Lhuillier 2007 Phytochimie de 4 Plantes Malgaches

N dordre : 2467
THESE
prsente pour obtenir LE TITRE DE DOCTEUR DE LINSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE cole doctorale : Transferts, Dynamique des Fluides, Energie et Procds Spcialit : Sciences des Agroressources
Par Melle Amlie LHUILLIER
CONTRIBUTION A LETUDE PHYTOCHIMIQUE DE QUATRE PLANTES MALGACHES : AGAURIA SALICIFOLIA HOOK.F EX OLIVER, AGAURIA POLYPHYLLA BAKER (ERICACEAE), TAMBOURISSA TRICHOPHYLLA BAKER (MONIMIACEAE) ET EMBELIA CONCINNA BAKER (MYRSINACEAE)
Soutenue le 20 avril 2007 devant le jury compos de : M. M. M. Mme M. M. Antoine GASET Salvador CAIGUERAL Bernard BODO Isabelle FOURAST Claude MOULIS Kurt HOSTETTMANN Prsident Rapporteur Rapporteur Directeur de thse Directeur de thse Membre
A Domie A mes parents et mes frres Pierre-Emile, Louis et Vincent A mon mari Alex A mes amis et tous les membres de ma famille
Remerciements
Jai eu la chance et le plaisir deffectuer ce travail de recherche dans le Laboratoire de Pharmacognosie de la Facult de Pharmacie de Toulouse (UMR 152 IRD UPS - Pharmacochimie des Substances Naturelles et Pharmacophores Redox) sous la direction respective des professeurs Isabelle Fourast et Claude Moulis.
Tout dabord, je tiens particulirement remercier Madame le Professeur Isabelle Fourast pour mavoir accueilli au sein du Laboratoire de Pharmacognosie, pour mavoir fait confiance, mavoir encourag et conseill tout en me laissant une grande libert. Pour son soutien et sa grande gnrosit, quelle soit assure de ma profonde gratitude.
Je remercie sincrement Monsieur le professeur Claude Moulis, quil trouve ici lexpression de ma profonde reconnaissance tant pour mavoir accord sa confiance que pour mavoir guid dans mon travail tout au long de ces annes. Ses conseils et ses commentaires mais aussi sa bienveillance et son humour auront t fort utiles.
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Mes remerciements vont galement Monsieur le Professeur Antoine Gaset de lENSIACET de Toulouse davoir accept de prsider le jury de ma soutenance de thse.
Jaimerais galement remercier Monsieur le Professeur Bernard Bodo du Musum Nationnal dHistoire Naturelle de Paris ainsi que Monsieur le Professeur Salvador Caigueral de la Facult de Pharmacie de Barcelone pour avoir accept de faire partie de mon jury de thse, pour avoir accept den tre rapporteurs et surtout pour lintrt quils ont port mon travail. Jai apprci notre interaction et leurs remarques avises lors de ma soutenance de thse.
Jadresse galement mes remerciements Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann de lUniversit de Lausanne pour avoir accept de juger ce travail.
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Cette thse est le fruit dune collaboration avec la division SERDEX des Laboratoires Bayer Consumer Care. Je tiens donc remercier Monsieur Grard Sen pour la confiance quil ma accorde en me confiant ce travail.
Mes remerciements vont galement Alain Loiseau pour son aide et pour les discussions enrichissantes qui ont contribues ce travail, ainsi qu Eric, Virginie, Caroline et tous les autres membres de lquipe pour mavoir trs fortement soutenu et impliqu dans leurs projets. Malgr lloignement gographique, je me suis toujours sentie intgre lquipe R & D.
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Je remercie tous ceux sans qui cette thse ne serait pas ce qu'elle est : aussi bien par les discussions que j'ai eu la chance d'avoir avec eux, leurs suggestions ou contributions.
Un trs grand merci Nicolas Fabre qui a jou un rle fondamental dans ma formation. Tout au long de ces trois annes, il a su maider orienter mes recherches. Je le remercie pour son amiti, son aide, sa confiance et ses conseils si prcieux tout le long de mon travail de thse.
Jadresse de sincres remerciements Monsieur le Professeur Edouard Stanislas pour sa bienveillance et sa gentillesse et ses encouragements.
Mes plus vifs remerciements pour leur accueil et leur disponibilit Cathy Claparols et Nathalie Martins du service commun de spectromtrie de masse de lUPS de Toulouse.
Merci aussi tous mes collgues et amis du laboratoire : ceux den haut Valrie et Fahtia, Lucia, Sverine, Alexis et Valrieet les autres, et tous ceux den bas Florence, Mohamed, Bndicte, Vincent, sans oublier mes super stagiaires Florian et Elose ! Merci tous pour leur amiti et pour leur aide prcieuse.
Je tiens enfin redire le plaisir que j'ai eu travailler au sein de lUMR 152, et j'en remercie ici tous les membres.
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Enfin, pour leur soutien sans faille et permanent, je tiens remercier de tout cur mes parents, mes frres et mes grands-parents ainsi quAlex pour son amour et sa comprhension.
Abrviations et symboles
Les abrviations ont gnralement t indiques sous la forme la plus couramment utilise dans la littrature, elles sont donc souvent issues de terminologie anglo-saxonne.
(1), (2), (3), 1-1, 1-2, 2-1, 2-2, []D A, B, C, AcOEt APCI
: dsignation des composs mentionns dans la partie bibliographique : dsignation des composs identifies par LC-MS dans Agauria polyphylla : dsignation des composs identifies par LC-MS dans Agauria salicifolia : pouvoir rotatoire : dsignation des composs naturels isols dans le prsent travail : actate dthyle : ionisation chimique pression atmosphrique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
APG APY Ara ASA br s CC CCM CDCl3 c-Hex CI CID COSY CPC C H d Da DCI DCM dd ddd DMSO-d6 ECC EDL EI ESI EtOH
: Angiosperm Phylogeny Group : Agauria polyphylla Baker : arabinose : Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver : singulet largi (broad singulet) : Chromatographie sur Colonne ouverte : Chromatographie sur Couche Mince : chloroforme deutri : cyclohexane : ionisation chimique (Chemical Ionisation) : dissociation induite par collision (Collision Induced Dissociation) : COrrelated SpectroscopY : Chromatographie de Partage Centrifuge : dplacement chimique du carbone (en ppm) : dplacement chimique du proton (en ppm) : doublet : Dalton (unit de masse molculaire) : ionisation chimique par dsorption (Desorption Chemical Ionisation) : dichloromthane : doublet ddoubl : doublet ddoubl ddoubl : dimthylsulfoxyde deutri : Embelia concinna Baker : Equivalent de Double Liaison : ionisation par impact lectronique (Electron Impact ionization) : ionisation par lectrospray (ElectroSpray Ionization) : thanol
FAB FD Gal GC-MS
: ionisation par bombardement datomes rapides (Fast Atom Bombardment) : dsorption de champ (Field Desorption) : galactose : chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (Gaz Chromatography-Mass Spectrometry)
Glc Gluc IT H2O HCCl3 Hex HMBC HPLC
: glucose : glucuronide : spectromtre trappe dions (Ion trap) : eau distille : chloroforme : hexane : Heteronuclear Multiple Bond Correlation : chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatography)
HSQC Hz J LC-MS
: Heteronuclear Single Quantum Coherence : Hertz : constante de couplage : chromatographie liquide haute performance couple la spectroscopie de masse (Liquid chromatography-Mass spectrometry)
LDL m m/z MeCN MeOH MeOH-d4 MPLC
: (Low Density Lipoprotein) : multiplet : masse / charge atomique : actonitrile : mthanol : mthanol ttradeutri (RMN) : chromatographie liquide moyenne pression (Medium Presure Liquid Chromatography)
MS NOESY ppm q q.s.p. Q-TOF RDA Rf Rha RMN RMN- H (Jmod) RMN- H ROS s semi-prep.
1 13
: spectromtrie de masse (Mass Spectroscopy) : Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY : partie par million : quintuplet : quantit suffisante pour : spectromtre hybride quadriples-temps de vol (Quadrupole-Time of flight) : Rtro Diels-Alder : rapport frontal (CCM) : rhamnose : rsonance magntique nuclaire : rsonance magntique nuclaire du carbone (en mode J modul) : rsonance magntique nuclaire du proton : drivs ractifs de loxygne (Reactive Oxygen Species) : singulet : semi-prparative (HPLC)
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sh SiO2 spp t TQ Tol tR TTI u UV UV(DAD) V/V Xyl
: shoulder, dsigne un paulement sur un pic : silice : espces : triplet : spectromtre Triple Quadriples : tolune : temps de rtention : Tambourissa trichophylla Baker : unit de masse atomique : ultraviolet : dtecteur ultraviolet barrettes de diodes (Diode Array Detector) : rapport volume / volume : xylose
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Table des matires

Abrviations Table des matires Introduction i v 1
I. SELECTION DES PLANTES DE LETUDE

1. Critres de slection des plantes 1.1. Une origine gographique commune : Madagascar Les atouts de Madagascar. Des ressources prserver. 1.2. Utilisation des plantes en mdecine traditionnelle 1.3. Aspects botaniques et chimiotaxonomiques 1.4. Les apports de la littrature 2. Slection des extraits : criblage biologique
4 5 5 5 5 7 8 8 9
II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1. Prsentation de Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae) 1.1. La famille des Monimiaceae Juss. Position systmatique. Caractristiques botaniques des Monimiaceae. Utilisations traditionnelles des Monimiaceae. 1.2. Genre Tambourissa Sonn. et T. trichophylla Baker 1.3. Principaux mtabolites secondaires des Monimiaceae Alcalodes. Huiles essentielles. Flavonodes. Polyphnols au sens large. 1.4. Travaux antrieurs sur le genre Tambourissa 2. Prsentation dAgauria salicifolia Hook.f. ex Oliver et Agauria polyphylla Baker (Ericaceae) 2.1. La famille des Ericaceae Juss. Position systmatique. Caractristiques botaniques des Ericaceae. Utilisations traditionnelles des Ericaceae. 2.2. Genre Agauria Benth. & Hook.f. 2.3. Principaux mtabolites secondaires des Ericaceae Juss. Tanins. Flavonodes. Autres drivs phnols et htrosides phnoliques. Huiles essentielles. Diterpnes toxiques. Triterpnes. 2.4. Travaux antrieurs sur le genre Agauria 3. Prsentation dEmbelia concinna Baker (Myrsinaceae) 3.1. La famille des Myrsinaceae R. Brown
11 12 12 12 14 14 15 18 18 19 20 20 21 22 22 22 23 24 25 28 28 28 28 29 30 31 32 34 34
v
Position systmatique. Caractristiques botaniques des Myrsinaceae. Utilisations traditionnelles des Myrsinaceae. 3.2. Genre Embelia Burm. f. et E. concinna Baker 3.3. Principaux mtabolites secondaires des Myrsinaceae Benzoquinones. Saponosides triterpniques et triterpnes sensu stricto. Autres substances. 3.4. Travaux antrieurs sur le genre Embelia 4. Flavonodes et spectromtrie de masse 4.1. Gnralits sur les flavonodes Chimie des flavonodes. Biosynthse des flavonodes. Classes de flavonodes. Distribution dans les plantes et le rgne vgtal. Rle dans les plantes. Importance dans lalimentation. Proprits chimiques et activits biologiques. 4.2. Analyse structurale des flavonodes par spectromtrie de masse 4.2.1. Les diffrentes techniques dionisation en spectromtrie de masse 4.2.2. Le couplage chromatographie-spectromtrie de masse 4.2.3. Elments didentification des flavonodes par spectromtrie de masse 4.2.3.1. Etude des gnines de flavonodes par MS Fragmentation de la gnine en mode positif. Fragmentation de la gnine en mode ngatif Flavonodes mthoxyls et autres substituants. 4.2.3.2. Apports de la MS ltude des flavonodes O-glycosyls Clivage htrolytique : formation des ions Yn. Clivage homolytique : formation du radical Y0. Position de la liaison osidique sur la gnine. Flavonodes di-O-glycosyls et O-diglycosyls. Flavonodes di-, tri-, tetra-glucosyls. Identification du sucre terminal. 4.2.4. Conclusion
34 34 35 36 38 38 38 39 41 43 43 43 43 44 45 46 46 46 49 49 50 50 51 52 54 56 57 57 57 58 59 61 61 61
III. RESULTATS
1. Screening chimique gnral prliminaire par CCM 1.1. Interprtation des CCM prliminaires de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla 1.2. Interprtation des CCM prliminaires de Tambourissa trichophylla 1.3. Interprtation des CCM prliminaires de Embelia concinna 2. Etude phytochimique des feuilles dAgauria polyphylla (APY) et dAgauria salicifolia (ASA) 2.1. Agauria polyphylla (APY) 2.1.1. Travaux prliminaires au fractionnement 2.1.2. Fractionnement de lextrait APY F3 et isolement des composs A C 2.2. Fractionnement de lextrait APY F2 et isolement du compos C 2.2.1. Dtermination de structure des composs A, B et C dAgauria polyphylla 2.2.1.1. Dtermination de structure du compos A
62 63 63 66 66 67 67 67 67 70 72 72
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2.2.1.2. Dtermination de structure du compos B 2.2.1.3. Dtermination de structure du compos C 2.3. Agauria salicifolia (ASA) 2.3.1. Fractionnement de lextrait ASA F1 et isolement du compos D 2.3.2. Dtermination de structure du compos D dAgauria salicifolia 2.4. Comparaison des fractions flavonodiques dASA et dAPY par LC-MS 2.4.1. Obtention des fractions flavonodiques : sparation des tanins condenss par prcipitation 2.4.2. LC-MS compare des fractions flavonodiques de ASA et APY 2.4.2.1. Profil HPLC des deux fractions flavonodiques. 2.4.2.2. Identification des composs des fractions flavonodiques par LC-MS. 2.4.3. Conclusion 2.5. Conclusions de ltude phytochimique dAgauria salicifolia et Agauria polyphylla 3. Etude phytochimique des feuilles de Tambourissa trichophylla (TTI) 3.1. Fractionnement de lextrait TTI F3 et isolement des composs E, F et G 3.1.1. Dtermination de structures des composs E, F et G de Tambourissa trichophylla 3.1.1.1. Dtermination de structure du compos E 3.1.1.2. Dtermination de structure du compos F 3.1.1.3. Dtermination de structure du compos G 3.1.2. Fractionnement du lot pilote TTI PL002 et isolement du compos H 3.1.3. Dtermination de structure du compos H de Tambourissa trichophylla 3.2. Conclusion de ltude phytochimique de Tambourissa trichophylla 3.3. Mthode analytique de TTI 4. Etude phytochimique des feuilles dEmbelia concinna (ECC) 4.1. Fractionnement de lextrait ECC F3 et isolement des composs I S 4.2. Dtermination de structures des composs I L isols des sous-fractions apolaires de ECC F3 4.2.1. Dtermination de structure du compos I 4.2.2. Dtermination de structure du compos J 4.2.3. Dtermination de structure du compos K 4.3. Dtermination de structures des composs L et M par LC-MS. 4.4. Dtermination de structure du compos N 4.5. Dtermination de structures des composs O R isols des sous-fractions polaires de ECC F3 4.5.1. Dtermination de structure du compos O 4.5.2. Dtermination de structure du compos P 4.5.3. Dtermination de structure du compos Q 4.5.4. Dtermination de structure du compos R 4.6. Conclusion de ltude phytochimique de Embelia concinna
76 80 84 85 86 89 89 91 91 92 96 96 98 98 99 99 104 107 108 109 112 112 114 114 118 118 123 128 130 133 135 135 137 140 142 144
IV. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES V. MATERIELS ET METHODES

1. Matriel vgtal et extraction 2. Mthodes chromatographiques analytiques 2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) Ractif la Vanilline sulfurique (Rvlateur polyvalent). Ractif de Neu ou NP/PEG (Rvlateur des flavonodes). Ractif de Dragendorff (Rvlateur dalcalodes).
145
150 151 152 152 153 153 153

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Ractif au Thymol sulfurique (Ractif des sucres). Ractif au sel de Bleu solide B (pour la dtection des phnols et des tanins). Ractif de Liebermann et Burchard (Ractif des strols, strodes et triterpnes). 2.2. Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV) 2.3. Chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (LC-MS) 3. Mthodes chromatographiques prparatives 3.1. Chromatographie sur colonne ouverte (CC) 3.2. Chromatographie liquide moyenne pression (MPLC) 3.3. Chromatographie sur cartouches de silice C18 (VAC ELUT) 3.4. Chromatographie prparative sur couche mince 3.5. Chromatographie de partage centrifuge (CPC) 3.6. Chromatographie liquide haute performance semi-prparative (HPLC semi-prp.) 4. Mthodes physico-chimiques 4.1. Pouvoir rotatoire 4.2. Spectromtrie Ultraviolet (UV) 4.3. Spectromtrie Infra-rouge (IR) 4.4. Spectromtrie de masse (MS) 4.5. Spectromtrie de rsonance magntique nuclaire (RMN)
153 153 153 154 154 155 155 155 155 156 156 156 157 157 157 157 157 158
VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES VII. ANNEXES

Constantes physiques et donnes spectrales des composs isols Publication et poster Lexique de botanique
159
172 173 190 200
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Introduction
Au travers des ges, lhomme a pu compter sur la nature pour subvenir ses besoins de base : nourriture, abris, vtements et galement pour ses besoins mdicaux. Lutilisation thrapeutique des extraordinaires vertus des plantes pour le traitement de toutes les maladies de lhomme est trs ancienne et volue avec lhistoire de lhumanit. Bien quune grande partie du XXme sicle ait t consacre la mise au point de molcules de synthse, la recherche de nouveaux agents pharmacologiques actifs via le screening de sources naturelles a rsult dans la dcouverte dun grand nombre de mdicaments utiles qui commencent jouer un rle majeur dans le traitement de nombreuses maladies humaines [Gurib-Fakim, 2006]. Dan le monde, 80% des populations ont recours des plantes mdicinales pour se soigner, par manque daccs aux mdicaments prescrits par la mdecine moderne mais aussi parce que ces plantes ont souvent une relle efficacit. Aujourdhui, le savoir des tradipraticiens est de moins en moins transmis et tend disparatre. Cest pour cela que lethnobotanique et lethnopharmacologie semploient recenser, partout dans le monde, des plantes rputes actives et dont il appartient la recherche moderne de prciser les proprits et valider les usages [Pelt, 2001]. La recherche de nouvelles molcules doit tre entreprise au sein de la biodiversit vgtale en se servant de donnes ethnopharmacologiques. Cette approche permet de slectionner des plantes potentiellement actives et daugmenter significativement le nombre de dcouvertes de nouveaux actifs. Madagascar dispose dune grande diversit floristique laquelle sajoute une tradition sculaire dutilisation traditionnelle des plantes. Sappuyant sur ces deux aspects, la socit Serdex, division du groupe Bayer Health Care Consumer Care dveloppe, fabrique et commercialise des extraits de plantes actives provenant pour lessentiel de Madagascar, cibls pour les industries pharmaceutiques et cosmtiques. Ce travail, fruit dune collaboration entre Serdex et le Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et Pharmacophores Redox (UMR-152) de la Facult des Sciences Pharmaceutiques de Toulouse, sinscrit dans le cadre de la recherche de nouveaux composs qui peuvent trouver une application thrapeutique ou cosmtique. Ce mmoire est consacr ltude phytochimique de quatre plantes malgaches, Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver, Agauria polyphylla Baker, Tambourissa trichophylla Baker et Embelia concinna Baker issues du screening de plantes traditionnellement utilises Madagascar. Le but de cette tude consiste renforcer la connaissance phytochimique de ces extraits de plantes et mettre en vidence de traceurs spcifiques pour chacune des plantes en vue de lutilisation ultrieure de leurs extraits dans lindustrie.
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Dans un premier chapitre, nous aborderons les diffrents critres, de lutilisation en mdecine traditionnelle au criblage biologique, qui ont conduit et orient le choix des plantes de cette tude. Ltat des connaissances bibliographiques botaniques et phytochimiques sur ces quatre plantes et leurs familles botaniques respectives sera prsent dans un second chapitre. Nous dvelopperons galement lutilisation de la spectromtrie de masse comme outil danalyse pour lidentification de composs naturels frquemment utiliss comme traceurs dans les prparations base de plantes : les flavonodes. Le troisime chapitre sera consacr aux rsultats de ltude phytochimique de Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver, Agauria polyphylla Baker, Tambourissa trichophylla Baker et Embelia concinna Baker. Pour chaque plante, nous dtaillerons les tapes de fractionnement et dcrirons lidentification de composs isols. Nous prsenterons galement lapplication de la chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (LC-MS et LC-MSn ) la comparaison phytochimique des plantes Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver et Agauria polyphylla Baker. Enfin, nous utiliserons tous ces rsultats pour dfinir quels traceurs employer pour les extraits de ces plantes
I. SELECTION DES PLANTES DE LETUDE
I. Slection des plantes de ltude
1. Critres de slection des plantes

Afin disoler des substances nouvelles de plantes et de trouver de ce fait de nouvelles voies dapplications tant dans les domaines de la pharmacie que de la cosmtique et afin de rendre la stratgie disolement le plus efficace, il convient de slectionner avec soin les plantes tudier. Dans cette optique, un certain nombre de critres ont t pris en compte pour slectionner les plantes de cette tude.
1.1. Une origine gographique commune : Madagascar

Les atouts de Madagascar. Lle de Madagascar, situe dans lOcan Indien, prsente tous les caractres dun petit continent dot dune nature extraordinairement varie. Sa flore prsente un intrt scientifique tout particulier en raison de sa diversit, de son anciennet et de sa trs grande richesse. La flore malgache actuelle est marque par la persistance de genres et despces trs archaques appartenant des familles seulement connues ltat de fossiles sur les autres continents. Lestimation du nombre total de taxons des plantes vasculaires de Madagascar varie de 10 000 12 000 espces selon les auteurs, rparties en 1 200 1 600 genres appartenant 200 familles environ et dont le niveau dendmisme est suprieur 80 % [Rajeriarison, 1996]. Ce taux dendmisme est dailleurs lev tous les niveaux taxonomiques, 8 familles sont considres comme tant entirement endmiques de lle. Tous ces facteurs contribuent faire de Madagascar une zone de choix pour la mise en lumire de nouvelles molcules. Les forts primaires et secondaires de lle (figure I 1) sont de vastes rservoirs despces qui peuvent fournir de nouveaux composs naturels aux chimistes et/ou qui sont le point de dpart pour le dveloppement de nouveaux mdicaments. Cette existence de matriel thrapeutique non dcouvert est une des raisons les plus importantes qui militent en faveur de la protection des forts tropicales et de la biodiversit en gnral. En travaillant sur des plantes endmiques, aux caractristiques potentiellement uniques, la probabilit est plus grande de trouver de nouvelles molcules (et ainsi de nouvelles voies thrapeutiques) largissant dautant la connaissance de la biodiversit de ce pays insulaire. Des ressources prserver. La socit Serdex, cre par les Laboratoires Laroche-Navarron et aujourdhui devenue division de Bayer Consumer Care, a, dans les annes 60 et sur proposition des Professeurs Ratsimamanga et Boiteau, mis sur le march des cicatrisants, les triterpnes de Centella asiatica sous le nom de Madcassol. Ds lors, une relation troite sest noue entre Serdex et Madagascar qui demeure ce jour.
LEGENDE EST : 0 - 800 m Fort dense humide sempervirente Formation secondaire (savoka) Savane boise Savane Mosaque fort - cultures - plantations EST : 800 - 1 800 m Fort dense humide sempervirente Formation secondaire Savane Mosaque fort - savane et Eucalyptus SAMBIRANO : 0 - 800 m Fort dense humide sempervirente Formation secondaire Savane (boise ou non) Mosaque savane - cultures - fort secondaire HAUTES ALTITUDES : + 1 800 m Fort dense humide sempervirente
MORAMANGA
Fourr Philippia et savane daltitude OUEST : 800 - 1 800 m Fort sclrophylle basse dgrade Savane OUEST : 0 - 800 m Fort dense sche et formation secondaire Savane boise Savane Mangroves SUD : 0 300 m Fort dense sche Didieraceae et Euphorbiaceae Fourr dense sec Formation secondaire Savane Mosaque fourr - sol nu AUTRES Marcages et rizires Plantations
Figure I 1. Carte des formations vgtales de Madagascar.
Les objectifs de cette troite collaboration sont de valoriser la ressource vgtale pour la sauvegarder, de contribuer ainsi son exploitation dans le respect de la diversit des espces et de faire prendre conscience aux populations des risques encourus du fait de la dforestation (toujours en cours Madagascar bien que de nombreuses rsolutions internationales ou nationales aient t adoptes). Les plantes exploites Madagascar proviennent de rcoltes et de collectes effectues dans la nature. La rgnration naturelle qui assure la production narriverait pas faire face des prlvements irrationnels et non contrls. Lobjectif de Serdex est de contribuer prserver la ressource par une concertation troite avec les institutions malgaches et par une politique de prise en compte du
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dveloppement durable et du commerce quitable, contreparties indispensables la satisfaction des besoins industriels en plantes (qualitatifs et quantitatifs). Dans cette optique, des bonnes pratiques de collecte ont t dfinies et mises en place Madagascar par Serdex pour les acteurs locaux de la filire : les paysans collecteurs et Sotramex, la socit malgache qui centralise la collecte et ralise une partie des extraits de plantes. Ce contrat moral reposant sur lapplication des bonnes pratiques permet dassurer un revenu rgulier aux collecteurs, dveloppe un volet social en faveur des communauts locales (programme de scolarisation) et assure la prennit des ressources, principes fondamentaux du dveloppement durable. En outre, les plantes des programmes de recherche et dveloppement de Serdex proviennent des forts secondaires daltitude de lEst de lle, dans la rgion de Moramanga (Figure I 1), aucun prlvement nest effectu dans les forts primaires dj extrmement menaces.
1.2. Utilisation des plantes en mdecine traditionnelle

Depuis 150 ans, les plantes mdicinales ont fourni la pharmacie des mdicaments trs efficaces. Aujourd'hui, de nombreux travaux mens dans le domaine de l'ethnopharmacologie, nous montrent que les plantes utilises en mdecine traditionnelle et qui ont t testes sont souvent d'une part, des plantes efficaces dans les modles pharmacologiques et d'autre part seraient quasiment dpourvues de toxicit [Gurib-Fakim, 2006]. Lethnobotanique et lethnopharmacologie mettent en relation les savoirs ancestraux des mdecins traditionnels et les connaissances scientifiques actuelles. Ce sont avant tout des domaines de recherche interdisciplinaire l'interface des sciences de l'Homme, comme l'ethnologie, l'histoire, la linguistique, et des sciences de la nature, comme la botanique, la pharmacologie, la pharmacognosie, la mdecine. Les informations de terrain recueillies auprs des populations (les vritables tradipraticiens ne subsistent plus que dans des zones recules) sont le reflet dune approche culturelle de la maladie qui, Madagascar comme dans dautres mdecines traditionnelles, est fonde sur la symptomatologie. Tel mlange de plantes est indiqu pour une douleur ou un symptme donn et non pour soigner une maladie. La traduction de ces donnes symptomatiques brutes en termes de mdecine tiologique est dlicate et le recours dun mdecin est souvent indispensable la caractrisation de la maladie. Le traitement varie selon le comportement du malade, ses dires, le rang social avec la prise en compte de son histoire familiale. De plus, le tryptique aliment-mdicament-poison rend difficile la catgorisation entre actifs et toxiques qui peuvent tre employs, dessein, simultanment. Il est galement ncessaire davoir lesprit que lutilisation mdicinale des plantes est souvent associe des concepts irrationnels qui font appel au mystique. La difficult vient ainsi de la ncessit de dceler, dans les mlanges traditionnellement employs, les plantes dont la prsence frquente fait penser quelles sont susceptibles de traiter un aspect donn de la maladie.
L'ethnopharmacologie et lethnobotanique ont donc pour finalit la comprhension des pratiques et des reprsentations relatives la sant, la maladie, et la description, l'valuation thrapeutique des plantes utilises dans les pharmacopes traditionnelles. Lusage empirique des diffrentes prparations traditionnelles plantes est donc extrmement important pour une slection efficace de plantes puisque la plupart des mtabolites secondaires de plantes employes en mdecine moderne ont t dcouverts par lintermdiaire dinvestigations ethnobotaniques [Gurib-Fakim, 2006]. Les enqutes ethnobotaniques, menes de 1973 1990, en collaboration avec lInstitut Malgache de Recherches Appliques (IMRA) ont t effectues par linstauration de relations quotidiennes avec les populations, notamment dans les gradins Est de lle aux confins de la fort primaire daltitude et ont permis le recueil de nombreuses informations quant lemploi des ressources vgtales environnantes.
1.3. Aspects botaniques et chimiotaxonomiques

Dans un second temps, la connaissance des plantes choisies au travers des enqutes ethnobotaniques peut tre enrichie par la connaissance botanique des espces cites. Les plantes appartenant aux mmes familles ou des familles voisines et/ou qui poussent dans les mmes biotopes sont susceptibles de synthtiser les mmes molcules chimiques. La chimiotaxonimie, ou classification des plantes en fonction des leurs mtabolites secondaires complte les classifications botaniques bases sur des critres morphologiques et molculaires (gntiques par exemple) [Grayer et al., 1999]. Elle permet, si des substances sont particulirement connues pour leur potentiel thrapeutique, de choisir des plantes chimiotaxonomiquement proches de celles dans laquelle la substance a t dtecte et tudie. Par ailleurs, connatre la raret ventuelle dune espce, son poque de floraison et sa disponibilit en terme de quantit peuvent galement constituer des critres de choix.
1.4. Les apports de la littrature

Les critres que nous venons dvoquer ayant permis dtablir une liste prliminaire de plantes potentiellement intressantes, nous avons ralis une bibliographie dtaille des connaissances phytochimiques des espces et de leurs genres dappartenance. Dans loptique de la dcouverte de nouvelles molcules et/ou de nouvelles voies dapplication thrapeutiques (ou cosmtiques), il est plus judicieux de choisir des plantes qui ont t peu ou pas travailles chimiquement. Cependant, si la famille ou le genre a dj t tudi, il sera plus facile de trouver des procds analytiques, didentifier rapidement les composs dj connus et de trouver des
traceurs qualitatifs et quantitatifs. Cela permet galement dliminer les genres et/ou les espces connues pour leur toxicit.
2. Slection des extraits : criblage biologique

Quand les causalits des traitements, les principes thrapeutiques et en particulier les modes dutilisations traditionnels sont tablis, un protocole dtude pharmacologique peut tre mis en place. Les travaux de laboratoire, guids par les usages vernaculaires, ont pour double but de constater le bien-fond de lusage dune plante donne en dmontrant les effets biologiques par des techniques pharmacologiques et dorienter les travaux chimiques ultrieurs vers une certaine fraction chimique de la plante. Ainsi, pour cette tude, une recherche dactivit pralable sur une liste despces endmiques (tablie grce aux critres que nous avons voqus prcdemment) a t effectue, avec pour rsultat des rponses parfois diffrentes des usages recenss sur le terrain. En effet, il nexiste pas toujours de cible biologique correspondant exactement une allgation traditionnelle et de la mme manire, il peut en exister plusieurs. De plus, comme nous lavons vu prcdemment, la mdecine traditionnelle repose souvent sur des bases mystiques donc invrifiables. La collaboration entre Serdex et lIMRA a servi en partie ltude et la mise au point de mdicaments de substitution bas cot pour le march malgache, dvelopps, fabriqus et distribus dans un contexte conomique difficile. Il y a donc eu des retombes pratiques et locales rsultant des recherches effectues, en terme de sant publique. Le savoir a t, ce jour, largement restitu. Les criblages pharmacologique et biologique mens par Serdex ont permis, pour un certain nombre de plantes pr-slectionnes, de confirmer ou dinfirmer leur activit prsume et le cas chant, dindiquer quel est lextrait actif. Pour des raisons de confidentialits, les rsultats de ce criblage ne seront pas prsents ici.
Pour le prsent travail, en tenant compte de tous ces critres, nous avons slectionn trois plantes endmiques de Madagascar ayant un fort potentiel dactivit du fait de leurs usages traditionnels largement rpandus : Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae), Agauria polyphylla Baker (Ericaceae) et Embelia concinna Baker (Myrsinaceae). Nous avons choisi dtudier une quatrime plante : Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver bien que les tudes pharmacologiques menes par Serdex naient pas dmontr dactivit pour cette plante. En effet, comme nous le dvelopperons dans le chapitre suivant, une confusion botanique peut tre faite avec Agauria polyphylla et nous allons tenter de faire une distinction phytochimique entre ces espces.
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Une synthse des connaissances bibliographiques la fois botaniques et phytochimiques de ces plantes et des familles auxquelles elles appartiennent est prsente au chapitre suivant.
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II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
II. Synthse bibliographique
1. Prsentation de Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae)

1.1. La famille des Monimiaceae Juss.
La famille des Monimiaceae est une famille de paloarbres dicotyldoniens de divergence ancienne comprenant environ 200 espces rparties dans 22 genres [Spichiger et al., 2000]. Ce sont de petits arbres, des arbustes, producteurs dhuiles essentielles, feuilles persistantes prsents dans les rgions sub-tropicales tropicales de lhmisphre sud, particulirement en Asie australe [Philipson, 1993].
Figure II 1. Rpartition mondiale des Monimiaceae selon Stevens [Stevens, 2001].
Position systmatique. Selon les classifications botaniques classiques pr-molculaires, les Monimiaceae sont des dicotyldones appartenant lordre des Laurales (Tableau II 1), ordre qui comprend galement les Amborellaceae, Trimeniaceae, Gomortegaceae, Calycanthaceae,
Idiospermaceae, Lauraceae et Hernandiaceae [Cronquist, 1988].
Tableau II 1. Taxonomie des Monimiaceae selon Cronquist [Cronquist, 1988]. Plantae, Tracheobionta (Plantes vasculaires) Embranchement : Spermatophyta (Plantes graines) Sous-Embranchement : Angiospermae (Plantes fleurs) Classe : Magnolopsida (Dycotyldones) Sous-classe : Magnoliideae Ordre : Laurales Famille : Monimiaceae
Parmi ces classifications bases essentiellement sur des critres morphologiques et anatomiques, celle de Cronquist est la plus utilise. Cependant, les apports rcents de la biologie molculaire, avec le dveloppement de la cladistique moderne ou de la systmatique molculaire base sur lanalyse des squences de gnes, ont boulevers les classifications usuelles et ont donn naissance en 1998 une nouvelle classification ordinale des plantes fleurs [APG, 1998]. La classification APG est la classification scientifique des angiospermes la plus rcente tablie selon les travaux dun groupe de chercheurs : the Angiosperm Phylogeny Group. Reflet d'un consensus sur les connaissances acquises
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lors de sa publication en 1998, cette classification a t rvise en 2003 [APG, 2003]1. Elle traduit les efforts faits en systmatique pour que les systmes de classification refltent au mieux la phylognie des familles mise en lumire par les avances constantes de la gntique [Spichiger et al., 2000]. Aujourdhui, lappartenance des Monimiaceae aux Laurales est indiscutablement admise (figure II 2). La classification infrafamiliale des Monimiaceae a fait lobjet de nombreuses investigations dans les annes 70 et au dbut des annes 80 avec les travaux de Phillipson [Philipson, 1993]. Certains taxonomistes prfraient alors mettre laccent sur la diversit des schmas floraux prsents dans la famille en la divisant en plusieurs petites familles, alors que dautres soulignaient la cohrence globale de la famille [Philipson, 1987]. Ce dernier point de vue en faveur de la reconnaissance des Monimiaceae comme une seule famille a finalement t adopt, choix justifi non seulement par la cohrence morphologique de la famille mais galement par les carts qui la sparent des autres familles des Laurales.
Figure II 2. Position systmatique des Monimiaceae selon lAngiosperm Phylogeny Group [Stevens, 2001].
En 1987, Phillipson rpartissait 32 genres de Monimiaceae en 6 sous-familles et 8 tribus (figure II 3). Cependant, ltude de la phylognie des Laurales par Renner, en 1999, partir de certaines squences de gnes, a tabli que les Monimiaceae taient clairement polyphyltiques si on y incluait les Atherospermatoideae et les Siparunoideae. Ces sous-familles ont donc t leves au rang de famille, respectivement les Atherospermataceae et les Siparunaceae (figure II 2) [Renner, 1999].
Cest pourquoi la classification de Cronquist est encore utilise comme rfrence dans de nombreux ouvrages dans un souci pragmatique de disposer doutils de classement stables pour permettre, entre autres, la communication entre botanistes.
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Sous-famille 1. Hortonoideae Genre : Hortonia Sous-famille 2. Atherospermatoideae Tribu 1. Atherospermateae Genres : Aterosperma, Laureliopsis Tribu 2. Laurelieae Genres : Daphnandra, Dryadodaphne, Doryphora, Laurelia, Nemuaron Sous-famille 3. Siparunoideae Genre : Siparuna Sous-famille 4. Glossocalycoideae Genre : Glossocalyx
Sous-famille 5. Mollinedioideae Tribu 1. Hedycaryeae Genres : Tambourissa, Hedycarya, Levieria, Ephippiandra, Decarydedron Tribu 2. Mollinedieae Genres : Mollinedia, Kibara, Wilkiea, Matthaea, Keiroa Tribu 3. Hennecartieae Genre : Hennecartia Sous-famille 6. Monimioideae Tribu 1. Palmerieae Genre : Palmeria Tribu 2. Monimieae Genre : Monimia Tribu 3. Peumiaea Genre : Peumus
Figure II 3. Synopsis des sous-familles et tribus des Monimiaceae daprs Philipson [Philipson, 1987].
Caractristiques botaniques des Monimiaceae. Les Monimiaceae sont des arbres ou arbrisseaux, parfois grimpants, sempervirents, huiles essentielles et souvent accumulateurs daluminium. Les feuilles sont opposes, simples, marge dente ou entire et contiennent des cellules sphriques huile essentielle dans le limbe. Certaines ponctuations du limbe peuvent tre laticifres. Les branches sont souvent aplaties au niveau des nuds. Linflorescence peut tre axillaire (racmes) ou terminale (rarement une fleur solitaire). Les fleurs, de petite taille, sont actinomorphes, bisexues ou unisexues le plus souvent et prsentent un rceptacle gnralement trs dvelopp. Le prianthe est gnralement peu visible et compos de tpales spalodes ou ptalodes. Dans les fleurs mles, de nombreuses tamines sont arranges en spirale ou en verticille, les filaments courts peuvent tre nectarifres la base et les anthres sont dresses et dhiscence longitudinale ou valvulaire. Les fleurs femelles possdent de nombreux carpelles (jusqu plus de 2000) 1-ovuls, sessiles et libres ou insrs dans le rceptacle. Les fruits sont des drupes spares ou des aknes plumeux, soit inclus dans le rceptacle charnu et persistant, soit exposs par de nombreux modes de fendage. Les graines sont endosperme huileux [Maberley, 1987 ; Philipson, 1993]. Utilisations traditionnelles des Monimiaceae. De nombreux genres de cette famille produisent du bois de coupe ou du bois duvre dintrt local (genres Hedycarya, Doryphora, Peumus), dautres sont cultivs comme plantes ornementales (Peumus, Hedycarya, Siparuna). Certains genres ont des fruits comestibles (Peumus). Quelques espces produisent des huiles essentielles utilises localement en parfumerie. Lcorce de Peumus boldus Molina est utilise pour le tannage du cuir et la teinture des textiles [Watson et Dallwitz, 1992]. Certaines espces sont utilises localement par les tradipraticiens. En Amrique du Sud, Mollinedia brasilensis Schott ex Tul. est rpute pour tre un puissant antispasmodique et tre utile contre les crampes [Leito et al., 1999]. Peumus boldus est utilis comme cholagogue et cholrtique [Bruneton, 1999] et apparat dans de nombreuses pharmacopes. Les Monimiaceae sont des plantes considres comme toniques, stimulantes, digestives ou carminatives.
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1.2. Genre Tambourissa Sonn. et T. trichophylla Baker

Le genre Tambourissa Sonn. est reprsent par environ 43 espces exclusivement distribues sur les les de louest de locan indien : Madagascar pour la plupart (26 spp.), aux Comores (5 spp.) et sur les les Mascareignes : lle Maurice (10 spp.) et lle de la Runion (2 spp.) [Lorence, 1985]. Ces espces montrent un fort degr dendmisme, chacune tant restreinte une le donne et frquemment un habitat donn sur lle en question. Dans ces zones gographiques, les Tambourissa sont occasionnellement prsents ou plus communs localement sur lensemble de la fort et du fourr sempervirents, humides et sub-humides de montagne depuis le niveau de la mer jusqu plus de 2 000 mtres daltitude [Lorence, 1985]. Les Tambourissa ont atteint le plus haut niveau de spcialisation de morphologie florale de toutes les Monimiaceae malgaches de la sous-famille des Mollinedioideae. Ces espces sont gnralement remarquables en raison de la particularit de leurs rceptacles floraux et de leurs fruits (reprsents figure II 4). On peut reconnatre ce genre ses fleurs femelles au rceptacle cupuliforme sphrique, aux carpelles enfouis dans le rceptacle et en particulier son grand rceptacle fructifre ligeux ligneux qui se fend pour rvler des fruits rouge-orange [Schatz, 2001].
Figure II 4. Fleurs et fruits de Tambourissa masoalensis ( gauche) et fruits de T. nicolliae ( droite) (source : site Internet du Missouri Botanical Garden).
Les Tambourissa (appels bois tambour ou bois de bombarde Madagascar et Maurice) sont utiliss comme bois de construction. A Madagascar, le tronc de Tambourissa religiosa A.DC., qui produit une gomme-rsine odorante, est utilis pour la fabrication de cercueils, qui, dit-on, empchent la putrfaction du corps. Les Tambourissa sont connus en Anjouan et sur lle de la Grande Comore pour lutilisation de leurs feuilles en infusion calmant et soulageant la douleur [Lorence, 1985].
Tambourissa trichophylla Baker est une espce endmique de Madagascar o elle a pour noms vernaculaires Amborahasa ou Ambura [Cavaco et Humbert, 1957]. Cette espce est dcrite dans la flore de Madagascar et des Comores.
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T. tambourissa Baker : Arbre de 5-12 m de haut ; jeunes rameaux densment tomenteux. Feuilles opposes, oblongues oblongues lancoles, de 8-20 cm de long et de 2.5-5.8 cm de large, brivement acumines au sommet, apex aigu, arrondies la base, dentes au tiers suprieur dents espaces, subcoriaces, poils pars au-dessus, densment tomenteuses en dessous, ptiole de 3 12 mm de long, pais, poilu (figures II 5 et II 6). Fleurs mles de 5-6 mm de diamtre, pdicelle de 5 mm de long, densment tomenteuses, solitaires ou en inflorescences racmiformes, axillaires ou terminales, de 1.5-3 cm de long ; bractes et bractoles ovales lancoles, de 5 mm de long, densment poilues ; rceptacle globuleux, densment poilu extrieurement, pais ; tamines nombreuses, plurisries ; anthres ovales, loges latrales, dhiscentes par une fente longitudinale ; filets larges, glabres, sessiles. Fleur femelle de 0.6 cm de diamtre, globuleuse, densment poilue, solitaire, brivement pdoncule, carpelles nombreux. Fruits globuleux, dprims, de 4.5 cm de diamtre, pricarpe coriace, renfermant de nombreuses drupes [Cavaco et Humbert, 1957].
Figure II 5. Feuilles de Tambourissa trichophylla (source : Laboratoires Bayer Consumer Care division Serdex).
La planche botanique de T. trichophylla tire de cette mme flore est prsente figure II 6.
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Figure II 6. Planche botanique de quelques espces du genre Tambourissa [Cavaco et Humbert, 1957].
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1.3. Principaux mtabolites secondaires des Monimiaceae

Dans cette partie, nous aborderons la phytochimie des Monimiaceae au sens le plus rcent, c'est--dire en excluant les genres qui appartiennent dsormais aux Atherospermataceae et aux Siparunaceae. Alcalodes. Les alcalodes, de type benzylttrahydroisoquinoline, constituent une classe chimique importante de la famille des Monimiaceae. Les diffrents alcalodes de ce groupe sont caractristiques dun certain nombre de familles de lordre des Magnoliales (sensu Cronquist), des Laurales ou de Papaverales. Au sein des benzylttrahydroisoquinolines, les aporphinodes (proaporphines, aporphines, oxoaporphinodes et leurs drivs) forment le plus grand groupe dalcalodes isols des Monimiaceae [Hegnauer, 1990 ; Leito et al., 1999]. Il sagit dun vaste groupe de plus de 500 composs surtout frquents dans certaines familles assez archaques comme les Monimiaceae [Bruneton, 1999]. Le tableau II 2 recense une cinquantaine dalcalodes isols de la famille des Monimiaceae et la figure II 7 rassemble les structures de ces alcalodes.
Tableau II 2. Alcalodes isols de Monimiaceae daprs Leito [Leito et al., 1999 ; DNP, 2006].
Genre
Hedycarya
(H. angustifolia A.Cunn., H. baudounii Baill.)
Alcalodes
boldine (1), laurline (2), cinnamolaurine (3), isosvanine (4), calycotomine (5), hdycarine (6)
Laurelia
(L. philipiana Looser, L. novaezelandiae A.Cunn, L.sempervirens Tul.)
4-hydroxyanonane, 4-hydroxynornantnine, 4-hydroxynornantnine, anonane (7), athroline (8), boldine, corydine (9), isoboldine , isolaurline, laurline, laurpukine, laurpukine-N-oxyde, laurolitsine , laurottanine, liriodnine, mcambroline (10), michelalbine, nantnine (11), norcorydine, norioscorydine, nornantnine, nornucifrine, norushinsunine, obabrine, obovanine, oxolaurline, oxonantnine, oxoputrine, oxyacantine, pukatine (12), pukatine-N-oxyde, pukatin-mthylther, rticuline (13), roemrine (14), romnine, secoisottrandrine, stpharine (15), talbugosine,4S-hydroxy-nornantnine, assimilobine
Mollinedia
(M. costaricensis Donn.SM.)
mollindine (19)
Monimia
(M. rotundifolia Thou.)
athroline, boldine, laurolitsine (16), laurottanine, N-mthyllaurottanine, norglaucine
Palmeria
(P. arfakiana Becc. et A.C.Sm., P. gracilis Perkins)
laurottanine (17), laurolitsine, N-mthyllaurottanine
Peumus
(P. boldus Molina)
a
boldine, isoboldine, isocorydine, isocorydine-N-oxyde, laurolitsine, laurottanine, N-mthyllaurottanine, norisocorydine, rticuline, sinoacutine (18)
Les numros entre parenthses renvoient aux structures prsentes la figure II 7.
A lheure actuelle, seulement deux aporphines sont incluses dans des spcialits pharmaceutiques disponibles sur le march franais dont lune, la boldine (1) (figure II 7) est extraite des feuilles et de lcorce dune Monimiaceae : le boldo (Peumus boldus Molina) et entre dans la composition de
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spcialits proposes dans le traitement dappoint des troubles dyspepsiques et des brlures oesophagiennes. Lautre aporphine est un produit de synthse [Bruneton, 1999].
R1 O R2 N O N R1 R2 N
O R3 O R4
O R3 O OH (8) O R4
(9) R1=Me, R2=H, R3=OMe, R4=H (1) R1=H, R2=Me, R3=H, R4=OH R O NH O
(3) R1=R2= -O-CH2-O-, R3=H, R4=H (13) R1=OMe, R2=OH, R3=Me, R4=OH
O N O R2 R3 O (12) R1=Me, R2=OH, R3=H (11) (7) R1=R2=R3=H (14) R1=Me, R2=R3=H N R1
O OH (16) R=H (17) R= Me
O (2) R1=Me, R2=H, R3=OMe O R1 N O HO (6) R1=Me, R2=H (5) R1=H, R2=Me R2 R1 R2 (19) R1=R2= -O-CH2-O(4) R1=OMe, R2=OH O N (10) R1=Me, R2=H, R3=OH
Figure II 7. Exemples daporphinodes extraits de Monimiaceae daprs Leito et Bruneton [Bruneton, 1999 ; Leito et al., 1999].
Huiles essentielles. La composition gnrale de lhuile essentielle des reprsentants de la famille des Monimiaceae est un mlange de terpnes et de drivs phnylpropanodes [Hegnauer, 1990 ; Leito et al., 1999]. Les principaux composants des huiles essentielles de quelques espces de Monimiaceae ont t recenss dans le tableau II 3 [DNP, 2006].
Tableau II 3. Composants des huiles essentielles de quelques espces de Monimiaceae [Hegnauer, 1969 ; Hegnauer, 1990 ; DNP, 2006]. Espces
Hedycarya angustifolia A.Cunn Hedycarya arborea Forst. Kibara rigidifolia A.C.Sm. Sitostrol, stigmastrol, campestrol, hexacosan-1-ol -ocimne (formes Z et E), -copane, -caryophyllne, [Brophy et al., 2005] [Brophy et al., 1998]
Principaux constituants de lhuile essentielle

Elmol, hdycaryol, -eudesmol, -eudesmol, -eudesmol
Rfrences
[Brophy et al., 2005]
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aromadendrne, viridiflorne, bicyclogermacrne, germacrne B, guaiol, spathulnol, globulol, lmicine Laurelia philippiana Looser Laurelia sempervirens Tul. Levieria acuminata Perk. Cinole, linalool 3-(3,4-methylendioxyphenyl) propen-2-en-1-ol 3-carne, terpinolne, -cadinne, calamnne, viridiflorne, cadina1,4-dine, spathulnol, n-dodecanal, n-dodecanol, n-undecanal, tridcan-2-one Mollinedia gilgiana Perk., M.marliae Peixoto & V.Peireira Peumus boldus Molina Ascaridol, cinole, -fenchol, -pinne, -pinne, -terpinol, camphne, camphor, fenchne, -terpinne, limonne, linaloo, pcymne, p-cymol, terpinn-4-ol, terpinolne, eucalyptol Tambourissa leptophylla A.DC. Limonne, cis--bergamotne, -3-carne, curcumne, trans-bergamotne, -copane, -pinne, p-cymne, bicyclogermacrne [Gallori et al., 2001] [Kretmair, 1952] Phytol, sitostrol, stigmastrol [Claros et al., 2000] [Hegnauer, 1990] [Hegnauer, 1990] [Brophy et al., 1998]
Flavonodes. Les flavonodes dcrits ce jour pour les Monimiaceae sont quasiment toujours des flavonols, trs rarement des flavones, substitus par des groupements hydroxyles et/ou O-glycosyls, trs peu tant mthoxyls. Des gnines de type querctine, isorhamntine ont t isoles des feuilles de diffrentes espces de Monimiaceae mais il est intressant de noter la prsence marque de drivs du kaempfrol (20) dans les flavonodes de cette famille [Hegnauer, 1990].
OH HO O
OH OH O
(20)
Polyphnols au sens large. Les composs phnoliques ont t peu dcrits dans la famille, on peut citer des drivs dacides cinnamiques comme le moupinamide (21) dcrits dans les bourgeons de Mollinedia gilgiana [Claros et al., 2000].
O HO HN (21) O
OH
20
1.4. Travaux antrieurs sur le genre Tambourissa

Le genre Tambourissa est connu pour produire des huiles essentielles. Les travaux de Gallori et al. sur un extrait theroptrolique de tguments de fruits de T. leptophylla A.DC. ont permis didentifier une quarantaine de composs parmi lesquels le limonne (24 %) (29), bergamotne (23 %) (22), le -3carne (8 %) (23), le curcumne (6 %) (26), l-copane (4 %) (24), l-pinne (4 %) (28), le pcymne (4 %) (25) et le bicyclogermacrne (3 %) (27) sont les plus abondants (figure II 8). Cette huile essentielle sest rvle active in vitro contre le champignon microscopique pathogne responsable de la cladosporiose des Cucurbitaceae : Cladosporium cucumerinum [Gallori et al., 2001].
(22) bergamotne
(23) -3-carne
(24) -copane
(25) p-cymne
(26) -curcumne
(27) bicyclogermacrne
(28) -pinne
(29) limonne
Figure II 8. Constituants principaux de lhuile essentielle de T. leptophylla [Gallori et al., 2001].
A notre connaissance, il nexiste aucune donne sur lespce T. trichophylla.
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2. Prsentation de Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver et Agauria polyphylla Baker (Ericaceae)

2.1. La famille des Ericaceae Juss.
Grande famille cosmopolite reprsente par 124 genres (dont Arbutus (arbousier), Calluna (calune), Erica (bruyre), Rhododendron) et environ 4 100 espces [Maberley, 1987], les Ericaceae prdominent en Arctique, dans les rgions tempres et dans les montagnes tropicales et extratropicales du sud-est de lAsie et dAmrique avec une forte concentration dans lHimalaya, en Nouvelle-Guine et dans les Andes (figure II 9). En gnral, la plus grande densit ainsi que la plus grande diversit des Ericaceae se retrouve sous les climats mditerranens notamment en Australie et en Afrique du Sud [Stevens et al., 2004].
Figure II 9. Rpartition mondiale des Ericaceae selon Stevens [Stevens, 2001].
Ce sont souvent des plantes mycorhizes prfrant les sols pauvres et acides. Leur habitat est gnralement caractris par une faible disponibilit en nutriments, un faible taux de matires organiques et souvent une priode de scheresse [Stevens et al., 2004]. Position systmatique. Du point de vue des classifications systmatiques anciennes, la famille des Ericaceae fait partie des Dicotyldones et appartient lordre des Ericales (tableau II 4) [Cronquist, 1988].
Tableau II 4. Taxonomie des Ericaceae selon Cronquist [Cronquist, 1988]. Plantae, Tracheobionta Embranchement : Spermatophyta Sous-Embranchement : Angiospermae Classe : Magnolopsida Sous-classe : Dilleniideae Ordre : Ericales Famille : Ericaceae
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Bien que les limites de la famille des Ericaceae soient bien dfinies, il existe de nombreuses subdivisions en sous-familles et en tribus tablies en 1971 puis rvises par les travaux de Stevens en 2004 [Stevens, 1971 ; Stevens et al., 2004]. Les relations phylogntiques au sein des Ericaceae ont t tudies au moyen danalyses cladistiques bases sur la combinaison de caractres phnotypiques (morphologie, anatomie, nombre de chromosomes et mtabolites secondaires) et de caractres molculaires (squences de nuclotides) [Kron et al., 1986 ; Stevens et al., 2004]. Les Ericaceae se rpartissent en 8 sous-familles (figure II 10), elles-mmes subdivises en tribus.
Figure II 10. Position systmatique et classification infra-familiale des Ericaceae selon lAngiosperm Phylogeny Group [Stevens, 2001].
Caractristiques botaniques des Ericaceae. Famille de plantes sempervirentes ou caduques, les Ericaceae sont des arbustes, parfois trs petits ou subherbaces, des arbres (parfois pachycaules), plus rarement des lianes ou des piphytes. Les feuilles des Ericaceae sont alternes subopposes ou verticilles, entires ou dentes ou souvent en aiguilles appeles ricodes (adaptations des rgimes hydriques dfavorables). Elles sont penninerves et dpourvues de stipules. Linflorescence, trs variable, peut tre terminale ou axillaire, souvent racmeuse ou panicule, parfois rduite une fleur solitaire. Les fleurs, petites, sont actinomorphes pentamres et hermaphrodites. Le calice possde 4-5
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spales plus ou moins souds la base ; il est parfois rduit un anneau ; il peut tre persistant et plus ou moins accrescent. Les ptales sont gnralement souds en tube. La corolle est campanule, en forme durne ou sphrique, aux lobes gnralement petits et distincts. Landroce, 8-10 tamines libres, est obdiplostmone par avortement, les filets sont libres et souds sur le rceptacle, les anthres sont dhiscence poricide, souvent avec appendices bicornes. Un disque nectarifre intrastaminal est parfois prsent. Lovaire est souvent supre. Le fruit est une petite baie charnue et indhiscente ou une capsule sche dhiscence loculicide parfois enferme dans une corolle persistante. La graine est trs petite, souvent aile albumen charnu [Maberley, 1987 ; Spichiger et al., 2000]. Utilisations traditionnelles des Ericaceae. Les reprsentants de la famille des Ericaceae produisant de nombreuses baies comestibles telles que la myrtille (Vaccinium myrtillus L.), la canneberge (V. macrocarpum Aiton, V. oxycoccos L.), lairelle rouge (V. vitis-idaea L.), larbouse (Arbutus unedo L.) qui peuvent tre cultives [Spichiger et al., 2000]. Dautres au contraire sont des poisons violents (genres Kalmia et Gaultheria). Des genres, comme Kalmia ou Rhododendron, contiennent des grayanotoxines (ou andromedotoxines) qui peuvent tre fatales ou causer des empoisonnements car elles peuvent passer dans le miel labor partir de ces plantes [Scott et al., 1971 ; Bruneton, 1999]). De nombreux genres et espces dEricaceae sont cultivs comme plantes ornementales (Rhododendron, Calluna, Erica). Il existe de nombreuses utilisations mineures despces dEricaceae, par exemple, les loupes de racines de bruyres (Erica arborea L. ou E. scoparia L.) sont utilise pour la fabrication de pipes [Watson et Dallwitz, 1992]. Il est galement fait mention de nombreuses utilisations dEricaceae dans les pharmacopes traditionnelles. Les infusions de feuilles de Rhododendron sect. Ledum, Vaccinium arctostaphylos L. et Gaultheria procumbens L. reprsentaient une importante source dacide salicylique avant sa production par synthse. On peut citer galement Arbutus unedo L., anti-diarrhique et antiinflammatoire, Calluna vulgaris (L.) Hull et Arctostaphylos uva-ursi Spreng, plantes astringentes et antiseptiques urinaires [Spichiger et al., 2000].
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2.2. Genre Agauria Benth. & Hook.f.

Le genre Agauria appartient la plus grande sous-famille des Ericaceae : les Vaccinioideae et la tribu des Lyoniae (figure II 11) [Kron et al., 1999]. Agauria est un genre dAfrique tropicale trs reprsent Madagascar (de 3 10 espces selon les auteurs) et aux Mascareignes. Bien que de nombreuses espces et sous-espces aient t dcrites, certains auteurs ne reconnaissent quune seule espce variable sur le continent africain, ce grand polymorphisme tant encore plus marqu Madagascar [Schatz, 2001].
Sous-famille VIII. Vaccinoideae Tribu.1 Oxydendreae Genre : Oxydendrum Tribu. 2 Lyonieae Genres : Craibiodendron, Pieris, Agarista (dont Agarista sect. Agauria) Tribu 3. Andromedeae Genres : Andromeda, Zenobia Tribu 4. Gaultherieae Genre : Chamaedaphne
Figure II 11. Position systmatique du genre Agauria au sein des Vaccinioideae [Kron et al., 1999 ; Stevens et al., 2004].
Les espces du genre Agauria ont t incluses dans le genre Agarista, genre du Nouveau Monde en raison dimportantes similitudes de caractres morphologiques et anatomiques : cest un des rares exemples de division tropicale transatlantique chez les Angiospermes. En effet, Agarista, genre dune trentaine despces, est localis dans les rgions tropicales du continent sud-amricain et en particulier dans lest du Brsil. Les deux groupes Agauria et Agarista affectionnent les mmes types dhabitat : les zones de montagnes tropicales. Ceci explique la grande dispersion de Agauria sur le continent africain o la ceinture tropicale ne compte pas densemble montagneux continu [Stevens, 1970]. Kron et Judd, en 1997, dans une tude sur la cladistique de certains genres des Vaccinoideae, concluent que les groupes despces amricaines et africaines forment un unit phntique et phylogntique et doivent tre considrs comme un seul genre : Agarista. Les espces amricaines dAgarista sont places dans la section Agarista et les espces africaines dans la section Agauria [Kron et Judd, 1997]. On peut reconnatre le genre Agauria ses feuilles gnralement entires qui sont souvent glauques sur leur face infrieure et ses inflorescences en grappe portant des fleurs quelque peu charnues, blanches roses ou rouges [Schatz, 2001].
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Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver est une espce dAfrique centrale, dAfrique du sud et de Madagascar, rpandue dans les forts et prairies des hauts plateaux (1 300 - 3 000 m daltitude) (figure II 12). Cest un des bois pionniers des coules de lave. A Madagascar, cette espce a pour noms vernaculaires Angavodiana, Avogandia, Ankavodiana, Angavodianandrano, Aavodiana, Kavodia et Bois de rempart ou Bois de gale La Runion. Cette espce est dcrite dans la flore des Mascareignes : A. salicifolia Hook.f. ex Oliver : Arbuste ou arbre (souvent petit arbre tortueux) denviron 10-20 m de haut tiges ramifies et bourgeons foliaires de couleur rougetre. Lcorce est gristre fissure en long. Le bois de cur est rougetre. Les feuilles sont nervure principale saillante, trs denses au sommet des rameaux, les jeunes feuilles sont rougetres. Le limbe est coriace elliptique ou lancol, acumin au sommet, tomenteux ltat jeune. La marge foliaire est replie vers le dessous. Linflorescence est en grappe de fleurs en clochettes crme rouges, terminales ou axillaires pluriflores. Les fruits capsulaires portent de petites graines disperses par le vent [Bosser et al., 1981].
Figure II 12. Rameau fleuri dA. salicifolia (source : Site Internet de la banque de donnes Prelude : utilisation de plantes en mdecine traditionnelle vtrinaire et humaine en Afrique sub-saharienne).
Le trs grand polymorphisme de cette espce a t soulign par de nombreux botanistes lors de sa dcouverte aussi bien par H. Perrier de la Bthie Madagascar, que par Baker lle Maurice et par J. de Cordemoy la Runion [Bosser et al., 1981]. De nombreuses publications font tat dA. salicifolia var. salicifolia originaire de lle Maurice et qui y porte le nom de Bois cabri [Ewane-Nyambi et al., 1993b]. En Afrique centrale, la sve des feuilles coupes dA. salicifolia ou A. salicifolia var. salicifolia est applique sur les plaies causes par les scarifications. Les feuilles ont des proprits analgsiques. La plante est galement utilise comme insecticide et comme antidote contre les flches empoisonnes. Lcorce broye est additionne deau frache puis bue au Kenya par les Massa comme aide la
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digestion ou aprs un excs de viande [Burkill, 1994]. A Madagascar, la plante grille est rduite en poudre et applique sur les plaies ulcreuses [Boiteau et al., 1959]. Elle est galement utilise pour traiter la syphilis et les nvralgies. En usage externe, les feuilles sont galement utilises comme traitement contre la gale. Les feuilles sont mortellement toxiques pour les hommes et le btail, mme les feuilles mortes peuvent provoquer vomissements, convulsions, difficults respiratoires et comas. Les racines sont galement toxiques [Loriaux et al., 1973]. En 2005, Martinet et al. ont rapport le cas dun empoisonnement par A. salicifolia. Une femme qui avait consomm par erreur cette plante en infusion a t sujette des vomissements, une hypotension artrielle et une bradycardie et a guri en quelques heures sous surveillance mdicale [Martinet et al., 2005].
Agauria polyphylla Baker est une espce endmique de Madagascar. Cest un arbre commun de la rgion centrale o il est appel Angavodiana ou Angavodianantanety (figure II 13).
Figure II 13. Agauria polyphylla (source : Laboratoires Bayer Consumer Care division Serdex)
La description botanique de cette espce se trouvant dans un volume non dit de la Flore de Madagascar et des Comores nest pas disponible. Certains botanistes considrent A. polyphylla comme une simple forme adapte la savane et aux milieux arides dA. salicifolia [Loriaux et al., 1973]. Comme celles dA. salicifolia, les feuilles de A. polyphylla sont utilises contre les ruptions et en cas de gale, on les utilise galement pour le traitement de rhumatismes et pour soigner les plaies. La plante provoque des accidents mortels sur le btail qui en consomme les feuilles [Boiteau, 1986]. Cette plante fournit un bois de construction de qualit mdiocre, utilis dans la fabrication de charbon de bois.
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2.3. Principaux mtabolites secondaires des Ericaceae Juss.

Tanins. Les tanins sont des constituants abondants des Ericaceae. Les reprsentants de cette famille produisent des tanins galliques, des tanins ellagiques et des tanins condenss et ce, essentiellement dans les feuilles. On connat peu de choses sur les structures exactes des tanins des Ericaceae cependant de nombreux lments constitutifs des tanins (ainsi que leurs polymres) ont t isols. Le plus rpandu est lacide gallique (30) mais on peut galement citer lacide o-protocatchique (31), lacide gentisinique (32) et le sparassol (33) ainsi que la catchine et lpicatchine parmi les plus rpandus (figure II 14) [Hegnauer, 1966 ; Hegnauer, 1989].
O OH COOH OH HO OH OH O O O COOH
HO OH
OH
OH
(30) acide gallique
(31) acide o-protocatchique
(32) acide gentisique
(33) sparassol
Figure II 14. Structures de base des tanins des Ericaceae.
Flavonodes. Les composs flavonodiques sont largement rpandus dans les feuilles et les fleurs dEricaceae. Ce sont surtout des flavonols, drivs O-glycosyls de querctine (34) mais aussi de kaempfrol et de myrictine. Quelques genres (Pieris, Kalmia) produisent des flavanones et des dihydrochalcones la place des flavonols ((39) (42)). Les pigments rouges et bleus des fleurs et fruits dEricaceae sont des anthocyanes et des flavanones. Ils ont t principalement tudis dans le genre Rhododendron dont deux flavones sont caractristiques : lazaline (37) et la 5-hydroxyazaline (figure II 15) [Hegnauer, 1966]. Autres drivs phnols et htrosides phnoliques. Certains htrosides phnoliques sont caractristiques des Ericaceae (figure II 16). On peut citer les drivs de diphnols qui sont reprsents par larbutine (48) et ses drivs, mthylarbutine (49), homoarbutine (50) et pyroside (51). Les feuilles de busserole (Arctostaphylos uva-ursi Spreng) contiennent 6-10 % darbutine qui, par hydrolyse, libre un diphnol qui soxyde immdiatement en hydroquinone. Cette plante, cite dans la Pharmacope europenne est utilise pour le traitement des infections des voies urinaires [Bruneton, 1999]. Les genres Chimaphila et Rhododendron sont connus pour produire, en plus de larbutine, des composs caractristiques : la pyrolatine (52) et la chimaphiline (53) (figure II 16). Dautres htrosides phnoliques, comme le monotropitoside (54) (ou gaulthrine) ont t caractriss dans les genres Gaultheria ou Monotropa. Le genre Rhododendron produit des drivs phnoliques (par exemple le rhododendrol (55)) qui sont le plus souvent monoglycosyls ; cest le cas de la
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rhododendrine (56). Quelques lignanes dont le lyonoside (57) ont t identifis dans le genre Lyonia [Hegnauer, 1989].
OH HO O
R1 = R2 = OH : Querctine (34) R1 = OH, R2 = O-galactose : Hyproside (35) R1 = OH, R2 = O-glucuronide : Miqulianine (36)
R HO O
OH
OH R2
OH
R1
R = O-Rhamnose : Astilbine (38)
R1 = O-Me, R2 = O-rhamnose : Azaline (37)
OH
OH O OH
R1 = H, R2 = OH : Phlortine (39) R1 = Me, R2 = OH : Asebognine (40) R1 = Me, R2 = O-glucose : Asbotine (41)

HO O OR1
R1
R1 = H : Farrerol (43) R1 = CH3 : Matteucinol (44)
R2
O R1 OH
R1 = OH, R2 = O-glucose : Phlorizine (42)

OH O
R1 = R2 = R3 = R4 = OH : Delphinidine (45) R1 = O-Me, R2 = R3 = R4 = OH : Ptunidine (46) R1 = O-Me, R2 = O-Me, R3 = R4 = Glucose : Malvine (47)
HO
R2 R4
R3
Figure II 15. Flavonodes communs isols des Ericaceae daprs [Hegnauer, 1966]
OMe CH2OR O O OH OH OH OR Me OH
OMe
R O-Glu
(48) R = H : Arbutine (51) R = Ac : Pyroside
R = H : Mthylhydroquinone (49) R = Glu : Mthylarbutine
(50) R = H : Homoarbutine
OH COOCH3 OR OR O O
(58) R = H : Salicilate de Mthyle (54) R = Xyl -Glu : Monotropitoside
(55) R = H : Rhododendrol (56) R = Glu : Rhododendrine
(53) Chimaphiline
OH O O O OH Xyl HO Glu
HO
O OH
(57) Lyonoside
(52) Pyrolatine
Figure II 16. Htrosides phnoliques et drivs quinoniques caractristiques des Ericeceae daprs Hegnauer [Hegnauer, 1989].
Huiles essentielles. Le genre des Ericaceae le plus tudi pour son huile essentielle est le genre Ledum avec pour composants majoritaires le pinne (28), le bornol (59), l-phellandrne (60), l29
caryophyllne (61) et le carvacrol (62) [Hegnauer, 1966] (figure II 17). Le salicylate de mthyle (58) est le composant principal de lessence de Wintergreen, huile essentielle obtenue dun arbuste nordamricain, Gaultheria procumbens L., dans laquelle il existe sous la forme de monotropitoside (figure II 16) [Bruneton, 1999].
HO OH
bornol (59)
-phellandrne (60)
-caryophyllne (61)
carvacrol (62)
Figure II 17. Composants majoritaires des huiles essentielles du genre Ledum [Hegnauer, 1966].
Diterpnes toxiques. Des diterpnes ont t isols en trs grand nombre dans certains genres Rhododendron, Lyonia, Leucothoe, Pieris et Agauria et leur confrent leurs proprits toxiques. Quelques exemples de ces diterpnes dEricaceae sont prsents figure II 18 [Hegnauer, 1966 ; Hegnauer, 1989]. Ces molcules, prsentes dans le pollen des fleurs de Rhododendron et Kalmia par exemple, peuvent passer dans le miel labor partir de ces plantes et sont lorigine de nombreuses intoxications notamment en Turquie [Scott et al., 1971 ; Bruneton, 1999].
OH O OH HO OH O OH OH OH OH OH HO grayanotoxine XIX (65) O OH OH HO OH OH HO
leucothol A (63)
piristoxine G (64)
grayanol A (71)
HO HO HO HO O HO grayanotoxine XV (66) O HO HO HO O OH O HO HO O rhodojaponine VII (70) lyoniol B (73) O OH OH OH OH OH HO OH OH OH OH O O O Asebotoxine V (68) OH OH O HO rhodomoside (69) OH Glu O OH OHOH
kalmanol (67)
Figure II 18. Quelque exemples de molcules diterpniques isoles dEricaceae daprs Hegnauer [Hegnauer, 1966 ; Hegnauer, 1989].
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Triterpnes. Lacide ursolique (74), le taraxrol (75), la -amyrine (76), le -sitostrol (77), la friedline (78) et le lupol (79) sont les triterpnes les plus frquemment cits dans la littrature pour les Ericaceae (figure II 19). Lacide ursolique, considr comme caractristique des Ericaceae, a ensuite t dcouvert dans de nombreuses autres familles [Hegnauer, 1966].
OH O O friedline (78) HO HO
acide ursolique (74)
-amyrine (76)
HO
taraxrol (75)
HO
lupol (79)
HO
-sitostrol (77)
Figure II 19. Triterpnes frquents dans les Ericaceae daprs Hegnauer [Hegnauer, 1966 ; Hegnauer, 1989].
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2.4. Travaux antrieurs sur le genre Agauria

Les travaux de Sosa et Dussy, en 1951, sur Agauria salicifolia, ont permis de montrer que les feuilles et lcorce contiennent dabondantes quantits de tanins catchiques et disoler des extraits alcooliques dcorce huit substances triterpniques que ces auteurs ont nommes : agaurol A, agaurol B, agaurol C, agaurol D, agaurol , agaurol , agaurilol et acide agauriolique [Dussy et Sosa, 1951]. Lidentification de lpoque navait abouti qu des hypothses quant la formule brute de ces composs. Ils montrrent un peu plus tard que lacide agauriolique est en fait lacide morolique (80) [Sosa et Dussy, 1951]. En 1959, Boiteau et al. ont tudi A. salicifolia et plus particulirement une forme considre comme la plus toxique de cette espce pour en trouver le principe actif toxique. En effet laction curarisante de cet arbuste a t mise en vidence en 1911 par Radais et Sartory par injection intra pritonale dextrait alcoolique des rats leur provoquant une paralysie complte du train postrieur, des tremblements et convulsions et une dyspne intense prcdant la mort. Boiteau et al. ont ainsi isol de lacide actylmorolique (81) et les agauriols et agaurols prcdemment isols ainsi quun acide triterpnique dicarboxylique nomm acide agaurique et dont lagaurate double de glucose et de sodium serait responsable de laction curarisante dA. salicifolia [Boiteau et al., 1959]. En 1973, Loriaux et al. ont isol et identifi, des feuilles de Agauria polyphylla cette fois, trois diterpnes : les grayanotoxine I (82), grayanotoxine II (83) et grayanotoxine III (84). Pour ces auteurs, ces composs sont responsables de la toxicit de cette plante et leur teneur est infrieur 50 mg/kg de feuilles sches [Loriaux et al., 1973]. Grgoire et Nyembo ont ensuite contribu ltude de lespce variable A. salicifolia en tudiant un lot dA. salicifolia var. salicifolia du Zare. Des extraits dcorces sches, ils ont isol des triterpnes qui sont lacide actyl-3-morolique (85), le -sitostrol (77), lactyl-3-moradiol (86), le taraxrol (75), lagauriastrone (87), la taraxrone (88) et lactyl-4-moraldhyde (89). Ces auteurs mentionnent quils nont pas retrouv les substances inconnues qui accompagnaient lacide actyl-3morolique dans les prcdentes tudes sur A. salicifolia [Grgoire et Nyembo, 1977]. Comme les grayanotoxines taient prsumes responsables des effets curarisants des Agauria, EwaneNyambi et al. ont tudi les effets dextraits de feuilles dA. salicifolia sur la permabilit au sodium de cellules isoles de muscles squelettiques et cardiaques de grenouilles. Ils ont montr que lextrait exerce un effet antagoniste sur les canaux sodium en agissant sur un seul site qui est diffrent du site habituel dinhibition [Ewane-Nyambi et al., 1993b ; Ewane-Nyambi et Raymond, 1993]. Cet effet inhibiteur ne serait pas d aux seules grayanotoxines [Ewane-Nyambi et al., 1993a].
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OH O R R=OH : acide morolique (80) R= OAc : acide 3-actylmorolique (85) O O
R=OH : 3-actylmoradiol (86)
O agauriastrone (87)
R=CHO : 3-actylmoraldhyde (89)
OH HO
3 14
OH HO HO
HO HO O taraxrone (88)
OAc
OH
HO HO
OH
OH
HO HO
OH
OH
grayanotoxine I (82)
grayanotoxine II (83)
grayanotoxine III (84)
Figure II 20. Molcules isoles du genre Agauria [Boiteau et al., 1959 ; Loriaux et al., 1973 ; Grgoire et Nyembo, 1977].
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3. Prsentation de Embelia concinna Baker (Myrsinaceae)

3.1. La famille des Myrsinaceae R. Brown
Famille comprenant environ un millier despces [Perrier de la Bthie et Humbert, 1953], les Myrsinaceae ont une distribution mondiale stendant au nord jusquau Japon, au Mexique et au nord de la Floride et au sud jusquen Afrique du Sud et en Nouvelle Zlande [Watson et Dallwitz, 1992]. Les genres herbacs sont distribus principalement dans les rgions tempres (chaudes) alors que les genres arborescents ou ligneux sont essentiellement tropicaux. Les genres principaux, Ardisia et Rapanea sont pantropicaux, occupant tant les basses terres que les zones montagneuses [Stahl et Anderberg, 2004]. Position systmatique. Les trois familles Theophrastaceae, Primulaceae et, la plus grande des trois, Myrsinaceae, gnralement traites comme appartenant aux Primulales dans les classifications anciennes (tableau II 5) forment un petit groupe reclass dans lordre des Ericales, un des principaux clade de la sous-classe des Asteridae [APG, 1998] (voir figure II 10 page 23). Ces familles sont considres comme formant un groupe monophyltique par les analyses cladistiques morphologiques ainsi quau niveau des donnes molculaires mais un ralignement taxonomique au sein de ce groupe a t men par Kallersjo et al. en 2000. Les interrelations phylogntiques de Primulaceae, Myrsinaceae et Theophrastaceae ont t tudies au travers des squences de gnes chloroplastiques. Il en a rsult llvation du genre Maesa (anciennement appartenant aux Myrsinaceae) au rang de famille : les Maesaceae et de nombreux transferts pour rendre les familles monophyltiques (les genres Lysimachia, Anagallis, Glaux, Asterolinon, Coris, Ardisiandra et Cyclamen et Pelletiera ont t dplacs chez les Myrsinaceae) [Kallersjo et al., 2000]. La dlimitation actuelle des Myrsinaceae est due Stahl et Andenberg : les Myrsinaceae comptent un millier despces rparties dans 49 genres sans autre subdivision infrafamiliale [Stahl et Anderberg, 2004].
Tableau II 5. Taxonomie des Myrsinaceae selon Cronquist [Cronquist, 1988]. Plantae, Tracheobionta Embranchement : Spermatophyta Sous-Embranchement : Angiospermae Classe : Magnolopsida Sous-classe : Dilleniideae Ordre : Primulales Famille : Myrsinaceae
Caractristiques botaniques des Myrsinaceae. Les Myrsinaceae sont des arbres ou arbustes, parfois grimpants, presque toujours feuillage persistant (certains genres peuvent tre herbacs). Les
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fleurs et les feuilles ont un aspect charnu et brillant. Les feuilles sont alternes, simples, entires ou dentes, coriaces, sans stipules et souvent groupes au sommet du rameau. Le limbe est marqu de cellules scrtrices (poches schyzognes) plus ou moins apparentes en forme de petits btonnets ou de ponctuations glanduleuses obscures (linoles) galement prsentes sur les autres organes. Linflorescence peut tre cymeuse, racmeuse ou panicule, parfois ramiflore. La fleur, gamoptale, ttra- ou pentamre, est actinomorphe, hypogyne, bisexue. Ses spales sont plus ou moins souds et les ptales, souds en entonnoir ou libres. Landroce est isostmone opposiptale, les tamines filets courts sont plus ou moins unies la corolle, parfois souds en tube ; les anthres sont souvent sagittes et connes et dhiscence introrse, longitudinale ou plus rarement par pores apicaux. Lovaire supre est uniloculaire et prsente de nombreux ovules. Le fruit peut tre une baie ou une drupe avec gnralement une petite graine noire albumen huileux [Perrier de la Bthie et Humbert, 1953 ; Spichiger et al., 2000]. Utilisations traditionnelles des Myrsinaceae. Certains genres de Myrsinaceae (Ardisia ou Cyclamen) sont cultivs comme plantes ornementales. Le feuillage persistant de certaines espces dArdisia est apprci au Japon o de nombreux cultivars ont t mis au point [Kobayashi et de Mejia, 2005]. Certaines espces de Myrsinaceae sont comestibles (baies de Ardisia elliptica Thunb. ou A. macrocarpa Wall.) mais cest surtout pour ses applications mdicales que cette famille est connue. En Inde et en Afrique, les Myrsinaceae sont largement utilises en mdecine traditionnelle en tant que remdes anthelminthiques et antibactriens [Ogweno Midiwo et al., 2002]). Plus sporadiquement, leurs proprits mdicales traditionnelles incluent le traitement de diarrhes, de cancers, dhpatites, de rhumatismes, de la tuberculose, des dmences ou de certaines affections virales [Burkill, 1994].
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3.2. Genre Embelia Burm. f. et E. concinna Baker

Le genre Embelia Burm. f. comprend une trentaine despces dont laire stend de lAfrique au Pacifique. Les 8 espces prsentes Madagascar sont toutes endmiques [Perrier de la Bthie et Humbert, 1953]. Les Embelia sont utilises par lhomme en mdecine traditionnelle. Embelia ribes Burm.f. est connue en mdecine ayurvdique ancienne pour ses proprits contraceptives [Chaudhury et al., 2001 ; Kumara Swamy et al., 2007]. Les fruits de cette plante ont galement des proprits carminatives, stomachiques, anti-diarrhiques et anthelminthiques [Prashanth et al., 2001]. Cette dernire proprit est partage par de nombreuses espces dEmbelia. Les fruits de E. schimperi Vatke constituent lanthelminthique le plus populaire dAfrique de lEst et dAfrique centrale, en particulier contre le tnia. Plante traditionnellement employe par les Massa de Tanzanie et du Kenya [Boegh et al., 1996], on la trouve dsormais facilement sur les marchs. Les activits biologiques de cette plante, confirmes par de nombreuses tudes, ont t recenses par Machocho et al. [Machocho et al., 2003]. Dautres espces comme E. guineensis Baker ou E. rowlandii Gilg, semblent partager les mmes applications et sont des succdanes dE. schimperi dans de nombreuses pharmacopes traditionnelles [Burkill, 1994]. E. angustifolia A.DC. est utilise La Runion dans le traitement traditionnel des dsordres urinaires, des nphrites, des cystites et des rhumatismes [Lund et al., 1997].
Embelia concinna Baker est endmique de Madagascar (figure II 21) o elle porte les noms de Tanterakala, Takasina, Kasiana, ou encore Sirahazo. La plante est commune dans les forts de cimes entre 1 200 et 2 000 m daltitude et fleurit doctobre janvier.
Figure II 21. Rameau fleuri de Embelia concinna (source : site internet de la Facult de Pharmacie de Greifswald).
La description botanique dE. concinna se trouve dans la Flore de Madagascar et des Comores.
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E. concinna Baker : Lianes toujours vertes, parfois, dans les lieux dnuds, arbustes rameaux plus ou moins sarmenteux (pyromorphose). Feuilles nombreuses, densment disposes, coriaces, dun brun sombre en herbier, ptiole grle (2-8 cm) ; limbe elliptique ou lancol (1.6-3.5 x 0.8-1.5 cm) ; par transparence, ltat adulte opaque, ltat jeune trs petits points rouges irrguliers sur fond rougetre et trame peu visible de rseau hyroglyphorme . Panicule terminal plus ou moins ramifi, de 1 5 cm de long ; axe et pdicelles portant des poils bruns et courts ; bractes troites, galant le tiers ou les deux tiers des pdicelles ; pdicelles de 2-3 mm de long ; petites fleurs (2.5 mm de long) quadra ou pentamres. Spales triangulaires aigus, de moins de 1 mm, portant quelques poils lextrieur, manifestement cilis, avec, au milieu, 4-5 points peu visibles. Ptales obovales, troitement obtus, papilleux, obscurment ponctue au milieu. Etamines plus courtes que les ptales ; anthres dorsalement ponctues. Ovaire glabre, ovode ; style cylindrique, de 1 mm ; stigmate discode, presque deux fois plus large que le sommet du style [Perrier de la Bthie et Humbert, 1953].
Figure II 22. Feuilles de Embelia concinna (source : Laboratoires Bayer Consumer Care division Serdex).
Deux sous-espces sont galement prsentes Madagascar : E. concinna var sclerophylla H. Perrier diffrant par des feuilles encore plus coriaces et des inflorescences en grappe simple et E. concinna var ericophila H. Perrier, forme altitudinaire feuilles trs petites [Perrier de la Bthie et Humbert, 1953]. E. concinna possde des proprits anthelminthiques, tnifuges et antihmorragiques
traditionnellement utilises par les populations malgaches [Heitz et Billet, 1973].
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3.3. Principaux mtabolites secondaires des Myrsinaceae

Les benzoquinones de type embline et les saponosides constituent les caractristiques phytochimiques de la famille de Myrsinaceae. Benzoquinones. Les benzoquinones constituent un trait caractristique de la famille des Myrsinaceae. Parmi les plus frquemment rencontres (voir figure II 23), citons lembline (90), la rapanone (91) et la vilangine (92) que lon retrouve quasi systmatiquement dans les genres les plus tudis : Ardisia, Rapanea, Myrsine, Aegiceras et Embelia. Ces composs sont prsents dans les feuilles, lcorce, mais surtout dans les fruits et le bois des Myrsinaceae [Hegnauer, 1969]. Les benzoquinones sont des composs anti-apptants, antimicrobiens, acaricides, insecticides et nmaticides et sont souvent les principes actifs des Myrsinaceae qui prsentent ce type dactivits. Lembline est souvent considre comme le principe actif des espces anthelminthique [Ogweno Midiwo et al., 2002]. Certains genres (Rapanea, Ardisia) peuvent galement renfermer des alkyl-rsorcinols ou des alkenylrsorcinols qui sont probablement des prcurseurs des benzoquinones [Hegnauer, 1990 ; Kozubek et Tyman, 1999].
O OH HO O O OH O OH
HO O Embline (90)
(CH2)10 O
OH HO O Vilangine (92)
(CH2)10
HO O
(CH2)n
(91) Rapanone, n=12 (93) Homorapanone, n=14
O O O O (94) Ardisianone, n=13 O (CH2)n O
OAc O OAc (CH2)13 OH (96) Ardisianol HO O (97) Ardisiaquinone (CH2)7 O (CH2)7 HO
O O
(95 Cornudentatone, n=11
OH
OH
HO
(CH2)7
(CH2)5
HO (99) Ardisine
(98) Alkenylresorcinol (Rapanea)
Figure II 23. Quelques exemples de benzoquinones et alkenylrsorcinols isols de Myrsinaceae [Hegnauer, 1969 ; Hegnauer, 1990].
Saponosides triterpniques et triterpnes sensu stricto. Comme les autres familles appartenant anciennement aux Primulales, la plupart des Myrsinaceae produisent des saponosides au niveau des racines, des branches, des feuilles et des graines [Stahl et Anderberg, 2004].
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Plus dune centaine de composs de ce type ont t extraits des genres les plus tudis des Myrsinaceae : Ardisia, Myrsine, Rapanea et Embelia [DNP, 2006]. Quelques exemples de triterpnes (qui peuvent se trouver sous forme libre ou en tant que gnines des saponosides) et de saponosides, isols despces de Myrsinaceae, sont prsents sur la figure II 24.
CHO O OH O OH HO (100) agiceradinol HO (101) acide chinocystique HO (102) ardisiogenine (Ardisia) OH
OH O O HO (103) agicrine OHC O (107) ardisiacrispine A, R= OH glu R (108) ardisiacrispine B, R= rha glu ara HO HO
(104) agiceradiol
(105) ilexol
glu xyl glu ara
(106) cyclamirtine A (Ardisia sp., Myrsine, Cyclamen)
Figure II 24. Exemples de triterpnes et saponosides des Myrsinaceae [DNP, 2006].
Autres substances. Peu de publications font tat des types de phnols que lon peut trouver dans les Myrsinaceae. Les principales gnines de flavonodes dcrites pour cette famille sont principalement les classiques myrictine (109), querctine, leucocyanidine (110), leucidelphinidine (111) ou cyanidine (112). Le genre Ardisia produit galement de lacide ardisique B (113) ou bergnine [Hegnauer, 1969 ; Hegnauer, 1990]. Le genre Myrsine produit des acides terpnobenzoques appels acides myrsinoques ((114) (117)) aux proprits anti-inflammatoires (figure II 25) [Hirota et al., 2002 ; Makabe et al., 2003].
39

OH OH HO O HO OH OH OH OH myrictine (109) OH OH cyanidine (112) OH OH OH O+ OH OH HO O OH OH
R R=H : leucocyanidine (110) R=OH : leucodelphinidine (111)
HO OH O OH O O Acide ardisique B (113) HO (114) myrsinionoside D (Myrsine seguini) HO O OH OH
OH O
OH
HO
OH OH O OH
HO HO O (115) acide myrsinoque C (Myrsine)
HO
(116) acide myrsinoque B (Myrsine, Rapanea)
(117) acide myrsinoque A (Myrsine)
Figure II 25. Exemples de la diversit des structures observes chez les Myrsinaceae daprs Hegnauer et DNP [Hegnauer, 1969 ; Hegnauer, 1990 ; DNP, 2006].
40
3.4. Travaux antrieurs sur le genre Embelia

La composition phytochimique des plantes du genre Embelia est tudie de longue date en raison de son abondante utilisation en mdecine traditionnelle et de lintrt que cela suscite. En 1950, la prsence de strols, de tanins, de saponines et de quinones (embline (90)) a t mise en vidence dans Embelia barbayena Mez. En dpit de sa forte toxicit, cette plante est couramment utilise comme vermifuge et purgatif [Paris et Rabenoro, 1950]. Lespce du genre Embelia la plus tudie est sans doute E. ribes Burm.f. pour ses proprits contraceptives [Krishnaswamy et Purushothaman, 1980 ; Seth et al., 1982]. Ces effets seraient dus la prsence dembline en grande quantit dans les fruits et les graines. Cette molcule a, outre ses proprits contraceptives, des proprits analgsiques, anti-inflammatoires, antioxydantes, antitumorales et antibactriennes [Chitra et al., 2003]. Lembline est galement le composant majoritaire des graines de nombreuses autres espces de Embelia (E. scandens Mez, E. robusta Roxb., E. kilimandscharica Gilg). De nombreuses autres quinones et benzoquinones ont t isoles des Embelia, dont E. angustifolia A.DC. notamment [Haq et al., 2005 ; DNP, 2006] (figure II 26).
O OH HO O OH O O OH (119) OH (120) embline (90) O OH O (118) O OH
HO
Figure II 26. Exemples de benzoquinones du genre Embelia [DNP, 2006].
Ltude, en 1973, dE. concinna Baker par Heitz et Billet a conduit lidentification de deux triterpnes pentacycliques : la primulagnine A (121) et lembliagnine (122) [Heitz et Billet, 1973]. Une autre reprsentante des Embelia trs tudie est E. schimperi Vatke, utilise en mdecine traditionnelle comme dpuratif et anthelminthique. Lefficacit de cette plante contre Taenia saginata a t confirme par des tudes in vitro [Boegh et al., 1996]. Comme les autres Embelia, cette plante renferme des benzoquinones substitues par de longues chanes alkyle (de type embline) ainsi que des anthraquinones (vilangine (92)) et des triterpnes pentacycliques (emblinone (123), schimprinone (124), agicrine (103), protoprimulagnine A (126) et primulagnine A (121)) (figure II 27) [Machocho et al., 2003].
41

OH OH OH O HO (121) primulagnine A
OH OH HO HO OH
(122) embeliagnine
(124) schimprinone
O R2 R1 R4 R3
R1=R2=O,R3=R4=H : emblinone (123) R1=OH, R2=H, R3=R4=O : agicrine (103) R1=R3=OH, R2=R4=H : protoprimulagnine A (126)
Figure II 27. Triterpnes pentacycliques isols du genre Embelia [Heitz et Billet, 1973 ; Boegh et al., 1996 ; Machocho et al., 2003].
Des flavonols ont t isols en grand nombre dans le genre Embelia, par exemple des drivs des gnines myrictine, querctine et kaempfrol : querctine-3-O-rutinoside, querctine-3-O-rhamnoside, querctine-3-O-galactoside et querctine-3-O-galactosyl(1 2)rhamnoside (E. schimperi Vatke) [Arot et Williams, 1997], ou de syringtine : syringtine-3-O-rhamnoside-7-O-glucoside, syringtine-3-Orhamnoside-7,4'-di-O-glucoside et de myrictine : myrictine-3-O-rhamnoside, myrictine-3-Oglucoside, myrictine-3-O-rhamnosyl(1 3)galactoside, myrictine-3-O-glucosyl(1 2)glucoside-7-Oglucosyl(1 4)rhamnoside, querctine-7-O-galactosyl(1 4)galactoside (des feuilles dE. keniensis R.E.Fr.) [Manguro et Williams, 1996].
42
4. Flavonodes et spectromtrie de masse

4.1. Gnralits sur les flavonodes
Occupant une place prpondrante dans le groupe des phnols, les flavonodes sont des mtabolites secondaires ubiquistes des plantes. A ce jour, plus de 4000 flavonodes naturels ont t dcrits. On estime que 2 % environ du carbone organique photosynthtis par les plantes, soit quelques 109 tonnes par an, est converti en flavonodes [Agrawal et Markham, 1989]. Chimie des flavonodes. Flavonodes (de flavus, jaune en latin) est le terme gnrique pour des composs bass sur un squelette 15 carbones, qui son niveau le plus simple, consiste en deux cycles phnyles, les cycles A et B, connects par un pont trois carbones (structure en C6-C3-C6). Le pont en C3 entre les cycles A et B est communment cyclis pour former le cycle C (figure II 28).
3' 2' 8 7 1 O 9 10 1' 2 6' 3 5 4 4'
B
5'
A
6
Figure II 28. Structure de base des flavonodes.
Biosynthse des flavonodes. Les flavonodes possdent tous le mme lment structural de base car ils drivent dune origine biosynthtique commune. Le cycle A est form partir de trois molcules de malonyl-coenzyme A (malonyl-CoA), issues du mtabolisme du glucose. Les cycles B et C proviennent eux aussi du mtabolisme du glucose mais par la voie du shikimate via la phnylalanine qui est convertie en p-coumarate puis en p-coumaroyl-CoA (figure II 29). Le p-coumaroyl-CoA et les 3 malonyls-CoA se condensent en une seule tape enzymatique pour former une chalcone, la 4,2,4,6-ttrahydroxychalcone (raction catalyse par la chalcone synthtase). Le cycle C se forme par cyclisation de la chalcone, raction catalyse par la chalconeisomrase qui induit une fermeture strospcifique du cycle conduisant une seule 2(S)-flavanone : la naringnine. Ce cycle shydrate ensuite pour former les diffrentes classes de flavonodes [Heller et Forkmann, 1993].
43
Mtabolisme du glucose shikimate Actyl-CoA phnylalanine
OH O 3x CoA 3 malonyl-CoA OH CoA O p-coumaroyl-CoA HO O p-coumarate O
OH
HO O cinnamate
OH HO OH HO O
OH
(2S)
Les ractions ultrieures aboutissent aux principales classes de flavonodes
OH
OH
4,2',4',6'-ttrahydroxychalcone
naringnine
Figure II 29. Schma de la biosynthse des flavonodes illustrant les voies de lactyle CoA et de la phnylalanine daprs Heller et Forkmann [Heller et Forkmann, 1993].
Classes de flavonodes. Les diverses classes de flavonodes diffrent en fonction de la cyclisation et du degr dinsaturation et doxydation du cycle C alors que les composs individuels au sein dune classe diffrent par la substitution des cycles A et B. Parmi les nombreuses classes de flavonodes prsentes figure II 30, nous citerons les principales : anthocyanes, flavanols, flavones, flavanones, isoflavones et proanthocyanidols [Harborne, 1988]. Les flavonodes sont souvent hydroxyls en positions 3, 5, 7, 3, 4 et/ou 5. Un ou plusieurs de ces groupes hydroxyles sont frquemment mthyls, actyls, prnyls ou sulfats. Dans les plantes, les flavonodes sont souvent prsents sous forme C- ou O-glycosyls ; les formes libres, sans sucres attachs, sont appeles gnines. Les O-glycosides, de loin les plus frquents, portent leurs substituants sur les groupements hydroxyles de la gnine, alors que pour les C-glycosides, la liaison se fait directement avec un carbone de la gnine, les C-6 et/ou C-8. En effet, la formation de la (ou des) liaison(s) htrosidique(s) est sous la dpendance de transfrases trs spcifiques quant au substrat et la position dosylation [Bruneton, 1999].
44
O H OH O
anthocyane
catchine
flavanone
OH
OH O O O
flavonol
O
flavone
chalcone
O O H O O H OH
isoflavone
dihydroflavonol
flavane
aurone
Figure II 30. Les diverses classes de flavonodes daprs Bruneton [Bruneton, 1999].
Plus de 80 sucres diffrents ont t trouvs lis aux flavonodes des plantes. Parmi eux, le D-glucose est de loin le monosaccharide le plus courant, dautres hexoses, le D-galactose et le D-mannose, ainsi que des pentoses, le D-xylose, le L-arabinose et le D-apiose sont frquents avec le L-rhamnose (seul dsoxyhexose) et des acides uroniques (le plus souvent lacide D-glucuronique). On trouve galement des disaccharides (une quarantaine dont les plus courants : le rutinose et le nohespridose), des trisaccharides (environ 30 espces) et quelques rares ttrasaccharides. Les sucres peuvent leur tour tre substitus par des groupements acyles tels que le malonate ou lactate [Hollman et Arts, 2000]. Distribution dans les plantes et le rgne vgtal. A de rares exceptions prs2, seules les plantes ont la capacit de biosynthtiser des flavonodes. Les flavonodes peuvent tre prsents dans toutes les parties des plantes. Dans la majorit des cas, les flavonodes sont prsents sous forme glycosyle dans les plantes car la glycosylation a pour effet de les rendre moins ractifs et plus hydrosolubles permettant alors leur stockage dans les vacuoles des cellules pidermiques des fleurs, de lpiderme et du msophylle des feuilles, des parenchymes des tiges et racines [Bruneton, 1999]. Les gnines seules sont prsentes dans les exsudats farineux de certaines plantes, dans les cuticules des feuilles, corces et bourgeons ou sous forme de cristaux dans les cellules de certaines Cactaceae et plantes de rgions arides [Iwashina, 2000]. Il est noter que flavanones et flavones sont souvent
2
Quelques flavonodes ont t isols dun corail marin et dun petit nombre de champignons [Iwashina, 2000].
45
prsentes dans la mme plante. Flavones et flavonols ne se trouvent gnralement pas ensemble, pas plus que flavanols et anthocyanes [Merken et Beecher, 2000]. La prsence de composs flavonodiques a t rapporte chez les Bryophytes, les Ptridophytes, les Gymnospermes et chez les Angiospermes [Markham, 1988]. Cette distribution quasi ubiquitaire dans les plantes, allie leur relative stabilit, leur relative facilit didentification et la forte tendance des plantes taxonomiquement proches produire les mmes types de flavonodes, ont fait des flavonodes des marqueurs chimiotaxonomiques de choix pour la classification vgtale [Cooper-Driver et Bhattacharya, 1998 ; Grayer et al., 1999]. Rle dans les plantes. Les flavonodes sont les pigments colors des fleurs. Par exemple, les couleurs orange, rouges et bleues des lgumes, fruits, fleurs et tissus de stockage des plantes sont dues des anthocyanes hydrosolubles (qui sont des flavonodes jaunes rduits). De ce fait, ils jouent un rle important dans les interactions avec les insectes (attraction et rle dans la pollinisation entomophile et la dispersion des graines). Ils sont impliqus dans les interactions plantes-microorganismes : dans les pathogenses comme dans les symbioses (nodules des lgumineuses). Ils agissent dans les systmes de dfense des cellules vgtales en rponses certains stress tels que les radiations ultraviolettes. Ce sont galement des inhibiteurs denzymes, des agents chlatants des mtaux nocifs aux plantes. De plus ils sont impliqus dans la photosensibilisation et les transferts dnergie, la morphogense et la dtermination sexuelle, la photosynthse et la rgulation des hormones de croissance des plantes [Di Carlo et al., 1999 ; Pietta, 2000]. Importance dans lalimentation. La contribution au rgime alimentaire humain des flavonodes est trs importante : de 50 800 mg/jour en fonction de la consommation de fruits et lgumes mais aussi de boissons comme le th ou le vin rouge (environ 200 mg par verre ou tasse) [Pietta, 2000]. On trouve galement des flavonodes dans de nombreuses plantes mdicinales et des prparations base de plantes contenant de flavonodes sont utilises en mdecine traditionnelle partout dans le monde [Hollman et Arts, 2000]. Proprits chimiques et activits biologiques. La proprit fondamentale des flavonodes est leur caractre antioxydant. A ce titre, ils agissent plusieurs niveaux : Inhibition denzymes ou chlation des lments traces impliqus dans la formation de radicaux : suppression de la formation de drivs ractifs de loxygne (ROS) [Pietta, 2000]. Les flavonodes inhibent la xanthine oxydase, source biologique importante du radical superoxyde (O2 ). Ils sont galement connus pour inhiber dautres enzymes impliques dans la
46
gnration de ROS telles que les cyclooxygnases, les lipooxygnases, ou les monooxygnases microsomiales [Pietta, 2000]. Le radical superoxyde ragit avec le peroxyde dhydrogne (en prsence de fer) pour donner par dismutation, des radicaux hydroxyles encore plus toxiques (OH). Cest cette raction, appele raction de Fenton, catalyse par le fer, qui est inhibe par certains flavonodes (tels que la querctine) par une action de chlation du fer [Cuyckens et Claeys, 2004].
Pigeage de radicaux En raison de leur faible potentiel redox, les flavonodes peuvent rduire les radicaux libres trs oxyds comme les superoxydes, les radicaux peroxydes ou les radicaux hydoxyles par transfert dhydrogne [Pietta, 2000]. Loxyde nitrique qui forme, en se combinant avec le radical superoxyde, le trs dltre peroxynitrite est galement pig par les flavonodes. Le radical flavonode ainsi form est stable et interrompt les vnements de dgradation cellulaire initis par lattaque radicalaire [Hollman et Katan, 1997].
Les radicaux seraient responsables daltrations des acides nucliques et des processus daltrations dinitiations et de cancrisation ainsi que de dgradations cellulaires lies leur ractivit avec les phospholipides membranaires (phnomnes de proxydation). Ces dommages oxydatifs peuvent tre impliqus dans de nombreuses affections : cancers, inflammations chroniques, athrosclroses Ainsi, leur proprit de pigeurs de radicaux implique les flavonodes dans la prvention des dommages oxydatifs causs par les ROS sur les molcules cellulaires. De nombreuses tudes in vitro ont montr des activits des flavonodes contre les processus inflammatoires et, de ce fait, contre les maladies inflammatoires chroniques et larthrose. En empchant les ROS daltrer lADN, les flavonodes limitent les mutations et les processus de carcinogenses [Merken et Beecher, 2000]. De ce fait, ils sembleraient galement intervenir dans la prvention de cancers, dmences, athrosclrose, hypertension et maladies cardio-vasculaires. Outre leur pouvoir antioxydant, certaines classes possdent des potentialits oestrogniques (isoflavones) et, plus gnralement, les flavonodes sont utiliss pour toute une gamme dactivits pharmacologiques : pour prserver lintgrit vasculaire, pour leurs proprits immunomodulatrices, anti-hpatotoxiques, anti-ostoporotiques, pour leur actions antimicrobiennes et contre les allergies [Sannomiya et al., 2005 ; de Rijke et al., 2006] ; les flavonodes sont aussi connus pour leur action sur le tractus gastro-intestinal en tant quagents antiulcreux, antispasmodiques, anti-scrteurs et antidiarrhiques [Di Carlo et al., 1999]. Des articles de synthse concernant leur mcanisme daction (la relation structure-activit lie la fonction antioxydante, notamment, a t tablie [Pietta, 2000]) et leurs utilisations thrapeutiques potentielles ont t publies ces dernires annes [Di Carlo et al., 1999 ; Hollman, 2001]. De
47
nombreuses preuves ont t apportes sur limportance des effets in vitro des flavonodes sur diffrents modles biologiques et, en particulier, enzymatiques [Hollman et Katan, 1997]. Cependant, le potentiel thrapeutique des flavonodes nest pas encore tabli cause de la connaissance limite de leur absorption chez lhomme [Hollman et Katan, 1997]. La biodisponibilit des flavonodes tant en gnral assez faible chez lhomme [Bruneton, 1999], il est ncessaire dtre prudent quant lextrapolation des donnes in vitro. A lheure actuelle, le lien entre consommation de flavonodes et prvention de cancer est encore faible. Aucune tude pidmiologique na encore apport la preuve que ce sont les flavonodes contenus dans les fruits, les lgumes et les boissons comme le th ou le vin rouge qui sont responsables de leffet protecteur de ces aliments. A linverse, plusieurs tudes ont dmontr que la consommation daliments riches en flavonodes est inversement corrle au risque de dvelopper des maladies cardio-vasculaires [Pietta, 2000 ; Hollman, 2001]. En raison de leur abondance dans les plantes consommes par lhomme et de leurs bnfices potentiels pour la sant humaine, les flavonodes sont lobjet dune attention croissance. Que ce soit pour ltude des relations structure-activit, le contrle de la qualit alimentaire ou le suivi de labsorption et de la mtabolisation de ces composs phnoliques naturels, il est ncessaire de disposer dune mthode rapide et fiable danalyse et didentification de ces molcules dans les plantes et les systmes biologiques. Parmi les mthodes envisageables, nous avons choisi de prsenter la spectromtrie de masse.
48
4.2. Analyse structurale des flavonodes par spectromtrie de masse

La spectromtrie de masse est une mthode physico-chimique applique la dtermination structurale des composs organiques. Elle permet daccder la masse molculaire dune substance et apporte des informations structurales par le biais de ltude des fragments molculaires engendrs [de Hoffmann et al., 1999]. Parmi les mthodes analytiques, la spectromtrie de masse (MS) occupe une place privilgie grce ses caractristiques : mthode hautement sensible (dtection de composs ltat de traces en quantit infrieure au milligramme), spcifique, applicable des mlanges complexes, combinable de nombreuses techniques chromatographiques et possdant un grande varit dapplications (analyses chimiques qualitatives et quantitatives, interaction entre molcules, biomdecine, entre autres) [Prasain et al., 2004]. Comme nous lavons voqu dans le paragraphe 4.1, limportance biologique des flavonodes justifie lattention considrable qui leur est porte et ainsi, leur sparation, leur identification et leur quantification dans divers milieux reprsentent un vritable enjeu. Lapplication des avances de la spectromtrie de masse de ces dix dernires annes aux flavonodes a fait faire un gigantesque bond en avant ltude de ces composs [Stobiecki, 2000]. Nous allons ici faire rapidement un point des techniques utilises avant de nous pencher sur les lments didentification que procure cette technique. Note. Dans cette partie, nous nous intresserons essentiellement aux flavonodes O-glycosyls de types flavone, flavonol ou flavanone, ces classes tant les plus frquemment rencontrs et notamment dans le cadre de nos travaux personnels.
4.2.1. Les diffrentes techniques dionisation en spectromtrie de masse

Limpact lectronique (EI) et lionisation chimique (CI) ont apport par le pass de nombreuses informations structurales mais ncessitaient des isolements pralables des substances tudier et souvent des drivations post-isolement car les flavonodes sont gnralement non-volatils [Ma et al., 1997]. La dsorption de champ (FD) a ensuite permis ltude des flavonodes sans drivation mais posait des problmes relatifs la prparation des chantillons qui restreignaient lapplication. Dautres techniques telles que lionisation par bombardement datomes rapides (FAB) et lionisation chimique directe (DCI) ont galement t appliques aux flavonodes [Stobiecki, 2000]. Ces dernires annes, lanalyse par spectromtrie de masse des flavonodes sest accrue avec le dveloppement de techniques dionisation dites douces : lelectrospray (ESI) et lionisation chimique pression atmosphrique (APCI) qui ont en outre permis lanalyse de trs faibles quantits
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dchantillons bruts. LESI et lAPCI sont des techniques qui gnrent principalement des ions molculaires pour des mtabolites relativement petits tels que les flavonodes [Wolfender et al., 2000]. Pour de nombreux auteurs, ce sont les techniques les plus adquates pour ltude des flavonodes [de Rijke et al., 2003 ; Prasain et al., 2004].
4.2.2. Le couplage chromatographie-spectromtrie de masse

Ce sont surtout les possibilits de couplage avec des techniques chromatographiques qui ont fait le succs de lanalyse par MS des flavonodes [Stobiecki, 2000]. La chromatographie en phase gazeuse (GC) couple la spectromtrie de masse (GC-MS) est trs peu utilise pour lanalyse des flavonodes car les flavonodes glycosyls sont trs peu volatils. Avec le dveloppement des sources dionisation pression atmosphrique (APCI, ESI), le couplage de la chromatographie liquide et de la spectromtrie de masse (LC-MS) est devenu la technique la plus efficace et de ce fait la plus utilise pour lanalyse des flavonodes dans des mlanges complexes (facilit de mise en uvre et disponibilit dappareils de routine performants et abordables). Les techniques de couplage sont plbiscites car ne ncessitant pas dtapes de purification pralable des composs, elles reprsentent un gain de temps important surtout lorsque les quantits dchantillons disponibles sont faibles [Cuyckens et Claeys, 2004]. Il existe de nombreux exemples de lapplication de cette technique pour lanalyse de mlanges de produits naturels complexes et, en particulier, de mlanges de flavonodes [Exarchou et al., 2005 ; Lee et al., 2005 ; Sannomiya et al., 2005 ; Shahat et al., 2005 ; Colombo et al., 2006] Le couplage LC-MS fournit, en fonction du type de technique de masse employe, divers lments relatifs la masse molculaire de chaque constituant dun mlange mais galement des informations dcoulant du comportement en LC (temps de rtention en fonction du type de colonne), de labsorbance UV et permet des comparaisons avec des standards ou des donnes pralablement acquises. Cest la technique de choix pour caractriser rapidement sans sparation chimique les lments dun mlange de composs naturels pour savoir sils sont, ou non, dj connus et sils mritent les ressources requises pour leur isolement et leur dtermination structurale (tape connue sous le terme anglais de dereplication) [Constant et al., 1997 ; Prasain et al., 2004]. Les informations apportes par la fragmentation sont primordiales pour une identification partielle ou une dereplication dun mlange complexe [Wolfender et al., 2000 ; Cuyckens et Claeys, 2004]. Pour lidentification de composs inconnus, la LC-MS dtection UV permet une identification rapide de la classe de flavonodes et est applique pralablement une grande varit de LC-MS/MS ou LCMSn. Ces techniques sont aussi employes pour lanalyse quantitative [Careri et al., 1999 ; Merken et Beecher, 2000].
4.2.3. Elments didentification des flavonodes par spectromtrie de masse
50
Linterprtation de la fragmentation des flavonodes par spectromtrie de masse permet daccder de nombreux lments utiles pour leur dtermination structurale, cela permet notamment dtablir la distribution des fragments gnrs entre les cycles A et B de la gnine. Ltude minutieuse des schmas de fragmentation peut aussi aider dterminer la nature, lenchanement et le site dattache des oses ports par la gnine. Nomenclature. Dans ce chapitre, pour dcrire les fragments de flavonodes obtenus par spectromtrie de masse, on utilisera le systme de nomenclature propos par Ma et al., dsormais communment utilis [Ma et al., 1997]. Pour les gnines, les notations i,jA et i,jB sont utilises pour dsigner les ions primaires produits contenant les cycles, respectivement A et B, intacts (i et j dsignant les liaisons qui ont t scindes). Dans le cas des flavonodes O-glycosyls, on utilisera la nomenclature de Domon et Costello reprise par Cuyckens et Claeys : Y0 dsigne lion de la gnine et Yn, lion de la gnine portant n monoglycosides (voir figure II 31). Dans certains cas, la position du clivage osidique sera indique par un chiffre en exposant, par exemple Y70 lion rsultant du clivage dun sucre fix en position 7 sur la gnine [Cuyckens et Claeys, 2004].
Y1
CH2OH O OH OH OH OH OH A C O Z1 CH2OH O O
Y0
Z0
1,3
B
B
OH
0 O 1 2 3
O
4
OH
B1
B2
1,3
Figure II 31. Nomenclature simplifie utilise pour dsigner les fragments flavonodes daprs Ma et al. et Domon et Costello [Ma et al., 1997 ; Cuyckens et Claeys, 2004].
4.2.3.1. Etude des gnines de flavonodes par MS Une approche dtaille de la caractrisation de la partie gnine dun flavonode consiste faire subir une fragmentation MS/MS lion molculaire de la molcule3 (fragmentation par dissociation induite par collision ou CID) puis de slectionner lion Y0 (Y0+ ou Y0-) de la gnine pour, nouveau, lui faire subir une fragmentation par CID (MS/MS/MS ou MS3) [Wolfender et al., 2000]. Cependant, il arrive frquemment suivant le type de spectromtre utilis, que la fragmentation dans la source produise lion de la gnine (Y0+ ou Y0-) utilisable pour la CID. Cest cet ion qui subit alors la MS/MS produisant de ce fait une pseudo MS3 . En spectromtrie de masse, pour lidentification de la gnine, les fragments de Y0 les plus porteurs dinformations sont ceux rsultant dun clivage C-C sur le cycle C. La formation de ces ions peut
Le pic de m/z le plus important nest pas forcment lion molculaire (respectivement [M+H]+ ou [M-H] en mode positif ou ngatif), car des adduits (Na+, K+) (en mode positif) ou des complexes molculaires ([2M+H]+ ou [2M-H] ) peuvent tre gnrs.
51
3
sexpliquer par des ractions de type rtro Diels-Alder (RDA). Cela donne alors le nombre et le type de substituants ports par les cycles A et B [Cuyckens et Claeys, 2004]. Fragmentation de la gnine en mode positif. En mode positif, les fragmentations les plus utiles en terme didentification de la gnine sont celles qui ont lieu entre les liaisons C-C 1 et 3, 0 et 2 ou 0 et 4 sur le cycle C (figures II 31 et II 32), aboutissant la formation des ions informateurs/diagnostiques
i,j
A+ et i,jB+ [Ma et al., 1997]. La fragmentation dpend de la classe de flavonodes tudie et la valeur
m/z des ions i,jA+ et i,jB+ indique clairement les substitutions respectives des cycles A et B [Wolfender et al., 2000]. Ma et al. ont tudi les voies de fragmentation en mode positif des gnines de flavones et flavonols (en ionisation FAB sur un spectromtre triple quadriple (TQ), nergie CID : 30 eV) et ont permis de mettre en vidence les fragments caractristiques de ces deux classes de flavonodes en interprtant les valeurs m/z de ces fragments [Ma et al., 1997] (figure II 32). Lion 1,3A+, observ pour tous les groupes de flavonodes est le fragment le plus abondant. Dans le cas le plus frquent o les positions 5 et 7 sont hydroxyles (mettre des exemples),
1,3
A+ a une valeur de
m/z 153 ou, en absence de ctone en position 4, c'est--dire pour les flavanes ou les flavanols, m/z 139. [Wolfender et al., 2000]. Il existe des ions diagnostiques de certaines classes de flavonodes (figure II 32). Typiquement, la fragmentation caractristique en mode positif dune flavone est le rsultat de trois voies de fragmentation qui coexistent, dont deux correspondant des ractions de rtro Diels-Alder. Elles produisent les ions 1,3A+, 1,3B+, 0,2B+, 0,4B+ et (0,4B+-H2O). Compars aux flavones, les spectres CID des flavonols en mode positif sont beaucoup plus complexes car la prsence dun groupement OH en position 3 offre plus de possibilits de fragmentations [Ma et al., 1997]. On observe alors les ions
1,3
A+, 0,2A+, 0,2A+-CO, 1,4A++2H et 1,3B+-2H [Ma et al., 1997 ; Wolfender et al., 2000]. Tous ces ions
caractristiques, ainsi que ceux des flavanones, sont illustrs figure II 32.
52

Flavones
1,3 +
R OH
Flavanones
1,3A+
R
HO
0 O 1 2 4 OH O 3
HO
0,2 +
B B 0,4 + B
1,3 +
1,3
OH
1,3B+ -CO 1,4 +
-H2O
0,4 +
0,4 +
B -H2O
0,4
1,4 +
1,3
B -2H
A
+
B -2H-CO
1,4
Flavones
0,2
B -H2O 145 161
Flavanones
1,4
B -2H-CO 119
B -2H 147
Apignine H 153 Lutoline OH 153
121 137
163 179
Naringnine OH 153
Flavonols
1,3 +
1,4 +
A +2H
R1 OH
0,2 +
A -CO
-CO 0,2 +
HO
O R2
0,2 +
OH OH O
1,3 +
B -2H
Flavonols Kaempfrol Querctine Myrictine
R1
R2
1,3
0,2
A - CO 137 137 137
1,3
B - 2H 133 149 165
0,2
H H OH H OH OH
153 153 153
121 137 153
Figure II 32. Voies de fragmentations caractristiques en mode positif des flavones, flavonols et flavanones (obtenues sur spectromtre Q-TOF avec source dionisation APCI ou trappe dion (IT) avec source ESI, nergie CID : 20-40 eV) daprs Wolfender et al [Wolfender et al., 2000].
Ltude de ces ions fragments permet de faire la distinction entre deux gnines isomres appartenant des classes diffrentes. A titre dexemple, la figure II 33 prsente les spectres MS/MS de la lutoline (gnine flavone) et du kaempfrol (gnine flavonol) donnant tous les deux un ion quasi-molculaire m/z 287.
(a)
(b)
Figure II 33. Spectre MS/MS de la lutoline (a) et du kaempfrol (b) obtenus par ESI en mode positif (analyseur TQ quip dune source dionisation FAB, CID de basse nergie).
53
En plus de la valeur m/z des fragments, leur intensit relative peut apporter des informations. Par exemple, il a t clairement dmontr par Ma et al. que lnergie de collision employe pour la fragmentation joue directement sur les abondances relatives des ions
1,3
A+ ,
0,2
A+ et
0,2
B+ [Ma et al.,
1997]. En ESI ou APCI, une nergie de collision basse de 30 eV est optimale pour obtenir un maximum de fragments dintensits exploitables [Cuyckens et Claeys, 2004]. Fragmentation de la gnine en mode ngatif [Fabre et al., 2001 ; Wu et al., 2004]. Le mode ngatif est trs utilis dans lanalyse par MS des flavonodes car il est plus sensible que le mode positif et produit un schma de fragmentation lgrement diffrent apportant des informations nouvelles et complmentaires[Cuyckens et Claeys, 2004]. Comme en mode positif, les fragmentations qui ont lieu sur le cycle C et les ractions de RDA produisant les ions i,jA et i,jB donnent des informations sur le nombre et le type de substituants des cycles A et B. Les fragmentations caractristiques de nombreux exemples de flavones, flavanones et flavonols ont t tudies en dtail par Fabre et al. [Fabre et al., 2001] et sont prsentes figure II 34.
Fragmentation de la querctine (flavonol)
54

Fragmentation de la lutoline (flavone)
Figure II 34. Fragmentations proposes par Fabre et al. pour lanion quasi-molculaire flavone (ici lutoline) et lanion quasi-molculaire flavonol (ici querctine) illustrant les voies de fragmentations caractristiques et les rtro Diels-Alder (RDA) (source ESI, analyseur trappe dions (IT), basse nergie de dissociation) [Fabre et al., 2001].
Cette tude a permis de dgager des caractristiques gnrales ; en mode ngatif, le fragment principal est lion 1,3A sauf pour les isoflavones o lion majoritaire et caractristique est lion 0,3B [Hughes et al., 2001]. Il a t dmontr par Fabre et al. que les flavones montrent des pertes de neutres caractristiques CO (-28 u) et CO2 (-44 u) qui sont dues une contraction caractristique du cycle C. La perte dH2O, [M-H-H20], indique la prsence de 2 groupements OH, en ortho lun de lautre, sur lun des cycle A ou B [Wu et al., 2004]. Le degr dhydroxylation du cycle B a un impact sur la fragmentation. Par exemple, pour des flavonols contenant au moins deux groupements OH sur le cycle B, (querctine, myrictine, fistine), les ions [1,2A-H] et [1,2B+H] sont observables alors que dans les cas dun cycle B non substitu, lnergie requise pour aboutir une fragmentation est beaucoup plus importante et de trop nombreux ions se forment alors [Cuyckens et al., 2000 ; Fabre et al., 2001]. Le tableau II 6 recense les fragments observs en mode ngatif pour quelques composs de type flavones, flavonols et flavanones.
55
Tableau II 6. Exemples dions fragments observs pour des flavones, flavonols et flavanones daprs de Rijke et al, CID : 25-30 eV. [de Rijke et al., 2006].
Composs Flavones flavone 7-hydroxyflavone 4-hydroxyflavone 6,4-dihydroxy-flavone genkwanine apignine chrysine acactine lutoline Flavonols galangine kaempfrol kampfride querctine morine rhamntine isorhamntine fistine Flavanones naringnine hespertine riodictyol isosakuramtine Substituants - OH - OCH3 [M H] 221 237 237 253 283 269 253 283 285
0,3
Ions fragments A
0,3
0,4
1,2
1,2
1,3
1,3
1,4
1,4
[M H15] 268 268
7 4 6,4 4 5,7,4 5,7 5,7 5,7,3,4
134
107 107 107
151 151 151 151 151
117 117 117 101 133 133
149
5,7 5,7,4 5,7 5,7,3,4 5,7,2,4 5,3,4, 5,7,4 7,3,4
269 4 299 301 301 315 315 285
7 3
135
107 107 107 121 107
179 163
121 121
151 151 151 151 165 151
132
161
284 300 300
5, 7, 4 5,7,3 5,7,3,4 5,7
4 4
271 301 287 285
107 107 107
151 151 151 151
119 135
125 125
286 270
En mode ngatif, il arrive que le spectre du premier ordre produise toutes les informations ncessaires sans avoir procder de la MS/MS (figure II 35) car la tension de la source induit dj une fragmentation de la gnine [Cuyckens et Claeys, 2004].
Figure II 35. Fragmentation de la gnine sur le spectre de premier ordre dun flavonol (querctine-3-Orhamnoside) mesur en ESI en mode ngatif (basse nergie de fragmentation).
Flavonodes mthoxyls et autres substituants. Dans les deux modes (positif et ngatif), en plus de lapparition dions dus la fragmentation caractristique des classes de gnines, la perte de petites molcules neutres comme CO (-28 u), CO2 (-44 u) ou C2H2O (-42 u) et la perte successive de ces fragments, par exemple -H2O-CO (-46 u) est communment observe. Ces pertes de neutres et/ou de radicaux sont utiles pour identifier la prsence de groupes fonctionnels spcifiques [Cuyckens et Claeys, 2004].
56
La fragmentation dun flavonode mthoxyl par exemple, entrane la formation dun ion radicalaire caractristique [M+H-CH3] (perte de 15 units) qui constitue le pic de base [Hvattum et Ekeberg, 2003]. Justesen et al. ont montr que dans le cas des flavonodes monomthoxyls, les fragments [M+H-28] et [M+H-29] sont galement caractristiques alors que [M+H-CH3], [M+H-30] et [M+H-28-30] sont prdominants dans le cas de flavonodes polymthoxyls [Justesen, 2001]. Ils ont galement mis en vidence quil est possible, en mode ngatif, en comparant la fragmentation des flavonodes mthoxyls avec celle de tmoins mthoxyls de mme masse, de dduire la position du groupement mthyle. 4.2.3.2. Apports de la MS ltude des flavonodes O-glycosyls Les mthodes de spectromtrie de masse permettent, dans de nombreux cas, en plus de lidentification de la gnine, de dduire la position de la ou des glycosylations, le type de liaison interglycosidique et/ou la nature du sucre terminal. Clivage htrolytique : formation des ions Yn. La fragmentation par spectromtrie de masse des flavonodes O-glycosyls produit un clivage de la liaison osidique avec rarrangement de protons (voir figure II 37). Il y a alors production de lion fragment Y0+ ou Y0- (fragment correspondant la gnine) et limination dun rsidu monosaccharidique qui sillustre par la perte de 162 u pour un hexose, 146 u pour un rhamnose, 132 u pour un pentose et 176 u pour un acide glucuronique permettant ainsi de dterminer la nature des sucres. [Wolfender et al., 1992 ; Cuyckens et Claeys, 2004]. Clivage homolytique : formation du radical Y0. En fonction de sa structure, un flavonode Oglycosyl peut subir, en plus du clivage htrolytique donnant lion Y0, un clivage homolytique de la liaison osidique produisant lion radical de la gnine not Y0. La figure II 36 illustre leffet de lnergie de collision (CE) sur labondance relative de Y0.
Figure II 36. Influence de lnergie de collision (CE) sur lintensit du radical Y0 en ESI en mode ngatif, illustr sur un flavonol glycosyl gnine querctine (Y0 m/z 300 et Y0- m/z 301) (analyseur triple quadriple).
57
La production par CID en mode positif de cet ion radicalaire a t tudie par Hvattum et Ekeberg. Les auteurs ont dmontr que ltude de labondance relative de ce radical par rapport lion de la gnine apportait des informations sur celle-ci. Pour les flavonols 3-O-glycosyls, le rapport Y0/Y0+ augmente avec le nombre de groupements hydroxyles ports par le cycle B alors que cest linverse qui se produit pour les flavones 7-O-glycosyles [Hvattum et Ekeberg, 2003]. Ce radical nest en outre pas observ dans le cas de flavonodes mthoxyls ni pour les flavanones ou les dihydrochalcones indiquant quune double liaison entre les positions 2 et 3 de la gnine adjacente au carbonyle C-4 est requise pour la formation dune radical gnine stable [Cuyckens et Claeys, 2004]. Il est noter que Hvattum et Ekeberg voient un lien entre la capacit dun flavonol O-glycoside produire en MS un ion radicalaire et lactivit antioxydante de ce compos. La capacit des flavonols O-glycosyls fournir un radical gnine serait similaire la capacit antioxydante des flavonodes (donneur dlectron). La fragmentation dun flavonode glycosyl [M-H] gnre un radical anion alors que lactivit antioxydante gnre un produit radicalaire neutre [Hvattum et Ekeberg, 2003 ; Hvattum et al., 2004].
Clivage homolytique
OH O O HO HO
OH O O O HO + O H HO OH OH O HO HO O O OH HO HO
OH + O OH O O O
Y0 (m/z 270)
OH
OH
OH
III
Mcanisme de formation de Y*
OH O I O O III II O
- 162 u
OH
OH HO HO OH OH OH + O H
HO HO
HO HO
OH
Y* (m/z 417)
OH
[M+H]+ (m/z 579)
I
OH O HO HO OH O O OH
II
OH HO O
Y1 (m/z 433)
OH
OH
Clivage htrolytique
OH
OH
Y0 (m/z 271)
Figure II 37. Synthse des mcanismes de formation des ions Y0+, Y1+, Y0 et Y* lors de la fragmentation dun flavonode, illustr ici en mode positif sur lapignine-7-O-nohespridoside (source ESI, analyseur TQ, basse nergie de fragmentation).
Position de la liaison osidique sur la gnine. Plusieurs sites de glycosylation sont possibles pour les flavonodes O-glycosyls rendant la dtermination de cette localisation dlicate. La majorit des substituants osidiques se situent au niveau des positions 3, 7 ou 4. La substitution du groupement
58
5 est trs rare dans la mesure o ce groupe prsente une faible ractivit pour la glycosylation car il participe la formation dune liaison H intramolculaire avec le groupement carbonyle 4. En mode ngatif, la position de la glycosylation peut tre dduite de labondance relative du radical gnine Y0 par rapport Y0 sur le spectre de dissociation de la gnine. Ce radical est trs abondant quand la liaison osidique se situe en position 3 [Hvattum et Ekeberg, 2003]. Cependant, les travaux de Cuyckens et Claeys ont montr que le ratio Y0/Y0 ne peut que suggrer une certaine position pour le sucre ou aider en cas de comparaison avec des tmoins [Cuyckens et Claeys, 2005] . La fragmentation du radical peut aussi apporter des informations, puisque en fonction du site de glycosylation, le radical est localis des endroits diffrents de la molcule. La fragmentation du radical gnine requiert une forte nergie de dissociation. Cette fragmentation prsente des diffrences avec la fragmentation de lion gnine : les ions m,nB produits sont plus abondants dans le cas dune 7 O-glycosylation alors que pour les 4O-glycosylations, les ions m,nA sont relativement plus abondants [Cuyckens et Claeys, 2005]. Ces deux techniques (ratio Y0/Y0 et fragmentation de Y0) ne peuvent tre appliques quen comparaison avec des tmoins connus. Elles sont insuffisantes dans le cas dun spectre flavonode Oglycosyl inconnu seul [Cuyckens et Claeys, 2005]. En mode positif, Cuyckens et Claeys se sont penchs sur la fragmentation en haute nergie de lion adduit [M+Na]+. Les adduits sodium peuvent tre trs communs et trs abondants quand la solution tudie a t stocke dans des rcipients en verre mais leur prsence dpend galement de la source dionisation employe et de la gomtrie de cette source. En fait, la fragmentation de cet ion adduit permet de localiser de faon certaine la position du groupement osidique. En effet, la prsence dun ion du cycle B contenant le rsidu osidique indique une liaison osidique en position 4 alors que la perte du cycle B de la gnine est caractristique dune liaison en position 3 ; la perte du cycle B la fois sur lion prcurseur [M+Na]+ et sur lion de la gnine est le signe dune liaison en position 7 [Cuyckens et Claeys, 2005]. Flavonodes di-O-glycosyls et O-diglycosyls. Plusieurs quipes et en particulier celle de Claeys ont tudi lapplication des mthodes de spectromtrie de masse, notamment MS/MS ltude de la diffrenciation des isomres de flavonodes. Ils ont mis en vidence que cette diffrenciation tait rendue possible par labondance relative de trois ions caractristiques que nous illustrerons dans le cas dune substitution par un rutinose ou un nohespridose (les disaccharides les plus frquents) : Y1, dans notre exemple [M+H- Rha]+, Y0, lion de la gnine [M+H-Rha-Glu]+ et un ion inattendu appel Y* form par la perte dun glucose interne. La formation des trois ions est illustre la figure II 37. La prsence de lion Y* peut induire en erreur quant la squence des sucres. En effet, cet ion a 162 units de masse de diffrence par rapport [M+H]+, ce qui pourrait correspondre la perte dun
59
glucose terminal. De ce fait, Y* pourrait tre lion Y1 dun isomre dont la squence serait Glu-Rha au lieu de Rha-Glu [Ma et al., 2001]. Labondance de lion Y* est dpendante de lnergie de collision (favorise par les faibles nergies), la nature de la gnine et du type de liaison interglycosidique. Ma et al. ont montr que, en ionisation par FAB en mode positif, pour les flavonodes 7-Odiglucosyls, la perte de glucose interne (prsence de lion Y*) est trs prononce pour les gnines de type flavanone alors quil est compltement absent pour les flavones et flavonols. [Ma et al., 2000 ; Cuyckens et al., 2001]. La liaison interglycosidique peut tre dtermine par la valeur du ratio Y0/Y1 : le ratio tait plus grand quand le substituant est un nohespridose (rhamnosyl-(1 2)-glucoside) que quand il sagit dun rutinose (rhamnosyl-(1 6)-glucoside) [Ma et al., 2001]. Dautres tudes sur les substitutions par nohespridose et rutinose sur un appareillage diffrent ont abouti aux mmes conclusions. [Cuyckens et al., 2001].
Les flavonodes 3,7-di-O-glycosides portant deux monosaccharides de masse diffrents peuvent tre diffrencis. Pour les molcules protones (mode positif), le rsidu 3-O-glycoside est plus facilement perdu que le rsidu 7-O-glycoside (Y70+ < Y30+) alors que cest linverse qui est observ pour les molcules dprotones (Y70 > Y30) (mode ngatif) ou les molcules sodes (mode positif) [Shahat et al., 2005]. Ablajan et al. ont dmontr que pour caractriser un flavonode de type flavonol 3,7-di-Oglycoside en mode ngatif, les deux ions [Y30-H] et [Y0-2H] doivent tre prsents dans le spectre MS/MS de [M-H] ([Y0-2H] nest jamais observ dans le cas dun flavonode O-diglycosyl). De plus, labondance de ces deux ions est proportionnelle au nombre de groupements hydroxyles ports par le cycle B [Ablajan et al., 2006].
Certaines quipes, notamment celle de Brodbelt, ont dvelopp dautres mthodes pour diffrencier les isomres de flavonodes di-O-glycosyls et O-diglycosyls. Ces mthodes sont gnralement plus difficiles mettre en uvre et ne sont pas utilises en routine. Une de ces mthodes consiste en laddition dun sel de mtal (Cu2+ ou Co2+) et dun ligand (par exemple le 2,2-bipyridine) pour former des complexes [M(II) (flavonode-H) Ligand]+. Les schmas de fragmentation de ces complexes permettent de distinguer facilement les liaisons (1 2) ou (1 6) des sucres ou de distinguer les 7-O-diglucosyls des autres substitutions [Satterfield et Brodbelt, 2001]. Ces complexations peuvent tre gnres au moyen de drivations post-colonnes et sont compatibles avec lutilisation de la LC-MS [Davis et Brodbelt, 2005].
60
Flavonodes di-, tri-, tetra-glucosyls. En 2004, Ferreres et al. ont montr quil tait possible en ESI de diffrencier les isomres de flavonodes portant deux glucoses (sophoroside : Glu-(1 2)-Glu ou gentiobioside : Glu-(1 6)-Glu, trois glucoses (sophorotrioside : Glu-(1 2)-Glu-(1 2)-Glu ou Xsophoroside-Y-glucoside) et mme quatre glucoses (X-sophorotrioside-Y-glucoside ou Xsophoroside-Y- sophoroside) en se basant sur les abondances relatives des ions Yn et Zn [Ferreres et al., 2004]. Identification du sucre terminal. Comme nous lavons vu prcdemment, la succession de clivages htrolytiques aboutissant la formation des ions Yn permet didentifier la squence des sucres ports par une gnine. Il est thoriquement possible didentifier le sucre terminal dun flavonode glycosyl en spectromtrie de masse. Cependant, le fragment saccharidique est rarement visible sur le spectre CID dun flavonode car la charge reste gnralement associe la gnine. En actylant la molcule de flavonode O-glycoside, lion fragment du sucre peractyl devient facilement dtectable comme lont montr Cuyckens et al. Dans leur tude, ils ont dmontr que dans le cas dun flavonode actyl, il est possible dobtenir, dans des conditions particulires dnergie de collision, une fragmentation stroslective et ainsi de pouvoir diffrencier certains isomres de monosaccharides (par exemple distinguer le glucose, du galactose ou du mannose) [Cuyckens et al., 2002].
4.2.4. Conclusion
Tout au long de ce chapitre, nous avons tent de montrer que la spectromtrie de masse peut apporter une grande contribution lidentification structurale des flavonodes. Cette puissante technique danalyse, hautement sensible et permettant des dterminations structurales sans isolement des composs, est un formidable atout pour dtecter la prsence de mtabolites secondaires dans des extraits vgtaux ( dereplication ). Aujourdhui, de nouveaux dveloppements augmentent son champ dapplication (dtection et quantification de substances dans les liquides biologiques, tude des interactions entre les molcules, tudes des mtabolisations[Franski et al., 2003 ; Davis et al., 2006]). Malgr les avances de la spectromtrie de masse au cours des dernires annes, cette technique nest pas suffisante pour lidentification de nouvelles structures flavonodiques mais est un pralable indispensable aux techniques de RMN mono et bi-dimensionnelles.
61
III. RESULTATS
III. Rsultats
1. Screening chimique gnral prliminaire par CCM

Pour chacune des plantes de cette tude, TTI (Tambourissa trichophylla), ASA (Agauria salicifolia), APY (Agauria polyphylla), et ECC (Embelia concinna), nous disposions de quatre extraits nomms F1 F4. F1 est lextrait thanolique 70 % de la plante et les trois autres fractions sont des extraits liquide/liquide successifs de la fraction aqueuse de F1 par, respectivement, de lhexane (F2) et de lactate dthyle (F3), (F4) tant la fraction aqueuse puise(cf. chapitre V). Des chromatographies sur couche mince (CCM) prliminaires ont t menes sur les fractions F1 F4 des quatre plantes pour avoir un aperu de la nature des constituants que lon peut rencontrer chez ces espces. Pour cela, une partie des extraits Fn ont t solubiliss dans le solvant appropri et dposs sur plaques de CCM qui ont ensuite t lues dans les systmes de solvants dcrits au chapitre V et rvls avec divers ractifs pour permettre une premire orientation sur les classes de composs prsentes dans les chantillons analyser (figure III 1A, 1B, et 1C). Les informations recueillies ont ensuite t confrontes aux donnes bibliographiques collectes sur les familles et les genres de ces plantes (cf. chapitre II).
1.1. Interprtation des CCM prliminaires de Agauria salicifolia (ASA) et Agauria polyphylla (APY)
Le criblage chimique en CCM a permis de mettre en vidence la prsence de flavonodes (ractif de Neu, fluorescence jaune-orange sous lumire UV) dans les fractions polaires de ASA et APY. On peut aussi mettre lhypothse que les composs polaires, qui apparaissent en rouge rvls la vanilline sulfurique, sont des tanins (composs frquents dans les Ericaceae). Pour valider cette hypothse, nous avons utilis un rvlateur propre aux tanins. La coloration en rouge orange obtenue avec le ractif au sel de Bleu solide B de ces composs confirme que ce sont des tanins. Les fractions apolaires semblent contenir des triterpnes (coloration bleue violette par rvlation la vanilline sulfurique (figure III 1A) et fluorescence 366 nm par rvlation avec le ractif de Liebermann et Burchard) et semblent identiques pour les deux espces. Les deux espces semblent avoir des composs en commun et des profils similaires pour certains extraits mais diffrent par la concentration notamment en tanins et flavonodes. On note cependant une diffrence majeure : une molcule polaire majoritaire de ASA F1 et ASA F3 (probablement de structure flavonodique) ne semble pas tre prsente dans les extraits de APY. Lobjectif de ce travail sera disoler les composs majoritaires de APY et certaines molcules de ASA afin de dgager des profils spcifiques pour chaque plante et de pouvoir les distinguer.
63
III. Rsultats
Solvant de migration : Tol / AcOEt / MeOH (80 : 18 : 2)
Rvlation
Ractif la vanilline sulfurique
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
Ractif de Neu (observation 366 nm)
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
Figure III 1A. CCM prliminaires des fractions Fn, dveloppement Tol / AcOEt / MeOH (80 : 18 : 2).
Solvant de migration : HCCl3 / MeOH (90 : 10)
Rvlation
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
Figure III 1B. CCM prliminaires des fractions Fn, dveloppement HCCl3 / MeOH (90 : 10).
64
III. Rsultats
Solvant de migration : AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10)
Rvlation
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
Ractif au thymol sulfurique
F1
F2 F3 TTI
F4
F1
F2 F3 ECC
F4
F1
F2 F3 APY
F4
F1
F2 F3 ASA
F4
Ractif de Dragendorf
F1
F2 F3 TTI
F4
Figure III 1C. CCM prliminaires des fractions Fn, dveloppement AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10).
65
III. Rsultats
1.2. Interprtation des CCM prliminaires de Tambourissa trichophylla (TTI)

Ltude des diffrentes CCM de TTI nous a montr que, linstar des extraits de ASA et APY, TTI semble contenir des tanins (rvls en rouge la vanilline sulfurique) (figure III 1B). Cela a t confirm par la rvlation au ractif au sel de Bleu solide B. Les extraits polaires de TTI (F1 et F3) semblent galement contenir quelques flavonodes assez polaires. Deux dentre eux semblent majoritaires et nous avons choisi de tenter de les isoler. En outre, bien que Tambourissa trichophylla appartienne aux Monimiaceae, famille riche en espces alcalodes, les extraits de TTI ne semblent pas contenir dalcalodes puisquon nobserve pas de raction sur CCM avec le ractif de Dragendorff (ractif dalcalodes).
1.3. Interprtation des CCM prliminaires de Embelia concinna (ECC).

Ltude par CCM des fractions Fn de ECC (figure III 1B) montre la prsence marque de flavonodes dans les fractions F1 et F3 (fluorescence en vert ou jaune-orang avec le ractif de Neu observe sous lumire UV). Les composs apolaires des fractions F1 F3 prsentent des colorations violettes aprs rvlation la vanilline sulfurique lexception dun compos majoritaire qui prsente une teinte rougetre. Nous allons tenter didentifier ce compos apolaire ainsi que de caractriser la composition flavonodique de ECC afin dtablir un profil chimique spcifique.
66
III. Rsultats
2. Etude phytochimique des feuilles de Agauria polyphylla (APY) et de Agauria salicifolia (ASA)
2.1. Agauria polyphylla (APY)
Lespce Agauria polyphylla Baker (Ericaceae) a retenu lattention de Serdex en premier lieu pour ses utilisations traditionnelles Madagascar dans le traitement des rhumatismes et pour soigner les plaies et, en second lieu, en raison du peu de travaux phytochimiques rpertoris sur elle. Lors du criblage dactivits pharmacologiques men par Serdex, lextrait F3, stant avr tre le plus actif, a t slectionn pour tre soumis une investigation phytochimique approfondie.
2.1.1. Travaux prliminaires au fractionnement

Lisolement de molcules de lextrait F3 de Agauria polyphylla sest rvl tre particulirement difficile en raison de la prsence de tanins dans lextrait. Ces composs sont prsents dans toutes les zones de polarit et prsentent une grande gamme de poids molculaires ce qui rend lisolement de molcules pures extrmement dlicate. Par consquent le travail prliminaire ltude des composs de cette plante a consist tester de nombreuses mthodes chromatographiques en association avec divers systmes de solvants afin de mettre au point un systme de fractionnement permettant la sparation des tanins des autres composs de lextrait. Lalternance de chromatographies dadsorption (en phases normale et inverse) et dexclusion permet en partie de remdier ce problme mais de nombreuses phases de purification sont ncessaires rendant le rendement final en compos pur trs faible. Ainsi, seuls deux composs purs ont pu tre isols dAPY F3.
2.1.2. Fractionnement de lextrait APY F3 et isolement des composs A C

Le schma de fractionnement de lextrait APY F3 est prsent sur la figure III 2. La fraction APY F3 a subi un premier fractionnement sur chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex LH20 lue avec un mlange H2O / MeOH parts gales pour donner sept fractions (F3.1 F3.7). Le fractionnement sur gel de Sephadex permet de sparer les molcules dun extrait selon leur poids molculaire. La figure III 3 prsente un exemple de CCM bilan du fractionnement du fractionnement de APY F sur ce support. La fraction F3.1 contient un trs grand nombre de composs prsents en trs faible quantit. Les fractions suivantes contiennent les tanins les plus apolaires. Il peut sagir de monomres ou oligomres de ces composs polymriss. La fraction F3.3 contient majoritairement des flavonodes ainsi que des tanins de polarits intermdiaires. Enfin, les fractions suivantes renferment les tanins de haut poids molculaire c'est--dire de fort degr de polymrisation.
67
III. Rsultats
APY F3 (2 g)
CC Sephadex LH20, lution isocratique MeOH / H2O (50 : 50)
F3.1 ~100 mg
F3.2 171 mg
F3.3 316 mg
F3.4 291 mg
F3.5 155 mg
F3.6 147 mg
F3.7 >800 mg
VAC ELUT cartouche C18, lution 100 % MeOH
CC Sephadex LH20, lution isocratique MeOH / H2O (50 : 50)
F3.2.1 47 mg
F3.2.2 n.p.1
F3.3.1 71 mg
F3.3.2 38 mg
F3.3.3 12 mg
F3.3.4 150 mg
F3.3.5 22 mg
CC silice 70-200 m, lution 100 % AcOEt
Compos B
CC silice 70-200 m, lution HCCl3 / MeOH (gradient 100 :0 50 : 50)
F3.2.1.1 n.p.
F3.2.1.2 6 mg
F3.2.1.3 n.p. F3.3.4.1 17 mg 100 : 0 F3.3.4.2 31 mg 95 : 5 F3.3.4.3 27 mg 90 : 10 F3.3.4.4 8 mg 85 : 15 F3.3.4.5 19 mg 80 : 20
Compos B
Compos A
Figure III 2. Schma de fractionnement de APY F31.
Compos B
Compos A
APY F3
Figure III 3. CCM du suivi de fractionnement dAPY F3 sur gel de Sephadex (lution : AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10) ; rvlation : ractif la vanilline sulfurique).
n.p. = non pes

68
III. Rsultats
La fraction F3.2 a subi un fractionnement sur cartouche de silice greffe C18 lue au MeOH puis un second par chromatographie dadsorption sur colonne de silice qui a permis dobtenir le compos B. Le compos B a galement t obtenu par le fractionnement de la fraction F3.3 par chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex lue avec MeOH / H2O (50 : 50). La fraction F3.3.4 a elle-mme subi un fractionnement par chromatographie dadsorption sur silice, en utilisant un gradient de HCCl3 / MeOH permettant ainsi dobtenir cinq sous-fractions (figure III 2). La sous-fraction F3.3.4.4 contenait un produit majoritaire qui a prcipit en solution (HCCl3 / MeOH 85 : 15) formant de petits flocons jaunes. Ce prcipit a t lav au chloroforme pour donner le compos A.
69
III. Rsultats
2.2. Fractionnement de lextrait APY F2 et isolement du compos C

Pour tudier les composs apolaires de lextrait APY F3, nous avons choisi de travailler sur lextrait APY F2 dans lequel ces composs sont galement prsents mais en plus grande quantit. En outre, labsence de tanins dans APY F2 semblait pouvoir faciliter lisolement de composs.
APY F2 2g
MPLC silice 5-35 m, lution Hex / AcOEt (gradient 90 : 10 100 : 0)
F2.1 42 mg 90 : 10
F2.2 114 mg 80 : 20
F2.3 111 mg 80 : 20
F2.4 84 mg 70 : 30
F2.5 50 mg 40 : 60
F2.6 56 mg 50 : 50
F2.7 102 mg 60 : 40
F2.8 212 mg 30 : 70
F2.9 183 mg 20 : 80
F2.10 n. p. 100 : 0
CC Sephadex LH20, lution 100 % HCCl3
F2.3.1 n. p.
F2.3.2 67 mg
F2.3.3 n. p.
F2.3.4 n. p.
CC Sephadex LH20, lution 100 % HCCl3
F2.3.2.1 traces
F2.3.2.2 60 mg
F2.3.2.3 traces
CC Silice 70-200 m, lution Tol / AcOEt (gradient 1 % AcOEt 20 % AcOEt)
F2.3.2.2.1 traces
F2.3.2.2.2
F2.3.2.2.3
12 mg 2-3 % AE
49 mg 4-10 % AE
F2.3.2.2.4 traces
F2.3.2.2.5 traces
1 % AE
10 % AE
10-20 % AE
CC Silice 70-200 m, lution isocratique Tol / AcOEt (98 : 2)
F2.3.2.2.3.1
F2.3.2.2.3.2
F2.3.2.2.3.3
F2.3.2.2.3.4
n. p.
29 mg
4 mg
> 3 mg
F2.3.2.2.3.5 traces
Compos C
Figure III 4. Schma de fractionnement de APY F2
70
III. Rsultats
Lextrait APY F2 a subi un premier fractionnement par chromatographie en phase inverse (C18) moyenne pression (MPLC) laide dun gradient H2O / MeOH pour donner dix fractions (F2.1 F2.10). La fraction F2.3 a t soumise des fractionnements successifs par chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex lue au HCCl3 puis deux chromatographies sur colonne de silice successives lues avec Tol / AcOEt pour donner le compos C (figure III 4). Le compos C semble tre le constituant majoritaire de APY F2 et semble tre prsent dans ASA F2.
71
III. Rsultats
2.2.1. Dtermination de structure des composs A, B et C de Agauria polyphylla
Note. Les constantes physiques et donnes spectrales des composs isols sont prsents en annexes (chapitre VII). 2.2.1.1. Dtermination de structure du compos A Le compos A se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Le spectre dabsorption UV montre deux maxima 258 et 352 nm, caractristiques des bandes I et II dun flavonol [Mabry et al., 1970]. Spectromtrie de masse. Sur le spectre de masse en electrospray en mode ngatif (ESI), nous observons un ion quasimolculaire m/z 433 [M H] suggrant une masse atomique de 434 u. (figure III 5).
[M-H]
Y0 [Y0-CH2O] Y0 [Y0-H2O-CO] [Y0-CH2O-CO] [Y0-H2O-2CO] - 132 u
Figure III 5. Spectre de masse du compos A (ESI, MeOH)
Comme souvent en mode ngatif, la fragmentation qui a lieu dans la source fournit dautres ions caractristiques. En effet, on observe un ion fragment m/z 301 [M-H-132] ou (Y 0 ) correspondant la perte dun pentose (-132 u) et un ion fragment m/z 300 correspondant [Y 0 -H] (ou Y 0 ). Dautres ions de moindre abondance sont aussi prsents m/z 271 [Y 0 -CH 2 O] , m/z 255 [Y 0 -H 2 OCO] et m/z 243 [Y 0 -CH 2 O-CO] . Nous pouvons en dduire que ce compos prsente une gnine de masse 302 u avec un double liaison entre les positions 3 et 4 (prsence du radical Y0). Par ailleurs, le ratio Y0/ Y0 trs suprieur 1 suggre que le site de glycosylation est sur la position 3 de la gnine [Hvattum et Ekeberg, 2003].
72
III. Rsultats
La fragmentation MS/MS de lion Y0 fait apparatre les ions 1 , 3 A m/z 151 et ion 1 , 2 A m/z 179 caractristiques dun flavonol portant deux groupements hydroxyles sur le cycle A laissant supposer une gnine de type querctine. Ainsi, nous pouvons proposer la formule brute C20H18O11 pour le compos A prsentant une gnine flavonode de type querctine, substitue par un pentose. Spectromtrie de RMN. Les protons du cycle A dun flavonode apparaissent sur un spectre RMN-1H entre 6 et 6.5 ppm [Mabry et al., 1970]. Dans cette zone, sur le spectre de RMN-1H du compos A, (figure III 6), nous observons deux protons aromatiques couplant entre eux avec la mme constante de couplage formant deux doublets H 6.21 et 6.40 ppm (J = 2.0 Hz), typiques dun couplage en meta sur un cycle aromatique. Ces signaux sont caractristiques du cycle A dun flavonode substitu en C-5 et C-7 et peuvent tre attribus aux protons H-6 et H-8 respectivement [Markham, 1982]. Les protons du cycle B dun flavonode sont visibles sur un spectre RMN-1H entre 6.7 et 7.9 ppm [Mabry et al., 1970]. Sur le spectre de RMN-1H de A, nous observons la prsence de trois protons aromatiques H 7.54 ppm (d, J = 2.1 Hz), 7.50 ppm (dd, J = 8.3, J = 2.1 Hz), 6.92 ppm (d, J = 8.3 Hz) dont les constantes de couplages indiquent quils forment un systme ABX sur le cycle B et que celui-ci est 1, 3, 4-trisubsititu. Ces protons sont respectivement attribus H-2, H-6 et H-5.
H-1" H-2' H-5' H-6' H-8 H-6 H-2" H-3" H-4" H-5"a et H-5"b
ppm
7.50
7.00
6.50
6.00
5.50
5.00
4.50
4.00
3.50
Figure III 6. Spectre de RMN-1H du compos A dans MeOD.
Le signal H 5.48 peut correspondre au proton anomrique du glycoside. Cinq autres signaux sont prsents sur le spectre de RMN-1H de A (figure III 6) et correspondent sans doute aux protons de la partie osidique. Le spectre de RMN-13C du compos A prsente vingt signaux distincts dont quinze correspondant aux signaux dun flavonode. Parmi ceux-ci, nous distinguons dix carbones quaternaires dont un groupement carbonyle (C 178.8 ppm) et le carbone 3 caractristique dun flavonol (C 133.7 ppm), et cinq CH aromatiques (figure III 7).
73
III. Rsultats
A ce stade, nous pouvons formellement identifier cette gnine de type flavonol comme tant la querctine (masse 302 u et hydroxylations en positions 5, 7, 3, 4 et 3).
Figure III 7. Spectre de RMN-13C du compos A dans MeOD.
Le spectre de RMN-13C de A prsente cinq signaux de CH et un CH2 dans la rgion des sucres indiquant la prsence dun pentose. Nous pouvons lidentifier comme tant un arabinofuranose grce aux dplacements chimiques C 82.1, 77.5, 86.8 et 61.4 ppm pour, respectivement, les carbones C-2, C-3, C-4 et C-5 [Markham et al., 1978 ; Agrawal, 1992]. Le dplacement caractristique du carbone C-1 (C 108.5 ppm) ainsi que le dplacement chimique du proton H-1 (H 5.48 ppm) et sa faible constante de couplage (J = 1.0 Hz) observs sur le spectre de RMN-1H indiquent un anomrie pour ce sucre. Toutes les valeurs de protons et de carbones ont t attribues daprs lanalyse des spectres de RMN 2D de corrlation homonuclaire COSY et htronuclaires HSQC et HMBC (figure III 8) ainsi quen comparant ces donnes avec celles de la littrature [Servettaz et al., 1984]. Le site de glycosylation de larabinofuranose sur la gnine querctine a t finalement dtermin grce la corrlation entre le proton anomrique du sucre et le carbone en position 3 de la querctine (figure III 8).
74
III. Rsultats
Corrlation H-1 avec C-3
Figure III 8. Spectre HMBC du compos A.
La molcule A est donc identifie comme tant la querctine-3-O--arabinofuranoside ou avicularine, une molcule trs rpandue dans les Ericaceae.
OH
3' 2' 4' 5' 6' 1''' 6 5 10 4 3 4'''
OH
HO
7
8 9
1'
OH
5'''
O
2'''
O HO
3'''
OH
OH
Figure III 9. Structure de la querctine-3-O--arabinofuranoside (compos A).
75
III. Rsultats
2.2.1.2. Dtermination de structure du compos B Le compos B se prsente sous forme dune poudre brun rougetre soluble dans le mthanol et partiellement soluble dans leau. Le spectre UV du compos B prsente deux maxima 226 et 278 nm. Les donnes du spectre IR (cf. chapitre VII) suggrent que, contrairement au compos A, le compos B ne prsente pas de groupement C=O. Spectromtrie de masse. Lanalyse du spectre de masse en electrospray en mode ngatif du compos B (figure III 10) permet dobserver un ion quasi molculaire m/z 289 [M-H] suggrant une masse molaire de 290 u. Lion de faible intensit observ m/z 579 peut correspondre au dimre du compos form dans la source [2M -H] .
[M-H]
[2M-H]
Figure III 10. Spectre de masse ESI du compos B (MeOH).
Spectromtrie de RMN. Le spectre de RMN-1H du compos B (figure III 11) prsente des similitudes avec celui du compos A. En effet, nous retrouvons les signaux des protons aromatiques des cycles A et B dun flavonode substitu en 5, 7, 3 et 4 : H-6 H 5.95 ppm (d, J = 2.3 Hz), H-8 H 5.93 ppm (d, J = 2.3 Hz), H-2 H 6.99 ppm (d, J = 2.0 Hz), H-5 H 6.77 ppm (d, J = 8.2 Hz) et H-6 H 6.81 ppm (ddd, J =8.2 Hz, J = 2.0 Hz, J = 0.6 Hz). Ce dernier proton forme un doublet ddoubl ddoubl de faible constante de couplage (J =0.6 Hz) qui ne se retrouve pas pour un autre proton du cycle aromatique. Nous envisageons la prsence dun groupement CH en position 2 et donc labsence de double liaison entre les positions 2 et 3.
76
III. Rsultats
Sur le spectre de RMN-1H du compos B, nous observons galement les signaux de deux protons H 2.88 et 2.75 ppm formant des doublets ddoubls dont lune des constantes de couplage J = 16.7 Hz est caractristique dun couplage gminal. Il peut donc sagir de deux protons non quivalents dun CH2. Par ailleurs, ces deux protons couplent tous les deux avec le proton dun groupement hydroxyle H 4.19 formant un doublet ddoubl de constantes de couplage J = 4.5 Hz et J = 3.0 Hz. Ce signal est encore ddoubl par la prsence dun autre proton (J = 1.5 Hz) fortement dblind dont le signal, sur le spectre de RMN-1H se prsente sous la forme dun singulet largi H 4.83.
Figure III 11. Spectre de RMN-1H du compos B dans MeOD.
Tenant compte des informations apportes par la spectromtrie infra-rouge et par la RMN du proton, nous pouvons affirmer que le compos B prsente les caractristiques dun flavonode sans groupement carbonyle, ce qui nous oriente vers une structure de type flavane substitue en position 3 c'est--dire une structure de type catchine. Ltude du spectre de RMN-13C de B apporte des informations complmentaires en affichant quinze signaux (figure III 12). Nous observons sept carbones quaternaires aromatiques ainsi que cinq CH aromatiques que nous pouvons attribuer aux cycles A et B dun flavonode substitu en 5, 7, 3 et 4. Le spectre HSQC nous permet dattribuer les trois signaux restant un CH substitu par un htroatome (C 78.5 / H 4.83 ppm), un groupe CHOH (C 66.0 / H 4.19 ppm) et un groupe CH2 (C 27.9 / H 2.88 et 2.75 ppm).
77
III. Rsultats
Figure III 12. Spectre de RMN-13C de B dans MeOD.
Compte tenu des informations tires du spectre HSQC de B et des donnes de la spectromtrie de masse, la formule brute du compos B semble tre C15H14O6. Les corrlations prsentes sur le spectre HMBC nous permettent de confirmer les attributions des signaux des cycles A et B et de confirmer la structure de type catchine. En effet nous observons des corrlations entre C-10 et les deux protons ports par C-4, C-1 et le proton H 4.83 ppm (C-2), ainsi que entre C-2 et le proton H 4.19 (H-3). Ainsi, le dblindage du proton H-2 et celui de H-3 sont expliqus par la prsence dun groupement hydroxyle en position 3. Le compos B est donc de type catchique substitu par des groupements hydroxyles en positions 5, 7, 3, 4 et 3. Lanalyse de la constantes de couplage observe entre les protons H-2 et H-3 (J = 1.5 Hz) indique que ces protons sont en position cis et permet de placer le groupement hydroxyle en position [Davis et al., 1996]. Nous avons mesur le pouvoir rotatoire du compos B dans le MeOH et observ la valeur []D - 55 . Ainsi, en comparaison avec les donnes de la littrature, nous pouvons identifier le compos B comme tant la (-)-picatchine (figure III 13) [Davis et al., 1996 ; Miketova et al., 1998]. Dans lextrait APY F3, le compos B appartient aux composs les plus apolaires parmi ceux que nous qualifions de tanins. Il sagit en fait de lunit de base de tanins catchiques, encore appels proanthocyanidols. Grce cette identification, la prsence de proanthocyanidols est avre dans les plantes du genre Agauria.
78
III. Rsultats
OH
3' 2' 8 9 7 6 5 3 10 4 1' 2 6' 5' 4'
OH
HO
OH
OH
Figure III 13. Structure de la (-)-picatchine (compos B).
79
III. Rsultats
2.2.1.3. Dtermination de structure du compos C Le compos C se prsente sous la forme dune poudre blanche, soluble dans le chloroforme et dans les solvants apolaires. Ce compos prend une coloration violette aprs rvlation en CCM par de la vanilline sulfurique et une coloration bleue au ractif de Liebermann-Burchard suggrant un compos de type triterpnique. Spectromtrie de masse. La mesure du spectre de masse en ionisation impact lectronique (EI) en mode positif (figure III 14) montre un ion m/z 426 qui correspond lion molculaire M+. Le spectre du compos C prsente galement des ions rsultant de la fragmentation de la molcule et notamment lion B m/z 207 qui est caractristique des cycles A et B dun triterpne (voir schma figure III 14) [Budzikiewicz et al., 1963][Ullah et al., 1999] ; la perte par cet ion dune molcule deau indique que les cycles A et B portent un groupement hydroxyle, trs probablement en position 3 pour des raisons biogntiques.
[A] [B-18]
[B]
HO
-H2O
m/z 189
A m/z 218
B m/z 207
[M ]
[M-15]
Figure III 14. Spectre de masse EI du compos C. (DCM, mode positif)
Spectromtrie de RMN. La majorit des signaux du spectre RMN-1H du compos C (figure III 15) est observe dans la rgion des hauts champs indiquant la prsence de protons aliphatiques. Parmi ceux-ci, le spectre prsente un profil typique de triterpne avec la prsence de sept groupements mthyles : six formant des singulets (H 1.05, 0.98, 0.96, 0.84, 0.81 et 0.77 ppm) et un formant un doublet ddoubl H 1.70 ppm (dd, J = 1.3 Hz, J = 0.6 Hz) [Karliner et Djerassi, 1966].
80
III. Rsultats
Figure III 15. Spectre RMN-1H du compos C dans CDCl 3.
Nous observons galement la prsence du signal dun groupement hydroxyle H 3.20 ppm et des signaux de deux protons olfiniques H 4.58 et 4.71 ppm. Les 30 signaux du spectre RMN-13C du compos C confirment la prsence dun triterpne avec sept mthyles dont lexprience HSQC a permis de dfinir les corrlations protons (C 28.0 / H 1.70, C 15.4 / H 0.81, C 16.1 / H 0.96, C 16.0 / H 1.05, C 14.6 / H 0.84, C 18.0 / H 0.77 et C 19.3 / H 0.98 ppm). Par ailleurs, nous observons la prsence dun carbone quaternaire olfinique C 151.0 ppm et dun carbone secondaire olfinique C 109.3 ppm. Les dplacements chimiques du CH C 79.0 / H 3.20 ppm confirme la prsence dun groupement hydroxyle. Les signaux dun CH C 55.3 / H 0.70 ppm sont caractristiques du CH-5 dune trans-dcaline A/B [Mahato et Kundu, 1994]. Lobservation conjointe des spectres de RMN-1H et
13
C nous indique la prsence des signaux
caractristiques dun groupement isoprne. En effet, les deux protons du CH2 olfinique (C 109.3 / H 4.58 et 4.71 ppm) couplent entre eux formant chacun un doublet (J = 2.5 Hz) ddoubl par le couplage avec les protons du mthyle H 1.70 ppm (dd, J = 1.3 Hz, J = 0.6 Hz).
81
III. Rsultats
Toutes ces informations nous permettent de dduire la formule brute du compos C C30H50O et de calculer les quivalents de doubles liaisons (EDL) afin denvisager le nombre de liaisons conjugues et/ou de cycles que compte la structure. La formule brute indique 6 degrs dinsaturations, nous pouvons mettre lhypothse que le compos C est un triterpne pentacyclique dont le cycle E est 5 liaisons et est substitu par un groupement isoprnyle. Le compos C peut donc tre de type lupane ou hopane [Mahato et Kundu, 1994]. Toutes les autres valeurs de protons et de carbones ont t attribues daprs lanalyse des spectres COSY, HSQC et HMBC (figure III 17), elles concordent avec une structure de type lupne. [Ammann et al., 1982 ; Reynolds et al., 1986].
29
20 30 19 21 22 12 25 11 26 14 1 2 3 10 9 8 27 4 5 6 7 15 13 18 17 28 16
HO
24
23
Figure III 16. Illustrations des principales corrlations observes sur le spectre HMBC.
En effet, en raison de lloignement de la chane latrale trois carbones dans le squelette hopne (figure III 18), les C-13 et Me-27 sont beaucoup plus dblinds que dans le squelette lupane [Mahato et Kundu, 1994].
20 28 19 20 21 12 13 18 17 19 22 12 21 22 13 18 17 28
27
27
hopne
Figure III 17. Squelettes de hopne et lupne.
lupne
Pour le compos C, le dplacement du C-13 est de C 38.1 ppm alors quon observerait une valeur denviron 50 ppm dans le cas dun hopne ; de la mme manire, le Me-27 C 14.6 dans le compos
82
III. Rsultats
C serait plus dbind (C ~ 18 ppm) dans une structure de type hopne [Meselhy et Aboutabl, 1997 ; Endale et al., 2005]. Le dplacement H 2.40 ppm est caractristique du H-19 dun lupne [Culioli et al., 2003]. Les corrlations observes sur le spectre HMBC entre dune part H-19 et C-20 et dautre part entre H-30, H-29 et C-19 (C 47.9 ppm) permettent de confirmer que le groupement isoprne est port par le carbone C-19. Les valeurs des constantes de couplage entre H-3 et les protons H-2 (dt, J = 11.3 Hz, J = 5.1 Hz) impliquent un couplage trans-diaxial entre H-3 et le proton H-2 axial permettant de placer le
groupement hydroxyle OH-3 en position equatorial. La configuration -oriente de ce groupement est confirme par le dplacement chimique du C-3 C 79.0 ppm (alors quelle serait proche de 76 ppm dans le cas dune orientation ) [Mahato et Kundu, 1994]. Sur le spectre NOESY, les corrlations entre H-3 et Me-23 et H-5 et H-9 suggrent une configuration pour ces groupements, en accord avec la prsence dune trans-dcaline. Le groupement Me-25 est positionn en axial () dans une trans-dcaline La position du groupement isoprne a t dduite de la corrlation spatiale, sur le spectre NOESY, entre le proton H-19 et le signal du proton H 0.81 ppm (Me-28) positionn en via les corrlations nOe entre Me-25, Me-26 et Me-28 (figure III 19).
29
20 30 19
H
21 22 18
H
12 11 25 1 2 10 9 8 26 14 15 13 17
H
16
28
H HO
H
3 4 5 6 24 7
27
H
23
Figure III 18. Illustrations des principales corrlations observes sur le spectre NOESY.
En comparant ces donnes avec celles de la littrature, nous pouvons identifier le compos C au (20)29-lupn-3-ol ou lupol [Pereira et al., 1996 ; Ali et al., 1997 ; Mutai et al., 2004].
83
III. Rsultats
HO
Figure III 19. Structure du (20)29-lupn-3-ol (compos C).
84
III. Rsultats
2.3. Agauria salicifolia (ASA)

2.3.1. Fractionnement de lextrait ASA F1 et isolement du compos D
Comme nous lavons vu au chapitre I., nous avons choisi dtudier la composition chimique de lextrait hydroalcoolique de ASA pour tablir un parallle avec la composition dAPY. Nous avons tent disoler en particulier le compos apolaire qui, en CCM, semble ntre prsent que dans ASA. Pour cela, lextrait ASA F1 a t spar par chromatographie moyenne pression (MPLC) en phase inverse C18, lue avec un gradient H2O / MeOH. Dix fractions (F1.1 F1.10) ont t obtenues (figure III 21).
ASA F1 (1 g)
MPLC silice C18, lution H2O / MeOH gradient 90 : 10 0 : 100
F1.1 77 mg 90 : 10
F1.2 83 mg 80 : 20
F1.3 52 mg
70 : 30
F1.4 80 mg
70 : 30
F1.5 95 mg 40 : 60
F1.6 63 mg 50 : 50
F1.7 39 mg 60 : 40
F1.8 107 mg 30 : 70
F1.9 28 mg 20 : 80
F1.10 26 mg 0 : 100
HPLC semi-prp, lution MeCN / H2O + 0.1 % HCOOH gradient 10 : 90 20 : 80 en 20 min
VAC ELUT cartouche C18, lution H2O / MeOH gradient 100 : 0 80 : 20
Compos D (3 mg)
F1.4.1 10 mg 100 : 0
F1.4.2 traces 95 : 5
F1.4.3 29 mg 90 : 10
F1.4.4 31 mg
85 : 15
F1.4.5 5 mg 80 : 20
HPLC semi-prp, lution MeCN / H2O + 0.1 % HCOOH gradient 10 : 90 20 : 80 en 20 min Compos D (10 mg)
Figure III 20. Schma de fractionnement de ASA F1
Le compos que nous cherchons isoler, appel compos D, est prsent dans les fractions F1.3 et F1.4. La fraction F1.3 a donc t fractionne par HPLC semi-prparative en phase inverse (cf. Chapitre IV). La phase mobile consistait en un gradient de MeCN / Acide formique 0.1 % dans leau de 10 : 90 20 : 80 en 20 minutes. Le compos D est lu 18 minutes. Cette purification ne nous a permis de recueillir que 3 mg de D. La fraction F1.4 a subi un nouveau fractionnement sur silice en phase inverse sur cartouche laide dune unit de filtration Vac Elut lue par un gradient H2O / MeOH. La fraction F1.4.4, enrichie en
85
III. Rsultats
compose D, a t purifie par HPLC semi-prparative en utilisant la mthode cite prcdemment. Cette tape a conduit lobtention denviron 10 mg de compos D pur (figure III 21).
2.3.2. Dtermination de structure du compos D de Agauria salicifolia

Le compos D se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans leau. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Les bandes de maxima dabsorption prsentes sur le spectre UV du compos D 254 et 346 nm sont caractristiques dun flavonol. Spectromtrie de masse. Le spectre en ESI montre un ion quasi-molculaire [M-H] m/z 477 suggrant une masse atomique de 478 u. La prsence du fragment de la gnine m/z 301 indique une perte de 176 u pouvant correspondre la perte dun acide glucuronique (figure III 22).
A
Y0 [M-H]
- 176 u
MS/MS de 477
1,3
1,2
Figure III 21. A. Spectre de masse du compos D (ESI, MeOH). B. Spectre MS/MS de lion 477 (ESI, MeOH).
La fragmentation MS/MS de lion [M-H] engendre les pics dions fragments m/z 301 (Y0 ), 179 (1,2A) et 151 (1,3A). Grce ces ions carcatristiques, nous supposons la prsence dune gnine
86
III. Rsultats
querctine mais cette fois substitue par un acide glucuronique et dduisons la formule brute C21H18O13 pour le compos D. Spectromtrie de RMN. Tout comme pour le compos A, le spectre de RMN-1H de D comporte, dans la zone des champs faibles, les signaux des protons aromatiques des cycles A et B dun flavonode et, champs intermdiaires, les signaux dun sucre. Le proton anomrique de ce sucre est visible H 5.38 ppm et forme un doublet de constante de couplage J = 7.4 Hz. Les signaux aromatiques sont en conformit avec une gnine de type querctine (figure III 23).
Figure III 22. Spectre RMN-1H du compos D dans MeOD.
Le spectre de RMN-13C du compos D montre vingt et un signaux (figure III 24). Ltude des quinze signaux en dehors de la rgion des sucres, en comparaison avec ceux du compos A, confirme que la gnine du compos D est la querctine. Les six signaux restant sur le spectre appartiennent au sucre, il sagit donc bien dun hexose. La prsence sur le spectre RMN-13C dun second carbonyle C 173.2 ppm renforce lhypothse mise daprs ltude du compos D en spectromtrie de masse de la prsence dun substituant acide uronique. Lanalyse conjointe des spectres de RMN-1H, RMN-13C, HSQC et HMBC montre quil sagit des signaux caractristiques dun acide glucuronique [Parejo et al., 2004].
87
III. Rsultats
Figure III 23. Spectre RMN-13C du compos D dans MeOD.
Le couplage sur le spectre HMBC entre le proton anomrique H-1 et le C-3 de la gnine indique que celui-ci porte lacide glucuronique. Par ailleurs, la constante de couplage du proton anomrique J = 7.4 Hz indique une configuration de la liaison osidique. La comparaison des donnes spectrales du compos D avec celles de la littrature confirme lidentit de celui-ci comme tant la querctine-3-O--glucuronopyranoside [Parejo et al., 2004]. Ce compos, galement appel miqulianine, a t isol pour la premire fois dune Ericaceae : Gaultheria miqueliana et est commun dans cette famille.
OH
3' 2' 4' 5' 6' 4
OH
HO
7 6
8 9
1'
10
O
1'''
O
2''' 5'''
O
6'''
OH
OH
4'''
HO
3'''
OH OH
Figure III 24. Structure de la querctine-3-O--glucuronopyranoside (compose D).

88
III. Rsultats
2.4. Comparaison des fractions flavonodiques de Agauria salicifolia et de Agauria polyphylla par LC-MS
Agauria salicifolia et Agauria polyphylla sont deux espces morphologiquement trs proches au point que certains auteurs refusent APY le statut despce ; il ne sagirait que dune forme adapte la scheresse de lespce ASA (cf. chapitre II). Or le criblage biologique de Serdex a montr que ces deux plantes prsentaient des activits biologiques diffrentes. Dans loptique dun dveloppement commercial de lextrait dAPY, il sest donc avr ncessaire de dvelopper une technique didentification complmentaire la botanique permettant de distinguer chimiquement les deux espces. Nous avons donc choisi de comparer les fractions flavonodiques des extraits F1 de ASA et APY par HPLC couple la spectromtrie de masse (LC-MS).
2.4.1. Obtention des fractions flavonodiques : mise au point dune mthode de sparation des tanins condenss (proanthocyanidols) par prcipitation
Afin de faciliter ltude des flavonodes par LC-MS, il tait ncessaire dobtenir une fraction enrichie en composs flavonodiques. Les essais prliminaires mens pour les fractionnements de APY F3 et ASA F1 ont montr que par les techniques chromatographiques classiques sur colonnes (exclusion et/ou adsorption), il nest pas possible de concentrer les flavonodes dans une fraction sans, dans le mme temps, enrichir considrablement cette fraction en proanthocyanidols. Nous avons donc mis au point une technique permettant dliminer les proanthocyanidols des extraits thanoliques bass sur la proprit quont les tanins dtre solubles dans mthanol et insolubles dans le chloroforme. Cette mthode simple, rapide et reproductible est destine liminer le maximum des tanins des fractions thanoliques de ASA et APY, en particulier les tanins les plus polaires, c'est--dire de haut degr de polymrisation. Ces derniers sont les plus difficiles sparer des flavonodes par les mthodes chromatographiques classiques. Le mode opratoire de cette mthode est prsent figure III 26. Il est noter que des techniques reposant sur les mmes proprits de solubilit des proanthocyanidols sont employes pour sparer les tanins du vin en fonction de leur degr de polymrisation [Saucier et al., 2001].
Elimination des proanthocyanidols par prcipitation : Dissoudre lextrait dans du
MeOH (8 mL de MeOH pour 300 mg dextrait). Ajouter une quantit suffisante de HCCl3 pour obtenir une solution 8 % de MeOH dans le HCCl3. On observe immdiatement une prcipitation des tanins. Mettre le mlange 4 pendant plusieurs heures. Filtrer et C vaporer le filtrat.
Figure III 25. Mode opratoire de la mthode dlimination des proanthocyanidols par prcipitation.
89
III. Rsultats
Contrairement dautres techniques (la chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex par exemple), cette technique peut facilement tre mise en uvre sur dimportantes quantits dextrait (jusqu plusieurs grammes). Plus on augmente la proportion de chloroforme plus on prcipite les tanins de faibles degrs de polymrisations. Nous avons tabli que la valeur limite dans notre cas est de 8 % de HCCl3, au-del de cette valeur, les flavonodes de lextrait commencent prcipiter galement. Cette mthode a t mise en uvre pour les fractions F1 de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla (respectivement ASA F1 et APY F1) (figure III 27).
Fraction F1
(5 g)
Solubilisation dans MeOH (130 mL) Ajout progressif de HCCl3 (1625 mL) puis stockage 4 pendant 3 H C
Prcipitation
Filtration sur fritt - Evaporation
Prcipit
(~3.5 g)
Filtrat
(~1.5 g)
CC Sephadex LH20 lution MeOH / H2O (80 : 20)
Fraction 1
Fraction 2
Fraction 3 (~250 mg)
Fraction 4
Fraction flavonodique
Figure III 26. Schma dobtention des fractions flavonodiques de ASA et APY
Comme cela est visible sur la CCM prsentant les deux fractions obtenues aprs prcipitation (figure III 28), le filtrat ainsi obtenu contient donc encore les proanthocyanidols les plus apolaires (mono et/ou oligomres). Un fractionnement sur gel de Sephadex lu au MeOH / H2O (8 : 2) est donc ncessaire pour liminer ces composs (figure III 27).
90
III. Rsultats
Prcipit
Filtrat
Figure III 27. CCM des deux fractions obtenues aprs la prcipitation des tanins sur APY F1 (lution : AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10) ; rvlation : ractif la vanilline sulfurique).
2.4.2. LC-MS compare des fractions flavonodiques de ASA et APY

Pour lanalyse en LC-UV(DAD)-ESIMS en mode ngatif des fractions flavonodiques de ASA et APY, les chantillons analyser ont t solubiliss dans un mlange de MeOH et H2O parts gales puis injects dans un systme HPLC dont les paramtres exprimentaux sont dcrits au chapitre IV. Nous avons galement tudi le comportement de tmoins dans les mmes conditions. Nous disposions de quatre tmoins commerciaux : querctine, kaempfrol, querctine-3-O-galactoside (hyproside), querctine-3-O-glucoside (isoquercitrine) et de trois tmoins obtenus au laboratoire : kaempfrol-3-O-arabinofuranoside, rhamnoside. Les rsultats de cette tude ont donn lieu la rdaction dune publication prsente en annexe. 2.4.2.1. Profil HPLC des deux fractions flavonodiques. Les chromatogrammes HPLC des extraits flavonodiques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla sont prsents figure III 29. A linstar des conclusions apportes par les CCM prliminaires, les profils HPLC 260 nm des deux plantes sont similaires mais pas totalement identiques. En effet, douze pics sont dtects aux mmes temps de rtention dans les deux extraits. Ces pics ont cependant des aires trs diffrentes dun extrait lautre. En outre, deux pics (correspondant aux composs 2-4 et 2-10) ne sont prsents que dans lextrait dASA (figure III 29 B). Ltude des spectres UV des pics 1-1 1-1 pour APY et 2-1 2-14 pour ASA ont montr que tous ces composs prsentent les caractristiques des flavones : une bande dabsorption 254-262 nm, une autre 341-360 nm et un paulement 290 nm (tableau III 1). kaempfrol-3-O-arabinopyranoside et kaempfrol-3-O-
91
III. Rsultats
AU
35 34 32 30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 5 10 15 20 25 30
1-7
Fraction flavonodique dAgauria polyphylla
1-6 1-12 1-11 1-1
1-3
1-4
1-10 1-8 1-9 1-5
1-2
35
40
45
50
55
60
65 min
AU
9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
2-14
B
2-7
2-8
Fraction flavonodique dAgauria salicifolia
2-2 2-1 2-4 2-3 2-5 2-6
2-9
2-10 2-12 2-11 2-13
55
60
65 min
Figure III 28. Chromatogrammes HPLC-UV(DAD) des fractions flavonodiques de Agauria polyphylla (A) et Agauria salicifolia (B) 260 nm.
2.4.2.2. Identification des composs des fractions flavonodiques par LC-MS. Par une premire analyse LC-MS, nous avons obtenu les spectres de premier ordre des composs (analyse en full scan mode ) puis nous avons procd des expriences MS/MS (analyses en mode product ion scan ). Les tmoins ont galement t analyss en LC-MS afin de comparer leurs caractristiques, savoir ; temps de rtention (tR), spectre UV et fragmentation en masse, celles des composants des deux extraits. Le tableau III 1 prsente les donnes obtenues lissue des analyses LC-MS et LC-MS/MS pour les composants des extraits dASA et APY ainsi que les temps de rtention de chaque compos. Le type de sucre attach dans le cas de flavonol O-glycosyl a t dtermin par la perte dun fragment correspondant un hexose ou un pentose (respectivement -162 u, -132 u) partir de lion quasi92
III. Rsultats
molculaire [M-H]. Pour les pertes de 146 u et 176 u, correspondant respectivement un dsoxyhexose et un acide uronique, nous admettrons, comme dans la littrature, quil sagit des pertes respectives dun rhamnose et dun acide glucuronique [Cuyckens et al., 2002 ; Cuyckens et Claeys, 2004]. Pour la majorit des composs, les ions fragments prsents sur le spectre de premier ordre nous ont permis didentifier la gnine. Pour tous les pics, la prsence de lion radical gnine Y0, en plus de lion de la gnine Y0, indique une double liaison entre les positions 2 et 3 du cycle C de la gnine confirmant la prsence de flavonols. Il a t dcrit par Petsalo et al. que dans le cas de lutilisation dun spectromtre de masse triple quadriple (comme cest le cas ici), la formation dun ion radical Y0 intense est due au clivage homolytique dune liaison osidique en position 3 (ce radical est faible ou absent dans le cas dune glycosylation en 7) [Petsalo et al., 2006]. Comme tous les spectres de masse des composs 1-1 1-11 et 2-1 2-13 prsentaient un ion radicalaire intense pour la gnine, nous pouvons supposer que la liaison osidique se trouve en position 3 comme cest le cas pour les flavonols glycosyls que nous avons isols de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla (cf. paragraphes 2.2.3.1 et 2.3.2). Les ions rsultant de la fragmentation de la gnine (soit prsents sur le spectre de premier ordre, soit obtenus par fragmentation de Y0 par pseudo MS3 quand Y0 est prsent sur le spectre de premier ordre) nous ont permis didentifier les gnines des composs par comparaison avec la fragmentation des tmoins. En effet, deux gnines ont pu tre identifies : - la querctine, pour les composs 1-1 1-7, 1-12, 2-1 2-8 et 2-14, avec les fragments caractristiques : Y0 m/z 301, [Y 0 -H] m/z 300 , 1,3A m/z 151 et 1,2A m/z 179 ainsi que [Y 0 CH 2 O] m/z 271 et [Y 0 -H 2 O-CO] m/z 255 ; - le kaempfrol, pour les composs 1-8 1-11 et 2-9 2-13, avec les fragments caractristiques Y 0 m/z 285, [Y 0 -H] m/z 284 ainsi que [Y 0 -CH 2 O] m/z 255 et [Y 0 -CH 2 O-CO] m/z 227. Les spectres de masse des composs 1-1 et 2-1, dune part, et 1-2 et 2-2, dautre part, prsentent la perte de 162 u correspondant un hexose. Ils ont t identifis comme tant la querctine-3-Ogalactoside ou hyproside (1-1 et 2-1) et la querctine-3-O-glucoside ou isoquercitrine (1-2 et 2-2) par comparaison de leurs temps de rtention respectifs avec ceux des substances de rfrence. La perte du fragment de 146 u, caractristique dun rhamnose, sur les spectres des composs 1-7 et 28, dune part, et, 1-11 et 2-13, dautre part, nous a permis didentifier ces couples de composs comme tant respectivement la querctine-3-O-rhamnoside ou quercitroside et le kaempfrol-3-O-rhamnoside.
93
III. Rsultats
Tableau III 1. Flavonodes identifis dans les fractions flavonodiques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla par LC-ESI-MS/MS en mode ngatif.
94
III. Rsultats
Les composs 1-8 et 2-9, 1-9 et 2-11, 1-10 et 2-12 montrent la fragmentation caractristique des kaempfrol-3-O-pentose (ion quasi-molculaire m/z 417, perte dun fragment 132 u et ion Y0 m/z 285). La comparaison des temps de rtention de ces composs avec ceux des kaempfrol-3-O-pentose tmoins a permis didentifier 1-8 et 2-9 comme tant le kaempfrol-3-O-arabinopyranoside et 1-10 et 2-12 comme tant le kaempfrol-3-O-arabinofuranoside ou euglanine. Les donnes LC-MS des composs 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 et 2-3, 2-5, 2-6, 2-7 ont apport les preuves de la prsence disomres de querctine-3-O-pentose (ion quasi-molculaire m/z 433, perte dun fragment 132 u et ion Y0 m/z 301) mais nont pas permis de les diffrencier. Nous avons mesur le temps de rtention du compos B (prcdemment isol de APY et identifi comme tant la querctine-3-Oarabinofuranoside) dans ces conditions analytiques. Ce temps de rtention correspond celui des composs 1-6 et 2-7 qui ont donc t identifis comme tant la querctine-3-O-arabinofuranoside ou avicularine. Nous lavons vu prcdemment, les profils flavonodiques de ASA et APY diffrent par la prsence des composs 2-4 et 2-10 sur le profil de ASA. Ces composs ont t identifis par la perte du fragment 176 u et par la fragmentation de leurs gnines comme tant respectivement la querctine-3-Oglucuronide et le kaempfrol-3-O-glucuronide. La concidence des temps de rtention de 2-4 et du compos D isol de ASA a permis de confirmer les donnes obtenues par la spectromtrie de masse : le compos 2-4 est la miqulianine.
OH OH HO O
1-1, 2-1 querctine-3-O-galactoside (hyproside), R = galactose 1-2, 2-2 querctine-3-O-glucoside (isoquercitrine), R = glucose 1-6, 2-7 querctine-3-O-arabinofuranoside (aviularine), R = arabinofuranose
OR OH O
1-7, 2-8 querctine-3-O-rhamnoside (quercitroside), R = rhamnose 2-4 querctine-3-O-glucuronide (miqulianine), R = glucuronide 1-12, 2-14 querctine
OH HO O
1-8, 2-9 kaempfrol-3-O-arabinopyranoside, R = arabinopyranose 1-10, 2-12 kaempfrol-3-O-arabinofuranoside (euglanine), R = arabinofuranose
OR OH O
1-11, 2-13 kaempfrol-3-O-rhamnoside (afzline), R = rhamnose 2-10 kaempfrol-3-O-glucuronide, R = glucuronide
Figure III 29. Structures des composs identifis de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla par LC-ESIMS.
95
III. Rsultats
2.4.3. Conclusion
La comparaison par LC-MS des extraits flavonodiques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla a rvl que ces deux extraits avaient des profils similaires o prdominaient la querctine-3-Oarabinofuranoside et la querctine-3-O-rhamnoside. Les douze flavonodes communs aux deux plantes constituent un ensemble caractristique pouvant constituer des marqueurs de qualit pour ces plantes. Les diffrences entre les deux fractions flavonodiques reposent sur les concentrations des composs et surtout sur la prsence de deux flavonols substituants acide glucuronique dans ASA uniquement.
2.5. Conclusions de ltude phytochimique de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla

Ltude des extraits thanoliques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla nous a permis de renforcer la connaissance phytochimique de ces deux plantes. Trois molcules ont t isoles de Agauria polyphylla : lavicularine (A), la (-)-picatchine (B) et le lupol (C). La miqulianine (D) a t isole de Agauria salicifolia. La comparaison par LC-MS des extraits flavonodiques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla nous a permis didentifier onze flavonodes supplmentaires sans les isoler (figure III 30) et de montrer quil existe des diffrences phytochimiques entre les deux plantes. Ces rsultats sont en accord avec le point de vue de botanistes comme Boiteau qui sont en faveur de lexistence distincte de lespce Agauria polyphylla (et non comme tant un polymorphisme de Agauria salicifolia) [Boiteau et al., 1959]. Ainsi, nos rsultats montrent, comme cela avait t dmontr pour dautres espces vgtales, que les flavonodes peuvent tre utiliss comme critres de diffrenciation taxonomique [Lauranson et al., 1995 ; Kawashty et El-Garf, 2000]. Cependant, un complment dtudes botaniques serait ncssaire pour trancher dfinitivement quant au statut despce de Agauria polyphylla.
Cette tude par LC-MS serait reconduire sur plusieurs lots de feuilles de Agauria salicifolia et de Agauria polyphylla pour prouver la spcificit de ces traceurs de diffrenciation. Si la distinction chimique tait reproductible sur plusieurs lots, nous aurions alors notre disposition une mthode analytique simple et rapide mettre en place : soit par analyse HPLC en dtectant la prsence ou labsence de la miqulianine pour savoir quelle espce appartient lchantillon analys ;
96
III. Rsultats
soit directement par MS en introduction directe et dtection (dans un spectromtre type triple quadriple par exemple) de la perte de neutre de -176 u (perte dun acide uronique spcifique des flavonodes de Agauria salicifolia).
97
III. Rsultats
3. Etude phytochimique des feuilles de Tambourissa trichophylla (TTI)

La plante Tambourissa trichophylla Baker a t choisie pour son utilisation traditionnelle Madagascar en tant que cicatrisant et dans les affections de la bouche. Suite au criblage pharmacologique men par Serdex, lextrait F3 de TTI a t choisi pour subir une tude phytochimique approfondie.
3.1. Fractionnement de lextrait TTI F3 et isolement des composs E, F et G

Lobjectif de ce travail sur lextrait TTI F3 tait disoler les flavonodes majoritaires observs lors du screening prliminaire par CCM. Or, ceux-ci sont plus polaires que ceux de APY et ASA et se situent dans la mme zone de polarit que la majorit des tanins de lextrait. Dans un premier temps, nous avons test les techniques mises en uvre pour ASA et APY (chromatographie dexclusion sur Sephadex ou chromatographie dadsorption sur silice en phase normale ou inverse) pour purifier les flavonodes de TTI mais ces mthodes se sont avres inefficaces. Nous avons donc choisi de sparer les molcules par chromatographie de partage centrifuge (CPC) (figure III 32). Cette technique permet de sparer les constituants dun mlange entre deux phases liquides non miscibles en fonction de leur coefficient de partage (cf. chapitre IV). Le systme de solvant utilis est un systme dcrit dans la littrature pour lisolement de flavonodes : AcOEt / EtOH / H2O dans les proportions 2 : 1 : 2. Les conditions opratoires sont dcrites au chapitre
IV.
La phase suprieure de ce mlange est utilise comme phase luante et la phase infrieure, comme
phase stationnaire [Marston et al., 1990a, b]. Le suivi par CCM de ce fractionnement, prsent la figure III 31, a permis de rassembler 8 fractions (figure III 31). Lessentiel de la masse de lextrait TTI F3 est concentr dans les fractions F3.6 F3.9 qui contiennent les tanins de haut poids molculaire (les plus polaires et les plus polymriss).
Figure III 30. CCM du suivi de fractionnement de lextrait TTI F3 par CPC (lution : AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10) ; rvlation : ractif la vanilline sulfurique).
Les fractions F3.4 et F3.5 ont ensuite t purifies sur chromatographies en phase inverse C18 sur cartouches, associes une unit de filtration Vac Elut, elues avec un gradient MeOH / H2O pour donner respectivement les composs E et F.
98
III. Rsultats
TTI F3 2.5 g
CPC, AcOEt / EtOH / H2O (2 :1 :2)
F3.1 Traces
F3.2 Traces
F3.3 Traces
F3.4 60 mg
F3.5 90 mg
F3.6 50 mg
F3.7 >300 mg
F3.8 >300 mg
F3.9 >300 mg
VAC ELUT cartouche C18, lution MeOH / H2O (gradient 10 : 90 100 : 0)
CC silice 70-200 m, lution isocratique DCM / AcOEt / Ac Actique (50 : 50 : 1)
Compos E 17 mg
VAC ELUT cartouche C18, lution MeOH / H2O (gradient 10 : 90 100 : 0)
F3.6.1 26 mg
F3.6.2 5.5 mg
F3.6.3 12 mg
F3.6.4 n.p.
Compos F 17 mg
Compos G
Figure III 31. Schma de fractionnement de lextrait TTI F3.
La fraction F3.6 contenait les molcules les plus apolaires, vraisemblablement monomres et/ou oligomres. Cette fraction a t soumise un fractionnement par chromatographie dadsorption sur silice lue par DCM / AcOEt / H2O (50 : 50 : 1) pour donner le compos G.
3.1.1. Dtermination de structures des composs E, F et G de Tambourissa trichophylla

3.1.1.1. Dtermination de structure du compos E Le compos E se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode confirme par les deux maxima 258 et 352 nm du spectre dabsorption UV, caractristiques des bandes I et II dun flavonol. Spectromtrie de masse. Le spectre en ESI montre un ion quasi-molculaire [M -H] m/z 609 suggrant une masse atomique de 610 u (figure III 33). Le spectre en ESI+ (figure III 34) confirme la masse atomique car il prsente les ions [M+Na]+ (m/z 633) et [M+K]+ (m/z 649). Sur le spectre MS/MS de lion [M+Na]+, nous observons les ions
99
III. Rsultats
fragments m/z 487 [M+H-146+Na] + indiquant la perte dun dsoxyhexose et 325 [M+H-146162+Na]+ et 324 [M+H-146-162+Na] + indiquant la perte additionnelle dun hexose. Il est noter que, de faon inattendue, lion du fragment osidique [146+162+Na]+ est visible sur ce spectre et constitue le pic de base (figure III 34). La fragmentation MS/MS de lion [M-H] engendre les pics dions fragments m/z 300 et 301 (respectivement Y0 et Y0 dans un ratio denviron 250 %), 271, 255, 179 (1,2A) et 151 (1,3A), comparables aux fragments des composs A et D. Tous ces lments laissent supposer pour E une structure de type querctine-3-O-diglycoside et la formule brute C27H30O16.
[M-H]
- 146 u 162 u
Y0 MS/MS de 609 [Y0-CH2O] [Y0-CH2O-CO] Y0
Figure III 32. Spectres de masse ESI du compos E (MeOH)
[M+Na]+
- 146 u 162 u
[1 4 6 + 1 6 2 + N a ] + MS/MS de 634
- 146 u
[Y0+Na]+ [Y0+Na]+ [Y1+Na]+
Figure III 33. Spectres de masse ESI+ du compos E (MeOH)

100
III. Rsultats
Spectromtrie de RMN. Les signaux prsents sur le spectre de RMN-1H du compos E (figure III 35) dans la rgion de protons aromatiques renforcent lhypothse de la prsence dune gnine de type querctine .En outre, nous observons les signaux de deux protons anomriques H 5.34 (d, J = 7.4 Hz) et 4,38 (d, J = 1,3 Hz) confirmant la prsence de deux sucres.
Figure III 34. Spectre de RMN-1H du compos E dans DMSO-d6.
Lanalyse du spectre RMN-13C montre les signaux caractristiques de la gnine querctine : signal C 178.0 ppm du groupement carbonyle, neuf carbones quaternaires (huit entre 130 et 170 ppm et un C 104.6 ppm) et cinq CH aromatiques (voir figure III 36) [Ternai et Markham, 1976].
Figure III 35. Spectre de RMN-13C du compos E dans DMSO-d6.

101
III. Rsultats
Parmi les signaux qui ne correspondent pas la gnine, nous observons les signaux de dix CH aliphatiques dont deux pouvant correspondre des carbones anomriques (C 101.9 et C 101.4 ppm), un CH2 (C 67.6 ppm) et un mthyle (C 18.4 ppm). Le spectre HMBC de E nous indique que ces carbones corrlent respectivement avec les protons anomriques H 4,38 et 5.34 ppm. Ces lments confirment la prsence de deux hexoses dans le compos E. Ltude du spectre HSQC nous permet galement de dduire les dplacements chimiques de protons des sucres bien que ceux-ci soient partiellement cachs par leau prsente 3.36 ppm dans le DMSOd6 (voir figure III 37). Les dplacements RMN-13C dans la rgion des sucres sont caractristiques, dune part, dun glucopyranose (C-2, C-3, C-4, C-5 et C-6 respectivement C 74.7, 77.1, 70.7, 76.6 et 67.6 ppm) dont on note la configuration grce la constante de couplage typique de son proton anomrique (J=7.4 Hz) et, dautre part, dun rhamnopyranose (C-2, C-3, C-4, C-5 et C-6 respectivement C 71.0, 71.2, 72.5, 68.9 et 18.4 ppm) en configuration (constante de couplage du proton anomrique H-1 J = 1.3 Hz) [Markham et Ternai, 1976 ; Senatore et al., 2000].
Figure III 36. Spectre HSQC du compos E centr sur la rgion des signaux des sucres dans DMSO-d6.
Par ailleurs, les corrlations HMBC observes entre les protons H 4.38 ppm (H-1) et le carbone situ 67.6 ppm (C-6) ont permis de montrer que les deux sucres sont lis en 1 6 et didentifier le diglycoside comme tant du rutinose (rhamnopyranosyl-(1 6)-glucopyranoside). Le rutinose est fix sur la gnine querctine en position 3 comme latteste la corrlation HMBC entre le carbone C-3 et le proton anomrique H-1.
102
III. Rsultats
Le compos E a donc t identifi comme tant la querctine-3-O--rutinoside, aussi appel rutine [Rastrelli et al., 1995]. Cette molcule a t identifie pour la premire fois dans Ruta graveolens (do son nom) et est prsente dans plus de trente familles de plantes principalement dicotyldones. Elle est galement trs connue pour ses nombreuses proprits biologiques notamment antidmateuse, anti-inflammatoire, anti-thrombosiques, anti-hypotensive, spasmolytique et antihmorragique [DNP, 2006].
OH
3' 2'
O OH OH
4' 5' 5'' 2'' 3''
6'''
4'''
15
1''' 2'''
5''' 3'''
OH OH
11
HO
7 6
8 9
O
4
O
6'' 4''
1' 6'
17
O
1''
10
OH
HO
OH OH
Figure III 37. Structure de la querctine-3-O--rutinoside (compos E).
103
III. Rsultats
3.1.1.2. Dtermination de structure du compos F Le compos F se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en affichant une fluorescence verte sous UV 365 nm laissant envisager une structure de type flavonode. Son spectre UV prsente les bandes dabsorption caractristiques dun flavonol 258 et 353 nm. Spectromtrie de masse. Nous observons la prsence sur le spectre ESI dun ion quasi-molculaire m/z 593 [M-H] pour le compos F. Sur le spectre MS/MS de lion m/z 593 en ESI, nous observons quatre ions issus de la fragmentation de lion [M-H] : m/z 284 Y 0 , m/z 285 Y 0 , m/z 255 [Y 0 -CH 2 O] et m/z 227 [Y 0 CH 2 O-CO] (figure III 39). La fragmentation en ESI+ de [M+Na]+ de F fait apparatre les ions [Y 1 +Na]+ m/z 472, [Y 0 +Na]+ m/z 309 et [Y 0 +Na]+ m/z 310 indiquant la perte successive dun dsoxyhexose (-146 u) puis dun hexose (-146-162 u) (figure III 40).
[M-H]
- 146 u 162 u
Y0 MS/MS de 593 [Y0-CH2O] [Y0-CH2O-CO]
Y0
Figure III 38. Spectres de masse ESI du compos F (MeOH)
104
III. Rsultats
[146+162+Na]+ MS/MS de 617 [Y 0 + N a ] + - 146 u 162 u
[M+Na]+
[Y0+Na]+
[Y1+Na]+
- 146 u
Figure III 39. MS/MS de lion 617 du spectre ESI+ du compos F (MeOH).
Spectromtrie de RMN. Ltude des signaux RMN-1H de la zone correspondant aux protons de la gnine a permis de mettre en vidence la prsence de substituants hydroxyles en C-5 et C-7 sur le cycle A, grce lidentification dun couplage meta des protons H-6 et H-8 du cycle A H 6.20 et 6.41 ppm. La substitution du noyau B est indique par la prsence deux couples de doublets couplant en position ortho H 7.98 (d, J = 8.8 Hz) et 7.98 (d, J = 8.8 Hz) pour H-2 et H-6 et H 6.88 (d, J = 8.7 Hz) et 6.88 (d, J = 8.7 Hz) pour H-3 et H-5. Ce systme 2H AA, 2H XX sur le cycle B nous permet de placer le groupement hydroxyle en position 4 sur le cycle B. Ces donnes semblent confirmer les hypothses formules grce la spectromtrie quant la prsence de la gnine kaempfrol. Comme pour le compos E (querctine-3-O-rutinoside), nous observons la prsence des signaux de deux protons anomriques de sucres H 5.30 et 4.38 ppm ainsi que dautres signaux partiellement cachs par une trace deau. Sur le spectre de RMN-13C du compos F, nous observons la prsence de 27 signaux trs similaires ceux du compos F lexception de certains carbones correspondant la gnine ce qui confirme les hypothses de la masse : les molcules E et F diffrent par leurs gnines. Les dplacements chimiques des signaux attribuables au cycle B de la gnine (diffrant de ceux du compos E) nous permettent dindiquer la prsence dun carbone quaternaire aromatique (C 121.5 ppm), dun carbone quaternaire aromatique portant un groupement hydroxyle (C 160.6 ppm) et de quatre CH aromatiques deux deux superposs C 131.5 et 115.8 ppm. Lquivalence des signaux confirme que le groupement hydroxyle se situe en position 4. Nous avons compar lensemble des donnes RMN (1H, 13C, COSY, HSQC, HMBC) du compos F avec celles du compos E et celles-ci ne diffrent quau niveau des signaux du cycle B. Le reste des signaux et notamment les signaux de la zone des sucres tant en tous points identiques, nous pouvons identifier le compos F comme tant le kaempfrol-3-O--rutinoside aussi appel nicotiflorine.
105
III. Rsultats
O OH
3' 2'
6'''
4'''
OH
4' 5'
15
1''' 2'''
5''' 3'''
OH OH
11
HO
7 6
8 9
O
4
O
6'' 5'' 2'' 3'' 4''
1' 6'
17
O
1''
10
OH
HO
OH OH
Figure III 40. Structure du kaempfrol-3-O--rutinoside (compos F).
La nicotiflorine est une molcule courante et a t isole de nombreuses espces de plantes telles que Sophora japonica L. [DNP, 2006] .
106
III. Rsultats
3.1.1.3. Dtermination de structure du compos G Les donnes analytiques du compos G (Rf, masse molaire et fragmentation, RMN-1H et RMN-13 sont en tous points identiques celles du compos B isol de APY. Le compos G est donc la (-)-picatchine.
OH
3' 2' 8 9 7 6 5 3 10 4 1' 2 6' 5' 4'
OH
HO
OH
OH
Figure III 41. Structure de la (-)-picatchine (compos G).
Comme ce fut le cas pour les deux Agauria, la prsence dpicatchine dans lextrait de Tambourissa trichophylla permet daffirmer que les tanins contenus dans cette plante sont des tanins catchiques ou proanthocyanidols.
107
III. Rsultats
3.1.2. Fractionnement du lot pilote TTI PL002 et isolement du compos H (application de la mthode de dtanification TTI)
A lissu de cette premire phase dinvestigation phytochimique, la plante Tambourissa trichophylla a t introduite dans le programme de dveloppement de Serdex. Cela sest traduit entre autres par le dveloppement dun mthode industrielle dobtention de lextrait F3 de Tambourissa trichophylla et, par la suite, par la mise en uvre dun lot pilote industriel ayant fourni un extrait de TTI appel TTI PL002. Les processus industriels mis en uvre pour extraire les composs des plantes sont sensiblement diffrents de ceux mis en place petite chelle et les extraits obtenus par ces mthodes peuvent lgrement diffrer. Les caractristiques de lextrait TTI PL002 sont quasiment identiques en CCM celles de TTI F3, si ce nest que la proportion de flavonodes est lgrement suprieure dans le lot de TTI PL002. Cela nous a permis denvisager disoler, partir de cet extrait, dautres molcules qui nous taient inaccessibles dans TTI F3 car trop peu concentres. Pour cela, nous avons appliqu la mthode de sparation des tanins par prcipitation, mise au point pour les extraits de ASA et APY, lextrait TTI PL002 (figure III 43). Lextrait dtanifi ainsi obtenu (environ 10 % en masse de lextrait de dpart) est fractionn sur colonne chromatographique de silice pour liminer les oligomres de tanins rsiduels puis nouveau spar par chromatographie de partage centrifuge dans les mmes conditions que celles dcrites pour lextrait TTI F3. Une ultime tape de purification par HPLC semi-prparative a permis disoler le compos H (par lution isocratique 30 % MeCN dans 70 % deau additionne de 0.1 % dacide formique pendant 35 min, cf. chapitre V).
108
III. Rsultats
TTI PL002
(5 g)
Solubilisation dans MeOH Ajout progressif de HCCl3 (q.s.p.. 8 % de HCCl3) puis stockage 4 pendant 3 H C
Prcipitation des tanins

Filtration sur fritt - Evaporation
Prcipit enrichi en tanins

(~ 4 g)
Filtrat dtanifi
(~1 g)
CC silice 70-200 m, lution DCM / AcOEt / Ac Formique (60 : 50 : 1)
TTI PL002.1
TTI PL002.2
TTI PL002.3 470 mg
CPC, AcOEt / EtOH / H2O (2 :1 :2)

TTI PL 1.1 Traces
TTI PL 1.2 12 mg
TTI PL 1.3 21 mg
TTI PL 1.4 13 mg
TTI PL 1.5 70 mg
TTI PL 1.6 87 mg
TTI PL 1.7 92 mg
TTI PL 1.8 110 mg
HPLC semi-prparative, phase inverse C18, lution isocratique MeCN / H2O + 0.1 % HCOOH 30 : 70 pendant 35 min
Compos H
Figure III 42. Schma de fractionnement de lextrait TTI PL002.
109
III. Rsultats
3.1.3. Dtermination de structure du compos H de Tambourissa trichophylla

Le compos H se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en affichant une fluorescence jaune sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Spectromtrie de masse. Le spectre de masse en ESI en mode ngatif montre un ion quasi-molculaire m/z 463 suggrant une masse atomique de 464 u (figure III 44). De plus, le fragment m/z 301 [M-H-132] dmontre la perte dune unit hexose et la fragmentation observe peut correspondre une gnine de type querctine.
Y0 [Y0-CH2O] Y0 [Y0-H2O-CO] - 132 u
[M-H]
Figure III 43. Spectre ESI du compos H (MeOH).
Spectromtrie de RMN. Les spectroscopies de RMN-1H et

13
C du compos H rvlent les signaux caractristiques dune
gnine querctine (voir molcules A, D et E), ainsi que les six signaux dun hexose (figures III 45 et III 46).
Figure III 44. Spectre de RMN-1H du compos H dans MeOD.
110
III. Rsultats
Figure III 45. Spectre RMN-13C du compos H dans MeOD.
Entre les spectres RMN-1H de H et A (querctine-3-O-arabinofuranoside) ou D (querctine-3-Oglucuronide), des diffrences significatives peuvent tre dtectes dans la rgion des protons du sucre (4-5 ppm). Les dplacements chimiques des protons du sucre ainsi que les constantes de couplage denviron 7 Hz entre H-3 et H-4 ainsi quentre H-4 et H-5 indiquent la prsence dun substituant glucopyranosyl [Markham et al., 1978]. Les dplacements chimiques caractristiques dun glucopyranoside (C 77.0, 76.7, 74.3, 69.8 et 61.2 ppm pour C-2, C-3, C-4, C-5 et C-6) sont galement observables sur le spectre RMN-13C de H (figure III 46) [Vvedenskaya et al., 2004]. La constante de couplage de J = 7.3 Hz observe pour le proton anomrique de H suggre une liaison de configuration entre le sucre la gnine. Enfin, le spectre HMBC montre une corrlation entre le proton anomrique du glucopyranose H-1 et le carbone C-3 de la gnine (corrlation entre C-3 et H-1). Ces donnes, en accord avec celles de la littrature, nous ont permis didentifier la molcule H comme tant la querctine-3-O--glucopyranoside plus connue sous le nom de isoquercitrine.
OH
3' 2' 4' 5' 6' 4
OH OH
6'' 5'' 2'' 3'' 4''
HO
7 6
8 9
1'
O
1''
10 5
OH
HO
OH OH
Figure III 46. Structure de la querctine-3-O--glucopyranoside (compos H).
111
III. Rsultats
3.2. Conclusion de ltude phytochimique de TTI

Ltude phytochimique des extraits de feuilles de Tambourissa trichophylla, nous a permis didentifier quatre composs : la rutine (E), la nicotiflorine (F), la (-)-picatchine (G) et lisoquercitrine (H). Ces composs navaient jamais t dcrits ni dans le genre ni dans lespce. Nous avons choisi de retenir les composs E, F et H comme traceurs pour cet extrait. Nous dcidons dcarter le compos G ; en effet, il sagit dun monomre de proanthocyanidols et, de ce fait, sa teneur dans un extrait de Tambourissa trichophylla peut tre amen varier si un quelconque traitement de lextrait (mauvaise condition de stockage par exemple) entranait une hydrolyse des polymres de proanthocyanidols contenus dans lextrait. Les trois flavonodes choisis ne sont pas spcifiques mais leur association dans des proportions dfinies peut ltre. De plus, ces molcules sont disponibles commercialement. Cela permet de pouvoir envisager leur dosage pour un contrle quantitatif de lextrait.
3.3. Mthode analytique de TTI

Suite la mise en place du dveloppement industriel des extraits de Tambourissa trichophylla par Serdex, nous avons pu obtenir plusieurs extraits TTI F3 provenant de lots de plantes diffrents (dates et lieux de rcolte diffrents). Une mthode analytique par HPLC pour lextrait TTI F3 a donc t mise au point dans le but de vrifier la prsence de trois composs choisis comme traceurs : les composs E, F et H. Les conditions analytiques de cette mthode sont dcrites au chapitre V. Les rsultats de lanalyse HPLC des trois lots de TTI F3, (appels respectivement lot 0227, lot 0408 et lot 0418) sont prsents figure III 49. Dans les trois lots, sur les chromatogrammes observs 340 nm (longueur donde dabsorption maximale spcifique des flavonodes), nous retrouvons les trois molcules choisies comme traceurs : E, F et H avec des temps de rtention respectifs de 41, 45 et 47 min. Il est noter que leurs proportions respectives semblent galement peu varier mais un dosage serait ncessaire pour vrifier la reproductibilit de ces proportions dun lot lautre. Lorsque la longueur donde du chromatogramme est fixe 276 nm, nous observons six pics bien rsolus (pics 1 6 sur la figure III 49) et qui sont prsents dans chacun des lots. Pour que ces composs servent caractriser qualitativement lextrait et fournir, avec les composs E, F et H, une empreinte HPLC de lextrait TTI F3, ils doivent pralablement tre identifis. Ainsi, cette mthode analytique est une mthode fiable, facile mettre en uvre en routine pour le contrle de la qualit des extraits de TTI. Elle permet galement un largissement du nombre de
112
III. Rsultats
traceurs si cela devenait ncessaire (notamment par lidentification des composs 1 6), par exemple pour dtecter une ventuelle falsification.
F 5 3 1 2 4 H 6E
TTI F3 Lot 0227
5 3 1 4 2 6 E H F TTI F3 Lot 0408 340 nm 276 nm
5 1 2 3 4 6 E H
F TTI F3 Lot 0418
Figure III 47. Chromatogrammes HPLC compars de trois lots de TTI F3 340 nm et 276 nm.
113
III. Rsultats
4. Etude phytochimique des feuilles de Embelia concinna (ECC)

La plante Embelia concinna Baker a t choisie par Serdex pour son utilisation traditionnelle Madagascar comme antifongique et antibactrien. Cest lextrait F3 qui a t retenu par le criblage pharmacologique pour tre tudi phytochimiquement.
4.1. Fractionnement de lextrait ECC F3 et isolement des composs I S

Lextrait ECC F3 a subi un premier fractionnement par chromatographie dabsorption en phase normale sur colonne de silice lue avec un gradient de cyclohexane / actate dthyle pour donner six fractions (F3.1 F3.6) (figure III 49) puis par un gradient actate dthyle / mthanol pour donner cinq fractions (F3.7 F3.11) (figure III 50). Le suivi par CCM rvle avec le ractif de Neu ou le ractif la vanilline sulfurique nous a permis de dterminer les fractions dans lesquelles se trouvaient les composs majoritaires cibls lors du screening sur CCM. Le compos majoritaire apolaire observ sur les CCM prliminaires se trouve dans les fractions F3.3 et F3.4. Ces deux fractions ont subi en parallle des fractionnements par chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex lues au chloroforme puis au mthanol. La fraction F3.3.2 a t fractionne par chromatographie sur colonne ouverte de silice lue par un gradient tolune / actate dthyle pour donner quatre fractions. Les fractions rsultantes F3.3.2.2 et F3.4.3 prsentaient en CCM des profils similaires et ont donc t rassembles (sous le nom de F3.3.2.2). Cette fraction tait trs enrichie en un compos (appel compos I) qui a t purifi par chromatographie sur colonne de silice lue au tolune puis par CCM prparative (lution par tolune / mthanol) pour enfin donner le compos I. Le compos J a t obtenu en purifiant la fraction F3.3.4 par chromatographie dexclusion sur gel de Sephadex en luant avec du chloroforme puis du mthanol.Le compos K a, quant lui, t isol de la fraction F3.3.3 par chromatographie sur colonne de silice normale lue par un gradient de cyclohexane et dactate dthyle. La fraction F3.5, issue du premier fractionnement de ECC F3, renfermait majoritairement les flavonodes les plus apolaires de ECC F3 mais aussi de pigments chlorophylliens. Cet extrait a t solubilis dans un mlange chloroforme et mthanol parts gales puis un ajout progressif deau a induit une prcipitation des flavonodes. Le prcipit ainsi obtenu a t purifi sur cartouche de silice C18 associe une unit de filtration Vac Elut pour donner les composs L et M.
114
III. Rsultats
Figure III 48. Schma de fractionnement de lextrait F3 de ECC.
115
III. Rsultats
Figure III 49. Schma de fractionnement de lextrait F3 de ECC (suite).
116
III. Rsultats
Un fractionnement sur gel de Sephadex de la fraction F3.6 a permis dobtenir la fraction F3.6.2 qui prsente un compos majoritaire appel compos N. Enfin, la fraction F3.6.3, qui contenait majoritairement les flavonodes de lextrait de ECC F3, a subi des fractionnements successifs par filtration sur gel de Sephadex puis une phase de purification par HPLC semi-prparative pour donner les composs O, P, Q, et R (conditions exprimentales dcrites au chapitre V).
117
III. Rsultats
4.2. Dtermination de structures des composs I L isols des sousfractions apolaires de ECC F3
4.2.1. Dtermination de structure du compos I
Le compos I a t obtenu sous forme dune poudre blanche amorphe, soluble dans le chloroforme et dans les solvants apolaires. En CCM, il prsente une coloration violette aprs rvlation au ractif la vanilline sulfurique et il ragit positivement au ractif Liebermann-Burchard, suggrant ainsi une structure de type triterpnique. Spectromtrie de masse. Lhypothse dune structure de type triterpne est taye par ltude en spectromtrie de masse du compos I. Sur le spectre de masse en impact lectronique (EI) en mode positif du compos I, nous observons lion molculaire M+ m/z 426. Le spectre EI nous apporte galement des informations sur la structure de ce compos. En effet, en plus du pic de lion molculaire, nous observons la prsence dautres ions, caractristiques dun raction de type rtro Diels-Alder sur un triterpne possdant une insaturation (figure III 51) : un ion m/z 302 et le pic de base du spectre m/z 204.
Figure III 50. Spectre de masse en EI en mode positif du compos I (HCCl3).
Cette fragmentation est caractristique dune insaturation en position 14-15 dun triterpne pentacyclique orientant vers une structure de type taraxarne (14) [Budzikiewicz et al., 1963]. Elle est illustre la figure suivante.
118
III. Rsultats
E E C D
HO
m/z 426 Pic de base m/z 204 Caractristique des cycles D et E d'un taraxarne retro Diels-Alder -124 u
- Me
- H 2O
m/z 269
HO
m/z 302
HO
m/z 287
Figure III 51. Fragmentation par EIMS et raction de retro Diels-Alder sur un taraxarne daprs Budzikiewicz et al. .
Lion 302 provient directement de la dcomposition par raction de rtro Diels-Alder du cycle D dun taraxarne. Cet ion est accompagn dun ion m/z 287 form par la perte du groupement mthyle en C-8 [Misra et al., 1984] et dun autre ion d une perte dH2O (m/z 269), indiquant que les cycles A, B et C portent un groupement hydroxyle, probablement en position C-3 pour des raisons biogntiques. Le pic de base (m/z 204) est galement caractristique et drive des cycles D et E. Cet ion est accompagn dun autre m/z 189 [204-Me] tmoignant dun rarrangement ayant provoqu la perte du mthyle en position 17 [Budzikiewicz et al., 1963]. On peut ainsi envisager la formule brute C30H50O pour le compos I, soit 6 degrs dinsaturation, compatible avec un triterpne pentacyclique. Spectromtrie de RMN. Le spectre de RMN-1H du compos I prsente huit signaux de mthyle formant des singulets entre 0.8 et 1.2 ppm confirmant la prsence des huit mthyles dun squelette triterpnique (figure III 53). Nous observons galement la prsence du signal dun groupement hydroxyle H 3.19 ppm et le signal dun proton olfinique H 5.53 ppm (dd, 3.2, 8.2) que nous pouvons situer en position 15 grce aux lments apports par la spectromtrie de masse.
119
III. Rsultats
Figure III 52. Spectre de RMN-1H de I dans CDCl3.
Les 30 signaux du spectre de RMN-13C du compos I (figure III 54) confirment la prsence dun triterpne avec sept mthyles dont lexprience HSQC a permis de dfinir les corrlations protons. Pour des raisons biogntiques, sur un taraxarne, ces mthyles sont ports par les carbones quaternaires C-4 (Me-23 C 28.0 / H 1.0 ppm et Me-24 C 15.5 / H 0.82ppm), C-10 (Me-25 C 15.4 / H 0.94ppm), C-8 (Me-26 C 25.9 / H 1.12 ppm), C-13 (Me-27 C 29.9 / H 0.92 ppm), C-17 (Me-28 C 29.8 / H 0.84 ppm) et C-20 (Me-29 C 33.4 / H 0.97 ppm et Me-30 C 21.3 / H 0.92 ppm) [Chaturvedula et al., 2003 ; Laphookhieo et al., 2004]. Par ailleurs, la double liaison est confirme par la prsence dun carbone quaternaire olfinique C-14 C 158.1 ppm et du CH olfinique C 116.0 / H 5.53 ppm. La position de cette double liaison est confirme par lobservation des corrlations HMBC (figure III 55). Le dplacement chimique du CH2 C 79.0 / H 3.20 ppm confirme la prsence dun groupement hydroxyle. Les signaux caractristiques du CH en position 5 C 55.3 / H 0.70 ppm montrent que la dcaline A/B est une trans-dcaline.
120
III. Rsultats
Figure III 53. Spectre de RMN-13C de I dans CDCl3.
Toutes les valeurs de protons et carbones on t finalement attribues par lanalyse des spectres HSQC et HMBC du compos I. Lobservation de couplages 2JHC et 3JHC du spectre HMBC partir des mthyles permet dlucider la structure du compos I.
HO
Figure III 54. Principales corrlations observes sur le spectre HMBC du compos I.
121
III. Rsultats
Les valeurs des constantes de couplage entre H-3 et les protons H-2 (dd, J = 4.6 Hz, J = 11.2 Hz) impliquent un couplage trans-diaxial entre H-3 et le proton axial de H-2 permettant de placer le groupement hydroxyle OH-3 en position quatoriale. Finalement, les corrlations observes sur le spectre NOESY du compos I nous ont permis de dfinir la configuration spatiale du compos I. En effet, nous observons des couplages NOESY (figure III 57) entre le proton H-3 axial et les protons du Me-23 ainsi que le H-5 axial qui couple lui-mme avec H-9. Enfin, les couplages NOESY entre Me-24 et Me-25, Me-25 et Me-26, Me-26 et H-18, H-18 et Me-30 et Me-28 permettent de placer ces groupements en position axiale.
Me30 H H Me26 H H H H Me23 H3 H5 H H9 H Me27 H15 H16ax H H H H18 H Me28 H Me29 H H
H H Me24 H HO
Me25
Figure III 55. Principales corrlations observes sur le spectre NOESY du compos I.
Ainsi, en accord avec les donnes de la littrature, nous pouvons identifier le compos I comme tant le 14-taraxeren-3-ol ou taraxrol.
30 29
27
20 19 18 17
21 22
12 25 1 2 3 4 10 H 5 6 7 11 9 8 15 14 13 H
16
28
HO
23
24
Figure III 56. Structure du 14-taraxrn-3-ol (compos I).
122
III. Rsultats
4.2.2. Dtermination de structure du compos J

Le compos J se prsente sous forme dune huile rougetre. Il est soluble dans le chloroforme et les solvants apolaires. Rvl en CCM par pulvrisation de vanilline sulfurique, ce compos prend une teinte rouge terne. Spectromtrie de masse. Le spectre de masse ESI du compos J montre un ion m/z 341 [M-H] indiquant une masse molculaire de 342 u et laissant envisager la formule brute C23H3402 (figure III 58). La fragmentation de lion quasi-molculaire engendre la formation de deux ions fragments m/z 122 et m/z 135.
[M-H]
[M-H] MS/MS de 341
Figure III 57. Spectre de masse ESI du compos J (MeOH).
Spectromtrie de RMN. Le spectre RMN-1H du compos J prsente neuf massifs de signaux (figure III 59). Dans la zone des signaux des protons aromatiques, nous observons deux signaux correspondant aux protons dun cycle aromatique : un doublet H 6.26 ppm (J= 2.2 Hz) intgrant pour deux protons et un triplet 6.19 ppm (J= 2.2 Hz) intgrant pour un proton. Nous pouvons en dduire que nous sommes en prsence dun cycle aromatique trisubstitu dont les protons sont situs en position meta les uns par rapport aux autres.
123
III. Rsultats
Dans cette zone, se situe galement le signal dun multiplet, entre H 5.31 et 5.45 ppm intgrant pour six protons olfiniques. Les six autres massifs se situent dans la zone des protons aliphatiques. Nous observons un signal intgrant pour quatre protons et formant un triplet H 2.83 ppm (J= 5.4 Hz), et un multiplet intgrant pour quatre protons entre 2.03 et 2.14 ppm ainsi quun autre multiplet intgrant pour huit protons 1.29 et 1.41 ppm. En outre, le spectre RMN-1H du compos prsente un signal H 1.00 ppm intgrant 3 H et formant un triplet (J= 7.5 Hz), caractristique dun groupement thyle. Enfin, nous observons la prsence dun triplet H 2.50 ppm (J= 7.3 Hz) intgrant pour un proton couplant avec un quintuplet H 1.59 ppm intgrant pour deux protons galement. De ce fait, nous pouvons supposer quil sagit de deux CH2 dune chane aliphatique en position respectivement et dun groupement lectroattracteur (cycle aromatique ou double liaison par exemple).
Figure III 58. Spectre de RMN-1H du compos J dans CDCl3.
Sur le spectre de RMN-13C du compos J (figure III 60), nous distinguons les six carbones dun cycle aromatique. Dune part, deux signaux de CH aromatiques superposs C 108.0 ppm et un CH aromatique C 100.1 ppm corrlant en HSQC avec les trois protons aromatiques respectivement H 6.26 et 6.19 ppm et, dautre part, trois carbones quaternaires dont deux superposs dont les
124
III. Rsultats
dplacements chimiques rvlent que les substituants du cycle aromatique sont deux groupements hydroxyles (C 156.6 ppm) et une chane carbone (C 146.1 ppm). La superposition des signaux des carbones quaternaires confirme la tri-substitution en meta et nous permet de placer les groupements OH en position 1 et 3. Le cycle aromatique du compos J est donc un noyau rsorcinol. Cinq signaux de carbones olfiniques sont prsents entre 125 et 140 ppm. Le spectre HSQC indique quils correspondent aux six protons olfiniques et que donc, deux signaux de carbones sont superposs. Ainsi, ces six signaux reprsentent trois doubles liaisons. Nous notons galement la prsence de huit CH2 entre 20 et 36 ppm et dun CH3 C 14.3 ppm.
Figure III 59. Spectre de RMN-13C du compos J dans CDCl3.
Ainsi, de ltude des spectres de RMN-1H et RMN-13C, nous pouvons dduire que le compos J est un rsorcinol substitu en position 5 par une chane alkyle non ramifie 17 carbones et comportant trois doubles liaisons, ce qui est en accord avec les informations apportes par le spectre de masse. En effet, le pic de base du spectre MS/MS du compos J (ESI ) m/z 135 [C10H16-H] correspond la rupture de la chane alkyle en dune double liaison [Suzuki et al., 1997] ; le pic m/z 123 correspond a lion dihydroxytropylium [C7H5(OH)2], (figure III 61) [Kozubek et Tyman, 1999 ; Wu et al., 2002].
125
III. Rsultats
OH m/z 135 HO m/z 123
Figure III 60. Fragmentation du compos J observe sur le spectre ESI .
Les corrlations HMBC (figure III 62) entre les carbones C-4 et C-6 et les protons H 2.50 ppm nous permettent didentifier le CH2-1 (C 35.8 / H 2.50 ppm). Les carbone C-1 et C-5 prsentent des corrlations avec les protons H 1.59 ppm permettant didentifier le CH2-2 (C 31.0 / H 1.59 ppm) (figure III 63 A).
Figure III 61. Spectre HMBC du compos J.
Les corrlations HMBC partir du CH3 terminal conduisent distinguer trois sous-units allyliques successives ainsi que de placer les doubles liaisons entre les positions 8 et 9, 11 et 12 et 14 et 15 (figure III 62 B). Les signaux de RMN-1H des quatre CH2 des positions 3, 4, 5 et 6 tant superposs, nous ne pouvons les distinguer et les valeurs de sont interchangeables [Chaturvedula et al., 2003].
126
III. Rsultats
A
OH
HO
B
Figure III 62. Principales corrlations HMBC du compos J.
La strochimie des doubles liaisons a t dtermine en observant la diffrence entre le dplacement chimique des carbones en des doubles liaisons et le dplacement chimique de leurs analogues dans la mme chane carbone sature et non en se rfrant aux constantes de couplage car les signaux sont superposs (dans le cas contraire, les constantes de couplages observes seraient J ~ 6 Hz pour une liaison (Z) et J ~ 12 Hz pour une liaison (E)). Les CH2 dune chane carbone sature ont des dplacements chimiques compris entre 20 et 30 ppm dans CDCl3. Le dplacement des valeurs C des CH2 allyliques de quelques ppm vers les hauts champs indique une configuration (Z) de la double liaison [Suzuki et al., 1996 ; Lund et al., 1997 ; Suzuki et al., 1997]. Ainsi, nous identifions le compos J comme tant le 5-(8(Z),11(Z),14(Z)-heptadcatrienyl) rsorcinol. Cette molcule a dj t isole de Philodendron scandens et est rapporte pour la premire fois dans le genre Embelia.
OH
1 2 3 6 2' 5 4 1' 3' 5' 7' 10' 11' 4' 6' 8' 9'
HO
13' 16' 14' 17' 15'
12'
Figure III 63. Structure du 5-(8(Z),11(Z),14(Z)-heptadcatrienyl) rsorcinol.

127
III. Rsultats
4.2.3. Dtermination de structure du compos K

Le compos K se prsente sous forme huileuse. Il est soluble dans le chloroforme et les solvants apolaires. Rvl en CCM par pulvrisation de vanilline sulfurique, ce compos prend une teinte rouge ros. Spectromtrie de RMN. Tous les spectres de RMN du compos K (figure III 65) prsentent dimportantes similitudes avec ceux du compos J (5-(8(Z),11(Z),14(Z)-heptadcatrienyl) rsorcinol). En effet, nous pouvons observer tous les signaux correspondant la chane alkyle non ramifie 17 carbones avec trois doubles liaisons (cf. paragraphe 4.2.2). Cependant, les signaux correspondant au noyau rsorcinol (six carbones aromatiques et trois protons aromatiques) sont absents. Toutefois, nous notons la prsence, sur le spectre de RMN-13C, du signal dun carbonyle C 180.5 ppm.
Figure III 64. Spectres de RMN-1H (A) et de RMN-13C (B) du compos K dans CDCl3.
Ainsi, grce ces lments et aux donnes de la spectromtrie de masse, nous pouvons tablir la formule brute C18H30O2 pour le compos K. Les deux oxygnes appartiennent un acide carboxylique et, les donnes spectrales concordant avec celles de la littrature, nous pouvons identifier le compos K comme tant lacide 9(Z),12(Z),15(Z)-octadecatrinoique ou acide linolnique, acide gras essentiel [Vatle et al., 1998 ; Cao et al., 2007].
128
III. Rsultats
O
18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 1 2
OH
Figure III 65. Structure de lacide linolnique (compos K).
129
III. Rsultats
4.3. Dtermination de structure des composs L et M par LC-MS.

Les composs L et M se prsentent chacun sous la forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ils montrent tous deux des profils de spectre UV caractristiques des flavonodes avec des absorptions maximales respectives dans le mthanol de 245 nm et 360 nm pour L et de 265 nm et 365 nm pour M. En CCM, le compos L prsente un Rf et une fluorescence jaune 366 nm (aprs pulvrisation par le ractif de Neu) identiques la querctine. Le Rf et la fluorescence verte (UV 366 nm, ractif de Neu) du compos M sont identiques ceux du kaempfrol. Nous avons donc choisi de comparer en LC-MS les donnes analytiques des composs L et M avec respectivement les tmoins querctine et kaempfrol (conditions chromatographiques : cf. chapitre v). Les temps de rtention (tR), les masses (respectivement 302 et 286 pour L et M) se sont rvles identiques aux deux tmoins. Les figures III 67 et III 68 et le tableau III 2 prsentent les ions obtenus par fragmentations MS/MS des composs L et M et des tmoins.
0 100 80 60 151.05 40 20 107.02 0 100 125.10 163.21 150 193.18 200 m/z 273.09 301.20 300 350 179.02
257.18 229.14 250
Figure III 66. A. Fragmentation MS/MS de lion m/z 301 [M-H] du tmoin querctine (ESI, trappe dion, MeOH). B. Fragmentation MS/MS de lion m/z 301 [M-H] du compos L (ESI, triple quadriple, MeOH).
130
III. Rsultats
0 100 80 60 40 20 106.89 0 100 150 200 m/z 250 300 131.52 150.81 229.10 213.13 239.15 267.23 285.26
A
257.16
185.15 169.03 199.17
Figure III 67. A. Fragmentation MS/MS de lion m/z 285 [M-H] du tmoin kaempfrol (ESI, trappe dion, MeOH). B. Fragmentation MS/MS de lion m/z 285 [M-H] du compos M (ESI, triple quadriple, MeOH).
Tableau III 2. Rcapitulatif comparatif des ions obtenus en ESI-MS/MS par la fragmentation de [M-H] des composs L et M et des tmoins querctine et kaempfrol.
Tmoin Compos querctine L Trappe Triple dion quadriple m/z 301 301 273 271 257 255 243 229 227 193 179 179 151 151 107 Tmoin kaempfrol Trappe dion m/z 285 257 241 229 213 199 151 285 255 241 227 213 151 Compos M Triple quadriple
Type de spectromtre utilis [M-H] [M-H-CO] [M-H-CH2O] [M-H-CO2] [M-H-H2O-CO] [M-H-2CO] [M-H-CH2O-CO] [M-H-CO2-CO] [M-H-H2O-2CO] [M-H-C2H2O-CO2] [M-H-c ycle B] 1,2 A 1,3 A 1,2 A-CO-CO2
Nous retrouvons pour les composs L et M les fragmentations des tmoins querctine et kaempfrol respectivement (avec notamment les ions caractristiques 1,2A et 1,3A). Cependant des diffrences de 2 units sont observables pour certains ions (en gris dans le tableau III 2). Cela peut sexpliquer par le fait que les spectres des tmoins et des composs L et M ont t enregistrs sur des spectromtres de
131
III. Rsultats
masse diffrents : la querctine et le kaempfrol ont t fragments sur un appareil muni dune trappe dions ( ion trap ) alors que L et M ont t fragments sur un appareil triple quadriple [de Rijke et al., 2006]. Nous avons donc identifi L comme tant la gnine flavonol querctine et M comme tant la gnine flavonol kaempfrol.
OH OH HO O
OH OH O
Figure III 68. Structure de la querctine (compos L)
OH HO O
OH OH O
Figure III 69. Structure du kaempfrol (compos M)
132
III. Rsultats
4.4. Dtermination de structure du compos N.

Le compos N est le composant majoritaire de la fraction F3.6.2 issue du fractionnement de lextrait ECC F3. Il prsente une fluorescence bleue en observation 366 nm aprs rvlation avec le ractif de Neu suggrant la prsence dun acide phnolique. Elu en CCM aux cts de divers tmoins dacides phnoliques (acide cafique, acide chlorognique, acide coumarinique et acide frulique) : il montre le mme Rf que lacide chlorognique. Nous avons choisi de tenter une identification de ce compos par LC-UV(DAD)-MS sans isolement pralable (identification dite on line ). Les conditions chromatographiques employes sont dcrites au chapitre V. Le profil du spectre UV du compos N montre des maxima dabsorption 222 et 216 nm avec un paulement 290 nm ce qui correspond aux donnes dcrites dans la littrature pour les drivs dacide cafique [Clifford, 2003]. Le spectre de masse en ionisation APCI ralis sur un spectromtre muni dune trappe dion ( ion trap ) du compos N est prsent figure III 71.
[M-H]
MS/MS de lion 353
MS3 de lion 191
Ions caractristiques de lacide 5caffoylquinique
Figure III 70. Spectre de masse du compos N et spectres MS/MS et MS3 (APCI)
133
III. Rsultats
Le compos N a une masse de 354 u comme latteste, sur le spectre en APCI , la prsence de lion m/z 353 [M-H]. Cette masse peut correspondre quatre acides cafoylquiniques : lacide 1-Ocafoylquinique, lacide 3-O-cafoylquinique, lacide 4-O-cafoylquinique et lacide 5-Ocafoylquinique (numrotation IUPAC [IUPAC, 1976]). Les fragmentations en masse de ces quatre isomres ont t dcrites par Clifford et al. (dans les mmes conditions, ionisation APCI et analyseur ion trap) : lacide 3-O-cafoylquinique prsente un pic de base en MS m/z 191 et un pic m/z 179 relativement intense (environ 50 % du pic de base) ; lacide 4-O-cafoylquinique prsente un pic de base en MS m/z 173 ; les acides 1-O-caffoylquinique et 5-O-cafoylquinique prsentent les mmes spectres MS savoir un pic de base m/z 191 et un ion trs faible indtectable (>5 % du pic de base) m/z 179 et sont diffrenciables par leur temps de rtention [Clifford et al., 2005]. Ainsi, la description des spectres des acides 1-O-caffoylquinique et 5-O-cafoylquinique correspond celle du compos N. La colution de ce compos avec le tmoin acide 5-O-cafoylquinique ou acide chlorognique en LC-MS nous permet de lidentifier comme tant lacide chlorognique [Clifford, 2003 ; Clifford et al., 2005].
OH O
5 4
OH
HO OH O
3'
OH
OH
Figure III 71. Structure de lacide chlorognique (compos N).
134
III. Rsultats
4.5. Dtermination de structure des composs O R isols des sousfractions polaires de ECC F3.
4.5.1. Dtermination de structure du compos O
Le compos O se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en prsentant une fluorescence jaune sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Spectromtrie de masse. La masse molculaire de 448 u a t dtermine par lexamen du spectre de masse en ESI du compos O qui prsentait un ion quasi-molculaire m/z 447 [M-H]. De plus, le fragment m/z 301 [M-H-146] dmontre la perte dune unit dsoxyhexose et la fragmentation peut correspondre une gnine de type querctine (figure III 73). En effet, nous observons la prsence des ions caractristiques de cette gnine (cf. tableau III 2). De plus la prsence de lion Y0 conforte lhypothse de la prsence dun flavonol et le rapport des abondances relatives entre Y0 / Y0 denviron 250 % indique une liaison osidique en position 3 de la gnine.
[Y0-H-CH2O] Y0 [Y0-H-H2O-CO] Y0 - 146 u [M-H]
Figure III 72. Spectre de masse ESI du compos O (MeOH)
Nous avons ralis des chromatogrammes HPLC du compos O ainsi que du tmoin quercitrine : querctine-3-O-rhamnopyranoside (conditions chromatographiques : cf. chapitre v). La colution du compos O avec la quercitrine permet denvisager quil sagit de la mme molcule. Afin de confirmer les lments didentification structurale apports par la spectromtrie de masse et lanalyse HPLC, notamment la configuration du carbone anomrique nous avons ralis un spectre de RMN-1H du compos O. Spectromtrie de RMN. Le spectre de RMN-1H du compos O (figure III 74) confirme les informations apportes par la spectromtrie de masse en montrant, entre 6.1 et 7.2 ppm , les signaux de la gnine querctine (cf. dtermination structurale des compos A, D et E) ainsi que les signaux caractristiques dun rhamnopyranoside : le signal dun groupement mthyle (H-6) formant un doublet H 0.94 ppm (d, J = 6.0 Hz), deux multiplets H 3.35 et 3.40 ppm (respectivement H-5 et H-4) et deux signaux
135
III. Rsultats
formant des doublets ddoubls H 3.75 ppm (dd, J = 9.1 Hz, J = 3.3 Hz) pour H-3 et 4.21 ppm (dd, J = 3.3 Hz, J = 1.7 Hz) pour H-2. Enfin le proton anomrique est observable H 5.35 ppm et forme un doublet de constante de couplage J = 1.7 Hz attestant de la configuration de la liaison anomrique.
Figure III 73. Spectre de RMN-1H du compos O dans MeOD.
Ainsi, la prsence de la querctine-3-O--rhamnopyranoside, galement appele quercitrine est confirme dans ECC.
OH
3' 2' 4' 5' 6' 1'' 6 5 10 4 3 5'' 6''
OH
HO
7
8 9
1'
O
2''
O OH
3''
OH OH
4''
OH
Figure III 74. Structure de la querctine-3-O--rhamnopyranoside (compos O)
136
III. Rsultats
4.5.2. Dtermination de structure du compos P

Le compos P se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu prsentant une fluorescence verte sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Spectromtrie de masse. La masse molculaire de 418 u a t dtermine par le spectre de masse en ESI du compos P qui prsentait un ion quasi-molculaire m/z 417 [M-H]. De plus, le fragment m/z 285 [M-H-132] dmontre la perte dune unit pentose et peut correspondre une gnine de type kaempfrol (figure III 76).
[M-H]
Y0 [Y0-H-CH2O] Y0 - 132 u
[Y0-H-2CO-2H]
Figure III 75. Spectre de masse du compos P (ESI, MeOH)
Spectromtrie de RMN. En raison de la trs faible quantit de produit obtenue (< 2 mg), les spectres de RMN du compos P ont t enregistrs sur un appareil fonctionnant une frquence de 500 MHz quip dune cryosonde permettant dobtenir un trs bon rapport signal/bruit et damliorer la rsolution. Lanalyse du spectre de RMN-1H du compos P a confirm la prsence des signaux des protons de la gnine kaempfrol ainsi que la prsence du signal du proton anomrique dun sucre H 5.15 ppm (d, J = 6.4 Hz). Les dplacements des autres protons de ce sucre sont caractristiques dun arabinose (H 3.91, 3.65, 3.81, 3.43 et 3.78 pour, respectivement, H-2, H-3, H-4 et les deux protons H-5) [Agrawal, 1992]. De plus, la constante de couplage entre H-2 et H-3 de J = 8.2 Hz indique une configuration trans-diaxiale, alors que la constante de couplage entre H-3 et H-4 (J = 3.2 Hz) implique une orientation axial-equatorial, c'est--dire la configuration dun arabinopyranose (figure III 77).
137
III. Rsultats
Figure III 76. Spectre de RMN-1H du compos P dans MeOD.
Lanalyse des 20 signaux du spectre de RMN-13C du compos P a indiqu dans lensemble une forte similitude avec celui du compos F (kaempfrol-3-O-rutinoside), lexception de la rgion des signaux des sucres. Les signaux en dehors de cette rgion ont confirm que la gnine du compos P est nouveau du kaempfrol [Ternai et Markham, 1976]. Les signaux de RMN-13C de la rgion des sucres sont caractristiques dun arabinose (C 71.3, 72.6, 67.6 et 65.4 ppm pour respectivement C-2, C-3, C-4 et C-5) [Agrawal, 1992].
Figure III 77. Spectre de RMN-13C du compos P dans MeOD.
138
III. Rsultats
La forme pyranose est confirme par le dplacement chimique du carbone C-4 (C 67.6 ppm contre ~ 85 ppm dans le cas dune forme furanose) [Agrawal, 1992]. Le doublet de constante de couplage J = 6.4 Hz form par le proton anomrique (C 103.0 / H 5.15 ppm) indique une orientation en axial du proton et de ce fait une liaison en avec la gnine. Lattribution complte des signaux a t ralise par lanalyse des spectres de corrlations homonuclaires COSY et htronuclaires HSQC et HMBC et par comparaison avec des donnes de la littrature. Le spectre HMBC a, en outre, permis de situer la liaison du sucre sur la gnine en montrant clairement le couplage du proton anomrique du pentose (H-1) avec le carbone C-3 de la gnine. Le compos P est donc identifi comme tant le kaempfrol-3-O--arabinopyranoside.
3' 2' 4' 5' 6' 4
OH
HO
7 6
8 9
1'
10 5
O
1''
OH
OH 5'' O
3'' 2'' 4''
OH
OH
Figure III 78. Structure du kaempfrol-3-O--arabinopyranoside (compos P).
139
III. Rsultats
4.5.3. Dtermination de structure du compos Q

Le compos Q se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu prsentant une fluorescence verte sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Spectromtrie de masse. Les ions prsents sur les spectres de masse en ESI des composs P et Q sont absolument identiques, seules diffrent les intensits relatives des diffrents ions (figure III 80). La spectromtrie de masse nous permet donc nouveau denvisager pour Q une structure du type kaempfrol-O-pentose, isomre du compos P.
Y0 [M-H]
- 132 u Y0 [M-H-CH2O] [M-H-2CO-2H]
Figure III 79. Spectre de masse du compos Q (ESI, MeOH)
Spectromtrie de RMN. Pour Q et R, comme prcdemment pour le compos P, les spectres RMN ont t obtenus sur un appareil fonctionnant une frquence de 500 MHz quip dune cryosonde pour amliorer le signal. Lanalyse du spectre de RMN-13C (figure III 81) a indiqu dans lensemble une forte similitude avec celui du compos P, lexception de la rgion des signaux des sucres. Les signaux en dehors de cette rgion ont confirm que la gnine du compos N est nouveau du kaempfrol. Les signaux RMN-13C et RMN-1H de la rgion des sucres sont absolument identiques ceux du compos B (querctine-3-O--arabinofuranoside).
140
III. Rsultats
Figure III 80. Spectre de RMN-13C du compos Q dans MeOD.
Le signal du proton anomrique apparat comme un doublet de constante J = 0.4 Hz, impliquant une anomrie de configuration . Lattribution complte des signaux carbones et protons a t ralise laide des spectres HSQC et HMBC et lensemble de ces donnes nous permet dtablir la structure de Q comme tant le kaempfrol-3-O--arabinofuranoside ou euglanine.
3' 2' 4' 5' 6' 1''' 6 5 10 4 3
OH
HO
7
8 9
1'
4'''
OH
5'''
O
2'''
O HO
3'''
OH
OH
Figure III 81. Structure du kaempfrol-3-O--arabinofuranoside (compos Q).
141
III. Rsultats
4.5.4. Dtermination de structure du compos R

Le compos R se prsente sous forme dune poudre jaune soluble dans le mthanol. Ce compos ragit avec le ractif de Neu en prsentant une fluorescence verte sous UV 365 mn laissant envisager une structure de type flavonode. Spectromtrie de masse. La masse molculaire de 432 u a t dtermine par le spectre de masse en ESI qui prsentait un ion quasi-molculaire m/z 431 [M-H]. De plus, le fragment le plus abondant m/z 285 [M-H-146] dmontre la perte dune unit dsoxyhexose et suppose la prsence dune gnine kaempfrol (figure III 83).
Y0
Y0 - 146 u Y0
Figure III 82. Spectre de masse du compos R (ESI, MeOH)
Spectromtrie de RMN. Sur le spectre de RMN-1H du compos R (figure III 84), nous retrouvons, comme dans le cas des composs Q et P, les signaux caractristiques de la gnine kaempfrol. Le signal du proton anomrique du sucre est galement visible H 5.40 ppm.
Figure III 83. Spectre de RMN-1H du compos R dans MeOD.

142
III. Rsultats
Comme dans le cas du compos P, les signaux du sucre sont caractristiques dun rhamnopyranoside dont la liaison anomrique est en position (constante de couplage entre H-1 et H-2 de J = 1.6 Hz). Les 20 signaux RMN-13C du spectre du compos R (figure III 85) confirment que nous sommes en prsence des signaux caractristiques dune gnine kaempfrol et dun rhamnopyranoside. Ces deux lments sont lis par une liaison osidique en position 3 de la gnine comme latteste la corrlation sur le spectre HMBC de R entre le proton anomrique H-1 et la carbone C-3.
Figure III 84. Spectre de RMN-13C du compos R dans MeOD.
Lensemble de ces donnes nous permet dtablir la structure de R comme tant le kaempfrol-3-O-rhamnopyranoside, galement appel afzline.
3' 2' 4' 5' 6' 1'' 6 5 10 4 3 5'' 6''
OH
HO
7
8 9
1'
O
2''
O OH
3''
OH OH
4''
OH
Figure III 85. Structure du kaempfrol-3-O--rhamnopyranoside (compos R).
143
III. Rsultats
4.6. Conclusion de ltude phytochimique de Embelia concinna

Ltude phytochimique de lextrait F3 de Embelia concinna a permis de renforcer la connaissance phytochimique de cette plante. Dix composs ont t identifis dans cet extrait : taraxrol (I), 5(8(Z),11(Z),14(Z)-heptadcatrienyl)rsorcinol (J), acide linolnique (K), querctine (L), kaempfrol (M), acide chlorognique (N), quercitrine (O), kaempfrol-3-O--arabinopyranoside (P), euglanine (Q) et afzline (R). La prsence des gnines libres querctine et kaempfrol dans lextrait ECC F3 est en accord avec lidentification des flavonodes glycosyls de cet extrait dont les gnines sont soit la querctine soit le kaempfrol. Le compos J peut tre utilis comme traceur spcifique puisquil na, notre connaissance, t dcrit dans aucune espce de la famille des Myrsinaceae. Les traceurs flavonodiques dont certains sont disponibles commercialement (composs L, M, N et O) seront prfrs pour les dosages de lextrait.
144
IV. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
IV. Conclusion et perspectives
La flore malgache est lune des plus riches au monde et possde de nombreuses plantes utilises en mdecine traditionnelle. Parmi elles, quatre plantes ont fait lobjet dune tude phytochimique approfondie. Cette tude sinscrit dans le cadre des travaux de recherche de lquipe Recherche et Dveloppement de Serdex, division de Bayer Consumer Care. Lobjectif tait lidentification de molcules, le dveloppement de techniques analytiques destines optimiser la recherche sur ces plantes et la mise en vidence de diffrents traceurs spcifiques en vue du dosage des extraits de ces plantes. En effet, la dtermination de la composition chimique dun extrait vgtal, la mise en vidence dventuelles spcificits et le contrle de sa qualit sont des tapes pralables cruciales au dveloppement et la commercialisation de cet extrait qui ncessitent la mise en place de mthodes danalyse spcifiques. Nous avons prsent les rsultats de ltude phytochimique des quatre plantes Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver, Agauria polyphylla Baker, Tambourissa trichophylla Baker et Embelia concinna Baker. Agauria salicifolia et Agauria polyphylla. La mise en place de techniques chromatographiques classiques de fractionnement des extraits de feuilles de Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver et Agauria polyphylla Baker a conduit lisolement et lidentification dun flavonol de Agauria salicifolia : la querctine-3-O-glucuronide (miqulianine (D)) ainsi que de trois molcules de Agauria polyphylla : deux flavonodes, la querctine-3-O-arabinofuranoside (avicularine (A)) et lpicatchine (B) et un triterpne pentacyclique, le lupol (C). Cette premire tape a permis de mettre en vidence la prsence de proanthocyanidols dans ces espces du genre Agauria. Ces espces ont dailleurs t tudies en parallle en raison de leur grande parent. Nous avons ralis une tude comparative par LC-MS de la composition des fractions flavonodiques de Agauria salicifolia et Agauria polyphylla. Cela a abouti lidentification on line c'est--dire sans isolement pralable de 8 composs de type flavonols glycosyls : la querctine-3-O-galactoside (hyproside), la querctine-3-O-glucoside (isoquercitrine), la querctine-3-O-rhamnoside (quercitroside), la gnine querctine, le kaempfrol-3-O-arabinopyranoside, le kaempfrol-3-O-arabinofuranoside, le kaempfrol-3-Orhamnoside (afzline) et le kaempfrol-3-O-glucuronide. Cette tude dmontre lefficacit de la technique danalyse que sont la LC-MS et la LC-MSn. Dans ce cas prcis o les techniques chromatographiques navaient donn que peu de rsultats, la LC-MS applique aux flavonodes a permis didentifier plus rapidement un nombre beaucoup plus important de composs sans avoir les isoler. Ceci est un bon exemple de dereplication, procdure utilise en phytochimie pour viter de r-isoler des composs connus.
146
Nous avons galement mis en vidence des diffrences phytochimiques entre ces deux espces : en effet, la miqulianine et le kaempfrol-3-O-glucuronide, deux flavonols substituants acide glucuronique ne sont prsents que dans Agauria salicifolia. Ce rsultat est important car il apporte un lment de rponse supplmentaire au problme taxonomique de la diffrenciation de ces deux espces. Comme nous lavons montr au chapitre II, il est difficile de diffrencier ces deux espces sur le plan botanique. Elles sont morphologiquement proches et Agauria salicifolia est dcrite comme tant polymorphe, Agauria polyphylla pourrait ne pas tre une espce part entire mais seulement une des formes de Agauria salicifolia. Dans loptique dun dveloppement industriel des extraits dAgauria polyphylla, la spectromtrie de masse apporte uns solution simple et fiable ce problme de diffrenciation. La distinction entre ces espces, base des molcules spcifiques et surtout sur un type de substituant spcifique Agauria salicifolia permet denvisager la mise en place de techniques danalyse diffrentielles par spectromtrie de masse en infusion directe de lextrait flavonodique. En saffranchissant de la sparation par HPLC, lanalyse devient plus simple et plus rapide et ne consiste plus quen la dtection dune perte de neutre correspondant au glucuronide dans lextrait. Agauria salicifolia et Agauria polyphylla nayant pas dmontr les mmes activits biologiques ni mme la mme toxicit (Agauria salicifolia semble plus toxique), cette technique danalyse, un fois valide, permettra dauthentifier lorigine dun extrait et mme de dceler dventuelles falsifications dAgauria polyphylla par Agauria salicifolia. En vue de lutilisation en cosmtique de lespce A. polyphylla, il serait galement ncessaire de pouvoir certifier labsence des composs diterpniques de type grayanotoxines (dcrits dans le genre Agauria) dans les extraits dintrt. Pour cela, une recherche plus cible de ces composs dans les extraits de A. salicifolia et A. polyphylla devrait tre entreprise et une mthode danalyse spcifique devrait tre mise en place. Tambourissa trichophylla. Lanalyse des extraits des feuilles de lespce Tambourissa trichophylla Baker a elle aussi t rendue difficile par la prsence de composs de type proanthocyanidols. La technique qui sest avre tre la plus efficace dans ce cas pour isoler et identifier des composs flavonodiques pour servir de traceurs est la chromatographie de partage centrifuge. A ce stade, trois molcules dont lassociation est spcifique de Tambourissa trichophylla ont t identifies et slectionnes pour servir de traceurs pour lextrait pilote industriel mis en place par Serdex : la rutine (E), la nicotiflorine (F) et lisoquercitrine (H). La mthode danalyse de cet extrait par HPLC reste valider. Malgr les rsultats des tudes phytochimiques antrieures attestant de la prsence dalcalodes dans de nombreuses Monimiaceae, aucun compos de cette classe na t dtect ou isol lors de ce travail. Dans une optique de valorisation de la ressource vgtale, les huiles essentielles de feuilles et dcorce de Tambourissa trichophylla vont tre tudies car elles ont donn des rsultats prometteurs contre Plasmodium falciparum, agent responsable du paludisme. Lanalyse de ces huiles essentielles par GC-MS est en cours et les rsultats chimiques et biologiques devraient donner lieu une publication scientifique.
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Embelia concinna. Dix composs (I R) ont t isols des extraits de feuilles dEmbelia concinna. Tous sont dcrits pour la premire fois dans cette espce. Le taraxrol (I), le 5-(8(Z),11(Z),14(Z)heptadcatrienyl)rsorcinol (J), lacide linolnique (K), le kaempfrol-3-O--arabinopyranoside (P), leuglanine (Q) et lafzline (R) ont t isols et identifis par des techniques chromatographiques et spectrales classiques (RMN 1D et 2D). Les quatre autres molcules, la querctine (L), le kaempfrol (M), lacide chlorognique (N) et la quercitrine (O) ont t identifis uniquement sur la base de leur comportement en LC-MS et en spectromtrie de masse. Lidentification par RMN du compos O a permis de confirmer lidentification faite par spectromtrie de masse et de montrer une fois de plus lefficacit de cette technique applique lidentification des flavonodes. Cette technique permet donc davoir accs rapidement lidentification dun certain nombre de molcules pouvant servir dempreinte chimique pour un extrait de plante donn. Aucune benzoquinone, pourtant largement dcrites dans le genre Embelia, na t isole ni dtecte dans lespce Embelia concinna, ce qui pourrait expliquer son absence de toxicit. Ces composs, ainsi que les alkylresorcinols auxquels appartient le compos J, sont connus pour tre cytotoxique et prsenter une large gamme dactivits biologiques notamment en tant quantimicrobiens et antiparasitaires [Kozubek et Tyman, 1999]. Il serait donc extrmement intressant de dterminer si ces composs sont les principes actifs dEmbelia concinna et de les rechercher de faon plus cible dans cette espce.
De faon gnrale, il sera ncessaire, la suite de cette tude, de chercher dterminer les molcules responsables des activits des plantes Agauria polyphylla, Tambourissa trichophylla et Embelia concinna. Pour cela, des mthodes in vitro rapides de dtermination des activits seront mettre au point, tout dabord pour tester les molcules dj isoles, puis, pour tre utilises en vue dun fractionnement bioguid.
Cette tude a permis de mieux connatre la chimie de quelques plantes tropicales malgaches. Seule une faible partie des 10 12 000 espces de la flore malgache a t caractrise du point de vue phytochimique. Les sujets dtude dans ce domaine ne manquent donc pas et chaque plante est un rservoir potentiel de mtabolites avec des caractristiques phytochimiques et pharmacochimiques originales valoriser.
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V. MATERIELS ET METHODES
V. Matriels et mthodes
1. Matriel vgtal et extraction

Les 4 plantes de cette tude, Agauria salicifolia, Agauria polyphylla, Embelia concinna, Tambourissa trychophylla ont t rcoltes Madagascar en 2004 dans les forts secondaires daltitudes de la rgion de Muramanga. Ces plantes ont t identifies par un botaniste malgache, M. Hery et des chantillons de rfrence se trouvent dans lherbier du laboratoire de Pharmacognosie de la Facult des Sciences Pharmaceutiques de Toulouse (sous les rfrences, respectivement, ASA 0403, APY 0403, ECC 0403 et TTI 0403). Les drogues ont t sches et broyes avant dtre extraites par la socit Sotramex Madagascar suivant le processus dcrit figure V 1. La drogue est extraite par macration agite lthanol 70 % 50 C. Lextrait thanolique obtenu, appel F1, est ensuite dgraiss lhexane par extraction liquide-liquide. La fraction hexanique obtenue est appele F2. Lextrait thanolique dgraiss est vapor siccit puis le rsidu, solubilis dans leau, est partag par extraction liquide-liquide entre lactate dthyle et leau. Lextrait actate dthyle est appel F3 et lextrait aqueux rsiduel est appel F4.
Drogue pulvrise
Marc
Macration dans EtOH 70 % Filtration Evaporation de lEtOH Extrait thanolique en solution dans leau Fraction thanolique F1
Evaporation siccit
Partage contre Hexane Evaporation
Extrait thanolique dgraiss
Fraction hexanique F2
Evaporation Solubilisation dans leau Partage contre Actate dthyle
Fraction aqueuse F4
Fraction actate dthyle F3
Figure V 1. Schma dextraction des plantes de cette tude et obtention des fractions F1 F4.
Pour cette tude, nous disposions pour chacune des plantes des fractions F1 F4 et denviron 1 kg de feuilles sches.
150
Tableau IV 1. Quantits dextraits disponibles.
APY F1 APY F2 APY F3 APY F4
48.7 g 11.7 g 12.8 g 64.2 g
ASA F1 ASA F2 ASA F3 ASA F4
43.6 g 4.5 g 17.5 g 52.9 g
TTI F1 TTI F2 TTI F3 TTI F4
64.0 g 4.6 g 24.5 g 48.9 g
ECC F1 ECC F2 ECC F3 ECC F4
37.6 g 5.4 g 7.3 g 48.9 g
En outre, compte tenu du dmarrage dun dveloppement industriel de lextrait de Tambourissa trichophylla par Serdex, nous avons eu notre disposition quelques grammes dextraits TTI F3 provenant de lots diffrents de plantes (appels lot 0227, lot 0408 et lot 0418).
2. Mthodes chromatographiques analytiques

2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
Utilises chaque tape pour le suivi et le contrle des purifications, les chromatogrammes sur couche mince permettent de vrifier la prsence et ltat de puret des produits suivis. Les analyses sur couche mince sont ralises en phase normale sur des plaques daluminium Silicagel 60 F254 (Merck). Le dveloppement des plaques seffectue dans des cuves en verre satures avec lluant appropri. Cette phase mobile est constitue dun mlange binaire, tertiaire ou quaternaire de solvants selon le type de sparation souhaite. Dans notre cas, les systmes de solvants pour les diffrentes classes de composs sont les suivants (les proportions sont donnes en volume et ils sont classs par polarit croissante) : Tol / AcOEt / MeOH (80 : 18 : 2) HCCl3 / MeOH (90 : 10) HCCl3 / MeOH / H2O (65 : 25 : 4) AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10) AcOEt / Acide formique / Acide actique / H2O (100 : 11 : 11 : 20) Lobservation des CCM seffectue en lumire visible et sous UV (254 et 356 nm), avant et, dans certains cas, aprs rvlation par les ractifs appropris. Lutilisation de diffrents ractifs permet de rassembler judicieusement les fractions rcoltes suites aux diffrentes chromatographies
151
Les ractifs utiliss pour le prsent travail sont les suivants : Ractif la Vanilline sulfurique (Rvlateur polyvalent). Prparer une solution compose de 1 g de vanilline, 2 ml dacide sulfurique et de lthanol 95% q.s.p. 100 ml. Aprs pulvrisation, chauffer la plaque de CCM 110C pendant 5 minutes environ. Plusieurs colorations apparaissent en fonction du type de composs. Ractif de Neu ou NP/PEG (Rvlateur des flavonodes). Prparer une solution A compose de 1 g dacide amino-2-thyldiphnylborique et de 100 mL de mthanol et une solution B compose de 5 g de PEG 4000 et de 100 mL d thanol. Pulvriser un mlange de 10 mL de solution A et 8 mL de solution B. Chauffer la plaque de CCM 110 C pendant 2 minutes environ [Wagner et Bladt, 2001]. Observs en lumire UV 366 nm, les flavonodes apparaissent sous forme de taches fluorescentes jaunes, vertes ou orange. Ractif de Dragendorff (Rvlateur des alcalodes). Prparer une solution compose de 0,85 g de nitrate basique de bismuth et 10 g dacide tartrique dans 40 mL deau (solution A) et une solution contenant 16 g de KI dans 40 mL deau (solution B). Mlanger extemporanment 5 mL de A, 5 mL de B, 100 mL deau et 20 g dacide tartrique. Vaporiser le mlange sur la plaque [Merck, 1975]. Les alcalodes apparaissent sous forme de taches orange. Ractif au Thymol sulfurique (Ractif des sucres). Prparer une solution compose de 0,5 g de thymol dans 95 mL dthanol puis ajouter 5 mL dacide sulfurique concentr. Aprs pulvrisation, chauffer la plaque de CCM 110C pendant 15 minutes environ. Les sucres apparaissent sous forme de taches roses [Merck, 1975]. Ractif au sel de Bleu solide B (pour la dtection des phnols et des tanins). Vaporiser avec une solution de 0,5 g sel de bleu solide B (sel de diazonium du di-O-anisidine) dans un mlange actone / eau (9:1, V/V), frachement prpar. Puis vaporiser avec 0,1 M dune solution de soude caustique. Les tanins apparaissent sous forme de taches rouge vif. Ractif de Liebermann et Burchard (Ractif des strols, strodes et triterpnes). Prparer, basse temprature et juste avant emploi, une solution de 5 mL danhydride actique, 5 mL dacide sulfurique concentr et q.s.p. 50 mL dthanol 95 %. Aprs pulvrisation, chauffer la plaque de CCM 110C pendant 10 minutes. Les composs rvls prsentent en fluorescence 366 nm.
152
2.2. Chromatographie liquide haute performance (HPLC/DAD-UV)

Les analyses HPLC/UV(DAD) ont t effectues l'aide d'une chane HPLC Merck Hitachi Lachrom munie dune pompe Lachrom 7100 et dun dtecteur UV barrettes de diodes (DAD-UV) Merck Hitachi Lachrom 7455 pilots par le logiciel D-7000 HSM (Merck). Les analyses ont t ralises en phase inverse avec une colonne HPLC de type LiChrospher RP-18 (Merck) (5 m, 250 x 4.5 mm). Pour toutes les analyses, les conditions chromatographiques sont un gradient de MeCN dans de leau acidifie (acide formique 0.1 %). Les solvants utiliss sont de qualit HPLC et le dbit est fix 1 mL/min. En rgle gnrale, pour lanalyse HPLC/UV des extraits bruts, des solutions de 1 3 mg/ml ont t utilises. Le solvant dinjection est de composition identique celui du solvant initial de lanalyse et le volume dinjection fix 20 L. Conditions chromatographiques particulires : Composs L et M et tmoins querctine et keampfrol : lution isocratique MeCN / HCOOH 0.1 % (80 : 20, V/V), pendant 40 min. Dtection 250 nm. Compos N : lution isocratique MeCN / HCOOH 0.1 % (87 : 13, V/V), pendant 40 min. Dtection 250 nm. Compos O : lution isocratique MeCN / HCOOH 0.1 % (80 : 20, V/V), pendant 40 min. Dtection 250 nm. Analyse de TTI : elution par gradient MeCN (A) / HCOOH 0.1 % (B) : 0 7 min, 10 % A, 7 45 min, de 10 20 % de A, de 45 55 min, de 20 30 % de A puis de 55 60 min, de 30 50 % de A avant de retourner aux conditions initiales. Dtection 275 et 340 nm.
2.3. Chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (LC-MS)

Les analyses LC-MS ont t effectues sur lappareillage constitu des lments suivants : Systme HPLC Perkin Elmer series 200 muni dune pompe quaternaire (PE series 200), dun autosampler (PE series 200) et dun dtecteur UV barrettes de diodes (PE 785 A). Spectromtre de masse triple quadriple Perkin-Elmer Sciex Api 365 quip dune interface dionisation electrospray et contrl par le logiciel Analyst (version 1.3.1). Les extraits flavonodiques dAgauria salicifolia et Agauria polyphylla ont t injects sur une colonne HPLC C18 Symetry (Waters) (3.5 m, 75 x 4.6 mm). Les sparations ont t menes temprature ambiante
153
avec une phase mobile constitue de deux solvants eau-acide formique 0.1 % (A) et actonitrile (B) dans les conditions suivantes : de 0 35 min, 13 % B pendant 35 min, puis en 2 min un gradient linaire de 13 20 % B, 20 % de B pendant 8 min, puis en 2 min un gradient linaire de 20 100 % B, enfin, retour aux conditions initiales (13 % B) en une minute pour rquilibrer la colonne avant une nouvelle injection. Pour toutes les analyses, les solvants utiliss sont de qualit HPLC (SDS, Peypin), le dbit est regl 0.7 mL/min, et la longueur donde de mesure fixe 260 nm. Le volume dinjection varie entre 20 et 100 L en fonction de compos ou de lextrait inject.
3. Mthodes chromatographiques prparatives

3.1. Chromatographie sur colonne ouverte (CC)
Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont t mis en uvre dans des colonnes en verre. La taille et le diamtre de la colonne sont choisis en fonction de la quantit dchantillon purifier et de la rsolution souhaite. Pour les chromatographies dadsorption, la phase stationnaire utilise est la silice en phase normale SDS 60 70-200 m (SDS, Peypin) pralablement active quelques heures ltuve 110 C. Llution est ralise par simple gravit. La quantit de silice utilise est gnralement 30 50 fois suprieure la quantit dchantillon dpose. Lextrait fractionner est adsorb sur une quantit de silice correspondant environ 2 fois sa masse et le dpt de lextrait a lieu sous forme solide. Les chromatographies dexclusion sont ralises sur gel de Sephadex LH20. Les fractions recueillies sont regroupes selon les rsultats de lanalyse par CCM.
3.2. Chromatographie liquide moyenne pression (MPLC)

La chromatographie liquide moyenne pression (MPLC) est ralise laide dune pompe Bchi 688, sur colonnes de chromatographie moyenne pression en verre Bchi remplies soit avec de la silice SDS 60 6-35 m (SDS, Peypin) en phase normale (pralablement active quelques heures ltuve 110 C), soit avec de la silice en phase inverse de type C18 90 40-60 m (AIT, Le Mesnil le Roy). Lchantillon est introduit sous forme solide mlang la phase stationnaire. Les systmes dlution utiliss sont gnralement des mlanges binaires dans des proportions variables au cours de llution. La colonne est lue avec un dbit denviron 20 mL/min et la pression est en moyenne de 2 bar. Les fractions recueillies sont regroupes selon les rsultats de lanalyse par CCM.
3.3. Chromatographie sur cartouches de silice C18 (VAC ELUT)

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Les colonnes prtes lemploi Analytichem MEGA BOND ELUTTM (VARIAN) utilises sont garnies de silice greffe C18. Ces cartouches, associes une unit de filtration sous vide Vac Elut SPS 24 (Analytichem International), autorisent un rglage de dbit prcis laide dune molette et dun manomtre, sous vide contrl.
3.4. Chromatographie prparative sur couche mince

Le compos I a t purifi par chromatographie prparative sur couche mince. Les plaques utilises sont des plaques gel de silice de 2 mm sur verre (Merck 60 F254). Lchantillon a t solubilis dans du chloroforme puis dpos sur la plaque laide dun dposeur automatique Camag ATS4. La plaque a t dveloppe dans une cuve sature contenant le mlange Tol / MeOH (90 : 10, V/V) Une frange de la plaque a t rvle par pulvrisation du ractif la vanilline sulfurique. La silice contenant le compos I a ensuite t rcupr laide dune spatule. La silice est ensuite disperse dans une petite quantit de solvant, puis filtre sous vide pour permettre la rcupration du compos I.
3.5. Chromatographie de partage centrifuge (CPC)

Base sur une technique de chromatographie de partage liquide/liquide, la chromatographie de partage centrifuge (CPC) utilise le principe de partage des soluts entre deux phases liquides non miscibles, prpares par mlange de deux ou plusieurs solvants ou solutions. Une phase est maintenue stationnaire par une force centrifuge, lautre pompe au travers, joue le rle de phase mobile permettant ainsi des changes entre les deux phases. La chromatographie de partage centrifuge a t utilise pour fractionner lextrait F3 de Tambourissa trychophylla. Ce fractionnement a t effectu grce un appareil FCPC Chromaton muni dun rotor de 200 mL rgl la vitesse de rotation de 2000 tours/min. La phase stationnaire est constitue de la phase suprieure du mlange tertiaire AcOEt / EtOH / H2O (2 : 1 : 2), la phase infrieure constituant la phase mobile est dlivre par une pompe Varian PS. Llution se fait en mode descendant un dbit de 8 mL/min. Les fractions ont t recueillies grce un collecteur automatique Varian PS et regroupes selon les rsultats de lanalyse par CCM.
3.6. Chromatographie liquide haute performance semi-prparative (HPLC semi-prp.)

Le systme HPLC semi-prparative est constitu de deux pompes Varian PS 218, dun dtecteur Varian PDA PS, dun enregistreur Varian Star et dun collecteur de fractions Varian PS 701.
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La sparation a t ralise sur une colonne XTerra RP18 (Waters) (10 m, 19 x 250 mm) en utilisant une pr-colonne XTerra RP18 (Waters). Le systme de solvants employ est MeCN / H2O additionn de 0.1 % dacide formique. Le dbit dlution est de 21.6 mL/min. La dtection se fait 250 nm. Conditions chromatographiques spcifiques : Compos D : lution par gradient MeCN / HCOOH 0.1 % (10 : 90) (20 : 80) en 20 minutes. Le compos D est lu 18 minutes. Compos H : lution isocratique par MeCN / acide formique 0.3 % (30 : 70) pendant 40 min. Le compos H est lu 27 minutes.
4. Mthodes physico-chimiques
4.1. Pouvoir rotatoire
Le pouvoir rotatoire des molcules B et G a t mesur sur un polarimtre de type Perkin-Elmer 241 la longueur donde de la raie D du sodium (= 589 nm) dans une cuve de 10 cm temprature ambiante. Le pouvoir rotatoire spcifique []D, exprim en degr, est calcul partir de la formule suivante : []D = 1000 . / l . c ( : angle de rotation, en degr, lu sur le polarimtre, l : longueur, en dm, de la cuve de mesure, c : concentration de la molcule en solution en g/L)
4.2. Spectromtrie Ultraviolet (UV)

Les spectres U.V. des composs ont t mesurs dans le mthanol laide dun spectrophotomtre de type Perkin-Elmer UV/Vis Lambda 20, double faisceau permettant des lectures directes contre tmoin. Les mesures se font dans des cuves de quartz trajet optique de 1 cm.
4.3. Spectromtrie Infra-rouge (IR)

Les spectres infra-rouge des molcules ont t raliss au moyen dun spectrophotomtre Perkin-Elmer Paragon 1000 FT-IR dans des pastilles de KBr.
4.4. Spectromtrie de masse (MS)

Les spectres de masse des produits purs isols ont t obtenus par plusieurs modes dionisation.
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Ionisation par Electrospray (Electro Spray Ionisation) ESI Lionisation est ici produite par application, pression atmosphrique, dun fort champ lectrique (3 6 KeV) sur un liquide traversant un capillaire un faible dbit (1-10 l.min-1). Ce champ provoque une accumulation de charges la surface du liquide, situ lextrmit du capillaire. La rupture de la phase liquide forme des gouttelettes hautement charges (Spray). Lvaporation du solvant contenu dans ces gouttelettes va provoquer leur rtrcissement jusquau sommet o des forces coulombiennes rpulsives vont approcher le niveau des forces de cohsion de celle-ci et provoquer leur explosion. Ces gouttelettes subissent alors une cascade de fissions donnant des gouttelettes de plus en plus petites, jusquau moment o le champ lectrique en leur surface devient suffisant pour provoquer la dsorption des ions. Ces ions ainsi produits sont porteurs dun grand nombre de charges sil existe plusieurs sites ionisables sur la molcule. Les spectres ESI ont t enregistrs en modes positifs et ngatifs sur un spectromtre triple quadriple Sciex API 365 (Perkin-Elmer) contrl par le logiciel Analyst (Agilent, version 1.3.1). Ionisation par chimique pression atmosphrique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) APCI LAPCI est une technique dionisation qui fait appel des ractions ions-molcules en phase gazeuse pression atmosphrique. Cest une technique analogue lionisation chimique (CI) o les ions primaires sont produits par des dcharges Corona sur un arosol de solvant. Lluat chromatographique (maximum 2 mL/min) est directement introduit dans un nbuliseur pneumatique o il est converti en un fin brouillard laide dun jet dair ou dazote haute vitesse. Les gouttelettes sont alors dplaces par le flux gazeux au travers dun tube de quartz chauff, appel chambre de dsolvatation / vaporisation. La chaleur transfre aux gouttelettes de larosol va permettre la vaporisation de la phase mobile et de lchantillon dans le courant de gaz. Le contrle de la temprature dans cette chambre rend les conditions de vaporisation dpendantes du dbit et de la nature de la phase mobile. Le gaz chaud (120 C) et les substances sortent de ce tube pour arriver dans la rgion de transfert de la source se trouvant pression atmosphrique o ils sont ioniss chimiquement par le transfert de protons en mode positif et le transfert dlectrons en mode ngatif. En gnral, la phase mobile vaporise joue le rle de gaz ionisant en produisant des ions pseudomolculaires [de Hoffman et al., 1999]. Les spectres APCI on t raliss sur un spectromtre trappe dion Finnigan LCQ ion trap (ThermoFinnigan). Impact Electronique (Electronic Impact) EI En EI, un faisceau dlectrons de haute nergie bombarde les molcules en phase gazeuse et le spectromtre de masse enregistre les impacts dlectrons sous la forme dun spectre dions positifs spars sur la base du rapport masse/charge (m/z). Les fragments sont forms partir de lion molculaire et la plupart dentre eux portent une charge positive unitaire. Lionisation par impact lectronique prsente un inconvnient quant au reprage de lion molculaire, dintensit souvent trs faible, voire indtectable.
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Les spectres de masse en EI ont t raliss sur un spectromtre Nermag R-10-10 avec un champ de 70 eV. Spectromtrie de masse haute rsolution Les spectres de masse de haute rsolution ont t enregistrs en electrospray sur un appareil Q-Tof Ultima (Waters). Ces analyses ont t menes par Vrna Poinsot du Laboratoire des Interactions Molculaires et Ractivit Chimique et Photochimique de lUniversit Paul Sabatier de Toulouse.
4.5. Spectromtrie de rsonance magntique nuclaire (RMN)

Les spectres de rsonance magntique nuclaire ont t enregistrs au service commun de RMN de lUniversit Paul Sabatier de Toulouse sur des appareils de type Brker Avance 300 (frquences de 300.13 (1H) et 75.46 MHz (13C)), ou Brker Avance 500 avec cryosonde (frquences de 500.13 (1H) et 125.75 MHz (13C)) selon la quantit de produit analyser et la rsolution souhaite. Les chantillons ont t solubiliss dans les solvants deutrs CDCl3, DMSO-d6, CD3OD et D2O (Eurisotop, Gif sur Yvette) dans des tubes analytiques de 5 mm de diamtre. Les dplacements chimiques () sont exprims en ppm par rapport au ttramthylsilane (TMS) ; les constantes de couplage sont exprimes en Hz. Les programmes de squences impulsionnelles standard fournies par Brker ont permis de raliser les expriences bidimensionnelles COSY, NOESY, HSQC et HMBC. Corrlations homonuclaires - COSY (1H 1H): cette exprience fournit des informations sur les couplages homonuclaires 2J et 3J (protons spars par deux ou trois liaisons) entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents. - NOESY (1H 1H) : cette technique permet dobserver, dans lespace, les corrlations entre protons (effets Overhauser) dune mme molcule. Corrlations htronuclaires - HSQC (1JHC) : cette technique permet d'observer les couplages chimiques entre les carbones et les protons directement lis entre eux. - HMBC (2JHC, 3JHC) : cette technique permet la dtection des couplages longue distance 2JHC et 2JHC.
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Sites Internet
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greifswald.de/gallery/yamasaki.htm. Site Internet de la banque de donnes Prelude : utilisation de plantes en mdecine traditionnelle vtrinaire et humaine en Afrique sub-Saharienne : www.metafro.be
171
VII. ANNEXES
VII. Annexes
Constantes physiques et donnes spectrales des composs isols
Chromatographies sur couche mince

Solvant de migration : AcOEt / MeOH / H2O (100 : 13.5 : 10) Rvlation : Ractif de Neu (observation 366 nm) ou Ractif la vanilline sulfurique
Compos B Compos A
Compos B
APY F3
Compos A
TTI F3
Compos B
APY F3
Compos H Compos F Compos E Compos D
ASA F3
Compos D Compos L
TTT F3
Compos N
Composs ECC F3 O P Q R
173
VII. Annexes
Solvant de migration : Tol / AcOEt / MeOH (80 : 18 : 2) Rvlation : Ractif la vanilline sulfurique
Compos C
Compos I Compos K Compos J
APY F2
Compos C
ECC F3
174
VII. Annexes
Compos A
querctine-3-O--arabinofuranoside C20H18O11 masse : 434 poudre jaune
OH
3' 2' 4' 5' 6' 1''' 6 5 10 4 3 4'''
OH
HO
7
8 9
1'
OH
5'''
O
2'''
O HO
3'''
OH
OH
UV : max (MeOH) 258, 352 nm IR : max (KBr) 3350 (OH), 1650 (C=O), 1603 (cycle aromatique), 1200, 1110 (C-O) cm
-1
ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel) : 433 (100), 301 (57), 300 (42), 271 (40), 255 (20), 243 (11), 227 (5)
RMN (400 MHz, CD3OD)

position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Ara 1 2 3 4 5a 5b C 158.2 133.7 178.8 161.8 98.9 164.8 93.5 157.4 104.4 121.9 115.7 145.1 148.7 115.3 121.8 108.5 82.1 77.5 86.8 61.4 H 6.21 (d, J = 2.0 Hz) 6.40 (d, J = 2.0 Hz) 7.54 (d, J = 2.1 Hz) 6.92 (d, J = 8.3 Hz) 7.50 (dd, J = 8.3, 2.1Hz) 5.48 (d, J = 1.0 Hz) 4.35 (dd, J = 3.0, 1.0 Hz) 3.93 (dd, J = 5.0, 3.0 Hz) 3.89 m 3.52 (dd, J = 11.5, 4.5 Hz) 3.48 (dd, J = 11.5, 3.6 Hz)
175
VII. Annexes
Composs B (et G) (-)-picatchine

2'
OH
3' 4'
OH
C15H14O6 masse : 290 poudre brun-rougetre
HO
7 6
8 9
O
3 4
1' 2 6' 5'
10 5
OH
OH
[]D - 55 (c = 0,42 dans MeOH ) UV : max (MeOH) 226, 278 nm IR : max (KBr) 3192 (OH), 1606 (cycles aromatiques), 1283, 1144 (C-O) cm ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 289 (100), 244 (10), 221 (4) RMN (400 MHz, CD3OD)
-1
position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6
C 78.5 66.0 27.9 156.3 95.0 156.6 94.5 156.0 98.7 130.9 118.0 144.4 144.6 113.9 114.5
H 4.83 brs 4.19 (ddd, J = 4.5, 3.0, 1.5 Hz) 2.88 (dd, J = 16.7, 4.5 Hz) 2.75 (dd, J = 16.7, 3.0 Hz) 5.95 (d, J = 2.3 Hz) 5.93 (d, J = 2.3 Hz) 6.99 (d, J = 2.0 Hz) 6.77 (d, J = 8.2 Hz) 6.81 (ddd, J =8.2, 2.0, 0.6 Hz)
176
VII. Annexes
Compos C
29
(20)29-lupn-3-ol ou lupol
30
20
C30H50O
12 13 18
19
21 22
masse : 426
1
25
11
26 14
17 28 16 15
9 10 8 27
poudre blanche
2 3
HO
23
5 6
24
EI-MS m/z (int. rel) : 426 (34), 411 (12), 216 (100), 207 (66), 189 (91) IR : max (KBr) 3440 (OH), 3070, 1631, 877 (mthylne terminal) cm RMN (400 MHz, CDCl3)
-1
Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Jmod CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 CH C CH2 CH2 C CH CH C CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH3
C 38.7 27.5 79.0 38.9 55.3 19.3 34.3 40.8 50.5 37.2 20.9 25.2 38.1 42.8 27.4 35.6 43.0 48.3 47.9 151.0 29.9 40.0 28.0 15.4 16.1 16.0 14.6 18.0 109.3 19.3
H 1.68 m, 0.91 m 1.04 m, 1.61 m 3.20 (dt, J = 11.3, 5.1 Hz) 0.70 (d, J = 8.9 Hz) 1.40 m, 1.51 m 1.40 m 1.28 m 1.23 m, 1.42 m 1.08 m, 1.69 m 1.65 m 1.04 m, 1.61 m 1.45 m 1.37 m 2.40 (dd, J = 11.0, 5.6 Hz) 1.31 m, 1.93 m 1.20 m, 1.40 m 0.98 s 0.77 s 0.84 s 1.05 s 0.96 s 0.81 s 4.71 (dd, J = 2.5, 0.6 Hz), 4.58 (dd, J = 2.5, 1.3 Hz) 1.70 (dd, J = 1.3, 0.6 Hz)
177
VII. Annexes
Compos D querctine-3-O--glucuronopyranoside
OH
ou miqulianine
2' 3' 4' 5' 6' 4
OH
C21H18O13 masse : 478 poudre jaune
HO
7 6
8 9
1'
10
O
1'''
O
2''' 5'''
O
6'''
OH
OH
4'''
HO
3'''
OH OH
UV : max (MeOH) 254, 346 nm ESI-MS m/z : 477 (100), 301 (85) RMN (400 MHz, CD3OD)
Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 gluc 1 2 3 4 5 6
C 157.7 134.1 178.0 161.7 98.5 164.6 93.3 157.1 104.3 121.5 116.1 148.5 144.5 114.7 121.8 102.9 74.0 76.4 72.0 76.4 173.2
H 6.42 (d, J = 2.0 Hz) 6.23 (d, J = 2.0 Hz) 7.72 (d, J = 1.9 Hz) 6.87 (d, J = 8.4 Hz) 7.60 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz) 5.38 (d, J = 7.4 Hz) 3.56 m 3.50 m 3.61 m 3.78 m -
178
VII. Annexes
Compos E Rutine ou querctine-3-O--rutinoside
OH
3' 2'
O OH OH
4' 5' 5'' 2'' 3''
6'''
4'''
15
1''' 2'''
5''' 3'''
OH OH
C27H30O16
11
HO
masse : 610 poudre jaune
7 6
8 9
O
4
O
6'' 4''
1' 6'
17
O
1''
10
OH
HO
OH OH
UV : max (MeOH) 258, 352 nm IR : max (KBr) 3347 (OH), 3372, 3256, 1652 (C=O), 1603 (cycle aromatique), 1200 (C-O) cm
-1
ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 609 (100), 300 (57), 301 (42), 271 (40), 255 (20), 179 (11), 151 (5), (positif) m/z (int. rel) : 645 (10), 488 (21), 326 (20), 332 (100), 325 (50) RMN (400 MHz, CD3OD)
Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glu 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 6'' Rha 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' C 157.3 134.0 178.0 161.9 99.4 164.8 94.3 157.1 104.6 121.8 116.9 145.4 149.1 115.9 122.3 101.9 74.7 77.1 70.7 76.6 67.6 101.4 71.0 71.2 72.5 68.9 18.4 H 6.20 (d, J = 1.8 Hz) 6.39 (d, J = 1.8 Hz) 7.56 s 6.84 (d, J = 8.1 Hz) 7.54 (d, J = 8.0 Hz) 5.34 (d, J = 7.4 Hz) 3.23 m 3.23 m 3.07 m 3.27 m 3,30 m 3,71 (d, J = 10,3 Hz) 4,38 (d, J = 1,3 Hz) 3.39 m 3.29 m 3.09 m 3.28 m 0,99 (d, J = 6,2 Hz) Corrlations HMBC H-2', H-6 H-1Glu C-10
H-6 C-3', C-2 H-2' H-6' C-4' C-3, C-2Glu C-3Glu C-2Glu, C-4Glu C-3Glu, C-5Glu, C-6Glu C-4Glu, C-6Glu C-1Rha C-6Glu C-3Rha, C-5Rha, C-6Rha C-3Rha, C-4Rha, C-6Rha C-5Rha
179
VII. Annexes
Compos F kaempfrol-3-O--rutinoside ou nicotiflorine

2' 3'
O OH OH
4' 5' 5'' 2'' 3''
6'''
4'''
15
1''' 2'''
5''' 3'''
OH OH
C27H30O15 masse : 594 poudre jaune UV : max (MeOH) 258, 353 nm
11
HO
7 6
8 9
O
4
O
6'' 4''
1' 6'
17
O
1''
10
OH
HO
OH OH
IR : max (KBr) 3352 (OH), 1647 (C=O), 1600 (cycle aromatique), 1201 (C-O) cm
-1
ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 593 (10), 284 (100), 285 (100), 227 (20), (positif) m/z (int. rel) : 617 (100), 471 (12), 331 (97), 308 (70), 309 (20) RMN (frquence MHz, solvant)
Position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' Glu 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 6'' Rha 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' C 157.5 133.9 178.0 161.8 99.6 164.9 94.4 157.2 104.5 121.5 131.5 115.8 160.6 115.8 131.5 102.0 74.8 77.0 70.6 76.4 67.5 H 6.41 s 6.20 s 7.98 (d, J = 8.8 Hz) 6.88 (d, J = 8.7 Hz) 6.88 (d, J = 8.7 Hz) 7.98 (d, J = 8.8 Hz) 5.30 (d, J = 7.4 Hz) 3.23 m 3.23 m 3.07 m 3.27 m 3,07 (t, J = 9.2 Hz) 3,71 (d, J = 10.3 Hz) 4.38 s 3.39 m 3.29 m 3.09 m 3.28 m 0.98 (d, J = 6.2 Hz) Corrlations HMBC C-2', C-6' C-1Glu
C-6 C-8 C-8, C-6 C-3', C-5' C-6' C-2', C-6', C-3', C-5' C-2' C-2Glu C-3Glu C-4Glu, C-2Glu C-6Glu, C-3Glu, C-5Glu C-4Glu, C-6Glu
101.4 70.9 71.3 72.5 68.9 18.4
C-6Glu C-4Rha C-2Rha, C-5Rha C-6Rha, C-5Rha, C-3Rha C-4Rha, C-4Rha, C-6Rha C-4Rha
180
VII. Annexes
Compos H querctine-3-O--glucopyranoside ou isoquercitrine C21H20O12

2'
OH
3' 4' 5' 6' 4
OH OH
6'' 5'' 2'' 3'' 4''
HO
masse : 464 Poudre jaune
7 6
8 9
1'
O
1''
10 5
OH
HO
OH OH
UV : max (MeOH) 253, 349 nm IR : max (KBr) 3747 (OH), 3370, 2356, 1650 (C=O), 1609 (cycle aromatique), 1185 (C-O) cm ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 300 (100), 271 (80), 255 (20), 483 (20) RMN (300 MHz, CD3OD)
position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Glu 1 2 3 4 5 6a 6b C 157.6 134.2 178.1 161.7 98.5 164.7 93.3 157.1 104.3 121.7 116.2 144.5 148.5 114.6 121.8 102.2 77.0 76.7 74.3 69.8 61.2 H 6.21 (d, J = 2.0 Hz) 6.40 (d, J = 2.0 Hz) 7.54 (d, J = 2.1 Hz) 6.92 (d, J = 8.3 Hz) 7.50 (dd, J = 2.1, J = 8.3 Hz) 5.12 (d, J = 1.0 Hz) 3.62 m 3.53 m 3.41 m 3.39 m 3.48 m 3.34 m
-1
181
VII. Annexes
Compos I
30 29
14-taraxeren-3-ol ou taraxrol C30H50O

12 27 20 19 18 17 13 H 9 1 8 10 H 3 5 4 6 7 15 14 16 28 21 22
masse : 426 poudre blanche

2
25
11
HO
23
24
EI-MS m/z (int. rel) : 204 (100), 218 (41), 189 (36), 287 (27), 302 (26), 426 (12) IR : max (KBr) 3550, 2960, 1450, 1375, 1158, 1065, 1050 cm RMN (400 MHz, CDCl3)
Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Jmod CH2 CH2 CHOH C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH2 C C CH CH2 C CH CH2 C CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C 37.7 27.1 79.1 38.7 55.5 18.8 41.2 39.0 49.3 38.0 17.5 35.1 37.6 158.1 116.9 37.7 35.8 48.7 36.7 28.8 33.7 33.1 28.0 15.5 15.4 25.9 29.9 29.8 33.4 21.3 H 1.61 m 1.51 m, 1.54 m 3.19 (dd, J = 11.2, 4.6 Hz) 0.78 (d, J = 13.0 Hz) 1.64 m, 1.49 m 1.36 m, 2.05 (dt, J = 12.8, 3.1 Hz) 1.43 m 1.51 m, 1.65 m 1.01 m, 1.36 m 5.53 (dd, J = 8.2, 3.2 Hz) 1.61 m, 1.91 (dd, J = 14.9, 3.1 Hz) 0.97 m 0.99 m, 1.33 m 1.63 m 1.34 m, 1.55 m 1.0 s 0.82 s 0.94 s 1.12 s 0.92 s 0.84 s 0.97 s 0.92 s
-1
182
VII. Annexes
Compos J
5-(8(Z),11(Z),14(Z)-heptadcatrienyl)rsorcinol
OH
1 2 6 2' 5 4 1' 3' 5' 7' 10' 11' 4' 6' 8' 9'
C23 H34 O2
HO
masse : 342 huile rougetre
13' 16' 14' 17' 15'
12'
IR : max (KBr) 3499, 3012, 2925, 2852, 1594, 1278, 732 cm ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 341 (100), 135 (54), 123 (50) RMN (500 MHz, CDCl3)
position 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Jmod C
-1
C 156.6 6.19 (t, J = 2.2 Hz) CH 100.1 C 156.6 CH 108.0 6.26 (d, J = 2.2 Hz) C 146.1 CH 108.0 6.26 (d, J = 2.2 Hz) 2.50 (t, J = 7.3 Hz) CH2 35.8 CH2 31.0 1.59 (q, J = 7.3 Hz) 1.33 m CH2 29.7* 1.33 m CH2 29.4* 1.33 m CH2 29.3* 1.59 m 29.3* CH2 2.08 m CH2 27.3 5.38 m CH 130.4 5.38 m CH 127.7 2.83 (t, J = 5.4 Hz) CH2 25.7 5.38 m CH 128.3 5.38 m CH 128.3 2.83 (t, J = 5.4 Hz) CH2 25.6 5.38 m CH 127.2 5.38 m CH 132.0 2.09 m 20.6 CH2 1.00 (t, J = 7.5 Hz) CH3 14.3 * Valeurs interchangeables
183
VII. Annexes
Compos K 9(Z),12(Z),15(Z)-octadecatrinoique ou acide linolnique C18H30O2
O
masse : 278 huileux
18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 1 2
OH
Compos L querctine C15H10O7 Masse : 302 Poudre jaune
OH OH HO O
OH OH O
UV : max (MeOH) 245, 360 nm ESI-MS (ngatif) m/z : 301 (71), 271 (100), 255 (42), 243 (15), 227 (10)
Compos M kaempfrol
OH
C15H10O6
HO
Masse : 286 Poudre jaune
OH OH O
UV : max (MeOH) 265, 365 nm ESI-MS (ngatif) m/z (int. rel): 285 (92), 255 (100), 227 (76), 213 (10)
184
VII. Annexes
Compos N
OH
acide 5-O-caffoylquinique ou acide chlorognique
5 4 3
OH
C16H18O9 masse : 354
HO OH O
3'
OH
OH
UV : max (MeOH) 222, 216, sh290 nm ESI-MS m/z : 353, 191 (12), 173 (50), 126 (100), 111 (25), 93 (62), 85 (87)
185
VII. Annexes
Compos O querctine-3-O--rhamnopyranoside ou quercitrine

2'
OH
3' 4' 5' 6' 1'' 6 5 10 4 3 5'' 6''
OH
C21H20O11 masse : 448
HO
7
8 9
1'
O
2''
O OH
3''
poudre jaune
OH OH
4''
OH
UV : max (MeOH) 254, 356 nm ESI-MS m/z : 447 (40), 301 (65), 300 (90), 271 (100), 255 (59) IR : max (KBr) 3450 (OH), 1660 (C=O), 1605 (cycle aromatique), 1112 (C-O) cm RMN (300 MHz, CD3OD)
position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Rha 1 2 3 4 5 6 C 158.9 136.2 179.3 163.0 100.0 166.1 95.0 158.4 105.7 122.9 117.5 149.9 145.9 123.4 116.0 102.1 70.5 70.7 71.8 70.7 16.3 H 6.22 (d, J = 2.1 Hz) 6.40 (d, J = 2.1 Hz) 7.31 (d, J = 2.0 Hz) 6.95 (d, J = 8.0 Hz) 7.22 (d, J = 8.0, 2.0 Hz) 5.38 (d, J = 1.8 Hz) 4.22 (dd, J = 3.2, 1.8 Hz) 3.71 (dd, J = 9.2, 3.2 Hz) 3.33 m 3.33 m 0.92 (d, J = 5.5 Hz)
-1
186
VII. Annexes
Compos P
3'
kaempfrol-3-O--arabinopyranoside C20H18O10 masse : 418 poudre jaune
2'
OH
4' 5' 6'
HO
7 6
8 9
O
4
1'
10 5
O
1''
OH
OH 5'' O
3'' 2'' 4''
OH
OH
UV : max (MeOH) 262, 341 nm ESI-MS (ngatif) m/z : 417 (100), 284 (55), 285 (22), 255 (45), 227 (20) IR : max (KBr) 3350 (OH), 1650 (C=O), 1603 (cycle aromatique), 1200, 1110 (C-O) cm RMN (500 MHz, CD3OD) position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Ara 1 2 3 4 5 C 157.3 134.1 178.0 161.6 98.9 165.7 93.6 157.2 103.9 121.2 130.8 114.8 160.3 114.8 130.8 103.0 71.3 72.6 67.6 65.4 H 6.21 (d, J = 2.0 Hz) 6.40 (d, J = 2.0 Hz) 8.09 (d, J = 9.0 Hz) 6.91 (d, J = 9.0 Hz) 6.91 (d, J = 9.0 Hz) 8.09 (d, J = 9.0 Hz) 5.15 (d, J = 6.4 Hz) 3.91 (dd, J = 8.2, 6.4 Hz) 3.65 (dd, J = 8.2, 3.2 Hz) 3.81 brs 3.43 (dd, J = 13.9, 3.4 Hz) 3.78 m
-1
187
VII. Annexes
Compos Q kaempfrol-3-O--arabinofuranoside ou euglanine C20H18O10 Masse : 418 Poudre jaune

3' 2' 4' 5' 6' 1''' 6 5 10 4 3 4'''
OH
HO
7
8 9
1'
OH
5'''
O
2'''
O HO
3'''
OH
OH
UV : max (MeOH) 262, 341 nm ESI-MS (ngatif) m/z : 417 (90), 284 (42), 285 (100), 255 (26), 227 (8) IR : max (KBr) 3352 (OH), 1655 (C=O), 1605 (cycle aromatique), 1205 (C-O), 1085 cm RMN (500 MHz, CD3OD) position C 2 157.9 3 133.5 4 178.5 5 161.7 6 98.6 7 165.2 8 93.5 9 157.2 10 104.1 1 121.4 2 129.3 3 115.1 4 160.2 5 115.1 6 129.3 Ara 1 108.2 2 82.0 3 77.2 4 86.6 5 61.1 H 6.23 (d, J = 2.2 Hz) 6.42 (d, J = 2.2 Hz) 7.99 (d, J = 9.1 Hz) 6.95 (d, J = 9.1 Hz) 6.95 (d, J = 9.1 Hz) 7.99 (d, J = 9.1 Hz) 5.51 (d, J = 0.4 Hz) 4.34 (dd, J = 3.0, 1.0 Hz) 3.93 (dd, J = 5.0, 3.0 Hz) 3.82 (dd, J = 9.2, 4.6 Hz) 3.50 (d, J = 3.9 Hz)
-1
188
VII. Annexes
Compos R kaempfrol-3-O--rhamnopyranoside
3'
ou afzline formule brute masse forme
2'
OH
4' 5'
HO
7 6
8 9
O
4
1' 6' 1''
5''
6''
10 5
O
2''
O OH
3''
OH OH
4''
OH
UV : max (MeOH) 262, 341 nm ESI-MS (ngatif) m/z : 431 (100), 284 (33), 285 (55) IR : max (KBr) 3348 (OH), 3372, 2356, 1652 (C=O), 1612, 1603 (cycle aromatique), 1514, 1200 (C-O) cm
-1
RMN (500 MHz, CD3OD)

position 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 Rha 1 2 3 4 5 6 C 157.8 134.8 178.2 161.8 98.6 165.1 93.5 157.2 104.4 121.2 130.5 115.1 160.2 115.1 130.5 102.1 70.5 70.7 71.8 70.7 16.3 H 6.22 (d, J = 2.1 Hz) 6.40 (d, J = 2.1 Hz) 7.79 (d, J = 8.8 Hz) 6.96 (d, J = 8.8 Hz) 6.96 (d, J = 8.8 Hz) 7.79 (d, J = 8.8 Hz) 5.40 (d, J = 1.6 Hz) 4.24 (dd, J = 3.3, 1.6 Hz) 3.73 (dd, J = 9.3, 3.3 Hz) 3.35 m 3.35 m 0.94 (d, J = 5.6 Hz)
189
VII. Annexes
Publication
A. Lhuillier, N. Fabre, F. Moyano, N. Martins, C. Claparols, I. Fourast and C. Moulis (2007) Comparison of flavonoid profiles of Agauria salicifolia (Ericaceae) by liquid
chromatography-UV diode array detectionelectrospray ionisation mass spectrometry. Journal of Chromatography A. In Press, doi:10.1016/j.chroma.2007.03.038
Poster
A. Lhuillier, F. Moyano, N. Martins, C. Claparols, N. Fabre and C. Moulis. Analysis of flavonoid profiles of Agauria salicifolia (Ericaceae) by LC-MS. 23rd LC/MS Montreux symposium, 8-11 novembre 2006, Montreux, Switzerland.
190
VII. Annexes
191
VII. Annexes
192
VII. Annexes
193
VII. Annexes
194
VII. Annexes
195
VII. Annexes
196
VII. Annexes
197
VII. Annexes
198
VII. Annexes
ANALYSIS OF FLAVONOID PROFILES OF AGAURIA SALICIFOLIA (ERICACEAE) BY LC-MS LCAmlie Lhuilliera*,Florian Moyanob, Nathalie Martinsb, Catherine Claparolsb, Nicolas Fabrea and Claude Moulisa
a
UMR-152 Laboratoire de Pharmacochimie de Substances Naturelles et Pharmacophores Redox, Facult des Sciences Pharmaceutiques, Universit Paul Sabatier, F-31062 Toulouse cedex 09, France b Service Commun de Spectromtrie de Masse, Universit Paul Sabatier, F-31062 Toulouse cedex 09 *Corresponding author : lhuillie@cict.fr
Introduction
Flavonoids are very common and wide spread secondary plant metabolites. They have a wide range of biological and physiological activities mainly based on their antioxidant properties [1]. The near ubiquitous distribution of flavonoids in green plants, their relative chemical stability and the strong tendency for related plants to produce similar types of flavonoids have made them particularly useful as taxonomic markers in plant classification. Flavonoids compounds have been used successfully as taxonomic markers to elucidate the organisation of genetic variability as well as the phylogenetic trends in several species complexes [2]. The present work investigates variation in flavonode profiles obtained from individuals belonging to two population of an Ericaceae: Agauria salicifolia differing in their morphology. For this purpose, Liquid Chromatography/Mass Spectrometry coupling (LC/MS) was applied on flavonoid extracts of the two plants to obtain information on the aglycone moiety, the type of carbohydrate (mono- or disaccharide, hexose or pentose,) or other substituants present for the structural characterisation of flavonoids [1, 3].
Plant
Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver (Ericaceae) is an arborescent shrub common to forest countries of Madagascar, Mascareigna Islands and tropical Africa (Figure 1). Its leaves, very toxic for animal which eat them, are used by traditional practitioners against ulcerous wounds and to treat scabies. They contain several kinds of active principles such as diterpenoids (grayanotoxins) and triterpenoids [4]. Although many species and subspecies have been described in the genus Agauria, some authors are in favour of the existence of only one very polymorph species: Agauria salicifolia [5].
Figure 1. Trunk and roots (a), leaves (b) and flowers (c) of Agauria salicifolia.
Experimental section
Plant material
dried plant Grind plant powder Methanol extraction methanolic extract Hexane extraction degreased methanolic extract
Chromatographic conditions (HPLC)

Column SYMETRY C18 (Waters) 3,5 m (4,6 x 75 mm)
Mass Spectrometry
Peaks were analysed using a API 365 PE Sciex triple quadrupole mass pectrometer equipped with an electrospray interface.
The leaves of two different populations of Agauria salicifolia were collected in Madagascar in 2003 (respectively population 1 and population 2). These populations, originating from contrasted ecogeographical situation, had strong morphological differences in particular in size and shape of leaves.
Table 2. Gradient elutiona employed for reversedphase HPLC separation of flavonoids in Agauria Time (min) 0 35 37 45 47 52
a 0.7
Size-exclusion Chromatography (Sephadex LH20) Elution : MeOH
solvent composition (% acetonitrile)b 13 13 20 20 100 100 Table1. ESI-MS conditionsa
Specific Extraction of Flavonoids

A specific protocol of extraction and separation was developed to isolate flavonoids (Figure 2).
DP 80 FP 310 CE 30 Temperature 450C.

a Conditions
Fractionations were monitored by TLC revealed by specific flavonoid reagent: Neu Reagent
Phenolic acid fraction
Flavonoid fraction
Tanin fraction
Figure 2. Specific extraction procedure for flavonoid fractions
mL min-1, b Gradient of acetic acid-water (0.1 % v/v) and acetonitrile
were optimized by flow injection of standard solution.
Results and discussion

C h a n n e l 1 fro m S a m p le 1 ( A S A e x t r a it 3 ) o f D a ta F l o r ia n 1 2 .w if f
41,13
M a x . 1 1 ,7 % .
16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 1 5 2 0 25 3 0 3 5 T i m e , m in 4 0 45 5 0 55 6 0 65
1 0 ,4 6 1 2 ,6 6 3 ,7 5 5 ,9 2 2 4 ,1 6 2 1 ,5 1
28,31 31,72
1 ,1 0
5 0 ,0 8
4 9 ,9 4
4 1 ,6 9
4 0 ,4 8
4 3 ,2 8
Figure 5. Example of fragmentation interpretation : first-order mass spectrum of the peak 41 min (population 2).
Figure 3: Compared HPLC chromatograms of flavonoid extracts of population 1 (in black) and population 2 (in red) 260 nm
The first-order spectra of each compounds found on figure 4 allowed us to identify their aglycone moieties. The radical aglycone [Y0-H]- is formed in addition to the aglycone fragment Y0- indicating a 2,3 doublebond in the aglycone. Moreover, the fragmentation pattern in negative mode of the molecules provided information needed to identify quercetin and keampferol aglycones by comparison with literature data (Table 3).
Figure 6. Ion nomenclature followed for flavonoid glycoside (illustrated on a flavone aglycone) adapted from [1].
Population 1
Population 2
Table 3. Interpretation of detected ions for flavonoid extracts

Predominant negative ion [M - H] 595 463 433 477 447 417 Main fragments by ESI-MSa 301 301, 300, 271, 255, 179, 151 271, 300, 301, 255, 243, 227, 179, 151 301b 300, 301, 271, 255, 243, 283, 151, 179 227, 255, 284, 285 285, 284b 284, 285, 255, 227 Structure hypothesis Quercetin-O-di-saccharide Quercetin-O-hexose Quercetin-O-pentose Quercetin-O-glucuronic acid Quercetin-O-rhamnose Kaempferol-O-pentose Kaempferol-O-glucuronic acid Kaempferol-O-rhamnose
Figure 4 : Total ionic currant of precursor ions of 301 and 285. Differences are labelled in red
461 431
a Obtained on first order mass spectrum , ordered by decreasing intensity b Obtained on precursor mass spectrum
Conclusion et perspectives
The leaf flavonod content in individual of Agauria salicifolia originating from population with contrasted ecogeographical situation and morphological characteristics is variable qualitatively and highly variable quantitatively. Two flavonoids out of thirteen / This substituant seem to be specific of the lot no. 1. This study points out chemical differences among a polymorphic species and this agrees with the hypothesis of the existence of several species. Until now, botanists were not able to conclude but it seems that the composition of flavonoid extracts is in favour of the presence of several species. However mass spectrometry techniques used in this study cannot give complete information on these flavonoids. These results have to be completed by other analysis including MS/MS and MS/MS/SM to bring structural information and confirm or not the existence of two distinct species.
References
[1] Cuyckens, F. and Claeys, M. (2004) Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids. Journal of Mass Spectrometry. 39 (4) 1-15. [2] Denford, K.E. (1984) Phytochemical approaches to biosystematics, in: Grant, W. (Ed.) Plant biosystematics. pp. 343-358 (New York, Academic Press). [3] Fabre, N., Rustan, I., de Hoffmann, E. and Quetin-Leclercq, J. (2001) Determination of flavone, flavonol, and flavanone aglycones by negative ion liquid chromatography electrospray ion trap mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 12 (6) 707-715. [4] Gregoire, J. and Nyembo, L. (1977) Triterpenoids from Agauria salicifolia. Phytochemistry. 16 (10) 1609-1610. [5] Loriaux, I., Boiteau, P. and Husson, H.P. (1973) Isolation of grayanotoxins from leaves of Agauria polyphylla. Phytochemistry. 12 (6) 1500.
Acknowledgment
The authors wish to thank Bayer Consumer Care Division SERDEX (Pau, France) for financial support and for providing plant material.
199
VII. Annexes
Lexique de botanique
Actinomorphe : qualifie une fleur rgulire symtrie axiale. Akne : fruit sec, indhiscent, dont la capsule contient une graine unique non soude avec le pricarpe. Cladistique : mthode de classification qui tabli des relations de parent phylogntiques entre taxons lorsquils possdent les mmes caractres drivs ou synapomorphies ; elle vise mettre en vidence la squence volutive de leurs transformations, c'est--dire dterminer leur tat primitif et leur(s) tat(s) drivs. Drupe : fruit charnu indhiscent caractris par son endocarpe lignifi. Epiphyte : qualifie des espces de vgtaux qui vivent sur les troncs, les branches, les feuilles d'un autre vgtal. Isostmone: qualifie un androce dont le nombre d'tamine est gal celui des ptales ou des spales. Laticifres : qui contient du latex Monophyltique : qualifie un ensemble d'units taxonomiques ayant un seul anctre commun ; une telle ligne est considre comme naturelle. Mycorhize : association symbiotique entre le myclium d'un champignon et les racines d'une plante Obdiplostmone : qualifie un androce dont le nombre d'tamines dispos sur deux verticilles est double de celui des ptales ou des spales et dont le verticille externe est oppos aux ptales. Pachycaule : plante dont la tige est succulente sur toute sa longueur et non pas particulirement sa base. Prianthe : ensemble des enveloppes florales protgeant les organes reproducteurs et constituant la partie asexue de la fleur. Pricarpe : enveloppe du fruit, provenant du dveloppement des parois du carpelle. Phylognie : tude de la formation et de l'volution des organismes en vue d'tablir leur parent Polyphyltique : qualifie une ligne artificielle ayant plus d'une origine volutive. Sempervirent : qualifie les vgtaux ligneux qui conservent un feuillage vert toute l'anne. Tomenteux : qualifie une plante ou une partie de plante recouverte de poils pais, courts et mous, d'une pubescence cotonneuse, entrecroise, feutre.
200
Contribution ltude phytochimique de quatre plantes malgaches : Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver, Agauria polyphylla Baker (Ericaceae), Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae) et Embelia concinna Baker (Myrsinaceae).
Ce travail est consacr ltude phytochimique de quatre plantes : deux Ericaceae, Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver et Agauria polyphylla Baker, une Monimiaceae, Tambourissa trichophylla Baker et une Myrsinaceae, Embelia concinna Baker slectionnes pour leur utilisation en mdecine traditionnelle malgache. Trois flavonodes et un triterpne ont t isols des deux espces de Agauria. Trois flavonols ont t isole des feuilles de T. trichophylla. Dix composs ont t identifis de E. concinna : un triterpne, six flavonols, un acide phnolique, ainsi quun alkyle rsorcinol et un acide gras. Les structures des composs ont t lucides par lutilisation de techniques de RMN 1D et 2D et par spectromtrie de masse. La comparaison par spectromtrie de masse des fractions flavonodiques de A. salicifolia et A. polyphylla a permis didentifier neuf composs supplmentaires. Deux composs sont spcifiques de A. salicifolia et permettent de distinguer chimiquement les deux espces. Mots-cls : Phytochimie - Flavonodes - Spectromtrie de masse - Agauria salicifolia Agauria polyphylla - Tambourissa trichophylla - Embelia concinna.
Contribution to the phytochemical study of four plants of Madagascar: : Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver, Agauria polyphylla Baker (Ericaceae), Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae) et Embelia concinna Baker (Myrsinaceae).
This report contributes to complete the phytochemical knowledge on four plants: Agauria salicifolia Hook.f ex Oliver, Agauria polyphylla Baker (Ericaceae), Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae) and, Embelia concinna Baker (Myrsinaceae) used in traditional medicine in Madagascar. Four compounds were isolated from the extracts of the Agauria: a flavonoid type compound and a triterpene. Three flavonol O-glycosides were isolated from T. trichophylla extracts. The study of E. concinna led to the isolation and characterization of a triterpnes, six flavonodes, a phenolic acid, a fatty acid and an alkylresorcinol. The use of these compounds as phytochemical markers was evaluated. Identification of the compounds was carried out by interpretation of MS, MS/MS, 1D and 2D NMR spectra. Liquid chromatography coupled mass spectrometry was used to compare the flavonoid fractions of A. salicifolia and A. polyphylla. Two flavonol O-glucuronides were found to differentiate the two populations.
Laboratoire Pharmacochimie des Substances Naturelles et Pharmacophores Redox UMR 152 IRD - UPS Facult des Sciences Pharmaceutiques - Universit Paul Sabatier - Toulouse III 31062 TOULOUSE cedex 09 - France

Lhuillier 2007 Phytochimie de 4 Plantes Malgaches

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N dordre : 2467

Par Melle Amlie LHUILLIER

FAB FD Gal GC-MS

Glc Gluc IT H2O HCCl3 Hex HMBC HPLC

LDL m m/z MeCN MeOH MeOH-d4 MPLC

sh SiO2 spp t TQ Tol tR TTI u UV UV(DAD) V/V Xyl

Table des matires

I. SELECTION DES PLANTES DE LETUDE

II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

IV. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES V. MATERIELS ET METHODES

150 151 152 152 153 153 153

VI. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES VII. ANNEXES

172 173 190 200

I. SELECTION DES PLANTES DE LETUDE

I. Slection des plantes de ltude

1. Critres de slection des plantes

1.1. Une origine gographique commune : Madagascar

I. Slection des plantes de ltude

Figure I 1. Carte des formations vgtales de Madagascar.

I. Slection des plantes de ltude

1.2. Utilisation des plantes en mdecine traditionnelle

I. Slection des plantes de ltude

1.3. Aspects botaniques et chimiotaxonomiques

1.4. Les apports de la littrature

I. Slection des plantes de ltude

2. Slection des extraits : criblage biologique

I. Slection des plantes de ltude

II. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

II. Synthse bibliographique

1. Prsentation de Tambourissa trichophylla Baker (Monimiaceae)

Figure II 1. Rpartition mondiale des Monimiaceae selon Stevens [Stevens, 2001].

Idiospermaceae, Lauraceae et Hernandiaceae [Cronquist, 1988].

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

1.2. Genre Tambourissa Sonn. et T. trichophylla Baker

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

1.3. Principaux mtabolites secondaires des Monimiaceae

athroline, boldine, laurolitsine (16), laurottanine, N-mthyllaurottanine, norglaucine

laurottanine (17), laurolitsine, N-mthyllaurottanine

Les numros entre parenthses renvoient aux structures prsentes la figure II 7.

II. Synthse bibliographique

O OH (16) R=H (17) R= Me

Principaux constituants de lhuile essentielle

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

1.4. Travaux antrieurs sur le genre Tambourissa

Figure II 8. Constituants principaux de lhuile essentielle de T. leptophylla [Gallori et al., 2001].

A notre connaissance, il nexiste aucune donne sur lespce T. trichophylla.

II. Synthse bibliographique

2. Prsentation de Agauria salicifolia Hook.f. ex Oliver et Agauria polyphylla Baker (Ericaceae)

Figure II 9. Rpartition mondiale des Ericaceae selon Stevens [Stevens, 2001].

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

2.2. Genre Agauria Benth. & Hook.f.

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

II. Synthse bibliographique

2.3. Principaux mtabolites secondaires des Ericaceae Juss.

(30) acide gallique

(31) acide o-protocatchique