Botechnologia Wyklad

W1 Biotechnologia- jedna z kluczowych nauk XIX wieku.
Biotechnologia jest nauk interdyscyplinarn skupiajc: - chemia - biologia - biofizyka - matematyka - inynieria chemiczna - inynieria rodowiskowa Biotechnologia: wykorzystanie moliwoci organizmw ywych oraz pochodzcych z nich biokatalizatorw do produkcji i ulepszania dbr konsumpcyjnych. Inspiracj dla rozwoju biotechnologii jest podpatrywanie przyrody i wykorzystywanie jej mechanizmw metabolicznych oraz regulacyjnych w celu polepszenia ycia czowieka. Podzia biotechnologii: - klasyczna - nowoczesna BIOTECHNOLOGIA KLASYCZNA Procesy fermentacyjne: produkcja piwa produkcja wina produkcja octu produkcja fermentowanych napojw mlecznych wytwarzanie chleba z uyciem zakwasu
Produkcja metabolitw wtrnych jest silnie uzaleniona od warunkw rodowiskowych (skad podoa, sposb hodowli). Faza intensywnego wzrostu mikroorganizmw TROFOFAZA. Metabolity wtrne produkowane s w IDIOFAZIE. Grupa wanych idiolitw: - antybiotyki - czynniki nieantybiotyczne (leki) - toksyny - biopestycydy - czynniki stymulujce wzrost rolin i zwierzt Antybiotyki: maoczsteczkowe substancje naturalne, najczciej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich psyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi Replikacja DNA: - aktynomycyna, ryfamycyna Translacje: - chloramfenikol - tetracykliny - streptomycyny Transport przez bony: - polimyksyny - jonofory - nystatyna Synteza skadnikw ciany komrkowej: - penicylina - cykloseryna - bacytracyna Procesy energetyczne: - antymycyna - oligomycyna W1 Przyczyny poszukiwania antybiotykw: - oporno drobnoustrojw - poprawa waciwoci farmakologicznych - dziaanie toksyczne Leki o dziaaniu nieantybiotycznym: POLIETERY (uywane jako promotory wzrostu u przeuwaczy): - Monensin - Lasalocid - Salonomycyna AVERMYKTYNY (makrocykliczne laktony produkowane przez Streptomyces avermitilis) wykazuj aktywno p/pasoytnicz STATYNY (pochodzenia grzybowego, czynniki obniajce poziom cholesterolu u ludzi i zwierzt): - Lovastatyna - Parastatyna - Kwas klawulanowy (inhibitor penicylaz)
Metabolity pierwszorzdowe: s to niewielkie czsteczki chemiczne, ktre mog by produktami kocowymi podstawowych procesw metabolicznych lub ich produktami porednimi Wane przemysowo metabolity pierwszorzdowe: - alkohole: alkohol etylowy - alkohole wielowodorotlenowe: glicerol - aminokwasy: Lys, Thr, Phe, Trp - kwasy organiczne: kwas octowy, kwas propionowy - cukry: fruktoza - polisacharydy: ksantan, gellan - witaminy: B2, B12 Biokonwersja (biotransformacja): aktywno mikroorganizmw w zakresie enzymatycznych przeksztace rnych zwizkw chemicznych, ktre nie wykazuj zazwyczaj adnej funkcji metabolicznej i z du wydajnoci gromadzone s pozakomrkowo.
W1 procesy biotransformacji nie dostarczaj energii nie dostarczaj prekursorw do syntez komrkowych przebiegaj z udziaem niewielkiej iloci enzymw s stereospecyficzne np. biokonwersja steroli
Metabolity wtrne: wszystkie procesy przemiany materii o nieznanej lub drugorzdowej funkcji biologicznej okrelane s mianem metabolitw wtrnych a przemiany ktrych s wynikiem metabolizmem wtrnym; charakteryzuj si wielokierunkow aktywnoci biologiczn
Printed with FinePrint - purchase at www.software-partners.co.uk PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com
AKARBOZA (Actinomycetes) : inhibitor jelitowej glukozydazy, hiperglikemia i synteza trjglicerydw w wtrobie i jelicie u pacjentw z cukrzyc, otyoci i hiperlipidemi IV Ukierunkowana biosynteza: manipulacje warunkami hodowli mikroorganizmw pozwalaj na pewn kontrol ich metabolizmu Stosuje si odpowiednie czynniki: - prekursory: biosynteza penicyliny G w podou z fenylooctanem - induktory: Met w syntezie cefalosporyn - mutagenez: szczepy o wysokiej wydajnoci i wybirczoci produkcji
Bacillusthuringiensis
ANALIZA ILOCIOWA MIKROORGANIZMW 1. Metody mikroskopowe: liczenie drobnoustrojw przy uyciu komr (Thoma, Burkera) liczenie drobnoustrojw w preparacie przeyciowym metoda Breeda metoda DEFT
BIOTECHNOLOGIA NOWOCZESNA Technologie rekombinacji DNA Technologia pozwalajca na manipulowanie materiaem genetycznym na najniszym poziomie strukturalnym genu w sposb cakowicie kontrolowany przez eksperymentatora (swoiste techniki). Najczciej wykorzystywane szczepy: - Escherichia coli - Bacillus subtilis - Sacharomycescerevisiae - Aspergillus niger
2. Metody hodowlane (tylko ywe komrki): metoda rozciecze W1 metoda pytkowa Kocha modyfikacje metody pytkowej Kocha: o metoda filtrw membranowych o metoda posieww spiralnych o metody kropelkowe o metoda mikrohodowli Frosta o plate loap o roll tube o gotowe zestawy z podoami nani9esionymi na plastikowe paski
W1 Otrzymujemy: - szczepionki - hormony - enzymy - przeciwciaa - czynniki wzrostu Biosynteza kombinatoryjna Technologie rekombinacji DNA uywane s aby wprowadzi geny odpowiedzialne za syntez odpowiednich zwizkw do materiau genetycznego mikroorganizmw, ktre wczeniej nie byy zdolne do produkcji tych zwizkw; dalsze postpowanie jest analogiczne do biosyntezy ukierunkowanej. Biopestycydy jako alternatywa dla klasycznych pestycydw posiadaj wski i specyficzny zakres dziaania dziaaj powoli powstrzymuj a nie eliminuj populacje chwastw krtki czas ptrwania bezpieczniejsze dla rodowiska brak problemu zalegania
Istniej dwa typy biopestycydw: 1. biochemiczne: struktura i funkcja podobna do naturalnie wystpujcych zwizkw chemicznych; nietoksyczne (analogi owadzich feromonw- kontrola owadzich populacji) 2. mikrobiologiczne: zwizki wytwarzane przez naturalnie wystpujce lub zmodyfikowane genetycznie bakterie, grzyby i inne. Bioinsektycydy Agrobacteriumtumefaciens
3. Metody wagowe (mokra lub sucha biomasa). 4. Metody optyczne (turbidymetria, nefelometria). 5. Metody biochemiczne: A. pomiar zawartoci pirogronianiu (340 nm) : kwas pirogronowy kwas mlekowy - enzym: dehydrogenaza mleczanowa - NADH+ + H+ NAD+ - reakcja redukcji - zasada: obnienie iloci zredukowanego NAD-u jest proporcjonalna do iloci mikroorganizmw B. bioluminescencja w wykrywaniu ATP: metod mona stosowa do badania stanu higienicznego zakadu, linii produkcyjnych czy pomiaru iloci drobnoustrojw w rodowisku I ETAP: ekstrakcja ATP (zwizki zwikszajce przepuszczalno bon komrkowych). II ETAP: dodatek substratu (lucyferyny) i enzymu (lucyferazy). Enzym w obecnoci ATP katalizuje reakcj oksydatywnej dekarboksylacji lucyferyny lucyferyna AMP, CO2, fotony wiata, utleniona lucyferyna - enzym: lucyferaza - dodatkowo: jony Mg2+ - zasada: wiato ktre jest wydzielane jest rwnowane steniu ATP; ilo emitowanego wiata jest proporcjonalna do iloci ywych komrek C. oznaczanie poziomu ergosterolu pomiar iloci grzybw w produktach ywnociowych D. testy reduktazowe 6. Metody biofizyczne: System Bioscrean: uniwersalny robot mikrobiologiczny (rozcieczenia, nanoszenia, mieszanie, kinetyczny pomiar zmtnienia hodowli); okrelanie zanieczyszcze mikrobiologicznych drody piwowarskich, skrobi, mleka. metoda impedymetryczna: impedancja jest opornoci przepywu prdu przez przewodzc poywk; rozwj mikroorganizmw prowadzi do obnienia impedancji podoa podczas gdy sia jonowa i przewodnictwo zwikszaj si; okrelanie zanieczyszcze mikrobiologicznych surowego i mroonego misa, mleka, sokw, kosmetykw, itp.
cytometria przepywowa: metoda wykorzystywana do kontroli prawidowoci przebiegu procesu biotechnologicznego opartego na hodowli mikroorganizmw
W1
hodowle na skosach agarowych hodowle na supach przygotowanych ze wieych skrawkw rolin wodna zawiesina zarodnikw liofilizaty zarodnikw lub grzybni wegetatywnej
PRZECHOWYWANIE MIKROORGANIZMW Podstawowym rdem szczepw s kolekcje drobnoustrojw. 1. ATCC- drode, bakterie, plenie; 2. NRRL- drode, bakterie, glony, grzyby strzpkowe 3. CBS- drode, porosty, grzyby strzpkowe; moliwo zdeponowania materiau genetycznego drobnoustrojw 4. DSMZ- drode, plenie, plazmidy, wirusy 5. NCTC- bakteria 6. NCIMB- bakterie dla przemysu i medycyny 7. CCM- bakterie, grzyby strzpkowe 8. CCY- drode i promieniowce Kolekcje wiatowe s zrzeszone w wiatowej Federacji Kultur z siedziba w Japonii.
POZYSKIWANIE I DOSKONALENIE MIKROORGANIZMW: Procesy biotechnologiczne prowadzone z udziaem drobnoustrojw izolowane ze rodowiska przebiegaj najczciej z wydajnoci niewystarczajc opracowania ekonomicznie procesw biotechnologicznych. Znaczc popraw ich wydajnoci mona uzyska poprzez zmiany mataboliczno-fizjologiczne powstae w wyniku modyfikacji genotypu drobnoustrojw. MUTACJE: Warunki naturalne: mutanty spontaniczne. Mutacje indukowane: czynniki mutagenne. Mutacje punktowe: odwracalne, nieodwracalne (przesunicie ramki odczytu).
Polskie kolekcje nalece do WFCC: Mutacje to gwna droga pozyskiwania szczepw dla przemysu. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. PCM- Polska Kolekcja Mikroorganizmw (Wrocaw) DMVB- Pastwowa Kolekcja Szczepw Oddziau Weterynarii (Puawy) LOCK- Orodek Czystych Kultur Drobnoustrojw Przemysowych (d) IAFB- Kolekcja Mikroorganizmw Przemysowych (Warszawa) LCC- Laboratorium Kolekcji Kultur (Olsztyn) IBA- Warszawa KOS- Gdynia CPPPPI- Kolekcja Patogenw Rolin (Pozna) Produkcja penicyliny: Penicylium chrysogenum (1945) Szczepy przemysowe, ktre charakteryzuje wybirczo produkcji: - produkcja L-lizyny Corynebacteriumglutamicum : a. mutacja genu kodujcego dehydrogenaz homoserynow (nie wytwarzaj Thr) b. zmiana charakteru kinazy asparaginowej (nie reaguje na due stenia L-Lys) Hybrydyzacja: a. hybrydyzacja naturalna: przekazanie informacji genetycznej dawcy do komrki biorcy w wyniku fizycznego kontaktu obu komrek i polega na wymianie odcinkw DNA midzy chromosomami lub genoforami b. fuzja protoplastw: do otrzymywania protoplastw stosuje si: - bakterie G(+)- lizozym - bakteria G(-)- lizozym, EDTA, warunki jonowe - grzyby- sok odkowy limaka Helix pomatia lub enzymy lityczne pochodzenia drobnoustrojowego (Cytophaga, Arthrobacter, Trichoderma)
Rosja : 1979 rok; ochrona patentowa na szczepy Polska: proces technologiczny moe podlega opatentowaniu ale szczep nie moe. METODY PRZECHOWYWANIA SZCZEPW okresowe przesiewy mikroorganizmw na poywki stae lub pynne i przechowywanie w 40C skosy agarowe zalane warstw jaowej parafiny opracowana indywidualnie metoda przechowywania (suszenie, liofilizowanie, mroenie)
Kolekcje o charakterze przemysowym zajmuj si ponadto przygotowaniem i dostarczaniem czystych kultur do zakadw przemysowych. PRODUKCJA SZCZEPIONEK PRZEMYSOWYCH 1. 2. 3. 4. Namnoenie szczepw skadanych w optymalnych rodowiskach hodowlanych Uzyskanie duej liczby komrek w stanie penej aktywnoci biochemicznej Standaryzacja skadu gatunkowego (zestawienie waciwych proporcji gatunkowych) Zabezpieczenie ywotnoci komrek i ich waciwoci biochemicznych przez odpowiednie utrwalanie szczepionki W1 Przemys winiarski, browarniczy, gorzelniczy- drode na skosach agarowych, w poywkach pynnych, zagszczane hodowle, suszone, granulowane preparaty w ochronnej polewie. Przemys piekarski- kultury liofilizowane lub mroone. Szczepionki grzybw s przygotowywane jako:
W1 Zblienie protoplastw, inicjacja fuzji (PEG)- rekombinacja wewntrz i midzygatunkowa; rekombinacja wicej ni dwch genotypw. Technologie rekombinacji DNA: Technologia rekombinacji DNA polega na przenoszeniu genw z jednego organizmu do drugiego i otrzymywaniu tzw. klonw komrek, ktre s zdolne do syntezy nowego biaka. Narzdzia pozwalajce na wycinanie i czenie fragmentw DNA, syntez DNA, itp.: - enzymy endonukleazy restrykcyjne: rozpoznaj specyficzne zazwyczaj palindronowe sekwencje w dwuniciowym DNA i hydrolizuj wizanie fofsodiestrowe w obu niciach w miejscu rozpoznania sekwencji lub w niewielkiej odlegoci od tego miejsca; - metylazy: towarzysza restryktazom; system chronicy komrki przed inwazj obcego DNA; - egzonukleazy: nukleaza S1 (endoegzonukleaza) hydroliza jednoniciowego DNA lub RNA; - alkaliczna fosfataza - polimerazy DNA: synteza DNA a. polimeraza I DNA- holoenzym - odwrotna transkryptaza
ligaza- czy polinukleotydy ufosforylowane w pozycji 5 do polinukleotydw posiadajcych woln grup 3-OH rybonukleazy- enzymy z trzustki cielcej enzymy lityczne- lizozym, celulazy, chitynazy
COOH
R H2N
COOH H
O L- KETOKWAS
L-AMINOKWAS
Do klonowania genw i ich wprowadzania do komrek gospodarzy su wektory. Proces klonowania genw skada si z kilku etapw: 1. izolacja lub synteza genu (cicia losowe DNA, synteza cDNA) 2. czenie genu z wektorem 3. wprowadzenie rekombinowanego DNA do komrki gospodarza 4. selekcja klonw komrek zawierajcych zrekombinowany DNA 5. produkcyjne wykorzystanie otrzymanych klonw komrek WYKORZYSTANIE REKOMBINOWANYCH SZCZEPW W BIOTECHNOLOGI: hormon wzrostu- somatotropina o wytwarzana przez przysadk mzgow o 191 aa o niedobr- karowato przysadkowa o usunicie sekwencji sygnaowej HGH cDNA, wprowadzenie kodonu start, miejsce wizania rybosomw, promotora lac- sztuczny gen o Escherichia coli- 2 mg/dm3 insulina: o pochodzenia zwierzcego mniej efektywna ni ludzka o aktywna insulina- 2 polipeptydy poczone mostkami siarczkowymi o chemiczna synteza genw odpowiedzialnych za produkcj polipeptydw, wklonowanie do plazmidu- aktywny promotor, transkrypcja, translacja- biako fuzyjne (zawiera fragment jednego z acuchw polipeptydowych) czynniki krzepliwoci krwi o czynniki VII, VIII, IX- krzepliwo krwi o hemofilia- brak jednego z czynnikw o produkcja z Escherichia coli immunoszczepionki: o biaka otoczkowe wirusw, biaka powierzchniowe bakterii o waciwociach antygenowych o wirusowe zapalenie wtroby typu B, wcieklizna, grypa o Lactococcus lactis z plazmidem ekspresyjnym (jadalna szczepionka p/tcowa) inne: o klonowana podpuszczka o enzymy hydrolityczne, pochodzenia mikrobiologicznego rodki piorce W2 BIOKATALIZA
pochodne kwasu
HO2H2CC H2N
COOH H
HO2CH2C O
COOH
KWAS L-Asp
KWAS SZCZAWIOOCTOWY
przeniesienie grupy aminowej z donora na akceptor

Substraty transaminazy: - 2-ketoglutaran - -fluorofenylopirogronian - 4-tiometylo-2-ketomalan - fenylopirogronian - indylopirogronian - 3-imidazolopirogronian Im bardziej skomplikowany enzym tym mniej substratw toleruje. S T E R E O S E L E K T Y W N O (enancjoselektywno, diastereoselektywno) Zdolno do odrniania pojedynczych enencjomerw lub diastereoizomerw. W2 A. Produkcja herbicydw pochodnych kwasu fenoksypropionowego:
CH3 CHCl COOH
R-dehydrogenaza
H3C HOOC
Cl H
H3C HOOC
OH H
kwas R,S- 2-chloropropionowy
kwas S, 2- chloropropionowy
kwas S-mlekowy
Biokatalizator- podstawowe narzdzie procesu biotechnologicznego. Najobszerniejsza klasa naturalnych substancji katalitycznych to enzymy. CECHY ENZYMW: 1. Selektywno enzymw: o selektywno substratowa o stereoselektywno o regioselektywno o chemiselektywno SELEK TY WNO SUBSTRATOWA Zdolno do tolerancji duej grupy substratw (ale enzym katalizuje tylko okrelony typ reakcji). Substratem R-dehydrogenazy jest izomer R. B. Produkcja aspartamu:
H C O2C C H kwas fumarowy CO2 + NH aspartaza
R-fenoksypropionowego
O2C
H2 C N L-Asp
CO2 H
O 2C
H2 C N
CO2 H
+
CO2CH3 H2N H
L-Asp
proces chemiczny temp: 80-180C produkt uboczny (kwas akrylowy) katalizator miedziowy (toksyczno)
O
termolizyna
CN C
CO2CH3 HN HOOC H2N O H
hydrataza nitrylowa
NH2
akrylonitryl
aspartam
akrylamid
3. Kataliza enzymatyczna jest przyjazna rodowisku. 4. Przyspieszanie reakcji chemicznej o warto 10-9-10-10
40.00 ton L-Asp / rok W2 ZARZUTY WOBEC ENZYMW: Biosynteza aspartamu- enzym w postaci enzymatycznej lub caej komrki, zawsze immobilizowany; 1 kg enzymu 10.000 kg produktu (3$/1 kg). REGIOSELEKTYWNO Zdolno odrniania grup funkcyjnych znajdujcych si w rnych regionach tej samej czsteczki. W2 Hydroksylacja steroli: 1. Dziaaj tylko w rodowisku wodnym (kamstwo- biokataliza w ukadach dwufazowych i niewodnych). 2. Cena enzymw. 3. Stabilno enzymw: BIOKATALIZATOR Aspartaza Fumaraza Deaminaza Arg Transaminaza Amidaza penicylazy Proteaza Izomeraza glukozy OKRES PTRWANIA 6 m. 2 l. 180 dni 140 dni 90 dni > 6 m. > 60 dni > 60 dni
O HO
Aspergillus niger O progestreon O 1,1-alfa-hydroksyprogesteron
CHE M I SE LE K T YW NO Zdolno do rozrniania okrelonych grup funkcyjnych spord grup o podobnej lub wyszej reaktywno. Hydroliza nitryli:
4. Wydajno reakcji katalizowanych przez enzymy: - reakcje wysokowydajne: o produkcja L-Asp przez immobilizowan aspartaz o produkcja L-Phe przez amidaz lub transaminaz o produkcja L-tert-Leu przez dehydrogenaz leucynow w reaktorze membranowym o produkcja kwasu 2-chloropropionowego z uyciem lipaz 5. Regeneracja kofaktorw: - metoda regeneracji NAD+: o dodatkowa reakcja chemiczna
CO2 O CO2 dehydrogenaza fenylopirogronianu
CN nitrylaza H3COOC H3COOC
COOH
fenylopirogronian NADH 2000 cykli NAD+
OH S- fenylomleczan
2. Enzymy pracuj w agodnych warunkach- minimalizacja niepodanych reakcji ubocznych (dekompozycja, racemizacja, izomeryzacja). Produkcja akrylamidu:
dehydrogenaza HOCCH3 alkoholowa
CH3CH3OH
10
W2 6. Enzymy nie katalizuj przemysowo atrakcyjnych reakcji: a. kwasy tuszczowe b. syropy fruktozowe c. aspartam d. akrylamid e. 6-APA f. aminokwasy g. cyklodekstryny h. S-2-chloropropionian Forma katalizatora ENZYMY ZALETY prosta aparatura, tolerancja na wysokie stenia substratw i produktw wysoka aktywno WADY niezbdny system regeneracji kofaktora
W2 o reaktor membranowy (zwikszenie masy kofaktora), np. otrzymywanie L-tert-Leu:

O (CH3)2C CO2 PEG-NADH 6000 cykli PEG-NAD+ + NH dehydrogenaza Leu (CH3)2C CO2 H2N H
reakcja w roztworach wodnych
CO2
dehydrogenaza mrowczanowa
reakcja w rozpuszczalnikach organicznych

HCOO-
zastosowanie caych komrek: rdo wgla napdzajce komrk alkohole wykorzystywane do produkcji lekw benzodiazepinowych 2 kg glukozy / kg produktu
immobilizowane
atwa procedura, substraty rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych, atwe odzyskanie enzymu atwe odzyskanie enzymu brak systemw regeneracji kofaktora
produkty uboczne, substraty nierozpuszczalne w wodzie, ekstarkcja niska aktywno
KOMRKI
O O O
CH3
Z. rouxii, glukoza
O O izomer S H
CH3 OH
kultury rosnce o stereoselektywna redukcja 2-podstawionych--ketoestrw kultury spoczynkowe

O R1 O R2Cl OEt R1 R2 OH H R1 NH2NH2 R2 H H OEt O O R. arrbizzus ATTC 1145
aktywno atwa obrbka, mniej produktw ubocznych wielokrotno uycia
utrata aktywnoci podczas procesu immobilizacji sprzt, obrbka duych objtoci, nisza tolerancja na reagentynisza produktywno, niska tolerancja na rozpuszczalniki organiczne, reakcje uboczne dua biomasa, produkty uboczne niska aktywno niska aktywno
immobilizowane
H R2
OH H
O OEt
NH2NH2
W2 WYKORZYSTANIE ENZYMW W PRZEMYLE 1. Optycznie czynne: a. D-p-hydroksymetyloglicyna (prekursor semisyntetycznych penicylin i cefalosporyn)
OH NH2
R1
R2
11
12
CO HO N H CHO racemizacja spontaniczna COOH + NH2 amidoalkilacja CO NH2 + D-hydantoinaza HO N H H CO NH CO NH CO
akrylonitryl woda hydratacja
oddzielenie katalizatora
dekoloryzacja
produkt
hodowla i immobilizacja mikroorganizmow
CH2CH2CH
hydrataza nitrylu woda
CH2CH2CHNH2
amidaza woda
CH2CH2COOH
- Rhodococcus rhodochrous (rwnie produkcja nikotynamidylu z 3-cyjanopirydyny) - H-NHaza 520 kDa- mocznik jako induktor, substraty alifatyczne - L-NHaza 130 kDa- cykloheksanokarboksyamid, substraty aromatyczne - Krotonamid- obie formy 3. Produkcja kwasu D-pantotenowego.
HOOC OH HO NHCOSH 2 H
H OH O O
OH H O O DL-PL O
OH O O
D-karboamylaza
D-P L L-specyficzna hydroliza
L-PL D-specyficzna hydroliza
HOOC HO H NH2
2. Produkcja akrylamidu.
O
OH H COOH
H OH COOH
odzyskanie katalizatora akrylonitryl woda usuniecie CO2 hydratacja oddzielenie katalizatora
L-PA
D-PA
nierozpuszczalny akrylonitryl zageszczenie usuniecie Cu (dekoloryzacja)
PL- lakton pentyloway PA- kwas pantoteinowy DL-PD- hydroliza enzymatyczna ekstrakcja D-PA obrbka D-PL L-PL obrbka DL-PL suszona mycelia Fusarium oxysporum 70% roztwr form L i D PL w pH 7 przez 20 h izomer D jest cakowicie hydrolizowany
W2 proces mikrobiologiczny:
W2 4. Produkcja hydroksyproliny. trans-4-hydroksy-Pro hydriksylacja Pro (8 izomerw) hydroksylaza z Dactylosporangium sp. (RHI-trans-4-hydroksy-1-Pro) hydrolaza z Streptomyces sp. (TH2-cis-3-hydroksy-1-Pro) dioksygenazy, askorbinian
SPOSOBY ZASTOSOWANIA ENZYMW W R. CHEMICZNYCH 1. 2. 3. 4. Typowe reakcje w roztworach wodnych. Enzymy immobilizowane. Reakcje w ukadach dwufazowych. Reakcje w rozpuszczalnikach organicznych.
13
14
ENZYMY W ROZPUSZCZALNIKACH ORGANICZNYCH Zastosowanie ukadw niewodnych: - umoliwia rozpuszczanie hydrofobowych substratw - przesuwa rwnowag reakcji w stron reakcji syntezy a nie hydrolizy (synteza estrw, peptydw, laktonw) - daje moliwo uniknicia niepodanych reakcji ubocznych zachodzcych w obecnoci wody - daje moliwo uniknicia procesu immobilizacji (atwy odzyski nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikach organicznych enzymw - w przypadku, gdy immobilizacja jest niezbdna wystarczy immobilizacja na porowatych powierzchniach - atwy odzysk produktu - wzrost termostabilnoci enzymw - obnione ryzyko zakaenia mikrobiologicznego Badania zastosowania enzymw w roztworach organicznych rozwijay si w kilku etapach: - woda / rozpuszczalnik organiczny mieszajcy si z wod - ukady dwufazowe - rodowisko niewodne Woda jest niezbdna enzymom do przyjcia odpowiedniej konformacji. Enzym musi by otoczony molekularn czsteczka wod. PROBLEM pH Enzymy liofilizowane bd wytrcone z roztworw o pH optymalnym- dla ich aktywnoci pami pH (najlepiej liofilizowa ze rodowiska o pH optymalnym, bo to pH enzym zapamita). W rozpuszczalnikach organicznych nie da si zmierzy pH- enzym bdzie w takim stanie w jakim by liofilizowany (grupy jednogenne enzymu odpowiedz na to w jakim s rodowisku). W2 P RZYGOTOWANIE BIOKATALIZATORA modyfikacja kowalencyjna, np. przyczenie PEG modyfikacja niekowalencyjna: o the ion pairing (parowanie jonw)- niezbdne niskie stenie surfaktantu o liofilizacja z roztworw wodnych w obecnoci: soli nieorganicznych (KCl), np. subtylizyna Carlsberga bya liofilizowana w obecnoci KCl, uzyskano enzym, ktrego aktywno w heksanie bya 4000 razy wysza zwizkw organicznych (etery koronowe, cyklodekstryny) substratw- zmiany w specyficznoci substratowej (molecular imprintinganalog stanu przejciowego jest zmieniony tak, e uzyskuje aktywno kataliyczn)
np. oksydaza polifenolowa- w heksanie podane produkty (chinony) d do pozostania blisko enzymu (utrata aktywnoci, reakcje uboczne); zamiast heksanu stosue si chloroform.
2. Rozpuszczalnik musi by obojtny dla reakcji: - reakcja transestryfikacji- zastosowanie rozpuszczalnika o charakterze cukru lub alkoholuestry rozpuszczalnikowe
Miar hydrofobowoci rozpuszczalnika jest log P (P- wspczynnik podziau pomidzy etanol a wod). log P wysoki- rozpuszczalniki niepolarne (proszki enzymatyczne) log P niski- rozpuszczalniki polarne REAKCJE ENZYMATYCZNE ZACHODZ CE W R O Z P U S Z C Z A L N I K A C H O R G A N I C Z N Y C H: a. utlenianie steroidw- sterole charakteryzuj si nisk rozpuszczalnoci w H2O; Nocardia rodocrous; 3--hydroksy-5-steroid 3-keto-4-steroid, np.: utlenianie cholesterolu do cholestenonu (heksan:benzen 1:1) b. reakcja epoksydacji i hydroksylacji
W2 c. reakcja katalizowanaprzez dehydrogenaz alkoholow, np. HLADH (wtroba koska); optycznie czynne alkohole, ketony; enzym immobilizowany na szklanych kulkach, eter izopropylowy, racemiczny alkohol lub keton, regeneracja kofaktoraaldehyd izomasowy d. polimeryzacja fenoli e. depolimeryzacja lignin f. synteza estrw- lipazy jako proszki enzymatyczne lub cae komrki, estryfikacja kwasw tuszczowych; i. wysuszone mycelia Rhizopus arrhizus w mieszaninie oktanolu + kwasu olejowego + sita molekularne (wi wod ze rodowiska) ii. reakcja interestryfikacji (wymiana grup acylowych) wana komercyjnie; produkcja masa kakaowego, niskotopliwe margaryny (topi si ju w 30C) iii. lipaza z Rhizopus nivens- przeksztacanie POP (pochodna glicerolu) przy udziale stearynianu w mieszanin zwizkw, ktre s skadnikami masa kakowego; modyfikacja triglicerydw wykorzystywana do otrzymywania niskotopliwych margaryn g. synteza peptydw- udzia wody 50% lub ukad niewodny; hydrofobowe pochodne aminokwasw i. chymotrypsyna immobilizowana na Sepharose ii. ester N-acetylo-L-Phe-o-metylowy + amid Ala (Gly) w butanodiolu (10% wody) iii. chymotrypsyna immobilizowana na chitynie katalizuje syntez HOOC-Tyr-Gly-NH2 95% acetonitrylu h. rozdzia mieszanin recemicznych- lipaza ze szczepu Candidacylindracea
WP YW ROZP USZCZALNIKA NA P ROCES BIOKATALIZY bezporedni wpyw na enzym- obnienie aktywnoci katalitycznej lub stabilnoci oddziaywanie na reagenty oddziaywanie na warstw molekularn otaczajc enzym
J A K W Y B R A R O Z P U S Z C Z A L N I K? 1. Kompatybilno rozpuszczalnika z planowan reakcj: - np. modyfikacja cukrw- cukry rozpuszczaj si w hydrofilowych, mieszalnych z wod rozpuszczalnikach; zastosowanie rozpuszczalnika niepolarnego jest niekorzystne poniewa nie dojdzie do kotaktu pomiedzy substratem a enzymem
15
16
lipaza C. cylindracea OH OCO(CH2)10CH
mikroesteraza z Candidalipolytica (5,7 kDa) mikroproteaza z termofilnego szczepu Actinomyces sp. mikrozym z archeabakterii Sulfolubus sulfataricus metaloproteinaza z Grant Kurthia spirofornie (alkalofilna, termostabilna) mikroesterazy z termofilnych grzybw (1530-5257 kDa)
Mikrozymy s alternatyw dla rybozymw i abzymw. Jaka jest rnica midzy ekstermofilami a ekstremozymami? (EGZAMIN)
(+) mentol + CH3(CH2)10COOH
(-)
EKSTREMOZYMY Enzymy pochodzce z mikroorganizmw ekstremofilnych. Termofile : Topt > 45C - hipertermofile : Topt > 85C - psychrofile : Tmin < 0C - acidofile : pH < 2 - alkalofile : pH > 10 - barofile : p > 1 atm - halofile : NaCl 4-5 M - metalofile : odpowiednie metale cikie - mikroaerofile : O2 < 21% - enetektofile : mikroorganizmy yjce w eutektycznej warstwie lodu (ld typu 4) Badania zaawansowane prowadzone s na termozymach.
W przemyle rozdzia mieszaniny racemicznej kwasw 2-halogenokarboksylowych (2chloro i 2-bromopropionian) przy pomocy butanolu, w heksanie. Rozdzia racemicznych alkoholi przy pomocy wiskiej lipazy trzustkowej, otrzymuje si 2-oktanol, 2-dodekanol, transestryfikacja z trichloroetylomalanem (izomer R reaguje dajc czysty R-ester, izomer S wydzielony)
W2 PERSPEKTYWYBIOKATLIZY 1. Dostosowanie biokatalitycznej czsteczki do procesu: poszukiwanie nowych biokatalizatorw pochodzcych z ekstremofili wprowadzanie zmian w molekularnej strukturze biokatalizatora (modyfikacje chemiczne, mutacje punktowe, ukierunkowana molekularna ewolucja in vivo) odpowiednia posta biokatalizatora inynieria warunkw fizycznych procesu inynieria rodowiska reakcji (rodowisko niewodne, dwufazowe, ciecz nadkrytyczna) 2. Katalityczne bioczsteczki: rybozymy (RNA-zymy)- niektre domeny natywnych czsteczek RNA o waciwociach katalitycznych, opisane na poczatku lat 90 deoksyrybozymy (DNA-zymy)- katalityczne DNA znalezione w kombinatoryjnych bibliotekach fragmentw jednoniciowych syntezowanych chemicznie i wyselekcjonowanych za pomoc metody Selex abzymy- p/ciaa katalityczne; immunizacja zwierzt dowiadczalnych przy pomocy analogu stanu przejciowego jakiego substartu (p/ciaa katalityczne); droga produkcja, okoo 100 rnych reakcji (hydroliza, kondensacja, inne) W3 ABZYMY (dodatkowo seminarium) S to katalityczne przeciwciaa wystpujce w naturze. mleko kobiet karmicych- abzymy o aktywnoci kinazy biakowej, rybonukleazy, deoksyrybonukleazy, -amylazy. mikrozymy masy molowe nisze ni 10 kDa
Komercyjny sukces: fag polimerazy z Thermus agnaticus (Pyrococcus furiosus): termofilne amylazy, ksylanazy, proteazy (produkcja glukozy i fruktozy ze skrobi, bielenie mas papierniczych, browarnictwo, detergenty piorce). Etap wdraania: - pullulanaza z Thermococcus aggregans - hydrataza nitrylowa z Bacillus pallidens W3 termoacydofilna esteraza z Bacillus acidocaldavirus termostabilne lipazy z Bacillus thermocatemulants
Badane psychrofile: - lipaza z Candidaautarctica - antarktyczna mletylizyna z TA41 (muteina 3G7-3 cykle ukierunkowanej ewolucji in vitro, wymiana 7 aminokwasw, 500-krotny wzrost termostabilnoci w 60C, przesunicie Ttop)- detergenty piorce - psychrofilne oksydorektuazy- biosensory, bioremedacja skaonych ropopochodnymi zwizkami rodowisk - lipazy i esterazy w rodowiskach niewodnych (gsto czsteczki) - glikozydaza - w niskotemperaturowych roztworach hydrolizy (hydroliza laktozy w mleku i ciekach o duej zawartoci serwatki Enzymy eutektofili- badanie metagenomu (rodowiskowe DNA). Ukierunkowana ewolucja enzymw in vitro opiera si na wykreowaniu duej liczby wariantw wyjciowego biaka katalitycznego i znalezienie wrd nich docelowego ulepszonego enzymu; stworzenie biblioteki wariantw genu enzymw (108 1012 wariantw) i sprawdzenie czy kady wariant ulega ekspresji;
- najmniejszy opisany enzym to mikroesteraza z Bacillus stearothermophilus (problemy z procedur izolacji i oczyszczania)
a. Tworzenie biblioteki genw: - metody nierekombinacyjne
17
18
Ep-PCR (error-prone PCR) mutacje chemiczne wyjciowego DNA techniki inynierii biakowej (ukierunkowane punktowe mutacje, mutacje poprzez nasycenie punktowe) o pasae genw przez mutatorowe szczepy Escherichia coli - metody rekombinacyjne o tasowanie genw (DNA shuffling) o STEP (Stagered Extention Process) o RACHITT (Random Chimera Genesis On Transient Template) b. Wizanie genotypu z fenotypem: - ekspozycja na fagu (biako fuzyjne z biakiem paszcza wirusa) - ekspozycja na powierzchni komrki drodowej (2002 r.) - ekspozycja na rybosomie (rybosom m-RNA biako = kompleks) - ekspozycja na m-RNA - kompertmentacja in vitro (jeden gen w kropelce wody; inertny) c. Sortowanie biblioteki wariantw zmutowanego genu fizycznie zwizanego z enzymem jako produktem jego ekspresji - selekcja (wana) - skrining wysokorpzepustowy o QUEST (obecny polimeryczne aktywator transkrypcji) o FAS (pomiar fluorescencji klonw zawierajcych rne warianty genw enzymu) d. Dotychczasowe osignicia DE: - zmieniona peroksydaza cytochromowu C W3 - Escherichia coli - galaktozydaza - glukozydaza - lipaza Staphylococcusaureus fosfolipaza - dehydrogenaza 3-izopropylojabczan (zwikszenie aktywnoci) - fragment DNA (biblioteka genw hipertemofilnego Pyrococcus furiosus) o aktywno -laktamazy - inynierowanie szlakami metabolicznymi (biosynteza karotenoidw) - modyfikacje DE (3-indolo-glicerol) o izomeraza fosforybozylo antranilanu o o o
o o
nowe makrolidy- manipulacje na poziomie syntezy poliketydylowej karotenoidy
ANTYBIOTYKI 1928 r. pocztek ery antybiotykw 1942 r. definicje antybiotykw S.A.Waksman ... antybiotyki s to substancje chemiczne wytwarzane przez mikroorganizmy i majce w duych rozcieczeniach zdolno zabijania lub hamowania wzrostu innych drobnoustrojw...
W3 DEFINICJA WSPCZESNA Makroczsteczkowe substancje naturalne, najczciej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich psyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi, ktre w maym steniu dziaaj wybirczo na struktury i procesy biologiczne hamujce wzrost lub rozmnaanie komrek. PODZIA ZE WZGLDU NA BUDOW CHEMICZN pochodne aminokwasw, np.: o -laktamy o antybiotyki polipeptydowe o antybiotyki glikopeptydowe o antybiotyki lipopeptydowe pochodne cukrw, np.: o aminoglikozydy o glikolipidy antybiotyki makrocykliczne chinony i ich pochodne, np.: o antracykliny inne (pochodne cykloalkanw, nukleozydy, polietery aromatyczne, fosfoniany, steroidy) PODZIA ZE WZGLDU NA WACIWOCI BAKTERIOBJCZE I BAKTERIOSTATYCZNE Antybiotyki -laktamowe penicyliny TYP PENICYLINY benzylowa (penicylina G) ACUCH BOCZNY PREKURSOR kwas fenylooctowy
Nowe postacie preparatw enzymw biokatalityczny plastik zoa do bioreaktorw enzymy zamykane w hybrydowych kompozytach organiczno- nieorganicznych biokatalizator zamykany w sieci polimeru wraz z czsteczkami magnetytu (zoa do reaktorw fluidalnych) sieciowanie krysztaw enzymw (CLESs) usieciowane agregaty biaek enzymatycznych (CLEAs) Inynierowanie rodowiskiem reakcji ciecze jonowe- sole wystpujce w temperaturze otoczenia w stanie ciekym (cieke w temperaturze T>300C, rozpuszczaj si w nich rne zwizki, organiczne i nieorganiczne polimery; wysoka polarno, znikome cinienie par, doskonaa kwasowo Lewisa Bronsteda, recykling) stosowane w laboratorium w procesach transestryfikacji, alkoholizy, amonolizy, rozdziale racematw P-chiralnych hydroksymetanofosfonatw, syntezie aspartamu (przy udziale termolizyny) rozpuszczalniki nadfluoranowe Biokataliza i biosynteza kombinatoryjna biokataliza kombinatoryjna jest technik stosowan w celu stworzenia bibliotek produktw naturalnych lub syntetycznych o lipaza z Candida antarctica (biblioteka 24 estrw; 4 alkohole + 6 estrw) biosynteza kombinatoryjna to przetwarzanie lub inynierowanie naturalnymi szlakami metabolicznymi aby otrzyma analogi produktw naturalnych
CH2
hydroksybenzylowa (X)
CO
kwas hydroksyfenylooctowy
HO
pentylowa (F)
CH2
CO
kwas 3-heksynowy
CO
fenoksymetylowa (V) kwas fenoksyoctowy
O
n-heptylowa (K)
CH2
CO
kwas karpylowy
CO
19
20
Penicylina G - pierwszy naturalny antybiotyk -laktamowy o bardzo dobrej aktywnoci wobec ziarenkowcw, Gram (+), wywiera dziaanie bakteriobjcze; nie jest stabilna w roztworach wodnych, wic nie moe by podawana doustnie. W3 Penicylina V- podobne spectrum aktywnoci- nieaktywna w stosunku do gronkowcw; podawana doustnie. AKTYWNO: Penicylina G 1667 mg-1 Penicylina V 1595 mg-1 Penicyliny degradowane s przez -laktamazy. Inhibitory -laktamaz: kwas klawulanowy, sublaktam, tiazolaktam. JAK DZIAA PENICYLINA? Blokuje ostatni etap biosyntezy bakteryjnej ciany komrkowej (tworzenie poprzecznych wiza pomidzy rnymi acuchami peptydoglikanu). Jej bezporednim celem jest transpeptydaza glikopeptydowa (mimikra molekularna). PROCES PRODUKCJI PENICYLIN: 1. 2. 3. 4. 5. Liofilizowane spory szczepu produkcyjnego. Hodowle na skosach agarowych. Kultury wegetatywne w kolbach stokowych. Namnaanie biomasy. Waciwy proces syntezy (dozowanie odpowiednich skadnikw i prekursorw, izolacja, oczyszczanie).
Poczenie to rozszerza zakres dziaania penicylin na bakterie wytwarzajce -laktamazy. Przykadem takich poczonych lekw jest amoksycylina z kwasem klawulanowym, ampicylina z sublaktamem czy piperocylina z tazolaktamem.
O C
H N N O
CH3 CH3
HN N O
CH3 CH3
acylaza, H2O
COOH
6APA
COOH
RCO penicylina G (V) metody chemiczne N RCO N O S CH3 CH3 COOH diacylopenicylina
Jak si otrzymuje semisyntetyczne penicyliny? (E) NOWE ANTYBIOTYKI -LAKTAMOWE Thienamycyna- Streptomyces cattleya szerokie spektrum dziaania (Gram +, Gram -); odporny na dziaanie -laktamaz.
PROCES BIOSYNTEZY PENICYLIN (II fazy): I. II. trofofaza- namnaanie grzybni (30-40 h), szybka asymilacja skadnikw podoa, temperatura 27-24C; idiofaza- waciwa faza produkcji
HO
3HC
H H N O COOH SCH2CH2NH2
WYODRBNIANIE PRODUKTU I OCZYSZCZANIE: A. B. C. D. oddzielenie grzybni od pynu pohodowlanego, filtracja; ekstrakcja rozpuszczalnikami w ukadzie ciecz-ciecz; chromatografia kolumnowa (wgiel aktywny); krystalizacja, suszenie i inne czynnoci prowadzce do otrzymania farmaceutyku Penicyliny semisyntetyczne Penicyliny psyntetyczne zostay wprowadzone do lecznictwa pod koniec lat 50. Niektre z nich maj wski zakres dziaania, np.: - p/gronkowcowe (Oksacylina, Kloksacylina, Metycylina, Nafcylina) - szeroki zakres (Ampicylina, Amoksycylina, Piperacylina) Najbardziej znanym antybiotykiem tej grupy jest Ampicylina, ktra jako pierwsza bya wprowadzona do lecznictwa. Nastpc Ampicyliny jest Amoksycylin, ktra wykazuje znacznie lepsz aktywno i korzystniejsze waciwoci farmakokinetyczne. W3 W ostatnich latach pojawiy si skuteczne preparaty, czce penicylin psyntetyczn z inhibitorem -laktamaz.
Kwas klawulanowy- Strepotmyces sp.; inhibitor -laktamaz. Epithienamycyny (kwas oliwanowy) Streptomyces olivaceus; aktywne wobec Gram (-); inhibitory -laktamaz. W3 Nocardicyny- Nocardia sp.; monocykliczne -laktamy, np.: - nocardicyna A (aktywna przeciwko Gram - , nietoksyczna, stabilna w roztworach wodnych, odporna na -laktamazy) Cefalosporyny Wzory strukturalne penicylin, Thienamycyny (E). Antybiotyki aminoglikozydowe Aminocukier + aminocyklitol
21
22
Produkty naturalne : Streptomycyna, Neomycyna, Kanamycyna, Gentamycyna Produkty semisyntetyczne: Dibekacyna, Amikacyna PODZIA ANTYBIOTYKW AMINOGLIKOZYDOWYCH aminocyklitol jest pochodn streptaminy- streptomycyna aminocyklitol jest pochodn -
o o
suszenie 275 kg siarczanu streptomycyny 98% czystoci
POSZUKIWANIE NOWYCH AMINOGLIKOZYDW skrining + inynieria genetyczna mutageneza modyfikacje chemiczne lub enzymatyczne synteza chemiczna
Bardzo silne antybiotyki. Szerokie spektrum dziaania- dziaanie bakteriobjcze. Aktywne przeciw Escherichia coli, Klebsiella sp, Proteus sp, Enterobacter enterococcus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcusaureus. Nieaktywne wobec Streptococcus sp., bakterii beztlenowych, grzybw, wirusw i pierwotniakw. Odporno na te antybiotyki powstaje powoli wrd bakterii MECHANIZM DZIAANIA Dziaaj na poziomie biosyntezy biaka rybosom 70S. Streptomycyna- podjednostka 30S, wizanie terminalnego RNA z rybosomami (inicjacja biosyntezy biaka), bdna odczytanie m-RNA . Gentamycyna, Neomycyna, Kanamycyna- dezorganizacja miejsca dekodowania, blokada splicingu autokatalitycznego grupy I intronw. TOKSYCZNO: narzdy suchu, nerki. Oporno na antybiotyki aminoglikozydowe moe by spowodowana: - zmianami w przepuszczalnoci bony komrkowej - mutacjami 30S - enzymami modyfikujcymi antybiotyki W4 STREPTOMYCYNY Rodzina antybiotykw: - Streptomycyna - Mannozylostreptomycyna - Dihydrostreptomycyna - Mannozylodihydrostreptomycyna - N-demetylostreptomycyna - Hydroksystreptomycyna PROCES WYTWARZANIA STREPTOMYCYNY: 1967 r. Singh et all opis procesu laboratoryjnego - Streptomyces griseus DTH2 liofilizowane spory zmieszane z ziemi zostaj umieszczone na pytkach Petriego lub butelkach Rouxa z agarem sojowym, inkubacja 2-3 tyg, w temp. 27C - inokulum o I etap: kultury wegetatywne; 0,5-2 l kolby Erlenmayera, sojowe podoe A o II etap: fermentator 5 l, sojowe podoe B - proces waciwy- fermentator produkcyjny, podoe B, pH 7-6,5-7,5, mieszanie, napowietrzanie (trofofaza, idiofaza) - oczyszczanie: o zawiesina pohodowlana o filtracja lub odwirowanie przescz (50 m3, 5,5 g/cm) o + 50 m3 H2O o chromatografia jonowymienna o wymywanie zwizku EDTA, woda nasycona CO2, 2,5 M H2SO4 o wodny roztwr siarczanu streptomycyny (2700 l, 90 g/cm) o dekoloryzacja na wglu aktywnym o zagszczanie pod prni
CEFALOSPORYNY Antybiotyki -laktamowe produkowane przez Cephalosporium (grzyb). Mechanizm dziaania analogiczny do penicylin (hamuje syntez biaka...). Poszczeglne generacje cefalosporyn rni si przenikalnoci do OUN i odpornoci w stosunku do -laktamaz. Proces wytwarzania FBC (Feed Batch Culture). W lecznictwie stosuje si ponad 50 cefalosporyn. W4
H2NCHCOOH(CH2)3CCOHN N O S CH2OCOCH3 COOH cefalosporyna H2N N O CH2OCOCH3 COOH ACA S
CEFAMYCYNY
OMe H2NCHCOOH(CH2)3COHN N O S CH2OCOCH3 COOH

Cefamycyna C- Nocardialactamdurans, Streptomycesclavuligerus; trwae Gram (-)- oporne na -laktamazy Cefoksytyna- zmodyfikowana cefamycyna (grupa tienacetylowa).
LINKOZAMIDY Linkomycyna- Streptomyces lincolnensis, metylotioaminocukier + aminokwas, Gram (+) (Staphylococcus sp., Diplococcus sp. ) oraz beztlenowce; dobra przenikalno do tkanek i koci; dziaanie- hamowanie biosyntezy biaka 50S.
ANTYBIOTYKI PEPTYDOWE Blastycydyna S- Pyricularia oryzae, Streptomyces sp., rolnictwo Bleomycyna, Bestatyna terapia p/nowotworowa
23
24
Bleomycyna- hamowanie syntezy biaek kwasw nukleinowych Bestatyna- hamuje aminopeptydazy
ZWIZKI P/NOWOTWOROWE Roliny, mikroorganizmy, ssacze kultury tkankowe. Trudnoci przy procesie produkcji: toksyczno, wydzielanie, oczyszczanie; detoksyfikacja ciekw. W4 1. 2. 3. 4. 5. 6. Poszukiwanie i izolacja odpowiednich produktw- izolacja produktu. Preskrining linie P388 mysiej leukemii. Testy in vitro sposb podania leku. I faza bada klinicznych. II faza bada klinicznych. III i IV faza bada klinicznych.
PRZECIWCIAA MONOKLONALNE - diagnostyka, terapia chorb zakanych - badanie waciwoci antygenowych biaek - charakterystyka wirusw - transplantacja organw KONIUGATY PRZECIWCIAO-LEK - indukowane wirusem komrki nowotworowe (limfoma myszy) - produkcja przeciwcia kozich (infekcja co 5 dni) - surowica- wysalanie 33% siarczanem amonu - frakcje immunoglobulin- odwirowanie, rozpuszczenie w buforze - trawienie pepsyn, 0,1 M octan sodu, pH 4,5, 16 h, 37C - fragmenty (Fab)2 - lek w postaci utlenionej, kowalencyjne wizanie typu zasady Schiffa - redukcja i stabilizacja wizania p/ciao-lek (HBr) - gotowy koniugat (2-10 moli leku / 1 mol p/ciaa) SIDEROFORY Makroelementy fosfor, wap, magnez, potas, sd, elazo. Fe3+ - warunki tlenowe Fe 2+ - warunki beztlenowe
Bezpieczestwo przy produkcji lekw cytotoksycznych- bariery biologiczne, filtry HEPA, czujniki, blokady, detoksyfikacja ciekw. ANTRACYKLINY Nale do najszerzej uywanych zwizkw p/nowotworowych. Budowa: chromofor antrachinowy podstawiony jednym lub wicej cukrem. Dannorubicyna (Daunomycyna)- Streptomyces coeruleorubidus Doksorubicyna (Adriamycyna)- mutant; Streptomyces peucetius; szerokie spektrum dziaania PROCES PRODUKCJI DAUNOMYCYNY Streptomyces peucetius, glikozyd, 60-70 g/ml daunomycyny, 5-15 g/ml adriamycyny. METODA I: Skosy agarowe (10 dni, 26-27C), kultury w kolbach (2 dni, mieszanie, napowietrzanie), 800 l fermentator (28C, 67 h). METODA II: Kultury w 4 l kolbach (zamroone mycelia, 28C, 2,5 dnia), 100 l fermentator (30C, 24h), 1000 l fermentator (12 dni), 10000 l fermentator (7-10 dni). PROCES PRODUKCJI ADRIAMYCYNY Agarowe skosy (26-27C, 10 dni), homogenizacja zaszczepu i zawieszenie w wodzie, kultury w kolbach (48 h), wytrzsanie (28C), 800 l fermentator (27C, 67-145C).
Rola elaza w organizmach ywych (mikroorganizmy) Skad komrki niedobr elaza powoduje zahamowanie wzrostu, zmniejszenie syntezy kwasw nukleinowych, hamowanie sporulacji, zmiany morfologii komrki procesy wymagajce elaza: CKT, transport elektronw, fosforylacja oksydacyjna, wizanie azotu, biosynteza aminokwasw aromatycznych, fotosynteza biosynteza porfiryn, toksyn, witamin, antybiotykw, pigmentw, kwasw nukleinowych (regulowane elazem) peroksydazy, dysmutazy nadtlenkowe, nitrogenazy, hydrogenazy syntaza glutaminy, cytochromy, ferrodoksyna, flawoproteiny
Metabolizm
Produkty metabolizmu Biaka i enzymy wymagajce elaza
Mikroorganizmy wyksztaciy specjalne mechanizmy umoliwiajce pobieranie elaza ze rodowiska. zewntrz enterobaktyna Fe3+ ferri-enterobaktyna rozpuszczanie bona komrkowa transport wewntrz enterobaktyna (synteza de novo) Fe2+ produkty hydrolizy asymilacja W4 CECHY SIDEROFORW
ANTYBIOTYKI NUKLEOZYDOWE Najsilniejsze czynniki cytotoksyczne, hamuj biosyntez kwasw nukleinowych i biaek, wykazuj aktywno antybiotyczn, antywirusow, immunosupresyjn. Produkcja: Streptomyces sp., Nocardia sp. Enzymy cytotoksyczne: L-asparaginaza- hamuje asparaginozalen biosyntez biaka i ewentualnie kwasw nukleinowych; limfocytowa leukemia u dzieci.
substancje niskoczsteczkowe (wzgldna masa czsteczkowa mniejsza 1500) rozpuszczalne w wodzie wi elazo z wysok swoistoci i powinowactwem (staa stabilno 1030) zwizki fenolowe lub hydroksomaty
W4 CO JESZCZE BIOTECHNOLOGIA DAJE MEDYCYNIE?
enterobaktyna- bakteria jelitowe ferichromy- grzyby ferrioksoamina- promieniowce egzochelina- bakteria luzowe
25
26
Drobnoustroje wytwarzaj siderofory zazwyczaj wtedy, gdy nika dostpno elaza ogranicza ich wzrost. Siderofory mog posiada aktywno antybiotyczn: sideromycyna, albomycyna, ferrimycyna. Produkcja przemysowa sideroforw jest trudna. Siderofor produkowany na skal przemysow: deksterioksamina (Desferal) produkowany przez Streptomyces pilosus. WYKORZYSTANIE SIDEROFORW zatrucia elazem- terapia chelatowa (cechy dobrego chelatora: atwo produkcji, efektywno, specyficzno, toksyczno, dostp do puli); hemochromatoza usuwanie toksycznych metali z organizmu zastosowanie pozamedyczne: rolnictwo (Pseudomonas putida- pseudobaktyna; Rhizobium)
HO SITOSTEROL
FERMENTACJA STEROLI Steran- 4-piercieniowy system cyklopentanoperhydrofenantrenu. Hormony sterydowe wana funkcja metaboliczna. Przemys leki.
HO SITOSTEROL
HO STERAN CHOLESTEROL
wypchnite przez analogi psyntetyczne W4 Analogi psyntetyczne: - diosgenina (Discorea mexicana, Discorea composita) - stygmasterol - - i - sitosterole (nasiona soi, baweny i trzciny cukrowej) W4
O CH3 O STYGMASTEROL
MIKROBIOLOGICZNA KONWERSJA STEROLI OBEJMUJE:
HO
HO DIOSGENINA
dehydrogenacj epoksydacj estryfikacj izomeryzacje hydroliz acetali hydroliz estrw hydroliz epoksydw hydroksylacj utlenianie alkoholi i ketonw
27
28
redukcja ketonw i podwjnych wiza
REAKCJE O ZNACZENIU PRZEMYSOWYM 1. Hydroksylowanie w pozycji 11 i 11, np. hydroksylowanie progesteronu w pozycji 11
O PROGESTERON
O
3. hydroksylowanie w pozycji 16-.
W4
HYDROKSYPROGESTERON
HO O OH OH F OH F
HO O OH OH
produkty uboczne: 6--, 11--dihydroksyprogesteron Rhizopus arrhizus, Rhizopus nigricans, Aspergillus ochraceus
O
W4
O fluorohydrokortyzon
HO OH
Streptomyces argenteolus 4. Modyfikacje acuchw bocznych.
hydroksy- -fluoro- -metylohydrokortyzon
O ZWIAZEK S
Currularia lunata, Cunninghamellablakestleeana MECHANIZM REAKCJI HYDROKSYLOWANIA- polega na wprowadzeniu jednego atomu tlenu czsteczkowego do substratu przy udziale specyficznych oksygenaz i redukcji drugiego do H2O. steroid enzym-FeO2+ NADP+ H2O O2
1
Nocardia sp., Streptomyces sp., Arthrobacter sp., Mycobacterium sp. Grupa ketonowa (C-17) oraz grupa karboksylowa (C-20). PROCES FERMENTACJI STEROIDW Produkty o znaczeniu komercyjnym: - kortyzon - hydrokortyzon - testosteron - testolakton - flokortolon - preolnizon - preolnizolon
steroid OH enzym - Fe2+ NADPH + H+
BIOTECHNOLOGIA SZTUCZNYCH KOMREK Bony komrki sztucznej: - pprzepuszczalna - grubo 0,002 m 1,8 nm - uzyskuje si w procesie emulsyfikacji a nastpnie polimeryzacji midzyfazowej (silastik, octan celulozy, nylon polietyloaminowy, materiay biodegradowalne). Zamykanie systemw enzymatycznych wymagajcych systemu regeneracji kofaktora: - heksokinaza i kinaza pirogronianowa (regeneracja ATP) o glukoza glukozo-6P
2. Dehydrogenacja w pozycji
Arthrobacter simplex, Bacillus sphaericus, Nocardia restricus, Septomyxa affinis, Fusarium solani
29
30
o fosfoenolopirogronian pirogronian dehydrogenaza alkoholowa i dehydrogenaza jabczanowa (NAD+ NADH) ureaza, dehydrogenaza glutaminianowa, dehydrogenaza glukozo-6P (mocznik amoniak -ketoglutaran) W4
SD otrzymywany z jczmienia browarnego (odpowiednie odmiany) produkcja sodu (wytworzenie i uaktywnienie enzymw ziarna koniecznych do rozkadu skrobi i biaek) obejmuje: o moczenie ziarna jczmienia o kiekowanie o suszenie podzia sodw: o jasne (pilzneskie) o ciemne (monachijskie)
Sztuczne komrki zawierajce komrki biologiczne i inny materia biologiczny: - sztuczne organy o powierzchnia wymiany 33 ml r 0,1 mm 2 m 2 o przepuszczalno 0,002 m 20 m - detoksyfikatory krwi - sztuczna wtroba - sztuczna nerka - substytuty krwi NOWE TRENDY BIOTECHNOLOGII DLA MEDYCYNY 1990 r.- Humane Genome Project USA Functional Genomics, FunctIonal Proteomics technologia rekombinacji DNA inynieria biaka wykorzystanie organizmw transgenicznych systemy ekspresji: o prokariotyczny system ekspresji Escherichia coli o eukariotyczny system ekspresji (Sacharomycescerevisiae, Pichia pastoris) o systemy ekspresji oparte na hodowlach komrek ssakw (chomik, mapa) o hodowle owadzie (system bakulowirusa, Drosphilla melanogaster) o ekspresja heterologicznych biaek w gruczoach mlecznych ssakw (myszy, krliki, owce, kozy, krowy) o systemy rolinne szczepionki (rekombinowane szczepionki antygenowe, hybrydowe szczepionki wirusowe i bakteryjne, antyidiotopowe, hybrydowe, biakowe, antygenowe syntetyczne peptydy) terapia genowa strategia antysensu i rybozymowa metody diagnostyczne
CHMIEL przyprawa rozdzielnopciowa bylina (Humulus lupus) kwiatostany eskie: gorzkie ywice (goryczka); olejki chmielowe (skadniki aromatyczne) stosowano suszone szyszki chmielowe (chmiel naturalny siarkowany w balotach) stosuje si preparaty chmielowe: proszki, granulaty, ekstrakty rodzaje chmielu: o - 14-21% ywice chmielowe: walory smakowe poprawiajce stabilno piany, waciwoci bakteriobjcze - 200 g/l piwa (sodu 100 razy wicej) W5 WODA zuycie wody w browarze: 3,7-10,9 hl/hl wyprodukowanego piwa woda- zacieranie alkaliczno resztkowa- rnice pomidzy waciwociami alkalizujcymi anionw (HCO3_), a waciwociami zakwaszajcymi kationw (Ca2+, Mg2+) piwa pilzneskie- AR<5n jony wpywajce ujemnie na proces produkcji: Fe2+, Fe 3+, Mn2+, NO3-, SiO3-, SO42systemy uzdatniania wody: (Ca2+)
W5 BIOTECHNOLOGIA DLA MEDYCYNY POLSKA Pozna, d- techniki chemicznej syntezy genw i ich analogw zesp prof. W. Markiewicza (JChB PAN Pozna)- nowe biblioteki kombinatoryjne zesp A. Legockiego (JChB PAN Pozna)- ekspresja immunogennego biaka powierzchniowego HBV w transgenicznych rolinach jadalnych zesp B. Szewczyk (UG-AMG Gdask)- system bakulowirusa do ekspresji heterologicznych biaek (antygenw biakowych wirusw grypy oraz opryszczki) AM d- Escherichia coli (czynniki nekrozy nowotworw)
DODATKI NIESODOWANE rdo wglowodanw: 15-20% dodatek do sodu kukurydza, ruta, patki, skrobia, syrop kukurydziany, ry, jczmie, sorgo, pszenica, cukier preparaty enzymatyczne, stabilizujce, filtrujce
DRODE mikroorganizmy odgrywaj pierwszoplanow rol w produkcji piwa Polska- wycznie drode; Niemcy, Belgia- bakteria (mlekowe): o drode- wytwarzanie alkoholu, substancji chromatycznych, obnienie pH brzeczki o bakterie- obnienie kwasowoci brzeczki drode dolnej fermentacji drode grnej fermentacji- Sacharomycescerevisiae dzikie drode Sacharomycespastorianus, Torulopsis (stchy smak i zapach)
BROWARNICTWO Egipcjanie praktykowali warzenie piwa ju 6000 lat temu. Narody wschodu potrafiy otrzymywa napoje fermentowane z ryu. 1643 r.- krl Karol I opodatkowa produkcj piwa XIX w.- Niemcy; produkcja i eksport XIX w.- L. Pasteur; badania majce na celu udoskonalenie francuskich technologii produkcji piwa (1889 r. francuski kongres browarnikw) 1883 r.- E. Hansen; czyste szczepy drody
ETAPY PRODUKCJI PIWA 1. Przygotowanie sodu: a. usunicie kiekw b. 5-6 tyg. odleenia 2. Mielenie sodu a. przygotowanie sodu do procesu zacierania b. celem mielenia jest uatwienie rozpuszczenia skadnikw ekstraktywnych sodu w wodzie i pobudzenie dziaania enzymw; stworzenie materiau do budowy warstwy filtracyjnej brzeczki w kadzi fermentacyjnej
31
32
c. najmniejsze rozdrobnienie uski, najwiksze rozdrobnienie bielma 3. Zacieranie a. ma na celu wyprodukowanie brzeczki (surowiec i podoe dla mikrobw) b. I faza przechodz do roztworu substancje rozpuszczalne sodu powstae na skutek enzymatycznych przemian bielma w czasie kiekowania c. II faza hydroliza skrobi w temp. 35-75C (maltoza i dekstryny graniczne); hydroliza biaek w temp. 48-55C; 50C przerwa biakowa d. typowy skad wglowodanw w typowej brzeczce: 44% maltoza, 31% dekstryny, 11% maltotrioza, 9% glukoza, 3% sacharoza, 2% fruktoza 4. Filtracja brzeczki W5 5. Gotowanie brzeczki z chmielem a. smak i aromat b. ma na celu: i. sterylizacja brzeczki ii. wytrcanie osadw iii. usuwanie niepodanych skadnikw iv. ustalenie barwy v. zakwaszenie i zagszczenie brzeczki vi. inaktywacja enzymw c. dawk chmielu ustala si na podstawie aktualnej zawartoci izo-zwizkw w chmielu oraz wymaganej zawartoci w piwie d. zwizki goryczkowe- kwasy, gotowanie formy izo (odpowiedni czas dodawania odpowiedniego rodzaju chmielu) 6. Usuwanie osadw gorcych. 7. Chodzenie i natlenianie brzeczki. 8. Usuwanie osadw zimnych. 9. Zadawanie drodami: a. czysta kultura lub drode z wczeniejszych szary b. pielgnacja drody: dekarboksylacja, przemywanie, przesiewanie, napowietrzanie, homogenizacja, przechowywanie c. przygotowanie do zaszczepu, napowietrzanie i mieszanie w celu ujednolicenia 10. Fermentacja: a. konwersja cukrw brzeczki do etanolu i CO2 b. wglowodany zuywane w odpowiedniej kolejnoci c. zwizki azotowe- aminokwasy, peptydy niskoczsteczkowe, zasady azotowe, purynowe i pirymidynowe d. aminokwasy- wysze alkohole alifatyczne i aromatyczne (Wal- diacetyl) e. jony f. temperatura g. fermentacja dolna (8-10 dni) h. fermentacja grna (2-3 dni) i. fermentacja gwna (burzliwa): i. zaszczepienie ii. faza krkw niskich iii. faza krkw wysokich iv. faza opadania krkw 11. Dojrzewanie piwa (leakowanie): a. dojrzewanie piwa (fermentacja wtrna) b. zachodzi: nasycenie piwa CO2, sklarowanie piwa, uzyskanie odpowiedniego stopnia odfermentowania, wytworzenie waciwego bukietu smakowo-zapachowego c. parametry kontrolowane- temperatura, zawarto ekstraktu, zawarto CO2, zmiana pH, zawarto diacetylu, ilo osadw drodowych 12. Filtracja, karbonizacja, rozlew piwa.
W5 Porter- mocne, ciemne piwo Piwa niemieckie: Altbier- miedziana barwa, ze sodu jczmiennego Bock- fermentacja dolna, mocne, sezonowe Eisbock- moc wzrasta dziki procesowi mroenia Weissbier- piwo pszennicze Piwa belgijskie: Guezue Saison Piwa holenderskie: Kruidenbier- piwo z przyprawami Piwa hiszpaskie: Oscura- ciemne piwo Produkcja piwa- etapy (E)
PRODUKCJA DRODY PIEKARSKICH czoowe miejsce wrd przemysw fermentacyjnych piekarnictwo, dodatek ywieniowy (witaminy B, aminokwasy) drode prasowane, suszone, suszone instant drode fermentacji grnej Sacharomycescerevisiae cechy drody piekarskich: o wysoka, waciwa szybko wzrostu o wysoka aktywno w procesie glikolizy o zdolno adaptacji do szybko zmieniajcych si substratw w poywce hodowlanej o wysoka aktywno inwertazy -glukozydazy, -fruktofuranozydazy o zdolno do wzrostu i syntezy enzymw i koenzymw zarwno w procesie tlenowym jak i beztlenowym o produkt- dobra trwao w czasie przechowywania przemysowa produkcja drody piekarskich- prowadzenie kilkuetapowej hodowli tlenowej ze zwikszeniem objtoci poywki hodowlanej brzeczka hodowlana- melasa, zwizki bdce rdem azotu i fosforu, witaminy (biotyna, kwas pantotenowy, inozytol, tiapirodoksyna, niacyna) III etapy produkcji: o stadium czystych kultur o generacja I o generacja handlowa
PRODUKCJA SCP (Single Cell Protein) wykorzystywanie do produkcji biaka biomasa mikroorganizmw rdem biaka W5 wykorzystywana przede wszystkim jako pasza dla zwierzt SCP korzyci z zastosowania: o bardzo szybki wzrost mikroorganizmw o moliwo modyfikacji genetycznej o odpady jako skadnik pokarmowy
Piwa angielskie: ALE- owocowy smak Lager- dolna fermentacja, zocista barwa
1. wytwarzanie SCP z wglowodanw: - wglowodory aromatyczne Pseudomonas sp., Anthrobacter sp., Nocardia sp., Candida sp., Torulopsis sp., Aspergillus sp., Penicillium sp.
33
34
n-oktadekan, n-heksadekan produkcyjna hodowla odbywa si w warunkach silnego napowietrzenia poywki w zemulgowanych rodowiskach - metan jako substrat dla mikroorganizmw 2. SCP z alkoholi a. etanol i metanol b. SCP z metanolu- firma U.V.Hoechst (Niemcy), Mitshubishi (Japonia), Methylophilus methylotrophus, ICI (Anglia), Pseudomonas sp. c. SCP z etanolu- Skonaft (Czechy), Amoco Foods (USA)- drode 3. SCP ze ciekw i odpadw przemysowych: - wywary gorzelnicze, melasa, serwatka, polady zb, korzenie, soma, uski, osady czynne biologicznych oczyszczalni ciekw - Szwecja- produkcja SCP z odpadw przemysu krochmalniczego, mieszanka dwch szczepw Endgmycopsisfibuligria, Candida utilis - Finlandia- produkcja z SCP z ugw posiarczanowych zbiaczonych przez Peacilomyces sp. - Anglia- Rank Haris McDougall wykorzystanie przemysu rolno-spoywczego - odpady lignino- celulozowe Clostridiumthermocellum - Szwecja- rozkad lignin Sporotriculumpulvenilentum
nadanie produktom specyficznych cech organoleptycznych (smak, aromat, konsystencja) zwikszenie ich wartoci odywczych zwikszenie przyswajalnoci skadnikw mineralnych stabilizacja biologiczna produktw (antagonistyczne waciwoci bakterii mlekowych)
W6 Gwne metabolity antagonistyczne: - kwasy organiczne- mlekowy, octowy, 2-pirolodono-5-karboksylowy - bakteriocyny- aktywne, gwnie w stosunku do bakterii Gram (+) - enzymy- ukad peroksydazy, lizozym - niskoczsteczkowe produkty przemiany materii: renteryna, diacetyl, aldehyd octowy, kwasy tuszczowe - inne: H2O2 PRODUKCJA SERW SERY produkty nabiaowe bogate w biako i tuszcz, otrzymane na drodze koagulacji kazeiny, odpowiedniej obrbki skrzepu oraz przemian biochemicznych zwanych dojrzewaniem
W6 MLEKO = pynna wydzielina gruczow mlecznych ssakw Skad chemiczny zaley od: rasy krw okresu laktacji sposobu odywiania pory roku, itp. SKADNIKI woda tuszcz kazeina inne biaka laktoza kwas cytrynowy, witaminy A, B1, B2, B6, B12,biotyna, inozytol, cholina, kwasy: pantotenowy, foliowy, nikotynowy popi Bakterie fermentacji mlekowej przetwarzaj laktoz i kazein. LAKTOZA- cukier, moe by w warunkach beztlenowych fermentowana z wydzieleniem gwnie kwasu mlekowego, ktry w odpowiednim steniu cina biaka mleka powodujc powstanie skrzepu. Niektre szczepy bakterii s zdolne do hydrolizy biaka mleka. PRODUKTY FERMENTACJI MLEKOWEJ: - diacetyl - aldehyd octowy - alkohol etylowy - kwas propionowy - kwas mrwkowy - lotne kwasy tuszczowe - alkohole - aceton - estry FERMENTACJA INDUKOWANA STARTERY Funkcja bakterii fermentacji mlekowej: rednia zawarto % 87,7 3,4 2,5 0,7 4,8 0,2 0,7
PODZIA SERW PODPUSZCZKOWYCH: twarde i ptwarde o typ szwajcarski (Ementaler, Grujer) o typ woski (Orana, Parmezan) o typ holenderski (Edamski, Gouda) o typ szwajcarsko-holenderski o typ angielski (Chedar) o typ z masy parzonej (Oscypek) mikkie o z porostem pleniowym (Camembert, Brie) o z przerostem pleniowym (Roquefort) o maziowe (Limburski) o pomazankowe (Bryndza)
PRZYGOTOWANIE MLEKA DO WYROBU SERW: standaryzacja- biaka/tuszcze (P/F stay) filtracja- 30C, filtr baweniany klarownie- 32-38C usuwanie bakterii- 99% bakterii, 95% spor subpasteryzacja- 63-65C, schodzenie ultrafiltracja- sery mikkie homogenizacja- rozbicie drobin tuszczu pasteryzacja- cakowite zabicie drobnoustrojw i inaktywacja enzymw 63C, 30 min. lub 72C, 16 s.
DODATKI DO MLEKA: CaCl2 azotany barwniki H2O2 lipazy
35
36
W6 PRODUKCJA SERW PODPUSZCZKOWYCH: - przygotowanie mleka do przerobu - przygotowanie i dodatek zakwasu lub preparatu bakterii fermentacji mlekowej - przygotowanie i zaprawienie mleka podpuszczk lub innym preparatem koagulacyjnym - obrbka skrzepu i gstwy - formowanie serw - ociekanie i prasownie - solenie - dojrzewanie i pielgnacja serw SERY TWARDE Mleko (30-32C) + CaCl2 + saletra potasowa + zakwas Zadaniem zakwasu dodawanego do mleka w iloci 0,3-2% jest prawidowe ukierunkowanie procesw fermentacji podczas obrbki gstwy serowej na wannie i w czasie dojrzewania oraz zahamowanie rozwoju drobnoustrojw niepodanych. Jednoczenie bakterie zakwasu posiadaj enzymy proteolityczne biorce udzia w degradacji biaka i tuszczu w czasie dojrzewania. ZAKWAS TERMOFILNY- bakterie termofilne Lactobacillussalivaris, Lactobacillus velveticus, Lactobacillus bulgaricus, bakterie propionowe. ZAKWAS MEZOFILNY- Streptococcus lactis, Streptococcusdiacetilacti, Streptococcus cremoris, Lactobacillus casei. FERMENTACJA LAKTOZY Po uzyskaniu skrzepu o odpowiedniej zwizoci nastpuje jego krojenie i rozdrobnienie do postaci ziarna w celu usunicia serwatki. Ziarno w serwatce (gstwa) miesza si i podgrzewa do 38C (Gouda) lub 54-58C (Ementaler). Formowanie, solenie. Dojrzewanie- 15C, wilgotno wzgldna powietrza 80-85%, proces w caej masie. Produkty powstajce w czasie dojrzewania i decydujce o cechach organoleptycznych sera: - produkty przemiany laktozy- kwas mlekowy, propionowy, octowy i inne, lotne kwasy, aldehyd octowy, diacetal - produkty degradacji biaek- peptydy, polipeptydy, aminokwasy oraz zwizki powstajce w wyniku deaminacji, dekarboksylacji aminokwasw - produkty przemiany tuszczw- aldehydy i estry - produkty biosyntezy powstajce w wyniku procesw yciowych mikroorganizmw
Camembert, Brie: - Penicillium camembert - Penicillium candidum - Penicillium caseicolum - Brevibacteriumlineus Roquert: - Penicillium roquefort BIOTECHNOLOGICZNE PRZETWARZANIE SERWATKI produkcja napojw fermentowanych (Streptococcus sp., Lactobacillus sp.) browarnictwo- zamiast wody do przygotowywania zacieru koncentraty biologicznie ukwaszonej serwatki- utrwalenie odpowiednich drody piekarskich SCP kwas mlekowy, kwas propionowy podoe z serwatk do hodowli pieczarek
1. Zsiade mleko: - wysoka pasteryzacja mleka - dodatek zakwasu - bakterie kwaszce i aromatyzujce: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris - inkubacja 30-35C, 7-12 h 2. Mleko acidofilne: - Lactobacillus acidofilus - mleko wysoce pasteryzowane lub sterylizowane - zakwas monokulturowy - inkubacja 38-40C, 7-12 h 3. Jogurt: - mleko pene lub odtuszczone, - zgszczone, - zakwas 1:1 lub 1:2 (Lactobacillusbulgaricus, Lactobacillus thermophilus); - metoda zbiornikowa lub termostatowa; - wzbogacenia: Lactobacillusacidophilus, Bifidobacteriumbifidum W6 4. Biogurt: - zakwas 1:3 (Lactobacillusacidophilus, Streptococcus lactis) 5. Kefir: - napj musujcy - grzybki kefirowe (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Lactobacillus desidious, Brevibacterium brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobiosis), drode (Candida kefyr, Candida pseudotropicalis, Kluyveromyces lactis, Saccharomycesflorentimus, Saccharomyces globasus, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomycesunisporus) 6. Malanka: - ukwaszenie malanki (proces ubocznego procesu produkcji masa) - zakwas Streptococcus Streptococcus cremois lub lactis, S. Diacetalis lub leuconostoc - 22oC, 18 godzin 7. Kwana mietana- zakwas mietankowy - 22oC, 18 godzin - S. cremosis lub lactis, S.leuconostoc 8. Kumys - Lactobacillus bulgaricus, Candida kefyr (bakteria + grzyb) - 28oC, 2 godziny 9. Szampan serwatkowy - niskoprocentowy napj alkoholowy 10. Maso: - najszlachetniejszy tuszcz jadalny - 15-16% woda, 83-84% tuszcze, mietanka - dojrzao fizyczna
W6 SERY MIKKIE: Pasteryzowane mleko o znormalizowanej zawartoci tuszczu zaszczepia si du dawk zakwasu mezofilnego (paciorkowce). Czas krzepnicia jest duszy- 1-2 h , nagromadzenie bakterii w szczepie. Uzyskany skrzep kroi si na due ziarna, gstw osusza si i bez dogrzewania dolewa si do form. Po soleniu sery umieszcza si w dojrzewalni. Otrzymana masa serowa posiada wicej laktozy, ktra ulega przemianie a tym samym jest bardziej kwana. Pielgnacja- pierwsze rozwijaj si drode, grzyby i bakterie Brevibacteriumlineus.
37
38
dojrzao biologiczna pH 5,5-5,9 zakwas Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis, Leuconostoc cremoris, Lactobacillus lactis
Lactobacillus warunki beztlenowe i powstaje CH3COOH zamiast mleczanu Leuconostocdextranium kwas cytrynowy kwas pirogronowy acetoina (zapach malany) diacetyl + CO2 L. bulgaricus, S. thermophilus acetaldehyd (gwny skadnik smakowy jogurtu) ZAKWASY STOSOWANE W MLECZNICTWIE: Zakwas- hodowla czystych kultur bakterii fermentacji mlekowej stosowana do wyrobu sera, twarogu, masa i napojw mlecznych. Zadaniem zakwasu jest prawidowe ukierunkowanie procesw fermentacyjnych podczas obrbki produktu. Cechy zakwasu: - odpowiedni skad mikrobiologiczny - wysoka aktywno - czysto mikrobiologiczna W6 Rodzaje zakwasw: - zakwasy pojedynczych szczepw - zakwasy wieloszczepowe - zakwasy mieszane kombinowane Kryteria doboru i selekcji nowych szczepw, ktre wprowadza si do serowarstwa: mieszanina szczepw przesiewanie aktywno syntazy kwasu mlekowego odporno na bakteriofagi identyfikacja plazmidw DNA badanie zgodnoci steroidw test na wytwarzanie substancji smakowo-zapachowych prbny wyrb sera ocena i klasyfikacja szczepu
HACCP (Hazard Analysis Critical Central Point) system krytycznych punktw kontroli ustalanych na podstawie przeprowadzonej analizy zagroe. Prawidowy stan mikrobiologiczny produktu zostaje osignity poprzez zapobieganie zagroeniom w caym acuchu zagroe. Krytyczny punkt kontrolny- surowiec, miejsce, postpowanie, procedura, operacja jednostkowa, punkt w ktrym naley dziaanie kontrolne lub zapobiegawcze w celu wyeliminowania lub zminimalizowania zagroe wpywajcych na jako kocowego produktu. Produkowanie zgodnie z praktyk higieniczn- cakowite wykluczenie moliwoci wzajemnego krzyowania si lub cofania drg surowca, pproduktu i gotowego wyrobu we wszystkich etapach produkcji. W6 Waciwe opracowanie drg i szlakw transportu wewntrznego w celu wyeliminowania ich ruchu przez obszary, ktre mog by rdem zanieczyszcze wtrnych (zasada first in- first out). Higiena personelu. Metody bada: - metody klasyczne- tamponowa, wypukiwania, bezporednia, odciskowa (daj efekt po upywie czasu) - metody nowoczesne- modyfikacja metody pytkowej, bioluminescencji (najszybsza metoda)
W7 PROCES KONWERSJI SKROBII Skrobia- rolinna substancja zapasowa wystpujca w dwch formach: amylazy i amylopektyny. Amylaza- nie ma rozgazie, czsteczki glukozy poczone wizaniami -1,4-glikozydowym.
OH OH
Amylopektyna- rozgazienia, na jedno wizanie -1,6-glikozydowe przypada 30 wiza -1,4glikozydowych.
CH2OH O OH HO CH2OH O OH OH O OH OH O OH O CHOH O OH CH2OH O
RODZAJE SZCZEPIONEK STOSOWANYCH W PRZEMYLE SPOYWCZYM cieke suszone zamroone
Konwersji podlega tylko skrobia kukurydziana. HFCS (High Fructose Corn Syrup)- mieszanina dekstrozy i fruktozy, 42%, 55%, 90% rodek sodzcy.
OCENA SANITARNA WARUNKW PRODUKCJI
39
40
PROCES PRODUKCJI: 1. Przygotowanie dekstrozy ze skrobii (-amylaza). 2. Przygotowanie do sacharyfikacji- zmiana pH i temperatury. 3. Sacharyfikacja (glukoamylaza). 4. I rafinacja- oczyszczanie hydrolizatu na wglu aktywnym: a. jony Mg2+ aktywuj izomeraz glukozy b. inhibitory kompetencyjne do jonw Ca2+ (ochrona) 5. Izomeryzacja- immobilizowana izomeraza glukozy. 6. II rafinacja- odparowanie: a. wgiel aktywny b. chromatografia jonowymienna 7. gotowy produkt- 42% HFCS (komercyjnie otrzymuje si) W7 Wytumaczy proces konwersji skrobi, na czym polega? (E) PREPARATY ENZYMATYCZNE STOSOWANE W PRZEMYLE. Dziki zastosowaniu preparatw enzymatycznych uzyskuje si: - oszczdno surowca, np. zastpienie sodu jczmiennego sodem pleniowym - zwikszenie wydajnoci procesu technologicznego, np. zastosowanie pektynaz do klarowania sokw - skrcenie cyklu produkcyjnego, np. zastosowanie enzymw proteolitycznych w przemyle misnym - poprawienie jakoci wyrobu, np. lepsza jako sokw odwasianych enzymatycznie - zwikszenie trwaoci produktu, np. stabilizacja piwa za pomoc oksydazy glukozowej - moliwo sterowania reakcj enzymatyczn 1896 r.- TAKADIASTAZA (enzymy hydrolityczne); surowy preparat enzymatyczny otrzymywany z hodowli Aspergillus oryzae prowadzonych na otrbach pszennych. OGLNY DIAGRAM PRODUKCJI PRZEMYSOWEJ ENZYMW mikroorganizmy produkcja biomasy tkanki rolinne i zwierzce mielenie i homogenizacja
proszek enzymatyczny
W7 Wikszo enzymw uywanych w przemyle to enzymy egzogenne. ENZYMY PROTEOLITYCZNE Stanowi 60% komercyjnie uywanych enzymw. HYDROLAZY PPEPTYDOWE pochodzenie rolinne, zwierzce i mikrobiologiczne enzymy indukcyjne enzymy egzogenne, endogenne PROTEINAZY SERYNOWE Trypsynopodobne, alkaliczne, -lityczne, proteinazy, Myxobacterium sp. Proteinazy trypsynopodobne- trypsyna (pankreatyna- przemys spozywczy, garbarstwo i przemys farmaceutyczny), chemotrypsyna, enzymy Streptomyces sp. Proteinazy alkaliczne- bakteria, drode i plenie, tkanki ssacze, znaczenie komercyjne: subtylizyna (alkaliczne enzymy detergentw), enzym Aspergillus oryzae (preparaty termostabilnych proteinaz alkalicznych), enzym Streptomyces vimosus (przemysowa produkcja oksytetracykliny). Proteinazy tioloweProteinazy kwane (karboksylowe): - reninopodobne- podpuszczka cielca i bakteryjna - peptydopodobne- wieprzpowa i woowa pepsyna proteinazy z Aspergillus Podpuszczka i proteinazy podobne- gorzkie peptydy, enzymy zwierzce, rybne (ryby morskie), niskie optimum temperatury, mikrobiologiczne (Aspergillus sp., Rhizopus sp.) Metaloproteinazy- naturalne, alkaliczne: - naturalne: o bakteryjne: Bacillus subtilis (browarnictwo); Bacillus stearothermophilus- termolizyna (aspartam) o grzybowe: Aspergillus oryzae (piekarnictwo, przemys spoywczy, modyfikacje biaek, przemys farmaceutyczny) - alkaliczne: Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp. (dtergenty) PRZEMYSOWE ZASTOSOWANIE PROTEAZ POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO: hydroliza biaek- zmiana waciwoci biaka i produktu, ktrego ma by skadnikiem kontrola gorzkiego smaku hydrolizatw biakowych [gorzkie peptydy- maskowanie (polifosforany, elatyna), usuwanie (filtracja, wytrcanie kwasem), zapobieganie (enzymem)] W7 hydrolizaty sojowe- doskonae waciwoci biaek soi, sosy i przetwory sojowe, suplementowanie biakami napojw, dietetycznej ywnoci hydroliza elatyny- zniesienie efektu elu, niski poziom Trp, rodki dietetyczne, przemys kosmetyczny; typowy proces 30% roztwr elatyny + mieszanina alkalicznych i neutralnych proteaz, > 4 h, pasteryzacja 90C hydroliza kazeiny i biaek serwatki hydroliza biaek misa biaka rybie kruszenie misa- enzymy rolinne (papaina, ficyna)
fermentacja wgbna
fermentacja powierzchniowa
wodna
ekstrakcja i filtracja
roztwr enzymu zagszczanie
suszenie rozdrabnianie
dodatek stabilizatora lub konserwantw roztwr enzymu
precypitacja filtracja suszenie rozdrabnianie
surowy preparat enzymatyczny
41
42
detergenty- enzymy o duej stabilnoci, aktywnoci w roztworze detergentu; mleczarstwo- serowarstwo (podpuszczka zwierzca 65%, renina + pepsyna 50:50) browarnictwo- mielenie sodu (zwikszenie wydajnoci, poziom aminokwasw, klarowaniepapaina) piekarnictwo- poprawa jakoci mki garbarstwo- proteazy alkaliczne, etap moczenia skry, oczyszczanie, odwasianie produkcja podoy mikrobiologicznych przemys farmaceutyczny- mieszanki poprawiajce trawienie, urokinaza, zaburzenia krzepnicia krwi, kolagenaza, likwidacja zmian skrnych INNE ENZYMY HYDROLITYCZNE
UHT MLEKO MLEKO UHT
pasteryzacja laktoza drozdzowa
hydroliza fermentowa
pakowanie sterylne
PEKTYNAZY- Aspergillus niger, Rhisopus (pektyny-kwasne polimery cukorwe) esteraza pektynowa- pomidor, Fusarium oxysporum, Clostridiummultifermentans egzopoligalaktouranaza- brzeczka pofermentacyjna (produkcja kwasu cytrynowego przez Aspergillus niger) LIAZY CELULAZY- Aspergillus niger, Penicillium sp.: enzymy odporne, stabilne w niskim pH substrat to celebioza zastosowanie: o przemysowy alkohol etylowy z celulozy o obrbka nasion (browarnictwo, przetwrstwo) o wydzielenie wielocukrw glonw morskich
pasteryzowane mleko bezlaktozowe hydroliza UHT hydrolizat bezlaktozowe mleko UHT
odparowanie
-GLUKANAZY: - hydroliza glukanu jczmienia - hydroliza poliglukanu wytworzonego przez grzyb etylujcy winogrona HEMICELULAZY I KSYLANAZY- plenie, hydroliza arabanu, galaktanu, mannanu, ksylanu (tkanki rolinne) wraz z pektynazami i celulazami. LAKTAZA- konwersja laktozy do glukozy i galaktozy, di- i trisacharydy sa produktami ubocznymi, enzymy rolinne (jabka, brzoskwinie, morele), zwierzta, mikroorganizmy, enzymy bakteryjne i drodowe (wewntrzkomrkowe), grzybowe (zewntrzkomrkowe); W7 znaczenie komercyjne Kuyveromyces lactis, Kuyveromyces fragilis, Aspergillus oryzae, Bacillus sp. RDO PRODUKT serwatka pasza dla zwierzt UWAGI zwikszenie wydajnoci, , wartoci odywczej, zapobieganie krystalizacji laktozy w koncentratach serwatkowych piekarnictwo, lody skadnik diety ludzi z nisk tolerancja laktozy, sodki smak, zapobieganie krystalizacji laktozy w koncentratach laktozowych
mleczny koncentrat bezlaktozowy
W7
mleko
bezlaktozowy syrop serwatkowy mleko bezlaktozowe
43
44
SERWATKA
Flavobacterium arborescens = cae komrki, glutaraldehyd Bacillus coagulans = lizat komrkowy, glutaraldehyd Sweetzyme Maxazyme Ketozym TakoSweet Optisweet22 = Bacillus coagulans = Actinoplanes missouriensis = Actinoplanes missouriensis = Streptomyces olivaceus = Streptomyces rubinosus
pasteryzacja
zmiana pH
ENZYMY PRZEMYSOWE PODSUMOWANIE

laktoza grzybowa
ENZYMY GLIKOLITYCZNE - amylazy

bla
hydroliza
Bacillus subtilis Aspergillus niger
bla
hydroliza
-amylazy celulazy -glukanazy dekstranazy 2-galaktozydaza glukoamylaza hemicelulazy pentozanazy ksylonazy inwertaza laktaza
pasteryzacja
odparowanie
Aspergillus niger Rhizopus
tekstylia, syropy glukozowe, detergenty, fermentacja etanolowa, karma dla zwierzt browarnictwo, piekarnictwo Bacillus browarnictwo, syropy maltozowe pyny do mycia naczy, pasze dla zwierzt, bioenergia, tekstylia piwowarstwo przemys spoywczy przemys spoywczy cukrownictwo syropy glukozowe i dekstranowe
bezlaktozowy syrop serwatkowy
UHT- Ultra High Temperature LIPAZY- Candida sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp., Mucor sp., lipazy trzustkowe, przemys farmaceutyczny, produkcja zapachw, przyspieszenie dojrzewania serw twardych, hydroliza olejw w produkcji myda. PROCES PRZEMYSOWY: kadzie przedmateczne z podoem A (biako sojowe); kadzie mateczne z podoem B (namok kukurydziany, skrobia kukurydziana, ekstrakt drodowy, silikan); fermentator produkcyjny (podoe B + dekstroza), 4-28 h, zasilany odpowiednio przygotowanym sterylizowanym namokiem kukurydzianym; immobilizacja; oddzielenie biomasy od pynu pohodowlanego; suszenie;
Klebsiella lactis Aspergillusoryzae Bacillus subtilis
mleczarstwo
naringinaza pektynaza pullulanaza
Klebsiella aerogenes Bacillus subtilis
usuwanie goryczy ze skrek cytrusowych produkcja sokw drode piekarskie, p/podziaowy W7
PROTEAZY proteinazy kwane proteazy alkaliczne pepsyna subtytlizyna Aspergillus niger piekarnictwo Aspergillus oryzae Bacillus subtilis detergenty, garbarstwo odki wieprzowe, woowe produkcja serw Bacillus subtilis
OKSYDOREDUKTAZY dehydrogenaza alkoholowa katalaza LIAZY histydaza
W7 IMMOBILIZACJA IG MIKROORGANIZM Actinoplanes missouriensis Streptomyces rubiginosus METODA IMMOBILIZACJI cae komrki, elatyna, glutaraldehyd, enzym, alumina enzym, elatyna
TRANSFERAZA glikozylotransferaza cyklodekstrynaza
45
46
MIKROBIOLOGICZNE RODKI SMAKOWE I ZAPACHOWE Zwizki aromatyczne i smakowe - kompleksowe mieszaniny Komercyjny sukces: wysoka wydajno tanie substraty ograniczenie syntezy chemicznej 1. METYLOKETONY aromat sera Penicilliumroqueforti formy spoczynkowe, nie wegetatywne, konwersja kwasw tuszczowych (C14) metyloketon (C1) produkcja przemysowa koszt toksyczno zwizkw lotno techniki fermentacyjne + konwersja enzymatyczna fermentacja grzybowa kwasy tuszczowe -oksydacja odzysk poprzez ekstrakcj lub destylacj
olejki eteryczne, rnorodno zapachw: owocowe, rane, geranium pachncy, trawiasty, migdaowy, grzybowy, kamforowy
7. JONONY: - produkty enzymatycznej hydrolizy karotenoidw - zapach tabaki 8. GEOSMIN: algi, baterie, grzyby, perfumy, olejki eteryczne. Mikroorganizmy mog syntezowa kompleksowe mieszaniny zwizkw, ktre uzupeniaj si: zapachy nabiaowe zapachy serowe (chipsy, sosy, wypieki), jogurtowe, mietankowe zapachy chlebowe: zapach biaego chleba skadniki, produkty fermentacji drodowej i bakteryjnej, degradacji, produkty reakcji termicznej, 2 kierunki : o zapachy prefermentacyjne (mieszanina drody, wody, cukru, soli, odtuszczonego mleka, poywki drodowej; 6h fermentacji bezporednio do ciasta lub podczas wyrabiania) o preparaty enzymatyczne: amylazy, proteazy mikrobiologiczne zapachy grzybowe: 1-octan-3-ol, kwas glutaminowy, 5-guanylan; poszukiwanie zapachw grzybowych nie koncentruje si na poszukiwaniu producentw; hodowla wgbna, suszenie zapachy i smaki z tkanek rolinnych: wanilia i mita pieprzowa, koszt i dostpno; metoda pozyskiwania: bezporednia ekstrakcja z materiau, podoa, biotransformacja, synteza enzymatyczna, wszystkie techniki z fermentacji mikrobiologicznej uywa si w produkcji zwizkw smakowych i zapachowych z rolin: selekcja komrek nadprodukujcych prekursory, manipulacje pooenia, hormony.
2. DIACETYL roztwr wodny charakterystyczny, ostry masowy zapach przemys spoywczy i perfumeryjny wystpuje w mieszaninie z acetoin Streptococcus lactis, Leuconostoc W7 3. LAKTONY cykliczne estry specyficzne hydroksykwasw zapachy: mietankowy, owocowy, brzoskwiniowy, orzechowy, kokosowy, miodowy 4. KWAS MASOWY: uzupenianie zapachu malanego w serowarstwie estry- pentylowy (zapach bananowy), izobutylowy (zapach gruszkowy) proces fermentacji zaley od pH i podoa
W8 AROMATY IDENTYCZNE Z NATURALNYMI

COH WANILINA OMe OH
W8 3. LAKTONY 4. KWAS MASOWY: - niskie stenie uzupenia zapach malany w serowarstwie, - naturalne 2% masa, - obligatoryjne anaeroby Clostridium, Eubacterium, Fusarium, wraliwe na pH, w fermentorze pH 5 (CaCO3), - toksyczny dla produktu: a) malan pentylowy = zapach owocw brzoskwini, ananasa, moreli; b) malan izobutylowy = gruszka, ananas, brzoskwinia 5. KWAS IZOWALERIANOWY: najsilniejszy zapach, zapach brudnych stp izowalerian etylu = zapach jabkowy (cukierki, gumy do ucia) izowalerian izopentylowy = zapach jabek, malinowy (przemys spoywczy) izowalerian izobutylu = zapach jabkowo-malinowy (przemys perfumeryjny) 6. TERPENY i produkty ich transformacji:
WANILINA = 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd (aromat identyczny z naturalnym) odpowiedzialna za zapach wanilii; w materiale rolinnym znajduje si 2% suchej masy wanilii; izolowana w postaci proszku o sodkim smaku i intensywnym zapachu; zastosowanie: przemys spoywczy, cukiernictwo, produkcja napojw, perfumy, kosmetyki; produkcja: 6000ton/rok; synteza chemiczna: gwajakol i ligniny, tanio 12$/kg zwizku (ludziom nie podoba si ten zwizek jest syntetykiem, wic rozpoczto poszukiwania metod do produkcji tych zwizkw, tzn. identycznych z naturalnymi: biotransformacje, synteza de novo przez specjalne szczepy). Aromaty identyczne z naturalnymi: zwizki produkowane przy udziale mikroorganizmw. 1. PRODUKCJA WANILINY PRZEZ BIOTRANSFORMACJ: - biotransformacja lignin: utlenianie white rot fungi; peroksydaza ligninowa z grzybw z rodzaju hub - biotransformacja kwasu ferulowego:
47
48
COOH
KWAS FERULOWY
OMe OH
zwiksza ilo biaka w mleku o 10%, ekonomicznie opacalne)
pochodna kwasu cynamonowego, enzymatyczne uwalnianie z lignin: esteraza ferulowa i hydrolaza estrw cynamonowych dekarboksylacja: grzyby i drode redukcja: Burkolderia cepacia, Lactobacillus plantarum, Saccharomyces cervisiae deacetylacja niezalena od CoA: Pseudomonas, Bacillus subtilis, Escherichia coli deacetylacja zalena od CoA: P. putida, Rhodotorula rubra - biotransformacja kwasu wanilinowego: Pseudomonas fluorescens, 95% wydajnoci;
COOH
DO MIKROBIOLOGICZNEJ PRODUKCJI AMINOKWASW WYKORZYSTUJE SI: Corynobacteriumglutamicum tzw. bakterie kwasu Bravibacteriumflavum glutaminowego W8 G(+), katalazododatnie, morfologicznie zmienne: tlenowce lub wzgldne beztlenowce w warunkach tlenowych: substrat CO2 + H2O;w warunkach beztlenowych: fermentacja mlekowa mezofile niskie wymagania pokarmowe (rdo N nieorganiczne, C mono-, disacharydy, kwasy tuszczowe, alkany), brak aktywnoci proteolitycznej (bardzo niskie) naturalne auksotrofy w stosunku do biotyny bd tiaminy,
KWAS WANILINOWY
OMe OH
- biotransformacja eugenolu i izoeugenolu: skadniki olejkw eterycznych z drzewa godzikowego: Corynobacterium, Pseudomonas; W8 - biotransformacje Phe; 2. Produkcja waniliny de novo (toksyczna dla organizmw, ktre j produkuj i nie jest moliwa jej konwersja) mutant Escherichia coli; nadprodukcja aminokwasw aromatycznych (Trp); konwersja glukozy w kwas wanilinowy, odzyskiwany i redukowany enzymatycznie do waniliny (dehydrogenaza alkoholu arylowego z Nocardia crassa) BIOTECHNOLOGICZNA PRODUKCJA AMINOKWASW PRODUKCJA AMINOKWASW JEST MOLIWA: na drodze syntezy chemicznej (D,L Met) na drodze syntezy enzymatycznej (L-Asp, L-Trp) w procesie jedno- lub wielostopniowej biosyntezy zastosowanie aminokwasw: przemys spoywczy, paszowy, medycyna, przemys farmaceutyczny, chemiczny aminokwasy glutaminian sodu (sl jednosodowa) L-Lys produkcja [t/rok] 370 000 70 000 mat. produkcji biosynteza biosynteza zastosowanie poprawia smak potraw wzbogacenie pasz biakowych (podawana krowom w dawkach 10mg/dziennie zwiksza ilo biaka w mleku o 10%, ekonomicznie opacalne) aspartam (produkt spoywczy jako sodzik) antyoksydant, dodatek do chleba wzbogacenie pasz biakowych (podawana krowom w dawkach 10mg/dziennie
Wsplne cechy tych bakterii: w sprzyjajcych warunkach produkuj i wydzielaj poza komrk kwas glutaminowy (due iloci); bardzo prosty materia pierwotny: manipulacje daj zmodyfikowane cieki metaboliczne, tak aby bya moliwo nadprodukcji materiau pierwotnego. 1. KWAS GLUTAMINOWY Kiedy synteza metod kwanej, cinieniowej hydrolizy bogatych w ten aa biaek pszenicy Obecnie jednostopniowa fermentacja glukoza
PEP
Corynebacterium glutamicum szczawiooctan pirogronian
cytrynian dehydrogenaza glutaminianowa (duza aktywnosc) dehydrogenaza alkoholowa (mala aktywnosc) cis-akonitan dodatek detergentu, penicyliny (zmodyfikowana blona komorkowa-latwosc przenikania aa) izocytrynian
L-Asp, L-Phe
7 000
L-Cys D,L-Met
7 000 70 000
synteza enzymatyczna, biosynteza biosynteza synteza chemiczna
ketoglutaran dehydrogenaza glutaminianowa dehydrogenaza 2-oksoglutaranu glutaminian
Skad poywki hodowlanej: 5 g/l biotyna (stenie nie moe by wiksze, hamuje wzrost) melasa buraczana (uboga w biotyn (NH4)2SO4 kreda (rodek zobojtniajcy) efektywna hodowla: napowietrzana, 300C, 40 72 h wydajno 50%
49
50
W8 Bakterie wykorzystujce inny cukier ni glukoza, np. Corynebacterium sp. R7. Wykorzystuj heksadekan i penicylin lub Tween 80 ( wydajno 75 g/l), mae stenie tiaminy. 2. KWAS ASPARAGINOWY Kiedy produkowany z soku asparagusa Teraz metody fermentacyjne, enzymatyczne Zastosowanie: medycyna: sl K, Mg (leczenie znuenia, chorb serca, wtroby, skurczw ng u diabetykw), sl Fe (anemia) kosmetyka: zwizki powierzchniowo czynne L-Asp + B6 (kremy rewitalizujce) przemys spoywczy (soki pomaraczowe, aspartam) Metoda fermentacyjna: glukoza: Brevibacteriumflavum kwas fumarowy: Bacillus, mutanty F. fluorescens, E. coli
metody mao wydajne; trudne do kontroli
o skadnik konserw obnia pH o inaktywacja oksydaz (oksydazy odpowiedzialne za ciemnienie owocw) o kompleksuje Me powodujce jeczenie tuszczw przemys metalurgiczny: czyszczenie powierzchni metali przed spawaniem przemys farmaceutyczny: o dodatek do tabletek musujcych o cytrynian sodu wykorzystywany jest jako preparat zapobiegajcy krzepniciu krwi w stacjach krwiodawstwa przemys chemiczny: o detergenty (wypar biodegradowalne fosforany) o plastyfikatory, stosowane w mleczarniach do usuwania kamienia mlecznego; Producenci: Aspergillus niger Aspergillus wenti Candida sp. Otrzymywanie kwasu cytrynowego (300.000 t/rok)
Metoda enzymatyczna: wykorzystanie liaz do produkcji (L-Asp cakowicie nie rozpuszczalny w wodzie, atwy do wydzielenia) CH COOH CH COOH aspartaza
a) metoda powierzchniowa: dwie fazy w systemie jednostopniowym 1 faza rozwj grzybni (72h) 2 faza koniec rozwoju grzybni, waciwa produkcja kwasu cytrynowego Surowiec: melasa buraczana (pozostao po produkcji cukru) rozcieczona do 16% zawartoci sacharozy + sole mineralne (KH2PO4, ZnSO4x7H2O, K4Fe(CN)6) rozlanie sterylnej poywki na system tac zaszczepienie zawiesin konidiw w wglu aktywnym wzrost grzybni (dojrzaa grzybnia 2-3cm) produkcja kwasu cytrynowego (za produkcj odpowiedzialna jest cz grzybni stykajcej si z powierzchni poywki) wydzielenie produktu (metoda cytrynianowa i bezcytrynianowa) wydajno 70%, proces trwa ok. 200h istnieje zagroenie zaraeniem mikrobiologicznym b) metoda wgbna: opiera si na wykorzystaniu bioreaktorw (50 100m3) warunkiem wydajnoci procesu jest surowiec o duej masie i wyszej klasie czystoci (cukier handlowy, soki cukrownicze, mczki cukrowe, hydrolizaty skrobiowe) zaszczepienie: konidia lub grzybnia indukcyjna W8 warunki: zamknity reaktor, dozowanie po wysterylizowaniu, niskie pH 2,5 3 ( nie sprzyja zakaeniom) czas 120 168 h, temperatura 30 32 0C poywka mineralna (sole) wydajno 80% normy spoywczego kw. cytrynowego musz by spenione (cukier handlowy, soki cukrownicze, mczki cukrowe, hydrolizat skrobiowy) problemy bioinynieryjne: o wzrost w staej objtoci, o zmiana rodowiska zewntrznego, o zmiana gstoci, o specjalne bioreaktory; problem z melas buraczan (mao wydajna) 2. KWAS MLEKOWY = kwas 2-hydroksypropionowy
zwizek optycznie czynny (L,D, racemat)
kwas fumarowy amoniak

CH 2 COONH4+ CH 2(NH2)COOH sl amonowa L-Asp
CH COONH4 CH COONH4 fumaran amonu
CH2 COOH CH2(NH2)COOL-Asp (zw. nierozpuszczalny w wodzie)
Stosuje si do tego celu specjalne kolumny wypenione immobilizowanymi komrkami Escherichia coli, jako nonika uywa si roztworu fumaranu amonu. kolumna z immobilizowanymi komrkami E. coli
roztwr 1,2 M fumaranu amonu + 1mM Mg2+ pH 8,5 37 0C powolny przepyw
odciek
zmiana pH 2,8, 60% H2 SO4 ochodzenie do 150C odwirowanie przemycie wod
krysztay L-Asp
W8 BIOTECHNOLOGIA PRODUKCJI KWASW ORGANICZNYCH 1. KWAS CYTRYNOWY

OH HOOC COOH COOH
- otrzymywany na drodze biologicznej
Zastosowanie: przemys spoywczy (80%):
COOH HO C H CH3
51
52
zaley od tego czemu ma suy kwas mlekowy, ceny i dostpnoci surowca surowce: melasa buraczana, trzcinowa, serwatka, ugi posiarczynowe przedsibiorstwo Akwawit: sacharoza + kieki lub ekstrakt drodowy; Lactobacillus delbrueckii; temp. 50 55 0C, 2-8 dni, neutralizacja Ca(OH)2 95% plenie: Rhizopus oryzae; mog wykorzystywa te same szlaki metaboliczne co bakterie mlekowe, te ktre s zdolne do wytwarzania pojedynczych enancjomerw hodowla wgbna
wany jest poziom napowietrzenia proces trwa 60 70 h wydajno 90%
Kwas glukonowy otrzymuje si jako roztwr 50% i wykorzystuje si go w przemyle. Po zakoczeniu procesu kwas jest neutralizowany; otrzyman sl neutralizuje si i oczyszcza. 5. KWAS OCTOWY Surowiec: etanol, alkohole, wino, sfermentowany sok jabkowy. Metody otrzymywania: a) powierzchniowa
Zastosowanie: zakwaszanie i konserwacja przetworw i konserwantw owocowo-warzywnych produkcja napojw chodzcych przemys garbarski, farbiarski, chemicznych przemys kosmetyczny, farmaceutyczny
OH HO OH OH OH COOH
3. KWAS GLUKONOWY = kwas pentahydroksykapronowy
(orleaska) Acetobacter aceti temperatura 25 - 280C najstarsza metoda samorzutna fermentacja wina w beczkach objto 1/3 beczki zaszczepiona bakteriami
otrzymywany metodami chemicznymi lub biologicznymi oksydaza glukozowa: Aspergillus niger, Gluconobacter sp., Pseudomonas sp. rdem wgla jest glukoza
W8 Zastosowanie: przemys spoywczy: zakwaszacze produktw, sztuczny mid, kiebasy, sery, napoje gazowane, proszek do pieczenia glukonian wapnia: zwizek atwo przyswajalny przez zwierzta rozpuszczalnik skrzepw krwi dodatek do antybiotykw: stabilno, rozpuszczalno, poziom we krwi przemys tekstylny: wybielanie i nabyszczanie tkanin przemys metalurgiczny: jak kwas cytrynowy glukonian sodu: automatyczne mycie butelek glukonian potasu: ochrona instalacji przemysowych produkcja 50 000 ton/rok -D-glukoza
w roztworze wodnym ustala si midzy nimi rwnowaga
W8 czterokrotnie odciganie czci zawartoci otrzymujemy ocet winny b) metoda ociekowa (wizana): dwie odmiany - metoda stojakowa (przestarzaa): maa wydajno 60 80 % , trudna kontrola - metoda generatorowa: unieruchamianie bakterii octowej na noniku np. pumeks, kolby kukurydzy, wiry bukowe, koks; - zacier = brzeczka: dzieli si j na 3 partie: i. 50% zacieru w kolumnie: stenia alkoholu ok. 4% ii. 25% : stenie alkoholu ok.. 3% iii. 25%: stenie alkoholu poniej 3% - proces prowadzi si do momentu a stenie alkoholu wyniesie ok. 0,03% - 14% EtOH (maksymalne stenie alkoholu) - poywka hodowlana 1 3% CH3COOH - stymulowany wzrost bakterii octowych (ekstrakt sodowy, drodowy, glukoza, sole mineralne N,P) - metoda fermentacyjna (metoda wgbna): i. fermentatory wyposaone w wownice (utrzymuj sta temperatur 300C) i system napowietrzajcy; ii. proces jest szybki, okresowy, wysoce efektywny iii. jedyna wada: produkt zanieczyszczony komrkami bakterii iv. zacier: 10 14% EtOH, 1- 3% kwas octowy, stymulatory wzrostu bakterii octowych (glukoza, ekstrakt drodowy, sole mineralne) v. materia biologiczny ocet spoywczy vi. materia chemiczny kwas octowy dla celw technicznych OCET BALSAMICZNY: - winogrona umieszczane s w beczce z drzewa kasztanowego o pojemnoci 100 l - po ich toczeniu otrzymuje si 70 l. wieego moszczu., stonych cukrw 16 18% - zachodzi tu fermentacja alkoholowa i octowa - gotowanie na wolnym ogniu pod goym niebem; 30 l koncentratu o steniu cukrw 30 36% - chodzenie w okresie zimowym, dekantacja w gsiorkach W9 POLISACHARYDY PRODUKOWANE PRZEZ MIKROORGANIZMY
-D-glukoza
oksydaza glukozowa: zawsze towarzysz jej katalazy, odszczepia 1C, dwa H, tworzy si lakton
D-glukozo--lakton
D-glukozo--laktan Aspergillus niger: proces wgbny poywka: 30% roztwr glukozy, P i N pH 5,5 5,6
kwas glukonowy
Typy mikrobiologicznych polisacharydw: egzopolisacharydy: o wydzielane na zewntrz komrki o gumy o nierozpuszczalne w wodzie i nieszkodliwe dla czowieka
53
54
o przemys spoywczy i farmaceutyczny o jako koagulanty, emulsyfikatory o opacalne pod wzgldem ekonomicznym wewntrzkomrkowe o stanowi materia zapasowy o komponenty ciany komrkowej o egzopolisacharydy (niektre wydzielane w postaci kapsuek)
homopolimer z czsteczkami --glukozy poczonymi w pozycjach 1,6--1,6-glukan: pyny infuzyjne (polimery 30 70kDa) Leuconostocmesenteroides: zdolny do przeprowadzania fermentacji, wykorzystuje sacharoz, w podou musi zawiera mao aminokwasw dekstrenosacharoza: transglukozydaza; hydroliza czsteczki glukozy na dekstran produkcja materiaw chromatograficznych, eli dekstranowych, Sephadex
3. ALGINIAN Producenci polisacharydw: o bakterie Gram + o bakterie Gram o glony o grzyby mikroorganizm Azotobacter vinelandii Zymononas mobilis Sclerotium rolfsii Aureobasidiumcampestris Pseudomonas elodea Xanthomonas campestris substrat sacharoza sacharoza glukoza sacharoza wglowodory laktoza Polisacharyd polisacharyd alginian skleroglukan pullan gellan ksantan produkowany gwnie przez glony morskie rdo Azotobacter vinelandii polisacharyd liniowy zbudowany z kwasu -mannozopiranosylurowego (-1,4) i kwasu glukoronowego (-1,4) nonik do immobilizacji enzymw
4. PULLULAN biay proszek bez smaku i zapachu, dobrze rozpuszczalny w wodzie, nie rozpuszcza si w metanolu i acetonie liniowy egzopolisacharyd podstawowa jednostka tri- lub tetrasacharyd
Pod wzgldem budowy polisacharydy dzielimy na: homopolisacharydy: pullulan, dekstran heteropolisacharydy: ksantan proste rozgazione Pod wzgldem niesionego adunku: kationowe obojtne neutralne 1. KSANTAN produkowany przez Xanthomonas campestris dodatek do ywnoci naturalne pochodzenie mikrobiologiczne otrzymywany na drodze fermentacji surowcw wgla W9 hydrokoloid zbudowany z glukozy, mannozy, i kwasu glukuronowego (3:2:2) tworzy pseudoplastyczne roztwory roztwory ksantanu oparte na: kwanym rodowisku, dziaaniu enzymw i zmianach temperatury chemiczna i fizyczna stabilno = zagszczanie produktw silnie kwanych, zasadowych ksantan + mczka chleba witojaskiego = el elastyczny, termoodwracalny
Zastosowanie: osonki produktw spoywczych substytut skrobi ywno niskokaloryczna modyfikacja chemiczna produkcja torebek, pudeek (czciowa estryfikacja: folie nierozpuszczalne w wodzie) dodatek plastycyzerw (poprawia plastyczno) kosmetyki, laminaty, wkna podobne do jedwabiu W9 Proces produkcji polisacharydw pochodzenia mikrobiologicznego - kontrola na poziomie rodowiska hodowlanego poywka: o Xanthomonas campestris = ksantan ograniczenie o Azotobacter vinelandii = alginian temp, pH, stenie O2, rozp.CO2 - kontrola na poziomie sprztowo technologicznym Problemy inynieryjne: wydzielanie i oczyszczanie produktu.
rda wgla
TUSZCZE I OLEJE POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO Roliny oleiste = soja, orzeszki ziemne, bawena, rzepak, sonecznik, oliwki, itp. Przemys spoywczy margaryny, tuszcze do pieczenia, majonezy, olej saatkowy, lody, cukiernictwo kosmetyki, leki detergenty, surfaktanty, myda woski, wybielacze, plastiki olej sojowy, z orzeszkw ziemnych, rzepakowy, oliwa z oliwek olej kokosowy, palmowy, rycynowy olej palmowy, kokosowy olej palmowy, sojowy olej sojowy olej palmowy
Zastosowanie: zagszczacz i substancja elujca: mleczne napoje fermentowane i niefermentowane, musztarda, majonez, kisiel, galaretka, marmolada, sery, demy, sery topione, twarogi emulgator i substancja elujca: mieszaniny masa i tuszczw rolinnych, napoje z czsteczkami owocw 2. DEKSTRAN noniki do wypenie kolumny
Przemys kosmetyczny Przemys chemiczny Przemys metalurgiczny
55
56
Mikroorganizmy olageageniczne: 20 25% biomasy w postaci lipidw drode, plenie i inne mikroorganizmy eukariotyczne zawieraj enzym liaz ATP cytrynianu mikroorganizmy zawierajce ten enzym zdolne s do przeprowadzania reakcji: cytrynian + ATP +CoA acetyloCoA + szczawiooctan + ADP +Pi biosynteza tuszczw styren
glukoza
pentan
frutozo-6-fosforan + aldehyd-3-fosfoglicerynowy
glikoliza
Mikroorganizmy produkuj lipazy, gdy poywka zawiera odpowiednie stenia rde N i C (C:N 50:1). Hodowla okresowa = wzrost biomasy do momentu wyczerpania rda azotu (pozostajce rdo C produkcja lipidw) Hodowla ciga = ograniczenie dostpnoci do rda N PRODUCENCI LIPIDW 1. Bakterie: - mycobakterie Nocardia - Arthrobacter 80% biomasy w postaci lipidw (triacyloglicerole) W9 poli--hydroksymalan o produkowany w warunkach ograniczonego dostpu do rda azotu; o synteza zalena od O2 o nierozpuszczalny w chloroformie, dlatego jest klasyfikowany jako lipid o polimer zapasowy o biodegradowalny plastik; producent : Alcaligenesenthropus (70 80% masy w postaci polimeru) woski: Acinetobacter; proste estry kwasw tuszczowych i alkoholi tuszczowych, poywka z bursztynianem jako rdem wgla lub octanem (10-25% lipidw) oraz alkohole tuszczowe wysoka wydajno 2. Glony: oleje-do 70% Chlorella perenoiclosa przejciowe produkty olejw napdowych
2-pirogronian
CO2
acetoina diacetyl 2,3-butanodiol
produkty otrzymywane z 2,3-butandiolu o 2-buten o 1,3-butadien o estry butanodiolu o eter tetrametylowy o MEK
GLICEROL zastosowanie: przemys spoywczy, kosmetyczny, farmaceutyczny, chemiczny, materia wybuchowy (pochodne estrowe) dodatek siarczku sodu drode zamiast etanolu wytworz glicerol
W10 ENZYMATYCZNA SYNTEZA TLENKW ALKENW O2

oksydaza 2-pyranosowa
propylen, Cl -, H2O2
chloroperoksydaza
W10 2,3-BUTANODIOL 1906r. odkrycie 2,3-butanodiolu w pynie pohodowlanym Klebsiella pneumoniae II w. w. przemys zbrojeniowy obecnie paliwo pynne, prekursory pianek, atramenty, farby drukarskie, plastyfikatory, materia wybuchowy producenci: o Klebsiella pneumoniae o Klebsiella oxytoc o Enterobacteraerogenes o Serratia marcescens o Bacillus subtilis o Bacillus polymyxa substraty: o Klebsiella oxytoca = melasy, enzymatycznie hydrolizowane zaciery zboowe, zhydrolizowana skrobia, pszenica, hydrolizaty drewna, odpady posiarczynowe o Bacillus polymyxa = skrobia kukurydziana, pszeniczne zaciery (enzymy amylolityczne) warunki fermentacji: pH 5-6,5, temp. 37oC, O2, stenie substratw 5-10% biochemia procesu:
chlorek hydroksypropylenu H Cl-
epoksydaza
tlenek propylenu
ALKOHOL ETYLOWY = ETANOL CH3CH2OH przemys spoywczy, odczynnik chemiczny, rozpuszczalnik, paliwo proces fermentacji cukrw z wytworzeniem alkoholu jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie produkcja przemysowa: gorzelnicze odmiany drody: Saccharomycescerevisiae, w USA: Saccharomyces cerevisiae+ Candida+ Kluyveromyces cechy drody gorzelniczych: o wysoka aktywno fermentacyjna o wydajno produkcji biomasy o wysoka stabilno cech morfologicznych i fizjologicznych o odporno na temperatur >30oC
57
58
odporno na due stenia etanolu w poywce zdolno do fermentowania brzeczek o podwyszonej zawartoci cukrw (nawet ok. 50%) fermentacja alkoholowa: piwowarska, winiarska, gorzelnicza surowce do produkcji alkoholu etylowego o surowce skrobiowe kukurydza, yto, ziemniaki, jczmie, owies, sorgo, ry o surowce zawierajce mulin opian, buraki o surowce zawierajce cukry proste i oligocukry melasa, sacharoza, serwatka, buraki paszowe, owoce, soki owocowe o surowce zawierajce celuloz drewno i jego odpady, torf, ugi posiarczynowe, trawa, soma surowce zawierajce skrobi: oczyszczanie, obrbka termiczna, obrbka enzymatyczna przygotowanie sodu gorzelnianego: -amylaza, -amylaza, -glukozydaza, glukozydaza amylopektynowa, oligo-1,6-glikozydaza warunki procesu: o 14 16 dni, temperatura 8 10oC, pmrok o rozdrobnienie i ugowanie enzymw wod = mleczko sodowe W10 o zacieranie = przemiana skleikowanej skrobi na cukry w temp. 55oC o -amylaza: pH op. 5-6, temp. op. 70oC 70% skrobi: 80% maltoza -amylaza: pH op. 4-5, temp. op. 40 50oC 20% dekstryny, glukoza preparaty enzymatyczne scukrzajce skrobi: o termamyl Bacilluslichenifornis o SAN Aspergillus niger o Fungamyl Aspergillus oryzae o BAN Bacillus subtilis przygotowanie drody gorzelnianych o namnoenie przez ok. 20h na przecieku drodowym o dobre rezultaty immobilizacja mniejsza zaleno od zmian kwasowoci i temperatury mniejsze ryzyko zakaenia mniejsze koszty inwestycyjne i energochonno szybko i wydajno produkcji fermentacja: o I = zafermentowanie 18 20h, powolny wzrost II = fermentacja gwna 20 22h, temp. max 30oC III = defermentowanie 20 30h, temp. 25 26oC o zacier dojrzay zawiera 8 12% alkoholu o produkty uboczne: kwas octowy, bursztynowy, aldehyd octowy, estry, wysze alkohole (fuzle) o teoretyczna wydajno: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 100g glukozy 51,5g EtOH o wydajno praktyczna: 45 48g metanolu / 87 94% w stosunku do wydajnoci teoretycznej o proces fermentacji surowcw zawierajcych cukry proste lub dwucukry nie wymaga stosowania sodu scukrzajcych preparatw enzymatycznych poszczeglne surowce: o melasa: rozcieczenie, sterylizacja, proces okresowy, cigy i pcigy o serwatka: Kluyveromyces; 42 l serwatki (4,4% laktozy) = 100% EtOH o surowiec zawierajcy celuloz: hydroliza destylacja o o napj destylowany Wdka Scotch Whisky Irish Whisky Canadian Whisky Gin (1650r) Aquavit surowiec ziemniaki, zboe jczmie jczmie, pszenica, owies, ry ry ziarna zb, owoce jaowca ziemniaki, ziarna zb, kminek
Tequilla Kirchwasser Brandy Cognac Rum
sok kaktusa Agare Aequilana sok winiowy owoce biae winogrona trzcina cukrowa
W11 METALWORKING FLUIDS W procesie obrbki metali stosowane s rne substancje cieke, ktre speniaj trzy podstawowe funkcje: 1. chodzenie 2. smarowanie 3. odprowadzanie drobin i opikw Ciecze niewodne oraz na bazie wody. Drobnoustroje zasiedlajce ciecze na bazie wody: szczepy Pseudomonas = due zdolnoci adaptacyjne do niekorzystnych warunkw ycia, wykorzystuj skadniki organiczne, tak wic: o utleniaj alkany do kwasw tuszczowych o przeprowadzaj -oksydacj kwasw tuszczowych o przeprowadzaj deaminacj aminy o hydrolizuj sulfoniany ropy naftowej o degraduj inhibitory korozji co powoduje zmiany w charakterze substancji (dekoloryzacja, zmiana pH) i przygotowania rodowiska ycia dla anaerobw szczepy anaerobw Desulfovibrio = nigdy nie pojawiaj si, gdy zasiedl rodowisko bardzo trudno si ich pozby; smrd H2S grzyby wszdobylskie Cephalosporium, Fusarium, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Candida: o zdolne do przetwarzania w obecnoci duych populacji Pseudomonas
Detekcje (wykrywanie) mikroorganizmw w cieczach zwizanych z obrbk metali: redukcja bkitu metylowego = populacje Pseudomonas oznaczanie poziomu ATP stenie O2 uwalnianego z H2O2 przez katalaz komrkow radiospirometria, konduktometria, kalorymetria nie s wykorzystywane
Choroby ludzi: 1978r. 250 pracownikw zakadw Forda Ford Pontiac Fever zwizane z obecnoci biocydw Problemy ze stosowaniem biocydw. Nie ma rodka uniwersalnego i zawsze skutecznego. Przykadowe biocydy: Dowcide, Bioban, Tris Nitro, Vancide TH.
W11 SCO = Single Cell Oil
59
60
Do SCO nie zalicza si woskw, zalicza si te, ktre maj struktur triacylogliceroli gwni producenci: glony, grzyby (plenie, drode) idealny substrat powinien zawiera taki sam stosunek reszt (2 nasycone : 1 nienasycone acuchy)
XXI w. - biotechnologia rolin i zwierzt Cel wprowadzenia: zwikszenie wydajnoci plonw aby rolnictwo byo przyjazne dla rodowiska TECHNOLOGIE GENOWE
Olej z drody jako odpowiednik masa kakaowego

CH2O H33C17 OC O CH CH2O CO C18H37 CO C 17H35
MASO KAKAOWE
Strategia doskonalenia rolnictwa zawsze koncentruje si na: dobr odpowiednich upraw zarzdzanie ziemi i wod walce ze szkodnikami i ochronie upraw Wprowadzanie do rodowiska organizmw transgenicznych musi mie wpyw na te czynniki.
CBE = substytut masa kakaowego (16:0, 18:0,18:1) ROLINY TRANSGENICZNE O2 produkt status prby polowe wczesne badania w handlu Producent roliny odporne na stres (susze, zasolenie) zboa zdolne do wizania N2 z genami rolin strczkowych roliny z tolerancj na pestycydy
R CH2 R1 inhibitor
R R1
CH2 CH2
R CH R1 CH
NADPH
desaturaza
NADP+
owoce i warzywa odporne na wirusy jadalne szczepionki pomidory z opnionym dojrzewaniem
prby polne badania w handlu
Monsanto Calgene Dupont Asgrow
Calgene
2 H2O Mutagenaza = Candida curvata nieaktywna desaturaza POLINIENASYCONE KWASY TUSZCZOWE prekursory prostaglandyn, leukotrienw, tromboksanw EPA i DHA polecane przy profilaktyce chorb serca kwasy -linolenowe (GLA) egzema o kwas -linolenowy (GLA) Mucorcircinelloides o kwas dihomo--linolenowy Mucorcircinelloides o kwas arachidonowy (ARA) Mucorcircinelloides o EPA powstaje w wyniku dziaania 17 desaturazie dziajcej na ARA 20% zawartoci lipidw u grzybw Mortierella i Pythium, glon Porphyridium cruentum 40% lipidw W11 DHA = grzyby morskie (Tchranstochytriumaureum) 50% lipidw komrkowych, brak EPA bakterie produkuj PUFAs Altermonas, Shewanella, Flexibacter, Vibrio = produkcja przemysowa EPA moliwa dla Shewanella putrifaciens (15 18 g biomasy, 12 18 h, 10 15 % biomasy to lipidy w tym 25 40 % EPA) W11 ZWIERZTA TRANSGENICZNE produkt p/ciaa monoklonalne hormon wzrostu zwierz lub jego produkt mleko krw tilapie (ryba) status
prby polowe
MIKROORGANIZMY TRANSGENICZNE produkt chymozyna status Zaakceptowane przez FDA
MIKROORGANIZMY W ROLNICTWIE (BIONAWOZY) Rhizobie wizanie N2 Cyanobacterie wizanie N2 P,N,S yzno gleby roliny strczkowe ry drzewa szpilkowe roliny
PERSPEKTYWY W AGROBIOTECHNOLOGII Nowa agrobiotechnologia bazuje na inynierii genetycznej, biologii molekularnej i mikrobiologii stosowanej. XX w. - biotechnologia mikroorganizmw
mikoryza kompost
CZYNNIKI BIOKONTROLI
61
62
biopestycydy bioinsektycydy bioherbicydy inne: diagnostyka, bioremediacja
ROLINY TRANSGENICZNE JAKO PRODUCENCI WANYCH DLA CZOWIEKA PRODUKTW oleje rolinne wglowodany biaka szczepionki, przeciwciaa, biofarmaceutyki (somatotropina), biaka przemysowe tyto i ziemniaki przeciwciaa wiksza aktywno biologiczna ni przeciwciaa monoklonalne o przeciwciaa IgA z tytoniu przeciwko mikroorganizmom powodujcym gnicie zbw u ludzi biofarmaceutyki hormony o somatotropina = w chloroplastach tytoniu
Biotechnologiczne doskonalenie rolin a rodowisko: 2001r. 52 mln hektarw upraw rolin transgenicznych (39 mln hektarw w Ameryce Pn) Biotechnologia rolin rozwija si w dwch kierunkach: 1. technik umoliwiajcych selekcj genetyczn rekombinantw przypieszajcych uzyskanie nowych odmian rolin techniki markerw molekularnych atwy i szybki sposb oceny segregujcej populacji przez co skraca si czas selekcji okrelonego genotypu mapowanie molekularne- suy do identyfikacji miejsca, w ktrym znajduj si okrelone geny co moe by wykorzystane w doborze komponentw do krzyowania techniki kultur in vitro, techniki mikrorozmnaania, otrzymywanie podwojonych haploidw, technika fuzji protoplastw i uzyskiwania mieszacw somatycznych 2. modyfikacji genetycznej
W11 ROLINNE SZCZEPIONKI BAKTERYJNE Nawz bakteryjny (szczepionka bakteryjna)- preparat skadajcy si z gleby, substancji odywczej oraz szczepu drobnoustroju, ktry moe: wzbogaca gleb w okrelony skadnik pokarmowy (szczepionki wzbogacajce w zwizki azotu mobilizowa procesy przeksztacania zwizkw chemicznych niedostpnych dla rolin w zwizki dostpne (szczepionki immobilizujce)
W11 MOLIWOCI MODYFIKACJI GENETYCZNEJ W PRZYKADZIE GENW WARUNKUJCYCH ODPORNO Geny rolinne kodujce: inhibitory enzymw trawiennych owadw toksyczne substancje (lektyny, chitynazy, alkaloidy) biaka biaka antywirusowe naturalne geny gospodarza kodujce odporno na patogeny Geny patogenu lub mikroorganizmu niepatogenicznego: geny biaek wirusa W celu zapewnienia dugotrwaego i silnego efektu ochronnego produktu trans genezy powinny cechowa si szerokim spektrum dziaania, np. gen Bs2 z papryki- produkty rozpoznaj biaka awirulencji bakterii Xanthomonas campestris , X. Oryzae gen Xa21 z ryu- produkty rozpoznaj biaka awirulencji bakterii Xanthomonas campestris , X. oryzae Korzystny efekt mona te uzyska poprzez optymalizacj KIERUNKI ROZWOJU TECHNIK TRANSFORMACJI metody transformacji za pomoc Agrobacterium jako system bardziej precyzyjny ni transformacje bezporednie transformacje chloroplastw jako metoda znacznie zwikszajca ilo produktu i umoliwiajca poziome rozprzestrzenienie si transgenw transformacja in plane precyzyjne transformacje do wybranego miejsca w genomie uycie nowych markerw selekcyjnych do selekcji pozytywnej rozwj metod eliminacji genw selekcyjnych
SZCZEPIONKI WZBOGACAJCE Nitragina Rhizobium Azotobakteryna (nie tylko do rolin motylkowych) Azotobacter (wystpuje tam gdzie duo zwizkw organicznych) SZCZEPIONKI IMMOBILIZUJCE Fosfobakteryna Bacillus megaterium (zdolno mineralizacji wiza fosforowych) szczepionki oparte o siderofory szczepionki oparte o mikoryz (wspdziaanie rolin wyszych z grzybami)- w lenictwie o zewntrzna obrasta korzenie, nie wnika do wntrza o wewntrzna przebija skr, przerasta strzpkami
BIOINSEKTYCYDY mikroorganizm Bacillus thuringensis Bacillus popilae Bacillus sphaericus Beauveria bassiana Hirutella thompson Verticillum lecani cel larwy Leptidopteran larwy Dipteran uki japoskie larwy komarw rne roztocza cytrusw mszyce w szklarniach sposb otrzymywania fermentacja
w handlu w handlu
fermentacja fermentacja fermentacja fermentacja
w handlu w handlu
W12 OCHRONA RODOWISKA Biotechnologia w ochronie rodowiska Tworzenie zintegrowanych systemw ochrony rodowiska: wydobywanie surowca transport surowca do punktu przerobu
63
64
przetwarzanie surowca eksploatacja urzdze procesu technologicznego zagospodarowanie surowcw ubocznych, odpadw, ciekw
np. zanieczyszczenie metalami cikimi: Cu: mniszek > skrzyp> trawy > saata > kukurydza Cd: toboek > szpinak > saata > wierzba > soma, jczmie > trawy Typy fitoremediacji: fitoakumulacje (fitoekstarkcje) - wnikanie do wntrza rolin; nie ulegaj one degradacji o wierzba o gryka o luceryna ryzofiltracje - rozwj rolin w rodowisku wodnym fitodegradacja - system korzeniowy, enzymy rolinne degraduj toksyny biodegradacja ryzosferyczna - rolina wydziela do rodowiska zwizki degradujce toksyny fitostabilizacje - wydzielanie zwizkw do podoa, unieruchamianie toksyn fitoutlenianie =-transpiracja toksyn przez licie kontrola hydrauliczna drzew Zalety: niski koszt nakadw inwestycyjnych minimalne zakcenie istniejcych warunkw rodowiska powszechna aprobata opinii publicznej Ograniczenia: wolne tempo oczyszczania ograniczenie dziaania do pytkich warstw gleby odpowiednio due powierzchnie W12 powolny wzrost i specyficzne wymagania oraz rna tolerancja na inne zanieczyszczenia gleby nie pomocne w wielu przypadkach toksyczno i biologiczne wasnoci produktw biodegradacji przenikanie do ywnoci niska efektywno w przypadku zanieczyszcze, silnie zaobserwowanych na nastpnych glebach BIOGEOCHEMIA - zajmuje si rol organizmw ywych w procesach obiegu pierwiastkw w przyrodzie, ich przemieszczaniem, akumulacj, tworzeniem i rozkadem mineraw oraz ska W12 Metody wymywania pierwiastkw: 1. techniki laboratoryjne perkolator - technika hodowli wstrzsanej; metoda zamknitej kolby ekologicznej; wymywanie pod cinieniem 2. metody in situ - hady niskoprocentowych rud hole to hole, hole to mine Czynniki warunkujce efektywno wymywania pierwiastkw: dostpno tanich rde wody odpowiedni skad rudy dobr odpowiedniego szczepu odczynniki chemiczne M IKR O B IOL O G IC Z N E R E A KC J E G E O CH E M ICZ N E O ZNACZENIU P RAKTYCZNYM 1. BIOGEOCHEMIA Cu: wymywanie Cu zwizane jest z reakcjami utleniania zwizkw towarzyszcych czyli zwizkw siarki i elaza: H2SO4, FeSO4, Fe2(SO4)3 Thiobacillus thiooxidans, Thiobacillus ferroxidans piryt: FeS2 + 7O2 + H2O 2FeSO4 + H2SO4 chalkopiryt: Fe S2 + 7,5O2 + H2O Fe2(SO4)3 + H2SO4 chalkozyn: Cu2S + 2Fe2(SO4)3 2CuSO4 + 4FeSO4 + S
LCA - cykl ycia produktw Strategie odpadw: unikanie ich powstawania lub zmniejszenie ich iloci i szkodliwoci materiaowe i energetyczne wykorzystanie odpadw Metody czyszczenia ciekw: mechaniczne fizykochemiczne biologiczne Zoe biologiczne - mikroorganizmy zamieszkujce bon biologiczn, przez ktr przesczaj si cieki Bioremediacje - uycie biologicznych ukadw w celu redukcji wielkoci zanieczyszczenia rodowiska lub transformacji rnego rodzaju zanieczyszcze w formy mniej szkodliwe bioremediacje podstawowe = naturalna mikroflora skaonego terenu jest wykorzystywana do obnienia substancji toksycznych w rodowisku do bezpiecznego poziomu w okrelonych i akceptowalnych ramach czasowych ( z naszej strony adnych dziaa tylko monitoring) biostymulacja = np. natlenianie i wprowadzanie poywek, wzbogacanie w azot i fosfor; zaley od pH, zasolenia i wilgotnoci bioaugmentacja = (wprowadzenie obcej mikroflory gdy bioremediacja podstawowa i biostymulacja zawodz) = wzbogacanie zanieczyszczonego terenu w specjalnie wyselekcjonowane mikroorganizmy o duej zdolnoci biodegradacji zanieczyszcze Przeprowadzanie bioremediacji: in situ = na miejscu ex situ Rodzaj i miejsce skaenia grunt skaony wglowodanami pochodzenia petrochemicznego Zalety: Koszt metody konwencjonalnej wydobycie gruntu i oczyszczenie ex situ 3 mln $ Koszt bioremediacji biowentylowanie 0,2 mln$ Rnica 2,8 mln $
procesy ekonomiczne moliwo prowadzenia procesu in situ grunt nadaje si do uytku bezporednio po przeprowadzeniu procesu oczyszczania nie wymaga stosowania kosztownej i skomplikowanej aparatury
Ograniczenia: rodzaje skaenia warunki panujce w miecie skaenie czasowe Technologie te znajduj szczeglne zastosowanie przy remediacji gruntw i wd gruntowych skaonych: produktami ropopochodnymi, benzenem, toluenem, paliwami, benzyn produktami organicznymi: pestycydami, rozpuszczalnikami, rodkami do impregnacji drewna metalami cikimi FITOREMEDIACJE - technologia oczyszczania rodowiska, ktra wykorzystuje naturalne zdolnoci rolin do pobierania i gromadzenia substancji zanieczyszczajcych lub do ich biodegradacji
65
66
CuSO4 + Fe2+ FeSO4 + Cu2+ Piryt towarzyszy zwizkom miedzi + +
Cu2S CuFeS2 CuS
Chalkozyn S Chalkopiryt S2-, Fe2+ kowelin S2-
2-
2. BIOGEOCHEMIA Zn: Skad chemiczny ZnS ZnO ZnCO3 Zn2(SiO4) Zn4(OH)2(SiO7) x H2O Nazwa minerau Sfaleryt Cynkit Smitsonit Wilemit Kupryt
rola biaka (Cd: chityna; Cu, Co: mannan) rnice w efektywnoci usuwania metali u bakterii Gram (+) i Gram () (rna budowa ciany komrkowej); Gram (+) 10x efektywniej wi metale, poniewa maj wielowarstwow cian co umoliwia wizanie jonowe z metalem) o wane jest jakie mikroorganizm posiada otoczki, warstwy luzowe (uatwiaj wizanie metalu) zmiana pH rodowiska: o zmiana odczynu powoduje przesunicie rwnowagi chemicznej pomidzy formami metali w roztworze, a porednio ma wpyw na powinowactwo adsorpcyjne metalu do otoczek i cian komrkowych o grzyby- obniaj pH rodowiska o bakterie- podwyszaj pH rodowiska o w rodowisku alkalicznym tworz si trudnorozpuszczalne zwizki o w rodowisku kwanym tworz si atworozpuszczalne zwizki o Alcaligenes denitrificans = usuwanie Cd zwizane jest ze zdolnoci do silnej alkalizacji rodowiska (prowadz proces denitryfikacji). o o
Thiobacillus ferrooxidans: ZnS + 2Fe2(SO4)3 + O2 ZnSO4 + 4FeSO4 + 2H2SO4 H2SO4 = uatwia wymywanie, zakwasza rodowisko, stwarza warunki dla wzrostu Thiobacillus ferroxidans
3. BIOGEOCHEMIA URANU: Podatno na wymywanie mikrobiologiczne + + + -
3. Pozakomrkowe wydzielanie przez mikroorganizmy substancji nieorganicznych i organicznych: kwasy organiczne, biaka przyczaj Cd i powstae kompleksy s deponowane w obrbie oson komrkowych mikroorganizmy redukujce siarczany do H2S wytrcaj metale w postaci nierozpuszczalnych siarczkw Citobacter sp. Cd (poywka z fosfoglicerolu, kwana fosfataza HPO42 , nierozpuszczalne MeHPO4 W13 4. Biotransformacje polegajce na przemianie enzymatyczne j metalu (f. rozpuszczalne f. mniej rozpuszczalne): reakcje utleniania i redukcji reakcje metylacji i demetylacji As utleniany przy pomocy oksydaz do As (V)- mniej rozpuszczalny i atwiej strcany przez fosforany czy FeCl3 Cr(VI) redukcja do Cr(III) Enterobacter elocae Hg Aeromonas hydrophila (proces dwuetapowy) 5. Akumulacja metali: biaka indukcyjne = pojawiaj si metalotioneiny (dua ilo grup tiolowych) = politiolowe polipeptydy gdy komrka ma kontakt z zawierajce due iloci (30%) Cys Zn, Cu, Ag, Sn, Mg, Cd metalem fitochelatony = glony, roliny wysze drode = niskoczsteczkowe polifosforany (kumulacja metalu w postaci granulek) ETAPY W PRZEMYSOWYCH PROCESACH USUWANIA METALI CIKICH ZE RODOWISKA biosorpcja: w tym procesie mona wykorzystywa: o mikroorganizmy stanowice produkt uboczny w przemyle farmaceutycznym czy fermentacyjnym lub procesach oczyszczania ciekw o mikroorganizmy hodowane i namnaane na specjalnych podoach i wykazujce zdolnoci do efektywnego wizania metali o biopreparaty: AMT BIOCLAM desorpcja i regeneracja biomasy Unieruchamianie biomasy: pasywne: o agregacja (biomasa mao odporna na uszkodzenia) o zasiedlenie nonikw o zastosowanie zwizkw chemicznych, np. aldehyd glukonowy aktywne: o specjalne noniki modyfikowane chemicznie (silnego zwizanie biomasy z nonikiem)
UO2
Uraninit Guninit Bekerelit Kofinit
238
U + 235U + 234U - naturalny uran
W13 AKUMULACJA METALI PRZEZ MIKROORGANIZMY 1. Usuwanie metali cikich ze rodowiska przez mikroorganizmy wynika z: powierzchni wizania metali przez reaktywne polimery i makroczsteczki oson komrkowych wewntrzkomrkowe wizanie metali Oporno mikroorganizmw na metale cikie wynika z obecnoci systemw komrkowych umoliwiajcych: wydalanie metali na zewntrz komrki akumulacj wewntrz komrki mechanizmy enzymatyczne prowadzce do powstawania form mniej toksycznych BIOSORPCJA - usuwanie metali ze rodowiska 2. Mechanizmy usuwania metali cikich: powierzchniowe wizanie metalu: o procesy wymiany jonowej = wana rola grupy COOH, fosforanowa (wystpuj jako skadniki bon komrkowych) o tworzenie trwaych kompleksw = grupy COOH, OH, NH3 (powinowactwo do elektrododatnich metali)
67
68
biomasa musi by zregenerowana, a metal odzyskany np. metod elektrolizy
MEOR = Microbiologically Ennanced Oil Recovery (wydobycie ropy naftowej przy uyciu mikroorganizmw) zoa odpowiednie dla MEOR: pH 4-8 temp. <75oC zasolenie < 10% obecno fazy wodnej (decydujca) w zoach panuj warunki beztlenowe, jest na duych gbokociach, panuje wysokie cinienie, pH wody jest ekstremalne, bardzo wysokie zasolenie(warunki ekstremalne nawet dla mikroorganizmw) istniej mikroorganizmy wykorzystujce wglowodory jako rdo wgla, ale tylko w warunkach tlenowych (w zou warunki beztlenowe), dlatego wraz z mikroorganizmami do zoa wprowadza si substancje odywcze W13 w metodzie tej nie uywa si bakterii wytwarzajcych polimery, bakterii fermentacyjnych, kaczkujcych w celu uniknicia zatkania por (miejsce iniekcji musi by czyste) problem dyspersji- mikroorganizmy wprowadzane jako zawiesina wodna, bakteria nie moe by wiksza ni por w skale (wany rodzaj skay) w zou znajduj si mikroorganizmy, wic moe doj do interakcji z bakteriami przez nas wprowadzonymi charakter ropy zmienia si pod wpywem obecnoci mikroorganizmw (rozwj, wzrost), np. utlenianie olejw do kwasw tuszczowych tworz si detergenty wzrost biomasy wypycha rop na zewntrz
69

Botechnologia Wyklad

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Botechnologia Wyklad

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

W1 Biotechnologia- jedna z kluczowych nauk XIX wieku.

przeniesienie grupy aminowej z donora na akceptor

CH3 CHCl COOH

kwas R,S- 2-chloropropionowy

Aspergillus niger O progestreon O 1,1-alfa-hydroksyprogesteron

CN nitrylaza H3COOC H3COOC

fenylopirogronian NADH 2000 cykli NAD+

dehydrogenaza HOCCH3 alkoholowa

W2 o reaktor membranowy (zwikszenie masy kofaktora), np. otrzymywanie L-tert-Leu:

reakcja w roztworach wodnych

reakcja w rozpuszczalnikach organicznych

produkty uboczne, substraty nierozpuszczalne w wodzie, ekstarkcja niska aktywno

kultury rosnce o stereoselektywna redukcja 2-podstawionych--ketoestrw kultury spoczynkowe

aktywno atwa obrbka, mniej produktw ubocznych wielokrotno uycia

CO HO N H CHO racemizacja spontaniczna COOH + NH2 amidoalkilacja CO NH2 + D-hydantoinaza HO N H H CO NH CO NH CO

akrylonitryl woda hydratacja

hodowla i immobilizacja mikroorganizmow

hydrataza nitrylu woda

D-P L L-specyficzna hydroliza

L-PL D-specyficzna hydroliza

odzyskanie katalizatora akrylonitryl woda usuniecie CO2 hydratacja oddzielenie katalizatora

nierozpuszczalny akrylonitryl zageszczenie usuniecie Cu (dekoloryzacja)

lipaza C. cylindracea OH OCO(CH2)10CH

a. Tworzenie biblioteki genw: - metody nierekombinacyjne

nowe makrolidy- manipulacje na poziomie syntezy poliketydylowej karotenoidy

suszenie 275 kg siarczanu streptomycyny 98% czystoci

OMe H2NCHCOOH(CH2)3COHN N O S CH2OCOCH3 COOH

Bleomycyna- hamowanie syntezy biaek kwasw nukleinowych Bestatyna- hamuje aminopeptydazy

Produkty metabolizmu Biaka i enzymy wymagajce elaza

W4 CO JESZCZE BIOTECHNOLOGIA DAJE MEDYCYNIE?

redukcja ketonw i podwjnych wiza

steroid OH enzym - Fe2+ NADPH + H+

DODATKI DO MLEKA: CaCl2 azotany barwniki H2O2 lipazy

Amylopektyna- rozgazienia, na jedno wizanie -1,6-glikozydowe przypada 30 wiza -1,4glikozydowych.

CH2OH O OH HO CH2OH O OH OH O OH OH O OH O CHOH O OH CH2OH O

RODZAJE SZCZEPIONEK STOSOWANYCH W PRZEMYLE SPOYWCZYM cieke suszone zamroone

OCENA SANITARNA WARUNKW PRODUKCJI

roztwr enzymu zagszczanie

dodatek stabilizatora lub konserwantw roztwr enzymu

precypitacja filtracja suszenie rozdrabnianie

surowy preparat enzymatyczny

UHT MLEKO MLEKO UHT

pasteryzacja laktoza drozdzowa

mleczny koncentrat bezlaktozowy

bezlaktozowy syrop serwatkowy mleko bezlaktozowe

ENZYMY PRZEMYSOWE PODSUMOWANIE

ENZYMY GLIKOLITYCZNE - amylazy

Bacillus subtilis Aspergillus niger

Aspergillus niger Rhizopus

bezlaktozowy syrop serwatkowy

Klebsiella lactis Aspergillusoryzae Bacillus subtilis

naringinaza pektynaza pullulanaza

Klebsiella aerogenes Bacillus subtilis

usuwanie goryczy ze skrek cytrusowych produkcja sokw drode piekarskie, p/podziaowy W7

OKSYDOREDUKTAZY dehydrogenaza alkoholowa katalaza LIAZY histydaza

TRANSFERAZA glikozylotransferaza cyklodekstrynaza

W8 AROMATY IDENTYCZNE Z NATURALNYMI

zwiksza ilo biaka w mleku o 10%, ekonomicznie opacalne)

Corynebacterium glutamicum szczawiooctan pirogronian

synteza enzymatyczna, biosynteza biosynteza synteza chemiczna

ketoglutaran dehydrogenaza glutaminianowa dehydrogenaza 2-oksoglutaranu glutaminian

metody mao wydajne; trudne do kontroli

kwas fumarowy amoniak