Związki pochodzenia naturalnego

w chemii medycznej

Materiały pomocnicze do ćwiczeń laboratoryjnych

Opracowanie Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Spis treści
1. Izolacja piperyny 2
2. Izolacja chlorowodorku glukozaminy (kozaminy) 3
3. Synteza kliokwinolu 5
4. Synteza zingeronu 7
5. Synteza anestezyny (benzokainy) 11
6. Synteza fenytoiny 15
7. Synteza paracetamolu (acetaminofenu) 19
8. Oznaczanie zawartości genisteiny i daidzeiny oraz ich glikozydów w
preparacie Soyfem (suplement diety) i w ekstrakcie z soi 21
9. Oznaczanie szybkości uwalniania, oznaczenie wytrzymałości
mechanicznej, analiza HPLC 23
a. HPLC – instrukcja obsługi 30
b. UV-VIS – instrukcja obsługi 32

Poznań 2010
Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Izolacja piperyny

Wzór piperyny
O

O
H
H
H
N H
O

Odczynniki:
- pieprz czarny zmielony 20 g - cykloheksan

- chloroform 100 ml - toluen

- 10% roztwór KOH w 50% EtOH

Preparatyka:
Zmielony czarny pieprz umieszcza się w papierowej gilzie w aparacie Soxhleta i ekstrahuje
chloroformem przez 2 godziny. Otrzymany roztwór odparowuje się na wyparce próżniowej do
uzyskania brązowego, gęstego oleju, a następnie mieszając dodaje się 20 ml roztworu 10% KOH w
50% etanolu. Mieszaninę odsącza się na lejku Büchnera, a przesącz pozostawia się w lodówce przez
noc. Powstałe kryształy surowej piperyny odsącza się na lejku Büchnera przemywając 2 ml zimnej
wody. Kryształy suszy się na powietrzu i krystalizuje się z mieszaniny cykloheksan-toluen 4:1 (v/v).

Temperatura topnienia: 130-131 C, wydajnośd: 150-400 mg

Surowy produkt może byd rekrystalizowany z jak najmniejszej ilości mieszaniny etanol -aceton 1:5
(v/v)

Uwagi:
 Po zakooczonej ekstrakcji chloroform zawracany z aparatu Soxhleta do kolby powinien byd
bezbarwny
 Do krystalizacji używa się mieszaniny rozpuszczalników w ilości około 10 ml na każde 200 mg
surowego produktu.

Zagadnienia
 Techniki ekstrakcyjne, rodzaje ekstrakcji
 Dieny i polieny sprzężone oraz izolowane

Literatura:
Classics in Spectroscopy: Isolation and Structure Elucidation of Natural Products Berger S., Sicker D.,
Wiley-VCH, New York, 2009
2 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski
Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Izolacja chlorowodorku glukozaminy (kozaminy)

Wzór glukozaminy

OH
HO O
HO OH
NH2

Odczynniki:
- chityna z krabów 5 g - węgiel aktywny 4 g

- kwas solny stężony 100 ml - etanol 4 ml

- celit

Dwiczenie należy przeprowadzad pod wyciągiem

Preparatyka:
W kolbie kulistej o pojemności 100 ml ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną sproszkowaną chitynę z
krabów z 30 ml stężonego kwasu solnego intensywnie mieszając przez trzy godziny. Mieszaninę
ochładza się do temperatury pokojowej, a następnie przesącza się przez celit. Na lejku pozostaje
brązowy osad. Przesącz mieszany jest z węglem aktywnym przez 30 minut w temperaturze 60 C.
Mieszanina jest oziębiana ponownie do temperatury pokojowej i sączona przez celit. Przesącz
powinien byd klarowny w kolorze jasnobrązowym. Wodę odparowuje się na wyparce próżniowej. Do
otrzymanej mieszaniny kryształów i oleju dodaje się 4 ml etanolu i po krótkim mieszaniu pozostawia
na noc w lodówce. Powstałe kryształy odsącza się na lejku Büchnera, przemywa eterem dietylowym
(5 ml). Kryształy suszy się na powietrzu lub pod zmniejszonym ciśnieniem.

Temperatura topnienia: 198 C – z rozkładem, wydajnośd: 1,3 g

Surowy produkt może byd rekrystalizowany z wody. W celu poprawienia wydajności krystalizacji po
oziębieniu do krystalizującej soli dodaje się dwukrotną ilośd etanolu w stosunku do użytej wody.

Uwagi:
 Na początku ogrzewania tworzy się brązowa galareta, która w trakcie dalszego ogrzewania
stopniowo się rozpuszcza.
 Sączenie przez celit wykonuje się na lejku próżniowym przez około 1-2 cm warstwę ubitego
celitu przykrytego bibułą filtracyjną.
 UWAGA – podczas dodawania węgla aktywnego do mieszaniny powstają pary zawierające
gazowy HCl

3 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Zagadnienia
 Cukry
 Polimery i polikondensaty
 Właściwości i reaktywnośd grupy aminowej

Literatura:
Classics in Spectroscopy: Isolation and Structure Elucidation of Natural Products Berger S., Sicker D.,
Wiley-VCH, New York, 2009

4 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Synteza kliokwinolu

Schemat reakcji:

(etap pierwszy) – otrzymanie 5-chloro-8-chinolinolu

Odczynniki:
- 8-hydroksychinolina 1,5 g - metanol

- 25% HCl 15 ml - NaHCO3 (roztwór nasycony)

- chloran (V) sodu 0,45 g - aceton (bezwodny) około 35 ml

Preparatyka:
W trójszyjnej kolbie kulistej o pojemności 100 ml, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i
termometr, rozpuszcza się 8-hydroksychinolinę w kwasie solnym. Następnie wkrapla się chloran (V)
sodu rozpuszczony w 3 ml wody, utrzymując temperaturę w granicach 28-32 C. Po wkropleniu
podnosi się temperaturę do 35-40 C i miesza jeszcze przez godzinę, a następnie oziębia do
temperatury około 10 C i pozostawia na około dwie godziny. Wytrącony osad chlorowodorku 5-
chloro-8-chinolinolu odsącza się na lejku Büchnera przemywa się 2 ml kwasu solnego. Wilgotny osad
chlorowodorku przenosi się do zlewki i rozpuszcza na gorąco w około 10-15 ml wody, a następnie
zobojętnia się nasyconym wodorowęglanem sodu do pH 6,5-7. Wytrącony osad 5-chloro-8-
chinolinolu sączy się na lejku Büchnera, przemywa 3 ml zimnej wody i suszy w temperaturze 60 C.

Temperatura topnienia: 127-130 C, wydajnośd: 60 %

Surowy produkt może byd rekrystalizowany z 80% etanolu

Uwagi:
 Temperatura topnienia chlorowodorku 5-chloro-8-chinolinolu wynosi 250 – 256 C
 Z uwagi na tworzenie się kompleksów produktu z żelazem należy unikad sprzętu metalowego

5 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

(etap drugi) synteza kliokwinolu

Odczynniki:
- 5-chloro-8-chinolinol 0,6 g - etanol (absolutny) 25 ml

- bezwodny octanu sodu 0,28 g - 5% siarczan (IV)sodu

- jod 0,85 g

W przypadku otrzymania innej niż zakładana ilośd substratu (5-chloro-8-

chinolinolu) należy przeliczyd ilości pozostałych odczynników.

Preparatyka:
W dwójszyjnej kolbie kulistej o pojemności 100 ml rozpuszcza się 5-chloro-8-chinolinol w 10 ml
etanolu, dodaje octan sodu i ogrzewa pod chłodnicą zwrotną dodając w czasie około 30 minut
roztwór jodu w 10 ml etanolu. Po zakooczeniu dodawania jodu ogrzewanie kontynuuje się przez 15
minut i oziębia do temperatury pokojowej. Następnie wkrapla się do powstałej zawiesiny d o
odbarwienia roztwór siarczanu(IV) sodu, oziębia w łaźni lodowej do 5 C i pozostawia na godzinę.
Wytrącony 5-chloro-7-jodo-8-chinolinol odsącza się na lejku Büchnera i przemywa dwoma porcjami 2
ml zimnego etanolu. Produkt suszy się na powietrzu.

Temperatura topnienia: 172-174 C, z rozkładem, wydajnośd: 70 %

Surowy produkt może byd rekrystalizowany z kwasu octowego lub octanu etylu i etanolu w stosunku
4:9

Uwagi:
 Kliokwinol to składnik przeciwbakteryjnego i przeciwgrzybicznego preparatu złożonego
Viosept (Jelfa)
 Widmo IR (KBr): 1266, 1198, 953, 808, 784 cm -1.

Zagadnienia
 Związki heterocykliczne o pierścieniach skondensowanych
 Fenole
 Substytucja elektrofilowa w związkach heterocyklicznych

Literatura:
Syntezy Środków Leczniczych pod redakcją Henryka Marony, wydawnictwo U. J. Kraków 2002.

6 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Synteza zingeronu

I ETAP Kondensacja waniliny z acetonem

4-(4'-hydroksy-3'-metoksyfenylo)-3-buten-2-on

Odczynniki: Aparatura i szkło:

wanilina 0,5 g kolba kulista 25 ml

aceton 3 ml korek
aq NaOH 1 ml (20%) zestaw do sączenia z
HCl 5 ml (3 M) lejkiem Büchnera
etanol 3 ml
woda 2 ml

Preparatyka:

W kolbie kulistej o poj. 25 ml umieścid 0,5 g waniliny oraz 3 ml acetonu. Mieszad do

rozpuszczenia ciała stałego. Następnie dodad 1 ml roztworu wodorotlenku sodu. Zamknąd kolbę
korkiem i energicznie nią wstrząsad aż pojawi się osad (biały i jasno-żółty). Mieszaninę pozostawid w
temperaturze pokojowej na tydzieo. Osad stopniowo ciemnieje, a roztwór nad nim nabiera
czerwonego koloru.

Po tym czasie otworzyd kolbę i dodad 10 ml kwasu solnego. Wstrząsad kolbą aż obecny w niej osad
rozpuści się i dojdzie do strącenia nowego osadu o żółtej barwie. Osad odsączyd wykorzystując
zestaw do sączenia z lejkiem Büchnera, przemyd kolbę i osad małą ilością wody. Produkt wysuszyd na
powietrzu.

Surowy produkt można przekrystalizowad - rozpuścid go w gorącym etanolu i dodad prawie taką samą
objętośd gorącej wody, mieszaninę ostudzid. Temperatura topnienia po rekrystalizacji wynosi 127-
128,5°C.

Produkt zważyd i pobrad próbkę do wykonania widma UV.

Obliczyd wydajnośd i sprawdzid temperaturę topnienia (surowy produkt, lit. t.t. 124-127°C).

7 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę TLC z SiO2 nanieśd substrat oraz otrzymany produkt. Poczekad chwilę aż płytka wyschnie.
Wstawid płytkę do kuwety z fazą nośną: chlorek metylenu/ octan etylu jak 10:1 (11 ml). Po
wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV i zakreślid plamkę ołówkiem, a następnie spryskad płytkę
TLC przygotowanym 10% roztworem H2SO4 w etanolu i wyprażyd na płytce grzewczej.

Widmo UV :

8 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

II ETAP Uwodornienie do Zingeronu

Odczynniki: Aparatura i szkło:

4-(4'-hydroksy-3'-metoksyfenylo)-3-buten-2-on 0,5 g kolbka 25 ml

wodór korek
rod 5% na Al2 O3 50 mg zestaw do uwodornienia
metanol 8 ml mieszadło magnetyczne
zestaw do sączenia z ziemią
okrzemkową oraz lejkiem Büchnera

Preparatyka:

W kolbie umieścid 0,5 g substratu, 50 mg katalizatora, 8 ml metanolu oraz mieszadełko

magnetyczne. UWAGA - wszystkie czynności związane z pracą z wodorem należy wykonad w
obecności ASYSTENTA. Nabrad wodór do balonika i ostrożnie przepłukad nim kolbkę reakcyjną- przez
1-2 min. Połączyd kolbkę z przygotowanym zestawem do uwodornienia. Ponownie nabrad wodór do
balonika i podłączyd do przygotowanego zestawu. Zanotowad początkową objętośd wodoru,
uruchomid mieszadło i otworzyd przepływ gazu do kolbki reakcyjnej.

W trakcie reakcji objętośd wodoru zmniejsza się. Należy obserwowad kiedy dojdzie do zatrzymania
lub znacznego spowolnienia tempa przepływu wodoru. Zanotowad zużytą objętośd gazu.

Zamknąd dopływ wodoru. Mieszaninę reakcyjną przesączyd wykorzystując zestaw do sączenia z

lejkiem Büchnera. W lejku umieścid niewielką ilośd ziemi okrzemkowej, użyd kilku mililitrów metanolu
żeby zwilżyd wypełnienie lejka i przepłukad kolbę. Przesącz odparowad, a otrzymany produkt zwayd i
przygotowad próbkę do wykonania widma UV.

Obliczyd ilośd zużytego wodoru i wydajnośd reakcji. Sporządzid widmo UV otrzymanego produktu.

9 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę TLC z SiO2 nanieśd substrat oraz otrzymany produkt. Poczekad chwilę aż płytka wyschnie.
Wstawid płytkę do kuwety z fazą nośną: chlorek metylenu/ octan etylu jak 10:1 (11 ml). Po
wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV i zakreślid plamki ołówkiem, a następnie spryskad płytkę
TLC przygotowanym 10% roztworem H2SO4 w etanolu i wyprażyd na płytce grzewczej.

Zagadnienia:

- reakcja aldolowa i krzyżowa reakcja aldolowa

- reaktywnośd grupy karbonylowej
- redukcja wiązania podwójnego C=C , reakcje uwodornienia

Literatura:

Rheosmin („Raspberry Ketone”) and Zingerone, and Their Preparation by Crossed Aldol-Catalytic
Hydrogenation Sequences; Smith L. R.; The Chemical Educator, 1 / vol.1, no.3, 1996 New York

Temporal Interactions between Oral Irritants: Piperine, Zingerone, and Capsaicin; Affeltranger M. A.,
McBurney D. H., Balaban C. D.; Chem. Senses 32; 455-462, 2007

10 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

SYNTEZA ANESTEZYNY (BENZOKAINY)

I Etap – SYNTEZA KWASU 4-AMINOBENZOESOWEGO (metoda I)

COOH COOH

FeSO4

NH4OH

NO2 NH2

Odczynniki: Sprzęt i szkło:

kolba stożkowa 250 ml

kwas p-nitrobenzoesowy 2.1 g kolba stożkowa 250 ml

12% NH4 OH 15 ml zestaw do sączenia pod zmniejszonym

25% NH4 OH 20 ml ciśnieniem z lejkiem Büchnera

FeSO4x7H2O 44.6 g kolba okrągłodenna 50 ml

Kwas cytrynowy papierki wskaźnikowe pH uniwersalne

Octan etylu cylinder 100 ml

Chlorek metylenu zlewka 250 ml

W kolbie (250 ml) przygotowad roztwór siedmiowodnego hydratu siarczanu żelaza(II) (44.6 g) w 50
ml wody i ogrzad do wrzenia (roztwór 1).

Jednocześnie rozpuścid w kolbie stożkowej (250 ml) kwas 4-nitrobenzoesowy (2.1 g) w 15 ml 12%
amoniaku (roztwór 2). W celu przyspieszenia procesu mieszaninę lekko ogrzad na łaźni wodnej.
Roztwór ten dodad powoli do kolby z roztworem FeSO 4, ciągle mieszając na mieszadle
magnetycznym. W razie potrzeby należy energicznie wstrząsad kolbą.
Po 20 minutach, do mieszaniny reakcyjnej powoli dodad 25% amoniaku (~15 ml) do odczynu słabo
alkalicznego (pH sprawdzad papierkiem wskaźnikowym).
Mieszanie kontynuowad przez kolejne 20 minut. Następnie gorącą mieszaninę przesączyd na lejku
Buchnera.

11 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Otrzymany przesącz zakwasid kwasem cytrynowym do odczynu lekko kwaśnego. Ekstrahowad (5x30
ml) mieszaniną octanu etylu/ chlorek metylenu (1:2). Połączyd warstwy organiczne, osuszyd bezw.
MgSO4 i odparowad na wyparce w wytarowanej kolbie.
Wypadają żółte kryształy kwasu 4-aminobenzoesowego o temp. top. 192 oC. Do kolejnego etapu użyd
surowy produkt - bez dalszego oczyszczania.

Uwaga! produkt bardzo łatwo rozpuszcza się w wodzie, etanolu i eterze!

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę SiO2 nanieśd substraty oraz otrzymany produkt. Płytkę wstawid do fazy nośnej: CH 2Cl 2 /
MeOH (8:2).

Po wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV, a następnie płytkę wywoład w komorze jodowej.

12 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

ETAP II PARA-AMINOBENZOESAN ETYLU (BENZOKAINA,

ANESTEZYNA)

COOH COOC2H5

EtOH
H+

NH2 NH2

Odczynniki: Sprzęt i szkło:

kolba kulistej 250 ml

kwas p-aminobenzoesowy 1.0 g kolba kulistej 100 ml

abs. EtOH 8 ml chłodnica zwrotna

H2SO4 (oleum) 0.6 ml kolba stożkowa 100 ml

5% NH4OH ~5 ml zestaw do sączenia pod zmniejszonym

ciśnieniem z lejkiem Büchnera

papierki wskaźnikowe pH uniwersalne

cylinder 100 ml

zlewka 100 ml

szalka Petriego

W kolbie kulistej (250 ml), zaopatrzonej w chłodnicę zwrotną, umieścid 1 g kwasu

p-aminobenzoesowego, 8 ml bezwodnego etanolu i 0.6 ml oleum. Ogrzewad pod chłodnicą zwrotną
przez 4 godz. Po tym czasie roztwór zalkalizowad stężonym amoniakiem do pH 10, a następnie
ekstrahowad produkt octanem etylu (3x30 ml).

Warstwy organiczne połączyd, przemyd solanką i suszyd nad MgSO 4.

Po odparowaniu uzyskuje się surowy produkt, który rekrystalizuje się z etanolu. Otrzymane kryształki
suszyd w temp. pokojowej.
Zważyd i obliczyd wydajnośd reakcji, zmierzyd temp. top. produktu (Lit. t.t. 92 oC).

13 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę SiO2 nanieśd substraty oraz otrzymaną benzokainę. Płytkę wstawid do fazy nośnej: CH 2Cl 2 /
MeOH (8:2).

Po wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV, a następnie płytkę wywoład w komorze jodowej.

Widmo IR - benzokainy

Zagadnienia:

- Właściwości I reaktywnośd grupy karboksylowej oraz aminowej

- Otrzymywanie i właściwości estrów

- Redukcja

Literatura:

Kar A. Advanced Practical Medicinal Chemistry. New Delhi: New Age International Limited;
2006

14 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

II etapowa synteza FENYTOINY

I ETAP DIBENZOIL

O O

OH O

HNO3/ CH3COOH

Odczynniki: Aparatura i szkło

kolba kulista 100 ml

benzoina 4g krystalizator

bezw. Kwas octowy 20 ml kuchenka

stęż. Kwas azotowy 10 ml mieszadło

etanol 10 ml czasza grzejna

papierek wskaźnikowy rurka do odprowadzania gazów

CH2Cl 2 zlewka 200 ml (wysoka)

zestaw do sączenia z lejkiem Büchnera

szalka Petriego

Pod wyciągiem, w kolbie kulistej o poj. 100 ml umieśd 4 g benzoiny i 20 ml bezwodnego

kwasu octowego oraz 10 ml stężonego kwasu azotowego. Ogrzewaj mieszaninę pod chłodnicą
zwrotną przez 1 godzinę.

Przebieg reakcji sprawdzaj na TLC (faza nośna: chlorek metylenu).

Po całkowitym przereagowaniu substratu, ochłodzid mieszaninę i wylad ją do zlewki o poj 200 ml z 40

g lodu i 20 ml zimnej wody. Całośd mieszad, aż olej całkowicie zastygnie, tworząc osad. Surowy

15 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

dibenzoil odsączyd na lejku Büchnera i przemyd starannie zimną wodą tak, aby odmyd kwas. Wyciek
sprawdzid papierkiem wskaźnikowym.

Krystalizacja produktu z etanolu (ok. 10 ml).

Obliczyd wydajnośd i zbadad temperaturę topnienia (lit. 94 – 96 oC).

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę SiO2 nanieśd substrat oraz otrzymany produkt. Poczekad kilka minut aż kwas wyschnie na
płytce.

Płytkę wstawid do kuwety z fazą nośną: chlorek metylenu (10 ml).

Po wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV i zakreślid sygnały ołówkiem, a następnie płytkę
wywoład w komorze jodowej.

16 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

II ETAP 5,5-DIFENYLOIMIDAZOLIDYNO-2,4-DION (FENYTOINA)

O O
O O
H2N NH2

KOH/EtOH
HN NH N NH

O OH

Odczynniki: Aparatura i szkło:

kolba kulista 100 ml

dibenzoil 2g chłodnica zwrotna

mocznik 0.96 g zestaw do sączenia z lejkiem Büchnera

95 % etanol 50 ml + 16 ml zlewka 400 ml

KOH cylinder 100 ml

CH2Cl 2 10 ml cylinder 50 ml

krystalizator na 500 ml

zlewka 50 ml

W kolbie o poj. 100 ml umieścid 2.0 g dibenzoilu, 0.96 g mocznika i wlad 50 ml 95% etanolu.
Całośd mieszad aż do rozpuszczenia substratów. Następnie do mieszaniny dodad 6 ml 9.4 M roztworu
KOH i ogrzewad pod chłodnicą zwrotną przez 2 godziny. Zrób TLC z CH 2 Cl 2 jako fazą rozwijającą.

Przy obróbce pracuj w rękawiczkach!

Jeśli substrat przereagował całkowicie usunąd na lejku Büchnera osad, a otrzymany roztwór przelej
do zlewki (400 ml) i dodad wodę z lodem (50 g lodu i 50 ml wody). Zlewkę włóżyd do krystalizatora z
wodą i lodem i do mieszaniny reakcyjnej wprowadź kroplami 10% HCl, aż pH roztworu osiągnie 4-5
pH. Lodowatą mieszaninę przesącz przez lejek Buchnera.

Otrzymany surowy produkt krystalizowad z mieszaniny wody i etanolu (2:8).

Zbadaj temperaturę topnienia otrzymanych kryształów (lit. Temp. top. 293-294 oC.

17 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę SiO2 nanieśd substrat oraz otrzymany produkt. Płytkę wstawid do kuwety z fazą nośną:
chlorek metylenu (10 ml).

Po wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV i zakreślid sygnały ołówkiem, a następnie płytkę
wywoład w komorze jodowej.

Widmo IR – fenytoiny

Zagadnienia:

- Związki heterocykliczne o skondensowanych pierścieniach

- Reaktywnośd związków z grupami: karboksylowymi, aminowymi
- Właściwości i reaktywnośd grupy aminowej i amidowej

Literatura:

Kar A. Advanced Practical Medicinal Chemistry. New Delhi: New Age International Limited;
2006

18 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

PARACETAMOL (ACETAMINOFEN)

H
NH2 O N CH3

O
+ O + H3C
OH
O
OH OH

Odczynniki: Aparatura i szkło:

kolba okrągłodenna 50 ml

p-aminofenol 5,5 g (0.05 mola) chłodnica zwrotna

bezwodnik octowy 6 ml (0.06 mola) zestaw do sączenia pod zmniejszonym

ciśnieniem z lejkiem Büchnera

wzorzec – tabletka APAP® lub Paracetamol ® zlewka 100 ml

bagietka

szalka Petriego

Pod dygestorium, przygotowad zestaw do ogrzewania pod chłodnicą zwrotną.

p-Aminofenol (5.5 g) umieścid w kolbie okrągłodennej i wlad 15 ml wody destylowanej. Następnie

ostrożnie wkroplid 6 ml bezwodnika octowego. Otrzymaną mieszaninę ogrzewad przez 30 min
(kamyczki wrzenne w kolbie!). Podczas ogrzewania cały substrat ulega rozpuszczeniu i przereagowuje
z bezwodnikiem octowym.

Po ochłodzeniu dodad powoli 5 ml wody i pozostawid do krystalizacji (jeśli osad nie pojawi się, to
należy roztwór zamieszad, pocierając bagietką o ścianki zlewki). Wytrącony produkt odsączyd i
przekrystalizowad z 15 ml wody (ogrzewad pod chłodnicą zwrotną).

19 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Otrzymane kryształki przesączyd na lejku Büchnera i przemyd 3 razy zimną wodą, wysuszyd na
powietrzu. Zważyd i obliczyd wydajnośd procesu. Zmierzyd temp. top. (lit. t.t. 169 oC).

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC)

Na płytkę SiO2 nanieśd substrat, otrzymany produkt oraz wyizolowany z tabletki acetaminofenon.
Płytkę wstawid do fazy nośnej: chloroform : metanol (8:2).

Po wysuszeniu rezultat odczytad pod lampą UV, a następnie płytkę wywoład w komorze jodowej.

Widmo IR – paracetamolu

Zagadnienia:

- Właściwości i reaktywnośd grupy aminowej i amidowej

- Fenole
- Właściwości i reaktywnośd bezwodników kwasowych

Literatura:

Kar A., Advanced Practical Medicinal Chemistry. New Delhi: New Age International Limited;
2006.

Corey E.J., Czakó B., Kürti L., Molecules and Medicine, Wiley, 2007.

20 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Oznaczanie zawartości genisteiny i daidzeiny oraz

ich glikozydów w preparacie Soyfem (suplement diety)
i w ekstrakcie z soi

Procedura:
1. Tabletkę Soyfemu pokruszyd w moździerzu, umieścid w fiolce, dodad 2 ml metanolu i
pozostawid na 30 min, wstrząsając co parę minut.
2. W drugiej fiolce umieścid ok. 300 mg odtłuszczonej mąki sojowej i potraktowad tak samo.
3. Przygotowad chromatograf (instrukcja) i przemywad kolumnę przez 15 min. eluentem
początkowym (przepływ 1 ml/min).
4. Po 30 min pobrad poprzez filtr strzykawkowy po ok. 500 μl ekstraktu do probówek
Eppendorffa.
5. Włączyd program analizy, wybierając odpowiednią metodę (wskazana przez prowadzącego).

Przykładowe warunki rozdziału:

Eluent A – 2% wodny kwas octowy; eluent B – metanol

0 min 70% A, 30 % B, gradient liniowy do 27% A, 73% B w ciągu 18 min. Rozdział

izokratyczny do 20 min.; powrót do warunków początkowych w 22 min.

6. Nastrzyknąd 10 μl ekstraktu z pierwszej próbki i prowadzid analizę.

7. Przemyd kolumnę po analizie i powtórzyd nastrzyk dla drugiej próbki.
8. Wydrukowad chromatogramy i porównad czasy retencji z czasami retencji podanymi dla
substancji wzorcowych. Określid (na podstawie integracji ) względne stężenia genisteiny i
daidzeiny oraz ich glikozydów w obu ekstraktach.
9. Uruchomid program płukania kolumny chromatograficznej.
.

U W A G A ! P r z e d r o z p o c z ę c i em an a l iz y z a p o z n ad s i ę z
i n s t r u k c j ą u ż y tk o w a n ia c h r o m a t o g r af u H P L C .

21 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Zagadnienia:
- chromatografia, rodzaje i zastosowania

- HPLC, mechanizm działania, typy chromatografów, układ faz

- izoflawonoidy, ich lecznicze właściwości

Literatura:
Molecules of Interest Genistein, R. A. Dixon, D. Ferreira, Phytochemistry, 2002, 60, 205-211

22 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Oznaczanie szybkości uwalniania, oznaczenie

wytrzymałości mechanicznej, analiza HPLC

Określenie jednolitości zawartości substancji leczniczej:

Oznaczenie przeprowadza się dla tabletek o deklarowanej zawartości substancji leczniczej 2 mg i
poniżej lub o zawartości poniżej 2% całkowitej masy tabletki. Zawartośd substancji leczniczej w każdej
z 10 losowo wybranych tabletek jednej serii w co najmniej 9 tabletkach nie może byd mniejsza niż
85% i większa niż 115% średniej zawartości.

Oznaczanie czasu rozpadu lub rozpuszczania:

Czas, w którym tabletka w odpowiednim środowisku ulegnie rozpadowi lub rozpuszczeniu, jest
jednym z czynników decydujących o jej wartości leczniczej. Czas rozpadu zwykle stosowanych
tabletek do połykania powinien byd jak najkrótszy, natomiast tabletek dojelitowych dostosowany do
miejsca wchłaniania.

"Czas rozpadu tabletek jest to czas, po którym tabletka zanurzona w odpowiedniej cieczy ulegnie
rozpadowi lub rozpuszczeniu, a na siatce o średnicy oczek 2,0 mm nie pozostaną cząstki tabletki;
mogą pozostad elementy nierozpuszczonej otoczki. Dopuszcza się pozostanie na siatce miękkiej
masy, bez twardego nawilżonego rdzenia." (FP VI)

Zasadnicze znaczenie dla czasu rozpadu mają: wielkośd nacisku przy tabletkowaniu, zwilżalnośd
kapilar i porowatośd.

METODY STATYCZNE I DYNAMICZNE.

Oznaczenie dla tabletek musujących lub dopochwowych przeprowadza się w zlewkach szklanych o
płaskim dnie. Natomiast dla innych tabletek w odpowiednim aparacie. Podstawowym elementem
aparatu jest uchwyt z rurkami z przezroczystego tworzywa, ograniczonymi sitem, wprowadzony w
ruch pionowy o amplitudzie 5,5 cm z częstotliwością 30 na min. Rurki zanurzone są w zlewce o poj.
1000 ml zawierającej odpowiedni płyn o temp. 37°C. Tabletki umieszcza się w rurkach i obciąża
cylindrycznymi krążkami z tworzywa sztucznego.

Czas rozpadu w odpowiedniej cieczy dla poszczególnych rodzajów tabletek:

- Tabletki niepowlekane do stosowania wewnętrznego - do 15 min; w wodzie.
- Tabletki do ssania - nie krótszy niż 15 min i nie dłuższy niż 60 min; w wodzie.
- Tabletki powlekane otoczką z substancji wielkocząsteczkowych - do 30 min, a otoczką cukrową - do
60 min; w wodzie. Jeżeli warunek ten nie zostanie spełniony, badanie należy p owtórzyd w kwasie
solnym (0,1 mol/l).
- Tabletki dojelitowe - nie powinny rozpaśd się ani wykazywad pęknięd otoczki w 0,1 mol/l kwasie
solnym przez 2 h, a w buforze fosforanowym o pH 6,8 powinny rozpaśd się przed upływem 60 min.
- Tabletki do sporządzania roztworów i zawiesin - do 3 min w wodzie o temp. pokojowej.
- Tabletki musujące - do 5 min; oznaczenie należy przeprowadzid w zlewce o poj. 250 ml zawierającej
200 ml wody o temp. 15-25°C.

23 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

- Tabletki dopochwowe - do 15 min; oznaczenie należy przeprowadzid w zlewkach zawierających po

100 ml kwasu mlekowego (1 g/l) o temp. 37°C. W odstępach 5 min należy mieszad zawartośd zlewek
ruchem obrotowym.

Oznaczenie szybkości uwalniania substancji leczniczej (dostępności

farmaceutycznej):
Substancja lecznicza przed wchłonięciem musi się rozpuścid, np. w soku żołądkowym lub jelitowym.
Szybkośd, z jaką pojawi się w krwiobiegu, zależy od szybkości jej uwolnienia (rozpuszczenia) z tabletek
w miejscu wchłaniania.

Do badao uwalniania substancji leczniczej stosuje się różne typy aparatów (łopatkowy, koszyczkowy i
przepływowy), w których starano się odtworzyd - w sposób modelowy - warunki, jakie występują w
poszczególnych odcinkach przewodu pokarmowego. Aparaty do uwalniania zbudowane są z
przezroczystych materiałów, co umożliwia obserwowanie badanej formy podczas badania.

Rys.1 Aparat do uwalniania substancji leczniczej.

Istotne dla wszystkich metod jest utrzymanie stałych warunków oznaczania: temperatury, szybkości
mieszania i (lub) przepływu płynu oraz pH. Temperaturę płynu, niezależnie od typu aparatu,
utrzymuje się na stałym poziomie 37°C. Szybkośd obrotów mieszadła wynosi 50 lub 75 obr./min, a

24 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

koszyczka, najczęściej 100 obr./min. W aparacie przepływowym, szybkośd przepływu rozpuszczalnika

przez komorę powinna byd stała i wynosi 4-16 ml/min.

Objętośd płynu do uwalniania wynosi najczęściej 900 ml. Nie zaleca się zmniejszania objętości płynu
poniżej 500 ml. Do oceny tabletek o niemodyfikowanej szybkości uwalniania (zwykłych) używa się
kwasu solnego (0,1 mol/l) lub wody. Dla tabletek dojelitowych badanie szybkości uwalniania
prowadzi się dwufazowo, zmieniając pH: w czasie pierwszych 2h tabletka umieszczana jest w kwasie
solnym (0,1 mol/l), a w czasie dalszych 45 min lub dłużej w buforze fosforanowym o pH 6,8. W celu
zmiany pH stosuje się stopniową lub całkowitą wymianę płynu.

W zalecanych odstępach czasu pobiera się do badania próbki roztworu i oznacza się w nich,
odpowiednią metodą (najczęściej spektrofotometryczną lub wysokosprawnej chromatografii
cieczowej), zawartośd rozpuszczonej substancji leczniczej. W przypadku postaci o niemodyfikowanej
szybkości uwalniania czas prowadzenia badania wynosi 30, 45 lub 60 min. Po tym czasie powinno się
uwolnid co najmniej 80% substancji leczniczej. W badaniach tabletek o modyfikowanej szybkości
uwalniania należy uwzględnid, że proces uwalniania in vivo zachodzi w czasie znacznie dłuższym (8-12
h) zarówno w żołądku, jak i w jelitach.

Oznaczenie dostępności biologicznej:

Dostępnośd biologiczną charakteryzują trzy parametry: ułamek dawki wchłoniętej do organizmu (AUC
- pole powierzchni pod krzywą zależności stężenia substancji leczniczej we krwi od czasu), czas, po
którym zostaje osiągnięte stężenie maksymalne - tmaks , i wartośd maksymalna stężenia cmaks .
Parametry te wyznacza się, śledząc stężenie substancji leczniczej we krwi, rzadziej w innych płynach
ustrojowych (ślinie, moczu).

Rys 2. Wykres zależności stężenia substancji leczniczej we krwi od czasu.

Dostępnośd biologiczna należy do podstawowych parametrów wyznaczających jakośd terapeutyczną

leku. Określa się ją w lekach o działaniu ogólnym, podawanych przede wszystkim doustnie w postaci
tabletek, kapsułek, proszków lub płynnych układów, w których substancja lecznicza jest zawieszona
lub zemulgowana, podawanych doodbytniczo czopków, kapsułek, tabletek i przezskórnie w postaci
roztworów, żeli, maści, plastrów.

25 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Dostępnośd biologiczna jest szczególnie ważna dla substancji trudno rozpuszczalnych w płynach
ustrojowych. Szczegółowe postępowanie i interpretacja danych są przedmiotem nauczania
biofarmacji.

LEKI SYNONIMOWE - (zasadniczo podobne) produkty farmaceutyczne pochodzące od różnych

producentów, które zawierają te same ilości określonej substancji leczniczej w tej samej postaci,
których dostępnośd farmaceutyczna, dostępnośd biologiczna, skutecznośd lecznicza i bezpieczeostwo
stosowania nie różnią się znamiennie.

Oznaczanie wytrzymałości mechanicznej:

Do podstawowych badao wytrzymałości mechanicznej tabletek, zalicza się badanie ścieralności
(odpornośd tabletek na tarcie, toczenie, uderzanie), twardości (odpornośd tabletek na zgniatanie) i
wytrzymałości tabletek na złamanie.

Oznaczenie odporności mechanicznej tabletek na ścieranie przeprowadza się w przyrządach zwanych

FRIABILATORAMI. Przyjmuje się, że jeżeli podczas 4-minutowego (100 obr.) przetaczania tabletki nie
stracą na masie więcej niż 1.0%,to ich wytrzymałośd jest wystarczająca. Oznaczenia przeprowadza się
tylko dla tabletek niepowlekanych.

Rys. 3 Friabilator – aparat do badania ścieralności tabletek.

Twardośd tabletek oznacza się w przyrządach zwanych TWARDOŚCIOMIERZAMI. Zasada oznaczania

twardości polega na działaniu na tabletkę zwiększającej się liniowo siły nacisku i rejestrowaniu
wartości siły, przy której tabletka ulega pęknięciu. Aparaty umożliwiają pomiar w zakresie nacisku 3-
300 N. W niektórych twardościomierzach istnieje również możliwośd pomiaru średnicy tabletek w
zakresie 3-30 mm.

26 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

Rys. 4 Twardościomierz – aparat do badania twardości tabletek.

Twardośd tabletek można wyrazid wielkością P maks., tj. siłą, przy której nastąpi zgniecenie tabletki, lub
tzw. współczynnikiem twardości T:

maks.

- T - współczynnik twardości wyrażony w N/m2 lub kG/mm2,

- Pmaks. - siła potrzebna do zgniecenia tabletki w N lub kG,
- r - promieo tabletki w m lub mm,
- h - grubośd tabletki w m lub mm.

Tabletki można uznad za dostatecznie odporne na zgniecenie, jeśli współczynnik twardości jest
większy od 0.1 kG/mm2 (> N/m2).

BADANIE ŚCIERALNOŚCI

1. Uruchom urządzenie (Rys.3) przyciskiem z tyłu obudowy, włącz drukarkę. Sprawdź czy dioda
gotowości drukarki na przednim panelu głównego modułu się świeci, jeśli nie, wciśnij przycisk
PRINT.
2. Na ekranie pojawi się liczba 100 - jest to ilośd obrotów bębna w prowadzonym teście.
3. Dokładnie zważ tabletki, które umieścisz w komorze 1 i 2.
4. Z pomocą asystenta! Połóż bęben pomiarowy płasko na górnej obudowie aparatu. Zdejmij
pokrywkę bębna i ostrożnie odłóż na bok. Umieśd tabletki w komorze 1 i 2. Nakryj bęben
pokrywką i ostrożnie umieśd na wale. Zamontuj i dokręd zacisk bębna.

27 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

5. Po naciśnięciu przycisku START/STOP pojawi się pole, w którym należy wpisad masę tabletki z
komory 1. Potwierdź przyciskiem ENTER, poprawki możesz wprowadzid po naciśnięci CLEAR.
6. Wpisz na klawiaturze masę tabletki z komory 2, potwierdź wciskając ENTER. Test ścieralności
automatycznie rozpocznie się.
7. Po wykonaniu 100 obrotów aparatura zatrzymuje się, test zostaje zakooczony. Ostrożnie
zdejmij bęben, wyjmij tabletki z komór 1 i 2. Dokładnie zważ tabletki wykorzystane w teście.
8. Wpisz na klawiaturze masę tabletki z komory 1 i wciśnij ENTER. Powtórz czynności dla
tabletki z komory 2. Zostanie wydrukowany raport, a aparatura powróci do stanu gotowości
do kolejnego testu.
9. Powtórz test na łącznie 10 tabletkach.
10. Po wykonanych testach, wyłącz drukarkę.
11. Wyłącz główny moduł.

BADANIE TWARDOŚCI
1. Uruchom twardościomierz (Rys.4) przyciskiem z tyłu aparatu. Drukarkę uruchom przyciskiem
po jej prawej stronie.
2. Włącz zewnętrzny moduł - urządzenie do pomiaru grubości i średnicy tabletki.
3. Podczas pierwszego użycia wyzeruj urządzenie przez naciśnięcie i przytrzymanie przycisku
ORIGIN.
4. Dźwignię przesuo ku dołowi, co spowoduje uniesienie się tłoczka pomiarowego. Pod
tłoczkiem umieśd tabletkę w pozycji - na płasko.
5. Zwolnij dźwignię, tłoczek przesunie się w dół, opierając na tabletce. Odczytaj wynik pomiaru
[mm].
6. Powtórz pomiar umieszczając tabletkę pod tłoczkiem w pozycji - na krawędzi. Odczytaj
wartośd jej średnicy *mm+.
7. Na górnej obudowie głównego modułu znajdują się szczęki do pomiaru twardości tabletki.
Umieśd tabletkę pomiędzy nimi, w pozycji - na płasko, tak aby opierała się o szczękę
sensorową (szczęka po lewej stronie).
8. Nakryj szczęki plastikową pokrywką ochronną i naciśnij przycisk TEST (wykonuj w okularach
ochronnych!).
9. Wynik odczytaj z ekranu [kp ; N]. (kilogram – siła 1kp = 1kgf = 9,80665 N)
10. W celu uzyskania raportu i oczyszczenia pamięci urządzenia, wciśnij przycisk
INITIALIZE/PRINT.
11. Powtórz pomiary dla łącznie 5 tabletek.
12. Wyłącz drukarkę.
13. Wyłącz moduł do pomiaru grubości tabletki.
14. Wyłącz moduł główny.

28 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

UWALNIANIE SUBSTANCJI LECZNICZEJ

1. Aparaturę (Rys. 1) uruchom włącznikiem na jej tylnej obudowie. "Centrum dowodzenia" z
panelem sterowania i ekranem, uruchom włącznikiem po lewej stronie górnego modułu.
2. W łaźni wodnej na dole maszyny znajduje się już woda destylowana.
3. Proces uwalniania prowadza się w naczyniach (vessels) zanurzonych w łaźni. Trzymając za
uchwyt z przodu górnego modułu podnieś go. Do naczynia A wlej 900 ml wody destylowanej,
do naczynia B wlej 900 ml 0,1M roztwór kwasu solnego.
4. Korzystając z panelu dotykowego wybierz MENU i ustal - temperaturę łaźni - 37°C ; ilośd
obrotów łopatek na minutę - 75 ; czas trwania testu - 2 h 15 min.
5. Poczekaj aż temperatura łaźni, a przez to również temperatura płynu w naczyniach
ustabilizuje się na 37°C. Aparat zaopatrzony jest w termometr, po umieszczeniu go w danym
naczyniu, można śledzid na ekranie zmiany temperatury.
6. Wprowadź jedną tabletkę do naczynia z fazą wodną oraz drugą tabletkę do naczynia z 0,1M
roztworem HCl.
7. Uruchom proces uwalniania naciskając przycisk RUN.
8. Pobieraj próbki - pierwsza po 15 min, każda następna co 30 min.
9. Próbki poddaj badaniu absorpcji na spektrofotometrze UV-VIS.
10. Po zakooczeniu procesu uwalniania podnieś górny moduł. W obecności asystenta! Umyj
naczynia oraz łopatki, ewentualne pozostałości tabletek wyrzud.
11. Po ponownym zmontowaniu poszczególnych elementów aparatury wyłącz górny moduł,
następnie wyłącz maszynę przyciskiem z tyłu obudowy.

Literatura:
FARMACJA STOSOWANA, Podręcznik dla studentów farmacji pod redakcją Stanisława Janickiego,
Adolfa Fiebiga, Małgorzaty Sznitowskiej, PZWL, 2008

29 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

HPLC
High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna chromatografia cieczowa

1. Włącz poszczególne moduły HPLC (przyciski z przodu obudowy), następnie uruchom

komputer.
2. Uruchom program GALAXIE, wybór potwierdź OK.
3. Na dole ekranu wybierz SYSTEMS, zaznacz pole PROSTAR.
4. W polu ze schematem aparatu włącz lampę deuterową - kliknij D2 , i czekaj aż pojawi się
zielone pole.
5. W tym samym polu uruchom - VIS. Poczekaj aż aparatura będzie gotowa do pracy - zielone
pole na METHOD READY.
6. Jeśli metoda wykorzystywana przy danej analizie jest już zapisana w systemie, to przejdź do
wyznaczenia warunków pomiaru. Jeśli metody nie ma w systemie to trzeba ją ustawid.
7. Ustawianie metody:
a) Klikaj w kolejności na FILE - NEW - NEW METHOD. Wybierz system PROSTAR, kliknij
NEXT. Wpisz nazwę dla metody i kliknij NEXT.
b) Na dole ekranu po lewej stronie kliknij myszką na CONTROL.
c) W głównym polu - pasek po lewej, jego górna częśd - kliknij na pole pompa 218.
d) Wybierz A i B - używane w analizie rozpuszczalniki - zgodnie z tym jak podłączone są
butelki z rozpuszczalnikami.
e) W tabelce poniżej wybierz odpowiedni procent fazy nośnej oraz czas jej użycia.
Dodając kolejne linie klikaj na "+". Zaznacz w jakim czasie ma dojśd do zmiany
stężenia faz. Na koocu powród do warunków początkowych analizy. Klikając na "-"
możesz cofnąd wybór.
f) W zakładce wybierz MISCELLANEOUS i następnie zaznacz START MODE - INJECT
TRIGGER ON PUMP A. Pozostałe opcje pozostaw tak jak jest.
g) W głównym polu - pasek po lewej, jego górna częśd - kliknij na pole 325 i wybierz
długośd fali detektora podczas analizy.
h) Metoda jest gotowa do użycia, klikaj więc w kolejności na FILE - SAVE - SAVE
METHOD.
i) Kliknij na dole ekranu na zakładkę SYSTEMS.
8. Przejdź do wyznaczenia tła pomiaru i wymycia kolumny. Na górze ekranu kliknij na
ACQUISITIONS, następnie na MONITORING BASELINE i wybierze stosowaną metodę.
Poczekaj! aż pojawi się komunikat RUNNING na schemacie aparatury.
9. Poczekaj aż kolumna zostanie przemyta - ok. 10 - 15 min (aż linia podstawowa będzie równa -
wyzerowana).
10. Gdy linia podstawowa jest płaska możemy przerwad przemywanie, kliknij na STOP (górny
lewy róg głównego pola) i następnie OK.
11. Na górnym pasku ekranu kliknij ikonę QUICK START. Wybierz nazwę systemu PROSTAR i
wybierz używaną przez Ciebie metodę – potwierdź OK.
12. Nazwij plik. Jeśli chcesz to możesz zmienid czas pomiaru (ACQUISITION TIME).
13. Kliknij na START. Poczekaj aż aparatura będzie gotowa do pracy - na schemacie pojawi się
informacja, że oczekiwany jest nastrzyk.

30 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

14. ZAWÓR INIEKCYJNY znajduje się w górnej prawej części aparatu, umieśd go w pozycji LOAD
(jeśli już nie znajduje się w tej pozycji). Wykonaj nastrzyk wprowadzając do pętli maksymalnie
20 μL analizy (strzykawkę umieszczając w zaworze - "do oporu"). Przekręd zawór do pozycji
INJECT. Gdy na ekranie zacznie pojawiad się wykres, przekręd zawór do pozycji LOAD i wyjmij
strzykawkę (przemyj ją wodą destylowaną i metanolem).
15. Obserwuj ekran monitora i czekaj na wynik. W głównym polu - na górze - pojawiają się
wskazania detektora. Po lewej stronie kliknij na ikonę pompy 210. W polu na dole ekranu
pokazany jest skład procentowy fazy w danym momencie analizy. Na małym wykresie po
prawej stronie, pokazana jest planowana zmiana stężenia fazy.
16. Po zakooczonej analizie gdy uzyskasz już wynik (możesz zatrzymad proces wcześniej
przyciskiem STOP) przejdź do wydrukowania chromatogramu. W tym celu klikaj w kolejności
FILE - OPEN CHROMATOGRAM - wybierz KATALOG danego miesiąca - wybierz nazywany
przez Ciebie PLIK. Następnie klikaj na FILE - PRINT, chromatogram zostanie wydrukowany.
17. Przejdź do płukania układu, w tym celu uruchom metodę MYCIE (10-15 min.).
18. Po zakooczeniu płukania, korzystając z pola systemu (schemat aparatury) wyłącz detektor
UV-VIS oraz lampę D2.
19. Zamknij program GALAXIE. Wyłącz komputer. Poszczególne moduły wyłącz przyciskami na
przedniej obudowie aparatu.
20. Wyłącz zasilacz.

31 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski

Związki pochodzenia naturalnego w chemii medycznej

SPEKTROFOTOMETR UV-VIS
1. Podłącz wtyczkę do gniazdka i włącz listwę bezpieczeostwa. Teraz możesz uruchomid
komputer. Spektrofotometr uruchamia się automatycznie, razem z komputerem. Podczas
startu komputera aparatura rozgrzewa się - poczekaj aż ucichną sygnały dźwiękowe.
2. Dobierz dwie takie same kuwety (wysokośd, szerokośd, grubośd ścianek). W jednej z nich
umieśd sam rozpuszczalnik - w celu zerowania linii podstawowej. W drugiej kuwetce umieśd
odpowiednio przygotowaną (rozcieoczoną) próbkę - kuweta pomiarowa.
3. Kliknij 2x na folder - Cary WinUV. Następnie kliknij 2x na ikonę - SCAN, odczekaj aż umilkną
sygnały dźwiękowe.
4. Na ekranie monitora pojawi się okno robocze. Kliknij pole SETUP po lewej stronie.
a) W nowym oknie, w zakładce CARY, możesz zmienid długośd fali w pomiarach (zakres
800-200 nm).
b) Upewnij się że pole CYCLE MODE jest odhaczone.
c) W konfiguracji skanu wybierz pole SIMPLE i szybkośd MEDIUM lub FAST.
d) Dla osi Y wybierz Abs - absorbancję, i odpowiedni zakres, np. 0-3.
e) Pole Beam mode ustaw- Dual Beam. Dla opcji wyświetlania wybierze - OVERLAY DATA
f) Przejdź do zakładki BASELINE i w polu CORRECTION zaznacz - BASELINE CORRECTION.
g) Aby potwierdzid wybór wszystkich opcji kliknij pole OK.

5. Po powrocie do głównego okna kliknij na pole BASELINE po lewej stronie ekranu.

6. Na ekranie pojawi się komunikat. Przesuo pokrywę komory pomiarowej i umieśd w niej
kuwetę z samym rozpuszczalnikiem (przezroczystymi ściankami zgodnie z przebiegiem wiązki
światła).
7. Wyjmij kuwetę kalibracyjną i umieśd w komorze pomiarowej kuwetę z próbką badanej
substancji. Kliknij pole START na górze ekranu.
8. Otworzy się pole zapisu skanu i wyboru nazwy próbki. Nazwij plik swoim nazwiskiem i zapisz
w folderze CHEMIA LEKÓW - DATA DWICZEO. Po kliknięciu pola SAVE, wybierz nr próbki i
kliknij OK.
9. Aparat wykona analizę i wyświetli wynik pomiaru na ekranie. Sprawdź czy drukarka jest
włączona i czy jest papier! Aby wydrukowad wykres klikaj, FILE - PRINT - (zaznacz ilośd stron) -
OK.
10. Aby otworzyd (i wydrukowad) dwa wykresy na jednym ekranie (kartce) otwórz plik z
wykresem. Następnie kolejny plik przeciągnij na otwarte już okno programu i na górnym
pasku wybierz opcje - SINGLE/MULTI GRAPH i AUTO ARRANGE GRAPHS.
11. Jeśli wykres jest poza skalą - rozcieocz próbkę i powtórz analizę. Jeśli sygnały są za słabe -
dobierz większe stężenie. Gdy zmieniasz długośd fali, wykalibruj ponownie aparat na
rozpuszczalniku.
12. Kuwetki przemywaj wodą i metanolem, powtórz pomiar dla wszystkich próbek. Gdy
skooczysz analizę, umyj kuwetki pomiarowe i wyłącz program (FILE - EXIT). Wyłącz komputer,
drukarkę i listwę.

32 Opracowanie: Anna Przybył, Michał Gładysz i Jakub Grajewski