2009-05-28

Katarzyna Ciężka
Agnieszka Deręgowska
Maria Drzyzga
Dorota Dynek
Magdalena Hawlicka

KORELACJA IN VITRO – IN VIVO

 Prezentacja wykonana na podstawie

rozdziałów: „In Vitro–In Vivo Correlation”
oraz „IVIVC for Oral Drug Delivery:
Immediate Release and Extended
Release Dosage Forms”
pochodzących z książki: Pharmaceutical
Product Development - In Vitro-In Vivo
Correlation.

1
 2009-05-28

Plan prezentacji
 Wstęp – czym właściwie jest IVIVC i gdzie się to
stosuje?
 Kategorie korelacji IVIV – poziomy A, B, C
 System klasyfikacji biofarmaceutycznej (BCS)
 Proces opracowywania IVIVC poziomu A
 Ocena korelacji IVIVC na poziomie A, B i C
 Korelacja in vitro-in vivo w przypadku nowoczesnych
pozajelitowych postaci leku o przedłużonym
uwalnianiu
- Stenty uwalniające lek
- VIADUR®
- Systemy transdermalne
- Liposomy

WSTĘP DO IVIVC
 Kluczowym celem rozwoju produktu
farmaceutycznego jest zrozumienie jego
skuteczności in vivo w oparciu o badania in vitro
różnych postaci leku, szczególnie tych o
kontrolowanych szybkościach uwalniania substancji
leczniczej.

 Dobra korelacja in vitro – in vivo (IVIVC) pozwala na

uwzględnienie badań nad rozpuszczalnością in vitro
w procesie sterowania produkcją oraz na
prognozowanie skuteczności działania in vivo
bazując na danych laboratoryjnych.

2
 2009-05-28

Definicje
IVIVC to matematyczny model predykcyjny
opisujący zależność pomiędzy
właściwościami preparatu badanymi w
warunkach in vitro (szybkość uwalniania lub
ilość uwolnionej substancji leczniczej) a
odpowiedzią biologiczną (stężenie leku we
krwi, ilość wchłoniętej substancji leczniczej).

Wg FDA

Definicje
IVIVC to ustanowienie liczbowej relacji pomiędzy
biologiczną aktywnością a fizykochemicznym
parametrem danej postaci leku.
 Parametry biologiczne:
 maksymalne stężenie leku (Cmax)
 pole powierzchni pod krzywą stężenia w czasie
(AUC)
 Parametr fizykochemiczny:
 profil rozpuszczalności in vitro

Wg U.S.Ph

3
 2009-05-28

Opracowanie IVIVC
 Od IVIVC wymaga się, aby uwzględniony był fakt, że
rozpuszczenie lub uwolnienie substancji leczniczej z
danej postaci leku odbywa się w etapach z
uwalnianiem ograniczonej dawki, czyli w sekwencji
kroków prowadzących do wchłonięcia leku.
 Dlatego, w niektórych przypadkach, korelacje IVIV
mogą nie być możliwe dla form o natychmiastowym
uwalnianiu, gdzie rozpuszczanie często nie występuje
w krokach o limitowanych dawkach.

Zastosowanie IVIVC
Substytut badań
biorównoważności pozwalający
na:
 zwiększenie jakości produktu
 zmniejszenie nadzoru organów
stanowiących
 proporcjonalne zwiększenie
dawki
 niewielkie zmiany w sprzęcie
oraz w procesie produkcyjnym

4
 2009-05-28

KATEGORIE KORELACJI IVIV

 Poziom A
 Poziom B
 Poziom C
 Rozszerzony poziom C

Poziom A
Korelacja:
 typu „punkt po punkcie” pomiędzy wskaźnikiem
wejściowym in vitro (np. stopniem rozpuszczenia) i
wskaźnikiem wejściowym in vivo
 zwykle liniowa (nieliniowości też możliwe)
 niosąca najwięcej informacji i najbardziej użyteczna w
opracowywaniu leków
 wiąże całościowy profil rozpuszczalności in vitro z
profilem stężenia in vivo
 pozwala na przewidywanie pełnej zależności stężenie-
czas in vivo na podstawie danych o rozpuszczalności
badanych in vitro.

5
 2009-05-28

Poziom A
W przypadku zależności liniowej, frakcja rozpuszczona
in vitro i frakcja wchłonięta in vivo powinny się
nakładać, lub zostaną na siebie nałożone poprzez
wprowadzenie współczynnika skalującego (rzadziej
funkcji skalującej).

Aby IVIV korelacja była poprawna, pojedynczy

współczynnik lub funkcja skalująca powinna być
możliwa do zastosowania przy różnych szybkościach
uwalniania substancji leczniczej z tej samej postaci
leku.

Poziom B
Korelacja na poziomie B wykorzystuje metody
momentów statystycznych do porównania
średnich stopni rozpuszczalności in vitro (np.
średni czas rozpuszczania) i średniego
parametru in vivo (np. MRT, średni czas
przebywania leku w organizmie lub średni
czas rozpuszczania in vivo).

6
 2009-05-28

Poziom B
Korelacja:
 nie jest typu „punkt po punkcie” (dane są
wyprowadzane dla jednego zintegrowanego
parametru)
 nie pozwala na odtworzenie przebiegu zmian
stężenia leku we krwi
 uważana za niezbyt użyteczną, ponieważ
wiele rozmaitych profili in vitro i in vivo może
prowadzić do tych samych parametrów
sumarycznych

Poziom C
Korelacja:
 pojedynczych parametrów
farmakokinetycznych (np. AUC) z
parametrami dostępności farmaceutycznej
(np.t50%)
 nie pozwala na obserwację całego przebiegu
krzywej stężenia w czasie
 może mieć zastosowanie tylko we wstępnej
fazie projektowania leku

7
 2009-05-28

Rozszerzony poziom C
Korelacja:
 odnosi kilka parametrów in vivo do
parametrów in vitro powiązanych ze stopniem
uwalniania leku w kilku punktach krzywej
rozpuszczalności.
 może być tak samo użyteczna jak korelacja na
poziomie A (jeśli jednak taka korelacja C jest
możliwa, to prawdopodobnie można również
opracować korelację na poziomie A)

SYSTEM KLASYFIKACJI
BIOFARMACEUTYCZNEJ

8
 2009-05-28

BCS
System klasyfikacji biofarmaceutycznej (BCS)
stanowi podstawę do klasyfikacji leków
bazując na ich rozpuszczalności w wodzie
oraz przenikalności przez bariery biologiczne.

Jak wspomniano wcześniej, IVIVC jest możliwa

kiedy rozpuszczalność następuje w krokach o
limitowanej dawce i lek ma wysoką
przenikalność.

Substancje grupy I
 dobrze rozpuszczalne
 dobrze wchłaniane

Postacie leku o uwalnianie składników opróżnianie

natychmiastowym uwalnianiu w żołądku żołądka

Opróżnianie żołądka stanowi krok ograniczający uwalnianie – proces, który nie

jest brany pod uwagę podczas testowania rozpuszczalności in vitro.
Kiedy rozpuszczalność in vivo jest szybsza w porównaniu z opróżnianiem
żołądka i lek szybko się wchłania rozpuszczalność in vitro nie odzwierciedla
dokładnie wchłaniania, więc IVIVC nie jest przeprowadzana dla substancji
grupy I.

9
 2009-05-28

Substancje grupy II
 słabo rozpuszczalne
 dobrze wchłaniane

Dostępność biologiczna leków jest ograniczona przez

ich słabe rozpuszczanie się, więc szybkość ich
wchłaniania jest zbliżona do szybkości rozpuszczania
się.
Leki z tej grupy wykazują wysoką korelację między
badaniami in vitro i in vivo.

Substancje grupy III

 dobrze rozpuszczalne
 słabo wchłaniane

Substancja lecznicza uwalnia się szybko, ale jest powoli

wchłaniana.
IVIVC nie jest wiarygodna jeśli rozpuszczalność jest
większa od szybkości wchłaniania w jelitach.

10
 2009-05-28

Substancje grupy IV
 słabo rozpuszczalne
 słabo wchłaniane

Wykazują bardzo słabą korelację między IVIV i muszą

być szczegółowo badane.

PROCES OPRACOWYWANIA
IVIVC POZIOMU A

11
 2009-05-28

1. Prowadzenie badań w odniesieniu do kilku

preparatów, różniących się między sobą
szybkościa uwalniania substancji leczniczej.

Trzy preparaty są zwykle wystarczające: dla

wolnego, średniego i szybkiego uwalniania.
Partie powinny osiągać (lub być bliskie)
oczekiwanym limitom określonym w
specyfikacji in vitro.

2. Dane o rozpuszczalności in vitro są

pozyskiwane za pomocą odpowiedniego testu
rozpuszczalności.

Wymagania:
1. Użycie, co najmniej 12 poszczególnych postaci
leku z każdej partii
2. Czasy pobierania próbek pozwalające na
odpowiednie scharakteryzowanie profilu
rozpuszczalności
3. Współczynnik zmienności mniejszy niż 10%
średniej dla profilu rozpuszczalności

12
 2009-05-28

3. Próbki stosowane są do badań

farmakokinetycznych w celu uzyskania danych
o stężeniu leku w warunkach in vivo.

Porównania mogą być dokonywane podczas:

1. jednego krzyżowego badania
farmakokinetycznego
2. równoległych badań
3. różnych badań, które są przeprowadzane jako
część procesu rozwojowego produktu

4. Podczas opracowywania IVIVC może być

konieczne poznanie różnych warunków
rozpuszczania in vivo, w celu zidentyfikowania
zmienności pomiędzy badanymi postaciami
leku.

5. Formuły są dostępne w dwóch grupach:

1. zbiór danych do opracowania IVIVC i estymacji
wewnętrznego błędu predykcji,
2. dane nieużyte do opracowania IVIVC służące
do zademonstrowania predykcji zewnętrznej.

13
 2009-05-28

Dobre dopasowanie do IVIVC opisane jest

wzorem:

obserwowana przewidywana
Prognozowany błąd wartość wartość
100
%PE
obserwowana
wartość

6. IVIVC może zostać uznana za poprawną jeśli:

1. rozpatrywanych jest trzy lub więcej różnych stopni

uwalniania
2. średni wewnętrzny błąd jest mniejszy niż 10% dla Cmax
i dla AUC
3. %PE dla poszczególnych preparatów użytych do IVIVC
nie przekracza 15%

7. Konieczność zewnętrznej weryfikacji istnieje jeśli:

1. wewnętrzny błąd predykcji jest większy niż 10%

2. %PE dla poszczególnych postaci leku różniących się
szybkością uwalniania przekracza 15%

14
 2009-05-28

Ocena korelacji IVIVC na poziomie A

- wprowadzenie
Procedura oceny korelacji IVIVC na poziomie A jest
dwuetapowa.
I
ETAP W pierwszym etapie sporządza się profile uwalniania substancji leczniczej z
postaci leku (in vitro) oraz przeprowadza badania jej dostępności biologicznej
(in vivo) z tych samych preparatów.
Dane dotyczące dostępności biologicznej (uzyskane podczas badao in vivo)
poddaje się dekonwolucji.

II
ETAP W drugim etapie sporządza się wykres zależności pomiędzy uwolnioną i
wchłonięta ilością substancji leczniczej.

Ocena korelacji IVIVC na poziomie A

- wprowadzenie

Proces dekonwolucji polega na estymacji ilości

uwolnionej lub wchłoniętej po podaniu dawki substancji
leczniczej in vivo, w oparciu o modele matematyczne.

Dekonwolucję danych przeprowadza się metodą

Wagnera-Nelsona, Loo-Riegelmana lub rozwiązując
równanie całkowe (transformacja Laplace’a).

15
 2009-05-28

Przykład badania oceny korelacji

na poziomie A

Przygotowano preparaty zawierające lek

przeciwpadaczkowy charakteryzujące się
różną szybkością uwalniania

• preparat o szybkim uwalnianiu substancji leczniczej (Formulation A)

• preparat o pośredniej szybkości uwalniania substancji leczniczej (Formulation B)
• preparat o wolnym uwalnianiu substancji leczniczej (Formulation D)

(B) Wykresy zależnośd całkowitej

(A) Wykresy zależności stężenia leku we krwi ilości uwolnionej substancji w
jako funkcja czasu po podaniu 3 preparatów o funkcji czasu.
różnej szybkości uwalniania substancji Czarnymi symbolami oznaczono
leczniczej. zależności otrzymane na
podstawie badao in vitro, białymi –
zależności otrzymane na
podstawie badao in vivo.

(B) Wykresy oznaczone

białymi symbolami
sporządzone zostały po
dekonwolucji danych.

(B) Wyraźnie widad, że całkowite

ilości uwolnione w warunkach in
vivo i in vitro są porównywalne,
natomiast w warunkach in vivo
substancja lecznicza uwalnia się
wolniej, z pewnym opóźnieniem.

(C) Wykres zależności pomiędzy ilością substancji leczniczej

uwolnionej w warunkach in vivo i w warunkach in vitro –
w celu sprawdzenia korelacji.

16
 2009-05-28

Ocena korelacji IVIVC na poziomie B

In vitro
MDT
(Mean Dissolution Time)
Korelacja na poziomie B opiera się o – średni czas rozpadu,
analizę momentów statystycznych. średni czas rozpuszczania
MDT (in vitro) porównuje się z MRT.
In vivo
Na poziomie B nie jest możliwe MRT
porównanie danych uzyskanych in vitro i (Mean Residence Time)
in vivo punkt po punkcie tak, jak w - średni czas przebywania leku w
przypadku korelacji na poziomie A. organizmie

MAT
(Mean Absorption Time)
- średni czas absorbcji

Ocena korelacji IVIVC na poziomie B

(A) Wykres korelacji na poziomie B.

Zależnośd średniego czasu
przebywania leku w organizmie od
średniego czasu rozpadu (in vitro)

17
 2009-05-28

Ocena korelacji IVIVC na poziomie C

(B) Wykres korelacji na poziomie C.

Zależnośd dostępności biologicznej w
czasie Tmax (in vivo) od czasu, w którym
uwolniona została połowa dawki
substancji leczniczej (in vitro).

Znajomość korelacji in vitro-in vivo pozwala

na ustalenie warunków rozpuszczania postaci
leku o modyfikowanym uwalnianiu.
FDA określa procedury postępowania podczas ustalania warunków
rozpuszczania postaci leku o modyfikowanym uwalnianiu w przypadku:
Korelacji na poziomie A;
Korelacji na poziomie C;
Oraz przy braku korelacji.

Przy stwierdzeniu braku korelacji in vitro-in vivo podczas ustalania

dopuszczalnego odchylenia od ilości uwolnionej substancji powinno się
korzystać z średniego profilu uwalniania. Dopuszczalne odchylenie w
każdym czasie nie powinno przekraczać 20% ( 10%). W przypadku
odchylenia wynoszącego 25% istnieje konieczność potwierdzenia, że
średnie profile rozpuszczania (dla górnej i dolnej granicy odchylenia) są
biorównoważne.

18
 2009-05-28

Znajomość korelacji in vitro-in vivo pozwala na

ustalenie warunków rozpuszczania postaci leku o
modyfikowanym uwalnianiu.
W przypadku istnienia korelacji in vitro-in vivo może być
ona wykorzystana do ustalenia parametrów
rozpuszczania badanej postaci leku. Stosując metody
konwolucji przewiduje się stężenie leku w osoczu,
kalkuluje pole powierzchni pod krzywą AUC oraz
stężenie maksymalne Cmax. Następnie sprawdza się,
czy profile uwalniania przy najwyższym i najniższym
stopniu uwalniania substancji (upper and lower release
rate), różnią się od profilu wzorcowego. Dopuszczalne
odchylenie wartości parametrów farmakokinetycznych
Cmax i AUC nie powinno przekraczać 20%.

Przykład: ustalanie stopnia uwalniania

pseudoefedryny z systemu OROS
 Dowiedziono, że istnieje korelacja na poziomie
A (1:1) pomiędzy stopniem uwalniania
pseudoefedryny in vitro i in vivo;

 Zaprojektowano postacie leku tak, aby z jednej

substancja lecznicza uwalniała się szybciej (90%
w ciągu 14h), z drugiej wolniej (65% w ciągu
14h).

19
 2009-05-28

Przykład: ustalanie stopnia uwalniania pseudoefedryny z systemu

OROS

(A) Profil uwalniania in vitro serii

badanej z uwzględnieniem
proponowanych parametrów
uwalniania in vitro.

(B) Przewidziane i zaobserwowane

stężenia pseudoefedryny in vivo.

Korelacja in vitro-in vivo w przypadku

nowoczesnych pozajelitowych postaci leku o
przedłużonym uwalnianiu
W celu badania nowoczesnych postaci leku niezbędne jest
poszerzenie wiedzy na temat korelacji in vitro-in vivo ponieważ:

 Substancja lecznicza z omawianych postaci leku uwalniana jest

przez okres kilku dni lub miesięcy, natomiast badania uwalniania in
vitro zaprojektowane są tak, aby proces uwalniania trwał do kilku
godzin;

 Do tej pory nie zaprojektowano środowiska in vitro, które

odzwierciadlałoby warunki in vivo.

Dostępna wiedza na temat doustnych postaci leku może być

zastosowana w celu określenia korelacji IVIVC dla postaci leków
takich jak: stenty uwalniające lek, liposomy czy plastry
transdermalne, natomiast znane procedury wymagają wielu
modyfikacji.

20
 2009-05-28

Stenty uwalniające lek

Stenty uwalniające lek (Drug-Eluting Stents) są to małe cylindryczne
rusztowania, które po umieszczeniu wewnątrz naczynia krwionośnego
utrzymują drożność i zapobiegają zamknięciu jego światła. Co więcej,
stenty są zaprojektowane tak, aby miejscowo uwalniały leki
przeciwzapalne i przeciwnowotworowe w celu zahamowania
infiltrancji leukocytów i proliferacji komórek mięśni gładkich.

Problem w zastosowaniu
klasycznych korelacji in vitro-in
vivo stanowi fakt, że w przypadku
omawianej postaci lek jest
uwalniany miejscowo.

VIADUR®
Implanty, takie jak np. VIADUR® zaprojektowane są, aby uwalniać
substancję leczniczą w sposób ciągły utrzymując stałe stężenie
leku we krwi. Preparat VIADUR zawiera octan leuproreliny i jest
stosowany w paliatywnym leczeniu zaawansowanej postaci raka
prostaty.
Przeprowadzono badania in vivo na szczurach rasy Fisher, którym
wszczepiono implanty z octanem leuproreliny. Następnie, po
upływie 3, 6, 9 i 12 miesięcy usunięto implanty i przy pomocy
metody z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii
cieczowej w układzie odwróconych faz zmierzono pozostałą w
implancie ilość leku.
Badania in vitro przeprowadzono umieszczając implanty w
probówkach zawierających PBS z 2% dodatkiem azydku sodu jako
środka konserwującego. Podczas badania probówki znajdowały się
w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni.

21
 2009-05-28

VIADUR®

Porównując wyniki badania

wykazano, że pomiędzy
uwalnianiem leku in vitro i in vivo z
implantu zawierającego octan
leuproreliny istnieje liniowa
korelacja.

Systemy transdermalne
 W przypadku leków transdermalnych zakłada
się, że kształt krzywej uwalniania in vitro jest
identyczny z kształtem krzywej uwalniania in
vivo.
 Różnice dotyczą całkowitej ilości
uwolnionego leku.

22
 2009-05-28

 Dla płynnego zbiornika leku w systemie transdermalnym

uwalnianie leku opisuje I prawo dyfuzji Fick`a:

 Gdzie:
dQ/dt – ilość substancji leczniczej uwolnionej w czasie
A – powierzchnia błony (cm 2)
Dm – współczynnik dyfuzji leku w membranie (cm 2/h)
Km – współczynnik podziału między membranę a podłoże
Hm – grubość błony systemu (cm)
C – stężenie leku w podłożu (mg/cm 3)

 Stopień absorpcji skóry wynosi:

 Gdzie:
ks – współczynnik podziału między stratum corneum a skórę
właściwą
Vs – objętość skóry
Hs – grubość skóry
Ds – współczynnik dyfuzji przez skórę

23
 2009-05-28

 W pewnym doświadczeniu użyto danych,

dotyczących stopnia uwalniania fentanylu
in vitro dla podania dożylnego, w celu
zademonstrowania korelacji in vitro-in vivo z
podaniem transdermalnym.

 Dla ustalenia odpowiedniego modelu przygotowano

następujące założenia:
 kształt krzywej uwalniania in vitro był zbliżony do
tego, który przedstawia krzywa uwalniania in vivo
(całkowita ilość uwolnionego leku mogła się różnić)
 przezskórna absorpcja była zaliczana do procesów
1-ego rzędu
 wyjaśniono wpływ promotorów sorpcji na absorpcję

24
 2009-05-28

 Jako wynik uzyskano dobrą korelację

pomiędzy przewidywanym i obserwowanym
stężeniem fentanylu w surowicy po podaniu
dożylnym i w systemie transdermalnym.

Ciekawostka

25
 2009-05-28

Liposomy
 Liposomy zbudowane są z podwójnej
amfipatycznej błony molekularnej
ograniczającej środowisko wodne. Lek
zostaje zamknięty w środku (wewnątrz
środowiska wodnego) lub we wnętrzu błony.
 Liposomy wykazują dłuższe uwalnianie leku
w organizmie na stałym poziomie.

 Liposomy mogą in vivo wchodzić w interakcje

z lipoproteinami i białkami występującymi we
krwi.
 Trudnością w ich przewidzeniu jest fakt, iż
często zdarzają się przypadki, w których
liposom in vivo zachowuje się odmiennie niż
w warunkach in vitro.

26
 2009-05-28

 Metoda określająca zachowanie się liposomu w

warunkach fizjologicznych jest ważna dla:
 Oceny jakości liposomu
 Zapewnienia prawidłowych procesów kontroli
 Zapewnienia uwalniania charakterystycznego dla
tego produktu
 Oceny zmian chemicznych, produkcyjnych
 Kontroli zmian w badaniach in vivo.

 Metoda ta jednak spotkała się z różnymi

efektami w praktyce
 Potencjalne powody braku korelacji mogą
mieć związek z rozległością błon lipidowych i
lipidów in vivo, do których uwolniony lek
może się wiązać.

27
 2009-05-28

WYKORZYSTANIE FARMAKODYNAMIKI W
ROZWOJU KORELACJI IN VIVO-IN VITRO

 Do pomiaru dostępności biologicznej, oprócz

pomiaru stężenia leku w płynach ustrojowych,
służy także odpowiedź farmakologiczna
ustroju na lek. Dostarcza ona danych o takim
samym znaczeniu, jak te uzyskane z
pomiarów stężenia leku we krwi lub w moczu.

 Założenia potrzebne dla wykorzystania odpowiedzi

farmakologicznej:
 Wartością limitującą etapy procesu jest dostępność
biologiczna
 Interakcje receptor – lek i transdukcja sygnału są szybkie.
 Wszystkie procesy są odwracalne tzn. usunięcie leku ze
środowiska skutkuje cofnięciem odpowiedzi
farmakologicznej
 Kinetyka leku jest liniowa

 Metody wykorzystujące odpowiedź farmakologiczną mogą

zostać wykorzystane tam, gdzie nie ma możliwości
oznaczenia stężenia leku.

28
 2009-05-28

WNIOSKI OGÓLNE
 Dobrą korelację IVIV otrzymuje się dla
transdermalnych systemów terapeutycznych i
innych postaci o przedłużonym oraz
kontrolowanym uwalnianiu.
 Dobrą korelację wykazują również substancje
lecznicze słabo rozpuszczalne w wodzie, ale
dobrze przenikające przez membrany
biologiczne (grupa II w klasyfikacji BCS),
niezależnie od postaci, w jakiej są podane.

29