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Distribuidora de Reactivos y Agentes de Diagnstico para Laboratorio

Blvd. J. Alonso de Torres 312 pte. Col. San Jernimo Len Gto.
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Inserto TriiodothyroninaTotal (T3t) ELISA

MONOBIND, INC.
Cdigo de Producto: 125-300
Intencin de uso:
La determinacin cuantitativa de d e la concentracin de Triiodotironina
Total en suero humano o plasma para un micro pl ato de enzima de
inmun oensayo.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
La medida de la concentracin del triiodothyronina del suero se mira generalmente
como herramienta valiosa en la diagnosis de la disfuncin de la tiroides. Esta
importancia ha proporcionado el mpetu para la mejora signific ativa en la
metodologa del anlisis que ha ocurrido en las dos dcadas pasadas . El
advenimiento anti-suero mono-especifico y el descubrimiento de los agentes de
bloqueo a las protenas obligatorias del suero T 3 han permitido el desarrollo de los
de radioinmunoensayo procedimientos simples (1.2).
Esta metodologa inmunolgica del anlisis de la enzima en micro placa provee la
tc nica con ptima sensibilidad mientras que requiere pocas manipulaciones
tc nicas. En este mtodo, la referencia del suero, el espcimen pac iente, o el
control primero se agrega a un micropozo de la placa. Se agrega la conjugacin del
la enzima de T 3, y entonces los reactivos se mezclan. El resultado de una reaccin
de la competicin entre la enzima conjugada y la triiodotironina nativa para un
nmero limitado de anticuerpo combinando s itios inmovilizados en el pozo.
Despus de la terminacin del perodo requerido de la incubacin, la conjugacin
atada del antic uerpo la enzima de T3 es separada de la conjugacin desatada de
T3 por la aspiracin o la decantacin. La actividad de la enzima presente en la
superficie del pozo es cuantificada por la reaccin con un sustrato conveniente
para producir color. El empleo de varias referencias del suero de la concentracin
sabida de triiodotironina permite la construccin de un grfico de actividad y de
concentracin. De la comparacin a la curva de la reaccin a cierta dosis, la
actividad de un espcimen desconocido se puede correlacionar con la
concentracin de T3.

PR INCI PIO
PRUEBA POR EIA:
Los reactivos esenciales requeridos por una fase slida enzima inmunoensayo
incluyen el anticuerpo inmovilizado, enzima-antgeno conjugado y antgeno nativo.
Mezclando el anticuerpo inmovilizado, conjugacin del enzima-antgeno y suero
que contienen el antgeno nativo, una reaccin de la competicin resulta entre el
antgeno nati vo y la conjugacin del enzima-antgeno para un limitado nmero de
insolubles sitios obligatorios. La interaccin es ilustrada por la ec uacin seguida:

Despus de que logrado el equilibrio, anticuerpo-atado a la fraccin es separado


del antgeno desatado por la decantacin o la aspiracin. La ac tividad enzimtica
del anticuerpo-atado a la fracc in es directamente proporcional a la concentracin
nativa del antgeno. Utilizando diversas referencias del suero de los valores
sabidos del antgeno, una curva de la reaccin a cierta dosis puede ser generada
de la cual la concentracin del antgeno de un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. SUERO HUMANO DE REFERENCIA -- 1ml/vial - a los frascos del A-F
Seis (6) frascos de referencia del suero para la triiodotironina en las
concentraciones de 0 (A, 0.5 (B), 1.0 (C), 2.5 (D), 5.0 (E) y 7.5 (F) ng/ml. Almacn
en 2-8C. Se ha agregado un preservati vo.
B. ENZIMA CONJUGADA DE T3 T OT AL - 1.5ml/vial - icono
Un (1) frasco de conjugacin de la peroxidasa de T3-horseradish (HRP) en una
matriz albumina- estabilizante. Se ha agregado un preservativo. Almacnese de 28C.

C. BUFFER CONJUGADO DE T3/T --13ml - reactivo de la botella del icono


Un (1) frasco que contiene el buffer intermediario, tinte rojo, preservati vo, e
inhibidores atados a la protena. Almacn en 2-C.
D. MICROPL ACA CUBIERT A DE ANTICUERPO T3 -- 96 pozos - mic roplaca 96micropozos del icono
uno cubierto con el suero de las ovejas anti-T3 y
empaquetado en un bolso de aluminio con un elemento deshidratador. Almacn en
2-8C
E. SOLUCION CONCENTRADA (WASH) -- 20ml - icono
Uno (1) frasco que contiene un surfactante en preservativo salino protegido fosfato
de A. Almacn en 2-30 C.
A
F. Substrato A -- 7ml/vial - botella del icono S una (1) que contiene el
tetrametilbenzidina (TMB) en solucin. Almacn en 2-8C.
G. Substrato B -- 7ml/vial - botella del icono SB uno (1) que contiene el perxi do de
hidrgeno (H2O2) Almacnese a 2-8C.
H. SOLUCIN DE PARO -- 8ml/vial - botella del icono
un cido fuerte (1N HCl). Almacnese en 2-30C. I.
I. INSERTO DE LA PRUEBA.

Uno (1) que contiene

Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fec ha de vencimiento del kit.


Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estn
almacenados en 2-8C.
Nota 3: Sobre los reactivo est para un solo micro placa 96-pozos

MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:


1. Mida con una pipeta capaz de entregar los volmenes 50l con una precisin de
mejor de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.300ml
con una precisin de mejor de 1.5%.
3. Lavador de Micro plac as o una botella del apretn pizeta (opcional).
4. Lector de Micro placa con capac idad de la absorbencia de la longitud de onda de
los 450nm - 620nm.
5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la micro placa.
6. plstico envolvente o tapa para la micro placa para los pasos de la incubacin.
7. Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado.
8. Contador de tiempo.
9. Materiales del control de calidad

PRECAUCIONES
Para el uso de diagnstic o in Vitro no para el uso interno o externo en seres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antgeno superfic ial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer termine el as eguramiento que los agentes infecciosos estn
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potencialmente peligroso y capaz de transmitir enfermedad. Los buenos
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la s angre se pueden
encontrar en el centro para el c ontrol de enfermedad/el instituto nacional de la
salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgicos y biomdicos," 2da Edicin,
1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION


Los especimenes sern la sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente
en la coleccin de muestras del veni-punctura deben s er observados. Para la
comparacin exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno
del s uero de la maana debe ser obtenida. La s angre se debe recoger en un tubo
llano del venipunctura del tapn rojo sin los aadidos o los anticoagulantes.
Permita que la sangre coagule. Centrifugue el espcimen para separar el suero de
las clulas . Las muestras se pueden refrigerar en 2-8C por un perodo mximo de
cinc o (5) das. Si el espcimen no se puede probar dentro de este tiempo, la
muestra se puede almacenar en las temperaturas de -20C por hasta 30 das.
Antes de hacer el ensayo traer los reactivos y muestras a temperatura ambiente de
20 C- 27 C Evite congelar y deshelar. Cuando est probado en duplicado,
0.100ml del espcimen se requiere.

PREPAR ACION DE LOS REACTIVOS


REACTIVO DE TRABAJO A - T3-ENZYME SOLUTION.
Diluir la enzima conjugada T3 1:11 con el buffer conjugado de T3/T4 en un envase
conveniente. Por ejemplo, 160l del conjugado con 1.6ml del buffer para 16 pozos
(el exceso leve de A de la solucin se hace). Este reactivo s e debe utilizar dentro
de 24 horas para el funcionamiento mximo del anlisis. Almacnese a 2-8C.

FORMULA GENERAL:
CANTIDAD DE BUFFER REQUERIDA = el nmero de pozos * 0.1
Cantidad de T 3-Enzima necesaria = numero de pozos * 0.01
Ejemplo = 16 x 0.1 = 1.6ml para T 3/T4 total Buffer c onjugado
16 x 0.01 = 0.16ml (160l) para T3 de la enzima conjugada

PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el anlisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a la temperatura ambiente (20 - 27C).
1. Ajuste a formato los pozos de los micro placas para que cada referencia del
suero, control y espcimen del paciente sean probados en duplicado. Substituya
cualquier tira inusitada del micro pozo nuevamente dentro del bolso de aluminio,
sllela y almacnela en 2-8C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100l) de los anticuerpos etiquetados biotinylated/enzyme a
cada uno bien. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del
pozo cubierto.
4. Remolina el micro placa suavemente por 20-30 segundos a la mezcla y cubre.
5. Incube 60 minutos en la temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido del micro placa por la decantacin o la aspiracin. Si
decanta, golpee ligeramente y borre la placa seca con el papel absorbente.
7. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparac in el reactivo),
decntelo (golpecito contra el papel absorbente o asprelo. Repita dos (2) veces
adicionales para un total de tres (3) lavadas. Una lavadora automtica o manual de
la placa puede ser utilizada. Siga la instruccin del fabricante para el uso
apropiado. Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada uno bien
presionando el envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada.
Decante la lavada y repita dos (2) veces adic ionales.
8. Agregue 0.100 ml (100l) de solucin activadora del substrato a todos los pozos
(vase la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos en
el mismo orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reacc in entre los
pozos.
9. Incube en la temperatura ambiente por quince (15) minutos .
10. Agregue 0.050ml (50l) de la solucin de la parada a cada uno pozo y
mzclese suavemente por 15-20 segundos. Agregue siempre los reac tivos en la
misma orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reaccin entre los
pozos.
11. Lea la absorbenc ia en cada pozo en los 450nm (con una longitud de onda de
referencia a los 620-630nm para reducir al mnimo de imperfecciones en el pozo)
en un lector del micro placa. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta
(30) minutos de agregar la solucin de paro.

CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los niveles en la gama hipotiroidea, eutiroidea y del hiper-tiroidea para supervisar funcionamiento del anlisis. Estos
controles se deben tratar como desconocidos y valores determinados en cada
mtodo de prueba realizado. Las c artas del control de calidad se deben mantener
para seguir el funcionamiento de los reactivos provistos. Los mtodos estadsticos
pertinentes se deben emplear para comprobar tendencias. La desviacin
significativa del funcionamiento establecido puede indic ar el cambio inadvertido en
condiciones o la degradacin experimentales de los reactivo del kit. Los reactivos
frescos se deben utilizar para determinar la razn de las variaciones.

RESULTADOS
Una curva de la reaccin a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentracin
de T3 en especimenes desconocidos.
1. Registre la absorbencia obtenida del listado del lector del micro placas conforme
al ejemplo 1.
2. Trace la absorbenc ia para cada referencia duplicada del suero contra la
concentracin correspondiente de T3 en ng/ml en el papel de grfico linear (no
haga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
3. Dibuje mejor-caben la curva a travs de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentrac in del T3 para un desconocido, localizar la
absorbencia media de los duplicados para cada des conocido en el eje vertical (ejey) del grfico, encontrar el punto que interseca en la curva, y lea la concentracin
(en ng/ml) del eje horizontal (eje-x) del grfico (los duplicados del desconocido se
pueden hacer un promedio segn lo indicado). En el ejemplo siguiente, la
absorbancia media 1.130 (interseca la curva de la reaccin a cierta dosis en
(1.95ng/ml) la concentracin T3
(Vase Figura1).

Nota: El software de la reduccin de datos de la computadora diseado para los


anlisis de ELISA se puede tambin utilizar para la reduccin de datos.

EJEMPLO 1
Muestra # Poz o
Abs (A)
A1
2.604
Cal A
B1
2.507
C1
2.073
Cal B
D1
2.128
E1
1.678
Cal C
F1
1.646
G1
0.964
Cal D
H1
0.969
A2
0.550
Cal E
B2
0.551
C2
0.372
Cal F
D2
0.369
Ctrl. 1
E2
1.701
F2
1.638
Ctrl. 2
G2
0.755
H2
0.791
PACIENT EA3
1.145
Paciente B3
1.638
1.130
Los datos presentados en el ejemplo 1 y
solamente y no se deben utilizar en lugar
preparacin de cada ensayo.

Abs (B)

Valor(ng/ml)

2.556

2.101

0.5

1.662

1.0

0.966

2.5

0.551

5.0

0.370

7.5

1.726

0.92

0.734

3.58

1.95
el cuadro 1 estn para la ilustracin
de una c urva de la reaccin a cierta

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD


En orden de que los res ultados del anlisis sean considerados vlidos los criterios
siguientes deben ser resueltos:
1. La absorbancia (OD) del calibrador F debe ser > 1.3.
2. Cuatro fuera de seis POOL del control de calidad deben estar dentro de los
rangos.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO


A. Funcionamiento
1. Del Anlisis. Es importante que el tiempo de la reaccin en cada uno pozos est
llevada a cabo constante para los resultados por reproducir.
2. El medir c on una pipeta de muestras no debe extender ms all de diez (10)
minutos para evitar la deriva del anlisis.
3. Si se utiliza ms de una (1) placa, se recomienda repetir la curva de la reaccin
a cierta dosis.
4. La adicin de la solucin del sustrato inicia una reaccin cintic a, que es
terminada por la adicin de la solucin de paro. Por lo tanto, la adicin del sustrato
y de la solucin que se deber agregar en la misma secuencia para eliminar en
cualquier momento la variacin de tiempo durante la reaccin.
5. Los lectores de la placa miden verticalmente. No toque el fondo de los poz os.
6. La falta de retirar la solucin adecuadamente en el paso del lavado y de la
aspiracin o de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a resultados
falsos.
7. Utilice los componentes del mismo lote. No mezcle reactivos de diferentes lotes.
B. Interpretacin
1. Si la reduccin de datos c ontrolados de la computadora se utiliza para interpretar
los res ultados de la prueba, es imprescindible que los valores predichos para los
calibradores bajen dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. La concentracin total de triiodotironina del suero es dependiente sobre una
multiplicidad de factores: funcin de la glndula de tiroides y su regulacin,
concentracin obligatoria de la globulina de la tiroxina (TBG), y el atascamiento de
triiodotironina a TBG (3, 4). As, la concentracin total de triiodotironina solamente
no es suficiente para determinar un estado clnico.
3. Una disminucin de valores totales de triiodotironina se encuentra con
enfermedades en las que se pierden protenas, ciertas enfermedades del hgado y
la administracin de la testosterona, del diphenylhydantoin o de los salicylates. Una
tabla de las drogas que interferan y de las condiciones, que afectan valores totales
de triiodotironina, ha sido compilada por el diario de la asociacin americana de los
qumicos clnicos 3.

RANGOS ESPERA DOS Y VALORES


Un estudio de la poblacin eutiroidea adulta fue emprendido para determinar los
valores previstos para el sistema de la prueba del T3 EIA. El (R) signific ado valora
las desviaciones de estndar (?) y los rangos previstos (2 s) se presentan en la
tabla 1. El nmero total de muestras era 105.

Es importante tener pres ente que el establecimiento de una gama de los valores
que se espera encontrar por un mtodo dado para una poblacin de "persona-

normal" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la especificidad del


mtodo, de la poblacin probada y de la precisin del mtodo en las manos del
analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender de la gama de valores
esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que una gama interna de
valores determinados por los analistas usando el mtodo con una poblacin
indgena al rea en la cual el laboratorio est situado.

CA RACTERISTICAS DE ACTUACION
La prec isin en y entre la precisin del anlis is del procedimiento de T3 ELISA por
Microplaca fue determinada por anlisis en tres diversos niveles de los sueros del
control. El nmero, el valor medio, la desviacin de estndar y el coeficiente de
variacin para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 3 y la
tabla 4.

Ultimo Recuadro
Solo una pequea c antidad de referencia de diagonal entre este mtodo y el
mtodo de referencia es indicada por la proximidad de los valores medios. La
ultima ecuacin de regresin del cuadrado y el coeficiente de correlac in indica el
excelente acuerdo del mtodo.
E. Especificidad: La reactividad cruzada del anticuerpo de triiodotironina a las
sustanc ias seleccionadas fue evaluada agregando la sustancia que interfera a una
matriz del suero en varias concentraciones. La reactividad cruzada fu calculada
derivando un cociente entre la dosis de la sustancia que interfera a la dosis de
triiodotironina necesitada para desplazar el mismo trazo de la cantidad.

Sust ancia
I-Triiodotironina
I-Tiroxina
lodotirosina
Diiodotirosina
Diiodotironina
Fen ilbutazona
Sodio Salicylate

Rea ctividad Cruzada


1.0000
< 0 .0002
< 0 .0001
< 0 .0001
< 0 .0001
< 0 .0001
< 0 .0001

Concentracin
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml
10g/ml

SENSIBILIDA D
El procedimiento de sistema de la prueba de Triiodothyronine tiene una sensibilidad
de 0.04ng/ml. que la sensibilidad fue comprobada determinando la variabilidad de
los 0 calibradores del suero de ng/ml y usando la estadstica de la certeza del
2?;(95%) para calcular la dos is mnima.

REFERENCIAS

* Segn lo medido en diez experimentos en duplicado sobre un perodo de diez


das. B. La exactitud del sistema de prueba de T3 por EIA fue comparada con un
mtodo de referencia de radioinmunoanlisis. Los especimenes biolgicos de
poblaciones hipotiroideas, eutiroideo y de hipertiroideo fueron utilizados (los valores
se extendieron de 0.15ng/ml - 8.0ng/ml). El nmero total de tales especimenes era
120. La menos ecuacin de la regres in del cuadrado (y = mx+b) y el coeficiente
de correlacin eran c omputados para el T3 EIA en comparacin con el mtodo de
referencia. Los datos obtenidos se exhiben en la tabla 4.

1. Gharib, H., Ryan, R.J., Mayberry, W.E., & Hockett, T.,


"Radioimmunoassay for Triiodothyronine (T3):.Affinity and
Specificity of Antibody for T3",J Clinical Endocrinol., 33,509
(1971)
2. Chopra, I.J., Ho, R.S.,& Lam, R. "An improved radioimmunoassay
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Med., 80, 729 (1971).
3. Young, D.S., Pestaner, L.C., and Gilberman, U., "Effects of
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Thyroid A Fundamental and Clinical Text 7th Ed. Philadelphia.
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(triiodothyronine) measurement in serum by time resolved
flourescence immunoassay. Clin.Chem.,37:1029.1991.

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