Professional Documents
Culture Documents
Z „BIOCHEMII ZWIERZĄT”
MARIA MIKA
KRAKÓW 2010
-1-
SPIS TREŚCI
2. Węglowodany.....................................................................................................................................5
2.1. Badanie własności monosacharydów, disacharydów i polisacharydów.....................................12
2.1.1. Reakcja Molischa z α -
nafolem........................................................................................12
2.1.2. Reakcja Seliwanowa z rezorcyną na ketozy.....................................................................12
2.2. Wykrywanie pentoz........................................................................................................................13
2.2.1. Próba Biala z orcyną na pentozy......................................................................................13
2.3. Reakcje redukcyjne.....................................................................................................................13
2.3.1. Reakcja Trommera............................................................................................................13
2.3.2. Reakcja Fehlinga..............................................................................................................14
2.3.3. Reakcja Bendedicta...........................................................................................................14
2.3.3. Reakcja Tollensa...............................................................................................................14
2.4. Disacharydy................................................................................................................................15
2.4.1. Hydroliza kwaśna sacharozy.............................................................................................15
2.5. Polisacharydy..............................................................................................................................15
2.5.1. Reakcja skrobi z jodem.....................................................................................................16
2.5.2. Reakcja glikogenu z jodem...............................................................................................17
2.5.3. Hydroliza kwaśna skrobi...................................................................................................17
2.6. Osazony.......................................................................................................................................17
2.7. Identyfikacja cukrów..................................................................................................................19
3. Aminokwasy....................................................................................................................................20
3.1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów............................................................................21
3.1.1. Miareczkowanie glicyny metodą Sorensena.....................................................................21
3.1.2. Reakcja van Slyke’a z kwasem azotowym (III)..............................................................22
3.1.3. Reakcja ninhydrynowa.....................................................................................................23
3.1.4. Reakcja dla cysteiny.........................................................................................................23
3.1.5. Reakcja ksantoproteinowa dla aminokwasów aromatycznych........................................24
3.1.6. Reakcja dla układu indolowego w tryptofanie................................................................24
3.1.7. Reakcja Sakaguchiego dla układu guanidynowego w argininie......................................25
4. Białka................................................................................................................................................26
4.1. Reakcje charakterystyczne dla białek.........................................................................................27
4.1.1. Wykazanie amfoterycznego charakteru białek.................................................................27
4.1.2. Zachowanie się białek w obecności kwasów....................................................................27
4.1.3. Zachowanie się białek w obecności zasad.......................................................................27
4.2. Białka jako koloidy.....................................................................................................................27
4.3. Denaturacja białek......................................................................................................................28
4.3.1. Denaturacja cieplna..........................................................................................................29
4.3.2. Denaturacja pod wpływem etanolu..................................................................................29
4.3.3. Denaturacja pod wpływem stężonego kwasu siarkowego...............................................29
4.3.4. Strącanie białka za pomocą kationów..............................................................................29
4.3.5. Strącanie białka za pomocą anionów...............................................................................30
4.4. Reakcje barwne białek...............................................................................................................30
4.4.4. Reakcja biuretowa............................................................................................................30
4.4.5. Reakcja Libermana...........................................................................................................31
4.5. Oczyszczanie białek metodą dializy...........................................................................................31
4.6. Kolorymetria...............................................................................................................................33
4.6.1. Ilościowe oznaczenie białka w surowicy krwi metodą Lowry’ego..................................35
-2-
5. Kwasy nukleinowe...........................................................................................................................36
5.1. Badanie własności kwasów nukleinowych.................................................................................37
5.1.1. Hydroliza kwasów nukleinowych , badanie produktów hydrolizy...................................37
5.2. Odróżnienie RNA od DNA..........................................................................................................39
5.2.1. Reakcja orcynolowa.........................................................................................................39
5.2.2. Reakcja z difenyloaminą..................................................................................................39
6. Lipidy...............................................................................................................................................40
6.1. Reakcje charakterystyczne dla lipidów prostych.......................................................................41
6.1.1. Rozpuszczalność lipidów.................................................................................................41
6.1.2. Badane składu lipidów prostych – próba akroleinowa....................................................41
6.1.3. Reakcja zmydlania...........................................................................................................42
6.1.4. Wykazane obecności w lipidach prostych nienasyconych kwasów tłuszczowych
– reakcja HÜbla................................................................................................................44
6.1.5. Utlenianie wiązania podwójnego.....................................................................................44
6.2. Tłuszcze złożone – badanie składu lecytyn...............................................................................44
6.2.1. Wykrywanie glicerolu......................................................................................................45
6.2.2. Wykrywanie kwasów tłuszczowych................................................................................45
6.2.3. Wykrywanie kwasu fosforowego....................................................................................45
7. Cholesterol........................................................................................................................................46
7.1. Reakcje charakterystyczne dla cholesterolu...............................................................................46
7.1.1. Reakcja Salkowskiego......................................................................................................46
7.1.2. Reakcja Libermana-Burcharda.........................................................................................46
8. Kwasy żółciowe................................................................................................................................47
8.1. Reakcje charakterystyczne dla kwasów żółciowych.................................................................47
8.1.1. Próba Haya........................................................................................................................47
8.1.2. Emulgujące działanie żółci...............................................................................................47
8.1.3.. Próba Pettenkofera...........................................................................................................47
9. Hormony steroidowe........................................................................................................................48
9.1. Reakcje charakterystyczne dla hormonów steroidowych..........................................................50
9.1.1. Reakcja Zimmermanna.....................................................................................................50
9.1.2. Reakcja Kobera.................................................................................................................50
9.1.3. Reakcja Portera-Silbera....................................................................................................50
9.1.4. Reakcja z błękitem tetrazoliowym....................................................................................50
10. Hemoglobina...................................................................................................................................51
10.1. Wykrywanie oraz oznaczanie hemoglobin i jej pochodnych..................................................52
10.1.1. Otrzymywanie methemoglobiny....................................................................................52
10.1.2. Otrzymywanie hematyny kwasowej..............................................................................52
10.1.3. Otrzymywanie hematyny zasadowej i hemochromogenu.............................................53
12. Witaminy........................................................................................................................................56
12.1. Reakcje charakterystyczne dla witamin rozpuszczalnych w wodzie....................................60
12.1.1. Wykrywanie obecności witaminy B1 – metoda Jensena.............................................60
12.1.2. Wykrywanie obecności witaminy B2 – metoda Eulera i Adlera.................................60
-3-
13. Enzymy..........................................................................................................................................63
13.1. Kinetyka reakcji enzymatycznych.........................................................................................64
13.1.1. Badanie szybkości reakcji I- rzędu i wyznaczanie stałej K na przykładzie
hydrolizy sacharozy...................................................................................................65
13.2. Enzymy reakcje barwne.........................................................................................................67
13.2.1. Wykrywanie katalazy.................................................................................................67
13.2.2. Wykrywanie peroksydazy..........................................................................................67
13.2.3. Wykrywanie oksydazy fenolowej..............................................................................68
13.2.4. Wykrywane oksydazy polifenolowej.........................................................................68
13.2.5. Rozkład mocznika pod wpływem ureazy...................................................................68
13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę.........................................................................69
13.2.7. Ilościowe oznaczanie aktywności amylazy śliny metodą Wolghemuta.....................69
13.2.8. Oznaczenie aktywności fosfatazy zasadowej w surowicy krwi zwierząt
gospodarskich.............................................................................................................71
-4-
1. Laboratorium chemiczne jest miejscem pracy w którym należy zachowywać się w sposób
odpowiedzialny i poważny.
2. W laboratorium znajdują się płyny żrące , łatwo palne , trujące , barwiące, dlatego należy
pracować w fartuchu ochronnym.
3. Na stołach laboratoryjnych znajdują się zestawy odczynników które są dokładnie opisane. Przed
opuszczeniem sali trzeba sprawdzić , czy wszystkie odczynniki znajdują się na swoim miejscu.
4. Korzystając z odczynników , należy pamiętać iż otwierając butelkę trzeba odłożyć korek tak ,aby
nie zabrudzić stołu. Po użyciu odczynnika butelkę zamknąć korkiem i odstawić na właściwe
miejsce.
5. Nie wolno używać tej samej pipety szklanej lub końcówki pipety automatycznej do różnych
roztworów. Nie wlewać raz pobranego roztworu ponownie do butelki.
6. Należy starannie usunąć rozlane na stół lub podłogę odczynniki.
7. Przy ogrzewaniu cieczy nad palnikami należy zwrócić uwagę na ustawienie probówki pod
odpowiednim kątem i zachować bezpieczeństwo pracy.
8. Odczynniki stężone i żrące znajdują się pod digestorium. Podczas pracy z nimi należy zachować
szczególną ostrożność i zabezpieczyć się , stosując opuszczoną szybę wyciągu. Wszystkie
odczynniki stanowią potencjalne zagrożenie , szczególnie dla oczu oraz błon śluzowych jamy ustnej i
nosa.
9. Nie wolno pipetować ustami stężonych kwasów, zasad, bromu i roztworów cyjanków.
Posługujemy się w tym celu pipetami zaopatrzonymi w gruszki gumowe, pipetami automatycznymi,
lub biuretami.
10. Żadnej substancji nie bada się smakiem.
11. W wypadku oparzenia się kwasem , należy natychmiast przemyć skórę roztworem węglanu
amonu lub węglanu sodu. W wypadku poparzenia się zasadą - przemyć skórę rozcieńczonym
roztworem kwasu octowego, a następnie spłukać wszystko wodą.
12. W razie dostania się kwasu lub zasady do ust - natychmiast przepłukać je duża ilością wody , a
następnie wymienionymi w p. 11 roztworami. W przypadku połknięcia roztworu kwasu lub zasady -
wypić dużą ilość mleka lub wody z surowym białkiem jaja.
13. Jeżeli jakiś płyn dostanie się do oka ,natychmiast należy przemyć go dużą ilością wody.
14. Każdy wypadek np. poparzenia lub skaleczenia należy zgłosić osobie prowadzącej ćwiczenia.
15. Wiele odczynników stosowanych w laboratorium biochemicznym jest truciznami , często więc
należy myć ręce, a bezwzględnie przed opuszczeniem laboratorium.
16. Po wykonaniu ćwiczeń laboratoryjnych i sprawdzeniu ich przez osobę prowadząca ćwiczenia
zawartość probówek wylewa się do specjalnie przygotowanych pojemników ,nigdy do zlewu!
17. Przed opuszczeniem laboratorium sprawdź czystość i porządek na swoim stanowisku pracy.
-5-
2. WĘGLOWODANY.
MONOSACHRYDY
Aldozy (grupa –CHO przy C1) Ketozy ( grupa –C=O przy C2)
Triozy ← 3 → -
Tetrozy ← 4 → terulozy
Pentozy ← 5 → pentulozy
Heksozy ← 6 → heksulozy
Szereg aldoz
-6-
Szereg ketoz
Cukry proste tworzą dwa szeregi konfiguracyjne D i L przy czym cukry które naturalne występują
w przyrodzie głównie należą do szeregu D. Przynależność danego cukru do szeregu D lub L zależy
od konfiguracji grupy OH i H przy ostatnim asymetrycznym atomie węgla tj. C4 dla pentoz i C5 dla
heksoz. Węgiel asymetryczny to taki węgiel który posiada cztery różne podstawniki (w postaci
atomów lub grup atomów).
-7-
Jeżeli grupa alkoholowa OH przy ostatnim węglu asymetrycznym jest po stronie prawej to taki
cukier należy do szeregu D , jeśli jest po stronie lewej do szeregu L.
Aldehyd D- glicerynowy Aldehyd L- glicerynowy
Od ilości węgli asymetrycznych w cząsteczce cukrów zależy ilość jego odmian optycznych tzw.
stereoizomerów. Zgodnie z regułą La Bel-Van’t Haffa przy „n” asymetrycznych węgla istnieje 2 n
odmian stereoizomerów. np. 21 = 2 (triozy), 22 = 4 (terozy) itd.
Obecność węgli asymetrycznych nadaje również cukrom zdolność optyczną skręcania płaszczyzny
światła spolaryzowanego (monochromatycznego) , które przechodzi przez dany monocukier lub jego
roztwór. Jeśli cukier skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego w prawo to jest to forma (+) ,
gdy w lewo (-). Prawo – lub lewoskrętność danego związku zależy od asymetrii wszystkich grup
alkoholowych (OH) natomiast przynależność do szeregu D lub L od asymetrii tylko jednej grupy
alkoholowej, która znajduje się przy ostatnim węglu asymetrycznym tj. węglu C4 w pentozach i C5
heksozach.
Oznacza to, że przynależność monosacharydu do szeregu D lub L nie pozostaje w żadnym
związku z jego prawo- lub lewoskrętnością i dlatego istnieją cukry należące do szeregu D, które
skręcają płaszczyzną światła spolaryzowanego w lewo np. D-fruktoza (-92,30).
Cechą charakterystyczna cukrów prostych jest zdolność tworzenia form cyklicznych
(pierścieniowych) w środowisku obojętnym lub słabo kwaśnym. Podczas cyklizacji powstaje nowy
węgiel asymetryczny przy C1 w aldozach i C2 w ketozach , przy czym cukry mogą cyklinować w
formy piranozowe lub furanozowe.
piran furan
-8-
Nowopowstały węgiel asymetryczny C1 w aldozach i C2 w ketozach nosi nazwę węgla
anomerycznego, a zachodzące zjawisko anomerii. Utworzenie nowego węgla daje możliwość
różnego ułożenia podstawników tj. grupy OH i H przy tym węglu, powstają więc anomery α i β .
Anomer α - występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy
ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji cis tj. po tej samej stronie cząsteczki.
Anomer β - występuje gdy nowopowstała grupa OH przy węglu anomerycznym i grupa OH przy
ostatnim węglu asymetrycznym jest w pozycji trans tj. po przeciwnych stronach cząsteczki
Cyklizacja monosacharydów
Przy przepisywaniu wzoru Fishera na pierścień wszystkie grupy OH będące po prawej stronie we
wzorze Fishera idą pod pierścień, a będące po stronie lewej nad pierścień.!!!
-9-
Wiele monosacharydów różni się między sobą jedynie przestrzennym ułożeniem atomów – są to
izomery . Na przykład glukoza, galaktoza, mannoza maja identyczny wzór sumaryczny , ale różnią się
przestrzennym ułożeniem grup OH i atomów wodoru przy jednym lub dwóch atomach węgla
Te niewielkie różnice konfiguracji mają jedynie znikomy wpływ na właściwości chemiczne tych
cukrów.
Pochodne monosacharydów
1. Estry cukrów:
Reszta fosforanowa -PO32- (w poniższych wzorach przedstawiana będzie jako P) może być
przyłączana przy C1 , C6 lub C1 i C6
CH2O - P
-10-
OLIGOSACHRYDY
-11-
Jeżeli między dwoma monosacharydami powstaje wiązanie o-glikozydowe przy udziale jednego
hydroksylu półacetalowego to takie disacharydy maja właściwości redukujące , tworzą osazony i
wykazują mutarotację są to np. maltoza i laktoza
POLISACHARYDY
Reakcje charakterystyczne
Cukry proste (monosacharydy) , zarówno aldozy jak i ketozy , ogrzewane ze stężonymi kwasami
solnym lub siarkowym ulegają odwodnieniu do cyklicznych aldehydów , przy czym z pentoz
powstaje furfural (aldehyd furylowy) natomiast z heksoz 5-hydroksymetylofurfural (aldehyd 5-
hydroksymetylofurylowy) zgodnie z podanymi reakcjami:
Do 1ml roztworu glukozy dodać 1-2 kropli świeżo sporządzonego 10% etanolowego roztworu α -
naftolu. Po dokładnym zmieszaniu , bardzo ostrożnie! po ściance probówki wprowadzić 1 ml
stężonego roztworu H2SO4 tak, aby była widoczna granica między cieczami. W miejscu zetknięcia
się obu cieczy powstaje czerwono-fioletowy pierścień. Pierścień zielony określa negatywną reakcję
. Dla porównania przeprowadzić reakcję z wodą!
Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl3 i 0,5 ml roztworu pentozy. Wstawić
do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone zabarwienie. Dla
porównanie przeprowadzić reakcję na heksozie (np. glukozie )
Do 2 ml glukozy dodać 5 kropli 1M NaOH i kroplami 0,2N CuSO 4, aż do momentu pojawienia się
osadu Cu(OH)2 (należy unikać nadmiaru siarczanu miedzi gdyż wytrąca się czarny tlenek miedzi (II)
maskujący właściwą barwę). Po podgrzaniu we wrzącej łaźni wodnej około 5 minut wytrąca się
pomarańczowo- czerwony osad Cu2O . Dla porównania reakcję wykonać na wodzie .
-14-
2.3.3.Reakcja Benedicta
Zasada: Podobnie jak w próbach Tromera i Fehlinga w tej reakcji redukcji ulegają jony Cu+2
do Cu+1 pod wpływem cukru. Odczynnikiem utrzymującym jony Cu+2 w roztworze jest cytrynian
sodowy ,pełniący rolę soli Seignetta
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki:roztwór glukozy
odczynnik Benedicta(CuSO4 + Na2CO3 bezw. + cytrynian sodu)
Do około 2 ml odczynnika Benedicta dodać kilka kropli glukozy, wymieszać i ogrzać na łaźni wodnej
3 – 5 minut. Po oziębieniu wytrąca się czerwono-pomarańczowy osad tlenku miedzi (I) Cu 2O.
Dla porównania przeprowadzić reakcję na wodzie.
Do suchej i czystej probówki wlać 0,5 ml roztworu azotanu srebra , a następnie dodawać po kilka
kropli amoniaku, aż powstający osad AgOH rozpuści się w nadmiarze. Do powstałej soli
kompleksowej dodać 2 ml glukozy lub innego cukry redukującego i po wymieszaniu umieścić
probówkę we wrzącej łaźni wodnej . Po około 10 minutach wydzieli się na ścianach probówki
metaliczne srebro w postaci lustra.
-15-
2.4. Disacharydy
Disacharydy (dwucukry) składają się z dwóch cząsteczek cukrów prostych połączonych wiązaniem
o- glikozydowym. Wiązanie glikozydowe nie odznacza się dużą trwałością szczególnie w obecności
jonów wodorowych. Hydrolizę wiązania glikozydowego można bardzo łatwo przeprowadzić pod
wpływem kwasów, lub enzymatycznie. Enzymy katalizujące tę reakcje odznaczają się dużą
specyficznością działania , zależną nie tylko od rodzaju składników ale i również od typu wiązania
glikozydowego ( α i β ).
Powszechnie występującym disacharydem jest sacharoza popularny cukier spożywczy, który
otrzymuje się na skale przemysłową z trzciny cukrowej i buraków cukrowych. Disacharyd ten
utworzony jest przez reszty glukozy i fruktozy połączone anomerycznymi atomami węgla.
Hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy katalizuje sacharaza nazywana również inwertazą.
2.5. Polisacharydy
-16-
Wiązanie α 1,6-glikozydowe
Miedzy dwiema resztami glukozy
Barwa kompleksu zależy od budowy i stopnia rozgałęzienia łańcucha polisacharydu. Amyloza daje z
jodem zabarwienie niebieskie, zaś amylopektyna - fioletowe. Amyloza o konfiguracji liniowej nie
jest zdolna do tworzenia kompleksu z jodem . Musi istnieć konfiguracja helisu, aby cząsteczki jodu
mogły się w niej regularnie ułożyć. Jedna cząsteczka jodu przypada na 6 reszt glukozydowych czyli
na jeden skręt helisu co jest przyczyną znikania zabarwienia z jodem
Wykonanie oznaczenia
Odczynniki:kleik skrobiowy
J2 w KJ
1M NaOH
2 M HCL
-17-
1. Wpływ zasad na zabarwienie z jodem.
W środowisku zasadowym zabarwienie nie powstaje ponieważ jod reaguje z zasadą według
równania:
J2 + 2NaOH → NaJ +Na JO + H2O
Do 2 ml kleiku skrobiowego dodać kilka kropli 1M roztworu NaOH i kroplę roztworu jodu w KJ.
Zabarwienie nie powstaje. Po zakwaszeniu kwasem solnym (2M HCL), barwa pojawia się.
W czasie hydrolizy skrobi tworzą się najpierw dekstryny o dużej cząsteczce - amylodekstryny
(zabarwienie z jodem -fioletowe), które ulegają dalszemu rozkładowi na erytrodekstryny
(zabarwienie z jodem- czerwone). Powstałe przy dalszej hydrolizie achrodekstryny nie dają
zabarwienia z jodem. Produktem końcowym jest maltoza.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kleik skrobiowy
2N H2SO4
J2 w KJ
2.6. Osazony
Monosachardy , zarówno aldozy jak i ketozy oraz disacharydy redukujące reagują z aminami np.
z fenylohydrazyną. W pierwszym etapie kondensacji z fenylohydrazyną powstają fenylohydrazony,
które następnie utleniają się w przypadku aldoz do ketofenylohydrazonów zaś ketozy do
aldofenylohydrazonów. Powstałe związki kondensują z kolejną cząsteczką fernylohydrazyny, co
prowadzi ostatecznie do wytworzenia difenylohydrazonów czyli osazonów , niezależnie od tego czy
cukrowcem była aldoza czy ketoza. Na tym etapie reakcja zatrzymuje się na wskutek powstania
chelatowego wiązania między atomami azotu obydwóch reszt fenylohydrazyny. Wytrąca się żółty
osad o charakterystycznych kształtach. Reakcja przebiega według równania:
-18-
Na podstawie tej reakcji nie można jednak rozróżnić monosacharydów epimerycznych . Różnią się
one bowiem ułożeniem podstawników tylko przy dwóch kolejnych (C-1i C-2) atomach węgla w
cząsteczce, przy których zachodzi właśnie reakcja kondensacji z fenylohydrazyną. Do takich heksoz
należy glukoza , fruktoza i mannoza. Proces enolizacji umożliwiający zamianę tych heksoz , zachodzi
w środowisku rozcieńczonych wodorotlenków następuje etapami i jest odwracalny. Otwarcie formy
pierścieniowej i przesunięcie równowagi w kierunku postaci łańcuchowej poprzez jego formę
enolową, prowadzi do wytworzenia cukrów epimerycznych. Enolizacja niweluje więc różnice
konfiguracji podstawników przy atomach C-1, C-2 , stąd osazony tych cukrowców mają identyczne
kryształy. Żółto zabarwione kryształy osazony poszczególnych mono- i disacharydów różnią się
temperaturą topnienia i kształtem kryształów co pozwala je łatwo identyfikować pod
mikroskopem
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki : roztwory cukrowców
mieszanina - chlorowodorek fenylohydrazyny + krystaliczny octan sodu (1:2)
Korzystając z poprzednio wykonanych reakcji można zidentyfikować nieznany cukier. Postępuje się
według niżej przedstawionego schematu:
r. Fehlinga (+)
(sacharoza)
-20-
3. AMINOKWASY
Ze zmianami pH roztworu zmienia się stan jonizacji cząsteczki aminokwasu .W roztworze kwaśnym
(np. pH 1) cofa się dysocjacja grupy karboksylowej – staje się ona niezjonizowana (COOH) , a
zjonizowana pozostaje grupa aminowa (NH3+) W roztworze zasadowym(np. pH 11) zjonizowana jest
grupa karboksylowa (COO-),a niezjonizowana - grupa aminowa (NH2)
Wszystkie aminokwasy (z wyjątkiem glicyny) zawierają cztery różne podstawniki wokół węgla α
(węgiel połączony z grupą karboksylową) . Ich steroizomery, należące do szeregu D lub L, są
optycznie czynne. W białkach występują tylko L-aminokwasy, a jonizacji ulegają jedynie grupy w
łańcuchach bocznych R aminokwasów oraz końcowa grupa aminowa i karboksylowa, ponieważ
pozostałe grupy karboksylowe i aminowe są zablokowane wiązaniem peptydowym ( CO-NH ).
Ze wzglądu na to , że łańcuch boczny aminokwasu może posiadać ładunek ujemny lub dodatni,
wyróżnia się aminokwasy obojętne, kwaśne i zasadowe Ponadto wchodzące w skład białek
aminokwasy, mogą zawierać w łańcuchu bocznym niepolarne grupy hydrofobowe bądź polarne reszty
hydrofilowe, które nie ulegają jonizacji lub mogą dysocjować tylko przy odpowiednim pH roztworu..
Różne łańcuchy boczne aminokwasów sprawiają, że związki te wykazują odmienne właściwości
fizykochemiczne. Aminokwasy mają różną wielkość i różny charakter kwasowo-zasadowy.
W obrębie aminokwasów wchodzących w skład białek tradycyjnie wyróżnia się dwie grupy . Do
pierwszej z nich należą aminokwasy niepolarne, które mają boczny łańcuch alifatyczny (glicyna,
alanina, walina, leucyna, izoleucyna i metionina) lub pierścień aromatyczny (fenyloalaniana,
tyrozyna, tryptofan). Do tej grupy zalicza się także prolinę hydrofobowy iminokwas zawierający
drugorzędową grupę iminową.
W obrębie drugiej grupy znajdują się aminokwasy polarne, które w łańcuchu bocznym mają grupę
hydroksylową niejonizującą w warunkach fizjologicznych (pH ok. 7,4), ale uczestniczącą w
tworzeniu wiązań wodorowych (seryna, treonina i tyrozyna) oraz nie jonizująca grupę sulfhydrylową
- cysteina, która może tworzyć wiązanie dwusiarczkowe z inną resztą cysteiny. Z kolei aminokwasy
dikarboksylowe (kwas asparaginowy i glutaminowy) zawierające dodatkową jonizującą grupę
karboksylową oraz aminokwasy diaminowe (arginina, lizyna, histydyna) mające dodatkowo
jonizującą grupę aminową , biorą udział w oddziaływaniach elektrostycznych.
-21-
Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów można podzielić na dwa typy. Pierwsze z nich to
reakcje wspólne dla wszystkich aminokwasów. Wynikają one z występowania grup funkcyjnych:
karboksylowej i aminowej. Z kolei reakcje specyficzne dla poszczególnych aminokwasów wiążą się
z występowaniem charakterystycznego układu w łańcuchu bocznym na przykład grupy
hydroksylowej –OH lub sulfhydrylowej –SH, reszty fenylu lub fenolu, bądź układu indolowego,
imidazolowego czy guanidynowego. Reakcje te pozwalają na odróżnienie niektórych aminokwasów.
Zależnie od charakteru bocznego łańcucha poszczególne aminokwasy tworzą różne barwne
pochodne.
-22-
W tym celu do roztworu aminokwasu dodaje się aldehyd mrówkowy (grupa NH+3 nie reaguje z
aldehydem) , co prowadzi do powstania połączenia N, N-dihydroksymetylowego danego aminokwasu
zgodnie z poniższą reakcją:
Do zlewki wlać 5 ml roztworu glicyny dodać 2 krople fenoloftaleiny. Następnie z biurety dodawać
roztwór NaOH, aż do uzyskania lekko różowego zabarwienia . Oznacza to osiągnięcie w roztworze
wartości pH wynoszącej około 8,3. Wtedy dla zablokowania grupy aminowej dodać 5 ml 20%
roztworu aldehydu mrówkowego o pH około 8,5. Różowe zabarwienie roztworu znika.
Dodawanie NaOH należy kontynuować, aż do ponownego uzyskania lekko różowego
zabarwienia miareczkowanego roztworu. Mnożąc ilość zużytego NaOH przez równoważnik
glicyny (0,0075) można obliczyć ilość glicyny w roztworze.
COOH COOH
H2N C H + HNO2 → HO CH + H2O + N2
R R
Wykonanie oznaczenia:
Odczynnik:i 10%NaNO2
stężony CH3COOH
0,5mol/l glicyny
-23-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: 0,5 mol/l roztwór glicyny
0,1% roztwór ninhydryny
Do około 1 ml roztworu glicyny dodać 2 krople roztworu ninhydryny. Próbkę ogrzewać we wrzącej
łaźni wodnej przez około 3 minuty , pojawia się niebiesko-fiołkowe zabarwienie.
COOH COOH
H2N CH + 2 OH- → C= O + NH3 + S2- + H2O
CH2 SH CH3
Cysteina kwas pirogronowy
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór cysteiny
30% NaOH
1 M Pb(CH3COO)2
Do 1 ml roztworu cysteiny dodać 2 ml NaOH i ogrzewać około 15-20 minut we wrzącej łaźni
wodnej. Następnie dodać kilka kropel roztworu Pb(CH3COO)2 i ponownie ogrzać powstaje
ciemnopopielaty roztwór z którego po około 10 minutach wytrąca się ciemny osad PbS.
-24-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
HNO3
NaOH stężony
Do 2 ml roztworu białka jaj kurzego dodać 2 ml HNO3 i bardzo ostrożnie lekko podgrzać (2 min).
Uwaga ! reakcja silnie egzotermiczna. Roztwór zabarwia się na żółto. Po oziębieniu zawartość
probówki zalkalizować NaOH ( tzn. dodać 5- 10 kropli bardzo ostrożnie) powstaje
pomarańczowe zabarwienie.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
kwas glioksalowy
H2SO4 stężony
2.5% aldehyd mrówkowy
HCL stężony
0.05%NaNO2
-25-
2. Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 1 kroplę 2,5% roztworu aldehydu mrówkowego oraz
2 do 3 ml stężonego HCL. Zawartość probówki ostrożnie wymieszać i odstawić na 5 minut. Po
upływie tego czasu dodawać kroplami(5-10 kropel) ,0.05% roztwór NaNO2 Odstawić na 20 minut.
Tworzy się zabarwienie fiołkowe.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór jaja kurzego
20% NaOH
2%α naftol
woda bromowa
4.BIAŁKA
Równowaga tej reakcji jest znacznie silniej przesunięta w kierunku hydrolizy niż w kierunku
syntezy. W związku z tym biosynteza wiązań peptydowych wymaga dostarczenia energii swobodnej,
natomiast hydroliza wiązań jest termodynamicznie korzystna. Wiele aminokwasów połączonych
wiązaniami peptydowymi tworzy liniową strukturę łańcucha polipeptydowego. W łańcuchu
polipeptydowym możemy wyznaczyć kierunek, ponieważ jego składniki mają dwa różne końce – z
jednej strony grupą aminowa, a z drugiej grupę karboksylową . Jako początek łańcucha
polipeptydowego umownie przyjęto jego koniec aminowy czyli koniec N i dlatego sekwencje
aminokwasowe łańcucha polipeptydowego zapisuje się poczynając od reszty aminokwasowej z wolną
(końcową) grupa α -aminową np:
-27-
-28-
+ H2O + H2O
(pęcznienie) podniesienie temp.
Koloid suchy ←→ żel ←→ zol
(osuszenie) obniżenie temp.
− H2O (osuszenie)
− H2O
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: żelatyna (subst.)
skrobia (subst.)
1.Do 2 probówek odważyć : do pierwszej 0,5 g skrobi a do drugiej 0,5 g żelatyny . Dodać 1ml wody
i po bardzo dokładnym wymieszaniu pozostawić na 30 minut w celu napęcznienia. Następnie dodać
po 5 ml wody , wymieszać dokładnie do otrzymania jednorodnego roztworu a następnie wstawić
do wrzącej łaźni wodnej. Wyjąć po około 5 minutach ostudzić pod zimną wodą lub w lodzie.
Otrzymuje się żele. Jeżeli ponownie wstawimy je do wrzącej łaźni wodnej otrzymamy zole .
-29-
Denaturację białka wywołują niektóre czynniki fizyczne takie jak: ogrzewanie, wysychanie,
ultradźwięki, promieniowanie krótkofalowe. Chemiczne czynniki denaturujące to: kwasy, zasady ,
jony metali ciężkich, mocznik , detergenty, fenol, chloroform, rozpuszczalniki mieszające się z wodą
jak : alkohol, aceton.
4.3.1.Denaturacja cieplna
Zasada: Ciepło powodując zrywanie wiązań wodorowych w cząsteczce, prowadzi do nieodwracalnej
denaturacji białek. Proces denaturacji cieplnej rozpoczyna się dla różnych białek w różnych
temperaturach (między 40 a 100oC ). Tylko nieliczne białka wytrzymują krótkie gotowanie (np.
żelatyna , rybonukleaza). Białko zdenaturowane w pI jest nierozpuszczalne.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka
NaCL (in substancja) MgSO4
Około 2 ml roztworu białka jaja kurzego zagotować do wrzenia. Tworzy się biały, kłaczkowaty
osad wytrąconego białka. Osad staje się wyraźniejszy po dodaniu niewielkiej ilości NaCL lub
MgSO4
Do 1ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml alkoholu etylowego. Po 10 minutach dodać 2 ml
wody . Strąt nie rozpuszcza się.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :roztwór białka
1% FeCL3
1% CuSO4
1.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli 1% roztworu FeCL3. Roztwór barwi się na
kolor brudnopomarańczowy. Po pewnym czasie wytrąca się brunatny osad białczanu żelazowego.
2.Do 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać parę kropli roztworu CuSO 4. Powstaje jasnobłękitny
osad białczanu miedziowego.
-30-
Do 1 ml roztworu białka kurzego dodać kilka kropel kwasu trichlorooctowego, wytrąca się białko w
postaci białego osadu.
4.4.Reakcje barwne białek
Białko lub peptyd , w którym wiązania peptydowe uległy enolizacji, reagują z jonami Cu , dając
kompleks barwy niebiesko-fioletowej. Nasilenie barwy kompleksu zależy od ilości wiązań
peptydowych i budowy łańcucha peptydowego, a więc intensywność barwy roztworu jest
proporcjonalna do stężenia białka. W przypadku peptydów o niezbyt długich łańcuchach powstaje
kompleks barwy czerwono-fioletowej
.
-31-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór białka jaja kurzego
10% NaOH
1% CuSO4
Do 2 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 2 ml 10% NaOH, a następnie dodać parę kropel roztworu
CuSO4 . Roztwór barwi się na niebiesko-fioletowo.
Do około 1 ml roztworu białka jaja kurzego dodać 3 ml stężonego HCL (ostrożnie!) i ogrzewać
przez 5 minut w łaźni wodnej . Roztwór barwi się na kolor fiołkowy.
Białka dają ponadto reakcje barwne charakterystyczne dla zawartych w nich aminokwasów.
W celu przyspieszenia dializy i możliwie maksymalnego oczyszczenia białek od soli lub innych
niskocząsteczkowych związków zmienia się roztwór do którego próbka jest dializowana , a także
stosuje się mieszanie.
Odczynniki:
mleko z dodatkiem NaCL ( 100 mg/25 ml mleka ) i glukozy (100 mg/25 ml mleka) = roztwór
przeznaczony do dializy (A)
10% NaOH
1%CuSO4
10% α -naftol
stężony H2SO4
Fehling I
Fehling II
20 mmol/l AgNO3
woreczek do dializy
Wykonanie oznaczenia:
• 1.Przygotować 4 probówki do których pobrać po 1 ml roztworu do dializy czyli płynu
przeddializacyjnego (A).
• 2. Przygotować woreczek do dializy, mocno związać sznurkiem jeden koniec.
• 3. Do zlewki oznakowanej symbolem B wlać 200 ml wody destylowanej
• 4.Wlać 20 ml roztworu do dializy A do woreczka dializacyjnego i mocno związać jego drugi
koniec sznurkiem
• 5. Umieścić napełniony woreczek dializacyjny w zlewce B z wodą destylowaną .
• 6. Zlewkę z napełnionym woreczkiem dializacyjnym umieścić na mieszadle magnetycznym.
• 7. Co 15 minut wylewać płyn dializacyjny (B) ze zlewki do erlenmajereki ( w celu
przeprowadzenia analizy) , a zlewkę napełniać 200 ml wody destylowanej przez okres 1
godz. Każdorazowo, do czterech probówek pobrać po 1 ml płynu dializacyjnego (B) w celu
przeprowadzenia analizy
• 8. Po upływie 1 godz. wylać z woreczka dializacyjnego płyn dializowany (C) do
erelenmajerki z której pobrać po 1 ml do czterech probówek w celu przeprowadzenia analizy
tego płynu.
-33-
4.6. Kolorymetria
-34-
Powstanie barwy lub jej zmiana są zawsze związane z deformacją normalnej elektronowej struktury
cząsteczki. Zmiany energii elektronowej pod wpływem naświetlania występują w cząsteczkach
zawierających grupy chromatoforowe, ugrupowania z wielokrotnymi wiązaniami nienasyconymi,
np.
Wzrost intensywności zabarwienia cząsteczki powoduje obecność tzw. grup auksochromowych, np.
OH, NH2, SH, CH3, Cl, Br, pierścień fenylowy czy naftylowy.
Ilość światła pochłoniętego po przejściu przez barwny roztwór zależy od grubości warstwy
barwnego roztworu. Zależność tą ujmuje prawo Lamberta. Zgodnie z tym prawem logarytm
stosunku natężenia światła padającego do natężenia światła przechodzącego jest wprost
proporcjonalny do grubości warstwy.
Io
Log = k • d
I
Io - natężenie światła padającego
I - natężenie światła po przejściu przez barwny roztwór
k - współczynnik proporcjonalności
d - grubość warstwy barwnego roztworu przez który przechodzi światło (cm)
Ilość światła pochłoniętego zależy również od stężenia substancji barwnej, zależność tą podaje
prawo Beera. Zgodnie z tym prawem logarytm ze stosunku natężenia światła padającego do
natężenia światła przechodzącego przez roztwór jest wprost proporcjonalny do stężenia barwnej
substancji.
Io
Log = k • c
I
gdzie : Io
Log —— - absorbancja = A
I
k - stała charakterystyczna dla danego ośrodka optycznego
c – stężenie substancji barwnej
Łącząc wzór określający prawo Lamberta z wzorem określającym prawo Beera otrzymuje się
nowe wyrażenie , ujmując matematycznie zależność pomiędzy gęstością optyczną a stężeniem
substancji i grubością warstwy roztworu
A= k•c•d
Absorbancja (A) jest miarą wygaszania światła przez barwny roztwór. Innym określeniem
absornbancji jest gęstość optyczna lub ekstynkcja
-35-
3.6.1.Ilościowe oznaczenie białka metodą Lowry’ego
Zasada:metoda Lowry opiera się na reakcji jaką dają wiązania peptydowe i aminokwasy aromatyczne
z odczynnikiem Folina Ciocaltou:
I etap → przyłączenie jonów miedzi (odczynnik Lowry C) do wiązań peptydowych
II etap → redukcja kwasu fosfowolframowego i fosfomolibdenianowego do odpowiednich
tlenków przez miedź związaną z białkiem, reakcja między odczynnikiem fenolowym, a tyrozyną i
tryptofanem
Metoda Lowry pozwala na oznaczenie białka już w stężeniu 1µ g/ml. Jest powszechnie stosowana
do oznaczania zawartości białka w płynach biologicznych i homogenatach tkankowych.
ä
rozcieńczenie surowicy: 0,1 ml surowicy + 9,9 ml Lowry C
lub 0,05 ml surowicy + 4,95 ml Lowry C
Po inkubacji zmierzyć absorbancję próbek (A) wobec próby odczynnikowej ”0”
przy fali o dł. λ = 660 nm w kuwecie o grubości warstwy d = 1cm
Obliczenie stężenia białka:
Organizmy żywe mogą istnieć wyłącznie wtedy, gdy są zdolne przekazać swą informację genetyczną
organizmom potomnym . Podstawę tej informacji genetycznej stanowi kwas dezoksyrybonukleinowy
DNA → RNA → białka → komórka → organizm
Zasady azotowe to : pochodne puryny lub pirymidyny. Zasadami purynowymi w DNA są adenina
(A) i guanina (G), a pirymidynowymi – tymina (T) i cytozyna (C).
Rdzeń DNA jest niezmienny, wzdłuż całej cząsteczki i składa się z reszt deoksyrybozy połączonych
resztami fosforanowymi. Grupa 3’-hydroksylowa reszt cukrowej jednego deoksyrybonukleotydu jest
połączona z grupą 5’- hydroksylową następnej reszty cukrowej wiązaniem fosfodiestrowym.
Komórkowy DNA składa się z dwóch bardzo długich łańcuchów polinukleotydowych, zwiniętych
wokół jednej wspólnej osi. Każda z dwóch nici helisy jest zorientowana w przeciwnym kierunku. Na
zewnątrz dwuniciowej helisy znajdują się rdzenie cukrowo-fosforanowe każdego z łańcuchów ,
podczas gdy zasady purynowe i pirymidynowe są skierowane do wnętrza helisy. Obydwa łańcuchy
są połączone wiązaniami wodorowymi między zasadami tworzącymi pary. Adenina (A) zawsze
tworzy parę z tyminą (T), a guanina (G) jest zawsze sparowana z cytozyną (C), dzięki czemu
jeden łańcuch helisy jest zawsze komplementarny do drugiego. Informacje genetyczną koduje ściśle
określona sekwencja zasad w każdym z łańcuchów. Wiele cząsteczek DNA tworzy formy koliste.
Podczas replikacji obydwa łańcuchy helisy DNA ulegają rozpleceniu i rozdzielają się w miarę
postępu syntezy nowych łańcuchów. Każdy łańcuch rodzicielski stanowi matrycę dla nowo
powstającego łańcuchu komplementarnego. Tak więc replikacja DNA jest procesem
semikonserwtywnym – każda potomna cząsteczka uzyskuje jeden łańcuch z rodzicielskiej
czasteczki DNA i drugi nowo syntetyzowany. Aktywnymi prekursorami w syntezie DNA są cztery 5 ’
–trifosforany deoksyrybonukleozydów. Nowa nić jest syntetyzowana w kierunku 5’ → 3’.
DNA nie jest jednak bezpośrednio matrycą do syntezy białek; funkcje takie pełnią natomiast
cząsteczki RNA – kwasu rybonukleinowego. RNA jest długą nierozgałęzioną makrocząsteczką
złożoną z nukleotydów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi 3’ → 5’. Jednostką cukrową
w RNA jest ryboza. Głównymi zasadami w RNA są : adeina (A)
uracyl, (U) guanina (G) oraz cytozyna (C). Adenina może tworzyć parę z uracylem , a guanina z
cytozyną
Funkcję pośredników przenoszących informację w procesie biosyntezy białka pełni klasa cząsteczek
RNA nazywanych informacyjnymi RNA (mRNA). Inne cząsteczki RNA, jak transportujący RNA
(tRNA) i rybosomowy RNA (rRNA) stanowią część mechanizmu syntezy białka . Wszystkie
rodzaje komórkowych RNA są syntetyzowane przez polimerazy RNA zgodnie z instrukcjami
przekazywanymi przez matrycę DNA.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: nukleinian sodu
2 M H2SO4
2 M NaOH
Do 2 ml nukleinianu sodu dodać 5 ml 2M H2SO4 i wstawić do wrzącej łaźni na 10 minut.
Hydrolizat zobojętnić 10% NaOH wobec papierka lakmusowego.
↓
Następne reakcje wykonujemy na otrzymanym hydrolizacie kwasów nukleinowych !!!
Do 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% HCl dodać kroplę FeCl3 i 0,5 ml roztworu hydrolizatu
Wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 3 - 5 minut. W obecności pentoz powstaje zielone
zabarwienie. przeprowadzić
Do 0,5 ml hydrolizatu dodać amoniaku, aż roztwór stanie się alkaliczny. Następnie zakwasić
stężonym HNO3 i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzać do wrzenia, pojawia się żółty osad
fosforomolibdenianu amonu.
-39-
Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA , a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po 1 ml
odczynnika orcynolowego i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na około 15 minut. W
probówce zawierającej RNA powstaje ciemno-zielone zabarwienie, probówka z DNA pozostaje
jasnozielona (reakcja negatywna).
Do jednej probówki wlać 1 ml roztworu RNA a do drugiej 1ml DNA a następnie dodać po dodać
po 2 ml odczynniki difenyloaminowego. Probówki umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 10 minut.
W probówce zawierającej DNA powstaje niebieskie zabarwienie. RNA nie wykazuje dodatniego
odczynu, próbka pozostaje bezbarwna.
-40-
6.LIPIDY
CH3CH2(CH=CHCH2)3(CH2)6COO-
18 3 kwas linolenowy
CH3(CH2)4(CH=CHCH2))4(CH2)2COO-
20 4 kwas arachidonowy
-41-
Woski to estry wyższych kwasów tłuszczowych i alkoholi innych niż glicerol .Spełniają w przyrodzie
rolę ochronną alkohole i kwasy tłuszczowe wosków są związkami nasyconymi o dłuższych
łańcuchach węglowych (od 26 do 42) niż kwasy tłuszczowe występujące w tłuszczach właściwych.
Lipidy złożone to materiał budulcowy wszystkich komórek, głównie błon plazmatycznych, a także
osłon włókien nerwowych. Występują szczególnie obficie w tkance nerwowej , krwi, limfie, wątrobie
żółtku jaj. Łączą je podobne właściwości fizykochemiczne i biologiczne.
II. Sfingolipidy różnią się pod względem budowy od innych lipidów. Zamiast glicerolu występuje w
nienienasycony 18-węglowy aminoalkohol sfingozyna (np. ceramidy, sfingomieliny)
Do dwóch probówek wlać po 1 ml wody, jedną pozostawić zimną, drugą podgrzać nad palnikiem,
Do kolejnych probówek wlać w takiej samej ilości (tzn. po 1 ml) alkohol, chloroform i aceton, a
następnie do wszystkich probówek dodać po około 0,5 ml oleju. Obserwując roztwory stwierdzić
różnicę rozpuszczalności w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach.
H
/
CH2 — OH C=O
-2H2O
CH — OH → CH
KHSO4
CH2 — OH CH2
Wynikiem reakcji jest ostra i nieprzyjemna woń będąca połączeniem zapachu SO2 i spalonego
tłuszczu. Odwodnienie glicerolu zachodzi pod wpływem kwaśnego siarczanu potasu, który ulega przy
tym redukcji do SO2 o charakterystycznym zapachu.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: olej
KHSO4 krystaliczny
Do trzech kropli oleju w probówce dodać szczyptę krystalicznego KHSO 4, Podgrzać nad palnikiem.
Po podgrzaniu wytwarza się po pewnym czasie akroleina, którą poznaje się po charakterystycznym
dławiącym zapachu spalonego tłuszczu.
Rozkład ten można również osiągnąć za pomocą hydrolizy zasadowej (KOH lub NaOH), z tym że
otrzymuje się wówczas odpowiednie sole kwasów tłuszczowych nazywane mydłami, a sam proces
nosi miano zmydlania tłuszczu. Sole sodowe i potasowe kwasów tłuszczowych dobrze rozpuszczają
się w wodzie , tworząc micelarne roztwory koloidowe.
-43-
a. wysalanie mydeł
Zasada: jest to odwracalny proces fizyczny, polegający na odwodnieniu koloidalnych cząsteczek
mydła. Cząsteczki mydła są otoczone warstewką wody związanej, dzięki czemu utrzymują się w
roztworze. Dodanie do roztworu mydła dobrze rozpuszczalnej, obojętnej soli powoduje odwodnienie
koloidalnych cząsteczek mydła, zmniejsza ich rozpuszczalność i następuje wytrącenie mydła w
postaci osadu. Po dodaniu wody mydło rozpuszcza się ponownie.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mydło (otrzymane w reakcji zmydlania)
NaCl in substantia
Do 2 ml mydła dodać NaCl in substantia, aż do nasycenia. Wytrąca się mydło wysolone w postaci
osadu. Płyn znad osadu odlać , a do osadu czyli wytrąconego mydła dodać wody. Mydło rozpuszcza
się.
-44-
Do 2 ml oliwy dodać kroplami odczynnik Hübla I. Roztwór zabarwia się na kolor brunatno-
brązowy. Następnie wkropić odczynnik Hübla II. Następuje odbarwienie roztworu.
Do probówki wlać parę kropli oleju a następnie dodać 3 ml Na2CO3. Mieszaninę lekko podgrzać. Po
czym dodać kroplami KMno4, aż do utworzenia brunatnego osadu dwutlenku manganu (MnO2)).
fosfatydylocholina
-45-
-
6.2.1.Wykrywanie glicerolu
Na suchej lecytynie wykonać reakcje akroleinową na obecność glicerolu.
Umieścić kilka granulek lecytyny w probówce i nalać około 3 ml 20% NaOH. Ogrzewać przez kilka
minut. Podczas ogrzewania czuć woń trimetyloaminy. W roztworze tworzą się mydła.
Do probówki wsypać kilka granulek lecytyny dodać dwukrotnie większą ilość mieszaniny do spalań
i trzymać nad płomieniem palnika tak długo, aż zawartość probówki przyjmie czarne zabarwienie.
Pozostałość w probówce rozpuścić w rozcieńczonym kwasie azotowym Zawartość probówki
przesączyć. Do otrzymanego przesączu wlać niewielką ilość molibdenianu amonu, aż do uzyskania
żółtego zabarwienia.
-46-
7. CHOLESTEROL
Cholesterol ( 5 cholesten-3-β -ol) wchodzi w skład lipidów budulcowych ustroju . Jest głównym
sterolem zwierzęcym. Wywodzi się on z 27-węglowego układu cholestenu i posiada jedno wiązanie
podwójne w pozycji 5 oraz grupę hydroksylową w pozycji 3.
Cholesterol występuje w komórkach wszystkich tkanek i narządów, przeważnie jako wolny, ale także
może być związany estrowo z kwasami tłuszczowymi. Wolny cholesterol stanowi niezbędny składnik
błon cytoplazmatycznych i błon organellowych.W obrębie cytoplazmy cholesterol może być
magazynowany w postaci pęcherzyków zawierających estry cholesterolu. Najwięcej tych
pęcherzyków jest w komórkach kory nadnerczy oraz gonad gdzie cholesterol jest substratem
koniecznym do syntezy hormonów steroidowych. W wątrobie z cholesterolu powstają kwasy
żółciowe.
Niewielką ilość cholesterolu wsypać do suchej probówki (obecność wody przeszkadza w reakcji !) i
dodać 2 ml chloroformu , a następnie bardzo ostrożnie po ściankach probówki wlać 2 ml stężonego
kwasu siarkowego tak , aby płyny nie zmieszały się. Otrzymaną reakcję oglądać pod lampa
kwarcową !. Warstwa dolna kwasu siarkowego wykazuje zabarwienie żółte z zieloną fluorescencją,
natomiast warstwa górna , chloroformowa jest zabarwiona na czerwono.
6.1.2.Reakcja Libermana – Burcharda
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: cholesterol
chloroform
bezwodnik kwasu octowego
H2SO4 stężony
47-
8 .KWASY ŻÓŁCIOWE.
Kwas glikocholowy
Kwas taurocholowy
8.1.1.Próba Haya
Zasada: kwasy żółciowe obniżają napięcie powierzchniowe cieczy – siarka lub talk w obecności żółci
nie utrzymuje się na powierzchni , lecz szybko opada na dno
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
talk
H2O
Do 2 probówek wlać po 5 ml wody. Do jednej dodać kroplę żółci i dokładnie wymieszać. Do obu
probówek wsypać szczyptę talku. W probówce do której dodano żółć (czyli kwasy żółciowe) talk
szybko opada na dno, natomiast probówce gdzie jest tylko woda talk utrzymuje się na powierzchni.
8.1.3.Próba Pettenkofera
Zasada: w środowisku silnie kwaśnym fruktoza tworzy 5-hydroksymetyelenofurfural, który
kondensuje z kwasami żółciowymi na barwne pochodne
-48-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona żółć
fruktoza lub sacharoza
H2SO4 stężony
Do 1 ml rozcieńczonej żółci dodać kilka kryształków fruktozy lub sacharozy i po rozpuszczeniu cukru
ostrożnie po ściankach probówki wlać około 1 ml stężonego kwasu siarkowego Na pograniczu obu
warstw tworzy się czerwony pierścień.
9.HORMONY STEROIDOWE
cholesterol (C27)
↓
pregnenolon (C21)
↓
progestageny (C21)
mineralokorykoidy (C21)
estrogeny (C18)
Głównymi miejscami syntezy tych grup hormonów są dla : progestegenów – ciałko żółte, estrogenów
– jajnik, androgenów – jądra, glukokortykoidów i mineralokortykoidów – kora nadnerczy.
-49-
9.1.1.Reakcja Zimmermanna
Zasada: w środowisku alkalicznym 17-ketosteroidy (androsteron, androstendion,
dehydroepiandrosteron) kondensują z m-dwunitrobenzenem na pochodne o barwie fiołkowo-
różowej.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki :alkohol etylowy absolutny (100%)
96% alkohol etylowy
2% m-dwunitrobenzen
2,5 mol/l KOH w alkoholu etylowym
Do probówki wsypać około 10µ g androsteronu, a następnie dodać kolejno przy pomocy pipety
automatycznej (200µ l)
1. 0,2 ml alkoholu etylowego absolutnego (100%)
2. 0,2 ml 2% m-dwunitrobenzenu
3. 0,2 ml 2,5mol/lKOH,
po czym inkubować roztwór przez okres minimum 30 minut w ciemności w temperaturze
pokojowej. Po tym okresie w celu zahamowania reakcji dodać 1 ml 96% alkoholu etylowego.
Powstaje zabarwienie fiołkowo-różowe.
9.1.2.Reakcja Kobera
Zasada: w obecności stężonego kwasu siarkowego, estrogeny z hydrochinonem tworzą różowo-żółte
zabarwienie o zielonej fluorescencji. Jest to reakcja specyficzna dla aromatycznego pierścienia A
estrogenów.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: estradiol
odczynnik Kobera (70%H2SO4 + hydrochinon)
9.1.3.Reakcja Portera-Silbera
Zasada: jest to reakcja charakterystyczna tylko dla 17-hydroksykortykosteroidów, czyli
posiadających grupę hydroksylową przy C17 (kortyzon, kortyzol). Z chlowodorkiem
fenylohydrazyny, w obecności kwasu siarkowego powstaje żółty hydrazyn.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: kortyzol lub kortyzon
odczynnik Portera-Silbera (chlorowodorek fenylohydrazyny + kwas siarkowy)
10.HEMOGLOBINA
Warunkiem wiązania tlenu przez hemoglobinę, białka należącego do grupy hemoprotein jest
obecność jednostki niebiałkowej, a mianowicie grupy hemowej. Składa się ona z części organicznej i
atomu żelaza. Część organiczna protoporfiryna, zbudowana jest z czterech pierścieni pirolowych,
połączonych mostkami metanowymi w pierścień tetrapirolowy. Do tego pierścienia przyłączone są
łańcuchy boczne, z których cztery są grupami metylowymi, dwa – grupami winylowymi i dwa –
resztami kwasu propionowego.
Grupa winylowa
Grupa metylowa
Atom żelaza w grupie hemowej , umieszczony w centrum pierścienia protoporfiryny, wiąże się z
czterema atomami azotu wiązaniami koordynacyjnymi, piąte wiązanie – z tlenem (zachodzi proces
utlenowania), a szóste wiązanie koordynacyjne służy do połączenia z białkiem przez pierścień
imidazolowy histydyny.
Sposób połączenia hemu z białkiem
W procesie utlenowania stopień utlenienia żelaza nie zmienia się, powstaje oksyhemoglobina (Hb-
O2). W przypadku utleniania żelazo zmienia swój stopień utlenienie z Fe+2 do Fe+3 z jednoczesnym
przyłączeniem cząsteczki H2O, powstaje methemoglobina (Met-Hb).
Hemoglobina jest przenośnikiem tlenu w organiźmie w postaci oksyhemoglobiny. tj. hemoglobiny
utlenowanej. Cząsteczka hemoglobiny może przyłączyć 4 cząsteczki tlenu atmosferycznego, 1g
hemoglobiny wiąże 1,36 ml tlenu. Proces utlenowania hemoglobiny i trwałość powstałej
oksyhemoglobiny zależy od ciśnienia parcjalnego tlenu, tzn. od jego stężenia.
Oksyhemoglobina pod działaniem kwasów, zasad i rozpuszczalników organicznych, jak etanol lub
aceton, przechodzi w parahematynę, inaczej nazywaną hemichromogenem. Część białkowa jest tu
zdenaturowana, a żelazo – w postaci Fe+3. Redukując hemichromogen otrzymuje się hemochromogen,
zbudowany z hemu i zdenaturowanej globiny .
-52-
Hematyna może powstać z hemoglobiny przez działanie na nią zasadą (hematyna zasadowa) lub
kwasem (hematyna kwasowa), w warunkach tlenowych, zawiera ona Fe+3 i nie ma części białkowej.
Zarówno kwasy, jak i zasady rozbijają hemoglobinę, przy czym uwolniony hem utlenia się tlenem z
Hb-O2 na hematynę, a globina ulega denaturacji. Oksyhemoglobina pod działaniem gorącego
stężonego roztworu CH3COOH i NaCl traci białko i w ten sposób powstaje hemina z żelazem Fe+3..
Hemina rozpuszczona w wodorotlenku przechodzi w hematyną zasadową.
Łagodne, nie denaturujące globinę, środki utleniające hemoglobinę, jak H2O2,, , K3[Fe(CN)6],
KMnO4, zmieniaja ją w methemoglobinę (Met-Hb), w której zamiast hemu występuje hematyna z
żelazem Fe+3
HbO2 + [Fe(CN)6]3- → Met-Hb + [Fe(CN)6]2- + O2
Barwniki hematynowe nie wiążą tlenu, CO i dają barwne pochodne z cyjankami
(cyjanomethemoglobina). Trujące działanie cyjanków polega na blokowaniu układu hemowego
enzymów biorących udział w utlenieniach tkankowych.
Z hemoglobiną 300-krotnie silniej niż tlen łączy się tlenek węgla, w wyniku czego powstaje
hemoglobina tlenkowowęglową,- karboksyhemoglobina (Hb-CO). Zdolność wiązania CO mają
chromoproteiny zawierające hem, natomiast proteiny hemetynowe właściwości tej nie wykazują.
Silne toksyczne działanie tlenku węgla wiąże się z wyłączeniem hemoglobiny z udziału w
transportowaniu tlenu i blokadą oksydazy cytochromowej, uczestniczącej w utlenianiu tkankowym.
10.1.1.Otrzymywanie methemoglobiny
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: krew (nie rozcieńczona)
K3[Fe(CN)6]
Do probówki wlewamy około 0,5 ml krwi nie rozcieńconej a następnie dodajemy parę kropli
roztworu heksacyjanożelazianu (żelazicyjanku) potasowego K3[Fe(CN)6]. Pod działaniem tego środka
utleniającego Hb-O2 przechodzi w Met-Hb. Krew przybiera zabarwienie brunatne.
Do probówki wlać około 2 ml rozcieńczonej krwi dodać 5 kropli 5% NaOH i łagodnie podgrzać.
Zawartość probówki przybiera zabarwienie brunatne wskutek utworzenia hematyny zasadowej. Po
dodaniu kilku kryształków Na2S2O4 barwa zmienia się na czerwoną w wyniku powstania
hemochromogenu. Reakcję oglądać pod światłem!. Dwutionian sodu redukuje hematynę do hemu ,
który ze zdenaturowaną globiną tworzy hemochromogen.
Normalne krwinki czerwone (erytrocyty) człowieka żyją około 120 dni. Stare komórki są usuwane z
obiegu i rozkładane przez śledzionę. Część białkowa hemoglobiny ulega hydrolizie do składników –
aminokwasów. Pierwszy etap rozpadu grupy hemowej do bilirubiny to rozszczepienie jej mostka
α -metinowego i utworzenie biliwerdyny, łańcuchowego tetrapirolu. Powstająca biliwerdyna (o
barwie zielononiebieskiej) występuje w dwóch formach tautomerycznych ; jedna z nich zawiera dwie
grupy –OH na końcu układu, zaś druga dwie grupy karbonylowe. W następnej reakcji biliwerdyna
pod wpływem specyficznej reduktazy biliwerdyny współdziałającej z NADPH + H+ , jest
zredukowana do bilirubiny ( o barwie pomarańczowo-żółtej).
Bilirubina wytworzona w śledzionie oraz w innych tkankach poza wątrobowych musi być
dostarczona do wątroby , tam bowiem zachodzi jej dalszy metabolizm. Tak więc bilirubina w
kompleksie z albuminą surowicy jest transportowana do wątroby, gdzie staje się bardziej
rozpuszczalna przez przyłączenie reszt cukru . Produkt sprzężenia bilirubiny z dwoma
glukuronianami, zwany diglukuronidem bilirubiny , dostaje się do żółci, a następnie wraz z nią
przedostaje się do jelita.
W ostatnim odcinku jelita cienkiego i na początku jelita grubego, pod wpływem bakteryjnej hydrolizy
następuje hydroliza mono- jak i diglukuronianów bilirubiny. Uwolniona wtedy bilirubina jest
następnie zredukowana do mezobilirubiny (związku o barwie żółtej). W trakcie dalszych reakcji
następuje redukcja grup metanowych, a także dochodzi do likwidacji wiązań podwójnych w
pierścieniach pirolowych, co ostatecznie prowadzi do powstania bezbarwnego urobilinogenu
( zwanego także sterkobilinogenem). Większość tworzonego urobilinogenu jest w jelicie grubym przy
udziale enzymów bakteryjnych utleniana do barwnej urobiliny i wydalana z kałem.
-55-
11.1.Reakcje charakterystyczne dla barwników żółciowych
11.1.1.Próba Gmelina
Zasada: stężony kwas azotowy utlenia barwniki żółciowe na pochodne o zmieniającej się barwie od
zielonej, poprzez niebieską, fioletową, czerwoną do żółtej. Barwy te odpowiadają kolejnym
produktom utlenienia bilirubiny.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki rozcieńczona żółć
HNO3 stężony
Do probówki wlać około 1 ml rozcieńczonej żółci, a następnie ostrożnie dodać 2-3 kropli jodu.
Bilirubina utlenia się na zieloną biliwerdynę.
W erlenmajerce zagotować 5 ml żółci, następnie dodać 2 krople nasyconego MgSO4 i około 1ml
10% chlorku baru (BaCl2). Wytrąca się osad. Roztwór z osadem ponownie zagotować. Po
zagotowaniu przesączyć roztwór do probówki. Pobrać trochę osadu z sączka przy pomocy bagietki
szklanej lub metalowej do kolejnej probówki , dodać 4 ml etanolu oraz 3 krople stężonego H 2SO4 i
kroplę KCLO3. Nie mieszać!!!!.
Gotować na płytce nad palnikiem przez 30 sek., po czym odstawić probówkę na 2 -5 minut. Po
opadnięciu osadu BaSO4 warstwa etanolu zabarwia się na kolor zielono –niebieski. Jest to
utleniona bilirubina i biliwerdyna.
11.1.4.Próba Schlesingera
Zasada: jest to próba pozwalająca wykryć obecność urobiliny w moczu, jako produkt utleniania
urobilinogenu. Urobilina z solami cynku daje zieloną fluorescencję.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocz
5 % roztwór J2
10% alkoholowy roztwór octanu cynku
Do probówki wlać około 3 ml moczu a następnie dodać 1-3 kropel 5% roztworu jodu. Odstawić na 5
minut , po czym dodać 3 ml 10% roztworu octanu cynku. Wymieszać i pozostawić do opadnięcia
osadu .Oglądać zieloną fluorescencję pod lampą kwarcową !
-56-
12.WITAMINY
Tiamina (witamina B1, aneuryna) Pirofosforan tiaminy jej ufosforylowana forma jest koenzymem
transferaz. Awitaminoza witaminy B1, nosi nazwę beri-beri i występuje przy odżywianiu się
wyłącznie odtłuszczonym ryżem. Jest poważnym problemem w krajach Dalekiego Wschodu. Podczas
tej choroby występują schorzenia neurologiczne i kardiologiczne, które objawiają się uszkodzeniami
obwodowego układu nerwowego, bólem nóg i rąk, osłabieniem mięśni i zmianami wrażliwości skóry
Serce może być powiększone i występuje niewydolność krążenia. Beri-beri jest schorzeniem które
spotkać można u chronicznie niedożywionych alkoholików.
Ryboflawina (witamina B2) jest grupa czynną koenzymów oksydoredukcyjnych (FMN, FAD)
Awitaminoza tej witaminy powoduje u zwierząt zahamowanie wzrostu i schorzenia skórne, u
człowieka są to zapalenia skóry oraz zmiany zapalne w okolicy warg.
-57-
Kwas pantotenowy (kompleks B2) jest dwupeptydem , który w połączeniu z cysteaminą tworzy
pantoteinę będącą składnikiem koenzymu A. Pełni funkcję jego prekursora. Brak kwasu
pantotenowego powoduje siwienie włosów u szczurów, pelagrę u drobiu. U człowieka jednak
objawy nie są znane.
Folian (kompleks B2 ) jest pochodną pterydyny, a formą czynną biochemicznie jest kwas
tetrahydrfoliowy , który jest koenzymem transferaz. U człowieka niedobór folianu objawia się
przede wszystkim zamianami obrazu krwi – anemią. Przyczyną tych zmian patologicznych jest nie
tyle niedobór folianu w pokarmie , ile zaburzenia w jego wykorzystaniu..
Pirydoksyna (witamina B6) jest pochodną pirydyny i stanowi składnik fosforanu pirydoksalu,
będącego ważnym koenzymem w przemianie aminokwasów .Niedobór witaminy B6 nie daje
typowego obrazu chorobowego. U dzieci obserwowane są drgawki epileptyczne, które spowodowane
są zaburzeniami w przemianie kwasu glutaminowego. Niekiedy występują również objawy łojotoku .
-58-
Kobalamina (B12) jest czynnikiem zapobiegającym anemii złośliwej. Już małe jej ilości leczą u
człowieka objawy tej choroby, która przejawia się znacznym zmniejszeniem ilości erytrocytów we
krwi. Awitaminoza ta spowodowana jest jednak nie brakiem witaminy w pożywieniu, a zaburzeniami
w resorpcji jej z przewodu pokarmowego .Pochodne kobalaminy uczestniczą w reakcjach
przekształceń wewnątrzcząsteczkowych. Funkcjonują miedzy innymi jako koenzymy w reakcji
przekształcania metylomalonylo-CoA do bursztynylo-CoA
-
Biotyna (witamina H) jest koenzymem transferaz.. U zwierząt objawy awitaminozy polegają na
zmianach skórnych i wypadaniu włosów. Awitaminozę tę powoduje podawanie specyficznego białka
awidyny (białko jaja kurzego) które silnie wiąże biotynę i w ten sposób ją inaktywuje.
Rozpuszczalne w tłuszczach to witaminy A, D, E i K
Witamina A (retinol) jest prekursorem retinolu, wrażliwej na światło rodopsyny i innych barwników
wzrokowych. Brak tej witaminy prowadzi do niedowidzenia o zmierzchu (tzw. kurzej ślepoty).
Ponadto młode zwierzęta potrzebują witaminy A do wzrostu. Kwas retinowy, aktywuje transkrypcję
specyficznych genów, które pośredniczą we wzroście i rozwoju.
-59-
-60-
Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B1 a następnie dodać 1 ml metanolu oraz przy ciągłym
mieszaniu 0,1ml 1% roztworu K3Fe(CN)6 i 1 ml NaOH. Tak przygotowaną mieszaninę odstawić do
statywu na około 1 minutę. Po upływie tego czasu dodać 6 ml alkoholu izobutylowego i silnie
wytrząsnąć. Po oddzieleniu warstwy alkoholowej oglądać reakcję pod lampą kwarcową
11.1.2.Wykrywanie obecności witaminy B2 – metoda Eulera i Adlera
Zasada: roztwory wodne witaminy B2, w środowisku obojętnym dają żółto-zieloną fluorescencję
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: roztwór wodny witaminy B2
mieszanina pirydyny, wody i metanolu
Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B2 dodać 2 ml mieszaniny pirydyny , wody i metanolu.
Reakcję oglądać pod lampą kwarcową – widoczna jest żółto-zielona fluorescencja witaminy B2.
Do probówki wlać około 0,5 ml witaminy B6 dodać kilka kropel 10 % FeCl3 - powstaje czerwone
zabarwienie.
-61-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: chloroformowy roztwór tranu (1:1)
chloroformowy roztwór bromu (1: 60)
Do suchej probówki wlać 1 ml chloroformowego roztworu tranu i 1 ml roztworu bromu. Przez krótki
okres czasu utrzymuje się zielone zabarwienie.
Odważyć 12,5 g pokrojonych liści kapusty. Rozetrzeć bardzo dokładnie odważoną kapustę w
moździerzu porcelanowym z 20 ml 2 % roztworu kwasu szczawiowego. Rozdrobniony materiał
przenieść ilościowo do 50 ml cylindra miarowego i uzupełnić do objętości 50 ml
2% roztworem kwasu szczawiowego. Wymieszać bardzo dokładnie i przesączyć przez sączek do
suchej zlewki.
Z przesączu odpipetować do dwóch 50 ml kolbek po 5 ml przesączu i szybko !!!!! miareczkować
roztworem barwnika do momentu wystąpienia różowego trwałego zabarwienia.
Wiedząc, że 1 ml barwnika utlenia 88µ g kwasu askorbinowego , obliczyć stężenie kwasu
askorbinowego w analizowanym materiale. Wyniki podać w mg/100mg
-63-
13.ENZYMY
Zgodnie z zaleceniami Komisji Enzymowej Unii Biochemicznej enzymy klasyfikujemy według typu
reakcji katalizowanej:
Klasa 1: Oksydoreduktazy – enzymy katalizujące reakcje utleniania i redukcji (np. dehydrogenaza,
reduktaza, oksydaza, oksygenaza, katalaza, peroksydaza)
Klasa 2: Transferazy- enzymy katalizujące przenoszenie określonych grup pomiędzy poszczególnymi
związkami (np. transaldolaza, transketolaza, , amino-, petptydylo-,acylo-, metylo-, glukozylo-, fosfo-
transferaza, kinaza)
Klasa 3: Hydrolazy – enzymy katalizujące rozkład różnych wiązań chemicznych z udziałem
cząsteczki wody ( np. esteraza, fosfataza, fosfodiesteraza, nukleaza, rybonukleaza, lipaza, amylaza,
peptydaza)
Klasa 4: Liazy (syntazy) – enzymy katalizujavce odłączenie grup od substratu bez udziału cząsteczki
wody lub dołączenie grup do wiązań podwójnych (np. dekarboksylaza, aldolaza, hydrataza,
dehydrtataza)
Klasa 5: Izomerazy – enzymy katalizujące reakacje izomeracji ( np.racemaza, epimeraza)
Klasa 6: Ligazy ( syntetazy) – enzymy katalizujące wytworzenie wiązań pomiędzy atomami w
cząsteczkach substratów (np. karboksylaza, ligaza DNA, polimeraza DNA)
Aktywność enzymu:
1. Międzynarodowa jednostka enzymu (U)– jest to aktywność enzymu która katalizuje
przemianę 1 mikromola substratu w ciągu 1 minuty w temp. 300C w optymalnych warunkach
2. Katal (kat)- aktywność enzymu który przekształca 1 mol substratu w casie 1 sekundy w
temperaturze 30o C w optymalnych warunkach.
Stężenie enzymu wyraża się jako stężenie aktywności w płynie biologicznym czyli liczbę zawartych
w 1 l roztworu (U/l lub kat/l) bądź w mol/l (M) . W celach diagnostycznych w płynach biologicznych
(surowica, mocz) oznacza się stężenie enzymów takich jak fosfataza alkaliczna, kwaśna, amylaza,
dehydrogenza mleczanowa, aminonotransferaza asparaginowa i alaninowa)
rx
V=
rt
V = szybkość reakcji enzymatycznej
x = stężenie produktu
t = czas (min. sek)
Zależność szybkości reakcji (v) od czasu (t) dla reakcji I rzędu
W reakcjach I rzędu szybkość reakcji jest funkcja stężenia substratu i można ja przedstawić
następująco:
rx
V = = k (a –x)
rt
r = przyrost
v = prędkość
t = czas
a = stężenie substratu
x = stężenie produktu
k = stała reakcji
k= 1 ln a = 2.303 x log a
t a –x t a-x
5 0,5 O 3 0,5 2 4
-66-
0znaczyć wartość absorbancji przy λ = 530 nm wobec próbki „O” (ślepa odczynnikowa), a
następnie: wykreślić krzywą standardową na papierze milimetrowym na podstawie podanego
poniżej przykładu
po odczytaniu stężenia w badanych próbkach wypełnić poniższą tabelę:
10
15
20
25
30
-67-
I. Oksydoreduktazy:
Katalaza i peroksydaza
Enzymy te są białkami złożonymi, należącymi do hemoprotein. Katalaza występuje głównie w
erytrocytach, a także w komórkach wątroby i nerek. Enzym ten usuwa toksyczny H 2O2 ze środowiska
reakcji, zapobiega tworzeniu rodnika hydroksylowego, uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form
tlenu. Katalaza przyspiesza reakcję, w trakcie której jedna cząsteczka nadtlenku wodoru jest dawcą
(donorem), zaś druga biorcą (akceptorem ) elektronów. Reakcja utleniania i redukcji przebiega
zgodnie z równaniem
H2O2 + H2O2 → O2 + 2H2O
Peroksydaza występuje w erytrocytach, a także komórkach tkanki płuc, tarczycy, trzustki. Enzym
ten podobnie jak katalaza uczestniczy w usuwaniu reaktywnych form tlenu. W reakcjach
katalizowanych przez ten enzym substratami oddającymi elektrony i protony mogą być różne
związki, natomiast akceptorem elektronów jest wyłącznie nadtlenek wodoru .
AH2 + H2O2 → A + 2H2O
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: rozcieńczona krew płynem fizjologicznym 1:10
CH3COOH
3% H2O2
benzydyna – nasycony roztwór
Do probówki wlać 0,5 ml rozcieńczonej krwi , dodać 1 kroplę kwasu octowego, następnie 5 kropli
3% H2O2 i 3 krople benzydyny. Roztwór barwi się na kolor niebieski.
II.Oksydazy
Oksydazy, są enzymami, które katalizują utlenianie substratu przez odebranie wodoru (protonów i
elektronów), przy czym akceptorem wodorów jest tlen atomowy bądź cząsteczkowy. W obrębie
komórki tego typu enzymy występują w mitochondriach oraz peroksysomach, a także w siateczce
śródplazmatycznej. W mitochondriach akceptorem wodorów jest zawsze tlen atomowy, co prowadzi
do powstania wody zgodnie z równaniem:
AH2 + ½ O2 → A + H2O
-68-
Na tarce jarzynowej utrzeć kawałek ziemniaka i trochę miąższu umieścić w probówce, a następnie
dodać 10 kropli 1% roztworu fenolu. Po pewnym czasie miąższ ziemniaka przyjmuje zabarwienie
brązowe, które z czasem nasila się.
Wykonanie oznaczenia
Odczynniki: sok, lub miąższ ziemniaczany
1% roztwór pirogallolu
Utarty na tarce miąższ ziemniaka przenieść do probówki , a następnie dodać 10 kropli pirogallolu. W
wyniku reakcji powstaje żółte zabarwienie.
III. Hydrolazy
Hydrolazy są enzymami, które katalizują rozszczepienie substratu przy udziale cząsteczek wody, w
wyniku czego z substratu powstają dwa produkty o mniejszej masie cząsteczkowej.
NH2
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: mocznik
ureaza
fenoloftaleina
-69-
13.2.6. Hydroliza sacharozy przez inwertazę
Zasada: Inwertaza należy do glikozydaz (podklasa hydrolaz). Enzym ten katalizuje reakcję hydrolizy
wiązania pomiędzy α -D-glukopiranozą i β -D-fruktofuranozą w sacharozie, która jest
nieredukującym disacharydem. . Enzym ten występuje w drożdżach.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: świeże drożdże
1% roztwór sacharozy
Fehling I i II
Grudkę drożdży rozdrobnić w około 5 ml wody, a uzyskaną zawiesinę drożdży rozdzielić do trzech
probówek (1,2,3)
-70-
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: bufor cytrynianowo-fosforanowy o pH 6,5
1 % roztwór skrobi w 0,9% NaCl
0,02 mol/l J2w KJ
ślina
2 ml
X = = 20 ml 1 % skrobi
0,1ml
-71-
Zasada: po inkubacji w temp. 370C w środowisku zasadowym oznacza się ilość odszczepionego
fosforu nieorganicznego. Po dodaniu molibdenianu amonu w środowisku kwaśnym powstaje kwas
fosfomolibdenianowy , który redukuje się . Po dodaniu kwasu 1,2,4 –aminonaftosulfonowego
powstaje związek o niebieskim zabarwieniu.
Wykonanie oznaczenia:
Odczynniki: surowica
KH2PO4 (zawiera 8μg fosforu w 1 ml)
0,5% β- glicerofosforan sodu
60% CCL3 COOH
2,5% molibdenian amonu
0,25% eikonogen (kwas 1,2,4 –aminonaftosulfonowy)
-72-
Ustawiamy probówki od 1-7 w statywie i w celu wywołania reakcji barwnej dodajemy do wszystkich
probówek 800 μl roztworu molibdenianu amonu i 200 μl eikonogenu. Bardzo dokładnie próbki
mieszamy i pozostawiamy na 10 minut w temperaturze pokojowej. Po tym okresie mierzymy
absorbancję próbek przy fali o długości λ = 660nm wobec próby ślepej odczynnikowej