Professional Documents
Culture Documents
Stała Michaelisa
− d[S ] ∆ [S]
v= v≈
dt ∆t
Wykonanie
E + S = ES
ES = E + P
[E ][S ]
K=
[ES ]
[E (0)][S ]
[ES ] =
K + [S ]
Vm[S ]
v=
Km + [S ]
(Vm − v )[S ]
Km =
v
Inhibitory
Vm[ S ] 1 1
v= Fs = Fes =
[ Ic] Ia [ Ic] [ Ia]
Km 1 + + [ S ] 1 + 1+ 1+
Kc Ka Kc Ka
2 L. Pauling, Molecular Architecture and Biological Reactions, Chem.Eng.,News. 1946. 24, 1375.
3 R. Wolfenden. Nature. 1969, 223, 704
vivo.. W 1969 roku było znanych zaledwie kilka analogów substratów, które
wykazywały znacznie wyższe powinowactwo do enzymów niż substraty, Wolfenden
wysunął przypuszczenie iż te związki są analogami strukturalnymi substratów w ich
stanie przejściowy.
Generalnie wszystkie reakcje zachodzą przez szereg krótkotrwałych stanów
przejściowych. Jeżeli założyć, że kluczowym dla przebiegu reakcji jest stan substratu,
w którym może nastąpić zerwanie jakiegoś wiązania chemicznego, wówczas stanem
przejściowym substratu będzie stan naprężenia tego wiązania i czas trwania takiego
stanu będzie odpowiadał czasowi pojedynczej wibracji wiązania, około 10-13 s. Jest to
czas w którym nie można konwencjonalnymi metodami spektroskopowymi wykazać
jego istnienia. Jednakże poznanie struktury stanu przejściowego ma zasadnicze
znaczenie dla zrozumienia mechanizmu reakcji katalitycznej. Jeżeli rozważać reakcje
katalityczne, wówczas należy założyć, że taki stan przejściowy substratu jest
niezwykle silnie związany z katalizatorem. Oznacza to że, enzym reaguje z substratem
tworząc kompleks "Michaelisa" o stałej dysocjacji Km, następnie przechodzi
w kompleks aktywny, w którym zarówno substrat jak i enzym występują w stanie
wzbudzonym. Powinowactwo substratu i enzymu w tym stanie wzbudzonym jest tak
duże i stała dysocjacji kompleksu tak mała, że zazwyczaj nie można zauważyć
uwalniania z centrum katalitycznego stanu wzbudzonego substratu, czyli stanu
przejściowego. Reakcja enzymatyczna tylko dlatego zachodzi, że stan przejściowy jest
nietrwały i natychmiast przechodzi w jeden ze stanów stabilnych, czyli z kompleksu
aktywnego powstaje na powrót kompleks enzym-substrat lub kompleks
enzym-produkt o znowu małym powinowactwie enzymu do produktu i stosunkowo
dużej Kp (stałej równowagi dysocjacji kompleksu enzym-produkt) porównywalnej co do
wielkości z Km.
Szybkość reakcji enzymatycznych ulega przyspieszeniu w stosunku do
niekatalitycznych reakcji zazwyczaj 1010 do 1015 razy, czyli jeżeli reakcja
enzymatyczna przebiega w przeciągu 1 sekundy, to identyczny efekt niekatalitycznej
reakcji wystąpi po 300 do 30.000.000 lat. Każda reakcja enzymatyczna przebiega przez
minimum trzy pośrednie etapy, często metodami kinetycznymi można wykazać
znacznie więcej takich pośrednich etapów, których czas półtrwania wynosi kilka
milisekund. Według teorii stanu przejściowego bardzo krótki okres czasu całego cyklu
reakcji, cząsteczka substratu spędza w postaci kluczowego dla procesu katalizy stanu,
który nazywa się stanem przejściowym. Kompleks tego stanu przejściowego
z enzymem powinien wykazywać stałą dysocjacji rzędu 10-14 do 10-23 M. Jeżeli
możliwe było by otrzymane związku, który jest stanem przejściowym substratu,
wówczas byłby to doskonały inhibitor, jednakże taki związek z natury swojej jest
nietrwały. Jeżeli nie można otrzymać stanu przejściowego substratu, to może można
otrzymać związek inny, podobny do stanu przejściowego, który będzie wykazywał nieco
słabsze powinowactwo do enzymu, lecz będzie związkiem trwałym.
Poniżej przedstawiono fragment reakcji w centrum katalitycznym hydrolaz
"serynowych". Stanem przejściowym podczas hydrolizy estrów i amidów kwasów
karboksylowych jest "tetraedryczna struktura grupy karbonylowej". Związki
analogiczne z tą strukturą znalazły zastosowanie jako doskonałe trucizny a czasem
jako środki owadobójcze.
Stan przejściowy substratu to inaczej substrat w stanie wzbudzonym, czyli
wysokoreaktywny. Wszystkie hydrolazy to katalizatory przyspieszające reakcje
przenoszenia ugrupowań takich jak acylowe, glikozydowe itp. na wodę, zwykle na
anion OH, rolę takiego akceptora przenoszonej grupy mogą pełnić także inne związki
niż woda. Taka sytuacja występuje w przypadku niektórych toksyn bakteryjnych.
Poniżej hydrolaza nukleozydowa.
O
Toksyny:
cholery
N
dyfterytu
kokluszu
N
O
ADP
Amidaza
penicylinowa
H H
H2N S
Kwas
aminopenicylinowy
N
O H COOH
Acylowanie
HN NH 2 SO3H
O
Ampicylina Sulbecylina
N
O
Cefoperazon
N
C2H5 O
Analogiczne do
ugrupowań
Piperacylina stanu przejściowego
penicylinazy
SULBAMETACYNA = ampicylina + sulbaktam
SULPERAZON = cefaloperazon + sulbaktam
AUGMENTAN = amoksycylina + kwas klawulanowy
N
O COOH
O H COOH R' = H; OH; OCH3; O-CO-CH3
β − laktamaza R'' = H - cefalosporyny
penicyliny R'' = OCH3 - cefalomycyny
Penicillinum notanum Cephalosporinum aceremonium
Streptomyces lipmani
S. clavuligerus
INHIBITORY β -LAKTAMAZY
MONOBAKTAMY
R' H OH
R N
R H
N C
C
N
N O
O
O
O SO3H H
COOH
Monobaktam Nokardycyny
KARBAPENY
RO H H
O OH
On H
CH
H3C
S
N
N R' O
N H COOH
O H
Tienamycyny
COOH
Kwas klawulanowy
O
O O
S
S
HO
NH
NH 2 N
N
O
C
C CH 2 O
O O
O
(Amoksacylina) O
SULTAMYCYLINA (Sulbaktam)
Samobójcze substraty enzymów
Pomysł syntezy bardzo swoistych inhibitorów enzymów zrodził się po słynnej pracy
Konrada Blocha z 1968 roku4. Inhibitory takie reagują z enzymem na wzór inhibitorów
konkurencyjnych i wywołują nieodwracalną inaktywację enzymów. Inaktywacja
występuje tylko wtedy gdy enzym w kompleksie z takim związkiem, katalizuje reakcję
tak jak z naturalnym substratem. Do hodowli bakterii, które wymagały obecności
w pożywce nienasyconych kwasów tłuszczowych, Bloch dodał kwas tłuszczowy
zawierający wiązanie potrójne zamiast podwójnego. Okazało się, że enzym, hydrataza
enoilo-CoA, ten enzym który katalizuje reakcję przyłączenia wody do nienasyconego
acylu w procesie degradacji kwasów tłuszczowych, ulega trwałej inaktywacji a ów
acetylenowy analog kwasu tłuszczowego zostaje trwale przyłączony do enzymu.
Enzym zawiera w centrum katalitycznym dwie reszty histydyny. Te też reszty,
a konkretnie atomy azotu pierścieni imidazolowych, biorą udział w katalizie reakcji.
Atom azotu z przyłączonym jonem wodorowym jest kwasem, nieuprotonowany jest
zasadą, czyli reakcja przebiega zgodnie z mechanizmem katalizy kwasowo-zasadowej.