UNIWERSYTET WARMISKO-MAZURSKI w OLSZTYNIE

WYDZIA OCHRONY RODOWISKA i RYBACTWA

Kierunek: ochrona rodowiska Specjalno: biotechnologia w ochronie rodowiska

Procedury konstrukcji rekombinowanych szczepw Escherichia coli wzbogaconych o gen kodujcy depolimeraz PHA pochodzcy z bakterii rodzaju Pseudomonas.

grupa 3 Magorzata Czartoryska Jacek Koziej

Olsztyn 2012

Wstp
Polihydroksykwasy (PHA) s to nierozpuszczalne w wodzie poliestry, gromadzone przez mikroorganizmy jako rdo wgla/energii oraz rwnowanikw redukcyjnych, w warunkach stresu pokarmowego, na przykad, gdy w rodowisku jest nadmiar wgla a niedomiar innych substancji takich jak azot, fosfor lub tlen. Rozwj biotechnologii polihydroksykwasw jest istotny, poniewa: polihydroksykwasy mog by wytwarzane z odnawialnych surowcw, co przyczynia si do zmniejszenia zuycia ropy naftowej. Obecnie, do produkcji polimerw syntetycznych, wykorzystuje si okoo 4% tego surowca, wykazuj podatnoo na biodegradacj, co jest wane z punktu widzenia unieszkodliwiania odpadw na skadowiskach. Wedug Association of Plastics Manufactures (APME), ilo odpadw z tworzyw sztucznych w Europie Zachodniej w 2002 r. wyniosa okoo 20 321 tys. ton, z czego 32% poddano recyklingowi, a pozostaa cz (62%) trafia na skadowiska, ich produkcja umoliwia tworzenie systemw zagospodarowywania odpadw w cyklu zamknitym, co jest zgodne z ide zrwnowaonego rozwoju. Polihydroksykwasy jako materia zapasowy gromadzone s gwnie przez bakterie dysponujce duymi moliwociami metabolicznymi si i przewaaj w tej grupie grammujemne, tlenowe paeczki. Bakterie Pseudomonas charakteryzuj specyficznym rodzajem operonu odpowiedzialnego za produkcj polihydroksykwasw o redniej dugoci acucha wglowego (mcl-PHA). Locus ten skada si z dwch rnych gen kodujcych polimeraz PHA (phaC1 i phaC2) przedzielonych genem kodujcym depolimeraz PHA (phaZ).

Rys.1. Schemat genw odpowiedzialnych za produkcj mcl-PHA. phaC1C2 oraz phaC2C1 startery reakcji PCR. (Przewodnik do wicze 2011)

Mimo i produkcja poliestrw hydroksykwasw alkanowych znajduje zastosowanie na szersz skal to ponosi za sob rwnie zbyt wysokie koszty. Ograniczenie to prbuje si ograniczy na wiele rnych sposobw: stosowanie wyselekcjonowanych szczepw bakterii naturalnie syntetyzujcych PHA, wykorzystanie mieszanych kultur bakterii takich jak osad czynny, konstruowanie rekombinowanych genetycznie bakterii, grzybw i rolin.

Wszystkie, wyej wymienione podejcia maj swoje dobre strony jednak najwiksze nadzieje wie si z wykorzystaniem rekombinowanych komrek E.coli. Aby utrzyma obcy DNA w komrce bakteryjnej, jako jego noniki, czyli wektory, stosuje si m.in. plazmidy bakteryjne. Typowy wektor plazmidowy uywany do klonowania genw jest stosunkowo ma kolist czsteczk DNA o dugoci kilku tysicy par nukleotydw, mogc ulega replikacji w komrce bakteryjnej. Wektor plazmidowy musi zawiera miejsce pocztku replikacji, ktre umoliwia jego replikacj w komrce, niezalen od replikacji chromosomu bakteryjnego. Musi te zawiera miejsce rozcinane przez nukleaz restrykcyjn, tak by mona byo otworzy plazmid i wprowadzi do niego obcy DNA. Plazmid zwykle zawiera te gen kodujcy jak cech selekcyjn, tak jak np: oporno na okrelony antybiotyk, ktra umoliwia identyfikacj zawierajcych go komrek. Ponadto dobry wektor plazmidowy powinien by maego rozmiaru co zwiksza jego pojemno klonujc oraz mie silny promotor. Powinien si rwnie cechowa du liczb kopii.

1.

Cel i zakres wiczenia

Celem wicze jest skonstruowanie rekombinowanych szczepw bakterii Escherichia coli

posiadajcych gen kodujcy depolimeraz PHA, pochodzcy od bakterii z rodzaju Pseudomonas. Zakres przeprowadzanych procedur obejmowa: Izolacj genomowego DNA z komrek bakteryjnych osadu czynnego Powielenie genu kodujcego de polimeraz PHA (phaZ) Przygotowanie komrek kompetentnych E. coli Przygotowanie pytek LB z odpowiednim antybiotykiem Oczyszczanie produktu PCR Klonowanie Identyfikacj kolonii bakteryjnych posiadajcych plazmid z wczonym genem kodujcym gen phaZ Namnoenie kolonii Izolacj plazmidowego DNA Analiz restrykcyjn plazmidw

2.

Materiay i metody
Materia do bada stanowiy bakterie z rodzaju Pseudomonas namnaane w hodowli

pynnej o mieszanym skadzie gatunkowym (osad czynny) oraz bakterie Escheichia coli namnaane rwnie w hodowli pynnej z wytrzsaniem. Hodowle prowadzone byy w Katedrze Biotechnologii w Ochronie rodowiska.
Wszystkie procedury wykonywane byy wedug instrukcji opracowanych przez dr hab. in. Sawomira Ciesielskiego, zamieszczonych w przewodniku do wicze z przedmiotu Inynieria Genetyczna w Ochronie rodowiska.

Izolacj genomowego DNA mikroorganizmw osadu czynnego przeprowadzono przy pomocy komercyjnego zestawu Genomic Mini (A&A Biotechnology). Liz komrek umoliwio zastosowanie buforu lizujcego LT, proteinazy K oraz lizozymu, a take inkubacja w wysokiej temperaturze (50-60C) z worteksowaniem, natomiast ekstrakcja i precypitacja DNA przebiegaa na zou krzemionkowym przy uyciu roztworu puczcego A1. Nastpnie za pomoc acuchowej reakcji polimerazy (PCR) z wykorzystaniem polimerazy DNA Taq oraz starterw phaC1C2 i phaC2C1 powielono gen kodujcy depolimeraz PHA (phaZ). Produkt PCR oczyszczono ze starterw i dimerw za pomoc
4

zestawu Clean-up. Przygotowano rwnie hodowl kompetentnych komrek bakterii E. coli przy pomocy CaCl2 oraz pytk z poywk LB zawierajc ampicylin, IPTG i X-gal. Klonowanie molekularne zostao przeprowadzone dziki zestawowi InsTAclone PCR Clonning Kit i skadao si z ligacji produktu PCR z Vectorem pTZ57R/T w obecnoci ligazy T4 DNA oraz transformacji mieszaniny ligacyjnej z przygotowanymi wczeniej bakteriami E. coli a take wysiania caoci na podgrzane medium LB metod murawow. Inkubacja prowadzona bya w temperaturze 37C. Bakterie do identyfikacji kolonii posiadajcych plazmid z wczonym insertem wybrano na podstawie barwy. Dokonano amplifikacji z wykorzystaniem starterw komplementarnych do sekwencji plazmidu otaczajcych insert (M13 R i F), polimerazy DNA Pfu, a take DMSO. Matryc DNA stanowiy bakterie pobrane bezporednio z kolonii bez ekstrakcji i oczyszczania (colony PCR). Na podou LB namnoono kolonie bakterii posiadajce wczony do plazmidu insert, a nastpnie metod lizy alkalicznej (roztwr lizujcy L2) dokonano izolacji plazmidowego DNA (zestaw PlazmidMini) i przeprowadzono analiz restrykcyjn plazmidw. W celu ekspresji genu kodujcego phaZ w komrkach E. coli, prowadzono ich hodowl (0,5 ml przygotowanych komrek zaszczepiono do poywki LB) z ampicylin. Za pomoc metody SDS-PAGE powinna zosta wykonana analiza produktu ekspresji, jednake z powodu braku wyniku kocowego w postaci wizualizacji rozdziau elektroforetycznego w wietle UV, procedura ta zostanie pominita w nastpnym rozdziale.

3.

Wyniki
Wyizolowane z komrek bakterii osadu czynnego DNA zawieszone w wodzie dejonizowanej

poddano analizie ilociowej po uprzednim rozcieczeniu (5 l DNA + 95 l wody dejonizowanej). A260=3,65 stenie DNA=73g/ml

Analizy

jakociowej

genomowego

DNA

dokonano

za

pomoc

rozdziau

elektroforetycznego w 1% elu agarozowym a jego wynikiem jest wizualizacja w wietle UV (Rys.2.). We wszystkich prbach zauwaalne s 4 prki o rnej szerokoci oraz nateniu, jednak w porwnaniu z innymi grupami prby przygotowane przez nas wida najsabiej. Najwolniej migrujce fragmenty to wielkoczsteczkowy DNA, nastpne za to prawdopodobnie geny kodujce biaka oraz rRNA maej i duej podjednostki rybosomalnej (23S rDNA, 16S rDNA oraz 5S rDNA) bakterii.

Rys.2. Elektroforetyczny rozdzia (1% el agarozowy) DNA wyizolowanego z komrek bakterii osadu czynnego. Numery grup odpowiadaj numerom prb.

Wyizolowane DNA poddano reakcji PCR ze starterami phaC1C2 i phaC2C1 (specyficznymi dla genu kodujcego depolimeraz PHA) oraz polimeraz DNA Taq, a nastpnie rozdziaowi metod elektroforezy agarozowej (1%) produktu PCR. W kadej z omiu prb (Rys.3.) zauwaono obecno fragmentw DNA o wielkoci odpowiadajcej genowi phaZ wraz ze starterami. Sam gen phaZ ma dugo ponad 800 pz natomiast startety dodatkowo ok. 150 pz, cay amplifikowany fragment liczy wic niespena 1000 pz. Wskazuje to jednoznacznie na obecno w badanym przez nas osadzie czynnym bakterii Pseudomonas, ktrych geny phaZ wykorzystane zostan podczas rekombinacji E.coli.

Rys.3. Elektroforetyczny rozdzia produktu reakcji PCR (genu kodujcego depolimeraz PHA phaZ oraz starterw phaC1C2 i phaC2C1) materiau genetycznego wyizolowanego z komrek bakterii z rodziny Pseudomonas. numery grup odpowiadaj numerom prb.

Zanim produkt PCR poddano ligacji z Vectorem pTZ57R/T, oczyszczono go ze starterw i dimerw zakcajcych proces czenia si tych dwch czsteczek i czynicych go mniej specyficznym. W efekcie otrzymano pomniejszone fragmenty DNA zawierajce ju tylko gen phaZ. Oczyszczony gen zawiera powinien ok. 800 nukleotydw, jednak w wikszoci przypadkw jest mniejszy i zawiera si pomidzy 600 pz ,a 700 pz, (fragment uzyskany przez nas by wielkoci ok. 700 pz), co potwierdzone zostao wizualizacj UV rozdziau elektroforetycznego prb w 1% elu agarozowym z markerem 100 bp DNA (Rys.4.).

Rys. 4. Elektroforetyczny rozdzia oczyszczonego produktu PCR (genu phaZ wyizolowanego z komrek bakterii z rodziny Pseudomonas). Numery grup odpowiadaj numerom prb. M marker 100 bp DNA.

Wszystkie kolonie bakteryjne, ktre wyrosy na podou LB z ampicylin posiaday odporno na ten antybiotyk. Zaobserwowano dwa rodzaje kolonii rnicych si barw. Kolonie ziolono-niebieskie prawdopodobnie skaday si z bakterii zmutowanych, z ma iloci plazmidw, czciowo wklejonym insertem lub te bez niego, jednak posiadajcych zdolno przeycia i namnaania si w obecnoci ampicyliny. Natomiast biae kolonie z pewnoci posiaday plazmid pTZ57R/T, ktry zawiera dziaajcy gen opornoci na ampicylin i te wanie bakterie wykorzystywane zostay do dalszych bada. Rozdziaowi elektroforetycznemu w 1% elu agarozowym poddano produkt PCR DNA pobranego bez ekstrakcji i oczyszczania z wybranych przez grupy (po 2 rne na grup) kolonii bakteryjnych. Do reakcji PCR wykorzystano startery komplementarne do sekwencji plazmidu otaczajcych insert (M13 R i F). Wynik elektroforezy przedstawia Rys.5. Prb nr 6 naley wykluczy z analizy ze wzgldu na niewyrany obraz w postaci smugi. Natomiast w prbie nr 5 zauwaalne s 2 prki. Prek bliszy studzienki obrazuje prawdopodobnie due (wolniej migrujce w elu) fragmenty DNA, natomiast dalszy mniejsze (szybciej migrujce) fragmenty powielanego w reakcji PCR plazmidowego DNA (pDNA).

pDNA

Rys. 5. Elektroforetyczny rozdzia produktu PCR DNA komrek bakteryjnych pobranych z kolonii posiadajcych odporno na ampicylin bez ekstrakcji i oczyszczania DNA- colony PCR.

Po namnoeniu wybranych kolonii rekombinowanych E.coli wyizolowano z nich plazmidowe DNA metod lizy alkalicznej (niszczenie cian komrkowych pod wpywem podwyszonego pH) z zastosowaniem roztworu lizujcego L2, nastpnie dziki roztworowi zobojtniajcemu GLS3, ktry powoduje sklejanie si chromosomalnego DNA oraz oczyszczaniu na minikolumnach z roztworami puczcymi W9 i A1. Efekt izolacji sprawdzono poprzez elektroforez agarozow (1%) 5 l wyizolowanych plazmidw (Rys.6.). rnice w szerokoci i intensywnoci prkw wynikaj z rnej szybkoci migracji plazmidw w elu agarozowym uzalenionej od ich konformacji. W omawianym przypadku wyrni moemy trzy rodzaje konformacji: najwolniej migrujc form kolist, ewentualn form przejciow oraz najszybciej migrujc form superzwinit. Plazmid z prawidowo wprowadzonym insertem powinien by wielkoci ok. 3600 pz. W porwnaniu z markerem (M) 1 kb DNA mona oszacowa wielko wyizolowanych plazmidw i stwierdzi, e plazmidy uzyskane przez nasza grup (3) s krtsze ni oczekiwano. Wskazuje to na bd w przeprowadzaniu badania, w wyniku ktrego najprawdopodobniej wklonowany zosta jedynie fragment insertu lub te sam plazmid uleg zmianom.

forma kolista forma przejciowa forma superzwinita

Rys. 6. Elektroforetyczny rozdzia plazmidowego DNA. Numery grup odpowiadaj numerom prb. M marker 1 kb DNA.

10

Analiza restrykcyjna plazmidw przeprowadzona zostaa na podstawie wizualizacji UV elektroforetycznego rozdziau tyche plazmidw (Rys.7.) potraktowanych wczeniej endonukleazami EcoRI oraz HindIII w obecnoci odpowiedniego bufora. W prbie nr 3 nie zaobserwowano miejsc restrykcyjnych odpowiednich dla zastosowanych enzymw, prawdopodobnie ma to zwizek z bdami popenionymi podczas przeprowadzania badania, a co za tym idzie niepoprawn budow plazmidu na poziomie nukleotydowym, poniewa w innych prbach przygotowywanych wedug identycznej instrukcji miejsca restrykcyjne wystpiy.

1500 1000 500

Rys.7. Elektroforetyczny rozdzia plazmidowego DNA po zastosowaniu restryktaz EcoRI oraz HindIII .Numery grup odpowiadaj numerom prb. M marker 100 bp DNA.

Pimiennictwo: Ciesielski S. 2011. Przewodnik do wicze z przedmiotu Inynieria Genetyczna w Ochronie rodowiska, Katedra Biotechnologii w Ochronie rodowiska,

UWM w Olsztynie Klimiuk E., Ciesielski S., Pokj T., Rogowski J. 2005 Gromadzenie polihydroksykwasw (PHA) w osadzie czynnym w warunkach limitowanego stenia azotu. Cz. II. Ocena zrnicowania zbiorowisk mikroorganizmw w osadzie czynnym i rodzaj kumulowanych polihydroksykwasw. Biotechnologia 4 (71) 214-226. Katedra Biotechnologii w Ochronie rodowiska, UWM w Olsztynie Klimiuk E., Pokj T., 2008. Produkcja polihydroksykwasw z osadu czynnego. Biotechnologia 3 (82) 9-27. Katedra Biotechnologii w Ochronie rodowiska, UWM w Olsztynie
11