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Avenida Luiz Boiteux Piazza, 1302 Florianpolis SC Brasil - CEP 88056-000
Pncreas (ATCC/Lote 61181029) e Melanoma humano (ATCC/Lote 61573377). Concentraes maiores no puderam ser
testadas devido a alterao do pH do meio de cultura. Para efeito de comparao, foram utilizados quimioterpicos
comercializados e utilizados para o tratamento clnico dos tumores avaliados (carcinoma de Pncreas e Melanoma). A
droga controle positivo utilizado para o carcinoma de Pncreas foi a Gencitabina (European Pharmacopoeia), um
anlogo de nucleosdeo, e para o Melanoma foi utilizado a Cisplatina (Sigma-Aldrich), um inibidor da sntese de DNA,
ambos nas concentraes de 0,1 M, 0,3 M, 1 M, 3 M e 10 M. Os resultados foram expressos em porcentagem de
clulas viveis em relao ao controle, e foi calculada a concentrao que causou a morte em 50% das clulas, ou seja, a
CI50 e a maior inibio observada nas concentraes utilizadas.
4. RESULTADOS
4.1 Escolha do melhor tempo de incubao dos compostos atravs do ensaio de citotoxicidade por MTT
A incubao das clulas de Melanoma com a Substncia Teste Monoetanolamina nas concentraes de 1.000
e 10.000 M ou com a Substncia de Referncia Cisplatina nas concentraes de 1 e 10 M, foi capaz de reduzir a
viabilidade celular aps 24 e 48 horas de incubao. Atravs desta anlise, foi utilizado o perodo de incubao de 48
horas para as avaliaes posteriores das diferentes concentraes das Fosfoetanolamina, Monoetanolamina,
Fosfobisetanolamina e da Cisplatina nas clulas de Melanoma humano. A alterao na viabilidade celular das clulas de
carcinoma de Pncreas somente ocorreu pela incubao com a Substncia Teste Monoetanolamina por um perodo de
48 horas e somente na maior concentrao (10.000 M). Aps 72 horas de incubao tanto a Monoetanolamina (1.000
e 10.000 M), quanto a Substncia de Referncia Gencitabina (1 e 10 M), apresentaram atividade citotxica sobre as
clulas de carcinoma de Pncreas. Sendo assim, para as avaliaes posteriores das diferentes concentraes das
Fosfoetanolamina, Monoetanolamina, Fosfobisetanolamina e da Gencitabina nas clulas de Carcinoma de Pncreas
humano, foi utilizado o perodo de 72 horas de incubao dos compostos.
4.2 Avaliao da citotoxicidade dos compostos atravs do ensaio de MTT
Os tratamentos com veculo (meio de cultura) ou com as Substncias Teste Fosfoetanolamina e
Fosfobisetanolamina nas concentraes de 100 M, 300 M, 1.000 M, 3.000 M e 10.000 M no resultaram em
nenhuma alterao sobre a viabilidade celular (citotoxicidade), tanto nas clulas de Melanoma, quanto nas de
carcinoma de Pncreas. No entanto, a incubao de Monoetanolamina nos meios de culturas nas concentraes de
100 M, 300 M, 1.000 M, 3.000 M e 10.000 M causou reduo proporcional a concentrao empregada da
viabilidade das clulas (citotoxicidade) de Melanoma, com IC50 aproximada de 7.774 M e inibio de 62,3%, bem como
nas clulas de carcinoma de Pncreas, com IC50 aproximada de 5.525 M e inibio de 75,3 %. O medicamento
antitumoral Cisplatina, utilizado como controle positivo sobre as clulas tumorais de Melanoma, apresentou IC50
aproximada de 2,96 M e inibio de 86,8%, j a Gencitabina, um antitumoral utilizado para o carcinoma de Pncreas
apresentou IC50 < 0,1 M. Assim, a Monoetanolamina foi aproximadamente 2.600 vezes menos potente que a Cisplatina
em relao a citotoxicidade de clulas de Melanoma. As CI50s tambm esto descritas no anexo I deste relatrio.
4.3 Avaliao da citotoxicidade dos compostos atravs do ensaio de Vermelho Neutro
A incubao das clulas com o veculo (meio de cultura) ou com as Substncias Teste Fosfoetanolamina e
Fosfobisetanolamina nas concentraes de 100 M, 300 M, 1.000 M, 3.000 M e 10.000 M no resultou em
nenhuma alterao na viabilidade celular (citotoxicidade) tanto nas clulas de Melanoma, quanto nas de carcinoma de
Pncreas, no ensaio de Vermelho Neutro. J a Monoetanolamina utilizada nas concentraes de 100 M, 300 M, 1.000
M, 3.000 M ou 10.000 M resultou em reduo da viabilidade das clulas (citotoxicidade), de forma proporcional a
concentrao usada, sobre as clulas de Melanoma, com IC50 superior a 10.000 M (inibio de 45,0%), bem como nas
clulas de carcinoma de Pncreas, com IC50 aproximada de 6.861 M e inibio de 64,2%. O antitumoral Cisplatina,
utilizado como controle positivo sobre as clulas tumorais de Melanoma apresentou IC50 de 3,4 M e inibio de 75,6%.
A Gencitabina, um antitumoral utilizado para o carcinoma de Pncreas apresentou IC 50 < 0,1 M. As CI50s esto descritas
na tabela 1 deste resumo.
4.4 Avaliao da proliferao celular dos compostos atravs do ensaio de incorporao pela Sulforrodamina B
A incubao das clulas com o veculo (meio de cultura) ou com as Substncias Teste Fosfoetanolamina e
Fosfobisetanolamina nas concentraes de 100 M, 300 M, 1.000 M, 3.000 M e 10.000 M no resultou em
nenhuma alterao significativa sobre a proliferao celular, tanto nas clulas de Melanoma, quanto nas de carcinoma
de Pncreas. A Monoetanolamina utilizada nas concentraes de 100 M, 300 M, 1.000 M, 3.000 M e 10.000 M
resultou em reduo proporcional a concentrao empregada sobre a proliferao de clulas de Melanoma, com IC50
aproximada de 7.413 M e inibio de 63,4 %, e nas clulas de carcinoma de Pncreas, com IC 50 aproximada de 3.347
M e inibio de 64,2 %. O antitumoral Cisplatina, utilizado como controle sobre as clulas tumorais de Melanoma
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apresentou uma IC50 aproximada de 1,13 M e inibio de 100 %. A Gencitabina, um antitumoral utilizado para o
carcinoma de Pncreas apresentou uma IC50 < 0,1 M. Assim a Monoetanolamina foi aproximadamente 6.500 vezes
menos potente que a Cisplatina em relao a proliferao de clulas de Melanoma. As CI50s esto descritas na tabela 1
deste resumo.
5. CONCLUSO DO ESTUDO
Os resultados descritos neste relatrio parcial demostram que somente a Monoetanolamina apresentou
atividade citotxica e antiproliferativa, sendo contudo, vrias ordens de magnitude menos potente que os antitumorais
Cisplatina e Gencitabina, utilizados como controle positivo. J a Fosfoetanolamina e a Fosfobisetanolamina no
apresentaram nenhuma atividade citotxica nem antiproliferativa em nenhuma das 3 metodologias utilizadas.
6. PRXIMAS ETAPAS
1) Sero realizados ensaios para avaliar a atividade citotxica e antiproliferativa dos trs compostos (Fosfoetanolamina,
Monoetanolamina e Fosfobisetanolamina), utilizando as metodologias de MTT, Vermelho Neutro e Sulforrodamina B
em clulas de carcinoma de Pulmo (ATCC).
2) Sero realizados ensaios para avaliao da atividade citotxica e antiproliferativa para a Monoetanolamina utilizando
as metodologias de MTT, Vermelho Neutro e Sulforrodamina B em clulas humanas sem cncer (fibroblasto).
3) Sero realizados ensaios in vitro para avaliar possveis mecanismos responsveis pelas atividades antiproliferativas
da monoetanolamina.
4) Ser avaliada possvel atividade anticncer in vivo da Monoetanolamina e da Fosfoetanolamina (USP) no modelo de
tumor xenogrfico de melanoma em camundongos nude (animal atmimico transplantado com clulas de tumor
humano).
7. REFERNCIAS
Albanesi, C. Keratinocytes in allergic skin diseases. Current Opinion in Allergy and Immunology (2010), 10:452456.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity
assays.J Immunol Methods. (1983) 16;65 (1-2):55-63.
Borenfreund E, Puerner JA. A simple quantitative procedure using monolayer cultures for cytotoxicity assays (HTD/NR90). Journal of tissue culture methods. (1985) 9: 7-9.
Outhouse EL. Amino-ethyl phosphoric ester from tumours. Biochem J. (1936) 30:197201.
Ferreira AK, et al. Anticancer effects of synthetic phosphoethanolamine on Ehrlich ascites tumor: an experimental study.
Anticancer Res. (2012) 32(1):95-104.
Ferreira AK, et al. Synthetic phosphoethanolamine has in vitro and in vivo anti-leukemia effects. British Journal of
Cancer (2013) 109, 28192828.
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mice bearing melanoma B16-F10 and in vitro induce apoptosis and arrest in G2/M phase. Biomedicine &
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Study. Anticancer Research (2012) 32: 95-104.
Ferreira AK, et al. Anti-Angiogenic and Anti-Metastatic Activity of Synthetic Phosphoethanolamine. Plos One (2013) 8:3.
TABELA 1
LINHAGEM
Melanoma
Carcinoma
de
Pncreas
MONOETANOLAMINA
CISPLATINA
GENCITABINA
7.774 M
2,9 M
----
3,4 M
----
Proliferao
7.413 M
1,1 M
----
5.525 M
----
6.861 M
----
3347 M
----
Citotoxicidade
(MTT)
Citotoxicidade
(Vermelho N)
Proliferao
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