Cincia

190 Rural, Santa Maria, v.37, n.1, p190-194, jan-fev, 2007

Barth et al.

ISSN 0103-8478

Avaliao de pirognios em produtos de uso veterinrio pelos testes da hipertermia em

coelhos e do lisado de amebcitos do Limulus

Pyrogens in veterinary products by the rabbit pyrogen test

and the Limulus amoebocyte lysate test

Thiago BarthI Volmir Joo DalmoraII Felipe Bianchini DAvilaI

Srgio Luiz DalmoraI*

RESUMO
Realizou-se a avaliao de pirognios em produtos
veterinrios de uso parenteral, pelo mtodo da hipertermia em
coelhos, calculando-se, para o teste das amostras, doses com
concentraes de trs a sete vezes superiores teraputica.
Preconizou-se como resposta positiva o aumento de
temperatura de 0,6C. Utilizou-se tambm o ensaio do lisado
de amebcitos do Limulus (LAL) por geleificao,
semiquantitativo, executando o teste de interferentes, validando
o procedimento e estabelecendo a mxima diluio vlida
para a anlise de cada produto. Paralelamente, efetuou-se
avaliao comparativa de amostras com o mtodo do LAL
cromognico, quantitativo, demonstrando correlao e
reprodutibilidade dos resultados. Avaliaram-se vinte e oito
produtos de diferentes classes farmacolgicas, observando-se
que dois no cumpriram as especificaes, sendo reprovados.
Sugere-se que as especificaes estudadas sejam adotadas,
contribuindo para aprimorar o controle de contaminantes,
garantindo a qualidade e a segurana dos produtos
veterinrios.
Palavras-chave: coelhos, pirognios, teste da hipertermia,
teste do lisado de amebcitos do Limulus.
ABSTRACT
The rabbit pyrogen test was used to evaluate
veterinary products, suggesting the temperature rise of 0.6C
as the ending point for the positive results. The test doses were
calculated based on the therapeutic dose increased from three
to seven times. The semi-quantitative Limulus amoebocyte
lysate (LAL) gel clot test was performed and compared to the
LAL spectrophotometric chromogenic, quantitative assay. The
comparative evaluation of the samples showed correlation and
reproducibility of the results. The interference test was carried
out, the procedure validated and the maximum valid dilution
established for the analysis of the products without

Pharmacopoeial specifications. Two of the twenty-eight products

of different pharmacological groups evaluated didnt meet the
requirements and were reproved. The specifications investigated
are suggested to be used for the purity evaluation of the
veterinary parenteral products, as a contribution to assure the
quality and safety of the products.
Key words: rabbit, pyrogens, temperature rise test, Limulus
amoebocyte lysate test.

INTRODUO
Os pirognios podem originar-se de
bactrias gram-negativas, gram-positivas, de fungos e
de vrus. Os moncitos/macrfagos reagem aos
componentes microbianos, induzindo a liberao de
pirognios endgenos, como prostaglandinas e as
citocinas pr-inflamatrias: interleucina-1, interleucina-6
e fator de necrose tumoral-. As endotoxinas
bacterianas so lipopolissacardios complexos de alta
massa molecular (~106 Da) que constituem a parede
celular de bactrias gram-negativas e so formadas pelo
ncleo polissacardico, ao qual se liga a cadeia O-antignica
e a unidade lipdica A, que responsvel pelas
propriedades pirognicas. So as mais comumente
encontradas em produtos injetveis de uso veterinrio
e humano. Os pirognios so quimicamente
heterogneos e podem apresentar composio e
estrutura varivel, as quais influenciam os efeitos
biolgicos como febre, alterao do quadro leucocitrio
e choque sptico (KLUGER, 1991; RIETSCHEL et al.,
1994; HENDERSON et al., 1996).

Departamento de Farmcia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria, (UFSM), 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail:
sdalmora@ccs.ufsm.br. * Autor para correspondncia
II
Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade do Contestado, Concrdia, SC, Brasil.
I

Recebido para publicao13.07.05 Aprovado em08.03.06

Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.

Avaliao de pirognios em produtos de uso veterinrio pelos testes da hipertermia em coelhos...

O teste da hipertermia em coelhos, baseado

na injeo intravenosa de solues sob pesquisa, tem
sido amplamente usado para o controle da qualidade
de preparaes parenterais. A resposta positiva
avaliada atravs da elevao da temperatura em 0,5 ou
0,6C, segundo a literatura adotada (EP., 2002;
HOFFMANN et al., 2005). um teste in vivo que
expressa os efeitos fisiopatolgicos induzidos pelos
pirognios, porm qualitativo, tem baixa sensibilidade,
no pode ser usado para frmacos que interferem com
a resposta pirognica e utiliza animais, cuja substituio
ou reduo recomendada (HOFFMANN et al., 2005).
Por sua vez, as observaes de que
preparaes de endotoxinas de Escherichia coli
causavam coagulao extracelular do sangue do
caranguejo Limulus polyphemus fundamentaram o
desenvolvimento do teste do lisado de amebcitos do
Limulus (LAL) in vitro, especfico e altamente sensvel
para detectar endotoxinas de bactrias gram-negativas
(LEVIN & BANG, 1964). O teste pode apresentar
resultados falsos (negativo ou positivo) com alguns
produtos, antibiticos e vacinas virais (FENNRICH et
al., 1999; POOLE & GAINES DAS, 2001).
Os testes da hipertermia em coelhos e do
LAL so recomendados pela Farmacopia Britnica
Veterinria (B.P. Vet., 2003), que oficializa tambm as
especificaes descritas pela Europia (EP., 2002). Esses
testes so essenciais para o controle de contaminantes
pirognicos nos produtos injetveis e para a validao
das metodologias sob investigao, baseadas no uso
de linhagens celulares (MOESBY et al., 1999), na cultura
de sangue total ou de moncitos de sangue humano
(FENNRICH et al., 1999; ANDRADE et al., 2003).
O presente trabalho teve por objetivo realizar
a avaliao de pirognios em medicamentos
veterinrios de uso parenteral, pelos testes da
hipertermia em coelhos, e do LAL, sugerindo doses e
especificaes que contribuem para aprimorar o
controle da qualidade e da segurana dos produtos.
MATERIAL E MTODOS
Padro de referncia, reagentes e produtos veterinrios
Utilizou-se o segundo padro internacional
de endotoxinas bacterianas, contendo 10.000 unidades
endotxicas (UE) /ampola (WHO 94/580), doado pelo
National Institute for Biological Standards and Control
(Inglaterra). Utilizou-se reagente lisado de amebcitos
do Limulus com sensibilidade de 0,06UE ml-1, Cape
Code (EUA) e Biowhittaker (EUA), e tambm novo azul
de metileno, Sigma (EUA). Produtos veterinrios
injetveis, disponveis comercialmente, foram
selecionados, observando-se o lote e prazo de
validade, e identificados nas tabelas respectivas com
base na substncia ativa e na concentrao,

191

acrescentando-se tambm as seguintes associaes:

A - dipropionato de imidocarb 120mg e vitamina B12
0,024mg por ml; B - enrofloxacino 100mg e piroxicam
12mg por ml; C - penicilinas G procana 1.500.000UI,
potssica 1.500.000UI, benzatina 3.000.000UI e
estreptomicina 2,5g por frasco; D - penicilina G procana
200.000UI, estreptomicina 80mg e piroxicam 6mg por
ml; E - Soluo: cido brico 40mg, gluconato de clcio
230mg, cloreto de magnsio 1,6mg, glicerofosfato de
sdio 30mg, efedrina 0,5mg e glicose 30mg por ml; F sulfadiazina 400mg e trimetoprima 80 mg por ml; G
sulfadoxina 200mg, trimetoprima 40mg e piroxicam 12mg
por ml.
Animais
Foram usados coelhos machos e fmeas da
linhagem Nova Zelndia, provenientes do Biotrio
Central da Universidade Federal de Santa Maria
(UFSM).
Teste da hipertermia em coelhos
O teste foi executado de acordo com as
recomendaes da literatura (F.BRAS., 1988; EP., 2002),
adotando-se as especificaes farmacopicas
disponveis, injetando-se trs coelhos com cada
amostra e registrando-se o aumento individual de
temperatura durante trs horas consecutivas. Para os
demais produtos, calcularam-se as dosagens com base
na maior posologia recomendada por kg de massa
corporal, pelo Laboratrio Produtor. Para as
associaes com composio expressa em massa,
somaram-se os teores das substncias ativas presentes
na dosagem sugerida e estabeleceu-se a dose inicial.
Por sua vez, para as formulaes com composio
declarada em unidades e miligramas, avaliou-se a
quantidade de cada componente na dosagem
teraputica, planejando-se o teste com base na
indicao farmacolgica do produto e no frmaco
presente em maior teor, usando-se sua expresso de
potncia para a especificao. Em ambos os casos, as
doses foram especificadas com concentraes
aproximadas, trs a sete vezes superiores teraputica,
conforme a tabela 1.
Validou-se o procedimento para produtos
com excipientes oleosos por via subcutnea,
designando-se trs grupos de animais, respectivamente,
para controle positivo, amostra e amostra contaminada
com a dose pirognica equivalente a 15UE ml-1 kg-1 do
segundo padro internacional de endotoxinas
bacterianas (SILVEIRA et al., 2004). Prolongou-se o
tempo de leitura, registrando-se as respostas
correspondentes durante quatro horas.
Teste do lisado de amebcitos do Limulus (LAL)
Calculou-se o limite de endotoxinas
bacterianas (LEC) para produtos veterinrios de uso
Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.

192

Barth et al.

parenteral, sem especificaes farmacopicas, com base

na dose teraputica, pela equao: LEC = K/M, em que
K = menor dose pirognica por kg de peso animal, igual
a 5UE kg-1 e M = dose mxima do produto recomendada
por kg de peso no perodo de uma hora. Calculou-se a
mxima diluio vlida (MDV), que deve apresentar
resposta negativa, e realizou-se o teste para
confirmao da sensibilidade do reagente LAL.
Teste de interferentes e validao
Realizou-se o teste de inibio/
potencializao da resposta pela adio do segundo
padro internacional de endotoxinas bacterianas a
diferentes diluies de cada produto veterinrio,
inferiores a MDV, que, em teste anterior, haviam
fornecido resultado negativo, mas que se tornaram
positivas aps a contaminao. A mdia geomtrica
(M) para as solues foi calculada pela equao M =
antilog ( e/f), em que e = soma dos logaritmos da
menor concentrao de endotoxinas com reao
positiva em cada srie de diluies da amostra e f =
nmero de replicatas. Considerou-se a amostra sem
fatores interferentes quando a sensibilidade do LAL
(), determinada na presena da soluo do produto,
foi igual ou maior que 0,5 e igual ou menor que 2
(EP., 2002; SILVEIRA et al., 2004).
Ensaio por geleificao
O ensaio foi realizado em placas de Petri ou
em tubos de ensaio (SILVEIRA et al., 2004), ajustandose os volumes dos reagentes e mantendo-se a relao
constante. Em placa de polietileno, adicionaram-se, em
duplicata, 10 l do reagente LAL e 10l de cada diluio
da amostra ou padro. Incubou-se em estufa a 37 1C
por uma hora. Para leitura da formao de gel,
adicionou-se 1l da soluo de novo azul de metileno
0,2% sobre cada ponto de reao, observando-se sua
mistura (reao negativa) ou distribuio na superfcie
do gel (reao positiva). Calculou-se o resultado,
multiplicando-se a maior diluio, na qual a resposta
foi positiva, e a menor diluio, na qual foi negativa,
pela sensibilidade do reagente LAL. Esses valores
representam a faixa de concentrao de endotoxinas
bacterianas em unidades endotxicas.
Ensaio cromognico
O ensaio foi realizado em microplacas de 96
cavidades a 37 1C (EP., 2002), adicionando-se 50l
do padro ou das amostras, respectivamente.
Acrescentaram-se, ento, 50l da soluo de lisado de
amebcitos do Limulus e procedeu-se incubao da
microplaca por 10 minutos a 371C. A seguir, foram
pipetados 100l da soluo de substrato cromognico
e, aps seis minutos de incubao a 371C,
interrompeu-se a reao pela adio de 100l de cido
actico 25%. A absorbncia foi medida em leitor de

placas a 405nm, os valores projetados na curva de

endotoxinas padro e os resultados expressos em UE
ml-1.
RESULTADOS
Realizou-se o teste em coelhos, registrandose os aumentos individuais de temperatura,
concluindo-se pela aprovao ou reprovao de cada
frmaco com base nas especificaes estabelecidas,
conforme mostra a tabela 1. Do mesmo modo, foram
avaliadas as amostras de florfenicol e ivermectina, em
veculo oleoso, que forneceram resultados negativos.
Para o teste do LAL por geleificao,
confirmou-se a sensibilidade do reagente do LAL de
0,06UE ml-1 e, ento, determinou-se a menor diluio
aceitvel e validou-se o teste para os produtos da tabela 2,
na qual se observa a mdia geomtrica entre 0,5 e 2,
com recuperao de 50 a 200% em relao
sensibilidade especificada, bem como os resultados
obtidos.
Pode-se observar, nas tabelas 1 e 2, que
alguns produtos, por cumprirem os requisitos do teste
do LAL, foram submetidos a avaliao pelos dois
mtodos, demonstrando a concordncia das respostas
Tabela 1 - Concentraes injetadas e resultados do teste da
hipertermia em coelhos, em produtos veterinrios de
uso parenteral.
Frmacos
-1

Abamectina 10mg ml
Bromexina 30mg/ml-1
Ceftiofur 50mg ml-1
Cetoprofeno 100mg ml-1
Dexametasona 2mg ml-1
Enrofloxacino 25mg ml-1
Florfenicol 300mg ml-1
Flumetasona 0,5mg ml-1
Furosemida 10mg ml-1
Heparina 5000UI ml-1
Ivermectina 10mg ml-1
Levamisol 75mg ml-1
Metoclopramida 5mg ml-1
Oxitetraciclina 200mg ml-1
Sulfxido de albendazol
150mg ml-1
Associao A
Associao B
Associao C
Associao D
Associao E
Associao F
Associao G

Doses kg-1

Resultado

0,6 mg/ml
0,9 mg/ml
15 mg/5ml
9 mg/ml
0,15 mg/ml
7,5 mg/ml
150 mg/ml*
0,063 mg/ml
0,75 mg/ml
2000 UI/ml
1 mg/ml*
20 mg/ml
3 mg/ml
5 mg/ml1

Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado
Aprovado

10 mg/2ml

Aprovado

15 mg/ml
30 mg/ml
4000 UI/ml
4000 UI/ml
996 mg/6ml
2160 mg/3ml
100 mg/ml

Aprovado
Aprovado
Reprovado**
Aprovado
Reprovado**
Aprovado
Aprovado

*Via subcutnea; 1B.P. Veterinria. **Reprovado=presena de

pirognios.

Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.

193

Avaliao de pirognios em produtos de uso veterinrio pelos testes da hipertermia em coelhos...

Tabela 2 - Resultados do teste de inibio/potencializao e avaliao de produtos veterinrios pelo ensaio do lisado de amebcitos do
Limulus (LAL), com sensibilidade de 0,06 UE/ml.
Frmacos
Amoxicilina 150mg ml-1
Bromexina 30mg ml-1
Cetoprofeno 100mg ml-1
Dexametasona 2mg ml-1
Dipirona 500mg ml-1
Enrofloxacino 25mg ml-1
Fenilbutazona 200mg ml-1
Florfenicol 992mcg mg-1
Flumetasona 0,5mg ml-1
Furosemida 10mg ml-1
Gentamicina 40mg ml-1
Heparina 5000UI ml-1
Levamisol 75mg ml-1
Metoclopramida 5mg ml-1
Ocitocina 10UI ml-1
Xilazina 20mg ml-1
Associao C
Associao D
Associao E
Associao F
Associao G
1

Mxima
diluio
vlida
1:625
1:833
1:283
1:3333
1:5833
1:416
1:416
1:625
1:3333
1:583
1:1113
1:2500
1:1662
1:416
1:8333
1:5533
1:500
1:333
1:83
1:1600
1:1000

Menor
diluio
vlida
1:32
1:64
1:32
1:32
1:8
1:32
1:32
1:16
1:8
1:64
1:128
1:8
1:512
1:16
0
1:2
1:16
1:128
0
1:32
1:128

Mdia
UE/ml
0,06
0,04
0,03
0,04
0,03
0,06
0,06
0,06
0,03
0,04
0,06
0,03
0,03
0,03
0,04
0,06
0,06
0,06
0,06
0,03
0,03

Limite de endotoxinas
0,25 UE/mg2
16 UE/mg1
1,7 UE/mg1
100 UE/mg1
0,7 UE/mg1
1 UE/mg1
0,125 UE/mg1
0,125 UE/mg1
400 UE/mg1
3,5 UE/mg2
1,67 UE/mg2
0,03 UE/UI1
1,33 UE/mg1
5 UE/mg1
50 UE/UI1
16,6 UE/mg1
0,01 UE/100 UI Penicilina G1
0,01 UE/100 UI Penicilina G1
0,015 UE/mg1
0,2 UE/mg1
0,3 UE/mg1

Resultado
UE/ml
< 0,06
< 0,06
0,96 1,92
< 0,06
< 0,06
< 0,06
0,06 0,12
0,06 0,12
< 0,06
0,12 0,24
< 0,06
< 0,06
< 0,06
0,12 0,24
< 0,06
3,84 7,68
61 122
< 0,06
491 983
< 0,06
< 0,06

Final
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
R
A
R
A
A

Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas; A=aprovado; R=reprovado (presena de pirognios).

e a vantagem de cada procedimento, qualitativo e

semiquantitativo.
Realizou-se tambm a avaliao
comparativa de diferentes produtos veterinrios pelo
teste do LAL com leitura da resposta por geleificao,
semiquantitativa, e cromognica espectrofotomtrica,
quantitativa. A tabela 3 mostra a reprodutibilidade e a
concordncia dos resultados de acordo com as
especificidades de cada procedimento.
DISCUSSO
Os testes de pirognios so necessrios
para avaliar-se a contaminao de frmacos, produtos
veterinrios injetveis e materiais de uso hospitalar.
Executou-se o teste da hipertermia em coelhos,
tambm preconizado para medicamentos de uso
humano, adotando-se como resposta positiva o
aumento de temperatura de 0,6C (HOFFMANN et
al., 2005). Observa-se que as doses-teste foram
planejadas com base na dosagem teraputica,
aumentada a fim de detectar-se, com maior segurana,
possveis contaminantes atravs de seu efeito
farmacolgico. Para produtos com veculos oleosos,
usados em preparaes de ao prolongada,
sugerida, preferencialmente, a avaliao dos
componentes da formulao, ou, havendo
necessidade, do produto acabado. As amostras no
cumpriram os parmetros de validao do teste do
LAL, sendo ento submetidas ao ensaio em coelhos,
como mostra a tabela 1.

O mtodo do lisado de amebcitos do

Limulus (LAL) foi validado, sempre que possvel, para
cada medicamento sob estudo, pois podem ser
encontrados resultados falsos, devidos interferncia
da substncia ativa ou dos componentes da formulao,
estabelecendo-se as especificaes descritas na tabela 2.
Alm disso, justificam-se os experimentos comparativos
com o mtodo cromognico, pois rotineiramente tem sido
adotado o mtodo por geleificao, por sua simplicidade
e custo, cumprindo os requisitos do controle da
qualidade (EP., 2002), em especial da rea veterinria
(BRASIL, 2004).
Conclui-se este trabalho, destacando a
importncia do mtodo da hipertermia em coelhos para a
avaliao especialmente de associaes de frmacos
largamente empregadas na rea veterinria, bem como
do teste do LAL in vitro, que se constitui um mtodo de
escolha com vantagens para os produtos que cumprem
os parmetros de validao. Sugere-se que as
especificaes estudadas sejam adotadas para o controle
de impurezas contaminantes, contribuindo para garantir
a qualidade, segurana e eficcia dos produtos
veterinrios de uso parenteral.
REFERNCIAS
ANDRADE, S.S. et al. Comparative evaluation of the human
whole blood and human peripheral blood monocyte tests for
pyrogens. International Journal of Pharmaceutics, v.265,
p.115-124, 2003.

Cincia Rural, v.37, n.1, jan-fev, 2007.

194

Barth et al.

Tabela 3 Resultados dos ensaios para geleificao e cromognico do lisado de amebcitos do Limulus (LAL), em produtos veterinrios.
Teste do LAL
Frmacos

Amoxicilina 150mg ml-1

-1

Gel UE ml-1

0,25 UE/mg2

< 0,06

Cromognico UE
ml-1
< 0,06

Resultado

Aprovado

Bromexina 30mg ml

16 UE/mg

< 0,06

< 0,06

Aprovado

Cetoprofeno 100mg ml-1

1,7 UE/mg1

0,96 1,92

1,26

Aprovado

Dexametasona 2mg ml-1

100 UE/mg1

< 0,06

< 0,06

Aprovado

0,7 UE/mg1

< 0,06

< 0,06

Aprovado

-1

Dipirona 500mg ml

-1

Enrofloxacino 25mg ml

< 0,06

< 0,06

Aprovado

Fenilbutazona 200mg ml

0,125 UE/mg

0,06 0,12

0,09

Aprovado

Florfenicol 992mcg mg-1

0,125 UE/mg1

0,06 0,12

0,10

Aprovado

-1

-1

1 UE/mg

Flumetasona 0,5mg ml

400 UE/mg

Furosemida 10mg ml-1

3,5 UE/mg

Gentamicina 40mg ml-1

1,67 UE/mg2

-1

Heparina 5000UI ml

Levamisol 75mg ml-1

Metoclopramida 5mg ml-1
Ocitocina 10UI ml-1
-1

Xilazina 20mg ml

Limite de endotoxinas

< 0,06

< 0,06

Aprovado

0,12 0,24

0,17

Aprovado

< 0,06

< 0,06

Aprovado

< 0,06

< 0,06

Aprovado

1,33 UE/mg

< 0,06

< 0,06

Aprovado

5 UE/mg1
50 UE/UI1

0,12 0,24

0,13

Aprovado

< 0,06

< 0,06

Aprovado

3,84 7,68

4,88

Aprovado

83,6

Reprovado

< 0,06

Aprovado

0,03 UE/UI

16,6 UE/mg

Associao C

0,01 UE/100 UI Penicilina G

61 122

Associao D

0,01 UE/100 UI Penicilina G1

< 0,06

Associao E

0,015 UE/mg1

491 983

500,24

Reprovado

Associao F

0,2 UE/mg1

< 0,06

< 0,06

Aprovado

Associao G

< 0,06

< 0,06

Aprovado

0,3 UE/mg

Calculado DFI; 2EP., 2002; UE=unidades endotxicas.

BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento.

Decreto n. 5.053 de 22 de abril de 2004. Aprova o regulamento
de fiscalizao de produtos de uso veterinrio e dos
estabelecimentos que os fabriquem ou comerciem, e d outras
providncias. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 23 abr. 2004.
BRITISH PHARMACOPOEIA (VETERINARY). London: Her
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EUROPEAN PHARMACOPOEIA, 4 ed. Strasbourg: European
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1988. V.5.1.2.
FENNRICH, S. et al. Detection of endotoxins and others
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Biological Standardization, v.101, p.131-139, 1999.
HENDERSON, B. et al. Bacterial modulins: a novel class of
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