Professional Documents
Culture Documents
2005/2006
16 maja 2006
1
2
Spis tre±ci
1 Kwasowa hydroliza skrobi 4
1.1 Wst¦p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.2 Mechanizm procesu hydrolizy kwasowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.3 Analityczne metody kontroli procesu hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4 Produkty uboczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.5 Przemysªowy proces hydrolizy skrobi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.6 wiczenia laboratoryjne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.1 Oznaczenie suchej masy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.2 Przeprowadzenie hydrolizy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6.3 Oznaczenie redukcyjno±ci hydrolizatu . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.4 Wykonanie krzywej wzorcowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.5 Wykonanie oznaczenia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6.6 Sprawozdanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
• zycznymi,
• chemicznymi,
• biologicznymi
oligosacharydy rewersja
HYDROLIZA HYDROLIZA
SKROBIA −−−−−−−→ dekstryny −−−−−−−→ GLUKOZA −
)− −−
−−−*− Produkty rewersji
hydroliza
y
Kwas mrówkowy ←−−−−− 5-hydroksymetylofurfural −−−−−→ Produkty polimeryzacji
y
Kwas 4-okso-pentanowy
1.1). Szybko±¢ procesu hydrolizy zale»na jest przede wszystkim od st¦»enia czynnika kata
lizuj¡cego (kwasu) oraz temperatury procesu. Prawdopodobnie czynnikiem wpªywaj¡cym
na globaln¡ szybko±¢ hydrolizy jest te» budowa, a szczególnie wielko±¢ ziarenek skrobio
wych.
• cie»ka A:
Protonowanie tlenu pier±cienia glukopiranozowego (A1) powoduje jego rozpad z wy
tworzeniem karbokationu na w¦glu C-1 (A2). W takiej sytuacji do karbokationu
przyª¡cza si¦ cz¡steczka wody (A3). Przesuni¦cie ªadunków w obr¦bie otrzymanego
kompleksu (A4) powoduje, z jednej strony, ponowne zamkni¦cie pier±cienia, a z
drugiej odszczepienie, zarówno kationu wodorowego, jak i cz¡steczki glukozy (lub
fragmentu ªa«cucha polimerowego w zale»no±ci od lokalizacji procesu w cz¡steczce
polimeru).
• cie»ka B:
Reakcja rozpoczyna si¦ protonowaniem mostkowego atomu tlenu przy wi¡zaniu
α-1,4-glikozydowym (B1). Przeniesienie ªadunku na ten atom umo»liwia rozerwa
nie wi¡zania glikozydowego i rozszczepienie ªa«cucha polimeru na dwa krótsze, lub
odszczepienie cz¡steczki glukozy, je±li reakcja ma miejsce na ko«cu ªa«cucha. Po
rozpadzie ªa«cucha na pozostaªej jego cz¦±ci odtworzony zostaje karbokation (B2)
umo»liwiaj¡cy w kolejnym etapie przyª¡czenie cz¡steczki wody (B3). Odszczepienie
6 Kwasowa hydroliza skrobi
CH2OH
O H
OH
glukoza O O glukoza
A
OH
B
+
+H + +H
CH2OH
H
O H CH2OH
A1 OH O H
OH B1
glukoza O O glukoza
OH glukoza O O glukoza
OH H
CH2OH - HO glukoza
H
O H
A2 OH CH2OH
glukoza O O glukoza O H
OH OH
B2
glukoza O
H2O
OH
CH2OH H
H H2O
O O
A3 H
OH
CH2OH
glukoza O O glukoza
OH O H
H
OH
O B3
glukoza O H
OH
CH2OH H
H
O O - H+
H
A4 OH
H H
C O C O H
HO OH
H C OH C O H
CH CH
HO C H HO C H
HOH2C CH C CHOH
- H2O O
H C OH H C OH
H C OH H C OH
CH2OH CH2OH
- H2O
OH OH
CH CH CH CH
HOH2C C CH CHO HOH2C C C CHOH
O O
- H2O
CH CH
5-hydroksymetylofurfural
HOH2C C C CHO
O
+ H2O
O O
OH OH
- H2O
OH O H CH2 OH OH O CH2
OH OH O
O
OH OH Izomaltoza
OH OH OH OH
OH OH
CH2OH
CH2OH wiazanie β-1,6 glikozydowe
O O
O O H
OH
OH CH2 OH - H2O
O OH CH2
OH
OH OH O
OH
OH
OH OH
OH OH OH
OH
Gencjobioza
CH2OH
O
OH
OH O H CH2 OH
OH O
OH
OH O CH2
OH O
OH
OH OH
- H2O OH
CH2OH
O
OH
OH O CH2
Izomaltotrioza
OH O α-D-glukopiranozylo-α-D-glukopiranozylo-O-6-D-glukopiranoza
OH
OH O CH2
OH O
OH
OH OH
OH
u p ³y n n ia n ie
s k r o b i
h y d r o liz a
( H C l)
z o b o jê t n ia n ie
( w ê g la n s o d u )
o c z y s z c z a n ie k r y s t a liz a c j a w ir o w a n ie p r z e r ó b
z a g ê s z c z a n ie
( w ê g ie l a k t y w n y ) c u k r z y c y o d c ie k ó w
G L U K O Z A G L U K O Z A
z a g ê s z c z a n ie K R Y S T A L I C Z N A H Y D R O L
Z E S T A L O N A
S Y R O P
S K R O B I O W Y
krystalicznej. Reakcj¦ hydrolizy prowadzi si¦ wtedy przy ni»szym st¦»eniu mleczka skro
biowego. W przypadku produkcji glukozy reakcj¦ prowadzi si¦ a» do osi¡gni¦cia warto±ci
DE na poziomie 92. W opisywanym procesie, oprócz tzw. glukozy zestalonej oraz glukozy
krystalicznej, uzyskuje si¦ tak»e, jako produkt odpadowy, hydrol. Wariacj¡ metody kwaso
wej otrzymywania glukozy jest proces kwasowo-enzymatyczny, w którym po pocz¡tkowej
hydrolizie surowca obni»a si¦ temperatur¦ procesu, zoboj¦tnia mieszanin¦ reakcyjn¡ oraz
dodaje enzym glukoamylaz¦ w celu jej scukrzenia metod¡ enzymatyczn¡.
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi z
dokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢
z dokªadno±ci¡ do 0,1% wraz z analiz¡ statystyczn¡.
Na wadze analitycznej odwa»y¢ 2,5g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ pocz¡t
kow¡ zawarto±¢ wody równ¡ 20%, a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡
poprawk¦). Skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do kolby miarowej o pojemno±ci 250cm3 i uzupeª
ni¢ do kreski wod¡ destylowan¡. Zawiesin¦ dobrze wymiesza¢ i pobra¢ z niej 10 próbek
po 25cm3 ka»da. Próbki umie±ci¢ w kolbkach Erlenmayera o pojemno±ci 100cm3 . Do 9
próbek doda¢ 12,5cm3 przygotowanego roztworu kwasu solnego (st¦»enia 5%, 10% lub
15% w zale»no±ci od grupy). Próbka 10 stanowi prób¦ zerow¡. Kolbki kolejno umie±ci¢ w
ªa¹ni wodnej o temperaturze 90◦ C na czas: 2, 3, 4, 6, 8, 15, 20, 30 i 40min. Po wyj¦ciu z
ªa¹ni, w celu zatrzymania reakcji hydrolizy, kolbki umieszcza¢ w ªa¹ni wodnej chªodzonej
lodem. Próbk¦ zerow¡ (nie zawieraj¡c¡ kwasu) ogrzewa¢ przez okres 40min, schªodzi¢ a
po ozi¦bieniu doda¢ do niej 12,5cm3 kwasu. Ochªodzone próbki natychmiast zoboj¦tni¢
30% NaOH (wobec papierka uniwersalnego) i umie±ci¢ w kolbach miarowych o pojemno±ci
100cm3 . Zawarto±¢ kolbek uzupeªni¢ do kreski wod¡ destylowan¡, wymiesza¢.
Kwasowa hydroliza skrobi 13
1.6.6 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wyniki
bada«, obliczenia, krzyw¡ wzorcow¡, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymane
dane nale»y skomentowa¢ i wyci¡gn¡¢ wnioski. Porówna¢ tak»e dynamik¦ zmian DE w
zale»no±ci od st¦»enia u»ytego kwasu.
14 Hydroliza enzymatyczna
∆G = ∆H − T ∆S (3)
odpowiada b¡d¹ to zmiana entalpii procesu (∆H) b¡d¹ te» zmiana uporz¡dkowania ukªadu
(zmiana entropii, ∆S).
Dodatkowo jednym z najistotniejszych czynników limituj¡cych przebieg reakcji jest wy
soko±¢ bariery aktywacji (energii aktywacji) zgodnie z równaniem Arrheniusa (Równanie
4).
Ea
k = A · e− RT (4)
gdzie:
• R - staªa gazowa,
• Ea - energia aktywacji,
• T - temperatura.
Hydroliza enzymatyczna 15
Procesem:
S1 + K = S1 K (6)
S1 K + S2 = P + K (7)
Gdzie:
• S1 ,S2 - substraty
• P - produkt
• K - katalizator
• S1 K - kompleks przej±ciowy
Je»eli dla reakcji (5) energia aktywacji wynosi EN to dla procesu katalizowanego wynosi
ona odpowiednio Ek1 (dla reakcji 6) i Ek2 (dla reakcji 7). Zmiany energii aktywacji procesu
katalitycznego obrazuje Rysunek 3.
2.2 Enzymy
Specycznymi katalizatorami reakcji chemicznych s¡ enzymy, grupa biaªek dziaªaj¡cych w
komórkach i pªynach ustrojowych »ywych organizmów i bior¡cych udziaª w procesach syn
tezy lub rozkªadu istotnych z biochemicznego punktu widzenia substancji organicznych.
Enzymy rzadko zbudowane s¡ z samego biaªka (np. trypsyna). W znakomitej wi¦kszo
±ci skªadaj¡ si¦ one z cz¦±ci biaªkowej (tzw. apoenzym) oraz niebiaªkowej, grup prostetycz
nych i koenzymów (maªocz¡steczkowe zwi¡zki nieorganiczne, atomy metali). Niebiaªkowe
cz¦±ci enzymu peªni¡, w reakcjach enzymatycznych, funkcj¦ przeno±ników elektronów,
okre±lonych atomów lub ich ugrupowa« w trakcie katalizowanych procesów. Bior¡ one
udziaª w cyklu reakcji enzymatycznych: w pierwszej jego fazie umo»liwiaj¡ dysocjacj¦
16 Hydroliza enzymatyczna
E n e r g ia
S 1 - - S 2
E N
E k 2 S 1 K - - S 2
E S 1 - - K
k 1
S 1 + S 2 + K
S 1 K
P + K
P o s tê p r e a k c ji
Rysunek 7: Przemiany energetyczne podczas zachodz¡ce podczas procesów chemicznych (S1 S2 -
kompleks aktywny reakcji niekatalizowanej; S1 K, S1 KS2 - kompleksy aktywne poszczególnych
etapów reakcji katalizowanej.
okre±lonych wi¡za« substratu oraz ich zwi¡zanie z enzymem. W fazie drugiej nast¦puje
natomiast zwi¡zanie atomów pochodz¡cych od substratu w produkt, oraz odtworzenie
cz¦±ci niebiaªkowej w pierwotnej postaci, po czym proces si¦ powtarza. Poª¡czenie koenzy
mów z przenoszon¡ grup¡ funkcyjn¡¡ odznacza si¦ du»¡ reaktywno±ci¡. Dzi¦ki cykliczno±ci
procesu przenoszenia, koenzymy mog¡ wyst¦powa¢ w »ywej komórce w ilo±ciach równo
wa»nych ilo±ciom enzymów, cho¢ reaguj¡ z substratami stechiometrycznie. Trwaªo±¢ po
ª¡czenia apoenzymu w koenzymami jest ró»na; je±li koenzym ªatwo dysocjuje, reakcje
przenoszenia grup chemicznych na koenzymy i z koenzymów katalizuje ukªad zªo»ony z 2
enzymów o wspólnym koenzymie; je±li koenzym jest zwi¡zany z enzymem trwale, enzym
ten katalizuje kolejno obie reakcje.
Cz¦±¢ biaªkowa odpowiada natomiast za konguracj¦ przestrzenn¡ enzymu oraz za
zmiany hydrofobowo±ci centrum aktywnego. Budowa taka powoduje »e enzymy zawiera
j¡ce t¡ sam¡ grup¦ prostetyczn¡ ale ró»ne cz¦±ci biaªkowe bed¡ katalizowa¢ ró»ne reakcje
jednostkowe.
Zgodnie z równaniami 6 i 7 podstaw¡ reakcji enzymatycznej jest wytworzenie odwra
calnego kompleksu pomi¦dzy enzymem i substratem reakcji. Kompleks ten ulega nast¦p
nie nieodwracalnej przemianie z odtworzeniem enzymu oraz wytworzeniem nalnego pro
duktu. Tak jak w przypadku wi¦kszo±ci katalizatorów st¦»enie enzymów w trakcie procesu
jest znacz¡co mniejsze niz st¦»enie substratów. Wynika st¡d i» mo»na przyj¡¢, »e st¦»enie
kompleksu S1 K jest staªe w czasie i zale»y tylko od st¦»enia enzymu.
Hydroliza enzymatyczna 17
Szybko±¢ reakcji enzymatycznej zale»na jest tak»e od wielu innych czynników (pH,
temperatura, st¦»enie koenzymów itp.), w tym przede wszystkim od st¦»enia substratu.
Zale»no±¢ szybko±ci procesu od tego st¦»enia opisuje równanie Michaelisa-Menten'a:
vmax · [S]
v= (8)
Km + [S]
Gdzie:
• Km - staªa Michaelisa-Menten'a
2.3.1 Endoamylazy
α-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu - EC 3.2.1.1
Enzymy z tej grupy umo»liwiaj¡ hydroliz¦ wi¡za« α-1,4-glikozydowych zarówno w amy
lozie jak amylopektynie a nie s¡ aktywne w stosunku do wi¡za« α-1,6- (np. w amylo
pektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku s¡ oligosacharydy posiadaj¡ce kon
guracje α przy w¦glu C1. Enzymy te dziaªaj¡ w ±rodku ªa«cucha polimerowego co po
woduje gwaªtowny spadek lepko±ci hydrolizowanego kleiku skrobiowego. Znane s¡ dwa
rodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α-amylaza termostabilna jest enzymem
pochodzenia bakteryjnego. Enzym ten w przypadku pochodzenia ze szczepu Bacillus sub
tilis wykazuje optimum temperaturowe pomi¦dzy 65 a 70◦ C w obecno±ci jonów wapnia,
i ze wzgl¦du na swoj¡ nisk¡ stabilno±¢ nie jest stosowana w zastosowaniach komercyj
nych. α-amylaza pochodz¡ca ze szczepu Bacillus licheniformis (Rysunek 2.3.1) jest na
tomiast aktywna i stabilna w temperaturach powy»ej 90◦ C, a dodatkowo jej aktywno±¢
w znacznie mniejszym stopniu zale»ny od obecno±ci jonów Ca2+ oraz stosowanego pH.
Hydroliza enzymatyczna 19
2.3.2 Egzoamylazy
Enzymy z grupy egzoamylaz dziela si¦ na ukªady dziaªaj¡ce z wytworzeniem glukozy lub
maltozy.
w zakresie 1,8-8,8 dla enzymu z Aspergillus niger oraz 1,8-10,5 dla ukªadu pochodz¡cego
z Aspergillus awamori). Enzym ten najwy»sz¡ aktywno±¢ przejawia przy pH z zakresu
4,0-5,6 w temperaturze 40-65◦ C. Odwrotnie ni» w przypadku α-amylazy jony Ca2+ wyka
zuj¡ inhibicyjne dziaªanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziaªem glukoamylazy.
η = K · Mα (9)
Oznaczanie produktów hydrolizy skrobi mo»liwe jest tak»e przy u»yciu nowoczesnych
metod instrumentalnych, gªównie chromatogracznych. W szczególno±ci nale»y wymieni¢
tutaj:
w o d n a z a w ie s in a s k r o b i
( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 .5
C a 2 + ; a - a m y la z a )
k le ik o w a n ie
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m in
h y d r o liz a
(a - a m y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g
9 0 - 1 2 0 m in )
in a k t y w a c j a e n z y m u
f ilt r a c j a i o c z y s z c z a n ie
( p H 3 - 5 ; 1 0 0 d e g ;
( w ê g ie l a k t y w n y )
5 m in )
S Y R O P
M A L T O D E K S T R Y N Y
S K R O B I O W Y
dekstryny posiadaj¡ nast¦puj¡cy ±redni skªad: 0,3-1,6% glukozy, 0,9-5,8% maltozy, 4-11%
maltotriozy i 1,4-6,1% maltotetraozy. Reszt¦ stanowi¡ poli- i oligo-sacharydy o DP > 4.
Maltodekstryny charakteryzuj¡ si¦ mi¦dzy innymi takimi wªa±ciwo±ciami jak: niska higro
skopijno±¢, wysoka lepko±¢, a tak»e bardzo niska sªodko±¢ (w sensie sensorycznym) oraz
wªasno±ci hamuj¡ce wzrost kryszatªów w takich substancjach spo»ywczych jak lody. Impli
kuje to ich szerokie zastosowanie w przemy±le spo»ywczym (produkcja lodów i cukierków)
i farmaceutycznym (powlekanie tabletek i produkcja syropów). Ponadto ze wzgl¦du na
skªonno±¢ do kapsuªkowania aromatów wykorzystywane by¢ mog¡ do ochrony zwi¡zków
maªocz¡steczkowych (np. aromatów »ywno±ci, skªadników leków itp.) przed utlenianiem.
Nowoczesne zastosowania maltodekstryn w przemy±le spo»ywczym skupiaj¡ si¦ na stoso
waniu ich jako zamienników tªuszczy, od»ywkach dla sportowców oraz ±rodkach spo»yw
czych dla niemowl¡t.
w o d n a z a w ie s in a s k r o b i h y d r o liz a
k le ik o w a n ie
( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 .5 (a - a m y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m in
C a 2 + ; a - a m y la z a ) D E < 1 5 )
s c u k r z a n ie
( D E > 9 6 ; a m y lo g lu k o z y d a z a , p u llu n a la z a ;
p H 4 .5 ; 5 5 - 6 0 d e g ; 4 8 - 9 6 h
f ilt r a c j a i o c z y s z c z a n ie
( w ê g ie l a k t y w n y )
S Y R O P
G L U K O Z O W Y
w o d n a z a w ie s in a s k r o b i
( 3 0 - 4 0 % w / v ; p H 6 .5
C a 2 + ; a - a m y la z a )
k le ik o w a n ie
1 1 0 - 1 4 0 d e g ; 5 - 1 0 m in
h y d r o liz a D E 5 - 1 0
(a - a m y la z a ; 9 0 - 9 5 d e g h y d r o liz a D E 3 8 - 4 0
9 0 - 1 2 0 m in ) (a - a m y la z a ; r o d . k w a n e )
s c u k r z a n ie D E > 9 6 ;
s c u k r z a n ie D E 4 5 - 6 0 s c u k r z a n ie D E 6 0 - 7 0
( a - m y la z a lu b b - a m y la z a ;
( a - m y la z a lu b b - a m y la z a ; ( a - m y la z a lu b b - a m y la z a ;
p H 5 .0 - 5 .5 ; 5 0 - 5 5 d e g )
p u llu la n a z a lu b iz o a m y la z a a m y lo g lu k o z y d a z a
p H 6 .0 ; 5 0 - 5 5 d e g ) p H 6 .0 ; 7 5 d e g )
f ilt r a c j a i o c z y s z c z a n ie in a k t y w a c j a e n z y m u
( w ê g ie l a k t y w n y ) ( 8 0 - 8 5 d e g ;
1 5 m in )
S Y R O P S Y R O P
M A L T O Z O W Y f ilt r a c j a i o c z y s z c z a n ie
M A L T O Z O W Y
O W Y S O K I E J ( w ê g ie l a k t y w n y )
Z A W A R T O C I
M A L T O Z Y
( 7 0 - 8 5 % )
S Y R O P
W Y S O K O S C U K R Z O N Y
nia procesu otrzymuj¡c syropy o ró»nej zawarto±ci maltozy. Zastosowanie enzymów usu
waj¡cych rozgaª¦zienia (pullulanaza lub izoamylaza) umo»liwia peªn¡ hydroliz¦ zarówno
amylozy jak i amylopektyny, co skutkuje wysok¡ zawarto±ci¡ zwi¡zków niskocz¡steczko
wych (zwªaszcza maltozy). W produkcji syropu wysokoscukrzonego równie» stosuje si¦
mieszanin¦ enzymów (α-amylaza i amyloglukozydaza) w celu zwi¦kszenia stopnia kon
wersji. Syropy maltozowe otrzymywane metod¡ enzymatyczn¡ znajduj¡ zastosowanie w
piwowarstwie, produkcji napojów, konserw i wyrobów cukierniczych. Ich dodatek do »yw
no±ci uªatwia kontrol¦ wodochªonno±ci. Syropy te stosuje si¦ tak»e jako wypeªniacze i
stabilizatory »ywno±ci przetworzonej. Mo»na je, podobnie jak maltodekstryny, stosowa¢
do opó¹niania wzrostu krysztaªów. Dodatkowo z syropu o wysokiej zawarto±ci maltozy
produkuje si¦ maltoz¦ krystaliczn¡ wykorzystywan¡ do w produkcji leków jako zamiennik
glukozy dla diabetyków, maltitolu, maltulozy. Syropy te charakteryzuj¡ si¦ nisk¡ lepko±ci¡
w roztworach, nisk¡ higroskopijno±ci¡ oraz stabilno±ci¡ w podwy»szonych temperaturach.
Produkcja pasz Dodatek odpowiednich enzymów do pasz mo»e poprawia¢ ich przyswa
jalno±¢, co obni»a wska¹nik zu»ycia pasz na przyrost ci¦»aru ciaªa. Do produkcji prepara
tów dla celów paszowych szczególnie nadaje si¦ Aspergillus oryzae, wytwarzaj¡cy enzymy
amylolityczne i proteolityczne. Preparaty enzymatyczne mog¡ by¢ stosowane w procesie
ich produkcji lub jako bezpo±redni dodatek do gotowych mieszanek paszowych.
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi
z dokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦C przez
1 godz. Nast¦pnie przenie±¢ próbk¦ do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢.
Z ró»nicy mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik
przedstawi¢ z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
Na wadze analitycznej odwa»y¢ 1,75g skrobi w przeliczeniu na such¡ mas¦ (zaªo»y¢ zawar
to±¢ wody równ¡ 20% a po okre±leniu suchej masy uwzgl¦dni¢ odpowiedni¡ poprawk¦).
Odwa»on¡ skrobi¦ przenie±¢ ilo±ciowo do wytarowanej kolby sto»kowej o poj. 300cm3 .
Zawarto±¢ uzupeªni¢ wod¡ destylowan¡ do masy 200g. Kolb¦ umie±ci¢ na wrz¡cej ªa¹ni
wodnej na okres 5 minut intensywnie mieszaj¡c zawarto±¢ (w celu otrzymania homogenicz
nego kleiku). Nast¦pnie otrzymany kleik gotowa¢ (stosuj¡c palnik gazowy) pod chªodnic¡
zwrotn¡ przez kolejne 5minut. Caªo±¢ schªodzi¢ do temperatury 60◦C (50◦C lub 40◦C w
zale»nosci od grupy) i po wytarciu kolby z zewn¡trz uzupeªni¢ ewentualne ubytki wody
do caªkowitej masy mieszaniny 200g. Caªo±¢ starannie wymiesza¢ i pobra¢ próbk¦ zerow¡
do oznaczenia redukcyjno±ci (5 cm3 ). Do pozostaªej próbki doda¢ 0,5 cm3 roztworu en
zymu i zawarto±¢ intensywnie wymiesza¢. Hydroliz¦ prowadzi¢ w temperaturach 60◦C
50◦C i 40◦C (zale»nie od grupy). Przed ka»dorazowym pobraniem próbki zawarto±¢ kolby
wymiesza¢. Próbki do bada« pobra¢ po 2, 5, 8 15, 25, 45, 65, 80 i 90 minutach.
W badaniach posªu»y¢ si¦ krzyw¡ wzorcow¡ otrzyman¡ w trakcie ¢wicze« nt. hydrolizy
kwasowej. Do próbówek odmierzy¢ 5 cm3 mieszaniny pªynów Fehlinga, 5 cm3 próbki oraz
15 cm3 wody. Próbk¦ ogrzewa¢ na wrz¡cej ªa¹ni przez 5min, przenie±¢ do probówek wirów
kowych i odwirowa¢ (2 min, 5000 rpm). Przeprowadzi¢ pomiar spektrofotometryczny jak
opisano to dla krzywej wzorcowej w ¢wiczeniu nt hydrolizy kwasowej. Okre±li¢ warto±¢
DE dla kolejnych próbek i sporz¡dzi¢ wykres jego warto±ci w zale»no±ci od czasu.
2.7.4 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, wyniki
bada«, wykres zale»no±ci DE od czasu. Wszystkie otrzymane dane nale»y skomentowa¢ i
30 Hydroliza enzymatyczna
3.1 Wst¦p
Skrobia utleniona chloranem (I) sodu znana jest jako tzw. skrobia chloranowana (ang.
chlorinated starch ) pomimo, »e w struktur¦ ªa«cucha skrobiowego nie zostaj¡ wbudo
wane atomy chloru. Utlenianie skrobi w obecno±ci chloranu(I) sodu prowadzi si¦ w roz
tworach skleikowanego polimeru. W reakcji tej utlenieniu do grup karboksylowych ulega
cz¦±¢ pierwszorz¦dowych grup hydroksylowych (przy w¦glu C1). Grupy te ulegaj¡ utlenie
niu zarówno do grup karbonylowych (aldehydowych) jak i karboksylowych. W zale»no±ci
od warunków prowadzenia procesu utlenienie ulega jedna grupa hydroksylowa na 35 do
50 jednostek glukozowych. W wi¦kszo±ci wypadków procesowi utleniania chloranem (I)
sodu towarzyszy cz¦±ciowa depolimeryzacja (degradacja) ªa«cuchów polisacharydowych.
Stopie« utlenienia skrobi zale»y gªównie, oprócz st¦»enia utleniacza, od pH ±rodowiska
CH2OH
O
OH
glukoza O O glukoza
OH
NaClO
COOH CHO
O O
OH OH
mo»e by¢ stosowana jako dodatek do »ywno±ci. Preparaty zawieraj¡ce skrobi¦ utlenian¡
chloranem(I) sodu stosuje si¦ jako stabilizatory przy produkcji ketchupów i do produkcji
nadzie« do ciast, jak równie» jako zag¦stniki i pomocnicze ±rodki »eluj¡ce mi¦dzy innymi
do sosów, galaretek, budyniów i kremów. Tak zmodykowana skrobia sªu»y tak»e jako
±rodek pomocniczy w przemy±le papierniczym w celu zwi¦kszenia odporno±ci papieru na
zrywanie.
Dziaªaj¡c na skrobi¦ jodanem(VII) sodu (lub kwasem jodowym(VII)) otrzymuje si¦ tzw.
skrobi¦ dialdehydow¡ (DAS). W modykacie tym wi¡zanie pomi¦dzy w¦glem C2 i C3
ulega rozerwaniu z wytworzeniem na ka»dym z tych atomów grup karbonylowych (aldehy
dowych). Utlenianie skrobi DAS na przykªad przy u»yciu Br2 lub NaClO2 prowadzi nato
miast do powstania tzw. skrobi dikarboksylowej (DCS) w której wspomniane grupy alde
hydowe utlenione s¡ do grup karboksylowych. Obok procesu z udziaªem NaClO utlenianie
NaIO4 jest gªówn¡ metod¡ przemysªowego utleniania skrobi. Skrobi¦ dialdehydow¡ wyko
CH2OH
O
OH
glukoza O O glukoza
OH
NaIO4
CH2OH CH2OH
O O
[O]
rzystuje si¦ jako substancj¦ zag¦szczaj¡c¡ w po»ywkach dla bakterii tlenowych i dro»d»y
jak równie» jako czynnik utrwalaj¡cy zapach (matryca do mikrokapsuªkowania). Skrobi¦
DAS wykorzystuje si¦ tak»e jako dodatek w przemy±le tworzyw sztucznych zwi¦kszaj¡cy
wytrzymaªo±¢ i rozpuszczalno±¢ w wodzie materiaªów pomocniczych. Skrobia dialdehy
dowa charakteryzuje si¦ spadkiem lepko±ci i masy cz¡steczkowej w porównaniu do skrobi
naturalnych a zmiany te zale»ne s¡ od stopnia utlenienia oraz od warunków prowadzenia
procesu. Skrobi¦ utlenion¡ wykorzystuje si¦ tak»e w produkcji jadalnej folii skrobiowej
oraz jako skªadnik ±rodków czysto±ci i tworzyw biodegradowalnych jak równie» substancji
34 Utlenianie skrobi
spowalniaj¡cych korozj¦.
-
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH
CH2OH CHOH
O O
OH + OH OH + H2O
glukoza O O glukoza glukoza O O glukoza
OH OH
CHOH CHO
O O +
+ H
OH + Fe3+ OH
O O
+ Fe2+
glukoza glukoza glukoza O O glukoza
OH OH
CHOH CHO
O O + H2O
OH + H2O2 OH
niania skrobi przy u»yciu nadtlenku wodoru podobnie jak jest to w przypadku NaClO
obserwuje si¦ depolimeryzacj¦ ªa«cucha polisacharydowego. Porównuj¡c oba opisywane
sposoby utleniania obserwuje si¦ tak»e wy»szy stosunek zawarto±ci grup karboksylowych
-COOH do karbonylowych -CHO ni» dla skrobi utlenionej NaClO.
w o d n a z a w ie s in a s k r o b i
( o k . 3 8 % w / v ; p H 9 - 1 0
3 0 - 3 5 oC ,; 3 % N a O H )
N a C lO
r e a k c j a
( 3 - 4 5 g C l/
u t le n ie n ia
1 k g s m s k r o b i)
p r z e r w a n ie r e a k c j i
( N a 2 S O 3 )
S K R O B I A z o b o jê t n ia n ie
U T L E N I O N A ( H C l; p H o k . 6 )
o d w a d n ia n ie , P r z e m y w a n ie
s u s z e n ie w o d ¹
( d o z a n ik u r e a k c j i n a C l-)
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi z
dokªadno±ci¡ do 0,0001 g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢
z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
Reakcja utleniania
Ze 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi, roztworu katalizatora oraz wody de
stylowanej sporz¡dzi¢ 40%w/w dyspersj¦ skrobi w wodzie. Naczynie z zawiesin¡ umie±ci¢
w ªa¹ni wodnej o temperaturze 40◦ C i ogrzewa¢ przez okres 60min stosuj¡c mieszanie
mechaniczne i wkraplaj¡c przy tym 10% roztwor H2 O2 w takiej ilo±ci aby ko«cowe st¦
»enie tego zwi¡zku w mieszaninie wynioslo 2%. Po wkropleniu utleniacza caªo±¢ miesza¢
w temperaturze reakcji przez dalsze 30min. Po zako«czeniu procesu skrobi oddzieli¢ od
roztworu na lejku Buechnera (intensywnie przepªukuj¡c materiaª wod¡ destylowan¡) i wy
suszy¢ w temperaturze 40◦ C. W otrzymanym materiale oznaczy¢ zawarto±¢ suchej masy
oraz zawarto±¢ grup karbonylowych i karboksylowych.
Ze 100g (w przeliczeniu na such¡ mas¦) skrobi oraz wody destylowanej sporz¡dzi¢ 40%
dyspersj¦ skrobi w wodzie. pH zawiesiny nale»y ustali¢ na 10 przy pomocy roztworu NaOH
(o st¦»eniu 2mol/dm3 ) korzystaj¡c z pehametu elektronicznego. Otrzyman¡ suspensj¦ mie
sza¢ przy u»yciu mieszadªa mechanicznego w temperaturze pokojowej wkraplaj¡c do niej
roztwór chloranu(I) sodu (15% roztwór wodny o aktywno±ci 98gCl/1000g roztworu) w
ilo±ci takiej by byªa ona równowa»na 20g chloru na 100g skrobi. Po zako«czeniu wkra
plania caªo±¢ miesza¢ przez 50min. Nast¦pnie przy pomocy roztworu H2 SO4 (1mol/dm3 )
Utlenianie skrobi 37
3.3 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, a
przede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy
ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ ilo±ci grup karbonylowych i karbok
sylowych otrzymanych w produktach utleniania ró»nymi utleniaczami.
38 Estrykacja skrobi
CH2OH O
O CH3
OH + O + NaOH
CH3
O C
O
CH2
O
OH + CH3COONa + H2O
glukoza O O glukoza
OH
Rysunek 20: Reakcja estrykacji skrobi bezwodnikiem octwoym (substytucja grupy pierwszorz¦
dowej)
CH2OH
O
O
OH + CH2 CH O C CH3
glukoza O O glukoza
OH
CH3
O C
O
CH2
O
OH + CH2 CH OH CH3 CHO
glukoza O O glukoza
OH
Rysunek 21: Reakcja estrykacji skrobi octanem winylu (substytucja grupy pierwszorz¦dowej)
CH2OH
O
OH
glukoza O O glukoza
OH
Na2HPO4 Na5P3O10
O O ONa
ONa
P P
O O ONa
OH
CH2 CH2
O O
OH OH
+ +
H2O Na3HP2O7
OH
CH2OH glukoza O O glukoza
O
OH
OH
O
glukoza O O glukoza CH2
OH O O
+ POCl3 P + HCl
CH2OH O OH
O CH2
OH O
glukoza O O glukoza OH
OH glukoza O O glukoza
OH
O
O
C NH2
C H
O O
CH2 CH2
A B
O O
OH OH
NO2 SO3
O O
CH2 CH2
D
C O O
OH OH
OH
glukoza O O glukoza
S OH
C S Me O
O
CH2
CH2
E S O
O C S S C F
OH O S
glukoza O O glukoza
OH
Rysunek 24: Inne estry skrobiowe: A - mrówczan skrobi (skrobia formylowana); B - karbaminian
skrobi; C - nitroskrobia; D - siarczan skrobi; E - ksantogenian skrobi; F - skrobia ksantydowa
sªu»¡ce jako koloidy ochronne, dodatki do klejów oraz jako ±rodek heparynopodobny. W
reakcji z disiarczkeim w¦gla w ±rodowisku zasadowym skrobia ulega transformacji do od
powiednich ksantogenianów. Ksantogeniany skrobi umo»liwiaj¡ mi¦dzy innymi usuwanie
jonów metali ci¦»kich z wód i ±cieków. Stosowane s¡ tak»e w przemy±le papierniczym
zwi¦kszaj¡c wytrzymaªo±¢ papieru i jego wodochªonno±¢. Utlenianie ksantogenianów skro
biowych prowadzi natomiast do tzw. skrobi ksantydowych równie» wykorzystywanych w
przemy±le papierniczym.
Do wysuszonych do staªej masy i zwa»onych naczynek wagowych odwa»y¢ ok. 0,1g skrobi z
dokªadno±ci¡ do 0,0001g. Naczynka z próbkami suszy¢ w temperaturze 130◦ C przez 1godz.
Nast¦pnie przenie±¢ próbki do eksykatora i po ostygni¦ciu ponownie zwa»y¢. Z ró»nicy
mas próbki przed i po suszeniu obliczy¢ zawarto±¢ suchej substancji. Wynik przedstawi¢
z dokªadno±ci¡ do 0,1%.
4.6 Sprawozdanie
Sprawozdanie powinno zawiera¢ zwi¦zªy opis wykonania ¢wiczenia wraz z uwagami, a
przede wszystkim wynikami bada«. Wszystkie otrzymane dane prosz¦ skomentowa¢ i wy
ci¡gn¡¢ wnioski. Nale»y zwróci¢ uwag¦ na zale»no±¢ stopnia zacetylowania otrzymanych
produktów od ilo±ci zastosowanego bezwodnika octowego.
Indeks
α-amylaza, 4-glukanohydrolaza-α-1,4-glukanu, disacharydy, 4
18 DNS, 23
α-amylaza termolabilna , 19
egzoamylaza, 18
α-amylaza termostabilna, 18
endoamylaza, 18
β -amylaza, maltohydrolaza-α-1,4-glukanu,
energia aktywacji, 14
20
energia swobodna, 14
β -amylaza, 20
entalpia, 14
γ -amylaza, 4-glukanoglukohydrolaza-α-1,4-glukanu,
entropia, 14
19
enzym, 15
γ -amylaza, 19
enzym usuwaj¡cy rozgaª¦zienia, 18
beta-anomer, 20
enzymy usuwaj¡ce rozgaª¦zienia, 20
±rednia masa cz¡steczkowa, 21
erytrodekstryny, 8
5-hydroksymetylofurfural, 4, 9
gencjobioza, 9
achrodekstryny, 8
glikogen 6-glukanohydrolaza, 21
amylodekstryny, 8
glikozylotransferaza cyklodekstryn, 18
amyloza, 4, 7
glukoamylaza, 19
apoenzym, 15
glukoza krystaliczna, 23
Aspergillus awamori, 20
GPC, 23
Aspergillus niger, 19, 20, 27
grupa prostetyczna, 15
bªonnik pokarmowy, 28
heksacyjano»elazian(III) potasu, 23
Bacillus licheniformis, 18
Hordeum vulgare, 20
Bacillus stearothermophilus, 21
HPAE-PAD, 23
Bacillus subtilis, 18
HPLC, 23
celebioza, 9 hydrol, 12
chromatograa »elowa, 23 hydrolazy, 17
chromatograa cienkowarstwowa, 23 hydroliza enzymatyczna, 4
Clostridium acetobutylicum, 27 hydroliza kwasowa, 4
Cu2 O, 8
ilo±¢ obrotów, 17
D-glukoza, 4 immobilizowanie, 20
dekstryny, 4 immobilzowanie, 19
dekstryny graniczne, 20 izoamylaza, 21
Dextrose Equivalent, 7 izomaltoza, 9
45
46 Estrykacja skrobi
izomerazy, 17 nefelometria, 22
nieredukuj¡y koniec ªa«cucha, 19
jednostka mi¦dzynarodowa, 17
jednostki aktywno±ci, 17 oksyreduktazy, 17
jodometria, 22 osmometria parowa, 22
jon wodorowy, 9
pier±cienia glukopiranozowy, 5
kapsuªkowanie, 24 polialkohol, 26
karbokation, 5 próba jodowa, 8
katal, 17 procesy odwracalne, 14
katalizator, 14, 15 pullulan-6-glukanohydrolaza, 21
koenzym, 15 pullulanaza, 21
kompleks przej±ciowy, 15
ró»niczkowy rozrzut mas cz¡steczkowych,
kompleksy inkluzyjne, 22
21
konguracja α, 18
równanie Arrheniusa, 14
kriometria, 22
równanie Marka-Houwinka, 22
krochmal zielony, 11
równanie Michaelisa-Menten'a, 17
kwas 3,5-dinitrosalicylowy, 23
równowa»nik glukozowy, 7
kwas 3-amino-5-nitrosalicylowy, 23
reakcja Maillarda, 11
kwas 4-okso-pentanowy, 9
reakcja redoks, 7
kwas cytrynowy, 27
rewersja, 9, 19
kwas itakonowy, 27
rozpad glukozy, 8
kwas lewulinowy, 9
rozpuszczalno±¢ w alkoholu, 8
kwas mlekowy, 27
kwas mrówkowy, 9 skr¦calno±¢ wªa±ciwa, 8
skrobia, 4
Lactobacillus amylophillus, 27
skrobia natywna, 4
Lactobacillus thermophillus, 27
soforoza, 9
lepko±¢ graniczna, 21
sorbitol, 26
liazy, 17
staªa gazowa, 14
ligazy, 17
staªa Michaelisa-Menten'a, 17
maltodekstryna, 23 staªa równowagi, 14
maltodekstryny, 8 staªa szybko±ci, 14
maltotrioza, 19 syrop ±rednioscukrzony, 11
maltoza, 4, 19 syrop glukozowy, 17, 23
merkaptan, 20 syrop maltozowy, 23
metoda Somogyi-Nelsona, 23 syrop niskoscukrzony, 11
Estrykacja skrobi 47
syrop normalnie, 11
syrop o wysokiej zawarto±ci fruktozy, 23
syrop skrobiowy, 11, 23
syrop wysokoscukrzony, 11
TLC, 23
transferazy, 17
trehaloza, 9
trypsyna, 15
turbidymetria, 22
wi¡zanie α- i β - 1,6-glikozydowe, 9
wi¡zanie α-1,4-glikozydowe, 18
wi¡zanie α-1,6 glikozydowe, 20
wspóªczynnik przedekspotencjalny, 14
wysokosprawna chromatograa cieczowa,
23
wysokosprawna chromatograa jonowymienna
z impulsow¡ detekcj¡ amperome
tryczn¡, 23