CO

LIM

LU

TR

DI
TU

AB

ES

AJ
A

DE

A
CH

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA

DOCTORADO EN CIENCIAS FISIOLGICAS CON

ESPECIALIDAD EN FISIOLOGA
CORRIENTES DE CALCIO A TRAVS DEL CANAL
MUTANTE LEANER EXPRESADO EN UN SISTEMA
HETERLOGO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN CIENCIAS FISIOLGICAS

CON ESPECIALIDAD EN FISIOLOGA
PRESENTA
Consuelo Mara Hernndez Valdivia
ASESORA
Dra. Esperanza Garca Martnez

Colima, Col., noviembre del 2005

NDICE
Tablas y figuras. i
Abreviaciones .ii
1

Resumen............................................................................................. 1

Summary... 2

Introduccin 3
3.1

Canales de calcio.. 5

3.2

Clasificacin y estructura de los canales de calcio activados

por voltaje... 7

3.3

Subunidad auxiliar . 11

3.4

Subunidad auxiliar 2.13

3.5

Subunidad auxiliar .

15
3.6

Inactivacin de canales inicos dependientes de voltaje... 16

3.7

Mecanismos de inactivacin de los canales de calcio ... 18

3.7.1 Inactivacin dependiente de voltaje... 18
3.7.2 Inactivacin dependiente de calcio.19

Antecedentes inmediatos 21
4.1

Modulacin de los canales de calcio por protenas G 22

4.2

Bases estructurales de la modulacin por protenas G. 23

4.3

Efecto modulador de la calmodulina sobre la inactivacin de

los canales de calcio tipo P/Q. 24

4.4

Ratones con mutaciones en canales de calcio: modelos para

estudiar desrdenes neurolgicos en humanos.. 26

Justificacin 29

Hiptesis. 31

Objetivo general 31
7.1

Objetivos particulares... 31

Materiales y mtodos... 32
8.1

Vectores usados 32

8.2

Tcnicas bacteriolgicas. 33
8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli. 33
8.2.2 Preparacin de las bacterias competentes... 33
8.2.3 Transformacin de las bacterias E. coli. 34

8.3

Determinacin de la concentracin de DNA. 34

8.4

Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN) 35

8.5

Sistema de expresin heterloga .. 36

8.6

Cultivo de clulas HEK 293. 36

8.7

Transfeccin de las clulas HEK 293 mediada por agregados

inorgnicos (fosfato de calcio).

36

8.7.1 Transfeccin celular. 37

8.8

Anlisis electrofisiolgico. ... 38

8.9

Medios y soluciones. ... 41

Resultados y discusiones 42
9.1

Efecto de la mutacin tgla corto sobre la densidad de corriente.. 42

9.2

Caracterizacin de la dependencia al voltaje de la activacin

del tgla corto cuando la corriente acarreadora es Ca+2.......... 43

9.3

Efectos sobre la cintica de inactivacin producida por

el tgla corto. .. 45

9.4

Efecto de la mutacin tgla corto sobre el grado de inactivacin

en funcin del potencial... 46

9.5

Efecto de la entrada previa de calcio sobre la inactivacin de

la corriente en la mutacin tgla corto.. ... 47

9.6

Efecto de la mutacin tgla corto sobre la inactivacin en estado

estable del canal de calcio tipo P/Q... 49

9.7

Efecto de la facilitacin en la corriente de calcio mediada por

un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve
duracin... 51

10

Conclusiones. 53

11

Perspectivas. .. 58
11.1

12

Anexo (figuras datos preliminares) 60

Referencias bibliogrficas. 65

ABREVIACIONES
ADN

cido desoxirribonucleico

ATP

Trifosfato de adenosina

BID

Dominio de interaccin beta

CAM

Calmodulina

CAM4

Calmodulina mutante 4

Ca

+2

Calcio

Cai

Concentracin de calcio intracelular

CBD

Sitio de unin constitutiva a calmodulina

CDI

Inactivacin dependiente de calcio

cDNA

DNA complementario

Cs+

Cesio

Cl-

Cloro

DMEM

Medio dubelcos modificado

EFH

EF hand

EGTA

cido tetraactico de etilen-glicol

E. coli

Escherichia coli

GFP

Protena verde fluorescente

HEK293

Clulas embrionarias de rin de humano

HEPES

2-4-(2-hidroximetil)-1-piperazinaetano cido sulfnico

hrs

Horas

IFM

Motivo isoleicona-fenilalanina-metionina

IV

Corriente-voltaje

K+

Potasio

Litros

LB
Li

Medio de Luria Bertani

Litio

Molar

min

minutos

ii

mM
Na

Milimolar
Sodio

NMG

N-metil-glucamina

ng

Nanogramos

Rb+

Rubidio

RE

Retculo endoplsmico

rpm

Revoluciones por minuto

seg

segundos

SBF

Suero bovino fetal

la

tg corto

leaner corto

tgla largo

leaner largo

TEA

Tetraetilamonio

Tris

Tris-(hidroximetil)-aminometano

UV

Ultravioleta

Alfa

Beta

Delta

Microlitros

Microgramos

Micromolar

iii

TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1.

Clasificacin de los canales de calcio dependientes de

voltaje. 8

Figura 1.

Conformacin estructural de los canales de calcio dependientes

de voltaje. 10

Figura 2.

Topografa transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A. 11

Figura 3.

Densidad de corriente de los canales de calcio tipo P/Q en clulas

HEK293.. 43

Figura 4.

Protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV.. 44

Figura 5.

Constantes de inactivacin de los canales de calcio tipo P/Q (1A y

tgla corto). 46

Figura 6.

Grado de inactivacin en funcin del potencial para los canales de

calcio tipo P/Q (tgla corto y 1A). 47

Figura 7.

Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada

por un pulso de prueba posterior a esta.. 49

Figura 8.

Inactivacin en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q (1A

y tgla corto). 50

Figura 9.

Evaluacin de la facilitacin de la ICa por prepulso para el canal

mutante tgla corto y el canal silvestre (1A). 52

PERSPECTIVAS ANEXO
Figura 1.

Efecto de la CAM4 sobre la dependencia al voltaje de la

activacin.. 60

Figura 2.

Efecto de la CAM4 sobre el curso temporal de la inactivacin

en funcin del potencial de membrana. 61

Figura 3.

En el canal silvestre la sobreexpresin de CAM4 no afecta

el grado de inactivacin en funcin del potencial de membrana.. 62

Figura 4.

En el tgla corto, el porcentaje de inactivacin en funcin del potencial

se modifica con la sobreexpresin de calmodulina mutante..63

Figura 5.

Inactivacin por prepulso: Efectos de la entrada previa de calcio

sobre la inactivacin de la ICa en el canal mutante tgla corto 64

RESUMEN
Los canales de calcio dependientes de voltaje, participan de manera relevante

en la regulacin de diversos procesos que dependen de calcio en las clulas

excitables. La apertura del canal, genera seales elctricas e incrementos
transitorios en la concentracin intracelular de calcio, que contribuyen en el control
de diferentes procesos fisiolgicos.
La familia de protenas que conforman a los canales de calcio tiene una gran
variabilidad gentica; para su ensamblaje y funcionamiento adecuados, se requiere
de la asociacin de hasta 5 diferentes subunidades (Caterall, 1995). En los ltimos
aos se han descrito enfermedades, que tienen una estrecha asociacin con
mutaciones en los genes que codifican para las subunidades que conforman a los
canales inicos (Meisler y cols., 2001).
La importancia del presente trabajo de investigacin, radic en tratar de
encontrar las posibles alteraciones electrofisiolgicas del canal de calcio tipo P/Q
como consecuencia de cambios en su estructura. Se utiliz la subunidad 1A del
canal de calcio tipo P/Q de humano, al cual se le introdujo la mutacin denominada
como leaner corto, que produce una alteracin importante en la regin carboxilo del
canal, con la consecuente prdida del sitio de unin constitutiva a calmodulina
(CBD), adems de un sitio de unin al complejo de protenas G.
Para estudiar las propiedades electrofisiolgicas del canal, el cDNA de la
protena mutada se expres en clulas HEK293 y se registraron las corrientes
totales. Los resultados sugieren que la activacin dependiente de voltaje no se ve
alterada por la mutacin. La cintica de inactivacin es ms lenta en el canal de
calcio mutado que en el canal silvestre. La inactivacin en estado estable no se ve
alterada en el canal truncado. La inactivacin dependiente de la entrada previa de
calcio difiere significativamente de la del canal silvestre. La isoforma corta incrementa
la magnitud de corriente cuando la protena es precedida por prepulsos
despolarizantes. Lo anterior sugiere que las alteraciones fenotpicas observadas en
el animal mutante se ven claramente influenciadas por alteraciones en los
mecanismos que participan en la modulacin del canal de calcio tipo P/Q.

SUMMARY
The voltage gated calcium channels have a relevant participation in the

regulation of diverse processes wich depends on calcium in the excitable cells. The
conformational changes that leads to the opening of these channels are produced by
the depolarization of the membrane. As consequence it generate an electrical signal
and a transitory increases in the intracelular calcium concentration, contributing to the
control of different physiological processes.
The family of proteins that form the calcium channels has a great genetic
variability, since its correct assembly and function needs of the association of 5
subunits that differ in their genetic origin (Caterall, 1995). The previous thing turns out
to be particularly important, since the last years there have been described some
diseases that have a narrow association with the present mutations in the genes that
codify for the subunits of the ionic channels (Meisler and cols., 2001).
To study electrophysiological properties of this channel, the cDNA of the
mutated protein was expressed in HEK293 cells and the total currents were register.
The results suggest that the activation dependent on voltage does not see to
be altered by the mutation. The kinetic of inactivation was slower in the mutated
calcium channel that in the wild channel. The inactivation in steady state does not
become altered in the truncated channel. The inactivation dependent on the previous
entry of calcium differs significantly with regard to the native P/Q calcium channel.
The short isoform increases in a significant way the magnitude of the current when
the protein was preceded for depolarizant prepulses. These results suggests that the
phenotypic alterations observed in the mutant animal meet clearly influenced by the
alterations in the mechanisms that participate in the modulation of the type P/Q
calcium channel.

INTRODUCCIN
En los sistemas biolgicos, el Na+, K+, Cl- y Ca+2 son los principales iones

involucrados en la realizacin de procesos celulares fundamentales. Para atravesar

la membrana celular que es una bicapa hidrofbica lipdica, estos iones deben ser
transportado a travs de: a) poros hidroflicos denominados canales inicos, b)
protenas transportadoras y c) bombas inicas.
Gran parte de la energa producida por el metabolismo celular se gasta en el
bombeo de iones en contra de su gradiente electroqumico a travs de la membrana
celular; este proceso requiere de la participacin de bombas inicas que a diferencia
de los canales inicos actan a travs de un mecanismo de transporte activo es
decir, requieren de

la energa liberada por la hidrlisis de ATP para generar el

movimiento de los iones. Estos gradientes contribuyen a la generacin de seales

elctricas en las que los canales inicos tienen una participacin importante. Las
seales elctricas viajan en forma de potenciales de accin por ejemplo, desde una
neurona hasta un sitio determinado donde desencadena otro tipo de seal no
elctrica como puede ser la liberacin de algn neurotransmisor o el inicio de
reacciones qumicas en cascadas de sealizacin intracelular.
Los canales inicos tienen una funcin aparentemente simple: permitir de
manera pasiva el flujo de iones a travs de la membrana celular, proceso que ha
resultado de una complejidad que va ms all de esta simple descripcin. As, los
canales inicos son protenas integrales de membrana que forman poros acuosos
que permiten el paso de iones a favor de su gradiente electroqumico. Algunos
canales son altamente selectivos a una especie inica en particular y al mismo
tiempo mantienen conductividades altas a esa especie inica. As mismo, los canales
inicos poseen mecanismos que permiten su regulacin a travs de la apertura y el
cierre del poro conductor. Gran parte de lo que se conoce a la fecha sobre los
canales inicos, se dedujo de mediciones elctricas gracias al hecho de que estos
permiten el flujo de iones a travs de las membranas biolgicas, con un movimiento
inico a favor del gradiente electroqumico que existe entre ambos lados de la
membrana. La importancia de estas protenas (que dan lugar a la formacin de
canales inicos) en una gran cantidad de fenmenos celulares, ha sido reconocida
3

en los ltimos aos, y se sabe que tienen una participacin determinante en la

transduccin de seales externas en seales internas que permiten a la clula
modular su actividad en funcin de su medio extracelular, lo que es vlido tanto para
clulas excitables como para las clulas no excitables. As, los canales inicos tienen
participacin en fenmenos tan diversos como son: la excitabilidad elctrica y
qumica, la secrecin, la contraccin muscular, la fecundacin, las reacciones
inmunes, la diferenciacin celular, etc. (Bers, 1991; Artalejo y cols., 1994; Murphy y
cols., 1991). El flujo de iones a travs de los canales inicos ocurre a una velocidad
de ms de 106 iones / segundo; caracterstica que permite poder observar la
actividad de una sola molcula a una resolucin temporal muy alta, algo nico en
biofsica. Esto, junto con el avance en las tcnicas de biologa molecular que hoy nos
permiten el acceso al uso de la clonacin y al empleo de sistemas de expresin
heterloga de los cDNAs para los canales inicos de inters, ha hecho posible la
diseccin a nivel molecular de los dominios estructurales de la protena que tienen
una relevancia funcional; como son aquellos implicados en la formacin del poro
acuoso, en su comportamiento cintico, o en la unin de drogas que modifican su
actividad. Lo anterior ha permitido la exploracin y el anlisis microscpico de la
relacin existente entre la estructura y la funcin de los canales inicos.

3.1

CANALES DE CALCIO
La concentracin libre de calcio (Ca+2) en el citosol de cualquier clula es

extremadamente baja (10-7M), mientras que la concentracin en el medio

extracelular

y en el retculo endoplsmico (RE) es considerablemente mayor

(10-3M). Esta diferencia genera un fuerte gradiente de concentracin que tiende a

permitir el paso de Ca+2 al citosol a travs de ambas membranas. Cuando se activan
las vas que permiten la entrada de calcio al citoplasma, se produce un marcado
incremento de la concentracin local de Ca+2 intracelular en un rango aproximado de
0.3-1M (Berridge, 2000).
El flujo de Ca+2 a travs de la membrana plasmtica est regulado por una
gran familia de canales, los cuales se abren o cierran en respuesta a un estmulo
determinado, el cual puede provenir de la interaccin entre la protena que conforma
el canal y nucletidos cclicos, de la unin de neurotransmisores con receptores del
canal o bien de cambios en el potencial elctrico a travs de la membrana.
A los canales de calcio que se activan por el potencial elctrico, se les ha
denominado como canales de calcio activados por voltaje, los que forman una gran
familia de protenas de membrana multimricas que controlan de manera selectiva el
flujo de iones de Ca+2 en respuesta a cambios en el potencial de la membrana.
El Ca+2 es un in que juega un papel muy importante en los procesos
intracelulares de las clulas excitables incluyendo a las neuronas. Durante el
desarrollo neuronal, la entrada de este in a travs de los canales de calcio
dependientes de voltaje tiene una participacin importante en diversas funciones
como por ejemplo, en el control de la liberacin de neurotransmisores, la muerte
neuronal, el crecimiento de las neuritas, en la formacin y eliminacin de sinpsis, en
la diferenciacin fenotpica, adems, acta como segundo mensajero en la expresin
de genes (Desmadryl y cols., 1998; Zwingman y cols., 2001).

El Ca+2 es un

mensajero intracelular por excelencia, que requiere de un control fino en sus niveles
citoplasmticos para mediar los distintos procesos en que se ve involucrado. Esto
significa que la concentracin de Ca+2 debe mantenerse en un rango estrecho del
orden nanomolar (Saris, 2005), ya que este catin puede llegar a ser txico para la
5

clula si sus niveles no son controlados de manera precisa. As, aunado a los
canales de calcio existen otros mecanismos involucrados en la regulacin del calcio
intracelular tales como las bombas e intercambiadores que remueven el Ca+2 del
citoplasma una vez que ha cumplido su papel como sealizador, logrando mantener
de esta forma las concentraciones basales del mismo.

3.2 CLASIFICACIN Y ESTRUCTURA DE LOS CANALES DE

CALCIO ACTIVADOS POR VOLTAJE
De acuerdo a sus propiedades electrofisiolgicas y farmacolgicas, los
canales de calcio dependientes de voltaje han sido clasificados en cinco tipos
denominados como T, L, N, P/Q y R (ver nueva nomenclatura en Tabla 1). Las
corrientes inicas acarreadas por los canales antes mencionados se caracterizan por
tener distintos umbrales de activacin, por lo que se les distingue bsicamente en
dos grupos: los canales de bajo umbral de activacin (tipo T), aquellos que se activan
con pulsos de despolarizacin cercanos al potencial de reposo, y los canales de alto
umbral de activacin (tipo L, N y P/Q), los cuales para su activacin requieren de
estmulos despolarizantes muy por encima de su potencial de membrana. Estos
canales son complejos hetero-oligomricos los cuales se activan tras la
despolarizacin de la membrana celular. La expresin y funcionamiento adecuados
de los canales de Ca+2 requieren del ensamblaje de la subunidad 1 (que es la
encargada de formar el poro de selectividad inica), y de las subunidades accesorias
, 2 y que estn implicadas en la regulacin del canal (Klugbauer y cols., 1999).
El primer canal de calcio activado por voltaje fue purificado y clonado de
tbulos transversos de msculo esqueltico (Curtis y Catterall 1986; Tanabe y cols.,
1987). Desde entonces, se han identificado siete genes que codifican para la
subunidad alfa que conforma el poro de los canales de alto umbral de activacin
(Hofmann y cols. 1999) y tres genes para los canales de bajo umbral (Lee y cols.,
1999). Si bien inicialmente las subunidades identificadas se nombraban segn el
tejido de procedencia, recientemente se ha adoptado una nueva nomenclatura en
base a las caractersticas que comparten (ver la Tabla 1).

Tabla 1.- Clasificacin de los canales de calcio dependientes de voltaje: conductancia

unitaria, agonistas, bloqueadores, caractersticas cinticas de la corriente, nomenclatura,
distribucin celular (Modificada de Catterall, 2000)

La subunidad 1 tiene un peso molecular de 190-250 kDa y es la estructura

fundamental de los canales de calcio activados por voltaje. Est conformada por
cuatro dominios transmembrana homlogos (I-IV) cada uno de ellos conformado por
6 alfa hlices transmembrana (S1-S6) circundantes a un poro central (Tanabe y cols.,
1987) (figura 1 A). Los extremos amino y carboxilo de la subunidad 1 se encuentran
localizados intracelularmente. Los segmentos S4 de cada uno de los dominios
poseen elementos estructurales especficos que incluyen residuos de aminocidos
cargados positivamente (lisina y arginina), los que tambin han sido reportados en
los canales de Na+ y K+ dependientes de voltaje. Dichos aminocidos forman el
sensor de voltaje, el cual sufre un cambio conformacional en respuesta a una seal
despolarizante (figura 1 A), del tal modo que este cambio puede acoplarse a la
apertura del poro del canal. Por analoga con algunos canales de K+, se ha sugerido
que la boca externa del poro esta dada por la invaginacin que ocurre en el asa del
poro, entre los segmentos 5 y 6 transmembrana (figura 1 A). Adems, el asa del
poro posee residuos de glutamato (o aspartato en algunos canales de bajo umbral de
activacin), los cuales dan lugar al filtro de selectividad del canal. Se cree que los
residuos de glutamato se coordinan con el Ca+2 durante su paso a travs del poro
8

(Ellinor y cols., 1995) y por otro, lado proveen el mecanismo que permite el bloqueo
del canal por metales pesados tales como el Cd+2 y el Co+2, los cuales se asocian
fuertemente con los sitios de unin para Ca+2 dentro del poro.
La subunidad 1 en su regin intracelular tiene secuencias altamente
conservadas que le permiten la interaccin con protenas. As, entre los dominios I y
II se encuentra un sitio de unin especfica a la subunidad denominado dominio de
interaccin alfa (AID) (figura 1 B). Un segmento entre el asa I y II de los canales tipo
no L une el complejo de protenas G (De Waard y cols., 1997; Zamponi y Snutch,
1998). En tanto, la regin carboxilo posee sitios que median la inactivacin de
canales tanto L como no L a travs del complejo Ca+2/Calmodulina (Lee y cols.,
1999; Zhlke y cols., 1999).

Figura 1. En el apartado A se muestra la conformacin estructural de la subunidad

1 de los canales de calcio dependientes de voltaje. Mientras que en apartado B, se
representa la composicin multimrica de los canales de calcio dependientes de
voltaje resultado de la asociacin de las distintas subunidades que los conforman;
adems se sealan algunos de sus determinantes moleculares (ver texto para
detalle).

10

3.3

SUBUNIDAD AUXILIAR

Debido a que la subunidad no forma parte de la protena que conforma el poro del
canal, se le ha denominado como subunidad accesoria o auxiliar. La primer
subunidad de este tipo con un peso molecular de 58 kDa se clon del msculo
esqueltico (Tanabe y cols., 1987). No posee segmentos transmembrana (figura 1
B). La estructura de su dominio se asemeja grandemente al dominio SH3 que une
regiones ricas en prolinas, lo que refuerza la idea de que la subunidad tambin
sirve como sitio de anclaje de la subunidad 1 a otras protenas (Miller, 1992; Zong,
1994). A la fecha, se han identificado 4 genes no allicos para esta subunidad
(Castellano y Prez-Reyes, 1993), adems de diversas variantes derivadas de
procesamiento alternativo. Estas protenas y sus formas alternas se expresan de
manera especfica en diferentes tejidos. La nomenclatura (con su distribucin mas
prevalente entre parntesis) es 1A (msculo esqueltico), 1B (cerebro), 2 (corazn,
pulmn, cerebro), 3 (cerebro, msculo liso) y 4 (cerebro, particularmente en cerebelo).

Como se mencion anteriormente, las subunidades se unen a la subunidad 1

mediante una secuencia especfica del "asa intracelular entre los dominios I y II de
esta ltima, al que se le ha denominado como AID (Pragnell y cols., 1994) (figura 1
B). Mientras que el dominio correspondiente en la subunidad se ha determinado
como el dominio de interaccin (BID) (figura 1 B). En el ratn letrgico, existe una
mutacin en la subunidad 4 antes del BID, lo que da como resultado una forma
truncada de RNA mensajero, con la consecuente prdida funcional de la protena.
Esta alteracin estructural es la responsable de los daos neurolgicos expresados
en este mutante, que incluyen la ausencia de epilepsia y presencia de ataxia
(Burgess y cols., 1997). Las subunidades juegan distintos roles, principalmente son
importantes para la expresin membranal de las subunidades 1 (Brice y cols.,
1997). En algunos casos, las subunidades pueden sufrir una especie de
"reorganizacin con el fin de compensar la sobre expresin o la ausencia de una de
las otras subunidades. Esto se observa con la subunidad 4, donde la forma
truncada de la protena causa el dao neurolgico observado en el ratn letrgico.
Sin embargo, la perdida del gen que codifica para la subunidad 1 en ratones knock
out conduce a la muerte en el nacimiento (Gregg y cols., 1993). De manera
11

secundaria, las subunidades ejercen diversos efectos sobre las propiedades

biofsicas de las subunidades 1, que son especficos para cada una de las
diferentes subunidades .

12

3.4

SUBUNIDAD AUXILIAR 2-

La familia de subunidades 2consiste de tres genes. La primer subunidad

identificada fue extrada del msculo esqueltico de conejo y se le denomin 21
(Ellis y cols., 1988). Existen otras cinco subunidades 2-1 generadas por expresin
alternativa (Angelotti y Hofmann, 1996) pero su importancia funcional an no ha sido
establecida. Dos nuevos miembros de esta familia de subunidades se identificaron
posteriormente en seres humanos y en ratones a las que se les llam 2y
2respectivamente

(Klugbauer y cols., 1999); estas nuevas subunidades

mantienen una homologa del 56 y 30% con la subunidad 2-1, respectivamente.

Una mutacin

en la subunidad 2-2 es la responsable del dao neurolgico

manifestado como ataxia en un ratn con mutacin espontnea denominado ducky

(Barclay y cols., 2001).
Las 3 subunidades 2 tienen perfiles hidrofbicos similares y contienen
varios sitios potenciales de N-glicosilacin. La subunidad 2-1 est conformada por
2 protenas, la 2 altamente glicosilada localizada extracelularmente y una pequea
protena que permite el anclaje de la 2 a la membrana celular (Brickley y cols.,
1995; Wiser y cols., 1996). Las dos protenas auxiliares 2 y son producto del
mismo gen y se originan por un corte proteoltico post-traduccional (De Jongh y cols.,
1990) (figura 1 B). Las subunidades 2 y se asocian mediante puentes disulfuro
que se forman entre los numerosos residuos de cistenas que se localizan en ambas
protenas (figura 1B). Si bien, la subunidad 2 posee 2 dominios hidrofbicos, se
piensa que esta subunidad se encuentra localizada extracelularmente y se une a la
subunidad transmembrana mediante puentes disulfuro (Brickley y cols., 1995).
Los efectos de la subunidad 2-1 sobre las propiedades biofsicas de las
subunidades 1 dependen del sistema de expresin y de las subunidades utilizadas.
Aunque invariablemente estas incrementan la densidad de corriente a travs de los
canales de calcio al aumentar la cantidad de canales funcionales en la superficie
celular. Adems, se ha reportado que altera de manera alostrica la activacin e
inactivacin de diversas subunidades 1 (Singer y cols., 1991; Bangalore y cols.;
1996, Felix y cols., 1997; Klugbauer y cols., 1999). Se sabe tambin que la
13

subunidad 2-1 incrementa la unin de dihidropiridinas a los canales de calcio tipo L

y de -conotoxina a los tipo N (Flix y cols., 1997; Brust y cols., 1993). Por otro lado,
se ha visto que la coexpresin de las subunidad 2-1 con la 2a muestra que estas
dos subunidades auxiliares tienen un efecto cooperativo sobre la expresin de los
canales Cav1.2

a nivel membranal, lo que se traduce en un incremento de la

densidad de corriente (Yamaguchi y cols., 2000).

14

3.5

SUBUNIDAD AUXILIAR
La primera secuencia que se dedujo a partir del msculo esqueltico indica

que la subunidad 1 es una protena de 25 kDa con cuatro dominios transmembrana

caractersticos (Jay y cols., 1990) (figura 1B). La funcin de esta subunidad en los
canales de calcio del msculo esqueltico an no se determina completamente;
aunque se sabe que en estos modula el pico de corriente adems de las cinticas de
activacin e inactivacin de la subunidad alfa 1 (Singer y cols., 1991; Eberst y cols.,
1997). Posteriormente se encontr que ratones que manifiestan ausencia de
epilepsia (fenotipo stargazer) poseen un gen homologo en los que se genera la
insercin de un transposn y da lugar a la subunidad denominada como 2 (Letts y
cols., 1998). Este nuevo miembro de la familia de subunidades se clon de tejido
cerebral y si bien, puede producirse cierta cantidad de RNA mensajero funcional, la
insercin del transposn causa considerables aberraciones fenotpicas. Adems de
la subunidad 2, recientemente han sido identificadas otras 3 subunidades (3- 5) en
ratones (Klugbauer y cols., 2000). Las subunidades 3 y 4 solamente han sido
encontradas en cerebro, mientras que la 5 es expresada en rin, msculo
esqueltico, hgado y pulmn (Klugbauer y cols., 2000). La homologa de la
subunidad 1 con el resto de las subunidades es muy baja, compartiendo solo el 25%
de identidad con la 2.
Finalmente, es importante resaltar que en su conjunto las subunidades
accesorias , 2 y modulan las cinticas de activacin e inactivacin, la densidad
de expresin, la dependencia del voltaje y las propiedades farmacolgicas de la
subunidad 1 del canal de calcio (Hofmann y cols., 1999).

15

3.6 INACTIVACIN DE CANALES INICOS DEPENDIENTES DE

VOLTAJE
Desde el punto de vista funcional, la inactivacin es un proceso comn y
crtico en muchos tipos de canales inicos dependientes de voltaje. Un ejemplo claro
es el canal de sodio dependiente de voltaje, donde la inactivacin rpida determina la
duracin del potencial de accin y el perodo refractario en tejidos excitables;
mientras que la remocin de la inactivacin del canal rompe el gradiente inico
conduciendo a la perdida de la excitabilidad.
A la fecha, se sabe poco sobre el proceso de inactivacin de los canales de
Ca+2 dependientes de voltaje (Stotz y Zamponi, 2001). Sin embargo, el proceso de
inactivacin de los canales de Na+ y K+ cuyas estructuras moleculares se asemejan a
la de los canales de calcio dependientes de voltaje, se encuentra mejor descrito. As,
el proceso de inactivacin de los canales de Na+ y K+ puede servir como punto de
partida para tratar de correlacionar de manera indirecta el o los mecanismos de
inactivacin presentes en los canales de Ca+2
Tanto los canales de Na+ como los de K+, presentan dos procesos diferentes
de inactivacin denominados como inactivacin rpida e inactivacin lenta, que son
mediados por diferentes componentes de la subunidad del canal. Estos
mecanismos son procesos independientes, ya que la remocin de la inactivacin
rpida, no elimina la inactivacin lenta; por ejemplo, la inactivacin rpida se elimina
mediante el tratamiento enzimtico intracelular (Rojas y Amstrong, 1971) y por
mutaciones en el asa citoplasmtico que une al tercer y cuarto dominios de la
protena que conforma el canal (Sthmer y cols., 1989; Patton y cols., 1992; West y
cols., 1992); sin embargo, estos tratamientos no ejercen ningn efecto sobre la
inactivacin lenta.
El mecanismo para el proceso de inactivacin rpida en los canales de
potasio, se describi en el canal de potasio tipo shaker, de acuerdo a un modelo de
bola y cadena (Hoshi y cols, 1990). En este modelo, un segmento de
aproximadamente 20 aminocidos situado en la regin amino terminal de cada
dominio, es potencialmente capaz de ocluir fsicamente el poro del canal en su regin
citoplasmtica.
16

La inactivacin rpida de los canales de Na+ se asocia a un mecanismo

cualitativamente similar; sin embargo, en estos canales la estructura de inactivacin
no est asociada a la regin amino terminal, sino al linker III y IV donde se ha
demostrado que existe una regin hidrofbica de 3 aminocidos (isoleucina [I],
fenilalanina [F] y metionina [M]) denominada como motivo IFM. Es decir; la oclusin
fsica del poro en los canales de Na+ durante la inactivacin, est mediada por la
unin del motivo IFM a un sitio de acoplamiento localizado en la subunidad del
canal. En este sentido, el linker III y IV funciona como una especie de tapadera que
cuando se acopla a la regin del poro es capaz de impedir el flujo de corriente (West
y cols., 1992).
La inactivacin lenta es un proceso que parece estar asociado a la obstruccin
de la boca externa del poro del canal. Esto es, que el poro es capaz de controlar la
selectividad del filtro por si mismo, contribuyendo de alguna manera en la cintica
caracterstica de la inactivacin lenta. Sin embargo, los mecanismos moleculares que
controlan este tipo de inactivacin distan mucho de estar claramente descifrados.
Para los canales de potasio, se sugiere que durante esta inactivacin, el poro
sufre un estrechamiento debido a un rearreglo estructural. El tetraetilamonio (TEA) es
capaz de reducir dramticamente la inactivacin lenta cuando se aplica
extracelularmente, como si sta no pudiese ocurrir mientras el TEA se mantiene
unido a la boca externa del poro. Por otro lado, los iones extracelulares juegan un
papel importante. As, la presencia de iones permeables como el K+ y el Rb+,
reducen de manera importante la inactivacin lenta, como si su presencia en el filtro
de selectividad previniera de alguna forma el estrechamiento del poro. De manera
notable, en ausencia de estos iones en el medio extracelular, el canal de potasio en
el estado de inactivacin lenta es permeable al sodio. Lo que ha llevado a sugerir
que el reacomodo de la parte ms externa del filtro de selectividad, conduce a un
estrechamiento y no a un colapso del poro durante la inactivacin (Jerng, 1999).
Por otro lado, en los canales de Na+, la inactivacin lenta parece ocurrir de
manera similar. Adems, la presencia de iones como el Na+, Li+, K+, Rb+ y Cs+, son
capaces de modificar la cintica de la inactivacin lenta en los canales de Na+
(Townsend y Horn, 1999).
17

3.7 MECANISMOS DE INACTIVACIN EN LOS CANALES DE

CALCIO.
Contrariamente a los canales de Na+ y K+, se sabe poco de las estructuras
moleculares que intervienen en los procesos de inactivacin de los canales de calcio.
A travs de la evolucin, los canales de calcio han desarrollado varios mecanismos
de inactivacin para controlar el flujo de Ca+2 al interior celular. A la fecha, se han
descrito tres tipos de inactivacin: inactivacin rpida dependiente de voltaje (Zhang
y cols., 1994), inactivacin dependiente de Ca+2 (Peterson y cols., 1999) e
inactivacin lenta dependiente de voltaje (Sokolov y cols., 2000).
En sistemas de expresin heterloga, las subunidades 1 de los canales de
Ca+2 no requieren de subunidades auxiliares para presentar una inactivacin
dependiente de voltaje, lo que sugiere que la inactivacin es un proceso intrnseco de
la subunidad 1 (Nargeot, 1992).

3.7.1

INACTIVACIN DEPENDIENTE DE VOLTAJE

El primer trabajo dirigido a la identificacin de los elementos estructurales de

la subunidad 1 que participan en este proceso de inactivacin dependiente de

voltaje fue reportado por el grupo de Tsien en 1994. Usando canales de calcio
quimricos que combinaban caractersticas estructurales de distintas subunidades,
mostraron que las diferencias en las cinticas de inactivacin observadas, se deban
exclusivamente a la regin S6 del dominio I tansmembranal. Sin embargo,
posteriormente se demostr que algunas mutaciones puntuales en distintas
secuencias de la subunidad 1, tales como la regin carboxilo, el linker entre el
dominio I-II, el linker entre el dominio III y IV adems de los segmentos S6
transmembrana, pueden afectar dramticamente la cintica de inactivacin. Lo
anterior, llev al empleo de otras estructuras quimricas utilizando canales
filogenticamente

ms

distantes

con

comportamientos

cinticos

diferentes,

logrndose encontrar que los cuatro dominios transmembrana contribuyen a la

dependencia del voltaje de la inactivacin.
18

3.7.2

INACTIVACIN DEPENDIENTE DE CALCIO

Las primeras evidencias de la existencia de un mecanismo de inactivacin

dependiente de calcio (CDI), surgieron de un estudio realizado por Brehm y Eckert en

1978 al encontrar que la cintica de inactivacin en canales de Ca+2 (de
Paramecium) era mucho ms rpida en presencia de Ca+2 que la observada cuando
perfundan soluciones con Ba+2. Adicionalmente, tambin encontraron que diversos
amortiguadores de calcio tenan como efecto una reduccin en la inactivacin del
canal.
Los canales de calcio dependientes de voltaje representan una de las vas
ms importantes de influjo de Ca+2 y

la CDI representa un mecanismo muy

importante de retroalimentacin negativa que permite al Ca+2 autorestringir su

entrada al interior celular.
Se han propuesto distintos mecanismos para explicar la CDI como son: los
procesos de desfosforilacin, as como la participacin de protenas de unin a Ca+2.
Si se toma en cuenta que la CDI es un proceso rpido, entonces resulta lgico
pensar que la defosforilacin y la produccin de segundos mensajeros no constituyen
el mecanismo primario que inicia la inactivacin mediada por calcio. De tal modo que,
los esfuerzos para tratar de descifrar este mecanismo, se han centrado en el papel
que juegan las protenas que unen calcio y que tienen la capacidad de unirse al
canal. As, en 1995 se encontr que los canales tipo L poseen determinantes
estructurales importantes para la CDI en la regin proximal del extremo carboxilo, a
la cual se le denomin como regin de inactivacin por Ca+2 (CI). La regin CI
contiene un motivo de unin a Ca+2 denominado con EF hand (EFH), el cual fue
propuesto como el sensor de Ca+2 para la CDI (De Len y cols, 1995). Sin embargo,
estudios posteriores donde se eliminaron de manera selectiva regiones del extremo
carboxilo del canal tipo L permitieron identificar dos grupos de aminocidos
necesarios para la CDI. (Zhlke y cols.,1998). Una de estas regiones es el motivo de
unin a calmodulina denominado como IQ, lo que dejaba abierta la posibilidad de
que la calmodulina pudiese estar participando en el mecanismo de inactivacin por
19

calcio. As, en los ltimos aos y gracias al empleo de sistemas de expresin

heterloga, diversos grupos han demostrado que la calmodulina acta como el
sensor de Ca+2 en la CDI (Lee y cols., 1999; Peterson y cols., 1999; Zhlke y cols.,
1999).

20

ANTECEDENTES INMEDIATOS
Durante muchos aos las enfermedades neurolgicas hereditarias fueron

reconocidas como errores congnitos asociadas al metabolismo. Sin embargo, en los

ltimos aos gracias al avance tcnico y cientfico se ha reconocido la presencia de
mutaciones en diversas protenas como son: receptores membranales, protenas
presentes en el citoesqueleto y recientemente en protenas de transporte,
particularmente en los canales inicos que dan origen a la manifestacin de diversas
enfermedades (Lehmann-Horn y Jurkat-Rott, 1999).
Como se mencion al principio del presente trabajo, los canales de Ca+2
activados por voltaje proveen un vnculo de suma importancia entre las seales
elctricas en la membrana plasmtica y una diversidad de procesos intracelulares
que requieren del in Ca+2 como segundo mensajero (como la liberacin de
neurotransmisores), o bien aquellos procesos cuya modulacin requiere de vas de
sealizacin intracelular dependientes de Ca+2 (como la expresin gnica).
Recientemente se han identificado mutaciones en el gen que codifica para la sntesis
de la subunidad 1a del canal de calcio tipo P/Q, que tienen una ntima relacin con
algunas alteraciones neurolgicas hereditarias en seres humanos, como son : la
ataxia cerebelar tipo 6, la migraa hemipljica familiar y la ataxia episdica tipo 2
(Zhuchenko, 1997; Ophoff, 1998).
El flujo inico a travs de los canales de calcio activados por voltaje da la pauta
inicial para el desencadenamiento de mltiples y diversos mecanismos de
sealizacin intracelular, por lo que la regulacin del curso temporal y la distribucin
subcelular de dicho flujo inico como respuesta a una despolarizacin tiene una
influencia directa sobre aspectos importantes de la fisiologa neuronal.
La subunidad 1a constituye a los canales de calcio tipo P/Q de alto umbral de
activacin, y se localiza principalmente en las prolongaciones dendrticas y en el
soma de las clulas de Purkinje, as como en las terminales sinpticas de las clulas
granulares (Westenbroek y cols., 1995). La distribucin subcelular, as como las
consecuencias funcionales de su interaccin con protenas de la membrana
presinptica, indican que estos canales desempean una funcin importante en la
regulacin de la eficiencia sinptica de estos tipos celulares (Sutton y cols., 1999).
21

4.1 MODULACIN
PROTENAS G

DE

LOS

CANALES

DE

CALCIO

POR

Algunos estudios utilizando la tcnica de patch clamp en la configuracin de

clula completa (Hamill y cols., 1981), han demostrado que la activacin de
receptores acoplados a la va de transduccin de seales mediada por protenas G,
ejerce un efecto inhibitorio sobre los canales de calcio tipo N y P/Q (Colecraft, 2001).
Lo anterior se refleja en una reduccin en la amplitud de la corriente al pico,
acompaada por una disminucin en las constantes de activacin e inactivacin de
estos canales. Por otro lado, se ha observado que esta inhibicin tiene un efecto
marcado a voltajes hiperpolarizantes, lo que implica que el grado de inhibicin
depende en gran medida del potencial de membrana. Esta inhibicin se manifiesta
como un desplazamiento hacia la derecha en la curva de inactivacin del canal, lo
que indica que en presencia de protenas G, los canales ven reducida su
probabilidad de apertura ante determinado potencial de la membrana. As, esta
dependencia al voltaje da como consecuencia una desestabilizacin de la protena G
cuando la conformacin del canal se encuentra en estados despolarizados, de tal
forma que el efecto inhibidor producido por la protena G desaparece mediante la
aplicacin de pulsos despolarizantes de gran amplitud (prepulsos antes del pulso de
prueba) a lo que se le ha dado el trmino de facilitacin. El efecto producido por la
facilitacin ya sea como algunos autores lo han sugerido, por un cambio
conformacional que no implica la desunin total de la protena G del canal (Kasai,
1989), o bien, por una disociacin fsica completa que expone al canal a una
reasociacin con la protena G (Hille, 1994) genera la posibilidad de estudiar cual es
el efecto modulador por protenas G en los canales de calcio (Zamponi y Snutch,
1998).
Estudios previos han mostrado que la activacin de receptores acoplados a la
va de transduccin mediada por protenas G inhibe los canales de calcio tipo N y
P/Q en neuronas centrales (Currie, 1997). La interaccin del heterodmero G con la
regin citoplsmica entre el dominio I y II del canal de calcio cambia el modo de
activacin, generando una poblacin de canales refractarios. En consecuencia, la
corriente macroscpica disminuye, la constante de tiempo de activacin de las
22

corrientes aumenta, y ocurre un cambio positivo en la dependencia al voltaje de la

activacin (Bean, 1989; Mintz y Bean, 1993). Los canales refractarios pueden
cambiar de nuevo al modo disponible de activacin si se aplican pulsos
despolarizantes de gran amplitud, a lo cual se ha denominado facilitacin. As, la
magnitud y la cintica de la facilitacin producida por despolarizaciones sostenidas, o
por pulsos relativamente breves a potenciales muy positivos (+100 a +150 mV) se
considera un criterio para explorar la modulacin de la corriente de calcio por
protenas G (Zamponi y Snutch, 1998).

4.2 BASES ESTRUCTURALES

PROTENAS G

DE

LA

MODULACIN

POR

Las primeras evidencias encaminadas a mostrar cuales son los determinantes

estructurales para la modulacin por protenas G surgieron del empleo de canales
quimricos (Cav2.2 y Cav2.1) (Zhang y cols., 1996). A partir de este trabajo diversos
estudios han sugerido la participacin de varios determinantes estructurales para la
interaccin de protenas G con el canal de calcio, que implican la participacin de la
regin carboxilo terminal; una regin de 38 aminocidos a la que se une el complejo
G (Qin y cols., 1997), y otra de 19 aminocidos, cercana al segmento
transmembranal S6 del dominio IV, a la que se une la subunidad G (Furukawa y
cols., 1998). Resulta interesante resaltar

que uno de los dos sitios de unin a

protenas G en el lazo citoplasmtico entre los dominios I y II se superpone con el

sitio de interaccin de la subunidad con el canal, lo que es consistente con la
evidencia de que las subunidades regulan la accin por protenas G en canales de
calcio (Bouring y cols., 1996, Fitzgerald y cols., 1995; Dolphin y cols., 2003 y Doering
y cols., 2004).

23

4.3 EFECTO MODULADOR DE LA CALMODULINA SOBRE LA

INACTIVACIN DE LOS CANALES DE CALCIO TIPO P/Q
La calmodulina (CAM) es una protena ubicua moduladora del calcio
intracelular que desempea un papel fundamental en la regulacin de una gran
variedad de procesos biolgicos. Tambin posee una funcin importante en la
diferenciacin neuronal; participa en la regulacin de numerosas protenas, entre las
que se incluyen algunas protein- quinasas, tales como la quinasa CaM de tipo II,
algunas formas de adenilato ciclasa, la fosfodiesterasa de adenosina monofosfato
cclico y fosfolipasas de membrana, tales como la fosfolipasa C (que hidroliza a
fosfatidilinositol 4,5-bifosfato [PIP2]) y fosfolipasa A2. La CAM es una pequea
protena (15 kD) de aproximadamente 148 aminocidos que se encuentra en el
citosol de la mayora de las clulas eucariotas. En concentraciones basales, el calcio
tiene una baja afinidad por la CAM pero a medida que la concentracin de calcio
aumenta, se ocupan los cuatro sitios de unin que posee para este in y se activa la
CAM. La variacin en las afinidades de las protenas por CAM permite que, al
aumentar la concentracin de calcio, dichas protenas se afecten de forma diferente.
Los mecanismos que subyacen a la inactivacin dependiente de calcio en los
canales de calcio tipo L son los mejor documentados a la fecha (Neely y cols., 1994;
Imredy y cols., 1994; Catterall y cols., 2000), no as para los canales de calcio tipo
P/Q. Sin embargo, recientemente utilizando tcnicas de doble hbrido en levadura y
de inmunoprecipitacin, se ha identificado un nuevo sitio de unin a CAM que se
encuentra localizado en la regin carboxilo terminal de la subunidad 1 del canal
Cav2.1 (Lee y cols., 1999). Este dominio de unin a calmodulina (CBD) est
localizado en la porcin carboxilo terminal de la subunidad 1 2.1 que es homloga a
la secuencia del dominio IQ de los canales Cav1.2 (Kraus y cols., 1998). Este
dominio est involucrado en la inactivacin de la corriente de calcio, pero tambin
forma parte del mecanismo de facilitacin a largo plazo (Lee y cols, 1999).
Aparentemente, la calmodulina se puede unir a esta regin del canal cuando la
concentracin de calcio intracelular es baja; y por otro lado, en respuesta a la
24

estimulacin con trenes de pulsos, lo cual genera la acumulacin de calcio en el

citoplasma; esta protena regula el curso temporal de la recuperacin de la
inactivacin. Este mecanismo de regulacin por calmodulina parece determinar la
disponibilidad de canales funcionales en funcin de la concentracin de calcio y de la
frecuencia con la que se despolariza la membrana (Lee y cols, 1999).

25

4.4 RATONES CON MUTACIONES EN CANALES DE CALCIO:

MODELOS PARA ESTUDIAR DESRDENES NEUROLGICOS EN
HUMANOS
A principios de los aos sesenta,

Sidman y Green (1965) sugirieron que

algunas enfermedades de tipo neurolgico podran explicarse por la existencia de

posibles mutaciones en los canales inicos. Aos despus, en 1996, el grupo de
Fletcher identific en los ratones tottering y leaner la primera mutacin en canales de
calcio. Recientemente, varios estudios a nivel de gentica molecular han evidenciado
que diferentes enfermedades en humanos estn claramente asociadas a mutaciones
en diversos canales inicos. A esta disfuncionalidad en los canales inicos se le ha
denominado con el trmino de canalopatas, asociadas en su mayora a cambios en
el flujo de iones de Na+, K+ y Ca+2 en diversos tipos de clulas. En seres humanos,
las canalopatas conducen a diversas enfermedades tales como la ataxia, la migraa,
algunas epilepsias y otros desrdenes neuromusculares.
Se han identificado algunos ratones que muestran mutaciones espontneas
llamados: tottering y leaner (Fletcher y cols., 1996; Doyle y cols., 1997), rolling
nagoya (Mori y cols., 2000), stargarzer (Letts y cols., 1998), lethargic (McEnery y
cols., 1998), rocker (Zwingman y cols., 2001), y ducky (Barclay y cols., 2001). Los
primeros tres tipos de ratones mutantes poseen variantes allicas, presentando
mutaciones en el cromosoma 8, en el locus asociado al gen Cacnal1a que codifica
para la subunidad 1 del canal de calcio tipo P/Q (ver figura 2)

26

Figura 2.- Topografa transmembrana de mutaciones en la subunidad 1A.

Donde: tg=tottering, tgla= leaner, rkr= rocker, rol= rolling nagoya; P=prolina,
L=leucina, R=arginina, G=glicina, T=Treonina, K=lisina (Adaptado de Fletcher y cols.,
1996).

Adems de los ratones con mutaciones espontneas, se han generado varios

ratones transgnicos mediante knocking out o mediante la sobre-expresin de
subunidades especficas de canales de calcio (Muth y cols., 2001). Los fenotipos
causados por las mutaciones en la subunidad 1A de los canales de calcio,
muestran diversos grados de severidad quiz como consecuencia del sitio en que se
presente la mutacin.
Algunos estudios han asociado a la mutacin en la subunidad 1A del canal
de calcio tipo P/Q con tres alteraciones neurolgicas en humanos: la migraa
hemipljica familiar, la ataxia episodica tipo 2 y la ataxia espinocerebelar tipo 6
(Ophoff y cols., 1998). As, tanto la ataxia espinocerebelar tipo 6 como el ratn leaner
ven interrumpida la secuencia intracelular de la regin caboxilo terminal (Fletcher y
cols., 1996; Zhuchenko y cols., 1997); lo que da como resultado una severa
degeneracin cerebelar (Herrup, 1982; Heckroth 1994; Herrup 1997).
Por otro lado, las mutaciones asociadas a la migraa hemipljica familiar, la
ataxia episdica tipo 2 y la mutacin leaner alteran la regin donde se localiza la
regin del poro del canal (Fletcher y cols., 1996; Ophoff y cols., 1996) lo que se
27

refleja en dao neurolgico sin sufrir grandes cambios en la morfologa cerebelar

(Heckroth, 1994).
A continuacin se enlistan algunas evidencias de paralelismo genotpico y
fenotpico de las patologas ligadas a canales de calcio tipo P/Q entre ratones y seres
humanos (Hess, 1996).
1) La secuencia de aminocidos de la subunidad 1A del canal de calcio sensible a
voltaje de ratn presenta un 94% de identidad con la protena correspondiente en
seres humanos.
2) El nivel de expresin del RNAm de la subunidad 1A en cerebelo es elevada, lo
cual coincide con el patrn de degeneracin neuronal asociado con la
manifestacin fenotpica de ataxia.
3) La localizacin cromosmica de la mutacin tottering y leaner es una regin
sintnica con el segmento del cromosoma humano 19p13, en el cual se han
localizado las mutaciones correspondientes a la migraa hemipljica familiar y la
ataxia episdica tipo 2.
4) La ataxia y la atrofia cerebelar progresiva en los ratones mutantes son
comparables a los sntomas descritos en individuos con migraa hemipljica
familiar, ataxia episdica tipo 2 y ataxia cerebelar tipo 6.
Las similitudes genotpicas y fenotpicas entre las enfermedades neurolgicas
y los ratones mutantes,

sugieren que los canales de calcio originados por las

mutaciones leaner y tottering son un excelente modelo para tratar de elucidar la

relacin existente entre los cambios estructurales y la funcin del canal.

28

JUSTIFICACIN
Durante la ltima dcada, diversas mutaciones en los genes que codifican

para distintos canales inicos han sido asociadas a enfermedades neurolgicas

hereditarias en seres humanos. De manera simultnea, tambin se han descrito
mutaciones en los genes que codifican para protenas similares pero en roedores, lo
que los coloca como modelos ideales para tratar de establecer la relacin entre la
mutacin y el fenotipo observado. As, diversas alteraciones genticas que ocurren
de manera espontnea en ratones que presentan epilepsia de ausencia y ataxia
cerebelar, se asocian a mutaciones en canales de calcio. Los ratones; tottering,
rocker, rolling Nagoya y leaner presentan mutaciones en la subunidad 1 del canal
de calcio tipo P/Q, que en neuronas cerebelares tiene un alto nivel de expresin; de
tal modo que las posibles alteraciones en las propiedades biofsicas del canal
mutado, pueden ser un factor importante de correlacin con el dao neuronal
observado en el animal mutante (Mori, 2000).

Lo anterior resulta de suma

importancia, ya que en seres humanos algunas alteraciones neurolgicas de tipo

hereditario como son la migraa hemipljica familiar, la ataxia episdica tipo 2 y la
ataxia espinocerebelar tipo 6 estn tambin asociadas a mutaciones en el gen que
codifica para el canal tipo P/Q (Fletcher y cols, 1996; Ophoff y cols, 1998).
Para establecer de manera fidedigna cmo las mutaciones afectan la actividad
del canal y desencadenan la enfermedad, es necesario estudiar su efecto en un
contexto fisiolgico. Sin embargo, el estudio biofsico de las mutaciones in vitro,
permiten detallar los mecanismos bsicos que se ven alterados en la funcin del
canal en un intento por tratar de comprender cmo estas alteraciones podran
conducir a la enfermedad.
As, mediante este trabajo se pretende analizar los efectos funcionales
producidos por la mutacin leaner en el canal de calcio tipo P/Q, utilizando un
sistema de expresin heterloga.
Como consecuencia de la mutacin leaner, se producen dos isoformas de
RNA mensajero diferentes con alteraciones en la secuencia del extremo carboxilo:
una forma larga (tgla largo) que incluye el segundo intrn (una secuencia
normalmente no transcrita) y una forma corta (tgla corto) que pierde la secuencia del
29

segundo exn (Fletcher y cols., 1996). Si bien, la mutacin afecta la regin carboxilo
del canal de calcio tipo P/Q donde se encuentran las secuencias que tienen que ver
con la modulacin del mismo, el inters del presente trabajo de tesis se centr en la
isoforma corta ya que es la que pierde el dominio CBD dejando intacto el motivo IQ.
As, la mutacin leaner nos sirvi como modelo para tratar de establecer cul es la
posible contribucin a nivel molecular del dominio IQ en la actividad elctrica del
canal. Para esto, usamos el cDNA de la subunidad 1A de humano a la que
mediante mutagnesis dirigida se le introdujo la mutacin leaner y que fue
generosamente proporcionado por el Dr. Terry Snutch (University of British
Columbia).
Como se mencion con anterioridad, la subunidad 1A del canal P/Q tiene en
su extremo carboxilo dominios de interaccin con protenas reguladoras del canal.
Una de las ms importantes es la calmodulina, una protena reguladora que participa
en una gran variedad de eventos fisiolgicos dependientes de calcio. Es una protena
de 148 aminocidos, capaz de unir 4 molculas de calcio de manera especfica, es
estructuralmente estable y flexible an bajo los cambios conformacionales inducidos
por el calcio y modula la actividad de una gran cantidad de protenas incluyendo
protenas cinasas, fosfodiesterasas, bombas de calcio, etc. Tanto la secuencia IQ
como el dominio CBD en el canal tipo P/Q son capaces de interaccionar con
calmodulina. As, considerando que la isoforma corta pierde el dominio CBD, result
de suma importancia tratar de establecer el papel modulador del dominio IQ mediado
por calmodulina sobre la actividad del canal.

30

HIPTESIS
La reduccin funcional observada en los canales de calcio tipo P/Q en el

modelo de epilepsia conocido como leaner podra deberse a cambios en los

mecanismos de regulacin de la protena que constituye el canal como resultado de
la alteracin en el dominio de interaccin con protenas moduladoras.

OBJETIVO GENERAL
Analizar las propiedades electrofisiolgicas de las mutaciones en el canal de

Ca+2 tipo P/Q utilizando como modelo la mutacin conocida como leaner corto, en un
sistema de expresin heterloga.

7.1

OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Estudiar la dependencia al voltaje de la corriente acarreada por Ca+2 a

travs del canal mutante tgla corto.

2.- Analizar el efecto de la corriente de Ca+2 evocada durante un prepulso
sobre la inactivacin del canal de calcio mutante.
3.- Evaluar la dependencia de voltaje de la inactivacin en estado estable
en el tgla corto.
4.- Comparar el grado de facilitacin asociado a la estimulacin con prepulsos
positivos usando Ca+2 como acarreador de corriente.

31

MATERIALES Y MTODOS
Las tcnicas y mtodos empleados son descritos en esta seccin. Todos los

reactivos utilizados tenan la calidad requerida para biologa molecular. Algunas

composiciones de soluciones especficas se describen en la metodologa general,
mientras que las soluciones amortiguadoras generales (buffer) se muestran en la
seccin de medios y soluciones.

8.1

VECTORES USADOS
Los constructos originales de cDNA usados a lo largo de este trabajo (1,

1tgla, 2 y

2A, fueron generosamente proporcionados por el Dr. T. Snutch

(University of British Columbia). Las diferentes secuencias de cDNA utilizadas se

encontraban insertadas en los siguientes vectores para su amplificacin y expresin
en el sistema de expresin heterloga.
pcDNA: es un vector de expresin eucaritica que puede ser cultivado en bacterias
E.Coli. Tiene un promotor de citomegalovirus para generar un alto nivel de
transcripcin de la secuencia insertada, una seal de poli-adenilacin, un sitio de
clonacin mltiple, un gen de resistencia a ampicilina y una secuencia de terminacin
de la transcripcin
pTracer: es un vector de expresin en clulas de mamferos que contiene la
secuencia de la Protena Verde Fluorescente (GFP), posee una secuencia de poliadenilacin, un gen de resistencia a zeocina y una secuencia de terminacin de la
transcripcin.

32

8.2

TCNICAS BACTERIOLGICAS

8.2.1 Cultivo y almacenamiento de bacterias E. coli

Las bacterias utilizadas para la amplificacin y la purificacin de los DNA
plasmdicos utilizados durante este trabajo fueron E. coli de la cepa DH5-. El cultivo
de estas bacterias se realiz en medio de Luria-Bertani (medio LB). Las bacterias se
crecieron en matraces de vidrio a 37C en agitacin constante a 225 rpm. El
antibitico de seleccin adicionado al medio LB dependi del cDNA a obtener, siendo
ampicilina (50g/ml) para las subunidades 1 (o 1tgla), 2 y 2A y zeocina (25
g/ml) para la protena verde fluorescente (GFP). Las cajas con agar slido se
prepararon usando medio LB adicionado con agar (15g/L). El medio se esteriliz
mediante calor hmedo a una temperatura de 121C y una presin de 15 libras por
pulgada cuadrada durante 20 minutos, posteriormente se adicion el antibitico
requerido que fue previamente esterilizado mediante un filtro de 0.22m. Una vez
obtenidas las colonias, las cajas con agar slido se mantuvieron a 4C para su
almacenamiento por perodos cortos (no mayor a 2 semanas).

8.2.2 Preparacin de las bacterias competentes

Para la preparacin de las clulas competentes se utilizaron las siguientes
soluciones: CaCl2 (50 mM) y CaCl2/Glicerol al 20 % (50 mM).
El procedimiento seguido fue el siguiente:
1.- Se inocularon 50 ml de medio LB con una sola colonia de bacterias E. coli de la
cepa DH5- y se incub toda la noche en agitacin constate a 225 rpm y 37C.
2.- Posteriormente se inocularon 200 ml de medio LB con 2 ml del cultivo anterior.
3.- Se tomaron 100 ml del medio anterior y se monitoreo el crecimiento bacteriano
hasta que alcanz una densidad ptica de 0.4 a una absorbancia de 600 nm.
4.- Una vez alcanzada la absorbancia indicada se transfiri el medio a tubos estriles
y se mantuvieron en hielo durante 25 min.
5.- Posteriormente el medio se centrifug a 3000 rpm por 5 min (4C) y se removi el
sobrenadante.
33

6.- Se resuspendi el pellet mediante agitacin suave con los 100 ml de medio
restantes del paso 2 y 50 ml de la solucin de CaCl2 50 mM.
7.- Se incub en hielo por 1 hora
8.- Posteriormente se centrifug a 2500 rpm

por 5 min (4C) y se removi el

sobrenadante.
9.- El pellet obtenido se resuspendi en 20 ml de la solucin de CaCl2/Glicerol 20%.
10. Finalmente se hicieron alcuotas de 0.5 ml

en crioviales estriles, que se

congelaron inmediatamente en una mezcla de hielo seco/etanol y as las bacterias

competentes se almacenaron a -70C.

8.2.3 Transformacin de las bacterias E. coli.

Los diferentes plsmidos de DNA empleados en el presente trabajo se
introdujeron en las bacterias competentes E. coli mediante una reaccin de shock
trmico a travs del siguiente procedimiento.
1.- Se adicionaron 10 a 15 ng del DNA requerido a 200l de bacterias competentes.
2.- Se incubaron en hielo por espacio de 30 min.
3.- Posteriormente se realiz un shock trmico a 42C por 40 seg.
4.- Se adicionaron 3 ml de medio LB y se incub a 37C por 60 min.
5.- Luego se centrifug a 14000 rpm por 1 min a temperatura ambiente.
6.- Se desech el sobrenadante y se resuspendi el pellet en el lquido remanente.
7.- Las bacterias se sembraron en las cajas con agar slido conteniendo el antibitico
de seleccin correspondiente y se incubaron a 37C durante toda la noche. Se
eligieron colonias completamente aisladas para su cultivo y posteriormente el DNA
se aisl mediante el procedimiento de Maxi-prep de QIAGEN.

8.3

Determinacin de la concentracin de DNA

La concentracin de los cDNA obtenidos se midieron mediante la tcnica de

espectrofotometra. Se utiliz la relacin de absorbancia 260/280 para determinar la

pureza de los cDNA, tomando un valor por arriba de 1.65, como indicador de que la
muestra se encontraba pura.
34

8.4

Aislamiento de DNA por Maxi-prep (QIAGEN)

Para obtener una produccin a gran escala (20g) de los distintos DNA

plasmdicos, se us un sistema de purificacin de plsmidos Maxi-prep (Qiagen)

siguiendo las instrucciones del fabricante:
1.- Una colonia de bacterias conteniendo el inserto requerido se cultiv en 3 ml de
medio LB en presencia del antibitico de seleccin requerido.
2.- 100ml de medio LB ms el antibitico de seleccin se inocularon con el medio
anterior y se incubaron a 37C durante toda la noche.
3.- Posteriormente se centrifug a 6000 rpm por 10 min, 4C y el paquete de clulas
se resuspendi en 10 ml del buffer P1 fro.
4.- Luego se adicionaron 10 ml del buffer de lisis P2 y se incub por 5 min a
temperatura ambiente.
5.- La solucin se neutraliz con 10 ml del buffer P3 y se incub en hielo durante 20
min.
6.- El componente lisado se centrifug a 12000 rpm por 30 min y 4C.
7.- El sobrenadante se decant en una columna de intercambio inico, que
previamente haba sido equilibrada con el buffer QBT (NaCl 750mM, MOPS 50mM,
pH 7.0, isopropanol 15%, Triton X-1000.15%)
8.- La columna se lav posteriormente 2 veces con 30 ml del buffer QC (NaCl 1M,
MOPS 50mM, pH 7.0, isopropanol 15%).
9.- El DNA se eluy con 15 ml del buffer QF (NaCl 1.25M, Tris-Cl 50mM, pH 8.5,
isopropanol 15%).
10.- El DNA se precipit con 10.5 ml de isopropanol y se centrifug a 12000 rpm por
20 min y 4C.
11.- El paquete de DNA se lav con etanol al 70% , se dej secar por espacio de 15
min y se resuspendi en agua desionizada estril para determinar su concentracin y
su posterior uso.

35

8.5

Sistema de expresin heterloga

Debido a que la mutacin leaner genera dos isoformas diferentes por edicin

alternativa en los canales de calcio tipo P/Q, se requiri de un sistema de expresin

que permiti evaluar de manera diferencial las propiedades electrofisiolgicas de la
isoforma corta (tgla) con respecto al canal de calcio tipo P/Q silvestre. Razn por la
que se decidi utilizar a la lnea celular HEK-293 como sistema de expresin
heterlogo, ya que esta no expresa canales de calcio tipo P/Q endgenos.

8.6

Cultivo de clulas HEK-293

Se logr el mantenimiento en el laboratorio de la lnea celular HEK-293

(obtenida de rin de humano en estado embrionario), como sistema de expresin

heterloga. Las clulas se mantuvieron en un medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM), enriquecido con suero bovino fetal (SBF) inactivado por calor al
10% y con antibitico penicilina-estreptomicina (50 U/ml), bajo una atmsfera de CO2
al 5% y a una temperatura de 37C. Para asegurar su continuidad se realizaron
resiembras peridicas al alcanzar un 70-80% de confluencia celular con una solucin
de tripsina 0.05%/EDTA 0.2% . El pasaje celular para preparar alcuotas de la
suspensin celular, se llev a cabo de manera similar excepto que las clulas se
transfirieron a una mezcla de SBF + DMSO al 10% y se mantuvo as un lote de
clulas congeladas a -70C.

8.7 Transfeccin de las clulas HEK-293 mediada por agregados

inorgnicos (fosfato de calcio)
12 horas previas a la transfeccin, las clulas se resembraron en cajas de
Petri de 35 mm a una confluencia aproximada del 20%. Se utiliz el mtodo de
fosfato de calcio (Okayama y Chen, 1990) para transfectar de manera transitoria las
clulas con el cDNA que codifica para cada una de las subunidades que conforman
el canal de calcio 1 (o 1 tgla), 2, 2A con 2 g de cada una para obtener una
relacin molar de 1:1:1. Como marcador para la identificacin visual, las clulas se
cotransfectaron con el vector pTracer que contiene la secuencia de la Protena Verde
36

Fluorescente (1 g) que emite luz verde al ser excitada en el rango de luz UV (

Cheng y cols., 1996) y para la reaccin general se emple el plsmido Bluescript
como acarreador de DNA (c.b.p 20g).
El procedimiento general para realizar el proceso de transfeccin fue el
siguiente:
Preparacin de la mezcla cDNA-fosfato de calcio:
1.- Se utilizaron en total 20 g de cDNA para transfectar 3x106 clulas, los cuales se
disolvieron en 220 l del buffer TE.
2.- Se adicionaron 250 l del buffer 2x HBS y se agit suavemente.
3.- Posteriormente se agregaron 30 l de CaCl2 2 M gota a gota y lentamente.
4.- La solucin con el cDNA se incub a temperatura ambiente por 30 min.

8.7.1 Transfeccin celular:

1.-La monocapa de clulas se lav una vez con el buffer PBS, para posteriormente
agregar medio DMEM sin suero e incubar por espacio de 30 min antes de la
transfeccin.
2.- Despus de los 30 min de incubacin se agreg la mezcla de cDNA-fosfato de
calcio gota a gota distribuyndola de manera uniforme en toda el rea de la caja de
Petri que contena la monocapa celular.
3.- Se incub a 37C/CO2 5% durante toda la noche.
4.- Tras la incubacin el medio se intercambi por medio completo (DMEM/SBF/PenEstrepto)
5.-Despus de 24 horas de haber sido realizada la transfeccin, las clulas se
resembraron en cubreobjetos de vidrio tratados previamente con polilisina (50g/ml),
donde se realizaron los registros electrofisiolgicos.

37

8.8

Anlisis electrofisiolgico
Los cDNA de las subunidades que codifican para el canal de calcio tipo P/Q

subclonados en los vectores pcDNA se transfectaron de manera transitoria en las

clulas HEK-293, en una relacin 1:1:1 usando el mtodo de fosfato de calcio. Los
cubreobjetos con las clulas transfectadas se montaron en una cmara de registro
sobre un microscopio invertido equipado con una lmpara de fluorescencia. Las
clulas se mantuvieron bajo un flujo de perfusin constante (1.5 ml/min) lo que
permiti el recambio de la solucin externa (Tris 140 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 1 mM,
Glucosa 10 mM a pH 7.4). Los registros se realizaron 24-72 horas despus de
haberse realizado la transfeccin, identificando como clulas positivas a la
incorporacin del cDNA exgeno aquellas que emitieron fluorescencia bajo luz UV.
El registro de las corrientes en la configuracin de clula completa se realiz
mediante el empleo del mtodo de fijacin de voltaje (Hamill y cols., 1981). Las
seales generadas por las corrientes se amplificaron mediante un amplificador
Axopatch 200B (Axon instruments, USA) y se adquirieron a travs de un convertidor
analgico digital de 16 bits (Axon instruments, USA) para su posterior anlisis. Los
electrodos de registro se fabricaron con capilares de borosilicato (Sutter BF150-86-10
0.86, 1.5 dimetros interno y externo respectivamente). La resistencia final de los
electrodos fue de 2.4M con la solucin interna (NMG 120mM, MgCl2 1mM, HEPES
60mM, EGTA 0.5mM, ATP-Mg 2mM a pH 7.2).
Las propiedades electrofisiolgicas de las corrientes producidas por los
canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto), se estudiaron a travs de los siguientes
protocolos experimentales: 1) La

relacin corriente voltaje (curva IV), se evalu

mediante la aplicacin de pulsos de voltaje de 800 ms a partir de un potencial de

mantenimiento de -100 mV, incrementando su amplitud cada 5 mV y evaluando un
rango de voltaje entre -50 y +45 mV. 2) La inactivacin dependiente de la magnitud
de la corriente durante un prepulso (inactivacin por prepulso), se estudi a travs de
la aplicacin de prepulsos de prueba breves (30 ms) a partir de un potencial de
mantenimiento de -100 mV; despus de un intervalo de 20 ms, se aplic un pulso de
prueba con duracin de 200 ms a un potencial de 0 mV. De esta forma se midi la
fraccin de corriente que puede evocarse por un segundo pulso, tomando en cuenta
38

que durante el prepulso la inactivacin es mnima. 3) Para analizar la inactivacin en

estado estable, se aplicaron prepulsos de voltaje de larga duracin (15 s) a partir de
un potencial de mantenimiento de -120 mV, incrementando su amplitud cada 10 mV
y explorando un rango de voltaje entre -120 y +70 mV; de esta manera se evalu la
magnitud de la corriente que evoc un pulso de prueba con duracin de 200 ms a
+10 mV, el cual fue aplicado inmediatamente despus del prepulso condicionante.
Maniobra experimental que permiti medir la disponibilidad de canales funcionales en
funcin del voltaje que produjo inactivacin. Finalmente, 4) la evaluacin de la
facilitacin por prepulsos positivos se realiz mediante un protocolo que consisti en
la aplicacin alternada de pulsos de prueba con duracin de 100 ms a +5mV,
precedidos o no por un prepulso con duracin de 50 ms a +150 mV. Esto permiti
medir la magnitud de la corriente evocada por el pulso de prueba generado en
ausencia de prepulso lo que se compar con el valor de la corriente evocada por el
pulso de prueba precedido por prepulsos positivos.
El anlisis estadstico de los resultados se llev a cabo con el programa de
computadora origin 6.0 (Microcal, USA).

La significancia estadstica de los

promedios de corriente se evalu mediante la prueba de t-Student, considerando

como significativo una p5%.
La relacin corriente-voltaje se analiz haciendo un ajuste con la ecuacin de
Boltzmann (I = {Gmax (Vm-Er) } {1/1 + exp[(Vm-Vh)/k]}), obteniendo de esta manera
los parmetros de dependencia de voltaje de la activacin del canal de calcio tipo
P/Q.
Donde:
I es la corriente normalizada
Vm es el potencial del pulso de prueba
Er es el valor extrapolado del potencial de inversin de la corriente.
Gmax es el valor mximo de la conductancia
Vh es el potencial al cual se alcanza el 50% de activacin.
k es el factor de Boltzmann (RT/zF) en mV.
Mientras que el porcentaje de inactivacin durante un pulso de prueba se
expres como la relacin entre la corriente al final del pulso de prueba denominada
39

como Ipedestal y la corriente mxima de denominada como Ipeak, los dos valores
se midieron en las corrientes que fueron evocadas por pulsos de voltaje en un rango
entre -50 y +45 mV y se expresaron como el cociente r= I pedestal/Ipeak.
Por otro lado, para la inactivacin en estado estable, una vez normalizada la
corriente esta se grafic en funcin del potencial del prepulso condicionante y se
ajust a una relacin de Boltzmann (I = { 1/[1 + exp(V Vh)/k]}).
Donde:
I es la corriente durante el pulso de prueba
V es el valor del potencial aplicado durante el prepulso
Vh es el potencial de membrana al cual el 50% de los canales estn
disponibles
k es el factor de Boltzmann.
Adems, para el anlisis de la inactivacin dependiente de la corriente durante
el prepulso, la corriente evocada durante cada pulso de prueba se normaliz y se
grafic en funcin del potencial aplicado durante el prepulso correspondiente; se
compar el rango de voltaje donde se observ la mxima inactivacin con el valor
correspondiente para la corriente mxima en la relacin corriente voltaje (curva IV).
Finalmente, la facilitacin por prepulso se calcul como el cociente de la
corriente evocada despus de un prepulso fuertemente despolarizante a +150mV
(I+PP) con respecto a la corriente evocada en ausencia del prepulso (I-PP). Se
graficaron los valores obtenidos en forma de histograma (I+PP/I-PP).

40

8.9

MEDIOS Y SOLUCIONES
Las soluciones utilizadas fueron esterilizadas mediante calor hmedo a

121C/15 PSI/20 min, a menos que se especifique otro mtodo de esterilizacin.

Medio LB: Tryptona 10%, Extracto de levadura 5%, NaCl 5%, Glucosa 1%. El medio
se adicion con antibitico cuando el protocolo lo requiri.
PBS 1X: NaCl 0.17M, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 8mM, KH2PO4 1.7 mM a pH 7.4.
TE 1X: (EDTA 0.1 Mm, Tris-HCl 1 mM pH8.0).
HBS 2X: NaCl 280 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1.5 mM, Dextrosa 12 mM, HEPES 50
mM pH 7.5.
CaCl2 2 M: Se disolvieron 14.7 g de CaCl2 en 100 ml de H20 desionizada.
P2: NaOH 200mM, Dodesil sulfato de sodio SDS 1% (peso/volumen)
P3: Acetato de potasio 3.1 M (pH 5.5)

41

RESULTADOS Y DISCUSIONES
El presente trabajo se centr en la caracterizacin funcional del canal de calcio

tipo P/Q de humano (1A) al que se le introdujo una mutacin en el extremo

carboxilo denominada como

leaner corto (tgla corto), mutacin que produce la

perdida del dominio de unin constitutiva a calmodulina (CBD), para evaluar sus
propiedades electrofisiolgicas y compararlas con las del canal silvestre.

9.1

Efecto de la mutacin tgla corto sobre la densidad de corriente

La figura 3 muestra que la expresin de la mutacin tgla corto en clulas

HEK293 no afecta de manera significativa (p>0.05) la densidad de corriente (pA/pF)

con respecto a la densidad de corriente generada por la transfeccin del canal
silvestre en el mismo tipo celular. Sin embargo, mientras que para el canal silvestre
se requirieron en promedio 30 horas despus de la transfeccin para alcanzar la
densidad de corriente observada, para el canal mutante en promedio fue necesario
mantener las clulas en incubacin por espacio de 55 horas despus de realizada la
transfeccin.

Lo anterior sugiere que al menos en el sistema de expresin

heterloga y bajo las condiciones de transfeccin empleadas, an cuando el canal

mutante tgla corto afecta el curso temporal de la expresin de la corriente, una vez
que el canal se encuentra en un estado activo la densidad de corriente tiene una
magnitud similar a la observada para el canal silvestre.

42

28
24

n = (4 )
3 0 h rs p o s t-tra n s fe c c i n

pA/pF

20

n = (6 )
5 5 h rs p o s t-tra n s fe c c i n

16
12
8
4
0

la

tg -c o r to + 2 A + 2

1A +2A +2

Figura 3.- Densidad de corriente (DC) expresada en pA/pF cuando se expresaron los canales de
calcio tipo P/Q en clulas HEK293. Canal silvestre (1A humano) coexpresado con las subunidades
auxiliares 2A y 2, con una DC promedio de 16 pA/pF (n=4) (
). Canal mutante tgla corto
coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2, con una DC promedio de 12 pA/pF
(n=6) ( ).

9.2
Caracterizacin de la curva corriente-voltaje del tgla corto cuando la
corriente es acarreada por Ca+2
En la figura 4B se pueden apreciar los trazos representativos de las corrientes
obtenidas a travs del canal silvestre y la mutacin tgla corto, cuando el in
acarreador es calcio (ICa); donde a simple vista se observa que hay diferencias
importantes en cuanto a la cintica de inactivacin en ambos canales, los trazos en
las corrientes obtenidas sugieren que la cintica de inactivacin de las corrientes
obtenidas para el tgla corto (coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2)
es mas lenta que la observada en los trazos de corrientes obtenidos para el canal
silvestre coexpresado con las mismas subunidades accesorias. La curva IV (figura
4A) se obtuvo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la misma
figura. As, los resultados arrojaron que la dependencia al voltaje de la activacin no
se ve afectada de manera significativa (p>0.05) en el tgla corto respecto al canal
43

silvestre. El ajuste a la curva hecho con la ecuacin de Boltzmann, mostr que

mientras el potencial al cual se alcanz el 50% de la activacin (Vh) para el tgla corto
result ser de -13.710.68 mV para el canal silvestre fue de -14.490.67 mV. As, los
resultados permiten sugerir que los cambios generados en la regin carboxilo del
canal de calcio tipo P/Q, como consecuencia de la mutacin tgla corto no muestra
incidencia sobre los mecanismos de activacin dependientes de voltaje que
participan en este tipo te canal. De tal forma que los resultados en cuanto a la
dependencia de activacin obtenidos durante el presente trabajo, concuerdan con los
datos reportados por Lorenzon y cols. (1998) para neuronas de Purkinje del ratn
mutante leaner.

A
1A humano n=5

Vm

la

tg corto n=6

0.0
-60

-40

-20

20

40

1A humano

1A humano

60

Corriente Normalizada

-0.2

50 pA
-0.4

100 ms

-0.6

tgla Corto

-0.8

-1.0

+45
-50
-100mV

50 pA

800 ms

100 ms

Figura 4.- Inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A se
aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuacin de Boltzmann (ver materiales y mtodos) para el
canal silvestre coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2 ( ) y para el canal
mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2 (
) . En el panel B se
observan trazos representativos de las corrientes obtenidas a travs de los canales silvestre (trazo
superior) y tgla corto (trazo inferior).

44

9.3

Efectos sobre la cintica de inactivacin producidas por el tgla corto

Las cinticas de inactivacin de las corrientes acarreadas por calcio a travs

del canal de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) tambin fueron estudiadas y los
resultados obtenidos se muestran en la figura 5.
El curso temporal de la inactivacin de la ICa a travs del canal de calcio 1A
(figura 5A) requiri de un ajuste biexponencial (fast, slow), mientras que la ICa a travs
del canal de calcio tgla corto ( figura 5B) se ajust a una sola exponencial (slow).
Estos resultados sugieren que las alteraciones generadas por la mutacin tgla corto
en el canal de calcio tipo P/Q producen: 1.- La perdida de la fast observada en el
canal silvestre que se encuentra en el orden de los 30 ms y 2.- una reduccin
significativa (p<0.05) en la constante de inactivacin lenta (slow en el orden de
500ms) comparada con la que se obtuvo para el canal silvestre (slow en el orden de
los 300 ms). Estos resultados, son por dems interesante debido a que la mutacin
afecta una regin estructural (dominio CBD) que ha sido asociado por algunos
autores como parte importante del proceso de regulacin de la inactivacin
dependiente de ICa del canal de calcio tipo P/Q (DeMara y cols., 2001).

45

B
1A humano + 2A + 2
n=5

190

1A humano + 2A + 2
n=5
tgla corto + 2A + 2
n=4

800

170
700

130

600

le n ta (m s )

r p id a(m s )

150

110
90
70

500

400

50
30

300

10
-10

-5

10

15

20

25

30

35

-10

Potencial de membrama (mV)

10

20

30

Potencial de membrama (mV)

Figura 5.- Constantes de inactivacin de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a
partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con
incrementos de 5 mV y con una duracin del pulso de prueba igual a 800 ms. El canal mutante tgla
corto coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2 tuvo un ajuste monoexponencial (panel
B
), dando lugar a una solo constante de inactivacin lenta (lenta) (n=4). El canal silvestre (1A)
coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2 a diferencia del canal mutante tuvo un ajuste
biexponencial generando dos constantes de inactivacin: una rpida (rpida) (Panel A
) y otra
) (n=5).
constante lenta (lenta) (Panel B

9.4
Efecto de la mutacin tgla corto sobre el grado de inactivacin en funcin
del potencial
En la figura 6 se muestra el grado de inactivacin en funcin del potencial,
medido como el cociente de la corriente al pico respecto a la corriente al final del
pulso (ver inserto de la figura 6) cuando el rango de voltaje analizado fue entre 0 y
+40 mV. La mutacin tgla corto mostr un grado de inactivacin menor que el
observado para el canal silvestre. Para el tgla corto se observ el grado mximo de
inactivacin a un potencial de +20 mV, siendo este cercano al 30% (figura 6B),
mientras que para el canal silvestre se observ tambin el mximo grado de
inactivacin al mismo voltaje pero con un porcentaje de inactivacin cercano al 80%
(figura 6A). Estos resultados sugieren que la mutacin tgla corto tiene un efecto
importante sobre el mecanismo de inactivacin bajo estas condiciones, ya que el
46

grado de inactivacin fue significativamente diferente (p<0.05) con respecto a los

resultados obtenidos para el canal silvestre. Aspecto que tambin soporta la idea de
que la alteracin producida en el extremo carboxilo del canal de calcio tipo P/Q,
como resultado del ensamblaje alternativo de la mutacin leaner que da lugar a la
isoforma corta, afecta los mecanismos que permiten al canal pasar a un estado
inactivo.

r = Iped / Ipeak

1A+2A+2 (n=4)

la

tg corto+2A+2 (n=6)
1.0

r=Iped/Ipeak

r=Iped/Ipeak

1.0
0.8
0.6
0.4

0.8

0.6

0.2
-10

10

20

30

40

50

60

Pulso (mV)

-10

10

20

30

40

50

60

Pulso (mV)

Figura 6.- El grado de inactivacin en funcin del potencial para los canales de calcio tipo
P/Q (tgla corto y 1A) se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak (ver inserto) de la corriente evocada por
pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos de 5 mV a partir de un
potencial de mantenimiento de -100Mv. En el panel A (
) se aprecia que el grado de inactivacin
mximo para el canal silvestre (1A) coexpresado con las subunidades accesorias 2A y 2 es
mucho mayor (cercano al 80%), mientras que en el panel B (
) se aprecia que el canal mutante tgla
corto coexpresado con las mismas subunidades 2A y 2 mostr una reduccin considerable en el
grado de inactivacin mxima en funcin del potencial (cercano al 30%).

9.5
Efectos en la entrada previa de calcio sobre la inactivacin de la
corriente en la mutacin tgla corto
En la figura 7 se muestran los resultados al evaluar el efecto de la entrada
previa de calcio sobre la inactivacin de la corriente acarreada por este in a travs
del canal mutante tgla corto y su comparacin con el canal silvestre (el protocolo de
pulsos seguido se muestra en el inserto de la figura). En la figura 7A se pueden
47

observar trazos representativos del efecto producido por la entrada previa de calcio
tanto para el tgla corto como para el canal silvestre. En los trazos de corriente del
pulso de prueba se marcan los voltajes que corresponden al prepulso condicionante.
De tal modo que puede apreciarse que al valor del prepulso (0 mV) donde se
produce la mayor entrada previa de calcio, existe una reduccin en la corriente
evocada por el pulso de prueba, respecto a la corriente obtenida por el pulso de
prueba cuando el prepulso condicionante (-40 mV) no genera una entrada previa de
calcio significativa; lo anterior, se visualiz tanto para el tgla corto (figura 7A inferior)
como para el canal silvestre (figura 7A superior). Por otro lado, en la figura 7B se
muestran los resultados obtenidos tras graficar la corriente normalizada que se
gener durante el pulso de prueba en funcin del potencial durante el prepulso
condicionante. As, para el canal silvestre (figura 7B superior) se pudo observar que
existe una correlacin directa en la reduccin de corriente en funcin de la entrada
previa de calcio, lo que gener una forma de U invertida de la curva corriente voltaje
(figura 4A).

De tal modo que a un

condicionante igual a 0 mV,

valor del potencial durante el prepulso

se obtuvo el grado mximo en la reduccin de la

corriente evocada durante el pulso de prueba, lo que se correlaciona con el rango de

voltaje (aproximadamente 0 mV) en el que para la curva IV se observa el pico
mximo de corriente (ver figura 4). Sin embargo, para la mutacin tgla corto se obtuvo
una variacin significativa con respecto a lo observado en el canal silvestre. Los
resultados obtenidos para el tgla corto sugieren que para un rango de voltaje entre 50 y +25 mV existe una poblacin de canales inactivados a los que la entrada previa
de calcio parece no afectarles y no es sino hasta que se genera una acumulacin de
calcio intracelular, que el canal mutante muestra inactivacin (potenciales mas
positivos que 25 mV) (7B inferior).

48

-0.60

1A + 2A+2

Corriente normalizada

1A + 2A

-0.65
-0.70
-0.75
-0.80
-0.85

0mV

-0.90

-40mV

-0.95
-1.00

100pA

-40

50ms

la

Corriente normalizada

-40mV

0mV

20

40

60

-0.6

0mV

+100
-40
-100mV

V prepulso

tg Corto

30 ms 200ms

-20

tgla corto+2A+2
-0.7

-0.8

-0.9

-1.0

-50

50pA

50

100

V prepulso

50ms

20ms

Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de
prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura). En el panel A se puede
observar que tanto para el canal silvestre (superior) como para el canal mutante tgla corto (inferior)
existe una reduccin en la corriente acarreada por calcio (trazos rojos) cuando hay una entrada previa
de calcio en comparacin con la corriente evocada por el pulso de prueba sin entrada previa de calcio
(trazos negros). En el panel B se muestra la corriente normalizada generada por el pulso de prueba en
funcin del voltaje correspondiente durante el prepulso condicionante. Para el canal silvestre ( ) se
observ que la fraccin mxima de inactivacin corresponde al rango de voltaje en que se obtuvo el
pico mximo de corriente durante la curva IV (ver figura 4). Sin embargo, el canal mutante tgla corto
( ) presenta un valor sostenido en el grado de inactivacin en un rango de voltaje de -50 a +25 mV,
disminuyendo el grado de inactivacin en la ICa a voltajes del prepulso mas positivos.

9.6
Efecto de la mutacin tgla corto sobre la inactivacin en estado estable
del canal de calcio tipo P/Q
La inactivacin en estado estable del canal de calcio tipo P/Q se evalu a
travs de un protocolo de doble pulso (ver inserto figura 8). A partir de las curvas de
inactivacin en estado estable tanto para el canal mutante como el silvestre (1A), se
hizo el anlisis de los resultados obtenidos ajustando a una ecuacin de Boltzmann
(ver materiales y mtodos), y este indic que no existe una diferencia significativa
(p0.05) en el potencial al cual se alcanza el 50% de inactivacin del canal, siendo
Vh=-33.610.71 para el canal silvestre y Vh=-33.130.5 para la mutacin tgla corto;
49

150

adems, el factor de Boltzmann (k) result ser similar para ambos canales (tgla corto
=5.050.5 y 1A =6.50.6). Los resultados permiten sugerir que los cambios
generados por la mutacin tgla corto en el extremo carboxilo no parecen alterar la
dependencia al voltaje durante el proceso de inactivacin del canal cuando se utiliza
calcio como in acarreador.

Corriente normalizada

1.0

0.8

1A (n=8)
Vh = -33.61 0.71
K = 6.5 0.6

0.6

tgla corto (n=7)

Vh = -33.13 0.54
K = 5.05 0.5

0.4

0.2

0.0
-100

+70mV

-50

50

Potencial prepulso (mV)

10 mv

200ms

Figura 8.- Para determinar la inactivacin en estado estable para el canal de calcio tipo P/Q
(1A y tgla corto), se llev a cabo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto de la figura. Las curvas
)
de inactivacin en estado estable para el canal silvestre (1A) (
) y el canal mutante tgla corto (
se obtuvieron graficando la corriente (normalizada) que se evoc durante el pulso de prueba en
funcin del valor de potencial aplicado durante el prepulso condicionante, ajustando a una relacin de
Boltzmann (ver materiales y mtodos). La grfica muestra que no existe una diferencia significativa
(p0.05) en la inactivacin en estado estable del canal mutante (Vh=-33.130.5) comparada con el
canal silvestre siendo (Vh=-33.610.71).

50

9.7
Efecto de la facilitacin en la corriente de calcio mediada por un prepulso
fuertemente despolarizante de muy breve duracin.
En la figura 9A se puede observar un trazo representativo del efecto de la
facilitacin en la corriente a travs del canal mutante tgla corto cuando se utiliz calcio
como in acarreador

de la corriente (el protocolo de pulsos que se emple se

muestra en el inserto de la figura 9). As, en la figura 9A se puede apreciar que la

magnitud de la corriente evocada por un pulso de prueba fue diferente dependiendo
de la presencia o ausencia de un prepulso fuertemente despolarizante de muy breve
duracin (150mV/50ms). De tal forma que la magnitud de la corriente evocada por el
pulso de prueba fue significativamente mayor (p0.05) cuando fue precedido por un
prepulso despolarizante (+PP), en comparacin con la magnitud de corriente
evocada por el pulso de prueba que no fue precedido por un prepulso despolarizante.
La facilitacin por prepulso ha sido reportada como un mecanismo que ocurre
mediante la disociacin del complejo de la protena G del sitio de unin
correspondiente

en los canales de calcio dependientes de voltaje y que

la

recuperacin de la facilitacin est mediada por la religacin del complejo a su sitio

de unin en el canal (Zamponi, 1998). Sin embargo, de suma importancia resulta
hacer notar que los cambios producidos por la mutacin tgla corto adems de
conducir a la perdida del sitio de unin constitutiva a calmodulina, tambin elimina el
sitio de unin al complejo de protenas G. As, estos resultados estn en
concordancia con los datos reportados por el grupo de Amy Lee (2000) en el sentido
de que la inactivacin de canales de calcio tipo P/Q puede recuperarse mediante la
aplicacin de trenes de pulsos previos que permiten la acumulacin de calcio
intracelular, proceso que se encuentra asociado al complejo Ca+2/Calmodulina es
decir, que es un evento independiente del papel que juega el sitio de unin a
protenas G situado en el extremo carboxilo del canal.

51

(n=9)

1.4
(n=8)

100 pA

- PP

20 ms

I+PP / I-PP

1.2
1.0
0.8
0.6
0.4

+ PP

0.2
0.0

1A

la

tg corto

150mV
5mV
-100mV

50ms

100ms

Figura 9.- La evaluacin de la facilitacin de la ICa por prepulso para el canal mutante tgla
corto y el canal silvestre (1A) se llev a cabo siguiendo el protocolo de pulsos mostrado en el inserto
de la figura. El grado de facilitacin medido como el cociente de la corriente obtenida despus de un
prepulso a -150 mV con respecto a la evocada en ausencia de prepulso (I+pp/I-pp), result ser
significativamente mayor (p<0.05) para el canal mutante tgla corto (rayado color rojo) en comparacin
al resultado obtenido para el canal silvestre (rayado color negro).

52

10

CONCLUSIONES
La subunidad 1A da lugar a la formacin del canal de calcio tipo P/Q, que

tiene un alto nivel de expresin en clulas granulares y

en clulas de Purkinje

(Westenbroek y cols., 1995). Por lo que dada su distribucin celular as como las
interacciones fisiolgicas con protenas de la membrana presinptica, sealan que
los canales de calcio tipo P/Q tienen un papel relevante en los mecanismos
reguladores de los procesos sinpticos; es decir, influyen de manera directa en la
liberacin de neurotransmisores (Sutton y cols., 1999).
La mutacin leaner en el canal de calcio tipo P/Q genera una isoforma
denominada como tgla corto, provocando cambios estructurales en la regin carboxilo
del canal que conducen a la perdida de sitios que permiten la interaccin con
protenas reguladores como: el dominio de unin a calmodulina (Lee y cols, 1998) y
el dominio de interaccin con protenas G (Furuwaka y cols, 1999). Dicha mutacin
se encuentra estrechamente asociada a algunas alteraciones neurolgicas en
humanos, como la migraa hemipljica familiar y la ataxia espino cerebelar tipo 2
(Zhchenko y cols., 1997).
As, para llevar a cabo este trabajo consideramos que dada la gran
importancia que tienen los canales de calcio en la regulacin de procesos fisiolgicos
implicados en la regulacin neuronal, resulta indispensable tratar de establecer la
interrelacin causa-efecto entre la mutacin tgla corto y las alteraciones neurolgicas
observadas. Si bien, lo ideal es estudiar la alteracin en un contexto lo ms cercano
a lo fisiolgico posible, tambin es cierto que la relacin que existe entre la mutacin
y el fenotipo clnico observado involucra procesos de sealizacin por calcio
sumamente complejos. De tal forma que es necesario estudiar las propiedades
electrofisiolgicas y la modulacin del canal mutante bajo condiciones estrictamente
controladas, por lo que el uso de un sistema de expresin heterolga como modelo in
vitro es el punto de partida inicial que contribuir de manera determinante en la
comprensin

de la posible participacin de la mutacin en la alteracin de la

excitabilidad neuronal, as como en la secrecin de neurotransmisores relacionadas

a procesos neurodegenerativos.

53

La elevacin intracelular de Ca+2 mediada por la apertura del canal de calcio

tipo P/Q, es capaz de inhibir la entrada de Ca+2. Este proceso denominado como
inactivacin mediada por calcio, representa un mecanismo importante de
retroalimentacin que contribuye a la aceleracin en la inactivacin del canal.
En la regin carboxilo de la subunidad 1A se localiza una secuencia de
aminocidos llamada dominio IQ, que tiene la peculiaridad de ser capaz de
interaccionar con calmodulina, una protena sensible a calcio. As, el complejo
Ca+2/calmodulina interacta con el dominio IQ a travs de un mecanismo sensible a
los niveles de calcio promoviendo la inactivacin del canal (Lee y cols., 1999). Sin
embargo, dicho mecanismo dista mucho de ser completamente conocido.
En el presente trabajo, se utiliz el canal de calcio tipo P/Q de humano (1A
humano) al que mediante tcnicas de mutagnesis dirigida se le introdujo la
mutacin leaner (tgla corto) y el cual fue comparado con la protena silvestre. Las
protenas que conforman el poro se coexpresaron con las subunidades accesorias
2A y 2 en las clulas HEK 293. Dichas coexpresiones permitieron realizar el
anlisis electrofisiolgico de los canales mencionados, en un intento por tratar de
comprender las posibles alteraciones en los mecanismos de inactivacin por calcio
generadas por los cambios promovidos en la regin carboxilo del canal por la
mutacin tgla corto; para ello, se utiliz la tcnica de patch clamp en su configuracin
de clula completa.
La coexpresin de las subunidades 1 de tgla corto+2A+2 no mostr
cambios significativos en la dependencia al voltaje de la activacin cuando el in
acarreador es calcio respecto al canal silvestre coexpresado bajo las mismas
condiciones experimentales. Estos resultados coinciden con los datos reportados
por los grupos de Lorenzon (1998) y Dove (1998) en experimento realizados en
clulas de Purkinje del ratn mutante leaner.
La

densidad

de

corriente

expresada

en

pA/pF

no

mostr

valores

significativamente diferentes, a diferencia de los datos reportados por Lorenzon y

cols. (1998) que manifiestan existe una reduccin significativa en la densidad de
corrientes en neuronas de Purkinje del ratn leaner. Sin embargo, se debe destacar
en principio, que los modelos experimentales son completamente diferentes,
54

mientras en este trabajo se emple un sistema de expresin heterolga que permiti

controlar el estudio de una sola isoforma mutada (tgla corto), ellos utilizaron clulas
nativas del animal mutante donde se desconoce cual es la contribucin y el efecto
funcional de las dos isoformas generadas por la mutacin leaner. Estos resultados
sugieren que los cambios generados en el extremo carboxilo en el tgla corto no
interfieren en la densidad de corriente expresada a travs del canal de calcio tipo P/Q
mutado.
El anlisis estadstico de los registros obtenidos para la inactivacin en estado
estable tanto para el canal mutante (tgla corto) como para el canal silvestre no mostr
una diferencia significativa. Resultados que tambin se encuentran en concordancia
con lo reportado en clulas nativas del ratn mutante leaner

(Lorenzon y cols.,

1998).
Por otro lado, los registros obtenidos bajo la configuracin de clula completa
sugieren que la mutacin

tgla corto promueve la prdida de un componente de

inactivacin rpido, observado en el canal silvestre. El canal mutante tgla corto

mostr solo una cintica de inactivacin lenta, que incluso fue significativamente
diferente de la constante de inactivacin homloga obtenida para el canal silvestre.
Resultados que sugieren la posible participacin de un mecanismo de inactivacin
mediado por el complejo Ca+2/Calmodulina a travs del sitio de unin constitutiva a
calmodulina (CBD), que ha sido asociada a la inactivacin por calcio en canales de
calcio dependientes de voltaje (Zlkhe y cols., 1999 y Lee y cols., 1999).
Adems de la prdida de un componente de inactivacin lenta, los resultados
generados de este trabajo indican que la mutacin tgla corto disminuye de manera
significativa el grado de inactivacin del canal en funcin del potencial de membrana
respecto al canal silvestre, lo que de alguna manera soporta la idea de que los
cambios generados por la perdida del dominio CBD como consecuencia de la
mutacin tienen una participacin importante en los cambios observados en los
mecanismo de inactivacin del canal.
Otro de los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigacin,
resultado de graficar los datos generados durante el protocolo de inactivacin por
prepulsos evocaron una forma de U invertida, que se asocia a la existencia de un
55

mecanismo de inactivacin dependiente del nivel de entrada previo de calcio. Sin

embargo, la mutacin tgla corto perdi esta forma caracterstica, sugiriendo que en un
rango de -50 a +25 mV existe una poblacin de canales en estado inactivo (meseta
en la figura 7 panel B inferior) y por otro lado, se observa que no es hasta que se
produce una acumulacin de calcio en el lado citoplasmtico que el canal muestra
regulacin por la entrada previa de calcio.
La facilitacin por prepulsos es un fenmeno en el cual un prepulso
fuertemente despolarizante seguido de un pulso de prueba a un potencial dado
induce un cambio conformacional en los canales de calcio dependientes de voltaje, lo
que permite un incremento en su probabilidad de apertura. Este fenmeno ha sido
asociado a la disociacin de protenas G de su sitio de unin en la regin carboxilo
del canal (Aparna, 2005). Sin embargo, la mutacin tgla corto genera la perdida del
sitio de interaccin con protenas G adems del dominio CBD. De manera
sorprendente los resultados obtenidos durante este trabajo sealan que la mutacin
tgla corto muestra un incremento significativo en la fraccin de corriente mediada por
calcio en comparacin a la facilitacin observada en el canal silvestre. Lo anterior
sugiere que probablemente el mecanismo que promueve este incremento en la
magnitud de corriente evocada por un pulso de prueba precedido por un prepulso
despolarizante, recae en la secuencia de aminocidos que codifica para el dominio
IQ y que es regulado por el complejo Ca+2/Calmodulina.
As, los resultados obtenidos con el presente trabajo de investigacin
muestran que la mutacin tgla corto:
a) modifica la cintica de inactivacin dependiente de calcio.
b) altera la fraccin de canales que inactiva en funcin del potencial de membrana.
c) la acumulacin de calcio intracelular promueve cambios conformacionales en la
regin carboxilo de la protena, lo que da como resultado alteraciones en los
mecanismos de retroalimentacin que intervienen en la inactivacin del canal.
d) el dominio isoleucina glutamina parece estar involucrado en un fenmeno de
facilitacin de la corriente de calcio que normalmente es asociado a la interaccin
con protenas G.

56

De tal modo que estas observaciones, soportan la hiptesis de que la

reduccin funcional observada en el canal de calcio tipo P/Q del modelo leaner se
debe a cambios en los mecanismos de regulacin de la protena que constituye el
canal, como resultado de la alteracin en el dominio de interaccin con protenas
moduladoras.

57

11

PERSPECTIVAS
Los resultados obtenidos de este trabajo, muestran que la alteracin en el

extremo carboxilo de la protena 1 perfila un largo camino para tratar de entender

cuales son los mecanismos que participan en la modulacin del canal tipo P/Q, que
comparativamente al resto de los canales de calcio dependientes de voltaje se
encuentran en menor grado dilucidados; siendo la mutacin leaner un modelo idneo
para este fin.
La mutacin leaner da lugar a la formacin de dos isoformas distintas: una
corta que pierde el dominio CBD y otra larga que incluye una secuencia normalmente
no transcrita (Fletcher, 1996). El proyecto se centr bsicamente en la evaluacin de
las consecuencias primarias de la mutacin tgla corto en base a que experimentos
previos de nuestro laboratorio mostraron que la mutacin tgla largo tiene un
comportamiento similar al del canal silvestre (datos no mostrados). Sin embargo,
resulta imprescindible llevar a cabo una reevaluacin a nivel electrofisiolgico de las
consecuencias primarias de la mutacin tgla largo y posteriormente disear
experimentos que permitan manipular la presencia de protenas reguladoras como
son la calmodulina y protenas G, con el fin de tratar de explicar de manera certera
cual es la participacin que tienen en la regulacin del canal.
En particular los resultados obtenidos, muestran que el dominio IQ parece
tener influencia en el proceso de facilitacin por prepulsos; aspecto que resulta por
dems interesante, debido a que la recuperacin de la inactivacin puede ser un
proceso determinante para la entrada de calcio al citoplasma celular y la liberacin
de neurotransmisores en las sinapsis (Forsythe y cols., 1998). Por lo que a futuro
resultara de gran importancia, evaluar el papel que juega la calmodulina y
variaciones de esta que inhiben su unin a calcio (calmodulinas mutantes), lo que
contribuira muy probablemente al esclarecimiento de los mecanismos que permiten
al complejo Ca+2/Calmodulina participar de manera diferencial en dos proceso tan
importantes como son la inactivacin y la facilitacin del canal de calcio tipo P/Q
(DeMara y cols., 2001).
En forma anexa se presentan algunas figuras de resultados preliminares
utilizando calmodulina mutante 1,2,3,4 (CAM4), una
58

protena

que pierde la

capacidad de unin a Ca+2 en sus 4 dominios. Estos datos no son concluyentes, la

idea a futuro es llevar a cabo los mismo protocolos que en el trabajo de tesis,
aumentar el nmero de muestras y complementar los resultados bajo condiciones de
sobreexpresin con calmodulina silvestre.

59

11.1 ANEXO
(FIGURAS DE DATOS PRELIMINARES)

Efecto de la CAM4 sobre la dependencia

al voltaje de la activacion
A

B
n=10
1A + CAM4
la
tg corto + CAM4 n=2

Vm
0.0
-40

-20

20

40

60

-0.2

Corriente Normalizada

-60

1A humano + CAM4

50 pA
100 ms

-0.4

-0.6
la

tg Corto + CAM4

-0.8

-1.0

+45
-50
-100mV

100 pA
100 ms

800 ms

Figura 1.- EI inserto muestra el protocolo de pulsos utilizado para obtener la curva IV. En el panel A
se aprecian las curvas IV ajustadas con la ecuacin de Boltzmann (ver materiales y mtodos) para el
canal silvestre coexpresado con la protena mutante CAM4 adems de las subunidades accesorias
2A y 2 ( ) y para el canal mutante tgla corto coexpresado con las subunidades accesorias 2A y
2 y la protena mutante CAM4 ( ) . En el panel B se observan trazos representativos de las
corrientes obtenidas a travs de los canales silvestre (trazo superior) y tgla corto (trazo inferior) bajo
las mismas condiciones experimentales.

60

Efecto de la CAM 4 sobre el curso temporal de la inactivacin

en funcin del potencial de membrana
1A + CAM4 n=8
tgla corto + CAM4 n=2

1000
900
800

(ms)

700
600
500
400
300
200
100
-10

10

20

30

Potencial de membrana (mV)

Figura 2.- Constantes de inactivacin de los canales de calcio tipo P/Q (1A y tgla corto) analizadas a
partir de un potencial de mantenimiento de -100Mv en un rango de voltaje de -10 a +40 mV con
incrementos de 5 mV y con una duracin del pulso de prueba igual a 800 ms. Tanto el canal mutante
tgla corto (n=2) ( ) como el canal silvestre (n=8) (
) coexpresado con las subunidades accesorias
2A y 2 y la CAM4 tuvieron un ajuste monoexponencial, dando lugar a una sola constante de
inactivacin () .

61

En el canal silvestre la sobreexpresin de CAM4 no afecta

el grado de inactivacin en funcin del potencial de membrana
1A
n=4
1A + CAM4 n=4

1.0
0.9

r=Iped/Ipeak

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0

10

20

30

40

Potencial de membrana (mV)

Figura 3.- El grado de inactivacin en funcin del potencial para el canal de calcio tipo P/Q
silvestre (1A) con ( ) y sin ( ) la sobreexpresin de CAM4 se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de
la corriente evocada por pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 Mv con incrementos
de 5 mV partiendo de un potencial de mantenimiento igual a -100mV. En la figura se aprecia que la
sobreexpresin de calmodulina mutante no afecta de manera significativa (p<0.05) el grado de
inactivacin del canal silvestre.

62

En el tgla corto, el porcentaje de inactivacin en funcin del potencial

se modifica con la sobreexpresin de calmodulina mutante
la

tg Corto
n=3
la
tg Corto + Cam4 n=4

1.0

r= Iped/Ipeak

0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0

10

20

30

40

Potencial de membrana (mV)

Figura 6.- El grado de inactivacin en funcin del potencial para el canal de calcio tipo P/Q
mutante denominado como tgla corto se obtuvo del cociente r=Iped/Ipeak de la corriente evocada por
pulsos de prueba en un rango de voltaje entre 0 y +40 mV con incrementos de 5 mV a partir de un
potencial de mantenimiento de -100mV. La figura muestra que la coexpresin del mutante tgla corto
con CAM4 (
) disminuye de manera significativa (p<0.05) el grado de inactivacin en funcin del
potencial con respecto al canal silvestre (
) expresado bajo las mismas condiciones.

63

INACTIVACIN POR PREPULSO: Efectos de la entrada previa de

calcio sobre la inactivacin de la ICa en el canal mutante tgla corto

-0.6

-0.60

tgla corto+2A+2

tglacorto + CAM4

Corriente normalizada

-0.65

-0.7

Corriente normalizada

-0.70
-0.75
-0.80
-0.85
-0.90
-0.95
-1.00
-1.05
-60

-40

-20

20

40

60

80

100

-0.8

-0.9

-1.0

120

-50

V prepulso

50

100

150

V prepulso

30 ms 200ms
+100
0mV
-40
-100mV
20ms

Figura 7.- Consecuencias de la entrada previa de calcio sobre la ICa evocada por un pulso de
prueba posterior a esta (ver protocolo de pulsos en el inserto de la figura. La figura muestra la
corriente normalizada generada por el pulso de prueba en funcin del voltaje correspondiente al
prepulso condicionante. Los resultados sugieren que la coexpresin del canal mutante tgla corto con
la CAM4 (
) no presenta un cambio significativamente diferente (p>0.05) en la inactivacin por
prepulso comparada con la expresin del tgla corto sin CAM4 ( ). Ambos canales presentan un valor
sostenido en el grado de inactivacin en un rango de voltaje de -50 a +25 mV, disminuyendo el grado
de inactivacin en la ICa a voltajes del prepulso ms positivos.

64

12

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Angelotti T & Hofmann F (1996) Tissue-specific expression of splice variants of the

mouse voltage-gated calcium channel 2 subunit. FEBS Letters 397:331-337
Aparna Nirdosh & Geral Zamponi (2005) Determinants of G protein inhibition of
presynaptic calcium channels. Kluwer Academic (1):154-167
Artalejo, C. R., Adams, E. M. & Fox, A. P. (1994) Three types of Ca+2 channels
trigger secretion with different efficacies in chromafin cells., Nature (367):72-76
Bahler M. & A. Rhoads (2002) Calmodulin signaling via the IQ motif, FEBS Letters
513:107.
Bangalore R, Mehrke G, Gingrich K, Hofmann F & Kass RS (1996). Influence of Ltype Ca+2 channel 2/-subunit on ionic and gating current in transiently transfected
HEK 293 cells. Am J Physiol 270:H1521-H1528
Barclay, J., Balaguero, N., Mione, M., Ackerman, S. L., Letts, V. A., Brodbeck, J.,
Canti, C., Meir, A., Page, K. M., Kusumi, K., PerezReyes, E., Lander, E. S., Frankel,
W. N., Gardiner, R. M., Dolphin, A. C. & Rees, M. (2001) Ducky mouse phenotype of
epilepsy and ataxia is associated with mutations in the Cacna2d2 gene and
decreased calcium channel current in cerebellar Purkinje cells. Journal of
Neuroscience 21:6095-6104.
Bean B.P. (1989) Neurotransmitter inhibition of neuronal calcium currents by changes
in channel voltage dependence. Nature 340:153-156.
Berridge, M. J., Lipp P & Bootman, M. D. (2000) The versality and universality of
calcium signalling. Nature Reviews 1:11-21
Bers, D. M. (1991) Excitation-contraction and cardiac contractile force. Kluwer
Academic, Dordrecht 234-243
Bourinet
E.,
Soong
T.W.,
Stea
A
&
Terry
P.
Snutch
(1996)
Determinants of the G protein-dependent opioid modulation of neuronal calcium
channels. PNAS 93: 1486-1491.
Brice, N. L., Berrow, N. S., Campbell, V., Page, K. M., brickley, K.,Tedder, I. &
Dolphin, A. C. 1997 Importance of the different subunits in the membrane
expression of the 1A and 2 calcium channel subunits: studies using a
depolarisation-sensitive 1A antibody. European Journal of Neuroscience 9:749-759.
Brickley K, Campbell V, Berrow N, Leach R, Norman RI, Wray D, Dolphin AC and
Baldwin SA (1995) Use of site-directed antibodies to probe the topography of the 2
subunit of voltage-gated Ca+2 channels. FEBS Letters 364:129-133
65

Brust PF, Simerson, McCue AF, Deal CR, Schoonmaker S, Williams ME, Velicelebi
G, Johnson EC, Harpold MM and Ellis SB (1993) Human neuronal voltage-dependent
calcium channels: studies on subunit structure and role in channel assembly.
Neuropharmacology 32:1089-1102
Burguess D.L. & Noebels J.L. (1999) Single gene defects in mice: the role of voltagedependent calcium channels in absence models. Epilepsy Res. 36:111-122.
Castellano A & Perez-Reyes (1993) Molecular diversity of Ca2+ channel beta
subunits. Biochem Soc Trans 22:483-488
Catterall W.A. (1998) Structure and function of neuronal Ca2+ channels and their
roles in neurotransmitter release. Cell Calcium 24(5/6):307-323.
Catterall W.A. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+channels. Annual
Review of Cell and Developmental Biology 16:521555
Cheng, L., Fu, J., Tsukamoto, A. & Hawley, R. G. (1996) Use of green fluorescent
protein variants to monitor gene transfer and expression in mammalian cells. Nature
Biotechnol. 14:606-609.
Chin D. & A.R. Means (2000) Calmodulin: a prototypical calcium sensor. Trends in
Cell Biology 10:322.
Colecraft H. M., Brody D. L. & Yue D. T. (2001) G-Protein Inhibition of N- and P/QType Calcium Channels: Distinctive Elementary Mechanisms and Their Functional
Impact. Journal of Neuroscience 21(4):1137-1147
Currie K.P. & Fox A. P.(1997) Comparison of N-and P/Q-type voltage-gated calcium
channel current inhibition. Journal of Neuroscience 17:4570-4579
Curtis BM, Catterall WA. (1986) Reconstitution of the voltage-sensitive calcium
channel purified from skeletal muscle transverse tubules. Biochemistry 11:30773083
DeMaria C. D., Soong T.W., Alselkhan B.A., Alvania R.S., & D.Y. Yue, 2001,
Calmodulin bifurcates the local Ca2+ signal that modulates P/Q type Ca2+ channels.
Nature 411:484.
De Jongh KS, Warner C & Catterall WA (1990) Subunits of purified calcium channels.
Journal of Biological Chemistry 265:14738-14741
De Leon, M., Y. Wang, L. Jones, E. Perez-Reyes, X. Wei, T. Wah Soong, T.P.
Snutch, & D.T. Yue. (1995). Essential Ca+2-binding motif for Ca+2-sensitive
inactivation of L-type Ca21 channels. Science 270:15021506.

66

Desmadryl, G., Hilaire, C., Vigues, S., Diochot, S. & Valmier, J. (1998) Developmental
regulation of T-, N- and Q-type calcium currents in mouse embryonic sensory
neurons. European Journal of Neuroscience 10:545-552.
De Waard, M., Liu, H., Walker, D., Scott, V.E.S., Gurnett, C.A., Campbell, K.P. (1997)
Direct binding of G-protein complex to voltage-dependent calcium channels. Nature
385:446-450
Doering C. J., Kisilevsky A. E., Feng Z. P., Arnot M. I., Peloquin J., Hamid J., Barr W.,
Nirdosh A., Simms B., Winkfein R. J., & Gerald W. Zamponi (2004)
A Single G Subunit Locus Controls Cross-talk between Protein Kinase C and G
Protein Regulation of N-type Calcium Channels. Journal of Biological Chemistry
279:29709-29717
Dolphin A.C. (2003) G protein modulation of voltage-gated calcium channels.
Pharmacological Reviews 55: 607-627.
Dove L.S., Abbott L.C. & Griffith W.H. (1998) Whole-cell and single-channel analysis
of P-type calcium currents in cerebellar Purkinje cells of leaner mutant mice. Journal
of Neuroscience 18(19):7687-7699.
Doyle J., Ren X., Lennon G. & Stubbs L. (1997) Mutations in the Cacnl1a4 calcium
channel gene are associated with seizures, cerebellar degeneration, and ataxia in
tottering and leaner mutant mice. Mammalian Genome 8: 113-120.
Eberst R, Dai S, Klugbauer S & Hofmann F (1997) Identification and functional
characterisation of a calcium channel gamma subunit. Pflugers Arch 433:633-637
Eckert R., & Brehm P. (1978) Ionic Mechanisms of Excitation in Paramecium. Annual
Review
of
Biophysics
and
Bioengineering
8:353-383
Ehlers M.D. & Augustine G.J. (1999) Calmodulin at the channel gate. Nature
399:105-108.
Ellinor, P. T., Yang, J., Sather, W. A., ZhanG, J. F. & Tsien, R. W. (1995) Ca2+
channel selectivity at a single locus for high-affinity Ca2+ interactions. Neuron
15:1121-1132.
Ellis SB, Williams ME, Ways NR, Brenner R, Sharp AH, Leung AT, Campbell KP,
McKenna E, Koch WJ, Hui A, Schwartz A & Harpold MM (1988) Sequence and
expression of mRNAs encoding the a1 and a2 subunits of a DHP sensitive calcium
channel. Science 241:1661-1664
Erickson M.G., Alseikhan B.A., Peterson B.Z. & D.T. Yue (2001) Preassociation of
calmodulin with voltage-gated Ca2+ channels revealed by FRET in single living cells.
Neuron 31:973.
67

Felix R., CA Gurnett., M De Waard., KP Campbell. (1997) Dissection of functional

domains of the voltage-dependent Ca2+ channel 2 subunit. Journal of
Neuroscience 17:6884-6891
Fletcher C.F., Lutz C.M., OSullivan T.N., Shaughnessy J.D., Hawkes R., Frankel
W.N., Copeland N.G. & Jenkins N.A. (1996) Absence epilepsy in tottering mutant
mice is associated with calcium channel defects. Cell 87:607-617.
Furukawa T., Miura R., Mori Y., Strobeck M., Suzuki K., Ogihara Y., Asano T.,
Morishita R., Hashii M., Higashida H., Yoshii M. & Nukada T. (1998) Differential
interactions of the C terminus and the cytoplasmic I-II loop of neuronal Ca2+ channels
with G-protein and subunits II. Evidence for direct binding. Journal of Biological
Chemistry 273(28):17595-17603.
Gregg, R. G., Powers, P. A., & Hogan, K. (1993) Assignment of the Human Gene for
the Subunit of the Voltage-Dependent Calcium Channel (CACNLB1) to
Chromosome 17 Using Somatic Cell Hybrids and Linkage Mapping. Genomics 15,
185187.
Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981). Improved patch-clamp
techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane
patches. Pflugers Arch 391:85-100.
Heckroth JA & Abbott LC (1994) Purkinje cell loss from alternating sagittal zones in
the cerebellum of leaner mutant mice. Brain Res 658:93-104
Herrup K & Wilczynski SL (1982) Cerebellar cell degeneration in the leaner mutant
mouse. Neuroscience 7:2185-2196
Herrup K & Kuemerle (1997) The compartmentalization of the cerebellum . Ann. Rev.
Neuro. 20:61-90
Hess E.J. (1996) Migraines in mice?. Cell 87:1149-1151.
Hille B. (1992) Ionic channels of excitable membranes. Sunderland, MA: Sinauer 2nd
edition.
Hille N. (1994) Modulation of ion-channel function by G-protein-coupled receptors.
Trends Neuroscience 17:531-536
Hfer, G. F. (1997) Intracellular Ca+2 inavtivates L-typr Ca+2 channels with a Hill
coefficient of 1 and an inhibition constant of 4 M by reducing channels open
probability. Biophys. J. 73:1857-1865
Hofmann F, Lacinov L & Klugbauer N (1999) Voltage-dependent calcium channels:
from structure to function. Rev Physiol Biochem Pharmacol 139:33-87
68

Hoshi T, WN Zagotta & RW Aldrich (1990) Biophysical and molecular mechanisms of

Shaker potassium channel inactivation. Science 250:533-538.
Imredy, J. P. & Yue, D. T. (1994) Mechanism of Ca+2-sensitive inactivation of L-type
Ca+2 channels. Neuron 12:1301-1318
Jay SD, Sharp AH, Kahl SD, Vedvick TS, Harpold MM & Campbell KP (1991)
Structural characterisation of the dihydropyridine-sensitive calcium channel 2subunit and the associate dpeptides. Journal of Biological Chemistry 266:32873293
Jerng H. H., Shahidullah, M., & Covarrubias, M (1999) Inactivation gating of Kv4
potassium channels. Molecular interctions involving the inner vestibule of the pore. J.
Gen. Physiol 113:641-660
Jurado L., Chockalingam P.S. & H.W. Jarrett (1999) Apocalmodulin. Physiol. Rev.
79(3):661.
Kasai H. & Aosaki T. (1989) Modulation of Ca-channel current by an adenosine
analog mediatede by a GTP-binding protein in shick sensory neurons. Pflugers Arch
414:145-149
Klugbauer N, Lacinov L, Marais E, Hobom M & Hofmann F (1999) Molecular
Diversity of the Calcium Channel 2 Subunit. Journal of Neuroscience 19: 684-691
Klugbauer N, Dai S, Specht V, Lacinov L, Marais E, Bohn G & Hofmann F (2000). A
family of calcium channel g subunits. FEBS Letters 470:189-197
Kraus, R. L., Hering, S., Grabner, M., Ostler, D., & Striessnig, J. (1998) Molecular
Mechanism of Diltiazem Interaction with L-type Ca2+ Channels
Journal of Biological Chemistry 273: 2720527212
Lau F.C., Abbott L.C., Rhyu I.J., Kim D.S. & Chin H. (1998) Expression of calcium
channel 1A mRNA and protein in the leaner mouse (tgla/tgla) cerebellum. Mol. Brain
Res. 59:93-99.
Lee, A., Wong, S. T., Gallagher, D., Li, B., Storm, D. R., Scheuer, T., & Catterall, W.
A. (1999). Nature 399:155159.
Lee A., Scheuer T. & W. Catterall 2000, Ca2+/Calmodulin-dependent facilitation and
inactivation of P/Q-type Ca2+ channels. Journal of Neuroscience 20(18): 6830.
Lee A., Westenbroek R.E., F. Haeseleer, K. Palczewski, T. Scheuer & W. A. Catterall
(2002) Differential modulation of Cav2.1 channels by calmodulin and Ca2+-binding
protein 1. Nature Neuroscience 5(3):210.
69

Lee A., Wong S.T., Gallagher D., Li B., Storm D.R., Scheuer T. & Catterall W.A.
(1999) Ca2+/calmodulin binds to and modulates P/Q-type calcium channels. Nature
399:155-159.
Lehmann-Horn, F. & Jurkat-Rott, K., (1999) Voltage-gated ion channels and
hereditary disease. Physiol. Rev.79: 1317-1372.
Letts, V. A., Felix, R., Biddlecome, G. H., Arikkath, J., Mahaffey, C. L., Valenzuela, A.,
Bartlett, F. S., Mori, Y., Campbell, K. P. & Frankel, W.N. 1998: The mouse stargazer
gene encodes a neuronal Ca2+ channel gamma subunit. Nature Genetics 19:340-347
Llins R.R., Sugimori M. & Cherksey (1989) Voltage-dependent calcium
conductances in mammalian neurons. The P channel. Ann. New York Acad. Sci.
560:103-111.
Lorenzon N.M., Lutz C.M., Frankel W.N. & Beam K.G. (1998) Altered calcium channel
currents in Purkinje cells of the neurological mutant mouse leaner. Journal of
Neuroscience 18(12):4482-4489.
McEnery M. W., Copeland, T. D. & Vance, C. L. (1998) Altered expression and
assembly of N-type calcium channel 1B and subunits in epileptic lethargic (lh/lh)
mouse. Journal of Biological Chemistry 273:21435-21438
Miller RJ, (1992) Voltage-sensitive Ca2+ Channels. Journal of Biological
Chemistry 267:1403-1406.
Mintz I. & Bean B.P. (1993) GABA receptor inhibition of p-type Ca2+ channels in
central neurons. Neuron 10:889-898.
Mori Y, Wakamori M, Oda S, Fletcher CF, Sekiguchi N, Mori E, Copeland NG,
Jenkins NA, Matsushita K, Matsuyama Z, Imoto K (2000) Reduced voltage sensitivity
of activation of P/Q-type calcium channels is associated with the ataxic mouse
mutation rolling Nagoya. Neuroscience 20: 5654- 5662.
Murphy, T. H., Worley, P. F. & Baraban, J.M. (1991) L-type voltage-sensitive calcium
channels mediate synaptiv activation of immediate early genes. Neuron 7:6235-635.
Muth J.N., Varadi G & Schwart Z.A. (2001( use of transgenic mice to study voltagedependent Ca+2channels. Trends in Pharmacological Sciences 22:526532
Nargeot J., Dascal N. & Lester HA (1992) Heterologous expression of calcium
channels. J Membr. Biol. 126(2):97-108.

70

Neely, A., Olcese, R., Wei, V., Birnbaumer, L. & Stefani, E. (1994) C+2-dependent
inactivation of a cloned cardiac Ca+2 channel 1 subunit (1C) expressed in
Xenopus oocyte. Biophys. J 66:1895-1903.
Okayama, H., & Chen, C (1990). Calcium phosphate mediated gene transfer into
established cell lines. Methods Mol. Biol. 15:21.
Ophoff R.A., G.M. Terwindt, R.R. Frants & M.D. Ferrari (1998) P/Q type channel
defects in migraine, ataxia, and epilepsy. Tips 19:121-127.
Pate P., Mochca-Morales J., Wu Y., Zhang J.-Z., Rodney G.G., Serysheva I.I.,
Williams B.Y., Anderson M.E. & S.L. Hamilton (2000) Determinants for calmodulin
binding on voltage-dependent Ca2+ channels. Journal of Biological Chemistry
275(59): 39786.
Patton, D.E., J.W. West, W.A. Catterall, & A.L. Goldin (1992) Amino acid residues
required for fast Na+-channel inactivation: charge neutralizations and deletions in the
III-IV linker. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:1090510909
Peterson, B. Z., Lee, J. S., Mulle, J. G., Wang, Y., De Leon, M. & Yue, D. T. (2000).
Critical determinants of Ca2+-dependent inactivation within an EF-hand motif of L-type
Ca2+ channels. Biophysical Journal 78:1906-1920
Pragnell, M., DE Waard, M., Mori, Y., Tanabe, T., Snutch, T. P. & Campbell, K. P.
(1994) Calcium channel -subunit binds to a conserved motif in the I-II cytoplasmic
linker of the 1-subunit. Nature 368:67-70.
Qin N, Platano D, Olcese R, Stefani E, Birnbaumer L (1997) Direct interaction of G
with a C terminal Gbg binding domain of the calcium channel a1 subunit is
responsible for channel inhibition by G protein coupled receptors. Proc Natl Acad Sci
USA 94:8866 8871.
Rojas, E., & Armstrong C.M. (1971) Sodium conductance activation without
inactivation in pronase-perfused axons. Nature New Biology. 229: 177-178
Saris N. E. L. & Carafoli E. (2005) A historical review of cellular calcium handling, with
emphasis on mitocondria. Biochemistry 70:187-194
Sidman RL. & Green MC. (1965) Retinal degeneration in the mouse. Location of the
rd locus in linkage group XVII. J Hered 56:23-29.
Singer D, Biel M, Lotan I, Flockerzi V, Hofmann F & Dascal N (1991) The roles of the
subunits in the function of the calcium channel. Science 253:1553-1557

71

Sokolov, S., Wei, R. G., Timin, E. N. & Hering, S. (2000). Modulation of slow
inactivation in class A Ca2+ channels by -subunits. Journal of Physiology 527: 445454
Sol C., S. Barrn, J.M. Tusell & Joan Serratosa (1999) The Ca2+/Calmodulin
signaling system in the neural response to excitability. Involvement of neuronal and
glial cells. Prog. Neurobiol 58:207.
Sol C., Barrn S., J. M. Tusell & J. Serratosa (2001) The Ca2+/calmodulin system in
neuronal hyperexcitability. IJBCB 33:439.
Starr T.V.B., Prystay W. & T.P. Snutch (1991) Primary structure of a calcium channel
that is highly expressed in the rat cerebellum. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:5621-5625.
Stotz S. C. & Zamponi G.W. (2001) Identification of inactivation determinants in the
domain IIS6 region of high voltage-activated calcium channels. Journal of Biological
Chemistry 276:33001-33010
Sthmer, W., Ruppersberg, J. P., Schroter, K. H., Sakmann, B., Stocker, M., Giese,
K. P., Perschke, A., Baumann, A., & Pongs, 0. (1989) Molecular basis of functional
diversity of voltage-gated potassium channels in mammalian brain. EMBO J 8: 32353244,
Sutton K.S., McRory J.E., Guthrie H., Murphy T.H. & T.P. Snutch (1999) P/Q type
calcium channels mediate the activity-dependent feedback of syntaxin-1A. Nature
401:800-804.
Tanabe, T., Takeshima, H., Mikami, A., Flockerzi, V., Takahashi, H.,Kangawa, K.,
Kojima, M., Matsuo, H., Hirose, T. & Numa, S. (1987) Primary structure of the
receptor for calcium channel blockers from skeletal muscle. Nature 328:313-318.
Townsend C., Horn R. (1999) Interaction between the Pore and a Fast Gate of
theCardiac Sodium Channel. J. Gen. Physiol. 113(2) 321-332
Tsuji W. & Meier H. (1971) Evidence for allelism of leaner and tottering in the mouse.
Genet Res. 17:83-88.
Van Eldik L.J. & Watterson D.M. (1998) Calmodulin and signal transduction.
Academic Press, New York. 471
Wakamori M., Yamazaki K., Matsunodaira H., Teramoto T., Tanaka I., Niidome T.,
Sawada K., Nishizawa Y., Sekiguchi N., Mori E., Mori Y. & Imoto K. (1998) Single
tottering mutations responsible for the neuropathic phenotype of the P-type calcium
channel. Journal of Biological Chemistry 273(52):34857-34867.
Walker D., Bichet D., Campbell K.P. & de Waard M. (1998) A 4 isoform-specific
interaction site in the carboxyl-terminal region of the voltage-dependent Ca2+ channel
1A subunit. Journal of Biological Chemistry 273(4):2361-2367.
72

West, J.W., D.E. Patton, T. Scheuer, Y. Wang, A.L. Goldin, & W.A. Catterall. (1992) A
cluster of hydrophobic amino acid residues required for fast Na+-channel inactivation.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89: 10910-10914
Westenbroek R.E., Sakurai T., Elliot E.M., Hell J.W., Starr T.V.B., Snutch T.P. & W.A.
Catterall (1995) Immunochemical identification and subcellular distribution of the 1A
subunits of brain calcium channels. Journal of Neuroscience 15(10):6403-6418.
Wheeler D.B., Randall A., Sather W.A. & Tsien R.W. (1995) Neuronal calcium
channels encoded by the 1A subunit and their contribution to excitatory synaptic
transmission in the CNS. Prog. Brain Res. 105:65-78
Wiser O, Trus M, Tobi D, Halevi S, Giladi E & Atlas D (1996) The 2/ subunit of
voltage sensitive Ca2+ channels is a single transmembrane extracellular protein
which is involved in regulated secretion. FEBS Letters 379:15-20
Yamaguchi H, Okuda M, Mikala G, Fukasawa K & Varadi G (2000) Cloning of the 2a
subunit of the voltage dependent calcium channel from human heart: cooperative
effect of 2/ and 2a on the membrane expression of the 1C subunit. Biochem
Bioph Res 267:156-163
Yoshiro Saimi & Ching Kung (2002) Calmodulin as an ion channel subunit. Annu.
Rev. Physiol. 64:289311.
Zamponi G.W. & T.P. Snutch (1998) Modulation of voltage-dependent calcium
channels by G proteins. Curr Opinion Neurobiol. 8:351-356.
Zhang, J. F., Ellinor, P. T., Aldrich, R. W. & Tsien, R. W. (1994). Molecular
determinants of voltage-dependent inactivation in calcium channels. Nature 372:97100
Zhuchenko O. Bailey J., Bonnen P., Ashizawa T., Stockton D.W., Amos C., Dobyns
W.B., Subramony S.H., Zoghbi H.Y. & Lee C.C. (1997) Autosomal dominant
cerebellar ataxia (SCA6) associated with small polyglutamine expansion in the alpha
1A-voltage-dependent calcium channel. Nat. Genet. 15: 62-69.
Zong S, Zhou J, Tanabe T, (1994) Molecular determinants of calcium-dependent
inactivation in cardiac L-type calcium channels. Biochem. Biophys. Res. Com.
201: 1117-1123.
Zhlke R. D.,Pitt G. S., Deisseroth K., Tsien R. W. & Reuter H. (1999) Calmodulin
supports both inactivation and facilitation of L-type calcium channels. Nature 399:159162

73

Zwingman T., Neumann P.E. & Noebels J.L. (2001) Rocker is a new variant of the
voltage-dependent calcium channel gene Cacna1a. Journal of Neuroscience 21:
1169-1178.

74