DECONVOLUCIN

La deconvolucin surgi como alternativa al confocal, con ella se pretenda eliminar la luz
fuera de foco de imgenes tomadas con una cmara digital o en fluorescencia
convencional, pero poco a poco ha ido avanzando y se ha adaptado para mejorar
imgenes tomadas tambin en un confocal.
El proceso de deconvolucin depura las imgenes, utilizando una serie de cortes de la
muestra el programa reconoce la luz fuera de foco a travs del psf, proporcionndonos
una imagen ms limpia y con ms detalle.
En definitiva, el proceso de deconvolucin consigue mostrarnos lo que el sistema ptico
no llega a ver, siendo capaz de separar estructuras que antes no ramos capaces de
diferenciar.

Para hacer deconvolucin hay que tener en cuenta dos factores:

- El criterio de Nyquist
- El psf (Point Spread Function)
Si algn factor fallase, la deconvolucin de nuestra imagen no sera la ptima.
El criterio de Nyquist determina la densidad mnima de la muestra necesaria para
capturar toda la informacin de la imagen desde el microscopio. Lo que necesita es una
informacin mnima por pxel, para poder tener la mayor cantidad de datos a la hora de
procesar la imagen.

Si nuestra imagen no cumple el criterio de Nyquist, la resolucin y la informacin con la

que tiene que trabajar el software estarn por debajo de lo necesario, producindose un
procesamiento ms lento y un resultado de peor calidad.
El psf es el lmite de resolucin que tiene el equipo donde se han tomado las imgenes.
Para saber este lmite se toman secciones de imgenes que estn por debajo del lmite de
resolucin, que es 0.2 m, y de estos cortes se consigue la informacin necesaria para
construir el psf.

psf en eje xy

Estas imgenes contienen informacin sobre el ndice de difraccin y posibles errores en

nuestro equipo. A partir de esta informacin se calcula el psf con los limites de resolucin
de nuestro equipo, de manera que cuando se haga el proceso de deconvolucin lo que se
intentar ser eliminar los ordenes de difraccin que quedan por fuera del punto central
al igual que se intenta deshacer de los halos que se encuentran alrededor de ste.

psf en el eje xy

psf en el eje xz

Si no se pudiesen tomar estos cortes de imgenes por debajo del nivel de resolucin, el
propio programa tiene una opcin para calcular directamente el psf, lo que llama psf
terico. En ese proceso el software calcula el psf a partir de la imagen que
posteriormente queremos tratar en deconvolucin.
En definitiva, la deconvolucin lo que intenta es eliminar los rdenes de difraccin y dejar
tan slo el punto central, eliminando as la luz fuera de foco.

Si no tenemos un buen psf el software no tendr la informacin suficiente para

diferenciar entre pixels que se corresponden con luz fuera de foco o no, producindose
una imagen de deconvolucin que apenas mejorar la original.
Para trabajar con estos programas se necesitan aparatos informticos de gran potencia ya
que son programas que continuamente estn haciendo clculos y necesitan mover
informacin a velocidades muy altas, estos software normalmente se encuentran en
ordenadores compuestos por ms de un procesador y con un tamao de memoria
bastante elevado.

HUYGENS

PROCESO DE DECONVOLUCIN
Hay que fijarse en la tabla de informacin y clculos necesarios para realizar
correctamente la deconvolucin.
http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/images/TextBox/Calculos_Deconvolucion.pdf

De esta tabla obtendremos los valores necesarios para hacer bien la deconvolucin
dependiendo del objetivo que tengamos y el fluorforo que estemos utilizando, como hay
bastante diferencia entre un fluorforo y otro, lo ptimo sera hacer la deconvolucin de
los canales por separado y una vez hecha la deconvolucin mezclar los canales.
Dentro de esta tabla nos tendremos que fijar dependiendo de si vamos a tomar imgenes
en confocal o en una cmara ccd, en:
Excitation: mide en nm la longitud de onda de excitacin que tiene el fluorforo.
Emission: mide en nm la longitud de onda, en este caso la de emisin (siempre
mayor que la de excitacin).
Pinhole (Airy units): parmetro de los confocales Zeiss, valor de Airy units para
conseguir un iris o pinhole ptimo.
Backprojected pinhole: este valor solo es para confocal y las imgenes del META
ya llevan el valor si se han guardado en formato .lsm dependiendo de la
apertura del pinhole o iris.

 Tamao Pxel: tambin en nm, es el tamao que debemos conseguir en nuestra

imagen a travs del zoom en el confocal. Ojo!! en el confocal nos dar el valor
en m Tambin podemos intentar conseguir esos tamaos de pxel utilizando la
mxima resolucin 2048x2048, para que de esta manera no se tenga que hacer
tanto zoom.
Secciones Confocal: valor que nos da en nm y que tenemos que tener en cuenta a
la hora de tomar secciones, ya que se refiere a la distancia step entre secciones.
El confocal normalmente da el valor en m.
Una vez que hayamos tomado las imgenes con los parmetros necesarios podemos
empezar el proceso de deconvolucin.

HUYGENS
Para entrar al programa tendremos que entrar en el sistema operativo Linux y con la
cuenta de usuarios. Una vez dentro abrimos el programa que aparece en el escritorio con
el siguiente smbolo:

MANEJO PROGRAMA
Al entrar en el programa, lo primero es abrir las imgenes que queremos procesar,
utilizando el men File/ Open:

Una vez abierta la imagen

Seleccionar la imagen y con el botn
derecho del ratn nos saldr un
men.

Para introducir los parmetros de la imagen. Si

hemos tomado las imgenes en el confocal Zeiss, reconoce bien los parmetros, el nico
valor a modificar sera el Refractive indexes: Medium, mirar la tabla de indices de
refraccion:
http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/images/TextBox/Indices_Refraccion.pdf

Para visualizar la imagen.

Para realizar de deconvolucion y calculos de PSFs.