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Cromatografa lquida

LECTURA
Tema 12
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
En este captulo se tratarn diversas formas de cromatografa en las que la fase
mvil es un lquido. Potencialmente, la cromatografa lquida (CL) es ms importante
que la cromatografa de gases (CG), ya que, cerca del 80 % de los compuestos qumicos
no son suficientemente voltiles para separarlos y determinarlos por CG, y en ellos se
incluyen una gran variedad de especies de inters industrial, biolgico y ambiental.
La cromatografa lquida considerada como clsica se lleva a cabo en columnas
abiertas y en ella la fase mvil fluye por gravedad (figura 12.1.a.) o mediante la
aplicacin de vaco, con un dispositivo como el representado en la figura 12.1.b.
eluyente
capa protectora

(arena, papel de filtro)

relleno
disco de vidrio sinterizado

vaco

a)

b)
Figura 12.1. Cromatografa lquida convencional

Claudio Gonzlez Prez

Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se
facilita mediante vaco (tambin por bombeo del lquido) el mecanismo de la separacin
puede ser de adsorcin, reparto, intercambio inico, en funcin del tamao
molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase
estacionaria, originndose distintos tipos de cromatografa que se considerarn en
este captulo.
La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamao de las
partculas del relleno, si bien, en este caso, la fase mvil fluye con mayor dificultad.
Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de
tamaos muy pequeos (entre 3 y 10 m), se requiere una instrumentacin sofisticada,
que contrasta con las simples columnas de vidrio usadas en cromatografa clsica.
Estos procedimientos operativos, relativamente modernos, se denominan como
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR o HPLC), cuyas caractersticas ms
importantes se incluirn tambin en este captulo.
En la parte final del captulo se har una breve descripcin de la cromatografa
de lquidos sobre soporte plano (papel y capa fina), pues con estas tcnicas se
consigue la resolucin de muchos problemas de forma sencilla y barata. Asimismo, se
har referencia a la cromatografa de fluidos supercrticos.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA CONVENCIONAL


La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo generalmente en columnas de
vidrio como las representadas en la figura 12.1. y cuyas dimensiones dependen de la
cantidad de material a separar. Como regla de uso comn, la longitud de la columna
debe ser, por lo menos, equivalente a diez veces su dimetro, de forma que una
columna tpica puede ser de 20 cm de largo y entre 1 y 2 cm de dimetro. Para
obtener la mxima eficacia, el relleno de la columna deber estar constituido por
partculas de tamaos similares y uniformemente empaquetada, evitando que se
formen canales. De este forma, se minimiza la distorsin de las bandas
cromatogrficas. Para conseguirlo, la fase estacionaria suele adicionarse a la columna
en forma de suspensin con una porcin de la fase mvil, dejando que se asiente
lentamente, proceso que se facilita en ocasiones mediante una suave agitacin.

Cromatografa lquida

La adicin de la muestra por la parte superior de la columna se har en forma de


disolucin concentrada, muy cuidadosamente para no remover la fase estacionaria. Con
esta finalidad, suele colocarse en la parte superior de sta una fina capa de arena,
lana de vidrio o papel de filtro*.

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION (CLS)


Las especies qumicas (tomos, molculas, iones) que estn en la capa superficial
de un slido no tienen todas sus cargas elctricas compensadas y como consecuencia
de ello, presentan fuerzas residuales, o sitios activos, que pueden actuar sobre los
componentes del fluido que baa su superficie, originando fenmenos de adsorcin.
Las fuerzas responsables de la adsorcin dependen de la naturaleza de la superficie y
de la estructura de las especies adsorbidas, ocurriendo la separacin como se indica
en el tema 10 ("Mecanismo de las separaciones cromatogrficas").
Adsorbentes. Aunque se ha utilizado una gran cantidad de slidos como fases
estacionarias en CLS, las ms empleadas son la gel de slice y la almina. La gel de
slice, (SiO2.xH2O), tambin llamado cido silcico, es un material que se obtiene por
precipitacin en medio cido de soluciones de silicato sdico. El rea superficial, el
tamao de poro y el pH de la superficie dependen de las condiciones de precipitacin.
As, a pH 3.7. la superficie especfica es 830 m2/g, mientras que a pH 5.7, el valor
obtenido es 348 m2/g. Los centros activos son los grupos silanol (SiOH)
superficiales, espaciados unos de otros aproximadamente 5 , los cuales pueden
desactivarse lentamente por adsorcin de agua superficial. Este tipo de agua
adsorbida puede eliminarse fcilmente por calefaccin a unos 200 C, con lo que se
reactiva el gel, pero si la calefaccin se realiza a temperatura del orden de 400 C,
tiene lugar una deshidratacin irreversible con prdida de rea superficial, debido a la
eliminacin de una molcula de agua de dos grupos silanol contiguos, producindose un
enlace siloxano, que es cromatogrficamente inactivo
SiOH H2 O

Si

SiOH

Si

La almina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interaccin con los solutos,
ya que, por una parte, tiene sitios activos cidos en las zonas prximas al Al3+, y
centros bsicos en las zonas prximas al O2. La proporcin relativa de centros cidos
* En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte
superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se
mezclen sobre la columna.

Claudio Gonzlez Prez

aumenta con la temperatura de activacin, mientras que la superficie puede


desactivarse por adicin de agua.
Disolventes. En CLS el disolvente compite con los solutos por los centros activos
de la fase estacionaria, por lo que la elucin puede describirse como un
desplazamiento del soluto por el disolvente. As, cuanto ms intensa sea la interaccin
disolvente-fase estacionaria, ms tiempo pasar el soluto en la fase mvil y, en
consecuencia, ms rpidamente ser eluido. De hecho, la capacidad relativa de los
distintos disolventes para eluir un soluto dado de una columna, es casi independiente
de la naturaleza del soluto. Por ello, en la prctica, la variable a controlar en
cromatografa de adsorcin, es el disolvente.
Una serie eluotrpica es una lista de disolventes ordenados conforme a su
capacidad relativa para desplazar solutos de un adsorbente dado. As, en columnas de
gel de slice, el poder eluyente disminuye en el orden siguiente:
agua > metanol > etanol > acetona > acetato de etilo > cloroformo > benceno >
tolueno > tetracloruro de carbono > ciclohexano > hexano
Utilizando series como la citada, es posible seleccionar un disolvente o una
mezcla con el poder eluyente adecuado para llevar a cabo una determinada
separacin*.

CROMATOGRAFIA DE REPARTO (CLL)


En la cromatografa de reparto, la fase estacionaria lquida est retenida por un
soporte slido, que deber reunir una serie de caractersticas ya mencionadas en
relacin con la cromatografa gas-lquido. Los soportes slidos ms utilizados en CLL
son: gel de slice, tierra de diatomeas (Kieselguhr, Celita, etc.) y celulosa, aunque,
tambin se han usado otros en menor extensin, como almidn o microbolas de vidrio.
La mayor dificultad en relacin con el soporte slido, es la presencia de
fenmenos de adsorcin, pues, aunque est totalmente cubierto por la fase
estacionaria, casi siempre muestra algo de actividad superficial.
Para la separacin de una gran cantidad de compuestos orgnicos, se utiliza agua
como fase estacionaria. Esto hace que como eluyentes se usen lquidos cuya
solubilidad en agua sea mnima, tales como cloroformo, tetracloruro de carbono,
hidrocarburos, etc. Sin embargo, como no existe sustancia alguna cuya insolubilidad
* La presencia de impurezas (por ejemplo, metanol en benceno) puede alterar de forma sustancial el poder

eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.

Cromatografa lquida

sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada
por la fase mvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos
paliarse, mediante una pre-saturacin del eluyente con la fase estacionaria.

CROMATOGRAFIA DE CAMBIO IONICO (CCI)


La cromatografa de intercambio inico se basa en el equilibrio de los iones de
soluto entre el disolvente y los sitios cargados en la fase estacionaria (ver la figura
10.5.c.). Esta consta de una matriz (R) con grupos funcionales cargados (A) y
contraiones de carga opuesta (M), susceptibles de intercambiarse con especies de la
misma carga contenidas en la fase mvil (X)
RA M+ + X+ <> RAX+ + M+ (intercambio catinico)
RA+M + Y <> RA+Y + M (intercambio aninico)
La competicin entre los iones de la muestra y el contra-in por un determinado
sitio es muy similar a la que existe entre el soluto y el disolvente para los sitios de
adsorcin en CLS. De hecho, en ocasiones, se hace referencia a la CCI como
cromatografa de adsorcin implicando interaccin electrosttica, si bien, la
naturaleza de las fases mvil y estacionaria, as como el tipo de muestras a separar,
hace que sea preferible considerarla independientemente de aquella.
Fases estacionarias. Existe una gran variedad de materiales, orgnicos e
inorgnicos, naturales y sintticos, que presentan propiedades adecuadas para el
intercambio inico, si bien, normalmente se prefieren sustancias sintticas conocidas
como resinas de intercambio inico. Las resinas se preparan introduciendo grupos
ionizables en una matriz constituida por un polmero orgnico, de los cuales el ms
comn es el poliestireno, obtenido por co-polimerizacin del estireno y del divinilbenceno.
CH=CH2
CH=CH2

Estireno

CH=CH2
Divinilbenceno

La polimerizacin da como resultado una estructura tridimensional de carcter


poroso y si se lleva a cabo en suspensin acuosa se obtienen pequeas esferas con
dimetros que van de 0.1 a 0.5 mm. El grado de entrecruzamiento vara con la

Claudio Gonzlez Prez

proporcin de divinilbenceno, que oscila entre 1 y 16 %*. Por otra parte, los anillos
bencnicos pueden modificarse para producir una resina de intercambio catinico, con
grupos SO3H o COOH, o una resina aninica, con grupos CH2N+R3 o CH2NR2
CH CH2 CH CH 2 CH CH2

SO3 H+

SO3H+

CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH
2
2
2
2
2

SO3 H+

SO3 H+

Resina de intercambio catinico (cido fuerte)


CH CH2 CH CH2 CH CH2

CH2 N(CH3 )3 Cl

CH2 N(CH3 )3 Cl

CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2

CH2 N(CH3 )3 Cl

CH2 N(CH3 )3 Cl

Resina de intercambio aninico (base fuerte)

Las resinas de cido sulfnico son intercambiadores de cido fuerte,


encontrndose disociados y pudiendo intercambiar protones prcticamente a cualquier
valor de pH, mientras que las que contienen grupos COOH el margen de intercambio
suele estar limitado entre 5 y 14.
En cuanto a las resinas aninicas, las que contienen compuestos de amonio
cuaternario son bases fuertes, mientras que las constituidas por aminas se comportan
como bases dbiles. Tanto unas como otras suelen emplearse en forma de cloruros, en
lugar de hidrxidos, debido a la mayor estabilidad de aquellos.
Desde el punto de vista prctico, es importante considerar el grado de
accesibilidad de los iones contenidos en la fase mvil a los centros de intercambio. En
este sentido, las resinas con bajo nivel de entrecruzamiento hacen posible que el
equilibrio de intercambio se establezca rpidamente, mientras que si el nivel de
* El grado de formacin de enlaces cruzados se indica con la notacin "XN" despus del nombre de la

resina. As, una resina Dowex 1X4 contiene 4 % de divinilbenceno.

Cromatografa lquida

entrecruzamiento es alto, ello significa tamaos pequeos para los poros, con lo que la
resina se hace ms selectiva para los iones pequeos. En este caso, la resina presenta
mayor capacidad de intercambio y selectividad, pero tiempos de equilibrio ms
elevados.
Selectividad de las resinas. Considrese una resina catinica con el in
intercambiable H+ en contacto con una disolucin conteniendo el in monovalente M+.
Se establece el siguiente equilibrio de intercambio:
R H+ + M+ <> R M+ + H+
donde R representa la matriz de la resina. La constante de equilibrio, llamada
coeficiente de distribucin o coeficiente de selectividad viene expresada por,

Kd=

+
R

donde [M+]R y [H+]R representan las concentraciones de M+ y de H+ en la resina*. La


constante Kd representa la afinidad de la resina por los iones M+, respecto a los iones
H+ (en este caso), de forma que cuanto mayor sea el valor de Kd, mayor ser la
tendencia a retener los iones M+.
Mecanismo de las separaciones. Cuando una pequea cantidad de disolucin
conteniendo iones M+ se pone en contacto con una resina como la mencionada
anteriormente y se lava con agua, todos los iones M+ reemplazarn a los iones H+ y
quedarn fijados en la parte superior de la columna formando una banda adsorbida
sobre la fase estacionaria. Si Kd es grande, la banda ser estrecha y concentrada,
mientras que si es pequea, la banda ser amplia y difusa.
Para desplazar la banda de iones M+ adsorbidos a lo largo de la columna, es
evidente que no puede utilizarse agua, pero s puede hacerse con un cido o con una
disolucin que contenga otro catin. La velocidad a la que se desplazar la banda de
iones M+ depende del pH del eluyente y del valor de Kd, de forma que dos iones con
diferentes afinidades para la resina (diferentes valores de Kd) se desplazarn a
diferente velocidad y podr tener lugar la separacin correspondiente.

* Cuando las disoluciones se apartan del comportamiento ideal las concentraciones debern reemplazarse

por las correspondientes actividades.

Claudio Gonzlez Prez

En solucin acuosa diluida, la afinidad de los cationes para la resina aumenta con
la carga, y, a igualdad de carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del
in hidratado, de forma que puede escribirse la siguiente secuencia:
Na+(ac) < Ca2+(ac) < Al3+(ac) < Th4+(ac)
Li+(ac) < Na+(ac) < K+(ac)
Mg2+(ac) < Ca2+(ac) < Sr2+(ac) < Ba2+(ac)
En el caso de las resinas aninicas, en soluciones acuosas diluidas la afinidad de
los aniones depende de su grado de polarizacin. En general, los aniones polivalentes
tienen mayor afinidad que los monovalentes y entre aniones de la misma carga, los de
mayor tamao presentan mayor afinidad,
Cl < CN < Br < NO3 < I << SO42
Aplicaciones. Dentro del campo de la qumica inorgnica es posible la separacin
de iones metlicos ordinarios por cromatografa de intercambio inico. Asimismo, el
desarrollo de mtodos de cambio inico para separaciones de lantnidos y otras
especies fisionables fue fundamental para el desarrollo de los reactores nucleares.
Por otra parte, la CCI se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgnicos y
bioqumicos, incluyendo drogas y sus metabolitos, conservantes alimentarios, azcares
y preparaciones farmacuticas, as como a la elucidacin de la estructura de protenas
y cidos nucleicos.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR (CEM)


La cromatografa de exclusin molecular, tambin denominada cromatografa de
filtracin en geles y cromatografa de permeacin en geles, es una tcnica que se
aplica fundamentalmente para la separacin y caracterizacin de sustancias de peso
molecular elevado. Se utiliza extensamente en Bioqumica para separar molculas
grandes como protenas e hidratos de carbono, si bien, tambin encuentra aplicaciones
en la qumica de los polmeros.
Mecanismo de las separaciones y principios tericos. La fase estacionaria est
constituida por una matriz porosa, cuyos poros tienen un tamao determinado y estn
completamente llenos con el disolvente usado como fase mvil.

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Cromatografa lquida

Las molculas de soluto que tienen dimetros significativamente menores que los
poros pueden penetrar en ellos y, de esta manera, ser retenidos durante un cierto
tiempo, mientras que las molculas que son ms grandes que el tamao medio de los
poros del relleno son excluidas, y, de esta forma, no se retienen, siendo eluidas en
primer lugar (figura 12.2.). Entre estos dos extremos existirn molculas de tamao
intermedio, cuya penetracin media en los poros depende de su tamao y cuyo avance
a lo largo de la columna ser algo retardado.

.
.

fase estacionaria porosa


molculas grandes (K=0)
molculas pequeas

Figura 12.2. Separacin por cromatografa de exclusin molecular.

En el captulo 10 se dedujo la ecuacin


VR = VM + K VS
donde VR es el volumen de retencin, VM el volumen muerto, VS el volumen de fase
estacionaria y K la constante de distribucin. En cromatografa de exclusin
molecular, VM se denomina generalmente volumen intersticial, Vo, y representa el
volumen de fase mvil que est en el exterior de la matriz porosa, mientras que VS es
el volumen de fluido contenido en los poros de la matriz, y suele representarse por Vi.
Reagrupando la ecuacin anterior, se obtiene*,

* La constante K se sustituye frecuentemente por una constante alternativa K , definida por


pr

K pr =

V R V o

Vt Vo
Si el material de que est constituida la matriz no ocupara volumen, Vi = Vt Vo, (Vt=volumen total de la
columna). Sin embargo, como sto no es as, Vt Vo ser mayor que Vi, aunque Vi es proporcional a Vt Vo,
puesto que el lquido dentro de las partculas ocupa una fraccin constante del volumen de ellas.

Claudio Gonzlez Prez

K=

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VR VM VR Vo
=
VS
Vi

La constante K caracteriza el comportamiento de un soluto en lo referente a su


retencin. Si K=0, el soluto en cuestin es totalmente excluido (VR=Vo), mientras que
para las molculas pequeas que penetran libremente en el gel, K=1 (VR=Vo+Vi). Las
molculas de tamao intermedio que pueden penetrar en algn grado en el gel, pero no
libremente, presentan valores de K que oscilan entre 0 y 1.
Las sustancias susceptibles de ser separadas por un determinado tipo de matriz
se obtienen a partir de una curva de calibrado como la indicada en la figura 12.3.,
donde se ha representado el peso molecular (Mr) frente a VR.

Figura 12.3. Curva de calibrado y cromatograma de exclusin molecular.

Las molculas cuyos tamaos sean mayores que el lmite de exclusin no son
retenidas por la columna y se eluyen todas juntas, igual que aquellas cuyos tamaos
sean inferiores al lmite de permeabilidad.
El fraccionamiento tiene lugar en la zona de permeabilidad selectiva, situada
entre ambos lmites, originndose picos que corresponden a solutos individuales. La
seleccin de un gel para llevar a cabo la separacin de una determinada mezcla de
sustancias se har de forma que sus pesos moleculares incidan en la zona recta del
calibrado*. Comercialmente se dispone de un gran nmero de geles con diferentes
* Debido a que el peso molecular no est directamente relacionado con el tamao y la forma de las

molculas, es necesario indicar, junto con los mrgenes de fraccionamiento, el tipo de molculas que se ha
utilizado para las determinaciones.

12

Cromatografa lquida

mrgenes de fraccionamiento. En la figura 12.4. se muestran las curvas de calibrado


de algunos.
Los efectos de la adsorcin sobre la superficie de las partculas de gel
normalmente suelen ignorarse, de forma que esta cromatografa puede considerarse
como un tipo de cromatografa de reparto, donde las fases mvil y estacionaria tienen
la misma composicin, ya que sta puede considerarse que es el lquido contenido en el
interior de los poros, y aquella el resto de lquido contenido en la columna.
10 7
IV

10 6

III

Mr
10 5

II
10 4

10 3
VR

Figura 12.4. Curvas de calibrado para determinados geles.

Tipos de geles. El gel deber ser una sustancia qumicamente inerte,


mecnicamente estable, con un tamao de partcula uniforme y con estructura de
poros perfectamente reproducible. Posiblemente, los dos tipos de materiales ms
utilizados sean los geles de dextranos con enlaces cruzados y los de poli-acrilamida.
En los geles de dextrano, el material de partida, dextrano, es un polisacrido
lineal, en el que las molculas de glucosa estn unidas mediante enlaces 1,6. La unin
entre unas y otras cadenas se produce mediante puentes de glicerilo entre grupos
hidroxilo, originndose la siguiente estructura:
O
HO

H 2C

HO
HO

HO

CH 2
O

HO

OH

OH

CH 2
O

HO

O
HO

HO

CH 2

HO

CH 2 O

HO

HO
HO

HO

El producto resultante, comercializado con el nombre de Sephadex G, es


insoluble en agua, pero hidroflico, debido a los grupos OH residuales, lo cual hace

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Claudio Gonzlez Prez

que al ponerlo en solucin es acuosas el gel se hinche, reteniendo entre 1 y 20 mL de


agua por gramo de resina seca. En disolventes no polares nicamente tiene lugar un
ligero hinchamiento, por lo que estas sustancias se utilizan casi exclusivamente en
medio acuoso.
Los geles de poliacrilamida, comercializados con el nombre de Bio-Gel P, se
preparan por copolimerizacin de la acrilamida con N,N'-metilenbisacrilamida y su
estructura puede representarse as:
O
=

CH 2 =CHCONH

(CH 2 =CHCNH)

Acrilamida
CONH

CH

2 CHCH

2 CHCH

CONH
2 CHCH

CONH
CONH
2 CHCH

2 C H

CONH

CH 2

CH

2 CH 2

NN'-metilenbisacrilamida

CONH

2 CHCH

2 CHCH

CH 2
CONH
CONH
2 CHCH
2 CH

CONH

CONH
CH 2

CONH
CHCH
CONH

2 CHCH

CONH
2 CHCH

2 CHCH

2 CH

CONH

Los geles de poliacrilamida se comportan de forma similar a los geles de


dextrano, si bien son menos resistentes a los lcalis y los grupos amida pueden
hidrolizarse a cidos carboxlicos cuando se ponen en contacto con disolventes de pH
extremos.
Los materiales descritos no son los nicos que se utilizan en cromatografa de
exclusin molecular. Los hay de naturaleza inorgnica, como la gel de slice y el vidrio
poroso y otros de naturaleza orgnica como los co-polmeros de estireno
divinilbenceno que se describieron en relacin con la C C I. Estos polmeros (sin los
grupos sulfnicos) se hinchan en disolventes como el tolueno o el cloruro de metileno,
y forman fases tiles para la cromatografa de macromolculas que son solubles en
disolventes orgnicos.
Aplicaciones. La aplicacin ms simple de la CEM es la separacin de dos grupos
de sustancias con pesos moleculares muy diferentes. Es posible le eliminacin de
especies de bajo peso molecular de disoluciones que contengan molculas grandes,
mediante el paso a travs de una columna de filtracin en gel. La tcnica, conocida
como desalinizacin, es til, por ejemplo, para la separacin de hemoglobina y cloruro
sdico. Asimismo, es posible el fraccionamiento de mezclas ms o menos complejas de

14

Cromatografa lquida

diferentes materiales, como pptidos, cidos nucleicos, enzimas, polisacridos, etc.


Por otra parte, la tcnica puede usarse con fines analticos o a escala preparativa.
Otra aplicacin de la CEM es la determinacin de pesos moleculares comparando
los volmenes de elucin de patrones. Sin embargo, debe considerarse que molculas
con el mismo peso molecular pero distinta forma exhiben diferentes caractersticas
de elucin.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD (CA)


La cromatografa de afinidad es, desde el punto de vista experimental, una
tcnica que generalmente se usa con fines preparativos ms que analticos. Se ha
convertido en una herramienta importante en la investigacin biomdica y consiste
bsicamente en lo siguiente: una especie (un ligando bio-especfico) que interaccione
con un solo soluto de una mezcla compleja se une covalentemente a la matriz de la
fase estacionaria de una columna (figura 12.5.a.). Cuando la mezcla se hace pasar a
travs de la columna, nicamente el mencionado soluto queda retenido, siendo
eliminados por lavado todos los dems (figura 12.5.b.), despus de lo cual, el nico
soluto retenido se eluye mediante el cambio de las condiciones experimentales al
debilitar lo suficiente el enlace gel-ligando (figura 12.5.c).
matriz
estacionaria

ligando bioespecfico
mezcla

b)

a)

lavado

elucin

c)

Figura 12.5. Representacin esquemtica de la cromatografa de afinidad.

La matriz deber estar constituida por partculas de tamao uniforme, porosas,


inertes y estables. Con esta finalidad, en muchas ocasiones, se utilizan geles de
dextrano, geles de poliacrilamida, celulosa, vidrio poroso y, muy frecuentemente, las
Sepharosas, que es el nombre comercial de la agarosa con enlaces cruzados*. La unin
entre el ligando y la matriz normalmente se hace a travs de los grupos OH de sta,
y debe poder realizarse en condiciones suaves, por lo que se hace necesario activar la
matriz.
* La agarosa es un polisacrido de galactosa y anhidrogalactosa. Es un componente del agar que se obtiene

de un tipo de algas marinas.

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Claudio Gonzlez Prez

La activacin de la matriz puede llevarse a cabo por reaccin con bromuro de


ciangeno, con lo que se forma un imido-carbonato,

OH
OH

O
+ CNBr

C=NH + HBr

imidocarbonato
En una etapa posterior, el ligando reacciona con la matriz activada para originar
el material con que se llenar la columna cromatogrfica.

NH

O
O

OCNHproteina

C=NH + H2 Nproteina

OH

Con frecuencia, el ligando est situado demasiado cerca de la matriz, lo cual


dificulta o impide su asociacin con la especie a retener, especialmente si se trata de
macromolculas (figura 12.6.a). Este problema se resuelva por va qumica con los
denominados "brazos de extensin", que son simplemente cadenas de hidrocarburos
situados entre la matriz y el ligando (figura 12.6.b.)
.
.

b)
a)
Figura 12.6. "Brazo de extensin" en cromatografa de afinidad.

Casi todas las aplicaciones de la cromatografa de afinidad inciden en el campo


de la Bioqumica, donde se utilizan las interacciones especficas en las que estn
implicados enzimas y sustratos o coenzimas, anticuerpos y antgenos, receptores y
hormonas, etc. Hay que mencionar que esta forma de cromatografa es la nica en la
que se disea la fase estacionaria para que interacte con un soluto particular.

Cromatografa lquida

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CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION


(CLAR o HPLC)
Los avances obtenidos en el desarrollo de la instrumentacin cientfica
consiguieron que al final de la dcada de 1960 fuese posible el anlisis de mezclas
complejas por cromatografa de gases en cuestin de minutos o incluso segundos,
pudindose detectar, en las condiciones ms favorables, cantidades de sustancias del
orden de los nano-gramos, y algunas veces de los pico-gramos. Sin embargo, para
muestras no voltiles, la cromatografa lquida clsica, a pesar de haber demostrado
un gran poder de separacin, no alcanzaba la eficiencia y la sensibilidad de la CG, ya
que, en muchas ocasiones, era necesario invertir horas para la elucin, recoger
fracciones de forma manual conteniendo miligramos o gramos de material eluido y
utilizar litros de disolvente. Era, pues, necesario lograr que la CL proporcionase unas
prestaciones similares a las logradas con la CG. Para ello, tena que acelerarse,
automatizarse y adaptarse a muestras mucho ms pequeas. Como consecuencia de los
esfuerzos efectuados en estas direcciones, surgi la moderna Cromatografa Lquida
de Alta Resolucin (CLAR o HPLC*)

PRINCIPIOS BASICOS
El primer aspecto considerado en orden a optimizar la CL fue incrementar la
velocidad de la fase mvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante
la utilizacin de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar
sometido el lquido a presiones elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias
convencionales, el empleo de altas velocidades de fase mvil implica una prdida de
resolucin. Para mejorar sta, se hace necesario modificar el empaquetamiento de la
fase estacionaria, lo cual se considerar seguidamente en conexin con la ecuacin de
van Deemter,

H=A+

B
+Cu
u

que, aunque desarrollada para cromatografa en fase gaseosa, es razonable considerar


que el ensanchamiento de las bandas en CL se debe al mismo tipo de factores.
La resolucin en cromatografa lquida se mejora al disminuir el tamao de las
partculas de la fase estacionaria, lo cual, en primer lugar, reduce el trmino A de la
* Ya se indic en el captulo 10 que las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin inglesa

High Performance Liquid Chromatography, si bien, en algunos artculos las mencionadas siglas significa "alta
presin", High Pressure.

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Claudio Gonzlez Prez

ecuacin de van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase mvil son ms
uniformes en el caso de partculas de menor tamao.
En relacin con la difusin longitudinal, B/u, este trmino es importante en
cromatografa de gases, pero como la difusin es mucho ms lenta en los lquidos, el
ensanchamiento de las bandas por este motivo en CL solo es significativo cuando la
velocidad de flujo es excesivamente lenta.
El trmino de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que,
con velocidades de flujo elevadas, se conseguirn bajas resoluciones, al menos que la
transferencia de solutos entre las fases mvil y estacionaria sea muy rpida. A esto
colabora decisivamente la reduccin del tamao de las partculas de la fase
estacionaria. Los materiales que normalmente se utilizan en cromatografa lquida
convencional estn constituidos por partculas de tamao relativamente grande (150
m ms) y con poros profundos, como se representa en la figura 12.7.a. Estos poros
se llenan con porciones estancadas de fase mvil y es posible que las molculas de
soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por difusin al lquido
mvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja con lentas
velocidades de flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas, se
origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.
poro
superficial

poro
profundo

150

50

poro
superficial

5
1-2

al detector
al detector
al detector
Dimetro de partcula
Longitud de la columna
Dimetro de la columna
Presin

150 m
50-200 cm
20-30 mm
1 atm.

40-70
m
50-100 cm
1-3 mm
30-50 atms.

5-10 m
10-50 cm
2-6 mm
100-200 atms.

Figura 12.7. Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partculas
peliculares. c) HPLC con partculas microporosas.

Cromatografa lquida

18

Los primeros intentos satisfactorios para mejorar las prestaciones en el sentido


indicado, condujeron a la utilizacin de fases estacionarias de partculas peliculares,
constituidas por partculas esfricas de un material slido no poroso (frecuentemente
bolitas de vidrio de unos 40 m de dimetro) recubiertas de una capa superficial
porosa y de espesor muy pequeo (entre 1 y 3 m ). Esta capa puede ser gel de slice,
almina o geles de poliamida (figura 12.7.b.). De esta forma, la presencia de poros
superficiales facilita considerablemente el proceso de transferencia de masa. Sin
embargo, debido al pequeo espesor de la pelcula porosa, el volumen de la fase
estacionaria, VS, es pequeo, por lo que este tipo de columnas no resultan adecuadas
para cromatografa preparativa.
En poca relativamente reciente se ha incrementado el uso de una nueva generacin
de materiales de partculas micro-porosas con tamaos inferiores a 30 m y que son
totalmente porosos (figura 12.7.c.). Estas fases estacionarias no pueden conseguirse
mediante simple pulverizacin, ya que de esta forma se obtienen partculas muy
irregulares, sino que requieren la utilizacin de una tecnologa diferente. En cualquier
caso, tanto con partculas peliculares como con partculas micro-porosas, el precio a
pagar es la elevada resistencia al flujo. Por ello, es necesario utilizar presiones
elevadas para forzar el paso de lquido a travs de la columna. Normalmente, se
requieren presiones que pueden llegar a ser de hasta 200 atmsferas para
velocidades de flujo de 0.5 a 5 mL/min.
La utilizacin de columnas de pequeo dimetro presenta ciertas ventajas, sobre
todo en anlisis de trazas, si bien, aunque la reduccin del dimetro de la columna a
niveles capilares tambin aumenta la resolucin, tales columnas no son de uso comn en
HPLC.

INSTRUMENTACION
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC se han representado
esquemticamente en la figura 12.8. y son:
*
*
*
*
*

Depsitos para la fase mvil.


Sistema de bombeo para proporcionar presin a la fase mvil.
Dispositivo para la introduccin de la muestra.
Columna cromatogrfica.
Detector.

* Sistema para el tratamiento de datos y registrador.

19

Claudio Gonzlez Prez

Como algunas fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas,
como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema
estn fabricados con materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayora de las
partes del cromatgrafo en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con
acero inoxidable, previamente pasivado con cido ntrico 6 M, de forma que en esas
condiciones, su superficie es resistente al ataque de la mayora de los disolventes, con
excepcin del cido clorhdrico. Las mayores ventajas del acero residen en su coste
relativamente bajo, la facilidad para construir con l los distintos componentes y la
resistencia mecnica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.
He
Introduccin de la muestra

Columna

Registro
Disolvente

Bomba
Detector

.
Figura 12.8. Componentes bsicos de un sistema para HPLC.

En cromatografa de gases se haca necesario un control bastante estricto de la


temperatura de trabajo. Sin embargo, en cromatografa lquida, este control no suele
ser tan necesario, debido a que la transmisin de calor del soluto entre las fases mvil
y estacionaria es mucho ms pequea. Por ello, los cambios en la temperatura ejercen
menos influencia sobre el grado de retencin y la resolucin. Esto hace que en muchas
aplicaciones no sea necesario un control estricto de esta variable y las columnas
trabajen a temperatura ambiente. De cualquier forma, es posible el control de la
temperatura mediante el empleo de hornos que la regulan desde la del ambiente hasta
150 C, o bien mediante el encamisado de la columna.

Cromatografa lquida

20

CARACTERISTICAS DE LAS FASES MOVILES Y SISTEMAS DE


ELUCION
Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase mvil (y las tuberas que la
conduzcan) tienen que ser inertes, esto es, el disolvente no deber extraer especie
alguna del material con que estn construidos. Generalmente se usan botellas de vidrio
y tubos de tefln, provistos stos ltimos de un sistema de filtros para eliminar
cualquier partcula que pueda contener la fase mvil.
Los disolventes ms utilizados en HPLC suelen ser agua, disoluciones tampn
acuosas y disolventes orgnicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas.
En cualquier caso, todos los disolventes debern ser espectroscpicamente puros,
exentos de partculas slidas y desgasificados. Esto puede llevarse a cabo por
filtracin a vaco a travs de filtros de 0.220.45 m, o mediante el burbujeo con un
gas inerte muy poco soluble, como nitrgeno o helio. La des-gasificacin reduce la
posibilidad de formacin de burbujas en la vlvulas de las bombas y en los detectores.
Asimismo, es importante porque se reduce el ruido de fondo cuando se utiliza un
detector ultravioleta, y porque se evita la interferencia del oxgeno disuelto en la
deteccin fluorimtrica. Adems, es fundamental cuando se utiliza elucin por
gradiente en fase inversa, especialmente con gradientes de presin baja, ya que de
esta forma se evita la formacin de burbujas de aire cuando se mezclan el agua y el
disolvente orgnico.
Aunque la separacin de muchas mezclas se lleva a cabo utilizando un disolvente
de composicin constante (elucin isocrtica), en ocasiones se usa la elucin por
gradiente, en la cual se cambia la composicin de la fase mvil durante el desarrollo
del cromatograma. Con ello se consigue aumentar la eficiencia de la separacin, con
unos efectos similares a los producidos por la programacin de temperatura en
cromatografa de gases. El esquema representado en la figura 12.8. corresponde a un
sistema de este tipo con dos disolventes.

SISTEMAS DE BOMBEO
Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeo
tamao de las partculas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que
proporcionen un flujo aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo usados en HPLC
debern reunir las siguientes caractersticas:
* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.

Claudio Gonzlez Prez

21

* Suministrar un flujo de eluyente libre de pulsaciones, en el margen


comprendido entre 0.1 y 10 mL/min con una precisin del 0.5 %.
* Generar presiones superiores a 6000 psi (lb/in2)*.
La mayor parte de los sistemas de HPLC utilizan las denominadas bombas
recprocas, cuyo principio de funcionamiento se ilustra en la figura 12.9.
Estas bombas consisten en un pistn de zafiro situado en el interior de una
cmara de volumen reducido (35400 L) que, alternativamente succiona eluyente
contenido en un depsito a baja presin y lo impulsa hacia la columna a presin alta,
mediante un sistema de vlvulas como el representado esquemticamente en la figura
12.9. Con este dispositivo se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal
constante, pudindose adaptar fcilmente a la tcnica de elucin con gradiente,
debido a su pequeo volumen interno. Sin embargo, producen un flujo pulsante que se
ha de amortiguar convenientemente, para lo cual se utiliza en ocasiones un sistema
constituido por dos pistones.

Vlvula de salida

Pistn

Vlvula de entrada

Eluyente
Figura 12.9. Principio de funcionamiento de una bomba recproca.

Las bombas de desplazamiento se utilizan mucho menos que las anteriores y


bsicamente consisten en una cmara relativamente grande equipada con un
mecanismo de tornillo (figura 12.10.). Suministran un flujo libre de pulsaciones, pero
presentan el inconveniente de su capacidad limitada ( 250 mL).

* Las presiones que se generan en HPLC, a pesar de ser muy elevadas, no constituyen peligro de explosin,

debido a la incompresibilidad de los lquidos. Unicamente, si el disolvente es inflamable, existir riesgo de


incendio como consecuencia de la rotura de algn componente.

22

Cromatografa lquida
Vlvula
de entrada

Vlvula
de salida

Eluyente

Columna

Cmara conteniendo
eluyente

Figura 12.10. Bomba de desplazamiento.

Las bombas neumticas hacen uso de la presin de un gas aplicado al recipiente


conteniendo la fase mvil. Estas bombas son muy sencillas y no provocan pulsaciones, si
bien, estn limitadas a presiones relativamente bajas.

INTRODUCCION DE LA MUESTRA
La introduccin de las muestras en la columna cromatogrfica es frecuentemente
el factor controlante de la reproducibilidad de las medidas. Los volmenes a inyectar
debern ser pequeos, para evitar la sobrecarga de la columna y se ha de introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
La forma ms simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum")
anlogo al utilizado en cromatografa de gases (ver la figura 11.3.a.), si bien este
sistema est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.
El mtodo ms utilizado en HPLC consiste en usar vlvulas de inyeccin con
bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 10.17 (Captulo 10) y,
ms esquemticamente, en la figura 12.11.
Bomba
Bomba
Columna

Columna

Jeringa

Entrada de
muestra

Bucle

a)

b)

Figura 12.11. Vlvula de inyeccin. a) Llenado. b) Inyeccin.

Claudio Gonzlez Prez

23

En la posicin de llenado (figura 12.11.a.), la fase mvil pasa directamente a la


columna, y la muestra se introduce en el bucle mediante una micro-jeringa. Una vez
lleno el bucle, se gira la vlvula a la posicin de inyeccin (figura 12.11.b.) en la que la
fase mvil impulsa la muestra hasta la columna. Un inconveniente que presenta este
sistema es que la precisin de la inyeccin vara con el tamao del bucle.

COLUMNAS, FASES ESTACIONARIAS Y FASES MOVILES


Las caractersticas fsicas de las columnas usadas en HPLC (longitud, dimetro)
se han indicado anteriormente (ver figura 12.7.), as como los tamaos de las
partculas que constituyen la fase estacionaria (partculas peliculares, partculas
micro-porosas). En cuanto a la resolucin, lo normal es operar con columnas que tienen
entre 40000 y 60000 platos tericos por metro.

Cromatografa de adsorcin
Las nicas sustancias usadas como fase estacionaria en este tipo de
cromatografa son la gel de slice y la almina, siendo aquella la preferida en casi todas
las aplicaciones.
Como ya se indic en relacin con la CLS convencional, la gel de slice presenta
gran actividad superficial, debido a la presencia de grupos silanol, los cuales pueden
interaccionar con grupos funcionales polares presentes en las molculas de soluto,
tales como alcoholes, aminas, cetonas y cidos carboxlicos.
La desactivacin de la gel de slice tiene lugar por hidratacin, pudindose
distinguir entre agua dbilmente unida, y que puede eliminarse fcilmente por
calefaccin o por extraccin, agua enlazada ms fuertemente y agua presente como
OH en grupos silanol contguos, y que nicamente puede eliminarse por calefaccin
fuerte. En los dos primeros casos, la deshidratacin es reversible, mientras que en el
ltimo, es irreversible.
El tamao de los poros superficiales influye sobre el proceso de deshidratacin.
As, puede considerarse que la superficie interna de los poros est recubierta de
grupos hidroxilo. Si se trata de poros anchos, la prdida de agua tiene lugar a 110 C,
originndose grupos siloxano, poco importantes cromatogrficamente, y que pueden
re-hidratarse con facilidad (figura 12.12.a.). Si, por el contrario, se trata de poros
estrechos, la deshidratacin puede transcurrir como se representa en la figura

24

Cromatografa lquida

12.12.b., en cuyo caso, el proceso es irreversible y conduce a una prdida efectiva de


rea superficial debida al entrecruzamiento producido.
Si

Si OH

Si

Si OH

H2O

a) Poros anchos

Si

OH
HO

Si

Si

Si

b) Poros estrechos

Figura 12.12. Tamao de poro y deshidratacin.

La composicin de la fase mvil es prcticamente la nica variable que puede


utilizarse para optimizar las separaciones de mezclas de solutos. Como se indic en
relacin con la cromatografa de adsorcin convencional, una serie eluotrpica es un
listado de disolventes ordenados segn su capacidad relativa para desplazar solutos
de un adsorbente dado. Una forma de cuantificar la fuerza de los disolvente es
utilizar el parmetro denominado fuerza eluyente, o, que se define como la energa
de adsorcin del disolvente por unidad de rea. Sin embargo, con frecuencia, un
disolvente solo no resulta adecuado para una determinada separacin, recurrindose
en estos casos a mezclas binarias o ternarias, con objeto de encontrar la ms
adecuada en cuanto a su fuerza eluyente. Para ello, puede utilizarse el tanteo, si bien,
es ms conveniente usar ciertos mtodos que se han desarrollado con esa finalidad.
Por otra parte, para la resolucin de determinadas mezclas, en ocasiones, es
necesario llevar a cabo una elucin por gradiente, en lugar de hacerlo isocrticamente.

Cromatografa de reparto
En cromatografa de reparto, las fases mvil y estacionaria deben seleccionarse
de forma que la solubilidad recproca sea mnima. Sin embargo, por muy distintos que
sean dos lquidos, siempre sern algo miscibles y, por ello, la fase mvil deber
presaturarse con la fase estacionaria antes de ponerse ambas en contacto dentro de
la columna. Esta pre-saturacin puede efectuarse simplemente por agitacin de ambas

25

Claudio Gonzlez Prez

hasta que se equilibren, si bien, suele ser preferible utilizar una pre-columna situada
antes del sistema de introduccin de las muestras. La pre-columna deber contener un
relleno de gran rea superficial, tal como gel de slice, recubierto con una cantidad
relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. Sin
embargo, cuando la fuerza del disolvente es lo bastante elevada para disolver
cantidades apreciables de fase estacionaria, la pre-saturacin se hace difcil. Por otra
parte, evidentemente, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide
utilizar la tcnica de la elucin con gradiente.

Cromatografa de fase enlazada (CFE)


Las limitaciones mencionadas que presenta la cromatografa de reparto
encontrar pares de lquidos inmiscibles, pre-saturacin de la fase mvil e imposibilidad
de la elucin por gradiente pueden superarse con la cromatografa de fases
enlazadas. En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria se une qumicamente a
la superficie del soporte slido, el cual casi siempre est constituido por
micropartculas de gel de slice, cuyos dimetros oscilan entre 3 y 10 m. Los grupos
OH pueden ser silanizados por reaccin con organocloro u organoalcoxisilanos para
formar enlaces siloxano estables
CH3
CH3
SiOSiR+ HCl
Si OH + ClSiR
CH3
CH3
As, por ejemplo, con octadecilclorosilano, el proceso es,

Si OH + C18H37Si(CH3 )2 Cl

CH3
SiOSiC18H37
CH3

Los grupos silanol residuales que no hayan reaccionado


desactivarlos, lo cual suele hacerse con clorotrimetilsilano.

es

necesario

Considerando las polaridades relativas de las fases mvil y estacionaria, se


distinguen, como ya se mencion, dos tipos de cromatografa. En la cromatografa en
fase normal, la fase estacionaria es polar, utilizndose como tales, rellenos en los que
R en la estructura del siloxano puede ser un grupo ciano (C2H4CN), diol (
C3H6OCH2CHOHCH2OH), amino (C3H6NH2) y dimetilamino [C3H6N(CH3)2]. La
elucin se lleva a cabo con disolventes no polares, como etilter, cloroformo o nhexano. Operando en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido
a que es el ms soluble en la fase mvil, y un aumento de la polaridad de sta, hace
disminuir el tiempo de elucin.

Cromatografa lquida

26

En la cromatografa en fase inversa, que es la utilizada en la mayora de las


aplicaciones, la fase estacionaria es no polar, tratndose frecuentemente de
hidrocarburos tales como C8 (n-octilo) C18 (n-octadecilo). Los tiempos de retencin
aumentan al hacerlo la longitud de la cadena de la fase enlazada. Para una determinada
fase, en esta modalidad de fase inversa, los componentes ms polares aparecen
primero y un aumento de polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin. Los
grupos de hidrocarburos de cadena larga se alinean unos junto a otros,
perpendicularmente a la superficie de la partcula, originando una estructura
semejante a la de un cepillo. La elucin se lleva a cabo con una fase mvil de polaridad
elevada, como disoluciones acuosas conteniendo metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano.
La principal limitacin de estas fases enlazadas con base silcea reside en que el
pH del eluyente debe estar comprendido entre 2 y 8, para evitar la hidrlisis de la
fase estacionaria. El mecanismo de retencin por las fases enlazadas no est
suficientemente claro. Para algunos, el proceso es anlogo al que tiene lugar en la
cromatografa convencional lquido-lquido, si bien, parece que simultneamente puede
participar tambin un mecanismo de adsorcin.
En cromatografa lquida, la seleccin de la columna y de la fase mvil para la
separacin de una mezcla determinada es un problema ms complicado que en
cromatografa de gases, ya que en aquella, los componentes de la muestra
interaccionan con ambas fases, mvil y estacionaria, mientras que en CG la fase mvil
nicamente se comporta como portador de los componentes a travs de la columna.
Para elegir una columna puede utilizarse la norma siguiente: la polaridad de la

fase estacionaria debe ser bastante similar a la de los analitos, y para la elucin
se utiliza entonces una fase mvil con una polaridad considerablemente distinta.

Esta norma tiene el inconveniente de que si la diferencia de polaridades es muy


grande, los tiempos de retencin pueden ser excesivamente largos. Tambin podra
utilizarse una fase estacionaria cuya polaridad fuese muy diferente a las de la fase
mvil y los componentes de la muestra, si bien, en este caso, los tiempos de retencin
podran ser demasiado cortos. En la prctica, se suele elegir la fase estacionaria de
una manera general, y seguidamente seleccionar la fase mvil empricamente, despus
de realizar una serie de ensayos.

Adems de los tipos de cromatografa mencionados, se han desarrollado fases


estacionarias para separaciones por HPLC mediante los mecanismos de intercambio
inico, exclusin molecular, as como fases quirales para la resolucin de
enantimeros. Esta cromatografa quiral implica un proceso de derivatizacin precolumna en el cual los componentes D- y L- de una mezcla racmica reaccionan con un

27

Claudio Gonzlez Prez

compuesto puro pticamente activo para originar una mezcla de diastereoismeros, la


cual puede resolverse por HPLC, en fase normal o inversa.
En las pginas anteriores se ha hecho referencia a todo un conjunto de tipos
distintos de HPLC y de fases estacionarias. El problema que se presenta en la prctica
es: cual de ellos se elegir para una determinada mezcla?. En este sentido, puede
decirse que en la mayora de los casos se utiliza un mtodo conocido, por haber sido
previamente publicado. Si esto no es as, o no se dispone de la columna requerida,
puede utilizarse en plan orientativo el cuadro representado en la tabla 12.1., si bien,
hay que tener en cuenta que suele haber varias formas posibles para separar los
componentes de una mezcla dada.
Tabla 12.1.
Guia simplificada para la eleccin del tipo de HPLC.

Compuesto

Cromatografa

agua

inico

CCI

no inico

C F E normal

ciano, amino

CH3OH

C F E normal

ciano, amino,
diol

CHCl3

C. Adsorcin

slice

hexano

C F E inversa

C8, C18, fenil,


ciano

Tamao

Cromatografa

Peso molecular

< 2000

Solubilidad

Compuesto
inico

Peso molecular

Fase
estacionaria

Solubilidad

agua

CCI
< 30 nm

C F E inversa

30-400 nm

CEM

disolventes

< 30 nm

C F E inversa

orgnicos

30-400 nm

CEM

>2000

no inico

Cromatografa lquida

28

DETECTORES
En HPLC no existen detectores de uso tan general como lo son el de
conductividad trmica o el de ionizacin de llama para cromatografa de gases. Por
ello, se utilizan distintos tipos de sistemas de deteccin que pueden clasificarse de la
forma siguiente:

Absorbancia ultravioleta
Propiedad del soluto

Fluorescencia
Electroqumicos

Propiedad de la disolucin

Indice de refraccin
Conductividad

Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad
fsica o fsico-qumica del soluto, y que generalmente no la presenta la fase mvil.
Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los
detectores basados en una propiedad de la disolucin comparan el cambio global de
alguna propiedad fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores
responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
Un detector ideal en HPLC deber reunir las siguientes caractersticas*:
*
*
*
*

Sensibilidad elevada.
Buena estabilidad y reproducibilidad.
Amplio margen de respuesta lineal.
Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.

* Pequeo volumen muerto, para minimizar el ensanchamiento de las bandas


cromatogrficas.
* Insensible a cambios en la presin y la temperatura.
* Respuesta independiente de la composicin de la fase mvil.
* No destructivo.

* Muchas de las caractersticas coinciden con las indicadas para los detectores relacionados con la

cromatografa de gases.

29

Claudio Gonzlez Prez

Los detectores que seguidamente se resean no cumplen todas las


caractersticas anteriores, pero, sin embargo, resultan adecuados para la mayora de
las aplicaciones rutinarias en HPLC. Se presentan en orden decreciente en cuanto a la
frecuencia de su uso.

Detectores de absorbancia ultravioleta


Los detectores de absorbancia ultravioleta (tambin visible) son los ms
utilizados en HPLC. Su fundamento es la espectrofotometra de absorcin, cuyos
principios se indican en el captulo 3. Para adaptar un espectrofotmetro convencional
a medidas en HPLC, la modificacin ms importante es disear adecuadamente la
clula de flujo. Esta deber contener un volumen mnimo (entre 1 y 10 L) y ser capaz
de soportar presiones de varias atmsferas. En la figura 12.13. se muestra
esquemticamente una de estas clulas, diseada en forma de Z.
De la
columna

Detector

Desecho

Figura 12.13. Clula de flujo para HPLC.

El detector ultravioleta ms sencillo utiliza la emisin intensa a 254 nm de una


lmpara de mercurio y la deteccin a una sola longitud de onda. Se estima que casi
las dos terceras partes de los solutos orgnicos analizados por HPLC presentan
absorcin a esa longitud de onda, especialmente los compuestos aromticos, los cuales
tienen absortividades molares del orden de 104.
En instrumentos ms verstiles se utiliza una lmpara de deuterio y un
monocromador para mediciones a longitud de onda variable. Cuando los picos estn
suficientemente separados, se puede elegir una longitud de onda para cada pico, si
bien, cuando se desean obtener los espectros completos con fines de identificacin,
puede pararse el flujo durante el tiempo necesario para efectuar el barrido de
longitudes de onda, o bien, utilizar algn sistema de barrido rpido, como el que se
menciona seguidamente.
Los detectores espectrofotomtricos ms potentes son los que utilizan un
montaje de fotodiodos para registrar el espectro completo de cada soluto que pasa

30

Cromatografa lquida

por el detector. En estos dispositivos, toda la radiacin procedente de la fuente


(lmpara de deuterio) se hace pasar a travs de la muestra, en lugar de seleccionar
previamente una radiacin determinada con un monocromador como en
espectrofotometra convencional (figura 12.14.).
La radiacin emergente de la clula de flujo se dispersa por una red de
difraccin hologrfica en radiaciones monocromticas que se focalizan
simultneamente sobre un conjunto de fotodiodos constituido por varios centenares
de elementos fotosensibles y dispuestos linealmente. Cuando la radiacin transmitida
incide sobre los fotodiodos, se genera una seal elctrica que se procesa para dar
datos de absorbancia, que representados en funcin de la longitud de onda detectada
por cada uno de los fotodiodos origina el correspondiente espectro de absorcin. Este
proceso puede repetirse muchas veces por segundo, por lo que pueden generarse una
gran cantidad de datos experimentales durante el tiempo que la muestra pasa por la
clula.
Fotodiodos

UV

Visible

Lmpara de deuterio

Clula de flujo
Red halogrfica

Figura 12.14. Dispositivo de fotodiodos.

Los datos de absorbancia se representan en funcin de la longitud de onda y del


tiempo, con lo que se obtienen grficos como el representado en la figura 12.15.,
donde se muestra el mapa espectral correspondiente a la separacin de los
compuestos 1, 2 y 3 por HPLC.
2

1
A
m
tie

po

, nm

Figura 12.15. Espectros de una separacin por HPLC con dispositivo de fotodiodos.

31

Claudio Gonzlez Prez

Detectores de fluorescencia
Un cierto nmero de compuestos qumicos tienen propiedades fluorescentes,
esto es, pueden absorber radiacin electromagntica de una determinada longitud de
onda y emitir radiacin fluorescente a longitud de onda ms larga. Como se coment en
el captulo 4, son compuestos tpicamente fluorescentes aquellos sistemas cclicos con
un alto grado de conjugacin. Tal es el caso de hidrocarburos aromticos
polinucleares, quinolenas, esteroides, alcaloides, etc.
Para detectar las especies fluorescentes en HPLC se utilizan dispositivos
semejantes en diseo a los fluormetros y espectrofluormetros que se describieron
en el tema 4. En ellos, el detector se coloca perpendicularmente a la direccin del haz
de radiacin de excitacin (figura 12.16.), la cual suele originarse por una lmpara de
xenn o deuterio y seleccionar la longitud de onda adecuada mediante los
correspondientes filtros.
.

Clula de flujo
Fuente de
radiacin

Filtros de
excitacin
Filtros de emisin

Detector (fotomultiplicador)
Figura 12.16. Diagrama esquemtico de un detector de fluorescencia.

Los detectores de fluorescencia se caracterizan por ser especialmente


sensibles, si bien, responden solo a la limitada gama de analitos que tienen propiedades
fluorescentes. Con objeto de incrementar su aplicabilidad, es posible comunicar
fluorescencia a determinados analitos mediante el uso de reactivos apropiados. Esta
derivatizacin puede realizarse en la muestra antes de la columna, si bien, lo normal
es llevar a cabo una derivatizacin poscolumna. Este proceso puede llevarse a cabo en
un dispositivo como el representado esquemticamente en la figura 12.17., donde el
reactivo derivatizante se aade continuamente al flujo que sale de la columna. Con
frecuencia, la reaccin qumica entre el reactivo y el analito necesita un cierto tiempo
para que ocurra, por lo cual suele colocarse un bucle entre el punto de insercin del
reactivo y el detector.

32

Cromatografa lquida

Bucle

Columna

Detector

Bao de agua

Bomba

Reactivo

Figura 12.17. Derivatizacin poscolumna.

Detectores electroqumicos
La deteccin electroqumica ofrece ciertas ventajas respecto a otros mtodos
de deteccin, en orden a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad,
especialmente para compuestos orgnicos. En este sentido, cualquier especie capaz de
ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de deteccin por via
electroqumica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacuticas y
qumicas. As, por ejemplo, fenoles, aminas, perxidos y mercaptanos pueden
detectarse por oxidacin, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas,
aldehidos y nitrocompuestos aromticos pueden ponerse de manifiesto mediante
procesos de reduccin. Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad
son la amperometra, voltamperometra y culombimetra*.
La configuracin bsica de un detector electroqumico se representa en la figura
12.18., y consta de un dispositivo en el que se incluyen un electrodo de trabajo, un
electrodo de referencia y uno auxiliar.
En el detector amperomtrico se aplica un determinado potencial al electrodo de
trabajo y se mide la intensidad de la corriente resultante de la reaccin
electroqumica que ocurra en dicho electrodo. La superficie de este electrodo suele
ser muy pequea (menor de 0.5 cm2), por lo que la electrlisis del analito es
incompleta. Cuando se usan electrodos de gran rea superficial, puede tener lugar una
reaccin cuantitativa sobre el electrodo, y entonces se tiene la deteccin
* En algunos textos se incluye tambien la conductimetra dentro de este apartado, si bien, los detectores de

conductividad suelen tratarse de forma independiente.

33

Claudio Gonzlez Prez

culombimtrica. Por su parte, la deteccin voltamperomtrica (incluida la


polarogrfica) implica la aplicacin de un potencial variable al electrodo de trabajo
seguida de la medida de la intensidad de la corriente resultante de la reaccin
electrdica.

Electrodo
de referencia
Electrodo
de trabajo

Electrodo
auxiliar
Figura 12.18. Configuracin bsica de un detector electroqumico.

De las tres tcnicas mencionadas, la ms utilizada en la prctica es la


amperometra. La polarografa se utiliza poco, debido a las dificultades para construir
clulas de pequeo volumen para el electrodo de gotas de mercurio, as como las
limitaciones de dicho electrodo para operar en la zona andica (ver "Caractersticas
del electrodo de gotas de mercurio" en el tema 9).
Los electrodos ms utilizados para la deteccin amperomtrica son los
siguientes: como electrodo de referencia se usan casi exclusivamente el de Ag-AgCl y
el de calomelanos, mientras que los electrodos auxiliares suelen ser de platino o de
carbn vtreo. En algunas clulas, el capilar de acero inoxidable usado para conectar la
columna cromatogrfica a la clula puede servir como electrodo auxiliar. En cuanto a
los electrodos de trabajo, se han utilizado una amplia variedad de materiales. Para
procesos de reduccin se usa fundamentalmente mercurio, mientras que para
oxidaciones el material ms empleado es el carbn, en sus distintas variedades de
pasta de carbn, carbn vtreo, grafito piroltico o fibra de carbn. El oro y el
platino tambin pueden usarse en procesos andicos.

Cromatografa lquida

34

En general, los detectores electroqumicos son relativamente simples y muy


sensibles para determinados analitos, pudindose medir fcilmente corrientes del
orden de los nano-amperios. La intensidad de la corriente es proporcional a la
concentracin en varios rdenes de magnitud, si bien, se requieren disolventes
acuosos u otros disolventes polares que contengan electrolitos disueltos, y, adems, en
ocasiones, deben estar rigurosamente exentos de oxgeno.

Detectores de ndice de refraccin


El detector de ndice de refraccin es, posiblemente, el que ms se aproxima al
detector universal ideal, ya que, en principio, el ndice de refraccin (IR) de la fase
mvil deber modificarse por la presencia de cualquier soluto que tenga un ndice de
refraccin diferente de ella. Por ello, la comparacin del IR de la fase mvil pura con
el de los efluentes que salen de la columna cromatogrfica, indicar la presencia de
cualquier soluto eluido.
El principal inconveniente de este tipo de detectores es que son muy sensibles a
los cambios de temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de 0.0001
C. Por otra parte, no resultan adecuados para trabajar con la modalidad de elucin
por gradiente.

Detectores de conductividad
Los detectores de conductividad son los ms utilizados cuando los solutos eluidos
son inicos, como, por ejemplo, cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos
despus de su separacin por cromatografa de cambio inico.
La medida de la conductividad de los lquidos se lleva a cabo normalmente
aplicando un potencial elctrico entre dos electrodos, lo cual origina un movimiento de
los aniones y cationes presentes en el seno de la disolucin. La resistencia (o la
conductividad) de la disolucin contenida entre los dos electrodos depende de la
naturaleza y concentracin de las especies inicas presentes. Generalmente se opera
con corriente alterna, con un dispositivo experimental como el que se muestra
esquemticamente en la figura 12.19., donde la clula de conductividad se coloca en
una de las ramas de un puente de Wheatstone.

35

Claudio Gonzlez Prez

R1
.

Rs

C.A.

R2

Clula de conductividad

Figura 12.19. Detector de conductividad.

Los detectores de conductividad son simples, baratos, robustos y de prolongada


duracin. Asimismo, pueden tener una sensibilidad elevada y responden
proporcionalmente a los cambios de concentracin de especies inicas. Sin embargo,
su principal limitacin proviene de que la elevada conductividad de los componentes de
las fases mviles usadas en cromatografa inica tiende a enmascarar la de los
analitos, reduciendo la sensibilidad. Este inconveniente se resolvi mediante el uso de
columnas supresoras colocadas inmediatamente despus de la columna cromatogrfica.
En ellas, se transforman los iones del disolvente en especies moleculares poco
disociadas, sin alterar los iones del analito*.

APLICACIONES
La cromatografa lquida de alta resolucin es una tcnica extraordinariamente
verstil, como lo prueba la amplia variedad de mezclas que pueden separarse con ella.
Posiblemente es la tcnica instrumental ms importante en relacin con anlisis
farmacutico y de alimentos. As-mismo, desempea un papel importante en estudios
fornsicos, ambientales y bioqumicos.
Adems de las aplicaciones mencionadas en pginas anteriores en relacin con la
cromatografa lquida convencional, se citan seguidamente algunos ejemplos
caractersticos.
* Para la separacin de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina

aninica en forma de hidrxido, con lo que el Cl queda retenido por la resina y los H+, con los OH forman
H2O,
H+ + Cl + ROH(s) > RCl(s) + H2O
En la separacin de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sdico como eluyente. En este
caso, la columna supresora contiene la forma cida de una resina catnica, con lo que se forma H2CO3 muy
poco disociado,
Na+ + HCO3 + RH+(s) > RNa+ + H2CO3

Cromatografa lquida

36

La cromatografa en fase normal se utiliza extensamente para el anlisis de


sustancias que son solubles en disolventes no polares, tales como vitaminas, pigmentos,
aceites esenciales, aditivos no polares en distintos productos comerciales y
formulaciones farmacuticas. As-mismo, uno de los usos ms importantes de esta
modalidad de cromatografa es la separacin de ismeros.
La cromatografa en fase inversa, y particularmente la de fase enlazada, es, sin
duda, la ms ampliamente utilizada. Se calcula que el 75 % de las separaciones por
HPLC se llevan a cabo por dicha tcnica. En la industria farmacutica sus aplicaciones
se centran, entre otras, en el anlisis de vitaminas, -bloqueantes, alcaloides,
esteroides, tetraciclinas, prostaglandinas, etc. As-mismo, es utilizada para el anlisis
de especies biolgicamente activas, como aminocidos, protenas y cidos nucleicos.
Por ltimo, mencionar que otro campo de accin de la tcnica es el anlisis de
muestras medioambientales, como pesticidas y herbicidas, incluyendo paracuat,
dicuat, carbamato y compuestos organofosforados, as como distintos polutantes,
tales como hidrocarburos poliaromticos fenolicos y aldehidos/cetonas.

37

Claudio Gonzlez Prez

CROMATOGRAFIA PLANA
La cromatografa plana es un tipo de cromatografa lquida en la que la fase
estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna.
Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y
cromatografa de capa fina (CCF). Aunque la CP precede en 1015 aos a la CCF, ha
sido ampliamente superada por sta, debido a su mayor rapidez, versatilidad y
reproducibilidad.
En cromatografa plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lmina o
superficie plana. Despus de evaporado el disolvente, la lmina se coloca verticalmente
en una cmara cerrada con su extremo sumergido en el eluyente elegido (fase mvil),
pero no la muestra (figura 12.20.a.). La fase mvil percola a travs de la fase
estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a distinta
velocidad, teniendo lugar la separacin. Una vez que el disolvente ha pasado a travs
de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lmina, se saca sta de la
cmara y se seca, ponindose de manifiesto la presencia de las especies separadas por
los procedimientos que se indicarn ms adelante. El cromatograma est constituido
por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados (figura
12.20.b.)
Componente A
Frente del
disolvente
.
dw

Lmina plana

dM

Componente B
Muestra

Eluyente

Compuesto
de referencia

dR

Componente C

dP

Aplicacin
de la muestra

a)

b)

Figura 12.20. Cromatografa plana. a) Cmara cromatogrfica. b) Cromatograma.

Cromatografa lquida

38

PRINCIPIOS BASICOS
Casi todos los parmetros y ecuaciones desarrolladas para la cromatografa
lquida en columna pueden aplicarse, con ligeras modificaciones, a la cromatografa
plana, si bien, en sta, la caracterizacin de los componentes separados se lleva a cabo
por el denominado factor de retardo, RF, definido por*,
distancia recorrida por el soluto (centro de la mancha) d R
RF =
=
distancia recorrida por el frente del disolvente
dM
Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen,
hasta valores prximos a cero. Estos valores pueden ayudar a la identificacin de una
determinada especie, si bien, la coincidencia en los RF no deber tomarse como prueba
inequvoca de identificacin, debido al gran nmero de variables que pueden influir,
como pequeas diferencias en la composicin de la fase mvil, temperatura, tamao de
la cmara, naturaleza de la mezcla, etc.
Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF debidas a los
factores mencionados, se ha propuesto utilizar el parmetro Rx, definido por,

Rx =

distancia recorrida por el soluto d R


=
distancia recorrida por un patrn d P

En cualquier caso, a pesar de la coincidencia en los valores de Rx, la identificacin


plena de un compuesto deber hacerse de forma especfica, con tcnicas auxiliares,
como espectroscopia IR, espectrometra de masas, RMN, etc.
El factor de retencin o factor de capacidad viene definido por,

k' =

t' R
tM

En cromatografa plana, t'R, (tiempo realmente invertido en la retencin de un


soluto por la fase estacionaria) es proporcional a la distancia recorrida por el frente
del disolvente menos la distancia recorrida por el soluto,
t'R = cte. (dM dR)
Por su parte, tM (tiempo de residencia del soluto en la fase mvil) ser
proporcional a la distancia recorrida por el soluto
* En realidad, el valor de R observado es un poco ms pequeo que el verdadero R termodinmico, el cual
F
F

puede obtenerse multiplicando el observado por un factor que vara entre 1.0 y 1.6.

Claudio Gonzlez Prez

39

tM = cte. dR
por lo que,
'

k =

cte. d M d R 1 R F
=
cte. d R
RF

Anlogamente a lo enunciado de forma general (ver tema 10), el nmero de platos


tericos, N, puede obtenerse por la expresin:

d
N = 16 R
dW

donde dW es la anchura de la gota.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (CCF)


Las separaciones por cromatografa de capa fina se llevan a cabo en placas de
vidrio o plstico recubiertas con una capa delgada de partculas finamente divididas
que contienen la fase estacionaria. Aunque descubierta muchos aos antes, las
primeras aplicaciones de la CCF datan de 1951, al utilizar esta tcnica para el
aislamiento e identificacin de los componentes de zumos de naranja y pomelo.
Histricamente, el desarrollo de la CCF ha estado relacionado con el anlisis de
alimentos, si bien, se utiliza tambin ampliamente en la industria farmacutica para la
determinacin de la pureza de frmacos, as como en laboratorios clnicos y en la
propia industria qumica. Por otra parte, el hecho de que las fases mvil y estacionaria,
as como muchas de sus aplicaciones, sean similares a las de la cromatografa lquida
en columna, hace que la CCF se utilice en muchas ocasiones como gua para desarrollar
las condiciones ptimas para separaciones cromatogrficas en columna. La rapidez y el
bajo coste de los ensayos de capa fina representan ventajas importantes. Respecto a
la cromatografa en papel, la CCF presenta la importante ventaja de su mayor
velocidad y, en muchos casos, mejor resolucin.

Fases estacionarias
Las propiedades generales de los adsorbentes (fases estacionarias) utilizables en
CCF son similares a las descritas para la cromatografa de adsorcin en columna.
Generalmente se utilizan partculas cuyo tamao oscila entre 10 y 25 m. En este
sentido, es preciso indicar que, mientras que en una columna, un material muy
finamente pulverizado resulta inadecuado, por no permitir altas velocidades de flujo,
en capa fina, un tamao de grano pequeo, adems de facilitar el flujo, incrementa
considerablemente la resolucin.

Cromatografa lquida

40

Tradicionalmente, los materiales ms usados como fase estacionaria han sido gel
de slice, almina, celita, poliamida y celulosa, si bien, en poca relativamente reciente,
el tipo de materiales usados con esta finalidad se ha extendido considerablemente,
tanto para operar en fase normal, como en fase inversa o enlazada, anlogamente a lo
que sucede en HPLC.
La gel de slice es la sustancia ms empleada en CCF. Se trata, como ya se
coment en relacin con otros tipos de cromatografa, de una fase estacionaria
inorgnica de caractersticas polares, y a la que es necesario activar por calefaccin
previa a su uso. Con frecuencia se adiciona CaSO4.1/2H2O con objeto de facilitar la
adherencia, designndose entonces con el sufijo "G". Esta fase estacionaria resulta
adecuada para separar numerosas sustancias, tales como aminocidos, alcaloides,
azcares, cidos grasos, lpidos, aceites esenciales, esteroides, as como tambin
cationes y aniones inorgnicos.
El mecanismo predominante con esta fase estacionaria es la adsorcin, siendo
posible la separacin de sustancias hidroflicas neutras, cidas y bsicas eligiendo
convenientemente el eluyente. Este es el modo de separacin considerado como
normal. Sin embargo, puede operarse tambin en fase inversa, para lo cual puede
recurrirse a impregnar el soporte con hidrocarburos de cadena larga, tales como
parafinas o aceite de silicona. Estos materiales resultan adecuados para el anlisis de
sustancias lipoflicas, tales como grasas y ceras, esteroides y vitaminas liposolubles,
etc. As-mismo, pueden formarse fases enlazadas de forma anloga a lo indicado para
HPLC.
Otro adsorbente polar, tambin muy utilizado, es la almina. Para obtener
resultados reproducibles y separaciones ptimas, es necesario proceder a su
activacin, con objeto de controlar la cantidad de agua adsorbida, la cual bloquea los
centros activos. Dicha activacin normalmente se lleva a cabo calentando a unos 125150 C durante un tiempo determinado.
La celita es un material diatomceo altamente poroso y de gran rea superficial,
si bien, su poder de adsorcin es pequeo. Este es el motivo por el que se utiliza en
menor extensin que la gel de slice y la almina. Sin embargo, es muy usado como
soporte slido para fases estacionarias en cromatografa de reparto.

41

Claudio Gonzlez Prez

Un cierto nmero de poliamidas, como policaprolactama y nylon 66 pueden


manufacturarse como fases estacionarias para CCF. Estas sustancias resultan
particularmente tiles para la separacin de compuestos relacionados con los fenoles,
al producirse la interaccin entre los solutos y la fase estacionaria por medio de
enlaces de hidrgeno.
Para la preparacin de las placas, el material que constituye la fase estacionaria
se dispone en forma de suspensin (en agua o en otro disolvente) y se extiende sobre
una lmina de vidrio o de plstico, que puede ser rgido o flexible. Es fundamental que
la capa sea lo ms uniforme posible, para lo cual suelen utilizarse dispositivos como el
representado en la figura 12.21.
Fase estacionaria
(suspensin)

.
.
Placas sin recubrir

Placas recubiertas
con la fase estacionaria

Figura 12.21. Preparacin de placas para CCF.

El espesor de las pelculas usadas para trabajos analticos suele ser de 0.2 a 0.3
mm, mientras que en cromatografa preparativa el espesor puede variar entre 2 y 10
mm. Una vez extendida la fase estacionaria, la placa se seca al aire y se activa por
calefaccin a 110 C.
Uno de los aspectos ms crticos de la CCF es la aplicacin de la muestra. Esta
suele hacerse por contacto entre la placa y un tubo capilar que contiene la muestra en
disolucin, a 1 2 cm del extremo. La aplicacin de la muestra deber hacerse con
sumo cuidado, al objeto de no perturbar la capa de adsorbente.

Fases mviles
Un disolvente adecuado para utilizarlo en CCF deber reunir las siguientes
caractersticas:
* Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria.

42

Cromatografa lquida
* Pureza elevada.
* Adecuada viscosidad y tensin superficial.
* Punto de ebullicin bajo, para facilitar el secado de las placas.
* Barato, de baja inflamabilidad y toxicidad.

La eleccin del disolvente, o mezclas de disolventes, adecuados para una


determinada separacin es fundamentalmente emprica, si bien, pueden utilizarse, en
funcin de las caractersticas de los compuestos a separar, las series eluotrpicas, ya
mencionadas anteriormente.

Desarrollo del cromatograma


Una vez preparada la placa y aplicadas las muestras, se coloca en una cmara
cerrada (para operar en atmsfera saturada de vapor del disolvente) como se indica
en la figura 12.20.a. y se espera a que el disolvente haya pasado a travs de la mitad o
de las dos terceras partes de la placa. Adems de la modalidad ascendente,
representada en la mencionada figura, pueden tambin utilizarse las modalidades
descendente (figura 12.22.a.), bidimensional (figura 12.22.b.) o radial (figura 12.22.c.).
La modalidad bidimensional se utiliza cuando se trata de grupos de compuestos
de estructura qumica y propiedades similares, tales como aminocidos, con valores de
RF demasiado prximos para que la separacin unidireccional proporcione resultados
satisfactorios. En esta modalidad, la muestra se aplica de forma normal y se
desarrolla segn la direccin 1 (ver la figura 12.22.b.), en contacto con un disolvente
determinado. A continuacin, se espera a que se seque y se eluye con un segundo
disolvente en la direccin 2.
Eluyente

.
Placa

.
Aplicacin
de la muestra
1

a)

b)

c)

Figura 12.22. Cromatografa de capa fina. a) Descendente. b) Bidimensional. c) Radial.

Claudio Gonzlez Prez

43

En la forma radial, la muestra se aplica en el centro de la placa, que normalmente


tiene forma de disco, y el disolvente se introduce por un orificio a travs de una
mecha sumergida en el depsito que lo contiene. A medida que se desarrolla el
cromatograma, se van formando una serie de crculos como los representados en la
figura 12.22.c.).

Localizacin de las sustancias separadas


La localizacin de las sustancias separadas sobre la placa puede hacerse
directamente si dichas sustancias son coloreadas. Para sustancias incoloras, es
necesario utilizar distintos mtodos qumicos o fsicos.
Mtodos qumicos. Estos mtodos implican una reaccin qumica, que puede ser
especfica para algn determinado componente, o general. Dentro de estas
ltimas, se utiliza el vapor de yodo, el cual se adsorbe reversiblemente sobre
una gran cantidad de sustancias, originando puntos oscuros en las zonas donde
existe un compuesto en la placa. Otro reactivo de aplicacin bastante general es
el cido sulfrico concentrado, el cual, pulverizado sobre una placa de slice,
permite visualizar las sustancias orgnicas despus de haber calentado la placa
en una estufa. Asimismo, la fluorescena origina color amarillo-verdoso con una
gran cantidad de sustancias orgnicas, y la ninhidrina se utiliza para detectar
aminocidos.
Mtodos fsicos. El mtodo fsico ms comn para la deteccin en CCF es la
radiacin ultravioleta, en combinacin con un indicador fluorescente. La placa
contiene un material fluorescente cuya emisin (a 254 nm) es inhibida por la
mayora de los solutos. Una vez evaporado el disolvente, se ilumina la placa con
radiacin ultravioleta en un cuarto oscuro. Las manchas de soluto se ven ms
oscuras, mientras que el resto de la placa es brillante.

Aplicaciones
En anlisis cualitativo, la identificacin de las sustancias separadas se basa en
los valores de los RF con respecto a patrones cuyo cromatograma se ha desarrollado
en las mismas condiciones. De todas formas, a pesar de la coincidencia en los valores
de RF, siempre se necesita una confirmacin, lo cual puede hacerse repitiendo el
ensayo con distintas fases mviles y estacionarias, as como tambin con distintos
reactivos de revelado. En ltima instancia, puede recurrirse a raspar la mancha,

Cromatografa lquida

44

disolver el analito y proceder a su identificacin por RMN, espectrometra de masas o


espectroscopia infrarroja.
La comparacin del rea de la mancha del patrn con la del analito permite hacer
una estimacin semicuantitativa de la cantidad presente. Otros procedimientos
cuantitativos implican la utilizacin de un densitmetro, as como proceder de forma
anloga a la indicada para fines cualitativos, extrayendo el analito y determinarlo por
algn mtodo qumico o fsico adecuado.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL (CP)


La tcnica es extraordinariamente simple, ya que utiliza una tira de papel de
filtro, por ejemplo, Whatman No 1, como medio para las separaciones. Actualmente, la
CP no se utiliza demasiado, debido al desarrollo alcanzado por otras tcnicas
cromatogrficas, especialmente la CCF, CG y HPLC.
El mecanismo que interviene en la cromatografa en papel es fundamentalmente
de reparto, donde la fase estacionaria es al agua adsorbida sobre las molculas de
celulosa del papel. Sin embargo, la misin del papel es realmente ms compleja que
actuar simplemente como soporte de la fase estacionaria, ya que, al parecer, la
adsorcin de los componentes de la fase mvil y de los solutos, as como efectos de
cambio inico, tambin toman parte en el proceso de separacin.
El papel utilizado puede ser, en principio, papel de filtro estndar, si bien,
existen en el comercio papeles especiales para CP. Estos papeles estn fabricados con
una porosidad y espesor determinados, as como con muy bajo contenido de restos
metlicos. El desarrollo del cromatograma debe hacerse, en estos papeles, en una
determinada direccin. Asimismo, deben conservarse en condiciones de humedad
controlada y en lugares exentos de humos o vapores que puedan adsorberse sobre las
fibras de celulosa y alterar las separaciones.
Si las sustancias a separar son apreciablemente solubles en agua, puede ser
conveniente impregnar el papel en un medio no acuoso para que acte como fase
estacionaria. En esta modalidad de cromatografa en fase inversa, la fase mvil no
tiene por qu ser necesariamente agua, si bien, el eluyente usado suele contenerla en
determinada proporcin.
La eleccin de la fase mvil en CP es esencialmente emprica. Normalmente se
utilizan mezclas, consistentes en un compuesto orgnico, agua y otras especies, tales

Claudio Gonzlez Prez

45

como cidos, bases o agentes complejantes que modifiquen la solubilidad de los


componentes de la muestra. Las sustancias polares, que son ms solubles en agua que
en lquidos orgnicos, se desplazarn muy lentamente si se utiliza un eluyente
totalmente anhidro, por lo que deber aadirse algo de agua. As, por ejemplo, el nbutanol no es un buen eluyente para aminocidos polares, al menos que est saturado
con agua. Si se aade tambin cido actico, entonces puede aumentarse la cantidad
de agua y la mezcla ternaria resultante incrementa considerablemente la solubilidad y
la movilidad de los aminocidos.
Muchos iones inorgnicos se separan en forma de complejos o de quelatos
apreciablemente solubles en lquidos orgnicos. As, por ejemplo, los complejos
clorurados de hierro son muy solubles en acetona, mientras que el niquel no.
Consecuentemente, podrn separarse hierro y nquel con este disolvente.
En la cmara cromatogrfica deber mantenerse una atmsfera saturada de
vapor del disolvente, con objeto de evitar la evaporacin del disolvente, ya que si sta
se produce, el aporte de fase mvil al frente del disolvente puede ser insuficiente
para su desplazamiento a travs del papel.
Las tcnicas para desarrollar el cromatograma son similares a las empleadas en
CCF, esto es, ascendente, descendente, bidimensional y radial. La muestra, disuelta en
un disolvente voltil, se aplica al papel con un capilar, una microjeringa o una
micropipeta. Su tamao deber ser de unos 2 mm de dimetro y la cantidad de
muestra comprendida entre 10 y 50 g. El disolvente se elimina por evaporacin (por
ejemplo, con un secador de pelo) y si la muestra es muy diluida se aplican varias gotas,
evaporando el disolvente despus de cada aplicacin. En la figura 12.23. se muestran
algunos sistemas para desarrollar los cromatogramas en CP.

Figura 12.23. Cromatografa en papel. a) Ascendente. b) Descendente.

Cromatografa lquida

46

La mayora de las tcnicas usadas para la localizacin de las sustancias


separadas en CCF pueden aplicarse a la cromatografa en papel, excepto,
evidentemente, aquellas que impliquen el uso de reactivos que puedan atacar al papel,
como el cido sulfrico concentrado. Sin embargo, la deteccin sobre papel es menos
sensible que en capa fina, debido a que las manchas se muestran generalmente ms
difusas.
Aunque se coment que en las ltimas dcadas, en muchas aplicaciones, la CP ha
sido sustituida por la CCF, an se sigue utilizando aquella, no solo con fines didcticos,
por su simplicidad, sino para separaciones de ciertas muestras clnicas y bioqumicas (
por ejemplo, azcares y aminocidos en orina), as como en otras aplicaciones
analticas generales.

47

Claudio Gonzlez Prez

CROMATOGRAFIA DE FLUIDOS SUPERCRITICOS (CFS)


En esta tcnica, la fase mvil es un fluido a temperatura y presin superiores a la
crtica. En la figura 12.24. se muestra el diagrama de fases para el CO2 puro, donde se
indican los estados de agregacin (slido, lquido, gas) para cualquier combinacin
presin-temperatura.
Zona
supercrtica

80
70

P, atms.

Punto crtico
(31.3C, 72.9 atms.)

60

Lquido
50

Slido

40
30

Gas

20
10
Punto triple (56.4 C, 5.11 atms.)

80

60

40

20

t, C

20

40

Figura 12.24. Diagrama de fases para el CO2.

A lo largo de cada una de las lneas del diagrama existe un equilibrio entre las
fases adyacentes, esto es, coexisten ambas fases, mientras que en el punto triple,
coexisten en equilibrio las tres fases, slida, lquida y gaseosa. Cuando se cruza alguna
de las lneas resulta un cambio de fase, como consecuencia de lo cual se produce un
cambio brusco en las propiedades fsicas (densidad, viscosidad, difusividad, etc.). Sin
embargo, por encima del punto crtico (caracterizado por una presin y un
temperatura definidas) solo existe una fase, cualquiera que sea la presin. Esa fase se
llama fluido supercrtico. Las propiedades fsicas del fluido en esas condiciones son
intermedias entre las del gas y el lquido, y varan gradualmente (no bruscamente) al
desplazarse dentro de esa zona.

Cromatografa lquida

48

El empleo de fluidos supercrticos como fase mvil presenta ciertas ventajas


sobre la utilizacin de fases gaseosas o lquidas, debido a lo siguiente: en CG la
separacin depende fundamentalmente de la volatilidad, por lo que si un analito no
tiene una presin de vapor suficientemente elevada o si es trmicamente inestable, en
principio, la tcnica no resulta adecuada para su separacin. En HPLC y en CFS, la
volatilidad del analito no constituye un prerrequisito, mientras que la separacin est
condicionada por diferencias de afinidad para la fase mvil y la fase estacionaria, de
forma que, para una columna dada, modificando la composicin de la fase mvil se
influye sobre las separaciones. Una caracterstica nica de la CFS es que la afinidad
de la fase mvil para un analito es tambin funcin de la densidad, y sta se puede
variar prcticamente a voluntad sin ms que modificar la presin. As, es posible la
elucin de compuestos que difieren ampliamente en los factores de capacidad
simplemente variando la presin.
En HPLC, la fuerza eluotrpica se modifica operando con elucin por gradiente y
en CG por aumento de la temperatura. En CFS este efecto se logra variando la
densidad del disolvente. Adems, la CFS es ms rpida y con mayor poder de
resolucin que la cromatografa lquida, debido a los mayores coeficientes de difusin
de los solutos en los fluidos supercrticos que en los lquidos, si bien, son menores que
en los gases. Sin embargo, la CFS no resulta adecuada para los sistemas de polaridad
elevada y particularmente los sistemas acuosos son difciles de manejar, sobre todo
por los elevados valores que presentan sus constantes crticas.
Hasta la fecha, la fase mvil ms utilizada para este tipo de cromatografa es el
dixido de carbono, debido a su temperatura crtica relativamente baja. Adems no
es txico y es compatible con el detector de ionizacin de llama empleado en CG. Por
otra parte, el CO2 presenta un amplio margen de densidad en las condiciones normales
de operacin, lo cual proporciona una gran versatilidad para optimizar las condiciones
de operacin. Otra ventaja es que puede obtenerse comercialmente en un alto grado
de pureza y es relativamente barato. Sin embargo, los compuestos muy polares y los
de peso molecular elevado tienen bajas solubilidades en CO2. Por este motivo, y para
incrementar su poder disolvente, se aaden modificadores, como metanol, isopropanol,
diclorometano, tetrahidrofurano y otras especies.
La instrumentacin para cromatografa de fluidos supercrticos suele ser
adaptacin de la empleada para HPLC o en CG. Un componente importante es la bomba,
que debe proporcionar a la fase mvil la presin necesaria de forma precisa y
controlada. Adems, es necesario, evidentemente, un control adecuado de la
temperatura de operacin. Un dispositivo caracterstico de la CFS es el restrictor,

Claudio Gonzlez Prez

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cuya misin es bsicamente facilitar la descompresin. Se sita despus del detector,


si ste requiere una fase mvil de densidad elevada (por ejemplo, detectores pticos),
mientras que si esto no es as, se coloca entre el sistema de deteccin y la columna.
En CFS se utilizan dos tipos de columnas: tubulares abiertas y empaquetadas. Las
primeras difieren de las empleadas en cromatografa de gases en que los dimetros
son ms pequeos. En la prctica, se utilizan columnas de 50 m de dimetro interno y
entre 10 y 20 metros de longitud. Las fases estacionarias ms utilizadas son
polisiloxanos.
Las columnas empaquetadas en CFS son similares a las usadas en HPLC, con
partculas porosas de 10, 5 y 3 m, y fases estacionarias enlazadas sobre una base de
gel de slice.
La mayora de los detectores utilizados en HPLC o en CG son compatibles con la
CFS, pero los ms empleados son el de ionizacin de llama y el de absorcin
ultravioleta. El primero proporciona buena sensibilidad y puede considerarse como el
detector universal para la mayora de los compuestos orgnicos. Sin embargo, es
incompatible con fases mviles que contienen modificadores orgnicos. En estos casos,
puede utilizarse el detector de absorcin UV. Asimismo, tambin es posible la
deteccin con espectrometra de masas y de infrarrojo.
La CFS encuentra aplicaciones en distintas reas. En Bioqumica se utiliza para la
separacin de antibiticos, drogas de abuso, lpidos y cidos grasos, prostaglandinas y
esteroides, mientras que en el campo puramente industrial se emplea para colorantes,
isocianatos, pesticidas, surfactantes, ceras y, sobre todo, en la industria
petroqumica, en la cual es muy frecuente la separacin de mezclas de compuestos
muy poco polares. En cualquier caso, a pesar de las numerosas aplicaciones de la CFS,
posiblemente el futuro ms prometedor de esta metodologa de fluidos supercrticos
resida en la tcnica de extraccin para la preparacin de muestras analticas.
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