Professional Documents
Culture Documents
Cromatografa lquida
LECTURA
Tema 12
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
En este captulo se tratarn diversas formas de cromatografa en las que la fase
mvil es un lquido. Potencialmente, la cromatografa lquida (CL) es ms importante
que la cromatografa de gases (CG), ya que, cerca del 80 % de los compuestos qumicos
no son suficientemente voltiles para separarlos y determinarlos por CG, y en ellos se
incluyen una gran variedad de especies de inters industrial, biolgico y ambiental.
La cromatografa lquida considerada como clsica se lleva a cabo en columnas
abiertas y en ella la fase mvil fluye por gravedad (figura 12.1.a.) o mediante la
aplicacin de vaco, con un dispositivo como el representado en la figura 12.1.b.
eluyente
capa protectora
relleno
disco de vidrio sinterizado
vaco
a)
b)
Figura 12.1. Cromatografa lquida convencional
Tanto en las columnas alimentadas por gravedad, como en las que el proceso se
facilita mediante vaco (tambin por bombeo del lquido) el mecanismo de la separacin
puede ser de adsorcin, reparto, intercambio inico, en funcin del tamao
molecular o dependiendo de la afinidad entre los diferentes solutos y la fase
estacionaria, originndose distintos tipos de cromatografa que se considerarn en
este captulo.
La eficacia de las columnas aumenta a medida que disminuye el tamao de las
partculas del relleno, si bien, en este caso, la fase mvil fluye con mayor dificultad.
Para solucionar las dificultades derivadas del empleo de fases estacionarias de
tamaos muy pequeos (entre 3 y 10 m), se requiere una instrumentacin sofisticada,
que contrasta con las simples columnas de vidrio usadas en cromatografa clsica.
Estos procedimientos operativos, relativamente modernos, se denominan como
Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR o HPLC), cuyas caractersticas ms
importantes se incluirn tambin en este captulo.
En la parte final del captulo se har una breve descripcin de la cromatografa
de lquidos sobre soporte plano (papel y capa fina), pues con estas tcnicas se
consigue la resolucin de muchos problemas de forma sencilla y barata. Asimismo, se
har referencia a la cromatografa de fluidos supercrticos.
Cromatografa lquida
Si
SiOH
Si
La almina (Al2O3.x H2O) presenta distintos tipos de interaccin con los solutos,
ya que, por una parte, tiene sitios activos cidos en las zonas prximas al Al3+, y
centros bsicos en las zonas prximas al O2. La proporcin relativa de centros cidos
* En ocasiones se utiliza un adaptador de flujo ajustable que se comprime estrechamente contra la parte
superior de la fase estacionaria, de modo que no quede espacio para que la muestra y el disolvente se
mezclen sobre la columna.
eluyente de una determinada sustancia. Por ello, es necesario utilizar disolventes lo suficientemente puros.
Cromatografa lquida
sea total, siempre, al cabo de cierto tiempo, la fase estacionaria va siendo arrastrada
por la fase mvil fuera de la columna. Este problema puede evitarse, o al menos
paliarse, mediante una pre-saturacin del eluyente con la fase estacionaria.
Estireno
CH=CH2
Divinilbenceno
proporcin de divinilbenceno, que oscila entre 1 y 16 %*. Por otra parte, los anillos
bencnicos pueden modificarse para producir una resina de intercambio catinico, con
grupos SO3H o COOH, o una resina aninica, con grupos CH2N+R3 o CH2NR2
CH CH2 CH CH 2 CH CH2
SO3 H+
SO3H+
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH
2
2
2
2
2
SO3 H+
SO3 H+
CH2 N(CH3 )3 Cl
CH2 N(CH3 )3 Cl
CH2 N(CH3 )3 Cl
CH2 N(CH3 )3 Cl
Cromatografa lquida
entrecruzamiento es alto, ello significa tamaos pequeos para los poros, con lo que la
resina se hace ms selectiva para los iones pequeos. En este caso, la resina presenta
mayor capacidad de intercambio y selectividad, pero tiempos de equilibrio ms
elevados.
Selectividad de las resinas. Considrese una resina catinica con el in
intercambiable H+ en contacto con una disolucin conteniendo el in monovalente M+.
Se establece el siguiente equilibrio de intercambio:
R H+ + M+ <> R M+ + H+
donde R representa la matriz de la resina. La constante de equilibrio, llamada
coeficiente de distribucin o coeficiente de selectividad viene expresada por,
Kd=
+
R
* Cuando las disoluciones se apartan del comportamiento ideal las concentraciones debern reemplazarse
En solucin acuosa diluida, la afinidad de los cationes para la resina aumenta con
la carga, y, a igualdad de carga, la afinidad es inversamente proporcional al radio del
in hidratado, de forma que puede escribirse la siguiente secuencia:
Na+(ac) < Ca2+(ac) < Al3+(ac) < Th4+(ac)
Li+(ac) < Na+(ac) < K+(ac)
Mg2+(ac) < Ca2+(ac) < Sr2+(ac) < Ba2+(ac)
En el caso de las resinas aninicas, en soluciones acuosas diluidas la afinidad de
los aniones depende de su grado de polarizacin. En general, los aniones polivalentes
tienen mayor afinidad que los monovalentes y entre aniones de la misma carga, los de
mayor tamao presentan mayor afinidad,
Cl < CN < Br < NO3 < I << SO42
Aplicaciones. Dentro del campo de la qumica inorgnica es posible la separacin
de iones metlicos ordinarios por cromatografa de intercambio inico. Asimismo, el
desarrollo de mtodos de cambio inico para separaciones de lantnidos y otras
especies fisionables fue fundamental para el desarrollo de los reactores nucleares.
Por otra parte, la CCI se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgnicos y
bioqumicos, incluyendo drogas y sus metabolitos, conservantes alimentarios, azcares
y preparaciones farmacuticas, as como a la elucidacin de la estructura de protenas
y cidos nucleicos.
10
Cromatografa lquida
Las molculas de soluto que tienen dimetros significativamente menores que los
poros pueden penetrar en ellos y, de esta manera, ser retenidos durante un cierto
tiempo, mientras que las molculas que son ms grandes que el tamao medio de los
poros del relleno son excluidas, y, de esta forma, no se retienen, siendo eluidas en
primer lugar (figura 12.2.). Entre estos dos extremos existirn molculas de tamao
intermedio, cuya penetracin media en los poros depende de su tamao y cuyo avance
a lo largo de la columna ser algo retardado.
.
.
K pr =
V R V o
Vt Vo
Si el material de que est constituida la matriz no ocupara volumen, Vi = Vt Vo, (Vt=volumen total de la
columna). Sin embargo, como sto no es as, Vt Vo ser mayor que Vi, aunque Vi es proporcional a Vt Vo,
puesto que el lquido dentro de las partculas ocupa una fraccin constante del volumen de ellas.
K=
11
VR VM VR Vo
=
VS
Vi
Las molculas cuyos tamaos sean mayores que el lmite de exclusin no son
retenidas por la columna y se eluyen todas juntas, igual que aquellas cuyos tamaos
sean inferiores al lmite de permeabilidad.
El fraccionamiento tiene lugar en la zona de permeabilidad selectiva, situada
entre ambos lmites, originndose picos que corresponden a solutos individuales. La
seleccin de un gel para llevar a cabo la separacin de una determinada mezcla de
sustancias se har de forma que sus pesos moleculares incidan en la zona recta del
calibrado*. Comercialmente se dispone de un gran nmero de geles con diferentes
* Debido a que el peso molecular no est directamente relacionado con el tamao y la forma de las
molculas, es necesario indicar, junto con los mrgenes de fraccionamiento, el tipo de molculas que se ha
utilizado para las determinaciones.
12
Cromatografa lquida
10 6
III
Mr
10 5
II
10 4
10 3
VR
H 2C
HO
HO
HO
CH 2
O
HO
OH
OH
CH 2
O
HO
O
HO
HO
CH 2
HO
CH 2 O
HO
HO
HO
HO
13
CH 2 =CHCONH
(CH 2 =CHCNH)
Acrilamida
CONH
CH
2 CHCH
2 CHCH
CONH
2 CHCH
CONH
CONH
2 CHCH
2 C H
CONH
CH 2
CH
2 CH 2
NN'-metilenbisacrilamida
CONH
2 CHCH
2 CHCH
CH 2
CONH
CONH
2 CHCH
2 CH
CONH
CONH
CH 2
CONH
CHCH
CONH
2 CHCH
CONH
2 CHCH
2 CHCH
2 CH
CONH
14
Cromatografa lquida
ligando bioespecfico
mezcla
b)
a)
lavado
elucin
c)
15
OH
OH
O
+ CNBr
C=NH + HBr
imidocarbonato
En una etapa posterior, el ligando reacciona con la matriz activada para originar
el material con que se llenar la columna cromatogrfica.
NH
O
O
OCNHproteina
C=NH + H2 Nproteina
OH
b)
a)
Figura 12.6. "Brazo de extensin" en cromatografa de afinidad.
Cromatografa lquida
16
PRINCIPIOS BASICOS
El primer aspecto considerado en orden a optimizar la CL fue incrementar la
velocidad de la fase mvil, lo cual puede hacerse sin demasiados problemas mediante
la utilizacin de bombas adecuadas y conexiones de tubos que impidan fugas, al estar
sometido el lquido a presiones elevadas. Sin embargo, con fases estacionarias
convencionales, el empleo de altas velocidades de fase mvil implica una prdida de
resolucin. Para mejorar sta, se hace necesario modificar el empaquetamiento de la
fase estacionaria, lo cual se considerar seguidamente en conexin con la ecuacin de
van Deemter,
H=A+
B
+Cu
u
High Performance Liquid Chromatography, si bien, en algunos artculos las mencionadas siglas significa "alta
presin", High Pressure.
17
ecuacin de van Deemter, ya que las trayectorias seguidas por la fase mvil son ms
uniformes en el caso de partculas de menor tamao.
En relacin con la difusin longitudinal, B/u, este trmino es importante en
cromatografa de gases, pero como la difusin es mucho ms lenta en los lquidos, el
ensanchamiento de las bandas por este motivo en CL solo es significativo cuando la
velocidad de flujo es excesivamente lenta.
El trmino de resistencia a la transferencia de masa, Cu, es fundamental, ya que,
con velocidades de flujo elevadas, se conseguirn bajas resoluciones, al menos que la
transferencia de solutos entre las fases mvil y estacionaria sea muy rpida. A esto
colabora decisivamente la reduccin del tamao de las partculas de la fase
estacionaria. Los materiales que normalmente se utilizan en cromatografa lquida
convencional estn constituidos por partculas de tamao relativamente grande (150
m ms) y con poros profundos, como se representa en la figura 12.7.a. Estos poros
se llenan con porciones estancadas de fase mvil y es posible que las molculas de
soluto penetren en ellos a una profundidad tal que su regreso por difusin al lquido
mvil sea lento. Esto es favorable en CL convencional, que trabaja con lentas
velocidades de flujo, pero cuando se opera con velocidades de flujo elevadas, se
origina un ensanchamiento de bandas excesivamente grande.
poro
superficial
poro
profundo
150
50
poro
superficial
5
1-2
al detector
al detector
al detector
Dimetro de partcula
Longitud de la columna
Dimetro de la columna
Presin
150 m
50-200 cm
20-30 mm
1 atm.
40-70
m
50-100 cm
1-3 mm
30-50 atms.
5-10 m
10-50 cm
2-6 mm
100-200 atms.
Figura 12.7. Columnas y fases estacionarias en CL. a) CL convencional. b) HPLC con partculas
peliculares. c) HPLC con partculas microporosas.
Cromatografa lquida
18
INSTRUMENTACION
Los componentes bsicos de un sistema para HPLC se han representado
esquemticamente en la figura 12.8. y son:
*
*
*
*
*
19
Como algunas fases mviles usadas en HPLC pueden ser qumicamente activas,
como cidos, bases o lquidos corrosivos, es esencial que los componentes del sistema
estn fabricados con materiales resistentes a esos posibles ataques. La mayora de las
partes del cromatgrafo en contacto con la fase mvil suelen estar fabricadas con
acero inoxidable, previamente pasivado con cido ntrico 6 M, de forma que en esas
condiciones, su superficie es resistente al ataque de la mayora de los disolventes, con
excepcin del cido clorhdrico. Las mayores ventajas del acero residen en su coste
relativamente bajo, la facilidad para construir con l los distintos componentes y la
resistencia mecnica, lo que permite operar a presiones muy elevadas.
He
Introduccin de la muestra
Columna
Registro
Disolvente
Bomba
Detector
.
Figura 12.8. Componentes bsicos de un sistema para HPLC.
Cromatografa lquida
20
SISTEMAS DE BOMBEO
Como consecuencia de las elevadas presiones de trabajo, debido al pequeo
tamao de las partculas de la fase estacionaria, es necesario utilizar bombas que
proporcionen un flujo aceptable de eluyente. Los sistemas de bombeo usados en HPLC
debern reunir las siguientes caractersticas:
* Estar construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados.
21
Vlvula de salida
Pistn
Vlvula de entrada
Eluyente
Figura 12.9. Principio de funcionamiento de una bomba recproca.
* Las presiones que se generan en HPLC, a pesar de ser muy elevadas, no constituyen peligro de explosin,
22
Cromatografa lquida
Vlvula
de entrada
Vlvula
de salida
Eluyente
Columna
Cmara conteniendo
eluyente
INTRODUCCION DE LA MUESTRA
La introduccin de las muestras en la columna cromatogrfica es frecuentemente
el factor controlante de la reproducibilidad de las medidas. Los volmenes a inyectar
debern ser pequeos, para evitar la sobrecarga de la columna y se ha de introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
La forma ms simple de inyectar la muestra es utilizar un diafragma ("septum")
anlogo al utilizado en cromatografa de gases (ver la figura 11.3.a.), si bien este
sistema est limitado a una presin mxima de operacin de 1500 psi.
El mtodo ms utilizado en HPLC consiste en usar vlvulas de inyeccin con
bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 10.17 (Captulo 10) y,
ms esquemticamente, en la figura 12.11.
Bomba
Bomba
Columna
Columna
Jeringa
Entrada de
muestra
Bucle
a)
b)
23
Cromatografa de adsorcin
Las nicas sustancias usadas como fase estacionaria en este tipo de
cromatografa son la gel de slice y la almina, siendo aquella la preferida en casi todas
las aplicaciones.
Como ya se indic en relacin con la CLS convencional, la gel de slice presenta
gran actividad superficial, debido a la presencia de grupos silanol, los cuales pueden
interaccionar con grupos funcionales polares presentes en las molculas de soluto,
tales como alcoholes, aminas, cetonas y cidos carboxlicos.
La desactivacin de la gel de slice tiene lugar por hidratacin, pudindose
distinguir entre agua dbilmente unida, y que puede eliminarse fcilmente por
calefaccin o por extraccin, agua enlazada ms fuertemente y agua presente como
OH en grupos silanol contguos, y que nicamente puede eliminarse por calefaccin
fuerte. En los dos primeros casos, la deshidratacin es reversible, mientras que en el
ltimo, es irreversible.
El tamao de los poros superficiales influye sobre el proceso de deshidratacin.
As, puede considerarse que la superficie interna de los poros est recubierta de
grupos hidroxilo. Si se trata de poros anchos, la prdida de agua tiene lugar a 110 C,
originndose grupos siloxano, poco importantes cromatogrficamente, y que pueden
re-hidratarse con facilidad (figura 12.12.a.). Si, por el contrario, se trata de poros
estrechos, la deshidratacin puede transcurrir como se representa en la figura
24
Cromatografa lquida
Si OH
Si
Si OH
H2O
a) Poros anchos
Si
OH
HO
Si
Si
Si
b) Poros estrechos
Cromatografa de reparto
En cromatografa de reparto, las fases mvil y estacionaria deben seleccionarse
de forma que la solubilidad recproca sea mnima. Sin embargo, por muy distintos que
sean dos lquidos, siempre sern algo miscibles y, por ello, la fase mvil deber
presaturarse con la fase estacionaria antes de ponerse ambas en contacto dentro de
la columna. Esta pre-saturacin puede efectuarse simplemente por agitacin de ambas
25
hasta que se equilibren, si bien, suele ser preferible utilizar una pre-columna situada
antes del sistema de introduccin de las muestras. La pre-columna deber contener un
relleno de gran rea superficial, tal como gel de slice, recubierto con una cantidad
relativamente grande (30-40%) de la sustancia usada como fase estacionaria. Sin
embargo, cuando la fuerza del disolvente es lo bastante elevada para disolver
cantidades apreciables de fase estacionaria, la pre-saturacin se hace difcil. Por otra
parte, evidentemente, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide
utilizar la tcnica de la elucin con gradiente.
Si OH + C18H37Si(CH3 )2 Cl
CH3
SiOSiC18H37
CH3
es
necesario
Cromatografa lquida
26
fase estacionaria debe ser bastante similar a la de los analitos, y para la elucin
se utiliza entonces una fase mvil con una polaridad considerablemente distinta.
27
Compuesto
Cromatografa
agua
inico
CCI
no inico
C F E normal
ciano, amino
CH3OH
C F E normal
ciano, amino,
diol
CHCl3
C. Adsorcin
slice
hexano
C F E inversa
Tamao
Cromatografa
Peso molecular
< 2000
Solubilidad
Compuesto
inico
Peso molecular
Fase
estacionaria
Solubilidad
agua
CCI
< 30 nm
C F E inversa
30-400 nm
CEM
disolventes
< 30 nm
C F E inversa
orgnicos
30-400 nm
CEM
>2000
no inico
Cromatografa lquida
28
DETECTORES
En HPLC no existen detectores de uso tan general como lo son el de
conductividad trmica o el de ionizacin de llama para cromatografa de gases. Por
ello, se utilizan distintos tipos de sistemas de deteccin que pueden clasificarse de la
forma siguiente:
Absorbancia ultravioleta
Propiedad del soluto
Fluorescencia
Electroqumicos
Propiedad de la disolucin
Indice de refraccin
Conductividad
Los detectores basados en una propiedad del soluto responden a una propiedad
fsica o fsico-qumica del soluto, y que generalmente no la presenta la fase mvil.
Estos detectores suelen ser bastante selectivos y muy sensibles. Por su parte, los
detectores basados en una propiedad de la disolucin comparan el cambio global de
alguna propiedad fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. Estos detectores
responden a un conjunto amplio de solutos, pero suelen ser poco sensibles.
Un detector ideal en HPLC deber reunir las siguientes caractersticas*:
*
*
*
*
Sensibilidad elevada.
Buena estabilidad y reproducibilidad.
Amplio margen de respuesta lineal.
Pequeo tiempo de respuesta, independiente de la velocidad de flujo.
* Muchas de las caractersticas coinciden con las indicadas para los detectores relacionados con la
cromatografa de gases.
29
Detector
Desecho
30
Cromatografa lquida
UV
Visible
Lmpara de deuterio
Clula de flujo
Red halogrfica
1
A
m
tie
po
, nm
Figura 12.15. Espectros de una separacin por HPLC con dispositivo de fotodiodos.
31
Detectores de fluorescencia
Un cierto nmero de compuestos qumicos tienen propiedades fluorescentes,
esto es, pueden absorber radiacin electromagntica de una determinada longitud de
onda y emitir radiacin fluorescente a longitud de onda ms larga. Como se coment en
el captulo 4, son compuestos tpicamente fluorescentes aquellos sistemas cclicos con
un alto grado de conjugacin. Tal es el caso de hidrocarburos aromticos
polinucleares, quinolenas, esteroides, alcaloides, etc.
Para detectar las especies fluorescentes en HPLC se utilizan dispositivos
semejantes en diseo a los fluormetros y espectrofluormetros que se describieron
en el tema 4. En ellos, el detector se coloca perpendicularmente a la direccin del haz
de radiacin de excitacin (figura 12.16.), la cual suele originarse por una lmpara de
xenn o deuterio y seleccionar la longitud de onda adecuada mediante los
correspondientes filtros.
.
Clula de flujo
Fuente de
radiacin
Filtros de
excitacin
Filtros de emisin
Detector (fotomultiplicador)
Figura 12.16. Diagrama esquemtico de un detector de fluorescencia.
32
Cromatografa lquida
Bucle
Columna
Detector
Bao de agua
Bomba
Reactivo
Detectores electroqumicos
La deteccin electroqumica ofrece ciertas ventajas respecto a otros mtodos
de deteccin, en orden a su especificidad, sensibilidad y amplia aplicabilidad,
especialmente para compuestos orgnicos. En este sentido, cualquier especie capaz de
ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de deteccin por via
electroqumica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacuticas y
qumicas. As, por ejemplo, fenoles, aminas, perxidos y mercaptanos pueden
detectarse por oxidacin, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas,
aldehidos y nitrocompuestos aromticos pueden ponerse de manifiesto mediante
procesos de reduccin. Las tcnicas electroqumicas ms utilizadas con esta finalidad
son la amperometra, voltamperometra y culombimetra*.
La configuracin bsica de un detector electroqumico se representa en la figura
12.18., y consta de un dispositivo en el que se incluyen un electrodo de trabajo, un
electrodo de referencia y uno auxiliar.
En el detector amperomtrico se aplica un determinado potencial al electrodo de
trabajo y se mide la intensidad de la corriente resultante de la reaccin
electroqumica que ocurra en dicho electrodo. La superficie de este electrodo suele
ser muy pequea (menor de 0.5 cm2), por lo que la electrlisis del analito es
incompleta. Cuando se usan electrodos de gran rea superficial, puede tener lugar una
reaccin cuantitativa sobre el electrodo, y entonces se tiene la deteccin
* En algunos textos se incluye tambien la conductimetra dentro de este apartado, si bien, los detectores de
33
Electrodo
de referencia
Electrodo
de trabajo
Electrodo
auxiliar
Figura 12.18. Configuracin bsica de un detector electroqumico.
Cromatografa lquida
34
Detectores de conductividad
Los detectores de conductividad son los ms utilizados cuando los solutos eluidos
son inicos, como, por ejemplo, cidos y bases, as como cationes y aniones inorgnicos
despus de su separacin por cromatografa de cambio inico.
La medida de la conductividad de los lquidos se lleva a cabo normalmente
aplicando un potencial elctrico entre dos electrodos, lo cual origina un movimiento de
los aniones y cationes presentes en el seno de la disolucin. La resistencia (o la
conductividad) de la disolucin contenida entre los dos electrodos depende de la
naturaleza y concentracin de las especies inicas presentes. Generalmente se opera
con corriente alterna, con un dispositivo experimental como el que se muestra
esquemticamente en la figura 12.19., donde la clula de conductividad se coloca en
una de las ramas de un puente de Wheatstone.
35
R1
.
Rs
C.A.
R2
Clula de conductividad
APLICACIONES
La cromatografa lquida de alta resolucin es una tcnica extraordinariamente
verstil, como lo prueba la amplia variedad de mezclas que pueden separarse con ella.
Posiblemente es la tcnica instrumental ms importante en relacin con anlisis
farmacutico y de alimentos. As-mismo, desempea un papel importante en estudios
fornsicos, ambientales y bioqumicos.
Adems de las aplicaciones mencionadas en pginas anteriores en relacin con la
cromatografa lquida convencional, se citan seguidamente algunos ejemplos
caractersticos.
* Para la separacin de cationes, cuando se usa HCl como eluyente, la columna supresora es una resina
aninica en forma de hidrxido, con lo que el Cl queda retenido por la resina y los H+, con los OH forman
H2O,
H+ + Cl + ROH(s) > RCl(s) + H2O
En la separacin de aniones, muchas veces se utiliza carbonato o bicarbonato sdico como eluyente. En este
caso, la columna supresora contiene la forma cida de una resina catnica, con lo que se forma H2CO3 muy
poco disociado,
Na+ + HCO3 + RH+(s) > RNa+ + H2CO3
Cromatografa lquida
36
37
CROMATOGRAFIA PLANA
La cromatografa plana es un tipo de cromatografa lquida en la que la fase
estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida en una columna.
Existen dos tcnicas de cromatografa plana: cromatografa en papel (CP) y
cromatografa de capa fina (CCF). Aunque la CP precede en 1015 aos a la CCF, ha
sido ampliamente superada por sta, debido a su mayor rapidez, versatilidad y
reproducibilidad.
En cromatografa plana, la muestra se aplica en forma de gota sobre una lmina o
superficie plana. Despus de evaporado el disolvente, la lmina se coloca verticalmente
en una cmara cerrada con su extremo sumergido en el eluyente elegido (fase mvil),
pero no la muestra (figura 12.20.a.). La fase mvil percola a travs de la fase
estacionaria por capilaridad y desplaza los componentes de la muestra a distinta
velocidad, teniendo lugar la separacin. Una vez que el disolvente ha pasado a travs
de la mitad o de las dos terceras partes de la longitud de la lmina, se saca sta de la
cmara y se seca, ponindose de manifiesto la presencia de las especies separadas por
los procedimientos que se indicarn ms adelante. El cromatograma est constituido
por un conjunto de manchas que corresponden a los componentes separados (figura
12.20.b.)
Componente A
Frente del
disolvente
.
dw
Lmina plana
dM
Componente B
Muestra
Eluyente
Compuesto
de referencia
dR
Componente C
dP
Aplicacin
de la muestra
a)
b)
Cromatografa lquida
38
PRINCIPIOS BASICOS
Casi todos los parmetros y ecuaciones desarrolladas para la cromatografa
lquida en columna pueden aplicarse, con ligeras modificaciones, a la cromatografa
plana, si bien, en sta, la caracterizacin de los componentes separados se lleva a cabo
por el denominado factor de retardo, RF, definido por*,
distancia recorrida por el soluto (centro de la mancha) d R
RF =
=
distancia recorrida por el frente del disolvente
dM
Los valores de RF pueden variar desde 1, para los analitos que no se retrasen,
hasta valores prximos a cero. Estos valores pueden ayudar a la identificacin de una
determinada especie, si bien, la coincidencia en los RF no deber tomarse como prueba
inequvoca de identificacin, debido al gran nmero de variables que pueden influir,
como pequeas diferencias en la composicin de la fase mvil, temperatura, tamao de
la cmara, naturaleza de la mezcla, etc.
Con objeto de minimizar las diferencias entre los valores de los RF debidas a los
factores mencionados, se ha propuesto utilizar el parmetro Rx, definido por,
Rx =
k' =
t' R
tM
puede obtenerse multiplicando el observado por un factor que vara entre 1.0 y 1.6.
39
tM = cte. dR
por lo que,
'
k =
cte. d M d R 1 R F
=
cte. d R
RF
d
N = 16 R
dW
Fases estacionarias
Las propiedades generales de los adsorbentes (fases estacionarias) utilizables en
CCF son similares a las descritas para la cromatografa de adsorcin en columna.
Generalmente se utilizan partculas cuyo tamao oscila entre 10 y 25 m. En este
sentido, es preciso indicar que, mientras que en una columna, un material muy
finamente pulverizado resulta inadecuado, por no permitir altas velocidades de flujo,
en capa fina, un tamao de grano pequeo, adems de facilitar el flujo, incrementa
considerablemente la resolucin.
Cromatografa lquida
40
Tradicionalmente, los materiales ms usados como fase estacionaria han sido gel
de slice, almina, celita, poliamida y celulosa, si bien, en poca relativamente reciente,
el tipo de materiales usados con esta finalidad se ha extendido considerablemente,
tanto para operar en fase normal, como en fase inversa o enlazada, anlogamente a lo
que sucede en HPLC.
La gel de slice es la sustancia ms empleada en CCF. Se trata, como ya se
coment en relacin con otros tipos de cromatografa, de una fase estacionaria
inorgnica de caractersticas polares, y a la que es necesario activar por calefaccin
previa a su uso. Con frecuencia se adiciona CaSO4.1/2H2O con objeto de facilitar la
adherencia, designndose entonces con el sufijo "G". Esta fase estacionaria resulta
adecuada para separar numerosas sustancias, tales como aminocidos, alcaloides,
azcares, cidos grasos, lpidos, aceites esenciales, esteroides, as como tambin
cationes y aniones inorgnicos.
El mecanismo predominante con esta fase estacionaria es la adsorcin, siendo
posible la separacin de sustancias hidroflicas neutras, cidas y bsicas eligiendo
convenientemente el eluyente. Este es el modo de separacin considerado como
normal. Sin embargo, puede operarse tambin en fase inversa, para lo cual puede
recurrirse a impregnar el soporte con hidrocarburos de cadena larga, tales como
parafinas o aceite de silicona. Estos materiales resultan adecuados para el anlisis de
sustancias lipoflicas, tales como grasas y ceras, esteroides y vitaminas liposolubles,
etc. As-mismo, pueden formarse fases enlazadas de forma anloga a lo indicado para
HPLC.
Otro adsorbente polar, tambin muy utilizado, es la almina. Para obtener
resultados reproducibles y separaciones ptimas, es necesario proceder a su
activacin, con objeto de controlar la cantidad de agua adsorbida, la cual bloquea los
centros activos. Dicha activacin normalmente se lleva a cabo calentando a unos 125150 C durante un tiempo determinado.
La celita es un material diatomceo altamente poroso y de gran rea superficial,
si bien, su poder de adsorcin es pequeo. Este es el motivo por el que se utiliza en
menor extensin que la gel de slice y la almina. Sin embargo, es muy usado como
soporte slido para fases estacionarias en cromatografa de reparto.
41
.
.
Placas sin recubrir
Placas recubiertas
con la fase estacionaria
El espesor de las pelculas usadas para trabajos analticos suele ser de 0.2 a 0.3
mm, mientras que en cromatografa preparativa el espesor puede variar entre 2 y 10
mm. Una vez extendida la fase estacionaria, la placa se seca al aire y se activa por
calefaccin a 110 C.
Uno de los aspectos ms crticos de la CCF es la aplicacin de la muestra. Esta
suele hacerse por contacto entre la placa y un tubo capilar que contiene la muestra en
disolucin, a 1 2 cm del extremo. La aplicacin de la muestra deber hacerse con
sumo cuidado, al objeto de no perturbar la capa de adsorbente.
Fases mviles
Un disolvente adecuado para utilizarlo en CCF deber reunir las siguientes
caractersticas:
* Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria.
42
Cromatografa lquida
* Pureza elevada.
* Adecuada viscosidad y tensin superficial.
* Punto de ebullicin bajo, para facilitar el secado de las placas.
* Barato, de baja inflamabilidad y toxicidad.
.
Placa
.
Aplicacin
de la muestra
1
a)
b)
c)
43
Aplicaciones
En anlisis cualitativo, la identificacin de las sustancias separadas se basa en
los valores de los RF con respecto a patrones cuyo cromatograma se ha desarrollado
en las mismas condiciones. De todas formas, a pesar de la coincidencia en los valores
de RF, siempre se necesita una confirmacin, lo cual puede hacerse repitiendo el
ensayo con distintas fases mviles y estacionarias, as como tambin con distintos
reactivos de revelado. En ltima instancia, puede recurrirse a raspar la mancha,
Cromatografa lquida
44
45
Cromatografa lquida
46
47
80
70
P, atms.
Punto crtico
(31.3C, 72.9 atms.)
60
Lquido
50
Slido
40
30
Gas
20
10
Punto triple (56.4 C, 5.11 atms.)
80
60
40
20
t, C
20
40
A lo largo de cada una de las lneas del diagrama existe un equilibrio entre las
fases adyacentes, esto es, coexisten ambas fases, mientras que en el punto triple,
coexisten en equilibrio las tres fases, slida, lquida y gaseosa. Cuando se cruza alguna
de las lneas resulta un cambio de fase, como consecuencia de lo cual se produce un
cambio brusco en las propiedades fsicas (densidad, viscosidad, difusividad, etc.). Sin
embargo, por encima del punto crtico (caracterizado por una presin y un
temperatura definidas) solo existe una fase, cualquiera que sea la presin. Esa fase se
llama fluido supercrtico. Las propiedades fsicas del fluido en esas condiciones son
intermedias entre las del gas y el lquido, y varan gradualmente (no bruscamente) al
desplazarse dentro de esa zona.
Cromatografa lquida
48
49