Rola bialek wiClzClcychDNA

Spis tresci
7.1 Struktura DNA
7.1.1 Nukleotydy i polinukleotydy 7.1.2 Podwojna helisa

144
145 145

7.2 Bialka
7.2.1 Cztery poziomy struktury bialka

150
151

7.3 Metody badania bialek wiqiqcych DNA
7.3.1 Identyfikacja w DNA miejsc wiazacych bialko 7.3.2 Oczyszczanie bialek wiazacych DNA 7.3.3 Badanie struktury bialek i kompleks ow DNA-bialko

156
156 160 160

7.4 Oddzialywania mi{?dzy DNA i bialkami
7.4.1 DNA jako partner 7.4.2 Bialko jako partner 7.4.3 Partnerstwo DNA i bialka

163
163 165 168

144

ROZDZIAL 7 • ROLA BIALEK WIA,2:ACYCH DNA

Fakty i zalozenia
• • • • • • • DNA i bialka sq liniowymi, nierczguiezionumi polimerami. przez sekioencje Podw6jna helisa DNA moze przubierac roznorodne konformacje. Funkcjonalna, tr6jwymiarowa struktura bialka jest determinowana aminokwas6w. Sekwencje DNA, technik. kt6re unqzq biatka.rmozna identyfikowac

za pomocq r6inorodnych

Analiza rentgenowska i NMR sq doskonalymi metodami umoiliwiajqcymi okreslenie struktury bialka. Bialka ioiqzqce DNA prawdopodobnie rozpoznajq swoje miejsca uiiqzania bezposrednio odczytujqc injormaqe zawartq w sekwencji podw6jnej helisy. Bialka toiqzqce eie z DNA majq specjalne motywy sirukiuralne, umoiliwiajqce oddzialywanie z podw6jnq helisq. im scisle

Genom jest struktura nieaktywna. Przechowywana jest w nim informacja, sam nie rna jednak zdolnosci przekazywania tcj inforrnacji do kornorki, To od bialek oddzialujacych z genom em - poprzez wiazanie do specyficznych sckwencji DNA Iub w mniej specyficzny sposob zalf'7.y, ktore gf'ny i w jakim czasie b~dq ulegac ekspresji. Do bialek wiazacych DNA nalcza enzymy przepisujace informacje zawarta w genach na czasteczki RNA oraz bialka wlaczajace i wylaczajace geny. Dlatego tcz zrozumienie sposobu dziaiania bialek wi'1/.qcych DNA jest kluczem do rozumienia dzialania genomu. Aktualna wiedza w tej dziedzinie opiera si~ na badaniach strukturalnych, umozliwiajacych szczegolowe opisanic oddzialywan micdzy czasteczkarni DNA i bialek. Podstawe tyeh badan stanowia prace prowadzone w pierwszcj polowie XX wieku. krorych ukoronowaniem byio odkryc:ie struktury DNA - podwojnej helisy (Watson i Crick, 1953) i wyjasnienie natury podstawowych jednostek strukturalnych bialek (Pauling i wsp., 1951; Pauling i Corey, 1953). Rozdzial niniejszy rozpoeznierny od przegladu tych klasycznyc:h pral' strukturalnych i pokazania, jak zostaly one poszerzone dzieki badaniom prowadzonyrn od lat 50. Nastepnie omowimy techniki, ktore znajduja zastosowanie w badaniach oddzialywan miedzy DNA i bialkami, a na koniec siegnierny do aktualnej wiedzy o tym, w jaki sposob bialka oddzialuja z DNA. Umozliwi nam to przejscie do rozdzialow 8 i 9, w ktorych

przyjrzymy si~ roznym rolom, odgrywanym przez bialka wiazace DNA w ekspresji genornu. Z rozdzialow 9 i 10 dowiemy sit;', ze pokrewne bialka, wiazace RNA, a nie DNA, pelnia rowniez wazna rolf;' w ekspresji genomu, a w rozdzialach 12 i 13 odkryjerny, ze bialka wiazace DNA odpowiadaja takze za replikacje genomu oraz korekte zmian w sekwencji DNA, wywolanych dzialaniem czynnikow chemicznych i fizycznych.

7.1 STRUKTURA DNA
Aby zrozumiec strukture DNA, musimy zadac dwa pytania. Pierwsze dotyczy struktury polinukleotydu, polimeru DNA zbudowanego z polaczonych podjednostek, kodujacego inforrnacje genetycznq. Ten aspekt struktury DNA zostal bardzo dokladnie opracowany przed rokiern 1940. Drugie pytanie dotyczy sposobu, w jaki lacza sie dwa polinukleotydy, tworzac dwuniciowa czasteczke DNA, ktora znajdujemy w zywych komorkach. To sarno pytanie zadawali sobie Watson i Crick we wczesnych latach 50. Dokonane przez nich odkrycie podw6jnej helisy bylo punktem zwrotnym w genetyce, nie wyjasnialo jednak do konca struktury DNA w zvwvch kornorkach. Ostatnie badania pokazuja, ze podwojna nelisa DNA moze przybierac rozne konformacje.

'gla 5' rcszty cukrowej.3): trzy 1. Struktura tego wiazania wskazuje. 2. Polinuk/eotydy W czasteczce polinukleotydu pojedyneze nukleotydy polaczone Sq wiazaniem fosfodiestrowym. kt6ra wydluzalaby polimer DNA w kierunku 5'->3'. jednak warto w tyrn miejscu zapoznac siE. Skr6ty nazw tych czterech nukleotyd6w to odpowicdnio: dAIP.' na to. Polinukleotyd RNA. Wiele dowodow wskazywalo. Reszty fosforanowe OZnaeZ011fSq symbolami C1.. Grupa fosforanowa. by mogla ona spelniac Iunkcje biologiczne. (IP. Odkryeia tego dokonano w dwoch etapaeh. zbudowanyeh z czasteezek DNA ziozonych z milionow par zasad. Dlatego eztery nukleotydy biorace udzial w syntezie RNA to: adenozyno-S' -trifosforan cytydyno-S' -trifosforan guanozyno-S'-tntosforan urydyno-5' -trifosforan Skr6ty nazw tych eztereeh nukleotyd6w to odpowiednio: AIP. to: 2'deoksyadenozyno-S' -trifosforan 2' deoksycytydyno-S' -trifosforan 2' -deoksyguanozyno 5'-trifosforan 2'deoksytyrnidyno·S' -trifosforan nego nukleotydu (rys.7. Zasada azotowa. Bye moze z tego tez powodu w sklad czasteczki RNA nie musi wchodzic wiecej niz kilka tysiecy nukleotydow. dCIP. ze w ezasie reakeji polimeryzaeji nastepuje usuniecie z nukleotydu dwoch zewnetrznyeh grup fosforanowyeh ~ i y i zastapienie ich grupq hydroksylowa polaczona z atomem wE. zapisywana jako 5' ->3' (w dot na rys 7.1.'grupa trifosforanowa polaczona z atomem wegla 5' (koniee 5'). ale dwie cechy rozniq go od DNA (rys. 3. ktora jest bardzo podobna. ze polinukleotyd rna okreslona orientacje. 1. 2' itd. Nazwa . Atomy wE.2). skladajaca si~ z jcdncj. podobnie jak DNA. ze reakcja cherniczna. . G i 1'. Nalezy zwrocic uwagE. Oznaeza to. a na drugim koncu grupa hydroksylowa polaczona z atomem wE.'gla 2' reszty cukrowej. 5. ale jako substraty w procesie syntezy DNA wykorzystywane Sq tylko trifosforany nukleozydow.1. a nawet milion6w jednostek. cytozyna lub tymina (jednopierscieniowa pirymidyna) alba adenina lub guanina (dwupierscieniowa puryna). laczacym atom wE. polinukleotydy DNA jest liniowym.1) lub 3'->5'. tysiecy. 7. zbudowanym z monomerycznych podjednostek .1 Nukleotydy .2.'gla 3' (koniec 3'). Na jednym koncu znajdujc siE. co powoduje dodatkowe kornplikacje w procesie replikaeji dwuniciowej czasteczki DNA (sekcja 12.! Sq posrednie efekty obecnosci grupy hydroksylowej polaczonej z atomem wE. zwiazanych z atorncrn wE.1). Waznq konsekwencja polarnosci wiazania fosfodiestrowego jest fakt. RNA jest rowniez polinukleotydem. Czasteczka skladajaca sie z eukru i zasady azotowej nazywana jest nukleozydem: przylaczenie reszty £05toranowej zamienia jq w nukleotyd. po drugie RNA zawiera uraeyl zarniast tyminy. C. nierozgalezionym polimerem. Zasada azotowa jest polaczona z reszta cukrowa wiazaniern ~-N-glikozydowym. ze dwa konce polinuklcotydu sa chernicznie rozne. Struktura chemiczna czterech nuk/eotyd6w Kazdy z czterech nukleotydow w DNA zawiera skladniki (patrz rys. gdy mowimy o sekwencji DNA .2' deoksyryboza" oznacza.3. w wyniku kt6rej nastepowaloby wydluzanie w kierunku 3'->5'. 1. Te same ograniczenia dotycza polimeraz RNA. dw6ch lub trzech reszt Iosforanowych. dwoma lub trzema resztarni fosforanowymi.1 STRUKTURA DNA 145 7. ze w wyniku przekazania DNA z jednej bakterii do drugiej biorca moze uzyskac now'! inforrnacje genetycznq. Jest ono jednak mniej stabilne niz w DNA. Po pierwsze cukrem wchodzacym w sklad RNA jest ryboza. Peine chemiczne nazwy ezterech nukleotyd6w. GIP i UIP lub A. zawiera wiazanie 3'-5'-fosfodiestrowe.A..1. ze geny bakteriofaga 1'2 Sq zbudowane z DNA (Badania i odkrycia 7. Po drugie w 1952 r. 7. G i U.'gla l' reszly cukrowcj z atomern azotu oznaczonyrn numerem 1 w pierscieniu piryrnidyny lub atornem azotu nurner 9 pu· ryny.' e struktura z RNA. enzym6w syntetyzujacych kopie RNA na czasteczkach DNA (sekeja 8. kt6ra jest pentoza. C. zostala zastapiona przez grup~ wodorowa (-H).czterech roznych chemicznie nukleotydow. laczacym atomy wegla 5' i 3' (patrz rys.2 Podw6jno heliso Polinukleotydowa strukture DNA znano.'gla nosza numery l' (jeden prim). RNA Chociaz nasza uwaga zwrocona jest g16wnie na DNA.1). CZf~goprzyczyn. udowodniono. jest rozna od reakcii.2). Po pierwsze w 1914 r. tworzac lancuchy skladajace sie z setek. w ktorcj grupa hydroksylowa (-OH) polaczona z atornem w~gla 2'. ~li y.1). Wszystkie naturalnie wystepujace polirnerazy DNA sa zdolne do przeprowadzania reakcji tylko w kierunku 5'->3'. 2'-dcoksyryboza. Komorki zawieraja nuklcotydy z jedna. pokazano. ze cukier ten jest pochodna rybozy. kt6re mogq bye polaczone w roznej kolejnosci. rodzajem cukru zawierajacym piec atornow wegla. Nie istnieja czasteczki RNA bedace odpowiednikami prokariotycznyeh i eu kariotycznych chromosornow. dGIP i dIIP lub. ktore w reakeji polimeryzacji tworza DNA.'gla 3' nastep- 7.1). Reszta Iosforanowa oznaczona symbolcm a bezposrcdnio biCZy sie z reszta cukrowa. zanim odkryto. ze DNA jest materialern genetyeznym.

Reszty fosforanowe ~ i y usuwane 5'1 z dodawanego nukleotydu w forrnie czasteczki pirofosforanu .146 ROZDZIAt.p-o- I I I 5' o II o II o II O· O~. znajdujqeym sie na koncu istniejqeego polinukleotydu..~O~~or' 5' I 0- 3' O~.ZA. Dodawany nukleotyd iaczy sie z weglern 3'.1 Synteza polinukleotydu DNA nastepuje w wyniku reakcji polimeryzaeji Reakeja syntezy zaehodzi w kierunku 5' ---? 3'. -0.CYCH DNA koniec 51 00p-o0P-O-CH.-O~O~_' 5 03' I OH koniec 3' + Ii II -o-p-o-p-o 0- o I 0 0- i pirofosforan 0- 0- 0- "Ov-r- i I ~O~ i I ~O~ i I 000 ~O~~oJ"" 5 3' o O~.! OH I o Rysunek 7. 7 • ROLA BIALEK WIA.~O~~O!~: 5 o I 0- 3' o I 5 O=I-O-C~H/o ~ 13.

szczeg6lnie jesli chodzi 0 role. (rozclz. jest ona wykorzystywana przez kom6rkowe polimerazy DNA. Rysunek 7. Czasteczka RNA rnoze tez tworzyc pary z DNA. 3) 7.! rowniez powstawac pary zasad: A I'!ezy sie z U.1 STRUKTURA DNA 147 (A) Rybonukleotyd 0-0- I I I 5' ~-O.2 Roznice w strukturze chemieznej miedzy DNA iRNA (A) RNA zbudowany jest z rybonukleotyd6w.1: Tworzenie par zasad w RNA W RNA mog. Skutkiem powstawania wewnqtrzezqsteczkowyeh par zasad jest faldowanie struktury tyeh czasteczek. Tylko te dwie kombinacje par zasad sa dopuszczalne: A. s. Zjawisko Iaczenia sil. ana sama byla bardzo bliska rozwiklania tej struktury. w reakcji syntezy czasteczek RNA ~ kopii gen6w. ktory poczatkowo zaproponowal bledny model potrojnej helisy.. W czasteczce RNA regiony polaczone w pary przybierajq przewai:.1 i 10. ze w czasic syntczy RNA adenina w matrycy DNA nie determinuje wstawienia tyminy do kopii RNA.~-O-I~O~I~~dal 0- 0- 000 ~H~ CH HC OH OH (B) Uracyl • gim lancuchu lub miedzy cytozyna w jednym a guaninq w drugim lancuchu (rys.3). jak i w transportujqeym RNA. W procesie tym sekwencja istniejacej nici dyktuje sekwencje nowej nici. Z ograniczenia.1 i 9.2. Jej odpowiednik. . [edno jest pewne ~ odkrycie podw6jnej helisy przez Watsona i Cricka w sobote.' zasad w pary rna rowniez szczcg6lne znaczenie ze wzglcdu na jego implikacje biologiczne.1. jest stabilizowana przez dwa rodzaje oddzialywan chemicznych: • Laczenie sie zasad w pary. Para puryna~puryna bylaby zbyt duza.2. jest wykorzystywany przez poli merazy RNA. a G tylko z C. dzieki czemu spelniaja one swe funkcje w procesie syntezy bialek (sekcje 10. Tylko puryna i pirymidyna mogq Iqczyc sie ze soba.! one zar6wno w rybosomowym RNA. by zmiescic sie wewnatrz helisy.. jak i asocjacja warstwowa Sq wazne w utrzymaniu razem dw6ch polinukleotycl6w. Jednak dorninujaca forma wystepowania par zasad w RNA sa pary wewnatrzczasteczkowe. polegajace na wytworzeniu wiazan wodorowych (patrz ramka 7. 7. wchodzacych w skiad DNA (rys. potwierdzajacych model podwojnej helisy.lqczy sie z T i G laczy sie z C.2. Trudno dzisiaj oddzielic Iakty od fikcji. Podstawowe cechy podw6jnej helisy Podw6jna helisa sklada sie z dwoch polinukleotvdow przeciwnic skierowanych i zwinietych razern (rys. a para pirymidyna-pirymidyna bylaby zbyt mala . Dlatego tez Watson i Crick. synteza RNA zalezna od matrycy. [edyna roznica rniedzy synteza DNA i RNA polega na tyrn.? z uracylem. Mechanizm ten nazwano synteza DNA zalezna od matrycy. Ograniczenie to wynika z geometrii zasad i wzglednego polozenia grup. (B) Zamiast tyminy RNA zawiera piryrnidyne o nazwie uracyl. a G z C. 7.2. na przyklad w czasie wycinania intron6w (sekeja 9. [ej badania z zastosowanicm dyfrakcji rent gcnowskicj dostarczyly olbrzyrniej ilosci danych doswiadczalnych.3H). zwiekszajace stabilnosc podw6jnej helisy po polaczeniu dwoch lancuchow przez wiazania wodorowe. l . kt6re mogq uczestniczyc w wytworzeniu wiazan chemicznych.f> czasteczki DNA w kornorce Scl zbudowane z dwoch lub wiece] polinukleotydow w jakis sposob ze soba polaczonych. a nie 2'-deoksyryboza. ktory umozliwia powstawanie dokladnej kopii czasteczki rodzicielskiej w wyniku replikacji DNA. Takie same pary adeniny z uracylem wystepuja w dwuniciowych strukturach RNA. ze A moze laczyc sie tylko z T. jak tez inni badaczc starali sie rozwiklac strukturc UNA. Asocjacja warstwowa. W czasteczce rybozy do wegla 2' przylaczona jest grupa hydroksylowa. 153) miedzy adenina w jednym a tymina w dru- Obydwa rodzaje oddzialywan ~ zarowno Iaczenie sie zasacl w pary. czasami nazywana oddzialywaniami typu 1(-1(.3A). a nie atom wodoru. s. bylo najwazniejszym przelomem w biologii XX wieku. kt6rej dtugosc nie przekracza zazwyezaj kilkudziesieciu par zasad. -Kopic te przechowuja inforrnacje biologiczna zawarta w sekwencji genomowej czasteczki DNA (rozdz. RNA nie zawiera tyminy i dlatego w hybrydach DNA-RNA adenina tworzy par(.1). jaka odegrala Rosalind Franklin. Wyst~puj. obejmuje oddzialywania hydrofobowe miedzy sasicdnimi zasadarni. wynika prosty sposob. w sklad kt6rych wchodzi cukier ryboza.2) lub z irma czasteczka RNA. ich praca byla desperackim wyscigiem z Linusern Paulingiern.t . 7 marca 1953 1'. Ramka 7. jak dzialaja geny.~-O. 12). 9).nie strukture helisy.2. [ak pisze Watson w swojej ksiazce Podw6jna spirala (patrz Literatura uzupelniajaca).7. Wyjasnienie jego struktury rnoglo pomoc zrozumiec. Por6wnaj ze struktura deoksyrybonukleotyd6w. tak jak w procesie transkrypcji (sekcje 9. Dzieki temu Watson i Crick zyskali czas potrzebny do ukonczenia struktury podwojnej helisy.

. infekujqcych Doswiadczenie nie z powodu wyclagnleto. Wynik ten wskazywal. .. wniosku. Obydwie te obserwacje doprowadzily geny faga zbudowane Sq z DNA. jest rzeczywiscie zjawiskiem w czystosc sie mozliwe. izotopami. ze nie wszyscy mikrobiolodzy czy transformacja pracy Avery'ego.11' odwirowane bakterie DNA zawieraja i tylko 70% fagowego 20% fagowych bialek akceptacji DNA jako materialu genetycznego. badania cytochemiczne ze chromosomy zawierajq [ader kow przy- fagowego DNA i tylko 20% fagowych bialek. i Chase jest tak wai:ne biolog6w. Wytrzqsanie powodowalo od powierzchni bakterii. 137-158.~~- . Fagi roznia siEi!od ze niekt6re enzym ten zawieral choc slady proteazy.IPrzypuszczenie doswiadczen to zakwesprzeprowa- na podstawie xx wieku. Med. a w szczegolnosci Watgenetycznym i dlatego do sona. 36. to falszywy by/by wynik podstawowego doswiadczenia. doswiadczen.J. i:e geny zbudowane sa z DNA. kt6ry dziedzicza fagi potomne.. podw6jnej Podobne eksperymenty cia ostatecznych inne grupy badaczy. Drugie decydujqce doswiadczenie Jorku. Eksperymentalne dowody pokazujqce. odroznic fag6w rodzicielskich. Hershey AD and Chase M (1952) Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. ze DNA rnoze bye materialem rnoze bye ukryty odkrycia mechanizm w DNA.}. pneumoniae przeprowadzili . Po zakonczeniu cyklu infekcyjnego fagi potomne zawieraly prawie polowe rodzicielskiego DNA i tylko 1% rodzicielskich bialek.wskazywal. ze nieznany skladnik ("czynnik transformujqcy") pochodzacy z zabitych bakterii Streptococcus pneumoniae rnoze przeksztalcic zywy.zostalo zakonczone w 1944 r. Niestety w tym czasie sadzono. Gen. 12). wytrzqsano w wytrzqsarce.}. a to wlasnie zmiennoscia powinien sie charakteryzowae material genetyczny. byto kluczowym momentem przetomowym i doprowadzito do powstania wsp6tczesnej biologii molekularnej w latach 50. lecz niezjadliwy szczep S. Olbrzymie znaczenie doswiadczenia Hershey'a i Chase Doswiadczenie Hershey'a i Chase zajmuje centralne na potwierdzenie miejsce og61nego z jedw historii biologii molekularnej. jednak do wyciqgniEi!uczeni nie potrafili nad nim badania. bakterie zawie- rajace tylko geny faga. by urnozliwic do bakterii. 7.BADANIA Geny sa zbudowane z DNA Odkrycie. ze wprowadzenie do bakterii fagowych gen6w jest zwiazane z wprowadzeniem DNA i ze to DNA jest tym skladnikiem infekcyjnych czastek fagowych. Macleod CM and McCarty M (1944) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types.:t~ ~ A~.. fagami T2 fagom hodowle odlqczepo 70% oparty na Iqczeniu sie komplementarprawdziwym ze geny zbu- powstalych na koncu cyklu infekcyjnego. Wykazano. ze blizeniu rowna ilosc DNA i bialek. rowniez wiarygodnosc pewnych Szczeg61nie watpiono Gdyby. mozna bylo oddzielk Nastepnie. Udalo bylo zbadanie im sie jednak inaczej nazywanych fagami. Rok wczesnie] James Watson i Ole Maal0e pr6bowali cyklu infekcyjnego. Wykonali je Avery.sprzeczny transformujqcym natychmiastowej Wynikalo byli pewni.w istocie duzy projekt badawczy . iz jego wynik sa z DNA. sa z RNA). Kwestionowano deoksyrybonukleazy uzywane] przez Avery'ego do inaktywacji czynnika transformujqcego. ale wykazac. kom6rek genomy Hershey'a ze geny zbudowane ale nie dlatego. jest eksperymentalnym dowodem potwierdzajqcym. Avery i wsp61pracownicy . ze geny z bialek. Literatura cytowana Avery OT. ze geny zbudowane sq z DNA Pierwsze z tych doswiadczen . Nie doprowadzil ze czynnikiem on jednak do I/ \ .1 Prowadzone m6rkowych wykazaly. w latach 20. Pomysl. wprowadzili hodowle Hershey i Chase wykorzystali kt6re przylqczyly siEi! o bakterii. d rowniez strategie znakowania modyfikacje. przesledzic losy fagowego DNA w czasie izotopami. ze zaalarmowalo warto prowadzic struktury replikacji. Alfred Hershey i Marta Chase z Cold Spring Harbor w Nowym celem ich eksperyment6w bakteriofag6w. ze DNA jest jedynym skladnikiem bakteriofaga malacym aktywnosc genetycznq.. jednak do niej wai:ne nych zasad w pary (patrz rozdz. ze bakterie zawieraly 39-56.!.~ \:~Jl ~~ fagl potomne zawieraia potowe rodzicielskicgo DNA i mniej nii I 'Yo rodzicielskich bialek genetycznym. w szczep Ich wynik wirulentny. co wydawalo Jl ~.. od fag6w potomnych.. Zakodowany w niej Wyniki tych doswiadczen nie doprowadzily wniosk6w. wywolujqcy zapalenie pluc. to czesciowo z faktu. dowane sa z DNA. aspekt6w serie skrupulatnych z oczekiwaniami jest DNA. Macleod i McCarty pracuiacy na Uniwersytecie brytyjski Columbia w Nowym Griffiths Jorku. Bakterie Escherichia coli infekowano i pozostawiano wprowadzenie nie pustych ich gen6w fag6w znakowanymi Nastepnie na kilka minut. Physio/. bakterie. Jeszcze wczesnie] lekarz Frederick bakteriofag T2 biatka wyznakowane DNA wyznakowany J5 s J2p wykazal. 79. zastosowaniu wirowania.. iz DNA jest mala czasteczka nie wykazujqcq zmiennosci. ze czynnikiem transformujqcym jest DNA. Exp. wcale jakie z niego nych na drugie moglo bye bledne (dzisiaj wiemy. do wniosku. ze ekstrapolowanie fagowe zbudowane wniosk6w. ze sekret zycia doprowadzil bezposrednio helisy. byl szczeg61nie wai:nym dowodem w tak znacznym stopniu. Poczqtkowym cyklu infekcyjnego czyli wirus6w przeprowadzili w 1952 r. stosujac rnetode znakowania przeprowadzily poniewai: bezposrednich dlatego. mUSZq bye zbudowane tionowano dzonych w polowie Dlatego te~ wysnuto dw6ch wniosek. z kt6rego wynikalo.

ktora pozwala ich czasteczkom przybierac nieco rozne ksztalty. Wynika to z tego.1 STRUKTURA DNA 149 (A) koniec S' para zasad S' 3' wiekszy ---_ rowek szkielet cukrowo-fosforanowy 3' S' koniec 3' (B) <---() cukier / #-<~:=:)--(l r H \ + N ()= .0.struktura helisy. T za pornoca tylko dw6ch wiazan wodorowych.czesc lewa oraz Strachan i Read (1996) .2.3 Struktura podw6jnej helisy DNA (A) Dwa schematy podw6jnej helisy. Ma ona charakterystyczne wymiary: srednice helisy . Przyjeto.3 nazywana jest forma B.4 nm. Aby mogla si~ zrnienic konforrnacja czasteczki. co odpowiada dziesieciu parom zasad na skret. Zwr6c uwage. musi sie .7. wiazarua wodorowe zaznaczono przerywana linia. Po prawej stronie .Dzisiaj jest jednak oczywiste.37 nm: przyrosl dlugosci helisy na par~ 'zasad . -N ki cu rer OH-N - + \ H guanina tymma adenina wiqzanie wodorowe cytozyna Rysunek 7. (1997) . ze czasteczki genomowego DNA nie maja jednorodnej struktury.3. C l'lczy sie za pornoca trzech wiazan wodorowych.struktura chemiczna trzech par zasad.czesc prawa Podw6jna helisa jest strukturq elastycznq Podwojna helisa opisana przez Watsona i Cricka i pokazana na rysunku 7. (6) A tworzy pare z T. ze para G .34 nm: skok helisy (odcinek przypadajacy na jeden skret helisy) . Rysunek w czesci (A) zaczerpnieto z: Turner et al. natorniast para A . ze nukleotydy w helisie charakteryzuja sie elastycznoscia. ze DNA w kom6rce wystepuje glownie w formie 13. a G z C. w kt6rej szkielet cukrowo-fosforanowy kai:dego polinukleotydu przedstawiono jako czerwona wstazke. z parami zasad w kolorze czarnym. Zasady przedstawiono schernatycznie. Po lewej stronie .

ze powierzchnia formy B DNA nie jest dokladnie gladka . Poziorny budowane jest stopniowo j tury zalezy od poziomu go bialka maja cztery rozne te sa hierarchiczne. i na poczatku lat 50. co umozliwia im pelnienie olbrzyrniej ilosci rozmaitych funkcji (tab. D.34 3. ale to.4). Istnieje wiele mozliwosci..84 nm. wezszy i plytszy. czyli ich struktura drugorzedowa (Pauling i wsp. ze wymiary podwojnej helisy zmieniaja si~\-gdy zmienia si~ wzgledria wilgotnose wl6kien zawierajacvch czastcczki DNA. zmodyfikowana wersja podwojnej helisy. [eden z nieh. Rotacja w obrebie poszczegolnych czasteczek nukleotydow prowadzi do zmian w ogolnej strukturze helisy. 1951. Inne znane wersje to forma B'.5). 7. co odpowiada jedenastu parom zasad na skret (tab. Struktura pierwszorzedowa bialka powstaje poprzez polaczenic aminokwasow w polipeptyd za Konformacja Cecha Typ helisy Srednica helisy (nm) Przyrost diugosci helisy na pare zasad (nm) Skok helisy (nm) Liczba zasad na skret T opologia wiekszego rowka T opologia mniejszego rowka B-DNA prawoskretna 2. zwana forma A (rys. Podstawy tej roznorodnosci ehemieznej beda tematem przewijajacyrn sie stale podczas zapoznawania si~ ze struktura bialek. poznano w pierwszej polowie XX wieku. skok helisy .29 3. by stworzyc CZqsteczke bialka 0 zlozonym. 7. mog'1 nie bye zdolne do rozpoznania tej samej sekweneji w czasteczce DNA 0 innej konformacji. 1. Forma A DNA rowniez rna dwa rowki . a drugi jest bardzo waski i gleboki. Wowezas to Pauling i Corey wyjasnili. plytki Z-DNA lewoskretna 1. podobnie jak DNA. nierozgalezionymi polirnerami. 7. gleboki . szczuplejszej wersji podwojnej helisy 0 srednicy tylko 1.3 i 7. Rysunki 7. Bialko kazdy jego poziorn strukpoprzedzajacego. ze poziomy struktury.84 0. mog'1 deterrninowac specyficznosc oddzialywan miedzy genomem i bialkarni wiazacyrni DNA. W forrnie Z DNA jeden rowek faktyeznie nie istnieje. Na przyklad.37 4. rna srednice 2.55 0.1 Cechy r6i:nych form podw6jnej helisy DNA Wynika stad. ktore maja strukture umozliwiajaca im rozpoznanie specyfieznej sekwencji nukleotydow. Obydwa typy rotacji maja znaczqcy wplyw na strukture podwojnej helisy: zmiana polozenia zasady wplywa na wzgledne polozenie dwoch polinukleotydow. ze bialka Wl'1Z'1ee DNA.3. powodujaca zmiane polozenia zasady w stosunku do reszty cukrowej. zmiany konformaeyjne wzdluz czasteczki DNA oraz polimorfizm strukturalny wvnikajacy z sekwencji nukleotydow.2 nm.5 12 plaski waski. podobnie jak DNA. stosunkowo szeroki i gl~boki. 7. Nie jest do tego potrzebne otwieranie helisy przez rozrywanie wiazan iaczacych pary zasad.2. Bialka charakteryzuje zadziwiajaca roznorodnosc cherniczna i strukturalna. Wszystkie te Iormy S'1 prawoskretnymi helisarni. [ak dowiemy sie pozniej z tego rozdzialu. liniowymi. ktorego dlugosc rzadko przekracza 2000 jednostek. Tabela 7. gleboki waski. Od lat 50. Ten etap rozwoju biochernii bialek mial kulminacje w lataeh /10. Sq. Drugi. w jakim stopniu wewnetrzne obszary helisy 5'1 dostepne z jej powierzehni.4 pokazuja. wiadorno.4).).2.55 nm. jakie sa podstawowe konformaeje polipeptydow. w jaki sposob te struktury drugorzedowe lacza sie ze soba. IV kazdej z form DNA czesc powierzchni wewnctrznej przynajmniej jednego rowka jest utworzona przez grupy cherniczne zasady azotowej. a mniejszy rowek plytszy i szerszy niz vv forrnie B (rys.29 nm. E i T. Istotna jest nie srednica ezy skok helisy. na przyklad w formie B DNA. Mozliwa jest rowniez bardziej drastyczna zmiana konformacji prowadzaca do powstania lewoskretnej formy Z DNA. Podstawowe ceehy struk tury bialka. C'.37 0. podobnie jak forma B. Monomeryczna podjednostka w bialkach nazywana jest aminokwascm (rys. C C.4 10 szeroki. trojwymiarowyrn ksztalcie. 7.spiralnie biegna wzdluz niej dwa rowki. gl~boki szeroki. 7. 1953). plytki A-DNA prawoskretna 2. ale do najwazniejszych zmian konforrnacyjnych nalezy rotacja wokol wiazania ~-N-glikozydowego.2 II waski. oraz obrot wokol wiazania miedzy atomami w~gla 3' i 4' reszty cukrowej. a obrot wokol wiazania 3'-4' wplywa na konforrnacje szkieletu cukrowo-fosforanowego. Same dane dotyczace wyrniarow roznych form podwojnej helisy nie odzwierciedlaja najbardziej znaczacej roznicy miedzy nimi. przyrost dlugosci helisy na par~ zasad wynosi 0. 7. a polimer .150 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WII\ZACYCH DNA nieco zrnienic wzgledne polozenie atomow w nukleotydzie.wiekszy rowek jest gl~bszy. Pauling i Corey. W ostatnich latach uwaga badaczy sku pia sie na zagadnieniu.1).polipeptydem. nazywany jest wiekszyrn rowkiem.2 BIAtKA Bialka. to mniejszy rowek.1 Cztery poziomy struktury bialka Tradyeyjnie uwaza si~. Dlatego tez bialka wiazace D0JA mog'1 z mniejsza lub wieksza dokladnoscia nezytae" sekwencje nukleotydowa po prostu poprzez kontakt z dnem rowka.

A-DNA (w srodku) i Z-DNA za zgoda z: Kendrew A (ed). Plate I. Copyright 1994 Blackwell Science .2 BIAtKA 151 Rysunel< 7. The Encyclopaedia of Molecular (po prawej stronie) ----------------------Biology.4 Przedrukowano Komputerowe modele B-DNA (po lewej stronie).7.

Struktura drugorzedowa dotyczy roznych konformacji.7). 2.1). Jest to reakcja kondensacji. prowadzacyrn do powstania trojwyrniarowej konfiguracji (rys. podczas kt6rej dwa arninokwasy zostajapolaczone wiazaniern peptydowyrn. wchodzqcyrni w sklad r6i:nych wiazan peptydowych.3. Dla jasnosci porninieto grupy R. 7_ 9) R. Zbudowane sa one z atomu wegla a. 7. by sfaldowac sie w serie struktur drugorzedowych. Lancuch polipeptydowy pokazano schernatycznie. Struktura trzeciorzedowa jest Tabela wiqzanie peptydowe Rysunek 7. koniec arninowy HJN-. lstnieja rowniez harrnonijki ~. Struktura trzeciorzedowa jest wynikiem faldowania poszczegolnych struktur drugorzedowych polipeptydu. kt6re powstaja porniedzy roznymi arninokwasarni w polipcptydzic. poniewai: w jej wyniku zostaje uwolniona czasteczka wody (A) Helisa a (B) Harmonijka ~ 7. Aminokwasy roznia sie miedzy soba gruparni R (patrz rys. 7. w kt6rych lancuchy sa skierowane zgodnie .2 Funkcjonalne bialka zr6i:nicowanie Przyklady bialek bialek ludzkich Funkcja Kataliza biocherniczna (enzyrny) Funkcja strukturalna Ruch Transport Regulacja Ochrona Magazynowanie polirnerazy DNA.dwa konce polipeptydu Sq chernicznie rozne. grupa arninowa i grupa R. Zwrocmy uwag~ na fakt.bialka strukturalne (np.1) bialka regulatorowe (np.6). histony: sekcja 6. polaczonego z atomem wodoru.6 Aminokwasy wiazaniern peptydowym w polipeptydach polaczone sa Na rysunku pokazano reakcje cherniczna.7 wystepujacych Dwa zasadnicze typy struktur drugorzedowych w bialkach: (A) helisa a.2. R2 HJN-C-H + + I HJN-C-COOH R + + HJN-C-COOH I I I Rysunek 7.2).1. 7. alba jako C----7N. Wyroznia sie dwa zasadnicze typy slruktur drugorzedowych: helisa a i harmonijka ~ (rys. Kazda strukture stabilizujq wiazania wodorowe rniedzy gruparni C=O i N-H. bialka zwiazane z krzepnieciem krwi ferrytyna .8). czynniki i transkrypcyjne: sekcja 8. polirnerazy RNA kolagen w kosciach i sciegnach aktyna i rniozyna w rniesniach hernoglobina horrnony takie jak insulina przeciwciala. 3. Pokazana na rysunku harrnonijka ~ jest przeciwbiei:na. Na jednym z nich znajduje sie wolna grupa arninowa i dlatego nazywa si~ go koncern aminowym. Wickszosc polipeptyd6w ma wystarczajaca dlugosc. nastepujacych po sobie wzdluz czasteczki. grup'l karboksylowa. jakie rnoze przybierac polipeptyd. koncern COOH lub koncem C. (B) harmonijka ~ Wsr6d bialek wiqzqcych DNA sa przyklady trzech klas funkcjonalnych: enzymy (np.6). Polipeptydy sa syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji miedzy grup4 karboksylowa jednego aminokwasu a grupq aminowa drugiego (rys. 7. POZYCJe atorn6w wegla a zaznaczono rnatyrni kropkarni.5 Og61na struktura aminokwasu ~H20 Og61na struktura wszystkich aminokwas6w jest taka sama. Na drugim koncu peptydu znajdujc sie wolna gru pa karboksylowa i nazywa sie go koncem karboksylowym.C-C-N-C-COOH + I H I R2 I konicc I 0 II H I karboksylowy pomocq wiazania peptydowego. Obydwie te slruktury Sq stabilizowane przez wiazania wodorowe. koncem NHzlub koncern N. polimerazy RNA:sekcja 8.152 ROZDZIAl7· ROLABIALEK WIAZACYCHDNA R. zc . Orientacje polipeptydu mozna wiec zapisac alba jako N----7C (od lewej do prawej na rys.rnagazynuje zelazo w watrobie Rysunek 7.podobnie jak w przypadku polinukleotyd6w . dwa lancuchy Sq przeciwnie skierowane.

7.argininy. W zaleznosci ad spelnianej funkcji bialka te magq rozpadac sie na skladowe polipeptydy lub zrnieniac swoje podjednostki. zwiqzanym nia wodorowe kowalencyjnych.2: Wi'lzania niekowalencyjne w biatkach Struktura drugorzedowa oraz wyzsze poziomy struktury bialka sa stabilizowane przez rozne rodzaje niekowalen- cyjnych wiazan i oddziatywan: • Wi'lzania troujemnym. . za pomacq wiazan wodorowych i oddzialywan hydrofobowych.2). mol-I. (1997) 0. Oddzialywania we wystepuja dowisku 3 kcal . jak atom wodoru w glicynie lub grupa metylowa w alaninie. DNA.1-0. Iaczacym rozne polipeptydy. Nie wszystkie bialka tworza struktury czwartego rzedu. ze tworzace je aminokwasy sa chemicznie rozne.ok. maja duze aromatyczne lancuchy boczne a ziozonej strukturze. a wiazari kowalencyjnych . jak fenyloalanina. wodorowe powstajq na skutek slabego wodoru. w wyniku sie one do powstawania powstaja wystepuiacego. oel ktorych zalezy nic tylko ogolna struktura powstajacego bialka. Sily przyciqgania powstajq w wyniku Hipotetyczna struktura bialka skladajqcego sie z trzech helis Q (serpentyny) i czteroniciowej harmonijki (3 (strzalki). 4. a atomem z innym atomem elektroujemnym.9. umieszczenie grup hydrofobojednak czesci bialka. 7. wodnym rniedzy grupami naladowanymi. Mozliwe jest rownicz tworzenie wiazan kowalcncyjnych. sily te sa stosunkowo Jest to skutkiem ekranujqcego grupami czasteczek wody. Jest to cecha wielu bialek pelniacych skornplikowane funkcje. z ktorych kazda sfaldowana jest w strukture trzeciorzedowa. [ednak podjednostki w wiekszosci bialek sa ze soba polaczone luzniej. Stepien upakowania czasteczek wewnatrz • bialka jest ograniczany elektrostatyczne odpychajqce. stabilizowana przez rozne rodzaje oddzialywan (ramka 7.8 Trzeciorzedowa struktura bialka 25°C wynosi 1-10 kcal rnol:".2 BIAtKA 153 konicc N Ramka 7. ale rownicz umiejscowienie grup aktywnych na jego powierzchni. co jest szczegolnie wazne w procesie Iqczenia sie bialka z DNA (sekcja 7. w tym bialck bioracych udzial w ekspresji 8enornu. Struktura czwartorzedowa powstaje poprzez polaczenie dwoch lub wiecej polipeptydow w bialko skladajace sie z kilku podjednostek. histyelyny i Iizyny. Niekt6re struktury czwartorzedowe utrzymuja sie dzieki mostkom dwusiarczkowym. Wyjqtek stanowia naladowane ujemnie Iancuchy boczne kwasu asparaginowego i glutaminowego oraz naladowane dodatnio . Rysunek zaczerpnieto z: Turner et al. Typowa energia wiqzania sa diuzsze i duzo slabsze od wiazan wego w temperaturze Podobnie wodorowe • Rysunek 7. zwanych mostkami dwusiarczkowymi. Przyczyniajq sie drugorzedowych. Sq to glownie wiazania wodorowe miedzy poszczegolnyrni aminokwasarni oraz oddzialywania hydrofobowe decydujace a tym. Oddzialywania stepuja miedzy naladowanymi sow wewnqtrz elektrostatyczne R aminokwa- czasteczki bialka oraz na jego powierz- chni. ze aminokwasy rnajace lancuchy bocznc niepolarne (tzn. kiedy dwa atomy za barwlaSnie przez sily lub wiazania [onoW srodzialania wyslabe . R6:i:norodnosc aminokwas6w biafek wynika z roinorodnosci dzo zbhza si~ do siebie. ' Przyczyna roznorodnosci arninokwasow sa grupy R. tryptofan i tyrozyna. deterrninujace wlasciwosci chemiczne bialka.4.7. Dlatego tez Iaczenie sie arninokwasow w sekwencie prowadzi do powstania roznych kombinacji reaktywnosci chemicznych. kt6re wymusza w wewnetrzne] hydrofobowe to gl6wnie bialka. ktore bardzo roznia si~ struktura i sa inne w kazdym aminokwasie. struktura nie sa prawdziwymi od nich zalezy trzeciorzedowa Funkcjonalna roznorodnosc bialek wynika z tego. Wiekszosc grup R jest nie naladowana. ktore powstaja micdzv cysteinami znajdujacyrni sie w roznych miejscach polipeptydu. wiqzania petla t'lczqca SHy van der Waalsa f1uktuacji w rozkladzie Ich energia wynosi Sily odpychajqce elektron6w mogq bye silami przyciqgajqcymi ladunku struktur sasiednich atom6w.2 kcal : mol-I.ponad 90 kcal mol-I. Oddzialywania wiqzaniami. Bialka zbudowane 54 z 20 arninokwasow (rys. Niektore z nich maja male grupy R a stosunkowo prostej budowie. • Oddzialywania czasteczek wych wody hydrofobowe polqczonych Sq skutkiem wiqzaniami dzialania wodoro- wymi. Wiazawodoro- przyciqgania elektrostatycznego miedzy atomem elek- jak tlen lub azot.3). Inne aminokwasy. jak w podw6jnej stabilizujq strukture helisie bialka. charaktervzujace sie lIawcrsjq do wody") sit schowane przed woda i wchodza w sklad wewnetrznych czesci bialka. odpychania lub odpychajqcymi. tab.3).

K WIALACYCH DNA (A) Niepolarne grupy R CH. NH2 C=N NH CH.9 Grupy R arninokwasow Dwadziescia arninokwasow. /NH. wg Lehninger (1970) Czesc arninokwasow rna polarne lancuchy boczne (np. leucyna i walina).9 to te. I I I I asparagina tyrozyna I glutamina (C) Ujemnie naladowane grupy R 0"". tryptofan I I I metionina (B) Polarne gru py R H HO CH2 CH. OH O~ C /NH. CH2 kwas glutaminowy I kwas asparaginowy (D) Dodatnio naladowane grupy R H. HO-CH SH CH2 I I I I glicyna I I I seryna treonina cysteina Q CH.informacyjnym RNA (rnRNA). CH2 I I I I HC=C fenyloalanina CH.2).2). alanina. /0 ""'C CH2 I ""'c I I I CH. Sit to aminokwasy zakodowane w sekwencji DNA genaw.1. kt6re Sq tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy wyznaczane przez kod genetyczny (sekcja 101. Hf-C\H. Klasyfikacja na arninokwasy niepolarne. aminokwasy te sa laczonc ze soba zgodnie z instrukcja zawarta w kopii genu . I I I I + H. CH. CH. [ednak cherniczna roznorodnosc bialek nie ogranicza sie tylko do tych 20 . opisane w tekscie. CH2 I 0"". walina I alanina H/ leucyna izoleucyna C 'COO- prolina Q HH CH2 CH. Dwadziescia arninokwas6w pokazanych na rysunku 7. ktore sa tradycyjnie klasyfikowane [ako aminokwasy wyznaczane przez kod genetyczny (sekcja 10. Blalka zawieraja r6wniei: inne aminokwasy. S CH. W procesie syntezy bialka. seryna i treonina). podczas powstawania polipeptyd6w.N+ CH.154 ROZDZIAl I • ROLA BIAU. CH. glicyna. /0- 0"". HN. CH2 CH. I I I I I I histydyna I I lizyna I arginina Rysunek 7. CH2 + HN-CH HC""'" II """N-C H CH. ""'C CH. w innych s4 one niepolarnc (np.u/CH. polarne itd.

Niekt6re aminokwasy z powodu charakteru swoich grup R czesciej wystepuja w helisach a. Aminokwas Alanina Arginina Asparagina Cysteina Fenyloalanina Glutamina Glicyna Histydyna Izoleucyna Kwas asparaginowy Kwas glutaminowy Leucyna Lizyna Metionina Prolina Seryna Treonina T ryptofan T yrozyna Walina R N C F Q G H I D E L K M P S T W Y V aminokwas6w. W procesie ekspresji genu sekwencja nukleotyd6w jest przekladana na sekwencje aminokwas6w w polipeptydzie (patrz rys.1.2). roznorodnosci • Dwa ezynniki bialek: powoduja zwiekszcnie • W ezasie syntezy bialka do lancucha polipeptydowego maze bye wlaczany przynajmniej jeden dodatkowy arninokwas selenocysteina (rys. Biochemicy wywnioskowali. fundamentalnych przeslanek genetyki jest stwierdzenie. ktore aminokwasy najczesciej wystepuja w danej strukturzc drugorzedowej.. Tak wiec.. Dlatego tez dana struktura drugorzedowa tworzy sie wokol grup aminokwas6w. rnusimy dokladnie] ornowic ten problem. Na podstawie struktury pierwszorzedowej polipeptydu mozna do pewnego aminokwasytworzace zarodek helisy peptyd niesfaldowany aminokwasy blokujqce wydiuzanie helisy Struktura pierwszorzt.enie tego aminokwasu zalezv od zmodyfikowane go sposobu odczytu kodu genetycznego (sekcja 10.2. Helisa wydiuza ste w obu kierunkach do mornentu napotkania grupy arninokwasow blokujqcych [e] formowanie . kt6re nie mogq wchodzic w jej sklad (rys.10 selenocysteina Budowa grupy R selenocysteiny Selenocysteina jest bardzo podobna do cysteiny._. 1 Wlqc7. ze geny okreslaja funkcje biologiczne dzieki informacji zakodowanej w sekwencji nuklco tyd6w. kt6re faworyzujq te strukture. Polaczenie genu z jego funkcja biologiczna jest mozliwe dzieki ternu. sekwencja aminokwas6w rnusi decydowac a funkcji bialka. SeH CH.3. 7.dowa decyduje o funkcji bialka [edna 7. Niekt6re biaika sa rnodyfikowane juz po zakonczeniu procesu ieh syntezy poprzez dodanie nowych grup chemicznych. s. np. powtarza si~ wzdluz polipeptydu do mornentu. ktore faworyzuja te strukture i inicjuja praces jej powstawania. oraz dzieki badaniorn nad faldowaniem sie malych peptyd6w a znanej sekwencji. [ednak wynikiern SH CH. procesu syntezy bialka jest tylko jego struktura pierwszorzedowa.1 I w polipeptydzie Powstawanie struktury drugorzedowe] cysteina Rysunek 7. 1. jakie sa prawa rzadzace tyrn etapem procesu faldowania sie bialek.7. 7. alba nie sa jej szczeg6lnie niechetne. Proces ten obejmuje nastepnie sasiednie aminokwasy. kt6re albo faworyzuja l~ sarna strukture. Ten proces powstawania zarodka dane] struktury. 0). sprawdzajac.11). 4). Jedyna roznica to zastapienie atomu siarki przez atom selenu Zarodek helivy a powstaje w miejscu zawierajacyrn aminokwasy. jakie struktury drugorzedowe beda po wstawac w polipeptydzie.3 Skr6ty nazw aminokwas6w Skr6t trzyliterowy Ala Arg Asn Cys Phe Gin Gly His lie Asp Glu Leu Lys Met Pro Ser Thr T rp T yr Val Skr6t jednoliterowy A-. 7anim pozegnarny sie z bialkami. Ten zwiazek wynika z hierarchieznej natury czterech poziorn6w struktury bialka.3). by mozna bylo polaczyc geny z Iunkrja biologiczna. poprzez acerylacje alba fosforylacje pewnych aminokwas6w lub przez przylaczenie duzych iancuchow bocznych skladajacych sie z reszt eukrowych (sekcja 10. natorniast inne czesciej znajduje sie w harmonijkach ~. ze sckwencja aminokwas6w determinuje. Formowanie struktury konczy sie w momencie napotkania jednego lub kilku blokujacych aminokwasow. w kt6rym wszystkie czesci lancucha przybiora preferowana przez siebie strukture.2 BIAtKA 155 Tabela 7. jej wydiuzania i ustalcnia jej granic. 1 powstanie zarodka helisy ---!-------~~----------1 wydtuzanie helisy i jeJ zakonczenie I I I I peptyd sfaldowany Rysunek 7.

Wynika to z tego. ze trafia w slepa uliczke. 4). ze fragrnenty DNA sa rozdzielane podczas elektroforezy w zelu agarozowym. poniewaz przez jego porowata strukture male fragmenty migruja szybciej niz duze (patrz Metody badan 3. czesciowo sfaldowane struktury. Przypornnij sobie.3 METODY BADANIA BIAtEK WI~CYCHDNA Poziom wiedzy we wszystkich dziedzinach biologii rnolekularnej i gcnetyki zalezy od dostepnosci i skutecznosci metod.3. a nastepnic jcdnostki struktur trzeciorzcdowych asocjuja tworzac zbudowane z podjednostek struktury czwartorzedowe. Proees faldowania bialka jest po prostu jednym z etapow dlugiej drogi. ktore mozna zastosowac do badan. Niezbyt dobrze poznano procesy towarzyszace <. znajdujacymi sie powyzej genow. Wiekszosc bialek zbudowana jest z dw6ch lub wiekszej ilosci domen strukturalnych. Badanie spowolnienia migracji w ie/u pozwala zidentyfikowac fragmenty DNA. Metody te dzialaja bardzo dobrze nawet w6wczas. z kt6rymi bialka i sekwencji DNA. dzieki ktorym mozna zidentyfikowac miejsca wiazace bialko w obrebie fragment6w DNA dlugosci kilku tysiecy par zasad. ze sekwencja nowo odkrytego genu. Ich dzialanie polega prawdopodobnie na zmniejszeniu prawdopodobienstwa.l. I wlasnie dlatego opracowano wicle metod. ze na roznych etapach procesu faldowania bialko przybiera alternatywne. zawierajaca region kodujacy DNA oraz sekwencje go poprzedzajace. w tym rowniez kornpleks6w tworzonych przez bialko zwiazane z DNA. ze w badaniach nad bialkami wiazacymi DNA dysponujemy wieloma technikarni. bywa. ze faldowanie sie domen jest procesem spontanicznym.przyzwoitka. a wiec i gen. Oznacza to. z ktora sit. ale cechy sekwencji DNA. opiekunka) pornagaja w procesie faldowania innych bialek. nie jest samo bialko. 1995). Metody badania struktury trzeciorzedowej bialek wiazacych DNA._'ono wiaze. kt6re mogq dostarczyc informacji na temat oddzialvwan .' zajmowac w nastepnyrn rozdziale. ze sekwencja arninokwasow. chaperone . z kt6rymi te bialka oddzialuja (rys 7. z ktorych tylko jedna moze stworzyc prawidlowa konfiguracje trzeciorzedowa. ktoryrni bedzierny sit. decyduje o funkcjonalnej. Mamy szczescie. kt6ry jq koduje.' wiaze.12). W komorce bialka opiekuncze (ang. Techniki te mozerny podzielic na trzy grupy: • • • Metody identyfikacji w czasteczce DNA rejonu (rejonow). Na przyklad podwyzszenie temperatury w prob6wce powodowalo rozfaldowanie bialka. ZC doswiadczenia genetyczne i z zakresu bioJogii molekularnej. ze bialko przybierze zlq strukture posrednia. iz wide bialek bioracych udzial w procesie ekspresji genomu wiaze sie z kr6tkimi sekwencjami DNA.2. w wyniku kt6rych jednostkowe struktury drugorzedowe Sq organizowane w struktury trzeciorzedowe. jakie struktury drugorzedowe bedzie on tworzyc (Barton. natychmiast dostarcza inforrnacji 0 miejscach wiazania przynajmnicj kilku bialek odpowiedzialnych za ekspresje tego genu. gdy bialko wiazace sie z DNA nie zostalo zidentyfikowane. z ktorymu) wiazc sie bialko./ /dentyfikacja w DNA miejsc wiqiqcych bialko Pierwsza rzecza. [esli bialko dokona zlego "wyboru" i jest czesciowo zle sfaldowanc. jaka najczesciej odkrywa sie w czasie badan nad bialkiern wiazacym DNA. nie jest sprzeczne 70 przeslanka. z ktoryrni ono sit. Metody oczyszczania bialek wiazacych DNA. ze bialko jest ponownie sfaldowane w prawidlowa strukture. sfaldowanej strukturzc bialka. przedstawionej na rysunku 1. Wr6cimy do tego zagadnicnia w sekcji 10.156 ROZDZIAt I • ROLA BIAtEK WIAZACYCH DNA stopnia przewidywac. kt6re wiqiq biaika Pierwsza sposrod tych metod wykorzystuje znaczna roznice we wlasciwosciach elektroforetycznych pomiedzy "nagim" fragrnentem DNA a fragmcntem zwiazanyrn z bialkami. biatka wiazace DNA \ 200bp ~ gen Rysunek 7.43). patrz rozdzial 8 i funkcji miejsc. na kt6rej nastepuje przejscie od informacji biologieznej zakodowanej w genie do bialka spelniajacego SWq funkcje. [ezeli fragment DNA zwiaze 7. z ktorej nie moze sic wycofac. 7. Zrozumicnic lego procesu utrudnia to. Uwaza sic iz oddzialywania miedzy nimi Sq prawdopodobnie dose slabe oraz ze poszczeg6lne domeny falduja sic niezaleznie. Cdy nastepnie obnizono temperature.3. ktore pomagaja w faldowaniu innych biaiek.' z jednoslkowych struktur drugorzedowych pochodzacych z calkiem roznych region6w polipeptvdu. W przypadku niekt6rych bialek wykazano.2B (s. ze wiele dornen sklada sit. na stcpnyrn dw6rn etapom faldowania bialck. zaobserwowano. [ednak nic dla wszystkich bialek udalo sie zadernonstrowac tego typu spontaniczne procesy. Istnienie alternatywnych drag faldowania sie bialka oraz bialek. s. a szczegolnie trudno jest to osiagnac w przypadku duzych czasteczek Przyczyna problem6w tkwi prawdopodobnie w tyrn.12 Miejsca przylqczania bialek wiazacych DNA najczescie] znaiduja sie powyzej genu Wi~cej informacji na temat polozenia wiqiq si~ bialka. pokazaly.

Ten pusty obszar. [ezeli fragment a spowolnionej migracji jest stosunkowo krotki.! wskazowka.bialko wiazace DNA Iqczy si~ z jeclnyrn fragrnentern. wyjatkiern tych. ktore] nie polaczono z ekstraktern jadrowyrn • Szczeg6ly techniczne dotyczacc tych dwoch metod pokazano na rysunku 7. kt6ra rozszczepia wszystkie wiazania fosfodiestrowe r. Trawienie nukleaza przeprowadza sit. badany fragment DNA jest znakowany izotopern na jednyrn koncu i laczony z bialkiern wiazacyrn DNA. obejmujacyeh przypuszczalne miejsce wiazania bialka. Bialko zostaje nastepnie usuniete i rnieszanina fragmentow DNA poddawana jest elektroforezie. DNaza I rozszczepia zazwyczaj wszystkie wiazania fosfodiestrowe. 7. Iootprinting). Badanie spowolnienia migracji w zelu jest wiec etapem poczatkowym i potrzebne sa inne techniki. :Ladna guanina chroniona przez zwiazane bialko nie bedzie zrnetylowana. Kompleks DNA··bialko rna wieksza rnase czasteczkowa niz "nagi" DNA. a drugi jego konier: powstaje w wyniku ciecia przez nukleaze. W praktyce doswiadczenie tego typu wykonuje sie z mieszanina fragrnentow restrykcyjnych. a co za tym idzie nie obserwujemy spowolnienia ich migracji.O ruchliwosc w zelu zostanie zahamowana. Mozliwe jest zastosowanie delikatniejszego i szybszego podejscia (rys. Mimo ze kazdy pojedynczy fragment jest przeciety tylko raz.13 Analiza spowolnienia migracji w zelu W wyniku polqczenia rnieszaniny fragrnent6w restrykcyjnych z ekstraktern biatek jadrowych . dodawanyrn w formic ekstraktu jqdrowego lub jako oczyszczone bialko. kt6ry przylacza grupy metylowe do nukleotyd6w zawierajacych guanin~ (G). to jeE. Spowolnione fragmenty identyfikuje sit.'w warunkach umozliwiajacych tylko czesciowe strawienie DNA. pozostawiajac tylko fragment DNA. w niskiej temperaturze lub stosujac male stezenie enzymu. to mozliwe. w calej populacji fragrnentow rozszczcpione zostana wszystkie wiazania z wyjqtkiem tych. Moze on zawierac kilka rniejsc wiazania dla roznych bialek. W rezultacie olrzymujemy drabinke prazkow odpowiadajaca fragmentom.14. do ktorej nie dodano bialek. rozniacym sie dlugoscia a je· den nukleotyd. W doswiadczeniu wykorzysluje sit. Poddanie dzialaniu czynnika metylujacego. Metoda ta nie okresla jednak tego miejsca z duza dokladnoscia. ze badamy komorki eukariotyczne). poniewaz dlugosr' sekwencji rozpoznawanej przez bialka nie przekracza kilkudziesieciu par zasad. czyli slad odpowiada pozycji chronionych wiazan fosfodicstrowych. tak by pojedyncza czasteczka DNA (pojedynczy fragment) byl . np. 7. Nazwano to spowolnieniem migracji w zclu (ang. czyli miejscu wiazania bialka w wyjsciowyrn fragmencie DNA . [ezeli jednak biaiko jest dostepne.7.' porownujac wzor prazkow otrzyrnany po elektroforezie ze wzorem otrzymanym po elektroforezie tej samej mieszaniny fragmentow restrykcyjnych.11). Powstaly kompleks poddaje sie nastepnie dzialaniu deoksyrybonuklcazy I (DNazy I) (Galas i Schmitz.' miejsce wiazania bialka. ktore Sq chronione przez bialko. aby otrzymac dokladniejsze informacje. i dlatego rnigruje wolniej podczas elektroforezy w zelu. ze miejsce wiazace bialko zawiera rowniez nukleotydy wchodzace w sklad sasiednich Iragmentow. 1981). Testy ochrony precyzyjnie okreslajq poloienie miejsc wiqiqcych Spowolnienie migracji w zelu jest ogoln.trafiany" srednio tylko jeden raz. to doswiadczenie mozna przeprowadzic z oczyszczonym bialkiem townie Iatwo jak z ekstraktem jadrowyrn. to cZt.' ekstrakt jadrowy. zaczynaja si~ testy modyfikacji. ktory byl chroniony przez zwiazane bialko.'s{:sekwenc:ji nukleotydowej bedzie chroniona przed modyfikacjami.' na analizie sladow (ang.3 METODY BADANIA BIALEK WIAZACYCH DNA 157 sie z bialkiern. poniewaz na ogol na tym etapie badan nie jest jeszcze oczyszczone bialko wiazace DNA. Garner i Revzin. Podczas badania sladow z uzyciern nukleazy. Tarn. Opieraja sie one na nastepujacej obserwacji: jezeli czasteczka DNA jest zwiazana z bialkiem. fragrnenty fragrnenty restrykcyjne + restrykcyjne bialko jadrowe standard wielkosci DNA prazek rnigrujqcy wolniej Rysunek 7. takiego jak siarczan dimetylu. Dlugosc fragmentu a spowolnionej migracji wynosi czesto kilkaset par zasad. Fragmenty DNA wyznakowanc izotopem rnozna uwidocznic. Moi:na go zidentyfikowac na podstawie por6wnania z wzorem prazkow otrzyrnanyrn po elektroforezie tej samej mieszaniny fragment6w restrykcyjnych. Oznacza to. gdzie koncza sic badania spowolnienia migracji w zelu. Sq dwa sposoby wprowadzenia takich modyfikacji: • Dzialanie nukleaza. Nie jest to najlepsze rozwiazanie. Obydwie melody opieraja sit. Drabinke przerywa pusty obszar.13). gel retardation. poniewaz sekwencjonowanie tak malego fragmentu moze bye trudne. Wskutek tego prazek odpowiadajacy temu Iragmentowi migrujc wolniej. gdzie w sekwencji DNA znajduje sit. Sarnodzielnie nie tworza one jednak stabilnych kompleksow z biaikiem. 1978). ktore byly chronione przez bialko. w ktorym nie rna zadnych wyznakowanych prazkow. ze w jednej czasteczce DNA rozszczepione zostanie tylko jedno wiazanie. Dlatego kompleks DNA-bialko tworzy prazek polozony blizej punktu startu elektroforezy (rys. Kazdy z £ragmcntow jest wyznakowany na jednym koncu. Mieszanine fragmentow DNA l'lczy sie z ekstraktern bialek jadrowych (zalozrny.

Fragmenty DNA poddaje sie nastepnie elektroforezie. kt6ra G zostala zmodyfikowana. na przyklad poprzez dodanie grupy metylowej.158 ROZDZIAl7· ROLA BIAlEK WIA. ktore Sq krytyczne dla wiazania bialka.15.ang. [edna z metod nalezaca do tej grupy test6w pokazano na rysunku 7. Uzyte na poczatku procedury fragmenty restrykcyjne trzeba wyznakowac tyko na jednym koncu. Fragmenty DNA zamiast trawienia DNazq I Sq poddawane dzialaniu DMS 0 malym stezeniu dobranym tak. autoradiografia Rysunek 7. Nastepnie dodaje sit. dimethyl sulphate) opiera si~ na podobnych zasadach.-- ----- } "slad" Metoda analizy sladow z uzyciem DNazy I Opis tej metody . Orugi prazek zawicra czasteczki. Aby stwierdzic. ktory znakuje je radioaktywnie na obu koncach. Mozna zaobserwowac dwa prazki.14 - -------------.tak dobranym. 1985). Guaniny. Wyznakowany na jednyrn koncu fragment DNA poddaje sie dzialaniu czynnika mody- fikujacego. W tym celu dluzsze fragmenty restrykcyjne poddaje sie dzialaniu enzymu. ktora przecina czasteczke w rniejscach. Wzor prazkow otrzymanych ala kontrolnego DNA. pokazuje pozycje wszystkich G w badanyrn fragmencie. Siad widoczny we wzorze prazkow testowanego DNA wskazuje. ktore sa chronione przez zwiazane bialko.' bialko wiazace DNA lub ekstrakt jadrowy i przeprowadza elektroforeze. ze jesli zmienimy nukleotydy krytyczne dla wiazania bialka. elektroforeza w zelu.fragmentowi DNA nie zwiazancrnu z bialkicm. poniewaz w czasie dzialania czynnika metylujacego zosta!a zmodyfikowana jedna lub wiecej G. a drugi .----. [eden odpowiada kompleksowi DNA-bialko. Test modyfikacji z zastosowaniem siarczanu dimetylu (DMS . autoradiografia 1 czesciowe trawienie DNazqI -~ 1 czesciowe trawienie DNazq I trawienie biatka. to wowczas uniemozliwirny zwiazanie tego bialka. ktore G byly chronione Nukleotydy bezposrednio oddzialujqce z bialkiem moina zidentyfikowac stosujqc test zaklocania modyfikacji Ochrony przed modyfikacja nie nalezy mylic z testem zaklocania mody£ikacji. Po usunieciu bialka na DNA dziala sie piperydynq. nie mogq bye zmodyfikowane.patrz tekst. w tym przypadku siarczanu dimetylu a malym stezeniu . fragment DNA izoluje sie z zelu i poddaje dzialaniu piperydyny.ekstrakt jq7" + ekstrakt jqdrowy ---. ktore nie bylo inkubowane z ekstraktem jadrowyrn. gdzie znajduja sie zmodyfikowane nukleotydy. do kt6rych bia!ko nie moglo sie przylaczyc. jak badanie sladow za pornoca DNazy I. by w pojedynczym fragmencie DNA zostala zmetylowana tylko jedna guanina. Wyznakowane w ten sposob czasteczki tnie sie drugim enzymem restrykcyjnyrn i nastepnie oddziela sie od siebie dwa rodzaje wyznakowanych fragrnentow.ZACYCH DNA znakowany koniec fragrnenty restrykcyjne znakowane na koricu . by w pojedynczym fragmenc:ie DNA zostala zmctylowana tylko jcdna guanina. Test zakl6cania modyfikacji opiera si~ na zalozeniu. odmienna technika a wiekszej czulosci. czynnika . ktora rowniez wykorzysruje sie do badania wiazania bialek z DNA (Hendrickson i Schleif.-elektroforeza w zelu.

zawierajqcy miejsce wiazania biatka.14 prowadzqcej do na jednym koncu (A) Chromatografia powinowactwa. Wyplukuje sie je buforem 0 duzym stezeniu soli. a zatem .. autoradiografia Rysunek 7.16 DNA znakowany fragment ma 200bp. Klony eDNA przenosi sie na filtr nylonowy. ktore pakuje si~ do kolumny chromarograficzne]..==:-_----:::7zmodyfikowane / reszty G _L-_ 1 _------ dodanie ekstraktu [adrowcgo .~.J. jest wiazany ze ztozem krzemionkowym. Opis procedury uzyskania fragmentu DNA wyznakowanego .ZACYCH DNA 159 znakowany koniec <'---_--' _ fragment restrykcyjny znakowany na koncu (A) / AkI~"'d' DNAlub ekstrakt [adrowy bufor 0 duzyrn stezeniu soli J ograniczone traktowanie siarczanem dimctylu t\ zlozc krzemionkowc . Po przepuszczaniu ekstraktu jqdrowego przez kolumne pozostajq w niej bialka specyficznie wiazace sie ze zwiazanyrn fragmentem DNA. kt6ry syntetyzowat odpowiednie bialko wiazace DNA.. Fragment DNA lub syntetyczny oligonukleotyd.-. zostaje zidentyfikowany dzieki hybrydyzacji z wyznakowanym fragmentem DNA.'_. (B) Hybrydyzacja kolonijna. L___j klon syntetyzujacy bialko wiazace DNA Dwa sposoby oczyszczania biatek wiazacych 200bp Rysunek 7 .~ ..7.3 METODY BADANIA BIAlEK WIA.. Klon.15 dimetylu Test zaklocania modyfikacji z uzyciem siarczanu Metod~ opisano w tekscie. zawierajqcym miejsce wiqzania tego biatka ..v" •~ standard wielkosci DNA bialko specyficznie wiazace sie z DNA niezwiazane bialka bialko wiazace DNA 1 1 brak wiazania (miejsce zablokowane) w zelu (B) elektroforeza i:&- ~~~7 -I' "\ 1 przeniesienie na filtr nylonowy z bialkiem) niespowolniony prazek (niezwiazany 1 -standard wielkosci DNA piperydyna / dodanie znakowanego oligonukleotydu elektroforeza w zelu.patrz pod pis pod rysunkiem 7..o.

nuclear magnetic resonance). Klony te przenosi sie na filtr nvlonowy w sposob urnozliwiajacy przeniesienie wszystkich bakterii wraz z wytwarzanymi przez nie bialkami (rys. 7. 7. gdy klon ten syntetyzuje odpowiednie bialko wiazace DNA.16A). na ktoryrn powstaje sena plamek. ktore nukleotydy A. W rezultacie kazdy fragment DNA jest ciety na dwa segmenty. W ten sposob mozna otrzyrnac ezyste bialko wiazace si~ konkretnym fragmen tern DNA. Meloda ta nieco rozni sie od metody przenoszenia na filtr. czyli 4000 razy mniejsza nil: swiatlo widzialne. takich jak chlorek sodu i siarczan cynku. kt6ry nukleotyd (nukleotydy) zostal zrnetylowany w wyjsciowyrn fragmenc:ie DNA. w kt6ryeh znajduje sie zmetylowana guanina. co jest niezbedne do bardziej szczegolowych badan strukturalnyeh. Dlugosc ta jest por6wnywalna z odleglosciami miedzy atomami w czasteczkach. ze wzgledne polozenie plarnek odzwierciedla ulozenie czasteczek w krysztale. ktory jest zwiazany z filtrem. plucze si~ )'1 buforem 0 duzym stezeniu soli. gdzic w sekwencji DNA znajduja si~ G. w jaki sposob bialko oddzialuje z helisa DNA. 7.01-10 nrn. ale rowniez dlatego. z kt6ryc:h tylko jeden jest wyznakowany na koncu. W rezultacie powstana nakladajace sie kola rozproszonych fal. 7. Mozna zastosowac podobne tec:hniki. pozostale bialka sa z niej wyplukiwane. Wiliam i Lawrence Braggowie otrzymali Nagrode Nobla za opracowanie podstawowej metodologii i wykorzystanie jej do okreslenia struktury krysztal6w soli. Metoda oczyszczania wykorzystuje zdolnosc bialka do wiazania sie Z okreslona sekwcncja.' do klonu bakterii.zar6wno samego bialka. Wyznakowany fragment DNA tylko wtedy przylacza sit. Fragment DNA lub oligonukleotyd za wierajacy rniejsce wiazania bialka jest znakowany i hybrydyzowany z filtrem. 104). ktory destabilizuje kompleksy bialko-DNA. .18. Jednak podstawy obydwu metod Sq podobne. Musimy dvsponowac biblioteka klonow bakterii zawierajacych eD:"-JA. 1991). Naprzeciw wiazki promieni umieszcza sie wrazliwy na promieniowanie rentgenowskie film fotografiezny.yC do olrzymania duzej ilosci bialka wiazacego DNA. powie narn. Metody te oraz badania..160 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WII\ZACYCH DNA rozszczepiajacego DNA w miejscach. ze ieh wyniki mozna analizowac za pornocq nowyc:h i coraz doskonalszych programow komputerowych.. takich samych czasteczek tworzacyeh rcgularna strukture.17 A). [ezeli krysztal sklada sie r. Przez kolumne przepuszcza sie ekstrakt biaiek w buforze 0 malyrn stezeniu soli.z ktorych kazdy koduje inne bialko pochodzace z badanego organizmu. kt6re biora udzial w reakcji wiazania bialka. zazwyczaj przez polaczenie jednego konca DNA ze zlozern krzemionkowym (Kadonaga. Gdy wiazka promieni rentgenowskich zostaje skierowana na krysztal. by stwierdzic rowniez. Tego typu badania dostarczaja najdokladniejszych danych dotyczacych oddziaIywan miedzy bialkiem i DNA dzieki precyzyjnemu okresleniu struktury czesci bialka wiazace] sie z DNA oraz rnozliwosci stwierdzenia. kt6ry umozliwia zwiazanie bialek z rozpoznawanymi przez nie sekwenc:jami. ktorc ze soba oddziaiuja. nie tylko z powodu rozwoju samych tyeh technik. Interesujace nas klony mozna nastepnie odzyskac z szalki wzorcowej i U7.3. Urnozliwi nam to stwierdzenie. Dlugosc wyznakowanego fragmentu (fragment6w) okreslona na podstawie kolejnej elektroforezy. 5. s.2 Oczyszczanie biafek wiqiqcych DNA Po zidentyfikowaniu w czasteczce DNA sekweneji wiazacej bialko rnozna jq wykorzystac do oczyszczenia tego bialka.3 Badanie struktury biafek i kompleksow DNA-biafko Oczyszczenie bialka wiazacego DNA stwarza mozIiwosc analizowania jego struktury . ze im 7. czyli rentgenogram dyfrakcyjny (rys. cz~sc z nich przechodzi prosto przez krysztal nic zmieniajac kierunku. Po calkowitym wvpiukaniu bialek niezwiazanych z kolurnna. Metoda opiera sie na dyfrakcji promieni rentgenowskich. ktore mozna dzieki nirn prowadzic. W metodzie tej fragment DNA lub syntetyc:zny oligonukleotyd jest wiazany z kolurnna. rys. Krystalografia rentgenowska jest szeroko stosowana w badaniach strukturalnych Krysialografia rentgenowska jest uznana metoda. a wzgledna intensywnosc plamek dostarcza informacji o strukturze czasteczki. W kolumnie pozostaja bialka specyficznie wiazace si~ ze zwiazanym fragmentem DNA. Jest on podstawa do opracowania struktury czastcczki.17B). jak i bialka polaczonego z sekwencja DNA przez nie rozpoznawanq. Promieniowanie rentgenowskie cha rakteryzuje sie bardzo mala dlugoscia fali: 0. Problem polega na tym. pozostale jednak zostaja rozproszone i opuszczaja go pod innym katcm niz do niego weszly (rys. stosowane do opracowywania struktury CZqS teczki na podstawie rentgenogramu dyfrakcyjnego. Opieraja sie one na zasadzie. [uz w 1915 r. w ktorym miejscu wyznakowany fragment DNA polaczyl sie z filtrem. Wyzwanie dla badaczy wykorzystujacych krystalo grafi~ rentgenowskq stanowia niezwykle zlozone metody. Klony mozna zidentyfikowac dzieki stwierdzeniu. 1988). sit jedna z najszybciej rozwijajacych sie dziedzin biologii molekularnej. Alternatywa opisanego sposobu jest wykorzystanie metody hybrydyzacyjnej (Singh i wsp.3. ktora omawialismy poprzednio i kt6rej celem by to badanie DNA zawartego w klonach (np.16B). ojciec i syn.ang. CiT biora udzial w wiazaniu. to kolejne promienie rentgenowskie beda rozpraszane w podobny sposob. [edna z rnozliwosci jest wykorzystanie chromatografii powinowactwa (rys 7. ktorej rodow6d siega konca XIX wieku. Clownyrni metodami stosowanymi w tej dziedzinie badan sa krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jadrowego (NMR .

to mozliwe jest zidentyfikowanie grup R po szczeg6lnych aminokwas6w w polipeptydzie oraz okreslenie ich wzajemnego polozenia.zaznaczono polozerue grupy R tyrozyny Rysunek 7.fragment mapy gestosci elektronowej sporzadzonej na podstawie tego rentgenogramu. [esli sic powicdzie. (D) przedrukowano za zgoda z: Zubay G. Perutz i Kcndrew otrzyrnali nagrodc Nabla w 1962 r. nawet z pomocq komputerow. to rnozliwe jest zidentyfikowanie grup R poszczeg61nych aminokwas6w. Rysunek (B) przedstawia rentgenogram dyfrakcyjny otrzymany dla krysztat6w rybonukleazy. 7. (B) i (C) przedrukowano za zgoda z: Neil Campbell. Biology.nq innowacja byla krystalizaeja bialek wiazacych . (D) [ezeli mapa ma wystarczajaco duza rozdzjelczosc. 1993). Pierwszymi bialkami. to stworzyc tr6jwymiarowy model czasteczki bialka (Rhodes. W przypadku czasteczki bialka bedzie to mapa sfaldowanego polipeptydu. a po drodze mozna napotkac wiele pulapek uniernozliwiajacych osiagniecic sukcesu. a rysunek (C) .17 Krystalografia rentgenowska (A) Rentgenogram dyfrakcyjny powstaje w wyniku przejscia wlazki promieni rentgenowskich przez krysztal badanej czasteczki. Copyright 1997 by McGraw~Hili Companies czasteczka jest bardziej zlozona. byly rnioglobina i hemoglobina. Dzieki ternu mozna wysuwac wnioski na ternat wiazan wodorowyeh i innych oddzialywan chernicznych wystepujaeyeh w obrcbic bialka. otrzymamy map<. lista opracowanych slruktur stopniowo rosla i obeenie zawiera ponad 30 bialek wiazacych DNA Waz. na podstawie kt6rej mozemy okrcslic polozenie takich struktur. jak helisy a i harmonijki [ezeli mapa jest wystarczajaco dokladna. Mirno napotykanych problcmow. Copyright 1993 by Benjamin Cummings Publishing Company. Uzyskanie i analiza danych otrzymanych z krystalografii renlgenowskiej dla nowego bialka ciaglc zajrnuje kilka miesiecy. Przy odrobinie szczescia pozwoli r~.3 METODY BADANIA BIALEK WIA.17C i D). kt6rych strukture okreslono na podstawie krystalografii rentgenowskiej. Za to osiagniecie jego autorzy.ZACYCH DNA 161 (A) I'owstawanie rentgenograrnu dyfrakcyjnego film wrazlrwy na prornienie rentgenowskie (R) Rcntgenogram dyfrakcyjny rybonuklcazy prornieniowame rentgenowskie -- kryszta! (C) Fragment rnapy gestosci elektronowej rybonukleazy (D) Interpretacja mapy gF. Szczeg6lnie trudne bylo zawsze otrzyrnanie odpowiedniego krysztalu bialka. 3rd edn.stosci elektronowej Mapa gestosci elektronowej 0 rozdzielczosci 2 A . g~stosei elektronowej (rys. Analiza danych jest trudna i czasochlonna. 4th edn. Biochemistry.7. w tym przypadku tyrozyny. tym wiecej plamek otrzymujemy i tym wiccej musimy wykonac porownan micdzy nimi.

!na podst.' z badan siegajacych poczatkow XX wieku. a wiec bedzierny dysponowac bardzo dokladnyrni danymi na temat struktury bialka (Evans. Tego typu badania czesto uzupelnia sie analiza bialka. [esli analiza NMR zakonczy sit. cz. by ich czestotliwosci rezonansowe nie zachodzily na siebie. Rozne jadra atomowe np.ebnego do przejscia ze stanu a do stanu ~.18 Zasada spektroskopii magnetycznego rezonansu j'ldrowego Po przylozeniu zewnetrznego pola magnetycznego wirujace [adro rnoze przybrac jedna Z dw6ch orientacji. roznica jest przewaznie mniejsza niz 10 ppm (ang. lI-I. Zalezy to od tego. Podstawowa zaleta mctody NMR jest rnozliwosc analizy bialek w roztworze. a Nagrode Nabla za to osiagniccie przyznano w 1952 r. na przyklad w czasie faldowania bialka lub w odpowiedzi na dodanie substratu. Dzieki innym typom analizy (np.yli czestotliwosci rezonansowej badanego jadra. dajacymi rowniez przydatne do analizy wyniki po zastosowaniu metody NMR. Mimo . Efekt ten. ze w wyniku pomiaru tej czestotliwosci przewaznie otrzyrnujcmy wyniki nieznacznie rozniace sie od wartosci standardowych.18). 1995).. [edna z nich to koniecznosc okreslenia czestotliwosci rezonansowej dla kazdego lub dla mozliwie najwiekszej ilosci jader lH lub inn ego rodzaju badanych jader.ny. Najistolniejsze w spektroskopii NMR jest jednak to.etapu niezbednego w przypadku analizy rentgenowskiej. wywolany jest obecnoscia elektronow w sasiedztwie obracajacego sie jadra atomowego.' problem6w czasarni wystepujacych podczas krystalizacji bialek . tym wieksza jest ilosc badanych jader atornowych. dzieki czemu unika sit. Orientacja a charakteryzuje sic. z ktora sie wiaza. ale nie polaczone z nim bezposrednio. Wadq metody NMR jest jej przydatnosc tylko do analizy stosunkowo malych bialek. Na podstawie takich informacji mozna wnioskowac a strukturze calego bialka. jakie jest polozenie bialka wzgledern podw6jnej hclisy To wlasnie tego typu dane leza u pod staw naszej dzisiejszej wiedzy na temat sposobu dzialania biaiek wiazacych DNA. Po przvlozeniu zewnetrznego pola magnetycznego. wywodzi sit. podobnie jak krystalografia rentgenowska. a wiec dostarcza inforrnacji na ternat struktury czasteczki. otrzymamy dane na tym samym poziomie rozdzielczosci co w przypadku krystalografii rentgenowskiej. NMR dostarcza dokfadnych informacji na temat struktury mafych biafek Metoda NMR. umozliwiaja ziden- tyfikowanie atornow polaczonych wiazaniern chemicznym z wirujacyrn jadrern. Elektrony do pewnego stopnia ekranuja jadro przed zewnetrznyrn polem magnetycznym. Im wieksze jest bialko. Szczegolne rodzaje analizy. Nie wszystkie rodzaje jader atomowyc:h mozna analizowac metoda NMR. Jest wiele przyczyn tego ograniczenia.! I I rosnaca energia spin a Rysunek 7. 13e. Wiekszosc badan bialek z zastosowaniem tej metody opiera sie na analizie jader lH w celu zidentyfikowania chernicznego otoczcnia kazdego atomu wodoru oraz wiazan chernicznych laczacych te atomy z innymi. Po raz pierwszy opisano jq w 1936 r.' sukcesem. Badanie bialka znajdujacego sie w roztworze jest rowniez bardziej przydatne. w kt6ryrn niektore atorny wegla i (lub) azotu zostaly zastapione rzadkimi izotopami 13e: i lSN. jezeli celem eksperymentu ma bye obserwacja zmian w jego strukturze.' od siebie przesuniecia chemiczne dla roznych jader tak. zwany przesunieciern chernicznym. ze ruch obrotowy naladowa nego jadra atomowcgo wytwarza moment magnetycz.'niece mniejsza energia i jest zgodna z kierunkiem zewnetrznego pola magnetycznego. wirujace jadro moze przybrac jcdna z dw6ch orientarji. ze czestotliwosci te beda sie pokrywac i nie uda sie uzyskac inforrnacji na temat struktury bialka. 15N charakteryzuja sic specyficzna dla siebie czestotliwoscia rezonanSOWq. NOESY) mozna zidentyfikowac atorny polozone blisko wirujacego jadra. a wiec i tym wieksza szansa.awie pomiaru czestotliwosci prornieniowania elektromagnetycznego potrzebnego do przejscia ze sranu a do stanu P DNA w obecnosci specyficznej sekwencji. Roznica miedzy obserwowana energia rezonanSOWq a jej wartoscia standardowa dla badanego jadra umozliwia wyciagniecie wnioskow dotyczqcych chemicznego otoczenia jadra. parts per million). Metoda ta opiera sit. zwane COSY i TOCSY. zwanych a lub ~ (spin a lub spin Pl. Wyniki takich doswiadczen pozwalaja okreslic strukture kornpleksu bialko-DNA oraz dokladnie stwierdzic. Roznice energii rniedzy stanern a i ~ okresla siE. W metodzie spcktroskopii NMR roznica energii miedzy orientacja a i ~ jest okreslana na podstawie porniaru czestotliwosci promieniowania elektromagnetycz nego potr:t. zwanych a lub ~ (rys 7.162 ROZDZIAl / • ROLA BIALEK WIAZACYCH DNA promieniowanie elektromagnetyczne o odpowiedniej ~ czestotliwosci t_ -:. na ile roznia sit.' na zasadzie.

2.2.4 Funkcje bialek wiqi:qcych DNA i RNA Funkcja bialka Bialka wi'!z'!ce DNA Upakowanie DNA Przyklady Odnosnik Rekombinacja DNA Naprawa DNA Replikacja DNA eukariotyczne histony bialka nukleoidu bakterii bialko RecA nukleazy.4). Liczne interesujace bialka sa wystarczajaco male.2 sekcja sekcja sekcja sekcja sekcja sekcja 8. vlozliwe jest rowniez otrzymanie bardzo istotnyeh . 13.4 ODDZIAtYWANIA I BIAtKAMI MIIiDZV DNA vlimo ze gl6wnym celern tego rozdzialu jest stworze nie pods taw dla naszych dalsz.3. na przyklad ieh wiazanie z kvvasami nukleinowymi.2).OZY DNA I BIAtKAMI 163 :nh ograniczen.2.' niespecyficznie z roznyrni sekwencjami wzdluz czasteczki DNA. doprowadzila do. 1 8.3.' urniejetnosc. Inne bialka wiaza si(.1 sekcja 10.5 sekcja 10. biora uclzial w procesach replikaeji 1 naprawy DNA.4. 1.zdolnosc wiazania DNA.2 sekcja 9. Bezposredni odczyt informacji zawartej w sekwencji nuk/eotyd6w Analiza struktury podw6jnej helisy opisanej przez Watsona i Cricka (sekcja 7.1. Czesc grup chemieznyeh polaczonych z zasadarni purynowymi i pirymidynowyrni jest dostepna z powierzehni hclisy.2 sekcja 13. Od dawna wiadomo. Duze znaczcnie rna rowniez grupa pokrewnvch bialek. 1 .4 sekcja 12. Wiekszosc bialek bioracych udzial w ekspresji genomu rozpoznaje specyficzne sekwcncje DNA i wiaze sie gl6wnie z nimi. Mozliwe.1 2. szczeg61nie gdy mamy do czynienia z bialkiem rozpoznajacym swoje speeyficzne miejsce wiazania. bialka wiazace DNA maja przynajmniej jedna wspolna ceche .2 sekcja 12.ianvch na podstawie strukturalnej analizy polipep . glikozydazy DNA bialka rozpoznajace miejsce inicjacji replikacji polimerazy DNA i ligazy bialka wiqi:'lce jednoniciowy DNA topoizomerazy eukariotyczne bialko wiazace sekwencje TATA podjednostka (J bakteryjnej polimerazy RNA polimerazy RNA eukariotyczne czynniki transkrypcyjne bakteryjne represory prokariotyczne enzymy restrykcyjne sekcja 6.2 8. [ak zobaczyrny daiej.3 sekcja 9.!ce RNA Ekspresja genomu Wycinanie intron6w Poliadenylacja mRNA Redagowanie mRNA Dojrzewanie rRNA i tRNA Translacja Degradacja RNA Bialka strukturalne rybosomu bialka snRNP czynniki CPSF. ze bialka wiazace DNA pelnia rowniez wiele innych funkeji i udzial w procesie ekspresji genomu jest tylko jedna z nich.3. Chociaz nie sa one kompletnymi bialkarni.3 8. 9.1 sekcja 12. ze tego typu zrniany strukturalne wplywaja w posredni spos6b na wiazanie bialka.2 sekcja 9.1. wniosku. znaja zmieniorie zasady w nukleotydach i Wli)Zq sie w tych miejscach. Zrniany w naszych pogladach dotycza wplywu sekwencji nukleotydowej na strukture podwojnej helisy. ie chociaz zasady azotowe znajduja sie wewnatrz czasteczki DNA.1. 1 sekcja 6.4.1 podrozdz. Dlatego tez bezposred- 7. musimy jednak parnietac. rnozna na tej podstawie tworzyc modele wyjasniajace -posob dzialania bialek. ze wazna jest sekwencja DNA.3.3.2 sekcja 12. CstF deaminazy adenozyny rybonukleazy syntetazy aminoacylo-tRNA czynniki translacyjne rybonukleazy bialka rybosomowe sekcja 9.2. by mozna je bylo analizowac za pomocq NMR.!z.2. metoda NMR jest nadal wysoko .2. Bialka biorace udzial w naprawie DNA rozpoTabela 7. ---- 7.2.:eniona. wydaje sie ze istnieje ograniczona ilosc sposob6w warunkujacych l(.2. nie sa one jednak cal kowicie schowane.2.2.2 sekcja 10. I DNA jako partner W ostatnich latach zmieniaja sie nasze poglady na role jaka w procesie oddzialywania DNA z bialkiem odgrywa sam kwas nukleinowy. wiazacych sie z RNA.3 8. Bialka nalezace do tej klasy spelniaja funkcje strukturalne w ehromosomach prokariotyeznyeh i eukariotycznych.ych rozwazan na ternat e' presji genomu.2 Ekspresja genomu Inicjacja transkrypcji Synteza RNA Regulacja transkrypcji Inne Biatka wi.3.2 podrozdz.74 ODDZIAtYWANIA MIF. a nie z DNA (lab 7. Mirna tcj roznorodnosci..vdow.

s. 7. W wiekszym rowku elementy te s. Wynika z tego. Asocjacja warstwowa. ktora moze pomoc bialku wiazacemu DNA w znalezicniu jego miejsca wiazania w czasteczce DNA. dostarczajac prawdopodobnie informacji slruk turalnej.' Iorrny B. Generalnie jednak uwazano. 1998) i dlatcgo bezposredni odczyt informaeji zawartej w formie II DNA opiera sic glownie na kontakcie bialka z wickszym rowkiem. Przedrukowano za zgoda z: Kielkopf CL.150). Skr6ty: a . Grupy chemiezne wyeksponowane wewnatrz mniejszego rowka pozwalaja odroznic par~ A· T od pary G· C. WykorzystujqC te dwa elernenty. Chodzi 0 konkretne miejsea w DNA. poniewaz nie zidentyfikowano zadnego bialka specyficznie rozpoznajqcego hclise w formie innej niz B. Kr6tkie segrnenly DNA mogly wystepowac w fonnie A. et aI. mniejszy rowek odgrywa znaczniejsza role w bezposrednim kontakcie z bialkami. Sekwencjo nukleotyd6w posrednio wpfywo no struktur~ he/isy Ostatnia zmiana naszych poglqd6w na temat struktury DNA dotyezy wplywu sekwencji nukleotydowej na konforrnacje helisy w roznych rniejscach wzdluz CZqSteczki.3. ze czasteczki DNA w komorce maja calkiern jednorodna strukture i wystepuja r. W takich czasteczkach zagiccic powstajc na koncu 3' regionu bogatego w adenine (Young i Beveridge.. Te zmiany konformacyjne zaleza od sekwencji nukleotyd6w i wynikaja g16wnie z asocjacji warstwowej miedzy sasiednirni zasadami w jednej nic:i. BiZ-DNA oraz form postednich miedzv nirni w obrebie jednej czasteczki DNA. ale nie wiedzialo.akceptor wiazania wodorowego. [ednak wielu badaezy wierzy. sugerujqce. kt6ry nukleotyd jest na kt6rej nici helisy. T poprzez oddzialywanie z rnniejszym rowkiem. Kielkopf i wsp. bicgnacyrni spiralnie wzd luz helisy (patrz rys. Podobnie jak inne zrniany konformacyjne. 149). Do niedawna sadzono. W formie Z DNA wiekszy rowek prawie nie istnieje i bezposredni odczyt informacji jest w pewnym stopniu mozliwy na powierzchni helisy. Aby mogly powstac wiazania cherniczne.38. w kt6rych jeden polinukleotyd zawiera dwie lub wiecej grup powtarzajacych sie adcnin tak. ze sekwencja nukleotydowa posrednio wplywa na ogolna konformacje helisy. iz istotne sa tylko dwa symetryczne elernenty (czarne strzalki). 1995). kt6re by lqczyly bialko wiazace DNA z grupami chemicznymi zasad azotowych. to dysponujerny duzo mniejSZq iloscia danych na temat ieh wiazarua z bialkarni. a tym samym determinuje konformacje helisy w poszczeg6lnyeh miejscach. ze DNA jest duzo bardziej polimorficzny. Wplywa ona rowniez na rotacje wokol wiazan kowalencyjnych w pojedynczych nukleotydach (patrz s.149). kt6re umozliwiaja powstawanie form kolistych i superskreconych.164 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WIAZJ\CYCH DNA wiekszy rowek vdW d 1 T 1 A (patrz tab. T.16wnie w forrnie B.19. musi ono wejsc w kontakt z jednym lub dwoma rowkami.1. a odstepy miedzy grupami wynoszq 10-11 nukleotyd6w. ze konformacja helisy maze odgrywac pewnq role w oddzialywaniach miedzy bialkiern a DNA. Mozliwe jest wsp6listnienie roznvch konfiguracji: A.donor wiazania wodorowego: vdW . bialko wiazace DNA moglo rozpoznac pare A· T. Science. 282. Ostatnio odkryto dwa asymetryczne elementy (zielone strzalki).! asymetryczne i dlatego bialko wiazace DNA rnoze ztdenryfikowac orientacje pary A . ze plytszy. [ezeli chodzi o pozostale formy DNA. d . Poczatkowo sadzono. s.sily van der Waalsa. s.bszy. w kt6ryeh sekwencja nukleotydowa powoduje zagiecie czasteczki. trudno jest jednak stwierdzic. Termin ten nie odnosi sie do zmian w strukturze DNA wynikajacych z jego naturalnej elastycznosci. szczeg61nie te znajdujace sie na koncach czasteczki. Pewne odcinki. Na razic jest to tylko teoretyczna mozliwosc. ale wydaje sie ze proces len przebiega inaczej. 150). Innym rodzajem zmiany konformacyjnej jest zagiede DNA (Travers. ze nie jest to rnozliwe w przypadku mniejszego rowka. Tak jak w przypadku zmian w konfor- a a vdW a mniejszy rowek Rysunek 7. ze jest rnozllwe okreslenie orientacji pary A . 7. poniewaz wydawalo sie. Dlatcgo jest prawdopodobne. wystapienie zagiecia DNA zalezv od sekwencji nukleotyd6w. Na przyklad w formie A DNA wiekszy rowek jest gl\. mogly bye zbudowane z Z-DNA. 7.19 DNA Rozpoznawanie pary zasad A· T w formie B Pare zasad A· T przedstawiono schernatycznie (patrz rys. w wyniku czego rozne czesci czasteczki maja rozna strukture.. wezszy i z tego powodu trudniej dostepny dla bialek . I I I-I 15. decyduje 0 stabilnosci helisy. 1998). podobnie jak laczenie sie zasad w pary. Copyright 1998 American Association for the Advancement of Science ni odczyt informacji zawartej w sekwencji nuklcotydow powinien bye mozliwy bez otwierania czasteczki DNA i rozrywania wiazan laczacych pary zasad. Strzalki pokazuja elementy struktury chemicznej. kt6ry nukleotyd z danej pary znajdujc sic na ktorej nici (rys. ze wiekszosc podw6jnej helisy skladala sie z nie zrnieniajqcej sit. 7. Zagiecie szczegolnie czesto obserwujc sic w czasteczkach DNA. ZC w kazdej grupie jest 3-5 A. kt6re mogq bye rozpoznawane od strony wiekszego rowka (powyzej) i mniejszego rowka (ponizej). W przypadku formy 13 DNA mozliwc jest jednoznaczne zidentyfikowanie i okreslenie orientaeji sekweneji na podstawic grup wy eksponowanyeh wewnatrz wiekszego rowka. Obecnie wierny.

Z punktu widzenia eksprcsji genomu jest to najwaz. Skupimy sie przede wszystkim na tych bialkach. ze zagiecic DNA. Po porownaniu struktury bialek wiazacych sie ze specyficznymi sekwencjami DNA. szybko staje sie jasne. decydujqcej 0 wiqzaniu przez to biatko sekwencji specyficznej. macji helisy. 1995). "N" i "C" oznaczaia odpowiednio koniec N i koniec C domeny.2.20 Domena typu helisa-skryt-helisa ------- Rysunek przedstawia umiejscowienie domeny HTH (kolor niebieski) represora bakteriofaga 434 E. Przedrukowano z: Andrew Travers. ze rodzine t~ mozna podzielic na kilka grup.czynnik transkrypcyjny kregowcow pit-l .' z dwierna domenami .bialko regulatorowe wyzszych Eukaryota SRY . Szczegolowe zapoznamy sit. nie wiadomo w Jakim stopniu zagiecie DNA wplywa na wiazanie bialek.3. ktore mog.5. Aby specyficznie wiazac si~ z podwojna helisa. T raversa .2). oct-I. W kilku przypadkach wykazano. Podstawa podzialu jest struktura segmentu bialka. 7. a wiec wiaza sie z ograniczona liczba miejsc w czasteczce DNA. bialko musi wejsc z nia w kontakt umozliwiajacy rozpoznanie sekwencji. histone fold) Domena HU/IHF* Szczelina w polimerazach * Domena HU/IHF bakteryjnych bialek HU niespecyficznie wiaze DNA (patrz sekcja 6.domena typu helisa-skret-hclisa oraz z palcem cynkowym. coli bialko Antennapedia Drosophila bialko Pax . Luisi. wywolane zwiazaniem bialka z odpowiednia sekwencja. Prawdopodobnie niektore z domen powstaly kilkakrotnie w czasie ewolucji.7.czynnik transkrypcyjny ssakow histony Eukaryota bakteryjne bialka HU i IHF polimerazy DNA i RNA Wstega-helisa-bellsa Domena TBP Dimer barytka-B (ang. Arc i Mnt eukariotyczne bialko wiazace sekwencje TATA bialko E2 papillomawlrusow NF-KB .drozdzowy czynnik transkrypcyjny represory bakteryjne . Dokonamy rowniez przegladu pozostalych dornen wiazacych DN!\' Rysunek 7.niejszv typ oddzialywan. Falvo i wsp. DNA .2 Biafko jako partner Zapoznalismy sit.4 ODDZIAt YWANIA MI~DZY DNA I BIAtKAMI 165 Tabela 7. czesto pochodzacych z bardzo roznych organizmow. istotnymi w tworzeniu kornpleksow z bialkarni i mozerny teraz zajac sit. 1993. high mobility group) Palce cynkowe Palec cynkowy typu C2H2 Cysteinowy palec cynkowy Dwujqdrowy palec cynkowy Domena zasadowa represory laktozowy i tryptofanowy E.5 Domeny wiazace DNA Przyklady bialek rnajacych taka domene Domena Domeny wiClzClce specyficzne sekwencje DNA Domena typu helisa-skret-helisa Typowa helisa-skret-helisa Domena homeotyczna Podwojna domena homeotyczna Domena POU Uskrzydlona helisa-skret-helisa Domena HMG (ang. Kazdy z rodzajow domeny wiazacej DNA mozna znalezc w wielu bialkach. 1995. zawarta w konformacji helisy. Przewaznie towarzysza ternu rnniej specyficzne oddzialywania z powierzchnia czasteczki DNA.drozdzowy czynnik transkrypcyjny GCN4 . odgrywa istotna role w regulacji ekspresji pewnych genow (np.! po prostu stabilizowac kompleks bialko-DNA lub dzieki ktorym jest bye moze odczytywana posrednia informacja 0 sekwencji nukleotydow. rei homology domain) Domeny niespecyficznie wi'lzClCe DNA Domena histonowa (ang.MetJ. ktory oddzialuje z DNA (tab.1 0 bialkach biorqcych udzial w upakowaniu nukleoidu) z wyjqtkiem domeny w bialku IHF (ang.' samymi bialkami. Chapman & Hall. za zgoda A. coli w wiekszym rowku podwojne] helisy DNA. 7. integration host factor).4. ~-barrel dimer) Domena RHB (ang.Protein Interactions. oct-2 .bialka regulatorowe kregowcow GABP . by mozliwy byl bezposredni odczyt sekwenrji. ktore rozpo znaja specyficzna sekwencje nukleotydow. W wiekszosci przypadkow jest to zwiazane z penetracja wiekszego lub mniejszego rowka tak.bialko ssakow determinuiace plec eukariotyczny czynnik transkrypcyjny TFIIIA receptory horrnonow steroidowych wyzszych Eukaryota GAL4 . sekcja 8.' juz z cechami strukturalnymi DNA.

1988). double strand RNA binding domain) jest podobna do domeny RNP. skladajaca sie z. Z RNA wiaze 13 na koncu domeny. w ktorych po raz pierwszy slwierdzono wystepowanie tego typu domeny (Herr i wsp. [ej orientacja w wiekszym rowku nie zawsze jest taka sama. a mianowicie: • Domena POU przewaznie wystcpuje w bialkach majacych rowniez dornene homeotyczna. Inne czesci bialka rowniez oddzialuja z powierzchnia czasteczki DNA.3. a polozenie aminokwasow bczposrednio oddzialujacych z nukleotydami jest rowniez zmienne. a wiec stanowi tylko niewielka czesc bialka. Irzecia helisa pelni role helisy rozpoznajacej.!. ktorcj kontakt z DNA decyduje 0 mozliwosci bezposredniego odrzytu informacji z sekwencji kwasu nukleinowego. Dornene typu heli$a-$kr~t-heli$a moi:na znaleic w bialkach prokariotycznych i eukariotycznych Pierwsza zidentyfikowana struktura wiazaca DNA byla domena typu helisa-skret-helisa (HIH . Miedzy druga i trzeciq helisa znajduje sie skret 13. naleza: • z czterech Domena rybonukleoproteinowa (RNP) sklada sie struktur 13 i dw6ch helis a polaczonych w kolejnosci 13-a-13-13-a-13. Motyw ten jest stosunkowo go znalezc przynajmniej w jednym rzadki. ze pasuje ona do wiekszcgo rowka DNA. winged he lix-turn-helix) jest inna rozbudowana wcrsja podstawowej struktury HIH. Jedno Bialko z bialek rybosomowych wiaze sle z rRNA za pornoca do domeny homeotycznej. 20 aminokwasow. Nazwa domeny pochodzi ad pierwszych liter nazw trzech bialek.20). • Domena K-homologiczna (ang. Glowna role w wiazaniu RNA odgrywajadwie kach wiazacych srodkowe struktury 13. w ponad 250 przypadkach.- Do najczesciej wystepujacych cych RNA (Twyman. z tym jest ai ze kolejnosc struktur drugorzedowych strukturami dwuniciowe eukariotycznych bialek wiazacych DNA i majacych dornene HIH.3. '1. DNA-Protein Interactions. jedno z bialek homeotycznych Drosophila. 1993. Domena HIH sklada sie przcwaznie z ok. reguluj4CY ekspresje operonu laktozowego (sekcje 8. Pierwsza helisa a razem ze skretern p umiejscawiaja druga helise a na powierzchni bialka. Sposrod roznych Ramka 7. dornena ta zbudowana jest z dwoch helis a oddzielonych skretern w lancuchu bialkowym (rys. K-homology domain) rna strukture 13-a-a-13-13-a.3. Struktura skretu nie jest przypadkowa. za zgoda A. Hclisa rozpoznajaca maze miec rozna dlugosc i przcwaznie jest dluzsza w bialkach eukariotycznych.ang.1).!. w przypadku pewnych struktury bialek moze rownlez podobnej wiazac RNA. W bial- RNA naiczescie] spotyka sle dornene • RNP. domena ta wystepu]e w bialkach wiazacych RNA. Obydwie dorneny prawdopodobnie wspolpracuja ze soba. Dlatego ta druga helisa a jest helisa rozpoznajaca. sklada jqCq sie z czterech aminokwasow. Zawieraja j4 niektore najlepiej poznane regulatorowe bialka bakteryjne. ktore wlaczaja i wylaczaja ekspresje poszczegolnych genow. Przedrukowano z: Andrew Travers. wiazac rozne fragmenty podwojnej helisy. represor laktozowy. 1990). Domena wi<lz<lca dwuniciowy RNA (dsRBD .ang. Z jednej strony domeny HIH rna ana trzecia helise a. helix-turn-helix) (Harrison i Aggarwal. Helisy 1-3 polozone sa w kierunku N-.166 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WIAll\CYCH DNA i 11.3: Domeny wiClzClce RNA domen bialkowych wi¥. Drugim z nich jest przewaznie glicyna. w taki sposob. RNA wiaze sie rniedzy para helis a. rnozna wymienic te.21 Domena homeotyczna Pokazano trzy pierwsze helisy typowej domeny homeotycznej. pornagajac w prawidlowym ulozeniu helisy rozpoznajacej w wiekszyrn rowku. Znane Sq rownicz inne wersje eukariotycznej dorneny typu I-ITH.ca DNA. a z drugiej strony . rnoze wiazac sie zar6wno z DNA. jak i z RNA (sekcja I 1. ktore Sq istotne dla regulacji ekspresji genow w procesie rozwoju. Rysunek 7.3). Bicoid.3. znaleziono j'!. Naleza do nich bialka z dorncna homeotyczna. lecz rna specyficzna konforrnacje zwana skretern ~..1. 1998). 60 aminokwasow tworzacych cztery helisy a. ale rnozna jadrowyrn bialku • • wiazacym RNA. Domena homeotyczna wi¥. jednak szczegoly oddzialywania helisy rozpoznajacej z wiekszyrn rowkiem DNA nie s4 dokladnie takie same we wszystkich przypadkach. a pierwsza he lisa oddzialuje z mniej szym rowkiem (rys. np. a helisa pierwsza oddzialuje z mniejszyrn rowkiem. ktorych rola zostanie omowiona w sekcji 11. Dornena homeotyczna jest rozbudowana wersja domeny HIH. a-13-13-13-a. Uskrzydlona helisa-skret-hclisa (ang. Damena HIH wystepuje w wielu prokariotycznych i eukariotycznych bialkach wiazacych DNA. Chapman & Hall. sie rniedzy Jak wynika z nazwy. [ak wynika r jej nazwy.C wzdiuz domeny. 7.21). Hclisa trzecia jest urniejscowiona w wiekszyrn rowku.1 Chociaz kazde z opisanych prokariotycznych i eukariotycznych bialek rna domene HIlI.harrnonijke ~. T raversa .

w tym z dwoch cystein i dwoch histydyn. Prawdopodobnie w wiekszosci przypadkow kazdy palec cynkowy niezaleznie oddzialuje z DNA. wieksza od standardowego palea cynkowego (rys. skladajacy sic z okolo 12 aminokwasow. skladajaca sie z dw6ch helis a zawierajqcych szesc cystein koordynujacych dwa atomy cynku. "N" I "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny. Tworza one razem jedna domene. 1993. z ktoryrn zapoznamy si~ szczegolowo. z kt6rych powstaje "palec" wystajacy z powierzchni bialka. jak: • Dornena zasadowa. 1998). za zgoda A. decydujaca 0 specyficznym oddzialywaniu z DNA. ze jedna helisa a umiejscawia si~ w wiekszym rowku DNA. Przedrukowano z: Andrew Travers. Miedzy nimi znajduje sie atom cynku. natomiast w eukariotycznych spotyka si~ jq dose C7. Chapman & Hall.kolor zielony. kt6ry utrzymuje harrnonijke i helisc w od· powiedniej pozycji w stosunku do siebie.23). Wyizolowano bialka majace dwa.kolor zielony. ze 1 % genow ssakow kodujc bialka majace t~ domene. zawierajaca liczne aminokwasy zasadowe. 1993. Szacujc sift' rowniez. ze sposrod 19 000 bialek nicienia Caenorhabdiiis elegans . a druga helisa a oddzialuje z innymi bialkami. jak arginina. zwiazany z dwiema cysteinami i dwiema histydynami (rys. Traversa • . w ktorej struktura rozpoznojaca DNA jest helisa a.harrnonijke ~ i nastepujaca po niej helise a. atom cynku jest zwiazany z cztererna cystcinami. Bialka z rodziny receptorow jadrowych (receptory steroidow) maja domene wiazaca DNA.5 zawiera palcc cynkowy (Clarke i Berg. Przedrukowano z: Andrew Travers.')3.4 ODDZIAlYWANIA MI~DZY DNA I BIAlKAMI 167 W bialkach eukariotycznych wiqiqcych DNA czesto wyst~pujq palce cynkowe Palec cynkowyjest drugim rodzajem domeny wiazace] DNA. Z wiekszym rowkiem DNA Rysunek 7. od atomu cynku. Osobliwoscia tej dorneny jest formowanie sie helisy a tylko wtedy. 7.22 Palec cynkowy typu Cys2His2 Na rysunku pokazano palec cynkowy biatka SW 15 drozdzy. struktura samego palea. Traversa N teinowym paleu cynkowym nie rna histydyn. Chapman & Hall. 7. Na przyklad w cys- Rysunek 7. ale sa rowniez przyklady bialek z duzo wieksza iloscia palcow.7. 1998). Pozostale odrniany palea cynkowego roznia sie od wersji Cys. Helisa a jest tq czescia domeny. Liczne bialka eukariotyczne maja dornene zasadowa. Niektore nie maja struktury P i skladaja sie po prostu z jednej lub kilku helis a. w ktorych helisa a nie jest struktura rozpoznajaca. Interesujaca cccha palea cynkowego jest wystepowanie w niektorych bialkach wielokrotnych kopii tej dorneny. w ktorym jest ich 37. Inne rodzaje domen specyficznie wiqiqcych DNA W roznych bialkach odkryto kilka innego rodzaju domen wiazacvch DNA.His. bialka biorace udzial w procesie transkrypcji DNA. Jej umiejscowienie w tym rowku zalezy od harmonijki ~. "N" i "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny. jak jedno z bialek ropuchy. trzy lub cztery palce cynkowe. Atom cynku jest zwiazany z dwiema cysteinami harmonijki ~ i dwiema histydynarni helisy o. Grupy R tych aminokwas6w . DNA-Protein Interactions. za zgoda A. Tego typu domena rzadko wystepuje w bialkach prokariotycznych. DNA-Protein Interactions.~Sto(Mackay i Crossley. Mozna wvroznic przynajmniej szesc roznych wersji palea cynkowego. Aminokwasy te tworza dwie struktury .23 Palec cynkowy receptora steroid6w Grupy R arninokwas6w oddziatujqcych z atornem cynku . sa jednak przyklady bardziej zlozonych zaleznosci miedzy paleami. oraz. Wydaje sie. seryna i treonina.His. Wydaje si~. oddzialujacej ze szkieletern cukrowo-fosforanowym. Pierwsza szczegolowo zbadana domena tego typu byl palcc cynkowy typu Cys. Domena typu wstega-helisa-helisa jest jed na z nielicznych domen. Rozny moze bye rownicz sposob utrzymywania atomu cynku na swoim miejscu. W bialku nie zwiazanym z DNA helisa nie powstaje.22). np. ktorej oddzialywania z wiekszym rowkiern DNA sa decydujace dla wiazania bialka. gdy bialko oddzialuje z DNA..

tzn. W niektorych przypadkach tworza sif. Aby osiagnac tf.. 1993. Lcucyny pochodzace z dwoch helis t'!cz'! sie ze soba dzieki ocldziatywaniorn hydrofobowym (patrz Tomko 7.3) i od tego bialka pochodzi tez nazwa domeny (Kim i wsp.4. TATA-binding protein) (sekcja 8. 1998). 7. Chapman & Hall. Oddzialywania mi~dzy DNA i biaikam. drugie ... Przedrukowano z: Andrew 1ravers. jed no . Biaika wiqzq sic z DNA za pomocq wiazan niekowalencyjnych. dimeryzujace helisy wydluzaja sre i tworza pare zasadowych domen wiazacych DNA. -_ . Podobnic. 1993.. kt6re wiaza sit. Wysunit. W przykladowe] domenie pokazanej na rysunku.. z kt6rymi rnogloby siE. Domene typu wstega-helisa-helisa znaleziono w kilku bakteryjnych bialkach regulato rowych . bialka te przewaznie lub nawet caly czas sa niespecyficznie polaczone z DNA (Stormo i Fields.24).ang. Traversa . s. Z terrnodynamicznego punktu widzenia wiazanie specyficzne jest faworyzowane i dlatego bialko laczy sif.' wiazacych. Wyrnaganie to czesciowo wyjasnia. w innych . Traversa oddzialywaniom elektrostatycznym 7. Chapman & Hall. Kulki przedstawiaja grupy R leucyny. "N" i "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny.2.' terrnodynarniczna preferencje.' gl6wnie dzieki Rysunek 7. za zgoda A.. ze na tyrn poziomie oddzialywan bialko-DNA kazdy przypadek jest unikatowy i szczeg6ly wiazania nalezy opracowac raczej na podstawie badan strukturalnych. Struktury ~ z lewej strony wiq±'! sie z wiekszym rowkiem podw6jnej helisy. Przedrukowano z: Andrew Travers.! czcsciamt dwoch roznych bialek. Dodatnio naladowane grupy R aminokwas6w.wiazac niespecyficznie. lqczq sit.dimeru skladajacego sie z dwoch identycznych bialek. Uogolniajac mozna stwierdzic. 7. coli .' bezposrednie wiazania wodorowe miedzy bialkiern a powierzchnia podwojnej helisy lub jej wiekszym rowkiem. jednak domena TBP oddzialuje z DNA g16wnie w mniejszyrn. Wiekszosc bialek. a nie w wiekszym rowku.' z nim niespecyficznie.kolor niebieski.2. jak w przypadku domeny typu wstcga-helisa-helisa. mimo ze dookola sa doslownie rniliony innych miejsc. ktore Iacza si~ z wiekszvm rowkiem. DNA-Protein Interactions. w czasie procesu wiazania bialka z DNA rnusi powstawac jak najwieksza ilosc polaczen miedzy nimi. chociaz mogq one rowniez tworzyc wiazarua wodorowe. utrzyrnujac razem dwa bialka tworzace dirner. struktura rozpoznajaca jest harmonijka ~. • Domena TBP zostala dotychczas zidentyfikowana tylko w bialku wiazacym sckwencje TAT A (TBP .'ze swoim specyficznym miejscern wiazania. ujemnie naladowanymi resztarni fosforanowymi na powierzchni helisy DNA. za zgoda A..' z nim. Suwak leucynowy __ _----_.25 _.zielony. W mniejszym rowku wazniejsze sa oddzialywania hydrofobowe. Niebieska i zielona struktura S. moze rownicz wiazac sit. DNA Protein Interactions.' wstega. ---------- Na rysunku przedstawiono suwak leucynowy typu b?IP .'to sugestie. a nie na podstawie porownan z innyrni bialkami.3 Partnerstwo DNA i bialka Konczac nasze rozwazania om6wimy jeszcze wazne elernenty partnerstwa DNA i bialek z nirn sit. dlaczego wiaze sit._. dwuniciowa harmonijka ~ (rys. 1993).168 ROZDZIAt I • ROLA BIALEK WII\LACYCH [)NA Rysunek 7. W wiekszyrn rowku DNA zasady azotowe i grupy R aminokwas6w struktury rozpoznajacej bialka lacza sie za pomOcq wiazan wodorowych.·helisa-helisa represora MetJ E.w wiazaniu posredniczy czasteczka wody. takich jak lizyna i arginine.24 Domena typu wstega-helisa-helisa Rysunek przedstawia dornene typu wstega. ze poniewaz w kornorce jest tak duzo DNA i tak malo kazdcgo rodzaju bialek wiazacych sit.' ze specyficznymi sekwencjarni w DNA. 153).

co prowadzi do ponad dwukrotnego . Turner JM.. 512 520. a inne miedzy jcdna zasada i dworna aminokwasami. 208. Hendrickson Wand Schleif R (1985) A dimer of AraC protein contacts three adjacent major groove regions at the Ara I DNA site. Galas D and Schmitz A (1978) DNase footpnnting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. jezeli tylko zostanie poznana sekwencja arninokwasow jego helisy rozpoznajacej. pp. Worth. Baird EE. Lacza sie one z takimi samymi resztami drugiej czasteczki bialka.. Bioi. Kielkopf el. et 01. Oxford University Press.. Harrison SC and Aggarwal AK (1990) DNA recognition by proteins with the helix-turn-helix motif. 7.. Mackay JP and Crossley M (1998) Zinc fingers are sticking together. Z jednej strony. 933-969.trzerna wchodzacymi w sklad helisy rozpoznajacej i czwartym bezposrednio z nia sasiadujacyrn. In: DMJ lilley. Falvo jV.dzie sit. IRL Press. tworzac dimer (rys.w stosunku do monomeru . Genes Develop. Geiger JH. sklada jacymi si~ z dwoch polaczonych ze soba czasteczek bialka. Wiele bialek wiazacych DNA jest dimerami. Curro Opinion Struct. tworzacych miejsce wiazania. Trends Biochem.zwiekszcnia ilosci polaczen z DNA.. Nature. 83. 23. Choo Y and Klug A (1997) Physical basis of a protein-DNA recognition code. I 17·125.25). 282. oct-L and Caenorhabditis elegans unc-86 gene products. 282. Herr W. Rev. Wiele bialek oprocz domeny wiazacej DNA rna rowniez charakterystyczna domene bioraca udzial w oddzialywaniu bialko-bialko. Sci. ktore jeszcze bardziej dopasowuja do siebie dwie laczace sie powierzchnie i umozliwiaja powstanie dodatkowyeh wiazan. (1988) The POU domain: a large conserved region in the mammalian pit-I. skladajacy si~ z helisy a. i wynika to rowniez z koniecznosci zwiekszenia liczby polaczen z DNA. 365. Sci. co umozliwilo sformulowanie zasad rzadzacych tymi oddzialywaniami.t-l. Annu. Tlumaczy to rowniez. Kadonaga JT (1991) Purification of sequence specific DNA binding proteins by DNA affinity chromatography. nalezacych do roznych palcow cynkowych. Science. 2018 2022. 372-376. 3157-3170. z kt6rq bt. dlaczego podczas oddzialywania nastepuja konformacyjne zmiany w strukturze jednego lub drugiego partnera. niezbednych do speeyfieznego wiazania sie z nim. I 10 I-I I I I. Kim YC. 59. Bioi. 10-23. 82. Nucleic Acids Res.. DNA-Protein' Structurot tnteroctions. Oxford. Z pcwnym prawdopodobicnstwcm popelnienia bledu pozwala to wy dedukowac. na powierzchni helisy a znaiduja sie reszty leucynowe. Proc. Luisi B (1995) DNA-protein interaction at high resolution. Cell. Oxford. Methods Enzvmoi. Natl Awd. w wyniku ktorego powstaje dimcr. LlTERATURA CYTOWANA Barton GJ (1995) Protein secondary structure prediction. . Nucleic Acids Res. Sturm RA. 3047-3060. by na podstawic okreslenia struktury helisy rozpoznajacej w domenie wiazacej bialka mozna bylo prze widziec specyficzna sekwencje. Curro Opinion Struct. oc. Dimeryzacja zachodzi w sposob umozliwiajacy oddzialywanie z helisa domen wiazacych DNA obydwu czasteczek tworzacych dimer.. Dimerarni jest wiele bialek majaeyeh dornene HTH oraz bialek z palcami cynkowymi. 1-48. Science. Tego typu domena jest suwak leucynowy. Czy na podstawie struktury helisy rozpoznajqcej moina przewidziec specyficznq sekwencjt. Lehninger A (1970) Biochemistry. Drugim rodzajem domeny odpowiedzialnej za dimeryzacje jest dornena typu helisa- -p~tla-helisa. z sekwencjami DNA przez nie rozpoznawanymi. Z jaka sekwencja bedzie sie wiazac nowy palec eynkowy. 9. 111-115. 3129-3133. z ktora bedzie sie ono wiazac? Dotyehezas nie udawalo sie osiagnac lego celu. New York. W tyeh bialkach najwazniejsze polaczenia z zasadami azotowymi nukleotydow. Clerc RG. 1-4. Garner MM and Revzin A (1981) A gel electrophoretic method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. ona wiqzac? Rodzi sie intrygujace pytanie. 1997). I S I 3-1 S 16. Clarke ND and Berg JM (1998) Zinc fingers in Coenorhabditis elegans: finding families and probing pathways. 2. 5. Czesc oddziaiywan zachodzi rnicdzy jcdnym aminokwascm i pojedyncza zasada. 7. chociaz wydedukowano niektore zasady rzadzace oddzialywaniami DNA z pewnymi typami palcow cynkowych (Choo i Klug.. Mimo podobnej nazwy jest ona zupclnie irma niz wiazaca DNA domena helisa-skret-helisa i nie nalezy ich mylic. Evans JNS (1995) Biomolecular NMR Spectroscopy. Hahn S and Sigler PB (1993) Crystal structure of a yeast TBP/T ATA-box complex. gdzie mozliwosc wytworzenia polaczen miedzy bialkiem i DNA jest najwieksza. zwinietej scislej niz standardowa helisa. USA. powstaja na skutek oddzialywan z czterema arninokwasami . White S. Porownano sekwencje aminokwasow w helisach rozpoznajacych. Czy mozna poznac proees speeyfieznego wiazania DNA na tyle dokladnie. Thanos D and Maniatis T (1995) Reversal of intrinsic DNA bends in the If'NP gene enhancer by transcription factor's and the architectural protein HMG I(Y). Dervan PB and Rees DC (1998) A structural basis for recognition of A·T and T·A base pairs in the minor groove of B-DNA.S. Biochem. Bialka tworzace dimer prawdopodobnie w pewien sposob wspoipracuja ze soba.4 ODDZIAl YWANIA MI~DZY DNA I BIAlKAMI 169 w czasie ewolucji struktury rozpoznajace wielu domen wiazacych DNA dokladnie dopasowaly sie do wiek szego rowka w podwojnej helisie. ed. Szewczyk JW.7.

New York.. free energy and information content in protein-DNA interactions. Przeklad polski: Podwojna spirala. Atheneum.Przyst~nie podane informaCJe na temat bialek wiqiqcych DNA Travers A (1993) DNA-Protein Interactions. Proc. Singh H. Baldwin AS and Sharp PA (1988) Molecular cloning of an enhancer binding protein: isolation by screening of an expression library with a recognition site DNA. Nat! Acad. 52. Strachan T and Read AR (1996) Human Molecular Genetics. Mol. London. LlTERATURA UZUPEtNIAJ)\CA Bates AD and Maxwell A (1993) DNA Topology.zfy opis struktury DNA Branden C and Tooze J (1991) Introduction to Protein Structure. DNA -Protein: Structural Interactions. 281. IRL Press. Bates AD and White MRH (1997) Instant Notes in Molecular Biology. Sci.Zwif. . Bio/ogia molekularna. Travers AA (1995) DNA bending by sequence and proteins. LeBowitz JH.' In Focus. . pp.Opracowanic tematu na pcriomic badawczym. In: DMJ Lilley ed. 205-211. Bioi. 729·-740. 27. Chapman & Hall. 49-75. Turner PC. 675-687. IRL Press. Nature. . 737-738. McLennan AG. . IRL Press. 37. Corey RB and Branson HR (1951) The structure of proteins: two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. Ptoc. Oxford.170 ROZDZIAl 7 • ROLA BIAlEK WIAZI\CYCH DNA Pauling L and Corey RB (1953) Configurations of polypeptide chains with favored orientations around single bonds: two new pleated sheets.Posrerra wiodotnosc! z tego rozdziafu 0 ciokfadniejsze informacje no temat bialek wiqiqcych RNA Neidle S (1994) DNA Structure and Recognition. BIOS Scientific Publishers. Sci. Lilley OMJ (ed) (1995) DNA-Protein: Structurallnteracitons. PWN. Nagai K and Mattaj IW (eds) (1994) RNA-Protein Interactions. Stormo GO and Fields OS (1998) Specificity. Oxford. Trends Biochem. Warszawa 1975. IRL Press. USA. London. j.Najbardziej przyst~pne opracowonie stJOsr6d wielu no ten temat. Sci. Oxford. Oxford. . Garland. WP. . 109-113. Warszawa 1999. Oxford. Oxford. Rhodes G (1993) Crystallography Made Crystal Clear. IRL Press. . Cell. Przeklad polski: Kr6tkie wykfady. Oxford. BIOS Scientific Publishers. Twyman RM (1998) AdvanGed Molecular Biology. Natl Acad. Young MA and Beveridge OL (1998) Molecular dynamics simulations of an oligonucleotide duplex with adenine tracts phased by a full helix turn. 23. London. Oxford. BIOS Scientific Publishers. Watson JO (1968) The Double Helix. 415-423. Watson JO and Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. 171.Najwainiejsze odkrycie XX wieku opisane w stylu opery mydlanej. . Pauling L. A Concise Reference. Academic Press. In Focus. USA.Najbardziej wszechstronne opracowanie na ten temat.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful