You are on page 1of 3

BAB I PENDAHULUAN Latar Belakang Transformasi adalah proses pemindahan molekul DNA donor dari lingkungan luar sel.

Vektor kloning yang merupakan pembawa gen yang akan dikloning ditransformasi ke dalamsel inang. Sel kompeten adalah sel inang yang memiliki kompetensi untuk dimasuki vektor kloning.Perlakuan untuk memasukkan sel kompeten dapat dilakukan dengan menggunakan metodekejutan panas (heat shock) atau kejutan pulsa listrik (metode electroporation). Penyeleksian koloni bakteri untuk mendapatkan kloning yang diinginkan dengan cara X-galatau pemotongan dengan enzim plasmid restriksi. Seleksi dengan X-gal dapat digunakan Sedangkan untuk mengidentifikasi rekombinan dengan komplementasi.

pemotongandengan enzim restriksi dapat digunakan untuk menyeleksi plasmid rekombinan hasil kloning.Hasil pemotongan tersebut dielektroforesis dan memperlihatkan pita fragmen DNA sisipanyang terpisah dari pita vektor kloning.

BAB III METODOLOGI A. Pembuatan Sel Kompeten Tahapan pembuatan sel kompeten sebagai berikut: 1. Tumbuhkan E. coli satu loop pada 5 ml media cair LB pada suhu 37oC dengan digoyang selama 20 jam 2. Pindahkan 1 ml kultur pada tabung mikro 1.5 ml 3. Centrifus selama 2 menit, buang supernatant 4. Ulangi tahap 2 dan 3 hingga 3 kali 5. Tambahkan 1ml 0.1 M CaCl2 dingin ke pellet, homogenkan 6. Centrifus selama 2 menit dan buang supernatant 7. Tambahkan 1 ml 0.1 M CaCl2 dingin ke pellet, homogenkan 8. Inkubasi pada es selama 30 menit 9. Sel kompeten sudah siap digunakan untuk transformasi B. Trnasformasi plasmid ke sel E. Coli Tahapan transformasi adalah sebagai berikut 1. Siapkan 5 tabung berisi 10 plasmid pCU118, pBM264, pBM690, pLG692, dan 10 H2O. 2. Tambahkan 200 l E coli kompeten pada masing-masing tabung 3. Aduk pelan-pelan dengan ujung pipet 4. Inkubasi 30 menit di es 5. Pindah tabung ke penangas air 42oC, biarkan 90 detik 6. Pindahkan ke es dan dan biarkan selama 2 menit 7. Tambahkan 800 l media cair LB, inkubasi pada 37 oC selama 30 menit 8. Tumbuhkan 0.1 l kultur pada media agar LB yang mengandung antibiotic ampicilin 9. Inkubasi pada suhu ruang selama 2 x 24 jam 10. Amati dan catat hasil transformasi setelah 24 jam dan 48 jama tahap 3 untuk koloni yang lain.

C. Seleksi Klon dan Hasil Transformasi Tahapn seleksi klon berdasarkan peetumbuhan pada media McConkey agar 1. Pilih 52 koloni yang berwarna dan yang tidak berwarna yang tumbuh pada media LB Amp agar 2. Sentuh satu koloni yang dipilih dengan ujung tusuk gigi 3. Goreskan tusuk gigi pada permukaan media agar McConkey 4. Sentuh koloni yang sama dengan tusuk gigi yang sama 5. Masukkan tusuk gigi pada 5 ml media cair LB Amp 6. Ulangi tahap 2 hingga 3 untuk yang lain terpilih 52 koloni 7. Ulangi tahap 2 hingga 5 untuk yang berbeda plasmidnya (2 plasmid) 8. Inkubasi media cair LB Amp dan McConkey pada suhu ruang selama 24 jam 9. Amati dan catat hasilnya 10. Untuk seleksi berdasarkan RFLP maka plasmid diekstrak dari klon yang tumbuh di media LB Amp. Selanjutunya dilakukan pemotongan dengan enzim EcoRI

You might also like