“Biodegradación de

Petróleo Diesel”

Autor: Rómulo Aycachi Inga

Docente: MSc. Carmen Rosa Carreño Farfán

Facultad de Ciencias Biológicas

Departamento de Microbiología y Parasitología
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallos

Lambayeque, 04 de abril del 2008.

1
 I. Introducción:

La industria petroquímica es importante en una sociedad moderna, no obstante la

falta de un programa de protección ambiental, hace que el medio ambiente se contamine
al producirse derrames de petróleo, principalmente de crudo, por un deterioro de los
oleoductos, descargas de efluentes contaminados, afloramientos naturales a través de
fisuras de la corteza terrestre y debido a la producción, transporte y almacenamiento de
este recurso natural.
A nivel mundial, el volumen de derrame de petróleo es de 1.7 a 8.8 millones de
toneladas métricas por año y en nuestra región (Pacífico Sudeste) es de 6000 toneladas
métricas al año. En el Perú se registran derrames de petróleo desde 1978, uno de ellos
fue el producido en el oleoducto marino de Talara, estando entre los últimos el ocurrido
el año 2000 en el río Marañón que afectó la Reserva Pacaya-Samiria y el producido el
30 de enero del 2008 en el que, debido a una explosión producida en un barco carguero,
se derramaron frente al mar de Tumbes 1300 barriles de crudo de petróleo. Pero no sólo
derrames mayores causan contaminación sino también los constantes derrames
accidentales en suelos de nuestra selva, los que se producen por el rompimiento del
Oleoducto Nor-Peruano, debido a accidentes naturales y por la actividad extractiva. Los
mares del planeta sufren cada año millones de pequeños derrames contaminantes
procedentes de barcos, refinerías costeras y plataformas petrolíferas. Un estudio de la
Universidad Politécnica de Cataluña advierte de que el impacto ambiental de los
pequeños vertidos diarios es mucho mayor que el ocasionado por un gran accidente y
han lanzado una seria advertencia sobre el enorme impacto ambiental que provocan los
pequeños vertidos de petróleo -desde un litro a unas 80 toneladas- por su excesiva
frecuencia.
Los dispersantes químicos utilizados para favorecer la remediación de los ambientes
contaminados pueden causar un mayor impacto ecológico que el mismo derrame, por su
toxicidad y recalcitrancia a la biodegradación. Por tanto, una mejor alternativa de
solución es el proceso de biorremediación, que es el tratamiento biológico del suelo,
aire y agua, mediante la biodegradación de compuestos tóxicos para transformarlos en
compuestos de menor o ningún impacto ambiental. Así en la biodegradación de
hidrocarburos, se utilizan bacterias con alta capacidad degradativa, entre estas:
Brevibacterium, Spirillum, Xanthomonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Nocardia,
Flavobacterium, Vibrio, Achromobacter, Acinetobacter, Micrococcus, Pseudomonas
aeruginosa, Serratia rubidae, Bacillus sp., Pseudomonas mendocina, Pseudomonas
aureofasciens, etc., las cuales disminuyen la concentración de hidrocarburos presentes
en el ambiente y al mismo tiempo son inocuas para la salud y el medio ambiente. Estas
bacterias producen bioemulsificantes y biosurfactantes que disminuyen la tensión
superficial entre el petróleo y el medio acuoso facilitando el acceso microbiano a la
fuente de carbono insoluble para su degradación.

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 II. Generalidades:

a. El crudo de petróleo:

El crudo de petróleo se caracteriza por ser un líquido negro, viscoso y con una
composición química sumamente compleja, pudiendo contener miles de compuestos,
básicamente de la familia de los hidrocarburos. Los hidrocarburos componen la familia
predominante de compuestos (un 50-98% de la composición), por lo que constituyen
uno de los grupos de contaminantes ambientales más importantes, tanto por su
abundancia, como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales.
Mayoritariamente son alcanos de cadena lineal (n-alcanos o nparafinas), alcanos
ramificados (en menor cantidad), cicloalcanos (o naftenos) y cantidades variables de
hidrocarburos aromáticos. La composición elemental de un crudo está condicionada por
la predominancia de los compuestos tipo hidrocarburo: 84-87% de C, 11-14% de H, de
0-8% de S, y de 0-4% de O y N y metales como el níquel y el vanadio. Los principales
componentes se subdividen y purifican en distintas fracciones: i) fracción saturada (n-
alcanos, alcanos ramificados con cadenas alquílicas y las cicloparafinas), ii) fracción
aromática (monoaromáticos, diaromáticos y hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAPs), iii) fracción de resinas y iv) fracción de asfaltenos que son menos abundantes y
consisten en compuestos más polares, pudiéndose encontrar hidrocarburos
heterocíclicos, hidrocarburos oxigenados y agregados de alto peso molecular .

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 b. Refinado del crudo de petróleo:

Para comprender la naturaleza química de los diferentes derivados del petróleo

que potencialmente pueden ser contaminantes en el medio ambiente, hay que entender
el proceso de refinado del crudo utilizado para la obtención de estos productos
petrolíferos.
El refinado pasa por un proceso de destilación, con la finalidad de eliminar el
color y olor, así como también, los compuestos del azufre. Se destila a emperaturas
crecientes obteniendo 4 fracciones principales: gasolina, queroseno, destilados medios
(querosenos, gasoil, aceites lubricantes) y un residuo. Este residuo se destila al vacío
obteniéndose otros aceites lubricantes (más pesados), ceras y parafinas y betumes
asfálticos (alquitranes).
Durante el proceso de refinado, se eliminan componentes de la fracción
asfalténica (altamente recalcitrante) lo que implica que los refinados intermedios
(gasoil, fueles, querosenos y también las gasolinas) sean productos relativamente más
biodegradables que los coques o alquitranes residuales. Así pues, la composición
química de la gasolina es diferente a la del gasoil debido a que se han obtenido como
productos de destilación del petróleo a partir de diferentes intérvalos de temperatura
(tabla 1.4). La obtención de gasolina es menos directa que la de los fueles y gasóleos, ya
que en una primera fase se obtiene por destilación del crudo entre 20-180ºC. Esto
implica una composición de n-alcanos más ligera (C6-C11) que los fueles y gasóleos
(C10-C25). En la gasolina encontramos como componentes más abundantes: nbutano,
isopentano, pentano, mono y dimetilpentanos, hexano, BTEX, mono y dimetil hexanos,
trimetilbencenos, metiletilbencenos, y en menor cantidad los naftalenos, sus mono y
dimetilados y heptano (de menor índice de octanaje).

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 Los fueles ligeros y el gasoil forman parte de la fracción intermedia de
destilación en el proceso de refinado, lo que implica un rango de puntos de ebullición
entre 185-345ºC, encontrando compuestos de 10 a 25 átomos de carbono, siendo los
más abundantes los C15-C17. (fig. 1.2). Su composición es de un 30% en parafinas (n-
alcanos e isoprenoides), 45% de naftenos (cicloalcanos) y un 25% de aromáticos. En
concreto a nivel de compuestos aromáticos encontramos alquilbencenos, y más
abundantemente, el naftaleno y sus alquilados. También se ha encontrado, en cantidades
menores, el fenantreno y el fluoreno. No contienen pireno ni fluoranteno (compuestos
de 4 anillos aromáticos), cuyos puntos de ebullición son más elevados que el intervalo
utilizado en la destilación de fracciones intermedias.

c. Biorredediación del petróleo Diesel usando diversos microorganismos:

La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para

producir una aceleración del proceso natural de biodegradación1.

1
Biodegradación: se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u otros microorganismos alteran
y convierten moléculas orgánicas en otras sustancias, como ácidos grasos y CO2.

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 La elevada complejidad de la composición del crudo de petróleo y derivados,
implica la existencia de una amplia capacidad enzimática si se quiere conseguir una
degradación significativa del crudo. La mayor parte de los estudios realizados se han
llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes
cepas aisladas.
En la mayoría de los casos, son degradadoras de alcanos, debido a que los
alcanos son los componentes más abundantes del crudo de petróleo. No obstante en
algunos casos, estas cepas tienen la capacidad de oxidar selectivamente las cadenas
alquílicas de ciertos HAPs alquilados, compuestos abundantes en el crudo.
Recientemente, se han descrito algunas cepas con la capacidad de degradar tanto HAPs
de elevado peso molecular como alcanos pero ésta, no parece que sea una norma
general. De hecho los degradadores de alcanos citados habitualmente en la bibliografía
generalmente no son capaces de romper el anillo aromático de los HAPs, mientras que
los degradadores de HAPs generalmente no crecen con alcanos.
La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización
de cultivos mixtos, los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no
definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas
aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí. Los
consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos directos de
enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de contaminación y
por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.

d. Biosurfactantes

Se dice que un soluto es un agente tensoactivo o surfactante cuando da lugar a

un descenso significativo de la tensión superficial. El descenso de la tensión facilita la
eliminación de las partículas de la suciedad de las superficies sólidas. Son moléculas
que contienen un segmento liposoluble (soluble en aceite) y otro hidrosoluble (soluble
en agua o disolventes polares). La solubilidad parcial tanto en agua como en aceite
permite al surfactante ocupar la interfase. Así pues, reducen la tensión superficial y las
tensiones interfaciales entre moléculas individuales en la superficie y la interfase,
respectivamente. Tienen propiedades emulsionantes.
Atendiendo a estos criterios un biosurfactante sería una molécula biológica
(orgánica) con propiedades surfactantes o tensoactivas producidas sobre superficies
vivas, mayormente superficies de células microbianas, o excretados al medio
extracelular.
Con excepción del poder bactericida de ciertos surfactantes, fenómeno del cual
no hay una explicación absolutamente segura, se puede decir que todas las propiedades
y usos de los surfactantes provienen de dos propiedades fundamentales de estas
sustancias: su capacidad de adsorberse a las interfases y de otra parte su tendencia a
asociarse para formar estructuras organizadas.

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Clasificación de los biosurfactantes

Los surfactantes microbianos son moléculas complejas que cubren un amplio

rango de estructuras químicas incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos,
glicolípidos, antibióticos, lipopéptidos, etc. Los microorganismos también producen en
algunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras químicas
como los surfactantes microbianos poliméricos. Muchos surfactantes microbianos han
sido purificados y sus estructuras químicas son conocidas. Mientras que los de alto peso
molecular son generalmente heteropolisacáridos polianiónicos que contienen tanto
polisacáridos como proteínas, los de bajo peso molecular suelen ser glicolípidos.
Podemos clasificar los biosurfactantes atendiendo a tres criterios: naturaleza
química, peso molecular y carga iónica de la parte superficialmente activa de la
molécula.

1. Naturaleza química

a) Lípidos d) Glucolípidos
b) Hidrtos de carbono e) Lipopéptidos
c) Aminoácidos

2. Peso molecular

a) Bajo peso molecular: Suelen ser glicolípidos. El más estudiado es el rhamnolípido,

producido por diversas especies como Pseudomonas. La función principal de estos
biosurfactantes es reducir la tensión superficial entre fases (agua-roca por ejemplo).

b) Alto peso molecular: Suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas,

lipopolisacáridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son tan
eficaces en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero si son bueno
emulsionantes. Además se ha demostrado que son muy eficaces a bajas concentraciones
y poseen una considerable afinidad por el sustrato. Un ejemplo sería Alasan producido
por Acinetobacter radioresistens.

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3. Carga iónica

a) Agentes aniónicos: Contiene generalmente uno de cuatro grupos polares solubles-

carboxilato, sulfonato, sulfato o fosfato- combinado con una cadena hidrocarbonada
hidrófoba. Si esa cadena es corta son muy hidrosolubles y en el caso contrario tendrán
baja hidrosolubilidad y actuaran en sistemas no acuosos como aceites lubricantes. Se
usan principalmente en la industria de jabones y detergentes.

b) Agentes catiónicos: Están compuestos por una molécula lipofílica y otra hidrofílica,
consistente de uno o varios grupos amonio terciarios o cuaternarios. Son utilizados
comúnmente en detergentes, agentes limpiadores, líquido de lavaplatos, tratamiento de
textiles, como sustancias activas antimicrobianas y en cosmética.

c) Agentes no iónicos: No se disocian en iones hidratados en medio acuoso. Las

propiedades hidrofílicas son provistas por hidratación de grupos amido, amino, éter o
hidroxilo.

d) Otros tipos de surfactantes: La combinación en la misma molécula de un grupo con

tendencia aniónica y de un grupo con tendencia catiónica produce un surfactante
anfotérico, como por ejemplo los aminoácidos, las betainas o los fosfolípidos. Según el
pH del medio una de las dos disociaciones prevalece. Este tipo de surfactante se usa
sólo en casos particulares debido a su alto costo.

Utilización de los Biosurfactantes

Los contaminantes hidrofóbicos presentes en los hidrocarburos del petróleo,

suelos y aguas del medio ambiente requieren su solubilización antes de ser degradados
por la célula microbiana.
La mineralización está gobernada por la desorción de los hidrocarburos del
suelo. Los surfactantes pueden aumentar el área de los materiales hidrofóbicos, como
pesticidas en suelos y agua del medio, aumentándose así su solubilidad en agua. Por
tanto, la presencia de biosurfactantes puede aumentar la degradación microbiana de los
contaminantes.
Se le ha dado una atención considerable a la producción de moléculas
tensoactivas de origen biológico por sus aplicaciones en el procesado de alimentos,
aromatización de bebidas alcohólicas, reciclaje de papel, fabricación de pulpa de papel,

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en farmacología, y la industria del aceite. En relación a esa última aplicación, los
accidentes que llevan a vertidos de aceite han llegado a ser numerosos y han causado
catástrofes tanto sociales como ecológicas. La habilidad de los biosurfactantes para
emulsionar hidrocarburos mezclados con agua ha sido ampliamente divulgada. Estas
propiedades emulsionantes también se ha demostrado que favorecen la degradación de
los hidrocarburos en el medio ambiente, por tanto los hacen muy útiles para el control
de la contaminación por vertidos de aceites.
En la biorremediación en vertidos de petróleo, estudios recientes han mostrado
que se puede utilizar el poder solubilizante de las micelas para extraer ciertas sustancias
contaminantes aún cuando su concentración sea extremadamente baja.

Las funciones que harían estos biosurfactantes a la hora de aumentar la

biodisponibilidad serían:

- Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.

- Aumenta la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Serían en este caso sobre
todo los de bajo peso molecular.
- Poseen también funciones evolutivas para los propios microorganismos. Pueden
ayudar a los microorganismos productores a desprenderse de las gotas de petróleo una
vez se ha agotado la fuente de hidrocarburo que utilizaba. Hay que tener en cuenta que
un microorganismos suele utilizar un solo tipo de hidrocarburo entre la mezcla que
existe. Por eso les sería útil poderse desprender de estas interacciones hidrofóbicas que
mantiene la membrana con la gota de petróleo, para así ir en busca de nuevas fuentes de
carbono. Además deja una microcápsula alrededor de la gota para marcarla como usada,
favoreciendo así a toda la población.

Una propiedad de los biosurfactantes curiosa es su actividad bactericida. Dicha

actividad se debe a su capacidad detergente.

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Surfactantes Microbianos

El interés por los surfactantes microbianos ha estado en aumento en los últimos

años debido a sus diversas características deseables tales como una efectiva
selectividad, respetuosos para la naturaleza, su estabilidad a elevadas temperaturas, a pH
y concentración de sales. Hay que añadir que los biosurfactantes han aumentado la
versatilidad en comparación a muchos surfactantes sintéticos y tienen la ventaja de
poder producirse por fermentación.
Hay células microbianas intactas con una superficie celular altamente
hidrofóbica que son ellas mismas surfactantes. En algunos casos, los propios
surfactantes juegan un papel natural en el crecimiento de las células microbianas sobre
sustratos insolubles en agua. Los surfactantes extracelulares están implicados en la
adhesión celular, emulsión, dispersión, floculación, agregación celular y fenómenos de
desorción. Aunque el tipo y cantidad de surfactante microbiana producido depende
primeramente del organismo productor, factores como el carbono y el nitrógeno,
elementos traza, temperatura, y aireación, también afectan a su producción por el
organismo.
Existen varios biosurfactantes producidos por bacterias, entre ellos tenemos:

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 Algunos ejemplos de bacterias y la producción de biosurfactantes:

1. Bacillus pumilus (estirpe 28-11) produce biosurfactantes con una gran capacidad de
emulsionar y eliminar compuestos hidrocarbonatos. Esto hace que se considere esta
estirpe como prometedora en el campo de la tecnología medio ambiental.

2. Candida ishiwade (Tailandia) es una levadura termotolerante que produce

monoacilgliceroles y glicolípidos.

3. Pseudomonas sp. Pueden reducir la tensión superficial, estabilizar emulsiones, y

promover la formación de espumas y generalmente son no tóxicos, no peligrosos y

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biodegradables. Debido a su diversidad, inocuidad para el medio ambiente, posibilidad
de producción a gran escala, selectividad, efectividad bajo condiciones extremas en
pequeñas cantidades, producción sobre recursos renovables, y sus aplicaciones
potenciales para la protección del medio ambiente, los biosurfactantes han ganado
importancia frente a los surfactantes químicos. Hay que añadir el valor del carbohidrato
presente, la ramnosa de los ramnolípidos biosurfactantes, es usada para el transporte de
drogas insolubles en humanos y actúa como precursor de componentes de saborizantes
de alta calidad. Los biosurfactantes potencian la emulsión de hidrocarburos y por eso
tienen el poder de solubilizar contaminantes hidrocarbonados y aumentar su
disponibilidad para la degradación microbiológica.

Así los microorganismos productores de biosurfactantes pueden jugar un

importante papel en la biorremediación acelerada de lugares contaminados con
hidrocarburos. Debido al alto costo de los procesos de remediación y otras aplicaciones
potenciales, la necesidad de aumentar la producción de biosurfactantes es determinada
por la genética del microorganismo, otros factores tales como las condiciones
ambientales y la naturaleza del sustrato también influyen en el nivel de expresión. Así,
la optimización de esas condiciones puede llevar a una producción elevada y segura de
biosurfactantes. Existen estudios para el desarrollo de métodos económicos para
aumentar la producción usando materias primas de bajo costo.

4. Pseudomonas aeruginosa LBI es un ejemplo claro de estructura química, propiedades

superficiales y actividad biológica en la producción de biosurfactantes. La naturaleza
química de los biosurfactantes producidos sería en este caso ramnolípidica, cuya
estructura de ramnosa contiene propiedades biosurfactantes.

5. Pseudomona putida PCL1445 produce biosurfactantes interesantes a nivel industrial.

En este caso se caracterizo dos lipopéptidos con actividad biosurfactante: putisolvin I y
putisolvin II; los cuales inhiben la formación de biopelículas o provoca la destrucción
de las mismas. Esta estirpe PCL1445 fue aislada de la raíz de una planta, crecida en una
zona contaminada con PAHs (hidrocarburos aromáticos policíclicos). Se vió que la
estirpe PCL1445 produce actividad biosurfactante hasta el final de la fase de
crecimiento.

Teniendo en cuenta el uso potencial de los tensioactivos en las tecnologías de

biorremediación, la utilización de los biotensioactivos parece tener más potencial que
los tensioactivos de síntesis (químicos), debido a la mayor diversidad estructural,
biodegradabilidad y biocompatibilidad de los biotensioactivos. Los biotensioactivos
más estudiados han sido los emulsanos de Acinetobacter sp. y el grupo de
ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa.

e. Ventajas y limitaciones de los procesos de biorremediación de suelos

contaminados.

Entre las distintas tecnologías disponibles para la descontaminación de un suelo,

es importante diferenciar aquéllas que suponen una solución temporal o el posible
traslado del contaminante a otros compartimentos ambientales de aquéllas que
potencialmente pueden transformar los contaminantes en productos inocuos. La
tecnología de la biorremediación, basada en la utilización de los microorganismos y su

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potencial metabólico biodegradador para eliminar o transformar los contaminantes del
medio en productos inocuos, tiene ciertas ventajas respecto a los métodos
fisicoquímicos (excavación, extracción química y incineración) tanto por su menor
coste económico, como por la no afectación de otros compartimentos ambientales y la
optimización de los recursos.
Los costes de las técnicas biológicas (bioventing, biopila, landfarming y plantas
de tratamiento biológico) son mucho más rentables económicamente que las técnicas
fisicoquímicas. Una consecuencia de ello es que en Alemania, por ejemplo, en 1998,
aproximadamente de las 2,2 MTm de suelo que fueron tratadas en las 109 plantas de
tratamiento que dispone, un 60% fueron tratadas de forma biológica. Si tenemos en
consideración que cada planta de tratamiento de suelos, tiene una capacidad de 4 x 10 5
Tm x año-1, se podría llegar a tratar una cantidad de suelo 10 veces superior que la
procesada en 1998.
Una de las limitaciones que presentan las técnicas biológicas respecto a las
técnicas fisicoquímicas es el tiempo necesario para alcanzar una biodegradación
aceptable según las normativas. Durante un proceso de biorremediación se produce una
ralentización del proceso de biodegradación ya sea por un enriquecimiento de
componentes más recalcitrantes o por una disminución de la biodisponibilidad de los
contaminantes. Sin embargo, las técnicas fisicoquímicas, aún pudiendo ser más rápidas
y efectivas en la disminución de la concentración de contaminantes, alteran o eliminan
por completo la microbiota autóctona del suelo, modifican las características
fisicoquímicas del suelo, y además, no eliminan los contaminantes, si no que los
trasladan a otro compartimento ambiental. Por lo tanto no cumplen con los criterios de
sostenibilidad en los que se debería basar la ley de protección de suelos.

Factores que condicionan la biorremediación de un suelo.

La biodegradabilidad de una mezcla de hidrocarburos presente en un suelo

contaminado depende de diversos factores como son: la presencia de una población
microbiana degradadora potencialmente activa, la estructura molecular del
contaminante, su concentración y biodisponibilidad, y factores ambientales como el pH,
temperatura, humedad del suelo, presencia de aceptores de electrones disponibles, y la
existencia de nutrientes inorgánicos (fuente de N y P) disponibles.

El pH, temperatura y la humedad

Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a factores

ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los cuales pueden afectar al
crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas. En consecuencia, cuanto mayor
sea la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de
tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los
casos, pero en términos generales a pH y temperaturas extremas y en suelos salinos la
biodegradación se ralentiza, siendo los rangos óptimos para la biodegradación: pH entre
6- 8 y temperaturas entre 20-30ºC.
La variación del pH del suelo afecta a la actividad microbiana y también a la
solubilización y adsorción/absorción de los contaminantes y de los iones. Las formas
catiónicas (NH4+, Mg2+, Ca2+) son más solubles a pH ácido mientras que las formas
aniónicas (NO3-, NO2-, PO43 Cl-) son más solubles a pH alcalino. En general, el pH
-

óptimo para las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido

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para los hongos (pH 4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es
neutro (pH 7,4-7,8).
La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la
actividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación. La mayor
parte de estudios realizados indican que las condiciones mesofílicas (20-30ºC) son las
óptimas para la biorremediación de suelos contaminados. No obstante, también se ha
descrito biodegradación de hidrocarburos temperaturas extremas: a 10ºC en suelos
subárticos y subalpinos, 5ºC en suelos árticos y hasta 60ºC por una cepa termófila de
Bacillus stearothermophilus aislada de un suelo contaminado con crudo de petróleo del
desierto kuwaití.
La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación,
fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el
contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades
de cada suelo, el tipo de contaminación y si la biodegradación es aeróbica o anaeróbica.
Un déficit de agua puede disminuir el transporte de nutrientes y de contaminantes, así
como también la migración bacteriana a través del suelo. El exceso de agua en un suelo
desplaza el aire residente en los poros del suelo, generándose con mayor facilidad
condiciones anaeróbicas, al agotarse el oxígeno disuelto en agua.

Estructura química

De las distintas familias de hidrocarburos del petróleo, los n-alcanos y los

alcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos más
fácilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden a
ser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son
más difíciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad en
agua. Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los n-
alcanos y alcanos ramificados. Asimismo, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos
aromáticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones
ambientales óptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 o
más anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una baja
solubilidad. Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una menor
degradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y al elevado peso molecular
de sus moléculas.

Biodisponibilidad

La tasa de degradación depende tanto de la capacidad de transporte y del

metabolismo microbiano, como de la transferencia de masas del compuesto. La relación
entre estos factores se conoce como biodisponibilidad. En los suelos uno de los factores
limitantes para la biodegradación es la transferencia de masas, ya que los
microorganismos de los suelos contaminados, suelen tener amplias capacidades
biodegradativas al estar expuestos a una gran variedad de compuestos orgánicos
diferentes. Por lo tanto la adsorción, la absorción, desadsorción, disolución y la difusión
son fenomenos, propios de la transferencia de masas, que condicionan la
biodisponibilidad de los contaminantes. Un fenómeno que afecta de forma negativa a la
biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento o ageing que se define
como la pérdida de la biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del tiempo en el
suelo (aunque la población microbiana mantenga intacto su potencial catabólico), el
cual es más importante en suelos con elevado contenido en materia orgánica. Este efecto

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se produce por una serie de fenómenos como son: la adsorción con la materia
particulada del suelo, absorción a la materia orgánica del suelo, a la baja difusividad de
los compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolución en fases líquidas
no acuosas (FLNAs), o a la formación de uniones covalentes con la materia orgánica e
inorgánica del suelo. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los
contaminantes existen numerosos ejemplos en la bibliografía de la utilización de
tensioactivos sintéticos y biotensioactivos en la biorremediación de suelos
contaminados por hidrocarburos.

Presencia de aceptores de electrones

La mayor parte de hidrocarburos presentes en los productos petrolíferos son

degradados con mayor extensión y rapidez de forma aeróbica (O2 como aceptor final de
electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones
alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los hidrocarburos pueden ser degradados,
pero con unas tasas de biodegradación muy inferiores a las aeróbicas.

Nutrientes inorgánicos

Las concentraciones de nitrógeno y fósforo asimilables presentes en el suelo,

suelen ser limitantes para un incremento y activación de la población microbiana,
mientras que otros nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- ya están
presentes en cantidades suficientes en el suelo.
La adición de fuentes de N y P inorgánicas, generalmente tiene un efecto
positivo incrementando las poblaciones microbianas y las tasas de biodegradación de
hidrocarburos en suelos contaminados. Las proporciones molares de C:N:P, descritas en
la bibliografía, respecto al contenido de carbono a degradar son muy distintas. La
Agencia de Proteccion Ambiental de USA recomienda utilizar proporciones C:N de
100:10 a 1000:10 para la biodegradación de suelos contaminados por hidrocarburos, y
dentro de este intervalo se han descrito proporciones C:N de 600:10, 500:10 y de
100:10:1 a 300:10:1 respecto al Carbono Orgánico Total a degradar. Aunque en general
la adición de fuentes inorgánicas de N y P al suelo es beneficiosa para los procesos de
biodegradación, existen estudios que han descrito efectos inhibitorios en la adición de
nutrientes inorgánicos.
Además es importante destacar que la acción de los nutrientes inorgánicos puede
estar limitada debido a la interacción química con los minerales del suelo (el amonio se
puede unir a las arcillas por intercambio catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar
con iones calcio, hierro y aluminio).

f. Microorganismos reportados como degradadores de Petróleo:

- Todos los ecosistemas acuáticos y marinos contienen algún tipo de

microorganismos degradadores de petróleo, entre los géneros reportados están:

- Bacterias:
o Achrornobacter o Bacillus
o Acinetobacter o Beneckea
o Actinomyces o Brevebacterium
o Alcaligenes o Coryneformes
o Arthrobacter o Erwinia

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 o Flavobacterium o Pseudomonas
o Klebsiella o Sarcina
o Lactobacillus o Spherotilus
o Leumthrix o Spirillum
o Moraxella o Streptomyces
o Nocardia o Vibrio
o Peptococcus o Xanthomyces

- Hongos:
o Allescheria o Oidiodendrum
o Aspergillus o Paecylomyses
o Aureobasidium o Phialophora
o Botrytis o Penicillium
o Candida o Rhodosporidium
o Cephalosporium o Rhodotorula
o Cladosporium o Saccharomyces
o Cunninghamella o Saccharomycopisis
o Debaromyces o Scopulariopsis
o Fusarium o Sporobolomyces
o Gonytrichum o Torulopsis
o Hansenula o Trichoderma
o Helmintrosporium o Trichosporon
o Mucor

- También se ha reportado la utilización de dos especies de camarones en la

biodegradación del petróleo, siendo estos Peanus duorarum y Peanus aztecuz
cuya capacidad de degradar los hidrocarburos casi en su totalidad van desde los
compuestos de 12 carbonos hasta los compuestos de 22 carbonos.
- La cantidad y diversidad de los microorganismos degradadores de petróleo
depende de la exposición de las aguas a estos hidrocarburos.
- La velocidad de degradación de los compuestos presentes en el petróleo es como
sigue:

HC saturados > aromáticos ligeros > aromáticos de alto PM > asfaltenos, resinas

III. Objetivos:

- Aislar bacterias degradadoras de de Petróleo Diesel.

- Cuantificar la actividad degradativa del Petróleo Diesel de cada una de las
bacterias aisladas.

IV. Materiales y métodos:

 Materiales:
o Muestra: 100 g de suelo de servicentro contaminado con Petróleo Diesel.
o Medios: Agar Bushnell Hass, Agar Tripticasa Soya, Petróleo Diesel.
o Frascos estériles.

16
 o Tubos de dilución
o Tubos medianos
o Placas de Petri
o Gradillas
o Mechero Bunsen
o Asas bacteriológicas
o Viales
o Pipetas
o Jeringas
o Biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift

 Método:

o Enriquecimiento de las muestras de suelo y adaptación de los

microorganismos a concentraciones crecientes de petróleo.

- Diseñar y acondicionar dos biorreactores tipo tanque Bacht Air Lift con flujo
descendente de 1 L de capacidad.
- Pesar 50 g de muestra de suelo previamente tamizada y llevarla hacia un
biorreactor conteniendo 100 mL de caldo Bushnell Hass (BH) con 1% de
Petróleo Diesel.
- Incubar a 30 ºC durante 72 h.
- Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el segundo biorreactor
conteniendo 100 mL de caldo BH con 2% de Petróleo Diesel. Lavar y esterilizar
el primer biorreactor.
- Incubar a 30 ºC durante 72 h.
- Tomar 10 mL de la muestra enriquecida y llevarla hacia el primer biorreactor
conteniendo 100 mL de caldo BH con 4% de Petróleo Diesel.
- Incubar a 30 ºC durante 72 h.

o Aislamiento de las bacterias degradadoras de Petróleo Diesel.

- A partir de la muestra enriquecida en caldo BH con 4% de Petróleo Diesel (PD)

tomar una alícuota y sembrarla mediante la técnica de agotamiento y estría
sobre la suèrficie de placas de Petri conteniendo Agar BH con 4% de PD.
- Incubar a 30 ºC durante 48 h.
- Seleccionar y repicar las cinco colonias que presenten la mayor biomasa y
mayor rapidez en el crecimiento hacia viales conteniendo agar BH con 4% de
PD y agar Tripticasa Soya (TSA).
- Incubar a 30 ºC durante 48 h.
- Conservar las cepas de bacterias biodegradadoras de PD en refrigeración

o Cuantificacion de la actividad degradativa sobre el PD de cada una de las

cepas de bacterias aisladas.

La actividad degradativa sobre el PD de cada una de las cepas bacterianas aisladas será
cuantificada a través del tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de
carbono y energía y del número de Unidades de Actividad Emulsificante (UAE) de cada
una de ellas.

17
- Preparación del inóculo:
o Reactivar cada una de las cepas bacterianas degradadoras del PD en 5
mL de caldo nutritivo a 30 ºC durante 24 h.
o Cantrifugar el caldo nutritivo a 3500 RPM durante 15 min; eliminar el
sobrenadante y lavar el sedimento con SSFE por dos veces.
o Con el paquete celular obtenido preparar una suspensión de celulas en
SSFE y estandarizarla con el tubo Nº 3 del Nefelómetro de McFarland
(9x108 celulas/mL).

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:

o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e
inocular por triplicado en tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo
10 mL de caldo BH con 0,2 mL de resarzurina y 0,1 mL de PD (dejar un
tubo con medio de cultivo no inoculado como testigo).
o Incubar a 30 ºC hasta por 5 días en agitación constante (150 RPM).
o Observar diariamente en busca del cambio de coloración del indicador
resarzurina (azul a rosado brillante) que será interpretado como positivo
para la utilización del PD como fuente de carbono y energía.

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante:

o De cada inóculo bacteriano previamente estandarizado tomar 1 mL e
inocular por triplicado con tubos de prueba de 16 x 150 mm conteniendo
10 mL de caldo extracto de levadura más 0,2 mL de etanol. Dejar un tubo
con medio de cultivo no inoculado como testigo.
o Incubar a 30 ºC durante 3 días en agitación constante (150 RPM).
o Diariamente observar en busca de la información de burbujas y turbidez
del medio de cultivo.
o Centrifugar el contenido de cada uno de los tubos, a 2000 RPM durante
30 min.
o Tomar 1 mL de cada uno de los sobrenadantes y colocarlos en tubos de
prueba conteniendo 9 mL de caldo levadura etanol más de 0,2 de PD.
Tapar herméticamente los tubos y agitarlos durante un min. Hasta lograr
la emulsión.
o Calibrar a cero el espectrofotómetro con tubo “blanco” conteniendo
caldo extracto de levadura con etanol no inoculado (testigo) y leer la
absorvancia de cada una de las muestras a 540 nm.
o Realizar la conversión de la absorvancia de cada una de las muestras a
UAE considerando 0.816 de absorvancia como una Unidad de Actividad
Emulsificante por mL (1 UAE/mL).

V. Resultados:

- Tiempo requerido para la utilización del PD como fuente de carbono y energía:

CEPA DÍAS DE VIRAJE COLOR DE VIRAJE pH

Cepa 01 ---- ---- ----
Cepa 02 5 días Violeta ≥ 6.8
Cepa 03 12 días Amarillo ≤ 5.2

18
- El indicador utilizado en este proceso de cuantificación fue el “púrpura de
bromocresol”. Este indicador se caracteriza por virar de acuerdo al pH, siendo
amarillo a un pH menor o igual a 5.2 y violeta a un pH mayor o igual a 6.8.

Inóculos al 1º día Inóculos al 5º día

Inóculos a 15 días

- Cuantificación de las Unidades de Actividad Emulsificante:

CEPA UAE
Cepa 01 1.281
Cepa 02 1.353
Cepa 03 1.561

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- Con el tubo blanco se lee la absorvancia a 540 nm. Luego los resultados
obtenidos se los divide entre 0.816 (1 UAE = 0.816).
- Identificación de las cepas aisladas:

CARACTERISTICAS CEPA 01 CEPA 02 CEPA 03

Bacilos largos,
Bacilos cortos,
delgados, Bacilos medianos
Morfología espora central
espora terminal no esporulados
no deformante
no deformante
De a dos o en Aislados y de a
Disposición De a dos
cadenas cortas dos
Tinción Gram Positivo Positivo Negativo
Catalasa Positivo Positivo Positivo
Película, Película,
Película, turbidez
Crecimiento en caldo turbidez y turbidez y
y sedimento
sedimento sedimento
Reducción de NO3-
O – F glucosa
Rojo de Metilo -
Voges Proskawer + + -
Hidrólisis de almidón + + +
Indol - -
Caldo glucosa + +
Caldo maltosa + +
Hidrólisis de gelatina + +
Género Bacillus sp. Bacillus sp. Pseudomonas sp.

VI. Referencias:

- LU CHAU, T. (2006). Biorremediación. Dpto. de Ingeniería Química.

Universidad de Santiago de Compostela. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.usc.es/uscmn/investigacion/documento/Prestige-
Biorremediaci%F3n.pdf
- VIÑAS C., M. Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos:
caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica. Facultad de
Biología. Universidad de Barcelona. Obtenido el 24 de marzo de 2008 en
http://www.tesisenxarxa.net/TESIS_UB/AVAILABLE/TDX-0920105-
085623//TESIS_MVI%D1AS_CANALS.pdf
- ALTAMIRANO, M. G. (2005). Aislamiento e identificación de bacterias
hidrocarburolíticas provenientes de un suelo sometido a biorremediación.
- ORTIZ, J. y J. RODRIGUEZ (2007). Biomarcadores y su utilidad en la
evaluación de la biodegradación del petróleo. Obtenido el 24 de marzo de 2008
en http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/biomarcadores_petroleo.pdf
- V. BOTELLO, A. (1974) Utilización y degradación del petróleo crudo por dos
especies de camarón: Penaeus duorarum y Peneaus aztecas. Universidad
Nacional Autónoma de México. Centro de Ciencias del Mar y Limnología.
Obtenido el 24 de marzo del 2008 en
http://biblioweb.dgsca.unam.mx/cienciasdelmar/centro/1975-1/articulo11.html

20
 - SULBARAN MORA, Miguel, BAHSAS, Ali, VELASQUEZ, William et al.
Caracterización de Biosurfactantes producidos por Pseudomonas Fluorescentes
aisladas de emulsiones de petróleo pesado. CIEN, jun. 2005, vol.13, no.2, p.228-
239. ISSN 1315-2076.
- PINEDO R., T. (2005) Biosurfactantes. Obtenido el 24 de marzo del 2008 en
http://www.personal.us.es/evpolo/pdf/trab_dirig/pinedorevilla_trigochorda.pdf

VII. Anexos:

 Fluxograma de trabajo:

Tamizar

Muestra: 100 g de
suelo contaminado
con PD
A
50g de
tamizado
100 mL de caldo
BH + 1% PD
B 10 mL de
30 ºC x 72 h
la muestra
enriquecida
A
100 mL de caldo
BH + 2% PD
10 mL de C
la muestra 30 ºC x 72 h
enriquecida
A

100 mL de caldo
BH + 4% PD

30 ºC x 72 h 21
 Sembrar
Agar BH
+ 4% PD
30 ºC x 48 h

Tomar una
alícuota de la
muestra
enriquecida C

Seleccionar y
Repicar repicar 3
colonias

> biomasa, > rapidez

de crecimiento

Incubar

Agar BH + 4% de
PD + TSA
30 ºC x 48 h

Conservar las cepas

en refrigeración

 Cuantificación de la actividad degradativa de las cepas aisladas sobre PD.

Tiempo requerido para su utilización

Reactivar

Incubar

Centrifugar
30 ºC x 24 h
5 mL caldo
nutritivo

3500 rpm x 15 min.

22
 Lavar sedimento con
SSFE x 2 veces
consecutivas Realizar esto por
cada cepa
Eliminar
sobrenadante

1 mL
Inocular de cada
cepa en botellas

Preparar suspensión
al Tubo Nº 3 del
NMF (9x108 cel/mL)
Dejamos un tubo con
medio no inoculado
como testigo
10 mL caldo BH con
0.2 mL de
resarzurina y 0.1 mL
de PD

Observar Incubar a 30 ºC x
diariamente si 5 d. a agitación
cambia de azul a cte. (150 rpm)
rosado brillante

Como se usó púrpura de bromocresol veremos

el cambio de color de lila a amarillo

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 Cuantificación de las unidades de actividad emulsificante (UAE).

Del inóculo
preparado al Tubo
Nº 3 del NMF (9x108 1 mL
cel/mL)
Inocular en tubos de
dilución con 10 mL
de caldo Extracto de
Levadura + 0.2 mL
de etanol

Incubar
30 ºC x 3 d. en
agitación constante
Observar y diariamente (150 rpm)
formación de burbujas y
turbidez del medio

Tomar el
sobrenadante
(1mL)

Centrifugar cada uno de

los tubos (2000 rpm)
9 mL caldo
levadura
Tapamos etanol + 0.2
herméticamente mL de PD

Agitamos 1 min.
hasta lograr una
emulsión

Realizar la conversión
Leer absorvancia de la absorvancia de
a 540 nm cada una de las
muestras a UAE
Calibramos a cero el
espectrofotómetro con
el tubo blanco
Considerar 0.816 de 24
absorvancia como 1 UAE/mL
ÍNDICE

25