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Blvd. J. Alonso de Torres 312 pte. Col. San Jernimo Len Gto.
(477) 718-5948 ventasleon@microelisas.com
MONOBIND, INC.
Cdigo de Producto: 125-300
Intencin de uso:
La determinacin cuantitativa de d e la concentracin de Triiodotironina
Total en suero humano o plasma para un micro pl ato de enzima de
inmun oensayo.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
La medida de la concentracin del triiodothyronina del suero se mira generalmente
como herramienta valiosa en la diagnosis de la disfuncin de la tiroides. Esta
importancia ha proporcionado el mpetu para la mejora signific ativa en la
metodologa del anlisis que ha ocurrido en las dos dcadas pasadas . El
advenimiento anti-suero mono-especifico y el descubrimiento de los agentes de
bloqueo a las protenas obligatorias del suero T 3 han permitido el desarrollo de los
de radioinmunoensayo procedimientos simples (1.2).
Esta metodologa inmunolgica del anlisis de la enzima en micro placa provee la
tc nica con ptima sensibilidad mientras que requiere pocas manipulaciones
tc nicas. En este mtodo, la referencia del suero, el espcimen pac iente, o el
control primero se agrega a un micropozo de la placa. Se agrega la conjugacin del
la enzima de T 3, y entonces los reactivos se mezclan. El resultado de una reaccin
de la competicin entre la enzima conjugada y la triiodotironina nativa para un
nmero limitado de anticuerpo combinando s itios inmovilizados en el pozo.
Despus de la terminacin del perodo requerido de la incubacin, la conjugacin
atada del antic uerpo la enzima de T3 es separada de la conjugacin desatada de
T3 por la aspiracin o la decantacin. La actividad de la enzima presente en la
superficie del pozo es cuantificada por la reaccin con un sustrato conveniente
para producir color. El empleo de varias referencias del suero de la concentracin
sabida de triiodotironina permite la construccin de un grfico de actividad y de
concentracin. De la comparacin a la curva de la reaccin a cierta dosis, la
actividad de un espcimen desconocido se puede correlacionar con la
concentracin de T3.
PR INCI PIO
PRUEBA POR EIA:
Los reactivos esenciales requeridos por una fase slida enzima inmunoensayo
incluyen el anticuerpo inmovilizado, enzima-antgeno conjugado y antgeno nativo.
Mezclando el anticuerpo inmovilizado, conjugacin del enzima-antgeno y suero
que contienen el antgeno nativo, una reaccin de la competicin resulta entre el
antgeno nati vo y la conjugacin del enzima-antgeno para un limitado nmero de
insolubles sitios obligatorios. La interaccin es ilustrada por la ec uacin seguida:
REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. SUERO HUMANO DE REFERENCIA -- 1ml/vial - a los frascos del A-F
Seis (6) frascos de referencia del suero para la triiodotironina en las
concentraciones de 0 (A, 0.5 (B), 1.0 (C), 2.5 (D), 5.0 (E) y 7.5 (F) ng/ml. Almacn
en 2-8C. Se ha agregado un preservati vo.
B. ENZIMA CONJUGADA DE T3 T OT AL - 1.5ml/vial - icono
Un (1) frasco de conjugacin de la peroxidasa de T3-horseradish (HRP) en una
matriz albumina- estabilizante. Se ha agregado un preservativo. Almacnese de 28C.
PRECAUCIONES
Para el uso de diagnstic o in Vitro no para el uso interno o externo en seres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antgeno superfic ial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer termine el as eguramiento que los agentes infecciosos estn
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potencialmente peligroso y capaz de transmitir enfermedad. Los buenos
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la s angre se pueden
encontrar en el centro para el c ontrol de enfermedad/el instituto nacional de la
salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgicos y biomdicos," 2da Edicin,
1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.
FORMULA GENERAL:
CANTIDAD DE BUFFER REQUERIDA = el nmero de pozos * 0.1
Cantidad de T 3-Enzima necesaria = numero de pozos * 0.01
Ejemplo = 16 x 0.1 = 1.6ml para T 3/T4 total Buffer c onjugado
16 x 0.01 = 0.16ml (160l) para T3 de la enzima conjugada
PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el anlisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a la temperatura ambiente (20 - 27C).
1. Ajuste a formato los pozos de los micro placas para que cada referencia del
suero, control y espcimen del paciente sean probados en duplicado. Substituya
cualquier tira inusitada del micro pozo nuevamente dentro del bolso de aluminio,
sllela y almacnela en 2-8C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100l) de los anticuerpos etiquetados biotinylated/enzyme a
cada uno bien. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del
pozo cubierto.
4. Remolina el micro placa suavemente por 20-30 segundos a la mezcla y cubre.
5. Incube 60 minutos en la temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido del micro placa por la decantacin o la aspiracin. Si
decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel absorbente.
7. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparac in el reactivo),
decntelo (golpecito contra el papel absorbente o asprelo. Repita dos (2) veces
adicionales para un total de tres (3) lavadas. Una lavadora automtica o manual de
la placa puede ser utilizada. Siga la instruccin del fabricante para el uso
apropiado. Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada uno bien
presionando el envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada.
Decante la lavada y repita dos (2) veces adic ionales.
8. Agregue 0.100 ml (100l) de solucin activadora del substrato a todos los pozos
(vase la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos en
el mismo orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reacc in entre los
pozos.
9. Incube en la temperatura ambiente por quince (15) minutos .
10. Agregue 0.050ml (50l) de la solucin de la parada a cada uno pozo y
mzclese suavemente por 15-20 segundos. Agregue siempre los reac tivos en la
misma orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reaccin entre los
pozos.
11. Lea la absorbenc ia en cada pozo en los 450nm (con una longitud de onda de
referencia a los 620-630nm para reducir al mnimo de imperfecciones en el pozo)
en un lector del micro placa. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta
(30) minutos de agregar la solucin de paro.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los niveles en la gama hipotiroidea, eutiroidea y del hiper-tiroidea para supervisar funcionamiento del anlisis. Estos
controles se deben tratar como desconocidos y valores determinados en cada
mtodo de prueba realizado. Las c artas del control de calidad se deben mantener
para seguir el funcionamiento de los reactivos provistos. Los mtodos estadsticos
pertinentes se deben emplear para comprobar tendencias. La desviacin
significativa del funcionamiento establecido puede indic ar el cambio inadvertido en
condiciones o la degradacin experimentales de los reactivo del kit. Los reactivos
frescos se deben utilizar para determinar la razn de las variaciones.
RESULTADOS
Una curva de la reaccin a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentracin
de T3 en especimenes desconocidos.
1. Registre la absorbencia obtenida del listado del lector del micro placas conforme
al ejemplo 1.
2. Trace la absorbenc ia para cada referencia duplicada del suero contra la
concentracin correspondiente de T3 en ng/ml en el papel de grfico linear (no
haga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
3. Dibuje mejor-caben la curva a travs de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentrac in del T3 para un desconocido, localizar la
absorbencia media de los duplicados para cada des conocido en el eje vertical (ejey) del grfico, encontrar el punto que interseca en la curva, y lea la concentracin
(en ng/ml) del eje horizontal (eje-x) del grfico (los duplicados del desconocido se
pueden hacer un promedio segn lo indicado). En el ejemplo siguiente, la
absorbancia media 1.130 (interseca la curva de la reaccin a cierta dosis en
(1.95ng/ml) la concentracin T3
(Vase Figura1).
EJEMPLO 1
Muestra # Poz o
Abs (A)
A1
2.604
Cal A
B1
2.507
C1
2.073
Cal B
D1
2.128
E1
1.678
Cal C
F1
1.646
G1
0.964
Cal D
H1
0.969
A2
0.550
Cal E
B2
0.551
C2
0.372
Cal F
D2
0.369
Ctrl. 1
E2
1.701
F2
1.638
Ctrl. 2
G2
0.755
H2
0.791
PACIENT EA3
1.145
Paciente B3
1.638
1.130
Los datos presentados en el ejemplo 1 y
solamente y no se deben utilizar en lugar
preparacin de cada ensayo.
Abs (B)
Valor(ng/ml)
2.556
2.101
0.5
1.662
1.0
0.966
2.5
0.551
5.0
0.370
7.5
1.726
0.92
0.734
3.58
1.95
el cuadro 1 estn para la ilustracin
de una c urva de la reaccin a cierta
Es importante tener pres ente que el establecimiento de una gama de los valores
que se espera encontrar por un mtodo dado para una poblacin de "persona-
CA RACTERISTICAS DE ACTUACION
La prec isin en y entre la precisin del anlis is del procedimiento de T3 ELISA por
Microplaca fue determinada por anlisis en tres diversos niveles de los sueros del
control. El nmero, el valor medio, la desviacin de estndar y el coeficiente de
variacin para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 3 y la
tabla 4.
Ultimo Recuadro
Solo una pequea c antidad de referencia de diagonal entre este mtodo y el
mtodo de referencia es indicada por la proximidad de los valores medios. La
ultima ecuacin de regresin del cuadrado y el coeficiente de correlac in indica el
excelente acuerdo del mtodo.
E. Especificidad: La reactividad cruzada del anticuerpo de triiodotironina a las
sustanc ias seleccionadas fue evaluada agregando la sustancia que interfera a una
matriz del suero en varias concentraciones. La reactividad cruzada fu calculada
derivando un cociente entre la dosis de la sustancia que interfera a la dosis de
triiodotironina necesitada para desplazar el mismo trazo de la cantidad.
Sust ancia
I-Triiodotironina
I-Tiroxina
lodotirosina
Diiodotirosina
Diiodotironina
Fen ilbutazona
Sodio Salicylate
Concentracin
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml
SENSIBILIDA D
El procedimiento de sistema de la prueba de Triiodothyronine tiene una sensibilidad
de 0.04ng/ml. que la sensibilidad fue comprobada determinando la variabilidad de
los 0 calibradores del suero de ng/ml y usando la estadstica de la certeza del
2?;(95%) para calcular la dos is mnima.
REFERENCIAS