TESTY IMMUNOLOGICZNE TESTY IMMUNOLOGICZNE

Istnieje wiele odmian testw immunologicznych;

wszystkie polegaj na zajciu reakcji wizania si antygenu ze swoistymi
(rozpoznajcymi go) przeciwciaami,
rni si natomiast sposobem wykrywania tej reakcji.
Testy immunologiczne porednie
wykrywaj immunoglobuliny, ktre
uprzednio zwizay si ze swoistym
antygenem.
Opieraj si one na na zaoeniu, e jeli
organizm krgowca zetkn si z konkretnym
antygenem, to w surowicy tego organizmu
bd si znajdyway swoiste wobec tego
antygenu przeciwciaa. Poniewa
immunoglobuliny jako takie maj waciwoci
immunogenne (wywouj odpowied
immunologiczn), mona uzyska swoiste
przeciwciaa skierowane wobec
immunoglobulin innego gatunku.
Charakteryzuj si wiksz czuoci, gdy
wykorzystuj naturaln zdolno ukadu
immunologicznego - amplifikacj sygnau, jaki
dociera do ukadu immunologicznego w
postaci antygenu.
BEZPOREDNIE BEZPOREDNIE POREDNIE POREDNIE
Testy immunologiczne bezporednie
wykrywaj okrelony antygen przy pomocy
znakowanych przeciwcia.
Antygeny wirusowe czy bakteryjne wystpuj jednak
czsto w ustroju w bardzo niewielkiej iloci, ktra
znalaza by si poniej progu detekcji. Z tego wzgldu
czsto stosuje si testy immunologiczne porednie
wykrywajce immunoglobuliny, ktre uprzednio
zwizay si ze swoistym antygenem.
Aglutynacja
Hemaglutynacja
Precypitacja
Odczyn wizania dopeniacza
Testy immunoenzymatyczne
Testy immunofluorescencyjne IFA
Testy radioimmunologiczne RIA
Ag + Ab Ag + Ab WYNIK WYNIK
Ag + Ab + Ab Ag + Ab + Ab
2 2
WYNIK WYNIK
TESTY SEROLOGICZNE TESTY SEROLOGICZNE
REAKCJA PRECYPITACJI REAKCJA PRECYPITACJI
Stenie antygenu
I
l
o

s
p
r
e
c
y
p
i
t
o
w
a
n
y
c
h


p
r
z
e
c
i
w
c
i
a

Nadmiar antygenu
Strefa rwnowagi
Nadmiar przeciwcia
Zachodzi pomidzy przeciwciaami a rozpuszczalnym antygenem
np. biakiem, wyizolowanym polisacharydem bakterii itp.
Wszystkie testy przeprowadza si w obecnoci roztworu elektrolitw.
Precypitacja probwkowa
Przeciwciaa
W miejscu wytrcania si kompleksw
immunologicznych pojawia si opalizujcy
prek
Rozpuszczalny
antygen
PRECYPITACJA W ELU PRECYPITACJA W ELU
Reakcja dyfuzji radialnej wg Manciniego
suy do ilociowej oceny antygenu
przeciwciaa unieruchomione s w elu agarowym, antygen dyfunduje
Reakcja podwjnej dyfuzji wg Ouchterlonyego
dyfunduj czsteczki antygenu i przeciwciaa
Miejsce naniesienia
roztworu antygenu
Pole
precypitacji
Miejsce naniesienia
roztworu antygenu
Miejsce naniesienia
roztworu przeciwcia
Pole
precypitacji
Pole precypitacji jest wprost proporcjonalne
do stenia antygenu.
Znane stenia antygenu x?
a b c x
s
t

e
n
i
e


a
n
t
y
g
e
n
u
rednica
x
el agarowy
zawierajcy okrelone
rozcieczenie przeciwcia
24 h
REAKCJA PODWJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONYEGO REAKCJA PODWJNEJ DYFUZJI WG OUCHTERLONYEGO
Pozwala okreli czy badane antygeny zawieraj identyczne, wsplne, czy te rne
determinanty antygenowe.
Przeciwciaa swoiste wobec
okrelonego antygenu
Badany
antygen
Znany
antygen
A
A
A B + C
Szybko dyfuzji antygenu w elu zaley od jego wielkoci
(jest odwrotnie proporcjonalna do masy czsteczki).
A
uk
precypitacji
Przeciwciaa
anty-A
Antygeny zawieraj rne
determinanty antygenowe
Antygeny zawieraj identyczne
determinanty antygenowe
Przeciwciaa
anty-A i anty-B
A B
Antygeny zawieraj wspln
determinant antygenow
A + B
anty-B
Przeciwciaa
anty-A i anty-B
anty-B
Antygeny zawieraj rne
determinanty antygenowe
Przeciwciaa
anty-A, anty-B i anty-C
anty-B
anty-C
TESTY SEROLOGICZNE TESTY SEROLOGICZNE
AGLUTYNACJA AGLUTYNACJA
Najbardziej efektywnymi aglutyninami s IgM.
Aby doszo do porwnywalnej aglutynacji antygenu z przeciwciaami IgG,
potrzeba 100 lub nawet 1000 razy wicej czsteczek IgG.
Zachodzi pomidzy przeciwciaami a upostaciowanym antygenem.
Reakcj mona zaobserwowa w postaci kaczkw.
Antygen moe znajdowa si na powierzchni komrek bakteryjnych, eukariotycznych
lub by zwizany z czstkami lateksu.
Bakteria
Przeciwciaa IgM wi si z epitopami
bakterii
HEMAGLUTYNACJA HEMAGLUTYNACJA
Erytrocyty w roztworze soli fizjologicznej tworz zawiesin pojedynczych komrek -
nie zlepiaj si. Powierzchnia jest erytrocytu naadowana ujemnie (ze wzgldu na
obecno reszt kwasu sjalowego w bonie komrkowej) i otoczona warstw kationw.
Erytrocyty, ktre stosuje si w testach aglutynacji specjalnie przygotowuje si: np.
traktuje si je kwasem taninowym, a nastpnie inkubuje z antygenem, ktry adsorbuje
si na ich powierzchni.
Erytrocyty opaszczone antygem czsto nazywa si krwinkami uczulonymi.
Jeli w badanej surowicy znajduj
si przeciwciaa swoiste wobec tego
antygenu, dochodzi do aglutynacji
erytrocytw.
Jeli badana surowica nie zawiera
przeciwcia swoistych wobec tego
antygenu, nie dochodzi do aglutynacji
erytrocytw.
krwinki
opadaj
na dno
Testy wykorzystujce zjawisko hemaglutynacji:
odczyn biernej hemaglutynacji
test hamowania hemaglutynacji
test Coombsa (odczyn antyglobulinowy)
stosuje si do oznaczania grupy Rh
http://vtpb-www.cvm.tamu.edu/vtpb/vet_micro/serology/titration/fig1.html
Odczyn biernej hemaglutynacji wykorzystuje si do okrelania miana
przeciwcia.
ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI ODCZYN BIERNEJ HEMAGLUTYNACJI
Miano przeciwcia - rozcieczenie, przy
jakim nastpia hemaglutynacja -
wynosi 1:80
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 K
aglutynacja brak aglutynacji
Kolejne rozcieczenia surowicy
Miano przeciwcia w surowicy
wyznacza dodatnia reakcja
antygen-przeciwciao uzyskana
z najwyszym rozcieczeniem
surowicy
W przypadku niektrych chorb np. zakanych i autoimmunizacyjnych okrelenie
miana przeciwcia w surowicy moe mie warto diagnostyczn!
Np. podwyszenie miana moe wskazywa na aktywny proces chorobowy.
Obecnie do oznaczenia miana przeciwciaa stosuje si inne, nowoczeniejsze metody.
SEROKONWERSJA - pojawienie si
w organizmie przeciwcia skierowanych
przeciwko okrelonemu antygenowi.
Zmiana statusu serologicznego osoby z
ujemnego do dodatniego.
Typowe dla zakae HIV, HBV.
Poziom
przeciwcia
czas
Poziom
detekcji
zakaenie
- - - - + + + +
Pacjent
seronegatywny
Pacjent
seropozytywny
TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI TEST HAMOWANIA HEMAGLUTYNACJI
Biaka niektrych wirusw maj zdolno do zlepiania erytrocytw.
Niektre hemaglutyniny
wirusowe
hemaglutynina wirusa
grypy
hemaglutynina wirusa
odry, winki i ryczki
erytrocyty wirusy aglutynacja erytrocytw
Waciwo ta nie ma nic wsplnego z reakcjami serologicznymi,
jest jednak wykorzystywana w diagnostyce - w tecie hamowania
hemaglutynacji.
Erytrocyty przeciwciaa wirusy nie dochodzi do
neutralizujce wirusy aglutynacji erytrocytw
AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH AGLUTYNACJA KULECZEK LATEKSOWYCH
Komercyjne testy aglutynacji wykorzystuj kuleczki lateksu opaszczone
antygenem lub przeciwciaami.
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecno antygenu.
Kuleczki opaszczone s przeciwciaami
swoistymi wobec wykrywanego
antygenu.
Wynik pozytywny: aglutynacja
Wynik negatywny: brak antygenu = brak
aglutynacji
lateks
antgen
Test aglutynacji bezporedniej
Wykrywanie czynnika
reumatoidalnego w surowicy
pacjenta z podejrzeniem
reumatoidalnego zapalenia
staww
Kuleczki lateksu opaszczone s
przeciwciaami IgG
skierowanymi przeciw
czynnikowi reumatoidalnemu.
aglutynacja
brak aglutynacji
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecno swoistych przeciwcia.
Kuleczki opaszczone s okrelonym
antygenem.
Wynik pozytywny: aglutynacja
Wynik negatywny: brak swoistych
przeciwcia = brak aglutynacji
Test aglutynacji poredniej
wykorzystuj przeciwciaa znakowane barwnikami fluorescencyjnymi:
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
CDC/Dr. William Cherry
Test immunoflurescencyjny. Bakterie Legionella pneumophila
Czsteczki barwnika przyczone s do czsteczek immunoglobulin kowalencyjnie
(poprzez grupy aminowe lizyny).
FITC
izotiocyjanian tetrametylorodaminy,
po wzbudzeniu emituje kolor czerwony
TRITC
izotiocyjanian fluoresceiny,
po wzbudzeniu emituje kolor zielony
bakteria
przeciwciaa znakowane
fluorescencyjnie
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie
pacjenta obecno antygenu/ bakterii.
Wynik pozytywny: fluorescencja
obserwowana pod mikroskopem
fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak antygenu = brak
fluorescencji
Test immunofluorescencyjny bezporedni
TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE TESTY IMMUNOFLUORESCENCYJNE
Wykrywa w surowicy/ plwocinie/ wymazie pacjenta przy pomocy znakowanych
fluorescencyjnie przeciwcia immunoglobuliny, ktre uprzednio zwizay si ze
swoistym antygenem. Charakteryzuj si wiksz czuoci.
Wynik pozytywny: fluorescencja obserwowana pod mikroskopem fluorescencyjnym
Wynik negatywny: brak przeciwcia = brak fluorescencji
Test immunofluorescencyjny poredni
Diagnostyka kiy
Wykrywanie autoprzeciwcia
przeciwjdrowych
(ukadowe schorzenia autoimmunizacyjne)
Dodajemy surowic pacjenta
www.primer.ru/std/gallery_std/ treponema.htm
Dodajemy przeciwciaa
znakowane fluorescencyjnie
przepukujemy
T. pallidum
Skrawek
tkanki
Krtek kiy
Jdro
komrkowe
https://courses.stu.qmul.ac.uk/smd/kb/pathology
/funmedpics/pathtes2.htm
ANA test
Jeli pacjent
by/jest zakaony
kia, obserwuje si
wiecenie krtkw
Przeciwciaa
pacjenta
Przeciwciaa
pacjenta
TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE TESTY IMMUNOENZYMATYCZNE
wykorzystuj reakcje enzymatyczne do uwidocznienia reakcji
immunologicznej.
Czsteczki enzymu zwizane s kowalencyjnie z przeciwciaami lub z biotyn.
Po dodaniu do prbki substratu - chromogenu, enzym przeksztaca go w barwny
produkt. W miejscu zwizania si przeciwcia pojawia si kolorowy precypitat.
Testy immunoenzymatyczne charakteryzuj si wiksz czuoci ni testy immunofluorescencyjne,
poniewa jedna czsteczka enzymu zwizana z przeciwciaami moe katalizowa powstanie wielu
czsteczek produktu.
Najczciej stosowane enzymy:
peroksydaza chrzanowa
alkaliczna fosfataza
chromogen
kolorowy
precypitat
Najczciej stosowane substraty:
DAB
AEC
4-chloro-1-naftol
Aby zwikszy czuo reakcji immunoenzymatycznej mona stosowa przeciwciaa
znakowane awidyn (biako jaja kurzego) lub streptawidyn (biako Streptomyces
griseus), ktre wykazuje silne powinowactwo do biotyny (witamina H). Enzymem
znakuje si wwczas biotyn.
immunoglobulina
z czsteczk enzymu
wykrywaj antygen in situ (w tkankach) - testy immunohistochemiczne
wykrywaj antygen lub przeciwciaa w roztworze - test ELISA