 

                 

Rysunek 16: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym

ROZDZIA 4. WYNIKI

31

Najwysz warto procentow komrek ywych obserwowano w obu prbach kontrolnych (kontrola 90,76%, kontrola z etanolem 100 M 89,62%), tym samym etanol nie wywiera wpywu cytotoksycznego na komrki. Najnisz warto procentow komrek ywych zaobserwowano w hodowli komrek z najwyszym steniem UA 100 M (60,72%), co stanowi znaczc rnic 30% (Rys. 15) w porwnaniu z kontrol. Ponadto liczba ywych komrek maleje wraz ze wzrostem stenia UA od 10 do 100 M. Liczba komrek nekrotycznych (Rys. 16) podobna i nie przekraczajca 2% dla kontroli, kontroli z etanolem i UA 10 M, znaczco wzrastaa przy wyszym steniu kwasu ursolowego (7,43%, UA 50 M). Ze wzgldu na bardzo wysokie odchylenie standardowe dla prby z UA 100 M wynik nie jest analizowany. W przypadku kwasu ursolowego liczba komrek apoptotycznych (Rys. 16) bya znaczco wysza ni komrek nekrotycznych i komrek kontrolnych i rosa wraz ze wzrostem stenia UA, osigajc najwysz warto (26,46%) przy steniu 50 M. Wpyw mieszaniny kwas ursolowego i kwasu oleanolowego Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci mieszaniny kwasu ursolowego i oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 7. Dla porwnania w tabeli umieszczono rwnie wyniki otrzymane dla komrek hodowanych z wolnym kwasem ursolowym w steniu 10 M oraz z kwasem oleanolowym w steniu 25 i 50 M.
Tabela 7: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym Kontrola EtOH 100 M 92,17% 0,94 2,77% 0,48 5,07% 0,47 UA10 M OA10 M 94,08% 0,91 3,03% 0,46 2,89% 0,59 UA10 M OA25 M 92,82% 0,5 5,03% 0,99 2,15% 1,51 UA10 M OA50 M 93,73% 1,23 2,84% 0,03 3,43% 1,27 UA 10 M OA 25 M OA 50 M

ywe nekroza apoptoza

92,96% 1,29 3,59% 0,4 3,47% 0,88

86,42% 88,20% 90,00% 1,57 1,29% 3,42% 1,53% 0,23 12,28% 8,37% 8,48% 1,33

ROZDZIA 4. WYNIKI

32

                 

Rysunek 17: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym

                ! "   ! ! " 


   


Rysunek 18: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym i oleanolowym

Liczba ywych komrek (Rys. 17) jest taka sama w poszczeglnych prbach (ok. 9294%). Najwicej komrek ywych wystpuje w prbie z UA 10 M + OA 10 M (94,08%), najmniej w kontroli z etanolem 100 M (92,17%). Rwnie liczba komrek apoptotycznych i nekrotycznych (Rys. 18) utrzymuje si

ROZDZIA 4. WYNIKI

33

na podobnie niskim poziomie we wszystkich prbach. Nie zaobserwowano te zalenoci midzy liczb komrek martwych a wzrastajcym steniem kwasu oleanolowego w mieszaninie. Apoptoza w adnym ze stosowanych ste zwizkw nie jest wiksza ni w kontroli, najwysz warto osigajc w kontroli z etanolem 100 M (5,07%), a najnisz dla mieszaniny UA 10 M + OA 25 M (2,15%). Z kolei w tej prbie nekroza osigna warto najwysz (5,03%), za najnisz w prbie z etanolem (2,77%). Porwnujc wyniki otrzymane dla komrek DeTa hodowanych z mieszanin kwasu oleanolowego i ursolowego z wynikami otrzymanymi dla hodowli z pojedynczymi kwasami, nie zaobserwowano istotnych rnic w liczbie komrek ywych i komrek nekrotycznych. Jedynie liczba komrek apoptotycznych jest wysza o ok. 10% dla prby z UA 10 M i o ok. 5% dla OA 25 M i 50 M od prby z mieszanin obu kwasw. Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 8.
Tabela 8: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego kontrola ywe 90,35% 0,68 nekroza 2,34% 0,16 apoptoza 7,32% 0,51 EtOH 100 M 87% 3,44 3,55% 0,24 9,46% 3,2 Mono 10 M 93,65% 0,15 2,77% 0,31 3,58% 0,45 Mono 25 M 91,28% 0,18 3,16% 0,03 5,56% 0,22 Mono 50 M 15,04% 4,35 79,68% 6,59 13,42% 2,23 Mono 100 M 2,70% 0,12 89,89% 0,47 7,42% 0,59 Mono 150 M 6,78% 0,53 81,26% 1,31 11,42% 1,57 Mono 200 M 6,57% 0,23 80,13% 4,48 13,30% 4,22

Podobnie wysokie wartoci liczby komrek ywych wystpuj w obu kontrolach (87% i 90%) i w obecnoci monoglukozydu OA przy steniach 10 M i 25 M (Rys. 19). Poczwszy od monoglukozydu OA w steniu 50 M liczba komrek ywych gwatownie maleje, osigajc najnisz warto dla stenia 100 M (2,7%). Dla obu najwyszych ste 150 i 200 M liczba komrek ywych jest podobna i wynosi ok. 6,5%. Wraz ze spadkiem liczby komrek ywych wzrasta liczba komrek martwych niewielka liczba komrek nekrotycznych wystpuje w przypadku obu kontroli i stenia 10

ROZDZIA 4. WYNIKI

34

                          

Rysunek 19: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego

M i 25 M monoglukozydu OA, nieprzekraczajc 3,55%. Liczba komrek nekrotycznych (Rys. 20) gwatownie wzrasta od stenia 50 M monoglukozydu i jest najwysza dla stenia 100 M (89,89%). W przypadku komrek apoptotycznych wida, e ich liczba jest zdecydowanie nisza ni nekrotycznych (Rys. 20). Ponadto liczba komrek apoptotycznych w kontrolach (rnica ok. 2%) i prbie z monoglukozydem w steniu 100 M jest wysza ni dla ste 10, 25. Najwicej komrek apoptotycznych wystpuje w obecnoci monoglukozydu OA w steniu 50 M i 200 M (ok. 13 %). Od stenia 100 M do 200 M liczba komrek apoptotycznych wzrasta. W obu kontrolach i w prbach z monoglukozydem w steniach 10 M i 25 M komrek apoptotycznych jest wicej ni nekrotycznych, natomiast przy wyszych steniach monoglukozydu OA odwrotnie. Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci triglikozydu kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 9. Najwicej komrek ywych (Rys. 21) znajduje si w kontroli (89,07%) i kontroli z etanolem (79,52%). Natomiast we wszystkich prbach z triglikozydem OA liczba ywych

ROZDZIA 4. WYNIKI

35

                                                 ! "     " 

Rysunek 20: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego Tabela 9: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego ywe nekroza apoptoza kontrola 89,07% 2,04 5,08% 1,6 5,85% 2,2 EtOH 100 M 79,52% 2,62 8,26% 1,42 12,26% 4,04 Tri 50 M 54,59% 3,68 30,18% 0,93 15,24% 2,74 Tri 100 M 52,46% 2,12 28,49% 0,3 19,06% 1,82 Tri 150 M 54,36% 1,7 31,86% 2,35 13,79% 0,65

komrek jest podobna i wynosi rednio 54%.

ROZDZIA 4. WYNIKI

36

            

Rysunek 21: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego

    
                              

Rysunek 22: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego

ROZDZIA 4. WYNIKI

37

Podobnie we wszystkich prbach z triglikozydem OA liczba komrek nekrotycznych wynosi ok. 30% (Rys. 22) bez wzgldu na stenie. Najmniej komrek apoptotycznych znajduje si w kontroli (5,85%), najwicej w prbie z triglikozydem o steniu 100 M (Rys. 22). Liczba komrek apoptotycznych wynosia mniej wicej poow liczby komrek nekrotycznych we wszystkich prbach z triglikozydem kwasu oleanolowego. Wpyw mieszaniny saponin Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w obecnoci mieszaniny saponin w rnych steniach zestawiono w tabeli 10.
Tabela 10: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin kontrola ywe nekroza apoptoza 92,96% 1,29 3,56% 0,4 3,47% 0,88 EtOH 100 M 92,17% 0,95 2,77% 0,48 4,41% 0,45 Sapo 29 M 91,64% 0,2 3,13% 0,78 5,07% 0,47 Sapo 57 M 92.30% 1,46 3,33% 0,33 5,52% 0,16 Sapo 86 M 93,43% 0,35 3,24% 0,11 5,20% 0,62 Sapo 143 M 92,46% 0,88 4,13% 0,98 4,97% 0,3 Sapo 200 M 91,86% 0,71 3,57% 0,67 4,38% 1,14

Nie obserwuje si znaczcych rnic midzy liczb ywych komrek przy wzrastajcych dawkach saponin (Rys. 23). Najnisze wartoci procentowe ywych komrek wystpiy w przypadku podania saponin w steniu 29 M (91,64%) i 200 M (91,86%), a najwysze (93,43%) przy steniu 86 M.

ROZDZIA 4. WYNIKI

38

      
                     !" "$ #$ $% & '   ' 

Rysunek 23: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin

      
         
   ! "    " 

Rysunek 24: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z mieszanin saponin

ROZDZIA 4. WYNIKI

39

We wszystkich przypadkach zarwno nekroza jak i apoptoza (Rys. 24) utrzymuje si na niskim poziomie, przy czym liczba komrek nekrotycznych we wszystkich prbach ma podobn warto ok. 3,5%, a komrek apoptotycznych nieco wysz w przypadku prb z saponinami (ok. 5%). Najnisza warto nekrozy wystpia u komrek kontrolnych z etanolem (2,77%), a najwysza u komrek z saponinami w steniu 143 M (4,13%). Najmniej komrek apoptotycznych znajdowao si w kontroli (3,47%). Natomiast najwicej w przypadku saponin w steniach 29, 57, 86 M, z czego najwiksz warto osigno dla komrek ze steniem saponin 57 M (5,52%).

Rozdzia 5

Dyskusja

Badanie waciwoci cytotoksycznych i proapoptotycznych Do medium, w ktrym hodowano komrki linii DeTa dodawano zwizki wystpujce w korzeniu B. vulgaris, czyli kwas oleanolowy, triglikozyd kwasu oleanolowego oraz mieszanin pozostaych omiu saponin. W celu zbadania, jak zmiany budowy czsteczki naturalnych triterpenoidw wpywaj na ich waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne, podawano rwnie zwizki, ktrych obecno w buraku wikowym nie zostaa wykryta [12], t.j. kwas ursolowy oraz jego mieszanin z kwasem oleanolowym, a take syntetyzowany 3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego. Monoglukozyd kwasu oleanolowego, zawierajcy pojedyncz glukoz poczon wizaniem glikozydowym z grup 3-hydroksylow kwasu oleanolowego, zosta wybrany jako zwizek poredni midzy wolnym kwasem oleanolowym a jego triglikozydow pochodn wyizolowan z korzenia B. vulgaris. Z kolei kwas ursolowy jest izomerem kwasu oleanolowego, rnicym si pooeniem grup metylowych przy wglach C-19 i C-20 i czsto wykazujcym silniejsze waciwoci farmakologiczne. Stenia podawanych zwizkw ustalono, analizujc przegld literatury. Istniej doniesienia o oddziaywaniu kwasu ursolowego i niektrych saponin na linie komrkowe ju przy steniach rzdu kilku M [17, 47, 50, 66] lub kilkudziesiciu M [19, 72]. W przypadku linii komrkowej HepG2, ludzkiego wtrobiaka zarodkowego, kwas ursolowy obnia ywotno komrek przy steniu poniej 30 M, natomiast powyej tej wartoci indukowa apoptoz, wywoujc fragmentacj DNA, powstanie komrek subdiploidalnych, uwolnie40

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

41

nie cytochromu c oraz zalenej od niego kaspazy 3 [33]. Na tej podstawie ustalono rozpito ste dla kwasu oleanolowego od 25 do 150 M i dla kwasu ursolowego od 10 do 100 M, dostosowujc do tych wartoci ilo pozostaych zwizkw. Inkubacj komrek ze zwizkami prowadzono 24 godziny, poniewa po tym czasie skad medium ulega zmianom, ktre mogyby mie wpyw na przeywalno komrek. W celu sprawdzenia, czy wyniki otrzymane dla wszystkich badanych zwizkw s porwnywalne, w tabelach 11, 12 i na rysunkach 25, 26 przedstawiono rezultaty pomiarw cytometrycznych dla wszystkich kontroli oraz kontroli z etanolem w steniu 100 M.
Tabela 11: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych ywe nekroza apoptoza OA 90,35% 0,68 2,34% 0,16 7,32% 0,51 UA 90,76% 0,86 1,85% 0,66 7,40% 0,21 UA+OA 92,96% 1,29 3,59% 0,40 3,47% 0,88 Mono 90,35% 0,68 2,34% 0,16 7,32% 0,51 Tri 89,07% 1,42 5,08% 1,34 5,85% 1,30 Sapo 92,96% 1,29 3,59% 0,40 3,47% 0,88 rednia 91,07 3,13 5,80

Tabela 12: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M ywe nekroza apoptoza OA 87,00% 3,44 3,55% 0,24 9,46% 3,20 UA 89,62% 0,95 1,29% 0,32 9,05% 1,20 UA+OA 92,17% 0,95 2,77% 0,48 5,0% 0,47 Mono 87,00% 3,44 3,55% 0,24 9,46% 3,20 Tri 76,52% 2,62 8,26% 1,42 12,23% 4,04 Sapo 92,17% 0,95 2,77% 0,48 4,41% 0,45 rednia 87,41 3,70 8,28

Wyniki otrzymane dla kontroli s podobne, rnice wynosz maksymalnie ok. 4%. Wiksze rnice wystpiy w zestawieniu kontroli z etanolem (7-15%). Porwnanie rednich wartoci wszystkich kontroli i kontroli z etanolem pokazuj niewielkie rnice (ok. 3-4%) midzy wartociami procentowymi komrek ywych i apoptotycznych oraz brak rnic dla komrek nekrotycznych. Podsumowujc, niewielkie rnice midzy prbami kontrolnymi pozwalaj porwnywa ze sob aktywnoci badanych zwizkw, co wicej obecno etanolu, w ktrym byy

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

42

 $   ! #    
          " " %%&" '( )( '( . )( *  +, -" % %

Rysunek 25: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych

   ! "# % & ' (               $ $ ))*$ +, -, +, 2 -, .  /0 1$ ) )

Rysunek 26: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M

rozpuszczone podawane triterpenoidy, praktycznie nie wpywaa na przeywalno komrek. Aktywno cytotoksyczn mierzono dwiema metodami jedn z zastosowaniem barwnika bkitu trypanu (pkt 3.8) i bardziej dokadn, rnicujc komrki martwe na ne-

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

43

krotyczne i apoptotyczne, metod cytometrii przepywowej (pkt 3.9). Otrzymane obiema metodami wyniki dla hodowli z 3-O-monoglukozydem OA oraz triglikozydem OA znacznie rni si midzy sob. Wyniki analizy cytometrycznej pokazuj radykaln aktywno cytotoksyczn 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego na komrki DeTa, ktry obnia liczb ywych komrek w prbie nawet o 97%. Z kolei przy zastosowaniu bkitu trypanu stwierdzono obnienie liczby ywych komrek o 83%. Poniewa cytometria przepywowa jest metod znacznie bardziej precyzyjn ni liczenie komrek pod mikroskopem wietlnym, wyniki uzyskane t metod s bardziej wiarygodne. Analizujc proporcje komrek apoptotycznych i komrek nekrotycznych okazao si, e aktywuje on gwnie mier na drodze nekrozy, w mniejszym stopniu indukujc programowan mier komrkow. Aktywno proapoptotyczna wystpia na podobnym poziomie, jak w hodowli w obecnoci OA w steniu 150 M oraz UA w steniu 10 M. Wyniki uzyskane obiema metodami dla triglikozydu kwasu oleanolowego rwnie rni si midzy sob. W pomiarze z uyciem bkitu trypanu zaobserwowano sabsz aktywno cytotoksyczn (ok. 70-80% ywych komrek) ni w pomiarze cytometrycznym (ok. 54%). Wrd komrek martwych komrki nekrotyczne do apoptotycznych wystpoway w stosunku 2:1. Stosujc obie metody, wykazano e dziaanie cytotoksyczne triglikozydu kwasu oleanolowego byo silniejsze ni wolnego kwasu oleanolowego, ale sabsze od 3-O-monoglukozydu OA. Interesujcym jest, e w pomiarze cytometrycznym nie zaobserwowano zmian aktywnoci triglikozydu w zalenoci od stenia. Wydaje si wic, e wynik uzyskany w metodzie z uyciem bkitu trypanu dla triglikozydu OA o steniu 100 M, ktry odbiega od dwch pozostaych wynikw dla ste 50 M i 150 M, jest najprawdopodobniej zwizany z niedoskonaoci zastosowanej metody. Kwas oleanolowy nie wykazywa znaczcego dziaania cytotoksycznego bez wzgldu na zastosowan metod. Rnice dotyczce liczby ywych komrek wyniosy kilka procent. Wraz ze wzrostem stenia tylko nieznacznie rosa liczba komrek znajdujcych si w apoptozie, dlatego mona powiedzie, e kwas oleanolowy w podanych steniach wykazywa jedynie bardzo sabe waciwoci proapoptotyczne na komrki linii DeTa.

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

44

Uzyskane wyniki wyranie wskazuj na zaleno dziaania cytotoksycznego od struktury triterpenoidu. Kwas oleanolowy z woln grup hydroksylow przy wglu C-3 i woln grup karboksylow przy wglu C-17 praktycznie nie wykazywa badanych aktywnoci, natomiast zablokowanie grupy hydroksylowej przez czsteczk glukozy radykalnie zmieniao waciwoci zwizku. 3-O-monoglukozyd OA zabija niemal wszystkie komrki w prbie. Obecno dodatkowej heksozy oraz kwasu glukuronowego w triglikozydzie OA obniaa aktywno cytotoksyczn prawie o poow. Jednak nieznajc dokadnej budowy reszt cukrowych triglikozydu kwasu oleanolowego wyizolowanego z B. vulgaris, ani miejsca ich przyczenia do aglikonu, nie mona wykluczy, e to nie liczba reszt cukrowych, a ich rodzaj i miejsce wystpowania w czsteczce saponiny decyduj o aktywnoci biologicznej caego zwizku. Z drugiej strony mieszanina omiu saponin triterpenowych z buraka wikowego w podanych steniach nie wykazaa ani wybirczo waciwoci proapoptotycznych ani waciwoci cytotoksycznych. W mieszaninie tej wystpuj zarwno di-, trijak i tetra-glikozydy kwasu oleanolowego (6 zwizkw) oraz kwasu hydroksy-oleanolowego (2 zwizki) o nieznanych proporcjach ilociowych. Jako e dominujcy ilociowo wrd saponin triterpenowych wystpujcych w korzeniu buraka wikowego, triglikozyd kwasu oleanolowego wykazywa dziaanie cytotoksyczne, a mieszanina pozostaych omiu zwizkw nie wykazywaa tej aktywnoci, to wydaje si e zarwno liczba reszt cukrowych, ich rodzaj i miejsce przyczenia maj istotny wpyw na aktywno biologiczn zwizku. Nie mona wykluczy, i w tej mieszaninie wystpuj glikozydy o aktywnoci cytotoksycznej, ale by moe wystpuj one w bardzo maych ilociach i/lub znosz wzajemnie swoje dziaanie. Podobnie Gurnkel i Rao [21] stwierdzili brak waciwoci cytotoksycznych saponin triterpenowych wyizolowanych z soi na komrki nowotworowe jelita grubego linii HT-29. Nastpnie przeprowadzili fermentacj glikozydowych pochodnych przez bakterie nalece do mikroory jelitowej, otrzymujc aktywne aglikony. Zatem glikozydowe pochodne mog potencjalnie dziaa przeciwnowotworowo in vivo, nie wykazujc takiego dziaania in vitro, poniewa w wyniku hydrolizy w organizmie chorego mog dostarcza aktywnych, czy to aglikonw czy zwizkw z mniejsz iloci reszt cukrowych, np. monoglikozydw.

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

45

W nienijszej pracy wykazano rwnie, i na waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne triterpenoidw mia wpyw nie tylko doczony do aglikonu cukier, ale take zmiana pooenia jednej grupy metylowej w piercieniu E. Ot kwas ursolowy, w przeciwiestwie do kwasu oleanolowego, obnia liczb ywych komrek linii DeTa o ok.24-30%, przy czym wicej byo komrek apoptotycznych ni komrek nekrotycznych, co wskazuje na waciwoci proapoptotyczne kwasu ursolowego. Wyniki dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego kwasu oleanolowego oraz kwasu ursolowego na komrki linii DeTa odbiegaj od danych literaturowych dotyczcych innych linii komrek nowotworowych. Harmand i wsppracownicy, badajc indukowanie apoptozy w komrkach linii HaCat przez kwasu ursolowy, otrzymali IC50 dla stenia 12.5 M [24]. Inni badacze, analizujc waciwoci cytotoksyczne UA na komrki linii B16, otrzymali IC50 przy steniu 10 M [17] za na komrki HepG2 przy 30 M [33]. Z kolei w badaniach dziaania cytotoksycznego kwasu oleanolowego IC50 wynosio poniej 10 g/ml dla trzech linii komrkowych HO-8910, Hela oraz HL60 [67]. Nie zaobserwowano synergistycznego dziaania kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego przy zastosowaniu mieszaniny obu kwasw w najniszych steniach, przy ktrych aden z nich z osobna nie wykazywa badanych aktywnoci. Oznacza to, e przy zastosowanych steniach oba izomery nie wpywaj wzajemnie na swoje dziaanie.

Podsumowanie
Z korzenia Beta vulgaris var. esculenta przy zastosowaniu rnych warunkw ekstrakcji i chromatograi wyizolowano mieszanin dziewiciu saponin triterpenowych, z ktrej wyodrbniono triglikozyd kwasu oleanolowego. Analiza MS wykazaa obecno siedmiu glikozydw kwasu oleanolowego oraz dwch glikozydw kwasu hydroksy-oleanolowego. Dominujcy ilociowo w mieszaninie saponin triglikozyd OA zawiera w swojej czsteczce dwie heksozy i kwas glukuronowy.

ROZDZIA 5. DYSKUSJA

46

Nastpnie zbadano waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne zwizkw wyizolowanych z B. vulgaris oraz wolnych kwasw triterpenowych oleanolowego i ursolowego, a take 3-O-monoglukozydu OA za pomoc dwch metod jednej z zastosowaniem bkitu trypanu i drugiej cytometrii przepywowej. Wyniki otrzymane po analizie cytometrycznej s znacznie bardziej precyzyjne. Wykazano zaleno aktywnoci cytotoksycznej i proapoptotycznej od struktury triterpenoidu. Wolny kwas oleanolowy nie wykazywa dziaania cytotoksycznego ani znaczcego dziaania proapoptotycznego. Zmiana pooenia jednej z dwch grup metylowych wystpujcych w kwasie oleanolowym przy wglu C-20 w pozycj C-19 w kwasie ursolowym powodowaa wzrost waciwoci proapototycznych kwasu ursolowego o ok. 18% i cytotoksycznych o ok. 24%. W badanych steniach nie stwierdzono synergistycznego dziaania kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego na komrki linii DeTa. Zdecydowany wpyw na badane waciwoci miao doczenie czsteczki glukozy do wolnego kwasu oleanolowego. Przy steniu 100 M 3-O-monoglukozyd OA praktycznie zabija wszystkie komrki. Z kolei obecno trzech reszt cukrowych, skadajcych si z dwch heksoz i kwasu glukuronowego, obniaa aktywno cytotoksyczn zwizku o poow. Obie pochodne glikozydowe w wikszym stopniu indukoway mier nekrotyczn ni apoptotyczn, co nie jest korzystne z punktu widzenia potencjalnego zastosowania w terapii, w ktrej powinny by stosowane zwizki wybirczo eliminujce komrki nowotworowe i nie niszczce zdrowej tkanki. Mieszanina omiu saponin triterpenowych bez triglikozydu kwasu oleanolowego nie wykazywaa istotnego wpywu na komrki linii DeTa. By moe aden spord zwizkw w mieszaninie nie wykazuje aktywnoci cytotoksycznej i proapoptotycznej lub te substancje aktywne mog wystpowa w niewielkich ilociach, a pozostae saponiny nie wykazywa badanych waciwoci i/lub znosi wzajemnie swoje dziaanie.

Bibliograa

[1] BB Aggarwal and S Shishodia. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer. Biochemical Pharmacology, (71):1397 1421, 2006. [2] B Alberts. Molecular Biology of The Cell. New York, 2002.
[cytowanie na str. 4]

[cytowanie na str. 8, 10]

[3] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis and evaluation of potential complement inhibitory semisynthetis analogs of oleanolic acid. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (9):18891894, 1999.
[cytowanie na str. 11]

[4] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis and evaluation of potential complement inhibitory semisynthetis analogs of oleanolic acid enantioselective synthesis and complement inhibitory assay of a/b-ring partial analogues of oleanolic acid. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, (11):16191623, 2001.
[cytowanie na str. 11]

[5] JH Baek, YS Lee, CM Kang, JA Kim, KC Kwon, HC Son, and KW Kim. Intracellular ca2+ release mediates ursolic acid-induced apoptosis in human leucemic hl-60 cells. International Journal of Cancer, (73):725728, 1997.
[cytowanie na str. 11]

[6] W BaerDubkowska. Chemoprewencja - prolaktyka i terapia wspomagana rakw gowy i szyji. Postpy w Chirurgii Gowy i Szyi, (2):314, 2003.
[cytowanie na str. 4]

[7] E Bedir, H Krmzpekmez, O Stitcher, and D Cal. Triterpene saponins from the fruits of hedera helix. Phytochemistry, (53):905, 2000.
[cytowanie na str. 8]

[8] SA Beresford, KC Johnson, C Ritenbaugh, NL Lasser, LG Snetselaar, HR Black, GL Anderson, AR Assaf, T Bassford, D Bowen, RL Brunner, RG Brzyski, B Caan, RT Chlebowski, M Gass, RC Harrigan, J Hays, D Heber, G Heiss, SL Hendrix,
47

BIBLIOGRAFIA

48

Howard BV, J Hsia, FA Hubbell, RD Jackson, JM Kotchen, LH Kuller, AZ LaCroix, DS Lane, RD Langer, CE Lewis, JE Manson, KL Margolis, Y Mossavar-Rahmani, JK Ockene, LM Parker, MG Perri, L Phillips, RL Prentice, J Robbins, JE Rossouw, GE Sarto, ML Stefanick, L Van Horn, MZ Vitolins, J Wactawski-Wende, RB Wallace, and Whitlock E. Low-fat dietary pattern and risk of colorectal cancer: the womens health initiative randomized controlled dietary modication trial. The Journal of the American Medical Association, 6(295):643654, 2006.
[cytowanie na str. 5]

[9] CY Choi, HJ You, and HG Jeong. Nitric oxide and tumor necrosis factor- production by oleanolic acid via nuclear factor-b activation in macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications, (288):4955, 2001.
[cytowanie na str. 9]

[10] YH Choi, JH Baek, MA Yoo, HY Chung, ND Kim, and KW Kim. Induction of apoptosis by ursolic acid through activation of caspases and down-regulation of c-iaps in human prostate epithelial cells. International Journal of Oncology, (17):565571, 2000.
[cytowanie na str. 11]

[11] I Chojnicka and W Janiszowska. Przeciwnowotworowe dziaanie rolinnych triterpenoidw: kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego oraz ich pochodnych. Kosmos, (3-4):335341, 2007.
[cytowanie na str. 9, 12]

[12] A Chouj, I Chojnicka, and W Janiszowska. Preliminary glc and ms analysis of aglycone moiety of saponins from beetroot (Beta vulgaris var. esculenta). Lublin, (71), 2006.
[cytowanie na str. 5, 12, 40]

[13] A Chouj and W Janiszowska. Pochodne kwasu oleanolowego i ich dziaanie farmakologiczne. Herba Polonica, (51):6675, 2005.
[cytowanie na str. 9, 12]

[14] J Crocker and PG Murray. Molecular Biology in Cellular Pathology. Chichester, 2003.
[cytowanie na str. 10]

[15] M Degowska and G Rydzewska. Chemoprewencja raka jelita grubego. Przewodnik Lekarski, (10):4641, 2005.
[cytowanie na str. 4, 9, 11]

[16] D Es-saady, A Simon, C Jayat-Vignoles, AJ Chulia, and C Delage. Mcf-7 cell cycle arrested at g1 through ursolic acid andincreased reduction of tetrazolium salts. Anticancer Research, (16):481486, 1996.
[cytowanie na str. 11]

BIBLIOGRAFIA

49

[17] D Es-saady, A Simon, M Ollier, JC Maurizis, AJ Chulia, and C Delage. Inhibitory eect of ursolic acid on b16 proliferation through cell cycle arrest. Cancer Letters, (106):193197, 1996.
[cytowanie na str. 11, 40, 45]

[18] J Fernandes, RO Castilho, M Rangel da Costa, K Wagner-Souza, MA Coelho Kaplan, and CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae species: cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines. (190):165169, 2003.
[cytowanie na str. 9]

Cancer Letters,

[19] J Fernandesa, RO Castilhob, MR da Costaa, K Wagner-Souzac, MA Kaplanb, and CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae species: cytotoxicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines. Cancer Letters, (190):165169, 2003.
[cytowanie na str. 40]

[20] O Guclu-Ustundag and G Mazza. Saponins: Properties, applications and processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, (47):231258, 2007.
[cytowanie na str. 12]

[21] RAO AV Gurnkel, DM and. Soyasaponins: The relationship between chemical structure and colon anticarcinogenic activity. Nutrition and Cancer, (47):2433, 2003.
[cytowanie na str. 44]

[22] R Hakkak, S Korourian, MJ Ronis, JM Johnston, and TM Badger. Soy protein isolate consumption protects against azoxymethane-induced colon tumors in male rats. Cancer Letters, 1(166):2732, 2001.
[cytowanie na str. 5]

[23] PO Harmand, R Duval, C Delage, and A Simon. Ursolic acid induces apoptosis through mitochondrial intrinsic pathway and caspase-3 activation in m4beu melanoma cells. International Journal of Oncology, (10):111, 2005.
[cytowanie na str. 11]

[24] PO Harmand, R Duval, B Liagre, C Jayat-Vignoles, JL Beneytout, C Delage, and A Simon. Ursolic acid induces apoptosis through caspase-3 activation and cell cycle arrest in hacat cells. International Journal of Oncology, (23):105112, 2003.
[cytowanie na str. 45]

[25] K Hostettmann and A Marston. Saponins. Cambridge University Press, 1995.

[cytowanie na str. 6]

BIBLIOGRAFIA

50

[26] Y Hsu, JJ Yang, and CC Lin. Eects of oleanolic acid and ursolic acid on inhibiting tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system postirradiation in mice. Cancer Letters, (111):713, 1997.
[cytowanie na str. 9]

[27] Sun HX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids from the rhizomes of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. (90):261265, 2004.
[cytowanie na str. 11] [cytowanie na str. 8]

Journal of Ethnopharmacology,

[28] M Jakbisiak and W Lasek. Immunologia. Warszawa, 2002.

[29] Z Kasprzyk and Z Wojciechowski. The structure of triterpenic glycosides from owers of Calendula ocinalis l. Phytochemistry, (6):69, 1967.
[cytowanie na str. 8]

[30] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and W Janiszowska. Incorporation of 1-14c-acetate into glycosides of oleanolic acid in Calendula ocinalis. Phytochemistry, (19):561, 1960.
[cytowanie na str. 8]

[31] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and A Kuczewska-Jankowska. des Science, (14):747, 1966.

The glycosides of

triterpenic acid from Helianthus annus l. owers. Bulletin LAcademie Polonaise

[cytowanie na str. 8]

[32] K Kawabata, T Tanaka, T Murakami, T Okada, H Murai, T Yamamoto, A Hara, M Shimizu, Y Yamada, K Matsunaga, T Kuno, N Yoshimi, S Sugie, and H Mori. Dietary prevention of azoxymethane-induced colon carcinogenesis with rice-germ in f344 rats. Carcinogenesis, 11(20):21092115, 1999.
[cytowanie na str. 5]

[33] DK Kim, JH Baek, CM Kang, MA Yoo, JW Sung, HY Chung, ND Kim, YH Choi, SH Lee, and KW Kim. (87):629636, 2000. [34] S Kohlm unzer. Warszawa, 1998. Apoptotic activity of ursolic acid may correlate with the inhibition of initiation of dna replication. International Journal of Cancer,
[cytowanie na str. 9, 41, 45]

Farmakognozja.
[cytowanie na str. 6, 7]

Number 277. Wydawnictwo Lekarskie PZWL,

[35] J Kotynia and E Maecka-Panas. Uwarunkowania rodowiskowe i chemoprewencja raka jelita grubego. Gastroenterologia Polska, (10):7583, 2003.
[cytowanie na str. 9]

[36] D Kritchevsky and DM Klurfeld. Interaction of ber and energy registration in experimental colon carcinogens. Cancer Letters, 1(114):5152, 1997.
[cytowanie na str. 5]

BIBLIOGRAFIA

51

[37] F Lauthier, L Taillet, P Trouillas, C Delage, and A Simon. Ursolic acid triggers calcium-dependent apoptosis in human daudi cells. Anticancer Drugs, (11):737745, 2000.
[cytowanie na str. 11]

[38] J Liu. Oleanolic acid and ursolic acid: Research perspectives. Journal of Ethnopharmacology, (100):9294, 2005.
[cytowanie na str. 12]

[39] H Lodish, A Berk, P Matsudaira, CA Kaiser, P Krieger, MP Scott, L Zipursky, and J Darnell. Molecular Cell Biology. www.whfreeman.com/lodish, 2003.
[cytowanie na str. 10]

[40] JS Mandel.

Colorectal cancer screening.

[cytowanie na str. 4]

Cancer and Metastasis Reviews,

(16):263279, 1997.

[41] S Marquina, N Maldonado, ML Garduno-Ramirez, E Aranda, ML Villarreal, Navarro V, R Bye, G Delgado, and L Alvarez. Bioactive oleanolic acid saponinc and other constituents from the roots of Viguiera decurrens. Phytochemistry, (56):9397, 2001.
[cytowanie na str. 11]

[42] GH McIntosh, GO Regester, RK Le Leu, PJ Royle, and GW Smithers. Dairy proteins protect against dimethylhydrazine-induced intestinal cancers in rats. The Journal of Nutrition, 4(125):809816, 1995.
[cytowanie na str. 5]

[43] Y Mimakia, M Fukushimaa, A Yokosukaa, SashidaaY, S Furuyab, and H Sakagamib. Triterpene glycosides from the roots of Sanguisorba ocinalis. (57):773779, 2001.
[cytowanie na str. 11]

Phytochemistry,

[44] Y Mizushina, A Ikuta, K Endoh, M Oshige, N Kasai, K Kamiya, T Satake, H Takazawa, H Morita, H Tomiyasu, H Yoshida, SugawaraF, and K Sakaguchi. Inhibition of dna polymerases and dna topoisomerase ii by triterpenes produced by plant callus. Biochemical and Biophysical Research Communications, (305):365373, 2003.
[cytowanie na str. 11]

[45] RG Montoya and MJ Wargovich. Chemoprevention of gastrointestinal cancer. Cancer and Metastasis Reviews, (16):405419, 1997.
[cytowanie na str. 5]

[46] RK Murray, DK Granner, PA Mayes, and Rodwell VW. Biochemia Harpera. Warszawa, 2006.
[cytowanie na str. 8, 9]

BIBLIOGRAFIA

52

[47] A Najid, A Simon, J Cook, EL Chable-Rabinovitch, C Delageb, AJ Chulia, and M Rigaud. Characterization of ursolic acid as a lipoxygenase and cyclooxygenase inhibitor using macrophages, platelets and dierentiated hl60 leukemic cells. FEBS Letters, (299):213217, 1992.
[cytowanie na str. 9, 40]

[48] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, and T Inakuma. Prevention of n-methylnitrosourea-induced colon carcinogenesis in rats by oxygenated carotenoid capsanthin and capsanthin-rich paprika juice. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 2(224):116122, 2000.
[cytowanie na str. 5]

[49] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, H Sakamoto, T Inakuma, Y Ishiguro, J Takayasu, and H Nishino. Prevention of n-methylnitrosourea induced colon carcinogenesis in f344 rats by lycopene and tomato juice rich in lycopene. Japanese journal of cancer research, 10(89):10031008, 1998.
[cytowanie na str. 5]

[50] T Oguro, J Liu, CD Klaassen, and T Yoshida. Inhibitory eect of oleanolic acid on 12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced gene expression in mouse skin. Toxicological Sciences, (45):88 93, 1998.
[cytowanie na str. 9, 40]

[51] W Oleszek, K Gowniak, and B Leszczyski. Biologiczne oddziaywania rodowiskowe. Number 13. Akademia Medyczna Lublin, 2001.
[cytowanie na str. 6, 7]

[52] MJ ONeil, A Smith, and PE Heckelman. The Merck Index - An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals. Number 753. New York, 2001.
[cytowanie na str. 7, 8]

[53] J Ostrowski, Z Szczepirkowski, L Trzeciak, M Rochowska, K Skurzak, and E Butruk. Induction of ornithine decarboxylase in normal and protein kinase c-depleted human colon carcinoma cells. Journal of Physiology and Pharmacology, (43):373382, 1992.
[cytowanie na str. 13]

[54] MA Pereira, CJ Grubbs, LH Barnes, H Li, GR Olson, I Eto, M Juliana, LM Whitaker, GJ Kello, Steele VE, and RA Lubet. Eects of the phytochemicals, curcumin and quercetin, upon azoxymethane-induced colon cancer and 7,12-dimethylbenz--anthracene-induced mammary cancer in rats. Carcinogenesis, 6(17):13051311, 1996.
[cytowanie na str. 5]

BIBLIOGRAFIA

53

[55] D Ruszkowski, A Szakiel, and W Janiszowska. Metabolism of [3-3h]oleanolic acid in Calendula ocinalis roots. Anatomy, Physiology and Pharmacology, (25):311, 2003.
[cytowanie na str. 8]

[56] A Schatzkin, E Lanza, D Corle, P Lance, F Iber, B Caan, M Shike, J Weissfeld, R Burt, MR Cooper, JW Kikendall, and J Cahill. Lack of eect of a low-fat, high-ber diet on the recurrence of colorectal adenomas. polyp prevention trial study group. The New England Journal of Medicine, 16(342):1149 1155, 2000.
[cytowanie na str. 5] [cytowanie na str. 10]

[57] WA Schulz. Molecular Biology of Human Cancers. Dordrecht, 2005. [58] Shimada, 2007.

http://www.shimadadesigns.com/gallery/v/beet.html.

[cytowanie na str. 6, 57]

[59] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud. Inhibition of lipooxygenase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic acid isolated from heater owers (Calluna vulgaris). Biochimica et Biophysica Acta, (1125):6872, 1992.
[cytowanie na str. 9]

[60] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud. Inhibition of lipooxygenase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic acid isolated from heater owers Calluna vulgaris. Biochmica et Biophysica Acta, (1125):6872, 1992.
[cytowanie na str. 9]

[61] American

Cancer

Society.

Cancer

facts

and

gures

2007,

2007.

http://www.cancer.org/downloads/STT/CAFF2007PWSecured.pdf. [62] LO Somova, A Nadar, P Rammanan, and FO Shode. hypertension. Phytomedicine, (10):115121, 2003.

[cytowanie na str. 3]

Cardiovascular, antihy-

perlipidemic and antioxidant eects of oleanolic and ursolic acids in experimental

[cytowanie na str. 9]

[63] SG Sprag, ME Light, and J van Staden. Biological activities and distribution of plant saponins. Journal of Ethnopharmacology, (94):219 243, 2004.
[cytowanie na str. 9, 11]

[64] H Strzelecka and J Kowalski. Encyklopedia zielarstwa i zioolecznictwa. Warszawa, 2006.

[cytowanie na str. 5]

BIBLIOGRAFIA

54

[65] K Subbaramaiah, P Michaluart, MB Sporn, and AJ Dannenberg. Ursolic acid inhibits cyklooxygenase-2 transcription in human mammary epithelial cells. Cancer Research, (60):23992404, 2000.
[cytowanie na str. 9, 11]

[66] MK Sung and RAO AV Kendall, CWC and. Chemical Toxicology, (33):357366, 1995.

Eect of soybean saponins and

gypsophila saponin on morphology of colon carcinoma cells in culture. Food and

[cytowanie na str. 40]

[67] SunHX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids from the rhizomes of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. (90):261265, 2004.
[cytowanie na str. 45]

Journal of Ethnopharmacology,

[68] JP Vincken, L Heng, A Groot, and H Gruppen. Saponins, classication and occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry, (68):275297, 2007.
[cytowanie na str. 8]

[69] MP Wasilewicz and D Bielicki. The role of cyclooxygenase and lipoxygenase in pathogenesis of colorectal neoplasmatic tumors - review of current knowledge. Gastroenterologia Polska, (12):133136, 2005.
[cytowanie na str. 9] [cytowanie na str. 8]

[70] P Wgleski. Genetyka molekularna. Warszawa, 2002.

[71] G Wulf. Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet. Number 108. Deutsche Apotheker Zeitung, 1968.
[cytowanie na str. 7]

[72] HJ You, CY Choi, JY Kim, SJ Park, KS Hahm, and HG Jeong.

Ursolic

acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production via nuclear factor-kappab activation in the resting macrophages. FEBS Letters, (509):156160, 2001.
[cytowanie na str. 40]

Spis symboli i skrtw

Skrt COX FAP HNPCC OA UA LOX GPx SOD PKC PMA IAP AIF DeTa FCS HEPES SPE TLC CC MS cyklooksygenaza

Opis

Strona 4 4 4 7 7 8 9 9 9 ?? 10 10 12 14 14 15 17 17 18

rodzinna polipowato gruczolakowata zesp Lyncha (dziedziczny rak jelita grubego niezwizany z polipowatoci kwas oleanolowy kwas ursolowy lipooksygenaza peroksydaza glutationowa dysmutaza ponadtlenkowa kinaza biakowa C 12-octan-13-mirystynianoforbolu inhibitory apoptozy czynnik indukujcy apoptoz linia ludzkich komrek nowotworowych jelita grubego podowa surowica cielca kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy ekstrakcja do fazy staej chromatograa cienkowarstwowa chromatograa kolumnowa spektrometria mas
55

SPIS SYMBOLI I SKRTW

56

Skrt EtOH HepG2 B16 HaCat Hela HO-8910 HL60 HT-29 IC50 alkohol etylowy

Opis

Strona 24 40 45 45 45 45 45 44 45

linia komrkowa ludzkiego wtrobiaka zarodkowego linia komrkowa mysich melanoma linia komrkowa ludzkich keratynocytw linia komrkowa linia komrkowa linia komrkowa linia komrkowa ludzkiego raka jelita grubego wspczynnik, przy ktrym miertelno wynosi 50%

Spis rysunkw

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Burak wikowy [58] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Kwas oleanolowy i kwas ursolowy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6 7

Korzenie buraka wikowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Schemat aparatury uytej do SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia buraka wikowego . . . 20 Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 Widmo MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . 23 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Schemat analizy cytometrycznej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym cytometrycznej hodowanych z kwasem oleanolowym . . . . . 28 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie . . . . . . . . . . . . . . 28 . . . . . . 30 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym . 24

Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym . . . . . . . . . . . . . . . . 30

57

SPIS RYSUNKW

58

17 18 19 20 21 22 23 24

Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym i oleanolowym . . . . . . . 32 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego . . . . . 35 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin . . . . . . . 36 . . . . . . 38

Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po analizie cytometrycznej hodowanych z mieszanin saponin . . . . . . . . . . . . . . . . 38

25 26

Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych . . . . . . . . . . . . . . 42 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M . . . 42

Spis tabel

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Zwizki podawane komrkom

. . . . . . . . . . . . . . 19 . 24

Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem oleanolowym Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z 3-O-monoglukozydem

kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego 35 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem 100 M . 37 41 41 27 29

Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i oleanolowym 31

59