PAUL SINGLETON

Bakterie
w biologii,
biotechnologii
i medycynie

tłumaczenie zbiorowe
pod redakcją naukową
Zdzisława Markiewicza
 Dane oryginału:
Bacteria in Biology,
Bacteriology and Medicine
Paul Singleton
Fifth edition
Copyright © 1981, 1992, 1995, 1997 and 1999 by John Wiley & Sons Ltd.
Baffins Lane, Chichester, West Sussex PO 19 1UD, England
AU rights reserved. Authorised translation from the English
language edition published by John Wiley & Sons Ltd.

Okładkę i strony tytułowe projektowała Maryna Wiśniewska

Fotografia na okładce (pochodząca z wydania angielskiego): barwienie Grama żywych

komórek wykorzystujące preparat fluorescencyjny BacLight™: Bacillus cereus (gramdodatnia,
pomarańczowa); Pseudomonas aeruginosa (gramujemna, zielona).
Szczegóły barwienia podano w sekcji 14. 9. 1. 1.
Zdjęcie dzięki uprzejmości Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon, USA.

Redaktor Krystyna Mostowik

Redaktor techniczny Jolanta Cibor

Podręcznik akademicki dotowany przez Ministerstwo Edukacji Narodowej

Copyright © for the Polish edition by Wydawnictwo Naukowe PWN SA

Warszawa 2000

ISBN 83-01-13212-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SA

ul. Miodowa 10, 00-251 Warszawa, tel.: 659 43 21
e-mail: pwn@pwn. com. pl http: //www. pwn. com. pl
 Spis treści
Wykaz skrótów czasopism i książek cytowanych w tekście VIII
Przedmowa do wydania polskiego IX
Przedmowa do wydania angielskiego XI
1 Bakterie - wprowadzenie 1
1. 1 Co to są bakterie? 1
1. 2 Dlaczego badamy bakterie? 3
1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii 4
2 Komórka bakteryjna 6
2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych 6
2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie 10
2. 3 Formy nitkowate i cenocyty 34
3 Wzrost i rozmnażanie 36
3. 1 Warunki wzrostu 36
3. 2 Wzrost pojedynczej komórki 41
3. 3 Wzrost populacji bakteryjnych 49
3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy) 55
3. 5 Pomiar wzrostu 55
4 Różnicowanie 56
4. 1 Cykl życiowy Caulobacter 56
4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming) 58
4. 3 Komórki spoczynkowe 59
4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia 63
5 Metabolizm I - energia 66
5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów 67
5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów 80
5. 3 Inne zagadnienia związane z metabolizmem energetycznym 83
5. 4 Systemy transportu 86
6 Metabolizm II - węgiel 95
6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów 96
6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów 97
6. 3 Synteza, wzajemne przemiany i polimeryzacja związków węgla 98
6. 4 Metylotrofia u bakterii 104
7 Biologia molekularna I - geny i ich wyrażanie się 106
7. 1 Chromosomy i plazmidy 106
7. 2 Kwasy nukleinowe - struktura 107
7. 3 Replikacja DNA 112

V
 7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA 118
7. 5 Synteza RNA - transkrypcja 120
7. 6 Synteza białka 122
7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA 130
7. 8 Regulacja ekspresji genów 133
7. 9 Bakteryjny RNA 155
8 Biologia molekularna II - zmienianie informacji genetycznej 157
8. 1 Mutacje.. .......................................................................................................... 157
8. 2 Rekombinacja................................................................................................... 162
8. 3 Transpozycja........................................................................................................ 163
8. 4 Przekazywanie (transfer) genów 167
8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA i podobne
techniki związane z analizą DNA 175
9 Bakteriofagi 231
9. 1 Fagi wirulentne — cykl lityczny................................................................ 233
9. 2 Fagi umiarkowane — lizogenia................................................................ 239
9. 3 Fagi męskie 241
9. 4 Konwersja fagowa 241
9. 5 Transdukcja.......................................................................................................... 242
9. 6 W jaki sposób fag unika restrykcyjnego systemu gospodarza? 243
10 Bakterie w świecie ożywionym 244
10. 1 Zespoły mikroorganizmów 244
10. 2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty 247
10. 3 Bakterie a obieg materii 249
10. 4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej wody
("lodotwórcze") 257
10. 5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja? 257
10. 6 Efekt cieplarniany 259
10. 7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku 260
10. 8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne 260
11 Bakterie w medycynie 262
11. 1 Bakterie jako patogeny 262
11. 2 Drogi infekcji 263
11. 3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby 274
11. 4 Mechanizmy obronne gospodarza 281
11. 5 Patogen — czynniki wirulencji 296
11. 6 Interakcje między patogenem a gospodarzem — nowa perspektywa.. 306
11. 7 Rozprzestrzenianie się choroby 306
11. 8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów w laboratorium 307
11. 9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych 312
11. 10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii 313
11. 11 Niektóre schorzenia bakteryjne 314
12 Bakteriologia stosowana I — żywność 320
12. 1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności 320
12. 2 Środki zapobiegające psuciu się żywności 322
12. 3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych 327
13 Bakteriologia stosowana II - różnorodne aspekty 334
13. 1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin 334
13. 2 Biokopalnictwo (bioługowanie) 336

VI
 13. 3 Biologiczne proszki do prania 337
13. 4 Oczyszczanie ścieków 337
13. 5 Skąd pobieramy wodę? 342
13. 6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka 348
13. 7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol 348
13. 8 Bioremediacja................................................................................................... 349
14 Nieco praktycznej bakteriologii 350
14. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium 350
14. 2 Podłoża bakteriologiczne................................................................................. 351
14. 3 Techniki aseptyczne 355
14. 4 Narzędzia bakteriologa 357
14. 5 Metody inokulacji 358
14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów 359
14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych 362
14. 8 Liczenie bakterii 363
14. 9 Barwienie.......................................................................................................... 365
14. 10 Mikroskopia................................................................................................... 368
15 Człowiek przeciwko bakteriom 372
15. 1 Sterylizacja........................................................................................................... 372
15. 2 Dezynfekcja...................................................................................................... 376
15. 3 Antyseptyka............................................................................................... 378
15. 4 Antybiotyki.................................................................................................... 379
16 Identyfikacja i klasyfikacja bakterii 401
16. 1 Identyfikacja....................................................................................................... 401
16. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotów 417
Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin, rzędów
i innych kategorii bakterii 430
Skorowidz 442
 Wykaz skrótów czasopism i książek
cytowanych w tekście
(Krótkie nazwy — Lancet, Nature, Science — nie są skracane)
AAC Antimicrobial Agents and Chemotherapy
AEM Applied and Environmental Microbiology
ARB Annual Review of Biochemystry
ARM Annual Review of Microbiology
ARP Annual Review of Physiology
BBA Biochimica et Biophisica Acta
BC Biodiversity and Conservation
BCID Bailliere's Clinical Infectus Diseases
BR Biological Reviews
CCM Critical Care Medicine
CMC Cell Motility and the Cytoskeleton
CMI Clinical Microbiology and Infection
COGD Current Opinion in Genetics and Development
EJB European Journal of Biochemistry
FEMSIMM FEMS Immunology and Medical Microbiology
FEMSME FEMS Microbiology Ecology
FEMSML FEMS Microbiology Letters
FEMSMR FEMS Microbiology Reviews
GD Genes and Development
IJSB International Journal of Systematic Bacteriology
INFIM Infection and Immunity
JAC Journal of Antimicrobial Chemotherapy
JAMA Journal of the American Medical Association
JB Journal of Bacteriology
JBC Journal of Biological Chemistry
JBM Journal of Basic Microbiology (Berlin)
JCB Journal of Cellular Biochemistry
JCM Journal of Clinical Microbiology
JGM Journal of General Microbiology
JID Journal of Infectious Diseases
JIM Journal of Immunology
JINF Journal of Infection
JMB Journal of Molecular Biology
JMM Journal of Medical Microbiology
JSB Journal of Structural Biology
LAM Letters in Applied Microbiology
MEHD Microbila Ecology in Health and Disease
MM Molecular Microbiology
MP Microbial Pathogenesis
MR Microbiological Reviews
NAR Nucleis Acids Research
NB Nature Biotechnology
NEJM New England Journal of Medicine
PB Process Biochemistry
PNARMB Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology
PNAS Proceedings of the National Academy of Science of the USA
PRS Proceedings of the Royal Society of London, Series B (Biological Sciences)
PTRSLB Philosophical Transaction of the Royal Society of London, Series B
RMM Reviews in Medical Microbiology
SAM Systematic and Applied Microbiology
TIBS Trends in Bichemical Sciences
TIBTECH Trends in Biotechnology
TIFS Trends in Food Science and Technology
TIG Trends in Genetics
TIM Trends in Microbiology
TLD Tubercle and Lung Disease
TREE Trends in Ecology and Evolution
TRSTMH Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene
 Przedmowa do wydania polskiego
Na książkę Paula Singletona Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie (czwarte
wydanie) trafiłem przeglądając niezmiernie bogaty zbiór podręczników do
mikrobiologii w znanej nowojorskiej księgarni akademickiej Barnes & Nobles
(mikrobiologia jest wciąż „modna" !). O mało jej nie przeoczyłem wśród znacznie
większych, grubszych, a przede wszystkim niezwykle barwnie i bogato ilustro-
wanych tomów, często wzbogaconych płytą kompaktową. Na szczęście wpadła
mi w ręce i, jak mniemam, bardzo dobrze się stało.
Książka Singletona nie na darmo wcześniej była przekładana na kilka języ-
ków. Jest ona znakomitym, nowoczesnym podręcznikiem, podającym w dobrze
zorganizowany sposób podstawowe i niezbędne dla kursu mikrobiologii infor-
macje, poszerzone o różne ciekawostki i fakty. Mimo skromniejszej szaty graficz-
nej od wspomnianych wyżej podręczników, nie ustępuje im jakością, tym bar-
dziej że zwraca uwagę na różne aspekty działalności bakterii i ich wykorzysta-
nia, często pomijane przez innych autorów. Główna część książki zajmuje się
fizjologią bakterii, gdyż to różnorodność przeprowadzanych przez nie procesów
metabolicznych stanowi o zastosowaniu tej grupy organizmów w wielu proce-
sach przemysłowych (biotechnologia). Bakterie przeprowadzając swoje procesy
życiowe przekształcają otaczające je środowiska, w tym środowiska organizmów
żywych, co może prowadzić do powstania objawów chorobowych. Singleton
pisze o wielu z tych procesów (o wszystkich nie sposób) i podaje przykłady róż-
nych mechanizmów chorobotwórczych. Rozdział 11 kończy się zbiorem krótkich
opisów najczęstszych schorzeń człowieka powodowanych przez bakterie. Godne
podkreślenia są wyczerpujące opisy współczesnych technik biologii molekular-
nej znajdujących zastosowanie np. w diagnostyce wielu chorób lub wyjaśnieniu
przyczyn lekooporności. W książce jest bardzo wiele prostych, ale przez to łatwo
zrozumiałych rycin, oraz kilkadziesiąt zdjęć.
Zaangażowanie osobiste i entuzjazm Paula Singletona zaowocował przy-
stąpieniem do tłumaczenia piątego, zmienionego i rozszerzonego wydania, a nie
czwartego, i to w niewiele tygodni po jego ukazaniu się w Wielkiej Brytanii.
Do końca kwietnia 2000 Paul Singleton przesyłał na moje ręce uzupełnienia oraz
drobne poprawki do wydania angielskiego. Stąd w polskim wydaniu Bakterii są
powołania na pozycje literaturowe (jedna z wielu zalet tej książki) z bieżącego
roku i jest ono bardziej aktualne niż jego pierwowzór.
Przekładu podjął się zespół pracowników Instytutu Mikrobiologii, Wydziału
Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, który w większości we współpracy
z PWN uczestniczył już w wydaniu, przekładzie lub unowocześnieniu pokaźnej

IX
liczby książek z zakresu mikrobiologii. W tym miejscu gorące podziękowania
należą się pani redaktor Krystynie Mostowik z PWN, która podjęła się trudnego
zadania ujednolicenia terminologii i stylistyki tekstu tłumaczonego przez sied-
miu mikrobiologów o często różnym temperamencie i sposobie pisania oraz
Markowi Woźniakowi z Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego, który
składając wspólne dzieło wielu osób nadał mu taki kształt, jaki trafia do rąk
szacownego Czytelnika.

Zdzisław Markiewicz
 Przedmowa do wydania angielskiego
Książka Bakterie omawia zagadnienia mikrobiologiczne odzwierciedlające
współczesne osiągnięcia nauki i ujmuje je w sposób zintegrowany W piątym jej
wydaniu znacznie poszerzono część dotyczącą fizjologii bakterii oraz roli tych
organizmów w wybranych działach medycyny i biotechnologii.
Wybierając materiał do książki, priorytet dano informacjom ważnym w róż-
nych kontekstach. By nie być gołosłownym, nowa sekcja omawiająca odpowiedź
na stres tlenowy szerzej zajmuje się regulacją genetyczną i również wyjaśnia
mechanizm oporności na izoniazyd (lek stosowany przeciw prątkom). Z kolei,
rozszerzony opis fuzji genowych odzwierciedla znaczenie tej techniki w bardzo
różnych badaniach (np. cyklu komórkowego, tworzenia endospor). Wprowadze-
nie w tym wydaniu opisu sekrecji typu IV białek służy co najmniej trzem celom:
poszerza wiedzę na temat mechanizmów transportowych (biologia); wyjaśnia
podstawy prezentacji cząsteczek na powierzchni komórki (biotechnologia) oraz
wyjaśnia tło patogenezy dyzenterii (medycyna). Tego typu podejście pozwoliło
na większy zakres informacji.
Postęp w nauce często jest odzwierciedleniem rozwoju w postaci nowych lub
ulepszonych metod. W wydaniu tym opisano zatem liczne nowe udoskonalenia
w technologii — a więc: nowe sondy DNA i RNA (sondy świetlne); fuzję genową
z wykorzystaniem „białka fluoryzującego na zielono"; mutagenezę transpozo-
nową; badania patogenezy in vivo (np. IVET, mutageneza typu STM); rozdział
immunomagnetyczny oraz badanie oporności na antybiotyki, wykorzystujące
techniki oparte na DNA. Technika PCR - odgrywająca bardzo dużą rolę we
współczesnej metodologii — opisana jest krótko, a jednocześnie wyczerpująco.
Podano również zasady technologii „DNA-chip".
W tekście znajdują się pozycje literaturowe umożliwiające Czytelnikowi
uzyskanie bardziej szczegółowych danych lub poszerzenie wiadomości. Pozycje
te wydrukowano w nawiasach kwadratowych, a klucz do skrótów odpowia-
dających tytułom czasopism umieszczono na s. VIII.
Różne firmy uprzejmie udostępniły informacje dotyczące swoich produktów:
Abbot Diagnostics (USA); Boehringer Mannheim (RFN); Chiron Diagnostics
(USA); Dynal (Norwegia); Gen-Probe (USA); Innogenetics (Belgia); Molecular
Probes (USA); Oxoid (Wielka Brytania); Perkin Elmer (USA); Pharmacia (Szwe-
cja) i Roche (Wielka Brytania).
Wielu ludzi szczodrze udostępniło publikacje, zdjęcia lub materiał przygoto-
wany do druku. Szczególne wdzięczny jestem następującym doktorom: Chantal
de Chastellier, INSERM U411, Paryż; Rasika M. Harshey, Uniwersytet Teksasu,

XI
Austin; Imrich Barak, Słowacka Akademia Nauk; William Margolin, Uniwersytet
Teksasu, Houston oraz Lurdews Monteiro, Szpital Pellegrin, Bordeaux.
Chciałbym złożyć podziękowania za niezwykle cenną pomoc ze strony
Biblioteki Medycznej Uniwersytetu w Bristolu oraz SRIS przy Bibliotece Brytyj-
skiej w Londynie.
Na koniec, jestem bardzo wdzięczny paniom Sally Beveridge i Lisie Tickner
(Nauki Medyczne i Przyrodnicze) oraz innym członkom zespołu wydawnictwa
John Wiley (Chichester), których zawodowe umiejętności bardzo przyczyniły się
do publikacji tej książki.

Paul Singleton
Clannaborough Barton, Devon
Styczeń, 1999
 ROZDZIAŁ

1
Bakterie - wprowadzenie

1. 1 Co to są bakterie?
Bakterie są niewielkimi organizmami, które występują prawie wszędzie. Zazwy-
czaj nie zdajemy sobie sprawy z ich obecności, niekiedy jednak nie budzi ona
wątpliwości — rany ulegają zakażeniom, mleko "kwaśnieje", mięso „psuje się".
Bakterie są bardzo małe. O ich istnieniu nie wiedziano aż do momentu wynale-
zienia mikroskopu w XVII wieku.
W większości przypadków bakteria jest pojedynczą, autonomiczną komórką.
Ma ona budowę prokariotyczną, która znacznie odbiega od organizacji komórek
eukariotycznych zwierząt i roślin. Niektóre z różnic przedstawiono w tabeli 1. 1
(cechy prokariotyczne zawarte w tabeli opisano dokładniej w dalszych roz-
działach). Eukarioty prawdopodobnie pojawiły się około 2-3, 5 miliarda lat temu
[Doolittle i wsp. (1996) Science 271: 470-477]. Jedna z hipotez zakłada, że
wywodzą się one ze związków symbiotycznych o podłożu energetycznym, do
których doszło pomiędzy dwoma rodzajami komórek prokariotycznych: jednej
z domeny Bacteria, a drugiej z domeny Archaea (patrz niżej) [hipoteza wodo-
rowa: Martin i Muller (1998) Nature 392: 37-41].
Bakterie zalicza się do kategorii „mikroorganizmów". Grupa ta, oprócz bakte-
rii, obejmuje kilka odmiennych typów organizmów — glony, grzyby, porosty,
pierwotniaki, wirusy. Wynika stąd, że wszystkie bakterie są mikroorganizmami,
lecz nie wszystkie mikroorganizmy są bakteriami. Powinno się także rozróż-
niać „mikrobiologię" (naukę o mikroorganizmach) i „bakteriologię" (naukę
o bakteriach).

1. 1. 1 Notka na temat stosowania terminu „bakterie"

Powszechnie stosowany termin „bakterie" często określa ogólnie „organizmy
prokariotyczne" — i w tym znaczeniu odnosi się do wszystkich prokariotów.
Badania molekularne wykazały jednak, że prokarioty można podzielić na dwie

1
zasadniczo różne grupy (domeny): domenę Bacteria i domenę Archaea [zagad-
nienie to zostało omówione w: Olsen, Woese i Overbeek (1994) JB 176: 1-6].
Z tego powodu, używany w książkach i czasopismach termin „bakterie" często
określa specyficznie kilku, bądź wszystkich przedstawicieli domeny Bacteria.
Czytelnik sam powinien próbować ocenić jego znaczenie, w zależności od konte-
kstu, w którym jest on użyty.
W niniejszej książce „bakterie" to przedstawiciele domeny Bacteria. Opisane
tu zostały prawie wyłącznie organizmy tej grupy.
Domena Archaea (patrz rys. 1. 1) grupuje organizmy, które uprzednio zakla-
syfikowano do królestwa Archaebacteria. Jest to mniejsza z dwóch grup proka-
riotów — chociaż nie wiemy, ile archeonów (a także bakterii) pozostaje nadal nie-
zidentyfikowanych. Wiele gatunków Archaea żyje w ekstremalnych środowi-
skach, charakteryzujących się wysoką temperaturą, dużym zasoleniem itp.
[dodatkowe informacje: Horikoshi (1998) Extremophiles (ISBN 0471 026182)].
Niektóre z nich występują jednak w środowiskach umiarkowanych, takich jak
gleba [Bintrim i wsp. (1997) PNAS 94: 277-282], natomiast istnieją gatunki bakte-
rii związane z warunkami ekstremalnymi. Różne aspekty biologii archeonów,
odróżniające te organizmy od „prawdziwych bakterii", są omówione w dalszych
rozdziałach.

2
 1. 2 Dlaczego badamy bakterie?
Ważnym powodem jest walka z chorobami. Bakterie wywołują kilka poważnych
oraz wiele mniej groźnych chorób. Zapobieganie tym chorobom oraz ich zwal-
czanie zależy w znacznym stopniu od wysiłku bakteriologów specjalizujących
się w medycynie, weterynarii oraz rolnictwie. Bakterie patogenne (tzn. wy-
wołujące choroby) opisano w rozdziale 11. Bakterie patogenne stanowią jedynie
niewielki procent wszystkich bakterii. Większość bakterii powoduje niewielkie
szkody, bądź nie wyrządza ich wcale. Wiele z nich jest dla nas pożytecznych.
Niektóre bakterie, na przykład, wytwarzają antybiotyki, które zrewolucjoni-
zowały medycynę, podczas gdy inne dostarczają enzymów np. do „biologi-
cznych" proszków do prania. Jeszcze inne wykorzystuje się jako „mikrobiologi-
czne insektycydy" — chroniące plony przed działaniem pewnych owadów —
szkodników. Bakterie znalazły też zastosowanie do wytwarzania tworzyw sztu-
cznych, które ulegają biodegradacji („Biopol" — sekcja 13. 7), a także ługowania
metali z ubogich rud lub trudno poddających się procesom metalurgicznym
ang. biomining — sekcja 13. 2).
Być może wyda się to dziwne, ale bakterie wykorzystuje się powszechnie
w przemyśle spożywczym (rozdz. 12). Gdy mowa o żywności, bakterie zwykle
źle się kojarzą, przyczyniają się bowiem do jej psucia się oraz powodują zatrucia
pokarmowe. Jednak niektóre rodzaje bakterii uczestniczą w produkcji żywności.
Na przykład, przy wytwarzaniu masła, sera i jogurtu pewne bakterie dokonują
przemiany cukru zawartego w mleku (laktozy) na kwas mlekowy. Bakterie
wytwarzają także związki, które nadają tym produktom charakterystyczny
smak. Ksantan, wytwarzany przez niektóre szczepy bakterii, jest wykorzysty-
wany jako środek żelujący i zagęszczacz w przemyśle spożywczym. Również
ocet winny jest produkowany z alkoholu (etanolu) dzięki działalności bakterii.
Bakterie stosuje się także w produkcji kakao i kawy.

3
 Niektóre z opisanych aktywności można zrozumieć dzięki poznaniu reakcji
chemicznych (metabolizmu) przeprowadzanych przez komórki bakteryjne
(rozdz. 5 i 6). W rozdziałach 12 i 13 przedstawiono sposoby działania kilku
pożytecznych bakterii.
Bakterie (i ich składniki) są bardzo ważne w medycynie, przemyśle i rolnic-
twie. Jednym z przykładów wykorzystania rekombinacyjnej technologii DNA
jest produkcja takich czynników jak streptokinaza (stosowana np. w leczeniu
zakrzepicy) (sekcja 8. 5. 10).
Bakterie odgrywają znaczącą rolę w naturalnych cyklach krążenia materii
(rozdz. 10), które ostatecznie są podstawą całego życia biologicznego. Bakterie
glebowe wpływają na żyzność i strukturę gleby, co ma olbrzymie znaczenie dla
rozwoju rolnictwa. Poznanie sposobów funkcjonowania tych organizmów
pozwoli lepiej gospodarować gruntami i zbiorami. Będzie to w przyszłości
konieczne, aby można było wyżywić naszą stale rosnącą populację.
Z tego krótkiego wprowadzenia powinno być oczywiste, że im więcej wiemy
o bakteriach, tym lepiej możemy ograniczyć ich szkodliwe działanie oraz pełniej
wykorzystywać aktywność pożyteczną. Istnieje potencjalne zagrożenie wykorzy-
stywania bakterii do produkcji broni biologicznej i zastosowania ich w teroryz-
mie. Kwestia ta została omówiona w kilku ostatnio opublikowanych książkach
[np. Schweitzer i Dorsch (1998) Superterrorism, Kluwer Academic Publis-
hers/Plenum].

1. 3 Klasyfikacja i nazewnictwo bakterii

W jaki sposób odróżnia się jeden typ bakterii od drugiego i jak się je klasyfikuje?
Bakterie mogą się różnić na przykład kształtem, rozmiarem, strukturą, aktywno-
ścią metaboliczną, rodzajem pobieranego pokarmu, formą wykorzystywanej
energii, warunkami fizycznymi koniecznymi do wzrostu oraz sposobem barwie-
nia z zastosowaniem niektórych barwników.
Przedstawione wyżej cechy, powszechnie wykorzystywane do klasyfikacji
(i identyfikacji) bakterii, mogą być z łatwością zbadane nawet w skromnie wypo-
sażonym laboratorium. Podobnie jak w innych działach biologii, bakterie są kla-
syfikowane w kategoriach ułożonych hierarchicznie, np. rodziny, rodzaje,
gatunki. Gatunki wystarczająco do siebie podobne są zaliczane do tego samego
rodzaju, a rodzaje wykazujące pewien stopień podobieństwa są zgrupowane
w rodzinie. Gatunek może być podzielony na dwa lub więcej szczepów, gru-
pujących organizmy nieznacznie różniące się od siebie, lecz na podstawie defini-
cji zaliczane do tego samego gatunku. Zasadniczo członkowie (powiedzmy)
rodziny bakterii powinni mieć podobną strukturę, wykorzystywać tę samą
formę energii i w podobny sposób reagować na pewne barwniki. Gatunki
w takiej rodzinie mogą być łączone w rodzaje na podstawie różnic w aktywno-
ściach metabolicznych, wymaganiach pokarmowych, warunkach wzrostu,
a także, w pewnej mierze, kształtu i rozmiaru.
Rodzaj klasyfikacji przedstawiony wyżej, chociaż użyteczny do wielu celów,
nie zawsze odzwierciedla ewolucyjne pokrewieństwo między bakteriami. Od
około dziesięciu lat prowadzi się badania mające na celu określenie najbardziej

4
podstawowych cech bakterii, które odzwierciedlałyby główne drogi ich ewolucji.
Ten aspekt klasyfikacji przedstawiono w dalszych rozdziałach.
Podobnie jak w przypadku zwierząt i roślin, każdemu gatunkowi bakterii
nadano łacińską, dwuczłonową nazwę. Składa się ona z: 1) nazwy rodzaju, do
którego należy dany organizm, i następującego po niej 2) „specyficznego epi-
tetu", pełniącego funkcję etykiety dla każdego z gatunków. Na przykład Escheri-
chia coli ma nazwę rodzaju (Escherichia) i określenie (coli). Według przyjętej
konwencji, łacińska, dwuczłonowa nazwa jest drukowana kursywą lub, gdy
pisana odręcznie, podkreślona pojedynczą linią. Nazwa rodzaju zawsze rozpo-
czyna się wielką literą, zaś nazwa epitetu — małą.
Nazwę gatunku można przedstawić w niepełnej formie skracając nazwę
rodzaju — np. Escherichia coli może być zapisana E. coli. Jednak, aby znaczenie
skrótu było zrozumiałe, można go zastosować jedynie wtedy, gdy pełna nazwa
rodzaju została wcześniej podana. (E. coli, często wspominana w tej książce, jest
bardzo powszechnym organizmem eksperymentalnym — nazwa i pisownia tego
rodzaju powinny więc być ogólnie znane).
Nazwy rodzin i rzędów bakterii nie są pisane kursywą i wszystkie rozpoczy-
nają się wielką literą. Nazwy te mają także standardowe końcówki. Nazwa
rodziny zawsze ma końcówkę „-aceae" (np. Enterobacteriaceae), a rzędów —
końcówkę „-ales" (np. Actinomycetales).
Nazewnictwem bakterii formalnie rządzi wiele reguł, które zostały stwo-
rzone przez International Commitee of Systematic Bacteriology. Korzyści wyni-
kające z międzynarodowej standaryzacji systemu nazewnictwa są oczywiste, lecz
nie zawsze reguły te są stosowane w literaturze. Może to wynikać z nieznajomo-
ści reguł lub wprowadzonych nazw, bądź być przejawem braku akceptacji dla
pewnych zmian taksonomicznych.
 ROZDZIAŁ

2
Komórka bakteryjna

2. 1 Kształty, rozmiary i ułożenie komórek bakteryjnych

2. 1. 1 Kształt
Komórki bakteryjne, zależnie od gatunku, mają bardzo zróżnicowany kształt.
Okrągłe lub kuliste komórki każdego gatunku nazywane są ziarniakami, zaś
formy wydłużone i pałeczkowate — pałeczkami lub laseczkami, zależnie od
kształtu i właściwości. Ziarniaki nie zawsze są idealnie kuliste i nie wszystkie
formy pałeczkowate mają dokładnie taki sam kształt. Na przykład niektóre ziar-
niaki mają kształt nerkowaty, a niektóre pałeczki o spiczastych końcach — wrze-
cionowaty. Wygięte pałeczki określa się jako przecinkowce. Występują także
owoidalne komórki, o kształcie pośrednim między ziarniakami i pałeczkami
(ang. coccobacilli). Są również dwa rodzaje komórek spiralnych: jedne dość
sztywne — śrubowce (fot. 2. 1, w dolnej, lewej części), drugie giętkie — krętki
(fot. 2. 4). Istnieją też tak zwane „bakterie kwadratowe" (o kształcie bardzo
płaskich prostopadłościanów) i „pudełkowate" (tworzące wielościany o nieregu-
larnych kształtach). W końcu są także promieniowce, których większość gatun-
ków, podobnie jak grzyby, rośnie w postaci cienkich nitek, nazywanych strzęp-
kami (rys. 2. 1n). Zgrupowane lub zmasowane strzępki nazywa się grzybnią.
Różne kształty bakterii przedstawiono na rysunku 2. 1 i na fotografiach 2. 1.
Wyniki badań prowadzonych nad ewolucją morfologii bakterii sugerują, że
kształt ziarniaków pojawił się niezależnie w wielu przypadkach (w różnych
liniach bakteryjnych), a gdy powstał, zazwyczaj przetrwał do dzisiejszego dnia.
Natomiast krętki i pozbawione ścian mikoplazmy powstały tylko raz w proce-
sie ewolucji bakterii. Ponadto, wydaje się prawdopodobne, że przedstawiciele
domeny Bacteria wywodzą się od wspólnego przodka przypominającego
pałeczkę, gdyż organizmy o takim właśnie kształcie mają najstarszy rodowód
genealogiczny. Ziarniak może więc być zdegenerowaną formą pałeczki. Wydaje
się, że stałe formy morfologiczne, widoczne u dzisiejszych bakterii, są odzwier-

6
ciedleniem zarówno biochemicznych i biofizycznych właściwości polimeru
ściany komórkowej — peptydoglikanu (sekcje 2. 2. 9. 1, 2. 2. 9. 2; rys. 2. 7), jak
i kontroli genetycznej związanej z jego syntezą [Siefert i Fox (1998) Microbio-
logy 144: 2803-2808].
Chociaż kształt komórek danego gatunku bakterii jest zwykle w miarę jedno-
lity, to jednak u kilku gatunków poszczególne komórki różnią się między sobą —
czasami bardzo znacząco. Zjawisko to nazywa się pleomorfizmem.
8
 Komórkowe formy L mają kształt nerkowaty lub kulisty. Są one wytwarzane
spontanicznie przez kilka gatunków bakterii lub, u innych, pojawiają się po indu-
kcji np. pod wpływem szoku termicznego lub innych rodzajów bodźców fizyko-
chemicznych. Nazwa bakterii pochodzi od Lister Institute of Preventive Medi-
cine w Londynie.

2. 1. 2 Wielkość
Wielkość komórek bakteryjnych zwykle określa się w mikrometrach, μm (wcześ-
niej nazywanych mikronami, μ); 1 μm = 0, 0001 mm. Najmniejsze bakterie mają
około 0, 2 μm (np. komórki Chlamydia). Na drugim końcu skali znajdują się
komórki Spirochaeta, które mają około 250 μm długości. Największą poznaną
bakterią (600 μm) jest Epulopiscium fishelsoni, która zamieszkuje jelito ryby mors-
kiej Acanthurus nigrofuscus [Angert, Clements i Pace (1993) Nature 326: 239-241].
Są to jednak krańcowe przypadki. Maksymalny rozmiar komórek większości
gatunków wynosi od 1 do 10 μm. Należy zwróć uwagę, że wymiary najmniejszej
bakterii znajdują się na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, co
wynosi około 0, 2 μm.

2. 1. 3 Układy tworzone przez komórki bakteryjne

Bakterie danego gatunku mogą być widoczne pod mikroskopem jako oddzielne,
pojedyncze komórki lub w formie charakterystycznych zgrupowań. Zależnie od
gatunku, komórki mogą występować w parach, w nieregularnych gronach,

Fot. 2. 1 Niektóre kształty, wielkości i układy komórek bakteryjnych

W lewej górnej części. Typowa komórka Helicobacter pylori (x 21 000), spiralnie skręcona pałeczka
z przewodu pokarmowego człowieka. Bakteria ta ma trzy rzęski (rys. 2. 2, sekcja 2. 2. 14). Każda rzęska
jest pokryta przedłużeniem komórkowej błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). Wydaje się, że bulwiaste
struktury widoczne na końcach rzęsek są miejscami, gdzie błona została „napompowana" — pra-
wdopodobnie jest to wynik technik stosowanych w mikroskopii elektronowej. Każda rzęska ma
około 3 μm długości. W górnej prawej części. Simonsiella — wielokomórkowa bakteria tworząca fila-
menty, która u około 25% ludzi wchodzi w skład mikroflory jamy ustnej. Preparat ten, barwiony
czerwienią rutenową, uwidacznia filament o długości około 3, 5 μm, przylegający do powierzchni
komórki nabłonka jamy ustnej. Centralnie. W zaplombowanym zębie: mikroorganizmy kolonizujące
niewielką przestrzeń między plombą a ścianą zęba. Każda ze struktur przypominających kolbę
kukurydzy jest złożona z dużej liczby małych ziarniaków (każdy o średnicy poniżej 1 μm) zgrupowa-
nych na końcu strzępki — być może wskazuje to na układ symbiotyczny między dwoma rodzajami
organizmów. W lewej dolnej części. Komórki Aquaspirillum peregrinum, ruchliwe bakterie wiążące
azot, występujące w wodach słodkich. Komórka na prawo ma około 7, 3 μm długości i 0, 6 μm grubo-
ści. W dolnej prawej części. Pojedyncza komórka Escherichia coli: prosta pałeczka o zaokrąglonych
końcach, mająca około 2 μm długości.
Zdjęcie Helicobacter pylori dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manche-
ster. Simonsiella dzięki uprzejmości dr Caroline Pankhurst, King's College, Londyn i Blackwell Scien-
tific Publications Ltd. Bakterie ułożone w formie „kolby kukurydzy" dzięki uprzejmości prof. dr.
Wolfganga Klimma, Medizinische Akademie Carl Gustav Carus, Drezno, Niemcy. Aquaspirillum
peregrinum dzięki uprzejmości dr. Hisanori Konishi, Yamaguchi University School of Medicine, Ube,
Japonia i Society for General Microbiology. Escherichia coli dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durren-
bergera, Uniwerytet w Zurychu, Szwajcaria.

9
w łańcuchach, w regularnych pakietach złożonych z czterech, ośmiu lub więk-
szej liczby komórek, bądź w formie palisady tworzonej przez wiele, ułożonych
w szeregu i przylegających do siebie, wydłużonych komórek. Gatunek Pelodic-
tyon clathratiforme jest dość niezwykły, gdyż jego komórki tworzą trójwymiarowe
sieci. Komórki wielu gatunków formują długie łańcuchy połączonych ze sobą
komórek (ang. trichomes) (sekcja 2. 3. 1). Niektóre rodzaje układów komórek
przedstawiono na rysunku. 2. 1. Te różnorodne układy nie są wynikiem agregacji
pojedynczych komórek. Tworzą się one, gdyż komórki różnych gatunków dzielą
się (rozmnażają) na różne sposoby, a dwie lub więcej komórek może pozostać
połączonych ze sobą po procesie podziału komórkowego.
W warunkach naturalnych pewne bakterie występują w stabilnych, wieloga-
tunkowych zbiorowiskach komórek, nazywanych konsorcjami [patrz np. Pearl
i Pickney (1996) Microbial Ecology 31: 225-247].

2. 2 Komórka bakteryjna — bliższe spojrzenie

Czy wszystkie bakterie mają podobną strukturę? Otóż nie: komórki poszczegól-
nych gatunków mogą różnić się znacznie zarówno strukturą, jak i składem
chemicznym. Nie istnieje więc bakteria o „typowej" budowie. Rysunek 2. 2
przedstawia schematyczny, uogólniony szkic komórki bakteryjnej.
Na rysunku tym widoczny jest chromosom komórki — zwykle kolista, silnie
zwinięta struktura DNA (rozdz. 7), nazywana nukleoidem. Nukleoid jest zanu-
rzony w cieczy o złożonej strukturze — cytoplazmie, która wypełnia wnętrze
komórki. Cytoplazma zawiera rybosomy — niewielkie ciała uczestniczące
w syntezie białek. Czasami występują także ziarnistości zapasowe, zawierające
zapasy składników odżywczych itp. Nukleoid, cytoplazma, rybosomy i ziarni-
stości zapasowe są otoczone błoną cytoplazmatyczną (nazywaną także błoną
komórkową lub błoną plazmatyczną). Najbardziej zewnętrzną warstwą,
widoczną na rysunku 2. 2, jest sztywna (odporna mechanicznie) ściana komór-
kowa. Błonę cytoplazmatyczną i ścianę komórkową określa się łącznie jako
osłony komórkowe (ang. cell envelope). Między błoną cytoplazmatyczną a ścia-
ną komórkową znajduje się przestrzeń peryplazmatyczna. Rzęska jest cienką,
włosowatą strukturą zbudowaną z białek. Umożliwia ona ruch komórki, tzn. jej
przemieszczanie. Rzęska jest połączona z osłonami komórkowymi za pomocą
wyspecjalizowanej struktury. Niektóre bakterie mają więcej niż jedną rzęskę.
Są też takie, które mają ich dużo bądź nie mają ich wcale. Te oraz inne cechy
komórki bakteryjnej są opisane w dalszych sekcjach.
Czasami mówi się, że komórka bakteryjna ma „prostą" budowę, ponieważ
nie zawiera wyspecjalizowanych struktur (jądro, mitochondrium) znajdowanych
w komórkach eukariotycznych. Jednak, na poziomie molekularnym, bakterie
stosują chytre i wyrafinowane strategie świadczące o wysokim stopniu ich struk-
turalnej i funkcjonalnej organizacji [Mayer (1993) FEMSMR 104: 327-346]. Na
przykład w pewnych bakteriach (i niektórych archeonach) grupy enzymów pro-
teolitycznych ulegają samoskładaniu, wytwarzając cylindryczne struktury (pro-
teasomy), których wnętrze zawiera aktywne miejsca enzymatyczne. Proteasomy
typu 20S są analogiczne do struktur eukariotycznych, w których zachodzi

10
degradacja białek. Białkowe substraty bakteryjnych proteasomów nie są znane.
Mogą nimi być uszkodzone lub nieaktywne białka, które muszą być degrado-
wane w sposób pozwalający na uniknięcie niekontrolowanej komórkowej prote-
olizy. Ponieważ wejście do proteasomu jest dość wąskie, jedynie niezwinięte
białka mogą się doń przedostać. Zakotwiczenie, rozwijanie i translokacja białek
(przeznaczonych do degradacji) — to prawdopodobnie procesy zależne od ATP
(jako że proteasomy mają miejsce wiązania dla ATPaz) [Prokariotyczne protea-
somy: De Mot i wsp. (1999) TIM 7: 88-92].
Przykładem wysokiego poziomu organizacji bakterii jest również obecność
(krótkotrwała) szczątkowej formy cytoszkieletu, pojawiającej się podczas podzia-
łu komórki (fot. 3. 1).
Rozmieszczenie białek w komórce bakteryjnej wydaje się obecnie dużo bar-
dziej uporządkowane niż wcześniej przypuszczano [Shapiro i Losick (1997)
Science 276: 712-718]. Podstawowym kryterium rozróżniania pewnych białek
jest ich aktywność w określonych miejscach komórki bakteryjnej (sekcja. 4. 1).
Staje się oczywiste, że białka biorące udział w różnych procesach fizjologicznych
pojawiają się w komórce w odpowiednim czasie i miejscu, co wymaga udziału
dynamicznych form regulacji [Dynamie spatial regulation in the bacterial cell:
Shapiro i Losick (2000) Cell 89-98].
Chociaż z reguły bakterie to organizmy jednokomórkowe, jednak niektóre
z nich są „stworzeniami socjalnymi". Ich zachowanie w zbiorowiskach może się
różnić od zachowania pojedynczych, wyizolowanych komórek (sekcja 10. 1. 2).
Ponadto pewne bakterie, tak jak organizmy wyższe, mogą podlegać rytmom
dobowym (sekcja 7. 8. 12).

2. 2. 1 Nukleoid
U większości bakterii chromosom jest kolistą cząsteczką kwasu deoksyrybonuk-
leinowego (DNA) (opisany w rozdz. 7), jednak u niektórych gatunków jest on
liniowy. DNA jest związany z pewnymi rodzajami białek, które biorą udział
w jego zwijaniu. Silnie zwinięty DNA tworzy w komórce zwartą strukturę
połączoną z błoną cytoplazmatyczną, tzw. nukleoid. U bakterii Escherichia coli

11
chromosom ma około 1, 3 mm długości. DNA jest więc upakowany w komórce
o długości zaledwie kilku mikrometrów — pozostawiając w niej jeszcze wiele
wolnego miejsca!
Pojedyncza bakteria, zależnie od gatunku i warunków wzrostu, może zawie-
rać więcej niż jedną kopię chromosomu (rozdz. 3). Na przykład u E. coli komórki
szybko rosnące mają więcej chromosomów niż te, które rosną powoli. U niektó-
rych gatunków wszystkie komórki mają zwykle kilka kopii chromosomu.
[The bacterial nucleoid revisited (artykuł przeglądowy): Robinow i Kellen-
berg (1994) MR 58: 211-232. ]

2. 2. 2 Cytoplazma
Cytoplazma jest wodnistą cieczą zawierającą rybosomy, składniki pokarmowe,
jony, enzymy, produkty przemiany materii i różnorodne cząsteczki związane
z syntezami, podtrzymywaniem funkcji komórkowych oraz metabolizmem ener-
getycznym. W pewnych warunkach mogą występować ziarnistości zapasowe.
Bakteryjna cytoplazma nie ma odpowiednika retikulum endoplazmatycznego
komórek eukariotycznych.
W wyjątkowych przypadkach, w cytoplazmie niektórych gatunków może
występować kilka unikatowych i interesujących struktur. Na przykład Bacillus
thuringiensis zawiera czasami kryształy, które są trujące dla wielu owadów.
Bakterie te wykorzystuje się w rolnictwie jako biologiczne insektycydy (rozdz.
13). Inne bakterie (pasożyty pierwotniaków) zawierają tzw. ciałka R, będące
ciasno zwiniętymi wstęgami zbudowanymi z elastycznego białka.
U niektórych wodnych bakterii niewielkie cząsteczki magnetytu (Fe3CO4),
nazywane magnetosomami [artykuł przeglądowy: Stolz (1993) JGM 139:
1663-1670], powodują odpowiednie ułożenie komórek w polu magnetycznym.

2. 2. 3 Rybosomy
Rybosomy są niewielkimi, zaokrąglonymi strukturami, o wielkości około 0, 02 μm,
zbudowanymi z RNA (polimer podobny do DNA — rozdz. 7) i białek. Wystę-
pują one w dużej ilości w cytoplazmie (fot. 8. 1, w górnej części) i są miejscem syn-
tezy białek (rozdz. 7).
Rybosomy bakteryjne są mniejsze od eukariotycznych, ale są podobne (roz-
miarami) do rybosomów chloroplastów roślin i glonów. Rybosomy charaktery-
zuje się zwykle nie na podstawie ich średnicy, lecz przez określenie szybkości
sedymentacji w ultrawirówce. Wartość tę podaje się w jednostkach Svedberga
(S); im jest ona większa, tym rybosomy sedymentują szybciej. Każdy rybosom
bakteryjny (70S) zawiera jedną podjednostkę 50S i jedną 30S (tak, 50S+30S=70S!).
Prawdopodobnie obie części rybosomu „trzymają się razem" dzięki wiązaniom
wodorowym oraz oddziaływaniom jonowym i hydrofobowym. Ważną rolę
w utrzymaniu tej struktury odgrywają jony magnezu.
Rybosom w około 70% jest zbudowany z RNA (rybosomowy RNA = rRNA),
od którego głównie zależy funkcjonowanie tego ciała. Podobnie jak rybosomy,

12
cząsteczki RNA również określa się w jednostkach Svedberga. Podjednostka 30S
zawiera 16S rRNA, natomiast podjednostka 50S zawiera 5S i 23S rRNA. Analiza
krystalograficzna rybosomowej podjednostki 30S Thermus thermophilus potwier-
dziła wcześniejsze przypuszczenia, że większa część regionu przylegającego do
drugiej podjednostki (prawdopodobnie najważniejsza funkcjonalnie) zawiera
RNA [Clemons i wsp. (1999) Nature 400: 833-840].
Rybosomowy RNA jest polimerem zawierającym cztery różne rodzaje pod-
jednostek (nukleotydy). W danej cząsteczce rRNA nukleotydy są ułożone
w określonej sekwencji kodującej. Sekwencje te wydają się pozostawać stosun-
kowo nie zmienione w ewolucyjnych odcinkach czasu. Odmienne sekwencje
w pokrewnych organizmach mogą zatem świadczyć o ewolucyjnej rozbieżności
między tymi organizmami. Na przykład, sekwencje cząsteczek 16S rRNA gatun-
ków należących do tego samego rodzaju zwykle różnią się w co najmniej 1, 5%.
W ostatnich latach cząsteczkę 16S rRNA wykorzystuje się do klasyfikacji bakterii
w grupy, które, jak się uważa, odzwierciedlają ich naturalne (ewolucyjne) pokre-
wieństwo. Na przykład, różnica w 16S rRNA była główną przyczyną wydzie-
lenia domen Archaea i Bacteria.
Białka rybosomowe stanowią około 30% masy rybosomu. U E. coli podjed-
nostka 30S ma 21 różnych rodzajów białek, podczas gdy podjednostka 50S ma
ich ponad 30.

2. 2. 4 Ziarnistości zapasowe
W pewnych warunkach wiele bakterii wytwarza polimery, które są odkładane
w cytoplazmie w formie ziarnistości. Do związków tych zalicza się poli-β-hydro-
ksymaślan i polifosforan.

2. 2. 4. 1 Poli-β-hydroksymaślan

Poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang. poly-β-hydroxybutyrate) jest liniowym poli-

merem β-hydroksymaślanu (rys. 2. 3). U niektórych gatunków granule PHB gro-
madzą się wtedy, gdy wzrost komórki jest hamowany brakiem składników
pokarmowych (innych niż źródło węgla). W komórkach tych PHB pełni rolę
magazynu źródła węgla i energii (rozdz. 5 i 6), z którego można korzystać, gdy
inne składniki odżywcze stają się bardziej dostępne. U bakterii glebowej Azoto-
bacter beijerinckii w warunkach niedostatku tlenu gromadzi się PHB, który może
stanowić do 80% masy komórki. W tym przypadku związek ten zastępuje tlen,
jako źródło siły oksydacyjnej.
Enzymy biorące udział w syntezie PHB (a także prawdopodobnie enzymy
depolimeryzujące) występują na powierzchni ziarnistości. Każda dojrzała gra-
nula jest otoczona jednowarstwą o grubości < 4 nm, zawierającą głównie fazyny

13
(cząsteczki białek amfifilowych) i fosfolipidy. Regiony hydrofilowe białek i fosfo-
lipidów są skierowane w stronę cytoplazmy [Mayer i Hoppert (1997) JBM 37:
45-52]. Ziarnistości PHB można wybarwić in situ (tzn. w komórce) barwnikami,
takimi jak np. błękit Nilu A.
PHB jest stosowany w produkcji tworzyw sztucznych, podlegających biode-
gradacji (Biopol: patrz sekcja 13. 7).
U niektórych bakterii spotyka się inne polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA,
ang. poly-β-hydroksyalkanoates). Na przykład Pseudomonas oleovorans, gdy roś-
nie na pożywce z n-oktanem, wytwarza granule poli-β-hydroksyoktanianu.
[Bacterial PHAs, including PHB and Biopol (wielu autorów, raport z sympo-
zjum): FEMSMR (1992) 103: 91-376].

2. 2. 4. 2 Polifosforan (polimetafosforan; wolutyna)

Granule polifosforanu (ΡO 3 2~ -Ο-[ΡO 3 ~ ] n -ΡO 3 2~ ) występują u większości bakte-
rii. Przyjmuje się, że stanowią one zapas fosforanu, zaś w niektórych przypad-
kach mogą być związane z metabolizmem energetycznym. Granule polifosfo-
ranu można wybarwić np. błękitem metylenowym, jednak uzyskują one inne
zabarwienie niż kolor stosowanego barwnika. Zjawisko to nazywa się metachro-
macją, a granule są czasami nazywane ziarnistościami metachromatycznymi.

2. 2. 5 Wakuole gazowe
Wakuole gazowe (patrz fot. 2. 2) występują jedynie u niektórych (typowo wod-
nych) prokariotów, np. u cyjanobakterii tworzących zakwity (takich jak Anabaena
flos-aquae) i u przedstawicieli Archaea (np. Halobacterium i Methanosarcina). Każda
wakuola składa się ze skupiska drobnych, długich, wypełnionych gazem pęche-
rzyków, o średnicy około 60-250 nm. Każdy z nich pokryty jest białkową ścianą.
W niektórych przypadkach wakuole gazowe wytwarzane są konstytutywnie,
w innych zaś powstają po indukcji.

14
 Obecność wakuoli gazowych wpływa na gęstość pławną komórek uno-
szących się w wodzie. Jest to szczególnie ważne dla organizmów fotosyntety-
zujących, gdyż dzięki temu zyskują one optymalny dostęp do światła. Gęstość
pławna komórek może być regulowana przez co najmniej dwa mechanizmy.
Niedobór światła stymuluje powstanie nowych pęcherzyków, a więc prowadzi
do zwiększenia gęstości pławnej. Intensywne światło hamuje zaś wytwarzanie
pęcherzyków, a te, które powstały wcześniej, ulegają „rozcieńczeniu" w trakcie
kolejnych podziałów komórki. Drugi z wymienionych mechanizmów funkcjo-
nuje np. u cyjanobakterii Oscillatoria agardhii.

2. 2. 6 Karboksysomy
Karboksysomy to wewnątrzkomórkowe struktury błonowe o średnicy około
100-500 nm, które występują u wielu bakterii autotroficznych (tzn. wykorzy-
stujących dwutlenek węgla jako główne źródło węgla). Pojedynczy karboksysom
zawiera wiele kopii enzymu (RuBisCO) biorącego udział w „wiązaniu" atmosfe-
rycznego dwutlenku węgla (rys. 6. 1).

2. 2. 7 Tylakoidy
Tylakoidy to spłaszczone, wewnątrzkomórkowe struktury błonowe, które spo-
tyka się u większości cyjanobakterii. Występują one w bliskim sąsiedztwie ściany
i ułożone są do niej równolegle. Błona tylakoidów różni się od struktury błony
komórkowej, gdyż zawiera chlorofile. W tylakoidach zachodzi proces fotosyn-
tezy (rozdz. 5). W niektórych przypadkach są one także miejscem aktywności
oddechowej (rozdz. 5). Struktury podobne do tylakoidów (ale nazywane chloro-
somami lub pęcherzykami Chlorobium) występują u bakterii z podrzędu Chlo-
robiineae. Pełnią one funkcje podobne jak tylakoidy.

2. 2. 8 Błona cytoplazmatyczna
Błona cytoplazmatyczna jest dwuwarstwą o grubości 7-8 nm, zbudowaną
z cząsteczek lipidów, w której zanurzone są, częściowo lub całkowicie, cząsteczki
białka. Niektóre z tych białek przechodzą przez całą grubość ściany (rys. 2. 4).
Cząsteczki lipidów ułożone są w taki sposób, że zarówno zewnętrzna, jak
i wewnętrzna strona błony jest hydrofilowa, tzn. „lubiąca wodę" (fot. 2. 3,
w lewej górnej części; wybarwiona na ciemno), podczas gdy wnętrze błony jest
hydrofobowe.
Lipidy są w większości fosfolipidami, z których u bakterii najpowszechniej
występuje fosfatydyloglicerol (rys. 2. 5). Obecność innych rodzajów lipidów
zależy głównie od tego, czy dana bakteria jest zaliczana do grupy bakterii gram-
dodatnich, czy gramujemnych — patrz sekcja 2. 2. 9. Fosfatydyloetanoloamina
(rys. 2. 5) występuje powszechnie u bakterii gramujemnych. Fosfatydylocholina
(lecytyna) (rys. 2. 5) obecna jest u niektórych bakterii gramujemnych, ale nie spo-

15
tyka się jej u bakterii gramdodatnich. W bakteryjnych błonach cytoplazmatycz-
nych są także niewielkie ilości glikolipidów. Sfingolipidy występują rzadko, a ste-
role jedynie u bakterii z rodziny Mycoplasmataceae. U E. coli głównym lipidem
jest fosfatydyloetanoloamina, lecz są również niewielkie ilości fosfatydyloglice-
rolu i difosfatydyloglicerolu (DPG, ang. diphosphatidylglicerol, kardiolipina).
Błona nie jest sztywną strukturą. Cząsteczki lipidów, występujące w stanie
płynnym, są utrzymywane razem dzięki działaniu sił międzycząsteczkowych.
Białka błony cytoplazmatycznej zawierają różne enzymy — np. „białka
wiążące penicylinę" (PBP, ang. penicillin binding proteins), które biorą udział
w syntezie peptydoglikanu, tj. polimeru ściany komórkowej (sekcja 2. 2. 9. 1
i 6. 3. 3. 1). Białka PBP mogą stanowić część kompleksu białkowego błony cytoplaz-

Połączenia między glicerolo-3-fosforanem i dwiema cząsteczkami kwasów tłuszczowych (zawie-

rającymi długie łańcuchy węglowe) to wiązania estrowe.

16
matycznej [Gittins, Phoenix i Pratt (1994) FEMSMR 13: 1-12]. Występują w niej
także składniki systemów transportu (które przenoszą przez błonę jony i inne
cząsteczki), a także elementy systemów przekształcających energię, takich jak
ATPazy i łańcuchy transportu elektronów (rozdz. 5). U kilku bakterii stwier-
dzono obecność „białek sensorowych", które rozpoznają zmiany w środowisku
zewnętrznym (patrz np. sekcje 2. 2. 15. 2 i 7. 8. 6).
Błona cytoplazmatyczna nie jest swobodnie przepuszczalna dla większości
cząsteczek. Niektóre małe, pozbawione ładunku lub hydrofobowe cząsteczki,
np. O2, CO2, NH 3 (ale nie NH 4 + ) i woda, mogą przechodzić przez nią dość swo-
bodnie. Inne cząsteczki (wliczając np. składniki pokarmowe) i jony muszą być
transportowane przez błonę za pomocą specjalnych mechanizmów. Niektóre
z nich wymagają dostarczenia energii przez komórkę. Dzięki tym mechanizmom
komórka może gromadzić pewne związki w stężeniu znacznie przewyższającym
ich zawartość w otaczającym środowisku.
Przepuszczalność błony cytoplazmatycznej odgrywa ważną rolę w osmore-
gulacji (sekcja 3. 1. 8). W błonie cytoplazmatycznej występują kanały aktywo-
wane naprężeniem mechanicznym, które zwiększają rozmiar porów w odpo-
wiedzi na wzrost turgoru w komórce. Ułatwiają w ten sposób wydalanie wody
i pewnych rozpuszczonych w niej substancji. Przykładem może być kanał MscL
u E. coli [Mechanosensitive channels in E. coli: Sukharev i wsp. (1997) ARP 59:
633-657]. Kanały tego typu występują u wielu bakterii, gdzie pełnią ważną rolę
w adaptacji do warunków stresu osmotycznego. Otwierają się one, gdy ciśnienie
turgorowe w komórce zbliża się do poziomu zagrażającego jej życiu [Levina
i wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1730-1737]. Dodatkowo, w błonie cytoplazmaty-
cznej wielu (nie wszystkich) bakterii występują molekularne szlaki, umożli-
wiające transbłonową dyfuzję wody i/lub niektórych innych obojętnych cząste-
czek. Ten rodzaj transportu po raz pierwszy zaobserwowano w krwinkach czer-
wonych, zaś białko w nim uczestniczące nazwano akwaporyną-1 (Aqpl). Akwa-
poryna-1 jest spokrewniona z: integralnym białkiem soczewki oka ssaków, inte-
gralnym białkiem tonoplastu roślin i białkiem GlpF Escherichia coli. Białka te, zali-
czane do „rodziny białek MIP" (ang. main intrinsic proteins), występują we
wszystkich grupach organizmów żywych. Posiadają one bardzo konserwatywne
regiony. W grupie tej wyróżnia się dwa typy białek: akwaporyny i transportery
glicerolu.
Szlak transbłonowy, który tworzą białka z rodziny MIP, nazywa się kanałem
MIP. Kanał ten składa się z pojedynczego polipeptydu, który zapętla się, prze-
chodząc wielkorotnie przez błonę cytoplazmatyczną. Struktura ta jest najwyraź-
niej stałą drogą transportu wody (kanał = akwaporyna) lub glicerolu (i/lub
innych obojętnych cząsteczek) (kanał = transporter glicerolu). U Lactococcus lactis
kanał MIP transportuje zarówno wodę, jak i glicerol.
U E. coli akwaporyna AqpZ jest kodowana przez gen aqpZ, a transporter gli-
cerolu kodowany jest przez gen glpF. Szczepy z mutacją w genie aqpZ rosną
gorzej w środowisku o niskim ciśnieniu osmotycznym, natomiast szczepy dzikie
reagują w tych warunkach wzmożoną ekspresją aqpZ. Sugeruje to, iż AqpZ
pełni ważną rolę fizjologiczną. Kanały MIP spotyka się u niektórych przedstawi-
cieli Archaea (np. Archaeoglobus fulgidus, Methanobacterium thermoautotrophicum),
lecz nie u wszystkich (np. brak u Methanococcus jannaschii). Nie ma ich również

17
u niektórych bakterii (np. Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylori, Mycobacterium
tuberculosis, Treponema pallidum) [Microbial MIP channels: Hohmann i wsp. (2000)
TIM 8: 33-38].
Często uważa się, że funkcją lipidów błony cytoplazmatycznej jest współ-
udział w procesie selektywnej przepuszczalności błony, zaś ważne funkcje, takie
jak przekształcanie energii i odbieranie bodźców, są pełnione przez białka. Jed-
nak fosfolipidy błony odgrywają też istotną rolę jako „chaperony" (lipidy opie-
kuńcze), tzn. cząsteczki, które pomagają w poprawnym zwijaniu specyficznych
białek (sekcja 7. 6). Na przykład, fosfatydyloetanoloamina (rys. 2. 5) jest niezbędna
do prawidłowego zwijania błonowego białka LacY (produkt genu lacY — sekcja
7. 8. 1. 1) u E. coli [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264].

2. 2. 8. 1 Protoplasty

Komórka, po utracie ściany komórkowej (rys. 2. 2), tworzy strukturę zwaną

protoplastem. Protoplast, chociaż ograniczony jedynie błoną cytoplazmatyczą,
może przetrwać (w warunkach laboratoryjnych) i nadal przeprowadzać wiele
procesów komórkowych. Jeśli protoplast znajdzie się w środowisku bardziej roz-
cieńczonym niż jego cytoplazma, woda zacznie przechodzić przez błonę (na dro-
dze osmozy), co spowoduje napęcznienie i w końcu pęknięcie komórki. Zjawisko
to nazywa się lizą osmotyczną. U bakterii delikatny protoplast jest zwykle chro-
niony przed lizą osmotyczną dzięki obecności sztywnej ściany komórkowej
(sekcja 2. 2. 9).

2. 2. 8. 2 Błona cytoplazmatyczna u przedstawicieli Archaea

Błona cytoplazmatyczna tych organizmów zawiera lipidy, których nie spotyka

się u przedstawicieli Bacteria. W lipidach bakteryjnych glicerol jest połączony
z kwasami tłuszczowymi wiązaniami estrowymi (rys. 2. 5), natomiast w lipidach
archeonów (zawierających np. izoprenoid lub hydroizoprenoid) występują
wiązania eterowe. Niektóre z lipidów błony cytoplazmatycznej archeonów
i bakterii są strukturalnymi analogami, np. lipidy dieterowe i diestrowe. Obydwa
typy cząsteczek mają pojedyncze polarne końce. Jednak w niektórych przy-
padkach (np. tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol) występują dwie, połączone wiąza-
niem eterowym, cząsteczki glicerolu — po jednej na każdym końcu cząsteczki
lipidu. Cząsteczki takie, mające dwa polarne końce, mogą przechodzić przez całą
grubość błony.
Wydaje się prawdopodobne, że właściwości lipidów (i białek) archeonów
odzwierciedlają ich zdolności adaptacyjne do życia w warunkach ekstremalnych.

2. 2. 9 Ściana komórkowa
U większości bakterii sztywna, zewnętrzna warstwa — ściana komórkowa
(rys. 2. 2) — chroni delikatny protoplast (sekcja 2. 2. 8. 1) przed uszkodzeniami
mechanicznymi i lizą osmotyczną. Określa ona także kształt bakterii: wyizolo-
wany protoplast jest kulisty, niezależnie od pierwotnego kształtu komórki.

18
Ponadto, działa jako „sito molekularne" — stanowi bowiem barierę przepusz-
czalności dla różnych cząsteczek, w tym niektórych antybiotyków. Ściany
komórkowej nie można jednak uważać za zwykle „pudełko" zamykające żywą
komórkę, gdyż odgrywa ona także aktywną rolę np. w regulacji transportu
jonów i cząsteczek.
Bakteryjna ściana komórkowa może znacznie się różnić grubością, strukturą
i składem. Wyróżnia się jednak tylko dwa główne typy ściany, które są określane
na podstawie sposobu barwienia pewnymi barwnikami. Komórki, mające dany
typ ściany, po barwieniu fioletem krystalicznym i jodem zatrzymują barwnik,
nawet po działaniu takich rozpuszczalników jak aceton lub etanol. U bakterii
o innej strukturze ściany, w podobnych warunkach, barwnik zostaje usunięty
(tzn. bakterie stają się bezbarwne). Ta ważna procedura barwienia została opra-
cowana w latach 80. XIX wieku przez duńskiego naukowca Christiana Grama.
Barwienie Grama opisano w sekcji 14. 9. 1. Bakterie, które zatrzymują barwnik
(mające jeden typ ściany), nazywa się bakteriami gramdodatnimi, natomiast te,
które mogą go utracić (mają drugi typ ściany), noszą miano bakterii gramujem-
nych. Kilka przykładów bakterii gramdodatnich i gramujemnych wymieniono
w tabeli 2. 1. Obydwa rodzaje ścian komórkowych omówiono dalej. (W przypad-
ku niektórych bakterii nie otrzymuje się jednoznacznego wyniku po zastosowa-
niu metody barwienia Grama: patrz sekcja 14. 9. 1, znaczenie określeń — bakterie
typu gramdodatniego i typu gramujemnego).

2. 2. 9. 1 Ściana bakterii gramdodatnich

ściana bakterii gramdodatnich jest stosunkowo gruba (około 30-100 nm) i, jak
wynika z obserwacji w mikroskopie elektronowym, ma prostą, jednolitą struk-
turę. Ściana w 40-80% jest zbudowana ze sztywnego, złożonego polimeru —
peptydoglikanu (zwanego także mureiną). Peptydoglikan składa się z liniowych
łańcuchów heteropolisacharydów, połączonych poprzecznie krótkimi pepty-
dami. Tworzą one trójwymiarową, podobną do sieci, strukturę (sakulus)
(rys. 2. 7), która otacza protoplast. Sakulus jest zbudowany z wielu warstw pepty-
doglikanu. W czasie wzrostu nowy Peptydoglikan odkłada się na wewnętrznej

19
(cytoplazmatycznej) stronie ściany. W miarę wzrostu, warstwy te przesuwają się
na zewnątrz w kierunku powierzchni komórki. Najstarsze z nich ulegają złusz-
czeniu i są stopniowo zrzucane. Do peptydoglikanu przyłączone są kowalencyj-
nie kwasy tejchojowe, zbudowane z polimerów fosforanów glicerolu lub rybi-
tolu. U niektórych bakterii (np. Mycobacterium) ściana zawiera lipidy, podczas
gdy u innych (np. szczepy Streptococcus) — węglowodany. Skład ściany komór-
kowej może się zmieniać w zależności od warunków wzrostu. Na przykład
zawartość fosforanów w podłożu wpływa na ilość kwasów tejchojowych w ścia-
nie komórkowej Bacillus.

2. 2. 9. 2 Ściana bakterii gramujemnych

W ścianie komórkowej bakterii gramujemnych (o grubości 20-30 nm) obserwo-

wanej w mikroskopie elektronowym widoczne są wyraźne warstwy. Warstwa
wewnętrzna (rys. 2. 6), najbliższa błonie cytoplazmatycznej, o grubości 15 nm,
zawiera Peptydoglikan, który stanowi od 1 do 10% suchej masy komórki.
Schemat przedstawiony na rysunku 2. 6 (który powstał m. in. dzięki mikroskopii
elektronowej) sugeruje, że Peptydoglikan jest wielowarstwowy. Jednak badania
szybkości metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach
Escherichia coli wskazują, że ścianę boczną komórki stanowi jego pojedyncza
warstwa [Park (1993) JB 175: 7-11], zaś wielowarstwowy Peptydoglikan może
występować na jej biegunach. Skład chemiczny peptydoglikanu E. coli przed-
stawiono na rysunku 2. 7, a przebieg jego syntezy omówiono w sekcji 6. 3. 3. 1.
Peptydoglikan jest scharakteryzowany w sekcji 3. 2. 1 i 5. 4. 7.
Zewnętrzna warstwa ściany, zwana błoną zewnętrzną (rys. 2. 6, fot. 2. 3
w lewej, górnej części), jest w istocie, zawierającą białka, dwuwarstwą lipidową
— przypomina więc błonę cytoplazmatyczną. Jednak w tym przypadku fosfoli-
pidy tworzą jedynie wewnętrzną warstwę błony, zaś jej warstwę zewnętrzną
stanowią makrocząsteczki nazywane lipopolisacharydami (LPS).

O-swoiste łańcuchy tworzą najbardziej zewnętrzną część ściany. Błona zewnętrzna — ważna bariera
przepuszczalności np. dla pewnych antybiotyków. Połączona jest ona z peptydoglikanem poprzez
lipoproteiny Brauna. Po lewej stronie błony zewnętrznej widoczna jest poryna (sekcja 2. 2. 9. 2).

20
 Lipid A (rys. 2. 6) jest glikolipidem. U E. coli składa się on z ufosforylowanego
disacharydu (dwie cząsteczki glukozoaminy) niosącego sześć lipofilowych
łańcuchów acylowych. Cztery z nich są związane z pojedynczą cząsteczką gluko-
zoaminy, do której także przyłączony jest oligosacharyd rdzeniowy. Wszystkie
łańcuchy acylowe są skierowane do lipofilowego wnętrza błony zewnętrznej.
Prekursorem lipidu A, wykorzystywanym również w syntezie peptydogli-
kanu, jest UDP-N-acetyloglukozoamina (UDP-GlcNAc) (sekcja 6. 3. 3. 1). W bio-
syntezie lipidu A UDP-GlcNAc jest początkowo monoacylowana przez enzym,
kodowany przez gen lpxΑ. Następnie pod wpływem deacetylazy (enzym zawie-
rający cynk i kodowany przez lpxC) zachodzi deacetylacja, po której następuje
wieloetapowy proces prowadzący do powstania heksaacylowanego disacharydu
(lipid A). Szczegóły syntezy lipidu A przedstawili Wyckoff, Raetz i Jackman
[(1998) TIM 6: 154-159].
Oligosacharyd rdzeniowy (np. u E. coli i pokrewnych jej bakterii) zawiera
cząsteczki glukozy i galaktozy, a także podstawione cząsteczki innych cukrów,
m. in. fosforan heptozy. Łańcuchy O-swoiste, które tworzą najbardziej zewnętrzną
część ściany komórkowej, składają się z liniowych lub rozgałęzionych łańcuchów
podjednostek wielocukrowych. Skład chemiczny łańcuchów O-swoistych może
się różnić u poszczególnych szczepów, co wykorzystuje się w serologicznej iden-
tyfikacji szczepów bakterii (sekcja 16. 1. 5. 1). (Zwróć uwagę, że niektóre bakterie,
np. Neisseria meningitidis, nie mają typowego dla E. coli O-swoistego łańcucha.
Struktura analogiczna do LPS nazywana jest lipooligosacharydem — LOS). [LOS:
Kahler i Stephens (1998) Critical Reviews in Microbiology 24: 281-334].
Około połowy masy błony zewnętrznej stanowią białka. Na przykład u E. coli
i pokrewnych jej bakterii występują tysiące cząsteczek lipoproteiny Brauna
(rys. 2. 6). Każda z nich jest połączona kowalencyjnie z leżącym niżej peptydogli-
kanem. W błonie występują także enzymy, białka związane ze specyficznym
mechanizmem pobierania („transportu") i poryny. Cząsteczki poryny, wystę-
pujące w zgrupowaniach po trzy (czasami po dwie), przechodzą przez błonę,
tworząc wypełnione wodą „pory". Obecność takich porów umożliwia niektórym
jonom oraz cząsteczkom przechodzenie przez błonę zewnętrzną. Poryny są
połączone z peptydoglikanem za pomocą mostków jonowych. U E. coli i po-
krewnych jej bakterii błona zewnętrzna zawiera kilka różnych typów poryn,
które nazwane są np. OmpC, OmpF itd. (Omp, białko błony zewnętrznej;
ang. outer membrane protein). Względne proporcje poszczególnych poryn mogą
się zmieniać w zależności od środowiska, w którym występuje komórka (patrz
np. sekcja 7. 8. 6).
Poszczególne elementy błony zewnętrznej utrzymywane są razem m. in.
dzięki oddziaływaniom jonowym. Przylegający do błony oligosacharyd rdze-
niowy jest z nią połączony kationami dwuwartościowymi, głównie Mg 2+ i Ca2+.
Usunięcie tych kationów za pomocą chelatorów jonów prowadzi do rozerwania
błony zewnętrznej. Lipid A jest połączony hydrofobowo z resztami kwasów
tłuszczowych fosfolipidów. Niektóre białka wydają się połączone z oligosachary-
dem rdzeniowym.
Błona zewnętrzna jest zwykle przepuszczalna dla niewielkich jonów i cząste-
czek hydrofilowych, jest jednak znacznie mniej przepuszczalna (lub nieprzepu-
szczalna) dla cząsteczek hydrofobowych lub amfipatycznych. Jej przepuszczal-

21
22
ność może się zwiększać (co jest niekorzystne dla bakterii) w obecności pewnych
antybiotyków, np. polimiksyny (sekcja 15. 4. 5), lub czynników hamujących bio-
syntezę lipidu A (sekcja 15. 4. 11).

2. 2. 9. 3 Ściana komórkowa u przedstawicieli Archaea

Ściana niektórych przedstawicieli tej grupy organizmów (np. gatunków Halobac-
terium, Methanococcus i Thermoproteus) składa się głównie, lub wyłącznie, z tak
zwanej warstwy S (sekcja 2. 2. 12), która jest ściśle związana z błoną cytoplazma-
tyczną. U np. Methanobacter ściana zawiera pseudomureinę — podobny do pep-
tydoglikanu polimer, w którym łańcuchy szkieletu zawierają N-acetylo-D-gluko-
zoaminę (i/lub N-acetylo-D-galaktozoaminę, zależnie od gatunku) oraz kwas
N-acetylo-L-talozoaminouronowy. Pseudomureina, w przeciwieństwie do pepty-
doglikanu, nie jest przecinana przez enzym lizozym.

2. 2. 9. 4 Warstwy leżące po zewnętrznej stronie ściany komórkowej

U niektórych bakterii występuje jedna bądź kilka warstw leżących po zewnętrz-

nej stronie ściany. Zalicza się do nich np. otoczki, warstwy S i białka Μ (patrz
dalej).
2. 2. 9. 5 Bakterie pozbawione ściany

Komórki prokariotyczne pozbawione ściany komórkowej spotyka się u przedsta-

wicieli domeny Bacteria (np. Mycoplasma) i Archaea (np. Thermoplasma).

Fot. 2. 3 Struktury osłon komórkowych i struktury powierzchniowe niektórych bakterii gram-

ujemnych
W lewej górnej części. Błona zewnętrzna (om), błona cytoplazmatyczna (cm) i mikrootoczka (mc) na
cienkim skrawku Bacteroides fragilis (x52 000). Mikrootoczka przedstawiona na mikrografii elektrono-
wej nie byłaby widoczna w mikroskopii świetlnej. W prawej górnej części. Osłony bakteryjne na
cienkim skrawku komórki E. coli po plazmolizie (x10 000). (Plazmoliza — usunięcie wody z komórki
powoduje „odstawanie" błony cytoplazmatycznej od błony zewnętrznej). Widoczne są szczeliny
powstałe między błoną zewnętrzną (grot strzałki) a leżącą niżej błoną cytoplazmatyczną. W pobliżu
centralnej części zdjęcia widoczne są miejscowe połączenia błon: zewnętrznej i cytoplazmatycznej.
Centralnie, w lewej części. Dwie komórki B. Fragilis posiadające otoczki, uwidocznione w mikros-
kopii elektronowej (x28000). Makrootoczki barwiono czerwienią rutenową. Centralnie, w prawej
części. Komórki B. fragilis w mikroskopii świetlnej (ok. x 1000) (z tej samej hodowli przygotowano
preparat do mikroskopii elektronowej — patrz zdjęcie obok). W tym przypadku tło zostało wybar-
wione na ciemno przez eozynę i fuksynę karbolową („barwienie negatywowe")- Każda otoczka jest
widoczna jako jasne „halo" otaczające komórkę. Komórka w górnej części zdjęcia jest w trakcie
podziału. W lewej dolnej części. Pilus kodowany przez plazmid F (będący wyspecjalizowaną, włoso-
watą strukturą) wyrastający z powierzchni komórki E. coli (x 150 000). Sam pilus, o średnicy poniżej
10 nm, jest prawie niewidoczny. Aby wykazać jego obecność, „wyznakowano" go pewnym, specyfi-
cznym dla tego pilusa, bakteriofagiem (MS2). W tym przypadku do pilusa zostały przyłączone trzy
cząstki wirusa MS2 (każdy o średnicy około 25 nm), które oznaczono grotami strzałek. W prawej
dolnej części. Fragment ściany E. coli, wybarwionej, aby uwidocznić dużą liczbę fimbrii (oznaczone
małymi grotami strzałek) (x54 000). Duże groty strzałek wskazują fragmenty rzęski.
Zdjęcia B. fragilis dzięki uprzejmości dr Sheili Patrick z Queen's University of Belfast. Miejsca
połączenia błon i pilus plazmidu F E. coli dzięki uprzejmości dr. Manfreda E. Bayera, Fox Chase Can-
cer Center, Filadelfia. Fimbrie E. coli dzięki uprzejmości dr Ann Field, Public Health Laboratory
Service, Londyn.

23
24
 2. 2. 10 Połączenia międzybłonowe (u bakterii gramujemnych)
Połączenia międzybłonowe to miejscowe fuzje pomiędzy błonami: zewnętrzną
i cytoplazmatyczną (fot. 2. 3: w prawej, górnej części), które obserwuje się
w warunkach plazmolizy. Ich obecność jest ważnym przyczynkiem do rozważań
o fizjologii bakterii [Woldringh (1994) MM 14: 597-607].

2. 2. 11 Otoczki i warstwy śluzowe

Wiele bakterii wytwarza substancję pokrywającą zewnętrzną powierzchnię
ściany komórkowej. Warstwa ta nazywana jest otoczką. Μakrootoczka, zwana
też „prawdziwą" otoczką, jest na tyle gruba, iż można ją zobaczyć (stosując
odpowiednią preparatykę) w zwykłym mikroskopie świetlnym (ponad -0, 2 μm
grubości). Występują też mikrootoczki, których obecność może być stwierdzona
jedynie po zastosowaniu mikroskopii elektronowej lub np. technik serologicz-

Rys. 2. 7 Peptydoglikan. Przedstawione struktury są typowe dla Escherichia coli. Podobne rodzaje
peptydoglikanu występują u wielu innych bakterii gramujemnych
(a) Trójwymiarowa, przypominająca sieć cząsteczka peptydoglikanu: łańcuchy szkieletu, z ułożo-
nymi na przemian cząsteczkami N-acetyloglukozoaminy (G) i kwasu N-acetylomuraminowego (M),
utrzymywane są razem dzięki krótkim peptydom łączącym reszty kwasu N-acetylomuraminowego.
Każdy mostek peptydowy, przedstawiony na schemacie, łączy dany łańcuch z innym łańcuchem
szkieletu. Wyniki badań dowodzą, że są także mostki peptydowe, które łączą razem trzy (lub nawet
cztery) łańcuchy szkieletu. Różne typy mostków peptydowych występujących w E. coli opisano
niżej w (b).
(b) Struktura mostków peptydowych łączących sąsiadujące ze sobą łańcuchy szkieletu. (Numery
pisane kursywą oznaczają poszczególne atomy węgla w cząsteczce). Do każdej reszty kwasu N-acety-
lomuraminowego dołączony jest krótki peptyd boczny — w tym przypadku tetrapeptyd: L-alanina -
kwas D-glutaminowy - kwas mezo-diaminopimelinowy (mezo-DAP) - D-alanina (obramowane
liniami przerywanymi). W tym rodzaju mostków peptydowych D-alanina jednego peptydu bocznego
związana jest kowalencyjnie z grupą ε-aminowej mezo-DAP, występującego w innym peptydzie bocz-
nym. Mostek taki, składający się z dwóch peptydów bocznych (każdy z nich zawiera cztery reszty
aminokwasowe), określa się jako dimer tetra-tetra (lub tetra-tetra). Inny rodzaj mostka peptydowego
— dimer tetra-tri (tetra-tri), powstaje po połączeniu jednego tetrapeptydu i jednego tripeptydu.
Trimerowy mostek peptydowy powstaje, gdy nastąpi połączenie trzech łańcuchów szkieletu. W tym
przypadku peptyd boczny, na trzecim łańcuchu szkieletu, tworzy wiązanie kowalencyjne z wolną
grupą ε-aminową (patrz schemat) mostka dimerowego. Poznanie różnych typów mostków peptydo-
wych jest niezbędne do zrozumienia modelu syntezy peptydoglikanu (sekcja 3. 2. 1).
Enzym lizozym hydrolizuje wiązanie β-l, 4-glikozydowe w łańcuchu szkieletu (patrz schemat),
co osłabia strukturę ściany komórkowej.
Budowa peptydoglikanu u bakterii gramdodatnich znacznie się różni od struktury przedstawionej
wyżej. Na przykład w łańcuchach szkieletu Mycobacterium występują reszty kwasu N-glikolilomura-
minowego. Odmienne są również rodzaje i usytuowanie wiązań poprzecznych. W peptydoglikanie
Staphylococcus aureus nie wszystkie reszty kwasu muraminowego są acetylowane, a peptydy boczne
połączone są mostkami penta- lub heksaglicynowymi. Mostki te mogą być trawione enzymem lizo-
stafiną, co powoduje lizę całej komórki.
Synteza peptydoglikanu jest zależna od enzymatycznych aktywności białek wiążących penicylinę
(PBP, ang. penicil binding proteins), które występują w obrębie osłon komórkowych (sekcja 2. 2. 8
i 6. 3. 3. 1). PBP mogą być inaktywowane przez penicylinę oraz pokrewne antybiotyki β-laktamowe
(sekcja 15. 4. 1).

25
nych (fot. 2. 3: centralnie i w lewej górnej części). Warstwa śluzowa jest wodnistą
wydzieliną, która swobodnie przylega do ściany komórkowej. Często rozprze-
strzenia się ona do podłoża, gdy komórka rośnie w środowisku płynnym.
Otoczki są zbudowane głównie z wody. Składnikiem organicznym jest
zazwyczaj homopolisacharyd (np. celuloza, dekstran) lub heteropolisacharyd
(np. alginian, kwas kolanowy, kwas hialuronowy). W szczepach niektórych
bakterii, np. Bacillus anthracis, otoczka jest homopolimerem kwasu D-glutamino-
wego. Gatunki Xanthobacter mogą wywarzać otoczkę z α-poliglutaminy wraz
z obfitym, wielocukrowym śluzem. Otoczki mogą być połączone ze ścianą
wiązaniami jonowymi i/lub kowalencyjnymi.
Otoczki pełnią różne funkcje. Mogą one na przykład: chronić przed wysy-
chaniem, stanowić barierę przepuszczalności dla toksycznych jonów metali,
zapobiegać infekcji przez bakteriofagi (rozdz. 9), stanowić rezerwę pokarmową,
umożliwiać adhezję (ważne np. dla bakterii jamy ustnej tworzących płytkę
nazębną) i chronić przed fagocytozą. U bakterii patogennych tworzenie otoczki
jest często skorelowane z patogennością (tzn. zdolnością do wywoływania cho-
roby). Tak więc w przypadku bakterii chorobotwórczej mającej zwykle otoczkę,
jej szczepy bezotoczkowe są zazwyczaj niepatogenne (patrz także sekcje 11. 3. 2. 1
i 11. 5. 1).
Niektóre z wydzielanych polisacharydów wykorzystuje się w przemyśle. Na
przykład heteropolisacharyd ksantan (wytwarzany przez szczepy Xanthomonas
campestris) jest stosowany w przemyśle spożywczym jako środek żelujący, stabi-
lizator żelu, zagęszczacz i inhibitor krystalizacji.

2. 2. 12 Warstwy S
Warstwa S jest zazwyczaj najbardziej zewnętrzną strukturą komórki. Składa się
ona z powtarzających się cząsteczek białka lub glikoprotein ułożonych w formie
kwadratów lub sześciokątów. Warstwa S, gdy występuje, zwykle otacza ścianę
komórkową (np. u bakterii gramujemnych okrywa błonę zewnętrzną). U niektó-
rych przedstawicieli Archaea warstwa S jest ścianą komórkową, tzn. okrywa
błonę cytoplazmatyczną. Podwójna warstwa S występuje np. w szczepach Aqua-
spirillum i Bacillus.

2. 2. 13 Białka Μ
Cząsteczki białka Μ tworzą cienką warstwę otaczającą ścianę komórkową pato-
gena Streptococcus pyogenes (paciorkowiec z grupy A Lancefield — patrz Strepto-
coccus — w Aneksie), który wywołuje np. (anginę, szkarlatynę, ropnie). Białko to
jest czynnikiem wirulencji, gdyż czyni bakterię mniej podatną na fagocytozę
i często działa jako adhezyna (sekcja 11. 5. 6).
Skład białka Μ różni się nieznacznie w poszczególnych szczepach S. pyogenes,
co umożliwia zastosowanie testów serologicznych do ich klasyfikacji (sekcja
16. 1. 5. 1). Wyróżnia się około 60 grup serologicznych (serogrupy Griffitha),
a wszystkie szczepy w danej grupie mają podobny rodzaj białka M. Jest to
przykład typowania (sekcja 16. 1. 5) pomocnego w badaniach epidemiologicznych.

26
 2. 2. 14 Rzęski, fimbrie i pili
U wielu bakterii występują drobne, włosowate włókna białkowe odchodzące od
powierzchni komórki. Struktury te można podzielić na trzy główne typy: rzęski,
fimbrie i pili.

2. 2. 14. 1 Rzęski

Rzęski umożliwiają bakterii poruszanie się w płynnym środowisku (sekcja

2. 2. 15). Bakteria, zależnie od gatunku, może mieć jedną rzęskę (urzęsienie mono-
trychalne), dwie rzęski — po jednej na każdym biegunie (urzęsienie amfitrychal-
ne), pęczek rzęsek na jednym bądź obu biegunach (monopolarne lub bipolarne
urzęsienie lofotrychalne), lub wiele rzęsek, na całej powierzchni komórki (urzę-
sienie perytrychalne) (patrz rys. 2. 1).
Każda rzęska składa się z włókna, haka i ciałka podstawowego (rys. 2. 2).
Włókno, o rozmiarach 5-20x0, 02 μm, ma strukturę helikalną. Zbudowane jest
ono z jedenastu podjednostek białkowych, ułożonych podobnie jak włókna liny.
Wzdłuż osi włókna biegnie kanał o średnicy około 70 A. U niektórych gatunków,
np. z rodzaju Pseudomonas i Vibrio oraz u Helicobacter pylori, włókno otoczone jest
pochewką, będącą przedłużeniem błony zewnętrznej (patrz fot. 2. 1, w górnej
lewej części). Hak jest pustą, giętką strukturą białkową (rys. 2. 8). Po zastosowa-
niu specjalnej metody barwienia, włókna rzęski mogą być widoczne w mikrosko-
pie świetlnym. [Proste barwienie rzęsek: Heimbrook i wsp. (1989) JCM 27:
2612-2615].
Każda rzęska bierze początek w ciałku podstawowym (=motor rzęski), które
usytuowane jest w osłonach komórkowych. Stanowi ono złożony mechanizm
przekształcający energię. Motor składa się z wielu struktur o kształcie pierścieni,
ułożonych osiowo (wraz z innymi składnikami) na pałeczkowatym rdzeniu
w błonie cytoplazmatycznej (rys. 2. 8). Szczegóły budowy (np. liczba pierścieni)
różnią się w zależności od gatunku.
Rzęska obraca się wokół własnej osi. Ruch rotacyjny zademonstrowano
poprzez zakotwiczenie wolnego końca rzęski na szklanej powierzchni, co umoż-
liwiło zaobserwowanie rotacji całej komórki. Obecnie uważa się, że (u np. E. coli
i innych bakterii jelitowych) pierścień MS wraz z pierścieniem C obraca się,
powodując rotację rdzenia, a więc i włókna. Przyjmuje się, że zakotwiczone
w osłonach komórkowych pierścienie L i Ρ tworzą „tuleję" dla wirującego rdze-
nia (rys. 2. 8).
Ruch rzęski wymaga dostarczenia energii w formie gradientu jonów w pop-
rzek błony cytoplazmatycznej (rozdz. 5).
Powstawanie rzęski. Przez kanał w pierścieniu MS, zakotwiczony w błonie
cytoplazmatycznej, transportowane są, w określonej kolejności, składniki rzęski
— najpierw podjednostki tworzące rurkowaty rdzeń, potem hak, i w końcu
włókno. Podjednostki białka (flagelliny), tworzące wydłużający się filament,
przechodzą przez jego kanał osiowy, a następnie, kolejno odkładane są na jego
rosnącym końcu.
Elementy składowe pierścieni L i P, w przeciwieństwie do innych białek rzę-
ski, mają sekwencje sygnałowe (sekcja 7. 6). Wydaje się, że mogą one być trans-

27
(a) Wcześniejszy model.
(b) Obecny model [oparty na np. Kihara i wsp. (1996) JB 178: 4582-4589; Katayama i wsp. (1996) JMB
255: 458-475]. Pierścienie L i Ρ są związane, odpowiednio, z błoną zewnętrzną i warstwą peptydogli-
kanu. Pierścienie S i Μ są teraz widoczne jako pojedyncza struktura — pierścień MS, występujący
w błonie cytoplazmatycznej. Zawiera on cząsteczki białka FliF (tab. 7. 3).
Pierścień C („przełącznik"), przyłączony do pierścienia MS, zawiera białka FliG, FliM i FliN
(tab. 7. 3). Białko FliG podtrzymuje pierścień MS. Białka FliM i FliN są składnikami obwodowymi.
Białka MotA i MotB (elementy stacjonarne) otaczają pierścień MS. MotB jest przyłączone do pepty-
doglikanu. Pierścienie L, P, MS i C, rdzeń i białka MotA i MotB stanowią motor rzęski (= ciałko pod-
stawowe). Wytwarzanie naprężeń (rotacja rzęski) następuje w wyniku interakcji zachodzących mię-
dzy FliG i MotA, dzięki energii powstałej w trakcie przepływu protonów przez motor. Pierścień C
odgrywa także rolę w chemotaksji (rys. 7. 13).
Katayama i wsp. (cytowany wyżej) wspomina o prawdopodobnym „aparacie eksportu" w pierś-
cieniu C (linia przerywana).

portowane w poprzek błony cytoplazmatycznej w podstawowym szlaku sekre-

cyjnym (sekcja 5. 4. 3), a nie przez pierścień MS.
Nie ulega wątpliwości, że komórka nie może tolerować istnienia otwartego
kanału łączącego cytoplazmę (gdzie powstają składniki rzęski) ze środowiskiem
zewnętrznym. Dlatego też tak zwany aparat eksportu musi pełnić funkcje
„portiera", pozwalającego przechodzić przez pierścień MS jedynie odpowiednim

28
białkom. „Aparat eksportu" i pierścień C powstają wraz z pierścieniem MS lub
wkrótce po jego pojawieniu się. Kontrolę genetyczną procesu powstawania
rzęski opisano w sekcji 7. 8. 2. 7.
Rzęski krętków. Krętki są bakteriami gramujemnymi, które mają unikatową
strukturę. Ich rzęski występują na obu biegunach komórki, między warstwą
peptydoglikanu i błoną zewnętrzną. W niektórych przypadkach zachodzą one
na siebie w centralnej części komórki. Są to tzw. rzęski peryplazmatyczne. Ich
liczba różni się w zależności od gatunku. Na przykład Leptonema illini ma dwie
rzęski ułożone biegunowo, zaś Borrelia burgdorferi ma ich około siedmiu, wyra-
stających z każdego bieguna komórki. Rzęska peryplazmatyczna wydaje się
obracać w sposób charakterystyczny dla innych rzęsek [Charon i wsp. (1992) JB
174: 832-840]. Peryplazmatyczne rzęski Treponema pallidum (bakteria wywołująca
kiłę) przedstawiono na fotografiach 2. 4.
Rzęska u przedstawicieli Archaea. Rzęska archeonów różni się znacznie od
rzęski bakteryjnej składem, strukturą i sposobem powstawania. Na przykład fla-
gellina archeonów jest glikozylowana, a włókno jest zwykle znacznie cieńsze od
włókien bakteryjnych. Ponadto flagellina archeonów zawiera sekwencję syg-
nałową (sekcja 7. 6), co sugeruje, iż białko to (odmiennie niż flagelliny bakterii,
które przechodzą przez puste struktury powstającej rzęski) jest transportowane
do błony. Cecha ta oraz widoczne podobieństwa pomiędzy flagellinami archeo-
nów i 4 typem fimbrii sugerują, że rzęska archeonów rośnie od podstawy, a więc
inaczej niż bakteryjna [Jarrel, Bayley i Kostyukova (1996) JB 178: 5057-5064].

2. 2. 14. 2 Fimbrie
Średnica fimbrii wynosi zwykle 2-10 nm, a długość od 0, 1 μm do kilku mikro-
metrów. Fimbrie występują na całej powierzchni komórki (fot. 2. 3, w prawej
dolnej części), bądź jedynie w określonych jej miejscach. Zbudowane są głównie
z białka o identycznych podjednostkach, w skład którego wchodzą również,
często wyspecjalizowane, podjednostki innego typu. Białka fimbrii zawierają
duże ilości aminokwasów niepolarnych, dzięki czemu komórka staje się bardziej
hydrofobowa.
Fimbrie występują powszechnie u bakterii i mogą być kodowane przez chro-
mosom lub plazmid — rozdział 7. U bakterii gramujemnych wyrastają one
z błony zewnętrznej.
Czasami fimbrie mylnie nazywane są pilusami (patrz sekcja 2. 2. 14. 3).
Obecność fimbrii umożliwia wielu bakteriom adhezję międzykomórkową.
W przypadku bakterii patogennej może to ułatwiać proces infekcji. Na przykład
u Neisseria spp. na końcach fimbrii występuje specjalne białko adhezyna, które
ułatwia związanie tych patogenów z komórkami gospodarza. Dla wielu patoge-
nów fimbrie są ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11. 5) (Adhezję u patoge-
nów omówiono w sekcji 11. 2. 1).
Bakterie mające dany typ fimbrii adhezyjnych mogą być wykryte w labora-
torium dzięki zdolności do hemaglutynacji, czyli zbijania erytrocytów (krwinki
czerwone) w widoczne skupiska. Jeśli obecność D-mannozy hamuje ten proces,
mówimy wtedy o „mannozowrażliwej" hemaglutynacji (MSHA, ang. mannose-
sensitive haemagglutination). Inne typy fimbrii powodują „mannozooporną"

29
hemaglutynację (MRHA, ang. mannose-resistant haemaglutination), na którą
cukier ten nie ma żadnego wpływu.
Niektóre przykłady fimbrii wymieniono w tabeli 2. 2. Pojedyncza komórka
może mieć kilka ich rodzajów. Synteza pewnych fimbrii (np. fimbrii typu 1

30
u E. coli i typu b u Haemophilus influenzae) bywa okresowo wyłączana przez
komórkę — nie wszystkie komórki mają wtedy taką fimbrię. U np. Neisseria
gonorrhoeae występuje mechanizm genetyczny powodujący cykliczne zmiany
składu białkowych podjednostek fimbrii.
Powstawanie fimbrii. Większość fimbrii powstaje od podstawy, a więc
odmiennie niż bakteryjne rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1). W co najmniej kilku przypad-
kach składanie tej struktury u bakterii gramujemnych zachodzi w następujący
sposób. Podjednostki białkowe fimbrii (mające sekwencję sygnałową — sekcja
7. 6) przechodzą najpierw przez błonę cytoplazmatyczną. Peryplazmatyczne
białko opiekuńcze (ang. chaperon) wiąże poszczególne podjednostki, uniemoż-
liwiając im w ten sposób abortywny kontakt z innymi podjednostkami. Powstałe
kompleksy przenoszone są do białka przekazującego znajdującego się w błonie
zewnętrznej, które trasportuje je ku podstawie powstającej fimbrii. Geny
kodujące elementy strukturalne fimbrii oraz geny mechanizmu składającego

31
występują w operonach (sekcja 7. 8. 1). Na przykład operon kodujący typ 1 fimbrii
zawiera geny fimA (główna podjednostka), fimC (chaperon) ifimD (białko prze-
kazujące) [Fimbriae in E. coli (artykuł przeglądowy (1996) FEMSMR19: 25-52].

2. 2. 14. 3 Pilusy

Pilusy to długie lub włosowate struktury białkowe, odchodzące od powierzchni

komórki. Biorą one czynny udział w koniugacji (rozdz. 8) bakterii gramujem-
nych, a więc w procesie umożliwiającym międzykomórkową wymianę materiału
genetycznego. Białka pilusów są kodowane przez elementy genetyczne nazy-
wane plazmidami (rozdz. 7). W danej komórce występuje zazwyczaj jeden lub
kilka pilusów.
Poszczególne typy pilusów różnią się np. wielkością i kształtem. Niektóre
z nich są długie, cienkie i giętkie, podczas gdy inne bywają krótkie i sztywne.
Rodzaj pilusa jest uzależniony od warunków fizycznych, w których zachodzi
proces koniugacji (rozdz. 8). Najlepiej został poznany giętki pilus kodowany
przez plazmid F(pilus typu F)(fot. 2. 3, w dolnej lewej części). Ma on średnicę
8-9 nm i długość od jednego do kilku mikrometrów. Pilus ten, zbudowany z heli-
kalnie ułożonych podjednostek białkowych, ma rurkowatą strukturę, w której
występuje kanał osiowy o średnicy około 2, 5 nm.

2. 2. 15 Ruch i chemotaksja
Wiele bakterii może się aktywnie poruszać w płynnym środowisku. Potrafią one
także przemieszczać się w kierunku występowania lepszych źródeł związków
odżywczych, a także uciekać od substancji szkodliwych. Taka kierunkowa
reakcja nazywa się chemotaksją.

2. 2. 15. 1 Ruch

W większości przypadków zdolność ruchu jest uwarunkowana występowaniem

jednej lub większej liczby rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1). Podstawą ruchu rzęskowego
jest rotacja rzęski w ciałku podstawowym.
U bakterii urzęsionych perytrychalnie (np. Salmonella, E. coli) rzęski obracają
się niezależnie od siebie [Macnab i Han (1983) Cell 32: 109-117]. Każda rzęska
przez około 95% czasu obraca się w kierunku niezgodnym z kierunkiem ruchu
wskazówek zegara (CCW, ang. counterclockwise), a przez resztę czasu — w kie-
runku zgodnym z ruchem wskazówek zegara (CW, ang. clockwise). Każda
rzęska sama reguluje częstość przełączania kierunku własnej rotacji. Gdy więk-
szość rzęsek tworzących wiązkę na jednym z biegunów obraca się w kierunku
CCW, bakteria pchana jest do przodu. Ten płynny ruch jest zaburzany (z częstoś-
cią raz na sekundę) przez krótkotrwałe przełączenie kierunku ruchu rotacji
(z CCW na CW) niektórych rzęsek. Wywołuje to koziołkowanie, czyli chwilowy
(trwający ok. 0, 1 sekundy), przypadkowy ruch komórki. Wznowienie płyn-
nego ruchu następuje, gdy większość rzęsek znowu zaczyna się obracać w kie-
runku CCW.

32
 Następujące na przemian: płynny ruch i koziołkowanie powoduje, że komór-
ka porusza się w przypadkowych kierunkach, po liniach prostych leżących
w różnych płaszczyznach.
Komórki urzęsione monotrychalnie (np. Pseudomonas aeruginosa) osiągają
zazwyczaj prędkość około 70 μm/s, zaś urzęsione perytrychalnie około 30 μm/s.
Wyjątkiem są perytrychalnie urzęsione komórki Thiovulum majus, które mogą się
poruszać z prędkością 600 μm/s [Fenchel (1994) Microbiology 140: 3109-3116].
W komórkach urzęsionych monotrychalnie rzęska obraca się równie długo
w kierunku CW, jak i w kierunku przeciwnym. Przypadkowość kierunku ruchu
(wywołana koziołkowaniem w komórkach urzęsionych perytrychalnie) może,
w tym przypadku, wynikać z ruchów Browna (patrz sekcja 16. 1. 1. 3).
Ruch krętków jest związany z rotacją ich rzęsek peryplazmatycznych. U Lep-
tonema Mini rotacja rzęski w kierunku CCW powoduje, że przednia część
komórki przybiera kształt śruby. Komórka zaczyna się obracać wokół własnej osi
w kierunku CW, w wyniku czego bakteria porusza się do przodu ruchem śrubo-
wym. Wydaje się natomiast, że Borrelia burgdorferi porusza się raczej ruchem
wężowym, mimo wygięcia wzdłuż długiej osi komórki, powodującego, że
poszczególne jej części znajdują się w różnych płaszczyznach. Podobnie jak
Leptonella illini, Borrelia również wydaje się obracać wokół własnej osi, zgodnie
z ruchem wskazówek zegara. [Structure/motility of spirochaetes: Goldstein,
Buttle i Charon (1996) JB 178: 6539-6545].
Ruch bez udziału rzęsek. Niektóre bakterie, nie posiadające rzęsek (np.
gatunki z rodzaju Beggiatoa i Oscillatoria), mogą się poruszać tzw. ruchem ślizgo-
wym. Jest to płynny ruch, który zachodzi jedynie wtedy, gdy komórki mają kon-
takt z powierzchnią podłoża stałego. Ślizgająca się komórka pozostawia za sobą
„ślad śluzu". Mechanizm tego ruchu nie jest znany.
U bakterii (wyposażonych w fimbrie) np. z rodzaju Neisseria i Pseudomonas,
które występują w cienkich błonach wody, obserwuje się ruch drgający (ang.
twitching motility). Jest to bierny ruch zachodzący najprawdopodobniej wskutek
działania zewnątrzkomórkowych sił fizykochemicznych.
Serratia marcescens wykazuje niezależny od rzęsek sposób przemieszczania,
w którym istotną rolę może odgrywać napięcie powierzchniowe [Matsuyama
i wsp. (1995) JB 177: 987-991].
U pewnych patogenów obserwuje się ruch zależny od aktyny, gdyż znajdują
się one wewnątrz komórek swoich gospodarzy (patrz np. sekcja 11. 2. 2. 1).
Niezależny od rzęsek ruch aktywowany wapniem (mechanizm nieznany)
występuje np. u szczepów cyjanobakterii Synechococcus [Pitta i wsp. (1997) JB
179: 2524-2528].

2. 2. 15. 2 Chemotaksja

Chemotaksja to ukierunkowany ruch komórki w odpowiedzi na gradient stężeń

różnych związków chemicznych. W środowisku chemicznie jednorodnym urzę-
sione komórki poruszają się w przypadkowych kierunkach (sekcja 2. 2. 15. 1).
Przypuśćmy jednak, że stężenie składników pokarmowych wzrasta w pewnym
kierunku. Czy komórka, która przypadkowo zmienia kierunek ruchu, może
podróżować w stronę zwiększającego się stężenia składników pokarmowych?

33
Może, po prostu poruszając się w tym kierunku zmniejszać częstość koziołkowa-
nia, a zwiększać, gdy zaczyna się od niego oddalać. Dzięki temu komórka przez
dłuższy okres porusza się płynnie w „odpowiednim" kierunku, a więc w stronę
większego stężenia składników pokarmowych.
Związki, które przyciągają komórkę, nazywa się atraktantami, natomiast te,
które powodują jej ucieczkę — repelentami. Obydwa rodzaje związków określa
się łącznie jako efektory.
W jaki sposób komórka „wyczuwa" różne stężenia danego związku i jak
kontroluje częstość koziołkowania? Komórka płynąca w kierunku zwiększa-
jącego lub zmniejszającego się stężenia efektora może wykryć zmianę stężenia
np. dzięki receptorom w jej ścianie komórkowej. W zależności od kierunku
gradientu, receptor (w danym czasie) może mieć większe bądź mniejsze powino-
wactwo do wiązania cząsteczki efektora.
Połączenie atraktanta z receptorem (bądź rozpad tego kompleksu) powoduje
hamowanie lub stymulowanie pewnych sygnałów wewnątrzkomórkowych.
Sygnały powstałe w kompleksie receptora trafiają do motora rzęskowego na dro-
dze przekazywania sygnału (ang. signal transduction pathway; sekcja 7. 8. 6;
rys. 7. 13). Na przykład, uwolnienie cząsteczki atraktanta od receptora MCP
wzmacnia sygnał wywołujący rotację rzęski w kierunku zgodnym z kierunkiem
ruchu wskazówek zegara (który sprzyja koziołkowaniu). Częstość koziołkowa-
nia wzrasta więc w miarę oddalania się komórki od atraktanta. Z drugiej strony
przybliżanie się do atraktanta wydłuża czas ruchu płynnego. Efektem występo-
wania gradientów stężeń różnych związków w środowisku jest tzw. przypad-
kowa celowość ruchu (ang. biased random walk). Celowe zachowanie jest więc
wynikiem selekcji ruchów przypadkowych. Ujednolicenie stężenia efektora
(duże lub małe stężenie) przywraca „normalną" częstość koziołkowania.
Różne aspekty wrażliwości bakterii na bodźce chemiczne omówiono w pracy
przeglądowej Mansona i wsp. [(1998) JB 180: 1009-1022].
Aerotaksja jest szczególnym rodzajem chemotaksji, w której ruchliwe
komórki reagują na gradient stężenia tlenu. Mogą one przemieszczać się w kie-
runku stężenia tlenu (wyższego lub niższego) optymalnego dla ich wzrostu (sek-
cja 3. 1. 6). Jaki jest mechanizm aerotaksji? W co najmniej kilku przypadkach
stwierdzono, że sygnał wywołujący ruch tego typu wymaga zmiany stanu ener-
getycznego komórkowej błony cytoplazmatycznej (sekcja 5. 3. 5).

2. 3 Formy nitkowate i cenocyty

Wspomniano wcześniej, że większość bakterii występuje w formie pojedyn-
czych, autonomicznych komórek. W łańcuchu paciorkowców, na przykład, cho-
ciaż komórki dzielą wspólne mikrośrodowisko, to jednak każda z nich funkcjo-
nuje zupełnie niezależnie. Jednak niektóre bakterie egzystują tworząc formy nit-
kowate lub cenocyty.

34
 2. 3. 1 Formy nitkowate
U niektórych bakterii, komórki po kolejnych podziałach pozostają ze sobą
połączone tworząc filamenty (ang. trichomes), które niekiedy mogą być pokryte
wspólną pochewką. Poszczególne komórki są oddzielone septami. Sąsiadujące
komórki komunikują się ze sobą za pomocą niewielkich porów (mikroplazmo-
desmy). (Pory takie nie występują w zwykłym „łańcuchu" komórek, jaki tworzą
np. paciorkowce). Umiejscowienie septy (w formie przewężenia) nie zawsze jest
widoczne z zewnątrz filamentu. Formy takie tworzy wiele cyjanobakterii i np.
gatunki z rodzaju Beggiatoa.

2. 3. 2 Cenocyty
Nitkowate promieniowce Streptomyces, a także niektóre inne bakterie tworzą
rurkowate strzępki pozbawione sept. W tym przypadku cytoplazma jest więc
ciągła — od jednego nukleoidu do następnego. Taki wielonukleoidowy orga-
nizm nazywany jest cenocytem.
 ROZDZIAŁ

3
Wzrost i rozmnażanie

Wzrost komórki bakteryjnej jest związany ze skoordynowanym zwiększeniem

masy jej części składowych, przy czym nie jest to jedynie wzrost całkowitej masy,
który np. mógłby być powodowany nagromadzeniem się związków zapasowych
w komórce.
Wzrost prowadzi zazwyczaj do podziału komórki na dwie komórki potomne,
podobne do siebie lub identyczne. Wynika z tego, że wzrost i rozmnażanie się
są u bakterii ściśle ze sobą związane, a termin wzrost oznacza zazwyczaj oba te
procesy.

3. 1 Warunki wzrostu
Bakterie rosną jedynie w odpowiednim dla siebie środowisku. Jeśli nie jest ono
optymalne, wzrost może być wolniejszy lub może nie zachodzić wcale, bakterie
mogą nawet ginąć, zależnie od gatunku i warunków.
Do czynników wzrostowych ważnych dla bakterii należą: 1) dostęp odpo-
wiednich substancji odżywczych, 2) źródło energii, 3) woda, 4) odpowiednia
temperatura, 5) odpowiednie pH, 6) odpowiednia ilość (lub brak) tlenu. Oczywi-
ście, żaden z tych czynników nie działa osobno, a zmiana jednego z nich może
zwiększyć lub zmniejszyć wpływ innego, np. wartość najwyższej temperatury
pozwalającej na wzrost bakterii może być znacznie obniżona w środowisku
o nieoptymalnym pH.

3. 1. 1 Substancje odżywcze
Komórki potrzebują substancji odżywczych do wzrostu, przeżycia i podziału.
Ogólnie, bakterie wykorzystują do odżywiania się bardzo różnorodne związki,
włączając różne cukry i inne węglowodany, aminokwasy, sterole, alkohole,
węglowodory, metan, sole nieorganiczne i dwutlenek węgla. Pojedyncza bakter-
ia nie może jednak wykorzystać tych wszystkich związków, ponieważ nie ma

36
wszystkich niezbędnych enzymów, jak również jej osłony nie mają systemów
umożliwiających pobranie (transport) tych licznych składników do wnętrza
komórki.
Niezależnie od gatunku, komórki bakteryjne potrzebują źródła węgla, azotu,
fosforu, siarki i innych pierwiastków tworzących materię organiczną. Niektóre
bakterie zdolne są do zaspokojenia tych potrzeb wykorzystując proste sole nieor-
ganiczne i takie związki jak dwutlenek węgla i amoniak, inne bakterie potrze-
bują, w różnym zakresie, bardziej lub mniej skomplikowanych związków organi-
cznych, pochodzących z innych organizmów. Niektóre ważne problemy
związane z odżywianiem się bakterii są poruszone w rozdziałach 6 i 10.

3. 1. 2 Energia
Energia jest potrzebna żywej komórce do przeprowadzenia większości ważnych
reakcji chemicznych. Niezbędna jest również np. do ruchu rzęski i do pobrania
różnych substancji odżywczych. Całość energii jest uzyskiwana ze źródeł znaj-
dujących się w środowisku. Gatunki fototroficzne otrzymują energię głównie lub
wyłącznie ze światła, natomiast gatunki chemolitotroficzne uzyskują energię na
drodze „przetwarzania" związków chemicznych pobranych ze środowiska.
Niektóre gatunki wykorzystują oba źródła energii. Energii poświęcony jest
rozdział 5.

3. 1. 3 Woda
Około 80% lub więcej bakteryjnej masy stanowi woda. Podczas wzrostu substan-
cje odżywcze wchodzą do komórki, a produkty odpadowe opuszczają ją
w postaci roztworów. Bakterie mogą więc rosnąć w środowisku zawierającym
odpowiednią ilość wolnej (dostępnej) wody. (Nie cała woda w danym środowi-
sku dostępna jest dla bakterii, np. niekiedy może być ona związana w hydrofilo-
wych żelach lub przez jony znajdujące się w roztworze).
Krańcowy brak wody (wysuszenie) jest tolerowany w różnym zakresie przez
poszczególne gatunki bakterii, wiele gatunków nie może jednak przeżyć przez
długi czas w stanie wysuszonym. [Desiccation tolerance of prokaryotes: Potts
(1994) MR 58: 755-805. ]

3. 1. 4 Temperatura
Ogólnie, każdy typ bakterii rośnie najszybciej w określonej temperaturze —
optymalnej temperaturze wzrostu. Wzrost zamiera, gdy temperatura przekra-
cza bądź nie osiąga optimum. Dla każdej bakterii istnieje określona maksymalna
i minimalna temperatura, poza którą w ogóle nie rośnie.
Bakterie termofilne to takie, których optymalna temperatura wzrostu prze-
kracza 45°C. Termofile występują np. w kompostach, gorących źródłach, komi-
nach hydrotermalnych na dnie oceanu. Zaliczamy do nich gatunki Thermobacteroi-
des (opt. 55-70°C) i Thermotnicrobium (opt. 70-75°C). Wśród Archaea, Pyrodictium

37
ma niezwykle wysoką temperaturą optymalną — 105°C. Niektóre termofile
odznaczają się cechami związanymi z adaptacją do wzrostu w wysokiej tempera-
turze. Adaptacja ta widoczna jest w budowie struktur komórki (np. błony cyto-
plazmatycznej), a w niektórych wypadkach nawet w rodzaju metabolizmu
energetycznego (patrz sekcja 5. 3. 6).
Bakterie termowytrzymałe mogą przeżywać — choć niekoniecznie rosnąć —
w temperaturze, która na ogół zabija większość innych wegetatywnych (tj.
rosnących) bakterii. W bakteriologii mleczarskiej do tej grupy zalicza się bakterie,
które przeżywają pasteryzację (sekcja 12. 2. 1. 1).
Mezofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze między 15 a 45°C. Mezo-
file żyją w wielu środowiskach; należą do nich bakterie patogenne dla człowieka
i zwierząt.
Psychrofilne bakterie rosną najlepiej w temperaturze 15°C lub poniżej, nie
rosną powyżej około 20°C, a najniższa temperatura umożliwiająca ich wzrost
to 0°C lub niższa. Psychrofile występują np. w morzach podbiegunowych.
Psychrotropowe bakterie mogą rosnąć w niskich temperaturach (np. 0-5°C),
najlepiej jednak rosną powyżej 15°C, górna granica ich wzrostu wynosi 20°C.

3. 1. 5 pH
Większość bakterii rośnie najlepiej w pH około 7 (obojętne), z czego znaczna
część nie może w ogóle rosnąć w pH silnie kwaśnym lub zasadowym. Jednak
pewne bakterie (odnajdywane np. w kopalnianych ściekach lub niektórych
gorących źródłach) nie tylko tolerują, lecz nawet „wolą" kwaśne lub bardzo
kwaśne środowisko. Do tych acydofilów należy Thiobacillus thiooxidans, gatunek,
dla którego optymalne pH wynosi 2-4. Gatunek Sulfolobus należący do Archaea
rośnie w pH 1-5, natomiast dla Thermoplasma acidophilum optymalne pH wynosi
0, 8-3.
Alkalofile rosną najlepiej w środowiskach zasadowych — zazwyczaj powy-
żej pH 8. Thermobacterium roseum (opt. pH 8, 2-8, 5) występuje np. w ciepłych
źródłach, a Exiguobacterium aurantiacum (opt. pH 8, 5 i 9, 5) było odnajdywane
w ściekach z przemysłu przetwórstwa ziemniaczanego. Inne alkalofile są spoty-
kane w naturalnych zasadowych jeziorach.
Acydofile i alkalofile mogą rosnąć wolno lub nie rosną wcale w pH 7.

3. 1. 6 Tlen
Niektóre bakterie wymagają do wzrostu tlenu, natomiast inne — jego braku.
Jeszcze inne mogą rosnąć niezależnie od dostępności lub braku tego pierwiastka.
Bakterie, które muszą mieć tlen do wzrostu, nazywane są właściwymi lub
bezwzględnymi tlenowcami, dla podkreślenia ich całkowitej zależności od tlenu.
Właściwe lub bezwzględne beztlenowce rosną jedynie w warunkach braku
tlenu, organizmy te występują np. w mułach rzecznych lub w żwaczu prze-
żuwaczy.
Bakterie zwykle rosnące w obecności tlenu, ale mogące również rosnąć
w warunkach beztlenowych (tj. przy braku tlenu), nazywane są względnymi

38
beztlenowcami. Podobnie te, które zwykle rosną beztlenowo, ale mają zdolność
do wzrostu w obecności tlenu, nazywamy względnymi tlenowcami.
Mikroaerofilne bakterie zazwyczaj rosną najlepiej, gdy stężenie tlenu jest
mniejsze niż w powietrzu (na ogół znacznie). Niektóre bakterie charakteryzują
się aerotaksja (sekcja 2. 2. 15. 2).

3. 1. 7 Jony nieorganiczne
Wszystkie bakterie wymagają jonów nieorganicznych (np. chlorkowych lub
magnezowych) w małym stężeniu; większe stężenie na ogół hamuje wzrost. Jony
pełnią różne funkcje, np. magnez — w błonie zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2), żelazo
w cytochromach (sekcja 5. 1. 1. 2) i w wielu innych enzymach, a mangan i nikiel —
w enzymach i systemach enzymatycznych (patrz również sekcja 11. 4. 1. 3).
Pewne bakterie (halofile) rosną jedynie w obecności dużych stężeń elektroli-
tów (zazwyczaj NaCl). Niektórzy przedstawiciele Archaea (np. Halobacterium
salinarium), które występują w słonych jeziorach, solonych rybach, itp., są
przykładami krańcowych halofilów: potrzebują stężenia przynajmniej 1, 5 Μ
NaCl do wzrostu, a 3-4 Μ do wzrostu wydajnego. Elektrolity służą do stabiliza-
cji struktur komórkowych, np. rybosomów i osłon komórki; w roztworach roz-
cieńczonych komórki niektórych gatunków pękają z powodu rozluźnienia osłon.
Halotolerancyjne bakterie są definiowane jako nie-halofile, które mogą
rosnąć w elektrolitach o stężeniu 2, 5 M; należy do nich wiele szczepów Staphylo-
coccus.
Jony nieorganiczne mogą być istotne dla regulacji wielu funkcji fizjologicz-
nych. Na przykład jony Ca 2+ pełnią stwierdzoną lub tylko przypuszczalną rolę
w nabywaniu zdolności transformacji (kompetencji) (sekcja 8. 4. 1), chemotaksji
(sekcja 2. 2. 15. 2) i sporulacji u B. subtilis (sekcja 7. 8. 6. 1) [Calcium signalling in
bacteria: Norris i wsp. (1996) JB 178: 3677-3682].

3. 1. 8 Odpowiedź na zmieniające się warunki — adaptacja

Bakterie żyjące w środowiskach bardzo wyspecjalizowanych, np. w krańcowej
temperaturze lub wewnątrz komórek innych organizmów, nie tolerują zazwy-
czaj innych środowisk. Wiele jednak bakterii nadal rośnie (lub przynajmniej
przeżywa) nawet wtedy, gdy w środowisku zaszły istotne zmiany. Taka konty-
nuacja wzrostu (lub przeżycie) oznacza, że organizmy te albo nie są wrażliwe na
określone zmiany, albo zdolne są zaadaptować się (tj. ulec zmianie) w sposób
umożliwiający tolerancję lub czerpanie korzyści z nowych warunków.
Adaptacja wymaga niejednokrotnie syntezy nowych rodzajów białek (nie-
zbędnych do pełnienia specyficznych funkcji) lub zahamowania syntezy innych,
co z kolei pociąga za sobą zmiany w wyrażaniu się różnych genów (rozdz. 7).
Jednym z przykładów może być adaptacja Salmonella typhimurium do warunków
silnie kwasowych (sekcja 7. 8. 2. 6).
Innym przykładem jest adaptacja do zmian osmolalności środowiska lub
pożywki (= osmoregulacja). Zwiększenie osmolalności prowadzi do wypływu

39
wody z komórki, a to z kolei zmniejsza turgor i zwiększa stężenie roztworów
wewnątrzkomórkowych do poziomu hamującego wzrost. W Escherichia coli
znaczne podwyższenie zewnętrznej osmolalności prowadzi do zmian we
względnych ilościach niektórych białek tworzących pory błony zewnętrznej, co
powoduje zmniejszenie ich rozmiarów.
Escherichia coli reaguje natychmiast na wzrost osmolalności, pobierając jony
potasowe (K+) i syntetyzując glutaminian (jon o przeciwnym ładunku). Prowadzi
to do przeciwdziałania wysokiej zewnętrznej osmolalności przez wzrost osmola-
lności zewnętrznej. W pobieraniu K+ bierze udział kilka systemów transportu
(sekcja 5. 4), np. system Trk (który jest konstytutywny — tzn. zawsze aktywny)
i system Kdp (który jest indukowany przez wysoką osmolalność, sekcja 7. 8. 6).
Wydaje się, że system Kdp zostaje włączony na skutek zmniejszenia turgoru (lub
przez podobny czynnik).
Podwyższenie ciśnienia osmotycznego przyczynia się również do pobrania
(lub syntezy de ηονο) nieszkodliwych substancji rozpuszczalnych, czyli pewnych
rodzajów małych cząsteczek, które mogą być gromadzone wewnątrz komórki
nawet w dużych stężeniach bez negatywnego wpływu na jej przeżywalność.
Prowadzi to do wzrostu wewnątrzkomórkowej osmolalności. Wynika z tego, że
substancje te mogą zastępować przynajmniej część nagromadzonych jonów pota-
sowych, których stopień fizjologicznej szkodliwości zależy od ich stężenia.
Do nieszkodliwych rozpuszczalnych substancji zalicza się betainę glicynową
((CH3) -N+-CH2COO") — cząsteczkę powszechnie występującą, która jest wydaj-
nie pobierana przez E. coli przy udziale systemu transportowego zależnego od
białka wiążącego (sekcja 5. 4. 1. 1) nazwanego ProU [Lucht i Bremer (1994)
FEMSMR 14: 3-20]. Pobranie betainy glicynowej w następstwie podwyższenia
ciśnienia osmotycznego jest zjawiskiem powszechnym zarówno wśród bakterii
gramujemnych, jak i gramdodatnich. Halotolerancyjna bakteria Staphylococcus
aureus ma dwa systemy transportujące betainę glicynową [patrz np. Pourko-
malian i Booth (1994) Microbiology 140: 3131-3138].
Sinorhizobium meliloti metabolizuje (a więc nie akumuluje) większość znanych
osmoprotektantów, włączając betainę glicynową, w związku z czym nie mogą
one powodować zwiększonej osmolalności tej bakterii. W przypadku tego orga-
nizmu zwiększenie ciśnienia osmotycznego powoduje gromadzenie endogen-
nych substancji rozpuszczalnych (np. glutaminianu i amidu N-acetyloglutaminy-
loglutaminowego), którego akumulacja jest stymulowana przez endogenną
sacharozę [Gouffi i wsp. (1998) JB 180: 5044-5051].
[Regulation of compatible solute accumulation in bacteria: Poolman i Glaa-
sker (1998) MM 29: 397-407].
Obniżenie ciśnienia osmotycznego prowadzi do aktywacji systemów wypły-
wu związków z komórki; np. K+ i glutaminian są gwałtownie usuwane przez
E. coli, a specyficzne, nieszkodliwe substancje rozpuszczalne są uwalniane przez
inne organizmy. Wypływ nie jest uzależniony od energii metabolicznej, co kon-
trastuje z pobieraniem betainy glicynowej przez system transportu ProU (który
jest zależny od ATP).
Większość K+ uwalnianego przez E. coli w wyniku obniżenia ciśnienia osmo-
tycznego przechodzi przez tzw. „kanały mechanowrażliwe" w błonie cytoplaz-

40
matycznej, np. kanał MscL (sekcja. 2. 2. 8); zostało to stwierdzone w trakcie badań
nad mutantami w genie mscL [Blount i wsp. (1997) JBC 272: 32150-32157].
Struktury zwane akwaporynami (ang. aquaporins) (sekcja 2. 2. 8) mogą odgry-
wać rolę w osmoregulacji, dowodów na to jednak nie ma.
Wiele względnie beztlenowych bakterii (sekcja 3. 1. 6) może adaptować się do
wzrostu beztlenowego (lub powracać do życia w warunkach tlenowych) przez
zmianę alternatywnych dróg metabolizmu energetycznego (rozdz. 5), co
wymaga, między innymi, syntezy nowych enzymów (białek).
Genetyczne i regulacyjne problemy związane z adaptacją są omawiane
w sekcjach 7. 8. 2. 3-7. 8. 2. 6 i 7. 8. 6.

3. 2 Wzrost pojedynczej komórki

W rosnących komórkach obserwujemy skoordynowany wzrost masy jej składni-
ków. Słowo „skoordynowany" nie znaczy, że wszystkie części komórki tworzą
się jednocześnie. Niektóre są syntetyzowane w sposób bardziej lub mniej ciągły,
inne tworzą się w określonej kolejności, podczas pewnych, dokładnie wyznaczo-
nych okresów. Ten cykl zdarzeń związanych ze wzrostem i podziałem komórki
na dwie potomne nazywany jest cyklem życiowym.

3. 2. 1 Cykl życiowy
Większość badań dotyczących cyklu życiowego komórki wykonano z Escherichia
coli (gramujemną pałeczką) i głównie na tych danych oparte jest przedstawione
podsumowanie.
Rozmiary komórki podczas wzrostu. Szybko rosnące komórki są większe
(pod względem masy i objętości) niż komórki rosnące powoli. Gdy czas podwo-
jenia liczby komórek (sekcja 3. 2. 3) jest krótszy niż 1 godz., okresy cyklu życio-
wego C i D, (rys. 3. 2, część dolna) są praktycznie stałe, a na początku okresu
C masa komórki (w przeliczeniu na ilość miejsc początku replikacji chromosomu,
tzw. origins) jest również stała dla danej szybkości wzrostu. W tych warunkach,
im szybciej komórka rośnie (tj. im krótszy jest okres I), tym większy będzie
wzrost jej masy (i objętości) pod koniec stałego okresu poprzedzającego podział
komórki, C + D.
Podczas wzrostu ze stałą szybkością przyrost masy komórki jest związany
jedynie z przyrostem jej długości, średnica pozostaje niezmienna. Wraz ze zwięk-
szeniem szybkości wzrostu komórka staje się większa: średnica komórki wzrasta
powoli, jej długość szybciej i, w rezultacie, komórka początkowo „przeholowuje"
(tzn. zwiększa się bardziej niż byłoby to właściwe dla nowej szybkości wzrostu).
Następnie rośnie średnica komórki, osiągając nową wartość, natomiast jej
długość zmniejsza się do rozmiaru końcowego (który nadal przewyższa rozmiar
początkowy). Zmniejszenie szybkości wzrostu prowadzi do początkowego, zbyt-
niego zmniejszenia się długości komórki. Również i w tym wypadku średnica
komórki przystosowuje się wolniej niż jej długość do nowej szybkości wzrostu
[Zaritsky i wsp. (1993) JBM 139: 2711-2714].

41
 Synteza osłon komórkowych. Synteza osłon komórkowych zachodzi prawdo-
podobnie w ciągu całego cyklu komórkowego podczas ciągłego, jednostajnego
wzrostu. Jeden z modeli [Cooper (1991) MR 55: 649-679] przyjmuje, że Peptydo-
glikan jest włączany w sposób rozproszony do ściany bocznej, a przede wszyst-
kim do biegunów komórki. Hipoteza ta jest zgodna z późniejszymi badaniami
dotyczącymi metabolicznego obrotu peptydoglikanu w rosnących komórkach
[Park (1993) JB 175: 7-11]. Wyniki tych badań sugerują, że ściana boczna zawiera
jedną warstwę peptydoglikanu, natomiast w okolicach biegunów występuje
kilka jego warstw.
Niedawno Holtje [Microbiology (1996) 142: 1911-1918] przedstawił model
woreczka (sakulusa) peptydoglikanowego, zwany „3 za 1". Model ten uwzględnia
zarówno liczne cechy biosyntezy, jak i istnienie różnych typów mostków peptydo-
wych, które występują w woreczku (ryc. 2. 7, nagłówek). Model jest przedsta-
wiony na rysunku 3. 1. W celu koordynacji różnych syntetycznych i litycznych
procesów związanych z syntezą woreczka, Holtje postuluje istnienie dwóch
typów holoenzymów: jednego działającego w ścianie komórkowej, drugiego —
związanego z tworzeniem septy. Oba typy enzymów byłyby związane z białkami
wiążącymi penicylinę (ang. PBPs, sekcja 2. 2. 8) i z „litycznymi transglikozyla-
zami", tj. enzymami mającymi zdolność do degradacji peptydoglikanu w sposób
procesywny (tzn. cięcie enzymatyczne związane jest z przesunięciem się enzymu).
Metaboliczny obrót peptydoglikanu pozwala na ponowne wykorzystanie
peptydów podczas wzrostu komórki (sekcja 5. 4. 6).
Przyjmuje się, że błona cytoplazmatyczna rozwija się w sposób bierny, tj. po
prostu „dotrzymuje kroku" rosnącemu woreczkowi peptydoglikanowemu. Syn-
teza peptydoglikanu zależy jednak od syntezy fosfolipidów błonowych, a to
sugeruje nowy sposób regulacji wzrostu osłony komórkowej [Rodionov i Ishi-
guro (1996) Microbiology 142: 2871-2877],
Replikacja chromosomu (DNA). Niezbędna koordynacja replikacji (DNA)
chromosomu (sekcja 7. 3) i podziału komórkowego jest przedstawiona w sekcji
3. 2. 1. 1 i na rysunku 3. 2.
Co kontroluje inicjację (rozpoczęcie) replikacji podczas cyklu życiowego?
Odpowiedź na to pytanie nie jest znana, wiadomo jednak, iż inicjacja, mimo że
jest regulowana, może zajść w różnych, określonych momentach od rozpoczęcia
cyklu (zależy to od szybkości wzrostu) oraz że zachodzi ona mniej więcej w tym
samym czasie we wszystkich miejscach origin, jakie są w komórce [Nordstrom
i Austin (1993) MM 10: 457-463]. Czasową zależność inicjacji replikacji od szyb-
kości wzrostu przedstawiono na rysunku 3. 2. Ważne jest porównanie górnych
i dolnych zbiorów sekwencji 1+ C + D oraz zwrócenie uwagi na synchronizacje
inicjacji (początek okresu C) z różną szybkością wzrostu. (Może to być przydatne
do narysowania nowego zbioru 1+ C + D, gdzie I, oznaczające początek replika-
cji, jest równe połowie C).
Niektóre czynniki pełnią istotną rolę w inicjacji replikacji. Jednym z nich jest
wewnątrzkomórkowe stężenie białka DnaA (lub, być może, jego aktywnej
formy). Inicjacja replikacji wymaga rozdzielenia dwóch nici DNA w chromoso-
mowym origin (sekcja 7. 3), a to z kolei jest uzależnione od uprzedniego
związania w tym miejscu wielu cząsteczek DNA. Wynika stąd, że niedostateczna
ilość DnaA może opóźniać inicjacje.

42
(a) Pojedyncza warstwa peptydoglikanu. Struktura ta znajduje się pod stałym naprężeniem. Środ-
kowy łańcuch , zwany łańcuchem „do wycięcia", zostanie zastąpiony przez trzy inne łańcuchy
(stąd nazwa „3 za 1").
(b) Trzy połączone łańcuchy są umieszczone pod (tzn. od strony cytoplazmy) warstwą peptydogli-
kanu. Boczne łańcuchy tej trójki są połączone kowalencyjnie z każdej strony z łańcuchem „do usunię-
cia". Aby te wiązania mogły powstać, boczny peptyd (rys. 2. 7b) każdego bocznego łańcucha łączy się
z grupą ε-aminową podwójnego mostka peptydowego, co prowadzi do powstania mostka potrój-
nego (rys. 2. 7b).
(c) Łańcuch „do usunięcia" usuwany jest enzymatycznie, a następnie, ze względu na naprężenie war-
stwy peptydoglikanu, nowy tryplet zajmuje pozycję usuniętego łańcucha. Ma to znaczenie
w wydłużaniu się komórki. Przedstawiony model zakłada, że środkowy łańcuch w trójce, po włącze-
niu do woreczka peptydoglikanowego, będzie funkcjonował jak nowy łańcuch „do usunięcia". Z tego
powodu podwójny mostek łączący każdy z bocznych łańcuchów powinien mieć wolną grupę ε-ami-
nową położoną w bocznym peptydzie bocznego łańcucha.
Według przedstawionego modelu podwojenie długości komórki wymaga, aby: 1) łańcuchy „do
usunięcia" wymieniły się w woreczku i 2) tylko te z łańcuchów do usunięcia, które były na początku
nowego cyklu komórkowego, zostały zastąpione przez nową trójkę. W ten sposób nowe łańcuchy
„do usunięcia" włączone podczas bieżącego cyklu komórkowego nie mogą być zastąpione dopóki
nie rozpocznie się nowy cykl. Widać stąd, że mechanizm wzrostu musi mieć możliwość odróżnienia
„starych" łańcuchów do usunięcia od „nowych". Jest to możliwe, ponieważ nowo syntetyzowany
Peptydoglikan jest związany z woreczkiem jedynie przez mostki peptydowe typu tetra-tetra
(rys. 2. 7b). Postulowano więc, że nowe łańcuchy (identyfikowane przez wiązania tetra-tetra) nie są
rozpoznawane jako łańcuchy „do usunięcia". Natomiast na początku każdego nowego cyklu
komórkowego wszystkie wiązania tetra-tetra muszą przejść (na skutek działania enzymu
LD-karboksypeptydazy) w wiązania tetra-tri, co z kolei pozwala na ich rozpoznanie jako łańcuchy
„do usunięcia".
Kolejne dodawanie trójek w miejscu wyznaczającym środek komórki, być może w połączeniu
z pierścieniem FtsZ (sekcja 3. 2. 1, tworzenie septy), może mieć znaczenie dla wrastania peptydo-
glikanu do wnętrza komórki podczas tworzenia się septy.

43
Replikacja zaczyna się w określonym miejscu chromosomu — origin (sekcja 7. 3), oznaczonym
jako małe kółko. Kiedy wzrost jest powolny (góra), każda z nowych komórek potomnych
ma dokładnie jeden chromosom. Dzieje się tak, ponieważ po podwojeniu się chromosomu nowa
runda replikacji nie zaczyna się przed końcem podziału komórkowego. Kiedy wzrost jest szybki,
nowa runda replikacji rozpoczyna się przed zakończeniem poprzedniej, a więc na długo przed
podziałem komórki. W wyniku tego każda komórka potomna przedstawiona na rysunku ma około
1 1 / 2 chromosomu.
Cykl podziału komórki może być przedstawiony jako liniowy ciąg złożony z trzech okresów: I, C i D.
C to okres, podczas którego zachodzi replikacja, D jest okresem tworzenia septy, pod jego koniec
następuje podział komórki. I oznacza okres między początkiem kolejnych rund replikacji chromo-

44
 Innym czynnikiem jest stopień metylacji origin (oriC) (sekcja 7. 4, 7. 8. 8). Regu-
lacja czasu inicjacji może być związana z opóźnioną lub stopniową metylacją
oriC, czego przyczyną może być trudna dostępność miejsc regulacyjnych dla
enzymów metylujących.
W końcu, inicjacja jest połączona z szybkością wzrostu. Jeden z sugerowa-
nych mechanizmów tej korelacji jest związany z małą cząsteczką, 5'-difos-
foranem 3'-difosfoguanozyny (tetrafosforanem guanozyny, ppGpp), którego
stężenie wewnątrzkomórkowe jest jest odwrotnie proporcjonalne do szybkości
wzrostu. Duże stężenie może hamować syntezę białka DnaA, a to z kolei może
opóźnić inicjację (patrz wyżej oraz rozdz. 7. 8. 2. 5). Ciekawe jest to, że ppGpp ma
również związek z syntezą białka FtsZ biorącego udział w tworzeniu septy, czyli
przegrody komórkowej (co będzie omówione dalej).
Dekatenacja i rozdział chromosomów. Podczas podziału każda z komórek
potomnych otrzymuje tę samą liczbę chromosomów. Zaraz po powieleniu chro-
mosomy występują w formie katenatów (czyli są szczepione ze sobą, jak ogniwa
łańcucha), a więc muszą się rozdzielić. Rozdział jest związany z funkcją pewnych
enzymów (topoizomeraz), które mogą przeciąć jedną lub dwie nici DNA,
a następnie przesunąć je (ją) przez powstałą lukę. Jeśli jakaś istotna topoizome-
raza jest niefunkcjonalna (np. w wyniku mutacji), dekatenacja nie zachodzi.
Niektóre z mutacji w genie parC E. coli (kodującym podjednostkę topoizomerazy
IV) zapobiegają dekatenacji i prowadzą do powstania bardzo długich komórek
— filamentów (zawierających sczepione chromosomy), jak również komórek
pozbawionych jądra (nie zawierających chromosomu).
Chromosomy po rozdziale ulegają zagęszczeniu i tworzą nukleoid (sekcja
2. 2. 1). Może to być zależne od przyłączenia wielu cząsteczek białka HU,
które wiąże się najlepiej do zgiętego DNA [Pontiggia i wsp. (1993) MM 7:
343-350].
Mechanizm rozdziału chromosomów do komórek potomnych nie jest znany.
Może polegać na: 1) połączeniu nukleoidów z błoną cytoplazmatyczną (wtedy
byłyby one rozsuwane mechanicznie); 2) wzajemnym odpychaniu się nukleoi-
dów lub/i 3) działaniu przypuszczalnego białka, związanego z tą funkcją (pro-
duktu genu mukB) [Chromosome partitioning in Escherichia coli: Lobner-Olesen
i Kuempel (1992) JB 174: 7883-7889].

somu (tj. DNA) i równa się czasowi podwojenia się liczby komórek (sekcja 3. 2. 3). Koniec poprzed-
niego okresu I zbiega się z początkiem okresu następnego.
W każdym, przedstawionym na diagramie, ciągu I + C + D stosunek między daną sekwencją
I + C + D a tą wykreśloną powyżej obrazuje stosunek komórek potomnych do rodzicielskich. Górny
zestaw I + C + D pokazuje kolejne cykle komórkowe podczas powolnego wzrostu. Należy zauważyć,
że gdy I = C + D, nowa runda replikacji chromosomu nie zacznie się przed końcem okresu D, tj.
przed końcem podziału komórek. Dolny zestaw I + C + D przedstawia kolejne cykle komórkowe, gdy
wzrost jest szybki. W tej sytuacji, okres I jest krótszy niż C, co znaczy, że kolejna runda replikacji
chromosomu rozpoczyna się zanim poprzednia runda dobiegnie końca, a więc pod koniec okresu D
nowa runda replikacji jest już w toku. W szybko rosnących komórkach stadium replikacji chromo-
somu w nowej komórce potomnej zależy od momentu inicjacji, czyli od początku okresu C w komó-
rce rodzicielskiej.
W szybko rosnących komórkach E. coli okresy C i D są mniej więcej stale i wynoszą odpowied-
nio 42 min i 22-25 min.

45
 Badania bakterii z rodzaju Bacillus sugerują, że rozdział nukleoidów może
być procesem dwufazowym. Początkowo regiony oriC nukleoidów odpychają się
wzajemnie w sposób aktywny, po czym następuje bierny ruch pozostałej, więk-
szej części każdego nukleoidu do miejsc wskazanych przez oriC. Ten bierny
ruch jest prawdopodobnie związany ze wzrostem osłon komórkowych [Sharpe
i wsp. (1998) JB 180: 547-555].
U Bacillus subtilis prawidłowy rozdział chromosomów (zarówno podczas
wzrostu, jak i sporulacji) jest zależny od produktu genu spoOJ. SpoOJ tworzy sku-
piska umiejscowione na biegunach komórki. Powielają się one na początku każ-
dej rundy replikacji DNA, a powstałe skupiska potomne dążą do biegunów
komórki. Ten rozdział skupisk, nie związany z wydłużaniem się komórki, przy-
czynia się prawdopodobnie do ruchu chromosomów potomnych do dwóch bie-
gunów komórki. Tak więc rozdział chromosomów wydaje się procesem dyna-
micznym, przypominającym mitozę [Glaser i wsp. (1997) GD 11: 1160-1168].
Białko Smc Bacillus subtilis (kodowane przez gen smc) prawdopodobnie
odgrywa ważną rolę w tworzeniu struktury nukleoidu, a w konsekwencji może
być potrzebne do jego prawidłowego rozdziału. Mutacje w smc są przyczyną
powstania nienormalnych (mniej gęstych) nukleoidów, które mogą być niepra-
widłowo zwinięte oraz mogą przeszkadzać w tworzeniu się prawidłowych sku-
pisk Spo0J. W E. coli mutacje w genie mukB dają prawdopodobnie ten sam efekt;
można z tego wysnuć wniosek, że Smc i MukB pełnią podobne funkcje. Homo-
logi Smc były opisane w archeonach, Methanococcus jannaschi i Archaeoglobus fulgi-
dus. Sugeruje się, że SpoOJ bierze udział w organizacji regionu oriC, z kolei
w pełnieniu tej funkcji pomaga obecność prawidłowego nukleoidu tworzonego
w obecności Smc. Zarówno SpoOJ, jak i Smc mają więc udział w tworzeniu
nukleoidów gotowych do rozdziału [Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12:
1254-1259].
Tworzenie septy. Rosnąca komórka może się podzielić na dwie potomne
przez wytworzenie rozdzielającej je ściany komórkowej (septy). Tworzenie septy
rozpoczyna się od powstania pierścieniowatego tworu złożonego z cząsteczek
białka FtsZ (produktu genu ftsZ) na obwodzie wewnętrznej powierzchni błony
cytoplazmatycznej w środku komórki (fot. 3. 1), co określa płaszczyznę później-
szej septy. Powstanie wiązania między FtsZ a białkiem należącym do osłon
komórkowych (ZipA) jest z pewnością konieczne do podziału komórki [Hale
i deBoer (1997) Cell 88: 175-185]. Inne białko błonowe, FtsW, również jest po-
trzebne do utworzenia pierścienia FtsZ. Utworzenie pierścienia FtsZ (pierście-
nia Z) wymaga dostarczenia energii. Związek między rozpoczęciem wytwarza-
nia tego pierścienia a cyklem komórkowym nie jest znany. Badania nad mutan-
tami ftsZ E. coli sugerują rolę ppGpp w kontroli ekspresji FtsZ podczas podziału
komórki [Powell i Court (1998) JB 180: 1053-1062].
Badania ostatnich lat wykazują, że składanie pierścienia Z rozpoczyna się
w tzw. „jądrze nukleacji", a następnie postępuje dwukierunkowo wzdłuż
obwodu komórki. Samo tworzenie miejsc nukleacji może zależeć od białka Era
(produktu genu era) — GTPazy należącej do superrodziny Ras, a więc era może
być ważnym czynnikiem podziału komórki [Bacterial division sites: Bouche
i Pichoff (1998) MM 29: 19-26].

46
 Co ciekawe, bezjądrowe komórki (powstałe w wyniku omawianej poprzed-
nio mutacji parC) również mogą tworzyć pierścień — pierścień C. Wskazuje to,
że tworzenie miejsc podziału nie zależy od obecności chromosomu [Sun, Yu
i Margolin (1998) MM 29; 491-503].
Pierścień Z wytwarzany jest również przez Archaea, co sugeruje, że aparat
związany z podziałem komórkowym występował już u wspólnego przodka
prokariotów [Wang i Lutkenhaus (1996) MM 21: 313-319].
Komórki E. coli rozchodzą się natychmiast po podziale. U innych gatunków
podział może nie następować natychmiast, co prowadzi do powstania zgrupo-
wań komórek (sekcja 2. 1. 3). Cykl komórkowy Archaea jest omówiony przez Ber-
nandera [(1998) MM 29: 955-961].

3. 2. 1. 1 Model Helmstettera-Coopera

W cyklu komórkowym bardzo ważna jest właściwa synchronizacja replikacji

chromosomu z podziałem komórki. Model Helmstettera-Coopera opisuje
(rys. 3. 2) replikację chromosomu w jednym cyklu komórkowym. Jeśli wzrost jest
powolny, to między podziałami zachodzi jedno całkowite podwojenie się chro-
mosomu. W tej sytuacji nowa komórka potomna otrzymuje tylko jeden chromo-
som. Podczas szybkiego wzrostu nowa runda replikacyjna rozpoczyna się, kiedy

47
poprzednia nie jest jeszcze zakończona, a więc każda komórka może otrzymać
więcej niż jeden chromosom — około 11/2 chromosomu, jak na rysunku 3. 2. W ten
sposób można wytłumaczyć wpływ szybkości wzrostu na liczbę chromosomów
w komórce (sekcja 2. 2. 1).

3. 2. 1. 2. Geny związane z cyklem komórkowym — „morfogeny"

Kontrola genetyczna (rozdz. 7) cyklu komórkowego wymaga prawidłowego

funkcjonowania tzw. morfogenów i ich produktów. Geny te muszą zapewnić nie
tylko tworzenie odpowiednich produktów we właściwym czasie, ale również
prawidłowe ich rozmieszczenie w obrębie komórki. Wiadomo jest na przykład,
że podczas podziału komórki septa musi się wytworzyć raczej w pozycji odpo-
wiadającej połowie jej długości, a nie blisko biegunów komórkowych. Oznacza
to, że białko FtsZ (sekcja 3. 2. 1) musi być w jakiś sposób skierowane do miejsca
odpowiadającego połowie długości komórki. Jeden z modeli zakłada, że produk-
ty genów minC i minD tworzą kompleks, MinCD, który wiąże się z alternatyw-
nymi miejscami tworzenia septy, położonymi blisko biegunów. Wiążąc się
w tych miejscach, MinCD usuwa białko FtsZ, a tym samym zapobiega tworzeniu
się septy w pobliżu biegunów. MinCD nie może się wiązać w środku komórki,
ponieważ wyklucza to poprzednie związanie się produktu genu minE (MinE)
w miejscu przyległym [Huang, Coa and Luthenhaus (1996) JB 178 5080-5085];
sytuacja ta pozwala białku FtsZ zapoczątkować tworzenie się septy w połowie
długości komórki. Należy zauważyć, ze podczas tworzenia się endospor (sekcja
4. 3. 1) w komórkach Bacillus subtilis tworzenie się septy przy biegunach może
również zależeć od działania kompleksu MinCD (patrz podpis do rys. 7. 14).
Produkt morfogenu envA jest konieczny do rozdziału septy, z wytworzeniem
dwóch nowych biegunów w komórkach potomnych.
Do morfogenów należą również geny, które kodują białka wiążące penicylinę.

3. 2. 1. 3 Kontrola cyklu komórkowego

W cyklu komórkowym jakiekolwiek zdarzenie może być bezpośrednio uzależ-

nione od wystąpienia zdarzenia poprzedniego. Zdarzenia te mogą być kontrolo-
wane niezależnie, bądź też mogą być skoordynowane. Niektórzy badacze [np.
Nordstrom, Bernander i Dasgupta (1991) MM 5 769-774] są zwolennikami istnie-
nia kontroli niezależnej. Za takim wnioskiem przemawia kilka faktów. 1) Nie-
które zdarzenia w cyklu komórkowym mogą być zablokowane niezależnie. Na
przykład podział komórki może nastąpić bez poprzedzającej go replikacji chro-
mosomu lub właściwego rozdziału nukleoidów, w tym wypadku żaden sygnał
nie może być przekazany (w normalnych warunkach) od zdarzenia poprze-
dzającego etap badany. 2) Nie ma bezpośrednich dowodów na związek replikacji
chromosomu z podziałem komórki, chociaż pośrednia ich koordynacja z pewnoś-
cią istnieje. Tak więc, uszkodzenie DNA potencjalnie prowadzące do zahamowa-
nia replikacji indukuje system SOS (sekcja 7. 8. 2. 2) — ogólny mechanizm regula-
cyjny, który między innymi hamuje podział komórkowy. To zahamowanie jest
związane z genem sulA należącym do systemu SOS, którego produkt blokuje
FtsZ, białko konieczne do zapoczątkowania tworzenia się septy (sekcja 3. 2. 1).

48
 3. 2. 2 Modele podziału komórkowego
Podział komórki (np. E. coli) na dwie potomne, które są zazwyczaj podobne lub
identyczne, nazywany podziałem na dwie, jest z pewnością najpowszechniej-
szym sposobem podziału komórek bakteryjnych. „Asymetryczny" podział, pro-
wadzący do wytworzenia komórek niepodobnych do komórki rodzicielskiej
występuje np. u Caulobacter (rozdz. 4).
Podział wielokrotny jest związany z powtarzającymi się podziałami podwój-
nymi i występuje np. u sinic.
Podział na trzy prowadzi do utworzenia trzech komórek z jednej i występuje
np. u Pelodictyon — organizmu tworzącego trójwymiarową sieć komórek.
Pączkowanie jest formą podziału, podczas którego komórka potomna
powstaje z komórki macierzystej (ojcowskiej) na skutek miejscowego przero-
stu (pączka) i spotykany jest np. u gatunków Blastobacter, Hyphomicrobium
i Nitrobacter.

3. 2. 3 Czas podwojenia liczby komórek

Czas konieczny do przebiegu jednego pełnego cyklu komórkowego, czyli czas
podwojenia liczby komórek, waha się zależnie od gatunku i warunków wzros-
tu. Czas ten jest najkrótszy w warunkach optymalnych. Dla E. coli minimalny
czas podwojenia liczby komórek wynosi około 20 min, dla niektórych innych
gatunków, np. Mycobacterium, czas ten wynosi wiele godzin. Wyliczono, że czas
podwojenia liczby komórek Mycobacterium leprae, bakterii wywołującej trąd,
w zainfekowanych tkankach trwa około 2 tygodni.

3. 3 Wzrost populacji bakteryjnych

Każda komórka potomna powstała w wyniku podziału komórkowego może
sama rosnąć i dzielić się. W związku z tym, w sprzyjających warunkach z jednej
komórki może powstać liczna populacja. Populacje mogą się rozwijać na
powierzchniach stałych lub w płynach. W bakteriologii każde ciało stałe lub płyn
przygotowany specjalnie do wzrostu bakterii nazywamy pożywką (podłożem)
(sekcja 14. 2).

3. 3. 1 Wzrost na podłożu stałym

Jednym z typowych stałych podłoży powszechnie stosowanych w bakteriologii
jest galaretowata substancja (żel agarowy) zawierająca związki odżywcze i inne
składniki. Załóżmy, że pojedyncza komórka bakteryjna została umieszczona na
powierzchni takiego podłoża dostarczającego wszystkich składników potrzeb-
nych do wzrostu i podziału. Komórka więc rośnie, dzieli się na dwie, a każda
z komórek potomnych powtarza te procesy. W trakcie ciągłego wzrostu i po-
działu potomstwo komórki wyjściowej tworzy widoczną gołym okiem masę
komórek. Nazywamy ją kolonią.
49
 Zazwyczaj, w określonych warunkach wzrostu, każdy gatunek tworzy kolo-
nie o charakterystycznym rozmiarze, kształcie (rys. 3. 3), kolorze i konsystencji.
Podczas wzrostu na różnych podłożach lub w innych warunkach różnicujących
mogą powstawać różne rodzaje kolonii. Wielkość kolonii może być ograniczona
np. przez miejscowe wyczerpanie się substancji odżywczych (zależne od wzros-
tu kolonii). Z tego powodu, liczne, położone blisko siebie kolonie są przeważnie
mniejsze od kolonii odległych. Szybkość powiększania się rozmiarów kolonii
zależy od temperatury i innych czynników. Bakterie wytwarzające barwniki
tworzą zazwyczaj jaskrawo zabarwione kolonie (np. czerwone, żółte, fioletowe).
Kolonie bakterii nie mających tej cechy są szare, białawe lub kremowe. Konsy-
stencja kolonii może być śluzowata (lepka, jak śluz), masłowata (podobna do
masła), krucha (rozpadająca się) itp. Powierzchnia kolonii natomiast bywa
gładka lub szorstka, świecąca lub matowa itp.
Przypuśćmy, że nie pojedyncza komórka, lecz ich duża liczba została rozpro-
wadzona na powierzchni podłoża. Może wówczas brakować dostatecznego
miejsca do wytworzenia się pojedynczych kolonii. Potomstwo tak wysianych
komórek będzie tworzyć jednolitą warstwę pokrywającą całą powierzchnię
podłoża. Taki jednolity wzrost nazywany jest zlewającym się („murawa").
Zlewający się wzrost obserwuje się również po wysianiu na podłoże jednej lub
kilku ruchliwych bakterii. Potomstwo takich bakterii może pływać w wilgotnej
warstewce pokrywającej powierzchnię i w ten sposób rozprzestrzeniać się po
całym podłożu.

3. 3. 2 Wzrost w pożywce płynnej

W pożywce płynnej bakterie mogą się swobodnie przemieszczać albo na drodze
dyfuzji, albo, w przypadku gatunków ruchliwych, na drodze aktywnego ruchu.
W ten sposób wzrost i podział komórek w podłożu płynnym doprowadza do ich
jednolitego rozprzestrzenienia się w całym środowisku. Zwiększenie się liczby
komórek prowadzi zazwyczaj do wzrostu zmętnienia pożywki. Wyjątkowo nie-
które bakterie mają skłonność do tworzenia warstwy (błony) na powierzchni
podłoża. Podłoże pod błoną może być prawie pozbawione komórek. Niektóre

50
błony składają się zarówno z bakterii, jak i produktów ich metabolizmu, np.
szczepy Acetobacter xylinum tworzą sztywną błonę zawierającą celulozę.

3. 3. 2. 1 Hodowle okresowe

Przypuśćmy, że kilka bakteryjnych komórek zostało wprowadzonych do odpo-

wiedniego płynnego podłoża, które następnie było przechowywane w tempera-
turze odpowiedniej dla danego gatunku. W regularnych odstępach czasu
pobrano małe próbki i policzono zawarte w nich bakterie (metody liczenia bak-
terii: sekcja 14. 8). Sposób ten umożliwia śledzenie rozwoju populacji, czyli
wzrostu liczby komórek w czasie. Wykres przedstawiający liczbę komórek
w funkcji czasu nazywamy krzywą wzrostu. Dla komórek danego gatunku
bakterii rosnących w ściśle zdefiniowanych warunkach krzywa wzrostu ma
określony kształt.
Namnażając bakterie w lub na podłożu otrzymujemy hodowlę. Hodowlą
nazywamy więc płynne lub stałe podłoże z bakteriami wyrosłymi (lub nadal
rosnącymi) w nim lub na nim. Zabiegi zmierzające do utrzymania określonej
temperatury (i/lub innych żądanych czynników) potrzebnych do wzrostu bak-
terii nazywamy inkubacją. Początkowe wprowadzenie komórek do podłoża
zwie się inokulacją (zaszczepieniem).
Nie zawsze podział komórki rozpoczyna się natychmiast po wprowadzeniu
bakterii do świeżego, płynnego podłoża. Często występuje początkowa faza
zastoju (faza lag), w czasie której komórki dzielą się powoli lub nie dzielą się
wcale. W fazie tej zachodzi adaptacja do nowego środowiska — np. tworzone są
enzymy niezbędne do wykorzystania nowych, dostępnych substancji pokarmo-
wych. Długość początkowej fazy zastoju zależy w znacznym stopniu od warun-
ków, w których bakterie bytowały przed wprowadzeniem do określonego
podłoża. Długa faza zastoju występuje, gdy komórki przebywały w trudnych
warunkach lub rosły wykorzystując inne substancje pokarmowe lub w innej tem-
peraturze. W przypadku wzrostu komórek w podobnym lub tym samym
podłożu początkowa faza zastoju jest krótka lub w ogóle nie występuje.
Podczas (adaptacyjnej) fazy początkowego zastoju zachodzi synteza związ-
ków chemicznych, ale wzrostowi masy populacji bakteryjnej nie towarzyszy
przyrost liczby komórek. Mówimy wówczas, że komórki charakteryzują się
wzrostem niezbalansowanym.
Po adaptacji do nowego podłoża, komórki zaczynają rosnąć i dzielić się
z szybkością maksymalną dla danego gatunku w tych warunkach. Tę fazę
wzrostu nazywamy logarytmiczną lub wykładniczą. Liczba komórek podwaja
się ze stałą szybkością, co dotyczy również całej populacji. Mówimy o wzroście
zbalansowanym.
W logarytmicznej fazie wzrostu wykres przedstawiający liczbę komórek
bakterii w funkcji czasu jest ostro wznoszącą się krzywą — przy założeniu, że
skala jest arytmetyczna (rys. 3. 4a). Oczywiste jest, że skala ta nie jest przydatna
dla dużej liczby bakterii. Czy istnieje inny sposób przedstawienia wzrostu
w fazie wykładniczej? Tabela 3. 1 (dolny rząd) pokazuje, że liczba komórek może
być wyrażona w postaci potęgi liczby 2, np. 8 komórek w czasie 60 min może być
3
oznaczone jako 2 (3 jest wykładnikiem potęgi). Każdy z wykładników w ta-

51
beli 3. 1 jest oczywiście logarytmem (przy podstawie 2, tj. log2) odpowiadającej
liczby komórek. Jeżeli więc, zamiast bezpośredniego wykreślania liczby komórek
wykreślimy log2 danej liczby, wynikiem będzie linia prosta (rys. 3. 4b). Na takim
wykresie każda jednostka na skali log2 określa podwojenie liczby bakterii. Czas
podwojenia liczby bakterii (w minutach) może być więc bezpośrednio odczytany
z osi wykresu przedstawiającej czas. Czas podwojenia liczby bakterii zwany jest
również czasem generacji.
Wykreślając krzywe wzrostu wygodniej jest zastosować logio zamiast log2;
logio i log2 mogą być wzajemnie zamienione z zastosowaniem następującego
wzoru: log 10 N=0, 301 log2N. Wykres w fazie logarytmicznej będzie nadal linią
prostą — zmieni się jedynie jej nachylenie.
Rosnące komórki zużywają substancje odżywcze i wytwarzają produkty
odpadowe, które gromadzą się w podłożu. Z tego powodu wzrost staje się wol-
niejszy wraz z upływem czasu, a następnie zatrzymuje się. Może to nastąpić
w wyniku wyczerpania się substancji odżywczych, nagromadzenia się produk-
tów odpadowych lub jednoczesnego działania tych dwóch czynników. Fazę,
podczas której w ogóle nie obserwujemy wzrostu liczby żywych komórek,
nazywa się fazą stacjonarną. (Warta przeczytania jest krótka monografia „Life
after log" [Siegele i Kotler (1972) JB 174: 345-348]. ) Po fazie stacjonarnej nastę-
puje faza śmierci, podczas której liczba żywych komórek w populacji stale się
zmniejsza.

52
 Na rysunku 3. 5 pokazano fazy wzrostu tzw. hodowli okresowej. Określenie
to pochodzi od tego, iż wzrost bakterii od początkowej fazy zastoju do fazy
śmierci zachodzi w tym samym podłożu.

3. 3. 2. 2 Komórki w różnych fazach wzrostu

Biologia komórek i ich metabolizm zmienia się zasadniczo w różnych fazach
wzrostu hodowli. Na przykład, komórki rosnące są zazwyczaj zabijane przez
penicylinę, a wraz z ustaniem wzrostu stają się oporne na ten antybiotyk.
W warunkach ograniczających wzrost lub gdy w ogóle go nie ma, uboczne
produkty podstawowego metabolizmu (związanego ze wzrostem) mogą być
zużywane przez komórki do syntezy tzw. metabolitów wtórnych, które nie są
potrzebne do wzrostu. Metabolity wtórne wytwarzane przez niektóre gatunki
bakterii to ważne antybiotyki lub toksyny. [Function of secondary metabolites:
Vining (1990) ARM 44: 395-427. ]
Dodanie substancji odżywczych we właściwym czasie do hodowli może
stworzyć optymalne warunki do syntezy określonych metabolitów w danej fazie
wzrostu. Takie hodowle okresowe, dokarmiane stosuje się w przemyśle.

3. 3. 2. 3 Hodowle ciągłe
Wzrost bakterii w stałej objętości podłoża (jak w hodowlach okresowych) spra-
wia, że jego skład nieustannie się zmienia w wyniku zużycia substancji odżyw-
czych i nagromadzenia się produktów odpadowych. Hodowle okresowe są
przydatne do wielu badań, choć czasami lepiej jest hodować bakterie w stałych,
kontrolowanych i ściśle określonych warunkach. Możemy to osiągnąć zakładając

53
hodowle ciągłe (hodowle z ciągłym przepływem, hodowle otwarte). W takich
hodowlach bakterie rosną w podłożu płynnym, w aparacie zwanym chemosta-
tem, a podczas wzrostu zapewniony jest ciągły dopływ świeżego, sterylnego
podłoża i jednoczesny, zachodzący z tą samą szybkością, odpływ hodowli (tj.
podłoża i komórek). Stałe i silne wytrząsanie zapewnia szybkie mieszanie się
wpływającego, świeżego podłoża z hodowlą w chemostacie. Takie warunki
umożliwiają ciągły wzrost logarytmiczny, tzn. zrównoważony w przedłużonym
czasie. Hodowle ciągłe, ze względu na wzrost w stałych i określonych warun-
kach, są użyteczne np. do badań bakteryjnego metabolizmu.
W chemostacie utrzymywana jest zazwyczaj szybkość wzrostu mniejsza od
maksymalnej, ponieważ szybkość zbliżona do maksymalnej powoduje niestabil-
ność układu. W ten sposób masa komórek (biomasa) w chemostacie pozostaje
nie zmieniona. W celu utrzymania równowagi w chemostacie, szybkość rozcień-
czania hodowli musi się ilościowo równać specyficznej szybkości wzrostu. Szyb-
kość rozcieńczania (D) równa się F/V, gdzie F to szybkość dopływu pożywki do
chemostatu (w litrach na godzinę), a V — objętość hodowli. Specyficzna szyb-
kość wzrostu (μ) oznacza ilość biomasy wytwarzanej w ciągu godziny w przeli-
czeniu na całkowitą biomasę, w gramach. Związek między specyficzną szybko-
ścią wzrostu a stężeniem substancji odżywczej ograniczającej wzrost opisuje
równanie Monoda:

gdzie μmax oznacza maksymalną szybkość wzrostu, s — stężenie substancji

odżywczej ograniczającej wzrost, ks — stężenie substancji odżywczej ograni-
czającej wzrost przy μ = 0, 5 μ m a k s .
Oczywiście wartość D nie powinna przekroczyć krytycznej szybkości D c ,
odpowiadającej μmax· Jeśli to nastąpi, hodowla stopniowo ulega rozcieńczeniu,
mówimy, że jest „wymywana".
W praktyce idealne (przewidywane) działanie chemostatu nie zawsze można
osiągnąć z powodu niedostatecznie szybkiego (natychmiastowego) mieszania
lub takich czynników jak wzrost bakterii na ścianach chemostatu, prowadzący
do wytworzenia wyodrębnionej, statycznej (nie mieszanej) populacji komórek.
Innym problemem jest pojawianie się mutantów (rozdz. 9) podczas długiego
okresu hodowli.

3. 3. 2. 4 Wzrost synchroniczny

W populacji rosnących bakterii komórki nie dzielą się jednocześnie. W laborato-

rium możemy jednak otrzymać populacje komórek dzielących się w przybliżeniu
w tym samym czasie. Logarytmiczna część krzywej obrazującej taki typ wzrostu
— zwany wzrostem synchronicznym — ma wówczas przebieg skokowy,
a każdy skok obrazuje gwałtowne podwojenie się liczby komórek.
Jedna z metod otrzymania hodowli synchronicznej, czyli synchronizacji
hodowli, opiera się na tym, że stosunek masy do objętości, tj. gęstość bakterii
zmienia się podczas cyklu komórkowego. Gęstość jest największa w komórkach
tuż przed podziałem i w świeżo powstałych komórkach potomnych. W populacji

54
niesynchronicznej komórki charakteryzujące się najmniejszą gęstością są więc
prawdopodobnie w podobnych stadiach cyklu komórkowego. Ta subpopulacja
mniej gęstych komórek może być oddzielona od reszty populacji przez zasto-
sowanie techniki wirowania w gradiencie gęstości (sekcja 8. 5. 1. 4). Zaletą tej
czysto fizycznej metody jest możliwość uniknięcia zakłóceń metabolizmu
komórkowego.

3. 3. 2. 5 Zależność wzrostu od temperatury — wykres Arrheniusa i wykres Ratkowsky'ego

Zmiany temperatury mają duże znaczenie dla szybkości wzrostu głównie
z powodu ich wpływu na reakcje chemiczne zachodzące w komórce (metabolizm
— rozdz. 5 i 6). W ograniczonym zakresie temperatur zależność między szybko-
ścią wzrostu a temperaturą jest podobna do zależności między szybkością reakcji
chemicznych a temperaturą, co obrazuje wykres Arrheniusa, w którym logarytm
szybkości wzrostu jest wykreślony względem odwrotności temperatury absolut-
nej (l/K). Jednak dla szerokiego zakresu temperatur wykres ten nie jest liniowy.
Ratkowsky i wsp. [JB (1983) 154: 1222-1226] pokazał, że zależność liniowa może
być osiągnięta dla całego zakresu temperatury biokinetycznej, jeśli wykreślimy
pierwiastek kwadratowy szybkości wzrostu względem temperatury absolutnej.

3. 4 Diauksja (wzrost dwufazowy)

Jeżeli w pożywce dostępne są dwie różne substancje pokarmowe, bakteria może
preferencyjnie zużywać jedną z nich. Zużywanie drugiej substancji rozpocznie
się po wyczerpaniu się pierwszej. Z mieszaniny glukozy i laktozy E. coli zużyje
najpierw glukozę, a po jej wyczerpaniu zacznie wykorzystywać laktozę.
W momencie zmiany substancji odżywczej wzrost może być powolniejszy lub
nawet się zatrzymać. Taki sposób wzrostu nazywamy diauksją. Mechanizm
diauksji jest omówiony w sekcji 7. 8. 2. 1.

3. 5 Pomiar wzrostu
Wzrost (zmiany liczby komórek lub biomasy w czasie) mogą być mierzone
przez: 1) liczenie komórek (sekcja 14. 8), 2) oznaczenie wzrostu suchej biomasy
w określonym czasie, 3) śledzenie pobrania (lub wydzielenia) określonej substan-
cji, 4) pomiar ilości substancji radioaktywnej włączonej do biomasy w określo-
nym czasie i 5) nefelometrycznie, czyli przez pomiar zwiększenia zdolności do
rozpraszania wiązki świetlnej podczas jej przejścia przez płynną hodowlę (roz-
proszenie światła zwiększa się wraz ze wzrostem liczby komórek).
 ROZDZIAŁ

4
Różnicowanie

U większości gatunków bakterii nie obserwuje się w cyklu życiowym dużych

zmian kształtu komórki lub jej funkcjonowania. Komórki potomne są w mniej-
szym lub większym stopniu identyczne, zarówno pod względem wyglądu, jak
i zachowania, z komórkami rodzicielskimi. Jednak u niektórych bakterii z komó-
rek określonego typu mogą powstać komórki znacząco różne. Moment rozpo-
częcia takiego różnicowania jest często związany z warunkami środowiska,
w jakich znajduje się komórka. Na następnych stronach omówimy kilka
przykładów różnicowania bakterii.

4. 1 Cykl życiowy Caulobacter

Caulobacter jest ściśle tlenową bakterią gramujemną, żyjącą w glebie i wodzie.
Tworzy on dwa zupełnie różne typy komórek, a przejście z jednego typu do dru-
giego stanowi ważną część cyklu życiowego (rys. 4. 1). Występowanie formy
ruchliwej w cyklu życiowym jest korzystne, gdyż pozwala organizmowi na prze-
noszenie się do różnych miejsc. Ruchliwą komórkę można traktować jako niedoj-
rzałą, gdyż przed kolejnym podziałem musi ona utracić rzęskę i wytworzyć
łodyżkę (prostheca). Macierzysta komórka z łodyżką (dojrzała forma) sama nigdy
nie staje się ruchliwa, ale może wytworzyć formę zdolną do ruchu.
Tak więc, w trakcie normalnego wzrostu Caulobacter w odpowiednim czasie
i miejscu powstaje rzęska i łodyżka, aby mogło dojść do asymetrycznego po-
działu na komórkę z rzęską i komórkę z łodyżką. Jak to się dzieje? Odpowiedzi
na pewne pytania dotyczące rozwoju i różnicowania dostarczają badania
wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek, z zastosowaniem takich technik jak
fuzja z GFP (sekcja 8. 5. 2). Dzięki nim w niektórych przypadkach można było
wykazać powiązanie aktywacji swoistych białek (wyznakowanych GFP)
w komórce z ważnymi aspektami jej podziału lub różnicowania.
Cyklem komórkowym Caulobacter rządzą sygnały pochodzące z samej
komórki. Ich natura jest nieznana, ale wydaje się, że przekazanie sygnału zacho-

56
1. Dojrzała komórka z łodyżką przyczepiona do powierzchni lepkim „zaczepem". 2. Komórka
z łodyżką zaczyna się dzielić. 3. Na wolnym końcu komórki potomnej powstaje rzęska. 4. Zachodzi
asymetryczny podział poprzeczny i ruchliwa komórka potomna odpływa. Komórka z łodyżką może
rosnąć i wytwarzać dalsze komórki ruchliwe. 5. Komórka ruchliwa traci rzęskę i przykleja się swoim
zaczepem do podłoża. 6. Rozwija się łodyżka i komórka dojrzewa. Staje się nową komórką macie-
rzystą, obdarzoną łodyżką.

dzi podobnie jak w dwuskładnikowym systemie regulacji (sekcja 7. 8. 6) lub

w transferze fosforu (rys. 7. 14). W Caulobacter crescentus regulatorem odpowie-
dzi jest CtrA.
Po rozpoczęciu replikacji DNA w komórkach z łodyżką (przed podziałem
komórki) poziom CtrA~P rośnie, co prowadzi do transkrypcji różnych genów —
w tym również „wczesnych" genów rzęskowych, takich jak fliF (kodującego
pierścień MS: rys. 2. 8), ftsZ (biorącego udział w tworzeniu przegrody (septy):
sekcja 3. 2. 1) i nieaktywnego białka FlbD, będącego regulatorem genów. Białko
FliF jest przenoszone (dzięki nieznanemu mechanizmowi) do swoistego miejsca
na biegunie rozwijającej się komórki potomnej, co oznacza, że pierścień MS
powstaje zanim zostanie wytworzona przegroda.
Po wytworzeniu przegrody między komórką z łodyżką i komórką potomną
białko FlbD jest aktywowane (fosforylowane) przez kinazę FlbE, zlokalizowaną
blisko przegrody w komórce potomnej; FlbD~P inicjuje transkrypcję „późnych"
genów rzęskowych w komórce potomnej, co prowadzi do powstania rzęski na
biegunie tej komórki. (Analogicznie w czasie sporulacji u Bacillus subtilis lokaliza-
cja fosfatazy SpoIIE na specyficznej stronie asymetrycznej przegrody jest waż-
nym czynnikiem różnicowania — patrz legenda do rys. 7. 14. ) Ponadto w komór-
ce potomnej (ale nie w komórce z łodyżką) CtrA~P wiąże się z origin chromo-
somu (sekcja 7. 3) i hamuje replikację DNA; tak więc komórka ruchliwa nigdy się

57
nie podzieli zanim nie stanie się dojrzała (rys. 4. 1). [Control of differentiation in
Caulobacter crescentus: Shapiro i Losick (1997) Science 276: 712-718. ]
Różnicowanie komórek nieruchliwych w ruchliwe, i vice versa, zachodzi też
w różnych gatunkach Hyphomicrobium i Rhodomicrobium.

4. 2 Wzrost „rozpełzliwy" (ang. swarming)

Proteus jest gramujemną pałeczką występującą w jelitach zwierząt i człowieka.
Jeśli hoduje się P. mirabilis (lub inny gatunek — P. vulgaris) na odpowiednim
podłożu stałym, to pierwsze komórki potomne są krótkimi pałeczkami o długo-
ści 2-A μm, zaopatrzonymi w kilka rzęsek; komórki te w normalny sposób dzielą
się i wytwarzają kolonię. Jednak po kilku godzinach wzrostu, komórki znaj-
dujące się na krawędzi kolonii rosną do długości 20-80 μm i pokrywają się licz-
nymi rzęskami. Komórki te (ang. swarm cells) wypływają z kolonii i osiadają
w miejscu oddalonym o kilka milimetrów od jej brzegu. Tam każda dzieli się na
kilka krótkich pałeczek — podobnych do komórek wyjściowych. Przez kilka
pokoleń komórki te normalnie rosną i dzielą się, tworząc grubą, koncentryczną
warstwę wzrostu wokół początkowej kolonii. Po pewnym czasie na zewnętrz-
nym brzegu tej strefy powstaje następne pokolenie długich komórek, zdolnych
do wzrostu „rozpełzliwego" i cykl się powtarza. W ten sposób cała powierzchnia
pożywki zostaje pokryta koncentrycznymi strefami wzrostu (fot. 4. 1).
Zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (ang. swarming) występuje też u róż-
nych innych bakterii, zarówno gramujemnych (w tym np. Serratia marcescens,

Widać koncentryczne pierścienie wzrostu (sekcja 4. 2), gdy hoduje się go na 1, 5% agarowym podłożu
minimalnym z glukozą i hydrolizatem kazeiny. Zdjęcie uzyskane dzięki uprzejmości: dr. Rasika M.
Harsheya, University of Texas w Austin, Texas, USA.

58
(fot. 4. 2) i E. coli), jak i gramdodatnich. Można to wykazać stosując podłoże aga-
rowe (sekcja 14. 2) o mniejszym niż zwykle stężeniu agaru. Nie zawsze powstają
przy tym koncentryczne pierścienie wzrostu, takie jak obserwuje się w przypad-
ku P. mirabilis (dzięki okresowemu występowaniu zdolności do wzrostu
„rozpełzliwego")· Niektóre bakterie rosną „rozpełzliwie" przez cały czas, tworzą
więc jedną cienką warstwę wzrostu, podczas gdy u innych powstają indywidual-
ne mikrokolonie. [Swarming (artykuł przeglądowy): Harshey (1994) MM 13:
389-394. ] Badania wykonane na E. coli wskazują, że chociaż w zjawisku tym
biorą udział składniki systemu chemotaksji (sekcja 2. 2. 15. 2), to substanc-
je/sygnały wywołujące wzrost „rozpełzliwy" różnią się od chemoefektorów
znanych w chemotaksji [Burkart, Toguchi i Harshey (1998) PNAS 95: 2568-2573].

4. 3 Komórki spoczynkowe
U niektórych bakterii w wyniku różnicowania powstają komórki spoczynkowe
— spory albo cysty. Formy te mogą pomagać w rozsiewaniu organizmu lub/i
służyć do przetrwania w niekorzystnym środowisku. W odpowiednich warun-
kach spora lub cysta kiełkuje i tworzy nową komórkę wegetatywną.

4. 3. 1 Endospory
Endospory zostały lepiej zbadane niż jakikolwiek inny typ spor bakteryjnych.
Wytwarzają je gatunki należące do rodzajów Bacillus, Clostridium, Coxiella, Desul-
fotomaculum, Thermoactinomyces oraz kilka innych gatunków. Endospora powsta-
je we wnętrzu komórki w odpowiedzi na niedobór składników odżywczych,
w szczególności na brak węgla, azotu i/lub fosforu. W dojrzałej endosporze
zachodzi bardzo niewiele (albo może nawet żadna) reakcji przebiegających
w rosnących komórkach wegetatywnych. Taki stan uśpienia może trwać bardzo
długo. Ta forma komórki jest niezwykle oporna na szkodliwe czynniki środowi-
ska: ekstremalne temperatury i pH, wysychanie, promieniowanie, różne czynniki
chemiczne, a także uszkodzenia fizyczne. Nieodwracalną inaktywację endospor
może zapewnić jedynie brutalny proces sterylizacji (sekcja 15. 1).
Tworzenie endospor przedstawiono schematycznie na rysunku 4. 2, a ich
budowę pokazano na fotografii 4. 2. Uważa się, że oporność endospor na wysoką
temperaturę jest spowodowana małą zawartością wody; dipikolinian wapnia
występujący w rdzeniu endospory może działać jako drugorzędny stabilizator.
W odpowiednich warunkach endospora kiełkuje, tzn. staje się metabolicznie
aktywna. Endospory niektórych gatunków wymagają „aktywacji" przed kiełko-
waniem. Aktywacja zachodzi np. po ogrzaniu w temperaturze subletalnej lub
poddaniu działaniu pewnych związków chemicznych. Samo kiełkowanie z kolei
rozpoczyna się pod wpływem pewnych substancji. Mogą to być, w zależności od
gatunku, np. L-alanina, niektóre nukleozydy purynowe, różne jony lub pewne
cukry. Kiełkowanie może się rozpocząć od przyłączenia takiego związku do
receptora w zewnętrznej błonie spory. Potem kiełkująca endospora przemienia
się w komórkę wegetatywną.

59
60
 Kontrola genetyczna inicjacji tworzenia endospor została opisana w sekcji
7. 8. 6. 1.
N o t k a . Słowo „endospora" zostaje niekiedy skrócone do „spora". Nie należy
jednak mylić endospor z innymi typami spor bakteryjnych (patrz sekcja 4. 3. 2).

4. 3. 2 Inne spory bakteryjne

U wielu promieniowców rosnących w formie strzępek powstają egzospory —
w wyniku tworzenia przegród i fragmentacji strzępek (rys. 4. 3). Spory te nie mają
wyspecjalizowanych struktur (takich jak korteks i płaszcz spory), ale wykazują
pewną oporność np. na ogrzewanie na sucho, wysychanie i niektóre związki che-
miczne. Spory Streptomyces są metabolicznie mniej aktywne niż strzępki wegeta-
tywne, chociaż nie są w stanie całkowitego uśpienia.
U takich promieniowców jak Actinoplanes i Pilimelia ruchliwe (urzęsione)
zoospory powstają w środku zamkniętego woreczka zwanego sporangium.
Sporangia rozwijają się ze strzępek wegetatywnych.

4. 3. 3 Bakteryjne cysty
Cysty wytwarza na przykład bakteria glebowa Azotobacter vinelandii. Cysty tego
gatunku, oporne na wysychanie, mogą w stanie uśpienia przetrwać w suchych
glebach przez wiele lat. Sygnałem do powstawania cyst mogą być zmiany
poziomu węgla i azotu w środowisku. Komórka traci wtedy rzęski i buduje
złożoną ścianę cysty, zawierającą polisacharyd alginian [Alginate biosynthesis
(artykuł przeglądowy): Gacesa (1998) Microbiology 144: 1133-1143], białka
i lipidy. Zwykle w cyście nagromadzony zostaje PHB (sekcja 2. 2. 4. 1).

Fot. 4. 2 Różnicowanie
Lewa górna część. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) endospory Bacillus
subtilis w komórce macierzystej (ok. 1 μm średnicy). „Rdzeń" (protoplast) endospory jest otoczony
błoną (mem). Między błoną i wielowarstwowym płaszczem spory (sc) leży korteks (cx). Endosporę
otacza osłona komórkowa (ce) komórki macierzystej. Prawa górna część. Mikrografia świetlna Anaba-
ena spiroides (grube nici) i Anabaena circinalis (cienkie nici) z jeziora Hebgen w Montanie, Stany Zjed-
noczone. Strzałki pokazują heterocysty, które powstały pomiędzy komórkami wegetatywnymi
w nici. Środek, część lewa. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu transmisyjnego) heterocysty
Anabaena oscillarioides. Zwróć uwagę na grube osłony. Bardzo małe czarne kropki (widoczne najlepiej
przez lupę) oznaczają miejsca lokalizacji enzymu — nitrogenazy (sekcja 10. 3. 2. 1); każda kropka to
cząstka złota koloidalnego, które jest przyłączone, jako materiał elektronogęsty, do cząsteczki
wiążącej się swoiście z nitrogenazą. Środek, część prawa. Mikrografia (z elektronowego mikroskopu
transmisyjnego) heterocysty (wyżej) i komórki wegetatywnej (niżej) Anabaena oscillarioides.
Dół. Komórki Serratia marcescens zdolne do wzrostu „rozpełzliwego"(patrz sekcja 4. 2). Zwróć uwagę
na dużą liczbę rzęsek na każdej z nich.
Endospory dzięki uprzejmości dr. Johna Coote'go, University of Glasgow, Szkocja. Heterocysty —
dzięki uprzejmości prof. Johna C. Priscu, Montana State University, Bozeman, Montana, USA.
Komórki wykazujące wzrost „rozpełzliwy" — dr Rasika M. Harsheya, University of Texas at Austin,
Texas, USA.

61
Stadium 0. Wegetatywna komórka zawierająca dwa chromosomy jest gotowa do sporulacji. Sta-
dium I. Wytworzone zostaje włókno osiowe, złożone z dwóch chromosomów. Stadium II. Powstaje
asymetryczna przegroda (septa), dzieląca protoplast na dwie nierówne części (fot. 4. 3). Przegroda jest
znacznie cieńsza niż ta, która powstaje w czasie normalnego podziału komórki, gdyż zawiera znacz-
nie mniej peptydoglikanu; który jest następnie usuwany w wyniku hydrolizy. Mniejszy z protopla-
stów, zwany presporą, stanie się endosporą. Błona cytoplazmatyczna większego protoplastu wypu-
kla się, otaczając presporę. Stadium II dzieli się na część 1, 2, 3, jak pokazano na rysunku. W sta-
dium III prespora zostaje całkowicie otoczona dwiema błonami. Stadium IV. Zmodyfikowany pep-
tydoglikan odkładany między tymi dwiema błonami tworzy sztywną warstwę zwaną korteksem.
W tym czasie może się też rozwijać luźna osłona białkowa, zwana egzosporium. Stadia V-VI. Na
zewnętrznej błonie odkładany jest wielowarstwowy, białkowy płaszcz spory (stadium V) i spora doj-
rzewa (stadium VI), nabywając takie cechy charakterystyczne jak oporność na ciepło i zdolność do
silnego rozpraszania światła, skąd jej obraz w mikroskopie świetlnym. W tym czasie w „rdzeniu",
tzn. protoplaście spory (otoczonym zewnętrzną błoną), nagromadza się dipikolinian wapnia.
Stadium VII. Dojrzała spora zostaje uwolniona wskutek zniszczenia komórki macierzystej. (Zwróć
uwagę, że nie każda endospora ma egzosporium. ).

62
(a) Koniec powietrznej strzępki wegetatywnej, (b) Koniec strzępki zaczyna się zwijać, (c) W całej zwi-
niętej strzępce powstają przegrody, (d) Ściany rozwijających się spor grubieją i każda z nich
zaokrągla się. (e) Spory zostają uwolnione.

4. 4 Akinety, heterocysty, hormogonia

Struktury te są tworzone przez różne nitkowate sinice — bakterie fotosyntety-
zujące występujące np. w glebie, wodach i żyjące w związkach symbiotycznych
z niektórymi eukariotami.

4. 4. 1 Akinety
Akinety są wyspecjalizowanymi komórkami wytwarzanymi przez niektóre
gatunki, np. w warunkach głodu. Każda ma zgrubiałą ścianę i zawiera w cyto-
plazmie wiele substancji zapasowych (takich jak glikogen). Akinety są zwykle
większe od komórek wegetatywnych i mają obniżony poziom metabolizmu.
Wykazują pewną oporność na wysychanie oraz niską temperaturę, mogą więc
stanowić formy ułatwiające przezimowanie i/lub rozsiewanie tych sinic.

4. 4. 2 Heterocysty
Heterocysty są tworzone przez pewne gatunki, gdy brak jest dostępnych źródeł
azotu. W takich warunkach dochodzi do różnicowania niektórych komórek
w nici i przekształcenia ich właśnie w heterocysty. Są to wyspecjalizowane
komórki „wiążące" azot atmosferyczny (gazowy) — czyli przeprowadzające go
w formę dostępną dla organizmu (sekcja 10. 3. 2. 1). Proces różnicowania obejmuje
między innymi: wytworzenie grubych osłon, rearanżację tylakoidów, zaprzesta-
nie wytwarzania tlenu (pochodzącego z fotosyntezy) i syntezę nitrogenazy
(enzymu wykorzystywanego w wiązaniu azotu). Wydaje się, że grube osłony
(patrz fot. 4. 2) chronią nitrogenazę przed tlenem atmosferycznym, na który jest
ona wrażliwa. Anabaena flos-aquae tworzy grubsze osłony, gdy hoduje się ją pod
zwiększonym ciśnieniem cząstkowym tlenu [Kangatharalingam, Priscu i Paerl
(1992) JGM 138: 2673-2678]. Komunikowanie się między heterocystą i sąsia-
dującą z nią komórką wegetatywną zachodzi poprzez cienkie pory (mikroplaz-

63
64
modesmy) występujące w przylegających błonach cytoplazmatycznych. Związa-
ny azot jest przenoszony do komórek wegetatywnych, które z kolei przekazują
heterocyście związki węgla i inne substancje.

4. 4. 3 Hormogonia
Hormogonium to krótka nić, nie zawierająca ani akinet, ani heterocyst, wytwo-
rzona np. z nici wegetatywnej. Zwykle wykazuje zdolność do ruchu ślizgowego.
Komórki w hormogonium mogą być mniejsze niż w nici macierzystej. U niektó-
rych gatunków (np. Nostoc muscorum) tylko hormogonia zawierają wakuole
gazowe, co może potwierdzać pogląd, że te krótkie nici służą do „rozsiewania"
sinic.

Fot. 4. 3 Sporulacja a podział komórki u Bacillus subtilis

Góra. Komórka jest we wczesnej fazie sporulacji (rys. 4. 2, stadium II1). Widać asymetryczną
przegrodę. Podziałka = 0, 3 μm. Środek. Endospora (prespora) w późniejszym stadium rozwoju.
Podziałka = 0, 3 μm. Dół. Wegetatywny podział komórki. Przegroda zlokalizowana pośrodku
komórki jest znacznie grubsza niż przegroda asymetryczna. Podziałka=0, 3 μm.
Fotografie — dr Imric Barak, Institute of Molecular Biology, Slovak Academy of Sciences, Bratislava,
Slovak Republic.
 ROZDZIAŁ

5
Metabolizm I - energia

„Metabolizm" to reakcje chemiczne zachodzące w żywych komórkach: cząstecz-

ki są syntetyzowane (anabolizm), rozkładane (katabolizm) lub zmieniane
z jednego typu na inny, a różne atomy są utleniane lub redukowane. W więk-
szości z tych reakcji biorą udział swoiste białka katalityczne, zwane enzymami.
Zwykle enzymy działają jedynie w ograniczonym zakresie warunków fizykoche-
micznych; poza tym zakresem mogą utracić swoją aktywność lub zostać zinakty-
wowane. Wydaje się, że enzymy „ekstremofili" (sekcja 1. 1. 1) mają unikatową
strukturę i/lub są stabilizowane przez takie czynniki jak np. termoprotektanty.
Stosuje się je w badaniach nad stabilnością enzymów. Jest też prawdopodobne,
że zostaną wykorzystane w biotechnologii [Danson i Hough (1998) ΉΜ 6:
306-314]. )
Sekwencja reakcji metabolicznych, w których jeden związek jest kolejno prze-
kształcany w inny (lub inne), zwana jest szlakiem metabolicznym. W takim
szlaku substrat (np. związek odżywczy) jest przekształcany poprzez jeden lub
wiele związków pośrednich do tak zwanego produktu końcowego lub produk-
tów końcowych. Liczne z bakteryjnych szlaków metabolicznych nie występują
u eukariotów.
Reakcje metaboliczne są w wielu wypadkach endoergiczne, tzn. wymagają
dostarczenia energii. Energia jest też potrzebna do ruchu (u gatunków ruchli-
wych) i do pobierania różnych składników pokarmowych. Większość bakterii
uzyskuje energię przekształcając związki chemiczne ze środowiska. Organizmy te
są zwane chemotrofami. Inne bakterie, które wykorzystują energię słoneczną,
określa się mianem fototrofów. Jednak ani związki chemiczne ze środowiska, ani
światło słoneczne nie mogą być wykorzystane bezpośrednio do zasilania proce-
sów komórkowych wymagających energii. Tak więc komórka musi mieć zdolność
przekształcania tych „środowiskowych" źródeł energii na taką jej formę, jaka
będzie mogła być przez nią wykorzystywana. Jaka jest ta „dogodna" forma ener-
gii? Wykorzystując pewne związki chemiczne lub światło słoneczne bakterie
mogą wytwarzać specyficzne związki „wysokoenergetyczne", które mogą następ-
nie zaspokajać ich potrzeby energetyczne. Do związków tych należą: adenozyno-

66
-5-fosforan (ATP), fosfoenolopirogronian, acetylofosforan i acetylo-CoA. Nazwa-
no je cząsteczkami „waluty" energetycznej, gdyż komórka może je wydatkować
(zamiast energii „środowiskowej"), tak jak my używamy monet i banknotów
zamiast sztabek złota. Niektóre z takich cząsteczek przedstawiono na rysunku 5. 1.
ATP (rys. 5. la) dostarcza energii, gdy zostaje rozerwane jego końcowe
wiązanie fosforanowe. Skutkiem tego, w miarę jak wykorzystywane są cząste-
czki ATP (do potrzeb energetycznych komórki), powstają cząsteczki adenozyno-
-5'-difosforanu (ADP). Tak więc poprzez fosforylację ADP energia środowi-
skowa zostaje sprzęgnięta z resyntezą ATP.
Inny typ „waluty" energetycznej stanowi dinukleotyd nikotynoamido-
adeninowy (NAD), który niesie energię w postaci „siły redukującej": może on
przyjmować i oddawać energię będąc, odpowiednio, redukowany i utleniany
(rys. 5. 1b). Inne nośniki siły redukującej to fosforan NAD (NADP) i dinukleotyd
flawinoadeninowy (FAD).
Energia pochodząca ze środowiska może też zostać przekształcona w formę
+
elektrochemiczną, w postaci gradientu jonów (zwykle protonów — H ) między
dwiema powierzchniami błony cytoplazmatycznej. Energia tego gradientu może
być wykorzystana do transportu, do napędzania ruchu obrotowego rzęsek (sek-
cja 2. 2. 14. 1) i do syntezy związków wysokoenergetycznych!
W jaki sposób bakteria tworzy związki wysokoenergetyczne lub gradient
jonów z energii „środowiskowej"? Chemotrofy i fototrofy wykorzystują do tego
celu różne strategie, co opisano niżej.

5. 1 Metabolizm energetyczny chemotrofów

Chemotrofy przetwarzają związki chemiczne, by uzyskać energię. Chemoorga-
notrofy wykorzystują związki organiczne, zaś chemolitotrofy — związki nieor-
ganiczne bądź pierwiastki chemiczne. (Mechanizmy pobierania związków che-
micznych zostały omówione w sekcji 5. 4. )

5. 1. 1 Metabolizm energetyczny chemoorganotrofów

Chemoorganotrofy wykorzystują substraty organiczne w dwóch głównych
typach metabolizmu energetycznego: fermentacji i oddychaniu1. Niektóre z nich
mogą przeprowadzać tylko jeden z tych procesów, inne — oba, w zależności
od warunków.

5. 1. 1. 1 Fermentacja
Fermentacja jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat
jest metabolizowany bez udziału egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika

1
Angielskie terminy „respiration" i „respiratory metabolism" są tłumaczone odpowiednio
jako „oddychanie" i „metabolizm oddechowy" i stosowane do określenia wszystkich procesów
dostarczających energii bakteriom chemotroficznym (zarówno chemoorganotrofom, jak i che-
molitotrofom), w których wykorzystany jest łańcuch transportu elektronów i fosforylacja
oksydatywna (przyp. tłum).

67
(a) Adenozyno-5'-trifosforan (ATP). Przy dostarczaniu energii rozrywane jest wiązanie γ i odłączona
zostaje grupa fosforanowa; powstający w wyniku tego adenozyno-5'-difosforan (ADP) musi być
fosforylowany, aby został zregenerowany ATP.
(b) Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD) w formie zredukowanej (wyżej) i utlenionej
+
(niżej); e=elektron. Ściśle rzecz biorąc forma utleniona powinna być zapisana jako NAD , ale dla
wygody często pisze się NAD; podobnie forma zredukowana powinna być zapisana jako
+
NADH + H , ale stosuje się NADH. Fosforan NAD (NADP) to 2'-fosforan NAD, który ma grupę
fosforanową w pozycji 2' cząsteczki (lewoskrętnej) cukru (D-rybozy).

utleniającego. ( N o t k a . Fermentacja zwykle (ale niekoniecznie) zachodzi beztle-

nowo, ale nie jest to cecha charakterystyczna wyłącznie dla tego procesu; jak
zobaczymy później, oddychanie też może zachodzić bez udziału tlenu. ) Ponie-
waż nie jest tu wykorzystywany zewnętrzny czynnik utleniający, produkty fer-
mentacji w sumie nie są ani bardziej, ani mniej utlenione niż substrat. Oznacza to,
że utlenianie jakiegoś związku pośredniego w fermentacji jest zrównoważone
przez redukcję innego związku pośredniego w tym procesie. Zostało to schema-
tycznie przedstawione na rysunku 5. 2.

68
W procesie tym z substratu organicznego powstają związki pośrednie, które wzajemnie się utleniają
i redukują. W sumie produkty mają taki sam stopień utlenienia jak wyjściowy substrat. (Porównaj
z rys. 5. 4).

Można te procesy lepiej zrozumieć rozważając pewne konkretne przykłady

szlaków metabolicznych. U wielu bakterii fermentacja glukozy zaczyna się od
szlaku zwanego glikolizą lub szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3).
W szlaku tym 1 cząsteczka glukozy dostarcza (poprzez pewną liczbę związków
pośrednich) 2 cząsteczek kwasu pirogronowego, będącego produktem końco-
wym. W dwóch miejscach tego szlaku (rys. 5. 3) energia pochodząca z reakcji
egzoergicznych (tzn. dających energię) jest wykorzystywana do fosforylacji
ADP, to znaczy do syntezy ATP z ADP. Proces bezpośredniego wykorzystania
energii pochodzącej z reakcji chemicznej do syntezy ATP z ADP zwany jest fos-
forylacją substratową.
Uwzględniając cząsteczki będące „walutą" energetyczną szlak EMP można
podsumować następująco:

2ATP + 4ADP + 2NAD -> 2ADP + 4ATP + 2NADH

Tak więc każda cząsteczka glukozy daje 2NADH i netto 2ATP.

Aby następne cząsteczki glukozy mogły być metabolizowane, musi zostać
dostarczony zarówno ADP, jak i NAD. ADP powstaje z ATP, gdy ten jest wyko-
rzystywany jako dawca energii. W jaki sposób jednak powstaje NAD z NADH,
skoro nie ma w fermentacji zewnętrznego czynnika utleniającego? Wspomniano
wcześniej, że fermentacja glukozy może zacząć się od glikolizy; w rzeczywistości
szlak ten jest jedynie początkiem pewnej liczby różnych dróg metabolicznych: to,
co się będzie działo z NADH (i kwasem pirogronowym), zależy od zacho-
dzących potem reakcji. W najprostszym przypadku NADH oddaje swoją siłę
redukującą kwasowi pirogronowemu, co oznacza, że utlenienie NADH do NAD
jest sprzężone z redukcją kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego:

kwas pirogronowy + NADH —» kwas mlekowy + NAD

Reakcja ta pokazuje jedną z możliwych odmian fermentacji — tak zwaną fer-

mentację mlekową. Reakcja, w której kwas mlekowy jest jedynym (lub domi-
nującym) produktem, zwana jest fermentacją homomlekową. W wyniku
fermentacji heteromlekowej obok kwasu mlekowego powstają też inne pro-
dukty. Kwas mlekowy — produkt końcowy fermentacji — zostaje uwolniony
przez komórki do środowiska.

69
Przerywaną strzałką, poczynając od fruktozo-1, 6-bisfosforanu, oznaczono uproszczony odcinek tego
szlaku. Każdą z dwóch fosforylacji substratowych zaznaczono gwiazdką; w obu przypadkach fosfo-
ran jest przenoszony na ADP z wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego w związku organi-
cznym. Chociaż dwie z reakcji w tym szlaku wymagają ATP, to zysk netto wynosi 2ATP na każdą
cząsteczkę zużytej glukozy. ( N o t k a . Nazwy kwas pirogronowy i pirogronian oraz kwas fosfoenolo-
pirogronowy i fosfoenolopirogronian używa się wymiennie. ) Większość reakcji tego szlaku jest
odwracalna.

Tak zwane bakterie mlekowe (np. różne gatunki Lactobacillus i Leuconostoc) są

szeroko wykorzystywane w przetwórstwie spożywczym (np. do wyrobu niektó-
rych serów i innych produktów mlecznych, salami, kiszonej kapusty i ogórków,
chleba pieczonego z użyciem zakwasu). [Genetics, metabolism and application of
lactic acid bacteria (sympozjum): FEMSMR (1993) 12: 1-272. ]
Należy zwróć uwagę, że kwas mlekowy (C3H6O3) ma taki sam stopień utle-
nienia jak glukoza (C6H12O6), tzn. netto nie zaszła tu ani redukcja, ani utlenienie.
Wprawdzie aldehyd 3-fosfoglicerynowy został utleniony, ale jest to zrównowa-
żone przez redukcję kwasu pirogronowego do kwasu mlekowego (rys. 5. 4).
Inne fermentacje, zaczynające się od glikolizy, to fermentacja kwasów miesza-
nych (rys. 5. 5) i fermentacja butanodiolowa (rys. 5. 6). W obu procesach kwas
pirogronowy jest metabolizowany do kilku produktów końcowych, których
względne ilości mogą się zmieniać w zależności od warunków wzrostu.

70
Zwróć uwagę na to, że utlenianie jest zrównoważone odpowiednią redukcją. Fermentację
homomlekową przeprowadzają niektóre tzw. bakterie mlekowe, wykorzystywane w przemyśle
spożywczym.

Fermentacja kwasów mieszanych (rys. 5. 5) zachodzi np. u Escherichia coli

i u bakterii należących do rodzajów Proteus i Salmonella. W kwaśnym środowi-
sku E. coli i inne gatunki, które mają układ enzymatyczny liazy mrów-
czan: wodór, mogą rozłożyć kwas mrówkowy na dwutlenek węgla i wodór; prze-
prowadzają więc fermentację z wytworzeniem gazu. Bakterie, które podobnie jak
Shigella nie mają tego systemu enzymatycznego, nie wytwarzają gazu. (Z tego
widać, że nie zawsze produktem fermentacji jest gaz. )
Fermentację butanodiolową (rys. 5. 6) przeprowadzają np. gatunki należące
do Enterobacter, Erwinia, Klebsiella i Serratia. Ilość kwasu wytworzonego w tym
procesie jest znacznie mniejsza niż w fermentacji kwasów mieszanych.
Niektóre szczepy w pewnych warunkach produkują małe ilości diacetylu
(CH3. CO. CO. CH3) z kwasu acetomlekowego.
Chociaż fermentacje kwasów mieszanych i butanodiolowa są bardziej skomp-
likowane niż fermentacja homomlekowa, to jednak podlegają tym samym pod-
stawowym zasadom. Tworzenie produktów bardziej utlenionych niż glukoza
(np. kwas mrówkowy) jest zawsze zrównoważone przez tworzenie produktów
bardziej od niej zredukowanych (np. etanol), natomiast względne proporcje pro-
duktów końcowych mogą się zmieniać.
NADH i inne związki powstające w czasie fermentacji są wykorzystywane
w różny sposób. Część NADH zostaje utleniona w reakcjach biosyntezy (zamiast
być wykorzystana do tworzenia takich produktów jak kwas mlekowy). Dzięki
temu związki takie jak pirogronian będą mogły zostać zużyte w reakcjach bio-
syntezy jako prekursory (sekcja 6. 3. 1 i rys. 6. 3). U chemoorganotrofów zarówno
w oddychaniu (sekcja 5. 1. 1. 2), jak i w fermentacji istnieje ścisły związek między
metabolizmem energetycznym i metabolizmem węglowym (sekcja 5. 3. 1).
Bakterie przeprowadzające fermentację wykorzystują związki wysokoenerge-
tyczne, takie jak ATP i NADH, a także mogą wykorzystywać energię w formie
gradientu jonów, o której wspomniano wcześniej. Ten rodzaj energii jest u nich
zwykle otrzymywany poprzez przekształcenie ATP w specyficznych, błonowych
systemach enzymatycznych zwanych ATPazami (szczegóły w sekcji 5. 1. 1. 2).
U niektórych bakterii fermentacyjnych gradient jonów może również powstawać
w wyniku wypływu produktów końcowych (sekcja 5. 3. 3).
N o t k a . Zanim skończymy omawiać ten temat, warto wspomnieć, że w prze-
myśle termin „fermentacja" jest powszechnie używany na określenie każdego
procesu chemicznego przeprowadzanego przez bakterie, nawet takiego, w któ-
rym reakcje fermentacji nie zachodzą.

71
72
73
 5. 1. 1. 2 Oddychanie

Oddychanie jest rodzajem metabolizmu energetycznego, w którym substrat jest

przekształcany z udziałem egzogennego (tzn. zewnętrznego) czynnika utle-
niającego (porównaj z fermentacją: sekcja 5. 1. 1. 1). Oddychanie może zachodzić
w obecności tlenu (przy czym sam tlen służy jako zewnętrzny czynnik utle-
niający) lub beztlenowo (gdy zamiast tlenu są wykorzystywane inne nieorgani-
czne lub organiczne czynniki utleniające). (Ponieważ wciąż mówimy o chemoor-
ganotrofach, substrat jest zawsze związkiem organicznym, chociaż czynnik utle-
niający może być organiczny bądź nieorganiczny. )
W sytuacji wykorzystania zewnętrznego czynnika utleniającego substrat
zostaje całkowicie utleniony (rys. 5. 7); glukoza na przykład może zostać utle-
niona do dwutlenku węgla i wody. Takie utlenienie substratu daje więcej energii
niż jego fermentacja.
W jaki sposób jest utleniany substrat i jak jest otrzymywana energia? Utlenia-
nie typowego substratu organicznego pokazano na rysunku 5. 7: jest ono sprzę-
żone z redukcją NAD, a powstający NADH jest utleniany przez zewnętrzny
czynnik utleniający. Zwykle NADH i zewnętrzny czynnik utleniający współdzia-
łają nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportu elektronów zlokalizo-
wany w błonie cytoplazmatycznej. Jest to łańcuch wyspecjalizowanych cząste-
czek (czynników redoks), które tworzą drogę przenoszenia elektronów. Sekwen-
cja poszczególnych czynników redoks jest taka, że elektrony mogą płynąć w dół
gradientu redoks (w kierunku bardziej dodatniego końca) w serii reakcji utlenie-
nia/redukcj'i. Elektrony z NADH mogą płynąć w dół gradientu do zewnętrznego
czynnika utleniającego; gdy jest nim tlen, całość procesu można podsumować tak
jak pokazano na rysunku 5. 8. Końcowy biorca elektronów (w tym wypadku tlen)
jest nazywany końcowym akceptorem elektronów.
Tego rodzaju przepływ elektronów dostarcza energii, gdyż elektrony porusza-
ją się w kierunku obszarów o mniejszej energii. Uwolniona energia jest wykorzys-
tywana przez komórkę do pompowania protonów (jonów wodorowych — H+)

Wzajemne powiązania między substratem, produktami końcowymi i zewnętrznym czynnikiem utle-

niającym w oddychaniu wykorzystującym typowy substrat organiczny (porównaj rys. 5. 2). W tym
przykładzie, NADH wytworzony w czasie metabolizowania substratu jest utleniany przez zewnętrz-
ny czynnik utleniający. Zachodzi to na ogół nie bezpośrednio, lecz poprzez łańcuch transportu
elektronów (patrz tekst).

74
Łańcuch transportu elektronów składający się z trzech składników (Χ, Υ i Z), z tlenem jako końco-
wym akceptorem elektronów, przy utlenianiu typowego, organicznego substratu oddechowego.
Metabolizm komórkowy wytwarza NADH, który musi być utleniany w celu odtworzenia NAD.
Część NADH jest utleniana do NAD w reakcjach biosyntezy, a część poprzez łańcuch transportu
elektronów. W łańcuchu tym NADH jest utleniany przez przeniesienie elektronów na utlenioną
formę X (która zostaje zredukowana). Zredukowana forma X zostaje utleniona przez przeniesienie
elektronów na utlenioną formę Υ — i tak dalej. Końcowym etapem jest redukcja tlenu do wody.
Ciągłe linie zakrzywione oznaczają drogę przepływu elektronów. Zarówno utlenienie NADH
(enzym dehydrogenaza NADH), jak i redukcja tlenu (przez oksydazę cytochromową) zachodzi na
wewnętrznej (tzn. cytoplazmatycznej) stronie błony cytoplazmatycznej.

poprzez błonę cytoplazmatyczną z jej strony wewnętrznej do zewnętrznej.

Prowadzi to do braku równowagi ładunkowej (i pH) między dwiema powierzch-
niami błony. Tendencja protonów do powrotu na stronę wewnętrzną błony
(a więc do stanu zrównoważonego) stanowi formę energii zwaną siłą protonomo-
toryczną. Siła ta jest jedną z najważniejszych i najbardziej uniwersalnych form
energii w komórce. Może zostać użyta bezpośrednio do zaspokojenia pewnych
potrzeb energetycznych, na przykład do napędzania ruchu rzęsek (sekcja 2. 2. 14. 1),
do transportu (pobierania) różnych jonów. Pobieranie jonów jest procesem wyma-
gających energii, gdyż błona cytoplazmatyczna jest zwykle dla nich nieprzepusz-
czalna (sekcja 2. 28). Siła protonomotoryczna może też dostarczać energii do trans-
portu niektórych substratów przez błonę cytoplazmatyczną (np. transport laktozy
u E. coli), do fosforylacji ADP (z wytworzeniem ATP) przez kompleksy enzymów
(ATPazy) zlokalizowane w błonie cytoplazmatycznej. Protony przechodząc
poprzez ATPazę (z zewnętrznej na wewnętrzną powierzchnię błony) dostarczają
energii niezbędnej do uwolnienia ATP z miejsc katalitycznych ATPazy na cyto-
plazmatycznej stronie błony. W oddychaniu, kiedy siła protonomotoryczna jest
wykorzystywana jako źródło energii do syntezy ATP z ADP, proces ten jest
zwany fosforylacją oksydatywną (porównaj z fosforylacją substratową w sekcji
5. 1. 1. 1). Ciekawe, że ATPazy błonowe mogą też katalizować hydrolizę ATP do
ADP, a uwolniona energia jest wykorzystywana do pompowania protonów (na
zewnątrz) przez błonę, tzn. do zwiększania siły protonomotorycznej. Tak więc
energia zawarta w ATP i sile protonomotorycznej może ulegać wzajemnym
przemianom. Cały ten mechanizm jest podsumowany na rysunku 5. 9.
Sama ATPaza składa się z dwóch głównych części. Domena Fo jest kanałem
protonowym, który przechodzi przez całą szerokość błony; domena F1 od-
działuje z cytoplazmatyczną stroną Fo i zawiera miejsca katalityczne, w których
syntetyzowany jest ATP. Takie ATPazy zwane są ATPazami typu (Fo F 1 ) . Domena
Fo obraca się względem domeny F1 w czasie translokacji protonów. [Energy
transduction in ATP synthase: Elston, Wang i Oster (1998) Nature 391: 510-513. ]

75
„Łańcuch oddechowy" to termin używany do określenia łańcucha transportu elektronów w metabo-
lizmie oddechowym (tzn. w oddychaniu). „ATPaza protonowa" jest systemem enzymatycznym
(w błonie cytoplazmatycznej), który katalizuje zależną od siły protonomotorycznej fosforylację ADP
do ATP, a także hydrolizę ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu (Pi). Siła protonomotoryczna jest
wykorzystywana do syntezy ATP, a sama zwiększa się w wyniku jego hydrolizy (dostarczającej
energii). Siła protonomotoryczna uczestniczy też w redukcji NADP przez NADH. NADPH jest
wykorzystywany np. w niektórych komórkowych reakcjach biosyntezy (np. asymilacja amoniaku
(sekcja 10. 3. 2).

U bakterii łańcuch transportu elektronów biorący udział w oddychaniu

(łańcuch oddechowy) występuje w błonie cytoplazmatycznej (i w pewnych
wypadkach w tylakoidach); jego składniki mogą różnić się u poszczególnych
gatunków, a także u danego gatunku w zależności od warunków wzrostu.
Składnikami łańcucha oddechowego mogą być: 1) cytochromy — białka zawie-
rające żelazo, które pobierają elektrony i następnie przekazują je w wyniku prze-
miennej redukcji i utleniania atomu żelaza; 2) białka żelazo-siarkowe, takie jak
ferredoksyny; i 3) chinony — związki aromatyczne, które mogą ulegać odwracal-
nej redukcji. Przy wykorzystaniu w oddychaniu typowego substratu organicz-
nego (rys. 5. 8), zarówno utlenienie NADH, jak i redukcja końcowego akceptora
elektronów (tlen na rys. 5. 8) wydają się zachodzić w wewnętrznej (tzn. cytoplaz-
matycznej) stronie błony cytoplazmatycznej.
Na rysunku 5. 8 źródło NADH jest określone po prostu jako „metabolizm
wytwarzający NADH". Możemy teraz przyjrzeć się niektórym szlakom wyko-
rzystywanym w bakteryjnym oddychaniu. U wielu bakterii metabolizm odde-
chowy glukozy rozpoczyna się szlakiem Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3).
Jednak po wytworzeniu kwasu pirogronowego droga fermentacyjna i oddecho-
wa są całkowicie różne. W tej drugiej kwas pirogronowy jest przekształcany
w acetylo-CoA i włączany do szlaku cyklicznego, znanego pod nazwą cyklu

76
kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10) lub cyklu Krebsa, czy też cyklu kwasu
cytrynowego.
Rysunek 5. 10 pokazuje, że w cyklu kwasów trikarboksylowych acetylo-CoA
i kwas szczawiooctowy łączą się, tworząc kwas cytrynowy. W następnych re-
akcjach wyjściowa cząsteczka kwasu pirogronowego jest w rezultacie utleniana
do dwutlenku węgla. Na każdą cząsteczkę utlenionego kwasu pirogronowego
zostają zredukowane 4 cząsteczki NAD(P) i 1 cząsteczka FAD, syntetyzowana
jest 1 cząsteczka ATP i zregenerowana 1 cząsteczka kwasu szczawiooctowego.
NADH i FADH2 zostają utlenione w łańcuchu oddechowym, a powstająca siła
protonomotoryczna może być wykorzystana np. do syntezy ATP przez błonową
ATPazę. Powinno być teraz jasne, że wydajność energetyczna oddychania jest
znacznie większa niż fermentacji. W oddychaniu utlenienie NADH prowadzi,
poprzez siłę protonomotoryczną, do syntezy ATP, podczas gdy w fermentacji
(gdzie nie ma zewnętrznego czynnika utleniającego) komórka musi pozbyć się
NADH syntetyzując takie produkty uboczne jak kwas mlekowy.
Oddychanie beztlenowe. Oddychanie beztlenowe w zasadzie jest takie samo
jak tlenowe: w obu rodzajach wykorzystywany jest zewnętrzny akceptor elektro-
nów. W warunkach beztlenowych, zamiast tlenu są jednak wykorzystywane
takie czynniki utleniające jak azotan, siarczan czy fumaran. Siła protonomoto-
ryczna powstaje w wyniku działania beztlenowego łańcucha oddechowego. Sub-
stratem (donorem elektronów) wykorzystywanym przez chemoorganotrofy
w oddychaniu beztlenowym może być któryś z rozlicznych związków organicz-
nych, w zależności od gatunku i warunków.
W oddychaniu azotanowym jako końcowy akceptor elektronów jest wyko-
rzystywany azotan, ulegając redukcji do azotynu, tlenku azotu, azotu lub amo-
niaku, w zależności od bakterii. Jeśli w wyniku redukcji powstaje głównie azot
cząsteczkowy i tlenek azotu (tzn. gazy), proces zwany jest denitryfikacją, gdyż
powoduje straty azotu do atmosfery. Denitryfikacja stanowi problem w rolnic-
twie, gdyż zmniejsza żyzność gleby (sekcja 10. 3. 2. 2). Może jednak być też proce-
sem pożytecznym, wykorzystywanym do usuwania azotu ze ścieków w oczysz-
czalniach (sekcja 13. 4).
Do bakterii denitryfikacyjnych należą Alcaligenes faecalis, Bacillus licheniformis,
Paracoccus denitrificans i Pseudomonas stutzeri. Niegdyś uważano, że denitryfikacja
zachodzi jedynie w warunkach beztlenowych lub gdy zawartość tlenu jest
zmniejszona. Teraz wiemy, że tlen działa różnie na poszczególne bakterie deni-
tryfikacyjne. Niektóre z nich przeprowadzają denitryfikację tylko w warunkach
beztlenowych. Inne są do niej zdolne nawet w obecności tlenu. Są wreszcie takie,
które wykorzystują jednocześnie tlen i azotan — chociaż zwykle szybkość deni-
tryfikacji maleje wraz ze wzrostem stężenia tlenu.
Niektóre gatunki, w odpowiednich warunkach, są zdolne do dysymilacyjnej
redukcji azotanu do amoniaku (sekcja 10. 3. 2).
Do substratów wykorzystywanych przez chemoorganotrofy jako donory
elektronów w oddychaniu azotanowym zalicza się np. bursztynian (u E. coli).
Bakterie redukujące siarczany i bakterie redukujące siarkę wykorzystują,
odpowiednio, siarczany i siarkę jako końcowe akceptory elektronów. W czasie

77
Bardzo rozpowszechniony w metabolizmie oddechowym (sekcja 5. 1. 1. 2). Reakcja kwas izocytry-
nowy -» kwas α-ketoglutarowy jest katalizowana przez enzym dehydrogenazę izocytrynianową,
która u większości bakterii jest raczej swoista dla NADP niż dla NAD. NADPH jest wykorzystywany
w reakcjach biosyntezy. FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy), podobnie jak NAD, niesie energię
w postaci „siły redukującej". FADH2 może zostać utleniony poprzez łańcuch oddechowy, co prowa-
dzi do powstania siły protonomotorycznej. U wielu bakterii w etapie prowadzącym od burszty-
nylo-CoA do kwasu bursztynowego zachodzi synteza guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) zamiast ATP.
GTP jest wykorzystywany jako cząsteczka „waluty" energetycznej, np. w czasie wiązania amino-
acylo-tRNA do miejsca „A" podczas syntezy białek (rys. 7. 9).

78
oddychania beztlenowego siarczan bądź siarka są redukowane do siarczku
(rys. 10. 3). Tego typu oddychanie beztlenowe przeprowadzają np. gatunki
rodzaju Desulfovibrio (redukują siarczan) i Desulfuromonas (redukują siarkę).
Można je znaleźć zwykle w mułach i glebie, gdzie są warunki beztlenowe.
Odpowiadają za większość siarkowodoru powstającego w wodach zanieczysz-
czonych materią organiczną.
W oddychaniu fumaranowym końcowym akceptorem jest pochodzący ze
środowiska fumaran, który ulega redukcji do bursztynianu. Tego typu oddycha-
nie występuje u różnych bakterii, w tym u E. coli, jeśli są ku temu odpowiednie
warunki.
Niektóre bakterie (zarówno gatunki gramdodatnie, jak i gramujemne) utle-
niając substraty organiczne (takie jak octan, mleczan, pirogronian, glicerol,
etanol) lub wodór wykorzystują arsenian i selenian jako końcowe akceptory
elektronów w oddychaniu beztlenowym. Donorem elektronów mogą być różne
związki w zależności od gatunku. Wykazano, że reduktazy arsenianu i selenianu
występują w peryplazmie i są związane z błonami. Bakterie o takim typie oddy-
chania można spotkać zarówno w środowiskach skażonych, jak i nieskażonych
tymi pierwiastkami. [Bacterial respiration of arsenic and selenium: Stolz
i Oremland (1999) FEMSMR 23: 615-627. ]

5. 1. 2. Metabolizm energetyczny u chemolitoautotrofów

Chemolitotrofy wykorzystują w swoim metabolizmie energetycznym substraty
nieorganiczne — np. siarczek, siarkę elementarną, amoniak, wodór, jony żela-
zawe itd. Metabolizm jest oddechowy, tlenowy bądź beztlenowy. Elektrony
z substratu są przenoszone na końcowy, zewnętrzny czynnik utleniający,
w wyniku czego powstaje siła protonomotoryczna (patrz też sekcja 5. 3. 4). Proces
ten zachodzi bez udziału NAD (porównaj z metabolizmem oddechowym chemo-
organotrofów). Do chemolitotrofów (bezwzględnych i względnych) zalicza się
na przykład bakterie z rodzaju Thiobacillus i bakterie nitryfikacyjne.
Gatunki z rodzaju Thiobacillus występują np. w glebie i osadach morskich.
Zwykle utleniają one, z użyciem tlenu, takie substraty jak siarczek czy siarkę,
choć T. denitrificans może wykorzystywać te substraty beztlenowo w oddychaniu
azotanowym. Donorem elektronów dla tej bakterii są Fe (II) (jony żelazawe),
wykorzystywane w czasie wzrostu beztlenowego, zależnego od azotanu (który
jest redukowany przede wszystkim do azotu cząsteczkowego) [Straub i wsp.
(1996) AEM 62: 1458-1460J. Thiobacillus ferrooxidans, bezwzględny tlenowiec,
może utleniać zarówno jony żelazawe, jak i substraty siarkowe. Bakterie
z rodzaju Thiobacillus odgrywają ważną rolę w obiegu siarki (sekcja 10. 3. 3).
Bakterie nitryfikacyjne są organizmami o bezwzględnie tlenowym metaboliz-
mie oddechowym. Żyją w glebie i środowiskach wodnych. Energię uzyskują
w wyniku nitryfikacji, czyli utleniania amoniaku do azotynu (np. gatunki
z rodzaju Nitrosococcus i Nitrosomonas) oraz azotynu do azotanu (np. gatunki
z rodzaju Nitrobacter i Nitrococcus). Odgrywają one ważną rolę w obiegu azotu
(sekcja 10. 3. 2).

79
 5. 1. 2. 1 Fermentacja nieorganiczna

Do całkiem niedawna uważano, że żaden substrat nieorganiczny nie może pod-

legać fermentacji. Jednak w roku 1987 Bak i Cypionka [Nature (1987) 326:
891-892] opisali taki typ metabolizmu energetycznego, w którym substraty (siar-
czyn lub tiosiarczan) podlegały „dysproporcjonacji", tworząc siarczek i siarczan.
Taką „chemolitotroficzną fermentację" przeprowadza np. Desulfovibrio sulfo-
dismutans.

5. 1. 2. 2 Wytwarzanie metanu

Metan (CH4) jest produktem końcowym procesu energetycznego przeprowadza-

nego przez pewne bezwzględnie beztlenowe organizmy należące do Archaea,
zwane metanogenami. Wydaje się, że żaden organizm należący do Bacteria nie
jest zdolny do wytwarzania metanu. Metanogeny żyją np. w mule rzecznym oraz
w żwaczu krów i innych przeżuwaczy (środowiska charakteryzujące się Eh niż-
szym niż -330 mV).
Niektóre metanogeny (np. Methanobacterium, Methanobrevibacter, Methanococ-
cus, Methanothermus) wytwarzają metan w serii złożonych reakcji, w których
w redukcji CO2 bierze udział wodór. Atom węgla z CO 2 wiąże się kolejno
z każdą z serii cząsteczek nośników C1 i podlega stopniowej redukcji poprzez
-CH 2 i CH 3 do metanu (CH4). Cząsteczki nośników to metanofuran, tetrahydro-
metanopteryna i kilka koenzymów. Końcowy etap reakcji jest termodynamicznie
korzystny i wydaje się sprzężony z wytworzeniem siły protonomotorycznej.
Niektóre metanogeny (np. Methanococcoid. es, Methanolobus) mogą wytwarzać
metan np. z octanu lub metanolu. Wzrost na pożywce z octanem jest wolniejszy
niż na dwutlenku węgla i wodorze (ΔG0 reakcji CH3COOH -> CH 4 + CO2
wynosi około -36 kJ). Zasadniczo w wyniku rozkładu octanu powstaje CO i CH 3 ,
przy czym ten ostatni jest redukowany do metanu, podczas gdy CO jest utle-
niany przez wodę (enzym dehydrogenaza CO) do CO 2 i 2H. W błotnistych
glebach octan może być substratem preferownym w niskich temperaturach
[Wagner i Pfeiffer (1997) FEMSME 22: 145-153].
[Enzymes in methanogenesis: Ferry (1999) FEMSMR 23: 13-38. ]

5. 2 Metabolizm energetyczny fototrofów

Fototrofy uzyskują energię ze światła słonecznego — w większości przypadków
w wyniku fotosyntezy.

5. 2. 1 Fotosynteza
W fotosyntezie energia w postaci światła jest absorbowana przez wyspecjalizo-
wane barwniki i wykorzystywana do wytworzenia cząsteczek „waluty" energe-
tycznej i/lub siły protonomotorycznej. We wszystkich przypadkach fotosynteza
zachodzi w błonach zawierających chlorofile, barwniki dodatkowe i łańcuch(y)

80
transportu elektronów. Chlorofile są zielonymi barwnikami zawierającymi mag-
nez. Sinice zawierają chlorofil a (który występuje też u glonów i roślin wyż-
szych). Inne bakterie fotosyntetyzujące zawierają jeden lub większą liczbę bakte-
riochlorofili - barwników podobnych do chlorofili. Tak zwane jasne reakcje
fotosyntezy obejmują wszystkie (fotochemiczne) zdarzenia biorące udział
w przekształcaniu energii świetlnej w siłę protonomotoryczną lub energię che-
miczną. Reakcje ciemne (= reakcje niezależne od światła) to przemiany związane
z wykorzystaniem przez komórkę energii pochodzącej z fotosyntezy do syntezy
związków węgla.
Bakterie fotosyntetyzujące można podzielić na dwie grupy: przeprowadza-
jące fotosyntezę tlenową (i wytwarzające tlen jako produkt uboczny), i takie,
które przeprowadzają fotosyntezę beztlenową (i nie wytwarzają tlenu).

5. 2. 1. 1 Fotosynteza oksygenowa (z wytworzeniem tlenu) u bakterii

Tego typu proces, bardzo przypominający fotosyntezę roślin zielonych i glonów,

zachodzi u sinic. Ponieważ sinice przeprowadzają fotosyntezę typu eukariotycz-
nego, były przez wiele lat uważane nie za bakterie, lecz za „niebieskozielone
glony". Dziś nie ma wątpliwości, że są one bakteriami.
U prawie wszystkich sinic fotosynteza zachodzi w błonach tylakoidów (sek-
cja 2. 2. 7). (W szczepach Gloeobacter, które nie mają tylakoidów, składniki aparatu
fotosyntetycznego występują w błonie cytoplazmatycznej. )
Chlorofile występują w tak zwanych centrach reakcji, do których światło jest
kierowane przez wyspecjalizowane kompleksy zbierające światło, zbudowane
z białek i barwników. Na skład tych kompleksów mają wpływ czynniki środo-
wiskowe, takie jak rodzaj światła oraz dostępność azotu i siarki [Grossman
i wsp. (1993) JB 175: 575-582]. Kiedy do chlorofilu dociera energia świetlna,
wyrzuca on elektrony o dużej energii. Elektrony te mogą „spłynąć" w dół łańcu-
cha transportu elektronów i dostarczyć energii do wytworzenia siły protono-
motorycznej i/lub bezpośredniej redukcji NADP. (Komórka wykorzystuje
NADPH np. do różnych reakcji biosyntezy. )
Fotosyntezę oksygenową przedstawia się na ogół w postaci schematu Z
(rys. 5. 11). Elektrony o dużej energii wyrzucone z fotosystemu II (PSU) prze-
pływają przez łańcuch transportu elektronów do fotosystemu I (PSI), co powo-
duje powstanie siły protonomotorycznej w poprzek błony tylakoidu. Proces
wykorzystania tej właśnie siły do syntezy ATP (przez ATPazę błonową) nazy-
wamy fotofosforylacją. Elektrony wyrzucone z PSI mają wystarczająco dużą
energię, by zredukować NADP do NADPH. Przepływ elektronów (z lewa na
prawo na rys. 5. 11) wymaga ich dostarczenia do PSU. Zachodzi to w wyniku
utlenienia wody, a powstającym produktem ubocznym jest tlen. W poddanym
ostatnio rewizji eukariotycznym schemacie Z, również zachodzi redukcja NADP
przez PSU [(patrz Prince (1996) TIBS 21: 121-122].
Niektóre sinice (np. Oscillatoria limnetica) mogą alternatywnie przeprowadzać
fotosyntezę beztlenowo, wykorzystując jako donor elektronów siarczek zamiast
wody, przy czym siarczek jest utleniany do siarki elementarnej. Istnieją też sinice
zdolne do wzrostu chemoorganotroficznego.

81
Energia świetlna powoduje, że centra reakcji (PSI, PSU) wyrzucają elektrony o wysokiej energii;
poziomy energetyczne i miejsca docelowe zaznaczono strzałkami. Przepływ elektronów z PSU do PSI
powoduje powstanie siły protonomotorycznej. Elektrony wyrzucone z PSU są uzupełniane przez
utlenianie wody, w wyniku czego uwalniany jest tlen. [How does PSU split water? (artykuł
przeglądowy): Rogner i wsp. (1996) TIBS 21: 44-49. ].

Niewielka grupa organizmów prokariotycznych (Prochlorophyta; prochloro-

fity), spokrewnionych z sinicami, zawiera oba chlorofile eukariotyczne: a i b.
Obecnie znamy tylko trzy gatunki tych bakterii: Prochloron didemni, Prochlorothrix
hollandica i Prochlorococcus marinus.

5. 2. 1. 2 Fotosynteza anoksygenowa
Fotosynteza anoksygenowa (w której nie powstaje tlen) jest przeprowadzana
beztlenowo przez bakterie z rzędu Rhodospirillales. U tak zwanych „purpuro-
wych" bakterii fotosyntetyzujących (podrząd Rhodospirillineae) wszystkie
składniki fotosyntetyczne występują w wewnątrzkomórkowych błonach, które
stanowią jedną całość z błoną cytoplazmatyczną. U „zielonych" bakterii fotosyn-
tetyzujących (podrząd Chlorobiineae) składniki kompleksów zbierających
światło mieszczą się w chlorosomach (sekcja 2. 27), natomiast centra reakcyjne
znajdują się w błonie cytoplazmatycznej.
U bakterii „purpurowych" elektrony wyrzucone z centrum reakcyjnego poru-
szają się na drodze cyklicznej — poprzez łańcuch transportu elektronów wracają
do centrum reakcji. Powstająca siła protonomotoryczna może być wykorzystana
np. do syntezy ATP (tzn. fotofosforylacji).
U bakterii „zielonych" przepływ elektronów powoduje powstanie siły proto-
nomotorycznej (zużytej np. do syntezy ATP) i może też być wykorzystany do
bezpośredniej redukcji NAD do NADH. Taki niecykliczny przepływ elektronów

82
wymaga więc ich dostarczenia z egzogennego donora. Donorami elektronów
u tych bakterii mogą być np. siarczek i tiosiarczan, ale nigdy woda, stąd ich foto-
synteza jest zawsze anoksygenowa.
Niektóre spośród Rhodospirillales (w tym wiele bakterii „purpurowych"),
w warunkach tlenowych lub przy małej zawartości tlenu mogą rosnąć chemo-
organotroficznie.

5. 2. 1. 3 Donory elektronów w fotosyntezie

Do nieorganicznych donorów elektronów biorących udział w fotosyntezie należy
np. woda (wykorzystywana jedynie przez sinice), siarczek, siarka i wodór.
Donory organiczne to np. kwas mrówkowy czy metanol. Fototrofy wykorzys-
tujące nieorganiczne donory elektronów nazywamy fotolitotrofami, te zaś,
które używają donorów organicznych — fotoorganotrofami.

5. 2. 2 Błona purpurowa
Niektóre szczepy Halobacterium saiinarum (ekstremalny halofil — sekcja 3. 1. 7),
należącego do Archaea, są zdolne do wykorzystywania energii słonecznej,
chociaż nie potrafią przeprowadzać fotosyntezy. Na świetle, w warunkach
beztlenowych lub przy małej zawartości tlenu wykształcają one zróżnicowany,
wybarwiony na purpurowo, obszar błony cytoplazmatycznej — błonę purpu-
rową. Głównym barwnikiem purpurowym jest bakteriorodopsyna. Kiedy
cząsteczka bakteriorodopsyny absorbuje energię świetlną, przechodzi bardzo
szybko przez szereg pośrednich stanów wzbudzonych (fotointermediatów), co
dzieje się w ciągu kilku tysięcznych części sekundy. W tym czasie protony są
pompowane na zewnątrz w poprzek błony, co oznacza, że w wyniku cyklicz-
nego fotowzbudzenia bakteriorodopsyny tworzy się siła protonomotoryczna.
Jednak w przeciwieństwie do fotosyntezy, siła ta w błonie purpurowej powsta-
je na skutek bezpośredniego pompowania protonów w poprzek błony, bez
udziału chlorofilu.

5. 3 Inne zagadnienia związane

z metabolizmem energetycznym
5. 3. 1 Wydajność tworzenia ATP
W żywej komórce żaden proces nie zachodzi w oderwaniu od innych, lecz raczej
stanowi część złożonej całości. Z tego powodu maksymalna teoretyczna wydaj-
ność tworzenia ATP w metabolizmie oddechowym, z powiedzmy jednej cząste-
czki glukozy, może nie być nigdy osiągana, biorąc pod uwagę oddziaływania
między tym metabolizmem a innymi procesami w komórce. Na przykład, nie
cała energia uwalniana w wyniku transportu elektronów jako siła protonomoto-
ryczna będzie wykorzystana do fosforylacji oksydatywnej. Pewna jej część może

83
zostać zużyta do transportu jonów lub ruchu rzęskowego. Ponadto część NADH
powstającego w czasie oddychania może zostać wykorzystana w reakcjach bio-
syntezy. Ten właśnie NADH nie zostanie utleniony w łańcuchu oddechowym,
a więc nie będzie uczestniczył w wytwarzaniu siły protonomotorycznej, a tym
samym w tworzeniu ATP. Wreszcie związki pośrednie powstające w metaboliz-
mie energetycznym mogą służyć komórce jako „cegiełki" budulcowe w reak-
cjach biosyntezy. Na przykład, kwas pirogronowy jest wykorzystywany do syn-
tezy aminokwasów — alaniny, waliny i leucyny. Oczywiście zysk energetyczny
jest wtedy mniejszy niż w przypadku całkowitego utlenienia tego kwasu.

5. 3. 2 Odwrotny transport elektronów

Bakterie wymagają siły redukującej — np. NADH i/lub NADPH — do reakcji
biosyntezy. Nie mają z tym nigdy problemu bakterie o fermentacyjnym typie
metabolizmu. Sinice i „zielone" bakterie fotosyntetyzujące uzyskują te cząsteczki
w wyniku bezpośredniej redukcji, z wykorzystaniem niecyklicznego przepływu
elektronów. Jednak „purpurowe" bakterie fotosyntetyzujące nie są w stanie tego
dokonać, gdyż elektrony wyrzucone z ich centrów reakcyjnych nie mają dość
energii, by zredukować NAD. Reakcję tę przeprowadzają w wyniku odwrotnego
transportu elektronów. W procesie tym siła protonomotoryczna jest wykorzy-
stana do przenoszenia elektronów „pod prąd", do enzymu błonowego, dehydro-
genazy NAD, gdzie NAD jest redukowany do NADH. Wymaga to dostarczenia
elektronów przez zewnętrzny donor elektronów. Bakterie „purpurowe" zwykle
wykorzystują do tego celu organiczne donory elektronów, ale niektóre z nich
mogą też wykorzystywać donory nieorganiczne, takie jak siarczek. Odwrotny
transport elektronów występuje również u bakterii nitryfikacyjnych i innych che-
molitotrofów (sekcja 5. 1. 2). Należy zwróć uwagę, że one także nie tworzą NADH
w czasie metabolizowania substratu energetycznego.

5. 3. 3 Pozbywanie się produktów odpadowych

Bakterie fermentacyjne wytwarzają bardzo dużo NADH. Muszą się pozbyć pew-
nej jego ilości, syntetyzując produkty odpadowe, takie jak kwas mlekowy (sekcja
5. 1. 1. 1). Zamieniając konieczność na korzyść, niektóre bakterie (np. Lactococcus
cremoris dawniej Streptococcus cremoris) uzyskują energię wiążąc protony z pro-
duktem ubocznym, jakim jest mleczan. Kiedy kwas mlekowy przechodzi przez
błonę cytoplazmatyczną, „towarzyszące" mu protony automatycznie zwiększają
siłę protonomotoryczną!

5. 3. 4 Utlenianie pozacytoplazmatyczne
Złożone substraty energetyczne są na ogół transportowane przez błonę cytoplaz-
matyczną i metabolizowane w komórce. Jednak niektóre proste substraty energe-
tyczne (takie jak H2 i Fe2+), jak się wydaje, są utleniane na zewnętrznej części

84
błony cytoplazmatycznej albo w przestrzeni peryplazmatycznej. Takie pozacyto-
plazmatyczne utlenianie substratu charakteryzuje się: 1) uwalnianiem protonów
z substratu i/lub wody poza teren cytoplazmy, 2) przepływem elektronów
(z substratu) przez błonę do jej strony cytoplazmatycznej (wewnętrznej)
i 3) oddziaływaniem tych elektronów z protonami i końcowym akceptorem
elektronów (np. tlenem). Czysty zysk to wytworzenie siły protonomotorycznej.
Na przykład ścisły tlenowiec Thiobacillus ferrooxidans zdobywa energię utleniając
Fe2+ (do Fe3+) w niskim pH. Według pewnej koncepcji wytworzony pozacyto-
plazmatycznie Fe 3+ reaguje z wodą, dając wodorotlenek żelaza i protony, pod-
czas gdy elektrony (z Fe2+) redukują końcowy akceptor elektronów (tlen?) na
cytoplazmatycznej stronie błony.
Niektóre bakterie (np. Pseudomonas aeruginosa) mogą wytwarzać siłę protono-
motoryczną w wyniku pozacytoplazmatycznego utleniania glukozy do gluko-
nianu. U bakterii tych enzym — dehydrogenaza glukozy (ze swoim kofaktorem
pirolochinolinochinonem — PQQ/ ang. pyrroquinoline quinone) występuje na
zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Glukonian zostaje przetrans-
portowany przez błonę i ulega fosforylacji do 6-fosfoglukonianu, który jest
włączany do szlaku Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2).
Escherichia coli (i wiele pokrewnych jej bakterii) zwykle syntetyzuje błonową
dehydrogenazę glukozy pozbawioną niezbędnego jej PQQ. Takie organizmy
przeprowadzają utlenianie pozacytoplazmatyczne tylko wtedy, gdy dostarcza
się im PQQ [Bouvet, Lenormand i Grimont (1989) IJSB 39: 61-67]. Jednak szczep
mutanta E. coli, który ma niefunkcjonalny system fosfotransferazowy (sekcja
5. 4. 2), może syntetyzować PQQ i przeprowadzać utlenianie pozacytoplazmaty-
czne. Świadczy to, że geny kodujące PQQ występują u tej bakterii, ale w normal-
nych warunkach nie ulegają ekspresji [Biville, Turlin i Gasser (1991) JGM 137:
1775-1782].

5. 3. 5 Siła protonomotoryczna a aerotaksja

Jest zadziwiające, że taka bakteria jak Azospirillum brasiliense, która charaktery-
zuje się metabolizmem oddechowym i wykorzystuje tlen jako końcowy akceptor
elektronów, to mikroaerofil (sekcja 3. 1. 6). Aby znaleźć się w warunkach optymal-
nych, organizm ten wykazuje aerotaksję (sekcja 2. 2. 15. 2), poruszając się w stronę
miejsc, gdzie stężenie tlenu wynosi tylko 3-5 mM. U A. brasiliense siła protono-
motoryczna rośnie, gdy komórka porusza się w stronę preferowanego stężenia
tlenu, i maleje, gdy odpływa ona w przeciwnym kierunku. Być może, to zmiana
poziomu siły protonomotorycznej działa jako sygnał regulujący ruchy aerotakty-
czne [Zhulin i wsp. (1996) JB 178: 5199-5204].
Wydaje się, że zdolność A. brasilense do prowadzenia tlenowego metabolizmu
respiracyjnego przy tak małym stężeniu tlenu wynika z bardzo wydajnej oksy-
dazy (enzymu redukującego tlen). Co ciekawe, warunki te są korzystne dla
wiązania azotu przez tę bakterię (sekcja 10. 3. 2. 1).
U E. coli, białko sensorowe Aer może pośredniczyć w aerotaksji, odpowia-
dając na zmiany redoks składnika(ów) łańcucha transportu elektronów. Białko
Tsr (białko MCP: rys. 7. 13) wydaje się innym, niezależnym sensorem w aerotaksji

85
i może odpowiadać na zmiany siły protonomotorycznej [Rebbapragada i wsp.
(1997) PNAS 94: 10541-10546].

5. 3. 6 Siła sodowomotoryczna
Siła sodowomotoryczna to energia związana z elektrochemicznym gradientem
jonów sodu między wewnętrzną i zewnętrzną powierzchnią błony cytoplazma-
tycznej; jest ona analogiczna do siły protonomotorycznej.
W pewnych przypadkach komórka może wytwarzać siłę sodowomotoryczną
wykorzystując siłę protonomotoryczną: wejście protonów do cytoplazmy jest
związane z wyjściem jonów sodu poprzez błonę (antyport Na + /H + ). U E. coli taki
antyport jest wykorzystywany jako źródło energii (siła sodowomotoryczna)
odpowiednie np. do pobrania (transportu, sekcja 5. 4) cukru melibiozy. Tak więc
melibioza i jony sodu są wspólnie transportowane do cytoplazmy (symport
Na+/melibioza), co oznacza, że pobieranie melibiozy zachodzi z wykorzysta-
niem siły sodowomotorycznej.
U pewnych bakterii morskich (np. Vibrio alginolyticus) energia z metabolizmu
oddechowego może być wykorzystana bezpośrednio do pompowania Na + na
zewnątrz poprzez pompę sodową. Organizm ten może np. wykorzystywać siłę
sodowomotoryczną do pobierania różnych aminokwasów i jako źródło energii
dla ruchu obrotowego swej biegunowej rzęski. Siła sodowomotoryczna jest też
wykorzystywana do poruszania biegunowej rzęski Vibrio cholerae [Kojima i wsp.
(1999) JB 181: 1927-1930].
Wzrost w wyższym zakresie temperatury powoduje zwiększenie właściwej
dla błony cytoplazmatycznej przepuszczalności zarówno dla protonów, jak
i jonów sodu. Jednak dla protonów wzrost ten jest większy niż dla jonów sodu.
W wyższych temperaturach organizm wykorzystujący siłę protonomotoryczną
będzie musiał wydatkować dodatkową energię na wytworzenie określonego jej
poziomu, po prostu w celu skompensowania zwiększonej dyfuzji protonów do
wnętrza. Pewne organizmy znalazły sposób na zminimalizowanie tego prob-
lemu. Skład ich błony cytoplazmatycznej jest taki, że podwyższona temperatura
ma mniejszy wpływ na przepuszczalność dla protonów. Jednak niektóre termo-
file (sekcja 3. 1. 4) zarzuciły wykorzystywanie protonów w swoim metabolizmie
energetycznym. Na przykład Clostridium fervidus wykorzystuje Na + jako jedyny
jon sprzęgnięty z metabolizmem energetycznym (tzn. gatunek ten nie wykorzy-
stuje siły protonomotorycznej), [Ion permeability at high temepratures: Driessen,
van de Vossenberg i Konigs (1996) FEMSMR 18: 139-148. ]
Enzymy biorące udział w przemieszczaniu jonów sodu zostały omówione
w artykule przeglądowym przez Dimroth [(1997) BBA 1318: 11-51].

5. 4 Systemy transportu
Błona cytoplazmatyczna (sekcja 2. 2. 8) jest skuteczną barierą, uniemożliwiającą
większości cząsteczek (i wszystkim jonom) swobodne przechodzenie do i z cyto-
plazmy. (Jest to oczywiście bardzo istotne, umożliwia bowiem komórce kontro-

86
lowanie swojego środowiska wewnętrznego. ) Bakterie gramujemne mają
dodatkową barierę w postaci błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2). W czasie meta-
bolizmu komórka musi mieć jednak możliwość pobierania różnych substratów
(do celów energetycznych i innych) i pozbywania się produktów ubocznych.
Służą do tego różne systemy transportu. Są one często swoiste dla poszczegól-
nych substratów lub dla małej liczby substratów podobnych — chociaż bywa,
że nawet w tej samej komórce dany związek może być przenoszony przez
systemy różnego typu.
Dzięki systemom transportu zachodzi powtórne wykorzystywane (ang. recy-
cling) różnych składników komórkowych (sekcja 5. 4. 6) i usuwanie antybiotyków
(patrz np. białko ΤΕΤ w sekcji 15. 4. 11).
Wyjątkowo dobrze poznany jest transport białek poprzez osłony komórkowe,
gdyż bakterie patogenne zwykle wywołują chorobę wydzielając toksyny
białkowe lub enzymy. Znane są cztery główne sposoby sekrecji białek: typ I
(sekcja 5. 4. 1. 2), typ II (sekcja 5. 4. 3), typ III (sekcja 5. 4. 4) i typ IV (sekcja 5. 4. 5)
(rys. 5. 13). Transport typu III wydaje się całkowicie związany z chorobotwórczo-
ścią, ale niektóre czynniki wirulencji są też transportowane przez inne systemy
— np. α-hemolizyna E. coli (wydzielana poprzez system typu I), czy też białko
IcsA Shigella odpowiedzialne za czerwonkę (system typu IV).
Transport często wymaga energii, która jest zwykle dostarczana w postaci
siły protonomotorycznej i/lub „wysokoenergetycznego fosforanu" takiego jak
ATP.
Siła protonomotoryczna może bezpośrednio napędzać transport pewnych
naładowanych i nienaładowanych rozpuszczonych substancji. Na przykład
u E. coli symport proton-laktoza pozwala na pobieranie laktozy kosztem siły
protonomotorycznej, jako że laktoza i protony są razem transportowane do
cytoplazmy.
Energia potrzebna do transportu jonów jest czasem dostarczana w wyniku
hydrolizy ATP przez błonową ATPazę. Na przykład u E. coli, K+ może być trans-
portowany przez tak zwany system Kdp (sekcja 7. 8. 6), z udziałem wyspecjalizo-
wanej K+-ATPazy (pompa potasowa). Hydroliza ATP umożliwia pompie pobra-
nie K+ wbrew gradientowi stężeń.
Transport poprzez system PTS (sekcja 5. 4. 2) jest związany z chemotaksją
i represją kataboliczną.
Wiele systemów transportowych ma złożoną budowę i ich działanie nie jest
całkowicie jasne; niektóre z nich zostały opisane w następnych sekcjach.

5. 4. 1 Transportery ABC
Transporter ABC to system transportu składający się z wielobiałkowego komp-
leksu w osłonach komórkowych. Dwa z tych białek mają (na swojej powierzchni
cytoplazmatycznej) swoiste miejsce wiązania ATP (ABC, ang. ATP-binding cas-
sette). Białko zawierające takie miejsce będzie tu określane mianem „białka
ABC". Hydroliza ATP w miejscu ABC dostarcza energii do transportu. Istnieje
wiele różnych przenośników ABC, a każdy z nich uczestniczy w imporcie lub
eksporcie/sekrecji określonych jonów lub cząsteczek. W sumie umożliwiają one

87
import/eksport bardzo różnych substratów, w tym jonów nieorganicznych,
cukrów i białek. Na przykład niektóre z nich importują związki odżywcze lub
jony ważne w osmoregulacji, podczas gdy inne wydzielają toksyny białkowe
i antybiotyki. Transportery ABC występują zarówno u bakterii gramujemnych,
jak i gramdodatnich.
Ciekawe, że biorąc udział w transporcie pewnych związków rozpuszczo-
nych, transporter ABC może też wpływać na kanały, przez które są przenoszone
inne związki rozpuszczone. Na przykład u Salmonella typhimurium transporter
kodowany przez geny sapABCDF bierze udział w imporcie pewnych toksycz-
nych peptydów (w celu ich detoksyfikacji), ale ma też wpływ na kanały dla
+
jonów K , które są niezbędne dla oporności bakterii na te peptydy [patrz np.
Higgins (1995) Cell 82: 693-696].
Regiony transporterów ABC odpowiedzialne za hydrolizę ATP zostały
omówione w artykule przeglądowym: Schneider i Hunke [(1998) FEMSMR
22: 1-20].

5. 4. 1. 1 Importery ABC (transportery zależne od białek wiążących; permeazy

peryplazmatyczne)

Importery pośredniczą w pobieraniu pewnych aminokwasów, cukrów i jonów.

Zwykle importer zawiera dwa różne białka (w błonie cytoplazmatycznej),
połączony dimer białek ABC i substratowo swoiste peryplazmatyczne białko
wiążące, które wiąże substrat i przenosi go do kompleksu błonowego. Wszystkie
importery zawierają białko wiążące. (Niektóre białka wiążące uczestniczą rów-
nież w „rozpoznawaniu" chemicznego stanu środowiska — ang. chemosensing. )
Przykładem importera ABC jest system ProK, uczestniczący w pobieraniu
cząsteczki osmoregulacyjnej, jaką jest betaina glicynowa (sekcja 3. 1. 8). Inny
przykład to system transportu histydyny u Salmonella typhimurium, w którym
białko peryplazmatyczne wiąże histydynę i przenosi ją do kompleksu błono-
wego. Ten z kolei przekazuje ją do cytoplazmy [patrz np. Liu i Ames (1997) JBC
272: 859-866]. Hung i współpracownicy opisali budowę krystaliczną HisP —
białka ABC permeazy histydynowej Salmonella typhimurium [(1998) Nature 396:
703-707].

5. 4. 1. 2 Eksportery ABC

Ogólnie mówiąc eksportery pośredniczą w eksporcie/sekrecji różnego typu

białek, np. enzymów, hemolizyn (sekcja 16. 1. 4. 1), antybiotyków peptydowych
i (u niektórych bakterii) polisacharydowych składników otoczek. Wydaje się,
że zwykle dany eksporter może transportować różnego rodzaju cząsteczki
pokrewne lub podobne [ABC transporters (bacterial exporters): Fath i Kolter
(1993) MR 57: 997-1017. ]
Jeden z eksporterów u E. coli pośredniczy w jednoetapowym transporcie
α-hemolizyny z cytoplazmy na zewnątrz komórki. Należy on do tzw. systemów
sekrecji typu I (rys. 5. 13). U Streptomyces antibioticus eksporter ABC wydziela
antybiotyk oleandomycynę (należącą do tej samej grupy co erytromycyna).

88
 W skład białek wydzielanych przez patogeny wchodzą niektóre ważne czyn-
niki wirulencji (sekcja 11. 5), np. cyklolizyna u Bordetella pertussis (wywołującej
krztusiec) czy alkaliczna proteaza u Pseudomonas aeruginosa.
Zwykle białka przenoszone przez eksportery ABC są pozbawione N-końco-
wej sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), ale mają C-końcową sekwencję sekrecyjną,
która może bezpośrednio oddziaływać z białkami ABC. Eksportery, które prze-
noszą cząsteczki do peryplazmy lub błony zewnętrznej jako miejsc docelowych,
mogą mieć mniej składników białkowych niż te, które wydzielają białka (tzn.
transportują je na zewnątrz komórki).
Niektóre eksportery u bakterii gramujemnych zawierają: białka ABC, tzw.
błonowe białko fuzyjne (MFP, ang. membrane fusion protein) (w błonie cyto-
plazmatycznej, ale częściowo też w peryplazmie) i składnik występujący
w błonie zewnętrznej. MFP może łączyć błonę cytoplazmatyczną i błonę zew-
nętrzną, ułatwiając transport. Niektóre badania sugerują, że przynajmniej
w pewnych przypadkach składniki eksportera układają się w określonym
porządku, tworząc w ten sposób kompletny system transportowy, i że zachodzi
to w wyniku związania substratu (tzn. cząsteczki, która ma być wydzielona)
z białkiem ABC. Po połączeniu substratu z ABC to ostatnie oddziałuje z MFP,
które z kolei wiąże się ze składnikiem błony zewnętrznej [Letoffe, Delepelaire
i Wandersman (1996) EMBO Journal 15: 5804-5811].

5. 4. 2 System fosfotransferazowy zależny od fosfoenolopirogronianu

System fosfotransferazowy (PTS, ang. phosphotransferase system) jest wykorzy-
stywany przez różne bakterie gramujemne i gramdodatnie do pobierania pew-
nych cukrów (np. glukozy, fruktozy, laktozy), alkoholocukrów (np. mannitolu)
i cukrów podstawionych (np. N-acetyloglukozoaminy), przy czym źródłem ener-
gii jest tu fosfoenolopirogronian (wzór rys. 5. 3). W najprostszym przypadku fos-
foenolopirogronian dostarcza fosforanu i energii do sekwencyjnej fosforylacji
dwóch kolejnych białek (oznaczonych I oraz H) w cytoplazmie. Fosforan i ener-
gia zostają przeniesione z Η na związaną z błoną cytoplazmatyczną permeazę
swoistą dla cukrów (tzw. kompleks II), która wiąże się z substratem, następnie
fosforyluje go i jednocześnie transportuje do cytoplazmy (rys. 5. 12).
Ponieważ cukry są często metabolizowane w postaci ich fosforylowanych
pochodnych (np. glukozo-6-fosforan na rys. 5. 3 i 6. 2), to fosforylacja w czasie
pobierania jest pozytywnym aspektem transportu PTS.
PTS odgrywa rolę nie tylko w transporcie: komórka może też wykazywać
chemotaksję w odpowiedzi na cukry pobrane przez system PTS. Jeden z możli-
wych mechanizmów to oddziaływanie fosforylowanych składników PTS
(rys. 5. 12), poprzez nieznany intermediat(y), z białkiem CheY systemu MCP
(rys. 7. 13), co wpływa na ruch rzęski. Chemotaksja zachodząca z udziałem PTS
różni się od systemu MCP [Titgemeyer (1993) JCB 51: 1-6]. Tak więc: 1) substrat
musi być transportowany (a nie po prostu związany); 2) w adaptacji nie bierze
udziału metylacja; i 3) PTS nie odpowiada na repelenty. [PTS (artykuł prze-
glądowy): Saier i Reizer (1994) MM 13: 755-764. ]

89
Pokazano udział PTS w transporcie mannitolu i glukozy poprzez błonę cytoplazmatyczną (CM)
z peryplazmy (wyżej) do cytoplazmy (niżej) u Escherichia coli. Zwróć uwagę, że glukoza i mannitol
są pobierane przez różne systemy związane z błonami („permeazy")/ jak opisano niżej.
Źródłem energii dla transportu jest fosfoenolopirogronian (PEP). System jest zasilany energety-
cznie w wyniku sekwencyjnego transferu grupy fosforanowej Ρ ζ „wysokoenergetycznego
fosforanu" w PEP na enzym I (oznaczonego I), a następnie na białko Hpr (oznaczone H).
Następnie fosforan zostaje przeniesiony na permeazę (kompleks enzymu II, oznaczony jako II).
(Zwróć uwagę, że cząsteczki Η i I nie są specyficzne dla żadnej permeazy, tzn. mogą fosforylować
każdą z nich. ) Permeaza mannitolowa (po lewej) jest enzymem całkowicie błonowym i składa
się z trzech domen: IIA, IIB i IIC. Hydrofobowa, transbłonowa domena IIC, która wiąże substrat, jak
się wydaje, uczestniczy w tworzeniu kanału transbłonowego. Zarówno domena IIA, jak i IIB zawiera
miejsca fosforylacji, ale przypuszczalnie tylko ta druga bierze bezpośredni udział w fosforylacji
substratu.
W permeazie glukozowej domena IIA jest odrębnym białkiem, sekwencja fosforylacji prowadzi od
IIA do IIB, a domena IIB uczestniczy w fosforylacji substratu.
We wszystkich przypadkach fosforylacja cząsteczki substratu jest integralnym elementem jej
transportu do cytoplazmy.
W przypadku niektórych permeaz PTS składniki są ułożone w inny sposób. Na przykład perme-
aza fruktozowa bakterii jelitowych składa się z białka błonowego, zawierającego IIC i IIB oraz
oddzielne białko, pełniące zarówno funkcję IIA, jak i H. Analogiczny enzym z Rhodobacter capsulatus
to pojedyncze białko łączące funkcje ΠΑ, Η i I.
Zgodnie z proponowaną nomenklaturą dla permeaz PTS [Seier i Reizer (1992) JB 174: 1433-1438],
MtlEco
permeazę mannitolowę E. coli oznacza się IICBA , a permeazę glukozową E. coli —
IICBGlc,
Eco
+
IIAGlc'Eco.
Poza rolą, jaką pełnią w transporcie, składniki H, IIA i IIB systemu PTS uczestniczą w regulacji
pewnych operonów katabolicznych (sekcja 7. 8. 2. 1).

PTS nie tylko bierze udział w transporcie substratów, ale kontroluje też
pewne procesy metabolizmu węgla. Tak więc cząsteczki przenoszące grupy fos-
foranowe w PTS (rys. 5. 12) regulują aktywność niektórych operonów (np. ope-
ronu lac, rys. 7. 11) uczestniczących w pobieraniu/katabolizmie źródeł węgla.
W wielu przypadkach ta kontrola operonów (sekcja 7. 8. 2. 1) zachodzi poprzez
fosforylację regulatorów transkrypcji, w miejscu określonym jako „domena
regulacji przez PTS" (PRD, ang. PTS-regulation domain) [Stulke i wsp. (1998)
MM 28: 865-874].

90
 5. 4. 3 Szlak sekrecji ogólnej (szlak zależny od sec,
system sekrecji typu II) u bakterii gramujemnych
Wiele z wydzielanych białek, np. toksyny, pewne enzymy, jest transportowa-
nych z cytoplazmy na zewnątrz komórki przez dwuetapowy szlak sekrecji ogól-
nej (GSP, ang. general secretory pathway). Taki transport wymaga energii: siły
protonomotorycznej i ATP. (Początkowy(e) etap(y) GSP są też wykorzystywane
przez białka, których końcowym przeznaczeniem jest błona cytoplazmatyczna,
peryplazma lub błona zewnętrzna. )
Wśród różnych szlaków sekrecji białek, GSP jest określony przez pewne geny
(analogiczne do genów sec E. coli), których produkty tworzą system transportu
białek do i przez błonę cytoplazmatyczną. Białka wydzielane w szlaku GSP są
syntetyzowane ze specjalną N-końcową sekwencją sygnałową (sekcja 7. 6), która
ułatwia ich przejście przez błonę cytoplazmatyczną i jest enzymatycznie odci-
nana od białka w czasie przechodzenia przez błonę.
Etap pierwszy. Albo jeszcze w trakcie translacji (sekcja 7. 6), albo zaraz po niej,
dane białko jest przenoszone przez białko opiekuńcze (chaperon), SecB, do
błony cytoplazmatycznej w miejsce, gdzie znajduje się SecA — błonowa ATPaza.
SecA jest związana z kompleksem białkowym (SecYEG) [Manting, van der Does
i Driessen (1997) JB 179: 5699-5704], zwanym translokonem, który tworzy kanał
sekrecyjny w błonie cytoplazmatycznej. SecB zostaje uwolnione, a energia
z hydrolizy ATP (w SecA) kieruje białko (które już całkowicie uległo translacji),
poprzez translokon, do peryplazmy.
W przypadku niektórych białek kierowanie z cytoplazmy do błony cytoplaz-
matycznej w czasie translacji zachodzi w inny sposób. Tak więc u E. coli
powstający peptyd (wraz ze swoim rybosomem) najpierw wiąże się z tak zwaną
cząstką rozpoznającą sygnał (SRP, ang. signal recognition particle), składającą
się z małej cząsteczki RNA i GTPazy. Następnie cały kompleks wiąże się przej-
ściowo z błoną cytoplazmatyczną (poprzez białko FtsY), zanim rybosom wraz
z polipeptydem zostanie uwolniony i połączony z translokonem SecYEG. Cały
proces jest zasilany energią z hydrolizy GTP [Valent i wsp. (1998) EMBO Journal
17: 2504-2512].
Etap drugi. Transport z peryplazmy na zewnątrz komórki jest słabo poznany.
Wydaje się, że ten etap GSP nie występuje u E. coli.

5. 4. 4 Systemy typu III sekrecji białek u bakterii gramujemnych

W systemach typu III białka są wydzielane przez por lub kanał, który przechodzi
przez osłony komórkowe, poczynając od cytoplazmy aż do powierzchni
komórki. Odmiennie niż w transporterach ABC (sekcja 5. 4. 1), w systemach tych
może uczestniczyć 20 lub nawet więcej białek. U różnych gatunków składniki
systemów typu III są podobne (homologiczne), co więcej niektóre z białek są
podobne do składników innych systemów sekrecji białek. Wydaje się, że systemy
typu III występują głównie lub wyłącznie u patogenów — np. szczepów EPEC
(sekcja 11. 2. 1), Salmonella, Shigella (sekcja 11. 2. 2. 1) i Yersinia (sekcja 11. 5. 1),

91
a wydzielane białka działają w sposób charakterystyczny na komórki eukarioty-
czne. Tego typu systemy wydzielania występują zarówno w bakteriach chorobo-
twórczych dla roślin [Alfano i Collmer (1997) JB 179: 5655-5662], jak i w patoge-
nach człowieka i zwierząt.
Wydzielane białka mają N-końcową sekwencję, która kieruje je do poru
i nie jest odcinana, jak to się dzieje w systemach typu II (zależnych od sec)
(sekcja 5. 4. 3).
Nieznane są wymagania energetyczne systemów typu III. Wiadomo, że u Yer-
sinia, związane z porem, cytoplazmatyczne białko YscN może działać jak
ATPaza.
U niektórych bakterii systemy typu III są przypuszczalnie aktywowane
przez kontakt z komórkami eukariotycznymi (np. szczepy EPEC [Wolff i wsp.
(1998) MM 28: 143-155] i Yersinia). W takich przypadkach białka mogą być
wydzielane przez bakterię bezpośrednio do komórki gospodarza. Potwierdzają
to następujące spostrzeżenia. Po pierwsze same białka wydzielane przez systemy
typu III mają mały wpływ, lub w ogóle nie wpływają na komórki gospodarza in
vitro. Po drugie wykazano, że przynajmniej niektóre z wydzielanych białek
występują w komórkach gospodarza. W przypadku Yersinia wydzielane białka
(Yop) wywierają swoiste działanie na gospodarza (sekcja 11. 5. 1). Białka wydzie-
lane przez inne patogeny to np. SipC (Salmonella typhimurium), EspB i EspE/Tir
(szczepy EPEC), IpaB u Shigella (sekcja 11. 5. 2) oraz „harpiny" (ang. harpins)
bakterii chorobotwórczych dla roślin.
[Systemy typu III (artykuł przeglądowy): Lee (1997) ΉΜ 5: 148-156. ]

5. 4. 5 Systemy typu IV sekrecji białek (autotransportery)

u bakterii gramujemnych
Białko wydzielane z udziałem tego systemu jest syntetyzowane jako część
większego białka, składającego się z: 1) N-końcowego peptydu liderowego,
2) domeny α i 3) C-końcowej domeny β. Mechanizm wydzielania nie jest w pełni
zrozumiały, a jeden z modeli określa to następująco. Peptyd liderowy działa jako
sekwencja sygnałowa (sekcja 7. 6) — tak więc białko najpierw przechodzi przez
błonę cytoplazmatyczną z udziałem systemu (typu II) zależnego od sec (sekcja
5. 4. 3). W tym czasie zostaje odcięta sekwencja sygnałowa.
Domena β tworzy następnie w błonie zewnętrznej por o strukturze „baryłki
β", przez który domena a (tego samego białka) przechodzi na powierzchnię
komórki. Białko może potem np.: 1) pozostać w stanie nienaruszonym w błonie
zewnętrznej; 2) ulec autokatalitycznemu rozszczepieniu, przy czym domena a
zostaje wydzielona; 3) ulec rozszczepieniu przez inne białko błony zewnętrznej
(takie jak proteaza OmpT E. coli), z wydzieleniem domeny a. Domena a jest więc
„pasażerem", który może być wydzielany przez domenę β tego samego białka.
Domenę a nazywa się też autotransporterem, choć może to być mylące, jako że
tę samą nazwę stosuje się do określenia całego (trzyczęściowego) białka prekur-
sorowego, opisanego wyżej.
Wymagania energetyczne systemu sekrecji typu IV nie są jasne.
92
 Pierwszym poznanym systemem autotransporterowym była proteaza IgAl
u Neisseria gonorrhoeae — białko (sekrecyjne), które rozszczepia przeciwciała
klasy IgA (rys. 11. 2). Innym przykładem jest białko IcsA (zatrzymywane na
powierzchni komórki) odpowiedzialne za inwazyjność Shigella wywołującej
czerwonkę (sekcja 11. 3. 3. 2).
System autotransporterowy AIDA-I (ang. adhesin involved in diffuse adhe-
sion) E. coli został wykorzystany do wyeksponowania heterologicznego białka
(np. podjednostki Β toksyny cholery) na powierzchni zmutowanych szczepów
E. coli pozbawionych OmpT. Do badań tych gen białka heterologicznego pod-
dano fuzji (in vitro) z DNA kodującym domenę β AIDA-I; tym samym, w czasie
ekspresji w komórkach E. coli, heterologiczne białko (pasażer) było eksportowane
i eksponowane na powierzchni komórki (8. 5. 13).
[Autotransportery: Henderson, Navarro-Garcia i Nataro (1998) TIM 6:
370-378; Holland (1998) TIM 6: 388-389. ]

93
 5. 4. 6 Transport metabolitów powtórnie wykorzystywanych
(salvage transport)
W pewnych przypadkach bakteria może ponownie wykorzystywać niektóre
(makro)cząsteczki, zamiast je tracić wydzielając do środowiska. Jest to sensowne
nie tylko z powodu oszczędności materiału budulcowego, ale również energii,
którą komórka musiałaby wydatkować na syntezę. Na przykład E. coli, rosnąc,
stale degraduje swój Peptydoglikan (rys. 2. 7) i częściowo ponownie wykorzy-
stuje powstałe produkty do jego resyntezy (recycling). Według jednego z przyję-
tych modeli, Peptydoglikan jest degradowany (przez enzymy peryplazmaty-
czne) do podjednostek disacharydotripeptydowych. Kompleksy podjednostek
z peryplazmatycznym białkiem wiążącym (oznaczonym MppA) są przenoszone
poprzez błonę cytoplazmatyczną przez swoisty system transportu (kodowany
przez geny oppBCDF). W cytoplazmie tripeptyd (L-alanylo-y-D-glutamylo-mezo-
-diaminopimelinian — rys. 2. 7) jest odłączany od podjednostki przez enzym
amidazę i dołączany do UDP-MurNAc (sekcja 6. 3. 3. 1) przez inny enzym (ligazę)
[produkt genu mph Mengin-Lecreubc i wsp. (1996) JB 178: 5347-5352]. W ten spo-
sób wchodzi ponownie do szlaku biosyntezy ściany komórkowej [Park i wsp.
(1998) JB 180: 1215-1223].

5. 4. 7 Transport poprzez barierę peptydoglikanu

Aby nie doszło do lizy osmotycznej, bakteria musi mieć nienaruszone osłony
komórkowe. Jednak warstwa peptydoglikanu nie może całkowicie otaczać pro-
toplastu, gdyż różne duże cząsteczki (np. α-hemolizyna E. coli, sekcja 5. 4. 1. 2)
muszą być transportowane poprzez osłony. Składanie fimbrii (i innych wypu-
stek) również wymaga przeniesienia na zewnątrz komórki ich składników
białkowych. Inny rodzaj dużych cząsteczek transportowanych przez ściany to
w pewnych typach koniugacji (sekcja 8. 4. 2) kompleks DNA-białko, który jest
przenoszony z komórki dawcy do biorcy. W warstwie peptydoglikanu musi też
powstać pewien „wyłom" w czasie składania ciałka podstawowego rzęski. Brak
w nim również ciągłości w miejscach połączenia błon — cytoplazmatycznej
i wewnętrznej (sekcja 2. 2. 10).
Składanie struktur związanych z transportem czy też innych struktur prze-
chodzących poprzez osłony komórkowe najprawdopodobniej zachodzi z udzia-
łem enzymu(ów), które lokalnie modyfikują Peptydoglikan, zachowując jednak
jego integralność (patrz rys. 3. 1). W pewnych przypadkach udało się rzeczywi-
ście powiązać te procesy [artykuł przeglądowy: Dijkstra i Keck (1996) JB 178:
5555-5562].
 ROZDZIAŁ

6
Metabolizm II - węgiel

Dlaczego węgiel? Po prostu dlatego, że właściwie wszystkie związki, jakie

są zawarte w żywych organizmach i są przez nie tworzone, to związki węgla.
W rozdziale tym omawiamy: 1) wymagania węglowe bakterii, 2) sposoby
przyswajania różnych związków węgla i 3) syntezę, przemiany i polime-
ryzację związków węgla. Metabolizm azotu i siarki jest przedstawiony w roz-
dziale 10.
Jakich rodzajów związków węgla wymagają bakterie do wzrostu? Niektóre
z nich mogą wykorzystywać dwutlenek węgla do syntezy większości lub wszyst-
kich związków węgla. Takie organizmy zwane są autotrofami, a wykorzysty-
wanie dwutlenku węgla jako jedynego (lub głównego) źródła węgla to autotro-
fia. U niektórych bakterii autotrofia jest względna, u innych — bezwzględna. Te
ostatnie mogą wykorzystywać wyłącznie dwutlenek węgla, nawet jeśli glukoza
czy inne substraty są łatwo dostępne. Bezwzględne autotrofy wykorzystują nie
tylko proste źródło węgla, ale również proste substraty energetyczne (rozdz. 5).
Są albo chemolitotrofami (tzn. chemolitoautotrofami), albo fotolitotrofami (tzn.
fotolitoautotrofami).
Metabolizm chemolitoautotroficzny występuje u stosunkowo nielicznych
bakterii (oraz u niektórych członków domeny Archaea). Ten typ metabolizmu
jest unikatowy w świecie ożywionym i można go znaleźć wyłącznie u niektórych
wyspecjalizowanych prokariotów. Chemolitoautotrofy odgrywają ważną rolę
np. w obiegu azotu (rozdział 10).
Metabolizm fotolitoautotroficzny występuje np. u sinic i oczywiście u roślin
zielonych oraz glonów.
Większość bakterii to nie autotrofy: nie mogą one wykorzystywać dwutlenku
węgla jako głównego źródła węgla. Ich wzrost zależy od złożonych związków
organicznych pochodzących z innych organizmów. Bakterie wymagające do
wzrostu złożonych związków węgla zwane są heterotrofami, a chemoorganotro-
ficzne heterotrofy to chemoorganoheterotrofy. Ogólnie, mogą one wykorzysty-
wać ogromną gamę związków węgla, w tym cukry, kwasy tłuszczowe, alkohole

95
i różne inne substancje organiczne. Bakterie heterotroficzne są szeroko rozpo-
wszechnione w przyrodzie. Są nimi, na przykład, wszystkie gatunki wywołujące
choroby człowieka, zwierząt i roślin.

6. 1 Asymilacja węgla u autotrofów

Autotrofy wykorzystują dwutlenek węgla występujący w środowisku do two-
rzenia złożonych związków organicznych. Gdy jest on włączany do tego typu
związków, mówi się, że został on „związany". Autotrofy dysponują różnymi
sposobami wiązania dwutlenku węgla, ale dwa ze znanych mechanizmów
występują najczęściej — cykl Calvina i reduktywny cykl kwasów karbo-
ksylowych.

6. 1. 1 Cykl Calvina
Szlak ten (zwany też reduktywnym cyklem pentozofosforanowym) wykorzy-
stują bardzo liczne autotrofy, w tym niektóre anoksygenowe bakterie fotosynte-
tyzujące i większość sinic. Część cyklu Calvina przedstawiono na rysunku 6. 1.
Każdy obrót cyklu wymaga znacznego nakładu zarówno ATP, jak i siły redu-
kującej, co oznacza, że wiązanie dwutlenku węgla łączy się z dużym nakła-
dem energii. Enzymem kluczowym tego szlaku jest karboksylaza-oksygenaza
rybulozo-l, 5-bisfosforanowa (RuBisCO — patrz też sekcja 2. 2. 6) i fosforybulo-
kinaza. Enzymy te występują tylko w komórkach wiążących dwutlenek węgla
w cyklu Calvina.

6. 1. 2 Reduktywny cykl kwasów karboksylowych

Szlak ten wykorzystują do wiązania dwutlenku węgla bakterie fototroficzne
z rodziny Chlorobiaceae i chemotroficzny archeon Sulfolobus. Zasadniczo przy-
pomina on działający w odwrotną stronę cykl kwasów trikarboksylowych
(rys. 5. 10), w którym reakcje nieodwracalne (takie jak kwas szczawiooc-
towy -» kwas cytrynowy) zostały zmodyfikowane przez różne enzymy/sekwen-
cje reakcji. Podobnie jak w cyklu Calvina, wiązanie dwutlenku węgla wymaga
tu wielkiego nakładu energii.

6. 1. 3 Karboksydobakterie
Karboksydobakterie mogą wykorzystywać tlenek węgla jako jedyne źródło
węgla i energii, co oznacza, że nie pasują one do ścisłej definicji „autotrofa". Utle-
niają one tlenek węgla do dwutlenku węgla (w warunkach tlenowych) i asymi-
lują dwutlenek węgla w cyklu Calvina. Organizmy takie występują w glebie,
zanieczyszczonych wodach i ściekach. Zalicza się do nich Bacillus Schlegelii
i Pseudomonas carboxydovorans.

96
Szlak ten umożliwia wykorzystanie dwutlenku węgla do syntezy złożonych związków budujących
komórkę. Węgiel wchodzi do cyklu wskutek wiązania dwutlenku węgla i opuszcza go w postaci
związków pośrednich pobranych do reakcji biosyntezy. Na przykład 3-fosfoglicerynian jest wykorzy-
stywany do syntezy pewnych aminokwasów (takich jak glicyna i seryna), a także do tworzenia piro-
gronianu — prekursora alaniny, leucyny i innych aminokwasów. Zwróć uwagę, że bezwzględne
autotrofy muszą syntetyzować wszystkie aminokwasy niezbędne do syntezy białek. Do ciągłego
działania cyklu Calvina konieczne jest stałe dostarczanie rybulozo-l, 5-bisfosforanu. Tak więc ilość
węgla pobieranego z cyklu nie może przekraczać ilości węgla doń wchodzącego. (Zamknięte w kole
„P" oznacza fosforan. ) RuBisCO to enzym karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfosforanowa.
Dla przejrzystości rysunku pominięto w cyklu Calvina liczne połączenia z innymi szlakami.

6. 2 Asymilacja węgla u heterotrofów

Heterotrofy mogą asymilować szeroką gamę związków organicznych. Niżej
podano jedynie kilka przykładów.
Wiele heterotrofów wykorzystuje glukozę, a sposób jej asymilacji zależy od
szlaków i systemów enzymatycznych, jakimi dysponuje dany organizm. Na
przykład liczne bakterie (w tym E. coli) mogą przyswajać glukozę w szlakach
„energetycznych", takich jak szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (glikoliza,
rys. 5. 3), a następnie — cykl kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10). Pseudomonas
aeruginosa jest zdolny do asymilacji glukozy w wyniku utleniania pozacytoplaz-
matycznego (sekcja 5. 3. 4). Wszystkie te procesy dostarczają zarówno energii, jak
i związków będących prekursorami w biosyntezie.

97
 Liczne bakterie (a także niektórzy przedstawiciele Archaea) przyswajają
glukozę i np. glukoniany poprzez szlak Entnera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Jest on
podobny do szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), ponieważ oba
zaczynają się fosforylacją heksozy i w obu przypadkach powstaje kwas piro-
gronowy. Szlak Entnera-Doudoroffa dostarcza NAD(PH) do biosyntez oraz
różnych cząsteczek prekursorowych. Ponadto, w organizmach przeprowa-
dzających oba wymienione szlaki, aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zasilać
glikolizę i dostarczać w ten sposób energii w wyniku fosforylacji substratowej.
U E. coli szlak Entnera-Doudoroffa może odgrywać ważną rolę w przyswajaniu
węgla, a substraty, takie jak glukoniany (występujące np. w jelitach ssaków),
mogą być metabolizowane nawet w obecności glukozy. [ED pathway in E. coli:
Peekhaus i Conway (1998) JB 180: 3495-3502. ]
Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) dostarcza
rybulozo-5-fosforanu (rys. 6. 2), ważnego prekursora nukleotydów (rozdz. 7)
i aminokwasu histydyny, oraz erytrozo-4-fosforanu, niezbędnego do syntezy
aminokwasów aromatycznych, takich jak L-tryptofan i L-fenyloalanina. Jest też
źródłem NADPH będącego siłą redukującą w różnych reakcjach biosyntetycz-
nych — np. w syntezie kwasów tłuszczowych. Szlak heksozomonofosforanowy
jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie. Występuje u mikroorganizmów
eukariotycznych, u zwierząt i roślin.
Escherichia coli rozszczepia cukier laktozę na glukozę i galaktozę. Glukoza jest
metabolizowana w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa (rys. 5. 3), natomiast
galaktoza — w szlaku Leloira. W szlaku tym galaktoza ulega fosforylacji
(z udziałem ATP) do galaktozo-1-fosforanu enzymatycznie przekształcanego
poprzez glukozo-1-fosforan w glukozo-6-fosforan, który zostaje włączony do
szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa.
Celuloza, polimer glukozy, jest źródłem węgla dla pewnej liczby promie-
niowców (bakterii występujących w glebie, kompoście itp. ) oraz np. bakterii
żwacza (część trawiąca przewodu pokarmowego krów i innych przeżuwaczy).
Bakterie te wytwarzają enzymy rozkładające na zewnątrz komórki pewne rodza-
je celulozy. Wśród powstających produktów jest też disacharyd — celobioza. Do
bakterii celulolitycznych (tzn. rozkładających celulozę) należą gatunki Cellulomo-
nas i n p . Clostridium thermocellum oraz szczepy Pseudomonas i Ruminococcus.
Trzeba tu podkreślić, że dostępność danego substratu nie musi oznaczać
wcale, że będzie on pobierany i wykorzystywany przez daną bakterię: patrz
represja kataboliczna (sekcja 7. 8. 2. 1).

6. 3 Synteza, wzajemne przemiany

i polimeryzacja związków węgla
6. 3. 1 Synteza związków węgla
Synteza ogromnej liczby różnorodnych cząsteczek budujących żywą komórkę
wymaga zachodzenia niezwykle złożonej (i ściśle kontrolowanej) sieci reakcji
chemicznych. Komórka potrzebuje jednak nie tylko cząsteczek „strukturalnych",

98
Szlak heksozomonofosforanowy (= szlak pentozofosforanowy) jest do niego podobny aż do etapu
6-fosfoglukonianu. Aldehyd 3-fosfoglicerynowy może zostać przekształcony w kwas pirogronowy
(podobnie jak w szlaku Embdena-Meyerhofa-Parnasa: rys. 5. 3) lub, jak na przykład u Pseudomonas
i bakterii pokrewnych, może ponownie wejść do szlaku Entnera-Doudoroffa poprzez glukoneoge-
nezę (sekcja 6. 3. 2).

99
ale również energii, niezbędnej do przeprowadzania reakcji anabolicznych.
Metabolizm węglowy i energetyczny są zwykle ze sobą ściśle związane (sekcja
5. 3. 1). Tu mamy jedynie tyle miejsca, by pobieżnie przejrzeć pewne ogólne wia-
domości dotyczące biosyntezy.
Wiele związków tworzonych na początku szlaków asymilacyjnych może
służyć jako prekursory biosyntez. Z punktu widzenia komórki nie jest to pozba-
wione sensu, bowiem gdyby do tego celu prowadził skomplikowany metabo-
lizm, to jakiekolwiek zaburzenie we wczesnych etapach przyswajania węgla
powodowałoby poważne komplikacje w drogach biosyntezy. A więc np. pierw-
szy produkt powstający w cyklu Calvina (rys. 6. 1), aldehyd 3-fosfoglicerynowy,
może zostać wykorzystany do syntezy aminokwasów: cysteiny, glicyny i seryny
(składników białek - sekcja 7. 6) oraz innych związków. Również kwas pirogro-
nowy (pochodzący ze szlaków Embdena-Meyerhafa-Parnasa i Entnera-Doudo-
roffa) jest prekursorem np. różnych aminokwasów, a rybozo-5-fosforan (szlak
heksozomonofosforanowy) jest wykorzystywany np. do syntezy nukleotydów
(składników DNA i RNA - rozdz. 7).
Związki pośrednie powstające w cyklu kwasów trikarboksylowych (rys. 5. 10)
też mogą zostać wykorzystane w biosyntezach. Na przykład kwas szczawiooc-
towy i α-ketoglutarowy są prekursorami pewnych aminokwasów; acetylo-CoA
bierze udział w syntezie kwasów tłuszczowych, a bursztynylo-CoA — porfiryn
— składników chlorofili i cytochromów. Gdy zostaną pobrane z cyklu kwasów
trikarboksylowych związki pośrednie, to nie mogą być wykorzystane do regene-
rowania kwasu szczawiooctowego, musi więc on być uzupełniany w jakiś inny
sposób, jeśli cykl ma zachodzić w ciągły sposób. Służą do tego różne reakcje, na
przykład w pewnych warunkach kwas szczawiooctowy może powstawać bezpo-
średnio w wyniku karboksylacji kwasu pirogronowego lub fosfoenolopirogro-
nianu. Tego typu reakcje uzupełniające zwane są reakcjami anaplerotycznymi.
Szlaki asymilacyjne zarówno u autotrofów, jak i heterotrofów dostarczają
zwykle 3-, 4- i 5-węglowych cząsteczek, które są dogodnymi prekursorami
w biosyntezie.
W pewnych przypadkach komórka może uniknąć biosyntezy składników
de ηονο, dzięki ponownemu wykorzystaniu swojego materiału budulcowego
w szlakach wtórnego wykorzystania metabolitów (ang. salvage pathways). Jed-
nym z przykładów jest ponowne wykorzystanie podjednostek tripeptydowych
peptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6).
Każdy etap reakcji biosyntetycznej jest zwykle katalizowany przez enzym,
tylko bardzo nieliczne reakcje zachodzą spontanicznie. Oprócz enzymów nie-
zbędne też są inne czynniki. W reakcjach redukcji uczestniczy NAD(P)H lub
FADH2, w utlenianiu — NAD lub FAD, a do fosforylacji potrzebny jest ATP,
GTP lub fosfoenolopirogronian. W metabolizmie bakteryjnym ważną rolę odgry-
wają koenzymy. Należy do nich np. koenzym A (nośnik grup acetylowych
i innych grup acylowych) oraz pirofosforan tiaminy (TPP) (biorący udział np.
w różnych reakcjach dekarboksylacji). Jeden koenzym może wpływać na kilka
różnych procesów metabolicznych. Jest to dobrze widoczne na przykładzie tetra-
hydrofolianu (THF), złożonego związku będącego pochodną pterydyny, kwasu
p-aminobenzoesowego i kwasu glutaminowego. Niektóre funkcje THF przedsta-
wiono w tabeli 6. 1. Zwróć uwagę, że uczestniczy on w procesach ważnych dla

100
wzrostu komórki: w syntezie dTMP i puryn (a tym samym syntezie DNA i RNA
— rozdz. 7) i syntezie białek. Sam THF jest syntetyzowany w wyniku redukcji
swojego prekursora, kwasu dihydrofoliowego (DHF). W szczepach niektórych
bakterii można zahamować syntezę DHF (a tym samym i THF) za pomocą sulfo-
namidów (sekcja 15. 4. 9), które w ten sposób hamują funkcje zależne od THF.
Niektóre przykłady prostych szlaków biosyntetycznych przedstawiono na
rysunku 6. 3.

6. 3. 2 Wzajemne przemiany związków węgla

W wielu szlakach poszczególne reakcje lub nawet ciągi reakcji mogą w zależno-
ści od warunków przebiegać w jednym z dwóch kierunków. Ponadto związki
pośrednie (jak również produkty końcowe) mogą przechodzić z jednego szlaku
do drugiego, dzięki czemu przepływ węgla do różnych produktów może być
regulowany zgodnie z zapotrzebowaniem komórki. W wielu przypadkach
bakterie potrafią syntetyzować ogromną różnorodność cząsteczek z jednego
źródła węgla. Przedstawiamy tu tylko kilka krótkich przykładów wzajemnych
przemian związków węgla.
Zjawisko wzajemnych przemian związków węgla dobrze ilustruje glukoneo-
geneza: synteza glukozo-6-fosforanu z substratów niewęglowodanowych, takich
jak octan, glicerol czy pirogronian. Zasadniczo zachodzi to w wyniku prze-
kształcenia substratu (gdy jest to konieczne) w związek pośredni glikolizy
(rys. 5. 3), po którym następuje odwrócenie szlaku. Obejście reakcji nieodwracal-
nych szlaku zachodzi w wyniku działania innych enzymów. Bakterie zdolne do
glukoneogenezy (np. E. coli) mogą, jeśli to konieczne, wykorzystywać związki
pośrednie (a także produkty końcowe) w odwróconym szlaku Embdena-Meyer-
hofa-Parnasa.
Gdy szlaki heksozomonofosforanowy i Entnera-Doudoroffa zachodzą w jed-
nej komórce, to 6-fosfoglukonian, ich wspólny związek pośredni (rys. 6. 2), może
być metabolizowany w każdym z nich. Zwiększony metabolizm w pierwszym ze
szlaków może być potrzebny np. w czasie replikacji chromosomu, gdyż synteza
DNA wymaga wzmożonego wytwarzania rybulozo-5-fosforanu, wchodzącego
w skład nukleotydów purynowych i pirymidynowych (sekcja 7. 2).

101
102
 6. 3. 3 Polimeryzacja związków węgla
Polimeryzacja polega na chemicznym łączeniu małych cząsteczek, z wytworze-
niem dużej cząsteczki, często w formie łańcucha, zwanej polimerem. Homopoli-
mer powstaje, gdy wszystkie małe cząsteczki są takie same, a heteropolimer —
gdy są różne. U bakterii w wyniku polimeryzacji są syntetyzowane pewne
związki zapasowe, a także różne składniki ściany i otoczek. W następnym roz-
dziale są omówione dwa bardzo ważne (hetero)polimery, tj. białka i kwasy
nukleinowe.

6. 3. 3. 1 Synteza peptydoglikanu
U E. coli N-acetyloglukozoamina i kwas N-acetylomuraminowy (rys. 2. 7) są syn-
tetyzowane w cytoplazmie, jako oddzielne pochodne UDP (urydyno-5'-di-
fosforan), w skrócie odpowiednio — UDP-GlcNAc i UDP-MurNAc. Następnie
do UDP-MurNAc zostaje dodany łańcuch pięciu aminokwasów. Powstaje w ten
sposób tzw. nukleotyd Parka, który jest przenoszony (z uwolnieniem UDP) na
długołańcuchową cząsteczkę lipofilową (baktoprenol) w błonie cytoplazmatycz-
nej. Potem, w wyniku dodania UDP-GlcNAc (z uwolnieniem UDP), powstaje
podjednostka złożona z baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Wreszcie pod-
jednostki takie zostają przeniesione z błony cytoplazmatycznej do peryplazmy
(z uwolnieniem baktoprenolu). Tu są łączone w reakcji transglikozylacji,
w wyniku czego powstają łańcuchy glikanowe (rodzące się nici peptydoglikanu).
Włączanie tego nowego peptydoglikanu do istniejącego już woreczka peptydo-
glikanowego zachodzi zgodnie z modelem 3-za-l (sekcja 3. 2. 1, rys. 3. 1). Pepty-
dowe wiązania poprzeczne są tworzone w reakcjach transpeptydacji. Transgli-
kozylacja i transpeptydacja zachodzą w wyniku aktywności enzymatycznej
białek wiążących penicylinę (sekcja 2. 2. 8).
U E. coli znacząca część peptydoglikanu jest rozkładana w czasie każdego
pokolenia. Jednak, w wyniku działania wydajnego systemu odzysku, tripeptydy
są ponownie wykorzystywane do syntezy nowego peptydoglikanu (sekcja 5. 4. 6).
Niektóre antybiotyki hamują syntezę peptydoglikanu, a β-laktamy (patrz sek-
cja 15. 4. 1) działają na jej etapie końcowym. Wankomycyna blokuje przenoszenie
podjednostek z błony do cytoplazmy, wiążąc się z częścią pentapeptydową

Rys. 6. 3 Niektóre proste szlaki biosyntetyczne — synteza aminokwasów:

L-alaniny (a), L-asparaginianu (b) i L-seryny (c). ( N o t k a . Biochemicy często podają wzór kwasu
organicznego w formie niezjonizowanej, ale związek nazywają tak, jakby był solą — np.
CH 3. CO. COOH = pirogronian. ) W przykładach tych reakcja z udziałem glutaminianu wprowadza
azot do cząsteczek prekursorowych nie zawierających tego pierwiastka. Glutamina spełnia to zadanie
w syntezie L-tryptofanu. Zwróć uwagę, że każda reakcja jest katalizowana przez swoisty enzym.
Zamknięte w kole „P" oznacza fosforan. „Pi" to fosforan nieorganiczny, (d) Urydyno-5'-fosforan
(UMP) (w górnej części) został zsyntetyzowany w wyniku serii reakcji (nie pokazanych) z prostych
cząsteczek prekursorowych — asparaginianu i karbamoilofosforanu. UMP najpierw podlega reakcji
w pozycji 2' — rybozy (patrz rys. 7. 2), tworząc 2'-deoksyrybozę. W następnej reakcji, koenzym
N5, N10-metyleno-THF (patrz sekcja 6. 3. 1 i tab. 6. 1) dostarcza grupy metylowej (~CH3) w pozycji 5
uracylu (rys. 7. 3), przekształcając w ten sposób uracyl w tyminę.

103
baktoprenolodisacharydopentapeptydu. Ten złożony antybiotyk glikopeptydo-
wy jest bakteriobójczy dla różnych bakterii gramdodatnich, natomiast nie wnika
do wnętrza bakterii gramujemnych. Z klinicznego punktu widzenia jest bardzo
pożyteczny w leczeniu np. przeciw szczepom MRSA (sekcja 15. 4. 11). Stosuje
się go też w przypadku rzekomobłoniastego zapalenia okrężnicy, przypisywa-
nego Clostridium difficile. Teikoplanina jest strukturalnie i funkcjonalnie podobna
do wankomycyny, ale jest bardziej aktywna w stosunku do enterokoków.

6. 3. 3. 2 Synteza poli-β-hydroksymaślanu

Kiedy zaczyna brakować niewęglowych składników odżywczych, wiele bakterii

tworzy wewnątrzkomórkowe granule poli-β-hydroksymaślanu (PHB). Są one
degradowane, gdy warunki wracają do normy. PHB służy więc jako zapas węgla
i/lub energii. Zwykle PHB (rys. 2. 3) jest syntetyzowany z acetylo-CoA poprzez
acetoacetylo-CoA i hydroksybutyrylo-CoA. Enzym polimeryzujący, syntetaza
PHB, występuje na powierzchni granul.
Synteza PHB została opisana w artykule przeglądowym o wytwarzaniu poli-
hydroksykwasów [Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13:
142-150].

6. 4 Metylotrofia u bakterii
Metylotrofia jest rodzajem metabolizmu tlenowego, który charakteryzuje się:
1) wykorzystywaniem (względnym lub bezwzględnym) pewnych związków jed-
nowęglowych (zwanych związkami C1) jako źródeł węgla i energii oraz 2) przy-
swajaniem formaldehydu, będącego produktem metabolizmu metylotroficz-
nego, jako głównego źródła węgla. Związki C1 wykorzystywane w metylotrofii
to metanol, metyloamina i metan. Niektóre bakterie metylotroficzne mogą wyko-
rzystywać grupy metylowe odłączone od pewnych większych cząsteczek. Do
metylotrofów (organizmów zdolnych do metylotrofii) zalicza się gatunki
należące do rodzaju Hyphomicrobium, Methylococcus, Methylomonas i Methylophi-
lus. Bakterie wykorzystujące tlenek węgla jako jedyne źródło węgla i energii (kar-
boksydobakterie — sekcja 6. 1. 3) były niegdyś zaliczane do metylotrofów, ale
zostały z nich wyłączone, gdyż nie wytwarzają/przyswajają formaldehydu.
Bezwzględny metylotrof Methylophilus methylotrophus był kiedyś hodowany
(na metanolu) na skalę przemysłową i wykorzystywany w żywieniu zwierząt.
Rokrocznie wytwarzano tysiące ton produktu o nazwie „Pruteen", dopóki cena
białka spożywczego nie spadła na tyle, że stało się to nieopłacalne.
Formaldehyd wytwarzany w czasie metabolizmu metylotrofów jest przyswa-
jany w szlaku rybulozomonofosforanowym (szlak RuMP, ang. ribulose mono-
phosphate pathway) lub szlaku serynowym. Oba są szlakami cyklicznymi.
W pierwszym formaldehyd łączy się z rybulozomonofosforanem, tworząc
heksulozo-6-fosforan. Następujące po tym reakcje regenerują cząsteczkę akcep-
tora (RuMP) i dostarczają pirogronianu do biosyntezy. W drugim szlaku formal-
dehyd łączy się z glicyną, tworząc serynę. W dalszych reakcjach dochodzi do
regeneracji glicyny, a 2-fosfoglicerynian bierze udział w biosyntezie.

104
 Bakteriami metanotroficznymi [artykuł przeglądowy: Hanson i Hanson
(1996) MR 60: 439-471] nazywamy takie metylotrofy, które są zdolne do wyko-
rzystania metanu jako jedynego źródła węgla i energii. Większość z nich to bez-
względne metanotrofy. Bakterie metanotroficzne, do których zalicza się gatunki
należące do Methylococcus i Methylomonas, występują np. w glebie, wodzie i osa-
dach. Wykorzystują one tlen (O2) i enzym monooksygenazę metanową (MMO,
ang. methane monooxygenase) do utleniania metanu do metanolu i wody. Dal-
sze utlenianie prowadzi do powstania formaldehydu, którego część jest przy-
swajana dzięki szlakowi RuMP lub serynowemu, a część jest utleniana do dwu-
tlenku węgla, z dostarczeniem energii, przy czym na ogół akceptorem elektro-
nów jest NAD lub NADP.
Utlenianie metanu przez metanotrofy w znaczący sposób wpływa na
globalny bilans metanu. Dzięki nim znacznie mniej tego gazu trafia do atmo-
sfery. Można więc powiedzieć, że metanotrofy mają swój udział w zapobiega-
niu globalnemu ociepleniu.
Ekologię gatunków metanotroficznych ostatnio badano metodami molekular-
nymi [Murrell i wsp. (1998) FEMSME 27: 1-3-114].
 ROZDZIAŁ

7
Biologia molekularna I
- geny i ich wyrażanie się

7. 1 Chromosomy i plazmidy
Chromosom (sekcja 2. 2. 1) składa się głównie z polimeru zwanego kwasem
deoksyrybonukleinowym (DNA, ang. deoxyribonucleic acid). DNA i pokrewny
polimer, kwas rybonukleinowy (RNA, ang. ribonucleic acid), należą do grupy
cząsteczek (kwasów nukleinowych), które mogą być nośnikami informacji. Infor-
macja jest zakodowana w sekwencji części składowych tych polimerów (tj. czte-
rech różnych nukleotydów). Chromosomowy DNA niesie całą informację nie-
zbędną do określenia zarówno struktury, jak i zachowania się bakterii.
DNA decyduje o życiu komórki dzięki kodowaniu wszystkich enzymów
(w tym kontrolujących strukturę i metabolizm) i różnych cząsteczek RNA (zaan-
gażowanych w syntezę białka i niektóre funkcje kontrolne). Informacja zawarta
w DNA reguluje oraz koordynuje wzrost i różnicowanie. Co więcej, DNA kon-
troluje własną replikację, jak również jest przykładem systemu zdolnego do
samokontroli — znane są różne mechanizmy wykrywające i reperujące znisz-
czony lub zmieniony DNA. Cała informacja przekazywana jest do komórek
potomnych podczas replikacji DNA i podziału komórki rodzicielskiej (sekcja
3. 2. 1). DNA w trakcie replikacji powiela się zazwyczaj bardzo dokładnie, tak że
cechy charakterystyczne dla gatunku nie zmieniają się w następnych genera-
cjach. Skłonność komórek potomnych do dziedziczenia cech rodzicielskich —
dziedziczność — jest głównym zainteresowaniem genetyki.
Wynika stąd, że kwas nukleinowy określa „normalne" życie komórki i dzie-
dziczność, obie te funkcje są tematem badań biologii molekularnej.
W większości bakterii długa cząsteczka DNA tworzy zamkniętą pętlę,
w innych (np. Borrelia burgdorferi i gatunki Streptomyces) DNA jest liniowy. Przy-
czyna tego nie jest znana.
Jak wiadomo, informacja niesiona przez DNA jest zakodowana w sekwencji
nukleotydów; dla niektórych gatunków znana jest obecnie całkowita sekwencja
nukleotydów w chromosomie — np. Escherichia coli [Blattner i wsp. (1997)
Science 277: 1453-1474], Helicobacter pylori [Tomb i wsp. (1997) Nature 388:

106
539-547], Borrelia burgdorferi [Fraser i wsp. (1997) Nature 390: 580-586] i Mycobac-
terium tuberculosis [Cole i wsp. (1998) Nature 393: 537-544].
Wiele bakterii oprócz chromosomu zawiera jeden lub więcej plazmidów.
Plazmidem nazywamy „dodatkowy" fragment DNA, zazwyczaj znacznie mniej-
szy od chromosomu, zdolny do niezależnej replikacji. Dużo, a nawet większość
plazmidów jest „kolistych" (tzn. są zamkniętą pętlą), ale niektóre z nich są
liniowe [patrz np. Hinnebusch i Tilly (1993) MM 10: 917-922]. Z tego powodu
niewłaściwa jest definicja plazmidów jako „małych cząsteczek kolistego DNA"
(spotykana w niektórych podręcznikach i publikacjach naukowych). Pewne
bakterie (np. B. burgdorferi) zawierają plazmidy koliste i liniowe.
Plazmidy mogą kodować różne funkcje. Niektóre kodują enzymy, inakty-
wujące poszczególne antybiotyki. Te tzw. plazmidy R (plazmidy opornościowe,
ang. resistance plasmids) sprawiają, że komórka staje się oporna na dany anty-
biotyk. Pewne plazmidy kodują elementy strukturalne — np. wakuole gazowe
(sekcja 2. 2. 5) w niektórych szczepach Halobacterium. Plazmid „Cit" koduje system
transportu (sekcja 5. 4) umożliwiający pobranie cytrynianu. Szczepy E. coli
zawierające ten plazmid mogą wykorzystywać cytrynian jako jedyne źródło
węgla i energii; zdolności tej nie mają zwykłe szczepy „dzikiego typu" E. coli.
(Pozostałe funkcje związane z obecnością plazmidów będą wspomniane
w innym miejscu książki. ) Mimo że plazmidy często kodują pożyteczne funkcje,
nie są zazwyczaj niezbędne dla komórki gospodarza.
Plazmidy są zwykle nieobecne w niektórych bezwzględnych patogenach
z podklasy alfa Proteobacteria (rys. 16. 5) — są jednak w innych bakteriach z tej
samej klasy (u tych, których byt związany jest z roślinami lub u zdolnych do
fotosyntezy). Przypuszcza się, że gatunki Anaplasma, Bartonella, Brucella i Rickett-
sia stały się bezplazmidowe, ponieważ ich względnie stałe (wewnątrzkomór-
kowe) środowisko nie wymaga genetycznej różnorodności niezbędnej dla gatun-
ków żyjących w bardziej zmiennych środowiskach [Moreno (1998) FEMSMR 22:
255-275], chociaż, na przykład, Chlamydia zawierają plazmidy [Thomas i wsp.
(1997) Microbiology 143: 1847-1854].
Niektóre (nie wszystkie) plazmidy kodują zdolność do samoprzenoszenia się
z jednej komórki do innej w procesie koniugacji (sekcja 8. 4. 2).
Plazmidy są powszechnie stosowane w biologicznych technikach związanych
z otrzymywaniem zrekombinowanego DNA (sekcja 8. 5).
Profagi (sekcja 9. 2), które nie integrują się z chromosomem gospodarza, ale
mają zdolność do replikacji, również nazywamy „plazmidami".

7. 2 Kwasy nukleinowe - struktura

Kwas nukleinowy jest polimerem złożonym z podjednostek zwanych nukleoty-
dami. Każdy nukleotyd ma trzy części: cząsteczkę cukru, zasadę azotową i grupę
fosforanową (rys. 7. 1). Nukleotydy zawierające cukier D-rybozę — rybonukleo-
tydy tworzą kwas rybonukleinowy (RNA), natomiast nukleotydy zawierające
2'-deoksy-D-rybozę to deoksyrybonukleotydy tworzące kwas deoksyrybonukle-
inowy (DNA) (rys. 7. 2). Zasada azotowa w każdym z nukleotydów jest albo
pochodną puryny, albo pirymidyny (rys. 7. 3). Rybonukleotyd może zawierać

107
adeninę, guaninę cytozynę lub uracyl. Deoksyrybonukleotyd może zawierać
adeninę, guaninę, cytozynę lub tyminę. Nazwy różnych nukleotydów i odpowia-
dających im nukleozydów zebrane są w tabeli 7. 1.

Cząsteczki te różnią się jedynie resztami cukru (rybozy), deoksyryboza nie ma atomu tlenu w pozycji
2'. (Cyfry 1, 2', itd. odnoszą się do pozycji atomu tlenu w cząsteczce rybozy). Zasadą może być ade-
nina, guanina lub cytozyna w każdej z dwóch cząsteczek, uracyl natomiast występuje jedynie w rybo-
nukleotydach, a tymina w deoksyrybonukleotydach. (W dideoksyrybonukleotydach, nie pokazanych
na schemacie, brak jest atomu tlenu w miejscach 2' i 3'. Dideoksyrybonukleotydy znajdują zastosowa-
nie np. w sekwencjonowaniu DNA — sekcja 8. 5. 6. ).

7. 2. 1 Kwas deoksyrybonukleinowy (DNA)

Nukleotydy tworzą w DNA nierozgałęziony łańcuch, w którym reszty cukier-
-zasada i reszty fosforanowe są połączone naprzemiennie (rys. 7. 4). Cechą charak-
terystyczną nici jest jej polarność: wyróżniamy koniec 5' i 3'. DNA zazwyczaj
jest złożony z dwóch nici połączonych wiązaniami wodorowymi utworzonymi
między zasadami azotowymi. Ta dwuniciowa struktura DNA nazywana jest
dupleksem (rys. 7. 5). Dwie nici w dupleksie mają przeciwną polarność, to zna-
czy, przyjmując kierunek od lewej do prawej (ryc. 7. 5), jedna nić ma polarność
5' do 3', a druga 3' do 5'.
Tworzenie wiązań wodorowych między zasadami azotowymi jest wybiórcze:
adenina tworzy parę z tyminą, a guanina z cytozyną (rys. 7. 6). Specyficzność
tworzenia się par zasad oznacza, że każda zasada w parze ma swojego komple-
mentarnego partnera, a zatem, każda nić DNA w dupleksie jest komplementarna
do drugiej nici.

108
Adenina i guanina są purynami zawierającymi podstawniki, inne zasady to pirymidyny. Tymina
występuje tylko w DNA, a uracyl tylko w RNA; adenina, guanina i cytozyna znajdują się zarówno
w DNA, jak i RNA. W nukleotydzie (rys. 7. 2) puryna w miejscu 9 połączona jest z cząsteczką cukru,
pirymidyna łączy się z cukrem w pozycji 1.

109
 Przypominający drabinę dupleks DNA tworzy helisę (rys. 7. 7), gdzie
odległość między poszczególnymi skrętami wynosi około 10 par zasad (10 pz).
Budowa takiej podwójnej helisy została przedstawiona przez Watsona i Cricka
w 1950 roku.
Wartością, w której podaje się długość dupleksu, jest zazwyczaj liczba
nukleotydów w jednej nici. Możliwe jest również określanie długości jako liczby
par zasad w dupleksie, ponieważ każdy nukleotyd w jakiejkolwiek nici odpo-
wiada połowie jednej pary zasad w dupleksie. Długość DNA chromosomu Esche-
richia coli wynosi około 4, 7 miliona par zasad, H. pylori — 1 , 7 miliona pz, M. tuber-
culosis 4, 4 miliona pz. Długość (liniowego) DNA B. burgdorfeiri wynosi tylko
900 000 pz.

(a) Cytozyna (na lewo) tworzy pary z guaniną (na prawo), (b) Tymina (na lewo) paruje się z adeniną
(na prawo). (Uwaga: W RNA (sekcja 7. 5) adenina tworzy pary z uracylem). Linie kropkowane
oznaczają wiązania wodorowe.

110
 Dupleks DNA w większości bakteryjnych chromosomów tworzy zamkniętą
pętlę (tzn. nie ma wolnych końców 5' i 3')· Taki DNA nazywamy kowalencyjnie
zamkniętym kolistym DNA (cccDNA, ang. covalently closed circular). Kolisty
dupleks może istnieć w różnych formach. Zrelaksowana pętla DNA teoretycznie
może leżeć w jednej płaszczyźnie jak gumowa wstążka na stole. Załóżmy jednak,
że pętla jest przecięta, a przed ponownym połączeniem się końców jeden z nich
uległ skręceniu, drugi zaś nie. Taka sytuacja może prowadzić do zwiększenia lub
zmniejszenia liczby skrętów helisy (i powstania helisy nadmiernie lub niedosta-
tecznie skręconej, zależnie od kierunku skręcenia). W takiej cząsteczce istnieje
duże naprężenie powodujące skłonność do utworzenia skrętu umożliwiającego
rozluźnienie naprężeń cząsteczki. W celu usunięcia naprężeń cała cząsteczka
skręca się, a oś helisy staje się helikalna, to znaczy cała helisa zwija się tworząc
helisę! Mówimy, że taka cząsteczka jest superzwinięta.
Naturalnie występujący DNA jest zazwyczaj „niedostatecznie zwinięty"
(tzn. negatywnie superzwinięty). Stopień superzwinięcia regulują enzymy
zwane topoizomerazami. W Escherichia coli ogólny stopień superzwinięcia zależy
od przeciwstawnego działania dwóch enzymów: topoizomerazy II (=gyrazy)
prowadzącej do negatywnego superskręcenia i topoizomerazy I, która temu
zapobiega. (Gyraza stanowi cel działania niektórych antybiotyków: sekcja 15. 4. 6,
patrz również Ccd w sekcji 7. 3. 1. ) Na superzwinięcie mają również wpływ czyn-
niki środowiska regulujące stan energetyczny komórki. Mechanizm tej zależno-
ści nie jest jeszcze znany, choć przyjmuje się, że może tu odgrywać rolę wpływ
środowiska na wewnątrzkomórkowe stężenie ATP, wiadomo bowiem, że aktyw-
ność gyrazy zależy od stosunku ATP: ADP. Normalny wzrost jest możliwy jedy-
nie w ograniczonym przedziale superzwinięcia DNA.

111
 Topoizomerazy III i IV mogą razem z gyrazą odgrywać rolę w dekatenacji
chromosomów (sekcja 3. 2. 1).
[Control of bacterial supercoiling: Drlica (1992) MM 6: 425-433. ]

7. 2. 1. 1 PNA (peptydowy kwas nukleinowy, ang. peptide nucleic acid)

PNA jest analogiem DNA, w którym łańcuchy będące szkieletem polimeru są
zmodyfikowanymi polipeptydami (a więc nie są zbudowane z jednostek cukro-
wo-fosforanowych). PNA może hybrydyzować, z utworzeniem helikalnego dup-
leksu podobnego do DNA [Witting i wsp. (1994) Nature 368: 561-563]. Cząstecz-
ka ta może mieć znaczenie ewolucyjne. Sugeruje się, że kwasy nukleinowe ist-
niejące przed powstaniem życia niekoniecznie musiały mieć szkielet cukrowo-
-fosforanowy (patrz również sekcja 8. 5. 15).

7. 2. 2 Kwas rybonukleinowy (RNA)

RNA jest liniowym polimerem złożonym z rybonukleotydów (rys. 7. 4). Rybonu-
kleotydy zawierają przeważnie adeninę, guaninę, cytozynę lub uracyl, jednak
mogą w nich również występować zmodyfikowane zasady. Bakteryjny RNA (w
przeciwieństwie do DNA) jest zazwyczaj jednoniciowy. Istnieją jednak regiony
dwuniciowe powstałe w wyniku tworzenia się par między komplementarnymi
zasadami obecnymi w różnych odcinkach tej samej cząsteczki RNA. W ten spo-
sób powstają struktury trójwymiarowe. Ważną rolę w powstaniu i aktywności
takich struktur odgrywają zazwyczaj jony metali (szczególnie Mg+2). Niektóre
z funkcji pełnionych przez RNA omówiono skrótowo w sekcji 7. 9.

7. 3 Replikacja DNA
Jak wspomniano poprzednio, sekwencja zasad w chromosomowym DNA koduje
informację określającą strukturę komórki i jej zachowanie. Przed podziałem
komórkowym DNA musi być precyzyjnie podwojony, tak aby każda komórka
potomna mogła otrzymać dokładną kopię (replikę) cząsteczki rodzicielskiej.
Synteza DNA (replikacja) jest procesem skomplikowanym. Niżej przedsta-
wiono jedynie zarys typowej replikacji chromosomu E. coli podczas cyklu
komórkowego.
Co jest sygnałem do rozpoczęcia (inicjacji) rundy replikacji DNA? Tego nie
wiemy (patrz sekcja 3. 2. 1). Wiadomo jednak, że runda replikacji rozpoczyna się
w określonym regionie dwuniciowej cząsteczki DNA, zwanym origin (oriC),
i wymaga wielu różnych białek, poza tym DNA musi być superzwinięty.
Duża liczba cząsteczek białka DnaA (prawdopodobnie jako DnaA ATP)
wiąże się do specyficznych miejsc (sekwencji wiążących DnaA) w obrębie sek-
wencji oriC, indukując miejscowe „topnienie" DNA (tj. rozdzielenie nici DNA)
w części przylegającej do oriC. W zdenaturowanym regionie jednoniciowy DNA
może być stabilizowany przez przyłączenie tzw. białek wiążących jednoniciowy
DNA (białek SSB, ang. single-strand binding). Mimo że rozdzielenie nici jest

112
pierwszym ważnym zdarzeniem replikacyjnym, replikacja z pewnością nie
zaczyna się w tym zdenaturowanym regionie. Wydaje się, że rozpoczyna się ona
w części oriC zawierającej sekwencje wiążące DnaA. Nie wiadomo, w jaki sposób
następuje rozdzielenie się nici dokładnie w miejscu początku replikacji. Być
może, ma w tym udział wiązanie białka DnaA w tym i w sąsiednich miejscach.
Inna teoria przyjmuje, że transkrypcja (sekcja 7. 5) powoduje przejściową denatu-
rację dupleksu DNA we właściwym punkcie regionu oriC. Rzeczywiście, polime-
raza RNA (sekcja 7. 5) konieczna jest do inicjacji replikacji DNA.
Jednym z czynników istotnych dla inicjacji replikacji DNA jest białko Fis (pro-
dukt genu fis). Fis ma kilka miejsc wiązania w oriC, znajdujących się niedaleko
miejsc wiążących DnaA, jak również pełni rolę w regulacji zgrupowania genów
(dnaA-dnaN-recF) [Froelich, Phuong i Zyskind (1996) JB 178: 6006-6012], do któ-
rych produktów należy białko DnaA i podjednostka β polimerazy DNA III
(rys. 7. 8b). Fis wiąże się z oriC w sposób zależny od cyklu komórkowego [Clas-
ser, Grimwade i Leonard (1995) EMBO Journal 14: 5833-5841] i wydaje się, że
bierze udział w tworzeniu kompleksu zapobiegającego replikacji [Wold, Crooke
i Sharstad (1996) NAR 24: 3527-3532] oraz wywiera słaby wpływ na promotor
dnaAp2. Nieznany jest mechanizm, według którego białko Fis reguluje inicjację
replikacji DNA.
Po rozpoczęciu replikacji, wskutek rozdzielenia się nici DNA, tworzą się dwa
widełki replikacyjne. Z każdymi widełkami połączony jest prymosom — komp-
leks białkowy złożony z DnaB i DnaG.
W jednej ze zdenaturowanych nici DNA, zasady odsłonięte wskutek roz-
działu nici tworzą pary z komplementarnymi zasadami w cząsteczkach trifosfo-
ranów rybonukleozydów, następnie zachodzi enzymatyczna polimeryzacja
rybonukleotydów (ich kowalencyjne połączenie) w kierunku 5' do 3', pro-
wadząc do utworzenia krótkiej nici RNA — startera (rys. 7. 8a, górna część).
W tym procesie dwie końcowe grupy fosforanowe są odcinane, a reakcja ta
dostarcza energii koniecznej do polimeryzacji. Nie wiadomo, czy polimeryzacja
RNA zachodzi pod wpływem działania białka DnaG (prymazy), czy polimerazy
RNA; oba te enzymy zdolne są do syntezy RNA.
Startery tworzą jedną z nici krótkich hybrydowych dupleksów RNA/DNA
(rys. 7. 8a, górna część). W trakcie dalszego rozdziału nici, nowo odsłonięte
zasady tworzą pary z cząsteczkami trifosforanów deoksyrybonukleotydów
i w ten sposób starter zostaje wydłużony w kierunku 5' do 3' przez nową nić
DNA. Na skutek tej polimeryzacji, którą katalizuje enzym polimeraza DNA III,
tworzy się początek tzw. nici wiodącej DNA (rys. 7. 8a, górna część). Trzeba
zauważyć, że nić wiodąca wraz z jedną z nici pierwotnego dupleksu stanowią
początkową część nowego dupleksu. Nić oryginalna określa sekwencje zasad
w nowej nici i dlatego nazywana jest nicią matrycową.
Aktywność polimeryzacyjna polimerazy DNA III wymaga startera RNA,
ponieważ polimeraza DNA nie może rozpocząć syntezy nici — może jedynie
wydłużyć nić już istniejącą.
Białko DnaB zawarte w każdym prymosomie jest helikazą — enzymem,
który w obecności gyrazy (sekcja 7. 2. 1) i ATP rozwija DNA, tj. rozdziela dwie
nici dupleksu (działając jak zamek błyskawiczny). W ten sposób dwa widełki
replikacyjne poruszają się w przeciwnych kierunkach oddalając się od oriC.

113
(a) Kolisty dupleks DNA rozdziela się miejscowo na dwie nici. Schemat przedstawia tylko połowę
rozdzielonego regionu. Rozdział nici postępuje w kierunku od lewej do prawej (w pokazanej
połowie). Na jednej z odsłoniętych nici (górnej na schemacie) syntetyzowany jest starter RNA (objaś-
nienie w tekście), późniejsze dodanie deoksyrybonukleotydów prowadzi do wytworzenia „wio-
dącej" nici DNA, która jest syntetyzowana w kierunku 5' do 3'. Na drugiej nici (dolnej na schemacie)
pierwszy starter RNA jest rozciągany przez fragment DNA (fragment Okazaki) również w kierunku
5' do 3' (wiadomo, że synteza DNA nie może zachodzić w kierunku 3' do 5'). Drugi starter jest two-
rzony i następny fragment jest syntetyzowany dopiero po dalszym rozdziale dupleksu. (Wszystkie
startery zostają później zastąpione przez DNA). Region zaznaczony kółkiem (widełki replikacyjne)
przesuwa się na prawo w trakcie replikacji, drugie widełki replikacyjne (nie pokazane na schemacie)
przesuwają się na lewo.

114
W temperaturze 37°C widełki replikacyjne poruszają się z prędkością 1000 nu-
kleotydów na sekundę.
Jak dotychczas, nasze rozważania dotyczyły tylko tej nici dupleksu, która
służyła jako matryca nici wiodącej. A co z drugą nicią? Ona również jest matrycą.
Zważywszy jednak, że dwie nici dupleksu mają przeciwną polarność, a DNA
może być syntetyzowany jedynie w kierunku 5' do 3', kierunek syntezy DNA
na tej nici matrycowej jest przeciwny do kierunku syntezy na drugiej nici
(rys. 7. 8a, dolna część). Rzeczywiście, nowa nić DNA (nić „opóźniona") jest syn-
tetyzowana jako zbiór krótkich fragmentów (fragmentów Okazaki) w sposób
opisany niżej. Kiedy obszar zdenaturowany w dupleksie DNA osiągnie pewną
długość, białko DnaG (prymaza) syntetyzuje pierwszy starter RNA w pobliżu
widełek replikacyjnych. Starter ten jest następnie wydłużany przez polimeryza-
cję deoksyrybonukleotydów w kierunku 5' do 3', co prowadzi do utworzenia
pierwszego fragmentu nowej, opóźnionej nici (rys. 7. 8a, dolna część). Podczas
dalszego rozdziału nici tworzony jest drugi starter, następnie drugi fragment
jest syntetyzowany, i tak dalej. Każdy fragment Okazaki ma długość około
2000 zasad (2 tys. zasad).
Koordynację syntezy dwóch nici, wiodącej i opóźnionej, oraz dużą szybkość
syntezy DNA zapewnia: fizyczne połączenie między dwiema cząsteczkami poli-
merazy DNA i powiązanie między polimerazami a helikazą — utrata wzajem-
nych powiązań prowadzi do bardzo dużego obniżenia aktywności helikazy [Kim
i wsp. (1996) Cell 84: 643-650]. Jeden ze schematów widełek replikacyjnych
pokazany jest na rysunku 7. 8(b). Należy zauważyć, że helikaza (rozwijająca dup-
leks) jest heksamerem (ma strukturę pierścienia złożoną z sześciu cząsteczek
białka DnaB) [West (1996) Cell 86: 177-180]. Na rysunku pokazano, że obie nici
dupleksu przechodzą przez pierścień helikazy, w rzeczywistości nie wiadomo,
czy przechodzą dwie, czy tylko jedna nić.
Dwa widełki replikacyjne poruszające się w przeciwnych kierunkach spoty-
kają się w miejscu chromosomu ter położonym w odległości 180° od oriC. Zanim
replikacja zostanie zakończona, wszystkie startery są zastąpione przez DNA.
W wyniku replikacji powstają dwa superzwinięte dupleksy DNA tworzące kate-
nat (sekcja 3. 2. 1).
Replikacja jest semikonserwatywna, ponieważ każdy dupleks DNA składa
się z jednej nici pochodzącej z poprzedniego (rodzicielskiego) dupleksu i z jednej
nowej (potomnej) nici.

(b) Schemat widełek replikacyjnych (skala nieprzestrzegana). Dwie cząsteczki polimerazy (jedna
syntetyzująca nić ciągłą, a druga nic opóźnioną) pracują w przeciwnych kierunkach i są połączone
ze sobą podjednostkami r. Pokazano również połączenia polimeraza-helikaza (helikaza jest
heksamerem złożonym z sześciu cząsteczek białka DnaB). Jednoniciowy DNA chroniony jest
przez białka wiążące jednoniciowy DNA (SSBs, ang. single-strand binding proteins) zanim
posłużą jako matryca do syntezy nici opóźnionej. Zacisk β (β jest podjednostką polimerazy DNA,
produktem genu dnaN) wpływa na procesywność, tj. połączenie aktywności z przesuwaniem się
polimerazy.
Rysunek (b) pochodzący z Cell (1996) 86: 177-180 mógł być zamieszczony dzięki uprzejmości
dr. Stephena C. Westa, Imperial Cancer Research Fund, UK, za pozwoleniem Cell Press, Cambridge
MA 0002138, USA.

115
 Inne sposoby replikacji DNA. Replikacja opisana w poprzedniej sekcji jest
typową replikacją chromosomu E. coli. Należy jednak podkreślić, że istnieją inne
sposoby replikacji. Nawet w E. coli, w pewnych warunkach, replikacja chromo-
somu może zachodzić według innego mechanizmu. Na przykład, po zainduko-
waniu systemu SOS, w komórkach zachodzi indukowana, stabilna replikacja
DNA (iSDR, ang. inducible, stable DNA replication), która zaczyna się w innym
origin (oriMs) i nie zależy od białka DnaA [Asai i Kogoma (1994) JB 176:
1807-1812].
Pewne bakterie mają liniowe chromosomy (i liniowe plazmidy), których
replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi z origin położonego wewnątrz cząste-
czki DNA. Przy założeniu, że synteza DNA odbywa się zawsze w kierunku 5' do
3' (rys. 7. 8), powstaje pytanie, dlaczego po replikacji nie zostają jednoniciowe
końce 3'matrycowej nici? Istnieje kilka modeli wyjaśniających możliwość repli-
kacji tych końców [patrz Chen (1996) TIG 12: 192-196]. Dwa z nich sugerują, że
koniec 3' nici matrycowej owija się wokół siebie i tworzy strukturę dwuniciową
wyznaczającą miejsce startu replikacji. Inny model zakłada, że nowa nić znaj-
dująca się w tworzącym dupleks końcu cząsteczki usuwa 5'-końcową sekwencję
nukleotydów matrycy, która jest następnie przenoszona na (komplementarny)
jednoniciowy DNA znajdujący się na drugim, potomnym dupleksie (w ten spo-
sób wypełniona jest jednoniciowa luka).
W genomie faga (tab. 9. 1) zbudowanym z liniowego dsDNA znajduje się
białko kowalencyjnie związane z każdym z końców 5' dupleksu (TP, ang. termi-
nal protein). W zakażonej komórce replikacja DNA fagowego rozpoczyna się
w dwóch końcach dupleksu. Kodowana przez faga polimeraza DNA wiąże się
z wolną cząsteczką kodowanego przez faga białka TP, a następnie kompleks ten
zostaje umiejscowiony na końcu 3' każdej nici, w czym prawdopodobnie bierze
udział jego wzajemne oddziaływanie z TP związanym w przyległym końcu 5'.
Polimeraza tworzy kowalencyjne wiązanie między dAMP (tab. 7. 1) a związanym
z DNA białkiem TP, co pozwala na rozpoczęcie syntezy nici DNA w kierunku
5' do 3', poczynając od tego początkowego nukleotydu. Replikacyjny starter (TP)
i polimeraza rozdzielają się po spolimeryzowaniu dziesięciu nukleotydów,
białko TP zostaje kowalencyjnie związane z końcem 5' nowej nici, a polimeraza
nadal wydłuża krótki starter DNA. Taka inicjacja z udziałem białka jest tylko
jedną ze strategii spotykanych w replikacji genomów liniowych. Genomy te nie
mogą być replikowane z użyciem starterów zbudowanych z RNA (jak na
rys. 7. 8), ponieważ ich usuwanie prowadziłoby do powstania jednoniciowych
odcinków DNA na końcach dupleksu. [Protein priming of DNA replication in
phage : Mendez, Blanco i Salas (1997) EMBO Journal 16: 2519-2527].
Mechanizm toczącego się koła jest spotykany w replikacji niektórych fagów,
np. M13 (sekcja 9. 2. 2), λ (rys. 9. 2) i ΦΧ174 oraz różnych plazmidów (sekcja 7. 3. 1).

7. 3. 1 Replikacja DNA plazmidowego

Plazmidy kontrolują własną replikację, jednak do syntezy każdego białka kodo-
wanego przez plazmid i związanego z jego replikacją potrzebny jest aparat bio-
syntetyczny komórki.

116
 Szybkość replikacji zależy od szybkości jej inicjacji, ta zaś jest kontrolowana
w różny sposób przez różne plazmidy. W plazmidzie ColEl, na przykład, kont-
rola jest związana z syntezą dwóch wolnych (nie połączonych ze sobą) nici RNA
kodowanego przez plazmid. Jedna z nich (RNA II) może wiązać się z plazmido-
wym origin i pełnić rolę startera, co umożliwia replikację. Inna nić (RNA I) może
temu przeszkadzać przez tworzenie par zasad z RNA II. Wynik oddziaływań
RNA I-RNAII decyduje o zajściu replikacji. A więc w plazmidzie ColEl inicjacja
jest kontrolowana na poziomie startera (patrz również sekcja 7. 6. 1). Rozpoczęta
replikacja plazmidu ColEl przypomina replikację chromosomu (patrz wyżej),
chociaż przebiega w jednym kierunku od miejsca origin.
Wiele małych plazmidów bakterii gramdodatnich (jak również niektóre plaz-
midy bakterii gramujemnych) replikują się według mechanizmu toczącego się
koła (rys. 8. 5). Replikacja rozpoczyna się przecięciem określonej nici w miejscu
origin przez białko Rep kodowane przez plazmid, w ten sposób tworzy się
koniec 3' niezbędny do syntezy DNA. Podczas jednej rundy replikacyjnej
powstaje jeden komplementarny plazmid dsDNA i jego kolista kopia ssDŃA,
która następnie replikuje się do formy dsDNA, korzystając ze startera RNA.
Istnieją różne sposoby kontroli inicjacji. Wzrost ilości białka Rep powoduje
zwiększenie replikacji, a więc replikacja może być kontrolowana przez regulację
syntezy i/albo aktywności Rep. W niektórych wypadkach małe, kodowane przez
plazmidy, cząsteczki RNA (transkrypt syntetyzowany z komplementarnej nici,
ctRNA — ang. countertranscript RNA) wiążą się z rep mRNA i prowadzą do
przedwczesnej terminacji transkryptu bądź do zahamowania translacji genu rep.
Inny mechanizm zakłada, że białko Rep jest inaktywowane już po jednorazo-
wym wykorzystaniu, przez związanie krótkiego oligonukleotydy kodowanego
przez plazmid. [Replication control in rolling circle plasmids: Rasooly i Rasooly
(1997) TIM 5: 440-446].
W wielu plazmidach bakterii gramujemnych białko inicjacyjne Rep wiąże się
do „prostych powtórzeń" sekwencji nukleotydowej (iteronów) w regionie origin
replikacji plazmidu, prowadząc do utworzenia kompleksu nukleoproteinowego,
który inicjuje replikację. RepE (białko E) pełni tę funkcję w plazmidzie F (którego
replikacja jest dwukierunkowa i zachodzi według mechanizmu „typu Cairnsa",
rys. 7. 8). W plazmidzie tym iterony mają określoną liczbę, rozmieszczenie i skład.
W niektórych plazmidach, Rep może również hamować własną transkrypcję
przez związanie się do odwróconych powtórzeń sekwencji, które zachodzą na
promotor. W kilku przypadkach (również w plazmidzie F) wykazano, że pod-
czas gdy monomery Rep wiążą się z iteronami (pobudzając replikację), dimery
wiążą się do promotorów własnych genów (hamując w ten sposób replikację).
Badania inicjacyjnego białka RepA plazmidu pSC10 Pseudomonas zasugerowały
model aktywacji tego typu białek Rep. Model postuluje, że dysocjacja dimerów
prowadzi do powstania monomerów, które mogą wiązać się z iteronami, a to sta-
nowi strukturalną podstawę aktywacji inicjacyjnych białek Rep [Giraldo, Andren
i Diaz-Orejas (1998) EMBO Journal 17: 4511-4526].
Zrozumienie zasad kontroli replikacji danego plazmidu wymaga informacji,
czy cząsteczki kontrolne są syntetyzowane ciągle czy okresowo, jak ich syn-
teza/aktywność są regulowane i jakie inne czynniki/cząsteczki biorą udział
w tym procesie. Ogólnie, replikacja plazmidów (i ich rozdział do komórek po-

117
tomnych podczas podziału komórkowego) zależą prawdopodobnie od pewnych
powiązań między plazmidem a błoną cytoplazmatyczną [Firshein i Kim (1997)
MM 23: 1-10. ]
W bakteriach liczba cząsteczek określonego plazmidu przypadająca na chro-
mosom nazywana jest liczbą kopii. Niektóre plazmidy (np. F lub R6) mają liczbę
kopii 1-2, dla innych plazmidów („wielokopiowych", takich jak ColEl lub R6K)
liczba ta wynosi 10-30. (Na liczbę kopii plazmidu mają wpływ mutacje — patrz
np. sekcja 7. 6. 1. )
Liczba kopii zależy od systemu kontroli replikacji plazmidu, szczepu bakte-
ryjnego i warunków wzrostu. Niektóre plazmidy mają własne mechanizmy
zapewniające ich stabilne utrzymywanie się w komórkach. Na przykład, plaz-
mid F koduje dwa białka, CcdB i CcdA. Białko CcdB jest toksyną (powodującą
śmierć komórki), która jest neutralizowana przez CcdA stanowiące antidotum.
Toksyna jest trwała, ale antidotum ulega stopniowemu rozkładowi przez prote-
azę Lon gospodarza. W związku z tym, po podziale komórkowym, każda
komórka bez plazmidu F będzie zabita. CcdB hamuje bakteryjną gyrazę (sekcja
7. 2. 1). Więcej informacji o operonie ccd można znaleźć w pracy Couturier,
Bahassi i van Melderena (1998) TIM 6: 269-275. ]

7. 3. 1. 1 Ścisła i zrelaksowana kontrola replikacji plazmidów

Niektóre plazmidy (np. plazmid F) nie replikują się, jeśli do komórki gospodarza
dodamy antybiotyk (np. chloramfenikol), który hamuje syntezę białka. Mówi się,
że replikacja takich plazmidów jest pod ścisłą kontrolą. Inne plazmidy (np.
ColEl) mogą się replikować w tych warunkach i osiągnąć liczbę kopii znacznie
przewyższającą ich liczbę naturalną. Replikacja takich plazmidów jest pod kon-
trolą zrelaksowaną.

7. 4 Modyfikacja i restrykcja DNA

U wielu (może wszystkich) bakterii po replikacji DNA następuje modyfikacja
DNA. Polega ona na modyfikacji niektórych zasad w określonych sekwencjach
nukleotydów, w każdej z nowo syntetyzowanych nici. W sekwencjach tych
grupa metylowa (-CH3) dodawana jest w pozycji N-6 adeniny i/lub w pozycji
C-5 cytozyny (pozycje pokazane są na rys. 7. 3). Modyfikacja zachodzi za pośred-
nictwem specjalnych enzymów, metylotransferaz (= „metylaz"), dla których
źródłem grup metylowych jest np. S-adenozylometionina.
W jakim celu DNA jest metylowany? Metylacja chroni DNA komórki przed
własnymi endonukleazami restrykcyjnymi (REs, ang. restriction endonucleases)
— enzymami przecinającymi każdy DNA, który nie jest metylowany we właści-
wej sekwencji nukleotydów. Dupleks DNA nie jest cięty, jeśli choć jedna nić jest
metylowaną. Bezpośrednio po replikacji nowo syntetyzowana (niemetylowana)
nić potomna jest zazwyczaj chroniona przed restrykcją przez (metylowaną) nić
matrycową aż do momentu jej własnej metylacji.
U różnych szczepów bakterii są metylowane inne sekwencje nukleotydów.
W ten sposób każdy szczep ma swoje, właściwe dla niego metylazy i restryktazy,

118
z których każda rozpoznaje określoną sekwencję nukleotydów. Na przykład,
w E. coli metylaza EcoRI metyluje wybiórczo resztę adeniny
CH 3

5'-GAATTC-3'
podczas, gdy restryktaza EcoRI przecina (niemetylowaną) nić w pozycji:
5'-G|AATTC-3'
gdzie „ |" oznacza cięcie. Warto zauważyć, że w przytoczonym przykładzie nić
komplementarna jest cięta następująco: 3'-CTTAA |G-5'. Wynikiem jest przesu-
nięte cięcie, co znaczy, że każdy z końców przeciętego dupleksu ma region jed-
noniciowy (w tym wypadku 5'-AATT) (patrz rys. 8. 11). (Patrz również metylacja
Dam: sekcja 7. 8. 8. )
Wiele szczepów bakteryjnych ma więcej niż jeden typ metylaz i restryktaz.
Sekwencja, którą rozpoznaje dana metylaza, nazywa się sekwencją rozpoz-
nawaną. Większość restryktaz może być zaklasyfikowana do typu I, II lub III na
podstawie wzajemnych relacji między sekwencją rozpoznawaną a miejscem cię-
cia. Na przykład, restryktazy należące do typu I przecinają DNA w miejscach
przypadkowych, oddalonych od sekwencji rozpoznawanych, natomiast typ II
restryktaz przecina między określonymi parami zasad w obrębie rozpoznawanej
sekwencji.
Stosunkowo niedawno odkryto nowy typ enzymów restrykcyjnych. Enzymy
te przecinają DNA z przesunięciem względem sekwencji rozpoznawanej
w dwóch miejscach otaczających tę sekwencję. W ten sposób zostaje wycięty
mały kawałek DNA zawierający sekwencję rozpoznawaną. Do swojej aktywno-
ści enzymy te wymagają Mg +2 i S-adenozylometioniny. Nowy enzym należący
do tej rodziny został opisany przez Searsa i wsp. [(1996) NAR 24: 3590-3592] —
Bael (z Bacillus sphaericus), którego wzory cięcia przedstawiono na rysunku 8. 11.
Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych obrazuje następujący przykład.
EcoRI: enzym z Escherichia coli, szczep R, „I" oznacza określony (z kilku ist-
niejących) enzym ze szczepu R. Inne przykłady restryktaz są podane w tabeli 8. 1.
Jaki jest cel restrykcji? Główna jej rola polega na ochronie komórki przed
„obcym", szczególne fagowym DNA wchodzącym do komórki [artykuł
przeglądowy o restrykcji: Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Mechanizm ten
czasami zawodzi w ochronie przeciwko fagom: patrz sekcja 9. 6. Co więcej, anty-
restrykcyjne białka (białka chroniące przed restrykcją) są kodowane przez
niektóre plazmidy [Belogurov, Delver i Rodzevich (1992) JB 174: 5079-5085].
Mogą one chronić komórki biorcy przed restrykcją podczas procesu koniugacji.
„Antyrestrykcja" ważna jest również w procesie koniugacyjnej transpozycji
(sekcja 8. 4. 2. 3).
„Nietypowe" sposoby restrykcji. Niektóre restryktazy działają dopiero po
jednoczesnym związaniu się do dwóch sekwencji rozpoznawanych, które nieko-
niecznie muszą się znajdować w jednej cząsteczce DNA. (Potrzeba związania się
w dwóch miejscach przypomina wymagania enzymów koniecznych do rekombi-
nacji zlokalizowanej — sekcja 8. 2. 2. )

119
 Restryktaza DpnI ze Streptococcus (nieprawidłowa nazwa Diplococcus) pneu-
moniae jest przykładem enzymu przecinającego jedynie miejsce zmetylowane,
a więc jest restryktazą zależną od metylacji (w przeciwieństwie do enzymów opi-
sanych wyżej). DpnI przecina sekwencję 5'-GATC-3' między A i Τ tylko wtedy,
jeśli adenina jest metylowana.
Restrykcja i modyfikacja w technologii rekombinowanego DNA. Typ II
restryktaz (wymagających Mg+2, ale nie ATP) znajduje powszechne zastosowa-
nie w przecinaniu DNA w określonych miejscach (sekcja 8. 5. 1. 3).

7. 5 Synteza RNA - transkrypcja

W komórce funkcje kodowane przez DNA są przenoszone na różne typy cząste-
czek RNA kopiowanych (transkrybowanych) z DNA.
Rybosomowy RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów (sekcja
2. 2. 3), małych organelli, na których są syntetyzowane białka. Do syntezy białek
są również konieczne inne rodzaje RNA. Synteza białka komórkowego wymaga
uprzedniego kopiowania genu, tj. sekwencji kodującej to białko, na jednoniciowy
RNA. Powstałą nić nazywamy informacyjnym RNA (mRNA, ang. messenger
RNA), ponieważ jest ona nośnikiem informacji zapisanej w genie. W syntezie
białka bierze również udział transportujący RNA (tRNA, ang. transfer RNA),
który jest nośnikiem aminokwasów i umożliwia ich polimeryzację w sposób
określony przez RNA (sekcja 7. 6).
Inne typy cząsteczek RNA pełnią specyficzne funkcje kontrolne. Cząsteczka
antysensownego RNA może np. hamować aktywność innych cząsteczek kwasu
nukleinowego po przyłączeniu się do swojej komplementarnej sekwencji (patrz
np. RNA I w sekcji 7. 3. 1).
Transkrypcja genu. RNA jest kopiowany z DNA na drodze kolejnego tworzenia
się par zasad między pojedynczymi rybonukleotydami a odsłoniętymi zasadami
na jednoniciowej matrycy DNA. Rybonukleotydy są polimeryzowane w kierunku
5'do 3'. Podobnie jak w syntezie DNA, trifosforany nukleozydów tworzą pary
z nicią matrycową, a dwie końcowe grupy fosforanowe zostają odcięte w reakcji
dostarczającej energii do polimeryzacji. Podczas polimeryzacji adenina tworzy
parę z uracylem, lecz nie z tyminą. Synteza RNA na matrycy DNA nazywa się
transkrypcją, zaś produkt, którym jest jednoniciowy RNA — transkryptem.
Polimeryzację rybonukleotydów przeprowadza enzym, polimeraza RNA.
Transkrypcja genu wymaga, aby polimeraza związała się ze specyficzną sek-
wencją nukleotydów, promotorem, w dwuniciowym DNA na początku genu.
Zazwyczaj w obrębie tej sekwencji znajduje się miejsce startu, czyli pierwszy
nukleotyd rozpoczynający transkrypcję, którego pozycja określana jest jako +1.
Nukleotydy leżące „za" nim są numerowane +2, +3... itp. (Nukleotydy leżące
w przeciwnym kierunku, tzn. „przed" transkryptem, numerowane są - 1 , -2, -3
itp. ). W komórce mogą się znajdować różne typy (klasy) promotorów dla róż-
nych genów, różnice w sekwencji promotorów obserwuje się nawet w obrębie
tej samej klasy. Miejsce +1 jest wygodnym punktem odniesienia do określenia
pewnych regionów w sekwencji promotora, które są ważne dla oddziaływań

120
z polimerazą RNA. W najczęściej występującym typie promotorów E. coli są to
regiony: 1) sześcionukleotydowa sekwencja najwyższej zgodności (consensus)
TATAAT, której środek znajduje się w lub blisko nukleotydu -10, 2) druga sek-
wencja consensus TTGACA ze środkiem w lub blisko nukleotydu -35, 3) odcinek
oddzielający te sekwencje i 4) bogate w pary AT miejsce poprzedzające te
regiony (element UP, ang. upstream element) między nukleotydami -40 a -60.
(Sekwencja consensus jest teoretyczną „typową" sekwencją nukleotydów, w któ-
rej każdy nukleotyd występuje w danym miejscu częściej niż trzy inne. Została
opracowana przez analizę różnych, występujących w naturze sekwencji
tego typu.
Można przyjąć, że im mniej różnią się heksamery -10 i -35 od swoich sek-
wencji consensus, tym „silniejszy" jest promotor, a zatem bardziej aktywny lub
funkcjonalny jest gen.
Przed przyłączeniem się do promotora polimeraza RNA musi wcześniej
związać inne białko zwane czynnikiem sigma. Komórka koduje więcej niż jeden
typ czynników sigma, które umożliwiają polimerazie wiązanie się z promoto-
rami różnych klas. W E. coli polimeraza RNA z czynnikiem σ70 może rozpocząć
transkrypcję w większości promotorów komórkowych. Niektóre z czynników σ
są syntetyzowane tylko wówczas, gdy istnieje potrzeba transkrypcji genów
określonej klasy (patrz sekcja 7. 8. 9).
Po związaniu holoenzymu polimerazy RNA (= polimeraza RNA + czynnik σ,
często oznaczony jako Εσ70, Eσ32, itp. ) do promotora, nici DNA rozdzielają się
w regionie startu, tworząc tzw. „kompleks otwarty", który pozwala na rozpoczę-
cie transkrypcji. Pierwszy trifosforan rybonukleozydu tworzy parę z odsłonię-
tym deoksyrybonukleotydem „+1". Następne trifosforany rybonukleozydów
tworzą pary (w pozycjach +2, +3, itp. ), a każdy z nich jest cięty do monofosfo-
ranu, co dostarcza energii do utworzenia wiązania fosfodiestrowego. Nić RNA
wydłuża się w trakcie polimeryzacji większej ilości rybonukleotydów. Wkrótce
potem czynnik sigma odłącza się, a polimeraza RNA kontynuuje syntezę pozos-
tałej części nici.
Elongacja to proces obejmujący postępujące rozwijanie się dupleksu i kolejne
dodawanie rybonukleotydów do wydłużającego się końca RNA. Nić RNA
odłącza się od matrycy, a dupleks DNA zostaje odtworzony.
Transkrypcja zatrzymuje się w określonej sekwencji nukleotydów (w miejscu
terminującym, czyli terminatorze) na nici matrycowej. Podczas tzw. rho-nieza-
leżnej terminacji w części transkryptu regionu terminatora tworzą się wewnę-
trzne pary zasad, powstała struktura drugorzędowa może prowadzić do
odłączenia się transkryptu i/lub polimerazy. W rho-zależnych terminatorach
czynnik rho (w E. coli jest on helikazą złożoną z sześciu podjednostek, wielkości
46-kDa każda) może zakończyć transkrypcję po rozpoznaniu określonego miej-
sca na transkrypcie.
Przedstawiono tu jedynie skrót dość skomplikowanego ciągu zdarzeń. Szcze-
gółowe informacje na temat oddziaływań polimeraza-promotor są zawarte
w pracy: de Haseth, Zupanic i Record [(1998) JB 180: 3265-3275], natomiast rola
polimerazy RNA w elongacji omówiona jest w artykule Mooney, Artisimovitch
i Landick [(1998) JB 180: 3265-3275].

121
 7. 5. 1 Regulacja transkrypcji - inne czynniki
W sekcji 7. 5 przedstawiono uproszczony obraz transkrypcji. Transkrypcja
zazwyczaj jest związana z aktywnością białek zwanych czynnikami transkryp-
cyjnymi, które wiążą się do określonych sekwencji DNA, bliżej lub dalej od
promotora. Wpływ tych białek na transkrypcję może być pozytywny lub nega-
tywny. Przykładem białek wiążących DNA jest białko represora (regulatora)
operonu lac (rys. 7. 11).
W badaniach wzajemnych oddziaływań białko — DNA użyteczne są techniki
hybrydyzacji „Southwestern" i badanie „odcisku stopy" (ang. footprinting) (sek-
cja 8. 15. 12).

7. 6 Synteza białka
Wszystkie białka komórkowe są kodowane przez DNA. Badanie syntezy białek
pozwoliło zrozumieć, jak jest zakodowana informacja genetyczna i w jaki sposób
działa kod genetyczny. Białko jest złożone z jednego lub kilku polipeptydów.
Polipeptyd jest łańcuchem zbudowanym z aminokwasów kowalencyjnie
połączonych wiązaniami peptydowymi (-CONH-). Każdy polipeptyd jest zwi-
nięty w trójwymiarową strukturę. Strukturę tę stabilizują wiązania wodorowe
lub wiązania disulfidowe utworzone między aminokwasami leżącymi w róż-
nych częściach łańcucha. Określone, trójwymiarowe struktury polipeptydu, nie-
zwykle ważne dla jego funkcji biologicznej, są zależne od rodzaju, liczby i sek-
wencji aminokwasów.
Dla każdego polipeptydu, rodzaj, liczba i sekwencja aminokwasów są deter-
minowane określoną sekwencją zasad w DNA. Ta sekwencja zasad odpowiada
jednej z definicji genu.
W jaki sposób gen „rządzi" syntezą polipeptydu? Inaczej, w jaki sposób gen
jest wyrażany? W przeciwieństwie do nukleotydów, aminokwasy nie mogą się
po prostu „ustawić" (i spolimeryzować) na matrycowej nici DNA. W istocie, syn-
teza białka obejmuje kilka etapów. Po pierwsze gen jest transkrybowany (sekcja
7. 5). Transkrypt genu (RNA), który niesie informację zakodowaną w DNA, nazy-
wany jest informacyjnym RNA (mRNA). W cząsteczce mRNA grupy trzech
kolejnych zasad kodują określony aminokwas, każda taka trójka nazywa się
kodonem. Na przykład, kodon UCA (uracyl-cytozyna-adenina) koduje amino-
kwas serynę (tab. 7. 2). W ten sposób kolejność kodonów w mRNA koduje sek-
wencję aminokwasów w polipeptydzie. Uczestnictwo w syntezie polipeptydu
jest uwarunkowane uprzednim związaniem aminokwasu z cząsteczką „łącz-
nika" właściwego zarówno dla aminokwasu, jak i własnego kodonu. „Łączni-
kami" są małe cząsteczki RNA — transportujący RNA (tRNA), z których każda
wiąże określony aminokwas, co prowadzi do powstania aminoacylo-tRNA.
(Wiązanie wymaga ATP). Każda cząsteczka tRNA zawiera miejsce wiążące ami-
nokwas i sekwencję złożoną z trzech zasad (antykodon) komplementarną do
kodonu dla danego aminokwasu. Dana cząsteczka tRNA może więc związać
określony aminokwas i przyłączyć go do właściwego kodonu w mRNA dzięki
zdolności tworzenia par zasad między kodonem a antykodonem.

122
 Synteza polipeptydu (proces translacji) zachodzi na rybosomie (sekcja 2. 2. 3).
Uproszczony przebieg tego procesu jest schematyczne pokazany i wytłuma-
czony na rysunku 7. 9.
Jak pokazano na rysunku 7. 9, kodonem inicjującym (tj. pierwszym kodonem
podlegającym translacji) jest zazwyczaj AUG. Odpowiednie ustawienie AUG
i rybosomowego miejsca Ρ umożliwia zazwyczaj określona sekwencja nukleoty-
dów (sekwencja Shine-Dalgarno) umiejscowiona przed kodonem AUG na
mRNA (tj. na lewo od AUG na rys. 7. 9). Sekwencja ta tworzy pary zasad z czę-
ścią, wchodzącej w skład rybosomu, cząsteczki 16S rRNA.
Kodon inicjujący AUG u większości bakterii (włączając E. coli) koduje zmody-
fikowany aminokwas N-formylometioninę. Inicjujący kodon tworzy parę
z wyspecjalizowanym inicjujacym tRNA, który transportuje N-formylometio-
ninę. Reakcja formylacji metioniny wymaga N10-formylotetrahydrofolianu
(tab. 6. 1). Należy podkreślić, że po zakończeniu translacji albo grupa formylowa,
albo cała formylometionina jest enzymatycznie usuwana z polipeptydu. W E. coli
formylometionina usuwana jest z około 50% białek. To, czy zostanie ona od-
cięta od określonej cząsteczki białka, zależy od przedostatniego, N-końcowego

123
124
aminokwasu. Im dłuższy jest łańcuch boczny tego aminokwasu, tym mniejsze
jest prawdopodobieństwo odcięcia formylometioniny. Formylometioninę odcina
enzym, aminopeptydaza metioninowa (MAP, ang. methionine aminopeptidase)
— przedstawiciel ważnych fizjologicznie enzymów [właściwości i funkcje ami-
nopeptydaz opisano w artykule: Gonzales i Robert-Baudouy (1996) FEMSMR
18: 319-344]. Natomiast enzym deformylaza metioninowa odcina tylko grupę
formylową.
Inicjacja syntezy białka wymaga uczestnictwa trzech białek, czynników ini-
cjujących — IF-1, IF-2 i IF-3, choć sposób i koordynacja ich działania nie są
w pełni poznane. Jest jednak powszechnie przyjęte, że IF-2 i GTP są niezbędne do
związania formylometionylo-tRNA do AUG w miejscu P. Ten tRNA wiąże się do
podjednostki 30S przed dodaniem podjednostki 50S (tzn. między etapami (a)
i (b) na rys. 7. 9). Wszystkie trzy czynniki inicjujące odłączają się przed ukończe-
niem etapu (b) — rys. 7. 9. Podczas tworzenia kompleksu 70S, IF-2 działa jak
GTPaza, a połączenie się podjednostek 50S i 30S jest związane z hydrolizą GTP.
[Bacterial initiation factors in protein synthesis (artykuł przeglądowy): Brock,
Szkaradkiewicz i Sprinzi (1998) MM 29: 409-417. ]
Elongacja łańcucha polipeptydowego zachodzi przez kolejne dodawanie ami-
nokwasów odpowiadających kodonom znajdującym się za AUG. Pierwszym eta-
pem elongacji jest związanie aminoacylo-tRNA do pustego miejsca A (rys. 7. 9,
etap C). W E. coli wiązanie jest uzależnione od GTP i czynnika elongacyjnego
EF-Tu. Po związaniu aminoacylo-tRNA następuje transpeptydacja (utworzenie
wiązania peptydowego) i translokacja (przemieszczenie kompleksu) (rys. 7. 9,
d-e). Etapy c-e powtarzają się w trakcie elongacji, a kodony są odczytywane
zgodnie z kodem genetycznym (tab. 7. 2).
Pary zasad tworzone między kodonami mRNA i antykodonami tRNA
zazwyczaj nie są stabilne w stopniu zapewniającym odpowiednią dokładność
i wydajność translacji. Ma na to wpływ również rybosom, konkretnie rRNA
[patrz np. Schoeder (1994) Nature 370: 597-598].

Rys. 7. 9 Synteza białek w bakteriach (schemat uproszczony, patrz sekcja 7. 6)

(a) rybosomowa podjednostka 30S wiąże się z mRNA. Region 16S rRNA zdolny do rozpoznania
kodonów zachodzi na miejsce „P" i „A". Kodon inicjujący (AUG) mRNA zajmuje miejsce P.
(b) Pierwszy aminokwas (ΑΑ1) związany z tRNA (tRNA1) zajmuje miejsce P, a antykodon tRNA1
paruje się z kodonem AUG. Podjednostka 50S wiąże się, tworząc cały rybosom.
(c) Drugi aminoacylo-tRNA zajmuje miejsce A, a antykodon tRNA2 paruje się z kodonem AUG.
(d) Tworzy się wiązanie peptydowe między grupą karboksylową pierwszego aminokwasu AA1
a grupa α-aminową drugiego aminokwasu AA2. Reakcję te nazywamy transpeptydacją. (AA1 stanie
się w ten sposób „końcem aminowym" lub końcem Ν łańcucha polipeptydowego). Reakcja trans-
peptydacji jest katalizowana przez enzym peptydylotransferazę. Enzym ten stanowi cześć ryboso-
mowej podjednostki 50S (oraz jest miejscem działania niektórych antybiotyków — patrz sekcja
15. 4. 4).
(e) Rybosom przesuwa się stopniowo po RNA na odległość jednego kodonu, w kierunku 5' do 3'
(translokacja). tRNA1 zostaje uwolniony. Dipeptyd związany z tRNA zajmuje teraz miejsce P, nato-
miast „akceptorowe" miejsce A naprzeciw trzeciego kodonu jest puste.
(f) Trzeci aminoacylo-tRNA wiąże się do miejsca A. Etapy d-f powtarzają się dla każdego kodonu.
Gdy zostanie napotkany kodon stop (np. UAA), czynnik uwalniający białko hydrolizuje wiązanie
estrowe między ostatnim tRNA a łańcuchem polipeptydowym. Uwalnia się gotowy łańcuch białka.

125
 Sygnałem terminacji translacji (zakończenia syntezy polipeptydu) jest
obecność w miejscu A jednego z kodonów stop (kodonów nonsensowych):
UAA, UAG i UGA (ochre, amber i opal, odpowiednio). Terminacja jest związana
z aktywnością czynnika uwalniającego, który musi rozpoznać sygnał stop
i oddziaływać bezpośrednio z mRNA. Prowadzi to do hydrolizy wiązania pep-
tyd-tRNA w miejscu Ρ i do uwolnienia polipeptydu. Tradycyjnie przyjmuje się,
że sygnał stop stanowi trójka zasad (jak wyżej), istnieją jednak dowody suge-
rujące, że zasada znajdująca się za kodonem stop wpływa na wydajność termina-
cji. Być może, właściwy sygnał stop jest 4-zasadową, a nawet dłuższą sekwencją
[Tate i Mannering (1996) MM 21: 213-219].
Podczas, gdy jeden z rybosomów przemieszcza się wzdłuż cząsteczki mRNA,
drugi może zająć puste miejsce inicjujące i rozpocząć translację innej cząsteczki
polipeptydu. Jedna cząsteczka mRNA może być pokryta przez większą ilość
rybosomów tworzących polirybosom (polisom) (rys. 7. 10).
Sekwencje sygnałowe. W wielu przypadkach białko będące częścią błony
lub transportowane przez błonę jest syntetyzowane ze specjalną N-końcową sek-
wencją aminokwasów (sekwencją sygnałową). Sekwencja ta pozwala wejść lub
przejść przez hydrofobowy region błony, a następnie zostaje enzymatycznie
odcięta (patrz również sekcja 5. 4. 3) [Signal sequences (artykuł przeglądowy):
Izard i Kendall (1994) MM 13: 765-773. ]
Zwijanie białek. Funkcjonowanie białek zależy od właściwego zwinięcia
(sfałdowania) łańcuchów polipeptydowych. W białkach znajdujących się w pery-
plazmie, w błonie lub w białkach wydzielanych na zewnątrz sfałdowanie jest
związane z utworzeniem mostków disulfidowych między określonymi amino-
kwasami w łańcuchu. (W E. coli mostków disulfidowych zazwyczaj nie ma
w białkach cytoplazmatycznych, ponieważ mogą być redukowane enzymatycz-
nie, np. przez zależny od NADPH system tioreduktazy) [ale patrz również Ste-
wart, Aslund i Beckwith (1998) EMBO Journal 17: 5543-5550]. ) Synteza disulfi-
dowych wiązań w peryplazmie E. coli jest katalizowana przez białka Dsb
(produkty genów dsb A i dsbB). (Mutacje białek Dsb mają charakter plejotropowy
(tzn. wieloraki), co jest spowodowane stabilizacyjnym wpływem mostków siar-
czkowych na liczne białka, np. białka rzęski, białka błony i różne białka wydzie-
lane na zewnątrz. W bakteriach patogennych mutacje takie mogą wpływać
na wydzielane, białkowe czynniki wirulencji, a więc obniżać wirulencję patoge-
nów [Disulphide bond formation (artykuł przeglądowy): Bardwell (1994) MM
14: 199-205].

126
 Białka zawierające prolinę do swojego, właściwego sfałdowania mogą wy-
magać izomeraz peptydyloprolilowych. W E. coli kilka izomeraz tego typu
(np. FkpA i PpiA) występuje w regionie peryplazmatycznym.
Synteza przynajmniej kilku enzymów związanych ze zwijaniem białka jest
z pewnością kontrolowana przez dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja
7. 8. 6) nazywany CpxA-CpxR. Aktywacja sensora, CpxA, prowadzi do fosfory-
lacji regulatora CpxR, który w następstwie tego zdolny jest do związania się
z DNA przed miejscem startu transkrypcji, np. w genach dsbA i ppiA. Aktywacja
systemu Cpx wykazuje zgodność z obserwowanym in vivo zwiększeniem trans-
krypcji obu tych genów [Pogliano i wsp. (19970 GD 11; 1169-1182]. Wydaje się, że
transkrypcja genów związanych z fałdowaniem białka jest zależna od czynnika
σΕ [Danese i Silhavy (1997) GD 11: 1183-1193].
Zwinięcie nowo syntetyzowanych białek i ich przejście przez błony w stanie
całkowicie lub częściowo zwiniętym jest ułatwione przez tzw. białka opiekuń-
cze (zazwyczaj nazywane chaperonami). Są to cząsteczki, które wiążą się i stabili-
zują nowo syntetyzowane białka, ułatwiają ich właściwe fałdowanie przez
hamowanie niewłaściwych sposobów zwinięcia. Każdy etap zwinięcia i translo-
kacji może wymagać udziału więcej niż jednego białka opiekuńczego. Białka
opiekuńcze mogą się wiązać z innymi białkami podczas translacji [patrz Fedorov
i Baldwin (1997) JBC 272: 32715-32718] albo po translacji.
Chaperony są syntetyzowane konstytutywnie, jednak w pewnych stresowych
warunkach (np. szok cieplny, sekcja 7. 8. 2. 3) synteza ich wzrasta — prawdopodob-
nie ze względu na konieczność ponownego zwinięcia zdenaturowanych białek.
Chaperony to zazwyczaj białka, ich przykładami są produkty genów groES,
groEL i dnaK E. coli. Jednak lipid obecny w błonie, fosfatydyloetanoloamina (PE,
ang. phosphatidylethanolamine; sekcja 2. 2. 8) pełni rolę chaperonu dla białka
LacY E. coli (sekcja 7. 8. 1. 1). Wczesne etapy zwijania tego białka (w błonie cytoplaz-
matycznej) są niezależne od lipidu, natomiast stadia późniejsze wymagają
udziału lipidu PE [Bogdanov i Dowhan (1998) EMBO Journal 17: 5255-5264].
[Protein folding and misfolding (some concepts and themes): Dobson i Ellis
(1998) EMBO Journal 17: 5251-5254. ]
Synteza peptydów bez rybosomów. Pewna ilość bardzo krótkich peptydów
syntetyzowana jest przez kompleks składający się z wielu enzymów, a nie przez
rybosomy i cząsteczki RNA. W ten sposób są syntetyzowane np. niektóre anty-
biotyki, takie jak tyrocydyna (cykliczny peptyd złożony z 10 reszt aminokwaso-
wych) i gramicydyna (liniowy peptyd). Takie antybiotyki (wytwarzane przez
Bacillus brevis) działają przeciw bakteriom gramdodatnim, najprawdopodobniej
przez zmianę przepuszczalności błony cytoplazmatycznej. [Non-ribosomal bio-
synthesis of peptide antibiotics (artykuł przeglądowy): Kleinkauf i von Dohren
(1990) EJB 192: 1-15. ]

7. 6. 1 Losy mRNA
Po spełnieniu swej roli wiele rodzajów bakteryjnego mRNA istnieje w komórce
krótko i szybko ulega degradacji do składników, które mogą być ponownie
użyte. Proces ten ma duże znaczenie, inaczej cytoplazma zostałaby szybko

127
zapełniona „zużytymi" cząsteczkami mRNA. (Zdarza się jednak, że degradacja
mRNA jest opóźniona — patrz sekcja 7. 8. 4). Degradacja zachodzi z udziałem
nukleaz (enzymów, które przecinają kwasy nukleinowe): endonukleaz (które
przecinają wiązanie fosfodiestrowe w regionach środkowych) i egzonukleaz
(odcinających nukleotydy od końca 3'). mRNA E. coli jest degradowany do
odcinków długości około 10 nukleotydów (nie mniejszych) przez RNazę II i fos-
forylazę polinukleotydową. W jaki więc sposób mRNA może być ponownie syn-
tetyzowany? Wydaje się, że nieznany dotychczas enzym RNaza* degraduje te
odcinki do pojedynczych nukleotydów, w ten sposób model degradacji mRNA
zostaje uzupełniony [Cannistraro i Kennel (1991) JB 173: 4653-4659].
Na degradację mRNA mają wpływ warunki wzrostu. Na przykład w E. coli
okres półtrwania przynajmniej niektórych cząsteczek mRNA jest bardzo
wydłużony podczas wolnego wzrostu w warunkach beztlenowych (czas podwo-
jenia liczby komórek = 700 min). W tych warunkach szybkość syntezy mRNA jest
znacznie mniejsza, a zwiększona trwałość mRNA może być mechanizmem
utrzymującym wyrażanie się genów podczas anaerobiozy [Georgellis i wsp.
(1993) MM 9: 375-381].
W nowszych pracach podkreśla się, że poliadenylacja pełni ważną rolę w sta-
bilizacji mRNA. Wiadomo jest, że większość eukariotycznych mRNA ma
„ogony" złożone z poliadenylanu (tj. -A-A-A-A 3'), natomiast mało jest doniesień
dotyczących poliadenylacji bakteryjnych mRNA. Jednak takie mRNA istnieją,
a w E. coli są przynajmniej dwa enzymy — polimerazy poli(A) (PAPs, ang.
poly(A)polymerases) odpowiedzialne za poliadenylację.
Znaczenie poliadenylacji nie jest znane, może np. pomagać w regulacji okresu
półtrwania (stabilności) pewnych cząsteczek RNA, których koniec 3' jest struk-
turą drugorzędową typu „pętli i łodygi" kodowaną przez rho-niezależny termi-
nator transkrypcji (sekcja 7. 5). Struktura pętli i łodygi jest zazwyczaj oporna na
działanie niektórych enzymów degradujących RNA; sugeruje się, że poliadeny-
lacja 3' struktury „pętli i łodygi" może ułatwiać degradację tych cząsteczek,
ponieważ dostarcza dogodnego miejsca do wiązania enzymów degradujących —
np. 3' egzonukleazy — fosforylazy polinukleotydowej.
Co ciekawe, mutacje w genie pncB E. coli (który koduje polimerazę poli(A),
PAPI) zmniejszają liczbę kopii np. plazmidu ColE1. Wydaje się, że antysensowna
cząsteczka RNA I jest zazwyczaj poliadenylowana, co ułatwia jej degradację.
W mutantach pcnB brak jest poliadenylacji, a to stabilizuje RNA I, jednocześnie
zwiększając jego hamujące działanie na RNA II i w rezultacie hamując replikację
ColEl (tj. redukując liczbę jego kopii).
[Polyadenylation of bacterial mRNA (artykuł przeglądowy): Sarkar (1996)
Microbiology 142: 3125-3133. ]

7. 6. 2 Białka wewnątrz białek - inteiny

W roku 1990 wykryto, że niektóre białka zawierają wewnętrzną sekwencję amino-
kwasów — inteinę, która katalizuje w białku wycięcie jego części. Inteina jest wyci-
nana (tworząc osobne białko), a dwie końcowe części oryginalnego peptydu (eks-
teiny) łączą się, co prowadzi do utworzenia funkcjonalnego białka. Schematycznie:

128
 eksteina-inteina-eksteina -> eksteina-eksteina + inteina
Zjawisko to po raz pierwszy obserwowano w eukariotycznym genie VMA1
(= TFP1) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae, później wykryto je w bakteriach
(np. w genie recA Mycobacterium tuberculosis i wśród archeonów (np. w genie
polimerazy DNA gatunku Pyrococcus i Thermococcus litoralis).
Długość intein wynosi zazwyczaj 350-550 aminokwasów. Ich zdolność auto-
katalitycznego wycinania jest potwierdzona brakiem wycinania w wyniku dele-
cji regionu DNA kodującego inteinę i faktem „heterologicznej" ekspresji genu
kodującego inteinę w organizmach, które nie mają tego genu. Na przykład,
wyrażanie się genu VMA1 w E. coli prowadzi do utworzenia zarówno gotowego
białka, jak i inteiny.
Podczas wycinania powstaje produkt pośredni, który jest rozgałęzionym
polipeptydem (z dwoma końcami Ν i jednym końcem C). Przypomina to
rozgałęziony mRNA, jaki tworzy się w organizmach eukariotycznych podczas
przekształcania pre-mRNA w dojrzały mRNA (patrz rys. 8. 8). Istnieje podobień-
stwo funkcji intein i pewnych intronów.
Niektóre inteiny pełnią funkcję zlokalizowanych endonukleaz (tak jak nie-
które ulegające translacji introny). Co więcej, wycięta inteina VMAl S. cerevisiae
specyficznie przecina gen VMA1, który nie ma sekwencji kodującej inteinę.
Przecięcie zachodzi w miejscu, które normalnie zajmowane jest przez DNA
inteiny. W szczepie S. cerevisiae zawierającym gen VMA1 kodujący inteinę oraz
kopie genu bez inteiny, po przecięciu kopii następuje Insercja DNA inteiny
w procesie (zwanym konwersją genu), w którym kopiowany jest gen zawie-
rający inteinę.
Zdolność inteiny do pobudzania wstawienia sekwencji ją kodujących do
kopii genu nie zawierających intein (jak w przedstawionym wyżej przykładzie
S. cerevisiae) nazywana jest powrotem inteiny. Inteiny, podobnie jak transpozony
(sekcja 8. 3), należą do ruchomych elementów genetycznych.
Inteiny były opisane w artykule przeglądowym Coopera i Stevensa [TIG
(1996) 12: 351-356]. Nowa inteina pochodząca z cyjanobakterii została odkryta
przez Pietrovskiego [TIG (1996) 12: 287-288]. Autor zaznacza, że nie jest znana
żadna pożyteczna dla komórki rola intein, sugeruje jednak, że niektóre z nich
mogą regulować aktywność białka, z którego pochodzą [Compilation and analy-
sis of intein sequences: Perler, Olsen i Adam (1997) 25: 1087-1093].

7. 6. 3 Rybosomy a szybkość wzrostu

Zwiększenie szybkości wzrostu jest w sposób oczywisty związane ze wzrostem
szybkości syntezy białka, a to z kolei wymaga większej ilości rybosomów
w komórce. Istnieje więc korelacja między szybkością wzrostu a szybkością syn-
tezy rybosomów.
Wytwarzanie rybosomów wymaga skoordynowanej syntezy rybosomowych
białek i rRNA (sekcja 2. 2. 3). Geny kodujące około 50 rybosomowych białek są
zgrupowane w kilkunastu różnych operonach (sekcja 7. 8. 1), z których każdy jest
transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka z zakodowanym zestawem białek

129
(tzw. policistonowy mRNA). Jeden z modeli opisujących kontrolę tych operonów
postuluje, że jedno z białek kodowanych przez określony operon działa jak czyn-
nik regulujący translację operonu, przez zahamowanie translacji przynajmniej
niektórych białek kodowanych przez policistronowy mRNA. Mechanizm
kontrolujący ekspresję jednego z tych operonów w E. coli przedstawiony jest
w sekcji 7. 8. 1. 3.
Niektóre z białek regulujących translację danego operonu mogą się również
wiązać do 16S i 23S rRNA. Uważa się, że wraz ze zmniejszeniem szybkości
wzrostu maleje ilość 16S i 23S rRNA dostępnego do syntezy rybosomów, co
z kolei sprawia, że wolne białka rybosomowe mogą się wiązać z własnymi trans-
kryptami i pełnić funkcję hamującą ekspresję. Należy zauważyć, że model ten
zakłada istnienie powiązań między syntezą białka a syntezą rRNA.
Synteza rRNA jest połączona z potrzebami translacyjnymi komórki, a przez
to jest podatna na regulację, zwiększając lub zmniejszając syntezę, zależnie od
warunków. W E. coli 16S, 23S i 5S rRNA są transkrybowane wspólnie (w takim
właśnie porządku), jako jeden transkrypt operonu rrn. Na chromosomie znajduje
się siedem kopii tego operonu (A-E, G, Η), z których wszystkie zawierają jedną
kopię każdego z trzech rodzajów rRNA — z wyjątkiem operonu D, który ma
dwie kopie genu 5S rRNA. Każde zmniejszenie ilości 16S lub 23S rRNA (np.
z powodu mutacji) może być kompensowane przez podwyższenie ekspresji ope-
ronów rrn. Przeciwnie, delecja dwóch lub większej liczby kopii genu 5S rRNA
w E. coli prowadzi do silnego zmniejszenia szybkości wzrostu (nie obserwuje się
efektu kompensacyjnego). To zmniejszenie szybkości wzrostu jest prawie całko-
wicie zahamowane przez insercję plazmidowego genu 5S rRNA do chromosomu
[Ammos, Rampersad i Fox (1999) NAR 27: 637-642].

7. 7 Kontrolowanie i naprawa DNA

Uszkodzony DNA może powstać na przykład w wyniku wstawienia niepra-
widłowego nukleotydu podczas replikacji. Ten DNA może być natychmiast roz-
poznawany i reperowany przez aktywność korekcyjną komórki. Polimeraza
DNA III może odciąć „zły" nukleotyd z końca 3' rosnącej nici, co pozwala na
zastąpienie go nukleotydem prawidłowym.
DNA jest podatny również na chemiczne zmiany zasad [Lindahl (1993)
Nature 362: 709-715]. Na przykład, błędna, nie enzymatyczna, spontaniczna
metylacja przez S-adenozylometioninę (dawcę grup metylowych — patrz sekcja
7. 4) może prowadzić do powstania 3-metyloadeniny i/lub 7-metyloadeniny,
a każda z tych na ogół występujących zasad purynowych może hamować funk-
cje DNA. W E. coli nietypowe zasady są wycinane przez N-glikozylazy, które
przecinają wiązanie między cukrem a zasadą. Glikozylaza DNA I (białko Tag),
syntetyzowana w sposób konstytutywny, wycina 3-metyloadeninę. Indukowana
glikozylaza DNA II (= białko AlkA) wycina nie tylko te dwie nietypowo metylo-
wane puryny, ale również niektóre nienormalnie metylowane pirymidyny. Bada-
nia struktury AlkA sugerują, że szeroka specyficzność tego enzymu jest
związana z nasyconą elektronami szczeliną, bogatą w aromatyczne łańcuchy

130
boczne, która może rozpoznawać każdą z nietypowo metylowanych zasad ubo-
gich w elektrony [Labahn i wsp. (1996) Cell 86: 321-329].
Spontaniczna, zachodząca z małą częstością deaminacja cytozyny (rys. 7. 3) do
uracylu może być naprawiona na drodze usuwania uracylu przez enzym, N-gli-
kozylazę uracylową (UNG, ang. uracil-N-glycosylase). (UNG znajduje zastoso-
wanie w technologii rekombinowanego DNA (sekcja 8. 5. 4. 3).
Wycięcie przez glikozylazę (pierwszy etap naprawy) zmienionych chemicz-
nie zasad zostawia miejsce apurynowe (bez puryny) lub apirymidynowe (bez
pirymidyny), zwane miejscem AP (= pozbawione zasady). Dalsze etapy procesu
obejmują wycięcie zasady (sekcja 7. 7. 1. 3).
W niektórych przypadkach deaminacja cytozyny następuje po metylacji tej
zasady w pozycji 5, co wynika z modyfikacji DNA (sekcja 7. 4). Spontaniczna
deaminacja 5-metylocytozyny prowadzi do powstania typowej zasady, tyminy
(rys 7. 3), która nie może być usunięta przez żaden enzym, zostaje więc w DNA,
a w następnej rundzie replikacji tworzy parę z adeniną, prowadząc do powstania
mutacji punktowej (sekcja 8. 1. 1, rys. 8. 1). CG w dupleksie wyjściowym zostaje
zastąpione przez TA w dupleksie potomnym. 5-metylocytozyna wyznacza
miejsca mutacji spontanicznej, tzw. „gorące miejsca" w DNA. (Zastąpienie jed-
nej pirymidyny lub puryny odpowiednio przez inną pirymidynę lub purynę
nazywamy tranzycją, zastąpienie puryny pirymidyną lub odwrotnie — trans-
wersją. )

7. 7. 1 System naprawy przez wycinanie

7. 7. 1. 1 Naprawa „mismatch" (pomyłek) (DDMR, ang. Dam-directed mismatch repair)

Pomyłki, które nie zostały naprawione przez aktywność korekcyjną polimerazy,
mają szansę być naprawione wkrótce potem (przed modyfikacją: sekcja 7. 4)
przez system naprawy zwany mismatch. Głównym zadaniem tego systemu jest
naprawa błędów powstałych w trakcie replikacji DNA. W E. coli wykrycie źle
dopasowanej pary zasad przez białko MutS aktywuje nukleazę MutH. MutH
przecina nową nić potomną (która charakteryzuje się przejściowym niskim stop-
niem metylacji) w miejscu 5' od (nie metylowanej) sekwencji GATC (Dam), która
może być oddalona nawet o 1000 nukleotydów od źle dopasowanej zasady.
MutL zapewnia koordynację między źle dopasowaną parą zasad a miejscem cię-
cia GATC. Po przecięciu przez MutH odcinek nici potomnej znajdującej się mię-
dzy miejscem cięcia a miejscem położonym za źle dopasowaną zasadą zostaje
usunięty. Przyjmuje się, że usunięcie tego odcinka wymaga helikazy II (MutU,
zwanej również UvrD) i endonukleazy DNA. Jednak szczepy nie mające egzo-
nukleazy 3'-5', Exol, oraz egzonukleazy 5'-3', Exo VII i RecJ, nie wykazują
zaburzeń w naprawie typu „mismatch" [Harris i wsp. (1998) JB 180: 989-993]. Jed-
noniciowa luka jest zapełniona przez polimerazę DNA (z wykorzystaniem nici
oryginalnej jako matrycy) i sklejona przez ligazę. [Replication errors (bacterial
and human) (artykuł przeglądowy): Jiricny (1998) EMBO Journal 17: 6427-6436. ]
Szczepy E. coli pozbawione produktów genów mut mają defekt w naprawie
DNA i charakteryzują się fenotypem mutatorowym (patrz również sekcja

131
8. 5. 5. 1). (Warto podkreślić, że u ludzi niektóre rodzaje nowotworów dolnych
odcinków przewodu pokarmowego, jak również inne, związane są z mutacjami
w genach homologicznych do mutS i mutL. )
Homologia sekwencji między MutH a enzymem restrykcyjnym Sau3Al
(tab. 8. 1) wskazuje na ich pokrewieństwo ewolucyjne [Ban i Yang (1998) EMBO
Journal 17: 1526-1534].

7. 7. 1. 2 Naprawa przez wycięcie nukleotydów (naprawa przez system UvrABC)

W E. coli system enzymów zależnych od ATP (UvrABC, „enzymy wycinające
ABC") rozpoznaje i naprawia DNA uszkodzony/zniekształcony w wyniku
naświetlenia promieniami ultrafioletowymi bądź z jakiś innych powodów.
UvrABC składa się z trzech białek kodowanych przez geny uvrA, uvrB i uvrC.
Początkowo dimer UvrA wiąże się do uszkodzonego DNA. Do dimeru przyłącza
się UvrB, a następnie UvrA2B przesuwa się dokładnie do miejsca uszkodzenia.
UvrA zostaje zastąpione przez UvrC. Kompleks UvrBC katalizuje przecięcie
z obu stron miejsca uszkodzonego, przecięcie po stronie 3' następuje wcześniej
niż po stronie 5'. Z kolei helikaza II (UvrD) usuwa UvrC razem z krótką sek-
wencją nukleotydów zawierającą miejsce uszkodzone. Polimeraza zapełnia jed-
noniciową lukę, jednocześnie usuwając UvrB, a ligaza kończy naprawę. W E. coli
wycinane jest tylko dziesięć nukleotydów obejmujących bliskie sąsiedztwo miej-
sca uszkodzonego — stąd nazwa naprawa krótkiego odcinka.
Naprawa wymaga energii (pochodzącej z hydrolizy ATP) np. do przesunięcia
się kompleksu UvrA2B do miejsca uszkodzonego. Białko UvrA jest ATPazą
wiążącą cynk.

7. 7. 1. 3 Naprawa przez usunięcie zasady (naprawa następująca po działaniu glikozylaz)

Niektóre systemy naprawiają głównie uszkodzenia powodowane przez okre-
ślone czynniki — np. uszkodzenia oksydacyjne [Demple i Harrison (1994) ARB
63: 915-949] lub wynikłe z niewłaściwej alkilacji lub deaminacji zasad (patrz
wyżej). Pierwszym etapem naprawy jest wycięcie zmienionej zasady, z utworze-
niem miejsca AP (patrz wyżej). Następnie wiązanie fosfodiestrowe z jednej
strony miejsca AP zostaje przecięte przez „AP endonukleazę". W E. coli główną
AP endonukleazą jest egzonukleaza III, wielofunkcyjny enzym, którego stru-
ktura sugeruje, że przecięcie wiązania fosfodiestrowego następuje w wyniku
ataku nukleofilowego na wiązanie P-3'O [Mol i wsp. (1995) Nature 374:
381-386]. Polimeraza DNA może następnie zastąpić sekwencją prawidłową
uszkodzony nukleotyd, a wraz z nim kilka nukleotydów leżących po stronie 3'
od miejsca uszkodzenia [Sandigursky, Fryer i Franklin (1998) NAR 26:
1282-1287]. Ligaza kończy naprawę.

7. 7. 2 Fotoliaza
Jeden z typów uszkodzeń DNA wywoływany przez promienie ultrafioletowe
polega na utworzeniu dimerów tyminy. Dimery te powstają w rezultacie
wytworzenia wiązań między dwiema sąsiednimi resztami tyminy w tej samej

132
nici. Niektóre bakterie, włączając E. coli, kodują enzym, fotoliazę, zdolną wyko-
rzystać do naprawy uszkodzenia energię pochodzącą ze światła widzialnego.
Badania in vitro naprawy dimerów tyminy mogą być ułatwione przez zasto-
sowanie nadmanganianu potasu (KMnO4) [Ramaiah i wsp. (1998) NAR 26:
3940-3943].

7. 7. 3 Wybiórcza naprawa genów aktywnie transkrybowanych

Intensywnie transkrybowane geny są naprawiane szybciej niż inne. Jeden
z modeli postuluje, że zmieniony DNA blokuje przesuwanie się polimerazy pod-
czas transkrypcji, a czynnik łączący transkrypcję z naprawą (TRCF, ang. transcri-
ption-repair coupling factor), kodowany przez gen powodujący zmniejszenie
częstości mutacji, mdf (ang. mutation frequency decline), wiąże się w tym miej-
scu, powodując uwolnienie polimerazy i niedokończonego mRNA. TRCF może
następnie oddziaływać z systemem UvrABC i wpływać na naprawę [Mini-
przeglądówka: Selby i Sancar (1993) JB 175: 7509-7514. ]

7. 8 Regulacja ekspresji genów

Nie wszystkie geny komórkowe są wyrażane przez cały czas. W warunkach
braku określonego substratu komórka traciłaby energię na syntezę białek (np.
enzymów) koniecznych do jego metabolizowania. Rzeczywiście, geny mogą być
„włączane" (indukowane) lub „wyłączane" (reprymowane), bądź też ich wyra-
żanie się może się zwiększać lub zmniejszać, zależnie od warunków. Taka regu-
lacja często zachodzi dzięki mechanizmowi, który zwiększa lub hamuje syntezę
mRNA poszczególnych genów. A więc ekspresja genu regulowana jest wówczas
„na poziomie transkrypcji", choć istnieją również inne sposoby regulacji. Nie-
które z nich zostały opisane w dalszej części rozdziału.
Ekspresja genów związana jest zazwyczaj z syntezą białek (sekcja 7. 6), jednak
należy pamiętać, że geny kodują np. tRNA i rRNA.
Geny są regulowane nie tylko przez czynniki zewnętrzne, ale również
wewnętrznie, co zależy od siły własnego promotora. Silne promotory ułatwiają
transkrypcję, natomiast słabe pozwalają jedynie na niski poziom wyrażania się
genu (patrz również sekcja 7. 5). Siła promotora nie jest jednak niezmienna,
w wielu wypadkach poziom transkrypcji rozpoczynającej się w danym promoto-
rze może być zmieniony w następstwie wiązania się określonych białek regula-
cyjnych w pobliżu miejsca promotora.
Niezakłócona transkrypcja zależy również od właściwego stopnia superzwi-
nięcia DNA (sekcja 7. 2. 1). Na przykład, zmniejszenie negatywnego superzwinięcia
prowadzi niejednokrotnie do zahamowania transkrypcji w wielu promotorach.
Wyrażanie się genu może również zależeć od innych czynników, takich jak
temperatura (sekcja 7. 8. 11) lub rytm dobowy (sekcja 7. 8. 12).
Mutacja(e) (sekcja 8. 1) w kodującej sekwencji genu może wpływać na rodzaj
i biologiczną aktywność jego produktu (rys. 8. 1). Mutacja w operonie może
wpływać na wyrażanie się innych genów położonych za genem zmutowanym.

133
Mówimy wtedy o mutacji polarnej. W niektórych genach ekspresja może być
zahamowana, jeśli mutacja w intronie (sekcja 7. 9) powoduje uszkodzenie mecha-
nizmu wycinania, nawet gdy sekwencja kodująca pozostaje bez zmiany.
Ekspresja genów u Archaea (zarówno transkrypcja, jak i translacja) bliższa
jest wzorom ekspresji genów eukariotycznych niż bakteryjnych [Bell i Jackson
(1998) TIM 6: 222-228].

7. 8. 1 Operony
Bardzo często sekwencja genów jest transkrybowana z jednego promotora jako
pojedyncza cząsteczka RNA. Zbiór genów, których ekspresja znajduje się pod
wspólną kontrolą, nazywa się operonem. Geny leżące w tym samym operonie
często kodują funkcjonalnie pokrewne produkty, np. enzymy tego samego
szlaku metabolicznego. Operony są kontrolowane przez różne mechanizmy,
często na poziomie transkrypcji (sekcja 7. 8. 1. 1 i 7. 8. 1. 2), ale czasami na poziomie
translacji (sekcja 7. 8. 1. 3).

7. 8. 1. 1 Operony, w których kontrolowany jest promotor

W operonach tych rolę kontrolną pełni białko regulatora, którego produkcja
może być mniej lub bardziej ciągła. Operony, które są wyrażane dopóki nie
zostaną „wyłączone" przez białko regulatora, znajdują się pod kontrolą nega-
tywną. Te, które nie są wyrażane, dopóki nie zostaną „włączone" przez białko
regulatora, są pod kontrolą pozytywną.
Operon lac w E. coli (rys. 7. 11) koduje białka, które umożliwiają pobranie
i metabolizm laktozy (dwucukru złożonego z reszt glukozy i galaktozy). Obec-
ność allolaktozy może „zaindukować" operon lac (rys. 7. 11). Gen lacY koduje
permeazę β-galaktozydową, która umożliwia pobranie laktozy ze środowiska.
Gen lacZ koduje enzym β-galaktozydazę rozszczepiającą laktozę na reszty glu-
kozy i galaktozy oraz powodującą przekształcenie niewielkich ilości laktozy do
formy allolaktozy. Produkt genu lacA (transacetylaza tiogalaktozydowa)
prawdopodobnie nie jest istotna dla metabolizmu laktozy. Rysunek 7. 11 tłuma-
czy regulację operonu lac, który znajduje się pod kontrolą negatywną.
Określenie „operon ara" odnosi się zazwyczaj do operonu araBAD. Geny araB,
araA i araD kodują enzymy, które umożliwiają metabolizm L-arabinozy do
D-ksylulozo-5-fosforanu. W E. coli są również dodatkowe geny związane
z pobraniem arabinozy (transport: sekcja 5. 4). Geny te (araE i araFG) znajdują się
w dwóch odległych miejscach chromosomu. Geny zlokalizowane we wszystkich
trzech miejscach są kontrolowane przez wspólne białko regulatora — AraC
(kodowane przez araC). Ze względu na istnienie wspólnego białka regulatora dla
genów zlokalizowanych w różnych miejscach, ten zestaw genów (pobranie +
metabolizm) stanowi regulon (sekcja 7. 8. 2).
W nieobecności arabinozy AraC pełni rolę represora (kontrola regulonu jest
negatywna, jak w operonie lac). Arabinoza powoduje konwersję AraC do akty-
watora, co umożliwia rozpoczęcie transkrypcji. W ten sposób zmodyfikowane
białko regulatora „włącza" system — jest to przykład kontroli pozytywnej.

134
(a) Gdy nie ma induktora, białko regulacyjne (produkt genu lacT) wiąże się do operatora O, co prowa-
dzi do zmniejszenia transkrypcji genów lacZ, lacY i lacA przez polimerazę RNA (na rysunku jest ona
związana z promotorem P). Zahamowanie nie jest całkowite. Kilka cząsteczek enzymów, np. produkt
genu lacZ — β-galaktozydaza może być syntetyzowany w warunkach represji.
(b) Obecność laktozy (pobranej przez komórkę na drodze symportu proton-laktoza, sekcja 5. 4) spra-
wia, że β-galaktozydaza zmienia laktozę w allolaktozę (sekcja 7. 8. 1. 1). Allolaktoza jest induktorem
operonu lac dzięki swej zdolności do wiązania się z białkiem regulacyjnym, a zatem — do jego
inaktywacji. Po inaktywacji białka regulacyjnego trzy geny mogą ulegać transkrypcji i translacji.
Pojedynczy transkrypt mRNA zawiera kodon inicjujący i terminacyjny dla każdego z trzech genów
— patrz sekcja 7. 6. )
Po zużyciu laktozy nie ma już konieczności dalszej transkrypcji operonu lac, induktor (allolaktoza)
już się nie tworzy, a białko regulacyjne ponownie „wyłącza" operon. mRNA ulega gwałtownej degra-
dacji (sekcja 7. 6. 1).
Operon lac jest również regulowany przez represję kataboliczną (sekcja 7. 8. 2. 1).
Na schemacie przedstawiono jedynie zarys działania operonu lac, w rzeczywistości proces ten jest
o wiele bardziej złożony. Na przykład, białko regulacyjne może się wiązać do dwóch innych miejsc
nazywanych O-2 i 0-3, choć z mniejszym powinowactwem. Wydaje się, że w warunkach represji ope-
ronu tetrametryczne białko regulacyjne wiąże się z głównym operatorem (O) i z O-2 (lub O-3) i two-
rzy w ten sposób pętlę DNA, co stabilizuje połączenia regulator-operator [Reznikoff (1992) MM 6:
2419-2422].
Izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) jest „niepotrzebnym" induktorem operonu lac, co znaczy, że
związek ten indukuje operon, ale nie może być metabolizowany. IPTG znajduje zastosowanie w tech-
nologii zrekombinowanego DNA (patrz rys. 8. 16)

135
 7. 8. 1. 2 Operony, w których kontrolowany jest atenuator
Operony te są związane z syntezą aminokwasów. Operony kontrolowane w ten
sposób zawierają początkową sekwencję nukleotydów w transkrypcie mRNA
(sekwencję wiodącą), kodującą mały peptyd (peptyd wiodący) bogaty w reszty
aminokwasu, którego synteza związana jest z tym operonem. W sekwencji lidera
znajduje się również rho-niezależny terminator (sekcja 7. 5) — atenuator,
położony między regionem kodującym peptyd wiodący a pierwszym genem
strukturalnym.
Jeżeli w komórce jest dostateczne stężenie danego aminokwasu (a więc
zbyteczna jest jego synteza), transkrypcja zatrzymuje się w atenuatorze. (Peptyd
wiodący może być syntetyzowany, ponieważ rybosomy podążają w bliskiej
odległości za polimerazą RNA, biorąc udział w translacji świeżo utworzonego
transkryptu). Przy niedostatecznym poziomie aminokwasu (a więc wymagana
jest jego synteza) rybosom syntetyzujący peptyd wiodący „zatrzymuje się", gdy
napotka kodony właściwe dla danego aminokwasu. W tej sytuacji dalsze odcinki
transkryptu mogą tworzyć strukturę drugorzędową w sposób wykluczający
powstawanie atenuatora, wtedy geny strukturalne mogą być transkrybowane.
Kontrola atenuacyjna zachodzi w operonie his (histydynowym) E. coli.
Operon trp (tryptofanowy) E. coli podlega negatywnej kontroli w promotorze
oraz kontroli atenuacyjnej.

7. 8. 1. 3 Regulacja operonu przez kontrolę translacyjną

Kontrola translacyjna zachodzi w operonie IF3-L35-L20 (odpowiednio geny infC,
rpml, rplT) w E. coli. Operon ten (transkrybowany jako pojedyncza cząsteczka —
policistronowy mRNA) koduje dwa białka rybosomowe (L35 i L20) oraz czynnik
białkowy związany z syntezą białka (IF3 — czynnik inicjacji translacji).
Translacja L35 i L20 jest hamowana przez L20, to znaczy że wewnątrzkomór-
kowe stężenie L20 reguluje wyrażanie się genów. Jego duże stężenie hamuje
translację. Hamujące działanie L20 wymaga związania się tego białka do mRNA
przed genem rpml. Mechanizm hamowania — represji nie jest znany. L20 może
po prostu blokować przyłączenie rybosomów do mRNA lub może samo wiązać
rybosom, z utworzeniem nieaktywnego kompleksu. Istnieje jednak wytłumacze-
nie alternatywne. Badania in vitro sugerują, że regulacja translacji jest związana
z wytworzeniem „pseudosupła" na RNA przed genem rpml. Być może, L20 sta-
bilizuje taki pseudosupeł, w którym zamknięta jest sekwencja Shine-Dalgarno
(sekcja 7. 6) i kodon inicjujący (sekcja 7. 6) dla genu rpml. W ten sposób hamowane
jest wiązanie rybosomów, co zapobiega translacji zarówno rpml, jak rplT (Chiarut-
tini, Milet i Springer (1996) EMBO Journal 15: 4402-4413].
(Patrz również sekcja 7. 6. 3. )

7. 8. 2 Regulony i inne globalne i wielogenowe systemy

Regulon jest systemem, w którym dwa lub więcej nie sąsiadujących genów i/lub
operonów (każdy z własnym promotorem) kontrolowanych jest przez tę samą

136
cząsteczkę regulatora. Wszystkie geny/operony mają podobne sekwencje regu-
lacyjne rozpoznawane przez regulator.

7. 8. 2. 1 Represja kataboliczna

Wzrost dwufazowy (sekcja 3. 4) udowadnia, że obecność laktozy niekoniecznie

prowadzi do indukcji operonu lac (sekcja 7. 8. 11), tzn. że indukcyjny wpływ allo-
laktozy jest zahamowany przez obecność glukozy. Glukoza również hamuje ope-
ron ara (sekcja 7. 8. 1. 1), nawet w obecności arabinozy. To są tylko dwa przykłady
represji katabolicznej („efektu glukozowego"). Jest to zjawisko powszechne
wśród bakterii, których komórki zużywają niektóre substraty węglowe/energe-
tyczne chętniej niż inne, nawet, gdy są one łatwiej dostępne. Molekularne pod-
stawy represji katabolicznej były niejasne aż do ostatnich lat. Obecny pogląd
zakłada istnienie przynajmniej dwóch różnych mechanizmów. Powstanie
sygnałów kontrolnych, niezależnie od mechanizmu, jest związane z systemem
transportu PTS (sekcja 5. 4. 2). Jeden z mechanizmów jest właściwy dla E. coli
i innych bakterii jelitowych, drugi spotykany jest prawie wyłącznie w bakteriach
gramdodatnich. Modele obu mechanizmów przedstawione są niżej.
Represja kataboliczna w bakteriach jelitowych. W organizmach tych
główną cząsteczką regulacyjną jest składnik IIA permeazy glukozowej z systemu
PTS (rys. 5. 12). Należy zauważyć, że składnik IIA tej permeazy jest cząsteczką
cytoplazmatyczną (tzn. „rozpuszczalną", ruchomą).
W nieobecności glukozy fosforylowana forma IIA (IIA~P) nie jest defosfory-
lowana przez IIB. W tych warunkach IIA-P aktywuje cyklazę adenylanową
i w ten sposób stymuluje syntezę cyklicznego AMP (cAMP, rys. 7. 12). cAMP
wiąże się z białkiem CRP (ang. cAMP receptor protein, zwane również CAP,
ang. catabolite activator protein) i aktywuje je.
Kompleks cAMP-CRP działa jak transkrypcyjny aktywator: wiąże się do pro-
motora operonu lac, ara i innych operonów, pozwalając na ich wyrażanie się
w obecności właściwych induktorów. Dokładny mechanizm aktywacji trans-
krypcji przez cAMP-CRP nadal nie jest znany. Badania operonów lac i gal suge-
rują jednak, że obecność cAMP-CRP nie jest konieczna po etapie wytworzenia
produktywnego „otwartego kompleksu" (sekcja 7. 5), a więc związek między
cAMP-CRP i polimerazą RNA jest tylko przejściowy [Tagami i Aiba (1998)
EMBO Journal 17: 1759-1767].

cAMP (3', 5'-cykliczny monofosforan adenozyny) jest syntetyzowany z ATP przez enzym cyklazę
adenylanową. Rozkład cAMP do AMP zachodzi z udziałem fosfodiesterazy cAMP. [Various roles of
cyclic AMP in prokaryotes (artykuł przeglądowy): Botsford i Harman (1992) MR 56: 100-122. ].

137
 W obecności glukozy niefosforylowany IIA wiąże się do permeaz różnych
cukrów (np. laktozy) w błonie, hamując ich pobranie. Wiadomo, że cukry te
indukują odpowiadające im operony, a więc opisane zjawisko nazywane jest
wykluczeniem induktora.
W niektórych wypadkach mechanizm podobny do działającego w bakteriach
gramdodatnich (patrz niżej) został wykryty w E. coli.
Represja kataboliczna w bakteriach gramdodatnich. Transkrypcja niektó-
rych katabolicznych operonów jest kontrolowana przez białko regulatora specy-
ficznego dla danego operonu, którego aktywność zależy od jego fosforylacji oraz
tego, które z białek PTS brało udział w fosforylacji. Każde białko regulatorowe
ma dwie kopie miejsca specyficznej fosforylacji. Kopie te nazywają się PRD (ang.
PTS regulation domain). Każde miejsce PRD może być fosforylowane przez
jeden z fosforylowanych pośredników systemu PTS: IIB lub Hpr (rys. 5. 12). Fos-
forylacja przez IIB prowadzi do inhibicji, tj. powoduje, że białko regulatora
hamuje transkrypcję z odpowiadającego mu operonu. Fosforylacja przez Hpr
stymuluje transkrypcję.
Zasada działania systemu jest następująca. W nieobecności induktora (sub-
stratu) składnik IIB danej permeazy jest fosforylowany i zdolny do przeniesienia
grup fosforanowych do miejsca PRD w cząsteczce regulatora, co prowadzi do
zahamowania ekspresji danego operonu. W obecności induktora, IIB~P przenosi
grupę fosforanową raczej na cząsteczkę induktora niż do odpowiedniego miejsca
PRD, a więc białko regulatora nie jest hamowane. Wobec jednoczesnego braku
glukozy (lub innego łatwo rozkładanego źródła węgla), Hpr~P może fosforylo-
wać miejsce PRD w cząsteczce regulatora — w ten sposób stymulowane jest
wyrażanie się danego operonu.
W obecności induktora i glukozy, grupy fosforanowe z IIB-P i Hpr~P są
zużywane do fosforylacji dwóch rodzajów cząsteczek wchodzących do komórki
(tj. induktora i glukozy), a wtedy oba miejsca PRD w białku regulatora pozostają
niefosforylowane. Brak stymulującej fosforylacji przez Hpr~P powoduje, że
białko regulatora jest nieaktywne, a więc operon nie jest wyrażany.
Zgodnie z przedstawionym modelem, wyrażenie się operonu wymaga, aby
jego regulator był fosforylowany, ale tylko przez Hpr~P (co zachodzi wyłącznie
wtedy, gdy nie ma glukozy, a induktor jest obecny). Operon jest nieaktywny, gdy
jedno z miejsc PDR fosforylowane jest przez IIB-P, drugie zaś przez Hpr~P (brak
induktora, brak glukozy) lub gdy oba miejsca nie są fosforylowane.
Niektóre z białek regulacyjnych zawierających miejsca PRD kontrolują ope-
rony działając jako antyterminatory zapobiegające przedwczesnej terminacji
transkrypcji w strukturach RNA zwanych terminatorami. Inne regulatory sty-
mulują inicjację transkrypcji.
W E. coli operon bgl związany z katabolizmem β-glukozydów, np. salicyny,
podlega regulacji przez białko nazywane BglG (antyterminator), zawierające
miejsca PRD. W nieobecności β-glukozydów BglG jest fosforylowane (inaktywo-
wane) przez składnik IIB białka BglF (permeazę β-glukozydową) i wtedy trans-
krypcja operonu bgl jest zablokowana.
[PDR regulators (artykuł przeglądowy): Stulke i wsp. (1998) MM 28:
865-874. ]

138
 7. 8. 2. 2 System SOS Ε. coli
System ten składa się z około 20 nie połączonych ze sobą genów wyrażających się,
gdy DNA jest uszkodzony lub nie może się replikować w wyniku działania pro-
mieniowania ultrafioletowego lub niektórych związków chemicznych. Wyrażenie
się systemu SOS może np. zatrzymać podział komórek, zwiększyć aktywność
naprawy DNA, wpływać na metabolizm energetyczny i hamować restrykcję.
W kontroli tej bierze udział białko LexA (produkt genu lexA). W normalnych
warunkach (DNA jest nieuszkodzony), LexA, prawdopodobnie w formie
dimeru, wiąże się w pobliżu promotorów genów SOS i hamuje ich transkrypcję.
Dla każdego genu SOS miejsce wiązania LexA („SOS box") charakteryzuje kon-
sensus 5'-CTGTN8ACAG-3' (Ns jest jakąkolwiek sekwencją złożoną z ośmiu
nukleotydów). Uszkodzenie DNA powoduje aktywację białka RecA (mechanizm
aktywacji nie jest znany). Aktywne RecA (oznaczone RecA*) funkcjonuje w spo-
sób nie enzymatyczny jako koproteaza, która stymuluje autokatalityczne prze-
cięcie LexA. Pozwala to na wyrażenie się genów SOS. Wynik eksperymentu
in vitro sugeruje, że przecięcie LexA (i derepresja genów SOS) zachodzi szybciej,
gdy miejsce chi (χ) (sekcja 8. 2. 1) znajduje się koło dwuniciowego przecięcia DNA.
Model zakłada, że obecność χ modyfikuje aktywność białek RecBCD i RecA, co
prowadzi do aktywacji RecA i przecięcia represora LexA [Anderson i Kowalczy-
kowski (1998) Cell 95: 975-979].
Produkt genu sulA należącego do systemu SOS hamuje tworzenie się septy
(sekcja 3. 2. 1) [SulA-FtsZ interaction: Huang, Cao i Luthenhaus (1996) JB 178:
5080-5085], a w następstwie hamuje podział komórkowy. Komórki rosną wtedy
w postaci filamentów nie mających sept. Zahamowanie podziałów komórko-
wych jest fizjologicznie korzystne dla komórki — daje jej czas do reperacji uszko-
dzonego DNA, co pozwala na kontynuację replikacji DNA (patrz część końcowa
sekcji 7. 3).
Naprawa DNA, włączając tę zachodzącą z udziałem endonukleazy UvrABC
(sekcja 7. 7. 1. 2), jest bardziej aktywna — geny uvrA i uvrB są składnikami systemu
SOS. Błędna reperacja prowadzi nie tylko do naprawy DNA, ale również do
zwiększenia liczby mutacji (sekcja 8. 1); zjawisko to nazywamy mutagenezą
SOS. W procesie tym RecA*, dzięki swej aktywności koproteazy, umożliwia
autokatalityczne przecięcie UmuD, z wytworzeniem aktywnego fragmentu
UmuD', który bierze udział w mutagenezie SOS. Mechanizm powstawania
mutacji w tym procesie nie jest znany, ale zazwyczaj jest związany z reperacyjną
syntezą DNA na nici matrycowej zawierającej „uszkodzenie" — np. dimer piry-
midynowy (dwie pirymidyny połączone kowalencyjnie). Synteza ta (zwana syn-
tezą „przez uszkodzenie") zachodzi z udziałem zmodyfikowanej polimerazy
DNA (powstałej w wyniku indukcji systemu SOS), która ze względu na brak spe-
cyficzności tworzenia par zasad może wprowadzić niewłaściwą zasadę(y) do
DNA. Późniejsza naprawa uszkodzenia przez jego wycięcie i następująca po tym
replikacja DNA prowadzi do mutacji. In vitro, przechodząca przez uszkodzenie,
synteza DNA na nici matrycowej zawierającej miejsce pozbawione zasady
(sekcja 7. 7. 1. 3) wymaga polimerazy III DNA, RecA, UmuD' i UmuC.
RecA, po naprawie uszkodzonego DNA, jest inaktywowane, a LexA znowu
hamuje system odpowiedzi SOS.

139
 Należy nadmienić, że wyrażenie się systemu SOS aktywuje lizę bakterii lizo-
gennych (patrz sekcja 9. 2. 1).
System SOS może być indukowany np. przez antybiotyki chinolonowe (np.
kwas nalidyksowy) i toksynę CcdB kodowaną przez plazmid F [Couturier,
Bahassi i van Helden (1998) TIM 6: 269-275].
Główna funkcja systemu SOS może być określona jako adaptacyjna, genety-
czna odpowiedź na niesprzyjające/inhibicyjne czynniki. W tych warunkach
populacja bakteryjna będzie czerpać niewątpliwe korzyści z wydajnej naprawy
DNA. Może się również adaptować przez częstsze powstanie kombinacji geno-
wych zwiększających zdolność do przeżycia. Znajduje to odzwierciedlenie
w lepszej zdolności do naprawy DNA, jak również w mutagenezie SOS
prowadzącej do powstania korzystnych (ale również letalnych) mutacji.
Obniżenie restrykcji zwiększa również możliwość wykorzystania obcego DNA,
który został wprowadzony do komórki. Zahamowanie podziałów komórkowych
może natomiast pomóc w oszczędzaniu energii i wykluczyć komórki potomne
niezdolne do życia.

7. 8. 2. 3 Odpowiedź na szok cieplny

Szok cieplny (nagłe podwyższenie temperatury) prowadzi do charakterystycznej
odpowiedzi adaptacyjnej w różnych organizmach, od bakterii do roślin
i zwierząt. Odpowiedź ta związana jest ze wzrostem syntezy tzw. białek szoku
cieplnego (HSPs, ang. heat-shock proteins).
W E. coli odpowiedź na szok cieplny następuje po podwyższeniu tempera-
tury od 30°C do 42°C. Może być również indukowana przez takie czynniki stre-
sowe jak promieniowanie ultrafioletowe, etanol i wewnątrzkomórkowe nagro-
madzenie nieprawidłowych, heterologicznych białek (co może wynikać z ich
nadprodukcji, sekcja 8. 5. 11. 4 (d)).
Niektóre z 17 białek szoku cieplnego E. coli zwalczają uszkodzenia powodo-
wane przez stres. Na przykład, białka opiekuńcze (molekularne chaperony)
GroES, GroEL i DnaK (sekcja 7. 6) zapobiegają nieprawidłowemu zwinięciu
białek i agregacji białek nie zwiniętych. Proteaza Lon (produkt genu lori) degra-
duje uszkodzone i nietypowe białka. Przykładem innych białek opiekuńczych są
produkty genów dna], rpoD i lysU.
W wyniku podwyższenia temperatury synteza HSPs szybko zwiększa się,
osiągając maksimum w ciągu minut, a następnie maleje do nowego, ustalonego
poziomu — wyższego niż w niższej temperaturze.
U E. coli kontrola regulonu szoku cieplnego jest związana z produktem genu
rpoH (poprzednio nazywanego htpR). RpoH to czynnik sigma (sekcja 7. 5), σ 32 ,
który jest (przejściowo) syntetyzowany w większej ilości po szoku cieplnym.
Czynnik σ32 pozwala na bardziej wydajną transkrypcję z promotorów genów
HSP, a więc powoduje zwiększoną syntezę białek HSP.
Wzrost stężenia σ32 po szoku cieplnym wynika głównie ze zwiększonej
translacji i stabilizacji (raczej, niż ze zwiększonej transkrypcji rpoH).
Indukowana temperaturą translacja mRNA rpoH jest związana ze zmianą
„drugorzędowej struktury" mRNA powstałej w wyniku tworzenia par zasad
między regionem znajdującym się zaraz za kodonem startu (ang. „downstream

140
box" — patrz sekcja 8. 5. 11. 2) i innym regionem w sekwencji kodującej. Sadzi się,
że ta drugorzędowa struktura hamuje translację w zwykłych warunkach, a efekt
ten jest zniesiony podczas szoku cieplnego [Yuzawa i wsp. (1993) Ν AR
21: 5449-5455].
Ostatnie badania wskazują, że translacja σ rzeczywiście jest indukowana
32

wpływem temperatury na σ mRNA. Podwyższona temperatura destabilizuje

32

strukturę drugorzędową, a więc sam mRNA może odgrywać rolę sensora tempe-
ratury (= termometru RNA) dla wyrażenia się σ [Storz (1999) GD 13; 633-636].
32

Czynnik σ jest syntetyzowany również w niższej temperaturze, ale wówczas

32

ma krótki okres półtrwania (około 1 min) i tworzy połączenia z DnaK, DnaJ

i GrpE, w następstwie czego jest degradowany przez proteazę FtsH. Podczas
szoku cieplnego DnaK wiąże się preferencyjnie ze zdenaturowanymi białkami.
Związanie DnaK pozwala σ, funkcjonować jako czynnik σ, co w rezultacie pro-
32

wadzi do zwiększonej syntezy HSP [patrz np. Gamer i wsp. (1996) EMBO Journal
15: 607-617].
Szok cieplny w innych bakteriach. U niektórych bakterii indukcja odpowie-
dzi na szok cieplny regulowana jest przez odmienne mechanizmy. Na przykład,
w pewnych wypadkach sekwencja regulacyjna umiejscowiona jest za genami
szoku cieplnego. Jest to odwrócone powtórzenie sekwencji zwane CIRCE (ang.
controlling inverted repeat of chaperone expression), którego istnienie zostało
stwierdzone w Bacillus, Clostridium i w pewnych bakteriach gramujemnych.
Kontrola u Bradyrhizobium japonicum składa się z co najmniej dwóch różnych
regulujących systemów, obejmujących CIRCE i czynnik podobny do σ32 [Narber-
haus i wsp. (1996) JB 178; 5337-5346].
Wyżej przedstawiono ustalony pogląd na regulację bakteryjnych genów
szoku cieplnego. Niedawno doniesiono o istnieniu negatywnej regulacji, zgodnie
z którą białko represora, w połączeniu z działającą w pozycji cis sekwencją
DNA, hamuje transkrypcję w zwykłych, fizjologicznych warunkach [Norberhaus
(1999) MM 31: 1-8].

7. 8. 2. 4 Odpowiedź na szok zimna

Gwałtowne obniżenie temperatury może powodować zmianę w wyrażaniu się
genów u Prokaryota i Eukaryota. U E. coli zjawisko to nazywane jest szokiem
zimna.
Odpowiedź na szok zimna następuje, gdy temperatura obniży się z 37°C
do 10°C (lub, zazwyczaj, spadek przekracza 13°C). Wzrost zatrzymuje się, a póź-
niej znowu zostaje wznowiony (ale z mniejszą szybkością) po fazie zastoju
trwającej około 4 godzin. Faza zastoju jest spowodowana wybiórczym zahamo-
waniem translacji, a wznowienie wzrostu jest jednoczesne ze wznowieniem syn-
tezy białka.
Szok zimna charakteryzuje się między innymi: 1) indukcją /wzmożoną syn-
tezą białek szoku zimna, 2) nieprzerwaną syntezą niektórych białek związanych
z translacją (mimo ogólnego zablokowania syntezy białka), 3) represją białek
szoku cieplnego. Uważa się, że jest to odpowiedź adaptacyjna.
Do białek szoku zimna zalicza się CspA — małe białko, złożone z 70 amino-
kwasów, które jest indukowane (natychmiast po obniżeniu się temperatury) na

141
poziomie translacji. Białko to, być może, funkcjonuje w połączeniu z kwasami
nukleinowymi. Prawdopodobnie działa ono jako: 1) aktywator translacji w nis-
kiej temperaturze; 2) białko pomocnicze (dla RNA) działające w niskiej tempera-
turze, zapobiegające tworzeniu się drugorzędowych struktur RNA, co powo-
duje, że może być ono istotne w translacji RNA w niskiej temperaturze [Jiang,
Hou i Inouye (1997) JBC 272: 196-202]; i 3) czynnik hamujący translację określo-
nych cząsteczek mRNA. W rzeczywistości rola CspA może nie być ograniczona
do niskiej temperatury, ponieważ białko to jest normalnie produkowane przez
E. coli podczas wczesnej fazy wzrostu wykładniczego w 37°C (tj. w warunkach
niestresowych) [Brandi i wsp. (1999) EMBO Journal 18: 1653-1659].
Do białek szoku zimna zaliczamy: RecA — inicjujący czynnik 2 (IF-2), który
uczestniczy w wiązaniu N-formylometionylo-tRNA do podjednostki rybosomu
30S w momencie startu translacji (sekcja 7. 6), NusA funkcjonujące na etapie ter-
minacji transkrypcji i podjednostkę α gyrazy DNA (topoizomerazy — sekcja
7. 2. 1). Jak dotychczas, nie wykryto indukowanych zimnem czynników σ.
Nie jest znany sposób regulacji genów szoku zimna. Sugeruje się regulacyjną
rolę CspA w aktywacji transkrypcji. (Samo białko CspA jest regulowane prawdo-
podobnie przez represor, który traci aktywność w niskich temperaturach).
Drobne cząsteczki, ppGpp i pppGpp (G — reszta guanozynowa, ρ — reszta fos-
foranowa), mogą pełnić rolę regulacyjną. Po obniżeniu temperatury stężenie tych
cząsteczek zmniejsza się. Spadek temperatury jest związany ze wzrostem syn-
tezy niektórych białek szoku zimna.
Odpowiedź szoku zimna może być również wywołana przez niektóre inhibi-
tory translacji, np. antybiotyki takie jak chloramfenikol, erytromycyna i tetra-
cyklina. Czynniki te (wiele z nich również zmniejsza stężenie (p)ppGpp) wywie-
rają wpływ podobny jak obniżenie temperatury, co sugeruje, że wspólny czynnik
— zmniejszenie zdolności komórki do translacji — może pełnić ważną rolę
w odpowiedzi na szok zimna. Zgodnie z jednym z modeli, obniżenie się tempe-
ratury powoduje, że zdolność translacyjna komórki staje się zbyt mała w porów-
naniu z ilością aminoacylowanych tRNA (jest to stan przypominający obecność
zbyt dużej ilości pokarmu). Stan ten sygnalizuje zmniejszenie stężenia
(p)ppGpp, czego następstwem jest indukcja odpowiedzi na szok zimna [Jones
i Inouye (1994) MM 11: 811-818].

7. 8. 2. 5 Odpowiedź ścisła

Głodzenie (np. brak ważnego aminokwasu) wywołuje u bakterii odpowiedź

ścisłą — polegającą na zmniejszeniu syntezy białek, rRNA i różnych innych
składników komórkowych oraz na zahamowaniu syntezy DNA. Odpowiedź ta
pozwala oszczędzać energię i budulec.
Odpowiedź jest spowodowana obecnością nie aminoacylowanego tRNA
w miejscu A rybosomu (patrz rys. 7. 9). To stymuluje związany z rybosomem
enzym, pirofosfotransferazę (= RelA, produkt genu relA, czynnik odpowiedzi
ścisłej), do syntezy ppGpp (G — guanozyna, ρ — fosforan) z GTP (lub GDP)
i ATP. ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny) jest przykładem alarmonu,
małej cząsteczki, która gromadzi się w warunkach stresu i stanowi sygnał do
zmiany metabolizmu komórkowego.

142
 ppGpp może hamować rozpoczęcie syntezy białek, np. przez oddziaływanie
z białkowym, inicjującym czynnikiem IF-2, co prowadzi do zablokowania
wiązania kompleksu tRNA do rybosomu. Wykazano, że ppGpp hamuje
zarówno syntezę białka, jak i rRNA [Svitil, Cashel i Zyskind (1993) JBC 268:
2307-2311].
ppGpp może z pewnością zwiększać transkrypcję niektórych operonów
związanych z biosyntezą określonych aminokwasów (np. histydyny). W ten spo-
sób ppGpp pomaga utrzymać właściwą równowagę ilości aminokwasów
w komórce. Na przykład, jeśli poziom histydyny jest dostatecznie niski, aby
wywołać odpowiedź ścisłą, zwiększenie syntezy ppGpp pozwala odzyskać rów-
nowagę przez zwolnienie syntezy białka i stymulację operonu his.
W komórkach z mutacją relA, całkowicie znoszącą funkcje genu, nie obser-
wuje się odpowiedzi ścisłej po głodzeniu aminokwasowym; mówimy, że mutan-
ty te są zrelaksowane.

7. 8. 2. 6 Odpowiedź prowadząca do tolerancji na zakwaszenie

Szok kwasowy wywołuje odpowiedź (ATR, ang. acid tolerance response)
związaną z syntezą tzw. białek szoku kwasowego (ASPs, ang. acid-shock prote-
ins). Sądzi się, że odpowiedź ta pozwala naprawić uszkodzenia powodowane
obecnością kwasów, jak również zwiększa przeżycie w niskim pH. U Salmonella
typhimurium odpowiedź ta jest procesem dwuetapowym [Foster (1991) JB 173:
6896-6902]. Zarówno synteza, jak i zahamowanie syntezy białek komórkowych
zachodzi w stadium poprzedzającym szok (pH około 6), a później w określonym,
niskim pH, komórki mogą przeżyć nawet w pH 3, 3. U Salmonella typhimurium
i w innych patogenach przewodu pokarmowego adaptacja i przeżycie w niskim
pH jest istotne dla ich chorobotwórczości, ponieważ infekcja następuje zazwyczaj
przez żołądek (bardzo kwaśne środowisko).
Po zwiększeniu kwasowości środowiska S. typhimurium syntetyzuje przynaj-
mniej 50 białek. Wyrażenie się genów ASP kontrolują dwa białka regulacyjne:
czynnik sigma σs (RpoS, produkt genu rpoS) i białko Fur (produkt genu fur).
RpoS, samo indukowane podczas odpowiedzi na szok kwasowy, kontroluje
część genów ASP. Mutanty nie posiadające funkcji (σs mogą nadal częściowo
odpowiadać na ten szok wskutek aktywności białka Fur, które reguluje geny
ASP niezależnie od (σs Co ciekawe, Fur reguluje również funkcje związane
z pobieraniem żelaza przez S. typhimurium (sekcja 11. 5. 5), jednak rola tego białka
w ATR i w pobieraniu żelaza jest fizjologicznie i genetycznie odmienna [Hali
i Foster (1996) JB 178: 5683-5691].
W komórkach E. coli szok kwasowy (lub brak tlenu) indukuje wyrażanie się
genów kodujących: dekarboksylazę glutaminianową i hipotetyczny system
transportu y-aminomaślanu (produktu dekarboksylacji glutaminianu) przez
błony. (Wyrażanie się tych genów, gadB i gadC, jest regulowane przez czynnik σs
Jeden z modeli zakłada, że glutaminian jest pobierany i dekarboksylowany
w reakcji zużywającej proton. y-Aminomaślan jest następnie eksportowany
(przez transporter), a to pozwala utrzymać równowagę pH. Inny model propo-
nuje, że GadB i GadC są składnikami energotwórczego systemu dzięki swojej
zdolności do transportu protonów. Powstająca pmf służy do syntezy ATP przez

143
ATPazę zlokalizowaną w błonie. [Possible function of gadCB products: Smali
i Watreman (1998) TIM 6: 214-216].

7. 8. 2. 7 Składanie bakteryjnej rzęski

Struktura i składanie rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1, rys. 2. 8) wymaga około 50 różnych
typów białek. Składanie jest wysoce zorganizowane — poszczególne części
dodawane są w ściśle określonym porządku, co znajduje odzwierciedlenie
w kolejności wyrażania się odpowiadających im genów. Niektóre z istotnych
genów są wymienione w tabeli 7. 3.
W E. coli najwcześniej wyrażane geny (geny klasy I) kodują pewne aktywa-
tory transkrypcji, które są prawdopodobnie potrzebne do wyrażania się genów
kodujących części składowe ciałka podstawowego i haka. Wyrażenie się genów
klasy I i II konieczne jest do wyrażenia się genów klasy III (do ich produktów
zalicza się białko budujące podjednostki włókna, flagellinę).
Transkrypcja genów klasy III zależy od czynnika σ (sekcja 7. 5) kodowanego
przez geny klasy II. Czynnik σ (białko FliA, produkt genu fliA) jest przejściowo
inaktywowany przez czynnik anty-σ (FglM, produkt genu flgM) do czasu, gdy
zostanie zakończone składanie ciałka podstawowego i haka. Zakończenie
składania haka stanowi sygnał umożliwiający wydalenie FglM z komórki (przez
kanał osiowy), co pozwala na aktywację transkrypcji genów klasy III przez FliA.
Jak widać, geny kodujące ostami etap konstrukcji rzęski są kontrolowane bezpo-
średnio przez stan złożenia jej poprzednich części.
Genetyczna kontrola składania rzęski była opisana w przeglądowej pracy
Shapiro [(1995) Cell 80: 525-527].

144
 7. 8. 2. 8 Odpowiedź na stres tlenowy
W pewnych warunkach bakterie mogą być uszkodzone lub zabite przez zewnę-
trzne lub wewnętrzne reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen spe-
cies), takie jak nadtlenek wodoru (H2O2), rodnik hydroksylowy (·ΟΗ) czy
ponadtlenek (-O2-). Reaktywne formy tlenu wchodzą w reakcję z kwasami nukle-
inowymi, białkami i tłuszczami. Bakterie patogenne są narażone na reaktywne
formy tlenu w fagolizosomie (sekcja 11. 4. 1). Wewnątrzkomórkowe, reaktywne
formy tlenu mogą powstawać np. w wyniku nieprawidłowej regulacji metaboli-
zmu żelaza. W ten sposób nadmiar żelaza (przeciążenie komórki żelazem)
w E. coli może katalizować powstanie rodników hydroksylowych z nadtlenku
wodoru (reakcja Fentona) [Touati i wsp. (1995) JB 177: 2305-2314].
Niektóre bakterie odpowiadają na stres tlenowy przez zwiększenie syntezy
enzymów przeciwutleniających. Do nich zalicza się dysmutazę ponadtlenkową
(SOD, ang. supweoxide dismutase), która degraduje ponadtlenek do H 2 O 2 , oraz
katalazę i peroksydazę degradujące nadtlenki. U E. coli jeden z regulonów stresu
tlenowego kontrolowany jest przez białko OxyR. Utlenione, a tym samym akty-
wne białko OxyR umożliwia transkrypcję genów katG, ahpC i innych. KatG (kata-
laza) katalizuje reakcję 2H 2 O 2 -» 2H2O + O2. AlpC jest podjednostką hydropero-
ksydazy alkilowej, enzymu degradującego nadtlenki organiczne. W innym regu-
lonie indukowane, zawierające mangan białko SOD (produkt genu sodA) jest
pozytywnie regulowane (w obecności nadtlenku) przez produkty genów
soxR/soxS.
Należy podkreślić, że niedobór żelaza może również wywołać stres tlenowy
— być może przez obniżoną aktywność przeciwutleniających enzymów zawie-
rających hem.
Kontrola stresu tlenowego u mikobakterii jest słabiej poznana. Niektóre utle-
niające enzymy, włączając KatG, występują w Mycobacterium tuberculosis, ale
tylko nieaktywna forma genu pokrewnego oxyR została opisana w grupie
M. tuberculosis. Białko IdeR negatywnie regulujące syntezę syderoforów (sekcja
11. 5. 5) prawdopodobnie zdolne jest także do pozytywnej regulacji niektórych
enzymów przeciwutleniających; mechanizm tej regulacji nie jest znany.
Czynniki związane ze stresem tlenowym wpływają również na wrażliwość
M. tuberculosis na ważny przeciwgruźliczy lek — izoniazyd. Wewnątrzkomór-
kowa, zależna od obecności nadtlenków aktywność KatG zmienia izoniazyd
w formę aktywną, która hamuje enzymatyczny etap(y) syntezy ważnych
składników ściany komórkowej, kwasów mikolowych. Bakterie nie posiadające
tych kwasów są również wrażliwe na izoniazyd, co sugeruje istnienie dodatko-
wych miejsc działania antybiotyku. Mutanty katG i ahpC charakteryzują się
zwiększoną opornością na izoniazyd. U prądków wzajemne związki między
regulacją żelaza, stresem tlenowym i wrażliwością na izoniazyd nie są w pełni
wyjaśnione [Dussurget i Smith (1998) TIM 6: 354-358].

7. 8. 3 Rekombinacyjna regulacja wyrażania się genów

Patrz — zlokalizowana rekombinacja (sekcja 8. 2. 2).
145
 7. 8. 4 Regulacja wyrażania się genów
związana z szybkością rozpadu mRNA
W niektórych przypadkach wyrażanie się bakteryjnych genów jest regulowane
przez szybkość rozpadu odpowiadających im mRNA; „rozpad" oznacza enzy-
matyczną degradację (sekcja 7. 6. 1). Taka regulacja była badana między innymi
w operonie puf fotosyntetyzującej bakterii Rhodobacter capsulatus. Geny puf
(kodujące składniki aparatu fotosyntezy) są transkrybowane wspólnie jako poje-
dynczy transkrypt (tj. policistronowy mRNA). (Przykład policistronowego
mRNA był pokazany na rys. 7. 11). Co ciekawe, różne części policistronowego puf
mRNA rozpadają się z różną szybkością, tzn. niektóre sekwencje trwają dłużej
niż inne. W ten sposób, odpowiednie geny wyrażane są we właściwym czasie,
umożliwiając optymalną fotosyntezę i wzrost komórek. Specjalne regiony sty-
mulujące i hamujące rozpad policistronowego mRNA mogą być odpowiedzialne
za obserwowaną różną szybkość rozpadu [Klug (1993) MM 9: 1-7].

7. 8. 5 Regulacyjna rola translacyjnej atenuacji

w wyrażaniu się genów
U niektórych gramdodatnich bakterii obecność chloramfenikolu (sekcja 15. 4. 4)
indukuje gen cat. Gen ten koduje acetylotransferazę chloramfenikolową —
enzym, który acetyluje chloramfenikol i inaktywuje go. Regulacyjną rolę
w indukowanej oporności na chloramfenikol pełni proces zwany translacyjną
atenuacją.
Transkrypt genu cat zawiera krótką sekwencję wiodącą, po której (w tym
samym transkrypcie) następuje sekwencja kodująca cat. W nieobecności chloram-
fenikolu gen cat jest transkrybowany, ale nie ulega translacji, ponieważ miejsce
wiązania rybosomów jest „zniekształcone" przez miejscowe tworzenie się par
zasad między rybonukleotydami. Sekwencja wiodąca jednak (która ma własne
miejsce wiązania rybosomów) ulega niezakłóconej translacji. W obecności chlo-
ramfenikolu, rybosomy zaangażowane w translację sekwencji wiodącej zostają
zatrzymane, co powoduje naprawę „zniekształconego" miejsca cat wiążącego
rybosomy, a w konsekwencji pozwala na translację sekwencji kodującej cat. Dla-
czego translacja cat nie jest hamowana przez chloramfenikol (który hamuje syn-
tezę białka)? Do indukcji cat wystarcza mniejsze stężenie chloramfenikolu niż jest
konieczne do zahamowania syntezy białka. Przyczyną tego zjawiska jest, być
może, udział samego peptydu wiodącego (jak również chloramfenikolu)
w zatrzymaniu rybosomów [Gu, Rogers i Lovett [(1993) JB 175: 5309-5313].
Inny przykład translacyjnej atenuacji stanowi regulacja genu pyrC w E. coli.
Gen ten koduje enzym, dihydroorotazę, konieczną do syntezy pirymidyn, a co za
tym idzie kwasów nukleinowych. Transkrypcja pyrC może się rozpocząć
w jakimkolwiek z kilku przyległych nukleotydów na matrycy DNA. Rozpoczęcie
transkrypcji w określonym nukleotydzie zależy od dostępności pirymidyn
w komórce (sensorem, czyli czujnikiem jest stosunek CTP/GTP). Większość
transkryptów pyrC syntetyzowanych w obecności dostatecznej ilości pirymidyn
umożliwia parowanie się RNA-RNA w regionie sekwencji Shine-Dalgarno, co

146
blokuje związanie się rybosomów i wyrażanie się genów. Kiedy poziom pirymi-
dyn jest niski, większość transkryptów ma odmienne miejsce startu, wyklu-
czające tworzenie się par zasad, co umożliwia syntezę enzymu.

7. 8. 6 Regulacja wyrażenia się genów przez przekazanie sygnału

Bakterie mogą wykryć wiele sygnałów środowiskowych (takich jak zmiany
osmolalności) przez systemy sensorów zlokalizowanych w osłonie komórki.
W obrębie komórki sygnały te działają po przekazaniu ich przez dwuskładni-
kowe systemy regulacyjne. Pierwszym składnikiem tego systemu jest kinaza
histydynowa, enzym, który zdolny jest do ATP-zależnej autofosforylacji (w miej-
scu aktywnym zawierającym histydynę) i do przeniesienia reszty fosforanowej
na inną cząsteczkę. W obecności odpowiednich sygnałów środowiskowych,
kinaza histydynowa przenosi fosforan na resztę asparaginianową drugiego
składnika tego systemu — białka regulatora (odpowiadającego na sygnał). Po
fosforylacji, białko regulatora może zmienić wyrażanie się niektórych genów, np.
przez kontrolę ich transkrypcji, i w ten sposób wywołać odpowiedź na sygnał
środowiskowy [Histidine kinases and signal transduction (artykuł przeglądo-
wy): Alex i Simon (1994) TIG 10: 133-138].
W niektórych wypadkach sygnał środowiskowy działa bezpośrednio na
kinazę, regulując jej aktywność, a więc kinaza jest sensorem. Na przykład,
u E. coli zwiększenie osmolalności stymuluje aktywność kinazową sensora,
EnvZ, umiejscowionego w osłonach komórkowych. EnvZ przenosi grupę fosfo-
ranową na białko regulacyjne, OmpR, które wówczas powoduje wzrost trans-
krypcji genu kodującego porynę OmpC (sekcja 2. 2. 9. 2) i hamuje transkrypcję
genu kodującego porynę OmpF. Co za tym idzie, jeśli osmolalność jest wysoka,
błona zewnętrzna zawiera więcej OmpC (które tworzy nieco mniejsze pory)
niż OmpF.
Wzrost ciśnienia osmotycznego w E. coli prowadzi również do zwiększenia
pobierania jonów potasowych ze środowiska (sekcja 3. 1. 8) — np. na drodze indu-
kowanego systemu transportu, Kdp, charakteryzyjącego się dużym powinowac-
twem. System ten (związany z błoną cytoplazmatyczną) składa się z kompleksu
białek Kdp A, KdpB i KdpC (kodowanych przez operon kdp ABC). KdpB jest
ATPazą, która hydrolizuje ATP dostarczając energii do pobrania K+. Wyrażanie
się operonu kdp jest zwiększone przy małym turgorze, co stymuluje sensorową
kinazę KdpD w błonie cytoplazmatycznej. Po aktywacji, KdpD przenosi grupy
fosforanowe na KdpE — cytosolowy regulator białkowy zwiększający translację
operonu.
Dwuskładnikowe systemy regulują wiele aktywności komórkowych, włącza-
jąc syntezę czynników wirulencji u bakterii patogennych. Na przykład, u Clostri-
dium perfringens dwuskładnikowy system reguluje geny kodujące toksyny
i odpowiedzialne za zgorzel gazową [Cheng i Rood (1997) RMM 8 (supple-
ment 1): S25-S27]. U Salmonella typhimurium system SSrA-SsrB reguluje trans-
krypcję genów, składników wyspy patogenności SPI-2, których produkty są
potrzebne do wewnątrzkomórkowego wzrostu patogena [Cirillo i wsp. (1998)
MM 30: 175-188]. (Patrz również sekcja 10. 1. 2 i zwijanie białek w sekcji 7. 6).

147
 W niektórych wypadkach sensor (= receptor) i kinaza są różnymi cząstecz-
kami. Sygnały cząsteczkowe wykrywane są przez sensor, który reguluje aktyw-
ność kinazy. Na przykład, sytuacja taka istnieje w szlaku chemotaksji E. coli
(patrz rys. 7. 13), kiedy kinaza kontroluje dwa różne białka regulacyjne.
U B. subtilis przeniesienie sygnału podczas rozpoczęcia sporulacji związane
jest z transferem fosforu (patrz sekcja 7. 8. 6. 1 i rys. 7. 14).

7. 8. 6. 1 Początek tworzenia endospory u Bacillus subtilis

Kiedy wzrost zaczyna być ograniczony z powodu niedoboru substancji pokar-
mowych, B. subtilis przestawia swój metabolizm. Podczas procesu dostosowywa-
nia się do nowych warunków geny są indukowane i hamowane. Nie obserwuje
się gwałtownego przejścia od aktywnego wzrostu do aktywnej sporulacji. Prze-
ciwnie, po wzroście wykładniczym (faza log) następuje okres przejściowy,
w czasie którego jednocześnie obserwuje się funkcje związane ze wzrostem
i z przeżyciem [Transition state in B. subtilis (artykuł przeglądowy): Strauch
(1993) PNARMB 46: 121-153]. W tym czasie zapada decyzja, czy utrzymać
wzrost wegetatywny charakteryzujący się niskim poziomem metabolizmu, czy
rozpocząć sporulację.
Oczywiste jest, że sporulacja jest etapem bardzo ważnym, a zanim ostateczna
decyzja zostanie podjęta, komórka musi zebrać i „zinterpretować" sygnały
pochodzące z różnych źródeł, zarówno zewnętrznych, jak i wewnętrznych. Na
przykład, jednym z ważnych sygnałów jest stężenie wapnia — sporulacja jest
zahamowana, gdy stężenie wapnia zmniejszy się poniżej 2 μΜ. (W zrozumieniu
znaczenia tego ograniczenia pomoże przypomnienie faktu, że rdzeń endospory
zawiera duże ilości dipikolinianu wapnia (sekcja 4. 3. 1); jeśli sporulacja zaczęłaby
się przy niedostatecznym stężeniu wapnia, proces mógłby zostać przerwany
w stadium pośrednim).
Sygnały pobudzające sporulację są rozpoznawane przez przynajmniej dwa
białkowe sensory: kinazę A (KinA) i kinazę Β (KinB). Nie są znane sygnały akty-
wujące te kinazy. Po odebraniu odpowiedniego sygnału, pochodzącego ze śro-
dowiska zewnętrznego lub wewnętrznego, kinazy ulegają ATP-zależnej autofos-
forylacji i przenoszą grupy fosforanowe na białko Spo0F — pierwszy składnik
systemu transferu fosforu (rys. 7. 14). Spo0F działa więc jako pierwszy łącznik
przekazujący sygnały z różnych wewnętrznych i zewnętrznych źródeł. W dal-
szych etapach transferu fosforu zachodzi fosforylacja białek Spo0B i Spo0A. Fos-
forylowana (tj. aktywna) forma Spo0A oznaczona jest jako Spo0A~P. Wewnątrz-
komórkowe stężenie Spo0A~P jest prawdopodobnie kluczowym czynnikiem
w podjęciu wyboru między sporulacją a kontynuacją wzrostu wegetatywnego.
Jak pokazano na rysunku 7. 14, Spo0A~P jest regulowane negatywnie (defos-
forylowane) przez fosfatazę Spo0E. Inne fosfatazy, nie pokazane na rysunku, są
także pomocne w regulacji stężenia Spo0A~P, na drodze pośredniej, przez
wybiórczą defosforylację Spo0F~P. Fosfatazy te, RapA i RapB, same również
podlegają regulacji (na poziomie transkrypcji) zależnej od fizjologicznego stanu
komórki. A więc, wydaje się, że zajście sporulacji zależy od wyniku zmagań mię-
dzy kinazami (pobudzającymi sporulację) a fosfatazami (hamującymi sporulację)
[Perego (1998) TIM 6: 366-370].

148
 7. 8. 7 Regulacja wyrażania się genów przez zmianę ramki odczytu
Czasami synteza (lub skład) polipeptydu są regulowane na poziomie translacji
(rys. 7. 9e). Określona sekwencja nukleotydów powoduje „przesunięcie się"
rybosomów na transkrypcie. Zazwyczaj jest to przesunięcie „+1" (przesunięcie
do przodu, zgodnie z kierunkiem transkrypcji) albo „-1" (przesunięcie do tyłu,
przeciwnie do kierunku transkrypcji). Oczywiście, takie przesunięcie wpływa
na wszystkie następne kodony transkryptu (porównaj z mutacjami prowa-
dzącymi do zmiany ramki odczytu, rys. 8. 1b). Zmiana ramki odczytu może pro-
wadzić do powstania nowego kodonu nonsensownego, co powoduje przedwcze-
sne zakończenie translacji (i utworzenie krótszego polipeptydu). Zmiana ramki
odczytu może również znieść działanie istniejącego kodonu kończącego transla-
cję. Znany jest wypadek, że zmiana ramki odczytu prowadząca do translacji
całego transkryptu zachodzi, gdy ilość polipeptydu jest mała, natomiast nie
zachodzi (kodon kończący translację nadal funkcjonuje), gdy ilość polipeptydu
jest wystarczająca.
Zmiana ramki odczytu jest potencjalnym mechanizmem powodującym
powstanie nowych białek powierzchniowych, a to prowadzi do zmienności anty-
genowej (sekcja 11. 5. 3).
[Translational frame-shifting (artykuł przeglądowy): Engelberg-Kulka i Scho-
ulaker-Schwarz (1994) MM 11: 3-8. ]

7. 8. 8 Metylacja DNA jako mechanizm kontrolny

Poreplikacyjna metylacja DNA (modyfikacja: sekcja 7. 4) chroni chromosom
przed własnymi enzymami komórkowymi. Sugeruje się, że po replikacji miejsce
origin chromosomu (oriC) pozostaje początkowo przez jakiś czas hemimetylo-
wane (tzn. tylko jedna nić jest metylowana). Czas potrzebny do metylacji drugiej
nici (co jest konieczne dla funkcjonalności oriC) może pełnić rolę czynnika regu-
lującego inicjację replikacji chromosomu podczas cyklu komórkowego (sekcja
3. 2. 1).
U E. coli metylaza Dam (kodowana przez gen dam) metyluje adeninę
w pozycji N-6 w sekwencji 5'-GATC-3'. Jeżeli taka Dam-metylacja nastąpi
w promotorze, w konsekwencji może to wpłynąć na wyrażanie się niektórych
genów. Na przykład, Dam-metylacja w promotorze genu kodującego transpo-
zazę na transpozonie Tn10 (transpozycja: sekcja 8. 3) hamuje syntezę transpozazy,
a w związku z tym przez większą część cyklu życiowego hamuje transpozycję
(wbudowanego w chromosom) Tn10. W czasie replikacji DNA zahamowanie
to jest przejściowo znoszone, natychmiast po przejściu widełek replikacyjnych
przez gen transpozazy (rys 7. 8), ale przed zajściem metylacji DNA. W ten sposób
transpozycja Tnl0 jest zahamowana podczas replikacji DNA (a więc jest po-
łączona z cyklem komórkowym).

149
(a) Receptory — nazywane chemotaktycznymi białkami przyjmującymi grupę metylową (MCPs,
ang. metyl-accepting chemotaxis proteins) występują w błonie cytoplazmatycznej, zaś ich regiony
funkcjonalne znajdują się w peryplazmie i cytoplazmie. Istnieją różne typy MCP, a każdy z nich roz-
poznaje własny zasięg chemoefektorów/bodźców środowiskowych. W komórce istnieje kilkaset
MCP, które są kodowane przez geny lap, tar, trg i tsr. Niektóre chemoefektory (np. asparaginian,
seryna) wiążą się bezpośrednio do MCPs, ale, na przykład, ryboza i niektóre inne cukry najpierw
tworzą kompleks z pewnymi białkami peryplazmatycznymi, a dopiero potem się wiążą.
Związanie/uwolnienie chemoreceptorów z/od białek MCP reguluje wewnątrzkomórkowy sygnał
kontrolujący częstość koziołkowania.

150
 7. 8. 9 Regulacja wyrażania się genów przez czynniki σ
Specyficzne czynniki σ (sekcja 7. 5) są konieczne do transkrypcji określonych
genów. Zależność ta pozwala komórce kontrolować synchronizację pewnych
zdarzeń przez syntezę danego czynnika sigma tylko wtedy, gdy jest on
wymagany.
Poziom niektórych czynników sigma jest minimalny podczas normalnego
wzrostu. Wyższy ich poziom, indukowany przez określone warunki stresowe,
prowadzi do wyrażenia się określonych genów. Do czynników sigma zaliczamy
np. σΗ (produkt genu spo0H; rys. 7. 14), σ 3 2 (produkt genu rpoH; sekcja 7. 8. 2. 3) i cf
(produkt genu rpoS, czynnik regulacyjny, działający w różnych warunkach stre-
sowych). W niektórych wypadkach warunki stresowe (szok cieplny dla σ32 i np.
szok osmotyczny dla σs) pobudzają zwiększenie syntezy czynnika sigma przez

(b) Powstanie wewnątrzkomórkowego sygnału jest związane z białkiem CheA (kodowanym przez
gen cheA). CheA jest kinaza histydynową (patrz sekcja 7. 8. 6). Na schemacie przedstawiono CheA
związane z MCP. W wiązaniu uczestniczy CheW. CheA może przenieść grupę fosforanową z ATP do
białka regulacyjnego CheY. Fosforylowana (aktywna) forma CheY (CheY ~P) zwiększa obroty rzęski
zgodnie z ruchem wskazówek zegara (w ten sposób zwiększając częstość koziołkowania) przez
oddziaływanie z pierścieniem C stanowiącym część motoru rzęski (z pewnością ze składnikiem FliM
— patrz rys. 2. 8). [Role of CheY: Silversmith i Bourret (1999) TIM 7: 16-22. ]. Podstawą przekazania
sygnału jest więc przeniesienie fosforanu z CheA na CheY. Sygnał jest modulowany (regulowany)
przez związanie/uwolnienie chemoefektora z/od MCP i przez stopień metylacji MCP. Rozpatrzmy
każdy z tych czynników po kolei, a następnie rozważmy, jak wspólnie regulują one przekazanie
sygnału i częstość koziołkowania.
Cytoplazmatyczna strona MCP podlega metylacji przez metylotransferazę CheR, która wyko-
rzystuje S-adenozylometioninę jako dawcę grup metylowych. Przeciwnie, metylotransferaza CheB
usuwa grupy metylowe. Aktywność CheB zwiększa się po jego fosforylacji przez CheA. Stopień
metylacji MCP zależy od aktywności zarówno CheR, jak i CheB. Zwiększenie metylacji zwiększa
aktywność CheA.
(c) W małym, stałym stężeniu chemoatraktanta (Catr) częstość koziołkowania komórek jest stała.
W momencie zwiększenia stężenia Catr wiąże się do MCP, hamując CheA (hamując fosforylację
CheY) i ułatwiając obroty rzęski przeciwne ruchowi wskazówek zegara (ruch prostoliniowy). Zaha-
mowanie CheA hamuje jednocześnie CheB, umożliwiając zwiększenie metylacji MCP. Częstość
koziołkowania wraca wtedy do wartości wyjściowej, następuje adaptacja do nowego, w przybliżeniu
stałego stężenia Catr (na schemacie MCP w środku). Po ponownym zmniejszeniu stężenia, uwolnienie
Catr stymuluje CheA i ułatwia rotację zgodną z ruchem wskazówek zegara (częstsze koziołkowanie).
Następuje równoczesna stymulacja CheB i demetylacja MCP do momentu, gdy zostanie obniżona
aktywność CheA do poziomu wyjściowego. Komórki adaptują się do nowego, stałego stężenia (MCP
z prawej strony schematu). Taka adaptacja wymaga wydajnej defosforylacji CheY i CheB, odpowied-
nio do zmienionego poziomu aktywności CheA. CheB ulega autodefosforylacji, a regulacja poziomu
CheY~P wymaga białka CheZ. Wydaje się, że w całkowicie zaadaptowanych komórkach około 30%
wewnątrzkomórkowej puli cząsteczek CheY jest w pełni fosforylowane. [Alon i wsp. (1998) EMBO
Journal 17: 4238-4248].
Trzeba zauważyć, że stopień metylacji MCP w zaadaptowanych komórkach odzwierciedla
wewnątrzkomórkowe stężenie chemoatraktanta.
Kontrola chemotaksji jest tematem artykułu przeglądowego Eisenbacha [(1996) MM 20: 903-910].
Eksperymentalne zmiany różnych składników systemu chemotaksji (np. CheR) wskazują, że mogą
one znajdować wyraz np. w czasie wymaganym do adaptacji (wraz ze zmianą stężenia CheR, różnice
czasu mogą być nawet większe niż 20-krotne), ale dokładność adaptacji (zdolność do osiągnięcia
poziomu koziołkowania równego temu przed działaniem bodźca) jest zachowana [Alon i wsp. (1999)
Nature 397: 168-1711.

151
Utworzenie endospory (sekcja 4. 3. 1) wymaga całej grupy białek, które nie są syntetyzowane w wege-
tatywnych (rosnących) komórkach, co z kolei jest związane ze skoordynowanym wyrażaniem się róż-
nych genów sporulacyjnych. Sporulacja wymaga nie tylko włączenia tych genów, ale również
włączenia genów, które hamują geny sporulacyjne podczas wzrostu wegetatywnego.
Wydaje się, że mechanizm inicjujący sporulację rozpoznaje zarówno zewnętrzne (środowiskowe),
jak i wewnętrzne (wewnątrzkomórkowe) sygnały. Przyjmuje się, że sygnały te powodują autofosfo-
rylację niektórych kinaz (sekcja 7. 8. 6. 1) — pokazanych na schemacie jako KinA i KinB. Kinazy prze-
noszą grupy fosforanowe (symbol na określony ciąg białek: Spo0F -> Spo0B —> Spo0A. Proces ten
nazywa się transferem fosforu [Strauch i Hoch (1993) COGD 3: 203-212; Hoch (1993) JCB 51: 55-61].
Wewnątrzkomórkowe stężenie fosforylowanej formy Spo0A - Spo0A~P wydaje się podstawowym
czynnikiem w inicjacji sporulaqi. Na schemacie, symbol oznacza czynniki hamujące, a symbol
— czynniki stymulujące wyrażanie się jakiegoś genu. W większości wypadków kontrola działa na
poziomie transkrypcji.
Spo0A~P ułatwia wyrażanie się niektórych genów sporulacyjnych (wymienionych w ramce z prawej
strony środkowej części schematu). SpoIIG (kodowane przez spoIIG) jest czynnikiem sigma
(sekcja 7. 5), σΕ, koniecznym do transkrypcji genu spoIID i niektórych genów komórki macierzystej.
Czynnik sigma kodowany przez SpoIIA, σf, jest niezbędny do transkrypcji niektórych genów
w presporze.

152
zwiększenie translacji odpowiadającego mu mRNA (raczej niż przez zwięk-
szenie transkrypcji genu). Zwiększenie translacji σ32 i σs jest następstwem
wpływu, jaki wywierają warunki indukujące ekspresję na drugorzędową struk-
turę mRNA.
Kiedyś uważano, że czynnik σs reguluje jedynie zdarzenia w fazie stacjonar-
nej. Teraz wiadomo, że odgrywa on regulującą rolę w odpowiedzi na różne
stresy zarówno w fazie stacjonarnej, jak i wykładniczej [Hengge-Aronis (1996)
MM 21: 887-893]. Czynnik ten działa często, być może zawsze, w połączeniu
z innymi formami regulacji. Tak więc, na przykład, σs i białko Fur regulują
tolerancję na zakwaszenie (sekcja 7. 8. 2. 6), natomiast podczas szoku osmotycz-
+
nego (sekcja 3. 1. 8) zwiększenie poziomu K i glutaminianu może mieć znaczenie
w pobudzeniu transkrypcji z niektórych promotorów regulowanych przez σs
[Ding i wsp. (1995) MM 16: 649-656].
Czynniki sigma pełnią również rolę w rozwoju fagów (patrz np. sekcja 9. 1. 1).

Podczas wzrostu wegetatywnego, SinR (kodowany przez gen sinR wymieniony w dolnej
ramce) hamuje ekspresję genów spoll (ramka prawa środkowa). Podczas sporulacji Spo0A~P
reprymuje abrB (ramka dolna) — w ten sposób hamuje ekspresję SinR, a wspomaga ekspresję
genów spoII. SinR hamowane jest przez oddziaływania bialko-białko, w tym wypadku białko
SinI hamuje białko SinR. Należy zauważyć, że transkrypcja sinI jest również ułatwiona przez
Spo0A~P.
Spo0A~P ułatwia ekspresję genów spo0F i spo0A (ramka lewa, środkowa) według mechanizmu pozy-
tywnego sprzężenia zwrotnego [Strauch i wsp. (1993) MM 7: 967-975]. Jednocześnie, wskutek zaha-
mowania abrB, Spo0A~P ułatwia wyrażanie się spo0H, którego produkt (Spo0H = σΗ) jest konieczny
do transkrypcji spo0F i spo0A (białko σΗ jest produkowane w małych ilościach podczas wzrostu wege-
tatywnego).
Synteza czynnika σΗ znacznie się zwiększa po rozpoczęciu sporulacji. Podczas sporulacji, σΗ jest
potrzebny do transkrypcji genu ftsZ (patrz FtsZ, sekcja 3. 2. 1) z promotora p2 różniącego się od
promotora ftsZ, który jest aktywny podczas wzrostu wegetatywnego. FtsZ jest niezbędne do utwo-
rzenia asymetrycznej septy.
Spo0E jest negatywnym regulatorem transferu fosforu [Ohlsen i wsp. (1994) PNAS 91: 1756-1760].
Enzym ten defosforyluje (a przez to inakrywuje) Spo0A-P, a więc w rezultacie może zapobiegać
sporulacji, dopóki połączony wpływ różnych (zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych)
sygnałów nie wskaże na jej konieczność.
W badaniach dotyczących genetycznej kontroli sporulacji bardzo przydatne są mutanty z zablokowa-
nymi poszczególnymi etapami tego procesu (rys. 4. 2).
Sporulacja może być zahamowana przez mutacje genów spo0. Na przykład, mutacja prowadząca
do całkowitej utarty produktu danego genu lub jego funkcji w genie spo0B blokuje transfer fosforu.
Dotychczas nie opisano mutacji wpływających na etap I (rys. 4. 2). Niektórzy badacze nie traktują tego
etapu jako wyodrębniony.
Mutacje genów spoII mogą zapobiec rozwojowi spory na etapach następujących po wytworzeniu
asymetrycznej septy.
Samo powstanie asymetrycznej septy nie jest w pełni wyjaśnione. Wyniki jednych badań pozwa-
lają wnioskować, że miejsce tworzenia się septy leżące w środku komórki (ważne dla podziału wege-
tatywnej komórki) jest zablokowane przez kompleks MinCD (sekcja 3. 2. 1. 2) pozostający pod
całkowitą kontrolą białka Spo0A [Barak, Prepiak i Schneisser (1998) JB 180: 5327-5333].
Badania prowadzone z zastosowaniem białka fuzyjnego SpoIIE-GFP (sekcja 8. 5. 2) wykazały, że
podczas sporulacji w komórkach dzikiego typu SpoIIE umieszczone jest w asymetyrycznej przegro-
dzie po stronie prespory (rys. 4. 2), gdzie, dzięki aktywności fosfatazy może uwalniać aktywne białko
σF z nieaktywnego prekursora. To może tłumaczyć, dlaczego σF tworzony jest tylko w presporze
(a nie w komórce macierzystej) [Wu i wsp. (1998) GD 12: 1371-1380]. (Porównaj SpoIIE i FlbE
w sekcji 4. 1. )

153
 7. 8. 10 Regulacja wyrażania się genów
przez zależną od tRNA antyterminację transkrypcji
U Bacillus subtilis (i niektórych innych gramdodatnich bakterii) pewne geny,
których produkty są konieczne do syntezy aminokwasów (i do związania amino-
kwasów z cząsteczkami tRNA), są włączane, gdy niedobór danego aminokwasu
prowadzi do pojawienia się w komórce nieaminoacylowanych cząsteczek odpo-
wiadającego mu tRNA. Nieacylowana cząsteczka tRNA wiąże się z wiodącym
regionem mRNA i może powodować przejście struktury terminatora transkry-
pcji (utworzonej w warunkach wystarczającego stężenia danego aminokwasu)
w strukturę antyterminatora — wtedy transkrypcja nie jest hamowana i amino-
kwas może być syntetyzowany.
[tRNA-directed transcription antitermination: Henkins (1994) MM 13:
381-387. ]

7. 8. 11 Termoregulacja wyrażania się genów

Odpowiedź na szok cieplny jest tylko jednym z przykładów reakcji bakterii na
zmiany temperatury. Rzeczywiście, temperatura reguluje różnorodne geny. Tak
więc, w patogenach niektóre cechy odpowiedzialne za wirulencję mogą być
wyrażone w temperaturze ciała gospodarza (np. u człowieka — 37°C), a nie poja-
wić się — w temperaturach niższych. Na przykład, szczepy E. coli związane
z zapaleniem miedniczek nerkowych wyrażają tzw. pilusy Pap (tab. 2. 2) w tem-
peraturze 37°C, ale nie wyrażają ich w 25°C.
W jaki sposób bakterie „czują" temperaturę? W niektórych wypadkach
zmiany temperatury zmieniają strukturę specyficznych mRNA w ten sposób, że
translacja (sekcja 7. 6) zachodzi lub jest zahamowana, zależnie od temperatury.
Dobrym tego przykładem może być gen IcrF (związany z wirulencją gen Yersinia
pestis). Transkrypcja IcrF zachodzi z podobną wydajnością w temperaturze 25°C
i w 37°C, ale w 25°C mRNA tworzy strukturę drugorzędową, która hamuje
translację. W 37°C struktura ta rozpada się, co umożliwia zajście translacji. Inny
przykład jest związany z mRNA rpoH (sekcja 7. 8. 2. 3).
W Salmonella białko TipA (funkcja nieznana) działa jak temperaturowrażliwy
regulator własnej transkrypcji. Dimer TipA hamuje transkrypcję, ale monomer
(powstający po podwyższeniu temperatury) nie powoduje zahamowania
[Hurme i wsp. (1997) Cell 90: 55-64].
W E. coli represja syntezy pilusa Pap w temperaturze 25°C jest związana
z białkiem wiążącym DNA, H-NS. Białko to hamuje również naprawę DNA
u Shigella, w sposób zależny od temperatury [Palchaudhuri, Tominna i Leon
(1998) JB 180: 5260-5262]. Przypuszczalny mechanizm regulacji wyrażania się
genów przez H-NS obejmuje: indukowaną przez temperaturę, zmianę samego
białka H-NS, co wpływa na jego wiązanie z DNA, indukowaną przez tempera-
turę oraz zmianę topologii/superzwinięcia DNA, co zapobiega wiązaniu H-NS
do miejsc(a) dla siebie specyficznych; możliwe jest łączne działanie obu
mechanizmów.
[Thermoregulation of genes in bacteria: Hurme i Rhen (1998) MM 30: 1-6. ]

154
 7. 8. 12 Dobowa regulacja wyrażania się genów
Mianem cyklu dobowego określa się cykliczne wahania (cykle około 24-godz. ),
które zachodzą we właściwościach organizmów żyjących w jednorodnych (sta-
łych) warunkach środowiska. Poprzednio sądzono, że zmiany te są charaktery-
styczne tylko dla eukariotów, teraz wiadomo, że zachodzą one przynajmniej
w niektórych prokariotach.
W jednokomórkowej sinicy, Synechococcus, gen psbA1 (kodujący składnik PSII
— rys. 5. 11) najsłabiej wyraża się o zmierzchu, najsilniej zaś o świcie. Niektóre
inne geny regulowane są odwrotnie. Co więcej, przy nie zmienionej intensywno-
ści oświetlenia, na synchronizację podziałów komórkowych wpływa wewnę-
trzny, 24-godzinny „zegar biologiczny", nawet gdy średni czas podwojenia
liczby komórek wynosi zaledwie 10, 5 godz. [Johnson, Golden i Kondo (1998)
TIM 6: 407-410]. [Molecular bases of circadian clocks (artykuł przeglądowy):
Dunlap (1999) Cell 96: 271-290. ]

7. 9 Bakteryjny RNA
Cząsteczki RNA (sekcja 7. 2. 2) mają różne formy i funkcje. Na przykład:
• rRNA, mRNA, tRNA: cząsteczki konieczne do syntezy białek (sekcja 7. 5,
7. 6).
• ctRNA (ang. countertranscript RNA): RNA transkrybowany z nici komple-
mentarnej, cząsteczka, która po związaniu z transkryptem wpływa na
transkrypcję, translację lub replikację — np. RNA I i inne regulatory replika-
cji DNA niektórych plazmidów (sekcja 7. 3. 1). Są to przykłady antysensow-
nych RNA: cząsteczek, które mogą wpływać na określoną funkcję(e)
po związaniu się z określonymi miejscami.
• SRP RNA: cząsteczka biorąca udział w transporcie białek (sekcja 5. 4. 3).
• pRNA: bakteriofagowy RNA wykorzystywany do upakowania białek (sek-
cja 9. 1. 4).
• RNaza P: rybozym, tj. enzymatyczna forma RNA.
Wiele cząsteczek RNA ulega potranskrypcyjnej modyfikacji. Na przykład nie-
które bakteryjne RNA są poliadenylowane (sekcja 7. 6. 1). Dla przypomnienia,
16S, 23S i 5S rRNA — razem z cząsteczkami tRNA — są transkrybowane w
postaci jednej cząsteczki, która następnie musi być przecięta w określonych miej-
scach przez odpowiednie enzymy, np. rybozym RNaza Ρ (patrz wyżej) przecina
koniec 5' cząsteczek tRNA.
Podobnie do typowych genów eukariotycznych, niektóre geny bakterii,
fagów i archeonów zawierają introny — sekwencje nukleotydów, które nie
kodują żadnej części produktu. Każda część odpowiadająca intronowi musi być
usunięta z transkryptu w celu utworzenia „dojrzałego" mRNA, zdolnego do pra-
widłowego kodowania produktu (patrz rys. 8. 8). Introny bakteryjne są autokata-
lityczne: to znaczy, że nukleotydowa sekwencja intronu jest automatycznie
„odcinana", dzięki enzymatycznej aktywności, która rozwija się w rdzeniu
właściwie zwiniętej cząsteczki mRNA. Sugerowano, że przynajmniej w niektó-

155
rych wypadkach, splicing zachodzi, gdy powstający transkrypt związany jest
z rybosomami (rybosomy zatrzymują się podczas wycinania intronu) [splicing
i translacja u bakterii (przegląd): Woodson (1998) GD 12: 1243-1247].
RNaza Ρ i SRP (o których wspominano poprzednio) to tylko dwie z większej
liczby małych cząsteczek RNA (sRNA) pełniących funkcje regulacyjne. Właści-
wości i rola dziesięciu sRNA z E. coli są opisane zbiorczo w pracy [Wassarman,
Zhang i Storz (1999) TIM 7: 37-45].
 ROZDZIAŁ

8
Biologia molekularna II
- zmienianie informacji genetycznej

DNA może podlegać zmianom. Na przykład, nawet podczas replikacji, niezależ-

nie od poprawnie funkcjonującego systemu korekcyjnego i naprawczego (sek-
cja 7. 7), mniej więcej jeden na 108-109 nukleotydów w nowej (potomnej) nici jest
podstawiony błędnie. Większe zmiany mogą być powodowane przez mutageny
fizyczne i chemiczne (sekcja 8. 1), rekombinację (sekcja 8. 2) i elementy transpozy-
cyjne (sekcja 8. 3). Poza tym genom komórki (jej „podstawowy genetyczny pro-
gram") może być uzupełniany przez plazmidy i inne fragmenty dodatkowego
DNA nabytego w procesach transferu genów (sekcja 8. 4).
Zmiany dokonywane w DNA przez celową działalność człowieka (technolo-
gia rekombinowania DNA in vitro) są omówione w sekcji 8. 4.

8. 1 Mutacje
Mutacja u bakterii jest trwałą, dziedziczną zmianą sekwencji nukleotydów
w DNA (u pewnych mikroorganizmów, np. niektórych bakteriofagów (rozdz. 9),
genom zawiera RNA, tak więc mutacje u tych mikroorganizmów będą dotyczyły
RNA). Należy zauważyć, że zmiana nawet jednej pary zasad (sekcja 7. 2. 1) zmie-
nia sekwencję całej cząsteczki DNA. Transkrypcja zmienionego DNA spowoduje
utworzenie zmienionego RNA, a taki mRNA może być przyczyną powstania
zmienionego polipeptydu (tab. 7. 2) ze zmienioną aktywnością biologiczną. Oczy-
wiście, mutacje mogą dotyczyć zarówno sekwencji kodujących polipeptydy, jak
i sekwencji genów regulacyjnych oraz sekwencji rozpoznawanych przez różne
czynniki komórkowe.
Mutacje spontaniczne zdarzają się z małą częstością i bez żadnej oczywistej
przyczyny; są to głównie błędy w replikacji i naprawie, ale pewne z nich są
powodowane przez oddziaływania chemiczne (sekcja 7. 7). Mutacje zachodzą
z większą częstością, gdy w komórce uszkodzone są pewne geny, tzw. geny
„mutatorowe" [Horst, Wu i Marinus (1999) TIM 7: 29-36].

157
 Zwiększenie częstości mutacji jest powodowane przez mutageny; czynniki
fizyczne, takie jak promieniowanie ultrafioletowe i promieniowanie X, oraz
związki chemiczne, jak czynniki alkilujące, dwusiarczki, hydroksyloamina, kwas
azotawy i analogi zasad (np. 5-bromouracyl), które mogą być włączane w miejsce
typowych zasad podczas replikacji DNA.
Mutageny działają w różny sposób. Promieniowanie ultrafioletowe może na
przykład wywoływać krzyżowe połączenia między sąsiadującymi tyminami;
a usuwanie powstających w takim przypadku dimerów tyminy przez naprawę
„powodującą błędy" (sekcja 7. 8. 2. 2) może wywoływać powstawanie bardzo róż-
norodnych mutacji (patrz także sekcja 7. 7. 2). Krzyżowe połączenia mogą także
powstawać w wyniku działania pewnych czynników alkilujących. Dwusiarczki
i kwas azotawy mogą np. deaminować cytozynę, z wytworzeniem uracylu;
a ponieważ uracyl nie jest normalnym składnikiem DNA, jego odmienna zdol-
ność tworzenia par może wywołać włączenie innej zasady (adeniny zamiast gua-
niny) w potomną nić podczas następnej rundy replikacji.
Mutacje w populacji bakterii na ogół powstają przypadkowo, oddziałując
na różne geny u poszczególnych osobników. (Co ciekawe, u enterobakterii, jak
się wydaje, mutacje pojawiają się częściej w miejscach odleglejszych od oriC

158
[Sharp i wsp. (1989) Science 246: 808-810]). Komórkę, w której nastąpiła mutacja,
nazywamy mutantem. Mutacje są często szkodliwe, a mogą być nawet letalne,
jeżeli zmieniona zostanie sekwencja kodująca produkt lub funkcję niezbędną
do życia. Mutacjami korzystnymi dla bakterii są np. zmiany zwiększające opor-
ność komórki na antybiotyki. Na przykład zmiana rybosomu uniemożliwiająca
wiązanie się z nimi streptomycyny i hamowanie przez nią syntezy białek;
tak więc Zmutowana komórka będzie wykazywała oporność na ten antybiotyk.
Mutacje polepszające wzrost bakterii w tzw. „normalnych warunkach" mogą
pozwolić komórkom mutanta zdominować wzrost subpopulacji komórek „dzi-
kich" (niezmutowanych) i stać się frakcją dominującą w populacji; taka „natura-
lna selekcja" odgrywa istotną rolę w ewolucji.

8. 1. 1 Rodzaje mutacji
Mutacje powstają w różny sposób i mogą też różnie oddziaływać na informację
genetyczną. Stosunkowo rzadko jest tracony, zyskiwany, odwracany lub nawet
translokowany cały fragment DNA (sekcja 8. 3). Mutacja punktowa polega na
utracie, zyskaniu lub podstawieniu pojedynczego nukleotydu; mimo to jej skutki
mogą mieć daleko idące konsekwencje dla komórki (rys. 8. 1).

Rys. 8. 1 Mutacje punktowe: ich wpływ na syntezę mRNA i polipeptydów. Efekt każdej mutacji
punktowej jest wskazany jako gruba strzałka ; po prawej stronie pokazano możliwy skutek
każdej mutacji

(a) mRNA i polipeptyd syntetyzowany z normalnego (nie zmutowanego, dzikiego) genu.

(b) Delecja nukleotydu guaninowego z DNA spowoduje utratę cytozyny (C) z kodonu UCG
w mRNA. Wskutek tego nie tylko UCG, ale i wszystkie następne kodony są zmienione: porównaj
aminokwasy kodowane w (a) i (b). Zauważ, ze jeżeli brakuje jednego nukletydu, to zamiast
niego odczytywany jest następny, czyli grupy trzech kolejnych są czytane jako kodony. Ponieważ
informacja genetyczna jest teraz w niewłaściwej fazie odczytu (w rejonie poniżej delecji), mutacja
taka jest nazywana mutacją zmiany fazy lub zmiany ramki odczytu. Gdy zdarzy się ona blisko
końca genu, tak że większa część polipeptydu jest prawidłowa, produkt może wykazywać
pewną aktywność biologiczną. Jeżeli mutacja zmieniająca ramkę odczytu nastąpi w operonie (sekcja
7. 8. 1), skutki mogą być różne zależnie od konkretnego miejsca, które uległo mutacji.
(c) Dodanie nukleotydu tyminowego do DNA spowodowało dodanie nukleotydu adeninowego
do kodonu UCG w mRNA; podobnie jak w (b) jest to mutacja typu zmiany ramki odczytu.
(d) W DNA, tymina zastąpiła guaninę, tak że teraz mRNA zawiera UAG (kodon „stop") zamiast
UCG; jest to tzw. mutacja nonsensowna. Synteza polipeptydu zatrzymuje się przy kodonie UAG;
polipeptyd może mieć pewną aktywność biologiczną, jeżeli większa jego część powstała przed natra-
fieniem w czasie translacji na kodon stop.
(e) W DNA, guanina zastąpiła adeninę, tak że mRNA zawiera teraz kodon CCG zamiast UCG;
zmieniony kodon zamiast seryny oznacza teraz prolinę; jest to tzw. zmiana sensu. Zauważ, że amino-
kwasy poniżej proliny nie są zmienione. Biologiczna aktywność polipeptydu zależy od natury
i położenia nieprawidłowo podstawionego aminokwasu.
(f) W DNA, tymina zastąpiła cytozynę, tak że mRNA zawiera teraz kodon UCA zamiast UCG;
zmieniony kodon jednak w dalszym ciągu koduje serynę (tab. 7. 2). Jest to tzw. cicha mutacja,
która oczywiście na zmienia biologicznej aktywności polipeptydu

159
 8. 1. 1. 1 Loci, geny i zmutowane geny - nomenklatura
Konkretne, funkcjonalnie zdefiniowane miejsce na chromosomie (= locus; w licz-
bie mnogiej loci) jest oznaczane przez trzyliterowy symbol drukowany kursywą
(lub podkreślany w rękopisie); na przykład, his i trp to loci dotyczące odpowied-
nio biosyntezy histydyny i tryptofanu.
Kiedy dany locus zawiera więcej niż jeden gen, każdy z nich jest dodatkowo
oznaczany wielka literą; tak więc na przykład, locus his jest operonem (sek-
cja 7. 8. 1) zawierającym wiele genów oznaczonych odpowiednio hisA, hisB... itd.
(Zauważ, że geny oznaczane w ten sposób niekoniecznie występują w obrębie
locus w porządku alfabetycznym; porównaj np. geny lac na rys. 7. 11). Geny, które
nie sąsiadują ze sobą na chromosomie, ale mają pokrewne funkcje, są oznaczane
w analogiczny sposób (porównaj np. ara w sekcji 7. 8. 1. 1).
System ten stosuje się, kiedy odnosi się do konkretnego locus lub genu —
np. locus his, gen his A.
Genotyp komórki jest jej genetycznym opisem (programem), odzwierciedla
on aktualną sekwencję nukleotydów w chromosomie. W celu zapisania geno-
typu określonego szczepu z zasady wymienimy tylko interesujące nas w danym
momencie geny, wskazując, czy są one typu dzikiego czy też są zmutowane.
Dziki typ genu jest wtedy oznaczany np. jako hisA+, podczas gdy odpowiadający
mu gen Zmutowany jako his A (lub czasem hisA'). Konkretne mutacje (w określo-
nych miejscach) oznaczane są dodatkowo numerami: np. hisA9 (mutacja w okre-
ślonym miejscu genu hisA).
Fenotyp komórki jest zbiorem jej aktualnie zauważalnych cech (właściwo-
ści). Cechy fenotypowe przedstawia się w następujący sposób: np. His- (niezdol-
ność do wzrostu bez histydyny, czyli auksotrofla histydynowa, sekcja 8. 1. 2);
His+ (prototrof histydynowy); Lac- (niezdolność do wykorzystywania laktozy);
Met- (auksotrof metioninowy); TcR (oporność na tetracykliny).

8. 1. 2 Izolacja mutantów
Każda konkretna mutacja spontanicznie zdarza się w populacji bakterii z małą
częstością; na przykład w populacji E. coli utrata zdolności do fermentacji ga-
laktozy następuje przeciętnie raz na każde 1010 cykli podziałowych komórki, to
jest z częstością 10~10. Nawet w populacji poddanej działaniu mutagenu,
komórki z konkretną mutacją są wciąż w mniejszości w stosunku do komórek
dzikiego typu i tych z innymi rodzajami mutacji.
Jak możemy wyizolować te nieliczne określone mutanty z olbrzymiej popu-
lacji bakterii? Jeżeli, na przykład, w populacji komórek wrażliwych na strepto-
mycynę pojedyncza komórka zmutowała do streptomycynooporności (sek-
cja 8. 1), ta komórka może rosnąć na stałym podłożu zawierającym streptomy-
cynę i utworzyć kolonię (sekcja 3. 3. 1); wszystkie inne komórki, których wzrost
jest hamowany przez streptomycynę, nie wyrosną na takim podłożu. Uogól-
niając, taki sposób selekcji może być wykorzystany, gdy niezmutowane komórki
na zastosowanym podłożu selekcyjnym lub w zastosowanych warunkach
rosnąć nie mogą.

160
 Jednakże, gdy komórka w wyniku mutacji utraciła zdolność do syntetyzowa-
nia określonego składnika (np. aminokwasu), który jest potrzebny do wzrostu, to
taki defektywny metabolicznie mutant (auksotrof) może rosnąć tylko wtedy,
gdy dostarczymy mu odpowiedniego składnika. (Odpowiadający mu dziki typ
komórki nazywamy prototrofem. ) Jak można więc wyizolować auksotrofy —
wiedząc, że każde podłoże, które umożliwia wzrost auksotrofom, pozwala także
rosnąć prototrofom? Jedna metoda to użycie podłoża minimalnego, to jest
takiego, które zawiera minimalny zestaw substancji odżywczych niezbędnych
prototrofom; określony auksotrof może rosnąć na podłożu minimalnym tylko
wtedy, gdy zostanie ono uzupełnione czynnikiem, który spełni jego specyficzne
wymagania wzrostowe. Jeżeli zamierzamy wyizolować auksotrofa wymaga-
jącego histydyny, minimalne podłoże musi być uzupełnione histydyną w małym
stężeniu — pozwalającym na bardzo ograniczony wzrost auksotrofa. Kolonie
tworzone przez komórki auksotroficzne szybko wyczerpią histydynę w swoim
otoczeniu, pozostając małe, podczas gdy komórki prototrofów osiągną normalną
wielkość. Zatem małe kolonie to potencjalne auksotrofy i powinny być testowane
dokładniej.
W alternatywnej metodzie izolowania auksotrofów populację o małej gęsto-
ści, zawierającą zarówno komórki prototroficzne, jak i auksotroficzne, wysiewa
się na podłoże pełne (kompletne), na którym mogą rosnąć oba typy komórek. Po
inkubacji wszystkie komórki wytworzą kolonie jednakowej wielkości. W celu
zidentyfikowania kolonii auksotrofów konieczne jest przesianie każdej kolonii
na podłoże minimalne, na którym będą rosły tylko prototrofy. Najwygodniej jest
tego dokonywać metodą replik płytkowych. W metodzie tej, krążek sterylnego
welwetu przyciska się do powierzchni podłoża pełnego (płytki matrycowej lub
wzorcowej), na której rosną zarówno kolonie prototrofów, jak i auksotrofów.
Komórki z każdej kolonii przyczepiają się do welwetu, który następnie odciska
się delikatnie na sterylnej płytce podłoża minimalnego (płytka replikowa). Po
inkubacji, miejsca kolonii na płytce replikowej porównuje się z miejscami kolonii
na płytce matrycowej; każda kolonia, która rośnie na płytce matrycowej, a nie
pojawia się na płytce replikowej, to potencjalny auksotrof (rys. 8. 2. ).

8. 1. 3 Test Amesa wykrywający czynniki rakotwórcze

Większość znanych karcynogenów (czynników rakotwórczych) to jednocześnie
mutageny. Test Amesa sprawdza potencjalną rakotwórczość substancji przez
określanie ich mutagenności (zdolności do wywoływania mutacji). Mutagenność
związków chemicznych ocenia się określając ich zdolności do wywoływania
rewersji mutacji w testowym organizmie, którym jest Salmonella typhimurium.
(Mutację, która znosi skutki pierwotnej mutacji, nazywamy mutacją powrotną
lub rewersją). Testowy szczep S. typhimurium jest auksotrofem histydynowym,
a test Amesa określa poziom jego rewersji do prototrofii. Prototrofów poszuku-
jemy w mieszaninie inkubacyjnej zawierającej komórki testowego szczepu, testo-
waną substancję oraz preparat enzymów z wątroby szczura; dodane enzymy sta-
nowią „metaboliczny aktywator" niezbędny do przejawienia aktywności przez
niektóre mutageny/karcynogeny.

161
(a) Płytka matrycowa: podłoże pełne z koloniami zarówno prototrofów, jak i auksotrofów, (b) Płytka
replikowa: podłoże minimalne wyłącznie z koloniami prototrofów. Na płytce matrycowej strzałka
wskazuje kolonię potencjalnego auksotrofa; w odpowiadającym jej miejscu na płytce replikowej nie
ma kolonii (auksotrof nie może bowiem rosnąć na podłożu minimalnym).

8. 2 Rekombinacja
Przez „rekombinację" rozumiemy przegrupowanie (zmianę rozmieszczenia) sek-
wencji w obrębie cząsteczki lub cząsteczek kwasów nukleinowych: cząsteczki
mogą być łączone, rozdzielane, wymieniać między sobą nici, a sekwencje w obrę-
bie cząsteczki mogą zostać utracone lub odwrócone itp.

8. 2. 1 Rekombinacja homologiczna (ogólna)

Rekombinacja homologiczna może obejmować np. wymianę nici między dwie-
ma dwuniciowymi cząsteczkami DNA. Może to następować tylko wtedy, gdy
długa sekwencja nukleotydów w jednej nici jest bardzo podobna do sekwencji
w drugiej nici, tzn., że dwie dupleksowe cząsteczki wykazują znaczny obszar
homologii. Innym wymogiem jest obecność w tych cząsteczkach jednego lub
kilku nacięć (pęknięć w szkielecie fosforanowo-cukrowym), umożliwiających
rozdzielanie się nici, lub luk (ang. gaps), czyli regionów jednoniciowego DNA.
Ważną rolę w tym procesie odgrywa białko RecA (produkt genu recA), które jest
zdolne do inicjowania różnego typu oddziaływań między cząsteczkami DNA.
(U Archaea, odpowiednikiem białka RecA jest RedA [Seitz i wsp. (1998) GD 12:
1248-1253]. ) Na przykład, wolny koniec ssDNA pochodzący z naciętego duple-
ksu może być zestawiony, przez białko RecA, z homologicznym ssDNA w in-
nym naciętym dupleksie. Obie nici formują następnie hybrydowy dupleks (hete-
rodupleks), który może zawierać jedną lub kilka błędnie połączonych zasad;
podobnie wolny koniec odsunięty z drugiego dupleksu może tworzyć specyfi-
czne pary z ssDNA w pierwszym dupleksie, także tworząc heterodupleks. Jeżeli
następnie wolne końce zostaną połączone, powstanie rozgałęziona struktura
zwana strukturą Hollidaya; region, w którym dwa dupleksy są utrzymywane
razem przez skrzyżowanie się pochodzących z nich pojedynczych nici. Każda nić
może kontynuować oddzielanie się od swego macierzystego dupleksu i tworzyć
specyficzne pary z ssDNA innego dupleksu, w wyniku czego struktura Holli-

162
daya będzie się przesuwała w odpowiednim kierunku; zjawisko to nazywamy
przemieszczaniem się ramion (ang. branch migration), a zakres tego przemiesz-
czania się zależy od całkowitej długość heterodupleksu. U E. coli przemieszczanie
się ramion jest „napędzane" przez dwie pierścieniowatego kształtu helikazy (po
jednej na każdym końcu struktury Hollidaya), przez które DNA się przesuwa;
każda helikaza jest heksamerem białka Ruv. (Porównaj z helikazą DnaB na
rys. 7. 8. ) Rozdzielenie struktury Hollidaya (czyli rozdzielenie dupleksów)
wymaga działania endonukleazy RuvC, która nacina odpowiednie nici, pozwa-
lając na ich połączenie (ligacje) w obrębie każdego dupleksu. U E. coli, RuvB
i RuvC, jak się wydaje, działają kooperatywnie [Gool i wsp. (1998) EMBO Journal
17: 1838-1845]. U przynajmniej niektórych organizmów chromosomy zawierają
pewne sekwencje DNA (rekombinacyjne „gorące miejsca"), które wzmagają
rekombinację homologiczną w swojej bliskości. Na przykład chromosom E. coli
zawiera około 1000 kopii tzw. sekwencji chi (χ) — 5'-GCTGGTGG-3', która
wzmaga rekombinację nawet 10-krotnie; wpływ χ (zmniejszający się wraz
z oddalaniem) obejmuje obszar około 10 kpz z każdej strony. Ostatnie badania
in vitro wskazują, że białko RecA wiąże się preferencyjnie z sekwencjami DNA
bogatymi w GT — w tym z sekwencjami χ Ε. coli. Sugeruje to, że specyficzna
aktywność (wzmagania poziomu rekombinacji w swoim sąsiedztwie) takich
miejsc może zależeć, przynajmniej częściowo, od ich zdolności do wiązania RecA
[Tracy i Kowalczykowski (1996) GD 10: 1890-1903].
Rekombinacja homologiczna zdarza się także w pewnych przypadkach od-
działywania między plazmidem i chromosomem.

8. 2. 2 Rekombinacja zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca)

W podstawowej formie rekombinacji specyficznej wobec miejsca (SSR, ang. site-
specific recombination) dwie specyficzne sekwencje dupleksowego DNA zbli-
żają się do siebie; w regionie zbliżenia przyłącza się białkowy katalizator reakcji
(rekombinaza); wprowadzane są naprzemienne nacięcia w każdym dupleksie,
a nacięte końce jednego dupleksu są ligowane (łączone) z naciętymi końcami
drugiego dupleksu (patrz rys. 8. 3c). [Działanie rekombinazy specyficznej wobec
miejsca: Stark, Boocock i Sheratt (1992) TIG 8: 432-439. ]
SSR może kontrolować ekspresję genów; w takiej rekombinacyjnej regulacji,
zdarzenia SSR kontrolują włączanie i wyłączanie genu(ów) lub przełączanie eks-
presji z jednego genu na inny (rys. 8. 3c). SSR uczestniczy także w integracji DNA
bakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli (rys. 8. 3b), w pewnych przy-
padkach także w interakcjach między plazmidem i chromosomem [Campbell
(1992) JB 174: 7495-7499], w mechanizmie replikatywnej transpozycji (rys. 8. 4),
a także w koniugacyjnej transpozycji (sekcja 8. 4. 2. 3).

8. 3 Transpozycja
Transpozycja jest to transfer (przenoszenie) małych, specyficznych fragmentów
DNA — lub ich „kopii" — z jednego miejsca w drugie w tym samym dupleksie,
do miejsca w innym dupleksie w tej samej komórce lub (patrz koniugacyjne

163
(a) Przesunięte (o nierównych końcach) cięcie w specyficznym miejscu jednego dupleksu DNA i prze-
sunięte cięcie (z reguły z udziałem takiej samej sekwencji nukleotydowej), wprowadzone w innym
miejscu tego samego dupleksu lub w innej cząsteczce DNA. Każdy jednoniciowy region w danym
miejscu cięcia może tworzyć komplementarne pary z zasadami w obrębie jednoniciowego regionu
drugiego miejsca cięcia. (Takie jednoniciowe regiony są czasem nazywane „lepkimi końcami").
W procesie tym uczestniczy białko (rekombinaza). Na schemacie przesunięte cięcie jest przedsta-
wione w postaci dwóch 4-nukleotydowych jednoniciowych regionów. Jednakże, ten jednoniciowy
region może mieć także długość 2 lub 6-8 nukleotydów; długość tych wystających odcinków, czyli
lepkich końców, zależy od konkretnej rekombinazy uczestniczącej w procesie.
(b) Integracja (kolistego, dwuniciowego) DNA bakteriofaga λ (sekcja 9. 2. 1) z chromosomem E. coli.
W DNA faga λ miejsce rekombinacyjne (czyli specyficzną sekwencję nukleotydów w dupleksie)
pokazano jako biały kwadrat; w chromosomie E. coli pokazane jest ono jako czarny kwadrat z boków
oflankowany przez geny operonu gal (wykorzystywanie galaktozy) i bio (biosynteza biotyny).
Na lewo: dwie koliste cząsteczki dwuniciowego DNA z zestawionymi ze sobą „miejscami rekombi-
nacyjnymi". Początkowo, z udziałem rekombinazy związanej z tym miejscami, wprowadzane są
przesunięte nacięcia każdego dupleksu; lepkie końce nacięcia w chromosomie wytwarzają komple-
mentarne połączenia z lepkimi końcami w DNA A, po czym nici są ligowane. Na prawo: DNA λ
włączony do chromosomu E. coli.
(c) Przykład rekombinacyjnej regulacji. W wielu szczepach Salmonella rzęski (sekcja 2. 2. 14. 1) mogą
być wytwarzane z jednego z dwóch różnych typów białek — kodowanych przez geny H1 i H2; nor-
malnie tylko jeden z tych genów jest wyrażany w danym czasie, tak że rzęski są zbudowane albo
z produktu genu H1, albo genu H2. Promotor operonu H1 jest oflankowany dwoma specyficz-
nymi miejscami które są rozpoznawane przez rekombinazę. Góra: operon H2 jest transkrybo-
wany; produkt genu H2 tworzy rzęskę, a represor H1 blokuje transkrypcję genu H1. Dół: między
miejscami rozpoznawanymi przez rekombinazę nastąpiła rekombinacja (typu SSR), sekwencja zawie-
rająca promotor genu H2 została odwrócona; bez funkcjonalnego promotora operon H2 nie może być
transkrybowany, ale utrata represora H1 pozwala na transkrypcję z H1 — tak że rzęska jest teraz two-
rzona z produktu genu H1.
Zmienność składu białkowego rzęsek Salmonella jest tylko jednym z przykładów bardziej ogólnego
fenomenu zwanego zmiennością fazową, w którym skład pewnych powierzchniowych kompo-
nentów komórkowych lub struktur ulega spontanicznym zmianom. Na przykład, w poszczegól-
nych komórkach E. coli wytwarzanie tzw. fimbrii typu 1 podlega włączaniu i wyłączaniu, co
powoduje, że komórki mogą mieć fimbrie lub nie i zmienić ten stan w wyniku rearanżacji
fragmentów DNA.

164
transpozony, sekcja 8. 4. 2. 3) do dupleksu w innej komórce. Ten „mały specyfi-
czny fragment DNA" jest nazywany elementem transpozycyjnym (TE,
ang. transposition element) lub skaczącym genem. Elementy transpozycyjne
występują np. w chromosomach bakteryjnych, w DNA bakteriofagów (roz-
dział 9) i w plazmidach. Niżej podane informacje odnoszą się do „klasycznych"
elementów transpozycyjnych (tzn. z wyłączeniem koniugacyjnych trans-
pozonów).
Dwa podstawowe typy TE to sekwencja insercyjne (IS, ang. insertion
sequence) i transpozony. Każdy z nich koduje białko(a), w tym transpozazę
(patrz niżej) potrzebną do transpozycji; ponadto transpozon koduje inne
funkcje — np. enzymy, które inaktywują określone antybiotyki. Sekwencja
nukleotydowa wszystkich TE zawiera co najmniej jedną parę odwróconych
sekwencji. Niżej podane są przykłady par terminalnych odwróconych
sekwencji:
5'-CTGACTA TAGTCAG-3'
3'-GACTGAT ATCAGTC-5'
Zauważmy, że lewy koniec dupleksu ma taką samą polarność jak koniec prawy,
tzn. sekwencja jest taka sama, gdy jest czytana od 5' (lub 3') końca w obu kierun-
kach, ale dwa końce dupleksu mają odwrotne orientacje. Odwrócone powtórze-
nia są niezbędne do transpozycji, prawdopodobnie stanowią miejsce rozpozna-
wane przez transpozazę.
Insercyjna sekwencja zawiera parę odwróconych powtórzeń, każde o długo-
ści 10-40 nukleotydów otaczających transponowane geny.
Klasa I transpozonów zawiera parę sekwencji insercyjnych (które nie muszą
być całkowicie identyczne) otaczających inne geny transpozonu; przykładem jest
transpozon Tn10.
Klasa II transpozonów zawiera parę odwróconych powtórzeń otacza-
jących inne geny transpozonu; przykładem jest transpozon Tn3.
Elementy transpozycyjne mogą być przenoszone przez „prostą" trans-
pozycję lub przez transpozycję „replikatywną" (wyjaśnienie na rys. 8. 4).
Dla pewnych TE (np. Tn7) miejsce docelowe (tarcza) jest ściśle określone.
Inne TE pozornie włączają się w przypadkowe miejsca, chociaż ich miejsca
docelowe wykazują pewien stopień selektywności [Craig (1997) ARB 66:
437-474]. Badania nad transpozycją sekwencji insercyjnej IS903 do dużego
(55 kpz) plazmidu wykazały, że chociaż Insercja może nastąpić w wielu róż-
nych miejscach, są jednak pewne preferowane regiony włączania IS903 [Hu
i Derbyshire (1998) JB 180: 3039-3048],
Obecność TE w określonym miejscu jest umownie oznaczana podwójnym
dwukropkiem, np. obecność Tn3 w genomie faga λ zapisuje się jako: A:: Tn3.
Transpozycja, zjawisko stosunkowo rzadkie, może powodować różnorodne
przegrupowania DNA (rearanżacje) w genomie, w tym insercje, delecje lub
odwrócenia sekwencji. Transpozycja, np. Tnl0 z chromosomowej lokalizacji, jest
jak się wydaje, powiązana z cyklem komórkowym (patrz sekcja 7. 8. 8).

165
(a) Dwie koliste, dwuniciowe cząsteczki DNA. Cząsteczka dawcy zawiera transpozon (linia przery-
wana), po obu stronach którego znajduje się stare miejsce „tarczowe" ; miejsce to zostało zdupli-
kowane podczas pierwotnego wbudowywania się transpozonu do cząsteczki dawcy (patrz dalej).
Cząsteczka docelowa (do której ma nastąpić wbudowanie transpozonu) ma pojedyncze miejsce tar-
czowe do którego nastąpi Insercja.
(b) Enzym (transpozaza — nie zaznaczona) pośredniczy w co najmniej początkowych etapach trans-
pozycji. Wprowadzane jest przesunięte nacięcie w obrębie miejsca tarczowego. Nacięcie jest też doko-
nywane w każdej nici transpozonu (po jego przeciwnych końcach), a wolne końce są ligowane z koń-
cami w cząsteczce docelowej, tak jak to pokazano na schemacie. W „prostej" transpozycji (np. przy
transpozycji Tnl0) następny (i jednocześnie końcowy etap) jest taki jak pokazano w części (c).
(c) Rezultat „prostej" transpozycji. Synteza DNA nastąpiła z każdego wolnego końca 3' w cząsteczce
docelowej, wykorzystując jednoniciowe odcinki miejsca tarczowego jako matrycę do syntezy nici
komplementarnych . Pozostałe końce nici transpozonu zostały przecięte i zligowane w przedsta-

166
 8. 4 Przekazywanie (transfer) genów
Nowy DNA może wniknąć do komórki bakteryjnej przez transformację, koniu-
gację lub transdukcję; transdukcja (wymagająca pośrednictwa bakteriofagów)
jest opisana w rozdziale 9.

8. 4. 1 Transformacja
W procesie transformacji bakteria pobiera z otoczenia fragment DNA; jedna nić
DNA pochodzącego z dawcy wnika do wnętrza komórki i może spowodować
genetyczną transformację biorcy przez rekombinację z homologicznym regionem
jego chromosomu. Transformacja u różnych gramdodatnich i gramujemnych
bakterii (chociaż nie u E. coli, patrz sekcja 8. 4. 1. 1) następuje spontanicznie; może
ona np. mieć znaczący udział w rozprzestrzenianiu się oporności na antybiotyki
u bakterii patogennych [Davies (1994) Science 264: 375-382].
Haemophilus influenzae i Neisseria gonorrhoeae wiążą DNA wtedy, gdy zawiera
on pewne sygnałowe sekwencje pobierania (ang. uptake-signal sequences),
które zdarzają się powtarzalnie w ich własnych chromosomach. Warunek ten nie
musi być spełniony u Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae, ale z kolei
gatunki te wiążą DNA tylko w ograniczonej liczbie miejsc na powierzchni
komórki.
Zdolność do wiązania i pobierania DNA, kompetencja, jest konstytutywna
u N. gonorrhoeae. U H. influenzae kompetencja jest indukowana przez warunki
wpływające hamująco na wzrost; kompetencję wzmaga np. wysoki poziom
wewnątrzkomórkowego cAMP (rys. 7. 12). U gatunków B. subtilis i S. pneumoniae
na poziom kompetencji wpływają warunki żywieniowe, jak również gęstość
populacji bakteryjnej (jest to przykład tzw. quorum sensing, czyli regulacji przez
„wyczuwanie liczebności"; sekcja 10. 1. 2). U S. pneumoniae kompetencja jest także
związana z procesem transbłonowego transportu wapnia [Trombe, Rieux i Baille
(1994) JB 176: 1992-1996].

wiony sposób. Zauważ, że miejsce tarczowe w cząsteczce docelowej zostało zduplikowane — porów-
naj z cząsteczką dawcy (a). Pozostała część cząsteczki dawcy może być nieaktywna i ulec dezintegra-
cji („samobójczy dawca").
(d) „Replikatywna" transpozycja (zachodzi np. w przypadku transpozonu Tn3) zawiera etapy (b), (d)
i (e). W punkcie (d) nowa synteza DNA jest kontynuowana (z końca 3' w cząsteczce docelowej) poza
miejsce tarczowe, wykorzystując nici transpozonu jako matryce; dzięki temu także cały transpozon
ulega replikacji. Koniec każdej nowej nici został połączony z wolnymi końcami w cząsteczce dawcy.
Struktura pokazana w etapie (d) jest kointegratem, linia zygzakowata wskazuje nowo syntetyzo-
wany DNA. Następny etap zachodzi z udziałem resolwazy — enzymu kodowanego przez transpo-
zon. Resolwaza rozdziela kointegrat w procesie zlokalizowanej rekombinacji (SSR) (sekcja 8. 2. 2),
tworząc cząsteczki pokazane w punkcie (e).
(e) Zarówno dawca, jak i cząsteczka docelowa zawierają kopie transpozonu; zauważ, że w tym
modelu każdy produkt transpozycji zawiera część oryginalnego transpozonu (linia przerywana)
i część nowo zsyntetyzowanego DNA (linia zygzakowata).
Przygotowane w formie zmodyfikowanej wg Molecular Biology of the Gene, 4 wyd. (1987),
J. D. Watson i wsp. (Menlo Park, California: Benjamin/Cummings Publishing Company), p. 336, za
pozwoleniem

167
 [Competence in transformation: Solomon and Grossman (1966) TIG 12:
150-155. ]
Transformację po raz pierwszy zaobserwował Griffith w latach dwudzies-
tych, stwierdziwszy, że niepatogenny szczep S. pneumoniae stał się wirulentny po
zmieszaniu z zabitym szczepem wirulentnym. Znacznie później wykazano, że to
DNA uwolniony z zabitych komórek spowodował transformację żywych komó-
rek; było to jedno z pierwszych wskazań na DNA jako element komórkowy
niosący informację genetyczną.

8. 4. 1. 1 Kompetencja indukowana laboratoryjnie

Kompetencja (np. u E. coli) może być indukowana przez zastosowanie pewnych
procedur zwiększających przepuszczalność osłon komórkowych. Na przykład
roztwór chlorku wapnia (około 50 mM, 0, 2 ml) zawierający 108-109 komórek
E. coli pochodzących ze środkowej fazy logarytmicznej chłodzi się w lodzie,
a następnie dodaje roztwór DNA (10 μl), tak aby końcowe stężenie DNA
wynosiło w przybliżeniu 0, 2 μg/ml. Po inkubacji mieszaniny komórek i DNA
w temperaturze 0°C (łaźnia lodowa) jest ona poddawana szokowi cieplnemu
(42°C przez 1, 5-2 min), a następnie po krótkim schłodzeniu dodaje się 1 ml
bulionu LB i inkubuje komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. (LB —
Luria-Bertani broth zawiera na 1 litr: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego
i 10 g NaCl; pH jest doprowadzone do wartości 7, 5 za pomocą NaOH. )
Osiąganie przez E. coli kompetencji przez inkubację w schłodzonym roztwo-
rze chlorku wapnia przypisuje się obecności w jej błonie cytoplazmatycznej dużej
ilości kompleksów poli-β-hydroksymaślanu z polifosforanem wapniowym.
Sugeruje się, iż kompleksy te mogą formować transbłonowe kanały ułatwiające
transport DNA i że dwuwartościowe kationy mogą działać przez wytwarzanie
połączeń między DNA i fosforanami przy wlocie do takiego kanału [Huang
i Reuch (1995) JB 177: 486-490].
Małe, koliste plazmidy mają tendencję do łatwiejszego wnikania do kompe-
tentnych komórek niż duże. U E. coli DNA w formie liniowych dwuniciowych
fragmentów (dsDNA) transformuje z bardzo małą wydajnością (lub wcale),
ponieważ jest degradowany przez enzym RecBC. Jednakże taka forma DNA
transformuje wydajnie niektóre mutanty recBC, gdyż nie wytwarzają one tego
enzymu.

8. 4. 1. 2 Elektroporacja
Bardzo wysoką wydajność transformacji E. coli przez plazmidowy DNA można
uzyskać stosując elektroporację; mieszanina komórek i DNA plazmidowego
jest poddawana działaniu pola elektrycznego o natężeniu nawet do około
16kV/cm, przez ułamek sekundy. Mechanizm pobierania DNA indukowany
przez impuls elektryczny nie jest w pełni zrozumiały; najważniejsze czynniki to
siła i czas trwania pulsu. Częstość elektrotransformacji zmienia się liniowo
w szerokim zakresie wartości wraz ze stężeniem DNA, zależy także od stężenia
(gęstości) komórek. [High-efficiency electroporation; Zhu and Dean (1999) NAR
27: 910-911. ]

168
 Elektroporacja była zastosowana do transformacji różnych bakterii [łącznie
z np. Helicobacter pylori: Lee i wsp. (1997) AEM 63: 4866-4871].

8. 4. 2 Koniugacja
Niektóre plazmidy (tzw. koniugacyjne) (sekcja 7. 1) oraz koniugacyjne transpo-
zony (patrz niżej) nadają swoim gospodarzom zdolność przenoszenia DNA do
innych komórek w procesie zwanym koniugacją. W procesie tym dawca
(komórka męska) przekazuje DNA do biorcy (komórka żeńska) podczas bezpo-
średniego kontaktu partnerów. Biorca, który otrzymał DNA od dawcy, jest nazy-
wany transkoniugantem.
Podobnie jak transformacja, koniugacja wywołuje ważne fenotypowe zmiany
biorcy, łącznie z nabywaniem kodowanej przez plazmidy oporności na antybio-
tyki. Jednakże, odmiennie niż transformacja, koniugacja wymaga udziału sze-
regu wyspecjalizowanych komponentów komórkowych (patrz niżej), których
komórka, w celu oszczędzania energii, zwykle nie syntetyzuje konstytutywnie.
Z reguły, geny związane z koniugacją są wyrażane tylko w odpowiednich
warunkach lub po otrzymaniu specyficznego sygnału; tak więc, np. pewne
systemy są indukowane przez odpowiednie antybiotyki, podczas gdy inne są
uruchamiane tylko wtedy, gdy liczba komórek bakteryjnych osiągnie pewien
określony poziom (kolejny przykład regulacji przez quorum sensing, czyli
wyczuwanie liczebności: sekcja 10. 1. 2. ). [Control of conjugative gene expression:
Zatyka and Thomas (1998) FEMSMR 21: 291-319. ]
Najpierw zapoznamy się z koniugacją zależną od plazmidów (sekcja 8. 4. 2. 1,
8. 4. 2. 2), a następnie z zależną od koniugacyjnych transpozonów.

8. 4. 2. 1 Koniugacja u bakterii gramdodatnich

Wyróżniamy dwa główne typy koniugacji zależnej od plazmidów:
W szczepach takich jak np. Enterococcus (dawniej Streptococcus) faecalis, poten-
cjalny biorca wydziela niewielkie ilości krótkiego peptydu (feromonu), który
powoduje rozpoczęcie syntetyzowania adhezyjnego czynnika powierzchnio-
wego przez dawcę zawierającego plazmid; następnie plazmid jest przekazywany
z dawcy do przyłączonej doń komórki biorcy. [Artykuł przeglądowy: Dunny
i wsp. (1995) JB 177: 871-8776. ] Taki rodzaj koniugacji zachodzi w płynnej (bulio-
nowej) hodowli, a warunkujące ją plazmidy zawierają często także geny odpo-
wiedzialne za oporność na antybiotyki i syntezę hemolizyny.
Szczep biorcy często wydziela kilka feromonów, z których każdy jest specyfi-
czny wobec określonego plazmidu; wydzielanie zatrzymuje się po uzyskaniu
przez komórkę odpowiedniego plazmidu.
Niektóre plazmidy kodują syntezę peptydu, który jest antagonistyczny
wobec odpowiedniego feromonu. Rolą takiego inhibitora może być zabezpiecze-
nie przed przedwczesnym rozpoczęciem procesu koniugacji (tzn. przed osiąg-
nięciem odpowiednio wysokiego stężenia feromonu), gdy komórka biorcy jest
jeszcze nie dość blisko, aby mogło nastąpić przypadkowe spotkanie partnerów.

169
Drugi typ koniugacji zależnej od plazmidów nie jest związany z wytwarzaniem
feromonów, wymaga jednak umieszczenia mieszaniny komórek dawcy i biorcy
na stałym podłożu, np. na powierzchni filtra nitrocelulozowego. Taka koniugacja
występuje w szczepach z rodzajów Streptococcus i Staphylococcus, a warunkujące
ją plazmidy kodują oporność na antybiotyki i są zazwyczaj niezbyt duże (do
15 kpz). Komórkowe i molekularne mechanizmu transferu DNA w tego typu
koniugacji są poznane w niewielkim zakresie.

8. 4. 2. 2 Koniugacja u bakterii gramujemnych

U dawców gramujemnych plazmid koduje (oprócz innych białek) białkowe

podjednostki strukturalne pilusa (sekcja 2. 2. 14. 3); pilusy wydają się niezbędne
do koniugacji u bakterii tej grupy. Różne typy pilusów warunkują koniugację
w różnych warunkach fizycznych oraz prawdopodobnie funkcjonują w różny
sposób.
Jednym z najlepiej poznanych typów koniugacji jest koniugacja u E. coli prze-
biegająca z udziałem plazmidu F. Plazmid F w komórce dawcy występuje zwyk-
le jako niezależna od chromosomu kolista cząsteczka DNA; komórki dawców
mające pilusy są oznaczane jako F+, podczas gdy komórki biorców (nie mające
pilusów) to komórki F-. Po zmieszaniu komórek F+ i F~, wierzchołki pilusów
oddziałują z powierzchnią komórek F~ (patrz fot. 8. 1: w prawej dolnej części). Co
zdarza się w kolejnym etapie, wciąż nie jest w pełni jasne. Badacze amerykańscy
twierdzili, że DNA może przechodzić poprzez pilus do komórki F~ [Harrington
i Rogerson (1990) JB 172: 7263-7264]. Szwajcarscy naukowcy obserwowali koniu-
gujące komórki przez połączony z kamerą wideo mikroskop świetlny oraz badali
miejsce połączenia dawcy z biorcą w mikroskopie elektronowym [Durrenberger,
Villiger i Bachi (1991) JSB 107: 146-156]; mikroskopia świetlna wykazała, że
komórki dawcy i biorcy są szybko (w ciągu kilku minut) przyciągane do siebie,

Fot. 8. 1 Góra. Koniugujące komórki Escherichia coli w kontakcie typu „ściana-ściana" (skala:
6 cm = 1 μm)
Mikroskopia elektronowa pokazuje „koniugacyjne połączenie": elektronowo gęsta (ciemna) linia
(pomiędzy ostrzami strzałek), które zaznaczają region kontaktu między dawcą i biorcą. Górna
komórka koniugująca jest tuż przed podziałem; porównaj koniugacyjne połączenie z miejscem
podziału komórkowego (najbardziej na prawo). Masy małych, ciemno wybarwionych plamek to
rybosomy.
Prawa dolna część. Koniugujące komórki E. coli
Ten preparat był wybarwiony w celu uwidocznienia F-pilusa (strzałki) biegnącego od jednej komórki
do drugiej. (Widoczne są też fragmenty rzęsek).
Lewa dolna część. Aparat użyty w eksperymencie autora w celu badania koniugacji „obligatoryjnie
wymagającej stałego podłoża" (patrz tekst)
Wiązka 80 chemicznie czystych 73-mm szklanych rurek kapilarnych (wewnętrzna średnica około
0, 8 mm) umieszczona wewnątrz zakręcanej butli. Podczas potrząsania butlą podłoże koniugacyjne
tworzy wielką ilość małych „nitek" płynu w rurkach kapilarnych, każda „nitka" ma na obu końcach
menisk, poniżej którego komórki biorcy i dawcy mogą być utrzymywane w ścisłym kontakcie przez
napięcie powierzchniowe.
Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. Markusa B. Durrenbergera, z Uniwersytetu w Zurichu, Szwajcaria.

170
171
a utworzony ścisły kontakt „ściana-ściana" jest utrzymywany przez następne
80 minut. Szybkie tworzenie bezpośredniego kontaktu następuje w wyniku
wciągania pilusa, co zresztą było przez wiele lat ogólnie akceptowane. W mikro-
skopie elektronowym można było także zaobserwować specyficzne „koniugacyj-
ne połączenie" między przylegającymi do siebie ściśle komórkami (fot. 8. 1: górna
część). Z obserwacji tych i z kinetyki transferu DNA szwajcarscy badacze
wyciągnęli wniosek że: „... DNA jest przekazywany raczej w czasie ścisłego kon-
taktu „ściana-ściana", niż... poprzez pilus wstępnie łączący komórki".
Na pewnym etapie kontaktu jakiś (nieznany) koniugacyjny sygnał uruchamia
proces przekazywania (transferu) DNA. Przekazywanie to zaczyna się od nacię-
cia DNA w specyficznym miejscu (oriT) w określonej nici plazmidu F; jest ogólnie
akceptowane, że nacięcie to jest wprowadzane przez helikazę I, białko kodo-
wane przez plazmid [Matson i Morton (1991) JBC 266: 16232-16237], która
następnie pełni główną rolę w rozwijaniu dupleksu od końca 5'. Szczegóły tego
procesu i sposób transferu DNA nie są jak dotychczas dokładnie poznane. Wolny
koniec 5' może wniknąć do komórki biorcy lub może pozostać zakotwiczony
w pobliżu połączenia partnerów, podczas gdy reszta nici w postaci pętli jest
wprowadzana do biorcy. Do biorcy wnika tylko nacięta nić, która w jego komór-
ce działa jako matryca do syntezy DNA; odtwarzana jest więc kompletna kolista
forma plazmidu, w wyniku czego biorca staje się F+. Wewnątrz dawcy, utracona
nić mogłaby być odtwarzana przez uzupełniającą syntezę DNA (dawcza koniu-
gacyjna synteza DNA, ang. donor conjugative DNA synthesis; DCDS) przebie-
gającą według modelu toczącego się koła (rys. 8. 5), jednak pewne zastrzeżenia
dotyczące niezbędności starterów do tego typu syntezy czyni to założenie
niepewnym.
Czasem, niezbyt często, plazmid F wbudowuje się do chromosomu komórki
gospodarza. Proces taki, fuzja plazmidu z chromosomem, w pewnym stopniu
przypomina integrację faga λ (rys. 8. 3), chociaż mechanizm obu zjawisk jest
różny. W rezultacie powstaje dawca typu Hfr. Ponieważ komórka Hfr tworzy
pilusy, może więc koniugować z komórką F~. Podczas krzyżówek Hfr χ F~ naj-
pierw jest przekazywany DNA plazmidowy, następnie chromosomowy i wresz-
cie, jeżeli nić DNA nie ulegnie przerwaniu — pozostała część DNA plazmido-
wego. Można to łatwiej zrozumieć, jeżeli wyobrazimy sobie, że oriT jest uloko-
wany w środku wbudowanego plazmidu F. Jeżeli przekazany zostanie komple-
tny plazmid i chromosom, biorca staje się dawcą typu Hfr, lecz zazwyczaj helisa
DNA w trakcie przekazywania ulega w pewnym punkcie przerwaniu i biorca,
który nie otrzymuje kompletnego plazmidu, pozostaje F'. Zwykle biorca otrzy-
muje, oprócz części plazmidu, również różnej wielkości fragment chromosomo-

172
wego DNA dawcy i jeżeli geny zlokalizowane na tym fragmencie ulegną rekom-
binacji z chromosomem biorcy, informacja genetyczna zawarta w chromosomie
biorcy zostanie zmieniona. To właśnie znaczna liczba zrekombinowanych komó-
rek powstająca w wyniku krzyżówek Hfr χ F~ spowodowała nazwanie tego typu
dawców Hfr (ang. high frequency of recombination).
Plazmid F może także „opuścić" chromosom, w wyniku czego dawca typu
Hfr staje się dawcą typu F + . Czasem plazmid podczas wycinania się z chromo-
somu może „zabrać ze sobą" przylegający fragment chromosomu, czego wyni-
kiem jest powstanie plazmidu F' (F-prime). W krzyżówkach F' xF~ przekazany
F' przekształca biorcę w dawcę (podobnie jak w przypadku F+), lecz przekazuje
on także fragment chromosomu (tak jak Hfr), to jest ten, zwykle niewielki,
fragment chromosomu, który plazmid zabrał do swego genomu podczas
wycinania się.
Plazmid F jest tylko jednym z wielu plazmidów koniugacyjnych, nie jest
nawet typowym przykładem takiego plazmidu, gdyż np. jego zdolność do two-
rzenia stabilnych dawców typu Hfr nie jest cechą powszechną. W przypadku
wielu plazmidów geny odpowiedzialne za tworzenie pilusa i inne geny
związane z koniugacją są w stanie represji, a więc w populacji potencjalnych
dawców tylko nieliczne komórki (z przejściowo zderepresjonowanymi genami
plazmidowymi warunkującymi koniugację) aktywnymi dawcami. Jak wspomi-
nano wcześniej (sekcja 7. 1), plazmidy mogą kodować, a liczne z nich także prze-
kazywać wiele różnych cech.
Koniugacja „uniwersalna" i „obligatoryjnie wymagająca stałego podłoża".
U bakterii gramujemnych koniugacja może być typu „uniwersalnego" lub „obli-
gatoryjnie wymagająca stałego podłoża", zależnie od typu pilusa kodowanego
przez plazmid koniugacyjny.
Plazmid, który koduje długie, giętkie pilusy — tak jak np. plazmid F (sek-
cja 2. 2. 14. 3), warunkuje tzw. uniwersalną koniugację; czyli taką, która może rów-
nie dobrze zachodzić w podłożu płynnym (np. hodowli bulionowej), jak i na wil-
gotnym (lecz nie zanurzonym), stałym podłożu (np. na powierzchni płytki aga-
rowej). Wyniki eksperymentów z koniugacją uniwersalną w podłożu płynnym
wskazują, że jej wydajność może być zwiększona przez podwyższenie w nim
stężenia elektrolitów [Singleton (1983) FEMSML 20: 151-153].
Plazmidy, które kodują pilusy krótkie, sztywne, podobne do gwoździa,
warunkują koniugację bezwzględnie wymagającą stałego podłoża, która nastę-
puje tylko na wilgotnej powierzchni stałej, lecz nie zanurzonej całkowicie
w płynie. Ten typ koniugacji, jak się wydaje, wymaga, aby koniugujące komórki
znajdowały się pod lub wewnątrz cienkiej błonki płynu, nie przekraczającej gru-
bości samych komórek; w naturze komórki spotykają takie warunki, gdy na
przykład znajdują się na cząstkach gleby wysychającej w wyniku parowania.
Prowadzano eksperymenty, aby stwierdzić, czy warunki odpowiednie do tego
typu koniugacji istnieją pod cienką warstwą płynu na chemicznie czystym szkle
(fot. 8. 1. dół, lewa strona); wyniki sugerują, że koniugacja taka wymaga lub jest
wspomagana przez napięcie powierzchniowe [Singleton (1983) FEMSLT 19:
179-182].

173
 8. 4. 2. 3 Koniugacyjna transpozycja (koniugacja niezależna od plazmidu)

Koniugacyjna transpozycja, która zdarza się głównie między bakteriami gram-

dodatnimi, jest typem koniugacji zależnej od koniugacyjnych transpozonów w,
bez udziału koniugacyjnych plazmidów. (Koniugacyjna transpozycja prawdopo-
dobnie nie następuje między bakteriami gramujemnymi; niemniej jednak u pew-
nych gramujemnych bakterii (np. u Neisseria meningitidis) stwierdzono obecność
DNA koniugacyjnych transpozonów, co sugeruje, że być może dostały się tam
one na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) lub zostały wprowadzone jako część
koniugacyjnego plazmidu. )
Koniugacyjne transpozony, podobnie jak te „klasyczne" (sekcja 8. 3), są rucho-
mymi elementami genetycznymi, które mogą się przemieszczać z jednej cząste-
czki DNA do innej. Występują one np. w chromosomach i plazmidach, a ich
wielkość zawiera się w zakresie od 18 kpz (Ύn916) do ponad 50 kpz; niektóre
z tych większych (np. Tn5253) zawierają elementy podobne do Tn916 wbudo-
wane do innego transpozonu, z których każdy może niezależnie ulegać transpo-
zycji. Koniugacyjne transpozony, z których każdy niesie przynajmniej jeden gen
warunkujący oporność na antybiotyki, są łatwo przenoszone w obrębie szero-
kiego wachlarza gatunków i rodzajów, będąc często odpowiedzialne za przeka-
zywanie antybiotykooporności między bezplazmidowymi gramdodatnimi pato-
genami. Stwierdzono ich obecność w szczepach Enterococcus faecalis, E. faecium,
i Streptococcus pneumoniae. Geny oporności na antybiotyki niesione przez te ele-
menty często warunkują oporność na tetracyklinę (gen tet(M) znaleziono we
wszystkich koniugacyjnych transpozonach u patogenów), chloramfenikol, ery-
tromycynę i kanamycynę. Białko Tet(M), odmiennie od białka ΤΕΤ (sekcja
15. 4. 11), może oddziaływać bezpośrednio z systemem syntezy białek, redukując
wrażliwość wiązania rybosomu z tRNA na tetracykliny [Burdett (1993) JB 175:
7209-7215].
Aktualny model koniugacyjnej transpozycji jest następujący. Kontakt między
komórkami dawcy i biorcy powoduje wycięcie transpozonu wewnątrz dawcy;
przy każdym końcu wbudowanego transpozonu powstają nacięcia w taki spo-
sób, że po wycięciu jedna nić przy każdym końcu transpozonu ma przyłączo-
nych sześć (najczęściej) nukleotydów z chromosomu gospodarza. Te jednoni-
ciowe końcowe sekwencje są nazywane sekwencjami łączącymi (ang. coupling
sequence). Wycinanie następuje z udziałem rekombinazy (produktu genu int)
kodowanej przez transpozon.
Wycięty transpozon ulega cyrkularyzacji w wyniku parowania (częściowo
błędnego) zasad pomiędzy sekwencjami łączącymi. Wydaje się prawdopodobne,
że do komórki dawcy przekazywana jest pojedyncza nić transpozonu i że w bior-
cy, przed insercją do chromosomu, jest syntetyzowana nić komplementarna.
Insercja dwuniciowego transpozonu w miejsce docelowe (ang. target) w chromo-
somie biorcy nie jest specyficzna, ale nie jest też całkowicie przypadkowa. Każde
miejsce docelowe zawiera sekwencje bogate w A (ang. A-rich) i Τ (T-rich), które
są od siebie odległe o około 6 nukleotydów. Podczas insercji końcowe jednoni-
ciowe sekwencje łączące tworzą pary z jednoniciowymi odcinkami utworzonymi
w naciętej sekwencji docelowej; błędnie sparowane zasady są naprawiane w cza-
sie pierwszej rundy replikacji DNA. Transpozon po wbudowaniu do chromo-

174
somu ma z jednej strony sekwencję łączącą z dawcy; jest ona tylko z jednej
strony, ponieważ sekwencje łączące (jedna przy każdym końcu transpozonu)
wbudowywane są w różne nici chromosomu gospodarza — w wyniku ich roz-
dzielenia się podczas, pierwszej po insercji, rundy replikacji DNA.
Koniugacyjne transpozony są w nowym gospodarzu niewrażliwe na jego
system restrykcyjny (sekcja 7. 4). Sugerowane wyjaśnienie tej cechy opiera się na
odnalezieniu, w transpozonie Tn916, genu (orf18) kodującego produkt podobny
do antyrestrykcyjnego białka kodowanego przez pewne plazmidy.
Koniugacyjne transpozony różnią się od „klasycznych" transpozonów (sek-
cja 8. 3) tym, że: 1) pośredniczą w koniugacji, 2) nie duplikują sekwencji docelo-
wej w genomie nowego gospodarza, 3) po wycięciu tworzą pośrednią formę
w postaci cccDNA.
[Artykuł przeglądowy: Scott i Churchward (1995) ARM 49: 367-397. ]

8. 5 Inżynieria genetyczna/technologia rekombinowanego DNA

i podobne techniki związane z analizą DNA
Kwasami nukleinowymi możemy manipulować, oddziaływać na nie in vitro,
a następnie wprowadzać je do komórek, w których mogą podlegać replikacji
i ekspresji. Taka technologia pozwala nam modyfikować komórki wysoce specy-
ficznymi sposobami, na przykład bakterie mogą być „zmuszone" do syntetyzo-
wania ssaczych białek, takich jak insulina. W istocie, mogą być w ten sposób syn-
tetyzowane przez bakterie białka różnych gatunków, ponieważ techniki rekom-
binacji pozwalają wprowadzać do nich całkiem nowy materiał genetyczny. To
wyjaśnia, dlaczego techniki rekombinacji in vitro mają przewagę nad technikami
typu „mutacji i selekcji", za pomocą których możemy modyfikować jedynie geny
już istniejące w komórce. Inną zaletą techniki rekombinowania genów jest to, że
zmiany genetyczne mogą być kontrolowane i można nimi świadomie kierować
(patrz np. mutageneza specyficzna wobec miejsca, zlokalizowana; sekcja 8. 5. 5. 2).
Technologia rekombinowania DNA często wykorzystuje bakterie lub ich
enzymy oraz plazmidy lub fagi. Sekcja 8. 5 wyjaśnia zasady pewnych technik
i wprowadza wiele terminów, idei i strategii. Niektóre opisane metody, np.
łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR, ang. polymerase chain reaction), znaj-
dują zastosowanie w innego typu badaniach, łącznie z wykrywaniem, identyfi-
kacją i taksonomiczną klasyfikacją bakterii oraz innych organizmów, stwierdza-
niem oporności pewnych patogenów na antybiotyki itp. (sekcja 15. 4. 11. 2).

N o t k a : Tematy poruszone w sekcji 8. 5 to:

8. 5. 1 Klonowanie i związane nim ogólne techniki — np. restrykcja DNA (cięcie);
przeszukiwanie (ang. screening); izolowanie i oczyszczanie chromosomo-
wego i plazmidowego DNA; wirowanie, tzw. blotting; wektory; linkery;
dodawanie określonych końców do fragmentu DNA (ang. tailing); ligacja.
8. 5. 2 Fuzja genów i fuzja białek.
8. 5. 3 Sondy; znakowanie sond (łącznie z „przesunięciem nacięcia", ang. nick-
translation).

175
8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR), zastosowania i zmodyfikowane
formy reakcji.
8. 5. 5 Mutageneza.
8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA (metoda Sangera terminacji łańcucha).
8. 5. 7 Wyrażanie się genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia.
8. 5. 8 Funkcjonalna analiza genomowego DNA.
8. 5. 9 Amplifikacja kwasów nukleinowych w łańcuchowej reakcji ligacji
i NASBA.
8. 5. 10 Zrekombinowana streptokinaza; przykład technologii rekombinowania
DNA.
8. 5. 11 Nadprodukcja zrekombinowanych białek.
8. 5. 12 Białka wiążące DNA; wybrane techniki (łącznie z tzw. genetycznym odci-
skiem stopy, ang. DNase I footprinting).
8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek.
8. 5. 14 Prezentowanie różnicujące.
8. 5. 15 Technologia „DNA~chip"
Po ogólnym wstępie zapoznamy się z powszechną dziś technologią: klono-
waniem (sekcja 8. 5. 1), przedstawione zostaną bardziej szczegółowo elementy
różnych technik związanych z tą procedurą, z których wiele znajduje także
zastosowanie w innych obszarach technologii rekombinowania DNA.

8. 5. 1 Klonowanie (klonowanie genu, klonowanie molekularne)

— przegląd
Klonowanie służy do otrzymania wielu kopii danego genu (lub innego frag-
mentu DNA) — np. w celu analizy sekwencji lub otrzymania dużej ilości pro-
duktu kodowanego przez gen.
Zaczynając od małej liczby kopii danego genu możemy amplifikować go
(czyli powielić) do wielu milionów kopii. Najpierw włączamy kopie genu
(in vitro) do tzw. wektora, którym często jest plazmid (sekcja 7. 1), czyli cząstecz-
ka, która może „wnieść" gen do komórki bakterii i następnie replikować go
w niej. Insercja DNA do plazmidu wektorowego jest przedstawiona na rysun-
ku 8. 6; podczas tego procesu kopie genu są mieszane z plazmidem i odpowied-
nim enzymem, tak że gen zostaje z pewną częstością włączany do cząsteczki
plazmidu. Hybrydowy plazmid, zawierający dany gen, może być wprowadzony
na drodze transformacji (sekcja 8. 4. 1) do komórki bakterii i będzie podlegał
replikacji podczas jej wzrostu i podziałów. Populacja bakterii może osiągnąć
bardzo dużą liczebność, dzięki temu możemy otrzymać wiele kopii hybrydo-
wego plazmidu, z których każdy zawiera kopię sklonowanego genu.
Na podstawie przestawionego schematu zakładamy, że podczas transforma-
cji każda bakteria otrzymuje kopię plazmidu. W praktyce musimy mieć możli-
wość wyselekcjonowania tych komórek, które rzeczywiście otrzymały plazmid,
ponieważ tylko te komórki są istotne w procesie klonowania. Jedną z powszech-
nie stosowanych metod jest użycie plazmidu wektorowego, który zawiera gen
oporności na antybiotyk; bakterie po transformacji takim wektorem są wysie-

176
(a) Plazmid i „obcy" DNA. Obie cząsteczki zawierają sekwencję nukleotydową GAATTC, która jest
rozpoznawana przez endonukleazę restrykcyjną EcoRI (sekcja 7. 4; tab. 8. 1). EcoRI tnie między
guanozyną (G) i adenozyną (A), jak wskazują strzałki.
(b) W wyniku cięcia przez EcoRI, obie cząsteczki mają teraz „lepkie końce" (terminalne, jednoniciowe
komplementarne sekwencje nukleotydów).
(c) „Obcy" DNA połączył się z cząsteczką wektora w wyniku komplementarnego parowania zasad
w regionie lepkich końców.
(d) Enzym, ligaza DNA, utworzył fosfodiestrowe wiązanie (rys. 7. 4) między resztami cukru nukleoty-
dów G i A, tworząc hybrydowy plazmid.
Populacja hybrydowych plazmidów może być teraz wprowadzona do bakterii przez transformację
(sekcja 8. 4. 1) w celu klonowania (sekcja 8. 5. 1). Zauważ, że gdy potrzeba, fragment może być następ-
nie wycięty z wektora z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego.

177
wane na podłoże uzupełnione odpowiednim antybiotykiem, dzięki czemu selek-
cjonujemy komórki zawierające plazmid. Należy jednak zwrócić uwagę, że
komórka może rosnąć na takim podłożu, jeżeli: 1) jest mutantem (sekcja 8. 1. )
opornym na dany antybiotyk, lub 2) pobrała plazmid, w którym nie ma intere-
sującego nas genu, gdyż podczas insercji nie został włączony do plazmidu
(rys. 8. 6); do tej drugiej możliwości powrócimy później w sekcji 8. 5. 1. 5.
W innej procedurze selekcyjnej (miareczkowanie represora) czyni się użytek
z: 1) specjalnie skonstruowanego szczepu E. coli, którego chromosom zawiera
gen oporności na kanamycynę pod kontrolą promotora /operatora lac (rys. 7. 11),
i 2) wielokopiowego wektora plazmidowego (sekcja 7. 3. 1) zawierającego sek-
wencję operatora lac. Komórki nie zawierające wektorowego plazmidu nie będą
zdolne do wzrostu na podłożu z kanamycyną (przy braku laktozy i IPTG), ponie-
waż transkrypcja z operatora lac jest blokowana przez białko represorowe LacI
(rys. 7. 11). Komórki zawierające wielokopiowy plazmid będą miały wiele dodat-
kowych kopii lac operatora utworzonych pod kontrolą plazmidu, które będą
współzawodniczyć z operatorem lac pochodzenia chromosomowego o represor
LacI; w tych warunkach LacI nie zdoła spowodować represji genu oporności na
kanamycynę, komórki będą więc rosły na podłożu z kanamycyną. Ponieważ
wektor ten nie niesie genów oporności na antybiotyk (porównaj z poprzednią
metodą), będzie mniejszy i w związku z tym bardziej wydajny w transformacji
(sekcja 8. 4. 1. 1). [Repressor titration: Wiliams i wsp. (1998) NAR 26: 2120-2124. ]
W celu odzyskania sklonowanego genu, komórki są lizowane i hybrydowy
plazmid izolowany z nich np. przez wirowanie równowagowe (izopykniczne)
(rys. 8. 12); lub alternatywnie, może być zastosowany protokół Qiagen (sek-
cja 8. 5. 1. 4; fot. 8. 2). Przy użyciu oryginalnych endonukleaz restrykcyjnych, zasto-
sowanych uprzednio w klonowaniu, gen może być wycięty z hybrydowego plaz-
midu i oddzielony od DNA plazmidowego np. przez elektroforezę.

8. 5. 1. 1 Klonowanie genu bakteryjnego

Interesujący nas gen musi być najpierw wyosobniony spośród innych genów
w genomie. Możemy rozpocząć tę pracę od skonstruowania biblioteki geno-
mowej danego gatunku (rys. 8. 7), a następnie odszukać w bibliotece odpo-
wiedni gen.
Poszukiwanie odpowiedniego genu (tzw. screening) jest procesem selekcji.
Załóżmy np., że poszukiwany gen koduje enzym niezbędny do syntezy histy-
dyny. Musimy sobie uzmysłowić, że ten szczególny, interesujący nas gen wystę-
puje w niewielkiej tylko frakcji cząsteczek składających się na daną bibliotekę
(rys. 8. 7). Jak więc możemy wyizolować zrekombinowany wektor zawierający
ten właśnie gen? Po pierwsze zastosujemy transformację (sekcja 8. 4. 1) w celu
wprowadzenia całego zbioru (biblioteki) zrekombinowanych cząsteczek do
komórek zmutowanych bakterii, z uszkodzonym genem, którego poszukujemy
(np. niezdolnych do syntetyzowania histydyny). Te auksotrofy histydynowe
(sekcja 8. 1. 2) nie będą rosły na podłożu bez histydyny, jednakże mutant transfor-
mowany cząsteczką wektorową z funkcjonalnym genem będzie zdolny do wzro-
stu i tworzenia kolonii na takim podłożu. Te wyselekcjonowane stransformo-
wane mutanty są ponownie rozsiewane na minimalnym podłożu bez histydyny,

178
Najpierw z populacji bakterii danego szczepu izolowany jest DNA chromosomowy, a następnie
poddawany działaniu odpowiedniego enzymu restrykcyjnego (sekcja 7. 4). Enzym wprowadza cięcia
w specyficznych miejscach izolowanych chromosomów (w lewej górnej części), tworząc wiele
fragmentów o różnej wielkości (w środkowej części na lewo). Populacja określonego plazmidu
(w górnej prawej części) dostarcza cząsteczek wektorowych. Dobieramy taki plazmid, który może
być cięty przez taki sam enzym jak zastosowany do cięcia chromosomu, jednakże takie miejsce musi
on mieć tylko jedno, tak aby cięcie jedynie zlinearyzowało cząsteczkę wektora (w środkowej części
na prawo).
Chromosomowe fragmenty i zlinearyzowany plazmid są mieszane w obecności ATP i ligazy DNA,
enzymu, który katalizuje wytwarzanie wiązań fosfodiestrowych (rys. 7. 4). Pewne plazmidy (i frag-
menty) mogą po prostu ulec recyrkularyzacji poprzez swoje lepkie końce, lecz koncentracja obu
rodzajów fragmentów jest tak dobierana, aby plazmidy ulegały połączeniu z fragmentami — w spo-
sób przypadkowy, poprzez lepkie końce (rys. 8. 6), z wytworzeniem dużej liczby cząsteczek zrekom-
binowanych, zawierających plazmid połączony z którymś z fragmentów chromosomu. (Wiązanie
plazmidu z fragmentem może być wspomagane sposobem opisanym pod hasłem ligacja w sekcji
8. 5. 1. 6. ) Ponieważ fragmenty są różnych rozmiarów, również i zrekombinowane plazmidy będą róż-
nej wielkości (dół schematu). Wspólnie zbiór cząsteczek zrekombinowanych plazmidów będzie
zawierał cały DNA chromosomu, stanowiąc tzw. bibliotekę genomową. Z wykorzystaniem transfor-
macji (sekcja 8. 4. 1) biblioteka może być wprowadzona do populacji bakterii — w ten sposób, że różne
komórki otrzymają różne fragmenty chromosomu. Komórki te mogą następnie tworzyć indywidua-
lne kolonie.

aby potwierdzić ich zdolność do wzrostu, co jest wskazaniem, że niosą one

wektor zawierający poszukiwany gen. Musimy dodatkowo sprawdzić, czy
wzrost ten nie jest spowodowany mutacją powrotną auksotrofa do prototrofii
(sekcja 8. 1. 3). Komórki z potwierdzoną obecnością określonego genu przesiewa

179
się do podłoża płynnego w celu namnożenia. Po wyizolowaniu z nich plazmido-
wego DNA, fragment niosący sklonowany gen może być izolowany w sposób
wskazany w sekcji 8. 5. 1
Alternatywną metodą odszukania genu jest zastosowanie hybrydyzacji kolo-
nijnej (patrz niżej).

8. 5. 1. 2 Klonowanie genów eukariotycznych w bakteriach

Genomy eukariotyczne są znacznie większe niż prokariotyczne, tak że do two-
rzenia biblioteki genomowej muszą być cięte na stosunkowo duże fragmenty
restrykcyjne, gdyż inaczej powstawałoby do sklonowania zbyt wiele fragmen-
tów. Z kolei jednak, klonowanie tych większych fragmentów DNA wymaga
zastosowania innego typu wektorów (sekcja 8. 5. 1. 5).
Kolejny problem stwarza to, iż geny eukariotyczne zawierają tzw. introny,
sekwencje, które nie kodują żadnej części produktu genu, lecz przerywają
ciągłość sekwencji kodującej. W komórce eukariotycznej każdy odcinek mRNA,
który był transkrybowany z intronu, jest później usuwany, tworząc dojrzały
mRNA (rys. 8. 8), czyli nieprzerwaną kodującą sekwencję genu, ulegającą następ-
nie translacji. Klonowanie genów z intronami nie stanowiłoby problemu, gdyby
naszym celem było jedynie określenie sekwencji genu in vivo. Jednak gdyby takie
geny (a nie dojrzałe cząsteczki mRNA) miały podlegać transkrypcji, nie mógłby
powstać normalny produkt. Jednakże, potrafimy in vivo odtworzyć sekwencję
DNA genu na podstawie sekwencji jego dojrzałego mRNA. Ta właśnie kopia,
tzw. cDNA (ang. copy DNA lub complementary DNA), może następnie być
sklonowana.
Biblioteki cDNA. Klonowanie genu eukariotycznego rozpoczynamy od kon-
struowania biblioteki cDNA danego gatunku. Najpierw z komórek wyrażających
interesujący nas gen izolujemy całkowity RNA (ang. total RNA). Całkowity RNA
zawiera, między innymi, dojrzały mRNA wszystkich aktywnych (aktualnie
wyrażanych genów). Wydawałoby się, że to ogromna ilość, ale ponieważ
w określonym czasie ekspresji podlega tylko około 1% genów komórki, ograni-
czona jest jednocześnie liczba klonów, które musimy przebadać w celu znalezie-
nia tego nas interesującego.

180
 Wyizolowanie mRNA spośród całkowitego RNA jest ułatwione dzięki temu,
że przez większość eukariotycznych mRNA ma poliadenylowany „ogon"
(A-A-A-A... ) przy końcu 3' cząsteczki (patrz rys. 8. 9). Ogon ten, poli(A), wiąże
się w wyniku komplementarnego parowania zasad z syntetyczną, oligo(dT)-ce-
lulozą, czyli oligonukleotydem (T-T-T-T... ) połączonym z celulozą, tak że
mRNA może być wyizolowany przez zastosowanie chromatografii powinowac-
twa (sekcja (8. 5. 1. 4). mRNA można też izolować metodami magnetycznymi (sek-
cja 14. 6. 1).
Dysponując wyizolowanym mRNA możemy przekształcić go (in vitro)
w odpowiadający mu cDNA. W jednej z metod krótka syntetyczna cząsteczka
oligo(dT) stosowana jest jako starter, który wiąże się do ogona poli(A) na cząs-
teczce mRNA, pozwalając enzymowi zwanemu odwrotną transkryptazą syntety-
zować nić cDNA na matrycy mRNA. (Polimeraza I DNA nie jest wykorzysty-
wana w tym przypadku, gdyż jest mało wydajna na matrycy RNA [Ricchetti
i Buc (1993) EMBO Journal 12: 387-396]. ); mRNA jest następnie usuwany (z uży-
ciem RNazy H) i zastępowany przez komplementarną nić DNA, z wytworze-
niem ds cDNA. Do każdej cząsteczki mogą być następnie dodane lepkie końce
(sekcja 8. 5. 1. 6) i biblioteka cDNA jest gotowa do włączenia do wektora i klono-
wania w bakteriach.
Otrzymany tą metodą cDNA jest czasami niekompletną kopią mRNA. Pełnej
długości cDNA może być otrzymywany metodą Okayamy-Berga (rys. 8. 9), która
jest szczególnie użyteczna, gdy klonowany cDNA ma następnie podlegać
ekspresjii.
Poszukiwanie określonych genów w bibliotekach (screening). Kolonie,
które powstały z komórek transformowaych odpowiednią biblioteką genów
(genomową lub cDNA), mogą być następnie analizowane w celu identyfikacji
określonego genu. Identyfikacja genu jest łatwiejsza, jeśli może on w gospodarzu
bakteryjnym ulegać ekspresji. Oczywiście bakteryjne geny zwykle mogą w tej
sytuacji ulegać ekspresji (patrz sekcja 8. 5. 1. 1). Jednakże, ekspresji mogą podlegać
także pewne cDNA, jeżeli wektor dostarcza niezbędnych elementów kontrol-
nych — jak np. promotor rozpoznawany przez bakteryjną polimerazę RNA (tak
że syntetyzowany może być mRNA, a następnie białko). Wektor, który jest
wyposażony w takie elementy regulacyjne, nazywany jest wektorem ekspresyj-
nym (patrz dalej). cDNA biblioteka ekspresyjna jest biblioteką cząsteczek cDNA
sklonowanych w wektorze ekspresyjnym. Kiedy komórki zawierające takie
wektory tworzą kolonie, czasem można zidentyfikować kolonię wyrażającą
cDNA metodami przedstawionymi na rysunku 8. 10.
Jeżeli sklonowany gen lub cDNA nie jest wyrażany w bakteryjnym gospoda-
rzu, możemy przeszukiwanie prowadzić innymi metodami. Hybrydyzacja kolo-
nijna zaczyna się (patrz rys. 8. 10) wykonaniem replik kolonii na filtr nitrocelulo-
zowy z podłoża na płytce. Kolonie na filtrze poddaje się lizie, uwolniony z nich
DNA jest denaturowany (czyli jego nici są rozdzielane) i jednoniciowy DNA jest
wiązany do powierzchni filtra. Znakowana sonda (ang. probe) (sekcja 8. 5. 3),
która może się wiązać ze specyficzną sekwencją w poszukiwanym genie lub
cDNA, jest następnie dodawana do filtra i po odmyciu niezwiązanej sondy,
znacznik sondy identyfikuje poszukiwany DNA na filtrze, a jednocześnie kolo-

181
Dojrzały, eukariotyczny mRNA (w lewej górnej części) pokazany jest z typowym poliadenylowym
„ogonem" na końcu 3'. Określony plazmid (w górnej prawej części) został przecięty (czyli zlinearyzo-
wany), a do jego końca 3' dodano (in vitro) „ogon" oligo(dT) (patrz dodawanie końców, „tailing",
sekcja 8. 5. 1. 6). Pokazany jest ogon tylko na jednym końcu cząsteczki. mRNA i plazmid oddziałują
między sobą (środkowa część na prawo) przez komplementarne parowanie zasad między „ogonami"
A i T. „Ogon" Τ działa jako starter, umożliwiając syntezę, z udziałem odwrotnej transkryptazy, nici
DNA (linia przerywana) na matrycy mRNA. Do końca 3' nowej nici dodawany jest ogon oligo(dC);
ponieważ tylko kompletna nowa nić może być wydłużana w ten sposób, ogon ten umożliwia nastę-
pującą potem selekcję kompletnych, pełnej długości, cząsteczek cDNA. Następnie plazmid jest cięty
przez HmdIII, pozostawiając jeden „lepki koniec" — wystającą sekwencję 5'-AGCT. Specjalnie skon-
struowany fragment (środkowa część na lewo), razem z ligazą, mogą teraz cyrkularyzować plazmid,
po czym enzym, RNazaH, usuwa nić mRNA, a polimeraza DNA syntetyzuje na jej miejsce nić DNA
— kończąc w ten sposób (z pomocą ligazy) tworzenie dsDNA zrekombinowanego plazmidu (dół),
który jest teraz gotowy do wprowadzenia do komórki bakteryjnej w celu klonowania.
Zauważ, że metoda ta zapewnia wbudowanie cDNA do plazmidu w znanej orientacji (porównaj
rys. 8. 6, gdzie DNA mógł być wbudowywany w obu orientacjach); jest to ważne, gdy zrekombino-
wany plazmid koduje funkcje kontrolne potrzebne do ekspresji genu (patrz wektory, sekcja 8. 5. 1. 5).

nię na oryginalnej płytce. Na przykład znacznik radioaktywny może być

wykryty w sposób przedstawiony na rysunku 8. 10.
Jak wybieramy sekwencję nukleotydów odpowiednią do sporządzenia
sondy? Jeżeli znamy sekwencję aminokwasową interesującego nas białka, może-
my „pracować od tyłu", dedukując możliwą sekwencję dojrzałego mRNA
(i oczywiście DNA) na podstawie sekwencji białkowej; powinniśmy wybrać
krótką sekwencję charakteryzującą się czymś szczególnym, np. zawierającą mało
powszechne aminokwasy (jak metionina), a następnie posługując się kodem
genetycznym (tab. 7. 2) zaplanować odpowiednią sekwencję mRNA. Ponieważ

182
wiele aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden kodon (tab. 7. 2),
wskazane jest zaprojektowanie więcej niż jednej sekwencji sondy., np.
Sekwencja aminokwasowa: Lys -Trp -Met -Lys -Glu -His -Phe
Odpowiadający mRNA: AAA -UGG -AUG -AAA -GAG -CAU -UUC
Odpowiadający DNA: TTC -ACC -TAC -TTT -CTC -GTA -AAG
Odpowiadający mRNA: AAG -UGG -AUG -AAG -GAA -CAC -UUU
Odpowiadający DNA: TTC -ACC -TAC -TTC -CTT -GTG -AAA

Biblioteka cDNA, w wektorze ekspresyjnym (sekcja 8. 5. 1. 2), została wprowadzona do populacji

bakterii, które następnie wytworzyły na płytkach pojedyncze kolonie. Naszym zadaniem jest teraz
odnalezienie kolonii, w której cDNA koduje (i wyraża) odpowiednie, interesujące nas białko.
Na kolonie zawierające cDNA (w lewej górnej części) nakładamy filtr nitrocelulozowy, po podniesie-
niu filtru pozostaje na nim replika (lustrzane odbicie) kolonii (w prawej górnej części). Komórki na
filtrze poddane są lizie, a białka z tych komórek (łącznie z kodowanymi przez cDNA) pozostają przy-
twierdzone do filtra (w środkowej prawej części). Filtr jest następnie poddawany działaniu przeciw-
ciał (λ) specyficznych wobec odpowiedniego białka (w środkowej lewej części); przeciwciała wiążą
się z tym białkiem (obecnym w jednej z kolonii). Niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane, a filtr
traktowany białkiem A — białko (otrzymane ze Staphylococcus aureus), które wiąże się do przeciw-
ciała; niezwiązane białko A jest także wypłukiwane, pozostawiając tylko białko A (małe kropki)
związane do specyficznego kompleksu przeciwciało-białko (dolna prawa strona). Białko A przed
użyciem jest znakowane radioaktywnie, tak że jego obecność można wykryć autoradiograficznie;
wymaga to eksponowania filtru wobec kliszy fotograficznej, a potem wywołania kliszy. Po
wywołaniu kliszy (w dolnej prawej części) możemy zidentyfikować na oryginalnej płytce kolonię,
która zawiera interesujący nas cDNA. Kolonię tę można użyć jako inokulum do wyhodowania
większej liczby identycznych komórek.

183
Każda z zaplanowanych sekwencji DNA może być użyta, w oddzielnych ekspe-
rymentach, jako sonda. (Jednakże, zauważmy, że na zależność między białkiem
a kodującą go sekwencją DNA mogą mieć wpływ takie czynniki jak potrans-
krypcyjna i potranslacyjna modyfikacja, np. usunięcie odpowiednio intronów
lub sekwencji sygnalnych, tak więc nie zawsze możemy precyzyjnie określić
kodującą sekwencję dojrzałego białka z danych aminokwasowych.

8. 5. 1. 3 Precyzyjne cięcie DNA

DNA może być cięty precyzyjnie i w przewidywalny sposób przez endonukle-

azy restrykcyjne typu II (sekcja 7. 4), które są enzymami tnącymi w obrębie
(lub bardzo blisko) specyficznej rozpoznawanej przez siebie sekwencji nukleoty-
dowej (tab. 8. 1).
Wiele RE (ang. restriction endonuclease) typu II powoduje tworzenie przesu-
niętych końców, tworząc „lepkie końce" (ang. sticky ends), lecz pewne (np.

184
ΗραI) tną równo poprzez obie nici tworząc „tępe końce" (ang. blunt ends)
(rys. 8. 11). Sekwencja 8-nukleotydowa rozpoznawana przez NotI, która nie jest
zbyt powszechna w genomach, powoduje, że cięcie tym enzymem nie następuje
często. Dlatego jest on stosowany do otrzymywania dużych fragmentów (o
długości większej niż milion pz), co jest przydatne przy tworzeniu bibliotek
genomowych (sekcja 8. 5. 1. 2).
Na aktywność enzymów restrykcyjnych ma wpływ pH, elektrolity, a także
typ ciętego DNA (liniowe/superzwinięte). Specyficzność cięcia pewnych ER
może być zmniejszona przez takie czynniki, jak: niewłaściwe stężenie enzymu,
stosowanie nieodpowiednich buforów i stężenie glicerolu większe niż 5% m/v.
Tak zwana aktywność z gwiazdką (*) (ang. star activity) odnosi się do zmiany
lub redukcji specyficzności cięcia pewnych endonukleaz restrykcyjnych (np.
BamHI, Sali) w nieoptymalnych warunkach reakcji.
Endonukleazy restrykcyjne pochodzące z różnych gatunków i rozpoznające
te same sekwencje nazywamy izoschizomerami.

8. 5. 1. 4 Izolacja i oczyszczanie kwasów nukleinowych

Kwasy nukleinowe do badań in vitro są otrzymywane przez lizę komórek
i oddzielenie od siebie różnych form DNA i RNA. Materiałem, od którego rozpo-
czynamy pracę, są kolonie lub masa komórek, czyli osad otrzymany przez odwi-
rowanie hodowli bulionowej; sedymentacja komórek hodowli bulionowej
wymaga wirowania przez 20 min przy 5000 g.
U bakterii gramdodatnich ściana komórkowa może być zniszczona przez
działanie lizozymem (patrz rys. 2. 7). (Dla Staphylococcus aureus może być użyta
lizostafina, enzym, który przecina oligopeptydowe połączenia między szkieleto-
wymi łańcuchami peptydoglikanu. ) U gramujemnych bakterii błona zewnętrzna
(sekcja 2. 2. 9. 2) jest zwykle niszczona przez chelatowanie stabilizujących ją katio-
nów za pomocą zbuforowanego EDTA, dzięki czemu lizozym może łatwo

Przesunięte cięcie (w lewej górnej części) przez HmdIII (tab. 8. 1) utworzyło „lepkie końce", czyli dwa
5'-AGCT wystające końce; te (komplementarne) wystające końce mogą się ponownie połączyć
(tzn. odtworzyć dupleks) lub każdy z nich może utworzyć pary z komplementarnym wystającym
końcem innej cząsteczki. (Zauważ, że pewne enzymy restrykcyjne, np. PstI, tworzą 3' wystające
końce, podczas gdy inne tworzą 5' wystające końce). „Tępe końce" (w prawej górnej części) są two-
rzone przez np. HpaI (tab. 8. 1); do tępych końców można dołączyć linkery lub homopolimerowe
ogony (sekcja 8. 5. 1. 6). Niżej: miejsce cięcia BaeI [Sears i wsp. (1996) NAR 24: 3590-3592] — jest to
jeden z rodziny enzymów, które tną z obu stron rozpoznawanej sekwencji (patrz sekcja 7. 4); miejsce
rozpoznawane przez BaeI jest podkreślone w górnej nici (N = dowolny nukleotyd), a strzałki wska-
zują miejsca cięcia.

185
oddziaływać na Peptydoglikan. (EDTA hamuje także nukleazy w lizacie komór-
kowym, działając tym samym ochronnie na kwasy nukleinowe. )
Dodanie sacharozy (3 M) zapobiega gwałtownej lizie, która mogłaby nastąpić
w wyniku nagłego szoku osmotycznego.
Często potrzebujemy izolować z bakterii, np. podczas klonowania, tylko plaz-
midowy DNA. Spośród różnych dostępnych metod, szybka i prosta procedura,
dająca dobrze oczyszczony plazmidowy DNA, jest opisana na rysunku 8. 12;
polega ona na łagodnej, kontrolowanej lizie komórek, podczas której błona cyto-
plazmatyczna jest rozrywana przy pomocy SDS (detergent).
Wirowanie równowagowe (przy odpowiednich wartościach g) może oddzie-
lić makrocząsteczki o różnych gęstościach. Próbka jest nawarstwiana na powierz-
chnię roztworu, którego stężenie, i co za tym idzie gęstość, wzrasta wraz z głębo-
kością, czyli od menisku górnego w kierunku dna probówki (jest to tzw. gradient
gęstości). Wirowanie do stanu równowagi ustawia każdą cząsteczkę w próbce
w tej części gradientu, która odpowiada jej własnej gęstości. W ten sposób np.
całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) może być oddzielony od DNA i od białek w gra-
diencie trifluorooctanu cezu; związek ten hamuje także RNazę (sekcja 7. 6. 1)
w lizacie, czyli pomaga chronić izolowany RNA. Różne formy DNA mogą być
rozdzielone w gradiencie chlorku cezu (patrz rys. 8. 13).
Chromatografia. Różne cząsteczki w próbce mogą być rozdzielone w wyniku
przepuszczania jej przez odpowiednie stacjonarne podłoże, które zatrzymuje lub
przepuszcza cząsteczki zależnie od ich fizycznych właściwości. Chromatografia
powinowactwa wykorzystuje specyficzność wiązania między pewnymi rodza-
jami cząsteczek — np. ogona A-A-A-A-... eukariotycznego mRNA w próbce
i T-T-T-T-... oligo(dT)-celulozy w stałym wypełnieniu kolumny (patrz sek-
cja 8. 5. 1. 2). Chromatografia w tzw. kolumnach zwirowywanych (ang. spun
column chromatography) wykorzystuje siłę odśrodkową (np. 300-400 g), aby
przyspieszyć przejście próbki przez kolumnę z np. ściśle upakowanych drob-
nych cząstek wypełniacza.

Rys. 8. 12 Zarys protokołu izolacji plazmidów z bakterii (np. E. coli) z użyciem zestawu Qiagen®
(Qiagen® plasmid mini kit); używając go można izolować do 20 μg plazmidowego DNA
(inny, większy, zestaw pozwala izolować nawet do 10 mg DNA)
Osad bakterii jest zawieszany w buforze Tris-EDTA zawierającym RNazę A; u bakterii gram-
ujemnych Tris-EDTA narusza błonę zewnętrzną. Po tym etapie przeprowadzana jest kontrolowana
liza alkaliczna przy użyciu NaOH i detergentu SDS (dodecylosiarczan sodu). SDS niszczy błonę cyto-
plazmatyczną, uwalniając rozpuszczalne składniki komórki (np. białka, RNA, plazmidy), NaOH
denaturuje plazmidowy (i chromosomowy) DNA oraz białka. RNaza A trawi zanieczyszczający
RNA. Czas lizy musi być zoptymalizowany, tak aby pozwolić na maksymalne uwolnienie plazmi-
dów z komórki bez uwalniania chromosomowego DNA i nie dopuścić do nieodwracalnej denaturacji
plazmidów (gdyż zdenaturowane plazmidy są oporne na trawienie enzymami restrykcyjnymi). Lizat
jest następnie neutralizowany schłodzonym buforem o dużym stężeniu soli (i pH 5, 5), wytrącającym
SDS; kompleksy soli z SDS wychwytują białka itp., podczas gdy plazmidy ulegają renaturacji i pozo-
stają w roztworze. Łagodne mieszanie zapewnia całkowitą precypitację SDS; należy natomiast unikać
gwałtownego mieszania, aby nie dopuścić do pofragmentowania chromosomu i zanieczyszczenia
supernatantu fragmentami chromosomowego DNA. Przeprowadzane jest następnie wirowanie (przy
np. 16 000 g) w celu otrzymania klarownego (ang. cleared) lizatu (zawierającego plazmidy).

186
Klarowny lizat jest filtrowany przez kolumienkę Qiagen zawierającą jonowymienną żywicę (ang.
resin) (a). Żywica ta została przygotowana specjalnie do izolowania kwasów nukleinowych; ma ona
+
dużą gęstość dodatnich grup anionowymiennych (odległość między sąsiadującymi N wynosi tylko
5A), co stwarza idealne warunki do wiązania kwasów nukleinowych. Ponadto, różne typy cząsteczek
wymywają się przy znacznie różniących się stężeniach soli — patrz profile elucji (b). Pozwala to na
stopniowa elucję i wydajne rozdzielanie cząsteczek z użyciem buforów o różnym stężeniu soli. Przy
określonym (małym) stężeniu elektrolitu i pH klarownego lizatu do złoża wiąże się tylko plazmi-
dowy DNA — zdegradowany RNA, białka itp. nie są zatrzymywane. Złoże jest przemywane bufo-
rem (zawierającym 1 Μ NaCl, pH 7), aby wyeliminować zanieczyszczenia (oraz usunąć białka
związane z DNA). DNA plazmidowy jest następnie eluowany buforem zawierającym 1, 25 Μ NaCl,
pH 8, 5). DNA wytrąca się (w temperaturze pokojowej) izopropanolem, i odwirowuje, a supernatant
usuwa się; po przemyciu 70% etanolem, DNA jest suszony w strumieniu powietrza (5 min) i zawie-
szany w buforze.
Schematy zamieszczono dzięki uprzejmości Qiagen GmbH, Hilden, Germany.

187
DNA izolowany ze zlizowanych bakterii może zawierać (góra) liniowe fragmenty chromosomów;
koliste plazmidy, w których jedna nić została przecięta (forma ocDNA), i koliste superhelikalnie zwi-
nięte cząsteczki (cccDNA) plazmidów.
Jeżeli DNA jest potraktowany barwnikiem — bromkiem etydyny, cząsteczki barwnika mają tenden-
cję do wbudowywania się między dwie przylegające pary zasad, co powoduje wydłużanie szkieletu
fosforanowo-cukrowego. To zniekształcenie helisy zmniejsza gęstość DNA. Cząsteczki liniowe i koli-
ste nacięte pobierają więcej barwnika niż cząsteczki superhelikalne, przez co ich gęstość zmniejsza się
bardziej niż cząsteczek superhelikalnych; dzięki temu, jeżeli DNA traktowany barwnikiem jest pod-
dawany równowagowemu ultrawirowaniu (ang. isopycnic centrifugation) (sekcja 8. 5. 1. 4) w gradien-
cie chlorku cezu, superhelikalny DNA tworzy oddzielne pasmo poniżej pasma zawierającego mniej
gęste liniowe i nacięte koliste cząsteczki (lewa strona).
Inna metoda, wykorzystująca tzw. chromatografię w kolumnach zwirowywanych (ang. spun
column chromatography) (sekcja 8. 5. 1. 4), jest szybsza i łatwiejsza. Wysokie pH wywołuje rozdziele-
nie nici (denaturację) DNA; po neutralizacji, renaturacja (powrót do formy dwuniciowej) jest bardziej
wydajna w superhelikalnych cząsteczkach niż w liniowych i kolistych naciętych — tak więc kolumna,
która silniej wiąże jednoniciowy DNA, spowoduje, że w wypływie pojawią się tylko superhelikalnie
zwinięte cząsteczki DNA plazmidowego (cccDNA) (prawa).
Obie metody pozwalają izolować cccDNA w miligramowych ilościach.

Elektroforeza może rozdzielić zmieszane, naładowane elektrycznie cząste-

czki. Do elektroforezy w żelu próbkę umieszcza się w tzw. studzience (kie-
szonce) na jednym końcu żelu, a przyłożenie napięcia wywołuje przemieszczanie
się cząsteczek poprzez żel w kierunku anody (+) lub katody (-), zależnie od
ładunku cząsteczki. Cząsteczki małe i/lub niosące wysoki ładunek zwykle poru-
szają się szybciej niż duże i/lub słabo naładowane.
Żele poliakryloamidowe, mające gęste usieciowanie, używa się do rozdziela-
nia małych fragmentów DNA lub RNA (o długości około 5-500 nukleotydów);

188
żele agarozowe stosuje się natomiast do rozdzielania większych fragmentów
DNA (o długości około 500-500 000 nukleotydów).
Cząsteczki lokują się w żelu w odrębnych strefach (zgodnie z wielkością),
które po wybarwieniu in situ ujawniają się jako prążki lub plamy. Mogą one być
w razie potrzeby przenoszone na odpowiednie (podobne do papieru) membrany
metodą Southerna (ang. Southern blotting), patrz rysunek 8. 14, lub przez
elektrotransfer.

Wewnątrz żelu fragmenty DNA są rozdzielane na określone prążki, zależnie od wielkości, w wyniku
przeprowadzonej elektroforezy (sekcja 8. 5. 1. 4). Fragmenty są najpierw denaturowane (prze-
kształcane w formy jednoniciowe) poprzez działanie na żel zasadami, następnie żel jest przenoszony
do neutralnego buforu i formowany jest zestaw do przenoszenia (jak pokazano na schemacie).
W wyniku działania sił kapilarnych neutralny roztwór w dolnym naczyniu podsiąka do żelu przez
porowaty materiał (knot, ang. wick), przechodzi przez żel oraz przepuszczalną nitrocelulozę do stosu
papierowych ręczników lub bibuły. Ten skierowany ku górze strumień płynu niesie ze sobą frag-
menty DNA z żelu do arkusza nitrocelulozy. (Ułożenie fragmentów DNA na arkuszu nitrocelulozy
odpowiada ich ułożeniu na żelu. ) Arkusz nitrocelulozy jest następnie zapiekany w temp. 70°C w pró-
żni, co powoduje przytwierdzenie DNA do jego powierzchni. Fragmenty DNA mogą być następnie
analizowane np. przez poddawanie działaniu specyficznych, znakowanych sond (sekcja 8. 5. 3).
Wiązanie się fragmentu z sondą (hybrydyzacja typu Southerna) jest wykrywane dzięki znacznikowi
niesionemu przez sondę — identyfikuje ona bowiem określoną sekwencję danego fragmentu.
Zamiast błony nitrocelulozowej można używać specjalnego papieru, zawierającego 2-aminofenylo-
trieter (tzw. papier-AFT). Przed użyciem APT jest chemicznie modyfikowany przez działanie diazo-
pochodną, tak aby jednoniciowe kwasy nukleinowe wiązały się z nim kowalencyjnie; nie jest wtedy
potrzebne wiązanie DNA poprzez zapiekanie. Ten (silniejszy) sposób wiązania fragmentu DNA
z podłożem pozwala na usuwanie związanej sondy i ponowne analizowanie badanego materiału
z użyciem innej sondy.
Transfer metodą „Nothern blotting" odnosi się do przenoszenia fragmentów RNA z żelu na odpo-
wiednią błonę.
Transfer metodą „Western blotting" odnosi się do przenoszenia białek na błonę.
Transfer metodą „Southwestern blotting": patrz sekcja 8. 5. 12. 1.
„Elektrotransfer" jest szybszą metodą transferu, w której do przenoszenia materiału na odpowiednie
błony wykorzystuje się siły pola elektrycznego zamiast sił kapilarnych.
„Immunotransfer" odnosi się do przenoszenia białek na odpowiednią błonę w celu poddania ich
działaniu znakowanych przeciwciał. Związanie przeciwciała z odpowiednim białkiem wskazuje na
jego antygenowy charakter.

Elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym (PFGE (ang. pulse-field gel

electrophoresis). Standardowa elektroforeza może rozdzielać fragmenty
o długości do około 20 000 pz. PFGE rozdziela cząsteczki o długości nawet ponad
10 milionów par zasad. W tym typie elektroforezy używa się dwóch pól elektry-

189
cznych, ustawionych do siebie pod kątem, a wypadkowe tempo migracji określo-
nej cząsteczki zależy od tempa, w jakim cząsteczka ta może zmienić swój kieru-
nek ruchu po zmianie kierunku przepływu prądu. [Użytecznym źródłem infor-
macji jest: Pulsed Field Gel Electrophoresis (Birren, B) Academic Press, 1993;
ISBN 0 12 101290 5. ]

8. 5. 1. 5 Wektory

Wektory służą do wprowadzania DNA do komórek (sekcja 8. 5. 1). Jest bardzo

pomocne, jeżeli wektor „sygnalizuje" swoją obecność w komórce. Na przykład
kiedy populacja bakterii jest transformowana biblioteką genów (sekcja 8. 5. 1. 1),
niektóre komórki mogą nie otrzymać wektora, z kolei pewne wektory mogą nie
posiadać insertu — co wynika z tego, że wektor uległ recyrkularyzacji bez wbu-
dowania obcego fragmentu DNA (patrz rys. 8. 7). Dlatego też powinniśmy dys-
ponować sposobem potwierdzenia pobrania wektora z insertem w celu uniknię-
cia pewnych wątpliwości zasygnalizowanych w sekcji 8. 5. 1. 1. W jaki sposób
możemy zidentyfikować kolonie zawierające wektor z insertem?
Pewne wektory zawierają geny oporności na antybiotyki. Geny te mogą syg-
nalizować swoją obecność (i obecność insertu) przez ekspresję (lub jej brak)
w komórce gospodarza; przykład przedstawiono na rysunku 8. 15. Inne wektory
mogą zawierać gen kodujący wytwarzanie β-galaktozydazy — enzymu, który
rozszczepia laktozę (sekcja 7. 8. 1. 1) i może tworzyć niebieskozielony produkt
przez rozszczepienie Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktozyd); gdy
konstruujemy bibliotekę (rys. 8. 7), możemy spowodować wbudowywanie frag-
mentów do tego genu (inaktywując go) po prostu przez wybranie miejsca cięcia
enzymem restrykcyjnym w jego obrębie. Następnie kolonie, o których wiemy, że
zawierają wektor (np. na podstawie wyrażania oporności na antybiotyk), mogą
sygnalizować obecność bądź brak insertu na podłożu zawierającym Xgal; kiedy
wektor zawiera insert, powstają białe kolonie (gen kodujący β-galaktozydazę jest
zinaktywawany przez insert), natomiast gdy wektor insertu nie zawiera niosące,
go komórki tworzą kolonie niebieskozielone (β-galaktozydaza jest obecna). Ten
system indykatorowy jest oczywiście użyteczny tylko w przypadku, kiedy
komórki jako takie nie wytwarzają β-galaktozydazy.
Klonowanie dużych fragmentów. Duże fragmenty DNA (sekcja 8. 5. 1. 2) klo-
nowane w wektorach plazmidowych tworzyłyby bardzo duże cząsteczki, które
nie byłyby wydajne w transformacji (sekcja 8. 4. 1. 1). Możemy wówczas zamiast
plazmidowych, użyć wektory fagowe (fagi: rozdz. 9), które wstrzykują swój
DNA do komórki. W tym przypadku, fragmenty przeznaczone do klonowania są
włączane do genomu fagowego i ulegają replikacji łącznie z nim wewnątrz
komórki. Tak zwane wektory wymienne (ang. replacement vector) są konstruo-
wane przez usunięcie części DNA fagowego, który nie jest niezbędny do jego
namnażania i zastąpienie go przez fragment przeznaczony do klonowania. Tak
więc, w wektorze pochodzącym od faga λ może być klonowany fragment o wiel-
kości około 20 kpz, podczas gdy w plazmidzie pBR322 — fragment nie większy
niż 10 kpz. Jeszcze większe fragmenty (nawet do 40 kpz) mogą być klonowane
w kosmidach (rys. 8. 15).

190
Wektory plazmidowe są zazwyczaj małe (w zakresie wielkości 3-5 kpz), ponieważ transformacja
z użyciem małych plazmidów jest bardziej wydajna i są one mniej wrażliwe na uszkodzenia podczas
izolacji z komórek.
Pokazano różne miejsca restrykcyjne (z podaniem ich odległości, w pz, w kierunku zgodnym
z kierunkiem ruchu wskazówek zegara, od góry). Każdy pokazany enzym restrykcyjny tnie pBR322
tylko raz (powodując linearyzację cząsteczki). Różnorodność miejsc restrykcyjnych pozwala na dużą
dowolność konstruowania zrekombinowanych cząsteczek z użyciem DNA pochodzącego z różnych
źródeł.
Obecność genów kodujących oporność na ampicylinę i tetracyklinę (transkrybowanych w prze-
ciwnych kierunkach, jak wskazują strzałki) pozwala stwierdzić obecność plazmidu w komórce oraz
obecność insertu w plazmidzie. Tak więc, jeżeli konstruując bibliotekę z zastosowaniem pBR322 uży-
jemy enzym BamHI (rys. 8. 7), fragmenty będą włączane w obrębie genów kodujących oporność na
tetracyklinę, powodując ich inaktywację, podczas gdy geny odpowiedzialne za oporność na ampicy-
linę pozostaną aktywne. A więc każda bakteria zawierająca plazmid może utworzyć kolonie na
podłożu z ampicyliną; jeżeli kolonie te będą następnie przereplikowane na podłoże z tetracykliną,
komórki zawierające wektor z insertem nie utworzą kolonii, ze względu na inaktywację genów opor-
ności na tetracyklinę (komórki zawierające zrecyrkularyzowany wektor wyrosną na obu podłożach).
Wektor do klonowania musi oczywiście posiadać origin replikacji (sekcja 7. 3). W pBR322 origin
replikacji (ori) pochodzi z plazmidu replikującego się pod zrelaksowaną kontrolą (sekcja 7. 3. 1. 1). Tak
więc pBR322 ma zdolność do replikacji w nierosnących (zahamowanych przez chloramfenikol)
komórkach bakteryjnych. Efekt ten jest wykorzystywany do tzw. amplifikacji liczby kopii wektora,
nawet do wielu tysięcy na komórkę.
Schemat wektora pBR322 dzięki uprzejmości Pharmacia Biotech Inc., Molecular Biology Reagent
Division, Milwaukee, Wisconsin, USA.

Fragmenty osiągające długość nawet 300 kpz mogą być klonowane w tzw.
sztucznych chromosomach bakteryjnych, (ang. bacterial artificial chromosomes,
BAC), dużych kolistych cząsteczkach wektorowych skonstruowanych w oparciu
o plazmid F, które replikują się w E. coli. Pobieranie takich ogromnych cząsteczek
przez komórki gospodarza następuje przy zastosowaniu elektroporacji (sek-
cja 8. 4. 1. 2).

191
Kosmid (góra) jest małym plazmidem, do którego wbudowano miejsce cos (czarny kwadrat) faga λ
(patrz rys. 9. 2); cos umożliwia zapakowanie plazmidu z insertem (in vitro) do główki faga λ.
Kosmidy są przecinane w pojedynczym miejscu restrykcyjnym, liniowe cząsteczki są mieszane
w obecności ligazy z fragmentami DNA (przerywane linie) ciętymi tym samym enzymem. Kosmidy
i fragmenty DNA łączą się przypadkowo, a w pewnych przypadkach fragmenty DNA mogą być oto-
czone dwoma kosmidami (środek); jeżeli w takiej cząsteczce odległość od jednego do drugiego miej-
sca cos wynosi około 40-50 kpz, to sekwencja ta jest odpowiedniej wielkości, aby mogła być zapako-
wana do główki faga λ. Enzymatyczne cięcie w miejscu cos (strzałka) powoduje powstanie lepkich
końców i w obecności składników faga następuje pakowanie rekombinacyjnych cząsteczek. Cząste-
czki po dodaniu ogonka mogą wstrzykiwać zrekombinowany DNA do odpowiedniej bakterii (tak jak
zwykły fag). DNA wprowadzony w ten sposób do komórki cyrkularyzuje z wykorzystaniem miejsc
cos i replikuje się tak jak plazmid. Jego obecność w komórce można wykryć np. dzięki ekspresji,
kodowanych przez plazmid, genów oporności na antybiotyki.
Poszukiwanie specyficznych sekwencji prowadzi się w sposób podobny do stosowanego do prze-
szukiwaniu bibliotek w wektorach plazmidowych.

Sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC, ang. yeast artificial chromosomes)

mogą nieść insert o wielkości nawet 2000 kpz. Te liniowe cząsteczki wektorowe,
konstruowane in vitro, zawierają części drożdżowego (Saccharomyces cerevisiae)
chromosomu konieczne do replikacji i segregacji w komórkach drożdży. YAC
stanowi użyteczną alternatywę dla bakteryjnych systemów klonowania i ekspre-
sji genów eukariotycznych. Wektor taki może bowiem nieść kompletne, nawet
bardzo duże geny eukariotyczne, łącznie z sekwencjami promotorowymi i kon-
trolnymi, co jest przydatne przy badaniu funkcji genów. Wektory takie znalazły

192
też zastosowanie do sekwencjonowania genomu ludzkiego i mapowania genów.
[Artificial chromosomes (artykuł przeglądowy): Monaco and Parin (1994)
TIBECH 12: 280-286.
Wektory ekspresyjne kodują elementy niezbędne do transkrypcji i translacji
insertu (rys. 8. 17); na schemacie nie pokazano wektorowych punków startów ori,
ani ich genów „markerowych" (np. genów oporności na antybiotyki). Ekspresja
może być kontrolowana na wiele sposobów, np. w pewnych systemach geny są
włączane przez określone zmiany temperatury. W razie potrzeby geny mogą być
klonowane w bakteriach, a potem wyrażane w komórkach eukariotycznych. Ist-
nieją wektory niosące Prokariotyczny origin replikacji i elementy niezbędne do
kontroli ekspresji w eukariotach.
Wektory wahadłowe (ang. shuttle vectors) mogą się replikować w różnych
typach organizmów. Mogą one na przykład zawierać zarówno prokariotyczne,
jaki i eukariotyczne sekwencje ori, pozwalające im replikować się w obu typach
komórek. Wektory wahadłowe wyposażone są także w prokariotyczne i eukario-
tyczne markerowe geny selekcyjne, na przykład geny oporności na antybiotyki
wyrażane w bakteriach i geny kodujące zdolność do syntezy leucyny, aktywne
w komórkach eukariotycznych. Komponenty eukariotyczne takich wektorów
pochodzą z Saccharomyces cerevisiae.
Odmianą wektorów wahadłowych są wektory zwane czasem „wektorami
odzyskującymi" (ang. retrieval vector = gapped shuttle vector). Mogą one kopio-
wać in vivo określony Zmutowany gen drożdżowy. Odpowiadający mu dziki typ
genu, łącznie z otaczającymi (flankującymi) go sekwencjami chromosomowymi,
jest włączany do wektora; gen ten jest potem, z użyciem enzymów restrykcyj-
nych, wycinany, tak aby w wektorze pozostały tylko sekwencje flankujące. Taki
„dziurawy wektor" (ang. gapped), czyli z wyciętym genem, wprowadzamy do
komórki niosącej Zmutowany allel tego samego genu. Sekwencje flankujące
w wektorze łączą się z sekwencjami flankującymi Zmutowany gen, który jest
kopiowany (rys. 8. 18). Końcowy produkt jest kompletnym (kolistym) wektorem
niosącym kopię zmutowanego genu, który może być następnie amplifikowany
w E. coli.

Fagmid jest wektorem skonstruowanym in vitro, który zawiera: 1) plazmi-

dowy origin replikacji; 2) tzw. polilinker, czyli miejsce wielokrotnego klonowa-
nia (MCS, ang. multiple cloning site) — patrz rys. 8. 16; 3) markerowy gen selek-
cyjny (np. gen oporności na kanamycynę); i 4) origin replikacji nitkowatego faga
(np. fl — tab. 9. 1). Fragment DNA może być włączony w obrębie MCS fagmidu,
który jest następnie wprowadzany do bakterii przez transformację.
Fagmid może być użyty do tworzenia dwuniciowych kopii insertu, tak jak
w klonowaniu konwencjonalnym. Alternatywnie, jeżeli zainfekujemy komórkę
bakterii zawierającą fagmid odpowiednim fagiem pomocniczym (ang. helper),
np. M13, replikacja będzie inicjowana z ori fagmidu, a wynikiem będzie tworze-
nie jednoniciowych kopii fagmidu (mechanizm procesu — patrz sekcja 9. 2. 2). Te
jednoniciowe kopie będą pakowane w fagowy płaszcz białkowy (kodowany
przez faga pomocniczego) i wydzielane do podłoża. Jednoniciowe kopie insertu
po uwolnieniu z płaszcza fagowego mogą być wykorzystane do sekwencjonowa-

193
Promotor (Pr) jest zwykle silnym promotorem hybrydowym — takim jak np. promotor tac (skonstru-
owany in vitro z promotorów operonów trp i lac E. coli), strzałki wskazują kierunek transkrypcji.
Aktywność promotora jest (w tym przypadku) kontrolowana przez komórkowe białko regulatorowe
operonu lac (patrz rys. 7. 11), które wiąże się z miejscem operatorowym (lacO) na plazmidzie, hamując
transkrypcję. Aktywność może być włączona przez dodanie do podłoża izopropylo-β-tiogalaktozydu
(IPTG). IPTG wiąże się do białka regulatorowego i inaktywuje je, pozwalając dzięki temu na przebieg
transkrypcji. Dla komórek, które nie syntetyzują białka regulatorowego operonu lac, możemy użyć
wektora z wbudowanym genem lacI (rys. 7. 11).
Miejsce wiązania rybosomu (RBS) zapewnia, że po zajściu transkrypcji utworzony mRNA będzie
zawierał sekwencję Shine-Dalgarno (sekcja 7. 6) potrzebną do związania rybosomu (RBS to krótka
sekwencja nukleotydów purynowych).
MCS (zwane także polilinkerem) jest miejscem wielokrotnego klonowania; sekwencją nukleotydów
zawierającą wiele różnych miejsc restrykcyjnych (często zachodzących na siebie); fragment takiego
MCS może wyglądać następująco:

DNA, który ma być wyrażany, klonujemy w MCS; duża liczba miejsc restrykcyjnych pozwala na
znaczną dowolność wyboru enzymów do przygotowania insertu.
Trzy ważne zasady, które należy spełnić, to: 1) insert musi być wbudowany we właściwej orientacji
w stosunku do kierunku transkrypcji, 2) odpowiednik kodonu inicjatorowego w insercie (transkry-
bowany jako AUG w mRNA — sekcja 7. 6) musi być we właściwej odległości od RBS, tak aby AUG
mógł ustawić się poprawnie w stosunku do miejsca „P" na rybosomie (patrz rys. 7. 9); dla zapew-
nienia maksymalnej wydajności translacji odległość ta powinna wynosić 5-13 nukleotydów, 3) jeżeli
w insercie brakuje sekwencji inicjatorowej, musi być ona dostarczona w wektorze (powyżej insertu),
w takim przypadku należy zadbać, aby po transkrypcji, odpowiadający insertowi mRNA był we
właściwej ramce odczytu, tzn., aby kodony insertu były w tej samej fazie co kodon inicjujący,
w innym przypadku wystąpi efekt analogiczny jak przy mutacji typu zmiany ramki odczytu
(rys. 8. 1b).
Jeden ze sposobów właściwego zorientowania insertu jest pokazany na rys. 8. 9. Alternatywnie,
gen, który ma być wyrażany, może być wyizolowany na fragmencie, który został wycięty z użyciem
dwóch różnych enzymów restrykcyjnych nie mających komplementarnych lepkich końców, wtedy
każdy lepki koniec fragmentu może się połączyć tylko z komplementarną sekwencją lepkiego końca
wektora przeciętego dwoma takimi samymi enzymami. (Procedura ta zapobiega jednocześnie
recyrkularyzacji wektora oraz insertu, zwiększając zatem efektywność włączania insertu do
wektora).

194
W chromosomie drożdżowym nastąpiła separacja nici w regionie zmutowanego genu , a wolne
końce nici wektora utworzyły połączenia z komplementarnymi sekwencjami w chromosomie.
Nić związana z „niższą" (5'-do- 3') nicią chromosomową działa jako starter (rys. 7. 8) do Syntezy DNA
(linia przerywana). Podobnie, synteza następuje od przeciwnego końca drugiej nici (linia przery-
wana). Tak więc po ligacji powstaje kompletny (kolisty) plazmid; zauważ, że nowo zsyntetyzowany
DNA zawiera kopię zmutowanego genu.

nia (sekcja 8. 5. 6). Wiele fagmidów po obu stronach MCS (na przeciwnych
niciach) zawiera sekwencje promotorowe, co umożliwia w razie potrzeby trans-
krypcję insertu.

8. 5. 1. 6 Linkery, adaptory, dodawanie tzw. „ogonów", ligowanie

Aby połączyć cząsteczki DNA, zazwyczaj stosujemy metodę pokazaną na
rysunku 8. 6; pozwala ona na ponowne wycięcie insertu, jeśli jest taka potrzeba,
z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego, który zastosowano do jego
włączania. Cząsteczki mogą jednak nie mieć miejsc restrykcyjnych lub zawierać
miejsca niezgodne. W takim przypadku możemy zmienić końce jednej lub obu
cząsteczek. Możemy lepkie końce fragmentu DNA zamienić na tępe (rys. 8. 11) —
albo przez usunięcie jednoniciowych wystających fragmentów (np. stosując
endonukleazę S1), albo przez dosyntetyzowanie komplementarnych nici na każ-
dym końcu „wystającej" nici z końcem 5'. Do powstałych tępych końców
dołączany jest, z udziałem ligazy, tzw. linker — krótka, syntetyczna cząsteczka
dsDNA zawierająca miejsce restrykcyjne, np.:
5'-GGAATTCC-3'
3'-CCTTAAGG-5'
zawiera sekwencję rozpoznawaną przez EcoRI (tab. 8. 1). Ponieważ linker jest sek-
wencją palindromową (tzn. sekwencja czytana w kierunku 5' do 3' jest taka sama
na obu niciach), obojętne jest, który jej koniec połączy się (zliguje) ze modyfiko-
waną cząsteczką. Po przyłączeniu linkerów przecinamy je odpowiednim enzy-
mem restrykcyjnym i otrzymujemy lepkie końce. Przed ligacją z wybranym lin-
kerem niezbędne jest upewnienie się, że w naszym fragmencie nie ma miejsc roz-
poznawanych przez ten enzym lub że są one przez metylację zabezpieczone
przed cięciem (sekcja 7. 4).
Linkery są także używane do dopasowywania ramek odczytu (rys. 8. 17).
Adaptory są podobne do linkerów, lecz zawierają więcej niż jedno miejsce
rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne i mogą być tak zaprojektowane, że
będą też wyposażone w lepkie końce. Adaptory są używane np. do insercji jed-
nego lub kilku miejsc restrykcyjnych do wektora, jeżeli dalsza część postępowa-

195
nia tego wymaga. Na przykład adaptor z lepkimi końcami EcoRI i wewnętrznym
miejscem Smal pozwala wyposażyć wektor w dodatkowe miejsce Smal.
Dodawanie „ogonów" (ang. tailing) to dodawanie nukleotydów do końca 3'
DNA z użyciem terminalnej transferazy deoksyrybonukleotydylowej. Reakcja
taka jest mniej wydajna w przypadku dsDNA niż ssDNA lub cząsteczki
z wystającym końcem 3'. Zazwyczaj dodawane są nukleotydy jednego rodzaju
— z wytworzeniem ogona homopolimerowego (np. deoksytymidynowego (dT)
— patrz rys. 8. 9). Takie homopolimerowe końce mogą być wykorzystane do
łączenia tępo zakończonych cząsteczek DNA, na przykład jeżeli jedna cząsteczka
zostanie wyposażona w koniec poli (dC), a druga — poli (dG). Zaletą takiej tech-
niki jest to, że wytworzenie specyficznych par może nastąpić tylko między
zakończeniami różnych cząsteczek, niemożliwa jest także recyrkularyzacja
cząsteczek. Zastosowanie takiej techniki utrudnia jednak ponowne rozcięcie
połączonych cząsteczek, gdyż sparowane homopolimerowe zakończenia nie
zawierają miejsc restrykcyjnych.
Ligacja to łączenie (kowalencyjne) zestawionych ze sobą ufosforylowanych
-5' i hydroksylowych -3' końców DNA, z wytworzeniem wiązania fosfodiestro-
wego (rys. 7. 4). Aby mogło to nastąpić, koniec 5' DNA musi być ufosforylowany
oraz konieczne jest dostarczenie energii (w postaci ATP). Enzymem powszechnie
stosowanym do przeprowadzania ligacji jest, zależna od ATP, ligaza kodowana
przez faga T4.
Proces przedstawiony na rysunku 8. 6 to ligacja w obrębie jednej nici DNA
w różnych miejscach cząsteczki. Ligacja tępych końców (łączenie dwóch tępo
zakończonych fragmentów dsDNA) wymaga większego stężenia enzymu, niż-
szej temperatury i dłuższego czasu reakcji.
Przy konstruowaniu bibliotek genów (rys. 8. 7) możemy zapobiegać recyrku-
laryzacji wektora (zwiększając tym samym częstość wiązania wektora z fragmen-
tem) przez defosforylację końców 5' przeciętego wektora, stosując enzym —
alkaliczną fosfatazę. Końce 5' fragmentu pozostają ufosforylowane, przez co jest
faworyzowane kowalencyjne wiązanie wektora z fragmentem. Wszelkie pozo-
stałe jednoniciowe przerwy w łańcuchach DNA są następnie naprawiane przez
systemy komórkowe.

8. 5. 2 Fuzja genów i białka fuzyjne

Wektory ekspresyjne (sekcja 8. 5. 1. 5; rys. 8. 16) mogą zawierać sekwencje dwóch
różnych genów mających swoje ramki odczytu w zgodnych fazach. Obie sek-
wencje mogą być wtedy transkrybowane z tego samego promotora, tworząc
wspólny transkrypt, którego translacja powoduje powstanie hybrydowego lub
fuzyjnego białka. Jakie jest zastosowanie takiej techniki? Opisana fuzja może
być wykorzystana do: 1) ułatwiania detekcji i izolacji produktu określonego
genu, 2) określenia wewnątrzkomórkowej lokalizacji specyficznych białek oraz
3) badania regulacji ekspresji genu. Poniżej podane są przykłady.
Podczas ekspresji niektórych sklonowanych genów ilość tworzonego białka
jest trudna do wykrycia i izolowania. W takich przypadkach można wywołać

196
fuzja sekwencji tego genu z sekwencją innego genu (tzw. genu partnerskiego
lub nośnikowego), którego produkt jest łatwy do wykrycia i izolacji, np. jeżeli
gen partnerski koduje S-transferazę glutationu (GST), białko fuzyjne może być
łatwo izolowane metodą chromatografii powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4) z uży-
ciem kolumny zawierającej glutation. (W tym przykładzie GST jest fragmentem
powinowactwa (ang. affinity tail) białka będącego przedmiotem naszego
zainteresowania. )
Gen, którego produkt normalnie jest zlokalizowany wewnątrzkomórkowo,
dzięki fuzji może być połączony z genem, którego produkt jest wydzielany do
środowiska. Może to ułatwić izolację i oczyszczanie badanego białka lub uchro-
nić je przez wewnątrzkomórkowymi enzymami degradacyjnymi — patrz np.
sekcja 8. 5. 11. 4(b).
Fuzja genów może mieć także zastosowanie do otrzymania produktu genu,
jeżeli normalnie jest on słabo wyrażany; umieszczamy wtedy sekwencję tego
genu poniżej silnie wyrażanego genu partnerskiego (tworzymy ich fuzję)
w wektorze ekspresyjnym. Gen partnerski może też wpływać korzystnie na pro-
dukt fuzyjny, zwiększając jego rozpuszczalność lub stabilność.
Po wyizolowaniu, białko fuzyjne może być przecięte enzymatycznie przez
odpowiednią specyficzną proteazę, co pozwala na rozdzielenie produktów każ-
dego z genów. Rozdzielenie białka fuzyjnego można także osiągnąć działając
czynnikami chemicznymi, takimi jak bromocyjan (który przecina łańcuch
białkowy przy reszcie metioninowej) lub hydroksyloamina (tnie między resztą
asparaginy i glicyny). Problemy napotykane przy cięciu chemicznym to: 1) cięcie
także specyficznych miejsc obecnych wewnątrz oczyszczanego białka i 2) wpro-
wadzanie nieplanowanych, niekorzystnych modyfikacji tego białka.
Powszechnie stosowanym partnerem fuzyjnym jest gen kodujący białko flu-
oryzujące na zielono (GFP, ang. green fluorescent protein). Białko to, wystę-
pujące naturalnie w meduzach rodzaju Aequorea, emituje światło zielone
(λ = 508 nm) przy naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 395 nm. Fuzja
z GFP może być wykorzystana do wykazania wewnątrzkomórkowej lokalizacji
specyficznego białka. W tym celu tworzymy fuzję genu kodującego to białko
z genem kodującym GFP; a fuzyjne białko wykrywamy następnie z użyciem
mikroskopu fluorescencyjnego. Na przykład, fuzja Smc-GFP była wykorzystana
do monitorowania lokalizacji białka Smc w badaniach nad rozdzielaniem chro-
mosomów (sekcja 3. 2. 1). W tych konkretnych badaniach, wektor (zawierający
jeden koniec smc w fuzji z gfp) był wbudowany w gen smc chromosomu, w celu
utworzenia kompletnej sekwencji sms-gfp, przez insercję z udziałem pojedyn-
czego crossing-over typu pokazanego na rys. 8. 21(a) [Britton, Lin i Grossman
(1998) GD 12: 1254-1259]. Fuzje z GFP są stosowane w różnorodnych badaniach
dotyczących struktur wewnątrzkomórkowych [Margolin 91998) TIM 6: 234-238.
Dodatkowe informacje na temat GFP: Chalfie and Kain (1998) Green Fluorescent
Protein (properties, applications and protocols) ISBN 0471 17839 X. ]
W fuzji lacZ, partnerski gen lacZ koduje β-galaktozydazę (patrz rys. 7. 11), tak
więc ekspresja tego genu (a jednocześnie genu nas interesującego) może być
monitorowana na podłożu zawierającym Xgal (sekcja 8. 5. 1. 5).
Fuzja może być też przydatna do badania regulacji ekspresji genów. Na
przykład, jeżeli ekspresja genu nie może być monitorowana (z powodu np. trud-

197
ności w oznaczaniu produktu genu), można określić aktywność promotora tego
genu po dokonaniu jego fuzji z genem reporterowym (ang. reporter gene), któ-
rego produkt lub aktywność jest łatwa do monitorowania. Geny reporterowe to
np.: gen kodujący galaktokinazę, acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT)
i zielono fluoryzujące białko. Chociaż z reguły opisane systemy eksperymentalne
działają prawidłowo, stwierdzono, że pewne geny reporterowe oddziałują na
aktywność niektórych promotorów [Forsberg, Pavitt i Higgins (1994) JB 176:
2128-2132]. Możliwość taką musimy uwzględniać interpretując wyniki, jako
nieprzewidywalną komplikację oddziaływań między cząsteczkami zrekombino-
wanych DNA.

8. 5. 3 Sondy
Załóżmy, że chcemy się dowiedzieć, czy dany plazmid, genom lub inna
cząsteczka DNA zawiera określoną, krótką sekwencję nukleotydów. Jeden ze
sposobów to użycie tzw. sondy molekularnej (ang. probe), tj. kawałka jednoni-
ciowego DNA (lub RNA), którego sekwencja jest komplementarna do sekwencji
poszukiwanej, i została w jakiś sposób wyznakowana. Ze względu na specyficz-
ność parowania zasad, dana sekwencja (jeżeli jest obecna) może być zlokalizo-
wana przez związanie się z komplementarną do siebie sondą, o czym poinfor-
muje nas znacznik (ang. label) obecny w sondzie. W praktyce, badany
(tarczowy) DNA jest w formie zdenaturowanej (jednoniciowej), związanej
z powierzchnią filtra nitrocelulozowego. DNA na filtrze jest inkubowany z nad-
miarem sondy. Jeżeli specyficzna sekwencja jest obecna w badanym materiale,
nastąpi jej związanie z sondą w rejonach komplementarności zasad. Po
dokładnym usunięciu (przez odpłukanie) niezwiązanej sondy, pozostaje tylko
frakcja sondy specyficznie związanej z DNA unieruchomionym na filtrze, moż-
liwa do zlokalizowania dzięki niesionemu znacznikowi. Sonda znakowana
radioaktywnym fosforem 3 2 P może być wykryta metodą autoradiografii
(patrz np. rys. 8. 10).
Ostatnio powszechne stało się nieradioaktywne (= nieizotopowe) znakowanie
sond. Znacznik w bezpośrednim nie izotopowym znakowaniu wiąże się kowa-
lencyjnie z sondą. Znacznikiem może być cząsteczka fluoryzująca (np. fluoresce-
ina lub rodamina); którą wykrywa się w świetle ultrafioletowym.
W pośrednim nieizotopowym znakowaniu wiązane są kowalencyjnie z sondą
małe cząsteczki, takie jak biotyna lub digoksygenina. Digoksygeninę wykrywa
się następnie przez dodanie odpowiedniego przeciwciała (sekcja 11. 4. 2. 1) —
antydigoksygeniny, z wcześniej dołączonym znacznikiem w postaci alkalicznej
fosfatazy. Kompleks ten (przeciwciało-znacznik) wiąże się z digoksygeniną i jest
wykrywany przez dodanie substratu, który może być rozszczepiany przez
enzym, z uwolnieniem barwnego produktu oznaczanego kolorymetrycznie. Bio-
tyna jest wykrywana przy użyciu streptawidyny — białka (ze Streptomyces avidi-
nii) wiążącego się silnie z biotyną, które uprzednio powinno być związane z fluo-
ryzującym lub enzymatycznym znacznikiem.
Znacznik enzymatyczny może być także wykrywany metodami chemilumi-
nescencji. Na przykład, sondę wyznakowaną alkaliczną fosfatazą możemy

198
wykryć przez dodanie substratu, który po rozszczepieniu przez ten enzym emi-
tuje światło, wykrywane na kliszy fotograficznej lub odpowiednim aparatem.
Do substratów chemoluminescencyjnych zaliczamy: 1, 2-dioksetany CSPD
i AMPPD (oznaczenia zastrzeżone przez Tropix, Badford, Massachusetts, USA).
W metodzie tej alkaliczna fosfataza może być wykrywana jako znacznik bezpo-
średni, albo pośredni. Taki znacznik może być użyty do znakowania nie tylko
sond, ale także np. starterów przy sekwencjonowaniu DNA metodą tzw. dideo-
ksy (sekcja 8. 5. 6).

Niektóre najnowsze ulepszenia. Określone sekwencje mogą być wykryte

przez dwie sondy oligonukleotydowe znakowane pirenem (jedna znakowana
przy końcu 3' a druga 5'). Jeżeli sondy zwiążą się obok siebie do komplementar-
nej nici tarczowej, to, w specyficznych pozycjach wiązania, oddziaływania
piren-piren spowodują fluorescencję o charakterystycznych cechach. [Paris,
Langenhan i Kool (1998) NAR 26: 3789-3793].
Molekularne sondy świetlne (ang. beacon probes) były zastosowane w
NASBA w celu monitorowania produktu tworzonego podczas fazy amplifikacji
(patrz sekcja 8. 5. 9. 2. )
Bezpośrednie sondowanie dwuniciowego DNA — nowa metoda [Fujiwara
i Oishi (1998) NAR 26: 5728-5733). Jeden koniec sondy (ssDNA) jest komplemen-
tarny do nici przy jednym końcu fragmentu tarczowego dsDNA. Sonda jest
dodawana łącznie z białkiem RecA (sekcja 8. 2. 1). RecA pośredniczy w zastąpie-
niu końcowego odcinka tarczowego DNA przez (homologiczną) sondę. Wolny
koniec sondy zawiera strukturę spinki do włosów, której końcowy nukleotyd
wiąże się kowalencyjnie (z udziałem ligazy) do nieodsuniętej nici DNA tarczo-
wego, stabilizując dodatkowo wiązanie sondy z tarczowym DNA.
Wykazano, że krótkie (np. 10-nukleotydowe) 5'-biotynylowane sondy, wy-
znakowane przez streptawidynę, związaną z alkaliczną fosfatazą przed hybry-
dyzacją, mogą dać wyniki porównywalne z otrzymywanymi z zastosowaniem
sond radioaktywnych, gdy analizie poddawane są tarczowe sekwencje DNA
unieruchomione na membranach. Przygotowywanie takich sond związanych
z enzymem jest opisane przez Guerasomową, Ivanov i Lehrach [(1999) NAR 27:
703-705].

Przygotowywanie sond. Sondy mogą być przygotowywane przez klonowa-

nie określonej sekwencji (sekcja 8. 5. 1; rys. 8. 6). Sklonowana sonda może być,
przed wycięciem z wektora, wyznakowana metodą tzw. przesunięcia nacięcia
(ang. nick translation) wg następujących zasad. Z zastosowaniem endonukleazy
wprowadzane są przypadkowo rozmieszczone, jednoniciowe nacięcia w hybry-
dowym wektorze, następnie inny enzym (np. polimeraza DNA I E. coli) usuwa
nukleotydy z naciętej nici (poczynając od nacięcia) i zastępuje je nukleotydami
znakowanymi, które są dodane w nadmiarze do mieszaniny reakcyjnej. Po liga-
cji, każda sonda, wyznakowana jako część hybrydowego plazmidu, jest wyci-
nana enzymami restrykcyjnymi.
Sondy mogą być też przygotowywane z wykorzystaniem PCR (sekcja 8. 5. 4)
lub syntetyzowane bezpośrednio w postaci każdej zaplanowanej sekwencji
nukleotydowej.

199
 8. 5. 4 Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR)
PCR jest metodą kopiowania DNA, w której powtarzane cykle replikacji określo-
nej sekwencji nukleotydów (tzw. amplikonu), zazwyczaj o długości poniżej
2 kpz, tworzą miliony kopii w ciągu kilku godzin. Metoda opiera się na wyko-
rzystaniu zdolności polimerazy DNA I do wydłużania startera przez syntetyzo-
wanie DNA na nici matrycowej (sekcja 7. 3; rys. 7. 8). (Technika PCR jest chro-
niona patentem będącym własnością Hoffmann-La Roche Inc. )
Podstawy metody są przedstawione na rysunku 8. 19. Należy zwrócić uwagę,
że utrzymywanie wysokiej temperatury (np. 72°C) jest niezbędne, aby nici
matrycowego DNA pozostawały rozdzielone podczas wydłużania starterów; co
jest z kolei podstawą syntezy DNA na jednoniciowych matrycach (sekcja 7. 3).
Nie wszystkie polimerazy DNA mogą funkcjonować w takiej temperaturze,
w związku z tym kluczowym składnikiem reakcji PCR jest termo stabilna poli-
meraza DNA. Przykładem takiego enzymu jest polimeraza Taq z Thermus aquati-
cus, bakterii, która żyje w gorących źródłach, a jej optimum wzrostu przypada na
temperatury 66-75°C. Zmodyfikowana, rekombinacyjna forma tego enzymu
(tzw. fragment Stoffela), zawiera C-końcową część białka wyrażanego w E. coli;
jest ona nawet bardziej termostabilna niż oryginalna polimeraza Taq, a także, jak
wykazano, pozwala osiągać bardziej powtarzalne wyniki w technikach opartych
na PCR, np. w RAPD (sekcja 16. 2. 2. 4).
Polimeraza Taq nie ma aktywności egzonukleolotycznej 3' do 5', czyli nie
może odszczepiać nukleotydów od końca 3' rosnącego łańcucha, co powoduje
brak aktywności korektorskiej (ang. proof-reading). Cecha ta jest bardzo ważna,
gdyż do pewnych celów (np. sekwencjonowania DNA) ważne jest, aby amplikon
był kopiowany z największą dokładnością. W takich przypadkach konieczne jest
zastosowanie termostabilnej polimerazy mającej aktywność korektorską. Jednym
z takich enzymów jest polimeraza DNA UlTma™ (Perkin Elmers), rekombina-
cyjna polimeraza z Thermotoga maritima, która wykazuje udokumentowaną zdol-
ność naprawy zasad błędnie podstawionych podczas PCR.
Do pewnych celów (np. AP-PCR: sekcja 16. 2. 24; rys. 16. 4c) wymagane jest,
aby starter wiązał się z matrycą, nawet gdy nie jest do niej w pełni komplemen-
tarny. W takich warunkach możemy zastosować mniej rygorystyczne (łagodnie-
jsze) warunki (ang. low stringency conditions), np. temperatury, pH lub stężenia
elektrolitów, co optymalizuje wiązanie, pozwalając „obejść" lub zminimalizować
wpływ obecności błędnie sparowanych zasad matrycy i starterów na przebieg
reakcji (w takim przypadku startery mogą wiązać się tylko w takich łagodnych
warunkach). Warunki o wysokiej rygorystyczności (ang. high-stringency condi-
tions) pozwalają na wiązanie się sondy do sekwencji tarczowej tylko wówczas,
jeżeli ich sekwencje są w pełni lub niemal w pełni komplementarne. Im wyższy
poziom rygorystyczności warunków (np. wyższa temperatura), tym konieczny
jest większy stopień zgodności sekwencji między starterem i sekwencją tar-
czową, aby nastąpiło poprawne związanie startera.
Gdy trudno jest zaplanować odpowiedni starter (np. ze względu na niekomp-
letne dane dotyczące sekwencji w tarczowym DNA), możliwe jest użycie tzw.
„uniwersalnego" nukleotydu w miejsce jednego lub kilku nieznanych nukleoty-
dów [Nichols i wsp. (1994) Nature 369: 492-493].

200
Skład mieszaniny reakcyjnej. 1) Próbka DNA. 2) Startery: małe fragmenty ssDNA, każdy o długości
około 20-30 nukleotydów; są dwa typy starterów: jeden komplementarny do końca 3' jednej nici
próbki DNA i drugi komplementarny do końca 3' drugiej nici. Mieszanina reakcyjna zawiera wiele
milionów kopii startera. 3) Deoksyrybonukleozydotrifosforany wszystkich czterech rodzajów.
4) Termostabilna polimeraza DNA. 5) Odpowiedni bufor.
Mieszanina reakcyjna podlega serii zmian temperatury; taki cykl zmian jest powtarzany około
20-30 razy — temperatura jest zmieniana automatycznie pod kontrolą elektronicznych urządzeń
odpowiednio zaprogramowanego „termocyklera". Początkowe ogrzanie do około 94°C denaturuje
próbkę DNA (góra) do formy jednoniciowej. Przejściowe schłodzenie do 45-60°C pozwala starterom
(w lewej górnej części) przyłączyć się (ang. anneal) do komplementarnych do siebie miejsc przy
końcu 3' każdej nici matrycowej. Zmiana temperatury do 72°C pozwala na przebieg syntezy DNA
(przerywana linia) od końca 3' każdego startera. Przy powtarzających się cyklach zmian temperatur
nowo zsyntetyzowane nici (podobnie jak nici oryginalne) działają jako matryce; liczba kopii
powstającą w czasie η cykli PCR wynosi teoretycznie 2", ale po około 25 cyklach tempo syntezy
zmniejsza się w wyniku np. nadmiernej liczby nici matrycowych współzawodniczących o pozostałą
ilość polimerazy.
Specyficzna sekwencja nukleotydów (w próbce), która jest amplifikowana w PCR, jest nazywana
amplikonem; kopie tej sekwencji powstałe w wyniku PCR są także nazywane amplikonami. Zauważ
jednak, że amplikonem może być też sekwencja nukleotydowa zawarta wewnątrz dłuższej cząsteczki
DNA; zasada jest taka sama — amplikon jest definiowany jako sekwencja nukleotydów ograniczona
przez każdą parę starterów.
Ważny jest wybór starterów, co wiąże się ściśle z doborem temperatury ich przyłączania (ang.
annealing). Startery nie powinny zawierać sekwencji, które umożliwiają im wzajemne wiązanie się ze
sobą (jest to szczególnie ważne w wielomiejscowym PCR) lub wytwarzanie w obrębie startera strukt-
ur drugorzędowych. Stosowana temperatura na etapie przyłączania starterów powinna być wyższa
przy większej w nich zawartości par G+C (porównaj liczbę wiązań wodorowych w parach GC i AT;
rys. 7. 6) — takie zaostrzenie wymagań (warunków) zwiększa specyficzność przyłączania starterów
zawierających dużo silnych wiązań GC. Temperatury przyłączania starterów z matrycą zawarte są
zazwyczaj w zakresie 45 do 60°C, ale czasem mogą być wyższe [np. 63°C: Ye i wsp. (1998) NAR 26:
3614-3615; 65°C: Talbot i wsp. (1997) JCM 35: 566-569].
Procedury różnych modyfikacji podstawowej wersji reakcji PCR opisano w sekcji 8. 5. 4. 2.

Ogólnie mówiąc, powodzenie reakcji PCR wymaga zwracania uwagi na wiele

szczegółów, i, co jest ważne, zabezpieczenia się przez skutkami mogącymi
wyniknąć z dostania się obcego DNA do mieszaniny reakcyjnej. Obcy DNA
może przez przypadek zawierać miejsca zdolne do związania stosowanych star-
terów lub sekwencje, które są zdolne zadziałać jako startery dla niepożądanych
sekwencji w naszej próbce DNA. W obu przypadkach, niepożądane sekwencje
(tak jak i te właściwe) mogą być amplikowane, dzięki czemu powstaje miesza-

201
nina produktów, w której te właściwe mogą stanowić tylko nieznanej wielkości
frakcję. Pewne rozwiązania zabezpieczające przed takimi problemami są opisane
w sekcji 8. 5. 4. 3.
Niektóre substancje (znajdujące się np. w próbkach klinicznych) mogą hamo-
wać reakcję PCR (patrz sekcja 8. 5. 4. 6).
PCR ma szeroki wachlarz zastosowań, z których wybrane są zaprezentowane
w sekcji 8. 5. 4. 1.

8. 5. 4. 1 Przykłady zastosowań PCR

Technikę PCR stosuje się w dziedzinach tak różnych jak ekspertyzy sądowe
i paleobiologia. Niektóre z zastosowań PCR w bakteriologii i biologii molekular-
nej wymieniono niżej, a o wykorzystaniu pewnych wariantów podstawowej
techniki PCR wspomniano w sekcji 8. 5. 4. 2.
1. W pewnych przypadkach technika PCR jest po prostu używana do stwier-
dzenia, czy jakaś szczególna, interesująca nas sekwencja nukleotydowa jest
obecna w badanej próbce, czy też nie. Założenie jest takie, że jeżeli sekwencja ta
jest obecna, to zostanie zamplifikowana, a następnie wykryta odpowiednim
sposobem. Ponieważ dany produkt PCR jest zazwyczaj określonej długości
(w sensie liczby nukleotydów), może być łatwo zidentyfikowany w elektrofore-
zie (sekcja 8. 5. 1. 3) jako prążek o określonej lokalizacji w żelu. Produkt amplifi-
kacji może być dodatkowo sprawdzony przez trawienie enzymami restrykcyj-
nymi (sekcja 8. 5. 1. 3) i ustalenie, czy powstały fragmenty o przewidywanej
wielkości. Alternatywnie, produkty mogą być analizowane metodą Southerna
i hybrydyzowane ze specyficzną znakowaną sondą (rys. 8. 14).
Szybko stało się oczywiste, że technika PCR może być pomocna w wykrywa-
niu patogenów w materiale klinicznym poprzez identyfikację unikatowych
sekwencji w ich DNA. Jest to szczególnie przydatne w przypadku patogenów,
które nie mogą być hodowane (czyli nie rosną in vitro), i tych, rosnących bardzo
powoli (np. Mycobacterium tuberculosis). Na skutek tego, technika PCR jest użyte-
czna w diagnostyce pewnych chorób i w badaniach epidemiologicznych.
Jednym z wczesnych przykładów była szybka diagnoza gruźliczego zapalenia
opon mózgowych [Kaneko i wsp. (1990) Neurology 40: 1617-1618]. PCR może
potwierdzić przypuszczalną diagnozę choroby w ciągu godzin (zamiast
tygodni, jak w metodach konwencjonalnych). (Patrz także sekcja 16. 1. 6. 1. )
Do celów diagnostycznych startery muszą być oczywiście wysoce specyficzne,
czyli występować tylko i wyłącznie w danym typie patogena; może to być
np. sekwencja kodująca unikatową toksynę. Warunki reakcji muszą być tak
dobrane, aby wydłużanie starterów następowało tylko wtedy, gdy sekwencja
tarczowa (poszukiwana) jest obecna w próbce klinicznej. Zwróćmy jednak
uwagę, że amplifikacja danej sekwencji nie informuje nas o obecności żywego
patogena.
2. PCR można zastosować do skopiowania określonego amplikonu, w celu
określenia lub sprawdzenia jego sekwencji nukleotydowej. Jeżeli amplifikujemy
fragment DNA w tym właśnie celu, produkty PCR możemy uzyskać stosując
tzw. asymetryczny PCR (sekcja 8. 5. 4. 2, a także 8. 5. 4. 5). Inne techniki, w których

202
chodzi o badanie sekwencji, to SSCP (rys. 8. 19c i sekcja 15. 4. 11. 2), „genetyczny
odcisk palca" typu dideoksy (ang. dideoxy fingerprinting) oraz test sondy linio-
wej (sekcja 15. 4. 11. 2).
3. Produkty PCR mogą być użyte jako sondy (sekcja 8. 5. 3).
4. Produkty PCR mogą być wbudowane do wektora ekspresyjnego (sekcja
8. 5. 1. 5).
5. Technika PCR jest przydatna w badaniach klasyfikacyjno-taksonomicznych
(sekcja 16. 1. 6. 2; 16. 2. 2. 4-16. 2. 2. 8).
6. PCR, z użyciem „sond o szerokim zakresie występowania" (sekcja 10. 8),
jest wykorzystywany do badań przeglądowych dotyczących różnorodności
gatunków w próbach środowiskowych.
7. PCR jest stosowany w analizie różnicowania poziomu ekspresji (ang. diffe-
rential disply) (sekcja 8. 5. 14).
[The future of PCR technology: White (1996) TIBTECH 14: 478-483. ]

8. 5. 4. 2 Pewne (spośród wielu) odmiany technik PCR

System wykrywania mutacji poprzez niepodatność na amplifikację techniką

PCR (ARMS, ang. amplification refractory mutation system). Patrz rysu-
nek 8. 20a.
PCR z użyciem arbitralnie dobranych starterów (AP-PCR, ang. arbitrarily
primed PCR). Patrz sekcja 16. 2. 2. 4 (także sekcja 8. 5. 14).
Asymetryczna reakcja PCR (ang. asymmetric PCR). W procedurze tej jedna
z dwóch typów sond jest stosowana w znacznie mniejszym stężeniu niż druga
(np. 1: 50), zostanie ona zużyta po kilku cyklach reakcji PCR, jednakże ogromny
nadmiar drugiej sondy spowoduje, że jedna z nici matrycowego dsDNA zostanie
skopiowana znaczącą ilość razy. Metoda ta może być zastosowana np. do przy-
gotowywania jednoniciowego DNA do sekwencjonowania (patrz sekcja 8. 5. 6)
lub użycia jako sondy (sekcja 8. 5. 3).
PCR ze wstępnym podgrzaniem (ang. hot-start PCR). Ten wariant reakcji
polega na wstrzymaniu dodania lub zablokowaniu aktywności niezbędnego
składnika mieszaniny reakcyjnej, póki nie zostanie ona ogrzana do temperatury
powyżej optymalnej temperatury wiązania startera; zwiększa to specyficzność
i czułość reakcji w wyniku uniemożliwienia wydłużania starterów związanych
w niespecyficznych miejscach matrycy.
W jednym z systemów polimeraza jest hamowana w początkowym etapie
reakcji ogrzewania aż do 70°C, przez związanie ze specyficznym przeciwciałem.
Inaktywacja polimerazy ustaje przy dalszym podwyższaniu temperatury, pro-
wadzącym do pierwszego etapu denaturacji, następnie reakcja PCR przebiega
normalnie.
W innym systemie mieszanina reakcyjna bez polimerazy jest pokrywana
warstwą wosku (AmpliWax™; Perkin Elmer), który został uprzednio stopiony
w temp. 75-80°C i pozostawiony do zakrzepnięcia. Polimeraza nałożona powy-
żej warstwy wosku może działać tylko po osiągnięciu podczas kolejnych cykli
odpowiedniej temperatury.

203
(a) Technika ARMS (ang. amplification-refractory mutation system). Technika ta pozwala wykryć
specyficzne mutacje punktowe w DNA, którego sekwencja „dzikiego typu" jest nam znana. Na sche-
macie zaznaczona jest mutacja G do C (guanina do cytozyny) jako „C" w górnej nici cząsteczki (góra).
Aby wykryć tę mutację, planujemy starter z 3'-końcową guanozyną, która powinna pasować do
potencjalnie zmutowanej zasady; po połączeniu ze Zmutowana nicią starter może być wydłużany
przez PCR — wskazując na obecność mutacji. W przypadku nici „dzikiego typu" (brak mutacji) (dół),
starter nie będzie wydłużany ze względu na niemożność utworzenia pary pomiędzy dwoma nukleo-
tydami guanozynowymi.
(b) Odwrócona reakcja PCR. W procedurze tej kopiuje się DNA, który otacza (flankuje) znaną sek-
wencję (a nie tę właśnie sekwencję). Metoda może być zastosowana np. do badania miejsca insercji
znanej sekwencji do chromosomu lub plazmidu. Schemat pokazuje liniowy fragment (góra), w któ-
rym znana sekwencja występuje w obrębie miejsca zaznaczonego kwadratem. Najpierw fragment jest
cyrkularyzowany (środek). Startery PCR są tak planowane, że gdy zwiążą się z fragmentem, ich
końce 3' będą wydłużane w kierunku wskazanym przez strzałkę. Następnie wprowadzane jest cięcie
w miejscu restrykcyjnym (linia przerywana) w pozycji między końcami 5' dwóch starterów. Opisana
linearyzacja powoduje powstanie cząsteczki o takim ułożeniu starterów wobec matrycy, jakie jest
w standardowej PCR (dół).
(c) Analiza polimorfizmu konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strand conformation
polymorphism). W analizie SSCP porównuje się różne (ale podobne) próbki jednoniciowego DNA,
wykrywając różnice ich sekwencji przez ujawnianie różnic w ruchliwości elektroforetycznej w żelu
poliakryloamidowym. Tą metodą mogą być wykryte nici, które różnią się nawet jedną zasadą. Tech-
nika PCR może być zastosowana do otrzymywania próbek jednoniciowego DNA.

204
 Jeszcze inna metoda opiera się na zastosowaniu chemicznie zmodyfikowanej
formy polimerazy DNA (AmpliTaqGold™DNA polymerase; PerkinElmer App-
lied Biosystems), która pozostaje nieaktywna, aż w odpowiedniej temperaturze
zostanie termicznie zaktywowana.
[Patrz także Birch i wsp. (1996) Nature 381: 445-445. ]
Odwrócona reakcja PCR (ang. inverse PCR). Patrz rysunek 8. 20b.
Złożona lub wielomiejscowa reakcja PCR (ang. multiplex PCR). Kilka róż-
nych par sond jest stosowanych jednocześnie, co umożliwia amplifikowanie wię-
cej niż jednej sekwencji w próbce. (Patrz np. zespól wstrząsu toksycznego — sek-
cja 11. 11).
Wewnętrzna reakcja PCR (ang. nested PCR). Patrz rysunek 8. 20d.
REP-PCR (amplifikacja repetytywnych sekwencji). Patrz sekcja 16. 2. 2. 5.
PCR z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (rtPCR, ang. reverse trans-
criptase PCR). Początkowo, enzym odwrotna transkryptaza tworzy kopię cDNA
próbki RNA (sekcja 8. 5. 1. 2), następnie reakcja PCR jest prowadzona w typowy
sposób. Przy użyciu właściwych starterów technika ta może być zastosowana np.
do wykrycia specyficznej cząsteczki mRNA lub obecności genomów pewnych
RNA fagów w komórce bakteryjnej (tab. 9. 1).

Pokrewne nici DNA mogą mieć odmienną ruchliwość elektroforetyczną także wówczas, gdy róż-
nice w ich sekwencji nukleotydowej wywołują różny poziom wewnątrzniciowego parowania zasad,
co z kolei powoduje powstawanie form konformacyjnych wpływających na ruchliwość elektrofore-
tyczną. Rysunek pokazuje dwie pokrewne nici DNA; w nici położonej niżej zmiana w sekwencji
nukleotydowej spowodowała utratę zdolności lokalnego wewnątrzniciowego parowania zasad —
tak że dwie pokazane nici mają teraz różną konformację, a co za tym idzie różną ruchliwość elektrofo-
retyczną. Żel używany w analizie SSCP jest niedenaturujący, aby zapobiec zrywaniu wszelkich ist-
niejących wewnątrzniciowych powiązań między zasadami.
Podobna metoda — analiza w żelu denaturującym (DGGE, ang. denaturing gradient gel electrop-
horesis ) — służy do porównywania próbek pokrewnych, tworzonych metodą PCR lub otrzymanych
w wyniku trawienia restrykcyjnego, dwuniciowych fragmentów DNA przez elektroforezę dwukie-
runkową. W metodzie tej [patrz np. Vijg (1995) Biotechnology 13: 137-139], fragmenty są wstępnie
rozdzielane (na podstawie wielkości) w pierwszej fazie elektroforezy. Następnie, w tym samym żelu
fragmenty są przemieszczane elektroforetycznie pod kątem prostym w stosunku do oryginalnej
ścieżki — tym razem poprzez wzrastający gradient czynników denaturujących DNA (np. mocz-
nik + formamid); na określonym poziomie gradientu następuje zlokalizowane, zależne od sekwencji,
„topnienie" DNA (rozdzielanie nici) w części fragmentów (parowanie zasad jest silniejsze w regio-
nach bogatych w pary GC) — co wpływa na ruchliwość elektroforetyczną i pozwala na rozdzielenie
fragmentów w żelu. DGGE stosowano np. do charakteryzowania organizmów przez porównywanie,
amplifikowanych metodą PCR, sekwencji z ich genów kodujących 16S rRNA [Ferris, Muyzer and
Ward (1966) AEM 62: 340-346], i do identyfikowania Rhizobium spp. [de Oliveira i wsp. (1999) LAM
28: 137-41.
(d) Wewnętrzna reakcja PCR (nPCR). Początkowo prowadzona jest standardowa reakcja PCR (przez
około 25 cykli) (góra). Następnie, wykorzystując część produktu jako matrycę, prowadzi się kolej-
nych 25 cykli PCR z użyciem pary starterów komplementarnych do subterminalnych sekwencji
matrycy. Końcowym produktem jest więc zbiór wielu kopii sekwencji zawartej wewnątrz sekwencji
oryginalnej (dół). nPCR, jak donoszono, zwiększa zarówno czułość, jak i specyficzność PCR. nPCR
stosowano np. w przypadku dostępności małej ilości tarczowego (tego, który chcemy amplifikować)
DNA lub gdy materiał wyjściowy był niezbyt dobrej jakości.

205
 Polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA (SSCP, ang. single-strand
conformation polymorphism). Patrz rysunek 8. 20c.
PCR na podłożu stałym (ang. solid-phase PCR). Patrz sekcja 8. 5. 15.

8. 5. 4. 3 Problem obecności obcego DNA w reakcji PCR; proponowane rozwiązania

Wspomniano wcześniej, że zanieczyszczenie obcym DNA może zagrażać pomy-
ślnemu przebiegowi reakcji PCR. Jest to niezwykle poważny problem, na
przykład w laboratoriach klinicznych, które rutynowo testują próbki w kierunku
obecności tylko jednego lub dwu amplikonów; próbka nowo wprowadzona do
testowania jest narażona na zanieczyszczenie pochodzące z nagromadzonego
DNA sekwencji tarczowych z poprzednich próbek.
Jednym z proponowanych rozwiązań tego problemu jest przeprowadzanie
reakcji PCR rutynowo z użyciem trifosforanu deoksyurydyny (dUTP) zamiast
trifosforanu deoksytymidyny. W metodzie tej każda mieszanina reakcyjna
zawiera enzym uracylo-N-glikozylazę (UNG), który usuwa uracyl z dUMP
w DNA. (UNG należy do enzymów naprawiających DNA: sekcja 7. 7. 1. 3. )
Rutynowo, przed rozpoczęciem właściwej reakcji, wprowadza się dodatkowy
etap, w którym UNG reaguje z zanieczyszczającymi pozostałościami DNA
z poprzedniej reakcji, po czym podczas pierwszego podwyższenia temperatury
do 95°C przy starcie reakcji amplikony poddane działaniu UNG zostaną znisz-
czone w wyniku powstających dwuniciowych pęknięć. Wysoka temperatura
inaktywuje jednocześnie UNG, tak że właściwa reakcja może być kontynuo-
wana już przy braku UNG i zanieczyszczeń. Zauważmy, że UNG nie wpływa
na matrycowy DNA — który ma normalny (zawierający tyminę) nukletyd,
dTMP.
Inne rozwiązanie polega na włączeniu izopsoralenu do mieszaniny reakcyj-
nej PCR. Po reakcji, mieszanina jest poddawana działaniu promieni ultrafioleto-
wych (np. 365 nm/4°C/15 min), co powoduje fotoaktywację izopsoralenu.
Zaktywowany izopsoralen wiąże kowalencyjnie dwie nici w dsDNA. W wyniku
tego końcowymi produktami PCR są amplikony dsDNA, które nie mogą ulec
denaturacji, a tym samym nie mogą działać jako matryce w reakcji. Metodę tę
można stosować, kiedy w produktach reakcji chcemy wykryć daną sekwencję
przez elektroforezę, nie może natomiast być użyta na przykład w ddF (sek-
cja 15. 4. 11. 2), który wymaga jednoniciowej matrycy DNA. [Optimal activation of
isopsoralen: Fahle i wsp. (1999) JCM 37: 261-262. ]
Ryzyko namnożenia niewłaściwych sekwencji w wyniku rozpoczęcia reakcji
od błędnego startera (ang. „mis-priming") jest znacznie bardziej prawdopodobne
w niższej temperaturze (mniej rygorystyczne warunki reakcji), np. podczas mie-
szania składników reakcji przed jej rozpoczęciem. Jest to szczególnie ważne,
ponieważ każdy niespecyficzny produkt utworzony we wczesnym etapie będzie
amplifikowany przez cały czas reakcji, co zredukuje jej wydajność i specyficz-
ność. Tworzenie niespecyficznych produktów jest minimalizowane (a nawet
eliminowane) w reakcji PCR typu „hot-start" (sekcja 8. 5. 4. 2).

206
 8. 5. 4. 4 Klonowanie tępo zakończonych produktów reakcji PCR
Prosta i wygodna metoda klonowania produktów reakcji PCR, np. przed sek-
wencjonowaniem (sekcja 8. 5. 6), polega na użyciu tzw. „rzadko tnącej" endonu-
kleazy restrykcyjnej (sekcja 8. 5. 1. 3), Srfi [Schlottere i Wolf (1966) TIG 12:
286-287]. Srfi tnie DNA tworząc w obrębie rozpoznawanej przez siebie sekwen-
cji tępe końce (sekcja 8. 5. 1. 3). Ponieważ sekwencje takie występują rzadko,
można założyć, że powstające produkty PCR w zasadzie nie zawierają miejsc
rozpoznawanych przez Srfi.
Wykorzystywany w tej metodzie wektor został skonstruowany przez insercję
miejsca rozpoznawanego przez Srfi do genomu faga M13 (patrz sekcja 9. 2. 2).
Aby włączyć produkt PCR do dwuniciowej kolistej cząsteczki wektora, produkt i
wektor inkubuje się w mieszaninie reakcyjnej z Srfi i ligazą łącznie. Miejsce Srfi
ulegnie przecięciu (linearyzując cząsteczkę wektora), ligacji, przecięciu, religacji
itd., póki nacięty koniec nie ulegnie zligowaniu z fragmentem, produktem PCR
(w wyniku ligowania tępych końców — sekcja 8. 5. 1. 6). Kiedy tak się stanie,
wektor przestanie być podatny na działanie Srfi i może nastąpić połączenie wol-
nych końców wektora oraz fragmentu, z wytworzeniem kolistej cząsteczki —
wektora zawierającego insert. Taki wektor można wprowadzić do bakterii przez
transformację.
Restryktaza Srfi (wytwarzana przez firmę Stratagen) rozpoznaje i przecina
następującą sekwencję:
5'-GCCC/GGGC-3'
3'-CGGG/CCCG-5'
W innej procedurze (z użyciem zestawu do „klonowania na tępe końce" —
firmy Boehringer Mannheim) produkty reakcji PCR włącza się w tępo zakończone
cięcie dokonane w obrębie letalnego genu wektora. Wbudowanie insertu inakty-
wuje ten gen, a więc wektor ze sklonowanym fragmentem może być wprowa-
dzony do komórki przez transformację i powielać się tam, podczas gdy zrecyrku-
laryzowany wektor, który niesie funkcjonalny letalny gen, spowoduje po trans-
formacji zabicie swojego gospodarza (jest to przykład systemu, który umożliwia
efektywną selekcję zrekombinowanego wektora).

8. 5. 4. 5 Przygotowywanie jednoniciowego DNA z produktów reakcji PCR

Oczyszczony jednoniciowy DNA jest potrzebny do wielu celów, np. do sekwen-
cjonowania (sekcja 8. 5. 6) lub użycia jako sondy molekularnej. Oczyszczony
ssDNA może być otrzymany z produktów reakcji PCR szybką i prostą metodą
opisaną przez Pagratisa [(1996) NAR 24: 3645-3646]. Przed reakcją PCR, jeden
z dwóch typów starterów jest znakowany biotyną. Po PCR, do mieszaniny rea-
kcyjnej dodaje się streptawidynę (białko pochodzące ze Streptomyces cwidinii),
która wiąże się z biotyna, znajdującą się tylko w jednym z dwóch typów produ-
ktu. Mieszanina jest następnie poddawana elektroforezie w żelu denaturującym
(np. zawierającym mocznik w dużym stężeniu), który hamuje tworzenie par mię-
dzy komplementarnymi nićmi, a więc jednoniciowe komplementarne produkty
PCR nie mogą hybrydyzować. Ponieważ jeden z produktów jest związany

207
z białkiem (streptawidyną), jego ruchliwość elektroforetyczna (czyli tempo poru-
szania się cząsteczki podczas elektroforezy) jest znacznie zredukowana, w wy-
niku czego drugi produkt utworzy w żelu dobrze oddzielony prążek. Jeżeli
potrzebna nam jest określona nić, przed reakcją PCR musi być biotynylowany
starter drugiej nici.

8. 5. 4. 6 Inhibitory reakcji PCR

Niektóre próbki zawierają substancje, które hamują reakcję PCR. Reakcja może
więc dać fałszywie negatywny wynik nawet w obecności specyficznej matrycy
Jest to oczywiście szczególnie ważne w laboratoriach klinicznych. Inhibitory
związane z krwią (sekcja 11. 8. 1. 1) to heparyna i hemina. Inhibitory w kale to
pewne polisacharydy pochodzące z pożywienia [Monteiro i wsp. (1997) JCM 35:
995-998]; można je usunąć stosując metodę preparatów DNA „uwięzionych"
(zatopionych) w agarozie [Moreira (1998) NAR 26: 3309-3310].
Inhibitory można wykryć przez dodanie kilku kopii „wewnętrznego kontro-
lera" (IC, ang. internal controler) do każdej badanej próbki przed amplifikacją
[Rosenstraus i wsp., (1998) JCM 36: 191-197]. IC jest nicią kwasu nukleinowego
o przypadkowej sekwencji, lecz region wiążący starter ma ona identyczny jak
właściwy amplikon; zawiera także unikatowe miejsce wiążące odpowiednią
sondę. Zamplifikowanie IC (co wykrywamy z użyciem sondy) świadczy o efe-
ktywności amplifikacji i braku inhibitorów.

8. 5. 4. 7 PCR — oznaczenia ilościowe

W reakcji PCR możemy określić początkową liczbę sekwencji matrycowych

(amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej.
Jedna z metod wymaga użycia tzw. sond TaqManR, które są tak zaplano-
wane, aby hybrydyzować (wiązać się) do wewnętrznej sekwencji w amplikonie.
Na początku reakcji PCR mieszanina reakcyjna zawiera dużą liczbę sond,
a każda sonda jest znakowana barwnikiem fluorescencyjnym i wygaszaczem
fluorescencji. Barwnik i wygaszacz są blisko siebie, tak że wolny (niezwiązany)
starter jest niefluorescencyjny z powodu działania wygaszacza.
Sondy TaqMan na etapie wiązania (ang. annealing) przyłączają się do komp-
lementarnych sekwencji w amplikonach. W określonym amplikonie sonda wiąże
się do sekwencji wewnętrznej, a startery — do sekwencji końcowych. Następnie
polimeraza wydłuża starter aż do osiągnięcia miejsca sondy. Wtedy to polime-
raza degraduje sondę (uwalniając barwnik i wygaszacz jako oddzielne cząste-
czki) i kontynuuje syntezę komplementarnej nici amplikonu, a niewygaszany
teraz barwnik staje się aktywny fluorescencyjnie. Zwróćmy uwagę, że na każdy
amplikon związany z sondą uwalniana jest jedna cząsteczka barwnika, tak więc
w miarę przebiegu kolejnych cykli reakcji stopień fluorescencji będzie się
zwiększał.
Jeżeli od początku, cykl po cyklu, monitorujemy fluorescencję, możemy
zidentyfikować pierwszy cykl, w którym fluorescencja przekracza poziom tła,
jest on nazywany cyklem progowym (ang. threshold cycle) i daje informację
o początkowej liczbie matryc (amplikonów) w mieszaninie reakcyjnej. Im wyższa

208
wartość progowa, tym liczba matryc mniejsza. Jest to logiczne: im mniejsza
początkowa liczba matryc, tym potrzeba większej liczby cykli do przekroczenia
progowej wartości fluorescencji. W istocie, występuje odwrotna zależność linio-
wa między numerem cyklu progowego i logarytmem początkowej liczby matryc;
tak więc otrzymamy linię prostą, jeżeli numer cyklu progowego (1, 2, 3...
33, 34, 35 itd. ) wykreślimy wobec logarytmu początkowej liczby matryc; gdy nie
znamy początkowej liczby matryc, możemy ją ekstrapolować z tego wykresu.
Takie podejście eksperymentalne było zastosowane np. do ilościowego
wykrywania Borrelia burgdorferi w próbkach zakażonej tkanki [Pahl i wsp. (1999)
JCM 37: 1958-1963].

8. 5. 5 Mutageneza
Jak już wiemy, na kwasy nukleinowe można w różny sposób oddziaływać
i manipulować nimi takimi metodami jak trawienie enzymami restrykcyjnymi
i ligacja, tworzenie fuzji itp. Mutageneza (w tym także zaplanowane tworzenie
mutacji) jest kolejną metodą oddziaływania na DNA. Możemy ją przeprowadzić
różnymi sposobami.
Mutacje mogą być wywoływane w celu: 1) zinaktywowania genu, tak aby stał
się on niefunkcjonalny lub nie kodował pierwotnego produktu, 2) zmodyfikowa-
nia genu, aby zmienić jego ekspresję. Inaktywacja danego genu może być nie-
zbędna do potwierdzenia jego roli w określonej funkcji przez porównywanie
komórki z genem aktywnym i komórki zawierającej gen uszkodzony. Modyfika-
cje genów mogą znaleźć zastosowanie w medycynie i w przemyśle, jak również
w badaniach naukowych z zakresu biologii.

8. 5. 5. 1 Tworzenie przypadkowych (ang. random) mutacji

Gdy bakterie są poddawane działaniu mutagenów, w różnych genach poszcze-
gólnych osobników (sekcja 8. 1) mogą powstawać mutacje. Stosując odpowiednie
warunki selekcyjne możemy izolować z mutagenizowanej populacji te komórki,
które uzyskują określony typ mutacji (i przejawiają dzięki temu jakąś zmienioną
cechę lub funkcję). Na przykład, w celu wyselekcjonowania zmutowanych
komórek, które uzyskały oporność na dany antybiotyk, mutagenizowaną popu-
lację bakterii hoduje się na podłożu z tym antybiotykiem, a mogą na nim
wyrosnąć tylko komórki oporne.
Mutageneza sklonowanego genu: szczepy mutatorowe. Efektywną drogą
wywoływania przypadkowych mutacji w sklonowanym genie jest wprowadze-
nie wektora (niosącego ten gen) do komórki mutatorowego szczepu bakterii,
czyli szczepu, który w wyniku mutacji jest niezdolny do naprawiania uszkodzeń
w DNA (sekcja 7. 7). Z powodu braku normalnego systemu naprawczego,
w genomie bakteryjnym i w wektorze plazmidowym (lub innym) niosącym sklo-
nowany gen, podczas wzrostu i kolejnych podziałów nagromadzają się mutacje.
Jednym z takich szczepów mutatorowych jest Epicurian Coli® XL1-Red (firmy
Stratagene). W szczepie tym mutacje nagromadzają się w tempie kilkanaście

209
tysięcy razy większym niż w odpowiadającym mu szczepie dzikim. W ten spo-
sób mutacje powstają bez użycia zewnętrznego mutagenu.

8. 5. 5. 2 Tworzenie mutacji specyficznych

Mutacje specyficzne mogą być wykorzystane do badań ekspresji i funkcji genu
oraz do modyfikowania w określony sposób produktu genu — np. w celu ulep-
szania i zwiększania aktywności enzymów wykorzystywanych w przemyśle
(przez zmiany określonych nukleotydów w kodujących je genach). Mutacje
punktowe (sekcja 8. 1. 1), a nawet rozleglejsze zmiany mogą być wprowadzane
do DNA w dokładnie zaplanowane miejsca.
Zasadę wprowadzania mutacji zwanych zlokalizowanymi lub specyficznymi
wobec miejsca (ang. site-specific mutagenesis) (=mutageneza kierowana przez
oligonukleotydy) pokazano na rysunku 8. 21.
Prostsza metoda (z użyciem zestawu Quick Change™ firmy Stratagene)
mutagenezy specyficznej wobec miejsca nie wymaga jednoniciowej formy DNA
(porównaj z metodą na rys. 8. 21). Zamiast tego stosuje się w niej dwuniciowe
koliste wektory, każdy zawierający insert poddawanego mutagenezie fragmentu
DNA. Cząsteczki wektorów są najpierw mieszane z dwoma typami mutagen-
nych oligomerowych starterów — analogicznych do tych, które pokazano na
rysunku 8. 21. Te dwa typy starterów są komplementarne do sekwencji na róż-
nych niciach insertu; ich sekwencje zachodzą na siebie i obie zawierają zaplano-
wane mutacje (zmiany sekwencji). Wektory są termicznie denaturowane, po
czym dodawane są startery, które wiążą się z odpowiednimi miejscami w inser-
cie. Startery są wydłużane przez termostabilną polimerazę Pfu (z Pyrococcus furio-
sus). Podczas kolejnych reakcji powstają kopie obu nici wektora zawierające
nacięcia (przerwy), a każda kopia posiadająca nacięcia zawiera insert, który nie-
sie zmienione sekwencje (mutacje). Każda kopia ma nacięcie w jednej z dwóch
różnych pozycji (pamiętajmy, że sekwencje startera są zachodzące), tak że dwie
komplementarne nacięte kopie mogą hybrydyzować tworząc dwuniciową
kolistą strukturę z nacięciami w różnych pozycjach. Następnie rodzicielskie (nie-
zmutowane) wektory są eliminowane z użyciem endonukleazy restrykcyjnej
Dpnl. Rodzicielskie cząsteczki wektorów replikowały się w E. coli, w związku
z czym będą one podatne na działanie restryktazy DpnI (sekcja 7. 4). Wektory
niosące zmutowane inserty, które były syntetyzowane in vitro, nie są metylo-
wane i nie będą podatne na działanie DpnI. Po wprowadzeniu ich do E. coli,
nacięcia zostaną naprawione in vivo, a wektory ulegną replikacji, wytwarzając
duże ilości zmutowanych insertów.
Zmutowany lub zrekombinowany DNA może być wbudowany do chromo-
somu bakterii różnymi sposobami. Wektor niosący zmutowaną sekwencję wpro-
wadzamy do komórki bakterii przez elektroporację (sekcja 8. 4. 1. 2) lub normalną
transformację. Rysunek 8. 22 pokazuje dwie metody pozwalające następnie wbu-
dować sekwencje wektorowe do chromosomu, zawierającego sekwencje homolo-
giczne do niesionych przez wektor. Obie metody mogą być użyte do modyfikacji
lub inaktywacji genu; dodatkowo, metoda (a) może posłużyć do przygotowania
fuzji genowej [np. Smc-GFP fusion: Britton, Lin i Grossman (1998) GD 12:
1254-1259].

210
Użycie wektora M13 pozwala na łatwe otrzymywanie jednoniciowych kopii danego genu. Najpierw
gen (w postaci dwuniciowego fragmentu DNA) jest wbudowywany w kolistą, dwuniciową formę
wektora M13 (patrz sekcja 9. 2. 2); replikacja M13 (w bakterii) tworzy jednoniciowe kopie genu wbu-
dowanego do kolistej jednoniciowej formy M13 (ccc ssDNA). Jeden taki genom, niosący gen tarczowy
(ten, do którego chcemy wprowadzić mutację), jest pokazany na schemacie.
Na schemacie pokazana jest (powiększona) 15-20-nukleotydowa sekwencja genu tarczowego.
W obrębie tej krótkiej sekwencji chcemy zastąpić deoksytymidynę (T) deoksycytydyną (C).
Aby to zrobić, najpierw syntetyzujemy kopię komplementarnej sekwencji (oligonukleotyd
15-20-nukleotydowy) zawierający jedną błędnie podstawioną zasadę (mis-match) w określonym
miejscu, czyli deoksyguanozynę (G) naprzeciwko deoksytymidyny (T). Każdy oligonukleotyd
przyłączany jest następnie do kopii genu tarczowego (góra) i użyty jako starter do przeprowadzenia
syntezy DNA in vitro (linia przerywana) (środek). Powstające cząsteczki dsDNA (każda z jednym
błędnie podstawionym nukleotydem) są wprowadzane do bakterii na drodze transformacji. Mecha-
nizmy naprawcze wewnątrz komórki bakteryjnej (sekcja 7. 7) korygują błąd, czasem zamieniając Τ
na C, czasem G na A. Nawet bez udziału mechanizmów naprawczych replikacja dupleksu z błędnie
podstawionym nukleotydem produkowałaby pewną liczbę cząsteczek z zaplanowaną dla mutanta
sekwencją (po prawej na dole). Komórki zawierające Zmutowaną sekwencję mogą być zidentyfiko-
wane przez np. hybrydyzację kolonijną (sekcja 6. 5. 1. 2), z użyciem znakowanych oligonukleotydów
jako sond.
Prostsze metody, z użyciem dostępnych obecnie dwuniciowych wektorów, opisano w sekcji
8. 5. 5. 2.

8. 5. 5. 3 Mutageneza transpozonowa

Potencjalne problemy, jakie mogą się pojawić przy mutagenezie z wykorzysta-

niem plazmidów (sekcja 8. 5. 5. 2), to: możliwość restrykcji (sekcja 7. 4) DNA plaz-
midowego wewnątrz komórki bakterii oraz ewentualne niepowodzenia homolo-
gicznej rekombinacji. Drugi problem można ominąć dzięki zastosowaniu trans-
pozonów (sekcja 8. 3).

211
(a) Kolisty plazmid skonstruowany in vitro niosący gen markerowy (pięć kropek, góra plazmidu)
oraz fragment DNA odpowiadający kodującej części sekwencji chromosomowego genu „tarczo-
wego"; lewy fragment genu zaznaczono czarnym kolorem, prawy — białym, aby pomóc w śledze-
niu losów każdej części fragmentu DNA. Plazmid jest wprowadzany na drodze transformacji do
populacji komórek zawierających gen tarczowy. Wewnątrz komórki następuje rekombinacja pomię-
dzy fragmentem w plazmidzie i odpowiadającą mu sekwencją (homologiczną) w chromosomowym
genie tarczowym (także oznaczonym kolorami czarnym i białym). Proces wymaga pojedynczego
crossing-over: powstania dwuniciowego pęknięcia zarówno w plazmidzie, jak i genie tarczowym (w
miejscu czarno/białego połączenia) oraz krzyżowego połączenia końców, z wytworzeniem ciągłej
struktury. Zauważ, że: 1) do chromosomu w obrębie sekwencji genu tarczowego wbudowany
został cały plazmid; 2) część kodującej sekwencji genu została zduplikowana (czarny/biały...
czarny/biały); z tego powodu proces jest czasem nazywany rekombinacją insercyjno-duplikacyjną
(lub integracją typu Campbella). Gen markerowy może kodować jakąkolwiek cechę przydatną do
selekcji (np. oporność na antybiotyk), tak aby rekombinanty można było łatwo wyselekcjonować na
odpowiednim podłożu lub w odpowiednich warunkach. Zauważ, że proces ten musi przebiegać
w warunkach, w których niemożliwa jest autonomiczna replikacja plazmidu; w dzielących się
komórkach może on po wbudowaniu się do chromosomu replikować się tylko jako część chromo-
somu (w stanie zintegrowanym). Zapewnia to, iż selekcjonując komórki z wykorzystaniem markera
plazmidowego będziemy identyfikować tylko te, które mają plazmid wbudowany w interesujący
nas gen chromosomowy. (Gdyby plazmid mógł replikować się autonomicznie, nie byłoby możliwe
odróżnienie poprzez selekcję komórek niosących plazmid autonomiczny od wbudowanego
w chromosom).
Jeżeli fragment niesiony przez plazmid zawiera Zmutowaną formę końca genu tarczowego, inser-
cja plazmidu spowoduje po prostu zastąpienie „dzikiego typu" końca genu przez Zmutowany frag-
ment z plazmidu — rezultatem będzie więc powstanie kompletnego (tzn. nieprzerwanego) chromo-
somowego genu ze zmutowaną sekwencją (w chromosomie będzie znajdował się także cały DNA
plazmidowy i zduplikowana sekwencja genu tarczowego).
Jeżeli plazmid niesie dziką formę końcowej części genu tarczowego w postaci fuzji (w zgodnej
ramce odczytu) z innym genem, Insercja plazmidu może spowodować, iż chromosom będzie
kodował białko fuzyjne (sekcja 8. 5. 2).
Jeżeli plazmid niesie fragment wewnętrznej sekwencji kodującej genu tarczowego, Insercja plaz-
midu spowoduje przerwanie sekwencji kodującej genu, powodując jego inaktywację.

212
 Mutageneza z użyciem transpozonów stosowana jest na przykład do wykry-
wania sekrecyjnych i powierzchniowych białek bakterii patogennych; białka te są
interesujące, ponieważ często ich obecność ma związek z wirulencją. Populacja
badanego patogena jest mutagenizowana z użyciem transpozonów zawiera-
jących bezpromotorowy gen kodujący alkaliczną fosfatazę (phoA); transpozony te
(TnphoA) wbudowują się przypadkowo w różne geny w obrębie populacji bakte-
rii. Po wysianiu na płytki, komórki z pojedynczych kolonii są testowane, z uży-
ciem chromogennego substratu, na obecność alkalicznej fosfatazy. Ponieważ sub-
strat jest dostępny tylko dla enzymów komórkowych, każda kolonia dająca
pozytywną reakcję (zmiana koloru) wskazuje na obecność fosfatazy wydzielonej
poza komórkę lub związanej z jej powierzchnią. Ponieważ phoA nie ma promo-
tora i sekwencji sygnałowej (sekcja 7. 6), tworzenie pozakomórkowej fosfatazy
przez komórki wskazuje, że TnphoA wbudował się do genu kodującego sekrecy-
jne lub powierzchniowe białko, jako że:
• phoA jest w odpowiedniej ramce odczytu i jest transkrybowany z genomo-
wego promotora,
• sygnałowa sekwencja genu, do którego jest wbudowany phoA, umożliwia
sekrecje fosfatazy.
Gen przerwany przez TnphoA jest teraz prawdopodobnie niefunkcjonalny,
a jeżeli jest to gen wirulencji, wirulencja komórek zmutowanego klonu może być
w znaczący sposób zmieniona. Taki klon mutanta można poddać testowi na
wirulencję, a odpowiedni gen wyizolować i poddać dalszej analizie (np. sekwen-
cjonowaniu). Zauważmy, że niezależnie od przypadkowości insercji transpo-
zonu metoda ta jest selektywna w taki sposób, iż pozwala na identyfikację specy-
ficznych (sekrecyjnych i powierzchniowych) białek i kodujących je genów.
Protokół dotyczący przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej w Haemo-
philus influenzae opisuje system nośnikowy posiadający specyficzną sekwencję
sygnałową niezbędną do pobierania DNA na drodze transformacji (ang. uptake-
signal system). System ten może być przydatny do badania regulacji genów
i „nokautowania" (ang. knock-out) fenotypów u tej bakterii [Kraib, Schlor
i Reidl (1998) AEM 64: 4697-4702].
Mutageneza typu STM (ang. signature-tagged mutagenesis) może być wykorzy-
stana do wykrywania tych genów wirulencji, których ekspresja w patogenie jest
konieczna do wzrostu wewnątrz komórki gospodarza. Zasady metody są przed-
stawione na rysunku 8. 23. Błędne rezultaty w STM mogą wynikać z nieprzypad-
kowej intergracji danego genu wirulencji (i brakiem sposobu jego wykrycia).

(b) W tym przypadku plazmid zawiera fragment genu tarczowego (biały), zawierający Zmutowany
region (pięć kropek); chromosomowa sekwencja odpowiadająca temu fragmentowi jest pokazana
jako biały region — poniżej. W tym przypadku wymiana krzyżowa może nastąpić po obu stronach
zmutowanego fragmentu, czego wynikiem będzie wymiana materiału pomiędzy plazmidem i chro-
mosomem; Zmutowana sekcja genu będzie przeniesiona z plazmidu do genu tarczowego, a odpo-
wiednia „dzikiego typu" sekwencja — z chromosomu do plazmidu. W ten sposób określona mutacja
może być wprowadzona do wybranego genu. Jeżeli zamiast zmutowanego regionu genu, fragment
wbudowany w sekwencję kodującą genu tarczowego będzie zawierał plazmidowy gen markerowy
(lub inny obcy DNA), nastąpi insercyjna Inaktywacja genu tarczowego.

213
 Unikatowa sekwencja („etykietka") o długości około 40 par zasad jest włączona do każdego typu
transpozonu w populacji, tzn. „etykietka" jest inna w każdym transpozonie. Każda z nich zawiera po
obu stronach krótkie miejsca wiązania starterów. Miejsca te są identyczne w każdym transpozonie.
Transpozony są użyte do mutagenizowania patogena, wbudowywane są one przypadkowo, w różne
geny w różnych komórkach.
Mutagenizowane komórki są wysiewane na płytki w celu otrzymania pojedynczych kolonii. Okre-
ślona kolonia zawiera klon zmutowanych komórek, z których każda niesie taki sam unikatowo ozna-
kowany etykietką transpozon w tym samym genie. Poszczególne kolonie są wykorzystywane do
założenia oddzielnych hodowli (odpowiednio uszeregowanych) w studzienkach płytki serologicznej
(używanej np. do testu ELISA). Płytka pokazana na rysunku ma 30 studzienek, ale zwykle używa się
płytek większych. Wykonuje się na membranach dwie repliki (poprzez „dot blotting") pierwotnej
płytki, repliki te są przeznaczone do badań hybrydyzacyjnych; w replikach komórki poddaje się lizie,
a ich DNA chromosomowy jest utrwalany i wiązany z membraną.
Następnie z każdej studzienki pobiera się komórki i łączy w jedną pulę. Pula ta jest wykorzysty-
wana do dwóch celów. Po pierwsze stanowi ona inokulum do zakażania zwierząt testowych.

214
Fałszywie dodatni wynik można otrzymać, gdy np. transpozon włączy się do
„niewirulentnego" genu w komórce, która (przypadkiem) już zawierała mutację
w genie wirulencji. Niemniej jednak system STM był użyteczny np. do identyfi-
kowania wysp patogenności (sekcja 11. 5. 7) w Salmonella typhimurium.

8. 5. 5. 4 Mutageneza w genach gospodarza w celu badania interakcji

między patogenem a jego gospodarzem
Inaktywacja pewnych genów gospodarza dostarczyła cennych informacji na
temat ich roli we wzajemnych oddziaływaniach między patogenem a jego gospo-
darzem. W „znokautowanych" myszach, Inaktywacja różnych genów układu
odpornościowego, jak się okazało, modyfikowała wrażliwość zwierząt na pewne
bakterie (przykłady: tab. 8. 2).

Po drugie, komórki tej puli poddaje się lizie, a ich DNA używa w reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4) z wyzna-
kowanymi starterami w celu amplifikowania unikalnych etykietek wszystkich transpozonów
w puli. Zamplifikowane etykietki następnie stosuje się jako sondy (sekcja 8. 5. 3) do jednej z replik na
membranach. W replice tej (Replika 1) każda unikalna etykietka powinna hybrydyzować
z DNA z komórki zawierającej odpowiadający jej transpozon. Ten proces wstępnego przeszukiwa-
nia (Replika 1) sprawdza wydajność amplifikacji unikalnych etykietek w puli (takie wstępne
przeszukiwanie nie jest potrzebne, jeżeli używamy zestawu „specjalnych" etykietek [Wren (1998)
TIM 6: 51]. )
Następnie odzyskuje się patogena z testowanego zwierzęcia przez wysiew na płytki. Otrzymane
kolonie łączy się (tworząc „odzyskaną pulę") i stosuje reakcję PCR (ze znakowanymi starterami)
w celu zamplifikowania etykietki każdego klonu w tej puli. Zamplifikowane, znakowane etykietki
są następnie użyte jako sondy do hybrydyzacji z drugą repliką na membranie (Replika 2).
Spośród wszystkich oryginalnych, mutagenizowanych komórek (w wyjściowej puli), interesujące
nas komórki to te, które w wyniku mutacji wywołanej przez transpozon nie są zdolne do zakażania
zwierzęcia testowego, czyli te, których wirulencja została obniżona. Takie komórki będą nieobecne
(lub będzie ich bardzo mało) w puli „odzyskanej" (w porównaniu z liczbą komórek, które rozwijają
się w zwierzęciu testowym normalnie). Skutkiem tego znakujące etykietki tych komórek o obniżonej
wirulencji (atenuowanych) będą obecne w wyjściowej puli, a nieobecne (lub nieliczne) w puli odzy-
skanej. Komórki mogą być zidentyfikowane dzięki temu, że hybrydyzują do pierwszej repliki, a nie
hybrydyzują wcale (lub słabo) do drugiej. (Jeżeli użyte były „specjalne" etykietki, komórki o obni-
żonej wirulencji byłyby zidentyfikowane przez brak hybrydyzacji w pierwszym etapie testu. )
Z każdego klonu o obniżonej wirulencji, odpowiedzialne za to geny (identyfikowane dzięki
wbudowanemu do nich transpozonowi) mogą być izolowane i sekwencjonowane do dalszych
badań.

215
 8. 5. 6 Sekwencjonowanie DNA
Pierwotnym źródłem informacji w DNA jest sekwencja budujących go nukleoty-
dów (sekcja 7. 1). Znając sekwencję nukleotydów możemy na przykład przewi-
dzieć skład białka — identyfikując najpierw odpowiedniki kodonów inicjujących
i terminacyjnych (sekcja 7. 6). (Zauważmy jednak, że pewne białka podlegają
potranskrypcyjnym i potranslacyjnym modyfikacjom, tak że skład dojrzałego
białka nie musi dokładnie odpowiadać sekwencji DNA, która je koduje).
Możemy także badać promotory i inne sekwencje kontrolne oraz identyfikować
takie cechy jak sekwencje REP (sekcja 16. 2. 2. 5). W genach eukariotycznych
porównanie sekwencji genu z odpowiadającym mu cDNA może wskazać liczbę,
pozycję i sekwencje intronów (sekcja 8. 5. 1. 2).
Jedna z metod sekwencjonowania jest przedstawiona na rysunku 8. 24. Jed-
noniciowa matryca do sekwencjonowania może być przygotowana w asyme-
trycznej reakcji PCR (sekcja 8. 5. 4. 2) — zamiast klonowania w wektorze M13 —
z użyciem starterów komplementarnych do znanej sekwencji po którejkolwiek
stronie sekwencji nieznanej. Jednoniciowe matryce mogą też być przygotowane
z wykorzystaniem wektorów fagmidowych (sekcja 8. 5. 1. 5). (Patrz także sek-
cja 8. 5. 4. 5. )

Rys. 8. 24 Określanie sekwencji nukleotydowej sklonowanego fragmentu DNA (czyli tzw.

sekwencjonowanie): metoda terminacji łańcucha wg Sangera (metoda dideoksy) (schemat)
Fragment przeznaczony do sekwencjonowania musi być otrzymany w formie jednoniciowej — np.
przez klonowanie w fagu M13 (patrz sekcja 9. 2. 2 i rys. 8. 20).
W omawianym przykładzie nieznaną sekwencją jest TCT... AGC (góra). Jeżeli klonowanie było
przeprowadzone w fagu M13, nieznana sekwencja została wbudowana do jego genomu, będzie więc
otoczona (oflankowana) z każdej strony przez jednoniciowy fagowy DNA. Skutkiem tego DNA po
AGC w kierunku 5' do 3' (linia przerywana) zawiera znaną sekwencję nukleotydów, co pozwala
skonstruować znakowany starter (czarna kropka), który będzie się wiązał za nieznaną sekwencją
(góra), tak że pierwszy nukleotyd dodawany do startera będzie tworzył parę z pierwszym 3' nukleo-
tydem nieznanej sekwencji.
Syntezę DNA in vitro w laboratorium prowadzi się w mieszaninie reakcyjnej zawierającej:
matryce, startery, cztery typy trifosforanów deoksyrybonukleotydów (dNTP: dATP, dCTP,
dGTP i dTTP — tabela 7. 1) oraz polimerazę DNA. Po związaniu się z matrycą starter jest
wydłużany w kierunku 5' do 3' przez dodawanie nukleotydów w kolejności określonej przez sek-
wencję matrycy.
W celu sekwencjonowania przygotowuje się cztery oddzielne mieszaniny reakcyjne (G, C, T, A) —
każda zawierająca wszystkie wymienione wyżej składniki (łącznie z milionami kopii nieznanej
sekwencji matrycy i starterem). Ponadto każda mieszanina zawiera określony fosforan dideoksyrybo-
nukleotydu (ddNTP) (rys. 7. 2); tak więc mieszanina G zawiera frifosforan dideoksyguanozyny (ddG),
mieszanina C — ddC, mieszanina Τ — ddT i mieszanina A — ddA.
Gdy do rosnącego łańcucha DNA zostanie dodany dideoksyrybonukleotyd, uniemożliwia on
dodanie kolejnego nukleotydu, gdyż nie zawiera grupy 3'-OH niezbędnej do wytworzenia następ-
nego wiązania fosfodiestrowego (rys. 7. 4). Tak więc wydłużanie startera zostaje zatrzymane (= termi-
nacja łańcucha) w każdej pozycji, gdzie został włączony dideoksyrybonukleotyd. W danej mieszani-
nie reakcyjnej stężenie ddNTP jest takie, że w większości rosnących nici synteza zostanie na pewnym
etapie zahamowana w wyniku włączenia dideoksyrybonukleotydu. Ponieważ dany ddNTP może
tworzyć parę z każdą komplementarną zasadą w matrycy, terminacja łańcucha może nastąpić w róż-
nych miejscach na różnych kopiach nici matrycowej — tak że jako produkty powstają nici o różnych
długościach. Na przykład, z ddG (patrz schemat) powstają trzy produkty różnej długości, ponieważ

216
podczas wydłużania startera ddG może parować z resztą cytozyny w trzech różnych regionach
matrycy; zauważ, że w tym przypadku długość danego produktu nici zależy od lokalizacji reszty
cytozyny w nieznanej sekwencji. Analogiczne reguły mają zastosowanie do innych ddNTP.
Po zakończeniu reakcji nowe produkty są oddzielane od matryc przez działanie formamidem.
Każdą z czterech reakcji poddaje się elektroforezie w oddzielnej ścieżce żelu poliakryloamidowego.
Podczas elektroforezy małe produkty w określonym czasie wędrują dalej niż duże; można rozróżnić
produkty odmienne co do długości tylko o jeden nukleotyd.
Żel zawiera mocznik, co hamuje parowanie między powstałymi powstałymi nićmi a matrycą.
Hamuje on także wytwarzanie wewnątrznidowych struktur. Jest to ważne, ponieważ dalsza analiza
polega na porównywaniu długości wszystkich wytworzonych nici w każdej reakcji, aby wydeduko-
wać miejsce danej zasady w matrycy (patrz powyżej), a to wymaga, aby długość każdej powstałej nici
była ściśle proporcjonalna do jej elektroforetycznej ruchliwości, tzn. do lokalizacji prążka w żelu
(gdyby tworzyły się jakiekolwiek wewnątrzniciowe połączenia zasad, produkty nie lokowałyby się
w żelu w pozycji proporcjonalnej do ich długości).
Po elektroforezie żel jest suszony. Jeżeli startery są znakowane 3 2 P, prążki produktów reakcji mogą
być zlokalizowane w żelu autoradiograficznie: przez ekspozycję filmu fotograficznego wobec żelu
i wywołanie go. W innej metodzie sekwencjonowanie jest prowadzone z użyciem starterów znako-
wanych biotyną. Po elektroforezie materiał z żelu jest przenoszony (blotting) na membranę, którą
poddaje się działaniu alkalicznej fosfatazy skoniugowanej ze streptawidyną (streptawidyna ma silne
powinowactwo do biotyny); prążki produktów mogą być wykryte przez użycie chemiluminescencyj-
nego substratu, np. CSPD (sekcja 8. 5. 3).
Położenie prążków (lewa strona na dole) wskazuje relatywną długość utworzonej nici; zauważ, że
pierwszy nieznany 3' nukleotyd (C) jest identyfikowany przez najkrótszy produkt, który wędrował
najdalej, a to, że produkt ten pochodzi z mieszaniny G, wskazuje zasadę, z którą wytworzyła parę G,
czyli C. Analogicznie, następna nieznana zasada (G) jest kolejnym najkrótszym produktem
pochodzącym z mieszaniny C, wskazując na obecność G w matrycy. W ten sposób możemy kolejno
określać położenie każdego nukleotydu w matrycy.
Po prawej stronie na dole. Część autoradiogramu żelu sekwencyjnego (dzięki uprzejmości Joopa
Gakena, z Molecular Medicine Unit, King's College, London).

217
 Odczytanie sekwencji do długości około 500 nukleotydów można przeprowa-
dzić z jednego startera. Dalsze sekwencjonowanie danego fragmentu może być
dokonane przez usuwanie nukleotydów z dwuniciowego fragmentu w kierunku
odczytywanej sekwencji (czyli skracanie go) i sekwencjonowanie następnego jed-
noniciowego fragmentu z nowego startera. Proces ten może być powtarzany,
(umiejscowione delecje, ang. nested deletions) aż zostanie zsekwencjonowany
cały fragment.
Gdy cały genom (chromosom) został już raz zsekwencjonowany, badania
porównawcze jego odmiennych form mogą być przeprowadzane metodami
wykorzystującymi sondy molekularne, jak to opisał Chee i wsp. [(1996) Science
274: 610-614].
Oporność na antybiotyki u Mycobacterim tuberculosis wykrywano np. zaadap-
towaną do tego celu tzw. metodą „dideoksy", czyli metodą Sangera (sek-
cja 15. 4. 11. 2).

8. 5. 7 Ekspresja genów eukariotycznych w bakteriach: ograniczenia

Większość genów eukariotycznych nie może ulegać ekspresji (wyrażaniu)
w bakteriach, bakterie bowiem nie potrafią (na przykład) radzić sobie z ich intro-
nami — stąd konieczność stosowania cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Dodatkowo, wiele
eukariotycznych białek podlega potranslacyjnym modyfikacjom, na przykład —
enzymatycznym cięciom lub dodawaniu oligosacharydów (glikozylacja)
w określonych miejscach. Te specyficzne modyfikacje, które zachodzą w komór-
kach eukariotycznych i są z reguły niezbędne do uzyskania normalnej aktywno-
ści biologicznej białek, nie mogą być przeprowadzone przez bakterie. Z wymie-
nionych powodów badanie ekspresji genów musi być prowadzone w komórkach
eukariotycznych, co z kolei jest utrudnione za względu na złożoność ich syste-
mów kontrolnych. W celu przezwyciężenia tego problemu do kontroli genów
w komórkach eukariotycznych zastosowano pewne dobrze scharakteryzowane
bakteryjne systemy regulacyjne [Gossen, Bonin i Bujard (1994) TIBTECH 12:
58-62].
Alternatywnie do stosowania systemów bakteryjnych, badanie ekspresji
genów eukariotycznych może być przeprowadzane z użyciem sztucznych chro-
mosomów drożdżowych, YAC (sekcja 8. 5. 1. 5); na przykład geny dzikiego typu
sklonowane w YAC mogą być wprowadzone do mutantów komórek eukarioty-
cznych w celu badania komplementacji (czyli zdolności genów do kompensowa-
nia defektu odpowiadających im zmutowanych genów obecnych w tej samej
komórce).

8. 5. 8 Funkcjonalna analiza DNA genomowego

Sekwencjonowanie DNA genomowego z różnych gatunków pozwoliło ujawnić
wiele nieznanych funkcji genów. Systematyczne podejście do funkcjonalnej ana-
lizy DNA z Rhodobacter capsulatus opisali Kumar, Fonstein i Haselkorn [(1996)

218
Nature 381: 653-654]. Metoda ta wykorzystuje zestaw 192 kosmidów (rys. 8. 16),
których zachodzące na siebie inserty sumarycznie pokrywają cały (3, 7 mln pz)
chromosom R. capsulatus. Każdy kosmid był trawiony enzymem restrykcyjnym
EcoRV, a powstające fragmenty (wielkości genów lub operonów) analizowano
metodą tzw. Southern blotting (rys. 8. 14) — wykonano więc 192 prób. Komplet
prób (ang. blots) reprezentuje zatem cały chromosom w taki sposób, że każdy
fragment ma w chromosomie swój odpowiednik wielkości kosmidu.
Wspólnie, te 192 próby użyto jako „wysokiej rozdzielczości matrycę do
hybrydyzacji" (HRHT, ang. high-resolution hybridization template) w celu
wykrywania zmienionych wzorów transkrypcji w różnych warunkach fizjologi-
cznych. Na przykład bakterie poddane szokowi cieplnemu (sekcja 7. 8. 2. 3)
dawały inny wzór transkrypcyjny niż pochodzące z normalnych warunków.
Całkowity RNA (sekcja 8. 5. 1. 2) izolowany z takich komórek może być odpowie-
dnio wyznakowany i użyty jako sonda (sekcja 8. 5. 3) do identyfikowania różnych
regionów chromosomu zawierających sekwencje, które są aktywne w badanych
warunkach. W ten sposób specyficzne miejsca chromosomu mogą być korelo-
wane z określonym fizjologicznym stanem komórki.
Metoda HRHT może być także zastosowana np. do badania wzorów trans-
krypcji mutantów delecyjnych R. capsulatus.

8. 5. 9 Metody amplifikowania DNA inne niż PCR

8. 5. 9. 1 Łańcuchowa reakcja ligacji (LCR) (ang. ligase chain reaction)

Podobnie jak w PCR, również w LCR wykorzystuje się cykle termiczne, w któ-
rych jest faza ogrzewania — do rozdzielenia nici matrycy; kiedy nici są już roz-
dzielone, dwa oligomery wiążą się z każdą nicią matrycy w taki sposób, że oligo-
mery na odpowiedniej nici pokrywają całą sekwencję tarczową (amplikon)
(rys. 8. 25). Jeżeli obydwa oligomery poprawnie sparują z amplikonem, zostaną
ze sobą połączone przez termooporną ligazę (ligacja: sekcja 8. 5. 1. 6. ). Cykle reakcji
są powtarzane np. 25 razy. Zauważmy, że aby nastąpiła ligacja: 1) dwa oligo-
mery muszą być tak ustawione obok siebie, aby ich zasady parowały poprawnie
z nukleotydami nici matrycowej (chociaż dopuszczalne są pojedyncze niedopa-

Jedna z dwóch nici dupleksowego DNA zawierająca amplikon (czyli sekwencję tarczową) jest poka-
zana na górze schematu: 3'-AT... AC-5'. Dwa oligomery (każdy zaznaczony ramką) przyłączają się na
zasadzie komplementarności zasad do sekwencji tarczowej i zostaną zligowane; zauważ, że aby
mogło się utworzyć wiązanie fosfodiestrowe, koniec 5' nukleotydu znajdującego się po prawej stro-
nie musi być ufosforylowany (rys. 7. 4). Dwa inne oligomery będą się przyłączały do sekwencji tarczo-
wej drugiej nici dupleksowego DNA i także ulegną zligowaniu (nie pokazano na schemacie). Aktual-
nie, do celów handlowych stosuje się bardziej złożoną formę LCR niż przedstawiona na schemacie.

219
sowania zasad w oligomerze), i 2) koniec 5' jednego oligomeru w każdej parze
musi być ufosforylowany. Zajście ligacji i amplifikacji dowodzi obecności danej
sekwencji tarczowej w próbce.

8. 5. 9. 2 Amplifikacja oparta na sekwencji kwasów nukleinowych

(NASBA, ang. nucleic acid sequence-based amplification)

Metoda ta jest przeznaczona głównie do amplifikacji specyficznych sekwencji

w RNA, a jej przebieg jest naszkicowany na rysunku 8. 26. NASBA jest bardziej
skomplikowana niż PCR, ale przebiega w temperaturze np. 41°C i nie wymaga
cykli termicznych. Podobny proces nazywany amplifikacją za pośrednictwem
transkrypcji (TMA, ang. transcription-mediated amplification) jest wykorzysty-
wany do wykrywania obecności Mycobacterium tuberculosis (sekcja 16. 1. 6. 1). Co
ciekawe, amplifikację RNA w procesach NASBA/TMA zaplanowano opierając
się na wzorze strategii replikacyjnej retrowirusów. Techniki te są omówione
w artykule przeglądowym: [Chan i Fax (1999) RMM 10: 185-196].
Produkty NASBA mogą być wykrywalne, podobnie jak w przypadku PCR,
przez identyfikację metodą wybarwienia lub hybrydyzacji określonych prążków
po elektroforezie w żelu. Jednakże ostatnio wprowadzono metodę umożli-
wiającą wykrycie produktów podczas amplifikacji. W metodzie tej wykorzystuje
się tzw. molekularne sondy świetlne (ang. molecular beacon probes). Każda
sonda jest jednoniciowym oligonukleotydem, którego końce tworzą pary, for-
mując sekwencję dwuniciowa, w wyniku czego cząsteczka ma strukturę
„trzonka i pętli". Sekwencja w rejonie pętli jest taka jak sekwencja tarczowa, czyli
komplementarna do sekwencji produktu — RNA. W rejonie trzonka jedna nić
zawiera barwnik fluorescencyjny, a druga — wygaszacz fluorescencji. Jeśli brak
produktu w postaci RNA, sonda nie fluoryzuje. Kiedy pętla sondy zwiąże się ze
specyficznym produktem, struktura sondy zmienia się tak, że barwnik i wyga-
szacz są rozdzielone, czyli sonda staje się aktywnym fluoroforem. Tego typu
sondy są włączane do mieszaniny reakcyjnej NASBA i amplifikacja sekwencji
tarczowej może być monitorowana przez pomiar wzrastającego stopnia fluores-
cencji. [Molecular beacon probes in NASBA: Leone et. al. (1998) NAR 26:
2150-2155. ]
Takie sondy (typu „beacon probes") w porównaniu z konwencjonalnymi son-
dami liniowymi o równoważnej długości mają większą specyficzność. Tak więc
pojedynczy błąd w parowaniu zasad między sondą i sekwencją tarczową może
być tą metodą łatwiej zidentyfikowany; wiązanie sondy typu „beacon probe" do
takiej sekwencji jest mniej stabilne niż sondy liniowej. Termodynamiczne pod-
stawy tej wzmożonej specyficzności są dyskutowane przez Bonnet i wsp. [(1999)
PNAS 96: 6171-6176].
Amplifikacja przez odsunięcie nici (SDA, ang. strand displacement amplifi-
cation) jest inną izotermalną (nie wykorzystującą cykli termicznych) metodą
stosowaną głównie do amplifikacji DNA, chociaż może też amplifikować RNA,
gdy do początkowego etapu włączymy odwrotną transkryptazę. Procedura jest
opisana przez Walkera i wsp. [(1992) NAR 20: 1691-1696; NAR (1966) 24:
348-353].

220
1. Pokazana jest nić RNA ze wskazaną sekwencją tarczową (amplikonem) odznaczoną dwiema krót-
kimi liniami pionowymi. Starter (starter 1) związał się z końcem 3' amplikonu. Koniec 5' tego
startera jest oznakowany krótką sekwencją (•) zawierającą promotor (sekcja 7. 5) polimerazy RNA.
2. Enzym odwrotna transkryptaza (sekcja 8. 5. 1. 2)
starter, z utworzeniem nici cDNA.
3. Enzym RNaza Η zdegradował (usunął) nić RNA, a drugi starter (starter 2) związał się z ampliko-
nem w sekwencji cDNA.
4. Odwrotna transkryptaza (która także może syntetyzować na matrycy DNA) wydłużyła starter
tworząc dwuniciowy cDNA, tak że powstał funkcjonalny (dwuniciowy) promotor. Polimeraza
RNA (O) przyłączyła się do promotora i będzie syntetyzowała nić RNA w kierunku strzałki, tzn.
w kierunku 5' do 3'.
5. Powstała nowa nić RNA. Zauważ polarność nici: jest ona komplementarna do amplikonu w wyj-
ściowej próbce RNA (porównaj etap 5 z 1).
6. Starter 2 związał się z nicią RNA.
7. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę cDNA na nici RNA.
8. RNaza Η usunęła nić RNA, a starter 1 przyłączył się do sekwencji amplikonu w cDNA.
9. Odwrotna transkryptaza przeprowadziła syntezę komplementarnej nici cDNA; polimeraza RNA
przyłączyła się do promotora i wytworzy nić RNA identyczną z tą pokazaną w etapie 5.
Powtarzanie się pokazanych cykli reakcji spowoduje powstanie wielu kopii amplikonu w formie
komplementarnego RNA i cDNA.

221
 8. 5. 10 Rekombinacyjna streptokinaza —
przykład technologii rekombinowania DNA
Streptokinaza jest białkiem, które w naturze jest wytwarzane przez pewne
gatunki Streptococcus. Ma ono zdolność przemiany ludzkiego plazminogenu do
plazminy (fibrynolizyny), enzymu, który rozkłada włókna fibryny. Tak więc
podczas infekcji streptokinaza może działać jako agresyna (sekcja 11. 3. 2) —
wspomagając rozprzestrzenianie się infekcji przez ułatwianie lizy fibrynowych
barier, które mogą otaczać (a więc lokalizować) uszkodzenia wywołane przez
streptokoki.
Zainteresowanie streptokinazą jako czynnikiem terapeutycznym wynika z jej
zdolności do rozpuszczania fibrynowych komponentów skrzepów krwi, co jest
istotne w leczeniu np. zakrzepicy. Wykorzystując dotychczasowe źródło strepto-
kinazy — streptokoki — uzyskuje się małą wydajność, natomiast możliwość
wyrażania się genu streptokinazy w E. coli (patrz rys. 8. 27) pozwala osiągnąć
wydajność nawet ponad dziesięciokrotnie większą [Estrada i wsp. (1992) Bio-
technology 10: 1138-1142].

8. 5. 11 Nadprodukcja białek rekombinacyjnych w Escherichia coli —

strategie optymalizacji ekspresji genu
„Nadprodukcja" odnosi się do syntezy w ilości ponad normę specyficznych
białek — zazwyczaj białek heterologicznych („obcych"), w warunkach ekspery-
mentalnych. Wykorzystano to w procedurze stosowanej np. do produkcji czyn-
ników terapeutycznych, jak opisana wyżej streptokinaza (sekcja 8. 5. 10).

Rys. 8. 27 Ekspresja genu streptokinazy w E. coli (sekcja 8. 5. 10); szkic technologii klonowania
DNA [Estrada i wsp. (1992) Biotechnology 10: 1138-1142].
Komórki Streptococcus equisimilis są lizowane, izolowany jest ich genomowy DNA, a gen kodujący
streptokinazę (lecz bez sekwencji sygnałowej) powielany techniką PCR (sekcja 8. 5. 4); wcześniejsze
badania sugerowały, że sekwencja sygnałowa tego genu może powodować problemy z jego ekspresją
w E. coli. Dwie nici genu streptokinazy są pokazane w górnej części rysunku. Startery do PCR
to: 5'-GGAATTCATGATTGCTG... 3' (starter SK2) i 5'-TGGATCCTTATITG... 3' (starter SK3). Zauważ,
że matryca, na której jest wydłużany SK2, jest nicią kodującą („nić sensowna"), czyli SK2 po pełnym
wydłużeniu utworzy nić komplementarną do nici kodującej. Po kilkunastu cyklach PCR wzrośnie
liczba nici utworzonych w reakcji PCR i zacznie działać jako matryca, a główny produkt PCR będzie
taki jak pokazano w środkowej części rysunku; gen streptokinazy będzie otoczony (oflankowany)
specyficznymi miejscami restrykcyjnymi (tab. 8. 1). Zauważ, że ATG w starterze SK2, kopiowane w
nici kodującej, pojawi się jako 3'... TAC... 5' (patrz parowanie zasad, sekcja 7. 2. 1); podczas transkrypcji
genu (sekcja 7. 5), odpowiadającym mu mRNA będzie 5'-AUG-3', czyli kodon inicjujący (sekcja 7. 6).
(Patrz także notka 3 w tab. 7. 2. ) Sekwencja ATT (w starterze SK2) będzie odpowiadała leucynie. Star-
ter SK3, po pełnym wydłużeniu przez PCR, tworzy nić kodującą; zauważ, że 5'-TTA-3' (w SK3) odpo-
wiada w mRNA kodonowi UAA, czyli ochre (jest to kodon stop, tab. 7. 2).
Fragment zamplikowany metodą PCR (środkowa część rysunku) jest wbudowywany do plazmidu
pTrp pomiędzy miejsca restrykcyjne BamHI i EcoRI, tworząc plazmid pEKG-3 (obydwa plazmidy dla
uproszczenia przedstawione w formie jednoniciowej); trp jest promotorem operonu tryptofanowego
E. coli, RBS miejscem wiązania rybosomu (rys. 8. 16), a terminator to terminator transkrypcji (sekcja
7. 5), Ampr oznacza oporność na ampicylinę.

222
 Szczep E. coli jest transformowany (sekcja 8. 4. 1) plazmidem pEKG-3, a transformowane komórki
wysiewane na podłoże zawierające ampicylinę w celu wyselekcjonowania tych, które pobrały
pEKG-3. Wybieranych jest kilkanaście kolonii, w których sprawdza się obecność genu streptokinazy.
Zidentyfikowane geny mogą być następnie klonowane przez namnożenie komórek z kolonii zawie-
rających właściwą sekwencję.
W pEKG-3 do kontroli transkrypcji genu streptokinazy wykorzystywany jest promotor operonu
tryptofanowego, trp, E. coli. W E. coli w regulacji promotora trp uczestniczy białko represorowe (TrpR,
kodowane przez gen trpR); w obecności tryptofanu, TrpR powoduje represję transkrypcji z promo-
tora trp. Pewne szczepy E. coli (mutanty) nie tworzą TrpR; szczep wybrany do wyrażania genu strep-
tokinazy (E. coli W3110) jest jednym z tych, o których wiemy, że tworzą TrpR, czyli szczepem z „dzi-
kim typem" allelu genu trpR. W szczepie W3110 transkrypcja z promotora trp może być zainduko-
wana („włączona"), gdy jest taka potrzeba, przez użycie analogu tryptofanu, kwasu 3-β-indoloakry-
lowego), jako induktora (porównaj z allolaktozą w operonie lac — rys. 7. 11).
Podczas wzrostu W3110 maksymalną ekspresję genu streptokinazy otrzymywano, gdy liczba
kopii plazmidu na komórkę wynosiła 420. Syntetyzowana streptokinaza pozostawała w formie
wewnątrzkomórkowej (przypomnienie: gen został pozbawiony sekwencji sygnalnej); wydajność pro-
dukcji enzymu wynosiła 25% całkowitej ilości białek komórkowych. Po zlizowaniu komórek rekom-
binacyjna streptokinaza była oczyszczana z zastosowaniem chromatografii powinowactwa (sekcja
8. 5. 1. 4), ze stałym nośnikiem (matriks) zawierającym ludzki plazminogen.

223
 Chociaż E. coli jest szeroko wykorzystywana w procedurach nadprodukcji,
nie może być użyta do ekspresji każdego genu. Na przykład, produkty pewnych
genów eukariotycznych wymagają potranslacyjnej modyfikacji, która nie może
zachodzić w prokariotach (patrz sekcja 8. 5. 7). W odniesieniu do genów, które
mogą być wyrażane, uzyskanie opłacalnego, wysokiego poziomu ekspresji
wymaga kontrolowania czynników mogących wpływać na końcową wydajność;
pewne z nich uwzględniono niżej. Interesujący nas gen musi być oczywiście
wbudowany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego (rys. 8. 17).

8. 5. 11. 1 Optymalizacja transkrypcji

Promotor danego genu powinien być silny (sekcja 7. 8). Powinien być także „ściś-
le regulowany", czyli gen nie wyrażany przed jego celową indukcją lub dere-
presją. Dlaczego? Zazwyczaj komórki są hodowane do znacznej gęstości przed
ekspresją danego genu w celu uzyskania maksymalnej ilości produktu. Ekspresja
genu przed odpowiednim momentem może jednak np. zmniejszyć tempo wzro-
stu i ograniczyć końcową ilość rekombinacyjnego białka. Ścisła regulacja jest
szczególnie ważna, jeżeli produkt genu jest toksyczny dla E. coli. Regulator trans-
krypcji musi także być odpowiednio dobrany w zależności od celu; tak więc np.
induktor, IPTG, (rys. 7. 11), który jest toksyczny dla człowieka, nie jest optymal-
nym regulatorem stosowanym w nadprodukcji białek terapeutycznych.

8. 5. 11. 2 Optymalizacja translacji

Na wydajność translacji wpływa stopień zgodności sekwencji Shine-Dalgarno

(SD) (sekcja 7. 6) i liczba nukleotydów między sekwencją SD a kodonem starto-
wym. Ponadto, pewne geny kodują wzmacniacz (ang. enhancer) translacji nazy-
wany też „downstream box" — specyficzną sekwencję nukleotydów poniżej, ale
blisko kodonu startowego. Czynniki te powinny być uwzględniane przy kon-
strukcji efektywnego wektora ekspresyjnego.

8. 5. 11. 3 Problem ciałek wtrętowych

Ciałka wtrętowe (w omawianym kontekście) są nierozpuszczalnymi agrega-

tami niezłożonych lub niepoprawnie złożonych białek, które często tworzą
się w cytoplazmie podczas nadprodukcji. Ustalono, że białka takie mogą być
później właściwie złożone in vitro; powstawanie ciałek wtrętowych może być
w pewnym sensie korzystne, gdyż ułatwiają one oczyszczanie białkowego pro-
duktu (np. przez wirowanie), a także stanowią ochronę przed degradacją przez
wewnątrzkomórkowe proteazy.
Przyczyna powstawania ciałek wtrętowych nie jest, jak dotychczas, w pełni
zrozumiała; w pewnych przypadkach składanie in vitro może powodować
powstawanie, małej ilości (lub niepowstawanie w ogóle) produktu aktywnego
biologicznie. Strategie radzenia sobie z tym problemem opierają się na: tworze-
niu fuzji genów (sekcja 8. 5. 2) w celu zwiększenia rozpuszczalności, równoczesnej
ekspresji białek opiekuńczych (ang. chaperones) (sekcja 7. 6) wspomagających
składanie, modyfikacjach pH i obniżaniu temperatury wzrostu. Jednakże właś-

224
ciwe rozwiązania muszą być zazwyczaj ustalane empirycznie; bo np. nie wszyst-
kie fuzje genów partnerskich będą zwiększały rozpuszczalność danego białka,
a białka opiekuńcze odpowiednie do wspomagania składania konkretnego
białka będą musiały być może dobrane metodą prób i błędów.

8. 5. 11. 4 Zapobieganie proteolizie

Cytoplazma E. coli zawiera wiele proteaz (enzymów degradujących białka),

a również pewne z nich znajdują się w przestrzeni peryplazmatycznej, tak więc
białkowy produkt genu powinien być niewątpliwie chroniony przed działaniem
tych enzymów. Strategię zapobiegania lub minimalizowania proteolizy są nastę-
pujące:
(a) Produkt genu może być kierowany bezpośrednio do peryplazmy (gdzie jed-
nak tych enzymów jest mniej) przez włączenie sekwencji sygnałowej (sek-
cja 7. 6) lub przez przeprowadzenie fuzji danego genu z genem białka pery-
plazmatycznego (np. DsbA).
(b) Produkt genu może być zamieniany w produkt sekrecyjny przez fuzję jego
genu z innym genem (np. α-hemolizyny — sekcja 5. 4. 1. 2), którego produkt jest
transportowany na zewnątrz komórki.
(c) Poszczególne miejsca w białku podatne na proteolizę mogą być eliminowane
przez zmianę zapisu kodującej je sekwencji w taki sposób, aby nie wpłynęło
to na funkcje białka.
(d) Można wykorzystać szczep E. coli z mutacją w genie rpoH. Kumulacja „nienor-
malnych" lub heterologicznych białek w cytoplazmie (tak jak się dzieje pod-
czas nadprodukcji) włącza odpowiedź szoku cieplnego (sekcja 7. 8. 2. 3) —
czego wynikiem jest wytwarzanie proteazy Lon, degradującej nietypowe
białka. Synteza proteazy Lon jest „włączana" przez produkt genu rpoH, nato-
miast mutant genu rpoH, defektywny w wytwarzaniu białka RpoH, jak wyka-
zano, produkuje w E. coli znacznie większe ilości białek heterologicznych.
Białka, których N-końcowym aminokwasem jest arginina, leucyna, lizyna,
fenyloalanina, tryptofan lub tyrozyna, wykazują tendencję do niestabilności
(mają krótkie okresy półtrwania — ang. short half-lives), co może sugerować
potrzebę „przekodowania" białka. Zwróćmy uwagę, że przedostatni N-końcowy
aminokwas w białku bakteryjnym jest także ważny, ponieważ po usunięciu koń-
cowej N-formylometioniny (sekcja 7. 6) staje się on aminokwasem końcowym.
Szczegółowy, poparty dobrymi referencjami, wyczerpujący opis możliwości
optymalizacji ekspresji genów na wysokim poziomie przedstawił Makrides [MR
(1996) 60: 512-538].

8. 5. 11. 5 Odpowiedź komórki na nadprodukcję

W przytoczonym przykładzie dotyczącym streptokinazy (sekcja 8. 5. 10) nawet do

25% białek syntetyzowanych przez E. coli było komórce niepotrzebnych (to jest
niefunkcjonalnych). Ze względów komercyjnych natomiast można to uznać za
dobry wynik. Ale jak na taką sytuacje reagują same komórki? Jak wspomniano
wyżej, kumulacja nietypowych białek włącza odpowiedź szoku cieplnego, co jest

225
W przedstawionym przykładzie, próbkę DNA stanowi region regulatorowy operonu galaktozowego
(gal) E. coli, który zawiera miejsce startu transkrypcji (sekcja 7. 5), promotor Pl i miejsce wiązania
białka CRP (=CAP) uczestniczącego w katabolicznej represji (sekcja 7. 8. 2. 1) operonu gal. Próbka
na jednym końcu jest wyznakowana radioaktywnym fosforem (32P). Badano interakcje tego DNA
z podjednostką α polimerazy RNA i CRP (=CAP). A dokładnie, celem analizy było zbadanie roli
podjednostki α w aktywacji promotora P1 gał przez CRP. Zwróć uwagę, że podjednostka α i CRP
są tylko częścią zespołu białek znajdujących się normalnie w miejscu promotorowym przy starcie
transkrypcji in vivo; zespół białek zawiera inne podjednostki polimerazy RNA oraz czynnik sigma.
Zauważ też, że CRP wiąże się z DNA jako dimer, czyli jednostka zawierająca dwie cząsteczki
białka CRP.
Fotografia pokazuje wzór elektroforetyczny sześciu eksperymentów „odcisku stopy" analizujących
oddziaływania między próbką DNA i białkami w różnych kombinacjach: 1) podjednostka a polime-
razy RNA, 2) dziki (czyli normalny) CRP i 3) CRP HL159 (Zmutowana forma CRP). W każdym ekspe-
rymencie próbka DNA była preinkubowana z białkami, poddawana działaniu DNazy I i analizo-
wana elektroforetycznie.
Ścieżka m jest rodzajem kalibracji, zawiera sekwencyjna drabinkę Maxama-Gilberta. W celu przy-
gotowania takiej drabinki, wiele kopii znakowanych na końcu próbek DNA poddanych było
chemicznemu działaniu siarczanu dimetylu, a następnie piperydyny, co powoduje specyficzne cię-
cie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy guaniną (G) a przylegającą zasadą (rys. 7. 4). W odpowied-
nich warunkach, każda z wielu kopii DNA będzie przecięta przy jednej tylko z obecnych w niej zasad
guaninowych. W wyniku tego, iż cięcie nastąpi w różnych kopiach próbki DNA przy różnych guani-
nach, otrzymamy fragmenty o szerokim zakresie długości. Podczas elektroforezy, fragmenty te
(o różnej długości) poruszają się z różnym tempie, formując tzw. „drabinkę" widzianą w ścieżce m.
Na lewo od ścieżki m podane są liczby wskazujące lokalizację niektórych zasad guaninowych
w próbce DNA, stanowi to użyteczną skalę; na której -1 odpowiada pierwszej zasadzie od miejsca
startu (patrz sekcja 7. 5). Miejsce wiążące CRP znajduje się pomiędzy zasadami -41 i -42. Ponieważ

226
wskaźnikiem stresu. Istotnie, przy wysokim poziomie zbędnych białek bakterie
zaczynają degradować swoje własne rybosomy i rRNA, czyli dążyć do zahamo-
wania translacji, a to może prowadzić do śmierci komórki [Kurland i Dong (1996)
MM 21: 1-4)

8. 5. 12 Białka wiążące DNA — wybrane techniki

Oddziaływania między białkami i DNA są ważne np. w transkrypcji (sek-
cja 7. 5. 1) i w inicjacji replikacji DNA. Informacje o takich oddziaływaniach mogą
być użyteczne wobec zamiaru wprowadzania specyficznych zmian w DNA
w celu manipulowania zdolnością wiązania białek do zmienionego DNA
w badaniach nad regulacją ekspresji genów itp. Niżej przedstawiono pewne
metody służące do wykrywania takich oddziaływań oraz określania miejsc
wiążących w DNA.

8. 5. 12. 1 Metoda „Southwestem blotting"

Technika ta pozwala wykryć białka wiążące DNA np. w lizatach komórkowych.
Badana próbka jest poddawana elektroforezie, a białka rozdzielone w żelu są
przenoszone metodą elektroblottingu na filtr nitrocelulozowy. Powinowactwo

sekwencja nukleotydowa całego regionu regulatorowego gal jest już znana, podobnie jak lokalizacja
promotorów oraz miejsca wiązania CRP, drabinka kalibracyjna może być łatwo wykorzystana do
określenia położenia miejsc oddziaływania między DNA i białkami w eksperymentach „odcisku
stopy".
Ścieżka a pokazuje prążki fragmentów powstałych po cięciu próbki DNA przez DNazę I przy braku
wiążących się białek. Fragmenty mają różną wielkość, ponieważ DNaza I może ciąć w wielu miejs-
cach w każdej próbce. Wykrywalne będą jednak tylko fragmenty mające na końcu 3 2 P. Znaczy to, że
z dwóch części powstałych przez przecięcie fragmentu DNA w próbce w żelu wykrywalny będzie
tylko jeden (ten wyznakowany).
Ścieżka b pokazuje wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności podjednostki α polimerazy
RNA. Nie widać „odcisku stopy", co wskazuje na brak oddziaływania pomiędzy próbką DNA i pod-
jednostką α przy braku innych białek.
Ścieżka c pokazuje „odcisk stopy" CRP (pomiędzy -29 i -54) (porównaj ścieżkę c ze ścieżką a). Obec-
ność CRP nie spowodowała ochrony całego regionu przed działaniem DNazy I, ponieważ przypusz-
czalnie przedostała się ona przez szczelinę między dwoma cząsteczkami dimeru CRP.
Ścieżka d pokazuje działanie DNazy I na próbkę DNA w obecności zarówno CRP, jak i podjednost -
ki α. Obecność podjednostki rozszerza „odcisk stopy" w obie strony. Sugeruje to, że podjednostka a
może wiązać się do miejsc po obu stronach dimeru CRP; jednakże, związanie się powyżej CRP
uznano za „prawdziwe" i ważne dla transkrypcji, wiązanie się poniżej CRP interpretowano jako arte-
fakt ze względu na brak ograniczającego wpływu innych podjednostek polimerazy. Powód wystąpie-
nia „odcisku stopy" w regionie -80 do -90 nie jest więc jasny.
Ścieżka e i f pokazują wynik działania DNazy I na próbkę DNA w obecności zmutowanej formy CRP,
odpowiednio z i bez podjednostki α polimerazy RNA. Wyniki wskazują, że ta konkretna mutacja
CRP hamuje wiązanie pomiędzy CRP i podjednostką — ponieważ wpływ podjednostki (widoczny
w ścieżce d) został ograniczony. Jako że mutacja w CRP wydaje się hamować wiązanie podjednostki
a, okazuje się, że wiązanie pomiędzy normalną (niezmutowaną) formą CRP i podjednostką nastę-
puje w miejscu CRP, które zostało uszkodzone przez mutację.
Zdjęcie przedrukowano z Attey i wsp. (1994) Nucleic Acid Research 22: 4375-4380 za pozwoleniem
Oxford University Press i dzięki uprzejmości profesora S. Busby'ego z University of Birmingham UK.

227
danego białka do specyficznej sekwencji DNA może być następnie określone
przez użycie znakowanych sekwencji DNA jako sond i wykrycie znacznika każ-
dej sondy związanej z określonym białkiem.

8. 5. 12. 2 Badanie zmian ruchliwości elektroforetycznej

(EMSA, ang. eiectrophoretic mobility-shift assay)

EMSA pozwala określić np., czy jakieś białko (w lizacie) może wiązać specy-
ficzną sekwencję DNA. Znakowany DNA danej sekwencji inkubujemy z lizatem,
aby umożliwić tworzenie kompleksów białko-DNA. Następnie elektroforetycz-
nie rozdzielamy niezwiązaną formę DNA od DNA związanego; ruchliwość
kompleksu białko-DNA będzie różna od ruchliwości wolnego DNA.

8. 5. 12. 3 Technika „białkowego odcisku stopy" (ang. footprinting)

W technice „odcisku stopy" sekwencja DNA, do której związało się białko, może
być wykryta jako region DNA chroniony przed enzymatycznym (lub chemicz-
nym) rozszczepieniem dzięki osłanianiu go przez związane białko. W praktyce,
dwa komplety homologicznych fragmentów DNA, znakowanych na końcach
(jeden komplet związany z białkiem) — są trawione enzymatycznie (lub chemi-
cznie) najlepiej w warunkach, w których każdy fragment jest cięty tylko w jed-
nym z kilku potencjalnych miejsc cięcia. Cięte fragmenty dają zbiór znakowa-
nych subfragmentów o pewnym zakresie wielkości (w wyniku cięcia w różnych
miejscach). Jeżeli we fragmentach związanych z białkiem, białka zasłaniają jedno
lub więcej miejsc, żaden z tych fragmentów nie będzie się kończył w tym miejscu;
kiedy więc dwa komplety fragmentów są porównywane elektroforetycznie, brak
pewnej wielkości subfragmentów w próbie poddanej reakcji wiązania z białkiem
przejawi się jako rodzaj luki (ang. gap) w szeregu prążków widocznych w żelu.
Luka ta odzwierciedla ochronny efekt białka; jest białkowym odciskiem stopy
(ang. footprint), a jej położenie w żelu w odniesieniu do pozostałych subfrag-
mentów wskazuje sekwencję wiążącą w DNA.
Technika „odcisku stopy" z użyciem DNazy I (stosowanie DNazy I — patrz
s. 226 i 227) ma tendencję do dawania większych i wyraźniejszych „odcisków",
ponieważ DNaza I, będąc stosunkowo dużym białkiem, nie tnie w miejscach,
które są bardzo blisko białka związanego z DNA. Lepszy rozkład miejsc
wiążących można jednak otrzymać stosując tworzone in vitro rodniki hydroksy-
lowe, które wywołują cięcia DNA niezależne od sekwencji (niespecyficzne);
wszystkie niechronione wiązania fosfodiestrowe są wrażliwe na rozszczepianie
przez ten czynnik, tak że wzór elektoforetyczny zawiera prążki odpowiadające
każdej nieosłoniętej pozycji w sekwencji.

8. 5. 13 Prezentowanie heterologicznych („obcych") białek

Specyficzne heterologiczne („obce") białka mogą być prezentowane na powierz-
chni bakterii (lub faga) w różnych celach. Na przykład, gdy na powierzchni
komórki bakteryjnej prezentowany jest produkt obcego genu, może być on

228
wtedy charakteryzowany przez chromatografię powinowactwa (sekcja 8. 5. 1. 4)
wobec znanych immobilizowanych ligandów (np. przeciwciał). Aby to wykonać,
przygotowujemy fuzję (sekcja 8. 5. 2) nieznanego genu do genu bakteryjnego lub
fagowego kodującego białko powierzchniowe, tak aby białko fuzyjne było wyra-
żane na powierzchni komórki. Prezentowane białka mogą być także użyteczne
do badań nad tworzeniem szczepionek, prezentowane białko może bowiem mieć
swój udział w antygenowej stymulacji; oczywiście białko to musi dać bodziec
immunologicznie poprawny.
W jednym z rozwiązań eksperymentalnych tworzona jest fuzja obcego DNA
z bakteryjnym genem kodującym flagellinę [Lu i wsp. (1995) Biotechnology 13:
336-372]. W innej metodzie wykorzystuje się autotransportery (sekcja 5. 4. 5), co
zostało określone jako autoprezentacja. Na przykład, można utworzyć fuzję
obcego genu z DNA kodującym domenę β białka AIDA-I w E. coli; jeżeli następnie
użyjemy mutanta, który nie ma powierzchniowej proteazy OmpT, (heterologi-
czna) α-domena nie będzie odszczepiana od β-domeny, dzięki czemu będzie pre-
zentowana na powierzchni bakterii [Maurer, Jose i Meyer (1997) JB 179: 794-804.

8. 5. 14 Wykrywanie zróżnicowania poziomu ekspresjii genów

z wykorzystaniem PCR (DD, ang. differential display)
DD jest metodą wykrywania genów, które są wyrażane tylko w pewnych
szczególnych warunkach; polega ona na porównywaniu cząsteczek mRNA
izolowanych z dwóch lub więcej populacji komórek poddanych działaniu
różnych warunków. Najpierw mRNA z każdej populacji są przekształcane
w cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2). Aby uczynić całe to zadanie łatwiejszym do wykonania,
tylko niektóre z wielu mRNA w populacji poddawane są konwersji w jednym
eksperymencie. Selekcji cząsteczek mRNA dokonuje się z użyciem startera
5'-TTTTTTTTTTGG-3', pozwalającym na konwersję tylko tych mRNA, w któ-
rych w odpowiedniej pozycji występują reszty cytozyny (C), a po nich jest
„ogon" 3'-AAAA... Następnie cDNA z każdej populacji są poddawane procedu-
rze AP-PCR (sekcja 16. 2. 2. 4) i otrzymuje się ich wzór elektroforetyczny (finger-
print). Wzory z różnych populacji komórek porównuje się, a odpowiednie pasma
(tzn. obecne w jednych, a nie występujące w innych) odzyskuje z żelu i amplifi-
kuje z użyciem tego samego „arbitralnego" startera. Zamplifikowane fragmenty
mogą być sekwencjonowane lub użyte jako sondy do przeszukiwania biblioteki.
Metoda DD jest dyskutowana przez Matza i Lukanova [(1998) NAR 26:
5537-5543].

8. 5. 15 Technologia „DNA-chip"
„DNA-chipy" to mikrozbiory fragmentów cząsteczek DNA (nukleotydów)
unieruchomionych na małych kawałkach (chipach) szkła, silikonu lub plastiku;
fragmenty te mogą być sondami, starterami lub sekwencjami tarczowymi.
„Chipy" produkuje się albo przez immobilizowanie preegzystujących cząste-
czek, albo syntezę „on-chip", czyli bezpośrednio na powierzchni podłoża, z uży-

229
ciem specjalnych szybkich aparatów (robotów) zdolnych do syntetyzowania
szerokiego zakresu kombinacji nukleotydów na pojedynczym chipie. Tą drugą
metodą, na przykład, może być zsyntetyzowanych ponad 65 tysięcy 8-nukleoty-
dowych (kompletny zbiór [48]) kombinacji na kawałku szkła o powierzchni
lcm2.
DNA-chipy używa się np. do wykrywania mutacji. Duży zbiór immobilizo-
wanych sond może reprezentować wszystkie możliwe mutacje w danej sekwen-
cji nukleotydów; kopie tej sekwencji zamplifikowane ze zmutowanej komórki
będą zatem hybrydyzowały tylko do pewnych sond zbioru, wskazując mutacje.
Hybrydyzacja może być w tej metodzie wykrywana z użyciem skaningowo-
-konfokalnej mikroskopii epifluorescencyjnej, gdyż tarczowy DNA znakuje się
uprzednio fluoroforem.
Reakcja PCR na podłożu stałym (niedawno wynaleziona) wykorzystuje dwa
komplety immobilizowanych starterów, które są poddawane działaniu roztworu
zawierającego DNA, i odpowiednie odczynniki reakcyjne. Takie postępowanie
zapewnia większą specyficzność reakcji i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia.
Technologia DNA-chipów jest także wykorzystywana do badania zróżnico-
wania ekspresji genów. W tym przypadku, dysponujemy pulą cząsteczek immo-
bilizowanego jednoniciowego cDNA, sondy znakowane fluoroforem pomogą
nam „odnaleźć" te geny, które są aktywne w specyficznych warunkach.
Pewnym problemem w wiązaniu jednoniciowego DNA do chipów jest ten-
dencja do parowania zasad w obrębie jednej nici, co może utrudniać jej wiązanie
z sekwencjami tarczowymi. Można to pokonać przez zastosowanie PNA (sek-
cja 7. 2. 1. 1), ponieważ hybrydyzacja DNA-PNA może zachodzić przy braku soli,
czyli w warunkach, które hamują wewnątrzniciowe parowanie zasad.
Postęp w technologii DNA-chipów polega np. na zastosowaniu elektrycznie
wspomaganej hybrydyzacji sonda-tarcza i następnie różnicującym denaturowa-
niu dupleksów mających nawet tylko pojedynczą błędną parę.
DNA-chipy są dyskutowane przez Marshalla i Hodgsona [(1998) NB 16:
27-31] oraz omówione w artykułach przeglądowych [Ramsay (1998) NB 14:
40-44 i Graves (1999) TIBTECH17: 127-134]. Zastosowanie tej techniki w identy-
fikacji Mycobacterium spp. opisał Troesch i wsp. [(1999) JCM 37: 49-55].
 ROZDZIAŁ

9
Bakteriofagi

Większość, a nawet wszystkie bakterie mogą być zakażane specyficznymi wiru-

sami (bakteriofagami, skrótowo fagami). Wirusem nazywamy organizm pozba-
wiony struktury komórkowej, nie mający zdolności do niezależnego metaboli-
zmu i namnożenia się. Jednak po wejściu do żywej komórki odpowiedniego
gatunku, wirus może „zawładnąć" zdolnością komórki do syntez biologicznych
i sprawić, że zacznie ona syntetyzować jego cząsteczki. Nowo utworzone wirusy
z komórki są uwalniane, a następnie mogą infekować inne komórki.
Wiele fagów składa się jedynie z kwasu nukleinowego otoczonego białko-
wym kapsydem („płaszczem"). Genomy fagów, zależnie od gatunku, mogą
zawierać dwuniciowy dsDNA, jednoniciowy ssDNA, dsRNA lub ssRNA. Nie-
które fagi są wielościanami, inne mają budowę nitkowatą lub wielopostaciową.
Pewne z nich są zaopatrzone w ogonek, za pomocą którego wiążą się z powie-
rzchnią bakterii (tab. 9.1, rys. 9.1, fot. 9.1). Zazwyczaj określony fag może zakażać
komórki tylko jednego rodzaju, gatunku lub szczepu bakteryjnego.
Wynik infekcji fagowej zależy od bakterii, faga, a nawet, do pewnego stopnia,
od warunków, w których zachodzi infekcja. Wirulentne fagi namnażają się
wewnątrz komórki gospodarza i powodują jej lizę, czego wynikiem jest śmierć
i rozerwanie komórki, z jednoczesnym uwolnieniem potomstwa faga. Łagodne
(umiarkowane) fagi mogą utrwalić stałe nielityczne stosunki z komórką gospo-
darza (lizogenię). Jeszcze inne mogą się namnażać wewnątrz gospodarza nie
powodując jego lizy, uwalniane są wówczas z żywych komórek.
Wpływ fagowej infekcji na chorobotwórczą bakterię może być istotny dla
organizmu zakażonego przez tę bakterię. W niektórych wypadkach fag wprowa-
dza cechę patogenności, ponieważ zawiera specyficzne determinanty wirulencji.
Na przykład, toksyny kodowane przez fagi są odpowiedzialne za botulizm, cho-
lerę, błonicę i zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS, ang. haemolytic, uraemic
Syndrome). Poznanie takich chorób wymaga znajomości zarówno biologii pato-
gennych bakterii, jak i ich fagów. Prowadzi się wiele badań w tym kierunku.
Zwraca się szczególną uwagę na regulację syntezy toksyn oraz na sposób, w jaki
są one uwalniane z bakterii. Na przykład, za uwolnienie toksyn podobnych do

231
toksyny shiga, związanych z zespołem HUS (kodowanych przez faga H-19B)
z EHEC (tab. 11.2), może być odpowiedzialne białko lityczne podobne do białka
kodowanego przez gen S faga λ (sekcja 9.1.2). Trzeba również mieć informacje,
czy fag jest zdolny do namnożenia się wewnątrz bakterii zakażającej człowieka
lub zwierzęta, ponieważ może to wpływać na intensywność wytwarzania
toksyny (np. przez zwiększenie liczby kopii genu kodującego toksynę). Na
przykład, fag CTXF kodujący toksynę cholery replikuje się wewnątrz bakterii
bytujących w jelicie ssaków [Bacteriophage biology and bacterial virulence: Wal-
der (1998) TIM 6: 6295-297.]
Zakażenie fagiem Shigella flexneri (bakterii wywołującej czerwonkę) może
prowadzić do modyfikacji O-specyficznych łańcuchów w polisacharydach (sek-
cja 2.2.9.2), co wpływa na antygeny O określające serotyp (sekcja 16.1.5.1).
W związku z tym, infekcja fagowa ma znaczenie przy opracowaniu szczepów
S. flexneri służących do produkcji szczepionki skutecznej przeciwko specyficz-
nym lub wielu serotypom tego patogena. [Serotype-converting bacteriophages
and O-antigen modification in Shigella flexneri: Allison i Verma (2000) TIM
8: 17-23.]

232
 9.1 Fagi wirulentne — cykl lityczny
Cykl lityczny rozpoczyna adsorpcja wirulentnego faga na powierzchni wrażliwej
komórki, a kończy liza komórek i uwolnienie potomstwa faga.

9.1.1 Cykl lityczny faga T4 w Escherichia coli

Na początku zakażenia fag przyczepia się końcami włókien ogonka do specyficz-
nych miejsc w błonie zewnętrznej bakterii (rys. 9.1). Następnie płytka podsta-
wowa faga wiąże się z powierzchnią komórki, a skurcz ogonka sprawia, że
wewnętrzny rdzeń faga przebija błonę zewnętrzną komórki E. coli, umożliwiając
przejście DNA przez kanał centralny do cytoplazmy. Przejście DNA przez błonę
cytoplazmatyczną wymaga siły protonomotorycznej.
W ciągu 5 min od początku zakażenia komórka przestaje syntetyzować
własny DNA, RNA i białka. „Wczesne" geny T4 zaczynają być transkrybowane
i następuje translacja. Białko Ndd kodowane przez faga [Bouet, Kirsch i Louam
(1998) JB 180: 5227-5230] niszczy chromosom komórki. Jest on degradowany
przez fagowe nukleazy do nukleotydów, które są zużywane do syntezy DNA
faga T4.

233
 Następnie transkrybowane są geny „pośrednie" i „późne". W transkrypcji
bierze udział polimeraza RNA gospodarza po wprowadzeniu kilku zmian indu-
kowanych przez faga, które pozwalają jej rozpoznawać inne promotory. Jedną
z takich zmian jest ADP-rybozylacja, czyli przeniesienie reszt ADP-rybozylo-
wych z NAD na polimerazę (rys. 5.1). Poza tym, w transkrypcji późnych genów
faga T4 bierze udział kodowany przez faga czynnik σ.
Replikacja DNA faga rozpoczyna się 5 min po zakażeniu. Startery niezbędne
do syntezy nici wiodącej (rys. 7.8) są syntetyzowane przez bakteryjną polimerazę
RNA, natomiast w syntezie fragmentów Okazaki biorą udział białka kodowane
przez faga. Nowo syntetyzowany DNA ulega poreplikacyjnej modyfikacji (sekcje
7.4 i 9.6).
Genom faga T4 stanowi liniowy, dwuniciowy DNA wielkości około
170 tys. pz, zawierający hydroksymetylocytozynę zamiast cytozyny. Synteza
hydroksymetylocytozyny wymaga enzymów kodowanych przez faga. DNA cha-
rakteryzuje się kolistą permutacją i nadmiarem terminalnym (końcowym). Zna-
czenie tych terminów przybliży analiza sekwencji:
5'-ABCD|EFGH . . . ABCDEFGHIABCD-3'
Sekwencja ta przedstawia (w porządku alfabetycznym) kolejność nukleotydów
w jednej nici DNA genomu T4. W innym genomie sekwencję można przedstawić
jako:
5'-EFGH |ABCDEFGH . . . ABCD|EFGH-3'
Warto zaznaczyć, że w genomach z kolistą permutacją, sekwencja wszystkich
cząsteczek jest taka sama tylko jej początek jest różny. Termin, „nadmiar termi-
nalny" oznacza, że te same sekwencje występują na dwóch końcach danej cząste-
czki (co pokazano na schematach).
Replikacja DNA faga T4 prowadzi do utworzenia jednoniciowych końców 3'.
Przyczyną tego jest brak możliwości syntezy ostatniego fragmentu Okazaki nici
opóźnionej na matrycy liniowego DNA. Jednoniciowe końce atakują komple-
mentarne sekwencje innych genomów fagowych, co odbywa się np. przez
zastąpienie krótkiej, homologicznej sekwencji w innej dwuniciowej cząsteczce.

Fot. 9.1 Wybrane bakteriofagi (patrz tekst i tab. 9.1)

1. Bakteriofag lambda (λ). 2, 3, 3a. Bakteriofagi T6, T4 i T2, odpowiednio (wszystkie w tym samym
powiększeniu). Fagi te są morfologicznie bardzo zbliżone, różnią się jedynie miejscami receptoro-
wymi (miejscami wiązania) na komórce E. coli. 4. Bakteriofag fd, nitkowaty fag zawierający
ss cccDNA; długość odcinka 50 nm. Na zamieszczonym niżej powiększonym zdjęciu wyraźnie
widać, że dwa końce faga fd różnią się. 5. Bakteriofag 029. Wydłużona główka (około 35-40 nm)
ma białkowe włókna i jest połączona z krótkim, niekurczliwym ogonkiem. 6. Bakteriofag Qβ, mały
dwudziestościenny fag (ok. 25 nm średnicy). 7, 8. Odpowiednio bakteriofagi T3 i T7 w tym samym
powiększeniu (odcinek = 50 nm). Oba bakteriofagi mają liniowy, niekurczliwy ogonek. 9. Bakteriofag
T1 (odcinek = 50 nm). Główka zawiera dsDNA, a długi ogonek jest niekurczliwy.
Dzięki uprzejmości dr. Michaela Wurtza, Uniwersytet w Bazylei, Szwajcaria. Reprodukowano
z wybranych zdjęć mikroskopowych opublikowanych w M. Wurtz „Bacteriophage structure"
MICRON Electron Microscopy Reviews vol. 5(2) Copyright 1992, Pergamon Press plc, za zgodą Elsevier
Science.

234
235
Ta aktywność rekombinacyjna umożliwia dalszą replikację (końce 3' pełnią rolę
replikacyjnych starterów) prowadzącą do powstania złożonej, rozgałęzionej sieci
replikujących się genomów fagowych. W ten sposób powstaje znaczna liczba
konkatemerów, z których każdy składa się z dużej liczby genomów fagowych
połączonych końcami (konkatemery są również tworzone podczas replikacji
faga λ — ale według innego mechanizmu).
Główka, ogonek oraz inne funkcje kodowane są przez geny „późne". Główka
składa się z produktów około 20 genów, a jej składanie rozpoczyna się od utwo-
rzenia specjalnej struktury zwanej „prekursorem główki", co zachodzi na
wewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej. Struktura ta montowana jest
wokół rdzenia, na który składają się „białka tworzące rusztowanie" (określające
kształt i wielkość struktury). Następnie rdzeń jest usuwany, a prekursor główki
odłącza się od błony i ulega dalszym przekształceniom konformacyjnym. DNA
pakowany jest do główki zgodnie z mechanizmem — „napełnić główkę". Jeden
koniec konkatemeru zostaje wprowadzony do główki, a pozostały DNA jest do
niej wpychany aż główka zostanie wypełniona, w końcu DNA zostaje przecięty.
Polimeryzacja ogonka zachodzi na płytce podstawowej, poczynając od jej rdze-
nia. Gotowy ogonek łączy się spontanicznie z główką wypełnioną DNA, potem
dodawane są włókna.
Fagowe potomstwo jest uwalniane na drodze lizy osmotycznej. Lizozym
kodowany przez faga, wspomagany przez fagowe białko lityczne, osłabia
osłony bakteryjne (rys. 2.7 i sekcja 9.1.2).
Rozwój T4 w komórce E. coli zależy od stanu jej fizjologicznego [Hadas i wsp.
(1997) Microbiology 143: 179-185].

9.1.2 Cykl lityczny innych fagów

Cykle lityczne innych fagów różnią się znacznie od cyklu faga T4.1) Nie wszyst-
kie fagi wiążą się na początku ze ścianą komórkową, u niektórych zachodzi
wiązanie z określonymi miejscami na pilusie: np. fag M12 wiąże się na powierz-
chniach bocznych (nie na końcu) pilusa F lub pilusów należących do grupy F.
2) W pewnych przypadkach chromosom bakteryjny jest funkcjonalny przez jakiś
czas, tak że mogą być wykorzystywane niektóre geny gospodarza. 3) W małych
fagach zawierających ssRNA (takich jak M12, MS2 lub Qβ) genom fagowy pełni
funkcję mRNA, a więc jego ekspresja wymaga tylko translacji. Z kolei RNA
fagowy, aby był zdolny do replikacji, musi kodować przynajmniej część replika-
cyjnego systemu, ponieważ żadna bakteria nie ma zdolności do syntezy RNA na
matrycy RNA. 4) Tworzenie konkatemerów podczas replikacji faga λ zachodzi na
drodze mechanizmu toczącego się koła (rys. 9.2).
Wiele fagów, zarówno bakterii gramujemnych, jak i gramdodatnich koduje
enzym degradujący Peptydoglikan, co umożliwia lizę komórek gospodarza
i uwolnienie potomstwa fagowego we właściwym czasie. Takie enzymy, do któ-
rych należy lizozym i endopeptydaza, noszą wspólną nazwę endolizyn. Endoli-
zyny nie mają sekwencji sygnalnej, można więc postawić pytanie, w jaki sposób
zdolne są do przejścia przez błonę cytoplazmatyczną do warstwy peptydogli-
kanu? Oprócz endolizyny niektóre z fagów kodują specyficzne białko lityczne

236
(zwane również holiną) umiejscowione w błonie cytoplazmatycznej i tworzące
„pory", przez które endolizyna może dotrzeć do peptydoglikanu. Holina jest
produktem genu S faga A, tę samą rolę pełni produkt genu l faga T4.

Liniowy DNA jest wstrzykiwany do komórki (przez ogonek). Dwuniciowa cząsteczka DNA, długości
około 49 kpz, ma komplementarne lepkie końce, każdy długości 12 zasad (górna część). Lepie końce
umożliwiają utworzenie cząsteczki kolistej. Dwuniciowy odcinek powstały przez sparowanie lepkich
końców nazywa się miejscem cos (czarny kwadrat). Zachodząca w komórce transkrypcja „wczes-
nych" genów fagowych prowadzi do syntezy białek regulacyjnych, których aktywności są wzajemnie
przeciwstawne. Wynikiem, na który mają wpływ warunki panujące zarówno wewnątrz komórki, jak
i w otaczającym środowisku, jest lizogenia (sekcja 9.2) lub opisana niżej liza.
Początkowo DNA replikuje się według mechanizmu typu Cairnsa (rys. 7.8), tzn. replikują się
struktury koliste. Następnie replikacja zaczyna przebiegać według mechanizmu „toczącego się koła",
powodując powstanie długiego łańcucha złożonego z genomów fagowych połączonych końcami.
W łańcuchu miejsce cos jest powtórzone w regularnych odstępach (środek). Takie kolejno powtórzone
cząsteczki nazywa się konkatemerem.
Białka główki i ogonka faga są kodowane przez geny „późne" transkrybowane z kolistych cząste-
czek DNA. Miejsca cos znajdujące się w konkatemerze są cięte enzymatycznie, a lepkie końce cos
umieszczone są w główkach fagowych. DNA wprowadzany jest do główki, aż zostanie napotkane
następne miejsce cos — wtedy następuje cięcie. W ten sposób do główki pakowany jest DNA znaj-
dujący się między dwoma kolejnymi miejscami cos. Do główki dołącza się ogonek, a fag, uwolniony
po lizie komórek, gotowy jest do infekcji nowej komórki gospodarza.

237
 Oczywiste jest, że holina musi być aktywna w określonym czasie po zakaże-
niu, ponieważ liza powinna być indukowana dopiero po zakończeniu tworzenia
się potomstwa fagowego w komórce. Jeśli liza wystąpiłaby wcześniej, mniej
całkowitych cząstek fagowych byłoby uwalnianych w jednym cyklu (tj. „wiel-
kość plonu" byłaby mniejsza). Taka przedwczesna liza była obserwowana
w przypadku faga λ zawierającego mutacje genu S Qohnson-Boar, Changand
Young (1994) MM 13: 495-504],
Co ciekawe, w niektórych fagach sekwencje kodujące holinę mają dwa
kodony inicjujące syntezę białka, oddzielone od siebie przez jeden lub dwa inne
kodony, co sprawia, że są kodowane dwa łańcuchy polipeptydowe (nieznacznie
różniące się wielkością). Krótszy polipeptyd to holina, dłuższy pełni prawdopo-
dobnie rolę inhibitora jej aktywności. Sposób, w jaki produkty tych dwóch
genów regulują czas zajścia lizy, jest opisany przez Blasiego i Younga C(1996)
MM 21: 675-682].

9.1.3 Działanie fagów wirulentnych na hodowle bakteryjne

Po dodaniu fagów wirulentnych do bulionowej hodowli wrażliwych bakterii
większość lub wszystkie komórki ulegają lizie, czego wynikiem jest przejaśnienie
gęstej, nieprzezroczystej hodowli.
Dodanie małej liczby cząstek fagowych do jednolitej warstwy wrażliwych
komórek (sekcja 3.3.1) sprawia, że każdy fag zakazi i spowoduje lizę pojedynczej
komórki, z której uwolni się wiele fagów potomnych. Fagi potomne z kolei mogą
zakazić i doprowadzić do lizy sąsiednich komórek, itp. Rezultatem tego jest
powstanie widocznego gołym okiem, zazwyczaj kolistego przejaśnienia, zwa-
nego łysinką, w mętnej warstwie jednolitego wzrostu. Łysinki powstają w każ-
dym miejscu, w którym początkowo wprowadzony fag zakaził komórki. Łysinki
przedstawione są na fotografii 16.1.

9.1.4 Pakowanie DNA

W rozdziale omawiającym łączenie się poszczególnych części faga T4 (sekcja
9.1.1) wspomniano, że DNA jest wprowadzany do główki fagowej. Mechanizm
wprowadzania DNA faga T4 (jak również innych fagów) nie jest jeszcze znany.
Najnowsze badania pozwoliły jednak zrozumieć pakowanie DNA faga
(tab. 9.1) i fagów spokrewnionych. Pakowanie DNA faga wymaga energii
pochodzącej z hydrolizy ATP, a umieszczenie DNA w główce zależy od obecno-
ści specyficznych cząsteczek RNA (nazwanego pRNA, ang. phage-encoded RNA)
kodowanego przez faga. Prawdopodobnie, sześć pofałdowanych cząsteczek RNA
tworzy pierścień wokół otworu, przez który wchodzi DNA. (Taka struktura przy-
pomina helikazę tworzącą pierścień złożony z sześciu cząsteczek białka DnaB
i biorącą udział w przemieszczaniu się DNA podczas replikacji typu Cairnsa:
rys. 7.8b). Jeden z modeli postuluje, że pierścień złożony z pRNA stanowi cześć
aparatu, który obraca się (wykorzystując energię pochodzącą z hydrolizy ATP)
powodując wchodzenie „nitkowatej" (tj. helikalnej) cząsteczki DNA do główki

238
fagowej w sposób przypominający przejście trzpienia przez nakrętkę. Jak dotych-
czas, istnienie pRNA zostało stwierdzone w fagach typu pRNA może wystę-
pować również w innych fagach lub, przeciwnie, funkcja tych cząsteczek może
być przejęta przez inne (być może złożone z białek) systemy.
[Upakowanie DNA w bakteriofagach: Hendrix (1998) Cell 94: 147-150.]

9.2 Fagi umiarkowane — lizogenia

Fag umiarkowany może wytworzyć z bakterią stabilny, nielityczny rodzaj sto-
sunku zwany lizogenią. Mówimy wówczas, że komórka gospodarza jest lizo-
genna. Lizogenna bakteria jest odporna na atak innych fagów tego samego typu
(odporność na superinfekcję). Jeden z mechanizmów odporności na superin-
fekcję obrazuje dobrze przykład lizogennej infekcji Salmonella typhimurium przez
faga P22. Fag ten powoduje glikozylację lipopolisacharydów komórki gospodarza
(sekcja 2.2.9.2) — w ten sposób niszczy własne miejsca receptorowe znajdujące się
na powierzchni komórki. Lizogenia najczęściej jest związana z połączeniem się
(integracją) genomu faga (tj. kwasu nukleinowego, zwanego profagiem) z chro-
mosomem gospodarza. W nielicznych przypadkach (np. fag P1) profag nie łączy
się z chromosomem, ale istnieje w formie cząsteczki kolistej („plazmidu").
Zawsze jednak replikacja profaga i komórki gospodarza jest skoordynowana, tak
że podczas każdego podziału komórka potomna bakterii otrzymuje profaga.
Utrzymanie stanu lizogenii wymaga syntezy białka represorowego kodowa-
nego przez faga. Utrata aktywności represora prowadzi do indukcji cyklu litycz-
nego. Jak widać, profag zazwyczaj zachowuje zdolność do wirulencji. W popula-
cji lizogennych bakterii indukcja może zachodzić spontanicznie w małej liczbie
komórek.
Wydaje się, że lizogenia jest zjawiskiem powszechnie występującym w przy-
rodzie.

9.2.1 Lizogenia/liza na przykładzie faga λ i Escherichia coli

DNA faga jest wprowadzany do bakterii w formie liniowego dsDNA i natych-
miast po wprowadzeniu tworzy formę kolistą (rys. 9.2). Rozpoczyna się trans-
krypcja „wczesnych" genów fagowych potrzebnych do lizy lub lizogenii. O zaj-
ściu jednego z tych procesów decyduje przewaga jednego z dwóch produktów
wczesnych genów: białka cI, które hamuje transkrypcję rozpoczynającą się
w niektórych promotorach i sprzyja lizogenii, i białka cro, hamującego trans-
krypcję genu cI. Rozstrzygający wpływ może mieć ogólna wewnętrzna kondycja
komórki. Na przykład, lizogenia ma większe szanse przy wielokrotnym zakaże-
niu komórki (tj. zakażeniu jednej komórki dużą liczbą fagów) w środowisku ubo-
gim w substancje odżywcze, natomiast liza jest bardziej prawdopodobna
w komórkach zakażonych tylko jednym fagiem, niezależnie od ilości substancji
odżywczych.
Lizogenia wymaga wstawienia się genomu faga λ w chromosom gospodarza,
co zachodzi na drodze zlokalizowanej rekombinacji (rys. 8.3b); fagowe białko
(produkt genu int) działa tu jak specyficzna rekombinaza.

239
 Indukcja (przejście od lizogenii do wirulencji) zachodzi spontanicznie w nieli-
cznych komórkach lizogennej populacji. Indukcję mogą wywoływać czynniki
powodujące zniszczenie DNA, takie jak promieniowanie ultrafioletowe lub anty-
biotyk — mitomycyna C. W tych warunkach, gdy czynny jest system SOS (sekcja
7.8.2.2), następuje aktywacja białka RecA i przecięcie przez nie białka fagowego
represora (białka cI), co prowadzi do indukcji cyklu litycznego. Cykl lityczny
wymaga również wycięcia profaga w procesie stanowiącym odwrotność jego
wstawienia. W wycięciu bierze udział fagowe białko xis. Po wycięciu genom faga
replikuje się, części składowe faga są syntetyzowane, a po ich połączeniu i lizie
komórki gospodarza cząstki fagów są uwalniane do środowiska.
Badania prowadzone z użyciem zmodyfikowanej (zmutowanej) polimerazy
RNA E. coli ujawniły, że lizogenia nie mogła zajść, jeżeli zaburzona była trans-
krypcja niektórych czynników fagowych. Czynniki konieczne do lizy były wów-
czas transkrybowane w ilości mniejszej niż normalnie, jednak liza nadal zacho-
dziła w pożywkach bogatych, natomiast nie obserwowano jej w pożywkach ubo-
gich. To sugeruje, że synteza czynników litycznych zależy od ilości substancji
odżywczych, a w niezmutowanej E. coli rosnącej w bogatym podłożu czynniki te
mogą być wytwarzane w nadmiarze, w ilości przewyższającej konieczną do lizy.
Nadprodukcja obserwowana podczas wzrostu w podłożach bogatych sugeruje,
że (względnie) mała ilość czynników litycznych wytwarzana podczas wzrostu
w uboższych pożywkach była ciągle wystarczająca do lizy. Może to być pod-
stawą strategii zachowania zdolności do namnożenia faga w warunkach ograni-
czenia substancji pokarmowych [Gabig i wsp. (1998) Microbiology 144:
2217-2224].

9.2.2 Replikacja DNA faga M13

Ml3 jest nitkowatym fagiem (którego genom stanowi ccc ssDNA) należącym do
tej samej grupy co fag fl (tab. 9.1) i fd (fot. 9.1). Zmodyfikowane formy M13 sto-
suje się jako wektory do klonowania w celu wytworzenia jednoniciowych kopii
DNA potrzebnych do sekwencjonowania (sekcja 8.5.6) lub zlokalizowanej muta-
genezy (sekcja 8.5.5).
Enzymy bakterii, po jej zakażeniu, na matrycy jednoniciowego genomu faga
(v lub „plus") syntetyzują nić komplementarną (c lub „minus"), prowadząc
do utworzenia replikacyjnej formy (RF) składającej się z ccc ds DNA. Następnie
cząsteczka ta ulega superskręceniu w wyniku działania komórkowej gyrazy
(wtedy nazywana jest RFI), a jej nić c zaczyna być transkrybowana. Nić ν zostaje
przecięta (przez enzym kodowany przez faga) i rozpoczyna się replikacja
według mechanizmu toczącego się koła (rys. 8.5). Na początku ssDNA nici ν jest
pocięty na odcinki odpowiadające jednej długości genomu. Ich końce łączą
się w formę kolistą, tworząc w ten sposób potomne formy RF. Następnie specyfi-
czne białka kodowane przez faga gromadzą się w komórce i pokrywają nowo
utworzone nici v, tym samym blokując ich przejście w formę RF. Jednocześnie,
te pocięte i koliste cząsteczki ssDNA są pakowane do płaszcza białkowego,
a dojrzale fagi — wypychane na zewnątrz przez osłony żyjącego wciąż
gospodarza.

240
 9.3 Fagi męskie
Fagi męskie zakażają tylko bakterie zawierające koniugacyjny plazmid. Jedną
ich grupę stanowią fagi nitkowate ssDNA, np. fl i fd (tab. 9.1), które adsorbują
się specyficznie na końcach niektórych typów pilusów. Przejście przez błonę
komórkową może być związane z zanikiem pilusa. Potomne fagi fl i fd są uwal-
niane po przejściu przez osłony komórkowe. Komórki gospodarza pozostają
żywe, jedynie rosną wolniej od komórek niezakażonych.
M12, MS2, f2 i Qβ są małymi fagami ssRNA, których kapsyd ma budowę
dwudziestościanu. Fagi te adsorbują się na bokach niektórych typów pilusów.

9.4 Konwersja fagowa

Bakterie lizogenne mogą mieć cechy, których są pozbawione komórki niezaka-
żone. Taka konwersja fagowa (konwersja bakteriofagowa, konwersja lizogenna)
może wynikać np. z wyrażenia się fagowych genów w komórce lub z inaktywacji
genów chromosomowych w wyniku wstawienia faga. Na przykład szczepy
Corynebacterium diphtheriae powodujące błonicę są lizogenne i zawierają pewien
typ faga kodującego silną toksynę. Szczepy nielizogenne nie wytwarzają tej
toksyny i nie powodują błonicy (patrz również toksyna cholery w sekcji 11.3.1.1).
U Staphylococcus aureus wstawienie genomu faga L54a prowadzi do utraty
aktywności lipazy wskutek inaktywacji odpowiedniego genu chromosomowego
(patrz również Salmonella w Aneksie).

9.4.1 Bakteriofag Mu
Insercja (wstawienie) DNA faga Mu do chromosomu zachodzi według mechani-
zmu konserwatywnej transpozycji (rys. 8.4a-c). Transpozycja zależy od działania
fagowego produktu genu A (transpozazy, która wiąże się z końcami fagowego
DNA). Wstawienie faga zachodzi w dowolnym miejscu chromosomu, niezależ-
nie od tego, czy następstwem infekcji jest liza czy lizogenia. Insercja DNA faga
Mu prowadzi do podwojenia się miejsca DNA długości 5 pz, w które wstawił się
fag. W związku z tym, że fag Mu często wstawia się w genom bakteryjny pro-
wadząc do jego inaktywacji, w populacji bakterii lizogennych zakażonych tym
fagiem obserwuje się znacznie zwiększoną częstość mutacji, obejmującą nawet
2-3% komórek; stąd nazwa Mu (mutator).
Lizogenia jest związana z aktywnością białka represorowego (produktu genu
c), które może np. regulować syntezę transpozazy.
Infekcja lityczna wymaga zajścia około 100, związanych z replikacją, transpo-
zycji między różnymi częściami chromosomu, w których fag zachowuje się jak
ogromny element transpozycyjny. Delecje, insercje, itp. zaburzenia powstające
w wyniku transpozycji w chromosomowym DNA wystarczą do spowodowania
śmierci komórki. Genomy fagowe są wycinane, a następnie pakowane na zasa-
dzie mechanizmu „napełnić główkę". Wszystkie genomy fagowe zawierają
kawałki bakteryjnego DNA na każdym z dwóch końców.

241
 9.5 Transdukcja
Przeniesienie chromosomowego (lub plazmidowego) DNA z jednej komórki do
drugiej za pośrednictwem faga nazywamy transdukcją.

9.5.1 Transdukcja ogólna

W procesie tym każdy z licznych genów faga może być przeniesiony z jednej
komórki bakterii do drugiej. W populacji bakterii zakażonych fagiem zdarza się
czasami, że podczas łączenia się części składowych faga, do główki pakowany
jest DNA chromosomowy lub plazmidowy bakterii zamiast DNA fagowego.
Takie nienormalne fagi mogą po uwolnieniu przylegać do innych komórek
i wprowadzać do nich DNA, ale, z powodu braku DNA fagowego i zawartej
w nim informacji, proces ten nie prowadzi ani do lizy, ani do lizogenii.
W komórce biorcy (transduktanta) transdukowany DNA może: 1) być
degradowany przez restrykcyjne endonukleazy (sekcja 7.4); 2) rekombinować
z chromosomem (lub plazmidem), czego wynikiem jest stabilne dziedziczenie
niektórych cech dawcy (transdukcja pełna); 3) trwać jako ustabilizowana, ale nie
replikująca się cząsteczka (transdukcja poronna). (W przypadku utworzenia
kolonii przez poronnego transduktanta tylko jedna komórka w kolonii zawiera
DNA dawcy).
Geny dawcy zawierające stabilny promotor mogą być wyrażane (zarówno
w transduktancie pełnym, jak i poronnym).
W niektórych przypadkach każdy gen gospodarza ma podobną szansę prze-
niesienia. Jednak w układzie Salmonella /fag P22 większą szansę przekazania na
drodze transdukcji ma pewien region chromosomu bakteryjnego. Region ten
przypomina sekwencję genomu faga związaną z pakowaniem DNA do główek
fagowych.
Przeniesienie genu bakteryjnego na drodze transdukcji ogólnej jest przypad-
kiem rzadkim. Jednoczesna transdukcja dwóch lub więcej genów (kotransduk-
cja) jest dowodem na ich chromosomowe sąsiedztwo. Transdukcja jest użyteczna
do szczegółowego mapowania chromosomów i plazmidów dawcy. Odległość
między genami określa się na podstawie częstości kotransdukcji.

9.5.2 Transdukcja ograniczona

W transdukcji ograniczonej biorą udział jedynie fagi umiarkowane, w których
zachodzi faza integracji z chromosomem gospodarza (patrz np. sekcja 9.1). Pod-
czas wycięcia profag może niekiedy zabrać część otaczającego chromosomu.
Zdarzenie to jest podobne (w ogólnych zarysach) do powstania plazmidu F' (sek-
cja 8.4.2.2). W układzie E. coli/fag λ profag jest ograniczony z dwóch stron przez
geny gospodarza —gal i bio (rys. 8.3b). Wynika stąd, że w rzadkich przypadkach
nieprawidłowego wycięcia profag może zabrać geny gal lub bio, często zosta-
wiając niektóre geny fagowe znajdujące się po przeciwnej stronie profaga. Taki
zrekombinowany genom fagowy może być następnie pakowany do główki i dal-

242
sze składanie faga zachodzi bez zakłóceń. Fag transdukcji ograniczonej (wyspe-
cjalizowana cząstka transdukcyjna, STP, ang. specialized transducing particle)
może utracić zdolność do replikacji (tj. może być wadliwy), jednak zachowuje
zdolność do wstrzyknięcia DNA do komórki biorcy, a co za tym idzie — zdol-
ność do przeniesienia genów dawcy (gal lub bio). Również w innych układach
bakteria/fag jedynymi genami, które mogą być przeniesione podczas trans-
dukcji, są geny otaczające profaga.

9.6 W jaki sposób fag unika

restrykcyjnego systemu gospodarza?
Głównym celem restrykcji w bakteriach (sekcja 7.4) wydaje się ochrona prze-
ciwko „obcemu" DNA — szczególnie DNA fagowemu. W jaki więc sposób fagi
zdolne są do replikacji w bakteriach? Wykorzystują w tym celu różne mecha-
nizmy antyrestrykcyjne [Bickle i Kruger (1993) MR 57: 434-450]. Na przykład,
DNA niektórych fagów (fag T7 E. coli) nie zawiera wcale albo zawiera niewiele
miejsc przecinanych przez endonukeazy gospodarza. Miejsca te zostały utracone
lub ich liczba zmniejszona w procesie selekcji (przeciwko zdolności do enzyma-
tycznego przecięcia).
Niektóre fagi kodują specyficzne inhibitory enzymów restrykcyjnych, inne
zaś kodują metylazy o specyficzności właściwej komórkom gospodarza.
Fagi T-parzyste (T2, T4 i T6 E. coli) są oporne na restrykcję, ponieważ ich
DNA jest glikozylowany, a przez to niewrażliwy na działanie endonukleaz.
Nawet w tym przypadku, po infekcji fagami T-parzystymi niektóre szczepy
E. coli wytwarzają enzym przecinający ich własny tRNA1ys (lizynowy tRNA).
W ten sposób zostaje zahamowana synteza białek fagowych, a więc replikacja
faga. Fag jednak koduje enzymy (z ligazą RNA włącznie) zdolne do naprawy
tego procesu samozniszczenia.
 ROZDZIAŁ

10
Bakterie w świecie ożywionym

Bakterie są często uważane za szkodniki, które należy zniszczyć, lub też traktuje
się je jak „torebki z enzymami" — przydatne do przeprowadzania doświadczeń.
Jednakże bakterie mają swoje własne życie poza laboratorium i wiele z ich akty-
wności jest istotnych nie tylko dla człowieka, lecz również dla zachowania rów-
nowagi w naturze. Ten aspekt bakteriologii obejmuje wiele zagadnień, ale w tym
rozdziale może być przedstawiony tylko krótki zarys niektórych z nich.

10.1 Zespoły mikroorganizmów

Większość bakterii należy do organizmów swobodnie żyjących, co oznacza, że
niekoniecznie tworzą one wyraźnie określone związki z innymi organizmami,
mimo że w naturalnych warunkach stanowią część sieci wzajemnych powiązań
i rzadko się zdarza, aby rozwijając się nie wpływały na inne organizmy lub by
same nie ulegały wpływowi. Bakterie zwykle występują jako członkowie miesza-
nego „kolektywu", w skład którego mogą wchodzić grzyby, glony, pierwotniaki
i inne organizmy. Takie zespoły można znaleźć w rozmaitych naturalnych siedli-
skach, jak: woda, gleba, powierzchnia roślin, wnętrze i powierzchnia ciała
człowieka oraz zwierząt. Mikroorganizmy występujące zazwyczaj w określonym
siedlisku nazywa się łącznie mikroflorą tego siedliska.
Mikroorganizmy, które kolonizują dane siedlisko, oddziałują na siebie w roz-
maity sposób: na przykład mogą współzawodniczyć o substancje pokarmowe
występujące w niedoborze, o tlen, o przestrzeń itp. Te organizmy, które nie mogą
efektywnie konkurować, są prawdopodobnie eliminowane z siedliska.
W pewnych warunkach organizm może czynnie przeszkadzać przynajmniej nie-
którym konkurentom, wytwarzając substancje dla nich toksyczne — zjawisko to
nazwano antagonizmem; na przykład mikroorganizm, który wytwarza antybio-
tyki (sekcja 15.4), może mieć nad innym przewagę we współzawodnictwie.
Zazwyczaj takie substancje skierowane przeciw mikroorganizmom są wytwa-
rzane tylko w okolicznościach ograniczenia wzrostu wobec małej zawartości sub-

244
stancji pokarmowych, a więc wtedy, gdy śmierć innych organizmów w siedlisku
może być korzystna na skutek zmniejszenia konkurencji o substancje pokar-
mowe, a nawet poprzez dopływ nowych substancji. Niektóre bakterie wydzielają
związki przeciw mikroorganizmom zwane bakteriocynami, do których należą
kolicyny i mikrocyny (tworzone przez i skierowane przeciwko gramujemnym
gatunkom) i lantybiotyki takie jak nizyna (tworzone przez i skierowane prze-
ciwko gramdodatnim gatunkom). Bakteriocyny hamują/zabijają komórki, prze-
ciw którym są skierowane, wpływając na syntezę kwasu nukleinowego lub
białek, czy też uszkadzając błony. Oczywiście bakterie muszą same się zabezpie-
czać przed własnymi bakteriocynami. Na przykład bakteriocyna lizostafina
wydzielana przez Staphylococcus simulans uszkadza Peptydoglikan we wrażli-
wych szczepach gronkowców (patrz rys. 2.7), a sam S. simulans zmienia Peptydo-
glikan za pomocą enzymu kodowanego przez gen lif, co powoduje, że staje się
niewrażliwy na lizostafinę. [Bacteriocins (artykuł przeglądowy): Baba i Schnee-
wind (1998) TIM 6: 66-71].
Wzajemne zależności w środowisku mogą również polegać na tym, że jeden
lub oba organizmy odnoszą korzyści, a żaden z nich nie ponosi szkody; na
przykład, organizm wytwarzający kwas może sprzyjać powstawaniu dogodnych
warunków dla innego organizmu, którego wzrost jest uzależniony od niskiego pH.
Jeżeli środowisko pozostaje niezakłócone, rozwija się w nim stabilny zespół
organizmów, w którym korzystne i antagonistyczne zależności osiągają stan
równowagi. Obcy mikroorganizm ma zwykle trudności w usytuowaniu się
w takiej wspólnocie, chyba że zakłócenia w środowisku zburzą równowagę tego
zespołu. Na przykład, w jelitach zwierząt zasiedlanie przez patogeny mogą czę-
sto utrudniać mikroorganizmy należące do naturalnej mikroflory, ponieważ zaj-
mują przestrzeń (a więc blokują dojście) i są dobrze dostosowane do warunków
jelit i z tego powodu mogą zwykle przerosnąć patogeny; jednakże jakiekolwiek
zakłócenie tej mikroflory — np. terapią antybiotykową — może stworzyć lepsze
warunki dla patogenów i spowodować chorobę.

10.1.1 Zespoły przejściowe

W odróżnieniu od stabilnych, mieszanych zespołów organizmów, w wielu śro-
dowiskach zdarzają się okoliczności, kiedy jeden lub kilka gatunków przejściowo
dominuje.
W przypadku cholery (sekcja 11.3.1.1) jelita pacjenta stają się żywym inkuba-
torem dla organizmu wywołującego chorobę Vibrio cholereae, a „stolce jak odwar
ryżowy" mogą zawierać 109 komórek V. cholerae w 1 mililitrze.
W jeziorach i innych zbiornikach wodnych pewne warunki mogą wspomagać
obfity wzrost określonych organizmów. Tworzy się wówczas tzw. zakwit — wi-
doczna na lub blisko powierzchni (często rzucająca się w oczy) warstwa organiz-
mów. Obejmują one (lub mogą składać się głównie z) pewne sinice (cyjanobakte-
rie) — szczególnie te, które wytwarzają wakuole gazowe (sekcja 2.2.5) — i/lub
niektóre mikroorganizmy eukariotyczne. Zakwity mogą być stymulowane np.
przez nadmiar składników pokarmowych (takich jak azot wyługowany z nawo-
zów rolniczych) i/lub przez termiczne uwarstwienie w wodzie. Śmierć/uszko-

245
dzenie organizmów tworzących zakwit (na skutek np. braku korzystnych czyn-
ników) może doprowadzić do znacznej utraty tlenu z wody, powodując czasem
uduszenie się ryb i innych zwierząt wodnych.
W niektórych przypadkach można zapobiec zakwitowi poprzez pompowanie
(krążenie) wody niedopuszczające do uwarstwienia i/lub stosując związki prze-
ciw sinicom, takie jak dichloronaftochinon (dichlon).
Anabaena i inne organizmy tworzące zakwity mogą wydzielać pewną sub-
stancję (geosminę), która czasem nadaje ziemisty lub zatęchły posmak wodzie
(i żyjącym w niej rybom).
Niektóre sinice powodujące zakwity (np. gatunki Anabaena, Microcystis, Nodu-
laria) wytwarzają toksyny, które mogą być śmiercionośne dla ryb i/lub innych
zwierząt.

10.1.2 Wyczuwanie liczebności — „quorum sensing"

W niektórych przypadkach komórki w populacji o wysokiej gęstości wykazują
cechy, których nie mają te same komórki w populacji o niskiej gęstości („gęstość"
rozumiana jako liczba komórek w jednostce objętości). Na przykład, Photobacte-
rium fischeri (= Vibrio fischeri) może być albo organizmem swobodnie żyjącym
(w populacji o niskiej gęstości) albo symbiontem (sekcja 10.2.4), jeśli występuje
w populacji o wysokiej gęstości — w „narządzie świetlnym" pewnych ryb
świecących. Jako symbiot P. fischeri emituje niebieskozielone światło (=biolumi-
niscencja: światło pochodzące od żywego organizmu), podczas gdy w stanie
wolno żyjącym (przy niskiej gęstości) nie wykazuje tej cechy lub tylko w niezna-
cznym stopniu. Ryby wykorzystują bakteryjną bioluminiscencję do sygnalizacji
między sobą, bakterie zaś odnoszą korzyść ze stabilnego siedliska, jakie znajdują
w tych zwierzętach.
Jak pojedyncze komórki wyczuwają (ang. sense) gęstość populacji i skąd
wiedzą, kiedy „włączyć światło"? Sygnał właściwie rozwija się jako bezpośred-
nia konsekwencja wzrostu w populacji. Tak więc, wszystkie komórki wydzielają
specjalnego rodzaju cząsteczki sygnalizujące. Jeśli gęstość komórek osiąga okre-
ślone minimum liczebności (ang. quorum), cząsteczki te nagromadzają się do
takiego stężenia, w którym są aktywowane pewne geny w komórkach, w tym
przypadku geny lux, dając w efekcie świecenie bakterii.
Sygnalizująca cząsteczka (o małej masie cząsteczkowej) jest nazywana autoin-
duktorem (ponieważ komórki same ją wytwarzają). Rozmaite bakterie mogą
wytwarzać różne autoinduktory regulujące pewne ich właściwości; czasem
odmienne gatunki wytwarzają ten sam autoinduktor, ale do regulacji różnych
genów. Niektóre bakterie wytwarzają kilka autoinduktorów kontrolujących
wyrażanie się różnych cech. W wielu przypadkach (w tym przykład P. fischeri)
autoinduktor należy do grupy laktonów N-acylo-L-homoseryny (AHLs) [AHL —
based quorum sensing: Swift i wsp. (1996) TIBS 21: 214-219].
W Pseudomonas aeruginosa są przynajmniej dwa systemy „quorum sensing" —
las i rhl (wymagające różnych laktonów homoseryny jako autoinduktorów), które
regulują geny kodujące określone czynniki wirulencji; ponadto wydaje się, że te
dwa systemy współdziałają w układzie hierarchicznym, zawsze jeden jest akty-
wowany przed drugim [Pesci i Iglewski (1997) TIM 5: 132-134].

246
 AHLs są popularnymi autoinduktorami w bakteriach gramujemnych.
Wydaje się, że zwykle działają dyfundując do komórki i po osiągnięciu wystar-
czającego stężenia łączą się z odpowiednim białkiem cytoplazmatycznym, które
reguluje transkrypcję określonego genu(ów).
Bakterie gramdodatnie zwykle wykorzystują jako autoinduktony peptydowe
cząsteczki sygnalizujące (= feromony).
Kiedy wzrost Bacillus subtilis powoduje osiągnięcie dużej gęstości komórek,
w środowisku pozakomórkowym gromadzą się dwa typy feromonów — ozna-
czone jako ComX i CSF. ComX pobudza rozwój stanu kompetencji w transforma-
cji (sekcja 8.4.1), zaś CSF wydaje się jednym z czynników biorących udział w ini-
cjacji sporulacji. Mechanizmy działania ComX i CSF są różne. ComX aktywuje
dwuskładnikowy system regulacyjny (sekcja 7.8.6): powoduje autofosforylację
kinazy histydynowej związanej z błoną (ComP). Enzym ten z kolei fosforyluje
i aktywuje czynnik transkrypcyjny — ComA, który reguluje aktywność genu
comS wymaganego do osiągnięcia stanu kompetencji. Inny feromon — CSF jest
pobierany przez system zależnej od ATP permeazy oligopeptydowej (transport)
obecnej w błonie cytoplazmatycznej; w cytoplazmie hamuje on aktywność nie-
których fosforylaz, które defosforylują Spo0F~P i w ten sposób umożliwiają
przenoszenie fosforu (rys. 7.14).
Koniugacja (sekcja 8.4.2.1) u Enterococcus faecalis jest związana z wydziela-
niem feromonów przez komórki potencjalnych biorców; podobnie jak CSF
(wyżej) feromony te są wprowadzane do wnętrza przez błonowy system per-
meaz [Peptide signalling (artykuł przeglądowy): Lazazzera i Grossman (1998)
TIM 6: 288-294].

10.2 Saprotrofy, drapieżniki, pasożyty, symbionty

10.2.1 Saprotrofy
Organizmy, które pobierają składniki pokarmowe z obumarłej materii organicz-
nej, są nazywane saprotrofami. Niektóre saprotrofy zużywają tylko związki roz-
puszczalne, pewne zaś mają zdolność do rozkładu celulozy (sekcja 6.2) czy też
innych polimerów poza komórką i przyswajają rozłożone produkty. Złożone
substraty mogą być rozkładane stopniowo, kolejno przez określone gatunki
saprotrofów przeprowadzających jeden (lub kilka) etapów tego procesu. Tego
typu współdziałanie jest istotne dla rozkładu, a zatem obiegiem materii organicz-
nej w naturze. Trzeba przyznać, że jest bardzo niewiele biologicznych związków,
które nie mogą być sprawnie rozłożone przez zespół saprotrofów „pracujących
w jednej drużynie". Bez saprotrofów (heterotrofów) ustałby obieg węgla
(rys. 10.1), jak i obiegi innych składników materii.

10.2.2 Drapieżniki
Bakterie z rzędu Myxobacterales (bakterie śluzowe) są gramujemnymi pałecz-
kami żyjącymi w glebie, w gnojówce i na rozkładających się szczątkach roślin-

247
nych. Większość gatunków tego rzędu żeruje na innych mikroorganizmach:
wydzielają one enzymy powodujące lizę innych bakterii oraz grzybów i rozwi-
jają się zużywając rozpuszczalne produkty. Oczywiście bakterie śluzowe nie są
typowymi drapieżnikami, gdyż drapieżniki zwykle pobierają swoją ofiarę do
wnętrza przed jej strawieniem.
Inny niezwykły drapieżnik — Bdellovibrio (patrz Aneks) żyje wewnątrz komó-
rek bakteryjnych. Nazwa „Bdellovibrio" pochodzi częściowo od greckiego słowa
oznaczającego „pijawkę". Ciekawe, że Bdellovibrio może wnikać do komórek
E. coli pomimo obecności grubej otoczki [Koval i Bayer (1997) Microbiology 143:
749-753].

10.2.3 Pasożyty
Pasożyt to organizm, który żyje na/lub w innym żywym organizmie (gospo-
darz) i odnosi korzyści (w różny sposób) jego kosztem; prawie we wszystkich
przypadkach pasożyt otrzymuje substancje pokarmowe od swojego gospodarza.
Gospodarz może w różnym stopniu ponosić szkody — poczynając od nieznacz-
nej niedogodności aż do śmierci.
Pasożytnictwo można traktować jako alternatywny sposób życia niektórych
wolno żyjących bakterii, lecz dla innych jest on obligatoryjny. Takie bakterie jak
Mycobacterium leprae (wywołujące trąd) mogą rosnąć jedynie wewnątrz określo-
nego typu komórek eukariotycznego gospodarza. Pasożyty obligatoryjne, takie
jak te przytoczone, są ściśle uzależnione od metabolizmu swoich gospodarzy
i często nie mogą być hodowane w laboratorium, chyba że w specjalnych hodow-
lach żywych komórek.
Pasożyt, który w takim stopniu oddziałuje niekorzystnie na swojego gospo-
darza, że wywołuje jego chorobę lub śmierć, nazywany jest patogenem. Nie
wszystkie pasożyty są patogenami i nie wszystkie patogeny są pasożytami;
przykładem niepasożytniczego patogena jest Clostridium botulinum (sekcja
11.3.1.2).

10.2.4 Symbionty
Początkowo symbiozę rozumiano jako każdy stabilny, fizyczny związek mię-
dzy różnymi organizmami (symbiontami) — niezależnie od rodzaju układów
między nimi. Później znaczenie tego terminu było ograniczone tylko do tych
okoliczności, w których wzajemne oddziaływania polegają na obopólnym odno-
szeniu korzyści. Jednakże obecnie jest tendencja (mimo możliwości pomyłek)
powrotu do pierwotnego znaczenia. Tak więc, powszechne rozumienie sym-
biozy uwzględnia zarówno oddziaływania między symbiontami polegające na
obopólnym odnoszeniu korzyści (mutualizm), jak i pasożytnictwo. Stosując tę
samą terminologię, komensalem jest symbiont, który odnosi korzyści od dru-
giego symbionta w taki sposób, że ten ostatni nie doznaje ani korzyści, ani strat
z tego związku.

248
 10.2.4.1 Symbiozy mutualistyczne
Związki partnerskie między bakteriami i innymi organizmami, z których obaj
partnerzy czerpią korzyści, są dość powszechne. Przykładem mogą być przeżu-
wacze (np. owce, krowy, itp.), które nie tworzą enzymów trawiących celulozę
zawartą w ich roślinnym pożywieniu. W przewodzie pokarmowym posiadają
natomiast komorę (żwacz) zawierającą znaczną ilość mikroorganizmów (w tym
bakterie takie jak Ruminococcus), przemieniających celulozę w proste związki,
które mogą być wchłaniane przez zwierzę. Z kolei mikroorganizmy odnoszą
korzyść ze stabilnego środowiska, o optymalnej temperaturze i bogatego
w składniki odżywcze (dostarczane przez zwierzę).
U niektórych owadów, wyspecjalizowane komórki (mycetocyty) w wyściółce
jelita zawierają (wewnątrzkomórkowo) bakterie, które, przynajmniej w kilku
przypadkach, dostarczają niezbędnych składników odżywczych gospodarzowi.
Z jelitem tych owadów może być również związany rodzaj odrębnej organelli
(mycetom), złożonej ze skupiska mycetocytów.
Korzenie roślin motylkowych (groch, fasola, koniczyna itp.) mają drobne
narośla (brodawki) zawierające bakterie z rodzaju Rhizobium. W układzie tym
roślina dostarcza związki odżywcze i ochronę, podczas gdy Rhizobium zaopa-
truje ją w azot „wiązany" z atmosfery (sekcja 10.3.2). Brodawki korzeniowe
umożliwiają roślinom rozwój na glebie ubogiej w azot [Legume nodulation
(artykuł przeglądowy): Albrecht, Geurts i Bisseling (1999) EMBO Journal 18:
281-288].
Bakterie wiążące azot tworzą również związki z roślinami innymi niż motyl-
kowe. Do takich przykładów należą brodawki zawierające bakterie z rodzaju
Frankia w korzeniach olchy (Alnus) i mała pływająca paproć Azolla, u której
w specjalnych zagłębieniach występuje Anabaena azollae. W wyglądających jak
korale korzeniach sagowców (Cycas, Encephalatos, Zamia) z ogrodu botanicznego
wykazano, stosując metodę PCR, obecność szczepu Nostoc należącego do sinic
[Costa, Paulsrud i Lindblad (1999) FEMSME 28: 85-91].

10.3 Bakterie a obieg materii

Pierwiastki, które wchodzą w skład żywych organizmów, występują na Ziemi
w ograniczonych ilościach. Aby więc życie mogło być kontynuowane, składniki
martwych organizmów muszą być ponownie użyte (włączane w obieg). W pro-
cesie tym kluczową rolę odgrywają bakterie i inne mikroorganizmy.

10.3.1 Obieg węgla

Głównym składnikiem strukturalnym wszystkich żywych organizmów jest
węgiel (rozdz. 6), dlatego też odzyskiwanie tego pierwiastka jest niezmiernie
istotne. Głównym udziałem bakterii w biologicznym obiegu węgla (rys. 10.1) jest
zużywanie i rozkład martwej materii organicznej przez (heterotroficzne) sapro-
trofy. W środowiskach naziemnych martwa materia organiczna obejmuje
szczątki roślinne i zwierzęce.

249
Bakterie mają znaczący udział zarówno jako autotrofy, jak i heterotrofy (rozdział 6), a przedstawiciele
Archaea — jako metanogeny (sekcja 5.1.2.2); do metylotrofów (sekcja 6.4) należą bakterie zużywające
metan. Mikroorganizmy (w tym bakterie) są odpowiedzialne za niezbędną przemianę „martwych"
organicznych związków węgla do biomasy i CO2; bez tego procesu obieg ustałby. Biomasa mikroor-
ganizmów, jako taka, jest zużywana np. przez zwierzęta filtrujące (ostrygi itd.) oraz w łańcuchach
pokarmowych przez ryby i inne zwierzęta. Udział węgla elementarnego (wolnego) w ich obiegach
jest minimalny (w porównaniu z azotem i siarką).

W środowiskach wodnych węgiel w rozpuszczalnych związkach organicz-

nych pochodzi, przynajmniej częściowo, z planktonu roślinnego (fitoplanktonu),
tj. mikroskopijnych fotosyntetyzujących (wiążących CO2) organizmów. (Wzrost
masy fitoplanktonu, glonów i lądowych roślin zielonych — wszystkich fotosyn-
tetyzujących organizmów — jest razem określany jako produkcja pierwotna).
W jeziorach często do puli węgla pochodzącego z fitoplanktonu dochodzi węgiel
organiczny pochodzenia lądowego dostający się wraz z wodami wpływającymi
z lądu. W otwartym oceanie prawie cały węgiel pochodzi z planktonu roślin-
nego. Mimo że większość fitoplanktonu jest zużywana jako pokarm przez zwie-
rzęta wodne, pozostały dostarcza również węgla do wzrostu bakterii (tj. produ-
kcji biomasy) i do oddychania. Ostatnio opublikowana praca wykazuje, że ilość
węgla ze związków rozpuszczalnych, zużytego przez bakterie w oddychaniu,
jest większa niż początkowo przypuszczano. Ponadto, wydaje się, że również

250
i tam, gdzie pierwotna produkcja w wodzie jest mała, szybkość tworzenia CO2
w wyniku bakteryjnego oddychania przewyższa wiązanie CO 2 przez fitoplan-
kton. Oznacza to, że przynajmniej okresowo obieg węgla nie jest równomierny
w różnych częściach oceanu. A to sugeruje, że okresy autotroficznego zysku
netto (kiedy wiązanie CO 2 przewyższa tworzenie CO 2 podczas oddychania)
mogą się pojawiać w różnym czasie w ciągu roku, aby równoważyć zysk netto
heterotrofii [del Giorgio, Cole i Cimbleris (1997) Nature 385: 148-151].
Znajomość obiegu węgla jest konieczna do zrozumienia „efektu cieplarnia-
nego" (sekcja 10.6), a ewolucja tego obiegu jest interesująca sama w sobie [Past
and present cycle of carbon on our planet (artykuł przeglądowy): Schlegel (1992)
FEMSMR 103: 347-354].

10.3.1.1 Ksenobiotyki
Wiele ksenobiotyków (zanieczyszczenia środowiska takie jak pestycydy, inne
związki chemiczne używane w rolnictwie i detergenty) trudno ulega biodegra-
dacji z powodu obecności w ich cząsteczkach jednego lub kilku wiązań etero-
wych (C-O-C). Pod tym względem przypominają one naturalny składnik,
jakim jest lignina, która wykazuje trwałość w środowisku powodując powstawa-
nie np. węgla kopalnego. Pomimo oporności ksenobiotyków na biodegradację, są
jednak zespoły bakterii, które mają zdolność ich rozkładu. Jest to szczęśliwe
rozwiązanie, ponieważ taka działalność pomaga ograniczyć niepożądane groma-
dzenie tych składników w środowisku. Bakteryjny rozkład wiązań eterowych
został omówiony przez White, Russell i Tidswell (1996) [MR 60: 216-232].

10.3.2 Obieg azotu

Azot jest składnikiem białek i kwasów nukleinowych, dlatego też jest niezbędny
dla wszystkich organizmów. Azot gazowy (diazot — N 2 ) stanowi ponad trzy
czwarte atmosfery Ziemi. Większość organizmów nie wykorzystuje jednak tej
jego formy, gdyż tylko niektóre z nich mają taką zdolność (sekcja 10.3.2.1).
Przyswajanie amoniaku. Wiele bakterii przyswaja azot w formie amoniaku,
głównie wbudowując grupę aminową (z amoniaku) albo do α-ketoglutaranu,
albo do glutaminianu — tworząc odpowiednio glutaminian lub glutaminę. Te
z kolei służą jako dawcy azotu w różnych reakcjach transaminacji w procesie
syntezy innych związków azotowych. Tak więc, glutaminian dostarcza azotu do
syntezy, np. L-alaniny i L-asparaginy (rys. 6.3), a glutamina jest dawcą azotu
w syntezie puryn i pirymidyn (zasady w kwasach nukleinowych) oraz amino-
kwasów — histydyny i tryptofanu.
U E. coli szlak asymilacji amoniaku zależy od jego stężenia i zachodzi z zuży-
ciem NADPH.
W dużych stężeniach amoniaku enzym dehydrogenaza glutaminianowa
katalizuje redukcyjną aminację α-ketoglutaranu do glutaminianu.
W małych stężeniach amoniaku (np. < 01 mM) reakcja zachodzi dwuetapowo.
Najpierw syntetaza glutaminowa (GS) katalizuje tworzenie glutaminy z glut-

251
aminianu i amoniaku, a następnie w drugim etapie aminotransferaza glutami-
nowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT, ang. glutaminę: 2-oxoglutarate aminotrans-
ferase; syntaza glutaminianowa) katalizuje reakcję, w której glutamina (1 cząste-
czka) i α-ketoglutaran (1 cząsteczka) tworzą glutaminian (2 cząsteczki).
U E. coli szlak katalizowany przez dehydrogenazę glutaminianową jest
istotny w warunkach ograniczonego dopływu energii (np. kiedy substraty ener-
getyczne są ograniczeniem), gdyż reakcja katalizowana przez ten enzym jest nie-
zależna od ATP, podczas gdy szlak, w którym uczestniczy GOGAT, jest zależny
od ATP [Pathway choice in glutamate synthesis in E. coli: Helling (1998) JB 180:
4571-4575].
Przyswajanie azotanów. Niektóre bakterie mają zdolność przyswajania azotu
w postaci azotanów, azotan jest wtedy najpierw redukowany do amoniaku
w procesie redukcji asymilacyjnej (rys. 10.2). Jest to proces różniący się od oddy-
chania azotanowego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2) np. tym, że nie towarzyszy mu
wytwarzanie energii.

Nitryfikacja jest procesem tlenowym, podczas gdy oddychanie azotanowe /denitryfikacja i wiązanie
azotu są w zasadzie związane z warunkami beztlenowymi lub ubogimi w tlen (ale patrz sekcja
5.1.1.2). U niektórych sinic wiązanie azotu zachodzi w heterocystach (sekcja 4.4.2). Azotany lub amo-
niak mogą być przyswajane (tj. wykorzystywane jako źródło azotu) przez wiele rodzajów bakterii —
azotany są redukowane wewnątrzkomórkowo do amoniaku (asymilacyjna redukcja azotanów).
Amonifikacja jest częścią procesu mineralizacji (sekcja 10.3.4).

252
 Azotany, azotyny, amoniak w metabolizmie energetycznym. Azotany lub
azotyny mogą być wykorzystywane przez niektóre bakterie jako akceptory ele-
ktronów w metabolizmie oddechowym. W zależności od gatunku organiczne lub
nieorganiczne substraty mogą być używane jako dawcy elektronów w tego typu
metabolizmie (test na redukcję azotanów jest opisany w sekcji 16. 1. 2.12). Zna-
nych jest kilka szlaków tych przemian.
Denitryfikacja jest procesem oddechowym (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.2), w któ-
rym azotany lub azotyny są redukowane do form gazowych (głównie N2 i/lub
tlenek azotu). Proces ten ma znaczenie dla upraw rolnych, ponieważ powoduje
zubożenie gleby pod względem biologicznie użytecznego azotu (sekcja 10.3.2).
Dysymilacyjna redukcja azotanów do amoniaku — DRNA (ang. dissimila-
tory reduction of nitrate to ammonia) jest procesem oddechowym przeprowa-
dzanym przez niektóre bakterie (np. gatunki Enterobacter i Vibrio) opisane jako
występujące w takich siedliskach jak osady morskie. Sądzi się, że DRNA zacho-
dzi najaktywniej w małych stężeniach azotanów, w wyższych stężeniach nastę-
puje redukcja przede wszystkim do azotynów i odpowiednio w mniejszej ilości
do amoniaku [Bonin (1996) FEMSME 19: 27-38].
Nitryfikacja (rys. 10.2) jest procesem zależnym od tlenu, dostarczającym
energii, w którym amoniak jest utleniany do azotynów, a azotyny do azotanów
przez grupę chemolitotroficznych bakterii (sekcja 5.1.2).

10.3.2.1 Wiązanie azotu

Wiązanie azotu atmosferycznego (redukcja azotu — N2 do amoniaku) jest
przeprowadzane tylko przez pewien typ bakterii i przez niektórych przedsta-
wicieli Archaea. Do tych diazotrofów należą niektóre sinice, np. Anabaena,
Nostoc, pewne gatunki Bacillus i Clostridium, Klebsiella pneumoniae (niektóre
szczepy) oraz przedstawiciele rodziny Azobacteriaceae i Rhizobiaceae, a także
z rzędu Rhodospirillales.
Wiązanie N2 jest katalizowane przez kompleks enzymatyczny — nitroge-
nazę. Elektrony z takiego źródła jak wodór lub NADPH są przenoszone np. na
ferredoksynę (sekcja 5.1.1.2) i kolejno na nitrogenazę. Redukcja azotu wymaga
znacznej ilości energii — około 12-16 cząsteczek ATP na każdą cząsteczkę
związanego azotu.
Amoniak tworzony w procesie wiązania azotu może być asymilowany np.
przez aminację glutaminianu do glutaminy.
Nitrogenaza jest bardzo wrażliwa na tlen. Wiele diazotrofów (np. laseczki
beztlenowe z rodzaju Clostridium) wiąże azot beztlenowo lub w warunkach
małego stężenia tlenu (warunki mikroaerobowe), a niektóre sinice proces ten
przeprowadzają wewnątrz heterocyst (sekcja 4.4.2). Tlenowce wiążące azot mają
specjalny mechanizm ochraniający własną nitrogenazę. W jednokomórkowych,
tlenowych, wiążących azot sinicach z gatunku Cyanothece wiązanie azotu prze-
biega tylko w okresie ciemności podczas przemiennych 12-godzinnych cykli
ciemności i światła, natomiast jest procesem ciągłym podczas 24-godzinnego
naświetlania. Wiązanie azotu w ciemności pozwala na uniknięcie tlenu, który

253
powstaje podczas fotosyntezy (sekcja 5.2.1.1), ale ciągła aktywność nitrogenazy
podczas nie przerywanego naświetlania wymaga dodatkowych wyjaśnień.
Jedno z możliwych dostrzega w tym rolę „zawiesiny ziaren", której powstawanie
towarzyszy wiązaniu azotu [Reddy i wsp. (1993) JB 175: 1284-1292]. [Nitrogen
fixation by non-heterocystous Cyanobacteria (artykuł przeglądowy): Bergman
i wsp. (1997) FEMSMR 19: 139-185].
Diazotrofy występują jako organizmy swobodnie żyjące w glebie i wodzie
lub też jako symbioty (sekcja 10.2.4).
Na zakończenie, intrygujące pytanie: dlaczego wiązanie azotu zachodzi tylko
w niektórych prokariotach, dlaczego na przykład nie w roślinach? Uważa się, że
w toku ewolucji rośliny włączyły organizmy prokariotyczne jako organelle (jak
np. mitochondria), ale zdolność prokariotów do wiązania azotu rozwinęła się
później w swobodnie żyjących organizmach. To właśnie, w połączeniu z nie-
dostateczną presją selekcyjną jest uważane za przyczynę wiązania azotu tylko
przez prokarioty [Postgate (1992) PTRSLB 338: 409-416].

10.3.2.2 Rolnictwo i obieg azotu

Znajomość udziału bakterii w obiegu azotu może znaleźć zastosowanie
w udoskonalaniu upraw rolniczych. Wydajność zbiorów płodów rolnych może
być ograniczona brakiem w glebie dostępnego azotu. Zatem dzięki znajomości
mechanizmów utraty azotu oraz możliwości wykorzystania jego wiązania
można często podjąć odpowiednie działania w celu zwiększenia wydajności
zbiorów.
Azot z gleby jest pobierany podczas wzrostu roślin i w czasie zbiorów, a rów-
nież jest z niej tracony w procesach denitryfikacji i nitryfikacji. Denitryfikacja
zazwyczaj zachodzi najintensywniej w warunkach beztlenowych lub słabego
dostępu do tlenu (mikroaerobowych), w obecności azotanów i związków orga-
nicznych; warunki spotykane np. w glebach uprawnych zalanych wodą. Denitry-
fikację można więc ograniczać przez ulepszenie struktury i drenowanie gleby,
przeciwdziałając rozwojowi warunków beztlenowych.
Szkodliwość denitryfikacji jest oczywista, ale dlaczego nitryfikacja prowadzi
do strat azotu? Odpowiedź leży w tym, że mimo iż zarówno azotany, jak i amo-
niak są rozpuszczalne, to jony amonowe adsorbują się łatwo do cząstek gleby
(cząstki gliny zazwyczaj niosą ładunek ujemny), a jony azotanowe nie. A więc
azotany są znacznie łatwiej wypłukiwane (wyługowane) z gleby przez deszcz
czy powódź. Dlatego też w nawozach azotowych lepiej stosować związki amo-
nowe niż azotany. Nitryfikacji można zapobiegać poprzez dodanie „inhibitora
nitryfikacji" do nawozu. Związki takie przede wszystkim hamują utlenianie
amoniaku, a jeden z nich, etridiazol, jest dodatkowo przydatny jako środek prze-
ciwgrzybiczny i znajduje zastosowanie np. na gleby i nasiona przeciwdziałając
butwieniu.
Nawozy azotowe mogą uzupełnić straty azotu, ale są kosztowne, w związku
z tym mało dostępne w krajach o największym na nie zapotrzebowaniu. Istnieją
jednak inne rozwiązania. Na przykład w płodozmian mogą być włączone
„rośliny wiążące azot", jak koniczyna i lucerna, oraz wprowadzone rośliny
tworzące „zielony nawóz", np. Azolla (sekcja 10.2.4.1). Jest to praktyka po-

254
wszechna w Azji Południowo-Wschodniej. W uprawach ryżu można np. zwięk-
szyć plony stymulując do wzrostu swobodnie żyjące, wiążące azot sinice.
Najlepszym rozwiązaniem byłoby stworzenie, wykorzystując metody mani-
pulacji genetycznej, roślin zdolnych do wiązania azotu bez pomocy prokar-
iotów.
Tworzenie brodawek przez rośliny niemotylkowe. Próby wyrażenia bakte-
ryjnych genów nif (wiązania azotu) w roślinach jak dotychczas nie powiodły się,
ale znalezienie brodawek zawierających Rhizobium wiążące azot (sekcja 10.2.4.)
w niemotylkowej roślinie Parasponia (krzew subtropikalny) zasugerowało inne
możliwości. Podjęto więc próby stymulacji rozwoju brodawek wiążących azot
w niektórych niemotylkowych roślinach, szczególnie w zbożach takich jak ryż
i pszenica, nie mających naturalnych brodawek. Celem takich działań jest zmniej-
szenie zapotrzebowania na nawozy azotowe w rolnictwie, aby np. obniżyć
koszty produkcji zboża i wspomóc ograniczanie stosowania (nieprzyjaznych śro-
dowisku) tych nawozów (azotany).
„Inwazja" niektórych roślin motylkowych (tropikalnych) przez bakterie
wiążące azot zachodzi wówczas, gdy roślina wytwarza korzenie boczne. Na tym
etapie wzrostu bakterie wnikają w miejscach, gdzie powstające korzenie boczne
penetrują korę pierwotną korzenia. Ten sposób inwazji bakterii jest nazywany
„wejściem przez pęknięcie". W następstwie korzenie boczne przekształcają się
w brodawki wiążące azot. Przeprowadzano doświadczenia mające na celu
stwierdzenie, czy pszenicę można „zainfekować" bakteriami z gatunku Azorhizo-
bium caulinodans wiążącymi azot, które tworzą brodawki na tropikalnej roślinie
motylkowej Sesbania rostrata. Azorhizobium caulinodans wprowadzono do ksylemu
i merystemu korzeniowego (tj. do wnętrza rośliny — endofitycznie), uzyskując
znaczący wzrost suchej masy i zawartości azotu w porównaniu z kontrolnymi
roślinami nie zaszczepionymi [Sabry i wsp. (1997) PRS 264: 341-346].

10.3.3 Obieg siarki

Siarka jest składnikiem np. aminokwasów — cysteiny i metioniny oraz ferredo-
ksyn (sekcja 5.1.1.2) i kofaktorów takich jak koenzym A. Rośliny zielone i wiele
bakterii może przyswajać siarkę w postaci siarczanów dostępnych powszechnie
w wystarczających ilościach w warunkach naturalnych. Zanim siarczany zostaną
wbudowane, muszą być zredukowane do siarczków w procesie asymilacyjnej
redukcji siarczanów (rys. 10.3). Proces ten różni się od oddychania siarczano-
wego (sekcja 5.1.1.2; rys. 10.3) podobnie jak asymilacyjna redukcja azotanów
różni się od oddychania azotanowego (sekcja 10.3.2). Pewne bakterie mogą przy-
swajać siarczki bezpośrednio ze środowiska.
W niektórych siedliskach (np. nieutlenione, stojące stawy) powstaje znaczna
ilość siarczków w procesie oddychania siarczanowego. Siarczek może być z kolei
wykorzystany jako dawca elektronów (utleniany jest do siarczynu i siarczanu)
przez beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące (sekcja 5.2.1.2).
Siarka elementarna może być zużywana np. przez archeona Sulfolobus oraz
przez Thiobacillus thiooxidans i T.ferroxidans (patrz Aneks). Wykazano, że niektóre

255
Wiele gatunków może zużywać siarczany (SO42-) jako źródło siarki (koniecznej np. do syntezy nie-
których aminokwasów); pokazane to jest na rysunku jako asymilacyjna redukcja siarczanów. W pro-
cesie tym siarczan jest redukowany wewnątrzkomórkowo do siarczku, który jest wbudowywany na
różnej drodze przez różne organizmy; np. u Escherichia coli siarczek jest wbudowywany do O-acetylo-
seryny, aby utworzyć cysteinę. Oddychanie siarczanowe (=dysymilacyjna redukcja siarczanów) jest
przeprowadzane np. przez „bakterie redukujące siarczany" — organizmy, które zużywają siarczany
(lub np. siarczyny) jako ostateczne akceptory elektronów w oddychaniu beztlenowym (sekcja5.1.1.2).
Desulfuromonas zużywa siarkę elementarną jako ostateczny akceptor elektronów w oddychaniu bez-
tlenowym. Thiobacillus spp. zazwyczaj przeprowadzają oddychanie tlenowe, w którym utleniają np.
siarczki (S2~) i/lub siarkę elementarna. Rhodopseudomonas sulfidophila jest jednym z gatunków, który
zużywa siarczki jako dawcę elektronów w beztlenowym fototroficznym metabolizmie (sekcja 5.2.1.2).

gatunki Thiobacillus tworzą włóknistą warstwę, za pomocą której przylegają do

cząsteczek siarki w osadzie ściekowym. Sugeruje się, że warstwa taka pełni
w naturalnym środowisku ważną funkcję w kolonizacji i utlenianiu siarki [Blais
i wsp. (1994) PB 29: 475-482].
Tiosiarczan i politioniany są ważnymi pośrednikami w bakteryjnym utlenia-
niu pirytu (siarczki metali), co jest związane ze szkodliwym dla środowiska two-
rzeniem kwaśnych wód kopalnianych. W procesie tym powstają jony żelazowe
(Fe III) jako skutek bakteryjnego utleniania jonów żelazawych (Fe II) w pirycie.
Wydaje się, że jony żelazowe utleniają siarkę w pirycie początkowo do tiosiar-
czanu, a następnie do tetrationianu, a tiosiarczan jest odtwarzany w cyklicznej
reakcji poprzez tritionian. Stałe uzupełnianie jonów żelazowych zachodzi dzięki,

256
towarzyszącemu tym procesom, metabolizmowi tlenowemu bakterii litotroficz-
nych takich jak Thiobacillus ferrooxidans. [Sulphur chemistry of bacterial leaching
of pyrite: Schippers, Jozsa i Sand (1996) AEM 62: 3424-3431].

10.3.4 Mineralizacja
Rysunki 10.1-10.3 pokazują, że w krążeniu materii złożone związki organiczne
są rozkładane do prostych związków nieorganicznych, jak: dwutlenek węgla,
siarczek, siarczan, amoniak i azotany. Taka przemiana materii organicznej na
nieorganiczną jest nazywana mineralizacją.

10.4 Bakterie stanowiące zarodki krystalizacji zamarzającej

wody („lodotwórcze")
W temperaturach nieco poniżej 0°C niektóre bakterie wspomagają przemianę
wody w lód, działając jak zawiązek, wokół którego tworzą się kryształy lodu.
Niektóre bakterie o zdolnościach „lodotwórczych" (ang. ice-nucleation) są często
spotykane na powierzchni roślin i mogą wywołać uszkodzenia różnych płodów
rolnych w czasie mrozu. Do bakterii takich należą gatunki Erwinia, Pseudomonas
i Xanthomonas.
Niektóre tkanki roślinne mogą przeżyć bez uszkodzeń oziębienie do kilku
stopni poniżej 0°C, a tylko w obecności bakterii „lodotwórczych" są w tych
warunkach uszkadzane. W temperaturach poniżej (około) -5°C występowanie
uszkodzeń może być ograniczone przez redukcję liczebności populacji bakterii
„lodotwórczych" na roślinie działaniem na jej powierzchnię np. antybiotykami
jak streptomycyna czy oksytetracyklina. Kontrola biologiczna (sekcja 13.1.2),
polegająca na działaniu odpowiednimi „nie-lodotwórczymi" bakteriami może
również być skuteczna. Stosując łącznie kontrolę biologiczną i działanie antybio-
tykami w celu ograniczenia uszkodzeń wywołanych mrozem w gruszy otrzy-
mano efekt będący sumą tych dwóch metod [Lindow i wsp. (1996) Phytopato-
logy 86: 841-848].

10.5 Bakteriologia in situ — fakt czy fikcja?

W idealnej sytuacji, badania organizmu powinny być prowadzone in situ, tj.
w jego naturalnym środowisku. Biologia traktuje przede wszystkim o rzeczywi-
stym żywym świecie. Niektóre dziedziny, np. badania struktur wewnątrzkomór-
kowych wymagają pracy in vitro (w laboratorium), ale w tych przypadkach, gdy
tylko jest to możliwe — „zachowanie" komórek najlepiej obserwować w warun-
kach, które najwierniej odtwarzają ich naturalne siedlisko.
Każde znaczące badanie in situ wymaga zaznajomienia się z danym środowi-
skiem, ponieważ bez tego plan doświadczenia mógłby być błędny. Niestety
wiele z badań, które uważa się za „in situ", podlegają oczywistym zakłóceniom
natury (czasem ekstremalnym), a więc mają małą wartość naukową.

257
 10.5.1 Komory z filtrem membranowym
W celu badania przeżywania bakterii np. w rzekach, zawiesinę bakterii zamyka
się w „komorach z filtrem membranowym". Są to, w zasadzie, szerokie plasti-
kowe rurki zamknięte na obu końcach filtrem membranowym (wielkość porów
0,22-0,45 μm.). Gdy taką komorę zanurzy się w wodzie w rzece, można uważać,
że bakterie wewnątrz komory są zasadniczo w „naturalnych" warunkach, tj.
próbę traktuje się za umieszczoną w środowisku, ponieważ komora jest w nim
po prostu zanurzona. Jednak próba w takiej komorze ma ograniczony kontakt ze
środowiskiem: otrzymuje ogólnie mniej światła i jest odgrodzona od zaburzeń
naturalnych (zatem od zmian temperatury itp.). Ponadto wnikanie lub wydosta-
nie się cząsteczek (w tym zbędnych produktów z próby) na zasadzie dyfuzji
zachodzi tu tylko przez bardzo małe pory w filtrze. Szybkość dyfuzji, przez filtry
z porami na tyle małymi, że zatrzymują badane organizmy, jest z konieczności
krańcowo mała.

10.5.2 Koniugacja in situ

W podjętych próbach wykonania koniugacji (sekcja 8.4.2) in situ — w rzece
i w kanale Welsh, zawiesiny dawców i biorców mieszano, a następnie
przesączano przez filtr membranowy. Filtr z osadzoną warstwą bakterii umiesz-
czono tą warstwą do spodu, na płaskim kamieniu, przytrzymano filtrem
z włókna szklanego i przytwierdzono razem do kamienia gumową opaską. Po
zanurzeniu w rzece lub w kanale przez 24 godziny, wykonano badania pod
kątem występowania transkoniugantów. Wykazanie obecności transkoniugan-
tów pozwoliło na wyciągnięcie wniosku, że „możliwe jest przekazywanie plaz-
midów między bakteriami w epilitonie rzecznym" [Bale, Fry i Day (1987) JGM
133: 3099-3107]. Oczywiście, aby wyciągnąć taki wniosek, warstwę bakterii na
filtrze należało traktować jako epiliton: zespół osiadłych osobników, które rosną
na powierzchni podwodnych kamieni.
Do jakiego stopnia „symulowany epiliton" przypomina epiliton naturalny? A
więc również, w jakim stopniu wniosek z doświadczenia jest uzasadniony?
Wcześniejsze badania innych autorów [Lock i wsp. (1984) Oikos 42: 10-22]
wykazały, że rzeczywisty epiliton składa się z komórek osadzonych we włókni-
stej, wielocukrowej warstwie. Zdjęcia z mikroskopu elektronowego uwidocz-
niają komórki i mikrokolonie umiejscowione w podłożu i oddzielone od siebie
przez substancję takiego podłoża. A więc, czyż w autentycznym epilitonie miej-
sca receptorowe biorcy dla pilusów nie są ukryte w warstwie podłoża? Czy pilus
może w ogóle dosięgnąć biorcy przez warstwę podłoża, która może wykluczać
makrocząsteczki? Ponadto, czy wobec obecności tej warstwy komórki biorcy
i dawcy mogą osiągnąć bezpośredni kontakt ścian komórkowych (typu pokaza-
nego na fot. 8.1, w górnej części)? Naśladowany epiliton nie może odpowiedzieć
na żadne z tych kłopotliwych pytań, ponieważ nie posiada istotnej cechy natural-
nego epilitonu, jaką jest wielocukrowa, włóknista warstwa!
Właściwa symulacja wymagałaby (oprócz warstwy podłoża) populacji komó-
rek podobnej do autentycznej w epilitonie — o rzeczywistej proporcji dawców

258
i biorców. Jednakże w opisanym eksperymencie na każdy centymetr kwadra-
towy filtra zostało nałożone 107 komórek dawcy dobrze wymieszanych
z 108 komórek biorcy (o znanej zgodności). Z danych tych autorów wynika, że
wartości te przekraczały ponad 100-krotnie całkowitą liczbę żywych bakterii
w autentycznym epilitonie. Ponadto, populacja na filtrze składała się wyłącznie
z dawców i biorców i z niewytłumaczalnych przyczyn taką sytuację traktowano
jako naśladującą naturę. W naturze nie ma takiej sytuacji i niesłuszne jest udawa-
nie, że ona istnieje.
Wydaje się możliwe, że w doświadczeniu tym kontakt dawcy z biorcą był
zapoczątkowany podczas mieszania i filtrowania, tj. nawet przed umiejscowie-
niem filtra „in situ" w badanej lokalizacji w rzece lub kanale.
Eksperyment ten chociaż pozornie dotyczył „naturalnego siedliska", w żaden
sposób nie odpowiadał rzeczywistemu środowisku i był niczym więcej niż labo-
ratoryjnym eksperymentem koniugacji przeprowadzanym poza laboratorium.
Takie doświadczenia mogą być zabawne, ale nie wnoszą niczego do nauki.

10.6 Efekt cieplarniany

W naturalnym obiegu węgla (sekcja 10.3.1; rys. 10.1) znaczną ilość CO 2 tworzą
zwierzęta, rośliny i mikroorganizmy podczas oddychania lub fermentacji, ale
jednocześnie równie dużo CO2 jest zużywane przez autotrofy fotosyntetyzujące
(np. rośliny zielone i sinice).
Ogólnie, ta ważna równowaga między produkcją biologiczną i zużyciem CO2
jest dezorganizowana np. przez zużywanie olbrzymich ilości paliw (nafta, gaz
itp.), prowadzące do wzrostu poziomu CO2, a w konsekwencji do ocieplania
naszej planety (efekt cieplarniany).
Czy wzrastający poziom CO 2 może być równoważony intensywnością foto-
syntezy w roślinach (tj. zwiększonym wiązaniem CO2)? W zbadanych roślinach
do typowej reakcji na wzrost ilości CO 2 należy np. zwiększony przyrost korzeni
i zmniejszenie ilości azotu w tkankach (tj. wyższy stosunek węgla do azotu).
W szczególności rośliny uprawne wykazują poprawę wzrostu i wyższą wydaj-
ność. Badania Korner i Arnone [Science (1992) 257: 1672-1675] ukazały jednak
mniej optymistyczny obraz. Autorzy ci obserwowali wpływ zwiększonej ilości
CO 2 na eksperymentalny ekosystem tropikalny i stwierdzili, że znaczący przy-
rost korzeni był związany głównie ze stymulacją metabolizmu mikroorganiz-
mów (w tym bakterii) w ryzosferze (środowisku gleby przylegającej do korzeni).
W interpretacji tych wyników wskazywano, że podwyższony poziom CO2 nieko-
niecznie musi powodować zwiększone odkładanie węgla, ale może prowadzić
do szybszego obiegu węgla (cyklicznej wymiany) pomiędzy atmosferą i ekosy-
stemami lądowymi [Plants and increasing levels of CO2: Murray (1997) Carbon
dioxide and plant responses, ISBN 0863 80213 3].
Oczywiście, wszystkie lasy kuli ziemskiej są głównym naturalnym „zlewem"
dla CO2. Niestety postępująca wycinka lasów ciągle redukuje efektywność tego
zbiornika. Nieco optymistyczne wydaje się, że niektóre głęboko tworzące się
trawy pastwisk przeniesione do sawanny Ameryki Południowej gromadzą
znaczne ilości węgla w swoim wyjątkowo masywnym systemie korzeniowym.

259
Mogłyby one być pomocne w równoważeniu niektórych niebiologicznych emisji
CO2 [Fisher i wsp. (1994) Nature 371: 231-238].
Inny cieplarniany gaz — metan (sekcja 5.1.2.2) jest utleniany przez metylo-
trofy (sekcja 6.4), ale pozostająca jego część przyczynia się do efektu cieplarnia-
nego. Podczas denitryfikacji (sekcja 5.1.1.2) tworzą się też gazy cieplarniane.
Harte [(1996) BC 5:1069-1083], komentując dane z antarktycznych i grenlan-
dzkich rdzeni lodowych, wskazał, iż globalne ocieplenie samo może powodować
zwiększony poziom gazów cieplarnianych. Istnieje więc możliwość efektu pozy-
tywnego sprzężenia, co nie jest odzwierciedlane w tworzonych modelach przy-
szłych zmian klimatycznych. Ponadto autor ten wskazuje na wiele współdziałań
(synergii), które istnieją pomiędzy różnymi formami degradacji środowiska,
a również, że założenie o prostej, liniowej (tj. proporcjonalnej) zależności między
wzrostem populacji ludzkiej i problemami środowiskowymi jest zbyt optymisty-
czne. Przeczytanie artykułu Harta jest godne polecenia szczególnie tym, którzy
uważają, że szkody środowiskowe mogą być rozpatrywane kawałek po
kawałku, tj. w izolacji od środowiska jako całości.

10.7 Problem rekombinantów bakteryjnych w środowisku

Zastosowanie bakterii otrzymanych metodami inżynierii genetycznej — np. do
kontroli biologicznej (sekcja 13.1.2) — wywołuje niepokój wynikający z niewy-
starczającej wiedzy o tym, jak mogą się zachować te organizmy lub jak mogą
przekazać swoje geny w naturalnym środowisku. Jednym z rozwiązań tego
zagadnienia jest biologiczna kontrola: zaaranżowany mechanizm genetycznej
„samodestrukcji", działający automatycznie, kiedy funkcje zrekombinowanego
organizmu zostają spełnione. Takie mechanizmy nie są w 100% skuteczne; nie-
które komórki rekombinantów przeżywają dzięki np. mutacji w zabijającym je
genie. Wydaje się jednak, że eliminacja większości komórek rekombinantów jest
celem wartym zachodu [„Suicide microbes" (artykuł przeglądowy): Ramos
i wsp. (1995) Biotechnology 13: 35-37].

10.8 Bakterie nie wyhodowane/niehodowalne

Prawdopodobnie tylko nieznaczna część z istniejących gatunków bakterii została
wyhodowana i wyizolowana w laboratorium. Wiele gatunków pozostaje niezna-
nych przypuszczalnie po prostu dlatego, że nie stworzono im właściwych
warunków do wzrostu in vitro.
Dawniej wobec niepowodzeń w wyhodowaniu i izolacji nowego organizmu
(np. widzianego pod mikroskopem) możliwa była tylko ograniczona jego chara-
kterystyka. Obecnie metody biologii molekularnej umożliwiają nam zarówno
wykrycie, jak i charakterystykę organizmu nie wyhodowanego — a nawet nie
widzianego! Jedna z możliwości opiera się na tym, że gen 16S rRNA zawiera,
obok zmiennych obszarów różniących się u poszczególnych rodzajów i gatun-
ków, kilka „wysoce konserwatywnych" sekwencji nukleotydów — wystę-
pujących powszechnie u przedstawicieli domeny Bacteria. Startery komplemen-

260
tarne do konserwatywnych sekwencji (startery o szerokim zakresie) mogą być
użyte w PCR (sekcja 8.5.4) do powielenia każdego możliwego bakteryjnego genu
16S rRNA (np. w próbach klinicznych lub ze środowiska). Sekwencję produktów
PCR można oznaczyć (sekcja 8.5.6) i porównać sekwencje zmiennych obszarów
z bazą danych tysięcy znanych gatunków ze wszystkich głównych grup bakterii.
Powielone geny mogą więc wskazać na obecność organizmu pokrewnego filoge-
netycznie do znanego gatunku lub grupy.
W ten sposób mogą być badane również próby zawierające niejednorodną
populację bakterii. W takich przypadkach w PCR tworzone są mieszane
produkty (tj. powielone różne 16S rRNA geny) i w celu określenia ich sekwencji
oraz dalszej analizy konieczne jest klonowanie każdego z nich. W analizie zróżni-
cowanego zespołu organizmów, z zastosowaniem PCR, problemem jest to, że
gen 16S rRNA różnych organizmów może być powielany z różną wydajnością —
taka wybiórczość powielania w PCR jest najwyraźniej zależna od oddziaływania
DNA przyległego do powielanego odcinka [Hansen i wsp. (1998) FEMSME 26:
141-149].

10.8.1 „Żyjące, ale niehodowalne" bakterie

Niektóre bakterie, dające się rutynowo hodować, po stresie (np. głodzenie) prze-
stają rosnąć w podłożach laboratoryjnych, ale wciąż wykazują cechy żywych
komórek — tj. aktywność metaboliczną i utrzymującą się strukturę. Komórki
takie nazwano: żyjące, ale niehodowalne (VBNC, VNC, ang. viable but non-
-cultivable). (Niektóre patogeny, włącznie z Vibrio cholerae [Colwell (1996)
Science 274: 2025-2031], nie tracą zjadliwości.) Stan VNC jest traktowany przez
niektórych autorów jako normalna odpowiedź na stres bakterii nie tworzących
form spoczynkowych, lecz mogących przetrwać w „uśpieniu" [McDougald
i wsp. (1998) FEMSME 25: 1-9].
Chociaż takie „uśpione" komórki mogą egzystować, to niektórzy uważają, że
niepowodzenia w ich wyhodowaniu mogą być spowodowane, przynajmniej
w niektórych przypadkach, nieodpowiednimi podłożami/warunkami. Na
przykład, komórki głodzone przeniesione do podłoża bogatego w składniki
odżywcze i w warunkach natlenienia mogą tworzyć toksyczne/śmiercionośne
wewnątrzkomórkowe rodniki (np. anion ponadtlenkowy,. O2~). Takie rodniki
(powszechne produkty uboczne w tlenowym metabolizmie) są zazwyczaj unie-
szkodliwiane przez specjalne enzymy (np. dysmutaza ponadtlenkowa), ale to nie
zachodzi w komórkach głodzonych (niezaadoptowanych). Tak więc, komórki
głodzone mogą doznać uszczerbku lub nawet zostać zabite na skutek wywoła-
nego przez siebie tlenowego uszkodzenia [Bloomfield i wsp. (1998) Microbiology
144: 1-3].
 ROZDZIAŁ

11
Bakterie w medycynie

11.1 Bakterie jako patogeny

Źródłem niektórych chorób są „błędy" w chemii organizmu, lecz w wielu przy-
padkach objawy chorobowe wynikają z działalności pewnych drobnoustrojów
lub produktów przez nie wytwarzanych na powierzchni lub wewnątrz organi-
zmu; każdy drobnoustrój, który (w sprzyjających warunkach) może powodować
chorobę, zwany jest patogenem. Wśród wielu chorób wywołanych przez drob-
noustroje, pewne są wywoływane przez grzyby, inne przez wirusy, jeszcze inne
przez pierwotniaki, a niektóre przez bakterie; przykłady chorób powodowanych
przez te ostatnie opisano w skrócie na końcu tego rozdziału.
W niektórych chorobach związek między objawami a patogenem jest wysoce
swoisty: daną chorobę może wywołać tylko odpowiedni gatunek lub nawet
określony szczep należący do tego gatunku. Wąglik, na przykład, powodowany
jest jedynie przez pewne szczepy Bacillus anthracis; szczepy te zawierają plaz-
midy (sekcja 7.1.), które kodują toksynę (cyklaza adenylanowa) oraz otoczkę
chroniącą patogena. W innych wypadkach przyczyną choroby może być jeden
z wielu czynników; przykładem jest zgorzel gazowa, którą wywołuje jeden lub
więcej różnych gatunków Clostridium.
Czasami choroba powodowana jest przez organizm zwykle nie zachowujący
się jak patogen i który może nawet należeć do własnej mikroflory organizmu
(tab. 11.1). Na przykład, niektóre gatunki Bacteroides, często występujące w jeli-
cie, mogą czasem, po przypadkowym urazie lub ingerencji chirurgicznej obej-
mującej dolną część przewodu pokarmowego, powodować zapalenie otrzewnej.
Tego typu organizmy zwane są patogenami oportunistycznymi.
Choroba nie zawsze musi być wynikiem zetknięcia się z danym „czynnikiem
sprawczym". W istocie, wystąpienie (lub nie wystąpienie) choroby zależy od róż-
nych czynników — w tym odporności gospodarza oraz wirulencji (zdolności do
wywoływania choroby) patogena. O współzależności między tymi czynnikami
świadczy to, że organizmy będące słabymi patogenami (lub będące niepato-
genne) mogą wywoływać ciężkie choroby u osób ze zmniejszoną odpornością.

262
 Szpitale, w których występuje zagęszczenie chorych, mogą same w sobie być
źródłem zakażeń. Choroba nabyta w szpitalu nosi nazwę infekcji szpitalnej
[infekcje szpitalne (różnorodne aspekty): Emmerson i Ayliffe (red.) BCID (1966)
3: 159-306].

11.2 Drogi infekcji

Skóra stanowi zwykle skuteczną barierę dla patogenów, lecz może ona zostać
uszkodzona np. przez skaleczenie, zabiegi chirurgiczne, ukąszenia owadów itp.
Powstałe rany mogą dopuszczać wiele różnych potencjalnych patogenów zdol-
nych do wywoływania chorób układowych (to jest chorób obejmujących całe
ciało) lub schorzeń miejscowych. Do bakteryjnych patogenów wnikających na
drodze ukąszeń należy m. in. czynnik czynnik powodujący dżumę dymieniczą.
Błony śluzowe występujące w przewodzie pokarmowym, układzie oddecho-
wym i układzie moczowo-płciowym zwykle są bardziej wrażliwe niż skóra i to

263
w tych miejscach często ma początek infekcja. Na przykład, w zapaleniu płuc
i krztuścu (koklusz) infekcja zaczyna się właśnie na powierzchniach oddecho-
wych, podczas gdy w cholerze i durze brzusznym — od błony śluzowej
wyściełającej przewód pokarmowy.
Możliwość zakażenia w czasie zabiegów chirurgicznych zwykle jest na ogół
ograniczana dzięki przestrzeganiu skutecznie technik sterylnych. Dalsze kroki
zapobiegawcze na przykład w ortopedii wiążą się z użyciem implantów z poli-
merów zawierających antybiotyki [Tunney, Gorman i Patrick (1966) RMM 7:
195-205] oraz cementu do kości impregnowanego antybiotykiem [Winniger
i Fass (1966) AAC 40: 2675-2679].

11.2.1 Adhezja jako czynnik w infekcji

W wielu chorobach występuje wczesna faza, w której zachodzi adhezja patogena
do określonych miejsc w organizmie gospodarza. Konieczność adhezji staje się
jasna, kiedy zastanowimy się na przykład nad tym, że miejsca często będące
początkiem infekcji, to jest błony śluzowe, są nieustannie omywane przez własne
wydzieliny i mogą podlegać takim ruchom jak perystaltyka, które to czynniki
utrudniają ustabilizowanie się patogena. Adhezja może też pozwolić patogenowi
skuteczniej współzawodniczyć z naturalną mikroflorą gospodarza.
Adhezja zazwyczaj następuje za pośrednictwem swoistych struktur lub
cząsteczek na powierzchni patogena — tak zwanych adhezyn (sekcja 11.5.6).
Adhezyny często są fimbriami (sekcja 2.2.14.2). Adhezja przebiegająca przy
współudziale fimbrii jest istotna na przykład w wirulencji enterotoksygennych
szczepów E. coli (ETEC, ang. enterotoxigenic strains of E. coli, tab. 11.2), które
wiążą się do błon śluzowych jelita. [Wytwarzanie fimbrii przez patogeny jeli-
towe (artykuł przeglądowy): Edwards i Puente (1998) TIM 6: 282-287]. Tego
typu adhezja ma również znaczenie na przykład w nawiązaniu pierwszego kon-
taktu między Haemophilus influenzae typ b a nabłonkiem układu oddechowego.
W krwiobiegu patogen ten, najprawdopodobniej w wyniku przypadkowej
i odwracalnej zmiany genetycznej, nie wytwarza fimbrii, co pozwala mu na unik-
nięcie przeciwbakteryjnej aktywności układu immunologicznego. [Adhezyny
Haemophilus., Actinobacillus i Pasteurella (artykuł przeglądowy): Jacques i Paradis
(1998) FEMSMR 22: 45-59.]
Do adhezyn nie będących fimbriami należą między innymi białka Μ pacior-
kowców (sekcja 2.2.13), nitkowata hemaglutynina (FHA, ang. filamentous hae-
magglutinin) Bordełella pertussis i białka adhezyjne o dużej masie cząsteczkowej
(HMW1, HMW2) „nietypowalnych" szczepów Haemophilus influenzae.
Do ssaczych receptorów dla adhezyn należą różnego typu cząsteczki po-
wierzchniowe, lecz wiązanie jest zwykle swoiste; na przykład, fimbrie E. coli
typu 1 (tab. 2.2) wiążą się do reszt mannozy, podczas gdy fimbrie Ρ szczepów
E. coli powodujących schorzenia układu moczowego wiążą się do α-D-galaktopi-
ranozylo-(l-4)-β-D-galaktopiranozydowych receptorów glikolipidów na nabłon-
ku wyściełającym przewody moczowe. Niektóre patogeny wiążą się do specyfi-
cznych integryn. Integryny to rodzina ssaczych glikoprotein na powierzchni
komórek, których rola polega na wiązaniu komórek gospodarza do takich

264
składników matriks, jak kolagen i fibronektyna; integryny występują, na przy-
kład, na komórkach nabłonkowych i śródbłonkowych. (Zwróć uwagę, że zgod-
nie ze swoją rolą w wiązaniu, integryny np. komórek nabłonkowych jelita wystę-
pują na powierzchniach bazolateralnych, a nie na apikalnych, to jest skierowa-
nych do światła jelita). Do patogenów wiążących się do swoistych integryn
nabłonka należą Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi i Yersinia enterocolitica.
W przypadku Listeria monocytogenes adhezyna zwana internaliną wiąże się do
E-kadheryny, należącej do innej rodziny glikoprotein występujących na powierz-
chni komórek (kadheryn), które, podobnie jak integryny, zwykle odgrywają rolę
w adhezji do komórek gospodarza.
Adhezja może być bardziej złożona niż proste wiązanie między gospodarzem
a patogenem. Na przykład, wiązanie adhezyny FHA B. pertussis do integryny na
monocycie inicjuje wewnątrz niego sygnały, które zwiększają aktywność inte-
gryny drugiego rodzaju — wiążącej się do innego miejsca na FHA. W ten sposób
B. pertussis wykorzystuje wewnętrzny system sygnalny gospodarza do induko-
wania dodatkowych miejsc wiązania.
Złożone procesy mają miejsce, gdy EPEC (ang. enteropathogenic E. coli)
(tab. 11.2) wiąże się do komórek nabłonkowych jelita. Według wcześniejszego
poglądu [Donnenberg, Kaper i Finlay (1997) TIM 5: 109-114] przebiegało to
następująco. Wstępnie wiązanie zachodzi za pośrednictwem fimbrii typu 4
(tab. 2.2) (zwanymi również fimbriami tworzącymi wiązki, BFP, ang. bundle-fo-
rming pili). Następnie EPEC, związane z powierzchnią komórki, wydzielają
kilka białek (tak zwana „sekrecja wywołana kontaktem"), między innymi EspA
i EspB; białka te wpływają na przekazywanie sygnałów wewnątrz komórki
gospodarza i mogą być wstrzykiwane bezpośrednio poprzez system sekrecji
typu III (sekcja 5.4) kodowany głównie przez wyspę patogenności LEE (sekcja
11.5.7). Zakłócenie przekazywania sygnałów wewnątrz komórki gospodarza
prowadzi do utraty mikrokosmków, fosforylacji białka Hp90 błony komórkowej
gospodarza oraz zmiany układu białek cytoszkieletu. Wówczas EPEC wiąże się
za pośrednictwem białka zwanego intyminą do ufosforylowanej formy białka
Hp90 gospodarza. Z kolei, zmiany układu aktyny poniżej miejsca związania
powodują powstanie piedestału wnikającego do światła komórki, z którym
związana jest komórka bakteryjna (fot. 11.1). Nowszy pogląd [patrz Kaper (1968)
TIM 6:169-172] wprowadza duże zmiany do tego rozumowania. Nie uważa się,
żeby rolę w nawiązaniu wczesnego kontaktu między EPEC a komórką gospoda-
rza miały BFP (nie wykazano ich wiązania in vitro do tkanki z jelita cienkiego).
(Ciekawe natomiast jest to, że wstępne wiązanie EHEC (tab. 11.2) do komórek
(ssaczych) HeLa wydaje się przebiegać za pośrednictwem bakteryjnych powierz-
chniowych wyrostków, które zawierają EspA [Ebel i wsp. (1998) MM 30:
147-161]. Adhezyna intyminą może posiadać co najmniej dwa receptory. Jednym
z nich jest bakteryjne białko, które zostaje wprowadzone do komórki gospodarza
(za pośrednictwem systemu typu III), w niej ulega fosforylacji, a następnie inte-
gruje z błoną komórkową gospodarza, gdzie pełni rolę receptora; za białko to,
zwane Tir (translokowany receptor intyminy), pierwotnie uważano białko
Hp90 gospodarza. BFP mogą pośredniczyć w wiązaniu EPEC-EPEC (między-
bakteryjnym), prowadząc do tworzenia mikrokolonii na błonie komórkowej
gospodarza.

265
266
 Enteroinwazyjne szczepy Ε. coli. Często występującymi szczepami są O124, O143 i O152.
3

4
Werocytotoksyczne szczepy E. coli (VTEC, ang. verotoxic Ε. coli; EHEC, ang. enterohaemorrhagic E. coli) noszą
swoją nazwę od toksyczności dla komórek Vero {komórki nerkowe z afrykańskiego makaka). Czasem zwane są też
STEC dla określenia szczepów E. coli wytwarzających toksyny Shiga-podobne. Do tych szczepów należą O26
i O157:H7. [Detection and control of E. coli O157:H7 in foods: Meng i wsp. (1994) ΉΕ5 5: 179-185; czas trwania
wydalania O157:H7 z odchodami przez dzieci: Swerdlow i Griffin (1997) Lancet 349: 745-746|. (patrz również sekcja
14.6.1).
5
Enterotoksygenne szczepy E. coli. Należą tu O6, O8, O63, O115 i O148.
6
Enteropatogenne szczepy E. coli. Należą tutaj O55, Olll (lecz patrz EaggEC w tej tabeli), O114 i O128.
7
Enteroagregujące szczepy E. coli.

Po adhezji, niektóre patogeny (w tym EPEC) pozostają na zewnątrz komórki,

to jest są związane z zewnętrzną powierzchnią komórek gospodarza; inne wni-
kają do jednego lub różnych rodzajów jego komórek (sekcja 11.2.2).

11.2.1.1 Adhezja w próchnicy zębów

Do próchnicy zębów przyczyniają się bakterie, które na drodze adhezji przyle-
gają do powierzchni zębów i brzegów dziąseł, tworząc płytkę nazębną. Jest to
błonka składająca się głównie z bakterii, produktów działalności bakteryjnej oraz
substancji zawartych w ślinie. Streptococcus mutans, często występujący w płytce
nazębnej, tworzy zewnątrzkomórkowe, nierozpuszczalne w wodzie glukany,
które pomagają w adhezji bakterii; zbędne produkty bakteryjnego metabolizmu
(np. kwas mlekowy) powodują miejscową demineralizację zębów, co umożliwia
penetrację bakterii.
Adhezja wydaje się również istotna w powstawaniu próchnicy zębów wy-
pełnionych plombami; bakteryjna kolonizacja występuje w małej szczelinie mię-
dzy wypełnieniem a ścianą ubytku [Buchmann i wsp. (1990) MEHD 3: 51-57]
(fot. 2.1, środek); z tego miejsca bakterie mogą penetrować kanaliki zębinowe,
doprowadzając do zniszczenia dentyny.

11.2.2 Bakteryjna inwazja komórek ssaczych

W niektórych chorobach patogen zwykle pozostaje na powierzchni komórek
gospodarza; wówczas patogen ulega adhezji do komórek będących celem jego
działania — na przykład w cholerze (Vibrio cholerne), rzeżączce (Neisseria gonorr-
hoeae) i krztuścu (Bordetella pertussis). W przciwieństwie do tego, niektóre pato-
geny wnikają do komórek gospodarza; „inwazja" jest procesem, w którym
bakterie indukują pobieranie (internalizację) swoich komórek przez gospoda-
rza; do tego typu patogenów należą gatunki Brucella i Chlamydia, enteroinwazy-
jna E. coli (EIEC), Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium
tuberculosis, Salmonella typhi, Shigella flexneri i Yersinia enterocolitica.
Inwazję poprzedza adhezja do komórek gospodarza (sekcja 11.2.1). Sama
inwazja zależy od patogena i rodzaju komórki gospodarza, jednak pobieranie
zwykle wymaga czynnego udziału komórki gospodarza. Zwykle wiąże się to ze
zmianą organizacji mikrofilamentów aktyny w cytoplazmie poniżej miejsca
przyłączenia bakterii; z tego powodu pobieranie bakterii jest zwykle hamowane
in vitro przez takie czynniki, jak cytochalazyny, które hamują reorganizację
cząsteczek aktyny w komórkach ssaczych.

267
Fot. 11.1 Adhezja: dwie elektronogęste komórki EPEC (enteropatogenna Escherichia coli) ulega-
jące adhezji za pośrednictwem piedestału do błony komórkowej komórki gospodarza (sek-
cja 11.2.1)
Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. M. S. Donnenberga, University of Maryland School of Medicine,
Baltimore, USA.

268
 11.2.2.1 Inwazja nabłonka jelitowego
Mechanizmy inwazji
Inwazja salmonelli następuje poprzez apikalne (to jest zwrócone do światła)
powierzchnie komórek nabłonka. Pobieranie komórki bakteryjnej jest poprze-
dzone sfałdowaniem błony komórkowej gospodarza; wypustki błony komórko-
wej, podtrzymywane od środka przez mikrowłókienka aktyny, szybko otaczają
i pochłaniają bakterię, która w ten sposób ulega internalizacji w dużej („obszer-
nej") wakuoli (=fagosom), zamykającej w sobie również płyn zewnątrzkomór-
kowy. Ten mechanizm pochłaniania komórki nosi nazwę makropinocytozy.
Przed pochłonięciem, adhezji bakterii towarzyszy podwyższone stężenie jonów
2+
Ca w komórce gospodarza, ponieważ są one konieczne do mobilizacji i rozmie-
szczenia aktyny w trakcie makropinocytozy. Rolę w regulacji rozmieszczenia
aktyny w komórce gospodarza i pochłanianiu salmonelli ma, jak się wydaje,
GTPaza gospodarza, o nazwie CDC42.
System sekrecji typu III u Salmonella (sekcja 5.4), kodowany przez zespół
genów inv-spa zlokalizowanych w chromosomowej „wyspie patogenności" (sek-
cja 11.5.7), niezbędny jest do inwazji i, jak się wydaje, transportuje bakteryjne
białko(a) efektorowe, które indukują fałdowanie błony komórkowej gospodarza
oraz pochłanianie komórki bakteryjnej; ten system sekrecji być może również
uczestniczy w translokacji białka(ek) efektorowych odpowiedzialnych za stany
zapalne i sekrecję płynów [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912] (patrz również
sekcja 11.3.3.1).
Wewnątrz wakuoli Salmonella może się namnażać.
Shigella, podobnie jak Salmonella (p. wyżej), wnika na zasadzie mechanizmu
„spustowego" (ang. trigger), lecz proces ten odbywa się przez bazolateralne
powierzchnie komórek nabłonkowych. Adhezyny są nieznane; w skład recep-
tora prawdopodobnie wchodzą integryny. Inwazja wymaga uczestnictwa sys-
temu sekrecji typu III (sekcja 5.4), kodowanego przez geny mxi-spa zloka-
lizowane na plazmidzie, oraz GTPazy Rho gospodarza (dla Salmonella —
GTPaza CDC42). Shigella ucieka z fagosomu (do cytoplazmy gospodarza) po
dokonaniu lizy błony; w lizie bierze udział białko bakteryjne IpaB (patrz też
sekcja 11.5.2).
Badania na zwierzętach wykazały, że Shigella jest pochłaniana przez fagocy-
tarne komórki „M" w kępkach Peyera [komórki Μ w infekcji (artykuł prze-
glądowy): Jepson i Clark (1998) TIM 6: 359-365]. Wewnątrz komórek Μ bakterie
mogą mieć dostęp do bazolateralnych powierzchni sąsiednich komórek
nabłonka, rozprzestrzeniać się wewnątrz warstwy nabłonka (istotna cecha czer-
wonki = dyzenterii). Rozprzestrzenianie się między komórkami zależy od obecno-
ści bakteryjnego białka błony zewnętrznej — IcsA (=VirG) kodowanego przez
gen plazmidowy. IcsA indukuje polimeryzację włókien aktyny na jednym z bie-
gunów bakterii; pchają one bakterię przez cytoplazmę w kierunku odwrotnym do
rosnącego „ogona" z aktyny. („Ogon" pozostaje w cytoplazmie gospodarza,
a ciągłe odkładanie aktyny powoduje ruch bakterii.) Poruszająca się bakteria
wpycha się do sąsiedniej komórki tworząc kieszeń, albo otaczając się wakuolą
(z podwójną błoną). Następnie Shigella powoduje lizę błon i wnika do sąsiedniej

269
komórki. (Mutanty pozbawione aktywnego białka IcsA nie rozprzestrzeniają się
i nie powodują dyzenterii). (Patrz również sekcja 11.3.3.2).
Alternatywnie, po pobraniu przez komórki M, Shigella może zostać
pochłonięta przez makrofagi (występujące pod komórkami M). Shigella może
zabić makrofagi (sekcja 11.5.2), wywołując reakcję zapalną, w której leukocyty
polimorfonuklearne (PMN, ang. polymorphonuclear leucocytes) migrują pomię-
dzy komórkami nabłonka i dostają się do światła jelita. Ta migracja PMN naj-
prawdopodobniej odsłania bazolateralne powierzchnie komórek nabłonka, nara-
żając je na dalszą inwazję przez Shigella, co jest istotnym czynnikiem w pato-
genezie dyzenterii (sekcja 11.3.3.2).
Listeria monocytogenes. W inwazji uczestniczy adhezyna występująca na
powierzchni komórki, zwana intemaliną A (produkt genu inlA). Receptorem jest
E-kadheryna, należąca do rodziny glikoprotein (kadheryn) biorących udział
w adhezji między komórkami; wewnątrzcytoplazmatyczna część cząsteczki
E-kadheryny za pośrednictwem białek zwanych kateninami oddziałuje wzajem-
nie z aktynowym cytoszkieletem komórki. Cząsteczki E-kadheryny występują na
bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonka.
Interakcja pomiędzy E-kadheryną i intemaliną A sama w sobie wydaje się ini-
cjować pobieranie bakterii. (Ciekawe jest to, że nawet kuleczki z lateksu opłasz-
czone intemaliną A ulegają internalizacji przez niektóre typy komórek ssaczych
[Lecuit i wsp. (1997) INFIM 54: 5309-5319].)
Inwazja po interakcji między E-kadheryną i intemaliną A przypomina
mechanizm „zamka błyskawicznego" w przypadku Yersinia enterocolitica (patrz
niżej) (fot. 11.2). Listeria monocytogenes ucieka z fagosomu (fot. 11.2) w wyniku
sekrecji kilku białek, w tym toksyny tworzącej pory, zwanej listeriolizyną O.
Toksyna ta należy do rodziny cytolizyn aktywowanych tiolem [Morgan, Andrew
i Mitchell (1996) RMM 7: 221-229], które mogą powodować lizę błon komórek
eukariotycznych zawierających cholesterol. Wewnątrz cytoplazmy gospodarza
L. monocytogenes rośnie i rozprzestrzenia się do sąsiednich komórek wykorzy-
stując napędzany aktyną ruch opisany dla Shigella — białko ActA odgrywa tę
samą rolę co białko IcsA Shigella. Bakteria po wepchnięciu do sąsiedniej komórki
znajduje się w przedziale otoczonym podwójną błoną (po jednej błonie z każdej
komórki). Ucieczka z tego przedziału wiąże się z sekrecją enzymu lecytynazy
(produkt genu plcB), który hydrolizuje lecytynę (fosfatydylocholinę) zawartą
w błonie.
[Listeria monocytogenes (patogenność): McLaughlin (1997) RMM 8:1-14; inwa-
zja i ruch oparty na aktynie: Cossart i Lecuit (1998) EMBO Journal 17:
3797-3806.].
Yersinia enterocolitica. U myszy (będących dobrym modelem do badania
schorzeń człowieka) bakteria ta początkowo zostaje pochłonięta przez fagocytar-
ne komórki Μ kępek Peyera. Badania w hodowlach tkankowych sugerują, że
patogen może z kolei dokonać inwazji sąsiadujących komórek nabłonka poprzez
ich powierzchnie bazolateralne. In vitro, niektóre adhezyny patogena (inwazyna
i białko YadA) wiążą się do integryn komórki gospodarza (sekcja 11.2.1); powo-
duje to napływ kolejnych integryn do tego miejsca, co prowadzi do wielu
połączeń między patogenem a gospodarzem (na zasadzie zamka błyskawicz-

270
nego) oraz powoduje pochłonięcie bakterii do wakuoli niewiele większej od niej
samej. In vivo, tego typu inwazja przez komórki Y. enterocolitica może zachodzić
jedynie na bazolateralnych powierzchniach komórek nabłonkowych, ponieważ
tylko na tych powierzchniach występują integryny.
Yersinia enterocolitica przeżywa wewnątrz wakuoli.
Patogen ten unika fagocytozy wykorzystując mechanizm krótko opisany
w sekcji 11.5.1.

11.2.2.2 Inwazja makrofagów

Niektóre bakterie mogą dokonać inwazji makrofagów, a po namnożeniu się,

opuścić je (fot. 11.2). W porównaniu z fagocytozą (sekcja 11.4.1) w procesie tym
mogą uczestniczyć np. inne adhezyny i receptory. Pierwszy kontakt między
patogenem i makrofagiem może decydować o przetrwaniu patogena. Czasem
przetrwaniu bakterii sprzyja brak inicjacji tzw. wybuchu tlenowego (ang. oxida-
tive burst) w makrofagu.
Po pobraniu:
• u np. Chlamydia spp., Legionella pneumophila i Mycobacterium tuberculosis fago-
som nie ulega zakwaszeniu i fuzji z lizosomem.
• nieliczne gatunki, np. Coxiella burneti, potrafią przetrwać wewnątrz fagoli-
zosomu.
Legionella pneumophila. W fagosomie wartość pH utrzymuje się blisko war-
tości obojętnej i patogen namnaża się, zabijając makrofagi. Geny icm (wewnątrz-
komórkowego namnażania, ang. intracellular multiplication) patogena, zwane
również genami dot (ang. defect in organelle trafficking), prawdopodobnie
kodują system sekrecji i cząsteczki efektorowe uczestniczące w blokowaniu fuzji
fagosomu z lizosomem. Mutacje w tych genach wpływają na zdolność patogena
do namnażania się i zabijania makrofagów [patrz np. Segal i Shuman (1998)
TIM 6: 253-255].
Mycobacterium tuberculosis. Na inwazję/przeżycie mogą mieć wpływ: che-
mia powierzchni konkretnego szczepu M. tuberculosis; miejsce infekcji (np.
płuca); czas kontaktu między patogenem a makrofagiem (np. w pierwotnej infe-
kcji lub w trakcie rozprzestrzeniania się w organizmie).
Opsonizacja (sekcja 11.4.2.1) z udziałem układu dopełniacza (sekcja 11.4.1.1)
może przebiegać jedną z czterech dróg aktywacji dopełniacza, w tym drodze
lektynowej i C2a (unikania zabijania, ang. salvage) (sekcja 11.4.1.1; rys. 11.1)
[Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Brown i Schorey (1998) TIM 6: 49-50].
Z kilku powodów, w tym małego stężenia dopełniacza w płynie pęcherzyko-
wo-oskrzelowym, w początkowych stadiach infekcji płuca istotną rolę może
odgrywać wiązanie bez udziału opsonin (to jest wiązanie niezależne od
dopełniacza i przeciwciał). Niektóre bakterie patogenne ulegają internalizacji po
związaniu wielocukrów na ich powierzchni z lektynami w receptorze CR3
makrofaga. Mycobacterium tuberculosis może się wiązać z receptorem za pośredni-
ctwem β-glukanów, co pozwala na pochłonięcie komórek przed wystąpieniem,
wywołanego stanem zapalnym, wzrostu poziomu dopełniacza [M. tuberculosis-
phagocyte interactions: Ehlers i Daffe (1998) TIM 6: 328-335].

271
272
(a) Dwie elektronowogęste komórki Listeria monocytogenes pobierane na zasadzie mechanizmu
„zamka błyskawicznego" (sekcja 11.2.2.1). (b) L. monocytogenes wewnątrz fagosomu w mysim makro-
fagu (strzałki wskazują na błonę fagosomu). Skala: 68 mm = Ιμm. (c) L. monocytogenes wewnątrz
mysiego makrofaga, uciekająca z fagosomu i dzieląca się wewnątrz cytoplazmy, otoczona siecią
włókien aktynowych (gwiazdki). Skala: 50 mm = 1 μm. (d) Mycobacterium avium dzieląca się
wewnątrz mysiego makrofaga — strzałki wskazują na błonę fagosomu. Skala: 60 mm = 1 μm.
Zdjęcie (a) z EMBO Journal (1998) 17: 3797-3806 za zgodą Oxford University Press i dzięki uprzejmo-
ści autorów (dr Pascale Cossart i Marca Lecuit), Unite des Interactions Bacteries-Cellules, Institut
Pasteur, Paris, France.
Zdjęcia (b)-(d) dzięki uprzejmości dr Chantal de Chastellier, Faculte de Medecine Necker-Enfants
Malades, INSERM U 411, Paris, France.

11.2.2.3 Paracytoza

Paracytoza jest formą inwazji, w której patogen przechodzi przez warstwę komó-
rek przenikając pomiędzy nimi W ten sposób Haemophilus influenzae przechodzi
między komórkami nabłonkowymi w płucach. Paracytozę w przypadku tego
patogena badano w hodowlach tkankowych z komórek nabłonka płucnego
[van Schilgaarde i wsp. (1995) INFIM 63: 4729-4737].

273
 11.2.2.4 Transcytoza
+
Transcytoza jest procesem, w którym pewne szczepy Opa Neisseria przechodzą
przez warstwę komórek nabłonkowych bez naruszenia połączeń pomiędzy
komórkami ssaczymi; proces ten jest zapoczątkowany pochłonięciem komórek
bakteryjnych po ich uprzednim związaniu ze swoistymi receptorami na komórce
gospodarza [Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.2.3 Stan utajenia

Patogen zazwyczaj albo powoduje chorobę, albo zostaje zabity przez układ
obronny gospodarza. W infekcji utajonej, powodowanej np. przez Mycobacterium
tuberculosis, patogen pozostaje żywy, lecz wyciszony w wyniku aktywności
układu immunologicznego gospodarza (sekcja 11.4); reakcja pacjenta na obec-
ność patogena może być seropozytywna, lecz nie stanowi on powodu choroby.
Stan utajenia występuje u około 60% osób zakażonych Mycobacterium tubercu-
losis, z czego u około 40% rozwija się czynna gruźlica; gruźlica utajona przez całe
życie niesie ryzyko rozwinięcia się choroby (ryzyko to zwiększa się np. w przy-
padku infekcji wirusem HIV lub stosowania leków immunosupresyjnych). Przy-
puszcza się, że u co trzeciej osoby występuje infekcja utajona spowodowana
przez M. tuberculosis.
Mechanizm stanu utajenia w gruźlicy jest nieznany. Po pochłonięciu komórek
przez makrofagi patogen przeżywa (sekcja W.222) i rozprzestrzenia się w orga-
nizmie. Miejsca przebywania utajonych komórek M. tuberculosis nie są znane; nie
zawsze można wykryć w tkankach bakterie kwasooporne stosując metodę Ziehl-
-Nielsena (sekcja 14.9.2). Nie jest więc jasne, czy patogen istnieje tam w formie
niekwasoopornej lub w postaci przypominającej spory, czy też po prostu wystę-
puje w małej ilości, trudno wykrywalnej. Możliwość istnienia formy sporo-
podobnej została zasugerowana w wyniku wykrycia genu sigF, kodującego czyn-
nik sigma (sekcja 7.5) podobny do białka specyficznego dla sporulacji oraz białek
reagujących na stres, występujące u innych bakterii.
[Stan utajenia w gruźlicy: Parrish, Dick i Bishai (1998) TIM 6: 107-112.]

11.3 Patogeneza — mechanizm rozwoju choroby

Jak patogen wywołuje chorobę? Różne patogeny czynią to rozmaitymi sposo-
bami. Niektóre wytwarzają toksyny (lub inne substancje), które naruszają swoi-
ste procesy fizjologiczne, podczas gdy inne wnikają do pewnych komórek lub
tkanek (gdzie również mogą wytwarzać toksyny). W pewnych przypadkach
(np. sekcja 11.3.5) mechanizm jest nieznany.
Molekularne badania chorób zakaźnych wskazują na to, że patogeneza wiąże
się ze złożonymi interakcjami między bakterią patogenną a gospodarzem (sek-
cja 11.6).
W przypadku pewnych chorób do rozwoju objawów chorobowych mogą się
przyczyniać mechanizmy obronne (np. układ immunologiczny) gospodarza
(sekcja 11.4.2.2).

274
 Niektórym chorobom zakaźnym towarzyszy uogólniona reakcja zwana poso-
cznicą lub sepsą. Podjęto próbę nadania terminowi „posocznica" (ang. sepsis)
ścisłego znaczenia, by można go jednoznacznie stosować do opisu prób klinicz-
nych wykonywanych dla różnych terapii przeciw temu stanowi. Ostatecznie
posocznicę zdefiniowano jako zespół uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, ang.
systemie inflammatory response Syndrome;). SIRS występuje, gdy pojawiają się
co najmniej dwa z następujących objawów:
Temperatura >38°C lub <36°C
Tętno > 90 uderzeń na minutę
Oddychanie > 20 oddechów na minutę, lub PaCO2 < 4,3 kPa
Leukocyty > 12000/mm3, <4000/mm3 lub > 10% form niedojrzałych
Przyczyny występowania SIRS mogą być różne, w tym niedokrwienie, martwica
tkanek lub urazy, jak również infekcja. Kiedy SIRS powstaje w wyniku infekcji,
wskazuje na obecność posocznicy. Sepsis/SIRS: JASC (1998) 41 (suplement A):
1-112].
[Treatment of sepsis: Baumgartner i Calandra (1999) Drugs 57: 127-132.]
Przykłady patogenezy podano niżej oraz w tabeli 11.2.

11.3.1 Patogeneza z udziałem toksyn

W niektórych chorobach większość lub nawet wszystkie objawy choroby można
przypisać skutkom danej egzotoksyny, tj. specyficznego białka o właściwościach
toksycznych, uwalnianego przez bakterię patogenną, które oddziałuje na kon-
kretne miejsca w organizmie. Do tego rodzaju chorób należy cholera, botulizm,
tężec i błonica.
W niektórych schorzeniach toksyna może być tylko jednym z czynników
patogenezy. Na przykład, toksyna może być potrzebna do modyfikacji syntezy
(lub uwalniania) cytokin (tab. 11.4), co jest warunkiem procesu chorobowego.
Jest też prawdopodobne, że w tego typu chorobach cytokiny odgrywają istotną
rolę jako główne cząsteczki efektorowe lub czynniki niezbędne do aktywności
toksyny [Henderson i wsp. (1997) TIM 5: 454-458](patrz np. sekcja 11.3.1.6).

11.3.1.1. Cholera
Przebiegowi cholery towarzyszą wymioty i obfita biegunka, stolce praktycznie
stają się wodniste. Patogen (pewne szczepy Vibrio cholerne) namnaża się w jelicie
i wytwarza rodzaj egzotoksyny — enterotoksynę (toksynę cholery, TC). TC
działa na komórki śluzówki w jelicie cienkim, gdzie stymuluje aktywność
cyklazy adenylanowej. Powstający wysoki poziom cAMP (rys. 7.12) prawdopo-
dobnie stymuluje sekrecję jonów chloru do światła jelita. Jako efekt towarzyszący
występuje również utrata HCO3~ .Wypływ wody do jelita powoduje charaktery-
styczne dla cholery wodniste stolce o wyglądzie odwaru ryżowego.
Infekcje wywołane szczepami V. cholerne, które nie wytwarzają TC, mogą
powodować mniej groźne objawy będące wynikiem aktywności innych toksyn
(Zot i Ace) kodowanych przez geny bakteryjne.
[Mechanisms of action of enterotoxins: Sears i Kaper (1996) MR 60:167-215.]

275
 Po dostaniu się V. cholerne z pokarmem, kolonizacja jelita cienkiego oraz roz-
wój choroby zależą od dwóch głównych czynników wirulencji (sekcja 11.5):
wyrostków uczestniczących w adhezji do powierzchni błony śluzowej, tak zwa-
nych „pilusów koregulowanych z toksyną" (TCP, ang. toxin co-regulated pili),
oraz TC. Geny kodujące TC i TCP podlegają wspólnej regulacji przez transkry-
pcyjne białka regulatorowe (ToxR, ToxS i ToxT), które pobudzają ekspresję TC
i TCP po odebraniu sygnałów środowiskowych w przewodzie pokarmowym.
Geny kodujące TC (jak również toksyny Zot i Ace) występują w genomie nit-
kowatego faga, [Waldor i Mekelanos (19967) Science 272:1910-1914; Wal-
dor i wsp. (1997) MM 24: 917-926]. Geny dla TCP występują w „wyspach pato-
genności" (sekcja 11.5.7). Stwierdzenie, że sygnały w środowisku jelita gospoda-
rza mają zdolność indukowania syntezy TCP, doprowadziło do poznania trans-
misji czynników wirulencji w warunkach in vivo (sekcja 11.5.8).
Patrz również „cholera" — w sekcji 11.11.

11.3.1.2 Botulizm
Botulizm jest związany z paraliżem mięśni, a wynikiem np. niedowładu (mięś-
niowego) układu oddechowego może być śmierć. Patogen (szczepy Clostridium
botulinum) wytwarza rodzaj egzotoksyny — neurotoksynę, która działa w miej-
scu połączeń między nerwami i mięśniami, hamując uwalnianie acetylocholiny i
— co zatem idzie — stymulację mięśni przez nerwy. Choroba może powstać
w wyniku dostania się wytworzonej toksyny do organizmu — zwykle ze ska-
żoną żywnością, jak: gotowane mięso, kiełbasy i niewłaściwie konserwowane
jarzyny. Nie jest więc konieczne spożycie z pokarmem samego patogena. [Wystę-
powanie i leczenia botulizmu (artykuł przeglądowy): Roblot i wsp. (1995) RMM
6: 58-62.]

11.3.1.3 Tężec
W przebiegu tężca występują niekontrolowane skurcze mięśni szkieletowych,
które często prowadzą do śmierci na skutek uduszenia lub wyczerpania. Choroba
rozwija się po zakażeniu głębokich ran, w których są warunki beztlenowe, przez
patogenną bakterię Clostridium tetani. Bakteria ta wytwarza neurotoksynę (tetano-
spazminę), która działa na pewne komórki (neurony wstawkowe) w ośrodko-
wym układzie nerwowym. Hamując uwalnianie neuroprzekaźnika (glicyny)
przez te komórki, tetanospazmina pozwala na równoczesne kurcze w parze mię-
śni antagonista-protagonista, co prowadzi do spastycznego paraliżu.

11.3.1.4 Toksyna botulinowa i tetanospazmina: podobieństwa

Chociaż tetanospazmina i toksyna botulinowa (jad kiełbasiany) wywołują bar-
dzo odmienne objawy kliniczne, obydwie te toksyny wykazują istotne podobień-
stwa. Wiążą się do komórek nerwowych, przez które są następnie pobierane
(internalizowane) i wywołują objawy w wyniku aktywności enzymatycznej (są
endopeptydazami cynkowymi), degradując specyficzne białka w komórkach
nerwowych, co powoduje zahamowanie uwalniania neuroprzekaźników [Me-

276
chanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins: Montecucco i Schiavo
(1994) MM 13: 1-8]. Wyjaśnienie enzymatycznego działania obydwu toksyn
może się przyczynić do znalezienia specyficznych inhibitorów o możliwym
zastosowaniu w chemioterapii botulizmu i tężca. Podobnie, aktywność ssaczego
enzymu endopeptydazy cynkowej, konwertującego angiotensynę, hamowana
jest przez kaptopryl, lek czasem stosowany w terapii nadciśnienia.

11.3.1.5 Zatrucia pokarmowe wywołane przez gronkowce

Gronkowcowe zatrucia pokarmowe (tab. 12.2) są spowodowane enterotoksy-
nami wytworzonymi przez pewne gatunki gronkowców (głównie Staphylococcus
aureus). Enterotoksyny te (typy od A do H) wkrótce po spożyciu skażonej żyw-
ności zwykle powodują wymioty i często biegunki. Mechanizm działania tych
toksyn jest nieznany, choć sądzi się, że odruchy wymiotne mogą być wywołane
przez stymulację jelitowych komórek zwojowych, powodując uwolnienie neuro-
peptydów, co z kolei indukuje uwolnienie m. in. histamin i leukotrienów
z komórek tucznych. Ponieważ enterotoksyny są superantygenami (sekcja
11.5.4.1), patogeneza może się wiązać z działaniem cytokin.

11.3.1.6 Toksyna Shiga i podobne toksyny (werotoksyny)

Enterotoksyny te, wytwarzane przez niektóre szczepy Shigella i EHEC (tab. 11.2)
mają podobny mechanizm działania. Wiążą się one do określonych miejsc w jeli-
cie i są pobierane na drodze endocytozy przy współudziale receptorów. Toksyny
te oddziałują na syntezę białka i hamują absorpcję NaCl. Jednakże, ich rola
w czerwonce (dyzenterii) (sekcja 11.3.3.2), krwotocznym zapaleniu okrężnicy
oraz w zespole hemolityczno-mocznicowym nie jest w pełni zrozumiała, lecz
wydaje się, że powodują one uszkodzenia naczyń krwionośnych.
Toksyna typu 1 Shigella dysenteriae, jak również podobne toksyny E. coli
O157:H7 i innych EHEC, są rozpoznawane przez receptory glikoproteinowe
(oznaczone Gb3) na komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwio-
nośne. Badania in vitro wykazały, że miejsca Gb 3 , które są bardziej liczne
w małych naczyniach krwionośnych, występują w jeszcze większej ilości w wy-
niku aktywności cytokin TNF-α i IL-1. W jednym z modeli uszkodzeń naczynio-
wych indukowanych przez EHEC, zmiany w ścianie następują w wyniku
związania toksyny z Gb3; aktywowane makrofagi ulegają adhezji do zmienio-
nych miejsc i są stymulowane (np. przez toksynę) do sekrecji IL-1 i TNF-α, powo-
dując miejscową proliferację miejsc Gb 3 i dalsze (w wyniku udziału toksyny) usz-
kodzenia [Tesh (1998) TIM 6: 228-232].
Toksyny E. coli O157:H7, podobne do toksyn typu 1 S. dysenteriae, można zne-
utralizować przez ich związanie z rozpuszczalnym w wodzie, węglowodano-
wym ligandem, zwanym STARFISH, ponieważ jego cząsteczka ma kształt roz-
gwiazdy (ang. starfish), pod względem struktury przypominając Gb 3 . Możliwość
neutralizacji toksyny stworzyła podstawy potencjalnego czynnika terapeutycz-
nego skierowanego przeciw EHEC. Synsorb Pk to preparat złożony z syntetycz-
nych analogów Gb3 — związanych z nierozpuszczalnymi cząsteczkami krze-
mionki. Czynnik ten jest badany pod kątem możliwości jego wykorzystania do

277
wiązania (sekwestracji) toksyny w przewodzie pokarmowym, co zapobiega jej
pobraniu, a zatem dotarciu do miejsc wiązania na nabłonku wyściełającym
naczynia [STARFISH: Nature (2000) 403: 669-672].

11.3.2 Patogeneza z udziałem innych produktów bakteryjnych

Agresyny to produkty, które pomagają patogenowi w procesach inwazji. Nie-
które bakterie, w tym Streptococcus pyogenes i większość koagulazododatnich
gronkowców, wytwarzają liazę hialuronianową, enzym, który hydrolizuje kwas
hialuronowy będący składnikiem tkanki łącznej u zwierząt. W przynajmniej nie-
których przypadkach enzym ten może ułatwiać penetrację bakterii w miejscu
zakażenia.
Inny przykład to streptokinaza produkowana przez paciorkowce. Jest to
białko wydzielane zewnątrzkomórkowo, które aktywuje składnik osocza —
plazminogen, tworząc plazminę (syn. fibrolizyna), która niszczy fibrynę. Ta zdol-
ność przeprowadzania lizy fibryny może ułatwiać patogenowi pokonanie
bariery fibrynowej w ranach lub zmienionych chorobowo miejscach. Produkcja
aktywatorów plazminogenu przez paciorkowce (i niektóre inne bakterie)
wiązana jest z inwazyjnością tych bakterii [patrz np. Lottenberg (1997) TIM 5:
466-467]. (Patrz również sekcja 8.5.10).
Produkty bakteryjne mogą się również przyczyniać do patogenezy w sposób
bardziej mechaniczny — np. w mukowiscydozie (patrz niżej).

11.3.2.1 Mukowiscydoza

Mukowiscydoza [artykuł przeglądowy: Rosenstein i Zeitlin (1998) Lancet 351:

277-282] jest chorobą dziedziczną, w której wadliwy transporter ABC powoduje
zaburzenia transportu chloru przez błonę komórkową. W typowych przypad-
kach w płucach zalega gęsty śluz i mogą występować takie mikroorganizmy, jak
prątki gruźlicy, Burkholderia cepacia i Pseudomonas aeruginosa. Ta ostatnia bakteria
może tworzyć gęsty alginianowy śluz, który hamuje fagocytozę i sprzyja zasto-
jowi, co jest złym rokowaniem. W chorobie tej prawdopodobnie znaczenie ma
długotrwała, intensywna kolonizacja Stenotrophomonas maltophila (uprzednio
Xanthomonas maltophila) [Denton (1997) RMM 8: 15-19].
Duże stężenie soli (NaCl) na nabłonkach dróg oddechowych u pacjentów
cierpiących na mukowiscydozę może sprzyjać bakteryjnej kolonizacji, przez
hamowanie prawidłowej aktywności przeciwbakteryjnej [Smith i wsp. (1996)
Cell 85: 229-236].
Większość szczepów P. aeruginosa niesie geny kodujące syntezę alginianu,
lecz u szczepów wyosobnionych ze środowiska geny te zwykle nie ulegają eks-
presji. U pacjentów z mukowiscydoza warunki w płucach wydają się sprzyjać
selekcji szczepów wytwarzających śluz (alginian) (mukoidalnych). W przypadku
P. aeruginosa przeobrażenie szczepów niemukoidalnych w mukoidalne zachodzi
po pojawieniu się swoistego czynnika sigma (sekcja 7.5) zwanego AlgU, który
uczestniczy w trankskrypcji genów alginianowych. AlgU może się stać konstytu-
278
tywnie (trwale) aktywny w wyniku mutacji w genie mucA (aktywność AlgU jest
hamowana przez związanie MucA). [Mucoidy of Pseudomonas aeruginosa in CF:
Schurr i wsp. (1996) JB 178: 4997-5004].

11.3.3 Patogeneza przebiegająca ze zniszczeniem komórek lub

tkanek gospodarza
11.3.3.1 Salmonelloza

W pierwszych etapach zakażenia salmonellą następuje inwazja nabłonka jelito-

wego (sekcja 11.2.2.1). W durze brzusznym S. typhi przenika do krwiobiegu (za
pośrednictwem układu limfatycznego) i namnaża się w wątrobie, pęcherzyku
żółciowym i trzustce. Wtórne zakażenie następuje z pęcherzyka żółciowego. Do
objawów należą bóle jelitowe i posocznica (sekcja 11.3). Stan zapalny jelita może
być tak intensywny (np. w kępkach Peyera), że prowadzi do miejscowej mart-
wicy tkanki, z wytworzeniem wrzodów, perforacji i wystąpienia krwotoków.
W przeciwieństwie do S. typhi wiele gatunków salmonelli (np. S. typhimurium
u ludzi, S. dublin u cieląt) zwykle powoduje stany chorobowe ograniczone do jelit
(stany zapalne, wydzielanie płynów), z migracją np. leukocytów polimorfo-
nuklearnych (z segmentowanym jądrem, PMN, ang. polimorphonuclear) do
zainfekowanych tkanek. Tego typu migracja wywoływana jest przez trans-
nabłonkową sygnalizację przez patogena, a mechanizm tego procesu z udziałem
osobliwego białka efektorowego SopB został opisany dla S. dublin — patogena
bydła [Galyov i wsp. (1997) MM 25: 903-912]. Geny enteropatogenności (w prze-
ciwieństwie do salmonelloz układowych) znajdują się w wyraźnie wyodrębnio-
nych wyspach patogenności (sekcja 11.5.7).

11.3.3.2 Czerwonka (dyzenteria)

Dyzenteria wywołana przez Shigella spp. (oraz np. EIEC: tabela 11.2) przebiega
ze zniszczeniem nabłonka jelita cienkiego/grubego, z bólem, gorączką, wodnistą
oraz (często) krwawą biegunką. Inwazja przez Shigella opisana jest w sekcji
11.2.2.1, a zabicie makrofagów — w sekcji 11.5.2. Rolę toksyny shiga omówiono
w sekcji 11.3.1.6.
Białko bakterii Shigella — IcsA kodowane przez gen niesiony na plazmidzie
(funkcja: sekcja 11.2.2.1) (jak również podobnego typu białko u EIEC) jest nie-
zbędne dla patogenności. W przypadku niektórych bakterii w błonie zewnętrz-
nej występuje proteaza (SopA u Shigella, OmpT u E. coli), która tnie/inaktywuje
białko IcsA (VirG). Jednakże proteazy tej nie ma ani u Shigella, ani u EIEC i to
wydaje się warunkiem ich patogenności [Nakata i wsp. (1993) MM 9: 459-468].
(IcsA jest domeną a autotransportera —: sekcja 5.4.5).
Jeden z modeli przebiegu dyzenterii zakłada, że śmierć makrofagów (sekcja
11.5.2) sprzyja odpowiedzi zapalnej (tworzeniu TNF-a, IL-1, IL-65 i IL-8), co
przyciąga PMN, zwiększając zakres inwazji oraz uszkodzenia tkanek (sekcja
11.2.2.1), lecz ostatecznie prowadząc do zatrzymania infekcji [Zychlinsky
i Sansonetti (1997) TIM 5: 201-204].

279
 11.3.3.3 Gorączka Oroya
Gorączka Oroya, choroba występująca w niektórych rejonach Ameryki
Południowej, charakteryzuje się wysoką gorączką i postępującą anemią. Przebieg
choroby często kończy się zgonem. Bakteria wywołująca tą chorobę, Bartonella
bacilliformis, jest przenoszona przez muchy i rozwija się w erytrocytach oraz
komórkach nabłonkowych wyściełających naczynia krwionośne. Wzrost bakterii
prowadzi do zniszczenia krwinek czerwonych oraz wywołuje towarzyszące
temu objawy.

11.3.4 Szok endotoksyczny (septyczny)

Endotoksyny bakterii gramujemnych to wielkocząsteczkowe kompleksy zawie-
rające pewne składniki błony zewnętrznej: lipopolisacharyd (LPS — sekcja
2.2.9.2), białka i fosfolipidy. Toksycznym składnikiem LPS jest lipid A.
Kończący się często zejściem śmiertelnym szok septyczny jest związany
z aktywnością endotoksyn przenoszonych przez krew (np. po udanej chemiote-
rapii skierowanej przeciw gramujemnemu patogenowi). Endotoksyny działają
na makrofagi i inne komórki układu immunologicznego, stymulując wydzielanie
pewnych silnie działających czynników fizjologicznych (cytokiny: tab. 11.4),
takich jak IL-1β i TNF-α. Cytokiny te mogą „zwerbować" kolejne, co prowadzi do
objawów szoku (np. znaczny spadek ciśnienia krwi) oraz blokowania naczyń
krwionośnych przez leukocyty. Śmierć może być następstwem narastającego
zaburzenia funkcjonowania narządów wewnętrznych. W związku z tym endoto-
ksyny zaklasyfikowano do grupy modulin (sekcja 11.5.4).
Próby zastosowania szczepionki zawierającej monoklonalne przeciwciała
skierowane przeciw endotoksynie były nieudane [Baumgartner (1994) RMM 5:
183-190]. Nadzieje są wiązane z niektórymi antybiotykami, które mogą zmniej-
szać ryzyko wystąpienia szoku septycznego, gdyż hamują szlak biosyntezy
lipidu A (sekcja 15.4.11).

11.3.5 Choroby układu pokarmowego przypisywane Helicobacter pylori

Helicobacter pylori (patrz Aneks) wiązany jest przyczynowo z występowaniem
zapalenia żołądka i z chorobą wrzodową, chociaż szczegóły przebiegu patoge-
nezy nie są do końca wyjaśnione. Stwierdzono jednak, że lipopolisacharyd (sek-
cja 2.2.9.2) H. pylori zawiera antygeny identyczne z antygenami Lewisa χ i y
występujących w błonie śluzowej żołądka u ludzi. Sugeruje to możliwość
powstania reakcji autoimmunologicznej i stanu zapalnego w wyniku wiązania
się przeciwciał skierowanych przeciw lipopolisacharydowi do antygenów
Lewisa w śluzówce [Molecular mimicry of H. pylori LPS: Appelmelk i wsp. (1997)
TIM 5: 70-73]. Hipoteza ta jest jednak kwestionowana, ponieważ dominujący
rodzaj przeciwciał skierowanych przeciw LPS, stwierdzany u wielu pacjentów
zakażonych H. pylori, odpowiada antygenowi, który nie jest podobny do tych
struktur w LPS H. pylori, przypominających antygeny Lewisa [Yokota i wsp.
(1998) INFIM 66: 3006-3011].

280
 Adhezja H. pylori do ścian żołądka (w przeciwieństwie do przebywania
bakterii wewnątrz warstwy śluzu w żołądku) prawdopodobnie sprzyja powsta-
waniu autoprzeciwciał, prowadząc do np. chronicznego zapalenia żołądka. To,
czy tego typu adhezja nastąpi w danym gospodarzu, może zależeć od szczegól-
nej kombinacji czynników w (genetycznie zróżnicowanych) populacjach pato-
gena i gospodarza [Dorell, Crabtree i Wren (1998) TIM 6: 379-380].
Patogeneza wydaje się związana z „wyspą patogenności" cag (sekcja 11.5.7)
oraz niezwiązanym z nią (lecz często wspólnie wyrażanym) genem vacA. Eks-
presja zarówno cagA, jak i vacA (w szczepach typu I izolowanych w środowisku
szpitalnym) wydaje się skorelowana z ciężkim schorzeniem układu pokarmo-
wego, podczas gdy szczepy typu II, które nie mają cagA i nie wyrażają aktywno-
ści VacA, zwykle nie są kojarzone z ciężkim przebiegiem choroby. Znane są
również szczepy powodujące schorzenia o pośrednim przebiegu. Białko VacA
jest toksyną o nieznanym mechanizmie wnikania do komórek gospodarza. Jej
wewnątrzkomórkowym celem działania może być czynnik uczestniczący
w regulacji rozwoju/dojrzewania wakuoli w komórce gospodarza [patrz np.
Cover (1998) TIM 6: 127-128; de Bernard i Arico (1998) TIM 6: 128-129].

11.3.6 Reakcja Jarischa-Herxheimera

Reakcja ta, mogąca mieć przebieg śmiertelny, czasami występuje po pierwszej
skutecznej dawce leku podanego do zwalczenia chorób powodowanych przez
pewne bakterie (szczególnie krętki) lub pierwotniaki [artykuł przeglądowy: Grif-
fin i wsp. (1994) BCID 1: 65-74]. Objawy, do których należy początkowy wzrost
temperatury, są związane z kaskadą cytokin (np. TNF, IL-6, IL-8), przypuszczal-
nie odpowiedzialnych za przynajmniej niektóre z objawów patofizjologicznych.
Mechanizm nagłego uwolnienia cytokin nie jest znany. Reakcji Jarischa-Herxhei-
mera można zapobiec podając przeciwciała przeciw TNF [Fekade i wsp. (1996)
NEJM 335: 311-315].

11.4 Mechanizmy obronne gospodarza

11.4.1 Mechanizmy konstytutywne
Mechanizmy konstytutywne (wrodzone) to nieswoiste mechanizmy obronne,
które działają przez cały czas.
Dla każdego potencjalnego patogena zdrowy organizm gospodarza zawiera
wiele przeszkód i barier. Skóra, na przykład, jest czymś więcej niż prostą
fizyczną barierą na drodze do infekcji. Dla większości bakterii stanowi ona śro-
dowisko nieprzyjazne: brakuje w niej wody, a miejsca sprzyjające infekcji są
zajmowane przez dobrze zaadaptowaną mikroflorę skóry. Niektóre gatunki tych
rezydentów wykorzystują lipidy wydzielane przez gruczoły łojowe, by wytwo-
rzyć z nich kwasy tłuszczowe o działaniu przeciwbakteryjnym.
Własne mechanizmy obronne mają również błony śluzowe. Wydzieliny,
które zwilżają te tkanki, utrudniają zasiedlenie przez patogena, zarówno mecha-
nicznym spłukiwaniem komórek bakteryjnych oraz przez obecność w nich sub-

281
stancji przeciwbakteryjnych. Łzy np. zawierają enzym lizozym (rys. 2.7) hydroli-
zujący wiązania mureiny w bakteryjnej ścianie komórkowej, a wiele wydzielin
zawiera np. przeciwciała slgA (sekcja 11.4.2.1; rys. 11.2). Istnieje też mikroflora
rezydentów, z którą każdy potencjalny patogen musi współzawodniczyć.
Fagocytoza. Gdy patogen przedrze się przez zewnętrzne mechanizmy
obronne, czekają go mechanizmy wewnętrzne. Wewnątrz tkanek oraz układu
krwionośnego i limfatycznego wyspecjalizowane komórki (fagocyty) pochłaniają
i niszczą cząsteczki „obcych" ciał — w tym wiele drobnoustrojów. Do komórek
tych należą makrofagi, a proces eliminacji drobnoustrojów nosi nazwę fagocy-
tozy. W przebiegu typowej fagocytozy kontakt między bakterią a makrofagiem
(który ułatwiony jest przez opsonizację — patrz niżej) zapoczątkowuje
pochłanianie komórki bakteryjnej, która zostaje zamknięta wewnątrz otoczonego
błoną woreczka (wodniczki), zwanego fagosomem. Wewnątrz fagosomu nastę-
puje stopniowe obniżanie się pH, a w pewnym momencie fagosom ulega fuzji
z lizosomem (woreczkiem zawierającym enzymy degradujące), tworząc fagoli-
zosom. Wewnątrz fagolizosomu drobnoustroje zwykle giną, lecz niektóre pato-
geny przeżywają, a inne blokują fuzję między fagosomem a lizosomem (sekcja
11.2.2.2).
Przeistoczenie się fagosomu w fagolizosom można prześledzić na podstawie
zmian pH oraz składu towarzyszących białek. Fagolizosom ma charakterysty-
czny skład białek, zwanych LAMP (ang. lysosome-associated membrane prote-
ins; białka błonowe związane z lizosomem). Gdy fuzja między fagosomem i lizo-
somem zostaje zablokowana, nie stwierdza się obecności LAMP.
Opsonizacja. Bakterie mogą ulegać opsonizacji, stając się tym samym bar-
dziej podatne na fagocytozę. W procesie tym następuje aktywacja dopełniacza
oraz związanie pewnych składników, np. C3b. Na powierzchni niektórych
rodzajów fagocytów występują swoiste receptory dla C3b, które za jego pośred-
nictwem wiążą opłaszczoną bakterię. W opsonizacji mogą też uczestniczyć prze-
ciwciała (sekcja 11.4.2.1). Regiony Fab (rys. 11. 2) mogą się wiązać do antygenu
na jego powierzchni, a fragment Fc przeciwciała — do swoistych receptorów dla
Fc na powierzchni pewnych fagocytów. W opsonizacji danej bakterii mogą więc
uczestniczyć zarówno przeciwciała, jak i układ dopełniacza.
Stan zapalny. Dłużej utrzymujący się patogen może wywołać stan zapalny —
miejscowe zaczerwienienie, obrzęk, wzrost ciepłoty, ból i utratę funkcji. Te nie-
specyficzne objawy (spowodowane również przez urazy mechaniczne czy che-
miczne) wiążą się ze zwiększonym przepływem osocza do uszkodzonej tkanki
(stąd obrzęk). Powoduje to miejscowy wzrost ilości czynników przeciwbakteryj-
nych, jak układ dopełniacza i przeciwciała. Zbierają się również neutrofile
i makrofagi. Neutrofile zwykle pojawiają się w ciągu kilku minut.
W stanie zapalnym uczestniczą różne cząsteczki sygnałowe. Niektóre z nich
powstają w wyniku aktywacji układu dopełniacza (patrz niżej) przez patogena.
Na przykład:
• C3a i C5a powodują uwolnienie histaminy (tab. 11.3). Histamina zwiększa
przepuszczalność drobnych naczyń krwionośnych, co pozwala na przepływ
osocza i również sprzyja szybkiej ekspresji cząsteczek selektyny na powierz-

282
 chni komórek nabłonkowych wyściełających światło naczynia. Powierz-
chniowe selektyny słabo wiążą się do leukocytów w układzie krwionośnym,
powodując toczenie się tych komórek po powierzchni nabłonka. Jest to pier-
wsze stadium procesu, w wyniku którego leukocyty opuszczają naczynia
krwionośne i przemieszczają się do tkanek.
• Antygenowoswoiste komórki Τ mogą być stymulowane przez patogena do
sekrecji cytokin (tab. 11.4). Jedna z nich, y-interferon, aktywuje makrofagi.
Te z kolei wydzielają zwiększone ilości niespecyficznych czynników prze-
ciwbakteryjnych (jak H 2 O 2 ) i mogą zabijać niektóre typy pochłoniętych pato-
genów, które mogą nie zostać zabite w nieaktywowanych makrofagach.
• Aktywowane makrofagi wydzielają cytokiny, np. czynnik martwicy nowo-
tworu (TNF, ang. tumor necrosis factor) oraz interleukiny 1 i 8 (IL-1, IL-8).
IL-1 i TNF mogą aktywować syntezę selektyn. IL-8 (chemokina: tab. 11.4)
wiąże się do komórek nabłonkowych i do leukocytów (już słabo związanych
przez selektyny). Tego typu wiązanie aktywuje cząsteczki integryny w leu-
kocytach, w wyniku czego komórki te silnie wiążą się — za pośrednictwem
integryn — do powierzchni nabłonka. Następnie leukocyty ulegają spłasz-
czeniu i toczą się wzdłuż nabłonka zgodnie z gradientem chemokiny,
a następnie przechodzą między komórkami nabłonka do tkanki (diape-
deza).
Na pewnym etapie miejsce objęte stanem zapalnym może również zawierać
cząsteczki uczestniczące w procesach naprawczych prowadzących do wylecze-
nia (patrz np. Martin (1997) Science 276: 75-81].
Stany zapalne mogą odgrywać ważną rolę w reakcji organizmu na patogeny.
Jak wspomniano wyżej, uczestniczą w pewnych aspektach odpowiedzi adapta-
cyjnej (sekcja 11.4.2) oraz w konstytutywnych mechanizmach obronnych.

11.4.1.1 Dopełniacz

Surowica zawiera dopełniacz, to jest zespół różnych białek, które w obecności

pewnych cząsteczek przechodzą „kaskadę" reakcji polegającą na kolejno nastę-
pującej aktywacji. W wyniku aktywacji poszczególne składniki tego układu
mogą spełniać specyficzne funkcje fizjologiczne (tab. 11.3).

283
 Układ dopełniacza może być aktywowany w różny sposób, a aktywator
determinuje, którą z czterech dróg będzie przebiegać (rys. 11.1). Na przykład,
lipopolisacharyd (LPS) bakterii gramujemnych (sekcja 2.2.9) może zapoczątko-
wać drogę alternatywną. Aktywacja przez bakterię gramujemną może mieć sze-
reg konsekwencji. Na przykład, wiązanie składnika czyni komórkę bardziej
podatną na fagocytozę przez makrofagi. Co więcej, jeśli składniki C5b-9 (komp-
leks atakujący błonę) zwiążą się z powierzchnią komórki, tworzą one perforację
w błonie zewnętrznej, która w pewnych przypadkach prowadzi do lizy komórki
(cytoliza odpornościowa). Liza ta wynika nie tylko z przełamania bariery błony
zewnętrznej, lecz również stwarza możliwość dotarcia lizozymu (rys. 2.7)
do warstwy mureiny tworzącej ścianę komórkową (rys. 2.6). Gramujemna bakte-

284
 Rys. 11.1 Uproszczony schemat aktywacji dopełniacza (sekcja 11.4.1)
Każdy z czterech szlaków wywołuje podobne efekty fizjologiczne, lecz jest zapoczątkowany
w odmienny sposób. Cl, C2 itd. określają poszczególne składniki układu dopełniacza, „a" i „b" okre-
ślają fragmenty tych składników powstające w wyniku enzymatycznego degradacji w trakcie procesu
aktywacji (dla jasności, schemat nie przedstawia wszystkich produktów degradacji — na przykład C4
ulega rozcięciu do fragmentów C4a i C4b, lecz tylko fragment C4b jest tu rozpatrywany). Linie
kropkowane wskazują na enzymatyczną aktywność kompleksu rozkładającego niektóre składniki
tego układu).
Droga klasyczna. Aktywacja tej drogi może być zapoczątkowana przez wiele typów kompleksów
antygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Taki kompleks może powstać np. w wyniku związania prze-
ciwciała antygenem na powierzchni komórki bakteryjnej. Na początku, Cl przyłącza się do tak zwa-
nego fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2) w kompleksie antygen-przeciwciało (ag-ab). Aktywo-
wany składnik Cl rozkłada C4. C4b wiąże C2, a C4b2 jest rozkładany przez Cl do C4b2a (konwertazę
C3). Konwertaza C3 rozkłada C3 do fragmentów C3a i C3b).
Jeśli aktywacja została zainicjowana przez kompleks antygen-przeciwciało na powierzchni
komórki bakteryjnej, fragmenty C3b mogą się wiązać z fragmentem Fc przeciwciała i/lub do
powierzchni bakterii. C3b sprzyja fagocytozie takich komórek lub kompleksów, do których się wiąże,
ponieważ na powierzchni makrofagów i innych fagocytów występują specyficzne miejsca recepto-
rowe dla C3b. C3b może również przekształcić się w kompleks będący konwertazą C5 (kolejna faza
aktywacji).
C3b ma krótki okres półtrwania, lecz fragment ten występuje zazwyczaj w małym stężeniu,
nawet bez aktywacji dopełniacza, w wyniku niskiego, spontanicznego poziomu hydrolizy C3.
Wyjaśnia to dostępność C3b dla inicjacji alternatywnej drogi, i to mimo inaktywacji przez czynnik I.
Kaskada reakcji przebiega tak jak na schemacie. Kompleks C5b67 wiąże się do błony i po
przyłączeniu kolejnych składników, C8 i C9, zwany jest kompleksem atakującym błonę (MAC,
ang. membrane attack complex). Jeśli MAC powstaje np. na błonie zewnętrznej bakterii gram-
ujemnej (sekcja 2.2.9.2), tworzy por lub kanał w tej błonie. Ściana takiego kanału składa się z sześciu
lub więcej cząsteczek C9. W niektórych przypadkach (patrz sekcja 11.4.1.1) może to prowadzić do
lizy bakterii.
Kompleks C5b67 może się wiązać do lub w pobliżu miejsca pierwotnej aktywacji dopełniacza.
Może też wiązać się do innej komórki w sąsiedztwie, prowadząc do jej lizy w razie utworzenia MAC.
Tego rodzaju liza zwana jest reaktywną
Droga alternatywna. Droga ta jest aktywowana np. przez lipopolisacharydy (LPS; sekcja 2.2.9.2).
Zwykle niski poziom C3b, wystarczający do aktywacji (patrz wyżej). Czynniki Β i D, jak również pro-
perdyna, to białka zwykle występujące w osoczu. Konwertazy C3 i C5 uczestniczące w tej drodze
aktywacji różnią się od tych w drodze klasycznej. Ważne jest również występowanie charakterystycz-
nej pętli amplifikacji C3.
Droga lektynowa. Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1).
Droga C2a (ang. salvage). Patrz tekst (sekcja 11.4.1.1).
Fragmenty C3a i C5a. Fragmenty te (nie pokazane na rysunku) zwane są anafilatoksynami, mogą
działać na komórki tuczne i bazofile, przyczyniając się do uwolnienia mediatorów procesów zapal-
nych, jak histamina. Histamina wpływa na przepuszczalność niektórych małych naczyń krwionoś-
nych, pozwalając na zwiększony wypływ osocza i komórek do zainfekowanych tkanek. Na dodatek,
C5a działa jako czynnik chemotaktyczny, przyciągający makrofagi i inne komórki do zmienionego
chorobowo miejsca.
Regulacja układu dopełniacza. Układ dopełniacza jest zdolny do wytworzenia czynników fizjolo-
gicznych o potężnym działaniu, a ponieważ na proces aktywacji składa się kilka różnych etapów
amplifikacji, musi on podlegać ścisłej kontroli. Z tego powodu, istnieją swoiste inhibitory kluczo-
wych etapów procesu aktywacji — np. cząsteczki, które hamują aktywność Cl i rozkładają/hamują
aktywność C3b.

285
ria patogenna (jak np. Haemophilus influenzae) narażona byłaby więc na lizę
z powodu obecności zarówno dopełniacza, jak i lizozymu w płynie obmy-
wającym gałkę oczną.
Klasyczna droga dopełniacza jest aktywowana przez wiele rodzajów komple-
ksów antygen-przeciwciało. (Większość przeciwciał — choć nie wszystkie —
należy do „wiążących dopełniacz"). Kaskada reakcji jest przedstawiona na
rysunku 11.1.
W drodze lektynowej uczestniczy szereg składników osocza: lektyna wiążąca
mannozę (MBL, ang. mannose-binding lectin) oraz proteazy serynowe związane
z MBL. Układ ten jest aktywowany, gdy MBL zwiąże się z odpowiednimi
ugrupowaniami na powierzchni osłon bakteryjnych. Skutecznie omija fazę Cl
klasycznej drogi. Droga lektynowa może być istotna szczególnie u niemowląt
w wieku od 4-6 miesięcy (kiedy tracona jest osłona w postaci matczynych
przeciwciał IgG) do około 18-24 miesięcy (kiedy rozwija się bardziej skuteczny
układ immunologiczny). Wiązanie do MBL może być jednakże hamowane przez
obecność otoczki bakteryjnej w przypadku takich patogenów jak np. Neisseria
meningitidis. [Mannose-binding lectin: Turner (1996) Immunology Today 17:
532-549].
Droga C2a, opisana w roku 1997, może mieć duże znaczenie dla patogennych
prątków. W drodze tej składnik C2a po związaniu z powierzchnią prątka
działa jako konwertaza C3 (rys. 11.1) [Schlesinger (1998) TIM 6: 47-49; Brown
i Schorey (1998) TIM 6: 49-50]. ( U w a g a : niektórzy autorzy zamiast C2a stosują
symbol „C2b").
Niektóre enzymy trzustki (np. trypsyna) degradują składniki dopełniacza,
z wytworzeniem anafilatoksyn (podpis, rys. 11.1), których poziom jest podwyż-
szony w doświadczalnym zapaleniu trzustki.
Dopełniacz jest wczesną, szybką i potężną formą obrony. Drogi alternatywna
i lektynowa należą do obrony wrodzonej organizmu, podczas gdy droga klasy-
czna jest częścią odpowiedzi nabytej (sekcja 11.4.2).

11.4.1.2 Interferony

Interferony (IFN) są białkami wytwarzanymi przez pewne rodzaje komórek

zwierzęcych w odpowiedzi na wirusy, niektóre bakterie i antygeny (sekcja
11.4.2.1).
Interferony typu 1, IFN-α i IΡΝ-β, są istotnymi czynnikami przeciwwiruso-
wymi. Po związaniu z komórkami zainfekowanymi wirusem indukują syntezę
pewnych białek, np. cząsteczki klasy 1 głównego układu zgodności tkankowej
(MHC, ang. major histocompatibility complex), które wzmagają odpowiedź typu
komórkowego (sekcja 11.4.2.2) skierowaną przeciw takim komórkom. Interfe-
rony te mogą działać na komórki zainfekowane wieloma różnymi wirusami, nie-
zależnie od typu indukującego IFN. W związku z tym, to ogólne, nieswoiste
uaktywnienie układu immunologicznego jest często uważane za część obrony
wrodzonej, mimo iż niektóre białka aktywowane przez IFN mogą być bardziej
swoiste (np. białko Μx, które hamuje replikację wirusa grypy).
Interferon typu 2, IFN-y, odgrywa mniejszą rolę jako czynnik przeciwwiru-
sowy, lecz ma podstawowe znaczenie jako cząsteczka sygnalna w odporności

286
nabytej (sekcja 11.4.2). Należy on do obszernego systemu cytokin (tab. 11.4).
IFN-y jest wytwarzany przez komórki (limfocyty) Τ aktywowane antygenem.
Do jego znanych lub prawdopodobnych funkcji należą:
• Aktywacja makrofagów (sekcja 11.4.1).
• Hamowanie wpływu IL-4 na limfocyty Β (sekcja 11.4.2.1).
• Indukcja cząsteczek MHC klasy II.
• Hamowanie syntezy receptorów dla transferyny (pobierania żelaza) na zain-
fekowanych komórkach ssaczych (zmniejszone pobieranie żelaza hamuje
wzrost wewnątrzkomórkowych patogenów).
• Indukcja syntezy tlenku azotu (sekcja 11.4.1.4) przez zainfekowane komórki
ssacze (jako mechanizmu hamującego metabolizm żelaza przez wewnątrz-
komórkowe patogeny).
• Stymulacja syntezy składnika C3 dopełniacza (rys. 11.1) w pneumocytach
typu II (komórkach pęcherzyków płucnych).

11.4.1.3 Sekwestracja jonów

Bakterie patogenne wymagają jonów pewnych metali, a sekwestracja takich

jonów przez gospodarza jest jedną z form obrony konstytutywnej. Żelazo, na
przykład, jest sekwestrowane przez chelatory zarówno w osoczu, jak i w wydzie-
linach (patrz sekcja 11.5.5).
Cynk występuje w niektórych enzymach (np. w deacetylazie biorącej udział
w biosyntezie lipidu A: sekcja 2.2.9.2). Jest on chelatowany przez kalprotektynę
— białko uwalniane przez neutrofile ginące w miejscach zapalnych (np. wrzody),
w których stężenie tego metalu może być duże. Kalprotektyna ma działanie
bakteriostatyczne, najprawdopodobniej w wyniku sekwestracji cynku. Przy
leczeniu wrzodów wpływ ten może być antagonistyczny w stosunku do tych
antybiotyków, które działają jedynie na komórki rosnące. [Cynk w obronie prze-
ciw drobnoustrojom: Sohnle (1997) RMM 8: 217-224].

11.4.1.4 Tlenek azotu

Po odpowiedniej aktywacji wiele rodzajów komórek (w tym makrofagi i komórki

nabłonkowe) syntetyzuje indukowalną formę enzymu — syntaza tlenku azotu
(iNOS, ang. nitric oxide synthase). Tego rodzaju synteza wymaga transkrypcyj-
nej aktywacji przez pewne cytokiny (tab. 11.4) (np. IFN-y, TNF-α). iNOS katali-
zuje zależną od NADPH oksydatywną deaminację L-argininy do L-cytruliny
i tlenku azotu (NO). NO (który w połączeniu z wodą i tlenem tworzy szereg
aktywnych pochodnych) może zabijać patogeny, niszcząc np. enzymy zawie-
rające żelazo. W komórkach będących celem działania naruszona jest replikacja
DNA oraz wiele ważnych procesów metabolicznych.
Zabijanie Mycobacterium tuberculosis przez aktywowane przez IFN-y mysie
makrofagi jest hamowane przez iNOS. Ponadto, inne badania na myszach
wykazały, że genetyczna inaktywacja IFN-y (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2) powoduje
zwiększoną podatność na M. tuberculosis, co jest skorelowane z brakiem iNOS.

287
288
 7
IL-8 należy do podklasy cytokin zwanych chemokinami. Chemokiny wykazują chemotaksję do szczególnych
subpopulacji leukocytów, które aktywują. Odgrywają ważną rolę w procesie, w którym leukocyty przemieszczają
się z naczyń krwionośnych do tkanek w stanie zapalnym (sekcja 11.4.1). Na podstawie różnic w strukturze i fun-
kcjach chemokiny dzielą się na dwa typy (CXC i CC)
Receptory dla chemokin na powierzchni leukocytów to cząsteczki z superrodziny rodopsyny. Niektóre receptory
wiążą tylko jeden typ chemokiny (np. CXC-CKR2 jest specyficzny dla chemokiny IL-8 należącej do typu CXC), lecz
inne mogą się wiązać do więcej niż jednego typu. Receptor na erytrocytach wiąże chemokiny zarówno CXC, jak
i CC. To wiązanie nie ma żadnej funkcji dla erytrocytu, lecz może służyć jako mechanizm zapobiegający niewłaści-
wej aktywacji leukocytów.
Monoklonalne przeciwciała skierowane przeciw IL-8 wykazują aktywność przeciwzapalną.
8
Cytokina przeciwzapalna. Jedną z jej funkcji jest zmniejszenie syntezy cytokin prozapalnych, takich jak TNF-α
i IL-1β.
TNF-α jest wytwarzany przez wiele typów komórek, lecz głównie przez aktywowane makrofagi. Receptory
9

oznaczone p55 i p75 występują na wielu typach komórek. TNF-α i IL-β stymulują własną produkcję, jak również sie-
bie nawzajem. TNF-β jest podobny do TNF-α. Wytwarzany jest przez limfocyty, wiąże się do tych samych recepto-
rów i wykazuje podobne właściwości. W wyniku endotoksemii w peryferycznym układzie krążenia występuje
podwyższony poziom rozpuszczalnych (uwolnionych) receptorów dla TNF. Może to być mechanizm zmniejszający
wpływ TNF na komórki.

Bakterie reagują na NO zwiększoną aktywnością enzymów uczestniczących

w odpowiedzi na stres tlenowy (sekcja 7.8.2.8). Oporność na NO może być zróż-
nicowana, zależnie od gatunku i szczepu patogena.
Dłużej trwające wytwarzanie NO może niekorzystnie oddziaływać na
gospodarza.
(NO (wpływ na patogeny i gospodarza): Piedrafita i Liew (1998) RMM 9:
179-189; NO w posocznicy i endotoksemii: Parrat (998) JAC 41 (suplement A):
31-39].

11.4.2 Odporność nabyta

11.4.2.1 Przeciwciała, produkcja przeciwciał i szczepienia
Niezależnie od obrony konstytutywnej, organizm może również reagować
w sposób swoisty na danego patogena. Pojedyncza komórka może być rozpo-
znana na podstawie jej „chemicznego wzoru", to jest takich cząsteczek jak lipo-
polisacharydy (LPS), które są dla niej charakterystyczne. Tego rodzaju cząsteczki
mogą działać jak antygeny, tzn. ich obecność w organizmie może powodować,
że pewne leukocyty (szczególnie niektóre subpopulacje limfocytów B) wytwa-
rzają białka zwane przeciwciałami. Przeciwciało w sposób swoisty reaguje
z antygenem, który zaindukował jego powstanie (u osobnika dorosłego wystę-
pują miliony różnych rodzajów limfocytów Β, ζ których każdy rozpoznaje inny
rodzaj antygenu i wytwarza odpowiadające mu przeciwciało). Wszystkie prze-
ciwciała są immunoglobulinami — białkami występującymi we krwi i innych
płynach ustrojowych (rys. 11.2). Pięć głównych klas immunoglobulin to: IgA
(występują głównie w ślinie, łzach i na powierzchniach błon śluzowych),
IgD, IgE (głównie związane z komórkami tucznymi i granulocytami zasado-
chłonnymi), IgG (najliczniejsza klasa immunoglobulin w osoczu) i IgM (duża
cząsteczka — pentamer — występująca prawie wyłącznie w układzie naczy-
niowym).
Przeciwciała zaindukowane przez danego patogena mogą się z nimi wiązać,
lecz co z tego wynika? Przypuśćmy, że przeciwciała wiążą się do antygenów

289
Cząsteczka ta, będąca glikoproteiną, składa się z czterech łańcuchów polipeptydowych: dwóch iden-
tycznych łańcuchów ciężkich (dłuższe linie) oraz dwóch łańcuchów lekkich (krótsze linie). Cztery
łańcuchy są ze sobą związane wiązaniami disulfidowymi (SS) oraz innymi, tworząc cząsteczkę
o kształcie litery Y.
Dwie stykające się ze sobą części łańcuchów ciężkich tworzą tak zwany fragment Fc. Rozchodzą
się one w regionie zawiasowym, formując ramiona litery Y. Każde ramię, które składa się z łańcucha
lekkiego i części łańcucha ciężkiego, nosi nazwę fragmentu Fab. Obydwa fragmenty Fab można
odciąć od cząsteczki za pomocą enzymu papainy. Inny enzym, pepsyna, odcina (jako jeden kawałek)
obydwa fragment Fab, wraz z regionem zawiasowym. Część ta nosi nazwę F(ab')2·
Na wolnym końcu każdego fragmentu Fab występuje miejsce wiązania antygenu.
Wśród wszystkich przeciwciał (sekcja 11.4.2.1) IgG, IgD i IgE mają opisaną wyżej formę monomeru.
IgM jest pentamerem, to jest cząsteczką złożoną z pięciu promieniście ułożonych monomerów,
połączonych swoimi fragmentami Fc.
IgA w osoczu występuje głównie w formie monomeru o masie cząsteczkowej -160000, lecz
w płynach pozanaczyniowych, jak łzy, ślina, wydzielinach w układzie oddechowym i pokarmowym
(w którym jest dominującym typem Ig), ma charakter dimeru zwanego wydzielniczym IgA
(s-IgA), w którym fragmenty Fc dwóch monomerów są połączone łańcuchem J oraz fragmentem
wydzielniczym.
IgG, o masie cząsteczkowej -150000, stanowi około 75% immunoglobulin w osoczu, z czego
większość należy do podklasy IgG1. Przeciwciała IgG odgrywają ważną rolę jako opsoniny i antyto-
ksyny w płynach pozanaczyniowych, jak również w układzie krwionośnym. Przeciwciała te mogą
przejść przez łożysko, chroniąc płód i noworodka. Przeciwciała IgG zwykle dominują po zmianie
klasy w odpowiedzi typu humoralnego na antygeny (sekcja 11.4.2.1).
IgM, o masie cząsteczkowej -970000, odpowiada za około 5-10% immunoglobulin w osoczu. Prze-
ciwciała IgM szczególnie dobrze aglutynują LPS oraz inne substancje, które charakteryzują się powta-
rzalnym wzorem determinantów antygenowych. U człowieka nie przekraczają one łożyska ani
bariery krew-mózg. Przeciwciała IgM zwykle powstają jako pierwsze w odpowiedzi typu humoral-
nego i są główną klasą przeciwciał powstających przeciw antygenom grasiczoniezależnym, takich jak
wielocukrowce pneumokoków (sekcja 11.4.2.1).
Termin izotyp odnosi się do klasy immunoglobulin (np. IgG, IgM). Dany izotyp występuje u wszyst-
kich zdrowych osobników danego gatunku.
Allotyp określa zmienioną formę cząsteczki immunoglobuliny. Dany allotyp nie występuje u wszyst-
kich osobników danego gatunku, lecz jedynie u tych, które mają odpowiedni allel w swoim genotypie
(allel jest jedną z kilku zmienionych form danego genu).
Termin idiotyp odnosi się zespołu determinantów immunogennych występujących w części zmien-
nej określonego przeciwciała.

(takich jak lipopolisacharyd) na powierzchni komórki. Kiedy się to zdarza,

komórka ta staje się bardziej podatna na fagocytozę (sekcja 11.4.1). Co więcej,
większość kompleksów antygen-przeciwciało aktywuje dopełniacz (sekcja
11.4.1), co również sprzyja opsonizacji (sekcja 11.4.1).

290
 Inną konsekwencją wiązania przeciwciała do komórki bakteryjnej jest cyto-
toksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (sekcja 11.4.2.2).
Przeciwciała mogą wydać się mało istotne w przypadku patogenów
wewnątrzkomórkowych, ponieważ wewnątrz komórek gospodarza bakterie te
są chronione zarówno przed przeciwciałami, jak i przed dopełniaczem. Jednakże
przeciwciała są pomocne i w tym przypadku. Na przykład przeciwciała skiero-
wane przeciw składnikom bakteryjnych osłon komórkowych mogą blokować
wstępną adhezję (sekcja 11.2.1) przez Chlamydia lub Salmonella lub pośredniczyć
w ADCC w przypadku Coxiella, podczas gdy antytoksyny (patrz niżej) mogą
neutralizować wydzielane toksyny [Casadevall (1998) TIM 6: 102-107].
Przeciwciała skierowane przeciw toksynom (antytoksyny) mogą po związa-
niu się z nimi neutralizować ich aktywność. Powstały kompleks toksyna-antyto-
ksyna jest usuwany przez pewne leukocyty, które mają receptory dla fragmentu
Fc przeciwciała.
Ujemna strona przeciwciał widoczna jest w przypadku pewnych reakcji nad-
wrażliwości — w tym alergii na takie antybiotyki jak penicylina. W przypadku
alergii na penicylinę pierwszy kontakt z tym antybiotykiem powoduje pojawie-
nie się większego niż prawidłowy poziomu przeciwciał IgE, z których wiele
wiąże się do receptorów na komórkach tucznych i granulocytach zasa-
dochłonnych, pozostawiając miejsca wiązania antygenu na powierzchni tych
komórek. Przy następnym kontakcie penicylina (antygen) wiąże się do tych prze-
ciwciał IgE na powierzchni komórek tucznych i granulocytów zasadochłonnych,
powodując ich degranulacje, to jest uwolnienie różnych, fizjologicznie czynnych
substancji (jak histamina), czego skutkiem może być nawet śmiertelny szok
anafilaktyczny.
Powstawanie przeciwciał. Mechanizm powstawania przeciwciał różni się
zależnie od rodzaju antygenu. Niektóre duże cząsteczki o powtarzających się
podjednostkach — np. wielocukry tworzące otoczkę bakteryjną — mogą powo-
dować wytwarzanie przeciwciał przez swoiste limfocyty Β bez pomocy limfocy-
tów T. Taki typ antygenu nosi nazwę grasiczoniezależnego (TI, ang. thymus
independent), ponieważ limfocyty Τ dojrzewają w grasicy. Jednakże, chociaż
antygeny Ή powodują proliferację swoistych limfocytów Β i powstawanie prze-
ciwciał, nie indukują one limfocytów pamięci (patrz niżej), a wytworzone prze-
ciwciała są prawie wyłącznie klasy IgM (rys. 11.2), które są pożyteczne działając
przeciw patogenom przenoszonym przez krew.
Takie antygeny TI, jak wielocukier otoczkowy Haemophilus influenzae typu b,
nie wywołują lub prawie nie wywołują odpowiedzi w postaci przeciwciał u nie-
mowląt i dzieci do drugiego roku życia. Najprawdopodobniej wynika to z nie-
dojrzałości u nich limfocytów B. Jest to bardzo ważne w kontekście szczepień
ochronnych — patrz szczepionki sprzężone, niżej.
Większość antygenów — np. mniejsze cząsteczki, rozpuszczalne białka — są
typu grasiczozależnych. Przyczyniają się one do wytwarzania przeciwciał przez
limfocyty Β jedynie przy współudziale limfocytów T.
Aby spowodować powstanie przeciwciała, grasiczozależny antygen musi
być najpierw pobrany i przetworzony przez komórki prezentujące antygen
(APC, ang. antigen-presenting cell), do których należą komórki dendrytyczne

291
i makrofagi. Po przetworzeniu (to jest np. po pocięciu enzymatycznym), antygen
łączy się z cząsteczką MHC klasy II (syntetyzowanej w komórce prezentującej
antygen) i jest prezentowany na powierzchni komórki limfocytowi T, która swo-
iście reaguje na dany antygen. Limfocyt Τ rozpoznaje i łączy się z kompleksem
przetworzonego antygenu i cząsteczki MHC klasy II — antygen wiąże się do
receptora limfocytu Τ (TCR, ang. Τ cell receptor) wiążącego antygen. Aktywo-
wany limfocyt Τ wydziela cytokiny (tab. 11.4), które mogą stymulować prolife-
rację i różnicowanie niektórych (antygenowo swoistych) limfocytów B, które
związały dany antygen. Niektóre antygenowo swoiste limfocyty Β stają się
komórkami plazmatycznymi, tzn. wytwarzają przeciwciała pasujące do danego
antygenu. Najpierw powstają przeciwciała klasy IgM, lecz później należą one do
innej klasy, zazwyczaj IgG — aczkolwiek zachowują tę samą swoistość (nadal
pasują do danego antygenu).
Przełączanie klas powstających immunoglobulin odbywa się w centrach roz-
rodczych grudek limfatycznych w śledzionie i węzłach limfatycznych.
Tam, cytokiny pochodzące od limfocytów Τ uczestniczą w procesie zmiany
ekspresji genów w limfocytach B, co prowadzi do syntezy różnych klas
przeciwciał. Grudki limfatyczne są również miejscem dojrzewania powinowa-
ctwa. W procesie tym następuje selekcja mutantów z proliferujących, stymulo-
wanych antygenem, limfocytów Β pod kątem wysokiego powinowactwa
do antygenu. Presją selekcyjną najprawdopodobniej jest zmniejszające się stęże-
nie antygenu.
Innym skutkiem interakcji między limfocytami Β i C jest to, że niektóre limfo-
cyty Β stymulowane przez antygeny tworzą komórki pamięci. Komórki te nie
wytwarzają przeciwciał, lecz trwają latami w postaci pobudzonej, mogąc szybko
i skutecznie reagować na pojawienie się tego samego antygenu. Ta wzmożona
wtórna odpowiedź odzwierciedla np. istnienie rozszerzonego klonu (swoiście
reaktywnych) limfocytów B, będącego wynikiem proliferacji po stymulacji
antygenem.
W odpowiedzi wtórnej komórki Β i Τ są już pobudzone na skutek wcześniej-
szego kontaktu z antygenem. W takich przypadkach do wytworzenia przeciw-
ciał mogą wystarczać wyłącznie pobudzone limfocyty Β i Τ oraz limfocyty Β pre-
zentujące antygen.
Limfocyty Τ biorące udział w powstawaniu przeciwciał należą do subpo-
+
pulacji CD4 (syn. Τ pomocnicze; Th, ang. Τ helper;). CD4 jest cząsteczką na
powierzchni (koreceptorem) umiejscowionym blisko TCR, która wiążąc się
z cząsteczką MHC klasy II pomaga stabilizować kontakt między limfocytem Τ
a komórką prezentującą antygen i uczestniczy w transdukcji sygnału po na-
wiązaniu kontaktu między komórką prezentującą antygen i limfocytem T.
Stymulacja antygenowa dziewiczego limfocytu Τ typu CD4 (tzn. takiego,
+

który nie zetknął się z odpowiadającym mu antygenem) może spowodować roz-

wój komórki w jednym z dwóch kierunków — zależnie od obecności swoistych
cytokin. W obecności IL-12 pochodzącej od makrofagów mogą się rozwinąć
cechy charakterystyczne dla subpopulacji Th1 limfocytów Τ typu CD4 . Komórki
+

te mogą wytwarzać np. IL-2 i IFN-α. Alternatywnie, w obecności IL-4 pocho-

dzącej od limfocytów Τ mogą się rozwinąć cechy charakterystyczne dla komórek
Th2, które wydzielają np. IL-4, IL-5 i IL-10.

292
 Znaczenie subpopulacji Thl i Th2 polega na tym, że wytwarzając różne grupy
cytokin wpływają na rozmaite aspekty odpowiedzi immunologicznej. Na
przykład, II-2 z komórek Th1 może stymulować wzrost limfocytów T, aktywo-
wać makrofagi i wzmagać aktywność komórek CD8+ (sekcja 11.4.2.2), podczas
gdy IFN-α pochodzący od Th1 może aktywować makrofagi i powodować
zmianę klasy przeciwciał na IgG w aktywowanych limfocytach B. Cytokina IL-4
pochodząca z Th2 może powodować zmianę klasy przeciwciał na IgE, podczas
gdy 11-10 hamuje rozwój komórek Th1.
Szczepienia. Powstawanie przeciwciał skierowanych przeciw antygenom
patogena może być stymulowane przez wprowadzenie tych antygenów do orga-
nizmu (szczepienie). Celem szczepienia jest pomoc organizmowi w obronie
w razie ataku ze strony danego patogena. Szczepionka — zawierająca antygeny
danego patogena (np. zabite komórki lub składniki komórkowe) — jest wprowa-
dzana przez wkłucie lub, rzadziej, doustnie [szczepionki doustne (problemy
i rozwiązania): Dougan (1994) Microbiology 140: 215-224). Na przykład, dobrą
ochronę przed patogennymi bakteriami jelitowymi uzyskuje się jedynie wtedy,
gdy antygeny te działają za pośrednictwem układu immunologicznego nabłonka
jelita. Dlatego też rozwój szczepionek przeciw ETEC (tab. 11.2) jest ukierunko-
wany na doustny sposób ich podawania (a nie dojelitowo) [Gaastra i van der
Ziejst (1996) RMM 7: 165-177]; także nie są już zalecane dojelitowe szczepionki
przeciw cholerze, gdyż dają niewystarczającą ochronę.
Organizm reaguje na szczepionkę wytwarzając odpowiadające jej przeciw-
ciała. Przyszły kontakt z danym patogenem stymuluje energiczne wytwarzanie
swoistych przeciwciał w wyniku odpowiedzi wtórnej (patrz wyżej).
Szczepionki przeciw krztuścowi (patogenem jest Bordetella pertussis) zawie-
rają albo całe komórki, albo frakcję bezkomórkową. Do tych ostatnich należą
szczepionki z inaktywowaną toksyną błoniczą oraz (zazwyczaj) składnikami
fimbrii. Szczepionki bezkomórkowe są w powszechnym użyciu w Japonii od
roku 1981, a obecnie ta nowa generacja szczepionek jest stosowana w Europie.
Nowe szczepionki bezkomórkowe wykazują znacznie mniejsze działanie ubo-
czne (w porównaniu z komórkowymi), a jednocześnie zapewniają taką samą
ochronę. Dają one jednak słabszą ochronę przed chorobami powodowanymi
przez B. parapertussis [Willems i Mooi (1996) RMM 7: 13-21].
Bakterie patogenne mające otoczki wielocukrowe mogą powodować różnego
typu choroby u małych dzieci (sekcja 11.5.1), ponieważ dzieci te nie reagują
odpowiednio na antygeny w rodzaju wielocukrów (patrz powstawanie przeciw-
ciał, wyżej). [Responsiveness of infants to capsular polysaccharides: Rijkers
i wsp. (1996) RMM 7: 3-12]. Dla małych dzieci skutecznymi szczepionkami są
wielocukry sprzężone z białkiem, tzw. szczepionki sprzężone. Tego typu szcze-
pionka powoduje powstawanie przeciwciał ochronnych już w czwartym mie-
siącu życia. Jest to czas odpowiedni, gdyż niemowlęta zwykle są chronione przez
pierwszych sześć miesięcy życia przez przeciwciała pochodzące od matki. Dys-
ponujemy skuteczną szczepionką sprzężoną do ochrony przez chorobami (np.
zapalenie płuc, zapalenie nagłośni) powodowanymi przez Haemophilus influenzae
typ b (Hib). [Ten years' experience with Hib conjugate vaccines in Finland:
Eskola i Kayjty (1996) RMM 7: 231-241].

293
 Wdrażane obecnie szczepionki sprzężone przeciw Streptoccus pneumoniae są
skuteczne jedynie wobec niewielkiej liczby rozmaitych serotypów tego patogena.
Poliwalentne szczepionki sprzężone (obejmujące większą liczbę serotypów)
byłyby kosztowne. Jednakże, niektóre jednak białka (antygeny grasiczozależne)
występują w osłonach komórkowych prawie wszystkich klinicznych szczepów
dwoinki zapalenia płuc i charakteryzują się niewielką zmiennością antygenową.
Szczepionka zawierająca kilka tych białek (uczestniczących w różnych stadiach
patogenezy) mogłaby zapewnić lepszą ochronę niż szczepionki obecnie dostępne
[Paton (1998) TIM 6: 85-87].
Szczepionki sprzężone przeciw meningokokowemu zapaleniu opon mózgo-
wych dały obiecujące rezultaty jedynie dla serogrupy C Neisseria meninigitidis.
Dalsze badania są w toku.
Szczepionki, które blokują pobieranie żelaza przez patogena, odzwierciedlają
absolutny wymóg dotyczący tego pierwiastka. Do zastosowanych antygenów
należą powierzchniowe receptory dla syderofilin (sekcja 11.5.5). Jedno z wcześ-
niejszych badań (u świń) wykazało, że białko Β Actinobacillus pleuropneumoniae
wiążące transferynę może indukować przeciwciała, chroniąc zwierzęta przed
zetknięciem się z homologicznym szczepem patogena. Białka receptorowe
N. meningitidis dla transferyny (TbpA, TbpB) są potencjalnymi antygenami dla
szczepionki przeciw zapaleniu opon mózgowych, aczkolwiek nadal pozostają
problemy z heterogennością antygenową dotyczącą różnych szczepów tego
patogena [Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37].
Są obecnie opracowywane żywe szczepionki przeciw szczepowi O139 Vibrio
cholerae (sekcja 11.11) po delecji genów patogena kodujących niektóre czynniki
wirulencji [Waldor i Mekelanos (1994) JID 170: 278-283].
Szczepionka przeciw gruźlicy, BCG (franc. bacille Calmette-Guerin), jest
żywym, atenuowanym szczepem Mycobacterium bovis podawanym podskórnie.
Skuteczność ochronna BCG w dużym stopniu zależy od położenia geograficz-
nego, odzwierciedlając zróżnicowany stopień stykania się z prątkami w śro-
dowisku.
Podobnie jak różne składniki patogena działają jako antygeny, również w ten
sposób mogą działać produkty bakteryjne, łącznie z toksynami. Połączenie
toksyny z przeciwciałem znosi jej szkodliwe właściwości i pomaga eliminować ją
z organizmu. Jednakże, w pewnych chorobach wywoływanych przez toksyny
(np. tężec) może nastąpić śmierć zanim organizm odpowiednio zareaguje prze-
ciwciałami. Szczepienie przeciw tego typu toksynie (jak tetanospazmina — sek-
cja 11.3.1.3) wiąże się z podaniem zmodyfikowanej formy toksyny, zwanej anato-
ksyną, która nie jest szkodliwa, lecz zachowuje właściwości antygenowe.
Anatoksyna indukuje zatem wytworzenie przeciwciał skierowanych przeciw
toksynie.
Szczepienie często stymuluje tworzenie przeciwciał w organizmie pacjenta.
W niektórych przypadkach podaje się przeciwciała preformowane. Procedura ta
zwie się immunizacją bierną.
Szczepienia zwykle stosuje się profilaktycznie, by zapobiec chorobie. Jednak
w botulizmie (sekcja 11.3.1.2) często do leczenia używa się surowicy odporno-
ściowej zawierającej przeciwciała preformowane skierowane przeciw toksynie.
[Challenges in vaccinology: Poolman (1996) RMM 7: 73-81].

294
 Przeciwciała monoklonalne. Po fuzji limfocytu Β ζ komórką nowotworową
powstaje hybrydoma, która może się namnażać jak komórka nowotworowa
i wytwarzać przeciwciała typu określanego przez limfocyt. W ten sposób można
otrzymać dużą populację identycznych (monoklonalnych) przeciwciał. Przeciw-
ciała monoklonalne (mAbs, ang. monoclonal antibodies) znajdują wiele zastoso-
wań, między innymi do wykrywania specyficznych drobnoustrojów, przez
wykorzystanie „piętnowanych" monoklonalnych przeciwciał, które rozpoznają
specyficzne antygeny. [Monoclonal antibodies specific for E. coli O157:H7 LPS:
Westerman i wsp. (1997) JCM 35: 679-684].

11.4.2.2 Odpowiedź typu komórkowego

Odpowiedź typu komórkowego to rodzaj reakcji immunologicznej, w której

efektorami są bezpośrednio komórki. Jest to inaczej, niż w przypadku odpowie-
dzi, w której uczestniczą wolne przeciwciała, tzw. odpowiedzi typu humoral-
nego. Głównymi komórkami efektorowymi w odpowiedzi typu komórkowego
są limfocyty T.
Limfocyty T, w przeciwieństwie do limfocytów B, nie tylko nie wiążą wol-
nego antygenu, lecz przeciwnie, wiążą antygen jedynie wtedy, gdy: 1) stanowi
on część powierzchni komórki i 2) jest połączony z cząsteczką MHC. Cząsteczki
MHC klasy I występują na powierzchni większości komórek organizmu zawie-
rających jądro. Występowanie cząsteczek MHC klasy II zwykle ogranicza się do
komórek prezentujących antygen (sekcja 11.4.2.1) — chociaż odpowiednie czyn-
niki mogą zaindukować ich obecność na niektórych innych typach komórek.
Ponieważ wiązanie limfocytów Τ jest ograniczone do powierzchni zawierających
cząsteczki MHC, mówi się, że odpowiedź limfocytów Τ podlega ograniczeniu
(restrykcji) przez MHC (w sekcji 11.4.2.1 pisaliśmy, że komórki CD4+ są ograni-
czone przez MHC II). [A kinetic view of Τ cell behaviour (krótki artykuł
przeglądowy): Lanzavecchia, Lezzi i Viola (1999) Cell 96: 1-4].
Cechy wiązania antygenów przez limfocyty Τ sugerują, że podstawową rolą
tych komórek jest reakcja na wewnątrzkomórkowe patogeny, których antygeny
znajdują się na powierzchni komórki. W istocie, limfocyty Τ subpopulacji CD8+
wiążą się do, i zabijają, komórki gospodarza prezentujące antygeny pewnych
patogennych bakterii połączone z cząsteczką MHC klasy I. Tego typu limfocyty
Τ zwane są komórkami cytotoksycznymi (Tcyt), a każda nich wiąże antygen
swoisty dla jej receptora. By zabić komórkę gospodarza, cytotoksyczne limfocyty
Τ muszą najpierw ulec aktywacji, np. przez interleukinę 2 (IL-2). W przynajmniej
niektórych przypadkach IL-2, jak się wydaje, pochodzi ze stymulowanych przez
antygen limfocytów CD4+, które uległy zróżnicowaniu do komórek Th1 (sekcja
11.4.2.1). Cytotoksyczne limfocyty Τ niszczą komórkę docelową: 1) uwalniając
czynniki letalne (w tym cząsteczki tworzące pory w błonie komórkowej — perfo-
ryny), i 2) indukując apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki). Ponieważ
apoptoza nie jest związane z lizą, ta metoda niszczenia komórek ogranicza
rozprzestrzenianie się patogena do innych komórek.
Niektóre limfocyty Τ typu CD4+ mogą mieć właściwości komórek cyto-
toksycznych. Są one zależne od MHC.

295
 Istnieją również dwie formy niszczenia komórek, które nie są zależne od
MHC. W cytoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał, bakterie opłasz-
czone przeciwciałami ulegają lizie przez pewne limfocyty, które na swojej powie-
rzchni posiadają receptory dla fragmentu Fc przeciwciała (rys. 11.2). Wśród
komórek tych znajdują się neutrofile (granulocyty obojętnochłonne), monocyty
i komórki cytotoksyczne. W innym procesie uczestniczą naturalne komórki
cytotoksyczne, które rozpoznają komórki zainfekowane przez wirusy oraz
komórki nowotworowe.
Stymulacja limfocytów Τ typu CD4+ przez specyficzny antygen może prowa-
dzić do ogólnego uaktywnienia układu immunologicznego. Stymulowane lim-
focyty Τ wytwarzają IFN-α, który aktywuje(niespecyficznie) każdego wrażli-
wego makrofaga w otoczeniu. Na przykład, odpowiedź immunologiczna na
Mycobacterium tuberculosis może pomóc w niszczeniu komórek Listeria monocyto-
genes wewnątrz makrofagów — nawet wobec braku nabytej odporności na tę
bakterię.
Odporność typu komórkowego w niektórych chorobach nie potrafi zapobiec
uszkodzeniu tkanek — lub nawet przyczynia się do tego. W gruźlicy, uszkodze-
nia towarzyszące gruzełkom gruźliczym (miejscowe, zdegenerowane miejsca
infekcji) przynajmniej w części są spowodowane znacznym zagęszczeniem
aktywowanych makrofagów wydzielających czynniki cytotoksyczne. U świnki
morskiej i człowieka dojrzałe gruzełki mają serowaty, nekrotyczny (martwiczy)
środek otoczony makrofagami oraz zewnętrzną okrywę z monocytów i limfocy-
tów (fot. 11.3). Podczas powstawania uszkodzenia, makrofagi są aktywowane
np. przez IFN-y wydzielany przez limfocyty. Jednakże, ponieważ limfocyty
nie penetrują do środka zmienionego miejsca, lecz pozostają na zewnątrz, stęże-
nie IFN-y w środkowych częściach dużego gruzełka może być zbyt małe, by
aktywować makrofagi (które prawdopodobnie wtedy giną). Sugeruje się więc,
że peryferyczne rozmieszczenie limfocytów jest powodem centralnej martwicy
obserwowanej w większych gruzełkach [Orme (1998) TIM 6: 94-97].

11.5 Patogen — czynniki wirulencji

Patogenność bakterii (szczególnie mechanizmy in vivo) jest obecnie przedmiotem
niezwykle intensywnych badań. Powodem tego jest narastająca oporność bakte-
rii na antybiotyki oraz powrót i nasilenie się starych problemów (takich jak gruź-
lica). Wydaje się, że dogłębne poznanie przebiegu choroby wewnątrz gospoda-
rza może stworzyć nowe cele dla chemioterapii lub zasugerować alternatywne
metody działania.
Badania dotyczące patogenezy nabrały przyśpieszenia po wprowadzeniu
nowych „molekularnych" metod, jak mutageneza transpozonowa i mutageneza
typu signature-tagged (ang.) (sekcja 8.5.5.3). Zarys innej nowej metody, technolo-
gii ekspresji in vivo (IVET, ang. in vivo expression technology) przedstawiono na
rysunku 11.3. IVET wykrywa te geny patogena, których promotory są aktywne
jedynie podczas infekcji gospodarza; takie geny mogą być „genami wirulencji".
Można je badać np. w testach na zwierzętach, z wykorzystaniem szczepów pato-
gena z mutacją w badanym genie.

296
Typowe części gruzełka są wskazane niżej. Centrum gruzełka składa się z bezpostaciowej, serowatej
masy martwicznej tkanki. Warstwa makrofagów nabłonkowych jest otoczona zewnętrzną warstwą
ciemno wybarwiających się limfocytów. Każda olbrzymia komórka Langhansa tworzy się w wyniku
fuzji wielu makrofagów. Jest to wielojądrzasta komórka, w której jądra są rozmieszczone peryferycz-
nie w cytoplazmie. Gruzełek klasyfikowany jest jako zmiana ziarniniakowa.

Zachowanie bakterii wewnątrz gospodarza oraz metodologia jego badania

została omówiona przez Smitha [(1998) TIM 6: 239-243].
Produkty bezsprzecznie agresywne, takie jak toksyny, są oczywiście czynni-
kami wirulencji. Jednakże, takimi czynnikami są też te produkty i strategie,
które pomagają patogenom zadomowić się w gospodarzu i uniknąć jego
układów obronnych. Niektóre z tych czynników omówione są niżej.

297
Rysunek przedstawia jedną z kilku form IVET (inne są opisane na końcu legendy).
IVET wykrywa te geny patogena, które są indukowane (włączone: podczas infekcji gospodarza zwie-
rzęcego.
Cząsteczki wektora (część górna, strona prawa) są wprowadzane na drodze transformacji (sekcja
8.4.1) do populacji komórek patogena. W każdej komórce jakiś fragment chromosomu z wektora
wbudowuje się do odpowiadającej mu części chromosomu patogena (na zasadzie mechanizmu inser-
cji-duplikacji: rys. 8.21a). Ponieważ cząsteczki wektora zawierają różne fragmenty chromosomu,
będą się wbudowywać do różnych miejsc chromosomowych w różnych komórkach, tworząc hetero-
genną populację zrekombinowanych komórek.
W niektórych z tych komórek, dwa geny pozbawione promotorów będą wstawione, zgodnie
z ramką odczytu, powyżej promotora. W takich komórkach, jeśli promotor jest aktywny, obydwa
geny ulegną transkrypcji.
Zrekombinowane komórki wykorzystuje się do infekcji zwierzęcia laboratoryjnego, któremu do
pokarmu dodano antybiotyk chloramfenikol (sekcja 15.4.4). W tych warunkach zrekombinowana
komórka rośnie, jeśli wytwarza acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT), to jest jeśli gen CAT
(w wektorze) jest pod kontrolą aktywnego promotora. Zatem fakt, że dana zrekombinowana
komórka rośnie, oznacza, że jej gen CAT jest pod kontrolą promotora aktywnego wewnątrz bada-
nego zwierzęcia (ponieważ synteza CAT odzwierciedla aktywny promotor, gen CAT czasem zwany
jest genem reporterowym). Komórki wytwarzające CAT tworzą duże populacje znacznie liczniejsze
niż te, które nie wytwarzają CAT.
Musimy wiedzieć, czy promotor kontrolujący gen CAT jest czynny jedynie wewnątrz badanego
zwierzęcia, czy jest też aktywny, gdy patogen jest namnażany np. na podłożu agarowym. Jeśli jest
aktywny jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, wskazuje to, że gen, który w zwykłych warunkach
jest pod kontrolą promotora, ulega indukcji podczas infekcji. Tego typu gen jest obiektem zaintereso-
wania, gdyż może mieć związek z wirulencją. Aby dalej zbadać aktywność promotora, odzyskiwane
bakterie wysiewa się na podłoże pozbawione chloramfenikolu, lecz zawierające X-Gal (sekcja 8.5.1.5),
i wszystkie powinny wyrosnąć. Jeśli promotor jest aktywny w hodowli, tworzy się β-galaktozydaza
(sekcja 8.5.1.5), a kolonie będą niebieskozielone, co świadczy o tym, że dany promotor ulega aktywa-
cji nie tylko w zwierzęciu laboratoryjnym. Biała kolonia (lac) świadczy o tym, że β-galaktozydaza
(i CAT) powstają jedynie w zwierzęciu laboratoryjnym, co oznacza, że promotor jest aktywny

298
 11.5.1 Unikanie fagocytozy
W przypadku niektórych patogenów ich fagocytozie zapobiega obecność otoczki
(sekcja 2.2.11). Na przykład, dla niektórych szczepów Streptococcus pyogenes
otoczka zbudowana z kwasu hialuronowego (składnik tkanek zwierzęcych) jest
rodzajem „kamuflażu". Innymi inhibitorami fagocytozy są białko Μ paciorkow-
ców (sekcja 2.2.13) oraz zbudowana z kwasu D-glutaminowego otoczka Bacillus
anthracis.
U gronkowca złocistego białko A będące składnikiem ściany komórkowej
wiąże się do części Fc przeciwciał (rys. 11.2), to jest do tej części, która zwykle
wiąże się do receptora Fc na powierzchni fagocyta.
Wiele bakterii, np. Haemophilus influenzae typ b (Hib), Neisseria meningitidis
i Streptococcus pneumoniae, wytwarza otoczki wielocukrowe. Otoczki te zazwyczaj
nie chronią przed fagocytozą u dorosłych i starszych dzieci z prawidłowym
układem immunologicznym, który reaguje: 1) produkcją przeciwciał skierowa-
nych przeciw wielocukrom, 2) wzmożoną opsonizacją za pośrednictwem do-
pełniacza (sekcja 11.4.1.1) i 3) fagocytozą. Jednak niemowlęta i małe dzieci słabo
reagują przeciwciałami na wielocukry i w tej grupie wiekowej wymienione pato-
geny mogą powodować zapalenie opon mózgowych oraz infekcje dróg oddecho-
wych. Stało się to przyczyną rozwoju i wprowadzenia szczepionek sprzężonych
(sekcja 11.4.2.1).
Yersinia spp. unika fagocytozy w inny sposób. Po kontakcie z fagocytem
bakteryjny system sekrecji typu III (sekcja 5.4) wstrzykuje do niego kilka białek.
Jedno z tych białek, YopH, jest enzymem, który defosforyluje pewne białka
gospodarza. Białka te w formie ufosforylowanej uczestniczą w procesie fagocy-
tozy oraz tzw. wybuchu tlenowym (ang. oxidative burst). Inne wydzielane
białko, YopE, narusza, przynajmniej in vitro, struktury tworzone przy współ-
udziale aktyny [The Yersinia Yop regulon: Cornelis and Wolf-Watz (1997) MM 23:
861-867]. Białko YopJ wpływa na obniżenie poziomu syntezy pewnych kinaz
i tym samym hamuje wytwarzanie prozapalnej cytokiny TNF-α W makrofagach
[Palmer i wsp. (1998) MM 27: 953-965].

wyłącznie podczas infekcji zwierzęcia. Gen, który zwykle jest pod kontrolą tego promotora, można
sklonować, zsekwencjonować itp. i zbadać jego rolę w wirulencji.
Inna wersja IVET wykorzystuje auksotroficzną populację (sekcja 8.1.2) patogena, która 1) rośnie
jedynie na podłożu agarowym wzbogaconym w odpowiedni czynnik wzrostowy, lecz 2) nie rośnie w
organizmie zwierzęcia laboratoryjnego, o ile nie jest obecny odpowiedni czynny gen. Każda cząste-
czka wektora niesie geny kodujące dany czynnik wzrostowy i β-galaktozydazę. Obydwa te geny są
pozbawione promotorów. Zasada metody jest podobna jak opisano wyżej.
W kolejnej wersji IVET, każda cząsteczka wektora zawiera transpozon kodujący oporność na tetra-
cyklinę, geny pozbawione promotorów kodujące transpozazę (sekcja 8.3) oraz β-galaktozydazę. Jeśli
promotor jest aktywny w zwierzęciu laboratoryjnym, transposaza jest syntetyzowana i następnie
wycina transpozon. Wycięty transpozon nie ulega replikacji, prowadząc do powstania klonu komó-
rek wrażliwych na tetracyklinę. Komórki te można wykryć metodą replik (sekcja 8.1.2), wykorzy-
stując równolegle podłoża pozbawione tetracykliny i zawierające ten antybiotyk. Tak jak wyżej, akty-
wność β-galaktozydazy wykorzystywana jest do wykrycia promotorów nieczynnych w hodowli.
Przykłady zastosowań IVET można znaleźć w pracy: Heithoff, Conner i Mahan [(1997) TIM 5:
509-513].

299
 11.5.2 Komórki cytotoksyczne układu immunologicznego
Fagocyty mogą być zabijane przez pewne substancje (leukocydyny), które
wydzielają niektóre gronkowce i paciorkowce. Gronkowcowa leukocydyna Pan-
tona-Valentine'a powoduje swoistą lizę makrofagów i leukocytów PMN (ang.
polymorphonuclear leucocytes).
Do tak zwanych patogenów toksyn RTX gramujemnych należy hemolizyna
HlyA E. coli. HlyA w dużym stężeniu może powodować lizę różnych komórek,
szczególnie PMN, uszkadzając ich błonę komórkową. Toksyna RTX Pasteurella
hemolytica (czynnik sprawczy chorób układu oddechowego u krów) wywołuje
lizę bydlęcych PMN. Toksyny RTX w niższych stężeniach mogą hamować two-
rzenie przeciwciał i sprzyjać patogenezie poprzez wywoływanie szkodliwych
stanów zapalnych [RTX toxins (artykuł przeglądowy): Coote (1996) RMM 7:
53-62].
Patogen jelit Shigella flexneri po fagocytozie może wydostać się z wakuoli
i zabić makrofaga za pomocą mechanizmu, w którym bierze udział białko IpaB
kodowane przez plazmid. Białko to jest wydzielane przez system sekrecji typu III
(sekcja 5.4). IpaB wiąże się do, i aktywuje, enzym makrofaga przekształcający
IL-1β. Enzym ten, z kolei, przeprowadza nieczynną IL-1β do formy aktywnej
i inicjuje apoptozę (zaprogramowaną śmierć komórki) w makrofagu [Chen i wsp.
(1996) EMBO Journal 15: 3853-3860]. Aktywowana IL-1β może indukować
odpowiedź zapalną (wytworzenie pewnych cytokin) w patogenezie czerwonki
(sekcja 11.3.3.2).

11.5.3 Zmienność antygenowa

Niektóre bakterie patogenne mogą zmieniać skład chemiczny swoich struktur
powierzchniowych i co za tym idzie — swoje antygeny. Może to być pomocne
dla bakterii, choćby przejściowo, w uniknięciu skutków działania swoistych
przeciwciał. Na przykład, w durze powrotnym (powodowanym przez gatunek
z rodzaju Borrelia) zachodzi kilka cykli gorączki i remisji, a bakterie izolowane
z krwi podczas każdego nawrotu gorączki mają inne antygeny powierzchniowe.
W przypadku B. hermsii antygeny podlegające zmienności są kodowane przez
wielokopiowy plazmid liniowy. Zmienność antygenowa jest najprawdopodob-
niej wynikiem rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8.2.2) — między poszczegól-
nymi plazmidami w danej komórce. Rekombinacja tego typu odpowiada za
zmienność fazową u Salmonella (rys. 8.3c).
U Helicobacter pylori zmienność antygenowa wiąże się z rekombinacją mię-
dzy genami o zbliżonych sekwencjach, kodujących różne białka powierzch-
niowe. Możliwe jest też, że zmienność jest wynikiem zmiany ramki odczytu
w translacji (sekcja 7.8.7). Sekwencje charakterystyczne dla tego typu mechani-
zmu zostały odnalezione w genomie tej bakterii [Tomb i wsp. (1997) Nature 388:
539-547].
Zmienność fazowa adhezyn Opa Neisseria wiąże się z rearanżacjami w DNA,
które mogą zmieniać ramki odczytu w genach opa.

300
 11.5.4 Moduliny
Moduliny to czynniki wirulencji, które mogą być szkodliwe dla gospodarza
z powodu indukowania nieodpowiedniej aktywności różnych cytokin [Hender-
son, Poole i Wilson (1996) MR 60: 316-341]. Cytokiny są białkami sygnałowymi,
które zazwyczaj koordynują aktywność różnych składników układu immunolo-
gicznego (np. odpowiedź zapalną). Są zatem potrzebne do skutecznej ochrony
przed patogennymi drobnoustrojami. Ponieważ cytokiny mają szeroki zakres
funkcji (tab. 11.4) i są ważnymi czynnikami fizjologicznymi, ich niewłaściwa
aktywność może prowadzić do efektów patologicznych, tak jak na przykład
w szoku endotoksycznym (sekcja 11.3.4; patrz też sekcja 11.3.6).
Do modulin należą endotoksyny (sekcja 11.3.4), fragmenty mureiny (pepty-
doglikanu) ściany bakteryjnej (które indukują np. IL-1β i IL-6 w monocytach);
superantygeny (sekcja 11.5.4.1) i toksyny podobne do toksyny shiga (które indu-
kują TL-1α, IL-6 i TNF-α w makrofagach). Cytokiny 11-1, IL-4, IL-6, TNF-α i IFN-α
są indukowane w komórkach jednojądrzastych przez białko A, które występuje
na powierzchni większości szczepów Staphylococcus aureus. Białko A działa rów-
nież jako czynnik antyfagocytarny wirulencji, wiążąc część Fc przeciwciał IgG.

11.5.4.1 Superantygeny
Superantygen A jest białkiem wydzielanym przez pewne patogeny, silnie
wiążącym się do tych limfocytów T, których receptory wyrażają dany łańcuch
Vb, i równocześnie mogącym wiązać się do cząsteczki klasy II głównego układu
zgodności tkankowej (MHC, ang. major histocompatibility complex,) na ko-
mórce prezentującej antygen (sekcja 11.4.2.1). Tego typu wiązanie powoduje pro-
liferacje limfocytów Τ oraz wydzielanie cytokin. Ponieważ populacja limfocy-
tów Τ wyrażających dany łańcuch Vb obejmuje wiele indywidualnych klonów
(z których każdy jest specyficzny dla danego, unikalnego antygenu), efektem jest
aktywacja poliklonalna, to jest aktywacja wielu różnych typów limfocytów C,
tak by był obecny cały zakres odmiennych antygenów. Wynikające z tego masy-
wne uwolnienie cytokin (z limfocytów T, komórek prezentujących antygen itp.)
może prowadzić do stanu zwanego zespołem wstrząsu toksycznego (TSS,
ang. toxic shock Syndrome) (sekcja 11.11) oraz prawdopodobnie również do
zespołu Kawasaki.
Superantygeny mogą aktywować zarówno komórki DD4+, jak i CD8+, wiążąc
się do łańcuchów Vb w miejscach będących poza rejonem wiązania antygenu.
Poszczególne superantygeny mogą preferencyjnie wiązać się do odmiennych
łańcuchów Vb (wpływając w ten sposób na różne subpopulacje limfocytów T).
W wyniku aktywacji, komórki danej subpopulacji ulegają proliferacji. Na
przykład u gryzoni większość komórek danej subpopulacji następnie zamiera,
a zwierzę przejawia (przejściowo) brak reakcji (anergię) na dany antygen.
W przypadku gryzoni anergia wobec danego antygenu może trwać miesiącami,
lecz u ludzi zjawiska tego nie obserwuje się.
Do możliwych terapeutycznych zastosowań superantygenów należy supresja
swoistych subpopulacji limfocytów Τ lub aktywacja limfocytów Τ ο aktywności
przeciwnowotworowej.

301
 „Superantygeny limfocytów B" są analogicznymi cząsteczkami, wiążącymi
się do łańcucha VH receptora na tych limfocytach.
Do superantygenów należą enterotoksyny Staphylococus aureus (enterotok-
syna F = toksyna 1 zespołu wstrząsu toksycznego) (TSST-1, ang. toxic shock
Syndrome toxin 1) oraz pewne toksyny paciorkowców grupy A, w tym pacior-
kowcowa egzotoksyna A, zwana paciorkowcowym superantygenem A (SSA,
ang. streptococcal superantigen A). Gen kodujący TSST-1 znajduje się na mobil-
nej wyspie patogenności (sekcja 11.5.7) i sugerowano, że owa mobilność może
być przyczyną rozprzestrzeniania się toksygenności TSST-1 u Staphylococcus
aureus [Lindsay i wsp. (1998) MM 29: 527-543].
[Superantygeny (artykuł przeglądowy): Fleischer (1995) RMM 6: 49-57; kli-
niczne znaczenie superantygenów dla limfocytów T: Michie i Cohen (1998) TIM
6: 61-65].

11.5.5 Patogenność i żelazo

Patogeny wymagają żelaza m. in. do syntezy niektórych enzymów i/lub cyto-
chromów, lecz może ono być trudno dostępne w organizmie gospodarza. Na
przykład w układzie krwionośnym ssaków glikoproteina gospodarza o właści-
wościach chelatujących żelazo, tak zwana transferyna, wiąże żelazo i przekazuje
je do komórek. Aby poradzić sobie z tym problemem, wiele patogenów koduje
własny system pobierania żelaza w postaci syderoforu, niskocząsteczkowego
chelatora jonu żelazowego wydzielanego przez patogena, oraz receptorów na
powierzchni komórki bakteryjnej, które wiążą kompleks żelazo-syderofor. Pato-
genne, pozajelitowe szczepy E. coli (np. te, które wywołują zapalenie opon móz-
gowych u noworodków) często wytwarzają aerobaktynę, siderofor z klasy
hydroksamatów, który po związaniu żelaza łączy się z receptorem w błonie zew-
nętrznej. Aerobaktyna skutecznie konkuruje z transferyną [Accjuisition of trans-
ferrin-bound iron by pathogens (artykuł przeglądowy): Cornelissen i Sparling
(1994) MM 14: 843-850].
Teoretycznie, siderofory mogłyby po prostu przenosić żelazo ze środowiska
do receptorów na powierzchni komórki. Jednakże, np. u E. coli siderofor zwany
enterocheliną (syn. enterobaktyna) najpierw wiąże się do receptora (białko FepA
w błonie zewnętrznej), a następnie zostaje przeniesieny do wnętrza komórki.
W cytoplazmie żelazo uwalniane jest dopiero po rozszczepieniu sideroforu przez
3+ 2+
esterazę. Fe ulega redukcji do Fe .
W przypadku Pseudomonas aeruginosa brak żelaza inicjuje syntezę zielo-
nożółtego fluoryzującego sideroforu — piowerdyny, który stymuluje wzrost
patogena nawet w obecności transferyny. Mechanizm regulowanej przez żelazo
indukcji piowerdyny (rys. 11.4) zaproponował Leoni i wsp. [(1996) JB 178:
2299-2313].
Salmonella typhimurium koduje syderofor z grupy katecholamin — enteroche-
linę, której ekspresja, podobnie jak w przypadku piowerdyny P. aeruginosa, jest
związana z regulacją przez białko Fur. U S. typhimurium białko Fur jest również
regulatorem odpowiedzi o charakterze tolerancji na kwasowość środowiska (sek-
cja 7.8.2.6).

302
(a) W odpowiednich stężeniach żelaza, represor transkrypcji, białko Fur (produkt genu fur) silnie
wiąże się do wysoce konserwatywnego regionu DNA (obszaru Fur), hamując transkrypcję genu pvdS.
(b) Gdy stężenie żelaza jest niewystarczające, Fur nie wiąże się do obszaru Fur, pozwalając na trans-
krypcję pvdS. Produkt pvdS (PvdS) jest czynnikiem sigma (patrz sekcje 7.5 i 7.8.9), który jest nie-
zbędny do transkrypcji innych genów uczestniczących w biosyntezie piowerdyny.

Mycobacterium tuberculosis do wzrostu zewnątrzkomórkowego wykorzystuje

syderofor egzochelinę oraz związany ze ścianą bakteryjną lipidowy związek,
zwanym mykobaktyną. Egzochelina odbiera żelazo od chelatorów gospodarza
(syderofilin: transferyny i/lub laktoferyny) i przekazuje je do mykobaktyny,
która uczestniczy w internalizacji. Transferyna występuje w osoczu, laktoferyna
w wydzielinach.
Niektóre patogeny uzyskują żelazo bezpośrednio z syderoforów gospodarza.
Neisseria gonorrhoeae ma receptory dla ludzkiej transferyny, a N. meningitidis
wiąże transferynę człowieka i niektórych innych naczelnych. Receptor na po-
wierzchni komórki bakteryjnej składa się z dwóch białek — TbpA i TbpB.
Szczepy tych patogenów, które nie potrafią wiązać siderofilin (z powodu braku
receptorów), są awirulentne. Co więcej, szczepy, które wytwarzają receptory, są
wirulentne jedynie w tych gatunkach gospodarza, w których receptory są
efektywne.
Helicobacter pylori uzyskuje żelazo z laktoferyny, gdy znajduje się w świetle
żołądka. Jednakże, kiedy organizm ten wnika pomiędzy komórki jego ściany,
jedynym źródłem żelaza jest hem, który wiąże się do specyficznych receptorów
w błonie zewnętrznej.
Do innych sposobów zdobycia żelaza przez patogeny należą: asymilacja
hemu po lizie erytrocytów oraz wykorzystanie wewnątrzkomórkowego żelaza
gospodarza.
Metody do zdobycia żelaza przez danego patogena określają, przynajmniej
częściowo, jakie gatunki gospodarza są podatne na zakażenie przez tego pato-
gena, jak również rodzaje wrażliwych tkanek/komórek. Dzieje się tak dlatego, że
patogen namnaża się jedynie w gospodarzach/tkankach/komórkach, w których
ma dostęp do odpowiedniej ilości żelaza. Actinobacillus pleuropneumoniae, na
przykład, ma receptory powierzchniowe dla transferyny świńskiej, a więc orga-
nizm ten powoduje zapalenie płuc u świń, a nie u ludzi. Z kolei zaś, Listeria mono-

303
cytogenes powoduje schorzenia bydła, owiec i ludzi, ponieważ ma zdolność
wykorzystywania syderoforów innych bakterii, jak również różnych związków
chelatujących żelazo, występujących w środowisku oraz w ssaczych gospoda-
rzach. Patogen ten najprawdopodobniej wykorzystuje enzym związany z powie-
rzchnię jego komórki, tj. reduktazę żelazową, która rozpoznaje wszystkie te
rodzaje chelatorów, nie musi zatem wytwarzać osobnych receptorów dla każ-
dego chelatora.
Absolutne wymagania patogenów dotyczące żelaza doprowadziły do bada-
nia możliwości wyprodukowania nowych szczepionek stymulujących wytwa-
rzanie przeciwciał skierowanych przeciw powierzchniowym receptorom dla
siderofilin (patrz sekcja 11.4.2.1).
Rolę żelaza w patogenezie wyczerpująco omówiono w artykule Weinberga
[(1998) RMM 9: 171-178].

11.5.6 Adhezyny
Zdolność patogena do adhezji na specyficznych komórkach w tkankach gospo-
darza jest często ważnym czynnikiem wirulencji (sekcja 11.2.1). Struktury czy
cząsteczki na powierzchni komórki bakteryjnej, które przyczyniają się do adhezji,
zwane są adhezynami. Istnieją różnego typu adhezyny, a dana bakteria może
wytwarzać kilka ich rodzajów. Niektóre adhezyny mają popularne nazwy, jak
inwazyna (Yersinia enterocolitica), internalina (Listeria monocytogenes), intymina
(szczepy EHEC, EPEC).
W wielu przypadkach adhezyny są fimbriami (sekcja 2.2.14.2) i często są
kodowane przez plazmidy. Szczepy ETEC (tab. 11.2) dysponują ponad 10 rodza-
jami fimbrii działających jako adhezyny, oraz kilkoma rodzajami adhezyn nie
będących fimbriami. [Gaastra i van der Zeist (1996) RMM 7: 165-177]. Do tych
ostatnich należą też paciorkowcowe białka Μ (sekcja 2.2.13).
Adhezyna TCP Vibrio cholerne jest ważna nie tylko z powodu uczestnictwa
w procesie adhezji, lecz również jako receptor dla faga, który promuje rozprze-
strzenianie się wśród szczepów patogena genów kodujących tę toksynę (sekcja
11.5.8).
Adhezyny białkowe Staphylococcus aureus, które zazwyczaj są związane
z peptydoglikanem (mureiną) ściany komórkowej, wykazują powinowactwo do
składników zewnątrzkomórkowej matriks komórek ssaków, jak kolagen i fibro-
nektyna [Foster i Hook (1998) TIM 6: 484-488].
Wszystkie patogenne szczepy z rodzaju Neisseria kodują adhezyny białkowe
zwane Opa. Patrz: Dehio, Gray-Owen i Meyer (1998) TIM 6: 489-495].

11.5.7 Wyspy patogenności

Wyspa patogenności [artykuł przeglądowy: Groisman i Ochman (1996) Cell
87: 791-794] to zbiór lub „kaseta" kilku do wielu genów kodujących zespół
czynników wirulencji. Wyspy takie występują w chromosomie i/lub w poza-
chromosomowych elementach, to jest plazmidach. Wyspy te charakteryzują się

304
zazwyczaj inną zawartością par GC niż w chromosomie danej bakterii, co
sugeruje, że ich nabywanie następuje w wyniku „horyzontalnego transferu
genów" (np. w koniugacji). Ciekawe jest, że procent GC w zespole genów
wirulencji Listeria monocyłogenes jest podobny do tego w pozostałej części
chromosomu.
Jednym z przykładów jest region chromosomów wielkości 35 kz w szcze-
pach EPEC (tab. 11.2), kodujący czynniki, przy pomocy których patogen wytwa-
rza charakterystyczne zmiany — „ang. attaching and effacing lesions" (sekcja
11.2.1). Region ten, wyspa patogenności LEE (ang. locus of enterocyte efface-
ment) [patrz np. Kaper (1998) TIM 6: 169-172], położony jest poniżej genu selC
(który koduje selenocysteinylo-tRNA). Do ciekawostek należy to, że uropato-
genny szczep E. coli (UPEC) zawiera inną wyspę patogenności (PAI-1 o wielko-
ści 70 kz kodującą np. hemolizynę), której miejsce integracji w chromosomie jest
dokładnie takie samo. Wydaje się przeto, że niepatogenny szczep E. coli może
po nabyciu wyspy LEE lub PAI-1 przeistoczyć się odpowiednio w EPEC lub
UPEC. Jednakże, samo nabycie wyspy patogenności nie gwarantuje zmiany
w patogenie, gdyż importowane geny muszą funkcjonować w zespole genów
całego chromosomu.
Do innych (chromosomowych) przykładów należą wyspa kodująca TCP
u Vibrio cholerae (sekcja 11.3.1.1) oraz wyspa cag u Helicobacter pylori [Tomb i wsp.
(1997) 388: 539-547].
Kilka wyraźnych wysp patogenności występuje u Salmonella, a jedna z nich
jak się wydaje, specyficznie przyczynia się do enteropatogenności (w przeciwień-
stwie do salmonellozy układowej) [Wood i wsp. (1998) MM 29: 883-891].
Gen toksyny zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1) Staphylococcus aureus
znajduje się na mobilnej wyspie patogenności [Lindsay i wsp. (1998) MM 29:
527-543].

11.5.8 Wpływ środowiska gospodarza na transfer czynników wirulencji

pomiędzy infekującymi bakteriami
Niedawne badania wskazują, że sygnały wewnątrz organizmu ssaka będącego
środowiskiem dla bakterii mogą sprzyjać transferowi toksygenności pomiędzy
szczepami infekujących bakterii. W warunkach in vitro (laboratoryjnych)
fag CTXO, który koduje toksynę cholery (sekcja 11.3.1.1), infekuje niektóre
szczepy V. cholerae CT~ z bardzo mała częstością. Jednakże, wewnątrz jelita
myszy, wydajność konwersji lizogennej tych szczepów przez CTXO (pocho-
+
dzącego z koinfekującego szczepu CT ) jest o prawie milion razy większa. Ta
zwiększona wydajność konwersji wydaje się wynikiem indukcji pilusów
TCP (sekcja 11.3.1.1) w odpowiedzi na sygnały w środowisku jelita, które następ-
nie służą jako receptory dla faga CTΧΦ. Przykład ten jest dobrą ilustracją
ogólnego rozprzestrzeniania się czynników wirulencji; bowiem jest wysoce
prawdopodobne, że czynnik, który w warunkach laboratoryjnych wydaje się
nie przenosić, w środowisku in vivo czyni to z łatwością [patrz Mel i Mekalanos
(19966) Cell 87: 795-798].

305
 11.6 Interakcje między patogenem a gospodarzem
— nowa perspektywa
Badania na poziomie molekularnym wykazały, że przebieg patogenezy może
być znacznie bardziej złożony niż wcześniej myślano. Informacji dotyczących
aktywności patogenów wewnątrz ich gospodarzy dostarczają różne nowe
metody, w tym np. STM (rys. 8.22) i IVET (rys. 11.3), które monitorują ekspresję
genów patogena podczas infekcji zwierząt będących gospodarzem. Jest teraz
jasne, że patogeny często „manipulują" funkcjami komórek gospodarza oraz że
niektóre bakterie chorobotwórcze mają wspólne mechanizmy jego eksploatacji
[artykuł przeglądowy: Finlay i Cossart (1997) Science 276: 718-725]. Geny gospo-
darza uczestniczące w interakcjach między patogenem a nim samym zbadano
przy pomocy myszy z „nokautami" genowymi (sekcja 8.5.5.4; tab. 8.2).
Do przykładów znanych lub proponowanych interakcji należą:
• zwiększona synteza miejsc receptorowych komórek gospodarza w wyniku
wstępnego związania Bordetella pertussis (sekcja 11.2.1).
• Fosforylacja przez gospodarza białka wydzielanego przez bakterię — białko
to następnie ulega insercji do błony komórkowej gospodarza, gdzie pełni
funkcję receptora dla patogena (sekcja 11.2.1).
• Bakteryjna indukcja cytoszkieletowych rearanżacji w komórce gospodarza
przed inwazją (sekcja 11.2.2).
• Indukcja specyficznych adhezyn na powierzchni Vibrio cholerae przez syg-
nały płynące z jelitowego środowiska gospodarza (sekcja 11.5.8). Podobną
indukcję fimbrii, w warunkach in vivo, opisano dla szczepu ETEC
kodującego STb.
• Indukcja „samobójstwa" (apoptozy) komórki gospodarza przez patogena
(sekcja 11.5.2).
• Indukcja cytokin za pośrednictwem toksyn, co powoduje wzrost podatności
gospodarza z powodu zwiększonej syntezy miejsc receptorowych
wiążących toksynę (sekcja 11.3.1.6). Zdolność toksyn do wpływania na
populację cytokin gospodarza jest dość częsta [Henderson, Wilson i Wren
(1997) TIM 5: 454-458].

11.7 Rozprzestrzenianie się choroby

W niektórych chorobach patogen zazwyczaj nie przechodzi od jednego osobnika
do drugiego. Przykładami są tężec i zgorzel gazowa. W schorzeniach tych pato-
gen zazwyczaj pochodzi z gleby, a nie od innego zakażonego osobnika.
Inne choroby bezpośrednio lub pośrednio przenoszą się między osobnikami
(ludźmi lub lub zwierzętami). Jedynie stosunkowo rzadko przeniesienie choroby
wymaga bezpośredniego kontaktu między osobnikiem zakażonym i zdrowym,
a sprawcą zazwyczaj jest patogen, który nie może przetrwać dłuższy czas poza
organizmem. Przykładem może być choroba weneryczna kiła, powodowana
przez krętka Treponema pallidum.

306
 Większość chorób przenosi się pośrednio z jednej osoby na drugą w sposób,
który na ogół wiąże się z najczęstszą drogą infekcji (sekcja 11.2). Na przykład,
patogeny, które zakażają poprzez przewód pokarmowy, zwykle przenoszą się
z zakażoną wodą lub żywnością. W ten sposób zwykle rozprzestrzenia się zapa-
lenie żołądkowo-jelitowe, czerwonka, dur brzuszny i cholera. Tego typu rozno-
szenie choroby na ogól jest związane z zanieczyszczeniem wody lub żywności
przez kał pacjenta cierpiącego na dana chorobę. Może się to zdarzyć, kiedy osoba
pracująca przy żywności ma ślady kału na rękach, gdy mucha domowa siada na
przemian na kale i żywności, czy też jest przeciek ścieków do źródła wody pitnej
(patrz też sekcje 12.3.2 i 13.5.1.3). Często można prześledzić przechodzenie pato-
gena — poprzez żywność lub wodę — do osobnika(ów) cierpiących na daną cho-
robę. Czasami źródłem patogena jest osoba, która nie choruje, lecz jest gospoda-
rzem dla patogena i tym samym rezerwuarem infekcji. Taka najwyraźniej
zdrowa osoba, będąca źródłem patogennych organizmów, zwana jest nosicie-
lem. Jedna „sławna" nosicielka, kucharka Mary Mallon, zaraziła prawie trzy-
dzieści osób, zanim została zidentyfikowana. Określenie „durowa Mary" jest
czasami używane w odniesieniu do rzeczywistego lub potencjalnego nosiciela
duru brzusznego lub innych chorób.
Patogeny zakażające poprzez układ oddechowy często są rozprzestrzenianie
tzw. drogą kropelkową. Kiedy ktoś kaszle lub kicha lub nawet głośno mówi,
przez pewien czas w powietrzu pozostają zawieszone drobniutkie kropelki
wydzielin błon śluzowych wydostające się z ust. Kropelki te mogą zawierać
organizmy patogenne, o ile występowały one na powierzchniach układu odde-
chowego. Ponieważ najmniejsze z tych kropelek utrzymują się w powietrzu
przez dłuższy czas, mogą być wdychane przez inne osobniki, będąc zatem prze-
nosicielami patogena. Przykładami chorób przenoszonych w ten właśnie sposób
są gruźlica, krztusiec i błonica.
Niektóre bakterie patogenne są przekazywane od jednej osoby do drugiej
za pośrednictwem wektora. Na przykład, dżumę dymieniczą (gruczołową)
(powodowaną przez Yersinia pestis) przenoszą pchły, dur wysypkowy (Rickettsia
prowazekii) — wszy, a tularemię (wywoływaną przez Francisella tularensis) —
gryzące muchy lub kleszcze. Kolejny przykład to gorączka Oroya (sekcja
11.3.3.3).

11.8 Wykrywanie i charakterystyka patogenów

w laboratorium
Szybkie wykrycie, identyfikacja i typowanie patogena jest szczególnie ważne
w niektórych chorobach i niekiedy bywa możliwe z użyciem technik wykorzy-
stujących kwasy nukleinowe: sekcja 16.1.6.
Bakterie podejrzane o spowodowanie choroby, a nie dające się wyhodować
w laboratorium, można zbadać stosując procedurę amplifikacji wykorzystującą
PCR; patrz np. choroba Whipple'a (sekcja 11.11).
Tradycyjne metody badań i opisów są nadal powszechne. Niektóre z nich
w zarysie przedstawiono niżej.

307
 11.8.1 Wyhodowanie patogena i wykrycie toksyny
Często (tam, gdzie to możliwe) podejmowane są próby wyhodowania patogena
z próbki np. śliny, ropy, moczu lub kału. By założyć hodowlę, mocz można
odwirować, a otrzymany osad użyć jako inokulum. Próbkę kału można zawiesić
w roztworze Ringera, a następnie część zawiesiny użyć jako inokulum. Wybór
podłoża oraz warunków inkubacji zależy od inokulum i rodzaju prawdopob-
nego patogena. Do hodowli stosuje się podłoże wzbogacające (sekcja 14.2.1).
Zarys procedury hodowli w krwi podano w sekcji 11.8.1.1.
Próbki (np. zakażona żywność) podejrzane o obecność egzotoksyny bada się
za pomocą różnych metod (patrz np. sekcja 12.3.1.1). Hodowlę Corynebacterium
diphtheriae można zbadać pod kątem toksykogenności (zdolności do wytwarza-
nia toksyny) np. metodą Eleka (sekcja 11.8.1.2).

11.8.1.1 Hodowle krwi

Hodowle krwi wykorzystuje się np. do wykrywania drobnoustrojów przenoszo-
nych przez krew, przede wszystkim bakterii, w takich chorobach jak dur brzu-
szny. Wprowadza się 5-10 ml krwi pobranej sterylnie od pacjenta (sekcja 14.3)
do 50-100 ml podłoża, np. bulionu tryptozowo-sojowego. Podłoże zwykle
uzupełniane jest czynnikiem hamującym krzepnięcie krwi, a czasem również
enzymami inaktywującymi antybiotyki przeniesione wraz z krwią. Zaszczepione
podłoże inkubuje się i codziennie bada robiąc wysiewy na odpowiednie podło-
że stałe.
Do wykrycia lub identyfikacji organizmów w hodowlach krwi można stoso-
wać metodę PCR (sekcja 8.5.4) poprzez amplifikację bakteryjnego DNA z uży-
ciem starterów swoistych dla danego gatunku. Można w ten sposób uzyskiwać
szybkie wyniki oraz wykrywać bakterie nie dające się wyhodować lub uszko-
dzone przez antybiotyk. Problemami w tej metodzie są: 1) konieczność stosowa-
nia tradycyjnych hodowli do badania podatności na antybiotyki (dopóki nie sta-
nie się dostępna technologia wykorzystująca do tego celu kwasy nukleinowe),
2) obecność, w hodowlach krwi, inhibitorów PCR, np. heminy, oraz czynników
przeciwzakrzepowych, jak heparyna, 3) niemożność określania intensywności
bakteriemii (to jest miana bakterii w próbce krwi) techniką PCR, chociaż ten pro-
blem może da się rozwiązać stosując techniki rozcieńczania. Niektóre handlowe
podłoża do hodowli krwi mogą zawierać polianetosulfonian sodowy (SPS) jako
czynnik zapobiegający krzepnięciu krwi oraz anty-dopełniacz. SPS hamuje PCR
i jego usunięcie z próbek stosowanych do PCR ułatwia wykrycie bakteryjnego
DNA w podłożach do hodowli krwi [Fredericks i Relman (1998) JCM 36:
2810-2816].
W niektórych przypadkach bakteriemii izolowane są beztlenowce (np. Bacte-
roides fragilis), w związku z czym pożyteczne są próby równoczesnego wykrywa-
nia tlenowców i beztlenowców. Tego typu podejście sprzyja również identyfika-
cji fakultatywnych tlenowców (sekcja 3.1.6) w podłożach beztlenowych. Proble-
mem jednak jest to, że obecnie stosowane podłoża do hodowli krwi nie są idealne
do tego celu. Świadczą o tym choćby dane dotyczące częstości występowania
bakteriemii powodowanej przez bakterie beztlenowe. Do skutecznej izolacji

308
beztlenowców powinno się stosować podłoża redukowane, sterylizowane
w warunkach beztlenowych [Anaerobic blood culture: Goldstein i wsp. (1997)
RMM 8: (suplement 1) S87-S89].

11.8.1.2 Wykrywanie toksyny błonicznej — płytka Eleka

Metodą tą wykrywa się toksynę bloniczną Corynebacterium diphtheriae. Sposób
przygotowania testu jest pokazany w fotografii 11.4 (część górna). Na wytwarza-
nie toksyny przez dany szczep wskazuje powstanie po inkubacji białawych linii
precypitatu. Precypitat ten jest wynikiem połączenia toksyny i antytoksyny,
które dyfundują z linii wzrostu oraz paska papieru. Konieczne jest stosowanie
kontroli pozytywnej i negatywnej, to jest toksykogennych i nietoksykogennych
szczepów C. diphtheriae. Wynik odczytuje się po 25-48 godzin inkubacji.
Ulepszona forma tego testu (fot. 11.4, część dolna) pozwala na odczyt już po 16
godzinach [Engler i wsp. (1997) JCM 35: 495-498].

11.8.2 Mikroskopia immunofiuorescencyjna

Technika ta pozwala na wykrycie specyficznego typu organizmu w rozmazie
(sekcja 14.9) zawierającym mieszaninę drobnoustrojów. Przeciwciała (sekcja
11.4.2.1) swoiste dla danego organizmu są najpierw chemicznie wiązane z fluory-
zującym barwnikiem (np. fluoresceiną). Koniugat (zawiesina przeciwciał
połączonych z barwnikiem) zostaje dodany do rozmazu. Po spłukaniu nie-
związanego koniugatu, preparat ogląda się pod mikroskopem epifluorescencyj-
nym, w którym światło ultrafioletowe skierowane jest na obiekt od góry. Światło
widzialne pochodzące od związanych, fluoryzujących przeciwciał widziane jest
tak jak zwykle, tzn. za pośrednictwem obiektywu mikroskopu.

11.8.3. Test wiązania dopełniacza

Test wiązania dopełniacza (CFT, ang. complement-fixation test) może być wyko-
rzystany do wykrywania swoistych przeciwciał w próbce surowicy. Obecność
przeciwciał przeciw konkretnemu patogenowi może wskazywać na trwające lub
przeszłe zakażenie tą bakterią.
Dopełniacz (sekcja 11.4.1.1) jest wiązany przez większość typów kompleksów
antygen-przeciwciało (sekcja 11.4.2.1). Zatem, jeśli po dodaniu do mieszaniny
swoistego antygenu i dopełniacza surowicy zajdzie wiązanie, oznacza to, że
zawiera ona przeciwciała pasujące do antygenu. Wiązanie w danej mieszaninie
reakcyjnej powoduje zmniejszenie ilości wolnego dopełniacza. Efekt taki oraz
jego wielkość, odzwierciedlającą ilość swoistego przeciwciała w próbce suro-
wicy, oznacza się za pomocą CFT.
Próbkę surowicy najpierw ogrzewa się (56°C/40 min), by zniszczyć własny
dopełniacz pacjenta, a następnie wykonuje się serię rozcieńczeń. Do każdego roz-
cieńczenia dodaje się standardową ilość swoistego antygenu i całość inkubuje
się przez 18 godz. w 4°C. Obecność/brak oraz ilość swoistego przeciwciała

309
Część górna: metoda standardowa. Na odpowiednie podłoże wzrostowe wysiano rysą, równolegle,
siedem szczepów C. diphtheriae: pięć szczepów testowych, jeden kontrolny szczep pozytywny (toksy-
genny) i jeden negatywny (metoksygenny). Szczep pozytywny jest u góry, negatywny u dołu. Przed
inkubacją, na podłoże położono pasek bibuły filtracyjnej impregnowanej antytoksyną (surowicą
zawierającą przeciwciała przeciw toksynie błonicznej). Po 24-48 godz. inkubacji, na obecność szczepu
toksygennego wskazuje cienka linia białawego precypitatu toksyny-antytoksyny (sekcja 11.8.1.2).
Zwróć uwagę, że szczep obok pozytywnej kontroli wytworzył linie precypitatu, które zlewają się
dokładnie z kontrolą. Tego rodzaju „linie identyczności" wskazują, że szczepy kontrolny i badany
tworzą podobny, ulegający dyfuzji produkt. Zwróć również uwagę, że ostatnia linia wzrostu (kon-
trola negatywna) nie tworzy linii precypitatu.
Część dolna: metoda zmodyfikowana. Ta forma testu jest oparta na metodologii stosowanej w Rosji
i na Ukrainie. W środku płytki umieszcza się krążek nasączony antytoksyną, a szczepy badane i kon-
trolne (pozytywne i negatywne) nanoszone są wokół niego, tak jak na fotografii. C. diphtheriae szczep
NCTC 10648 jest mocną kontrolą pozytywną, NCTC jest szczepem słabo pozytywnym, a NCTC 10356
jest kontrolą negatywną. Τ to toksynogenny szczep (dwukrotnie na tej samej płytce).
Zdjęcia dzięki uprzejmości dr Kathryn H. Engler, Public Health Laboratory Service, Central Public
health laboratory, London, UK.

310
w danym rozcieńczeniu surowicy określa się na podstawie ilości wolnego (nie
związanego) dopełniacza. Postały dopełniacz oznacza się przez dodając do każ-
dego rozcieńczenia system hemolityczny, to jest zawiesinę „uczulonych" erytro-
cytów, które w obecności dopełniacza ulegają lizie. Jeśli w danym rozcieńczeniu
surowicy nie następuje liza erytrocytów (komórki sedymentują), to nie zawiera
ono już dopełniacza i nastąpiło maksymalne związanie antygen-przeciwciało.
Inaczej mówiąc, przy tym rozcieńczeniu surowicy stężenie przeciwciał było na
tyle wysokie, że po utworzeniu kompleksu z antygenem cały dopełniacz został
związany. Jeśli, z kolei, wszystkie erytrocyty ulegają lizie w największym stęże-
niu surowicy, to test jest ujemny. Oznacza to, że surowica ta zawierała cały
dodany dopełniacz, a zatem brak w niej wykrywalnych przeciwciał.
Wykonując CFT należy pamiętać o odpowiednich kontrolach.
Dobrym przykładem CFT jest klasyczny test Wassermana wykrywania kiły.

11.8.4 Test immunoenzymatyczny

Test immunoenzymatyczny (ELISA, ang. enzyme-linked immunosorbent assay)
jest bardzo czułym sposobem wykrywania swoistych antygenów lub przeciw-
ciał. Zasada tego testu jest przedstawiona na rysunku 11.5.

11.8.5 Hybrydyzacja in situ (ISH) i hybrydyzacja fluorescencyjna

in situ (FISH)
Stosując znakowane sondy (sekcja 8.5.3) często można wykryć patogenne bak-
terie in situ — wewnątrz zakażonej tkanki. Sondy zawierają sekwencje nukleoty-
dów specyficzne dla danego szczepu lub gatunku, które hybrydyzują z komple-
mentarnymi sekwencjami w DNA lub RNA patogena.
Bezpośrednie wykrycie patogenów za pomocą ISH (ang. in situ hybridiza-
tion) ma dwie główne zalety. Po pierwsze ISH wykrywa patogena zanim da się
go wyhodować, co jest szczególnie istotne w przypadku długiego czasu wzrostu
(np. tygodnie dla Mycobacterium tuberculosis) lub jeśli w ogóle nie daje się go
hodować (np. Mycobacterium leprae). Gatunki z rodzaju Mycobacterium wykryto
metodą ISH zarówno w świeżo zamrożonych skrawkach zakażonej tkanki, jak
i w skrawkach tkanek zatopionych w parafinie.
Po drugie, ISH może być użyteczny w diagnozie u pacjentów z niedoborem
układu immunologicznego (np. AIDS), u których słaba reakcja immunologiczna
może wykluczyć stosowanie testów serologicznych ukierunkowanych na prze-
ciwciała przeciw konkretnym patogenom. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, prze-
ciwciała nie muszą być wykrywalne na każdym etapie infekcji.
ISH rozróżnia wirulentne i niewirulentne szczepy patogena na podstawie
sond wykrywających geny kodujące swoiste czynniki wirulencji.
Początkowo do badań wykorzystywano radioizotopy. Zapewniają one
wysoką czułość przy ograniczonej rozdzielczości będącej wynikiem drogi roz-
padu cząsteczek radioaktywnych w emulsji fotograficznej. Wadą metodologii
wykorzystującej radioizotopy są jednak związane z nimi zagrożenia oraz koszty.

311
(a) Specyficzny antygen (pełne kółka) jest immobilizowany np. na wewnętrznej powierzchni pro-
bówki z tworzywa sztucznego, a następnie wprowadzony w kontakt z surowicą. Pojedyncza cząste-
czka specyficznego przeciwciała wiąże się z odpowiadającym jej antygenem. Przeciwciała, które nie
związały się, są następnie wymywane.
(b) Pojedyncze, związane przeciwciało jest wykrywane za pomocą przeciwciał skierowanych przeciw
immunoglobulinie, tzn. takich, dla których antygenami są również specyficzne przeciwciała. Przed
użyciem, każde przeciwciało antyimmunoglobulinowe jest chemicznie sprzęgnięte ze szczególnym
enzymem. Kompleks przeciwciało antyimmunoglobulinowe-enzym (trójkąt) wiąże się do pojedyn-
czego związanego przeciwciała, powodując jego wyznakowanie przez enzym. Wykrycie enzymu
pozwala na stwierdzenie tego przeciwciała. Wykrycie enzymu polega na dodaniu odpowiedniego
substratu, który w obecności enzymu daje wykrywalny produkt, ulegający amplifikacji na skutek
ciągłej aktywności enzymatycznej.

Obecnie szeroko wykorzystuje się znakowanie fluorescencyjne (oraz mikrosko-

pię epifluorescencyjną). Zestawy do FISH (ang. fluorescence in situ hybridiza-
tion) oraz znakowania sond oligonukleotydowych są łatwo dostępne (np. Mole-
cular Probes Inc., Eugene, USA).
Różne aspekty metodologii ISH i FISH są omówione w specjalnym wydaniu
Histochemical Journal [(1995) 27: 1-99].

11.8.6. Charakterystyka patogena

Czysta hodowla patogena może być badana za pomocą metod i testów zaryso-
wanych w rozdziale 16. Zazwyczaj pozwalają one na identyfikację do poziomu
gatunku (lub serotypu, sekcja 16.1.5.1). Podatność danej bakterii patogennej na
pewien zakres antybiotyków (tak zwany antybiogram) często określa się za
pomocą testu dyfuzji krążkowej (sekcja 15.4.11.1).

11.9 Zapobieganie i kontrola chorób zakaźnych

Gdy już wiemy, jak rozprzestrzenia się dana choroba, często można stworzyć
metody mające zapobiec lub ograniczyć jej rozszerzanie się. Jest oczywiste, że
każdej chorobie, której rozprzestrzenianie się następuje poprzez bezpośredni

312
kontakt fizyczny, można zapobiec po prostu unikając zakażonych osobników.
W przypadku innych chorób zakaźnych, zapobieganie lub kontrola może się
wiązać z zablokowaniem drogi zakażenia. Rozprzestrzenianie się takich chorób,
jak dur brzuszny i cholera może być zahamowane przez odpowiednie środki,
jak: 1) poprawa higieny osobistej — np. mycie rąk po wizycie w toalecie;
2) ochrona żywności przed muchami i innymi owadami mogącymi przenosić
patogeny oraz zmniejszenie ilości tych przenosicieli przez stosowanie środków
owadobójczych; 3) ochrona wody pitnej przed zakażeniem przez ścieki oraz sku-
teczna ochrona komunalnych zapasów wody przez np. chlorowanie; 4) odkaża-
nie niewielkich ilości wody przed spożyciem, np. gotowaniem lub środkiem
dezynfekującym, np. halazon; 5) wykrycie, izolowanie i leczenie nosicieli
(sekcja 11.7).
Zazwyczaj trudniej jest poradzić sobie z chorobami rozprzestrzeniającymi się
drogą kropelkową. Fizyczne wykluczenie kropelek (np. użycie maski na twarz)
jest mało praktyczne, a głównym środkiem zapobiegawczym w takich chorobach
jak błonica jest szczepienie (sekcja 11.4.2.1). Skuteczna może też być izolacja
(kwarantanna) chorych do momentu, kiedy już nie stanowią potencjalnego
źródła patogena.
Choroby przenoszone przez wektory można kontrolować eliminując wektor
lub ograniczając jego liczebność. Tego typu kontrola znajduje zastosowanie np.
w durze plamistym i dżumie dymieniczej.

11.10 Kilka uwag dotyczących chemioterapii

Dostępność szerokiego zakresu antybiotyków (sekcja 15.4) oznacza, że do wielu
chorób wywołanych przez bakterie można stosować chemioterapię, to jest tera-
pię wykorzystującą związki chemiczne, np. takie jak antybiotyki.
Skuteczność antybiotyków można zaprzepaścić, jeśli ich stosowanie nie
uwzględnia specyficzności i farmakologii. Co więcej, zastosowanie nieodpo-
wiednich antybiotyków może zniweczyć szansę wyleczenia choroby i przyczynić
się do pogłębienia problemu oporności na te związki. Do czynników wpły-
wających na wybór antybiotyku należą:
• Skuteczność wobec danego patogena. Idealna jest sytuacja, gdy patogen
oraz jego podatność na antybiotyki znane są przed rozpoczęciem leczenia,
lecz w niektórych przypadkach (np. w zapaleniu opon mózgowych) che-
mioterapia zostaje zainicjowana przez potwierdzeniem etiologii. Wówczas
chemioterapia jest ukierunkowana na prawdopodobne patogeny. Prawdo-
podobieństwo to określa się na podstawie takich czynników, jak: lokalne
występowanie konkretnego gatunku lub szczepu patogena oraz wieku
pacjenta [przykład (zapalenie opon mózgowych u dzieci): Schaad (1997)
RMM 8: 171-178].
• Lokalne występowanie szczepów opornych na antybiotyki. Pewne pato-
geny są obecnie oporne na antybiotyki, na które kiedyś były niezmiennie
wrażliwe (sekcja 15.4.11). Liczne z nich wykazują oporność na wiele anty-

313
 biotyków i w niektórych przypadkach możliwość chemioterapii jest prak-
tycznie wyczerpana.
• Antagonizm w stosunku do innych antybiotyków (sekcja 15.4.10) lub innych
czynników chemioterapeutycznych. Ryfampicyna, na przykład, potęguje
działanie pewnych ssaczych enzymów degradujących hormony (np. estro-
geny) i może zatem mieć niekorzystne skutki podczas stosowania doust-
nych środków antykoncepcyjnych.
• Możliwe działanie uboczne, np. alergia na penicylinę (sekcja 11.4.2.1).
• Możliwość teratogenności w trakcie ciąży, to jest groźba uszkodzenia płodu.
• Farmakokinetyka. Fizykochemiczne właściwości antybiotyku mogą mieć
wpływ na jego dotarcie do konkretnej tkanki daną drogą. Na przykład,
antybiotyki o pewnych cechach molekularnych nie mogą pokonać bariery
krew-mózg. Podane dożylnie, nie docierają do płynu mózgowo-rdzenio-
wego. Inne pokonują tą barierę jedynie wtedy, gdy jej przepuszczalność
zostaje zmieniona na skutek stanu zapalnego. Niektóre penicyliny (np. amo-
ksycylina) są absorbowane z jelita dużo łatwiej niż inne (np. ampicylina).
Jednakże, brak absorpcji może być czasem korzystny. Na przykład, neomy-
cyna podana doustnie jest bardzo słabo pobierana z jelit, co pozwala na sto-
sowanie jej do dezynfekcji (sterylizacji) jelita przed chirurgią. W tym przy-
padku słaba absorpcja ma duże znaczenie, gdyż pobranie neomycyny
w znacznych ilościach do krwiobiegu mogłoby stworzyć ryzyko uszkodze-
nia słuchu (zależne od stężenia uszkodzenie ósmego nerwu czaszkowego).
Sulfonamidy (sekcja 15.4.9), które są łatwo usuwane z organizmu z moczem,
stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego.
Jak widać, antybiotyk, aby był skuteczny, musi w danej tkance osiągnąć
odpowiednie stężenie. W pewnych wypadkach poziom antybiotyku powinien
być dużo wyższy niż przewidywany na podstawie testów in vitro. Na przykład,
w bakteryjnym zapaleniu opon mózgowych, stężenie antybiotyku w płynie móz-
gowo-rdzeniowym musi dziesięciokrotnie przewyższać jego minimalne stężenie
bakteriobójcze — MBC (ang. minimum bactericidal concentration).
W niektórych przypadkach czas działania antybiotyku można przedłużyć
hamując jego usuwanie z organizmu. Usuwanie penicyliny przez proksymalne
kanaliki nerkowe można zahamować stosując inny lek, o nazwie probenicyd.
W pewnych chorobach (botulizm, błonica) leczenie może się wiązać z równo-
czesnym podaniu antytoksyny — preparatu zawierającego przeciwciała przeciw
odpowiedniej toksynie. Leczenie zgorzeli gazowej — poza lekami — obejmuje
usuwanie martwej/zakażonej tkanki i stosowanie (czasami) tlenu pod zwiększo-
nym ciśnieniem.

11.11 Niektóre schorzenia bakteryjne

Podane niżej zwięzłe opisy mają dać pojęcie o zakresie rodzajów zakażeń powo-
dowanych przez bakterie. Niektóre z tych chorób (np. zapalenie spojówek) mogą
być wywoływane przez inne czynniki niż bakterie, lecz większość z nich powo-
dują jedynie bakterie, a niektóre — tylko bardzo specyficzne patogeny. Po

314
nazwie schorzenia podana jest: 1) nazwa czynnika chorobotwórczego, 2) charak-
terystyczne objawy i 3) droga zakażenia, jeśli jest znana.
Bakteryjna waginoza. Pochwa zawiera zwiększoną liczbę przedstawicieli
z rodzajów Bacteroides, Gardnerella i Mobiluncus oraz mniej (zwykle wystę-
pujących) bakterii mlekowych. Cuchnąca wydzielina. Odczyn w pochwie jest
mniej kwasowy (np. pH>4,5) i przeważają procesy „redukcji" niż zazwyczaj.
W wymazach występują charakterystycznie zmienione komórki (komórki
nabłonka pochwy opłaszczone gramzmiennymi pałeczkami). Jedną z pożytecz-
nych metod diagnostycznych jest barwienie oranżem akrydyny oraz mikrosko-
pia fluorescencyjna [Nunns i wsp. (1997) JINF 34: 211-213].
Błonica. Corynebacterium diphtheriae (szczepy wirulentne). Gorączka. Tworze-
nie w okolicach migdałków nalotów, które utrudniają oddychanie i/lub
przełykanie. Toksyna może powodować zapalenie mięśnia sercowego. Znane
jest nosicielstwo (sekcja 11.7). Infekcja drogą kropelkową (sekcja 11.7) lub
poprzez zakażoną żywność — mleko itp. [Microbiology and epidemiology of
diphtheriae: Esfratiou i George (1996) RMM 7: 31-42].
Botulizm. Clostridium botulinum (szczepy wirulentne). Ogólne osłabienie, pro-
blemy z widzeniem, paraliż układu oddechowego (sekcja 11.3.1.2). U dorosłych:
najczęściej pochłonięcie gotowej toksyny; rzadziej: infekcja jelitowa toksygen-
nym szczepem C. botulinum [Sonnabend i wsp. (1987) Lancet i 357-360]. Rzadko
zakażenie ran przez C. botulinum. U dzieci: toksykoinfekcja, w której C. botulinum
wytwarza toksynę w układzie pokarmowym.
Brucelloza. Brucella sp. Ból głowy, złe samopoczucie, powracająca gorączka,
która może trwać latami. Zakażenie poprzez jamę ustną (np. niepasteryzowane
mleko), spojówki lub rany. U zwierząt choroba zwykle dotyczy układu rozrod-
czego, często występują poronienia.
Cellulitis. Najczęściej szczepy Staphylococcus lub Streptococcus. Rozległy i roz-
szerzający się stan zapalny, który zwykle dotyczy tkanki łącznej. Infekcja przez
rany.
Cholera. Vibrio cholerae (szczepy zjadliwe). Infekcja jelitowa. Obfita, wodnista
biegunka (sekcja 11.3.1.1) i odwodnienie. Infekcja drogą pokarmową, zwykle
przez zakażoną wodę. Do niedawna cholerę wywoływała jedynie grupa serolo-
giczna Ol (wyróżniona na podstawie antygenów O), do której należą: biotyp
cholerae (klasyczna) i El Tor. Żadna inna ze 137 znanych grup serologicznych nie
powoduje cholery. Ostatnio, w południowych Indiach pojawiła się nowa grupa
serologiczna (nie Ol) oznaczona O139 Bengal. Odporność na V. cholerae Ol nie
chroni przed O139, lecz trwają prace nad uzyskaniem szczepionki anty-O139.
[V. cholerae O139 Bengal: Nair i wsp. (1996) RMM 7: 43-51].
Choroba z Lyme (borelioza). Borrelia burgdorferi. Często: wysypka, artretyzm
z objawami neurologicznymi lub kardiologicznymi lub bez. Ukąszenia przez
zakażone kleszcze. [Treatment of early Lyme disease (artykuł przeglądowy):
Loewen i wsp. (1999) Drugs 57: 157-173].
Choroba Tyzzera. Clostridium piliforme. U źrebiąt: nekrotyzujące zapalenie
wątroby i okrężnicy, z towarzyszącą gorączką i, w niektórych przypadkach,
żółtaczką i bliznowaceniem. Nagły początek, a śmierć może nastąpić nawet
w ciągu kilku godzin lub dni. Choroba również dotyczy np. gryzoni, kotów
i małpek rezus.

315
 Choroba Whipple'a. Tropheryma whippelii (gramdodatnia laseczka, której
dotychczas nie udało się wyhodować). Objawy dotyczą głównie jelit — złe
wchłanianie substancji odżywczych, biegunka, lecz mogą też objąć ośrodkowy
układ nerwowy. Diagnoza polega głównie na histologicznych badaniach tkanek
[Histology in Whipple's disease: von Herbay i wsp. (1996) Virchovs Archiv 429:
335-343]. Diagnoza potwierdzana jest metodą PCR z wykorzystaniem tkanki
z dwunastnicy lub [diagnosis and treatment of Whipple's disease: Singer (1998)
Drugs 55: 699-704].
Czerwonka (dyzenteria) (bakteryjna). Shigella spp., EHEC, EIEC (tab. 11.2).
Bóle jelitowe, wodniste stolce (często gorączka i złe samopoczucie), po których
następuje biegunka krwawa lub śluzowa. Odwodnienie. Patogeneza: patrz sekcje
11.2.2.1 i 11.3.1.6. Infekcja przez układ pokarmowy, np. zakażoną żywność,
wodę (dyzenteria nie bakteryjna może być wywoływana przez amebę Entamoeba
histolytica lub orzęska Balantidiwn coli).
Dur plamisty (klasyczny, epidemiczny). Rickettsia prowazekii. Bóle głowy,
utrzymująca się gorączka oraz wysypka, która może krwawić, bóle mięśniowe.
Zakażenie rany lub ukąszenia odchodami wszy, zawierającymi R. prowazekii.
Możliwe też wdychanie wysuszonych, skażonych odchodów wszy.
Dur brzuszny. Salmonella typhi. Gorączka, przejściowa wysypka, stan zapalny
jelit, posocznica, której czasami towarzyszy martwica tkanek i krwawienie
wewnątrzjelitowe. Występuje nosicielstwo (sekcja 11.7). S. typhi zazwyczaj umie-
szcza się w pęcherzyku żółciowym. Droga ustna infekcji — przez skażoną wodę
lub żywność.
Dżuma (dymienicza, gruczołowa). Yersinia pestis. Gorączka, krwotoki, zapal-
nie powiększone, martwicze węzły chłonne; posocznica i np. zapalenie opon
mózgowych. Infekcja jest przenoszona przez pchły. Postać płucna: przebieg
z ciężkim zapaleniem płuc. Przenoszona drogą kropelkową.
Gorączka Q. Coxiella burnetii. Forma ostra: np. gorączka, bóle mięśniowe,
zapalenie osierdzia, objawy oddechowe; forma chroniczna: zapalenie wsierdzia,
zapalenie szpiku kostnego, poronienia. Wdychanie, picie zakażonego mleka,
przejście bakterii z matki do płodu (rzadko), transfuzje krwi itp. [Mini-
przeglądówka: Raoult (1996) JMM 44: 77-78].
Gruźlica (płucna). Zwykle Mycobacterium tuberculosis. Infekcja przez inhala-
cję, przebieg może być ukryty (sekcja 11.2.3) lub aktywny. W płucach powstają
gruzełki (fot. 11.3). Patogen może przetrwać w makrofagach (sekcja 11.2.2.2)
i rozprzestrzeniać się do różnych części ciała poprzez układ krwionośny lub lim-
fatyczny. Gruźlica jest istotną przyczyną zgonów. Rosnącą częstość występowa-
nia w USA przypisuje się: 1) czynnikom społecznym, 2) nieskutecznym progra-
mom leczenia oraz 3) zwiększającej się liczbie osób z AIDS [Epidemiological
aspects of tuberculosis: Bloom i Murray (1992) Science 257: 1055-1064]. Obecnie
występują problemy ze szczepami o wielorakiej lekooporności (MDR, ang. multi-
drug-resistance). Testy oparte na DNA (sekcja 15.4.11.2) mogą być pomocne
w wykryciu lekooporności. Mycobacterium tuberculosis wydaje się sprzyjać infe-
kcji przez HIV [Goletti i wsp. (1996) JIM 157: 1271-1278]. Gruźlica wywoływana
przez M. bovis, powodująca zejścia śmiertelne, została opisana u pacjentów cho-
rych na AIDS [Guerrero i wsp. (1997) Lancet 350: 1738-1742]. [Mycobacterial
disease (artykuły przeglądowe): BCID (1997) 4: 1-238].

316
 Jaglica. Chlamydia trachomatis. Zapalenie spojówek, wtręty na powiekach, usz-
kodzenie rogówki przez rzęsy wywinięte w kierunku gałki ocznej, co prowadzi
do bliznowacenia. Infekcja przez zatarcie itp.
Kiła. Treponema pallidum. Twardy wrzód w miejscu infekcji (zazwyczaj ślu-
zówka narządu rodnego), później wysypka, a w przypadku niepodjęcia leczenia
— po miesiącach czy nawet latach nacieki guzkowe w sercu, ośrodkowym
układzie nerwowym itp. Infekcja w wyniku bezpośredniego kontaktu, szczegól-
nie płciowego.
Ksztusiec (koklusz). Bordetella pertussis. Napady kaszlu, którym towarzyszy
charakterystyczne „pianie" przy wdechu. Droga kropelkowa.
Leptospiroza. Leptospira interrogans (krętek). Łagodny przebieg: gorączka, ból
głowy, bóle mięśniowe; w typowych przypadkach zakłócona praca nerek. Ostry
przebieg (choroba Weila, wirusowe zapalenie wątroby: wymienione wyżej
objawy, połączone z wymiotami, biegunką, powiększeniem wątroby, żółtaczką,
krwotoki, zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych. Infekcja poprzez rany lub
błony śluzowe. Bakteria występuje w wodzie zakażonej moczem chorych
zwierząt.
Listerioza. Listeria monocytogenes (szczepy wirulentne, patrz również Aneks);
jest to jedna z nielicznych patogennych bakterii, która potrafi pokonać barierę
krew-mózg oraz łożysko. Właściwości te są odzwierciedlone w szerokim zakre-
sie chorób wywoływanych przez tę bakterię: zapalenie opon mózgowych (szcze-
gólnie u osób z niedoborem odporności), posocznica, poronienie, czasami zapa-
lenie żołądkowo-jelitowe. Częstość zgonów najczęściej przekracza 20%. Zakaże-
nie poprzez produkty żywnościowe. U zwierząt występują poronienia (infekcja
przez paszę: patrz sekcja 13.1.1.1). [Listerioza: McLaughlin (1997) RMM 8:
1-145].
Płonica. Streptococcus pyogenes. Często u dzieci: ból gardła, gorączka,
nabrzmiałe szyjne węzły limfatyczne, wysypka. Zakażenie drogą kropelkową,
picie zakażonego mleka itp.
Róża. Często, Streptococcus pyogenes (grupa A). Zwykle wyraźnie oddzielone
obszary róży, często na twarzy, choć może się pojawić gdzie indziej. Łagodniej-
szy przebieg niż w cellulitisie. Mogą występować: gorączka, wyczerpanie i po-
socznica. Infekcja poprzez rany, zatarcia.
Rzeżączka. Neisseria gonorrhoeae (gonokok). Wydzieliny z układu moczowo-
-płciowego, którym mogą towarzyszyć inne objawy. Kontakt seksualny.
Tężec. Clostridium tetani (szczepy zjadliwe). Utrzymujące się bezwolne skur-
cze mięśni (sekcja 11.3.1.3). Infekcja zazwyczaj przez zakażone rany.
Trąd. Mycobacterium leprae. Zależnie od rodzaju trądu — owrzodzenia obej-
mujące różne tkanki (zwykle łącznie ze skórą) oraz uszkodzenie nerwów peryfe-
rycznych powodujące utratę czucia i funkcji motorycznych. Trąd typu guzowa-
tego: słaba odpowiedź immunologiczna typu komórkowego, liczne prątki
w tkankach, liczne wrzody skórne ulegają zlaniu. Trąd typu gruźliczego: rzadkie
wrzody skórne, rzadkie prątki; wrzody, typowa granuloma. [Epidemiology: van
Beers, de Wit i Klatser (1996) FEMSML 136: 221-230; globalna eliminacja trądu
(perspektywy): Gillis i Krahenbuhl (1998) RMM 9: 39-48].

317
 Tularemia. Francisella tularensis. Dreszcze, gorączka, mdłości, ból głowy,
wymioty, wyczerpanie. Czasami ostre objawy żołądkowo-jelitowe/posocznica.
Infekcja w wyniku ran, uszkodzenia błony śluzowej, ukąszeń pcheł lub much.
Wąglik. Bacillus anthracis (szczepy zjadliwe). Lokalne pryszcze na skórze lub,
rzadziej, infekcja płucna lub jelitowa. Wykazano kiełkowanie endospor B. anthra-
cis oraz wyrażanie się genów kodujących toksyny wewnątrz mysich makrofagów
pęcherzykowych [Guidi-Rontani i wsp. (1999) MM 31: 9-17]. Zakażenie poprzez
rany, wdychanie, pobranie z pokarmem.
Zapalenie cewki moczowej. Różne bakterie, np. Neisseria gonorrhoeae (w rze-
żączce), lub w niespecyficznym gonokokowym zapaleniu — Chlamydia trachoma-
tis, Mycoplasma hominis. Często infekcja w wyniku kontaktu seksualnego.
Zapalenie opon mózgowych. Różne organizmy, np. Neisseria mengitidis, Hae-
mophilus influenzae typu b (częsta przyczyna u niemowląt i małych dzieci), Strep-
tococcus pneumoniae. Zapalenie błon osłaniających mózg i rdzeń kręgowy. Infekcja
drogą kropelkową, rany głowy itp. [Prevention of meningococcal meningitis
(perspektywy): Ferreiros, Gomez i Criado (1998) RMM 9: 29-37].
Zapalenie pęcherza. Różne, np. Escherichia coli (szczepy wytwarzające fimbrie
typu Ρ przylegają do nabłonka dróg moczowych), Proteus spp. Zapalenie pęche-
rza moczowego. Infekcja: w dół od nerek lub (częściej) w górę od cewki moczo-
wej. W tym ostatnim przypadku najczęściej zapalenie powodują E. coli i Pro-
teus spp.
Zapalenie płuc. Różne bakterie, np. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae typu b, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae. Gorączka, trudności
z oddychaniem, bóle klatki piersiowej, kaszel. Zakażenie drogą kropelkową.
Zespół PMC — rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy (ang. pseudomembra-
nous colitis). Potencjalnie śmiertelna choroba, przebiegająca z wodnistą bie-
gunką, gorączką i rzekomymi błonami powstającymi z wysięku zapalnego,
głównie na błonie śluzowej okrężnicy. Choroba zwykle jest poprzedzona terapią
antybiotykową (przede wszystkim w wypadku stosowania klindamycyny);
a czynnikiem powodującym chorobę jest zwykle lub zawsze Clostridium difficile.
C. difficile wytwarza toksyny A (enterotoksyna) i Β (cytotoksyna). Toksyna A
prawdopodobnie stymuluje powstawanie wysięków po uszkodzeniu komórek
przez toksynę Β [Sears i Kaper (1996) MR 60: 167-215]. [Laboratory diagnosis of
C. difficile-associated disease; Brazier (1995) RMM 6: 236-245].
Zapalenie spojówek. Różne, np. Staphylococcus aureus, inne gronkowce, Hae-
mophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. Zapalnie spojówki (śluzówki oka).
[Ocular bacteriology, including conjunctivitis (artykuł przeglądowy): Willcox
i Stapleton (1996) RMM 7: 123-131].
Zatrucie pokarmowe. Różne, np. Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Clostri-
dium perfringens, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus,
Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica. Ostre zapalenie żołądka i jelit. Ból.
Zwykle biegunka (lecz może jej nie być lub tylko ograniczona w przypadku
gronkowcowego zatrucia pokarmowego oraz powodowanego przez jeden typ
B. cereus). Często występują mdłości i wymioty. Droga zakażenia przez przewód
pokarmowy, patogen lub toksyna pobrane z żywnością (patrz sekcja 12.3).
Zespół Kawasaki. Występuje u niemowląt i małych dzieci. Czasem przebieg
śmiertelny, z gorączką i zapaleniem naczyń. Etiologia choroby nieznana, lecz

318
przynajmniej w niektórych przypadkach przyczyną może być superantygen
(sekcja 11.5.4.1).
Zespół oparzonej skóry. Szczepy Staphylococcus aureus, głównie z grupy
fagowej II, produkujące toksynę tzw. złuszczającą (ET, ang. exfoliative toxin). Na
ogół u noworodków i małych dzieci: wypełnione płynem pęcherzyki (zawie-
rające S. aureus) lub wysypka, z następującą utratą powierzchniowych warstw
skóry. Działanie ET najprawdopodobniej polega na aktywacji proteazy seryno-
we]" w naskórku lub aktywności superantygenowej (sekcja 11.5.4.1). [Artykuł
przeglądowy: Rago i Schlievert (1998) RMM 9: 9-15].
Zespół wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxic shock Syndrome). Szczepy Sta-
phylococcus aureus wytwarzające superantygen B, C lub F (sekcja 11.5.4.1) oraz
paciorkowce grupy A wytwarzające enterotoksynę A. Gorączka, zmiany skórne,
wymioty, biegunka, obniżone ciśnienie. U małych dzieci często mogą się
pojawiać objawy zapalenia mózgu w wyniku przejścia cytokin przez barierę
krew-mózg. Bakteriemia jest rzadka (gronkowcowy TSS) lub częsta (paciorkow-
cowy TSS). W fazie ostrej występuje więcej np. komórek Vβ2 Τ i podwyższony
poziom cytokin (np. IL-2, IL-4, TNF-α, TNF-β, IFN-y). Stosunkowo wysoka śmie-
rtelność. U niemowląt i dzieci zakażenie przez np. oparzenia. W przypadku
kobiet często w związku ze stosowaniem tamponów podczas miesiączki. Pacior-
kowcowy zespół wstrząsu toksycznego często przebiega z martwicą tkanek
i prowadzącym do martwicy zapaleniu powięzi [Multiplex PCR for detection of
the B,C and F superantigen genes of Staphylococcus aureus: Schmitz i wsp. (1998)
JMM 47: 335-340].
Zgorzel gazowa. W typowych przypadkach — Clostridium perfringens (typ A),
C. septicum i/lub C. novyi. Postępująca martwica tkanek, które zawierają pęche-
rze gazu tworzonego w wyniku metabolizmu bakteryjnego. Nie leczona prowa-
dzi do śmierci spowodowanej toksemią i szokiem. Toksyna α Clostridium perfrin-
gens (która hydrolizuje lecytynę i ma również aktywność sfingomielinazy)
wydaje się główną letalną toksyną [Awad i wsp. (1995) MM 15: 191-202]. Zaka-
żenie ran i odtlenionych tkanek.
 ROZDZIAŁ

12
Bakteriologia stosowana I — żywność

12.1. Bakterie biorące udział w produkcji żywności

Bakterie stosuje się w przemyśle spożywczym: 1) do przeprowadzenia fermenta-
cji w przetwórstwie mleczarskim; 2) w produkcji kawy i kakao; 3) do wytwarza-
nia dodatków poprawiających smak żywności; 4) w innych procesach, np. pro-
dukcji octu. (Udział bakterii w wytwarzaniu karmy dla zwierząt hodowlanych
omówiono w rozdziale 13.)

12.1.1 Przetwory mleczarskie

W produkcji masła, sera i jogurtu mleko poddaje się fermentacji homomlekowej
(sekcja 5.1.1.1), w wyniku której laktoza ulega przekształceniu do kwasu
mlekowego.
Tak zwane masło śmietankowe powstaje w wyniku traktowania pasteryzo-
wanej śmietany hodowlą starterową zawierającą różne bakterie mlekowe, np.
Lactococcus (Streptococcus) cremoris i/lub L. (S.) lactis subsp, diacetilactis, i/lub
Leuconostoc cremoris - główny producent diacetylu. Kwas mlekowy i diacetyl
nadają masłu typowy dla niego aromat. Diacetyl tworzy charakterystyczny
zapach i smak świeżego produktu. W wyniku procesu fermentacji (pH wówczas
spada do około 4,6) powstaje masa, którą schładza się i „ubija", co prowadzi do
destabilizacji globulek tłuszczu. Fazę wodną (maślankę) odsącza się, a masło,
często zasolone, można długo przechowywać np. w temperaturze -25°C. Masło
nazywane śmietankowym, słodkim, wytwarza się bez zastosowania hodowli
starterowej.
Sery powstają w wyniku koagulacji i fermentacji mleka. Różnice między
gatunkami serów są związane z rodzajem surowca (np. mleko krowie, kozie)
oraz innych jego właściwości (mleko pełne, odtłuszczone). Decydującą rolę
w produkcji odgrywają stosowane drobnoustroje — najczęściej bakterie z gatun-
ków Lactococcus i Lactobacillus. Wykorzystuje się także hodowle starterowe kon-

320
struowane metodami inżynierii genetycznej. W serze cheddar, gdzie konieczne
jest kontrolowanie rozwoju patogennej" bakterii Listeria monocytogenes, zastoso-
wano właśnie tak zmodyfikowaną hodowlę starterową [Buyong, Kok i Luchen-
sky (1988) AEM 64: 4842-4845]. W wyniku fermentacji obniża się pH, co wstęp-
nie prowadzi do koagulacji białka mleka, dodatkowo inne produkty fermentacji
(np. kwas octowy i propionowy) zapewniają charakterystyczny aromat.
(Typowy zapach serom szwajcarskim, np. typu Emmentaler i Gruyere, nadaje
kwas propionowy wytwarzany przez Propionibacterium spp. stosowane do ich
produkcji). Ser, to jest wytrącone białko i tłuszcz, podlega oddzieleniu od fazy
wodnej — serwatki, a w dalszym procesie jest przekształcany, przez solenie, doj-
rzewanie — aż do uzyskania produktu dojrzałego.
Jogurt jest zazwyczaj wytwarzany z mleka pasteryzowanego, o niskiej zawar-
tości tłuszczu, bogatego w składniki stałe. Mleko zostaje zaszczepione hodow-
lami Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus. Fermentację prowadzi się
w temperaturze 35-45°C, przez kilka godzin, pH spada wówczas do około 4,3,
a białka mleka zostają wytrącone. Bakterie współdziałają ze sobą: L. bulgaricus
powoduje rozkład białek do aminokwasów i peptydów — które stymulują roz-
wój S. thermophilus. Kwas mrówkowy wydzielany przez S. thermophilus nasila
rozwój L. bulgaricus, który jest głównym producentem kwasu mlekowego.

12.1.2 Kawa i kakao

Wytworzenie kawy z surowych nasion kawowych wymaga wstępnego usunięcia
lepkiego i śluzowatego mezokarpu (osłony) łączącego dwa nasiona w każdym
owocu. Gdy warstwa zewnętrzna zostanie rozerwana, uwolnione nasiona pod-
daje się fermentacji. Otoczka śluzowata zostaje uszkodzona w wyniku oddzia-
ływania enzymów rośliny oraz z udziałem egzoenzymów wytwarzanych przez
drobnoustroje. Oprócz drożdży (są to jednokomórkowe grzyby) rolę odgrywają
także bakterie pektynolityczne — np. Bacillus i Erwinia. Po zakończeniu fermen-
tacji, nasiona płucze się, suszy, sporządza się odpowiednie mieszanki, a następ-
nie kawa jest „opalana".
Kakao wytwarza się z nasion (fasolek) rośliny kakaowca. Owoc jest torebką
zawierającą do 50 nasion zlepionych białym śluzem. Śluz poddawany jest fer-
mentacji z udziałem drożdży wytwarzających etanol, który podlega prze-
kształceniu do kwasu octowego. Dzieje się to za przyczyną niektórych bakterii
tlenowych i innych drobnoustrojów obecnych w środowisku. W czasie trwającej
tydzień fermentacji nasiona pozbawione śluzu ciemnieją, następnie są suszone
i „opalane".

12.1.3 Środki dodawane do żywności

Glutaminian monosodowy jest powszechnie stosowany jako środek wzmac-
niający smak produktów żywnościowych. Otrzymuje się go z niektórych bakte-
rii, np. szczepów Corynebacterium glutamicum hodowanych beztlenowo na takich
podłożach jak melasa lub hydrolizowana skrobia. Bakterie te wytwarzają kwas

321
glutaminowy z kwasu α-ketoglutarowego. Przemysłowe szczepy C. glutamicum
nie metabolizują kwasu α-ketoglutarowego w cyklu kwasów trikarboksylowych
(TCA, rys. 5.10), dzięki czemu gromadzi się w dużych ilościach kwas glutami-
nowy. Aby umożliwić wydobycie się kwasu z bakterii, należy zwiększyć prze-
puszczalność osłon komórkowych, co wymaga zastosowania specjalnych metod.
Jest to także niezbędne, by zapobiec hamowaniu zwrotnemu syntezy kwasu
glutaminowego.
Ksantan, substancja gumopodobna, jest śluzem wydzielanym pozakomór-
kowo przez niektóre szczepy Xanthomonas campestris. Znajduje wielorakie zasto-
sowanie, jako substancja żelująca, stabilizator żelu, zagęszczacz i środek hamu-
jący krystalizację niewskazaną w niektórych środkach spożywczych.

12.1.4 Ocet
Produkcję octu, zwaną fermentacją octową przeprowadza się z surowców
zawierających etanol, np. z wina, soku jabłkowego, piwa. Jest to ściśle kontrolo-
wany proces polegający na utlenieniu etanolu przez różne gatunki z rodzaju Ace-
tobacter. Produkt może być poddawany dojrzewaniu, sączeniu, butelkowaniu
i pasteryzacji.
Ocet, nazywany u nas zazwyczaj spirytusowym, jest wytwarzany na drodze
chemicznej (np. karbonylacji metanolu), bez udziału bakterii. Jest produktem
tańszym niż uzyskiwany z wykorzystaniem bakterii.

12.2 Środki zapobiegające psuciu się żywności

Znane są i stosowane różnorodne metody zapobiegające lub opóźniające psucie
się żywności, zarówno powodowane działalnością drobnoustrojów, jak również
wynikające z innych przyczyn. Muszą być także brane pod uwagę środki, które
przeciwdziałają wytwarzaniu toksyn, będących źródłem zatruć pokarmowych.
Metody te pozwalają na zachowanie wartości spożywczych, przedłużają czas
bezpiecznego przechowywania we wskazanych warunkach. Przypuszcza się, że
bezpieczniejsze są metody fizyczne (np. zamrażanie) niż chemiczne traktowanie
żywności.

12.2.1 Metody fizyczne zabezpieczania środków spożywczych

12.2.1.1 Pasteryzacja i procedura UHT

Pasteryzację przeprowadza się działając podwyższoną temperaturą na takie pro-
dukty jak mleko, ocet, w celu zabicia niektórych patogenów i innych drobno-
ustrojów odpowiedzialnych za psucie się żywności. Mleko podgrzewa się do
minimum 72°C, przez przynajmniej 15 sekund (jest to tzw. pasteryzacja HTST,
ang. high temperature, short time — polegająca na stosowaniu wysokiej tempe-
ratury przez krótki czas). Pasteryzacja niszczy bakterie patogenne, odpowie-

322
dzialne za salmonellozy i gruźlicę, jak również większość niepatogennej mikro-
flory mleka. Unieczynnia także niektóre enzymy bakteryjne, np. lipazy, powo-
dujące psucie się produktu. Pasteryzacja HTST nie zabija niektórych zarazków,
np. sprawcy gorączki Q (Coxiella burnetii).
Tak zwana procedura UHT (ang. ultra-heat treated) polega najczęściej na
wtłaczaniu mleka pomiędzy rozgrzane płyty, w temperaturze około 141°C, przez
3 sekundy. Mleko oznakowane UHT jest pakowane aseptycznie i może być prze-
chowywane poza chłodnią przez około 6 miesięcy. W metodzie alternatywnej
ciepło wprowadza się do mleka w postaci pary pod ciśnieniem. Ta procedura jest
szczególnie przydatna w produkcji np. kremów i innych lepkich środków
spożywczych.
W trakcie przechowywania pasteryzowanych produktów, np. w magazy-
nach, pobiera się kontrolne próbki wykluczające ich zakażenie. W tym celu
wykonuje się testy, stosując np. system Lumac, dający szybki wynik (patrz sek-
cja 12.3.3.1).

12.2.1.2 Konserwy

Odpowiednio przygotowany pokarm umieszcza się w metalowych pojemnikach

(puszkach), usuwa się z nich powietrze, zamyka w sposób hermetyczny zaci-
skając wieczko. Następnie puszki podgrzewa się do co najmniej 100°C. Puszki
schładza się zimną, sterylną wodą, by nie dopuścić do zakażenia pokarmu,
gdyby zacisk nie był dostatecznie szczelny (rys. 12.1). Ważnym problemem jest
ustalenie właściwego czasu i temperatury przygotowania konserw. Posłużymy
się w tym celu wykresem (patrz rys. 12.2). Wskazuje on działanie temperatury na
populację komórek lub endospor, umożliwiając określenie wartości parame-
trów D, z i F istotnych w przemyśle spożywczym.
Odpowiednio przygotowane konserwy w puszkach nie mogą zawierać
bakterii Clostridium botulinum (sekcja 11.3.1.2) zdolnej do wzrostu i wytwarzania
toksyn w warunkach przechowalnictwa. Aby to osiągnąć, poziom ogrzewania
należy dostosować zależnie od wartości pH i typu produktu spożywczego oraz
od sposobu przechowywania. Produkty „naturalne" (takie jak ziemniaki, mar-
chew, grzyby) wymagają zastosowania co najmniej 12D (tzw. „wartość botuli-
num", to jest ogrzewania przez czas 12-krotnie dłuższy niż stosowany jako czas
D dla endospor C. botulinum, w tej samej temperaturze. Prawdopodobieństwo
zakażenia przez C. botulinum po takim traktowaniu określa się jako nieistotne.

Brzeg wieczka jest wywinięty wokół obrzeżenia górnej strony puszki, tak by grubość w tej części
wieczka była pięciokrotnie większa od grubości blachy. Boki puszki, czego nie pokazano na rysunku,
mają w kilku miejscach poprzeczne wyniesienia blachy w celu zmniejszenia nacisku w czasie
podgrzewania konserwy. (1) wieczko (2) ściana boczna puszki.

323
W sytuacji idealnej, tj. w teorii, liczba komórek przeżywających maleje wykładniczo w czasie
i w określonej temperaturze. Wykres wówczas jest liniowy, jeśli sporządzi się go w skali loga-
rytmicznej. W praktyce występują odchylenia od odpowiedzi liniowej. Dzieje się tak w części
początkowej i końcowej (wykresu). Te jego fragmenty oznaczono linią przerywaną.
Posługując się pojęciem „śmierci wykładniczej" możemy określić trzy ważne parametry wykorzy-
stywane w przetwórstwie żywności.
Wartość D: czas (w minutach), w określonej temperaturze, dla populacji określonego typu bakterii
lub przetrwalników, niezbędny do zmniejszenia o 90% liczby form żywych (to jest o jedną jednostkę
w skali log10. W części liniowej wykresu liczebność populacji zmalała o 1 jednostkę log w czasie
2 minut, tak więc w tym przypadku D = 2. Należy zauważyć, że w części liniowej wykresu rzeczy-
wista liczba zabitych organizmów w określonym czasie zależy od początkowej liczebności populacji.
Na przykład, gdy liczebność organizmów maleje z 10 000 do 1000, w ciągu 2 minut ginie 9000 bakterii
lub przetrwalników. Gdy liczebność populacji maleje z 1000 do 100, w czasie 2 minut ginie 900 orga-
nizmów. Tak więc stała pozostaje proporcja komórek/przetrwalników zabitych w danym czasie,
w liniowej części wykresu.
Temperatura, w której określa się wartość D (wyznaczona doświadczalnie), znajduje się zazwyczaj
we frakcji dolnej, np. D 7 0 = wartość w 70°C. Dla komórek Staphylococcus aureus wartość D 7 0 jest
zazwyczaj mniejsza niż 1 minuta (ale znacznie większa dla niektórych szczepów), a dla S. epidermidis
wynosi około 3 minut. D60 wynosi 1 godzinę w przypadku Salmonella seftenberg, natomiast dla Escheri-
chia coli D 6o zazwyczaj tylko kilka minut.
Wartość z: oznacza, o ile temperatura (°C) musi zostać podwyższona, aby uzyskać wartość D obni-
żoną o 90% (tj. o 1/10 tej wartości). Na przykład, jeśli, jak na wykresie temperatura konieczna do
zabicia określonych komórek lub przetrwalników wskazuje D = 2, wówczas wartość 2 równa się
wzrostowi temperatury niezbędnemu, by osiągnąć D = 0,2, dla komórek/przetrwalników tego
samego typu.
Wartość F: czas w minutach konieczny do skutecznego działania temperatury 121,1°C, określony
z czasu niezbędnego do osiągnięcia podobnego efektu, lecz w innej temperaturze (określonej odpo-
wiednią wartością D), przyjmując wartość 2 wynoszącą np. 10°C. Wartości F służą do porównywania
efektu działania ciepła w różnych temperaturach.
Wartości D, 2 i F stanowią podstawę określenia odpowiedniego (tj. skutecznego) działania ciepła.
Należy brać pod uwagę również inne czynniki, np. czas penetracji ciepła w głąb puszki wypełnionej
określonym produktem spożywczym.

324
 Środki spożywcze o wartości pH poniżej 4,6 wymagają niższych wartości D,
gdyż, jak się powszechnie sądzi, w takich warunkach C. botulinum nie rośnie i nie
wytwarza toksyn. Znane jest jednak jedno doniesienie [Raarjes i Smelt (1979)
Nature, 281: 398-399] opisujące wzrost i produkcję toksyn na podłożu laborato-
ryjnym (a więc nie w żywności) w pH obniżonym do wartości 4,0.
Puszki dużych rozmiarów, transportowane w pojemnikach, np. konserwo-
wane mięsa (między innymi szynka), można zabezpieczać przed psuciem ogrze-
waniem w stosunkowo niskiej temperaturze, np. 70°C (w centralnej części
puszki), przez kilka minut. Tak przygotowane puszki muszą być jednak przecho-
wywane w chłodni. Bezpieczeństwo (brak wzrostu i wytwarzania toksyn przez
C. botulinum) jest w tym przypadku warunkowane połączonym działaniem tem-
peratury (niskiej) i konserwujących soli.
Mleko słodzone, zagęszczone, po zamknięciu w puszkach nie jest podgrze-
wane, gdyż duża zawartość cukru (mała aktywność wody, sekcja 3.1.3) hamuje
wzrost większości bakterii.
W tabeli 12.1 podano warunki termiczne stosowane przy produkcji konserw
w puszkach zawierających różne produkty spożywcze.
Psucie się puszkowanej żywności. Wysoka temperatura na ogół inaktywuje
przynajmniej niektóre enzymy, które mogłyby powodować psucie się puszkowa-
nej żywności. Jednakże przyczyną psucia są często enzymy zwane ciepłostałymi
lub niektóre bakterie i endospory niewrażliwe na wysoką temperaturę. Na
przykład endospory Bacillus stearothermophilus mogą przeżyć wartość botulinową.
Mogą także wywołać psucie się konserw z małą zawartością kwasu, jeśli tylko
temperatura przechowywania jest powyżej 30°C. Produkt może być nawet
skwaśniały, a puszki nie wykazują typowych wzdęć. Produkty spożywcze
o wysokim pH (tj. zawierające mało kwasu) należy podgrzewać powyżej mini-
malnej wartości botulinowej. Wówczas produkt może być przechowywany
bezpiecznie.

325
 Żywność w puszkach może być zazwyczaj przechowywana przez kilka lat,
w odpowiednich warunkach.

12.2.1.3 Chłodnictwo

Temperatury w zakresie 0-8°C powodują zahamowanie metabolizmu i wzrostu

drobnoustrojów, a także wydzielanych przez nie enzymów. Ten rodzaj przecho-
wywania stosowany przez krótki czas opóźnia psucie się produktów spożyw-
czych. Jednak organizmy psychotropowe (sekcja 3.1.4) mogą także w tych
warunkach zachować swą szkodliwą działalność. Niektóre bakteryjne patogeny,
np. Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica zachowują aktywność nawet
w temperaturze 4°C.
Zamrażanie (stosowane w celu przechowywania przez długi czas) może zabi-
jać niektóre drobnoustroje, redukuje także dostępność wody (sekcja 3.1.3).
W temperaturach poniżej zera, np. -5 do -10°C, rozwijają swoją niszczycielską
działalność niektóre grzyby. Narażone są na nią np. surowce mięsne.

12.2.1.4 Odwodnienie

Odwodnienie produktu redukuje ilość dostępnej wody (sekcja 3.1.3) do punktu,

w którym drobnoustroje zakażające nie mogą się już rozwijać. Stan taki uzyskuje
się przez odparowanie, stosowane np. do produkcji suchego (sproszkowanego)
mleka. Zawartość dostępnej wody zmniejsza się także przez dodanie chlorku
sodu (solenie ryb) lub stosując syropy (w przechowalnictwie owoców).

12.2.1.5 Promieniowanie jonizujące

Promieniowanie jonizujące (np. elektrony o wysokiej energii, lub promieniowa-

nie gamma) stosuje się w niektórych krajach w celu zapobiegania psuciu się dro-
biu, ryb, truskawek, przypraw.

12.2.2 Inne sposoby zapobiegania psuciu się żywności

12.2.2.1 Zakwaszanie

Tradycyjnym sposobem ochrony przetworów spożywczych jest obniżenie pH.

Produkty takie nazywane są piklami lub marynatami. Obniżenie pH uzyskuje się
dodając kwasy, np. mlekowy, octowy, albo w niektórych przypadkach przez
wywoływanie fermentacji np. kapusty. W wyniku fermentowania powstają
kiszonki naturalnie zakwaszone kwasem mlekowym, wytwarzanym przez
bakterie z rodzaju Lactobacillus lub Leuconostoc.

12.2.2.2 Środki ochronne

Środki do ochrony żywności są chemikaliami, które zabijają np. drożdże lub

bakterie, lub jedne i drugie. Stosuje się w tym celu kwas benzoesowy (do ochrony
przed psuciem soków, miodów pitnych), azotyny i kwas sorbowy. Antybiotyk

326
peptydowy, zwany nizyną, należący do grupy lantybiotyków, działa aktywnie
przeciw bakteriom gramdodatnim, zapobiegając również przejściu endospor
w formy wegetatywne. Nizynę stosuje się przy produkcji niektórych serów oraz
pewnych produktów spożywczych puszkowanych. Zakres i rodzaj stosowanych
chemicznych środków ochronnych jest regulowany zarządzeniami odpowied-
nich władz.
Tradycyjna metoda peklowania, np. mięsa wieprzowego, polega na traktowa-
niu produktu, w temperaturze 4°C, roztworem chlorku sodu (redukującym
aktywność wody) i azotynem sodu, który w odpowiednich warunkach hamuje
wzrost bakterii i kiełkowanie endospor.
W procesie wędzenia bekonu, ryb itp. produkt poddaje się przez kilka godzin
(a nawet kilka dni) działaniu dymu pochodzącego z palonego drewna. W ten
sposób zmniejszana jest aktywność wody. Produkt wędzony zostaje również
nasycony substancjami pochodzącymi z dymu, np. związkami fenolowymi,
wykazującymi właściwości przeciwdrobnoustrojowe.

12.3 Zatrucia pokarmowe i higiena środków spożywczych

Zatruciami pokarmowymi nazywamy zazwyczaj ostre zapalenia przewodu
pokarmowego spowodowane spożyciem pokarmu zanieczyszczonego czynni-
kami patogennymi lub ich toksynami (tab. 12.2). Zalicza się tu również przy-
padki botulizmu (zatrucia jadem kiełbasianym) (sekcja 11.3.1.2 i 11.11).
Listerioza (sekcja 11.11) nie odpowiada opisowi typowego zatrucia pokarmo-
wego (wyżej). Niemniej, choroba ta często kończy się śmiercią, a główną przy-
czyną infekcji jest spożycie skażonego pożywienia. Chociaż obecność Listeria
monocyłogenes stosunkowo często stwierdzana jest w żywności różnego typu, np.
w niektórych serach i wędlinach, dokładne określenie ryzyka listeriozy utrudnia
obecność słabo patogennych lub niepatogennych szczepów [Hof, Nichterlein
i Kretschmar (1994) TIFS 5: 185-190].

12.3.1 Bakterie źródłem zatruć pokarmowych

Jakie są źródła zakażenia żywności potogenami? W niektórych przypadkach,
dotyczy to np. drobiu, jaj, skorupiaków, sprawcy zatruć są już w samym pro-
dukcie wyjściowym. Najczęściej jednak zakażenie żywności następuje w czasie
pomiędzy surowcem a momentem spożycia. W kuchni czynniki patogenne są
często przenoszone z jednego pokarmu na drugi. Najczęściej zarazki przedostają
się z surowego mięsa lub drobiu na przygotowany pokarm.
Czasem czynnik patogenny musi się rozwinąć, tj. rozmnożyć na powierzchni
lub wewnątrz żywności, i dopiero gdy ilość zarazków lub wytwarzanych przez
nie toksyn osiągnie pewną wartość progową, może po ich spożyciu dojść do cho-
roby. Rozmnożenie zarazków nie jest jednak konieczne, gdy chorobę wywołuje
już niewielka liczba bakterii, np. zaledwie 100 pałeczek czerwonki (Shigella), lub
nawet mniej niż 100 komórek Campylobacłer.

327
 Zatrucia pokarmowe mogą przebiegać jako stan zapalny jelit lub jako skutek
działania toksyn (zatrucia pokarmowe toksyczne).
Ryzyko zatrucia pokarmowego jest zależne od następujących czynników:
1. Początkowego stopnia zakażenia produktu. W procesie produkcyjnym prze-
tworu im bardziej zakażony jest surowiec, tym mniejsze jest prawdopodobie-
ństwa ograniczenia zagrożenia do poziomu bezpiecznego — w samym proce-
sie obróbki. W gotowych już produktach spożywczych zakażenie żywności
może być powyżej lub poniżej poziomu niezbędnego do wywołania choroby.
2. Sposobu przerabiania surowca, przechowywania i form podania do spożycia.
Ryzyko zatrucia pokarmowego zależy od tego, jak łatwo zarazek może się
dostać i namnożyć na powierzchni lub wewnątrz żywności w całym cyklu
przygotowania produktu oraz od możliwości unieszkodliwiania drobnou-
strojów, z którymi wiąże się ryzyko wywołania zatrucia. W przypadku mięsa
i drobiu idealna jest taka sytuacja, gdy możliwe jest eliminowanie patogenów
już na miejscu hodowli, na farmie. W etapach późniejszych, po uboju, proces
eliminacji zarazków jest już trudniejszy.
3. Relacja wielkości dawki zarazka do reakcji w postaci choroby. Jest to szczegól-
nie ważne, gdy dawka (liczba bakterii lub toksyn) wywołująca zatrucie jest
mała. W rzeczywistości, wrażliwość na zarazki nie jest wartością stałą, różni
się w znacznym stopniu zależnie od wieku, stanu odporności, ogólnej kondy-
cji. Do grupy dużego ryzyka należą dzieci, ludzie starzy, kobiety ciężarne,
chorzy z obniżoną barierą odporności (w tym chorzy na AIDS). Ponieważ
relacja — dawka czynnika patogennego: „odpowiedź organizmu" jest
zmienna, określenie stopnia zainfekowania żywności, często jest oparte na
badaniach epidemiologicznych, w nieznacznym stopniu na wynikach doświa-
dczeń i na zgodności poglądów [żywność a ryzyko mikrobiologiczne: Baird-
Parker (1944), Microbiology 140: 687-695)].

12.3.1.1 Wykrywanie patogenów i toksyn w żywności

Często pojedynczy przypadek zatrucia pokarmowego zostaje wyjaśniony zanim
zarazek mógłby być wyhodowany z podejrzanego produktu spożywczego czy
z chorego organizmu. Mimo to podejmuje się badania w celu dokonania ustaleń
epidemiologicznych lub dochodzeń sądowych. Jest rzeczą oczywistą, że podłoża
wzrostowe muszą być dobrane zależnie od rodzaju zarazka, który powinien być
poszukiwany także wewnątrz produktu spożywczego, a więc po zniszczeniu
struktury próbki.
Niektóre zarazki (np. E. coli O157) mogą wywołać infekcję nawet wówczas,
gdy dawka zakaźna jest mała (np. mniej niż 100 bakterii). Dlatego też, gdy bada-
nia są wykonane pod kątem poszukiwania tego typu zarazka, konieczne jest sto-
sowanie bardzo czułej metody. Do uzyskania lepszej wykrywalności zarazków
z różnych próbek żywności (patrz również tab. 14.2) przydatny jest rozdział
immunomagnetyczny (sekcja 14.6.1).
W celu wykrycia małej zawartości toksyn wywołujących zatrucia pokarmowe
również niezbędne jest stosowanie bardzo czułych metod. Do wykazania obe-
cności toksyn gronkowcowych przydatna jest aglutynacja (czułość około

329
Zarazek występuje u zwierząt i na produktach pochodzenia zwierzęcego, szczególnie na drobiu.
Częstym sposobem przenoszenia zarazka jest krzyżowe zanieczyszczenie innych przetworów spo-
żywczych (sekcja 12.3.1).
Fotografia, dzięki uprzejmości dr. Alana Curry, PHLS, Withington Hospital, Manchester, UK.

330
1 ng/ml) krwinek czerwonych (lub cząstek lateksu) pokrytych antytoksyną (dro-
biny toksyny działają jako „mostki" pomiędzy krwinkami lub ziarenkami late-
ksu). Stosuje się także test oparty na zasadzie ELISA (rys. 11.5), za pomocą któ-
rego można wykryć obecność toksyn gronkowcowych w stężeniu 0,5 ng/ml, lub
nawet mniejszym. [Wykrywanie toksyn gronkowcowych: Tranter i Brehm (1994)
RMM 5: 56-64].

12.3.2 Higiena żywności — w domu

W samej kuchni zdrowa żywność może ulec zepsuciu, nie dając nawet żadnych
objawów wskazujących na nieprzydatność do spożycia (nie zmieniony smak,
dobry zapach, prawidłowy wygląd). Oto przykłady:
1. Źródłem zakażenia mogą być brudne ręce (droga: odchody-usta) przygoto-
wującego pokarm. Brudne ręce mogą zakażać surowiec (np. mięso, drób),
z którego wykonuje się, produkty gotowe do spożycia. Może wówczas dojść
do przeniesienia np. pałeczek Salmonella z drobiu. Jest to szczególnie groźne
wówczas, gdy żywność jest pozostawiana w temperaturze pokojowej, co
umożliwia namnożenie się zarazków do niebezpiecznego poziomu.
2. Stosowanie noży do obróbki surowca, a następnie bez starannego umycia —
do potraw przygotowanych już do spożycia.
3. Zakażenie surowca patogenami, których źródłem są handlarze żywności.
Dotyczy to często zatruć pokarmowych wywoływanych przez paciorkowce.
4. Zakażenie przeniesione przez muchy itp.
5. Niedogotowanie zakażonego mięsa lub drobiu. Zdarza się to wówczas, gdy
surowiec nie jest należycie odmrożony przed gotowaniem.
6. Nieodpowiednie gotowanie jaj przechowywanych w chłodni. Takie jaja są
bardziej zimne niż jaja (nieodpowiednio) trzymane w temperaturze pokojowej
i muszą być gotowane dłużej.
7. Przechowywanie żywności w zbyt wysokiej temperaturze, co prowadzi do
namnożenia się patogenów do niebezpiecznego poziomu. Chłodnie nie
powinny być przeładowane żywnością, ale tak, by powietrze mogło swobod-
nie przepływać wokół półek. Najniższa temperatura w odpowiednim miejscu
urządzenia chłodniczego powinna wynosić 0-5°C. Część zamrażająca musi
mieć temperaturę nie wyższą niż -18°C.
Pamiętajmy, że Yersinia enterocolitica (i Listeria monocytogenes) mogą rozmna-
żać się w temperaturze 5°C lub nawet niższej, a więc w temperaturze chłodni.
8. Spożywanie żywności przeterminowanej lub nawet przed datą bezpiecznego
użycia, gdy warunki przechowywania nie były właściwe.

12.3.3 Higiena żywności — warunki przemysłowe

Wiodącą zasadą higieny w produkcji jest eliminacja patogenów i redukcja zaka-
żeń do bezpiecznego (akceptowalnego) poziomu. Polega to między innymi na
zabiegach dotyczących surowców (selekcja mięsa zwierząt, drobiu, ryb) pocho-

331
dzących od zwierząt zdrowych (niezainfekowanych) oraz na stosowaniu odpo-
wiednich metod przechowywania i zapobiegania infekcji (sekcja 12.2).
Żywność niepewna, wytwarzana na dużą, przemysłową skalę, może zagra-
żać licznym populacjom ludzkim, stąd też sposoby produkcji i sprzedaży podle-
gają regulacjom prawnym. Jedną z metod zapewnienia bezpieczeństwa spożycia
jest stosowany na szeroką, światową skalę tzw. System HACCP.

12.3.3.1 System analizy krytycznych punktów zagrożenia (HACCP)

System HACCP (ang. hazard analysis critical control points) sprowadza się
w zasadzie do szczegółowego nadzoru nad procesem produkcyjnym i kontrolą
dających się przewidzieć zagrożeń na poszczególnych etapach przeróbki
surowca.
Obejmuje on następujące fazy: 1) obiektywne oznaczenie momentów zagro-
żenia poprzez analizę wykresu ciągu produkcyjnego pokazującego wszystkie
aspekty procesu. Analiza ta może obejmować również źródła surowca i rozpro-
wadzenie (sprzedaż) gotowego produktu; 2) identyfikację krytycznych punktów
kontrolnych (CCP, ang. critical control points), to jest tych etapów procesu,
w czasie których działalność prewencyjna lub korygująca może zapobiec zagro-
żeniom; 3) monitorowanie na etapach CCP w celu oznaczenia, czy proces prze-
biega w granicach z góry określonej tolerancji.
Oznaczenia bakteriologiczne w CCP mogą wykazać obecność lub stopień
zainfekowania, mogą również wykryć występowanie drobnoustrojów patogen-
nych i w ten sposób wyznaczyć niezbędność szybkiej reakcji korygującej, jeśli
taka jest wskazana. Metody tradycyjne, szczególnie oparte na liczeniu kolonii, są
zbyt powolne, aby można było szybko interweniować w nowoczesnym procesie
produkcyjnym. Oto niektóre szybkie metody:
Lumac® Autobiolicznik Μ 4000 (Perstorp Analytical LUMAC, Landgraaf,
Holandia). System ten oparty jest na wykrywaniu zanieczyszczeń mikrobiologi-
cznych w próbkach mleka UHT itp. Zasada wiąże się z oznaczeniem ATP
w próbce. Obecność ATP, który pochodzi z żywych zakażających drobnoustro-
jów, wykrywany jest w następujący sposób. Badane próbki preinkubuje się (30°C
przez 48 godz.), tak by możliwy był wzrost zakażających mikroorganizmów. Po
inkubacji określoną objętość (np. 50 ml) przenosi się do kuwety bez ATP, w celu
oznaczenia w obecności hydrolizującej ATPazy (wartość tła ATP). Następnie
próbkę traktuje się odczynnikiem, który niszczy błony cytoplazmatyczne wszel-
kich zakażających organizmów. Po takim zabiegu z komórki wycieka ATP. Jego
ilość określa się stosując reakcję lucyferyny z lucyferazą, wywołującej pojawienie
się światła (chemiluminescencja) w obecności nawet minimalnej ilości ATP.
Wyemitowane światło mierzy się na fotopowielaczu (miernik światła), a wynik
przedstawia się jako wartość cyfrową. Cała procedura jest zautomatyzowana, co
pozwala na wykonanie testu w ciągu 15-20 minut. Produkty, z których pobrano
próbkę do oznaczeń, trafią do dystrybucji, gdy wyniki oznaczeń są zadowalające.
Pomimo opóźnienia na skutek preinkubacji próbki, proces produkcyjny może
być kontynuowany. Konieczne jest jedynie przechowywanie partii (transzy)
poddanej analizie.

332
 Oznaczenie oporności. Próbkę żywności przenosi się do odpowiedniej poży-
wki wzrostowej. Przyjmuje się założenie, że liczba bakterii w badanym materiale
jest proporcjonalna do poziomu metabolizmu wykrywanego w pożywce. Inten-
sywność metabolizmu, tj. jego poziom, oznacza się mierząc spadek oporu elek-
trycznego (wzrost przewodnictwa) w zależności od czasu. Spadek oporu, jak
można założyć, jest spowodowany metabolizowaniem dużych cząsteczek i wzro-
stem liczebności jonów. Są jednak pewne problemy utrudniające interpretację:
drobnoustroje odpowiedzialne za zakażenie żywności mogą nie rosnąć w zasto-
sowanej pożywce, a bliżej nieokreślone czynniki mogą hamować normalny meta-
bolizm innych drobnoustrojów.
Określenie zawartości dwutlenku węgla. W niektórych przypadkach sto-
pień zakażenia drobnoustrojami określa się mierząc wytwarzanie dwutlenku
węgla. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy nie można zastosować oznacza-
nia zmian oporności.
Metoda bezpośredniego oznaczania epifluorescencji na filtrach (DEFT, ang.
direct epifluorescent filter technicjue) (patrz sekcja 14.8.1) jest szczególnie przy-
datna do badania zakażeń mleka.
Test z wykorzystaniem lizatów amebocytów Limulus (LAL, ang. Limulus
amoebocyte lysate). Za pomocą tego testu oznacza się ilość lipopolisacharydu
(LPS), (patrz sekcja 2.2.9.2) bakterii gramujemnych. Zasada testu polega na
koagulacji przez LPS krwinek (ameboctów) kraba Limulus polyphemus. Pozwala
na wykrycie zawartości LPS w minimalnej ilości, mniejszej niż 10-9 g/ml. Za
pomocą testu LAL wyznacza się zawartość LPS zarówno żywych jak i martwych
bakterii.
Oznaczenia z użyciem sond DNA. Wyznakowana sonda DNA (sekcja 8.5.3)
wykrywa określone gatunki bakterii w próbkach żywności, pod warunkiem jej
odpowiedniej specyficzności w stosunku do poszukiwanego drobnoustroju.
Modyfikacją tej metody jest test PCR (sekcja 8.5.4), za pomocą którego wykrywa
się określone bakterie stosując specyficzne startery — podobnie jak w diagno-
styce bakterii chorobotwórczych (sekcja 8.5.4.1).
 ROZDZIAŁ

13
Bakteriologia stosowana II
- różnorodne aspekty

13.1 Karmienie zwierząt, ochrona roślin

Bakterie nie tylko oddziałują na żyzność gleby (rozdział 10), lecz także mają
swój pożyteczny udział w karmieniu zwierząt hodowlanych i ochronie niektó-
rych zbiorów.

13.1.1 Kiszenie paszy i białko z jednokomórkowców

13.1.1.1 Kiszonki
Zakwaszanie jest tradycyjnym sposobem przechowywania traw (i niektórych
innych roślin uprawnych). Umożliwia to podawanie zwierzętom odpowiedniej
paszy także w zimie, wobec niedostatku pokarmu roślinnego. Zasada sporządza-
nia kiszonek polega na fermentacji, w warunkach beztlenowych, poszatkowanej
trawy. Bakterie, np. z rodzaju Lactobacillus, żyją na powierzchni roślin i zatem
również w zbiornikach (silosach), w których zakwasza się masę roślinną. Bakte-
rie fermentujące przetwarzają cukry roślinne (fruktozę, glukozę, sacharozę)
głównie na drodze fermentacji mlekowej (sekcja 5.1.1). Wytworzony kwas mle-
kowy gwałtownie obniża pH (do około 4,0), zabijając te bakterie (szczególnie
z rodzaju Clostridium), które powodowałyby gnicie. Pozwala to na zachowanie
wartości odżywczych zbiorów. Zakwaszenie powoduje także zahamowanie roz-
woju Listeria monocytogenes. W niedostatecznie sfermentowanych kiszonkach,
gdy pH jest wyższe niż 5,5, L. monocytogenes rozmnaża się, a jest to bakteria
potencjalnie chorobotwórcza, wywołująca np. poronienia lub obumarcie płodu.
W produkcji kiszonek na dużą skalę używane są wielkie czarne worki plasti-
kowe zamiast silosów. W procesie sporządzania kiszonek stosuje się różnorodne
dodatki, które przyspieszają kwaszenie, lub jako pasza wpływają na przyrost
masy karmionych nimi zwierząt. Powszechne jest również wzbogacanie kiszonki
szczepami bakterii mlekowych wywołujących homofermentację (sekcja 5.1.1.1).

334
 W zależności od potrzeb bierze się pod uwagę dodawanie szczepów bakterii
dostosowanych do rozkładu surowca roślinnego, wykorzystywanie szczepionek
zawierających bakterie fermentacji heteromlekowej, wytwarzające lotne kwasy
tłuszczowe, które hamują rozwój grzybów w warunkach tlenowych, gdy kiszon-
ki są gotowe do skarmiania zwierząt. Rozważa się także możliwość modyfiko-
wania bakterii metodami inżynierii genetycznej, w celu nadania szczepionce
właściwości rozkładu wielocukrów, wówczas gdy surowiec roślinny zawiera
mało rozpuszczalnych węglowodanów [nowe tendencje w szczepieniu kiszonek:
Weinberg i Muck (1996), FEMSMR 19: 53-68].

13.1.1.2 Białko z organizmów jednokomórkowych (SCP)

SCP (ang. single-cell protein) uzyskuje się z komórek niektórych drobnoustrojów
(bakterii, drożdży i jednokomórkowych glonów) hodowanych na dużą skalę.
Stanowią one źródło białka paszy dla zwierząt i w diecie człowieka. We wczes-
nych latach osiemdziesiątych, gdy cena białka była wysoka, rozpoczęto produ-
kcję tysięcy ton białka bakteryjnego stosowanego jako paszę. Bakterią wykorzy-
stywaną do tego celu był Methylophilus methylotrophus; metylotrof (sekcja 6.4)
hodowany na podłożu metanolowym. Do genomu tej bakterii wbudowywano
gen E. coli, odpowiedzialny za wytwarzanie dehydrogenazy glutaminianowej,
której obecność zwiększała asymilację amoniaku.

13.1.2 Kontrola biologiczna — inne zastosowania bakterii

Termin „kontrola biologiczna" używany jest zwykle do określenia, wykorzysty-
wanej przez człowieka, właściwości bakterii ograniczającej liczebność lub aktyw-
ność biologiczną innych organizmów. Na dużą skalę właściwość ta znajduje
zastosowanie między innymi w rolnictwie i leśnictwie. Polega ona na wprowa-
dzaniu do środowiska określonych drobnoustrojów lub ich toksyn w celu zabicia
ewentualnie uszkodzenia owadów stanowiących zagrożenie dla upraw. Bakterie
takie (lub ich toksyny) nazywa się bioinsektycydami, lub biopestycydami.
Szczepy Bacillus thuringiensis wytwarzają różne typy owadobójczych kry-
ształów białkowych (ICP, ang. insecticidal crystal protein), oznaczanych symbo-
lami Cry typu I-IV (z różnymi podtypami). Mają one szerokie zastosowanie
wobec licznych owadów — szkodników plonów. Geny odpowiedzialne za
wytwarzanie tych białek zwykle umiejscowione są na plazmidach.
Większość białek ICP powstaje w czasie wytwarzania przetrwalników, jako
kryształy umiejscowione wewnątrz komórki w sąsiedztwie endospor. Synteza
ICP jest związana ze sporulacją, gdyż odpowiednie geny ICP podlegają trans-
krypcji z udziałem specyficznych czynników sigma, takich jak σΈ analogiczny do
σΕ Bacilus subtilis (patrz rys. 7.14). Geny dla ICP, CryIII, podlegają transkrypcji
w stadium wegetatywnym wzrostu, a ich silne wyrażenie występuje u mutan-
tów, u których zablokowane jest stadium fosforylacji (rys. 7.14).
[Regulacja wytwarzania ICP: Baum i Malvar (19995) MM 18: 1-12].
Kryształy, którymi potraktowano plony, podlegają szybko degradacji, stąd
zabieg trzeba powtarzać, aby osiągnąć efekt. Udało się jednak zmodyfikować

335
Β. thuringiensis, tak by substancja toksyczna dla owadów gromadziła się
wewnątrz toksykogennych bakterii — wykazując w tej formie wysoką aktyw-
ność [Lereclus i wsp. (1995) Biotechnology 13: 67-71].
Niektóre szczepy B. thuringiensis, B. sphaericus i Clostridium bifermentans
wytwarzają toksyny zabijające komary. Podejmowane są wysiłki, by, między
innymi (wykorzystując techniki inżynierii genetycznej), uzyskać odmiany bakte-
rii toksycznych dla komarów przenoszących zarazki takich chorób jak malaria,
filarioza i żółta gorączka [Porter, Davidson i Liu (1993) MR 57: 838-861].
Zastosowanie bakterii gramdodatnich w procesach kontroli biologicznej
omówione zostało przez Emmermeta i Handelsmana (1999) FEMSML171,1-19].
Pseudomonas fluorescens może zmniejszać straty niektórych upraw wywo-
ływane przez mróz, wykorzystując składniki odżywcze niezbędne dla bakterii
„lodotwórczych" powodujących powstawanie kryształków lodu (sekcja 10.4).

13.2 Biokopalnictwo (bioługowanie)

Od wielu łat bakterie chemolitotroficzne (gatunki np. Thiobacillus) stosowano na
skalę przemysłową w celu wydobywania (ługowania) niektórych metali z ubo-
gich rud. Dziś takie biokopalnictwo (zwane też biogórnictwem, lub bioługowa-
niem) ma jeszcze większe znaczenie w związku z wyczerpaniem się zasobów
niektórych bogatych rud. Szacuje się, że roczne odzyskiwanie miedzi metodami
mikrobiologicznymi przekracza 1 milion ton [Ehrlich i Brierley (1990) Microbial
Mineral Recovery; New York: McGraw-Hill].
Miedź można odzyskać np. z ubogich rud zawierających chalkopiryt
(CuFeS2). Jedna ze stosowanych metod polega na recyklicznym przepuszczaniu
roztworu z kwasem siarkowym przez pokruszoną rudę z zawartymi w nim
bakteriami chemolitotroficznymi. Żelazo (Fe2+) wypłukiwane z rudy jest utle-
niane przez bakterie do Fe3+, co prowadzi do powstania żelaza rozpuszczonego.
To powoduje wypłukiwanie siarki, która jest utleniana do siarczanu. Leptospiril-
lum ferrooxidans (utleniacz żelaza) i Thiobacillus thiooxidans (utleniacz siarki) mogą
przeprowadzać te procesy. Pożywkę dla bakterii stanowi albo stosowany w pro-
cesie płyn wymywający, albo sama ruda. Z materiału wyługowanego usuwa się
periodycznie miedź (do 5 gramów na litr) — stosując np. elektrolizę. Metaboli-
zujące bakterie utrzymują temperaturę około 40-50°C, a konwekcja powietrza
zabezpiecza niezbędne warunki tlenowe.
Ługowanie miedzi przy bardzo niskim pH, korzystne, gdyż zapobiega precy-
pitacji Fe 3+ , uzyskuje się stosując odpowiednie szczepy Thiobacillus thiooxidans
i Leptospirillum ferrooxidans. W celu oznaczenia bakterii przeprowadzających
ługowanie bada się region DNA zawarty między genami dla 16S i 23S rRNA
(patrz sekcja 16.6). DNA potrzebny do badań ekstrahuje się z substancji wyługo-
wanych [Vasquez i Espejo (1997) AEM 63: 332-334].
Z badań nad przemianami siarki w procesie ługowania wynika, że biolo-
giczne wypłukiwanie pirytu przebiega w sposób cykliczny, a produkty rozkładu
zwierają tiosiarczany i politioniany. Jony żelazowe (Fe3+), wytwarzane w wyniku
2+
utleniania jonów Fe przez bakterie, odgrywają aktywną rolę zarówno w utle-
nianiu pirytu, jak i tiosiarczanów. Metabolizm litotroficznych bakterii przepro-

336
wadzających ługowanie utrzymuje stały poziom tych jonów [Schippers, Jozsa
i Sands (1996) AEM 62: 3424-3431].
W ostatnich latach zastosowano bioługowanie, między innymi w Afryce
Południowej, Brazylii i Australii, jako podstawową metodę wydobywania złota
z tzw. ubogich rud arsenopirytowych.
Z tego typu rud wypłukiwanie złota metodami zwykle stosowanymi, to
jest za pomocą cyjanków, nie jest możliwe, gdyż piryt i arsenopiryt zawarte
w rudzie chronią złoto przed cyjankami. Rozkruszona ruda jest poddawana
działaniu bakterii (fot. 13.1), a arsenopiryt (FeAsS) podlega upłynnieniu
przez utlenianie (do FeAsO4 i H2SO4), odsłaniając złoto, które wydobywa się
traktując cyjankami. Złoto oddziela się z kompleksu z cyjanem, przez adsorpcję
na węglu. Płyn pozostały po ługowaniu może być oczyszczony przez bakterie,
cyjanki — utlenione do dwutlenku węgla i mocznika, a mocznik utleniony do
azotanu.
[Mikrobiologia ługowania metali (sprawozdanie z konferencji): FEMSMR
(1993) 11:1-267. Drobnoustroje w kopalnictwie (artykuł przeglądowy): Rawlings
i Silver (1995) Biotechnology 13: 773-778]. Uaktualniony przegląd głównych
typów bakterii w przemysłowych procesach bioługowania podaje Rawlings,
Tributsch i Hansford [(1999) Microbiology 145: 5-13].

13.3 Biologiczne proszki do prania

„Biologiczne" (zwane u nas enzymatycznymi) proszki do prania zazwyczaj
zawierają enzymy nazywane subtylizynami. Wytwarzają je gatunki Bacillus.
Jeden z tych enzymów, zwany „subtylizyna Carlsberga", uzyskiwany z B. licheni-
formis, hydrolizuje większość wiązań peptydowych białek i niektóre wiązania
estrowe lipidów. Enzym ten jest stabilny w szerokim zakresie pH, a jego stabil-
ność jest niezależna od Ca 2+ . Ta druga właściwość jest ważna, gdyż proszki do
prania zawierają zazwyczaj związki chelatujące między innymi jony wapnia usu-
wane w celu zmiękczania wody.

13.4 Oczyszczanie ścieków

Ścieki zawierają zarówno zanieczyszczenia z mieszkań i domów (tzw. ścieki
komunalne, z urządzeń sanitarnych), jak również pochodzące z działalności
przemysłowej i rolniczej. W ich skład wchodzą zawiesiny, substancje rozpusz-
czone i koloidalne. Ścieki zrzucone do rzek i jezior mogą wywierać różnorakie,
szkodliwe działania. Mogą na przykład stać się źródłem infekcji, np. cholery.
Inny ważny problem stanowią związki organiczne w ściekach. Bakterie, znaj-
dujące się w dużych ilościach w ściekach, metabolizują substancje organiczne,
szybko wykorzystując dostępny tlen na obszarach wodnych, szczególnie
w wodach nieruchomych lub wolno płynących. Oznaczać to może śmierć ryb
i innych zwierząt, dla których tlen jest niezbędny. Powstające warunki beztle-
nowe umożliwiają wzrost bakterii redukujących siarczany (sekcja 5.1.1.2
i rys. 10.3) oraz innych organizmów, których produkty metabolizmu zawierają

337
Arsenopiryt został roztarty na pyl, zmieszany z wodą, kwasem i pożywką dla bakterii. Mieszaninę
przepuszczono przez szereg nawietrzanych tanków bioutleniających zaszczepionych bakteriami
chemolitotroficznymi. Bakterie upłynniają arsenopiryt — odsłaniając zawarte w nim złoto, które
teraz może być ekstrahowane za pomocą cyjanku. W wyniku bioługowania ilość odzyskanego złota
może być dwukrotnie większa niż bez tego zabiegu. Bioługowanie nie wymaga dużej energii
w porównaniu z tradycyjną metodą uzyskiwania złota z rud ubogich, np. stapiania (utleniania
w wysokiej temperaturze) i ługowania pod ciśnieniem, w środowisku zakwaszonym, napowietrza-
nym. Fotografia — dzięki uprzejmości A. Hartleya.

siarczki i inne trucizny. Podstawowe cele oczyszczania ścieków to, po pierwsze

— wyeliminowanie lub zmniejszenie liczby drobnoustrojów patogennych, po
drugie zmniejszenie zużywania tlenu przez ścieki, to jest zmniejszenie biologicz-
nego zapotrzebowania tlenu, tzw. BZT w ściekach.

13.4.1 Tlenowe oczyszczanie ścieków

Surowe (to jest poddane oczyszczaniu) ścieki wprowadza się w celu wstępnej
obróbki do zbiornika sedymentacyjnego, w którym usuwane są cząstki nierozpu-
szczalne, stanowiące tzw. osad. Jego nadmiar wraz z opadłymi kłaczkami, złożo-
nymi z drobnoustrojów, jest usuwany. W tej fazie wstępnie oczyszczone ścieki
poddawane są drugiemu etapowi na przykład na tzw. złożach zraszanych,

338
będących rodzajem filtra biologicznego (fot. 13.2, góra). Osad podlega rozprosze-
niu za pomocą obracających się rur, z których wycieka przez umieszczone w nich
otwory. Właściwe złoże składa się z rozkruszonych kamieni, umieszczonych
w postaci grubej warstwy w zbiorniku. Przepływając przez złoże, ścieki wchodzą
w kontakt z tzw. błonkami biologicznymi otaczającymi rozdrobnione kamienie.
Błonki składają się z dużej ilości pierwotniaków (orzęski) i licznych bakterii tleno-
wych, takich jak Zoogloea ramigera. Wraz z rozproszonymi ściekami na złoże
dostaje się tlen w postaci rozpuszczonej. Substancje organiczne zawarte w ście-
kach podlegają biologicznemu utlenieniu, dzięki drobnoustrojom w błonkach
biologicznych. Dochodzi w ten sposób do mineralizacji materii organicznej zawa-
rtej w ściekach (sekcja 10.3.4). Usuwany oczyszczony ściek ma już znacznie obni-
żone zapotrzebowanie na tlen i zrzucony do rzeki, lub innego zbiornika wodnego
nie zużywa w nich tlenu — odmiennie niż ścieki przed oczyszczeniem. Duże ilo-
ści bakterii w błonkach biologicznych stają się pokarmem dla pierwotniaków.
Drugim sposobem oczyszczania tlenowego jest stosowanie tzw. osadu czyn-
nego. Ścieki, wstępnie oczyszczone przez sedymentację, wprowadza się do
zbiornika (reaktora) zawierającego osad czynny będący zbiorowiskiem różnych
organizmów, głównie bakterii (np. Acinetobacter spp., Alcaligenes spp., Sphaeroti-
lus natans, Zoogloea ramigera) i pierwotniaków (orzęski, wiciowce, ameby). Płyn
i osad energicznie miesza się i napowietrza przez 6-12 godzin. Powoduje to utle-
nienie substancji organicznej lub jej asymilację w postaci komórek biomasy.
Rezultatem jest znaczne obniżenie wartości BZT. Całkowicie oczyszczone ścieki
odpływają z urządzenia oczyszczającego po przepłynięciu przez osadnik usu-
wający osad. Pełne oczyszczenie wymaga skutecznej flokulacji, to jest agregacji
występujących organizmów, które później osadzają się tworząc osad. Proces flo-
kulacji jest ułatwiony hydrofobowością powierzchni komórek, prowadzącą do
łączenia się ich w tzw. kłaczki dostrzegalne gołym okiem. Ścieki dostają się do
wnętrza kłaczków przez kanały (pory w obrębie kłaczków). [Olofsson, Zita i Her-
mansson (1998) Microbiology 144: 519-528]. [Structure of microbial communities
in sewage treatment plants: Amann, Lemmer i Wagner (1998) FEMSME 25:
205-215].
W czasie oczyszczania metodą osadu czynnego jego objętość zwiększa się,
jako rezultat rozmnażania się drobnoustrojów, a część zostaje zachowana w celu
ciągłego stosowania w procesie oczyszczania kolejnych partii ścieków.
W ostatnim dziesięcioleciu udoskonalono proces oczyszczania ścieków sto-
sując technologię napowietrzanych filtrów biologicznych (fot. 13.2, dół).
Urządzenie zasadniczo zbudowane jest z zanurzonego złoża, składającego się
z małych granulek, pokrytych błonką biologiczną (fot. 13.2, dół, wstawka).
Powietrze wtłaczane jest od dołu złoża, a zastosowanie drobnych granulek
powoduje odsączanie małych cząstek zawartych w ścieku oraz mineralizację
w ściekach substancji organicznej. Tego typu złoże zawiera do pięciu razy więcej
biomasy w postaci błonki biologicznej, w porównaniu ze zwykłym urządzeniem
filtrującym o podobnych rozmiarach. Unowocześnione reaktory zajmują więc
mniej miejsca.
Gdy przepływ ścieków jest odpowiednio duży, a tym samym napowietrzanie
znaczne, w błonkach biologicznych rozwijają się także bakterie nitryfikacyjne
(sekcja 5.1.2; rys. 10.2). Jest to korzystne, ponieważ nitryfikacja jest pierwszym

339
340
etapem usuwania azotu ze ścieków. Jeśli nitryfikacja jest skuteczna, wypływający
ściek, częściowo już oczyszczony, może zostać poddany procesowi denitryfikacji
(sekcja 5.1.1.2 i 10.3.2, rys. 10.2). Ponieważ metoda ta może także być zastoso-
wana w warunkach beztlenowych (co sprzyja denitryfikacji), znaczne ilości azotu
zostają usunięte z urządzeniach złożonych z reaktorów naprzemiennych: tleno-
wych i beztlenowych. Do denitryfikacji można również wykorzystywać bakterię,
która przeprowadza ten proces tlenowo [Patureau i wsp. (1994) FEMSME 14:
71-78], w ten sposób zmniejszając koszt, gdyż używany jest tylko jeden reaktor,
w którym przebiega nitryfikacja i denitryfikacja. Proces ten został przedyskuto-
wany przez Kuenena i Robertsona [(1994) FEMSMR 15: 109-117],
Zbiorniki oczyszczające okresowo przemywa się, przepuszczając wodę
w odwrotnym kierunku.
Trzy podstawowe metody oczyszczania ścieków w warunkach tlenowych
przedstawiono w tabeli 13.1.
Usunięcie soli amonowych ze ścieków przeciwdziała eutrofizacji w odbieral-
nikach wodnych. Termin eutrofizacja oznacza nadmierne wzbogacenie wody
w substancje odżywcze wykorzystywane przez glony i sinice (cyjanobakterie)
do wzrostu, co prowadzi do zanieczyszczeń zbiorników wodnych. Jednym
z ostatnich osiągnięć jest zastosowanie reaktora, w którym proces nitryfikacji
przebiega z dużą wydajnością, nawet wówczas, gdy zawartość amoniaku jest
wyższa od 0,5 g azotu na litr. Po oczyszczeniu związki amonowe są prawie
zupełnie utlenione do azotynów. Urządzenie to pracuje w temperaturze 35°C,
a głównym nitryfikatorem jest Nitrosomonas [Logemann i wsp. (1998) FEMSME
27: 239-249].

13.4.2 Beztlenowe oczyszczanie ścieków

Ścieki zawierające w dużej ilości zanieczyszczenia stałe, np. odpady z ferm,
pozostałości po oczyszczaniu w warunkach tlenowych, mogą być poddane pro-
cesom beztlenowym. Wówczas wielkocząsteczkowe związki organiczne podle-
gają rozkładowi do substancji prostych i gazów. Procesy te przeprowadzają
liczne bakterie, których metabolizm odbywa się bez udziału tlenu. Rozkład ście-
ków przebiega zwykle w temperaturze około 35°C. Polimery, np. wielocukry, są
trawione przez egzoenzymy, a powstające cukry są fermentowane (przez bakte-
rie z rodzaju Bacteroides i Clostridium). Produktami fermentacji są octany, mle-
czany, propioniany, etanol, dwutlenek węgla i wodór. Większość węgla zostaje
usunięta ze ścieków w postaci dwutlenku węgla i metanu.

Fot. 13.2 Tlenowe oczyszczanie ścieków, wg starej i nowej technologii (patrz sekcja 13.4.1)
Góra — złoża zraszane, w Bodmin, Konwalia, UK. Część dolna (wstawka): bakterie (pow.
ok. 11000x) na powierzchni złoża „dwuwęglanowego", stosowanego w niektórych oczyszczalniach
typu BAF.
Fotografie złoża — dzięki uprzejmości B. Lessware'a, ABIPP, South-West Water, Exeter, UK.
Fotografie z mikroskopu elektronowego bakterii na cząstkach dwuwęglanu — uprzejmość Anjou
Recherche — OTV, Compagnie Generale des Eaux, Maisons Laffitte, Francja.

341
 Końcowy produkt oczyszczania beztlenowego jest prawie bezwonny i bogaty
w biomasę złożoną z drobnoustrojów. W tej postaci może być stosowany
w rolnictwie jako nawóz. Produkt gazowy (tzw. biogaz) zawiera ponad 50%
metanu. Jest to źródło energii wykorzystywane w procesie oczyszczania.

13.4.3 Wpływ oczyszczania ścieków na środowisko

Technologia właściwego oczyszczania ścieków jest znana i stosowana od wielu
lat. Mimo to nadal buduje się systemy rurociągów, którymi część ścieków usuwa
się wpuszczając je do zbiorników wodnych mórz i oceanów. Jest to tylko pozor-
nie najtańszy sposób pozbycia się zanieczyszczeń ściekowych. Cena niszczenia
środowiska jest olbrzymia.

13.5 Skąd pobieramy wodę?

Słodką wodę pobieramy głównie z rzek (woda powierzchniowa) i podziemnych
cieków wodnych zalegających między skałami, w podziemnych zbiornikach
wodnych. Wody powierzchniowe są z reguły bardziej zanieczyszczone. Stopień
wykorzystywania wód powierzchniowych jest różny, zależnie od położenia geo-
graficznego jej użytkowników. Na przykład Kanada i Szkocja wykorzystują
przede wszystkim wody powierzchniowe, podczas gdy Austria, Dania i Portu-
galia — głównie zasoby podziemne.
Woda przeznaczona do spożycia powinna być odpowiednio uzdatniona, aby
wyeliminować z niej zarazki, powodujące choroby (np. cholera). Proces uzdat-
niania wody pitnej ma też drugi cel — usunięcie, lub zmniejszenie do bezpiecz-
nego stopnia ilości substancji szkodliwych. Ważne jest także, by końcowy pro-
dukt był klarowny, bez smaku i zapachu.

342
 13.5.1 Uzdatnianie wody na dużą skalę — do spożycia w miastach
Woda, zanim trafi do systemu rozprowadzania i pobierania jej, poddawana jest
różnorodnym zabiegom. Im jej początkowa jakość jest gorsza, tym procesy
uzdatniania muszą być bardziej złożone. W praktyce stosuje się zabiegi w róż-
nych kombinacjach.

13.5.1.1 Uzdatnianie wód gruntowych

Wody gruntowe (podziemne) pobierane są ze studni głębinowych i ze źródeł.
Mają one zazwyczaj dobrą jakość i wymagają jedynie słabego napowietrzania,
przesączania przez „szybkie" filtry piaskowe i dezynfekcji (patrz niżej). Konie-
czne jest natomiast specjalne oczyszczanie wówczas, gdy woda gruntowa
zawiera znaczne ilości azotynów (patrz niżej).

13.5.1.2 Uzdatnianie wód powierzchniowych

Zanieczyszczona woda, zanim zostanie poddana procesowi oczyszczania, może
być pozostawiona w zbiornikach sedymentacyjnych. W tych warunkach niektóre
drobne cząstki osadzają się na dnie, a płyn znad osadu bywa poddawany
odsączaniu w bębnach z nierdzewnej stali, o wielkość otworów około 30 μm).
Woda zarówno powierzchniowa, np. z zanieczyszczonych rzek, jak i podpo-
wierzchniowa (gruntowa) zawiera tlen czasem w niewielkich stężeniach, tak że
musi być wówczas napowietrzana, za pomocą urządzeń kaskadowych lub rozpy-
lających, zapewniających dobry kontakt wody z powietrzem. Jest to konieczne,
aby zapewnić skuteczność dalszego oczyszczania.
Pozostałe drobne cząstki różnych substancji usuwa się dodając koagulanty
(np. siarczan glinu). Pod ich wpływem zanieczyszczenia łączą się w duże kłaczki,
które następnie muszą być oddzielone od wody. W tym celu wodę pompuje się
do górnej części urządzenia, w którym kłaczki, zlepione zazwyczaj śluzem,
tworzą warstwę, nad którą znajduje się klarowna woda. Tanki klarujące wodę
działają w procesie ciągłym. Z nich — czysta woda podawana jest do dalszej
obróbki.
Woda, która zawiera już tylko bardzo drobne cząstki oraz substancje rozpu-
szczone, może być poddawana dalszemu oczyszczaniu na tzw. szybkich filtrach
piaskowych, działających na zasadzie mechanicznego sita. Woda spływa
poprzez warstwę piasku, o średnicy ziaren około 1 mm. Złoże piasku oczyszcza
się tłocząc od dołu powietrze, a następnie wodę. Powoduje to usunięcie z piasku
cząstek, które zostały oddzielone od wody w procesie filtracji.
Filtry piaskowe, zwane powolnymi, składają się z warstwy piasku o mniej-
szych ziarenkach, w górnej swej części stwarzają warunki rozwoju błonki biolo-
gicznej złożonej z bakterii i glonów — dzięki temu filtr piaskowy działa nie tylko
jako sito mechaniczne, lecz także pełni funkcję oczyszczania biologicznego,
mineralizując substancje organiczne i usuwając częściowo azot i fosfor. Filtry pia-
skowe powolne mogą również eliminować substancje psujące smak i nadające
wodzie niemiły zapach. Usuwają również toksyny wytwarzane przez sinice,

343
które mogą żyć w wodach. Do tego rodzaju niebezpiecznych toksyn należą sub-
stancje występujące w tzw. zakwitach sinic, jak Anabaena, Aphanizomenon, Micro-
cystis, Nodularia i Oscillatoria. W odpowiednich warunkach drobnoustroje te żyją
w różnych zbiornikach wodnych, a wytwarzane przez nie toksyny mogą powo-
dować stany zapalne przewodu pokarmowego, choroby wątroby i inne przy-
padłości u człowieka i zwierząt [Bell i Codd (1994) RMM 5: 256-264].
Błonka biologiczna zawierająca także bakterie nitryfikacyjne (patrz sekcja
5.1.2) działające w warunkach tlenowych. Z tej przyczyny powolne filtry pia-
skowe spełniają swe funkcje tylko wówczas, gdy woda została odpowiednio
napowietrzona. Powolne filtry piaskowe nie są oczyszczane przez odwrotny
przepływ wody, jedynie górna warstwa piasku jest od czasu do czasu usuwana,
a następnie złoże piaskowe jest uzupełniane świeżym piaskiem.
Przed dezynfekcją (zazwyczaj na drodze chlorowania) pH wody może
wymagać skorygowania metodą chemiczną, gdyż kwasowość ma wpływ na sku-
teczność chlorowania.
Dezynfekcja. Woda przeznaczona do spożycia jest dezynfekowana, zwykle
za pomocą chloru, który działa szczególnie skutecznie na bakterie patogenne
pochodzące z odchodów. Są to między innymi takie bakterie jak E. coli oraz różne
gatunki Campylobacter, Clostridium, Salmonella, Shigella i Vibrio. Dlatego też zabieg
chlorowania zapobiega cholerze, durowi brzusznemu i wielu innym chorobom.
Chlor, będąc silnym czynnikiem utleniającym, reaguje i jest pobierany przez
różnorodne zanieczyszczenia wód. Część chloru zostaje od razu związana i unie-
czynniona w wyniku tego procesu. Gdy ten poziom „zapotrzebowania" chloru
przez system zostanie osiągnięty, dalsze chlorowanie jest źródłem wolnych rod-
ników chloru, które reagując z wodą dostarczają Cl2, HClO i CIO-. Zalecanym
poziomem wolnych związków chloru jest około 0,5 części na miliom (ppm)
( = 0,5 mg/litr). Chlor działa skuteczniej w wodzie, której pH jest niższe od 7.
W tych warunkach dysocjacja kwasu podchlorowego, związku chloru najbar-
dziej skutecznego w dezynfekcji, jest słabsza.
Jeśli woda zawiera amoniak, reaguje on z chlorem tworząc chloraminy. Są
one substancjami dezynfekującymi, które rozkładają się wolno, uwalniając chlor.
Są one mniej skuteczne, ale bardziej trwałe niż chlor. Zwiększanie zawartości
chloru w wodzie zwiększa zawartość chloramin do maksimum (zależnego od
początkowej zawartości amoniaku). Dalsze dodawanie chloru powoduje utlenia-
nie chloramin. Prowadzi to do zmniejszenia zawartości związków chloru. Po
osiągnięciu punktu załamania (rys. 13.1) dodatek chloru do wody powoduje
powstanie wolnych rodników. Tak więc, aby osiągnąć ten stan, dawka chloru
musi przekroczyć punkt załamania (rys. 13.1).
Nieliczne stacje uzdatniania wody stosują dodawanie amoniaku, wraz z chlo-
rem. Skuteczność dezynfekcji zależy jednak na połączonym działaniu rodników,
w wyższym stopniu niż na zawartości wolnych rodników.
Chlorowanie dużymi dawkami. Celem tego zabiegu jest eliminacja zapachu
i złego smaku wody przeznaczonej do picia. Nadmiar chloru jest w tym przy-
padku usuwany przez dodatek dwutlenku siarki, tzw. sulfonację. Działanie
dwutlenku siarki przerywa się, gdy zostanie osiągnięty normalny resztkowy
poziom chloru.

344
Chlor wprowadzony na początku może utleniać różne związki i jony. Początkowy odcinek krzywej
wskazuje na zapotrzebowanie chloru przez system, a następny odcinek określa spadek skuteczności
chlorowania. Dodany chlor reaguje z amoniakiem, tworząc monochloroaminę (NH2C1). Wzrost
zawartości chloru prowadzi do pojawienia się dichloroaminy (NHCl2). Wzrost poziomu chloramin
(tj. związane pozostałości chloru) widoczny jest na krzywej jako wzrost zawartości resztkowego
chloru. Dodając dalej chlor osiąga się punkt, w którym zaczyna on utleniać chloraminy (do N2 i HC1).
Wówczas ich zawartość (jako pozostałości chloru) maleje. Gdy związane pozostałości (chloraminy)
osiągną najniższy poziom (poziom załamania), dalsze dodawanie chloru prowadzi do gromadzenia
się wolnych resztek chloru, tj. chloru i produktów jego reakcji z wodą (sekcja 13.5.1.2).

Oznaczanie zawartości wolnego chloru. Test można przeprowadzić na

przykład za pomocą Ν,Ν-dietylo-p-fenylenodiaminy (tabletki DPD). Zawartość
wolnego chloru w wodzie odczytuje się na podstawie intensywności czerwonej
barwy powstającej w wyniku reakcji DPD z chlorem. Powstałą barwę porównuje
się z wzorcową skalą barw.
Należy pamiętać, że chlorowanie wody nie usuwa wszystkich zagrożeń zaka-
żenia. Niektóre wirusy (np. wirus Norwalk) i pierwotniaki (np. grubościenne
oocyry Cryptosporidium) mogą przeżyć rutynowe chlorowanie.
Ozon (w porównaniu z chlorem) jest silniejszym środkiem dezynfekującym,
lecz działa krócej. Aby osiągnąć wysoki stopień odkażenia wody, po zadziałaniu
ozonem można stosować chlorowanie małymi dawkami.
Oznaczenie skuteczności dezynfekcji. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO),
jak również Amerykańska Agencja Ochrony Środowiska (USEPA), podobnie jak
Komisja Europejska (EC), oraz agencje krajowe określają normy jakości bakterio-
logicznej wody pitnej. Niektóre bakterie, szczególnie bakterii z grupy coli (patrz
Aneks) i „paciorkowce kałowe" — są wskaźnikami zanieczyszczenia odchodami.
Ich obecność w uzdatnionej wodzie pitnej wskazuje na niewłaściwy stopień
oczyszczania wody, albo też na późniejsze skażenie. W tabeli 13.2 podano wykaz
niektórych obowiązujących norm.
Pałeczki okrężnicy i paciorkowce kałowe są organizmami wskaźnikowymi ze
względu na ich obfitość w jelitach. Ich obecność w próbkach wody wskazuje na
możliwość skażenia ściekowymi drobnoustrojami chorobotwórczymi. Byłoby
działaniem niepraktycznym badanie próbek na obecność poszczególnych, licz-
nych zarazków mogących występować w ściekach, gdyż określony patogen

345
może przebywać tam jedynie przejściowo. Co ważniejsze, bakterie wskaźnikowe
występują w jelitach w znacznie większych ilościach niż zarazki (np. E. coli —
około 108 komórek na gram odchodów). Dlatego też identyfikacja tych właśnie
bakterii w badanej próbie jest łatwiejsza. Umożliwia to również wykrycie nawet
bardzo małych zanieczyszczeń wody odchodami.
Jednym z tradycyjnych testów na wykrycie bakterii wskaźnikowych jest
metoda sączenia przez filtry membranowe (wielkość por około 0,2 μm). Następ-
nie filtry suszy się i nasącza odpowiednim podłożem bakteriologicznym. Jest
to podłoże selekcyjne, umożliwiające wytworzenie kolonii na filtrze jedynie
określonym bakteriom, np. E. coli.
Test probówkowy. Równe objętości wody dodaje się do szeregu probówek
zawierających pożywkę z laktozą (np. bulion MacConkeya — tab. 14.1). W podło-
żu umieszcza się małe probówki (rurki) Durhama, w których gromadzi się gaz
powstający w wyniku fermentacji cukru. W probówkach, w których znalazła się
przynajmniej jedna pałeczka coli (w określonej objętości), test wypadnie pozyty-
wnie i wykaże fermentację laktozy oraz wytworzenie gazu, zbierającego się
w rurce Durhama. Liczbę dodatnich i ujemnych probówek porównuje się z tablicą
statystyczną, z której odczytuje się najbardziej prawdopodobną liczbę (NPL)
pałeczek coli w próbce wody. W rzeczywistości wynik podaje jedynie przypusz-
czalną liczbę bakterii coli, gdyż podobny rezultat otrzymujemy w przypadku obe-
cności w próbce pewnych bakterii przetrwalnikujących, które także fermentują
laktozę i wytwarzają gaz. Błąd tego typu jest szczególnie prawdopodobny, gdy
badaniu poddaje się próbki wody chlorowanej, gdyż bakterie wytwarzające spory
są bardziej oporne na ten zabieg niż pałeczki okrężnicy. Dla potwierdzenia, że
w próbce jednak znajdowały się pochodzące z odchodów bakterie coli, które są
tolerancyjne na podwyższoną temperaturę, należy wykonać dwa dodatkowe
testy (przeprowadzane w temperaturze 44°C/24 godz.). Jest to test indolowy
(patrz sekcja 16.1.2.5) oraz test Eijkmana. W tym ostatnim z każdej „pozytywnej"
probówki dokonuje się posiew na podłoże (np. bulion tryptozowy z laurynianem
i laktozą), które zawiera czynnik powodujący zahamowanie wzrostu bakterii
przetrwalnikujących. Inkubując podłoże w 44°C i wykrywając fermentację
laktozy z produkcją gazu, oraz wytwarzanie indolu z tryptofanu, uzyskuje się
potwierdzenie obecności E. coli w badanej próbce wody.

346
 Woda należycie chlorowana nie powinna zawierać bakterii wskaźnikowych.
Duża liczba E. coli we wspomnianych testach wskazuje na znaczne zanieczysz-
czenie ujęć wodnych, lub wtórne zanieczyszczenie uzdatnionej już uprzednio
wody. Niewielka liczba pałeczek okrężnicy sugeruje słabsze lub wcześniejsze
zanieczyszczenie. Wykrycie źródeł skażenia wody odchodami może ułatwić
informacja dotycząca spektrum oporności na antybiotyki paciorkowców
kałowych, izolowanych w przypadku zakażeń wywołanych spożyciem wody,
do której dostały się odchody ludzkie lub zwierzęce [Wiggins (1996) AEM 62:
3997-4002].
Problem azotanów, pestycydów i innych substancji. Azotany występują
w wodach powierzchniowych i ostatnio coraz częściej w wodach gruntowych,
jako skutek używania nawozów w rolnictwie. Górna, dopuszczalna granica
zalecana przez Unię Europejską/Wlk. Brytanię (NO3/litr) wynosi 50 mg/litr.
Wartość zalecana przez USEPA (str. 345) wynosi 44,29 mg/litr (to jest 10 mg/litr
w formie N). Wodę, która zawiera azotany w dużym stężeniu, niekiedy miesza
się z wodą o małej zawartości. Można również taką wodę przetrzymywać przez
dłuższy czas w stacji uzdatniania. Wówczas możliwa jest denitryfikacja (patrz
sekcja 10.3.2). Praktykuje się również usuwanie azotanów na drodze jono-
wymiennej.
Pestycydy i niektóre inne toksyczne substancje można usuwać poprzez
adsorpcje na węglu aktywowanym.
Usuwanie wspomnianych wyżej substancji szkodliwych określane jest jako
trzeci stopień oczyszczania.

13.5.1.3 Problemy związane z systemami rozprowadzania

Masowe namnażanie drobnoustrojów i wytwarzane przez nie śluzy, gdy doty-

czy to rur wodociągowych, mogą obniżać jakość wody i ograniczać wydajność jej
pompowania. Zjawisko nadmiernego rozmnażania się drobnoustrojów w syste-
mie rozprowadzania wody wiązany był z obecnością węgla organicznego, któ-
rego dostępność zwiększa się działaniem chloru i ozonu, będącymi środkami
utleniającymi. Jednakże ostatnio, dzięki badaniom prowadzonym w Finlandii,
wykazano, że na wzrost drobnoustrojów ma wpływ zawartość fosforu. Nawet
wówczas gdy zawartość węgla w wodzie jest duża, namnażanie drobnoustrojów
zostaje ograniczona w warunkach deficytu fosforu. Usunięcie fosforu z wody
może stanowić ważny czynnik ograniczający koszt działań zapobiegających zja-
wisku bujnego rozmnażania się drobnoustrojów w rurach wodociągowych i
w urządzeniach towarzyszących [Miettinen, Vartiainen i Martikainen (1996)
Nature 381: 654-655]. [Drinking water biofilms: Kalmbach, Manz i Szewzyk
(1997) FEMSME 22: 265-279].
Zarazki mogą się dostać do wody gotowej już do picia poprzez uszkodzone
rury, pompy, zawory i inne urządzenia, np. wieże ciśnień, i mogą się w nich
namnażać, jeśli poziom resztkowy środka dezynfekującego jest nieodpowiedni.
Taka sytuacja może prowadzić do złożonych interakcji wielu przeróżnych para-
metrów (ponowny wzrost pałeczek coli w wodzie pitnej [LeChevallier, Welch
i Smith (1996) AEM 62: 2201-2211].

347
 13.5.2 Rozprowadzanie wody na małą skalę
Małe, wiejskie ujęcia wody, np. ze strumieni i studni, można dezynfekować
naświetlaniem promieniami ultrafioletowymi, po uprzednim przepuszczeniu
wody przez odpowiedni filtr z włókien. Alternatywnym sposobem jest dezyn-
fekcja przefiltrowanej wody za pomocą podchlorynu wapnia (tabletek)
w urządzeniu zwanym „chlorynatorem". Tabletki ulegają stopniowemu rozpu-
szczaniu, uwalniając chlor.
Woda w małych ilościach (np. w czasie wypraw) może być gotowana,
albo traktowana tabletkami halazonu (p-karboksylo-N,N-dichlorobenzenosulfo-
namid).
W niektórych krajach rozwijających się wprowadza się nowe metody popra-
wiania jakości wody przeznaczonej do picia na terenach wiejskich. Można wodę
sączyć przez wielowarstwowy filtr z dostępnych na miejscu włókien. Filtr taki
zatrzymuje większość planktonu, w którym znajdują się zarazki cholery.
Działanie to znacznie zmniejsza występowanie cholery w takich krajach jak Ban-
gladesz [Huq i wsp. (1996) AEM 62: 2508-2512]. W Kenii do dezynfekcji wody do
celów spożywczych stosuje się ciepło pochodzenia słonecznego. Trwają badania
kliniczne, które potwierdzą skuteczność tej metody w zapobieganiu biegunkom
dziecięcym w społeczności Masajów [Joyce i wsp. (1996) AEM 62: 399-402].

13.6 Wykorzystywanie zarazków dla dobra człowieka

Takie zarazki jak Clostridium botulinum i C. tetani wytwarzają groźne neuro-
toksyny, które mogą wywoływać choroby kończące się zgonem. Toksyna botuli-
nowa (tzw. jad kiełbasiany) blokuje wydzielanie neuroprzekaźnika - acetylocho-
liny. Prowadzi to do ograniczenia funkcji mięśni i ich paraliżu. Jednakże ta
właśnie toksyna jest wykorzystywana w leczeniu niektórych neurologicznych
chorób mięśni, np. zeza. [Neurotoksyna botulinowa (zastosowania medyczne)
Schantz i Johnson (1992) MR 56: 80-99; Jankovic i Hallett: Therapy with Botuli-
num Toxin; New York: Marcel Dekker, 1994].

13.7 Tworzywa pochodzenia bakteryjnego - Biopol

Materiałem zapasowym bakterii jest polimer poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang.
polyhydroxybutyrate, sekcja 2.2.4.1). Ta naturalna substancja jest materiałem
wyjściowym dla wielu tworzyw termoplastycznych podlegających biodegradacji
(„Biopol", nazwa handlowa firmy Zeneca, Wielka Brytania). Homopolimer
(PHB) jest wytwarzany w odpowiednich warunkach hodowli, gdy Alcaligenes
eutrophus korzysta z glukozy jako jedynego źródła węgla. Jeśli podłoże uzupełni
się odpowiednimi składnikami, bakteria ta wytwarza kopolimer złożony
z hydroksymaślanu i hydroksywalerianianu. Kontrola składu podłoża wpływa
na proporcję obu składników w polimerze. Polimery (albo PHB, albo kopolimer)
tworzą wewnątrzkomórkowe ziarenka, które podlegają oczyszczeniu do postaci
drobnego, białego proszku.

348
 Biopol może być wykorzystany do produkcji pojemników, form, włókien
i warstw powierzchniowych oraz obrabiany w procesach wydmuchiwania
i wstrzykiwania. Stabilny w czasie normalnego użytkowania, wykorzystany —
po odpowiednim potraktowaniu — jest w pełni degradowalny.
Ostatnio zmodyfikowano geny A. eutrophus kodujące enzymy szlaku biosyn-
tezy PHB i wyrażono je w plastydach rośliny Arabidopsis thaliana, powodując
wytwarzanie przez nią. Może to pozwolić na wykorzystanie tego typu roślin
transgenicznych do przemysłowej produkcji tworzyw sztucznych [artykuł
przeglądowy: Poirier, Nawrath i Somerville (1995) Biotechnology 13: 142-150].
Obecnie czynione są wysiłki, by utworzyć transgeniczną formę rośliny Brassica
napus (rzepak) do przemysłowej produkcji biologicznych tworzyw.
Pożyteczny artykuł przeglądowy dotyczący biologicznych tworzyw: Lee
(1996) Biotechnologu and Bioengineering 49: 1-14).

13.8 Bioremediacja
Termin bioremediacja oznacza biotechnologiczne (z udziałem drobnoustrojów)
usuwanie zanieczyszczeń ze środowiska. Drobnoustroje są wysoce zróżnico-
wane metabolicznie, tak że, przynajmniej teoretycznie, każde zanieczyszczenie
typu organicznego powinno dać się zdegradować dzięki odpowiedniemu dobo-
rowi drobnoustrojów. Ponadto, mikrobiologiczna degradacja zanieczyszczeń
potencjalnie prowadzi do prostych związków nieorganicznych, jak CO 2 i woda,
podczas gdy inne formy technologiczne (np. dekontaminacja metodami fizycz-
nymi) może po prostu spowodować przeniesienie problemu z jednego miejsca
w inne.
Jednakże, podczas gdy metody fizyczne są zazwyczaj szybkie, a ich przebieg
najczęściej przewidywalny, metody biologiczne często mogą mieć nieznany, nie-
przewidywalny czy też niewymierzalny wpływ na środowisko. Na przykład
biodostępność czynnika zanieczyszczającego, to jest jego dostępność dla popula-
cji drobnoustrojów, może być zmniejszona w wyniku jego adsorpcji do składni-
ków gleby, a to może ograniczyć lub nawet wykluczyć bioremediację.
W celu powszechniejszego zaakceptowania bioremediacji, należy wykazać,
że jest ona skuteczna i niezawodna w środowisku. Skuteczność bioremediacji
można ocenić przez np.: 1) określenie stopnia podatności na degradację biolo-
giczną wszystkich zanieczyszczeń w określonym miejscu; 2) określenie trwałości
produktów degradacji zanieczyszczeń; 3) chemiczne oznaczenie poziomu/stanu
składników środowiska i 4) poznanie specyficznych genów drobnoustrojowych
uczestniczących w katabolizmie zanieczyszczeń [patrz np. Bogan i wsp. (1996)
AEM 62: 2381-2386].
[Bioremediation: towards a credible technology (artykuł przeglądowy): Head
(1998) Microbiology 144: 599-608].
 ROZDZIAŁ

14
Nieco praktycznej bakteriologii

14. 1 Bezpieczeństwo w laboratorium

Student spotykający się po raz pierwszy z bakteriologią powinien sobie zdawać
sprawę z tego, że na co dzień ma do czynienia z żywymi bakteriami, wśród któ-
rych mogą być właściwe lub potencjalne patogeny. Dobra bakteriologia to bez-
pieczna bakteriologia, należy więc poznać zasady bezpieczeństwa w labora-
torium przed przystąpieniem do jakichkolwiek czynności manualnych. Szczegól-
nie ważne są następujące zasady:
1. Podczas pracy noś czysty fartuch laboratoryjny, by ochronić własne ubranie.
Nie noś tego fartucha na zewnątrz laboratorium.
2. Nie wkładaj do ust niczego. Jedzenie, picie czy palenie w laboratorium jest
potencjalnie niebezpieczne. Do pipetowania stosuj gumową gruszkę lub spe-
cjalne urządzenia mechaniczne; nie używaj ust. Jeśli konieczne jest stosowanie
etykiet, wybieraj samoprzylepne.
3. Utrzymuj stoły laboratoryjne, tak jak całą resztę laboratorium, czysto
i schludnie.
4. Usuwaj wszystkie zakażone materiały, wkładając je (nie wrzucając) do odpo-
wiedniego pojemnika.
5. Zostawiaj zakażone pipety, szkiełka podstawowe itp. w odpowiednim,
aktywnym płynie dezynfekującym przed ich umyciem i sterylizacją.
6. Unikaj skażenia środowiska aerozolami zawierającymi żywe bakterie lub ich
przetrwalniki. Aerozol składa się z bardzo drobnych (niewidocznych) cząste-
czek płynu lub ciał stałych rozproszonych w powietrzu; aerozole tworzą się
podczas pękania pęcherzyków, przy dodawaniu jednego płynu do drugiego
lub kiedy kropla płynu spada na stałą powierzchnię — sytuacje te mogą się
zdarzać w trakcie pracy bakteriologicznej (patrz np. rys. 16. 2). Cząstki o śred-
nicy mniejszej niż kilka mikrometrów mogą pozostać zawieszone w powie-
trzu przez dłuższy czas, wdychane przez osoby w otoczeniu. Aerozole mogą
być potencjalnym źródłem zakażenia. Czasami prace bakteriologiczne prowa-

350
 dzi się w specjalnych komorach (opisanych w dalszej części), częściowo po
to, by uniknąć ryzyka zakażenia aerozolami.
7. O wszystkich wypadkach i rozlanych płynach natychmiast poinformuj opie-
kuna sali lub asystenta.
8. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyj ręce.

14. 2 Podłoża bakteriologiczne

Podłoże (pożywka) to każdy płyn przygotowany do hodowania, przechowywa-
nia lub przenoszenia bakterii. Płyn taki może być zestalony, tworząc podłoże stałe.
Podłoże zwykle zawiera wszystkie niezbędne składniki odżywcze. Przed użyciem
podłoże musi zostać wysterylizowane, to znaczy nie może zawierać żywych orga-
nizmów. (Metody sterylizacji podłoży są przedstawione w rozdziale 15. )
Przed omówieniem poszczególnych podłoży pomocne będzie wyjaśnienie
znaczenia kilku terminów często stosowanych w bakteriologii. Najlepiej to
uczynić posługując się opisem prostej czynności laboratoryjnej. Aby wyhodować
taki organizm jak E. coli, bakteriolog stosuje odpowiednie sterylne podłoże
i dodaje do niego małą ilość materiału składającego się, lub zawierającego, żywe
komórki tego gatunku. Ta „mała ilość materiału" nazywana jest inokulum,
a proces dodawanie jej do podłoża — inokulacją lub szczepieniem. (Narzędzia
i procedury stosowane do inokulacji opisano w sekcjach 14. 3 do 14. 5. ) Zaszcze-
pione podłoże jest następnie inkubowane, to jest trzymane przez pewien czas
w odpowiedniej temperaturze, wilgotności itp. Inkubację zwykle przeprowadza
się w termostatowej szafce, zwanej po prostu termostatem. Podczas inkubacji
bakterie rosną i dzielą się tworząc hodowlę. Zatem hodowla to podłoże zawie-
rające bakterie, które wyrosły (i nadal rosną) na lub wewnątrz tego podłoża.
Podłoże płynne można stosować w probówce (zamkniętej korkiem ze steryl-
nej waty lub metalowym kapturkiem) — patrz np. rys. 16. 3) lub w szklanej
butelce z zakrętką. Butelka uniwersalna (rys. 14. 1) jest cylindryczna, o pojemno-
ści około 25 ml, podczas gdy tzw. bijou ma pojemność 5-7 ml.
Większość podłoży stałych to galaretowate substancje składające się z roz-
tworu substancji odżywczych „zestalonych" agarem (złożony wielocukier uzys-
kiwany z pewnych glonów). Do podłoży zazwyczaj używa się plastykowe szalki
(płytki) Petriego (rys. 16. 2) o średnicy wieczka około 9 cm. Podłoże w stanie
ciekłym (rozpuszczonym) rozlewa się do szalek Petriego, w których następnie
krzepnie. (Przewietrzana płytka Petriego ma trzy małe uwypuklenia w równych

351
odstępach na wewnętrznej krawędzi wieczka, które utrzymują wieczko
zamkniętej płytki nieco nad denkiem, pozwalając na utrzymanie równowagi
między powietrzem/gazami wewnątrz i na zewnątrz płytki.

14. 2. 1 Rodzaje podłoży (pożywek)

Dla wielu bakterii chemolitoautotroficznych podłożem może być prosty roztwór
soli nieorganicznych (źródłem węgla jest CO2).
Heterotrofom o niezbyt dużych wymaganiach pokarmowych (jak E. coli)
wystarczają powszechnie występujące związki organiczne w najczęściej stosowa-
nych podłożach (tab. 14. 1). Wiele bakterii nie rośnie w podłożach podstawo-
wych, dopóki nie zostaną uzupełnione takimi substancjami, jak żółtko jaja, krew
lub surowica. Tego typu podłoża nazywane są wzbogaconymi.

352
 Podłożem selekcyjnym jest takie, które podtrzymuje wzrost pewnych bakte-
rii w przeciwieństwie do pozostałych. Przykładem jest bulion MacConkeya
(tab. 14. 1) — w którym sole żółci hamują wzrost bakterii niejelitowych, lecz nie
hamują wzrostu gatunków jelitowych. Podłoże to może być stosowane do izola-
cji bakterii jelitowych z mieszaniny bakterii jelitowych i niejelitowych w inoku-
lum. (W pewnym sensie wszystkie podłoża są selektywne, gdyż nie ma takiego
podłoża, które w równym stopniu podtrzymywałoby wzrost wszystkich rodza-
jów bakterii. )
Podłoże wzbogacające pozwala, by pewne gatunki bakterii rosły szybciej niż
inne, albo poprzez sprzyjanie wzrostowi danego gatunku, albo poprzez hamo-
wanie wzrostu innych. Jeśli zatem inokulum zawiera tylko kilka komórek intere-
sującego nas gatunku (w dużej populacji organizmów zbędnych), wzrost
w odpowiednim podłożu wzbogacającym może zwiększyć proporcję danego
gatunku (wzbogacić go) w stosunku do pozostałych. Na przykład, bulion z sele-
nianem hamuje wiele rodzajów bakterii jelitowych (w tym E. coli), lecz nie
hamuje Salmonella typhi, bakterii powodującej dur brzuszny. Przypuśćmy, na
przykład, że chcemy wykryć S. typhi w próbce kału od pacjenta z podejrzeniem
duru. Próbka może zawierać jedynie kilka komórek S. typhi, które trudno wykryć
wśród ogromnych ilości niepatogennych bakterii jelitowych. Jeśli jednak inoku-
lum próbki zostanie wsiane do bulionu z selenianem, procent komórek S. typhi
wzrośnie do poziomu, w którym będą znacznie łatwiej wykrywane.
Podłoże stałe używane jest, na przykład, by uzyskać kolonie (sekcja 3. 3. 1)
danego gatunku. Wiele podłoży stałych to po prostu podłoża płynne, które
zostały zestalone przez dodatek czynnika żelującego, takiego jak żelatyna czy
agar. Agar jest najczęściej używanym związkiem żelującym, gdyż zdecydowana
większość bakterii nie rozkłada go, nie topi się w 37°C, w której to temperaturze
inkubuje się wiele rodzajów bakterii. (Żelatyna natomiast w tej temperaturze
staje się płynna, a ponadto rozkładają ją niektóre bakterie. ) Jednym z często sto-
sowanych podłoży jest agar odżywczy (tab. 14. 1), podłoże ogólnego przeznacze-
nia, które wykorzystuje się do hodowania wielu typów bakterii. Można również
wzbogacać i czynić selektywnym dodając do niego różne substancje.
Agar z krwią jest podłożem z dodatkiem 5-10% krwi, zestalone agarem.
Wykorzystywane jest do wzrostu bakterii o dużych wymaganiach odżywczych,
jak Bordetella pertussis (powoduje krztusiec), oraz do wykrywania hemolizy (sekcja
16. 1. 14. 1). Agar „czekoladowy" uzyskuje się po podgrzaniu agaru z krwią
w temp. 70-80°C do barwy czekoladowobrązowej. Agar taki lepiej nadaje się do
hodowli niektórych patogenów (np. Neisseria gonorrhoeae) niż zwykły agar z krwią.
Agar MacConkeya jest przykładem podłoża różnicującego, to jest takiego,
na którym różne gatunki bakterii można od siebie odróżnić na podstawie
wyglądu ich kolonii itp. Na podłożu MacConkeya bakterie jelitowe (jak E. coli)
zdolne do wykorzystywania laktozy tworzą czerwone kolonie, gdyż wytwarzają
kwaśne produkty (z laktozy), na które reaguje wskaźnik pH w podłożu. Kolonie
bakterii jelitowych nie wykorzystujących laktozy (np. większość szczepów Sal-
monella) są bezbarwne.
Agar MacConkeya z sorbitolem, przypomina agar McConkeya, lecz zamiast
laktozy zawiera sorbitol. Używa się go do wykrywania patogennego szczepu
O157 E. coli (EHEC/VTEC), który nie fermentuje sorbitolu, a zatem na tym

353
podłożu tworzy bezbarwne kolonie. (Większość szczepów E. coli fermentuje sor-
bitol i kolonie są różowe. ) Dodatek cefuksymu (cefalosporyny trzeciej generacji)
oraz telurynu potasu zwiększa częstość izolacji szczepu O157, gdyż zahamo-
wany jest wzrost innych bakterii nie fermentujących sorbitolu (jak Proteus).
Niektóre podłoża stałe nie zawierają ani agaru, ani żelatyny. Na przykład,
podłoże jajowe Dorseta uzyskuje się przez podgrzanie (i skoagulowanie) homo-
genizowanych jaj kurzych w soli fizjologicznej. Podłoże to wykorzystywane jest
do namnażania, a następnie „przechowywania" danego organizmu. Podłoże
Dorseta powszechnie stosuje się do przechowywania Mycobacterium tuberculosis.
Wiele podłoży zawiera substancje (np. pepton, woda wodociągowa), których
dokładny skład jest zwykle nieznany. Czasami zachodzi potrzeba stosowania
podłoża, którego wszystkie składniki, łącznie z tymi, które występują w ślado-
wych ilościach, są określone ilościowo. Tego typu podłoże zdefiniowane przy-
gotowywane jest ze znanych ilości czystych substancji, np. soli nieorganicznych,
glukozy, aminokwasów itp. w wodzie destylowanej lub dejonizowanej. Podłoże
zdefiniowane może być użyte do określenia wymagań pokarmowych danego
gatunku bakterii.
Podłoże transportowe stosuje się do przenoszenia (lub tymczasowego
przechowania) danego materiału (np. wymazu), które ma być zbadane pod
kątem obecności konkretnego organizmu(ów). Zadaniem takiego podłoża jest
jedynie utrzymanie drobnoustrojów przy życiu, gdyż ich wzrost bywa przesz-
kodą w przetrwaniu z powodu powstających zbędnych produktów. Jedno
z takich podłoży, podłoże transportowe Stuarta (tab. 14. 1) nadaje się dla bakterii
zaliczanych do beztlenowych oraz dla „delikatnych" bakterii, jak Neisseria
gonorrhoeae.

14. 2. 1. 1 Systemy BACTEC do hodowli prątków

Systemy BACTEC™ (Becton Dickinson) to płynne pożywki służące do hodowli
powoli rosnącego patogena Mycobacterium tuberculosis. W pożywkach tych pato-
gen rośnie nieco szybciej (1-2 tygodnie) niż na podłożach stałych. Pożywki tego
typu mogą być używane do wykrywania M. tuberculosis i badania podatności
wyizolowanego szczepu na antybiotyki. W badaniach wrażliwości na antybio-
tyki określa się zdolność danego szczepu do wzrostu w pożywce wzbogaconej
określonym antybiotykiem o znanym stężeniu.
Wcześniej stosowane systemy były oparte na radiometrii (wzrost określano
badając pojawianie się znakowanego dwutlenku węgla powstającego w wyniku
wykorzystania radioaktywnego substratu w podłożu). Jeden z typów BACTEC
niedawno wprowadzony do użytku, BACTEC MGIT 960, pozwala na określanie
wzrostu prątków na podstawie fluorescencyjnego systemu monitorowania stop-
nia zużycia tlenu. System ten został dokładnie przetestowany i opisany przez
Hanna i wsp. [(1999) JCM 37: 748-752].

14. 2. 2 Przygotowanie podłoży

Większość podłoży produkuje się przemysłowo w postaci bezwodnego proszku.
Podłoża takie zwykle rozpuszcza się w określonej objętości wody, sterylizuje

354
i rozlewa do odpowiednich sterylnych naczyń. Jednak niektóre podłoża rozlewa
się do naczyń przed sterylizacją.
Do uzyskania większości podłoży zawierających agar (np. agar odżywczy)
proszek miesza się z wodą, podgrzewając mieszaninę aż do rozpuszczenia
agaru. Podłoże następnie sterylizuje się w autoklawie (sekcja 15. 1. 13), schładza
do około 45°C, to jest do temperatury, w której jeszcze nie krzepnie. By przygoto-
wać płytkę, około 15-20 ml płynnego podłoża z agarem wlewa się do sterylnej
szalki Petriego, której nie należy ruszać aż agar zestali się. Płytki z krwią przygo-
towuje się mieszając roztopione podłoże agarowe (o temp. około 45-50°C)
z 5-10% objętości krwi (np. z cytrynianem) przed wylaniem płytek.
Do niektórych celów (np. wysiew, sekcja 14. 5. 2) powierzchnia świeżo wylanej
płytki musi być przesuszona, tzn. jest należy pozwolić na odparowanie nad-
miaru wilgoci powierzchniowej. Często uzyskuje się to zostawiając szalkę,
z nieco zsuniętym wieczkiem, na około 20 minut w inkubatorze o temperaturze
37°C. Można również suszyć płytki obsiane (sekcja 14. 5. 2. ).
Aby przygotować skos z agaru odżywczego (rys. 14. 1), roztopione podłoże
agarowe wlewa się do probówek lub buteleczek, pozostawiając do skrzepnięcia
po ustawieniu naczyń skośnie do poziomu.
Pewnych rodzajów podłoży nie można sterylizować przez autoklawowanie,
gdyż niektóre z ich składników mogą ulec zniszczeniu w temperaturze osiąganej
w autoklawie. Do takich podłoży należy np. DC A (tab. 14. 1), które jest sterylizo-
wane w parze (aparacie Kocha), a nie autoklawowane, oraz podłoże zawierające
glukozę lub inne cukry wrażliwe na wysoką temperaturę. Przygotowując tego
typu podłoża, roztwór cukru przed dodaniem do (autoklawowanego) podłoża
sterylizuje się osobno, np. przez filtrację (sekcja 15. 1. 3).

14. 3 Techniki aseptyczne

Narzędzia i podłoża muszą być sterylne przed użyciem (sekcja 15. 1). Jeśli nie
mamy co do tego pewności, to nie będziemy wiedzieć, co się dzieje w trakcie
naszej pracy. Poza tym, w czasie manipulacji bakteriologicznych instrumenty
i wszelkie materiały muszą być chronione przed zakażeniem przez organizmy
zawsze obecne w środowisku. Techniki aseptyczne wymagają sterylizacji
wszystkich narzędzi, naczyń, podłoży itp. przed ich użyciem oraz unikania ich
kontaktu z nie sterylną materią, w tym palców, powierzchni stołu itp.
Naczynia ze sterylną zawartością są zamknięte, z wyjątkiem krótkiego czasu
potrzebnego na dostęp do nich. Przed otwarciem naczynia (np. sterylnej butelki,
lub butelki zawierającej czystą hodowlę) jego krawędź krótko opala się w pal-
niku gazowym, by zapobiec dostaniu się do naczynia żywych organizmów, które
mogłyby zakazić zawartość. Robi się to zawsze, gdy z hodowli pobierane jest
inokulum lub gdy zaszczepia się sterylne podłoże. Opalanie stosuje się również
tuż przed zamknięciem naczynia. Zwykle nie stosuje się opalania w pracy z szal-
kami Petriego, a nigdy — gdy zawartość naczynia jest łatwopalna.
Ryzyko zakażenia w laboratorium można jeszcze bardziej zmniejszyć prze-
mywając powierzchnię stołów itp. odpowiednim czynnikiem dezynfekującym
oraz filtrując powietrze w celu usunięcia komórek i form przetrwalnych bakterii

355
i grzybów. Czasami pewne prace bakteriologiczne wykonuje się w specjalnych
komorach. W komorze klasy II sterylne (filtrowane) powietrze stale spływa na
powierzchnię roboczą, po czym przechodzi na zewnątrz po dodatkowej filtracji
(ryc. 14. 2). Prace prowadzi się przez otwarty panel w przedniej części komory.
Komora klasy III to szczelna komora, w której powietrze jest filtrowane zarówno

356
przed wejściem do niej, jak i przed odprowadzeniem do środowiska. Wszelkie
prace wykonuje się przez gumowe rękawice zamocowane w przednim panelu,
a dostęp do wnętrza komory jest poprzez osobną dwudrzwiową komorę steryli-
zacyjną/dezynfekcyjna. Komory typu II są częste w laboratoriach uniwersytec-
kich, zaś komory klasy III stosuje się do prac z bardzo patogennymi
drobnoustrojami.

14. 4 Narzędzia bakteriologa

W większości przypadków prace z bakteriami można prowadzić posługując się
prostymi przyrządami (rys. 14. 3). Ezę lub igłę sterylizujemy przez opalenie bez-
pośrednio przed użyciem. Drucianą część przyrządu ogrzewa się do czerwoności
w płomieniu palnika, a następnie przed użyciem schładza.
Gdy sterylną ezę zanurzy się w zawiesinie bakterii, to po jej wyciągnięciu
druciane oczko zatrzymuje małą błonkę cieczy zawierającą komórki bakteryjne,
które mogą służyć jako inokulum. Wielkość tego inokulum zależy od stężenia
komórek w zawiesinie oraz rozmiarów oczka ezy, która może przenosić od 0, 01
do 0, 005 ml cieczy; są to oczywiste dwa czynniki, które mogą być kontrolowane.
Mniejsze objętości można przenosić za pomocą prostej igły, zatrzymującej jedy-
nie bardzo znikomą ilość cieczy, która do niej przylega.
Ezy i igły można używać do pobierania drobnych próbek materiału stałego,
np. małych ilości wzrostu bakteryjnego z kolonii. Ilość pobieranego materiału
przylegająca do igły jest nieznana, lecz zwykle nie ma to większego znaczenia.
Ciekłe lub stałe inokulum przenoszone przez oczko ezy lub igłę może być użyte
do inokulacji (zaszczepienia) ciekłego lub stałego podłoża (sekcja 14. 5).
Zarówno ezę, jak i igłę należy zawsze zaraz po użyciu opalić w płomieniu, by
nie zanieczyściły stołu laboratoryjnego ani środowiska. Podczas opalania ezy
z pozostałością inokulum może nastąpić pryskanie, tworząc aerozolie. Z tego
powodu często opalanie przeprowadza się za pomocą specjalnego (gazowego)
palnika Bunsena wyposażonego w płaszcz ochronny. Można również wykony-
wać tę czynność wewnątrz bezpiecznej komory.

(a) Eza: platynowy, niklowo-stalowy lub chromowy drutu z zagięciem na końcu, tworzącym oczka,
osadzony w metalowej oprawce o długości 10-12 cm. (b) Igła lub prosty drut: w metalowej oprawce
osadzony jest drut długości 5-8 cm. (c) Pipeta pasterowska: rurka otwarta z obu końców, z cieńszą
częścią o wewnętrznej średnicy około 1 mm. Grubszy koniec przed sterylizacją zatykany jest watą,
a bezpośrednio przed użyciem na pipetę nakłada się małą gumową gruszkę. Kalibracja pipety
pasterowskiej opisana jest w podpisie do rys. 14. 6.

357
 Większe objętości cieczy można przenosić za pomocą pipet pasterowskich lub
kalibrowanych. Płyn wsysa się za pomocą gumowej gruszki lub urządzenia
mechanicznego — nigdy ustami. Końce pipet stosowanych do prac bakteriologi-
cznych przed sterylizacją zwykle wypełnia się watą (rys. 14. 3) w celu uniknięcia
zakażenia z gruszki lub z urządzenia mechanicznego podczas ich użycia. Pipety
zwykle sterylizuje się (partiami) w metalowych tubusach lub w „kopertach"
z grubego papieru. Przy wyjmowaniu pipety z tubusa należy chwycić jedynie
koniec wypełniony watą, by uniknąć zakażenia dalszej części pipety. Pipety
pasterowskie zwykle są jednorazowego użytku, po wykorzystaniu wrzuca się je
do słoja zawierającego środek dezynfekujący. Kalibrowane pipety natychmiast
po użyciu zanurza się w środku dezynfekującym aż do czasu ich umycia, steryli-
zacji i ponownego użycia.

14. 5 Metody inokulacji

14. 5. 1 Inokulacja podłoża płynnego
W celu zaszczepienia podłoża płynnego płynnym inokulum po prostu zanurza
się w podłożu ezę (lub igłę) zawierającą materiał bakteryjny, a następnie wy-
ciąga. Można również użyć pipety pasterowskiej. Jeśli inokulum jest stałe, można
lekko potrzeć ezę lub igłę o wewnętrzną ściankę naczynia zawierającą podłoże,
by mieć pewność, że część inokulum pozostanie po wyciągnięciu przyrządu.

14. 5. 2 Inokulacja podłoża stałego

Podłoża stałe można szczepić w różny sposób, zależnie od planowanego celu.
Wysiew redukcyjny (rys. 14. 4) stosuje się, gdy potrzebne są dobrze oddzie-
lone od siebie kolonie, a inokulum zawiera bardzo dużo komórek. W metodzie
tej inokulum jest stopniowo „rozcieńczane" w taki sposób, by na przynajmniej
niektórych częściach płytki pozostały pojedyncze komórki, zwykle przy trzecim,
czwartym, a nawet piątym „rozcieńczeniu" (rys. 14. 4). Po inkubacji, z każdej
komórki dobrze oddzielonej od pozostałych wyrasta pojedyncza kolonia.
W inokulacji przez wkłucie w podłoże stałe, w np. dolną, grubą część skosu
pionowo wbija się igłę lub prosty drut, inokulum (na końcu igły lub drutu)
zostaje wtedy rozprowadzone wzdłuż linii wkłucia. Procedurę tę stosuje się do
zaszczepienia głębokich, mikrotlenowych lub beztlenowych części podłoża.
Murawkę otrzymuje się wysiewając, np. pipetą automatyczną, niewielką
objętość płynnego inokulum (np. 0, 05-0, 1 ml) na powierzchnię płytki, rozprowa-
dzając następnie wprowadzone inokulum po całej powierzchni płytki za pomocą
sterylnej szklanej „głaszczki".
Czasem zalewa się całą powierzchnię płytki agarowej płynnym inokulum,
a następnie usuwa nadmiar płynu sterylną pipetą pasterowską.
Jeśli inokulum wylane czy rozprowadzone po powierzchni płytki zawiera
odpowiednio dużo komórek, ich wzrost prowadzi do powstania tzw. murawki,
to jest pokrycia całej powierzchni zlewającym się wzrostem bakteryjnym (sek-
cja 3. 3. 1).

358
(a) Oczko ezy zawierające wysiewany materiał delikatnie przeciąga się tam i z powrotem po powierz-
chni peryferycznej części szalki, tak jak w punkcie 1. Następnie ezę opala się w płomieniu, schładza
i przeciąga sterylne oczko po podłożu jak w punkcie 2. Podobnie wykonuje się czynności 3, 4 i 5
z opalaniem i schładzaniem ezy między każdą z nich, jak również po ostatniej, (b) Po inkubacji na
tych częściach szalki, na których wysiano wiele komórek, wyrasta „murawka" (1, 2 i 3). Komórki
dobrze od siebie oddzielone dają początek koloniom (5).
Podczas wysiewania rysą za pomocą ezy płaszczyzna oczka nie powinna być pionowa. We właści-
wej orientacji (dolna część rysunku) oczko — będące w lekkim kontakcie z powierzchnią podłoża —
poruszane jest w kierunku do patrzącego i z powrotem.

Czasami bakterie wysiewa się na płytkę za pomocą wacika, tj. ściśle zbitej
waty na końcu cienkiego, drewnianego czy plastikowego pręcika. Sterylny wacik
stosuje się do pobierania drobnoustrojów z określonych miejsc (np. gardła).
Następnie wacik przeciąga się lekko po powierzchni odpowiedniego podłoża,
tak by wszystkie jego powierzchnie zetknęły się z nim. Wacik może służyć do
wysiania bakterii na całą powierzchnię płytki lub tylko na jej część, z której dalej
bakterie rozprowadza się ezą.

14. 6 Przygotowanie czystej kultury z mieszaniny organizmów

Niektóre z podstawowych technik bakteriologicznych można prześledzić na
przykładzie prostej procedury polegającej na wyizolowaniu konkretnego
szczepu lub gatunku z mieszaniny drobnoustrojów. Podany przykład dotyczy
izolacji E. coli z próbki ścieków (która zazwyczaj zawiera wiele organizmów jeli-
towych i nie-jelitowych).

359
 Próbkę ścieków pobraną oczkiem ezy wysiewa się na szalkę z podłożem
MacConkeya (sekcja 14. 2. 1), którą następnie inkubuje się 18-24 godzin w 37°C.
(Szalki często są inkubowane odwrócone do góry dnem, aby uniknąć skapywa-
nia na podłoże wody skondensowanej na wieczku i rozmycia inokulum). Pod-
czas inkubacji, z dobrze oddzielonych komórek jakiegokolwiek gatunku
rosnącego na podłożu, powstaną pojedyncze kolonie. Po 24 godzinach na agarze
MacConkeya E. coli tworzy okrągłe, czerwone kolonie o średnicy 2-3 mm. Jed-
nak nie wszystkie tak wyglądające kolonie będą tworzone właśnie przez
komórki E. coli. W następnym etapie wybiera się kilka takich kolonii, do dalszego
badania. Ponieważ E. coli jest w ściekach częsta, przynajmniej jedna z wybranych
kolonii będzie wytworzona przez komórki tej właśnie bakterii.
Przed przystąpieniem do identyfikacji należy zadbać, by każda z wybranych
kolonii zawierała jedynie komórki jednego gatunku. Zawsze istnieje możliwość,
że kolonia, nawet dobrze oddzielona od pozostałych, zawiera komórki dwóch
odmiennych gatunków. Zdarzy się tak, gdy podczas wysiewania dwie różne
komórki przypadkowo znajdą się w bezpośrednim sąsiedztwie na powierzchni
podłoża agarowego. Aby nie było wątpliwości, daną kolonię lekko dotyka się
sterylną ezą i zaszczepia nią świeżą, sterylną pożywkę. Po okresie inkubacji
wyrosłą zawiesinę bakterii ponownie wysiewa się (w opisanym przypadku) na
płytkę sterylnego podłoża MacConkeya. Ponieważ niektóre bakterie tworzą bar-
dzo drobne kolonie, często wygodniej jest dotknąć powierzchni takiej kolonii
końcem sterylnej igły lub nawet wykałaczki, a następnie wysiać inokulum rysą
na powierzchni świeżego podłoża stałego. Jeśli każda czerwona kolonia była
utworzona przez komórki jednego gatunku, to powinniśmy otrzymać wiele czy-
stych kultur, z których przynajmniej jedna jest kulturą E. coli. Powyższą proce-
durę można na wszelki wypadek przeprowadzić jeszcze raz. Każdą czystą kul-
turę badana jest następnie tak jak opisano w rozdziale 16.

14. 6. 1 Dynabeads® oraz rozdział immunomagnetyczny

Rozdział magnetyczny to technika pozwalająca na wydzielenie z mieszaniny
różnych rodzajów komórek (lub cząsteczek) tych które swoiście absorbujących
do powierzchni specjalnie opłaszczonych kuleczek, które następnie są przesu-
wane w polu magnetycznym.
Kuleczki te (Dynabeads®, nazwa handlowa firmy Dynal z Norwegii) to jed-
nolitej wielkości mikroskopijne paciorki zawierające mieszaninę tlenków
żelaza, co nadaje im właściwości superparamagnetyczne, tzn. wykazują właści-
wości magnetyczne jedynie w polu magnetycznym. Kuleczki te można opłasz-
czyć dowolnym typem liganda, określając w ten sposób ich zastosowanie
do konkretnego celu (to jest rodzaju komórki lub cząsteczki mającej absorbować
na ich powierzchni). Kuleczki miesza się z próbą (w warunkach określonych
w przepisie), tak by zostały rozprowadzone w całej jej objętości.
Komórki/cząsteczki absorbują na powierzchni kuleczek, które następnie są
przyciągane w polu magnetycznym do jednej ze ścian naczynia. Po usunięciu
niepotrzebnego materiału, komórki/cząsteczki można przemyć przed dalszym

360
użyciem. (Istotne są cechy stosowanych kuleczek — gdyby miały trwałe
momenty magnetyczne, wykazywałyby raczej tendencję do zbijania się razem,
niż rozpraszania w objętości próby. )
Kuleczki opłaszczone swoistymi przeciwciałami można stosować do izolacji
konkretnych patogenów — (np. E. coli O157, Listeria monocytogenes, Salmo-
nella spp. ) z żywności i innych prób (patrz fot. 14. 1); kompleks kuleczka-pato-
gen wysiewa się na odpowiednie podłoże. Podobnie, kuleczki opłaszczone
przeciwciałami można stosować do uzyskiwania konkretnych komórek eukario-
tycznych z mieszaniny komórek. Technika ta nosi nazwę rozdziału immuno-
magnetycznego (IMS, ang. immunomagnetic separation).
Kuleczki Dynabeads można również opłaszczyć ligandami dla kwasów
nukleinowych. Na przykład Dynabeads Oligo (dT)25 wiążą ogony poli-A cząste-
czek mRNA i są pomocne do rozdzielenia mRNA od całkowitego RNA w przy-
gotowywaniu bibliotek cDNA (sekcja 8. 5. 1. 2).
Dynabeads® DNA DIRECT™ wiążą genowy DNA w nieoczyszczonych pre-
paratach, tym samym dostarczając próbek do techniki PCR (sekcja 8. 5. 4). Po
zagęszczeniu otrzymanego DNA procedura ta zwiększa czułość PCR. Ponadto,
przemywanie kompleksu kuleczka-DNA pomaga usunąć inhibitory procesu
PCR.
Niektóre zastosowania Dynabeads są podane w tabeli 14. 2.

361
 14. 7 Inkubacja w warunkach beztlenowych
Bakterie beztlenowe inkubuje się w warunkach braku tlenu. Warunki takie
można uzyskać w pojemniku anaerobowym, np. w naczyniu McIntosha i Fil-
desa, który jest mocnym cylindrem z metalu, szczelnie zamkniętym okrągłym,
płaskim wieczkiem. Do naczynia wkłada się zaszczepione szalki, a wieczko
mocuje śrubą. Naczynie to, za pośrednictwem jednego z dwóch zaworów
w wieczku, podłączone jest do pompy próżniowej. Po kilku minutach zawór
zostaje zamknięty. Przez drugi zawór wprowadza się wodór, a następnie zawór
zamyka. Czynności te można powtórzyć kilka razy. Na wewnętrznej stronie
wieczka umieszczone jest opakowanie z gazy zawierające katalizator (np. śrut
aluminiowy opłaszczony palladem), który przyśpiesza chemiczną reakcję mię-
dzy wodorem a resztkami tlenu. Naczynie inkubuje się przez odpowiedni czas
(szalki wewnątrz naczynia są umieszczone denkami do dołu; gdyby były
odwrócone denkami do góry, podłoże agarowe mogłoby w warunkach próżni
zostać oderwane).
Inny (bardziej współczesny) typ słoja anaerobowego to cylinder z mocnego,
przezroczystego tworzywa sztucznego, szczelnie zamykany płaską pokrywką.
Po włożeniu szalek do słoja, do małego opakowania zawierającego specjalne
odczynniki wlewa się nieco wody, następnie szybko wkłada się je do słoja, bez-
pośrednio przed zamknięciem. Odczynniki wyzwalają wodór, który w obecności
katalizatora wiąże cały tlen w słoju. Ponieważ w tym przypadku nie powstaje
próżnia, szalki można umieszczać w słoju do góry denkami, aby uniknąć kon-
densacji wody na powierzchni agaru.

362
 Większość naczyń anaerobowych zawiera wskaźnik redoks, który sygnali-
zuje stan beztlenowości w słoju. W naczyniach metalowych wskaźnik znajduje
się w małym szklanym ramieniu bocznym, a w przypadku słojów plastykowych
— poduszeczka nasączona wskaźnikiem jest zwykle widoczna przez ścianę
naczynia.
Niektóre beztlenowce mogą rosnąć (bez naczynia beztlenowego) w takich
podłożach jak podłoże mięsne Robertsona (mielony bydlęcy mięsień sercowy,
ekstrakt wołowy (1%), pepton (1%), chlorek sodu (0, 5%) oraz czynnik redu-
kujący, np. L-cysteina lub tioglikolan). Podłoże to, po sterylizacji w autoklawie,
przechowywane jest w butelkach ze szczelną zakrętką, które czasem dodat-
kowo po zaszczepieniu i przed zamknięciem znajdują się w warunkach
beztlenowych.
Komory beztlenowe pozwalają na inkubację i pracę z próbkami czy hodow-
lami w warunkach pozbawionych tlenu oraz w stałej temperaturze, wilgotności
i stężeniu CO 2 . Dostęp do przedmiotów wewnątrz komory jest za pośrednic-
twem gazoszczelnych rękawic umieszczonych w przednim panelu.
(Patrz też beztlenowe hodowle z krwią w sekcji 11. 8. 1. 1).

14. 8 Liczenie bakterii

Licząc komórki bakteryjne w danej próbce można określić wszystkie komórki (to
jest żywe i martwe) lub tylko komórki żywe. Wartości zwykle określają liczbę
komórek w mililitrze, ewentualnie w litrze.

14. 8. 1 Całkowita liczba bakterii

Całkowitą liczbę bakterii w płynnej próbce (np. hodowli w bulionie) można okre-
ślić stosując komorę do liczenia (rys. 14. 5).
Inną metodę, zwaną techniką bezpośredniej epifluorescencji na filtrze
(DEFT, ang. direct epifluorescent filter technique) stosuje się do liczenia drobno-
ustrojów w mleku. Mleko sączy się przez filtr membranowy, a komórki zatrzy-
mane na powierzchni filtra barwi się barwnikiem fluoryzującym. Następnie filtr
naświetla się promieniowaniem ultrafioletowym, a (fluoryzujące) komórki
widziane są w mikroskopie w postaci jasnych cząstek na ciemnym tle. (W przy-
padku DEFT mleko jest najpierw wstępnie przygotowane do badania, by np. roz-
bić kropelki tłuszczu, które mogłyby zatkać filtr. )
Całkowitą liczbę bakterii można również określić porównując zmętnienie
próbki ze zmętnieniem w serii probówek (probówki Browna lub McFarlanda)
zawierających rosnące stężenia zawiesiny siarczanu baru. Probówki oznacza się
od 1 (przezroczysta) do 10 (nieprzejrzysta). Dla danego gatunku bakterii gęstość
w jednej z probówek odpowiada gęstości zawiesiny komórek o znanej liczbie
komórek w mililitrze. Próbka badana znajduje się w probówce o grubości i wiel-
kości zbliżonej do tych, w której znajdują się zawiesiny wzorcowe. Dopasowuje
się optycznie gęstość próbki do gęstości w konkretnej probówce i odczytuje się
stężenie z tabeli towarzyszącej probówkom.

363
Instrument pokazany z boku (a), składa się z prostokątnej płytki szklanej, w której centralna płasz-
czyzna leży dokładnie 0, 1 mm niżej niż części boczne. Płaska część centralna jest oddzielona od części
bocznych rowkami, a sama podzielona jest na dwie części dodatkowym płytszym rowkiem (widocz-
nym w b). Na powierzchni każdej z tych części wyryta jest siateczka (c) tworząca kwadrat podzielony
na 400 małych części o wielkości 1/400 mm2. Szkiełko nakrywkowe nakłada się jak w części
(b) i silnie przyciska do części bocznych. By zapewnić właściwe przyleganie, podczas przyciskania
szkiełko można lekko przesunąć. O dobrym przyleganiu szkiełka świadczy pojawienie się barwnego
wzoru (pierścienie Newtona) pokazanego w postaci czarnych linii w (b).
Stosowanie komory. Pipetą pasterowską pobiera się małą objętość płynu (nie więcej niż do wysoko-
ści 10 mm), a następnie dotyka się nią centralnej płaszczyzny, tak by brzegiem dotykała szkiełka
nakrywkowego. W tej pozycji, płyn na zasadzie sił kapilarnych przechodzi z pipety pod szkiełko
nakrywkowe. Płyn nie powinien przelewać się do rowków (czasem konieczne jest lekkie stuknięcie
końcem pipety, by płyn zaczął się przesuwać). Jeśli jest taka potrzeba, w drugiej części komory do
liczenia można zbadać kolejną próbkę. Komorę zostawia się na 30 minut, by komórki osiadły na dnie,
a następnie pod mikroskopem liczy się je. Ostrość nastawia się na siatkę. Dokładnie znana objętość
między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym pozwala na precyzyjne obliczenie komórek w jednost-
ce objętości.
Przykład liczenia. Ponieważ każda mała kratka utworzona przez siateczkę ma wymiary 1/400 mm2,
a odległość między siateczką a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 1/10 mm, objętość cieczy na każdą
kratkę jest 1/4000 mm 3 tj. 1/4000000 ml.
Przypuśćmy np., że po przejrzeniu wszystkich 400 kratek znaleziono 500 komórek. Dałoby to
średnią 1, 25 na kratkę, tzn. 1, 25 komórki w 1/4000000 ml. Próbka musiała zatem zawierać
1, 25x4 000 000 komórek w ml, czyli 5 x 106 komórek w ml. Można w ten sposób zbadać kilka powtó-
rzeń próbek i wyliczyć średnią.
Jeśli próbka była rozcieńczona przed zbadaniem (gdyż była zbyt gęsta), otrzymaną liczbę komórek
należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia; np., jeśli została rozcieńczona dziesięciokrotnie,
liczba komórek powinna być pomnożona przez 10.
Opisane wyżej urządzenie nazywa się komorą Thoma. W komorze Helbera odległość między po-
wierzchnią a szkiełkiem nakrywkowym wynosi 0, 02 mm.

364
 14. 8. 2 Liczba bakterii żywych
Większość metod określania liczby żywych bakterii polega na wysianiu danej
próbki (lub jej rozcieńczeń) na powierzchnię podłoża stałego. Po inkubacji, liczbę
komórek w inokulum określa się na podstawie liczby kolonii powstających na
podłożu lub w jego głębi. Zakłada się, że każda kolonia powstaje z pojedynczej
komórki. Liczba komórek, z których powstają kolonie, przynajmniej w części
zależy od rodzaju zastosowanego podłoża oraz warunków inkubacji.
W metodzie płytkowej (powierzchniowej) na całej powierzchni sterylnego
podłoża z agarem rozprowadza się około 0, 05-0, 1 ml próby, jak opisano wcześ-
niej. Po okresie inkubacji płytki określa się liczbę żywych komórek bakteryjnych
w próbce na podstawie: 1) liczby kolonii, 2) objętości inokulum oraz 3) stopnia
rozcieńczenia wysiewanego materiału. Jeśli są podstawy, aby przypuszczać, że
próbka zawiera dużo komórek, np. 106 komórek/ml, można przygotować szereg
dziesięciokrotnych rozcieńczeń, a następnie wysiać np. 0, 1 ml z każdego rozcień-
czenia na oddzielne płytki, wówczas przynajmniej jedno z rozcieńczeń da poli-
czalną liczbę kolonii.
W metodzie płytek lanych płynne inokulum miesza się z rozpuszczonym
podłożem agarowym (o temperaturze około 45°C), następnie wylewa się do
płytek Petriego, w których podłoże krzepnie. W czasie inkubacji kolonie wyra-
stają w głębi podłoża (oraz na jego powierzchni) i liczbę żywych komórek okre-
śla się jak wyżej.
Kolejny sposób liczenia żywych bakterii to metoda Milesa i Misry'ego (rys.
14. 6).
Jeśli w badanej próbce przypuszczalnie powinno się znajdować niewiele bakte-
rii (np. w wodzie z czystej rzeki), przesącza się ją przez sterylny filtr o wielkości
porów np. 0, 2 μm. Komórki bakteryjne zostają na powierzchni filtra. Po przesącze-
niu np. 100 ml próby filtr kładzie się — do góry powierzchnią z komórkami — na
powierzchni odpowiedniego podłoża. Substancje odżywcze dyfundują przez filtr,
na którym wyrastają kolonie. Liczbę żywych bakterii w próbce określa się na pod-
stawie: liczby kolonii na filtrze oraz objętości przesączonej próbki.

14. 8. 3 Liczenie komórek wewnątrz (lub na) ciał stałych

Czasami konieczne jest określenie liczby bakterii w próbce materiału, żywności
itp. W tym celu cząstki np. żywności należy rozkruszyć i bakterie oddzielić od
próby. Agregaty bakterii również powinny być rozbite. Próbkę i płyn do rozcień-
czeń (np. roztwór Ringera) można szczelnie zamknąć np. w sterylnym plastiko-
wym woreczku, który następnie poddawany jest mechanicznym wstrząsom.
W ten sposób przynajmniej część bakterii można przeprowadzić w zawiesinę.

14. 9 Barwienie
Barwienie często wykorzystywane jest do wykrywania, klasyfikacji lub identyfi-
kacji bakterii, jak również do obserwowania składników komórek bakteryjnych.
Najczęściej bakterie przed wybarwieniem zabija się i utrwala.

365
Próbkę zwykle najpierw rozcieńcza się np. 1/10, 1/100... itd. Jedną kroplę (o znanej objętości) każ-
dego rozcieńczenia nakłada się na różnych częściach powierzchni odpowiedniego, lekko przesuszo-
nego podłoża. Po wyschnięciu kropli, płytkę inkubuje się aż do widocznego wzrostu bakterii. Z kropli,
które zawierały dużą liczbę bakterii, powstanie „murawka", podczas gdy z tych, w których było
mniej niż około 15 komórek, wyrosną drobne, policzalne kolonie. Zakładając, że każda kolonia
powstaje z oddzielnej komórki, to z liczby tych kolonii, objętości kropli oraz współczynnika rozcień-
czenia można wyliczyć liczbę żywych bakterii w próbce.
Do nakroplenia próbek można użyć tej samej pipety pasterowskiej, pod warunkiem że zaczniemy
od największego rozcieńczenia, posuwając się w stronę najmniejszego.
Pipetę pasterowską można wykalibrować, tzn. zmierzyć objętość podawanych przez nią kropel.
W tym celu do pipety wystarczy nabrać znaną objętość wody (np. 1 ml) oraz policzyć krople
powstające podczas wypuszczania pobranej cieczy. Jeśli 1 ml „schodzi" np. w 30 kroplach, to objętość
każdej kropli wyniesie około 1/30 ml.

Barwnikiem zwykle zalewa się bardzo cienką warstwę komórek na mikrosko-

powym szkiełku podstawowym. Komórki z czystej kultury można obejrzeć sto-
sując następującą procedurę. Na szkiełko podstawowe nanosi się oczkiem ezy
kropelkę wody, a następnie nieco materiału bakteryjnego pobranego ezą miesza
się z tą kroplą, tworząc zawiesinę komórek. Używając ezy rozprowadza się
materiał na powierzchni 1-2 cm2 i pozwala, by wysechł, otrzymując rozmaz.
Wyschnięty rozmaz utrwala się przeprowadzając szkiełko podstawowe szybko
dwa razy przez płomień palnika, po czym rozmaz jest gotowy do wybarwienia
i obejrzenia pod mikroskopem.
Rozmaz można również wykonać bezpośrednio np. z osadu odwirowanego
moczu lub ropy z rany.

14. 9. 1 Barwienie Grama

Teoria leżąca u podstawy tego barwienia podana jest w sekcji 2. 2. 9. Przebieg bar-
wienia opisany niżej jest jedną z wielu stosowanych wersji.
Utrwalony rozmaz (patrz wyżej) barwi się przez 1 minutę roztworem fioletu
krystalicznego. Następnie przemywa się go pod bieżącą wodą, traktuje przez
minutę płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu) i ponownie przemywa.

366
Z kolei przeprowadza się odbarwianie rozmazu komórek bakteryjnych za
pomocą etanolu (95%), acetonu lub roztworu jodu w acetonie. Ten etap barwie-
nia jest bardzo ważny: rozpuszczalnik spływa po pochylonym szkiełku tylko tak
długo, jak barwnik spływa z niego swobodnie (około 1-3 sekund). Następnie
należy rozmaz natychmiast przemyć bieżącą wodą. Na tym etapie komórki
gramujemne będą bezbarwne, a gramdodatnie fioletowe. W ostatnim etapie roz-
maz traktuje się barwnikiem kontrastowym, np. rozcieńczonym roztworem
fuksyny karbolowej, aby komórki gramujemne zabarwić na czerwono. Po krót-
kim spłukaniu wodą, rozmaz delikatnie osusza się bibułą i ogląda w mikrosko-
pie z użyciem obiektywu immersyjnego (powiększenie około 1000x).
Niektóre gatunki bakterii w barwieniu Grama nie barwią się jednoznacznie
lub nie zawsze barwią się tak samo. Czasami reagują dodatnio, czasem ujemnie.
O takich bakteriach mówimy, że są gramzmienne. Aby uniknąć problemu gram-
zmienności w taksonomii, wiele bakterii opisuje się jako typu gramdodatniego
lub typu gramujemnego, zależnie od tego, czy struktura ich ściany komórkowej
jest gramdodatnia czy gramujemna (sekcja 2. 2. 9).

14. 9. 1. 1 Barwienie Grama żywych komórek

Reakcję Grama żywych komórek można określić za pomocą różnicującego pro-
cesu barwienia (LIVE BacLight™ Bacterial Gram Stain Kit: Molecular Probes,
USA). Bakterie z logarytmicznej fazy wzrostu hodowli traktuje się mieszaniną
dwóch fluoryzujących barwników, z których każdy jest selektywny dla kwasów
nukleinowych. Barwnikami są SYTO® 9 i jodek heksydyny. W przypadku bak-
terii gramdodatnich kwasy nukleinowe wybiórczo wybarwia jodek heksydyny,
który skutecznie współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania. Kwasy
nukleinowe bakterii gramujemnych wybarwiają się SYTO® 9, ponieważ tylko ten
barwnik przenika przez ich błonę zewnętrzną. W promieniowaniu o długości fali
około 480 nm, związany jodek heksydyny fluoryzuje na pomarańczowo, zaś
związany SYTO® 9 — na zielono.

14. 9. 2 Barwienie Ziehl-Neelsena (barwienie kwasooporne)

Bakterie kwasooporne różnią się od wszystkich innych bakterii tym, że po wy-
barwieniu ich gorącym, stężonym roztworem fuksyny karbolowej nie ulegają
odbarwieniu przez kwasy nieorganiczne ani mieszaninę kwasu i etanolu. Do
bakterii tego typu należy np. Mycobacterium tuberculosis. Rozmaz utrwalony pod-
wyższoną temperaturą zalewa się roztworem fuksyny karbolowej i podgrzewa
się szkiełko podstawowe do momentu, gdy roztwór zaczyna parować. Nie powi-
nien się gotować. Szkiełko utrzymuje się w temperaturze bliskiej wrzenia przez
około 5 minut, schładza w powietrzu, a następnie spłukuje bieżącą wodą. Odbar-
wianie przeprowadza się zanurzając szkiełko podstawowe w mieszanie kwasu
i alkoholu (np. 3% stężonego kwasu solnego w 90% etanolu), za każdym razem
zmieniając roztwór na świeży. Po spłukaniu wodą rozmaz barwi się kontrasto-
wym barwnikiem, np. zielenią malachitową, ponownie spłukuje wodą i suszy.
Bakterie kwasooporne barwią się na czerwono, pozostałe na zielono.

367
 14. 9. 3. Barwienie otoczek
Obecność otoczek bakteryjnych można wykazać na przykład barwieniem nega-
tywowym (fot. 2. 3: środek, strona prawa). Komórki miesza się na szkiełku pod-
stawowym np. z roztworem nigrozyny naniesionym oczkiem ezy i przykrywa
szkiełkiem nakrywkowym. W mikroskopie z obiektywem immersyjnym lub
zwykłym o dużym powiększeniu (np. 40x) otoczka jest widoczna jako przejrzy-
sta, jasna strefa między komórką a jej ciemnym tłem.

14. 9. 4 Barwienie endospor

Patrz sekcja 16. 1. 1. 4.

14. 9. 5 Rozróżnianie żywych bakterii od martwych przez barwienie

Bakterie żywe i martwe można odróżnić na przykład prostym barwieniem z uży-
ciem zestawu LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit (Molecular Pro-
bes, USA). Bakterie traktuje się mieszaniną dwóch fluoryzujących barwników,
z których każdy łączy się z kwasami nukleinowymi. Barwniki te to SYTO® 9 (flu-
orescencja zielona) i jodek propidyny (fluorescencja czerwona). Jodek propidyny
wnika tylko do komórek z uszkodzoną błonę cytoplazmatyczną (cecha charakte-
rystyczna martwych komórek), nie wnika do zdrowych, żywych komórek.
SYTO® 9 wnika zarówno do komórek żywych, jak i martwych. W mikroskopie
fluorescencyjnym żywe komórki fluoryzują na zielono, a w martwych jodek pro-
pidyny współzawodniczy z SYTO® 9 o miejsca wiązania i takie komórki fluory-
zują na czerwono.
[Metody pozwalające na określenie żywotności drobnoustrojów zostały
szczegółowo opisane przez Lloyda i Hayesa (1995) FEMSML 133: 1-7. ]

14. 10 Mikroskopia
W bakteriologii często zachodzi konieczność stosowania dużych powiększeń
(np. 1000x), do czego mikroskop musi być wyposażony w obiektyw immersyjny
(powiększenie około 100x) oraz odpowiedni okular (około 10x). W obiektywie
immersyjnym przestrzeń między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym (lub,
jak się czasem zdarza, między obiektywem a rozmazem bakteryjnym) wypełnia
kropla olejku immersyjnego. Po co jest ten olej? Silna soczewka obiektywu ma
bardzo krótką ogniskową i światło przechodzące przez obiekt musi wnikać do
soczewki pod bardzo dużym kątem. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy przestrzeń
między obiektywem a obiektem wypełnia płyn o odpowiednim współczynniku
załamania (rys. 14. 7).
Maksymalne użyteczne powiększenie uzyskiwane w danym obiektywie im-
mersyjnym wynosi tysiąckrotność jego apertury numerycznej (rys. 14. 7).

368
W schemacie badany (cienki) preparat znajduje się między szkiełkiem podstawowym i szkiełkiem
nakrywkowym, a promienie biegną z jednego punktu w preparacie w kierunku soczewki obiektywu.
Kiedy przestrzeń pomiędzy soczewką a szkiełkiem nakrywkowym wypełnia olej o współczynniku
załamania 1, 5 (prawa strona schematu), promienie światła przechodzące przez szkiełko nakrywkowe
wnikają do środowiska o współczynniku załamania podobnym do szkła (mniej więcej 1, 5). Każdy
promień będzie zatem dalej biec w tym samym kierunku (nie załamując się), jak gdyby wciąż biegł
w szkle. Schemat pokazuje taki promień, który wnika do soczewki. Zwróć uwagę, że promienie wni-
kają do soczewki nawet pod największymi kątami.
Kiedy między obiektywem z szkiełkiem nakrywkowym znajduje się powietrze o współczynniku
załamania 1, promień biegnący pod kątem podobnym do tego pokazanego w prawej części sche-
matu nie może opuścić środowiska szkła — odbija się od górnej powierzchni szkiełka nakrywko-
wego. Promienie biegnące pod mniejszym kątem w porównaniu z pionem wnikają do soczewki obie-
ktywu. Ogólnie, do soczewki trafia mniej światła i zatem mniej promieni przechodzących przez
obiekt.
Apertura liczbowa (AL) to cecha charakterystyczna soczewki:

gdzie η — współczynnik załamania środowiska między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym,

θ — połowa maksymalnego kąta, po którym promienie wnikają do soczewki. W schemacie θ jest
kątem a w powietrzu, zaś a' kątem w olejku immersyjnym.
Maksymalna zdolność rozdzielcza obiektywu zależy od jego apertury liczbowej.

369
 14. 10. 1 Oświetlenie Kohlera
W celu otrzymania najlepszego obrazu obiekt musi być równomiernie oświet-
lony, i to niezależnie od nierówności w źródle światła. Oświetlenie Kohlera,
które jest optymalne, wykorzystuje lampę zaopatrzoną w soczewkę kondensa-
cyjną oraz regulowaną przesłonę, która determinuje średnicę wiązki oświet-
lającej. Kiedy jest poprawnie ustawiona, na niższej płaszczyźnie ogniskowej kon-
densatora pod stolikiem widać obraz włókna lampy i promienie z każdego
punktu tego obrazu przechodzą przez kondensor w postaci równoległych pro-
mieni, które oświetlają obiekt i wnikają do soczewki obiektywu (rys. 14. 8).

14. 10. 2 Mikroskopia kontrastowo-fazowa

Zwykły mikroskop świetlny może ujawnić szczegóły budowy, gdy poszczególne
części obiektu pochłaniają różne ilości światła lub (czasem na skutek barwienia)
absorbują różne barwy. Komórki nie barwione też czasem są widoczne, lecz nie
na tyle dobrze, by widać było szczegóły ich budowy.
Mikroskopia kontrastowo-fazowa pozwala dostrzec szczegóły budowy
w przezroczystych/przejrzystych, nie barwionych, żywych komórkach dzięki
wykorzystaniu różnic fazy między światłem biegnącym przez obiekt, ule-
gającym i nie ulegającym dyfrakcji (rys. 14. 9).

Wewnątrz przezroczystego lub przejrzystego obiektu światło oświetla region, który powoduje jego
ugięcie; fale ugięte (linie przerywane) ulegają opóźnieniu o około jednej czwartej długości fali
(1/41). Gdyby fale ugięte oraz bezpośrednie ulegały interakcji w normalnym mikroskopie (z jasnym
polem), to amplituda fali wypadkowej byłaby zbliżona do fal tła i obserwowany obiekt nie byłby
dobrze widoczny. Oba rodzaje fal nieznacznie różniłyby się fazą, lecz oko ludzkie nie potrafiłoby
tego wykryć.
W mikroskopie kontrastowo-fazowym kondensor w przedniej płaszczyźnie ogniskowej ma
pierścieniową przysłonę powodującą powstanie pustego stożka światła, który skupia się (w postaci
jasnego małego pierścienia) na płytce fazowej umieszczonej w tylnej płaszczyźnie ogniskowej
obiektywu (patrz schemat). Płytka fazowa jest wykonana ze szkła, na który naniesiony jest pierścień
z np. fluorku magnezu o takiej grubości, że opóźnia np. o 1/4λ przechodzące przez niego światło.
Pod nieobecność obiektu całe światło przechodzi przez pierścień fazowy. W trakcie badania jakie-
goś obiektu (np. niezabarwionej komórki bakteryjnej) fale tła (linie ciągłe) przechodzą przez
pierścień, podczas gdy fale ugięte (linie przerywane) przechodzą przez płytkę fazową przez strefy na

370
zewnątrz pierścienia. Opóźniając fale tła o 1/4λ, pierścień fazowy sprowadza wszystkie fale do tej
samej fazy. W płaszczyźnie obrazu interakcja między falami ugiętymi i falami tła powoduje powsta-
nie widocznego obrazu, gdyż wypadkowa fala ma amplitudę większą niż fale tła (tj. fala tworząca
obraz jest jaśniejsza niż fale tła). Taki rodzaj mikroskopii kontrastowo-fazowej nosi nazwę „ujemnej"
(„negatywowej") lub „jasnej". Efekt odwrotny — obraz ciemniejszy niż tło — powstaje w kontraście
fazowym „dodatnim" („pozytywowym") lub „ciemnym".
Lepszy obraz uzyskuje się, gdy kondensor jest wyposażony w zielony filtr.
Należy stosować mocniejszą lampę niż w mikroskopii w jasnym polu, gdyż jedynie część mocy
lampy jest wykorzystywana do tworzenia obrazu.
Należy też pamiętać, aby przesłona pierścieniowa w kondensorze była zgodna z używanym
obiektywem kontrastowo-fazowym.
Mały jasny pierścień na płytce fazowej musi się dokładnie zgadzać z pierścieniem fazowym (patrz
schemat). Jeśli trzeba, kiedy kondensator jest we właściwej pozycji, a obiekt jest maksymalnie ostry,
należy dokonać regulacji. W tym celu należy usunąć okular i zastąpić go specjalnym „mikroskopem
pomocniczym". Mikroskop ten należy skupić na płytce fazowej i używając odpowiednich śrub
centrujących w kondensorze (zależnie od modelu mikroskopu) zmienić położenie jasnego pierścienia

14. 10. 3 Mikroskopia immunofluorescencyjna/epifluorescencyjna

Patrz sekcje 11. 8. 2 i 11. 8. 5
 ROZDZIAŁ

15
Człowiek przeciwko bakteriom

Bakterie mogą być uciążliwe, a nawet niebezpieczne w wielu codziennych sytua-

cjach, dlatego potrzebne są nam sposoby eliminowania ich lub hamowania ich
aktywności. Czasem niezbędne jest całkowite zniszczenie wszystkich form
żywych na jakimś obiekcie, jak na przykład podczas przygotowywania do użycia
narzędzi chirurgicznych. W innych sytuacjach wystarczające może być jedynie
wyeliminowanie potencjalnie szkodliwych organizmów. Szczególny problem
stwarza konieczność inaktywacji patogennych bakterii na lub wewnątrz ży-
wych tkanek.

15. 1 Sterylizacja
Każda procedura gwarantująca zabicie wszystkich żyjących organizmów —
łącznie z ich endosporami (sekcja 4. 3. 1) oraz wirusów — jest nazywana procesem
sterylizacji (jałowienia). (Ponieważ sterylizacja zabija wszystkie organizmy,
wyrażenie takie jak „częściowa sterylizacja" jest bezsensowne. ) Idealnie byłoby,
gdyby metody sterylizacji były wydajne, szybkie, proste i tanie i aby mogły być
zastosowane dla szerokiego wachlarza materiałów (nie uszkadzając ich). Steryli-
zację zazwyczaj przeprowadza się z zastosowaniem czynników fizycznych —
powszechne jest ogrzewanie do odpowiednio wysokiej temperatury.

15. 1. 1 Sterylizacja przez ogrzewanie

Komórki poszczególnych gatunków bakterii różnią się wrażliwością na ogrzewa-
nie, a endospory są znacznie bardziej wytrzymałe niż komórki wegetatywne.
Komórki wegetatywne giną gwałtownie we wrzącej wodzie, podczas gdy endo-
spory mogą w tych warunkach przetrwać przez długi czas.
Sterylizująca skuteczność ogrzewania zależy nie tylko od temperatury, ale
także od takich czynników jak czas, wilgotność oraz liczba i stan fizjologiczny

372
niszczonych mikroorganizmów. Należy zauważyć, że im wyższa jest począt-
kowa liczebność populacji bakterii, tym dłuższy czas będzie potrzebny do
uzyskania sterylności w danej temperaturze; ilustruje to rysunek 12. 2.

15. 1. 1. 1 Płomień

Płomień stosuje się np. do szybkiej sterylizacji powierzchni, oczek inokulacyj-

nych (ez) itp. (sekcja 14. 3, 14. 4), podczas gdy jednorazowe materiały takie jak
ochronne ubrania chirurgiczne, strzykawki itp. mogą być sterylizowane i nisz-
czone przez spalenie. Jednak w wielu przypadkach stosuje się mniej radykalne
metody.

15. 1. 1. 2 Sterylizatory wykorzystujące gorące powietrze

Aparaty te używane są np. do sterylizacji przedmiotów odpornych na wysoką

temperaturę, takich jak czyste szkło laboratoryjne. W tzw. sterylizatorach utrzy-
mywana jest przez 60-90 minut temperatura 160-170°C. W warunkach takich
następuje denaturacja białek, odwodnienie cytoplazmy i utlenianie różnych
składników wszelkich obecnych organizmów. Wewnątrz urządzenia powietrze
powinno być w obiegu, aby możliwy był jego dostęp do wszystkich przedmio-
tów poddawanych sterylizacji; powinny więc one być tak rozmieszczone, aby nie
utrudniać przepływu gorącego powietrza.

15. 1. 1. 3 Sterylizacja gorącą parą wodną: autoklaw

Para wodna może sterylizować w niższych temperaturach (przez krótszy czas)

niż stosowane w sterylizatorach. Przy normalnym ciśnieniu atmosferycznym,
para ma temperaturę tylko 100°C, czyli taką, w której endospory mogą przeżywać
przez długi czas. Kiedy jednak znajduje się pod podwyższonym ciśnieniem,
może osiągać wyższe temperatury; w istocie istnieje określona zależność między
ciśnieniem i temperaturą czystej pary wodnej, czyli pary nie zawierającej żadnej
domieszki powietrza. Im wyższe jest ciśnienie, tym wyższa temperatura. Gdy
sterylizujemy przy użyciu gorącej pary wodnej, przedmioty przeznaczone do
sterylizacji umieszczamy w mocnej, metalowej, szczelnej komorze (zwanej auto-
klawem). Wewnątrz komory w wyniku wrzenia wody powstaje para (rys. 15. 1)
lub w przypadku większych autoklawów jest ona wpuszczana przewodami
z zewnętrznego tworzącego ją urządzenia (bojlera); powietrze jest wypychane
przez otwarty zawór, póki komora nie wypełni się czystą parą — następnie
zawór jest zamykany. Ciśnienie i temperatura pary zwiększają się, gdyż pod-
grzewanie trwa nadal (rys. 15. 1), ewentualnie para wciąż dopływa z zewnętrz-
nego źródła. Po osiągnięciu określonego ciśnienia otwiera się odpowiedni zawór,
zapobiegając nadmiernemu zwiększaniu ciśnienia i temperatury; automatyczna
regulacja pozwala na utrzymanie wcześniej zaprogramowanego ciśnienia na
stałym poziomie przez określony czas.
Czas sterylizacji musi być tak dobrany, aby wszystkie znajdującego się w auto-
klawie ładunki materiałów osiągnęły właściwą do sterylizacji temperaturę i pozo-
stawały w tej temperaturze aż wszystkie mikroorganizmy zostaną zabite.

373
Woda znajduje się na dnie komory. Materiały przeznaczone do sterylizacji są umieszczone na perfo-
rowanej tacy, która utrzymuje je powyżej poziomu wody. Pokrywa z zaworem (kranikiem) do usu-
wania powietrza i pary jest przymocowana do kotła specjalnymi klamrami, gumowa uszczelka zape-
wnia szczelność zamknięcia. Element grzejny jest włączony i woda gotuje się. Para wodna wypełnia
komorę, wypychając z niej przez otwarty zawór całe powietrze. Gdy czysta para wodna zaczyna
wydobywać się przez zawór, jest on zamykany. Podczas dalszego podgrzewania woda paruje powo-
dując wzrost ciśnienia (i temperatury) wewnątrz komory. Po osiągnięciu odpowiedniego ciśnienia
jest ono utrzymywane na stałym, zaprogramowanym wcześniej poziomie. Po upływie odpowied-
niego czasu (patrz tekst), element grzewczy jest wyłączany, a autoklaw schładza się powoli, póki ciś-
nienie wewnątrz komory nie spadnie do poziomu ciśnienia atmosferycznego. Teraz można odkręcić
zawór i otworzyć pokrywę komory.
W tekście znajdziesz uwagi na temat pewnych zasad bezpieczeństwa.

Standardowe warunki (kombinacja temperatury i czasu) zalecane do pow-

2
szechnego stosowania to: 115°C (przy ciśnieniu 0, 68 bara [=69 kPa; 10 lb/cal ]
powyżej ciśnienia atmosferycznego przez 35 minut, 121°C (1, 02 bara [103 kPa;
2 2
15/lb/cal ]) przez 15-20 minut, lub 134°C (2, 04 bara [207 kPa; 30 lb/cal ]) przez
4 minuty. Czas może być różny, zależnie od rodzaju ładunku i stopnia zakażenia
(patrz sekcja 15. 1. 1). Zauważ, że odliczanie czasu zaczyna się od momentu
osiągnięcia sterylizującej temperatury przez każdy element ładunku. Zwróć też
uwagę, że manometr autoklawu może wskazywać ciśnienie jako ciśnienie powy-
żej atmosferycznego (jak w podanych powyżej przykładach) lub jako ciśnienie
całkowite, czyli sumę ciśnienia atmosferycznego i ciśnienia pary wodnej. Także
urządzenie pomiarowe może być wykalibrowane w innych jednostkach
niż podano w przykładzie (w przybliżeniu 1 bar = 101 kPa = 14, 7 lb/cal2 =
760 mmHg).
Aby sterylizacja była skuteczna, para wodna musi być nasycona, tzn. zawie-
rać tak dużo wody w formie pary jak jest to możliwe dla danej temperatury i ciś-
nienia; obecność powietrza w komorze zaburzyłaby zależności ciśnienia i tempe-

374
ratury, gdyż mieszanina pary i powietrza ma w tym samym ciśnieniu niższą
temperaturę niż czysta para wodna. Tak więc przed zamknięciem zaworu całe
powietrze z komory autoklawu musi być usunięte.
Małe przenośne autoklawy laboratoryjne odpowiadają budową i działaniem
domowym szybkowarom. W dużych autoklawach, jak np. używane w szpita-
lach, para jest zwykle dostarczana ze źródła zewnętrznego, a czynniki takie jak
czas, ciśnienie i jakość pary są kontrolowane automatycznie. W niektórych mode-
lach para wodna jest dostarczana od góry komory, tak że powietrze jest wypy-
chane w kierunku dolnym; jest to bardziej efektywny system niż przy odwrot-
nym kierunku dopływu pary (jak to jest w małych autoklawach), gdyż w stoso-
wanych warunkach para jest lżejsza od powietrza.
W innym typie autoklawu powietrze jest usuwane z komory przez pompę
próżniową przed dostarczeniem pary; pozwala to na szybką i dokładną penetra-
cję pary do wszystkich porowatych sterylizowanych materiałów, takich jak ubra-
nia, pościel itp., mających tendencję do zatrzymywania powietrza.
Pewne materiały nie mogą być sterylizowane przez autoklawowanie; np. sub-
stancje takie jak wazelina i substancje lotne lub niszczone przez wysoką tempera-
turę. Pewne z tych substancji (np. wazelina) mogą być sterylizowane w steryliza-
torze z suchym gorącym powietrzem (15. 1. 1. 2).
Niektóre materiały ulegające zniszczeniu w warunkach autoklawowania
mogą być sterylizowane przez działanie mieszaniny pary wodnej i formalde-
hydu w niższej temperaturze (np. 80°C); metoda ta zabija endospory w ciągu
2 godzin i jest stosowana do sterylizacji wrażliwych na temperaturę narzędzi
chirurgicznych, plastikowych węży, wełnianych koców itp.
U w a g a d o t y c z ą c a b e z p i e c z e ń s t w a : Aby uniknąć ryzyka wybuchu
butli zawierających płyny itp.: pozostaw nie dokręcone korki przed wstawieniem
do komory oraz pozwól płynom schłodzić się do temperatury ~80°C przed
otworzeniem komory.

15. 1. 2. Sterylizacja promieniami jonizującymi

Promienie jonizujące — np. promienie beta (elektrony), promienie gamma, pro-
mienie X — sterylizują przez dostarczanie energii do zajścia wielu letalnych
reakcji chemicznych w zanieczyszczających organizmach. Promieniowanie
gamma (zazwyczaj jego źródłem jest kobalt-60) stosuje się do sterylizacji mate-
riałów do pracowni biologicznych i medycznych, takich jak np. jednorazowe
plastikowe płytki Petriego, jednorazowe strzykawki itp.

15. 1. 3. Sterylizacja przez filtrację

Płyny, które chcemy pozbawić nawet najmniejszych mikroorganizmów
(np. wirusów), możemy sterylizować przez przepuszczenie go przez filtr
membranowy (o odpowiedniej wielkości por) zatrzymujący także wszystkie
inne mikroorganizmy. Płyn może być przeciągany przez filtr do sterylnego

375
pojemnika z zastosowaniem podciśnienia lub przepychany z użyciem np. tłoka
strzykawki. Filtr jako taki to cienki płatek membrany z octanu celulozy, poli-
węglanu lub podobnego materiału, wielkość porów może wynosić nawet
tylko 0, 2 μm.
Filtrację stosuje się np. do sterylizacji surowicy (na użytek laboratoryjny), roz-
tworów antybiotyków wrażliwych na temperaturę i roztworów zawierających
cukry nietrwałe w podwyższonej temperaturze.

15. 1. 4 Sterylizacja z użyciem czynników chemicznych

Związki chemiczne stosowane do sterylizacji muszą być wysoce reaktywne i usz-
kadzające żywe tkanki; niezbędne jest więc ostrożne obchodzenie się z nimi.
Wskazane jest stosowanie ich tylko w odpowiednio wyposażonych instytucjach
przez przeszkolony w tym zakresie personel.
Tlenek etylenu (C2H4O) — rozpuszczalny w wodzie cykliczny eter — jest
gazem w temperaturze powyżej 10, 8°C i tworzy wybuchową mieszaninę
z powietrzem; jest więc rozcieńczany innymi gazami, takimi jak dwutlenek
węgla lub azot. Do sterylizacji mieszanina taka jest używana w specjalnych
komorach, a temperatura, wilgotność, czas i stężenie czynnika muszą być
dokładnie kontrolowane. Tlenek etylenu jest czynnikiem alkilującym, który rea-
guje z różnymi grupami w białkach i kwasach nukleinowych. Stosuje się go do
sterylizacji czystego sprzętu medycznego, pościeli, materiałów wrażliwych na
ogrzewanie, jak np. pewne plastiki.
Inne przykłady chemicznych środków sterylizujących to aldehyd glutarowy
i β-propiolakton.
Terminem „gas plasma" określa się proces, w którym nadtlenek wodoru
wstrzykiwany jest do komory sterylizującej (suche powietrze pod zmniejszonym
ciśnieniem) i energia o częstotliwości fal radiowych zamienia nadtlenek wodoru
w reaktywny czynnik powodujący sterylizację. Ważne są warunki procesu; nie-
skuteczna sterylizacja może wynikać z: niskiej temperatury (<42°C); obecności
lipidów; obecności celulozy lub zawilgocenia ładunku. Metodę tę wykorzystuje
się do sterylizacji niektórych narzędzi medycznych (np. endoskopów).

15. 2 Dezynfekcja
Dezynfekcja to każda procedura prowadząca do zniszczenia, inaktywacji lub
usunięcia potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów — niekoniecznie wpły-
wająca na inne obecne organizmy; zwykle nie ma żadnego (lub jedynie nie-
wielki) wpływu na endospory bakteryjne.
„Dezynfekcja" zwyczajowo odnosi się do stosowania pewnych środków che-
micznych w celu zmywania niektórych powierzchni i nieżyjących obiektów, jak-
kolwiek termin ten czasem używamy w odniesieniu do antyseptyków (sek-
cja 15. 3). Chociaż chemiczna dezynfekcja jest szeroko stosowana, do pewnych
celów bardziej odpowiednie są metody fizyczne.

376
 15. 2. 1 Dezynfekcja środkami chemicznymi
Najlepiej byłoby, gdyby środki dezynfekujące powszechnego użytku zabijały
szeroki wachlarz rzeczywistych i potencjalnych patogenów. Jednakże, dany śro-
dek dezynfekujący jest zwykle bardziej aktywny wobec określonych organiz-
mów, a ponadto aktywność ta może zależeć od takich czynników jak stopień roz-
cieńczenia, temperatura, pH, obecność związków organicznych lub detergentów.
Środek dezynfekujący, aby w ogóle był aktywny, potrzebuje określonych warun-
ków, odpowiedniego stężenia i czasu działania. Pewne środki (np. podchloryny)
są raczej niestabilne, a inne (np. olejki sosnowe) do uzyskania aktywności muszą
być używane w formie rozpuszczonej. W małym stężeniu niektóre środki nie
tylko tracą aktywność, ale mogą być metabolizowane przez pewne bakterie —
np. niektóre gatunki Pseudomonas mogą rosnąć w rozcieńczonym roztworze
kwasu karbolowego (fenolu).
Środki dezynfekujące, które zabijają bakterie, są nazywane bakteriobój-
czymi. Inne jedynie hamują (zatrzymują) wzrost bakterii; jeżeli zostaną one
zinaktywowane (np. przez rozcieńczenie lub chemiczną neutralizację), bakterie
mogą na nowo podjąć wzrost. Takie środki dezynfekujące są nazywane
bakteriostatycznymi. Po rozcieńczeniu środek bakteriobójczy może stać się
bakteriostatycznym.
Spośród wielu będących w użyciu środków dezynfekcyjnych omówimy niżej
tylko kilka najpopularniejszych.
Fenol i jego pochodne (np. takie jak krezole i ksyleny) mogą w odpowiednich
stężeniach działać bakteriobójczo; co wynika głównie z ich wpływu na przepusz-
czalność błony cytoplazmatycznej. Lizol jest mieszaniną metylofenoli z mydłem;
w stężeniu 0, 5% zabija on w ciągu 15 minut wiele patogenów nie wytwa-
rzających spor, ale endospory mogą przeżyć nawet w 2% lizolu przez wiele dni.
Chlor jest powszechnie używany do dezynfekcji wody wodociągowej oraz
wody w basenach kąpielowych. Działa on (bezpośrednio lub w formie kwasu
podchlorawego) jako efektywny czynnik dezynfekujący, chociaż jego aktywność
maleje w obecności substancji organicznych lub innych, z którymi może reagować.
„Czwartorzędowe związki amonowe" (QACs, ang. quaternary ammonium
compounds) są kationowymi detergentami stosowanymi np. do dezynfekcji
sprzętu w zakładach przetwórstwa spożywczego (w tym mleczarskiego), są one
bakteriostatyczne w małych stężeniach, a bakteriobójcze w wyższych. QACs są
bardziej aktywne wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych, uszkadzają
błonę cytoplazmatyczną, a ich aktywność jest hamowana przez np. mydło,
pewne kationy (Ca2+, Mg2+), niskie pH i substancje organiczne.
Podchloryny są wysoce aktywne wobec wielu bakterii (także endospor), nie-
zdysocjowana forma HOCl jest silnie bakteriobójcza. Jako stabilizator dostęp-
nych w handlu dezynfekujących środków podchlorynowych używany jest
zazwyczaj wodorotlenek sodu.

15. 2. 1. 1 Testowanie środków dezynfekujących

Skuteczność dezynfekujących środków fenolowych można określić tzw.
współczynnikiem fenolowym, czyli antybakteryjną aktywnością danego środka

377
w odniesieniu do fenolu (w wystandaryzowanych warunkach). Współczynnik
fenolowy może być oznaczony w teście zawiesinowym (ang. suspension test),
w którym różne rozcieńczenia badanego czynnika w płynnym podłożu działają
w określonej temperaturze i przez określony czas na odpowiedni organizm
testowy.
Test zawiesinowy Rideala-Walkera określa rozcieńczenie badanego czyn-
nika, które zabija testowy organizm (np. Salmonella typhi NCTC 786) w tempie
równoważnym do standardowych rozcieńczeń fenolu; wynik jest przedstawiany
jako współczynnik Rideala-Walkera.
Test zawiesinowy Chicka-Martina określa współczynnik fenolowy w obec-
ności substancji organicznej (np. drożdży), to jest w warunkach symulujących
spotykane w praktyce; jest to ważne, ponieważ środek dezynfekujący może być
inaktywowany przez substancje organiczne.
Ogólnie, dla różnych środków dezynfekujących, stosuje się test „pojemno-
ści" (ang. capacity test) określający zdolność danego czynnika do zachowywania
aktywności przy wzrastającej liczbie bakterii. Do stałej objętości badanego czyn-
nika dezynfekującego dodaje się okresowo bakterie, a następnie w pewnych
przedziałach czasowych pobierane są próbki w celu oznaczenia liczby żywych
bakterii. Test pojemnościowy Kelseya-Sykesa określa skuteczność środka de-
zynfekującego w warunkach symulujących spotykane w praktyce; spośród
różnych testowych organizmów (np. Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749, Staphy-
lococcus aureus NCTC 4163) wybiera się ten, o którym wiadomo, że jest najbar-
dziej oporny na testowany czynnik.
Test nośnikowy (ang. carrier test) określa zdolność badanego czynnika do
dezynfekcji obiektu (nośnika), który uprzednio został sztucznie zakażony mikro-
organizmami.
Procedury testowania środków dezynfekujących są obecnie weryfikowane,
ze szczególnym zwracaniem uwagi na skuteczność ich działania w praktycznie
występujących sytuacjach.

15. 2. 2 Dezynfekcja czynnikami fizycznymi

Naświetlanie promieniami ultrafioletowymi wywołuje uszkodzenia DNA
i może być letalne dla bakterii przy zastosowaniu odpowiednich warunków. UV
ma niewielką zdolność penetracji (jest łatwo pochłaniane przez stałe podłoża),
ale lampy ultrafioletowe (o długości fali około 254 nm) są z powodzeniem uży-
wane do dezynfekcji powietrza i odkrytych powierzchni w zamkniętych pomie-
szczeniach (np. sale operacyjne, boksy do pracy w warunkach sterylnych itp. )
Dezynfekcja mleka przez pasteryzację i proces UTH opisano w sekcji 12. 2. 1. 1.

15. 3 Antyseptyka
Antyseptyka jest to w istocie dezynfekcja żywych tkanek; może być stosowana
profilaktycznie (czyli w celu zapobiegania infekcjom) lub terapeutycznie (do
leczenia infekcji).

378
 Ogólne uwagi na temat środków dezynfekujących (sekcja 15. 2. 1) stosują się
też do antyseptyków; czyli środków chemicznych używanych do celów
antyseptyki
Dettol jest fenolowym antyseptykiem ogólnego stosowania używanym
w rozcieńczonej formie, ale domowe środki dezynfekujące w bardziej stężonej
formie są oparte na chloroksylenach.
Heksachlorofen był stosowany w antyseptycznych mydłach; jest on bifeno-
lem (czyli cząsteczką zawierająca dwie grupy fenolowe) Jest on bardziej efek-
tywny wobec bakterii gramdodatnich niż gramujemnych.
Mieszanina etanolu i wody (70: 30) jest powszechnym środkiem aseptycz-
nym do odkażania skóry.
Mydła ogólnie mają małą lub żadną aktywność antybakteryjną póki nie
zostaną uzupełnione antyseptykiem; pomagają jednakże usuwać bakterie ze
skóry łącznie ze zmywanym brudem i tłuszczem.
QACs (sekcja 15. 2. 1) zawierają bromek cetylotimetyloamonowy (Cetrimide,
Cetavlon itp. ), który często występuje w kremach antyseptycznych.
Jodyna (w roztworze wodnym lub alkoholowym) jest silnym bakteriobój-
czym i zabijającym spory antyseptykiem.
Chlorheksydyna jest używana w roztworze alkoholowym do dezynfekcji
skóry, nie jest sporobójcza, lecz bakteriostatyczno-bakteriobójcza (zależnie od
stężenia) i może działać uszkadzając błony komórkowe lub hamując ATPazy.
Jest inaktywowana przez mydła, anionowe detergenty i niskie pH. Chloroheksy-
dyna jest stosowana np. przeciwko MRSA (sekcja 15. 4. 11), chociaż pewne
szczepy MRSA wykazują wobec niej oporność kodowaną przez plazmid [patrz
np. Grubb (1998) RMM 9: 153-162).

15. 4 Antybiotyki
Pierwotnie słowo „antybiotyk" określało jakikolwiek produkt wytwarzany przez
drobnoustroje, który nawet w bardzo małych stężeniach hamował wzrost lub
zabijał pewne mikroorganizmy. Obecnie termin ten jest zwykle stosowany
w szerszym znaczeniu i dodatkowo obejmuje wszelkie półsyntetyczne lub
nawet całkowicie syntetyczne substancje mające takie właściwości.
Nie ma antybiotyku skutecznego wobec wszystkich bakterii. Niektóre wyka-
zują aktywność w stosunku do wąskiego zakresu gatunków, a inne działają na
szerokie spektrum organizmów, zarówno gramdodatnich, jak i gramujemnych.
W pewnych przypadkach naturalny antybiotyk (to jest wytwarzany przez drob-
noustrój) można chemicznie zmodyfikować w laboratorium, otrzymując antybio-
tyk półsyntetyczny mogący mieć znacząco różne spektrum aktywności.
Podobnie jak w przypadku środków dezynfekujących, antybiotyki mogą
mieć działanie bakteriobójcze lub bakteriostatyczne, a niektóre z nich mogą być
bakteriobójcze w większym stężeniu, zaś bakteriostatyczne w mniejszym.
Antybiotyk zwykle działa w ściśle określonym miejscu w komórce. Zależnie
od antybiotyku, miejsce to może się znajdować w ścianie komórkowej, błonie
cytoplazmatycznej, w szlaku biosyntezy białek lub być np. enzymem uczest-
niczącym w syntezie kwasów nukleinowych. Ponieważ bakteria pod wieloma

379
względami różni się od komórki eukariotycznej (tab. 1. 1), jest małe prawdopodo-
bieństwo, aby toksyczny wpływ antybiotyku na komórkę bakteryjną był również
wywierany na komórki ludzkie lub zwierzęce. Z powodu tej selektywnej toksy-
czności niektóre antybiotyki są skuteczne w zwalczaniu pewnych chorób —
bakteryjny patogen może być zaatakowany bez szkody dla gospodarza. Oczywi-
ście, tak użyty antybiotyk musi zachować aktywność wewnątrz organizmu na
tyle długo, by być skuteczny wobec patogena.
Z wielu znanych antybiotyków stosunkowo nieliczne nadają się do leczenia
chorób. Niektóre z nich wymienione są niżej.

15. 4. 1 Antybiotyki β-laktamowe

Do tej grupy antybiotyków (rys. 15. 2) należą m. in. penicyliny, cefalosporyny,
karbapenemy, klawamy i monobaktamy. W każdym z nich w skład cząsteczki
wchodzi czteroczłonowy pierścień zawierający azot, tzw. pierścień β-lakta-
mowy. Penicyliny i cefalosporyny są wytwarzane przez grzyby, zaś karbape-
nemy, klawamy, monobaktamy i nokardycyny — przez bakterie. [Bacterial
production of carbapenems and clavams: McGowan, Bycroft i Salmond (1998)
TIM 6: 203-208. ] Działanie antybiotyków β-laktamowych polega na naruszeniu
syntezy mureiny ściany komórkowej w rosnących komórkach. Wiążą się one
do tzw. białek wiążących penicylinę (PBP, ang. penicillin binding proteins), to
jest enzymów uczestniczących w późnych etapach syntezy mureiny, hamując
powstawanie woreczka mureinowego (sakulusa) otaczającego komórkę
(rys. 2. 7). Liza komórek najwyraźniej powodowana jest przez enzymatyczną
degradację mureiny. W osłonach komórki bakteryjnej znajdują się zarówno
enzymy uczestniczące w syntezie, jak i w hydrolizie tej makrocząsteczki, które
łącznie odgrywają rolę we wzroście sakulusa (rys. 3. 1) tak że selektywne
zahamowanie aktywności syntetaz (PBP) może prowadzić do lizy. Należy
zwrócić uwagę na to, że antybiotyki β-laktamowe zabijają jedynie komórki
rosnące.
Inne antybiotyki (np. wankomycyna) hamują syntezę mureiny na wcześniej-
szym etapie jej syntezy (sekcja 6. 3. 3. 1).
Różnego typu antybiotyki β-laktamowe są przedstawione na rysunku 15. 2.
W przypadku wielu antybiotyków β-laktamowych pierścień β-laktamowy
jest podatny na rozszczepienie przez pewne enzymy bakteryjne (β-laktamazy:
sekcja 15. 4. 1. 2). Rozszczepienie pierścienia niszczy antybiotyk, a organizmy
wytwarzające te enzymy zwykle wykazują przynajmniej pewien stopień opor-
ności na niektóre antybiotyki β-laktamowe.

15. 4. 1. 1 Penicyliny

Pierwsze stosowane penicyliny (np. penicylina benzylowa) wykazują słabą akty-

wność wobec bakterii gramujemnych na skutek słabego przenikania przez błonę
zewnętrzną (sekcja 2. 2. 9. 2). Słabo (lub wcale) działają na te bakterie gramdodat-
nie, które wytwarzają β-laktamazy. Niektóre penicyliny półsyntetyczne (jak klo-
ksacylina, metycylina, nafcylina) są oporne na kilka różnych β-laktamaz (w tym

380
Każdy wzór przedstawia podstawowy szkielet cząsteczki jednego przedstawiciela rodziny anty-
biotyków β-laktamowych. Antybiotyki te zgrupowane są razem, gdyż każdy z nich ma pierścień
β-laktamowy.
Przedstawione szkielety (a) penicylin, (b) cefalosporyn, (c) nokardycyn, (d) monobaktamów
i (e) karbapenemów.
Struktura w (f) przedstawia kwas klawulanowy (klawam). Kwas klawulanowy jest słabym anty-
biotykiem, lecz inaktywuje wiele typów β-laktamaz (sekcja 15. 4. 1. 2. ). Reaguje kowalencyjnie ze spe-
cyficzną sekwencją aminokwasów w enzymie. Stosowany jest zatem w połączeniu z innymi anty-
biotykami β-laktamowymi — antybiotyk działa na komórkę bakteryjną, podczas gdy kwas klawula-
nowy chroni go przed działaniem β-laktamazy. Na przykład, Augmentin® jest mieszaniną amoksy-
cyliny (z grupy penicylin) i kwasu klawulanowego.
Strzałka przerywana pokazuje miejsce działania β-laktamaz. Enzymy te otwierają pierścień
β-laktamowy, tym samym unieszkodliwiając, inaktywując antybiotyk. Miejsce działania innego
enzymu, amidazy penicylinowej, przedstawione jest w (a).
Wzory z Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2. wyd., Singleton i Sainsbury, str. 483,
za zgodą wydawcy, John Wiley, Chichester, W. B.

wytwarzane przez niektóre gronkowce), lecz nadal wykazują słabe działanie na

bakterie gramujemne. Ampicylina i jej pochodne (np. amoksycylina) łączą
w sobie oporność na niektóre β-laktamazy ze zwiększoną aktywnością wobec
bakterii gramujemnych. [Farmakologia kliniczna i stosowanie penicylin w terapii
(artykuł przeglądowy): Nathwani i Wood (1993) Drugs 45: 866-894. ]

381
 15. 4. 1. 2. β-Laktamazy

Enzymy te inaktywują (podatne) antybiotyki β-laktamowe hydrolizując pierścień

β-laktamowy (rys. 15. 2). Mogą one być kodowane przez geny chromosomowe
lub geny przenoszone przez plazmidy lub transpozony. Niektóre β-laktamazy są
wydzielane do podłoża, a inne — są zatrzymywane przez osłony komórkowe.
Dana β-laktamaza inaktywuje konkretny zakres antybiotyków β-laktamo-
wych, będąc nieczynna lub bardzo słabo aktywna wobec innych. Antybiotyki
podatne na działanie jednej β-laktamazy mogą być oporne na inne. Zatem bakte-
ria wytwarzająca konkretną β-laktamazę może być oporna jedynie na określone
β-laktamy.
Niektóre β-laktamazy są indukowalne, a pewne antybiotyki β-laktamowe są
szczególnie dobrymi induktorami (patrz np. rys. 15. 2). Oporność bakterii na
β-laktamy powodowaną przez indukowalne β-laktamazy można wykazać za
pomocą testu dyfuzji krążkowej (patrz np. Staphylococcus aureus w sekcji
15. 4. 11. 1 oraz inaktywacji enzymatycznej, fot. 15. 1).
Wytwarzanie β-laktamaz jest łatwo wykazać. Jedna ze stosowanych metod
wykorzystuje chromogenną cefalosporynę zwaną nitrocefinem, która po hydroli-
zie pierścienia β-laktamowego zmienia barwę z żółtej na niebieską. Kropla roz-
tworu nitrocefinu dodana do kolonii bakterii wytwarzającej β-laktamazę zmienia
zabarwienie na czerwone prawie natychmiast lub w ciągu 30 minut inkubacji.
Oporność na antybiotyki β-laktamowe wynikająca z aktywności β-laktamaz
stwarza problem kliniczny, który można próbować rozwiązać stosując, o ile moż-
liwe, antybiotyki innego typu. Inną możliwością jest stosowanie antybiotyków
β-laktamowych o szerokim spektrum działania, które są oporne na β-laktamazy
wytwarzane przez danego patogena lub stosowanie kombinacji leków, jak Aug-
mentin®, który oprócz antybiotyku zawiera kwas klawulanowy będący inhibito-
rem β-laktamaz (rys. 15. 2). Niestety, dwa ostatnie sposoby powodują silną presję
selekcyjną w kierunku ewolucji β-laktamaz i niektóre obecnie wytwarzane unie-
czynniają antybiotyki β-laktamowe o szerokim spektrum działania i są oporne na
inaktywacje przez wiążące się do nich inhibitory. Ewolucja dwóch β-laktamaz —
TEM-1 (występująca w transpozonie Tn3) oraz SHV — omówiona jest przez
Petrosino, Cantu i Palzkill (1998) TIM 6: 323-327].

15. 4. 2 Antybiotyki aminoglikozydowe

Przedstawicielami tych typowo bakteriobójczych antybiotyków o szerokim
spektrum aktywności są amikacyna, gentamycyna1, kanamycyna, neomycyna
i streptomycyna. Działają one zarówno na bakterie gramdodatnie, jak i gramuje-
mne. Antybiotyki aminoglikozydowe oddziałują na wiele funkcji komórki bakte-
ryjnej, lecz przede wszystkim wiążą się do podjednostki 30S rybosomu i hamują
syntezę białka. Małe stężenia streptomycyny powodują mylne czytanie mRNA
(wbudowywanie niewłaściwych aminokwasów), podczas gdy duże stężenia
całkowicie hamują syntezę białek, swoiście blokując rybosomy na starcie transla-
cji (etap w rys. 7. 9b).
1
Litera „i" (właściwa pisownia — gentamicyna) oznacza grzybowe pochodzenia antybiotyku
(przyp. tłum. ).

382
 Oporność na antybiotyki aminoglikozydowe może wynikać: 1) z mutacji
w białkach rybosomowych w podjednostce 30S (co wpływa na wiązanie antybio-
tyku), 2) z modyfikacji (inaktywacji) cząsteczki antybiotyku przez bakteryjne
enzymy, które mogą powodować jego O-fosforylację, N-acetylację lub O-adeny-
lację, 3) ze zmniejszonego pobierania antybiotyku [Davies i Wright (1997) TIM
5: 234-240].
Działanie uboczne tych antybiotyków (szczególnie neomycyny i streptomy-
cyny) polega na możliwości uszkodzenia 8. nerwu czaszkowego, co powoduje
upośledzenie słuchu. Działanie takie jest zależne od dawki antybiotyku. Mogą
również występować reakcje nadwrażliwości.

15. 4. 3 Tetracykliny
Antybiotyki tej grupy, działające bakteriostatycznie, wykazują szerokie spek-
trum działania (rys. 15. 3). Hamują one syntezę białka wiążąc się do rybosomów
(w przypadku E. coli selektywnie wiążą się do białka S7 w podjednostce 30S), co
hamuje wiązanie aminoacylo-tRNA do miejsca A (rys. 7. 9). Stosuje się je w lecze-
niu chorób ludzi i zwierząt, wywołanych m. in. przez organizmy z rodzajów Bru-
cella, Chlamydia, Mycoplasma i Rickettsia oraz, co wydaje się ciekawe, w leczeniu
pewnych schorzeń roślinnych jak żółknięcie drzew kokosowych prowadzące do
ich zamierania (wywołane przez organizm podobny do Mycoplasma).
Bakterie zwykle akumulują tetracykliny (w sposób wymagający nakładu
energii). Niektóre bakterie są jednak na nie oporne, gdyż wypompowują
cząsteczki antybiotyku na zewnątrz błony cytoplazmatycznej: patrz białko ΤΕΤ
w sekcji 15. 4. 11. Inna forma oporności polega na mniej wrażliwym wiązaniu
między rybosomem a tRNA: patrz białko Tet(M) w sekcji 8. 4. 2. 3. Trzeci mecha-
nizm (nieco rzadszy) polega na modyfikacji (to jest unieczynnieniu) tetracyklin
przez bakterie. Oporność na jeden rodzaj tetracykliny zwykle oznacza oporność
na pozostałe.
[Tetracycline resistance (artykuł przeglądowy): Roberts (1996) FEMSMRR 19:
1-24. ]

15. 4. 4 Makrolidy, chloramfenikol i streptograminy

Wszystkie te antybiotyki hamują syntezę białka wiążąc się do podjednostki 50S
rybosomu (rys. 7. 9).
Makrolidy. Cząsteczka składa się z dużego (> 12-członowego) pierścienia
laktonowego podstawionego jedną lub większą liczbą cząsteczek cukru lub

383
aminocukrami. Powszechnie znany makrolid erytromycyna zawiera pierścień
14-członowy związany z kladinozą i dezozaminą. Makrolidy, których działanie
zazwyczaj jest bakteriostatyczne, powodują przedwczesną terminację syntezy
polipeptydów. Wiążą się one do transferazy peptydylowej (rys. 7. 9d) i w pew-
nych warunkach mogą hamować transpeptydację lub inicjować abortywną trans-
lokację (rys. 7. 9e), co prowadzi do oddysocjowania niepełnego polipeptydu.
Makrolidy są skuteczne głównie wobec bakterii gramdodatnich. Mutanty E. coli
oporne na erytromycynę mają zmodyfikowane białko(a) w podjednostce 50S.
W przypadku gronkowca złocistego indukowalna oporność wiąże się z obecno-
ścią enzymu metylującego miejsce w 23S rRNA podjednostki 50S.
Chloramfenikol. Ta drobna cząsteczka (łatwo syntetyzowana) hamuje akty-
wność transferazy peptydylowej, prawdopodobnie uniemożliwiając prawidłowe
wiązanie aminoacylo-tRNA w miejscu A na rybosomie. Chloramfenikol jest anty-
biotykiem o szerokim spektrum działania bakteriostatycznego, lecz jego stoso-
wanie jest ograniczone ze względu na toksyczność (oddziałuje na rybosomy
mitochondrialne w komórkach ssaków). Wykorzystywany jest do zwalczania
Salmonella typhi oraz w takich przypadkach, kiedy inne leki zawodzą. Pseudomo-
nas aeruginosa jest z natury oporny na ten antybiotyk. Bakterie nabywające opor-
ność często zawierają gen kodujący acetylotransferazę chloramfenikolową (CAT,
ang. chloramphenical acetylotransferase). Enzym ten inaktywuje antybiotyk.
U bakterii gramdodatnich CAT jest zazwyczaj indukowalny (patrz sekcja 7. 8. 5),
a u bakterii gramujemnych enzym ten jest konstytutywny.
Streptograminy to antybiotyki o złożonej budowie. Zwykle zawierają dwie
zupełnie odmienne części — wielonienasycony pierścień laktonowy (część A)
oraz cykliczny heksadepsipeptyd (część B). A i Β tworzą synergiczny związek,
który może być bakteriobójczy dla pewnych (głównie gramdodatnich) patoge-
nów. Część A inaktywuje aktywne miejsca w transferazie peptydylowej, nie
dopuszczając do transpeptydacji. Część Β hamuje wiązanie rosnącego łańcucha
polipeptydowego w miejscu Ρ podczas translacji pewnych aminokwasów
(np. proliny), inicjując wczesne uwolnienie niekompletnego łańcucha polipepty-
dowego.
Nowa streptogramina, chinuprystyna/dalfoprystyna (RP 59500: Synercid®),
jest aktywna wobec pewnych patogenów (w tym MRSA) i charakteryzuje się
długim efektem poantybiotykowym (sekcja 15. 4. 12). Jest skuteczna w zwalczaniu
poważnych infekcji powodowanych przez gramdodatnie patogeny charaktery-
zujące się wieloraką opornością [Finch (1996) Drugs 51 (suplement): 31-37].
[In vitro activity of quinupristin/dalfopristin against Staphylococcus aureus: Low
i Nadler (1997) JAC 39: 53-58. ]

15. 4. 5 Polimyksyny
Polimyksyny to peptydy aktywne wobec wielu bakterii gramujemnych, podczas
gdy większość bakterii gramdodatnich jest na nie oporna. Działanie polimyksyn
na bakterie gramujemne polega na zwiększeniu przepuszczalności ich błony
cytoplazmatycznej i błony zewnętrznej.

384
 15. 4. 6 Kwas nalidyksowy i chinolony; nowobiocyna
Antybiotyki chinolonowe reagują z podjednostka A gyrazy (sekcja 7. 2. 1) w kom-
pleksie żyraza-DNA, hamując aktywność enzymu i stabilizując przerwę w obu
niciach DNA wprowadzoną przez żyrazę. Kwas nalidiksowy działa na bakterie
gramujemne. Do innych chinolonów należą kwas oksolinowy, norfloksacyna,
ofloksacyna, ciprofloksacyna i fleroksacyna, z których jedne (np. ofloksacyna,
ciprofloksacyna) są nie tylko aktywne wobec niektórych bakterii gramdodatnich,
ale również skuteczne. Oporność na te antybiotyki może wynikać ze zmienionej
żyrazy, o słabszym powinowactwie do antybiotyku i/lub zmniejszonej prze-
puszczalności osłon komórkowych.
Nowobiocyna jest pochodną kumaryny, która hamuje syntezę DNA wiążąc
się do podjednostki Β żyrazy i blokuje aktywność ATPazową enzymu (niezbędną
do jego aktywności). Stosowanie nowobiocyny jest ograniczone na skutek opor-
ności łatwo nabywanej przez bakterie oraz jej toksyczności.
[Gyrase-targeted antibiotics: Maxwell (1997) TIM 5: 102-109. ]
Do potencjalnych antybiotyków należą związki oparte na naturalnie wystę-
pujących toksynach, jak toksyna CcdB kodowana przez plazmid F, która wpływa
na żyrazę w innych miejscach niż antybiotyki chinolonowe i nie wykazuje opor-
ności krzyżowej z chinolonami. [Couturier, Bahassi i van Medleren (1998) TIM 6:
269-275].

15. 4. 7 Metronidazol
Metronidazol jest pochodną nitroimidazolu (rys. 15. 4). Jest skutecznym czynni-
kiem przeciw drobnoustrojom jedynie przy niskim potencjale oksydoredukcyj-
nym, w związku z czym używany jest przeciw bakteriom beztlenowym (i niektó-
rym patogennym pierwotniakom). W komórkach wrażliwych beztlenowców
grupa nitrowa leku ulega redukcji (przez składniki transportu elektronów, jak
np. ferredoksyny — sekcja 5. 1. 1. 2), z wytworzeniem nietrwałych cytotoksycz-
nych pochodnych, które wprowadzają cięcia w DNA. Badania nad mechaniz-
mem działania metronidazolu na Helicobacter pylori wykazały, że efekt bakterio-
bójczy bardziej zależy od zredukowanej (aktywnej) formy antybiotyku niż od
czynnych form tlenu powstających w czasie jego redukcji. Oporność na metroni-
dazol wydaje się skorelowana ze zwolnioną redukcją antybiotyku [Jorgensen
i wsp. (1998) JAC 41: 67-75].
Metronidazol jest stosowany przeciw Clostridium difficile w rzekomobłonia-
stym zapaleniu okrężnicy i, profilaktycznie, w zabiegach chirurgicz-
nych jelit w celu ochrony przed takimi beztlenowcami jak Bacteroides
i klostridiami.

385
 15. 4. 8 Ryfamycyny
Antybiotyki te, np. ryfampicyna (= „ryfampina")/ zazwyczaj działają na bakterie
gramdodatnie, w tym prątki i gronkowce, i na niektóre bakterie gramujemne.
Działanie ich polega na hamowaniu aktywności polimerazy RNA i w konsek-
wencji — syntezy RNA (sekcja 7. 5). Oporność na ryfampicynę wynika z mutacji
w genie rpoB (patrz sekcja 15. 4. 11. 2).

15. 4. 9 Sulfonamidy, trimetoprim i kotrimoksazol

Sulfonamidy (rys. 15. 5) działają bakteriostatycznie na podatne bakterie gramdo-
datnie i gramujemne. Hamują one syntezę kwasu dihydrofoliowego (DHF)
będącego prekursorem koenzymu — kwasu tetrahydrofoliowego (THF), hamując
funkcje komórkowe zależne od THF (sekcja 6. 3. 1). Związki te działają jako: kom-
petytywne inhibitory enzymu syntetazy dihydropterynianowej (DHPS, uczest-
niczącego w syntezie DHF), i jako substraty dla DHPS — prowadząc do powsta-
nia funkcjonalnie defektywnych analogów DHF. Aktywności te wydają się
odzwierciedlać strukturalne podobieństwo pomiędzy cząsteczką sulfonamidu
i kwasu p-aminobenzoesowego (PABA) będącego prekursorem DHF.

Niektóre bakterie wykorzystują zewnętrzne źródło kwasu foliowego i nie są

zatem wrażliwe na działanie sulfonamidów. Większość jednak sama syntetyzuje
ten związek. Oporność na sulfonamidy powstaje łatwo i wynika z: wytwarzania
wyższych stężeń PABA (tym samym zwalczając kompetetywną inhibicję) i/lub
powstania zmutowanej formy DHPS o znacznie obniżonym powinowactwie do
sulfonamidów w porównaniu z PABA.
W obecności sulfonamidów, komórki wrażliwe na te związki rosną jeszcze
przez kilka pokoleń aż do całkowitego wyczerpania zapasu kwasu foliowego.
Sulfonamidy stosuje się do leczenia schorzeń układu moczowego (duża część
leku wydalana jest z moczem). Do najczęściej stosowanych sulfonamidów należą
sulfadiazyna i sulfametazyna.
Trimetoprim, będący pochodną diaminopirydyny, hamuje przekształcenie
DHF do THF, gdyż oddziałuje na enzym reduktazę dihydrofolianową (DHFR).
DHFR występuje we wszystkich komórkach (mikroorganizmów i ludzi), lecz tri-
metoprim hamuje reduktazę bakteryjną nie wpływając w stosowanych dawkach
w znaczący sposób na ludzki DHFR.

386
 Kotrimoksazol (np. Bactrim) jest synergistyczną kombinacją trimetroprimu
i sulfonamidu sulfametoksazolu — dwóch chemioterapeutyków blokujących
odmienne reakcje w tym samym szlaku.

15. 4. 10 Synergistyczne i antagonistyczne działanie antybiotyków

Jeśli dwa antybiotyki równocześnie działające na dany organizm powodują efekt
większy niż każdy z nich osobno, mówimy o ich synergistycznym działaniu.
Kotrimoksazol (sekcja 15. 4. 9) jest jednym z przykładów synergistycznego
działania antybiotyków. Innym jest kombinacja składników A i Β streptogramin
(sekcja 15. 4. 4).
Antagonizm jest odwrotnością synergizmu. Na przykład antybiotyki, które
hamują wzrost (np. chloramfenikol), są antagonistyczne wobec antybiotyków
działających jedynie na komórki rosnące (np. β-laktamy). Inna forma antagoni-
zmu występuje w przypadku tych antybiotyków, które indukują wytwarzanie
enzymów inaktywujących inne antybiotyki. Przykładem jest antagonistyczne
działanie imipenemu i cefoksytyny wobec innych antybiotyków β-laktamowych
(fot. 15. 2).

15. 4. 11 Bakteryjna oporność na antybiotyki

Dlaczego niektóre bakterie nie są podatne na działanie antybiotyków? Pewne
bakterie są oporne, ponieważ nie posiadają struktury będącej celem działania
antybiotyku. Odnosi się to np. do gatunków należących do rodzaju Mycoplasma,
gdyż nie mają one ścian komórkowych są zatem niewrażliwe na działanie peni-
cylin, które wpływają na syntezę peptydoglikanu ściany. Niektóre bakterie mogą
nie przeprowadzać procesu hamowanego przez dany antybiotyk: sulfonamidy
nie będą działać na te bakterie, które uzyskują gotowy kwas foliowy ze swojego
środowiska życiowego. Oporność może również być wynikiem niedopuszczania
antybiotyku do miejsca jego działania. U wielu bakterii gramujemnych błona
zewnętrzna jest nieprzepuszczalna dla pewnych antybiotyków, a u bakterii gra-
mdodatnich, jak i gramujemnych barierą przepuszczalności może być błona
cytoplazmatyczna.
Niektóre bakterie wytwarzają enzymy inaktywujące pewne rodzaje antybio-
tyków. Na przykład wiele szczepów gronkowca wytwarza enzymy inaktywujące
niektóre penicyliny; takie „penicylinazy" są przykładem β-laktamaz (sekcja
15. 4. 1. 2).
Bakterie mogą również nabywać oporność na antybiotyki. Zdarza się to na
skutek mutacji (sekcja 8. 1) lub np. pobrania plazmidu R (sekcja 7. 1). Mutacja
może spowodować taką zmianę w bakteriach, że antybiotyk nie wpływa na nie.
Na przykład, mutacja nadająca oporność na streptomycynę może w taki sposób
zmieniać rybosom, że antybiotyk ten przestaje się do niego wiązać lub nawet gdy
to nastąpi, nie hamuje funkcji rybosomu. Pojedyncza mutacja zwykle nadaje opo-
rność na jeden antybiotyk lub na antybiotyki ściśle spokrewnione mające ten
same cel działania. Oporność na lek izoniazyd, stosowany do zwalczania

387
prątków gruźlicy, może powstawać w wyniku mutacji w jednym z kilku różnych
genów (sekcja 7. 8. 2. 8).
We Francji opisano szczepy Enterobacter aerogenes, bakterii chorobotwórczej
często spotykanej w szpitalach, charakteryzujące się opornością na antybiotyki
spowodowaną zmianami w porynach błony zewnętrznej (sekcja 2. 2. 9. 2) i utratą
kanałów wejściowych dla antybiotyków, w tym cefepimu i innych nowszych
cefalosporyn [Mallea i wsp. (1998) Microbiology 144: 3003-3009].
Plazmidy R i transpozony mogą kodować enzymy inaktywujące antybiotyki
— np. acetylotransferazę chloramfenikolową [O-acetylotransferazy: Murray
i Shaw (1997) AAC 41: 1-6] i/lub β-laktamazy; tego rodzaju geny mogą być
indukowalne (sekcja 7. 8. 5). W komórkach E. coli występuje białko błony cyto-
plazmatycznej ΤΕΤ (kodowane przez transpozon Tn10), które wypompowuje
tetracyklinę do peryplazmy [Thanassi, Suh i Nikaido (1995) JB 177: 998-1007].
W niektórych przypadkach „kaseta genowa" kodująca oporność na antybio-
tyki może na drodze rekombinacji zlokalizowanej (sekcja 8. 2. 2) ulegać insercji do
specyficznej sekwencji DNA — tak zwanego integronu, występującego np.
w plazmidach i transpozonach i nie tylko zawierającego miejsce integracji, lecz
również kodującego integrazę (rekombinazę) niezbędną do tego procesu. [Inte-
grony i kasety genowe: Bennet (1999) JAC 43: 1-4.
Inny mechanizm oporności polega na zwiększonej produkcji jakiegoś meta-
bolitu w celu przezwyciężenia kompetytywnej inhibicji ze strony antybiotyku;
mechanizm taki występuje np. w jednej z form oporności na sulfonamidy (sekcja
15. 4. 9).
W wyjątkowych przypadkach pozorna oporność na antybiotyki może wyni-
kać z nietypowego metabolizowania antybiotyku przez organizm gospodarza.
Przykładem jest brak efektów chemioterapeutycznych w kilku przypadkach kiły,
mimo stosowania odpowiednich dawek penicyliny. Pacjentów tych określano
mianem „szybkich sekretorów penicyliny". W rzadkich przypadkach od pacjen-
tów tych izolowano wrażliwe na penicylinę krętki, które po wszczepieniu króli-
kom powodowały charakterystyczne zmiany chorobowe.
Chociaż w kilku ostatnich dziesięcioleciach wprowadzono do użytku wiele
nowych antybiotyków, towarzyszy temu pojawianie się oporności na niektóre
z nich. Oznacza to ciągłą konieczność produkcji nowych antybiotyków oraz
potrzebę zapobiegania lub opóźniania oporności bakteryjnej powstającej w wy-
niku niewłaściwego stosowania tych leków [artykuł przeglądowy: Neu (1992)
Science 257: 1064-1073]. Jednym z przykładów tego ostatniego problemu jest
powstanie metycylinoopornych szczepów Staphylococcus aureus (tak zwanych
MRSA, ang. methicilin resistant Staphylococcus aureus). Szczepy te, które zwykle
są oporne i na inne antybiotyki β-laktamowe (często również na aminoglikozydy
i makrolidy), są (obecnie) zazwyczaj wrażliwe na wankomycynę i teikoplaninę —
chociaż opisano już kliniczny szczep MRSA charakteryzujący się niskim pozio-
mem oporności na wankomycynę [Hiramatsu i wsp. (1997) JAC 40: 135-136].
W szczepach MRSA wysoki poziom oporności na metycylinę jest kodowany
przez chromosomowy gen mecA: gen ten (wykrywalny na drodze hybrydyzacji
DNA: sekcja 15. 4. 11. 2) koduje nowe białko wiążące penicylinę, zwane PBP 2a
(syn. PBP2'), o masie 78 kDa, które charakteryzuje się niskim powinowactwem
do antybiotyków β-laktamowych. Oporność ta jest tracona w wyniku mutacji

388
w genie mecA lub w genach fem (fem = czynnik niezbędny dla oporności na mety-
cylinę, ang. factor essential for methicillin resistance). Mutacja w operonie femAB
powoduje powstanie niewłaściwych mostków międzypeptydowych w peptydo-
glikanie (rys. 2. 7), które są słabym substratem dla aktywności transpeptydazo-
wej PBP 2a. Ponieważ konstytutywne (metycylinowrażliwe) PBP radzą sobie
lepiej z niewłaściwymi mostkami niż PBP 2a, mutant pozostaje wrażliwy na
metycylinę.
Oporność gronkowca złocistego na metycylinę, nie wynikająca z obecności
funkcjonalnego genu mecA, może być wynikiem nadprodukcji β-laktamaz (sekcja
15. 4. 1. 2), obecności zmutowanych form PBP o niższym powinowactwie do
β-laktamów lub obecności metycylinazy [Berger-Bachi (1994) TIM 2: 389-393].
Wyrażanie się oporności na metycylinę przez gronkowca złocistego jest
złożone, gdyż podlega kontroli przez temperaturę oraz stężenie elektrolitów.
Podłoża hodowlane zazwyczaj zawierają około 4% NaCl i są inkubowane
w 30-35°C. Większość szczepów MRSA charakteryzuje się heteroopornością, to
jest jedynie niewielka część populacji opornej pod względem genetycznym
wykazuje oporność fenotypową. Mechanizm tej heterooporności nie jest do
końca wyjaśniony.
[Genetyka MRSA: Grubb (1998) RMM 9: 1563-162. ]
Innym przykładem bakteryjnej oporności na antybiotyki jest pojawienie się
tzw. gruźlicy opornej na RISE, wywoływanej przez szczepy Mycobacterium tuber-
culosis oporne na różne powszechnie stosowane antybiotyki, w tym ryfampicynę,
izoniazyd, streptomycynę i etambutol.
Dalsze przykłady oporności na antybiotyki to: oporne na penicylinę szczepy
Streptococcus pneumoniae [Appelbaum (1996) Drugs 51 (suplement 1): 1-5];
oporne na tetracyklinę szczepy Neisseria gonorrhoeae i Shigella dysenteriae; oporne
na wankomycynę enterokoki oraz inne bakterie gramdodatnie [Kłoszewska
i Markiewicz (1999) Postępy Biochemii 45: 67-16; przyp, tłum. ]; szczepy Vibrio
cholerae Ol oporne na wiele antybiotyków [Dubbon i wsp. (1997) Lancet 349: 924]
oraz w przypadku pacjentów zarażonych wirusem HIV — szczepy Myco-
bacterium bovis oporne na 11 antybiotyków, wywołujące gruźlicę o wysokiej
śmiertelności [Guerrero i wsp. (1997) Lancet 350: 1738-1742].
Sympozjum Fundacji Ciba (Antibiotic Resistance: Origins, Evolution, Selec-
tion and Spread, Londyn, 16-18 Lipca, 1996) [wydawnictwo John Wiley (1997)]
uchwaliło szereg postulatów:
• Ogólnoświatowy przegląd oporności na antybiotyki.
• Lepiej kontrolowane stosowanie antybiotyków.
Wiązałaby się z tym działania mające zapewnić stosowanie się do zalecanej
chemioterapii, to jest zapewnienie, by właściwe dawki były podawane
w odpowiednim czasie.
• Wprowadzenie nowych antybiotyków dających wybór terapii.
Wybór odpowiedniej chemioterapii jest szczególnie ograniczony w przy-
padku gramdodatnich patogenów opornych na wiele antybiotyków (jak np.
MRSA). Do nowych, potencjalnie przydatnych antybiotyków w walce
z tymi bakteriami należą chinuprystyna/dalfoprystyna (sekcja 15. 4. 4) oraz
oksazolidinony, jak linezolid i eperzolid [Ford i wsp. (1997) TIM 5: 196-200]

389
 — oksazolidinony hamują translację (rys. 7. 9), nie dopuszczając do tworze-
nia kompleksu N-formylometionina-rybosom-mRNA [Swaney i wsp.
(1998) AAC 42: 3251-3255].
• Lepsza kontrola zakażeń w szpitalach.
Przykładem jest niski poziom występowania MRSA w Holandii, co wiązane
jest z polityką ścisłej izolacji zakażonych pacjentów oraz aktywnych badań
przesiewowych i leczenia nosicieli MRSA [patrz np. Vandenbroucke-Grauls
(1998) RMM 9: 109-116].
• Lepsze procedury diagnostyczne.
Należą tu procedury oparte na technikach DNA — np. te, które są stoso-
wane w diagnostyce gruźlicy, dające odpowiedź w kilka godzin, a nie tygo-
dni. Szybka diagnoza (i odpowiednia chemioterapia) sprzyja nie tylko
pacjentowi, ale również społeczności, gdyż może prowadzić do ogranicze-
nia rozprzestrzeniania się choroby (co jest szczególnie istotne w przypadku
patogenów o wielorakiej lekooporności). Równie ważne są procedury
wykorzystujące techniki DNA, ułatwiające wykrywanie lekooporności
patogenów (sekcja 15. 4. 11. 2).
• Stosowanie nowych/ulepszonych szczepionek przeciw pospolitym choro-
bom zakaźnym.
• Zapobieganie chorobom przez szczepienia pomaga unikać stosowania
antybiotyków w przypadku pierwotnych lub wtórnych infekcji. Do obecnie
rozwijanych szczepionek należą skierowane przeciw zapaleniu opon móz-
gowych wywoływanemu przez meningokoki, to jest szczepionki sprzężone
oraz szczepionki skierowane przeciw białkom uczestniczącym w pobieraniu
żelaza (sekcja 11. 4. 2. 1).
Z powodu narastającej oporności na antybiotyki poszukiwane są nowe cele
działania wewnątrz komórki bakteryjnej. Takim nowym celem z komórce E. coli
jest enzym deacetylaza, będący produktem genu lpxC, który jest niezbędny do
biosyntezy lipidu A (sekcja 2. 2. 9. 2) wchodzącego w skład błony zewnętrznej
bakterii gramujemnych. Inhibicja deacetylazy przez pochodne związku
L-573, 655 przejawia się skutecznym działaniem przeciwbakteryjnym [Onishi
i wsp. (1996) Science 274: 980-982]. Ponadto, zahamowanie biosyntezy lipidu
może mieć inne pozytywne skutki, tj.: zwiększenie przepuszczalności błony zew-
nętrznej na inne antybiotyki (np. erytromycyna i wankomycyna) oraz zmniejsze-
nie ryzyka wystąpienia szoku endotoksycznego w trakcie chemioterapii (sekcja
11. 3. 4) [Wyckoff, Raetz i Jackman (1998) TIM 6: 154-159].

15. 4. 11. 1 Testy na antybiotykowrażliwość (tradycyjne)

Można przeprowadzić testy, aby określić podatność patogena na różne antybio-
tyki. Wzór podatności danego szczepu na różne antybiotyki nazywa się antybio-
gramem. Wyniki tego typu testów mogą być pomocne w celu wybrania antybio-
tyków o optymalnej aktywności (sekcja 11. 10).
Częstą formą badania jest test dyfuzji krążkowej. Na płytkę odpowiedniego
podłoża zestalonego agarem wysiewa się czystą hodowlę patogena w taki spo-
sób (często wacikiem do wymazów), aby po inkubacji cała jej powierzchnia była

390
pokryta wzrostem bakteryjnym — tzw. murawką (sekcja 3. 3. 1). Przed inkubacją,
w różnych miejscach na powierzchni płytki umieszcza się małe krążki bibuły
nasączone poszczególnymi antybiotykami. Podczas inkubacji z każdego krążka
antybiotyk dyfunduje do podłoża. Jeśli bakteria jest wrażliwa na dany antybio-
tyk, wokół krążka powstaje strefa zahamowania wzrostu. Metodyka musi być
standaryzowana. Obecność lub wielkość (średnicę) strefy zahamowania można
tylko wtedy właściwie zinterpretować, gdy cała procedura jest standaryzowana
ze względu na rodzaj podłoża, gęstość inokulum na płytce itp. Możliwe reakcje
w teście dyfuzji krążkowej są pokazane w fotografii 15. 1.
Test dyfuzji krążkowej nie nadaje się dla bakterii rosnących powoli (np. Myco-
bacterium tuberculosis), ponieważ antybiotyki uległy zbytniej dyfuzji przed poja-
wieniem się widocznego wzrostu bakterii. Test ten jest skuteczny dla tych bakte-
rii, których wzrost jest widoczny po całonocnej inkubacji.
W teście dyfuzji krążkowej strefa braku wzrostu (mylnie wskazująca na wraż-
liwość) może powstawać, gdy bakteria wytwarza indukowalne enzymy inakty-
wujące antybiotyk — np. w przypadku szczepów Staphylococcus aureus kodu-
jących indukowalną β-laktamazę. Komórki bakteryjne w pobliżu krążka są zabi-
jane zanim wytworzą odpowiednie stężenie enzymu. Te dalej od krążka
doświadczają stopniowo zwiększających się stężeń antybiotyku w miarę jego
dyfundowania do podłoża i w pewnej odległości od niego komórki wyprodu-
kują wystarczająco dużo enzymu, by przeżyć. Komórki te wytworzą normalnej
wielkości lub względnie duże kolonie, wykorzystując substancje odżywcze
niewykorzystane przez zabite komórki w ich pobliżu. Przykład strefy charak-
terystycznej dla inaktywacji enzymatycznej jest przedstawiony na fotogra-
fii 15. 1.
Niektóre testy wykorzystują tabletki lub papierowe czy plastikowe paski
zawierające antybiotyk (fot. 15. 2).
W teście rozcieńczeń bada się zdolność danej bakterii do wzrostu w obecno-
ści różnych stężeń antybiotyku (na podłożu stałym lub w płynnym). Najmniejsze
stężenie antybiotyku całkowicie hamujące wzrost zwane jest minimalnym stęże-
niem hamującym (MIC, ang. minimum inhibitory concentration) tego antybio-
tyku wobec badanej bakterii w danych warunkach. Wartości MIC jakiegoś anty-
biotyku wobec różnych szczepów bakteryjnych mogą być całkiem różne.
Test punktów przełamania (ang. breakpoint) wykorzystuje opisaną wyżej
technikę rozcieńczeń w celu określenia, czy MIC wobec danych szczepów jest
poniżej lub powyżej pewnego wybranego stężenia antybiotyku — co pozwala na
określenie, które z tych szczepów są „oporne", a które „wrażliwe". Wyboru kon-
kretnego stężenia dokonuje się na podstawie czynników klinicznych, farmakolo-
gicznych i mikrobiologicznych. Stężenia stosowane w testach tego typu nie są
takie same we wszystkich krajach.
Test Ε (fot. 15. 2) jest testem dyfuzyjnym określającym MIC. Jedna strona
plastikowego paska (ta, która wchodzi w kontakt z podłożem) powleczona jest
gradientem stężenia antybiotyku, podczas gdy na stronie odwrotnej (górnej)
naniesiona jest skala MIC. Po inkubacji należy odczytać najmniejsze stężenie na
skali, przy którym następuje zahamowanie wzrostu.
[Developments in antimicrobial susceptibility testing: Brown (1994) RMM 5:
65-75].

391
Oporność. Brak strefy zahamowania: Bakterie rosną przy samym krążku.
Oporność pośrednia. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka.
Wrażliwość. Szeroka strefa wokół krążka wolna od wzrostu.
Inaktywacja enzymatyczna. Wąska strefa braku wzrostu wokół krążka. W przeciwieństwie do strefy
„pośredniej", brzeg strefy jest ostro zarysowany i składa się na niego nieco silniejszy wzrost w postaci
pewnych kolonii normalnej wielkości lub większych niż pozostałe (wytłumaczenie podano w sekcji
15.. 4. 11. 1).
Działanie selektywne. Taki wynik otrzymuje się, gdy inokulum zawiera dwa szczepy różniące
się podatnością na dany antybiotyk. W pobliżu krążka stężenie antybiotyku jest na tyle duże, że
hamuje wzrost obydwu szczepów (wąska strefa wolna od wzrostu). W dalszej odległości od krążka
(mniejsze stężenie antybiotyku) wzrost jednego ze szczepów zostaje zahamowany, podczas gdy
drugi rośnie.
Porównanie z kontrolą. „Półstrefa" otrzymana ze szczepem kontrolnym (po jednej stronie krążka)
jest naprzeciwko „półstrefy" dla szczepu badanego (po przeciwnej stronie krążka). By to uzy-
skać, szczepy badany i kontrolny wysiewa się na odrębne połówki szalki, a krążek kładzie się między
nimi.
Mutanty oporne. Inokulum zawierało niewielki procent komórek zmutowanych zdolnych do two-
rzenia kolonii w warunkach hamujących wzrost komórek dzikich. Mutanty zwykle charakteryzują
się opornością na antybiotyk. Istnieje jednak pewien typ mutantów rosnących jedynie w obecności
danego antybiotyku i mutanty te będą również tworzyć kolonie w strefie wolnej od wzrostu innych
komórek bakteryjnych. Przykładem są mutanty zależne od streptomycyny, które mają takie zmiany
w rybosomach, że dopiero w obecności streptomycyny następują przemiany konformacyjne pozwa-
lające na ich prawidłowe funkcjonowanie.
Zakażenia. Inokulum składa się z mieszaniny organizmów, z których przynajmniej jeden jest oporny
na badany antybiotyk.
Synergizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. Strefa zahamowania wzrostu jest większa niż
suma efektów każdego z antybiotyków z osobna. Inaczej mówiąc, działanie tych antybiotyków jest
synergiczne.
Antagonizm. Dwa krążki zawierają różne antybiotyki. W tym przypadku jeden z antybiotyków
hamuje aktywność drugiego. Przykłady antagonizmu podano na fot. 15. 2.
Zdjęcie uzyskano dzięki uprzejmości Oxoid, Basingstoke, WB.

392
 15. 4. 11. 2 Wykrywanie oporności na antybiotyki za pomocą technik DNA
- „genotypowanie"
Wrażliwość na antybiotyki dla wielu patogenów można łatwo i szybko określić
korzystając z tradycyjnych metod (sekcja 15. 4. 11. 1). Metody te jednak nie są
właściwe w przypadku patogenów wolno rosnących (takich jak Mycobacterium
tuberculosis). Ponadto, metody te mogą nie ukazywać mechanizmu oporności na
dany antybiotyk, która to informacja może być konieczna do zastosowania opty-
malnej chemioterapii. Wskażemy tu możliwość wykorzystania technik DNA do
szybkiej detekcji antybiotykooporności u Mycobacterium tuberculosis oraz Staphy-
lococcus aureus: metodyka ta może być wykorzystywana również w odniesieniu
do innych patogenów.

Mycobacterium tuberculosis
Oporność na powszechnie stosowane leki jest wynikiem pewnych mutacji, które
można wykryć stosując techniki DNA. Oporność na izoniazyd powstaje w wy-
niku mutacji w jednym z kilku genów (np. ahpC, katG), podczas gdy oporność na
ryfampicynę jest zwykle wynikiem mutacji w pojedynczym genie rpoB, jest
zatem łatwiejsza do wykrycia.
Gen rpoB koduje podjednostkę β polimerazy RNA (sekcja 7. 5). W szczepach
dzikich (wrażliwych na ryfampicynę) ryfampicyna wiąże się do podjednostki β
hamując aktywność enzymu i blokując syntezę RNA, co prowadzi do śmierci
komórki. Pewne mutacje w rpoB powodują powstanie zmienionej podjednostkiβ,
która nie wiąże ryfampicyny. Zmieniony enzym nie traci aktywności i komórka
staje się oporna na antybiotyk.
Mutacje można wykryć na drodze: 1) analizy SSCP, 2) dideoksy „odcisku
palca" lub 3) testu sond liniowych. Każda z wymienionych metod rozpoczyna się
od amplifikacji sekwencji DNA w genie rpoB za pomocą techniki PCR (sekcja
8. 5. 4). Produkty PCR uzyskane dla badanych szczepów są następnie porówny-
wane ze szczepem dzikim.
1. Analiza SSCP. W metodzie tej (patrz rys. 8. 20c) technika PCR jest wykorzy-
stana do amplifikacji sekwencji (kodon 435 -» kodon 458) w genie rpoB, ponie-
waż właśnie ta sekwencja jest miejscem częstych mutacji nadających komórce
oporność, jest zatem dobrym celem do analizy SSCP. Amplikony dwunicio-
wego DNA są przed elektroforezą poddawane denaturacji. Wykorzystując
wspomnianą wyżej sekwencję Whelen i wsp. [(1995) JCM 33: 556-561] po-
prawnie zidentyfikowali 20 na 20 szczepów wrażliwych na ryfampicynę.
W kolejnym szczepie, opornym na ryfampicynę, analiza sugerowała mutację
powodującą zastąpienie seryny leucyną, co zostało potwierdzone po otrzyma-
niu sekwencji nukleotydowej amplikonu.
Ciche mutacje (ryc. 8. 1f) mogą przeszkadzać w analizie SSCP. Tak więc
w wyniku cichej mutacji nić DNA ze szczepu wrażliwego na ryfampicynę
wykazywała taką samą konformację, jak nić ze szczepu opornego [Kim i wsp.
(1997) JCM 35: 492-494]. Tego rodzaju fałszywie dodatnie wyniki mogą być
również powodowane przez mutacje delecyjne w rpoB.
2. Metoda dideoksy „odcisku palca" (ddF, ang. dideoxy fingerprinting) (rys. 15. 6)
łączy cechy metody dideoksy sekwencjonowania (sekcja 8. 5. 6), PCR i SSCP.

393
Górna część fotografii. Badanie podatności pięciu szczepów Staphylococcus aureus na metycylinę
(penicylinę oporną na wiele β-laktamaz). Najpierw każdy ze szczepów wysiano na płytkę tworząc
szerokie równoległe prążki. Na prążki te nałożono, pod kątem prostym, pasek papieru nasycony
metycyliną. Po inkubacji (np. 18 godz. w 30°C) odczytuje się wynik. W podanym przykładzie szczepy
pierwszy i czwarty są oporne, pozostałe zaś wrażliwe.
Część środkowa. Test Ε (patrz sekcja 15. 4. 11. 1). W tym przypadku badano reakcję szczepu Pseudomo-
nas aeruginosa na cztery różne antybiotyki. Dla każdego z tych antybiotyków wartość MIC odczytuje
się w miejscu przecięcia skali przez strefę braku wzrostu. Test Ε jest okazał się równie dokładny jak
inne metody (w tym metod stosujących rozcieńczenia)[Baker i wsp. (1991) JCM 29: 533-538]. Od tego
czasu wykazano skuteczność Testu Ε dla wielu innych bakterii, w tym dla Helicobacter pylori [Piccolo-
mini i wsp. (1997) JCM 35: 1842-1846].

394
 Dla każdej próbki przeprowadza się procedurę polegającą na amplifikacji
pewnej sekwencji w rpoB i użyciu otrzymanych amplikonów jako matryc
w zmodyfikowanej formie sekwencjonowania wykorzystującej cykle tempera-
turowe (jak w technice PCR). Pozwala to na zastosowanie dwuniciowych
amplikonów, które w wyższej temperaturze tworzą matryce jednoniciowego
DNA. W przeciwieństwie do zwykłego sekwencjonowania (rys. 8. 23) wyko-
rzystywany jest tylko jeden rodzaj dideoksynukleotydu. Ten sam ddNTP jest
stosowany dla każdego szczepu, co pozwala na porównanie otrzymanych
wyników. W rysunku 15. 6 dla każdego szczepu zastosowano ddG.
Po sekwencjonowaniu przeprowadza się elektroforezę w żelu niedenatu-
rującym (tak jak w SSCP) w celu wykrycia mutacji. Przejawiają się one np.
w postaci zmienionej ruchliwości elektroforetycznej produktów, co jest wyni-
kiem zmian w wewnątrzniciowym parowaniu zasad. Mutacje mogą również
być widoczne w postaci zmian w liczbie rodzajów (wielkości) produktów
w danej reakcji. Zatem danego produktu jest mniej lub więcej, gdy w wyniku
mutacji zmniejsza się lub zwiększa liczba miejsc zakończenia łańcucha
w (zmutowane)) nici matrycowej. Miejscem zakończenia łańcucha jest zasada
komplementarna do ddNTP w danej reakcji.
Femlee i wsp. [(1995) JCMM 33: 1617-1623] porównali metodę ddF z SSCP
w celu zbadania występowania oporności na ryfampicynę u M. tuberculosis.
Doszli oni do wniosku, że metoda ddF, z powodu lepszej informacji opartej
na sekwencji, łatwiej różnicuje między mutacjami cichymi a tymi, które nadają
komórce oporność. (Interpretacja wyników ddF ułatwiona jest dzięki temu, że
wiele częstych mutacji prowadzących do oporności zostało zmapowanych,
tzn. znane są ich dokładne szczegóły — zmiana zasad i lokalizacja. )
Test sond liniowych. Amplikony z rejonu genu rpoB podatnego na imitowa-
nie (patrz powyżej) — zwane tu rejonem oporności — są denaturowane do
produktów jednoniciowych, które reagują z szeregiem sond immobilizowa-
nych na membranie. Niektóre z tych sond odpowiadają sekwencjom wew-
nątrz rejonu oporności w typie dzikim. Sekwencje sond częściowo zachodzą
na siebie, tak że razem pokrywają cały rejon oporności typu dzikiego. Produk-

Dolna część. Badanie wykorzystujące tabletki. Neo-Sensitabs to tabletki zawierające antybiotyk. Są

one barwne, by ułatwić identyfikację i większość z nich jest stabilna w temperaturze pokojowej przez
przynajmniej 4 lata. Neo-Sensitabs są standardowo stosowane do badania podatności bakterii na
antybiotyki w Danii, Holandii, Belgii, Norwegii, Finlandii oraz również w kilku innych krajach.
Zbadano podatność szczepu Pseudomonas aeruginosa na kilka antybiotyków β-laktamowych: peni-
cyliny — piperacylinę (1) i tikarcylinę (2); cefalosporyny — cefsulodyna (3), cefotaksym (4), ceftria-
kson (5), cefalotyna (6) i cefmandol (7); imipenem — karbapenem (9) i monobaktam — aztreonam
(10). Tabletka 8 zawiera cefoksytynę, która należy do cefamycyn (7-alfa-metoksycefalosporyn). Grupa
7-alfa-metoksy charakteryzuje się obniżoną aktywnością przeciwbakteryjną, lecz wyższą opornością na
β-laktamazy. [Cefoxitin (current uses): Goodwin (1995) RMM 6: 146-153].
Zwróć uwagę na antagonizm między imipenem a penicyliną i aztreonamem. Imipenem zaindu-
kowal syntezę β-laktamaz w komórkach inokulum — imipenem jest oporny na ich działanie, podczas
gdy penicylina i aztreonam są wrażliwe. Zwróć również uwagę na oporność P. aeruginosa na wiele z
testowanych antybiotyków, w tym na cefoksytynę.
Zdjęcie testu z metycyliną otrzymano dzięki uprzejmości Mast Diagnostics Ltd, Bootle, Merseyside,
WB. Zdjęcie testu Ε dzięki uprzejmości dr Carolyn Baker, Centers for Disease Control, Atlanta, USA.
Zdjęcie Neo-Sensitabs — dzięki uprzejmości A/S ROSCO, Taastrup, Denmark

395
Początkowo PCR służy do amplifikacji specyficznej sekwencji celowej w każdej badanej próbce DNA.
W schemacie DNA z dwóch zmutowanych szczepów (B i C) porównywany jest z DNA ze szczepu
dzikiego (A).
Amplikony otrzymane dla każdego szczepu służą jako matryce w zmodyfikowanej formie sek-
wencjonowania dideoksy wykorzystującej tylko jedną mieszaninę reakcyjną (zamiast czterech)
i w której może stosowany być dowolny ddNTP. W schemacie stosowana jest ddG. Mieszanina
reakcyjna poddana jest cyklom temperatury jak w procedurze PCR (np. 30 cykli), co pozwala na uży-
cie dwuniciowych amplikonów jako substratów i uniknięcie potrzeby stosowania matryc jednonicio-
wego DNA. Stosowany jest tylko jeden typ primera, który wiąże się do i wydłuża tylko jedną specy-
ficzną nić amplikonu.
Produkty reakcji sekwencjonowania dideoksy są badane za pomocą elektroforezy w niedenatu-
rującym żelu. Przed elektroforezą produkty i matryce są oddzielane przez krótkie podgrzanie
i schłodzenie w buforze do próbek zawierającym czynnik denaturujący (np. formamid). Produkty ze
wszystkich trzech szczepów są porównywane w osobnych ścieżkach na tym samym żelu. Na sche-
macie fragmenty poruszają się w dół strony, tzn. najmniejsze fragmenty są najniżej.
W szczepie A, każdy produkt ma sekwencję typu dzikiego, a jego długość i konformacja są
odzwierciedlone położeniem odpowiedniego prążka na żelu.
W szczepie B, mutacja C —> Τ (w pobliżu jednego z końców sekwencji celowej) spowodowała
utratę miejsca terminacji łańcucha. W konsekwencji, w przypadku tego szczepu brakuje najdłuższego
produktu, który jest widoczny dla szczepu A, i na żelu brak odpowiedniego prążka dla tego
produktu. Prążek dla pełnego, najdłuższego produktu w wypadku szczepu Β pokazany jest nato-

396
 ty reakcji PCR z badanych dzikich szczepów zwiążą się ze wszystkimi son-
dami, podczas gdy produkty uzyskane ze szczepów niosących mutacje w rejo-
nie oporności nie zwiążą się przynajmniej z jedną z sond, ponieważ warunki
hybrydyzacji są tak ściśle dobrane (sekcja 8. 5. 4).
Inne sondy odpowiadają sekwencjom zmutowanym w rejonie oporności. Pro-
dukty PCR ze szczepów zawierających jakiekolwiek często występujące mutacje
zwiążą się z co najmniej jedną z tych sond.
Mutacje są zatem wykrywane na podstawie wzoru wiązania między jednoni-
ciowymi produktami oraz zestawami sond ze szczepów dzikich i znanych
mutantów. Hybrydyzacja do jakiejkolwiek sondy jest wykrywana przez dodanie
odczynników zmieniających barwę.
Technika sond liniowych opisana jest na rysunku 15. 7.
Badania De Beenhouwera i wsp. [(1995(TLD 76: 425-430] wykazały, że
wyniki testu sond liniowych były w pełni zgodne z konwencjonalnymi testami
w 65 z 67 przypadków szczepów pozytywnych. Dwa uzyskane fałszywie
negatywne wyniki mogły być wynikiem mutacji na zewnątrz rejonu oporności
lub istnienia innego mechanizmu oporności.

Staphylococcus aureus
W przypadku S. aureus wysoki poziom oporności na metycylinę jest często
powodowany obecnością genu mecA (MRSA, sekcja 15. 4. 11). Wykazywanie opor-
ności częściej polega na wykrywaniu mecA niż na wykrywaniu mutacji.
Wysoki poziom oporności (powodowany przez mecA) jest ważny z klinicz-
nego punktu widzenia: infekcje wywoływane przez te szczepy często wymagają
stosowania wankomycyny, gdyż jest to jeden z nielicznych antybiotyków sku-
tecznych wobec mecA-MRSA i jego użycie powinno być ograniczane, by uniknąć
pojawienia się szczepów opornych. MRSA nie związany z mutacją w genie mecA
(sekcja 15. 4. 11) jest skutecznie zwalczany za pomocą β-laktamów [np. Chambers
i wsp. (1989) AAC 33: 424-428], dlatego odróżnienie oporności związaną z mecA
od innych typów metycylinooporności jest tak ważne.

miast w położeniu hipotetycznym nieco różniącym się od pełnego produktu szczepu A. Tego rodzaju
zmiana położenia może nastąpić, jeśli mutacja C —» Τ w szczepie Β spowodowałaby powstanie
pełnego produktu o zmienionej konformacji/ruchliwości. Inne produkty dla szczepu Β byłyby wolne
od wpływów takiej mutacji (która znajduje się poza tymi produktami) i zatem wszystkie prążki
miałyby takie same położenie jak w przypadku szczepu A. Gdyby mutacja (C -» T) była bliżej miejsca
wiązania primera, wtedy albo jeden, albo inne z produktów zostałyby zmienione.
W szczepie C, mutacja G -> C wprowadziłaby nowe miejsce C do sekwencji docelowej, to jest
nowe miejsce terminacji łańcucha w reakcji ddG. Powoduje to powstanie dodatkowego produktu, co
przedstawiono w postaci dodatkowego prążka na żelu. W przypadku szczepu C prążki odpowia-
dające produktowi o pełnej długości i najdłuższemu produktowi są pokazane w hipotetycznych
położeniach różniących się od odpowiadających im produktów dla szczepu A. Ten typ zmiany jest
możliwy, ponieważ pozycja mutacji G -> C w matrycy jest tego typu, że może powodować zmianę
w konformacji/ruchliwości tych dwóch produktów.
Jest więc jasne, że mutacje inne niż dodające lub odejmujące zasadę kończącą łańcuch nie wpłyną
na liczbę prążków na żelu. Jednakże, mutacje takie można wykryć, jeśli wpływają na konforma-
cję/ruchliwość jakiegokolwiek produktu, w którym występują.

397
(a) Rejon oporności w genie rpoB M. tuberculosis, pokazujący te części pokryte przez każdą z pięciu
sond typu dzikiego (S1-S5) i czterech sond z mutantów (R2, R4a, R4b i R5). Sondy R4a i R4a zawierają
różne mutacje w tym samym locus. Mutacje pokryte przez sondy „R" są wskazane strzałkami. Są to:
(R2) kwas asparaginowy -» walina w kodonie 516, (R4a) histydyna -» tyrozyna w kodonie 526, (R4b)
histydyna -» kwas asparaginowy w kodonie 526 oraz (R5) seryna -» leucyna w kodonie 531 (kodony
zgodne z nomenklaturą dla E. coli). Każdy rodzaj sondy jest immobilizowany w postaci osobnego
prążka na pasku nitrocelulozy, jak przedstawiono w części (b).
Dla danego szczepu sekwencja docelowa (o długości około 250 pz) jest amplikowana za pomocą
PCR i koniec 5' jednego ze starterów jest znakowany biotyną. Amplikony (dwuniciowy DNA) są
denaturowane, a po dodaniu roztworu hybrydyzacyjnego i badanego paska całość inkubuje się
w dokładnie 62°C, z wytrząsaniem. Ten etap pozwala na specyficzną hybrydyzację między sondami
i biotynylowanym jednoniciowym DNA z amplikonów (etap czasem zwany „odwróconą hybrydy-
zacją", gdyż to sondy są immobilizowane).

398
 Gen mecA można wykryć za pomocą techniki PCR, stosując odpowiednie
startery. Geha i wsp. [(1994) JCM 32: 1768-1772] zidentyfikowali w ten sposób
40 szczepów mecA-dodatnich wśród 228 badanych szczepów. Wszystkie szczepy
z genami mecA wykazywały oporność fenotypową. Cztery spośród pozostałych
188 szczepów mecA ujemnych również wykazywały oporność, która wynikała
z wysokiej nadprodukcji β-laktamazy.
Jak wspomniano w sekcji 15. 4. 11, szczepy mecA niosące mutacje/em również
mogą się charakteryzować fenotypową opornością na metycylinę.

15. 4. 12 Efekt poantybiotykowy

Efekt poantybiotykowy (PAE, ang. post-antibiotic effect) odnosi się do zahamo-
wania wzrostu bakteryjnego (w typowych przypadkach przez kilka godzin) po
krótkotrwałym kontakcie bakterii z niektórymi czynnikami przeciwbakteryjnymi
— w tym aminoglikozydami, β-laktamami, 4-chinolonami, makrolidami i strep-
tograminami. PAE jest czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę rozpatrując
dawkę tych antybiotyków i częstość ich podawania. W warunkach klinicznych
PAE może być korzystne, gdy zbiega się z częstym podawaniem antybiotyku
w małych awkach. Kolejną jego zaletą jest to, że w okresie zahamowania wzrostu
bakterie są łatwiej usuwane przez układ immunologiczny.
Badania dotyczące poszczególnych bakterii i antybiotyków sugerują, że są
różne mechanizmy powstawania PAE [Gottfredsson i wsp. (1995) AAC 39:
1314-1319].
Z punktu widzenia praktyki klinicznej poantybiotykowy efekt sub-MIC
(PA-SME, ang. post-antibiotic sub-MIC effect) może mieć ważniejsze znaczenie
niż PAE (patrz np. MacKenzie, Milne i Gould JAC 43: 71-77].

15. 4. 12 Aktywność antybiotyków wewnątrz komórek eukariotycznych

Niektóre bakterie patogenne (np. Listeria monocytogenes, Mycobacterium spp.
i nawet Staphylococcus aureus) mogą przetrwać i czasem nawet rosnąć wewnątrz
fagocytów. Z tego powodu warto wiedzieć, czy antybiotyk podawany pacjen-
towi może penetrować do wnętrza fagocytów i czy działa na bakterie wewnątrz
fagocytów. Ten aspekt aktywności antybiotykowej został omówiony przez Pas-
cuala [(1995) RMM 6: 228-235] i niektóre z jego wniosków przedstawiono
w tabeli 15. 1.

Nie związany DNA jest odmywany, a następnie dodaje się koniugat — streptawidyna-alkaliczna
fosfataza, który wiąże się do biotyny na DNA związanym przez sondę. Po przemyciu, dodawany jest
chromogen, który ulega przecięciu przez alkaliczną fosfatazę, z wytworzeniem purpurowego precy-
pitatu — w ten sposób znacząc każdą sondę, która związała amplikony.
Wyniki dla szczepów wrażliwych na ryfampicynę są następujące: pozytywne (purpurowe) bar-
wienie prążków S1-S5, brak zabarwienia prążków „R". Brak zabarwienia jednej (lub więcej) sond S
oznacza obecność mutacji. Jeśli dana mutacja należy do, jednej z czterech często występujących,
zawartej w sondach „R", to odpowiednia sonda ulegnie wybarwieniu. Na przykład, częsta mutacja
seryna -» leucyna w kodonie 531 spowoduje wybarwienie R5 i brak wybarwienia S5.

389
 Badania in vitro dotyczące wrażliwości Borrelia burgdorferi (patogena wy-
wołującego boreliozę) wskazują, że wewnątrz komórek eukariotycznych B. burg-
dorferi chroniony jest przed penicyliną i ceftriaksonem, ale nie przed doksycyliną
czy erytromycyną. Wewnątrzkomórkowe trwanie tego patogena może zatem
tłumaczyć nieskuteczność chemioterapii w kilku opisanych przypadkach [Brou-
cjui, Badiaga i Raoult (1996) AAC 40: 1552-1554].
 ROZDZIAŁ

16
Identyfikacja i klasyfikacja bakterii

16. 1 Identyfikacja
W jaki sposób identyfikujemy bakterię? Zwykle najpierw otrzymujemy jej czystą
kulturę (sekcja 14. 6), a następnie, po wykonaniu pewnych obserwacji i testów,
sprawdzamy, czy możemy ją zaliczyć do znanych gatunków. Bywa to dość cza-
sochłonne. Do celów medycznych i weterynaryjnych (gdzie szybka diagnoza
może mieć decydujące znaczenie) wprowadza się obecnie szybkie metody
identyfikacji, wykorzystywane także w przemyśle spożywczym. Metody szyb-
kiej identyfikacji na podstawie kwasów nukleinowych zostały omówione
w sekcji 16. 1. 6.
W rozdziale tym przedstawiono również metody tradycyjne, gdyż są one
nadal powszechnie wykorzystywane i dobrze ilustrują cechy pozwalające roz-
różnić bakterie.
Stosując testy tradycyjne musimy dysponować czystą kulturą. W hodowli
zanieczyszczonej (mieszanina organizmów) zachowanie jednego organizmu
może się różnić od zachowania innego — niemożliwe jest więc uzyskanie jedno-
znacznych wyników. Jednak nawet gdy stosujemy czystą kulturę, zdarza się, że
cechy badanej bakterii nie w pełni zgadzają się z opisanymi w podręczniku.
Może tak być, na przykład, jeśli jakaś mutacja (sekcja 8. 1) zmieni jedną lub więcej
typowych cech danej bakterii. Również plazmid (sekcja 7. 1) może nadać bakterii
właściwości nietypowe dla gatunku. Przyczyną uzyskania niejednoznacznych
wyników bywają też nieznaczne zmiany metod i/lub materiałów wykorzy-
stanych w samych testach.
Zasadniczo w tradycyjnym postępowaniu porównuje się cechy nieznanego
organizmu z cechami pewnej liczby znanych i nazwanych gatunków, aż się go
dopasuje do któregoś z nich. Reguła jest więc dość prosta, ale w praktyce rodzi
się pytanie, jakie kryteria zastosować w danym przypadku, i czy rzeczywiście
musimy porównywać badany mikroorganizm z tysiącami innych, znanych
gatunków bakterii? Źródło pochodzenia często wskazuje nam (wraz z wynikami
kilku prostych testów i pewnymi obserwacjami), z jakim organizmem mamy do

401
czynienia, albo przynajmniej zawęża poszukiwania do jednej z głównych grup
bakterii. Na przykład, jeśli bakteria pochodzi ze ścieków i jest gramujemną,
ruchliwą pałeczką, o metabolizmie względnie fermentacyjnym, bakteriolog
pomyśli natychmiast o rodzinie Enterobacteriaceae, gdyż zawiera ona wiele
bakterii tego typu, a niektóre z nich zwykle występują w ściekach. Identyfikacji
na poziomie gatunku dokonuje się przez porównanie cech nieznanego organi-
zmu z właściwościami rodzajów i gatunków rodziny Enterobacteriaceae.
Oczywiście identyfikacja jest znacznie łatwiejsza, jeśli bakteriolog wie, jakiego
typu organizmy mogą być w danym środowisku oraz zna główne cechy rozróż-
niające rodziny, rodzaje i gatunki powszechnie występujących bakterii. Tego
typu informacje zostały przedstawione w Aneksie.
Na wstępie bada się wymienione niżej cechy, gdyż mają wielką wartość róż-
nicującą. Każda z nich pomaga wykluczyć jedną lub więcej głównych grup
bakterii. Są to: 1) wyniki pewnych barwień, a w szczególności barwienia metodą
Grama (sekcja 14. 9. 1); 2) morfologia komórki (ziarniak, pałeczka/laseczka, itp. );
3) ruchliwość; 4) zdolność do tworzenia endospor; 5) zdolność do wzrostu
w warunkach tlenowych i/lub beztlenowych; 6) zdolność do wytwarzania
enzymu katalazy. Wszystkie te cechy są jednymi z najłatwiejszych do zbadania.

16. 1. 1 Wstępne obserwacje i testy

16. 1. 1. 1 Różne metody barwienia

Rozmaz (sekcja 14. 9) przygotowany z czystej kultury barwi się na ogół metodą
Grama (sekcja 14. 9. 1). Jeśli zdolność do wytwarzania otoczki jest ważną cechą
różnicującą, wykonuje się barwienie otoczek (sekcja 14. 9. 3).

16. 1. 1. 2 Morfologia
Morfologię komórek określa się oglądając pod mikroskopem rozmaz wybar-
wiony np. metodą Grama. Można zastosować prostsze barwienie traktując pre-
parat (po utrwaleniu przez ogrzewanie) przez jedną minutę błękitem metyleno-
wym lub fuksyną karbolową. Następnie ogląda się go zwykle pod mikroskopem
z obiektywem immersyjnym (całkowite powiększenie około 1000x), chociaż
komórki niektórych gatunków (np. Bacillus megaterium) są dobrze widoczne przy
użyciu zwykłych obiektywów o dużym powiększeniu (całkowite powiększenie
około 400x).

16. 1. 1. 3 Zdolność do ruchu

Zdolność do ruchu (sekcja 2. 2. 15. 1) można często określić badając pod mikrosko-
pem preparat „w kropli wiszącej" (rys. 16. 1). Nawet stosując preparat niewybar-
wiony i zwykły mikroskop (z jasnym polem), można zobaczyć, czy bakterie
poruszają się. Jednak widać je wyraźniej w mikroskopie z ciemnym polem lub
z kontrastem fazowym. Zdolność do ruchu należy odróżnić od ruchów Browna
— nieznacznych, przypadkowych ruchów wykazywanych przez każdą cząstkę

402
(a) Na czystym szkiełku nakrywkowym umieszcza się kroplę hodowli zawierającej żywe, niewybar-
wione bakterie, (b) Na szkiełku podstawowym przyczepia się krążek z plasteliny. (c) Szkiełko
to odwraca się i przyciska do szkiełka nakrywkowego, (d) Całość odwraca się i ogląda pod mikro-
skopem.

o wielkości około 1 μm (lub mniejszej) znajdującą się w podłożu płynnym. Ruchy

Browna (widoczne np. w zawiesinach koloidalnych) są wywołane bombardowa-
niem obserwowanych cząstek przez cząsteczki płynu.
O zdolności danego organizmu do ruchu można czasem wnioskować ze spo-
sobu jego wzrostu na podłożach stałych: gatunki ruchliwe mają tendencję do
wzrostu na zewnątrz od miejsca pierwotnego posiewu, gdyż mogą pływać
w cienkiej warstewce wilgoci na powierzchni pożywki.

16. 1. 1. 4 Tworzenie endospor

Stosunkowo mało bakterii wytwarza endospory (sekcja 4. 3. 1). Jeżeli taką bakterię
hoduje się przez kilka dni lub tydzień na podłożu stałym, można zwykle wykryć
endospory, stosując specjalny typ barwienia („barwienie spor"). Jest ono podob-
ne do barwienia Ziehl-Neelsena (sekcja 14. 9. 2), ale do odbarwienia używa się
w nim np. etanol. Endospory zatrzymują barwnik, natomiast komórki wegeta-
tywne odbarwiają się. Można je następnie kontrastowo dobarwić.
Endospory można też wykryć metodą pośrednią, ogrzewając hodowlę do
80°C przez 10 minut. Większość typów komórek wegetatywnych zostaje zabita,
zaś endospory zwykle przeżywają takie postępowanie. Jeżeli po posianiu świe-
żego podłoża tak potraktowaną hodowlą uzyskamy wzrost, będzie to świad-
czyło o obecności endospor.
Kształt endospory i jej położenie w komórce to cechy wykorzystywane nie-
kiedy w identyfikacji. Badania w tym przypadku najlepiej przeprowadzać
w mikroskopie z kontrastem fazowym (sekcja 14. 10. 2, rys. 14. 9), stosując przyży-
ciowy, mokry preparat, pod szkiełkiem nakrywkowym. W takim preparacie
komórki macierzyste zawierające spory nie ulegają skurczeniu, jak to się dzieje
w przypadku rozmazów utrwalanych przez ogrzewanie. Łatwiej więc można
określić położenie spory, którą widać jako jasne ciało (owalne lub okrągłe w za-
leżności od gatunku) z ciemnym brzegiem.
Spory można odróżnić od innych inkluzji wewnątrzkomórkowych poprzez
barwienie różnicujące. Na przykład granule PHB (sekcja 2. 2. 4. 1), ale nie endo-
spory, można wybarwić takimi barwnikami jak czerń Sudanowa B.

403
 16. 1. 1. 5 Wzrost tlenowy/beztlenowy

Łatwo można sprawdzić, czy dany organizm jest tlenowcem, beztlenowcem lub
względnym beztlenowcem (sekcja 3. 1. 6) hodując go w warunkach tlenowych
i beztlenowych (sekcja 14. 7).

16. 1. 1. 6 Wytwarzanie katalazy

Katalaza jest enzymem zawierającym żelazo, wytwarzanym przez większość

bakterii tlenowych. Unieszkodliwia ona nadtlenek wodoru (H2O2) powstający
w czasie metabolizmu tlenowego, katalizując jego rozkład do wody i tlenu. Test
na wykrycie katalazy jest wykorzystywany do stwierdzenia obecności enzymu
w danym szczepie bakterii. Bakterie poddaje się działaniu nadtlenku wodoru,
a pojawienie się bąbelków gazu (tlenu) świadczy o obecności enzymu. W trady-
cyjnej formie tego testu odrobinę hodowli przenosi się ezą do kropli nadtlenku
wodoru znajdującej się na szkiełku. W przypadku dodatniej reakcji pękające
pęcherzyki gazu powodują powstanie aerozolu (sekcja 14. 1). Dzięki zastosowa-
niu metody autora tej książki (rys. 16. 2) można uniknąć tego problemu.
Niektóre bakterie (np. pewne szczepy Lactobacillus i Enterococcus (Streptococ-
cus) faecalis) wytwarzają pseudokatalazę, enzym nie zawierający żelaza., zacho-
wujący się jak katalaza.
Jeżeli do testu używa się bakterii hodowanych na agarze z krwią (sek-
cja 14. 2. 1), należy uważać, by nie pobrać erytrocytów (krwinek czerwonych),
które zawierają katalazę, przez co można uzyskać fałszywy wynik dodatni.

16. 1. 2 Obserwacje dodatkowe i testy metaboliczne („biochemiczne")

Gdy poszukiwania zostały ograniczone do jednej lub kilku rodzin, bakteriolog
wykonuje pewne proste testy „biochemiczne", które pozwalają rozróżnić rodzaje
i gatunki bakterii na podstawie odmienności metabolicznych. Na przykład,
dzięki odpowiedniemu testowi można rozróżnić gatunki, które fermentują (bądź
nie) dany węglowodan, albo które wytwarzają (bądź nie) określony produkt,
metabolizując dany substrat. Niżej opisano kilka z wielu testów często przepro-
wadzanych w laboratoriach bakteriologicznych, niektóre w formie mikrometod
(sekcja 16. 1. 3).

16. 1. 2. 1 Test na obecność oksydazy

Ten test wykrywa szczególny typ łańcucha oddechowego (sekcja 5. 1. 1. 2), tj. taki,
który zawiera końcowy cytochrom c i związaną z nim oksydazę. Bakterie mające
taki właśnie łańcuch mogą utleniać pewne odczynniki, jak odczynnik oksyda-
zowy Kovacsa (1% dichlorowodorek tetrametylo-p-fenylodiaminy). Elektrony są
przenoszone z tego związku na cytochrom c, a następnie poprzez oksydazę na
tlen. Utleniony w ten sposób odczynnik staje się intensywnie fioletowy. W teście
mały kawałek bibuły filtracyjnej zwilża się odczynnikiem Kovacsa, a następnie
rozprowadza się na nim, szklaną szpatułką lub platynową ezą (ale nie ezą niklo-

404
(a) Małą ilość hodowli bakteryjnej umieszcza się w czystej, pustej szalce Petriego, (b) W bliskiej
odległości nanosi się dwie krople nadtlenku wodoru, (c) Następnie zamyka się szalkę, (d) Zamkniętą
szalkę nachyla się tak, aby nadtlenek wodoru spłynął na hodowlę. Pojawienie się bąbelków gazu
świadczy o dodatniej reakcji.

wo-chromową), małą ilość hodowli bakteryjnej. Szczepy oksydazododatnie dają

natychmiast lub w ciągu 10 sekund zabarwiają się fioletowo. Zaliczają się do nich
gatunki Neisseria, Pseudomonas i Vibrio. Reakcję ujemną wykazują gatunki
rodziny Enterobacteriaceae.

16. 1. 2. 2 Test na obecność koagulazy (do wykrywania gronkowców)

Niektóre szczepy Staphylococcus („koagulazo-dodatnie") wytwarzają jedno lub
(zwykle) dwa różne białka zwane koagulazami; przedstawiony niżej test ma na
celu wykrywanie zdolności bakterii do ich wytwarzania.
Wolna koagulaza (= prawdziwa koagulaza lub stafilokoagulaza) jest uwal-
niana do podłoża i można ją wykryć (w teście probówkowym) dzięki jej właści-
wości koagulowania (tzn. ścinania) osocza krwi zawierającego antykoagulant,
taki jak cytrynian, szczawian czy heparynę. Antykoagulant jest tu niezbędny, bez
niego bowiem osocze może ścinać się samoistnie. W jednej wersji tego testu do
probówki zawierającej 1 ml osocza dodaje się 0, 5 ml 18-24-godzinnej hodowli
bulionowej badanego szczepu. Probówkę inkubuje się w 37°C, sprawdzając
obecność skrzepu po 1, 2, 3, 4 i po 24 godzinach. Wolna koagulaza powoduje
zmianę fibrynogenu (białka osocza) w fibrynę, która tworzy skrzep. Szczepy
koagulazo-dodatnie, które produkują również fibrynolizynę (enzym lizujący
fibrynę), mogą nie tworzyć skrzepu bądź mogą go rozpuszczać zaraz po jego
powstaniu — stąd konieczność tak częstego sprawdzania wyniku testu.
Koagulaza związana (ang. „dumping factor") jest białkowym składnikiem
powierzchni komórek. Wiąże się ona z fibrynogenem, co powoduje zlepianie się
komórek (parakoagulacja). (Porównaj z powstawaniem skrzepu w osoczu. )
Związaną koagulazę wykrywa się w teście szkiełkowym: do kropli gęstej

405
zawiesiny bakterii na szkiełku mikroskopowym dodaje się ezą osocze z cytry-
nianem lub szczawianem i miesza. W przypadku wyniku dodatniego komórki
zlepiają się w ciągu 5 sekund.
W każdej z opisanych form testu powinno się stosować jako kontrolę znane
szczepy koagulazododatnie i koagulazoujemne.
Oprócz gronkowców istnieją inne bakterie wytwarzające koagulazy, np. nie-
które szczepy Yersinia pestis.

16. 1. 2. 3 Test oksydacyjno-fermentacyjny (test Hugh-Leifsona)

Jest to test wstępny, mający na celu stwierdzenie, czy bakteria wykorzystuje

określony węglowodan (zwykle glukozę) w metabolizmie oksydatywnym
(oddechowym), czy też fermentacyjnym. Probówki napełnia się do wysokości
około 8 cm podłożem peptonowo-agarowym zawierającym dany węglowodan
i wskaźnik pH (błękit bromotymolowy, który nadaje podłożu zielony kolor
w pH 7, 1). Tuż przed użyciem jedną z probówek ogrzewa się (aby pozbyć się
rozpuszczonego tlenu), a następnie szybko schładza. Każdą z probówek szczepi
się badanym organizmem, zanurzając ezę (sekcja 14. 5. 2) na głębokość około 5 cm.
Probówkę „ogrzewaną" pokrywa się następnie warstwą sterylnej, płynnej
parafiny, o grubości około 1 cm (aby uniemożliwić dostęp tlenu). Obie probówki
inkubuje się i po 1-14 dniach bada się wykorzystanie węglowodanu, tzn. wytwa-
rzanie kwasu, którego obecność powoduje zażółcenie wskaźnika pH.
Organizmy z metabolizmem oddechowym (takie jak gatunki Pseudomonas)
wywołują zażółcenie tylko w podłożu nie pokrytym parafiną („tlenowym").
Escherichia coli zażółca oba podłoża. W podłożu pokrytym parafiną następuje fer-
mentacja glukozy, a w nie pokrytym — glukoza jest najpierw wykorzystana
w wyniku oddychania, a potem fermentacji.

16. 1. 2. 4 Wytwarzanie kwasu/gazu z węglowodanów („cukrów")

Gatunki wchodzące w skład niektórych rodzajów można rozróżnić na podstawie

ich zdolności do metabolizowania pewnych węglowodanów („cukrów"). Okreś-
la się, jakie cukry dany organizm może wykorzystywać, hodując go po prostu na
serii podłoży, z których każde zawiera inny cukier (jako źródło węgla) i jakiś
wskaźnik. Podstawą podłoża może być woda peptonowa lub bulion odżywczy,
które oprócz cukru zawierają wskaźnik pH, umożliwiający wykrycie zakwasze-
nia powstającego w wyniku zużywania cukru. Tego typu podłoża są wykorzy-
stywane np. w testach dla bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Jeżeli dany
cukier jest metabolizowany, to wytwarzane są produkty kwasowe, a kwasowość
jest wykrywana przez wskaźnik pH.
Niektórych bakterii nie można badać z wykorzystaniem wody peptonowej
czy bulionu — np. gatunki z rodzaju Bacillus tworzą z peptonu tak dużo produk-
tów zasadowych, że niemożliwe jest wykrycie produktów kwaśnych powsta-
jących w czasie metabolizmu cukrów. W takim przypadku badanie przeprowa-
dza się na podłożu zawierającym sole nieorganiczne i dany cukier. Dla innych
typów bakterii należy z kolei podłoże wzbogacić, np. surowicą, w przeciwnym
razie nie uzyskuje się wzrostu.

406
 Przedstawione testy wykonuje się na ogół w probówkach lub w małych
zakręcanych buteleczkach (sekcja 14. 2). Można w nich umieścić odwróconą rurkę
Durhama (rys. 16. 3), w której gromadzi się gaz powstający w czasie metaboli-
zowania cukru. Gaz tworzy się w fermentacji kwasów mieszanych i butano-
diolowej (rys. 5. 5 i 5. 6), gdzie kwas mrówkowy zostaje rozłożony do dwutlenku
węgla i wodoru w wyniku działania układu enzymatycznego liazy mrów-
czan-wodór.

16. 1. 2. 5 Testy IMViC

Jest to grupa testów stosowanych do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacte-

riaceae. Nazwa pochodzi od pierwszych liter angielskich nazw testów: test na
indol, test z czerwienią metylową, test Vogues-Proskauera i test z cytrynianem.
(Patrz np. Escherichia w Aneksie. )
Test na indol. Ten test wykrywa zdolność organizmu do wytwarzania indolu
z aminokwasu — tryptofanu. Bakterię hoduje się na wodzie peptonowej lub na
wodzie tryptonowej przez 48 godzin. Następnie do hodowli dodaje się odczyn-
nik Kovacsa do wykrywania indolu (0, 5 ml na 5 ml hodowli) i łagodnie wytrząsa
w zamkniętym pojemniku. W przypadku reakcji dodatniej, indol obecny
w hodowli rozpuszcza się w odczynniku, który staje się różowy lub czerwony
i tworzy warstwę na powierzchni pożywki.
Test z czerwienią metylową (test MR, ang. methyl red). W teście MR bada się
zdolność organizmu, rosnącego na podłożu peptonowo-glukozowym zbuforo-
wanym fosforanami, do wytworzenia takiej ilości kwasu (wskutek metabolizo-
wania glukozy), która obniży pH z 7, 5 do 4, 4 lub niższego. Podłoże szczepi się
i inkubuje przez co najmniej 48 godzin w 37°C, po czym bada się pH hodowli
przez dodanie kilku kropel 0, 004% czerwieni metylowej (żółtej w pH 6, 2, czerwo-
nej w pH 4, 4). W przypadku bakterii wykazującej odczyn MR dodatni, hodowla
staje się czerwona.
Test Voges-Proskauera (test VP). W teście tym bada się zdolność organizmu
do tworzenia acetoiny (acetylometylokarbinolu) — patrz fermentacja butanodio-
lowa, rys. 5. 6. Podłoże glukozowo-peptonowe zbuforowane fosforanami szczepi
się badaną bakterią i inkubuje w 37°C przez 2 dni lub w 30°C przez przynajmniej
5 dni. W jednej z wersji tego testu (metoda Barritta) do 1 ml hodowli dodaje się
kolejno: 0, 6 ml 5% roztworu alfa-naftolu w etanolu, a następnie 0, 2 ml 40% roz-

407
tworu wodorotlenku potasu. Zamkniętą probówkę czy buteleczkę z zakrętką
wytrząsa się energicznie, a następnie kładzie poziomo, aby maksymalnie wysta-
wić hodowlę na działanie tlenu. Po 30 i 60 minutach odczytuje się wynik. Jeśli
acetoina jest obecna, to zostaje utleniona do diacetylu (CH3. CO. CH3), który
w tych warunkach daje czerwone zabarwienie (dodatni wynik testu VP).
Test cytrynianowy. Testem tym bada się zdolność organizmu do wykorzy-
stania cytrynianu jako jedynego źródła węgla. W skład podłoży, jakie się w nim
stosuje, np. podłoża cytrynianowego Kosera (płynne) i agaru cytrynianowego
Simmonsa, wchodzi kwas cytrynowy lub cytrynian, diwodorofosforan amonowy
(jako źródło fosforu i azotu), chlorek sodu i siarczan magnezu. Bakterie pobiera
się z podłoża stałego i robi ich zawiesinę w soli fizjologicznej. Za pomocą igły
(sekcja 14. 4) szczepi się tą zawiesiną podłoże Kosera. Po jednym lub dwóch
dniach inkubacji sprawdza się, czy występują oznaki wzrostu (zmętnienie).
Bakterie, które wyrosną na tym podłożu, określa się jako „cytrynianododatnie".
Do posiewu stosuje się igłę, aby w inokulum przenieść jak najmniej pożywia.
Związki odżywcze przeniesione wraz z hodowlą wyjściową mogą bowiem
pozwolić na niewielki wzrost w podłożu z cytrynianem, dając fałszywy wynik
dodatni. W alternatywnym sposobie szczepienia przenosi się igłą małą ilość
bakterii pobranych bezpośrednio z powierzchni kolonii.

16. 1. 2. 6 Wytwarzanie siarkowodoru

Wiele gatunków bakterii wytwarza siarkowodór, np. wskutek redukcji siarczanu
(sekcja 5. 1. 1. 2) lub metabolizowania aminokwasów siarkowych. Czuły test na
wykrywanie siarkowodoru da pozytywny wynik nawet w przypadku bakterii
wytwarzających małe jego ilości. Mniej czuły test pozwala na rozróżnienie gatun-
ków wytwarzających niewielką ilość siarkowodoru od tych, które produkują go
dużo. W teście drugiego rodzaju organizm zostaje posiany przez wkłucie zestalo-
nego żelatyną podłoża, zawierającego pepton i chlorek żelaza w małym stężeniu.
Bakterie wytwarzające dużo siarkowodoru powodują powstanie widocznych
ilości czarnego siarczku żelaza. W bardziej czułym z testów pasek bibuły
nasączonej octanem ołowiu umieszcza się ponad podłożem, na/w którym hodo-
wany jest organizm. Obecność siarkowodoru wykrywa się dzięki powstawaniu
siarczku ołowiu zaczerniającego bibułę.

16. 1. 2. 7 Test na obecność ureazy

Ureazy to enzymy hydrolizujące mocznik (NH2)2-CO) do dwutlenku węgla
i amoniaku. Wytwarzanie amoniaku przez bakterie jelitowe można zbadać
hodując je np. na agarze Christensena z mocznikiem (podłożu zbuforowanym
fosforanami, zawierającym glukozę, pepton i jako wskaźnik pH czerwień feno-
lową — żółtą w pH 6, 8, czerwoną w pH 8, 4). Szczepy „ureazododatnie" uwal-
niają w czasie wzrostu na tym podłożu amoniak, powodujący podwyższenie pH,
w wyniku czego wskaźnik staje się czerwony. Do bakterii ureazododatnich
należą n p . Klebsiella pneumoniae i Helicobacter pylori.

408
 16. 1. 2. 8 Testy na obecność dekarboksylazy
Testy te wykazują zdolność organizmów do wytwarzania swoistych dekarbo-
ksylaz — enzymów, które dekarboksylują aminokwasy: argininę, lizynę i orni-
tynę, odpowiednio do agmatyny, kadaweryny i putrescyny. Trzy probówki
z bulionem Mollera, zawierającym glukozę, pepton, jeden z trzech aminokwa-
sów i wskaźniki pH, tzn. purpurę bromokrezolową oraz czerwień krezolową,
szczepi się badanym organizmem. Po pokryciu pożywki warstwą sterylnej para-
finy (aby odciąć dostęp powietrza), probówki inkubuje się w 37°C przez 4 dni
i codziennie bada. Podłoże najpierw staje się kwaśne (żółte) wskutek metabolizo-
wania glukozy. Jeśli nie jest wytwarzana dekarboksylaza, to pozostaje ono żółte.
Natomiast dekarboksylacja aminokwasów prowadzi do powstania produktów
zasadowych, które podwyższają pH, wskutek czego podłoże staje się purpu-
rowe. Podłoże kontrolne jest takie samo jak testowe, lecz nie zawiera aminokwa-
sów. Powinno się ono zrobić żółte i takie pozostać.

16. 1. 2. 9 Test na obecność deaminazy fenyloalaniny

Testem tym wykrywa się zdolność organizmu przeprowadzania deaminacji
fenyloalaniny do kwasu fenylopirogronowego. Bakterie hoduje się przez noc na
podłożu zawierającym ekstrakt drożdżowy, Na 2 HPO 4 , chlorek sodu i DL-fenylo-
alaninę. Następnie dodaje się 0, 2 ml 10% roztworu chlorku żelazowego. Powsta-
nie zielonego zabarwienia świadczy o obecności kwasu fenylopirogronowego.
Do bakterii wykazujących odczyt dodatni należy np. Proteus vulgaris.

16. 1. 2. 10 Test ONPG

Bakteria, aby mogła wykorzystać laktozę, musi mieć dwa enzymy: „permeazę"
galaktozydową (ułatwiającą pobieranie laktozy) i β-D-galaktozydazę (rozszcze-
piającą laktozę na glukozę i galaktozę). Takie gatunki jak E. coli zwykle syntety-
zują oba te enzymy. Istnieją jednak bakterie, które choć wytwarzają β-D-galakto-
zydazę, nie są zdolne do wykorzystania laktozy, lub metabolizują ją bardzo
powoli. Dzieje się tak, gdyż nie syntetyzują permeazy galaktozydowej. Aby
wykazać w nich obecność β-D-galaktozydazy, wykorzystuje się o-nitrofenylo-β-
galaktopiranozyd (ONPG), który może wchodzić do komórki bez udziału swoi-
stej permeazy. Tam jest rozkładany przez galaktozydazę do galaktozy i żółtego
o-nitrofenolu. W teście ONPG bakterie hoduje się przez 18-24 godziny w bulio-
nie zawierającym ONPG. O pozytywnym wyniku testu (a więc o obecności
β-D-galaktozydazy) świadczy pojawienie się żółtego o-nitrofenolu w podłożu.

16. 1. 2. 11 Test na obecność fosfatazy

Niektóre bakterie wytwarzają fosfatazy, enzymy hydrolizujące organiczne fosfo-
rany. Można je wykryć dzięki następującemu testowi. Bakterie hoduje się 18-24
godziny na podłożu stałym zawierającym sól sodową difosforanu fenoloftaleiny.
Związek ten jest hydrolizowany przez fosfatazy, z uwolnieniem fenoloftaleiny
(wskaźnik pH), która jest bezbarwna w pH 8, 3, a czerwona w pH 10, 0. Aby

409
sprawdzić obecność fenoloftaleiny (dodatni wynik testu), hodowlę poddaje się
działaniu amoniaku (w postaci gazu), który powoduje, że kolonie wytwarzające
fosfatazy stają się czerwone.

16. 1. 2. 12 Test na redukcję azotanów

Test służy do wykrywania zdolności organizmu do redukcji azotanów (patrz

oddychanie beztlenowe, sekcja 5. 1. 1. 2). Do bakterii jelitowych oraz Pseudomonas
i bakterii pokrewnych można zastosować następujący test. Badany organizm
hoduje się przez jeden lub więcej dni na bulionie z azotanem (np. woda pepto-
nowa zawierająca 0, 1-0, 2% azotanu potasu), a następnie sprawdza się, czy
nastąpiła redukcja azotanu. Aby zbadać obecność azotynów, do hodowli dodaje
się po 0, 5 ml odczynnika A i odczynnika Β do oznaczania azotynów. Łączą się
one z azotynami, tworząc rozpuszczalny, czerwony barwnik azowy. Brak czer-
wonego zabarwienia może świadczyć o tym, że 1) azotan nie został zreduko-
wany, lub 2) powstał azotyn, lecz następnie został zredukowany np. do azotu
cząsteczkowego bądź amoniaku. Aby rozróżnić te dwie możliwości, bada się
podłoże na obecność azotanów, dodając nieco sproszkowanego cynku, który
redukuje azotan do azotynu. Jeśli więc azotan jest obecny (tzn. nie został zredu-
kowany przez badany organizm), to dodanie cynku wywoła czerwone zabarwie-
nie, ponieważ wytworzony azotyn przereaguje z odczynnikami już uprzednio
dodanymi.

16. 1. 2. 13 Reakcje zachodzące w mleku z lakmusem

Wiele gatunków bakterii wywołuje charakterystyczne reakcje, gdy hoduje się je

na mleku z lakmusem (odtłuszczone mleko z lakmusem — wskaźnikiem pH).
Badany szczep może wykazywać jeden lub kilka z wymienionych efektów:
1) brak widocznych zmian; 2) wytwarzanie kwasu z cukru mlecznego (laktozy),
na co wskazuje lakmus; 3) wytwarzanie odczynu zasadowego, zwykle w wyniku
hydrolizy białka znajdującego się w mleku (kazeiny); 4) redukcja (odbarwienie)
lakmusu; 5) wytwarzanie skrzepu kwaśnego, który jest rozpuszczalny w zasa-
dach; 6) tworzenie skrzepu w pH bliskim obojętnemu, dzięki działaniu bakteryj-
nych enzymów typu reniny; 7) wytwarzanie kwasu i gazu, co powoduje, że
powstający skrzep jest porozrywany przez bąbelki gazu.

16. 1. 2. 14 Hydroliza eskuliny

Niektóre bakterie hydrolizują eskulinę (pochodna 6-β-D-glukozylowa 6, 7-di-

hydroksykumaryny), w wyniku czego uwalniana jest 6, 7-dihydroksykumaryna.
Związek ten można wykryć dzięki temu, że wytwarza on brązowe zabarwienie
w połączeniu z solami żelazowymi. W jednej z form testu organizm hoduje się na
podłożu agarowym zawierającym eskulinę (0, 1%) i chlorek żelaza (0, 005%).
Brązowe zabarwienie świadczy o dodatnim wyniku testu. Do bakterii hydroli-
zujących eskulinę należą np. szczepy Bacteroides, Enterococcus i Streptococcus,
a także Listeria monocytogenes.

410
 16. 1. 2. 15 Test MUG dla Escherichia coli
Test MUG pomaga w wykryciu E. coli, np. w hodowlach. Przed zaszczepieniem
podłoża dodaje się do niego 4-metylo-umbelliferylo-β-D-glukuronid (MUG).
Większość szczepów E. coli ma enzym — β-glukuronidazę, która rozszczepia
ten związek. Powstający w wyniku tego fluoryzujący związek, 4-metyloumbel-
liferon, wykazuje zielononiebieską fluorescencję, którą można uwidocznić
oglądając hodowlę w świetle ultrafioletowym o długości fali 366 nm. (Zwróć
uwagę na to, że zewnętrzne źródła glukuronidazy, występującej np. w skoru-
piakach, mogą prowadzić do fałszywych wskazań dodatnich. ) Metoda alterna-
tywna polega na rozmazaniu kolonii na bibule nasączonej MUG i oglądaniu jej
w świetle UV.

16. 1. 3 Mikrometody (układy wielotestowe)

W bakteriologii klinicznej mikrometody są zminiaturyzowanymi postępowa-
niami testowymi, polegającymi na jednoczesnym przeprowadzeniu pewnego
zakresu identyfikacyjnych testów biochemicznych dla jednego organizmu bada-
nego. Używa się do tego celu zestawów będących w sprzedaży, co pozwala
zaoszczędzić czas, miejsce i materiały. Kilka takich testów (spośród wielu) opi-
sano niżej.
Test API składa się z plastikowej taśmy z umocowanymi na niej mikropro-
bówkami, z których każda zawiera inne odwodnione podłoże. Każdą mikropro-
bówkę szczepi się zawiesiną badanej bakterii. Do niektórych dolewa się olej
mineralny, aby wykluczyć dostęp powietrza. Po inkubacji, jeśli jest to potrzebne,
dodaje się odpowiednie odczynniki, w celu wykrycia poszczególnych produk-
tów metabolizmu. Istnieją oddzielne testy API przeznaczone dla bakterii jelito-
wych, dla paciorkowców i dla bakterii beztlenowych (jako że różne reakcje są
właściwe dla każdej z tych grup bakterii).
Test Staph-Ident jest podobny do API, ale zawiera testy, które są przezna-
czone do identyfikacji gronkowców.
Test Enterotube II składa się z 12 pojemniczków, z których każdy zawiera
inne podłoże agarowe. Szczepi się je igłą, wkłuwając ją w podłoże wzdłuż osi
probówki.
System PathoTec składa się z różnych pasków testowych, z których każdy
jest nasączony odwodnionym podłożem o odpowiednim składzie. Każdy pasek
inkubuje się w zawiesinie badanego organizmu (lub szczepi się bezpośrednio
z kolonii). Po określonym czasie odczytuje się wynik testu.
Test Rapidec Staph służy do identyfikacji koagulazododatnich gronkowców,
poprzez wykrywanie aureazy, enzymu swoistego dla tych bakterii. Aureaza
i protrombina (odczynnik zawarty w teście) tworzą kompleks, który może powo-
dować lizę substratu wykorzystywanego w teście. Wskutek lizy powstaje
związek, który fluoryzuje w ultrafiolecie, więc jest łatwy do wykrycia.

411
 16. 1. 4 Inne testy i obserwacje
16. 1. 4. 1 Hemoliza
Gdy niektóre bakterie rosną na agarze z krwią (sekcja 14. 2. 1), ich kolonie są oto-
czone przejrzystą strefą podłoża, w której erytrocyty uległy lizie, a tym samym
krew odbarwiła się. Liza erytrocytów (hemoliza) wynika z aktywności białek
(hemolizyn) uwalnianych przez bakterie. Niektóre gatunki wywołują hemolizę
całkowicie przejrzystą i bezbarwną, która ostro kontrastuje z nieprzezroczystą,
czerwoną pożywką. Jest tak w przypadku Streptococcus pyogenes i niektórych
szczepów Staphylococcus aureus. (Taka całkowicie przejrzysta hemoliza
wywołana przez Streptococcus jest często zwana β-hemoliza, natomiast przez
S. aureus — α-hemolizą. Wydaje się, że lepiej byłoby mówić o niej jako o „przej-
rzystej hemolizie". )
Tak zwane paciorkowce zieleniejące, i niektóre inne bakterie, tworzą wokół
kolonii strefy zielonkawobrunatnego odbarwienia.
Hemolizę w przypadku bakterii o właściwościach hemolitycznych można
wykazać jedynie na podłożach zawierających krew określonego typu(ów) zwie-
rząt (np. konia, królika, człowieka itd. ).

16. 1. 5 Typowanie
„Typowanie" oznacza: 1) porównywanie nieznanego szczepu ze swoistym zna-
nym szczepem danego gatunku (rodzaj identyfikacji) i 2) rozróżnianie poszcze-
gólnych szczepów danego gatunku (rodzaj klasyfikacji). W obu procedurach sto-
suje się podobne kryteria (i metody). Oczywiście punkt 2) musi poprzedzać 1).
Należy sobie zdawać sprawę, że w znaczeniu 1) nie istnieje system typowa-
nia, który mógłby udowodnić, iż nieznany szczep jest całkowicie identyczny
z konkretnym znanym szczepem — co może oznaczać brak identyczności. Dzieje
się tak dlatego, że każdy z systemów typowania służy do określania podobień-
stwa, i to w dodatku w stosunku do jednej (lub niewielu) cech. Tak więc nawet
jeśli nieznany szczep jest identyczny ze znanym pod względem konkretnych
cech, to może się różnić od niego innymi właściwościami. Stąd, stosując różne
rodzaje typowania można uzyskać dla danego, nieznanego szczepu różne wy-
niki i często tak się właśnie dzieje.
Typowanie jest szczególnie użyteczne np. w epidemiologii. Główną prze-
słanką jest to, że różne izolaty danego patogena, pochodzące z tego samego
łańcucha infekcji, lub wybuchu choroby, to potomstwo tej samej komórki wyj-
ściowej. Takie pokrewieństwo można wykryć dzięki znacznemu podobieństwu
genotypów i/lub fenotypów izolatów, w porównaniu z innymi losowo
pobieranymi izolatami tego samego gatunku. Tak więc, jeśli wyróżniono
(w wyniku typowania) różne szczepy patogena, to można często porównać
świeży izolat patogena z jednym z nich. Umożliwia to powiązanie choroby
z określonym źródłem infekcji (np. przez stwierdzenie występowania określo-
nych szczepów w danym miejscu). [Evaluation and use of epidemiological
typing systems: Struelens i wsp. (1996) CMI 2: 2-11. ]

412
 Podstawą typowania może być np.: serologia (sekcja 16. 1. 5. 1); wrażliwość na
fagi (sekcja 16. 1. 5. 2); elektroforeza enzymów (sekcja 16. 1. 5. 3); sekwencje kwasów
nukleinowych (16. 1. 6); a także (u Pseudomonas aeruginosa) zmienność piower-
dyny (sekcja 11. 5. 5) [Meyer i wsp. (1997) Microbiology 143: 35-43].

16. 1. 5. 1 Testy serologiczne

Dzięki tym testom można rozróżniać blisko spokrewnione bakterie, badając róż-
nice w ich antygenach powierzchniowych (sekcja 11. 4. 2. 1). Na przykład, wyko-
rzystując testy serologiczne można rozróżnić tysiące szczepów Salmonella, przede
wszystkim na podstawie nieznacznych różnic w ich antygenach O (antygeny
lipopolisacharydowo-białkowe) i antygenach Η (antygeny rzęskowe). Różnice
w antygenach O występują w ich łańcuchach O-swoistych (sekcja 2. 2. 9. 2).
Szczepy, które rozróżnia się głównie na podstawie ich antygenów, zwane są
serotypami (patrz np. Salmonella w Aneksie). (Patrz też sekcja 2. 2. 13. )
W praktyce możemy wykryć (i zidentyfikować) dany serotyp wykorzystując
swoiste przeciwciała, które będą się łączyły tylko z antygenami znanego sero-
typu(ów) r Przeciwciała można otrzymać wstrzykując zwierzęciu doświadczal-
nemu antygeny znanego serotypu. Po pewnym czasie jego surowica będzie
zawierała przeciwciała przeciw temu antygenowi. Taką surowicę nazywa się
swoistą surowicą odpornościową. Gdy zmieszamy ją z komórkami tego samego
serotypu, dojdzie do połączenia ich antygenów powierzchniowych z wystę-
pującymi w surowicy odpowiadającymi im przeciwciałami.
Powstające kompleksy bakteria-przeciwciało zwykle tworzą w probówce
białawą, widoczną masę lub osad (reakcja aglutynacji). Jeżeli ta sama surowica
odpornościowa powoduje aglutynację nieznanego szczepu, można wywniosko-
wać, że ma on antygen(y) wspólny(e) z oryginalnym serotypem. Tak więc można
zidentyfikować nieznany serotyp, badając go z zastosowaniem różnych surowic
odpornościowych, z których każda zawiera przeciwciała swoiste dla danego,
znanego serotypu(ów).
Wyniki można otrzymać bardzo szybko, jeśli zastosuje się testy szkiełkowe
aglutynacji z lateksem, w których odczynnik składa się z mikroskopijnych
cząstek lateksu opłaszczonych swoistymi przeciwciałami (których fragmenty
wiążące antygen zwrócone są na zewnątrz). Bakterie zawierające odpowiednie
antygeny powierzchniowe będą wiązały ze sobą te cząstki, powodując ich aglu-
tynację w widzialne strąty. Tak więc powstanie strątów oznacza dodatni wynik
testu. Jednym z przykładów takiego badania jest test lateksowy E. coli 0157
(produkt DR620, Oxoid, Basingstoke, Wlk. Brytania).

16. 1. 5. 2 Typowanie bakteriofagami („typowanie fagami")

Procedura ta pozwala na rozróżnienie szczepów blisko spokrewnionych bakterii
dzięki badaniu różnic w ich wrażliwości na bakteriofagi (rozdz. 9). Badany
szczep posiewa się tak, aby urósł w postaci murawki (sekcja 14. 5. 2), płytkę
Petriego „suszy się" (sekcja 14. 2. 2), a na zewnętrznej stronie jej denka rysuje się
siatkę. Następnie na agar zawarty w każdym z kwadratów siatki nanosi się jedną

413
kroplę zawiesiny innego faga. Gdy płyn wsiąknie, płytkę inkubuje się. Zwykle
jeden, dwa lub kilka fagów będzie litycznych dla danego szczepu. Liza (a więc
wrażliwość na danego faga) prowadzi do powstania łysinek (sekcja 9. 1. 3)
w murawie bakteryjnej w miejscu posiania faga. W ten sposób można określać,
na jakie fagi szczep jest wrażliwy, co umożliwia jego identyfikację. Typowanie
fagowe stosuje się n p . dla Staphylococcus aureus i Yersinia enterocolitica. (Patrz
fot. 16. 1. )

16. 1. 5. 3 Elektroforetyczna analiza izoenzymów (MEE, ang. multilocus

enzyme electrophoresis)
W metodzie tej szczepy rozróżnia się porównując ruchliwość elektroforetyczną
różnych enzymów badanej bakterii z równoważnymi enzymami pochodzącymi
z jednego lub większej liczby spokrewnionych organizmów. Enzymy muszą być
izolowane i badane w warunkach, w których zachowują one swoją aktywność.
Identyfikuje się je w żelu stosując specyficzne substraty, dające barwne
produkty.

414
 16. 1. 6 Szybkie metody wykrywania/identyfikacji i typowania
z zastosowaniem metod wykorzystujących kwasy nukleinowe

16. 1. 6. 1 Szybkie metody wykrywania/identyfikacji

Do szybkiego wykrywania określonego(ych) organizmu(ów) w próbkach klini-

cznych lub pobranych ze środowiska można wykorzystać sondy (sekcja 8. 5. 3)
specyficzne dla danego gatunku czy szczepu. Na przykład, stosując test PACE
2C (Gen-Probe, San Diego USA), w próbach pobranych z szyjki macicy można
jednocześnie wykryć dwa patogeny — Chlamydia trachomatis i Neisseria gonorrhoe-
ae, i to z dokładnością podobną do tej, jaką się otrzymuje stosując metody pole-
gające na hodowaniu bakterii [Iwen i wsp. (1995) JCM 33: 2587-2591]. Ponieważ
obie bakterie chorobotwórcze występują bardzo często w tych samych próbach,
test ten obecnie stosuje się w wielu laboratoriach klinicznych. (Patrz też sek-
cja 11. 8. 5. )
PCR (sekcja 8. 5. 4) pozwala na szybkie wykrycie i identyfikację danego orga-
nizmu, jeżeli zastosujemy bardzo specyficzne startery. Może to być pomocne np.
we wczesnej diagnozie pewnych chorób (sekcja 8. 5. 4. 1, pozycja 1). Małą ilość
próbki poddaje się PCR, a uzyskane swoiste produkty (amplikony) wykrywa
się/identyfikuje z zastosowaniem innych metod, na przykład elektroforezy
w żelu (sekcja 8. 5. 1. 4), z wybarwieniem fluorescencyjnym [np. Talbot i wsp.
(1997) JCM 35: 566-569], albo hybrydyzacji w płytkach mikrotestowych (ang.
microtitre plate-based hybridization assay) [Nelson i wsp. (1997) JCM 35:
117-120]. Aby zidentyfikować patogena w bakteryjnym zapaleniu rogówki,
w próbkach pobranych z rogówki amplifikowano, stosując PCR, sekwencje
bakteryjnego DNA kodującego 16S rRNA. Następnie amplikony porównywano
z sekwencjami zawartymi w banku danych [Knox, Cevellos i Dean (1998)
JCM 36: 3492-3496].
Teoretycznie PCR umożliwia wykrycie patogena, nawet jeśli próbka zawiera
tylko jedną kopię docelowego DNA. Jednak trzeba pamiętać, że próbki stoso-
wane w PCR mają bardzo małą objętość (mierzoną w mikrolitrach). Aby wykry-
cie danego DNA było możliwe, materiał wyjściowy powinien zawierać przynaj-
mniej 103-104 komórek/ml. Jeżeli stężenie komórek jest za małe, można wzmoc-
nić detekcję (i tym samym czułość metody), wykorzystując technikę IMS (sek-
cja 14. 6. 1). Dzięki IMS można zagęścić albo DNA o swoistej sekwencji, po uwol-
nieniu go z komórki [np. dzięki „wyłapywaniu" sekwencji metodą PCR: Mangia-
pan i wsp. (1996) JCM 34: 1209-1215], albo całe komórki o określonej swoistości
[np.: Mycobacterium paratuberculosis w mleku: Grant, Ball i Rowe (1998) AEM 64:
3153-3158]. W niektórych testach zamiast DNA amplifikuje się rRNA, którego
tysiące kopii zawiera każda komórka.
Skuteczność wykrywania swoistych komórek można zwiększyć przez krót-
kotrwałe hodowanie próbki przed wykonaniem PCR (czy innych metod opie-
rających się na kwasach nukleinowych) [patrz np. Luk i wsp. (1997) JCM 35:
714-718].
Innym sposobem zwiększenia skuteczności PCR jest sprawdzenie sprawności
działania tej metody na próbce pobranej z badanego materiału. Do takiej próbki
415
dodaje się kilka kopii znanej sekwencji tarczowej. Uzyskanie wyniku negatyw-
nego może świadczyć o obecności inhibitorów PCR w badanym materiale (patrz
sekcja 8. 5. 4. 6), co powinno skłonić do dalszych badań z zastosowaniem właści-
wej metody. Może się zdarzyć, że otrzymamy wówczas pozytywny wynik tam,
gdzie początkowo był on negatywny [Rosenstraus i wsp. (1998) JCM 36:
191-197].
Amplifikacja oparta na transkrypcji (TMA, ang. transcription-mediated amp-
lification) jest podobna do NASBA (sekcja 8. 5. 9. 2). Wykorzystuje się ją do wykry-
wania Mycobacterium tuberculosis. W teście „Amplified Mycobacterium tuberculosis
Direct Test" (AMTDT; Gen-Probe, San Diego) amplifikuje się swoistą sekwencję
rRNA i wykrywa zamplifikowany produkt za pomocą sondy chemiluminescen-
cyjnej. [Evaluation of Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct
Test: Miller. Hernandez i Cleary (1994) JCM 32: 393-397. ] AMTDT został dopusz-
czony przez US Food and Drug Administration do stosowania w przypadku pró-
bek dających dodatni wynik barwienia w kierunku bakterii kwasoopornych (sek-
cja 14. 9. 2). Unowocześniona wersja testu (z możliwością zastosowania próbki
o większej objętości) charakteryzuje się zwiększoną czułością [Gamboa i wsp.
(1998) JCM 36: 684-689].
Test podobny do TMA jest też stosowany np. dla Chlamydia trachomatis [np.
Pasternack, Vuorinen i Miettinen (1997) JCM 35: 676-678].
Do wykrywania Neisseria gonorrhoeae [Kehl i wsp. (1998) JCM 36: 3549-3551]
oraz Mycobacterium tuberculosis [Gamboa i wsp. (1998) JCM 36: 1324-1329; Gar-
rino i wsp. (1999) JCM 37: 229-232] stosuje się LCR (sekcja 8. 5. 9. 1).

16. 1. 6. 2 Typowanie metodami opierającymi się na kwasach nukleinowych

Typowanie (sekcja 16. 1. 5) może się opierać na jakiejkolwiek z metod opisanych

w sekcjach 16. 2. 2. 3-16. 2. 2. 8. Na przykład RFLP (sekcja 16. 2. 2. 6) został wykorzy-
stany do identyfikowania i typowania Chlamydia [Meijer i wsp. (1997) JCM 35:
1179-1183], a kombinację metod (w tym REP-PCR i rybotypowania PCR) stoso-
wano do typowania Haemophilus somnus [Appuhamy i wsp. (1997) JCM 35:
288-291].
Kilka metod opierających się na PCR można zastosować bez uprzedniej zna-
jomości genomu. Tak więc RAPD (sekcja 16. 2. 2. 4) wykorzystano do typowania
Staphylococcus aureus [Young i wsp. (1994) LAM 18: 86-89] i Campylobacter spp.
[Madden, Moran i Scates (1996) LAM 23: 167-170]. Powtarzalność tych metod
PCR z dowolnymi starterami (ang. „arbitrarily primed" PCR) wydaje się zależeć
od różnych czynników. W zalecanych przepisach zwraca się uwagę na: 1) ilo-
ściowe oznaczenie DNA i starterów; 2) stosowanie optymalnego stosunku star-
ter/matryca; 3) stosowanie starterów dobrze scharakteryzowanych; 4) standary-
zację polimerazy DNA i stężenia MgCl2; 5) wykorzystanie odpowiedniego apa-
ratu i warunków reakcji (ang. thermocycling) [Tyler i wsp. (1997) JCM 35:
339-346].
W jednej ze zwykłych metod typowania stosuje się restrykcję (cięcie) chromo-
somu, a następnie PFGE (sekcja 16. 2. 2. 3) [np. Shi i wsp. (1997) JCM 35: 325-327].
W przypadku typowania izolatów MRSA metoda PFGE okazała się bardziej

416
różnicująca niż metody typowania oparte na PCR [Schmitz i wsp. (1998) JMM
47: 341-351].
Różne molekularne metody typowania Neisseria gonorrhoeae zostały omó-
wione przez Poh [(1998) RMM 9: 1-8].
W przypadku Neisseria meningitidis udało się wykonać typowanie oparte na
PCR bezpośrednio z próbek klinicznych (tzn. bez uprzedniego hodowania)
[Newcombe i wsp. (1997) JCM 35: 1809-1812]. Może to być użyteczne do badań
epidemiologicznych, kiedy to z powodu chemioterapii poprzedzającej przyjęcie
do szpitala (podejrzenie o zapalenie opon) nie można namnożyć patogena z pró-
bek krwi/płynu mózgowo-rdzeniowego.
Analiza plazmidowego DNA z zastosowaniem endonukleazy restrykcyjnej
(REAP, ang. restriction endonuclease analysis of plasmid DNA) jest stosowana
do typowania bakterii na podstawie ich plazmidów. Polega na izolowaniu plaz-
midów, ich restrykcji i elektroforezie. Prosta elektroforeza plazmidów (bez
restrykcji) może być niewiarygodna z powodu: 1) różnic w zachowaniu elektro-
foretycznym poszczególnych form tego samego plazmidu (superskręconej itd. ),
i 2) możliwości wystąpienia polimerycznych form plazmidu.
Wykorzystanie w badaniach epidemiologicznych typowania opierającego się
na kwasach nukleinowych nazwano epidemiologią molekularną.

16. 2 Klasyfikacja (taksonomia) prokariotów

Idealnie byłoby, gdyby klasyfikacja biologiczna (taksonomiczna) mogła być file-
tyczna, tzn. oparta na naturalnych (ewolucyjnych) związkach między organiz-
mami. Jest tak w przypadku organizmów wyższych — u których związki ewolu-
cyjne można wydedukować z cech strukturalnych i innych. „Prosta" budowa
prokariotów dostarcza jednak zbyt mało cech ważnych dla klasyfikacji filetycz-
nej. Organizmy te tradycyjnie były klasyfikowane na podstawie widocznych
cech fenotypowych, które opisano w sekcji 16. 1.
Nowoczesna klasyfikacja filetyczna prokariotów opiera się na kryteriach
molekularnych: organizmy są klasyfikowane przede wszystkim zgodnie z różni-
cami (i podobieństwami) ich kwasów nukleinowych, co zostało omówione na
następnych stronach. (Wskazane jest zaznaczyć w tym miejscu, że istnieje też
taksonomia polifazowa (ang. polyphasic taxonomy), której celem jest stworzenie
klasyfikacji na podstawie maksimum dostępnych informacji, włączając zarówno
dane fenotypowe, jak i molekularne [Polyphasic taxonomy: Vandamme i wsp.
(1996) MR 60: 407-438]. ) Zanim rozważymy „nową taksonomię" spójrzmy krót-
ko na stosowane wcześniej kryterium molekularne, jakim jest zawartość GC.

16. 2. 1 Zawartość GC (% GC) w DNA

Zawartość GC (=% GC) w DNA jest wyrażoną w procentach ilością guaniny
i cytozyny w stosunku do wszystkich zasad azotowych:
(guanina + cytozyna)/(guanina + cytozyna + adenina + tymina) x 100%

417
Zawartość GC w danej próbce DNA można oszacować różnymi metodami fi-
zycznymi, np. mierząc jego gęstość z zastosowaniem wirowania równowago-
wego (w gradiencie gęstości) (sekcja 8. 5. 1. 4). Zawartość GC była wykorzysty-
wana jako wstępne kryterium do porównania DNA różnych organizmów.
Trzeba pamiętać, że podobne wartości tego wskaźnika nie muszą świadczyć
o bliskim pokrewieństwie taksonomicznym, natomiast wartości znacznie od sie-
bie odbiegające wskazują na brak pokrewieństwa. U bakterii zawartość GC waha
się w granicach od 24 do 76%. Niektóre procentowe wartości GC podano
w Aneksie.

16. 2. 2 Sekwencje nukleotydowe — pamięć zawarta w cząsteczkach

Dzięki dziedziczeniu (sekcja 7. 1) cechy organizmu są utrzymywane z pokolenia
na pokolenie, gdyż chromosom jest wiernie kopiowany przy każdym podziale
komórki. Jednak w długich (ewolucyjnie) odcinkach czasu z istniejących wcześ-
niej sekwencji nukleotydowych wyłaniają się nowe, zatem powstają i nowe
organizmy. Tym samym chromosom stanowi więcej niż tylko odbitkę organizmu
— zawiera on pewne elementy związane z jego historią i rozwojem. Można je
odkryć, porównując pewne sekwencje w DNA różnych organizmów. Organizmy
mogą więc być klasyfikowane na podstawie unikatowych sekwencji nukleotydo-
wych występujących w chromosomach.
Jeżeli badamy określoną sekwencję nukleotydową w DNA czy RNA, to róż-
nice w odpowiadających jej sekwencjach u różnych organizmów mogą wskazy-
wać na dużą ewolucyjną dywergencję między nimi (np. na poziomie królestw)
lub na mniejszą wariację (np. na poziomie gatunku). To, czy chodzi tu o dużą czy
mniejszą rozbieżność taksonomiczną zależy od tego, jaką sekwencję badamy
i jaka jest jej względna stabilność w czasie ewolucji, z tym że różnice w sekwencji
stabilnej wydają się bardziej znaczące niż te w sekwencji mniej stabilnej.
W jaki sposób porównujemy sekwencje nukleotydowe różnych komórek?
Zwykle komórki poddaje się lizie (otwiera) i izoluje ich kwasy nukleinowe, sto-
sując odpowiednie techniki (sekcja 8. 5. 1. 4). W pewnych przypadkach izoluje się
DNA, w innych RNA. Następnie porównuje się sekwencje dzięki metodom opi-
sanym w następnych sekcjach i przedstawionych na rysunkach 16. 4 i 16. 6.
Ponieważ do klasyfikacji niezbędne jest scharakteryzowanie i porównanie
organizmów, niektóre z tych metod są też pożyteczne do identyfikacji; metody,
którymi rozróżnia się blisko spokrewnione szczepy, są szczególnie przydatne do
typowania (sekcja 16. 1. 5).

16. 2. 2. 1 Hybrydyzacja DNA-DNA

W metodzie tej porównuje się DNA dwóch różnych organizmów mierząc sto-
pień, w jakim dwie próbki DNA mogą hybrydyzować (hybrydyzacja odnosi się
do parowania zasad między nićmi DNA z dwóch różnych organizmów). Im wię-
kszy jest stopień hybrydyzacji między nimi, tym bliższe jest pokrewieństwo
(rys. 16. 4a). Metoda ta jest przydatna np. do badania pokrewieństwa na poziomie
gatunku. Organizmy, których DNA wykazuje > 70% stabilnej hybrydyzacji, będą
zaklasyfikowane do tego samego gatunku.

418
 Wyniki uzyskane dzięki hybrydyzacji DNA-DNA (i innych metod opie-
rających się na sekwencji) mogą się znacząco różnić od tych, jakie otrzymano
wcześniej w klasyfikacji tradycyjnej. Na przykład, w tradycyjnej klasyfikacji
rodzaju Listeria, jego dwa gatunki — L. grayi i L. murrayi były usytuowane
blisko gatunku typowego, L. monocytogenes. Na podstawie hybrydyzacji
DNA-DNA udowodniono, że gatunki te są jednak odległe od L. monocytogenes.
Hybrydyzacja między L. grayi i L. monocytogenes wynosiła <25% [Hartford
i Sneath (1993) IJSB 43: 26-31]. Skąd biorą się takie rozbieżności? W klasyfikacji
tradycyjnej porównuje się organizmy głównie na podstawie cech fenotypo-
wych (obserwowalnych, mierzalnych), takich jak enzymy, budowa subkomór-
kowa, zdolność do ruchu i produkty metaboliczne. W przeciwieństwie do tego
hybrydyzacja DNA-DNA (która bada cały chromosom) porównuje sekwencje
kodujące cechy fenotypowe oraz różne sekwencje nie wyrażane fenotypowo
przez komórkę (np. sekwencje REP — sekcja 16. 2. 2. 5). Tak więc hybrydyzacja
porównuje organizmy w szerszym zakresie, niż jest to możliwe metodami
tradycyjnymi.

16. 2. 2. 2 16S rRNA — zapis gatunków i królestw

16S rRNA jest bardzo dogodny do klasyfikacji filetycznej, gdyż występuje we

wszystkich bakteriach i zawiera zarówno sekwencje nukleotydowe w wysokim
stopniu konserwatywne (stabilne), jak i sekwencje bardziej zmienne. Druga
cecha pozwala na klasyfikację zarówno na najniższym, jak i najwyższym pozio-
mie taksonomicznym. Porównując u różnych organizmów sekwencje w wyso-
kim stopniu konserwatywne, można stwierdzić dywergencję na poziomie
wyższych jednostek taksonomicznych (np. królestw, domen), natomiast porów-
nując regiony bardziej zmienne, ocenia się rozbieżności na poziomie gatunków
lub szczepów.
W katalogowaniu oligonukleotydowym 16S rRNA, kwas ten tnie się enzy-
matycznie na małe fragmenty (oligonukleotydy) i określa ich sekwencję
(rys. 16. 4b). Powstający w ten sposób „katalog" jest charakterystyczny dla
danego organizmu, dzięki czemu na podstawie katalogów można porównywać
różne organizmy i klasyfikować je. Dzięki tej metodzie bakterie początkowo
podzielono na dwa królestwa: Eubacteria i Archaebacteria (patrz Aneks). Nastę-
pnie 16S rRNA został „zsekwencjonowany" (tzn. określono sekwencję nukleoty-
dową całej cząsteczki), co ujawniło istnienie dwóch głównych grup archebakterii:
tj. tych, które są zależne od siarki, i grupy obejmującej metanogeny, ekstremalne
halofile oraz pozbawiony ściany komórkowej gatunek Thermoplasma acidophilum
[Yang, Kaine i Woese (1985) SAM 6: 251-256]. Potem Eubacteria i Archaebacteria
uzyskały wyższe rangi taksonomiczne. Stały się domenami i zmieniono im
nazwy odpowiednio na Bacteria i Archaea. Na rysunku 16. 5 pokazano pewne
zgrupowania organizmów w obrębie obu domen, a także określano przynależ-
ność niektórych gatunków.
Analiza 16S rRNA jest też wykorzystywana na niższych szczeblach taksono-
micznych. Zbadano na przykład, że w obrębie danego rodzaju taksonomicznego
16S rRNA różni się na ogół o przynajmniej 1, 5%. Okazało się jednak, że pewne
szczepy Bacillus, które można wyraźnie rozróżnić na podstawie hybrydyzacji

419
(a) Hybrydyzacja DNA-DNA (sekcja 16. 2. 2. 1). W jednej z form tej metody, jednoniciowy (zdenaturo-
wany ciepłem), chromosomowy DNA ze szczepu A zostaje związany z błoną nitrocelulozową (lub
innym materiałem). Na schemacie ten DNA jest pokazany w postaci długiej, cienkiej linii. Chromoso-
mowy DNA ze szczepu Β jest fragmentowany odpowiednimi metodami, a fragmenty zostają zdena-
turowane przez ogrzewanie. Przygotowuje się też takie same, jednoniciowe fragmenty znakowanego
DNA ze szczepu A. W odpowiednich warunkach, nie znakowany DNA szczepu A (związany z nitro-
celulozą) jest eksponowany na fragmenty DNA szczepu Β (krótkie, cienkie linie) i jednocześnie na
fragmenty znakowanego DNA szczepu A (krótkie, grube linie). Pozwala to fragmentom hybrydyzo-
wać (w wyniku parowania zasad) z komplementarnymi sekwencjami związanego DNA.
Fragmenty ze szczepów A i Β współzawodniczą o sekwencje na związanym DNA. Jednak stężenie
fragmentów Β jest znacznie większe, niż fragmentów A. W konsekwencji, jeśli szczepy A i Β są bar-
dzo podobne, to niewiele (jeśli w ogóle) fragmentów A ulegnie hybrydyzacji. Natomiast jeśli szczepy
A i Β bardzo się różnią, to ulegnie hybrydyzacji wiele fragmentów A. Tak więc liczba fragmentów A
biorących udział w hybrydyzacji wskazuje na podobieństwo szczepów A i B. Określa się je mierząc
znakowanie po wypłukaniu wszystkich niezwiązanych fragmentów. Oczywiście niezbędne są odpo-
wiednie kontrole; w jednej z nich stosuje się wyłącznie znakowane fragmenty A (bez fragmentów B),
dzięki czemu można określić maksymalne wiązanie przez fragmenty A.
Wyniki są znaczące jedynie wówczas, gdy fragmenty hybrydyzują w sposób stabilny. Stabilność
jest oceniana poprzez monitorowanie dysocjacji fragmentów od związanego DNA w miarę stopnio-
wego wzrostu temperatury.

420
DNA-DNA, mają właściwie identyczne 16S rRNA [Fox, Wisotzky i Jurtshuk
(1992) IJSB 42: 166-170]. Prawdopodobnym wytłumaczeniem tego zjawiska jest
stosunkowo niedawne (w ewolucyjnej skali czasu) rozdzielenie się tych szcze-
pów, tak więc ich 16S rRNA nie miał dość czasu, aby ulec zmianom.
W wielu badaniach taksonomicznych wykorzystuje się obecnie gen 16S rRNA
(a nie sam 16S rRNA). Do ich wykonania potrzeba wiele kopii genu, i w pewnych

(b) Katalogowanie oligonukleotydowe 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2). W metodzie tej 16S rRNA jest cięty
szczególnymi enzymami — np. RNazą T1, która swoiście tnie RNA w miejscach (gdzie Gp
to guanozyno-3'-monofosforan, a Ν jest następnym nukleotydem). Uzyskane fragmenty stanowią
„katalog". Szczepy są porównywane poprzez porównywanie ich katalogów.
(c) PCR z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang. arbitrarily primed PCR) (sekcja 16. 2. 2. 4). Kopie
dowolnie wybranego startera wiążą się w różnych miejscach z każdą z nici (zdenaturowanego termi-
cznie) chromosomowego DNA w warunkach mniej rygorystycznych (low-stringency conditions)
(sekcja 8. 5. 4). Startery wiążą się z najbardziej dopasowanymi sekwencjami, chociaż zdarzają się
błędy. W niektórych wypadkach dwa startery będą się wiązały stosunkowo wydajnie z przeciwstaw-
nymi nićmi, w miejscach odległych o kilkaset zasad. Jeżeli elongacja nici z tych starterów będzie
zachodziła wydajnie, i jeśli będzie ona ograniczona w czasie, to powstające produkty PCR będą
dwiema krótkimi, jednoniciowymi fragmentami DNA.
Na schemacie dwie nici chromosomowego DNA są pokazane jako długie linie równoległe. Na
prawo, dwa startery (krótkie linie) związały się niedaleko siebie, na przeciwległych niciach. Na lewo,
dwa startery związały się z przeciwległymi nićmi w miejscach bardziej oddalonych. Wydłużanie nici
z każdego startera (linia przerywana) prowadzi do wytworzenia czterech pokazanych fragmentów.
(Zwróć uwagę, że fragment zsyntetyzowany na jednej nici zawiera kopię sekwencji najlepiej dopaso-
wanej drugiej nici. ) Kolejny cykl PCR w warunkach mniej rygorystycznych jest stosowany do
wytworzenia większej liczby kopii fragmentów.
Następnie przeprowadza się wiele cykli PCR w warunkach bardziej rygorystycznych, z wykorzy-
staniem kopii tego samego startera. W tych warunkach startery wiążą się raczej z sekwencjami naj-
bardziej dopasowanymi (niż z innymi) znajdującymi się na fragmentach, które powstały w wyniku
pierwszej reakcji PCR. Jednak z powodu warunków bardziej rygorystycznych nie wszystkie z tych
fragmentów zwiążą startery. Tak więc tylko część fragmentów wytworzonych w warunkach mniej
rygorystycznych może zostać zamplifikowana w warunkach bardziej rygorystycznych. W elektro-
forezie fragmenty z danego szczepu tworzą charakterystyczny wzór prążków („odcisk")
(patrz fot. 16. 2).
(d) Metoda PCR oparta na sekwencjach powtarzalnych (REP-PCR, ang. repetitive sequence-based
PCR) (sekcja 16. 2. 2. 5). W metodzie tej w PCR (sekcja 8. 5. 4) stosuje się startery, które wiążą się z sek-
wencjami REP. Na schemacie pokazane są trzy sekwencje REP (R) na jednej nici chromosomowego
DNA. Starter (P) związał się z każdą sekwencją REP i nastąpiła elongacja od lewej do prawej. Strzałka
pokazuje koniec nowo powstałego fragmentu. Zwróć uwagę, że elongacja z danego startera nie może
zajść poza następny starter. (Fragmenty nie mogą zostać połączone, gdyż mieszanina nie zawiera
ligazy, enzymu, który mógłby wytworzyć odpowiednie wiązanie. ) Po zajściu pewnej liczby cykli
PCR cząsteczki o różnych wielkościach są rozdzielane elektroforetycznie, dając odcisk charakterysty-
czny dla danego chromosomu.
(e) Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) (sekcja 16. 2. 2. 6). Linie poziome przed-
stawiają pokrewne dupleksy DNA. Górny dupleks ma dwa miejsca cięcia dla danej endonukleazy
restrykcyjnej. Cięcie enzymatyczne w każdym z obu miejsc powoduje powstanie trzech fragmentów
restrykcyjnych. W dupleksie środkowym drugie miejsce restrykcyjne zostało zgubione w wyniku
mutacji, więc cięcie enzymatyczne powoduje powstanie jedynie dwóch fragmentów, przy czym frag-
ment 1 jest nie zmieniony. W dolnym dupleksie doszło do insercji nowej, krótkiej sekwencji nukleoty-
dów (linia przerywana). Cięcie enzymatyczne tego dupleksu daje trzy fragmenty, ale fragment 2 jest
dłuższy niż ten w dupleksie górnym. Elektroforeza fragmentów uzyskanych z każdego dupleksu da
odmienny odcisk.

421
422
przypadkach można je otrzymać z zastosowaniem PCR (sekcja 8. 5. 4). Geny
zamplifikowane za pomocą PCR są szczególnie dogodne, gdy nie można wyho-
dować bakterii stosując standardowe techniki [patrz Haygood i Distel (1993)
Nature 363: 154-156].
[Bacterial phylogeny based on 16S and 23S sequence analysis (artykuł prze-
glądowy): Ludwig i Schleifer (1994) FEMSMR 15: 155-173. ]

16. 2. 2. 3 Odcisk DNA (odcisk chromosomowy) i rybotypowanie

Odcisk DNA (ang. DNA fingerprinting), czyli analiza z zastosowaniem enzy-
mów restrykcyjnych (REA, ang. restriction enzyme analysis), jest wykorzysty-
wana np. do identyfikowania/klasyfikowania organizmów na poziomie
gatunku/szczepu. W oryginalnej metodzie DNA chromosomowy danego
szczepu jest cięty określonymi endonukleazami restrykcyjnymi (sekcja 7. 4;
tab. 8. 1), a powstałe różnej długości fragmenty są rozdzielane w elektroforezie
żelowej (sekcja 8. 5. 1. 4). Następnie fragmenty są denaturowane (stają się jednoni-
ciowe) in situ (tzn. w żelu) i przenoszone na błonę nitrocelulozową lub inny noś-
nik (rys. 8. 13). Po przeniesieniu (ang. blotting) prążki utworzone przez frag-
menty DNA są wybarwiane. Wzorzec dla danego organizmu, tworzony przez
wybarwione fragmenty (tzn. odcisk — ang. fingerprint), odzwierciedla liczbę
i lokalizację miejsc restrykcyjnych (dla danego enzymu) w chromosomie — jest
więc charakterystyczny dla danego organizmu. Różniące się organizmy mogą
być więc klasyfikowane/identyfikowane na podstawie ich „odcisków". (Aktual-
nie termin „odcisk" odnosi się też do nowszych metod, takich jak AP-PCR (patrz
dalej), w których odcisk uzyskuje się innymi metodami. )
W oryginalnej metodzie problem może stanowić zbyt duża liczba fragmen-
tów, dających tak złożony odcisk, że jest on zbyt trudny do interpretacji. Jednym
z rozwiązań tego problemu jest zastosowanie enzymu, który tnie DNA „rzadko"
(tab. 8. 1). Powstające nieliczne, większe fragmenty można rozdzielić do analizy
np. stosując PFGE (sekcja 8. 5. 1. 4).
Innym rozwiązaniem jest wykorzystanie znakowanej sondy (sekcja 8. 5. 3),
wiążącej się jedynie z tymi nielicznymi fragmentami chromosomu przeniesio-
nymi na membranę, które zawierają sekwencję komplementarną do niej. Ponie-
waż zaś tylko te fragmenty, które wiążą się z sondą, będą uwidocznione, to
odcisk będzie się składał z małej liczby prążków. Jedną z takich sond może być
znakowany rRNA. Będzie się on wiązał z fragmentami chromosomu zawie-
rającymi geny kodujące rRNA. Wiele bakterii (chociaż np. nie Mycobacterium
tuberculosis) zawiera liczne kopie genów rRNA, tak że sekwencje wiążące sondę
będą występowały na małej liczbie fragmentów chromosomu. Powstający odcisk
będzie się składał z małej liczby prążków. Metoda ta, wykorzystująca sondę ze
znakowanego rRNA lub ze znakowanego komplementarnego DNA, zwana jest
rybotypowaniem (rys. 16. 6a). Rybotypowanie jest wykorzystywane w epidemio-
logii molekularnej. Rozróżniono dzięki niemu szczepy Legionella pneumophila
z 1 serogrupy, które są identyczne, gdy się je bada stosując rutynową metodę
określania sereotypów (serotypowania) [Matsiota-Bernard i wsp. (1994)
FEMSIMM 9: 23-28].

423
 16. 2. 2. 4 Metody wykorzystujące PCR z dowolnymi starterami
Kilka bardzo podobnych metod — powszechnie stosowanych do typowania —
wykorzystuje PCR (sekcja 8. 5. 4) ze starterami o przypadkowej (dowolnej) sek-
wencji. Wszystkie te metody nazwano analizą polimorfizmu długości zampli-
fikowanych fragmentów (AFLP, ang. amplification fragment length poly-
morphism) (ale zwróć uwagę na „Odcisk DNA z wykorzystaniem AFLP" na
stronie 428).
W metodach tych starter jest wykorzystywany do zamplifikowania przypad-
kowych, nieciągłych sekwencji chromosomowego DNA. Potrzebny jest tylko
jeden typ startera (porównaj z podstawową metodą PCR, w którym stosuje się
dwa startery). Kopie dowolnego startera wiążą się z różnymi sekwencjami o naj-
wyższej zgodności w najbardziej rygorystycznych warunkach (sekcja 8. 5. 4)
a powstające różne produkty PCR są następnie badane z zastosowaniem elektro-
forezy żelowej i barwienia (co ukazuje „odcisk" lub inaczej „profil" danego orga-
nizmu). Ponieważ starter jest dowolny, nie możemy przewidzieć, które sekwen-
cje w chromosomie zostaną skopiowane; jednak metodę tę można zastosować do
typowania, gdyż w określonych warunkach, zawsze te same sekwencje będą
kopiowane.
Metody te mają pewne korzystne cechy dla typowania, tzn. cały chromosom
jest potencjalnie dostępny do badania i nie musimy wcześniej znać genomu, tak
więc może być w ten sposób typowany każdy z wyizolowanych szczepów.
Reakcja PCR z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang. arbitrarily primed PCR),
którą można uznać za metodę reprezentatywną, opisano na rysunku 16. 4c.
W tabeli 16. 1 porównano ją z innymi metodami.

424
 Analiza polimorfizmu przypadkowo zamplifikowanego DNA (RAPD ana-
lysis, ang. random amplified polymorphic DNA) jest bardzo podobna do
AP-PCR. Niektórzy autorzy uznają obie metody za równoważne. Różnią się one
np. tym, że w pierwszej z nich wykorzystuje się zwykle krótsze startery
(tab. 16. 1). Kiedy grupę szczepów porównuje się z zastosowaniem analizy
RAPD, należy powtórzyć badanie z kilkoma różnymi starterami. Różne startery

W przypadku każdego szczepu krótkie kawałki DNA (skopiowane z chromosomu) rozdzielono

w elektroforezie żelowej (na fotografii DNA przesuwa się z góry na dół). Skala po lewej stronie
podaje wielkość fragmentów w postaci liczby zawartych zasad. (Zwróć uwagę, że w czasie elektrofo-
rezy mniejsze kawałki DNA przesunęły się dalej. ) Jeden ze szczepów (29) różni się wyraźnie od pozo-
stałych. Inne można pogrupować zgodnie z ich sekwencjami. Zdjęcie dzięki uprzejmości dr. Michaela
McClellanda, California Institute of Biological Research, La Jolla, California, USA.

425
dają odmienne produkty PCR (jako że wiążą się z innymi sekwencjami najlepiej
dopasowanymi (ang. „best-fit"), tak więc postępowanie to zwiększa szansę
odkrycia różnic między szczepami. Metoda RAPD jest stosowana np. w moleku-
larnej epidemiologii.
Metoda otrzymywania odcisku w wyniku bezpośredniej amplifikacji (DAF,
ang. direct amplification fingerprinting) różni się od dwóch innych metod np.
tym, że stosuje się tu bardzo krótkie startery (tab. 16. 1).
Kłopoty we wszystkich tych metodach sprawia powtarzalność. W danym labo-
ratorium po wystandaryzowaniu metod uzyskuje się wyniki powtarzalne, nato-
miast mogą być one odmienne od wyników otrzymanych w innych placówkach,
jeśli nie stosuje się tam identycznych procedur. Porównywalność odcisków
zależy nie tylko od startera, ale również od zastosowania swoistej polimerazy
[Schierwater i Ender (1993) NAR 21: 4647-4648] i od sposobu przygotowania
próbki DNA [Micheli i wsp. (1994) NAR 22: 1921-1922]. (Patrz też sekcja
16. 1. 6. 2. )

16. 2. 2. 5 Metoda PCR oparta na sekwencjach powtarzalnych

W metodzie PCR opartej na sekwencjach powtarzalnych (REP-PCR, ang. repeti-
tive sequence - based PCR) stosuje się PCR do stworzenia odcisków DNA przez
kopiowanie określonego rodzaju sekwencji w chromosomie (a nie sekwencji
przypadkowych, jak w omówionych wcześniej metodach). Można się nią
posłużyć tylko w przypadku tych bakterii (np. Escherichia coli), których chromo-
som zawiera wiele kopii swoistej sekwencji nukleotydowej — takiej jak sekwen-
cja REP (ang. repetitive extragenic palindromic sequence) Każda taka sekwencja
zawiera sekwencję palindromową (tzn. region kwasu nukleinowego z parą
odwróconych powtórzeń — patrz sekcja 8. 3). Występują one w niekodujących
(fenotypowo niewyrażanych) częściach chromosomu.
Startery w REP-PCR są tak zaplanowane, że mogą się wiązać z różnymi for-
mami sekwencji REP, jakie występują w poszczególnych szczepach. Dzięki
REP-PCR uzyskuje się cząsteczki DNA o różnych rozmiarach (rys. 16. 4d), a ich
zróżnicowana długość odzwierciedla różnice w odległości między kolejnymi
sekwencjami REP w danym chromosomie. Po rozdzieleniu w elektroforezie żelo-
wej cząsteczki te dają charakterystyczny odcisk, na podstawie którego można
porównywać/klasyfikować organizmy.

16. 2. 2. 6 Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

(RFLP, ang. restriction fragment length polymorphism) i PCR-RFLP
Można porównać pokrewne sekwencje nukleotydów (np. zmienne formy danej
części chromosomu) poddając je działaniu tej samej endonukleazy restrykcyjnej
(lub kilku takich enzymów). Oczywiście, w przypadku identycznych sekwencji,
stosując dany enzym(y) otrzymamy takie same fragmenty. Jeśli jednak mutacja
w jednej sekwencji zniszczyła (lub stworzyła) miejsce restrykcyjne (miejsce cię-
cia) lub jeśli jakieś nukleotydy uległy delecji bądź insercji, to otrzymamy różne
fragmenty (rys. 16. 4e). Elektroforeza i wybarwienie fragmentów z danej sekwen-

426
cji da charakterystyczny odcisk DNA. Można więc porównywać różne sekwen-
cje, porównując ich odciski. (Już same fragmenty wytworzone w tej metodzie
nazywa się często RFLP. )
Można wykorzystać RFLP dwoma różnymi sposobami — w zależności od
długości cząsteczki tarczowej. Elektroforeza i barwienie prążków w żelu (jak opi-
sano wyżej) jest odpowiednia dla stosunkowo krótkich cząsteczek — takich jak
duże plazmidy lub część bakteryjnego chromosomu (otrzymanego np. w wyniku
PFGE), gdyż uzyskujemy tu stosunkowo mało prążków w żelu. W przypadku
dużych cząsteczek (np. całego chromosomu bakteryjnego) stosuje się wstępne
cięcie enzymem(ami) restrykcyjnym(i), a uzyskane fragmenty rozdziela się
elektroforetycznie. Po przeniesieniu ich metodą Southerna (ang. Southern blot-
ting) (rys. 8. 13) na membranę poddaje się ją działaniu (znakowanych) sond, które
są komplementarne tylko do jednej lub nielicznych sekwencji w chromosomie -
i tym samym wiążą się tylko z jednym (lub nielicznymi) prążkami w żelu. Zwróć
uwagę, że rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3) jest szczególna formą typowania
opartą na RFLP.
Taką analizę RFLP, jak opisano wyżej, stosuje się do identyfikacji/klasyfikacji
na poziomie gatunku/szczepu.
W konwencjonalnej analizie RFLP trudność może sprawić przygotowanie
dostatecznej ilości określonej sekwencji. Innym potencjalnym problemem jest
metylacja DNA (sekcja 7. 4) wyizolowanego z komórek: może ona wpływać na
aktywność enzymów restrykcyjnych wybranych do badania. Dzięki analizie
PCR-RFLP można przezwyciężyć te kłopoty. Wybiera się tu wstępnie i amplifi-
kuje, stosując PCR, swoistą sekwencję tarczową (zwykle o długości 1-2 kz).
Produkt amplifikacji (niemetylowany, gdyż zsyntetyzowany in vitro) jest na-
stępnie poddawany analizie RFLP, jak opisano wyżej. PCR-RFLP stosowano np.
do badania genów 23S rRNA szczepów Campylobacter jejuni [Iriarte i Owen
(1996) LAM 23: 163-166] i do typowania szczepów Staphylococcus aureus izolo-
wanych z krów i owiec z zapaleniem wymienia [Marcos i wsp. (1999) JCM 37:
570-574].

16. 2. 2. 7 Rybotypowanie z zastosowaniem PCR

Konwencjonalne rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3; rys. 16. 6a) jest dość cza-
sochłonne. Alternatywą jest metoda PCR (sekcja 8. 5. 4), którą można wykorzystać
do rozróżniania szczepów, przez poszukiwanie różnic w specyficznej części
chromosomu, kodującej rRNA. Metoda ta, zwana rybotypowaniem z zastosowa-
niem PCR (ang. PCR ribotyping), została przedstawiona w opisie rysunku 16. 6b.
Wykorzystano ją np. do typowania szczepów Burkholderia [Kostman i wsp. (1992)
JCM 30: 2084-2087] i do wykrywania gatunków Rhizobium [de Oliveira i wsp.
(1999) LAM 28: 137-141].
Jeżeli badając określone szczepy uzyskujemy identyczne produkty PCR, to
niekiedy można wykazać różnice między nimi poddając ponownemu typowaniu
właśnie te uzyskane produkty PCR. Nie udało się to w przypadku analizy 40 izo-
latów Clostridium difficile, których produkty uzyskane metodą PCR były identy-
czne (rybotyp 1 PCR). Produkty te badano ponownie — z zastosowaniem analizy
RFLP (sekcja 16. 2. 2. 6) i różnych endonukleaz restrykcyjnych (sekcja 8. 5. 1. 3;

427
(a) Rybotypowanie (sekcja 16. 2. 2. 3). Chromosomy danego szczepu bakterii są cięte endonukleazą
restrykcyjną na fragmenty. Przedstawiono jeden z takich chromosomów, a kreski oznaczają miejsca
cięcia. Geny kodujące rRNA zostały pokazane jako linie pogrubione po prawej stronie (ich względna
długość jest dla przejrzystości przesadnie duża). Geny te zostały przecięte na trzy fragmenty.
Wszystkie fragmenty chromosomu poddaje się elektroforezie i po przeniesieniu na membranę (blot-
ting) są one eksponowane na działanie znakowanych sond. Trzy prążki DNA — odpowiadające
trzem wspomnianym wyżej fragmentom — zwiążą się z wyznakowaną sondą, dzięki czemu będzie
można je wykryć. Znakowanie radioaktywne uwidacznia się dzięki autoradiografii (zasady wyjaśnia
rys. 8. 10). Rybotypowanie odzwierciedla więc rozmieszczenie miejsc cięcia (dla danego enzymu)
w genach rRNA badanego szczepu. Bakterie należące do różnych szczepów mają różne miejsca cięcia
w swoich genach rRNA, powstaną więc fragmenty o odpowiednio różnej długości, wykrywane jako
prążki różniące się względną pozycją na autoradiogramie.
(b) Rybotypowanie z zastosowaniem PCR (sekcja 16. 2. 2. 7). U większości, a może nawet u wszystkich
bakterii, trzy typy rRNA (sekcja 2. 2. 3) są kodowane przez geny tworzące operon (sekcja 7. 8. 1).
Na przykład u E. coli kolejność transkrypcji jest następująca: 16S rRNA, 23S rRNA i 5S rRNA. U wielu
bakterii (ale nie u Mycobacterium tuberculosis) chromosom zawiera wielokrotne kopie operonu
rRNA. Schemat pokazuje część operonu rRNA, kodującego cząsteczki 16S i 23S. Obie nici duple-
ksu pokazano jako oddzielne, cienkie linie równoległe, a regiony kodujące obu genów jako grube
linie Sekwencja nukleotydowa między regionami kodującymi zwana jest przerywnikiem
(ang. spacer). Startery (małe strzałki) są tak zaplanowane, aby wiązały się z niektórymi, w wysokim
stopniu konserwatywnymi, sekwencjami w regionach kodujących 16S i 23S. Produkty PCR utwo-
rzone w czasie elongacji (linie przerywane) będą więc zawierały przerywniki. Długość przerywnika
może być inna w różnych kopiach operonu rRNA w obrębie tego samego chromosomu. Stąd też po
elektroforezie można otrzymać więcej niż jeden prążek — choć dla danego szczepu może to być
powtarzalne. Ogólnie mówiąc, zmienność długości DNA przerywnika w różnych izolatach można
wykorzystać do typowania.

tab. 8. 1), nie znajdując różnic między szczepami (co wskazuje na wysoki stopień
ich homogeniczności), chociaż dla szczepów kontrolnych (o różnych rybotypach
PCR) uzyskano różne wyniki RFLP [Brazier, O'Neill i Duerden (1997) RMM 8
(supplement 1): S55-S56].

16. 2. 2. 8 Odcisk DNA z wykorzystaniem AFLP

Metoda ta (rys. 16. 7) polega na: 1) trawieniu chromosomu dwoma typami enzy-
mów restrykcyjnych, 2) dodaniu krótkiej sekwencji „adaptorowej" do obu koń-

428
(a) Po lewej stronie pokazano jeden koniec fragmentu, przeciętego EcoRI (tab. 8. 1). („N" jest nukleoty-
dem, tzn. A, T, C lub G. ) Po prawej stronie widać jeden z dwóch typów cząsteczek adaptorowych.
Ma ona lepki koniec (5'-AATT) odpowiadający miejscu restrykcyjnemu EcoRI.
(b) Koniec fragmentu i cząsteczka adaptora, pokazane w (a), zostały zligowane, a następnie w czasie
PCR doszło do rozdzielenia nici. Wyższa nić związała starter {5'-NNNNAATTCT). Starter może
zostać wydłużony w reakcji PCR, jeżeli jego koniec 3' (T) ulegnie sparowaniu z komplementarną
zasadą — w tym wypadku adeniną (A) — w nici fragmentu. Dotyczy to każdego miejsca wiążącego
starter, więc tylko niektóre startery ulegną elongacji. Produkty reakcji PCR bada się metodą elektrofo-
rezy żelowej. Znakowane startery tworzą prążki, które stanowią odcisk.

ców wszystkich fragmentów i 3) amplifikacji za pomocą PCR niektórych frag-

mentów. (Nie jest to „analiza AFLP" wymieniona w sekcji 16. 2. 2. 4. )
Fragmenty retrykcyjne są mieszane z dwoma typami cząsteczek adaptoro-
wych (typu „A" i „Β"), z których każda ma jeden lepki koniec odpowiadający
miejscu cięcia przez jedną lub drugą endonukleazę restrykcyjną. W wyniku liga-
cji powstają więc następujące rodzaje sekwencji: A-fragment-A, A-fragment-B,
B-fragment-A i B-fragment-B. (Zwróć uwagę, że w każdej cząsteczce adaptoro-
wej nukleotyd bezpośrednio przylegający do wystającej części jednoniciowej jest
tak dobrany, aby po ligacji nie dochodziło do powstania miejsca cięcia. Dzięki
temu unika się cyklu ligacja-restrykcja-ligacja-restrykcja... itd. )
Startery PCR są tak zaplanowane, by były komplementarne do cząsteczek
adaptorowych (włączając miejsce restrykcyjne). Ważne jest, by koniec 3' każdego
startera rozciągał się o jeden (lub kilka) nukleotydów za miejsce restrykcyjne —
tak że dany fragment będzie amplifikowany tylko wówczas, gdy te końcowe
„selektywne" nukleotydy są komplementarne do zasad we fragmencie. Aby
zapewnić swoistość, we wcześniejszych cyklach PCR zachowuje się najbardziej
rygorystyczne warunki (sekcja 8. 5. 4). Każdy starter można wyznakować, co
umożliwia detekcję prążków po elektroforezie produktów zamplifikowanych za
pomocą PCR.
Dzięki AFLP rozróżnia się blisko spokrewnione szczepy. Metoda jest użyte-
czna do typowania oraz w epidemiologii [Janssen i wsp. (1996) Microbiology 142:
1881-1893]. Była stosowana np. do przeprowadzenia oceny taksonomicznej
Bacillus anthracis i niektórych spokrewnionych z nim gatunków [Keim i wsp.
(1997) JB 179: 818-824], a także do badania zmienności genetycznej Xanthomonas
[Restrepo i wsp. (1999) Microbiology 145: 107-114].
 ANEKS

Krótkie opisy niektórych rodzajów, rodzin,

rzędów i innych kategorii bakterii

Przedstawione tu krótkie opisy, zawierające najbardziej istotne cechy bakterii

wymienionych w tekście, mają na celu szybkie dostarczenie Czytelnikowi nie-
zbędnych informacji. Inne szczegóły dotyczące tych, a także wielu innych bakte-
rii (oraz innych mikroorganizmów) można znaleźć w Dictionary of Microbiology
and Molecular Biology [Singleton i Sainsbury (2 wyd. 1987); John Wiley: Chiche-
ster, Wlk. Brytania; ISBN 0-471-94052-6]. Słownik zawiera też hasła dotyczące ter-
minów, testów, technik, szlaków biochemicznych i tematów z dziedziny gene-
tyki, biologii molekularnej, medycyny i immunologii.
Różnica między terminem „gramdodatni" a „typu gramdodatniego" itp.
została wyjaśniona w sekcji 14. 9. 1.
Zawartość % GC (sekcja 16. 2. 1) podaje zakres dla rodzaju lub innej kategorii.
Gatunek typowy to gatunek uważany za „stałego przedstawiciela" danego
rodzaju.
„Coccobacillus" (l. m. coccobacilli) to forma pośrednia między ziarniakiem
a pałeczką/laseczką. Termin ten nie ma polskiego odpowiednika (przyp. tłum. ).
Acetobacter (rodzaj). Typ gramujemny. Komórki owoidalne/pałeczki, 0, 6-0, 8x1-4 μm. Nie-
ruchliwe lub urzęsione. Ściśle tlenowe. Temperatura opt. 25-30°C. Chemoorganohetero-
trofy. Metabolizm oddechowy. Wiele szczepów utlenia etanol do kwasu octowego/CC^;
wykorzystywane do produkcji octu. Cukry są najprawdopodobniej metabolizowane
w szlaku heksozomonofosforanowym i w cyklu kwasów trikarboksylowych. 51-65% GC.
Gatunek typowy: A. aceti.
Acinetobacter (rodzaj). Typ gramujemny. Pałeczki, 0, 9-1, 6x1, 5-2, 5 μm. Nieruchliwe. Ściśle tle-
nowe. Temperatura opt. zwykle 33-35°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm odde-
chowy. Większość szczepów rośnie na podłożu minimalnym z solami i octanem, etanolem
lub mleczanem; nieliczne wykorzystują glukozę. Oksydazoujemne. Występują w glebie,
w wodzie; mogą być oportunistycznymi patogenami człowieka. [Taksonomia i epidemiolo-
gia: Gerner-Smidt (1995) RMM 6: 186-195. ] Ok. 38-47% GC. Gatunek typowy:
A. calcoaceticus.
Actinobacillus (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/ziarniaki, ok. 0, 3-0, 5 χ 0, 6-1, 4 μm; nieruchliwe.
Względne beztlenowce. Temperatura opt. ok. 37°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm
oddechowy i fermentacyjny. Wymagają bogatych podłoży. Brak gazu w fermentacji glu-

430
 kozy, laktozy itp. Występują u ludzi, zwierząt; mogą być patogenami. 40-43% GC. Gatunek
typowy: A. lignieresii.
Actinomyces (rodzaj). Typ gramdodatni. Pałeczki lub formy nitkowate, często rozgałęzione;
nieruchliwe. Brak spor. Zwykle beztlenowce/mikroaerofile. Temperatura opt. ok. 37°C.
Chemoorganoheterotrofy. Przede wszystkim fermentacyjne. Węglowodany fermentowane
bez wytworzenia gazu. Występują u zwierząt stałocieplnych, np. w jamie gębowej; mogą
być patogenami. Około 57-73% GC. Gatunek typowy: A. bovis.
Actinomycetales (rząd). Typ gramdodatni. Większość rodzajów tlenowce. Ziarniaki, pałeczki,
grzybnia (w zależności od rodzaju); zwykle nieruchliwe. Spory u wielu gatunków. Wystę-
pują w glebie, kompoście, wodzie itd.; niektóre gatunki symbiotyczne dla roślin, inne pato-
genne dla człowieka, zwierząt lub roślin. Duża liczba gatunków, w tym Actinomyces, Arthro-
bacter, Corynebacterium, Mycobacterium i Streptomyces.
Aeromonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki lub „coccobacilli", 0, 3-1, 0 χ 1, 0-3, 5 μm; pojedyncze,
pary, łańcuszki, formy nitkowate. Niektóre gatunki ruchliwe (urzęsienie zwykle monotry-
chalne); gatunki psychrotrofowe — nieruchliwe. Względne beztlenowce. Chemoorganohete-
rotrofy. Metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Wykorzystują cukry, kwasy organiczne
jako jedyne źródło węgla. Oksydazododatnie. Występują w wodach słodkich i morskich.
Aeromonas salmoncida (temperatura opt. 22-25°C) jest pasożytem/patogenem ryb. Są
dowody na jego chorobotwórczość dla ludzi (np. biegunki, zakażenia ran) [Thornley i wsp.
(1997) RMM 8: 61-72]. 57-63% GC. Gatunek typowy: A. hydrophila.
Agrobacterium (rodzaj). Gramujemny. Pałeczki 0, 6-1x1, 5-3 μm, z otoczkami, ruchliwe. Tle-
nowce. Temperatura opt. 25-28°C. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowy. Glu-
koza metabolizowana głównie w szlaku Entnera-Doudoroffa i heksozomonofosforanowym
(sekcja 6. 2). Występują w glebie; większość szczepów może indukować nowotwory roślin,
a ich Patogenność jest kodowana przez plazmidy. 57-63% GC. Gatunek typowy:
A. tumefaciens.
Alcaligenes (rodzaj o nieustalonej pozycji taksonomicznej). Gramujemne. Pałeczki, „coccoba-
cilli", ziarniaki; ruchliwe. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy, niektóre szczepy chemolito-
trofy. Metabolizm oddechowy. Wykorzystują octan, mleczan, aminokwasy itd. jako źródła
węgla. Oksydazododatnie. Występują w glebie, wodzie, kręgowcach itd. 56-70% GC. Gatu-
nek typowy: A. faecalis.
Alteromonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 7-1, 5 x 1, 8-3 μm, niektóre barwne (żółte, poma-
rańczowe, fioletowe itd. ); urzęsienie monotrychalne. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy.
Metabolizm oddechowy. Źródła węgla to np. octan, alkohole, aminokwasy, cukry. Wystę-
pują w wodzie morskiej. Około 38-50% GC. Gatunek typowy: A. macleodii.
Anabaena (rodzaj). Typ gramujemny. Sinice nitkowate (patrz); w nici komórki kuliste, owoidal-
ne lub cylindryczne. Wakuole gazowe. Heterocysty. Anabaena flos-aąuae może powodować
„zakwity" (sekcja 10. 1. 1) i wytwarzać toksyny (anatoksyny).
Anaplasma (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, około 0, 3 μm średnicy. Rozwijają się w erytrocy-
tach (krwinkach czerwonych) przeżuwaczy. Występują na całym świecie.
Aphanizomenon (rodzaj). Typ gramujemny. Sinice nitkowate (patrz); w niciach poszczególne
komórki cylindryczne, natomiast komórki końcowe zwężają się stożkowato, tworząc bez-
barwne „komórki włosowate". Wakuole gazowe. Heterocysty. Mogą tworzyć „zakwity"
(sekcja 10. 1. 1) w wodach słodkich i słonawych; niektóre szczepy wytwarzają toksyny.
Aquaspirillum (rodzaj). Gramujemne. Komórki zwykle helikalne, sztywne, 0, 2-1, 4x2-30 μm
(u niektórych gatunków dłuższe). Ruchliwe. Tlenowe/względnie beztlenowe. Chemoorga-
noheterotrofy/chemolitoautotrofy. Metabolizm oddechowy. Źródło węgla: np. amino-
kwasy, zwykle nie są to węglowodany. Niektóre gatunki (np. A. peregrinum) mogą beztle-
nowo wiązać azot cząsteczkowy. Zwykle oksydazododatnie. Występują w różnych sied-
liskach wód słodkich. 49-66% GC. Gatunek typowy: A. serpens.
Archaea (domena). Patrz sekcja 1. 1. 1 i rys. 16. 5.

431
Archaebacteria (królestwo). Różnią się od Eubacteria (patrz) (i od organizmów eukariotycz-
nych) np. sekwencją nukleotydów 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2), budową chemiczną błony
cytoplazmatycznej i ściany komórkowej (w której brak jest peptydoglikanu). Archaebacteria
występują w „nieprzyjaznych" środowiskach — wiele z nich to np. ekstremalne termofile
lub halofile (sekcja 3. 1. 4 i 3. 1. 7). Obejmują takie rodzaje jak Desulfurococcus, Halobacterium,
Thermoproteus. Obecnie w wyniku reklasyfikacji królewstwo zostało przekształcone
w domenę Archaea.
Azotobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/"coccobacilli"/formy nitkowate; ruchliwe bądź
nieruchliwe. Cysty (sekcja 4. 3. 3). Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Źródła węgla: np.
cukry, etanol. Wiążą azot (sekcja 10. 3. 2. 1). Większość szczepów oksydazododatnia. Wystę-
pują np. w żyznych glebach o prawie obojętnym pH. 63-68% GC. Gatunek typowy:
A. chroococcum.
Bacillus (rodzaj). Typ gramdodatni. Laseczki, często 0, 5-1, 5x2-6 μm, zwykle ruchliwe. Endo-
spory (sekcja 4. 3. 1). Tlenowce lub względne beztlenowce, w zależności od gatunku. Metabo-
lizm oddechowy lub względnie fermentacyjny. Większość gatunków to chemoorganohete-
rotrofy; wiele rośnie na agarze odżywczym. Niektóre gatunki (np. B. polymyxa) wiążą azot
(sekcja 10. 3. 2. 1). Bacillus Schlegelii może rosnąć chemolitoautotroficznie. Żyją jako saprotrofy
w glebie i wodzie; niektóre gatunki wywołują choroby człowieka i zwierząt (w tym pew-
nych owadów). 30-70% GC. Gatunek typowy: B. subtilis.
Bacteroides (rodzaj). Pałeczki lub formy nitkowate (niektóre barwne), nieruchliwe lub ruchliwe.
Beztlenowce. Metabolizm zwykle fermentacyjny; niektóre szczepy mogą oddychać beztle-
nowo. Większość szczepów wykorzystuje cukry, inne peptony. Występują np. w przewo-
dzie pokarmowym zwierząt stałocieplnych; część gatunków to patogeny oportunistyczne.
28-61% GC. Gatunek typowy: B. fragilis. (Jak to widać chociażby z zakresu %GC, rodzaj Bac-
teroides jest bardzo niejednorodny. Niektórzy uważają, że powinno się do niego zaliczać
tylko B. fragilis i organizmy ściśle z nim spokrewnione [Shah & Collins (1989) IJSB 39:
85-87]. )
Bartonella (rodzaj). Gramujemne, oksydazoujemne. Pałeczki. B. bacilliformis jest czynnikiem
wywołującym gorączkę Oroya (sekcja 11. 3. 3. 3); B. clarridgeiae wiąże się z chorobą kociego
pazura [Kordick i wsp. (1997) JCM 35: 1813-1818]. Rodzaj ten zawiera obecnie bakterie
uprzednio zaliczane do rodzaju Rochalimaea. Można je hodować w obecności 5% CO 2 np. na
podłożach agarowych wzbogaconych krwią baranią. [Bartonella (artykuł przeglądowy):
Adal (1995) RMM 6: 155-164. ]
Bdellovibrio (rodzaj). Gramujemne. Komórki: o kształcie zbliżonym do przecinkowców,
0, 2-0, 5 x 0, 5-1, 4 μm, zaopatrzone w jedną rzęskę z pochewką. Tlenowce. Metabolizm odde-
chowy. Chemoorganoheterotrofy. Drapieżne: rosną w przestrzeni peryplazmatycznej
innych bakterii (np. Aąuaspirillum serpens, Escherichia coli, Pseudomonas spp. ), trawiąc je.
Występują np. w glebie i ściekach. 33-51% GC. Gatunek typowy: B. bacteriovorus.
Beggiatoa (rodzaj). Gramujemne. Nici złożone z komórek. Tlenowce/mikroaerofile/beztleno-
wce. Metabolizm oddechowy. Zwykle chemoorganoheterotrofy; źródła węgla np. octan, ale
nie heksozy (np. glukoza). Występuje w wielu siedliskach wodnych.
Beijerinckia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, zwykle 0, 5-1, 5x1, 7-4, 5 μm, ruchliwe lub nie-
ruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy; wykorzystują
cukry (np. glukozę) jako źródła węgla. Mogą wiązać azot (sekcja 10. 3. 2. 1). Temperatura opt.
20-30°C. Nie rosną w 37°C. Występują np. w glebie i na powierzchni liści. 55-61% GC.
Gatunek typowy B. indica.
Bordetella (rodzaj). Gramujemne. „Coccobacilli", ok. 0, 2-0, 5x0, 5-2 μm, nieruchliwe bądź
ruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Źródła węgla: np. aminokwasy; nie wykorzy-
stują cukrów. Wymagają bogatych podłoży do wzrostu. Występują np. jako pasożyty/pato-
geny układu oddechowego ssaków. 66-70% GC. Gatunek typowy: B. pertussis.

432
Borrelia (rodzaj należący do rzędu Spirochaetales — patrz szczegóły). Komórki:
0, 2-0, 5 x 3-20 μm. Beztlenowce/mikroaerofile. Niektóre gatunki można hodować na pożyw-
kach złożonych. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. Gatunek
typowy: B. anserina.
Brucella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, „coccobacilli" lub komórki kokoidalne około
0, 5-0, 7x0, 6-1, 5 μm; nieruchliwe. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganohetero-
trofy. Do hodowli wymagają złożonych podłoży wzbogaconych. Większość szczepów —
oksydazododatnia i na ogół ureazododatnia. Występują zwykle jako wewnątrzkomórkowe
pasożyty/patogeny zwierząt i człowieka. 55-58% GC. Gatunek typowy: B. melitensis.
Burkholderia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki. Tlenowce. Burkholderia cepacia (uprzednio Pseudo-
monas cepacia) może wywołać choroby roślin i człowieka (patrz sekcja 11. 3. 2. 1). Gatunek
typowy: B. cepacia. [B. cepacia (medical, taxonomic and ecological issues): Govan, Hughes &
Vandamme (1996) JMM 45: 395-407. ]
Catnpylobacter (rodzaj). Gramujemne. Komórki: spiralne, zwykle 0, 2-0, 5x0, 5-5 μm (patrz fot.
12. 1); ruchliwe dzięki pojedynczej rzęsce (bez pochewki) usytuowanej na jednym lub na obu
biegunach. Mikroaerofile, wymagające 3-5% CO 2 do wzrostu. Metabolizm oddechowy.
Chemoorganoheterotrofy. Źródła węgla: aminokwasy lub związki pośrednie uczestniczące
w cyklu Krebsa (rys. 5. 10), ale nie węglowodany. Oksydazododatnie. Występują np.
w układzie rozrodczym i przewodzie pokarmowym człowieka i innych zwierząt. 30-38%
GC. Gatunek typowy: C. fetus. (C. pylori został przeniesiony do nowego rodzaju Helicobacter
[Goodwin i wsp. (1989) IJSB 39: 397-405.
Caulobacter (rodzaj). Gramujemne. Złożony cykl życiowy (sekcja 4. 1). Niektóre szczepy są
barwne. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy. Występują w niektó-
rych glebach i wodach. 64-67% GC. Gatunek typowy: C. vibrioides.
Cellulomonas (rodzaj). Typ gramdodatni. Pałeczki/formy nitkowate/komórki kokoidalne, nie-
ruchliwe bądź ruchliwe. Tlenowce/względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy lub fer-
mentacyjny. Chemoorganoheterotrofy. Rozkładają skrobię i celulozę. Występują np. w gle-
bie. 71-77% GC. Gatunek typowy: C. flavigena.
Chlamydia (rodzaj). Gramujemne. Komórki: różny wygląd w zależności od fazy cyklu rozwojo-
wego, ale są nieruchliwe, kokoidalne, o średnicy 9, 2-1, 5 μm, i pleomorficzne. Bezwzględne
pasożyty/patogeny wewnątrzkomórkowe człowieka i innych zwierząt. Można je hodować
w pęcherzyku żółtkowym zarodków kurzych i hodowlach komórkowych. 41-44% GC.
Gatunek typowy: C. trachomatis.
Chlorobium (rodzaj). Gramujemny. Pałeczki lub przecinkowce, o długości około 1-2 μm, nie-
ruchliwe. Bezwzględne beztlenowce. Głównie fotolitoautotrofy (donor elektronów: np. siar-
czek). Chlorofil mieści się w chlorosomach (sekcja 2. 2. 7). Występują np. w mule zawie-
rającym siarczki.
Clostridium (rodzaj). Typ gramdodatni. Komórki: laseczki 0, 3-1, 9 χ 2-10 μm, ruchliwe lub nie-
ruchliwe. Endospory (sekcja 4. 3. 1). Bezwzględne beztlenowce (w niewielu przypadkach
aerotolerancyjne). Chemoorganoheterotrofy. Zwykle metabolizm fermentacyjny, chociaż
niektóre szczepy (np. C. perfringens) mogą przeprowadzać oddychanie azotanowe (sek-
cja 5. 1. 1. 2). Wzrost w/na podłożach podstawowych często słaby. Występują np. w glebie
i w jelitach człowieka i innych zwierząt; niektóre gatunki są patogenne. 22-55 % GC. Gatu-
nek typowy: C. butyricum. (Na podstawie wyników badania sekwencji genów 16S rRNA
stwierdzono, że rodzaj Clostridium jest bardzo niejednorodny i zaproponowano przeniesie-
nie niektórych gatunków do pięciu nowo utworzonych rodzajów: Caloramator, Filifactor,
Moorella, Oxobacter i Oxalophagus [Collins i wsp. (1994) IJSB 44: 812-826]. )
coli (grupa coli). Ogólnie: każda gramujemna, nie tworząca spor, względnie beztlenowa
pałeczka, która może fermentować laktozę w 37°C, z wytworzeniem w ciągu 48 godz. kwasu
i gazu. Dla bakteriologów zajmujących się badaniem wody (w Wielkiej Brytanii) do tej grupy
należy każdy przedstawiciel Enterobacteriaceae, który rośnie w 37°C i zwykle ma enzym

433
 β-galaktozydazę [patrz Report 71 (1994) HMSO, London; ISBN 011 753010 7]. Escherichia coli
jest typową bakterią z grupy coli. (Patrz tab. 1. 3. 2. )
Corynebacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki, często zakrzywione/formy pleomorficzne,
nieruchliwe. Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowy
i fermentacyjny. Występuje np. w glebie i szczątkach roślinnych; niektóre gatunki są pasoży-
tami/patogenami człowieka i innych zwierząt. 51-59% GC. Gatunek typowy: C. diphtheriae.
Coxiella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki (bardzo pleomorficzne), 0, 2-0, 4x0, 4-1 μm, nie-
ruchliwe. Endospory (sekcja 4. 3. 1). Jedyny gatunek C. burnetii jest bezwzględnym pasoży-
tem/patogenem wewnątrzkomórkowym kręgowców i stawonogów; przechodzi cykl roz-
wojowy. Około 43% GC.
cyjanobakterie (polski synonim — sinice), („glony niebieskozielone")· Kategoria nie taksono-
miczna. Bakterie fotosyntetyzujące, które różnią się od innych prokariotów fototroficznych
tym, że: mają chlorofil a i przeprowadzają fotosyntezę oksygenową (sekcja 5. 2. 1. 1) (por. Pro-
chloron). Komórki: typu gramujemnego, występują pojedynczo lub w niciach (w zależności
od gatunku). Brak rzęsek; niektóre wykazują ruch ślizgowy (sekcja 2. 2. 15. 1). Niektóre mają
wakuole gazowe (sekcja 2. 2. 5). W zależności od wytwarzanych barwników komórki mogą
być niebieskozielone, żółtawe, czerwone, purpurowe lub prawie czarne. Pewne gatunki
tworzą akinety, heterocysty i/lub hormogonia (sekcja 4. 4).
To na ogół fotolitoautotrofy, wiążące CO 2 w cyklu Calvina (sekcja 6. 1. 1). Metabolizm
oddechowy, wykorzystujące tlen jako końcowy akceptor elektronów. Niektóre mogą rosnąć
jak chemoorganoheterotrofy oddychając beztlenowo lub nawet przeprowadzając fermenta-
cję. Pewne z nich są zdolne do przeprowadzania fotosyntezy anoksygenowej, z wykorzysta-
niem fotosystemu I (rys. 5. 11), np. z siarczkiem jako donorem elektronów.
Występują w wielu siedliskach wodnych i lądowych; niektóre tworzą „zakwity" (sek-
cja 10. 1. 1). (Patrz też sekcja 13. 5. 1. 2)
Desulfomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, nieruchliwe. Beztlenowce. Metabolizm odde-
chowy: oddychanie siarczanowe (sekcja 5. 1. 1. 2) z wykorzystaniem np. pirogronianu jako
donora elektronów. Występują np. w jelicie człowieka. 66-67% GC. Gatunek typowy:
D. pigra.
Desulfurococcus (rodzaj). Archaea. Ziarniaki, około 1 mm średnicy, ruchliwe lub nieruchliwe.
Beztlenowce, termofilne, chemolitoautotrofy i/lub chemolitoheterotrofy. Metabolizm odde-
chowy (oddychanie siarczanowe: sekcja 5. 1. 1. 2). Występują np. w islandzkich solfatarach.
51% GC.
Dichelobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki. Beztlenowce. Ό. nodosus (uprzednio Bacteroides
nodosus) jest czynnikiem wywołującym zakaźną zanokcicę u owiec.
Enterobacteriaceae (rodzina). Gramujemne, nie sporujące, względnie beztlenowe pałeczki,
zwykle 0, 3-1 χ 1-6 μm; ruchliwe (najczęściej urzęsienie perytrychalne) lub nieruchliwe.
Komórki występują pojedynczo lub w parach. Chemoorganoheterotrofy; zwykle rosną
dobrze na /w podstawowych podłożach (sekcja 14. 2. 1). Źródłem węgla mogą być cukry.
Metabolizm oddechowy i fermentacyjny. Oksydazoujemne. Wszystkie, z wyjątkiem nielicz-
nych szczepów, katalazododatnie. Występują np. jako pasożyty/patogeny lub komensale
człowieka i innych zwierząt oraz jako saprotrofy w glebie i wodzie.
Rodzaje (i gatunki) rozróżnia się dzięki testom biochemicznym, takim jak IMViC (sek-
cja 16. 1. 2. 5), test na obecność ureazy (sekcja 16. 1. 2. 7) i dekarboksylazy (sekcja 16. 1. 2. 8). Zwy-
kle laktozę fermentują: E. coli, Klebsiella pneumoniae i niektóre szczepy Citrobacter, ale nie
wykorzystują jej: Salmonella, Shigella, Proteus czy Yersinia. Szczep, który nie fermentuje
laktozy, może się stać do tego zdolny, jeśli nabędzie plazmid Lac (kodujący zdolność do
pobierania i metabolizowania laktozy). Rodzaje wchodzące w skład tej rodziny to np. Citro-
bacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella
i Yersinia.
Enterococcus (rodzaj). Patrz notka o Streptococcus.

434
Erwinia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae - patrz szczegóły). Saprotrofy lub patogeny roślin
i zwierząt. Zwykle ruchliwe. Kwas (mało/brak gazu) z cukrów. Temperatura opt. 27-30°C.
50-58 % GC. Gatunek typowy: E. amylovora.
Escherichia (rodzaj należący do rodziny Enterobacteriaceae — patrz informacje podstawowe).
Następujące dane dotyczą E. coli. Komórki: pojedyncze lub w parach, zwykle ruchliwe (urzę-
sienie perytrychalne). Mają fimbrie (sekcja 2. 2. 14. 2); patrz też na fot. 2. 1, 2. 3 i 8. 1. Tempera-
tura opt. 37°C. W warunkach tlenowych metabolizm oddechowy, a w warunkach beztleno-
wych przeprowadzają fermentację (sekcja 5. 1. 1. 1) bądź oddychanie azotanowe (sek-
cja 5. 1. 1. 2). Fermentują glukozę (zwykle z wytworzeniem gazu) w fermentacji kwasów mie-
szanych (rys. 5. 5). W testach IMViC (sekcja 16. 1. 2. 5) wykazuje następujące reakcje: +, +, -, -;
w teście z cytrynianem — wynik dodatni w szczepach zawierających plazmid Cit (sek-
cja 7. 1); ureazoujemne; H 2 S — wynik ujemny; laktoza wynik dodatni (kwas i gaz). Wystę-
pują np. jako część zwykłej mikroflory jelita człowieka i innych zwierząt; niektóre szczepy
mogą być patogenami (tab. 11. 2). 48-52% GC. Gatunek typowy: E. coli.
Eubacteria (królestwo). Zawiera prokarioty nie zaklasyfikowane do Archaebacteria (patrz) —
np. wszystkie sinice i anoksygenowe bakterie fotosyntetyzujące, wszystkie enterobakterie
oraz Pseudomonas i bakterie pokrewne, a także mykoplazmy. Eubacteria różnią się od Archa-
ebacteria np. sekwencją 16S rRNA (sekcja 16. 2. 2. 2) oraz budową chemiczną błony cytoplaz-
matycznej i ściany komórkowej. Wszystkie prokariota ważne z medycznego punktu widze-
nia i te, z którymi można się zetknąć na podstawowym kursie mikrobiologii, są eubakte-
riami. Obecnie królestwo zostało przekształcone w domenę Bacteria (sekcja 1. 1. 1).
Francisella (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, „coccobacilli" lub pałeczki (w zależności od
gatunku i warunków wzrostu); nieruchliwe. Tlenowce. Chemoorganoheterotrofy; powoli
metabolizują węglowodany, bez gazu. Temperatura opt. 37°C. Oksydazoujemne. Katalaza
— słabo dodatnia. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. 33-36%
GC. Gatunek typowy: F. tularensis (uprzednio Pasteurella tularensis).
Gardnerella (rodzaj). Typ gramujemny (?). Pałeczki (pleomorficzne), około 0, 5 x 1 , 5-2, 5 μm.
Bezwzględne beztlenowce i szczepy względnych beztlenowców. Chemoorganohetrotrofy;
wzrost tylko na podłożach wzbogaconych. Oksydazoujemne. Katalazoujemne. Temperatura
opt. 35-37°C. Występują w układzie moczowo-płciowym człowieka (patrz waginoza: sek-
cja 11. 11). Około 42-44% GC. Gatunek typowy: G. vaginalis (uprzednio Haemophilus
vaginalis).
Haemophilus (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/„coccobacilli" (pleomorficzne), często około
0, 4x1-2 μm, bądź formy nitkowate; nieruchliwe. Względne beztlenowce. Metabolizm
oddechowy i fermentacyjny. Chemoorganoheterotrofy; wzrost zachodzi na podłożach
wzbogaconych, np. na agarze czekoladowym (sekcja 14. 2. 1). Zwykle fermentują glukozę,
lecz nie laktozę. Do wzrostu tlenowego niezbędny jest czynnik X (hemina) i czynnik V
(NAD) — oba obecne w zlizowanych erytrocytach. Temperatura opt. 35-37°C. Występują
jako pasożyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. 37-44% GC. Gatunek typowy:
H. influenzae.
Hafnia (rodzaj należący do Enterobacteriaceae — patrz szczegóły). Zwykle ruchliwe w 25°C,
często nieruchliwe w 35°C. Przeważnie w 22-25°C odczyn MR ujemny, a VP dodatni.
Zwykle testy z laktozą ujemne, z cytrynianem też. Mają dekarboksylazę lizyny i ornityny.
Rosną na agarze cytrynianowym z deoksycholanem (DCA) i w podłożach z KCN. Wystę-
pują u ludzi, zwierząt, w glebie i wodzie. Mogą być przyczyną biegunek [np. Ridell i wsp.
(1994) JCM 32: 2335-2337]. Stwierdzono, że niektóre szczepy wywołują zmiany chorobowe,
podobne do tych, spowodowanych przez EPEC. Gatunek typowy: H. alvei.
Halobacterium (rodzaj — domena Archaea). Pałeczki lub formy nitkowate, ruchliwe lub nie-
ruchliwe. Większość ma wakuole gazowe (sekcja 2. 2. 5). Ekstremalnie halofilne. Względne
beztlenowce. Metabolizm tlenowy: chemoorganoheterotroficzny i oddechowy, z wykorzy-
staniem np. aminokwasów lub węglowodanów jako źródeł węgla. Oksydazododatnie. Nie-

435
 które szczepy uzyskują energię wykorzystując błonę purpurową (sekcja 5. 2. 2). Występują
np. w solankach, na solonych rybach itp. 66-68% GC. Gatunek typowy: H. salinarum
(uprzednio H. halobium).
Helicobacter (rodzaj). Gramujemny. Komórki: helikalne, ruchliwe za pomocą kilku rzęsek
z pochewkami (sekcja 2. 2. 14. 1; fot. 2. 1, lewa, górna część). Istnieje kilka gatunków. Helicobac-
ter pylori [Goodwin i wsp. (1989) IJSB 39: 397-405] jest mikroaerofilem i chemoorganohetero-
trofem. Wytwarza ureazę. To patogen związany z chorobą wrzodową i rakiem żołądka (sek-
cja 11. 3. 5). [Genome and main features of H. pylori: Tomb i wsp. (1997) Nature 388: 539-547.
Prospects for a therapeutic vaccine: Telford i Ghiara (1996) Drugs 52: 799-804. Various
aspects of H. pylori: BCID (1997) 4 (3) (cały numer). Diagnosis and treatment of H. pylori infec-
tion: Goodwin, Mendall i Northfield (1997) Lancet 349: 265-269. ]
Klebsiella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz informacje podstawowe). Komórki:
pojedyncze, pary, krótkie łańcuszki; z otoczkami. Nieruchliwe. Często odczyn MR ujemny,
natomiast VP — dodatni. Występują np. w glebie, wodzie i jako pasożyty/patogeny
człowieka i innych zwierząt. 53-58% GC Gatunek typowy: K. pneumoniae.
Kurthia (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki lub formy nitkowate; pałeczki są urzęsione perytry-
chalnie. Tlenowce. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrofy; wykorzystują amino-
kwasy, alkohole, kwasy tłuszczowe jako źródła węgla. Występują np. na mięsie i jego prze-
tworach. Około 36-38% GC. Gatunek typowy: K. zopfii.
Lactobacillus (rodzaj). Gramdodatni. Pałeczki lub „coccobacilli", występujące pojedynczo lub
w łańcuszkach; zwykle nieruchliwe. Beztlenowce, mikroaerofile lub względne tlenowce.
Zwykle katalazoujemne. Chemoorganoheterotrofy wykorzystujące np. cukry jako źródła
węgla. Metabolizm fermentacyjny, jako charakterystyczny produkt fermentacji glukozy
wytwarzają kwas mlekowy (fermentacja homomlekowa, sekcja 5. 1. 1. 1) lub produkty mie-
szane, w tym kwas mlekowy (fermentacja heteromlekowa). Występują na roślinach i w róż-
nych produktach uzyskanych na drodze fermentacji, stanowią część zwykłej mikroflory
człowieka. Około 32-53% GC. Gatunek typowy: L. delbrueckii.
Lactococcus (rodzaj). Patrz notka do rodzaju Streptococcus.
Legionella (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/formy nitkowate, 0, 3-0, 9x2-20 μm; ruchliwe, tle-
nowce. Chemoorganoheterotrofy wykorzystujące aminokwasy (nie fermentacyjnie) jako
źródło węgla i energii. Rosną np. na buforowanym agarze z dodatkiem węgla aktywowa-
nego, ekstraktu drożdżowego i L-cysteiny. Katalazododatnie. Oksydazoujemne. Tempera-
tura opt. 35-37°C. Występują w wielu siedliskach wodnych (takich jak np. strumienie, do
których odprowadza się podgrzaną wodę); większość/wszystkie gatunki są patogenne dla
człowieka. [Taxonomy and typing of legionellae: Harrison i Saunders (1994) RMM 5: 79-90. ]
Gatunek typowy: L. pneumophila.
Leuconostoc (rodzaj). Gramdodatnie. Komórki: kokoidalne, o średnicy około 1 μm, występują
w parach lub łańcuszkach; nieruchliwe. Względne beztlenowce. Metabolizm fermentacyjny
i oddechowy. Fermentują glukozę głównie do kwasu mlekowego, etanolu i CO 2 . Występują
np. w różnych produktach mleczarskich i fermentowanych napojach. Około 38-44% GC.
Gatunek typowy: L. mesenteroides.
Listeria (rodzaj). Gramdodatnie. Pałeczki lub „coccobacilli", około 0, 5x0, 5-2 μm. Zwykle
ruchliwe w 25°C, wydają się zawsze nieruchliwe w 37°C. Tlenowce, względne beztlenowce.
Chemoorganoheterotrofy. Katalazododatnie. Oksydazoujemne. Ureazoujemne. Fermentują
cukry (kwas, bez gazu). Hydrolizują eskulinę. Rosną w obecności chlorku sodu do stężenia
10-12%. Występują w glebie, w rozkładających się resztkach roślinnych, niektórych pokar-
mach i jako patogeny różnych zwierząt i człowieka. Gatunek typowy: L. monocytogenes.
metanogeny (kategoria nie taksonomiczna). Grupa ta obejmuje organizmy zdolne do wytwo-
rzenia metanu. Wszystkie metanogeny są bezwzględnymi beztlenowcami z domeny
Archaea. Występują np. w mule rzecznym i żwaczu krów oraz innych przeżuwaczy. Nazwy
kilku rodzajów zostały wspomniane w sekcji 5. 1. 2. 2 i na rys. 16. 5.

436
Methylococcus (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki o średnicy około 1 μm, nieruchliwe. Tlenow-
ce/mikroaerofile. Bezwzględne metylotrofy (sekcja 6. 4); mogą wykorzystywać metan jako
jedyne źródło węgla i energii. Występują np. w mule, glebie. Około 63% GC. Gatunek
typowy: M. capsulatus.
Mobiluncus (rodzaj). Gramzmienne. Pałeczki, ruchliwe. Beztlenowce. Wywołują waginozę
(sekcja 11. 11). 49-52% GC. Gatunek typowy: M. mulieris.
Mycobacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Laseczki, 0, 2-0, 8x1-10 μm, formy kokoidalne,
rozgałęzione laseczki lub delikatne formy nitkowate; niektóre barwne. Nieruchliwe. Kwaso-
oporne (sekcja 14. 9. 2), przynajmniej w pewnych stadiach wzrostu. Tlenowce lub mikroaero-
file. Metabolizm oddechowy. Zwykle to chemoorganoheterotrofy, chociaż niektóre szczepy
mogą być chemolitotrofami. Na ogół nie mają specjalnych wymagań pokarmowych, choć
wzrost niektórych może być stymulowany np. dodatkiem surowicy lub żółtka jaja. Wystę-
pują jako swobodnie żyjące saprotrofy w glebie, wodzie lub na roślinach albo jako paso-
żyty/patogeny człowieka i innych zwierząt. Około 62-70% GC. Gatunek typowy:
M. tuberculosis.
Mycoplasma (rodzaj). Komórki pleomorficzne — od kokoidalnych (0, 3-0, 8 μm średnicy) po
rozgałęzione formy nitkowate. Niektóre zdolne do ruchu ślizgowego (sekcja 2. 2. 15. 1). Brak
ściany komórkowej. Względne lub bezwzględne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy.
Wzrost tylko na podłożach złożonych. Wszystkie gatunki wymagają cholesterolu lub steroli
pokrewnych. Katalazoujemne. Występują jako pasożyty /patogeny układu oddechowego
i moczowo-płciowego zwierząt i człowieka. Około 23-40% GC. Gatunek typowy:
M. mycoides.
Neisseria (rodzaj). Typ gramujemny. Zwykle ziarniaki, o średnicy 0, 6-1 μm, nieruchliwe. Tle-
nowce. Chemoorganoheterotrofy; niektóre szczepy wymagają podłoży wzbogaconych (np.
agaru czekoladowego). Oksydazododatnie. Są pasożytami/patogenami człowieka i zwie-
rząt. Około 46-54% GC. Gatunek typowy: N. gonorrhoeae.
Nitrobacter (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, około 0, 6-0, 8x1-2 μm, zwykle nieruchliwe. Roz-
mnażają się przez pączkowanie (sekcja 3. 2. 2). Bezwzględne tlenowce. Niektóre szczepy to
bezwzględne chemolitoautotrofy (bakterie nitryfikacyjne: sekcja 5. 1. 2; rys. 10. 2), inne są
względnymi chemoorganoheterotrofami. Temperatura opt. 25-30°C. Występują np. w gle-
bie. Około 61% GC. Gatunek typowy: N. winogradskyi.
Nitrosococcus (rodzaj). Gramujemne. Ziarniaki, o średnicy około 1, 5 μm; ruchliwe lub nie-
ruchliwe. Bezwzględne tlenowce. Bezwzględne chemolitoautotrofy, utleniające amoniak do
azotynu (sekcja 5. 1. 2.; rys. 10. 2). Występują w glebie.
Nostoc (rodzaj). Typ gramujemny. Nitkowate cyjanobakterie (patrz). Heterocysty. Wakuole
gazowe u przynajmniej niektórych gatunków. Żyjące swobodnie lub w związkach sym-
biotycznych z różnymi eukariotami — np. sagowcami (sekcja 10. 2. 4. 1), porostami
i wątrobowcami.
Oscillatoria (rodzaj). Gramujemne. Nitkowate cyjanobakterie (patrz). Nici: ruchliwe, złożone
ze spłaszczonych, dyskowatych komórek. Wakuole gazowe. Hormogonia. Występują w róż-
nych siedliskach wodnych i lądowych. 40-50% GC.
Pasteurella (rodzaj). Gramujemne. Komórki kokoidalne, pałeczkowate/pleomorficzne, około
0, 3-1 x 1-2 μm, występujące pojedynczo, w parach lub krótkich łańcuszkach. Nieruchliwe.
Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Opt. temperatura wzrostu: 37°C. Katala-
zododatnie. Na ogół oksydazododatnie. Są pasożytami/patogenami człowieka i zwierząt.
40-45% GC. Gatunek typowy: P. multocida.
Pelodictyon (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki/formy kokoidalne, mogące tworzyć łańcu-
szki/trójwymiarowe sieci; nieruchliwe. Wakuole gazowe. Beztlenowce. Fototrofy. Wystę-
pują np. w mułach zawierających siarczki.
Prochloron (rodzaj). Gramujemne. Komórki zawierają chlorofil a i b. Przeprowadzają fotosyn-
tezę oksygenową. Taksonomia niepewna: zaliczane do prochlorofitów, w tym np. P. didemni

437
 (występujący jako symbiont słodkowodnych żachw). Zawierają, podobnie jak sinice, chloro-
fil a, ale różnią się od nich obecnością chlorofilu b i brakiem pewnych, typowych dla sinic
barwników. Być może są spokrewnione z przodkami chloroplastów. [Photosynthetic machi-
nery in Prochlorophytes: Post i Bullerjahn (1994) FEMSMR 13: 393-414. ]
Propionibacterium (rodzaj). Gramdodatnie. Pleomorficzne, rozgałęzione/nierozgałęzione
pałeczki lub formy kokoidalne; nieruchliwe. Brak spor. Beztlenowce. Chemoorganohetero-
trofy. Metabolizm fermentacyjny: heksozy (np. glukoza) lub mleczan fermentowane głównie
do kwasu propionowego. Rosną np. na podłożach zawierających pepton, ekstrakt droż-
dżowy, mleczan. Występują np. w produktach mleczarskich i są częścią mikroflory ciała
(tab. 11. 1). Mogą być patogenami [P. acnes (potencjał patogenny dla człowieka): Eady
i Ingham (1994) RMM 5: 163-173; P. acnes (w ropniu mózgowym, opis przypadku): Senne-
ville i wsp. (1997) JINF 34: 269-271]. Około 57-67 % GC. Gatunek typowy: P. freudenreichii.
Proteus (rodzaj należący do rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Ruchliwy,
często wykazuje zdolność do wzrostu „rozpełzliwego" (sekcja 4. 2). H 2 S i ureaza — zwykle
odczyn dodatni. Do wzrostu wymagają kwasu nikotynowego. Występują np. w glebie,
zanieczyszczonych wodach i w jelicie ssaków; niektóre gatunki (np. P. mirabilis) mogą być
patogenami. 38-41% GC. Gatunek typowy: P. vulgaris.
Pseudomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 5-1 x 1, 5-5 μm. Większość gatunków ma jedną
lub kilka biegunowych rzęsek bez pochewki, chociaż P. mallei jest nieruchliwy (tzn. nie ma
rzęsek), a rzęski niektórych gatunków mają pochewki (sekcja 2. 2. 14. 1). Tlenowce lub
względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy: wiele gatunków przeprowadza oddycha-
nie azotanowe (sekcja 5. 1. 1. 2). Zwykle są chemoorganoheterotrofami, bardzo różnorodnymi
pod względem sposobu odżywiania. Wiele szczepów rośnie na podłożach zawierających
sole mineralne i organiczne źródło węgla, a niektóre mogą rosnąć chemolitoautotroficznie.
Katalazododatnie. Na ogół oksydazododatnie. Występują w glebie i wodzie oraz jako pato-
geny człowieka, zwierząt i roślin. 58-70% GC. Gatunek typowy: P. aeruginosa.
Pyrodictium (rodzaj, domena Archaea). Rosną w postaci sieci lub nici złożonych z włókien,
z przyłączonymi dyskowatymi komórkami o średnicy 0, 3-2, 5 μm. Beztlenowce. Energię
uzyskują w metabolizmie zależnym od siarki. Chemolitoautotrofy. Termofile (sekcja 3. 1. 4),
halotolerancyjne. Występują w podwodnych regionach wulkanicznych.
Rhizobium (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 5-0, 9 x 1, 2-3 μm; ruchliwe. Tlenowce. Chemoor-
ganoheterotrofy; źródłem węgla mogą być cukry. Występują w glebie i brodawkach korze-
niowych (sekcja 10. 2. 4. 1). 59-64% GC. Gatunek typowy: R. leguminosarum.
Rickettsia (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 3-0, 6 χ 0, 8-2 μm; nieruchliwe. Bezwzględne paso-
żyty/patogeny wewnątrzkomórkowe kręgowców (w tym człowieka) i stawonogów (klesz-
czy, roztoczy itp. ). Metabolizm oddechowy, z glutaminianem jako głównym substratem
energetycznym; nie wykorzystują glukozy. Temperatura opt. 32-35°C. Około 29-33% GC.
Gatunek typowy: JR. prowazekii.
Ruminococcus (rodzaj). Typ gramdodatni. Ziarniaki, o średnicy około 1 μm, w parach lub
łańcuszkach. Beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy; metabolizm zwykle heterofermenta-
cyjny, z węglowodanów wytwarzają np. kwas octowy i mrówkowy. Wiele szczepów potrafi
wykorzystywać celulozę. Występują w żwaczu. Około 40-45% GC. Gatunek typowy:
R. flavefaciens.
Salmonella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Zwykle ruchliwe.
Typowe są reakcje jak następuje. Testy IMViC (sekcja 16. 1. 2. 5): -, +, -, +; glukoza odczyn
dodatni (gaz i kwas w 37°C), a laktoza zwykle ujemny (ale zdolność do fermentacji laktozy
może być kodowana przez plazmid). H 2 S odczyn dodatni; ureaza — ujemny; dekarboksy-
laza lizyny i ornityny — dodatnie (sekcja 16. 1. 2. 8). Salmonelle rosną na podłożach podsta-
wowych, a także np. na agarze MacConkeya oraz agarze cytrynianowym z deoksycholanem
(DCA) (tab. 14. 1). Podłoża wzbogacające to np. bulion seleninowy (tab. 14. 1). Są patogenami
różnych zwierząt i człowieka. 50-52% GC. Gatunek typowy: S. choleraesuis.

438
 W odróżnieniu od innych bakterii są powszechnie identyfikowane i określane raczej
w formie serotypów (sekcja 16. 1. 5. 1), a nie gatunków. W schemacie klasyfikacyjnym Kauff-
manna-White'a istnieje około 2000 serotypów, którym nadano nazwy. Każdy z nich jest okre-
ślony poprzez antygeny O i Η (sekcja 16. 1. 5. 1), a niektóre poprzez antygen Vi. Jest to antygen
polisacharydowy mikrootoczki (sekcja 2. 2. 11), odgrywającej rolę w wirulencji wobec danego
gospodarza. Każdy serotyp ma określony wzór antygenowy, który wymienia w następującej
kolejności: antygeny O, potem Vi (jeśli występują) i H. W wielu serotypach antygeny Η mogą
ulegać przełączaniu, wskutek czego występuje zjawisko zmienności fazowej (patrz rys. 8. 3c).
Tak więc w tym wypadku wzór serotypu zawiera dwa alternatywne antygeny Η (lub dwa
alternatywne zestawy antygenów H). Na przykład wzór antygenowy S. typhimurium jest
następujący: 1, 4, [5], 12: i: l, 2. Oznacza to: obecność antygenów O - 1 , 4, 5 ([. ] oznacza obecność
lub brak) i 12, antygenu Η - 'i' z fazy 2 oraz antygenów Η — 1 i 2 z fazy 2. Antygen O — 1 jest
podkreślony, aby wskazać, że jego obecność jest związania z konwersją lizogenną (sekcja 9. 4).
N o t k a s p e c j a l n a . Nazwa rodzaju Salmonella pochodzi od nazwiska amerykańskiego
bakteriologa D. E. Salmona.
Serratia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe). Zwykle ruchliwe.
Niektóre szczepy tworzą czerwony barwnik, prodigiozynę. Reakcje typowe: MR — odczyn
ujemny, VP — dodatni (w 30°C, ale może być ujemny w 37°C); cytrynian — dodatni; laktoza
— dodatnia lub ujemna w zależności od gatunku. Glukoza jest fermentowana w szlaku Ent-
nera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Występują np. w glebie i wodzie, na roślinach, a także
w człowieku i w zwierzętach. 52-60% GC. Gatunek typowy: S. marcescens.
Shigella (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz dane podstawowe. Nieruchliwe. Cukry
zwykle fermentowane bez gazu. MR — odczyn dodatni; VP — ujemny; cytrynian — ujemny;
H 2 S — ujemny; dekarboksylaza lizyny — ujemna. Występują jako patogeny jelitowe
człowieka i innych naczelnych. 49-53% GC. Gatunek typowy: S. dysenteriae.
Simonsiella (rodzaj). Gramujemne. Płaskie, wielokomórkowe nici. Komórki końcowe mają
zaokrągloną powierzchnię zewnętrzną (fot. 2. 1: prawa górna część). Ruch ślizgowy. Chemo-
organoheterotrofy. Występują np. w jamie ustnej ludzi i gębowej zwierząt.
Sinice p. cyjanobakterie.
Spirochaetales (rząd). Ruchliwe. Gramujemne, zwykle komórki helikalne o charakterystycznej
budowie (patrz sekcja 2. 2. 14. 1); 0, 1-3x5-250 μm, w zależności od gatunku. Podczas gdy
większość gatunków, jak się wydaje, ma kształt helikalny, Borrelia burgdorferi pływa
w postaci spłaszczonej fali. [Struktura/ruchliwość krętków: Goldstein, Buttle i Charon
(1996) JB 178: 6539-6545. ] Do krętków zalicza się gatunki swobodnie żyjące i patogenne, tle-
nowce i beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm oddechowy i/lub fermentacy-
jny. Zalicza się tu rodzaje Borrelia, Leptospira, Spirochaeta i Treponema.
Staphylococcus (rodzaj). Gramdodatnie. Ziarniaki, o średnicy około 1 μm, często w skupie-
niach, niektóre zawierają pomarańczowe lub żółte barwniki karotenoidowe; nieruchliwe.
Względne beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. W skład źródeł węgla wchodzą różne
cukry. Często halotolerancyjne (sekcja 3. 1. 7). Katalazododatnie. Gronkowce dzieli się na
szczepy koagulazododatnie i koagulazoujemne (sekcja 16. 1. 2. 2). W skład pierwszej grupy
wchodzą S. aureus i S. intermedius, a drugiej — S. epidermidis (uprzednio S. albus). Występują
jako komensale i patogeny różnych zwierząt i człowieka. Około 30-39% GC. Gatunek
typowy: S. aureus.
Stenotrophomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, ruchliwe. Większość szczepów wymaga
cystyny lub metioniny. Silnie lipofilowe. Jeden gatunek: S. maltophila, uprzednio Xanthomo-
nas maltophila. Występują np. w glebie, wodzie. Może wpływać na rokowanie w mukowiscy-
dozie. (sekcja 11. 3. 2. 1).
Streptococcus (rodzaj). Gramdodatnie. Ziarniaki, zwykle o średnicy około 1 μm, często wystę-
pujące w parach lub łańcuszkach. Nie tworzą spor. Często wytwarzają otoczki. Względne
lub ścisłe beztlenowce. Katalazoujemne. Chemoorganoheterotrofy. Zwykle metabolizm fer-

439
 mentacyjny, cukry wykorzystywane bez wytworzenia gazu. Występują jako komensale
i patogeny człowieka i zwierząt. 34-46% GC. Gatunek typowy: S. pyogenes.
Streptokoki (paciorkowce) mogą być identyfikowane i klasyfikowane np. na podstawie
testu przynależności grupowej wg Lancefield. Wymaga to ekstrakcji i identyfikacji pewnych
węglowodanów związanych z osłonami komórkowymi (tzw. wielocukier C). Zwykle,
w danym szczepie występuje tylko jeden typ tego wielocukru. Aby go wyekstrahować,
należy autoklawować zawiesinę komórek w roztworze NaCl przez 15 min w 121°C. Do
badania wykorzystuje się supernatant. W jednej formie testu, ekstrakt jest nakładany na
surowicę (zawierającą przeciwciała przeciw określonemu wielocukrowi C) znajdującą się
w małej probówce. Test jest powtarzany z surowicami przeciw różnym wielocukrom C, aż
do osiągnięcia wyniku pozytywnego, tzn. uzyskania białawego precypitatu w interfazie
między ekstraktem i surowicą. Wszystkie szczepy, których wielocukry C reagują z daną
surowicą, są umieszczane w tej samej grupie serologicznej wg Lancefield. Grupy są ozna-
czane kolejnymi literami A, B, C... itd. Szczepy S. pyogenes należą do grupy A.
Pewna liczba gatunków, uprzednio zaliczanych do rodzaju Streptococcus, została przenie-
siona do innych rodzajów. Na przykład S. faecalis i S. faecium przeniesiono do Enterococcus
jako odpowiednio E. faecalis i E. faecium [Schleifer i Kilpper-Balz (1984) IJSB 34: 31-34]. Oba
gatunki zwykle rosną w 10°C i 45°C, przeżywają ogrzewanie przez 30 min w 60°C i mogą
rosnąć w obecności 6% NaCl oraz w pH 9, 6. Różnią się tym, że E. faecalis może uzyskiwać
energię z pirogronianu, cytrynianu i jabłczanu, a E. faecium — nie.
Streptococcus lactis został przeniesiony do Lactococcus jako L. lactis [zatwierdzenie rodzaju
Lactococcus: (1986) IJSB 36: 354-356]. Laktokoki są ziarniakami/formami kokoidalnymi,
występującymi pojedynczo, w parach lub w łańcuszkach. Rosną w 10°C, ale nie w 45°C. Są to
bakterie fermentacyjne, a kwas L(+) mlekowy jest głównym produktem metabolizmu glu-
kozy. Występują np. w produktach mleczarskich. Gatunek typowy: L. lactis.
Artykuł przeglądowy na temat taksonomii (klasyfikacji) streptokoków napisali Hardie
i Whiley (1994) RMM 4: 151-162].
Streptomyces (rodzaj z rzędu Actinomycetales — patrz). Gramdodatnie. Grzybnia (sekcja 2. 1. 1)
ulegająca częściowej fragmentacji, z wytworzeniem łańcuchów spor (sekcja 4. 3. 2; rys. 4. 3).
Tlenowiec. Metabolizm oddechowy. Chemoorganoheterotrof. Wykorzystywane źródła
węgla to np. glukoza, mleczan i skrobia. W skład antybiotyków wytwarzanych przez Strep-
tomyces wchodzi chloramfenikol (sekcja 15. 4. 4) i streptomycyna (sekcja 15. 4. 2). Występuje
np. w glebie i jako patogen roślin. 69-78% GC. Gatunek typowy: S. albus.
Sulfolobus (rodzaj, domena Archaea). Ziarniaki, komórki kokoidalne lub o kształtach nieregu-
larnych. Ściana komórkowa złożona tylko z warstwy S (sekcja 2. 2. 12). Termofile (wzrost
zachodzi w temp. między 50 a 90°C). Acydofile (sekcja 3. 1. 5). Tlenowce lub względne beztle-
nowce. Energię uzyskują z utleniania siarki lub Fe 2 + z wykorzystaniem tlenu lub w oddycha-
niu siarkowym (sekcja 5. 1. 1. 2), w którym siarka elementarna jest wykorzystywana jako osta-
teczny akceptor. Bezwzględne heterotrofy lub względne autotrofy. Występują np. w niektó-
rych gorących źródłach.
Thermoproteus (rodzaj, domena Archaea). Pałeczki, formy nitkowate, około 0, 5 χ 80 μm. Beztle-
nowce. Energię uzyskują w oddychaniu siarkowym (patrz też Sulfolobus). Termofile. Auto-
trofy i/lub heterotrofy (w skład źródeł węgla wchodzą glukoza, etanol, mrówczan). Wystę-
pują np. w islandzkich solfatarach.
Thiobacillus (rodzaj) Gramujemne. Pałeczki, około 0, 5x1-3 μm; zwykle ruchliwe. Bez-
względne tlenowce lub (niektóre) względne beztlenowce. Metabolizm oddechowy; energia
zazwyczaj otrzymywana w wyniku utleniania siarki i /lub jej zredukowanych związków.
Bezwzględne lub względne chemolitoautotrofy. Występują np. w glebie, mule, gorących
źródłach. GC 50-68%. Gatunek typowy: T. thioparus.
Treponema (rodzaj z rodziny Spirochaetales — patrz informacje podstawowe). Komórki:
0, 1-0, 4x5-20 μm. Beztlenowce lub mikroaerofile. Niektóre gatunki można hodować na

440
 złożonych podłożach, innych (w tym T. pallidum) — nie. Te rosną np. w jądrach królika.
Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i pewnych zwierząt. 25-54% GC. Gatunek
typowy: T. pallidum.
Vibrio (rodzaj). Gramujemne, zakrzywione (przecinkowce) lub proste, 0, 5-0, 8 x 1, 4-2, 6 μm.
Ruchliwe za pomocą rzęski zaopatrzonej zwykle w pochewkę (sekcja 2. 2. 14. 1). Względne
beztlenowce. Zwykle oksydazododatnie. Chemoorganoheterotrofy; fermentują glukozę
w fermentacji kwasów mieszanych (rys. 5. 5), na ogół bez gazu. Wszystkie gatunki rosną
w 20°C, większość w 30-35°C, a niektóre w 40°C. Pewne gatunki tolerują wysokie wartości
pH (np. V. cholerae może rosnąć w pH 10). Występują w różnych siedliskach wodnych
(w wodzie słodkiej, morskiej i przy ujściach rzek do morza) oraz jako patogeny człowieka,
ryb i skorupiaków. 38-51% GC. Gatunek typowy: V. cholerae.
Xanthomonas (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, 0, 4-0, 7x0, 7-1, 8 μm, zwykle zawierające żółte
barwniki; niektóre tworzą zewnątrzkomórkowy śluz. Ruchliwe. Tlenowce. Chemoorgano-
heterotrofy. W szczepach X. campestris glukoza jest metabolizowana np. w szlaku Ent-
nera-Doudoroffa (rys. 6. 2). Oksydazoujemne (lub słabo dodatnie). Katalazododatnie. Wystę-
pują np. jako patogeny roślin. 63-71% GC. Gatunek typowy: X. campestris.
Yersinia (rodzaj z rodziny Enterobacteriaceae — patrz szczegóły). Komórki: 0, 5-0, 8x1-3 μm.
Większość gatunków ruchliwych w 30°C, nieruchliwych w 37°C; Y. pestis jest nieruchliwa.
Rosną na podłożach podstawowych. Odczyn VP ujemny w 37°C (w niektórych szczepach
dodatni w 25°C); odczyn MR dodatni; kwas (bez gazu lub z jego małą ilością) z glukozy;
zwykle laktoza — ujemna. Ureazoujemne (np. Y. pestis) lub dodatnie (np. Y. enterocolitica).
Optymalna temperatura wzrostu: 28-29°C; Y. enterocolitica jest psychrotrofem i może rosnąć
w 4°C. Występują jako pasożyty/patogeny człowieka i zwierząt. 46-50% GC. Gatunek
typowy: Y. pestis.
Zoogloea (rodzaj). Gramujemne. Pałeczki, urzęsione monotrychalnie, 1-1, 3x2, 1-3, 6 μm, zwy-
kle występują w masie otoczone polisacharydowym śluzem. Tlenowce. Metabolizm odde-
chowy. Chemoorganoheterotrofy. Oksydazododatnie. Katalazododatnie. Optymalna tempe-
ratura wzrostu: 28-37°C. Występują np. w wodach słodkich zanieczyszczonych substancja
organiczną i w oczyszczalniach ścieków, w których się stosuje metody tlenowe. Około 65%
GC. Gatunek typowy: Z. ramigera.
 Skorowidz
Wykonała Jadwiga Baj
Gwiazdką oznaczono numery stron, na których hasła znajdują się na rysunku, w podpisie lub
w tabeli. Numery stron, na których znajduje się główny opis, są pogrubione.

A - F H A 265
Acanthurus nigrofuscus 9 - O p a 300, 304
acetoacetylo-CoA 104 - T C P 304
Acetobacter 322, 430, 430 ADP (adenozyno-5'-difosforan) 67, 69,
-aceti 430 71-73*, 75
- xylinum 51 - w z ó r 68*
acetoina 73*, 407 ADP-rybozylacja 234
N-acetylacja 383 Aeąuorea 197
acetylo-CoA 67, 72*, 76, 77, 100, 104 aerobaktyna 302
acetylofosforan 67, 72* Aeromonas 19, 431
N-acetyloglukozoamina 23, 24*, 103 - salmoncida 431
O-acetyloseryna 256 - hydrophila 431
acetylotransferaza chloramfenikolowa (CAT, aerotaksja 34, 39, 85
ang. chloramphenicol acetyltransferase) agar 351, 353
146, 198, 298*, 384, 388 - Christensena z mocznikiem 408
Acholeplasma laidlaioii 232* - cytrynianowy Simmonsa 408
Acinetobacter 263*, 339, 430 - z deoksycholanem 435, 438
- calcoaceticus 430 - czekoladowy (z krwią na gorąco) 352*,
Actinobacillus 430 353, 435
- lignieresii 431 - MacConkeya 352*, 353, 438
- pleuropneumoniae 294, 303 - odżywczy 352*, 355
Actinomyces 263*, 431 -z krwią 352*, 353, 404, 412
- bovis 431 agaroza 424*
Actinomycetales 431 aglutynacja 329, 413
Actinoplanes 61 agmatyna 409
acydofil 38, 440 agresyna 222, 278
adaptacja 39-41 Agrobacterium 431
adaptor 195 - tumefaciens 422*, 431
adenina (A) 108, 123* AIDA-I (ang. adhesin involved in diffuse
-, metylacja 118, 149 adhesion) 93
-, wzór 109* AIDS 311, 316, 329
S-adenozylometionina 118, 119, 130, 151* akceptor elektronów zewnętrzny 77
adenozyna 109* akineta 63, 434
O-adenylacja 383 aktyna 265, 267
adhezja 26, 31*, 291 aktywacja poliklonalna 301
-, jako czynnik w infekcji 264-267 aktywator translacji 142
- międzykomórkowa 29 akwaporyna 41
adhezyjny czynnik powierzchniowy 169 - Aqpl, AqpZ 17
adhezyna(y) 26, 29, 264, 270, 304 alanina 84, 97
-białkowe 304 -, forma D 25*

442
-, - L 25*, 59, 251 amplikon 200, 201*, 208, 395, 396*, 415
- synteza 102*, 103* Anabaena 246, 253, 343, 422*, 431
alarmon 142 -azollae 249
Alcaligenes 431, 339, 431 - circinalis 61*
- eutrophus 348 -flos-aquae 14, 63, 431
-faecalis 77, 422*, 431 - oscillarioides 61*
aldehyd 3-fosfoglicerynowy 70*, 71, 97*-100 anabolizm 66
- glutarowy 376 anafilatoksyny 285*, 286
- octowy 72*, 73* analiza SSCP 393, 395
alergia na penicylinę 291 - plazmidowego DNA z zastosowaniem
alginian 26, 61, 278 endonukleazy restrykcyjnej (REAP, ang.
alkaliczna fosfataza 196, 198, 199, 213, 217* restriction endonuclease analysis of plas-
- proteaza 89 mid DNA) 417
alkalofile 38 - polimorfizmu długości zamplifikowanych
allolaktoza 134, 135*, 137 fragmentów (AFLP, ang. amplification
allotyp 290* fragment length polymorphism) 424
Alteromonas 431 - przypadkowo zamplifikowanego DNA
- macleodii 431 (RAPD, ang. random amplified polymorp-
-laidlawii 232* hic DNA analysis) 416, 424*, 425
ameby 339 - z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych
amid N-acetyloglutaminyloglutaminowy 40 (REA, ang. restriction enzyme analysis)
amidaza 94 423
- penicylinowa 381 analog(i) zasad 158
amikacyna 382 Anaplasma 107, 431
aminoacylo-tRNA 122, 125 - marginale 422*
aminoglikozydy p. aminokwasy aminogli- anatoksyna 294
kozydowe anemia 280
aminokwas(y) aromatyczne 98 anergia 301
- siarkowe 408 angina 26
-, synteza 100, 136 anion ponadtlenkowy 261
y-aminomaślan 143 antagonizm 244
aminopeptydaza metioninowa (MAP. ang. antybiogram 390
methionine aminopeptidase) 125 antybiotyk(i) 20*, 53, 127, 280, 313, 379-400,
aminotransferaza alaninowa 102* 440
- asparaginianowa 102* - aminoglikozydowe 382, 383, 399, 400
- fosfoserynowa 102* -, antagonizm 387, 392*
- glutaminowo-α-ketoglutaranowa (GOGAT, - chinolonowe 140, 385
ang. glutamine: 2-oxoglutarate aminotrans- - glikopeptydowe 104
ferase) 252 - β-laktamowe 25*, 380-382, 388, 395*
amoksycylina 314, 381* - makrolidowe 383, 384
amoniak 344, 410 - nitroimidazolowy 385*
-, powstawanie 77. 253 -, oporność 167, 168, 174, 192*, 218, 313,
-, przyswajanie 251, 252 383, 384, 386, 387-399
-, utlenianie 79 - peptydowy 88, 327
amonifikacja 252* - pólsyntetyczny 379
cAMP 137, 167 -, synergizm 387, 392*
-, wzór 137* -, usuwanie 87, 88
ampicylina 381 antygen grasiczoniezależny 291
-, oporność 191 - grasiczozależny 291, 294
amplifikacja oparta na sekwencji kwasów - H 413, 439
nukleinowych (NASBA, ang. nucleic acid -Lewisa 280
sequence-based amplification) 220, 221* - O 232, 413, 439
transkrypcji (TMA, ang. transcrip- - powierzchniowy 413
tion-mediated amplification) 220, 416 - V i 439
- przez odsunięcie nici (SDA, ang. strand antykodon 122, 123*
displacement amplification) 220 antyport Na + /H + 86

443
antyseptyka 378, 379 autotrofia 95
antyterminacja transkrypcji zależna Azolla 249, 254
od tRNA 154 Azorhizobium caulinomodans 255
antyterminator transkrypcji 138, 154 azot gazowy 251
antytoksyna 290*, 291, 314 - o b i e g 251-255
aparat Kocha 355 -, wiązanie 85, 253-255, 431, 432
apertura liczbowa 369* azotany 347
Aphanizomenon 344, 431 -, powstawanie 79
apoptoza 295, 300 -, przyswajanie 252
Aquaspirillum 26, 431 -, redukcja asymilacyjna 252*
- peregrinum 9*, 431 -, - dysymilacyjna 77, 252*, 253
- serpens 431 -, — do amoniaku (DRNA, ang. dissimila-
Arabidopsis thaliana 349 tory reduction of nitrate to ammonia) 253
arabinoza 134 - -, test 410
Archaea (p. też archeony) 2, 3*, 26, 47, 83, Azotobacter 432
162, 419, 422*, 431, 432, 434-436, 438 - chroococcum 432
-, błona cytoplazmatyczna 18 - beijerinckii 13
-, ekspresja genów 134 - brasiliense 85
-, rzęska 29 - vinelandii 61
-, ściana komórkowa 23 Azotobacteriaceae 253
Archaebacteria (archebakterie) 2, 419, 432 azotyny 326, 341
Archaeoglobus fulgidus 17, 46 -, powstawanie 77
archeony (p. też Archaea) 2, 46, 96, 129, 155, -, utlenianie 79
255
arginina 409 Β
-, deaminaza 287 BAC (ang. bacterial artificial chromosome)
Arthrobacter 431 191
arsenian 79 Bacillus 19*, 20, 26, 59, 141, 253, 321, 406,
ASP (ang. acid-shock proteins) 143 432
asparagina 251 - anthracis 7*, 26, 262, 299, 318, 429
asparaginian 150* -cereus 318, 328*
-, synteza 102*, 103* - licheniformis 77, 252
atenuacja translacyjna 146 - megaterium 402
atenuator 136 -polymyxa 432
ATP (adenozynotrifosforan) 66, 69, 71-73*, -Schlegelii 96, 432
122, 252, 253 - sphaericus 119, 336
-, hydroliza 75, 87, 238 - stearothermophilus 325
-, oznaczanie 332 - subtilis 46, 48, 57, 65*, 148, 167, 247, 422,
-, synteza 69, 77, 78*, 82, 143 432
-, -, wydajność 83, 84 - thuringiensis 12, 335, 336
-, wzór 68* Bacteria 2, 3*, 6, 260, 419, 422*
ATPaza 17, 71, 75-77, 81, 87, 91, 147, 385 Bacteroides 19*, 262, 263*, 315, 341, 385, 410,
- typu FoF1 75 432
- wiążąca cynk 132 -fragilis 23*, 308, 432
atraktant 34, bakteria(e) autotroficzne 15
auksotrof 160, 161, 178 - beztlenowe p. beztlenowce
aureaza 411 - celulolityczne 98
autofosforylacja 147, 148 - chemolitotroficzne p. chemolitotrofy
autoinduktor 246, 247 - denitryfikacyjne 77,
- peptydowy 247 - fotosyntetyzujące 63, 146, 434
autoklaw 355, 373-375 - anoksygenowe 96
autoradiografia 183*, 428 - beztlenowe 255
autotransporter 92, 229, 279 - „purpurowe" 82, 83
autotrofy 95 - - „ z i e l o n e " 82, 84
-, asymilacja węgla 96, 97 - gramdodatnie 15, 19, 40, 79, 137, 138, 167,
- bezwzględne 95 174, 245, 247, 327, 367, 382, 384

444
- gramujemne 15, 19, 40, 79, 137, 167, 245, - P M 2 232*
247, 367, 380-384 - pomocniczy 193
- gramzmienne 367 -Qβ 234*, 236, 241
- grupy coli 345, 346*, 433, 434 -, replikacja DNA 116
- halofilne p. halofile - R N A 205, 241
- halotolerancyjne 39 - T I 234*
- jelitowe (enterobakterie) 28*, 90*, 158, - T 2 234*, 243
232*, 353, 410, 411 - T3 234*
- kwasooporne 367, 416 - T 6 234*, 243
- lizogenne 140, 241 - T 7 234*, 243
- „lodotwórcze" 257 - wirulentne 231, 233-239
- metanotroficzne 105 -(CΤΧΦ 232, 276, 305
- metylotroficzne p. metylotrofy - Φ29 116, 232*, 234*, 238, 239
- mezofilne (mezofile) 38 -ΦΧ174 116, 232*
- mikroaerofilne p. mikroaerofile - λ 232*, 234*, 236, 237*, 239, 240
- mlekowe 70, 71*, 315, 320, 334 —, integracja 164
-, morfologia 402 bakteriorodopsyna 83
- morskie 86 bakteriostatyczny 377
- niehodowalne 260, 261 baktoprenol 103
- nitryfikacyjne 79, 84, 339, 344 Balantidium coli 316
- patogenne (p. też patogeny) 3, 26, 29, 87, Bartonella 107, 432
145, 147, 167, 213, 322 - bacilliformis 280, 422, 432
- pektolityczne 321 - clarridgeiae 432
- psychrofilne (psychrofile) 38 barwienie 365-368, 402
- psychrotropowe 38 - Grama 19, 366, 367,
- redukujące siarczany 77, 256*, 337 - negatywowe 23*, 368
- redukujące siarkę 77 - Ziehl-Neelsena (kwasooporne) 367
-śluzowe 247 barwnik(i) dodatkowe 80
- termofilne p. termofile - fluorescencyjny 208, 220, 363
- termowytrzymałe 38 baryłka β 92
- typu gramdodatniego 19, 367, bazofil(e) 283*, 285*
- gramujemnego 19, 367, - względny 38, 41, 404
-wskaźnikowe 345-347 Bdellovibrio 248, 432
- żywe, ale niehodowalne (VBNC, VNC, - bacteriovorus 432
ang. viable but non-cultivable) 261 Beggiatoa 33, 35, 432
bakteriemia 319 Beijerinckia 432
bakteriobójczy 377 - indica 432
bakteriochlorofil 81 betaina glicynowa 40, 88
bakteriocyna 245 beztlenowiec(e) 41, 308, 385, 404, 411, 431
bakteriofag(i) (fagi) 155, 231-243, 266 - względny 404
-, czynniki sigma 153 białk(o)aA 183*, 299
- f l 193, 232*, 240, 241 -ABC 87-89
-f2 241 -ActA 270
- fd 234*, 241 - amfifilowe 14
-H-19B 232 - antyrestrykcyjne 119, 175
-L54a 241 -AraC 134
- łagodne (umiarkowane) 231, 239, 240, - B 294
242 -BglF 138
-M12 232*, 241 -CcdA, CcdB 118
- M13 116, 193, 232*, 236, 240, - CheA, CheR, CheW, CheZ 151*
- męskie 241 -CheY 89, 151*
-MS2 23*, 236, 241 - chemotaktyczne przyjmujące grupę
- M u 232*, metylową (MCPs, ang. methyl-accepting
- nitkowaty 232, 234*, 240, 241 chemotactic proteins) 150*, 151*
- P l 239 -cI 239, 240
- P 2 2 239, 242 cro 239

445
białk(o)a - M C P 85
- CRP (ang. cAMP receptor protein = CAP, - MinCD 48, 153*
ang. catabolite activator protein) 137, 226* - MIP (ang. main intrinsic protein) 17
- CspA 141, 142 -, modyfikacje potranslacyjne 218
-CtrA 57 - M o t A i M o t B 28*
- cytoplazmatyczne 126 - M p p A 93
- DnaA 42, 45, 112, 113 - MutH, MutL, MutS 131
-DnaB 113-115, 238 - Μ x 286
- DnaG (prymaza) 113-115 - N d d 233
- D n a I 141 - N u s A 142
- DnaK 140, 141 - O m p 21,
- D O D 145 - O m p T 93, 279
- D s b 126 - opiekuńcze (chaperony) 24, 31, 127, 140,
- E r a 46 224
-EspA, EspB 92, 265 - - s e c B 91
-Exol 131 -OxyR 145
-ExoVII 131 - peryplazmatyczne 150*
-FepA 302 - R a s 46
- F i s 113 - RecA 139, 132, 162, 163, 199, 240
-FlbD, FlbE 57 -RecA* 139
-FlgM 144 -RecBC 186
-FliA 144 -RecBCD 139
-FliF 28*, 57 -RecJ 131
-FliG 28* -RedA 162
- FliM 28*, 151* - rekombinacyjne, nadprodukcja 222-227
-FliN 28* -RelA 142
- fluoryzujące na zielono (GFP, ang. green - R e p 117
fluorescent protein) 47*, 56, 97 -RepA 117
-FtsW 46 -RepE 117
-FtsY 91 - represorowe 239, 241
- FtsZ 45, 46, 48, 153* - - L a d 178
- Fur 143, 153, 302, 303* -RpoS 143
- fuzyjne (hybrydowe) 153*, 196-199, - R u v 163
--FtsZ-GFP 47* - rybosomowe 136
-, glikozylacja 218 - SecA, SecB, SecYEG 91
- G l p F 17 -, sekrecja 87
-GroEL 140 -, sekwencje sygnalne 126
-GroES 140 - sensorowe Aer 85
- G r p E 141 -SinJ, SinR 153*
- heterologiczne 222, 228 -SipC 92
- H i s p P 88 - Smc 46, 197
- H - N S 154 -SopA 279
- H p 9 0 265 - SpoOA, SpoOB, SpoOE, SpoOF 148, 152*,
- H p r 90* 153*
- H U 45 -, synteza (p. też translacja) 122-127
- I C P 335 -, -, zahamowanie 382
-IcsA 87 - szoku cieplnego (HSPs, ang. heat-shock
-IdeR 145 proteins) 140
- IpaA (VirG) 269, 279 - kwasowego (ASP, ang. acid-shock prote-
-IpaB 92, 269, 300 ins) 143
-KatG 145 - - zimna 141, 142
- KdpA, KdpB, KdpC, KdpD, KdpE 147 - Tag (glikozylaza DNA) 130
- LacY 18, 127 -TbpA, TbpB 294, 303
-LexA 139 - ΤΕΤ 87, 174, 388
-lityczne 232, 236, 237 -Tet(M) 174
- M 26, 264, 299, 304 -Tir 265

446
-ToxR, ToxS 276 - pertussis 89, 264, 265, 267, 317, 353, 422, 432
- TP (ang. terminal protein) 116 borelioza (choroba z Lyme) 315, 400
-, translokacja 127 Borrelia 433
-Tsr 85 - anserina 433
- U m u C , UmuD 139 - burgdorferi 29, 30*, 33, 106, 107, 110, 265,
-UVrABC 132 315, 400
- UvrD (MutU) 131 -hermsii 300
-VacA 281 botulizm 231, 276, 294, 314, 315, 327
- wiążące DNA 122, 227, 228 Bradyrhizobium japonicum 141
- jednoniciowy DNA (SSB, ang. Brassica napus 349
single-strand binding) 112, 114* brodawki 249, 255
- penicylinę (PBP, ang. penicillin binding - korzeniowe 438
protein) 16, 25*, 42, 48, 103, 388, 389 bromek etydyny 188*, 424*
-xis 240 bromocyjan 197
-YadA 270 Brucella 19*, 107, 267, 315, 433
-Yop 92 -abortus 422
-YopH, YopE 299 - melitensis 433
-YscN 92 brucelloza 315
- z organizmów jednokomórkowych (SCP, bulion 352*, 406
ang. single-cell protein) 335 -MacConkeya 346, 353
-ZipA 46 -Mollera 409
-, zwijanie 126, 127 - odżywczy 352*
- żelazo-siarkowe 76 - seleninowy 438
biblioteka cDNA 180, 183* - tryptozowo-sojowy 308
- ekspresyjna 181, 183* - tryptozowy 346
- genomowa 178, 179*, 185 Burkholderia 427, 433
-, przeszukiwanie (screening) 181-184 - cepacia (Pseudomonas cepacia) 278, 433
biegunka 266*, 275, 277, 315, 319, 328*, 431, bursztynian 77, 79
435 bursztynylo-CoA 78*, 100
- krwawa 279, 328* 2, 3-butanodiol 73*
biogaz 342
bioinsektycyd 335 C
biologiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT) Caloramator 433
338, 339 Campylobader 327, 344, 433
bioluminescencja 246 -fetus 433
bioługowanie 336, 337 - jejuni 318, 328*, 330*, 433
biomasa 54 CAT (ang. chloramphenicol acetyltransfe-
biopestycyd 335 rase) 146, 198, 298*, 384, 388
biorca 170, 174, 258 Caulobacter 49, 433
bioremediacja 349 - crescentus 56-58
biotyna 198, 207, 398* - vibrioides 433
1, 3-bisfosfoglicerynian 70*, 97* cefalosporyny 380, 381*, 395*
Blastobacter 49 cefuksym 354
błękit bromotymolowy 406 ceftriakson 400
- metylenowy 14, 352*, 402 cellulitis 315
- N i l u A 14 Cellulomonas 98, 433
błona cytoplazmatyczna 15-18, 75*, 76, 84 -flavigena 433
- nitrocelulozowa 189, 420*, 423 celobioza 98
- purpurowa 83, 436 celuloza 2, 26, 51, 98, 247, 249, 433, 438
- zewnętrzna 20-23, 40, 185, 302, 387 cenocyty 34, 35
błonica 231, 241, 307, 314, 315 centrum reakcji 81, 82*
błonka biologiczna 339, 343, 344 CFT (ang. complement fixation test)
błonowe białko fuzyjne (MFP, ang. 309-311
membrane fusion protein) 89 chalkopiryt 336
Bordetella 19*, 432 chaperony (białka opiekuńcze) 18, 31, 127,
- parapertussis 293 140, 224

447
chelator 21, 287, 302, 304 -, dekatenacja 112
chemiluminescencja 198, 199, 332 - liniowy 106, 116
chemioterapia 280, 313, 314, 390 -, replikacja (p. też DNA, replikacja) 42-46
chemoatraktant 151* -, - dwukierunkowa 116
chemoefektor 59, 150* ciałko(a) podstawowe rzęski 27, 28*, 144
chemokiny 283, 289* - R 12
chemolitoautotrofy 95, 431, 438, 440 - wtrętowe 224
-bezwzględne 437 ciprofloksyna 385
-, metabolizm energetyczny 79, 80 ciśnienie osmotyczne 147
chemolitoheterotrofy 434 Citrobacter 434
chemolitotrof 67, 84, 95, 336, 431 Clostridium 19*, 59, 141, 252*, 253*, 262, 263*,
-bezwzględne 79 341, 344, 433
- względne 79 - bifermentans 336
chemoorganoheterotrofy 95 - botulinum 248, 276, 315, 323, 325, 328*
chemoorganotrofy 67 - butyricum 433
chemotaksja 28*, 33, 34, 87, 89, 148, 283* -difficile 318, 385, 427
- zależna od receptora 150* -fervidus 86
chemotrof 37, 66, 67, - novyi 319
chinolony 385, 399 - perfringens 147, 318, 319, 328*, 422, 433
chinon(y) 76, -piliforme 315
chinuprystyna 389 -septicum 319
Chityna 2* -tetani 276
Chlamydia 9, 107, 267, 271, 291, 433 - thermocellum 98
- trachomatis 18, 317, 318, 415, 416, 433 „coccobacillus" 430
chlor 344, 377 coli p. grupa coli
-, oznaczanie zawartości 345 consensus p. konsensus
chloramfenikol 118, 142, 174, 383, 384 Corynebacterium 263*, 434
chloraminy 344 - diphtheriae 7*, 241, 309, 315, 433
chlorek cezu 186, 188* - glutamicum 321, 322
- wapnia 168 Coxiella 59, 291, 434
chlorheksydyna 379 - burnetii 316, 323, 422, 434
Chlorobiaceae 96 CrickF. 110
Chlorobiineae 15, 82 crossing-over 212*
Chlorobium 433 CRP (ang. cAMP receptor protein = CAP,
chlorofil 80, 81, 100 ang. catabolite activator protein) 137, 226*
-a 81, 82, 437, 438 Cryptosporidium 345
-b 82, 437, 438 Cyanothece 253
chlorosomy (pęcherzyki Chlorobium) 15, 82, Cycas 249
433 cyjanobakterie (p. też sinice) 7*, 14, 15, 33,
chlorotetracyklina 383* 35, 129, 434
cholera 137*, 231, 245, 275, 276, 307, 315 cykl Calvina (reduktywny cykl pentozofos-
cholesterol 437 foranowy) 96, 97*
choroba(y) bakteryjne 314-319 - dobowy 155
-, diagnoza 415 - komórkowy 48, 49, 165
- kociego pazura 432 - kwasów trikarboksylowych (cykl kwasu
-, mechanizm rozwoju 274-281 cytrynowego, cykl Krebsa) 77, 78*, 97,
- Tyzzera 315 100, 322, 430
-Whipple'a 307, 316 - lityczny faga 233-239
- wrzodowa 436 - życiowy Caulobacter crescentus 56-58
- wywoływane przez E. coli 266* Cyklaza adenylanowa 137, 262
- zakaźne, zapobieganie 312, 313 cyklolizyna 89
- z Lyme (borelioza) 315, 400 cynk 287
chromatografia 186 cysta 59, 61, 432
- powinowactwa 181, 186, 197, 223, 229 cysteina 100, 255, 256*, 363, 436
- w kolumnach zwirowywanych 188* cystyna 439
chromosom 10, 106 cytochalazyna 267

448
cytochrom(y) 76, 100 - wirulencji 26, 29, 89, 126, 246, 276, 147,
-c 404 296-305
cytokiny 275, 277, 280, 281, 283, 287, 288, - X (hemina) 435
292, 293, 301, 319 czysta kultura 401
cytolizyna aktywowana tiolem 270 - -, izolowanie 359-361
cytoplazma 10, 12
cytoszkielet 11 D
cytotoksyczność komórkowa zależna od DAF (ang. direct amplification fingerprin-
przeciwciał 291, 296 ting) 424*, 426
cytotoksyna 318 dATP 216*
cytozyna (C) 108, 123* dawca 170, 174, 258
-, deaminacja 131, 158 +
- t y p u F 170, 173
-, metylacja 118 - - H f r 170, 173
-, wzór 109* dCTP 216*
cytrynian 107, 408, 440 DD (ang. differential display) 229
cytydyna 109* ddF (ang. dideoxy fingerprinting, dideoksy
czas podwojenia (czas generacji) 41, 49, 52 odcisk palca) 206, 393, 395
cząsteczka MHC klasy I 295 ddNTP (fosforan dideoksyrybonukleotydu)
II 292, 295 216*
cząstka rozpoznająca sygnał (SRP, ang. deaminaza fenyloalaniny 409
signal recognition particle) 91, 156 deformylaza metioninowa 125
- transdukcyjna 243 DEFT (ang. direct epifluorescent filter tech-
czerń Sudanowa Β 403 nique) 333, 363
czerwień fenolowa 408 dehydrogenaza CO 80
- krezolowa 409 -glukozy 85
- metylowa 407 - glutaminianowa 251, 252, 335
-obojętna 352* - izocytrynianowa 78*
- rutenowa 9*, 23* - N A D 84
czerwonka (dyzenteria) 87, 93, 232, 266*, dekarboksylaza aminokwasów, test 409
277, 279, 300, 307 - glutaminianowa 143
czwartorzędowe związki amonowe 377, 379 -lizyny 435, 438
czynnik(i) alkilujący 158, 376 - ornityny 435, 438
- anty-σ 144 dekatenacja chromosomów 45, 46, 112
- elongacyjny 125, 126 dekstran 26
- inicjacyjny transkrypcji IF-1 125 delecja 165
IF2 125, 142, 143 - umiejscowiona (ang. nested deletion) 218
IF3 125, 136 denitryfikacja 77, 252*, 253, 260, 341, 347
- kolonizacyjny CFi i CFII 266* -, rola w rolnictwie 254
- łączący transkrypcję z naprawą (TRCF, deoksyadenozyna 109*
ang. transcription-repair coupling factor) deoksycholan sodu 352*
133 deoksycytydyna 109*
- martwicy nowotworu (TNF, ang. tumor 2'-deoksy-D-ryboza 103*, 107, 109*
necrosis factor) 281, 283, 288* deoksyguanozyna 109*
TNF-alfa 287, 299, 301, 319 deoksyrybonukleotyd 107
TNF-beta 319 -, wzór 108*
- rakotwórczy (karcynogen) 161 deoksyryboza 103*
- r h o 121, deoksytymidyna 109*
- sigma (σ) 121, 144, 234, 278, 303* deoksytymidyno-5'-monofosforan (dTMP)
- - σ Ε 127, 335 102*
- - σ Η 151 deoksyurydyno-5'-monofosforan (dUTP)
- - (σs (RpoS) 143, 151, 153 192*
- - σ 3 2 140, 141, 151, 153 Desulfomonas 434
--σ70 121 - pigra 434
- transkrypcyjne 122, 247 Desulfotomaculum 59
- uwalniający 126 Desulfovibrio 79
- V ( N A D ) 435 - sulfodismutans 80

449
Desulfurococcus 422, 432, 434 cDNA (ang. copy DNA, complementary
Desulfuromonas 256 DNA) 180-182*, 218
detergenty 186, 251 ocDNA 188*
dezozamina 384 ssDNA p. DNA jednoniciowy
dezynfekcja 376-378 DNaza I 226*
DGGE (ang. denaturating gradient gel elec- dNTP 216*
trophoresis) 205* doksycylina 400
diacetyl 71, 408, 320 domena 419
diapedeza 283 - Bacteria p. Bacteria
diauksja (wzrost dwufazowy) 55 - Archaea p. Archaea
diazotrofy 253, 254 donor elektronów 77, 83
Dichelobacter 434 „dot blotting" 214*
- nodosus 434 drabinka Maxama-Gilberta 226*
dichloronaftochinon (dichlon) 246 drapieżnik 247
dichlorowodorek tetrametylo-p-fenylodi- DRNA (ang. dissimilatory reduction of
aminy 404 nitrate to ammonia) 253
dideoksy odcisk palca (ddF, ang. dideoxy droga infekcji 263-274
fingerprinting) 206, 393, 395 - - kropelkowa 307, 313, 315, 318
dideoksyrybonukleotyd 108* - przekazywania sygnału (ang. signal trans-
difosfatydyloglicerol (kardiolipina) 16 duction pathway) 34
5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny drożdże (p. też Saccharomyces cerevisiae) 321
(tetrafosforan guanozyny, ppGpp) 45, 46, dTTP 216*
142, 143 dupleks DNA 108, 110*, 111, 163
difosforan fenoloftaleiny 409 - DNA/RNA 113, 114*
digoksygenina 198 dur brzuszny 279, 307, 308, 316
6, 7-dihydroksykumaryna 410 - plamisty 313, 316
dihydroorotaza 146 - powrotny 300
dimer pirymidynynowy 139 - wysypkowy 307
-tetra-tetra 25* dwoinka(i) 7*
-tetra-tri 25* - zapalenia płuc p. Streptococcus pneumoniae
- tyminy 132, 158 dwusiarczek 158
dioksan 199 dwuskładnikowy system regulacji 57, 147,
1, 2-dioksyetan 199 247
dipikolinian wapnia 59, 62*, 148 CpxA-CpxR 127
DNA 11, 106 dwutlenek siarki 344
-, budowa 107-112 - węgla 341
- c h i p 229, 230 —, wytwarzanie 71-73*
- dwuniciowy (dsDNA) 231, 232*, 239 —, redukcja 80
-, glikozylacja 243 dysmutaza ponadtlenkowa 145, 261
-, izolacja 185-190 dyzenteria p. czerwonka
- jednoniciowy (ssDNA) 162, 201, 207, 231, dżuma dymienicza 263, 307, 313, 316
232* - gruczołowa 316
- liniowy 116
-, metylacja 130, 149, 427 Ε
-, modyfikacje 234 EaggEC (EAEC, ang. enteroaggregating
-, naprawa 130-133 Ε. coli) 266*
-, rearanżacje 165, 300 EDTA 185, 186
-, replikacja (p. też chromosom, replikacja) efekt cieplarniany 251, 259, 260
112-118 - glukozowy 137
-, - typu Cairnsa 114*, 117, 237, 238 - poantybiotykowy (PAE, ang. post-antibio-
-, superzwinięcie 133, 154 ticeffect) 399
-, synteza p. DNA, replikacja efektor 34
-, - „przez uszkodzenie" 139 egzochelina 303
-, topnienie 112 egzoenzymy 341
cccDNA (ang. covalently closed circular) egzonukleaza 128
111, 175, 188*, 232* -3'-5' 128, 131

450
-5'-3' 131 II 119, 120, 184
- I I I 132 III 119
egzospora 61, 63*, - zależna od metylacji 120
egzotoksyna 275, 276 -RuvC 163
- A (paciorkowcowy antygen A) 302 - S I 135
EHEC (ang. enterohaemorrhagic E. coli) 277, endopeptydaza cynkowa 276
304, 316, 328*, 353 endospora(y) 48, 59-61, 318, 323, 324*, 325*,
EIEC (ang. enteroinvasive E. coli) 328* 372, 377, 433, 434
ekson 180* -, barwienie 403
eksport 87 -, tworzenie (sporulacja) 62*, 65*, 148, 152*,
eksporter(y) ABC 88, 89 153*, 335
eksteina 128, 129 -, wykrywanie 403
ekstrakt drożdżowy 436, 437 endotoksyna 280, 288*, 301
elektroblotting 227 endtoksemia 289
elektroforetyczna analiza izoenzymów (MEE, Entamoeba histolytica 316
ang. multilocus enzyme electrophoresis) Enterobacter 71, 253, 434
414 - aerogenes 388
elektroforeza 208 Enterobacteriaceae 402, 405, 406, 433, 434
- w żelu 188, 423, 424, 415 enterochelina (enterobaktyna) 302
poliakryloamidowym 217* Enterococcus (Streptococcus) (p. też entero-
- w zmiennym polu elektrycznym (PFGE, koki) 410, 434
ang. pulse-field gel electrophoresis) 189, -faecalis 169, 174, 247, 404, 434
190, 416, 423 -faecium 174
- dwukierunkowa 205* enterokoki (p. też Enterococcus) 104, 389
elektroporacja (elektrotransformacja) 168, enteropatogenność 305
169, 191, 210 enterotoksyna 266*, 275
elektrotransfer 189 - A 319
element transpozycyjny (TE, ang. transposi- - F 302
tion element) 165 enzym(y) 66
- UP (ang. upstream element) 121 - indukowany 384
ELISA (ang. enzyme-linked immunosorbent - konstytutywny 384
assay) 311, 312*, 331 - restrykcyjne p. endonukleazy restrykcyjne
elongacja 121 eozyna 23*
EMSA (ang. electropheretic mobility-shift EPEC (ang. enteropathogenic E. coli) 91, 92,
assay) 228 265, 266*, 268*, 304, 305, 328*
Encephalos 249 eperzolid 389
endocytoza 277 epidemiologia 429
endolizyna 236, 237 - molekularna 417, 423, 426
endonukleaza(y) 128, 129, 131 epifluorescencja 333, 369
- restrykcyjna(e) (RE, ang. restriction endo- Epulopiscium fishelsoni 9
nuclease) (restryktazy) 45, 118, 179*, 184, Erwinia 71, 257, 321, 434, 435
185, 423, 426, 428* - amylovora 435
—, aktywność z gwiazdką (ang. star acti- erytromycyna 88, 124, 174, 384, 390, 400
vity) 185 erytrozo-4-fosforan 98
- - BaeI 119, 184*, 185* Escherichia 435
- - D p n I 120, 210 - coli 7*, 9*, 11, 31, 40, 85, 252, 256*, 263*,
- - EcoRI 119, 177* 318, 324, 343, 346, 353, 422*, 428*, 432, 434,
- - HmdII 184*, 185* 435
- - H p a I 184*, 185* —, chromosom 106, 110
- -, inhibitory 243 —, cykl życiowy 41^48
- - , przykłady 184* —, czas podwojenia 49
- - Pstl 184*, 185* —, diauksja 55
—, rozpoznawane sekwencje 184* —, elektroporacja 168, 169
--Sau3AI 132 - - f a g i 232*
- - S r f I 207 —, fermentacja 71, 406
- - t y p u I 119 —, fimbrie 31

451
Escherichia coli fazyna 13
- -, koniugacja 170-173 fenoloftaleina 409
—, krzywa wzrostu 52*, 53* fenotyp 160
—, patogeneza 154 fenyloalanina 98, 409
- -, rzęska 28*, 32, 144 fermentacja 67-73
—, szczep(y) EHEC (ang. enterohaemorrha- - butanodiolowa 70-72*, 407
gic E. coli) 177, 304, 316, 328*, 353 - cukrów 406
—, - enteroagregujące (EaggEC, EAEC, - heteromlekowa 69, 335, 436
ang. enteroaggregating E. coli) 266* - homomlekowa 69, 71*, 320, 436
—, - enteroinwazyjne (EIEC, ang. - kwasów mieszanych 70-72*, 407, 435, 441
enteroinvasive Ε. coli) 328* - mlekowa 69, 334
—, - enteropatogenne (EPEC, ang. entero- - nieorganiczna 80
pathogenic E. coli) 91, 92, 265, 266*, 268*, -octowa 322
304, 305, 328* -, schemat 69*
—, - enterotoksygenne (ETEC, ang. feromon 169, 247
enterotoxygenic E. coli) 31*, 328* -ComX 247
- - , -K88 31* -CSF 247
- - , -K99 31* ferredoksyna 76, 253, 255, 385
- -, - O157 277, 329, 353, 361, 362* FHA (ang. filamentous hemagglutinin) 264
—, - uropatogenne (UPEC, ang. uropatho- fibroblasty 288*
genic E. coli) 305 fibronektyna 265
- - , -W3110 223* fibryna 278, 405
—, - werocytotoksyczne (VTEC, ang. fibrynogen 405
verocytotoxic E. coli) 266*, 328* fibrynolizyna 405
- -, ściana 20-23 filament(y) (ang. trichomes) 35, 139
—, wywoływane choroby 266* filarioza 336
- -, wzrost 52, 53 Filifactor 433
eskulina 410, 436 filtr biologiczny 339
etambutol 389 - membranowy 258
etanol 341, 430, 440 - nitrocelulozowy 170, 183, 198, 227
-, utlenianie 79, 322 - piaskowy 343, 344
-, wytwarzanie 71-73* filtracja 355, 375
ETEC (ang. enterotoxygenic E. coli) 31*, fimbria 23*, 29-32, 94, 293
328* - typu 1 164*, 264
etridiazol 254 - 4 (fimbrie tworzące wiązki, BFP, ang.
Eubacteria 435 bundle-forming fimbriae) 265
eutrofizacja 341 - w adhezji 264
ewolucja 159 fiolet krystaliczny 366
Exiguobacterium aurantiacum 38 FISH (ang. fluorescence in situ hybridiza-
eza 357, 359 tion) 311, 312
fitoplankton 250
F flagellina 27, 29, 144
FAD (dinukleotyd flawinoadeninowy) 67, fleroksacyna 385
77, 78*, 100 flokulacja 339
FADH 100 fluoresceina 198, 309
fag p. bakteriofag fluorescencja 368, 411
fagmid 193, 195 fluorochinony 400
fagocytoza 26, 271, 282 forma L 9
-, unikanie 299 - replikacyjna (RF, ang. replication form)
fagocyty 282, 399, 400 240
fagolizosom 145, 271, 282, formaldehyd 104, 105, 375
fagosom 269, 270, 273*, 282, formamid 217*, 396*
faza logarytmiczna (wykładnicza) 51, 53* formy nitkowate bakterii 34, 35
- stacjonarna 52, 53* formylacja metioniny 123
- śmierci 52, 53* N-formylometionina 101*, 123, 125
- zastoju (faza lag) 51, 53* N-formylometionylo-tRNA 125, 141

452
N-formylotetrahydrofolian (N-formylo-THF) β-galaktozydaza 134, 135*, 298*, 299*, 409
101*, 123 Gardnerella 315, 435
fosfataza fosfoseryny 102* - vaginalis (Haemophilus vaginalis) 435
- SpoIIE 57, 148 gatunek 4
- RapA i RapB 148 -, identyfikacja 427
-, test 409, 410 - typowy 430
fosfatydylocholina (lecytyna) 15, 270 gazy cieplarniane 260
fosfatydyloetanoloamina 15, 18, 127 gen(y) abrA 153*
fosfatydyloglicerol 15, 16 -ahpC 145, 393
fosfodiesteraza 137* -aqpZ 17
fosfoenolopirogronian 67, 72*, 89, 90*, 100 - araA, araB, araC, araD, araE, araFG 134
2-fosfoglicerynian 104 -cI 239
3-fosfoglicerynian 97*, 102 -cat 145
6-fosfoglukonian 99*, 101 -CAT 298*
6-fosfoglukono-5-lakton 99* -comS 247
3-fosfohydroksypirogronian 102* -dnaA 113
fosfolipidy 15, 20*, 42, 280 -dnaI 140
fosfor 347 -dnaK 127
- 3 2 P 217, 226* - dnaN 113, 115*
fosforybulokinaza 96, 97* -dot 271
fosforylacja białek 127 -dsbA, dsbB 126, 127
- oksydatywna 75, 83 - envA 48
- substratowa 69, 70*, 98 - era 46
O-fosforylacja 383 - eukariotyczne, ekspresja w bakteriach 218
fosforylaza polinukleotydowa 128 -fem 389, 399
3-fosfoseryna 102 -fimA, fimC, fimO 32
fotofosforylacja 81, 82 -fis 113
fotoliaza 132, 133 -flgE, flgH, flgI, flgM 144*
fotolitoautotrof 95, 433, 434 -flcC 144*
fotolitotrof 83, 95 -fliF 57, 144*
fotoorganotrof 83 -fliG, fliM, fliN 144*
fotosynteza 80-83, -ftsZ 46, 47*, 57, 153*
- anoksygenowa 82, 83, 434 -fur 143
- oksygenowa 81, 82, 437 -gadB, gadC 143
-, reakcje ciemne 81 -glpF 17
-, - jasne 81 -groEL, groES 127
fotosystem I (PSI0 i II (PSII) 81, 82* -H1, H2 164*
fototrof 37, 66 -icm 271
-, metabolizm energetyczny 80-83 -IcrF 154
fragment Okazaki 114*, 115, 172*, 234 -, Inaktywacja 210
Francisella 435 -, - insercyjna 213
- tularensis (Pasteurella tularensis) 307, 317, -MA 270
435 -int 174, 239
Frankia 249 - inv-spa 269
fruktozo-l, 6-bisfosforan 70* -katG 145, 393
fruktozo-6-fosforan 70* - lacA 134, 135*,
fuksyna karbolowa 23*, 367, 402 - lacI 135*, 194*
fumaran 79 - lacY 134, 135*
Fusobacterium nucleatum 7* - lacZ 134, 135*
fuzja FtzZ-GFP 47* -lexA 139
- genów (genowa) 196-199, 210, 224, 225 - lif 245
-lon 140
G -ΙpxΑ 21
galaktokinaza 198 -lpxC 21, 390
galaktoza 98, 134 -lux 246
galaktozo-1-fosforan 98 -lysU 140

453
gen(y) -tet(M) 174
- markerowy 212 - t r g 150*
- mdf 133 - t s r 150*
-mecA 388, 389, 397, 399 - uvrA, uvrB, uvrC 132, 139
- minC, minD 48 -VMAC1 129
- motA, motB 144* - „wczesne" 233, 237*, 239
-mpl 94 -vac 281
- mscL 41 - 16S rRNA 260, 261, 336, 421, 433
-mukB 45, 46 -23SrRNA 336
- mut 131, 132 genom liniowy 116
- mutatorowy 157 gentamycyna (gentamicyna) 382
- mxi-spa 269 geosmina 246
- nif 255 GFP (ang. green fluorescent protein) 47*, 56,
-opa 300 197
- oporności na antybiotyki 190 gleba 98
-oppBCDE 94 glicerol 18, 79, 101
-parC 45 glicerolo-3-fosforan 16*
- partnerski (nośnikowy) 197 glicyna 97*, 100, 101*, 104
-phoA 213 glikogen 63
-plcB 270 glikolipidy 16, 21
-pncB 128 glikoliza (szlak Embdena-Meyerhofa-
- „ p ó ź n e " 234, 236, 237* -Parnasa) 69, 70*, 71, 76, 85, 97
-ppiA 127 glikozylacja DNA 243
-psbAI 155 glikozylaza DNA 130
-puf 146 --I (białko Tag) 130
-pvdS 303 - - II (białko AlkA) 130
-pyrC 146 - uracylowa (UNG) 131
-recA 162 globalne ocieplenie 105
-recF 113 Gloeobacter 81, 422*
-, regulacja ekspresji 133-155 glony 250, 341, 343
-relA 142, 143 glukan 267, 271
-rep 117 glukoneogeneza 99*, 101
- reporterowy 198, 298* glukonian 85, 98
- rpoB 386, 393 glukoza 134, 137
-rpoD 140 -, utlenianie 70*, 72*, 85, 98, 99*
-rpoH 140, 151, 154, 225 glukozo-1-fosforan 98
- rpoS 143. 151 glukozo-6-fosforan 70*, 98, 99*, 101
-rRNA 423, 428* glukozoamina 21
- S 237 β-glukozydy 138
-sapABCDF 88 β-glukuronidaza 411
- sec 91 glutamina 103*, 251-253
-selC 305 glutaminian 40, 102*, 103*, 153, 251-253,
-sinR 153* 438
- smc 46 - monosodowy 321
-sodA 145 głaszczka 358
-SOS 139 główka faga 232*, 236, 237*
- soxR/soxS 145 gnicie 334
-spoIID, spoIIG 152* GOGAT (ang. glutamine: 2-oxoglutarate
- spoOA, spoOB, spoOF 153* aminotransferase) 252
- spoOH 151, 153* gonokok p. Neisseria gonorrhoeae
-spoOJ 46 gorączka 279, 288*, 300, 319
-su/A 48, 139 -Oroya 280, 307, 328*
- „średnie" 234 - Q 316
-t 237 gospodarz 247
-tap 150* GramC. 19
-tar 150* gramicydyna 127

454
granule PHB (ρ. też poli-β-hydroksymaślan) hemaglutynina nitkowata (FHA, ang. fila-
403 mentous hemagglutinin) 264
granulocyty obojętnochłonne 296 hemina 208, 308
- zasadochłonne 289, 291 hemocytometr 364*
Griffith F. 168 hemolizyna 88, 169, 412
gronkowiec(e) 7*, 245, 277, 300, 318, 386 -HlyA 300
- koagulazododatnie 278, 405, 411, 439 -a 87, 94, 412
- koagulazoujemne 439 -β 412
- złocisty p. Staphylococcus aureus heparyna 208, 308
grupa aminowa 251 heterocysta 61, 63, 65, 252*, 253, 431, 434
grupa coli 433 heterodupleks 162, 163
- formylowa 123, 125 heterotrofy) 95
- metylowa 118 -, asymilacja węgla 97, 98
gruźlica 274, 296, 307, 316, 323, 389, 390 - chemoorganotroficzne 95
- utajona 274 histamina 282, 283*, 285*
gryzonie 315 histon(y) 2*
grzybnia 6, 440 histydyna 98, 99*, 251
grzyby 380 hodowla 51, 351
GSP (ang. general secretory pathway) p. - beztlenowa 362, 363
system sekrecji typu Π - ciągła 53, 54
GTP (guanozyno-5'-trifosforan) 78*, 91 - okresowa 51-53
-, hydroliza 125 - starterowa 320
GTPaza 46, 91 - synchroniczna 54, 55
-CDC42 269 - tkankowa 270
guanina (G) 108, 123* holina 237, 238
-, wzór 109* holoenzym 42
guanozyna 109* - polimerazy RNA 121
gyraza (żyraza, topoizomeraza II) 111, 118, homologia DNA 162
142, 240, 385 hormogonium 65, 434, 437
HRHT (ang. high-resolution hybridization
Η template) 219
Haemophilus 19*, 435 HSPs (ang. heat-shock proteins) 140
- influenzae 31, 167, 213, 264, 273, 286, 291, hybrydoma 295
293, 299, 318, 422, 435 hybrydyzacja DNA-DNA 418, 419
- somnus 416 - fluorescencyjna in situ (FISH, ang. fluores-
Hafnia 43, 435 cence in situ hybridization) 311, 312
-alvei 543 - in situ (ISH, ang. in situ hybridization)
hak rzęski 27, 28*, 144 311, 312
halazon 313, 348 - kolonijna 180, 181, 183*, 211
Halobacterium 14, 23, 107, 432, 435 - „odwrócona" 398
-halobium 422, 436 - typu Southerna 189
- salinarum 39, 23, 436 hydroizoprenoid 18
halofile 39, 432 hydroksamaty 302
- ekstremalne 83, 419, 435 hydroksybutyrylo-CoA 104
harpiny (ang. harpins) 92 hydroksyloamina 158, 197
heksulozo-6-fosforan 104 hydroksymaślan 348
Helicobacter 436 hydroksymetylocytozyna 234
- pylori 9*, 18, 27, 106, 110, 169, 263*, 280, hydroksyperoksydaza alkilowa 145
281, 300, 303, 305, 385, 394*, 408, 422, 436 hydroksywalerian 348
helikaza 113-115, 163 Hyphomicrobium 49, 58, 104
-DnaB 163
- I 172 I
- II (MutU, UvrD) 131, 132 ICP (ang. insecticidal crystal protein) 335
helisa DNA 110, 111* identyfikacja bakterii 401-417
hem 303 - Enterobacteriaceae 407
hemaglutynacja 29 idiotyp 290*

455
igła 357 ISH (ang. in situ hybridization) 311, 312
immunizacja bierna 294 iteron 117
immunoglobuliny (p. też przeciwciała) 289 IVET (ang. in vivo expression technology)
-, budowa 290* 296-299
-, klasy 289 izomeraza peptydyloprolilowa 127
immunotransfer 189 izoniazyd 145, 387, 389, 393
import 87 izoprenoid 18
importer(y) ABC (transportery zależne od izopsoralen 206
białek wiążących, permeazy cytoplazmaty- izoschizomer 185
czne) 88 izotyp 290*
IMS (ang. immunomagnetic separation)
360-362, 415
indol 346 J
-, test 407 jabłczan 440
induktor 135*, 138 jaglica 317
infekcja 275 jałowienie p. sterylizacja
- szpitalna 263 jednostka Svedberga 12
- utajona 274 jodyna 379
inkubacja 51 jogurt 320, 321
inokulacja (szczepienie) 51, 351, 358-390 Κ
inokulum 357, 392* kadaweryna 409
insektycyd biologiczny 12 E-kadheryna 265, 270
Insercja 165, 212* kakao 321
insulina 175, 180* kalprotektyna 287
integracja Campbella (rekombinacja insercyj- kanał 91
no-duplikacyjna) 212* - mechanowrażliwy 17, 40
integron 388 - M I P 17
integryna 264, 265, 269, 270, 283 -MscL 17, 41
inteina 128, 129 - osiowy rzęski 144
interferon(y) 286, 287 - sekrecyjny 91
-IFN-α 286, 292, 296 - transbłonowy 90*, 168
-TFN-β 180, 286 kanamycyna 174, 382
-IFN-y 283, 286-288*, 319 kapsyd (płaszcz) 231
interleukina IL-1 283, 288*, 301 karbamoilofosforan 103*
- IL-2 288*, 293, 295, 319 karbapenemy 380, 381*
- IL-4 287, 288*, 292, 293, 301 karboksydobakterie 96
-IL-5 292 karboksylaza-oksygenaza rybulozo-l, 5-bisfo-
-IL-6 281, 283, 288* sforanowa (RuBisCO) 15, 96, 97*
-IL-8 281, 283, 288* LD-karboksypeptydaza 43*
-IL-10 288*, 292, 293 karboksysom 15
-IL-12 288*, 292 karcynogen (czynnik rakotwórczy) 161
internalina 304 kardiolipina difosfatydyloglicerol) 16
- A 270 kaseta genowa 388
internalizacja 267, 269, 303 kaskada cytokin 281
intron(y) 155, 180, 218 katabolizm 66
intymina 265, 304 katalaza KatG 145
inwazja 267-274 -, test 404, 405*
-makrofagów 271-273 katalogowanie oligonukleotydowe 16S rRNA
- nabłonka jelitowego 269-271 419-423
inwazyjność 93 katenat 45, 115
inwazyna 270, 304 katenina 270
inżynieria genetyczna 175-230, 260 kawa 321
IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktozyd) 135*, keto-3-deoksy-6-fosfoglukonian 99*
178, 194 α-ketoglutaran 102*, 251, 252
iSDR (ang. inducible stable DNA replica- kępki Peyera 269, 270, 279
tion) 116 kiełkowanie endospor 59

456
kiła 306, 311, 317, 388 -pamięci 291, 292
kinaza(y) A (KinA) 148, 152* - plazmatyczne 292
-, autofosforylacja 152 -, podział 139
-B(KinB) 148, 152* - prezentująca antygen (APC, ang. anti-
-FlbE 57 gen-presenting cell) 291
- histydynowa 147, 151, 247 - prokariotyczna 2*
- K d p D 147 - spoczynkowe 59-62
kiszonki 326, 334, 335 - Τ (limfocyty T) 283, 287, 288*, 291, 295,
kladinoza 384 301
klasyfikacja (taksonomia) bakterii 4, 5
+
- - cytotoksyczne (Tc) (CD8 ) 295, 296, 300,
-prokariotów 417-429 301
klawamy 380, 381*
+
- - pomocnicze (Th) (CD4 ) 292, 293, 296,
Klebsiella 71, 436 301
- pneumoniae 252*, 253*, 318, 408, 434, 436 Th1 i Th2 288*
kleszcze 307 - tuczne 283, 285*, 289, 291
klindamycyna 318 kompetencja 167, 168, 247
kloksacylina 380 kompleks antygen-przeciwciało (ag-ab)
klonowanie 171, 176-196 285*, 286, 290, 309
- produktów PCR 207 - atakujący błonę (MAC, ang. membrane
klostridia p. Clostridium attack complex) 283-285*
kłaczki 339, 343 - zbierający światło 81
koagulaza, test 405, 406 komplementacja 218
- wolna 405 kompost 98
- związana 405 koniczyna 254
kod genetyczny 123* koniugacja 107, 169-173, 247, 305
kodon 122, 123*, 159, 183 - in situ 258, 259
- inicjacyjny (AUG) 123, 125, 136, 194*, 216 - niezależna od plazmidu 174, 175
- stop (nonsensowny, terminacyjny) 123*, - uniwersalna 173
126, 216 - wymagająca podłoża stałego 173
-UAA (ochre) 123*, 126 koniugat 309
- UAG (amber) 123*, 126 konkatemer 236, 237*
- UGA (opal) 123*, 126 konsensus (sekwencja najwyższej zgodności)
koenzym A 100 5'-CTGTN8ACAG-3' 121, 139
kointegrat 167* konserwy 323
kolagen 265 konsorcjum 10
kolicyna 245 kontrola atenuacyjna 136
kolista permutacja 234 - biologiczna 260, 335, 336,
kolonia 49, 51, 353 - replikacji plazmidów, ścisła 118
-, kształt 50* , zrelaksowana 118, 191*
-, otrzymywanie 359*, 360 konwersja fagowa (lizogenna) 241, 439
- Proteus 58 - g e n u 129
komary 336 konwertaza 285*, 286
komensale 248, 439, 440 końcowy akceptor elektronów 74
komin hydrotermalny 37 koproteaza 139
komora beztlenowa 363 korteks 61*, 62*
- do liczenia 363, 364* kosmid 190, 192*, 219
- do pracy jałowej 356* kotransdukcja 242
-Helbera 364* kotranslacja 123*
-Thoma 364* kotrimoksazol 386, 387
komórka(i) Β (limfocyty B) 287-291, 295 koziołkowanie 32, 150*, 151*
- dendrytyczne 288*, 291 krezol 377
- eukariotyczna 2* krętek(i) 6, 7*, 281, 317, 422*, 439
- F- 170, 172 kropla wisząca 403*
- F + 170 królestwo Archaebacteria 432
- H f r 172, 173 - Eubacteria 435
- M 269, 270 krwotoczne zapalenie okrężnicy 277

457
krztusiec (koklusz) 264, 267, 307, 317 - bulgaricus 321
krzywa wzrostu 51 -delbrueckii 422, 436
- Escherichia coli 53* Lactococcus (Streptococcus) 436
ksantan 3, 26, 322 - cremoris 84, 320
ksenobiotyki 251 -lactis 17, 320
ksylen 377 lakmus 410
D-ksylulozo-5-fosforan 134 β-laktamaza 380-382, 388, 389, 391, 394
kumaryna 385 β-laktamy 103, 382, 399, 400
Kurthia 436 laktoferyna 303
- zopfii 436 laktokoki (p. też Lactococcus) 440
kwarantanna 313 lakton N-acylo-L-homoseryny (AHL, ang.
kwas acetomlekowy 71, 73* A-acyl-L-homoserine lactone) 246, 247
- N-acetylo-L-talozoaminouronowy 23 laktoza 98, 320, 409
- N-acetylomuraminowy 24*, 103, lantybiotyki(i) 245, 327
- p-aminobenzoesowy (PABA) 100, 386 LCR (ang. ligase chain reaction) 219, 220
- p-benzoesowy 326 laseczka 6, 7*
- bursztynowy 72*, 78* lecytyna 270
- cytrynowy 77, 78*, 96 lecytynaza 270
- dihydrofoliowy 101*, 386 Legionella 436
- fenylopirogronowy 409 - pneumophila 267, 271, 422, 423, 436
-foliowy 386 leki immunosupresyjne 274
- fosfoenolopirogronowy 70* lekooporność 390
- fosfoglicerynowy 70* lektyna 271
- fumarowy 78* - wiążąca mannozę (MBL, ang. manno-
- N-glikolilomuraminowy 25* se-binding lectin) 286
- glutaminowy 100, 299, 322 lepkie końce (ang. sticky ends) 172*, 184,
- D-glutaminowy 25*, 26 185*, 194*, 195, 237*
- hialuronowy 26, 278, 299 Leptonema illini 29, 33
- 3-β-indoloakrylowy 223* Leptospira interrogans 317
- izocytrynowy 78* Leptospirillum ferrooxidans 336
-jabłkowy 78* leptospiroza 317
- karbolowy (fenol) 371 Leuconostoc 70, 326, 436
- α-ketoglutarowy 78*, 100, 322 - cremoris 320
- klawulanowy 381*, 382 - mesenteroides 436
- kolanowy 26 leucyna 84, 97*
- mezo-diaminopimelinowy 25* leukocydyna(y) 300
- mikolowe 145 - Pantona-Valentine'a 300
- mlekowy 69-73*, 267, 320, 321, 326, 334, leukocyt PMF 300
436 liaza hialuronianowa 278
- mrówkowy 71-73, 83, 321, 438 - mrówczan: wodór 7, 407
- nalidyksowy 140, 385 liczba kopii plazmidu 118, 128
- nikotynowy 438 liczenie bakterii 363-365
- nukleinowe p. DNA, RNA ligacja 163, 196, 219
- octowy 72*, 326, 430, 438 ligand 229
- oksolinowy 385 ligaza 131, 132
- pirogronowy 69-73*, 77, 78*, 84, 98, 99* - DNA 177, 179*, 182*
- podchlorawy 344, 377 - - f a g a T4 196
- propionowy 321, 438 - termooporna 219
- sorbowy 326 lignina 251
- szczawiooctowy 77, 78*, 96, 100 Limulus 333
-tejchojowe 20 linezolid 389
- tetrahydrofoliowy 386 linker 195
- tłuszczowy(e) 16*, 98, 100, 281, 335, 436 lipaza 241
L lipid(y) 15, 16, 18
Lactobacillus 19*, 70, 263*, 329, 326, 334, 404, - A 20*, 21, 280, 390
436 - archeonów 18

458
- diestrowe 18 mangan 39, 145
- dieterowe 18 mannitol 352*
lipooligosacharyd (LOS) 20 D-mannoza 29
lipopolisacharyd (LPS) 20, 21, 280, 284, 285" masło 320
-, glikozylacja 239 maślanka 320
-, oznaczanie 333 MBC (ang. minimum bactericidal concentra-
lipoproteina Brauna 20*, 21 tion) 314
Listeria 19*, 422, 436 MCPs (ang. methyl-accepting chemotactic
- grayi 419 proteins) 150*, 151*
- monocytogenes 215*, 265, 266, 270, 273*, MCS (ang. multicloning site) 193-195
296, 303, 327, 331, 334, 361, 399, 410, 419, mechanizm(y) obronne gospodarza 281-296
436 - replikacji typu Cairnsa 237, 238
- murrayi 419 - toczącego się koła 116, 117, 172, 236, 240
listeriolizyna O 270 mediator procesu zapalnego 285*
listerioza 317, 327 MEE (ang. multilocus enzyme electrophore-
liza bakterii 231, 236, 237*, 283*, 285* sis) 414
—, alkaliczna 186* mejoza 2*
—, osmotyczna 18, 94 metabolit wtórny 53
- makrofagów 300 metabolizm fermentacyjny 406, 433, 439
lizogenia 231, 237*, 239, 240, - oddechowy 78*, 79, 406, 438
lizol 377 metachromacja 14
lizosom 271, 281 metan 260, 341, 342, 437
lizostafina 25*, 185, 245 -, utlenianie 104, 105
lizozym 23-25*, 185, 282, 286 -, wytwarzanie 80
lizyna 409 metanofuran 80
locus 160 metanogen(y) 80, 250*, 419, 436
lucerna 254 metanol 80, 83, 104
lucyferaza 332 metanotrofy 105
lucyferyna 332 N5, N10-metenylo-THF 101*
luka (ang. gap) 162, 228 Methanobacter 23
Methanobacterium 80
Ł -bryantii 422
łańcuch infekcji 412 - jannaschii 17
- lekki i ciężki immunoglobulin 290 - thermoautotrophicum 17
- oddechowy beztlenowy 77 Methanobrevibacter 80
- O-swoisty 20*, 21 Methanococcoides 80
- transportu elektronów 17, 74-76, 78*, 80, Methanococcus 23, 80
82 - jannaschii 46, 422
łańcuchowa reakcja ligacji (LCR, ang. ligase Methanolobus 80
chain reaction) 219, 220 Methanosarcina 14
łańcuchowa reakcja polimeryzacji p. PCR Methanothermus 80
łańcuszek 10 Methylococcus 23, 104, 105, 437
łodyżka (prostheca) 56, 57* - capsulatus 437
łysinka 238, 414 Methylomonas 104, 105
Methylophilus 104
Μ - methylotrophus 335
mAbs (ang. monoclonal antibodies) 280, 295 metionina 101*, 255, 439
MAC (ang. membrane attack complex) -, formylacja 123
283-285* metoda Barritta 407
magnetosom 12 - bezpośredniego oznaczania fluorescencji
magnez 12, 21, 39, 112, 119 na filtrach (DEFT, ang. direct epifluores-
makrofag(i) 271, 279, 280, 282, 285*, 292, 296 cent filter technique) 333
makrolidy 383, 384, 399, 400 - Milesa i Misry'ego 365, 366*
makrootoczka 23*, 25 - Okayamy-Berga 181, 182*
makropinocytoza 269 - płytek lanych 365
malaria 336 - płytkowa liczenia bakterii 365

459
metoda przesunięcia nacięcia (ang. nick mikroplazmodesmy 35, 63
translation) 199 mikroskop fluorescencyjny 47*, 197
- replik płytkowych 161, 162*, 299 -świetlny 370
-Southerna 189, 427 - z ciemnym polem 402
- „Southwestern blotting" 227, 228 - - kontrastem fazowym 370, 371, 402, 403
-Ziehl-Neelsena 274 mikroskopia 368-371
metronidazol 385 - epifluorescencyjna 312
metycylina 380, 394* - fluorescencyjna 315
metycylinazy 389 - immunofluorescencyjna 309
metylacja DNA 149 - kontrastowo-fazowa 370, 371
-oriC 45 mineralizacja 252*, 256*, 257, 339
metylaza p. metylotransferaza minimalna dawka infekcyjna 266*
5 10
N , N -metyleno-THF 101*, 103* minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC,
3-metyloadenina 130 ang. minimum bactericidal concentration)
7-metyloadenina 130 314
metyloamina 104 - hamujące (MIC, ang. minimum inhibi-
5-metylocytozyna 131 tory concentration) 391, 394*
N5-metylo-THF 101* mitochondria 2*
metylotransferaza (metylaza) 118, 243 mitomycyna 240
- C h e B i C h e R 151* mitoza 2*
- D a m 149 mleczan 79, 341, 430, 440, 438
-EcoRI 119 mleko 320, 325
metylotrof(y) 104, 250*, 260, 335, 437 -, badanie zakażeń 333
metylotrofia 104, 105 - U H T 323, 332
metyloumbelliferylo-β-D-glukuronid (MUG) - z lakmusem 410
411 Mobiluncus 315, 437
MFP (ang. membrane fusion protein) 89 mocznik 217*, 408
MHC (ang. major histocompatibility comp- model Helmstettera-Coopera 47, 48
lex) 286, 287, 292, 295, 296 - 3-za-l 42, 43*, 103
MIC (ang. minimum inhibitory concentra- moduliny 280, 301
tion) 391, 394* modyfikacje DNA 118-120
Microcystis 246, 343 monobaktamy 380, 381*
miedź 336 monocyty 288*, 296, 301
miejsce A rybosomu 125, 142 monofosforan deoksytymidyny (dTMP)
- AP (pozbawione zasady) 131, 132, 139 101*
- apirymidynowe 131 monooksygenaza metanowa (MMO, ang
- apurynowe 131 methane monooxygenase) 105
- c h i ( c ) 139 Moorella 433
-cos 191*, 237* morfogen 48
- Ρ rybosomu 123, 125. 194* mostek disulfidowy 126
- receptorowe faga 234* - peptydowy 25*, 42
- restrykcyjne 192*, 195 motor rzęski 28*, 151*
-ter 115 mrówczan 440
- wiązania rybosomu 194* MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococ-
- wielokrotnego klonowania (MCS, ang. cus aureus) 104, 379, 384, 388-390, 397,
multicloning site) 193-195 399, 416
mikoplazmy 6 MUG (ang. 4-methylumbelliferyl-β-D-glu-
mikroaerofil(e) 39, 85, 431-433, 436 curonide) 411
mikrocyna 245 mukowiscydoza 278, 279, 439
mikroflora 244 murawka bakteryjna 50, 358, 391, 413
- ciała 435 mureina p. Peptydoglikan
- człowieka 263* mutacja(e) 133, 157-162, 401
-jelita 245, 435 - a fag Mu 241
-mleka 323 -letalne 159
-skóry 263*, 281 -cicha 159*, 393
mikrootoczka 23*, 25, 439 - nonsensowna 159*

460
- plejotropowa 12 nadtlenek wodoru 145, 376, 404
- polarna 134 nadwrażliwość 291
- powrotna (rewersja) 161, 179 nafcylina 380
- punktowa 131, 159*, 210, 211* α-naftol 407
- specyficzne 210, 211 najbardziej prawdopodobna liczba (NPL)
- spontaniczne 157 346
-, typy 159, 160 naprawa DNA 131, 132
-, wykrywanie 230 NASBA (ang. nucleic acid sequence-based
- zmiany fazy (zmiany ramki odczytu) 159* amplification) 220, 221*, 416
mutagen 158, nawozy azotowe 254
mutageneza 209-215 - „zielone" 254
- SOS 139, 140 nazewnictwo bakterii 4, 5
- transpozonowa 211-215 nefelometria 55
- typu STM (ang. signature-tagged mutage- Neisseria 29, 33, 300, 304, 405, 437
nesis) 213 - gonorrhoeae 7*, 31, 93, 167, 267, 274, 303,
- zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca) 317, 318, 353, 389, 415-417, 422, 437
(=mutageneza kierowana przez oligonu- - menigitidis 20, 174, 286, 294, 299, 303, 318.
kleotydy) 210, 211* 417, 422
mutant 159 neomycyna 382, 383
- auksotroficzny 162 neurotoksyna 276, 348
-, izolacja 160, 161 neutrofile 287, 296
- zależny od streptomycyny 392 nićc 240
- zrelaksowany 143 - matrycowa 113-115
mutualizm 248 - opóźniona 234
mycetocyt 249 -v 240
mycetom 249 - wiodąca 113-115
Mycobacterium 20, 25*, 49, 437 niewydolność nerek 266*
-avium 273* nikiel 39
- bovis 215*, 294, 316, 389 Nitrobacter 49, 79, 252*, 437
-leprae 49, 248, 311 - winogradskyi 437
- paratuberculosis 362*, 415 nitrocefin 382
- tuberculosis 18, 107, 110, 129, 145, 215*, nitroceluloza 189*
218, 220, 263*, 267, 271, 274, 278, 287, 296, Nitrococcus 79, 252*
303, 311, 316, 354, 367, 388, 389, 391, 393, o-nitrofenol 409
398*, 416, 423, 428*, 437 o-nitrofenylo-β-galaktopiranozyd (ONPG)
Mycoplasma 387, 437 409
-hominis 318 nitrogenaza 61*, 63, 253, 254
- mycoides 437 Nitrosococcus 79, 252*, 437
Mycoplasmataceae 16 Nitrosomonas 79, 252*, 341
mydła 379 nitryfikacja 79. 252*, 253, 339, 342*
mykobaktyna 303 -, rola w rolnictwie 254
mysz „z nokautami genowymi" 215, 306 nizyna 245, 327
Myxobacterales 247 Nodularia 246, 343
nokardycyna 380, 381*
Ν norfloksacyna 385
nacięcie DNA 199 nosiciel 307
NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeni- nosicielstwo 315, 316
nowy) 67, 69, 71-73*, 100, 105 Nostoc 249, 253, 437
-, wzór 68* - muscorum 65
NADH 69, 71-73*, 100 nowobiocyna 385
-, wzór 68* nukleaza 186, 233, 128
nadmanganian potasu 133 - M u t H 131
nadmiar terminalny 234 nukleoid(y) 10-12, 45
NADP (fosforan dinukleotydu nikotynoami- —, rozdział 46
doadeninowego) 67, 77, 78*, 81, 100, 105 nukleotyd(y) 107, 108*
NADPH 251 -, budowa 108*

461
nukleotyd(y) -fim 31
-Parka 103 -gal 137, 164*, 226*
-, synteza 98-101 -his 136, 143
nukleozyd 108* -IF3-L35-L20 136
- kataboliczny 90*
O -kdpABC 147
obiektyw immersyjny 368, 369*, 402 -, kontrola 90, 134
ocet 3, 322, 430 - lac 90, 134, 135*, 137
octan 79, 80, 101, 341, 431 -, mutacje 133, 134
odcisk DNA (ang. DNA fingerprinting) 423 -puf 146
- - z wykorzystaniem AFLP 428, 429 - rrn 129, 130
- stopy (ang. footprinting) 226*, 228 - r R N A 428*
odczynnik Kovacsa do wykrywania indolu - trp 136
407 oporność krzyżowa 385
- oksydazowy Kovacsa 404 - wieloraka 384
oddychanie 67, 74-79 opsonina 271, 290*
- azotanowe 77, 79, 252, 253, 433, 435, 438 opsonizacja 271, 282, 290, 299
- azotynowe 252*, 253 oranż akrydyny 315
- beztlenowe 77 organizmy wskaźnikowe 345
- fumaranowe 78 origin (początek replikacji) 41, 116, 191*
- siarczanowe 77, 78, 255, 434 - oriC 41, 42, 44*, 45, 57, 112, 115, 149, 158
- siarkowe 440 - oriMs 116
odporność nabyta 289-296 -oriT 172
- na superinfekcję 239 ornityna 409
odpowiedź ścisła 142 orzęski 339
- typu humoralnego 295 osad czynny 339, 342*
- - komórkowego 286, 295, 296 Oscillatoria 33, 343, 422*, 437
-wtórna 292, 293 -agardhii 15
- zapalna 270, 279, 283*, 301 - limnetica 7*, 81
odwrotna transkryptaza 181, 182*, 220, 221* osłony komórkowe 10, 23*, 28*
odwrotny transport elektronów 84 osmoregulacja 17, 39, 88
odwrócone powtórzenia sekwencji 117, 165 oświetlenie Kohlera 369*, 370
ofloksacyna 385 otoczka 25, 26, 88, 262, 286, 291, 299, 439
ogon poliA 186 -, barwienie 368
„ogon" z aktyny 269 - wielocukrowa 293, 299
ogonek faga 232*-234*, 236, 237* owadobójcze białko krystaliczne (ICP, ang.
ogólny szlak sekrecji (GSP, ang. general insecticidal crystal protein) 335
secretory pathway) p. system sekrecji owady 249
typu II Oxalophagus 433
oksazolidinony 389, 390 Oxobacter 433
oksydaza 85 ozon 345
- cytochromowa 75*
-, test 404, 405 Ρ
oksytetracyklina 257, 383* paciorkowce (streptokoki) 7*, 278, 299, 300,
oleandomycyna 88 331, 411
olejek immersyjny 369* - grupy A Lancefield 26, 319
oligo(dT) 181 -, grupy serologiczne wg Lancefield 440
oligo(dT)-celuloza 181 - kałowe (p. też Enterococcus) 345-347
oligosacharyd rdzeniowy 20*, 21 - zieleniejące 412
ONPG 409 paciorkowcowy superantygen A (SSA, ang.
operator lac 178 streptococcal superantigen A) 302
operon 134-136, 159* PAE (ang. post-antibiotic effect) 39
- ara 134, 137 pakiet 10
-bgl 138 pakietowce 7*
-bio 164* pałeczka 6, 7*, 247
-ccd 118 - czerwonki p. Shigella

462
Paracoccus denitrificans 77 „penicylinaza" 387
paracytoza 273 pepton 352*, 354, 363, 438
parafina 409 peptyd cykliczny 127
parakoagulacja 405 - liniowy 127
paraliż spastyczny 278 -, synteza bez rybosomów 127
Parasponia 255 - wiodący 92, 136, 146
parowanie nukleotydów 110* Peptydoglikan (mureina) 2*, 7, 19, 20, 24*,
pasożyt 248, 431-437 25*, 62*, 245, 301
- wewnątrzkomórkowy 434 -, mostki 389
pasożytnictwo 248 -, obrót metaboliczny 42
pasteryzacja 322, 323 -, recykling 94
- HTST (ang. high temperature short time) -, synteza 42, 43*, 103, 104, 380
322, 323 peptydylotransferaza 125
Pasteurella 437 perforyna 295
- haemolytica 300 permeaza(y) 89, 90*, 247
patogen (p. też bakteria patogenna) 89, 91, - fruktozowa 90*
92, 248, 262, 431-441 -β-galaktozydowa 134, 135*, 409
-jelitowy 264 - glukozowa 137, 90*
- oportunistyczny 262, 430 - β-glukozydowa 138
- roślin 435, 438, 440, 441 - histydynowa 88
- wewnątrzkomórkowy 295, 434 - mannitolowa 90*
patogeneza 266*, 274-281 - oligopeptydowa 247
pączkowanie 49, 437 - peryplazmatyczne (importery ABC) 88
PBP (ang. penicillin binding protein) 16, -PTS 90*
25*, 42, 48, 103, 388, 389 peroksydaza 145
PCR (ang. polymerase chain reaction, łańcu- peryplazma 79, 89, 90*, 126, 225
chowa reakcja polimeryzacji) 175, peryplazmatyczne białko wiążące 88
200-209, 215, 222, 229, 261, 308, 316, 333, pestycydy 251, 347
361, 393, 398*, 399, 415 pęcherzyk gazowy 14
- asymetryczna 202, 203, 216 - Chlorobium (chlorosom) 15, 82, 433
-, inhibitory 416 PFGE (ang. pulse-field gel electrophoresis)
- na podłożu stałym (ang. solid-phase PCR) 189, 190, 416, 423
206, 230 PHA (ang. poly-β-hydroxyalcanoates) 14
-, odmiany 203-206 PHB p. poli-β-hydroksymaślan
- odwrócona (ang. inverse PCR) 204* Photobacterium fischeri (Vibrio fischeri) 246
- oparta na sekwencjach powtarzalnych piedestał 265, 268*
(REP-PCR, ang. REP sequence-based PCR) pierścień 380-382
416, 421*, 426 - dihydrotiazynowy 381*
-, oznaczenia ilościowe 208, 209 - FtsZ (pierścień Z) 43*, 46, 47*
- wewnętrzna (ang. nested PCR) 205* -laktonowy 383, 384
- wielomiejscowa (ang. multiplex PCR) 205 - oksazolinowy 381*
- z dowolnymi starterami (AP-PCR, ang. - rzęski 27, 28*
arbitrarily primed PCR) 416, 421, 424-426 - - C 144*, 151*
- z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy - - L 144*
(rtPCR, ang. reverse transcriptase PCR) - - M S 57, 144*
205 - - P 144*
-, zastosowania 202, 203 - tiazolidynowy 381*
- ze wstępnym podgrzaniem (ang. hot start pierwotniaki 281, 339, 385
PCR) 203, 206 Pilimelia 61
Pelodictyon 49, 437 pilus(y) 29, 32, 170, 172, 173, 258
- clathratiforme 10 - koregulowane z toksyną (TCP, ang. toxin
penicylina(y) 25, 53, 314, 380-382, 395* co-regulated pili) 31*, 276, 305
-, alergia 291 - P a p 154
-benzylowa 380 - t y p u F 23*, 32, 236, 241
- półsyntetyczne 380 piowerdyna 302, 303*
-, wzory 381* piperydyna 226

463
pipeta pasterowska 357*, 308, 364* -stałe 353, 403
piren 199 -Stuarta 352*, 354
pirofosforan tiaminy (TPP) 100 -, szczepienie 351
pirofosfotransferaza (RelA) 142 - transportowe 352*, 354
pirogronian 79, 97*, 101, 102*, 434, 440 - wzbogacające 308
pirolochinolinochinon (PQQ) 85 - wzbogacone 352
pirydyna 107, 109*, 131 - zdefiniowane 354
pirymidyna(y) 107, 109*, 131 podział komórkowy 49
-, synteza 146 - asymetryczny 56
piryt 256 poliadenylacja 128
plazmid(y) 32, 107, 262, 266*, 335, 304, 401, poliadenylowy „ogon" 181, 182*
431 poliakryloamid 424*
- bakterii gramdodatnich 117 polifosforan (polimetafosofran, wolutyna)
- C i t 107, 435 14
- ColEl 118, 128 -wapnia 168
- F 117, 118, 140, 170, 172, 173 alfa-poliglutamina 265
- F ' 173, 242 polihydroksykwasy tłuszczowe (PHA, ang.
- koliste 107, 168 poly-β-hydroxyalcanoates) 14
- koniugacyjne 169, 173 poli-β-hydroksymaślan (PHB, ang.
-Lac 434 poly-β-hydroxybutyrate) 13, 14, 64, 168,
- liniowe 107, 300 348, 403
- pBR322 190, 191* -, synteza 104
-pSCIO 117 -, wzór 13*
- p T r p 222*, 223* poli-β-hydroksyoktanian 14
- R (opornościowe) 107, 170, 388 polilinker p. miejsce wielokrotnego klono-
- R 6 118 wania
-R6K 118 polimeraza DNA 132, 216
-, replikacja 116-118 - - P f u 210
- wektorowy 176, 177* - - T a q 200
plazmina (fibrynolizyna) 222, 278 - - termostabilna 200, 210
plazminogen 222, 278 - - I 181, 199, 200
plazmoliza 23 - - I I I 113-115, 130, 139
pleomorfizm 7* - poli(A) (PAP, ang. poły (A) polymerase)
płaszcz spory 62* 128
płonica 317 - RNA 113, 120, 121, 135, 137, 221*, 386,
płyn Lugola 366 393
płytka Eleka 309-311 polimorfizm długości fragmentów restryk-
- nazębna 26, 267 cyjnych (RFLP, ang. restriction fragment
- podstawowa faga 233, 236 length polymorphism) 416, 421*, 426, 427
pmf p. siła protonomotoryczna polimyksyna 23, 384
PN A (ang. peptide nucleic acid, peptydowy polipeptyd 122
kwas nukleinowy) 112 polirybosom (polisom) 126
pochewka 35 polisacharyd 61
początek replikacji p. origin politioniany 256, 336
podchloryn 377 połączenia międzybłonowe 23
podłoże (pożywka) 49, 351-355 pompa potasowa 87
- cytrynianowe Kosera 408 - sodowa 86
- jajowe Dorseta 353 ponadtlenek 145, 261
- mięsne Robertsona 363 por 40, 91, 147
- minimalne 161, 430 porfiryna 100
- peptonowo-glukozowe 407 poronienie 315-317
- podstawowe 3352 porosty 437
-, przygotowanie 355 poryna 20*, 21, 147
-, rodzaje 352 - OmpC, OmpF, OmpR 147
- różnicujące 352*, 353 posocznica (sepsa) 275, 279, 316, 317
- selekcyjne 346, 352*, 353 potas 40, 147, 153

464
ppGpp (5'-difosforan 3'-difosfoguanozyny) przeciwciała 183*, 189*, 198, 203, 282, 289,
45, 46, 142, 143 290, 309, 361, 413
pppGpp 142 -IgA 289, 290*
prątek(i) 145, 362*, 386 - I g D 289, 290*
- gruźlicy p. Mycobacterium tuberculosis - IgE 288*-290*, 293
pre-mRNA 180* - IgG 286, 289, 290*, 292, 300
prespora 65*, 152* - I g M 289, 290*-292
probenicyd 314 - monoklonalne (mAbs, ang. monoclonal
Prochlorales 362* antibodies) 280, 295
Prochlorococcus marinus 82 -, powstawanie 291-293
prochlorofity 82, 437 -, region zawiasowy 290
Prochloron 263*, 310, 437 -sIgA 282, 290*
-didemni 422 przegroda komórkowa p. septa
Prochlorophyta (prochlorofity) 82, 437 przekazywanie sygnału 147, 150*
Prochlorothrix hollandica 82 przemieszczanie się ramion (ang. branch
Prodigiozyna 439 migration) 163
produkcja pierwotna 250 przerywnik (ang. spacer) 428*
profag 107, 239, 240, 242 przestrzeń peryplazmatyczna 10, 85, 225
prokarioty 3 przetwórstwo spożywcze 70
promieniowanie beta 375 przeżuwacze 80, 249, 431
- gamma 375 pseudokatalaza 404
- jonizujące 326, 375 Pseudomonas 19*, 27, 33, 98, 117, 257, 394*,
- ultrafioletowe 132, 139, 158, 206, 240, 348, 405, 406, 410, 432, 438
363, 378, 411 - aeruginosa 32, 85, 89, 216, 278, 302, 303*,
- X 158, 375 384, 395*
promieniowce 6, 61, 63, 98 - carboxydovorans 96
promotor 120, 133 -fluorescens 336
- lac 178, 194* - oleovorans 14
-tac 194* -stutzeri 77, 252*
-trp 194*, 223* pseudomureina 23
properdyna 285 psychrotrofy 431, 441
β-propiolakton 376 pterydyna 100
propionian 341 PTS (ang. phosphotransferase system) 84,
Propionibacterium 19*, 263*, 321, 438 89, 90, 137, 138
-acnes 422 purpura bromokrezolowa 409
proteasom 10 puryna 101*, 107, 109*, 131
proteaza 197, 224, 225 -, metylacja 130
- F t s H 141 putrescyna 409
- I g A l 93 Pyrodictium 38, 438
- L o n 118, 140, 225 - occultum 422
- OmpT 92, 229, 279 Pyrococcus 129
- serynowa 286, 319 -furiosus 210
-SopA 279
Proteobacteria alfa 107, 422* Q
- beta, gamma, epsilon 422* quorum sensing (wyczuwanie liczebności)
Proteoliza 225 167, 246, 247
Proteus 58, 71, 438, 434
- mirabilis 58 R
-vulgaris 58, 409, 422 radioizotopy 311
protoplast 18 rak żołądka 436
prototrof 161 ramka odczytu 194*, 195
protrombina 411 RAPD (ang. random amplified polymorphic
próchnica 267 DNA analysis) 416, 424*, 425
prymaza (białko DnaG) 113-115 rdzeń endospory 62*, 148
prymosom 113 -faga 233
przecinkowce 6, 7*, 441 reakcja anaplerotyczna 100

465
reakcja autoimmunologiczna 28 -, poliadenylacja 155
- Fentona 145 -, rodzaje 155, 156
- Jarischa-Herxheimera 281 -, synteza (p. też transkrypcja) 120-122
REA (ang. restriction enzyme analysis) 423 - I 120, 128
REAP (ang. restriction endonuclease analysis - I I 128
of plasmid DNA) 417 ctRNA (ang. countertranscript RNA) 117,
receptor 59 155
- dla adhezyn 264 dsRNA (ang. double stranded RNA) 231,
- limfocytu Τ (TCR, ang. Τ cell receptor) 232*
292 mRNA 120, 122, 155
- mannozowy 264 -dojrzały 180
reduktaza arsenianu 79 - eukariotyczny 180
- dihydrofolianowa 386 -, okres półtrwania 128
- selenianu 79 -, policistronowy 130, 136, 146
- żelazowa 304 -, rozpad 127, 128, 146
reduktywny cykl kwasów karboksylowych -, struktura drugorzędowa 140
96 pRNA (ang. phage encoded RNA) 155, 238,
- pentozofosforanowy (cykl Calvina) 96, 239
97* rRNA 12, 120, 125
regulator CpxR 127 5SrRNA 13, 130, 155
regulon 134, 136-145 16S rRNA 13, 123, 130, 155, 419
- stresu tlenowego 145 23S rRNA 13, 130, 155
rekombinacja homologiczna (ogólna) 162, sRNA 156
163, 167 ssRNA (ang. single stranded RNA) 231,
- insercyjno-duplikacyjna (integracja Camp- 232*
bella) 212* tRNA 120, 122
- zlokalizowana (specyficzna wobec miejsca) RNaza 186
163, 164*, 167*, 239, 300, 388 - A 186*
rekombinant 260 - H 181, 182*
rekombinaza 163, 164*, 174, 239 - P 155, 156
renina 410 - T I 421*
repelent 34, 89 - I I 128
represja kataboliczna 87, 135*, 137-139 RNaza* 128
represor 141 Rochalimaea 432
-LexA 139 rodamina 198
- operonu lac 122 rodnik hydroksylowy 145, 228
resolwaza 167* rodzaj (w taksonomii) 4
restrykcja DNA 118-120 rodzina (w taksonomii) 4
restryktaza p. endonukleaza restrykcyjna roślina motylkowa 249, 255
rezerwuar infekcji 307 - transgeniczna 349
rezusy 315 - zielona 250, 255, 259
RFLP (ang. restriction fragment length poly- rozdział immunomagnetyczny (IMS, ang.
morphism) 416, 421*, 426, 427 immunomagnetic separation) 360-362
Rhizobiaceae 253 rozmaz 309, 366
Rhizobium 205*, 249, 427, 438 roztwór Ringera 308, 365
- leguminosarum 438 RuBisCO (karboksylaza-oksygenaza rybulo-
Rhodobacter capsulatus 90*, 146, 218, 219 zo-l, 5-bisfosforanowa) 15, 96, 97*
Rhodomicrobium 58 ruch 32, 33, 75
Rhodopseudomonas sulfidophila 256 -Browna 32, 402, 403
Rhodospirillales 82, 83, 253 - drgający (ang, twitching motility) 31*, 33
Rhodospirillineae 82 -krętków 33
Rickettsia 107, 422, 438 - rzęskowy 32-34, 89
- prowazekii 307, 316, 438 - ślizgowy 33, 65, 434, 437, 439
RNA 91, 106, 112, - zależny od aktyny 33
-, amplifikacja 222* ruchome elementy genetyczne 174
- antysensowny 120, 128, Ruminococcus 98, 249, 438

466
- flavefaciens 438 SDS 186
rurka Durhama 346, 407 sekrecja 87, 88
rybonukleotyd 107 - białek 93*
-, wzór 108* sekwencja ORCE (ang. controlling inverted
rybosom 2*, 12, 13, 123, 387 repeat of chaperone expression) 141
- a szybkość wzrostu 129, 130 -GATC(Dam) 131
-, podjednostka 30S 125, 282 - insercyjna (IS, ang. insertion sequence)
-, -50S 125, 384 165
rybotypowanie 423, 427, 428* --IS903 165
- z zastosowaniem PCR (ang. PCR riboty- - łącząca (ang. coupling sequence) 174
ping) 416, 427, 428* - najwyższej zgodności p. konsensus
D-ryboza 107, 109* - odwrócona 165
2'-ryboza 103* - palindromowa 195, 426
rybozo-5-fosforan 99*, 100 - promotorowa 195
rybozym 155 - REP (ang. repetitive extragenic palindro-
rybulozo-l, 5-bisfosforan 97* mic sequence) 426
rybulozo-5-fosforan 97*-101 - rozpoznawana 119
rybulozomonofosforan 104 - sekrecyjna 89
ryfampicyna (ryfampina) 314, 386, 393, 400 - Shine-Dalgarno 121, 136, 146, 224
ryfamycyna 386, 398* - sygnałowa 27, 29, 31, 89, 91, 92, 126, 213,
ryzosfera 259 222*, 236
rzekomobłoniaste zapalenie okrężnicy 104, - tarczowa 206, 220
318, 385 -TATAAT 121
rzęska 2*, 7*, 9*, 10, 27-29, 32, 56, 89 -TTGACA 121
- archeonów 29 -X 163
- krętków (peryplazmatyczna) 29, 30* sekwencjonowanie DNA 216-218
-Salmonella 164* —, metoda terminacji łańcucha wg Sangera
-, składanie 144 (metoda dideoksy, ddF) 216*-218, 396*
- z pochewką 432, 436, 438, 441 - genomowego 218
rzeżączka 267, 317 sekwestracja jonów 287
-toksyny 278
s selektyna 282, 283, 288*
Saccharomyces cerevisiae 129, 192, 321 selenian 79, 352*
sacharoza 186 selenocysteina 123*
- endogenna 40 selenocysteinylo-tRNA 305
sagowce 249, 437 sensor 147, 148
sakulus (woreczek mureinowy) 19, 42, 380 - aerotaksji 85
-, wzrost 42, 43* -CpxA 127
salicyna 138 sepsa (posocznica) 275, 279, 316, 317
Salmonella 19*, 32, 71, 91, 154, 164*, 242, 269, septa (przegroda komórkowa) 35, 42-45, 62*,
291, 331, 344, 361, 434, 438 139, 153*
- choleraesuis 438 -, tworzenie 46-48
-dublin 279 serogrupy Griffitha 26
- seftenberg 324 serotyp(y) 423
- typhi 267, 279, 384 316, 353 Serratia 71, 434, 439
- typhimurium 39, 88, 92, 143, 144*, 147, 161, - marcescens 33, 58, 61*, 439
215, 239, 302, 318 serwatka 321
salomonelloza 279, 323, 328* sery 320, 321
saprotrofy 247, 249, 432, 435 seryna 97*, 100, 101*, 104, 150*
Sarcina ventriculi 7* -, synteza 100-103*
schemat klasyfikacyjny Kauffmanna-Whitte'a Sesbania rostrata 255
439 sfingolipidy 16
- Z 81, 82* Shigella 87, 91-93, 154, 269, 277, 316, 344,
SCP (ang. single-cell protein) 335 327, 434, 439
SD A (ang. strand displacement amplifica- - dysenteriae 277, 389, 439
tion) 220 -flexneri 267, 232, 300

467
siarczan dimetylu 226* stan utajenia 274
-, powstawanie 80 -zapalny 280
-, redukcja 408 Staphylococcus 19*, 39, 170, 263*, 315, 439
- asymilacyjna 255, 256* - aureus (gronkowiec złocisty) 7*, 25*, 40,
-, - dysymilacyjna 77, 79, 256* 185, 241, 277, 299, 301, 304, 318, 319, 324*,
siarczek, powstawanie 79, 80 328*, 382, 384, 391, 393, 394*, 399, 412, 414,
-, przyswajanie 255 425*, 439
-, utlenianie 79, 91, 83, 84, 256 —, szczepy MRSA (ang. methicillin-resistant
siarczyn 80, 256* Staphylococcus aureus) 104, 379, 384, 388-
siarka 79, 81, 83, 255, 256 390, 397, 399, 416
-, obieg 79, 255-257 - epidermidis 324*
-, powstawanie 81 - simulans 245
-, redukcja 77, 79, 256 starter 182*, 201*, 207, 333
-, utlenianie 79, 83, 256*, 440 - D N A 116
siarkowodór 79, 408 - d o P C R 222*
sila protonomotoryczna (pmf, ang. proton - R N A 113-115
motive force) 75, 77-84, 143, 233 - znakowany biotyna 217*
- -, funkcje 76* Stenotrophomonas 439
- sodowomotoryczna 86 - maltophila (Xanthomonas maltophila) 278
Simonsiella 9*, 439 sterole 437
sinice (p. też cyjanobakterie) 49, 63, 65, 81, sterylizacja (jałowienie) 59, 323, 372-376
84, 96, 155, 245, 249, 252*, 259, 341, 343, sterylizator 373
362*, 434 STM (ang. signature-tagged mutagenesis)
- nitkowate 431, 437 213
Sinorhizobium meliloti 40 streptawidyna 198, 207, 217*
SIRS (ang. systemic inflammatory response Streptoccus 19*, 20, 315, 410, 439, 440
Syndrome) 275 - cremoris p. Lactococcus cremoris
skos 351*, 355 - equisimilis 222
skrobia 433, 440 -faecalis p. Enterococcus faecalis
skrzep kwaśny 410 -faecium p. Enterococcus faecium
sole żółci 352 * - lactis p. Lactococcus lactis
solfatara 434 - mutans 267
sonda (ang. probe) 181, 184, 189*, 198, 199, - pneumoniae 7*, 167, 168, 174, 222, 294, 299,
311, 415 318, 389
- 5'-biotynylowana 199 - pyogenes 7*, 317, 412, 440
- chemiluminescencyjna 416 - thermophilus 321
- D N A 333 streptograminy 383, 384, 399
- oligonukleotydowa 312 streptokinaza 4, 278
- świetlna (ang. beacon probe) 199, 220 - rekombinacyjne 222
- znakowana 423 streptokoki (p. też Streptococcus) 222, 440
sorbitol 353, 354 Streptomyces 19*, 35, 61, 63*, 106, 440
specyficzna szybkość wzrostu 54 -albus 7*, 440
Sphaerotilus natans 339 - antibioticus 88
Spirillum natans 422 - avidinii 198
- volutans 7* - coelicolor 422
Spirochaeta 9 streptomycyna 159, 257, 382, 383, 389
Spirochaetales 433, 439, 440 Streptoverticillium 19*
spora 59, 61, 440 stres tlenowy 145, 289
sporangium 61 - osmotyczny 17
sporulacja 62*, 65*, 148, 152*, 153*, 335 struktura Hollidaya 162, 163
-, inicjacja 247 - pętli i łodygi 128
splicing 156 - spinki do włosów 199
SRP (ang. signal recognition particle) 91, - trzonka i pętli 220
156 strzępka 6, 61
SSCP (ang. single-strand conformation poly- - powietrzna 63*
morphism) 204*-206 subtylizyna 337

468
sulfadiazyna 386 szczepionki 229, 232, 280, 293, 390
sulfametazyna 386 -BCG 294
sulfametoksazol 387 - poliwalentna 294
sulfanilamid 386* - przeciw krztuścowi 293
Sulfolobus 38, 96, 255, 440 - sprzężona 293, 294
- solfatarius 422 szkarlatyna 26
sulfonacja 344 szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa (gliko-
sulfonamidy 101, 314, 386, 387 liza) 69-71, 76, 85, 97
superantygen 277, 301, 302 - Entnera-Doudoroffa 98, 99*, 101, 431, 439,
- A 301 441
- B , C, F 319 - heksozomonofosforanowy (szlak pentozo-
supresja restrykcji 140 fosforanowy) 98, 99*, 101, 430, 431
surowica 309, 352*, 376 -Leloira 98
- odpornościowa 294, 413 - metaboliczny 66
syderofiliny 294, 303 - rybulozomonofosforanowy (RuMP) 104,
syderofory 145, 302, 303 105
symbiont 246, 248, 249, 254, 437 - serynowy 104, 105
symbioza 248, 249 szok anafilaktyczny 291
- mutualistyczna 249 - cieplny 140, 141, 151, 154, 219, 225
symport Na + /melibioza 86 - endoseptyczny (septyczny) 280, 301
- proton-laktoza 87 - endotoksyczny 390
synchronizacja hodowli 54, 55 - kwasowy 143
Synechococcus 33, 155 - osmotyczny 151, 153
syntaza glutaminianowa 252 - zimna 142, 143
- tlenku azotu (iNOS, ang. nitric oxide synt- sztuczny chromosom bakteryjny (BAC, ang.
hase) 287 bacterial artificial chromosome) 191
- tymidylanowa 102* - drożdżowy (YAC, ang. yeast artificial
syntetaza glutaminowa 251 chromosome) 192, 193, 218
- P H B 104
system(y) autotrasporterowy AIDA-I (ang. ś
adhesin involved in diffuse adhesion) 93 ściana komórkowa 10, 18-24, 437
- fosfotrasferazowy (PTS, ang. ścieki 96, 256, 356
phosphotransferase system) 84, 89, 90, -, oczyszczanie 77, 337-342
137, 138 śluz 25, 26
- HACCP (ang. hazard analysis critical śrubowce 6, 7*
control points) 332
- M C P 89 Τ
-ProK 88 taksonomia polifazowa 417
- restrykcyjny 175, 243 taurocholan sodu 352*
- sekrecji typu I 88, 93* TCP (ang. toxin co-regulated pili) 31*, 276,
II 91, 93* 305
III 91-93*, 265, 269, 299, 300 technika(i) aseptyczne 355-357
IV 92, 93 - bezpośredniej epifluorescencji na filtrze
- SOS 40, 116, 139, 140, 240 (DEFT, ang. direct epifluorescent filter
- transportu 86-94 technique) 333, 363
- - Kdp 40, 87, 147 - IMS (ang. immunomagnetic separation)
- - P r o U 40 360-362, 415
- - T r k 40 - „odcisku stopy" (ang. footprinting)
-UvrABC 132, 133 228
szalka Petriego 351 z użyciem DNazy I 226*, 227
szczawiooctan 102* technologia „DNA-chip" 229, 230
szczep 4 - ekspresji in vivo (IVET, ang. in vivo
- mutatorowy 209 expression technology) 296-299
-, identyfikacja 427 - rekombinowanego DNA 131, 175-230
szczepienia 293-295 teikoplanina 104, 388
szczepienie (inokulacja) 351, 358-360 teluryn potasu 354

469
terminalna transferaza deoksyrybonukleoty- Thermomicrobium 38
dylowa 196 Thermoplasma 23
terminator 121 - acidophilum 38, 419, 422
- transkrypcji 138, 154 Thermoproteus 23, 432, 440
- rho-niezależny 128, 136 - tenax 422
termocykler 201* Thermotoga maritima
termofil (bakteria termofilna) 86, 438, 440 Thermus aąuaticus 200
- ekstremalny 432 - thermophiłus 13
termoprotektant 66 THF (tetrahydrofolian) 100, 101*
test(y) Amesa 161 Thiobacillus 19*, 79, 256, 333, 338*, 440
- A P I 411 - denitrificans 79, 252*
- cytrynianowy 408 -ferrooxidans 79, 85, 255-257
- dyfuzji krążkowej 382, 390-392* - thiooxidans 38, 255, 256*, 336
-E 391, 394* - thioparus 440
- Eijkmana 346 Thiovulum majus 33
- immunoenzymatyczny (ELISA, ang. enzy- tioglikolan sodowy 352*, 363*
me-linked immunosorbent assay) 311, tioreduktaza 126
312*, 331 tiosiarczan 80, 83, 256, 336
-IMViC 407 tlen, formy reaktywne (ROS, ang. reactive
- indolowy 346 oxygen species) 145
- M U G 411 -, powstawanie 81, 82*
- na antybiotykowrażliwość 390-392 -, redukcja 74
- nośnikowy 378 tlenek azotu 77, 253, 287-289
- oksydacyjno-fermentacyjny (Hugh-Leif- -etylenu 376
sona) 406 - węgla 96
- O N P G 409 tlenowce 404
- pojemnościowy 378 - bezwzględne 38, 79, 437
- - Kelsey-Sykesa 378 - względne 39
- probówkowy 346, 405 TMA (ang. transcription-mediated amplifica-
- punktów przełamania 391 tion) 220, 416
- rozcieńczeń 391 TNF (ang. tumor necrosis factor) 281, 283,
- serologiczne 413 288*
- sond liniowych 393, 394, 397, 398* toksemia 319
- szkiełkowy 405 toksyna(y) 53, 231, 262, 275-278, 343, 431
- aglutynacji 413 - 1 zespołu wstrząsu toksycznego (TSST-1,
- Voges-Proskauera 407 ang. toxic shock Syndrome toxin 1) 301,
- Wassermana 311 305
- wiązania dopełniacza (CFT, ang. comple- - A 318
ment fixation test) 309-311 -Ace 275. 276
- z czerwienią metylową 497 - B 318
- zawiesinowy Rideala-Walkera 378 - białkowa 87, 88
- - Chicka-Martina 378 - błonicza 241, 293
tetanospazmina 276, 294 - botulinowa (jad kiełbasiany) 276, 348
tetracyklina 142, 383 -CcdB 140, 385
-, oporność 174, 191* -cholery 232, 275, 305
-, wzór 383 - ciepłostała STa (STI) 266*
tetrahydrofolian (ang. THF) 100, 101* --STb(STII) 266*
tetrahydrometanopteryna 80 - fagowa 266*
tetra-O-di(bifitanylo)diglicerol 18 - gronkowcowa 331
tetrationian 256 - I shiga-podobna (SLTI) 166*, 277
tępe końce 184*, 185, 195 - II shiga-podobna (SLTII) 266*
tężec 276, 306 -LTIiLYII 266*
Thermoactinomyces 59 -RTX 300
Thermobacterium roseum 38 -shiga 232, 277
Thermobacteroides 37 - złuszczająca (ET, ang. exfoliative toxin) 319
Thermococcus litoralis 129 - Z o t 275, 276

470
-α 319 transporter ABC 87-89, 278
toksynogenność 308 - glicerolu 17
topoizomeraza 45, 111 transpozaza 149, 166, 241, 299
- I 111 transpozon 266, 388
-II(gyraza) 111 -, klasa I i II 165
-III 112 - koniugacyjny 174
- IV 45, 112 -, mutageneza 211-215
transacetylaza tiogalaktozydowa 134, 135" - T n 3 165, 167*, 382
transaminacja 251 - T n 7 165
transcytoza 274 -Tn10 149, 165, 166*, 338
transdukcja 242, 243 - Tn916 174, 175
-ogólna 242 - Tn5253
- ograniczona 242, 243 transpozycja 163-167
- poronna 242 - koniugacyjna 119, 174, 175
transduktant 242 - konserwatywna 241
transfer fosforu 57, 148, 152*, 153*, 247 - „prosta" 165, 166*
- genów 167-175 - „replikatywna" 165, 166*
- horyzontalny 305 transwersja 131
- metodą „Northern blotting" 189* tranzycją 131
- „Southwestern blotting" 189* Treponema 7*, 18, 29, 30*, 440
- - „Western blotting" 189* -pallidum 306, 441
S-transferaza glutationu 197 trifosforan(y) deoksyrybonukleotydów 113
transferaza peptydylowa 384 - deoksyurydyny (dUTP) 206
transferyna 287, 294, 302, 303 trimetoprim 386, 387
transformata 167, 168, 177*, 210, 247 tritionian 257
transglikozylacja 103 TRCF (ang. transcription-repair coupling
transglikozylaza lityczna 42 factor) 133
transhydrogenaza 76* Tropheryma whippelii 316
transkoniugant 258 trójfluorooctan cezu 186
transkrypcja 120-122 tryptofan 98, 346
-, elongacja 121 -, analog 223*
-, regulacja 122 -, synteza 251
-, terminacja 121 TSS (ang. toxic shock Syndrome) 301, 319
transkrypt 120 tularemia 307, 317
translacja (p. też synteza białek) 123-127 turgor 40, 147
-, elongacja 125 tylakoidy 15, 63, 76
-, inicjacja 125 tymina (T) 108, 131
-, regulacja 130 -, dimery 132
-, terminacja 126 -, wzór 132
-, zmiana ramki odczytu 149 typowanie 412-414
translokacja 125, 127 -bakteriofagami 413-417
translokon 91 tyrocydyna 127
transpeptydacja 103, 125, 384
transport 75, 86-94 U
- aminokwasów 86, 88 UDP (urydyno-5'-difosforan) 103
-cukrów 88, 89 UDP-GlcNAc 21, 103
- glicerolu 17 UDP-MurNAc 103
- glukozy 90* UHT (ang. ultra-heat treated) 323
- histydyny 88 układ dopełniacza 271, 283-286
- jonów 19, 88 - -, aktywacja 282, 284, 285, 290
- laktozy 75, 89 - -, funkcje 283
- mannitolu 90* - immunologiczny 274, 280
- melibiozy 86 - zgodności tkankowej (MHC, ang. major
- PTS p. system fosfotrasferazowy histocompatibility complex) 286, 287, 292,
- wapnia 167 295, 296
- wody 17 ultrawirowanie 188

471
UMP (urydyno-5'-monofosforan) 102* wielkość plonu faga (ang. burst size) 238
UPEC (ang. uropathogenic E. coli) 305 wielocukier C 440
uracyl 108, 123*, 131, 206 wirowanie w gradiencie gęstości 55
-, wzór 109* - równowagowe (izopykniczne) 178, 186,
uracylo-N-glikozylaza (UNG) 206 188, 418
ureaza 436 wirulencja 154, 213, 214*, 231, 262
-, test 408 -faga 240
urydyna 109* wirus grypy 286
urzęsienie typu amfitrychalnego 27 - H I V 274
— lofotrychalnego 27 -Norwalk 345
— monotrychalnego 27, 33 włókno ogonka 233*, 234*
— perytrychalnego 27, 32 -rzęski 27, 28*, 144
utlenianie pozacytoplazmatyczne 84, 85, 97 woda peptonowa 352*, 406, 407
-pitna 342
V - -, uzdatnianie 343-347
Vibrio 27, 41, 253, 405, 441 —, dezynfekcja 344, 345
- alginolyticus 86 - tryptozowa 407
- cholerne 7*, 86, 245, 261, 275, 294, 304, 305, wodniczka 282
315, 389, 441 wodór 341
-fischeri ρ. Photobacterium fischeri -, utlenianie 79, 80, 83
- parahaemolyticus 318, 328*, 422 -, wytwarzanie 71-73*
VTEC (ang. verocytotoxic E. coli) 266*, 328* wolutyna (polifosforan) 14
współczynnik fenolowy 377
W - Rideala-Walkera 378
waginoza 315, 435, 436 wszy 307
wakuola 269, 270 wybuch choroby 412
- gazowa 14, 15, 65, 107, 431, 434, 435, 437 - tlenowy (ang. oxidative burst) 271, 299
walina 84 wygaszacz fluorescencji 208, 220
wankomycyna 103, 104, 380, 388, 390, 397 wykluczenie induktora 138
wapń 21, 39, 148, 269 wykres Arrheniusa 55
warstwa S 25 - Ratkowsky'ego 55
- śluzowa 26 wymaz 315
WatsonJ. D. 110 wymieniacz jonowy 187
wąglik 262, 318 wymioty 275, 277, 328*
wątrobowce 437 wysiew redukcyjny 358
wektor 190-195, 207, 313 wyspa patogenności 147, 215, 266*, 269, 276,
- ekspresyjny 193, 194*, 196 279, 302, 304, 305
- fagmidowy 216 --cag 281, 305
- fagowy 190, 207, 211*, 240 - - L E E 265, 305
- kosmidowy 190, 192* - - P A I - 1 305
- plazmidowy 176-178 wzmacniacz (ang. enhancer) 224
- wahadłowy 193, 195* wzór elektroforetyczny 228
- wymienny (ang. replacement vector) 190 wzrost 36-55
- zrekombinowany 178 - dwufazowy (diauksja) 55
werotoksyna 277 -komórki 41^8
węgiel, asymilacja 96-98 - niezbalansowany 51
-, obieg 249-251 - populacji bakteryjnych 49-55
wiązanie disulfidowe 122, 290 - rozpełzliwy (ang. swarming) 58, 59, 61*,
- estrowe 16*, 18 438
- eterowe 18, 251 - synchroniczny 54, 55
- fosfodiestrowe 110*, 121, 128, 177*, 196 - zbalansowany 51
- peptydowe 103, 122
- wodorowe 108, 109*, 111*, 122 X
wiciowce 339 Xanthobacter 26
wić 2* Xanthomonas 257, 429, 441
widełki replikacyjne 113-115, 149 - campestris 26, 322, 441

472
Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-gala- - Kawasaki 301, 318
ktozyd) 190, 197, 298* - mikroorganizmów 244-256
- uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS, ang.
Υ systemie inflammatory response
YAC (ang. yeast artificial chromosome) 192, Syndrome) 275
193, 218 - wstrząsu toksycznego (TSS, ang. toxic
Yersinia 91, 92, 299, 434, 441 shock Syndrome) 301, 319
- enterocolitica 265, 267, 270, 271, 304, 326, - zapalonej skóry 319
328*, 331, 414, 441 zgorzel gazowa 147, 262, 306, 314
- pestis 154, 307, 316, 406, 441 ziarniak 6, 7*, 9*
ziarnistości metachromatyczne 14
Z - zapasowe 10, 13-15
zacisk β 115* zieleń malachitowa 367
zakrzepica 4, 222 złoto, ługowanie 337, 338*
zakwit 14, 245, 246, 343, 431 złoże zraszane 338, 342*
Zamia 249 zmiana ramki odczytu 149, 300
zanokcica 434 w translacji 300
zapalenie cewki moczowej 318 zmienność antygenowa 148, 294, 300
- miedniczek nerkowych 154 -fazowa 164*439
- mięśnia sercowego 315 znacznik 198
-mózgu 319 - radioaktywny 182
-nagłośni 293 Zoogloea 198, 441
- nerek odmiedniczkowe 31* - ramigera 339, 441
- opon mózgowych 31*, 202, 294, 299, 313, zoospora 61
316-318, 390 związki Cl (jednowęglowe) 104
- osierdzia 316
- otrzewnej 262 Ż
- pęcherza 31*, 318 żachwy 438
- p ł u c 264, 293, 294, 318 żel agarozowy 189
- rogówki 415 - denaturujący 205*
-spojówek 314, 317, 318 - krzemionkowy 187
-żołądka 280, 318 - niedenaturujący 205*, 396*
- żołądkowo-jelitowe 266*, 307, 317, 318 - poliakryloamidowy 188, 204*, 217*
zasada azotowa 107 żelatyna 353, 408
- purynowa p. puryna żelazo 39, 143, 145, 287, 294
zastój krwi 278 - a Patogenność 302-394
zatrucie(a) jadem kiełbasianym (botulizm) -, pobieranie 143
231, 276, 284, 314, 315, 327 -, utlenianie 79, 256, 440
- pokarmowe 277, 318, 327-333 żółta gorączka 336
zawartość GC (% GC) 305, 417, 418, 430 żwacz przeżuwaczy 80, 98, 249, 436
zbiornik sedymentacyjny 343 żyraza (gyraza) 385
zespół hemolityczno-mocznicowy (HUS, żywica jonowymienna 187
ang. haemolytic uraemic Syndrome) 231,
232, 266*, 277