AWETAN LAPISAN LUAR MEMBRAN PROTEIN SEBAGAI

KANDIDAT VAKSIN EFEKTIF DARI Vibrio alginolyticus

TERJEMAHAN

Disadur dari makalah :

A CONSERVED OUTER MEMBRANE PROTEIN AS AN
EFFECTIVE VACCINE CANDIDATE FROM Vibrio alginolyticus

Oleh :
Rong-Hua Qian , Zhao-Hua Xiao , Chong-Wen Zhangb, Wu-Ying Chud, Lian-
a,b c

Sheng Wanga, Hong-Hao Zhoua, Yong-wei Weib, Lian Yub,*

Diterjemahkan Oleh :
ROMI NOVRIADI
Pengendali hama dan Penyakit Ikan

DEPARTEMEN KELAUTAN DAN PERIKANAN

DIREKTORAT JENDERAL PERIKANAN BUDIDAYA
BALAI BUDIDAYA LAUT BATAM
2008
 AWETAN LAPISAN LUAR MEMBRAN PROTEIN SEBAGAI
KANDIDAT VAKSIN EFEKTIF DARI Vibrio alginolyticus

Rong-Hua Qiana,b, Zhao-Hua Xiaoc, Chong-Wen Zhangb, Wu-Ying Chud, Lian-

Sheng Wanga, Hong-Hao Zhoua, Yong-wei Weib, Lian Yub,*

*
Institut Farmakologi Klinik, Universitas Central South, 410078, China
b
Institut Pengobatan Pencegahan Penyakit Veteriner, Universitas Zhejiang, Hangzhou, 310029,
China
c
Rumah Sakit Xiangya Universitas South Central, Changsha, 410078, China
d
Universitas Changsa, Changsa, 410003, China

ABSTRAK

Vibrio alginolyticus, yang merupakan bakteri Gram-negatif, adalah satu dari

Vibrio patogen yang umumnya terdapat pada manusia dan binatang laut.
Lapisan luar membrane protein memainkan sebuah peranan yang penting
selama terjadinya infeksi dan induksi dari respon kekebalan tubuh inang. Pada
riset yang dilakukan saat ini, gen Ompk dari V.alginolyticus telah dapat dikloning
dan dinyatakan. Frame pembacaan terbuka berisikan 846 bp, dan protein yang
sudah matang terdiri atas 261 residu asam amino. Analisis penjajaran
menunjukkan bahwa Ompk telah dapat diawetkan, dimana dapat menyediakan
sebuah permukaan antigen untuk kandidat vaksin terbaik. SDS-PAGE
mengindikasikan bahwa Ompk dapat digunakan pada E.coli BL21(de3).
Kombinasi ulang protein dapat dimurnikan dengan menggunakan daya afinitas
kromatogafi pada Ni-NTA resin aliran cepat. Analisis noda barat mengungkapkan
bahwa protein Ompk telah di immunoreaktivitaskan. Pseudosciaena crocea
yang divaksinasikan dengan menggunakan Ompk secara signifikan dapat
dilindungi dan dapat melawan infeksi oleh V.alginolyticus. penelitian ini
menunjukkan bahwa awetan Ompk merupakan kandidat vaksin yang efektif
dalam melawan infeksi oleh V.alginolyticus.

Kata Kunci :
Vibrio alginolyticus, Ompk, Pernyataan, Pemurnian, Kandidat Vaksin

I. Pendahuluan

Pada bakteri pathogen gram-negatif, lapisan luar membran memainkan

sebuah peranan penting pada infeksi dan tingkat patogenisitasnya kepada inang
(Tsolis,2002). Lapisan membran luar bakteri pada dasarnya tersusun atas
protein, lemak dan gula, yang dapat dengan mudah dikenali sebagai unsur zat
asing pada sistem pertahanan tubuh inang. Diantara komponen ini, protein
membran memiliki peranan rumit pada banyak proses sel dan fisiologi, dimana
sangat menarik digunakan untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin dan
diagnosa kit (Pizza et al., 2000; Qian et al., 1999). Studi terbaru saat ini
ditekankan pada peranan OMPs dari bakteri pathogen pada sifat perlindungan
antigen ( Fang et al., 2000; Bricknell et al., 1999 ). Ompk, sebagai satu dari
bagian besar OMPs secara luas didistribusikan diantara Vibrio dan
Photobacterium, menunjukkan dapat bertindak sebagai reseptor dari KVP40,
sebuah cakupan-lebar-inang Vibriofag pada V.parahaemolyticus ( Inoue et al.,
1995 ).
Vibrio alginolyticus, bakteri halophilis gram-negatif, tinggal di laut dan
lingkungan muara, adalah satu dari bakteri Vibrio patogen terhadap manusia (
McLaughlin et al., 1999 ), yang secara garis besar menyebabkan sindrom
penyakit klinis termasuk infeksi luka, otitis media, intoksikasi makanan,
gastroenteritis (tukak lambung) dan septicemia ( Hlady dan Klontz, 1996; Morris
dan Black, 1985 ). Selain hal itu, Vibrio alginolyticus adalah satu dari Vibrio
patogen utama yang dapat menyebabkan peristiwa serius pada binatang laut,
seperti pada ikan laut, udang dan kerang-kerangan ( Lee et al., 1996; Zorilla et
al., 2003 ), dan membawa dampak kerusakan yang besar pada perekonomian.
Oleh karena itu, sangat penting untuk mengeksplorasi cara perlindungan yang
efektif untuk melawan infeksi dari mikroorganisme ini.
Pada penelitian yang paling baru, awetan dari Ompk dari strain Vibrio
alginolyticus ZJ04107 telah dikloning, dan dinyatakan, rekombinasi protein yang
telah dimurnikan dan dievaluasi jika itu dapat digunakan sebagai kandidat vaksin
efektif melawan Vibrio alginolyticus.

2. Bahan dan Metoda

2.1 Strain Bakteri dan Plasma

Strain bakteri V.alginolyticus ZJ04107 telah diisolasi dari Pseudosciaena

crocea yang terinfeksi dan dibudidayakan di Keramba Jaring Apung di pantai
Xiangshan, Provinsi Zhejiang, China. Strain V.alginolyticus lainnya yang
disediakan sebagai jenis khusus/khas lainnya telah dibeli dari Institut
Mikrobiologi Akademi Ilmu Pengetahuan China. Kedua strain tersebut dikultur
dengan menggunakan media agar TCBS (Thiosulfat-Citrat-Bile Salt-Sukrosa)
(Tianhe, Hangzhou, China). Kemudian dikultur dalam Zobell2216E broth yang
terdiri atas 15% gliserol pada suhu 700c, strain E.coli DH5α, BL21 (DE3)
(Novagen) yang digunakan untuk subsion dan menyatakan Ompk gen. pGEM-T-
Easy vector plasmid digunakan untuk megawetkan cloning Ompk gen untuk
proses Sequencing. pET-30a(+) (Novagen) dengan etiketnya digunakan untuk
membangun recombinant plamid yang dihasilkan.
Gambar 1. Identifikasi elektroforesis dari Ompk cloning gen dan deteksi dari
pET-Ompk recombinant plasmid oleh analisis pembatasan enzim. Baris 1. DNA
marker (DL2000); Baris 2-3, 846 Bp fragment amplifikasi dari gen Ompk; Baris
ke-4, deteksi dari pET-Ompk rekombinan plasmid disarikan dengan BamHI dan
Xhol; Baris ke-5, pET-30a (+); Baris ke-6, GenerulerTMDNA Lander Mix.

2.2 Kloning gen Ompk

Genomik DNA dari strain V.alginolyticus ZJ04107 diekstraksi dari kultur

pada media tumbuh Vibrio dengan menggunakan pemurnian DNA genomik
wizard kit (Promega) menurut prosedur manual pada produk.
Dirancang menurut sequencing dari kebanyakan wilayah awetan dari
Ompk Vibrio lainnya di GenBank (Gambar 2).
Primer (P1 ATGCG-TAAATCACTTTTAGCTCTTAG) dan primer P2
(TTAGAACTTGTAAGTTACTGCCGATGTAG) digunakan untuk memperoleh full-
length open reading frame (ORF) dari Ompk gen. proses menggunakan
Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu
950c selama 3 menint; 32 siklus dengan tahapan denaturasi selama 45 detik
pada suhu 940c, annealing selama 30 detik pada suhu 54,50c dan ekstensi
selama 3 menit pada suhu 720c, dan reaksi disempurnakan dengan melakukan
inkubasi pada suhu 720c selama 10 menit. Produk dari PCR dianalisa dengan
melakukan elektroforesis dengan 1,0% gel agarose, dan dimurnikan dengan
PCR Purification kit (Sangon, Shanghai, China). Produk PCR yang murni
kemudian di sub-kloningkan kedalam pGEM-T-Easy vector (Promega).
Rekombinan plasmid kemudian diidentifikasi dengan analisis pembatasan enzim
dan di Sequencing pada sebuah Sequencer ABI Prisma otomatis (Invitrogen).

2.3 Konstruksi dari Plasmid Rekombinant

Primer (P3 GCGAATTCGCGGCTACTTCAGCTCCAGTTATG dan primer

P4 GCCTCGAGAACTTGTAAGTTACTGCGATGTAGT dengan elemen
pembatasan spesifik (BamH I/Xho 1) yang dirancang dari sequencing cloning
nukleotida untuk menuju proses amplifikasi sandi sequencing untuk Ompk
protein, dan disatukan kedalam PCR. Prosedur PCR dilakukan seperti berikut :
Denaturasi awal pada suhu 940c selama 3 menit; 30 siklus dari 35 s pada suhu
940c, 30 s pada suhu 60,50c, dan 1,5 menit pada suhu 720c, diikuti dengan
penambahan 10 menit pada suhu 720c. hasil produk PCR kemudian di digestion
dengan endonuclease yang sama. Produk plasmid dinamakan pET-Ompk
dideteksi dengan analisa pembatasan enzim dan tahapan sequencing.

2.4 Pernyataan dan Pemurnian Dari Nilai Rekombinan Protein

Kultur yang dilakukan selama 24 jam dari BL21 (DE3) yang mengandung
nilai rekombinan plasmid pET-Ompk diencerkan 1:100 (v/v) dalam LB segar
dengan Kanamycin (50 µg ml-1) dan diinkubasi pada suhu 370c hingga
kepadatan absorbansi optikal 600 nm (OD600) mencapai 0,6. pernyataan nilai
protein disebabkan oleh 1 mM isoprophyl-β-D-thiogalaktosida (IPTG)(BBI)
selama 5 jam pada suhu 370c setelah optimalisasi kondisi pernyataan.
Sel bakteri diambil dengan metoda sentrifugasi pada 10 000 xg selama 20
menit pada suhu 40c. Kemudian seluruh pellet dicuci dengan 50 mM Tris-HCl, 1
mM EDTA dan 100 mM NaCl (pH 8.0), disuspensi kembali dalam 50 mH Buffer
Natrium Posfat (pH 8.0) terdiri atas 10 mM Imidazole dan 8 M Urea, kemudian
diinkubasikan selama 30 menit dalam ice bath. Suspensi sel diganggu oleh
dentuman dalam ice bath (350 w, 10 menit x 3). Diikuti dengan sentrifugasi pada
12000 xg selama 20 menit pada suhu 40c. Sel yang tertinggal dibuang, lapisan
supernatant digunakan untuk pemurnian dengan sifat afinitas kromatografi pada
Ni-NTA superflow resin (Pierce) menurut instruksi pabrikan. Bagian yang di elusi
kemudian dikumpulkan dan dianalisa dengan SDS-PAGE dengan 12% gel
acrylamide. Konsentrasi protein dianalisa dengan menggunakan metode Lowry.
Protein murni disimpan pada suhu -400c sebelum digunkaan.

2.5 Antiserum

Serum dari kelinci telah digunakan untuk mendeteksi nilai rekombinasi

protein. Dua ekor kelinci Selandia Baru laki-laki dewasa, secara beraturan
diimunisasikan secara Intramuskular dengan rekombinasi protein Ompk murni
(300 µg tiap kelinci) dan diemulsikan dengan Freund’s complete adjuvant.
Setelah 4 minggu dari proses imunisasi awal, diberikan dosis lain dari protein
murni dalam Freund’s complete adjuvant (100 µg protein per dosis). Dua minggu
berikutnya, Sampel darah diambil dari kelinci dan dibekukan pada suhu ruang
selama 1 jam, dan disimpan pada suhu 40c semalaman. Dengan menggunakan
sentrifugasi, antiserum yang dipisahkan disimpan pada suhu -700c. Serum kelinci
yang telah diimunisasikan diencerkan 1:3000 dan ditambahkan pada masing-
masing sampel Ompk murni selama 15 jam inkubasi. Setelah dicuci sebanyak 6
kali dengan 1xPBS plus 0,5% Tween20, sampel yang telah diinkubasikan
dengan 1:1000 antibodi kambing sekunder antibodi anti-kelinci dikonjugasikan
dengan HRP selama 15 jam. Setelah pengembangan substrat, plate dibaca
dengan menggunakan plate reader.

2.6 SDS-PAGE dan Analisa Western Blot

Pernyataan dari rekombinasi protein Ompk telah diuji dengan

elektroforesis gel Sodium dodecyl Sulfate Polyacrylamide (SDS-PAGE).
Menggunakan antiserum kelinci polyklonal yang telah disiapkan melawan
rekombinasi protein Ompk. Aktifitas kekebalan telah dianalisa dengan metode
Western blot menurut prosedur standart ( Sambrook et al., 2000 ). Lima puluh
mikroliter dari sampel protein dicampur dengan jumlah yang sama dari 2x SDS
loading buffer, dan dipanaskan selama 10 menit. Duabelas persen SDS gel
Polyacrylamide digunakan untuk menganalisa rekombinasi protein. SDS-PAGE
telah dilakukan dalam sistem elektroforesis protein menggunakan EPS 601
Elektroforesis Power Suplai (Amersham). Setelah proses elektroforesis
dilakukan, gel diwarnai dengan Coomasie briliant blue R250 untuk penampakan
pita protein.
Setelah SDS-PAGE, pita protein dipindahkan ke membran nitrosellulosa
(Hybond-C,Amersham) dan membran diperlakukan dengan larutan blocking (5%
susu bebas lemak) selama 2 jam. Setelah mencuci sebanyak tiga kali (15 menit
untuk masing-masing waktu) dengan TBST ( TBS dengan 0,05% Tween-20).
Membran diinkubasikan dengan anti-Ompk serum kelinci dicairkan dengan 1:800
dengan guncangan lembut selama 1 jam. Dan dilanjutkan dengan inkubasi
selama 1 jam dengan Horse Radish Peroksida (HRP)-dikonjugasi dengan anti-
kelinci Immunoglobulin G antibodi (Diagnosa Roche) diencerkan 1:1000. Setelah
melalui pencucian dengan TBST, membran dicelupkan ke dalam HRP TMB
(Tetramethylbenzidine) Liquid Membran Substrate (Amresco, Solon, USA) untuk
pengembangan warna

2.7 Vaksinasi dan Uji Tantang

Pseudosciaena crocea (n=250) dengan berat sekitar 50 gram yang

diambil dari Keramba budidaya di Ningbo, China, secara random dibagi menjadi
dua kelompok. Dan diaklimatisasi selama satu minggu. Sementara divaksinasi,
ikan dibius dengan dimasukkan ke dalam 50 mgL-1 larutan Tricaine methan
sulfonate (MS-222), grup 1 (n=125) telah secara intraperitonel diimunisasikan
dengan Ompk (100 µg protein tiap ikan) dalam 100 µl dari PBS Steril, kelompok
2 (n=125) secara oral diinjeksi dengan 100 µl PBS sebagai negatif kontrol. Dua
minggu kemudian, ikan diperlakukan dengan prosedur yang sama. Ikan
dipelihara dalam 6 m3 air yang masuk dengan proses filterisasi pasir dan
perlakuan UV air laut pada suhu 280c. Salinitas 36 ppm, pH 8.0 dan 7,5 mg/l
oksigen terlarut melalui proses injeksi oksigen. Ikan diberi makan dua kali setiap
hari dengan 3-5 mm pelet diet kering (10% karbohidrat, 20% lemak, 55% protein
dan 12% kadar abu). Setelah 4 minggu, lima ekor ikan pada tiap-tiap kelompok
mengalami pendarahan dari pembuluh darah caudal. Dan Sera digunakan
sebagai antibodi pada pendeteksian.

Tabel 1.
Strain dan Kenaikan jumlah dari gen Ompk yang digunakan untuk Analisa

Strain untuk Kenaikan Starin untuk Kenaikan

Ompk Jumlah Ompk Jumlah
V.alginolyticus DQ063588 V. chloreae AE004301
V.parahaemolyticus DQ016304 V.harveyi DQ279076
V.vulnificus AE016795 V.profunduma CR378665
a
= P.,Photobacterium

Sisa ikan pada masing-masing kelompok kemudian secara random dibagi

menjadi 2 sub-kelompok (60 per kelompok) untuk uji tantang. Ikan pada dua-
subkelompok dari masing-masing kelompok kemudian dibius. Dan berturut-turut
ditantang dengan injeksi pada Intraperitoneal dengan strain V.alginolyticus
ZJ04107 dan strain yang khusus. Dosis uji tantang dari dua strain secara
berturut-turut adalah 1,0x108 CFU (100 µl dari 1 x 109 CFU ml-1) dan 4,0x108
CFU (00 µl dari 1 x 109 CFU ml-1) per ikan (LD50 yang ditentukan sebagai
2,0x107 CFU untuk strain ZJ04107 dan 8,0x107 untuk strain khusus pada
pengujian kadar logam pendahuluan). Suspensi bakteri dipersiapkan sebagai
berikut : strain V.alginolyticus ZJ04107 dan strain khusus ditumbuhkan
semalaman dalam Zobell2216E broth pada suhu 370c. Diambil dengan cara
sentrifugasi pada 6000 xg selama 10 menit dan dicuci tiga kali dengan PBS
buffer. Bakteri akan tersuspensi dalam 0,01 M PBS (pH 7.8) dan konsentrasi
disesuaikan kira-kira 1x109 CFU ml-1. jumlah kumulatif kematian dan tanda-tanda
klinis dicatat tiap hari selama tiga minggu setelah uji tantang. Kematian ikan
diotopsi untuk menentukan penyebab kematian dan untuk mengetahui pengaruh
keberadaan dari V.alginolyticus dalam jaringan oleh kultur bakteri pada media
agar TCBS. Persentase relatif survival (RPS) dikalkulasikan sebagai : RPS=1-
(Kematian kelompok yang divaksin/kematian kelompok kontrol) x 100%
(Amend,1981). Perbedaan signifikan dikalkulasikan menggunakan uji Fisher’s
exact.

Gambar 2. Pelurusan Sequencing Ompk dari V.alginolyticus dan strain lainnya

(daftar pada tabel 1). Sequencing asam amino diperjelas dengan menggunakan
program Clustal W dari Bioinformatika Institut Eropa (Cambridge, Inggris).
Idntitas residu asam amino ditunjukkan pada kotak yang dihitami, dan blok abu-
abu menunjukkan residu yang sejenis. Perbedaan tersebut diluruskan dengan
ditandai (-). Tanda panah menunjukkan signal-sequence peptide cleavage. V-X-
A menunjukkan kutub ellips. Wilayah yang digunakan untuk rancangan primer
ditunjukkan dengan kutub vertikal.
2.8 Elisa

Lima sampel sera dari masing-masing kelompok yang divaksinasi dan

kelompok kontrol diambil untuk dianalisa melalui enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA). Antisera dan negatif kontrol dilarutkan pada 2-fold serial in a 96-
lubang ELISA plate ( 50 µg per lubang/sumur) dan dihentikan dengan inkubasi
pada 40c selama seharian. Plate dicuci tiga kali dengan PBS yang mengandung
0,1% Tween-20, dihalangi dengan 10% susu krim yang mengandung 0,02%
NaN3 selama 12 jam pada suhu 40c dan dicuci tiga kali dengan PBST.antigen
Ompk dalam PBS (40 µg/ml, 50 µl per lubang/sumur) telah ditambahkan
(pelemahan sera dan konsentrasi dari antigen Ompk ditunjukkan pada uji
pendahuluan). Setelah 12 jam inkubasi pada suhu 40c, plate dicuci tiga kali
dengan PBST dan direaksikan dengan anti kelinci-serum Ompk, kemudian
direaksikan dengan goat anti-rabbit IgG. Reagen pewarna (0,25% o-
phenylendiamine, asam sitrat-H2O 1.02 g NaH2PO4.12H2O 3.69 g/100 mL) telah
ditambahkan pada 100 µl di tiap-tiap lubang. Dan diinkubasikan selama 20 menit
pada suhu 250c, 1 M H2SO4 ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Plate
kemudian dibaca pada 492 nm dengan menggunakan micro-plate reader.
Perbedaan signifikan kemudian dikalkulasikan menggunakan uji Student’s.

Gambar 3. (A) SDS-PAGE dari pET-Ompk pada E.coli (DE3). Baris 1, Protein
molekular marker, Baris ke-2, pET-Ompk dengan induksi IPTG. Baris ke-3, pET-
Ompk tanpa induksi IPTG, Baris ke-4, pET-30ª(+) dengan IPTG Induksi. (B)
Analisa Western blot dari pET-Ompk. Baris 1 Protein molekulat marker, Baris ke-
2 pET-Ompk dengan induksi IPTG; Baris ke-3, pET-30ª(+) dengan induksi IPTG.
3. Hasil dan Pembahasan
3.1 Kloning gen Ompk

Dengan menggunakan PCR dan proses sequencing, 846 bp full length

ORF dari gen Ompk telah dihasilkan dari genome DNA V.alginolyticus strain
ZJ04107 (Gambar 1). Sequence asam amino yang dihasilkan dari gen Ompk
terdiri atas 281 residu asam amino dengan berat molekul diprediksikan adalah
31,3 kDa. Jumlah protein Ompk terdiri atas 261 asam amino (Gen Bank
accession no dq063588)

3.2 Karekterisasi Sequence

Berdasarkan data di GenBank, Ompk dari V.alginolyticus telah ditemukan

memiliki kesamaan yang sangat tinggi dengan bakteri Vibrio spp lainnya (Tabel
1). Identitas asam amino memiliki kisaran : 81,2% dengan V.parahaemolyticus,
78,1% dengan V.harveyi, 75,2% dengan V.vulnificus. 73,7% dengan V.chloreae,
yang mengindikasikan bahwa protein Ompk telah diawetkan. Analisa pelurusan
dari terjemahan sequence asam amino dari Ompk juga telah ditunjukkan dapat
diawetkan (Gambar 2). Dimana dapat menyediakan antigen permukaan untuk
kandidat vaksin terbaik. Pada C-terminal, protein Ompk memiliki a phenylalanine,
sebuah karakteristik yang umum terdapat pada protein membrane lapisan luar
(Struywe et al., 1991).

Gambar 4. titer spesifik antibody ELISA pada serum Pseudosciaena crocea 4

minggu setelah divaksinasi dengan Ompk. Lima kolom pada (A) adalah sera dari
ikan yang divaksinasi dengan Ompk. Pada (B) adalah sera dari ikan yang tidak
divaksin dengan Ompk. 1 – 5 adalah jumlah individu ikan. Dasil diperoleh
dengan pengamatan duplo. Perbedaan signifikan dari kelompok control p<0,05
Gambar 5. Tingkat kelulus hidupan Pseudosciaena crocea setelah uji tantang
dengan V.alginolyticus ZJ04107 (A) dan strain khusus/khas. (B) kelompok
divaksin dengan Ompk. Merupakan kelompok ikan yang tidak divaksin
dengan Ompk. Perbedaan signifikan dari kelompok control telah diperoleh pada
table (A) dan (B).

Analisa menggunakan SignalP 3.0, ORF dari Ompk termasuk kedalamnya

20 asam amino signal peptide dalam daerah N-terminal. Dimana umumnya
memiliki karakteristik pada signal bakteri peptida. Signal peptide memiliki
sebuah bagian pembelahan bersama untuk petunjuk peptidase. Pada posisi-3
hingga -1, A(G/S/L/T/V/C)-X-A- adalah umum diamati dalam proses sequence
(Von Heijne,1985,1986). Pada gambar 2, tanda panah menunjukkan bagian
signal-sequence peptide merusak bagian. Posisi asam amino -3 hingga -1
adalah V-M(L/F)-A untuk Ompk, dimana tetap konsisten dengan sequence yang
diamati V-X-A dari signal peptide transmembran OMP. Karakterisasi dengan
menggunakan struktur β-barrel, OMPs transmembran dapat berpindah
menyeberangi membrane sitoplasma oleh mesin sekresi. membelah signal
peptide oleh Leader peptidase (Lep) dan tiba di lapisan luar membrane (Schulz,
2002, Eicken et al., 2002).

3.3 Pernyataan dan Pengukuran Protein Ompk rekombinasi

Dideteksi oleh analisa enzim pembatasan (Gambar 1) dan proses

sequencing. Pernyataan konstruksi rekombinasi plasma pET-Ompk telah
diperlakukan pada E.coli BL21 (DE3), dan kontrol negative telah
ditransformasikan dengan pET-30a(+) vector sendirian. Percobaan pendahuluan
menunjukkan bahwa dimulainya pernyataan nilai rekombinan dari protein pada
2.5 h dan mencapai maksimum level pada 4-6 h. Selanjutnya, waktu optimal
untuk pernyataan protein adalah 5 h setelah induksi 1 mM IPTG. Rekombinan
protein dianalisa dengan menggunakan SDS-PAGE dengan 12% SDS gel
polyacrilamide. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kedua nilai rekombinan
protein Ompk diperoleh melebihi pernyataan pada E.coli BL21 (DE3) (Gambar
3A). dengan tambahan western blot analisa menggunakan serum anti-kelinci.
Sifat antigen dari gabungan rekombinan protein telah didemonstrasikan. Kelinci
yang telah diimunisasi sera mengenali rekombinan protein Ompk memiliki ukuran
yang sama seperti rekombinan gabungan protein dengan etiket-nya.

3.4 Vaksinasi dan Uji Tantang

Respon immunitas dari Pseudosciaena crocea terhadap vaksinasi Ompk

telah dapat diketahui dengan menggunakan ELISA. Ikan yang divaksin secara
intraperitoneal dengan Ompk menghasilkan antibody anti-Ompk yang sangat
efektif. Pada ikan yang divaksinasi, antibody melawan Ompk secara statistik
berfungsi pada pengenceran serum 1:100 dalam hubungannya dengan negative
kontrol. Gambar 4 mengindikasikan bahwa titer spesifik antibody melawan
Ompk terdeteksi pada seluruh sera dari Pseudosciaena crocea yang divaksinasi
menggunakan ELISA (p<0,05). Control test menunjukkan penurunan absorbansi
menurut kepada uji pelemahan antigen dan antibody.
Dengan vaksinasi Ompk, ikan memperoleh perlindungan pada tingkatan
tertentu. Hasil menunjukkan bahwa tingkat kelulushidupan ikan secara signifikan
lebih tinggi pada ikan yang divaksin dibandingkan kelompok kontrol setelah uji
tantang dengan strain V.alginolyticus ZJ04107 dan strain khusus lainnya
(Gambar 5). Pada hari ke-tiga, ikan mulai ada kematian pada kelompok control,
pada hari ke 5-10, ikan mengalami peningkatan kematian mendadak, kemudian
menurun hingga hari ke-17. Bagaimanapun, pada kelompok ikan yang
divaksinasi memiliki tingkat kelulushidupan secara signifikan lebih tinggi
dibandingkan ikan yang tidak divaksin. Dari perbandingan pada gambar 5A dan
B, sangat mudah untuk mengetahui bahwa, strain khusus RPS (79,2%) adalah
lebih tinggi dibandingkan strain ZJ04107 (70,4%). Dimana diindikasikan bahwa
keganasan dari strain khusus lebih lemah dibandingkan isolasi strain ZJ04107
dari Pseudosciaena crocea patogen besar. Selanjutnya hal ini juga
mengindikasikan ikan yang divaksinasi dengan Ompk dapat berbeda dalam
melawan strain V.alginolyticus. analisa Histopatologi dari ikan yang divaksin
dengan ikan yang tidak divaksin yang dapat bertahan hidup melawan uji tantang
bakteri dapat mengungkapkan tanda dari luka jaringan yang dihasilkan dari
infeksi v.alginolyticus. luka berat pada umumnya yang sedang diamati terdapat
pada liver, limpa dan ginjal termasuk beberapa nekrosis dan heemorhagic (data
tidak dapat ditampilkan).
V.alginolyticus, adalah satu dari bakteri Vibrio patogen yang paling utama
Terhadap binatang laut.. dan memimpin terhadap dampak kerusakan ekonomi
pada budidaya ikan. Sangatlah dirasa perlu untuk mengembangkan vaksin yang
efektif untuk melawan bakteri pathogen lainnya. Vaksinasi dengan Omps telah
ditunjukkan sangat efektif dalam melawan infeksi Aeromonas salmonicida,
V.anguillarum, dan A.hydrophilia pada ikan. (Fong et al.,2000, Bricknell et al.,
1999). Studi ini menunjukkan bahwa awetan Ompk dari strain V.alginolyticus
ZJ04107 adalah kandidat vaksin terbaik dari V.alginolyticus. Pada saat yang
bersamaan, peneliti mengamati apakah awetan Ompk ini juga berguna sebagai
vaksin yang efektif melawan bakteri Vibrio pathogen lainnya.

Kesimpulan

Studi ini didukung oleh bantuan dana dari National Key Technologies R&D
Program, China (No. 2004BA757C) dan Zhejiang Province Key Technologies
R&D Program, China (No. 2005C23085) dan Dr. Zhijuan Mao

Referensi

Amend, D.F, 1981, Potency testing of fish vaccines, In : Anderson, D.P.,

Hennesen, H (eds) Fish Biologics. Serodiagnostics and Vaccines,
Departemen Standarisasi Biologi, Karger, Basel, hal.447-454
Bricknell, I.R., King,J.A., Bowden, T.J., Ellis, A.E., 1999, Duration of Protective
Antibodies, And the Correlation With Protection In Atlantic Salmon (Salmo
solar L) Following Vaccination With an Aeromonas salmonicida Vaccine
Containing Iron-Regulated Outer Membrane Proteins and Secretory
Polysaccharide. Fish Shellfish Immunol. 9, hal.139-151
Eicken,C., Sharma, V., Klabunde, T., Lawrnz, M.B., Hardham, J.M., Norris, S.J.,
Sacchettini, J.C., 2002, Crystal Structure of Lyme Disease Variable
Surface Antigen VIsE of Borrelia burgdorferi J. Biol. Chem.227, 21691-
21696
Fang H.M., Ling, K.C., Ge, R., Sin, M., 2000, Enhancement of Protective
Immunity In Blue Gourami, Trichogaster trichopterus (Pallas), against
Aeromonas hydrophila dan Vibrio anguillarum by A.hydrophila major
adhesion. J. Fish, Dis 23. hal 137-145
Hlady, W.G., Klontz, K.C., 1996, The Epidemiology of Vibrio Infections In Florida,
1981-1993. J.Infect, Dis.173, 1176-1183
Inoue, T., Matsuzaki, S., Tanaka.S., 1995, Cloning and Sequence Analysisi of
Vibrio parahaemolyticus Ompk gen encoding a 26-kDa outer membrane
protein, that serves a receptor for a broad-host-range Vibriophage,
KVP40. FEMS Microbiol, Lett, 134. 245-249
Lee, Kuo-kau, Yu, Shu-Ru, Liu, Ping-Chung, 1996, Alkaline serine protese Is a
Ecotoxin of V.alginolyticus In Kuruma Prawn, Penaeus japanicus, Curr,
Microbiol, 34, Hal 110-117
McLaughlin J.C., 1999, In:Murray,P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenofer, F.C.,
Yolken, R.H.,(Eds)., Manual of Clinical Microbiology, Edisi ke-7, ASM
Press, Washington, D>C., hal465-476.Vibrio
Morris, J.G., Black, R.E., 1985, Chlorela and other Vibrioses in the United States,
N.Engl. J.Med. 312. 343-350
Pizza,M., Scarlato, V., Masignani. V., et al., 2000. Identification Of Vaccine
Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-genome
Sequencing. Science 287, 1816-1820
Qian, R.H., Chu, W.Y., Mao, Z.J., et al., 2007. Expression, Characterization and
Immunogenicity of a Major Outer Membrane Protein From Vibrio
alginolyticus, Acta Biochim. Biophys. Sin.39, 194-200
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 2000. Molecular cloning: a Laboratory
Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor.
Schulz, G.E., 2002, The Structure of Bacterial Outer membrane Protein.
Biochem. Biophys. Acta 1565, hal 308-317
Struywe, M., Moons, M., Tommassen, J., 1991. Carboxy-terminal Phenylalanine
Is essential For The Correct Assembly Of a Bacterial Outer Membrane
Protein. J.Mol. Biol 218, 141-148
Tsolis, R.M., 2002. Comparative Genome Analysis Of The Alpha-Proteobacteria :
Relationships Between Plant and Animal Pathogens and Host Specifity.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12503-12505
Von Heijne, G., 1985, Signal Sequence. The Limits Of Variation. J.Mol.Biol 184,
99-105
Von Heijne, G., 1986, A New Method For Predicting Signal sequence Cleavage
Sites. Nucl.Acid Res. 14, 4683-4690
Zorilla, L., Arijo, S., Chabrillon, M., Diaz, P., et al., 2003, Vibrio species Isolated
From Diseased Farmed Sole (Solea senegalensis, kaup), and Evaluation
Of The Potential Virulence Role Of Their Extracellular Products. J.Fish Dis
26. hal 103-108