RELACIN DE RESULTADOS ENTRE PRUEBAS DE RESAZURINA Y CONTEO DE CLULAS SOMTICAS PARA LA DETERMINACIN DE LA CALIDAD HIGINICA Y SANITARIA DE LA LECHE Y LOS

EFECTOS DE ELEVADOS NMERO DE CLULAS SOMTICAS EN LA CALIDAD DE LA LECHE PROCESADA RELATION OF RESULTS BETWEEN RESAZURINA TESTS AND COUNTING OF SOMATIC CELLS FOR DETERMINING THE HYGIENIC AND SANITARY QUALITY OF MILK AND THE EFFECTS OF ELEVATED NUMBER OF SOMATIC CELLS IN PROCESSED MILK QUALITY
ZEMANATE AVIRAMA, DAVID ALEJANDRO 1 GRASS RAMREZ, JOS FERNANDO 2

PALABRAS CLAVE:
Mastitis, clulas somticas, conteo de clulas somticas (CCS), casena, enzimas proteolticas y lipolticas, hidrolizacin, potencial de oxido reduccin.

RESUMEN
La Asociacin de Productores de Leche de Sotar ASPROLESO, ubicada en Paispamba, cabecera municipal de Sotar (Cauca), conformada por alrededor de 150 campesinos de la regin, desarrolla la actividad econmica de produccin, acopio, enfriamiento y comercializacin de leche fresca. Como medida para valorar la calidad microbiolgica aplica la prueba de resazurina en el laboratorio de control de calidad de la Asociacin. Esto permite dar a los productores bonificaciones con el objetivo de reducir prdidas econmicas en la comercializacin ante las industrias lcteas de la regin, debido a la deficiente calidad microbiolgica de la leche acopiada. Con el fin de buscar informacin acerca del origen de la alta carga microbiana se llev a cabo la comparacin de dos parmetros: resazurina y conteo de clulas somticas en muestras de leche de ordeo de 65 productores. Para la determinacin del primer parmetro se emple una solucin de resazurina al 0.005% (P/V) de concentracin, en el laboratorio de control de calidad de ASPROLESO, y para el segundo, conteo de clulas somticas por medio del sistema contador electrnico de partculas, se enviaron las muestras al Laboratorio Mdico Veterinario (L.M.V) ubicado en Bogot. El anlisis de los resultados obtenidos expresa la no existencia de relacin entre las dos pruebas.

KEY WORDS:
mastitis, somatic cells, counting of somatic cells, casein, proteolitic and lipolitic enzymes, hydrolyzation, oxide reduction potential.

ABSTRACT
The milking milk samples analysis of 65 producers belonging to the Producers Association of Milk in Sotar ASPROLESO, was done by means of resazurina
____________ Recibido para evaluacin: Diciembre 15 de 2004. Aprobado para publicacin: Enero 25 de 2005. 1 2 Estudiante de pregrado de Ingeniera Agroindustrial. Universidad del Cauca. Docente de Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad del Cauca.

Correspondencia: Jos Fernando Grass. e_mail: jfgrass@unicauca.edu.co

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trials with solutions at 0.0005% (P/V)of concentration in the quality control laboratory of ASPROLESO, as well as the count of somatic cells by means of the electronic count system of particles in the Medical Veterinary Laboratory (L.M.V.) located on Bogot, getting as a result the existence of non-relation between the two trials due to their different principles of reaction.

INTRODUCCION.
La leche es, segn la literatura el producto ntegro, no adulterado ni alterado y sin calostro, procedente de la ordea higinica, regular y completa de vacas sanas y bien nutridas (1). Por sus excelentes caractersticas nutritivas, la leche permite la multiplicacin muy rpida de una gran variedad de microorganismos, convirtindola en el alimento que ms fcilmente se altera. Con el fin de determinar si existe alguna relacin entre el conteo de clulas somticas (C.C.S.) y los resultados de pruebas de resazurina, anlisis realizado, para conocer el estado higinico y sanitario de la leche por parte de las organizaciones lcteas, las cuales liquidan el valor de la misma con base en este resultado en el sistema de pago por calidad a sus proveedores, se determinaron estos dos parmetros a la par, teniendo como muestras de leche las obtenidas por productores de la Asociacin de Productores de Leche de Sotar ASPROLESO en sus rutinas de ordeo.

son leucocitos y el 2% son clulas epiteliales de descamacin por envejecimiento. Estas son clulas de alto poder fagoctico (capacidad para ingerir las partculas invasoras) y con capacidad para liberar respuestas inespecficas capaces de destruir gran nmero de los organismos invasores. Otra poblacin importante en la defensa de la glndula est constituida por las mismas clulas epiteliales glandulares. Cuando estas mismas clulas mueren debido a la agresin bacteriana, se desprenden del tejido mamario arrastrando consigo gran cantidad de bacterias adheridas a ellas. (3) Actualmente se determina este parmetro mediante el conteo de clulas somticas, empleando para ello un contador electrnico de clulas, que es un instrumento capaz de contar y medir partculas en suspensin. El sistema est formado por los siguientes elementos: 1. Dos electrodos, uno en el interior de un tubo con un pequeo orificio que se introduce en la suspensin de partculas a contar, y un segundo electrodo que se introduce directamente en dicha suspensin. El tubo con el orificio est conectado a un manmetro de mercurio y a una bomba. El manmetro controla mediante el desplazamiento del mercurio la conexin y desconexin de los electrodos. 2. Un amplificador electrnico de la seal, un analizador de altura de los pulsos, y una escala, conectados a los electrodos. Cuando la vlvula que controla el manmetro se abre 0.5 ml de la suspensin entran en el interior del tubo por el pequeo orificio. Durante ese tiempo los electrodos estn conectados y registran y transmiten al equipo de amplificacin y anlisis de la seal las oscilaciones de resistencia que detectan. Cada vez que una clula atraviesa el orificio se produce una variacin de la resistencia proporcional al tamao. Estos datos se registran y se analizan. (5) Se han establecido como parmetros de referencia los siguientes:

TEORA.
La mastitis, es un proceso inflamatorio de origen infeccioso de la glndula mamaria que puede ser ocasionada por factores fsicos, qumicos, mecnicos o infecciosos, producido por varias clases de microorganismos, pero que, en el medio colombiano, por lo menos en el 85% de los casos, involucra a bacterias de los gneros Streptococcus y Staphylococcus. El resto pueden ser producidas por otras bacterias como E coli, Pseudomonas spp, Corynebacterium, y por mohos y levaduras. (2) Las clulas somticas, son clulas que se difunden desde la sangre a los tejidos y conductos de la glndula mamaria, como respuesta inflamatoria defensiva a una agresin traumtica o, en la mayora de los casos, infecciosa. Aproximadamente el 98% de esas clulas

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CUADRO 1. Interpretacin de CCS.

1~PHUR GH FpOXODV VRPiWLFDV SRU P/ &6P/         &DOLILFDFLyQ ([FHOHQWH %XHQD 5HJXODU 0DOD

Equipos Bao termosttico, balanza analtica, autoclave, contador electrnico de partculas, pila refrigeradora. Materiales y reactivos Pipetas volumtricas de 1 y 10 mL, pipeteadores, recipientes de polipropileno esterilizados, gradillas, varillas de agitacin, tubos de ensayo con tapa rosca, beakers de 100 y 200 mL, solucin de resazurina al 0,005% p/v, lquido fijador. Mtodos de anlisis. Los dos mtodos empleados fueron: Conteo de clulas somticas CCS (mtodo electrnico para contar partculas). Resazurina (mtodo de xido reduccin). Procedimiento experimental. Debido a que los productores se encontraban dispersos en una amplia zona de la regin de Sotar, era imposible el realizar la toma de muestra de ordeo por el personal tcnico de ASPROLESO, por lo cual, a los productores se les capacit y se les entregaron recipientes de polipropileno esterilizados para que ellos tomaran adecuadamente las muestras y las entregaran al centro de acopio o a los carros de recoleccin de leche. Una vez llegaban al laboratorio de control de calidad de ASPROLESO las muestras enviadas por los productores, stas se fraccionaban para la determinacin de los dos parmetros en estudio, como se explica a continuacin. Protocolo de toma de muestras para CCS. El protocolo utilizado para CCS fue el siguiente:

Fuente: COTRINO, Vctor. 2004. Con relacin a la resazurina, sta es un indicador de pH que vira entre 3,8 (anaranjado) a 6,5 (prpura) Es una oxazona que imparte color azul a la leche normal. Por prdida de oxgeno se reduce en dos etapas: en la primera pasa por diversas tonalidades de violeta hasta rojorosa, color ste que se atribuye a la formacin de un compuesto denominado resorufina; a diferencia del azul de metileno esta etapa de reduccin es irreversible, es decir, en contacto con el oxgeno del aire el color azul original no se restituye. Si la prdida de oxgeno contina, la reduccin pasa a una segunda etapa reversible, en la cual la resorufina se reduce a dihidro-resorufina, compuesto incoloro que por oxidacin puede pasar de nuevo a resorufina (rojo-rosa). (4) La rapidez de la reduccin est en proporcin directa con la densidad bacteriana.

MATERIALES Y METODOS.
Materia Prima Se utiliz la leche producida en el municipio de Sotar (Cauca), por los productores vinculados a ASPROLESO. CUADRO 2. Interpretacin de resultados de resazurina.
&DOLGDG ([FHOHQWH %XHQD 5HJXODU 0DOD &RORU $]XO FHOHVWH 9LROHWD D]XODGR 9LROHWD URML]R 5RMR URVD LQFRORUR &DOLGDG EDFWHULDO 8)&P/   D 
3$

Fuente: Friesland de Colombia.

Se agitaron las muestras. Se tomaron 7 mL de leche de cada una de las muestras, con pipetas estriles para cada una. Se depositaron los 7 mL de leche en tubos de ensayo con lquido conservante, suministrados por el Laboratorio Mdico Veterinario LMV. Figura 1. Se taparon los tubos de ensayo y se homogeniz la mezcla contenida. Se rotularon los tubos de ensayo. Se colocaron en refrigeracin los tubos de ensayo, a 4 C.

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Las muestras refrigeradas despacharon, al Laboratorio Mdico Veterinario ubicado en la ciudad de Bogot, cumpliendo las siguientes pautas.

FIGURA 1. Muestras de leche y tubos de ensayo con lquido conservante.

Se asegur que el tiempo trascurrido entre la toma de las muestras y la recepcin en el laboratorio en Bogot, no fuera mayor a 36 horas ya que esto causara el deterioro de ellas. Se garantiz que las muestras estuvieran correctamente rotuladas e identificadas con marcador resistente al agua Se enviaron en cajas de copor o trmicas, con hielo, .para proporcionar ambiente de refrigeracin. Se evit que los tubos de ensayo entraran en contacto directo con el hielo.

Protocolo de toma de muestras para resazurina. El protocolo utilizado para la prueba de la resazurina fue el siguiente: Se agitaban las muestras. Se tomaron 10 mL de leche de cada una de las muestras parciales, con pipetas estriles para cada una. Se depositaron los 10 mL de leche en tubos de ensayo y se rotulaban. Se adicion a cada tubo de ensayo 1 mL de solucin de resazurina al 0.005 % p/v. Se tap el tubo y se homogeniz la mezcla contenida. Se rotularon los tubos de ensayo. Se incubaron las muestras en el bao termosttico a 37 oC, durante 1 hora. Se observ el cambio de coloracin y se compar con la tabla patrn. Figura 3. Se realiz la clasificacin.

Fuente: El autor. FIGURA 2. Toma de muestra de leche en tubos de ensayo con conservante

Fuente: El autor.

RESULTADOS Y DISCUSIN.
Una vez obtenidos los conteos de clulas somticas y la valoracin de la resazurina, se obtuvieron los siguientes resultados: (Cuadro 1 y 2) De lo anterior se puede determinar que de las muestras analizadas a travs de resazurina el 78.78% muestran una calificacin de excelente calidad, (Cuadro 3) mientras que de acuerdo con el conteo de clulas somticas (CCS) slo se encuentran dentro de este rango un

28.79% de stas (Cuadro 4). Lo anterior puede ser explicado porque la resazurina es slo un indicador del potencial de oxido-reduccin (Eh) del oxgeno disuelto en la leche y debido a la presencia en baja proporcin de microorganismos aerobios y por su bajo consumo de oxigeno se produce una disminucin lenta del potencial Eh al cabo del tiempo de duracin de la prueba. Esto se refleja en una coloracin azul al momento de realizar la lectura, lo que significa que el mayor nmero de bacterias presentes en este tipo de leche son de tipo anaerobio, conclusin a la cual se llega con base en los CCS y en la literatura consultada.

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FIGURA 3. Tabla patrn de coloracin

6.0

5.5
Excelente.

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0
Regular.

2.5

2.0

1.0
Mala.

0.0

Buena.

CUADRO 3. Resultados de CCS

&DOLGDG GH OHFKH ([FHOHQWH %XHQD 5HJXODU 0DOD 0XHVWUDV     3RUFHQWDMH    

Fuente: El autor. Cuadro 4. Resultados de resazurina.

&DOLGDG GH OHFKH ([FHOHQWH %XHQD 5HJXODU 0DOD 0XHVWUDV     3RUFHQWDMH    

Esta situacin es evidente se en las leches con calificacin tipo regular, psima, mala y pobre, para las cuales los CCS arrojaron un 22.72%, mientras por prueba de resazurina estas leches solo arrojaron un 6.05 %. Esto indica que la prueba de la resazurina permite determinar condiciones mltiples de circunstancias higinicas y bacteriolgicas de la leche objeto de examen. Este complejo puede estar formado por tres tipos de integrantes: grmenes acidificantes y reductores, en especial coliaerogenes, estreptococos y estafilococos; otras bacterias, y clulas a consecuencia de la mastitis, los cuales no pueden ser identificadas por la resazurina debido al limitado mecanismo de reaccin de la prueba. Se ha demostrado que nmeros elevados de clulas somticas, como algunos de los encontrados en este estudio, afectan la composicin de la leche, debido a los incrementos en la concentracin de enzimas proteolticas, tambin las llamadas enzimas tipo plasminas y lipolticas, esto como consecuencia de la lisis sufrida por leucocitos y bacterias durante la accin de defensa del sistema intramamario contra las infecciones bacterianas. As es como la plasmina rompe la kappa-casena en fragmentos ineficientes a la hora de la coagulacin, disminuyendo la capacidad de formacin de la cuajada, la firmeza y calidad del queso, debido a la hidrolizacin y alteracin de la estructura de la micela de casena (6) (de alto valor industrial), disminuyendo su proporcin en la leche. As mismo, puede producir gelificacin y deterioro tem-

Fuente: El autor. FIGURA 4. Resultados de pruebas de resazurina.

5HVXOWDGRV GH FDOLGDG GH OHFKH &&6PO 9V 5HVD]XULQD

 h r r q r w h r p Q

90,00% 80,00% 70,00% 60,00% 50,00% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% Excelente Buena Regular Mala
8 hyvqhqqryrp ur

C.C.S/ml Resazurina

Fuente: El autor.

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prano de la leche ultrapasterizada debido a la reduccin de la tolerancia de la leche a los tratamientos trmicos causada por cambios en el perfil mineral y en la proporcin de lactosa porque la capacidad de filtracin selectiva ejercida por el epitelio mamario aumenta varias veces las concentraciones de sodio y cloro y disminuye las concentraciones de calcio, fosfatos, magnesio y potasio, buscando mantener el balance osmtico por la reduccin de la lactosa en la leche calculada en un 10%. Por otro lado, como consecuencia de la presencia de enzimas lipolticas, a medida que aumenta el CCS aparecen sabores rancios debido a la accin de las lipasas sobre las grasas de la leche, deteriorndolas y liberando cidos grasos de bajo peso molecular que producen sabores desagradables. (6)

das en el potencial de xido-reduccin sin tomar en cuenta la contaminacin de bacterias anaerobias, resulta bastante equivocado en casos de leches mastticas, pues no se est considerando esta ltima clase de microorganismos y que resultan de alto riesgo para la salud de los consumidores. En caso contrario, leches no mastticas, es una prueba fcil, rpida y econmica para determinar indirectamente la calidad microbiolgica de la leche.

REFERENCIAS
(1) AMIOT, J. Ciencia y Tecnologa de la leche. Principios y aplicaciones. Zaragoza (Espaa): Acribia, 1987, p 9. (2) FEDERACIN NACIONAL DE GANADEROS, FEDEGAN. COTRINO B., Vctor D.M.V. [en lnea] Manejo integrado de plagas y enfermedades en explotaciones ganaderas. Mastitis y calidad de la leche. Bogot. Agosto de 2003. [Citado en 30 de agosto de 2004]. Disponible desde Internet: URL:http:www.fedegan.org.co81manejoIntegrado.html (3) COOPERATIVA COLANTA. Revista Despertar Lechero. Clulas somticas y calidad de leche. Medelln (Colombia): Colanta, 2000. v. 17, p. 39-48. (4) UNIVERSIDAD DE ZULIA. Introduccin al control de la calidad de la leche cruda. Gua prctica. [en lnea]. Maracaibo. 2003 [citado en 30 de agosto de 2004]. Disponible desde Internet: URL:http// www.members.tripod.com.ve/tecnologa/ introduccin.htl. (5) UNIVERSIDAD AUTNOMA DE MXICO UNAM. III Congreso nacional de control de mastitis y calidad de la leche [en lnea] Diagnstico de la mastitis subclnica bovina. Miguel ngel Blanco Ochoa. Ciudad de Mxico. 23 de junio de 2003. [Citado en 30 de agosto de 2004].Disponible desde Internet: URL:http://www.cnmweb.bizland.com/ publicaciones/Blanco.PDF (6) COOPERATIVA COLANTA. Revista Desper tar Lechero. Relacin del recuento de clulas somticas con la protena en leche de bovinos. Medelln (Colombia): Colanta, 2001. v. 21, p. 10-32.

CONCLUSIONES.
De acuerdo con los resultados obtenidos por las pruebas, se estableci que la diferencia al evaluar calidades de leche mediante los dos mtodos es bastante notoria. Se debe tomar en cuenta que un CCS evala de manera indirecta la totalidad de bacterias presentes en la leche, tanto aerobias como anaerobias, mientras la prueba de resazurina y la de reduccin de azul de metileno por mencionarla, tasan nicamente la presencia de bacterias aerobias, debido a que utilizan como principio de reaccin la xido-reduccin del oxgeno disuelto presente en la leche y que es consumido por las bacterias para su reproduccin. Esto limita y/o desestima la presencia de contaminacin procedente de bacterias anaerobias, las cuales son las principales fuentes de infeccin intramamaria en las ubres de las vacas y que desencadenan la mastitis clnica o sub-clnica dependiendo de la agresividad de las bacterias, tal como lo reporta la literatura. Los grmenes acidificantes y reductores, mencionados anteriormente, son los ms importantes en la prueba de la resazurina, mientras que las clulas somticas a consecuencia de la mastitis son las que menos la influencian. (Figura 4) Por lo tanto, el determinar el estado de la calidad higinica y sanitaria de la leche por medio de pruebas basa-