BENMERITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA VICERRECTORA DE DOCENCIA DIRECCIN GENERALDE EDUCACIN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

LICENCIATURA EN FARMACIA REA: MICROBIOLOGA

ASIGNATURA: LABORATORIO DE MICROBIOLOGA FARMACUTICA

CDIGO: FARM-017 L ELABORADO POR: M.S.P. Carlos Cabrera Maldonado M. C. Gloria Len Tello M.S.P. Jess Luzuriaga Galicia. M.C. Nidia Gary, Pazos Salazar M.C. Ana Berta Escobedo Lpez. M.S.P. Mara de la Cruz Meneses Snchez Dr. Juan Manuel lvarez Lpez

FEBRERO 2009

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NDICE
NMERO DE LA PRCTICA PRCTICA No. 1 PRCTICA No. 2 PRCTICA No. 3 PRACTICA NO 4 PRCTICA No. 5 PRCTICA No. 6 PRCTICA No. 7 PRCTICA No. 8 PRCTICA No. 9 PRACTICA No 10 PRCTICA No. 11 PRCTICA No. 12 PRCTICA No. 13 PRCTICA No. 14 PRACTICA No 15 PRACTICA No 16 TITULO DE LA PRCTICA INTRODUCCIN AL TRABAJO DE LABORATORIO OBSERVACIN DE GRUPOS MICROBIANOS PREPARACIN DE MATERIAL PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO TCNICAS ASPTICAS PARA TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS TCNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS MEDIOS DE CULTIVO Y MORFOLOGA COLONIAL EFECTO DE AGENTES FSICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO EFECTO DE AGENTES QUMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO TCNICAS PARA RECUENTO DE BACTERIAS TCNICAS DE TINCIN DIFERENCIALES TCNICAS DE TINCIN PARA ESTRUCTURAS BACTERIANAS PRUEBAS BIOQUMICAS MORFOLOGA DE HONGOS EVALUACIN DEL LABORATORIO PGINA 4 6 9 10 12 14 17 20 24 27 28 31 33 36 41

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PRESENTACIN El presente manual ha sido elaborado con el fin de proporcionar a los estudiantes el conocimiento sobre el manejo y condiciones adecuadas en las que se debe trabajar a los microorganismos. El laboratorio de microbiologa general representa los cimientos que apoyan la formacin del profesional que de desarrollar en las diferentes disciplinas de esta materia, as que desde este momento el alumno debe adquirir la mentalidad de que su desempeo debe ajustarse correctamente a la ejecucin de buenas prcticas de laboratorio. El orden de este manual va de lo general a lo particular iniciando con el conocimiento microscpico hasta la revisin de las caractersticas bioqumicas que identifican a un organismo en particular. Para su realizacin se ha contado con el apoyo de los diferentes profesores del Departamento de Microbiologa encargados de impartir la materia, quienes con su experiencia han hecho las aportaciones necesarias para que este manual represente un verdadero apoyo acadmico para el alumno de licenciatura.

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PRACTICA No.1 (SEMINARIO) INTRODUCCION AL TRABAJO DE LABORATORIO Para cumplir con un buen desempeo en este laboratorio presentamos la siguiente: Gua para el desarrollo del Trabajo en el Laboratorio de Microbiologa 1. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, despus de ese tiempo, se tomar como retardo, cada retardo equivale a medio punto menos en la calificacin final del laboratorio. 2. La asistencia deber ser del 100 % 3. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. 4. Colocar todo su material y ropas en los cajones de las mesas de trabajo o en las mesas laterales del laboratorio. 5. Lavarse las manos antes y despus de iniciar la sesin prctica. 6. No comer ni fumar en el laboratorio, ni introducir ningn objeto en la boca. 7. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usar. 8. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo debe realizarse sentado. 9. Hablar solo lo necesario con los compaeros. 10. Antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente las instrucciones, siga instrucciones del profesor, si no entiende pregunte. 11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos, debe de esterilizarse en la flama del mechero antes y despus de su uso. 12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. 13. Todo el material que va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. 14. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporcione, el material de desecho no contaminado depostelo en los botes de basura, el material contaminado no lo lave y depostelo donde le indique el profesor. 15. Etiquete todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: Grupo.

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Seccin. Equipo. Nombre del alumno. Fecha

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MANEJO DE MATERIAL INFECTO-CONTAGIOSO

NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organizacin y funcionamiento de los laboratorios clnicos.

Referencias Para la correcta aplicacin de esta Norma es necesario consultar las siguientes: 1 NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos. 2 NOM-009-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene para el almacenamiento, transporte y manejo de sustancias corrosivas, irritantes y txicas en los centros de trabajo. 3 NOM-012-STPS-1993, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo donde se produzcan, usen, manejen, almacenen o transporten fuentes generadoras o emisoras de radiaciones ionizantes. 4 NOM-114-STPS-1994, Sistema para la identificacin y comunicacin de riesgos por sustancias qumicas en los centros de trabajo.

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PRACTICA No.2 OBSERVACIN DE GRUPOS MICROBIANOS Introduccin. La Microbiologa estudia a los microorganismos desde el punto de vista de su morfologa, funcin, relacin con el ambiente y los mtodos que nos llevan a su identificacin. Los estudios de cada grupo en particular corresponden a ramas especficas de la microbiologa, como son: Bacteriologa (bacterias). Micologa (hongos) Ficologa (algas). Protozoologa (protozoarios). Virologa (virus. En 1969 Whittaker propone un sistema de 5 reinos, basndose en tres puntos principales: complejidad celular (procariontes y eucariontes), complejidad tisular(unicelular, multicelular-multinucleados) y nutricin (absorcin, fotosntesis, ingestin) los cuales son: Monera, Protista, Fung, Vegetal y Animal. Protozoarios: Son clasificados dentro del reino Protista, siendo microorganismos unicelulares y eucariotes. Son en tamao mayores a las bacterias y sus estructuras internas muchas veces fcilmente observables. Por su morfologa se puede diagnosticar la especie. Hongos: Son clasificados dentro del reino Fung, siendo organismos multinucleados y eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorcin. En cuanto a su tamao es variable, presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme.

Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de hifas es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se le denomina VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominndose micelio
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AEREO. Estos hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento radial. El otro tipo de crecimiento es el levaduriforme, el cual se caracteriza por su tipo de multiplicacin o divisin llamado GEMACIN. En tamao son mayores a las bacterias, son unicelulares y no desarrollan filamentos o micelio. Algunos gneros forman el llamado pseudomicelio, con tinciones apropiadas podemos observar el ncleo, otros organelos como mitocondrias o inclusiones como grnulos de volutina, estn presentes en el citoplasma, las colonias de levaduras son de aspecto cremoso.

Bacterias: Se encuentran dentro del reino Monera, son clulas procariotas y unicelulares, se reproducen por fisin binaria, pueden ser mviles por la presencia de flagelos simples, las formas fundamentales de las bacterias son: esfricas (cocos), alargadas (bacilos), helicoidales (espirilos), los cocos pueden agruparse en pares, cadenas, racimos o tetradas, dependiendo del gnero.

Un grupo importante de microorganismos son las Archeas cuya forma fundamental es diferente al de las bacterias, se pueden presentar en forma de estrella o en forma cuadrangular, la caracterstica principal de este grupo microbiano es su crecimiento, requieren condiciones especiales extremas, como altas temperaturas o altas concentraciones de sal. Objetivo 1. Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupacin, usando microscopa ptica Material Preparaciones fijas de Bacterias, Hongos y Protozoarios. Microscopio ptico.

Desarrollo Hacer la observacin microscpica de cada preparacin proporcionada, anotando el aumento al que se observo.

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Cuestionario 1. Quin apoy la clasificacin de Whittaker en 5 reinos y bajo que fundamento? 2. Qu caractersticas microscpicas diferencian a los hongos de las bacterias? 3. Cul es el tamao promedio de cocos, bacilos, levaduras y virus? 4. Menciona 5 beneficios de los microorganismos para la humanidad 5. Menciona 5 consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la humanidad 6. Menciona en forma ascendente en tamao, los organismos observados. 7. Dibuja tus observaciones

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PRACTICA No.3 (SEMINARIO) PREPARACION DE MATERIAL El material del laboratorio de Microbiologa requiere de una preparacin especial, deber ser estril, para que no ofrezca un riesgo de contaminacin de la(s) muestra(s). ya que de ellos depender el xito o fracaso del estudio microbiolgico a realizar. La esterilizacin se mide en grado absoluto, es decir, se encuentra o no estril, y se define como el proceso (ya sea fsico o qumico) por el cual se elimina toda forma de vida microbiana, incluyendo formas bacterianas esporuladas y vegetativas, virus, hongos y parsitos. La desinfeccin no es sinnimo de esterilizacin, es un proceso qumico o fsico, por el cual son eliminadas solo formas bacterianas vegetativas y no formas esporuladas. Dentro de los procesos fsicos para la esterilizacin se encuentra el calor (hmedo y seco), la filtracin, las radiaciones, ultracentrifugacin y ultrasonido. Dependiendo de la naturaleza del material (ya sea termo resistente o termolbil) se deber elegir el mtodo de esterilizacin. Los mtodos de esterilizacin pueden ser evaluados a travs de agentes fsicos (termopares y termmetros), qumicos( cinta testigo) y biolgicos (ampolletas Sterikon)

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PRACTICA No.4 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Introduccin Un medio de cultivo es un sustrato que proporciona los nutrientes necesarios para el desarrollo del microorganismo a probar. Los microorganismos presentan diferencias en sus requerimientos nutricionales que son reflejo de la extrema diversidad bioqumica y fisiolgica. El agua, sales inorgnicas, fuentes de carbono, fuentes de nitrgeno y metales son necesarios a todos microorganismos. Existen bacterias que necesitan la presencia de determinado nutriente, sin el cual no pueden desarrollarse, este nutriente se denomina: factor de crecimiento y las bacterias que necesitan de ellos se llaman auxtrofos. Los medios de cultivo con base en su contenido de material gelificante pueden ser: lquidos, semislidos y slidos (los lquidos carecen de material gelificante). En Microbiologa el material gelificante ms utilizado es el agar, qumicamente es un polisacarido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas que la mayora de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia y cantidad de ste permite diferenciar los medios semislidos y slidos, de 0.5-1.5% y una concentracin mayor o igual al 2% respectivamente. Los medios de cultivo para Microbiologa se fabrican o bien de forma granulada o de polvo, ambas presentaciones son higroscpicas por lo que deben mantenerse perfectamente cerradas y en ambientes secos. Objetivo 1. Preparar diferentes medios de cultivo slidos y aplicar la esterilizacin por calor hmedo. Material Cajas Petri estriles. Matraz Erlenmeyer. Pipetas. Mechero. Autoclave.

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Medios de Cultivo en polvo Probeta. Balanza. Esptula o cuchara. Parrilla de calentamiento Guantes para calor.

Desarrollo La forma en al cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada etiqueta y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente: a) Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar. b) Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejndolo reposar unos 15 minutos. c) Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando continuamente, evitar el calentamiento prolongado. Proceso de Esterilizacin 1) Verificar el nivel de agua de la autoclave. 2) Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de esterilizar medios de cultivo en tubos con tapn de rosca, estos deben estar tapados flojamente y cerrados perfectamente despus de esterilizar). 3) Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de poner vlvula de presin. 4) Esterilizar a 121 (15 lbs. de presin) por 15 minutos. C 5) Deben incluirse controles de esterilizacin para autoclave. 6) Compuestos termolbiles no deben ser autoclaveados. Cuestionario 1. Define los trminos: esterilizacin, desinfeccin, sepsis y antisepsis. 2. Menciona los mtodos existentes para esterilizar. 3. Menciona que es un medio enriquecido, selectivo y diferencial. 4. Menciona las formas de cultivar antes de la existencia del agar 5. Qu ventajas presenta el agar?

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PRACTICA No. 5 TECNICAS ASEPTICAS PARA TRANSFERENCIA DE MICROORGANISMOS

Introduccin El grupo de bacterias Gram negativas incluye una amplia variedad de tipos bacterianos. Se encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de hospederos como parte de su flora normal o hasta contaminando alimentos. Independientemente de su respuesta a la tincin de Gram, los microorganismos poseen complejidad bioqumica y fisiolgica con manifiesto alguna propiedad metablica. Dependiendo de su composicin y de su empleo los medios de cultivo pueden ser: Diferenciales: aquellos que sirven para la clasificacin de microorganismos en base a una caracterstica bioqumica individual; Selectivos: contienen inhibidores que impiden el crecimiento de un tipo de bacterias pero no de otras; Enriquecidos: carecen de inhibidores y son abundantes en su contenido de nutrientes por lo que en ellos se puede aislar a la mayora de las bacterias; De enriquecimiento: son medios que favorecen el crecimiento de un tipo bacteriano sin que necesariamente impida el de otros; De transporte: sirve para preservar una muestra en las condiciones originales y se emplea cuando existe demora entre la toma y el procesamiento. Objetivo 1. Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gram negativas e interpretar los cambios bioqumicos presentados en ellos. caractersticas que se hacen evidentes al emplear medios de cultivo de composicin qumica especial, que ponen de diversos

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Material Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde Brillante y Sulfito de Bismuto. Mechero Bunsen Asa bacteriolgica Cepas: las que proporcione el profesor

Desarrollo 1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa proporcionada por el profesor. 2. Incubar las placas sembradas a 37 por 18-24 hrs. C 3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada cepa. Cuestionario 1. Qu componentes estn presentes en un medio de cultivo? 2. De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro:
Medio Tipo de medio Indicadores
Vire del indicador (pH) cido neutro bsico

Inhibidores

Fuente de carbono

3. Qu indica el vire del indicador en los medios empleados? 4.- Dibuja las placas antes y despus de inocular

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PRACTICA NO. 6 TECNICAS PARA EL AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS Introduccin. Definicin de aislamiento: Es la separacin de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza; el cultivo, es el crecimiento de las poblaciones microbianas en ambientes artificiales (medios de cultivo) en condiciones de laboratorio. El proceso mediante el cual se separan los microorganismos se denomina aislamiento y el microorganismo separado aislado. La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de cultivo Medio lquido: la inoculacin se efecta mediante el asa bacteriolgica, pipeta o hisopo. Medio semigelificado (semislido): con ayuda del asa bacteriolgica recta Medio gelificado (slido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la inoculacin se realiza por estra o picadura. Un cultivo en el que se desarrolla solamente un tipo poblacin bacteriana se conoce como cultivo puro o axnico. Un cultivo que tiene ms de una poblacin bacteriana se conoce como cultivo mixto; en el caso especial de que contenga slo dos clases de microorganismos, deliberadamente mantenidos en mutua asociacin se denomina cultivo bimembre. Objetivo: 1. Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas de medio de cultivo simple, con el asa bacteriolgica por el mtodo de estra cruzada. Material: 2 Placas con agar nutritivo por alumno

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Mechero Bunsen. Asa bacteriolgica Cepa bacteriolgica: Escherichia coli. Benzal Algodn 2 placas de agar nutritivo

Desarrollo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn Flamear el asa bacteriolgica hasta llevarla al rojo vivo. Dejar enfriar el asa Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema Tomar la muestra con el asa bacteriolgica y volver a tapar el tubo. Hacer las estras sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de estras y enfriarla en una orilla de la placa. Con la ltima serie de estras no volver a tocar la primera serie de estras.

1 serie 7. 8. 9.

2 serie

3 serie

4 serie

Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del material que se va a meter a incubar Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 horas a 37 C. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn

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10. 11.

Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto Colocar el material sucio en el cuarto de lavado

Otras de formas para la siembra de cepas con asa bacteriolgica empleadas en microbiologa son:

Cuestionario: 1. Por qu se incuban las cajas con las tapas hacia abajo? 2. Qu ventajas e inconvenientes ofrece el mtodo de estra cruzada? 3. Con que propsito se emplean las otras tcnicas de siembra diferentes a la estra cruzada? 4. Cul es la diferencia entre un medio slido, semislido y lquido?

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Practica 7 MEDIOS DE CULTIVO Y MORFOLOGA COLONIAL Introduccin Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones ambientales ptimas crecern como un agregado macroscpico de muchas e idnticas clulas provenientes de una, formando una colonia en la superficie de un medio de cultivo slido. Una vez aisladas las colonias los pasos a seguir identificacin del tipo bacteriano son: a) Determinar las caractersticas de la morfologa colonial. b) Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones. c) Observacin de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad metablica. d) Realizar pruebas metablicas diferenciales. Morfologa Colonial. Las caractersticas que determinan la morfologa colonial son:
1. Tamao de las colonias en milmetros. 2. Color de las colonias. 3. Forma: puntiforme, circular, irregular, filamentosa 4. Elevacin: plana, elevada, convexa, pulvinada, embonada, umbicada 5. Superficie: lisa, rugosa, granular 6. Aspecto: hmedo, seco. 7. Bordes: enteros, ondulados, filamentosos

para llegar a la

8. Luz reflejada: brillante o mate. 9. Luz transmitida: opaca, translcida, transparente. 10. Consistencia: suave (butirosa, mucoide o friable) o dura.

Objetivo:

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1. Aprender a leer la morfologa colonial. Material: Mechero. Asas bacteriolgicas. Placas sembradas con diferentes microorganismos.

Desarrollo Reporte la Morfologa macroscpica de las colonias aisladas utilizando la siguiente tabla.
Caracterstica Tamao (mm) Color Forma: puntiforme circular irregular Elevacin: plana elevada convexa pulvinada umbonada Superficie: Aspecto: Bordes: lisa rugosa hmedo seco enteros irregulares filamentosos Luz Reflejada: Luz transmitida: Consistencia suave: Consistencia brillante mate opaca translcida transparente butirosa mucoide friable dura Agar: Agar: Agar: Agar:

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Cuestionario 1.- Se present la misma morfologa en los diferentes medios de cultivo?, si hubo variaciones explica a que crees que se deban? 2.- Por qu es importante conocer la morfologa en los diferentes medios de cultivo? 3.- Realiza la tincin de gram y dibuja tus observaciones

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PRACTICA No.8 EFECTO DE LOS FACTORES FSICOS SOBRE EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Introduccin Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben satisfacer todos sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en condiciones de cultivo que aseguren por un lado, el suministro de los sustratos adecuados y por otro el mantenimiento de las condiciones fsicas optimas, que nos ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los factores fsicos que mas influyen en este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un control preciso, son: temperatura, pH, concentracin de azcares, luz y concentracin de sales. Temperatura: este factor influye sobre las reacciones metablicas que cada m.o. realiza, de manera que cada especie se desarrolla mejor en ciertos rangos de temperatura. As tenemos que los m.o. que crecen a temperaturas menores de 20 se C denominan Psicroflicos. En el otro extremo encontramos a los m.o. que crecen a temperaturas mayores de 45 y se denominan Termfilos. Otros m.o. crecen en C rangos de 20 a 45 y se les llama Mesoflicos. En los rangos, los extremos superior C C e inferior se designan como temperaturas mxima y mnima de crecimiento respectivamente, sin embargo los m.o. se desarrollan mejor a un valor especfico de temperatura que se designa entonces como temperatura ptima de crecimiento. pH: Segn el pH a la que se desarrollan las bacteria se clasifican en Acidfilos: Se desarrollan en un rango de pH entre 1 y 5; Neutrfilos: Su rango es entre 5.5 y 8.5 y Basfilos: Crecen entre 9 y 12. Sales y azcares: Existen organismos que para su crecimiento necesitan de altas concentraciones de sales y se les denomina haloflicos, mientras otros soportan esas altas concentraciones denominndose como sal tolerantes, debe entenderse

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entonces que en el primer caso se refiere a un requerimiento mientras en el segundo es una adaptacin a las condiciones de cultivo. Objetivos: 1. Determinar las condiciones ptimas de crecimiento de microorganismos cultivados bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentracin de sal y de azcar. 2. Determinar las diferencias en los parmetros anteriores de acuerdo al grupo microbiano. Material Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida sp, Staphylocuccus aureus proporcionadas por el profesor. Tubos con Caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables: a) pH: 2, 5, 7 y 12. b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%. c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%. d) Normales para incubacin a diferentes temperaturas. Desarrollo 1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables de cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearn para analizar el comportamiento de una sola cepa. 2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos anteriores. El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo. 3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y Sacarosa a 37 durante 24 hrs. C 4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes temperaturas: 4 25 37 y 45 durante 24 hrs. , , 5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en el cuadro de reporte. 6. Para el llenado siga el mtodo de las cuatro cruces. Comparando simultneamente los cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigne valores de 1-4 cruces segn la turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.
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CEPA

pH

% Sacarosa

% NaCl

Temperatura en C

12

2.5 5.5 10 20

0.85 5

10

Incubar a 37 / 24 hrs. C

Incubar por 24 hrs. a 4 25 37 45

Cuestionario. 1. Con respecto a los microorganismos, diga qu son las temperaturas cardinales. 2. Determine las condiciones ptimas de crecimiento para las diferentes cepas empleadas con respecto a cada factor valorado. 3. Explique a que se deben las diferencias de crecimiento, si las hay, para los microorganismos sembrados bajo las variantes de cada factor.

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CUADRO DE REPORTE
Microorganismo 1 2 3 4 DIFERENTES pH 5 7 4 C TEMPERATURA 25 C 37 C 45 C

Microorganismo 1 2 3 4

12

% NaCl Microorganismo 1 2 3 4 % SACAROSA Microorganismo 1 2 3 4 2.5 5.5 10 20 0.85 5.0 7.0 10.0

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PRACTICA No. 9 EFECTO DE LOS AGENTES QUMICOS SOBRE EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS Introduccin Para el control del crecimiento microbiano o la eliminacin total de las poblaciones microbianas podemos emplear sustancias qumicas conocidas como desinfectantes o antispticos, que actan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos: Ruptura de pared. Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma. Alterando la permeabilidad. Inactivando enzimas. Desnaturalizando protenas. Disminuyendo la tensin superficial. Entre los agentes qumicos empleados tenemos: cidos, bases, jabones, detergentes, alcoholes, metales pesados y colorantes. l termin desinfectante est restringido a las sustancias que son aplicadas sobre superficies. La accin desinfectante se ve aumentada por la temperatura y la concentracin. Objetivo 1. Observar el efecto de diversos agentes qumicos sobre el crecimiento de los microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos. Material Placas con agar nutritivo. Hisopos estriles. Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:

a) Agentes surfactantes: benzal, jabn, detergente y sales biliares. b) Metales pesados: merthiolate. c) Desinfectantes: Cloro, yodo.
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d) Colorantes: cristal violeta, safranina. e) Antibioticos. Pinzas. Cepas las que proporcione el profesor

Desarrollo: 1. Sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando hisopos estriles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en la siguiente forma:

2. Empleando pinzas flameadas en el mechero, colocar adecuadamente discos de papel filtro impregnados con el agente qumico a probar. La distancia entre cada disco no debe ser menor a 2 cm. 3. Incubar todas las placas a 37 durante 18-24 horas. C 4. Hacer lectura midiendo en mm el dimetro de los halos de inhibicin alrededor de los discos de papel filtro impregnados con el agente qumico.
Crecimiento microbiano

Papel filtro impregnado con agente Qumico

Halo de inhibicin del crecimiento bacteriano

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Informe: Llenar el cuadro registrando los resultados de cada cepa.

Cepa: Agente qumico Tamao de halo de inhibicin Respuesta
Sensible (S) Resistente (R)

Cuestionario 1. Menciona la diferencia entre desinfectante y esterilizar 2. Menciona si crecieron igual los diferentes microorganismos frente a los diferentes agentes qumicos. Explique a que crees que se deban las diferencias si las hay. 3. Menciona el mecanismo de inhibicin de algn agente qumico sobre el crecimiento de un microorganismo.

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PRACTICA NO. 10 (SEMINARIO) CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO El crecimiento microbiano se denota como un crecimiento poblacional y no como un crecimiento individual. El crecimiento microbiano se limita por: Escasez de fuentes de energa Acumulacin de productos txicos Disminucin de espacio Disminucin de oxigeno

Dando como resultado un grafico con cuatro fases: A) fase de Latencia, B) fase Logaritmica, C) fase Estacionaria, D) fase de Muerte.

Logaritmo del no. De bacterias B

tiempo

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PRACTICA NO. 11 TECNICAS PARA RECUENTO DE BACTERIAS Introduccin. Si se pretende conocer el nmero total de microorganismos presentes en una muestra lquida o slida, es recomendable que se encuentren sta ltima en forma lquida y homogenizada, adems de utilizar un mtodo apropiado. Es importante sealar que el nmero no guarda relacin con el tipo de microorganismos patgenos, por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse como un indicador de las caractersticas higinicas de la muestra. Adems dependiendo de las caractersticas del medio utilizado y de las condiciones de incubacin, los microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general recuentos anaerobios totales. Objetivo: 1. Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema utilizando el mtodo de diluciones y vertido en placa. Material: Muestra de agua o de alimento. Mechero bunsen 3 Matraces conteniendo 500 ml de agar nutritivo estril cada uno 30 Pipetas de 10 ml puntas azules estriles y micropipeta con capacidad de 1000 l. 20 Tubos conteniendo 9 ml de solucin salida isotnica estril (diluyente) 30 Cajas petri estriles desechables. Benzal Algodn Marcador de tinta permanente Desarrollo se investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes aunque en ciertas situaciones puede ser de inters hacer

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1. Colectar 100 ml de muestra en un frasco estril. 2. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn 3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 ml de solucin salina estril (diluyente) y numerarlos. 4. Tomar 1 ml de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo que contenga 9 ml de diluyente, as se obtiene una dilucin 10-1, homogenizar el contenido. 5. Transferir 1 ml a un tubo de dilucin que contenga 9 ml de diluyente, agitarlo vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilucin 10-2. 6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 ml de la muestra a otro tubo con 9 ml de diluyente para obtener las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 como se indica en el esquema. 7. Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones separado a una caja petri estril vaca. 8. Adicionar inmediatamente en las cajas petri de 10 a 15 ml de agar nutritivo mezclando el inculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la derecha, a la izquierda y de arriba abajo. 9. Dejar gelificar las placas. 10. Rotular las placas indicando la dilucin que contienen y el tipo de muestra, incluir su nombre as como la fecha de ingreso y de salida del material. 11. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 horas a 37 C. 12. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn. 13. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, hacer el recuento de las unidades formadoras de colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar los resultados. 14. Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilucin que presente entre 30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC). 15. Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilucin para obtener el No. de bacterias/ ml presentes en la muestra. 16. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado. realizadas y transferirlos por

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| Mtodo de Diluciones y vertido en placa

Informe del aislamiento de microorganismos 1. Nmero de colonias encontradas en las placas sembradas en las diluciones: 10-1____________ 10 4____________ 2. 10 2____________ 10 3_____________ 10 5 ____________ 10 6_____________

No. de bacterias/ ml presentes en la muestra:_________________

Cuestionario: 1. Cul es el fundamento de la tcnica de vertido en placa? 2. Qu ventajas e inconvenientes presenta este mtodo? 3. Escriba 3 ejemplos donde se aplique este procedimiento. 4. Qu es una unidad formadora de colonias (UFC)?

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PRACTICA No. 12 TECNICAS DE TINCIN DIFERENCIALES Introduccin Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se observan al microscopio. Cuando los organismos son teidos antes de observarlos, aumenta en gran medida el contraste de las clulas y su medio. Antes de teir es necesario hacer un frote y fijarlo. Un frote es una delgada capa de clulas que cubre un rea de un portaobjetos, este frote debe ser secado al aire y fijado por calor o qumicamente con alcohol. As los frotes no fijados son lavados en el proceso de tincin. Existen varias tcnicas de tincin ocupadas en Microbiologa, por ejemplo: Tincin simple o directa. Tincin diferencial. Tincin de estructuras. Tincin negativa. Tincin de material de reserva, etc. La tincin ms empleada en microbiologa es la de Gram, que es una tincin diferencial. Los microorganismos difieren entre s desde el punto de vista qumico y fsico por lo que reaccionan de manera diferente a los colorantes. Las tinciones diferenciales ocupan dos colorantes, uno primario y otro de contraste o secundario. Para la tincin de Gram el colorante primario es cristal violeta mientras la safranina corresponde al de contraste. La tincin de Gram clasifica a los microorganismos segn su capacidad de retener el colorante primario (Gram positivas) o el colorante de contraste (Gram negativas). Objetivo: 1. Aprender el fundamento y la tcnica de la Tincin de Gram para determinar la morfologa microscpica de diferentes cepas. Material: Mechero. Asas bacteriolgicas.

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Placas sembradas con diferentes microorganismos. Portaobjetos. Colorantes de Gram. Microscopios.

Desarrollo. Tcnica de Tincin de Gram 1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar. 2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero. 3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante y lavar con chorro suave de agua corriente. 4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar. 5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar. 6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar. 7. Dejar secar al aire. 8. Observar el frote con objetivo de inmersin. 9. Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada cepa empleada Cuestionario 1. Qu importancia tiene la tincin de Gram? 2. Cmo explicas la tincin de Gram? 3. Escribe 4 ejemplos de bacterias Gram positivas y 4 de Gram negativas. 4. Por qu es importante fijar el frote? 5. Definir un colorante y las partes que lo conforman. 6. Dibuja tus observaciones

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PRACTICA No. 13 (SEMINARIO) TECNICAS DE TINCION PARA ESTRUCTURAS BACTERIANAS

TINCIN ESTRUCTURALES A - TINCIN DE ESPORAS Fundamento. Slo algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su interior formas de resistencia denominadas endsporas. Su enorme importancia se debe a su resistencia al calor. Mientras que calentando a 80 durante 10 min (pasteurizacin) mueren todas las bacterias y las propias formas vegetativas de las formadoras de esporas, las endsporas termorresistentes soportan en algunos casos incluso la coccin durante horas. La esporulacin se inicia en el interior de la bacteria con una concentracin de material proteico (la espora contiene casi toda la materia seca de la clula materna, pero en 1/10 de su volumen). Se forma una doble capa envolvente que representa el 50 % de peso y volumen en la espora madura. La esporulacin se produce cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos txicos, etc.), formndose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante aos. En general las esporas, se tien muy dificilmente, requiriendo determinados colorantes muy concentrados as como la presencia de calor que facilite su penetracin; pero, ahora bien, una vez teidas es muy difcil perder el colorante, propiedad que es utilizada para poder
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demostrar la presencia de stas. La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes: 1. Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente. 2. Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endsporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua , y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante. Procedimiento Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las bacterias produzcan las esporas. 1. Preparar frotis bacteriano de Bacillus sp. 2. Cubrir el frotis bacteriano con papel de filtro, de manera que el papel de filtro no sobresalga del portaobjetos. 3. Teir con verde de malaquita cubriendo el porta durante 2 min 4. Con unas pinzas de madera, colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta que se desprendan vapores blancos. No ha de hervir, secarse ni quemarse. Retirar la preparacin del fuego. Aadir ms colorante y repetir la operacin 4 veces. 5. Retirar el papel de filtro y lavar con abundante agua corriente el exceso de colorante.
5 - MICROSCOPA . TINCIONES BACTERIANAS 65

6. Teir con safranina 2-3 min y lavar con agua corriente. Secar la preparacin. 7. Observar la preparacin al microscopio con objetivo de inmersin. 8. Dibujar y anotar la disposicin y la morfologa de las endsporas. 9. Clasificar el tipo de endsporas segn la fig.5.8 Fig. 5.8 Interpretacin de los resultados La posicin y la morfologa de la endspora en el interior de la bacteria constituyen un carcter taxonmico til para diferenciar especies dentro de un mismo gnero. Las tres bacterias de la fig. 5.8 difieren en la disposicin y morfologa de las endsporas. B. sphaericus posee una endspora esfrica con localizacin terminal y deformante de la clula vegetativa, por lo que suele ser denominada en palillo de tambor. B.thuringiensis tiene localizada la endspora elipsoidal en el centro de la clula vegetativa, lo que provoca un abombamiento caracterstico denominado huso. B.subtilis forma una espora cilndrica
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subterminal no deformante.

Por ultimo, entre de las tinciones estructurales podramos encontrar la tincin de cpsulas, importantisimo para observar el factor de virulencia bacteriana, bien por los metodos de Hiss, Anthony o Burry-tinta china; la tincin de corpsculos metacromticos por el mtodo de Loeffer; la tincin de flagelos, observando los mismos de las bacterias identificadas como mviles.

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Practica 14 PRUEBAS BIOQUIMICAS Introduccin El aislamiento de bacterias de productos biolgicos es un procedimiento de rutina en un laboratorio clnico, que tiene como finalidad encontrar al agente causal de algn cuadro infeccioso. El xito del aislamiento de bacterias depende en un principio de la correcta toma de la muestra, que deber ser representativa del estudio deseado (exudado faringeo, coprocultivo, urocultivo, exudado de herida, exudado otico, hemocultivo, cultivo de liquido cefalorraquideo, etc), el siguiente paso es la seleccin de los medios de cultivo adecuados, que debern ser selectivos diferenciales y/o enriquecidos dependiendo de los microorganismos buscados. Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para la identificacin de los microorganismos son las pruebas metablicas o pruebas bioqumicas, las cuales se basan en la determinacin de enzimas, productos finales del metabolismo, etc. Dichas pruebas son caractersticas de cada genero y especie, para esto se siembra a los microorganismos en medios que contienen un sustrato especifico, un indicador de pH, y los nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas ocasiones es necesario agregar algunos reactivos al medio donde se ha desarrollado el microorganismo para visualizar la reaccin bioqumica). Objetivos: Conocer el fundamento de las pruebas metablicas

Material Tubos con agar TSI Tubos con agar LIA Tubos con agar MIO Tubos con agar Citrato Tubos con agar Urea Reactivos para la prueba de Catalasa

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Reactivos para la prueba de Oxidasa Colorantes de Gram Portaobjetos Asa bacteriolgica Mechero Microscopios Cepa: la proporcionada por el profesor

Desarrollo: Pruebas metablicas Al trmino de la incubacin pasar a la identificacin de bacterias de inters mdico, para lo cual se utilizarn las pruebas metablicas o bioqumicas, de la siguiente manera: Realizar tincin de Gram. Con la ayuda de un aplicador estril tomar una colonia de inters y colocarla en un portaobjetos con una gota de perxido de hidrogeno al 10% (prueba de catalasa. De igual forma hacer prueba de oxidasa Con el asa bacteriolgica estril en punta tomar una colonia y depositarla en el tubo con agar TSI. Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las bioqumicas. Poner atencin a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos. Rotular e incubar a 37 por 18-24 hrs. C Leer e interpretar las pruebas bioqumicas para la lectura de produccin de indol agregar una gota de reactivo de Kovacs, (apyese en la siguiente Tabla para la identificacin de enterobacterias)

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Reacciones Bioqumicas de la familia Enterobacteriaceae

TSI Sup Fondo

Shigella Escherichia Salmonella (general) Salmonella typhi Arizona Citrobacter freundii Citrobacter diversus Klebsiella Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Hafniae Enterobacter agglomerans Serratia marcescens Serratia liquefaciens Serratia rubideae Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii Proteus rettgeri Providencia Edwardsiella Yersinia enterocolitica K A K K KA KA K A A A K A A A A K K K K K K A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Gas + + + + + + + + + -+ -w + + + + -w -+ + H2 S -2-4+ 1+ 2-4+ 2-4+ 2-4+ 4+ 3+ -

Urea Indol

MR

VP

Citrato

Movilidad L

Descarboxilasas A - (+) ++ + + + + + O -+ ++ + -+ ++ + + + + + + + +

+ + + + -s -s -s -s + + + +

++ + -+ + + + + + +

+ + + + + + + -+ + + + + + + +

+ + + + + + + ++ ++ -

+ + + + + + + ++++ ++ +++ +-

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

++ + + + + + + + + + -

s = superficie, (+) = positivo tardo, + = positivo, w = positivo dbil, K = alcalino, A = cido

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Cuestionario 1. Qu pruebas se pueden realizar en un TSI? 2. Qu lectura da el medio LIA cuando es lisina positiva? 3. Por qu se puede determinar la movilidad de una bacteria en el medio MIO? 4. Como interpreta el vire del citrato? 5. A partir de que compuesto se obtiene el indol? 6. Cual es el fundamento de la prueba de urea? 7. Que indica una prueba de catalasa positiva? 8. Cul es el fundamento de la prueba de oxidasa? 9. Llena el siguiente cuadro. Prueba bioqumica Indicador Fuente de carbono Pruebas a realizar Todas las posibles lecturas Dibujo del medio sin inocular

TSI

LIA

MIO

Citrato

Urea

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10.- Anotar los resultados de la cepa de trabajo en la siguiente tabla Prueba bioqumica TSI Lectura Dibujo Interpretacin

LIA

MIO

Citrato

Urea

Catalasa

Oxidasa

11.- Con base a los resultados menciona la cepa de trabajo

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Prctica No. 15 MORFOLOGA DE HONGOS Introduccin. La mayora de los que deben relacionarse con la rama micolgica, a menudo se sienten confundidos y desalentados en sus tentativas para estudiar los hongos debido a la gran variacin en el aspecto macroscpico de las colonias, a la multiplicidad de las estructuras microscpicas y a la nomenclatura poco conocida. Sin embargo, estas dificultades son ms psicolgicas que reales y cuando se llegan a dominar unos cuantos conceptos bsicos basados en las morfologas macroscpica y microscpica, la identificacin de los hongos resulta ms fcil y rpida que en otras bacterias ordinarias. Los hongos emiten una o ms prolongaciones tubulares llamadas tubos germinales o tambin llamadas hifas, que se alargan por el crecimiento de su extremo distal. La hifa puede dividirse por formacin de paredes transversales a intervalos regulares. Las hifas divididas por tabiques se denominan hifas tabicadas, sin embargo algunos hongos no desarrollan tabicaciones en las hifas y se denominan no tabicadas o cenocticas. Finalmente, el conjunto de hifas desarrollan lo que se conoce como micelio, la diferenciacin de los hongos se basa principalmente en su aspecto colonial y morfologa microscpica. l.- La morfologa colonial se basa en los siguientes parmetros: - Aspecto - Consistencia.

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- Pigmentacin de la colonia. - Difusin de pigmento al medio. - Luz reflejada. - Luz transmitida. - Bordes.

ll.- Morfologa microscpica ( referente al micelio ) - Tabicado o septado. - Cenoctico. - Hialino. - Pigmentado ( fugilaginoso, carotenoide ) - Macrosifonado - Microsifonado. Objetivo. El alumno ser capaz de diferenciar las colonias de los hongos y los diversos tipos de estructuras bsicas, como por ejemplo, el micelio por medio de tcnicas de observacin en fresco o directa y algunas preparaciones facilitadas por el profesor, valorando estos parmetros como fundamentales en la identificacin de los hongos. Tcnicas a emplear. A).- Tcnica de resiembra en tubo. 1.- Con el asa micolgica en ngulo de 90 tomar un pequeo fragmento de loas colonias con morfologa diferente y depositarlo en un tubo con medio inclinado PDA o SDA.

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2.- Incubar a 28 C 3.- Observar cada 40 horas el desarrollo de las colonias. B).- Tcnica de observacin microscpica en fresco. 1.- Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodn lactofenol. 2.- Con el asa micolgica tomar un pequeo fragmento de la colonia y colocarlo sobre el porta objetos. 3.- Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de hongos con esporulacin abundante). 4.- Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de diseccin o bien con la misma asa micolgica. 5.- Colocar sobre la preparacin un cubre objeto evitando formar burbujas de aire. 6.- Observar al microscopio a seco dbil y seco fuerte, nunca usar aceite de inmersin. Material a emplear. 1.- Colonias de hongos proporcionadas por el profesor. 2.- Tubos con medio PDA o SDA. 3.- Colorante azul de algodn. 4.- Preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. 5.- Porta y cubre objetos. Desarrollo de la prctica. 1.- Escoger diferentes tipos de colonias y resembrarlas en tubos con medio PDA o SDA. 2.-Observar comparativamente las caractersticas macroscpicas de las colonias desarrolladas. 3.- Hacer preparaciones en fresco con azul de algodn lactofenol de las colonias aisladas resultando de la prctica anterior.

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4.- Observar comparativamente el micelio de las muestras aisladas preparaciones fijas proporcionadas por el profesor. Dibujos: a.- Hifa. b.- Micelio. c.- Micelio macrosifonado septado. d.- Micelio macrosifonado cenoctico. e.- Micelio septado fugilaginoso. f.- Micelio microsifonado.

con las

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