You are on page 1of 332

Genetyka zwierzt

Wydanie II unowoczenione

Krystyna M. Charon Marek Switoski

WYDAWNICTWO NAUKOWE PWN WARSZAWA 2004

Autorzy
Prof. dr hab. Krystyna Magorzata Charon
Katedra Genetyki i Oglnej Hodowli Zwierzt, Wydzia Nauk o Zwierztach, SGGW, Warszawa

Prof. dr hab. Marek witoski


Katedra Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierzt, Wydzia Hodowli i Biologii Zwierzt, Akademia Rolnicza, Pozna

Okadk i strony tytuowe projektowa Edwin Radzikowski


Redaktor Krystyna Kruczyska

Redaktor techniczny Jolanta Cbor Podrcznik akademicki dotowany przez Ministerstwo Edukacji Narodowej i Sportu

Copyright by Wydawnictwo Naukowe PWN SA Warszawa 2000, 2004

ISBN 83-01-14022-4

Wydawnictwo Naukowe PWN SA 00-251 Warszawa, ul. Miodowa 10 tel. (O-prefiks-22) 69-54-321 faks (O-prefiks-22) 69-54-031 e-mail: pwn @pwn.com.pl http://www.pwn.pl

Wydawnictwo Naukowe PWN SA Wydanie drugie unowoczenione Arkuszy drukarskich 20 + 12 stron ilustracji Druk ukoczono w marcu 2004 r. Skad i amanie: Fototype, Warszawa Druk i oprawa: WDG Drukarnia w Gdyni Sp. z o.o. ul. Sw. Piotra 12, Gdynia

Przedmowa

Coraz wiksze wykorzystywanie w hodowli zwierzt najnowszych osigni genetyki sprawia, e uaktualnianie programw nauczania tego przedmiotu na kierunkach studiw zwizanych z nauk o zwierztach staje si koniecznoci. Cytogenetyczna i molekularna identyfikacja mutacji, kontrola pochodzenia za pomoc markerw zwizanych z polimorfizmem DNA czy budowanie map genomw, to tylko niektre przykady obrazujce obszary genetyki istotnie rozbudowane w ostatnich latach. W niniejszym podrczniku podjto prb zaprezentowania, obok podstawowych wiadomoci z zakresu genetyki klasycznej, najnowszych osigni, ktre znajduj zastosowanie w hodowli zwierzt. Podrcznik jest adresowany przede wszystkim do studentw ksztaccych si na kierunkach: zootechnika, weterynaria, biotechnologia i biologia. Mamy take nadziej, e podrcznik bdzie przydatny specjalistom, ktrzy profesjonalnie zajmuj si hodowl zwierzt lub prowadzeniem bada z tego zakresu. Wan czci niniejszego opracowania s oryginalne ilustracje, ktre cile nawizuj do wybranych zagadnie z cytogenetyki, genetyki molekularnej czy zmiennoci klasycznych cech jakociowych (np. umaszczenie). W przygotowaniu tej dokumentacji pomogli nam PT Wsppracownicy z Katedry Genetyki i Podstaw Hodowli Zwierzt AR w Poznaniu: A. Pietrzak, J. Klukowska, A. Piekowska, M. Zajc, D. Lechniak, D. ado i J. Sosnowski oraz J. Gruszczyska, Z. Nowak i M. Gajewska z Katedry Genetyki i Oglnej Hodowli Zwierzt SGGW w Warszawie. Ponadto, kilka zdj zostao nam udostpnionych przez E. Sot i B. Danielak-Czech z Instytutu Zootechniki w Balicach, H. Geringera z AR we Wrocawiu, K. Jaszczaka i R. Parad z Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierzt PAN w Jastrzbcu. Niektre zdjcia pochodz z archiwum Redakcji Przegldu Hodowlanego. Za okazan pomoc serdecznie dzikujemy.

Spis treci

1 2

Wstp zarys historii genetyki .......................... Chromosomy i podziay jdra komrkowego ..


2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. Budowa chromosomu ......................................................................... Barwienie prkowe chromosomw .................................................... Mitoza..............................................................................., ...................... Kariotyp .............................................................................................. Mejoza ................................................................................................. Gametogeneza ......................................................................................

n 1 5
16 23 31 33 37 43

Gen i jego ekspresja ..........................................


3.1. Budowa kwasw nukleinowych .............................................................. 3.1.1. DNA ................................................................................................. 3.1.2. RNA ................................................................................................. 3.2. Replikacja DNA .................................................................................... 3.3. Kod genetyczny .................................................................................... 3.4. Transkrypcja .......................................................................................... 3.5. Translacja ................................................................................................. 3.6. Budowa genu ........................................................................................... 3.7. Regulacja ekspresji genu ....................................................................... . 3.7.1. Czynniki transkrypcyjne .................................................................. 3.7.2. Geny homeotyczne .......................................................................... 3.7.3. Metylacja DNA .................................................................................... 3.7.4. Pitno gametyczne ......................................................................... 3.7.5. Inaktywacja chromosomu X w zarodkach eskich ......................

48
48 49 50 52 53 54 56 57 60 61 62 63 64 66

Metody analizy i modyfikacji genomu .................


4.1. Endonukleazy restrykcyjne ................................................................. 4.2. Wektory....................................................................................................

69
69 72

4.3. Rekombinacja molekularna i klonowanie ............................................ 4.4. Amplifikacja DNA za pomoc acuchowej reakcji poimerazy (PCR) . . 4.5. Techniki hybrydyzacji i sondy molekularne ........................................... 4.6. Polimorfizm fragmentw restrykcyjnych DNA (RFLP) ......................... 4.7. Biblioteki genomowe i genowe ............................................................ 4.8. Sekwencjonowanie DNA ....................................................................... 4.9. Badanie ekspresji genw ...................................................................... 4.10. Transgeneza ......................................................................................

76 78 82 86 87 88 91 91

Mutacje .............................................................
5.1. Mutacje genomowe .............................................................................. 5.2. Mutacje chromosomowe ..................................................................... 5.3. Mutacje genomowe i chromosomowe zidentyfikowane u zwierzt hodowanych w Polsce .............................................................................. 5.4. Mutacje genowe ................................................................................... 5.4.1. Przyczyny i rodzaje mutacji genowych ............................................. 5.4.2. Skutki mutacji genowych ................................................................... 5.4.3. Mutacje genowe wpywajce na cechy produkcyjne zwierzt . . . 5.4.4. Mutacje genowe wywoujce choroby genetyczne ........................ 5.4.4.1. Geny letalne, semiletalne i subwitalne ..................................... 5.4.4.2. Choroby monogenowe wywoujce wrodzone wady rozwojowe 5.4.4.3. Choroby monogenowe wywoujce zaburzenia procesw bio chemicznych .......................................................................................... 5.4.4.4. Ograniczanie wystpowania chorb genetycznych....................... 5.4.5. Mutacje genowe odpowiedzialne za odporno/podatno zwierzt na patogeny ............................................................................................ 5.5. Mutacje w mitochondrialnym DNA ....................................................

95
96 100 111 112 112 118 123 124 124 127 132 135 143 144

Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech ..


6.1. Dziedziczenie cech warunkowanych jedn par alleli ........................... 6.1.1. Wspdziaanie alleli ...................................................................... 6.1.2. Niezalene dziedziczenie cech (II prawo Mendla) ......................... 6.1.3. Dziedziczenie cech sprzonych ................................................... 6.1.4. Cechy sprzone z pci ................................................................. 6.1.5. Plejotropia ....................................................................................... 6.2. Wspdziaanie genw z rnych ld w ksztatowaniu fenotypu . . . 6.2.1. Komplementarno ............................................................................. 6.2.2. Epistaza ........................................................................................... 6.2.3. Geny modyfikujce ............................................................................ 6.2.4. Sumujce dziaanie genw ................................................................. 6.3. Dziedziczenie umaszczenia..................................................................... 6.4. Penetracja i stopie ekspresji (ekspresywno) genw ........................... 6.5. Dziedziczenie pozajdrowe .................................................................

146
147 147 150 152 157 160 160 161 162 163 164 164 175 176

Zmienno cech.....................................
7.1. Rodzaje zmiennoci i czynniki j wywoujce ........................................ 7.2. Miary zmiennoci .................................................................................... 7.2.1. Miary skupienia .............................................................................

179
179 182 182

7.2.2. Miary rozproszenia ........................................................................ 7.3. Zmienno cech ilociowych .................................................................... 7.3.1. Dziedziczenie cech ilociowych ....................................................... 7.3.2. Zmienno transgresywna .............................................................. 7.3.3. Geny o duym efekcie ....................................................................

185 187 187 189 190

8 Podstawy genetyki populacji ...............................


8.1. Prawo rwnowagi genetycznej ............................................................ 8.2. Frekwencja genw i genotypw w przypadku dominowania ........... 8.3. Frekwencja genw i genotypw w przypadku cech uwarunkowanych szeregiem (seri) alleli wielokrotnych ....................................................... 8.4. Frekwencja genw genotypw w przypadku cech sprzonych z pci 8.5. Czynniki naruszajce rwnowag genetyczn .................................... 8.6. Wykorzystanie frekwencji alleli do szacowania zmiennoci genetycznej wewntrz i midzy populacjami .............................................................. .

198
198 201 201 204 205 210

9 Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm ..................................................


9.1. Determinacja pci ssakw .................................................................... 9.2. Interseksualizm ....................................................................................

210
216 221

10

Genetyczne podstawy odpornoci i opornoci ..


10.1. Genetyczne podoe rnorodnoci przeciwcia ................................... 10.2. Genetyczne podoe rnorodnoci receptorw limfocytw T . . . . 10.3. Gwny ukad zgodnoci tkankowej MHC ................................... 10.3.1. Struktura i funkcje gwnego ukadu zgodnoci tkankowej . . . 10.3.1.1. Gwny ukad zgodnoci tkankowej myszy ........................... 10.3.1.2. Gwny ukad zgodnoci tkankowej czowieka ...................... 10.3.1.3. Gwny ukad zgodnoci tkankowej zwierzt gospodarskich 10.3.2. Identyfikacja czsteczek gwnego ukadu zgodnoci tkankowej 10.3.3. Znaczenie gwnego ukadu zgodnoci tkankowej ................... 10.3.3.1. Zwizek MHC z odpornoci na choroby .............................. 10.3.3.2. Zwizek MHC z cechami produkcyjnymi i reprodukcyjnymi 10.4. Zarys przebiegu reakcji odpornociowej ........................................... 10.5. Genetyczna oporno na choroby ......................................................

227
227 230 231 233 236 237 239 243 243 243 244 245 247

11

Markery genetyczne .............................................


11.1. 11.2. 11.3. 11.4. 11.5. 11.6. Antygeny erytrocytarne (grupy krwi) ................................................. Biaka surowicy krwi, erytrocytw i leukocytw ............................... Allotypy immunoglobulin i lipoprotein ............................................... Biaka mleka ....................................................................................... Polimorfizm DNA .............................................................................. Wykorzystanie markerw genetycznych w hodowli zwierzt...............

253
254 259 263 263 265 268

1 2 Mapy genomowe ...............................................


12.1. Organizacja DNA jdrowego ................................................................. 12.2. Organizacja DNA mitochondrialnego ................................................. 12.3. Markerowa mapa genomu ................................................................. 12.3.1. Fizyczna mapa genomu ............................................................... 12.3.2. Genetyczna mapa genomu ........................................................ 12.3.3. Strategia mapowania genomu......................................................... 12.3.4. Aktualny stan map genomowych zwierzt gospodarskich . . . . 12.3.5. Wykorzystanie markerowych map genomowych w hodowli . . .

275
275 277 279 280 284 287 289 292

Literatura uzupeniajca ............................................


Podrczniki ................................................................................................ Artykuy przegldowe ....................................................................................

293
298 298

Skorowidz ...................................................................

301

Rozdzia

Wstp - zarys historii genetyki

Genetyka stanowi wyodrbnion dyscyplin nauk biologicznych, ktrej przedmiotem bada jest zmienno i dziedziczenie cech organizmw ywych. Powstanie tej dyscypliny stao si moliwe dziki intensywnemu rozwojowi biologii w wieku XIX. Postp ten znaczony by z jednej strony poznawaniem struktury i funkcji organizmw, tkanek, komrek i ich organelli, a z drugiej formuowaniem przeomowych hipotez i teorii, wrd ktrych cz miaa epokowe znaczenie dla rozwoju wiedzy o wiecie oywionym. Opis struktury i funkcji organizmw na poziomie komrkowym lub wewntrzkomrkowym jest zaleny od dostpnych urzdze i metod badawczych. Tym samym rozwj nauk biologicznych opiera si na osigniciach fizykw, chemikw, konstruktorw, a ostatnio rwnie informatykw. W wieku XIX sformuowano trzy teorie o ogromnym znaczeniu dla dalszego rozwoju biologii. Autorami pierwszej z nich teorii komrkowej budowy organizmw, ogoszonej w 1838 roku, byli Schwann i Schleiden. Gwn tez tej teorii byo twierdzenie, e wszystkie roliny i zwierzta s zbudowane z komrek, kor mog powstawa jedynie przez podzia innych komrek. Okazao si to niezwykle stymulujce dla rozwoju cytologii, czyli nauki o budowie i funkcji komrek. Dwadziecia lat pniej w 1859 roku Darwin opublikowa dzieo pt. O powstawaniu gatunkw drog doboru naturalnego, ktre stao si pocztkiem nauki o ewolucji. Zgodnie z teori Darwina, podstaw ewolucji organizmw ywych jest dobr naturalny, ktry faworyzuje osobniki najlepiej przystosowane do rodowiska bytowania, umoliwiajc im nie tylko przeycie, ale take przekazanie tych korzystnych waciwoci potomstwu. W ten sposb powstaj organizmy coraz lepiej przystosowane do danego rodowiska. Kilka lat pniej w 1866 roku Mendel opublikowa skromn prac pt. Badania nad mieszacami rolin, stanowic zacztek genetyki. Bya ona syntez kilkuletnich obserwacji dziedziczenia siedmiu cech u grochu (Pisum sativum), roliny samopylnej. Kada z analizowanych cech miaa dwie atwo odrnialne formy: kwiaty
11

czerwone lub biae, nasiona gadkie lub pomarszczone, nasiona te lub zielone itd. Dokonujc krzyowania midzy ustalonymi formami przeciwstawnymi, Mendel uzyska pierwsze pokolenie mieszacw (F1), ktre rozmnaajc si w sposb naturalny (samopylnie) dawao drugie pokolenie mieszacw (F2). Bardzo skrupulatna analiza cech w obu pokoleniach daa podstawy do sformuowania wnioskw, e dziedziczenie cech przebiega na drodze przekazywania zawizkw dziedzicznych (genw) od rodzicw do potomstwa za porednictwem gamet, przy czym jedna gameta zawiera tylko jeden taki element. Spostrzeenia te ostatecznie pozwoliy na sformuowanie praw dziedziczenia. Niestety donioso tego odkrycia nie zostaa doceniona przez wczenie yjcych biologw. Wiek XIX przynis take wane odkrycia dotyczce budowy komrki, w tym struktur zwizanych z dziedziczeniem. Jdro komrkowe zastao po raz pierwszy opisane przez Browna ju w 1831 roku. Pierwsze doniesienia o paeczkowatych" strukturach, nazwanych w 1888 roku przez Waldeyera chromosomami, zostay podane przez polskiego botanika Strasburgera w 1880 roku. Podziay jdra komrkowego zostay opisane pod koniec XIX wieku. Opis mitozy przedstawi w 1882 roku Flemming, a opis mejozy powsta w 1883 roku i zawdziczamy go van Bendenowi i Boveriemu. Na pocztku XX wieku podjto wiele bada, ktrych celem byo poznanie praw rzdzcych dziedziczeniem cech. Dopiero wwczas zrozumiano genialno odkry Mendla. Stao si to za spraw trzech badaczy: Corrensa, de Yriesa i Tschermacka, ktrzy niezalenie od siebie doszli do wnioskw, ktre kilkadziesit lat wczeniej poda Mendel. Nastpne lata to lawinowy rozwj nauki nazwanej przez Batesona w 1906 roku genetyk. W lad za tym terminem w 1909 roku Johannsen zaproponowa okrelenie gen" dla czynnika dziedzicznego warunkujcego pojawienie si cechy. W 1909 roku Hardy i Weinberg stworzyli podstawy genetyki populacji. Badacze ci niezalenie od siebie sformuowali prawo rwnowagi genetycznej. Rok pniej Morgan ogosi chromosomow teori dziedziczenia, ktr mona uwaa za pocztek cytogenetyki. W latach 20. Fischer, Wright i Haldane wprowadzili do genetyki metody statystyczne, ktre okazay si bardzo istotnymi narzdziami badawczymi, za pomoc ktrych moliwe stao si poznawanie mechanizmw odpowiedzialnych za zmienno i dziedziczenie tzw. cech ilociowych. Ten dzia genetyki okrela si czsto jako genetyk cech ilociowych. Niektrzy autorzy uwaaj, e zagadnienia genetyki populacji i genetyki cech ilociowych s na tyle sobie bliskie, e mona je okrela tylko jednym terminem genetyka populacji. Pomimo ogromnego zaangaowania si wielu naukowcw w badania genetyczne, do koca pierwszej poowy XX wieku niewiele mona byo powiedzie o chemicznej naturze informacji genetycznej. Przez wiele lat przypuszczano, e nonikiem informacji genetycznej s biaka, o ktrych rnorodnoci wiedziano ju wwczas do duo. Przeom nastpi w 1944 roku, kiedy to trzej badacze: Avery, MacLeod i McCarty wykazali, e
12

nonikiem informacji genetycznej jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA). Do wniosku tego doszli na podstawie wynikw eksperymentu, w ktrym do niechorobotwrczych szczepw bakterii na drodze transformacji wprowadzili DNA pochodzcy z zabitych bakterii wywoujcych zapalenie puc u myszy. W wyniku tego bakterie niechorobotwrcze nabyy cech zjadliwoci. W dowiadczeniu tym mona upatrywa pocztku genetyki molekularnej. Odkrycie to nie zostao od razu zaakceptowane przez rodowisko biologw. Pocztek lat 50. to czas usilnych bada, ktrych celem byo poznanie struktury chemicznej DNA. Model czsteczki DNA przedstawili w 1953 roku Watson i Crick. Po tym odkryciu przyszed czas mudnych prac zmierzajcych do rozszyfrowania kodu genetycznego. Zostay one zakoczone w pierwszej poowie lat 60., a wiodc rol w tych badaniach odegrali midzy innymi Khorana, Nirenberg i Ochoa. W tym czasie podjto rwnie molekularne badania nad regulacj ekspresji genw. Doniosym osigniciem stao si ogoszenie w 1960 roku przez Jacoba i Monoda tzw. teorii operonu, ktra wyjaniaa mechanizm ekspresji genw u bakterii. Rozwj genetyki molekularnej i zwizanych z ni wyrafinowanych metod badawczych umoliwi przejcie od opisu materiau dziedzicznego do prowadzenia na nim manipulacji i w ten sposb wyodrbnia si nowa dyscyplina inynieria genetyczna. Odkrycie enzymw restrykcyjnych (1962 r.) oraz enzymu odwrotnej transkryptazy (1970 r.), opracowanie techniki rekombinacji i klonowania DNA (1972 r.), sekwencjonowania DNA (1975 r.) czy amplifikacji fragmentw DNA za pomoc acuchowej reakcji polimerazy PCR (1983 r.) to tylko najwaniejsze przykady wspczesnych narzdzi i metod badawczych wykorzystywanych obecnie powszechnie w genetyce molekularnej i inynierii genetycznej. Warto podkreli, e molekularne poznanie genomw czowieka, zwierzt, rolin czy mikroorganizmw ma ogromne znaczenie aplikacyjne zwizane z diagnostyk i terapi chorb genetycznych, hodowl zwierzt i rolin, wykrywaniem 1 zwalczaniem patogenw, przetwrstwem ywnoci, ochron rodowiska itp. Denie do jak najgbszego poznania informacji genetycznej zwierzt gospodarskich doprowadzio w ostatnich atach do uruchomienia interdys cyplinarnych prpgramw mapowania genomw takich gatunkw, jak winia, bydo, ko, owca, kura czy pies. Celem tych programw jest wskazanie pooenia genw w chromosomach oraz ustalenie odlegoci midzy genami umiejscowionymi w tym samym chromosomie. W przypadku czowieka celem jest nie tylko mapowanie genomu, ale rwnie jego sekwencjonowanie, tzn. ustalenie kolejnoci par nukleotydw w caym DNA ludzkim, liczcym ponad trzy miliardy par nukleotydw. Program ten zosta urucho miony w 1987 roku, a w lutym 2001 roku ogoszono na amach dwch renomowanych czasopism: Natur oraz Science zakoczenie podstawowego etapu tych bada. Warto zaznaczy, e przedsiwzicie to przez kilka ostatnich lat byo prowadzone przez dwa niezalene zespoy: 1) midzy narodowe konsorcjum HUGO (ang. Human Genome Organisation Project)
13

oraz 2) prywatn firm CELERA. W grudniu 2002 roku ustalono sekwencj genomu myszy, a we wrzeniu 2003 roku ogoszono wstpn sekwencj genomu psa. Przewiduje si, e do 2005 roku zostan zsekwencjonowane genomy byda, wini i kury. Osignicia z zakresu genetyki stay si motorem postpu nauk biologicznych i ich aplikacji, czego jednym z licznych przykadw jest hodowla zwierzt. Gwnymi metodami hodowlanymi s selekcja i krzyowanie, dla ktrych podstaw teoretyczn jest wiedza z zakresu genetyki cech ilociowych oraz genetyki populacji. Istotnym elementem pracy hodowlanej jest kontrola pochodzenia, ktr prowadzi si z wykorzystaniem wiedzy dotyczcej grup krwi i polimorfizmu biaek, a ostatnio take polimorfizmu DNA. Identyfikacja i eliminacja z populacji hodowlanych nosicieli niepodanych mutacji chromosomowych lub genomowych wymaga zastosowania metod cytogenetycznych, a w przypadku mutacji genowych metod genetyki molekularnej. Wytwarzanie zwierzt majcych wprowadzony sztucznie obcy gen (zwierzta transgeniczne) zwizane jest z zastosowaniem technik inynierii genetycznej. Ostatnio due nadzieje s pokadane w wykorzystaniu map genomowych do molekularnej identyfikacji genw majcych znaczcy wpyw na ksztatowanie si cech uytkowych zwierzt. Wykrycie takich genw stworzy nowe warunki do prowadzenia selekcji, bowiem zamiast oceny genotypu za pomoc metod statystycznych mona bdzie ustala genotyp osobnika na podstawie bada molekularnych. Pierwsze osignicia zostay ju opublikowane. Ustalono, jakie mutacje s odpowiedzialne za hipertrofi miniow byda, wysok plenno owiec rasy boorola i inverdale, wysok misno wi czy wydajno tuszczu w mleku krw. Obecny poziom wiedzy genetycznej i moliwoci jej wykorzystania wywouj czasami rwnie niepokj. Wydaje si, e za postpujcym w oszaamiajcym tempie rozwojem genetyki nie nada niestety wiadomo niektrych twrcw i wielu odbiorcw tych osigni. Moliwo ingerowania metodami inynierii genetycznej i komrkowej w informacj genetyczn drobnoustrojw, rolin, zwierzt, a take czowieka powinna wywoa gbokie zastanowienie si nad tym, gdzie jest granica, ktrej dla wsplnego dobra wszystkich organizmw zamieszkujcych Ziemi nie mona przekroczy.

Rozdzia

Chromosomy i podziay jdra komrkowego

W podziale systematycznym organizmw ywych wyrnia si, biorc pod uwag organizacj informacji genetycznej i budow komrki, dwie podstawowe grupy organizmw: prokarionty (Procaryota) i eukarionty (Eucaryota). Prokarionty nie maj wyodrbnionego jdra komrkowego, zdolnego do podziaw (kariokinezy). Odpowiednikiem jdra komrkowego jest nukleoid, zbudowany z nagiej" kolistej czsteczki DNA. Tym samym organizmy te zawieraj pojedynczy zestaw genw, czyli s haploidalne. Do prokariontw zalicza si bakterie i sinice. Niektrzy systematycy zaliczaj do tej grupy take wirusy i riketsje. Eukarionty zbudowane s z komrek majcych jdra komrkowe, ktre podlegaj podziaom (mitoza, mejoza). W jdrze komrkowym wystpuj chromosomy, ktre s zbudowane z kwasw nukleinowych i biaek. Podczas podziau jdra komrkowego chromosomy podlegaj procesowi kondensacji i dziki temu moliwe jest prowadzenie ich obserwacji za pomoc mikroskopu. Chromosomy w stadium metafazy podziau mitotycznego maj charakterystyczn dla siebie wielko i morfologi, a za pomoc barwienia rnicujcego moliwe jest ujawnienie wzoru prkw poprzecznych pojawiajcych si wzdu chromosomu. Do eukariontw zalicza si wszystkie organizmy komrkowe, oprcz bakterii i sinic. Odkrycie chromosomw i opis ich zachowania si podczas podziaw jdra komrkowego oraz wiedza o mechanizmach dziedziczenia cech u rolin i zwierzt wskazyway ju na pocztku XX wieku na istotne znaczenie chromosomw w procesie dziedziczenia informacji genetycznej. Kompleksowe ujcie tego problemu zostao dokonane przez Morgana, ktry w 1910 roku ogosi chromosomow teori dziedziczenia. Gwnymi tezami tej teorii byo twierdzenie, e: 1) geny zlokalizowane s w chromosomach, 2) kady gen ma stae pooenie (locus) w chromosomie i 3) loci genw uszeregowane s liniowo w chromosomie. Naley jednak podkreli, e nie
15

wiedziano wwczas, z jakich zwizkw chemicznych zbudowany jest chromosom i co jest rzeczywistym nonikiem informacji genetycznej oraz jak przedstawia si struktura wewntrzna chromosomu.

2.1. Budowa chromosomu


Chromosom jest struktur jdra komrkowego zbudowan z kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA), kwasw rybonukleinowych (RNA), biaek histonowych i niehistonowych. Chromosomy s atwym obiektem do obserwacji mikroskopowej podczas podziaw jdra komrkowego. Dziki kondensacji czsteczki DNA, ktra nastpuje za pomoc biaek histonowych i niehistonowych, chromosom

Ry. 2-1. Fazy (GO, Gl, S, G2 i podzia jdra :komrkowego) cyklu yciowego komrki w powizaniu ze zmianami struktury chromosomu. Oznaczenia: P profaza, M metafaza, A anafaza i T telofaza

16

osiga najmniejsze rozmiary podczas metafazy mitotycznej bd mejotycznej. Wwczas to chromosom ma dugo rzdu kilku mikrometrw, a jego morfologia jest bardzo wyrazista i dziki temu mikroskop wietlny jest wystarczajco czuym instrumentem pozwalajcym prowadzi szczegow analiz cytogenetyczn, ktra obejmuje nie tylko ustalenie liczby chromosomw, ale take opis ich morfologii i charakterystycznego ukadu prkw poprzecznych. Chromosom w stadium metafazy mitotycznej jest zbudowany z dwch chromatyd poczonych w przeweniu pierwotnym, okrelanym jako centromer. O chromatydach mwi si, e s siostrzane, poniewa powstay w wyniku replikacji DNA w fazie S cyklu komrkowego (ry. 2-1). Chromatydy siostrzane zawieraj po jednej czsteczce DNA o identycznej sekwencji nukleotydw i tym samym nios dokadnie tak sam informacj genetyczn. Centromer dzieli chromosom na rami krtkie (p) oraz rami dugie (q). Cz kocowa ramienia chromosomowego nazywana jest telomerem. Telomery s zbudowane z powtarzajcej si 6-nukleotydowej sekwencji TTAGGG/AATCCC. Zalenie od pooenia centromeru wyrnia si cztery typy morfologiczne chromosomw: meta-, submeta-, subtelo-i akro-(telocentryczny) (ry. 2-2). Stosunek dugoci ramienia dugiego do dugoci ramienia krtkiego jest parametrem okrelajcym morfologi chromosomu. Warto tego parametru dla wymienionych wyej typw morfologicznych chromosomu mieci si odpowiednio w przedziaach: (1,00-1,70), (1,71-3,00), (3,01-7,00) i (7,01-oo). Niektre chromosomy maj, oprcz przewenia pierwotnego, take przewenie wtrne, okrelane inaczej jako obszar jderkotwrczy NOR (ang. nucleolar organizer region), ktry jest odpowiedzialny za uformowanie jderek podczas interfazy. W jderkach budowane s podjednostki rybosomw. W obszarze jderkotwrczym umiejscowione s geny kodujce rybosomowe kwasy rybonukleinowe (rRNA) o staej sedymentacji 5.8S, 18S i 28S. Czwarta

chromarydy siostrzane

Ry. 2-2. Morfologia chromosomw obserwowanych podczas metafazy mitotycznej. Typy morfologiczne s wyodrbniane na podstawie wielkoci stosunku dugoci ramion q: p 17

frakcja rRNA 5S rRNA jest kodowana przez geny wystpujce w innych miejscach genomu. Fragment ramienia chromosomu, ktry wystpuje za przeweniem wtrnym, nazywa si satelit. Chromosomy dzielone s na dwie podstawowe grupy: autosomy i heterosomy (chromosomy pci). W grupie autosomw wystpuj identyczne pary homologiczne zarwno u pci mskiej, jak i eskiej. Chromosomy homologiczne maj identyczne uszeregowanie loci tych samych genw. W kadej parze jeden chromosom pochodzi od matki, a drugi od ojca danego osobnika. Podobiestwo molekularne wystpujce w obrbie pary chromosomw homologicznych umoliwia ich koniugacj podczas profazy I podziau mejotycznego. Heterochromosomy, oznaczane u ssakw symbolami X oraz Y, wystpuj w ukadzie XX u samic oraz XY u samcw. Chromosomy X i Y rni si midzy sob pod wzgldem dugoci (chromosom X jest przecitnie dwa razy duszy ni chromosom Y), morfologii, ukadu prkw poprzecznych oraz, co najwaniejsze zestawu loci genw, ktre s w nich pooone. Chromosom Y jest znacznie mniejszy ni chromosom X i przez to rwnie uboszy w informacj genetyczn (ry. 2-3). Konsekwencj tych rnic jest szcztkowa homologia chromosomw X i Y, ktra ogranicza si do niewielkiego fragmentu okrelanego jako obszar pseudoautosomalny. Oznacza to, e w tym obszarze wystpuje homologia pozwalajca na mejotyczn koniugacj, podobnie jak wystpuje to w obrbie par homologicznych autosomw lub pary X-X. Kwestia funkcji heterochromosomw bdzie poruszona w rozdziale: Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm. Chromosomy podlegaj w kadym cyklu komrkowym procesowi kondensacji na pocztku podziau jdra komrkowego oraz dekondensacji po zakoczeniu podziau. W teofazie i pierwszym okresie interfazy (faza Gl) chromosomy s zbudowane z jednej chromatydy, ktra z kolei zawiera jedn czsteczk DNA. Podczas fazy S nastpuje replikacja 18

Ry. 2-4. Struktura wewntrzna chromosomu metafazowego (wg Biotechnologia zwierzt, 1997, PWN)

samoodtworzenie DNA, ktra prowadzi do powstania w obrbie chromosomu dwch chromatyd siostrzanych. Wejcie komrki w stadium podziau wie si z uruchomieniem procesu kondensacji chromosomu, w wyniku czego podczas metafazy staje si on struktur maksymalnie skrcon. Przyjmuje si, e stosunek dugoci czsteczki DNA do dugoci chromosomu w stadium metafazy wynosi okoo 8000:1. Kondensacja i dekondensacja czsteczki DNA zachodzi wielostopniowo, a procesy te, ze wzgldu na ich powtarzalno w kolejnych cyklach yciowych komrki, charakteryzuj si niezwyk precyzj (ry. 2-4). Podstawow jednostk organizacji wewntrznej chromosomu jest nukleosom. Jest on zbudowany z rdzenia biakowego (oktamer histonowy, zawierajcy po dwie czsteczki histonw: H2A, H2B, H3 i H4), na ktry jest nawinity fragment DNA dugoci od 165 do 245 par nukleotydw, inaczej par zasad (pz). Fragment DNA owinity na oktamerze histonowym (1,8 obrotu DNA na oktamerze) jest nazywany rdzeniem nukleosomu i skada si ze 146 pz. Fragment czsteczki DNA pomidzy nukleosomami ma dugo okoo 60 pz, w zakresie od 0 do 80 pz.

19

Ni nukleosomowa jest z kolei zwinita spiralnie tworzc solenoid. W jego powstaniu istotn rol odgrywaj czsteczki histonu Hl, ktre odpowiadaj za zblienie si ssiednich nukleosomw. Solenoid podlega dalszej spiralizacji, a jej ostatecznym etapem jest utworzenie domen ptlo wych, ktre s zakotwiczone w rdzeniu biakowym chromatydy, zbudowanym z biaek niehistonowych. Sekwencje DNA lece u podstaw ptli s bogate w pary nukleotydw A-T i wi si z biakami rdzenia chromosomu, nalecymi do rodziny biaek HMG (ang. high mobility group). Dlatego te sekwencje DNA okrelane s terminem S AR (ang. scaffold attachment region), czyli regionami wicymi si ze szkieletem chromosomu. Przedstawiony proces kondensacji chromosomu metafazowego prowadzi do skrcenia jego dugoci, z jednoczesnym bardzo wydatnym zwikszeniem rednicy z 2 nm w przypadku rednicy czsteczki DNA do 700 nm w przypadku rednicy chromatydy chromosomu metafazowego. Dziki tym zmianom chromosomy s dobrze widoczne w mikroskopie wietlnym. W obrbie chromosomu wyrnia si dwie frakcje chromatyny: euchromatyn i heterochromatyn. Euchromatyna podlega cyklicznym procesom kondensacji i dekondensacji. W niej zlokalizowane s kodujce sekwencje DNA, czyli geny. Podlega ona replikacji w pocztkowym okresie fazy S. Heterochromatyna jest frakcj skondensowan i dzieli si na dwa typy: heterochromatyn fakultatywn i heterochromatyn konstytutywn. Heterochromatyna fakultatywna jest czci chromatyny, ktra moe ulec trwaej kondensacji; przykadem jest jeden z chromosomw X u osobnikw eskich, ktry ulega kondensacji i wystpuje w jdrze interfazowym w postaci tzw. ciaka Barra. Heterochromatyna konstytutywna jest frakcj chromatyny, ktra zawsze wystpuje w stanie skondensowanym. Zbudowana jest z niekodujcycK. sekwencji nukleotydowych, gwnie powtarzalnych sekwencji DNA. Jej replikacja wystpuje w pnym okresie fazy S. Chromosomy wystpujce w jdrze interfazowym s zdespiralizowane i w obrazie mikroskopowym s widoczne w postaci mao zrnicowanej chromatyny, rozprzestrzenionej rwnomiernie na pbszarze caego jdra komrkowego. Wiadomo jednak, e chromatyna pojedynczych chromosomw zajmuje wyodrbnione-przestrzenie tzw. domeny, przy czym domeny chromosomw homologicznych nie maj tendencji do czenia si. Tendencje takie natomiast wykazuj regiony heterochromatyny konstytutywnej rnych chromosomw, ktre tworz wiksze chromocentra. Chromosomy interfazowe zachowuj struktur nukleosomowa. Liczba chromosomw wystpujca w jdrze prawidowej komrki somatycznej jest okrelana terminem diploidalnej (2n) liczby chromosomw. Pojawia si ona podczas zapodnienia, wtedy bowiem haploidalny (n) zestaw chromosomw pochodzenia ojcowskiego zawarty w plemniku czy si z haploidalnym zestawem pochodzenia matczynego obecnym 20

w oocycie drugiego rzdu (komrce jajowej). W wyniku tego w jdrze komrkowym zygoty oraz w potomnych komrkach somatycznych wystpuj pary chromosomw homologicznych, w ktrych jeden chromosom jest pochodzenia ojcowskiego, a drugi matczynego. Chromosomy homologiczne maj loci tych samych genw, ale mog zawiera w nich rne allele

21

Diploidana liczba chromosomw u zwierzt uytkowanych przez czowieka mieci si w szerokim przedziale, od 30 u norki do 78 u psa (tab. 2-1, ry. 2-5 i 2-6). Naley podkreli, e czasami liczba chromosomw obserwowana u danego gatunku nie jest staa. Przykadem takiej sytuacji jest wystpowanie zmiennej liczby chromosomw B u lisa pospolitego lub jenota. Chromosomy B, czyli nadliczbowe wzgldem podstawowego ze-

22

stawu A, charakteryzuj si niestabilnym zachowaniem w podziaach mitotycz-nych i mejotycznych. Efektem tego jest zmienno ich liczby zarwno midzy osobnikami, jak i pomidzy komrkami w obrbie jednego osobnika. Do tej pory nie poznano funkcji tych chromosomw, chocia wiadomo, e czsto s zbudowane z heterochromatyny konstytutywnej, czyli mona przypuszcza, i s nieaktywne genetycznie. Drugim przykadem braku staoci liczby chromosomw w obrbie gatunku jest szerokie rozprzestrzenienie mutacji chromosomowej, np. fuzji centrycznej u lisw polarnych. Konsekwencj tego jest wystpowanie u lisw osobnikw, ktre mog mie 50,49 lub 48 chromosomw.

2.2. Barwienie prkowe chromosomw


Zrnicowanie wewntrzne chromosomu, wynikajce ze stopnia spiralizacji nici chromatynowej oraz wzajemnego stosunku ilociowego par nukleo-tydw G-C oraz A-T, moe by uwidocznione za pomoc technik barwienia rnicujcego. Zastosowanie przez Casperssona w 1969 roku kwinakryny do barwienia chromosomw otworzyo nowy rozdzia w cytogenetyce. Okazao si, e rnorodne techniki barwienia chromosomw pozwalaj nie tylko na opis ich wielkoci i morfologii, ale take na ujawnianie na nich charakterystycznych wzorw prkw poprzecznych. Prki maj identycz23

ny ukad i wielko na chromosomach homologicznych i dla danej pary chromosomw s sta cech w obrbie gatunku. Wynika z tego, e gatunek moe by charakteryzowany nie tylko przez typow dla niego diploidaln liczb chromosomw, ale take ukad prkw na chromosomach. Zalenie od charakteru prkw przypisuje si im odpowiednie symbole. Prki Q (QFQ) uwidaczniane s w mikroskopie fluorescencyjnym, po wybarwieniu chromosomw roztworem fluorochromu kwinakryny. Na chromosomach pojawiaj si poprzeczne prki wiecce i nie wiecce
24

(ry. 2-7a). Silne wizanie barwnika kwinakryny nastpuje w miejscach, gdzie dominuj pary zasad A-T. Podobny efekt uzyskuje si po wybarwieniu chromosomw barwnikiem DAPI. Prki G (GTG) pojawiaj si na chromosomach po przeprowadzeniu wstpnego trawienia roztworem trypsyny (enzym proteolityczny), a nastpnie barwienia roztworem Giemsy. W efekcie na chromosomach

25

pojawiaj si prki ciemne i jasne (ry. 2-8). Prki ciemne wystpuj w tych samych miejscach, gdzie przy barwieniu QFQ obserwowane s prki wiecce, a prki jasne odpowiadaj nie wieccym prkom Q. Prki R, pojawiajce si w ukadzie prkw wieccych i nie wieccych (opisywane symbolem RBA) powstaj po wbudowaniu bromodeoksyurydyny do DNA chromosomw podczas ich replikacji i barwieniu oranem akrydyny (ry. 2-7b). Wzr ten mona rwnie uwidoczni w postaci prkw ciemnych i jasnych (opisywane symbolem RBG), po zastosowaniu barwnika Giemsy zamiast oranu akrydyny. Ukad prkw R na danym chromosomie jest odwrotny "do ukadu prkw GTG oraz QFQ. Oznacza to na przykad, e prek R wieccy (lub ciemny przy barwieniu RBG) pojawia si na chromosomie w miejscu, gdzie przy barwieniu QFQ wystpuje prek nie wieccy, a przy barwieniu GTG prek jasny. Pozytywne prki R (wiecce lub ciemne) s bogatsze w pary nukleotydw G-C. Zaleno ta jest szczeglnie interesujca, poniewa ponad 50% genw u ssakw poprzedzonych jest sekwencj powtarzajcych si niezmetylowanych dinukleotydw CpG (tzw. wysepki CpG). Zalenie od zawartoci par G-C wyrnia si pi klas regionw DNA (izochor) w chromosomach, s to izochory lekkie: LI i L2 oraz izochory cikie: Hl, H2 i H3. Najwiksze zagszczenie genw wystpuje w obrbie izochor H3, w ktrych jest te najwicej wysepek CpG. Izochory H3 s lokalizowane przede wszystkim w obrbie prkw T. Wskazuje to zatem, e prki R s gwnymi regionami, w ktrych zlokalizowane s geny, a miejscami szczeglnie bogatymi w loci genw s prki T. S one podklas prkw R i powstaj po dodatkowym ogrzaniu preparatw w 90C. Powysze trzy rodzaje wzorw prkowych wykorzystywane s do identyfikacji chromosomw homologicznych lub ich fragmentw w przypadku nieprawidowoci chromosomowych. Ponadto, s one niezbdne przy mapowaniu fizycznym genw, ktre polega na wskazaniu locus genu (lub anonimowej sekwencji DNA) w konkretnym chromosomie. Za pomoc barwie prkowych moliwe jest rwnie ledzenie zmian ewolucyjnych, ktre zaszy w kariotypach zwierzt. Oprcz opisanych wyej metod prkowych, wykorzystywanych do identyfikacji chromosomw homologicznych, znane s metody, ktre pozwalaj na uwidocznienie charakterystycznych regionw chromosomu, takich jak heterochromatyna konstytutywna i obszary jderkotwrcze. Prki C (CBG) wykorzystywane s do ujawnienia miejsc na chromosomach bogatych w heterochromatyn konstytutywn. Chromosomy poddawane s dziaaniu kwasu solnego oraz wodorotlenku baru. W takich warunkach znaczna cz euchromatyny zostaje usunita, a pozostaj trudne do usunicia, silnie skondensowane obszary heterochromatynowe, ktre si wybarwiaj roztworem Giemsy. Heterochromatyna konstytutywna
26

jest zlokalizowana przede wszystkim w pobliu centromerw (ry. 2-9a), a rzadziej na kocach, czy te w czciach rodkowych ramion. Znane s rwnie takie gatunki zwierzt, u ktrych niektre chromosomy maj cakowicie heterochromatynowe ramiona, np. ramiona krtkie dziesiciu par autosomw u lisa polarnego (ry. 2-9b). Prki Ag-I, inaczej Ag-NOR, to barwienie azotanem srebra, ktre pozwala na ujawnienie na chromosomach aktywnych obszarw jderkotwrczych (NOR). W miejscach tych nastpuje wytrcenie metalicznego srebra, ktre w obrazie mikroskopowym ma wygld ciemnych plam (ry. 2-10). 27

Diploidalna liczba chromosomw oraz ich morfologia i wzory prkowe s cechami charakteryzujcymi genomy poszczeglnych gatunkw. Poniej przedstawiono podstawowe cechy opisujce chromosomy najwaniejszych gatunkw zwierzt domowych.
28

Bydo, 2n - 60 (ry. 2-5b). Wszystkie autosomy s akrocentryczne. Chromosomy pci s atwe do identyfikacji, poniewa s to jedyne w kariotypie chromosomy dwuramienne: chromosom X jest duym submetacentrykiem, a chromosom Y jest maym metacentrykiem. Heterochromatyna konstytutywna (prki C) wystpuje w okolicach centromeru we wszystkich autosomach, natomiast w chromosomie X pojawia si jedynie jako blady prek interstycjalny w ramieniu dugim, a chromosom Y wykazuje ciemniejsze zabarwienie na caej dugoci (ry. 2-9a). Obszary jderkotwrcze (NOR) wystpuj w piciu parach autosomw na kocu ramion dugich. Koza, 2n = 60. Podobnie jak w przypadku byda, take koza ma wszystkie autosomy akrocentryczne. Rwnie akrocentryczny jest chromosom X, a chromosom Y jest maym metacentrykiem. Prki C pojawiaj si w okolicy centromerowej wszystkich autosomw. W chromosomie X brak jest centromerowego prka C. Obszary jderkotwrcze wystpuj, podobnie jak u byda, w czci telomerowej ramion dugich piciu par autosomw. Owca, 2n = 54 (ry. 2-6a). Wrd autosomw wystpuj trzy pary duych chromosomw metacentrycznych oraz 23 pary akrocentrykw. Chromosom X jest duym akrocentrykiem, a chromosom Y jest maym metacentrykiem. W stadium prometafazy, w ktrym nie jest jeszcze zakoczona kondensacja chromosomw, w chromosomie X widoczne s krtkie ramiona, co odrnia go od autosomw akrocentrycznych o podobnej wielkoci. Ukad prkw C, a take rozmieszczenie obszarw jderkotwrczych s podobne do obserwowanego w kariotypie byda i kozy. winia, 2n = 38 (ry. 2-5a). Grupa chromosomw autosomalnych skada si z 12 par chromosomw dwuramiennych (meta- i submetacentrycznych) oraz 6 par akrocentrycznych. Chromosom X jest redniej wielkoci metacentrykiem, trudnym do odrnienia na podstawie morfologii od autosomw. Chromosom Y jest najmniejszym chromosomem metacentrycznym. Prki C wystpuj w okolicy centromeru wszystkich autosomw i chromosomu X, natomiast chromosom Y ma cakowicie heterochromatynowe rami dugie. W grupie chromosomw akrocentrycznych czsto obserwowane jest zjawisko polimorfizmu wielkoci prkw C. Obszary jderkotwrcze wystpuj w dwch parach autosomw dwuramiennych, w ramionach krtkich, w pobliu centromeru (ry. 2-10a). Ko, 2n = 64 (ry. 2-6b). Wrd autosomw mona wyrni grup 13 par chromosomw dwuramiennych oraz grup 18 par akrocentrykw. Chromosom X jest duym chromosomem metacentrycznym, a chromosom Y jest akrocentrykiem. Chromosomy pci s trudne do odrnienia od autosomw o podobnej wielkoci i morfologii. Prki C wystpuj w okolicach centromeru wszystkich autosomw i chromosomu X, ktry ma dodatkowy prek 29

interstycjalny w ramieniu dugim. Chromosom Y jest w znacznej czci heterochromatynowy. Obszary jderkotwrcze wystpuj w trzech parach autosomw: w czci terminalnej ramienia krtkiego najwikszego chromosomu oraz w czci przycentromerowej dwch maych akrocentrykw (ry. 2-10b). Kura, 2n = 78. W kariotypie kury, podobnie jak u innych ptakw, wystpuje liczna grupa bardzo maych chromosomw, nazywanych mikrochromosomami, dla ktrych okrelenie morfologii oraz wzoru prkowego jest niemoliwe. Dlatego szczegow analiz cytogenetyczn prowadzi si jedynie w odniesieniu do duych chromosomw autosomalnych (makrochromosomw) i chromosomw pci Z oraz W. W grupie duych autosomw analizuje si najczciej 8 par, wrd ktrych jest 5 par chromosomw dwuramiennych i 3 pary akroentryczne. Chromosom Z jest duym metacentrykiem, a chromosom W jest maym metacentrykiem. Obszar jderkotwrczy wystpuje tylko w jednej parze autosomw, z grupy mikrochromosomw. Lis pospolity, 2n = 34 +B (ry. 2-7a). Wszystkie autosomy z grupy A s chromosomami dwuramiennymi, a chromosomy z grupy B s akroentryczne lub subtelocentryczne. Chromosom X jest duym metacentrykiem, a chromosom Y bardzo maym akrocentrykiem, ktrego na podstawie wielkoci bd morfologii nie mona odrni od chromosomw B. Liczba chromosomw B waha si od O do 7, przy czym najczciej obserwowano l, 2 lub 3 chromosomy B. Kariotyp lisa pospolitego jest wyjtkowo ubogi w heterochromatyn konstytutywn, ktr mona zidentyfikowa barwieniem CBG jedynie w trzech parach duych autosomw, w okolicach centromeru, oraz w chromosomie Y. W chromosomach B ciemny prek C nie pojawia si i dziki temu barwienie CBG pozwala na odrnienie chromosomu Y od chromosomw B. Obszary jderkotwrcze wystpuj w czci telomerowej ramion dugich trzech par autosomw z grupy A. Lis polarny, 2n = 50, 49 lub 48. W zwizku z szerokim rozprzestrzenieniem fuzji centrycznej (translokacji robertsonowskiej) obserwuje si trzy formy kariotypowe rnice si dipoidaln liczb chromosomw. U formy podstawowej (2n = 50) wystpuj 22 pary autosomw dwuramiennych i dwie pary akrocentrykw. Chromosom X jest duym metacentrykiem, a chromosom Y bardzo maym akrocentrykiem. Kariotyp tego gatunku jest bardzo bogaty w heterochromatyn konstytutywn. Wszystkie chromosomy, cznie z chromosomami pci, maj bloki heterochromatynowe w okolicy centromeru. Ponadto, 10 par dwuramiennych autosomw ma cakowicie heterochromatynowe ramiona krtkie (ry. 2-9b). Obszary jderkotwrcze wystpuj w szeciu parach autosomw w czci telomerowej krtkich ramion heterochromatynowych.
30

Pies, 2n = 78 (ry. 2-8b). Wszystkie autosomy s akrocentryczne. Chromosom X jest duym metacentrykiem, a chromosom Y jest maym metacentrykiem. Heterochromatyna konstytutywna jest umiejscowiona tylko w kilku parach autosomw. Wyrane prki C pojawiaj si w okolicach centromerowych w czterech parach autosomw, chromosomie X (prek centromerowy i interstycjalny w ramieniu q) i Y. Obszary jderkotwrcze s obecne w trzech parach autosomw i chromosomie Y, w czci terminalnej ramion dugich.

2.3. Mitoza
Mitoza to proces podziau jdra komrkowego, ktry prowadzi do powstania dwch komrek potomnych, majcych genotyp identyczny z tym, jaki miaa komrka rodzicielska. Komrki potomne maj nie tylko tak sam liczb chromosomw, ale take identyczn sekwencj nukleotydw w DNA. Podziay mitotyczne s nierozcznie zwizane z procesem wzrostu organizmu, odnawianiem niektrych komrek u dorosych organizmw (np. komrki krwi, nabonka), proliferacj limfocytw przy reakcji odpornociowej organizmu, a take z pierwszymi etapami gametogenezy. Podzia mitotyczny jest jedn z czterech faz wystpujcych w cyklu yciowym komrki. Fazy Gl, S i G2 tworz okres midzypodziaowy interfaz, a czwart faz jest podzia. W fazie Gl wystpuje ekspresja genw zwizanych z funkcj danej komrki, a faza S jest zwizana z procesem samoodtworzenia si DNA (replikacja). Rozpoczcie fazy S oznacza, e komrka zmierza do podziau i dlatego faza G2 jest traktowana jako okres przygotowywania si komrki do podziau. W cyklu yciowym komrki zmianie ulega zawarto DNA w jdrze. Jeeli ilo DNA wyrazimy za

31

pomoc umownych wartoci C, to w jdrze komrkowym po replikacji jest 4C, a poczwszy od telofazy do pocztku fazy S zawarto DNA wynosi 2C. W trakcie omawiania podziau mej etycznego pokazane zostanie, e najmniejsz zawarto DNA (1C) maj gamety (ry. 2-11). Mitoza skada si z czterech faz: profazy, metafazy, anafazy i telofazy (ry. 2-12). W profazie rozpoczyna si proces kondensacji chromosomw. Istotnym zmianom podlegaj rwnie inne organelle komrkowe. Centrioe, odpowiedzialne za powstanie wrzeciona podziaowego, rozchodz si do przeciwlegych biegunw komrki. W obrbie jdra komrkowego zanikaj jderka, organelle komrkowe odpowiedzialne za wytwarzanie rybosomw. W kocu, dezintegracji ulega bona jdrowa. Po zajciu powyszych procesw i osigniciu stanu maksymalnej kondensacji chromosomw nastpuje metafaza. W tej fazie chromosomy s rozprzestrzenione w caej komrce. Nastpuje formowanie si wrzeciona podziaowego, ktrego wkienka, wychodzce z centrosomu (obszar wok centrioli), cz si z centromerami chromosomw w taki sposb, e do kadego chromosomu dochodz wkienka z dwch przeciwlegych biegunw. Chromosomy w tej fazie s atwym obiektem do bada z uyciem mikroskopu wietlnego s krtkie (ich dugo jest rzdu kilku (im) oraz maj wyran morfologi. Chromatydy siostrzane s ze sob poczone tylko w centromerze. Po ustawieniu si chromosomw w paszczynie rwnikowej komrki rozpoczyna si proces podziau centromeru wzdu osi podunej chromosomu. Z chwil zakoczenia tego procesu rozpoczyna si anafaza. Po podzieleniu chromosomu chromatydy siostrzane staj si chromosomami siostrzanymi, ktre pod wpywem kurczcych si wkienek wrzeciona podziaowego przesuwaj si do przeciwlegych biegunw komrki. Po ich osigniciu rozpoczyna si ostatni etap kariokinezy telofaza. W telofazie zachodz procesy odwrotne do tych, jakie wystpuj w profazie. Chromosomy ulegaj dekondensacji, odbudowuje si bona jdrowa oraz jderka, a centriole dziel si na dwie parzyste struktury. W wyniku kariokinezy w komrce powstaj dwa jdra potomne, majce tak sam diploidaln liczb chromosomw jak komrka rodzicielska, w ktrych kady z chromosomw jest zbudowany z jednej chromatydy. Po zakoczeniu podziau jdra komrkowego nastpuje cytokineza, czyli podzia cytoplazmy i rozdzia organelli komrkowych. Komrka dzieli si ostatecznie na dwie komrki potomne przez przewenie w czci rodkowej. Po zakoczeniu podziau komrki potomne odbudowuj do niezbdnego poziomu liczb organelli komrkowych.

2.4. Kariotyp
Uszeregowanie chromosomw, wystpujcych w jdrze komrki somatycznej, w pary homologiczne okrelane jest terminem kariotyp. Ukadanie kariotypu dla danego osobnika polega na zestawieniu par homologicznych 32

spord chromosomw w stadium metafazy mitotycznej obecnych w pojedynczej komrce. Chromosomy wycinane s ze zdjcia mikroskopowego metafazy mitotycznej. Zabieg wycinania jest ostatnio coraz czciej zastpowany przez specjalistyczne programy komputerowe pozwalajce na analiz obrazw mikroskopowych przesanych za pomoc kamery do pamici komputera. Do badania kariotypu najczciej wykorzystuje si dzielce si w warunkach pozaustrojowych (in vitro) komrki limfocytw.

By. 2-12. Schemat przebiegu podziau mitotycznego. Oznaczenia: P profaza, PM prometafaza, M metafaza, A anafaza, T telofaza, C cytokineza, a centriole, b zanikajce jaderko, c dezintegrujca bona jdrowa, d mikrotubule wrzeciona podziaowego (wg: Genetyka zwierzt, Wydawnictwo AR, Pozna 1988)

33

Chromosomy homologiczne rozpoznawane s na podstawie charakterystycznych cech morfologicznych, do ktrych zalicza si: dugo chromosomu, pooenie centromeru wyznaczajce typ morfologiczny chromosomu (meta-, submeta-, subtelo- lub akrocentryczny) oraz wzr prkowy uzyskiwany metodami Q, G lub R. Podstawowe znaczenie w ukadaniu kariotypu przypisuje si wzorowi prkowemu, poniewa posugiwanie si wycznie kryteriami wielkoci i typu morfologicznego chromosomu nie pozwala na precyzyjn identyfikacj wszystkich par homologicznych. Jest to spowodowane tym, e czsto chromosomy z rnych par s podobnej wielkoci i reprezentuj ten sam typ morfologiczny. Skrajnym tego przykadem mog by zestawy chromosomowe byda, kozy i psa, w ktrych wszystkie

Ry. 2-13. Kariotyp knura (barwienie metod prkw G) uszeregowany zgodnie ze wzorcem ustalonym przez Komitet ds. Standaryzacji Kariotypu wini. Chromosomy pochodz z pytki metafazowej przedstawionej na ry. 2-8a

34

chromosomy autosomalne s akrocentryczne i mona je usytuowa w szeregu o stopniowo zmniejszajcej si dugoci, przy czym rnice dugoci pomidzy kolejnymi parami s praktycznie niezauwaalne. Nawet w przypadku gatunkw majcych niewielk liczb diploidaln oraz chromosomy

Ry. 2-14, Idiogram kariotypu wini (ukad prkw G) wg Komitetu ds. Standaryzacji Kariotypu wini (Hereditas 109:151-157,1988)

35

zrnicowane pod wzgldem morfologicznym, precyzyjne sporzdzenie kariotypu z pominiciem technik prkowych jest niemoliwe. Przykadem moe by kariotyp wini (2n = 38), w ktrym rozrnienie niektrych par wymaga zastosowania technik prkowych (ry. 2-13). Graficzne przedstawienie kariotypu, obejmujce schematyczne obrazy poszczeglnych chromosomw z zaznaczonym pooeniem centromeru i ukadem prkw, nazywa si idiogramem (ry. 2-14). Opracowanie kariotypu, czasami okrelanego kariogramem, dla konkretnego osobnika polega na uszeregowaniu par chromosomw homologicznych zgodnie z midzynarodowym wzorcem, przyjtym dla danego gatunku. We wzorcu poszczeglnym parom chromosomowym przyporzdkowane s kolejne numery, w zakresie wyznaczonym przez liczb par dla danego gatunku. Kada para homologiczna ma opisan morfologi, wielko oraz wzr prkowy (najczciej prki G lub R). Ponadto, dla poszczeglnych par mog by wskazane prki charakterystyczne (ang. landmarks). Prek taki (lub prki) dzieli (-) rami chromosomowe na regiony, ktre s numerowane (ry. 2-14). W obrbie regionw numerowane s take kolejne prki, ktre zalenie od zastosowanej metody barwienia mog by ciemne i jasne lub wiecce i nie wiecce. Tak opracowany idiogram stanowi bardzo wane narzdzie suce do opisywania mutacji chromosomowych oraz mapowania genw w chromosomach. Pierwsze wzorce kariotypw opracowano podczas Konferencji Standaryzacyjnej, ktra odbya si w 1976 roku w Reading (W. Brytania). Opracowano wwczas wzorce kariotypw barwionych metod prkw G dla: byda, wini, konia, owcy, kozy i kota. W latach 80. powstay wzorce dla lisa polarnego i pospolitego oraz opublikowano ulepszone wzorce dla wini, byda, owcy, kozy i konia. Natomiast w drugiej poowie lat 90. opracowano czciowo wzorce kariotypu psa (obejmujcy 22 pary spord 39) i kury (obejmujcy 9 najwikTabela 2-11

Wykaz gatunkw, dla ktrych uzgodniono midzynarodowe wzorce kariotypw Gatunek Bydo Owca Koza winia Ko Lis polarny Lis pospolity Krlik Pies Kura 36 Wzory prkowe G, Q, R G, Q, R R G, R G, R G, C, Ag-I G, C, Ag-I G G G, R rdo
Cytogenetics and Celi Genetks 92:283-299, 2001
jw. i 85:317-324, 1999

J w-

Hereditas 109:151-157, 1988

Chromosome Research 5:433-443, 1997


Hereditas 103:33-38, 1985 Hereditas 103:171-176, 1985

Cytogenetics and Celi Genetks 31:240-248, 1981 Chromosome Research 4:306-309, 1996 Cytogenetics and Celi Genetks 86:271-276, 1999

szych par spord 39) oraz poprawiono wzorzec kariotypu konia. Obecnie s prowadzone prace nad uzgodnieniem wzorca kariotypu norki. W tabeli 2-II zestawione s gatunki, dla ktrych opracowano wzorce, z zaznaczeniem zastosowanych metod prkowego barwienia chromosomw.

2.5. Mejoza
Podzia mejotyczny prowadzi do powstania komrek, w ktrych liczba chromosomw jest zredukowana o poow, czyli osobniki o dipoidalnej liczbie chromosomw wytwarzaj gamety z haploidaln ich liczb. Komrki po podziale mejotycznym maj zrekombinowan informacj genetyczn, tzn. w ich genomie powstaj unikatowe kombinacje alleli pochodzenia ojcowskiego i matczynego. Ponadto, komrki te maj zmniejszon do poziomu 1C zawarto DNA. Przedstawiona wyej oglna charakterystyka mejozy wskazuje rwnoczenie na najwaniejsze rnice midzy mitoz i mejoz. Mejoza skada si z dwch podziaw, w ktrych wystpuj takie same fazy jak w mitozie, tzn.: profaza, metafaza, anafaza i telofaza (ry. 2-15). Wejcie komrki w podzia mejotyczny poprzedzone jest, podobnie jak w przypadku podziaw mitotycznych, replikacj DNA w fazie S. Komrka rozpoczynajca podzia mejotyczny zawiera 4C DNA. W profazie pierwszego podziau mejotycznego wyrnia si pi stadiw: leptoten, zygoten, pachyten, diploten i diakinez. Podczas profazy I zachodz oglne zmiany o charakterze cytologicznym, ktre wystpuj rwnie w mitozie. Nale do nich: kondensacja chromosomw, dezintegracja bony jdrowej, zanik jderek oraz rozchodzenie si centrioli do przeciwlegych biegunw komrki. Oprcz tego w profazie I zachodz bardzo wane procesy majce podstawowy wpyw na dalszy przebieg podziau. W zygotenie rozpoczyna si koniugacja chromosomw homologicznych, polegajca na czeniu si i cisym przyleganiu na caej dugoci chromosomw homologicznych. Koniugacja chromosomw zachodzi dziki specjalnej strukturze biakowej, pojawiajcej si w zygotenie i pachytenie profazy I, ktra jak spoiwo czy ze sob dwa uoone rwnolegle chromosomy homologiczne. Struktur t jest kompleks synaptonemalny (ang. synaptonemal complex SC), ktry skada si z dwch elementw lateralnych oraz wystpujcego pomidzy nimi elementu centralnego (ry. 2-16 i 2-17). Midzy elementami lateralnymi wystpuj guzki (ciaka) rekombinacyjne, ktre s zespoem biaek odpowiedzialnych za przeprowadzenie crossing over. Element lateralny przylega do rdzeni biakowych chromatyd siostrzanych chromosomu, a element centralny powstaje w miejscu, gdzie wkienka poprzeczne wychodzce z elementw lateralnych zazbiaj si. Kady element lateralny zakoczony jest tarczk przylegajc, ktra mocuje chromosom do wewntrznej strony bony jdrowej. Elementy lateralne
37

Tli

Ry. 2-15. Schemat przebiegu podziau mejotycznego. Oznaczenia: PI profaza I, L leptoten, Z zygoten, P pachyten, DL diploten, DK diakineza, MI metafaza I, AI anafaza I, TI telofaza I, Pil profaza II, MII metafaza II, Ali anafaza II, Tli telofaza II, a tarczka przylegajca, b centromer, c pocztek budowania kompleksu synaptonemalnego, d guzek rekombinacyjny, e chiazma (wg: Genetyka zwierzt, Wydawnictwo AR, Pozna 1988)

cz si tylko z niewielk czci DNA chromosomw (okoo 1%). Pozostaa cz DNA jest uoona wzdu chromosomu w postaci tzw. domen ptlowych, ktrych dugo, zalenie od gatunku, mieci si w granicach od 20 000 pz (inaczej 20 kpz) do 120 000 pz (120 kpz). Wynika z tego, e tylko niewielka cz DNA homologicznych chromosomw kontaktuje si midzy sob za porednictwem kompleksu synaptonemalnego. Poniewa koniugacja ma charakter homologiczny, to biaka kompleksu synaptonemalnego cz si ze cile okrelonymi, chocia jeszcze nie poznanymi, sekwencjami DNA, wystpujcymi w tej czci domen ptlo wy ch, ktre s zakotwiczone w rdzeniu biakowym chromatydy. Wiele wskazuje na to, e fragmenty DNA kontaktujce si z biakami SC s bogate w powtarzajce si tandemowo sekwencje mikrosatelitarne oraz rozproszone elementy nukleotydowe (LIN i SINE). Badania biaek SC pokazay, e zdecydowana ich wikszo jest syntetyzowana tylko w komrkach dzielcych si mejotycznie. U ssakw dobrze poznano struktur trzech biaek SCP (ang. synaptonemal complex protein): SCP1, SCP2 i SCP3. Biako SCP1 wystpuje w obrbie elementu centralnego i spenia podstawow rol w spinaniu struktury biwalentu. Biaka SCP2 i SCP3 uczestnicz w budowie elementw lateralnych. Funkcja kompleksw synaptonemalnych bya powszechnie czona z przeprowadzeniem koniugacji chromosomowej, ktra z kolei miaa umoliwia zajcie crossing over na pocztku pachytenu. Ostatnio przeprowadzone badania pokazay jednak, e crossing over moe zaj, zanim dojdzie do koniugacji za porednictwem SC. Koniugacja chromosomw
39

zostaje zakoczona na pocztku pachytenu (ry. 2-17b). Wynikiem tego procesu jest pojawienie si haploidalnej liczby biwalentw. Biwalent jest take formowany przez heterochromosomy X i Y (ry. na okadce), dziki
40

niewielkim regionom pseudoautosomalnym (ang. pseudoautosomal region PAR), ktre uruchamiaj homologiczn koniugacj. Na pocztku pachytenu wystpuje zjawisko crossing over, ktre polega na wymianie fragmentw chromatyd niesiostrzanych w obrbie biwalentu. Zasadniczo crossing over jest zdarzeniem losowym, tzn. zachodzi w przypadkowym miejscu biwalentu, przy czym liczba tych zdarze waha si od l do 5. Losowo zachodzenia crossing over jest jednak ograniczona. Wiadomo, e wystpienie crossing over w okrelonym miejscu chromosomu wpywa ograniczajco na moliwo zajcia crossing over w pobliu. Zjawisko to okrelane jest terminem interferencji. Przyjmuje si, e oglna liczba crossing over w komrce dzielcej si mejotycznie jest ograniczona. Potencjalnie mogoby istnie niebezpieczestwo, e na jednych chromosomach liczba ta byaby znaczna, a na innych brak byoby takich wymian. Miaoby to bardzo negatywny wpyw na proces segregacji chromosomw w anafazie I, poniewa brak crossing over pociga za sob brak chiazm. Poniewa tak si nie dzieje, dlatego poszukiwano mechanizmu gwarantujcego rwnomierno wystpowania crossing over. Mechanizmem tym jest wspomniane wczeniej zjawisko interferencji, a w wietle ostatnich bada mona przypuszcza, e SC jest w to istotnie zaangaowany. Losowo crossing over naruszona jest rwnie przez to, e zachodzi ono rzadziej w pobliu centromeru, a czciej w kocowych czciach ramion chromosomowych w obrbie prkw T, ktre s podklas prkw R. Naley podkreli, e crossing over jest zjawiskiem obligatoryjnym, czyli musi zaj w obrbie kadego biwalentu. Zasada ta dotyczy take biwalentu X-Y, gdzie crossing over wystpuje w obrbie regionu pseudoautosomalnego. Crossing over prowadzi do powstania nowych ukadw alleli w obrbie pojedynczej chromatydy. Chromatyda, ktra uczestniczya w wymianie, uzyskuje kombinacj alleli pochodzenia ojcowskiego i matczynego, w przeciwiestwie do sytuacji, jaka bya przed crossing over. Wwczas to chromosom, a tym samym i jego chromatydy, mia zestaw alleli tylko jednego z rodzicw, co wynika z zasady, e w obrbie pary chromosomw homologicznych jeden pochodzi od ojca, a drugi od matki. Crossing over jest jednym z trzech mechanizmw odpowiedzialnych za rekombinacj genetyczn (mowa jest o tym na kocu tego podrozdziau), ktrej efektem jest zmienno w wiecie oywionym. Naley jednak pamita, e pierwotnym rdem zmiennoci s mutacje, ktre jeli si pojawi podlegaj rekombinacjom podczas mejozy. Po zakoczeniu pachytenu w diplotenie, nastpuje rozkad kompleksw synaptonemalnych, poza miejscami, gdzie wystpio crossing over, w ktrych powstaj chiazmy, stanowice cytologiczny dowd zajcia crossing over. W ostatnim stadium profazy I diakinezie kontynuowana jest kondensacja chromosomw oraz rozpoczyna si proces terminalizacji chiazm, tzn. ich zanikania. W metafazie I biwalenty, skadajce si z maksymalnie skondensowanych chromosomw homologicznych, zmierzaj do paszczyzny rwnikowej

41

komrki (ry. 2-18a). Wkna wrzeciona podziaowego rozpoczynaj proces czenia biegunw komrki z centromerami w taki sposb, e do centromeru przyczaj si wkna tylko z jednego bieguna, natomiast do centromeru chromosomu homologicznego wi si wkna z bieguna przeciwlegego. Po zakoczeniu terminalizacji chiazm rozpoczyna si anafaza I, w ktrej chromosomy homologiczne rozchodz si do przeciwlegych biegunw komrki (ry. 2-18b). Oznacza to, e do kadego z biegunw zmierza po jednym chromosomie z kadej pary homologicznej, czego wynikiem jest zmniejszenie o poow liczby chromosomw w jdrach powstaych po pierwszym podziale mejotycznym. W telofazie nastpuje odbudowa jdra poczona z dekondensacj chromosomw (ry. 2-18c). Po zakoczeniu pierwszego podziau mejotycznego nastpuje drugi podzia, ktry nie jest poprzedzony replikacj DNA. Tym samym jdro komrkowe rozpoczynajce drugi podzia mejotyczny zawiera 2C DNA.
42

Drugi podzia ma przebieg zgodny z mitoz, z tym jednak e uczestniczy w nim ju tylko haploidalna liczba chromosomw, a ich chromatydy maj zrekombinowane ukady alleli. Po ustawieniu si chromosomw podczas metafazy II (ry. 2-18d) w paszczynie rwnikowej nastpuje podzia centromeru i rozpoczyna si anafaza II. Wkna wrzeciona podziaowego rozcigaj chromatydy siostrzane do przeciwlegych biegunw komrki. Gdy jednochromatydowe chromosomy siostrzane osign bieguny, rozpoczyna si telofaza, w ktrej zachodz procesy odwrotne do tych, jakie wystpuj w profazie mitotycznej. Po zakoczeniu podziau mej etycznego zawarto DNA w jdrach komrkowych maleje do poziomu 1C. Chromosomy haploidalnego zestawu s zbudowane z pojedynczych chromatyd, wrd ktrych jedne s pochodzenia ojcowskiego, inne matczynego, a niektre maj zrekombinowany ukad alleli. Rekombinacje genetyczne zachodzce podczas mejozy, rozumiane w szerokim sensie, mona podzieli na: chromosomowe, chromatydowe i wewntrzchromatydowe. Podczas pachytenu profazy I w wyniku crossing over powstaj chromatydy skadajce si z fragmentw o pochodzeniu ojcowskim i matczynym jest to rekombinacja wewntrzchromatydowa (rekombinacja w cisym sensie). W trakcie anafazy I chromosomy homologiczne rozchodz si losowo do przeciwlegych biegunw komrki. W wyniku tego procesu w telofazie I powstaj jdra komrkowe zawierajce kombinacje chromosomw pochodzenia ojcowskiego i matczynego, przy czym chromatydy tych chromosomw mog by ju zrekombinowane jest to rekombinacja chromosomowa. Wreszcie w anafazie II do przeciwlegych biegunw komrki rozchodz si losowo chromatydy, ktre mog by zrekombinowane lub mie ukad alleli pochodzenia ojcowskiego albo matczynego. Ten typ okrelany jest jako rekombinacja chromatydowa. Trzystopniowa rekombinacja sprawia, e wrd gamet nie wystpuj dwie o tym samym zestawie alleli. Ten fenomen, obok mutacji, jest gwn przyczyn obserwowanej ogromnej zmiennoci genetycznej wrd organizmw.

2.6. Gametogeneza
Proces tworzenia gamet jest nierozcznie zwizany z podziaem mejotycznym. Przebieg mejozy, a w tym czas i tempo tego podziau oraz procesy prowadzce do powstania w peni wyksztaconych gamet sprawiaj, e pomidzy gametogenez msk (spermatogeneza) i esk (oogeneza) wystpuj znaczne rnice. Gametogeneza mska przebiega w kanalikach plemnikotwrczych gonady mskiej jdrach. W procesie spermatogenezy mona wyrni trzy gwne etapy: 1) podziay mitotyczne spermatogonii (spermatogoniogeneza), 2) podzia mejotyczny spermatocytw (spermatocytogeneza) oraz 3) spermio43

geneza, ktra prowadzi do powstania z niezrnicowanych haploidalnych spermatyd wyspecjalizowanych gamet mskich plemnikw (ry. 2-19). Intensywne podziay mitotyczne spermatogonii w jdrach dojrzaych samcw umoliwiaj masowe wytwarzanie plemnikw. Pierwszy podzia prowadzi do powstania dwch spermatogoniw, z ktrych jedna komrka zajmuje miejsce pierwotnego spermatogonium, a druga podlega dalszym podziaom. Taki sposb podziau pierwotnego spermatogonium jest typowy dla komrek pierwotnych (ang. stem cells), czyli komrek nie w peni zrnicowanych, ktre wykazuj zdolno do samoodnawiania. Nastpne podziay mitotyczne spermatogoniw, a jest ich najczciej sze, nie kocz si cytokinez. Podziay te s zsynchronizowane, a powstajce kolejne pokolenia spermatogonii s poczone mostkami cytoplazmatycznymi. Po zakoczeniu cyklu mitoz spermatogonia przeksztacaj si w spermatocyty I rzdu, ktre rozpoczynaj podzia mejotyczny. Rwnie kolejnym dwm podziaom mejozy nie towarzyszy cytokinez. Ostatecznie, po zakoczeniu mejozy, powstaje grupa liczca kilkaset spermatyd poczonych mostkami cytoplazmatycznymi, ktra jest okrelana jako syncytium. Spermatydy, jako komrki niezrnicowane, podlegaj gbokim przeobraeniom podczas procesu spermiogenezy, w wyniku ktrego powstaj plemniki. Gwne zmiany, jakie zachodz podczas spermiogenezy, polegaj na: 1) przeksztaceniu aparatu Golgiego w akrosom, ktry okrywa grn cz jdra komrkowego znajdujcego si w gwce plemnika, 2) zgrupowaniu mitochondriw w pobliu centrioli, ktre s umiejscowione po przeciwnej, w stosunku do akrosomu, stronie jdra komrkowego, 3) wyksztaceniu na bazie centrioli wkna osiowego witki, 4) usuniciu prawie caej cytoplazmy obecnej w spermatydzie i 5) zamianie biaek histonowych na biaka protaminowe w chromosomach, czego skutkiem jest utrata struktury nukleosomowej przez chromatyn jdra plemnika. Dojrzay plemnik zbudowany jest z gwki, w ktrej jest umiejscowione jdro komrkowe i akrosom, wstawki znajdujcej si u podstawy gwki, w ktrej zgrupowane s mitochondria, oraz witki, ktra stanowi przeduenie wstawki. Gametogeneza eska u ssakw rozpoczyna si ju w yciu podowym (ry. 2-20). Po ukierunkowaniu rozwoju osobniczego na pe esk niezrnicowane gonady podowe przeksztacaj si w jajniki, w ktrych komrki linii pciowej lokuj si w czci korowej gonad. Pierwotne oogonia po przejciu kilku podziaw mitotycznych przeksztacaj si w oocyty I rzdu, ktre niezwocznie rozpoczynaj podzia mejotyczny. W przypadku byda nastpuje to okoo 60 dnia rozwoju podowego. Oocyty I rzdu po osigniciu stadium diplotenu profazy I mejozy zatrzymuj rozwj. Stan ten osigany jest u byda powyej 100 dnia rozwoju podowego. Oocyty przechodz w stan spoczynkowy, ktry jest nazywany diktiotenem. W ten sposb wszystkie oogonia, ktre wystpoway w jajniku, zostaj przeksztacone w oocyty I rzdu, bdce w stadium diktiotenu. Umieszczone s one zazwyczaj pojedynczo w pierwotnych pcherzykach jajnikowych.
44

Dalsze etapy oogenezy nastpuj po osigniciu przez samic dojrzaoci pciowej. W kolejnych cyklach pciowych, regulowanych hormonalnie, pewna cz pcherzykw rozpoczyna wzrost, a w nich rozrasta si rwnie oocyt, ktry jest wspomagany przez otaczajce komrki pcherzykowe. W pcherzykach, ktrych wzrost by wystarczajco intensywny, przed owulacj nastpuje ponowne uruchomienie podziau mejotycznego. Oocyt I rzdu koczy pierwszy podzia mejotyczny, w wyniku ktrego powstaje oocyt II rzdu oraz ubogie w cytoplazm ciako kierunkowe. Oocyt znajduje si w stadium metafazy II. Obie komrki umieszczone s w glikoproteinowej osonce przejrzystej (zona pellucida) i w takim stadium rozwoju dochodzi do owulacji. Komrki przemieszczaj si w jajowodzie i jeeli podczas wdrwki natrafi na plemniki, to moe nastpi dokoczenie oogenezy. Tym samym zapodnienie jest niezbdnym warunkiem zakoczenia oogenezy. Zapodnienie oocytu przez plemnik stymuluje dokoczenie mejozy eskiej, przy rwnoczesnym zablokowaniu dostpu innych plemnikw do wntrza oocytu. Dzieje si to na drodze wyrzucenia przez oocyt zawartoci
45

ziaren korowych, znajdujcych si pod powierzchni oocytu, do przestrzeni pomidzy bon oocytu a osonk przejrzyst. Powoduje to utwardzenie" osonki przejrzystej, ktra staje si barier nie do pokonania dla plemnikw. Po wnikniciu plemnika oocyt ponownie podejmuje podzia mejotyczny. Rozpoczyna si anafaza II i dochodzi do wyrzucenia" drugiego ciaka kierunkowego, po czym nastpuje telofaza II. Chromosomy pozostae w oocycie tworz przedjdrze eskie, a chromatyna plemnika, ktry zapodni oocyt, podlega dekondensacji i powstaje przedjdrze mskie. Zapodniony oocyt II rzdu przeksztaca si w zygot, w ktrej wystpuj dwa haploidalne przedjdrza: jedno powstae z jdra plemnika, a drugie reprezentujce zestaw chromosomw eskich, ktre pozostay w oocycie
46

po zakoczeniu drugiego podziau mejotycznego. Chromosomy przedjdrza eskiego podlegaj dekondensacji i rwnolegle z chromatyn przedjdrza mskiego przechodz proces replikacji DNA. Zawarto DNA wzrasta do poziomu 4C, co powoduje, e zygota jest gotowa do rozpoczcia podziau mitotycznego. Chromosomy ulegaj kondensacji i pocztkowo nadal wystpuj jako dwa oddzielne zestawy chromosomw, z tym jednak e kady z nich jest zbudowany z dwch chromatyd siostrzanych. W stadium metafazy pierwszego podziau mitotycznego zygoty dochodzi do poczenia si przedjdrzy (syngamii), a dalej nastpuje anafaza oraz telofaza i powstaje zarodek zbudowany z dwch komrek (blastomerw), ktry dalej bdzie wzrasta na drodze kolejnych podziaw mitotycznych. Od przedstawionego wyej schematu oogenezy wystpuj odstpstwa u niektrych gatunkw. Na przykad, profaza I nie zostaje zakoczona w yciu podowym u psa i niektrych gryzoni. U gatunkw tych mona znale oocyty I rzdu w stadium pachytenu w jajnikach nowo urodzonych osobnikw eskich. Z kolei u krlika owulacja jest bezporednio indukowana przez akt krycia lub inseminacji. Poznanie procesw gametogenezy oraz wczesnego rozwoju zarodkowego umoliwio rozwj biotechnologii gamet i zarodkw. W hodowli zwierzt na szerok skal stosowane s nastpujce biotechniki wspomagajce rozrd: konserwacja nasienia w niskich temperaturach (kriokonserwacja), inseminacja, przenoszenie zarodkw (stadium moruli lub blastocysty) pozyskanych od tzw. samic dawczy do rogw macicy tzw. samic biorczy, kriokonserwacja zarodkw i zapodnienie pozaustrojowe (in vitro). Ostatnio do praktyki hodowlanej wprowadzane s kolejne techniki, ktre umoliwiaj uzyskiwanie potomstwa podanej pci. Naley do nich oznaczanie pci zarodkw i segregowanie plemnikw na frakcj z chromosomem X i frakcj z chromosomem Y. Warto zauway, e zarwno produkcja zwierzt modyfikowanych genetycznie (zwierzta transgeniczne), jak i klonowanie zwierzt rwnie bazuj na manipulacjach prowadzonych na oocytach II rzdu, zygotach, zarodkach, a take hodowanych w warunkach pozaustrojowych komrkach somatycznych. Jedna z najpowszechniej obecnie wykorzystywanych technik dotyczy manipulacji na oocytach II rzdu, z ktrych usunito mikrochirurgicznie wrzeciono podziaowe (chromosomy w stadium metafazy II). Do takich oocytw, ktre s okrelane jako enukleowane, mona wprowadzi technik elektrofuzji komrk somatyczn, pochodzc z hodowli pozaustrojowej (komrka taka moe by zmodyfikowana genetycznie). W taki wanie sposb sklonowano synn owc Doiy, do uzyskania ktrej wykorzystano komrk nabonkow pochodzc z gruczou mlekowego dorosej owcy.

Rozdzia

3
Gen i jego ekspresja

Znaczenie kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) jako nonika informacji genetycznej zostao udowodnione w 1944 roku dziki eksperymentowi, ktry polega na transformacji niepatogennych bakterii dwoinek zapalenia puc z wykorzystaniem DNA wyizolowanego ze szczepu patogennego. Efektem tego dowiadczenia byo nabycie przez niektre bakterie niepatogenne cech zjadliwoci. Badania te przeprowadzili badacze amerykascy O.T. Avery, C.M. MacLeod i M. McCarty. W lad za tym odkryciem nastpiy nastpne. W 1953 roku J.D. Watson i F. Crick przedstawili model budowy DNA, a przez nastpne lata rozszyfrowywano kod genetyczny, przypisujc poszczeglnym trjkom nukleotydw odpowiednie aminokwasy. DNA charakteryzuje si trzema waciwociami, ktre s niezbdne do penienia funkcji nonika informacji genetycznej. Po pierwsze, w sekwencji nukleotydw zapisana jest, za pomoc kodu genetycznego, informacja o pierwszorzdowej strukturze biaek, a take o strukturze czsteczek rybosomowego (rRNA), transportujcego (tRNA) i niekodujcego (ncRNA) kwasu rybonukleinowego. Po drugie, DNA ma zdolno do samoodtwarzania si, czyli replikacji. Po trzecie, DNA moe podlega mutacjom, czyli procesowi generujcemu pierwotn zmienno genetyczn, ktre z kolei podlegaj rekombinacjom podczas mejozy.

3.1. Budowa kwasw nukleinowych


Zapis informacji genetycznej oraz jej ujawnienie si w postaci cechy (ekspresja genu) zwizane s z funkcjonowaniem kwasw nukleinowych. U zdecydowanej wikszoci organizmw nonikiem informacji genetycznej jest DNA. Tylko u nielicznych wirusw (retrowirusy) informacja genetyczna jest zawarta w kwasie rybonukleinowym (RNA). Z kolei proces ekspresji
48

genu jest nierozerwalnie zwizany z RNA, wystpujcym w trzech podstawowych wariantach: mRNA (informacyjny RNA) powstajcy podczas transkrypcji genu, rRNA (rybosomowy RNA) stanowicy cz strukturaln rybosomw, ktre s organellami komrkowymi odpowiedzialnymi za przeprowadzenie translacji, i tRNA (transportujcy RNA), ktry jest zaangaowany w proces translacji poprzez dostarczanie do rybosomw waciwych aminokwasw.

3.1.1. DNA
Czsteczka DNA skada si z dwch owinitych prawoskrtnie wok siebie acuchw polinukleotydowych. Struktura ta okrelana jest w jzyku polskim terminem podwjna helisa (ang. helix), a rzadziej podwjny heliks. Podstawow jednostk struktury DNA jest deoksyrybonukleotyd, w ktrego skad wchodz: zasada azotowa, cukier deoksyryboza i reszta kwasu fosforowego (ry. 3-1). W DNA wystpuj cztery zasady azotowe, ktre zaliczane s do puryn: adenina (A) i guanina (G) lub pirymidyn: ty mina (T) i cytozyna (C). W rdzeniu kadego acucha polinukleotydowego czsteczki deoksyrybozy poczone s ze sob poprzez reszt kwasu fosforowego wizaniami fosfodiestrowymi midzy atomem wgla w pozycji 5' jednej czsteczki cukru i atomem wgla 3' ssiedniej czsteczki deoksyrybozy. Czsteczki zasad azotowych poczone s wizaniami N-glikozydowymi

49

z atomami wga wystpujcymi w pozycji l' czsteczki deoksyrybozy i s skierowane do wntrza podwjnej helisy. Uoenie zasad azotowych w acuchach polinukleotydowych podwjnej helisy DNA oparte jest na zasadzie komplementarnoci, tzn. naprzeciw adeniny zawsze wystpuje tymina, a naprzeciw guaniny znajduje si cytozyna. Taka organizacja podwjnej helisy DNA sprawia, e sekwencja nukleotydw w jednej nici jest rna od sekwencji nukleotydw w drugiej nici. Pomidzy zasadami powstaj sabe wizania wodorowe; tak wic w parze AT s dwa wizania wodorowe, a w parze GC trzy takie wizania. Dugo czsteczki DNA wyraa si liczb par nukleotydw, lecz czciej stosuje si okrelenie liczba par zasad (skrt: pz w jz. polskim lub bp od sw angielskich base pairs), bo skierowane do wntrza podwjnej helisy zasady azotowe stanowi jakby szczeble drabiny. acuchy polinukleotydowe DNA s przeciwnie spolaryzowane. Polaryzacja acucha zwizana jest z wystpowaniem na jego kocach wolnych atomw wgla, czyli kady acuch ma koniec 3' i 5'. Przeciwna polaryzacja polega na tym, e naprzeciw koca 3' jednego acucha znajduje si koniec 5' drugiego acucha. Polaryzacja acuchw ma bardzo wane znaczenie dla przebiegu procesu replikacji i transkrypcji, a w przypadku mRNA take dla procesu translacji. Zwijajce si wok siebie acuchy polinukleotydowe tworz na powierzchni podwjnej helisy dwie bruzdy biegnce spiralnie. Ze wzgldu na ich szeroko okrela si je jako bruzd wiksz i mniejsz.

3.1.2. RNA
Kwasy rybonukleinowe s czsteczkami zbudowanymi z pojedynczych acuchw polinukleotydowych, w ktrych zamiast deoksyrybozy wystpuje ryboza oraz zamiast zasady pirymidynowej tyminy (T) wystpuje inna pirymidyna uracyl (U). W oglnej puli RNA wystpujcych w komrce najliczniej reprezentowany jest rybosomowy RNA (rRNA), ktry wraz z biakami tworzy struktur rybosomw i uczestniczy w przeprowadzaniu translacji. W jderku zlokalizowane s cztery rodzaje rRNA, ktre s wyrniane ze wzgldu na wielko czsteczki, okrelan wielkoci S staa sedymentacji. Trzy rodzaje rRNA: 5.8S, 18S i 28S s kodowane przez geny umiejscowione w obszarach jderkotwrczych (ang. nucleolar organizer region NOR), inaczej nazywanych przeweniami wtrnymi. Podczas transkrypcji, prowadzonej przez polimeraz I RNA, powstaje pre-rRNA o staej sedymentacji 45S, z ktrej po obrbce formowane s wspomniane wyej trzy rodzaje rRNA. Przyjmuje si, e w obszarze jderkotwrczym wystpuje nawet kilkadziesit powtrze genu kodujcego prekursorow czsteczk 45S rRNA, ktrego dugo wynosi okoo 14 000 pz. Liczba tych obszarw jest cech charakterystyczn kariotypu danego gatunku, natomiast liczba aktyw50

nych obszarw, czyli takich, ktre podlegaj transkrypcji, jest zmienna. Czwarty rodzaj 5S rRNA jest kodowany przez gen, wystpujcy w wielu powtrzeniach w innej czci genomu. Geny 5S rRNA s transkrybowane przez polimeraz III RNA. Wymienione rodzaje rRNA uczestnicz w budowie rybosomu, zatem 18S rRNA wystpuje w podjednostce maej (40S) rybosomu, a trzy pozostae rodzaje, tzn. 5S, 5.8S i 28S, zlokalizowane s w podjednostce duej (60S). Dobrze poznanym rodzajem RNA jest transportujcy RNA (tRNA), ktry jest zaangaowany w dostarczanie aminokwasw do rybosomw. Tak jak w przypadku innych czsteczek RNA take i ten rodzaj zbudowany jest z pojedynczego acucha polinukleotydowego. W nici takiej mog jednak wystpowa fragmenty komplementarne, ktre po poczeniu wizaniami wodorowymi midzy komplementarnymi zasadami azotowymi tworz struktur przestrzenn takiej czsteczki. Czsteczka tRNA jest zbudowana z mniej ni 100 nukleotydw, a jej struktura jest bardzo charakterystyczna i przypomina li koniczyny (ry. 3-2). W strukturze tRNA wyrnia si cztery ptle: 1) ptla I (liczc od koca 5') uczestniczy w wizaniu si z enzymem syntetaz aminoacylow, ktra katalizuje zwizanie tRNA z.waciwym aminokwasem; 2) ptla II antykodonowa, zawiera ukad trzech nukleotydw, ktre s komplementarne do kodonu aminokwasu transportowanego przez tRNA; 3) ptla III dodatkowa, o mao poznanej funkcji; 4) ptla IV zaangaowana jest w wizanie si kompleksu aminoacylo-tRNA z rybosomem. Na kocu 3' czsteczki tRNA wystpuje sekwencja CCA, w ktrej do rybozy nukleotydu adenylowego jest przyczany aminokwas. Liczba rnych czsteczek tRNA wystpujcych w komrce zawiera si w przedziale od 40 do 60, co oznacza, e przekracza liczb znanych aminokwasw.
51

Informacyjny RNA (mRNA) powstaje podczas transkrypcji genw ulegajcych ekspresji w komrce i z tego wzgldu jest to najbardziej zrnicowana klasa kwasw rybonukleinowych. Struktura czsteczek mRNA jest opisana w czci dotyczcej procesu transkrypcji. Na uwag zasuguje jeszcze jedna klasa RNA, okrelana terminem niekodujcy RNA (ncRNA ang. noncoding RNA). Ostatnie badania wykazuj, e jest to bardzo wana grupa RNA, ktra bierze udzia w procesie wycinania intronw z pre-mRNA, modyfikacji nukleotydw, a take regulacji ekspresji genw.

3.2. Replikacja DNA


Proces samoodtwarzania si (replikacji) DNA przebiega w fazie S cyklu yciowego komrki i jest niezbdnie potrzebny do przeprowadzenia podziau jdra komrkowego, czyli mitozy, bd mejozy. Kady podzia mitotyczny musi by poprzedzony replikacj. Podobnie jest w przypadku mejozy, z tym jednak e przed drugim podziaem mejotycznym nie dochodzi do replikacji. Z powodu ogromnej dugoci czsteczek DNA zawartych w chromosomach replikacj rozpoczyna si rwnoczenie w wielu miejscach, ktre okrelane s jako replikony. Replikon zawiera miejsce rozpoczcia i zakoczenia replikacji. Na przykad, liczba replikonw w genomie ssakw szacowana jest na okoo 25 000, a rednia wielko jednego replikonu wynosi okoo 150 000 par nukleotydw.

52

Replikacja obejmuje dwa zasadnicze etapy: rozplecenie podwjnej helisy DNA i dobudowanie komplementarnych acuchw polinukleotydowych. W ten sposb powstaj tzw. wideki replikacyjne (ry. 3-3). Rozplecione acuchy polinukleotydowe stanowi matryce, na ktrych w sposb komplementarny syntetyzowane s drugie acuchy. Wynika z tego, e po replikacji dwie nowo powstae czsteczki DNA skadaj si z jednego starego acucha i jednego nowego. Taki sposb replikacji nazywany jest semikonserwatywnym (pzachowawczym). Przyczanie kolejnych nukleotydw katalizowane jest przez enzym polimeraz DNA, ktry odpowiada za powstanie wizania estrowego midzy atomem wgla 3' (wolna grupa 3'-OH) wyduanego acucha i nowym nukleotydem (trifosforanem nukleozydu). Oznacza to, e kierunek budowania komplementarnego acucha jest cile okrelony i postpuje od koca 5' w kierunku 3' (5'3'). W efekcie tylko na jednym acuchu matrycowym replikujcej czsteczki DNA dobudowywanie nowego acucha przebiega w sposb cigy. Na drugim acuchu dobudowywane s krtkie fragmenty (tzw. fragmenty Okazaki), ktre nastpnie s czone przez enzym ligaz w cig ni. Ni syntetyzowana w sposb cigy jest nazywana prowadzc, a ni powstajca w sposb niecigy opnion.

3.3. Kod genetyczny


Informacja genetyczna jest zapisana w DNA za pomoc kodu genetycznego, majcego charakter trjkowy, tzn. trzy kolejne nukleotydy (kodon, tryplet) w DNA zawieraj informacj o aminokwasie, ktry ma by wbudowany w procesie biosyntezy biaka. Poniewa kady kodon skada si z trzech spord czterech nukleotydw, to ogem moliwe jest utworzenie 64 trjek (tab. 3-1). Wrd nich jest 61 trjek sensownych oraz trzy kodony nonsensowne, tzn. takie, ktre nie koduj adnego aminokwasu, a ich wystpienie powoduje zatrzymanie procesu biosyntezy polipeptydu. Tryplet AUG, ktry odpowiada za wbudowanie metioniny w acuchu polipeptydowym, rozpoczyna cz kodujc genu. Komplementarne uoenie nukleotydw w dwch acuchach polinukleotydowych czsteczki DNA sprawia, e sekwencje nukleotydw w tych acuchach, w obrbie danego odcinka DNA, s rne. Tym samym tylko jeden z tych acuchw zawiera informacj i ni ta nazywana jest sensown. Drugi, komplementarny acuch polinukleotydowy peni funkcj matrycy (ni matrycowa) w procesie transkrypcji. Kod genetyczny ma kilka cech o podstawowym znaczeniu dla jego funkcjonowania. Po pierwsze, kod ma charakter trjkowy, o czym bya ju mowa wyej. Po drugie, jest on uniwersalny, tzn. w caym wiecie oywionym funkcjonuje ten sam system kodowania informacji genetycznej. Od tej zasady s tylko nieliczne wyjtki, ktre dotycz niektrych kodonw w mitochondrialnym DNA, np. kodon UGA w kodzie uniwersalnym jest
53

kodonem stop, a w mitochondrialnym DNA ssakw odpowiada za wczenie tryptofanu do acucha polipeptydowego. Po trzecie, kod genetyczny jest zdegenerowany, co wynika z faktu znaczco wikszej liczby kodonw ni aminokwasw. W rezultacie prawie kady aminokwas, z wyjtkiem metioniny i tryptofanu, jest kodowany przez wicej ni jedn trjk (maksymalnie przez sze kodonw, w przypadku leucyny i argininy). Po czwarte, kod genetyczny jest nie zachodzcy na siebie i bezprzecinkowy, czyli kodony s uoone kolejno jeden za drugim bez nukleotydw je rozdzielajcych. W efekcie podczas translacji sekwencja nukleotydw w mRNA jest odczytywana w sposb cigy.

3.4. Transkrypcja
Pierwszym etapem procesu ekspresji genu jest transkrypcja, ktra polega na syntezie informacyjnego kwasu rybonukleinowego (mRNA) na matrycowej nici DNA. Transkrypcja rozpoczyna si od rozplecenia podwjnej helisy DNA i przyczenia polimerazy RNA do sekwencji promotora, ktra poprzedza cz strukturaln genu. Zwizanie si polimerazy RNA z pro54

motorem jest uzalenione od rwnoczesnego przyczenia si w tym miejscu zespou biaek (czynniki transkrypcyjne), ktre kontroluj przebieg transkrypcji. acuch mRNA jest syntetyzowany w kierunku od koca 5' do koca 3' (5'3'), czyli kierunek tej reakcji jest taki sam jak przy replikacji. Z kolei matrycowa ni DNA (komplementarna do nici sensownej) jest odczytywana w kierunku 3'5'. Dziki temu powstajcy mRNA ma sekwencj nukleotydw zgodn z sekwencj nici sensownej DNA (ry. 3-4). Poniewa u organizmw eukariotycznych geny zbudowane s w czci strukturalnej z fragmentw kodujcych (eksony) i niekodujcych (introny), to z pierwotnego transkryptu FINA (pre-mRNA) musz by usunite introny. Proces polegajcy na ich wycinaniu nazywany jest skadaniem RNA (ang. splicing) i stanowi istotn cz tzw. obrbki potranskrypcyjnej pre-mRNA, ktra jest drugim etapem ekspresji genu. Poza wyciciem intronw, na kocu 3' mRNA

dobudowana jest sekwencja poliA, a na kocu 5' doczona zostaje 7-metyloguanozyna (tzw. czapeczka lub inaczej kapturek, ang. cap). Podczas transkrypcji powstaj obok czsteczek mRNA, penicych funkcj matrycy, na ktrej syntetyzowany jest acuch polipeptydowy, take inne czsteczki kwasw rybonukleinowych, majcych zasadnicz rol w translacji (tRNA i rRNA).

3.5. Translacja
Po zakoczeniu obrbki potranskrypcyjnej mRNA przechodzi do cytoplazmy i tam czy si z rybosomami, co rozpoczyna kolejny etap ekspresji genu, jakim jest translacja. W procesie tym na matrycy mRNA budowany jest acuch polipeptydowy (ry. 3-5). Synteza acucha polipeptydowego rozpoczyna si zawsze od aminokwasu metioniny, ktry jest kodowany przez trjk nukleotydw AUG znajdujc si na kocu 5' mRNA. Metionina czy si z tzw. inicjatorowym tRNA dla metioniny i taki kompleks jest wizany z rybosomem, a antykodon tego tRNA wie si komplementarnie z pierwszym kodonem na kocu 5', jakim jest zawsze AUG. Nastpnie do rybosomu dostarczany jest kolejny aminokwas, przez waciwy tRNA, ktrego antykodon jest komplementarny do drugiego kodonu mRNA. Po wprowadzeniu drugiego aminokwasu dochodzi do powstania wizania peptydowego midzy nim i metionin w taki sposb, e nie zwizana grupa karboksylowa pierwszego aminokwasu metioniny czy si z nie zwizan grup aminow drugiego aminokwasu. Wynika z tego, e polipeptyd jest wyduany od koca NH 2 do koca COOH. Zsyntetyzowany dipeptyd jest zwizany z tRNA dla drugiego aminokwasu, a rybosom przesuwa si o jeden kodon w kierunku koca 3' uwalniajc jednoczenie inicjatorowy tRNA dla metioniny. Synteza acucha polipeptydowego postpuje w ten sposb do momentu, kiedy rybosom obejmie jeden z trzech kodonw nonsensownych, a wic kodonw stop (UAA, UAG lub UGA). Z chwil osignicia kodonu stop nastpuje zakoczenie translacji i uwolnienie acucha polipetydowego. Uwolniony acuch polipeptydowy podlega modyfikacjom potranslacyjnym, w wyniku ktrych zostaje uformowana ostateczna posta biaka. Modyfikacje potranslacyjne obejmuj zmiany dotyczce wiza chemicznych (np. rozerwanie wizania peptydowego) w obrbie polipeptydu, modyfikacje koca aminowego lub karboksylowego polipeptydu oraz modyfikacje acuchw bocznych aminokwasw wchodzcych w skad polipeptydu. Ostatnia z wymienionych kategorii modyfikacji potranslacyjnych jest najczciej spotykana i polega na przyczaniu rnych grup chemicznych w wyniku np.: glikozylacji (przyczanie reszt cukrowych), fosforylacji (przyczanie grup fosforanowych, gwnie reszty kwasu fosforowego), metylacji (przyczanie grupy metylowej), acetylacji (przyczanie grupy reszty acetylowej) itp. 56

3.6. Budowa genu


Gen jest podstawow jednostk dziedzicznoci i zajmuje cile okrelone miejsce (locus) w chromosomie lub te wystpuje poza jdrem komrkowym, wewntrz mitochondriw i chloroplastw (dotyczy rolin). Zmiany w obrbie genu mutacje genowe prowadz do powstania form allelomorficznych,
57

czyli alleli. Zatem, cech genu jest take podleganie mutacjom, ktre mog si ujawnia fenotypowo. Naley jednak zaznaczy, e nie kada mutacja przejawia si fenotypowo. Jeli mutacja nie zmieni sensu zapisu genetycznego, np. zmutowany kodon odpowiada za wczenie tego samego aminokwasu co kodon niezmutowany (kod genetyczny jest zdegenerowany) lub mutacja wystpi w obrbie intronu (introny s wycinane w trakcie obrbki potranskrypcyjnej pre-mRNA), to ujawnienie fenotypowe nie nastpi. Mutacja nie wywoujca zmiany w budowie kodowanego produktu doprowadzi jedynie do powstania allelu, ktrego obecno moe by wykryta poprzez bezporednie badanie DNA. W takiej sytuacji mona mwi o polimorfizmie DNA danego genu. Gen jest rwnie podstawow jednostk uczestniczc w rekombinacji genetycznej podczas podziau mejotycznego. Pod wzgldem molekularnym gen jest regionem DNA, ktry podlega transkrypcji. W ramach genu rozumianego jako jednostka transkrypcyjna naley wyrni cz strukturaln genu, czyli ten fragment DNA, w ktrym zawarta jest informacja genetyczna o produkcie (biako, rRNA, tRNA), oraz sekwencje regulatorowe, ktre odpowiadaj za uruchomienie transkrypcji (ry. 3-6). Cz strukturalna genu skada si z eksonw, czyli sekwencji, ktre po transkrypcji uczestnicz w translacji, oraz intronw, ktre s wycinane z pre-mRNA podczas skadania RNA (ang. splicing) i nie uczestnicz w translacji. Oprcz tego z obu stron czci strukturalnej (na kocu 5' i 3') wystpuj sekwencje oskrzydlajce (ang. untranslated region UTR) czci kodujce pierwszego i ostatniego eksonu. Sekwencje oskrzydlajce nie podlegaj translacji. Zgodnie z wczeniej opisanym fenomenem polarnoci czsteczki DNA naley podkreli, e pocztek genu znajduje

58

si na kocu 5', a koniec genu na kocu 3'. Pierwszy ekson (koniec 5') rozpoczyna sekwencja ATG, ktra koduje metionin (kodon AUG w mRNA) pierwszy aminokwas kadego polipeptydu. Z kolei na kocu 3' genu, po sekwencji stop" (kodony TAA, TAG lub TGA), pojawia si sekwencja AATAAA, ktra koduje sygna rozpoczcia poliadenylacji pre-mRNA podczas obrbki potranskrypcyjnej, a za ni znajduje si sekwencja (GT)n odpowiedzialna prawdopodobnie za zakoczenie transkrypcji. Cz regulatorowa genu obejmuje sekwencje promotora, wzmacniacza (ang. enhancer) i wyciszacza (ang. silencer). Promotor bezporednio poprzedza cz strukturaln genu i peni kluczow rol w rozpoczciu transkrypcji. W obrbie promotora wystpuj dwie sekwencje o szczeglnym znaczeniu. W odlegoci okoo 30 pz od miejsca inicjacji transkrypcji wystpuje sekwencja TATA (ang. TATA-box), ktrej obecno jest niezbdna do przyczenia polimerazy II RNA. Przyczenie polimerazy wymaga rwnoczesnego powizania grupy biaek (czynniki transkrypcyjne) z promotorem. Sekwencja CAAT znajduje si okoo 70-90 pz przed miejscem rozpoczcia transkrypcji. Przypuszcza si, e rwnie ta sekwencja bierze udzia w procesie regulacji transkrypcji. Warto wreszcie zwrci uwag, e wikszo genw (okoo 56%) zawiera w obrbie promotora sekwencj skadajc si z licznych powtrze dinukleotydu CG, ktre s nazywane wysepkami CpG. Wysepki CpG towarzysz wszystkim genom ulegajcym powszechnej ekspresji, tzn. we wszystkich komrkach. S to geny penice funkcj gospodarza komrki (ang. housekeeping genes), czyli ich ekspresja jest konieczna do funkcjonowania komrki. Sekwencje regulujce typu wzmacniacza i wyciszacza mog by pooone w znacznej odlegoci od genu, ktrego ekspresja znajduje si pod ich kontrol, dziki oddziaywaniu na nie czynnikw transkrypcyjnych. Wzmacniacz jest odpowiedzialny za nasilenie transkrypcji genu, a wyciszacz za spowolnienie tego procesu. Pooenie tych sekwencji wzgldem genu jest bardzo zrnicowane i moe wystpowa przed lub za genem, a nawet w jego obrbie, w jednym z intronw. Wielko genu, a konkretnie jego czci strukturalnej, mieci si w bardzo szerokich granicach od kilkuset par nukleotydw (pz) do ponad dwch milionw pz. Przykadem bardzo maego genu jest gen SR, ktry zawiera tylko jeden ekson, skadajcy si z 669 nukleotydw. Produktem tego genu jest biako o dugoci 223 aminokwasw, odpowiedzialne za ukierunkowanie rozwoju niezrnicowanej gonady podowej w jdro. Gigantycznym genem jest ludzki gen DMD kodujcy biako dystrofin, ktre jest zbudowane z 3685 aminokwasw. Gen ten jest zbudowany z okoo 2,5 min pz i w jego skad wchodzi 79 eksonw i 78 intronw, ale tylko 0,6% dugoci tego genu obejmuje cz kodujc. Mutacje w tym genie odpowiedzialne s za rozwj gronej choroby genetycznej czowieka dystrofii miniowej Duchenne'a, ktra prowadzi do zaniku mini. 59

3.7. Regulacja ekspresji genu


W genomie ssakw wystpuje okoo 35 tysicy genw. Wrd nich znaczn grup stanowi geny penice tzw. funkcje gospodarza komrki (ang. housekeeping genes). Produkty kodowane przez te geny s zaangaowane w podstawowe procesy yciowe komrki, takie jak: przemiany energetyczne, replikacja DNA, budowa struktur komrkowych itp. Geny z tej grupy podlegaj ekspresji we wszystkich komrkach. Warto pamita, e w komrce somatycznej kady gen (oprcz genw pooonych w chromosomach pci u samcw) reprezentowany jest przez dwa allele, ktre mog wystpowa w ukadzie homo- lub heterozygotycznym, co ma oczywicie zwizek z ekspresj genw. Podczas rozwoju ontogenetycznego, obok genw ulegajcych powszechnej ekspresji, jest wczana i wyczana ekspresja rnych genw, zalenie od tego, w jakim kierunku rnicuje si dana komrka. Z drugiej strony, w zrnicowanej komrce ekspresja niektrych genw moe by okresowo wczana lub wyczana. Jest to bardzo zoony proces, ktrego caociowe poznanie wymaga jeszcze wielu lat bada. Niemniej znanych jest ju wiele mechanizmw, ktre s zaangaowane w kontrol ekspresji genw, czyli ich fenotypowe ujawnianie si w postaci odpowiedniej cechy. Ekspresja genu obejmuje procesy: transkrypcji, potranskrypcyjnej modyfikacji mRNA, translacji i potranslacyjnej modyfikacji biaka. Uksztatowane w ten sposb biako mona zidentyfikowa i analizowa metodami laboratoryjnymi (np. elektroforeza biaek, badania serologiczne grupy krwi, hybrydyzacja ze znakowanym przeciwciaem itp.) lub te mona obserwowa waciwo fenotypow organizmu bdc efektem obecnoci okrelonego biaka (np. umaszczenie, obecno rogw, podatno na stres itp.). W przypadku cech uwarunkowanych przez du liczb genw o nie poznanej jeszcze funkcji (tzw. poligeny, wrd ktrych geny o dziaaniu sumujcym maj podstawowe znaczenie) fenotyp opisuje si za pomoc estymatorw statystycznych. Regulacja ekspresji genw zachodzi najczciej na poziomie transkrypcji, zatem poznanie mechanizmw odpowiedzialnych za podjcie transkrypcji przez dany gen ma znaczenie podstawowe. Naley jednak pamita, e kontrola ekspresji moe rwnie polega na potranskrypcyjnej modyfikacji mRNA, regulacji stabilnoci mRNA i jego transporcie do cytoplazmy oraz potranslacyjnej modyfikacji biaek. Modyfikacja mRNA, oprcz zmian opisanych w podrozdziale powiconym transkrypcji, obejmuje take inne procesy. Podczas wycinania intronw moliwe jest zrnicowane skadanie ostatecznego transkryptu, w skad ktrego bd wchodziy rne kombinacje eksonw. Mechanizm ten nazywa si alternatywnym skadaniem mRNA. Budowa mRNA moe by modyfikowana rwnie przez wybr miejsca terminacji transkrypcji. Zakoczenie transkrypcji zwizane jest z sekwencj AAUAAA, ktra wskazuje, e w odlegoci okoo 10-30 nukleotydw od tego miejsca powinna nastpi poliadenylacja transkryptu, czyli dobudowa60

nie sekwencji poliA (tzw. ogonek poliA) na kocu 3' mRNA. Okazuje si, e niektre geny mog mie kilka miejsc poliadenyacji i dlatego na tej samej matrycy DNA mog powstawa rne transkrypty. Przykadem takiej sytuacji jest wystpowanie dwch miejsc poliadenyacji w genie acucha cikiego immunoglobulin. Forma rozpuszczalna tego biaka powstaje na matrycy mRNA, ktry jest krtszy o dwa eksony w porwnaniu z mRNA dla formy zakotwiczonej w bonie plazmatycznej limfocytw B. Wreszcie mRNA powstay podczas transkrypcji moe ulega, przed przejciem do cytoplazmy, modyfikacjom polegajcym na zmianie sekwencji nukleotydw. Proces ten nazywa si redagowaniem mRNA. Efektem tego moe by na przykad pojawianie si w transkryptach, powstajcych w niektrych tkankach, dodatkowego kodonu stop. Funkcjonuj wwczas dwa rodzaje mRNA, powstae na bazie tego samego matrycowego DNA, odpowiedzialne za syntez polipeptydw o rnej dugoci. Tak form modyfikowania mRNA opisano m.in. w przypadku niektrych genw kodowanych przez mitochondrialny DNA (mtDNA). Intensywno procesu biosyntezy acuchw polipeptydowych zaley od liczby kopii mRNA wdrujcych z jdra do cytoplazmy oraz od czasu trwania mRNA w cytoplazmie, czyli od jego stabilnoci.

3.7.1. Czynniki transkrypcyjne


Czynnikami transkrypcyjnymi nazywane s biaka, ktre wic si z sekwencjami regulatorowymi genu umoliwiaj przyczenie polimerazy RNA i rozpoczcie transkrypcji. Biaka te w swojej strukturze zawieraj dwa istotne obszary. Jeden odpowiada za wizanie si czynnika transkrypcyjnego z waciw sekwencj nukleotydw w obrbie promotora lub wzmacniacza, a drugi obszar zaangaowany jest w czenie si z polimeraz RNA lub innymi czynnikami transkrypcyjnymi. Czynniki transkrypcyjne, zalenie od ich struktury trzeciorzdowej, s zaliczane do nastpujcych grup: biaka zawierajce tzw. palce cynkowe (ang. zinc finger), biaka o strukturze typu heliks-skrt-heliks (ang. helix-turn-helix) i biaka o strukturze okrelanej terminem zamek leucynowy (ang. leucine zipper). Wymienione struktury wchodz w kontakt z nici DNA. Ekspresja genw kodujcych czynniki transkrypcyjne moe zalee od innych czynnikw transkrypcyjnych lub pozostawa pod kontrol stymulatorw pozakomrkowych, takich jak hormony. Sposb oddziaywania hormonw na ekspresj genw jest zrnicowany (ry. 3-7). W przypadku hormonw steroidowych regulacja ekspresji genw przebiega z udziaem receptorw wewntrzkomrkowych. Hormon steroidowy po wnikniciu do komrki czy si z waciwym biakiem receptorowym. Kompleks hormon-receptor wnika do jdra komrkowego i tam wie si z sekwencjami regulatorowymi genu docelowego lub genu kodujcego odpowiedni czynnik
61

Ry. 3-7. Schemat regulacji ekspresji genw za pomoc hormonw. Oznaczenia: HP hormon peptydowy, HS hormon steroidowy, R receptor hormonu peptydowego, RS receptor hormonu steroidowego, T1 T2 przekaniki wewntrzkomrkowe, Pl P2 promotory genw, Gj, G2 czci strukturalne genw

transkrypcyjny uczestniczcy w regulacji ekspresji kolejnego genu. Receptor hormonu steroidowego ma domen wic DNA oraz domen wic hormon. Domena wica DNA jest aktywna tylko wwczas, gdy do receptora jest przyczony hormon steroidowy. Hormony peptydowe (np. hormon wzrostu, insulina itp.) nie wnikaj do wntrza komrki, a jedynie wi si z receptorami bonowymi. Wizanie takie wywouje wiele reakcji. W ich wyniku sygna zostaje przeniesiony od zaktywowanego receptora bonowego do jdra komrkowego za pomoc wewntrzkomrkowych przekanikw, ktrych mechanizm dziaania jest jeszcze sabo rozpoznany, lub te z udziaem przekanikw modyfikujcych biaka w cytoplazmie, co mona uzna za regulacj ekspresji genw na etapie potranslacyjnym.

3.7.2. Geny homeotyczne


Uksztatowanie si wielokomrkowego organizmu z jednokomrkowej zygoty zaley z jednej strony od intensywnych podziaw komrkowych, a z drugiej strony od rnicowania si komrek. Poznanie genw od62

powiedzialnych za rozwj zarodkowy i podowy ma podstawowe znaczenie dla zrozumienia podoa licznych wrodzonych wad rozwojowych. Postp w tym obszarze wiedzy osignito dziki badaniom prowadzonym na muszce owocowej. Rozwj muszki owocowej przebiega pod kontrol genw, ktre odpowiadaj za poszczeglne etapy morfogenezy. Geny te funkcjonuj w ukadzie hierarchicznym, tzn. ich ekspresja nastpuje w cile okrelonej kolejnoci. Najpierw uaktywniaj si geny odpowiedzialne za orientacj zarodka na cz przedni i tyln. Nastpnie kilka grup genw kieruje uksztatowaniem si segmentw ciaa wzdu osi podunej. Wreszcie za rnicowanie si poszczeglnych segmentw odpowiadaj geny homeotyczne, ktre w genomie muszki owocowej wystpuj w dwch kompleksach, ANT-C i BX-C, pooonych w jednym chromosomie. Pierwszy segment zawiera geny odpowiedzialne za rnicowanie gowy i przedniej czci tuowia, a drugi za rnicowanie tylnych segmentw tuowia i segmentw odwoka. W obrbie kompleksu loci genw uoone s w porzdku wczania ich ekspresji. Ekspresja kolejnych genw odpowiada za rnicowanie si kolejnych segmentw ciaa. Struktura tych genw wykazuje zaskakujce podobiestwo. Okazao si, e maj one sekwencj o dugoci okoo 180 pz (tzw. homeoboks), ktra koduje fragment biaka (tzw. domena biakowa) o dugoci 60 aminokwasw. Domena ta jest odpowiedzialna za utworzenie struktury charakterystycznej dla czynnikw transkrypcyjnych typu heliks-skrt-heliks. Geny o podobnej budowie i funkcji zidentyfikowano take u krgowcw i nazwano je genami HOX. U ssakw geny te, w liczbie okoo 30, zgrupowane s w czterech kompleksach: HOX1, HOX2, HOX3 i HOX4.

3.7.3. Metylacja DNA


Wanym procesem wpywajcym na ekspresj genw jest modyfikacja struktury DNA, ktra polega przede wszystkim na przyczaniu grupy metylowej do cytozyny. Metylacja wywouje zmian powinowactwa DNA do czynnikw transkrypcyjnych oraz reorganizacj nici nukleosomowej, czego skutkiem jest przejcie DNA w stan nieaktywny. Oznacza to, e metylacja DNA w sekwencjach regulatorowych moe mie istotne znaczenie dla ekspresji genu. Prawie cay DNA zawiera zmetylowan cytozyn, a wyjtek stanowi dinukleotydy CpG (wysepki CpG) wystpujce w obrbie promotorw w genach aktywnych transkrypcyjnie. Do promotorw majcych niezmetylowan cytozyn w wysepkach CpG mog si przyczy czynniki transkrypcyjne niezbdne do ekspresji genu. Trzeba jednak podkreli, e nie wszystkie geny maj w obrbie promotora sekwencje CpG szacuje si, e okoo 56% genw zawiera te sekwencje. Wynika z tego, e brak metylacji wysepek CpG nie jest uniwersalnym sposobem uaktywniania ekspresji genw. Obok wielu genw, ktrych transkrypcja jest hamowana poprzez metylacj cytozyny w nukleotydach wystpujcych
63

w czci poprzedzajcej gen, czyli ze strony koca 5', znane s liczne geny, dla ktrych nie obserwuje si zalenoci midzy transkrypcj i metylacj DNA. Metylacja cytozyny nie narusza komplementarnoci wizania z guanin, czyli nie wpywa na prawidowo replikacji wysepek CpG. Po replikacji nowo wbudowane nukleotydy zawierajce cytozyn podlegaj metylacji, wwczas gdy w matrycowej czsteczce DNA naprzeciw guaniny wystpowaa metylowana cytozyna. Stan metylacji DNA badany jest z uyciem dwch enzymw restrykcyjnych. Jeden z nich - HpaII przecina sekwencj CCGG, w ktrej cytozyny nie s metylowane, a drugi MspI przecina t sekwencj niezalenie od tego, czy cytozyna jest metylowana, czy niemetylowana.

3.7.4. Pitno gametyczne


W klasycznym podejciu do zagadnienia ekspresji genw przyjmuje si rwnowano alleli w parze, tzn. genotyp Aa jest rwnowany genotypowi aA, czyli nieistotne jest, od ktrego z rodzicw pochodzi allel A, a od ktrego allel a. Jednak w przypadku niektrych genw stwierdza si zrnicowan ekspresj, zalen od tego, czy allel pochodzi od ojca, czy od matki. Zjawisko to niekiedy dotyczy caych regionw chromosomowych, ktre mog by nieaktywne, gdy pochodz np. od matki, lub aktywne, jeli pochodz od ojca. Pitnowanie alleli czy caych regionw chromosomu zwizane jest prawdopodobnie z metylacj DNA i wystpuje podczas gametogenezy (ang. gametic imprinting). Pitno utrzymuje si podczas rozwoju zarodkowego i podowego, a take w komrkach somatycznych organizmu dorosego. Dopiero podczas gametogenezy dotychczasowe pitno gametyczne zostaje zniesione i ustala si wzr pitna, typowy dla danej pci (ry. 3-8). Dowd na to, e do rozwoju osobniczego niezbdny jest zarwno genom ojca, jak i genom matki, a nie tylko diploidalna liczba chromosomw, znaleziono przy okazji obserwacji rozwoju partenogenetycznych zarodkw myszy. Powstae na drodze manipulacji zarodki ginogenetyczne, tzn. zawierajce dwa genomy eskie, rozwijay si do dobrze, z tym jednak e struktury wywodzce si z trofoblastu, czyli uczestniczce w formowaniu oyska, byy zdecydowanie niedorozwinite. Natomiast zarodki androgenetyczne, tzn. majce dwa genomy mskie, dobrze rozwijay struktury trofoblastu, niedorozwinity za by sam zarodek. W obu przypadkach dochodzio do obumarcia zarodka. Jedynie zarodki zawierajce zarwno genom eski, jak i mski rozwijay si prawidowo. Pitno gametyczne prowadzi do zrnicowanego fenotypowo ujawnienia si niektrych mutacji chromosomowych, w ktre zaangaowane s fragmenty podlegajce pitnowaniu. Przykadem niech bdzie delecja fragmentu przycentromerowego ramienia dugiego chromosomu 15 (delecja 15ql-q3) u ludzi. Jeli pacjent odziedziczy tak uszkodzony chromosom od ojca, to
64

ZYGOTA
2ENSKA

M P ZYGOT-A MSKA

Ry. 3-8. Pitnowanie gametyczne. Fragment podlegajcy pitnowaniu w spermatogenezie jest zaciemniony, a fragment pitnowany w oogenezie jest zaznaczony kolorem czerwonym. P chromosom pochodzcy od ojca, M chromosom pochodzcy od matki

wwczas rozwija si zesp zmian fenotypowych (m.in. otyo i niedorozwj umysowy), ktry nosi nazw zespou Pradera-Willego. Natomiast odziedziczenie takiej samej mutacji od matki wywouje zesp zmian (m.in. gbokie upoledzenie umysowe, brak mowy, drgawki) okrelanych jako zesp Angelmana. Przyjmuje si, e fragment chromosomu 15 podlega pitnowaniu gametycznemu. W zespole Pradera-Willego stan jest nastpujcy: brakuje fragmentu w chromosomie odziedziczonym od ojca, a odpowiedni homologiczny fragment w chromosomie pochodzcym od matki nie podlega ekspresji. W efekcie pacjent nie ma adnej aktywnej kopii genw wystpujcych w czci chromosomu objtego delecj. Podobna sytuacja powstaje, gdy paq"ent ma dwie kopie tego fragmentu chromosomowego pochodzce od matki (matczyna disomia). W zespole Angelmana brakuje fragmentu chromosomu 15 pochodzenia matczynego, a ekspresja odpowiadajcego fragmentu chromosomu ojcowskiego jest wyczona lub pacjent ma dwie ojcowskie kopie tego fragmentu chromosomowego (disomia ojcowska). Wiadomo, e w zespole Pradera-Willego wystpuje utrata ekspresji wielu genw pochodzenia ojcowskiego, podczas gdy w zespole Angelmana dotyczy to waciwie tylko jednego genu (UBE3A ang. ubiquitin protein ligase E3) pochodzenia matczynego. Wynika z tego, e w krytycznym regionie 15ql-15q3 inny fragment jest pitnowany w gametogenezie mskiej, a inny w gametogenezie eskiej. Tak wic, tylko jeden gen UBE3A nie podlega ekspresji, jeli pochodzi od ojca, natomiast kilka genw (m.in. gen SNRPN ang. smali nuclear ribonucleoprotein polypep65

tide N), nie ulega ekspresji, jeli s pooone w chromosomie pochodzcym od matki. W zygocie oraz we wszystkich potomnych pokoleniach komrek somatycznych stan napitnowania genu (-w) jest utrzymywany. Moe si jednak zdarzy, e gen napitnowany podczas gametogenezy bdzie powtrnie pitnowany podczas rozwoju osobniczego. Naoenie si obu rodzajw pitnowania oraz obecno tkankowe specyficznego biaka (czynnik transkrypcyjny) regulujcego ekspresj genu prowadzi do ostatecznego uksztatowania si wzoru ekspresji genu w kolejnych stadiach rozwojowych i odpowiednich tkankach. Przykadem moe by gen Igf2 (ang. insulin growth factor type 2) u myszy, ktry podlega pitnowaniu podczas gametogenezy eskiej. W genie tym wystpuj dwa regiony, ktre podlegaj metylacji. W stadium przedimplantacyjnym zarodka oba allele (ojcowski i matczyny) podlegaj ekspresji, a w zarodkach starszych oraz komrkach osobnika dorosego wystpuje monoalleliczna ekspresja genu matczynego. Sytuacja ta jest spowodowana tym, e pitnowanie w gametogenezie eskiej prowadzi do metylacji miejsca, do ktrego nie moe si przyczy biako (represor), wywoujce zahamowanie transkrypcji. W efekcie oba allele s transkrybowane. Podczas wtrnego pitnowania dochodzi do metylacji fragmentu promotora genu ojcowskiego, co oczywicie uniemoliwia przyczenie czynnikw transkrypcyjnych, niezbdnych do podjcia transkrypcji. Powoduje to wstrzymanie ekspresji allelu ojcowskiego. Szczegowe badania przeprowadzone u myszy ujawniy obecno wielu regionw chromosomowych, ktre s objte zjawiskiem pitnowania gametycznego. Na przykad, due fragmenty chromosomu 7, a take 11 i 12 podlegaj pitnowaniu. Obecnie znane s 34 geny, ktre podlegaj pitnowaniu gametycznemu u myszy.

3.7.5. Inaktywacja chromosomu X w zarodkach eskich


Szczeglnym przykadem trwaej inaktywacji duej czci chromatyny jest fenomen zwizany z inaktywacj jednego z chromosomw X w zarodkach eskich. W komrkach mskich wystpuje tylko jeden chromosom X, obok chromosomu Y. Stan taki okrelany jest terminem hemizygotycznoci. W komrkach eskich wystpuj dwa chromosomy X, ale podobnie jak w komrkach mskich tylko jeden chromosom X wykazuje aktywno transkrypcyjn. Okazao si, e inaktywacj chromosomu X jest form pitnowania, ktre zachodzi podczas wczesnego rozwoju zarodkowego. W momencie przejcia kontroli nad rozwojem zarodka przez jego wasny genotyp oba chromosomy X s aktywne w zarodkach eskich (ukad XX). W momencie przechodzenia ze stadium moruli do stadium blastocysty nastpuje losowa inaktywacj jednego z chromosomw X, czyli aktywny pozostaje albo chromosom pochodzenia ojcowskiego, albo matczynego.
66

Wzr inaktywacji jest nastpnie utrzymany we wszystkich komrkach potomnych. W konsekwencji organizm eski jest swoist mozaik, w ktrej cz komrek ma aktywny chromosom pochodzenia ojcowskiego, a cz pochodzenia matczynego (ry. 3-9). Inaktywowany chromosom X podlega kondensacji (heterochromatynizacji) w jdrze interfazowym, a jego obecno ujawnia si w postaci tzw. ciaka Barra. W cyklu yciowym komrki chromosom ten podlega typowym przemianom zwizanym z okresow kondensacj (przed i w trakcie podziau jdra komrkowego) i niepen dekondensacj (podczas interfazy). Rozrnienie aktywnego i nieaktywnego chromosomu X w metafazie mitotycznej jest moliwe po zastosowaniu metody barwienia prkami R, ktre odzwierciedlaj tempo replikacji poszczeglnych regionw chromosomowych. Barwienie to pokazuje, e nieaktywny chromosom X jest replikowany w pnym okresie fazy S. Proces inaktywacji rozpoczyna si od miejsca okrelanego jako centrum inaktywacji chromosomu X. Wiadomo, e w ludzkim chromosomie X centrum to wystpuje w ramieniu dugim w obrbie prka Xql3. W centrum inaktywacji zidentyfikowano locus Xist (ang. X inactive specific transcript), ktry peni gwn rol w uruchomieniu inaktywacji. Pocztkowo ekspresji podlega tylko gen Xist pooony w chromosomie ojcowskim i to odbywa si jeszcze przed rozpoczciem procesu inaktywacji chromosomu X. Pniej, ekspresja genu Xist pojawia si losowo, albo w chromosomie ojcowskim, albo matczynym. W lad za ekspresj genu Xist w jednym z chromosomw X przebiega stopniowo inaktywacja kolejnych regionw tego chromosomu. Inaktywacja jest zwizana z metylacj DNA danego chromosomu, ktry to stan jest utrzymywany w komrkach potomnych. Warto zaznaczy, e produktem locus Xist jest niekodujcy RNA (ncRNA). Spenia on funkcj regulacyjn, w zakresie zmiany struktury chromatyny inaktywowanego chromosomu X.

Rozdzia

4.1. Endonukleazy restrykcyjne


Analiza materiau genetycznego moe by przeprowadzana bezporednio w komrkach (tzw. metody in situ) bd w wyizolowanym DNA lub RNA. Wikszo metod wymaga fragmentacji (pocicia; strawienia) DNA, co umoliwia np. wyizolowanie okrelonego odcinka DNA lub podzielenie czsteczki DNA danego organizmu na krtsze fragmenty do dalszych szczegowych bada. W celu przecicia czsteczki DNA w cile okrelonym miejscu stosowane s izolowane z bakterii endonukleazy restrykcyjne, nazywane inaczej enzymami restrykcyjnymi bd restryktazami. Endonukleazy restrykcyjne su bakteriom do obrony przed inwazj wirusw, niszczc niepodane, obce czsteczki DNA. W celu ochrony wasnego DNA przed dziaaniem restryktaz, bakterie wyksztaciy system restrykcji-modyfikacji. System ten polega na tym, e bakterie wytwarzaj dwa rodzaje enzymw. Jeden to endonukleazy, rozpoznajce i przecinajce (inaczej trawice) okrelone sekwencje nukleotydw, drugi to metylotransferazy (zwane te metylazami), ktre rozpoznaj te same sekwencje nukleotydw i modyfikuj (metyluj) je tak, by nie zostay przecite przez endonukleazy. Poniewa obcy, np. wirusowy, DNA nie jest odpowiednio oznaczony (zmetylowany), niszczony jest przez endonukleazy bakterii. Obecnie znanych jest ju ponad 1000 restryktaz (w handlu dostpnych jest ponad 200) i tyle samo metylaz. Nazewnictwo endonukleaz tworzone jest w ten sposb, e pierwsza litera stanowi skrt nazwy rodzaju bakterii, druga i trzecia gatunku, nastpnie moe by rwnie stosowana litera okrelajca nazw szczepu lub serotypu bakterii, ponadto podawana jest cyfra rzymska oznaczajca numer kolejny enzymu wyizolowanego z danego gatunku bakterii. Na przykad, enzym HindIII pochodzi z bakterii Haemophilus influenzae, serotyp d i jest to trzeci (III) z kolei enzym uzyskany od tego gatunku i serotypu bakterii. Endonukleazy dzieli si na trzy klasy, w zalenoci od ich mechanizmu dziaania, substratw i produktw, a take kofaktorw. Do klasy I enzymw 69

zaliczane s te restryktazy, ktre wykazuj aktywno nukleazy, a ich dziaanie zaley od obecnoci takich kofaktorw, jak ATP, jony magnezu (Mg2+) i S-adenozylometionina. Cech tych enzymw, utrudniajc ich wykorzystywanie w analizie DNA, jest to, i wprawdzie rozpoznaj specyficzne sekwencje nukleotydw, ale przecinaj czsteczk DNA niespecyficznie w pewnej odlegoci (nawet do 1000 nukleotydw) od rozpoznanej sekwencji. Klas III stanowi restryktazy majce podobne waciwoci do restryktaz klasy I, czyli wymagaj obecnoci ATP i Mg2+ (obecno Sadenozylometioniny nie jest niezbdna, ale wzmacnia ich aktywno). Rnica midzy tymi dwiema klasami polega na tym, e odlego sekwencji rozpoznanej od sekwencji przecinanej przez enzym klasy III jest dla danego enzymu staa i wynosi rednio 25 nukleotydw. Przykady endonukleaz klasy I i III zawarte s w tabeli 4-1.
Tabela 4-1
Przykady enzymw restrykcyjnych

70

Najbardziej przydatne w analizie materiau genetycznego s enzymy restrykcyjne zaliczane do klasy II (przykady w tab. 4-1). Enzymy te rozpoznaj najczciej sekwencje DNA zoone z 4 lub 6, rzadziej 8 nukleotydw, charakteryzujce si dwustronn symetri (tzw. sekwencje palindromowe). Niektre enzymy przecinaj czsteczk DNA w miejscach znajdujcych si naprzeciw siebie, dajc fragmenty majce tzw. tpe koce. Jednak wikszo endonukleaz przecina czsteczki DNA w dwch rnych miejscach, czego konsekwencj jest powstawanie fragmentw DNA o tzw. lepkich kocach. Koce te uatwiaj czenie fragmentw DNA ze sob w procesie rekombinacji molekularnej. Fragmenty o tpych i lepkich kocach wygldaj nastpujco: Enzym Thal (pochodzcy z bakterii Thermoplasma acidophilum) rozpoznaje i tnie sekwencj:

Niektre enzymy, mimo e pochodz z rnych szczepw bakterii, rozpoznaj te same sekwencje DNA. S to izoschizomery. Jednak miejsca, w ktrych enzymy przecinaj te sekwencje, mog by rne.

Izoschizomery Smal (Serratia marcescens) i Xmal (Kanthomonas mafaacearum)

przecinaj rozpoznan sekwencj w rnych miejscach:

od rozpoznawanej sekwencji. Na przykad enzym MboII (Moraxella bovis) tnie czsteczk DNA nastpujco: 5'...GAAGA(N)8'...3' 3'...CTTCT(N)7...5'
podobnie enzym FokI (Flavobacterium okeanokoites):

5'...GGATG(N)9'...3' 3'...CCTAC(N)13...5' Ponadto wikszo endonukleaz klasy II przecina dwuniciowe czsteczki DNA, a tylko nieliczne enzymy (np. HinPI) tn jednoniciowy DNA. Warunki optymalne dla aktywnoci poszczeglnych enzymw restrykcyjnych rni si przede wszystkim temperatur, w ktrej mieszanina DNA z enzymem jest inkubowana, oraz skadem buforu. Niektre enzymy potrzebuj takich samych buforw. Dokadne informacje o tych warunkach dostarczane s wraz z enzymami przez firmy biotechnologiczne. Wykrycie bakteryjnych enzymw restrykcyjnych miao ogromne znaczenie dla rozwoju technik molekularnych. S one podstawowym narzdziem, wykorzystywanym m.in. do sporzdzania map genomowych, sekwencjonowania DNA, izolacji i identyfikacji genw, klonowania molekularnego i rekombinacji genw czy fragmentw genomu, diagnostyki chorb genetycznych (wykrywanie mutacji genowych) lub w analizie polimorfizmu dugoci fragmentw restrykcyjnych DNA (RFLP).

4.2. Wektory
Wektory s podstawowym narzdziem klonowania DNA. Wprowadzenie (transformacja) fragmentu DNA do komrki biorcy nastpuje za porednictwem wektora, do ktrego fragment ten zosta uprzednio wczony (rekombinacja molekularna). W zarysie klonowanie polega na namnoeniu fragmentu DNA w komrkach mikroorganizmw (gwnie bakterii). Wektor (np. plazmidowy, fagowy, drodowy) jest zdolny do autonomicznej replikacji. Wektory charakteryzuj si nastpujcymi cechami: s to niewielkie czsteczki DNA, opisane pod wzgldem fizycznym i genetycznym, majce zdolno do samodzielnej replikacji w cytoplazmie gospodarza, maj miejsca rozpoznawane przez rne endonukleazy restrykcyjne (uzyskanie lepkich kocw), miejsce rozpoznania przez enzym restrykcyjny nie powinno si znajdowa w takim rejonie czsteczki, ktrego uszkodzenie powodowaoby zaburzenie moliwoci jej replikacji, powinny mie jeden lub kilka silnych promotorw tak, aby wstawiajc
72

w ich ssiedztwo fragment obcego DNA mona byo uzyska efektywn ekspresj wprowadzonych genw, zawieraj znaczniki (markery), za pomoc ktrych mona je ziden tyfikowa, np. geny opornoci na antybiotyki, nie s zdolne do przeycia poza komrk gospodarza, ze wzgldw etycznych wektor nie powinien mie genw, kor mog stanowi zagroenie ekologiczne.
RODZAJE WEKTORW

Wektorami najczciej uywanymi do klonowania DNA w komrkach prokariotycznych s bakteriofagi (fagi), plazmidy i kosmidy.
Wektory plazmidowe

Plazmidami s wystpujce u wielu gatunkw bakterii kowalentnie zamknite koliste czsteczki DNA. Plazmidy stosowane w technice klonowania jako wektory s specjalnie konstruowane z fragmentw naturalnych plazmidw bakteryjnych. Wektor plazmidowy musi zawiera region inicjacji replikacji DNA replikon oznaczony symbolem ori, gen opornoci na antybiotyk, umoliwiajcy bakteriom transformantom rozwj na poywce zawierajcej antybiotyk. Wikszo wektorw plazmidowych ma wstawiony syntetyczny oligonukleotyd, polilinker" (miejsce wielokrotnego klonowania), ktrego sekwencje s rozpoznawane przez wiele enzymw restrykcyjnych. Dziki temu w wektor taki mona wstawia odcinki klonowanego DNA uzyskane przez trawienie odpowiednimi enzymami. Do niektrych wektorw wprowadzono sekwencj umoliwiajc atw identyfikacj zrekombinowanych bakterii. Najczciej jest to gen kodujcy enzym, rozkadajcy barwny substrat, np. gen -galaktozydazy oznaczony symbolem lacZ. Metoda selekcji rekombinantw zostanie omwiona w podrozdziale: Rekombinacja molekularna i klonowanie. Przykadowy wektor plazmidowy pUC19, ktry ma dugo 2686 par zasad, przedstawiony jest na rycinie 4-1.
Kosmidy

Kosmid jest plazmidem zmodyfikowanym przez dodanie do niego sekwencji cos z faga . Dziki temu kosmidy cz zalety wektorw plazmidowych i fagowych. Sekwencja cos umoliwia upakowanie DNA faga w otoczk biakow. Kosmidy su do klonowania wikszych czsteczek DNA, dugoci 10-40 kpz, i dlatego s wykorzystywane w badaniach wielu genw eukariotycznych oraz do tworzenia bibliotek genomowych.
Wektory fagowe

Spord wektorw fagowych najwiksze znaczenie ma fag . Za pomoc modyfikacji molekularnych (np. eliminacja miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne) otrzymano wiele pochodnych tego faga. Podobnie jak
73

Ry. 4-1. Schemat wektora plazmidowego pUC19. Zaznaczono miejsca restrykcyjne dla niektrych endonukleaz

w przypadku wektorw plazmidowych, do wektorw fagowych wprowadzono polilinkery, geny markerowe i silne promotory. Wektory fagowe s stosowane do klonowania fragmentw DNA mniejszych ni w wektorach plazmidowych, ale efektywno tego dziaania jest wiksza.
Sztuczny chromosom bakteryjny (BAC)

Do klonowania dugich fragmentw DNA (100-300 kpz) jest wykorzystywany sztuczny chromosom bakteryjny BA (ang. bacterial artificial chromosome) skonstruowany na bazie plazmidowego czynnika F bakterii E. coli. Do klonowania fragmentw DNA w organizmach eukariotycznych (np. drodach, komrkach ssakw) stosowane s:
Wektory pochodne wirusw

Pochodne niektrych wirusw s wektorami stosowanymi do wprowadzania DNA do komrek rolinnych i zwierzcych. W przypadku komrek zwierzcych s to pochodne wirusw SV40, Papilloma, krowianki, bakulowirusw, adenowirusw i retrowirusw. Najwczeniej by stosowany wirus SV40, ktrego zalet jest dua wydajno uzyskiwania zrekombinowanego genu, wad natomiast organiczona dugo wbudowanego obcego DNA. Obecnie coraz czciej stosuje si retrowirusy zapewniajce du efektywno transfekcji (transfekcja jest to wprowadzanie fragmentw DNA do komrek eukariotycznych). S one rwnie stosowane w somatycznej terapii rnych schorze.
Wektory drodowe

Wektory te wykazuj zdolno replikacji tak w komrkach drody, jak


74

i komrkach bakteryjnych. Zdolno ta wynika z wystpowania odrbnych sekwencji startu replikacji i genw markerowych. Typowy wektor drodowy jest skonstruowany z czci prokariotycznej (zawiera sekwencj ori i marker selekcyjny) i eukariotycznej (zawiera sekwencj ori rozpoznawan przez polimeraz eukariotycznego gospodarza, marker selekcyjny i sekwencje umoliwiajce ekspresj genu). Taka konstrukcja pozwala na klonowanie genw w E. coli, a nastpnie badanie ich ekspresji w drodach. Do wektorw tych nale take sztuczne chromosomy drodowe YACs (ang. yeast artificial chromosomes), skonstruowane po raz pierwszy w 1983 roku. S one stosowane do klonowania bardzo dugich fragmentw DNA, do 5 milionw par zasad. S take wykorzystywane m.in. w budowie map genomowych. Oprcz sekwencji typowych dla wektorw drodowych, sztuczne chromosomy drodowe maj sekwencje umoliwiajce replikacj chromosomw i ich segregacj w trakcie podziaw mitotycznych.
Sztuczne chromosomy ludzkie

Po skonstruowaniu sztucznego chromosomu drody rozpoczto intensywne prace nad konstrukcj ludzkiego sztucznego chromosomu HAC (ang. human artificial chromosome). Byo to moliwe dziki poznaniu sekwencji telomerowych chromosomw i sekwencji, od ktrych zaczyna si replikacja czsteczki DNA. O wiele wikszym problemem okazao si wydzielenie czci chromosomu nazwanej centromerem. Dotychczasowe badania zaowocoway skonstruowaniem sztucznego chromosomu ludzkiego zoonego z telomerowego DNA, fragmentw DNA rozpoczynajcych replikacj oraz, zamiast centomerowego DNA, -satelitarnego DNA (sekwencja powtarzajca si, dugoci 171 par zasad) (ry. 4-2). Wszystkie te fragmenty DNA zostay wprowadzone do komrek ludzkiej linii nowotworowej, hodowanych in vitro. Komrki te, w przeciwiestwie do komrek prawidowych, maj zdolno nieograniczonej liczby podziaw. Uzyskany dotychczas sztuczny chromosom, nazwany mikrochromosomem, rni si znacznie od chromosomu funkcjonalnego. Jeeli konstrukcja sztucznego chromosomu ludzkiego zakoczy si powodzeniem, chromosomy te (HACs) bd mogy by uyteczne do badania ekspresji genw oraz jako wektory stosowane w terapii genowej (dostarczanie genw do komrek somatycznych in vivo).

75

4.3. Rekombinacja molekularna i klonowanie


Rekombinacja molekularna, bdca podstawow metod inynierii genetycznej, polega na czeniu ze sob rnych czsteczek DNA lub RNA. Metoda rekombinacji DNA umoliwia uzyskanie za pomoc klonowania bardzo duej liczby kopii wybranego fragmentu DNA. Klonowaniem molekularnym nazywamy replikacj w komrkach biorcy (np. bakterii) zrekombinowanych wektorw zawierajcych DNA dawcy, uzyskany za pomoc jednej z nastpujcych metod: wycicie odpowiedniego fragmentu DNA dawcy za pomoc enzymw restrykcyjnych, wyizolowanie z komrek dawcy okrelonego rodzaju mRNA, stano wicego transkrypt pojedynczego genu, a nastpnie zastosowanie reakcji odwrotnej transkrypcji (przepisanie sekwencji mRNA na komplementarn sekwencj mRNA cDNA), chemiczna synteza fragmentu DNA. Ligacja. Fragment DNA, ktry zamierzamy sklonowa, musi by poczony z odpowiednim wektorem. By poczenie to byo moliwe, konieczny jest wytwarzany przez bakterie enzym nazwany ligaz DNA. In vivo ligaz bierze udzia w procesie replikacji DNA oraz naprawie uszkodze DNA, katalizujc powstawanie wiza fosfodiestrowych midzy nukleotydami. Dziki swym waciwociom ligaz bierze udzia w tworzeniu wiza midzy czsteczkami DNA pochodzcymi od -rnych organizmw. Do rekombinowania DNA stosowana jest ligaz, ktr uzyskuje si z komrek Escherichia coli zakaonych fagiem T4 (ligaz jest kodowana przez gen tego faga). Ligaz ma zdolno czenia ze sob fragmentw o kocach zarwno lepkich, jak i tpych, jednak wydajno tego procesu jest wiksza w przypadku kocw lepkich. Z reguy do przecicia wektora uywany jest ten sam enzym restrykcyjny, ktrym by trawiony DNA. Transformacja. W celu wprowadzenia zrekombinowanych czsteczek DNA do komrki bakteryjnej wykorzystywana jest naturalna zdolno wielu bakterii do pobierania czsteczek DNA z podoa. Waciwo t odkry w 1928 roku Griffith w dowiadczeniu na myszach zaraanych dwoink zapalenia puc. Bakteria E. coli, ktra jest czsto uywana w biologii molekularnej, nie ma zdolnoci pobierania czsteczek DNA z podoa. Dlatego wprowadzenie czsteczek DNA do jej wntrza musi by dokonane na drodze indukcji chemicznej (destabilizowanie bony komrkowej jonami wapnia inkubacja komrek z CaCl2 w temperaturze bliskiej 0C) bd elektroporacji (dziaanie impulsw pola elektrycznego w urzdzeniu zwanym elektroporatorem). Wydajno transformacji zaley od stosowanej metody, w pierwszym przypadku (dziaanie jonami wapnia) moliwe jest uzyskanie okoo 106 transformantw z l g zrekombinowanego DNA, w drugim natomiast znacznie wicej, maksymalnie do 1010.
76

Wprowadzenie zrekombinowanych czsteczek DNA do komrek eukariotycznych nosi nazw transfekcji. Jest kilka metod transfekcji, m.in. mikroiniekcji DNA, elektroporacji oraz indukcji chemicznej fosforanem wapnia lub dekstranem. Selekcja transformantw (bakterii, ktre zawieraj zrekombinowany wektor). Jedna z metod selekcji transformantw wykorzystuje zjawisko komplementacji. Jest ona moliwa do stosowania w przypadku wektora plazmidowego z serii pUC. Waciwie mona mwi o dwustopniowej selekcji komrek bakterii po transformacji. Pierwsza zachodzi podczas hodowli bakterii na poywce zawierajcej antybiotyk. Poniewa wektor plazmidowy ma gen opornoci na antybiotyk, uzyskuje si wzrost kolonii bakterii, ktre maj wektor. Drugi etap selekcji umoliwia odrnienie komrek zawierajcych zrekombinowany wektor od komrek z wektorem niezrekombinowanym (ry. 4-3). Wektory z serii pUC maj promotor genu -galaktozydazy (enzym ten jest kodowany przez gen oznaczony symbolem lacZ) i sekwencj kodujc N-kocow cz tego biaka (fragment alfa galaktozydazy). Z kolei stosowane do transformacji komrki bakterii dostarczaj C-kocow sekwencj genu lacZ (fragment omega). W wyniku poczenia, po pobraniu przez bakteri wektora, obu sekwencji genu lacZ (zjawisko -komplementacji) (ry. 4-3) powstaje funkcjonalny gen -galaktozydazy. Dziki syntezie tego enzymu kolonie bakterii zawierajcych plazmid, hodowane na podou z chromogenem X-gal, bd miay barw

Ry. 4-3. Zasady -komplementacji (poczenie fragmentw genu lacZ z plazmidu i bakterii) synteza funkcjonalnego genu enzymu -galaktozydazy

77

niebiesk. Jeeli do wektora (w obrb polilinkera znajdujcego si w czci plazmidowej" genu lacZ) zostanie wprowadzony obcy fragment DNA, synteza N-kocowej czci (-galaktozydazy zostanie zablokowana, co spowoduje brak syntezy aktywnego biaka i biae zabarwienie kolonii bakterii zawierajcych zrekombinowany wektor.

4.4. Amplifikacja DNA za pomoc acuchowej reakcji polimerazy (PCR)


acuchowa reakcja polimerazy PCR (ang. polymerase chain reaction) jest podstawow technik badawcz i diagnostyczn wykorzystujc zdolno DNA do replikacji. Reakcja ta jest katalizowana, podobnie jak to si dzieje w komrkach, przez polimerazy DNA, zwane take replikazami. acuchowa reakcja polimerazy znana jest od ponad 10 lat, a jej twrc by Kary Mullis, ktry za swoje badania otrzyma Nagrod Nobla w roku 1993. O ogromnym znaczeniu tej metody decyduje to, i umoliwia ona analiz DNA nawet w przypadku bardzo maej jego iloci (np. w kryminalistyce lady krwi). PCR jest enzymatyczn metod amplifikacji (powielania) okrelonych sekwencji DNA, a jej czuo pozwala na zwielokrotnienie (uzyskanie wielu milionw kopii) cile okrelonych sekwencji DNA, mimo obecnoci innych sekwencji. Mona amplifikowa poszukiwane odcinki DNA, dysponujc DNA wyizolowanym nawet z pojedynczych komrek. Jednak najlepszy DNA do celw diagnostycznych uzyskujemy, gdy pochodzi z minimum 103 komrek. Z reguy amplifikacja okrelonego fragmentu DNA jest moliwa wtedy, gdy znana jest jego sekwencja nukleotydowa, na podstawie ktrej syntetyzowane s krtkie, zazwyczaj okoo dwudziestonukleotydowe oligonukleotydy, tzw. startery (ang. primer), komplementarne do badanego DNA (jeden starter do jednej, drugi do drugiej nici). Aby moga zaj acuchowa reakcja polimerazy, niezbdne s nastpujce warunki: obecno jednoniciowej matrycy DNA (badany dwuniciowy DNA jest rozdzielany na dwie nici przez denaturacj termiczn, proces ten nazywany jest inaczej topnieniem), wspomnianych ju starterw, trifosforanw deoksynukleotydw (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz enzymu polimerazy DNA. Konieczny jest rwnie bufor reakcyjny uzupeniajcy niezbdne do aktywnoci enzymu jony metali (potasu i magnezu). Trifosforany w trakcie amplifikacji uczestnicz w wyduaniu sekwencji starterw zgodnie z regu komplementarnoci zasad azotowych wzgldem amplifikowanej nici DNA. Enzym katalizujcy reakcj Taq polimeraza DNA pochodzi z bakterii Thermus aquaticus, yjcej w gorcych rdach. Dlatego polimeraza (nazwana od skrtu gatunku bakterii Taq polimeraza) zachowuje sw aktywno nawet w bardzo wysokiej temperaturze (> 90C). Zanim wykryto ten enzym, przeprowadzenie reakcji amplifikacji byo ogromnie
78

pracochonne i wymagao wielokrotnego dodawania enzymu. Obecnie moe by stosowana take inna polimeraza, PrimeZyme, pochodzca z innej termofilnej bakterii Thermus brockianus. Reakcja amplifikacji DNA skada si z powtarzajcych si cykli, a kady z nich przebiega w trzech etapach (ry. 4-4): 1 denaturacja dwuniciowego DNA (ang. denaturation), zachodzca w temperaturze 92-96C (zalenie od rodzaju probwki i termocyklera, ktrym jest termostat z automatycznie zmieniajc si temperatur); 2 przyczenie (ang. annealing) starterw do komplementarnych sekwencji na zdenaturowanej matrycy DNA, w temperaturze 37-72C. Temperatura przyczania starterw zaley gwnie od zawartoci w tych starterach nukleotydw G i C. Mona j w przyblieniu okreli, wykorzys tujc wzr (Mazaras i wsp., NAR 19:4783, 1991): T = 69,3C + 41 x (G + C)/L - 650/L gdzie: (G + C) czna liczba nukleotydw guanylowych i cytydylowych L czna liczba wszystkich nukleotydw; 3 wyduanie starterw (ang. elongation) polegajce na doczaniu, poczwszy od wolnego koca 3'-OH startera, nukleotydw komplementar nych wzgldem amplifikowanej nici DNA; proces ten zachodzi w temperaturze 72C.
79

W wyniku wyduenia starterw powstaj syntetyzowane de novo" nici DNA, ktre zawieraj miejsce wizania dla startera w nastpnym cyklu. Zatem kada nowa ni DNA staje si matryc w kolejnym cyklu amplifikacji, co prowadzi do zwikszania si liczby amplifikowanych fragmentw w postpie logarytmicznym. Po 30 cyklach tej reakcji jest ju 230, czyli 1073 741 824, powielonych fragmentw DNA. Dugo powstajcych fragmentw determinuj koce 5' starterw. Denaturacja DNA w pierwszym i wyduanie starterw w ostatnim cyklu przebiegaj w nieco duszym czasie ni w cyklach pozostaych. Dla kadego fragmentu DNA, ktry ma by zamplifikowany, naley dobra waciwe warunki reakcji, przede wszystkim temperatur przyczania starterw. Cakowity czas trwania acuchowej reakcji polimerazy wynosi z reguy najwyej kilka godzin. Po zakoczeniu reakcji zamplifikowany fragment DNA, czyli tzw. produkt PCR, moe by przechowywany w temperaturze 4C, do momentu nastpnego etapu bada. Metoda PCR ma wiele zastosowa, midzy innymi do: wykrywania obecnoci w genomie okrelonych odcinkw/genw oraz identyfikacji nosicieli mutacji powodujcych choroby genetyczne wykrywania obecnoci w organizmie wirusowego lub prowirusowego DNA zwikszenia iloci wybranych odcinkw DNA do pniejszego sekwencjonowania lub tworzenia biblioteki genw. Opracowane zostay modyfikacje acuchowej reakcji polimerazy: Wewntrzna (ang. nested) PCR. Stosowana jest w przypadku braku pewnoci, e zamplifikowany zosta waciwy fragment DNA. Metoda ta polega na amplifikacji mniejszego odcinka DNA, zawartego w obrbie wczeniej zamplifikowanego duszego fragmentu. Oczywicie w tej drugiej reakcji stosowane s inne startery. Za pomoc tej metody moemy take zwikszy czuo reakcji, dziki dodatkowej amplifikacji produktw wczeniejszej reakcji. RAPD (ang. random amplified polymorphic DNA). Jest to metoda losowej amplifikacji fragmentw DNA, w ktrej, w odrnieniu od metody PCR, stosowany jest tylko jeden starter. Rwnie warunki reakcji s nieco inne, nisza jest temperatura przyczania starterw do matrycowego DNA, a liczba cykli reakcji jest wiksza (40-50). Przykad wzoru prkowego (losowo zamplifikowanych fragmentw DNA) przepirki japoskiej uzyskanego w wyniku reakcji RAPD przedstawiono na rycinie 4-5. LCR (ang. ligase chain reaction). Ligazowa reakcja acuchowa; zbliona jest do PCR. Rnice polegaj m.in. na tym, e w LCR oligonukleotydy s dusze (50-60 nukleotydw) i tak przygotowane, by po hybrydyzacji, odpowiednio do koca 5' i 3' matrycowego DNA, nie pozostaa midzy nimi
80

przerwa. Enzymem uywanym do tej reakcji jest termostabilna ligaza, ktra czy specyficznie dwa przylege oligonukleotydy, gdy s one zhybrydyzowane z komplementarn matryc. Oligonukleotydy s amplifikowane podczas cykli termicznych w obecnoci drugiej pary starterw. W pierwszym etapie reakcji matryca DNA jest poddawana denaturacji (rozdzielana na dwie nici) przez dziaanie wysok temperatur (94C). Ochodzenie mieszaniny reakcyjnej do 60C powoduje, e komplementarne do normalnego allelu cztery diagnostyczne startery hybrydyzuj z komplementarnymi sekwencjami na matrycy DNA. Jeli jest idealna komplementarno midzy matryc i zhybrydyzowanymi z ni oligonukleotydami (starterami), wwczas termostabilna ligaza tworzy kowalentne wizanie midzy oligonukleotydami. Te dwa etapy s powtarzane, a produkty ligacji staj si matrycami do hybrydyzacji w kolejnych cyklach, amplifikujc badany gen (odcinek DNA). Jeli nie ma komplementarnoci w miejscu poczenia starterw z matryc DNA (np. mutacja punktowa), wwczas nie tworzy si wizanie midzy starterami i nie ma produktu amplifikacji. Reakcja ta stosowana jest do wykrywania mutacji punktowych, co jest szczeglnie istotne z medycznego punktu widzenia (diagnostyka chorb monogenowych). W celu identyfikacji produktu LCR stosowane s nieradioaktywne metody znakowania barwnego, np. z zastosowaniem biotyny. O znakowaniu biotyn bdzie jeszcze mowa w podrozdziale: Techniki hybrydyzacji i sondy molekularne. RT-PCR (ang. reverse transcription-polymerase chain reaction). Odwrotna transkrypcja-PCR. acuchowa reakcja polimerazy umoliwia amplifikacj jedynie kwasu deoksyrybonukleinowego. Nie moe by natomiast
81

wykorzystana w badaniach ekspresji genw, w ktrych okrelana jest ilo mRNA, jak rwnie do wykrywania wirusw, ktrych materiaem genetycznym jest RNA. W tych przypadkach moe by stosowana metoda RT-PCR, polegajca na tym, i acuchowa reakcja polimerazy jest poprzedzona odwrotn transkrypcj, podczas ktrej na matrycy mRNA syntetyzowany jest komplementarny DNA (nazwany cDNA). Reakcja ta przebiega dziki zastosowaniu enzymu odwrotnej transkryptazy. Kocowym etapem jest amplifikacja uzyskanego cDNA na drodze acuchowej reakcji polimerazy. SSCP (ang. single stranded conformation polymorphism). Polimorfizm konformacji jednoniciowych acuchw DNA; jest to technika czsto wykorzystywana do wstpnej identyfikacji mutacji punktowych w badanym fragmencie DNA. Badanie polega na amplifikacji technik PCR wybranego fragmentu DNA, a nastpnie jego denaturacji i elektroforezie. Efektem denaturacji jest uzyskanie jednoniciowych acuchw DNA, ktre przyjmuj okrelon konformacj przestrzenn. Konformacja ta zaley od sekwencji nukleotydw, bowiem pomidzy niektrymi sekwencjami wchodzcymi w skad acucha bd powstaway wizania wodorowe midzy komplementarnymi zasadami azotowymi. Dziki temu szybko migracji jednoniciowych acuchw DNA podczas elektroforezy zaley nie tylko od ich wielkoci/ale take konformacji przestrzennej. Zdenaturowany DNA allelu zmutowanego moe przyjmowa inn konformacj ni allelu prawidowego i w konsekwencji fragmenty te bd migroway podczas elektroforezy z rn szybkoci. Jeli badany DNA pochodzi od nosiciela zmutowanego genu, to wwczas na elektroforegramie pojawiaj si prki (fragmenty) reprezentujce allel prawidowy oraz allel zmutowany. Stwierdzenie takiej formy polimorfizmu wskazuje jedynie na to, e testowany osobnik jest heterozygot w obrbie amplifikowanego fragmentu DNA. Nie mona jednak na tej podstawie zidentyfikowa typu mutacji ani okreli miejsca mutacji. Dlatego szczegowa analiza mutacji wymaga zastosowania dodatkowych metod, np. RFLP lub sekwencjonowania, ktre jest oczywicie najbardziej precyzyjne. Poszukiwanie okrelonego fragmentu DNA lub RNA moe by przeprowadzane take bezporednio w komrkach i tkankach za pomoc metody PCR in situ.

4.5. Techniki hybrydyzacji i sondy molekularne


Hybrydyzacja DNA jest moliwa dziki zdolnoci kwasw nukleinowych do rozdziau na pojedyncze nici komplementarne i ponownego czenia si w struktury dwuniciowe. Jak wiadomo, midzy nimi DNA:DNA, RNA: RNA i RNA: DNA istniej wizania wodorowe, ktre uatwiaj ten
82

proces. Zjawisko to stao si podstaw metod analizy kwasw nukleinowych, takich jak hybrydyzacja Southern blotting (DNA), northern blotting (RNA) czy PCR (hybrydyzacja starterw z matryc). Ogromn zalet hybrydyzacji jest to, e mona j stosowa nawet wwczas, gdy nie jest dokadnie znana caa sekwencja nukleotydowa badanego fragmentu DNA. Southern blotting jest metod przenoszenia odpowiednio przygotowanego DNA na filtr nitrocelulozowy lub nylonowy. Przygotowanie DNA polega na trawieniu jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi i rozdzieleniu elektroforetycznym uzyskanych fragmentw w elu agarozowym (dusze, czyli cisze fragmenty) lub poliakryloamidowym (krtsze, lejsze, do 500 par zasad). By bya moliwa hybrydyzacja sondy z badanym DNA, kwas nukleinowy znajdujcy si w elu musi by zdenaturowany (rozdzielony na pojedyncze nici poprzez dziaanie roztworem kwasu solnego). Przeniesienie fragmentw DNA z elu na filtr nastpuje przez bufor transferowy, ktry przenikajc przez el zabiera ze sob fragmenty DNA. Fragmenty te s nastpnie zatrzymywane na filtrze. Przeniesiony DNA naley utrwali na filtrze dziaajc wysok temperatur bd promieniami UV. Tak przygotowany DNA mona nawet kilkakrotnie hybrydyzowa z sondami molekularnymi. Sondy molekularne s to odcinki DNA majce sekwencj nukleotydw komplementarn do badanej. Sondami molekularnymi mog by fragmenty DNA bezporednio pochodzce z genomu (np. wirusw lub organizmw wyszych), klonowane sekwencje lub syntetyczne oligomery stosowane w PCR. Technika northern blotting, stosowana w hybrydyzacji kwasu rybonukleinowego, ktry jest nici pojedyncz, nie wymaga etapu denaturacji. Znakowanie sond. Sonda musi by odpowiednio wyznakowana, by byo moliwe wykrycie powstaej hybrydy. Sposb znakowania sond mona podzieli na dwie gwne grupy: 1. Znakowanie izotopowe (radioaktywne) przez wprowadzenie do czsteczki sondy izotopu promieniotwrczego. Sygna jest wykrywany metod autoradiografii przez ekspozycj bony fotograficznej na dziaanie promieniowania powstaej hybrydy. Znakowanie izotopowe charakteryzuje si du czuoci, jednak niewielk rozdzielczoci. Wad sond znakowanych izotopem jest rwnie to, i musz by stosowane wkrtce po ich wyznakowaniu. Najczciej stosowanymi izotopami s: fosfor radioaktywny (32P), ktry emituje wysokoenergetyczne promieniowanie (energia promieniowania E = 1,71 MeV megawoltw), czas ptrwania 14,3 dnia. Izotop ten jest stosowany do znakowania DNA i RNA, a jego podstawowym rdem s radioaktywne nukleotydy wyznakowane w pozycji : dATP, dCTP i UTP a 32P,
83

izotop siarki (35S), emitujcy promieniowanie , ktre jest okoo 10 razy sabsze ni fosforu (energia promieniowania E = 0,167 MeV), okres ptrwania 87,1 dnia. Siarka radioaktywna jest stosowana do znakowania kwasw nukleinowych, gwnie DNA. Atom tlenu w grupie fosforanowej i P moe by zastpiony przez S, tak powstaj pochodne nukleotydw, tryt (3H), ktry emituje promieniowanie (energia promieniowania E = 0,018 MeV), okres ptrwania 12,26 roku, uywany jest do znakowania kwasw nukleinowych, gwnie DNA. Podstawowym rdem trytu jest trytowana tymidyna. 2. Znakowanie nieizotopowe (nieradioaktywne) przez doczenie do sondy lub wbudowanie w ni znacznika fluorescencyjnego (np. biotyny, digoksygeniny). Ten rodzaj znakowania wymaga dodatkowego mechanizmu detekcji (immunologicznego lub fluorescencyjnego), w zalenoci od zastosowanego znacznika. Detekcja immunologiczna jest bardzo dobra do hybrydyzacji na filtrach. Znakowanie nieizotopowe zapewnia dobr rozdzielczo, ale daje mniejsz czuo detekcji. Znacznik (izotopowy lub nieizotopowy) moe by rwnomiernie rozmieszczony w caej sekwencji sondy bd sonda moe by znakowana na kocach (terminalnie). Znakowanie sond mona przeprowadza za pomoc kilku rnych metod. Hybrydyzacja na filtrach. Hybrydyzacj z wyizolowanym DNA mona przeprowadza, gdy jest on unieruchomiony na filtrze. Zalet tej metody jest to, i stosunkowo dua ilo kwasu nukleinowego moe by zwizana z filtrem i wyeksponowana na dziaanie sondy. Ponadto niezhybrydyzowana sonda jest odpukiwana po inkubacji. Hybrydyzacja jest poprzedzona prehybrydyzacj, ktrej celem jest wysycenie miejsc na filtrze mogcych niespecyficznie zwiza sond. Roztwr prehybrydyzacyjny ma taki sam skad jak hybrydyzacyjny, z wyjtkiem obecnoci sondy. Sam proces hybrydyzacji polega na dugotrwaej inkubacji (na przykad przez ca noc) badanego DNA w buforze zawierajcym wyznakowan sond. Podczas tej inkubacji zachodz wielokrotnie procesy asocjacji i dysocjacji sondy z prbk DNA. Kinetyka tych procesw w duej mierze zaley od rnicy midzy temperatur topnienia Tm (jest to temperatura, w ktrej 50% dugoci nici jest zdysocjowane) hybrydy a temperatur, w ktrej przebiega hybrydyzacja. Przyjmuje si, e rnica ta powinna wynosi 20-25C. Hybrydyzacj przeprowadza si z reguy w temperaturze 68C. Na wydajno hybrydyzacji wpywaj take inne czynniki, jak ilo kwasu nukleinowego zwizanego z filtrem (nie mniej ni 10 g), stenie sondy molekularnej w roztworze hybrydyzacyjnym (optimum to 50-1200 ng/ml) i stenie jonw Na+. Po hybrydyzacji nadmiar sondy jest odpukiwany (najczciej w temperaturze 65-70C), a detekcja sygnau jest poprzez autoradiografi (ry. 4-6).
84

Wykorzystanie metody hybrydyzacji. Metoda hybrydyzacji suy m.in. do wykrywania cile okrelonych fragmentw DNA (np. w diagnostyce chorb). W metodzie zwanej odcisk palca" DNA (ang. fingerprint) stosowana jest sonda molekularna komplementarna do sekwencji minisatelitarnej (metoda ta jest opisana w rozdziale: Markery genetyczne). Metoda odcisku palca" DNA jest stosowana w kontroli pochodzenia oraz do oceny zmiennoci genetycznej wewntrz i midzy rasami/populacjami. Podobnie jak metoda PCR, rwnie hybrydyzacja moe by przeprowadzana na preparatach chromosomowych. Metoda ta nosi nazw hybrydyzacji in situ (ISH). Jej rne warianty s opisane w rozdziale: Mapy genomowe. Hybrydyzacja w zminiaturyzowanej postaci, okrelana jako technika mikromacierzy DNA, pozwala ustala genotyp albo analizowa ekspresj setek lub tysicy genw. Na niewielkiej pytce (ok. l cm2) umieszczone s sondy oligonukleotydowe dla poszczeglnych mutacji (genotypowanie) lub genw (ekspresja). Detekcja hybrydyzacji sondy z wyizolowanym DNA (genotypowanie) lub z DNA (ekspresja) jest zautomatyzowana.
85

4.6. Polimorfizm fragmentw restrykcyjnych DNA (RFLP)


Polimorfizm fragmentw restrykcyjnych DNA (ang. restricted fragment length polymorphism) uwarunkowany jest rnicami w sekwencji nukleotydw w obrbie genu. Mutacje te mog powodowa powstanie lub likwidacj istniejcego miejsca cicia dla enzymu restrykcyjnego. Enzymy restrykcyjne rozpoznaj specyficzne dla nich sekwencje nukleotydowe i przecinaj DNA w okrelonym miejscu. Polimorfizm fragmentw restrykcyjnych DNA znajduje zastosowanie w testach identyfikacji nosicielstwa okrelonego allelu danego genu (metoda PCR-RFLP). Zamplifikowany (powielony) za pomoc acuchowej reakcji polimerazy (PCR) fragment badanego genu poddawany jest dziaaniu okrelonego enzymu lub kilku enzymw restrykcyjnych. Nastpnie pocity DNA jest rozdzielany elektroforetycznie w elu agarozowym lub poliakryloamidowym. Czsteczki DNA (take RNA) maj adunek ujemny i w zalenoci od masy czsteczkowej (dugoci) wdruj z rn prdkoci w kierunku anody im krtsze, czyli lejsze, tym szybciej. Due fragmenty bd wic widoczne w postaci prkw znajdujcych si w elu w mniejszej odlegoci od miejsca rozpoczcia rozdziau, natomiast dalej bd prki o zmniejszajcej si masie. Obraz elektroforetycznego rozdziau uzyskanych fragmentw DNA umoliwia identyfikacj poszczeglnych alleli danego genu. Poniszy przykad obrazuje sposb identyfikacji genotypu w okrelonym locus. Enzym restrykcyjny Hindlll rozpoznaje i przecina 6-nukleotydow sekwencj: 5'...ATAGCTT ...3' 3'...TTCGA,A-..5' Dowolny zamplifikowany za pomoc acuchowej reakcji polimerazy (PCR) odcinek DNA poddany dziaaniu tego enzymu (trawiony) zostanie pocity na fragmenty rnej dugoci. Odcinek DNA przed trawieniem ma nastpujc sekwencj (pogrubionym drukiem zaznaczono motyw rozpoznawany przez enzym Hindlll):

GTCGGCAAGCTTAGGTCAGGAGCGGACTAAAGCTTCCGATA CAGCCGTTCGAATCCAGTCCTCGCCTGATTTCGAAGGCTAT
Po trawieniu (ciciu) DNA enzymem otrzymujemy fragmenty DNA:

GTCGGCA'AGCTTAGGTCAGGAGCGGACTAA'AGCTTCCGATA CAGCCGTTCGA,ATCCAGTCCTCGCCTGATTTCGAA,AGGCTAT
86

Po rozdziale elektroforetycznym fragmenty DNA uo si w kolejnoci 23 pz, 11 pz i 7 pz. Metoda PCR-RFLP jest wykorzystywana w hodowli zwierzt do identyfikacji genotypw pod wzgldem genw, ktrych budowa molekularna jest znana; wrd nich s geny determinujce cechy jakociowe, a take ilociowe (ang. quantitative trait loci QTLs) oraz odpowiedzialne za rozwj chorb genetycznych czy odporno na niektre patogeny. Przykady takich cech s przedstawione w podrozdziaach: Mutacje genowe, Geny o duym efekcie, Interseksualizm.

4.7. Biblioteki genomowe i genowe


Bibliotek (bankiem) genomow nazywamy zbir klonw bakterii zawierajcych zrekombinowane wektory niosce fragmenty DNA. Biblioteka genomow powinna si skada z fragmentw DNA tworzcych razem cay genom okrelonego gatunku. Natomiast biblioteka genowa (inaczej biblioteka lub bank cDNA) jest to zbir sekwencji kodujcych biaka, wprowadzonych za pomoc wektorw do bakterii. Klony bakteryjne zawierajce fragmenty DNA lub cDNA mog by przechowywane w stanie zamroonym do momentu ich wykorzystania. Do tworzenia bibliotek (bankw) genomowych i genowych wykorzystywana jest, omwiona wczeniej, metoda rekombinacji molekularnej.
Tworzenie biblioteki genomowej

Materiaem wyjciowym jest DNA wyizolowany z tkanek i strawiony (pocity) enzymem restrykcyjnym. Tak powstae fragmenty DNA s wprowadzane za pomoc wektora do bakterii. Proces ten jest opisany w czci dotyczcej klonowania DNA. W zalenoci od wielkoci fragmentw DNA uywane s rne wektory. Dla prokariontw i niszych eukariontw stosowane s wektory plazmidowe lub fagowe, natomiast dla wyszych eukariontw niezbdne s bardziej pojemne wektory, jak kosmidy, sztuczny chromosom bakteryjny (BA) lub sztuczny chromosom drodowy (YAC). Biblioteki duych genomw najczciej skadaj si z bibliotek dla poszczeglnych chromosomw (biblioteki chromosomowe).
Tworzenie biblioteki genowej (cDNA)

Tworzenie biblioteki genowej jest znacznie trudniejsze ni genomowej. Materiaem wyjciowym w tym przypadku jest RNA. Po wyizolowaniu RNA z tkanek naley oddzieli mRNA. Kolejnym krokiem jest przepisanie" za pomoc reakcji odwrotnej transkrypcji (katalizowanej przez enzym odwrotn transkryptaz) informacji z mRNA na DNA. Tak otrzymany cDNA zawiera tylko sekwencje kodujce, czyli eksony. Jest on amplifikowany 87

metod PCR, a nastpnie rekombinowany z wektorem i wprowadzany do bakterii. W ten sposb kady klon bakterii ma cay okrelony gen. Wykorzystanie okrelonego rodzaju biblioteki zaley od celu bada. Jeli zamierzamy pozna organizacj caego genu cznie z intronami i promotorem, wykorzystuje si bibliotek genomow. Biblioteka genomowa jest rwnie przydatna w poszukiwaniu genu, o ktrym niewiele wiadomo. Stosowana jest wwczas metoda zwana spacerem po chromosomie" (ang. chromosome walking), ktrej pierwszym krokiem jest znalezienie w bibliotece klonu zawierajcego gen bd marker sprzony z poszukiwanym genem. Fragment kocowy sekwencji sprzonej traktowany jest jako sonda, ktra jest wykorzystywana do poszukiwania klonu zawierajcego ssiadujcy, nieznany jeszcze fragment. Postpujemy tak do momentu, gdy w ktrym z kolejnych odcinkw znajdziemy poszukiwany gen. Do badania ekspresji genu wykorzystuje si bibliotek cDNA. Najczciej stosowan metod analizy bibliotek jest hybrydyzacja z sondami molekularnymi (metoda hybrydyzacji DNA zostaa ju opisana wczeniej). Zasadniczym elementem tych bada jest odnalezienie klonu zawierajcego interesujcy nas gen. Inn metod poszukiwania okrelonego genu jest zastosowanie reakcji immunologicznej, czyli reakcji antygen-przeciwciao. W tym celu naley doprowadzi do syntezy przez bakterie biaka kodowanego przez ten gen. Surowica zawierajca przeciwciao identyfikujce okrelone biako (antygen) suy jako swego rodzaju sonda" do przegldania zbioru biblioteki.

4.8. Sekwencjonowanie DNA


Sekwencjonowanie DNA, polegajce na okreleniu sekwencji nukleotydw, jest stosowane do czsto w genetyce molekularnej, przede wszystkim do analizy sklonowanych fragmentw DNA lub produktw acuchowej reakcji polimerazy. Metoda ta umoliwia take wykrycie miejsc mutacyjnych i opracowanie testu molekularnej identyfikacji genotypw zwierzt pod ktem nosicielstwa okrelonych alleli. Sekwencjonowanie mona przeprowadza za pomoc dwch rnych metod: enzymatycznej i chemicznej. Metoda enzymatyczna zostaa opracowana w 1977 roku przez F. Sangera. Podstaw tej metody jest enzymatyczna (przeprowadzana przez polimeraz DNA) synteza komplementarnej nici na zdenaturowanej (jednoniciowej) matrycy DNA. Poniewa w nici DNA s cztery rodzaje nukleotydw (rnice si zasad), przeprowadzane s cztery oddzielne reakcje syntezy DNA. Kada z czterech probwek zawiera matrycowy DNA, starter, mieszanin deoksynukleotydw, bufor reakcyjny, polimeraz DNA oraz jeden z dideoksynukleotydw (ddNTP): ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddTTP (ry. 4-7). Rol tych dideoksynukleotydw (tzw. terminatorw) jest zakoczenie syntezy nici
88

autoradiogram elu sekwencyjnego

Ry. 4-7. Schemat sekwencjonowania DNA metod enzymatyczn Sangera; kolorem szarym zaznaczono nukleotyd serii dideoksy (wg: Nu i wsp., Postpy Biologii Komrki, 25 supl. 10 :219-237, 1998)

komplementarnej w miejscu wczenia okrelonego dideoksynukleotydu. W wyniku kadej z czterech reakcji otrzymujemy fragmenty DNA o rnej dugoci, koczce si odpowiednim nukleozydem, zalenie od uytego w reakcji dideoksynukleotydu. Zatrzymanie syntezy komplementarnej nici nastpuje po powstaniu penej sekwencji jednej czsteczki, poniewa stosunek dideoksynukleotydw (ddNTP) do deoksynukleotydw (dNTP) jest tak dobrany, by tylko cz syntetyzowanych fragmentw DNA ulega terminacji. Po zakoczeniu reakcji syntezy powstay DNA jest denaturowany i rozdzielany w drodze elektroforezy wysokonapiciowej (okoo 2000 V) w elu poliakryloamidowym (dugoci 40-100 cm, gruboci 0,2-0,6 mm). W celu detekcji prkw DNA, metod autoradiografii, w reakcji wykorzystywane s wyznakowane izotopowe (izotop fosforu lub siarki) deoksynu89

kleotydy lub wyznakowany starter. Mona rwnie zastosowa detekcj fluorescencyjn lub wyznakowanie biotyn. Enzymatyczna metoda sekwencjonowania ma t zalet, e jest szybka, ma bardzo du rozdzielczo i pozwala na sekwencjonowanie odcinka DNA dugoci okoo 500-700 nukleotydw. Metoda chemiczna, opracowana w 1977 roku przez Maxama i Gilberta, polega na degradacji sekwencjonowanego fragmentu DNA poprzez chemiczne rozszczepienie poszczeglnych nukleotydw. Do rozszczepiania wykorzystywane s hydrazyna, siarczan dimetylu (DMS) i kwas mrwkowy, ktre maj zdolno modyfikacji zasad w czsteczce DNA. Do mieszaniny reakcyjnej dodawana jest take piperydyna, ktra powoduje przerwanie acucha DNA w miejscu zmodyfikowanym przez jeden z wymienionych zwizkw chemicznych. Sekwencjonowanie metod chemiczn przeprowadza si, podobnie jak przy metodzie enzymatycznej, w czterech oddzielnych probwkach. Przebiegaj w nich reakcje rozszczepie prowadzonych w 4 wariantach (ry. 4-8):

autoradiogramelusekwencyjnego

Ry. 4-8. Schemat sekwencjonowania DNA metod chemiczn Maxama-Gilberta; kolorem szarym zaznaczono znakowany nukleotyd (wg: Nu i wsp., Postpy Biologii Komrki, 25 supl. 10 :219-237, 1998)

90

W wyniku tych reakcji otrzymujemy fragmenty DNA zaczynajce si zawsze od wsplnego radioaktywnego koca, ktrych dugo zaley od miejsca rozszczepienia acucha DNA. Nastpnym etapem, podobnie jak w metodzie enzymatycznej, jest rozdzia elektroforetyczny tych fragmentw w elu poliakryloamidowym, autoradiografia i odczytanie sekwencji nukleotydw. Metoda ta umoliwia sekwencjonowanie fragmentw DNA dugoci okoo 250-300 nukleotydw. Sekwencjonowanie kwasw nukleinowych zostao zautomatyzowane, kilka firm oferuje specjalistyczn aparatur. Najnowsza metoda sekwencjonowania, tzw. pyroseuencing, znacznie rni si od powyszych metod. Wykorzystuje ona bowiem enzymatyczne (z udziaem 4 enzymw i specyficznych substratw) dobudowywanie nici komplementarnej do badanego fragmentu DNA, przy czym przy wczeniu kadego nukleotydu powstaje sygna wietlny. Reakcja ta przebiega na mikropytkach (96 dokw na pytce) po dodaniu substratw i enzymw do doka zawierajcego badan prb DNA. Sekwencja badanego fragmentu DNA jest odczytywana przez specjaln kamer poczon z komputerem (z oprogramowaniem do analizy tych danych) na podstawie sygnau wietlnego, zamienionego na pik proporcjonalny do liczby nukleotydw wczonych do nici komplementarnej do matrycowego DNA (badana prba).

4.9. Badanie ekspresji genw


Ekspresja genu moe by badana na etapie transkrypcji (hybrydyzacja in situ na skrawkach tkanek; northern blotting; RT-PCR) i translacji (western blotting). Jedna z wymienionych metod, hybrydyzacja in situ na skrawkach tkanek, pozwala take na wyrnienie grup komrek, ktre morfologicznie nie rni si od ssiednich, ale s inne pod wzgldem biochemicznym. Przykadem mog by komrki nowotworowe badane bezporednio po transformacji. Rni si one od innych komrek ekspresj pewnych genw, nieaktywnych w komrkach zdrowych.

4.10. Transgeneza
Transgenez nazywamy technik modyfikowania genomu metodami inynierii genetycznej. Zwierzta transgeniczne to takie, ktre w swoim genomie zawieraj zintegrowany DNA pochodzcy od innego osobnika. Jednym z pierwszych eksperymentw transgenezy byo wprowadzenie na pocztku lat 80. do zygoty myszy szczurzego genu hormonu wzrostu. Gwnym efektem tego zabiegu byo szybsze tempo wzrostu i wyrane wyduenie ciaa myszy transgenicznych. Samce transgeniczne przekazyway swojemu potomstwu obcy gen, natomiast samice byy niepodne. Podobne 91

rezultaty otrzymano po wprowadzeniu myszom ludzkiego genu czynnika uwalniajcego hormon wzrostu. Materia genetyczny wprowadza si do komrki zazwyczaj za pomoc jednej z nastpujcych technik: bezporednia mikroiniekcja genu lub fragmentu DNA do przedjdrza, najczciej mskiego, zapodnionej komrki jajowej. Po mikroiniekcji DNA dokonywany jest transfer zarodkw do hormonalnie przygotowanych biorczy. Jest to gwna metoda uzyskiwania transgenicznych zwierzt gospodarskich; transfer materiau genetycznego przez zakaanie zrekombinowanymi retrowirusami. Wielko fragmentu DNA, okoo 8 kpz, ktry moe by wprowadzony t metod, ogranicza jej stosowanie. Ponadto istnieje pewne niebezpieczestwo replikacji wirusa, ktre mona zmniejszy przez stosowanie zmodyfikowanych wirusw zdolnych do jednego tylko cyklu replikacyjnego; zastosowanie pierwotnych komrek zarodkowych ESC (ang. embryonic steam cells). W metodzie tej wykorzystuje si zdolno pierwot nych komrek zarodkowych do wzrostu in vitro. Zrekombinowany fragment DNA wprowadzany jest do hodowanych w warunkach in vitro ESC, ktre wczeniej zostay pozyskane z wzw zarodkowych blastocysty. Nastpnie komrki te s wprowadzane ponownie do enukleowanych oocytw lub pcherzy trofoblastycznych (tzn. blastocyst pozbawionych wza zarodkowe go). Jak dotychczas opisana technika jest stosowana z sukcesem u myszy. Transformacj komrek mona te wykona na drodze elektroporacji komrki biorcy lub lipofekcji (dostarczenie do komrki obcego DNA w liposomach). Dotychczas stosowane metody wprowadzania transgenu nie daj moliwoci sterowania tym procesem. Na razie nie mamy adnego wpywu na to, w ktrym miejscu genomu wczy si transgen. Skutki tego procesu w zalenoci od miejsca inkorporacji transgenu mog by rne, nawet niekorzystne. Naley jednak zauway, e w procesie transgenezy wprowadzane s konstrukty genowe, ktre zazwyczaj zoone s z czci strukturalnej wprowadzanego genu i czci promotorowej innego genu, umoliwiajcej ukierunkowan ekspresj transgenu (np. w gruczole mlecznym).
Wykorzystanie techniki transgenezy

1. Doskonalenie zwierzt gospodarskich Transgeneza stwarza due moliwoci poprawy cech uytkowych zwierzt gospodarskich poprzez modyfikacj ich genomu. Technika ta moe by stosowana do: uzyskania zwierzt o przyspieszonym tempie wzrostu (wzrost produk cji misa) przez wprowadzenie do ich genomu genw kodujcych polipeptydy wpywajce na wzrost, np. gen struktury hormonu wzrostu (ang. growth hormone GH); 92

modyfikacji skadu mleka; due nadzieje wie si z popraw jakoci biaek mleka. W tabeli 4-II przedstawione s niektre moliwoci modyfikacji skadu mleka w drodze transgenezy; modyfikacji cech biochemicznych u zwierzt, na przykad poprawy jakoci i tempa wzrostu weny, poprzez wprowadzenie do genomu owiec genw biaek keratynowych. Due nadzieje wie si z uzyskiwaniem transgenicznych zwierzt wykazujcych tolerancj lub odporno na patogenne wirusy i bakterie. Odporno na choroby mona uzyska przez wprowadzenie do komrek
93

zwierzt genw kodujcych mRNA o sekwencji antysenswnej" do wirusowych kwasw nukleinowych, blokujcych w ten sposb namnaanie wirusw i ekspresj ich genw. Ptaki odporne na infekcje wirusowe i bakteryjne mona uzyska wprowadzajc geny, najlepiej dominujce, kodujce syntez biaek otoczki wirusw lub antygeny powierzchniowe bakterii, ktrych obecno w organizmie stymulowaaby wytworzenie odpowiednich przeciwcia. 2. Medycyna Zwierzta transgeniczne mog suy medycynie czowieka jako bioreaktory" do produkcji biaek o dziaaniu leczniczym. Ekspresj obcych biaek mona skierowa do gruczou mlecznego wykorzystujc promotory genw biaek mleka i przyczajc do nich geny struktury innych biaek. Zalet tej metody jest to, i samice transgeniczne wytwarzaj mleko zawierajce obce biako. Uzyskano ju transgeniczne owce z genem cdantytrypsyny (niedobr tego biaka powoduje przede wszystkim u osb palcych rozedm puc), krowy wytwarzajce mleko z ludzk laktoferyn, winie z ludzkim genem kodujcym IX czynnik krzepliwoci krwi (jego niedobr powoduje hemofili). Transgeniczne zwierzta mog by wykorzystywane do bada biomedycznych. Na myszach transgenicznych prowadzone s badania endokrynologiczne z hormonem wzrostu, ktrych celem jest ocena jego wpywu na wzrost, laktacj, metabolizm wglowodanw i lipidw. Uzyskano rwnie myszy ze specyficznym analogiem hormonu wzrostu, wykazujce karowato. Prowadzone na nich badania powinny przyczyni si do wykrycia hormonu majcego dziaanie antagonistyczne w stosunku do hormonu wzrostu. Wyniki tych bada mog mie zastosowanie w leczeniu pacjentw ze zwikszon zawartoci hormonu wzrostu. Rozwaana jest moliwo wykorzystania transgenezy w celu uzyskania zwierzt dawcw narzdw (tzw. ksenotransplantw) dla ludzi. Dotychczasowe prby przeszczepu zwierzcych narzdw czowiekowi koczyy si niepowodzeniem, z powodu nadostrej reakcji ukadu immunologicznego biorcy, prowadzcej do odrzucenia przeszczepionego narzdu. Wyniki najnowszych bada wskazuj moliwo uzyskania transgenicznych zwierzt (np. winie) z genami czowieka kontrolujcymi odpowied ukadu immunologicznego na obce gatunkowo antygeny. W dowiadczeniach ywieniowych zwierzta transgeniczne mog suy do bada ekspresji genw rnych czynnikw metabolicznych. 3. Badania naukowe Obiecujce s wyniki bada regulacji ekspresji genw prowadzone na zwierztach transgenicznych. Szczeglnie wane dla bada biomedycznych jest tworzenie nowych modeli zwierzcych, ktre wykazuj nadekspresj okrelonych genw, ekspresj genu w niewaciwej tkance lub ekspresj genw zmutowanych.

Rozdzia

Mutacje

Mutacje to nage i trwae zmiany w informacji genetycznej. Dzieli si je na: genomowe, chromosomowe i genowe. Mutacje genomowe dotycz zmian w liczbie caych genomw lub pojedynczych chromosomw. Ich identyfikacja odbywa si przede wszystkim na drodze obserwacji mikroskopowej. Mutacje chromosomowe, nazywane te aberracjami chromosomowymi, zwizane s z naruszeniem budowy chromosomu, a ich diagnoza jest dokonywana rwnie metod analizy mikroskopowej. Wreszcie mutacje genowe dotycz zmian w budowie genu, a poznanie ich podoa wymaga zastosowania metod molekularnych. Mutacje mog powstawa samoistnie, jako wynik bdw w przebiegu niektrych procesw komrkowych, takich jak replikacja DNA czy podzia jdra komrkowego, a take naprawa uszkodze powstaych pod wpywem czynnikw mutagennych, czyli takich, ktre uszkadzaj DNA lub struktur chromosomu (np. promieniowanie jonizujce, niektre zwizki chemiczne). W przypadku powstania mutacji w komrce somatycznej jej trwanie ograniczone jest okresem ycia organizmu. Naleaoby zatem rozrni proces przenoszenia mutacji, powstaych de novo, przez kolejne pokolenia komrek (mutacja w komrkach somatycznych) od dziedziczenia mutacji, za porednictwem komrek pciowych, przez nastpne pokolenia. Oczywicie mutacja moe by odziedziczona przez potomstwo jedynie wwczas, gdy jej skutkiem nie jest mier lub niepodno nosiciela. Mutacje s pierwotnym rdem zmiennoci genetycznej i dlatego s nierozerwalnie zwizane ze zmianami ewolucyjnymi, obserwowanymi wrd organizmw ywych. Poniewa mutacja ma charakter przypadkowy i bezkierunkowy, dlatego wikszo z nich jest niekorzystna dla organizmw. Dugotrwaa ewolucja pozwalaa na utrwalenie tylko tych mutacji, ktre byy korzystne lub obojtne dla organizmu. Hodowla zwierzt jest oczywicie procesem nieporwnywalnie krtszym w stosunku do ewolucji, a ponadto, cel hodowlany jest realizowany zazwyczaj tylko przez kilka najbliszych
95

pokole. Dlatego mona bez wikszych zastrzee przyj, e mutacje s zjawiskiem oglnie niepodanym w populacjach hodowlanych, a hodowca jest zazwyczaj zainteresowany eliminacj nosicieli nowo powstajcych i niektrych utrwalonych mutacji. Dotyczy to przede wszystkim mutacji genomowych i chromosomowych. W przypadku mutacji genowych kwestia ta nie jest ju tak oczywista, poniewa obok mutacji szkodliwych (np. choroby genetyczne) znanych jest wiele przykadw pokazujcych, e hodowca jest zainteresowany utrzymaniem mutacji w populacjach zwierzt. Klasycznym przykadem s mutacje odpowiadajce za barw okrywy wosowej, pojawiajce si od czasu do czasu na fermach zwierzt futerkowych. Znane s i inne mutacje, ktre wpywaj korzystnie na cechy produkcyjne zwierzt, takie jak: hipertrofia miniowa u niektrych ras byda misnego (mutacja genu miostatyny), wysoka plenno u niektrych ras owiec (np. mutacja w genie BMPR-IB) itp. W dalszej czci tego rozdziau duy nacisk pooymy na omwienie negatywnych skutkw mutacji, z jakimi spotykamy si w hodowli zwierzt gospodarskich.

5.1. Mutacje genomowe


Mutacje genomowe dzieli si na dwie kategorie: euploidie i aneuploidie. Euploidia jest mutacj prowadzc do zmiany liczby genomw w komrce. Na przykad, zamiast dwch genomw (2n) w komrce pojawiaj si trzy (3n triploidia) albo cztery (4n tetraploidia) genomy lub tylko jeden genom (n haploidia, monoploidia). Jeeli powstaj ukady o wikszej liczbie genomw ni dwa, to stan ten okrela si jako poliploidalno. Powstawanie w zygocie mutacji genomowych typu euploidii moe by wynikiem rnych nieprawidowoci, wrd ktrych do najwaniejszych zalicza si (ry. 5-1): 1. Zapodnienie haploidalnego oocytu II rzdu przez wicej ni jeden plemnik, co daje pocztek zygocie triploidalnej (zapodnienie przez dwa plemniki) czy tetraploidalnej (zapodnienie przez trzy plemniki). Zdarzenia takie okrela si mianem poispermii. 2. Zaburzenie przebiegu mejozy, gwnie eskiej, prowadzce do powstania oocytw II rzdu o niezredukowanej (2n) liczbie chromosomw. Zapodnienie takiego oocytu przez haploidalny plemnik daje pocztek triploidalnej zygocie. Zakcenie przebiegu mejozy moe nastpi podczas anafazy I i wwczas nie dochodzi do wyrzucenia pierwszego ciaka kierunko wego, a oocyt II rzdu ma diploidaln liczb chromosomw. Do zaburzenia wyrzucenia ciaka kierunkowego moe doj rwnie podczas anafazy II, ktra odbywa si ju po wnikniciu plemnika do oocytu. Take w takim przypadku przedjdrze eskie bdzie miao diploidaln liczb chromoso mw. Po replikacji i zlaniu przedjdrzy powstaje zygota triploidalna.
96

Ry. 5-1. Niektre mechanizmy powstawania mutacji genomowych typu euploidii

3. Podjcie podziau mejotycznego przez spermatogonium lub oogonium o nieprawidowym poziomie ploidalnoci, np. tetraploidalne oogonium, ktre powstao w wyniku zakcenia cytokinezy po mitotycznym podziale jdra komrkowego. Z komrki takiej po zakoczeniu mejozy i zapodnieniu powstaje triploidalna zygota. 4. Aktywacja partenogenetyczna polegajca na podjciu podziaw mitotycznych przez niezapodniony oocyt (ginogeneza), czego skutkiem jest rozwj haploidalnego zarodka. W trakcie rozwoju zarodkowego moe doj do uformowania ukadu miksoploidalnego, to znaczy takiego, gdzie w obrbie zarodka wystpuj komrki rnice si poziomem ploidalnoci, np. 2n i 4n czy 2n i 3n itd. Jest to skutek zakce w pierwszych podziaach mitotycznych zarodka, takich na przykad jak brak cytokinezy po podziale jdra komrkowego. Poniewa komrki te wywodz si z jednej zygoty, ukad taki klasyfikowany jest jako mozaicyzm. Euploidie s mutacjami letalnymi, co oznacza, e prowadz one do mierci osobnika, zazwyczaj we wczesnym okresie rozwoju zarodkowego. Tym samym kady przypadek takiej mutacji zalicza si do kategorii nowo powstaych (de novo). Praktycznie nie spotyka si tego rodzaju mutacji w okresie pourodzeniowym. Mutacje te s jedn z przyczyn niepowodze 97

w rozrodzie zwierzt. Trudno jednak okreli, jaka jest skala tego problemu. Z bada prowadzonych na zarodkach uzyskiwanych metod zapodnienia in vitro wynika, e co najmniej kilkanacie procent tak uzyskanych zarodkw moe by obarczonych mutacjami typu poliploidii lub haploidii. Aneuploidia to druga kategoria mutacji genomowych, ktra zwizana jest ze zmian liczby chromosomw w pojedynczych parach homologicznych. Tak wic brak chromosomu nazywa si monosomi (2n 1), a nadmiar chromosomw to trisomia (2n +1). Jeli zmiany wystpi rwnoczenie w dwch parach chromosomw, to stan taki okrelany jest jako podwjna monosomi (2n l 1) lub podwjna trisomia (2n + l + l). Jeli natomiast wystpuje brak obu chromosomw w parze, to stan taki okrelany jest jako nullisomia (2n 2), a obecno czterech chromosomw homologicznych nazywany jest tetrasomi (2n + 2). Aneuploidie s spowodowane nieprawidowociami w przebiegu podziaw komrkowych. W mejozie momentem krytycznym jest segregacja chromosomw do przeciwlegych biegunw komrki podczas anafazy I. Nieprawidowa segregacja w jednym biwalencie, gdy oba chromosomy zmierzaj do jednego bieguna komrki, prowadzi do powstania gamet o liczbie chromosomw n + 1 oraz n 1. Jeeli gamety takie bd uczestniczyy w zapodnieniu, to powstan zarodki obarczone trisomia (2n +1) lub monosomi (2n 1). Rwnie podczas podziaw mitotycznych (lub drugiego podziau mejotycznego) moe doj do powstania komrek z nieprawidow liczb chromosomw. Gdy podczas anafazy mitotycznej chromosomy siostrzane nie rozejd si symetrycznie do przeciwlegych biegunw komrki, to w komrkach potomnych powstan ukady 2n + l (oba chromosomy siostrzane po podziale centromeru przeszy do jednego bieguna) oraz 2n l (do bieguna nie przeszed aden z chromosomw siostrzanych). Bd segregacji chromosomw siostrzanych podczas podziau komrek somatycznych (np. zarodka) prowadzi do mozaicyzmu. Zdecydowana wikszo aneuploidii jest letalna. Aneuploidie tylko niektrych chromosomw nie prowadz do mierci nosiciela, jednak powoduj powstanie licznych wad rozwojowych. Wyjtek stanowi aneuploidie chromosomw pci, ktrym na og nie towarzysz wyrane zaburzenia w rozwoju somatycznym. Wrd zidentyfikowanych u zwierzt gospodarskich aneuploidii dominuj wanie przypadki dotyczce chromosomw pci. Zazwyczaj mutacje te stwierdzano w ukadzie mozaikowym, w ktrym obok linii komrkowej z prawidowym zestawem chromosomowym wystpowaa jedna lub wicej linii aneuploidalnych. Wskazuje to, e aneuploidie w postaci czystej prowadz prawdopodobnie do mierci osobnika. Rwnoczenie wynika z tego, e podczas rozwoju zarodkowego dochodzi do nieprawidowej segregacji chromosomw siostrzanych. Aneuploidie chromosomw pci prowadz zazwyczaj do niepodnoci. Aneuploidia najczciej opisywan u zwierzt jest monosomi chromosomu X u klaczy (ry. 5-2a). Klacz obarczona t mutacj ma kariotyp 98

2n = 63,X0 (0" oznacza brak chromosomu X) lub czciej jest to kariotyp mozaikowy 63,XO/64,XX. Zwierzta takie maj zasadniczo normalny eksterier, zazwyczaj nie wykazuj objaww rui i s bezpodne ze wzgldu na niedorozwj jajnikw. W zwizku z tym hodowca nie moe znale przyczyny jaowoci takiej klaczy, dopki nie zdecyduje si na przeprowadzenie badania cytogenetycznego. Znane s rwnie przypadki trisomii XXY u buhajw. Osobniki takie maj diploidaln liczb chromosomw 61,XXY lub wystpuje u nich ukad mozaikowy 60,XY/61,XXY.

99

Rwnie w przypadku tej chromosomopatii nosiciel dotknity jest bezpodnoci, z tym jednak e zazwyczaj towarzyszy temu wolniejsze tempo wzrostu somatycznego oraz widoczny niedorozwj jder, co moe by stosunkowo atwo zauwaone przez hodowc czy lekarza weterynarii. Stwierdzenie wymienionych zaburze jest wystarczajc podstaw wybrakowania takiego osobnika. Przypadki trisomii chromosomu X opisywano znacznie rzadziej. Przykadem moe by niepodna suka o prawidowym eksterierze (ry. 5-2b). W przeciwiestwie do monosomii X0 oraz trisomii XXY do czsto si zdarza, e osobniki majce w swoim kariotypie trzy chromosomy X s podne. W potomstwie takich samic mog si pojawi zwierzta obarczone trisomi XXY lub XXX. Jest to skutek segregacji chromosomw w anafazie I, w wyniku ktrej pojawia si okoo 50% gamet z chromosomem X oraz okoo 50% gamet z ukadem XX. Zapodnienie tych ostatnich prowadzi do powstania zarodka z trisomi. Przedstawione wyej prawidowoci wskazuj, e aneuploidie ilekro si pojawiaj, to zazwyczaj maj pochodzenie de novo, gdy skutkiem ich wystpienia jest albo mier nosiciela, albo gbokie zaburzenia rozwojowe lub bezpodno. Dziki temu, poza nielicznymi wyjtkami, nie ma ryzyka przeniesienia tej mutacji na nastpne pokolenia, a zatem i szerokiego rozprzestrzenienia w populacji. Niemniej jednak, niezidentyfikowanie nosiciela wrd zwierzt hodowlanych moe by przyczyn duych strat ekonomicznych hodowcy, wynikajcych z kosztw odchowu oraz utrzymania zwierzcia o upoledzonych funkcjach rozrodczych. Sytuacja taka jest szczeglnie dotkliwa dla hodowcw koni, ze wzgldu na do czste wystpowanie u klaczy monosomii chromosomu X, ktrej zdiagnozowanie, bez zastosowania metod cytogenetycznych, jest niemoliwe.

5.2. Mutacje chromosomowe


Pierwotn przyczyn zmian w budowie chromosomu jest jego uszkodzenie (pknicie). Jeeli pknicie nie zostanie naprawione, przez odpowiedzialne za to systemy naprawy komrkowej, to nastpi utrata fragmentu chromosomu (delecja). Moliwe jest rwnie nieprawidowe przeprowadzenie naprawy uszkodzenia. Wwczas dochodzi do przegrupowania fragmentw w obrbie jednego chromosomu (inwersja) lub kariotypu (fuzja centryczna, tandem fuzja, translokacja wzajemna). Mog powsta take inne nietypowe struktury, takie jak izochromosomy (s zbudowane z dwch identycznych ramion) lub chromosomy koliste. Za przyczyn powstania izochromosomw uznaje si nieprawidowy podzia centromeru w paszczynie prostopadej do osi chromosomu, podczas podziau komrkowego. Z kolei chromosom kolisty moe powsta w wyniku dwch pkni na przeciwlegych kocach chromosomu, a nastpnie poczenia tych miejsc z rwnoczesn utrat maych fragmentw na obu kocach chromosomu. Przyczyn mutacji chromosomowej moe by rwnie niezrwnowaona wymiana fragmentw chromatyd
100

niesiostrzanych podczas crossing over, prowadzca do powstania chromosomw z brakiem (delecja) lub z podwojeniem (duplikacja) jakiego fragmentu. Mutacja chromosomowa moe wystpi w ukadzie zrwnowaonym, jeeli w komrce nie nastpia zmiana iloci informacji genetycznej, lub te w ukadzie niezrwnowaonym, gdy ilo informacji genetycznej w komrce zostaa zmieniona. Pewne mutacje chromosomowe s ze swojej natury klasyfikowane ju od momentu powstania do grupy niezrwnowaonych (delecje, duplikacje, izochromosomy). Inne tzn. translokacje wzajemne, tandem fuzje, fuzje centryczne, inwersje, wystpujc pierwotnie w ukadzie zrwnowaonym, mog prowadzi poprzez zakcony przebieg segregacji chromosomowej w anafazie I do powstania gamet niezrwnowaonych, a dalej do powstania zygot o zmienionej zawartoci materiau genetycznego. Dziedziczenie mutacji chromosomowych moliwe jest oczywicie jedynie wwczas, gdy wystpuje ona w komrkach linii pciowej. Mutacje chromosomowe, ktrych skutkiem jest przegrupowanie informacji genetycznej w kariotypie, prowadz do zmiany ssiedztwa genw. Zmiana taka moe pocign za sob naruszenie procesw kontroli ekspresji genw. Zdarzy si moe, e przegrupowanie w pobliu jakiego genu moe wywoa jego ekspresj lub jej zanik. Ma to zwizek zarwno z funkcjonowaniem sekwencji poprzedzajcych gen (promotor, wzmacniacz, wyciszacz), jak i ze struktur samego genu. Znane s liczne przykady u ludzi, a take i zwierzt laboratoryjnych wpywu takich przegrupowa chromosomowych na aktywacj onkogenw lub inaktywacj antyonkogenw, czego skutkiem jest uruchomienie procesu nowotworowego. U zwierzt gospodarskich najczciej diagnozowane s mutacje chromosomowe w ukadzie zrwnowaonym. Wynika to przede wszystkim z tego, e mutacje chromosomowe niezrwnowaone, podobnie jak aneuploidie, s letalne lub prowadz do powanych, zauwaalnych zmian fenotypowych. Przypadki takie, odnotowywane jako martwe urodzenie, padnicie po urodzeniu lub ubj z koniecznoci, bardzo rzadko s zgaszane przez hodowcw czy lekarzy weterynarii do bada cytogenetycznych i dlatego mona przyj, e zdecydowana wikszo tych przypadkw nie jest identyfikowana. Z kolei mutacje zrwnowaone, nie wywoujc zazwyczaj efektu w postaci zauwaalnych zmian fenotypowych, maj najczciej negatywny wpyw na podno nosiciela mutacji. Jeeli dotknie to osobnika o duej wartoci genetycznej, to szansa na wykrycie nosicielstwa mutacji jest znacznie wiksza, bo osobniki takie z urzdu mog by objte badaniami cytogenetycznymi (np. buhaje), ponadto hodowcy s bardziej zainteresowani poznaniem przyczyny zmniejszonej podnoci. W dalszej czci tego rozdziau bdzie mowa o mutacjach chromosomowych, ktre w momencie powstania maj charakter zrwnowaony. Zaliczane s do nich: fuzje centryczne, inaczej centromerowe (translokacje robertsonowskie), fuzje tandemowe, translokacje wzajemne i inwersje, wrd ktrych wyrniane s inwersje peri- i paracentryczne. Szczeglna
101

uwaga bdzie powicona mechanizmom powodujcym zmniejszenie podnoci u nosicieli tego typu mutacji. Fuzja centryczna (translokacja robertsonowska) powstaje wwczas, gdy dwa chromosomy akrocentryczne pkn w pobliu centromeru, a nastpnie uszkodzenie to zostanie niewaciwie naprawione (ry. 5-3a,

102

5-4a). Due fragmenty, reprezentujce prawie cale ramiona dugie chromosomw, zostaj poczone w centromerze i w efekcie powstaje jeden duy dwuramienny chromosom, natomiast mae fragmenty okoocentromerowe zostaj zagubione podczas nastpnych podziaw komrkowych (nie wchodz do jder komrkowych odbudowujcych si podczas telofazy). Utrata maych fragmentw z okolicy centromeru, ktry zawiera przede wszystkim niekodujce sekwencje powtarzalne, nie odbija si negatywnie na nosicielu.

Ry. 5-4. Translokacje robertsonowskie: (a) rob(l;29), buhaj, barwienie roztworem Giemsy; chromosom translokacyjny oraz chromosomy pici s wskazane; (b) rob(5;7), kozio, kompleksy synaptonemalne obserwowane w transmisyjnym mikroskopie elektronowym; triwalent oraz biwalent X-Y s wskazane

103

Skutkiem tej mutacji jest zmniejszenie liczby chromosomw o jeden, z rwnoczesnym zachowaniem nie zmienionej liczby ramion chromosomowych. Jeeli fuzji ulegy chromosomy homologiczne, to podczas anafazy I mejozy nastpi nieprawidowa segregacja chromosomw. W pachytenie profazy I nowo powstay chromosom dwuramienny pozostanie jako uniwalent, natomiast w anafazie I do jednego bieguna przejdzie tene dwuramienny chromosom, podczas gdy na drugim biegunie zabraknie jednego chromosomu. Prowadzi to oczywicie do tego, e poowa gamet bdzie typu n l (ukad powstajcy na biegunie, do ktrego nie przeszed chromosom dwuramienny), a druga bdzie miaa n chromosomw, z tym jednak e wrd nich bdzie chromosom dwuramienny, co w rzeczywistoci odpowiada ukadowi n + 1. W przypadku zapodnienia powstaj zygoty aneuploidalne, ktre z duym prawdopodobiestwem zgin ju podczas rozwoju embrionalnego bd podowego. Zupenie inaczej przedstawia si sytuacja, gdy fuzja obejmie chromosomy wywodzce si z rnych par homologicznych. Wwczas w komrce powstaje ukad skadajcy si z jednego chromosomu dwuramiennego oraz po jednym chromosomie z dwch par akrocentrycznych. Jeeli komrka taka rozpocznie podzia mejotyczny, to w pachytenie profazy I uformuje si triwalent, w ktrym chromosomy akrocentryczne koniuguj z homologicznymi ramionami chromosomu powstaego w wyniku fuzji (ry. 5-3b, 5-4b). W anafazie I zazwyczaj dochodzi do zrwnowaonej segregacji, podczas ktrej chromosom dwuramienny przechodzi do jednego bieguna, a oba chromosomy akrocentryczne do drugiego bieguna komrki. W efekcie powstaj gamety o zrwnowaonej informacji genetycznej, mimo i poowa z nich (niosca dwuramienny chromosom) bdzie miaa n l chromosomw. Jednake liczba ramion chromosomowych w obu rodzajach gamet bdzie taka sama. W niewielkiej czci komrek w stadium anafazy I moe doj do niewaciwej segregacji triwalentu i wwczas powstan gamety, a dalej zygoty o nieprawidowej liczbie ramion chromosomowych, czyli uksztatuje si ukad aneuploidalny. Zarodki takie bd giny w okresie ycia zarodkowego lub podowego. Hodowca bdzie wwczas odnotowywa zmniejszon podno takiego osobnika. Naley zaznaczy, e nosiciele fuzji maj prawidowy fenotyp i nie mona ich zidentyfikowa w inny sposb, jak poprzez badanie cytogenetyczne. Fuzje centryczne s czsto identyfikowane u byda, szczeglnie ras misnych. Opisano wiele rnych fuzji, w ktrych uczestniczyy chromosomy z rnych par, ale najpowszechniejsza jest fuzja obejmujca chromosomy z pary l i 29 (ry. 5-4a). Mutacj t po raz pierwszy opisa w 1964 roku Gustavsson u czerwono-biaego byda szwedzkiego. Pi lat pniej ten sam badacz wykaza, e jej nosiciele maj zmniejszon podno o okoo 5%. Fuzje 1/29 zidentyfikowano w ponad 50 rasach byda, na wszystkich kontynentach, a w tym rwnie w Polsce. Najwicej przypadkw fuzji stwierdza si w rasach misnych (montbelliard, blonde d'Aquitaine itp.),
104

a niekiedy take w maych izolowanych rasach lokalnych (np. biae bydo rrytyjskie, woskie bydo rasy podolian czy bydo korsykaskie). Obserwowane zmniejszenie podnoci jest skutkiem wczesnej zamieralnoci zarodkw o niezrwnowaonym kariotypie. Oprcz fuzji 1;29 zdiagnozowano wiele innych przypadkw, w ktrych zaangaowane byy chromosomy z innych par. Przykadem moe by fuzja midzy chromosomami z pary 5 i 22, ktr opisano w Polsce. Szerokie rozprzestrzenienie fuzji centrycznych u byda i zwizane z tym zmniejszenie podnoci stao si gwn przyczyn wprowadzenia w wielu krajach do praktyki hodowlanej obowizkowych bada cytogenetycznych buhajw przed ich dopuszczeniem do uytkowania rozpodowego. Szwecja bya pierwszym krajem, ktry wprowadzi tak regulacj. W Polsce, poczwszy od 1989 roku, obowizkowymi badaniami objte s wszystkie mode buhaje, przed ich wprowadzeniem do stacji produkcji nasienia. Gatunkiem, u ktrego fuzja centryczna wystpuje bardzo czsto, jest lis polarny. W tym przypadku mona wrcz mwi o polimorfizmie kariotypowym, bowiem okoo 50% zwierzt ma kariotyp heterozygotyczny ze wzgldu na fuzj (dotyczy ona, jedynych w kariotypie lisa, dwch par akrocentrykw, nr 23 i 24), a okoo 30% ma kariotyp podstawowy 2n = 50 oraz pozostae okoo 20% ma kariotyp homozygotyczny ze wzgldu na fuzj 2n = 48. Ciekawe, e u tego gatunku nie stwierdza si zmniejszonej podnoci zwierzt o 2n = 49, natomiast niektre opracowania wskazuj na zwikszon plenno samic o kariotypie 2n = 48.

Ry. 5-5. Dziedziczenie translokacji robertsonowskiej na przykadzie byda. Chromosomy biorce udzia w fuzji przedstawiono schematycznie

105

Naley podkreli, e fuzja centryczna jest dziedziczona przez poow potomkw nosiciela. Jeeli na przykad u byda zostan skojarzeni ze sob nosiciele tej samej fuzji centrycznej, to u potomstwa moemy si spodziewa 25% osobnikw o normalnym kariotypie 2n = 60, 50% nosicieli fuzji o 2n = 59 i 25% osobnikw bdcych homozygotami ze wzgldu na fuzj, 0 2n = 58 (ry. 5-5). Przedstawione obserwacje wskazuj, e szerokie rozprzestrzenienie fuzji centrycznych w populacjach zwierzcych (gwnie bydo, lisy polarne, a w mniejszym stopniu take owce i kozy) jest skutkiem ich dziedziczenia, a nie czstego powstawania de novo. Pokazuje to jedno czenie, jak atwo mutacja taka moe zosta rozprzestrzeniona w populacji, szczeglnie wwczas, gdy rozrd jest oparty na sztucznej inseminacji. Translokacja wzajemna powstaje w wyniku niewaciwego poczenia podczas procesu naprawy pkni nici chromatynowych, pochodzcych z dwch rnych chromosomw. Jeeli mutacji takiej bd podlegay chromosomy homologiczne i wymienione zostan nierwne fragmenty chromosomw, to podczas mejozy dojdzie do powstania gamet, ktre bd obarczone bd delecj, bd duplikacj. Skutek takiej translokacji bdzie zazwyczaj letalny, tak jak to najczciej obserwuje si przy mutacjach niezrwnowaonych. Jeeli translokacj wzajemn bd objte chromosomy niehomologiczne (ry. 5-6a, 5-7), to podczas pachytenu profazy I zostanie uformowany tetrawalent (ry. 5-6b, 5-8), ktry zazwyczaj bdzie segregowa w anafazie 1 w ukadzie 2:2, tzn. dwa chromosomy przejd do jednego bieguna i dwa chromosomy do drugiego bieguna komrki. Segregacja symetryczna (2:2) nie gwarantuje jeszcze, e powstan gamety o zrwnowaonej informacji genetycznej. Wrd trzech moliwych segregacji symetrycznych tylko jedna warunkuje powstanie biegunw o zrwnowaonej iloci informacji genetycz nej. Jest to segregacja naprzeciwlega, w wyniku ktrej do jednego bieguna wdruj po jednym nie zmienionym (prawidowym) chromosomie z obu par, a do drugiego przechodz chromosomy, ktre uczestniczyy w trans lokacji. Naley zaznaczy, e suma informacji genetycznej zawarta w dwch chromosomach, ktre podlegay translokacji, jest taka sama jak w dwch nie zmienionych chromosomach. W ten sposb segregacja naprzeciwlega odpowiada za powstanie gamet o zrwnowaonej iloci informacji genetycznej. Dwa pozostae rodzaje segregacji, okrelane jako ssiednie, prowadz do uformowania niezrwnowaonej (delecje, duplikacje) iloci informacji genetycznej w gametach. Na niezrwnowaenie iloci informacji genetycznej wpywa rwnie crossing over, jeli zajdzie na odcinku midzy punktem pknicia i wymiany fragmentw chromosomowych a centromerem. Oczy wicie segregacja niesymetryczna (3: l lub 4:0) rwnie powoduje utworze nie gamet genetycznie niezrwnowaonych. Podobnie jak w przypadku fuzji centrycznej, take translokacj wzajemna jest mutacj dziedziczn, jeli oczywicie wystpi w linii komrek pciowych. Przyjmuje si, e okoo 50% gamet wytwarzanych przez
106

*Schemat nie uwzgldnia segregacji tetrawalentu, w ktrym crossing over wystpio midzy centromerem i punktem pknicia/wymiany

Ry. 5-6. Translokacja wzajemna: (a) schemat powstawania; (b) segregacja tetrawalentu podczas mejozy

nosiciela translokacji jest niezrwnowaonych genetycznie i dlatego jeeli bd one uczestniczyy w zapodnieniu, to doprowadz do powstania zygot, ktre bd giny zazwyczaj w yciu podowym. Hodowca odnotuje
107

wwczas okoo 50-procentowy spadek podnoci (lub plennoci) u takiego osobnika. Druga poowa gamet bdzie miaa zrwnowaon ilo informacji genetycznej, ale wrd nich poowa bdzie miaa ukad, w ktrym wystpi dwa translokowane chromosomy. Wanie te gamety s odpowiedzialne za przenoszenie translokacji wzajemnej do nastpnego pokolenia. W ostatecznym rozrachunku po nosicielu skojarzonym z osobnikami o prawidowym kariotypie uzyska si potomstwo, w ktrym polowa bdzie miaa prawidowy kariotyp, a poowa bdzie nosicielami translokacji. Potomstwo o niezrwnowaonym kariotypie zazwyczaj ginie w okresie ycia podowego lub wkrtce po urodzeniu. Na krtkie omwienie zasuguje specjalna kategoria translokacji wzajemnych, ktra prowadzi do bezpodnoci samcw nosicieli. Stan taki towarzyszy nosicielstwu translokacji wzajemnej, w ktr zaangaowany jest chromosom X (translokacja typu X-autosom). Bezpodno samcw nosicieli jest wynikiem zablokowania procesu spermatogenezy we wczesnych stadiach mejozy (pachyten profazy I). Przypuszcza si, e ma to zwizek z przedwczesnym uaktywnieniem chromosomu X podczas spermatogenezy. U samic nosicielek stwierdza si jedynie zmniejszenie podnoci, podobnie jak w przypadku translokacji typu autosom-autosom. Translokacje wzajemne najczciej s rozpoznawane u wi (ry. 5-7). Do tej pory zidentyfikowano na wiecie, w rozmaitych rasach, ponad 90 rnych translokacji wzajemnych, ktre byy rozprzestrzenione w populacjach w rnym stopniu. Trzeba podkreli, e nosiciele translokacji (kariotyp zrwnowaony) maj prawidowy fenotyp i niczym nie odrniaj si od osobnikw o prawidowym kariotypie. Knury nosiciele maj prawidowe libido, a obraz nasienia (koncentracja, morfologia czy ruchliwo plemnikw) nie rni si w porwnaniu z nasieniem knurw o prawidowym kariotypie. Podobnie normalny fenotyp maj lochy nosicielki. Jedyn wskazwk sugerujc nosicielstwo takiej mutacji s obnione wskaniki podnoci lub plennoci. Oczywicie stan taki moe by spowodowany rnymi czynnikami. Niemniej obserwacje takie powinny by traktowane jako sygna skaniajcy do przeprowadzenia bada cytogenetycznych. Na przykad we Francji badania cytogenetyczne wykonywane s u knurw, po ktrych uzyskano mioty o obnionej liczebnoci (poniej 8 prosit w miocie). Fuzja tandemowa jest mutacj podobn do fuzji centrycznej. Jej powstanie zwizane jest z nieprawidow napraw pkni w dwch chromosomach. Jedno z nich wystpuje w czci kocowej ramienia w chromosomie jedno- lub dwuramiennym, a drugie tu pod centromerem w ramieniu dugim chromosomu akrocentrycznego. W efekcie due fragmenty chromosomowe zostaj poczone tandemowo jeden za drugim, a mae fragmenty (okoocentromerowy z chromosomu akrocentrycznego i dystalny z drugiego chromosomu) zostaj zagubione, podobnie jak w przypadku fuzji centrycznej. Jeeli tandem fuzja zajdzie midzy dwoma homologicznymi 109

chromosomami akrocentrycznymi, to podczas mejozy, podobnie jak przy fuzji centrycznej, dojdzie do powstania aneuploidalnych gamet. Powstanie tandem fuzji midzy chromosomami niehomologicznymi wywouje analogiczne skutki jak fuzja centryczna, tzn. moe powodowa nieznaczne zmniejszenie podnoci z powodu zamierania zarodkw, ktre powstay na bazie gamet o niezrwnowaonej iloci informacji genetycznej. Mutacja ta jest dziedziczona przez poow potomkw nosiciela, analogicznie do schematu przedstawionego dla translokacji robertsonowskich. Tandem fuzja bya rzadko opisywana u zwierzt gospodarskich. Znane s nieliczne przypadki tej mutacji u byda, chocia w rasie czerwonej duskiej jej rozprzestrzenienie w latach 70. byo do due. Oceniano wwczas, e zmniejszenie podnoci wywoane przez t mutacj byo rzdu 10%. Inwersja jest mutacj zachodzc w obrbie jednego chromosomu, w ktrym wystpiy dwa pknicia, a nastpnie zostay one niewaciwie naprawione w taki sposb, e fragment pomidzy punktami pkni zosta odwrcony o 180. Jeeli w obrbie odwrconego fragmentu wystpuje centromer, to wwczas inwersja jest okrelana jako pericentryczna. Jeeli odwrcony fragment nie obejmuje centromeru, to nieprawidowo jest okrelana jako inwersja paracentryczna. Inwersja pericentryczna zazwyczaj zmienia morfologi chromosomu, z wyjtkiem sytuacji, gdy pknicia wystpiy w rwnych odlegociach od centromeru w obu ramionach chromosomowych. Przebieg koniugacji podczas pachytenu profazy I, w obrbie fragmentu objtego inwersj na jednym z chromosomw, moe przebiega w trojaki sposb: 1) chromosomy tworz ptl inwersyjn, ktra zapewnia zachowanie homologicznej koniugacji wzdu caego biwalentu, 2) chromosomy czciowo pozostaj nieskoniugowane w czci, gdzie na jednym z chromosomw wystpuje odwrcony fragment, oraz 3) pena koniugacja, ktra czciowo jest niehomologiczna, tam gdzie fragment odwrcony koniuguje z fragmentem prawidowym. Najmniej korzystny, z punktu widzenia skutkw gametogenezy, jest pierwszy sposb koniugowania, podczas ktrego dochodzi do uformowania ptli inwersyjnej. Jeeli w obrbie ptli zajdzie crossing over, to wwczas powstan gamety obarczone delecj lub duplikacj, z jednoczesn moliwoci powstania chromosomw dicentrycznych (majcych dwa centromery) oraz acentrycznych (pozbawionych centromeru). Taki przebieg mejozy prowadzi oczywicie do powstania gamet o niezrwnowaonej iloci informacji genetycznej i ostatecznie do zmniejszenia podnoci nosiciela mutacji, spowodowanej zamieraniem zarodkw o niezrwnowaonym kariotypie. Brak koniugacji lub koniugacja niehomologiczna uniemoliwia zajcie w tym obszarze crossing over i tym samym nie ma ryzyka powstania gamet obarczonych wymienionymi nieprawidowociami. Inwersje do rzadko opisywano u zwierzt gospodarskich. Niewtpliwie jest to czciowo wynikiem trudnoci w ich rozpoznawaniu. Jeeli zajciu inwersji nie towarzyszy widoczna zmiana morfologii, to bardzo atwo mona j przeoczy podczas obserwacji mikroskopowej. Uwaga ta dotyczy
110

wszystkich inwersji paracentrycznych, ale take niektrych przypadkw pericentrycznych. Dotychczas zdiagnozowano na wiecie co najmniej siedem przypadkw inwersji pericentycznych u byda i trzy u wi oraz tylko jeden przypadek inwersji paracentrycznej u wini. W przypadku dwch inwersji u wini analizowano proces formowania kompleksw synaptonemalnych i w adnym z nich nie stwierdzono obecnoci ptli inwersyjnej. Nie wizano rwnie jednoznacznie tych mutacji ze zmniejszon podnoci ich nosicieli.

5.3. Mutacje genomowe i chromosomowe zidentyfikowane u zwierzt hodowanych w Polsce


Badania cytogenetyczne zwierzt gospodarskich maj w Polsce dug tradycj. W okresie ostatnich 25 lat zdiagnozowano wiele przypadkw nieprawidowoci chromosomowych. Byy wrd nich mutacje typu aneu-

Oznaczenia: rb translokacja robertsonowska; rep translokacja wzajemna (w nawiasach wskazano numery chromosomw zaangaowanych w mutacj); rcp(?;?) translokacja wzajemna, dla ktrej nie ustalono, jakie chromosomy w niej uczestniczyy; inv inwersja; chimeryzm wystpowanie dwch linii komrkowych XX oraz XY w limfocytach (patrz: frymartynizm); * cz przypadkw ma kariotyp mozaikowy, np. XX/XO lub XXY/XY
111

ploidii chromosomw pci, a take mutacje chromosomowe, takie jak fuzje centryczne, translokacje wzajemne i inwersje. Oprcz tych typowych chromosomopatii zidentyfikowano take liczn grup zwierzt bdcych nosicielami chimeryzmu w komrkach krwi, polegajcego na wystpieniu linii eskiej XX i linii mskiej XY. Nieprawidowo t szczegowo omwiono w podrozdziale: Interseksualizm. Sumaryczne zestawienie wynikw przeprowadzonych bada przedstawione jest w tabeli 5-1. Zgromadzona wiedza o wystpowaniu mutacji genomowych i chromosomowych w krajowej populacji byda sprawia, e ju w 1989 roku wprowadzono obowizkowe badania cytogenetyczne modych buhajw przed ich dopuszczeniem do uytkowania w stacjach produkcji nasienia. Aktualne regulacje (1999 r.) prawne obowizkiem takim objy take rozpodniki innych gatunkw wykorzystywane w inseminacji: knury, ogiery, tryki i kozy. Dziki temu mona skutecznie zapobiega rozprzestrzenianiu si nieprawidowoci chromosomowych.

5.4. Mutacje genowe 5.4.1. Przyczyny i rodzaje mutacji genowych


Mutacje genowe s to zmiany sekwencji nukleotydw w obrbie genu. Mutacje te mog zachodzi samoistnie, gwnie na skutek bdw w procesie replikacji DNA, rzadziej na drodze modyfikacji chemicznych zasad azotowych w DNA. Mutacje te nosz nazw mutacji spontanicznych. W odrnieniu od nich mutacje indukowane s powodowane dziaaniem mutagennych czynnikw chemicznych lub fizycznych. Czynniki te mog powstawa w wyniku przemian metabolicznych zachodzcych w komrkach lub mog pochodzi ze rodowiska zewntrznego. Do najsilniej dziaajcych czynnikw mutagennych nale: promieniowanie jonizujce (np. Roentgena), ktre powoduje zmiany struktury zasad lub rozrywanie mostkw wodorowych midzy zasadami w DNA. Wraliwo organizmw na promieniowanie jonizujce zaley od posiadanych przez nie mechanizmw naprawy. Na przykad, niektre rodzaje bakterii czy gatunki owadw s znacznie bardziej odporne na promieniowanie jonizujce ni czowiek i zwierzta; promieniowanie nadfioletowe (UV), intensywnie pochaniane przez DNA, indukujce zmiany w zasadach pirymidynowych, np. ich dimeryzacj (dimery pirymidynowe powstaj w wyniku wytwarzania kowalencyjnych wiza midzy lecymi obok siebie w acuchu DNA zasadami pirymidynowymi) lub rozrywanie podwjnej helisy DNA; hydroksyloamina wywoujca zmian cytozyny na pochodn uracylu, co prowadzi do tranzycji CT; 112

kwas azotawy powodujcy deaminacj zasad w DNA i RNA. Na rrzykad na skutek deaminacji cytozyny powstaje uracyl, ktry podczas replikacji przycza adenin zamiast guaniny, komplementarnej do cytozyny; zwizki alkilujce, ktre dziki posiadanym grupom etylowym, metylowym lub bardziej zoonym powoduj alkilacj (metylowanie lub etylowanie) zasad w kwasach nukleinowych; barwniki akrydynowe (np. proflawina, oran akrydynowy, akryflawina), ktre wnikaj midzy zasady w acuchu DNA, powodujc deforma cje podwjnej helisy DNA; analogi zasad (np. 5-bromouracyl, analog tyminy oraz 2-aminopuryna, analog adeniny), ktre mog by wbudowywane w DNA. Pomimo duej rnorodnoci czynnikw mutagennych, mog one powodowa te same typy mutacji w rnych organizmach. Dzieje si tak dlatego, i wszelkie typy uszkodze w DNA wywoane mutagenami stanowi tylko zmiany premutacyjne, ktre w wyniku procesw naprawy mog zosta zlikwidowane. W przypadku nieskutecznej naprawy dochodzi do utrwalenia zmian mutacyjnych. Niekorzystne skutki dziaania czynnikw mutagennych s agodzone przez enzymatyczne procesy naprawy. Analizujc procesy naprawy mona wyrni napraw bezporedni (przez wycinanie) i poredni (poreplikacyjn, zwan te napraw w nici potomnej). Naprawa bezporednia NER (ang. nucleotide excision repair) polega na wycinaniu nukleotydu (usuwane s due uszkodzenia) bd zasady, uszkodzonej przez promieniowanie jonizujce i czynniki alkilujce. W uproszczeniu proces ten przebiega tak, i po rozpoznaniu uszkodzenia specyficzny enzym (zalena od ATP endonukleaza) nacina ni DNA po obu stronach uszkodzenia, nastpnie jednoniciowy, kilku- lub kilkunastonukleotydowy fragment z uszkodzeniem jest usuwany. Powstaa przerwa jest wypeniana przez polimeraz, a ni DNA jest scalana przez ligaz. Przypuszczalnie w komrce funkcjonuj dwa rodzaje NER, jeden polega na naprawie nici transkrybowanej genw aktywnych transkrypcyjnie (ang. transcription-couped repair), drugi natomiast polega na naprawie pozostaej czci genomu (ang. global genome repair), czyli nici kodujcej i DNA nieaktywnego transkrypcyjnie. Zwykle uszkodzenia nici transkrybowanej usuwane s dwa lub trzy razy szybciej ni uszkodzenia nici kodujcej. Mechanizmy naprawy s dokadnie zbadane u organizmw prokariotycznych, natomiast proces usuwania uszkodze w komrkach zwierzcych jest nadal sabo poznany. Wiadomo jednak, i w komrkach zwierzcych rodzaj i umiejscowienie uszkodze zale nie tylko od sekwencji nukleotydw w nici DNA, ale rwnie od struktury chromatyny. Wyszy poziom organizacji chromatyny zwiksza dostpno DNA dla niektrych czynnikw mutagennych. Na przykad, promieniowanie jonizujce wytwarza wicej wiza krzyowych midzy biakiem i DNA w chromatynie czynnej w porwnaniu z nieczynn.
113

Naprawa porednia zachodzi po zreplikowaniu uszkodzonego DNA. U bakterii E.coli znany jest kompleks enzymatyczny, ktry rozpoznaje zmiany konformacyjne nowo replikowanego DNA, bdce efektem niekomplementarnoci zasad. Kompleks ten odrnia nowo zsyntetyzowan ni DNA od nici matrycowej i dokonuje wycicia niewaciwie wstawionych nukleotydw oraz uzupenia powstae braki komplementarnymi nukleotydami. Niestety analogiczny proces w komrkach zwierzcych nie jest jeszcze dokadnie poznany. Mutacje genowe zachodzce w komrkach rozrodczych powoduj trwae zmiany przekazywane z pokolenia na pokolenie. Mutacje te mog zachodzi w genach kodujcych struktur biaka lub rzadziej w genach kodujcych struktur tRNA lub rRNA. Mutacje genowe zachodzce w komrkach somatycznych nie s dziedziczne. Mutacje te w zalenoci od okresu rozwoju zarodka mog dotyczy wszystkich komrek lub tylko pewnych czci komrek dorosego organizmu. W fenotypie osobnika z mutacj somatyczn mona zaobserwowa tzw. mozaikowo, polegajc na miejscowym wystpowaniu zmienionej cechy, np. czarny krlik majcy niebieskie plamki czy kura o jednej nodze tej, a drugiej biaej. Znacznie wiksze znaczenie maj mutacje somatyczne, zachodzce ju po urodzeniu, u osobnikw w rnym wieku. S one zazwyczaj indukowane przez czynniki mutagenne. Jeeli mutagen taki odpowiada za uruchomienie transformacji nowotworowej, to okrelany jest jako karcynogen. Mutacje takie, prowadzc do defektw lub zaburze ekspresji genw zwizanych z proliferacj komrek czy napraw uszkodze DNA, powoduj nie kontrolowany, inwazyjny wzrost tych komrek oraz zasiedlanie przez nie innych, nawet odlegych narzdw. Mutacje genowe spontaniczne charakteryzuje odwracalno i powtarzalno. Odwracalno procesu mutacji polega na tym, e allel, ktry powsta dziki mutacji genu, moe zmutowa wstecznie do formy wyjciowej tego genu. Graficznie mona to przedstawi nastpujco:

przy czym A i a s allelami, natomiast u i v oznaczaj czsto mutacji w obu kierunkach. Potwierdzeniem odwracalnoci mutacji jest bezrono i rogato u owiec. Zarwno owce bezrogie w rasie dorset horn, jak rwnie owce rogate w rasach bezrogich mog by wynikiem mutacji w tym samym locus. Lepiej poznane s zmiany normalnego allelu w kierunku mutanta, ale mutacje odwrotne zmutowanego allelu do normalnego rwnie s obserwowane.
114

Mutacja wsteczna nie zawsze jest jednak wynikiem powrotu do pierwotnego zapisu genetycznego, moe ona by nastpstwem tzw. mutacji supresorowej, zachodzcej w obrbie tego samego genu, w ktrym nastpia mutacja pierwotna, lub w zupenie innym genie. Istot powtarzalnoci mutacji genowej jest to, i okrelona mutacja moe wystpi ponownie, dajc zblione, a czsto nawet takie same skutki fenotypowe. Przykadem tego moe by recesywna achondroplazja, wystpujca u kilku ras byda. Podatno na mutacje nie jest jednakowa wrd wszystkich genw. Majc to na uwadze, mona podzieli geny na mniej i bardziej labilne lub stabilne. Do genw labilnych mona zaliczy gen czynnika VIII krzepliwoci krwi. Wrd chorych na hemofili a 1/3 przypadkw tej choroby jest wynikiem mutacji de novo. Z kolei genem bardzo stabilnym jest gen choroby (plsawicy) Huntingtona, cikiego neurodegeneracyjnego zaburzenia dziedzicznego, pojawiajcego si z czstoci l: 10000 osb w wikszoci populacji pochodzenia europejskiego. Choroba ta ujawnia si najczciej w wieku powyej 40. roku ycia i prowadzi do mierci. Zostaa ona opisana w 1872 roku przez Johna Huntingtona, std jej nazwa, znana bya jednak od XVII wieku. Pojawia si w Europie i przez emigrantw zostaa przeniesiona na inne kontynenty. Dotychczas nie wiadomo, czy byy jakie inne ogniska pocztku tej choroby. Wynika z tego, e diagnozowane przypadki choroby Huntingtona s efektem dziedziczenia mutacji w genie huntingtyny, a nie jej pojawiania si de novo. Czsto, z jak wystpuj mutacje w rnych loci, jest niejednakowa. W przypadku niektrych genw wykazano, i wikszo spontanicznych mutacji zachodzi w kilku miejscach charakterystycznych dla danego genu, nazwanych gorcymi miejscami (ang. hot spots). Badania genu hemofilii A u ludzi potwierdziy, i takimi gorcymi miejscami s sekwencje dinukleotydowe CG, zwane wyspami CpG. Wiszo mutacji zarejestrowanych w obrbie genu hemofilii A polegao na zamianie dinukleotydowej sekwencji CG na TG, rzadziej CG na CA. Rwnie w obrbie genu DMD, zlokalizowanego w chromosomie X u ludzi, warunkujcego chorob zwan dystrofi miniow Duchenne'a, stwierdzono istnienie dwch regionw (gorce miejsca), w ktrych najczciej wystpuj mutacje. Pierwszy region znajduje si w odlegoci 0,5 miliona par zasad od promotora, w regionie DXS164/DXS206, drugi natomiast w czci centralnej genu, tj. 1,2 miliona par zasad od promotora. Na czsto mutacji genowych spontanicznych mog mie wpyw rwnie czynniki dziedziczne. U muszki owocowej (Drosophila melanogaster) wykryto gen MuF, zlokalizowany w chromosomie 2 pary, warunkujcy wiksz podatno innych genw na mutacje. Wikszo mutacji jest dla organizmu szkodliwa, a nawet letalna. Czasem jednak mutacja zmienia waciwoci organizmu tak, e zyskuje on cechy korzystne. Zdarzaj si rwnie mutacje zupenie lub niemal zupenie 115

obojtne dla organizmu. W wyniku takich mutacji powstay, na przykad, serie alleli wielokrotnych, ktre s omwione w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech. Rodzaje mutacji genowych i ich skutki mona analizowa na poziomie DNA lub na poziomie polipeptydu. Rozpatrujc mutacj na poziomie DNA mona wyrni nastpujce zmiany w sekwencji nukleotydw w danym genie (ry. 5-9): 1) tranzycja zamiana jednej zasady purynowej na drug purynow lub pirymidynowej na inn pirymidynow (w podwjnej helisie bd zamiany par zasad A/T G/C), 2) transwersja -- zamiana zasady purynowej na pirymidynow i od wrotnie pirymidynowej na purynow; w podwjnej helisie bd to zamiany:

3) delecja wypadnicie (utrata) jednej lub kilku par nukleotydw, 4) insercja wstawienie jednej lub kilku par nukleotydw. Przyczyn samorzutnej zamiany jednej pary nukleotydw na inn, wedug hipotezy Watsona i Cricka, mog by tautomeryczne przeksztacenia zasad azotowych, zachodzce pod wpywem dziaania czynnikw zewntrznych. Przeksztacenia te polegaj na zmianie pooenia przestrzennego poszczeglnych atomw oraz zmianie rozkadu elektronw

Ry. 5-9. Mutacje genowe zmiany sekwencji nukleotydw

116

i protonw w czsteczce zasady. W dwuniciowej helisie DNA zasady komplementarne tworz wizania midzy grupami aminowymi (NH2) i ketonowymi (CO). Przeksztacenie tautomeryczne powoduje zamian grupy aminowej na iminow (=NH), za ketonowej na enolow (=COH), a w konsekwencji zmian konfiguracji pocze wodorowych wystpujcych midzy zasadami purynowymi i pirymidynowymi. Adenina w formie ketonowej czy si z tymin dwoma mostkami wodorowymi, natomiast w formie enolowej czy si trzema mostkami z cytozyn. Z kolei, guanina w normalnej formie (ketonowej) czy si z cytozyn, a w formie tautomerycznej z tymin. Tautomeryczne formy enolowe s nietrwae i po pewnym czasie wracaj samorzutnie do formy ketonowej, odzyskujc zdolno czenia si z zasadami komplementarnymi dla tych form. Skutkiem przemian tautomerycznych moe by bd wczania bd bd replikacji. Bd wczania polega na tym, e enoowa forma tyminy czy si z guanina. Tautomeryczna forma tyminy powraca do formy ketonowej i w nastpnej replikacji czy si z adenin. Bd replikacji zachodzi wwczas, gdy na przykad w DNA podczas replikacji tymin ulega przeksztaceniu z formy ketonowej w enoowa i zamiast z adenin czy si z guanina. Z kolei, w nastpnej replikacji do guaniny przyczy si komplementarna do niej cytozyn. Skutkiem tego bdzie pojawienie si pary G-C w miejscu, gdzie przed bdem replikacji bya para Oba rodzaje bdw wystpuj take po przeksztaceniach tautomerycznych innych zasad. Mutacje genowe mog by take nastpstwem zakce w splicingu, czyli tzw. obrbce mRNA, nazwanej dojrzewaniem. Splicing polega na wycinaniu intronw z pierwotnego transkryptu (pre-mRNA), w wyniku ktrego powstaje mRNA zawierajcy tylko sekwencje kodujce (eksony). Przykadem takiej mutacji jest delecja w genie as1kazeiny mleka, prowadzca do powstania alleli: F (delecja 3 eksonw) i D (delecja l eksonu). Od niedawna znany jest bardzo specyficzny rodzaj mutacji genowych mutacje dynamiczne. Dotychczas wykryto je u ludzi w 12 loci, z ktrych 10 powoduje choroby genetyczne, midzy innymi chorob Huntingtona, zesp kruchego chromosomu X, dystrofi miotoniczn. Mutacje te zwizane s z tzw. niestabilnymi sekwencjami DNA, nalecymi do powtarzajcych si sekwencji mikrosatelitarnych i polegaj na tym, i z pokolenia na pokolenie zwiksza si (znacznie rzadziej zmniejsza) liczba powtrze tych sekwencji. Im wikszy stopie zwielokrotnienia danej sekwencji, tym wczeniej rejestrowany jest pocztek objaww chorobowych. Na przykad choroba Huntingtona jest wynikiem zwielokrotnienia liczby powtrze sekwencji CAG w eksonie l genu kodujcego biako huntingtyn, zlokalizowanego w chromosomie 4. U ludzi zdrowych liczba powtrze wynosi 10-36, przekroczenie liczby 36 powtrze powoduje wystpienie choroby. Z zaburzeniami tymi wie si zjawisko zwane antycypacj. W przypadku choroby Huntingtona (HD) i dystrofii miotonicznej modociana posta choroby jest zwizana z dziedziczeniem ojcowskim (antycypacja odojcowska). Inn

117

cech charakterystyczn mutacji dynamicznej w genie HD jest tzw. pitno gametyczne. Jeli allel zmutowany pochodzi od matki, rnica w liczbie powtrze u potomka w stosunku do liczby powtrze u matki moe wynie do 4. Natomiast jeli ojciec przekazuje zmutowany allel, rnica w dugoci sekwencji moe dochodzi do 50%. Przypuszcza si, i jest to spowodowane niestabilnoci tej sekwencji w spermatogenezie. Zjawisko to jest charakterystyczne take dla innych zaburze wywoanych mutacjami dynamicznymi.

5.4.2. Skutki mutacji genowych


Mutacje genowe nie zawsze powoduj zmiany w skadzie aminokwasowym polipeptydu. Taka sytuacja jest moliwa, gdy spord 20 aminokwasw a 18 jest kodowanych przez 2 do 6 trjek nukleotydowych (kodonw, trypletw). Jedynie metionina (AUG) i tryptofan (UGG) s kodowane przez pojedyncze kodony. Na przykad tranzycja UC powoduje zmiany aminokwasu w acuchu polipeptydowym, gdy kodon AAC rwnie koduje asparagin. Naley podkreli, i mutacje genowe powodujce zauwaalny efekt fenotypowy stanowi jedynie ma cz mutacji zachodzcych w DNA. Przewaajca cz mutacji genowych nie powoduje adnych zmian w produkcie genowym, dlatego nazywane s cichymi podstawieniami (ang. substitution at silent site). S one wykorzystywane w analizie polimorfizmu DNA, identyfikacji markerw genetycznych przydatnych w programach mapowania genomw. Jednym ze skutkw mutacji genowych, polegajcych na pojedynczej zmianie sekwencji nukleotydw w okrelonym genie, majcym szczeglne znaczenie dla molekularnej analizy DNA, jest polimorfizm fragmentw restrykcyjnych RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism). Polimorfizm ten jest wynikiem mutacji punktowych zarwno w obrbie eksonu, jak i intronu. Mutacje w obrbie intronu nie wpywaj zazwyczaj na funkcj genu, ani kodowanego przez ten gen biaka. Rwnie mutacja w obrbie eksonu moe nie powodowa zmiany produktu genowego. Natomiast jej skutkiem moe by powstanie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny lub utrata miejsca restrykcyjnego dla danego enzymu. Dziki temu RFLP okrelonych loci moe by wykorzystywany jako marker genetyczny. Technika RFLP opisana w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu znajduje rwnie zastosowanie w ustalaniu genotypw pod wzgldem zmutowanych alleli genw gwnych (QTL) kontrolujcych cechy jakociowe (np. biaka mleka) czy odpowiedzialnych za powstanie choroby genetycznej. Analizujc skutki mutacji genowych na poziomie polipeptydu mona wyrni nastpujce typy mutacji:
118

1. Mutacje typu zmiany sensu - - na skutek tranzycji lub transwersji kodon dla jakiego aminokwasu zostaje zamieniony na kodon dla innego aminokwasu. Na przykad, jeli kodon GAU dla kwasu asparaginowego w wyniku tranzycji AG zostanie zmieniony na kodon GGU kodujcy glicyn, skutki tego mog by dla organizmu letalne. Konsekwencj takiej mutacji w 383 nukleotydzie genu kodujcego podjednostk CD18 p2-integryny jest choroba BLAD (ang. bovine leukocyte adhesion deficiency), przejawiajca si zmniejszeniem odpornoci cielt, ktrej nastpstwem jest mier przed ukoczeniem 1. roku ycia osobnikw homozygotycznych pod wzgldem zmutowanego genu. Szerzej mutacja ta i inne tego typu zostan omwione w czci dotyczcej molekularnej diagnostyki chorb. Jak ju wczeniej wspomniano, mutacje genowe nie zawsze maj niekorzystny skutek. Wynikiem mutacji typu zmiany sensu s niektre geny warunkujce umaszczenie czy polimorficzne biaka. Przykadem allelu powstaego w drodze tego rodzaju mutacji jest allel Ed w locus E (Extension) u byda, warunkujcy czarne umaszczenie. Mutacja ta jest przedstawiona na rycinie 5-10. Allel dominujcy E d jest wynikiem tranzycji tyminy w cytozyn w kodonie 99 allelu dzikiego E+, ktra w acuchu peptydowym powoduje zamian aminokwasu leucyny na prolin. Innym przykadem mutacji typu zmiany sensu, odnoszcym si do polimorficznych biaek, jest locus -laktoglobuliny (biako mleka). Rnica midzy allelem A i B -laktoglobuliny polega na zamianie A-G, w wyniku ktrej w pozycji 64 acucha polipeptydowego typu A zamiast glicyny jest kwas asparaginowy, oraz TC (zapis dla DNA; w mRNA: Ucej informacji o genetycznym uwarunkowaniu i znaczeniu polimorficznych biaek surowicy krwi, mleka, nasienia i jaj zawiera rozdzia: Markery genetyczne. 2. Mutacje typu nonsens (mutacja stop) - na skutek tranzycji lub transwersji kodon dla jakiego aminokwasu (kodon sensowny) zostaje zamieniony na jeden z trzech kodonw nonsensownych (terminacyjnych) -

Ry. 5-10. Mutacje typu zmiany sensu i zmiany fazy odczytu w locus E u byda

119

amber (UAG), ochr (UAA) lub opal (UGA), ktre nie koduj aminokwasw, lecz stanowi sygna zakoczenia translacji. Wynikiem tej mutacji jest zmiana dugoci polipeptydu kodowanego przez dany gen; powstaje krtszy N-kocowy fragment tego polipeptydu. Przykadem nastpstwa mutacji typu nonsens jest recesywna wada metaboliczna - cytrulinemia, wystpujca u byda rasy holsztysko-fryzyjskiej. Tranzycja cytozyny na tymin w 86 kodonie genu syntetazy argininobursztynianowej (enzym biorcy udzia w cyklu mocznikowym) powoduje zamian kodonu CGA dla argininy na kodon TGA koczcy translacj. W jej konsekwencji, zamiast aktywnego enzymu skadajcego si z 412 aminokwasw, powstaje nieaktywny peptyd zoony z 85 aminokwasw. Cielta homozygotyczne pod wzgldem tego zmutowanego genu padaj w pierwszym tygodniu ycia na skutek zaburze w wydalaniu mocznika z organizmu. Cytrulinemia wystpuje rwnie u ludzi, przy czym dotychczas stwierdzono 20 mutacji w genie kodujcym syntetaz argininobursztynianow. Podobna mutacja polegajca na zamianie cytozyny na tymin w 405 kodonie genu syntazy urydynomonofosforanowej, czego nastpstwem jest zamiana kodonu CGA (dla argininy) na kodon TGA koczcy translacj biaka, wystpuje u byda. Nastpstwem tego jest skrcenie acucha polipeptydowego (utrata wikszoci C-kocowych 76 aminokwasw) i utrata przez enzym funkcji katalitycznych. Jest to schorzenie nazwane DUMPS (ang. deficiency uridine monophosphate synthase). Jest ono przyczyn zamierania zarodkw, a w konsekwencji zmniejszenia podnoci krw. 3. Mutacje zmiany fazy odczytu na skutek delecji lub insercji jednej lub kilku par nukleotydw (liczba par nie moe by podzielna przez 3) nastpuje przesunicie fazy odczytu, a powstajcy polipeptyd ma od miejsca mutacji do koca C nieprawidowo wczone aminokwasy. Mutacje te wynikaj z cechy bezprzecinkowoci kodu genetycznego. Podobnie jak mutacje typu zmiany sensu, rwnie i ten rodzaj mutacji moe mie skutki obojtne dla organizmu. We wspomnianym ju locus E u byda allel recesywny e, kodujcy u zwierzt homozygotycznych ee umaszczenie czerwone, powsta w drodze mutacji typu zmiany fazy odczytu spowodowanej delecj jednej zasady. Poczwszy od kodonu 104 (GGT) dla glicyny, w ktrym delecj guaniny (oznaczona na schemacie symbolem ) powoduje przesunicie fazy odczytu, w procesie translacji przyczane s inne aminokwasy. Schemat tej mutacji przedstawiono na rycinie 5-10. Bydo holsztyskie ma umaszczenie z reguy czarno-biae, ale s take zwierzta czerwono-biae pojawiajce si w wyniku kojarzenia czarno-biaych nosicieli recesywnego allelu czerwonego umaszczenia. Opracowano test molekularny identyfikacji nosicielstwa genu czerwonego umaszczenia, wykorzystujcy to, i recesywny allel nie ma miejsca restrykcyjnego dla enzymu Mspl, natomiast allel dominujcy ma takie miejsce. Zamplifikowany za pomoc PCR fragment genu jest trawiony enzymem, nastpnie roz120

dzielany elektrofor etycznie. Uzyskany eektroforegram (obraz prkw) wkazuje obecno jednego prka dugoci 531 pz w przypadku allelu recesywnego, dwch prkw (201 pz i 331 pz) w przypadku allelu dominujcego. 4. Mutacje typu delecja lub insercja aminokwasu delecja lub insercja trzech par nukleotydw stanowicych kodon dla aminokwasu (lub wielokrotnoci liczby 3) w acuchu DNA powoduje najczciej utrat lub dodanie jednego bd kilku aminokwasw w biaku kodowanym przez dany gen. W przypadku delecji trjki nukleotydw moe nastpi: utrata dwch aminokwasw w acuchu peptydowym, a na ich miejsce pojawi si inny aminokwas (jeli wypadn" zasady z dwch kolejnych kodonw); utrata jednego aminokwasu (delecja kodonu) lub powstanie kodonu stop". Insercja trjki moe spowodowa: dodanie aminokwasu w biaku, jeli trjka nukleotydw zostanie wstawiona midzy kodony; zamian fazy odczytu, jeli trjka rozerwie" istniejcy dotychczas kodon; moliwe jest take pojawienie si kodonu stop". Mutacje te mog prowadzi do powanych zaburze, a nawet miertelnych chorb genetycznych. Przykadem mutacji typu delecja aminokwasu jest mukowiscydoza u ludzi, polegajca na zakceniu transportu jonw chlorkowych. U chorych na mukowiscydoz przewody wyprowadzajce z narzdw wewntrznych zostaj zaczopowane przez bardzo gst wydzielin. Dotyczy to przede wszystkim trzustki, puc i oskrzeli. Czsto wystpowania tej wady, prowadzcej do przedwczesnej mierci, wynosi l: 2500 osb. Prawidowy gen warunkuje syntez biaka bdcego regulatorem przewodnictwa bonowego, zwanego CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), penicego funkcj kanau chlorkowego. W obrbie tego genu wykryto wiele mutacji, przy czym najczciej jest stwierdzana mutacja w eksonie 10, oznaczona symbolem F508 (ry. 5-11). Mutacja ta prowadzi

121

do utraty jednego aminokwasu fenyloalaniny w 508 pozycji kodowanego przez ten gen acucha polipeptydowego. Podczas procesu translacji zamiast kodonu ATC dla izoleucyny (w 507 pozycji acucha polipeptydowego) i nastpujcych po nim kodonw TTT i GGT (fenyloalanina 508 pz. i glicyna 509 pz. acucha) odczytywany jest kodon ATT (inny tryplet dla izoleucyny), a nastpnie sekwencja GGT dla glicyny. Przykadem mutacji typu insercja aminokwasu jest wspomniana ju wczeniej choroba Huntingtona u ludzi. Zwielokrotnienie powtarzajcej si sekwencji CAG, kodujcej aminokwas glutamin, powoduje powstanie domeny glutaminowej, zoonej z takiej liczby glutamin, jaka jest zakodowana w sekwencji (CAG)n. 5. Mutacje zachodzce podczas obrbki potranskrypcyjnej, zwanej skadaniem (ang. splicing) pre-mRNA --w wyniku zaburze w procesie wycinania intronw powstaje nieprawidowy mRNA, czego konsekwencj jest synteza zmienionego biaka. Biako takie moe mie inne waciwoci katalityczne ni biako prawidowe, na przykad biako determinowane przez locus Albino (C). Gen C warunkuje wytwarzanie enzymu tyrozynazy. W nastpstwie nieprawidowej obrbki potranskrypcyjnej mRNA powstaj allele zmutowane. Czsto tych mutacji wynosi 10-40%. Rwnie niektre allele genu determinujcego warianty biaka mleka s1-kazeiny u kz powstay w wyniku zaburze w procesie obrbki pre-mRNA, o czym pisano ju wczeniej. W przypadku allelu D podczas wycinania intronw zosta dodatkowo wycity ekson kodujcy 11 aminokwasw, natomiast w allelu F - 3 eksony kodujce 37 aminokwasw. Fenotypowy efekt mutacji genowych moe by zauwaalny wkrtce po urodzeniu osobnika, na przykad wielopalczasto, skrcenie krgosupa u byda i psw, oklapnite uszy u kotw szkockich zwisouchych czy skrcenie ogona u kotw bobtail (ry. 5-12 wkadka kolorowa), a take umaszczenie zwierzt i inne, ale moe by rwnie rozpoznawalny w okresie pniejszym, na przykad w pierwszym tygodniu ycia (cytrulinemia) lub pierwszym roku ycia (BLAD). W wyniku wikszoci mutacji genowych nastpuje utrata lub modyfikacja zdolnoci organizmu do wytworzenia specyficznego biaka, najczciej enzymu koniecznego do prawidowego przebiegu jakiego procesu. Czsto s to zaburzenia przebiegu szlaku metabolicznego (tzw. blok metaboliczny), w ktrym produkt jednej przemiany enzymatycznej stanowi substrat dla nastpnej przemiany. Jednym z najlepiej poznanych blokw metabolicznych u ludzi s nieprawidowoci w przemianie aminokwasw fenyloalaniny i tyrozyny (ry. 5-13). Mutacje jednego z genw warunkujcych okrelony enzym tego bloku powoduj nastpujce schorzenia: A. Fenyloketonuria brak lub niedobr enzymu hydroksylazy fenyloalaninowej, przeksztacajcego fenyloalanin w tyrozyn; powoduje uszkodzenie ukadu nerwowego oraz niedorozwj umysowy i fizyczny; 122

B. Kretynizm tarczycowy brak enzymu katalizujcego przemian tyrozyny w hormon tarczycy (tyroksyn i trijodotyronin), powodujcy rny stopie nasilenia niedorozwoju umysowego; C. Tyrozynoza -- niedobr enzymu hydroksylazy kwasu p-hydroksyfenylopirogronowego, biorcego udzia w przemianie tego kwasu w kwas homogentyzynowy, nie powodujcy wyranie zych skutkw dla organizmu; D. Alkaptonuria -- brak oksydazy kwasu homogentyzynowego, prze ksztacajcego ten kwas w kwas maleiloacetooctowy; kwas homogen tyzynowy jest odkadany w stawach, chrzstkach i skrze wywoujc stany zapalne, a jego nadmiar jest wydalany z moczem, powodujc jego ciemnienie na powietrzu; E. Albinizm, czyli bielactwo - - brak enzymu tyrozynazy, przekszta cajcego 3,4-dihydroksyfenyloalanin (DOPA) w barwnik skry melanin; osobniki albinotyczne maj bardzo jasn skr, biae wosy, brwi i rzsy, tczwka oka nie jest zabarwiona, a przewiecajce przez ni naczynia krwionone nadaj jej rowe zabarwienie. Albinizm wystpuje take u zwierzt. Bloki metaboliczne mog dotyczy rwnie enzymw zwizanych z przemianami innych zwizkw, np. cukrw czy lipidw.

5.4.3. Mutacje genowe wpywajce na cechy produkcyjne zwierzt


Mutacje genowe mog mie znaczcy wpyw na efektywno hodowli zwierzt. Jednym z genw, ktrego polimorficzne formy wykazuj zwizek z rnymi cechami uytkowymi zwierzt gospodarskich, jest gen hormonu wzrostu somatotropiny (ang. growth hormone GH).
123

Inne mutacje genowe nie maj tak wszechstronnych skutkw jak mutacje w genie hormonu wzrostu. Wykryte dotychczas mutacje u wi wpywajce na jako misa dotycz: receptora rianodyny (RYR1) mutacja powodujca gorczk zoliw oraz locus PRKAG3 mutacja powodujca tzw. kwane miso (RN). U byda i owiec wykryto mutacje powodujce hipertrofi miniow. U byda cecha ta warunkowana jest zmutowanym allelem genu miostatyny (locus w chromosomie 2). U owiec natomiast hipertrofia miniowa (CLPG) jest determinowana mutacj locus kodujcego ncRNA. Opacalno hodowli zwierzt w duej mierze zaley od cech reprodukcyjnych. U trzody chlewnej stwierdzono zwizek midzy polimorfizmem genu receptora estrogenu (ang. estrogen receptor gene ESR) a wielkoci miotu. Poszczeglne allele tego genu warunkuj wzrost liczebnoci miotu o 1,15 prosicia u wi bardzo plennej rasy meishan i 0,42 prosicia u wielkiej biaej. Spord wykrytych dotychczas mutacji, wpywajcych na liczb jagnit rodzonych przez owc w jednym miocie, najwiksze znaczenie ma mutacja w genie BMPR-IB wykryta u owiec rasy merynos booroola. W pojedynczej kopii allel zmutowany zwiksza liczebno miotu o l jagni. Inne mutacje to: gen FecJ u owiec jawajskich, gen Thoka u owiec islandzkich i gen Belle-Ile u owiec utrzymywanych w pnocnej Francji. Pojedyncza kopia kadego z tych genw powoduje wzrost liczebnoci miotu o okoo 0,6 jagnicia. Podobny efekt fenotypowy ma gen FecX' sprzony z pci, wykryty u owiec rasy romney. Szerzej mutacje te s opisane w rozdziale: Zmienno cech (podrozdzia: Geny o duym efekcie).

5.4.4. Mutacje genowe wywoujce choroby genetyczne


Mutacje genowe czsto prowadz do powstania chorb genetycznych, ktre mog si przejawia zaburzeniami rozwojowymi o charakterze morfologicznym lub upoledzeniem rnych funkcji organizmu, np. metabolicznych, odpornociowych, endokrynologicznych, psychicznych itp. Naley jednak pamita, e rozwj niektrych chorb genetycznych zaley rwnie od wpywu czynnikw rodowiskowych. Std poznanie podoa wielu chorb genetycznych, a szczeglnie wrodzonych wad rozwojowych, sprawia duo trudnoci. O podou molekularnym niektrych chorb metabolicznych wspomniano ju w podrozdziale: Skutki mutacji genowych.
5.4.4.1. Geny letalne, semiletalne i subwitalne

Wpyw szkodliwego dziaania zmutowanych genw jest rny. Zalenie od stopnia penetracji tych genw mona je podzieli na:
124

geny letalne, powodujce mier ponad 90% osobnikw, w ktrych genotypach wystpi w dawce aktywnej (np. homozygota recesywna), geny semiletalne, powodujce w aktywnej dawce mier od 50 do 90% osobnikw, geny subwitalne, ktre osabiaj wydolno fizjologiczn i mog powodowa mier od 10 do 50% osobnikw. Geny letalne warunkuj nieprawidowoci rozwojowe i zakcenia w procesach fizjologicznych. Niektre z nich, z nie wyjanionych dotd przyczyn, powoduj mier osobnika, w ktrego genotypie wystpi. Rwnie okres w yciu osobnika, w ktrym dany gen przejawia dziaanie letalne, moe by rny. Jedne geny letalne powoduj mier zygoty we wczesnym stadium ycia embrionalnego, inne za pniej, w okresie pourodzeniowym lub u dorosych osobnikw. Geny letalne dominujce ujawniaj swoje dziaanie niekorzystne ju w ukadzie heterozygotycznym; powodujc mier nie tylko homo-, ale take i heterozygotycznych osobnikw same si eliminuj i mutacja taka nie utrwala si w populacji. Geny letalne o niezupenej dominacji sygnalizuj swoj obecno w pojedynczej dawce, nie ograniczajc na og przeywalnoci czy sprawnoci yciowej. Geny te dziaaj letalnie w ukadzie homozygotycznym, natomiast u osobnikw heterozygotycznych nie s letalne, ale daj zauwaalny efekt fenotypowy. Przykadem jest gen platynowego ubarwienia u lisw, gen siwej barwy (sziras) weny u owiec rasy karaku czy gen achondroplazji u byda i kur. Gen platynowej barwy u lisw (W p ) jest wynikiem mutacji genu w, warunkujcego srebrzyst barw wosa. Innym genem, bdcym rwnie wynikiem mutacji genu , jest gen W, warunkujcy umaszczenie tzw. biaopyskie. Oba zmutowane geny w ukadzie homozygotycznym (WpWp, WW) dziaaj letalnie, rwnie heterozygoty WpW nie s zdolne do ycia i gin przed urodzeniem. Kojarzenie midzy sob lisw platynowych bd biaopyskich powoduje zmniejszenie plennoci wskutek zamierania zarodkw homozygotycznych. Z punktu widzenia ekonomicznego korzystniejsze s kojarzenia heterozygotycznego osobnika platynowego z homozygota pod wzgldem genu srebrzystego ubarwienia, uzyskamy wwczas lisy zdolne do ycia, w stosunku l platynowy: l srebrzysty (ry. 5-14 wkadka kolorowa). Gen siwej barwy karakuw powoduje mier osobnikw homozygotycznych w wieku 4-9 miesicy wskutek zaburze w funkcjonowaniu przywspczulnego ukadu nerwowego, powodujcych powane zakcenia procesu trawienia. Gen achondroplazji stwierdzony po raz pierwszy u byda irlandzkiej rasy kerry, ktry jest letalny w podwjnej dawce, w ukadzie heterozygotycznym zaznacza sw obecno skrceniem odny (krtkonogie bydo nazwane dexter). U kur gen achondroplazji (Cp) w ukadzie hetero-

125

zygotycznym (Cpcp) warunkuje krtkonono. Zarodki o genotypie CpCp zamieraj w okresie od 3 do 4 dnia inkubacji. Przykadem genu letalnego o niezupenej dominacji sprzonego z pci jest gen oznaczony symbolem A31, warunkujcy pasmowy brak owosienia u byda rasy holsztysko-fryzyjskiej. Zmienno tej cechy u krw jest dua. U krw heterozygotycznych nieowosione pasma s ledwie dostrzegalne, natomiast u homozygotycznych bardzo wyrane. Krowy takie s wraliwe na zimno i le znosz czyszczenie. Cecha ta wystpuje tylko u samic. U samcw gen ten jest letalny. Z kojarzenia krowy homozygotycznej pod wzgldem tego genu z buhajem normalnym w potomstwie uzyskuje si

W przypadku gdy matka jest heterozygot, w potomstwie wystpuje stosunek samcw do samic l: 2, co obrazuje schemat:

jedynie samice. Kojarzenie to przedstawia schemat: Wikszo genw letalnych ma charakter recesywny autosomalny. Nosiciele tych genw (heterozygoty) fenotypowo niczym si nie rni od osobnikw normalnych. Zakres dziaania tych genw jest rny, od niewielkich zmian (np. miejscowy brak nabonka u byda ayrshire) do rozlegych zaburze, jak achondroplazja recesywna. Stopie fenotypowego przejawienia si genu letalnego zaley zarwno od wspdziaania danego genu z innymi genami, jak te od interakcji ze rodowiskiem. Niektre geny letalne mog take powodowa mier matki. Przykurcz mini koczyn i szyi (cecha recesywna) podw owiec, byda i wi powoduje czste padanie matek na skutek utrudnionych porodw. Geny semiletalne czsto jest trudno odrni od genw letalnych, gdy ich dziaanie zaley midzy innymi od czynnikw rodowiskowych. Te same geny mog by letalne dla swych nosicieli przebywajcych w zych warunkach rodowiskowych, nieszkodliwe za dla osobnikw znajdujcych si w dobrych warunkach. Wrodzona katarakta u byda lub brak gaek ocznych oraz wiele innych podobnych nieprawidowoci powoduj, i zwierzta obarczone nimi mog y tylko w szczeglnych warunkach rodowiskowych i pod troskliw opiek hodowcw. Ponadto niektre z tych genw mog by letalne w stosunku do jednych zwierzt, natomiast u innych mog tylko zmniejsza sprawno fizjologiczn.
126

Geny subwitalne powoduj odchylenia od normy w budowie anatomicznej i procesach fizjologicznych, a jednoczenie zmniejszaj odporno zwierzt na choroby i niekorzystne czynniki rodowiskowe. Niektre z tych genw s przyczyn zaburze metabolicznych, powodujc tzw. bloki metaboliczne. Przykad takiego bloku podano ju wczeniej. Wiele wad determinowanych genami subwitalnymi dotyczy ukadu rozrodczego, powodujc niepodno czy utrudniajc akt kopulacji. Na przykad buhaje dotknite spastycznym niedowadem koczyn (wada ta ma dwie postacie wystpuje do 8 tygodnia ycia lub dopiero w wieku 2-3 lat) niechtnie kryj i s eliminowane z rozpodu. Poniewa wikszo wad dziedzicznych jest uwarunkowana genami letalnymi, nastpny podrozdzia dotyczy wad wrodzonych, ich rodzajw, sposobw dziedziczenia i ograniczania wystpowania tych wad w hodowli zwierzt gospodarskich.
5.4.4.2. Choroby monogenowe wywoujce wrodzone wady rozwojowe

Wrodzonymi wadami rozwojowymi nazywamy wszelkie nieprawidowoci budowy ciaa, powstajce w okresie podowym. Niektre z wad s zauwaalne ju w chwili przyjcia na wiat osobnika, inne ujawniaj si w pniejszym okresie ycia (np. epilepsja u byda). Teratologia, nauka zajmujca si zaburzeniami rozwojowymi, wyodrbnia trzy grupy tych zaburze: 1) potwornoci s to bardzo rozlege zmiany w wygldzie ciaa, obarczone nimi zwierzta nazywane s potworkami, 2) wady s to pewne zaburzenia w prawidowej budowie, 3) braki (defekty czy usterki) s to drobne zmiany nie majce wikszego znaczenia dla ycia zwierzcia. Przyczyny powstawania wad wrodzonych mog by dwojakiego rodzaju: 1) genetyczne bdce wynikiem mutacji genowych, chromosomowych lub genomowych, 2) rodowiskowe powstae na skutek dziaania niekorzystnych czyn nikw rodowiskowych na rozwijajcy si pd, wady te nie dziedzicz si. Nie kada wada wrodzona jest zatem uwarunkowana genetycznie. W niektrych przypadkach na powstanie takiej nieprawidowoci maj wpyw rwnoczenie czynniki rodowiskowe i genetyczne. Wikszo wad wrodzonych dziedzicznych ma okrelony obraz fenotypowy. Zdarza si jednak, e niektre anomalie, mimo e s pochodzenia pozagenetycznego, do zudzenia przypominaj nieprawidowoci uwarunkowane zaoeniami genetycznymi. Wady takie, przypominajce mutanty, a powstae pod wpywem czynnikw rodowiskowych, nosz nazw fenokopii. W przypadku prowadzenia kontroli wrodzonych wad dziedzicznych i ograniczania ich wystpowania istotnym problemem jest odrnienie fenokopii od wady majcej podoe genetyczne. Mona to uczyni biorc pod uwag:
127

1) zgodno wygldu danej anomalii z opisem genetycznie uwarun kowanych wad wrodzonych w danej rasie, 2) wystpienie wady u noworodka pochodzcego z kojarze krewniaczych zarwno bliskich, jak i dalszych, 3) ujawnienie si tej samej wady u potomstwa jednego rozpodnika, 4) pojawienie si podobnej anomalii u zwierzt spokrewnionych z ro dzicami noworodka.
OPIS NIEKTRYCH WRODZONYCH WAD ROZWOJOWYCH

Wady ukadu kostnego

Jednym z najwczeniej poznanych zaburze rozwojowych bya achondroplazja, czyli zahamowanie rozwoju ukadu kostnego. Nieprawidowo ta wystpuje gwnie u byda (po raz pierwszy zostaa opisana w Irlandii, daa pocztek nowej rasie byda dexter). Badania genetyczne wykazay, e pody dotknite t wad, homozygotyczne pod wzgldem genu niezupenie dominujcego, ulegaj poronieniu zwykle przed smym miesicem (ry. 5-15 wkadka kolorowa). W 2002 roku w Australii wykryto odpowiedzialn za t wad mutacj, polegajc na insercji 4 nukleotydw w genie, ktrego lokalizacja nie zostaa ujawniona (zapewne test molekularny zostanie opatentowany). Mutacja ta powoduje powstanie kodonu terminacyjnego, skutkiem czego krtszy jest o 1/3 acuch polipetydowy, kodowany przez ten gen. Achondroplazja moe by take uwarunkowana genem recesywnym i w takim przypadku objawia si gwnie zaburzeniami w rozwoju koci gowy lub deformacj szkieletu i koczyn. Nosicielstwo allelu achondroplazji, oznaczonego symbolem bd (ang. bulldog disease), stwierdzono u francuskiego buhaja rasy holsztysko-fryzyjskiej, charakteryzujcego si wybitn wartoci hodowlan. Poszczeglne wady wrodzone czsto wystpuj w poczeniu z innymi nieprawidowociami. Do anomalii towarzyszcych tego rodzaju zaburzeniom rozwojowym nale: skrcenie czci twarzowej gowy, skrcenie lub brak uchwy, przepuklina mzgowa i ppkowa oraz rozszczepienie podniebienia. U drobiu achondroplazja jest warunkowana genem niezupenie dominujcym Cp (ang. creeper pezacz). Gen ten jest letalny u wikszoci homozygot midzy 3 a 4 dniem inkubacji. Osobniki heterozygotyczne charakteryzuj si skrconymi odnami. Do mutacji wpywajcych na cay kociec naley karowato. U byda wada ta wystpuje u ras misnych (np. u herefordw). Jest to prosta cecha recesywna. Gen karowatoci u osobnika heterozygotycznego, powodujc tylko nieznaczne skrcenie koczyn, wpywa porednio na zwizo budowy. U japoskiego byda misnego, u ktrego wystpuje recesywna karowato chondrodysplastyczna (ang. chondrodysplastic dwarfism), cechujca si skrceniem koczyn, japoscy badacze wykryli dwie mutacje (substytucja zasad i delecja) w genie zlokalizowanym w chromosomie 6 i oznaczonym symbolem LBN (LIMBLIN).
128

Zaburzeniem, ktre wystpuje u wikszoci ras byda, a take u owiec, wi, a nawet ludzi jest tzw. amputacja koczyn (akroteriaza) (ry. 5-16 wkadka kolorowa). Anomalia ta uwarunkowana jest genem recesywnym. U osobnika dotknitego t wad odna kocz si blisko stawu okciowego, pcinowego lub kolanowego. Wadzie tej czsto towarzysz: skrcenie uchwy, rozdwojenie podniebienia i brak wikszoci zbw. U owiec niektrych ras misnych (suffolk, hampshire) w Stanach Zjednoczonych w latach 80. pojawia si wada budowy koca okrelana mianem zespou pajczego (ang. spider syndrome). Jest ona wynikiem mutacji (transwersja adeniny na tymin, ktrej nastpstwem jest zmiana aminokwasu waliny na kwas glutaminowy w pozycji 700 acucha polipeptydowego) w genie receptora czynnika wzrostu fibroblastw (ang. fibroblast growth factor receptor 3 -- FGFR3). W ukadzie homozygotycznym allel zmutowany powoduje ktow deformacj koczyn, deformacj grzbietu, eber i mostka oraz czci pyskowej (garbaty nos). Natomiast osobniki heterozygotyczne charakteryzuje delikatna budowa koca z wyranym wydueniem koci dugich. miertelno wrd jagnit dotknitych zespoem pajczym jest bardzo wysoka, a u tych, ktre przeyy, stwierdza si osabione zdolnoci rozrodcze, a nawet niepodno. Anomali ukadu kostnego, ktra zalenie od gatunku, a nawet pci wykazuje rny stopie letalnoci, jest autosomalna recesywna cecha skrcenie krgosupa. Jest ona letalna u byda i indykw. U byda mlecznego form tej wady jest wrodzone znieksztacenie krgw CVM (ang. central vertebral malformation). U psw skrcenie krgosupa nie jest letalne dla suk, rozmnaaj si one prawidowo. Ze wzgldu na zmieniony sposb siedzenia suki te nazwane s pawianowatymi". Natomiast samce prawdopodobnie nie osigaj dojrzaoci. Moliwe wic, e jest to cecha letalna dla jednej pci. Szczenita obarczone t wad cechuje mniejsza ywotno, bezporednio po urodzeniu mona je rozpozna po skrconym ogonie. Do wrodzonych wad w budowie koczyn nale: zesztywnienie staww i wielopalczasto. Oglne zesztywnienie staww notowane jest u byda, wi i owiec. Genetycznym podoem tej wady jest autosomalny gen recesywny. U jagnit, cielt i prosit sztywno staww przy urodzeniu jest poczona z dziedzicznym przykurczem mini. Do najczciej spotykanych anomalii w budowie gowy zalicza si przepuklin mzgow uwarunkowan recesywnym genem letalnym. Wada ta, obserwowana gwnie u byda, polega na niezroniciu si koci czaszki, ktremu towarzyszy twr rnych rozmiarw wypeniony przewanie pynem. Anomalia ta czsto wystpuje w poczeniu z zespoem wad typu achondroplastycznego. Prost autosomalna cech recesywna u byda jest skrcenie uchwy. Wada ta jest oddzieln jednostk w odrnieniu od podobnej anomalii wystpujcej w przypadku tzw. amputacji koczyn. Moe ona natomiast towarzyszy: wodogowiu, przepuklinie mzgowej, brakowi gaek ocznych
129

lub zesztywnieniu staww. U owiec obserwowana jest rwnie cecha recesywna brak uchwy. W pewnym sensie odpowiednikiem skrcenia uchwy u byda jest typ dziobu kaczor Donald" u kurczt. Anomalia ta polega na skrceniu dolnej czci dzioba. Wyniki bada wskazuj, e wada ta ma charakter semiletalny i jest rezultatem dziaania autosomalnego recesywnego genu oznaczonego symbolem dek (ang. duck).
Wady ukadu powokowego

Wady ukadu powokowego odnosz si nie tylko do skry, ale i takich jej wytworw, jak wosy i pira. Jedn z najpowaniejszych letalnych wad dziedzicznych skry jest rybia uska u byda. Nienormalno ta jest prost cech recesywna, ktra powstaje w wyniku wytwarzania nadmiernej iloci keratyny i w nastpstwie nieprawidowego rogowacenia nabonka. Skra nowo narodzonego cielcia skada si jakby z rogowych pytek przypominajcych due uski. Pytki te s porozdzielane rowkami, w ktrych rosn wosy. Normalna skra i wosy pokrywaj jedynie okolice nadgarstka i stepu. Opisana wada ukadu powokowego (rybia uska) wystpuje take u ludzi. Zaburzeniem wykazujcym du zmienno u rnych ras byda jest cecha recesywna okrelana jako miejscowy brak nabonka. Miejsca nie pokryte nabonkiem najczciej wystpuj na koczynach powyej pcin i na gowie za luzawic. Schorzenie to przybiera najostrzejsz form, prowadzc do mierci podw lub noworodkw, u byda rasy Jersey, natomiast najagodniejsz, u byda ayrshire. Jednake i u cielt rasy ayrshire miejsca chore mog ulega zakaeniu, a to z kolei moe spowodowa mier w pierwszych tygodniach ycia. Inn wad dziedziczn ukadu powokowego jest brak owosienia. U byda, krlikw i kotw anomalia ta jest determinowana recesywnym genem autosomalnym. U byda wada ta moe wystpowa samodzielnie lub w poczeniu z innymi nieprawidowociami wrodzonymi, jak wodogowie, skrcenie szczki, niedorozwj czci twarzowej czaszki lub cyklopia (dwie gaki oczne w jednym oczodole). Cielta dotknite t wad w warunkach naturalnych gin. U psw brak owosienia uwarunkowany jest genem dominujcym. Na podstawie szczegowych bada mona sdzi, e wszystkie bezwose psy (tzw. psy tureckie, chiskie, perskie lub meksykaskie) s heterozygotami, gdy gen bezwosowoci w podwjnej dawce powoduje tak due nieprawidowoci, e osobniki homozygotyczne rodz si martwe. U drobiu wad ukadu powokowego jest nago, uwarunkowana recesywnym genem sprzonym z pci, oznaczonym symbolem n (ang. naked). Prawie poowa pisklt dotknitych tym zaburzeniem zamiera w cigu ostatnich 2-3 dni inkubacji. Ptaki, ktre przeyj i bd odchowywane w temperaturze wyszej ni zwykle, w wieku 4-5 miesicy pokryj si rzadkim upierzeniem. Nieno kur obarczonych t wad jest znacznie zmniejszona. 130

Wady ukadu pokarmowego

Najczciej obserwowanymi wadami zwizanymi z ukadem pokarmowym s brak odbytu i niedrono jelit. Brak odbytu jest recesywn cech letaln, powodujc wczesne zejcie miertelne lub prowadzc do uboju z koniecznoci. Niedrono jelit za, to prosta autosomalna cecha recesywn wystpujca zarwno u byda, jak i u koni. U byda nienormalno ta dotyczy jelita biodrowego, u koni natomiast okrnicy.
Wady ukadu nerwowego

Wady dziedziczne ukadu nerwowego stanowi okoo 16% zaburze rozwojowych u byda. Anomalie ukadu nerwowego wyraaj si midzy innymi bezmzgowiem lub niedorozwojem mdku (hipoplazja mdku). Obie nienormalnoci warunkowane s genem recesywnym. Bezmzgowie wystpuje na og w poczeniu z rozszczepieniem krgosupa i zaburzeniami w rozwoju narzdw wewntrznych. Niedorozwj mdku najlepiej zosta poznany u byda i owiec, u ktrych jest prost cech recesywn. Zwierzta dotknite t wad rodz si ywe, ale nie mog sta. Badania anatomiczne wykazuj znaczne zmniejszenie mdku lub patologiczne zmiany w warstwie korowej. Podobna nieprawidowo obserwowana u kur jest warunkowana recesywnym genem sprzonym z pci. Schorzenie to nazywane jest dreniem i ujawnia si w wieku od 18 do 35 dni. U drobiu wystpuje rwnie recesywne, sprzone z pci zaburzenie zwane paroksyzmem. Kurczta w wieku okoo 2 tygodni lub starsze reaguj na haas i raptowne owietlenie biegiem, nastpnie upadkiem, usztywnieniem ng oraz dreniem ciaa. Atak taki trwa okoo 10 sekund. Wikszo z tych kurczt ginie przed 15 tygodniem ycia. Cech dziedziczn u wielu gatunkw zwierzt jest epilepsja, determinowana u byda genem dominujcym, natomiast u krlikw recesywnym. U wikszoci cielt homozygotycznych pod wzgldem genu warunkujcego epilepsj objawy pojawiaj si w wieku od 3 do 6 miesicy. Prost autosomalna cech wystpujc u byda, wi i drobiu jest wodogowie wewntrzne. Cielta dotknite t wad rodz si zazwyczaj ywe, wykazuj powikszenie czaszki, nie potrafi utrzyma si na nogach i gin w cigu 2 dni. Z punktu widzenia anatomicznego schorzenie to jest spowodowane nadmiarem pynu nagromadzonego w komorach mzgowia lub niekiedy w przestrzeniach midzy opon pajcz i mikk. U wi gen warunkujcy t wad wykazuje dziaanie plejotropowe, wpywa bowiem na umaszczenie, powodujc jego rozjanienie. Prosita z wodogowiem wewntrznym padaj do drugiego dnia ycia. U drobiu wodogowie uwarunkowane jest niezupenie dominujcym genem Cr (ang. crest), przy czym u kur gen ten nie jest letalny (np. rasy houdan i polskie czubatki), podczas gdy u biaych kaczek (crested white) osobniki homozygotyczne gin, natomiast heterozygoty maj pikny czub, pod ktrym czaszka jest silnie wysklepiona wskutek cinienia powikszonych pkul mzgowych. U indykw i kur notowane jest wrodzone zaburzenie rwnowagi, warun131

kowane recesywnym genem letalnym lo (ang. loco). Pisklta obarczone t wad kuj si dobrze, ale nie mog je, pi i gin w cigu kilku dni. Anomali o duej czstoci wystpowania, szczeglnie u buhajw, powstajc w wyniku zaburze orodkowego ukadu nerwowego jest spastyczne poraenie koczyn tylnych. Fenotypowym obrazem tej wady jest spionizowanie stawu skokowego w wyniku skurczu minia brzuchatego. Wada ta czasami ujawnia si dopiero w wieku 10-12 lat. Zaburzeniem ukadu nerwowego, zwizanym z niedorozwojem przodomzgowia, jest parali i przykurcz mini koczyn i szyi, wystpujcy u byda, wi i owiec. Jest to prosta, autosomalna cecha recesywna, ktrej objawy mog by dwojakie: parali wszystkich koczyn bd tylko koczyn tylnych.
Wady ukadu rozrodczego

Do czsto wystpujce, a rwnoczenie dobrze poznane s anomalie budowy i czynnoci ukadu rozrodczego, takie jak: niedorozwj (hipoplazja) jder, nasieniowodw, jajnikw, macicy, niedrono jajowodw czy wntrostwo. U biaych jawek rasy belgijskiej bkitnej i shorthorn bezpodno wynika z niedorozwoju pochwy i macicy. Anomalia ta jest prawdopodobnie wynikiem plejotropowego dziaania genu biaego umaszczenia w poczeniu z nieznan liczb genw z innych loci. Niepodno obserwowana jest take u buhajw. Plemniki buhajw dotknitych t nieprawidowoci cechuje znaczne zgrubienie akrosomu, czyli szczytowej czci gwki, dlatego nazwano je gakowatymi". Ten typ niepodnoci wystpuje u buhajw homozygotycznych pod wzgldem recesywnego genu kn (ang. knurl). Zaburzeniem rozwojowym ukadu rozrodczego spotykanym najczciej u psw, ale take u knurw, ogierw i samcw innych ssakw jest wntrostwo, czyli niezstpienie jednego lub obu jder przez kana pachwinowy do moszny. Nienormalno t mona usun zabiegiem chirurgicznym. Obustronne wntry s niepodne rwnie po takim zabiegu. W przypadku jednostronnego wntrostwa osobnik jest podny i moe przekazywa t wad potomstwu. Dlatego konieczne jest usuwanie z hodowli rozpodnikw obarczonych wntrostwem. Inne przykady zaburze rozwoju cech pciowych s omwione w rozdziale: Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm. 5.4.4.3. Choroby monogenowe wywoujce zaburzenia procesw biochemicznych Wpyw genw na budow morfologiczn i anatomiczn zwierzt jest znacznie atwiejszy do rozpoznania ni ich oddziaywanie na procesy fizjologiczne. Podoe genetyczne zaburze natury biochemicznej, jak na przykad brak lub niedobr pewnych enzymw czy hormonw, jest trudne do identyfikacji. Trudno t powiksza to, i objawy pojawiaj si u zwierzt w rnym wieku.
132

Typow nieprawidowoci natury biochemicznej jest porfiria wystpujca u byda i wi. U byda na skutek zaburze metabolicznych powstaje czerwony barwnik porfiryna, wytwarzany w nadmiernych ilociach i odkadany we krwi, kociach, zbach i innych czciach ciaa. Schorzenie to wie si z zahamowaniem enzymatycznym tworzenia hemu, skadnika hemoglobiny. Zwierzta dotknite porfiria s bardzo wraliwe na promienie soneczne, reaguj powstawaniem pcherzy na skrze, a w skrajnych przypadkach wrzodw. Genetycznym podoem tej wady u byda jest gen recesywny. U wi porfiria jest prawdopodobnie warunkowana genem dominujcym i schorzenie to ma inne podoe ni u byda, gdy winie obarczone tym defektem nie s uczulone na wiato soneczne. Uczulenie na promienie soneczne wystpuje rwnie u owiec, lecz jest ono jednak innej natury ni porfiria u byda. Wtroba jagnit dotknitych t anomali nie wydziela fikoerytryny, ktra jest produktem rozkadu chlorofilu. Fenotypowym obrazem tej wady jest egzema na pysku i uszach, powodujca mier w dwa do trzech tygodni po pojawieniu si pierwszych objaww. Ta nieprawidowo metaboliczna ujawnia si u osobnikw homozygotycznych. Schorzeniem notowanym u ludzi i psw, a take owiec, charakteryzujcym si zmniejszon krzepliwoci krwi na skutek braku jednego z czynnikw biorcych udzia w tym procesie jest hemofilia, wywoywana dziaaniem genu recesywnego sprzonego z pci. S dwa rodzaje tego schorzenia: hemofilia A cechuje si brakiem czynnika VIII (globulina przeciwhemofilowa), ktry przyspiesza przemian protrombiny w trombin, i hemofilia B, majca agodniejszy przebieg, a dotyczca czynnika IX (czynnik Christmas), niezbdnego do wytwarzania tromboplastyny osocza. U szczenit chorych na hemofili A pierwsze objawy pojawiaj si w wieku od 6 tygodni do 3 miesicy. Czsto nawet niewinna zabawa szczenit moe spowodowa mier osobnika chorego na hemofili. U owiec hemofilia A jest chorob mierteln dla wikszoci obarczonych ni zwierzt. Locus kontrolujcy syntez czynnika VIII u owiec znajduje si w dugim ramieniu chromosomu X w regionie Xq24-q33. Omwione wyej wady s uwarunkowane allelami powstaymi w wyniku mutacji genowych. Rwnie innego rodzaju mutacje aberracje chromosomowe mog by przyczyn wad bd zmniejszenia wartoci cech uytkowych. Zagadnienie to jest omwione w podrozdziale: Mutacje chromosomowe oraz rozdziale: Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm. Oprcz ogromnej liczby wrodzonych wad dziedzicznych, ktrych podoe genetyczne jest dobrze poznane, istnieje wiele anomalii, ktre s niewtpliwie dziedziczne, ale mechanizm ich dziedziczenia nie jest jeszcze wyjaniony. Nale do nich przypadki wielokoczynowoci, zrolaki (zronite dwa pody), wynicowce (niezronicie powok brzusznych lub klatki piersiowej, a w konsekwencji tego wydostanie si zawartoci jamy brzusznej lub klatki piersiowej na zewntrz) oraz przepukliny. Zestawienie waniejszych chorb monogenowych dziedzicznych jest zawarte w tabeli 5-II.
133

134

5.4.4.4. Ograniczanie wystpowania chorb genetycznych

Czsto wystpowania genetycznie warunkowanych wad rozwojowych u zwierzt gospodarskich jest rna w rnych krajach. Tam gdzie prowadzona jest dokadna rejestracja przypadkw wad wrodzonych poczona z ograniczeniem ich wystpowania, czsto jest niewielka. W Polsce, niestety, kontrola wad wrodzonych nie jest jeszcze dobrze zorganizowana. Istniej jednak akty prawne dotyczce ograniczania wystpowania tych zaburze. Opisane wyej wady s dziedziczone w prosty sposb (jedna para alleli), ale jedynie te, ktre s uwarunkowane genami dominujcymi (o zupenej lub niepenej dominacji), s zauwaalne i atwe do eliminacji. Wikszo wad jest jednak uwarunkowanych genami recesywnymi i trudno je wyeliminowa z populacji hodowlanych. Zapobieganie rozprzestrzenianiu si wad dziedzicznych w pogowiu zwierzt odbywa si przez usuwanie ich nosicieli. Terminem nosiciel okrelamy osobnika, ktry jest fenotypowo normalny, ale w swoim genotypie 135

ma gen letalny (czy semiletalny) w ukadzie heterozygotycznym. Ujawnienie si jakiej wady w populacji u 1% osobnikw oznacza, e a 18% osobnikw jest nosicielami niepodanego allelu. Wyjanienie tego wyliczenia znajduje si w rozdziale: Podstawy genetyki populacji. W przypadku genw sprzonych z pci wykrycie nosicielstwa tych genw nie stwarza wikszych trudnoci. Nosicielami mog by tylko osobniki pci homogametycznej (u ssakw s to samice, u ptakw samce). Na przykad od koguta nosiciela recesywnego genu letalnego sprzonego z pci, skojarzonego z normalnymi kurami, bd pochodzi wszyscy synowie fenotypowo normalni, jednake poowa z nich bdzie homozygotami dominujcymi, a poowa nosicielami niepodanego genu. Natomiast wrd jego crek poowa bdzie normalnych, a u poowy ujawni si wada dziedziczna. Jeli bdzie to gen letalny powodujcy zamieranie zarodkw, to po wykluciu stosunek liczbowy pci u potomstwa bdzie odbiega od oczekiwanego 1 : 1 i bdzie wynosi 2:1. Znaczne trudnoci sprawia wykrywanie nosicieli autosomalnych genw letalnych o charakterze recesywnym. Geny te, jak ju wspomniano, fenotypowo ujawniaj sw obecno wwczas, gdy wystpuj w stanie homozygotycznym. Zatem nosicielstwo niepodanego genu moe by potwierdzone lub wykluczone poprzez zastosowanie odpowiednich kojarze. Postpowanie to ma na celu wykrycie nosicielstwa u rozpodnikw, gwnie wykorzystywanych w sztucznej inseminacji (np. buhaje). Znane s trzy klasyczne metody testowania rozpodnikw na nosicielstwo genw recesywnych: 1. Kojarzenie testowanego samca z samicami o genotypie homozygoty recesywnej. Testowanie takie jest moliwe jedynie wtedy, gdy homozygoty recesywne wykazujce wad yj i s podne. Schemat takiego kojarzenia jest nastpujcy:

Jeeli testowany osobnik jest nosicielem allelu recesywnego, to okoo 50% jego potomkw bdzie homozygotami recesywnymi. 2. Kojarzenie samca (domniemanego nosiciela) z du liczb samic, wrd ktrych mona si spodziewa obecnoci nosicielek recesywnego allelu.

136

Pojawienie si w potomstwie pochodzcym z takich kojarze osobnika obarczonego wad wiadczy o obecnoci poszukiwanego allelu recesywnego w genotypach testowanego rozpodnika oraz matki noworodka. 3. Dokadn metod identyfikacji nosicielstwa recesywnego genu, lecz trudn do zaakceptowania ze wzgldw hodowlanych, jest kojarzenie samca z jego wasnymi crkami. Jeli przyjmiemy, e samice matki tych crek s homozygotyczne (AA), a samiec jest heterozygotyczny, to wrd crek poowa bdzie miaa genotyp AA, a poowa Aa. Wwczas schemat kojarzenia testowego jest nastpujcy:

Kojarzenie rozpodnika (ewentualnego nosiciela) z jego wasnymi crkami powinno da w potomstwie rozszczepienie w stosunku 7 normalnych do l obarczonego wad. W hodowli byda mode buhaje, zakupione przez Stacje Hodowli i Unasieniania Zwierzt, kojarzone s z losowo wybranymi samicami. Celem zasadniczym jest ocena wartoci genetycznej rozpodnika w zakresie cech uytkowoci mlecznej na podstawie potomstwa (metoda ta jest opisana w podrcznikach z zakresu metod hodowlanych). Przeprowadzone kojarzenie moe umoliwi take wykrycie obecnoci w genotypie zwierzt recesywnych genw letalnych (tzw. test automatyczny). Jeli oboje rodzice maj genotyp heterozygotyczny w danym locus, w potomstwie moe si ujawni z prawdopodobiestwem rwnym 1/4 niepodana cecha recesywna. Cakowita eliminacja z populacji genw letalnych o nieznanej budowie molekularnej jest niemoliwa. Zatem jednym ze sposobw unikania w hodowli masowej strat powodowanych dziedzicznymi wadami wrodzonymi jest niedopuszczanie do kojarze krewniaczych. Ponadto naley rejestrowa i zgasza w zakadach unasieniania lub w okrgowych stacjach hodowli zwierzt wszystkie przypadki rodzenia si zwierzt ywych lub martwych z wadami wrodzonymi. Rejestracja ta z jednej strony daje obraz czstoci wystpowania tych wad, z drugiej natomiast umoliwia usuwanie z hodowli nosicieli (zwaszcza mskich).
137

Rozwj genetyki molekularnej pozwala coraz czciej na identyfikacj nosicielstwa zmutowanych alleli poprzez testy oparte na analizie restrykcyjnej (RFLP) zamplifikowanych metod PCR fragmentw DNA, w ktrych wystpuje gen odpowiedzialny za powstanie dziedzicznej wady wrodzonej czy choroby genetycznej. Zagadnienie to opisano niej.

DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA NIEKTRYCH CHORB GENETYCZNYCH

Wikszo chorb genetycznych zwierzt gospodarskich jest spowodowana mutacjami genowymi, ktre prowadz do zmiany sekwencji kodujcej skad aminokwasowy okrelonego biaka. Ostatnie lata przyniosy postp w poznawaniu podoa molekularnego chorb dziedzicznych. W diagnostyce tych chorb stosowane s techniki biologii molekularnej, gwnie PCR-RFLP, ktra polega na ustalaniu dugoci fragmentw restrykcyjnych DNA przez cicie (trawienie) zamplifikowanego DNA enzymami restrykcyjnymi (endonukleazy), a nastpnie rozdzia tych fragmentw za pomoc elektroforezy (patrz rozdzia: Metody analizy i modyfikacji genomu). Najbardziej rozpowszechnion chorob genetyczn w hodowli byda rasy holsztysko-fryzyjskiej jest BLAD (ang. bovine leukocyte adhesion deficiency) zmniejszona odporno cielt, spowodowana wrodzonym niedoborem leukocytarnych czsteczek adhezyjnych. Jest to choroba autosomalna recesywna, wystpujca rwnie u ludzi pod nazw LAD (ang. leukocyte adhesion deficiency). Jest ona warunkowana zmutowanym recesywnym allelem (oznaczonym symbolem D128G) genu ITGB2, ktry koduje strukturaln podjednostk CD18 p2-integryny. Biako to odgrywa istotn rol w odpornoci organizmu. Pewnym niebezpieczestwem rozprzestrzeniania tej choroby jest to, i przypuszczalnie geny korzystnych cech ilociowych s istotnie sprzone z locus genu ITGB2. Osobniki heterozygotyczne (nosiciele niekorzystnego zmutowanego allelu) cechuje jednoczenie wysoka warto hodowlana. Na pocztku lat 90. w USA frekwencja nosicieli niekorzystnego allelu D128G wynosia okoo 15% wrd buhajw i 6% wrd krw. U byda zesp BLAD by znany od kilkunastu lat, po raz pierwszy opisano go w 1983 roku. Analiza rodowodowa wykazaa, e mutacja genu ITGB2 wystpia u buhaja urodzonego w USA w 1952 roku. Jednak molekularna identyfikacja allelu D128G (BLAD) nastpia dopiero w 1992 roku. W latach 70. rozpocz si intensywny import do Polski byda rasy holsztysko-fryzyjskiej w celu poprawy wartoci genetycznej rodzimego byda czarno-biaego, tym samym wprowadzono do puli genowej naszego byda niekorzystny allel D128G. Poniewa jest to gen recesywny, szczeglne znaczenie ma identyfikacja jego nosicieli (osobniki heterozygotyczne, fenotypowo zdrowe). Stwierdzona w pozycji 383 nukleotydu mutacja, powodujca zamian w pozycji 128 acucha polipeptydowego kwasu asparagino138

wego na glicyn, jest podstaw testu molekularnego umoliwiajcego wykrywanie nosicielstwa. Za pomoc analizy fragmentw restrykcyjnych okrela si, jaki allel wystpuje w badanym DNA. Wykorzystuje si do tego celu istnienie rnych miejsc cicia dla enzymw restrykcyjnych Haelll i Tacjl zalenie od normalnych i zmutowanych sekwencji nukleotydowych. W allelu prawidowym znajduje si miejsce restrykcyjne rozpoznawane przez enzym Haelll i miejsce restrykcyjne dla enzymu TaqI. Natomiast w allelu zmutowanym D128G mutacja punktowa zmienia sekwencj rozpoznawan przez enzym TaqI i w nastpstwie tego enzym nie przecina czsteczki DNA. Z kolei, ta sama mutacja punktowa powoduje powstanie drugiego miejsca restrykcyjnego dla enzymu HaeIII. Po zamplifikowaniu fragmentu genu 2-integryny produkt PCR dugoci 58 par zasad poddaje si trawieniu jednym z wymienionych enzymw, a nastpnie uzyskane fragmenty rozdziela elektroforetycznie (metoda RFLP). Obraz elektroforetycznego rozdziau wyglda nastpujco:

W obrbie genu kodujcego podjednostk 2-integryny stwierdzono take drug mutacj, tzw. ciche podstawienie 775 nukleotydu, ktre nie wpywa na sekwencj aminokwasow biaka kodowanego przez ten gen. Inn chorob genetyczn byda rasy holsztysko-fryzyjskiej jest cytrulinemia, opisana po raz pierwszy u byda mlecznego w Australii w 1986 roku. W 1993 roku stwierdzono jej wystpowanie rwnie u byda tej rasy w USA. Mutacja ta zostaa ju przedstawiona wczeniej. Jej podoem genetycznym jest zmutowany, recesywny allel genu warunkujcego syntez enzymu syntetazy argininobursztynianowej, ktry bierze udzia w cyklu mocznikowym. Nosiciele cytrulinemii maj genotyp ASAS/asas i fenotypowo s normalni, natomiast cielta homozygotyczne asas/asas padaj 5-6 dnia po urodzeniu z powodu upoledzenia zdolnoci usuwania mocznika z organizmu. Ze wzgldu na moliwo wprowadzenia tego niekorzystnego allelu do genotypw byda w innych krajach, podejmowane s rodki prewencyjne. Opracowany test diagnostyczny cytrulinemii z zastosowaniem techniki PCR-RFLP wykorzystuje to, i zmutowany allel nie ma miejsca restrykcyj139

nego dla enzymu Avall w kodonie 86. Wynikiem testu molekularnego dla osobnika homozygotycznego pod wzgldem allelu zmutowanego jest jeden prek dugoci 194 pz, dla heterozygotycznego trzy prki: 194 pz, 118 pz i 72 pz, a dla normalnej homozygoty dwa prki 118 pz i 72 pz. W obrbie genu syntetazy argininobursztynianowej stwierdzono take tranzycj cytozyny na tymin, powodujc polimorfizm w 175 kodonie dla proliny (CCCCCT), nie dajc adnych skutkw fenotypowych. Kolejn, rwnie wczeniej przedstawion mutacj letaln, wystpujc u czarno-biaego i czerwono-biaego byda holsztysko-fryzyjskiego, jest recesywna mutacja genu syntazy urydynomonofosforanowej. Zmutowany allel genu UMPS, okrelony symbolem DUMPS (ang. deficiency uridine monophosphate synthase), powoduje zamieranie homozygotycznych zarodkw okoo 40 dnia ciy, dlatego nazwano go genem zamieralnoci zarodkw". Osobniki heterozygotyczne s fenotypowo normalne, ale wykazuj obniony poziom aktywnoci enzymu. Konsekwencj tego jest podwyszony poziom kwasu orotowego w mleku i moczu krw heterozygotycznych. Z drugiej jednak strony, krowy takie charakteryzuje wiksza wydajno mleka i zawarto biaka w mleku, natomiast buhaje maj wysz warto hodowlan w zakresie cech uytkowoci mlecznej. Aby nie dopuszcza do kojarze nosicieli tego niekorzystnego genu, ktrych skutkiem byoby zmniejszenie podnoci krw (zamieralno zarodkw homozygotycznych), konieczna jest identyfikacja genotypw heterozygotycznych (nosicieli). Podobnie jak w przypadku poprzednich mutacji, do identyfikacji nosicielstwa zmutowanego allelu stosowana jest metoda PCR-RFLP. Mutacja ta w kodonie 405 genu UMPS znosi miejsce restrykcyjne dla enzymu Aval. Prawidowy gen syntazy urydynomonofosforanowej bdzie przez ten enzym trawiony, natomiast allel zmutowany (DUMPS) nie bdzie. Zamplifikowany fragment genu trawiony enzymem Avol da nastpujcy obraz rozdziau elektroforetycznego: osobniki homozygotyczne (zdrowe) dwa prki: 53 pz i 36 pz osobniki heterozygotyczne (nosiciele) trzy prki : 53 pz, 36 pz i 89 pz Ze wzgldu na letalny efekt allelu DUMPS w ukadzie homozygotycznym, niemoliwa jest analiza DNA osobnikw homozygotycznych. Prowadzone s jednak badania blastocyst przewidzianych do embriotransferu pochodzcych z kojarze osobnikw heterozygotycznych. U koni dotychczas poznano molekularne to dwch chorb genetycznych. Pierwsza z nich to okresowy parali, nazwany HYPP (ang. hyperkalemic periodic paralysis), pojawiajcy si u koni uarter" w USA. Odpowiedzialna za t chorob jest mutacja w genie kanau sodowego mini, polegajca na transwersji CG w transbonowej domenie IVS3 podjednostki a genu kanau sodowego (zamiana fenyloalaniny na leucyn w regionie midzy 1358 a 1514 aminokwasem w biaku). Objawami tej choroby s ataki drenia mini i paraliu, wystpujce po zmianie diety, okresie godzenia, za140

dziaaniu czynnika stresogennego lub spoyciu siana z lucerny bogatej w potas. Okresowy parali wystpuje u koni cennych pod wzgldem wartoci genetycznej, dobrze uminionych. Selekcja koni na podstawie wynikw gonitw na torze wycigowym moe prowadzi do wzrostu frekwencji tego niekorzystnego allelu. Mutacja HYPP dziedziczy si z niezupen dominacj, u koni homozygotycznych objawy s silniejsze ni u heterozygotycznych. Diagnostyka molekularna nosiciela zmutowanego alelu prowadzona jest za pomoc metody PCR-RFLP, z zastosowaniem enzymu restrykcyjnego Tagi. Podobna choroba od 50 lat znana jest u ludzi. Druga choroba genetyczna o znanym podou molekularnym wystpujca u koni to ciki zoony brak odpornoci (ang. severe combined immunodeficiency disease SCID). Choroba ta charakteryzuje si brakiem limfocytw T oraz B, co powoduje zaamanie si ukadu immunologicznego. rebita o genotypie homozygoty recesywnej padaj wkrtce po urodzeniu wskutek rozwoju rnorodnych infekcji. Za rozwj tej choroby odpowiedzialna jest mutacja polegajca na delecji 5 nukleotydw w genie kodujcym katalityczn podjednostk kinazy biakowej zalenej od DNA (DNA-PK). Mutacj t stwierdzono u koni czystej krwi arabskiej hodowanych w USA, natomiast badania przeprowadzone w Polsce wykazay, e nie wystpuje ona w polskiej populacji koni arabskich. Omawiajc choroby genetyczne nie sposb pomin tzw. chorb prionowych. Wprawdzie s one wywoywane przez nietypowy czynnik zakany, ktrym jest biako, jednak predyspozycje do tych chorb mog by warunkowane mutacj genow. Biakowe czsteczki infekcyjne, nazwane prionami, namnaaj si w ten sposb, i przeksztacaj prawidowe czsteczki biaka w szkodliwe, indukujc zmiany ich konformacji. Znane choroby prionowe powoduj czsto ubytki w mzgu i w konsekwencji prowadz do mierci. Z tego powodu okrelane s gbczastymi encefalopatiami (ang. spongiform encephalopathies). Przypuszcza si, i biako prionowe i biako komrkowe (normalne) s kodowane przez ten sam gen, a rnica midzy nimi wynika z zakce w wycinaniu intronw tego genu (splicing mRNA). Gen kodujcy biako komrkowe oznaczono symbolem PrPc, jego zmutowany allel, warunkujcy biako prionowe symbolem PrPSc. Gen ten u czowieka znajduje si w krtkim ramieniu chromosomu 20, na granicy prka 12 i 13 (20pl2-pl3), natomiast u byda i owiec w dugim ramieniu chromosomu 13, przy czym u byda w pozycji 13ql7, u owiec 13ql7-ql8. Jedn z najdawniej, bo okoo 250 lat temu, poznanych chorb prionowych u zwierzt jest trzsawka (ang. scrapie drapa) u owiec. Choroba ta jest miertelna i charakteryzuje si dugim okresem inkubacji, trwajcym miesice lub lata bez adnych objaww. W czasie jej rozwoju przeksztacone czsteczki biaka gromadz si w mzgu i niektrych tkankach, jak
P

141

ledziona czy wzy chonne. Diagnozowanie choroby jest oparte na pomiertnym klinicznym badaniu mzgu. W cigu ostatnich 20 lat czyniono prby ograniczenia wystpowania scrapie przez selekcj owiec odpornych na ni i brakowanie podatnych. Metoda ta okazaa si jednak zbyt droga i dugotrwaa, a jej rezultaty nie byy zadowalajce. Znacznie wiksze moliwoci eliminacji scrapie stwarzaj techniki biologii molekularnej. W obrbie genu PrPc u owiec szczeglnie istotne s trzy mutacje punktowe w nastpujcych kodonach: 136 (kodon dla waliny zmieniony w kodon dla alaniny; oznaczenia literowe V/A), 154 (arginina/histydyna; R/H) oraz 171 (arginina/glutamina; R/Q) (tab. 5-III). Jednak dua zmienno rasowa w podatnoci na scrapie ogromnie utrudnia okrelenie genotypu podatnego" i odpornego". Wydaje si, e najbardziej odporne s owce o genotypie AA136RR154RR171, a najbardziej podatne owce o genotypie W136RR154QQ17j (genotyp ten wystpuje jednak bardzo rzadko). U byda chorob prionow jest rozmikczenie mzgu (ang. bovine spongiform encephalopathy BSE). Pierwszy przypadek tej choroby zanotowano w 1985 roku w Wielkiej Brytanii, rok pniej zostaa opisana jej patologia. Jest to choroba orodkowego ukadu nerwowego. Jej charakterystyczn cech jest tworzenie i gromadzenie biaka amyloidowego (odpornego na dziaanie enzymw proteolitycznych) w mzgu zakaonych zwierzt. Czynnikiem zakanym BSE jest to samo biako prionowe, ktre wywouje scrapie u owiec. Biako to ma okoo 250 aminokwasw. W genie PrPc u byda (w chromosomie 13 BTA13ql7) wykryto polimorfizm, zwizany z rnic w liczbie omiopeptydowych powtrze (5 lub 6 powtrze) (ry. 5-17). Dotychczas stwierdzono, e czciej wystpuje 6 powtrze. Spord trzech moliwych genotypw (6:6, 6:5 i 5:5) najrzadziej wystpuje genotyp homozygotyczny pi powtrze. Ponadto tylko ten genotyp nie wystpowa u krw z BSE. Prowadzone s intensywne badania na myszach transgenicznych z bydlcym genem PrPc, ktre powinny przyczyni si do wyjanienia genetycznego ta tej choroby. Ostatnie badania wykazay, e w pobliu genu biaka prionowego znajduje si gen Prnd (ang. prion-doppel). Gen ten koduje biako okrelane jako Dpl (ang. downstream prion-like protein) lub doppel, ktre wykazuje 25% homologii w skadzie aminokwasowym z biakiem prionowym. Nadekspresja tego genu w mzgu moe powodowa inn chorob neurodegeneracyjn. Wykryto ju kilka mutacji w tym genie u owiec, kz i byda. 142

5.4.5. Mutacje genowe odpowiedzialne za odporno/podatno zwierzt na patogeny


Gen odpornoci na kleszcze

W niektrych krajach, gwnie w pnocnej Australii i innych regionach tropikalnych, jak rwnie w Europie, bydo jest szczeglnie podatne na inwazje kleszczy. Z kolei, bydo indyjskie jest bardzo odporne na kleszcze. T odporno mona przenosi na mieszace poprzez krzyowanie z rasami podatnymi, ale jednoczenie powoduje to zmniejszenie produkcyjnoci potomstwa krzywkowego. Australijscy badacze wykryli u linii pochodzcych z krzyowania byda misnego ras hereford i shorthorn gen o duym efekcie, determinujcy odporno na kleszcze. Wykorzystanie tego genu stwarza moliwo stosunkowo szybkiego zwikszenia odpornoci na kleszcze rnych ras byda.
Gen K88 i F18

U wi odporno na niektre choroby infekcyjne jest kontrolowana przez pojedynczy gen. Nale do nich biegunki okresu noworodkowego u prosit, w przewaajcej mierze wywoywane enterotoksycznymi szczepami Escherichia coli, powodujce rocznie padnicie okoo 10 min prosit na wiecie. Podatno na te biegunki zaley od obecnoci receptorw na powierzchni komrek nabonka jelita cienkiego u zwierzt, umoliwiajcych adhezj bakterii i ich rozwj. Z kolei, wystpowanie tych 143

receptorw warunkowane jest genem gwnym (o duym efekcie). Loci receptorw dla E. coli K88 zlokalizowano w chromosomie 13, blisko locus Tf (transferyny). Receptory te prawdopodobnie peni take jakie funkcje fizjologiczne, stwierdzono bowiem, i zwierzta majce te receptory charakteryzuj si zwikszonymi dobowymi przyrostami masy ciaa w przedziale wagowym od 24 do 100 kg. U prosit w pniejszym wieku (4-12 tygodni) wystpuje choroba obrzkowa, ktrej objawami s m.in. ataksja, konwulsje i parali oraz biegunka poodsadzeniowa (kolibacilloza jelitowa), schorzenia wywoywane przez enterotoksyny wytwarzane przez zasiedlajcy powierzchni jelita cienkiego szczep F18 E. coli (bakterie te maj fimbrie). Odporno/podatno na adhezj tej bakterii jest kontrolowana przez locus ECF18R (locus receptora dla E. coli F18), znajdujcy si w chromosomie 6 i wchodzcy w skad halotanowej grupy sprzeniowej. Podatno jest cech dominujc (allel B), a odporno recesywn (allel b). Niedawno stwierdzono sprzenie midzy locus ECF18R a dwoma loci (FUT1 i FUT2) dla -l,2-fukozylotransferazy. W jednym z nich (FUT1) wykryto dwie mutacje, z ktrych jedna, oznaczona symbolem M307, polegajca na tranzycji G-A w kodonie 307 (w acuchu peptydowym zamiana alaniny na treonin), wykazuje cise sprzenie z genem ECF18R. Mutacja ta likwiduje miejsce trawienia DNA dla enzymu CfoI. Analiza polimorfizmu DNA przeprowadzona metod RFLP wykazuje obecno dwch prkw (93 pz i 328 pz) u osobnikw homozygotycznych MSOZA/A (allel zmutowany), trzech prkw (93, 241 i 87 pz) u homozygot M307G/G (allel normalny) oraz wszystkich czterech prkw u zwierzt heterozygotycznych. W badaniach szwajcarskich wykazano 100% sprzenie allelu ECF18R1', warunkujcego odporno na infekcje E. coli F18, z alelem zmutowanym M307A, oraz takie samo sprzenie allelu ECF18RB (podatno na biegunki i chorob obrzkow) z alelem normalnym M307G. Stwarza to szans wczesnego wykrywania prosit podatnych na infekcje E. coli F18 na podstawie testu diagnostycznego dla mutacji M307 w locus -fukozylotransferazy. Badania przeprowadzone w Polsce wykazay wysok frekwencj allelu odpornoci w rasie zotnicka pstra.

5.5. Mutacje w mitochondrialnym DNA


Mutacje w mitochondrialnym DNA (mtDNA) zachodz znacznie czciej ni mutacje w DNA jdrowym. Przyczyn tego moe by brak w mitochondriach mechanizmw naprawy uszkodze DNA. Mutacje te mog by dziedziczone po matce, mog take powstawa de novo w komrce jajowej lub w zarodku we wczesnym stadium rozwojowym. Cz mutacji w mitochondrialnym DNA zachodzi w cigu caego ycia osobnika, a ich charakterystyczn cech jest to, i mog
144

dotyczy caych tkanek, pojedynczych komrek lub nawet poszczeglnych czsteczek mtDNA tej samej komrki. Miejsce i zasig wystpowania danej mutacji powoduj, i w tkance wystpuj razem gen prawidowy i jego zmutowany allel bd dana mutacja moe wystpowa w kadej czsteczce mtDNA we wszystkich tkankach. Pierwszy rodzaj mutacji nazywany jest mutacj heteroplazmatyczn, drugi natomiast mutacj homoplazmatyczn. Mutacje w mitochondrialnym DNA s przyczyn bardzo powanych chorb genetycznych u ludzi. Nale do nich przede wszystkim choroby orodkowego ukadu nerwowego i ukadu miniowego. Niestety brak jest efektywnych metod leczenia chorb wywoywanych tymi mutacjami. Cech charakterystyczn chorb powodowanych mutacjami w mtDNA jest to, i mutacja jest przekazywana przez komrk jajow od chorej matki zarwno crkom, jak i synom, ale dalszym pokoleniom cech t przekazuj tylko crki. Mutacje w mitochondrialnym DNA, podobnie jak w DNA jdrowym, polegaj na substytucjach nukleotydw (gwnie tranzycja), insercji bd delecji nukleotydw. Skutkiem tranzycji s takie choroby u czowieka, jak dziedziczna neuropatia nerwu wzrokowego zesp Lebera (LHON) i neuropatia obwodowa mini poczona z ataksj i barwnikowym zwyrodnieniem siatkwki (NARP). Podstawienia nukleotydw w genach kodujcych tRNA powoduj m.in. mitochondrialn miopati, padaczk miokloniczn i tzw. poszarpane czerwone wkna (MERRF), dziedziczn miopati i kardiomiopati (MMC) oraz zesp chorobowy oznaczony skrtem MELAS (encefalomiopatia mitochondrialn, kwasica mleczanowa i napady udaropodobne). Z kolei mutacje typu insercja-delecja s przyczyn wikszoci miopatii ocznych (np. chroniczny postpujcy parali mini oka CEOP) i zespou Pearsona, polegajcego na zaburzeniach funkcjonowania szpiku kostnego u dzieci i niewydolnoci trzustki. Wikszo mutacji w mtDNA cechuje specyficzna relacja midzy genotypem a fenotypem. Okrelona choroba moe by wywoana mutacjami w rnych genach i odwrotnie dana mutacja moe by przyczyn rnych chorb. Przykadem pierwszej sytuacji jest wspomniana ju choroba LHON, ktrej podoem genetycznym s mutacje w 6 rnych podjednostkach dehydrogenazy NADH lub mutacja w genie apocytochromu b. Z kolei, mutacja w pozycji 8993 genu syntazy ATP warunkuje chorob NARP oraz zesp Leigha (miertelna choroba wieku dziecicego). Badania wystpowania i skutkw mutacji genw mitochondrialnych u zwierzt s nieliczne. Wiadomo na przykad, e niektre allele genu karboksylazy fosfoenolopirogronianowej (enzym biorcy udzia w szlaku glukoneogenezy) wystpuj u kurczt podatnych na chorob Mareka, wywoywan przez wirus, inne natomiast u odpornych.

Genetyka klasyczna (mendlowska) jako cech okrela waciwo organizmu, ktra jest atwa do odrnienia w zespole innych waciwoci (np. barwa umaszczenia, posiadanie/brak rogw). Dziki osigniciom genetyki biochemicznej powstaa hipoteza jeden gen jeden enzym. W myl tej hipotezy synteza kadego enzymu jest kontrolowana przez okrelony gen. Dalsze badania spowodoway ucilenie tej hipotezy: jeden gen jeden acuch polipeptydowy. Oznacza to, e jeden gen warunkuje sekwencj aminokwasw w polipeptydzie. W opisie mechanizmw dziedziczenia atwiej jest posugiwa si mendlowskim pojciem cechy jako pewnej waciwoci. Oglnie cechy mona podzieli na jakociowe i ilociowe. Cechy jakociowe s warunkowane jedn, rzadziej kilkoma wspdziaajcymi ze sob parami genw. Natomiast podoe genetyczne cech ilociowych jest bardziej zoone, bowiem na ich ekspresj wpywa kilkanacie, a nawet kilkadziesit par genw. Ponadto, w przypadku wielu cech ilociowych ich warto jest modyfikowana przez czynniki rodowiskowe. Mechanizm dziedziczenia cech ilociowych jest omwiony w rozdziale: Zmienno cech. Do cech jakociowych zalicza si takie, jak: umaszczenie zwierzt, kolor upierzenia u drobiu; rogato lub bezrono byda, owiec i kz; ukady grupowe krwi itd. Wspln waciwoci tych cech jest to, e identyfikacja rnych wariantw fenotypowych danej cechy jest wzgldnie prosta. Mechanizm dziedziczenia cech jakociowych jest zrnicowany, a ich ujawnienie si zaley przede wszystkim od zaoe genetycznych. Wpyw czynnikw rodowiskowych na ekspresj tych cech jest niewielki i dotyczy tylko nielicznych przypadkw, np. umaszczenia. Znane s rwnie przykady, kiedy jeden gen wpywa na ksztatowanie si kilku cech. Zjawisko to nazywa si plejotropi. 146

Zestaw genw wystpujcych w komrkach jednego osobnika nazywamy genotypem, a zesp cech warunkowanych przez genotyp i czynniki rodowiskowe fenotypem. Genotyp jest ustalany na podstawie fenotypu osobnika lub jego krewnych bd przez bezporednie badanie DNA. Fenotyp jest opisywany na podstawie obserwacji lub pomiaru cechy oraz analiz molekularnych (identyfikacja biaek). Jak ju wspomniano, cechy jakociowe mog by warunkowane jedn lub kilkoma parami genw wspdziaajcych ze sob. Pierwszy rodzaj wspdziaania nosi nazw allelicznego (1 para genw), drugi natomiast nieallelicznego (kilka par genw). Para genw warunkujcych powstanie okrelonej cechy zajmuje okrelone miejsce (locus) w dwch homologicznych chromosomach. Geny te nazywane s par alleli lub allelomorfw. Allelomorficzn par genw oznacza si t sam liter wielk lub ma (np. A-a). Wybr litery zwykle jest zwizany z angielsk nazw pierwszego wariantu allelu wykrytego w danym locus. Zygota, ktra zawiera dwa jednakowe geny z danej pary alleli, nazywa si homozygot (AA lub aa), natomiast majca dwa rne geny heterozygot (Aa). Kojarzenie jednakowych homozygot midzy sob daje zawsze potomstwo jednolite pod wzgldem interesujcej nas cechy. W przypadku kojarzenia heterozygot w potomstwie wystpi rozszczepienie cech, dajc wszystkie moliwe formy danej cechy. Podstawowe reguy dziedziczenia cech zawarte s w prawach Mendla. I prawo Mendla, zwane prawem czystoci gamet, mwi o tym, e gameta zawiera tylko jeden gen z danej pary alleli. W procesie gametogenezy allele z danej pary rozchodz si do gamet. Podczas zapodnienia dochodzi do losowego czenia si alleli w pary. Potomek dziedziczy zatem jeden allel z danej pary od ojca, drugi natomiast od matki.

6.1. Dziedziczenie cech warunkowanych jedn par alleli


6.1.1. Wspdziaanie alleli
Cechy jakociowe kontrolowane przez jeden gen s wynikiem wspdziaania midzy par alleli tego genu. Mona wyrni nastpujce rodzaje tego wspdziaania: 1) dominowanie cakowite typ Pisum 2) dominowanie niezupene (dziedziczenie porednie) typ Zea 3) kodominowanie 4) naddominowanie. 147

Przykadem cakowitej dominacji moe by bezrono u byda. Stwierdzono, i cecha bezronoci/rogatoci jest kontrolowana przez locus polled (znajdujcy si w l chromosomie), ktry ma dwa allele: P dominujcy allel bezronoci i p recesywny gen rogatoci. Wszystkie zwierzta (bydo) rogate s homozygotyczne pod wzgldem recesywnego allelu p. Allel ten u osobnikw heterozygotycznych nie ujawnia si w fenotypie, gdy gen dominujcy P maskuje jego ekspresj. Para rodzicw, bdcych homozygotami alternatywnymi (PP i pp) pod wzgldem locus polled, zawsze da potomstwo heterozygotyczne, wykazujce dominujc form cechy. Kojarzc te osobniki midzy sob uzyskamy w nastpnym pokoleniu 3/4 zwierzt bezrogich (PP i Pp) i 1/4 rogatych (pp). Innym przykadem jest biay pas u czarno umaszczonych wi rasy hampshire, kontrolowany przez allel dominujcy Bew z locus Be. Z kolei u wi rasy cornwall, rwnie czarno umaszczonych, w locus tym wystpuje allel be, jednolitego umaszczenia. Krzyowanie midzyrasowe wi obu tych ras przedstawiono na rycinie 6-1. Przedstawiony na przykadzie sposb dziedziczenia z dominowaniem cakowitym nazywany jest rwnie dziedziczeniem typu Pisum. Do cech dziedziczcych si z dominowaniem cakowitym nale take: bezrono (cecha dominujca) i rogato kz, jednolite umaszczenie (dominuje) i aciato u byda, czarne umaszczenie u byda, dominujce nad czerwonym i inne. Dominowanie niezupene genw z jednej pary alleli polega na tym, e u osobnikw heterozygotycznych pod wzgldem danej pary alleli wystpuje porednia forma cechy. Ilustracj tego typu dziedziczenia, nazywanego rwnie dziedziczeniem typu Zea, jest poniszy przykad. U byda rasy shorthorn obok zwierzt czerwono umaszczonych zdarzaj si osobniki o umaszczeniu biaym oraz zwierzta majce umaszczenie porednie mroziate. Kojarzc zwierzta umaszczone czerwono ze zwierztami biaymi, otrzymuje si potomstwo (pokolenie Fl) mroziate. Natomiast z kojarzenia osobnikw mroziato umaszczonych uzyskuje si potomstwo (pokolenie F2), z ktrego cz ma umaszczenie czerwone, cz mroziate, cz za biae. Jeeli obserwacje bd prowadzone na duej grupie zwierzt, to stosunek liczbowy osobnikw czerwonych, mroziatych i biaych w pokoleniu F2 wyniesie 1:2:1. Charakterystyczn cech tego typu dziedziczenia jest to, e fenotyp zwierzcia odzwierciedla jego genotyp. Wiele cech zwierzt domowych dziedziczy si tak jak cecha umaszczenia u shorthornw. S to na przykad: szurpato u kur (pira nastroszone i pozwijane), upierzenie kur andaluzyjskich (czarne, biae i stalowoniebieskie), dugo uszu u owiec rasy karaku i inne. W przypadku kodominowania w fenotypie ujawniaj sw obecno obydwa geny z okrelonej pary alleli. S one zatem w stosunku do siebie rwnorzdne. Przykadem tego typu wspdziaania allelicznego jest grupa
148

krwi AB w ukadzie ABO u ludzi, w ktrej oba allele LA i LB ulegaj ekspresji w jednakowym stopniu. Naddominowanie polega na tym, e genotyp heterozygotyczny (Aa) warunkuje wiksz ekspresj cechy ni genotyp homozygotyczny (AA lub aa). Przedstawione dotychczas rodzaje wspdziaania dotyczyy genw wystpujcych w postaci par alleli majcych tylko dwie alternatywne formy. W przypadku niektrych loci, w wyniku mutacji genowych (patrz rozdzia: Mutacje), obok dotychczasowej pary alleli pojawia si allel trzeci, ktry warunkuje t sam cech co allele pierwotne, dajc jedynie inn jej form lub natenie. Zdarzaj si rwnie takie loci, w ktrych u rnych osobnikw znajduj si wicej ni trzy allele. Ukad taki, w ktrym w jakiej populacji
149

wystpuj wicej ni dwa allele, nazywamy szeregiem (seri) alleli wielokrotnych. Allele wielokrotne charakteryzuj si tym, i: warunkuj tylko jedn cech kady osobnik moe mie tylko dwa allele z danego szeregu wrd zwierzt stanowicych populacj mona napotka wiele geno typw zarwno homozygotycznych pod wzgldem ktregokolwiek allelu z tego szeregu, jak i heterozygotycznych pod wzgldem jakichkolwiek dwch alleli liczba rnych genotypw w populacji zaley od liczby alleli w danym szeregu. Jeli szereg skada si z n liczby alleli, to liczba genotypw bdzie si rwnaa:

Przedstawione przykady dziedziczenia dotyczyy tylko jednej cechy kontrolowanej przez jedn par alleli. Jeli rozpatrywane jest dziedziczenie dwch lub wicej takich cech rwnoczenie, to mog si one dziedziczy niezalenie od siebie lub zalenie (cechy sprzone).

6.1.2. Niezalene dziedziczenie cech (II prawo Mendla)


Niezalene dziedziczenie cech stwierdzi Grzegorz Mendel, badajc m.in. sposb dziedziczenia barwy kwiatw i ksztatu nasion u groszku. Na podstawie uzyskanych wynikw sformuowa prawo (II prawo Mendla), mwice o niezalenym dziedziczeniu si cech. Oznacza to, e podczas mejozy segregacja alleli jednej pary jest niezalena od alleli drugiej pary. Warunkiem niezalenego dziedziczenia si cech jest umiejscowienie determinujcych je genw w rnych parach chromosomw. Rwnie gdy loci genw znajduj si w tym samym chromosomie w duej odlegoci od siebie, to ich segregacja jest praktycznie niezalena. Niezalene dziedziczenie cech obrazuje przykad krzyowania zwierzt rnicych si dwiema cechami umaszczeniem (czarne, czerwone), warunkowanym par alleli Ed-e (z locus Extension umiejscowionego w chromosomie 18) i bezronocia/rogatoci (allele P-p z locus polled w chromosomie 1). Wszystkie gamety osobnika aberdeen-angus (bydo czarne, bezrogie) zawieraj dominujce geny Ed i P, natomiast gamety osobnika rasy shorthorn (czerwone, rogate) allele recesywne e i p. Zwierzta z pokolenia Fj bd mie genotyp EdePp, czyli bd czarne, bezrogie. Kady osobnik z tego pokolenia wytwarza 4 rne rodzaj gamet: EdP, Edp, eP, ep. Dzieje si tak

150

151

dlatego, e allele Ed-e przechodz do komrek rozrodczych niezalenie od alleli P-p, gdy te dwie pary genw znajduj si w innych parach chromosomw homologicznych. Poniewa kady osobnik wytwarza 4 rodzaje gamet, to w wyniku losowego poczenia si gamety mskiej i eskiej moe powsta 4 x 4 = 16 moliwych kombinacji. Najatwiej przedstawi wszystkie moliwe genotypy w pokoleniu F2, sporzdzajc szachownic genetyczn Punneta. Spord 16 moliwych kombinacji genw w pokoleniu F2 uzyskuje si tylko 4 rne fenotypy w nastpujcym stosunku liczbowym: 9 (czarne, bezrogie): 3 (czarne, rogate): 3 (czerwone, bezrogie): l (czerwone, rogate) (ry. 6-2). Najliczniejsz grup potomstwa stanowi osobniki o genotypie, w ktrym wystpuje przynajmniej jeden gen dominujcy z kadej pary, a najmniej liczn grup (tylko l na 16 moliwych) stanowi osobniki podwjnie recesywne homozygotyczne (ee pp czerwony, rogaty). Liczbowy stosunek rozszczepienia cech w pokoleniu F2 (9:3:3:1) wystpi tylko wtedy, gdy obie cechy dziedzicz si z dominowaniem cakowitym. W przypadku obu cech dziedziczcych si z dominowaniem niezupenym (typ Zea) naley spodziewa si nie 4, lecz 9 rnych fenotypw. Natomiast gdy jedna cecha dziedziczy si wedug typu Pisum, a druga wedug typu Zea, istnieje moliwo ujawnienia si 6 rnych fenotypw. Jeli bdzie rozpatrywana wiksza liczba cech rwnoczenie, zwikszy si liczba moliwych fenotypw. Liczb gamet wytwarzanych przez osobniki heterozygotyczne pod wzgldem n par alleli, liczb oczekiwanych fenotypw i genotypw w pokoleniu F2 mona obliczy ze wzorw: liczba rnych gamet = 2n liczba fenotypw = 2 n liczba genotypw = 3 n

6.1.3. Dziedziczenie cech sprzonych


Podstaw II prawa Mendla o niezalenym dziedziczeniu si cech stanowi to, i geny umiejscowione w rnych chromosomach zachowuj si niezalenie podczas mejozy. W tym przypadku mona mwi o niezalenej segregacji chromosomw. Jednak organizmy ywe maj tysice, dziesitki tysicy rnych genw, a tylko kilka do kilkudziesiciu chromosomw. Zatem kady chromosom zawiera wiele genw. Podczas procesu gametogenezy geny znajdujce si w okrelonym chromosomie bd przekazane do powstajcej komrki rozrodczej cznie, inaczej mwic, cechy kontrolowane przez te geny bd si dziedziczy razem. Cechy takie nazywamy sprzonymi. Podany wyej wzr na obliczanie liczby rnych gamet (2n) nie moe
152

by stosowany do tych cech. Sposb segregacji genw znajdujcych si w tym samym chromosomie zaley od odlegoci midzy nimi. W rozdziale: Chromosomy i podziay jdra komrkowego wspomniano o tym, i w profazie I podziau mejotycznego zachodzi koniugacja chromosomw i powstaj biwalenty, zoone z homologicznych chromosomw. Dochodzi wwczas do wymiany odcinkw midzy niesiostrzanymi chromatydami, zwanej crossing over. W wyniku crossing over u czci osobnikw potomnych, tzw. rekombinantw, pojawi si kombinacje cech w innym ukadzie ni u rodzicw. Czsto tej wymiany jest tym wiksza, im dalej od siebie znajduj si geny. Prawidowo ta zostaa wykorzystana w opracowywaniu map genetycznych ukazujcych wzgldne pooenie poszczeglnych loci w chromosomach. Sposb okrelania sprzenia (odlegoci) loci przedstawia poniszy przykad. U muszki owocowej (Drosophila melanogaster) w drugim chromosomie znajduj si midzy innymi geny warunkujce czarn barw ciaa (gen recesywny b black) i ksztat skrzyde, skrzyda szcztkowe (gen recesywny v vestigal). Normalny fenotyp barwy ciaa muszki to barwa jasnobrunatna, normalne skrzyda s dusze od odwoka. Przyjmuje si symbol + " na oznaczenie allelu normalnej formy (tzw. dzikiej) kadej cechy u muszki. Jednak w celu lepszego zrozumienia zostan przyjte symbole B (barwa ciaa dzika dominujca) i V (ksztat skrzyde dziki dominujcy). W odrnieniu od cech segregujcych niezalenie, genotyp dla cech sprzonych jest zapisywany w postaci uamka, w ktrym licznik oznacza jeden chromosom, mianownik drugi chromosom z tej pary. Dla muszki dzikiej genotyp pod wzgldem dwch rozpatrywanych cech jest nastpujcy:

Natomiast genotyp podwjnej homozygoty recesywnej:

W celu okrelenia, jakie allele u osobnika heterozygotycznego (dominujce czy recesywne) z dwu loci sprzonych s przenoszone przez ten sam chromosom, zostaa przyjta nazwa faza sprzenia. Geny dominujce z tych loci mog si znajdowa w tym samym chromosomie i wtedy mwimy, e s one w fazie przycigania (cis), bd w rnych chromosomach i jest to faza odpychania (trans).

153

Ewentualne sprzenie cech najatwiej jest sprawdzi krzyujc osobniki heterozygotyczne z homozygotami recesywnymi jest to klasyczne krzyowanie testowe.

Zatem rodzicielski ukad alleli wystpi u 172 osobnikw (s to typy rodzicielskie fenotypu), natomiast pozostae 39 miao genotypy rekombinacyjne (osobniki takie s nazywane rekombinantami). W danym przykadzie rekombinanty stanowi okoo 18,5% caego potomstwa z tej krzywki. Procent rekombinacji przyjto za jednostk odlegoci midzy genami, ktrej symbolem jest cM (centymorgan, od nazwiska twrcy chromosomowej teorii dziedziczenia Tomasza Morgana), czyli l cM = 1% rekombinacji. W naszym przykadzie odlego midzy loci B i V wynosi 18,5 cM. Dowiadczalnie zostao udowodnione, e cechy sprzone daj w krzywkach zawsze zbliony procent rekombinantw. Wynika to z tego, i czsto, z jak crossing over zachodzi midzy sprzonymi loci, jest staa. W przedstawionym wyej przykadzie nie zostaa uwzgldniona moliwo zajcia podwjnego crosing over. Podwjny crossing over zachodzi znacznie rzadziej ni pojedynczy. Mona jednak przewidzie czsto wystpowania podwjnego crossing over, jest ona iloczynem czstoci przypadkw pojedynczych crossing over. Na przykad, jeli pojedynczy
154

crossing over w obszarze I zachodzi z czstoci 0,02 (2%), a w obszarze II 0,05 (5%), to czsto wystpowania podwjnego crossing over wynosi 0,02x0,05 = 0,001, czyli 0,1%. Jest to jednak warto przybliona, gdy w naturze jest ona nisza. Przyczyn stanowi to, i zajcie crossing over w jakim odcinku chromosomu zmniejsza prawdopodobiestwo drugiego crossing over w pobliu tego odcinka. Zjawisko to nosi nazw interferencji. Rekombinanty s osobnikami majcymi nowe kombinacje genw sprzonych. Jeli jednak zajdzie podwjny crossing over, ukad genw bdzie taki, jak przed t wymian i nie bdzie mona odrni rekombinantw. Skutkiem tego bdzie zmniejszona liczba rekombinantw i bd w obliczeniu odlegoci midzy loci sprzonymi. By tego unikn, stosuje si tzw. krzywki trzypunktowe, umoliwiajce dokadne ustalenie pooenia loci wzgldem siebie. Jeli przyjmiemy, e kolejno uoenia loci w chromosomie jest nastpujca: A-B-C, to obliczona odlego midzy loci A i C powinna by sum odlegoci midzy A i B oraz B i C. Sposb ustalenia sprzenia midzy trzema genami przedstawiony zostanie na omawianym przykadzie muszki owocowej. Trzeci cech rozpatrywan bdzie kolor oczu. U muszki owocowej dominuje czerwony kolor oczu (dziki), a gen recesywny c (cinnabar), warunkuje kolor cynobrowy. Rwnie w tej krzywce, w celu lepszego uwidocznienia efektu crossing over, allele dominujce bd oznaczone literami alfabetu, a nie za pomoc przyjtego dla nich symbolu + ". Jeli skrzyujemy osobniki rnice si allelami w trzech loci sprzonych, to na podstawie fenotypw potomstwa wykryjemy wszystkie przypadki pojedynczych i podwjnych crossing over midzy skrajnymi loci. Ponadto moliwe bdzie ustalenie kolejnoci uoenia trzech rozpatrywanych loci w chromosomie. W pokoleniu rodzicielskim jedna pe musi mie genotyp potrjnie heterozygotyczny:

Natomiast drugi rodzic ma genotyp:

W wyniku pojedynczego crossing over w obszarze I midzy genami B i C powstan gamety bCV i Bcv, natomiast skutkiem pojedynczego crossing over w obszarze II midzy genami C i V bd gamety BCv i bcV. Z kolei, podwjny crossing over w obszarze I i II da gamety o nastpujcym zestawie alleli: bCv i BcV. 155

W potomstwie uzyskano nastpujce genotypy i liczebnoci:

Obliczanie odlegoci midzy loci sprzonymi: Odlego midzy genami B i C jest stosunkiem sumy rekombinantw powstaych w wyniku crossing over w I obszarze i rekombinantw powstaych po podwjnym crossing over do wszystkich fenotypw, wyraonym w procentach:

Analogicznie do tego odlego midzy loci C i V wynosi:

Odcinek chromosomu 2 Drosophila melanogaster zawierajcy rozpatrywane loci wyglda nastpujco:

Dla kadej grupy genw sprzonych mona ustali odlegoci midzy nimi oraz ich wzajemne pooenie w chromosomie. W ten sposb tworzone s mapy genetyczne. Odlegoci mapowe s obliczone z czstoci rekombinacji midzy analizowanymi genami i kolejno sumowane. W celu okre156

lenia, w ktrym chromosomie znajduje si dana grupa genw sprzonych, naley zastosowa inne metody badania (cytogenetyczne). Powstaje wwczas mapa fizyczna. O mapach genetycznych i fizycznych oraz ich zastosowaniu jest mowa w rozdziale: Mapy genomowe. W rozdziale tym pokazano m.in., e odlegoci genetyczne midzy sprzonymi loci szacuje si za pomoc funkcji Kosambiego.

6.1.4. Cechy sprzone z pci


Cechy, ktrych geny s umieszczone w chromosomach pci, nazywamy cechami sprzonymi z pci. Najczciej zjawisko to odnosimy do pooenia genu w chromosomie X ssakw lub chromosomie Z ptakw. Dzieje si tak dlatego, e chromosomy te maj nieporwnywalnie wicej loci genw ni chromosom Y (ssaki) i chromosom W (ptaki). Sposb ich dziedziczenia jest inny ni cech autosomalnych. U zwierzt pci heterogametycznej wszystkie cechy sprzone z pci zale od jednego genu, a nie jak u pci homogametycznej od pary genw. U ssakw samice s homogametyczne (XX), samce za heterogametyczne (XV). Natomiast u ptakw pci homogametyczn s samce (okrelane dla odrnienia od ssakw ZZ), a heterogametyczn samice (ZW). Sposb dziedziczenia cechy sprzonej z pci obrazuje poniszy przykad. Cecha zmniejszonej krzepliwoci krwi (hemofilia), wystpujca u ludzi, psw i niektrych zwierzt gospodarskich, uwarunkowana jest recesywnym genem h. Dominujcy allel z tej pary (H) warunkuje prawidow krzepliwo krwi. Wszystkie moliwe fenotypy i genotypy pod wzgldem tego locus mona zapisa symbolami w dwojaki sposb:
Fenotyp Samice Samce Samice Samce

Jak wynika z tego zestawienia, samce nie mog by heterozygotami (nosicielami genu hemofilii), poniewa genotyp cechy sprzonej z pci wyznaczany jest u nich tylko jednym genem. Ukad genetyczny polegajcy na tym, i u osobnika diploidalnego wystpuje tylko jeden gen z danej pary, nazywamy hemizygotycznym, a osobnika hemizygot. Gdy pe heterogametyczn ma cech dominujc, a ple homogametyczn cech recesywn, obserwujemy zjawisko dziedziczenia na krzy (crki dziedzicz po ojcu, a synowie po matce). Gdy jest odwrotny ukad (cecha dominujca u osobnika homogametycznego), cecha bdzie si dziedziczy tak jak prosta cecha autosomalna. 157

Ry. 6-3. Dziedziczenie barwy upierzenia u kur cecha sprzona z pci, w pokoleniu F, dziedziczenie na krzy"

Dziedziczenie na krzy przedstawiono na rycinie 6-3 na przykadzie jastrzbiatoci upierzenia u kur: Gen B, warunkujcy cech jastrzbiatoci upierzenia, dominuje nad jego allelem b (gen czarnej barwy upierzenia). Gen ten hamuje okresowo odkadanie si czarnego pigmentu podczas wzrostu pira. Skutkiem tego jest obecno czarnych i jasnych prkw w chorgiewce. Obecno w genotypie dwch kopii genu B zahamowuje odkadanie pigmentu na duszy okres ni obecno jednego genu. Dlatego koguty homozygotyczne pod wzgldem tego genu s janiejsze ni hemizygotyczne kurki (ry. 6-4 wkadka kolorowa). Cechy sprzone z pci wykorzystano w hodowli kur do wytworzenia ras lub mieszacw autoseksingowych, tj. takich, u ktrych zaraz po

158

wykluciu mona rozrni pe. Ras autoseksingow s polbary, wytworzone przez polsk badaczk Laur Kaufman, majce gen jastrzbiatego upierzenia. Do produkcji mieszacw autoseksingowych mona wykorzysta geny srebrzystoci (np. rasa sussex) i zocistoci upierzenia (rhode island red), geny kontrolujce tempo opierzania si skrzyde i ogona (K-k) czy gen karowatoci (dw, ang. dwarf karowaty). Gen karowatoci u homozygotycznych (dwdw) samcw wpywa na zmniejszenie masy ciaa osobnika dorosego o okoo 40% w porwnaniu z ptakiem dorosym. Natomiast kury majce ten gen (dw-) zuywaj okoo 25% mniej paszy ni kury o genotypie Dw-. Potomstwo (brojlery) pochodzce z kojarzenia koguta DwDw z kur dw- bdzie miao mas ciaa tylko o 3% mniejsz ni brojlery po normalnych rodzicach. Taki dobr par rodzicielskich jest opacalny z ekonomicznego punktu widzenia. Ciekawym przykadem cech sprzonych z pci u kotw jest czarna i ruda barwa sierci, warunkowana przez locus O (ang. orange), zlokalizowany w chromosomie X. Samce mog by tylko czarne (o-) lub rude (O-). U samic heterozygotycznych wystpuje umaszczenie szylkretowe cz wosw czarnych, inne rude (genotyp Oo) (ry. 6-5 wkadka kolorowa). Jest ono nastpstwem tego, i allele czarnego i rudego umaszczenia ujawniaj si fenotypowo niezalenie od siebie, co wynika z losowoci inaktywacji chromosomu X pochodzenia ojcowskiego lub matczynego podczas rozwoju zarodkowego. U zwierzt domowych jest wiele cech sprzonych z pci, cz z nich przedstawiono w rozdziale: Mutacje. Znane s przypadki cech sprzonych z pci warunkowanych szeregiem alleli wielokrotnych. Barwa upierzenia u gobi jest kontrolowana przez szereg zoony z trzech alleli: B A (popielatoczerwone), B (niebieskie dzikie) i b (czekoladowe). Nie wszystkie cechy typowe dla danej pci s sprzone z chromosomem X. Niektre z nich to tzw. cechy zwizane z pci. Geny warunkujce te cechy nale do autosomalnych (umieszczone w autosomach), ale ich ekspresja jest uzaleniona od pci. Osobniki mskie i eskie, majc taki sam genotyp, mog si rni fenotypowo. Przykadem takiej cechy jest rogato owiec rasy dorset horn. Zwierzta homozygotyczne pod wzgldem dominujcego genu bezronoci bd bezrogie niezalenie od pci, natomiast osobniki homozygotyczne recesywne bd rogate. Rnice w fenotypie wystpi u zwierzt heterozygotycznych samce bd rogate, samice za bezrogie. Rna ekspresja fenotypowa tego samego genotypu u osobnikw obu pci jest nastpstwem oddziaywania hormonw wytwarzanych przez dan pe. Innymi przykadami cech zwizanych z pci s: mahoniowo-biae i czerwono-biae umaszczenie byda rasy ayrshire oraz broda u kozw. Wpyw pci na fenotypowa ekspresj genw jest take obserwowany w przypadku cech, ktrych zaoenia genetyczne znajduj si u osobnikw obu pci, ale ujawniaj si tylko u jednej pci. Cechy te nazywane s cechami 159

ograniczonymi pci lub ograniczonymi do pci. Nale do nich: zdolno wydzielania mleka u samic ssakw, nieno samic ptakw, wntrostwo czy przepuklina mosznowa u samcw.

6.1.5. Plejotropia
O plejotropii mwimy wwczas, kiedy jeden gen oddziauje na powstanie kilku cech. Plejotropia moe by waciwa lub rzekoma. Plejotropia waciwa wystpuje wtedy, gdy gen plejotropowy oddziauje na kilka odrbnych orodkw. Przykadem jest gen warunkujcy platynow barw u lisw. Lisy platynowe w przeciwiestwie do osobnikw umaszczonych standardowo s mniej ywotne i bardziej pobudliwe. Osobniki homozygotyczne pod wzgldem tego genu nie s zdolne do ycia i zamieraj w okresie prenatalnym. Podobnie gen warunkujcy siw (sziras) barw wosw u karakuw powoduje mier jagnit homozygotycznych w wieku 4-9 miesicy. Rwnie u koni niektre geny umaszczenia wykazuj dziaanie plejotropowe. Na przykad u okoo 1/4 potomstwa pochodzcego z kojarzenia midzy sob koni srokatych (overo) wystpuje zesp biaych rebit", opisany w podrozdziale: Dziedziczenie umaszczenia. W podrozdziale tym omwiony jest take plejotropowy efekt genw umaszczenia u innych gatunkw zwierzt. Przyczyny plejotropii waciwej mog mie podoe biochemiczne. Na przykad gen warunkuje syntez enzymu, ktry bierze udzia w syntezie jakiego zwizku (np. hormonu). Z kolei ten zwizek ma rnorodne funkcje fizjologiczne, wpywa zatem na inne waciwoci organizmu. W przypadku plejotropii rzekomej gen kontroluje jak cech, ktra z kolei rzutuje (w zalenoci od wpyww rodowiska) na zrnicowanie innych cech. Na przykad gen warunkujcy szurpato (zmiany w budowie pir) u drobiu wpywa take m.in. na tempo przemiany materii, prac serca i aktywno procesw trawiennych. Zmiany te s jednak nastpstwem nieprawidowego opierzenia, ktre nie chroni ptaka przed nadmiern utrat ciepa.

6.2. Wspdziaanie genw z rnych loci w ksztatowaniu fenotypu


W omawianych dotychczas przykadach jedna para wspdziaajcych ze sob genw allelomorficznych warunkowaa powstanie jednej cechy. Jednake nie tylko geny nalece do tej samej pary mog wspdziaa ze sob w wytworzeniu cechy. W przypadku wielu cech geny z rnych par alleli, w wyniku cznego dziaania, powoduj pojawienie si nowej formy cechy jakociowej.
160

Wspdziaanie midzy genami z rnych par alleli w ksztatowaniu fenotypu nosi nazw wspdziaania nieallelicznego. Jest kilka rodzajw tego wspdziaania.

6.2.1. Komplementarno
Jednym z najprostszych przykadw wspdziaania genw nieallelicznych jest dziedziczenie ksztatu grzebienia u kur (ry. 6-6a). W wyksztaceniu czterech form tej cechy bior udzia geny z dwch rnych /cz: R-r oraz P-p.

Ry. 6-6a. Wspdziaanie dopeniajce dwch par genw w przypadku krzyowania kur z grzebieniem ryczkowym i groszkowym 161

Gen R warunkuje ksztat ryczkowy grzebienia, a jego allel r pojedynczy, natomiast gen P powoduje powstanie grzebienia groszkowego, jego allel p grzebienia pojedynczego (ry. 6-6b wkadka kolorowa). Typ grzebienia pojedynczego jest zatem recesywny zarwno w stosunku do grzebienia groszkowego, jak i ryczkowego, warunkujcy go genotyp to podwjna homozygota recesywna rrpp. W wyniku wspdziaania genw R i P powstaje czwarta forma cechy grzebie orzeszkowy, ktrej genotyp moe mie kilka rnych wariantw, gdy wystarczy obecno jednego genu dominujcego z kadej pary alleli (R_P_). Z krzyowania osobnikw o ustalonej cesze ksztatu grzebienia, tj. z grzebieniem ryczkowym (Rrpp) i groszkowym (rrPP), w pokoleniu Ej wszystkie ptaki bd podwjnymi heterozygotami RrPp i bd miay grzebie orzeszkowy. Natomiast w pokoleniu F2 nastpi rozszczepienie cech w stosunku 9 orzeszkowych : 3 ryczkowe : 3 groszkowe : l pojedynczy. Rnice midzy wynikami tego krzyowania a krzyowania uwzgldniajcego dwie niezalenie dziedziczce si cechy polegaj na tym, e w pokoleniu Fl pojawia si nowy fenotyp, cakowicie rny od obojga rodzicw, natomiast w pokoleniu F 2 , w ktrym wystpi 4 fenotypy w stosunku 9:3:3:1, pojawia si rwnie nowy typ grzebie pojedynczy, ktrego nie byo w dwch pokoleniach przodkw. Dwa dominujce geny z rnych par alleli, wspdziaajce razem i wytwarzajce odmienn form cechy ni ta, ktra powstaje w wyniku dziaania kadego z nich osobno, nazywamy genami komplementarnymi lub dopeniajcymi si.

6.2.2. Epistaza
Kolejnym rodzajem wspdziaania genw nieallelicznych jest epistaza, charakteryzujca si tym, e od obecnoci genu z okrelonej pary alleli zaley ekspresja innej pary alleli. Gen, ktry hamuje ujawnienie si genu z innej pary, nazywany jest genem epistatycznym, natomiast gen hamowany to gen hipostatyczny. Zjawisko epistazy wystpuje na przykad w dziedziczeniu umaszczenia u wi niektrych ras biao umaszczonych. Gen dominujcy z locus I (inhibitor) hamuje ujawnienie si barwy kolorowej mimo obecnoci w genotypie genw barwnego umaszczenia. Zjawisko epistazy moe wyjani poniszy przykad. Kury niektrych ras (np. wyandotte, plymouth rock) maj upierzenie biae, gdy brak w ich genotypach genu C, warunkujcego wytwarzanie pigmentu (melaniny) w pirach. Ich genotyp pod wzgldem tej pary alleli jest homozygota recesywna (cc), ktra blokuje syntez tyrozynazy enzymu biorcego udzia w wytwarzaniu melaniny. U biaych leghornw jest inna sytuacja, podobna do wspomnianej wyej u wi. Ptaki te s rwnie biae, ale maj
162

Ry. 6-7. Rny stopie biaej plamistoci spowodowany dziaaniem genw modyfikujcych

w swych genotypach gen C. Dziaanie tego genu jest jednak hamowane przez inny dominujcy gen z locus I, ktry w ukadzie homozygotycznym cakowicie uniemoliwia syntez melaniny w pirach. Genotyp leghornw pod wzgldem barwy upierzenia jest nastpujcy: IICC. W potomstwie F2, ktrego dziadkowie naleeli do dwch ras biaych leghornw i wyandotte (iicc), oprcz ptakw biaych pojawi si osobniki o upierzeniu barwnym w stosunku 13 biaych : 3 barwnych. Podobnie umaszczenie biae u wi jest wynikiem epistatycznego dziaania genw z locus L Genotyp biao umaszczonych wi (np. rasy wielkiej biaej i landrace pod wzgldem trzech podstawowych loci jest nastpujcy: aa II EPEP, natomiast czarno umaszczonych (np. rasy cornwall): aa ii EE. Allele z locus E i A s opisane w dalszej czci tego rozdziau, dotyczcej dziedziczenia umaszczenia. Gen epistatyczny nie zawsze jest dominujcy w swojej parze. W przypadku albinizmu ukad epistatyczny w stosunku do genw barwy stanowi dwa geny recesywne cc (z tego samego locus co gen C). Inne przykady epistatycznego wspdziaania genw nieallelicznych przedstawione s take w podrozdziaach: Dziedziczenie umaszczenia i Antygeny erytrocytarne. Przedstawiony wczeniej rodzaj wspdziaania komplementarnego jest take form oddziaywania epistatycznego genu dominujcego jednej pary wobec ukadu homozygotycznego recesywnego drugiej pary. Jednak nie zawsze jedna para genw maskuje ekspresj tylko jednej innej pary genw. Geny epistatyczne mog tumi dziaanie wielu innych par.

6.2.3. Geny modyfikujce


Istnieje pewna grupa genw, ktre modyfikuj przejawianie si jakiej prostej cechy, warunkowanej zwykle jedn par genw. Geny te, zwane modyfikatorami, powoduj due zrnicowanie cechy u osobnikw o jednakowych zaoeniach warunkujcych t cech. Na przykad geny modyfikatory wpywaj na zasig i rozmieszczenie biaych plam u byda (ry. 6-7), psw i kotw, mimo i cecha aciatoci warunkowana jest inn par alleli.
163

6.2.4. Sumujce dziaanie genw


Inn form wspdziaania nieallelicznego genw jest polimeria. Zjawisko to polega na tym, i wiele (nawet kilkadziesit) genw z rnych loci warunkuje jedn cech, powodujc rne jej nasilenie, zalene od sumujcego si ich dziaania. Geny te nazywane s genami polimerycznymi, addytywnymi lub poligenami. Ich sumujce si dziaanie jest podstaw dziedziczenia cech ilociowych (np. wydajno mleczna, nieno itd.). Naley pamita, e ksztatowanie si tych cech zaley rwnie od wpywu czynnikw rodowiskowych. Mechanizm dziaania genw poimerycznych omwiony jest w podrozdziale: Zmienno cech ilociowych.

6.3. Dziedziczenie umaszczenia


Umaszczenie zwierzt zaley przede wszystkim od pigmentu zawartego we wosach i pirach. Synteza, rozmieszczenie i wielko ziarenek tego pigmentu s determinowane genetycznie przez wiele rnych loci, ale czynniki rodowiskowe mog modyfikowa umaszczenie, wpywajc na przykad na zmian iloci wytwarzanego pigmentu. U wielu zwierzt ubarwienie sierci zmienia si w zalenoci od pory roku (np. biaa w zimie, a czarna lub brzowa w lecie). Zmiany te spowodowane s dziaaniem niektrych hormonw, takich jak gonadotropiny, kortykotropina i hormon melanotropowy MSH (ang. melanocyte stimulating hormone). U ptakw wikszo kolorw jest zwizana z obecnoci pigmentw karoteinowych, natomiast u ssakw pigmentacja zaley od syntezy i rozmieszczenia melanin w rdzeniu wosa i korze wosowej oraz naskrku skry waciwej. Wyrnia si dwa podstawowe typy melanin eumelaniny (kolor brzowy lub czarny), syntetyzowane z metabolitw DOPA-chromu, i feomelaniny (kolor czerwony lub ty), wytwarzane z metabolitw cysteinylo-DOPA-chinonu. Enzymem wczonym w syntez obu typw pigmentu jest tyrozynaza. Jest to enzym zawierajcy mied i katalizujcy trzy rne reakcje w procesie biosyntezy melaniny (ry. 6-8): 1) hydroksylacj tyrozyny do 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA) 2) oksydacj DOPA do DOPA-chinonu 3) oksydacj 5,6-dihydroksyindolu (DHI) do indolochinonu. Niski poziom tyrozynazy prowadzi do wytwarzania feomelaniny, natomiast wysoki poziom tyrozynazy powoduje produkcj eumelaniny. Do niedawna uwaano, i tyrozynaza jest jedynym enzymem niezbdnym do wytwarzania pigmentu. Ostatnie badania wykazay, e przypuszczalnie rwnie inne geny specyficzne dla procesu syntezy pigmentu mog modulowa pigmentacj. 164

Ry. 6-8. Schemat biosyntezy melaniny

Aktywno tyrozynazy jest regulowana przez hormon melanotropowy (MSH) i receptor MSH. Hormon melanotropowy, zwany rwnie intermedyn lub melanotropin, jest wytwarzany przez cz poredni czci gruczoowej przysadki. Hormon ten stymuluje produkcj poszczeglnych melanin na przemian. Reakcja na dziaanie tego hormonu jest kontrolowana przez locus A (Agouti). Natomiast receptor hormonu melanotropowego (MSH) kontroluje poziom tyrozynazy wewntrz melanocytu. Receptor ten jest determinowany przez locus E (Extension). Nastpstwem dziaania tego receptora jest wzrost poziomu tyrozynazy i produkcja eumelaniny. Gwn jego funkcj natomiast jest regulacja syntezy czarnego pigmentu (eumelanina), a hamowanie produkcji feomelaniny wewntrz melanocytw. Melaniny s wytwarzane w melanocytach. Melanocyty pochodz z rdzenia nerwowego, a podczas rozwoju embrionalnego wdruj do powstajcej skry. Ta wdrwka melanocytw znajduje si pod cis kontrol genw. W determinacj koloru jest wczonych wiele loci. Wiele genw, jeli nie wszystkie zwizane z wytwarzaniem pigmentu, ma dziaanie plejotropowe na rozwj i rnicowanie organizmu. Wytwarzanie melanin u ssakw jest kontrolowane przez geny dziaajce na rnych poziomach: tkankowym, komrkowym i subkomrkowym.
REGULACJA NA POZIOMIE TKANKOWYM

Regulacja genetyczna na poziomie tkankowym polega na kontroli liczby i rozmieszczenia melanocytw. Jest wiele genw, ktre wspdziaaj ze sob w sposb kompleksowy. Geny, ktre zostay ju sklonowane, warunkujce pigmentacj ssakw i dziaajce na poziomie tkankowym to przede wszystkim: gen srokatoci (Piebaldism) i gen nabytego bielactwa (Vitiligo). Badania genetycznego ta umaszczenia s najbardziej rozwinite w od165

niesieniu do myszy. Do loci dziaajcych na poziomie tkankowym, zmapo-wanych w genomie myszy nale take loci: Splotch (Sp) - plamisty, Dominant White Spotting (W) - - dominujcy biay nakrapiany i Steel (Sl) - stalowy.
REGULACJA NA POZIOMIE KOMRKOWYM

Geny regulujce wytwarzanie pigmentu na poziomie komrkowym oddziauj na struktur i/lub funkcje istniejcych melanocytw, co wpywa na koloryt (ukad barw). Nale do nich geny z loci D (Dilute rozjaniony), E (Extension - - pena barwa), A (Agouti dziki), Pa (Pallid blady) i P (Pink-eyed dilution gen rozcieczonych rowych oczu). Mutacje w tych loci wpywaj wyranie na kolor oczu, w jednolity typowy sposb, przez dziaanie na mechanizmy wczone w funkcj melanocytu. Wikszo z tych mutacji ma wpyw plejotropowy na rozwj. Locus D koduje strukturalne biako, ktre wydaje si istotne dla rozdziau ziaren melaniny do peryferyjnych melanocytw. U osobnikw ze zmutowanym allelem w locus D dendryty melanocytw s istotnie mniej rozwinite ni u osobnikw normalnych (typu dzikiego), a konsekwencj tego jest ograniczenie rozdziau melanosomw i rozjaniony kolor wosw. Locus E (Extension) koduje przede wszystkim receptor MSH, penicy istotn rol w interakcji melanocytw z hormonem melanotropowym. Locus ten kontroluje ilo eumelaniny. Locus A (Agouti) kontroluje syntez biaka bdcego antagonist receptora MSH i majcego zdolno blokowania dziaania tego receptora. Nastpstwem dziaania tego biaka jest niski poziom tyrozynazy i wytwarzanie feomelaniny. Na przykad u byda zwierzta homozygotyczne ee bd umaszczone to lub czerwono. U osobnikw typu dzikiego, nazywanych agouti, melanocyty wytwarzaj w rnym czasie eumelanin lub feomelanin, oba typy melanin nie s wic syntetyzowane jednoczenie. Locus Agouti dziaa wewntrz mikrorodowiska mieszkw wosowych, podczas gdy locus Extension dziaa w melanocytach.
REGULACJA NA POZIOMIE SUBKOMRKOWYM

Melanogeneza jest regulowana take na poziomie subkomrkowym (enzymatycznym), gdzie krytyczn rol odgrywa synteza i ekspresja rnych melanogenicznych enzymw i inhibitorw. Geny, ktre dziaaj na pigmentacj ssakw na poziomie subkomrkowym, wpywaj bezporednio na ilo i typ wytwarzanej melaniny. W wyniku ich dziaania moe nastpi istotny wzrost lub zmniejszenie iloci pigmentu tworzonego w melanocytach (np. brak syntezy melaniny w przypadku albinizmu), lub te mog wystpi zmiany typu syntetyzowanej melaniny (np. odwracalna zamiana wytwarzania czarnej eumelaniny na produkcj tej feomelaniny). 166

Najwaniejsze z loci dziaajcych na poziomie subkomrkowym to Albina (C) i Brown (B). Locus C kontroluje liczb i intensywno ziaren pigmentu. Historycznie by on uwaany za locus strukturalny dla tyrozynazy, gdy biakiem kodowanym przez ten locus jest enzym tyrozynaza, ktrej funkcja jest decydujca dla wytwarzania pigmentu. Tyrozynaza przejawia sw ekspresj w melanocytach. Mutacje w locus C powoduj brak pigmentu we wosach, skrze i tczwce oka, ale mutacje te maj take wpyw plejotropowy jeszcze dokadnie nie poznany. Jednym ze znanych efektw plejotropowego dziaania mutacji w tym locus jest zaburzenie czucia. Interesujce jest to, i mutacja w genie tyrozynazy u myszy jest pojedyncz mutacj punktow, natomiast u ludzi stwierdzono ponad 30 mutacji powodujcych albinizm, ale s to mutacje typu nonsens, zmiany sensu i mutacje zmiany fazy odczytu. Niekiedy mutacje w locus Albino powstaj podczas skadania mRNA (splicingu), czyli wycinania intronw, a konsekwencj tego jest synteza biaka o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Takie biaka nie s kompetentne katalitycznie, ale dotychczas nie stwierdzono, czy peni one jak rol (np. inhibitora) w melanocytach. Badania poszczeglnych mutacji w locus Albino u krlikw, warunkujcych umaszczenie himalajskie i szynszylowate, wykazay, e melanocyty mutanty wytwarzaj tyrozynaz z istotnie zmienion aktywnoci katalityczn. Mutacja umaszczenia himalajskiego (ch) polega na zmianie w glikozylacji, ktra powoduje uwraliwienie efektu fenotypowego na temperatur. U szynszyla (cch) natomiast zwikszona jest wraliwo na inaktywacj proteolityczn, prowadzca do osabienia funkcji enzymu. Geny z locus C u krlikw tworz szereg alleli wielokrotnych, w ktrym wystpuje dominacja w nastpujcej kolejnoci: C, cch, ch, c (ry. 6-9 wkadka kolorowa). Tyrozynaza jest najistotniejszym enzymem w wytwarzaniu melaniny, natomiast inne geny reguluj typ formowanego pigmentu, jeszcze inne sposb, w jaki pigment ma by formowany. Locus B (Brown) struktura i organizacja genu z tego locus jest podobna do genu Albino, a biako kodowane przez ten gen ma wszystkie cechy charakterystyczne dla tyrozynazy. Specyficzna funkcja tego biaka nie jest jeszcze poznana. Fenotypowym efektem mutacji w genie Brown jest wytwarzanie brzowej meaniny, ale mechanizm dziaania tego genu dotd nie jest znany. Wiadomo jednak, i kolor brzowy wynika z punktowej mutacji w obrbie genu Brown, ktra prowadzi do wymiany cysteiny na tyrozyn. Mutacja ta zachodzi w bogatej w cystein pierwszej domenie biaka.
Mechanizm dziedziczenia umaszczenia u zwierzt futerkowych na przykadzie lisa

Istniej dwa gatunki lisa lis pospolity (Vulpex vulpex) i lis polarny (Alopex lagopus). Umaszczenie u obu gatunkw determinowane jest gwnie genami z podstawowych loci A, B i E. Warunkiem ekspresji genw z tych loci jest 167

oczywicie obecno odpowiednich genw z locus C. W przypadku genotypu homozygoty recesywnej cc bdzie fenotyp albinotyczny, bez wzgldu na to, jakie s geny z innych loci. Genotypy umaszczenia rnych odmian lisa pospolitego i polarnego s przedstawione w tabeli 6-1. U lisa pospolitego w locus A s dwa allele: Ar dominujcy i a recesywny. Allel Ar warunkuje wstrzymanie wytwarzania eumelaniny. Jego alternatywny allela w podwjnej dawce warunkuje umaszczenie czarne lisa srebrzystego. Natomiast u lisa polarnego zamiast allelu A jest allel A". Allel ten odpowiedzialny jest za eliminacj eumelaniny. Feomelanina, ktra z reguy zajmuje miejsce eumelaniny, u lisa polarnego jest rozcieczona lub usunita w ogle. Lis polarny o genotypie aa jest czarny, ale genotyp ten wystpuje bardzo rzadko (np. w populacji lisa polarnego w Islandii). W locus B rwnie s dwa allele dominujcy B (czarny pigment) i b, w ukadzie homozygotycznym -- pigment czekoladowobrzowy. Jedynie odmiana burgundzka lisa pospolitego jest homozygotyczna pod wzgldem allelu b. W locus E, warunkujcym wytwarzanie czarnej/czekoladowobrzowej eumelaniny, u obu gatunkw s dwa allele E i Ed. Allel E w ukadzie homozygotycznym nie ma wpywu na umaszczenie, w tym przypadku kolor jest determinowany allelami z locus A. U obu gatunkw lisa allel Ed cechuje si niezupen dominacj. Oprcz omawianych loci u lisa pospolitego wystpuje szereg innych loci, jak G, P, S, R, W, warunkujcych rne odmiany umaszczenia. We wszystkich tych loci, z wyjtkiem locus W, efekt fenotypowy daj tylko genotypy homozygotyczne recesywne: u lisa burgundzkiego -- genotyp gg, u lisa

168

srebrzystego: genotyp pp - - perowe umaszczenie oraz genotyp ss umaszczenie perowe Mansfield i rr umaszczenie Radium. W locus W s nastpujce allele: w, W (biaopyski), W (platynowy), W3 (biay Georgian) i W M (gen marble), przy czym genotyp ww wystpuje u lisa rudego i srebrzystego, natomiast gen marble daje inny efekt fenotypowy u tych odmian. Mutacje dominujce, takie jak W i W, w ukadzie homozygotycznym maj efekt letalny. Letalny jest take genotyp WW. U lisa polarnego na wiele odmian umaszczenia wpywaj allele recesywne (w homozygocie) z loci: D (dd biay polarny, DD niebieski), F (ff szafir) i G (gg arktyczny niebieski) oraz u lisa niebieskiego allele dominujce z loci l (L Laponia), s (trzy allele: S, SJ i SH) i t (T). Mutacja w locus s (Shadow) charakteryzuje si heterochromi, ktrej skutkiem moe by rny kolor oczu u tego samego osobnika, np. jedno oko niebieskie, a drugie brzowe.
Genetyczne podoe umaszczenia u byda

Wyniki wielu bada sugeruj, e u byda umaszczenie czarne, brzowe i czerwone jest determinowane przez allele z dwch loci: Extension (E) i Agouti (A). Locus E koduje syntez biaka MSH-R (ang. melanocyte stimulating hormon receptor), zoonego z okoo 350 aminokwasw. W locus tym, umiejscowionym w chromosomie 18, s 3 allele: Ed warunkujcy umaszczenie czarne dominujce, recesywny allel e, ktry w ukadzie homozygotycznym warunkuje umaszczenie czerwone, oraz allel E+ umoliwiajcy ekspresj alleli z locus A. Allele te powstay w wyniku mutacji punktowych, opisanych w rozdziale: Mutacje. Allel dominujcy Ed, kodujcy czarny kolor, jest homologiczny do allelu ES0 u myszy. W acuchu polipeptydowym kodowanym przez allel ES0 nastpia zamiana trzech kolejnych czsteczek leucyny na aminokwasy leucyna-prolina-leucyna, natomiast u byda ten sam fragment alelu Erf koduje nastpujc kolejno aminokwasw: prolina-leucyna-leucyna. Locus A koduje syntez biaka, bdcego antagonist biaka MSH-R. W locus tym s dwa allele: dominujcy A+ (synteza pigmentu brzowego) i recesywny a. Allele z tego locus mog wykaza ekspresj tylko wtedy, gdy w locus E jest genotyp E+_. U zwierzt z genotypem E+E+ lub E+e allel A+ koduje umaszczenie brzowe, natomiast allel a w ukadzie homozygotycznym recesywne czarne. Fenotypy czarny dominujcy (determinowany przez allel E'') i czarny recesywny s nieodrnialne. Niestety dotychczas nie przeprowadzano bada molekularnych locus A. Wyniki bada porwnawczych wskazuj na homologi dziaania alleli z locus Extension (E) u byda i myszy. Wszystkie allele dotychczas zidentyfikowane w locus E u byda maj odpowiadajce im allele u myszy, natomiast w locus A tylko w przypadku allelu recesywnego a jest analogiczny allel u myszy. Z kolei allel A+ u byda wydaje si wywoywa efekt rny od dziaania wikszoci innych alleli z locus Agouti (A) opisanych dotychczas u ssakw. 169

Wiele innych loci bierze udzia w determinacji rnych odmian umaszczenia. Na przykad, cecha jednolitego umaszczenia lub aciatoci znajduje si pod kontrola genw z locus S (Self): dominujcy S jednolite umaszczenie, recesywny s aciato. U ras byda (np. belgijskie bkitne), u ktrych allel s jest utrwalony, obserwowana jest zmienno w ekspresji cechy aciatoci, niektre zwierzta s niemal cakowicie pozbawione pigmentowanych at. W tym samym locus u byda tej rasy znajduje si allel Sc, warunkujcy fenotyp nazwany colorsided aciaty, ktry dominuje nad s, ale jest recesywny w stosunku do allelu S. U niektrych ras byda pewne geny wykazuj niekorzystne dziaanie plejotropowe, powodujc rne zaburzenia. Przykadem jest zmapowany w 5 chromosomie locus Roan dereszowate (kras, mroziate), w ktrym s dwa allele: r+ czarny (u byda bkitnego belgijskiego) lub czerwony (u byda rasy shorthorn) i R biay. U jawek obu ras locus Roan wpywa istotnie na wystpowanie choroby biaych jaowic, kora jest efektem plejotropowego oddziaywania allelu R na podno. Choroba ta jest opisana w rozdziale: Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm. Zrnicowanie umaszczenia czerwone lub czarne wynika z tego, e bydo belgijskie bkitne charakteryzuje dua frekwencja allelu dominujcego E w locus Extension, a maa allelu e (czerwone umaszczenie), natomiast u shorthornw jest odwrotnie.
Genetyczne podoe umaszczenia u wi

U wi znane s cztery gwne loci determinujce umaszczenie: locus A (Agouti), locus E (Extension), locus I (biay dominujcy) i locus Be (Belted opasany). W locus A zidentyfikowano dwa allele: A w (agouti biay brzuch) i allel a - - nieagouti. Allel A w jest obecny u dzikich wi i jest dominujcy w stosunku do pozostaych kolorw oraz koloru mangalica, ale recesywny w stosunku do biaego (I). Wikszo ras wi udomowionych ma allel recesywny a nieagouti. W locus E stwierdzono dotychczas trzy allele: E umaszczenie jednolite czarne jak w rasie wielkiej czarnej, cornwall i hampshire, Er umaszczenie czarne nakrapiane (spotting) jak u berkshire, poland-china i pietrain, e umaszczenie jednolicie czerwone (rude) jak u tamworth i duroc-jersey. Kolejno dominowania tych alleli jest nastpujca: E-Ep-e. Badania, w ktrych do analizy sprze uyto ponad 230 markerw genetycznych, wskazuj, i locus ten jest umiejscowiony w chromosomie 6, blisko telomerowego regionu ramienia p. Wyniki bada porwnawczego mapowania locus Extension u myszy (chromosom 8), byda (chromosom 18) i wi (chromosom 6) wskazuj na homologi midzy tymi gatunkami. Podobnie jak u myszy i byda, take u wi receptor hormonu melanotropowego MSH-R jest determinowany przez geny z locus E. W locus I s dwa gwne allele: 7 (inhibicja koloru), odpowiedzialny za umaszczenie dominujce biae, i allel i recesywny (kolorowy). Wrd 170

wi domowych dominujcy biay jest przewaajcy, wystpuje on w homozygocie (II) w rasie wielka biaa i wszystkich odmianach landrace, natomiast inne rasy s homozygotami recesywnymi (ii). Locus I zosta zlokalizowany w chromosomie 8. Dziedziczenie umaszczenia u mieszacw niektrych ras sugeruje istnienie dalszych trzech alleli w tym locus, oznaczonych symbolem Id (deresz), I p (czarne aty) oraz im (brudny szary). Biay pas, charakterystyczny dla niektrych ras, jak np. wessex saddleback, hampshire (ry. 6-10 wkadka kolorowa), hannover-braunschweig, jest kodowany przez allel Be w z locus Be, dominujcy w stosunku do jednolitego umaszczenia. Zmienna szeroko pasa zaley od dziaania genw modyfikujcych (zmienno poligeniczna). Genotyp tego knura jest nastpujcy: aa U EE BewBew. Na umaszczenie wi oprcz wymienionych czterech loci wpywaj take allele z locus C. Na przykad u wi rasy mangalica umaszczenie brudnobiae jest prawdopodobnie determinowane przez allel c e z locus C. Rwnie geny z innych loci u rnych ras wi koduj specyficzne wzory umaszczenia. Na przykad u wi rasy hampshire stwierdzono obecno genw recesywnych z loci Red-eye (czerwonych oczu) i Dilution (rozjaniony).
Genetyczne podoe umaszczenia u koni

Umaszczenie u koni determinowane jest gwnie przez geny znajdujce si w locus E (Extension) i A (Agouti). Rozjanienie barwy jest warunkowane dziaaniem genw z co najmniej trzech loci: C (Albina), D (Dun buany) i Z (Siher dapple siwy jabkowity). Umaszczenie biae, siwe i dereszowate jest kontrolowane odpowiednio przez allele z loci W (White dominujcy biay), G (Gray siwy) i RN (Roan deresz). Wzory umaszczenia, takie jak tobiano (TO), overo (O), sabino (SB) czy tarantowate (LP), s determinowane przez geny z innych loci. We wszystkich wymienionych loci dotychczas zidentyfikowano po dwa allele, ale prowadzone s badania w celu potwierdzenia hipotez o istnieniu innych alleli (np. trzeciego allelu w locus Extension ED). Locus E warunkuje wytwarzanie okrelonego rodzaju melaniny, allel dominujcy E determinuje syntez eumelaniny, w przypadku jego braku (genotyp ee) syntetyzowana jest feomelanina. Allele z tego locus wpywaj na ekspresj genw z locus A. Allel recesywny e w podwjnej dawce (ee) tumi dziaanie allelu A. Natomiast obecno w genotypie alleli dominujcych z obu loci (E i A) warunkuje umaszczenie gniade. W locus C u koni nie wystpuje allel recesywny c, ktry w ukadzie homozygotycznym u innych gatunkw zwierzt warunkuje albinizm. Rozjanienie umaszczenia u koni powodowane jest przez allel C"', wykazujcy niepen dominacj. W ukadzie homozygotycznym (CcrCcr) allel ten warunkuje umaszczenie kremowe (ang. cremello). Umaszczenie biae u koni jest warunkowane przez dominujcy allel W (jest to dominacja cakowita, zatem wystarczy jeden allel W, by byo 171

umaszczenie biae), ktry wykazuje dziaanie epistatyczne w stosunku do poznanych dotychczas genw kontrolujcych umaszczenie. Wszystkie rodzaje umaszczenia, z wyjtkiem biaego, w locus W maj genotyp homozygoty recesywnej (ww). Natomiast umaszczenie siwe kontroluje allel dominujcy z locus G, ktry jest epistatyczny w stosunku do wszystkich alleli z innych loci, z wyjtkiem allelu W, wobec ktrego jest hipostatyczny. Allel G (w homo- i heterozygocie) powoduje redukcj wytwarzania pigmentu postpujc wraz z wiekiem zwierzcia. Locus D kontroluje intensywno wytwarzania eumelaniny i feomelaniny. Allel D z locus Dun wykazuje zupen dominacj, osobniki homozygotyczne (DD) s nie do odrnienia na podstawie fenotypu od heterozygot (Dd). Jego wpyw na rozjanienie barwy jest jednak mniejszy ni allelu C cr z locus Albina. Na przykad obecno allelu D w genotypie osobnika karego powoduje umaszczenie myszate (aaE_CCD_). Niektre spord wymienionych genw umaszczenia dziaaj plejotropowo. Nale do nich allele dominujce z loci W, O i RN. Allel W w podwjnej dawce (genotyp homozygoty dominujcej) powoduje zamieranie zarodkw we wczesnym okresie ciy. Konie umaszczone biao s heterozygotyczne pod wzgldem genw tego locus (Ww). Z kolei wikszo rebit homozygotycznych pod wzgldem allelu O jest obarczona zespoem biaych rebit" - LWFS (ang. lethal white foal syndrome), polegajcym na niemonoci wydalenia smki z powodu braku komrek nerwowych (zwojw autonomicznych) kontrolujcych ruchy perystaltyczne jelita lub, znacznie rzadziej, na skutek braku czci jelita. Natomiast ukad homozygotyczny w locus RN (RNRN) jest uwaany za letalny. Genotypy w 7 loci, determinujce wybrane rodzaje umaszczenia koni, zestawiono w tabeli 6-II.

172

Genetyczne podoe umaszczenia u owiec

U owiec stwierdzono trzy typy pigmentu: czarna eumelanina, czekoladowobrzowa (moorit) eumelanina i brzowoczerwona (tan) feomelanina. Badania specjalistyczne wykazay, e umaszczenie tan jest warunkowane wytwarzaniem pigmentu feomelaniny. Przykadem tego jest brzowoczerwony kolor weny karakuw. Najczciej wystpujce umaszczenia u owiec s klasyfikowane zgodnie z trzema kryteriami: typ pigmentu, wzr koloru i obecno lub brak biaych znakw. Wzory koloru skadaj si bd z regularnej mieszaniny jasno i ciemno ubarwionych powierzchni ciaa, bd mieszaniny jasnych i ciemnych wkien weny. Owce biao umaszczone s zwykle prawie pozbawione pigmentu, ale mog mie pigment tan, ktry w fenotypie ujawnia si ze zmienn intensywnoci, od umaszczenia jasnobrzowego do intensywnego czerwonawobrzowego. Umaszczenie owiec jest kontrolowane prawdopodobnie przez geny z 11 loci (tab. 6-III). Loews Agonii odpowiada za biae lub brzowe (tan) umaszczenie i wzory umaszczenia. W locus tym stwierdzono ogem 16 alleli kontrolujcych zmian syntezy eumelaniny na syntez feomelaniny. Niektre z nich warunkuj wytwarzanie pigmentu tylko w poszczeglnych partiach ciaa, inne wpywaj na typ wkien, bd te oba efekty wystpuj cznie. Allel A wh , bdcy pierwszym w kolejnoci dominowania z szeregu alleli z tego locus, warunkuje biae umaszczenie owiec. Gwnym efektem allelu Awh jest cakowite zahamowanie wytwarzania eumelaniny, podczas gdy feomelanina moe by syntetyzowana. Konsekwencj tego moe by umaszczenie brzowoczerwone (tan) owiec, w ktrych genotypach jest allel Awh. Ten typ umaszczenia wystpuje u owiec rasy french solognot i brzowych (dominujcych) karakuw, natomiast o wiele janiejsze umaszczenie brzowoczerwone (tan) wystpuje u owiec islandzkich i welsh mountain. Biae umaszczenie owiec ras wenistych jest wynikiem selekcji prowadzonej przeciwko umaszczeniu brzowoczerwonemu (tan) u owiec nosicieli allelu Awh. Nastpne geny w szeregu alleli z locus Agouti czciowo hamuj syntez eumelaniny, natomiast allel recesywny Ae w ukadzie homozygotycznym umoliwia pen syntez eumelaniny. Niektre allele z tego locus maj efekt plejotropowy, np. allel Awh zmniejsza podno owiec o okoo 0,15 jagnicia w miocie i hamuje aktywno seksualn maciorek islandzkich poza normalnym sezonem rozpodowym. Locus Brown determinuje syntez czarnego i czekoladowobrzowego (moorit) pigmentu. Allel typu dzikiego, Bw, warunkuje wytwarzanie czarnej eumelaniny, natomiast recesywny allel, Brw czekoladowobrzowej eumelaniny.
173

Na umaszczenie u owiec wpywaj take allele z innych loci: Allel recesywny Ca z locus Albino warunkuje w ukadzie homozygotycznym cakowity albinizm. Umaszczenie czarne dominujce jest kontrolowane przez allel dominujcy Edb z locus Extension. Allel ten inaktywuje dziaanie alleli z locus Agouti poprzez zahamowanie syntezy feomelaniny. Allel typu dzikiego, recesywny, Ew umoliwia normaln ekspresj alleli z locus Agouti. Allel recesywny Ss z locus Spotting w podwjnej dawce (SSSs) determinuje biae znaki u owiec umaszczonych kolorowo. Owce ras wenistych, z biao umaszczon gow s zwykle homozygotyczne pod wzgldem genu biaych plam (SSSS), a take homozygotyczne biae, AwhAwh. U owiec heterozygotycznych pod wzgldem allelu A1"1' allel Ss redukuje pigment tan (brzowy), natomiast homozygoty SSSS s cakowicie biae. U umaszczonych kolorowo owiec kouchowych biae lub zote koce wosw s warunkowane allelem Gs z locus Sur. Allel ten jest recesywny lub hipostatyczny w stosunku do barwy czarnej dominujcej, ale epistatyczny do dominujcej brzowej (tan). Umaszczenie biae dominujce (biae perskie, aciate afgaskie) jest kontrolowane przez allel W a z locus White. Allel ten jest epistatyczny 174

w stosunku do wszystkich innych genw umaszczenia. Inny allel z tego locus, Wrn, warunkuje dominujc szaro u karakuw, ktra w formie homozygotycznej jest letalna; rwnie w poczeniu z allelem dominujcej biaoci allel Wrn wywouje w wikszoci przypadkw efekt miertelny.

6.4. Penetracja i stopie ekspresji (ekspresywno) genw


Fenotyp rozpatrywany jako caoksztat cech jest wynikiem dziaania wszystkich genw danego osobnika, wspdziaania tych genw midzy sob oraz wspdziaania ze rodowiskiem. Omwione przykady wspdziaania allelicznego i nieallelicznego wiadcz o tym, i dziaanie genw moe wywoywa rnorodne efekty. Czsto zdarzaj si przypadki, kiedy wrd osobnikw o jednakowych genotypach niektre wykazuj fenotypow obecno cechy, inne za jej nie maj. Z drugiej strony, ten sam genotyp u rnych osobnikw moe spowodowa rne nasilenie cechy w fenotypie. Pierwsze z tych zjawisk okrelane jest jako penetracja genu, natomiast drugie jako ekspresywno genu, rozumiana take jako stopie ekspresji (przejawiania si) genu lub wyrazisto. Oba pojcia penetracja genu i ekspresywno genu zostay wprowadzone w 1926 roku przez neuropatologa Oskara Yogta. Penetracja, inaczej okrelana jako przenikliwo, jest to czsto, z jak dominujcy lub recesywny gen (w homozygocie) albo ukad heterozygotyczny ujawnia si w fenotypie nosiciela. Penetracja moe by cakowita lub niezupena. O penetracji cakowitej mwimy wwczas, gdy u wszystkich osobnikw o danym genotypie wystpuje taki sam fenotyp. Natomiast jeli nie wszystkie osobniki, majce taki sam genotyp, wykazuj charakterystyczny dla niego fenotyp, mwimy o penetracji niezupenej. Na przykad, jeeli gen dominujcy ujawnia sw obecno w fenotypie tylko u 80% osobnikw, to mwimy, e jego penetracja wynosi 80%. Przykadem penetracji niezupenej u zwierzt gospodarskich moe by wada pojawiajca si u nowo wylonych kurczt wrodzone drenie. Natenie drga jest bardzo zrnicowane. Stwierdzono to na podstawie wynikw dowiadczenia, w ktrym po 4 latach prowadzenia kojarze ptakw heterozygotycznych pod wzgldem genu drenia uzyskano jedynie 10% kurczt dotknitych t wad, zamiast 25% oczekiwanych zgodnie z klasycznym stosunkiem mendlowskiej segregacji genw. Penetracja okrelonego genu moe by rna zalenie od pci, a nawet, w przypadkach kracowych, ograniczona do jednej pci (patrz podrozdzia: Cechy sprzone z pci). 175

Pojcie stopie ekspresji (ekspresywno, stopie przejawiania si) genu oznacza poziom zmiennoci fenotypowej okrelonej cechy wrd osobnikw o tym samym genotypie. Zmienno ekspresywnoci genu czsto jest obserwowana w przypadku chorb genetycznych i wad dziedzicznych. Przykadem wady dziedzicznej 0 rnym stopniu przejawiania si genu jest miejscowy brak nabonka u byda rasy ayrshire (agodna forma) i Jersey (forma bardzo ostra) (patrz rozdzia: Mutacje). Obserwowana zmienno stopnia ekspresji genu moe by wywoana dziaaniem rnych u tych ras genw modyfikujcych. W przypadku chorb genetycznych czy wad dziedzicznych ocen ekspresywnoci genu mog utrudnia takie czynniki, jak: wiek, w ktrym pojawiaj si pierwsze objawy, czy wystpowanie fenokopii (patrz podrozdzia: Mutacje genowe wywoujce choroby genetyczne), ktre nie s dziedziczne. Zmienno stopnia ekspresji jest do rozpowszechnion waciwoci genw. Naley jednak pamita o tym, e nie zawsze zmienno fenotypowa jakiego genotypu jest wynikiem rnego stopnia przejawiania si genu. Geny z rnych loci mog dawa podobne fenotypy, ujawniajce si w rnym stopniu. Take allele tego samego genu mog charakteryzowa si podobn ekspresywnoci. Pewno, i mamy do czynienia ze zmiennoci przejawiania si tego samego genu, moemy mie wtedy, gdy jest ona obserwowana u osobnikw spokrewnionych ze sob. Pojcia penetracja i ekspresywno genu s czasem trudne do rozdzielenia. Wiele genw o maym stopniu penetracji wykazuje jednoczenie sab ekspresywno. Z kolei, geny charakteryzujce si du ekspresywnoci wykazuj wysoki stopie penetracji. Zarwno stopie penetracji, jak i fenotypowego przejawiania si genu zale od wspdziaania tego genu z innymi genami oraz od jego wspdziaania ze rodowiskiem. Spord czynnikw niegenetycznych wpywajcych na ekspresj genu wan rol odgrywaj wpywy matczyne na rozwijajcy si pd (w szczeglnoci naley do nich zaliczy hormony, sole mineralne oraz inne zwizki krce we krwi, docierajce przez oysko do rozwijajcego si podu). Nie bez znaczenia jest stan zdrowotny matki, a take pooenie zarodka w macicy i nawet obecno innych podw.

6.5. Dziedziczenie pozajdrowe


Wszystkie omawiane dotychczas cechy s uwarunkowane genami zawartymi w DNA jdrowym, a ich sposb dziedziczenia okrelany jest oglnym terminem dziedziczenie mendlowskie. Ju na pocztku naszego stulecia zauwaono, e niektre cechy nie podporzdkowuj si temu terminowi, dziedzicz si rnie, zalenie od kierunku krzyowania. Wykrycie obecnoci DNA poza jdrem komrkowym w mitochondriach, a take chloroplas176

tach rolin wyjanio podoe tego zjawiska. Powsta nowy termin dziedziczenie pozachromosomowe, inaczej pozajdrowe lub cytoplazmatyczne. Mitochondrialny DNA, w przeciwiestwie do DNA jdrowego, jest przekazywany nastpnemu pokoleniu wycznie przez matki. Wprawdzie w 1991 roku w dowiadczeniu na myszach wykryto u potomstwa czsteczki mtDNA pochodzce od ojca, ale czsto ich wystpowania bya minimalna i wynosia 10-4 czstoci matczynego mtDNA. Taki sposb dziedziczenia moe by przyczyn powstawania heteroplazmii (rwnoczesne wystpowanie zmutowanego i prawidowego mtDNA u danego osobnika). Jak dotd, u adnego innego gatunku nie potwierdzono przekazywania potomstwu mtDNA przez ojca. Przyczyn tego, w wietle wynikw najnowszych bada, moe by znakowanie (pitnowanie) czsteczkami biaka (zwanego ubikwityn) mitochondriw w dojrzewajcych plemnikach podczas procesu spermiogenezy. Po zapodnieniu komrka jajowa moe rozpoznawa tak napitnowane organelle i niszczy je. Plemnik zawiera od 50 do 100 mitochondriw, natomiast komrka jajowa ma ich okoo 100 tysicy. W miar rozwoju zarodka liczba mitochondriw ojcowskich maleje. O mutacjach zachodzcych w obrbie mitochondrialnego DNA i ich skutkach jest mowa w rozdziale: Mutacje. U zwierzt gospodarskich badania wpywu genw w mitochondrialnym DNA na cechy produkcyjne najczciej prowadzone s na bydle mlecznym. Geny mitochondrialne koduj przede wszystkim enzymy niezbdne do przebiegu procesw zachodzcych w acuchu oddechowym. Ponad 90% energii potrzebnej komrkom sekrecyjnym gruczou mlecznego jest dostarczane przez ATP (adenozynotrifosforan) wytwarzany w mitochondriach. U byda rasy holsztyskiej stwierdzono dodatni korelacj, ktrej warto zawiera si w granicach od 0,3 do 0,4, midzy syntez ATP w mitochondriach a wartoci genetyczn w zakresie produkcji mleka. Badania wpywu genotypu w mtDNA krowy na wydajno mleka i tuszczu wykazay, e warunkuje on od 2 do 10% zmiennoci tych cech. W celu oszacowania wpywu loci mitochondrialnego DNA na cechy uytkowoci mlecznej porwnywano rednie wartoci tych cech w rodzinach (po okrelonej matce) z polimorfizmem alleli mtDNA, analizowanego metod RFLP. W pewnym dowiadczeniu spord 2713 krw z 131 stad wybrano rodziny charakteryzujce si wysok, redni i nisk wydajnoci mleka. Oszacowany dla tych rodzin efekt matki wynosi odpowiednio: + 991 108 kg, +26 99 kg, -879 114 kg mleka. Analiza polimorfizmu fragmentw restrykcyjnych mitochondrialnego DNA wykazaa, i najwiksza frekwencja alleli wystpujcych we wszystkich grupach wynosia ^ 0,9. Natomiast allele charakteryzujce si nisk frekwencj (^ 0,1) rozkaday si nielosowo w grupach wydajnoci mleka i pochodzeniowych po matce, co moe wskazywa na zwizek midzy polimorfizmem mtDNA a wydajnoci mleka.
tli

Wyniki bada prowadzonych na bydle holsztysko-fryzyjskim przez innych badaczy potwiedzaj istnienie tej wspzalenoci. Stwierdzono bowiem istotny wpyw zamiany (tranzycji - - rodzaj mutacji punktowej opisany w rozdziale: Mutacje) adeniny na guanin w 169 nukleotydzie regionu D-loop (jest to szczeglnie wany region) mitochondrialnego DNA na zawarto tuszczu w mleku i warto energetyczn mleka. Wpyw matczynego mtDNA na cechy uytkowoci mlecznej potomstwa moe by wykorzystany w doskonaleniu byda. Potencjalne moliwoci stwarzaj techniki klonowania oparte gwnie na umieszczaniu w enukleowanym (pozbawionym jdra) oocycie jdra komrki somatycznej. Mona zatem wykorzystywa do tego celu oocyty pochodzce od krw majcych szczeglnie korzystne allele w mitochondrialnym DNA. U owiec badania mitochondrialnego DNA, prowadzone za pomoc technik molekularnych (RFLP), wykazay istotn wspzaleno midzy polimorfizmem fragmentw restrykcyjnych mtDNA a mas jagnit przy urodzeniu. Organizacja molekularna mtDNA jest omwiona w rozdziale: Mapy genomowe.

Rozdzia

7.1. Rodzaje zmiennoci i czynniki j wywoujce


Zmienno jest to rnorodno wartoci lub jakoci cech obserwowana wrd osobnikw. Zmienno danej cechy moe by obserwowana midzy osobnikami i jest to zmienno osobnicza, czyli indywidualna. Istnieje take zmienno grupowa, wystpujca midzy osobnikami nalecymi do rnych ras (zmienno rasowa) lub gatunkw (zmienno gatunkowa). W przypadku cech, ktre ujawniaj si periodycznie u tego samego osobnika w kolejnych sezonach (np. wydajno mleczna w kolejnych laktacjach), mamy do czynienia ze zmiennoci wewntrzosobnicz. Wszelkie rnice uzewntrzniajce si (widoczne lub dajce si okreli bd zmierzy) midzy zwierztami okrelamy mianem zmiennoci fenotypowej. Zmienno ta powstaje w wyniku rnic genetycznych midzy zwierztami (zmienno genetyczna) oraz oddziaywania zrnicowanych warunkw rodowiskowych (zmienno rodowiskowa). Na zmienno fenotypow, zwan take ogln, moe rwnie wpywa zmienno wynikajca z wzajemnego wspdziaania genotypw z warunkami rodowiskowymi, tzw. interakcja genotyp-rodowisko. Zmienno oznaczamy symbolem S2, jeli rozpatrujemy populacj zwierzt, lub S2 w przypadku prby losowej pochodzcej z tej populacji.

179

Podstaw genetycznego doskonalenia zwierzt jest zmienno genetyczna. Jej rdem s przede wszystkim mutacje i rekombinacje genetyczne oraz w mniejszym stopniu wspdziaanie midzy genami. Mutacje prowadz do powstawania nowych genw, innych ukadw w obrbie chromosomu lub midzy chromosomami. Natomiast rekombinacje, bdce wynikiem segregacji chromosomw i crossing over w czasie mejozy oraz losowego czenia si gamet zrnicowanych genetycznie, s przyczyn powstawania rnych genotypw. Gwnymi skadnikami zmiennoci genetycznej s: zmienno addytywna, odchylenie dominacyjne i odchylenie epistatyczne.

Zmienno addytywna spowodowana jest niejednakowym sumujcym efektem dziaania alleli z loci poligenw, ktre kontroluj wystpowanie danej cechy. Ten rodzaj zmiennoci zostanie omwiony szerzej w podrozdziale: Zmienno cech ilociowych. Zmienno dominacyjna jest to cz zmiennoci genetycznej, ktra jest powodowana dominacyjnym wspdziaaniem genw warunkujcych cech. Efekt dominacji przejawia si nieaddytywnym zrnicowaniem wartoci midzy osobnikiem heterozygotycznym, w ktrego genotypie funkcjonuje jeden gen dominujcy, i osobnikami homozygotycznymi dominujcym i recesywnym. Poniszy schemat krzyowania byda obrazuje to odchylenie. Osobniki fenotypowo identyczne (bezrogie), ale rnice si pod wzgldem zaoe genetycznych (homo- i heterozygotyczne) dadz potomstwo rnice si nie tylko pod wzgldem genotypu, ale take fenotypu (bezrogie i rogate).

Zmienno epistatyczna jest skadow zmiennoci genetycznej powodowan nieallelicznym wspdziaaniem genw epistaz. Przykadem epistatycznego dziaania genw jednej pary alleli na geny innej pary jest
180

biae upierzenie kur rasy leghorn i whiterock. Barwa upierzenia u tych ras jest warunkowana dwiema parami alleli: C-c (wystpienie barwy) oraz I-i (blokada wytwarzania me/aniny, upierzenie biafe). Z krzyowania osobnikw 0 biaym upierzeniu, nalecych do tych ras, uzyskuje si mieszace biao upierzone. W pokoleniu F2 wystpi natomiast osobniki zarwno biao, jak 1barwnie upierzone.

W pracy hodowlanej szczeglnie wana jest znajomo udziau zmiennoci genetycznej, a zwaszcza jej skadnika zmiennoci addytywnej, w zmiennoci fenotypowej danej cechy ilociowej. Do szacowania tego udziau stosowane s parametry genetyczne, do ktrych naley odziedziczalno. Szczegowe informacje dotyczce odziedziczalnoci i pozostaych parametrw genetycznych oraz ich wykorzystania w doskonaleniu zwierzt znajduj si w podrcznikach z zakresu metod hodowlanych. Zmienno rodowiskowa wynika z rnorodnych warunkw rodowiskowych oddziaujcych na zwierzta stale (np. czynniki klimatyczne) lub okresowo (ywienie, sposb utrzymania itp.). Do czynnikw rodowiskowych, majcych istotne znaczenie, naley take efekt matki pre-i postnatalny. Wpyw rodowiska matki zostanie omwiony w dalszej czci tego rozdziau. Zmienno cechy moe mie charakter skokowy lub cigy w zalenoci od jej genetycznego uwarunkowania. Zmienno skokowa odnosi si przede wszystkim do cech jakociowych, warunkowanych zwykle jedn par alleli. Udzia pojedynczego genu w wyksztaceniu cechy jakociowej jest duy, dlatego gen ten ujawnia si mimo ewentualnego modyfikujcego dziaania rodowiska czy wpywu na dan cech innych genw zwanych modyfikatorami. Charakterystyka zmiennoci cechy jakociowej polega na okreleniu czstoci wystpowania (frekwencji) genw, genotypw i fenotypw w danej populacji (stadzie). Zagadnienie to jest szerzej omwione w rozdziale: Podstawy genetyki populacji. Zmienno skokowa wystpuje rwnie w przypadku pewnych cech ilociowych, ktrych warto wyraana jest za pomoc liczb naturalnych, np. liczba prosit w miocie. Zmiennoci cig charakteryzuje si wikszo cech ilociowych. Nasilenie tych cech wyraane jest za pomoc liczb rzeczywistych z przedziau
181

charakterystycznego dla danej cechy, np. wydajno mleka w kilogramach, wysoko w kbie w centymetrach, procentowa zawarto tuszczu w mleku itp. Charakterystyka zmiennoci tych cech przedstawiana jest za pomoc miar zmiennoci opisanych poniej.

7.2. Miary zmiennoci


Okrelanie zmiennoci fenotypowej cechy przeprowadzane jest na wybranej losowo z populacji odpowiednio licznej grupie osobnikw, zwanej prb. Z punktu widzenia statystycznego populacj nazywamy zbir zwierzt, ktrego elementami s poszczeglne osobniki. W celu okrelenia zmiennoci cechy musimy j oznaczy (np. zmierzy) u wszystkich osobnikw stanowicych prb. Uzyskany w ten sposb nie uporzdkowany materia wymaga zestawienia (uporzdkowania) np. wedug wartoci rosncych lub malejcych (szereg statystyczny uporzdkowany). Jeli liczba obserwacji jest dua, a niektre wartoci powtarzaj si, dane zestawia si w tzw. szereg rozdzielczy, w ktrym na podstawie przyjtych przedziaw klasowych mona wyodrbni poszczeglne klasy. Takie uporzdkowanie danych liczbowych (obserwacji) uatwia statystyczn i graficzn analiz zmiennoci cechy. Szczegow charakterystyk populacji mona przeprowadzi po oszacowaniu odpowiednich parametrw statystycznych, ktre mona podzieli na dwie grupy: 1) miary skupienia 2) miary rozproszenia (dyspersji).

7.2.1. Miary skupienia


Do miar skupienia nale przecitne klasyczne (rednia arytmetyczna, waona, harmoniczna i geometryczna) oraz przecitne pozycyjne (warto rodkowa mediana i warto modalna dominanta). rednia arytmetyczna nie odzwierciedla zmiennoci, ale informuje o poziomie cechy w danej populacji i obliczana jest ze wzoru:

rednia arytmetyczna charakteryzuje si nastpujcymi waciwociami:

Przykad (dane z tab. 7-1):

redni waon obliczamy wwczas, gdy danej wartoci cechy odpowiada kilka obserwacji (tworzy si wwczas przedziay wartoci cechy) lub gdy obliczamy redni dla populacji na podstawie rednich dla prb. Wzr na jej obliczanie jest nastpujcy:

rednia harmoniczna jest stosowana najczciej do obliczania rednich wartoci otrzymywanych ze wskanikw czasu, np. do obliczania redniej prdkoci. Wzr na obliczanie redniej harmonicznej jest nastpujcy:

Przykad:

Waono mleko oddawane przez krow w kolejnych minutach doju. W pierwszej minucie uzyskano 4 kg mleka, w drugiej 2 kg, a w trzeciej l kg. Stosujc wzr na obliczanie redniej harmonicznej uzyskujemy wynik mwicy, jaka bya rednia szybko oddawania mleka:

183

redni geometryczn stosuje si wtedy, gdy rozkad zmiennoci cechy jest asymetryczny, tzn. odbiega od rozkadu normalnego. Jest ona szczeglnie przydatna do obliczania redniego tempa przyrostu (lub zmniejszania si) jakiego wskanika w jednostce czasu. rednia geometryczna jest pierwiastkiem n stopnia z iloczynu n wartoci cechy. W celu uproszczenia oblicze mona si posuy form logarytmiczn:

Przykad:

Okrelano mas ciaa cielt od urodzenia do 6 miesicy w odstpach miesicznych, a nastpnie obliczono wskanik wzrostu dla kolejnych miesicy (wskanik wzrostu jest to przyrost masy ciaa wyraony w procentach redniej masy ciaa w danym okresie). Wartoci zlogarytmowane tego wspczynnika wyniosy: 0,3010; 0,1239; 0,0864; 0,0697; 0,0414; 0,0294, natomiast ich suma = 0,6518. Chcc okreli tempo wzrostu cielt w okresie 6 miesicy naley obliczy redni geometryczn:

redni wskanik tempa wzrostu cielt w okresie 6 miesicy wynis 1,28, czyli 128%. Warto rodkowa (mediana) jest to warto cechy, ktra dzieli szereg uporzdkowany malejco lub rosnco na poow. Warto modalna (rednia modalna) jest to warto cechy, ktra najczciej powtarza si w szeregu liczbowym.

7.2.2. Miary rozproszenia


Podstawowe miary rozproszenia to wariancja, standardowe odchylenie i wspczynnik zmiennoci. Wariancja jest to redni kwadrat odchyle obserwacji (xi) od redniej arytmetycznej

Biorc pod uwag, e najczciej rednia arytmetyczna nie jest liczb cakowit, w celu uatwienia oblicze stosuje si wzr roboczy, w ktrym licznik jest sum kwadratw odchyle:

Jeli prb stanowi maa liczba obserwacji, w celu uniknicia bdu zalecane jest dzielenie nie przez N obserwacji, ale przez N1.. Za mao liczn prb przyjmuje si poniej 100 obserwacji. Wariancja nie moe mie wartoci ujemnej. Ma ona miano takie jak analizowana cecha, ale podniesione do kwadratu.
185

Standardowe odchylenie jest pierwiastkiem kwadratowym z wariancji.

Jego warto informuje o rednim odchyleniu in plus i in minus od redniej arytmetycznej i jest liczb mianowan w jednostkach badanej cechy. Charakteryzujc zmienno cechy podaje si warto redniej arytmetycznej i standardowego odchylenia Wspczynnik zmiennoci obliczany jest ze wzoru:

gdzie:

Wspczynnik zmiennoci wyraa zmienno w procentach, dziki czemu znajduje zastosowanie do porwnywania zmiennoci rnych cech (mierzonych w rnych jednostkach, np. wydajno mleczna [kg] i zawarto tuszczu w mleku [%]) w tej samej populacji, a take zmiennoci tej samej cechy w rnych populacjach (np. wydajno mleczna w stadzie krw rasy nizinnej czarno-biaej i czerwonej polskiej). Wspczynnik zmiennoci moe by rwnie miar precyzji w dowiadczeniu przeprowadzanym na kilku grupach zwierzt. Dobr zwierzt do grup dowiadczalnych powinien by losowy, tak wic zmienno badanej cechy we wszystkich grupach musi by zbliona. Rnica wartoci wspczynnika zmiennoci w granicach 5-10% oznacza moliw do przyjcia precyzj dowiadczenia. Sposb obliczania miar rozproszenia przedstawiono niej, wykorzystujc dane liczbowe zawarte w tabeli 7-1, dotyczce masy ciaa owiec w wieku 10 miesicy. Wariancja:

7.3. Zmienno cech ilociowych


7.3.1. Dziedziczenie cech ilociowych
Cechy o znaczeniu gospodarczym w zdecydowanej wikszoci nale do kategorii cech ilociowych. W przeciwiestwie do cech jakociowych mechanizm ich dziedziczenia jest zoony i trudny do penego wyjanienia. Ponadto zmienno tych cech zaley rwnie od wpywu czynnikw rodowiskowych. Cechy ilociowe warunkowane s wieloma genami z rnych loci (poligeny). Poligeny, nazywane inaczej genami polimerycznymi, addytywnymi lub kumulatywnymi, specyficznie ze sob wspdziaaj. Przyjmuje si, e efekty poszczeglnych poligenw sumuj si i w ten sposb warunkuj nasilenie cechy. Liczba poligenw kontrolujcych cechy ilociowe jest nieznana. Zakada si, e kady poligen ma dwa allele, pomidzy ktrymi zachodzi dziedziczenie porednie, przy czym jeden z nich ma dziaanie pozytywne (tzn. zwikszajce warto cechy), a drugi neutralne, czyli obojtne dla wartoci cechy. Kolejnym zaoeniem jest to, e efekty alleli pozytywnych z rnych loci poligenw s sobie rwne i wreszcie efekty te sumuj si przy ksztatowaniu fenotypu. Genetyczne to cech ilociowych stwarza moliwo bardzo duej liczby kombinacji ukadw alleli kontrolujcych dan cech. Najczciej wystpuj genotypy warunkujce wartoci fenotypowe cechy, ktre skupiaj si wok wartoci redniej, natomiast zmniejsza si czsto wystpowania form skrajnych. Zagadnienie to obrazuje przykad, w ktrym hipotetycznie przyjto, e nieno kur warunkowana jest trzema parami alleli z rnych loci. Kury o genotypach pozytywnych" AABBCC s zdolne do produkcji 240 jaj rocznie, natomiast o genotypach zawierajcych allele neutralne aabbcc do produkcji 120 jaj rocznie. Zaoono rwnie, e efekty genw A, B i C s identyczne (A = B = C) i kady z tych genw zwiksza nieno kur o 20 jaj. Koguty o genotypach AABBCC, majce zaoenia genetyczne warunkujce nieno 240 jaj rocznie, skrzyowano z kurami o genotypach aabbcc, nioscymi 120 jaj rocznie. AABBCC x aabbcc 240 120 Uzyskane w pokoleniu Fl potomstwo byo heterozygotyczne (AaBbCc), czyli miao zaoenia genetyczne warunkujce nieno 180 jaj rocznie. U potomstwa w pokoleniu F2 nastpio rozszczepienie, uzyskano 64 genotypy, warunkujce 7 poziomw nienoci (fenotypw tej cechy). Szeregujc w pionie genotypy warunkujce takie same wartoci cechy i czc lini krzyw genotypy znajdujce si najwyej, uzyskujemy przedstawiony niej obraz graficzny: 187

Po zestawieniu wartoci fenotypowych cechy, determinowanych przez okrelone genotypy i obliczeniu redniej wartoci cechy w pokoleniu F2 uzyskujemy:

W podanym przykadzie celowo pominito wpyw czynnikw rodowiskowych. Czynniki te oraz ich wpyw na fenotypow ekspresj cech ilociowych bd omwione nieco pniej. Znaczenie tych czynnikw jest istotne, gdy zacieraj one rnice midzy fenotypami, co w przypadku cech ilociowych o zmiennoci cigej powoduje, e graficznym obrazem tej zmiennoci jest krzywa rozkadu normalnego, zwana krzyw Gaussa. Rozkad normalny charakteryzuje si tym, i: jest to rozkad, w ktrym najwicej osobnikw wykazuje warto cechy zblion do redniej, a najmniej skrajne wartoci, poniej i powyej redniej, rozkad ten jest symetryczny, a o symetrii przechodzi przez punkt, w ktrym jest rednia warto cechy, 188

mediana i warto modalna (opisane wczeniej) znajduj si w tym samym punkcie, co warto redniej arytmetycznej, w przedziale xS znajduje si ok. 68,2% wszystkich obserwacji, w przedziale x 2 S znajduje si ok. 95,4% wszystkich obserwacji, w przedziale x3 S znajduje si ok. 99,6% wszystkich obserwacji cechy. Jak ju wspomniano, na fenotypowe ujawnienie si kadej cechy ilociowej wyrany wpyw wywieraj czynniki rodowiskowe. Mog one maskowa oddziaywanie poligenw. Spord czynnikw rodowiskowych na szczegln uwag zasuguje efekt matki (ang. maternal effect). Mimo i potomstwo otrzymuje od ojca i od matki tak sam liczb chromosomw, wpyw matki na potomstwo jest wikszy od wpywu ojcowskiego. Wpyw ten wynika z trzech rde: pierwszym jest podoe genetyczne dodatkowe zaoenia dziedzicz ne przekazywane przez matk poza chromosomami (tzw. dziedziczenie pozajdrowe, omwione w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedzicze nia cech), dwa nastpne rda wynikaj z oddziaywania rodowiska matki w okresie ycia podowego (efekt prenatalny) i po urodzeniu (efekt postnatalny). Efekt prenatalny zosta wykryty przez wykorzystanie transferu zarodkw zwierzcych i analiz ich rozwoju. Na ten efekt skada si przede wszystkim wpyw: wielkoci macicy, iloci substancji odywczych dostarczanych podowi (lub podom), wielkoci matki oraz jej stanu fizjologicznego i zdrowotnego. Wielko prenatalnego efektu matki zaley rwnie od zaoe genetycznych przekazywanych potomstwu zarwno w jdrowym, jak i mitochondrialnym DNA. Niedawno u byda mlecznego wykazano istotny wpyw genw mitochondrianych na wydajno mleka, procent tuszczu w mleku oraz warto energetyczn mleka. Efekt postnatalny wystpuje przede wszystkim u ssakw i zosta okrelony za pomoc eksperymentw krzyowego podsadzania noworodkw innym matkom (np. z innych ras). Efekt ten wynika bowiem z mlecznoci samicy i jej zachowania opiekuczego (tzw. behawior matczyny). U trzody chlewnej, na przykad, stwierdzono, e wpyw efektu matki jest najistotniejszy dla wzrostu prosit do 21 dnia ycia, a wic wwczas gdy prosita odywiaj si jedynie mlekiem matki. Wielko efektu matki pr- i postnatalnego zaley od gatunku, rasy, a take wielu czynnikw rodowiskowych.

7.3.2. Zmienno transgresywna


Zwierzta gospodarskie, nawet ras o ustalonym genotypie, s heterozygotyczne pod wzgldem znacznej liczby loci. W wyniku krzyowania takich osobnikw potomstwo moe mie zaoenia genetyczne warunkujce 189

wartoci cechy takie, jakie obserwowano u rodzicw, bd wartoci wysze lub nisze ni u rodzicw, czyli wykazujce wiksz zmienno cechy. Zjawisko to nosi nazw transgresji. Ilustruje je przykad: Zamy, e wydajno mleczna krw jest kontrolowana przez geny z 3 loci D, E i F. Efekty genw D, E i F s identyczne (D = E = F), a kady z nich zwiksza produkcj mleka o 400 kg. Genotyp ddeeff warunkuje wydajno 2400 kg mleka, DDEEFF 4800 kg, natomiast heterozygotyczny DdEeFf 3600 kg mleka. W potomstwie rodzicw heterozygotycznych pod wzgldem genw kontrolujcych produkcj mleka mog wystpi rne genotypy (typowe rozszczepienie przy krzyowaniu heterozygot), warunkujce rn wydajno mleczn. Przewaajca cz potomstwa bdzie si charakteryzowa redni wartoci cechy, rwn wartoci cechy u rodzicw. Pojawi si jednak take inne wartoci cechy wysze ni u rodzicw (np. genotyp DDEEFF, warunkujcy produkcj 4800 kg mleka) lub nisze (ddeeff 2400 kg mleka). Zjawisko transgresji jest do czsto obserwowane w hodowli zwierzt gospodarskich i jest rdem zmiennoci transgresywnej, wykorzystywanej w pracy hodowlanej.

7.3.3. Geny o duym efekcie


W podanych wyej przykadach determinacji cech ilociowych zakadano udzia kilku lub kilkunastu par alleli z rnych loci o maym efekcie addytywnym (dziedziczenie poligeniczne). Cechy takie charakteryzuj si rozkadem normalnym. W przypadku niektrych cech zaobserwowano zmienno, ktrej graficzny obraz odbiega od krzywej Gaussa i moe by dwumodalny lub przesunity, spaszczony albo nadmiernie uwypuklony. Jest to wynikiem dziedziczenia, w ktrym obok poligenw dziaa gen o duym efekcie, zwany inaczej genem gwnym. Gen o duym efekcie jest identyfikowany wwczas, gdy u przeciwstawnych homozygot rnice wartoci fenotypowej cech wynosz co najmniej jedno standardowe odchylenie. Identyfikacja tych genw poprzez statystyczn analiz rozkadu zmiennoci cechy w populacji jest trudna. Niektre geny o duym efekcie zostay wykryte przypadkowo. Od niedawna dla genw o duym efekcie fenotypowym w zakresie cech produkcyjnych uywa si okrelenia locus cechy ilociowej QTL (ang. quantitative trait locus). Jednym z genw majcych duy wpyw na rne cechy produkcyjne zwierzt gospodarskich jest gen hormonu wzrostu GH (ang. growth hormone). U byda locus GH znajduje si w chromosomie l (w regionie 1q23-q25). Wykazano istotny wpyw polimorfizmu w tym locus na wydajno krw ras mlecznych. W badaniach prowadzonych na simentalerach stwierdzono, i zwierzta homozygotyczne pod wzgldem allelu B hormonu
190

wzrostu charakteryzoway si o 382 + 18,5 kg wiksz wydajnoci mleka w porwnaniu z osobnikami homozygotycznymi AA. U byda misnego gen hormonu wzrostu wpywa na cechy uytkowoci misnej. Wsplnie z genem czynnika wzrostu insulinopodobnego l (IGF-1) odgrywa on istotn rol w ksztatowaniu tempa wzrostu i skadu tuszy. Hormon wzrostu reguluje rozwj mini, a IGF-1 wspomaga jego dziaanie. Badania prowadzone na mieszacach piedmontese x chianina wskazuj na istotn zaleno midzy polimorfizmem tego genu a dugoci i obwodem klatki piersiowej. Stwierdzono take, i gen hormonu wzrostu oddziauje na proces starzenia si i reprodukcj oraz na odpowied immunologiczn organizmu. Loews GH u wini znajduje si w chromosomie 12pl4 i wykazuje du homologi do genu GH u czowieka, byda i szczura. Wykazano wpyw hormonu wrostu na zwikszenie masy mini, z rwnoczesnym zmniejszeniem otuszczenia, a take na popraw wykorzystania paszy i przyrosty dzienne masy ciaa. Opisano dotychczas okoo 20 alleli hormonu wzrostu u tego gatunku. Dalsze badania zmierzaj do ustalenia, ktre allele maj zwizek z uytkowoci misn. Wpyw polimorfizmu genu hormonu wzrostu na cechy uytkowoci misnej i tempo wzrostu jest przedmiotem bada prowadzonych take na drobiu. Dotychczas wykazano, i polimorficzne warianty genu hormonu wzrostu (u kur znanych jest ju 16 alleli) s odpowiedzialne za niektre zaburzenia rozwojowe, jak karowato i akromegalia. Pozostae waniejsze geny o duym efekcie zostan przedstawione z podziaem na gatunki zwierzt, a najnowsze osignicia s omwione w rozdziale 12.3.5.
winie

U trzody chlewnej zidentyfikowano kilka genw o duym efekcie. Gen receptora rianodyny (KYR1). Autosomalny recesywny allel (gorczki zoliwej) genu RYR1 jest najlepiej poznanym genem o duym efekcie u trzody chlewnej. Badania cytogenetyczne wykazay, i jest on zlokalizowany w chromosomie 6 (lokalizacja ta przedstawiona jest w rozdziale: Mapy genomowe). W wyniku dziaania tego genu zwiksza si podatno wi na stresy (zesp PSS ang. porcine stress syndrome), powodowane transportem, warunkami termicznymi i niektrymi czynnikami chemicznymi. Nastpstwem miopatii stresowych s niekorzystne zmiany fizykochemiczne w organizmie, prowadzce do pogorszenia jakoci misa odbarwienie i nieprzyjemny zapach. Przypadek takich zmian po raz pierwszy zosta opisany w 1957 roku przez Ludwigsena. Jednoczenie gen ten ma dodatni wpyw na niektre cechy zwizane z uytkowoci misn, jak zawarto misa w tuszy i powierzchnia oka poldwicy. Paramety tych cech s najkorzystniejsze u zwierzt heterozygotycznych, bdcych nosicielami zmutowanego allelu. Zwierzta takie s wic dobrym materiaem do tuczu. 191

Poniewa gen gorczki (hipertermii) zoliwej powoduje specyficzn wraliwo na gaz uywany w anestezji halotan, pocztkowo oznaczono go symbolem Haln. U osobnikw HalnHaln (homozygoty recesywne) wystpuje nadmierny transport jonw Ca++ z retikulum endoplazmatycznego do cytoplazmy komrek. Badania przeprowadzone przez naukowcw kanadyjskich wykazay, e fenotypowo rozpoznany Haln jest mutacj genu receptora rianodyny (RYR1), jednej z podjednostek kanau wapniowego w miniach szkieletowych. Dlatego obecnie gen hipertermii zoliwej jest oznaczany symbolem RYR1. W obrbie genu RYR1 stwierdzono 18 mutacji punktowych, z ktrych najistotniejsza jest mutacja w 1843 nukleotydzie, powodujca zamian argininy w cystein w pozycji 615 acucha polipeptydowego. Mutacja ta likwiduje miejsce trawienia niektrymi enzymami, co umoliwio opracowanie molekularnych testw diagnostycznych. W jednym z nich stosowane s dwa enzymy restrykcyjne (HgiAI oraz HinPI). W innym, opatentowanym przez badaczy kanadyjskich, fragment genu receptora rianodyny zawierajcy mutacj trawiony jest enzymem Hhal. Procedur tego testu przedstawiono na rycinie 7-1. Zamplifikowany fragment DNA dugoci 81 par zasad obejmuje rejon wystpienia mutacji punktowej CT. W normalnym genie enzym HhaI rozpoznaje sekwencj GCGG i tnie DNA na dwa odcinki, natomiast w zmutowanym

192

allelu zmiana tej sekwencji powoduje, e enzym nie znajduje miejsca cicia, czego wynikiem jest uzyskanie nie strawionego fragmentu genu. Obraz elektroforetycznego rozdziau zamplifikowanego odcinka genu dla osobnika homozygotycznego (NN) wykae dwa prki dugoci 49 pz i 32 pz, dla homozygotycznego (nn) - - jeden prek dugoci 81 pz, natomiast dla heterozygoty trzy prki: 81 pz, 49 pz, 32 pz. Diagnostyka wraliwoci wi na stres za pomoc testu molekularnego umoliwia eliminowanie z hodowli osobnikw podatnych. W pracy hodowlanej naley prowadzi kojarzenia tak, by wykorzysta wspomniane ju wczeniej zalety genotypu heterozygotycznego. Gorczka zoliwa wystpuje take u innych gatunkw zwierzt oraz u ludzi. Gen hipertermii u ludzi jest zlokalizowany w chromosomie 19, u byda w 18, a u koni w 10 chromosomie. Gen kwanego misa" gen podjednostki kinazy biakowej aktywowanej przez AMP (PRKAG3). Pierwsze sugestie co do istnienia genu o duym efekcie, wpywajcego na wzrost zawartoci glikogenu w tkance miniowej u wi rasy hampshire pojawiy si w 1986 roku. Loews odpowiedzialny za cech kwanego misa zlokalizowano w chromosomie 15 na podstawie analizy asocjacji przeprowadzonej dla rodzin referencyjnych z wykorzystaniem markerw genetycznych i oznaczono symbolem RN. Dalsze badania z zastosowaniem precyzyjnych metod analizy genomu zostay uwieczone w 2000 roku wykryciem mutacji w genie PRKAG3 (gen trzeciej izoformy podjednostki y kinazy biakowej aktywowanej przez AMP). W genie tym stwierdzono siedem mutacji, ale tylko tranzycja G-A w kodonie 200, powodujca zamian argininy na glicyn w acuchu polipeptydowym, warunkuje cech kwanego misa. U nosicieli zmutowanego allelu stwierdza si dwukrotnie wiksz zawarto glikogenu w miniach (zwaszcza w szynce). Test molekularny wykrywajcy mutacj genu PRKAG3 zosta opatentowany. Gen wpywajcy na wielko miotu (ESR). Niektre chiskie rasy wi charakteryzuj si niezwyk plennoci. Badania prowadzone w USA miay na celu wykrycie genetycznego podoa tej cechy. Wyniki tych bada wskazuj, i zlokalizowany w chromosomie l (1p2.5-2.4) locus genu receptora steroidowego hormonu pciowego estrogenu ESR (ang. estrogen receptor gene) moe mie istotny wpyw na wielko miotu. Stwierdzono, e jeden z alleli tego genu, wystpujcy w chiskiej plennej rasie meishan, wykazuje zwizek z wielkoci miotu i moe by uwaany za gen gwny kontrolujcy t cech. Lochy majce w swym genotypie dwie kopie tego genu daj mioty wiksze o l do 1,4 prosicia ywo urodzonego w porwnaniu z lochami nie majcymi tego genu. Badania molekularne (z zastosowaniem enzymw restrykcyjnych) genu receptora estrogenu, prowadzone u wi innych ras (niemiecka landrace, yorkshire, duroc), pozwoliy na wykrycie dwch mutacji punktowych (zamiana AT w kodonie 1665 i AG w kodonie
193

1754). Gen ten nie wykazuje plejotropowego negatywnego dziaania na inne, ekonomicznie wane cechy, jak wzrost i grubo soniny na grzbiecie. Polimorfizm tego genu moe mie szczeglne znaczenie w pracach zmierzajcych do utworzenia syntetycznych linii wi, wyprowadzanych z udziaem rasy meishan.
Bydo

Geny biaek mleka. Do genw gwnych o szczeglnym znaczeniu dla wynikw ekonomicznych hodowli byda nale geny biaek mleka: -kazeiny i -laktoglobuliny. Gen -kazeiny, zlokalizowany w chromosomie 6, ma dugo okoo 13 tysicy par zasad i zawiera 5 eksonw. W najduszym eksonie 4 znajduje si wikszo sekwencji kodujcych dojrzae biako -kazeiny. Wykazano zwizek midzy genami kazein a cechami uytkowoci mlecznej (wydajno mleka, biaka i tuszczu). Mleko krw z genem -kazeiny typu B ma wiksz zawarto biaka oraz lepsz przydatno do produkcji serw ni mleko z wariantem -kazeiny A. Allele kontrolujce syntez poszczeglnych wariantw tego biaka powstay w wyniku mutacji punktowej w genie -kazeiny wariantu A. W nastpstwie takiej mutacji w pozycji 136 acucha polipeptydowego kazeiny wariantu A znajduje si aminokwas izoleucyna (kodon ATC), podczas gdy w wariancie B treonina (w DNA kodon ACC). Natomiast w pozycji 148 wariant B -kazeiny ma kwas asparaginowy (kodon GAT), wariant A alanin (GCT). Te dwa warianty -kazeiny mona rozrni za pomoc analizy polimorfizmu dugoci fragmentw restrykcyjnych. Podstawienia zasad w nukleotydach powoduj powstanie miejsc cicia dla enzymu HindIII, natomiast zniknicie miejsca trawienia przez enzym Hm/L Dziki rnicy w skadzie nukleotydowym genu moliwe jest okrelanie genotypu kontrolujcego wariant -kazeiny w mleku za pomoc testu PCR-RFLP (ry. 7-2). Opracowana zostaa metoda identyfikacji genotypw -kazeiny, wykorzystywanych jako dodatkowe kryterium selekcji buhajw, utrzymywanych w zakadach unasieniania. Dotychczas genotyp ojca mona byo okreli na podstawie segregacji polimorficznych wariantw -kazeiny, identyfikowanych w mleku crek, przy czym genotypy homozygotyczne mogy by weryfikowane jako statystycznie bardziej lub mniej prawdopodobne. Gen -laktoglobuliny uwaany jest za gen o duym efekcie, gdy okrelony wariant tego biaka, podobnie jak -kazeiny, wpywa na wydajno mleka i jego skadnikw. Mleko zawierajce -laktoglobulin B rni si od mleka z wariantem A wiksz zawartoci suchej masy, tuszczu i kazein oraz lepsz przydatnoci technologiczn. Gen -laktoglobuliny ma dugo okoo 7800 par zasad, zawiera 7 eksonw. Biako wariantu A rni si od B dwoma aminokwasami. Jest to konsekwencja rnic w sekwencji nukleo-

194

AB

AA

BB

Ry. 7-2. Identyfikacja genotypu -kazeiny (wariant A i B) metod PCR-RFLP. a marker, b produkt nie strawiony, l trawienie enzymem restrykcyjnym Hinfi, 2 trawienie enzymem restrykcyjnym Hindlll

tydowej obu alleli. Stosowane s rne warianty molekularnej identyfikacji genotypw -laktoglobuliny z zastosowaniem metod PCR-RFLP i SSCP. Wyniki oznacze s wykorzystywane jako dodatkowe kryterium selekcyjne w doskonaleniu cech uytkowoci mlecznej. Gen hipertrofii miniowej (MH ang. muscular hypertrophy). Hipertrofia miniowa wystpujca u niektrych ras byda misnego (belgijskiego bkitnego i asturiana) determinowana jest zmutowanym allelem genu miostatyny (locus miostatyny zmapowano w chromosomie 2, jego lokalizacja jest przedstawiona w rozdziale: Mapy genomowe). Gen miostatyny naley do rodziny TGF (ang. transforming growth factor ). Zmutowany allel rni si od normalnego delecj 11 nukleotydw midzy 821 a 831 nukleotydem, dlatego mutacja ta jest oznaczona jako nt821(del11). Bezporednim nastpstwem ekspresji tego allelu jest zwikszona zawarto chudego misa w tuszy oraz jego lepsze waciwoci dietetyczne, spowodowane zmniejszon iloci tuszczu i tkanki cznej. Dlatego cecha ta jest preferowana przez hodowcw zarwno w hodowli czystych ras, jak i ich mieszacw. Obecno zmutowanego allelu w genotypie ma jednak take niekorzystne nastpstwa, nale do nich: opnienie okresu dojrzaoci pciowej u osobnikw obu pci, zmniejszona zdolno rozpodowa u buhajw mniejsze stenie hormonw pciowych w osoczu krwi, mniejszy obwd i masa jder, natomiast u krw dusza cia. Dua masa podu stwarza wyrane trudnoci naturalnego porodu. Rozwizaniem

195

ograniczajcym miertelno okooporodow cielt jest pord przez cesarskie cicie. Powoduje ono jednak wyduenie okresu midzywycieleniowego o okoo 20 dni. Pomimo ujemnych nastpstw zwizanych z hipertrofi mini, cecha ta ze wzgldw ekonomicznych (koszt cesarskiego cicia jest rwny tylko 1/10 wartoci misa cielcia) jest w niektrych krajach utrwalana w hodowli byda typu misnego (ry. 7-3 wkadka kolorowa). Najnowsze badania struktury molekularnej genu miostatyny w rnych rasach misnych wykazay obecno kolejnych czterech mutacji, ktre uszkadzaj funkcj kodowanego biaka. Trzy z nich powoduj przedwczesne pojawienie si kodonu stop" i w efekcie skrcenie acucha polipeptydowego miostatyny. S to: a) insercja 10 nukleotydw powizana z delecj 7 nukleotydw, poczwszy od pozycji 419 nukleotydu, b) tranzycja CT w 610 nukleotydzie, c) transwersja G T w nukleotydzie 676. Czwarta mutacja d) polega na tranzycji G A w nukleotydzie 938, ktra jest odpowiedzialna za substytucj cysteiny przez tyrozyn. Co ciekawe, mutacje te s charakterystyczne dla okrelonych ras byda misnego. Mutacje a) i c) wystpuj u byda francuskiego maine-anjou, b) u charolaise (Francja) i d) u gasconne (Francja) i piedmontese (Wochy). Owce Gen hipertrofii miniowej (CLPG). U owiec wystpuje mutacja powodujca hipertrofi miniow, ktra jest zwizana ze wzrostem masy mini o okoo 32% i zmniejszeniem zawartoci tuszczu o okoo 8% oraz lepszym wykorzystaniem paszy. Analiza molekularna DNA przeprowadzona u rodzin referencyjnych z wykorzystaniem 21 markerw genetycznych byda umoliwia zmapowanie genu hipertrofii miniowej w 18 chromosomie. Jest to pojedynczy autosomalny gen, nazwany callipyge (z greckiego calli pikne, pyge -- poladki) -- symbol CLPG. Prowadzone s badania w celu jego izolacji. Przypuszcza si, e istniej dwa allele CLPG i clpg, przy czym zwierzta o genotypie CLPG/clpg cechuje hipertrofia, natomiast osobniki z genotypem clpg/clpg i CLPG/CLPG maj normalny fenotyp. Jak wykazay ostatnie badania, w przypadku genotypu heterozygotycznego wystpienie hipertrofii zaley od tego, czy gen CLPG pochodzi od ojca, czy od matki. Gen CLPG pochodzcy od matki jest nieaktywny. Hipertrofia ujawnia si u potomka wwczas, gdy dziedziczy on gen CLPG od ojca (pitno gametyczne). Ostatnio ustalono, e podoe molekularne tej cechy zwizane jest z mutacj w niekodujcym regionie DNA. Jest to substytucja nukleotydowa AG w regionie niekodujcym adnego biaka. Przypuszcza si, e locus ten podlega transkrypcji, a jego produkt to niekodujcy RNA (ncRNA ang. noncoding RNA), ktry peni nieznan jeszcze funkcj regulacyjn. Gen wysokiej plennoci (BMPR-IB) u owiec rasy merynos booroola. U owiec wykryto geny gwne, warunkujce zwikszony stopie owulacji, takie jak gen Inverdale (FecXI, zlokalizowany w chromosomie pci X) 196

u owiec rasy romney, Thoka" u owiec islandskich, gen wysokiej plennoci u owiec rasy olkuskiej w Polsce czy u syntetycznej rasy owiec Cambridge. Jednak najbardziej znany jest gen wysokiej plennoci zidentyfikowany na pocztku lat 80. ubiegego wieku u owiec rasy merynos booroola w Australii i okrelony wwczas symbolem FecB (ang. fecundity gene of booroola). W przeciwiestwie do owiec ras wysokopiennych (owca romanowska, owca fiska), u ktrych zwikszona plenno jest cech poligeniczn, uwarunkowan genami o addytywnym efekcie, wysoki stopie owulacji u maciorek rasy merynos booroola jest wynikiem wpywu genu FecB na rozwj pcherzykw Graafa i ciaek tych. Ponadto maciorki majce ten gen w swym genotypie wydzielaj mniej hormonw inhibitorw dziaajcych na hormony gonadotropowe. Poniewa obecno nawet jednej jego kopii w genotypie maciorki powoduje znaczny wzrost stopnia owulacji (w konsekwencji zwiksza jej plenno o okoo l jagni w miocie), w niektrych krajach czynione s prby wprowadzenia tego genu do ras miejscowych i wykorzystania go w programach intensyfikacji produkcji ywca jagnicego. Prowadzone przez badaczy nowozelandzkich badania segregacji cechy duej plennoci w rodzinach referencyjnych, poczone z badaniami polimorfizmu w loci markerowych (markery klasy I i II), wskazay lokalizacj tego genu w chromosomie 6 (6q23-q21). Dalsze wieloletnie badania z zastosowaniem metod genetyki molekularnej zaowocoway wykryciem w 2001 roku mutacji w genie receptora biaka oznaczonego symbolem BMP-IB, odpowiedzialnej za du plenno owiec rasy merynos booroola. W locus BMPR-IB wykryto mutacj w 830 nukleotydzie, polegajc na tranzycji adeniny na guanin, ktrej konsekwencj jest zamiana glutaminy na arginin w pozycji 249 acucha polipeptydowego. Opracowany test molekularny (PCR-RFLP) identyfikacji genotypu w locus BMPR-IB z zastosowaniem restryktazy AvaII wykorzystuje to, e mutacja powoduje powstanie sekwencji rozpoznawanej przez ten enzym. Obraz rozdziau elektroforetycznego zamplifikowanego i strawionego enzymem fragmentu genu BMPR-IB, zawierajcego miejsce mutacyjne, bdzie nastpujcy: 2 prki (110 pz i 30 pz) dla osobnikw homozygotycznych pod wzgldem allelu zmutowanego, trzy prki (110 pz, 30 pz i 140 pz) dla heterozygotycznego i jeden prek (140 pz; produkt PCR nie strawiony) dla homozygoty typu dzikiego.

Rozdzia

Podstawy genetyki populacji

Przedstawione w poprzednich rozdziaach genetyczne uwarunkowania zmiennoci cech i mechanizmy ich dziedziczenia, mimo i dotyczyy nieraz grupy zwierzt, w istocie odnoszone byy do genotypu czy zwierzcia jako jednostki. Wiele zjawisk i procesw nie dotyczy jednak pojedynczych osobnikw, lecz zbiorowoci okrelonej jako populacja. Hodowla jest dziaalnoci genetyczno-populacyjn. Populacj stanowi zwierzta nalece do jednego gatunku, mogce si rozmnaa i wystpowa na danym obszarze. Suma wszystkich genw wystpujcych w genotypach zwierzt tworzcych populacj nazywa si pul genow. Szczegowe omwienie wszystkich zagadnie z zakresu genetyki populacji zainteresowani znajd w innych podrcznikach. W rozdziale tym przedstawiono jedynie zagadnienie struktury genetycznej populacji oraz wykorzystanie frekwencji alleli w szacowaniu zmiennoci genetycznej. Podstawowym prawem genetyki populacji, opisujcym czsto wystpowania (frekwencj) poszczeglnych alleli i genotypw, jest prawo rwnowagi genetycznej sformuowane w 1908 roku przez angielskiego matematyka G.H. Hardy'ego i niemieckego lekarza W. Weinberga. Poniewa badacze ci dziaali niezalenie od siebie, prawo to nosi nazw Hardy' ego-Weinberga.

8.1. Prawo rwnowagi genetycznej


Struktura genetyczna populacji

Populacj tworzy okrelona, teoretycznie nieskoczona liczba osobnikw. Rozpatrujc dan cech mona powiedzie, e kady osobnik ma okrelony fenotyp, tak wic w populacji wystpuje okrelona liczba fenotypw,
198

z ktrych kady reprezentowany jest przez pewn liczb osobnikw. Czsto wystpowania, inaczej frekwencja danego fenotypu, oznacza stosunek tego fenotypu do cakowitej liczby fenotypw. Frekwencj wyraamy w procentach lub w postaci uamka dziesitnego. Suma frekwencji wszystkich fenotypw rwna si l lub 100%. Z kolei stosunek liczby osobnikw o danym genotypie do oglnej liczby osobnikw wystpujcych w populacji okrelamy mianem frekwencji genotypw. Natomiast frekwencja genw jest to udzia liczby loci zajtych przez dany allel wzgldem oglnej liczby loci, ktre ten allel mgby zaj w badanej populacji. Frekwencja genotypw i frekwencja genw s elementami skadowymi oglniejszego pojcia struktury genetycznej populacji. Oba te elementy s od siebie zalene. Frekwencja genw w danym pokoleniu zaley od frekwencji poszczeglnych genotypw, natomiast frekwencja genotypw w pokoleniu nastpnym zaley od frekwencji genw w gametach pokolenia poprzedniego (rodzicielskiego). Obliczenie frekwencji genw na podstawie fenotypw jest najprostsze w przypadku cech dziedziczcych si porednio (z niezupen dominacj). Fenotyp osobnika jest bowiem odzwierciedleniem jego genotypu. Sposb postpowania obrazuje poniszy przykad. W stadzie kur andaluzyjskich (barwa upierzenia dziedziczca si z niezupen dominacj) liczcym 1000 ptakw jest 250 ptakw czarnych, 250 biaych i 500 o upierzeniu niebieskim (andaluzyjskim). Frekwencja poszczeglnych fenotypw i jednoczenie genotypw jest nastpujca:

czna liczba alleli warunkujcych omawian cech wynosi 2000 (1000 ptakw, kady ma dwa allele). 250 ptakw czarnych ma w swych genotypach 500 genw A, ptaki niebieskie maj 500 genw A i 500 genw a. W genotypach 250 ptakw biaych jest 500 alleli a. Zatem w stadzie tym jest 1000 alleli A i 1000 a. Czsto wystpowania (frekwencja) allelu A = 1000/2000 = 0,5 (50%), podobnie frekwencja allelu a = 1000/2000 = 0,5 (50%). Suma frekwencji obu alleli wynosi l (100%). Jeli frekwencj allelu dominujcego oznaczymy symbolem p, a allelu recesywnego symbolem q, to:

199

Rozpatrywana cecha dziedziczy si z niezupen dominacj, zatem rozkad fenotypw i genotypw w tej populacji wynosi:

Suma frekwencji genotypw jest rozwiniciem kwadratu dwumianu (p + q)2 i wynosi l (100%). Jeli w populacji bd kojarzenia losowe oraz bdzie jednakowa frekwencja genw u obu pci, wwczas struktura genetyczna w pokoleniu potomnym bdzie nastpujca:

czyli: Zatem struktura genetyczna populacji w pokoleniu potomnym jest taka sama jak w pokoleniu rodzicielskim. Prawidowo ta zawarta jest w prawie Hardy 'ego-Weinberga, ktre mwi o tym, e: w duej, losowo kojarzcej si populacji, w ktrej frekwencje genw u obu pci s jednakowe, a osobniki charakteryzuj si rwn podnoci i ywotnoci, frekwencje genw i genotypw nie zmieniaj si z pokolenia na pokolenie, jeli nie dziaaj czynniki naruszajce rwnowag. Prawo to rzadko jest spenione w odniesieniu do wszystkich loci, bowiem nawet w naturalnych populacjach nastpuje dobr naturalny i selekcja naturalna, a' zdarzaj si rwnie migracje i mutacje, ktre wpywaj na zmian struktury genetycznej populacji. O czynnikach naruszajcych rwnowag genetyczn bdzie mowa nieco dalej. 200

8.2. Frekwencja genw i genotypw w przypadku dominowania


W przypadku cechy dziedziczcej si z dominacj zupen fenotyp dominujcy wystpuje u osobnikw bdcych homozygot dominujc lub heterozygot pod wzgldem danego locus. Zatem obliczanie frekwencji zarwno tych genotypw, jak i genw stwarza pewne trudnoci. W populacji rozmnaanej losowo rdem informacji do oblicze frekwencji genw jest czsto genotypw homozygotycznych recesywnych, gdy w ich przypadku wiadomo na pewno, e zawieraj jedynie allele recesywne. Wiedzc, e frekwencja homozygot recesywnych wynosi q2, atwo jest wyliczy frekwencj allelu recesywnego Z kolei frekwencja allelu dominujcego wynosi p = l q. Tok postpowania obrazuje poniszy przykad: W pewnym stadzie byda na 1000 krw 910 jest czarno umaszczonych, a 90 czerwonych. W stadzie tym prowadzone s kojarzenia losowe. Frekwencja genotypw recesywnych (osobniki czerwone ee) wynosi 0,09. Pozostae 910 krw ma genotypy homo- (EdEd) lub heterozygotyczne (Ede). Znajc frekwencj genotypu recesywnego (ee) mona obliczy frekwencj allelu czerwonego umaszczenia e q, ktra wynosi Std frekwencja genu d czarnego umaszczenia (E = p) wynosi l 0,3 = 0,7. Wiedzc, e w przypadku losowych kojarze rozkad genotypw jest nastpujcy:

atwo jest obliczy frekwencj pozostaych genotypw:

W stadzie tym na 910 krw czarno umaszczonych naley oczekiwa 490 osobnikw o genotypach homozygotycznych dominujcych i 420 heterozygot. Podany sposb obliczania czstoci genw i genotypw stosuje si do populacji bdcych w stanie rwnowagi genetyczej.

8.3. Frekwencja genw i genotypw w przypadku cech uwarunkowanych szeregiem (seri) alleli wielokrotnych
W przypadku cech warunkowanych szeregiem alleli wielokrotnych rozkad genotypw w populacji bdzie nastpujcy:

201

przy czym p,q, r lub inne litery symbolizuj czsto wystpowania genw w szeregu alleli wielokrotnych. Suma frekwencji wszystkich alleli tworzcych szereg wynosi l (100%). Sposb obliczania frekwencji poszczeglnych genw i genotypw zostanie przedstawiony na przykadzie cechy warunkowanej szeregiem zoonym z trzech alleli. U krlikw podstawowe typy umaszczenia warunkowane s szeregiem alleli wielokrotnych Umaszczenie dzikie warunkuje gen C, himalajskie i albinotyczne gen c w ukadzie homozygotycznym (cc). W rozmnaajcej si losowo populacji zoonej ze 150 krlikw stwierdzono 135 osobnikw dziko umaszczonych (pena barwa), 13 himalajskich i 2 albinosy. Frekwencja poszczeglnych fenotypw wynosi zatem:

Frekwencj genw oznaczono symbolem p dla genu C, q dla genu dla genu c. W populacji tej, w ktrej s kojarzenia losowe, fenotypy, genotypy i ich frekwencja s nastpujce (tab. 8-1):

202

Po dodaniu takich samych genotypw uzyska si rozkad:

Z zestawienia tego wynika, e suma czstoci fenotypw umaszczenia himalajskiego i albinotycznego wynosi:

Zatem suma czstoci genw d1 i c wynosi q + r i rwna si pierwiastkowi kwadratowemu z sumy czstoci wystpowania fenotypw umaszczenia himalajskiego i albinotycznego. Podstawiajc dane liczbowe, (q + r) rwna si:

Frekwencj genu c = r mona obliczy, znajc frekwencj fenotypu (jednoczenie genotypu) krlikw albinotycznych (cc). W danym przykadzie r2 = 0,013, std r = = 0,114. Frekwencj genu mona obliczy nastpujco:

W badanej populacji krlikw frekwencja genw umaszczenia jest wic nastpujca:

203

ogem = 1,000

8.4. Frekwencja genw i genotypw w przypadku cech sprzonych z pci


W odrnieniu od cech warunkowanych genami znajdujcymi si w chromosomach autosomalnych, ktrych liczba w genotypach jest jednakowa bez wzgldu na pe osobnika, geny warunkujce cechy sprzone z pci mog wystpowa take w formie hemizygotycznej. Osobniki pci heterogametycznej mog mie jedynie dwa rodzaje genotypw pod wzgldem cechy sprzonej z pci (cecha wystpuje lub nie na skutek braku genu, ktry j warunkuje). U osobnikw homogametycznych dodatkowo moe wystpi nosicielstwo genu recesywnego (osobniki heterozygotyczne). Rozkad genotypw u osobnikw pci heterogametycznej nie bdzie zatem rozkadem dwumianowym, lecz przyjmie posta:

przy czym A jest genem dominujcym, natomiast a jego recesywnym allelem. Natomiast u osobnikw homogametycznych frekwencja poszczeglnych genotypw bdzie taka jak w przypadku cech autosomalnych, czyli zgodna z rozkadem dwumianowym. U ludzi jedn z najczciej wystpujcych cech sprzonych z pci jest daltonizm. Frekwencja genu d warunkujcego daltonizm w populacji ludzkiej wynosi rednio q = 0,08. Na tej podstawie mona oszacowa czsto wystpowania daltonizmu zarwno u kobiet, jak i u mczyzn. U kobiet (pe homogametyczna) frekwencja poszczeglnych genotypw pod wzgldem tej cechy wynosi:

U mczyzn (pe heterogametyczna) frekwencja genotypw jest rwna frekwencji genw rozrniania barw lub daltonizmu:
204

D- = p = 0,92 d- = q = 0,08

Zatem wrd 10000 kobiet daltonizm (dd) wystpi u 64, 1472 kobiety bd rozrniay barwy, ale bd nosicielkami genu daltonizmu (Dd), pozostae za 8464 nie maj w swych genotypach genu daltonizmu (DD). W grupie mczyzn o tej samej liczebnoci a 800 mczyzn bdzie daltonistami (d ), pozostali natomiast (9200) bd normalnie rozrnia barwy (D ).

8.5. Czynniki naruszajce rwnowag genetyczn


Do czynnikw naruszajcych rwnowag genetyczn populacji nale: mutacje, migracje, selekcja, dobr par do kojarze i dryf genetyczny. O ile mutacje i dryf genetyczny nie zale od hodowcy, o tyle pozostae czynniki s zwizane z jego wiadom dziaalnoci. Wszystkie te czynniki, z wyjtkiem doboru, wpywaj na zmian frekwencji genw i genotypw. Dobr zmienia jedynie frekwencj genotypw (bdzie o tym mowa dalej).
Mutacje

Mutacje genowe zmieniajc frekwencj genw naruszaj rwnowag genetyczn populacji. W nastpstwie tych mutacji nie tylko ulega zmianie frekwencja alleli istniejcych w danym locus, ale take mog si pojawi nowe allele. Konsekwencj zmiany frekwencji genw jest zmiana frekwencji genotypw. Ekspresja fenotypowa mutacji, ktra moe wpyn na zmian struktury genetycznej populacji, zaley od genetycznego uwarunkowania danej cechy. Jeli zmutuje jeden z genw addytywnych, kontrolujcych cech ilociow, mutacja ta moe by fenotypowo niezauwaalna i nie ma wwczas szans na utrwalenie jej w drodze selekcji. Natomiast mutacja genu warunkujcego cech jakociow, np. umaszczenie zwierzt futerkowych, powodujca pojawienie si nowej barwy okrywy wosowej, moe przyczyni si do wytworzenia odmiany z frekwencj genw umaszczenia inn ni w populacji, w ktrej mutacja wystpia. W rozdziale dotyczcym mutacji podano, i czsto mutacji allelu dominujcego w recesywny oznaczamy symbolem u, natomiast czsto mutacji odwrotnej symbolem v. Jeli zmutuje allel dominujcy, jego frekwencja zmaleje o warto rwn up. Analogicznie, mutacja allelu recesywnego spowoduje zmniejszenie jego frekwencji o vq. czna zmiana frekwencji allelu recesywnego w przypadku dwukierunkowej mutacji wyniesie:

205

Frekwencja allelu dominujcego zmieni si o warto: Na przykad: w pewnym stadzie liczcym 100 krw frekwencja allelu czarnego umaszczenia (locus E) wynosia Ed = p = 0,7, allelu czerwonego umaszczenia e = q = 0,3. Pula alleli w tym locus skadaa si z 140 alleli czarnego i 60 alleli czerwonego umaszczenia. W wyniku mutacji genowej, i wyniosa 0,66, natomiast czsto allelu e zmienia si o: ktrej czsto bya taka sama dla allelu dominujcego i recesywnego i wynosia 0,1,14 alleli Ed zmutowao w kierunku allelu e, a 6 alleli e w kierunku allelu Ed. W konsekwencji frekwencja allelu Ed zmienia si o warto: czyli wzrosa do 0,34. Zmianie ulega take frekwencja genotypw. Zgodnie z prawem Hardy'ego-Weinberga frekwencja genotypw w tym stadzie bya nastpujca: przed mutacj: EdEd = p2 = 0,49; Ede = 2pq = 0,42; ee = q2 = 0,09, po mutacji: EdEd = p2 = 0,4356; Ede = 2pq = 0,4488; ee = q = 0,1156.
Migracje

Migracje zwierzt polegaj na wprowadzaniu nowych osobnikw do stada lub ich usuwaniu. Wpyw tego czynnika na struktur genetyczn populacji zostanie omwiony na przykadzie imigracji (wprowadzania) osobnikw do populacji. Przy krzyowaniu rnych ras w zalenoci od tego, ile razy dokonywane jest to krzyowanie, wielko zmian frekwencji genw i genotypw jest rna. Jeli jest to zabieg jednorazowy, po pewnym czasie populacja wrci do rwnowagi, czyli ustali si nowy ukad genetyczny. Natomiast krzyowanie uszlachetniajce, ktre polega na kilkakrotnym przekrzyowaniu pogowia prymitywnego z ras szlachetn, powoduje zdecydowan zmian frekwencji genw istniejcych w populacji wyjciowej. Moe nawet, w przypadku wielokrotnego krzyowania, doprowadzi do cakowitego wyparcia genw rasy prymitywnej przez geny rasy szlachetnej (jest to tzw. krzyowanie wypierajce). W hodowli niektrych gatunkw zwierzt stosowana jest sztuczna inseminacja, zatem migracja nie zawsze wie si z wprowadzaniem osobnikw, moe ona dotyczy wprowadzania nasienia. Sztuczna inseminacja moe powodowa bardzo szybkie rozpowszechnianie genw. Rozpatrzmy przykad wprowadzenia do populacji (stada) jakiej grupy zwierzt. Jeli stosunek nowo wprowadzonych genotypw do cakowitej liczby genotypw w populacji po imigracji (jest to intensywno imigracji)

206

oznaczymy liter m, to cz osobnikw rodzimych bdzie rwna (1 m). Z kolei frekwencj genu w stadzie wyjciowym oznaczamy liter p, a frekwencj genu u osobnikw wprowadzonych do stada liter p', zatem nowa frekwencja genu bdzie rwna: a zmiana frekwencji tego genu bdzie wynosia: Zamy, e do omawianego wczeniej stada liczcego 100 krw, w ktrym frekwencja allelu Ed wynosia 0,7, wprowadzono 20 krw, z frekwencj allelu Ed wynoszc 0,9. Frekwencja genotypw w stadzie wynosia: EdEd = p2 = 0,49; Ede = 2pq = 0,42; ee = q= 0,09 natomiast w grupie zwierzt imigrantw: E d E d = p 2 = 0,81; E d e = 2pq = 0,18; ee = q = 0,01. Nowa frekwencja allelu Ed wynosi teraz: P1 = 0,2 0,9 + (l -0,2) 0,7 = 0,74 czyli wzrosa o 0,4. Nowa frekwencja allelu e wynosi (1 0,74) = 0,26. Mona to sprawdzi za pomoc wzoru: Frekwencja poszczeglnych genotypw w stadzie po imigracji przedstawia si nastpujco: EdEd = p2 = 0,5476; E'e = 2pq = 0,3848; ee = q2 = 0,0676 Po imigracji w stadzie wzrosa liczba zwierzt z genotypem homozygotycznym EdEd, zmalaa osobnikw heterozygotycznyh Ede i homozygotycznych ee. Wielko zmiany frekwencji genotypw w przypadku imigracji zaley od intensywnoci imigracji (m) oraz rnicy we frekwencji genw midzy zwierztami w danej populacji i osobnikami wprowadzonymi do niej.
Selekcja

Wybr zwierzt, ktre hodowca zamierza pozostawi do hodowli, nazywany jest selekcj. Hodowca preferuje geny korzystne, a eliminuje z populacji zwierzt geny niepodane. Selekcjonujc zwierzta najlepsze hodowca pozostawia w populacji okrelone genotypy. Rwnoczenie z selekcj prowadzone jest brakowanie (usuwanie) zwierzt w zwizku z ich nieprzydatnoci wynikajc z wieku, stanu zdrowotnego, obnienia podnoci i produkcyjnoci lub niepodanego genotypu. Zmiany w strukturze genetycznej populacji zale od tego, jakie geny czy genotypy s preferowane. Zmiany te s trwae i pozostaj nawet po zaprzestaniu prowadzenia selekcji.
207

Si oddziaywania selekcji okrela si mianem wspczynnika selekcji i oznacza symbolem s. Wspczynnik ten moe przybiera warto od O do l, co oznacza, e warto O jest wwczas, gdy nie ma w ogle selekcji, warto l wspczynnik osiga, gdy usuwane s wszystkie niepodane genotypy. Zmiana frekwencji genu, bdca konsekwencj selekcji, zaley od rodzaju tej selekcji. Jeli selekcja w zakresie cechy dziedziczcej si z dominacj zupen prowadzona jest przeciwko genotypom recesywnym, zmian czstoci genu recesywnego, bdc jej konsekwencj, mona obliczy ze

Jeli natomiast selekcja preferuje genotyp recesywny, wwczas frekwencja genu tworzcego ten genotyp wyniesie:

wzoru:

Od pewnego czasu w hodowli byda cecha rogatoci jest uwaana za niekorzystn. Cecha ta dziedziczy si z dominacj zupen, czyli osobniki bezrogie maj genotyp homozygoty dominujcej lub heterozygotyczny pod wzgldem locus P (polled). W pewnym stadzie, w ktrym frekwencja allelu bezronoci wynosi 0,8, prowadzona jest selekcja przeciwko genotypowi recesywnemu pp. Jeli wspczynnik selekcji bdzie wynosi 0,4, to oznacza, e w kadym pokoleniu bdzie usuwanych 40% osobnikw z genotypem homozygoty recesywnej. Wwczas korzystajc ze wzoru moemy obliczy wielko zmiany czstoci genu recesywnego:

Frekwencja allelu recesywnego w stadzie w wyniku selekcji przeciwko genotypowi recesywnemu zmniejszy si o 0,013 i wyniesie 0,187. Jeli selekcj przeprowadzimy tylko w jednym pokoleniu i nie bd dziaay inne czynniki naruszajce rwnowag genetyczn populacji, wwczas w pokoleniu potomnym ustali si nowa frekwencja genw oraz genotypw i populacja wrci do rwnowagi. Efekt selekcji zostanie zachowany.
Dobr par do kojarze

W hodowli zwierzt nie zawsze stosowane s kojarzenia losowe. Jeli celowo dobierane s zwierzta w pary rodzicielskie, prowadzi to do naruszenia rwnowagi genetycznej populacji poprzez zmian frekwencji genotypw. Zamy, e w omawianym ju wczeniej stadzie kur andaluzyjskich, zoonym z 1000 ptakw, zastosowano kojarzenia w obrbie takich samych
208

genotypw. Oznacza to, i kojarzono koguty czarne z kurami czarnymi, koguty niebieskie (forma porednia cechy) z kurami niebieskimi i koguty biae z kurami biaymi. W stadzie tym frekwencja genw jest jednakowa u osobnikw obu pci i wynosi p = 0,5 (allel A) i q = 0,5 (allel a). W pokoleniu rodzicielskim frekwencja genotypw bya nastpujca: 0,25 AA + 0,5 Aa + 0,25 aa = l Po zastosowaniu kojarze podobnego z podobnym" frekwencja ulega zmianie

Frekwencja genw pozostaa nie zmieniona, pod warunkiem e hodowca nie prowadzi selekcji i nie wprowadzono do stada nowych zwierzt. Aby si o tym przekona, mona przeprowadzi obliczenia:

Jeeli hodowca znw zastosuje kojarzenia losowe w stadzie i nadal nie bdzie prowadzi selekcji, stado powrci do stanu rwnowagi genetycznej. Przy kojarzeniach osobnikw o genotypach identycznych wzrasta frekwencja genotypw homozygotycznych, maleje natomiast czsto genotypw heterozygotycznych. Odwrotna sytuacja zaistniaaby, gdyby kojarzono midzy sob osobniki bdce przeciwstawnymi homozygotami. Wwczas zwikszyaby si czsto genotypw heterozygotycznych kosztem homozygotycznych. Niekiedy, na przykad w celu wzmocnienia (utrwalenia danej cechy) w populacji, stosowane s kojarzenia osobnikw spokrewnionych, np. ojca z crk czy matki z synem. Kojarzenia takie powoduj wzrost czstoci wystpowania homozygot w pokoleniu potomnym. W hodowli zwierzt laboratoryjnych kojarzenia w bliskim pokrewiestwie (najczciej
209

brat x siostra) prowadz do wytworzenia tzw. szczepw wsobnych, w ktrych stopie homozygotycznoci jest bliski 100%. Szczepy wsobne s wykorzystywane w badaniach biomedycznych.
Dryf genetyczny

Dryf genetyczny, zjawisko tak nazwane przez Wrighta w 1931 roku, polega na zmianie frekwencji genw i genotypw w maych populacjach, ktra jest wynikiem odchyle w losowej segregacji genw do gamet i losowego czenia si gamet. Dryf genetyczny jest zjawiskiem cakowicie niezalenym od woli hodowcy. Rozkad genotypw w pokoleniu potomnym zaley od frekwencji genw u rodzicw. Prawidowo tego rozkadu wynika z prawdopodobiestwa losowego poczenia gamet w nastpstwie kojarze losowych. Wszelkie odstpstwa od oczekiwanego rozkadu s konsekwencj dryfu genetycznego, zwaszcza w maych populacjach, w ktrych dziaa on najsilniej. Dryf przyczynia si do zwikszania si rnic midzy maymi populacjami w zakresie struktury genetycznej, jednoczenie zmniejsza si zmienno genetyczna w obrbie poszczeglnych populacji. Niekorzystnym nastpstwem dryfu jest take wzrost frekwencji genotypw homozygotycznych kosztem heterozygotycznych. Biorc pod uwag, i allele niekorzystne z reguy s recesywne, szczeglnie niebezpieczny moe by wzrost homozygot recesywnych, ktrego skutkiem bdzie zmniejszenie podnoci, ywotnoci czy ujawnienie si wad dziedzicznych. Dla zobrazowania tego zjawiska grup 20 owiec heterozygotycznych pod wzgldem locus A skrzyowano z trykiem rwnie heterozygotycznym w tym locus. Przy losowej segregacji genw do gamet i losowym czeniu gamet w zygoty naley oczekiwa, i w potomstwie uzyskamy 5 osobnikw homozygot dominujcych, 10 heterozygot i 5 homozygot recesywnych pod wzgldem rozpatrywanego locus. Moe jednak si zdarzy tak, e jedynie plemniki zawierajce allel dominujcy wnikn do komrek jajowych. Wtedy w potomstwie bdzie 10 osobnikw (50%) homozygot dominujcych i 10 heterozygot. Jeli byo to jednorazowe zaburzenie, to w nastpnym pokoleniu ustali si nowa rwnowaga genetyczna, w ktrej frekwencja genu dominujcego wyranie wzronie. Jeeli zaburzenie kojarze losowych bdzie si powtarza, to struktura genetyczna populacji bdzie si zmienia (dryfowa) w rnych kierunkach.

8.6. Wykorzystanie frekwencji alleli do szacowania zmiennoci genetycznej wewntrz i midzy populacjami
Zmienno genetyczna ma ogromne znaczenie dla wszystkich gatunkw zwierzt. Im wiksza jest pula genw w jakiej populacji, tym silniejsze s zdolnoci adaptacyjne tej populacji do zmiennych warunkw rodowisko210

wych. Na skutek dugotrwaej selekcji, zwaszcza w maych populacjach, moe doj do znacznego ograniczenia puli genw, czego wynikiem bdzie utrata zdolnoci adaptacyjnych. By temu niekorzystnemu zjawisku zapobiec, zalecane jest monitorowanie zmian w strukturze genetycznej populacji, ktre zachodz w wyniku pracy hodowlanej. W tym celu szacuje si zmienno genetyczn w populacji na podstawie frekwencji alleli w loci markerowych, na przykad warunkujcych antygeny erytrocytarne, rne typy biaek surowicy krwi czy enzymy erytrocytarne. Mog to by loci kontrolujce syntez transferyny, albuminy, esterazy, amylazy, ceruloplazminy czy anhydrazy wglanowej, nalece do markerw genetycznych klasy I, opisanych w rozdziale: Markery genetyczne. Od pewnego czasu do tego celu wykorzystywane s niekodujce sekwencje DNA (polimorfizm mini- i mikrosatelitarny, czyli markery genetyczne klasy II). Parametrem charakteryzujcym zmienno genetyczn w populacji jest wspczynnik heterozygotycznoci. Warto tego parametru zawiera si w granicach od O do l, mona take przedstawia j w procentach. rednia heterozygotyczno (H) w danej populacji obliczana jest ze wzoru:

211

Parametrem charakteryzujcym stopie zmiennoci (polimorficznoci) danego locus jest wskanik okrelany symbolem PI (ang. polymorphic Information content). Jednak najczciej parametr ten suy do okrelenia przydatnoci danego markera genetycznego do analizy sprze z innymi loci. O markerach genetycznych jest mowa w innym rozdziale. By obliczy warto PI, naley zna frekwencj wszystkich alleli w danym locus:

Dystans genetyczny

Zrnicowanie genetyczne midzy populacjami mona okreli porwnujc czsto wystpowania okrelonych genw w tych populacjach i szacujc tzw. dystans genetyczny na podstawie polimorfizmu grup krwi i biaek lub sekwencji mikrosatelitarnych. Sekwencje mikrosatelitarne charakteryzuj si wyjtkowo wysokim stopniem polimorfizmu i dziki temu s bardziej przydatne ni markery klasy I do szacowania dystansu genetycznego midzy gatunkami blisko ze sob spokrewnionymi, a take midzy populacjami w obrbie gatunku. Szacowanie dystansu genetycznego i wybr ras, ktre cechuje dua zmienno genetyczna, suy zachowaniu biologicznej rnorodnoci zwierzt gospodarskich. Do szacowania dystansu genetycznego (Dr), tak na podstawie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych, jak i polimorfizmu biaek i antygenw erytrocytarnych, najczciej stosowany jest wzr:

Dystans genetyczny moe by przedstawiany graficznie w postaci dendrogramw, obliczonych rnymi metodami, na przykad: najbliszego ssiedztwa SLM (ang. single linkage method), najdalszego ssiedztwa CLM (ang. complete linkage method) lub skupienia parami UPGM (ang. unweighted pair group method).
212

Sposb szacowania dystansu genetycznego obrazuje poniszy przykad (wg: Niemczewski i wsp., Prace i Materiay Zootechniczne, 50:111-120, 1997).

Na podstawie frekwencji alleli w 14 loci obliczono dystans genetyczny midzy liniami mskimi koni czystej krwi arabskiej ze stadnin pastwowych. Czsto wystpowania poszczeglnych alleli zawarto w tabelach 8-II i 8-III. Analiz objto 141 koni z linii El Paso, 219 z linii Palasa, 146 z linii Celebesa, 150 z linii Banata, 369 z linii Probata, 146 z linii Partnera i 202 z linii Bandosa. Do sporzdzenia dendrogramu dystansu genetycznego wykorzystano obliczenia wykonane metod najbliszego ssiedztwa SLM. Najwikszy dystans genetyczny stwierdzono midzy liniami El Paso i Celebesa, najmniejszy midzy lini Celebesa a Probata, Palasa a Partnera, a take midzy lini Banata a Celebesa i Probata. Na przykad, warto dystansu genetycznego midzy liniami Celebesa a Banata wyniosa 0,32, Partnera a Banata 0,39 oraz Palasa a Partnera 0,37 (ry. 8-1).
213

Do szacowania zmiennoci genetycznej i dystansu genetycznego wykorzystuje si rwnie markery genetyczne klasy II (sekwencje mikroi minisatelitarne), a take metod RAPD, opisan w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu. W przypadku polimorfizmu mikrosatelitarnego postpowanie jest podobne do opisanego wyej. W wyniku analizy polimorfizmu minisatelitarnego (tzw. odcisk palca DNA, opisany w rozdziale: Markery genetyczne) i RAPD uzyskujemy obraz prkw DNA w danej prbie DNA (moe to by DNA jednego osobnika bd zbiorczy DNA dla grupy osobnikw losowo wybranych z populacji). Porwnujc wzory prkowe dwch prb DNA mona obliczy indeks podobiestwa BS - ang. band sharing), okrelajcy prawdopodobiestwo, e prek wystpujcy w jednej prbie bdzie wykryty take w drugiej prbie DNA, wykorzystujc wzr:

gdzie: Nab liczba identycznych prkw w obu prbach DNA (a i b) NaiNh cakowita liczba prkw odpowiednio w prbie a i prbie b Warto tego prawdopodobiestwa zawiera si w granicach 0-1. Im mniejsza zmienno genetyczna w danej populacji, tym wiksza warto tego wspczynnika.

Rozdzia

Determinacja i rnicowanie pci oraz interseksualizm

Ewolucja krgowcw doprowadzia do powstania rnych mechanizmw determinujcych pe organizmw. Pe moe zalee od warunkw rodowiska zewntrznego, gwnie temperatury, w jakich rozwijaj si zarodki. Przy takim mechanizmie determinacji zostaje ona ustalona raz w momencie rnicowania si gonad i nie zmienia si przez cae ycie. Ten typ determinacji pci obserwuje si u wielu gatunkw gadw, w tym u wszystkich krokodyli, wielu gatunkw wi i niektrych gatunkw jaszczurek. Z kolei u niektrych gatunkw ryb zachodzi tzw. behawioralna determinacji pci. Zwierzta takie s zazwyczaj obojnakami, tzn. maj gonady mskie i eskie. Zalenie od rodowiska spoecznego osobnik przyjmuje rol msk lub esk. Wrd ryb spotyka si rwnie gatunki, ktre s hermafrodytami sekwencyjnymi, czyli zmieniaj one pe w cigu ycia. U ptakw i ssakw pe osobnika zaley od ukadu chromosomw pci, a konkretnie od genotypu w loci odpowiedzialnych za ksztatowanie cech pciowych. W przypadku ssakw wyrnia si chromosomy X oraz Y, a w przypadku ptakw Z oraz W. U ssakw pci heterogametyczn s samce (ukad XY), a pci homogametyczn s samice (ukad XX). U ptakw sytuacja jest odwrotna samce s homogametyczne (ukad ZZ), a samice heterogametyczne (ukad Z W).

9.1. Determinacja pci ssakw


Uksztatowanie si cech pciowych ssakw obejmuje trzy zasadnicze etapy: 1) powstanie w wyniku zapodnienia ukadu chromosomw pci XX lub XY w zygocie ksztatuje si wwczas tzw. pe chromosomowa, 2) rozwj niezrnicowanych gonad zarodka w kierunku jdra lub jajnika wyksztacenie tzw. pci gonadowej i 3) uformowanie si wewntrznych
216

i zewntrznych cech pciowych powstanie tzw. pici fenotypowej (ry. 9-1). Ple fenotypowa obejmuje rwnie zmiany powstajce w mzgu, ktre s odpowiedzialne za uksztatowanie si zachowania samczego bd samiczego. W rozwijajcym si zarodku zawizki gonad powstaj z komrek rdnerczowych i w ich kierunku wdruj pierwotne komrki pciowe. Pojawiaj si one w endodermie pcherzyka tkowego, a nastpnie ruchem amebowatym migruj midzy komrkami do grzebienia pciowego przylegajcego do pranerczy. Nastpnie grzebie pciowy oddziela si od pranercza i przeksztaca si w niezrnicowan gonad. Pierwotne komrki pciowe po zasiedleniu gonad podlegaj intensywnym podziaom mitotycznym.
217

Dotychczasowe badania wykazay, e rnicowanie si gonad w okresie rozwoju podowego jest kontrolowane przez co najmniej 15 genw, a w tym: WT1, SF1, SOX9, SRY, Fgf9, ZFX i FOXL2. Gen WT2 (ang. Wilms' tumor l gene) zosta pierwotnie zidentyfikowany jako onkogen odpowiedzialny za rozwj raka nerki nowotwr Wilmsa u dzieci. Ekspresj tego genu stwierdzono rwnie w grzebieniu pciowym rozwijajcego si zarodka. Produktem tego genu jest biako zawierajce tzw. palce cynkowe, ktre peni rol czynnika transkrypcyjnego, czyli kontrolujce uruchomienie i przebieg transkrypcji innych genw. Gen SF1 (ang. steroidogenic factor 1) koduje biako receptora jdrowego, regulujcego ekspresj hydroksylaz steroidowych. Gen ten podlega ekspresji, oprcz kory nadnerczy, take w niezrnicowanej gonadzie. W uksztatowanej gonadzie mskiej ekspresja genu SF1 nadal zachodzi, w przeciwiestwie do jajnika, gdzie obserwuje si zanik jego ekspresji. W jdrze podowym produkt genu SF1 pojawia si w komrkach Sertolego i wpywa on na regulacj ekspresji genu hormonu antymullerowskiego. Trzecim genem oddziaujcym na wzrost niezrnicowanej gonady jest gen SOX9, ktrego produkt naley, podobnie jak biako SRY, do grupy biaek okrelanych skrtem HMG (ang. high mobility group). Wiadomo o nich, e peni funkcj czynnikw transkrypcyjnych. W rosncej gonadzie wyrnia si cz korow i rdzeniow. Cz rdzeniowa szczeglnie intensywnie rozwija si w gonadzie rnicujcej si w kierunku jdra, a cz korowa w jajniku. W rozwijajcym si jdrze istotn rol dla procesu rnicowania pci mskiej odgrywaj komrki podporowe (Sertolego) i rdmiszowe (Leydiga). Od koca lat 50. wiadomo byo, e zasadnicz rol w procesie determinacji pci mskiej u ssakw odgrywa chromosom Y. Badania cytogenetyczne prowadzone u ludzi dowiody, e w istocie tylko niewielki fragment krtkiego ramienia chromosomu Y ma podstawowe znaczenie. Przyjto, e jest tam zlokalizowany gen TDF (ang. testis determining factor) czynnik determinujcy jdro. Produkt tego genu mia odpowiada za tzw. przeczenie rozwojowe, polegajce na wprowadzeniu niezrnicowanej gonady podowej na tory rozwoju zmierzajce do powstania gonady mskiej. Badania molekularne pokazay, e funkcja tego genu jest tosama z funkcj genu SRY (ang. sex determining region Y), ktrego locus wystpuje w chromosomie Y. Gen SRY zbudowany jest z pojedynczego eksonu i koduje informacj o peptydzie skadajcym si z ponad 200 aminokwasw. Biako kodowane przez ten gen skada si z trzech regionw (ry. 9-2).

218

Region rodkowy, skadajcy si z 79 aminokwasw, ma struktur podobn do biaek z grupy HMG, ktre maj zdolno wizania si z DNA i dlatego uwaane s za czynniki transkrypcyjne, czyli biaka wpywajce na uruchomienie i przebieg procesu transkrypcji. Bardzo ciekawe jest rwnie to, e w czci poprzedzajcej gen SRY znajduje si sekwencja CpG (tzw. wysepka CpG), w ktrej obrbie wystpuje sekwencja nukleotydw przyczajca czynnik transkrypcyjny WT1, omwiony wczeniej. Biako SRY, tak jak biaka WT1 i SOX9, peni funkcj czynnika transkrypcyjnego, odpowiedzialnego za kontrol ekspresji genw zwizanych z rnicowaniem si pierwotnej gonady w kierunku jdra. Jego ekspresja zachodzi w grzebieniu pciowym (listwie pciowej), w momencie kiedy rozpoczyna si proces formowania gonady mskiej. Bardziej szczegowe dane wskazuj, e ekspresja genu SRY wystpuje w rnicujcych si komrkach Sertolego. Na podstawie przedstawionych informacji o sekwencji nukleotydw poprzedzajcych gen SRY mona przypuszcza, e jego ekspresja jest kontrolowana przez produkt genu WTL Z kolei produkt genu SRY zawiaduje ekspresj genu SOX9, a pod kontrol genu SOX9 znajduj si geny AMH i Fgf9 (czynnik wzrostu fibroblastw 9). Kaskadowe wczanie tych genw, po pojawieniu si produktu genu SRY, odpowiada za prawidowe rnicowanie si gonady mskiej. Rozwojowi gonad towarzyszy powstanie zawizkw przewodw wyprowadzajcych komrki pciowe. Z przewodw Wolffa rozwin si mog nasieniowody, a z przewodw Miillera jajowody i macica. Zalenie od przyjtego kierunku rozwoju jeden z tych przewodw zanika, a drugi rozwija si. W przypadku rozwoju pci mskiej zanikowi podlegaj przewody Miillera. Proces ten jest zaleny przede wszystkim od ekspresji genu MIS (ang. Miillerian inhibitor substance), okrelanego take jako hormon antymiillerowski (ang. anti-Mullerian hormone AMH). Ekspresja tego genu zachodzi w komrkach Sertolego. Biako AMH wpywa na zatrzymanie rozwoju i zanik przewodw Miillera. Rwnolegle w komrkach Leydiga nastpuje ekspresja genu kodujcego testosteron, ktry podtrzymuje rozwj przewodw Wolffa. Z testosteronu powstaje dihydrotestosteron, ktry peni zasadnicz rol w rnicowaniu si zewntrznych narzdw pciowych. Gdy gen SRY jest nieobecny, niezrnicowana gonada podowa rozwija si spontanicznie w jajnik. Wiedza na temat kontroli genetycznej rnicowania si jajnika jest duo mniejsza, anieli w odniesieniu do jdra. Pocztkowo przypuszczano, e proces ten jest w znacznej mierze kontrolowany przez ekspresj genu DAX1. Wiadomo, e jego locus wystpuje w chromosomie X, a jego produktem jest jdrowy receptor dla hormonw. Ekspresja tego genu jest stwierdzana ju w niezrnicowanej gonadzie. Obecnie wiksz rol przypisuje si genowi ZFX (tzw. gen palca cynkowego), rwnie pooonemu w chromosomie X, oraz autosomalnemu genowi FOXL2 (receptor hormonu stymulujcego rozwj pcherzykw jajnikowych). W rozwijajcym si jajniku nie zachodzi ekspresja genu MIS oraz genu
219

kodujcego testosteron. W efekcie nastpuje spontaniczny rozwj przewodw Miillera w jajowody, macic i grn cz pochwy. Procesowi temu towarzyszy rwnoczesny zanik przewodw Wolffa. Interesujce s wnioski pynce z obserwacji osobnikw z ukadem chromosomw XY, w ktrych genotypie wystpuje duplikacja locus DSS (DAX1). U takich osobnikw nastpuje rozwj interseksualny wynikajcy z niepenego zrnicowania gonady w kierunku jdra. Jeli w genotypie wystpi delecja tego locus, to rozwj w kierunku mskim nie jest zakcony. Mutacje tego typu (duplikacja lub delecja) nie maj wpywu na rozwj cech pciowych samic. Zakada si, e produkt locus DSS (DAX1) konkuruje z produktem genu SRY w wizaniu si z promotorami innych genw odpowiedzialnych za ksztatowanie si gonady mskiej. Jeli w genotypie osobnika mskiego wystpuj dwie kopie locus DSS (DAX1), to wwczas dochodzi do zakcenia procesu kontroli ekspresji genw przez biako SRY. Poznanie molekularnych podstaw determinacji pci ma w hodowli due znaczenie praktyczne. Wczesna ocena pci zarodkw pozwala na uzyskiwanie potomstwa o podanej pci, jeli stosuje si nowoczesne biotechniki rozrodu powizane z przenoszeniem zarodkw do tzw. samic biorczy. Zarodki mog by pozyskiwane od superowulowanych samic dawczy lub powstawa podczas zapodnienia pozaustrojowego (in vitro), czy te klonowania. Bardzo przydatn metod okrelania pci zarodkw jest wykrywanie sekwencji genu SRY w DNA wyizolowanym z komrek zarodka mskiego. Zastosowanie znajduje te metoda polegajca na analizowaniu sekwencji molekularnych genu amelogeniny (AMEL). Gen ten umiejscowiony jest w obu chromosomach pci, z tym jednak e gen pooony w chromosomie Y obarczony jest delecja (jest krtszy o 63 pary nukleotydw) wzgldem genu pooonego w chromosomie X. Wykrywanie obecnoci genu SRY oraz alleli genu amelogeniny prowadzone jest na podstawie amplifikacji technik PCR (patrz rozdzia: Metody analizy i modyfikacji genomu) wybranego fragmentu DNA oraz elektroforezy uzyskanych produktw. Naley rwnie zwrci uwag, e w chromosomie Y poza genem SRY, ktry peni zasadnicz rol w procesie rnicowania si gonady mskiej, wystpuj take inne geny. Szczeglnie istotn czci chromosomu Y jest region AZF. Jego nazwa pochodzi od sw angielskich azoospermia factor, oznaczajcych czynnik odpowiedzialny za powstanie azoospermii, czyli brak plemnikw w ejakulacie. W regionie tym wystpuj geny, ktrych ekspresja zwizana jest z przebiegiem spermatogenezy. Delecje w tym regionie prowadz do zaburze procesu spermatogenezy, takich jak cakowity brak spermatogoniw, lub do zahamowania podziau mejotycznego. Do tej pory udao si zidentyfikowa tylko kilka genw z tego obszaru chromosomu Y, np. gen RBM (ang. RNA binding motif) biorcy prawdopodobnie udzia w procesie skadania (ang. splicing) mRNA. Znane s te geny pooone w innych czciach chromosomu Y, np. gen Ube1Y (ang.
220

ubiuitin activating enzyme-1), ktry prawdopodobnie jest zaangaowany w ubikwitynacj histonw w spermatydach, co moe z kolei mie zwizek z wymian histonw na protaminy w chromatynie plemnikw. Z przedstawionych wyej informacji mona wycign wniosek, e informacja genetyczna zawarta w chromosomie Y jest bogatsza, ni to wczeniej zakadano.

9.2. Interseksualizm
Zaburzenie procesu determinacji i rnicowania pci prowadzi do powstania wrodzonych wad rozwojowych ukadu rozrodczego, ktre okrela si terminem interseksualizmu lub obojnactwa. Zaburzenia tego typu wywoywane s przez mutacje chromosomw pci lub mutacje genw zaangaowanych w proces determinacji i rnicowania pci oraz mog by skutkiem nieprawidowego przebiegu ciy (np. frymartynizm). Precyzyjna diagnoza przypadkw interseksualizmu stwarza niejednokrotnie problemy, ze wzgldu na bardzo due zrnicownie obserwowanych zmian. Kiedy niemoliwe jest jednoznaczne okrelenie podoa obserwowanych zmian, czsto takie przypadki klasyfikuje si na dwie kategorie: 1) hermafrodytyzm prawdziwy, kiedy stwierdza si rwnoczesn obecno gonad mskich i eskich lub gdy wystpuj struktury zoone typu jajnikojdro (ovotestis) i 2) pseudohermafrodytyzm mski, kiedy gonadom mskim towarzysz zaburzenia w przeksztacaniu si przewodw Wolffa i Miillera lub w powstawaniu zewntrznych narzdw pciowych.
Frymartynizm

Frymartynizm jest najczciej wystpujc postaci interseksualizmu u zwierzt domowych, gwnie przeuwaczy. Podczas rozwoju ciy mnogiej moe doj do powstania pocze naczyniowych (anastomoz) midzy oyskami rozwijajcych si podw. Jeli poczenie oysk dotyczy podw rnopciowych, to wwczas rozwj cech pciowych samicy (frymartyna) jest zaburzony, co w konsekwencji prowadzi prawie zawsze do niepodnoci. Poczenie krwiobiegw blinit rnopciowych sprawia, e zwizki hormonalne oraz inne czynniki aktywne wytwarzane przez jdra podowe docieraj do organizmu samicy i wpywaj na proces rnicowania si eskich cech pciowych. Rozmiar zaburze w uksztatowaniu cech pciowych samicy frymartyna zaley od momentu, w ktrym powstay poczenia naczyniowe. W rozwoju embrionalnym rnicowanie si jder poprzedza okres, w ktrym ksztatuj si jajniki. Jeli do pocze ttniczo-ylnych oysk doszo w okresie rnicownia si pierwotnej gonady w kierunku jdra u osobnika mskiego, to wydzielany czynnik transkrypcyjny SRY moe zakci proces ksztatowania jajnikw u osobnika bliniaczego pci
221

eskiej w takim stopniu, e rozwinie si nawet gonada mska, a w lad za tym drogi pciowe bd miay charakter mski. Jeli anastomozy powstan w chwili gdy jajnik jest ju uksztatowany, to wwczas wydzielany przez jdra podowe hormon antymiillerowski i testosteron spowoduj zakcenia w rnicowaniu si drg wyprowadzajcych gamety oraz zewntrznych narzdw pciowych. Moliwe jest rwnie powstanie pocze, w okresie gdy przewody Miillera bd ju przeksztacone w jajowody i macic. Wwczas dihydrotestosteron, powstajcy z wydzielanego przez komrki Leydiga testosteronu, moe zakci, w mniejszym lub wikszym zakresie, proces ksztatowania si zewntrznych narzdw pciowych. Trzeba podkreli, e prawie we wszystkich przypadkach, niezalenie od stopnia zakcenia procesu rnicowania cech pciowych, stwierdza si niepodno samic frymartynw. Jednoczenie cechy pciowe mskiego bliniaka s rozwinite prawidowo. Buhaje takie mog by wykorzystywane w rozrodzie, chocia parametry okrelajce ich przydatno rozpodow (np. obraz nasienia, wskanik niepowtarzalnoci rui itp.) s czsto obnione. Istotn kwesti jest moliwo wykrywania frymartynizmu u samic hodowlanych, a take wskazywanie samcw pochodzcych z ci bliniaczych rnopciowych. Okazuje si, e badania kliniczne samic s niewystarczajce, szczeglnie wwczas, gdy zewntrzne narzdy pciowe s prawidowo uformowane. Bardzo pomocne okazao si badanie cytogenetyczne, polegajce na ustaleniu zestawu chromosomw pci w leukocytach. Ze wzgldu na wspln cyrkulacj krwi u podw, ktrych oyska s poczone anastomozami, dochodzi do zagniedenia si komrek macierzystych szpiku kostnego samicy w szpiku kostnym samca i odwrotnie. Z tego powodu we krwi frymartynw, a take samcw bdcych blinitami frymartynw, stwierdza si obecno dwch linii komrkowych jednej wasnej, a drugiej wspbiniaka. Linie te rni si ukadem chromosomw pci w jednej wystpuje ukad XX, a w drugiej ukad XY. Poniewa linie te pochodz od dwch rnych genotypw, dlatego stan taki okrelany jest jako chimeryzm leukocytarny XX/XY. Chimeryzm dotyczy rwnie erytrocytw, ktre jak wiadomo pozbawione s u ssakw jder komrkowych. Chimeryzm erytrocytarny mona stwierdzi przez badanie grup krwi. Postp genetyki molekularnej umoliwia wykrywanie chimeryzmu leukocytarnego nie tylko za pomoc metod cytogenetycznych, ale take molekularnych (np. sekwencje mikrosatelitarne). Identyfikacja sekwencji typowych dla chromosomu Y (np. sekwencja SRY) w DNA wyizolowanym z komrek krwi samicy, przy jednoczesnym ich braku np. w komrkach bony luzowej, moe by wskazwk, e badany osobnik jest frymartynem. Powstawanie anastomoz jest bardzo czsto stwierdzane u byda. Szacuje si, e w przypadku ponad 90% ci bliniaczych rozwijane s anastomozy. Znacznie rzadziej zdarza si to u owiec (od l do 10%, zalenie od rasy). Biorc jednak pod uwag, e cie mnogie wystpuj bardzo rzadko u byda (poniej 2% ci), a czsto u owiec (od 40 do blisko 100% ci, zalenie od
222

rasy), w konsekwencji czsto frymartynizmu u tych gatunkw ksztatuje si na zblionym poziomie, w zakresie od 0,5% (bydo) do kilku procent (niektre rasy owiec, np. merynos booroola). Nieznane jest do tej pory molekularne podoe powstawania anastomoz. Z bada przeprowadzonych na owcach wynika, e skonno do tworzenia anastomoz moe by uwarunkowana genetycznie. Wniosek taki wycignito na podstawie pojawiania si chimeryzmu leukocytarnego XX/XY u zwierzt spokrewnionych.
Mutacje chromosomw pci

Przyczyn rozwoju interseksualnego czsto s mutacje zwizane z chromosomami pci. Z jednej strony mog to by aneuploidie, wrd ktrych najczciej obserwuje si przypadki monosomii chromosomu X (zesp chorobowy X0) oraz trisomii chromosomw pci (zespoy chorobowe XXY, XYY lub XXX). U ludzi monosomia chromosomu X odpowiada za powstanie zespou Turnera, a trisomia XXY jest przyczyn rozwoju zespou Klinefeltera. Z drugiej strony wan rol odgrywaj mutacje strukturalne, w ktre s zaangaowane chromosomy pci. Przyczyny powstawania tych mutacji zostay omwione w rozdziale: Mutacje. Aneuploidie chromosomw pci prowadz przede wszystkim do upoledzenia funkcji gonad. Zazwyczaj nie towarzysz im zaburzenia polegajce na rwnoczesnym rozwoju struktur typowych dla dwch pci. Monosomia chromosomu X najczciej jest diagnozowana u klaczy, ktre s fenotypowo prawidowo rozwinite. U nosicielek ruja nie wystpuje w ogle lub wystpuje nieregularnie. Gonady s niedorozwinite i brak w nich rozwijajcych si pcherzykw jajnikowych. Zmiany te prowadz do trwaej bezpodnoci samic z monosomia chromosomu X. W grupie trisomii chromosomw pci najwicej przypadkw dotyczy trisomii XXY. Kilkanacie takich przypadkw opisano u buhajw. Charakteryzoway si one gorszym tempem wzrostu, miay niedorozwinite jdra, a w nasieniu takich osobnikw zazwyczaj nie stwierdzano plemnikw, co oczywicie prowadzio do bezpodnoci. Z kolei trisomie XXX oraz XYY zazwyczaj nie prowadz do bezpodnoci oraz nie wywouj zmian fenotypowych.
Zesp niewraliwoci na androgeny

Mutacje genw zaangaowanych w proces determinacji i rnicowania pci s przyczyn wielu przypadkw interseksualizmu. Przykadem moe by zesp niewraliwoci na androgeny (zesp feminizujcych jder). Zwierzta obarczone tym zespoem chorobowym maj w swoich komrkach ukad chromosomw pci XY i prawidowo rozwinite zewntrzne narzdy pciowe eskie, niedorozwinite wewntrzne narzdy pciowe eskie oraz jdra. Przyczyn tych zaburze jest mutacja zlokalizowanego w chromosomie X genu kodujcego receptor dla androgenw. Konsekwencj wystpowania
223

nieprawidowego receptora dla androgenw jest nieodbieranie przez komrki docelowe sygnau zwizanego z obecnoci testosteronu i dihydrotestosteronu, co prowadzi do rnicowania si wewntrznych i zewntrznych narzdw pciowych w kierunku eskim.
Zesp odwrconej pci u koni

W hodowli koni czstym typem interseksualizmu jest tzw. zesp odwrconej pci (ang. sex reversal), ktry polega na niezgodnoci midzy pci fenotypow i chromosomow. Najczciej zesp ten diagnozowany jest u fenotypowych samic, ktre maj ukad chromosomw XY. Zewntrzne narzdy pciowe s zazwyczaj prawidowo rozwinite, chocia zdarzaj si zwierzta z powikszon echtaczk. Wewntrzne narzdy pciowe wywodz si z przewodw Miillera i s prawidowo wyksztacone lub przejawiaj oznaki niedorozwoju. W zdecydowanej wikszoci przypadkw stwierdza si niedorozwinite gonady eskie, a w nielicznych przypadkach opisano obecno niedorozwinitych jder lub jajnikojder. Badania molekularne genw pooonych w chromosomie Y, z wykorzystaniem techniki PCR, ujawniay u samic z zespoem odwrconej pci obecno genw charakterystycznych dla tego chromosomu (AMEL, ZFY, STS), przy jednoczesnym braku kluczowego genu SRY. Przyczyny takiego stanu mog by rne, a wrd nich naley wymieni: mutacj w locus SRY (np. czciowa lub cakowita delecja), przeniesienie genu SRY podczas nierwnowaonego crossing over do chromosomu X lub translokacj chromosomow midzy chromosomem Y i autosomem. U koni wystpuj rwnie przypadki odwrcenia pci u osobnikw z ukadem chromosomw XX. Zewntrzne narzdy pciowe takich zwierzt mog by bardzo zrnicowane, od prawie typowo samczych do samiczych, ale z powikszon echtaczk. Zazwyczaj stwierdza si obecno niefunkcjonalnych jder, w ktrych kanaliki plemnikotwrcze s wycielone jedynie komrkami Sertolego. W genotypie tych zwierzt nie ma genu SRY, ktry uznawany jest za niezbdny do rozwoju gonady mskiej. Taki typ odwrcenia pci spotykany jest rwnie u kz, wi i psw.
Interseksualizm bezrogich kz

Ze szczeglnym przypadkiem interseksualizmu mona si spotka w hodowli kz. Bezrono kz uwarunkowana jest przez dominujcy allel P, a wystpowanie rogw zwizane jest wycznie z genotypem homozygoty recesywnej pp. Okazao si, e wrd osobnikw bezrogich czsto zdarzaj si zwierzta obojnacze, ktre maj ukad chromosomw pci XX, a w ich genotypie nie stwierdza si genu SRY. Osobniki takie powinny by samicami, tymczasem w procesie rnicowania pci wystpuj zaburzenia dotyczce zarwno zewntrznych, jak i wewntrznych cech pciowych, a stopie
224

nasilenia tych zmian jest bardzo zrnicowany. Gonady zazwyczaj maj struktur jdra, a rzadko jajnikojdra. Jdra takich osobnikw nie wykazuj jednak aktywnoci spermatogenetycznej. Usytuowanie gonad moe by pachwinowe lub mog by pooone w worku mosznowym. Zewntrzne cechy pciowe mog mie nieomal prawidowy charakter eski i wwczas odrnienie takiego obojnaka od prawidowej samicy jest praktycznie niemoliwe. Czasami stwierdza si zwikszon odlego midzy odbytem i sromem lub znaczne powikszenie echtaczki. W przypadku takich osobnikw stosunkowo atwo udaje si zdiagnozowa interseksualizm. Wreszcie mog wystpowa rwnie osobniki, ktre maj zdecydowanie samczy fenotyp. S one trudne do odrnienia od samcw o prawidowej pci chromosomowej, czyli majcych ukad chromosomw pci XY, a w ich genotypie wystpuje gen SRY. W wyniku przeprowadzonych bada nad zmapowaniem locus genu bezronoci ustalono, e jest on pooony w chromosomie l w czci dystalnej. Ciekawe jest, e locus genu bezronoci byda zosta umiejscowiony rwnie w chromosomie l, ale w czci proksymalnej (w pobliu centromeru). Z bada porwnawczych wiadomo, e kariotypy obu gatunkw s prawie identyczne, rwnie w zakresie ukadu loci w chromosomach. Mona z tego wycign wniosek, e za wystpowanie rogw odpowiedzialne s co najmniej dwa loci u tych gatunkw. Co wicej naley podkreli, e u byda wystpowanie rogw nie wpywa na zakcenie rnicowania si pci. W 2001 r. ukoczono wieloletnie badania, ktrych celem bya identyfikacja locus odpowiedzialnego za obojnactwo bezronych kz (tzw. gen PIS ang. polledness and intersexuality syndrome). Okazao si, e odpowiedzialna za to jest delecja 11 700 par zasad, zlokalizowana w niekodujcym fragmencie DNA, co zakca ekspresj dwch pooonych w pobliu genw: PISRT1 (zaangaowany w determinacj pci poprzez oddziaywanie na produkt genu SOX9) oraz FOXL2 (uczestniczy prawdopodobnie w rozwoju jajnikw w okresie podowym).
Choroba biaych jaowic

Innym przykadem genu o dziaaniu plejotropowym, ktry jest odpowiedzialny za rozwj interseksualny, jest allel R genu Roan (umaszczenie dereszowate) u byda. Allel R odpowiada za powstanie biaego umaszczenia, allel r+ za umaszczenie czarne (u byda belgijskiego bkitnego) lub czerwone (u shorthornw). Allele te prezentuj typ dziedziczenia poredniego, z tym jednak e genotyp Rr+ wykazuje niepen penetracj, tzn. okoo 9% biaych zwierzt ma genotyp heterozygotyczny i podobna proporcja heterozygot ma umaszczenie barwne. U obu ras byda stwierdzono, e allel R zakca rnicowanie si przewodw Miillera w kierunku eskich wewntrznych narzdw pciowych u jawek. Zaburzenia te polegaj na braku lub niedorozwoju pochwy, szyjki macicy i macicy, natomiast jajniki s rozwinite prawidowo. Zesp tych zmian jest okrelany jako choroba biaych jaowic
225

(ang. white heifer disease), bowiem ponad 90% chorych jawek ma umaszczenie biae, a wrd pozostaych 10% przewaaj jawki umaszczone niebiesko (belgijskie bkitne) lub mroziato (shorthorny). Dotychczasowe obserwacje dowodz, e choroba biaych jaowic ma zoone podoe, w ktrym oprcz czynnikw genetycznych (allel R) istotn rol odgrywaj rwnie nie rozpoznane jeszcze wpywy rodowiskowe. Locus genu Roan umiejscowiono w chromosomie 5 w kariotypie byda. Przypuszcza si, e genem roan moe by gen kodujcy czynnik wzrostu komrek tucznych. Locus tego genu zosta wczeniej zmapowany w regionie, w ktrym ostatnio umiejscowiono locus genu Roan.
Interseksualizm u wi

Przypadki interseksualizmu u wi obserwuje si z czstoci okoo 0,3%. To genetyczne tych przypadkw jest sabo poznane. Badania chromosomowe wykazuj, e zdecydowana wikszo zwierzt obarczonych interseksualizmem ma kariotyp eski 38,XX. Wrd nich niejednokrotnie zdarzaj si przypadki, gdzie gonady maj struktur jdra lub jajnikojdra, pomimo nieobecnoci genu SRY, a zewntrzne i wewntrzne narzdy pciowe s nieprawidowo rozwinite. Sytuacja taka wskazuje, e powstanie gonady mskiej moe nastpi pomimo braku genu SRY. Zakada si, e produkt genu SRY wstrzymuje ekspresj nieznanego genu autosomanego, ktry koduje polipeptyd wpywajcy na zahamowanie ekspresji innych genw uczestniczcych w rnicowaniu pci mskiej. Zatem rozwj w kierunku mskim osobnikw z chromosomami XX byby spowodowany tym, e produkt tego zmutowanego genu nie hamuje rozwoju cech mskich. W Polsce opisano powtarzajce si przypadki takiego wanie interseksualizmu na fermie tuczu trzody chlewnej. W potomstwie jednego knura pojawio si kilkanacie obojnakw, w ktrych kariotypie wystpoway dwa chromosomy X. U zwierzt tych stwierdzano obecno jder, pomimo braku genu SRY w ich genotypie, macicy i nasieniowodw oraz zewntrznych narzdw pciowych eskich, z tym jednak e echtaczka bya bardzo powikszona, a srom tworzy z odbytem wsplny otwr (ry. 9-3 wkadka kolorowa). Rozwj interseksualizmu u wi stwierdzano take u osobnikw z ukadem chromosomw XY lub chimeryzmem leukocytarnym 38,XX/38,XY. Badania cytogenetyczne nie daj oczywicie wicej odpowiedzi na pytanie o podoe genetyczne rnych form interseksualizmu. Mona natomiast przypuszcza, e chimeryzm leukocytarny XX/XY wskazuje na frymartynizm, a ukad chromosomw XY i zewntrzne narzdy eskie s oznakami zespou niewraliwoci na androgeny.

Rozdzia

10

Genetyczne podstawy odpornoci i opornoci

Ukad odpornociowy jest pod wzgldem inteligencji" drugim po ukadzie nerwowym ukadem komrkowym organizmu. Ma on, podobnie jak ukad nerwowy, zdolno uczenia si, zapamitywania, reagowania na rne bodce i umiejtno oceny tych bodcw pod ktem ich oddziaywania na organizm. Gwn rol tego ukadu jest rozrnianie obcych biaek (antygenw) i reakcja immunologiczna, ktrej celem jest zwalczenie, usunicie tych obcych biaek. Zastanawiajce jest, i ukad moe rozrni ogromn liczb antygenw i odpowiedzie na infekcje, mimo e ma tylko pi klas przeciwcia. Zdolno ta wynika przede wszystkim ze specyficznego sposobu genetycznej kontroli syntezy przeciwcia, ale take z posiadania przez organizmy wysze unikatowego ukadu genetycznego, jakim jest gwny ukad zgodnoci tkankowej.

10.1. Genetyczne podoe rnorodnoci przeciwcia


Immunoglobuliny, czyli przeciwciaa, wykryte w 1890 roku przez von Behringa i Shibasaburo Kitasato, s grup zoonych biaek obecnych w surowicy krwi i pynach tkankowych wszystkich ssakw. Ich wytwarzanie przez limfocyty B jest stymulowane przez kontakt ukadu odpornociowego organizmu z obc immunogenetycznie czsteczk (antygenem). S one elementem odpornoci swoistej (nabytej, adaptatywnej), ich zadaniem jest rozpoznanie i neutralizacja obcych antygenw (np. bakterii czy wirusw). Czsteczka przeciwciaa ma mas 150 kDa i skada si z dwch acuchw cikich (ang. heavy H), po 50 kDa kady, poczonych z dwoma acuchami lekkimi (ang. light L), o masie po 25 kDa. Jest pi typw acuchw cikich (gr. - - alfa, - - delta, - - epsilon, - - gamma
227

i - - mi) i dwa typy lekkich ( kappa i . lambda). Stosunek przeciwcia, ktre maj acuch lekki typu , do acucha zaley od gatunku (np. u ludzi wynosi on 70:30, u myszy l: 20, u koni l: 25). Immunoglobuliny dzieli si na podstawie rnic w budowie acuchw cikich na 5 klas : IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Nazewnictwo to pochodzi od: Ig skrt od angielskiego sowa immunoglobulin, natomiast A, D, E, G i M od symboli acuchw cikich. Przeciwciao ma ksztat litery Y (ry. 10-1), utworzonej przez acuchy cikie, a wzdu jej ramion znajduj si acuchy lekkie. acuchy cikie poczone s ze sob wizaniami dwusiarczkowymi, ktrych liczba i miejsce zale od klasy i podklasy immunoglobuliny. Zarwno acuchy cikie, jak i lekkie maj czci zmienne (ang. variable V) oraz czci stae (ang. constant C). W czci zmiennej znajduj si trzy regiony hiperzmienne (ang. hypervariable), oznaczone HV1, HV2 i HV3. Poniewa regiony te determinuj swoisto przeciwcia, nazywane s take regionami determinujcymi dopasowanie (ang. complementarity determining regions CDR). W czci staej acucha cikiego, midzy domen CH1 i CH2, znajduje si tzw. region zawiasowy (ang. hinge region), w ktrym s wizania dwusiarczkowe czce oba acuchy cikie. Genetyczne podoe powstawania przeciwcia zostao wyjanione przez Susumu Tonegawa w 1976 roku. Badacz ten odkry, i informacja genetyczna

228

immunoglobulin zawarta jest w znajdujcych si w rnych chromosomach czterech grupach minigenw", ktre nazwa segmentami. Rnorodno przeciwcia, ich swoisto wynikaj z tego, i dziedziczone s nie cae geny immunogobulinowe, ale ich segmenty. Proces syntezy przeciwciaa nastpuje po skompletowaniu genw, czyli poczeniu si segmentw po jednym z kadej grupy minigenw. Dopiero po poczeniu w cao segmenty te tworz kompletny funkcjonalny gen. Proces ten zachodzi w poszczeglnych limfocytach B podczas ich dojrzewania. Za to odkrycie Tonegawa otrzyma w 1987 roku Nagrod Nobla. Cz zmienna acucha lekkiego jest determinowana przez dwa geny V (ang. variable) i J (ang. joining), natomiast acucha cikiego przez trzy geny: V, D (ang. diversity) i J. Cz staa obu rodzajw acuchw jest kodowana przez gen C. Geny kodujce acuch ciki znajduj si u czowieka w 14 chromosomie, natomiast geny acucha lekkiego typu w 2, typu w 22 chromosomie, u myszy natomiast odpowiednio w chromosomach 2, 6 i 16. Rnorodno przeciwcia wynika z wielu przyczyn, przede wszystkim z: rearanacji genw czci zmiennych (V) i staych (C) acuchw immunoglobulin rekombinacji midzy wieloma genami V insercji minieksonw mutacji somatycznych Rnorodno cikich acuchw immunoglobulinowych wynika z rekombinacji (rearanacji) genw V, D, J i C, a acuchw lekkich z rekombinacji regionw V, ] i C. Teoretycznie jest moliwo powstania do 10n rnych immunoglobulinowych sekwencji domen. Jednak rzeczywista liczba powstaych wariantw przeciwcia wynosi 107-108. Przypuszczalnie jest wiele genw kodujcych region V. Dla acucha cikiego ich liczba nie jest dokadnie znana (kilkadziesit, moe kilkaset), dla lekkiego kilka. Istniej co najmniej 3 rodziny genw (liczce 1-9 genw kada) dla regionu D, 6 genw funkcjonalnych i 3 pseudogeny regionu J, natomiast dla regionu C > 30 genw u ludzi i > 300 u myszy dla acucha lekkiego typu K oraz 6 u ludzi i 4 u myszy dla acucha typu A,. Oglnie liczb genw determinujcych poszczeglne regiony acuchw immunoglobulin mona okreli jako kilkaset genw V, kilkadziesit genw D i kilka genw J. Geny determinujce region C rni si od pozostaych tym, e wpywaj na funkcj przeciwciaa, a nie na jego powinowactwo do antygenu. Kompletne funkcjonalne geny kodujce czsteczki przeciwcia powstaj z omwionych wyej genw, ktrych kolejno czenia si jest nastpujca: gen D z genem J, nastpnie z genem V; powstay kompleks DJV czy si z genem kodujcym cz sta acucha cikiego. W funkcjonalnym genie acucha lekkiego nie ma genu D (ry. 10-2). Rekombinacyjne czenie si genw, zachodzce dziki aktywnoci enzymu rekombinazy, jest gwnym rdem rnorodnoci przeciwcia. 229

Podczas procesu powstawania genu kompletnego do pocze midzy genami segmentami (V-J, V-D i D-J) mog by wstawiane nukleotydy (od l do 15), bd te usuwane (do okoo 20 nukleotydw). Poniewa s to nowo powstae odcinki DNA, prowadzi to do zmiennoci na zczach i utworzenia nowego genu, tym samym liczba wariantw genu D] moe by zwikszona okoo 10 razy, natomiast genu VDJ nastpne 10 razy. Dodatkowo na rnorodno sekwencji przeciwcia maj wpyw mutacje somatyczne zachodzce w rekombinowanym genie VJ (dla acucha lekkiego) i VDJ (dla acucha cikiego). Kady limfocyt B wytwarza tylko jeden rodzaj acucha cikiego i jeden lekkiego, ktre razem stanowi przeciwciao, bdce specyficznym receptorem tego limfocytu. Geny kodujce acuchy maj zdolno niezwykle szybkiego mutowania w odpowiedzi na pobudzenie limfocytu B poprzez zwizanie obcego biaka (antygenu). Najczciej s to mutacje punktowe, powodujce zmian pojedynczego aminokwasu, rzadziej natomiast delecje, insercje lub konwersje. Pojedyncza nawet zmiana aminokwasu w czci zmiennej acucha cikiego moe doprowadzi do cakowitej utraty przez przeciwciao zdolnoci wizania antygenu lub te do zwikszenia jego powinowactwa do antygenu.

10.2. Genetyczne podoe rnorodnoci receptorw limfocytw J


W odpowiedzi immunologicznej organizmu bior udzia dwie populacje limfocytw: limfocyty T i limfocyty B, przy czym limfocyty T uczestnicz w odpowiedzi typu komrkowego, atakujc i niszczc komrki zakaone (Tc cytotoksyczne limfocyty T), oraz odpowiedzi typu humoralnego
230

(Th pomocnicze limfocyty T), podobnie jak limfocyty B, ktre odpowiadaj za syntez przeciwcia. Dwie subpopulacje limfocytw T (Tc i Th) rni si receptorami bonowymi. Limfocyty pomocnicze maj receptory CD4, cytotoksyczne CD8. Reaktywno tych receptorw znajdujcych si na limfocytach pomocniczych i cytotoksycznych jest skierowana odpowiednio na antygeny MHC klasy II i klasy I. Proces rearanacji elementw genw receptorowych, ktry nastpuje podczas dojrzewania komrek T w grasicy, zachodzi podobnie jak rekombinacja genw przeciwcia. Poprzez proces rearanacji genw, jeden do czterech elementw zostaje wczonych do genw kodujcych pierwotn struktur biaek receptora komrki T. Znane s dwa rodzaje receptorw limfocytw T receptory skadajce si z acuchw i oraz receptory skadajce si z acuchw i . U czowieka geny kodujce acuchy receptorw znajduj si w chromosomie 7 (dla acuchw i ) i 14 (dla acuchw i ). Czci zmienne acuchw kodowane s przez geny V i J (acuchy a i y) i przez geny V, D i J (acuchy p i ). Na przykad u myszy 100 regionw acucha -V i 50 regionw acucha -J moe tworzy do 5000 rnych genw dla acucha . Podobnie, okoo 500 rnych genw kodujcych acuch moe by utworzonych z 20 genw -V, 2 regionw D i 12 genw dla acucha -J. Oczywicie jest mao prawdopodobne, e wszystkie elementy genw s wczone w rearanacje, ale teoretycznie losowe kombinacje acuchw i mog da do 2,5 x 106 - heterodimerw. Gdyby zostay wzite pod uwag wszystkie mechanizmy biorce udzia w tworzeniu rnorodnoci struktury receptorw limfocytw T, liczba rnych receptorw wyniosaby do 1015 receptorw - i 1018 -. Potencja dla rnorodnoci receptorw komrek T jest istotnie wyszy ni wynosi liczba komrek T obecnych w organizmie.

10.3. Gwny ukad zgodnoci tkankowej MHC


Gwny ukad zgodnoci tkankowej zosta odkryty w wyniku bada nad genetycznym tem przyjmowania lub odrzucania przeszczepu u myszy. Bodcem do podjcia tych bada byo odkrycie przez Landsteinera grup krwi systemu ABO i wyjanienie zjawiska aglutynacji krwinek czerwonych biorcy pod wpywem surowicy krwi dawcy. Prowadzone w latach 30. przez Petera Gorera poszukiwania innych antygenw grupowych krwi, odpowiedzialnych za przyjcie przeszczepu, doprowadziy do wykrycia grup (klas) antygenw oznaczonych I, II i III. Przeomowe znaczenie dla poznania i wyjanienia roli tych antygenw miao wytworzenie przez Georga Snella linii kongenicznych myszy rnicych si tylko locus zgodnoci tkankowej, ktry kontroluje ich syntez. Badania polegajce na przeszczepach skrnych 231

midzy tymi liniami, wykonywanych dla kilkunastu kolejnych pokole, wykazay, i reakcja na ten zabieg zaley przede wszystkim od locus gwnego ukadu zgodnoci tkankowej (ang. major histocompatibility complex MHC), a tylko w niewielkim stopniu od innych loci, nazwanych sabymi antygenami zgodnoci tkankowej (ang. minor histocompatibility loci). Za badania nad MHC Snli wraz z Francuzem Daussetem i Amerykaninem Benacerrafem otrzymali w 1980 roku Nagrod Nobla. Rnice midzy sabymi antygenami zgodnoci tkankowej a MHC s zarwno natury jakociowej, jak i ilociowej. Geny sabych antygenw zgodnoci tkankowej nie s jeszcze dobrze poznane i, by moe dlatego, czsto ich efekt jest niedoceniany. Tymczasem niektre z tych antygenw stymuluj silniejsz odpowied transplantacyjn ni antygeny MHC. W zasadzie antygeny minor H loci nie bior udziau w reakcji immunologicznej prowadzcej do syntezy przeciwcia, natomiast mog by rozpoznawane przez limfocyty T w poczeniu z antygenami MHC, podobnie jak to wystpuje przy rozpoznawaniu antygenw wirusowych. U myszy loci sabych antygenw zgodnoci tkankowej (minor H loci) s najlepiej poznane i wiadomo, e wikszo z nich znajduje si w chromosomie 2. Do sabych antygenw transplantacyjnych myszy nale midzy innymi: H-Y (tylko u samcw), H-l, H-3, H-5 i inne. Antygeny te s istotn barier podczas transplantacji tkanek, zwaszcza transplantacji szpiku kostnego. Nawet wwczas, gdy biorca i dawca s zgodni pod wzgldem haplotypw MHC, sabe antygeny transplantacyjne mog spowodowa odrzucenie przeszczepu. W dziedziczeniu sabych antygenw zgodnoci tkankowej obserwuje si pewne charakterystyczne zjawiska. Antygen H-Y wystpuje tylko u samcw, gdy gen kodujcy go jest zlokalizowany w chromosomie Y. Zatem jest on przekazywany przez ojca mskim potomkom. Natomiast inny antygen, nazwany Mta (ang. maternally transmitted antigen), pochodzi tylko od matki, poniewa jest on kontrolowany przez gen mitochondrialny (zjawisko to jest omwione w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech).

Tabela 10-1

Lokalizacja MHC i nazwa u poszczeglnych gatunkw

232

Poniewa gwn funkcj genw MHC jest determinowanie antygenw leukocytarnych (ang. leukocyte antigens LA), nazewnictwo tego ukadu u poszczeglnych gatunkw stanowi symbol zawierajcy w pierwszym czonie nazw gatunku, a drugim podstawow funkcj LA (tab. 10-1). Gwny ukad zgodnoci tkankowej jest ogromnie konserwatywnym regionem DNA, jego struktura i funkcje s podobne u ludzi i wszystkich gatunkw zwierzt. Umoliwia to prowadzenie bada molekularnych MHC u jednego gatunku z zastosowaniem sond molekularnych uzyskanych z DNA innego gatunku.

10.3.1. Struktura i funkcje gwnego ukadu zgodnoci tkankowej


U ludzi i zwierzt MHC jest odcinkiem DNA skadajcym si ze specyficznych regionw genw kodujcych trzy klasy biaek klas I, II i III, bdcych glikoproteinami. U drobiu nie stwierdzono regionu klasy III. Wykryto natomiast specyficzny region klasy IV, kodujcy biaka zlokalizowane na krwinkach czerwonych. Z powodu powiza tego ukadu z ukadem grupowym krwi B, MHC u drobiu nazwano kompleksem B. Poniewa wiele biaek MHC zostao zidentyfikowanych metod serologiczn, czsto s one nazywane antygenami MHC. Biaka (czsteczki) MHC tak ze wzgldu na podobiestwo na poziomie struktury biaka, jak i na poziomie genw zaliczane s do nadrodziny immunoglobulin. Mechanizm dziedziczenia ukadu zgodnoci tkankowej jest taki jak w przypadku jednej pary alleli. Potomek otrzymuje od kadego rodzica po jednym chromosomie z kadej pary chromosomw homologicznych, a wraz z nim haploidalny genotyp MHC (haplotyp). Poniewa MHC zawiera wiele genw oraz, jak ju wspomniano, ukad ten cechuje ogromny polimorfizm, w populacji istnieje bardzo dua liczba rnych haplotypw. Zwaszcza niektre geny MHC, nalece do klasy I i II (np. regionu K, D i L u myszy i B, C i A u ludzi), s wysoce polimorficzne. W wielu przypadkach polimorfizm ten jest wynikiem konwersji genw, rzadziej mutacji punktowych, crossing over czy rekombinacji wewntrzgenowych. W obrbie MHC znajduj si regiony szczeglnie czsto uczestniczce w rekombinacjach genetycznych. Polimorfizm alleliczny obserwowany w loci MHC charakteryzuje si tym, i: liczba alleli w wikszoci loci jest bardzo dua (> 50) allele czsto rni si du liczb mutacji punktowych typu zmiany sensu, powodujcych podstawienia aminokwasw w czsteczce MHC (> 20 dla loci klasy II i > 30 dla loci klasy I); w wikszoci innych systemw genetycznych allele rni si nielicznymi podstawieniami nukleotydw
233

polimorfizm wystpuje gwnie w odcinkach istotnych funkcjonalnie, a wic w tych, ktre koduj miejsce wizania peptydw; zjawisko polimorfizmu w innych systemach genetycznych czciej obserwowane jest w re gionach, ktrych znaczenie funkcjonalne jest mniej istotne polimorfizm w obrbie MHC, co zostao ju udowodnione, wpywa na moliwo immunologicznego rozpoznania obcych biaek. Mimo i pocztkowo uwaano, e MHC peni funkcj tylko w odrzucaniu przeszczepu, obecnie wiadomo, e biaka kodowane przez ten region bior udzia w mechanizmach rozpoznania immunologicznego, w tym take w interakcji rnych komrek limfoidalnych oraz limfocytw i komrek prezentujcych antygen. Czsteczki MHC klasy I s obecne na powierzchni wszystkich komrek jdrzastych i warunkuj zachowanie si cytotoksycznych limfocytw T, biorc tym samym udzia w reakcji przeciwko infekcji wirusowej, a take w odrzucaniu przeszczepu. Czsteczki te skadaj si z dwch acuchw polipeptydowych lekkiego i cikiego (ry. 10-3). acuch ciki jest kodowany przez geny MHC, natomiast zwizany z nim niekowalencyjnie acuch lekki p2-mikroglobuliny (biako o masie 12 kDa) jest determinowany przez gen znajdujcy si poza ukadem MHC. acuch ciki skada si z trzech czci: Najduszy, N-kocowy fragment acucha cikiego, stanowi okoo 80% jego dugoci i znajduje si na zewntrz komrki. Jest on kodowany przez geny MHC i ma trzy koliste domeny, oznaczone symbolami l, 2 i 3, kada zoona z okoo 90 aminokwasw. Domena 3 jest cile sprzona z 2-mikroglobulin. Ma ona wewntrzacuchowe dwusiarczkowe wizanie i podobn struktur trzeciorzdow do domeny immunoglobuliny. Domeny l i 2 odznaczaj si polimorfizmem, ktry jest podstaw rnic midzy czsteczkami MHC klasy I pochodzcymi od rnych osobnikw. W domenach tych wystpuj alloantygeniczne miejsca,
234

zawierajce determinanty specyficzne dla osobnikw. Fragment wglowodanowy (CHO) jest doczony do domeny 2. Domeny l i 2 tworz rowek osadzony na 2-mikroglobulinie i domenie 3, ktre s midzy nim a bon komrkow. W rowku tym wizane s antygeny, ktre nastpnie s prezentowane limfocytom T. Druga cz acucha cikiego to zawierajcy okoo 20 aminokwasw fragment hydrofobowy, przechodzcy przez bon komrkow. Trzeci czci jest liczcy okoo 20-40 aminokwasw fragment hydrofilowy czsteczki MHC klasy I (C-kocowy), ktry ley w cytoplazmie komrki. Czsteczki MHC klasy II, stwierdzane tylko na powierzchni wyspecjalizowanych komrek ukadu odpornociowego (makrofagi, komrki den-drytyczne i limfocyty B), reguluj immunologiczne rozpoznanie antygenw za pomoc limfocytw B i T. Czsteczki te s zbudowane z dwch niekowalencyjnie poczonych acuchw o podobnej budowie, oznaczonych symbolami i , kontrolowanych przez geny zlokalizowane w obrbie MHC (ry. 10-4). acuchy te, podobnie jak acuch ciki czsteczki klasy I, skadaj si z trzech czci: zewntrzkomrkowej N-kocowej, rdbonowej i wewntrzkomrkowej. Oba acuchy maj w czci N-kocowej po dwie koliste domeny. Domeny 2 i 2 s strukturalnie podobne do domen czci staych acuchw cikich im-munoglobulin. Domeny zewntrzne (l i l) obu acuchw tworz rowek podobny do tworzonego przez domeny l i 2 acucha cikiego biaek MHC klasy I. Polimorfizm czsteczek MHC klasy II dotyczy przede wszystkim domen l i l. Czsteczki MHC klasy II maj zdolno wytwarzania dimerw zoonych z dwch acuchw a i dwch acuchw .

235

Zarwno biaka MHC klasy I, jak i klasy II prezentuj obcy peptyd (antygen) limfocytom T. Jednak czsteczki klasy I mog wiza jedynie krtki, zoony z kilku aminokwasw peptyd, poniewa maj zamknite miejsce wice. Natomiast biaka MHC klasy II mog wiza peptydy rnej dugoci, od kilkunastu do ponad 20 aminokwasw, gdy ich miejsce wice pozostaje otwarte z obu stron. Czsteczki MHC klasy III wchodz w skad ukadu dopeniacza (komplementu). Zadaniem ukadu dopeniacza jest uzupenianie (dopenianie) roli przeciwcia w zakresie unieszkodliwiania antygenu. W jego skad wchodz biaka surowicy i pynw tkankowych, ktrych jest cznie z czynnikami regulujcymi okoo 30. Biaka te s oznaczane liter C (ang. complement) i liczb. Biaka C2, C4 i czynnik B (BF) u ludzi s kontrolowane przez loci MHC klasy III, u myszy natomiast przez loci regionu S w obrbie H-2.

10.3.1.1. Gwny ukad zgodnoci tkankowej myszy

Badania gwnego ukadu zgodnoci tkankowej byy prowadzone pocztkowo u myszy, a ich wyniki miay ogromne znaczenie dla pniejszych bada MHC czowieka, a potem rwnie zwierzt gospodarskich. Pierwotnie w MHC u myszy zidentyfikowano regiony K, I, S i D, ktre okrelono symbolem H-2 (ry. 10-5). Pniejsze badania ujawniy, e take geny w regionach sprzonych Qa i Tl koduj czsteczki MHC. Geny kodujce biaka MHC klasy I znajduj si w regionach H-2K i H-2D (tzw. klasyczne czsteczki klasy I, oznaczane symbolem la). Geny zlokalizowane w regionach Qa Tl koduj czsteczki zaliczane take do klasy I, z tym jednak e okrelane s one jako czsteczki nieklasyczne (Ib), niektre z nich te bior udzia w odpowiedzi immunologicznej. Geny klasy I MHC maj po osiem eksonw kodujcych funkcjonalne domeny biaek MHC klasy I. Dotychczas wykryto co najmniej 15 genw klasy la, kontrolujcych syntez klasycznych biaek MHC klasy I. Badania sekwencji genu Qa-2,3 wskazuj na wysok homologi (80%) tego genu z genami klasycznych antygenw transplantacyjnych. Natomiast produkty genw kompleksu Tl i Qa wyka-

236

uj wiele rnic w porwnaniu z antygenami transplantacyjnymi. W regionie Qa-2,3 i Tla zmapowano dotychczas 31 genw. Gen kodujcy acuch lekki (2-mikroglobulin) czsteczek klasy I, bardzo istotny dla ekspresji produktw genw klasy I, znajduje si poza MHC, u myszy w 2, u czowieka w 15 chromosomie, w grupie sprzeniowej z locus dehydrogenazy sorbitolu. Gen ten u ludzi skada si z omiu eksonw, natomiast u myszy z trzech eksonw. Sekwencja aminokwasowa 2-mikroglobuliny wykazuje wysok homologi z domen immunoglobulin i odpowiednimi domenami antygenw transplantacyjnych klasy I. Biaka klasy II s determinowane przez geny zlokalizowane w subregionach H2-A i -E, -P, -O/N oraz -M. Kada podklasa ma co najmniej jeden gen acucha i , z wyjtkiem H2-P, ktry ma pojedynczy pseudogen oznaczony symbolem H-2Pb. Wzr eksonw i intronw genw klasy II wskazuje na blisk wspzaleno midzy tymi genami i podobiestwa struktury z genami klasy I oraz genem 2-mikroglobuliny. Biaka klasy III s kontrolowane przez geny regionu S. Wrd regionw H-2 na szczegln uwag zasuguje region I (midzy regionami K i S), w ktrym znajduj si geny kontrolujce odpowied immunologiczn (wytwarzanie przeciwcia przeciwko ponad 40 rnym antygenom), oznaczone symbolem Ir (ang. immune response).

10.3.1.2. Gwny ukad zgodnoci tkankowej czowieka

U ludzi MHC (HLA) znajduje si w krtkim ramieniu chromosomu 6, zajmuje cznie okoo 4 mpz DNA (4 miliony par zasad), czyli ponad 0,1% caego genomu. Czsto rekombinacji midzy skrajnymi kocami tego kompleksu genw wynosi okoo 1%. Struktura HLA przedstawiona jest na liniowym diagramie (ry. 10-6). Klasyczne czsteczki klasy I kodowane s przez 3 loci HLA-A, -B i -C, natomiast czsteczki kontrolowane przez loci HLA-E, -F i -G nale do nieklasycznych czsteczek klasy I. Geny klasy II HLA znajduj si w piciu podklasach: DQ, DR, DP, DOB/DNA i DM, przy czym trzy pierwsze

koduj klasyczne czsteczki klasy II, podczas gdy czwarta podklasa, DOB/DNA, determinuje syntez nieklasycznych czsteczek klasy II. Odkryty niedawno locus DM jest nieco inny ni pozostae, bowiem jego sekwencja jest w takim samym stopniu podobna do genw klasy I, jak i do genw klasy II. Czsteczka MHC kodowana przez ten locus odgrywa szczegln rol w prezentacji antygenw, co potwierdza fakt, i komrki nie wykazujce ekspresji tej czsteczki maj upoledzon zdolno prezentacji antygenw. Podobnie jak u myszy, region klasy II HLA zawiera take geny, ktre strukturalnie nie nale do genw klasy II. Najbardziej interesujce z immunologicznego punktu widzenia s geny wczone w przetwarzanie wasnych biaek komrkowych. Bior one udzia w proteolizie biaek, m.in. biaek transkrypcyjnych oraz biaek nieprawidowych. S to geny TAP1 i TAP2 kodujce peptydowe transportery, przenoszce peptydy (pocite biaka) do siateczki rdpazmatycznej w celu prezentacji ich przez czsteczki klasy I MHC. Dwa inne geny LMP2 i LMP7 koduj podjednostki kompleksu biaek cytoplazmatycznych nazywanych proteasomami. O szczeglnej roli proteasomu wiadczy okrelanie go jako wewntrzkomrkowego ukadu immunologicznego". Dotychczas wykryto 267 allei klasy I HLA, 314 alleli klasy II i 40 aleli klasy III. Ta liczba alleli wynika z ogromnego polimorfizmu genw MHC. Stwierdzono na przykad, e geny HLA-A, -B, -DRB i -DPB wystpuj w postaci kilkudziesiciu alleli (tab. 10-11). Nieliczne z genw MHC, na przykad DRA, maj tylko 2 allele. Jest pewnym paradoksem, i czsteczka DR jest kodowana przez wysoko polimorficzny gen DRB (determinujcy syntez acucha ) oraz dialleliczny gen DR (kontrolujcy syntez acucha ). Ponadto w obrbie HLA wykryto take kilkanacie pseudogenw, nie podlegajcych transkrypcji (np. HLA klasy II DPB2 i DPA2) oraz geny kodujce inne biaka, m.in. geny dla 21-hydroksylazy (CYP21), biaek szoku

238

cieplnego 70 (HSP70) i dwa geny dla czynnika martwicy nowotworu (TNFA i TNFB). Jak wspomniano na pocztku tego podrozdziau, gwny ukad zgodnoci tkankowej jest regionem wzgldnie konserwatywnym i istnieje wiele homologii midzy MHC u ludzi i rnych gatunkw zwierzt. Na przykad homologia genw klasy II u ludzi i myszy jest nastpujca:

myszy: ludzie:

Aa A DQ DQ

E E DK DR

P O/N DP DOB/DNA

M DM

10.3.1.3. Gwny ukad zgodnoci tkankowej zwierzt gospodarskich Gwny ukad zgodnoci tkankowej zwierzt gospodarskich jest mniej poznany. Wiadomo jednak, i homologia midzy poszczeglnymi gatunkami i czowiekiem jest dua. Porwnanie genw znajdujcych si w obrbie MHC u poszczeglnych gatunkw zwierzt zawarto w tabeli 10-111.
Gwny ukad zgodnoci tkankowej byda

Gwny ukad zgodnoci tkankowej byda zlokalizowano w 23 chromosomie, w ktrym znanych jest take ponad 30 genw strukturalnych i kilkanacie markerw mikrosatelitarnych. Jest to najlepiej poznany chromosom byda. Liczba poznanych haplotypw BoLA jest ju bardzo duga i stale si zwiksza. Struktura BoLA przedstawiona jest na rycinie 10-7. Produkty genw klasy I s to klasyczne czsteczki MHC. Nie wykryto dotd czsteczek klasy I bdcych nieklasycznymi czsteczkami. Geny klasy I nale do dwch grup A i B, rnicych si delecj 6 par zasad w eksonie 5, ktry koduje krtki fragment transbonowy acucha czsteczki

239

MHC. W obrbie klasy II obserwowany jest duy polimorfizm genw. Za pomoc analizy molekularnej (RFLP) zidentyfikowano ju 46 haplotypw DRB, 26 DQB i 31 DQA. W locus DRB wykryto pseudogen (DRB1), rnicy si od genw tego locus kodonem stop" w eksonie kodujcym transbonowy fragment acucha czsteczki MHC. Homologia midzy genami BoLA i HLA jest stosunkowo dua. Na przykad gen DRB3 wykazuje 85% homologii z genem HLA DRB1, natomiast DQA byda i czowieka 75% homologii.
Gwny ukad zgodnoci tkankowej wini

Gwny ukad zgodnoci tkankowej wi zosta zmapowany w chromosomie 7 ponad wier wieku temu. Regiony klasy I i II znajduj si blisko siebie, odlego midzy nimi wynosi 0,4 cM. Natomiast odlego midzy genami klasy I i III oraz III i II jest co najmniej o 100 ty. par zasad mniejsza ni w MHC u ludzi. Nie jest znana dokadna liczba genw klasy I SLA, szacuje si, e jest ich okoo 7-10. Tylko kilka genw regionu klasy I wykazuje ekspresj. S to PD1, PD7 i PD14, ktrych homologia wynosi okoo 80-85%, i bardziej rnice si od nich (podobiestwo okoo 50%) PD6 i PD15. Wydaje si, e region klasy I SLA jest mniejszy od analogicznego regionu u ludzi i myszy. Region klasy II zawiera wiele genw, spord ktrych przypuszczalnie tylko DR i DQ wykazuj ekspresj na poziomie biaka. Niektre geny, DQA, DQB, DR i DRB, maj du homologi, w granicach 75-87%, z odpowiadajcymi im genami HLA. Podobnie jak u innych gatunkw, w SLA
240

Ry. 10-8. Schemat gwnego ukadu zgodnoci tkankowej wini (SLA) (wg: Schook i Lamont, 1996, zmodyfikowano)

znajduj si take pseudogeny. Jest nim na przykad gen DRB2, w ktrym stwierdzono delecj nukleotydu w kodonie 53. W regionie klasy III, w przeciwiestwie do innych gatunkw, znajduj si po jednym genie CYP22, C2 i C4. W regionie tym s take inne geny typowe dla tego ukadu (ry. 10-8).
Gwny ukad zgodnoci tkankowej owcy

Gwny ukad zgodnoci tkankowej owiec oznaczony jest skrtem OLA, ale mona rwnie spotka okrelenie Ovar (ang. ovine aries). Dotd nie sporzdzono mapy fizycznej tego ukadu, ale informacje uzyskane za pomoc analizy sprze wykazuj podobiestwa OLA do MHC u ludzi i byda. Mapa sprzeniowa owczego chromosomu 20, w ktrym znajduje si gwny ukad zgodnoci tkankowej, ma dugo 5,6 cM. W regionie OLA klasy I zidentyfikowano blisko sprzone loci: OLA -A i -B, a czsto rekombinacji midzy nimi wynosi 0,6%. W regionie klasy II, podobnie jak u byda, obok genw MHC znajduj si pseudogeny. Najlepiej poznany jest pseudogen DRB2. W wyniku mutacji, ktre wykryto w tym pseudogenie, w eksonach 3 i 4 znajduj si kodony stop", powodujce, i nie jest on funkcjonalny. Geny klasy II wykazuj duy polimorfizm, przy czym geny z locus DQB cechuje wikszy polimorfizm ni z locus DQA i DR.
241

Struktura genetyczna regionu OLA klasy III wykazuje du homologi do HLA. Dugo tego regionu u owiec wynosi okoo 150 ty. par zasad. Cecha charakterystyczn klasy III OLA jest duplikacja loci dopeniacza C4 i 21-hydroksylazy (CYP21).
Gwny ukad zgodnoci tkankowej kury

U drobiu geny MHC s zlokalizowane w dwch kompleksach: B i Rfp-Y, ktre s klasyfikowane niezalenie. Kompleks B znajduje si w 16 mikrochromosomie, natomiast w odniesieniu do Rfp-Y wikszo badaczy uwaa, e jest on zlokalizowany rwnie w tym chromosomie (ry. 10-9). Chromosom 16 jest jedynym chromosomem u drobiu majcym obszar jderkotwrczy (NOR). Za typowy MHC uwaany jest kompleks B, przypuszcza si natomiast, e kompleks Rfp-Y jest wczony w proces rozpoznania przez komrki NK naturalnych zabjcw. Dugo kompleksu B u drobiu wynosi prawdopodobnie 300-400 kpz, czsto rekombinacji midzy skrajnymi loci tego ukadu -- okoo 0,5%. Z kolei, czsto rekombinacji regionu Rfp-Y z regionem B wynosi 100%. Badania MHC u drobiu koncentruj si na kompleksie B. Dotychczas stwierdzono ponad 30 haplotypw tego kompleksu. Region klasy I oznaczony jest symbolem B-F, klasy II B-L, a klasy IV B-G. O ile funkcje regionw B-F i B-L s znane, o tyle funkcja regionu B-G wci nie jest wyjaniona. U drobiu nie ma regionu klasy III, chocia niedawno zmapowano w obrbie MHC u drobiu gen G9a nalecy do klasy III HLA. Wyniki bada prowadzonych na duych populacjach referencyjnych wskazuj na moliwo sprzenia przynajmniej kilku genw klasy III z MHC drobiu. Jak ju wspomniano przy omawianiu budowy czsteczki klasy I, gen acucha lekkiego (2-mikroglobuliny) znajduje si poza gwnym ukadem

242

zgodnoci tkankowej. U drobiu zlokalizowano go metod FISH (hybrydyzacja fluorescencyjna in situ) w duym mikrochromosomie (numer 9 lub 10 pod wzgldem wielkoci).

10.3.2. Identyfikacja czsteczek gwnego ukadu zgodnoci tkankowej


Okrelanie genotypu osobnika pod wzgldem ukadu zgodnoci tkankowej (haplotypu) moe by przeprowadzane dwoma podstawowymi sposobami: 1) za pomoc metod serologicznych, pozwalajcych na identyfikacj okrelonej czsteczki (biaka, antygenu) MHC, 2) poprzez analiz molekularn DNA, dziki ktrej moliwe jest wykrycie obecnoci danego allelu MHC. Do bada serologicznych wykorzystywane s surowice lub, od pewnego czasu, przeciwciaa monoklonalne. Natomiast bezporednia identyfikacja genw MHC jest moliwa dziki takim technikom genetyki molekularnej, jak: hybrydyzacja z sond komplementarn do danego allelu (ang. allele specific oligonucleotides ASO), poprzedzona amplifikacj danego frag mentu DNA (PCR), metoda RFLP. Czsteczki MHC klasy II mona rwnie identyfikowa w mieszanej hodowli limfocytw (MLC). Udoskonaleniem tej techniki jest test HTC, w ktrym uywane s homozygotyczne komrki stymulujce. Zainteresowani tym zagadnieniem znajd szczegowe informacje w podrczniku immunologii.

10.3.3. Znaczenie gwnego ukadu zgodnoci tkankowej


10.3.3.1. Zwizek MHC z odpornoci na choroby

Najwaniejsz funkcj czsteczek MHC jest udzia w odpowiedzi immunologicznej organizmu na infekcje wewntrzkomrkowe. Mechanizm ten przedstawiony jest w podrozdziale: Zarys przebiegu reakcji odpornociowej. Rola gwnego ukadu zgodnoci tkankowej w odpornoci/podatnoci na wiele chorb u ludzi jest przedmiotem intensywnie prowadzonych bada. Znane s ju powizania antygenw MHC z zapadalnoci na rne choroby. U zwierzt gospodarskich analogiczne badania s znacznie mniej zaawansowane, ale ich wyniki wiadcz o wpywie MHC na podatno/odporno na niektre choroby. Na przykad, badania ukadu zgodnoci tkankowej u byda (BoLA) wykazay jego zwizek z odpornoci na mastitis, biaaczk, tuberkuloz, inwazj kleszczy i pasoytw oraz trypanosomatoz (tab. 10-IV).
243

U owiec najbardziej zaawansowane s badania nad zalenoci midzy podatnoci/odpornoci na inwazje pasoytnicze a gwnym ukadem zgodnoci tkankowej. Podstawowym celem tych bada jest ustalenie antygenw MHC mogcych by wskanikami selekcyjnymi odpornoci owiec na pasoyty wewntrzne. Gwny ukad zgodnoci tkankowej u koni (ELA) jest najmniej poznany, ale stwierdzono ju jego zwizek z odpornoci na raka skry. U trzody chlewnej geny klasy I s przypuszczalnie gwnymi genami wczonymi w regulacj odpowiedzi immunologicznej na inwazj nicieni Trichinella spiralis. U kur gwny ukad zgodnoci tkankowej jest zwizany z odpornoci na chorob Mareka, kokcydioz, misaka Rousa i choler ptasi. Coraz czciej u zwierzt gospodarskich identyfikowane s haplotypy zwizane z okrelon reakcj na infekcje. Na przykad, haplotypy klasy II byda uznane za skorelowane z odpornoci/podatnoci na biaaczk s nastpujce: DQA*3A-DQB*3A-DRB2*2A-DRB3.2*11 odporno DQA*12-DQB*12-DRB2*3A-DRB3.2*8 podatno 10.3.3.2. Zwizek MHC z cechami produkcyjnymi i reprodukcyjnymi Gwny ukad zgodnoci tkankowej, oprcz szczeglnej roli w reakcji immunologicznej, oddziauje take na inne cechy (produkcyjne i reprodukcyjne). U byda mlecznego stwierdzono istotne oddziaywanie niektrych
244

czsteczek MHC klasy I na cechy zwizane z uytkowoci mleczn, natomiast u byda ras misnych zauwaono korelacj midzy przyrostami masy ciaa i przekrojem minia najduszego grzbietu a obecnoci okrelonych antygenw MHC. Wyniki bada prowadzonych na trzodzie chlewnej wiadcz o wpywie MHC na cechy tuczne i rzene wi, przy czym stwierdzono rn wspzaleno danego haplotypu z cechami produkcyjnymi zalenie od rasy. Badania znaczenia gwnego ukadu zgodnoci tkankowej w reprodukcji zwierzt gospodarskich prowadzone byy przede wszystkim na winiach. Dotyczyy one wpywu MHC na stopie owulacji, przeywalno zarodkw i podw oraz liczebno miotu. Wykazano wyrany wpyw haplotypu rodzicw na te cechy. Rwnie u byda antygeny MHC mog wpywa na zamieralno zarodkw, obnia stopie przeywalnoci i mas ciaa cielt. Wykazano ponadto istotny zwizek niektrych antygenw klasy II z zatrzymaniem oyska. U koni natomiast stwierdzono, i geny ELA mog wpywa na zmniejszenie podnoci przy kojarzeniach ogierw i klaczy o identycznych haplotypach. Dokadne poznanie struktury i funkcji gwnego ukadu zgodnoci tkankowej zwierzt gospodarskich oraz jego zwizku z odpornoci, reprodukcj i produkcyjnoci powinno w przyszoci umoliwi wykorzystanie czsteczek (antygenw) MHC jako markerw genetycznych w doskonaleniu zwierzt pod wzgldem tych cech.

10.4. Zarys przebiegu reakcji odpornociowej


W odpowiedzi na wniknicie patogenw (wirusy, bakterie i pasoyty) do organizmu ukad immunologiczny reaguje w rny sposb, zalenie od rodzaju patogenu i miejsca infekcji. Zasadnicz rol w ich rozpoznaniu, bez wzgldu na to, czy s to antygeny zewntrzkomrkowe czy wewntrzkomrkowe, odgrywaj czsteczki gwnego ukadu zgodnoci tkankowej. Przebieg reakcji immunologicznej jest niezmiernie skomplikowany i, jak dotychczas, nie do koca zosta poznany. Obecna wiedza pozwala na przedstawienie jedynie w zarysie przebiegu reakcji, zwaszcza w odniesieniu do zakaenia zewntrzkomrkowego. Czsteczki MHC klasy I bior udzia w odpowiedzi ukadu immunologicznego na wirusow infekcj wewntrzkomrkow. W zakaonej komrce biaka wirusowe ulegaj proteolizie (w cytosolu), czyli s degradowane do peptydw. Peptydy te s nastpnie przekazywane do siateczki rdplazmatycznej. W siateczce rdplazmatycznej s syntetyzowane czsteczki klasy I MHC. Tutaj te nastpuje zwizanie czsteczki MHC z peptydem, po czym powstay kompleks transportowany jest na powierzchni komrki, gdzie zostaje rozpoznany przez obecne w pobliu limfocyty T cytotoksyczne,
245

nazywane inaczej zabijajcymi, majce na powierzchni czsteczk CD8. Limfocyty te uwalniaj cytokiny hamujce replikacj wirusw i cytotoksyny, ktre zabijaj zakaon komrk (ry. 10-10a). Czsteczki MHC klasy II uczestnicz w reakcji przeciwko infekcji zewntrzkomrkowej, prezentujc przede wszystkim obce antygeny, ktre zostay pochonite przez wyspecjalizowane komrki ukadu immunologicznego komrki dendrytyczne, makrofagi lub limfocyty B. Podczas infekcji bakteryjnej, jeli bakterie zostan pochonite przez makrofagi, s rozkadane na peptydy w wakuolach (endosomach). Peptydy te wi si z czsteczkami MHC klasy II, przedostajcymi si z siateczki rdplazmatycznej. Powstay

Ryc. 10-10. Reakcja immunologiczna: (a) prezentacja antygenu przez czsteczki MHC klasy I; (b) prezentacja antygenu przez czsteczki MHC klasy II

246

kompleks jest transportowany na powierzchni komrki i tutaj rozpoznawany przez limfocyty T CD4 typu zapalnego (Thl). Limfocyty te nie mszcz komrek tak jak limfocyty T cytotoksyczne (CD8), ale uwalniaj limfokiny aktywujce komrk do zwalczenia infekcji (ry. 10-10b). W okrelonych przypadkach, gdy jest zbyt maa liczba limfocytw B zdolnych do rozpoznania antygenu (co moe wystpi przy pierwszym zetkniciu si organizmu z danym antygenem) bd gdy fagocytowane czsteczki lub bakterie s duych rozmiarw, makrofagi mog peni rol poredni, prezentujc limfocytom B czsteczki po fagocytozie i wstpnej fragmentacji. Makrofagi wchaniaj, degraduj i prezentuj wszystkie antygeny (ry. 10-10b). Jeli bakterie zostan pochonite przez limfocyty B, w odpowiedzi immunologicznej bior udzia limfocyty T CD4 pomocnicze, okrelane jako Th2. Dojrzay limfocyt B ma na swej powierzchni przeciwciaa IgM lub IgM i IgD, ktre su jako receptory antygenw. Obce biako rozpoznane przez limfocyt B jest przekazywane do wakuoli (endosomw) i tam trawione na krtkie peptydy. Nastpnie peptydy te s wizane przez czsteczki klasy II, ktre dotary tu z siateczki rdplazmatycznej. Utworzony kompleks, po przedostaniu si na powierzchni komrki, jest rozpoznawany przez limfocyt pomocniczy T. Limfocyt ten daje sygna limfocytom B do proliferacji (namnaania) i syntezy przeciwcia. Zaktywowane limfocyty B rozpoczynaj syntez przeciwcia wtrnych (IgG, IgE lub IgA), ktre rni si od pierwotnych tylko struktur acucha cikiego. Tak wic wytwarzanie przeciwcia przez limfocyty B jest kontrolowane przez czsteczki MHC i limfocyty T (ry. 10-10b). Zdolno czsteczek MHC do wizania peptydw, a raczej ich pojemno jest rna. Jedna czsteczka MHC klasy I moe w swym rowku zwiza okoo 1000 rnych peptydw, natomiast czsteczka klasy II moe ich zwiza dwa razy wicej. Czsteczki MHC bior take udzia w usuwaniu wasnych biaek pochodzcych z komrek, ktre ulegy apoptozie. Apoptoza (gr. apoptosis opadanie) jest to programowana mier komrki, czyli jej fizjologiczna mier. Podczas tego procesu komrka pocztkowo kurczy si i oddziela od ssiednich komrek, chromatyna ulega kondensacji na obrzeach jdra, wkrtce potem jdro, a nastpnie caa komrka pka, a jej fragmenty s trawione przez ssiadujce komrki.

10.5. Genetyczna oporno na choroby


Zmienno obserwowana u zwierzt dotyczy nie tylko cech uytkowych (mleczno, nieno itd.), ale take opornoci/podatnoci na choroby zakane i inwazyjne. Ostatnio coraz wicej uwagi powica si genetycznie uwarun247

kowanej opornoci na choroby. Oporno na choroby jest definiowana jako waciwo organizmu uniemoliwiajca rozwj choroby pomimo wniknicia patogenu. Genetyczna oporno nie obejmuje typowej odpowiedzi immunologicznej. Mechanizm dziedziczenia genetycznej opornoci na rne choroby nie zosta jeszcze w peni poznany. Na og jest to cecha poligeniczna, chocia w przypadku niektrych schorze stwierdzono, i oporno na nie zaley od pojedynczego genu o duym efekcie, np. mutacja w genie FUT1 odpowiadajca za oporno prosit na chorob obrzkow. W orodkach naukowych wielu krajw prowadzone s intensywne badania, ktrych celem jest znalezienie takich genw. Podstawowe zaoenia poszukiwania genw odpowiedzialnych za oporno zwierzt na choroby obrazuje schemat (ry. 10-11). Wybr cechy bdcej wskanikiem opornoci powinien by przeprowadzony z uwzgldnieniem pewnych kryteriw. Cecha ta powinna: charakteryzowa si du genetyczn zmiennoci i odziedziczalnoci mie istotn warto ekonomiczn; moe ni by produkt nadajcy si do sprzeday bd zmniejszajcy koszty produkcji by atwa do mierzenia bez ponoszenia wysokich kosztw. Gdy cecha wskanik opornoci jest ju wybrana, naley oszacowa jej zmienno genetyczn. Umoliwi to poznanie sposobu jej dziedziczenia. W przypadku gdy oporno na chorob jest cech poligeniczna, nastpnym krokiem jest oszacowanie parametrw genetycznych: odziedziczalnoci tej cechy i jej korelacji genetycznej z innymi cechami istotnymi ekonomicznie. Informacje te mog by przydatne w opracowaniu strategii doskonalenia opornoci. Jeli okae si, i cecha opornoci jest warunkowana pojedynczym genem, celowe jest zmapowanie tego genu, czyli okrelenie jego pooenia w chromosomie, nastpnie sklonowanie go i poznanie sekwencji nukleotydw.

248

Zasadniczym krokiem w badaniach genetycznej opornoci jest poszukiwanie sprze midzy genetyczn opornoci, warunkowan wieloma lub jednym genem, a markerami genetycznymi, takimi jak antygeny erytrocytarne czy biaka polimorficzne (markery klasy I) lub niekodujce sekwencje DNA (markery klasy II). Sprzenia takie s szczeglnie korzystne w selekcji, gdy umoliwiaj okrelanie opornoci/podatnoci zwierzcia bez koniecznoci zaraania go patogenami. W opracowaniu strategii doskonalenia opornoci genetycznej wykorzystuje si zarwno metody tradycyjne, jak i techniki inynierii genetycznej. Tradycyjna praca hodowlana w kierunku zwikszenia opornoci zwierzt moe by prowadzona w drodze selekcji poredniej na podstawie takich cech, jak: cechy eksterierowe (widoczne goym okiem), cechy, ktre s okrelane za pomoc testw serologicznych lub elektroforezy, cechy ustalane za pomoc bada molekularnych DNA. Klasycznymi przykadami cech eksterierowych s: ciemna obwdka wok oczu u byda rasy hereford (bydo z biao umaszczon gow), zwizana z opornoci na raka oczu, i barwne upierzenie drobiu, wskazujce na wiksz ni u osobnikw biaych oporno na choroby wirusowe. Znajomo cech okrelanych metodami serologicznymi, ktre mog by wskanikami opornoci na choroby, umoliwiaaby prowadzenie selekcji wrd zwierzt modych. Wyniki bada prowadzonych na owcach w Australii i Nowej Zelandii wskazuj na zaleno midzy genotypem hemoglobiny a czstoci zaraenia pasoytem Haemonchus contortus. Zwierzta z hemoglobin AA s bardziej oporne ni osobniki z hemoglobin AB i BB. Innym markerem biochemicznym mog by antygeny erytrocytarne grup krwi. Na przykad, u byda opornego na biaaczk czciej wystpuj antygeny erytrocytarne B, Y2/ D' i P'. Najwiksze moliwoci ograniczania wystpowania chorb u zwierzt na drodze hodowlanej stwarzaj wyniki bada molekularnych okrelajcych sekwencje nukleotydowe genw, jak rwnie badania genetycznej struktury gwnego ukadu zgodnoci tkankowej (MHC). Ustalenie na tej podstawie opornoci (lub podatnoci) na choroby jest moliwe ju u zarodka, co ma zasadnicze znaczenie w hodowli byda wobec coraz szerzej stosowanego ich transferu. Na zmienno w podatnoci na choroby infekcyjne i pasoytniczne skadaj si zarwno rnice osobnicze, jak i rasowe. Na przykad, rodzime rasy byda w Indii s bardziej wraliwe na bruceloz ni ich mieszace z rasami europejskimi. W Kenii zaraenie byda motylic wtrobow jest o wiele czstsze u ras importowanych z Europy ni u ras miejscowych. Powszechnie znana jest oporno rodzimego byda afrykaskiego N'Dama na infekcj widrowca Trypanosoma brucei brucei, ktra prowadzi do piczki afrykaskiej (trypanosomatoza). Choroba ta dziesitkuje populacje byda 249

afrykaskiego. Rnice rasowe w opornoci/podatnoci na choroby mog by wykorzystywane do krzyowania w celu uzyskania mieszacw opornych na dan chorob. Zmienno podatnoci zwierzt na choroby najlepiej poznano u kur. Dziki wysokiej plennoci i szybkiej rotacji pokole prowadzona u tego gatunku intensywna selekcja w kierunku opornoci na chorob Mareka umoliwia wytworzenie rodw kur cakowicie niewraliwych na to schorzenie, z zachowaniem ich wysokiej produkcyjnoci. Mechanizm opornoci na chorob Mareka przypuszczalnie polega na ograniczaniu rozwoju guzw u zainfekowanych ptakw, nie zabezpieczajc ich przed infekcj. Zjawisko opornoci u kur obserwowane jest take w odniesieniu do kokcydiozy i salmonellozy. Kokcydioza powoduje obniony stopie wzrostu, zmniejszone wykorzystanie paszy, a take, zwaszcza u modych kurczt, miertelno. Za wskanik opornoci na kokcydioz przyjto liczb produkowanych oocyst. Badania genetycznych uwarunkowa opornoci na kokcydioz wskazuj na rol genw gwnego ukadu zgodnoci tkankowej (MHC) i genw zlokalizowanych poza tym ukadem. Kokcydioza jest rwnoczenie przykadem choroby, ktrej czsto wystpowania jest w duej mierze stymulowana dziaaniem czynnikw rodowiskowych, w tym przypadku jest to temperatura otoczenia. Zaleno ta jest nastpstwem zrnicowanej zdolnoci termoregulacji u modych ptakw. Wyniki bada wraliwoci kur na bakterie Salmonella (S. typhimurium, S. pullorum, S. gallinarum, S. enteritidis) sugeruj, e oporno na nie zaley od funkcji fagocytarnych komrek przede wszystkim ledziony i wtroby. Ponadto wiadcz one, i oporno na salmonelloz jest dominujca i moe by warunkowana pojedynczym genem. Wykorzystanie zjawiska genetycznej opornoci w celu poprawy zdrowotnoci zwierzt gospodarskich ma szczeglne znaczenie w przypadku chorb trudnych do zwalczania metodami weterynaryjnymi. Nale do nich stany zapalne gruczou mlecznego (mastitis), ktre s przyczyn powanych strat ekonomicznych w hodowli byda mlecznego. Jedn z drg ograniczania wystpowania mastitis u byda jest wykorzystanie w pracy hodowlanej rnic w genetycznych skonnociach do tego schorzenia. Obserwowane s zarwno rnice rasowe, jak i indywidualne. Na przykad, krowy rasy nizinnej czarno-biaej i czerwonej duskiej czciej zapadaj na zapalenia gruczou mlecznego ni holsztysko-fryzyjskiej, simentalery czy szwyce. Oprcz rnic rasowych w podatnoci krw na mastitis stwierdzono take wyrane rnice w czstoci wystpowania tego schorzenia midzy rodzinami (po matkach) i liniami (po ojcach). Ze wzgldu na stosowan sztuczn inseminacj problem przekazywania przez ojca opornoci na mastitis jest bardzo istotny. Prowadzone s badania nad moliwoci wprowadzenia do oceny wartoci hodowlanej buhajw cechy choroba" (mastitis). W Norwegii od 1978 roku mastitis jest ju wczone jako cecha
250

selekcyjna w programach hodowlanych. Ocena rozpodnikw jest dokonywana na podstawie zdrowotnoci gruczou mlecznego ich potomstwa eskiego. Inn drog zwalczania mastitis jest selekcja buhajw w kierunku zmniejszenia zawartoci komrek somatycznych w mleku ich crek. Ta metoda selekcji jest zalecana na przykad w Szwecji. Jednake badania niektrych autorw wykazay istotn rol poszczeglnych rodzajw komrek somatycznych w zabezpieczaniu wymienia przed drobnoustrojami chorobotwrczymi. Mona zatem przypuszcza, i selekcja w kierunku zmniejszenia zawartoci komrek somatycznych w mleku moe zmniejszy zdolno krw do reakcji na infekcje gruczou mlecznego. Wydaje si, i byoby celowe prowadzenie selekcji poredniej, opartej na wskanikach fenotypowych opornoci. Wielu badaczy wie skonno krw do stanw zapalnych (mastitis) z budow i wielkoci wymienia oraz strzykw, ktra w znacznym stopniu jest uwarunkowana genetycznie. Stwierdzono na przykad, e mastitis najczciej wystpuje u krw, ktrych wymiona wykazuj morfologiczne i fizjologiczne odchylenia od normy, takie jak: nieproporcjonalny rozwj przednich i tylnych wiartek, zbyt dua wielko i niskie zawieszenie, za due lub za mae strzyki. Obecnie w programach hodowlanych kadzie si wyrany nacisk na cechy morfologiczne wymion i zdolno wydojow krw, w celu ograniczania wystpowania mastitis poprzez selekcj. Podstawowymi kryteriami tej selekcji s, oprcz wydajnoci, ksztat i wielko wymienia oraz strzykw, ustawienie strzykw, wysoko zawieszenia wymienia i szybko oddawania mleka. Wybr tych cech jest uzasadniony ich uwarunkowaniem genetycznym i powizaniem ze stanem zdrowotnym wymienia. Celem tych dziaa jest wyselekcjonowanie krw o prawidowej budowie wymienia, charakteryzujcych si wysok produkcj mleka i zwikszon opornoci na mastitis. Innym schorzeniem u byda, ktrego leczenie jest bezskuteczne, jest biaaczka limfatyczna. Jej wystpowanie stwierdzono na wszystkich kontynentach, ale najczciej atakuje ona bydo w krajach strefy umiarkowanej. Poniewa wszelkie metody zwalczania biaaczki (poza eliminacj zwierzt zaraonych) stosowane przez lekarzy weterynarii nie przynosz oczekiwanych wynikw, coraz wicej uwagi powica si zagadnieniom wpywu zaoe genetycznych na skonno do tego schorzenia, jak rwnie niekorzystnym warunkom rodowiska (np. niedobr niektrych pierwiastkw, jak: magnez, wap, kobalt i mangan). Na podstawie licznych bada mona sdzi, e skonno do biaaczki jest przekazywana przez rodzicw, a zwaszcza przez chore matki. Wydaje si, e wiksza zapadalno na biaaczki krw od matek chorych jest nastpstwem nie tylko dziedziczenia skonnoci do tej choroby, ale take zakaenia przez oysko, siar i mleko oraz, co zostao udowodnione, przez uprzednio zaraon wirusem biaaczki komrk jajow. Wpyw buhajw na skonno ich crek do biaaczki nie jest tak silny jak wpyw matek. Wiadomo, i wirus biaaczki limfatycznej nie jest przenoszony podczas sztucznej inseminacji przez nasienie. Z drugiej 251

jednak strony wielu badaczy stwierdzao, e krowy po niektrych buhajach znacznie czciej zapadaj na t chorob, co moe by dowodem na dziedziczenie podatnoci na biaaczk. Badania nad genetyczn opornoci wi na choroby dotycz przede wszystkim biegunek u prosit, ale take innych schorze, na przykad schorze koczyn. Genetyczne uwarunkowanie opornoci prosit na biegunki okresu noworodkowego i poodsadzeniowego wywoywane szczepami K88 E. coli i F18 E. coli jest opisane w podrozdziale: Mutacje genowe. W tym miejscu naley podkreli, e praktycznie nie jest moliwe uzyskanie zwierzt opornych na kilka chorb jednoczenie. Mona jedynie mwi 0 doskonaleniu cechy opornoci na okrelone schorzenie. U owiec stwierdzono zrnicowan oporno na pasoyty wewntrzne. Stwarza to moliwo wykorzystywania tej waciwoci w ograniczaniu stopnia inwazji pasoytniczych u tego gatunku zwierzt. Oporno owiec na pasoyty odkowo-jelitowe moe przejawia si jako zdolno ywiciela do kontrolowania wystpowania pasoyta, przez zmniejszanie jego iloci 1 ograniczanie przeywalnoci (ang. resistance), lub te jako zdolno do wspycia z pasoytem (ang. resilience) poprzez utrzymywanie produkcyjnoci na nie zmienionym poziomie nawet podczas inwazji. Genetyczna zmienno zdolnoci do wspycia ywiciela z pasoytem, w odrnieniu od genetycznej zmiennoci opornoci, cieszy si mniejszym zainteresowniem wrd badaczy, przede wszystkim z powodu trudnoci w znalezieniu odpowiedniego wskanika tego stanu. Stwierdzono, i midzy opornoci owiec na zaraenie nicieniami odkowo-jelitowymi (np. Haemonchus contortus) a resilience" istnieje dodatnia korelacja genetyczna, ktrej warto waha si w granicach 0,5-0,6. Prowadzc selekcj w kierunku opornoci na pasoyty mona oczekiwa poprawy skorelowanej z ni cechy zdolnoci wspycia z pasoytem.

Rozdzia

W klasycznym ujciu marker genetyczny to cecha jakociowa, uwarunkowana w sposb prosty tzn. przez jedn par alleli, przydatna do celw analizy genetycznej. Przydatno markera zaley od tego, czy jest on polimorficzny, co zachodzi wwczas, gdy w populacji wystpuj przynajmniej dwa allele w locus tego markera. Polimorfizm markerw bada si zazwyczaj za pomoc metod analitycznych, wrd ktrych dominuj metody serologiczne oraz biochemiczne oparte na elektroforezie. Metody serologiczne wymagaj stosowania surowic testowych, zawierajcych przeciwciaa skierowane przeciw cile okrelonej postaci biaka, a dokadniej rozpoznajce konkretn determinant antygenow. W ten sposb badane s antygeny erytrocytarne (grupy krwi), antygenowe determinanty biaek surowicy krwi (allotypy), antygeny gwnego ukadu zgodnoci tkankowej, umiejscowione na niektrych frakcjach leukocytw (antygeny klasy II) lub innych komrkach majcych jdro (antygeny klasy I). Technik elektroforezy wykorzystuje si do rozdziau w polu elektrycznym biaek oraz fragmentw DNA. Rozdzia elektroforetyczny ujawnia formy rnice si ruchliwoci, ktra zaley od wielkoci i adunku elektrycznego czsteczki biaka (lub fragmentu DNA) oraz jej konformacji przestrzennej, a z drugiej strony od parametrw fizycznych rozdziau (napicie, temperatura, stenie nonika elu itp.). W przypadku DNA rozdzia moe by poprzedzony trawieniem wyizolowanego (lub zamplifikowanego metod PCR) DNA z uyciem enzymw restrykcyjnych. Zastosowanie enzymw restrykcyjnych pozwala na ujawnienie polimorfizmu dugoci fragmentw restrykcyjnych (RFLP) w obrbie genw lub polimorfizmu powtarzalnych sekwencji minisatelitarnych, ktre nie koduj informacji genetycznej. Natomiast bezporednia elektroforeza wybranych fragmentw DNA, uzyskanych metod PCR, pozwala na analiz polimorficznych loci zawierajcych sekwencje mikrosateitarne lub te ujawnienie zrnicowanej konformacji pojedynczych acuchw zamplifikowanego frag253

mentu DNA genu (metoda SSCP ang. single stranded conformation polymorphism). Objcie badaniami niekodujcych sekwencji DNA spowodowao, e markery zostay podzielone na dwie klasy. Klasa I obejmuje klasyczne markery, czyli sekwencje kodujce -- geny. Polimorfizm tych markerw wykrywany jest poprzez analiz produktw genw (metody serologiczne i technika elektroforezy biaek) lub badanie DNA tych genw (metody RFLP, SSCP). Klasa II markerw to sekwencje niekodujce; wrd nich najwaniejsze miejsce zajmuj tandemowo powtarzajce si sekwencje mikrosatelitarne, a w mniejszym stopniu sekwencje minisatelitarne. W tym przypadku maj zastosowanie tylko badania oparte na elektroforezie DNA. Oprcz wymienionych wyej dwch klas markerw genetycznych mona wyrni jeszcze grup markerw zwizanych z polimorfizmem chromosomowym, ktry jest wykrywany za pomoc technik prkowego barwienia chromosomw. Polimorfizm chromosomowy dotyczy przede wszystkim wielkoci blokw heterochromatyny konstytutywnej (barwienia technik CBG) oraz obszarw jderkotwrczych (technika Ag-I, czyli Ag-NOR).

11.1. Antygeny erytrocytarne (grupy krwi)


Grupy krwi byy najwczeniej wykorzystane w analizie genetycznej, np. dotyczcej kontroli pochodzenia. Do pionierw tych bada naley zaliczy m.in. polskiego badacza Ludwika Hirszfelda. Przez grup krwi naley rozumie typ krwi, cechujcy si obecnoci charakterystycznych biaek, o waciwociach antygenowych, na powierzchni erytrocytw. Identyfikacja antygenw erytrocytarnych wymaga zastosowania surowic testowych, ktre zawieraj swoiste przeciwciaa skierowane przeciw konkretnemu antygenowi. Intensywne badania nad polimorfizmem antygenw erytrocytarnych u zwierzt domowych podjto na przeomie lat 50. i 60. Ich efektem byo wykrycie wielu ukadw grupowych. W ich obrbie zidentyfikowano liczne antygeny i allele je warunkujce. Konkretny ukad grupowy krwi jest warunkowany przez pojedynczy gen (locus), ktry w populacji jest reprezentowany zazwyczaj przez wiele alleli (seria alleli wielokrotnych). Biaka kodowane przez te geny peni rnorodne funkcje biologiczne. Z bada prowadzonych u czowieka wynika, e mog one by enzymami, receptorami, czsteczkami adhezyjnymi czy biakami strukturalnymi. Wspln ich waciwoci jest to, e s zwizane z bon plazmatyczn erytrocytw, a ich obecno mona wykry metodami serologicznymi. Po dodaniu do surowicy testowej zawiesiny erytrocytw dochodzi do reakcji anty-genprzeciwciao. Przeciwciaa obecne w surowicy testowej wi si z determinantami antygenowymi. W wyniku reakcji antygen-przeciwciao dochodzi do aglutynacji lub hemolizy krwinek czerwonych. Jeli biako ma tylko jedn determinant antygenow, wwczas jest rozpoznawane
254

za pomoc jednej surowicy testowej. Jeli biako ma kilka determinant antygenowych, to wwczas ta forma biaka jest wykrywana po zastosowaniu odpowiedniej liczby surowic testowych. Wreszcie moe by taka sytuacja, e biako jest pozbawione determinant wykrywalnych dostpnymi surowicami testowymi. Wystpowanie rnych form determinanty antygenowej w danym biaku jest skutkiem mutacji punktowych. Mutacja taka moe doprowadzi do zmiany sekwencji aminokwasw, a to z kolei moe wpyn na zmian struktury biaka, a w tym jego determinanty antygenowej. Struktura biaka zaley rwnie od modyfikacji potranslacyjnej polipeptydu przeprowadzonej przez enzymy kodowane przez inne geny. Jeli takie geny maj wiele alleli, moe to prowadzi do zrnicowanej modyfikacji potranslacyjnej, a przez to do utworzenia (lub zlikwidowania)

255

nowej determinanty w antygenie erytrocytarnym. Gdyby dla uproszczenia przyj, e biako ma tylko jedn determinant antygenow, to wwczas kada mutacja genu, prowadzca do zmiany budowy biaka rozpoznawanej przez surowice testowe bdzie skutkowaa powstaniem nowego allelu (ry. 11-1). Sytuacja staje si bardziej zoona, gdy biako ma wicej determinant antygenowych. Wwczas pojedynczy allel jest opisywany za pomoc kilku surowic testowych. Mwi si wwczas o fenogrupach, czyli zespole antygenw, ktre dziedzicz si jak jednostka, a wic s uwarunkowane przez jeden allel. W takiej sytuacji mutacja genu zmienia jedn

Ry. 11-2. Mechanizm powstawania zrnicowania antygenw erytrocytarnych; przykad dla biaka majcego kilka determinant antygenowych, ktre pojawiaj si w trzech fenogrupach: abc, ab oraz abc). Schemat opiera si na zaoeniu, e nowe determinanty antygenowe s skutkiem mutacji genu kodujcego acuch polipeptydowy antygenu erytrocytarnego 256

z determinant, ale nie narusza struktury pozostaych (ry. 11-2). Badania prowadzone u zwierzt wykazay, e wystpuj obie sytuacje. Naley jednak zaznaczy, e istnieje take druga teoria tumaczca fenomen fenogrup. Przyjmuje ona, e kady antygen warunkowany jest przez jeden gen. Wwczas zesp antygenw dziedziczcy si jako jednostka genetyczna byby uwarunkowany przez grup genw bardzo silnie ze sob sprzonych. Przy takim uwarunkowaniu genetycznym moe dochodzi do powstawania rekombinantw, a w konsekwencji do nietypowego dziedzi-

257

czenia antygenw krwinkowych. Przykady takie opisano u byda, gwnie w odniesieniu do ukadu grupowego B. Naley pamita, e istniej biaka zbudowane z podjednostek kodowanych przez rne geny. Zatem moliwe jest, e w niektrych przypadkach obie teorie bd miay zastosowanie do wyjanienia poimorfizmu antygenw erytrocytarnych. Liczba znanych ukadw grupowych (loci) u zwierzt gospodarskich wynosi: 7 w genomie konia (ukady: A, C, D, K, P, Q, U) oraz owcy (ukady: A, B, C, D, M, R, X), 11 w genomie byda (ukady: A, B, C, F, J, L, M, S, Z, T', R'), 13 w genomie kury (ukady: A, B, C, D, E, F, G, H, J, K, M, O, P) oraz 15 w genomie wini (ukady: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O). Biologiczna funkcja powyszych biaek nie zostaa jeszcze poznana. Natomiast bardzo bogata jest wiedza na temat poimorfizmu wystpujcego w obrbie poszczeglnych ukadw (tab. 11-1). W przypadku wielu ukadw grupowych znane jest umiejscowienie chromosomowe loci. Wrd poznanych ukadw s takie, w ktrych wykryto dotd tylko dwa allele (np. ukad L byda czy ukad C wini), przy czym jeden z nich jest odpowiedzialny za wystpowanie biaka majcego determinant antygenow wykrywan przez surowic testow, a drugi allel (allel ") koduje biako, ktre w reakcji z dostpn surowic testow nie daje reakcji serologicznej. Ukad grupowy, w ktrym wystpuje allel " okrelany jest jako otwarty. Na drugim biegunie s ukady o olbrzymim polimorfizmie, jak np. ukad grupowy B byda, w ktrym wykryto 40 antygenw i opisano okoo 1000 alleli (fenogrup). Mona przypuszcza, e czsteczka biaka kodowana przez ten gen ma bardzo zrnicowan struktur i przez to ma wiele determinant antygenowych. Ponadto determinanty mog

258

mie wiele wariantw, a kady z nich jest rozpoznawany przez odrbn surowic testow. W efekcie wrd alleli bd takie, ktre warunkuj pojawienie si tylko jednej determinanty (rozpoznawanej przez jedn surowic), oraz takie, ktre odpowiadaj za wystpowanie kilku determinant (rozpoznawanych przez analogiczn liczb surowic). Pomidzy tymi skrajnymi przykadami s liczne ukady grupowe, w ktrych zidentyfikowano kilka czy kilkanacie alleli. W tabeli 11-11 przedstawione s rozpoznane dotychczas antygeny i allele u koni. Na uwag zasuguje ukad grupowy A wini. Jego ekspresja zalena jest od dodatkowego locus S, ktry ma dziaanie epistatyczne w stosunku do locus ukadu A. Gen S ma dwa allele: S oraz s. W ukadzie grupowym A wystpuj dwa antygeny A oraz O. Pojawienie si antygenu A lub O uzalenione jest od genotypu w locus S, przy czym dziaanie epistatyczne pojawia si przy genotypie homozygoty recesywnej ss. Jak to ju wczeniej wspomniano, badanie grup krwi wymaga stosowania surowic testowych, ktre powinny spenia warunek swoistoci. Surowice takie s produkowane przez laboratoria, ktre zajmuj si badaniami antygenw erytrocytarnych na potrzeby kontroli pochodzenia zwierzt. Procedura produkcji oparta jest na immunizacji zwierzt, pozyskaniu od nich surowicy odpornociowej (na og poliwalentnej, czyli zawierajcej wiele rnych przeciwcia), a nastpnie jej oczyszczaniu" (absorpcji niespecyficznych przeciwcia) do momentu otrzymania surowicy testowej (monowalentnej), to znaczy zawierajcej przeciwciaa skierowane przeciw konkretnemu antygenowi erytrocytarnemu. Niezmiernie istotne jest, aby surowice testowe, wyprodukowane w rnych laboratoriach, charakteryzoway si identyczn swoistoci. Cel ten osiga si poprzez cykliczne przeprowadzanie, pod auspicjami Midzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierzt (ang. International Society for Animal Genetics ISAG), midzynarodowych testw porwnawczych (ang. comparison test). Polegaj one na tym, e do laboratoriw uczestniczcych w tecie przesyane s zestawy zakodowanych prbek krwi zwierzt. Za pomoc dostpnych surowic testowych naley ustali, jakie antygeny wystpuj na erytrocytach w poszczeglnych prbkach. Zbiorcze wyniki testu s udostpniane zainteresowanym laboratoriom. W Polsce produkcj surowic testowych zajmuje si Instytut Zootechniki (bydo, winie, konie) oraz Zakad Hodowli Koni AR w Poznaniu (konie).

11.2. Biaka surowicy krwi, erytrocytw i leukocytw


Biaka surowicy krwi, erytrocytw i leukocytw s drug, po grupach krwi, pod wzgldem liczebnoci grup markerw genetycznych klasy I. Poszczeglne warianty tych biaek s okrelane za pomoc technik elektroforetycznych (np. elektroforeza w elu poliakryloamidowym lub elektroforeza
259

dwuwymiarowa czy rozdzia biaek w gradiencie pH tzw. elektrofokusing). Identyfikacja wariantw tych biaek musi by potwierdzona w tecie porwnawczym (pod kontrol Midzynarodowego Towarzystwa Genetyki Zwierzt). Na przykad u koni testy takie wykonywane s dla 16 systemw biaek. Polimorfizm biaek leukocytw, nazywanych take czsteczkami lub antygenami gwnego ukadu zgodnoci tkankowej (MHC), i ich znaczenie s omwione szczegowo w rozdziale: Genetyczne podstawy odpornoci i opornoci. Polimorfizm biaek surowicy krwi wynika ze zmiennoci ich form strukturalnych, bdcych skutkiem mutacji punktowych w genie kontrolujcym syntez danego biaka lub genach kodujcych enzymy odpowiedzialne za modyfikacj potranslacyjn. Niektre biaka i enzymy surowicy krwi zestawiono w tabeli ll-III. Spord ponad 25 biaek najbardziej polimorficzne

260

s albumina, inhibitor -proteaz i transferyna. Liczba rozpoznanych wariantw elektroforetycznych biaek jest jednak specyficzn cech gatunkow. Albuminy wspdziaaj z globulinami w regulacji rwnowagi pynw ustrojowych. Najwicej wariantw tego biaka zidentyfikowano u byda. U owiec synteza albumin jest kontrolowana przez locus ALB umiejscowiony w chromosomie 6 i bdcy w sprzeniu z locus biaka wicego witamin D, przy czym jeden z alleli (ALBS) wystpuje u wikszoci ras. U wi locus albuminy jest umiejscowiony w chromosomie 8ql2. Inhibitory -proteaz cechuje najwikszy polimorfizm u takich gatunkw, jak winia, ko i koza. U wi s one determinowane przez cile sprzone loci (Pi1, PO1A, PO1B, PIZ, P/3, PJ4) zajmujce cznie region dugoci okoo 2 centymorganw (chromosom 7q24-q26). Ze wzgldu na to, e rne rasy wi maj cakowicie odmienne haplotypy (czyli ukady sprzonych alleli z loci genw dla inhibitorw -proteaz), s one cennymi markerami genetycznymi. Tak wic, w rasie szwedzkiej yorkshire oraz landrace zidentyfikowano po okoo 40 rnych haplotypw. Z drugiej strony, niektre allele s charakterystyczne dla danych ras, jak np. PO1AB i PO1BY dla wielkiej biaej polskiej. U koni w jednym poznanym dotychczas locus inhibitora -proteaz wykryto 20 alleli, z kolei u kz inhibitory -proteaz s kontrolowane przez 4 loci, charakteryzujce si podobnym stopniem polimorfizmu (3-5 alleli). Transferyna jest -globulin, majc dwa aktywne centra wizania elaza. Jej podstawow funkcj jest transport elaza z miejsc absorpcji w przewodzie pokarmowym do rnych komrek organizmu. Jest to najbardziej polimorficzne biako zidentyfikowane dotychczas u podstawowych gatunkw zwierzt gospodarskich. U koni jest ono determinowane przez 13 alleli, przy czym jedynie allele Tf-D i Tf-F2 wystpuj prawie u wszystkich ras koni. Natomiast u wi allel TfB jest gwnym allelem u ras europejskich i azjatyckich, podczas gdy allel TfA wystpuje przede wszystkim u yorkshire, hampshire i duroc. Najrzadsze allele to TfE (tylko u wi rasy hampshire) oraz Tf1 (u dzika europejskiego). Locus transferyny u wi znajduje si w chromosomie 13 (13q31), u byda w chromosomie l, u owiec take w chromosomie l (Iq42q45). Spord biaek i enzymw erytrocytarnych (tab. 11-IV) szczeglnie interesujce s deaminaza adenozyny i hemoglobina. Deaminaza adenozyny zostaa dotychczas wykryta u trzody chlewnej, owiec (chromosom 15), kur i byda, przy czym u byda jest to enzym leukocytarny. U wi w locus ADA znanych jest sze alleli. Polimorficzne warianty s zwizane z rn aktywnoci tego enzymu. U osobnikw o genotypie ADAADA brak jest deaminazy adenozyny w erytrocytach, natomiast jest ona aktywna w leukocytach i innych tkankach. Allel ten, okrelany jako zerowy, wystpuje szczeglnie czsto u zwierzt podatnych na stres, ktre maj skonno do wytwarzania misa typu DFD (ciemne, twarde i suche).
261

Hemoglobina wykazuje najwikszy polimorfizm u owiec, byda i kz. Warianty tego biaka rni si tylko budow acucha . Na przykad u byda w trzech pozycjach tego acucha, kontrolowanego przez locus znajdujcy si w chromosomie 15q22-q27, s rne aminokwasy. Polimorfizm genu kontrolujcego hemoglobin wystpuje u niektrych ras byda, jak np. u rasy Jersey i niektrych ras misnych. Wikszo ras byda, wrd nich bydo czarno-biae i czerwono-biae, jest monomorficzna. U owiec warianty hemoglobiny kontrolowane s przez loci: HBA (24 chromosom) i HBB (15
262

chromosom). Ciekawe jest, i acuch hemoglobiny C (HBB C) jest wytwarzany tylko w przypadku anemii i tylko u osobnikw majcych allel HBA, a wielko tego wytwarzania zaley od nasilenia anemii. Ponadto wariant A hemoglobiny (HBB A) wykazuje wiksze powinowactwo do tlenu ni wariant B (HBB B) i zwizany jest z wiksz wartoci hematokrytu.

11.3. Allotypy immunoglobulin i lipoprotein


Antygenowe waciwoci surowicy krwi, okrelane terminem allotypy, s to ugrupowania chemiczne (najczciej jeden lub kilka aminokwasw) wystpujce na czsteczkach biaek i rnicujce osobniki tego samego gatunku. U wikszoci gatunkw zwierzt gospodarskich poznane allotypy zlokalizowane s przede wszystkim na -, - i -globulinach. Stopie polimorfizmu allotypowego jest rny zalenie od gatunku. U wi zidentyfikowano dotychczas 16 allotypw we frakcji -globulin, 14 allotypw dla -globulin i 3 dla -globulin. Natomiast u owiec wykryto 11 antygenowych markerw czsteczek -globulin, 10 determinant antygenowych we frakcji -globulin oraz 7 we frakcji -globulin. W przypadku antygenw immunoglobulin u byda, dotychczas zidentyfikowano 3 allotypy, kontrolowane przez allele bval, bva2 oraz bvb. Rwnie lipoproteiny, biorce udzia w transporcie cholesterolu, wykazuj waciwoci antygenowe. W zalenoci od waciwoci fizycznych wyrnia si pi klas tych biaek, od lipoprotein o bardzo maej gstoci (VLDL) do lipoprotein o bardzo duej gstoci (VHDL). Najwiksze zrnicowanie allotypw lipoprotein, oznaczonych symbolem Lp, stwierdzono dotychczas u wi, u ktrych najbardziej polimorficzny, bo liczcy ponad 21 allotypw, jest ukad Lpb. Wikszo tych allotypw jest determinowana przez kodominujce allele. W nastpnych ukadach (Lpr, Lpt i Lpu) znane s po dwa allele, a w pitym ukadzie (Lps) tylko jeden allel. U pozostaych gatunkw zwierzt polimorfizm allotypowy lipoprotein jest niewielki. U byda zidentyfikowano 3 allotypy, u owiec 1.

11.4. Biaka mleka


Gwnymi biakami mleka s kazeiny s1, s2, i oraz biako serwatkowe P-laktoglobulina. U byda loci kazein znajduj si obok siebie w 6 chromosomie (6q26-q33) i zajmuj razem odcinek DNA dugoci okoo 200 kpz (tysicy par zasad). Ze wzgldu na cise sprzenie loci kazein, ukad sprzonych alleli nazywany jest haplotypem. Genotyp zwierzcia w loci kontrolujcych biaka mleka mona okrela za pomoc metody elektroforezy stosowanej zarwno w przypadku rozdziau biaek (el skrobiowy lub poliakryloamidowy), jak i analizy na poziomie DNA (el agarozowy lub poliakryloamidowy). Okrelenie genotypu na podstawie
263

badania biaka jest moliwe tylko u samic bdcych w okresie laktacji. Natomiast analiza polimorfizmu genw kodujcych biaka (z wykorzystaniem metody RFLP, opisanej w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu) moe by przeprowadzana u osobnikw obu pci i w kadym wieku. U byda w locus kazeiny sl wykryto pi alleli: A, B, C, D i E, przy czym najwiksz frekwencj u byda europejskiego charakteryzuje si allel B, a u byda indyjskiego alle C. Biako s2-kazeiny rni si dugoci acucha od biaka s1-kazeiny, skadaj si one bowiem odpowiednio z 207 i 199 aminokwasw. Poszczeglne warianty aS2-kazeiny s kontrolowane przez 4 allele: A, B, C i D, z ktrych jedynie A i D s obecne w genotypie byda ras europejskich. -Kazeina wykazuje wikszy polimorfizm ni kazeiny s1 i S2, albowiem w locus kontrolujcym syntez tego biaka stwierdzono 7 alleli. U byda europejskiego najczciej wystpuje wariant -kazeiny A, bardzo rzadko wariant -kazeiny B (prawie wycznie stwierdzane s genotypy heterozygotyczne AB). Dotychczas u byda wykryto 6 typw -kazeiny, determinowanych allelami: A, B, C, E, F i G. Rnice midzy poszczeglnymi wariantami polegaj na zmianie aminokwasu, bdcej konsekwencj mutacji punktowej (tranzycji jednej zasady na inn). Tak wic allele A i B rni si nukleotydami w dwch miejscach acucha DNA, ktre powoduj zmian aminokwasu. W pozycji 136 acucha polipeptydowego B jest treonina, a w wariancie A izoleucyna, natomiast w pozycji 148 wariant B -kazeiny ma kwas asparaginowy, a wariant A alanin. Molekularna identyfikacja alleli A i B metod PCR-RFLP jest przedstawiona w rozdziale: Zmienno cech. Allel E -kazeiny rni si od A i B podstawieniem AG (seryna->glicyna w pozycji 155 acucha polipeptydowego). Allel F powsta w wyniku mutacji punktowej w allelu A, polegajcej na tranzycji GA, ktrej skutkiem jest zmiana w pozycji 10 acucha polipeptydowego aminokwasu argininy na histydyn. Podobnie allel G powsta wskutek tranzycji CT w allelu A, powodujcej zamian argininy na cystein w pozycji 97 sekwencji aminokwasowej biaka. Mutacje te tworz miejsca restrykcyjne dla enzymw HhaI i MaII, co stwarza moliwo molekularnej identyfikacji poszczeglnych alleli za pomoc metody PCR-RFLP. Biako serwatkowe mleka byda, -laktoglobulina, wystpuje w dwch wariantach A i B. -Laktoglobulina odgrywa rol w odpornoci organizmu, pobierana bowiem przez oseski z mlekiem matki chroni je przed infekcjami. Mleko zawierajce -laktoglobulin B rni si od mleka z -laktoglobulina A wiksz zawartoci suchej masy, tuszczu i kazein oraz lepsz przydatnoci technologiczn do produkcji serw. Podobnie jak w przypadku kazeiny, znane s rnice w sekwencji aminokwasowej obu wariantw laktoglobuliny, wynikajce z polimorfizmu genu kodujcego to biako. Biako -laktoglobuliny skada si z 162 aminokwasw. Rnica midzy
264

wariantem A i B polega na tym, e wariant A w pozycji 64 sekwencji aminokwasowej zawiera kwas asparaginowy (GAT), natomiast wariant B glicyn (GGT). Z kolei w pozycji 118 w wariancie A jest walina (GTC), za w B -- alanina (GCC). Zmiana zasady w kodonie 118 genu stwarza miejsce restrykcyjne dla enzymu HaeIII (GG/CC) w allelu -laktoglobuliny B. Zostao to wykorzystane w opracowanym tecie PCR-RFLP, ktry take jest ju rutynowo stosowany. W mleku kz i owiec, podobnie jak byda, s cztery frakcje biaek. Najbardziej polimorficzny jest gen kazeiny s1 u kz (7 alleli A, B, C, D, E, F, O). O ile allele A, B, C i E rni si midzy sob kilkoma podstawieniami aminokwasw, o tyle allele D i F wykazuj znacznie wiksze rnice, polegajce na delecji odpowiednio 11 i 37 aminokwasw. W pozostaych loci wykryto po 2 allele. Podobnie u owiec, z wyjtkiem locus P-laktoglobuliny (chromosom 3p28), w ktrym s 3 allele, w loci kontrolujcym gwne biaka mleka wystpuj po 2 allele.

11.5. Polimorfizm DNA


W jdrowym DNA zdecydowanie przewaaj sekwencje niekodujce, wrd ktrych du przydatno dla potrzeb analizy genetycznej maj sekwencje powtarzajce si tandemowo. W poowie lat 80. opisano po raz pierwszy sekwencje minisatelitarne. Ich cech charakterystyczn jest to, e dugo podstawowego motywu powtarzajcego si wynosi zazwyczaj kilkanacie nukleotydw. Do najbardziej znanych sekwencji minisatelitarnych nale: 33.5 (motyw podstawowy: GGGAGGTGGGCAGGAGG), 33.6 (motyw podstawowy: AGGGCTGGAGG) i 33.15 (motyw podstawowy: AGAGGTGGGCAGGTGG). Sekwencje te wystpuj w wielu miejscach (loci) genomu, a w konkretnym locus moe by rna liczba powtrze motywu podstawowego. Jeli strawiony enzymem restrykcyjnym i rozdzielony elektrofortycznie DNA hybrydyzuje si z wyznakowan radioaktywnie sond zawierajc sekwencj minisatelitarn, to na bonie radiograficznej pojawia si ukad prkw, ktry reprezentuje fragmenty DNA o rnej dugoci. Fragmenty te pochodz z wielu loci, a ich dugo zaley od liczby powtrze motywu podstawowego i take odlegoci, jaka dzielia sekwencj minisatelitarn od miejsca cicia przez enzym restrykcyjny. Uzyskany ukad prkw, nazywany niekiedy odciskiem palca" DNA (ang. DNA fingerprint), przedstawia wysoce charakterystyczny obraz osobniczego DNA, ktry moe by wykorzystany m.in. do kontroli pochodzenia i identyfikacji ladw biologicznych. Obok rwnoczesnej analizy wielu loci moliwe jest take badanie polimorfizmu sekwencji minisatelitarnej w pojedynczym locus. Badanie takie wymaga zastosowania sond o duej specyficznoci, to znaczy zawierajcych nie tylko sekwencj minisatelitarn, ale take sekwencje j otaczajce, oraz przeprowadzenia hybrydyzacji zgodnie z zaostrzon proce265

dur (ang. high stringency). Z zebranych do tej pory informacji o wystpowaniu sekwencji minisatelitarnych w rnych genomach wynika, e ich loci s pooone gwnie w czciach telomerowych chromosomw. Z tego wzgldu ich przydatno w budowaniu markerowych map genomo-wych jest ograniczona. Wkrtce po odkryciu polimorfizmu sekwencji minisatelitarnych opisano polimorfizm krtkich sekwencji, bo zawierajcych motyw podstawowy dugoci kilku nukleotydw, take powtarzajcych si tandemowo. Zostay one okrelone terminem sekwencji mikrosatelitarnych. Do tej pory najczciej opisywano dwu- (np. CA) lub czteronukleotydowe (np. CATA) motywy podstawowe. Sekwencje mikrosatelitarne mog wystpowa jako proste powtrzenia motywu podstawowego lub mog mie ukad zoony, polegajcy na tym, e powtrzenia motywu podstawowego s przedzielone inn sekwencj np. (CA)nAT(CA)m lub te sekwencja przedzielajca jest otoczona rnymi powtarzajcymi si motywami podstawowymi np. (GT)nGAT(AG)m. Wykrywanie polimorfizmu mikrosatelitarnego moe by prowadzone podobnie jak sekwencji minisatelitarnych, tzn. hybrydyzacji z sondami i wwczas analiza dotyczy rwnoczenie wielu loci. Szczeglne jednak znaczenie zyskay sekwencje mikrosatelitarne w chwili, gdy za pomoc techniki PCR, po rozpoznaniu sekwencji otaczajcych sekwencj mikrosatelitarn, moliwe stao si analizowanie pojedynczych loci. Na podstawie wiedzy o sekwencjach otaczajcych mikrosatelit syntetyzowane s oligonukleotydy penice funkcj starterw dla polimerazy DNA. Badanie polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych w pojedynczym locus polega na amplifikacji technik PCR specyficznych fragmentw, pochodzcych z DNA wyizolowanego od danego osobnika, a nastpnie okreleniu ich dugoci za pomoc klasycznej elektroforezy (np. el poliakryloamidowy + barwienie azotanem srebra) lub w automatycznym sekwenatorze DNA. Zalenie od genotypu osobnika stwierdza si wystpowanie jednego fragmentu, w przypadku homozygoty, lub dwch fragmentw u heterozygoty (ry. 11-3 wkadka kolorowa). Sekwencje mikrosatelitarne stay si najpowszechniejszym rdem markerw genetycznych, dziki wysokiemu polimorfizmowi i rwnomiernemu rozproszeniu w genomie. Szacuje si, e w genomie ssakw sekwencje takie wystpuj co 6-10 tysicy par nukleotydw. Warto zaznaczy, e sekwencje mikrosatelitarne mog wystpowa w intronach (przykadem s geny apolipoproteiny A oraz B wini) lub nawet w eksonach (gen kodujcy huntingtyn u czowieka). Wykrywanie polimorfizmu (markerw) DNA moliwe jest rwnie wwczas, gdy nie s znane ani sondy molekularne, ani sekwencje starterowe umoliwiajce amplifikacj technik PCR konkretnego, polimorficznego fragmentu DNA. Jedn z czciej stosowanych procedur w takiej sytuacji jest losowa amplifikacja polimorficznego DNA (ang. random amplified polymorphic DNA RAPD). Analiza tego typu polega na amplifikacji nieznanych fragmentw DNA, za pomoc sekwencji starterowej o losowej
266

kombinacji nukleotydw (zazwyczaj skada si z 10 nukleotydw), w ktrej dominuj nukleotydy C i G. Zamplifikowane fragmenty, reprezentujce zazwyczaj rne loci w genomie, s poddawane elektroforezie, w wyniku ktrej uzyskuje si kilka prkw (fragmentw DNA rnej dugoci). Badajc grup osobnikw mona stwierdzi rnice w ukadzie prkw, ktre s wynikiem mutacji punktowych tworzcych lub znoszcych miejsce rozpoznawane przez losowy 10-nukleotydowy oligonukleotyd starterowy dla reakcji PCR. Zidentyfikowanie takiego polimorficznego fragmentu pozwala na dalsz jego analiz, w tym sekwencjonowanie. Po okreleniu sekwencji tego fragmentu moliwe staje si ograniczenie analizy genetycznej do tego pojedynczego locus. W ten sposb identyfikuje si markery okrelane skrtem SCAR (ang. seauence characterized amplified region). Jeli amplifikowany fragment jest wystarczajco duy, to moliwe jest jego zlokalizowanie w chromosomie (mapowanie fizyczne). Przykadem takiej procedury jest identyfikacja polimorficznego markera RAPD, amplifikowanego przez starter 5'-AGAATAGGC-3', charakterystycznego dla psw obcionych chorob genetyczn postpujcym zanikiem siatkwki (ang. progressive rod-cone degeneration). Polimorficzny fragment, wykryty za pomoc techniki RAPD, zosta nastpnie molekularnie opisany, co doprowadzio do identyfikacji markera specyficznego SCAR, ktry zlokalizowano w chromosomie 9 u psa. Naley zaznaczy, e markery RAPD czy SCAR mog zawiera sekwencje kodujce lub niekodujce i dlatego ich jednoznaczna klasyfikacja do kategorii markerw klasy I lub II jest trudna. Badanie polimorfizmu DNA jest powszechnie stosowane take dla markerw klasy I. Analiza taka opiera si najczciej na wykrywaniu polimorfizmu dugoci fragmentw restrykcyjnych (RFLP), a take polimorfizmu konformacji jednoniciowych acuchw DNA (SSCP). Istot obu metod jest identyfikacja mutacji punktowych w obrbie genw. O metodach tych napisano w rozdziale: Metody analizy i modyfikacji genomu. Dynamiczny rozwj bada, ktrych celem jest sekwencjonowanie genomw rnych gatunkw, zaowocowa identyfikacj nowej klasy markerw genetycznych, okrelanych symbolem SNP (ang. single nucleotide polymorphism). Polimorfizm ten zwizany jest z wystpowaniem pojedynczych zmian sekwencji nukleotydw w homologicznych sekwencjach, np. allel l - AATCGGC oraz allel 2 AATGGGC. Mutacja punktowa prowadzi do powstania miejsca polimorficznego typu SNP, jeli kady z alleli wystpuje w populacji z czstoci nie mniejsz ni 1%. Polimorfizm SNP wie si zazwyczaj z obecnoci w puli genowej populacji jedynie dwch alleli. Niewtpliw zalet polimorfizmu SNP jest jego powszechno w genomach rnych gatunkw. Na przykad, prace nad ustaleniem sekwencji DNA genomu czowieka ujawnio co najmniej 1,4 mln miejsc SNP, spord ktrych wikszo wystpuje poza struktur genw. Wynika z tego, e te proste podstawienie nukleotydw zazwyczaj ma charakter tzw. cichego podstawienia, czyli nie wpywa na budow polipetydu, ale moe od267

dziaywa na ekspresj genu. Jednake niektre z tych podstawie mog wywoywa skutki fenotypowe. Ogromne nasycenie genomw markerami SNP sprawia coraz powszechniejsze ich wykorzystywanie w analizie genetycznej. Do identyfikacji alleli SNP moe by przydatna technika RFLP (jeli mutacja zmienia sekwencj rozpoznawan przez enzym restrykcyjny) lub SSCP. Jednak identyfikacja wielu miejsc SNP wymaga odwoania si do innych technik, w tym sekwencjonowania DNA. Polimorfizm na poziomie sekwencji nukleotydw moe by rwnie zwizany z brakiem (delecja) lub wstawieniem (insercja) jednego lub kilku nukleotydw. Tego typu markery opisywane s terminem InDel (Insertion Deletion polymorphism) i mog mie np. nastpujce formy: allel l TCGAATGAATT (insercja AAT) i allel 2 TCGGAATT (delecja AAT).

11.6. Wykorzystanie markerw genetycznych w hodowli zwierzt


Markery genetyczne znajduj zastosowanie w pracy hodowlanej midzy innymi w kontroli pochodzenia, ocenie wartoci genetycznej zwierzt pod ktem cech uytkowych i selekcji poredniej, tzw. MAS (ang. marker assisted selection), ocenie zmiennoci genetycznej wewntrz i midzy populacjami (liniami) oraz szacowaniu dystansu genetycznego. Informacje o umiejscowieniu loci markerw genetycznych znajduj si w markerowych mapach genomu (rozdzia: Mapy genomowe). Kontrola pochodzenia u zwierzt od wielu lat jest prowadzona na podstawie ukadw grupowych krwi i polimorficznych biaek, czyli markerw genetycznych klasy I. Podstaw tej kontroli jest to, e potomek dziedziczy jeden allel z kadego locus od ojca, drugi od matki. Zatem w przypadku grup krwi nie moe on mie antygenu erytrocytarnego, ktrego nie stwierdzono u jednego z rodzicw. Do kontroli pochodzenia najlepsze s ukady grupowe, w ktrych wystpuje wiele antygenw, u byda s to ukady B (40 antygenw), C (12 antygenw) oraz S (8 antygenw), u wi ukady M (12 antygenw), E (17 antygenw) i L (12 antygenw), natomiast u koni ukady A (7 antygenw), D (17 antygenw), P (4 antygeny) i Q (3 antygeny). Przykad kontroli pochodzenia na podstawie polimorfizmu antygenw erytrocytarnych oraz biaek surowicy krwi i erytrocytw przedstawiono w tabeli 11-V. Porwnanie genotypw i fenotypw rebaka i klaczy wskazuje na to, e w fenotypie ojca musiay wystpi antygeny erytrocytarne A-a, D-cgm, P-ad i Q-b oraz typy biaek TF-O, ALB-A, ES-I, PHI-I. Warunkw tych nie spenia ogier l, mona wykluczy jego ojcostwo. Spenia je ogier 2, on zatem moe by ojcem rebicia. Poniewa kontrola pochodzenia na podstawie polimorfizmu antygenw erytrocytarnych (grup krwi) i polimorficznych biaek surowicy krwi nie zawsze stwarza moliwo jednoznacznego wskazania pary rodzicielskiej, 268

ostatnio coraz czciej s stosowane do tego celu markery genetyczne klasy II (niekodujce sekwencje DNA). Daje to moliwo wykorzystania znacznie bardziej precyzyjnych kryteriw analizy genetycznej. Mona wyrni dwie podstawowe metody stosowane do kontroli pochodzenia; jedna jest oparta na polimorfizmie minisatelitarnym, druga na polimorfizmie mikrosatelitarnym. Polimorfizm minisatelitarny jest podstaw metody odcisku palca" DNA. W metodzie tej strawiony (pocity) enzymem restrykcyjnym i rozdzielony elektroforetycznie DNA jest hybrydyzowany z sond, ktr jest np. sekwencja minisatelitarna. Uzyskany obraz prkw jest charakterystyczny dla danego osobnika, ale potomek otrzymuje od kadego z rodzicw po jednym prku (allelu") danej sekwencji (ry. 11-4). Prawdopodobiestwo wystpienia tego samego obrazu prkw u dwch niespokrewnionych osobnikw jest minimalne. Dokadno kontroli pochodzenia mona zwikszy przez uycie w analizie kilku sond molekularnych. W celu okrelenia prawdopodobiestwa wykluczenia pochodzenia danego osobnika po danym rodzicu (-ach) stosowane s odpowiednie wzory. W przypadku analizy polimorfizmu w jednym locus minisatelitarnym u potomka i jednego z rodzicw (nie zawsze dysponujemy penymi danymi pochodzenia) prawdopodobiestwo wykluczenia obliczane jest ze wzoru:

Gdy dostpne s informacje dotyczce polimorfizmu minisatelitarnego w DNA obojga rodzicw i potomka, prawdopodobiestwo wykluczenia obliczane jest ze wzoru: 269

Jak ju wspomniano, analiza polimorfizmu w kilku loci minisatelitarnych rwnoczenie zwiksza dokadno kontroli pochodzenia. W takim przypadku okrela si tzw. czne prawdopodobiestwo wykluczenia dla wszystkich
270

badanych loci. Wzr na obliczanie tego prawdopodobiestwa ma t sama posta dla obu przypadkw, dostpnoci informacji zarwno o jednym, jak i obojgu rodzicach:

Druga metoda stosowana obecnie do kontroli pochodzenia wykorzystuje polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych. W przypadku kadej sekwencji mikrosatelitarnej potomek otrzymuje jeden allel od matki, drugi od ojca, dokadnie tak, jak to jest przy cechach monogenowych jakociowych. Istnieje moliwo kontroli pochodzenia za pomoc PCR multipleks, w ktrej stosuje si kilka markerw rwnoczenie. Dugo alleli (produktu PCR zamplifikowanych sekwencji mikrosatelitarnych) moe by oznaczana za pomoc automatycznego sekwenatora. Przykad kontroli pochodzenia na podstawie sekwencji mikrosatelitarnej 2319 (powtrzenie 4-nukleotydowe) u lisw, ktrej dugo okrelono metod elektroforetycznego rozdziau w elu poliakryloamidowym barwionym azotanem srebra oraz za pomoc automatycznego sekwenatora, przedstawiono na rycinie 11-5 (wkadka kolorowa). Krzywe 1-5 obrazuj genotypy szczenit (3-5) oraz ich domniemanych rodzicw ojca (1) i matki (2). Ojciec jest homozygot pod wzgldem allelu dugoci 235 pz, matka natomiast heterozygot (jeden allel - 243 pz, drugi 263 pz). Wszystkie szczenita s heterozygotami, przy czym allel dugoci 235 pz odziedziczyy po ojcu. Dwa z nich otrzymay od matki allel dugoci 243 pz, natomiast trzeci allel 263 pz. Widoczny pik" przy dugoci 270 pz jest to marker wielkoci fragmentu DNA, dodawany do kadej prby DNA analizowanej za pomoc sekwenatora. W ostatnich latach badacze coraz czciej zastanawiaj si nad wykorzystaniem do kontroli pochodzenia polimorfizmu pojedynczych nukleotydw, okrelanego symbolem SNPs (ang. single nucleotide polymorphisms). Polimorfizm ten jest wynikiem mutacji punktowych (zamiana okrelonej zasady w danym nukleotydzie na inn). Przyczyn odchodzenia od wykorzystywania sekwencji mikrosatelitarnych w kontroli pochodzenia s gwnie zachodzce w nich mutacje, ktrych czsto szacuje si na 10-2-10-5 na pokolenie. Zalet SNPs jest bardzo dua gsto ich rozmieszczenia w genomie (na przykad w genomie czowieka wystpuj one co ok. 1300 par zasad). Rwnie to, e do identyfikacji genotypu w przypadku polimorfizmu pojedynczych nukleotydw mona zastosowa zdecydowanie wicej technik molekularnych ni do identyfikacji genotypu w loci mikrosatelitarnych, sprawia, i w niedalekiej przyszoci polimorfizm pojedynczych nukleotydw zastpi sekwencje mikrosatelitarne nie tylko w kontroli pochodzenia, ale take w poszukiwaniach genw wanych z hodowlanego punktu widzenia, szacowaniu zmiennoci genetycznej i dystansu genetycznego. 271

Badacze niemieccy wybrali na razie 60 SNPs do kontroli pochodzenia u byda holsztysko-fryzyjskiego, brunatnego szwajcarskiego i simentali. Identyfikacji genotypu w loci tych markerw daje 99,99% prawdopodobiestwa wykluczenia. Sekwencje mikrosatelitarne s bardzo pomocne w analizie genetycznego ta cech ilociowych. Cechy uytkowe (ilociowe) s determinowane przez wiele genw o maym efekcie kadego z nich, dlatego identyfikacja ekspresji tych genw jest znacznie utrudniona. Prowadzone s badania w celu znalezienia takich genw, ktre maj znaczcy wpyw na ksztatowanie si cech uytkowych. Analiza asocjacji midzy markerami mikrosatelitarnymi a cechami ilociowymi jest pierwszym krokiem do identyfikacji genw wanych", czyli istotnych z hodowlanego punktu widzenia. Znajc sprzenie midzy okrelonym markerem genetycznym a np. wydajnoci biaka w mleku, mona dla modej jawki okreli, jaka bdzie warto tej cechy w przyszoci. Wykorzystujc markery mikrosatelitarne wykryto u byda kilka loci znajdujcych si w rnych chromosomach, warunkujcych cechy uytkowoci mlecznej (tab. 11-VI). U wi okrelono take regiony chromosomw sprzone z cechami uytkowoci misnej i rozpodowej (tab. 11-VII). Niektre cechy uytkowe wystpuj tylko u jednej pci lub nie mona ich zmierzy przyyciowe. Cechy takie mog by doskonalone jedynie poprzez selekcje poredni. Rozwj technik molekularnych przyczyni si do opracowania metody selekcji poredniej nazwanej MAS (ang. marker assisted selection). W metodzie tej kryterium wyboru zwierzcia jest jego genotyp w locus markera genetycznego wykazujcego asocjacj z doskonalon cech uytkow. Wikszo cech uytkowych o znaczeniu ekonomicznym ujawnia si fenotypowo u zwierzt w okrelonym wieku (np. cechy uytkowoci mlecznej). W takim przypadku selekcja porednia (MAS) jest znacznie bardziej intensywna i dokadna w porwnaniu z selekcj tradycyjn, a postp genetyczny jest uzyskiwany w krtszym czasie. Wynika to z moliwoci okrelenia genotypu u bardzo modych zwierzt. Badania asocjacji markerw genetycznych z cechami ilociowymi zaowocoway ju wykryciem u wikszoci gatunkw zwierzt gospodarskich sporej liczby loci genw wanych, o istotnym wpywie na cechy uytkowe. Okazao si, e niektre geny oddziaujce na warto cechy ilociowej maj ogromne znaczenie. Geny takie nazwano gwnymi lub genami o duym efekcie. Nale do nich midzy innymi geny warunkujce hipertrofi miniow u byda i owiec, zwikszon plenno wi, zwikszon podno owiec oraz geny biaek mleka -kazeiny i -laktoglobuliny (jest o nich mowa w rozdziale: Zmienno cech). W przypadku tych cech jest ju moliwa selekcja bezporednia, ktrej kryteriami s genotypy zwierzt w danych loci. Markery genetyczne, gwnie klasy II, s rwnie pomocne w doskonaleniu niektrych cech jakociowych. Przykadem tego jest wykorzystanie markerw mikrosatelitarnych do identyfikacji obecnoci w genotypie heterozygotycznym recesywnego allelu rogatoci u byda. Jest to cecha dziedziczca
272

si z dominacj cakowit, ktrej fenotyp jest taki sam u osobnika homozygotycznego i heterozygotycznego. Problem eliminacji z populacji genu rogatoci jest do istotny w krajach zachodnich, w ktrych coraz wicej uwagi powica si dobrostanowi zwierzt. Posiadanie rogw jest cech niekorzystn tak w aspekcie dobrostanu (gdy moe by przyczyn uszkodze ciaa), jak rwnie intensywnej hodowli (zasiniaczenia i ukryte
273

uszkodzenia tusz s przyczyn istotnych strat ekonomicznych w produkcji ywca). Stosowany w stadach byda misnego zabieg usuwania rogw powoduje cierpienie zwierzt oraz zmniejszenie ich dziennych przyrostw, ponadto jest zabiegiem kopotliwym. Aby tego unikn, coraz wicej uwagi powica si genetycznemu uwarunkowaniu bezronoci i moliwoci prowadzenia selekcji w tym kierunku. Dotychczas wiadomo jedynie, e locus polled, kontrolujcy bezrono/rogato u byda, wystpuje w l chromosomie. Identyfikacja nosicieli genu p moe by przeprowadzana za pomoc analizy polimorfizmu sprzonych z tym genem markerw genetycznych. Znane s ju dwie sekwencje mikrosatelitarne, sprzone z locus polled, ktre mog by wykorzystane do tego celu. Polimorfizm markerw genetycznych jest wykorzystywany w badaniach nad odpornoci/podatnoci zwierzt na rne choroby i zaburzenia genetyczne, dziki czemu nosiciele niekorzystnych alleli mog by wykrywani, zanim wystpi objawy chorobowe. Szczeglne znaczenie maj badania zwizku midzy antygenami/genami gwnego ukadu zgodnoci tkankowej (MHC) a wystpowaniem chorb, zwaszcza infekcyjnych. Zagadnienie to jest opisane w rozdziale: Genetyczne podstawy odpornoci i opornoci. W badaniach z zakresu genetyki populacji znajduj zastosowanie zarwno markery genetyczne klasy I, jak i klasy II. Zastosowanie frekwencji alleli markerw genetycznych klasy I do szacowania zmiennoci genetycznej wewntrz i midzy populacjami omwione zostao w rozdziale: Podstawy genetyki populacji. Znaczenie markerw genetycznych w hodowli zwierzt podkrela to, e s one wykorzystywane do analizy zmiennoci genetycznej w ramach programw wiatowej Strategii Zachowania Zasobw Genetycznych Zwierzt Gospodarskich FAO (Global Strategy for the Farm Animal Genetic Resources), w ktrej s uwzgldnione zasady midzynarodowego porozumienia Konwencji o Biologicznej Rnorodnoci. Zmienno genetyczna w obrbie ras gincych lub uznanych za zagroone jest okrelana na podstawie polimorfizmu markerw genetycznych, przede wszystkim polimorfizmu antygenw erytrocytarnych (grup krwi) i polimorfizmu DNA mikrosatelitarnego. Markery genetyczne s take niezwykle przydatne w szacowaniu stopnia zinbredowania (homozygotycznoci) poszczeglnych populacji (linii), w analizie podobiestw i rnic midzy populacjami i ustalaniu dystansu genetycznego midzy nimi. Szacowanie dystansu genetycznego i wybr ras, ktre cechuje dua zmienno genetyczna, suy zachowaniu biologicznej rnorodnoci zwierzt gospodarskich. Z kolei ocena zmiennoci genetycznej midzy populacjami (liniami) uatwia wybr optymalnego wariantu krzyowania, a w krzyowaniu towarowym uzyskanie maksymalnego efektu heterozji, ujawniajcego si gwnie zwikszeniem wydajnoci cech uytkowych zwierzt. Charakterystyka wybranych markerw genetycznych pozwala ledzi wpyw pracy selekcyjnej na struktur genetyczn danej populacji, jak okrelone geny ulegaj eliminacji rwnolegle z eliminacj cech niekorzystnych z hodowlanego punktu widzenia.
274

Rozdzia

12

Mapy genomowe

Genom jest pojciem okrelajcym zbir informacji genetycznej zawartej w gamecie. Skada si na ni przede wszystkim DNA jdra komrkowego oraz DNA wystpujcy w mitochondriach (mtDNA). Poniewa dugo czsteczki mtDNA jest niezmiernie maa w porwnaniu z DNA haploidalnego zestawu chromosomw, dlatego pojcie genomu odnoszone jest do DNA jdrowego. Genom moe by opisany za pomoc kilku parametrw. Po pierwsze, jest to haploidalna liczba chromosomw charakterystyczna dla gatunku. Drugim parametrem jest czna dugo DNA wystpujcego w haploidalnym zestawie chromosomw. Wielko ta zawiera si u ssakw w przedziale midzy 2 a 3 miliardy par zasad. Wreszcie genom moe by opisany za pomoc cakowitej liczby loci genw. Przyjmuje si, e w genomie ssakw wystpuje okoo 35 tysicy genw. Odlegoci midzy sprzonymi ze sob genami mona wyrazi za pomoc jednostki wzgldnej centymorgana (cM), ktra odzwierciedla czsto zachodzenia crossing over midzy loci sprzonych genw. Cakowita dugo genomu u ssakw, wyraona w cM, mieci si w przedziale od 1600 cM (mysz) do 3200 cM (czowiek). U zwierzt gospodarskich wielko ta oscyluje wok 2500 cM. Rozmieszczenie loci genw w genomie jest nierwnomierne. Miejscami silnie nasyconymi genami s regiony wystpujce na kocach ramion chromosomowych. Tam te znacznie czciej zachodzi crossing over. Miejsca te mona wybarwi metod barwienia prkowego typu T.

12.1. Organizacja DNA jdrowego


W obrbie genomu wystpuj zarwno sekwencje kodujce, czyli geny, jak i sekwencje niekodujce. Zdecydowanie przewaaj sekwencje niekodujce, ktre stanowi okoo 97% caego DNA (ry. 12-1). Sekwencje powtarzalne
275

dzieli si na dwie podstawowe grupy: a) sekwencje powtarzajce si tandemowo i b) elementy nukleotydowe. Cech charakterystyczn sekwencji powtarzajcych si tandemowo jest to, e dana sekwencja nukleotydw (ukad podstawowy) wystpuje w wielu miejscach genomu, ale w kadym z tych miejsc (loci) sekwencja ta powtarza si wielokrotnie w ukadzie tandemowym (jeden za drugim). Zalenie od dugoci ukadu podstawowego sekwencje powtarzalne dzielone s na mikrosatelitarne (do 10 nukleotydw) i minisatelitarne (powyej 10 nukleotydw). W genomie wystpuj due skupienia sekwencji niekodujcych w obrbie heterochromatyny konstytutywnej, ktr uwidocznia si metod barwienia prkami C. Niezalenie od tego, sekwencje powtarzalne s rozproszone rwnie w obszarach euchromatynowych. Sekwencje mikrosatelitarne okazay si bardzo bogatym rdem wysoce polimorficznych markerw genetycznych. Szacuje si, e w genomie ludzkim sekwencje te pojawiaj si przecitnie co kilka tysicy par zasad. Oznacza to, e genom jest bardzo silnie nimi nasycony. Szczeglnie cenne, z punktu widzenia przydatnoci tych sekwencji do analizy genetycznej, jest to, e liczba powtrze danego ukadu podstawowego wykazuje w obrbie
276

populacji silne zrnicowanie. Inaczej mwic, dla danego locus funkcjonuj niejednokrotnie dugie serie alleli wielokrotnych, ktre rni si midzy sob liczb powtrze podstawowego ukadu nukleotydw. Szczeglnym przykadem sekwencji mikrosatelitarnych ze wzgldu na funkcj biologiczn, jest sekwencja telomerowa (TTAGGG/AATCCC), ktra stanowi zakoczenia ramion chromosomowych. Funkcj biologiczn tych sekwencji jest ochrona zakocze chromosomw przed degradacj podczas kolejnych replikacji. Skrceniu ulegaj wanie sekwencje telomerowe. Na chromosomach ludzkich kady telomer zawiera od 250 do 1500 powtrze tej sekwencji. W przypadku sekwencji minisatelitarnych stopie rwnomiernoci rozproszenia w genomie jest mniejszy. Zazwyczaj s one zlokalizowane w czciach dystalnych tzn. w pobliu kocw ramion chromosomw. Elementy nukleotydowe to takie sekwencje, ktre rwnie s rozproszone w wielu miejscach genomu, ale w danym miejscu wystpuje tylko jedna kopia sekwencji. Podobnie jak poprzednio, sekwencje te dzieli si na dwie grupy zalenie od ich dugoci: a) SINE (short interspersed nucleotide element), ktrych dugo mieci si poniej 500 pz oraz b) LINE (long interspersed nucleotide element), ktrych dugo jest powyej 500 pz i moe dochodzi do kilku tysicy pz. Przykadem elementu nukleotydowego z grupy SINE jest rodzina sekwencji Alu, ktrej nazwa pochodzi od enzymu restrykcyjnego majcego miejsce cicia czsteczki DNA w obrbie tej sekwencji. Sekwencje te bardzo czsto s zlokalizowane w okolicach centromerw. Funkcja sekwencji powtarzalnych, z wyjtkiem sekwencji telomerowych, jest do tej pory sabo rozpoznana. Przy okazji bada molekularnych kompleksw synaptonemalnych okazao si, e sekwencje te, podobnie jak elementy nukleotydowe, le w pobliu biakowych struktur kompleksw. Moe to wiadczy o roli tych sekwencji w kotwiczeniu domen pdowych DNA w strukturze biakowej kompleksu synaptonemalnego. Organizacja chromatyny w jdrze interfazowym charakteryzuje si pewnymi szczeglnymi cechami. Wiadomo, e utrzymywana jest w nim nukleosomowa organizacja nici chromatynowej. Poszczeglne chromosomy zajmuj w jdrze wyodrbnione domeny, przy czym domeny chromosomw homologicznych zazwyczaj nie kontaktuj si ze sob. Z kolei czci chromosomw zbudowane z heterochromatyny konstytutywnej pozostaj mocniej skondensowane i niejednokrotnie wykazuj tendencje do tworzenia chromocentrw, w ktrych asocjuje heterochromatyna z kilku chromosomw.

12.2. Organizacja DNA mitochondrialnego


Badania na zwierztach i rolinach przyczyniy si do wykrycia obecnoci informacji DNA poza jdrem komrkowym w mitochondriach (u rolin i zwierzt) i chloroplastach (u rolin).
277

Mitochondria nale do organelli komrkowych przeksztacajcych energi. W nich odbywa si wikszo reakcji oddychania komrkowego. Niektre biaka uczestniczce w oddychaniu nie mog przechodzi przez bony organelli, zatem musz by syntetyzowane wewntrz mitochondriw. Informacja o skadzie aminokwasowym tych biaek jest zapisana w mitochondrialnym DNA. Wiadomo ju, e mitochondrialny DNA (mtDNA) koduje biaka bdce skadnikami mitochondrialnego acucha oddechowego i systemu fosforylacji oksydacyjnej (ang. oxidative phosphorylation OXPHOS), poza tym 2 rodzaje rRNA i 22 rodzaje tRNA. Cakowita liczba genw w ludzkim mtDNA wynosi 37. Geny kodujce biaka i rRNA s od siebie oddzielone genami kodujcymi tRNA. Biaka bdce podjednostkami enzymw acucha oddechowego (np. ubichinon/koenzym Q, cytochrom c czy oksydoreduktaza) nale do piciu kompleksw oznaczonych cyframi rzymskimi I-V, przy czym kompleks V jest to syntaza ATP. Wikszo biaek wchodzcych w skad tych kompleksw jest kodowana przez DNA jdrowy, a tylko cz przez mtDNA. Porwnanie liczby podjednostek biakowych kodowanych przez DNA mitochondrialny i jdrowy zawiera ponisze zestawienie.

Struktura mtDNA jest inna ni DNA jdrowego, mtDNA jest bowiem kolisty. Jego dugo wynosi okoo 16 tysicy par zasad. Wikszo komrek zawiera od tysica do 10 ty. kopii mtDNA. Jedynie w oocytach II rzdu liczba kopii jest wyranie wiksza i siga okoo 100 ty. Zwielokrotnienie liczby kopii w oocycie jest czci przygotowa tej komrki do podoania przez zygot wymaganiom energetycznym zwizanym z wczesnym rozwojem zarodka lub zapewnieniem wystarczajcej liczby kopii mtDNA dla pierwszych blastomerw zarodka, w ktrych by moe replikacja mtDNA nie zachodzi.

278

DNA wystpujcy w mitochondriach nie jest powizany z biakami, w odrnieniu od DNA jdrowego. Prawie cay mtDNA zawiera sekwencje kodujce, a sekwencje powtarzajce si tandemowo s reprezentowane bardzo nielicznie. Kolejn cech charakterystyczn mtDNA jest to, e geny mitochondrialne nie zawieraj intronw, co wicej, transkrypcji podlegaj obie nici kolistego DNA, a niektre geny nawet nakadaj si na siebie. acuchy komplementarne, wchodzce w skad czsteczki mtDNA, rni si udziaem nukleotydw i dlatego wyodrbnia si acuch ciki (H), ktry ma wikszy udzia nukleotydw guanylowych G i tymidylowych - T ni acuch lekki (L). Na acuchu cikim wystpuje 12 genw kodujcych biaka oraz 14 genw kodujcych czsteczki tRNA i 2 geny kodujce rRNA, a na acuchu lekkim umiejscowiony jest tylko jeden gen kodujcy biako i 8 genw kodujcych czsteczki tRNA. W strukturze acucha cikiego wyrnia si rwnie ptl D, w ktrej obrbie wystpuje potrjna struktura DNA, uformowana przez krtki fragment nowego acucha H, pozostajcy w asocjacji z czsteczk macierzyst. W mtDNA wystpuje jedno miejsce inicjujce transkrypcj, ktra przebiega rwnoczenie, ale w przeciwnych kierunkach, na obu acuchach. Rola i zachowanie si mtDNA w dziedziczeniu pozajdrowym opisane s w rozdziale: Podstawowe mechanizmy dziedziczenia cech.

12.3. Markerowa mapa genomu


Wiedza o lokalizacji genw oraz sekwencji niekodujcych w DNA jdrowym jest bardzo sabo rozwinita w porwnaniu z wiedz o mapie mtDNA. Dlatego w dalszej czci tego rozdziau bd omwione zagadnienia zwizane z poznawaniem (mapowaniem) DNA jdrowego, ktry stanowi dominujc cz genomu. Markerowa mapa genomu jest zbiorem informacji o: a) pooeniu loci sekwencji kodujcych, tzn. genw (markery klasy I), i niekodujcych, czyli tandemowo powtarzajcych si sekwencji anonimo wych (markery klasy II) w chromosomach, b) stopniu polimorfizmu w obrbie znanych loci (wykaz alleli), c) odlegociach genetycznych, wyraonych w cM, pomidzy sprzo nymi loci oraz ich uszeregowaniu. Mapa, ktra wskazuje pooenia loci w chromosomach, nazywa si cytogenetyczn lub fizyczn map genomu. Z kolei mapa opisujca sprzenia, uszeregowanie i odlegoci genetyczne pomidzy takimi loci okrelana jest terminem genetycznej lub sprzeniowej mapy genomu. Poniewa mapy genomowe budowane s przede wszystkim na bazie polimorficznych markerw genetycznych, dlatego niejednokrotnie mwi si o markerowej mapie genomu.
279

12.3.1. Fizyczna mapa genomu


Podstawow, ale nie jedyn, metod mapowania fizycznego jest hybrydyzacja in situ pomidzy zdenaturowan i wyznakowan sond DNA a zdenaturowanymi chromosomami metafazowymi utrwalonymi na preparacie mikroskopowym. Sonda jest to sklonowana molekularnie sekwencja nukleotydowa, reprezentujca gen (lub jego cz) bd fragment DNA obejmujcy niekodujc sekwencj, na przykad mikrosatelit marker klasy II. Czsto sond stanowi tzw. cDNA (komplementarny DNA) genu. Jest to taka sekwencja nukleotydowa, ktra powstaa na drodze syntezy DNA z udziaem enzymu odwrotnej transkryptazy na bazie wyizolowanego mRNA. Tak utworzony cDNA jest wbudowywany do wektorw i klonowany. Rnica midzy DNA genu a jego cDNA polega na tym, e w cDNA nie wystpuj introny, poniewa w mRNA, na bazie ktrego syntetyzowano cDNA, sekwencje intronowe zostay ju wczeniej wycite podczas obrbki potranskrypcyjnej (ang.

280

Ry. 12-3. Lokalizacja markera mikrosatelitarnego ZuBeCa4 metod fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. FISH) na chromosomie 3 psa; (a) chromosomy barwione metod prkw Q; (b) ta sama metafaza po hybrydyzacji; jasne punkty wskazuj miejsce, gdzie sonda hybrydyzowaa z DNA chromosomu

splicing). Schemat mapowania genw metod hybrydyzacji in situ jest przedstawiony na rycinie 12-2. Trzeba podkreli, e do identyfikacji chromosomu, zgodnie z przyjtym wzorcem kariotypu, wykorzystuje si techniki prkowego barwienia (G, Q lub R), ktre stosuje si albo przed hybrydyzacj, albo po hybrydyzacji. Miejsce, w ktrym sonda poczy si z DNA chromosomu, jest rozpoznawane przez obserwacj mikroskopow, dziki wyznakowaniu sondy pierwiastkiem promieniotwrczym lub analogiem jednego z nukleotydw, zwizanego z barwnikiem fluorescencyjnym (ry. 12-3). Hybrydyzacj in situ ma wiele odmian, ktre w ostatnim czasie s szeroko wykorzystywane do opisu genomu zwierzt. Warto wspomnie o dwch: tzw. malowaniu chromosomw (ang. chromosome painting) i mapowaniu na chromatynie jder interfazowych. Malowanie chromosomw polega na zastosowaniu sondy, ktra zawiera unikatowe sekwencje DNA wybranego chromosomu. Pierwszym etapem prowadzcym do uzyskania takiej sondy jest pozyskanie jednorodnej frakcji wybranego chromosomu na drodze ich sortowania w cytometrze przepywowym lub mikrodysekcji przeprowadzonej za pomoc mikromanipulatora na preparacie mikroskopowym. Kolejnym etapem jest amplifikacja (metoda PCR) lub klonowanie molekularne fragmentw DNA tego chromosomu. W trakcie amplifikacji blokowane s sekwencje powtarzalne i dziki temu nastpuje zwielokrotnienie unikatowych sekwencji nukleotydowych danego chromosomu. Przeprowadzenie hybrydyzacji in situ z uyciem takiej sondy daje efekt w postaci sygnau (np. wiecenie barwnika flurescencyjnego zwizanego z sond) na obszarze caego chromosomu (ry. 12-4 wkadka kolorowa). Stosowanie techniki malowania chromosomw umoliwia detekcj mutacji genomowych (gwnie aneuploidii) i chromosomowych. Podejcie takie jest alternatywne w stosunku do klasycznej procedury opartej na identyfikacji chromosomw za pomoc barwie prkowych. Ponadto, technika ta wykorzystywana jest do identyfikacji homologii midzy chromosomami rnych gatunkw. Analiz tak okrela si terminem porwnawczego malowania chromosomw (ang. comparative chromosome 281

painting) i polega ona na tym, e sond chromosomowo specyficzn, utworzon dla jednego gatunku (np. czowieka), stosuje si do hybrydyzacji na preparatach chromosomowych pochodzcych od innego gatunku (np. byda). W ten sposb mona wskaza, ktre chromosomy byda zawieraj fragmenty homologiczne wzgldem konkretnego chromosomu ludzkiego. Przeprowadzone eksperymenty ujawniy, e w genomach byda, konia czy wini mona zidentyfikowa ponad czterdzieci fragmentw chromosomowych, ktre s malowane" sondami reprezentujcymi wszystkie chromosomy czowieka (tab. 12-1). Dowodzi to, e zmiany na poziomie chromosomowym, jakie zaszy podczas ewolucji, s bardzo zoone. Naley jednak

282

zaznaczy, e metoda malowania chromosomw ma ograniczon dokadno, przyjmuje si bowiem, e sonda chromosomowo specyficzna da widoczny sygna, jeeli obejmuje segment dugoci co najmniej kilku milionw par zasad. Du rol w postpie mapowania genomw odegraa metoda hybrydyzacji komrek somatycznych. Polega ona na tym, e w warunkach in vitro doprowadza si do poczenia komrek pochodzcych od dwch rnych gatunkw, np. mysich komrek nowotworowych, utrzymywanych w hodowli, z fibroblastami pochodzcymi z mini czy skry byda. Komrki takie po poczeniu powinny mie liczb chromosomw odpowiadajc sumie liczb diploidalnych u obu gatunkw, czyli 40 (mysz) plus 60 (bydo) daje 100 chromosomw. Okazuje si jednak, e jeeli takie komrki s hodowane w warunkach in vitro, to stopniowo gubione" s chromosomy, ktre nie pochodz z komrek nowotworowych. W tym przypadku s to chromosomy byda. W rezultacie mona wyprowadzi klony (komrki bdce potomstwem jednej wyjciowej komrki), ktre bd si midzy sob rniy liczb zachowanych chromosomw byda. Liczba zachowanych chromosomw zazwyczaj jest rzdu kilku, ale czasami moe si zdarzy tak, e tylko pojedyncze chromosomy byda zostan zachowane w danym klonie komrkowym. Tak wyprowadzone klony poddawane s analizie elektroforetycznej, ktrej celem jest identyfikacja biaek lub markerw DNA typowych dla komrek gatunku, ktrego genom jest badany w tym przykadzie s to komrki bydlce. Objcie badaniami duej liczby klonw stwarza moliwo wykrycia w komrkach hybrydowych loci, ktre zawsze pojawiaj si razem. Sytuacja taka wiadczy o tym, e grupa tych loci jest pooona w tym samym chromosomie. Loci takie nazywa si syntenicznymi. 0 ich umiejscowieniu wiadomo jedynie tyle, e s pooone w jednym chromosomie. Nie mona natomiast wskaza, ktry jest to chromosom 1 w jakim regionie mieszcz si badane loci, nieznana pozostaje rwnie wzajemna odlego midzy nimi. Lokalizacja chromosomowa grup syntenicznych wymaga przeprowadzenia bada cytogenetycznych, ktrych celem jest identyfikacja chromosomu (-w) gatunku mapowanego w danym klonie hybrydowym. Do techniki uzyskiwania hybrydowych linii komrek somatycznych zostaa ostatnio wprowadzona istotna modyfikacja. Polega ona na poddawaniu komrek gatunku mapowanego, przed hybrydyzowaniem z komrkami nonikowymi (np. komrki nowotworowe myszy), nawietlaniu promieniami jonizujcymi. Efektem nawietlania jest powstanie licznych pkni czsteczek DNA, a zatem fragmentacja chromosomw. Komrki z pofragmentowanymi chromosomami poddawane s hybrydyzacji, podczas ktrej dochodzi do fuzji fragmentw chromosomowych z chromosomami komrek nonikowych. W ten sposb w komrkach hybrydowych zachowane s fragmenty chromosomw gatunku mapowanego. Na przykad, nawietlanie fibroblastw psa promieniowaniem o dawce 5000 radw dao fragmenty o redniej wielkoci okoo 16,6 milionw par zasad, a w kadej
283

z uzyskanych linii hybrydowych zachowane fragmenty chromosomowe stanowiy okoo 20% genomu psa. Tak zmodyfikowan technik hybrydyzacji komrek somatycznych okrela si terminem mapowania radiacyjnego. Zalet tej techniki mapowania jest moliwo identyfikacji loci markerowych pooonych bardzo blisko siebie, na tyle blisko, e klasyczne mapowanie sprzeniowe nie pozwala na okrelenie odlegoci genetycznej, ze wzgldu na zbyt mae prawdopodobiestwo zajcia crossing over. Dotyczy to szczeglnie loci o niskim stopniu polimorfizmu, w takim przypadku bowiem analiza segregacji alleli (mapowanie genetyczne) jest nieefektywna. Dawki promieniowania jonizujcego, wykorzystywane w mapowaniu radiacyjnym, wynosz zazwyczaj 5 ty., 7 ty. lub 12 ty. radw. Wielko uzyskiwanych fragmentw chromosomowych zaley od dawki promieniowania jonizujcego czym wiksza dawka, tym mniejsze fragmenty. Uzyskiwanie maych fragmentw chromosomowych zwiksza rozdzielczo mapowania, przez ktr rozumie si najmniejsz odlego midzy loci ssiednich markerw moliw do wykrycia.

12.3.2. Genetyczna mapa genomu


Analiza segregacji alleli w loci markerowych, u potomstwa osobnikw o znanych genotypach, suy tworzeniu genetycznej mapy genomu. Kolejno postpowania jest nastpujca. Najpierw poszukuje si sprze pomidzy loci. Dalej, na podstawie liczby zidentyfikowanych rekombinantw szacuje si odlegoci genetyczne (cM) midzy sprzonymi loci, ktre odzwierciedlaj czsto, z jak zachodzio crossing over midzy nimi podczas gametogenezy u rodzicw. Poznanie wzajemnych odlegoci midzy sprzonymi loci stwarza warunki do poznania ich uszeregowania, w czym pomocne moe by przeanalizowanie rodzin z rwnoczesnym uwzgldnieniem trzech loci (tzw. krzywka trjpunktowa). Jednostk odlegoci genetycznej jest l cM. Odlego taka oznacza, e crossing over midzy dwoma sprzonymi loci zachodzi jeden raz na sto podziaw mejotycznych. Do wykrywania sprze jest stosowana powszechnie funkcja zwana logarytmem ilorazu wiarogodnoci (ang. loci).

L - - funkcja wiarogodnoci, obliczana jako prawdopodobiestwo wystpienia okrelonych genotypw, przy zaoonym wspczynniku rekombinacji (r), wzgldem hipotezy alternatywnej, przyjmujcej niezalene dziedziczenie (r = 0,5) r - - wspczynnik rekombinacji, zawierajcy si w przedziale (0; 0,5) Badanie sprzenia dokonuje si poprzez analiz segregacji genw w dwch loci. W tym celu korzysta si z wiedzy o genotypach osobnikw
284

nalecych do rodzin co najmniej dwupokoleniowych. Jednak nie wszystkie kojarzenia s informatywne. Jeeli oboje rodzice s homozygotami w obu loci, to oczywicie identyfikacja segregantw jest niemoliwa. Z kolei, jeeli oboje rodzice s heterozygotami o identycznych allelach, to niemoliwe jest ustalenie fazy (cis lub trans), w jakiej allele analizowanych loci wystpuj u rodzicw. Tego typu kojarzenie te nie jest informatywne. Wynika z tego, e informatywne s kojarzenia typu podwjna heterozygota z podwjn homozygot lub kojarzenie midzy heterozygotami, u ktrych w badanych loci wystpuj rne alele. Obliczenie wartoci loci przeprowadza si dla z gry zaoonych wartoci wspczynnika rekombinacji (r), mniejszych ni 0,5. Jeeli warto loci, dla niektrych wielkoci wspczynnika rekombinacji, bdzie wiksza ni 3,0, to oznacza, e analizowane loci s ze sob sprzone. Najwiksz warto loci przewyszajc 3,0 uznaje si za oszacowanie wspczynnika r, czyli czstoci, z jak dochodzi do rekombinacji midzy analizowanymi loci. Warto loci mniejsza ni 2 oznacza, e dla testowanej wartoci wspczynnika r nie stwierdza si sprzenia midzy analizowanymi loci. Natomiast wartoci z przedziau ( 2; 3) nie pozwalaj na wycignicie jednoznacznego wniosku dotyczcego sprzenia, czyli analizowany materia rodzinowy by zbyt may lub loci byy ze sob na tyle sabo sprzone, e zachowuj si tak jakby si dziedziczyy niezalenie. Badanie sprzenia polega na wyliczaniu wartoci loci dla kolejnych wielkoci wspczynnika r (np. 0,1; 0,2; 0,3; 0,4). Jeli dla wszystkich testowanych wielkoci wspczynnika r warto loci jest mniejsza ni 2,0, to mona przyj, e badane geny nie s ze sob sprzone. Pojawienie si wartoci loci powyej 3,0 dowodzi, e geny s ze sob sprzone i rwnoczenie poznajemy wspczynnik r. Jeli warto loci mieci si midzy 2,0 i 3,0, to naley zwikszy liczb badanych rodzin, tak aby doj do wicych wnioskw. Po ustaleniu, e loci s ze sob sprzone, mona przystpi do oszacowania odlegoci genetycznej midzy nimi. W tym celu wykorzystywana jest tzw. funkcja Kosambiego (x), ktra wyraa odlegoci genetyczne midzy sprzonymi loci w centymorganach (cM).

r - - oszacowana czsto rekombinacji midzy analizowanymi loci Funkcja ta uwzgldnia dwie okolicznoci wpywajce na czsto identyfikowanych zjawisk crossing over. Po pierwsze, bierze pod uwag to, e identyfikacja rekombinantw w potomstwie pozwala na wykrycie tylko nieparzystych przypadkw crossing over, parzysta ich liczba bowiem nie zmienia ukadu alleli w chromatydzie i tym samym nie pojawiaj si w potomstwie osobniki o zrekombinowanym ukadzie alleli. Po drugie, brane jest pod uwag zjawisko interferencji, polegajce na tym, e zajcie crossing over w danym miejscu wpywa ograniczajco na moliwo
285

powtrnego wystpienia crossing over w pobliu. Naley podkreli, e do obliczania funkcji loci oraz funkcji Kosambiego opracowano programy komputerowe. Wyniki bada nad czstoci crossing over ujawniy ciekaw zaleno polegajc na tym, e dugo genetyczna chromosomu, szacowana na podstawie rekombinacji zachodzcej w gametogenezie eskiej, jest zazwyczaj wiksza, anieli w przypadku gdy podstaw takiego oszacowania byy rekombinacje zachodzce podczas spermatogenezy (ry. 12-5). Mona zatem sdzi, e w oogenezie crossing over zachodzi czciej anieli w spermatogenezie. Brak jest jednoznacznej odpowiedzi na pytanie, dlaczego tak jest. By moe prawidowo ta wynika ze specyfiki spermatogenezy, podczas ktrej jest wytwarzanych nieporwnanie wicej gamet ni podczas oogenezy i dlatego eska rekombinacja wewntrzchromatydowa (crossing

286

over) zachodzi z wikszym nasileniem, aby dorwna ogromnej zmiennoci genetycznej wrd plemnikw. Trzeba te pamita, e chiazmy utrzymuj struktur biwalentu w oocycie przez znacznie duszy czas ni w sperma tocy ci. Naley rwnie podkreli, e odlegoci genetycznej (cM) midzy sprzonymi loci nie mona w bezporedni sposb przelicza na odlegoci fizyczne, mierzone np. liczb par zasad, jaka je dzieli. Przyjmuje si z duym przyblieniem, e odlego 1 cM odpowiada dugoci czsteczki DNA, liczcej okoo jednego miliona par zasad. Brak prostej zalenoci midzy odlegoci wzgldn i bezwgldn wynika z tego, e losowo zachodzenia crossing over jest ograniczona tym, i w chromosomie s obszary, gdzie zachodzi ono znamiennie czciej (prki T), oraz takie, gdzie zdarza si bardzo rzadko (heterochromatyna konstytutywna).

12.3.3. Strategia mapowania genomu


Markerowa mapa genomu powinna charakteryzowa si kilkoma cechami, ktre wyznaczaj jej warto poznawcz i aplikacyjn. Po pierwsze, markery genetyczne powinny by moliwie wysoce polimorficzne, tzn. w puli genowej populacji powinna wystpowa moliwie duga seria alleli wielokrotnych. Wykrycie w drugiej poowie lat 80. wysoce polimorficznych sekwencji anonimowych typu mini- i mikrosatelitarnego spowodowao, e markery zostay podzielone na dwie klasy. Do klasy I zostay zaliczone klasyczne markery genetyczne (sekwencje kodujce, czyli geny). Polimorfizm tych markerw identyfikowany jest na poziomie produktu, za pomoc metod serologicznych ukady grupowe krwi, antygeny gwnego ukadu zgodnoci tkankowej itd. lub elektroforezy polimorficzne biaka surowicy krwi, mleka itd. Moliwe jest rwnie wykrywanie polimorfizmu tych markerw poprzez badanie polimorfizmu DNA tych genw metodami opartymi na elektroforezie (RFLP i SSCP). W grupie markerw klasy II znalazy si wszystkie rodzaje polimorfizmu zwizane z niekodujcymi sekwencjami nukleotydowymi, a wrd nich gwn rol odgrywaj sekwencje mikrosatelitarne. Metody analizy ich polimorfizmu opisano w rozdziale: Markery genetyczne. Wan cech mapy genomu jest rwnomierno rozproszenia loci markerowych. Pocztkowo zakadano, e stopie rwnomiernoci powinien by taki, aby maksymalna odlego genetyczna midzy dwoma dowolnymi ssiednimi loci nie przekraczaa 20 cM. Spenienie tego warunku stwarza sytuacj, w ktrej dowolny locus genu znajduje si w odlegoci nie wikszej ni 10 cM od jakiego markera. Odlego taka pozwala zidentyfikowa pooenie dowolnego genu, gdy w badaniach rodzinowych analizowane loci markerowe byyby rozproszone rwnomiernie w caym genomie, a gen bdcy obiektem zainteresowania byby reprezentowany w analizowanej
287

rodzinie przez wicej ni jeden allel. Obecnie stopie nasycenia map genomowych podstawowych gatunkw zwierzt gospodarskich jest znacznie wikszy i w przypadku byda oraz wi ksztatuje si poniej poziomu 3 cM. Kolejn istotn cech mapy genomu jest informatywno jej mapy fizycznej. Zakada si, e na kadym ramieniu chromosomu powinny by zlokalizowane co najmniej dwa markery, jeden w pobliu centromeru (marker proksymalny), a drugi w kocowej czci ramienia (marker dystalny). Spenienie tego kryterium dowodzi, e na obszarze caego genomu zostay zlokalizowane markery genetyczne. Ostatecznym celem programw budowania map genomowych jest stworzenie zintegrowanej mapy, tzn. takiej, w ktrej wszystkie grupy genw sprzonych oraz syntenicznych maj znan lokalizacj chromosomow. Taka mapa moe by przedmiotem porwnania z najbardziej rozwinitymi mapami, do ktrych zalicza si map genomu czowieka i myszy. Porwnanie to odnosi si przede wszystkim do lokalizacji tzw. loci zakotwiczonych (ang. anchor loci). Nale one do markerw klasy I, o ktrych wiadomo, e s rwnomiernie rozproszone w genomie czowieka, myszy, kota i byda. Z przeprowadzonych bada porwnawczych wynika, e w genomach tych gatunkw odlegoci midzy dwoma dowolnymi loci zakotwiczonymi mieszcz si w granicach od 5 do 10 cM. Przyjmuje si, e ich lokalizacja odzwierciedla obszary konserwatywne pod wzgldem ewolucyjnym. Konserwatyzm genetyczny jest rwnie czsto wykorzystywany w mapowaniu fizycznym markerw klasy I. Polega to na tym, e sondy molekularne uzyskane na bazie genomu jednego gatunku s przydatne do mapowania tego genu w genomie innego gatunku. Spenienie podstawowych warunkw dotyczcych nasycenia mapy fizycznej i genetycznej genomu oznacza, e w przypadku genomu gatunkw ssakw, ktrych wielko wynosi okoo 2500 cM, minimalna liczba rwnomiernie rozproszonych (na poziomie 20 cM) polimorficznych markerw genetycznych wynosi okoo 120. Oczywicie jest to rozwaanie czysto teoretyczne, poniewa przystpujc do mapowania kolejnych markerw nie mona przewidzie, w ktrym miejscu mog one mie swoje loci. Moe si zdarzy tak, e wiele takich markerw zostanie zlokalizowanych w niewielu tylko chromosomach, lub wrcz w niektrych ich regionach. Wynika z tego wniosek, e osignicie stanu rwnomiernego nasycenia mapy markerami genetycznymi wymaga zmapowania o wiele wikszej liczby loci, niby to wynikao z teoretycznego wyliczenia. Wysikom skierowanym na tworzenie mapy markerowej towarzysz prace, ktrych celem jest identyfikacja genw kontrolujcych cechy uytkowe zwierzt lub istotnie na nie wpywajcych. Osignicie tego celu wymaga skrupulatnych obserwacji zmiennoci fenotypowej interesujcej cechy w tzw. rodzinach referencyjnych. S to zazwyczaj trzypokoleniowe rodziny, w ktrych rodzice wywodz si z odlegych genetycznie ras lub nawet blisko spokrewnionych gatunkw (np. winia domowa i winia dzika lub bydo domowe i bydo zebu). Duy dystans genetyczny (patrz rozdzia: Podstawy
288

genetyki populacji) wskazuje, e pule genowe tych ras s inne zarwno ze wzgldu na wystpowanie w populacjach rnych alleli dla danego locus, jak i rnic we frekwencji tych samych alleli. Zrnicowanie to dotyczy tak loci markerowych, jak i loci genw wpywajcych na ksztatowanie si cech bdcych obiektem zinteresowania hodowcy. Skrzyowanie tak dobranych rodzicw daje wysoce heterozygotyczne pokolenie Fl, ktre jest kojarzone midzy sob w celu uzyskania pokolenia F2. W pokoleniu F2 analizuje si odlegoci genetyczne midzy markerami oraz asocjacje midzy markerami i cechami uytkowymi, bdcymi obiektem zainteresowania hodowcw. Zbudowanie markerowej mapy genomowej, ktra mogaby by uytecznym narzdziem sucym do identyfikacji genw kontrolujcych wane cechy uytkowe, jest zadaniem wymagajcym wsppracy specjalistw z wielu dziedzin, takich jak: genetyka molekularna, immunogenetyka, cytogenetyka czy biometria. Przekracza to zatem moliwoci pojedynczych zespow badawczych. Na pocztku lat 90. zostay utworzone midzynarodowe programy badawcze. Jako pierwszy powsta program Mapowania Genomu wini - - PiGMaP. W przedsiwzicie to zostao wczonych kilkanacie laboratoriw, wywodzcych si z pastw Wsplnoty Europejskiej. Rok pniej, na podobnych zasadach, powoano Program Mapowania Genomu Byda BovMap. W tym programie zarejestrowano udzia ponad dwudziestu laboratoriw. Oprcz tych dwch wiodcych programw rozwijay si inne midzynarodowe przedsiwzicia, zmierzajce do stworzenie mapy genomu kury, konia, owcy, kozy czy psa (DogMap). W niektrych programach bior udzia rwnie polskie laboratoria (mapa genomu konia i psa, a take wini). Ponadto, powstao wiele przedsiwzi realizowanych przez laboratoria jednego kraju. Na przykad, w Polsce prowadzono badania w ramach Polskiego Projektu Mapowania Genomu wini, ktry by realizowany w ramach wsppracy midzy trzema zespoami badawczymi. Gwnym celem tego projektu byo poszukiwanie genw gwnych, oddziaujcych istotnie na ksztatowanie cech zwizanych z tuczem i uytkowoci rzen.

12.3.4. Aktualny stan map genomowych zwierzt gospodarskich


Dynamiczny rozwj bada nad mapami genomowymi utrudnia prezentacj aktualnego stanu wiedzy z tego zakresu. Nieomal kady dzie przynosi nowe informacje wzbogacajce mapy rnych gatunkw. Dane pochodzce z drugiej poowy 1996 roku wykazay, e w genomie byda opisano ju ponad 1600 loci, a w genomie wini ponad 1300 loci. Rok pniej liczba ta wzrosa do 3300 u byda i 1600 u wini. Wrd loci markerowych zdecydowanie przewaaj markery klasy II, a bardzo wane jest to, e s one rwnomiernie rozproszone w genomach obu gatunkw. Oczywicie s
289

regiony silniej nasycone markerami, gdzie odlego midzy ssiednimi loci wynosi poniej l cM, ale s rwnie i takie, gdzie odlego ta siga 20 cM. Mona jednak stwierdzi, e zakadany na pocztku lat 90. podstawowy cel, polegajcy na zbudowaniu mapy, w ktrej odlego midzy dowolnymi ssiednimi loci nie bdzie wiksza ni 20 cM, zosta w odniesieniu do genomu byda i wini ju osignity (tab. 12-11). Opracowana w 1997 roku mapa genetyczna genomu byda, oparta na analizie segregacji 1240 markerw, charakteryzuje si znacznym nasyceniem loci markerowych. rednia odlego midzy dwoma dowolnymi ssiednimi loci wyniosa 2,5 cM. Ogln dugo genomu, bdc sum czstkowych odlegoci midzy kolejnymi loci w chromosomach, oszacowano na poziomie 2990 cM. W przypadku wini map skonstruowano na podstawie analizy segregacji 1042 loci. rednia odlego midzy ssiednimi loci wyniosa 2,2 cM, a oglna dugo genomu 2286 cM. Prawie wszystkie badane loci naleay do kategorii anonimowych sekwencji mikrosatelitarnych. Na uwag zasuguje bardzo rozwinita mapa genomu kury (tab. 12-11). Zauway trzeba nie tylko du liczb markerw wykorzystanych do budowy mapy sprzeniowej, ale take i to, e cakowita dugo mapy (3800 cM) jest znacznie wiksza ni w przypadku ssakw. Szerokie zastosowanie analizy molekularnej hybrydowych linii komrkowych, powstaych na bazie komrek poddanych napromieniowaniu (tzw. mapowanie radiacyjne) przyczynio si do gwatownego zwikszenia nasycenia map genomowycn loci markerowymi. Obecnie coraz czciej publikowane s mapy poszczeglnych chromosomw, a nie caych genomw. Na mapach takich uwzgldnione s dane pochodzce z mapowania fizycznego (informacje pochodzce z zastosowania techniki hybrydyzacji in

290

situ, analizy hybrydowych komrek somatycznych, a w tym take mapowania radiacyjnego) i sprzeniowego. Tak opracowane mapy okrelane s terminem map zintegrowanych (ang. comprehensive map). Szczegowe dane dotyczce map poszczeglnych genomw, a w tym i konkretnych chromosomw, s zamieszczone w internetowych bazach danych (tab. 12-111). Warto zwrci uwag, e rwnie mapy genomw innych gatunkw zwierzt gospodarskich, obok wymienionych w tabeli 12-11, s coraz lepiej poznane. Coraz wicej informacji pojawia si o mapach: kota, krlika, bawoa, a take ososia i pstrga tczowego. Do grupy gatunkw objtych mapowaniem doczyy ostatnio rwnie zwierzta futerkowe, takie jak: lis pospolity, lis polarny oraz jenot. W lad za programem sekwencjonowania genomu czowieka podjto analogiczne przedsiwzicia dotyczce gatunkw zwierzt laboratoryjnych (sekwencj genomu myszy opublikowano w grudniu 2002 r.) i domowych. Wrd tych ostatnich pierwszym genomem, dla ktrego ustalono sekwencj nukleotydw, jest genom psa. Opublikowano j we wrzeniu 2003 r. Przewiduje si, e do 2005 r. zostanie ustalona sekwencja genomu byda, wini i kury. Powizanie ze sob markerowych map genomowych z sekwencj DNA genomu danego gatunku umoliwi jeszcze efektywniejsze poszukiwanie genw o duym znaczeniu w hodowli zwierzt.
291

12.3.5. Wykorzystanie markerowych map genomowych w hodowli


Markerowa mapa genomu staa si nieodzownym narzdziem sucym do identyfikacji loci genw, ktre z hodowlanego punktu widzenia maj istotne znaczenie. Dziki takiej mapie moliwe jest wykrycie sprze midzy markerem (-ami) genetycznym (-i) o znanym pooeniu na mapie a loci poszukiwanych genw. Procedura postpowania opiera si na cisej wsppracy naukowcw z hodowcami. Hodowca wskazuje cech, ktra ma istotne znaczenie gospodarcze, np. wydajno biaka w mleku, wydajno rzena, marmurkowato misa, odporno na infekcje specyficznymi patogenami, bezrono, choroby genetyczne itp. Mog to by zatem zarwno cechy ilociowe, jak i jakociowe. Punktem wyjcia jest precyzyjne opisanie zmiennoci cechy, tak aby pojedynczemu osobnikowi mona byo przypisa warto fenotypow w zobiektywizowanej skali. Nastpnie podejmowana jest mudna analiza, polegajca na klasyfikacji fenotypw dla interesujcej cechy, jak i genotypw w jak najwikszej liczbie loci markerowych, zlokalizowanych w rnych miejscach genomu. Analiz tak prowadzi si w obrbie rodzin (zazwyczaj trzypokoleniowych), dziki czemu ledzi si rwnoczenie segregacj alleli w loci markerowych i fenotypw badanej cechy. Stwierdzenie, e allele ktrego z markerw kosegreguj z okrelonymi fenotypami cechy, wskazuje, e z tym markerem jest sprzony gen kontrolujcy ksztatowanie si badanej cechy lub istotnie na ni wpywajcy (tzw. gen gwny w przypadku cech ilociowych). Wykrycie sprzenia jest pierwszym krokiem na drodze do molekularnego scharakteryzowania poszukiwanego genu, ktre polega na opisie struktury genu, a w tym przede wszystkim ustaleniu sekwencji nukleotydw i wskazaniu miejsc zmutowanych, odpowiedzialnych za wystpowanie rnych alleli. Jednoczenie poznawany jest produkt tego genu oraz jego szczegowa funkcja biologiczna. Osignicie takiego poziomu wiedzy o genie zazwyczaj pozwala na opracowanie testu molekularnego (najczciej typu PCR-RFLP), ktry znajduje zastosowanie w identyfikacji genotypu osobnika na podstawie bezporedniej analizy DNA. Oglny schemat postpowania, ktrego celem jest identyfikacja nieznanego genu, jest pokazany na rycinie 12-6. Klasycznym przykadem wykorzystania bada markerw genetycznych do identyfikacji genu wpywajcego na wan cech produkcyjn jest historia 20-letnich poszukiwa genu odpowiedzialnego za podatno wi na stres i zwizanej z tym zmniejszonej wartoci technologicznej misa (tzw. miso blade, mikkie i wodniste, ang. pale, soft, exudative PSE). Najpierw ustalono, e cecha ta warunkowana jest monogenowo, a konkretnie przez allel recesywny. Nastpnie opracowano test (inhalacja halotanem) do identyfikacji zwierzt podatnych na stres, tzn. homozygot recesywnych
292

Ry. 12-6. Oglny schemat postpowania zmierzajcego do identyfikacji nieznanego genu o duym znaczeniu hodowlanym, np. genu gwnego wpywajcego na ksztatowanie poligenicznych cech produkcyjnych

(nn). Na podstawie tego testu wprowadzono symbol HAL na oznaczenie genu. Kilka lat pniej zidentyfikowano pierwsze markery genetyczne (m.in. locus ukadu grupowego krwi H oraz loci polimorficznych biaek krwi - GP7, PGD i A1BG), ktre okazay si cile sprzone z locus HAL. Loci tych markerw umiejscowiono, za pomoc hybrydyzacji in situ, w chromosomie 6 wini (ry. 12-7a). Wreszcie w 1991 roku zidentyfikowano gen kandydujcy (ang. candidate gene). By nim gen receptora rianodyny (RYR1), ktrego produkt jest zaangaowany w transport jonw wapniowych w miniach szkieletowych. Badania molekularne tego genu u osobnikw wraliwych na stres wykazay, e jedna z kilkunastu zidentyfikowanych mutacji punktowych prowadzi do zmiany w acuchu polipeptydowym, ktra polega na zamianie argininy na cystein w pozycji 615. Zamiana ta jest skutkiem tranzycji CT w pozycji 1843 cDNA genu RYR1. Odkrycie to pozwolio na wskazanie enzymu restrykcyjnego HhaI, ktry nie rozpoznaje 293

Ry. 12-7. Lokalizacja niektrych genw gwnych o znanej ju budowie molekularnej: (a) KYR1, (b) MSTN, (c) BMPR-IB, (d) PRKAG3 oraz regionw chromosomowych, w ktrych prawdopodobnie wystpuj geny gwne kontrolujce: (e) otuszczenie tuszy i tempo wzrostu/ (f) otuszczenie tuszy i zawarto misa w tuszy

sekwencji zawierajcej mutacj. W ten sposb opracowano test PCR-RFLP (patrz rozdzia: Zmienno cech), ktry umoliwia wykrycie allelu recesywnego w genotypie homozygot recesywnych i heterozygot. Od poowy lat 80. wiadomo byo, e hipertrofia miniowa (tzw. podwjne uminienie) u belgijskiego byda bkitnego zaley od recesywnego genu mh (ang. muscular hyperthrophy). Poszukiwanie markerw genetycznych sprzonych z locus mh pozwolio ustali, e gen ten jest pooony w czci przycentromerowej ramienia dugiego chromosomu 2 byda. Porwnanie tego regionu z homologicznym segmentem chromosomu ludzkiego doprowadzio do wskazania w 1997 roku na gen miostatyny (MSTN), jako gen kandydujcy do miana odpowiedzialnego za hipertrofi miniow (ry. 12-7b). Analiza molekularna tego genu u zwierzt z hipertrofi miniow, wywodzcych si z rasy belgijskiej
294

bkitnej i asturiana, wskazaa na obecno w ich genotypie dwch zmutowanych allei (homozygota recesywna). Okazao si, e mutacja polegaa na braku (delecji) 11 nukleotydw. Skutkiem tej mutacji jest powstanie skrconego acucha polipeptydowego (przedwczesne pojawienie si kodonu stop"), ktry jest biologicznie nieaktywny, co fenotypowo objawia si hipertrofi miniow. Badania molekularne genu MSTN w innych europejskich rasach misnych doprowadziy do identyfikacji kolejnych czterech, rnych mutacji uszkadzajcych funkcj biaka miostatyny. Osignicie to pozwala na ustalanie genotypu zwierzt metodami genetyki molekularnej (patrz rozdzia: Zmienno cech). Rozwijajce si dynamicznie badania nad mapami genomw zwierzt gospodarskich umoliwiy identyfikacj markerw genetycznych sprzonych z rnymi genami gwnymi, ktre na poziomie molekularnym nie zostay dotychczas jeszcze rozpoznane. Co wicej, nie udao si jeszcze wskaza genw kandydujcych. Przykadem moe by gen FecB, wpywajcy na plenno owiec rasy merynos booroola, a konkretnie kontrolujcy liczb owulujcych oocytw podczas rui. Locus tego genu jest sprzony z markerami mikrosatelitarnymi BM1329 i OarAE101, ktre umiejscowione s w chromosomie 6 (ry. 12-7c). W 2001 r. ustalono, e gen FecB to zmutowana posta genu BMPR-IB. Substytucja A > G w tym genie odpowiada za wbudowanie w pozycji 249 acucha polipeptydowego argininy zamiast glutaminy. Powoduje to zmian siy wizania ligandw przez receptor kodowany przez gen BMPR-IB. Innym przykadem jest gen RN, ktry odpowiada za zawarto glikogenu w miniach. Dominujcy gen RN~ powoduje wiksz, a allel recesywny rn+ mniejsz zawarto glikogenu. Efektem zwikszonej zawartoci glikogenu jest uzyskanie po uboju tzw. kwanego misa, ktre ma mniejsz warto technologiczn. Locus genu RN umiejscowiono w chromosomie 15, dziki identyfikacji sprzonych markerw mikrosatelitarnych Sw120 i Sw936 (ry. 12-7d). W 2000 r. zakoczyy si wieloletnie poszukiwania genu RN. Okazao si, e jest nim zmutowany allel genu PRKAG3, ktry koduje podjednostk y kinazy biakowej aktywowanej przez AMP. Mutacja polegaa na zmianie sekwencji nukleotydw G > A w kodonie 200 tego genu. Badania zmierzajce do identyfikacji genw gwnych, ktre w znaczcy sposb wpywaj na cechy uytkowe, s prowadzone w licznych orodkach naukowych. W pocztkowym stadium bada zakada si, e zmienno wybranej cechy produkcyjnej moe zalee od jakiego genu z duym efektem dziaania, czyli genu gwnego. Analiza segregacji licznych markerw genetycznych, pokrywajcych w miar rwnomiernie wikszo genomu, oraz zmiennoci cechy produkcyjnej w rodzinie referencyjnej (najczciej 3-pokoleniowej) moe doprowadzi do wskazania regionu chromosomowego, w ktrym prawdopodobnie wystpuje locus genu gwnego. W 1994 roku ukazaa si praca dowodzca, e w chromosomie 4 wini, 295

midzy markerami S0001 i S0067, wystpuje prawdopodobnie locus (loci?) genu gwnego wpywajcego na tempo wzrostu oraz otuszczenie tuszy (ry. 12-7e). Sugestia ta zostaa potwierdzona take w innych badaniach. Do tej pory jednak nie udao si zaproponowa genu (-w?) kandydujcego, ktry odpowiadaby za ksztatowanie tych cech ilociowych. Podobne badania przeprowadzone w ramach Polskiego Projektu Mapowania Genomu wini sugeruj, e w chromosomie 12, midzy markerami mikrosatelitarnymi S0083 i S0090, wystpuje locus (loci?) genu gwnego wpywajcego na odkadanie tuszczu brzusznego i zawarto misa w tuszy (ry. 12-7f). Z kolei w padzierniku 2003 r. doniesiono, e mutacja w intronie 3 genu IGF2 (insulinopodobnego czynnika wzrostu 2) wywouje bardzo duy wpyw na misno wi. Prosta substytucja G > A prawdopodobnie zakca interakcj DNA z nieznanym biakiem represorowym, czego efektem jest 3-krotny wzrost ekspresji genu IGF2. Trzeba zaznaczy, e gen ten podlega pitnowaniu gametycznemu. W przypadku genu IGF2 ekspresji podlega jedynie allel pochodzcy od ojca, czyli duy efekt fenotypowy pojawia si tylko wtedy, gdy zmutowany allel jest odziedziczony od ojca. Odnotowano te znaczce osignicie dotyczce byda. Z bada prowadzonych w rodzinach referencyjnych wynikao, e w chromosomie 14 zlokalizowany jest gen wpywajcy w znaczcy sposb na wydajno i skad mleka. W 2001 r. wykazano, e mutacja typu podstawienia dwunukleotydowego AA > GC w genie DGTA1 (acylo-CoA: diacylogliceroloacylotransferaza) wywouje zmian lizyny na alanin, a to upoledza funkcj kodowanego enzymu. W efekcie dochodzi do znacznego zwikszenia wydajnoci tuszczu w mleku. Mapy genomowe s powszechnie wykorzystywane do identyfikacji genw odpowiedzialnych za monogenowe choroby genetyczne lub markerw genetycznych z nimi sprzonych. Jednym z przykadw moe by letalna wada rozwojowa achondroplazja, okrelana symbolem bd (ang. bulldog disease), ze wzgldu na wywoywane zmiany m.in. w budowie czaszki. Nosicielstwo genu recesywnego bd stwierdzono w 1999 roku w genotypie francuskiego buhaja, charakteryzujcego si wybitn wartoci hodowlan. W pocztkowym okresie jego uytkowania stwierdzono, e okoo l % potomkw by obarczony letalnymi znieksztaceniami czaszki i koczyn. Oznaczao to, e rwnie wiele krw byo nosicielkami zmutowanego genu bd. Badacze francuscy wytypowali 75 rodzin (buhaj nosiciel, krowa nosicielka, chore ciel homozygota recesywna), w ktrych przeprowadzono analiz dziedziczenia markerw genetycznych rozproszonych rwnomiernie po caym genomie. Wkrtce potem udao si zidentyfikowa marker genetyczny silnie sprzony z genem bd. Osignicie to pozwalao na identyfikacj potomkw buhaja nosiciela, ktrzy rwnie byli nosicielami tego niepodanego genu. Dziki temu udao si zapobiec rozprzestrzenianiu niepodanego genu, w wyniku wykorzystywania do inseminacji nasienia buhaja nosiciela. Mona si spodziewa, e wkrtce zostanie rwnie zidentyfikowany gen odpowiedzialny za powstanie tej wady wrodzonej.
296

W tym samym czasie w populacji duskiej byda holsztysko-fryzyjskiego zidentyfikowano inn letaln wad rozwojow, polegajc na znieksztaceniu krgw (ang. CVM central vertebral malformation). Rwnie dla tego genu udao si zidentyfikowa sprzone markery genetyczne, a ostatnio scharakteryzowano gen oraz mutacj w nim wystpujc. Niestety bada tych nie opublikowano, a opracowany test molekularny skomercjalizowano. Szczeglne osignicia dotyczce identyfikacji genw odpowiedzialnych za rozwj monogenowych chorb dziedzicznych odnotowano u psw. U gatunku tego znanych jest ponad 300 jednostek chorobowych uwarunkowanych przez mutacje pojedynczych genw. Wiele z tych mutacji wystpuje w cile okrelonych rasach. Dotychczas opisano na poziomie molekularnym trzydzieci genw i ich mutacji odpowiedzialnych za rozwj choroby dziedzicznej. Wrd nich s geny wywoujce takie schorzenia, jak: dziedziczna dystrofia siatkwki u owczarkw francuskich (briardw), narkolepsja u dobermanw i labradorw, ciki zoony niedobr odpornoci psw rasy welsh corgi czy fukozydoza u angielskich springer spanieli. W latach 2001-2003 podjto udane prby terapii genowej niektrych chorb dziedzicznych psa (np. dziedziczny zanik siatkwki u owczarkw francuskich). Przedstawione powyej przykady wykorzystania markerowych map genomowych do rozwizywania konkretnych problemw hodowlanych pokazuj, e genetyka molekularna staa si kluczowym narzdziem sucym postpowi w hodowli zwierzt.

Literatura uzupeniajca

Podrczniki Biochemia (1997), L. Stryer (tum. z j. ang. pod red. J. Augustyniaka i J. Michejdy), Wydawnictwo Naukowe PWN. Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej (2001), pod red. J. Bala, Wydawnictwo Naukowe PWN. Biotechnologia zwierzt (1997), pod red. L. Zwierzchowskiego, K. Jaszczaka i J. Modliskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN. Cytobiochemia (1995), L. Kyszejko-Stefanowicz, Wydawnictwo Naukowe PWN. Genetyka czowieka. Rozwizywanie problemw medycznych (2003), B.R. Korf (przekad pod red. A. Pawlaka), Wydawnictwo Naukowe PWN. Genetyka molekularna (1995), pod red. P. Wgleskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN. Genom czowieka. Najwiksze wyzwanie wspczesnej genetyki i medycyny molekularnej (1997), pod red. W. Krzyosiaka, Wydawnictwo Naukowe PWN. Genomy (2001), T.A. Brown (przekad pod red. P. Wgleskiego), Wydawnictwo Naukowe PWN. Immunologia (1996), I. Roitt, J. Brostoff, D. Mae (tum. z j. ang. pod red. J. eromskiego), Wydawnictwo Medyczne Sotwiski Yerlag, Brema. Jeyk genw. Poznawanie zasad dziedziczenia (1997), P. Berg i M. Singer (tum. z j. ang. M. Waniewska-Brzeska i J. Brzeski), Prszyski i S-ka, Warszawa. Karty z Dziejw Zootechniki Polskiej. Cz. II lata 1972^-1997 (1997), pod red. A. Filistowicza, J. Juszczaka i S. Wyka, Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, Warszawa. Leksykon biologiczny (1992), pod red. Cz. Jury i H. Krzanowskiej, Wiedza Powszechna. Leksykon rozrodu zwierzt (1996), pod red. K. Rosanowskiego, Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu. Leksykon terminw z zakresu genetyki i hodowli zwierzt (1994), B. Nowicki i wsp., Wydawnictwo Polskiego Towarzystwa Zootechnicznego, Warszawa. Sownik terminw genetycznych (2002), R.C. King, W.D. Stansfield (przekad zbiorowy pod red. W. Prus-Gowackiego), Orodek Wydawnictw Naukowych PAN, Pozna. The Major Histocompatibility Complex Region of Domestic Animal Species (1996), pod red. L.B. Schook i S.J. Lamont, CRC Press Inc., USA.

298

Artykuy przegldowe
Barsh G. (1996). The genetics of pigmentation: from fancy genes to complex traits. Trends in Genetics 12 (8): 299-305. Bartnik E. (1997). Ludzki genom mitochondrialny mutacje, polimorfizmy i choroby. Postpy Biologii Komrki 24 (8): 69-75. Charon K.M. (1998). Wykorzystanie metod molekularnej analizy genomu zwierzt w pracy hodowlanej. Postpy Nauk Rolniczych 7 (nr 5): 87-97. Charon K.M. (1998). Znaczenie gwnego ukadu zgodnoci tkankowej w hodowli zwierzt. Medycyna Weterynaryjna 54 (2): 92-96. Cotinot C. i wsp. (2002). Molecular genetics of sex determination. Seminars in Reproductwe Medicine 20: 157-167. De Gortari M.J., Freking B.A., Cuthbertson R.P., Kappes S.M., Keele J.W., Stone R.T., Leymaster K.A., Dodds K.G., Crawford A.M., Beattie C.W. (1998). A second-generation linkage map of the sheep genome. Mammalian Genome 9: 204-209. Ellis S.A. (1994). Minireview MHC studies in domestic animals. European Journal of Immunogenetics 21: 209-215. Friend S.H., Stoughton R.B. (2002). Magiczne mikromacierze. wiat Nauki 4 (128): 36-43. Grzybowski G. (1997). Wybrane praktyczne aspekty technik molekularnych PCR-RFLP i automatycznego sekwencjonowania DNA w badaniach genomu zwierzt gospodarskich. Prace i Materiay Zootechniczne 50: 69-78. Grzybowski G., Dymnicki E. (1997). Metody oraz znaczenie sterowania proporcj pci u byda. Biotechnologia 3 (38): 38-50. International Human Genome Seuencing Consortium (2001). Initial seuencing and analysis of the human genome. Natur 409: 860-921. Kamiski S. (1996). Bovine kappa-casein (CASK) gene molecular natur and application in dairy cattle breeding. Journal of Applied Genetics 37: 179-196. Kamiski S. (2002). DNA microarrays a methodological breakthrough in genetics. Journal of Applied Genetics 43: 123-130. Kappes S.M., Keele J.W., Stone R.T., McGraw R.A., Sonstegard T.S., Smith T.P.L., Lopez-Corrales N.L., Beattie C.W. (1997). A second-generation linkage map of bovine genome. Genome Research 7: 235-249. Kirkness E.F. i wsp. (2003). The dog genome: survey seuencing and comparative analysis. Science 301: 1898-1903. Krzanowska H. (1999). Duga historia krtkiego chromosomu jak poznano geny podnoci sprzone z chromosomem Y u ssakw. Postpy Biologii Komrki 26 (supl. 12): 53-58. Kury J. (1998). Geny oddziaujce na jako tuszy i misa wi. Prace i Materialy Zootechniczne. Zeszyt specjalny 8: 9-18. Lechniak D. (1996). Anomalie chromosomowe przyczyn zamierania gamet i zarodkw bydlcych. Medycyna Weterynaryjna 52 (2): 89-93. Long S.E. (1997). Chromosome abnormalities in domestic sheep (Ovis aries). Journal of Applied Genetics 38: 65-76. Pareek Ch.S., Kamiski S. (1996). Bovine leukocyte adhesion deficiency (BD) and its worldwide prevalence. Journal of Applied Genetics 37 (3): 299-312. Parham P., Ohta T. (1996). Population biology of antigen presentation by MHC class I molecules. Science 272: 67-74. Pierzchaa M. (1996). Mapa genomu wini (Sus scrofa domestica). Prace i Materialy Zootechniczne 49: 7-28. Ramikssoon Y., Goodfellow P. (1996). Early steps in mammalian sex determination. Current Opinion in Genetics & Development 6: 316-321.

299

Rejduch B., witoski M., Sota E., Danielak B., Kozubska-Sobociska A. (1994). Aberracje chromosomowe u byda o uytkowoci misnej. Medycyna Weterynaryjna 50 (8): 379-382. Rohrer G.A., Alexander L.J., Hu Z., Smith T.P.L., Keele J.W., Beattie C.W. (1996). A comprehensive map of the porcine genome. Genome Research 6: 371-391. Ruvinsky A. (1999). Basics of gametic imprinting. Journal of Dairy Science 82 (suppl. 2):288-237. Somski R., Napieraa D., Kwiatkowska J. (1998). Reakcja acuchowa polimerazy (PCR) w badaniach naukowych i diagnostyce molekularnej. Postpy Biologii Komrki 25 (supl. 10): 195-217. Stachurska A. (1997). Inheritance of colours in horses. Journal of Applied Genetics 38:195-204. Sysa P.S. (1997). Krajowy system kontroli cytogenetycznej buhajw. Medycyna Weterynaryjna 53 (10): 581-584. Szatkowska L, Zych S., Kulig H. (2003). Determinacja pci u ssakw. Medycyna Weterynaryjna 59: 847-852. Szwaczkowski T. (1993). Identyfication of animal major genes in field collected data by use of statystical methods. Journal of Animal and Feed Sciences 2/3: 91-103. Szydowski M. (1994). Wybrane aspekty analizy loci markerowych w doskonaleniu ilociowych cech zwierzt. Prace i Materiay Zootechniczne 46: 29-40. Szymaski M., Barciszewska M.Z., ywiecki M., Barciszewski J. (2003). Noncoding RNA transcripts. Journal of Applied Genetics 44: 1-20. witoski M. (1998). Markerowe mapy genomowe i ich wykorzystanie w hodowli zwierzt. Postpy Biologii Komrki 25 (supl. 10): 113-122. witoski M., Kury J. (1998). Poszukiwanie genw kontrolujcych cechy tuczne, opasowe i rzene najnowsze osignicia. Prace i Materiay Zootechniczne 52: 37-42. witoski M., Stranzinger G. (1998). Synaptonemal complexes in domestic mammals a review. Journal of Heredity 89 (6): 473-480. Walawski K. (1999). Genetic aspects of mastitis resistance in cattle. Journal of Applied Genetics 40 (2): 117-128. Waterston R.H. i wsp. (2002). Initial seuencing and comparative analysis of the mouse genome. Natur 420: 520-562. Wgrzyn J., Skiba E. (1997). Antigenic markers of protein genes and their nomenclature in cattle. Journal of Applied Genetics 38 (3): 319-328. Wierzbicki H. (1998). Genetyczne uwarunkowania odmian barwnych lisa pospolitego (Vulpes vulpes) i lisa polarnego (Alopex lagopus). Prace i Materiay Zootechniczne 53: 35-48. Yenter C. i wsp. Celera Genomics (2001). The seuence of the human genome. Science 291: 1304-1351. Zwierzchowski L., Rosochacki S.J. (1998). Transgeneza moliwoci i perspektywy zastosowania w produkcji zwierzcej. Prace i Materiay Zootechniczne 50: 11-39. Zwierzchowski L. (1998). Biotechnologiczne wykorzystanie gruczou mlecznego perspektywy manipulacji genetycznych biakami mleka. Biotechnologia 2 (41): 33-56.

Skorowidz
Opracowali: Krystyna M. Charon, Marek witoski

Numery stron, na ktrych znajduje si gwny opis, s pogrubione. Gwiazdk oznaczono numery stron, na ktrych hasa znajduj si na rysunku lub w jego podpisie.

You might also like