LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA NÚMERO 4

Facultad de Ciencias Médicas

Cátedra de Microbiología
Tercer Semestre

COLORACIÓN DE ZIEHL-
NEELSEN

REALIZADO POR: JESSICA G. JIMÉNEZ B.

REVISADO POR: DR. ROBERTO AGUIRRE
 Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

UNIDAD DE COMPETENCIA:
Identificar prácticamente los microorganismos patógenos con los
alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y orden

ELEMENTO DE COMPETENCIA:
4.- Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Zhiel Neelsen
además de reconocer los microorganismos Zhiel Neelsen positivos con
orden e iniciativa.

NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO:
4.- Técnica de tinción – Coloración de Zhiel Neelsen. Realización de tinción
de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los propios alumnos.
Visualización de tinciones de Ziehl-Neelsen positivas.

ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO:

Guía de prácticas descriptiva. Realización de de una coloración Ziehl
Neelsen y visualización en el microscopio.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN:
• Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología
bacteriana en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram
negativas.

“La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.

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Coloración de Ziehl Neelsen.

OBJETIVOS:
• Realizar la tinción de Ziehl-Neelsen a partir de expectoraciones de los
propios alumnos.
• Visualizar las tinciones de Ziehl-Neelsen positivas.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La tinción de Ziehl-Neelsen es una técnica de tinción diferencial que se basa

en que las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos
(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-acido, después
de la tinción con colorantes básicos. Las micobacterias absorben los
colorantes solo muy lentamente debido a la elevada proporción de ceras y
lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción del colorante fuscina y
así la formación del complejo micolatofusina en la pared celular, se calienta
la solución de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente
hasta la formación de vapores. Una vez que las micobacterias han absorbido
el colorante, difícilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solución
decolorante alcohol-ácido clorhídrico. Por esto se denominan bacilos alcohol
acido resistente o BARR y aparecen en el preparado microscópico teñidas
de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos
se tiñen de acuerdo con la contratinción.1

Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico clínico
puesto que algunos microorganismos patógenos ácido-alcohol resistentes,
tales como Mycobacterimum tuberculosis son patógenos muy importantes
para los humanos.2

MICOBACTERIAS.

Las micobacterias son bacilos aerobios no formadores de esporas, existen

más de 50 especies de Mycobacterium, las cuales incluyen muchas que son
saprófitas. Entre las especies consideradas patógenas tenemos al M.
tuberculosis cuyo único reservorio es el humano, es el agente causal de la
tuberculosis pulmonar y diseminada. El M. leprae en el causante de la lepra
y al igual que en el M. tuberculosis su reservorio es el humano.
Mycobacterium bovis también esta considerado dentro de este grupo,
origina una enfermedad similar a
tuberculosis.3

Otras especies potencialmente patógenas

en humanos tales como: el M. avium-
intracellulare y las atípicas con frecuencia
infectan a pacientes con SIDA, son patógenos
oportunistas en otras personas
inmunodeficientes, y en ocasiones producen enfermedad en pacientes con
sistema inmunitario normal.3

Las micobacterias no constituyen el único grupo que tienen

propiedades alcohol-acido resistentes. Las especies de Nocardia y
Rhodococcus poseen una alcohol-acido resistencia parcial así como

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Legionella micdadei causante de neumonía. Los quistes de los géneros
Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con
acido alcohol.5

Pared Celular de las bacterias

Acido- Alcohol Resistentes
(BAAR).
Químicamente, la pared celular de
los BAAR consiste en un esqueleto
formado por dos tipos de polímeros,
unidos covalentemente entre sí:
 Un peptidoglucano especial (la
diferencia más importante es
que en vez de N-acetil
murámico existe N-glucolil-
murámico);
 Un arabinogalactano de gran peso molecular.7

Ambos polímeros se encuentran enlazados a través de fosfodiéster entre

una unidad de murámico y una de las arabinosas. Pero a su vez, este
esqueleto se une covalentemente a los ácidos micólicos.7

Los ácidos micólicos son ß-hidroxiácidos grasos ramificados en a, cuya

longitud de cadena es grande (desde C78 a C91 en Mycobacterium). Están
unidos al esqueleto de la P.C. de forma uniforme, a través de enlaces con
los -OH en 5 de las unidades de arabinosa.7

Por lo tanto, el esqueleto de la P.C. de estas bacterias consiste en:

peptidoglucano---arabinogalactano---ácidos micólicos.

Pero aparte de este esqueleto complejo, la P.C. de las bacterias ácido-

alcohol resistentes exhibe una variedad de lípidos:
1) Glucolípidos:
a) Micolatos de trehalosa: Constituyen el llamado factor de crecimiento
en cuerdas, debido a que son responsables de la agregación de los
individuos bacterianos en forma de “cuerdas”.
b) Sulfolípidos de trehalosa: están localizados en la periferia de la P.C., y
parecen ser importantes factores de virulencia. En Mycobacterium
tuberculosis estos sulfolípidos de trehalosa funcionan como evasinas, es
decir, facilitan el que la bacteria escape a la acción de los macrófagos
inhibiendo la fusión del fagosoma con el lisosoma, lo cual puede explicar el
hecho de que estos microorganismos tengan éxito como parásitos
intracelulares.
c) Micósidos: Localizados en la periferia, consisten en la unión por enlace
éster entre ácidos micólicos y azúcares (incluyendo ácidos urónicos,
desoxiosas, aminozúcares, etc.).
2) Ceras: Unión de ácidos micólicos con tioceroles (alcoholes ramificados
de alto peso molecular).7

El alto contenido en lípidos confiere una serie de propiedades a estas

bacterias (aparte de la ácido-alcohol resistencia ya citada): aspecto y

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consistencia cérea de sus colonias; crecen formando grumos en medios
líquidos; gran impermeabilidad de la P.C., que a su vez condiciona una gran
resistencia a la desecación y gran resistencia a sustancias antibacterianas
(detergentes, oxidantes, ácidos, bases, etc).5

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.

Las estadísticas muestran que un tercio de la población mundial está

infectada por el bacilo causante de la tuberculosis. Según la Organización
Mundial de la Salud, “Una persona con tuberculosis activa, no tratada,
infecta un promedio de 10 a 15 personas al año y cada segundo se produce
en el mundo una nueva infección por el bacilo de la tuberculosis. Del 5 % al
10% de las personas infectadas por el bacilo de la tuberculosis, enferman o
son contagiosas en algún momento de sus vidas. La tuberculosis es la
principal causa de muerte en las personas infectadas por el VIH.8

En el Ecuador, la tasa de prevalencia de tuberculosis para el año 2007 fue

de 36.7 x 100.000 habitantes y la tasa de incidencia de 32.6 x 100.000
habitantes; tuberculosis pulmonar con baciloscopía positiva, que es la forma
contagiante de la enfermedad se presentaron 3448 casos que corresponden
al 78% del total; tuberculosis pulmonar con baciloscopía negativa 480=11%,
y extrapulmonares 503=11%.8

La transmisión de los bacilos de la tuberculosis se produce casi

exclusivamente por medio de núcleos suspendidos en pequeñas gotas que
son expulsadas con la expectoración de las personas afectadas por
tuberculosis pulmonar. Estas pequeñas gotas pueden permanecer
infectantes en el aire durante bastante tiempo y pueden ser inhaladas por
otras personas. La infección de los contactos es más probable cuando
conviven o permanecen durante un tiempo prolongado cerca del enfermo
que está expectorando bacilos y en un ambiente poco ventilado. No todas
las personas infectadas enferman, sólo una de cada diez aproximadamente,
que son las más susceptibles. La tuberculosis puede manifestarse en
cualquier órgano, porque M. tuberculosis se disemina por todo el organismo;
sin embargo, la enfermedad pulmonar es la más frecuente (80-85% de
todos los casos diagnosticados) debido a que el bacilo necesita abundante
oxígeno para multiplicarse. En los pulmones de los enfermos se pueden
formar cavidades en las que se alojan grandes poblaciones de bacilos que
pueden ser detectados en muestras de esputos. Los síntomas más
característicos de la tuberculosis pulmonar son la tos y la expectoración
persistentes por más de 2 semanas. A las personas con estos síntomas se
Los llama Sintomáticos Respiratorios (SR). Otras manifestaciones pueden
ser pérdida de peso, febrícula, sudores nocturnos, cansancio físico y dolores
de tórax.4
El diagnóstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma
confiable en el laboratorio demostrando la presencia de bacilos en una
muestra de
La lesión o el cultivo.4

LA MUESTRA.
La muestra más examinada es el esputo debido a que, como se ha dicho, la
tuberculosis pulmonar es la más frecuente. Sin embargo, dado que la
enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano, con menor frecuencia
puede requerirse la investigación de muestras muy variadas: orina, líquido
cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades

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abiertas, biopsias. Estas muestras de lesiones extrapulmonares deben
procesarse también por cultivo.4

EL ESPUTO.
El envase.
Debe tener las siguientes características:
• Boca ancha: de no menos de 50 mm de diámetro
• Capacidad entre 30 y 50 ml: para facilitar que el paciente pueda
Depositar la expectoración con facilidad dentro, sin ensuciar sus
Manos o las paredes del frasco y para que en el laboratorio se pueda
Seleccionar y tomar la partícula más adecuada, con comodidad, para
Realizar el extendido.
• Cierre hermético: con tapa a rosca, para evitar derrames durante
El transporte y la producción de aerosoles cuando se abre en el laboratorio.
• Material plástico transparente, resistente a roturas, para poder
Observar la calidad de la muestra cuando la entrega, evitar
Roturas y derrames de material infeccioso y para que pueda ser
desechado.4

Obtención espontánea del esputo.

Para la recolección de las muestras:
• Elegir un lugar bien ventilado y que ofrezca privacidad.
Puede ser una habitación bien ventilada y con acceso de luz natural (sol) o
algún lugar abierto no concurrido.2
• Entregar el envase de recolección ya rotulado con su nombre o número de
identificación y el servicio que solicita. Estos datos deben ser escritos en la
pared del frasco y no en la tapa para evitar errores, con rótulos que no se
despeguen o con lápiz indeleble.
• Obtener una buena muestra de esputo instruyendo al
paciente con lenguaje simple y comprensible para que:
- inspire profundamente llenando sus pulmones de aire
tanto como sea posible
- retenga el aire un momento (10 a 15 segundos)
- expulse luego la expectoración con un esfuerzo de tos,
tratando de arrastrar las secreciones del pulmón
- recoja el esputo producido dentro del envase tratando
de que entre en su totalidad, sin manchar sus manos o las paredes externas
del frasco
- repita esta operación otras dos veces colocando todas las secreciones en
el mismo frasco
- limpie el exterior del envase con un pañuelo de papel y se lave las manos
con agua y jabón

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Calidad de la muestra
La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la
que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos
Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente
espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El
color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso). A veces son
sanguinolentas.
Las secreciones nasales, faríngeas o la saliva no son buenas muestras para
investigar tuberculosis, aunque es conveniente examinarlas, de todas
formas, porque siempre existe la posibilidad de que contengan parte de la
expectoración o bacilos expulsados por la tos que hayan quedado en la
boca, nariz o faringe.3

Mucopurulenta Sanguinolenta Mucosa Salivosa

Si las muestras de esputo no van a ser procesadas en el día, es aconsejable

introducir cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa encima
de la tapa, de manera que quede sujeta firmemente. Las muestras deben
ser conservadas en refrigerador, preferentemente dentro de la caja de
plástico. Si no se cuenta con refrigerador, ubicarlas en un lugar fresco y
protegidas de la luz.4

PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION ZIEHL- NEELSEN.

El calentamiento del portaobjetos permite mayor penetrancia de la

carbolfuscina en la pared celular. Los ácidos micólicos y las ceras forman
complejos con el colorante básico, que luego no se eliminan con la
decoloración con ácidos débiles.5

MATERIALES:
Portaobjetos
Mechero
Asa de siembra
Pipetas
Pinzas de madera
Microscopio óptico
Equipo de tinción (barras paralelas)
REACTIVOS:
Fucsina fenicada básica
Alcohol acido 3,0 %
Azul de metileno
Microorganismos uno BAAR y uno no BAAR
Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO: (ver anexo 1)

1. Se fija los portaobjetos al calor con la muestra.
2. Se cubre el frotis con el reactivo de colorante de carbolfuscina y se
calienta con suavidad hasta la aparición de vapores durante 1 minuto

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mediante flameo por debajo de la rejilla de sostén con un mechero de
gas.
3. Se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 4-5minutos,
sin calentar.
4. Se lavan los frotis con agua destilada y se los inclina para eliminar el
exceso de agua.
5. Se decoloran con acido alcohol al 3,0 % durante 2 minutos. Se lavan
los frotis con agua destilada y se los inclina para escurrir el resto de
agua.
6. Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1
minuto.
7. Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.
8. Se examinan con aceite de inmersión en búsqueda de BAAR.5

RESULTADOS:

Positiva rojos BAAR

Negativo azul no BAAR

Un hallazgo positivo significa “presencia de bacilos alcohol acido

resistentes” y un hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos alcohol
acido resistentes”.6

BAAR

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ANEXO 1

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BIBLIOGRAFÍA
1. - CLARE, George. Stains and staining (microscopy). 4ta edition Williams
and Williams.
2.- Prácticas de Microbiología. Departamento de Microbiología y Genética
Universidad de Salamanca
3.- Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual
moderno, México, México 2002
4.- SEQUEIRA, L. Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis
normas y guía técnica. OPS 2008
5.- Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial
Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.
6.- Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana,
110 − 111.
7. - Mandell, Bennett, & Dolin: Principles and Practice of Infectious Diseases
6th ed.
Copyright © 2005. Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier.
8.- http://www.opsecu.org/informativo/informativo5/tuberculosis.htm

“La razón habla, la ignorancia y el error gritan” anónimo.