P. 1
7 - Rola białek wiążących DNA

7 - Rola białek wiążących DNA

|Views: 1,152|Likes:
Wydawca: silence645

More info:

Published by: silence645 on May 29, 2011
Prawo autorskie:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

12/11/2012

pdf

text

original

Rola bialek wiClzClcychDNA

Spis tresci
7.1 Struktura DNA
7.1.1 Nukleotydy i polinukleotydy 7.1.2 Podwojna helisa

144
145 145

7.2 Bialka
7.2.1 Cztery poziomy struktury bialka

150
151

7.3 Metody badania bialek wiqiqcych DNA
7.3.1 Identyfikacja w DNA miejsc wiazacych bialko 7.3.2 Oczyszczanie bialek wiazacych DNA 7.3.3 Badanie struktury bialek i kompleks ow DNA-bialko

156
156 160 160

7.4 Oddzialywania mi{?dzy DNA i bialkami
7.4.1 DNA jako partner 7.4.2 Bialko jako partner 7.4.3 Partnerstwo DNA i bialka

163
163 165 168

144

ROZDZIAL 7 • ROLA BIALEK WIA,2:ACYCH DNA

Fakty i zalozenia
• • • • • • • DNA i bialka sq liniowymi, nierczguiezionumi polimerami. przez sekioencje Podw6jna helisa DNA moze przubierac roznorodne konformacje. Funkcjonalna, tr6jwymiarowa struktura bialka jest determinowana aminokwas6w. Sekwencje DNA, technik. kt6re unqzq biatka.rmozna identyfikowac

za pomocq r6inorodnych

Analiza rentgenowska i NMR sq doskonalymi metodami umoiliwiajqcymi okreslenie struktury bialka. Bialka ioiqzqce DNA prawdopodobnie rozpoznajq swoje miejsca uiiqzania bezposrednio odczytujqc injormaqe zawartq w sekwencji podw6jnej helisy. Bialka toiqzqce eie z DNA majq specjalne motywy sirukiuralne, umoiliwiajqce oddzialywanie z podw6jnq helisq. im scisle

Genom jest struktura nieaktywna. Przechowywana jest w nim informacja, sam nie rna jednak zdolnosci przekazywania tcj inforrnacji do kornorki, To od bialek oddzialujacych z genom em - poprzez wiazanie do specyficznych sckwencji DNA Iub w mniej specyficzny sposob zalf'7.y, ktore gf'ny i w jakim czasie b~dq ulegac ekspresji. Do bialek wiazacych DNA nalcza enzymy przepisujace informacje zawarta w genach na czasteczki RNA oraz bialka wlaczajace i wylaczajace geny. Dlatego tcz zrozumienie sposobu dziaiania bialek wi'1/.qcych DNA jest kluczem do rozumienia dzialania genomu. Aktualna wiedza w tej dziedzinie opiera si~ na badaniach strukturalnych, umozliwiajacych szczegolowe opisanic oddzialywan micdzy czasteczkarni DNA i bialek. Podstawe tyeh badan stanowia prace prowadzone w pierwszcj polowie XX wieku. krorych ukoronowaniem byio odkryc:ie struktury DNA - podwojnej helisy (Watson i Crick, 1953) i wyjasnienie natury podstawowych jednostek strukturalnych bialek (Pauling i wsp., 1951; Pauling i Corey, 1953). Rozdzial niniejszy rozpoeznierny od przegladu tych klasycznyc:h pral' strukturalnych i pokazania, jak zostaly one poszerzone dzieki badaniom prowadzonyrn od lat 50. Nastepnie omowimy techniki, ktore znajduja zastosowanie w badaniach oddzialywan miedzy DNA i bialkami, a na koniec siegnierny do aktualnej wiedzy o tym, w jaki sposob bialka oddzialuja z DNA. Umozliwi nam to przejscie do rozdzialow 8 i 9, w ktorych

przyjrzymy si~ roznym rolom, odgrywanym przez bialka wiazace DNA w ekspresji genornu. Z rozdzialow 9 i 10 dowiemy sit;', ze pokrewne bialka, wiazace RNA, a nie DNA, pelnia rowniez wazna rolf;' w ekspresji genomu, a w rozdzialach 12 i 13 odkryjerny, ze bialka wiazace DNA odpowiadaja takze za replikacje genomu oraz korekte zmian w sekwencji DNA, wywolanych dzialaniem czynnikow chemicznych i fizycznych.

7.1 STRUKTURA DNA
Aby zrozumiec strukture DNA, musimy zadac dwa pytania. Pierwsze dotyczy struktury polinukleotydu, polimeru DNA zbudowanego z polaczonych podjednostek, kodujacego inforrnacje genetycznq. Ten aspekt struktury DNA zostal bardzo dokladnie opracowany przed rokiern 1940. Drugie pytanie dotyczy sposobu, w jaki lacza sie dwa polinukleotydy, tworzac dwuniciowa czasteczke DNA, ktora znajdujemy w zywych komorkach. To sarno pytanie zadawali sobie Watson i Crick we wczesnych latach 50. Dokonane przez nich odkrycie podw6jnej helisy bylo punktem zwrotnym w genetyce, nie wyjasnialo jednak do konca struktury DNA w zvwvch kornorkach. Ostatnie badania pokazuja, ze podwojna nelisa DNA moze przybierac rozne konformacje.

Nie istnieja czasteczki RNA bedace odpowiednikami prokariotycznyeh i eu kariotycznych chromosornow. w wyniku kt6rej nastepowaloby wydluzanie w kierunku 3'->5'. jednak warto w tyrn miejscu zapoznac siE.1.'gla 2' reszty cukrowej. G i 1'. w ktorcj grupa hydroksylowa (-OH) polaczona z atornem w~gla 2'. Komorki zawieraja nuklcotydy z jedna. Zasada azotowa jest polaczona z reszta cukrowa wiazaniern ~-N-glikozydowym.'gla nosza numery l' (jeden prim). 5.3): trzy 1. Po pierwsze w 1914 r.'grupa trifosforanowa polaczona z atomem wegla 5' (koniee 5'). skladajaca si~ z jcdncj.1) lub 3'->5'. Bye moze z tego tez powodu w sklad czasteczki RNA nie musi wchodzic wiecej niz kilka tysiecy nukleotydow.! Sq posrednie efekty obecnosci grupy hydroksylowej polaczonej z atomem wE. ale dwie cechy rozniq go od DNA (rys. zapisywana jako 5' ->3' (w dot na rys 7.'gla 5' rcszty cukrowej. Reszty fosforanowe OZnaeZ011fSq symbolami C1. Te same ograniczenia dotycza polimeraz RNA. Skr6ty nazw tych czterech nukleotyd6w to odpowicdnio: dAIP. co powoduje dodatkowe kornplikacje w procesie replikaeji dwuniciowej czasteczki DNA (sekcja 12. RNA jest rowniez polinukleotydem. Struktura chemiczna czterech nuk/eotyd6w Kazdy z czterech nukleotydow w DNA zawiera skladniki (patrz rys. ze reakcja cherniczna. jest rozna od reakcii. Zasada azotowa. Struktura tego wiazania wskazuje. podobnie jak DNA. (IP. 2' itd.3. RNA Chociaz nasza uwaga zwrocona jest g16wnie na DNA. 7. a nawet milion6w jednostek. dGIP i dIIP lub. kt6ra jest pentoza.1 STRUKTURA DNA 145 7. kt6re mogq bye polaczone w roznej kolejnosci. dwoma lub trzema resztarni fosforanowymi. Polinuk/eotydy W czasteczce polinukleotydu pojedyneze nukleotydy polaczone Sq wiazaniem fosfodiestrowym. 3.. udowodniono. Grupa fosforanowa.'gla l' reszly cukrowcj z atomern azotu oznaczonyrn numerem 1 w pierscieniu piryrnidyny lub atornem azotu nurner 9 pu· ryny. ktora jest bardzo podobna. CZf~goprzyczyn. Waznq konsekwencja polarnosci wiazania fosfodiestrowego jest fakt. Odkryeia tego dokonano w dwoch etapaeh. cytozyna lub tymina (jednopierscieniowa pirymidyna) alba adenina lub guanina (dwupierscieniowa puryna). ze dwa konce polinuklcotydu sa chernicznie rozne.'gla 3' nastep- 7. Reszta Iosforanowa oznaczona symbolcm a bezposrcdnio biCZy sie z reszta cukrowa.1). zbudowanym z monomerycznych podjednostek . pokazano.2). Dlatego eztery nukleotydy biorace udzial w syntezie RNA to: adenozyno-S' -trifosforan cytydyno-S' -trifosforan guanozyno-S'-tntosforan urydyno-5' -trifosforan Skr6ty nazw tych eztereeh nukleotyd6w to odpowiednio: AIP. Peine chemiczne nazwy ezterech nukleotyd6w. ze DNA jest materialern genetyeznym. Wiele dowodow wskazywalo. zbudowanyeh z czasteezek DNA ziozonych z milionow par zasad. 2.' e struktura z RNA. ze w wyniku przekazania DNA z jednej bakterii do drugiej biorca moze uzyskac now'! inforrnacje genetycznq. Nalezy zwrocic uwagE.1 Nukleotydy .1. po drugie RNA zawiera uraeyl zarniast tyminy.2 Podw6jno heliso Polinukleotydowa strukture DNA znano. zwiazanych z atorncrn wE. Jest ono jednak mniej stabilne niz w DNA. ze cukier ten jest pochodna rybozy. ktore w reakeji polimeryzacji tworza DNA. Czasteczka skladajaca sie z eukru i zasady azotowej nazywana jest nukleozydem: przylaczenie reszty £05toranowej zamienia jq w nukleotyd.1). 1. Po pierwsze cukrem wchodzacym w sklad RNA jest ryboza. Nazwa . laczacym atom wE. Polinukleotyd RNA. laczacym atomy wegla 5' i 3' (patrz rys. tysiecy. ale jako substraty w procesie syntezy DNA wykorzystywane Sq tylko trifosforany nukleozydow. dw6ch lub trzech reszt Iosforanowych.2). C. nierozgalezionym polimerem.7. zostala zastapiona przez grup~ wodorowa (-H). ze geny bakteriofaga 1'2 Sq zbudowane z DNA (Badania i odkrycia 7. 7.1. C.2' deoksyryboza" oznacza.czterech roznych chemicznie nukleotydow. rodzajem cukru zawierajacym piec atornow wegla. Wszystkie naturalnie wystepujace polirnerazy DNA sa zdolne do przeprowadzania reakcji tylko w kierunku 5'->3'. polinukleotydy DNA jest liniowym. 2'-dcoksyryboza. tworzac lancuchy skladajace sie z setek. GIP i UIP lub A. zawiera wiazanie 3'-5'-fosfodiestrowe. gdy mowimy o sekwencji DNA . Na jednym koncu znajdujc siE. ze w ezasie reakeji polimeryzaeji nastepuje usuniecie z nukleotydu dwoch zewnetrznyeh grup fosforanowyeh ~ i y i zastapienie ich grupq hydroksylowa polaczona z atomem wE. zanim odkryto.2. ~li y.. Oznaeza to. Atomy wE. ze polinukleotyd rna okreslona orientacje. a na drugim koncu grupa hydroksylowa polaczona z atomem wE. to: 2'deoksyadenozyno-S' -trifosforan 2' deoksycytydyno-S' -trifosforan 2' -deoksyguanozyno 5'-trifosforan 2'deoksytyrnidyno·S' -trifosforan nego nukleotydu (rys. G i U. dCIP.'gla 3' (koniec 3'). enzym6w syntetyzujacych kopie RNA na czasteczkach DNA (sekeja 8.A. by mogla ona spelniac Iunkcje biologiczne. kt6ra wydluzalaby polimer DNA w kierunku 5'->3'.' na to. 1. . Po drugie w 1952 r.1).1).

ZA.p-o- I I I 5' o II o II o II O· O~.~O~~O!~: 5 o I 0- 3' o I 5 O=I-O-C~H/o ~ 13.1 Synteza polinukleotydu DNA nastepuje w wyniku reakcji polimeryzaeji Reakeja syntezy zaehodzi w kierunku 5' ---? 3'.-O~O~_' 5 03' I OH koniec 3' + Ii II -o-p-o-p-o 0- o I 0 0- i pirofosforan 0- 0- 0- "Ov-r- i I ~O~ i I ~O~ i I 000 ~O~~oJ"" 5 3' o O~. 7 • ROLA BIALEK WIA..~O~~or' 5' I 0- 3' O~. Dodawany nukleotyd iaczy sie z weglern 3'. -0.146 ROZDZIAt.CYCH DNA koniec 51 00p-o0P-O-CH. znajdujqeym sie na koncu istniejqeego polinukleotydu. Reszty fosforanowe ~ i y usuwane 5'1 z dodawanego nukleotydu w forrnie czasteczki pirofosforanu .! OH I o Rysunek 7.

ich praca byla desperackim wyscigiem z Linusern Paulingiern.1: Tworzenie par zasad w RNA W RNA mog.f> czasteczki DNA w kornorce Scl zbudowane z dwoch lub wiece] polinukleotydow w jakis sposob ze soba polaczonych. 153) miedzy adenina w jednym a tymina w dru- Obydwa rodzaje oddzialywan ~ zarowno Iaczenie sie zasacl w pary. Wyst~puj.7.1 STRUKTURA DNA 147 (A) Rybonukleotyd 0-0- I I I 5' ~-O. jak i asocjacja warstwowa Sq wazne w utrzymaniu razem dw6ch polinukleotycl6w. jak dzialaja geny. czasami nazywana oddzialywaniami typu 1(-1(. 7. W czasteczce RNA regiony polaczone w pary przybierajq przewai:. s. -Kopic te przechowuja inforrnacje biologiczna zawarta w sekwencji genomowej czasteczki DNA (rozdz. ana sama byla bardzo bliska rozwiklania tej struktury.! rowniez powstawac pary zasad: A I'!ezy sie z U.1.~-O-I~O~I~~dal 0- 0- 000 ~H~ CH HC OH OH (B) Uracyl • gim lancuchu lub miedzy cytozyna w jednym a guaninq w drugim lancuchu (rys. potwierdzajacych model podwojnej helisy. kt6rej dtugosc nie przekracza zazwyezaj kilkudziesieciu par zasad.1).2. Ramka 7.? z uracylem. jaka odegrala Rosalind Franklin. Rysunek 7.2. Zjawisko Iaczenia sil. Mechanizm ten nazwano synteza DNA zalezna od matrycy. Czasteczka RNA rnoze tez tworzyc pary z DNA. (rozclz. wchodzacych w skiad DNA (rys. a G z C. 7. [edno jest pewne ~ odkrycie podw6jnej helisy przez Watsona i Cricka w sobote. Asocjacja warstwowa. bylo najwazniejszym przelomem w biologii XX wieku.. 3) 7. tak jak w procesie transkrypcji (sekcje 9. Podstawowe cechy podw6jnej helisy Podw6jna helisa sklada sie z dwoch polinukleotvdow przeciwnic skierowanych i zwinietych razern (rys. a G tylko z C. Por6wnaj ze struktura deoksyrybonukleotyd6w.t . s. W procesie tym sekwencja istniejacej nici dyktuje sekwencje nowej nici.1 i 10. jest stabilizowana przez dwa rodzaje oddzialywan chemicznych: • Laczenie sie zasad w pary.1 i 9. jak i w transportujqeym RNA. dzieki czemu spelniaja one swe funkcje w procesie syntezy bialek (sekcje 10.2 Roznice w strukturze chemieznej miedzy DNA iRNA (A) RNA zbudowany jest z rybonukleotyd6w. Tylko puryna i pirymidyna mogq Iqczyc sie ze soba. Takie same pary adeniny z uracylem wystepuja w dwuniciowych strukturach RNA. l .~-O. ktory umozliwia powstawanie dokladnej kopii czasteczki rodzicielskiej w wyniku replikacji DNA. Dzieki temu Watson i Crick zyskali czas potrzebny do ukonczenia struktury podwojnej helisy. a nie atom wodoru. Z ograniczenia. Wyjasnienie jego struktury rnoglo pomoc zrozumiec. Tylko te dwie kombinacje par zasad sa dopuszczalne: A. 12). [ak pisze Watson w swojej ksiazce Podw6jna spirala (patrz Literatura uzupelniajaca). Jednak dorninujaca forma wystepowania par zasad w RNA sa pary wewnatrzczasteczkowe. RNA nie zawiera tyminy i dlatego w hybrydach DNA-RNA adenina tworzy par(. W czasteczce rybozy do wegla 2' przylaczona jest grupa hydroksylowa.2. Ograniczenie to wynika z geometrii zasad i wzglednego polozenia grup. ktory poczatkowo zaproponowal bledny model potrojnej helisy. [ej badania z zastosowanicm dyfrakcji rent gcnowskicj dostarczyly olbrzyrniej ilosci danych doswiadczalnych.nie strukture helisy. synteza RNA zalezna od matrycy. [edyna roznica rniedzy synteza DNA i RNA polega na tyrn.2. ze w czasic syntczy RNA adenina w matrycy DNA nie determinuje wstawienia tyminy do kopii RNA. szczeg6lnie jesli chodzi 0 role. 7 marca 1953 1'.2. Skutkiem powstawania wewnqtrzezqsteczkowyeh par zasad jest faldowanie struktury tyeh czasteczek. zwiekszajace stabilnosc podw6jnej helisy po polaczeniu dwoch lancuchow przez wiazania wodorowe. Dlatego tez Watson i Crick. by zmiescic sie wewnatrz helisy. w sklad kt6rych wchodzi cukier ryboza. ze A moze laczyc sie tylko z T. . na przyklad w czasie wycinania intron6w (sekeja 9.' zasad w pary rna rowniez szczcg6lne znaczenie ze wzglcdu na jego implikacje biologiczne.3H). jest wykorzystywany przez poli merazy RNA. 9).lqczy sie z T i G laczy sie z C.! one zar6wno w rybosomowym RNA.2) lub z irma czasteczka RNA. a nie 2'-deoksyryboza. jak tez inni badaczc starali sie rozwiklac strukturc UNA.3A). kt6re mogq uczestniczyc w wytworzeniu wiazan chemicznych. a para pirymidyna-pirymidyna bylaby zbyt mala . w reakcji syntezy czasteczek RNA ~ kopii gen6w. obejmuje oddzialywania hydrofobowe miedzy sasicdnimi zasadarni. polegajace na wytworzeniu wiazan wodorowych (patrz ramka 7. Jej odpowiednik. Trudno dzisiaj oddzielic Iakty od fikcji. (B) Zamiast tyminy RNA zawiera piryrnidyne o nazwie uracyl.. wynika prosty sposob.3). Para puryna~puryna bylaby zbyt duza. jest ona wykorzystywana przez kom6rkowe polimerazy DNA.

ze DNA jest jedynym skladnikiem bakteriofaga malacym aktywnosc genetycznq. Zakodowany w niej Wyniki tych doswiadczen nie doprowadzily wniosk6w. badania cytochemiczne ze chromosomy zawierajq [ader kow przy- fagowego DNA i tylko 20% fagowych bialek. Jeszcze wczesnie] lekarz Frederick bakteriofag T2 biatka wyznakowane DNA wyznakowany J5 s J2p wykazal. Pomysl. Med. dowane sa z DNA. kt6ry dziedzicza fagi potomne. ze ekstrapolowanie fagowe zbudowane wniosk6w. pneumoniae przeprowadzili . bakterie. to falszywy by/by wynik podstawowego doswiadczenia. ze geny z bialek. Macleod i McCarty pracuiacy na Uniwersytecie brytyjski Columbia w Nowym Griffiths Jorku. a w szczegolnosci Watgenetycznym i dlatego do sona.. jednak do wyciqgniEi!uczeni nie potrafili nad nim badania.wskazywal. 137-158. zastosowaniu wirowania. Hershey AD and Chase M (1952) Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. Obydwie te obserwacje doprowadzily geny faga zbudowane Sq z DNA. przesledzic losy fagowego DNA w czasie izotopami. Wytrzqsanie powodowalo od powierzchni bakterii.. 7. . Poczqtkowym cyklu infekcyjnego czyli wirus6w przeprowadzili w 1952 r. aspekt6w serie skrupulatnych z oczekiwaniami jest DNA. w latach 20.:t~ ~ A~. Alfred Hershey i Marta Chase z Cold Spring Harbor w Nowym celem ich eksperyment6w bakteriofag6w.J. Wynik ten wskazywal. wniosku. sa z RNA). byl szczeg61nie wai:nym dowodem w tak znacznym stopniu. stosujac rnetode znakowania przeprowadzily poniewai: bezposrednich dlatego. ze geny zbudowane sq z DNA Pierwsze z tych doswiadczen . w szczep Ich wynik wirulentny. Gen.}. i:e geny zbudowane sa z DNA. ze nieznany skladnik ("czynnik transformujqcy") pochodzacy z zabitych bakterii Streptococcus pneumoniae rnoze przeksztalcic zywy.!. iz jego wynik sa z DNA.~ \:~Jl ~~ fagl potomne zawieraia potowe rodzicielskicgo DNA i mniej nii I 'Yo rodzicielskich bialek genetycznym. jest eksperymentalnym dowodem potwierdzajqcym. Olbrzymie znaczenie doswiadczenia Hershey'a i Chase Doswiadczenie Hershey'a i Chase zajmuje centralne na potwierdzenie miejsce og61nego z jedw historii biologii molekularnej. ze DNA rnoze bye materialem rnoze bye ukryty odkrycia mechanizm w DNA. 79.IPrzypuszczenie doswiadczen to zakwesprzeprowa- na podstawie xx wieku. fagami T2 fagom hodowle odlqczepo 70% oparty na Iqczeniu sie komplementarprawdziwym ze geny zbu- powstalych na koncu cyklu infekcyjnego. bakterie zawie- rajace tylko geny faga. Wykazano. ale wykazac.~~- . lecz niezjadliwy szczep S. .}. wytrzqsano w wytrzqsarce. ze zaalarmowalo warto prowadzic struktury replikacji. Drugie decydujqce doswiadczenie Jorku.11' odwirowane bakterie DNA zawieraja i tylko 70% fagowego 20% fagowych bialek akceptacji DNA jako materialu genetycznego. kom6rek genomy Hershey'a ze geny zbudowane ale nie dlatego. mozna bylo oddzielk Nastepnie. Udalo bylo zbadanie im sie jednak inaczej nazywanych fagami.BADANIA Geny sa zbudowane z DNA Odkrycie. od fag6w potomnych.. jednak do niej wai:ne nych zasad w pary (patrz rozdz.sprzeczny transformujqcym natychmiastowej Wynikalo byli pewni. byto kluczowym momentem przetomowym i doprowadzito do powstania wsp6tczesnej biologii molekularnej w latach 50. wcale jakie z niego nych na drugie moglo bye bledne (dzisiaj wiemy. co wydawalo Jl ~.w istocie duzy projekt badawczy . jest rzeczywiscie zjawiskiem w czystosc sie mozliwe. a to wlasnie zmiennoscia powinien sie charakteryzowae material genetyczny. iz DNA jest mala czasteczka nie wykazujqcq zmiennosci. wprowadzili hodowle Hershey i Chase wykorzystali kt6re przylqczyly siEi! o bakterii. ze sekret zycia doprowadzil bezposrednio helisy. z kt6rego wynikalo. 36. izotopami. do wniosku. doswiadczen. Kwestionowano deoksyrybonukleazy uzywane] przez Avery'ego do inaktywacji czynnika transformujqcego. Fagi roznia siEi!od ze niekt6re enzym ten zawieral choc slady proteazy..zostalo zakonczone w 1944 r. d rowniez strategie znakowania modyfikacje. mUSZq bye zbudowane tionowano dzonych w polowie Dlatego te~ wysnuto dw6ch wniosek. Literatura cytowana Avery OT. ze wprowadzenie do bakterii fagowych gen6w jest zwiazane z wprowadzeniem DNA i ze to DNA jest tym skladnikiem infekcyjnych czastek fagowych. Po zakonczeniu cyklu infekcyjnego fagi potomne zawieraly prawie polowe rodzicielskiego DNA i tylko 1% rodzicielskich bialek. Macleod CM and McCarty M (1944) Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Nie doprowadzil ze czynnikiem on jednak do I/ \ . infekujqcych Doswiadczenie nie z powodu wyclagnleto. Physio/. ze blizeniu rowna ilosc DNA i bialek. podw6jnej Podobne eksperymenty cia ostatecznych inne grupy badaczy. 12). Rok wczesnie] James Watson i Ole Maal0e pr6bowali cyklu infekcyjnego. Niestety w tym czasie sadzono. Wykonali je Avery. Eksperymentalne dowody pokazujqce. ze bakterie zawieraly 39-56.. wywolujqcy zapalenie pluc. ze czynnikiem transformujqcym jest DNA. ze nie wszyscy mikrobiolodzy czy transformacja pracy Avery'ego. by urnozliwic do bakterii. Bakterie Escherichia coli infekowano i pozostawiano wprowadzenie nie pustych ich gen6w fag6w znakowanymi Nastepnie na kilka minut. Avery i wsp61pracownicy . rowniez wiarygodnosc pewnych Szczeg61nie watpiono Gdyby. Exp... to czesciowo z faktu. i Chase jest tak wai:ne biolog6w. odroznic fag6w rodzicielskich.1 Prowadzone m6rkowych wykazaly.

a G z C. Wynika to z tego. co odpowiada dziesieciu parom zasad na skret.struktura chemiczna trzech par zasad. w kt6rej szkielet cukrowo-fosforanowy kai:dego polinukleotydu przedstawiono jako czerwona wstazke. natorniast para A . Zasady przedstawiono schernatycznie.7.2. Przyjeto. -N ki cu rer OH-N - + \ H guanina tymma adenina wiqzanie wodorowe cytozyna Rysunek 7. Rysunek w czesci (A) zaczerpnieto z: Turner et al. Zwr6c uwage. ktora pozwala ich czasteczkom przybierac nieco rozne ksztalty.Dzisiaj jest jednak oczywiste.3.1 STRUKTURA DNA 149 (A) koniec S' para zasad S' 3' wiekszy ---_ rowek szkielet cukrowo-fosforanowy 3' S' koniec 3' (B) <---() cukier / #-<~:=:)--(l r H \ + N ()= . ze nukleotydy w helisie charakteryzuja sie elastycznoscia. Aby mogla si~ zrnienic konforrnacja czasteczki. C l'lczy sie za pornoca trzech wiazan wodorowych.3 Struktura podw6jnej helisy DNA (A) Dwa schematy podw6jnej helisy.czesc prawa Podw6jna helisa jest strukturq elastycznq Podwojna helisa opisana przez Watsona i Cricka i pokazana na rysunku 7. Po lewej stronie . ze para G .34 nm: skok helisy (odcinek przypadajacy na jeden skret helisy) .37 nm: przyrosl dlugosci helisy na par~ 'zasad . ze czasteczki genomowego DNA nie maja jednorodnej struktury.4 nm. ze DNA w kom6rce wystepuje glownie w formie 13. Po prawej stronie .struktura helisy. z parami zasad w kolorze czarnym.3 nazywana jest forma B. T za pornoca tylko dw6ch wiazan wodorowych. musi sie .0. (6) A tworzy pare z T. wiazarua wodorowe zaznaczono przerywana linia.czesc lewa oraz Strachan i Read (1996) . (1997) . Ma ona charakterystyczne wymiary: srednice helisy .

Sq. Bialko kazdy jego poziorn strukpoprzedzajacego. 1953). plytki Z-DNA lewoskretna 1. szczuplejszej wersji podwojnej helisy 0 srednicy tylko 1.1).5).5 12 plaski waski. podobnie jak forma B. czyli ich struktura drugorzedowa (Pauling i wsp.37 0. rna srednice 2. skok helisy . Poziorny budowane jest stopniowo j tury zalezy od poziomu go bialka maja cztery rozne te sa hierarchiczne. nazywany jest wiekszyrn rowkiem.3.2 BIAtKA Bialka. 7.4).4). Obydwa typy rotacji maja znaczqcy wplyw na strukture podwojnej helisy: zmiana polozenia zasady wplywa na wzgledne polozenie dwoch polinukleotydow. W forrnie Z DNA jeden rowek faktyeznie nie istnieje. C'. ale do najwazniejszych zmian konforrnacyjnych nalezy rotacja wokol wiazania ~-N-glikozydowego. Rysunki 7. oraz obrot wokol wiazania miedzy atomami w~gla 3' i 4' reszty cukrowej.34 3. ale to. Istnieje wiele mozliwosci. a polimer . a obrot wokol wiazania 3'-4' wplywa na konforrnacje szkieletu cukrowo-fosforanowego. Ten etap rozwoju biochernii bialek mial kulminacje w lataeh /10. Rotacja w obrebie poszczegolnych czasteczek nukleotydow prowadzi do zmian w ogolnej strukturze helisy.4 10 szeroki.2 nm. gleboki . 1951. a drugi jest bardzo waski i gleboki. 1. mog'1 nie bye zdolne do rozpoznania tej samej sekweneji w czasteczce DNA 0 innej konformacji. C C. Mozliwa jest rowniez bardziej drastyczna zmiana konformacji prowadzaca do powstania lewoskretnej formy Z DNA. zwana forma A (rys.1 Cechy r6i:nych form podw6jnej helisy DNA Wynika stad. Struktura pierwszorzedowa bialka powstaje poprzez polaczenic aminokwasow w polipeptyd za Konformacja Cecha Typ helisy Srednica helisy (nm) Przyrost diugosci helisy na pare zasad (nm) Skok helisy (nm) Liczba zasad na skret T opologia wiekszego rowka T opologia mniejszego rowka B-DNA prawoskretna 2. [ak dowiemy sie pozniej z tego rozdzialu.3 i 7. Wowezas to Pauling i Corey wyjasnili. Od lat 50. podobnie jak DNA. 7.4 pokazuja. 7. 7.84 nm.84 0. ze bialka Wl'1Z'1ee DNA. Tabela 7. ktore maja strukture umozliwiajaca im rozpoznanie specyfieznej sekwencji nukleotydow. Podstawy tej roznorodnosci ehemieznej beda tematem przewijajacyrn sie stale podczas zapoznawania si~ ze struktura bialek.150 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WII\ZACYCH DNA nieco zrnienic wzgledne polozenie atomow w nukleotydzie. to mniejszy rowek. by stworzyc CZqsteczke bialka 0 zlozonym.polipeptydem. na przyklad w formie B DNA. jakie sa podstawowe konformaeje polipeptydow.).55 0. Forma A DNA rowniez rna dwa rowki .. nierozgalezionymi polirnerami. a mniejszy rowek plytszy i szerszy niz vv forrnie B (rys. stosunkowo szeroki i gl~boki. [eden z nieh.2 II waski. mog'1 deterrninowac specyficznosc oddzialywan miedzy genomem i bialkarni wiazacyrni DNA. Inne znane wersje to forma B'.37 4.55 nm.2. podobnie jak DNA. 7. co umozliwia im pelnienie olbrzyrniej ilosci rozmaitych funkcji (tab. 7. Podstawowe ceehy struk tury bialka. co odpowiada jedenastu parom zasad na skret (tab. Na przyklad. Drugi. Nie jest do tego potrzebne otwieranie helisy przez rozrywanie wiazan iaczacych pary zasad. zmiany konformaeyjne wzdluz czasteczki DNA oraz polimorfizm strukturalny wvnikajacy z sekwencji nukleotydow. Bialka charakteryzuje zadziwiajaca roznorodnosc cherniczna i strukturalna. trojwymiarowyrn ksztalcie. ze wymiary podwojnej helisy zmieniaja si~\-gdy zmienia si~ wzgledria wilgotnose wl6kien zawierajacvch czastcczki DNA. gleboki waski. zmodyfikowana wersja podwojnej helisy. Dlatego tez bialka wiazace D0JA mog'1 z mniejsza lub wieksza dokladnoscia nezytae" sekwencje nukleotydowa po prostu poprzez kontakt z dnem rowka. Same dane dotyczace wyrniarow roznych form podwojnej helisy nie odzwierciedlaja najbardziej znaczacej roznicy miedzy nimi. gl~boki szeroki. wezszy i plytszy. IV kazdej z form DNA czesc powierzchni wewnctrznej przynajmniej jednego rowka jest utworzona przez grupy cherniczne zasady azotowej. w jakim stopniu wewnetrzne obszary helisy 5'1 dostepne z jej powierzehni. W ostatnich latach uwaga badaczy sku pia sie na zagadnieniu. Wszystkie te Iormy S'1 prawoskretnymi helisarni. Monomeryczna podjednostka w bialkach nazywana jest aminokwascm (rys. i na poczatku lat 50. liniowymi. ze powierzchnia formy B DNA nie jest dokladnie gladka .1 Cztery poziomy struktury bialka Tradyeyjnie uwaza si~. plytki A-DNA prawoskretna 2. E i T.29 3.wiekszy rowek jest gl~bszy. poznano w pierwszej polowie XX wieku. wiadorno. Istotna jest nie srednica ezy skok helisy. Pauling i Corey. przyrost dlugosci helisy na par~ zasad wynosi 0. ze poziomy struktury.2.29 nm. w jaki sposob te struktury drugorzedowe lacza sie ze soba.spiralnie biegna wzdluz niej dwa rowki. powodujaca zmiane polozenia zasady w stosunku do reszty cukrowej. ktorego dlugosc rzadko przekracza 2000 jednostek. D. 7.

7. A-DNA (w srodku) i Z-DNA za zgoda z: Kendrew A (ed). The Encyclopaedia of Molecular (po prawej stronie) ----------------------Biology.2 BIAtKA 151 Rysunel< 7. Copyright 1994 Blackwell Science . Plate I.4 Przedrukowano Komputerowe modele B-DNA (po lewej stronie).

wchodzqcyrni w sklad r6i:nych wiazan peptydowych. czynniki i transkrypcyjne: sekcja 8. Struktura trzeciorzedowa jest Tabela wiqzanie peptydowe Rysunek 7. dwa lancuchy Sq przeciwnie skierowane.bialka strukturalne (np.7). Zwrocmy uwag~ na fakt.5 Og61na struktura aminokwasu ~H20 Og61na struktura wszystkich aminokwas6w jest taka sama.3. koncem NHzlub koncern N. kt6re powstaja porniedzy roznymi arninokwasarni w polipcptydzic. Polipeptydy sa syntetyzowane w wyniku reakcji kondensacji miedzy grup4 karboksylowa jednego aminokwasu a grupq aminowa drugiego (rys.1) bialka regulatorowe (np. Na drugim koncu peptydu znajdujc sie wolna gru pa karboksylowa i nazywa sie go koncem karboksylowym. Kazda strukture stabilizujq wiazania wodorowe rniedzy gruparni C=O i N-H. 7. polimerazy RNA:sekcja 8. Orientacje polipeptydu mozna wiec zapisac alba jako N----7C (od lewej do prawej na rys.C-C-N-C-COOH + I H I R2 I konicc I 0 II H I karboksylowy pomocq wiazania peptydowego.podobnie jak w przypadku polinukleotyd6w . Aminokwasy roznia sie miedzy soba gruparni R (patrz rys. R2 HJN-C-H + + I HJN-C-COOH R + + HJN-C-COOH I I I Rysunek 7. polaczonego z atomem wodoru. Dla jasnosci porninieto grupy R.2). jakie rnoze przybierac polipeptyd.6). w kt6rych lancuchy sa skierowane zgodnie . Struktura trzeciorzedowa jest wynikiem faldowania poszczegolnych struktur drugorzedowych polipeptydu. koncern COOH lub koncem C. 2. grup'l karboksylowa. lstnieja rowniez harrnonijki ~. bialka zwiazane z krzepnieciem krwi ferrytyna . Wyroznia sie dwa zasadnicze typy slruktur drugorzedowych: helisa a i harmonijka ~ (rys. Pokazana na rysunku harrnonijka ~ jest przeciwbiei:na. histony: sekcja 6.6 Aminokwasy wiazaniern peptydowym w polipeptydach polaczone sa Na rysunku pokazano reakcje cherniczna. Lancuch polipeptydowy pokazano schernatycznie.1. 7. prowadzacyrn do powstania trojwyrniarowej konfiguracji (rys.8). poniewai: w jej wyniku zostaje uwolniona czasteczka wody (A) Helisa a (B) Harmonijka ~ 7. Struktura drugorzedowa dotyczy roznych konformacji. Wickszosc polipeptyd6w ma wystarczajaca dlugosc. 3.6). (B) harmonijka ~ Wsr6d bialek wiqzqcych DNA sa przyklady trzech klas funkcjonalnych: enzymy (np. POZYCJe atorn6w wegla a zaznaczono rnatyrni kropkarni.152 ROZDZIAl7· ROLABIALEK WIAZACYCHDNA R. Na jednym z nich znajduje sie wolna grupa arninowa i dlatego nazywa si~ go koncern aminowym.1). grupa arninowa i grupa R. 7.7 wystepujacych Dwa zasadnicze typy struktur drugorzedowych w bialkach: (A) helisa a. Jest to reakcja kondensacji.rnagazynuje zelazo w watrobie Rysunek 7. podczas kt6rej dwa arninokwasy zostajapolaczone wiazaniern peptydowyrn. nastepujacych po sobie wzdluz czasteczki. 7. by sfaldowac sie w serie struktur drugorzedowych.2 Funkcjonalne bialka zr6i:nicowanie Przyklady bialek bialek ludzkich Funkcja Kataliza biocherniczna (enzyrny) Funkcja strukturalna Ruch Transport Regulacja Ochrona Magazynowanie polirnerazy DNA. zc . koniec arninowy HJN-. 7_ 9) R. polirnerazy RNA kolagen w kosciach i sciegnach aktyna i rniozyna w rniesniach hernoglobina horrnony takie jak insulina przeciwciala. Obydwie te slruktury Sq stabilizowane przez wiazania wodorowe. alba jako C----7N.2.dwa konce polipeptydu Sq chernicznie rozne. Zbudowane sa one z atomu wegla a.

Oddzialywania we wystepuja dowisku 3 kcal . Struktura czwartorzedowa powstaje poprzez polaczenie dwoch lub wiecej polipeptydow w bialko skladajace sie z kilku podjednostek.7. Sily przyciqgania powstajq w wyniku Hipotetyczna struktura bialka skladajqcego sie z trzech helis Q (serpentyny) i czteroniciowej harmonijki (3 (strzalki). . • Oddzialywania czasteczek wych wody hydrofobowe polqczonych Sq skutkiem wiqzaniami dzialania wodoro- wymi. ktore bardzo roznia si~ struktura i sa inne w kazdym aminokwasie. wodorowe powstajq na skutek slabego wodoru. mol-I.8 Trzeciorzedowa struktura bialka 25°C wynosi 1-10 kcal rnol:". Iaczacym rozne polipeptydy. ze aminokwasy rnajace lancuchy bocznc niepolarne (tzn. kiedy dwa atomy za barwlaSnie przez sily lub wiazania [onoW srodzialania wyslabe . jak w podw6jnej stabilizujq strukture helisie bialka. Rysunek zaczerpnieto z: Turner et al. R6:i:norodnosc aminokwas6w biafek wynika z roinorodnosci dzo zbhza si~ do siebie.ok. w tym bialck bioracych udzial w ekspresji 8enornu. 7. Dlatego tez Iaczenie sie arninokwasow w sekwencie prowadzi do powstania roznych kombinacji reaktywnosci chemicznych. tab. oel ktorych zalezy nic tylko ogolna struktura powstajacego bialka.ponad 90 kcal mol-I. Stepien upakowania czasteczek wewnatrz • bialka jest ograniczany elektrostatyczne odpychajqce. ale rownicz umiejscowienie grup aktywnych na jego powierzchni. Bialka zbudowane 54 z 20 arninokwasow (rys. struktura nie sa prawdziwymi od nich zalezy trzeciorzedowa Funkcjonalna roznorodnosc bialek wynika z tego. Jest to cecha wielu bialek pelniacych skornplikowane funkcje. ktore powstaja micdzv cysteinami znajdujacyrni sie w roznych miejscach polipeptydu. a wiazari kowalencyjnych . 4.2: Wi'lzania niekowalencyjne w biatkach Struktura drugorzedowa oraz wyzsze poziomy struktury bialka sa stabilizowane przez rozne rodzaje niekowalen- cyjnych wiazan i oddziatywan: • Wi'lzania troujemnym. Sq to glownie wiazania wodorowe miedzy poszczegolnyrni aminokwasarni oraz oddzialywania hydrofobowe decydujace a tym. a atomem z innym atomem elektroujemnym. Przyczyniajq sie drugorzedowych. Wiekszosc grup R jest nie naladowana. kt6re wymusza w wewnetrzne] hydrofobowe to gl6wnie bialka. w wyniku sie one do powstawania powstaja wystepuiacego.argininy. Mozliwe jest rownicz tworzenie wiazan kowalcncyjnych. Wyjqtek stanowia naladowane ujemnie Iancuchy boczne kwasu asparaginowego i glutaminowego oraz naladowane dodatnio . W zaleznosci ad spelnianej funkcji bialka te magq rozpadac sie na skladowe polipeptydy lub zrnieniac swoje podjednostki. 7. charaktervzujace sie lIawcrsjq do wody") sit schowane przed woda i wchodza w sklad wewnetrznych czesci bialka.2 kcal : mol-I. maja duze aromatyczne lancuchy boczne a ziozonej strukturze. jak atom wodoru w glicynie lub grupa metylowa w alaninie. sily te sa stosunkowo Jest to skutkiem ekranujqcego grupami czasteczek wody. histyelyny i Iizyny. wiqzania petla t'lczqca SHy van der Waalsa f1uktuacji w rozkladzie Ich energia wynosi Sily odpychajqce elektron6w mogq bye silami przyciqgajqcymi ladunku struktur sasiednich atom6w. Nie wszystkie bialka tworza struktury czwartego rzedu. ze tworzace je aminokwasy sa chemicznie rozne. zwiqzanym nia wodorowe kowalencyjnych. wodnym rniedzy grupami naladowanymi. stabilizowana przez rozne rodzaje oddzialywan (ramka 7. odpychania lub odpychajqcymi. umieszczenie grup hydrofobojednak czesci bialka. Niektore z nich maja male grupy R a stosunkowo prostej budowie.9. Oddzialywania wiqzaniami. zwanych mostkami dwusiarczkowymi. Typowa energia wiqzania sa diuzsze i duzo slabsze od wiazan wego w temperaturze Podobnie wodorowe • Rysunek 7.4. za pomacq wiazan wodorowych i oddzialywan hydrofobowych. [ednak podjednostki w wiekszosci bialek sa ze soba polaczone luzniej. deterrninujace wlasciwosci chemiczne bialka. Niekt6re struktury czwartorzedowe utrzymuja sie dzieki mostkom dwusiarczkowym. Oddzialywania stepuja miedzy naladowanymi sow wewnqtrz elektrostatyczne R aminokwa- czasteczki bialka oraz na jego powierz- chni.1-0.3).2 BIAtKA 153 konicc N Ramka 7.3). z ktorych kazda sfaldowana jest w strukture trzeciorzedowa.2). DNA. ' Przyczyna roznorodnosci arninokwasow sa grupy R. jak fenyloalanina. Wiazawodoro- przyciqgania elektrostatycznego miedzy atomem elek- jak tlen lub azot. (1997) 0. co jest szczegolnie wazne w procesie Iqczenia sie bialka z DNA (sekcja 7. tryptofan i tyrozyna. Inne aminokwasy.

CH. Blalka zawieraja r6wniei: inne aminokwasy. ""'C CH. /0 ""'C CH2 I ""'c I I I CH. CH2 I 0"". ktore sa tradycyjnie klasyfikowane [ako aminokwasy wyznaczane przez kod genetyczny (sekcja 10.2). kt6re Sq tradycyjnie klasyfikowane jako aminokwasy wyznaczane przez kod genetyczny (sekcja 101. wg Lehninger (1970) Czesc arninokwasow rna polarne lancuchy boczne (np. S CH. Sit to aminokwasy zakodowane w sekwencji DNA genaw.N+ CH. W procesie syntezy bialka. I I I I asparagina tyrozyna I glutamina (C) Ujemnie naladowane grupy R 0"". /0- 0"". polarne itd.154 ROZDZIAl I • ROLA BIAU. opisane w tekscie. seryna i treonina). podczas powstawania polipeptyd6w.K WIALACYCH DNA (A) Niepolarne grupy R CH. Klasyfikacja na arninokwasy niepolarne. glicyna. CH. CH2 kwas glutaminowy I kwas asparaginowy (D) Dodatnio naladowane grupy R H. Hf-C\H. HO-CH SH CH2 I I I I glicyna I I I seryna treonina cysteina Q CH.informacyjnym RNA (rnRNA). OH O~ C /NH. CH2 CH. tryptofan I I I metionina (B) Polarne gru py R H HO CH2 CH. /NH. Dwadziescia arninokwas6w pokazanych na rysunku 7. leucyna i walina). aminokwasy te sa laczonc ze soba zgodnie z instrukcja zawarta w kopii genu . HN. CH.2). CH2 I I I I HC=C fenyloalanina CH. alanina. w innych s4 one niepolarnc (np. NH2 C=N NH CH.9 Grupy R arninokwasow Dwadziescia arninokwasow. [ednak cherniczna roznorodnosc bialek nie ogranicza sie tylko do tych 20 .u/CH.1. CH2 + HN-CH HC""'" II """N-C H CH. walina I alanina H/ leucyna izoleucyna C 'COO- prolina Q HH CH2 CH.9 to te. I I I I + H. I I I I I I histydyna I I lizyna I arginina Rysunek 7.

Jedyna roznica to zastapienie atomu siarki przez atom selenu Zarodek helivy a powstaje w miejscu zawierajacyrn aminokwasy.3 Skr6ty nazw aminokwas6w Skr6t trzyliterowy Ala Arg Asn Cys Phe Gin Gly His lie Asp Glu Leu Lys Met Pro Ser Thr T rp T yr Val Skr6t jednoliterowy A-. oraz dzieki badaniorn nad faldowaniem sie malych peptyd6w a znanej sekwencji.10 selenocysteina Budowa grupy R selenocysteiny Selenocysteina jest bardzo podobna do cysteiny. roznorodnosci • Dwa ezynniki bialek: powoduja zwiekszcnie • W ezasie syntezy bialka do lancucha polipeptydowego maze bye wlaczany przynajmniej jeden dodatkowy arninokwas selenocysteina (rys. 1. Na podstawie struktury pierwszorzedowej polipeptydu mozna do pewnego aminokwasytworzace zarodek helisy peptyd niesfaldowany aminokwasy blokujqce wydiuzanie helisy Struktura pierwszorzt. 0). sprawdzajac.7. fundamentalnych przeslanek genetyki jest stwierdzenie. Ten zwiazek wynika z hierarchieznej natury czterech poziorn6w struktury bialka. 7. Aminokwas Alanina Arginina Asparagina Cysteina Fenyloalanina Glutamina Glicyna Histydyna Izoleucyna Kwas asparaginowy Kwas glutaminowy Leucyna Lizyna Metionina Prolina Seryna Treonina T ryptofan T yrozyna Walina R N C F Q G H I D E L K M P S T W Y V aminokwas6w. by mozna bylo polaczyc geny z Iunkrja biologiczna. ktore aminokwasy najczesciej wystepuja w danej strukturzc drugorzedowej. 1 Wlqc7. procesu syntezy bialka jest tylko jego struktura pierwszorzedowa. Tak wiec. kt6re faworyzujq te strukture. W procesie ekspresji genu sekwencja nukleotyd6w jest przekladana na sekwencje aminokwas6w w polipeptydzie (patrz rys.. Biochemicy wywnioskowali. Ten proces powstawania zarodka dane] struktury. ktore faworyzuja te strukture i inicjuja praces jej powstawania.2. [ednak wynikiern SH CH.enie tego aminokwasu zalezv od zmodyfikowane go sposobu odczytu kodu genetycznego (sekcja 10. jakie sa prawa rzadzace tyrn etapem procesu faldowania sie bialek. alba nie sa jej szczeg6lnie niechetne. jakie struktury drugorzedowe beda po wstawac w polipeptydzie.dowa decyduje o funkcji bialka [edna 7.2). 7anim pozegnarny sie z bialkami. Niekt6re biaika sa rnodyfikowane juz po zakonczeniu procesu ieh syntezy poprzez dodanie nowych grup chemicznych. 1 powstanie zarodka helisy ---!-------~~----------1 wydtuzanie helisy i jeJ zakonczenie I I I I peptyd sfaldowany Rysunek 7. sekwencja aminokwas6w rnusi decydowac a funkcji bialka. SeH CH. 7.3._. w kt6rym wszystkie czesci lancucha przybiora preferowana przez siebie strukture. jej wydiuzania i ustalcnia jej granic. kt6re nie mogq wchodzic w jej sklad (rys.11). np. poprzez acerylacje alba fosforylacje pewnych aminokwas6w lub przez przylaczenie duzych iancuchow bocznych skladajacych sie z reszt eukrowych (sekcja 10. s. 4). kt6re albo faworyzuja l~ sarna strukture. ze sckwencja aminokwas6w determinuje. Polaczenie genu z jego funkcja biologiczna jest mozliwe dzieki ternu.2 BIAtKA 155 Tabela 7.. rnusimy dokladnie] ornowic ten problem. Proces ten obejmuje nastepnie sasiednie aminokwasy.3). Dlatego tez dana struktura drugorzedowa tworzy sie wokol grup aminokwas6w.1 I w polipeptydzie Powstawanie struktury drugorzedowe] cysteina Rysunek 7. powtarza si~ wzdluz polipeptydu do mornentu. Formowanie struktury konczy sie w momencie napotkania jednego lub kilku blokujacych aminokwasow. Helisa wydiuza ste w obu kierunkach do mornentu napotkania grupy arninokwasow blokujqcych [e] formowanie . natorniast inne czesciej znajduje sie w harmonijkach ~. Niekt6re aminokwasy z powodu charakteru swoich grup R czesciej wystepuja w helisach a.1. ze geny okreslaja funkcje biologiczne dzieki informacji zakodowanej w sekwencji nuklco tyd6w.

3 METODY BADANIA BIAtEK WI~CYCHDNA Poziom wiedzy we wszystkich dziedzinach biologii rnolekularnej i gcnetyki zalezy od dostepnosci i skutecznosci metod. I wlasnie dlatego opracowano wicle metod.l. ze bialko przybierze zlq strukture posrednia. ale cechy sekwencji DNA. ze w badaniach nad bialkami wiazacymi DNA dysponujemy wieloma technikarni. z ktoryrni ono sit. 1995). w wyniku kt6rych jednostkowe struktury drugorzedowe Sq organizowane w struktury trzeciorzedowe. Cdy nastepnie obnizono temperature. ktore pomagaja w faldowaniu innych biaiek. na stcpnyrn dw6rn etapom faldowania bialck. ze faldowanie sie domen jest procesem spontanicznym. z kt6rymi bialka i sekwencji DNA. nie jest sprzeczne 70 przeslanka.12 Miejsca przylqczania bialek wiazacych DNA najczescie] znaiduja sie powyzej genu Wi~cej informacji na temat polozenia wiqiq si~ bialka. iz wide bialek bioracych udzial w procesie ekspresji genomu wiaze sie z kr6tkimi sekwencjami DNA. z ktora sit. Wiekszosc bialek zbudowana jest z dw6ch lub wiekszej ilosci domen strukturalnych. pokazaly. dzieki ktorym mozna zidentyfikowac miejsca wiazace bialko w obrebie fragment6w DNA dlugosci kilku tysiecy par zasad. zawierajaca region kodujacy DNA oraz sekwencje go poprzedzajace. patrz rozdzial 8 i funkcji miejsc. ze trafia w slepa uliczke. zaobserwowano. biatka wiazace DNA \ 200bp ~ gen Rysunek 7. 7. W komorce bialka opiekuncze (ang. ze wiele dornen sklada sit. ZC doswiadczenia genetyczne i z zakresu bioJogii molekularnej. Istnienie alternatywnych drag faldowania sie bialka oraz bialek.156 ROZDZIAt I • ROLA BIAtEK WIAZACYCH DNA stopnia przewidywac.2.43). Metody te dzialaja bardzo dobrze nawet w6wczas. [ezeli fragment DNA zwiaze 7. s. ze na roznych etapach procesu faldowania bialko przybiera alternatywne. gdy bialko wiazace sie z DNA nie zostalo zidentyfikowane. Techniki te mozerny podzielic na trzy grupy: • • • Metody identyfikacji w czasteczce DNA rejonu (rejonow). Przypornnij sobie.' z jednoslkowych struktur drugorzedowych pochodzacych z calkiem roznych region6w polipeptvdu._'ono wiaze. natychmiast dostarcza inforrnacji 0 miejscach wiazania przynajmnicj kilku bialek odpowiedzialnych za ekspresje tego genu. Mamy szczescie. Oznacza to. 4). Proees faldowania bialka jest po prostu jednym z etapow dlugiej drogi. z ktorej nie moze sic wycofac. bywa. ktoryrni bedzierny sit. poniewaz przez jego porowata strukture male fragmenty migruja szybciej niz duze (patrz Metody badan 3. Wr6cimy do tego zagadnicnia w sekcji 10. Niezbyt dobrze poznano procesy towarzyszace <. Ich dzialanie polega prawdopodobnie na zmniejszeniu prawdopodobienstwa.przyzwoitka. [esli bialko dokona zlego "wyboru" i jest czesciowo zle sfaldowanc./ /dentyfikacja w DNA miejsc wiqiqcych bialko Pierwsza rzecza. a wiec i gen. Uwaza sic iz oddzialywania miedzy nimi Sq prawdopodobnie dose slabe oraz ze poszczeg6lne domeny falduja sic niezaleznie. jakie struktury drugorzedowe bedzie on tworzyc (Barton.' zajmowac w nastepnyrn rozdziale. przedstawionej na rysunku 1. a nastepnic jcdnostki struktur trzeciorzcdowych asocjuja tworzac zbudowane z podjednostek struktury czwartorzedowe. a szczegolnie trudno jest to osiagnac w przypadku duzych czasteczek Przyczyna problem6w tkwi prawdopodobnie w tyrn. kt6ry jq koduje. Badanie spowolnienia migracji w ie/u pozwala zidentyfikowac fragmenty DNA. czesciowo sfaldowane struktury. nie jest samo bialko. Metody badania struktury trzeciorzedowej bialek wiazacych DNA. ze fragrnenty DNA sa rozdzielane podczas elektroforezy w zelu agarozowym.3. decyduje o funkcjonalnej. Na przyklad podwyzszenie temperatury w prob6wce powodowalo rozfaldowanie bialka. na kt6rej nastepuje przejscie od informacji biologieznej zakodowanej w genie do bialka spelniajacego SWq funkcje. Zrozumicnic lego procesu utrudnia to. kt6re wiqiq biaika Pierwsza sposrod tych metod wykorzystuje znaczna roznice we wlasciwosciach elektroforetycznych pomiedzy "nagim" fragrnentem DNA a fragmcntem zwiazanyrn z bialkami.' wiaze. z ktorymu) wiazc sie bialko. [ednak nic dla wszystkich bialek udalo sie zadernonstrowac tego typu spontaniczne procesy.3. W przypadku niekt6rych bialek wykazano. jaka najczesciej odkrywa sie w czasie badan nad bialkiern wiazacym DNA. kt6re mogq dostarczyc informacji na temat oddzialvwan . ze sekwencja arninokwasow. ktore mozna zastosowac do badan. sfaldowanej strukturzc bialka. ze bialko jest ponownie sfaldowane w prawidlowa strukture. w tym rowniez kornpleks6w tworzonych przez bialko zwiazane z DNA. znajdujacymi sie powyzej genow. z kt6rymi te bialka oddzialuja (rys 7. ze sekwencja nowo odkrytego genu.2B (s. Metody oczyszczania bialek wiazacych DNA. Wynika to z tego. chaperone . z ktorych tylko jedna moze stworzyc prawidlowa konfiguracje trzeciorzedowa. opiekunka) pornagaja w procesie faldowania innych bialek.12).

w niskiej temperaturze lub stosujac male stezenie enzymu.13). poniewaz sekwencjonowanie tak malego fragmentu moze bye trudne. Spowolnione fragmenty identyfikuje sit. gdzie w sekwencji DNA znajduje sit.'w warunkach umozliwiajacych tylko czesciowe strawienie DNA. to doswiadczenie mozna przeprowadzic z oczyszczonym bialkiem townie Iatwo jak z ekstraktem jadrowyrn. Nazwano to spowolnieniem migracji w zclu (ang.3 METODY BADANIA BIALEK WIAZACYCH DNA 157 sie z bialkiern. Wskutek tego prazek odpowiadajacy temu Iragmentowi migrujc wolniej. kt6ra rozszczepia wszystkie wiazania fosfodiestrowe r. W doswiadczeniu wykorzysluje sit. Garner i Revzin.' ekstrakt jadrowy. ze miejsce wiazace bialko zawiera rowniez nukleotydy wchodzace w sklad sasiednich Iragmentow. zaczynaja si~ testy modyfikacji. to jeE.11). Sarnodzielnie nie tworza one jednak stabilnych kompleksow z biaikiem. Metoda ta nie okresla jednak tego miejsca z duza dokladnoscia. to mozliwe. :Ladna guanina chroniona przez zwiazane bialko nie bedzie zrnetylowana. ktore Sq chronione przez bialko. obejmujacyeh przypuszczalne miejsce wiazania bialka. a co za tym idzie nie obserwujemy spowolnienia ich migracji. Powstaly kompleks poddaje sie nastepnie dzialaniu deoksyrybonuklcazy I (DNazy I) (Galas i Schmitz. Dlatego kompleks DNA-bialko tworzy prazek polozony blizej punktu startu elektroforezy (rys.'s{:sekwenc:ji nukleotydowej bedzie chroniona przed modyfikacjami. poniewaz dlugosr' sekwencji rozpoznawanej przez bialka nie przekracza kilkudziesieciu par zasad. ze badamy komorki eukariotyczne). Ten pusty obszar. Mieszanine fragmentow DNA l'lczy sie z ekstraktern bialek jadrowych (zalozrny. badany fragment DNA jest znakowany izotopern na jednyrn koncu i laczony z bialkiern wiazacyrn DNA. [ezeli fragment a spowolnionej migracji jest stosunkowo krotki.13 Analiza spowolnienia migracji w zelu W wyniku polqczenia rnieszaniny fragrnent6w restrykcyjnych z ekstraktern biatek jadrowych . Trawienie nukleaza przeprowadza sit.! wskazowka. ze w jednej czasteczce DNA rozszczepione zostanie tylko jedno wiazanie. 1981). Mimo ze kazdy pojedynczy fragment jest przeciety tylko raz. w calej populacji fragrnentow rozszczcpione zostana wszystkie wiazania z wyjqtkiem tych. to cZt. Iootprinting). Kompleks DNA··bialko rna wieksza rnase czasteczkowa niz "nagi" DNA. czyli miejscu wiazania bialka w wyjsciowyrn fragmencie DNA . Moze on zawierac kilka rniejsc wiazania dla roznych bialek. dodawanyrn w formic ekstraktu jqdrowego lub jako oczyszczone bialko. ktory byl chroniony przez zwiazane bialko. Mozliwe jest zastosowanie delikatniejszego i szybszego podejscia (rys. Podczas badania sladow z uzyciern nukleazy. Nie jest to najlepsze rozwiazanie.O ruchliwosc w zelu zostanie zahamowana. rozniacym sie dlugoscia a je· den nukleotyd. aby otrzymac dokladniejsze informacje. fragrnenty fragrnenty restrykcyjne + restrykcyjne bialko jadrowe standard wielkosci DNA prazek rnigrujqcy wolniej Rysunek 7. Oznacza to. kt6ry przylacza grupy metylowe do nukleotyd6w zawierajacych guanin~ (G). Tarn.bialko wiazace DNA Iqczy si~ z jeclnyrn fragrnentern. Bialko zostaje nastepnie usuniete i rnieszanina fragmentow DNA poddawana jest elektroforezie. do ktorej nie dodano bialek. ktore] nie polaczono z ekstraktern jadrowyrn • Szczeg6ly techniczne dotyczacc tych dwoch metod pokazano na rysunku 7. ktore byly chronione przez bialko. DNaza I rozszczepia zazwyczaj wszystkie wiazania fosfodiestrowe. W praktyce doswiadczenie tego typu wykonuje sie z mieszanina fragrnentow restrykcyjnych. Drabinke przerywa pusty obszar. poniewaz na ogol na tym etapie badan nie jest jeszcze oczyszczone bialko wiazace DNA. np. pozostawiajac tylko fragment DNA.7. Kazdy z £ragmcntow jest wyznakowany na jednym koncu. [ezeli jednak biaiko jest dostepne.' na analizie sladow (ang. w ktorym nie rna zadnych wyznakowanych prazkow. gel retardation. wyjatkiern tych. Opieraja sie one na nastepujacej obserwacji: jezeli czasteczka DNA jest zwiazana z bialkiem. gdzie koncza sic badania spowolnienia migracji w zelu.14. Testy ochrony precyzyjnie okreslajq poloienie miejsc wiqiqcych Spowolnienie migracji w zelu jest ogoln. takiego jak siarczan dimetylu. Dlugosc fragmentu a spowolnionej migracji wynosi czesto kilkaset par zasad.' porownujac wzor prazkow otrzyrnany po elektroforezie ze wzorem otrzymanym po elektroforezie tej samej mieszaniny fragmentow restrykcyjnych. 7. 1978). Sq dwa sposoby wprowadzenia takich modyfikacji: • Dzialanie nukleaza. Badanie spowolnienia migracji w zelu jest wiec etapem poczatkowym i potrzebne sa inne techniki. a drugi jego konier: powstaje w wyniku ciecia przez nukleaze. Poddanie dzialaniu czynnika metylujacego. Moi:na go zidentyfikowac na podstawie por6wnania z wzorem prazkow otrzyrnanyrn po elektroforezie tej samej mieszaniny fragment6w restrykcyjnych.trafiany" srednio tylko jeden raz. tak by pojedyncza czasteczka DNA (pojedynczy fragment) byl . Obydwie melody opieraja sit. 7. czyli slad odpowiada pozycji chronionych wiazan fosfodicstrowych. i dlatego rnigruje wolniej podczas elektroforezy w zelu. Fragmenty DNA wyznakowanc izotopem rnozna uwidocznic. W rezultacie olrzymujemy drabinke prazkow odpowiadajaca fragmentom.' miejsce wiazania bialka.

15. Test modyfikacji z zastosowaniem siarczanu dimetylu (DMS . ktora rowniez wykorzysruje sie do badania wiazania bialek z DNA (Hendrickson i Schleif.fragmentowi DNA nie zwiazancrnu z bialkicm. Fragmenty DNA poddaje sie nastepnie elektroforezie.tak dobranym. to wowczas uniemozliwirny zwiazanie tego bialka. fragment DNA izoluje sie z zelu i poddaje dzialaniu piperydyny. jak badanie sladow za pornoca DNazy I. na przyklad poprzez dodanie grupy metylowej. ktora przecina czasteczke w rniejscach. poniewaz w czasie dzialania czynnika metylujacego zosta!a zmodyfikowana jedna lub wiecej G. by w pojedynczym fragmencie DNA zostala zmetylowana tylko jedna guanina. Wyznakowane w ten sposob czasteczki tnie sie drugim enzymem restrykcyjnyrn i nastepnie oddziela sie od siebie dwa rodzaje wyznakowanych fragrnentow. Fragmenty DNA zamiast trawienia DNazq I Sq poddawane dzialaniu DMS 0 malym stezeniu dobranym tak. Orugi prazek zawicra czasteczki. ktore G byly chronione Nukleotydy bezposrednio oddzialujqce z bialkiem moina zidentyfikowac stosujqc test zaklocania modyfikacji Ochrony przed modyfikacja nie nalezy mylic z testem zaklocania mody£ikacji. w tym przypadku siarczanu dimetylu a malym stezeniu .-- ----- } "slad" Metoda analizy sladow z uzyciem DNazy I Opis tej metody .-elektroforeza w zelu. a drugi . Wyznakowany na jednyrn koncu fragment DNA poddaje sie dzialaniu czynnika mody- fikujacego. ktory znakuje je radioaktywnie na obu koncach. ktore sa chronione przez zwiazane bialko.158 ROZDZIAl7· ROLA BIAlEK WIA. elektroforeza w zelu. 1985). kt6ra G zostala zmodyfikowana. dimethyl sulphate) opiera si~ na podobnych zasadach. odmienna technika a wiekszej czulosci.ekstrakt jq7" + ekstrakt jqdrowy ---. Nastepnie dodaje sit. Uzyte na poczatku procedury fragmenty restrykcyjne trzeba wyznakowac tyko na jednym koncu.----. czynnika . ktore Sq krytyczne dla wiazania bialka.ZACYCH DNA znakowany koniec fragrnenty restrykcyjne znakowane na koricu . Siad widoczny we wzorze prazkow testowanego DNA wskazuje. Mozna zaobserwowac dwa prazki.patrz tekst.ang. autoradiografia Rysunek 7. Wzor prazkow otrzymanych ala kontrolnego DNA.' bialko wiazace DNA lub ekstrakt jadrowy i przeprowadza elektroforeze. [edna z metod nalezaca do tej grupy test6w pokazano na rysunku 7. by w pojedynczym fragmenc:ie DNA zostala zmctylowana tylko jcdna guanina. gdzie znajduja sie zmodyfikowane nukleotydy. pokazuje pozycje wszystkich G w badanyrn fragmencie. Po usunieciu bialka na DNA dziala sie piperydynq. ktore nie bylo inkubowane z ekstraktem jadrowyrn. ze jesli zmienimy nukleotydy krytyczne dla wiazania bialka. [eden odpowiada kompleksowi DNA-bialko. autoradiografia 1 czesciowe trawienie DNazqI -~ 1 czesciowe trawienie DNazq I trawienie biatka. Aby stwierdzic.14 - -------------. W tym celu dluzsze fragmenty restrykcyjne poddaje sie dzialaniu enzymu. Guaniny. do kt6rych bia!ko nie moglo sie przylaczyc. nie mogq bye zmodyfikowane. Test zakl6cania modyfikacji opiera si~ na zalozeniu.

. Opis procedury uzyskania fragmentu DNA wyznakowanego . (B) Hybrydyzacja kolonijna. Klon. Klony eDNA przenosi sie na filtr nylonowy.~. zawierajqcy miejsce wiazania biatka.15 dimetylu Test zaklocania modyfikacji z uzyciem siarczanu Metod~ opisano w tekscie.ZACYCH DNA 159 znakowany koniec <'---_--' _ fragment restrykcyjny znakowany na koncu (A) / AkI~"'d' DNAlub ekstrakt [adrowy bufor 0 duzyrn stezeniu soli J ograniczone traktowanie siarczanem dimctylu t\ zlozc krzemionkowc . Fragment DNA lub syntetyczny oligonukleotyd. autoradiografia Rysunek 7. a zatem .==:-_----:::7zmodyfikowane / reszty G _L-_ 1 _------ dodanie ekstraktu [adrowcgo .J.'_. kt6ry syntetyzowat odpowiednie bialko wiazace DNA... jest wiazany ze ztozem krzemionkowym.14 prowadzqcej do na jednym koncu (A) Chromatografia powinowactwa. zawierajqcym miejsce wiqzania tego biatka . ktore pakuje si~ do kolumny chromarograficzne]..3 METODY BADANIA BIAlEK WIA..16 DNA znakowany fragment ma 200bp.patrz pod pis pod rysunkiem 7.v" •~ standard wielkosci DNA bialko specyficznie wiazace sie z DNA niezwiazane bialka bialko wiazace DNA 1 1 brak wiazania (miejsce zablokowane) w zelu (B) elektroforeza i:&- ~~~7 -I' "\ 1 przeniesienie na filtr nylonowy z bialkiem) niespowolniony prazek (niezwiazany 1 -standard wielkosci DNA piperydyna / dodanie znakowanego oligonukleotydu elektroforeza w zelu.. Wyplukuje sie je buforem 0 duzym stezeniu soli.. Po przepuszczaniu ekstraktu jqdrowego przez kolumne pozostajq w niej bialka specyficznie wiazace sie ze zwiazanyrn fragmentem DNA.-.7.~ . zostaje zidentyfikowany dzieki hybrydyzacji z wyznakowanym fragmentem DNA.o. L___j klon syntetyzujacy bialko wiazace DNA Dwa sposoby oczyszczania biatek wiazacych 200bp Rysunek 7 .

W metodzie tej fragment DNA lub syntetyc:zny oligonukleotyd jest wiazany z kolurnna. Jest on podstawa do opracowania struktury czastcczki. Urnozliwi nam to stwierdzenie.01-10 nrn. co jest niezbedne do bardziej szczegolowych badan strukturalnyeh. Przez kolumne przepuszcza sie ekstrakt biaiek w buforze 0 malyrn stezeniu soli. CiT biora udzial w wiazaniu. ale rowniez dlatego.16B). 1991). Klony mozna zidentyfikowac dzieki stwierdzeniu. s. powie narn. Interesujace nas klony mozna nastepnie odzyskac z szalki wzorcowej i U7. Wyzwanie dla badaczy wykorzystujacych krystalo grafi~ rentgenowskq stanowia niezwykle zlozone metody. Clownyrni metodami stosowanymi w tej dziedzinie badan sa krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jadrowego (NMR .3. pozostale jednak zostaja rozproszone i opuszczaja go pod innym katcm niz do niego weszly (rys. 7. czyli rentgenogram dyfrakcyjny (rys. [edna z rnozliwosci jest wykorzystanie chromatografii powinowactwa (rys 7. 5. nuclear magnetic resonance).zar6wno samego bialka. Opieraja sie one na zasadzie.. ze im 7. Po calkowitym wvpiukaniu bialek niezwiazanych z kolurnna. takich samych czasteczek tworzacyeh rcgularna strukture. kt6ry umozliwia zwiazanie bialek z rozpoznawanymi przez nie sekwenc:jami. gdzic w sekwencji DNA znajduja si~ G. stosowane do opracowywania struktury CZqS teczki na podstawie rentgenogramu dyfrakcyjnego.' do klonu bakterii. W rezultacie kazdy fragment DNA jest ciety na dwa segmenty. 104). W rezultacie powstana nakladajace sie kola rozproszonych fal. w ktorym miejscu wyznakowany fragment DNA polaczyl sie z filtrem.17B).160 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WII\ZACYCH DNA rozszczepiajacego DNA w miejscach.16A).z ktorych kazdy koduje inne bialko pochodzace z badanego organizmu. [ezeli krysztal sklada sie r.ang. ktory jest zwiazany z filtrem. gdy klon ten syntetyzuje odpowiednie bialko wiazace DNA. Mozna zastosowac podobne tec:hniki. a wzgledna intensywnosc plamek dostarcza informacji o strukturze czasteczki. 7. w jaki sposob bialko oddzialuje z helisa DNA. Tego typu badania dostarczaja najdokladniejszych danych dotyczacych oddziaIywan miedzy bialkiem i DNA dzieki precyzyjnemu okresleniu struktury czesci bialka wiazace] sie z DNA oraz rnozliwosci stwierdzenia. . czyli 4000 razy mniejsza nil: swiatlo widzialne. sit jedna z najszybciej rozwijajacych sie dziedzin biologii molekularnej. Alternatywa opisanego sposobu jest wykorzystanie metody hybrydyzacyjnej (Singh i wsp. Promieniowanie rentgenowskie cha rakteryzuje sie bardzo mala dlugoscia fali: 0. na ktoryrn powstaje sena plamek. ze wzgledne polozenie plarnek odzwierciedla ulozenie czasteczek w krysztale. kt6re biora udzial w reakcji wiazania bialka. Krystalografia rentgenowska jest szeroko stosowana w badaniach strukturalnych Krysialografia rentgenowska jest uznana metoda. Musimy dvsponowac biblioteka klonow bakterii zawierajacych eD:"-JA. 1988). Problem polega na tym. ojciec i syn. ktorc ze soba oddziaiuja. jak i bialka polaczonego z sekwencja DNA przez nie rozpoznawanq. zazwyczaj przez polaczenie jednego konca DNA ze zlozern krzemionkowym (Kadonaga. cz~sc z nich przechodzi prosto przez krysztal nic zmieniajac kierunku. Wiliam i Lawrence Braggowie otrzymali Nagrode Nobla za opracowanie podstawowej metodologii i wykorzystanie jej do okreslenia struktury krysztal6w soli.yC do olrzymania duzej ilosci bialka wiazacego DNA. takich jak chlorek sodu i siarczan cynku. pozostale bialka sa z niej wyplukiwane. z kt6ryc:h tylko jeden jest wyznakowany na koncu. 7. ktory destabilizuje kompleksy bialko-DNA. Dlugosc ta jest por6wnywalna z odleglosciami miedzy atomami w czasteczkach. ktorej rodow6d siega konca XIX wieku. Metody te oraz badania. w kt6ryeh znajduje sie zmetylowana guanina. Metoda opiera sie na dyfrakcji promieni rentgenowskich. Klony te przenosi sie na filtr nvlonowy w sposob urnozliwiajacy przeniesienie wszystkich bakterii wraz z wytwarzanymi przez nie bialkami (rys. kt6ry nukleotyd (nukleotydy) zostal zrnetylowany w wyjsciowyrn fragmenc:ie DNA. plucze si~ )'1 buforem 0 duzym stezeniu soli. Meloda ta nieco rozni sie od metody przenoszenia na filtr. W ten sposob mozna otrzyrnac ezyste bialko wiazace si~ konkretnym fragmen tern DNA. nie tylko z powodu rozwoju samych tyeh technik.2 Oczyszczanie biafek wiqiqcych DNA Po zidentyfikowaniu w czasteczce DNA sekweneji wiazacej bialko rnozna jq wykorzystac do oczyszczenia tego bialka. Gdy wiazka promieni rentgenowskich zostaje skierowana na krysztal. Metoda oczyszczania wykorzystuje zdolnosc bialka do wiazania sie Z okreslona sekwcncja. Naprzeciw wiazki promieni umieszcza sie wrazliwy na promieniowanie rentgenowskie film fotografiezny. rys. ktore mozna dzieki nirn prowadzic. Dlugosc wyznakowanego fragmentu (fragment6w) okreslona na podstawie kolejnej elektroforezy. Wyznakowany fragment DNA tylko wtedy przylacza sit. by stwierdzic rowniez. 7.17 A). to kolejne promienie rentgenowskie beda rozpraszane w podobny sposob.18. Fragment DNA lub oligonukleotyd za wierajacy rniejsce wiazania bialka jest znakowany i hybrydyzowany z filtrem. Jednak podstawy obydwu metod Sq podobne.. W kolumnie pozostaja bialka specyficznie wiazace si~ ze zwiazanym fragmentem DNA. ktora omawialismy poprzednio i kt6rej celem by to badanie DNA zawartego w klonach (np. [uz w 1915 r.3. ktore nukleotydy A. ze ieh wyniki mozna analizowac za pornocq nowyc:h i coraz doskonalszych programow komputerowych.3 Badanie struktury biafek i kompleksow DNA-biafko Oczyszczenie bialka wiazacego DNA stwarza mozIiwosc analizowania jego struktury .

17 Krystalografia rentgenowska (A) Rentgenogram dyfrakcyjny powstaje w wyniku przejscia wlazki promieni rentgenowskich przez krysztal badanej czasteczki.ZACYCH DNA 161 (A) I'owstawanie rentgenograrnu dyfrakcyjnego film wrazlrwy na prornienie rentgenowskie (R) Rcntgenogram dyfrakcyjny rybonuklcazy prornieniowame rentgenowskie -- kryszta! (C) Fragment rnapy gestosci elektronowej rybonukleazy (D) Interpretacja mapy gF. Copyright 1993 by Benjamin Cummings Publishing Company.3 METODY BADANIA BIALEK WIA.nq innowacja byla krystalizaeja bialek wiazacych . Mirno napotykanych problcmow. (D) [ezeli mapa ma wystarczajaco duza rozdzjelczosc. 4th edn. Dzieki ternu mozna wysuwac wnioski na ternat wiazan wodorowyeh i innych oddzialywan chernicznych wystepujaeyeh w obrcbic bialka. Biochemistry. to mozliwe jest zidentyfikowanie grup R po szczeg6lnych aminokwas6w w polipeptydzie oraz okreslenie ich wzajemnego polozenia. W przypadku czasteczki bialka bedzie to mapa sfaldowanego polipeptydu. a rysunek (C) .17C i D). lista opracowanych slruktur stopniowo rosla i obeenie zawiera ponad 30 bialek wiazacych DNA Waz. [esli sic powicdzie. a po drodze mozna napotkac wiele pulapek uniernozliwiajacych osiagniecic sukcesu. Biology. Szczeg6lnie trudne bylo zawsze otrzyrnanie odpowiedniego krysztalu bialka. w tym przypadku tyrozyny. Uzyskanie i analiza danych otrzymanych z krystalografii renlgenowskiej dla nowego bialka ciaglc zajrnuje kilka miesiecy. Za to osiagniecie jego autorzy.stosci elektronowej Mapa gestosci elektronowej 0 rozdzielczosci 2 A . to rnozliwe jest zidentyfikowanie grup R poszczeg61nych aminokwas6w. Perutz i Kcndrew otrzyrnali nagrodc Nabla w 1962 r. na podstawie kt6rej mozemy okrcslic polozenie takich struktur. Rysunek (B) przedstawia rentgenogram dyfrakcyjny otrzymany dla krysztat6w rybonukleazy.zaznaczono polozerue grupy R tyrozyny Rysunek 7. Copyright 1997 by McGraw~Hili Companies czasteczka jest bardziej zlozona. nawet z pomocq komputerow.fragment mapy gestosci elektronowej sporzadzonej na podstawie tego rentgenogramu. kt6rych strukture okreslono na podstawie krystalografii rentgenowskiej. 7. 3rd edn. (D) przedrukowano za zgoda z: Zubay G. 1993). otrzymamy map<. (B) i (C) przedrukowano za zgoda z: Neil Campbell. jak helisy a i harmonijki [ezeli mapa jest wystarczajaco dokladna. Analiza danych jest trudna i czasochlonna. Pierwszymi bialkami. byly rnioglobina i hemoglobina.7. Przy odrobinie szczescia pozwoli r~. g~stosei elektronowej (rys. to stworzyc tr6jwymiarowy model czasteczki bialka (Rhodes. tym wiecej plamek otrzymujemy i tym wiccej musimy wykonac porownan micdzy nimi.

.' sukcesem. Mimo . Rozne jadra atomowe np. z ktora sie wiaza. parts per million).awie pomiaru czestotliwosci prornieniowania elektromagnetycznego potrzebnego do przejscia ze sranu a do stanu P DNA w obecnosci specyficznej sekwencji. Roznice energii rniedzy stanern a i ~ okresla siE. wywolany jest obecnoscia elektronow w sasiedztwie obracajacego sie jadra atomowego. tym wieksza jest ilosc badanych jader atornowych.' na zasadzie. Dzieki innym typom analizy (np. Podstawowa zaleta mctody NMR jest rnozliwosc analizy bialek w roztworze. Po przvlozeniu zewnetrznego pola magnetycznego. NOESY) mozna zidentyfikowac atorny polozone blisko wirujacego jadra. Na podstawie takich informacji mozna wnioskowac a strukturze calego bialka. cz. Elektrony do pewnego stopnia ekranuja jadro przed zewnetrznyrn polem magnetycznym. NMR dostarcza dokfadnych informacji na temat struktury mafych biafek Metoda NMR. w kt6ryrn niektore atorny wegla i (lub) azotu zostaly zastapione rzadkimi izotopami 13e: i lSN. [edna z nich to koniecznosc okreslenia czestotliwosci rezonansowej dla kazdego lub dla mozliwie najwiekszej ilosci jader lH lub inn ego rodzaju badanych jader. ale nie polaczone z nim bezposrednio. a wiec dostarcza inforrnacji na ternat struktury czasteczki. zwane COSY i TOCSY. lI-I. a Nagrode Nabla za to osiagniccie przyznano w 1952 r. ze czestotliwosci te beda sie pokrywac i nie uda sie uzyskac inforrnacji na temat struktury bialka. zwanych a lub ~ (spin a lub spin Pl. na przyklad w czasie faldowania bialka lub w odpowiedzi na dodanie substratu. [esli analiza NMR zakonczy sit.162 ROZDZIAl / • ROLA BIALEK WIAZACYCH DNA promieniowanie elektromagnetyczne o odpowiedniej ~ czestotliwosci t_ -:. wirujace jadro moze przybrac jcdna z dw6ch orientarji.18 Zasada spektroskopii magnetycznego rezonansu j'ldrowego Po przylozeniu zewnetrznego pola magnetycznego wirujace [adro rnoze przybrac jedna Z dw6ch orientacji. roznica jest przewaznie mniejsza niz 10 ppm (ang. Nie wszystkie rodzaje jader atomowyc:h mozna analizowac metoda NMR. zwany przesunieciern chernicznym. 15N charakteryzuja sic specyficzna dla siebie czestotliwoscia rezonanSOWq.18).etapu niezbednego w przypadku analizy rentgenowskiej. Wyniki takich doswiadczen pozwalaja okreslic strukture kornpleksu bialko-DNA oraz dokladnie stwierdzic. Badanie bialka znajdujacego sie w roztworze jest rowniez bardziej przydatne. Tego typu badania czesto uzupelnia sie analiza bialka. Roznica miedzy obserwowana energia rezonanSOWq a jej wartoscia standardowa dla badanego jadra umozliwia wyciagniecie wnioskow dotyczqcych chemicznego otoczenia jadra.ebnego do przejscia ze stanu a do stanu ~.! I I rosnaca energia spin a Rysunek 7. dzieki czemu unika sit. jakie jest polozenie bialka wzgledern podw6jnej hclisy To wlasnie tego typu dane leza u pod staw naszej dzisiejszej wiedzy na temat sposobu dzialania biaiek wiazacych DNA. zwanych a lub ~ (rys 7. a wiec bedzierny dysponowac bardzo dokladnyrni danymi na temat struktury bialka (Evans.' z badan siegajacych poczatkow XX wieku. W metodzie spcktroskopii NMR roznica energii miedzy orientacja a i ~ jest okreslana na podstawie porniaru czestotliwosci promieniowania elektromagnetycz nego potr:t. Po raz pierwszy opisano jq w 1936 r.ny. dajacymi rowniez przydatne do analizy wyniki po zastosowaniu metody NMR. Szczegolne rodzaje analizy. 13e. Wadq metody NMR jest jej przydatnosc tylko do analizy stosunkowo malych bialek. by ich czestotliwosci rezonansowe nie zachodzily na siebie. umozliwiaja ziden- tyfikowanie atornow polaczonych wiazaniern chemicznym z wirujacyrn jadrern. jezeli celem eksperymentu ma bye obserwacja zmian w jego strukturze. na ile roznia sit.' od siebie przesuniecia chemiczne dla roznych jader tak. a wiec i tym wieksza szansa. 1995). Zalezy to od tego. Im wieksze jest bialko. Najistolniejsze w spektroskopii NMR jest jednak to. wywodzi sit. ze ruch obrotowy naladowa nego jadra atomowcgo wytwarza moment magnetycz. Orientacja a charakteryzuje sic. podobnie jak krystalografia rentgenowska.'niece mniejsza energia i jest zgodna z kierunkiem zewnetrznego pola magnetycznego. Jest wiele przyczyn tego ograniczenia. Metoda ta opiera sit.!na podst. Wiekszosc badan bialek z zastosowaniem tej metody opiera sie na analizie jader lH w celu zidentyfikowania chernicznego otoczcnia kazdego atomu wodoru oraz wiazan chernicznych laczacych te atomy z innymi.' problem6w czasarni wystepujacych podczas krystalizacji bialek . ze w wyniku pomiaru tej czestotliwosci przewaznie otrzyrnujcmy wyniki nieznacznie rozniace sie od wartosci standardowych. otrzymamy dane na tym samym poziomie rozdzielczosci co w przypadku krystalografii rentgenowskiej. Efekt ten.yli czestotliwosci rezonansowej badanego jadra.

szczeg61nie gdy mamy do czynienia z bialkiem rozpoznajacym swoje speeyficzne miejsce wiazania. Mirna tcj roznorodnosci.2 sekcja 12. vlozliwe jest rowniez otrzymanie bardzo istotnyeh . 13.4 Funkcje bialek wiqi:qcych DNA i RNA Funkcja bialka Bialka wi'!z'!ce DNA Upakowanie DNA Przyklady Odnosnik Rekombinacja DNA Naprawa DNA Replikacja DNA eukariotyczne histony bialka nukleoidu bakterii bialko RecA nukleazy. Bialka nalezace do tej klasy spelniaja funkcje strukturalne w ehromosomach prokariotyeznyeh i eukariotycznych.4.1 2. Wiekszosc bialek bioracych udzial w ekspresji genomu rozpoznaje specyficzne sekwcncje DNA i wiaze sie gl6wnie z nimi.2 sekcja 10. Chociaz nie sa one kompletnymi bialkarni.1 sekcja 10.3 8.1.2. wydaje sie ze istnieje ograniczona ilosc sposob6w warunkujacych l(.4. Dlatego tez bezposred- 7. doprowadzila do. bialka wiazace DNA maja przynajmniej jedna wspolna ceche .:eniona.2.2.2 sekcja 12. Duze znaczcnie rna rowniez grupa pokrewnvch bialek.74 ODDZIAtYWANIA MIF.!ce RNA Ekspresja genomu Wycinanie intron6w Poliadenylacja mRNA Redagowanie mRNA Dojrzewanie rRNA i tRNA Translacja Degradacja RNA Bialka strukturalne rybosomu bialka snRNP czynniki CPSF.3.2 sekcja 13.4 ODDZIAtYWANIA I BIAtKAMI MIIiDZV DNA vlimo ze gl6wnym celern tego rozdzialu jest stworze nie pods taw dla naszych dalsz. nie sa one jednak cal kowicie schowane.3. 1 8. Liczne interesujace bialka sa wystarczajaco male.3..2. CstF deaminazy adenozyny rybonukleazy syntetazy aminoacylo-tRNA czynniki translacyjne rybonukleazy bialka rybosomowe sekcja 9. 1 sekcja 6.2 podrozdz.zdolnosc wiazania DNA. I DNA jako partner W ostatnich latach zmieniaja sie nasze poglady na role jaka w procesie oddzialywania DNA z bialkiem odgrywa sam kwas nukleinowy.2 sekcja 9. 9.2.2. by mozna je bylo analizowac za pomocq NMR. ze bialka wiazace DNA pelnia rowniez wiele innych funkeji i udzial w procesie ekspresji genomu jest tylko jedna z nich.' niespecyficznie z roznyrni sekwencjami wzdluz czasteczki DNA. znaja zmieniorie zasady w nukleotydach i Wli)Zq sie w tych miejscach.3 sekcja 9.1 podrozdz. wiazacych sie z RNA.2.1 sekcja 12.2 sekcja sekcja sekcja sekcja sekcja sekcja 8.2. [ak zobaczyrny daiej. Inne bialka wiaza si(.ych rozwazan na ternat e' presji genomu.ianvch na podstawie strukturalnej analizy polipep .2 Ekspresja genomu Inicjacja transkrypcji Synteza RNA Regulacja transkrypcji Inne Biatka wi.2.2). rnozna na tej podstawie tworzyc modele wyjasniajace -posob dzialania bialek.' urniejetnosc.5 sekcja 10.3. na przyklad ieh wiazanie z kvvasami nukleinowymi. ze wazna jest sekwencja DNA. Bialka biorace udzial w naprawie DNA rozpoTabela 7.1. musimy jednak parnietac.3. ---- 7. a nie z DNA (lab 7. Od dawna wiadomo. wniosku. glikozydazy DNA bialka rozpoznajace miejsce inicjacji replikacji polimerazy DNA i ligazy bialka wiqi:'lce jednoniciowy DNA topoizomerazy eukariotyczne bialko wiazace sekwencje TATA podjednostka (J bakteryjnej polimerazy RNA polimerazy RNA eukariotyczne czynniki transkrypcyjne bakteryjne represory prokariotyczne enzymy restrykcyjne sekcja 6. Czesc grup chemieznyeh polaczonych z zasadarni purynowymi i pirymidynowyrni jest dostepna z powierzehni hclisy. Zrniany w naszych pogladach dotycza wplywu sekwencji nukleotydowej na strukture podwojnej helisy.3 8. 1. ie chociaz zasady azotowe znajduja sie wewnatrz czasteczki DNA.OZY DNA I BIAtKAMI 163 :nh ograniczen.1.4 sekcja 12. metoda NMR jest nadal wysoko .vdow. 1 . Mozliwe.2 8.2.2 sekcja 9. biora uclzial w procesach replikaeji 1 naprawy DNA. Bezposredni odczyt informacji zawartej w sekwencji nuk/eotyd6w Analiza struktury podw6jnej helisy opisanej przez Watsona i Cricka (sekcja 7.3.4). ze tego typu zrniany strukturalne wplywaja w posredni spos6b na wiazanie bialka.!z.

Zagiecie szczegolnie czesto obserwujc sic w czasteczkach DNA. ale wydaje sie ze proces len przebiega inaczej. Termin ten nie odnosi sie do zmian w strukturze DNA wynikajacych z jego naturalnej elastycznosci. Skr6ty: a . kt6ry nukleotyd z danej pary znajdujc sic na ktorej nici (rys. s. W wiekszym rowku elementy te s. szczeg61nie te znajdujace sie na koncach czasteczki.1. Grupy chemiezne wyeksponowane wewnatrz mniejszego rowka pozwalaja odroznic par~ A· T od pary G· C.donor wiazania wodorowego: vdW .16wnie w forrnie B. s. I I I-I 15. poniewaz wydawalo sie. sugerujqce. Innym rodzajem zmiany konformacyjnej jest zagiede DNA (Travers. 282. Copyright 1998 American Association for the Advancement of Science ni odczyt informacji zawartej w sekwencji nuklcotydow powinien bye mozliwy bez otwierania czasteczki DNA i rozrywania wiazan laczacych pary zasad. Wplywa ona rowniez na rotacje wokol wiazan kowalencyjnych w pojedynczych nukleotydach (patrz s. wystapienie zagiecia DNA zalezv od sekwencji nukleotyd6w.38. Strzalki pokazuja elementy struktury chemicznej. 1998) i dlatcgo bezposredni odczyt informaeji zawartej w formie II DNA opiera sic glownie na kontakcie bialka z wickszym rowkiem. BiZ-DNA oraz form postednich miedzv nirni w obrebie jednej czasteczki DNA. kt6re umozliwiaja powstawanie form kolistych i superskreconych.akceptor wiazania wodorowego. Dlatcgo jest prawdopodobne. bialko wiazace DNA moglo rozpoznac pare A· T. ze nie jest to rnozliwe w przypadku mniejszego rowka. w wyniku czego rozne czesci czasteczki maja rozna strukture. W formie Z DNA wiekszy rowek prawie nie istnieje i bezposredni odczyt informacji jest w pewnym stopniu mozliwy na powierzchni helisy. iz istotne sa tylko dwa symetryczne elernenty (czarne strzalki).19. mogly bye zbudowane z Z-DNA. 7. a odstepy miedzy grupami wynoszq 10-11 nukleotyd6w. ktora moze pomoc bialku wiazacemu DNA w znalezicniu jego miejsca wiazania w czasteczce DNA.. ze plytszy. [ednak wielu badaezy wierzy. Obecnie wierny.150). wezszy i z tego powodu trudniej dostepny dla bialek . et aI. Pewne odcinki.164 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WIAZJ\CYCH DNA wiekszy rowek vdW d 1 T 1 A (patrz tab. Wynika z tego. Przedrukowano za zgoda z: Kielkopf CL. musi ono wejsc w kontakt z jednym lub dwoma rowkami. Kielkopf i wsp. Kr6tkie segrnenly DNA mogly wystepowac w fonnie A.! asymetryczne i dlatego bialko wiazace DNA rnoze ztdenryfikowac orientacje pary A . poniewaz nie zidentyfikowano zadnego bialka specyficznie rozpoznajqcego hclise w formie innej niz B.' Iorrny B. Podobnie jak inne zrniany konformacyjne. Mozliwe jest wsp6listnienie roznvch konfiguracji: A. ze jest rnozllwe okreslenie orientacji pary A . d . Chodzi 0 konkretne miejsea w DNA. Na razic jest to tylko teoretyczna mozliwosc. ze czasteczki DNA w komorce maja calkiern jednorodna strukture i wystepuja r. W takich czasteczkach zagiccic powstajc na koncu 3' regionu bogatego w adenine (Young i Beveridge.. decyduje 0 stabilnosci helisy.3. Poczatkowo sadzono. ze wiekszosc podw6jnej helisy skladala sie z nie zrnieniajqcej sit. ze konformacja helisy maze odgrywac pewnq role w oddzialywaniach miedzy bialkiern a DNA. ze DNA jest duzo bardziej polimorficzny. 149). Do niedawna sadzono. ze sekwencja nukleotydowa posrednio wplywa na ogolna konformacje helisy. dostarczajac prawdopodobnie informacji slruk turalnej.bszy. ZC w kazdej grupie jest 3-5 A. Generalnie jednak uwazano. Aby mogly powstac wiazania cherniczne. s. 150). 1995).19 DNA Rozpoznawanie pary zasad A· T w formie B Pare zasad A· T przedstawiono schernatycznie (patrz rys. trudno jest jednak stwierdzic. mniejszy rowek odgrywa znaczniejsza role w bezposrednim kontakcie z bialkami. 1998). to dysponujerny duzo mniejSZq iloscia danych na temat ieh wiazarua z bialkarni. 7. kt6ry nukleotyd jest na kt6rej nici helisy. 7. WykorzystujqC te dwa elernenty. w kt6rych jeden polinukleotyd zawiera dwie lub wiecej grup powtarzajacych sie adcnin tak. a tym samym determinuje konformacje helisy w poszczeg6lnyeh miejscach. Asocjacja warstwowa. Science. kt6re by lqczyly bialko wiazace DNA z grupami chemicznymi zasad azotowych. [ezeli chodzi o pozostale formy DNA. T poprzez oddzialywanie z rnniejszym rowkiem. podobnie jak laczenie sie zasad w pary. bicgnacyrni spiralnie wzd luz helisy (patrz rys.sily van der Waalsa. ale nie wiedzialo. w kt6ryeh sekwencja nukleotydowa powoduje zagiecie czasteczki. Na przyklad w formie A DNA wiekszy rowek jest gl\. Sekwencjo nukleotyd6w posrednio wpfywo no struktur~ he/isy Ostatnia zmiana naszych poglqd6w na temat struktury DNA dotyezy wplywu sekwencji nukleotydowej na konforrnacje helisy w roznych rniejscach wzdluz CZqSteczki. Ostatnio odkryto dwa asymetryczne elementy (zielone strzalki).149). Te zmiany konformacyjne zaleza od sekwencji nukleotyd6w i wynikaja g16wnie z asocjacji warstwowej miedzy sasiednirni zasadami w jednej nic:i. kt6re mogq bye rozpoznawane od strony wiekszego rowka (powyzej) i mniejszego rowka (ponizej). W przypadku formy 13 DNA mozliwc jest jednoznaczne zidentyfikowanie i okreslenie orientaeji sekweneji na podstawic grup wy eksponowanyeh wewnatrz wiekszego rowka. 7. Tak jak w przypadku zmian w konfor- a a vdW a mniejszy rowek Rysunek 7. T.

histone fold) Domena HU/IHF* Szczelina w polimerazach * Domena HU/IHF bakteryjnych bialek HU niespecyficznie wiaze DNA (patrz sekcja 6. DNA . a wiec wiaza sie z ograniczona liczba miejsc w czasteczce DNA. decydujqcej 0 wiqzaniu przez to biatko sekwencji specyficznej. rei homology domain) Domeny niespecyficznie wi'lzClCe DNA Domena histonowa (ang. integration host factor). 7. Podstawa podzialu jest struktura segmentu bialka. Chapman & Hall. Skupimy sie przede wszystkim na tych bialkach. oct-I.20 Domena typu helisa-skryt-helisa ------- Rysunek przedstawia umiejscowienie domeny HTH (kolor niebieski) represora bakteriofaga 434 E. 1993. ze rodzine t~ mozna podzielic na kilka grup. za zgoda A.2. nie wiadomo w Jakim stopniu zagiecie DNA wplywa na wiazanie bialek. wywolane zwiazaniem bialka z odpowiednia sekwencja. Po porownaniu struktury bialek wiazacych sie ze specyficznymi sekwencjami DNA.Protein Interactions. by mozliwy byl bezposredni odczyt sekwenrji.5. Przewaznie towarzysza ternu rnniej specyficzne oddzialywania z powierzchnia czasteczki DNA.niejszv typ oddzialywan. Falvo i wsp. Szczegolowe zapoznamy sit. szybko staje sie jasne.4 ODDZIAt YWANIA MI~DZY DNA I BIAtKAMI 165 Tabela 7.bialko ssakow determinuiace plec eukariotyczny czynnik transkrypcyjny TFIIIA receptory horrnonow steroidowych wyzszych Eukaryota GAL4 . Arc i Mnt eukariotyczne bialko wiazace sekwencje TATA bialko E2 papillomawlrusow NF-KB . oct-2 .3. 1995). coli w wiekszym rowku podwojne] helisy DNA. ktory oddzialuje z DNA (tab.drozdzowy czynnik transkrypcyjny GCN4 .4. 1995. high mobility group) Palce cynkowe Palec cynkowy typu C2H2 Cysteinowy palec cynkowy Dwujqdrowy palec cynkowy Domena zasadowa represory laktozowy i tryptofanowy E. macji helisy. T raversa . ze zagiecic DNA. odgrywa istotna role w regulacji ekspresji pewnych genow (np.' juz z cechami strukturalnymi DNA. istotnymi w tworzeniu kornpleksow z bialkarni i mozerny teraz zajac sit. "N" i "C" oznaczaia odpowiednio koniec N i koniec C domeny.5 Domeny wiazace DNA Przyklady bialek rnajacych taka domene Domena Domeny wiClzClce specyficzne sekwencje DNA Domena typu helisa-skret-helisa Typowa helisa-skret-helisa Domena homeotyczna Podwojna domena homeotyczna Domena POU Uskrzydlona helisa-skret-helisa Domena HMG (ang.2 Biafko jako partner Zapoznalismy sit.czynnik transkrypcyjny kregowcow pit-l .1 0 bialkach biorqcych udzial w upakowaniu nukleoidu) z wyjqtkiem domeny w bialku IHF (ang. Aby specyficznie wiazac si~ z podwojna helisa. sekcja 8. Przedrukowano z: Andrew Travers.! po prostu stabilizowac kompleks bialko-DNA lub dzieki ktorym jest bye moze odczytywana posrednia informacja 0 sekwencji nukleotydow. Dokonamy rowniez przegladu pozostalych dornen wiazacych DN!\' Rysunek 7.czynnik transkrypcyjny ssakow histony Eukaryota bakteryjne bialka HU i IHF polimerazy DNA i RNA Wstega-helisa-bellsa Domena TBP Dimer barytka-B (ang. 7. W kilku przypadkach wykazano.bialka regulatorowe kregowcow GABP . Kazdy z rodzajow domeny wiazacej DNA mozna znalezc w wielu bialkach.2). Luisi.' samymi bialkami. ~-barrel dimer) Domena RHB (ang. Prawdopodobnie niektore z domen powstaly kilkakrotnie w czasie ewolucji.' z dwierna domenami . bialko musi wejsc z nia w kontakt umozliwiajacy rozpoznanie sekwencji. ktore rozpo znaja specyficzna sekwencje nukleotydow. zawarta w konformacji helisy. Z punktu widzenia eksprcsji genomu jest to najwaz.domena typu helisa-skret-hclisa oraz z palcem cynkowym.MetJ. ktore mog. coli bialko Antennapedia Drosophila bialko Pax .drozdzowy czynnik transkrypcyjny represory bakteryjne . W wiekszosci przypadkow jest to zwiazane z penetracja wiekszego lub mniejszego rowka tak. czesto pochodzacych z bardzo roznych organizmow.7.bialko regulatorowe wyzszych Eukaryota SRY .

a helisa pierwsza oddzialuje z mniejszyrn rowkiem. ktore wlaczaja i wylaczaja ekspresje poszczegolnych genow. Chapman & Hall. ktorych rola zostanie omowiona w sekcji 11. 20 aminokwasow. a pierwsza he lisa oddzialuje z mniej szym rowkiem (rys. 1990). ktorcj kontakt z DNA decyduje 0 mozliwosci bezposredniego odrzytu informacji z sekwencji kwasu nukleinowego.1). Inne czesci bialka rowniez oddzialuja z powierzchnia czasteczki DNA.1.3). jedno z bialek homeotycznych Drosophila. sie rniedzy Jak wynika z nazwy. ktore Sq istotne dla regulacji ekspresji genow w procesie rozwoju. DNA-Protein Interactions. 7. jednak szczegoly oddzialywania helisy rozpoznajacej z wiekszyrn rowkiem DNA nie s4 dokladnie takie same we wszystkich przypadkach. 1998). wiazac rozne fragmenty podwojnej helisy. naleza: • z czterech Domena rybonukleoproteinowa (RNP) sklada sie struktur 13 i dw6ch helis a polaczonych w kolejnosci 13-a-13-13-a-13. • Domena K-homologiczna (ang.harrnonijke ~. a wiec stanowi tylko niewielka czesc bialka. Jedno Bialko z bialek rybosomowych wiaze sle z rRNA za pornoca do domeny homeotycznej. Znane Sq rownicz inne wersje eukariotycznej dorneny typu I-ITH. w ktorych po raz pierwszy slwierdzono wystepowanie tego typu domeny (Herr i wsp. ale rnozna jadrowyrn bialku • • wiazacym RNA. a z drugiej strony .21). '1. T raversa . Przedrukowano z: Andrew Travers. jak i z RNA (sekcja I 1. represor laktozowy. Dlatego ta druga helisa a jest helisa rozpoznajaca. np. w ponad 250 przypadkach.21 Domena homeotyczna Pokazano trzy pierwsze helisy typowej domeny homeotycznej. a polozenie aminokwasow bczposrednio oddzialujacych z nukleotydami jest rowniez zmienne.3: Domeny wiClzClce RNA domen bialkowych wi¥. Miedzy druga i trzeciq helisa znajduje sie skret 13. z tym jest ai ze kolejnosc struktur drugorzedowych strukturami dwuniciowe eukariotycznych bialek wiazacych DNA i majacych dornene HIH. domena ta wystepu]e w bialkach wiazacych RNA. znaleziono j'!.1 Chociaz kazde z opisanych prokariotycznych i eukariotycznych bialek rna domene HIlI. [ej orientacja w wiekszym rowku nie zawsze jest taka sama. Struktura skretu nie jest przypadkowa.C wzdiuz domeny. Helisy 1-3 polozone sa w kierunku N-. Rysunek 7. Pierwsza helisa a razem ze skretern p umiejscawiaja druga helise a na powierzchni bialka. Uskrzydlona helisa-skret-hclisa (ang. helix-turn-helix) (Harrison i Aggarwal. ze pasuje ona do wiekszcgo rowka DNA.3. Damena HIH wystepuje w wielu prokariotycznych i eukariotycznych bialkach wiazacych DNA. dornena ta zbudowana jest z dwoch helis a oddzielonych skretern w lancuchu bialkowym (rys. w taki sposob. Motyw ten jest stosunkowo go znalezc przynajmniej w jednym rzadki. Nazwa domeny pochodzi ad pierwszych liter nazw trzech bialek. rnoze wiazac sie zar6wno z DNA. Hclisa trzecia jest urniejscowiona w wiekszyrn rowku.ang. w przypadku pewnych struktury bialek moze rownlez podobnej wiazac RNA. Z RNA wiaze 13 na koncu domeny. 1988). Glowna role w wiazaniu RNA odgrywajadwie kach wiazacych srodkowe struktury 13. Domena wi<lz<lca dwuniciowy RNA (dsRBD . W bial- RNA naiczescie] spotyka sle dornene • RNP. reguluj4CY ekspresje operonu laktozowego (sekcje 8. a mianowicie: • Domena POU przewaznie wystcpuje w bialkach majacych rowniez dornene homeotyczna. sklada jqCq sie z czterech aminokwasow. Naleza do nich bialka z dorncna homeotyczna.3. Domena homeotyczna wi¥. RNA wiaze sie rniedzy para helis a. K-homology domain) rna strukture 13-a-a-13-13-a. Obydwie dorneny prawdopodobnie wspolpracuja ze soba. Z jednej strony domeny HIH rna ana trzecia helise a. Dornena homeotyczna jest rozbudowana wersja domeny HIH..!. Domena HIH sklada sie przcwaznie z ok. pornagajac w prawidlowym ulozeniu helisy rozpoznajacej w wiekszyrn rowku.3. winged he lix-turn-helix) jest inna rozbudowana wcrsja podstawowej struktury HIH.166 ROZDZIAl 7 • ROLA BIALEK WIAll\CYCH DNA i 11. lecz rna specyficzna konforrnacje zwana skretern ~. Zawieraja j4 niektore najlepiej poznane regulatorowe bialka bakteryjne. Hclisa rozpoznajaca maze miec rozna dlugosc i przcwaznie jest dluzsza w bialkach eukariotycznych. Bicoid. Irzecia helisa pelni role helisy rozpoznajacej. [ak wynika r jej nazwy. Drugim z nich jest przewaznie glicyna. rnozna wymienic te.- Do najczesciej wystepujacych cych RNA (Twyman.20). skladajaca sie z.3.ang. za zgoda A.!. 1993.ca DNA. Sposrod roznych Ramka 7. double strand RNA binding domain) jest podobna do domeny RNP. 60 aminokwasow tworzacych cztery helisy a. Dornene typu heli$a-$kr~t-heli$a moi:na znaleic w bialkach prokariotycznych i eukariotycznych Pierwsza zidentyfikowana struktura wiazaca DNA byla domena typu helisa-skret-helisa (HIH . a-13-13-13-a.

Jej umiejscowienie w tym rowku zalezy od harmonijki ~. Pozostale odrniany palea cynkowego roznia sie od wersji Cys. Inne rodzaje domen specyficznie wiqiqcych DNA W roznych bialkach odkryto kilka innego rodzaju domen wiazacvch DNA. Interesujaca cccha palea cynkowego jest wystepowanie w niektorych bialkach wielokrotnych kopii tej dorneny. jak arginina. "N" I "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny. atom cynku jest zwiazany z cztererna cystcinami. struktura samego palea. Osobliwoscia tej dorneny jest formowanie sie helisy a tylko wtedy.5 zawiera palcc cynkowy (Clarke i Berg. ze jedna helisa a umiejscawia si~ w wiekszym rowku DNA. w ktorym jest ich 37. 1998). Liczne bialka eukariotyczne maja dornene zasadowa. oraz. 7. jak: • Dornena zasadowa. 1993. kt6ry utrzymuje harrnonijke i helisc w od· powiedniej pozycji w stosunku do siebie. Bialka z rodziny receptorow jadrowych (receptory steroidow) maja domene wiazaca DNA. Chapman & Hall. Tworza one razem jedna domene. 1993. Helisa a jest tq czescia domeny. bialka biorace udzial w procesie transkrypcji DNA. Prawdopodobnie w wiekszosci przypadkow kazdy palec cynkowy niezaleznie oddzialuje z DNA. np. wieksza od standardowego palea cynkowego (rys. skladajaca sie z dw6ch helis a zawierajqcych szesc cystein koordynujacych dwa atomy cynku. za zgoda A.22).22 Palec cynkowy typu Cys2His2 Na rysunku pokazano palec cynkowy biatka SW 15 drozdzy.kolor zielony. natomiast w eukariotycznych spotyka si~ jq dose C7. 1998). gdy bialko oddzialuje z DNA.')3. w tym z dwoch cystein i dwoch histydyn. Domena typu wstega-helisa-helisa jest jed na z nielicznych domen. Pierwsza szczegolowo zbadana domena tego typu byl palcc cynkowy typu Cys. decydujaca 0 specyficznym oddzialywaniu z DNA. Chapman & Hall. 7.7. ale sa rowniez przyklady bialek z duzo wieksza iloscia palcow. Niektore nie maja struktury P i skladaja sie po prostu z jednej lub kilku helis a. w ktorych helisa a nie jest struktura rozpoznajaca. Wyizolowano bialka majace dwa. w ktorej struktura rozpoznojaca DNA jest helisa a.harrnonijke ~ i nastepujaca po niej helise a. Atom cynku jest zwiazany z dwiema cysteinami harmonijki ~ i dwiema histydynarni helisy o. ze sposrod 19 000 bialek nicienia Caenorhabdiiis elegans . "N" i "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny. ktorej oddzialywania z wiekszym rowkiern DNA sa decydujace dla wiazania bialka. Wydaje sie. Przedrukowano z: Andrew Travers. DNA-Protein Interactions. skladajacy sic z okolo 12 aminokwasow. Grupy R tych aminokwas6w . trzy lub cztery palce cynkowe. W bialku nie zwiazanym z DNA helisa nie powstaje..His. seryna i treonina. oddzialujacej ze szkieletern cukrowo-fosforanowym. Wydaje si~. Traversa N teinowym paleu cynkowym nie rna histydyn. z ktoryrn zapoznamy si~ szczegolowo. z kt6rych powstaje "palec" wystajacy z powierzchni bialka. sa jednak przyklady bardziej zlozonych zaleznosci miedzy paleami.His. DNA-Protein Interactions. Aminokwasy te tworza dwie struktury . jak jedno z bialek ropuchy. Traversa • . ze 1 % genow ssakow kodujc bialka majace t~ domene. zawierajaca liczne aminokwasy zasadowe. Szacujc sift' rowniez. Miedzy nimi znajduje sie atom cynku.~Sto(Mackay i Crossley.kolor zielony. od atomu cynku.23). Tego typu domena rzadko wystepuje w bialkach prokariotycznych. Mozna wvroznic przynajmniej szesc roznych wersji palea cynkowego. Przedrukowano z: Andrew Travers. Na przyklad w cys- Rysunek 7. a druga helisa a oddzialuje z innymi bialkami.4 ODDZIAlYWANIA MI~DZY DNA I BIAlKAMI 167 W bialkach eukariotycznych wiqiqcych DNA czesto wyst~pujq palce cynkowe Palec cynkowyjest drugim rodzajem domeny wiazace] DNA.23 Palec cynkowy receptora steroid6w Grupy R arninokwas6w oddziatujqcych z atornem cynku . Z wiekszym rowkiem DNA Rysunek 7. Rozny moze bye rownicz sposob utrzymywania atomu cynku na swoim miejscu. za zgoda A. zwiazany z dwiema cysteinami i dwiema histydynami (rys.

TATA-binding protein) (sekcja 8. mimo ze dookola sa doslownie rniliony innych miejsc.' terrnodynarniczna preferencje. 1993. tzn. Oddzialywania mi~dzy DNA i biaikam. Przedrukowano z: Andrew Travers. ktore Iacza si~ z wiekszvm rowkiem.25 _. a nie na podstawie porownan z innyrni bialkami.2.. 1998).ang. W wiekszyrn rowku DNA zasady azotowe i grupy R aminokwas6w struktury rozpoznajacej bialka lacza sie za pomOcq wiazan wodorowych. Aby osiagnac tf.zielony. chociaz mogq one rowniez tworzyc wiazarua wodorowe. w czasie procesu wiazania bialka z DNA rnusi powstawac jak najwieksza ilosc polaczen miedzy nimi. s. bialka te przewaznie lub nawet caly czas sa niespecyficznie polaczone z DNA (Stormo i Fields. za zgoda A. Kulki przedstawiaja grupy R leucyny.wiazac niespecyficznie. Struktury ~ z lewej strony wiq±'! sie z wiekszym rowkiem podw6jnej helisy.3 Partnerstwo DNA i bialka Konczac nasze rozwazania om6wimy jeszcze wazne elernenty partnerstwa DNA i bialek z nirn sit. 1993).' gl6wnie dzieki Rysunek 7. jak w przypadku domeny typu wstcga-helisa-helisa. takich jak lizyna i arginine.._. ---------- Na rysunku przedstawiono suwak leucynowy typu b?IP . z kt6rymi rnogloby siE. 7. DNA Protein Interactions.. 1993. Wiekszosc bialek. DNA-Protein Interactions.24 Domena typu wstega-helisa-helisa Rysunek przedstawia dornene typu wstega. -_ . 153). ujemnie naladowanymi resztarni fosforanowymi na powierzchni helisy DNA. ze na tyrn poziomie oddzialywan bialko-DNA kazdy przypadek jest unikatowy i szczeg6ly wiazania nalezy opracowac raczej na podstawie badan strukturalnych. "N" i "C" oznaczaja odpowiednio koniec N i koniec C domeny. ze poniewaz w kornorce jest tak duzo DNA i tak malo kazdcgo rodzaju bialek wiazacych sit. a nie w wiekszym rowku. Traversa oddzialywaniom elektrostatycznym 7.' z nim niespecyficznie.4. Suwak leucynowy __ _----_.' wiazacych.' ze specyficznymi sekwencjarni w DNA. Uogolniajac mozna stwierdzic. dlaczego wiaze sit. lqczq sit. kt6re wiaza sit. za zgoda A. Przedrukowano z: Andrew 1ravers.' bezposrednie wiazania wodorowe miedzy bialkiern a powierzchnia podwojnej helisy lub jej wiekszym rowkiem.'to sugestie.' z nim. jednak domena TBP oddzialuje z DNA g16wnie w mniejszyrn. • Domena TBP zostala dotychczas zidentyfikowana tylko w bialku wiazacym sckwencje TAT A (TBP .kolor niebieski.2.. W przykladowe] domenie pokazanej na rysunku.' wstega. dimeryzujace helisy wydluzaja sre i tworza pare zasadowych domen wiazacych DNA. coli . Domene typu wstega-helisa-helisa znaleziono w kilku bakteryjnych bialkach regulato rowych .·helisa-helisa represora MetJ E. Chapman & Hall.168 ROZDZIAt I • ROLA BIALEK WII\LACYCH [)NA Rysunek 7. Niebieska i zielona struktura S.24). Podobnic.! czcsciamt dwoch roznych bialek. Wysunit. Z terrnodynamicznego punktu widzenia wiazanie specyficzne jest faworyzowane i dlatego bialko laczy sif. W niektorych przypadkach tworza sif..w wiazaniu posredniczy czasteczka wody. drugie . Biaika wiqzq sic z DNA za pomocq wiazan niekowalencyjnych. w innych . Traversa . jed no . Wyrnaganie to czesciowo wyjasnia. moze rownicz wiazac sit. Dodatnio naladowane grupy R aminokwas6w. utrzyrnujac razem dwa bialka tworzace dirner. W mniejszym rowku wazniejsze sa oddzialywania hydrofobowe.'ze swoim specyficznym miejscern wiazania. 7.3) i od tego bialka pochodzi tez nazwa domeny (Kim i wsp.. Lcucyny pochodzace z dwoch helis t'!cz'! sie ze soba dzieki ocldziatywaniorn hydrofobowym (patrz Tomko 7. dwuniciowa harmonijka ~ (rys.. struktura rozpoznajaca jest harmonijka ~.dimeru skladajacego sie z dwoch identycznych bialek. Chapman & Hall.

Z pcwnym prawdopodobicnstwcm popelnienia bledu pozwala to wy dedukowac. Nucleic Acids Res. W tyeh bialkach najwazniejsze polaczenia z zasadami azotowymi nukleotydow. 1997). Bioi. niezbednych do speeyfieznego wiazania sie z nim. Clerc RG. In: DMJ lilley. 10-23. skladajacy si~ z helisy a.. 7. 82. Tego typu domena jest suwak leucynowy. ona wiqzac? Rodzi sie intrygujace pytanie. Dervan PB and Rees DC (1998) A structural basis for recognition of A·T and T·A base pairs in the minor groove of B-DNA. powstaja na skutek oddzialywan z czterema arninokwasami . 5. 3157-3170.dzie sit. i wynika to rowniez z koniecznosci zwiekszenia liczby polaczen z DNA.. Oxford. Wiele bialek wiazacych DNA jest dimerami. IRL Press... Trends Biochem. Evans JNS (1995) Biomolecular NMR Spectroscopy. Tlumaczy to rowniez. Annu. Oxford University Press. Sturm RA. 2018 2022. Science. 7.. ed. Hahn S and Sigler PB (1993) Crystal structure of a yeast TBP/T ATA-box complex.w stosunku do monomeru . 1-4. oct-L and Caenorhabditis elegans unc-86 gene products. Kadonaga JT (1991) Purification of sequence specific DNA binding proteins by DNA affinity chromatography. zwinietej scislej niz standardowa helisa. Harrison SC and Aggarwal AK (1990) DNA recognition by proteins with the helix-turn-helix motif. Luisi B (1995) DNA-protein interaction at high resolution. z kt6rq bt. Falvo jV. ktore jeszcze bardziej dopasowuja do siebie dwie laczace sie powierzchnie i umozliwiaja powstanie dodatkowyeh wiazan. 59. (1988) The POU domain: a large conserved region in the mammalian pit-I. dlaczego podczas oddzialywania nastepuja konformacyjne zmiany w strukturze jednego lub drugiego partnera. Lacza sie one z takimi samymi resztami drugiej czasteczki bialka. Szewczyk JW. Nucleic Acids Res. 282. Porownano sekwencje aminokwasow w helisach rozpoznajacych. 1-48. Cell. 3129-3133. sklada jacymi si~ z dwoch polaczonych ze soba czasteczek bialka. Geiger JH. jezeli tylko zostanie poznana sekwencja arninokwasow jego helisy rozpoznajacej.zwiekszcnia ilosci polaczen z DNA. New York. LlTERATURA CYTOWANA Barton GJ (1995) Protein secondary structure prediction. na powierzchni helisy a znaiduja sie reszty leucynowe. 933-969. . 282. Z jaka sekwencja bedzie sie wiazac nowy palec eynkowy.t-l. oc. Science. Galas D and Schmitz A (1978) DNase footpnnting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Czesc oddziaiywan zachodzi rnicdzy jcdnym aminokwascm i pojedyncza zasada. 365. Sci. White S. Bioi. Clarke ND and Berg JM (1998) Zinc fingers in Coenorhabditis elegans: finding families and probing pathways. Mimo podobnej nazwy jest ona zupclnie irma niz wiazaca DNA domena helisa-skret-helisa i nie nalezy ich mylic. z sekwencjami DNA przez nie rozpoznawanymi. Z jednej strony. chociaz wydedukowano niektore zasady rzadzace oddzialywaniami DNA z pewnymi typami palcow cynkowych (Choo i Klug. I S I 3-1 S 16. Lehninger A (1970) Biochemistry.trzerna wchodzacymi w sklad helisy rozpoznajacej i czwartym bezposrednio z nia sasiadujacyrn. by na podstawic okreslenia struktury helisy rozpoznajacej w domenie wiazacej bialka mozna bylo prze widziec specyficzna sekwencje.. Oxford. I 17·125. Mackay JP and Crossley M (1998) Zinc fingers are sticking together. z ktora bedzie sie ono wiazac? Dotyehezas nie udawalo sie osiagnac lego celu. Rev. 3047-3060. Kielkopf el. Kim YC. Dimerarni jest wiele bialek majaeyeh dornene HTH oraz bialek z palcami cynkowymi. Curro Opinion Struct. gdzie mozliwosc wytworzenia polaczen miedzy bialkiem i DNA jest najwieksza. co umozliwilo sformulowanie zasad rzadzacych tymi oddzialywaniami. Natl Awd. Czy mozna poznac proees speeyfieznego wiazania DNA na tyle dokladnie. Turner JM. Dimeryzacja zachodzi w sposob umozliwiajacy oddzialywanie z helisa domen wiazacych DNA obydwu czasteczek tworzacych dimer.. USA.25). 9.7. Proc. 512 520. Baird EE. Sci. Garner MM and Revzin A (1981) A gel electrophoretic method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. nalezacych do roznych palcow cynkowych. Worth.4 ODDZIAl YWANIA MI~DZY DNA I BIAlKAMI 169 w czasie ewolucji struktury rozpoznajace wielu domen wiazacych DNA dokladnie dopasowaly sie do wiek szego rowka w podwojnej helisie. Choo Y and Klug A (1997) Physical basis of a protein-DNA recognition code. DNA-Protein' Structurot tnteroctions. I 10 I-I I I I.. 23. Hendrickson Wand Schleif R (1985) A dimer of AraC protein contacts three adjacent major groove regions at the Ara I DNA site. 208. pp. tworzacych miejsce wiazania. Genes Develop. Bialka tworzace dimer prawdopodobnie w pewien sposob wspoipracuja ze soba. Thanos D and Maniatis T (1995) Reversal of intrinsic DNA bends in the If'NP gene enhancer by transcription factor's and the architectural protein HMG I(Y). a inne miedzy jcdna zasada i dworna aminokwasami. 111-115. et 01. Herr W. Methods Enzvmoi. Wiele bialek oprocz domeny wiazacej DNA rna rowniez charakterystyczna domene bioraca udzial w oddzialywaniu bialko-bialko. 83. co prowadzi do ponad dwukrotnego . 372-376. w wyniku ktorego powstaje dimcr. Drugim rodzajem domeny odpowiedzialnej za dimeryzacje jest dornena typu helisa- -p~tla-helisa. Czy na podstawie struktury helisy rozpoznajqcej moina przewidziec specyficznq sekwencjt. Nature. tworzac dimer (rys. Biochem. 2. Curro Opinion Struct.S.

A Concise Reference. . WP. 171.Posrerra wiodotnosc! z tego rozdziafu 0 ciokfadniejsze informacje no temat bialek wiqiqcych RNA Neidle S (1994) DNA Structure and Recognition. IRL Press.Przyst~nie podane informaCJe na temat bialek wiqiqcych DNA Travers A (1993) DNA-Protein Interactions. Warszawa 1999. London. Nat! Acad. 205-211. Mol. Trends Biochem. Corey RB and Branson HR (1951) The structure of proteins: two hydrogen-bonded helical configurations of the polypeptide chain. 37. 729·-740. 109-113. . McLennan AG. IRL Press. Natl Acad. IRL Press. Bates AD and White MRH (1997) Instant Notes in Molecular Biology. USA. Proc. Sci. . Watson JO (1968) The Double Helix. 52. Oxford. Atheneum. Young MA and Beveridge OL (1998) Molecular dynamics simulations of an oligonucleotide duplex with adenine tracts phased by a full helix turn.. New York. BIOS Scientific Publishers. BIOS Scientific Publishers. free energy and information content in protein-DNA interactions. London. Stormo GO and Fields OS (1998) Specificity. Ptoc. IRL Press. Twyman RM (1998) AdvanGed Molecular Biology. . Chapman & Hall. Turner PC. Oxford. USA. j. Pauling L. Travers AA (1995) DNA bending by sequence and proteins. Bio/ogia molekularna. Nagai K and Mattaj IW (eds) (1994) RNA-Protein Interactions.Najbardziej przyst~pne opracowonie stJOsr6d wielu no ten temat. Oxford.Zwif. Cell. BIOS Scientific Publishers.Opracowanic tematu na pcriomic badawczym.' In Focus. Strachan T and Read AR (1996) Human Molecular Genetics. 49-75. 23. 415-423. Oxford. DNA -Protein: Structural Interactions.170 ROZDZIAl 7 • ROLA BIAlEK WIAZI\CYCH DNA Pauling L and Corey RB (1953) Configurations of polypeptide chains with favored orientations around single bonds: two new pleated sheets. LlTERATURA UZUPEtNIAJ)\CA Bates AD and Maxwell A (1993) DNA Topology. In Focus. Sci. Przeklad polski: Kr6tkie wykfady.zfy opis struktury DNA Branden C and Tooze J (1991) Introduction to Protein Structure.Najbardziej wszechstronne opracowanie na ten temat. Oxford.Najwainiejsze odkrycie XX wieku opisane w stylu opery mydlanej. Academic Press. Sci. . In: DMJ Lilley ed. Przeklad polski: Podwojna spirala. Oxford. Oxford. PWN. . Bioi. Singh H. Baldwin AS and Sharp PA (1988) Molecular cloning of an enhancer binding protein: isolation by screening of an expression library with a recognition site DNA. Oxford. Nature. 27. Watson JO and Crick FHC (1953) Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. 281. . 737-738. Lilley OMJ (ed) (1995) DNA-Protein: Structurallnteracitons. pp. Garland. Warszawa 1975. London. IRL Press. . 675-687. Rhodes G (1993) Crystallography Made Crystal Clear. LeBowitz JH.

You're Reading a Free Preview

Pobierz
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->