Universidad de Alcal

Departamento de Bioqumica y Biologa

Molecular






EFECTO DE LOS CANNABINOIDES EN
CLULAS TUMORALES DE PRSTATA PC-3.
PAPEL DEL RECEPTOR CB2


Tesis Doctoral

Nuria Olea Herrero
Madrid, 2010





Financiacin








































FINANCIACIN




Financiacin

Esta Tesis Doctoral ha sido realizada gracias a la financiacin de los siguientes proyectos de
investigacin por diferentes organismos pblicos:

TTULO DEL PROYECTO: "Efecto de agonistas y antagonistas de cannabinoides y vanilloides
sobre la proliferacin de clulas tumorales de prstata. Estudio in
vitro e in vivo.
ENTIDAD FINANCIADORA: CAM, GR/SAL/0640/2004
DURACIN: 2005
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet


TTULO DE PROYECTO: "Efecto de los agonistas de cannabinoides y vanilloides sobre la
diferenciacin neuroendocrina de clulas tumorales de prstata.
ENTIDAD FINANCIADORA: MEC, SAF 2005-00602
DURACIN: 2005-2008
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet


TTULO DE PROYECTO: Mecanismos de accin de los cannabinoides sobre clulas
tumorales de prstata. Diferenciacin neuroendocrina.
ENTIDAD FINANCIADORA: CCG06-UAH/SAL-0562
DURACIN: 2007
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet


TTULO DE PROYECTO: ESTUDIO DE LA NEUROFARMACOLOGA Y POTENCIAL
TERAPUTICO DEL SISTEMA ENDOCANNABINOIDE
ENTIDAD FINANCIADORA : CAM S-Sal-0261-2006
DURACIN: 2007-2010
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Manuel Guzmn Pastor


Financiacin


TTULO DEL PROYECTO: Estudio Del Sistema Endocannabinoide en ClulasTumorales.
Regulacin de la Secrecin de Citoquinas e Implicaciones
Metablicas.
ENTIDAD FINANCIADORA: SAF2008-03220
DURACIN: 2009-2011
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet


TITULO DEL PROYECTO: Accin de componentes naturales sobre la proliferacin y
secrecin de citoquinas en clulas tumorales de prstata.
ENTIDAD FINANCIADORA: Comunidad Castilla-LaMancha, PII1/09-0165-0822
DURACIN: 2009-2011
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Ins Daz-Laviada Marturet


TITULO DEL PROYECTO: Propiedades antitumorales de los vanilloides en clulas
tumorales de prstata
ENTIDAD FINANCIADORA: CAM/UAH, CCG08-UAH/BIO-3914
DURACION: 2009
INVESTIGADOR PRINCIPAL: Sophie Malagarie-Cazenave


Agradecimientos






























AGRADECIMIENTOS


Agradecimientos



En primer lugar tengo que agradecer a mi Directora de Tesis, la Doctora Ins Daz-Laviada,
haberme dado la gran oportunidad de cumplir este sueo. Gracias por llevarme de la mano en el arduo
camino de la ciencia, pero sobre todo por tu aliento. Gracias por aceptar ser mi maestra, por ensearme lo
que es el rigor cientfico y gracias tambin por tu gran calidad humana.

A la Universidad de Alcal y al Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, por permitirme
realizar aqu la Tesis Doctoral. Tambin a todo el personal del Departamento de Bioqumica as como de
los Centros de Apoyo de la Universidad de Alcal. Gracias a Anglica por facilitarme tantsimo lo relativo a
la burocracia. A Juan y Guillermo, por sus lecciones de seguridad en el laboratorio, as como por su gran
ayuda y disposicin. A Rafa por su amable ayuda con los trmites de las becas. Y a Aurora por su diligente
labor en la gestin.

A mis compaeros de laboratorio, sin los cuales este trabajo habra sido irrealizable. Gracias a Lidia
y Mara, por mis primeras lecciones sobre ciencia emprica y por su infinita comprensin en mis primeros
das de laboratorio. A Ana, por ser mi gua durante toda esta Tesis; qu hubiera hecho yo sin ella Y
tambin por ser el ejemplo del esfuerzo, el tesn y el amor al trabajo. A Sophie, por su gran cario y
camaradera, siempre dispuesta a pararlo todo para escucharme y regalarme su comprensin, adems de
por todas sus sabias lecciones. A Diana, por ensearme tantas cosas, por sus infinitos nimos y su enorme
confianza, pero sobretodo, por su dulce afecto tan reconfortante. Y a mis ltimos compaeros de
laboratorio, Sergio, Marta y Cecilia, por renovar con su mpetu mi ilusin por la ciencia. Gracias a todos y
cada uno tambin por ser adems de compaeros, amigos.

Gracias igualmente a todos mis compaeros del Departamento de Bioqumica. No puedo dejar aqu
de nombrar a algunos, los ms cercanos. Gracias a Ana Fernndez, Ana Valdehta, Ana Bajo, Eva Vacas y
a todos los dems miembros de su laboratorio por la solicitud y el compaerismo. A Borja, Lus y Eva por
su inestimable ayuda y sus nimos. Y especialmente, gracias a Alberto por ilustrarme en tantas ocasiones,
por ser siempre una referencia y por estar en todo momento ms que dispuesto a ayudar; a Lus, por su
grandsimo apoyo y su desinteresado y desmedido favor; y a Arantxa, por su increble mpetu, su alegra y,
ante todo, por su especial cario. Gracias a todos por regalarme adems su enorme amistad.

Agradecimientos



Al grupo de Bioqumica del Hospital Ramn y Cajal. Gracias al Doctor Javier Martnez Botas y al
Doctor Diego Gmez-Coronado por darme la oportunidad de trabajar en su grupo y por instruirme en la
Biologa Molecular. Al Doctor Miguel ngel Lasuncin, por permitirme tambin formar parte de su grupo y
por lo mucho que aprend durante sus seminarios. Y a todos mis compaeros, por nuestras innumerables
charlas sobre ciencia, vuestro gran apoyo y acertado consejo. Gracias necesariamente tambin por vuestra
amistad, de forma especial a Alberto, Carolina, David y Andrea.

Gracias tambin al Doctor Neil Perkins y a su grupo, por acogerme en su laboratorio y poner
adems a mi disposicin todos los medios del mismo. La estancia en su laboratorio signific para m una
nica y valiossima oportunidad.

Gracias al Doctor Jorge Montserrat, a Miguel y a Leticia, por su inestimable ayuda esclareciendo
mis dudas sobre Inmunologa y por guiarme en los experimentos con los linfocitos. Gracias aqu tambin a
todos los voluntarios que hicieron posible estos experimentos.

Tengo demasiado asimismo que agradecer a todos mis amigos fuera del mbito laboral, tanto de la
universidad como de Guadalajara, sin cuyo apoyo este trabajo habra sido muy difcil de realizar. Gracias
por compartir tanto conmigo, por regalarme vuestras magnficas risas y por calmar mis lgrimas. Gracias
por estar siempre ah y, ms an, por contar siempre conmigo. Tard en encontrarles en mi camino, pero
desde luego la espera no fue balad.

Por ltimo, a mi familia, especialmente a mi madre y a mi hermana. Me siento terriblemente
afortunada de contar con su proteccin, cario y comprensin. Gracias por darme tanto y por apoyarme en
cada uno de los pasos que me han llevado hasta aqu.



Abreviaturas








































ABREVIATURAS

Abreviaturas


AA cido araquidnico
AEA Anandamida
2-AG 2-Araquidonil-glicerol
AP-1 Protena activada 1
AR Receptor de andrgenos
A-SMasa Esfingomielinasa cida
ATCC American Type Culture Collection
ATF4 Factor de transcripcin 4
ATF6 Factor de transcripcin 6
ATP Adenosina trifosfato
BAFFR Factor activador de clulas B
BCR Receptor de clulas B
BPH Hiperplasia benigna de prstata
BSA Albmina srica bovina
cAMP Adenosin monofosfato cclico
CB1 Receptor de cannabinoides tipo 1
CB2 Receptor de cannabinoides tipo 2
CBC Cannabicromeno
CBD Cannabidiol
CBG Cannabigerol
CBN Cannabinol
CD40 Cluster de diferenciacin 40
CerS Ceramida sintasa
CerK Ceramida quinasa
C1P Ceramida 1 fosfato
CPZ Capsazepina
cox-2 Cicloxigenasa tipo 2
CREB Protena de unin a elementos de respuesta a AMP cclico
CTL Clulas T citotxicas
CYP450s Citocromo P-450 s
DAG Diacilglicerol
DAGL Diacilglicerol lipasa
DAPI 4, 6-diamidino-2-fenilindol
DCFH-DA 6-carboxi-2,7-diclorodihidrofluoresceina acetoximetilester
DETAPAC cido dietilenotriaminopentactico
DED Dominio efector de muerte
DD Dominio de muerte
DMSO Dimetil sulfxido
DOPG Dileoyl-fosfatidilglicerol
dpm desintegraciones por minuto
EGF Factor de crecimiento epidrmico
ERSA Elemento de respuesta a estrs de retculo
ERK Quinasa regulada por seales extracelulares
FADD Dominio de muerte asociado a Fas
FAAH Enzima aminohidrolasa de cidos grasos
FAK Quinasa de adhesin focal

Abreviaturas


FBS Suero fetal bovino
FITC Isotiocianato de fluoriscena
gp130 glicoprotena 130
GRP78 Chaperona regulada por glucosa 78
HDL Lipoprotenas de alta densidad
HRP Peroxidasa de rbano
IkB Protena inhibidora de NFkB
IKK Quinasa de los inhibidores de NFkB
IL-1 Interleuquina 1
IL-1R Receptor de IL-1
IL-6 Interleuquina 6
IL-6Ra Receptor de IL-6 alfa
IP Ioduro de propididio
IRE1 Enzima dependiente de insitol 1
ITS Insulina, transferrina, selenio
Jak Janus quinasa
JNK c-Jun N-terminal quinasa
KSR Quinasa supresora de Ras
MAPK Protena quinasa activada por mitgenos
MAP2K Protena quinasa activada por mitgenos
MAP3K Protena quinasa quinasa quinasa activada por mitgenos
MAP4K Protena quinasa quinasa quinasa quinasa quinasa activada
por mitgenos
MEK Quinasa activada por mitgenos
MET Metanandamida
mRNA RNA mensajero
mTOR Protena diana de rampamicina en los mamferos
MTT Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazol
NADA N-araquidonil-dopamina
NAC N-acetil- cistena
NAPE N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina
NAPE-PLD Fosfolipasa D selectiva para NAPE
NEMO Modulador esencial de NFkB
NGF Factor de crecimiento nervioso
NIDDM Diabetes mellitus no insulino dependiente
NIK Quinasa inuctora de NFkB
NFB Factor nuclear kappa B
N-SMasa Esfingomielinasa neutra
LOX Lipoxigenasa
O-AEA O-araquidonil-etanolamina o virodhamina
PA cido fosfatdico
PAK Protena quinasa activada por p21
PAP Fosfatasa cida prosttica
PBS Tampn fosfato salino
PEA N-palmitoiletanolamina
PERK Quinasa del retculo endoplasmtico
PC Fosfatidil colina

Abreviaturas

PI Fosfatidilinostidos
PIA Atrofia proliferativa inflamatoria
PIN Neoplasia intraepitelial prosttica
PIP Fosfatidilinositol 4-fosfato
PI3K Fosfatidil inositol 3-quinasa
PKA Protena quinasa A
PKB Protena quinasa B
PKC Protena quinasa C
PMSF Fenil metilsulfonilfluoruro
PLA1 Fosfolipasa 1
PLD Fosfolipasa A
PLC Fosfolipasa C
PLD Fosfolipasa D
PP1 Protean fosfatasa 1
PP2A Protean fosfatasa 2A
PSA Antgeno prosttico especfico
RHD Dominio homlogo a Rel
RTK Receptor tirosina quinasa
SDS Dodecil sulfato sdico
sgp130 glicoprotena 130 soluble
sIL-6R Receptor de IL-6 soluble
SM Esfingomielina
SMasa Esfingomielinasa
SPT Serina palmitoil transferasa
siRNA RNA de interferencia
STAT Factor de transcripcin transductores de la seal y activadores
de transcripcin
STI Inhibidor de tripsina de soja
THC
9
- Tetrahidrocannabinol
TEA Trietanolamina
TCA cido tricloroactico
TLC Cromatografa en capa fina
TLR Receptor similar a Toll
TMB 3,3,5,5- tetrametilbenzidina
TNF Factor de necrosis tumoral
TNFR Receptor de TNF
Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol
TRP Canal activado por potencial transitorio
TRPA Canal activado por potencial transitorio tipo ankirina
TRPC Canal activado por potencial transitorio cannico
TRPM Canal activado por potencial transitorio tipo melastatina
TRPML Canal activado por potencial transitorio tipo mucopolina
TRPP Canal activado por potencial transitorio tipo policistina
TRPV Canal activado por potencial transitorio tipo vanilloide
UPR Respuesta al mal plegamiento de protenas
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascular
XBP1 Protena 1 de unin a X-box

ndice







































NDICE



ndice

NDICE

INTRODUCCIN 1
1.- LA PRSTATA 3
1.1.- Prstata normal 3
1.1.1. Anatoma de la prstata 3
1.1.1. Histologa de la prstata 4
1.2.- Patologas de la prstata 5
1.2.1.Prostatitis 5
1.2.2.Hiperplasia benigna de prostta (HBP) 6
1.2.3.Cncer de prstata 7
1.2.3.1.Estados premalignos 7
1.2.3.2.Desarrollo y evolucin del cncer 9
1.2.3.3 Fases del cncer de prstata 9
1.2.3.4 Modelos celulares 11
2.- MECANISMOS MOLECULARES Y CELULARES IMPLICADOS EN EL
CNCER DE PRSTATA. POSIBLES DIANAS TERAPUTICAS 14
2.1.Sealizacin celular 14
2.1.2.Vas de sealizacin que conducen a apoptosis 14
2.1.2.Vas de proliferacin implicadas en
crecimiento y supervivenciacelular 20
2.2.Sistema inmune: Inmunoterapia 23
2.2.1.Papel de las clulas T 24
2.2.2.Papel de la IL-6 26
2.2.3.Papel del factor nuclear kappa B 29
3.- CANNABINOIDES Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE 32
3.1.Resea histrica 32
3.2.Tipos de cannabinoides 33
3.2.1.Compuestos bioactivos de Cannabis sativa 34
3.2.2.Ligandos endgenos 34
3.2.3. Ligandos sintticos 35
3.3.Receptores de cannabinoides 36

ndice



3.3.1.CB1 y CB2 37
3.3.2.GPR-55 37
3.3.3. TRPV1 38
3.4.Mecanismos de transduccin a travs de CB1 y CB2 39
3.5.Cannabinoides y cncer 40
3.5.1.Cannabinoides y cncer de prstata 42
3.5.2.Cannabinoides y sistema inmune 42

HIPTESIS Y OBJETIVOS 45

MATERIALES Y METODOS 49
1.- MATERIALES 51
1.1.- Materiales empleados en cultivos celulares 51
1.2.- Reactivos empleados en la elaboracin de tampones 51
1.3.- Agonistas, antagonistas e inhibidores 52
1.4.- Lneas celulares 52
2.- MTODOS 53
2.1.- Medida de la viabilidad celular mediante MTT 53
2.2.- Medida de la divisin celular mediante incorporacin de [
3
H]-timidina 54
2.3.- Tincin de clulas con Ioduro de Propidio para anlisis del cilo c
elular por citometra de flujo 54
2.4.- Unin de Ioduro de Propidio y anexina V-FITC 54
2.5.- Tincin de ncleos con DAPI 55
2.6.- Medida de los niveles de ceramida 55
2.6.1.- Extraccin de lpidos 55
2.6.2.- Cuantificacin de ceramidas 56
2.7.- Determinacin de niveles de IL-6

57
2.8.- Determinacin de niveles de IL-17 57
2.8.1.- Aislamiento de clulas mononucleares 57
2.8.2.- ELISA de IL-17 58
2.9.- Separacin de fraccin particulada y solube de las clulas 58
2.10.- Separacin ncleo / citosol 59
2.11.- Cuantificacin de protenas 59

ndice

2.12.- Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunopredeteccin
de protenas 60
2.13.- Silenciamiento con RNA de interferencia 62
2.14.- Aislamiento de RNA 63
2.15.- Retrotranscripcin(RT) 63
2.16.- PCR a tiempo real (RT-PCR qPCR) 64
2.17.- Ensayo de inmunoprecipitacin de la cromatina (CHIP) 65
2.17.1.-Fijacin de la unin DNA-protenas y fragmentacin
del DNA 65
2.17.2.- Inmunoprecipitacin 66
2.17.3.- Aislamiento de DNA 66
2.17.4.- Cuantificacin de las muestras 66
2.18.- Experimentacin animal 67
2.18.1.- Animales 67
2.18.2.- Induccin de tumores 67
2.18.3.- Tratamiento de las muestras 68
2.19.-Anlisis estadstico 68

RESULTADOS 69
1.-EFECTO DE MET Y JWH015 SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTE
CELULAR 71
2.- PAPEL DEL RECEPTOR CB2 EN EL EFECTO ANTIPROLIFERATIVO
DE LOS CANNABINOIDES 77
3.- ESTUDIO DE LA SEALIZACIN CELULAR ACTIVADA POR
CANNABINOIDES 81
3.1.- Sntesis de ceramida 81
3.2.- Cascadas de sealizacin intracelulares 85
4.- EFECTO ANTITUMORAL IN VIVO DE JWH015 87
5.- ESTUDIO DE LA SECRECIN DE IL-6 89
5.1.- Papel de CB2 91
5.2.- Papel de la sntesis de ceramida en la secrecin de IL-6 98
5.3- Sealizacin celular implicada en la secrecin de IL-6 93
5.3.1.Ruta de selaizacin de NFB 93

ndice



5.3.2. Ruta de selaizacin de PI3K/Akt 97
5.3.3. NFB controla la expresin de IL-6 99
6- PAPEL DE IL-6 EN EL CRECIMIENTO Y MUERTE CELULAR 100
6.1.- Funcionalidad de la IL-6 secretada por las clulas PC-3 100
6.2.- Efecto de IL-6 sobre la viabilidad celular 102
6.3- Expresin y actividad de STAT3 102
7- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA TH17 103

DISCUSIN 105
1.-EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DE LOS CANNABINOIDES 107
2.- MECANISMO DE ACCIN DE LOS CANNBINOIDES SOBRE LAS C
LULAS PC-3 111
3.- SECRECIN DE IL-6 INDUCIDA POR LOS CANNABINOIDES 115
4.- PAPEL DE IL-6 SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA MUERTE CELULAR 118
4.- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA TH17 121
4.- PAPEL DE DEL RECEPTOR CB2 122

CONCLUSIONES 127

BIBLIOGRAFA 131

ANEXO I: SUMMARY 149

ANEXO II: PUBLICACIONES A LAS QUE HA DADO
LUGAR ESTA TESIS DOCTORAL 155






















La utopa est en el horizonte. Camino
dos pasos, ella se aleja dos pasos y el
horizonte se corre diez pasos ms all.
Entonces para qu sirve la utopa? Para
eso, sirve para caminar.

Eduardo Galeano




Jams el esfuerzo desayuda a la fortuna

Fernando de Rojas




Introduccin































INTRODUCCIN






Introduccin

1.- LA PRSTATA
3

Figura 1. Ubicacin regional de la prstata.
1.1.- Prstata normal

La prstata es una glndula tbulo-alveolar del rgano reproductor masculino, de pequeo
tamao, situada debajo de la vejiga y delante del recto, que envuelve la primera porcin de la uretra
(figura 1). Se desarrolla por invaginacin del epitelio desde la uretra durante el tercer mes de gestacin
bajo la influencia del mesnquima. Permanece sin cambios hasta la pubertad, cuando se produce un
aumento de su tamao que puede alcanzar unos 20 g en un adulto de 25 30 aos. Su funcin es
segregar un lquido ligeramente alcalino que forma parte del semen y que protege a los espermatozoides,
neutralizando el pH cido de la vagina y aumentando as su supervivencia.

Prstata
Uretra
Pene
Testculos
Epiddimo Escroto
Tnica
testicular
Ano
Vescula
seminal
Recto
Vejiga
1.1.1 Anatoma de la prstata

Segn la clasificacin de McNeal, la prstata est formada por una zona fibromuscular anterior y
una zona glandular, dividida a su vez en tres zonas: la zona central, cruzada por los conductos
eyaculadores que supone un 25% de la glndula, la zona de transicin, que rodea a la uretra posterior
con un 5% del volumen glandular y la zona perifrica, con un 70% del volumen glandular (McNeal, 1968).
En la zona de transicin es dnde se origina la hiperplasia benigna de prstata (BPH), mientras que en la
perifrica es dnde se desarrolla principalmente el cncer de prstata (De Marzo et al., 2007). Tambin

Introduccin

existe otra clasificacin, menos utilizada, que divide anatmicamente a la prstata en cinco lbulos:
anterior, posterior, medio y dos laterales (figura 2).
Lbulos laterales
Lbulo anterior
Cpsula prosttica
Lbulo medio
Lbulo posterior
Conductos eyaculadores
Uretra
B) A)
Zona central
Zona de transicin
Zona perifrica

Figura 2. Anatoma de la prstata. A) Esquema de las zonas de la glndula prosttica segn la clasificacin de
McNeal (vista anteroposterior). B) Esquema de la clasificacin de la prstata en lbulos.


1.1.2 Histologa de la prstata

La glndula prosttica est formada por dos tipos de tejidos: estroma y epitelio-glandular (figura
3). El estroma rodea el epitelio y ambos tejidos interaccionan entre s mediante la secrecin de
andrgenos, hormonas esteriodeas, factores de crecimiento y mediadores que regulan el crecimiento y la
diferenciacin, manteniendo as la homeostasis de la prstata. Los separa una membrana basal, una
capa de tejido conectivo y una capa de glicosa-aminoglicanos, polisacridos y glicolpidos que conforman
la denominada matriz extracelular. Dicha matriz tiene una funcin conectora y de comunicacin que es
fundamental (Nieto et al., 2007; Cunha, 2008).

El estroma se conforma de msculo liso, colgeno y fibroblastos, adems de contener terminales
nerviosos, vasos sanguneos y clulas infiltradas del sistema inmune.

El epitelio est formado por distintas capas de clulas:

- Las clulas luminales secretoras son las ms cercanas a la luz de la glndula y las ms
abundantes en el tejido normal. Forman un compartimento exocrino que secreta antgeno especfico
prosttico (PSA) y fosfatasa cida prosttica (PAP) en el lumen glandular. Estas dos protenas sirven de
4


Introduccin

marcador tumoral, ya que sus niveles se modifican en el cncer. Son las clulas ms diferenciadas y
expresan altos niveles del receptor de andrgenos (AR), dependiendo as de la presencia de andrgenos
para su supervivencia.
marcador tumoral, ya que sus niveles se modifican en el cncer. Son las clulas ms diferenciadas y
expresan altos niveles del receptor de andrgenos (AR), dependiendo as de la presencia de andrgenos
para su supervivencia.
- Las clulas basales forman la membrana basal. Estn relativamente indiferenciadas y
no posen actividad secretora. Presentan niveles bajos o nulos del AR, por lo que son andrgeno
independientes. S expresan receptor de estrgenos (ER) y responden a stos proliferando.
- Las clulas basales forman la membrana basal. Estn relativamente indiferenciadas y
no posen actividad secretora. Presentan niveles bajos o nulos del AR, por lo que son andrgeno
independientes. S expresan receptor de estrgenos (ER) y responden a stos proliferando.
- Tambin existe un pequeo nmero de clulas neuroendocrinas en el compartimento
basal, que secretan serotonina y otros neuropptidos (Lang et al., 2009).
- Tambin existe un pequeo nmero de clulas neuroendocrinas en el compartimento
basal, que secretan serotonina y otros neuropptidos (Lang et al., 2009).
5

Figura
- Adems hay un reducido nmero de clulas madre, que originan todos los tipos
celulares del epitelio al diferenciarse, dependiendo del balance entre estrgenos y andrgenos (Sun et al.,
- Adems hay un reducido nmero de clulas madre, que originan todos los tipos
celulares del epitelio al diferenciarse, dependiendo del balance entre estrgenos y andrgenos (Sun et al.,
3. Histologa de la prstata. Clulas que conforman la unidad epitelial y estromal.
2009).
est provocada por una infeccin bacteriana y puede ser aguda o crnica, si se reitera. La no bacteriana
suele ser la ms frecuente, y a su vez se divide en in itos en el fluido
Clulas que conforman la unidad epitelial y estromal.
2009).
est provocada por una infeccin bacteriana y puede ser aguda o crnica, si se reitera. La no bacteriana
suele ser la ms frecuente, y a su vez se divide en in itos en el fluido

1.2.- Patologas de la prstata 1.2.- Patologas de la prstata

1.2.1 Prostatitis 1.2.1 Prostatitis

Es una manifestacin que incluye distintos procesos de naturaleza inflamatoria o infecciosa que
afectan a la glndula prosttica. Se puede clasificar en dos clases, bacteriana y no bacteriana. La primera
prosttico, y no inflamatoria, que se da en ausencia de inflamacin urogenital. Tambin existe una
tercera, no asintomtica, que slo se manifiesta al explorar la prstata a causa de otras patologas
(Krieger et al., 2008) .
Es una manifestacin que incluye distintos procesos de naturaleza inflamatoria o infecciosa que
afectan a la glndula prosttica. Se puede clasificar en dos clases, bacteriana y no bacteriana. La primera
prosttico, y no inflamatoria, que se da en ausencia de inflamacin urogenital. Tambin existe una
tercera, no asintomtica, que slo se manifiesta al explorar la prstata a causa de otras patologas
(Krieger et al., 2008) .
flamatoria, con presencia de leucoc flamatoria, con presencia de leucoc
AR AR AR AR
Clulas luminales
secretoras
Clulas basales
Clulas
neuroendocrinas
Clulas estromales
Clulas madre
Epitelio
Estroma

Introduccin

6

cin. Una continua exposicin de la prstata a la inflamacin puede conducir a
cambios

e caracteriza por una proliferacin anormal de las
clulas de la prstata, y normalmente acontece en la zona de transicin periuretral de la glndula
(Ember

La prostatitis crnica puede ocasionar dao celular en el estroma y en el epitelio, causando
frecuentemente inflama
dramticos en la estructura y funcin de las protenas, as como alteraciones genticas,
produciendo dao tisular que puede inducir neoplasia (Karan et al., 2009; Khandrika et al., 2009).
Distintas fuentes asocian de hecho la prostatitis con el inicio y progresin de la hiperplasia benigna de
prstata (Begley et al., 2008; Delongchamps et al., 2008; Penna et al., 2009) as como del cncer de
prstata (De Marzo et al., 2007; Sciarra et al., 2007; Rebbeck et al., 2008; Wong et al., 2009), pudiendo
ser tambin esta alteracin el eslabn que une ambas patologas.


1.2.2 Hiperplasia Benigna de prstata
La hiperplasia benigna de prstata (BPH) s
ton et al., 2008). Existen distintos factores que pueden influir en la aparicin de esta patologa. El
ms relevante de ellos es la edad, ocurriendo frecuentemente una remodelacin tisular en la prstata,
principalmente en la zona de transicin, que viene acompaada de la alteracin de las delicadas
interacciones entre el estroma y el epitelio. Estas modificaciones suelen afectar sobre todo a las clulas
basales, que cambian su metabolismo y se convierten en hipertrficas (Geramoutsos et al., 2004). Las
alteraciones hormonales tambin estn presentes en el desarrollo de la BPH. Existe un incremento de la
sealizacin andrognica en la BPH, que afecta a las clulas luminales secretoras, que dependen de
andrgenos para diferenciarse (Roberts et al., 2004a; Roberts et al., 2004b). Por otro lado, un aumento
de la estimulacin estrognica puede producir crecimiento aberrante en las clulas epiteliales y un
aumento en la proliferacin de las clulas estromales (Prins et al., 2008). Por ltimo la asociacin entre la
BPH y el sndrome metablico ha sido estudiada recientemente, considerndose la diabetes mellitus no
insulinodependiete (NIDDM), la hipertensin, la obesidad y los altos niveles de lipoprotenas de alta
densidad (HDL) factores de riesgo para la BHP (Briganti, 2009).
La BPH, aunque no es considerada un estado premaligno, s puede ser empleada como un factor
de prognosis del cncer de prstata (Alcaraz et al., 2009).



Introduccin

7

1.2.3 Cncer de prstata
l cncer de prstata es el tumor maligno ms diagnosticado en varones en el mundo occidental,
el segun
1.2.3.1 Estados premalignos
La patognesis del cncer de prstata incluye tanto elementos hereditarios como ambientales.
Dentro
trofia proliferativa inflamatoria
La atrofia proliferativa inflamatoria (PIA) es una atrofia focal de la glndula prosttica ocasionada
por da
unque la mayora de las atrofias focales se consideran quiescentes, algunas de las clulas
daad

E
do tumor maligno ms frecuente del sexo masculino y la segunda causa de muerte por cncer en
el varn (Crawford et al., 2009; Sorensen et al., 2010).


de stos ltimos, el 20 % de todos los cnceres en adultos derivan de un estado de inflamacin
crnica. Esta inflamacin puede provocar una atrofia en el epitelio que termina desarrollando un estado
premaligno previo al cncer (De Marzo et al., 2007; Rebbeck et al., 2008; Vindrieux et al., 2009). Se
diferencian dos estados premalignos que secuencialmente pueden dar lugar al desarrollo del tumor.

A

os repetidos en el epitelio derivados de la inflamacin crnica. Las caractersticas principales de
este estado premaligno son la presencia de clulas inflamatorias tanto en el epitelio como en el estroma,
que producen dao y muerte celular, causando una remodelacin del tejido que morfolgicamente se
manifiesta como una atrofia del estroma con cantidad variable de fibrosis (Joshua et al., 2008). Los
agentes oxidantes provenientes de las clulas inflamatorias infiltradas que no se destoxifican, las toxinas
derivadas de la dieta, o la orina que refluye dentro de la prstata, pueden ocasionar la proliferacin
discreta del epitelio glandular con apariencia morfolgica de una simple atrofia o una hiperplasia post-
atrfica (Sciarra et al., 2007).

A
as pueden proliferar dando lugar al desarrollo del cncer o, ms comnmente, al segundo de los
estados premalignos, la neoplasia intraepitelial prosttica.

Introduccin

Neoplasia intraepitelial prosttica

La neoplasia intraepitelial prosttica (PIN) es una proliferacin preneoplsica que suele darse en
la zona perifrica de la glndula prosttica, conservndose la estructura del acino y de los ductos, pero
existiendo daos y modificaciones celulares. Se puede producir por daos repetidos en el epitelio que
ocurren principalmente durante la PIA, induciendo una excesiva proliferacin al intentar ser reparados que
en ocasiones conduce a daos irreversibles en el genoma. Adicionalmente se produce un incremento de
clulas epiteliales que poseen un fenotipo intermedio entre clulas basales y luminales. En algunas de
estas clulas ocurren modificaciones somticas que incrementan la inestabilidad gentica induciendo
cambios irrevocables que dan lugar al desarrollo del cncer (De Marzo et al., 2007). Por otro lado se
incrementa la secrecin de enzimas proteolticas que causan degradacin de la membrana basal, lo que
permite la invasin del estroma y, en el peor de los casos, la invasin a otros tejidos (Kryczek et al.,
2009a) (figura 4).

Mutaciones somticas
Cambios gnicos agresivos
PIA PIN
Prstata
normal
Cncer de prstata no
agresivo
Cncer de prstata
invasivo
Figura 4. Modelo celular de progresin en el cncer de prstata. Existen dos estados premalignos anteriores a la
aparicin del tumor, la atrofia proliferativa inflamatoria (PIA) y la neoplasia intraepitelial prosttica (PIN) que pueden
terminar dando lugar al cncer de prstata. En el primero existe una atrofia celular en la zona epitelial y una inflamacin
crnica y en el segundo hay un estado precanceroso de las clulas epiteliales, con cambios citolgicos anticipatorios del
cncer, aunque se conserva la membrana basal, si bien ms reducida. En ltimo trmino se desarrolla un
adenocarcinoma. (Modificado de Witte, 2009).

8


Introduccin

9

1.2.3.2 Desarrollo y evolucin del cncer

Como ya se ha descrito, las patologas benignas y los estados premalignos de la prstata pueden
ser factores biolgicos de riesgo en la progresin del cncer de prstata. An as, la etiologa del cncer
de prstata est lejos de ser elucidada. Entre las posibles causas moleculares que influyen en su
desarrollo se encuentran tanto mutaciones y cambios en la funcin de diversos oncogenes y genes
supresores de tumores (Ramsay et al., 2009), como alteraciones en las distintas interacciones entre los
componentes estromal y epitelial de la prstata. Estas alteraciones involucran a diversas hormonas y
factores de crecimiento que en condiciones normales regulan adecuadamente los procesos de desarrollo,
maduracin y crecimiento tisular prosttico (Liu et al., 2009). En ltimo trmino se desarrolla un cncer de
prstata, siendo el ms frecuente el adenocarcinoma (se da en ms del 95% de los casos), aunque
tambin pueden surgir otros tumores como sarcomas y pequeos carcinomas celulares (van Bokhoven et
al., 2003).

El adenocarcinoma es un tumor maligno de las clulas secretoras en el cual las clulas pierden
su funcin y estructura, desapareciendo la lmina basal y ocurriendo un crecimiento descontrolado. Se
desarrolla en dos fases, una dependiente de andrgenos, en la cual la privacin andrognica frena la
progresin del tumor y otra independiente de andrgenos, en la que la prstata responde a otras
hormonas que normalmente no son ligandos del AR.

1.2.3.3 Fases del cncer de prstata

Fase andrgeno dependiente

Los andrgenos son un importante factor de crecimiento en la prstata normal, donde
ejercen sus efectos por unin al AR localizado en el citoplasma de las clulas estromales y secretoras del
epitelio. El AR es un factor transcripcional miembro de la familia de receptores de hormonas esteroideas.
Al producirse la unin con los andrgenos, el AR se transloca al ncleo, donde regula la expresin de una
gran cantidad de genes involucrados en procesos tales como proliferacin, diferenciacin, apoptosis y
secrecin. Los andrgenos, por tanto, regulan el balance entre proliferacin y supervivencia dentro de la
prstata, controlando su homeostasis (Nieto et al., 2007).


Introduccin

10

Los andrgenos adems, estimulan distintos procesos inflamatorios que dan lugar a las ya
mencionadas lesiones benignas y estados premalignos los cuales, si adquieren caractersticas malignas,
evolucionan a un cncer de prstata. Por ello, el tratamiento ms comn en la primera fase del cncer de
prstata es la terapia por ablacin de andrgenos. Hay dos aproximaciones para conseguir esta ablacin.
La primera se realiza mediante la administracin oral de anti-andrgenos, que inhiben directamente la
unin de los andrgenos a su receptor y la liberacin de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH),
que acta a nivel del eje hipotalmico-pituitario-gonadal, disminuyendo la produccin de andrgenos
indirectamente al reducir los niveles de gonadotropina. La segunda se consigue mediante ciruga,
practicando una orquidectoma y/o prostactectoma radical, que se realiza cuando el tumor est localizado
(Vindrieux et al., 2009). Desafortunadamente el 20 % de los pacientes no tienen una buena respuesta, o
incluso cuando el tratamiento funciona, finalmente en el 80 % de los casos se da una regresin clnica,
resurgiendo el proceso canceroso esta vez como un tumor capaz de crecer en ausencia de andrgenos
(Ramsay et al., 2009).

Fase andrgeno independiente

La independencia a andrgenos se define como un estado clnico dentro del cncer de
prstata en el cual las clulas son capaces de sobrevivir y proliferar sin participacin de las seales
producidas por los andrgenos circulantes. La reduccin en los niveles de andrgenos que se provoca en
la terapia hormonal o en la prostactectoma radical puede favorecer la seleccin de clulas minoritarias
capaces de crecer en ausencia de andrgenos. Esta resistencia puede ocurrir por distintas causas que
afectan a la regulacin de la sealizacin del AR, haciendo que ste est activo en ausencia de ligando,
como son: sobreexpresin del AR, mutaciones activadas por los bajos niveles de andrgenos o por otros
ligandos esteriodeos, activacin del AR por ligandos no esteroideos tales como factores de crecimiento y
citoquinas, expresin alterada de co-activadores o co-represores y procesamiento proteoltico del AR
transformndose en una isoforma no dependiente de andrgenos (Devlin et al., 2009). Adems tambin
pueden activarse oncogenes o bloquearse genes supresores de tumores, permitindose de esta forma la
proliferacin descontrolada en independencia de andrgenos (Ramsay et al., 2009).

A nivel histolgico, en el estado final el tumor se vuelve heterogneo, dndose una mezcla de
clulas alteradas capaces de proliferar y metastatizar que incluyen no solo clulas luminales, sino
tambin clulas basales, neuroendocrinas o clulas con un fenotipo intermedio (Kelly et al., 2008). En
este contexto, estudios recientes han demostrado que las clulas madre pueden promover la malignidad

Introduccin

11

en las ltimas fases de la enfermedad. Sobre el papel de las clulas madre en el desarrollo del cncer
existen dos teoras. La teora clsica defiende que todas las clulas cancerosas son igualmente malignas,
pero slo algunos clones poseen caractersticas biolgicas favorables que permiten que el tumor siga
creciendo. La segunda teora sugiere que en el tumor se mantiene una jerarqua similar a la del tejido
normal, existiendo slo una subpoblacin de clulas en la cima de esta jerarqua que son capaces de
promover la malignidad (Lawson et al., 2007; Lang et al., 2009). Estas clulas presentan propiedades
caractersticas de las clulas madre adultas, incluyendo mecanismos anti-apoptticos, resistencia a
quimioterapia e independencia de andrgenos (Antonarakis et al., 2010a).

Una vez el cncer se vuelve andrgeno-independiente las opciones teraputicas son muy
limitadas. Frecuentemente se administran al paciente una variedad de compuestos quimioteraputicos
para combatir la enfermedad, pero este tratamiento suele tener slo un xito modesto, debido a
problemas de toxicidad y a la adquisicin de una resistencia a drogas a la que es particularmente
propensa el cncer de prstata (Lee et al., 2008).

1.2.3.4 Modelos celulares

La naturaleza heterognea del cncer de prstata dificulta la comprensin de los factores
involucrados en la iniciacin y progresin de la enfermedad. Esta compleja naturaleza hace necesario el
uso de modelos experimentales in vitro representativos de los diferentes estados de la enfermedad que
ayude al estudio de los mecanismos involucrados en la iniciacin y progresin del tumor. La mayora de
los estudios in vitro se han focalizado en tres lneas celulares, LNCaP, PC-3 y DU 145. Todas tienen
morfologa epitelial y fueron desarrolladas entre 1977 y 1980.

La lnea LNCaP es una lnea bien establecida procedente de una metstasis a un ndulo
linftico supraclavicular de un adenocarcinoma prosttico. Estas clulas expresan el AR y son
dependientes de andrgenos para su crecimiento, aunque en condiciones de cultivo pueden llegar a
perder el AR tras un gran nmero de pases. Mantienen las caractersticas propias de las clulas normales
de prstata. Por tanto, esta lnea se podra considerar representativa de un estado temprano del cncer
de prstata andrgeno-dependiente.

La lnea PC-3 deriva de una metstasis sea de un adenocarcinoma de prstata de grado
IV. Posee caractersticas tpicas de las clulas epiteliales neoplsicas, presentando numerosas

Introduccin

microvellosidades, uniones celulares complejas y orgnulos como el ncleo, nuclolo y mitocondrias
anormales. Exhibe baja actividad fosfatasa cida alcalina, as como niveles reducidos de 5-alfa-
reductasa. Es una lnea casi tripliode con un nmero modal de 62 cromosomas. Su tiempo de replicacin
es aproximadamente de 33 h, y generan tumores de 1-3 cm de dimetro aproximadamente a los 60 das
al ser inyectadas subcutneamente en ratones atmicos desnudos. No responden a la ausencia de
andrgenos, glucocorticoides, factor de crecimiento epidrmico (EGF) o factor de crecimiento de
fibroblastos (FGF), presentando un acelerado crecimiento (Dozmorov et al., 2009). En la tabla 1 se
recogen los principales genes relacionados con tumorognesis cuya expresin vara en esta lnea celular.

GEN

FUNCIN GRADO DE
EXPRESIN EN PC-3
REFERENCIA
H-ras Proto-oncogen Sobre-expresado (Yamazaki et al., 1994)
c-myc Proto-oncogen Sobre-expresado (Rijnders et al., 1985)
p53 Supresor tumoral, factor de
transcripcin, protena pro-
apopttica
Inexistente en este tipo
celular
(Navone et al., 1993)
Bin1 Supresor tumoral, inhibe la
transformacin maligna por
interaccin con c-myc
Expresin reducida (Ge et al., 2000)
NFB Factor de transcripcin Actividad elevada (Lindholm et al., 2000)
IKK Incrementa la actividad de
NFB
Constitutivamente activa (Palayoor et al., 1999)
Bcl-2 Protena anti-apopttica Sobre-expresado (Fahy et al., 2005)
Bcl-Xl Protena anti-apopttica Sobre-expresado (Li et al., 2001)
PTEN Supresor tumoral Inexistente en este tipo
celular
(Davies et al., 1999)
p-glicoprotena Asociada con resistencia a
drogas
Altos niveles (Theyer et al., 1993)
AR Receptor de andrgenos Mutado (Kaighn et al., 1979; van
Bokhoven et al., 2001)
P16(INK4) Supresor de tumoral Baja expresin (Yang et al., 1998)
Activador de
plasmingeno
Implicado en angiognesis Baja expresin (Vaarala et al., 2000)
MXB GTPasa Baja expresin (Vaarala et al., 2000)
Tabla 1: Alteraciones genticas en la lnea celular PC-3.
12


Introduccin

La lnea DU 145 proviene de una metstasis cerebral de un carcinoma prosttico. Son las
clulas ms agresivas, no presentan sensibilidad a andrgenos, son dbilmente positivas para la
fosfatasa cida alcalina y no expresan antgeno prosttico. Presentan microvellosidades, desmosomas y
mitocondrias anormales.

Las lneas celulares DU 145 y PC-3 tienen un fenotipo ms agresivo y son capaces de crecer en
ausencia de andrgenos, representando un avanzado estado de la enfermedad (Dozmorov et al., 2009).

La lnea RWPE-1 son clulas epiteliales derivadas de la zona perifrica de una prstata
histolgicamente normal inmortalizada con una copia simple del virus del papiloma humano (HPV-18). La
transfeccin con el virus del papiloma humano tiene un especial inters ya que este virus est involucrado
en una gran variedad de cnceres anogenitales, pudiendo tambin estar implicado en la carcinognesis
del cncer de prstata.
Figura 5. Lneas celulares comnmente usadas en el estudio del cncer de prstata. La lnea LNCaP responde a
andrgenos y por tanto representa una fase temprana de la enfermedad. Las lneas PC-3 y DU 145 son insensibles a
andrgenos por lo que se usan como modelos de la fase independiente de andrgenos. La lnea RWPE-1 se utiliza
como modelo de clula epitelial no tumoral.

En este trabajo se ha empleado principalmente la lnea PC-3 y ocasionalmente LNCaP, DU 145 y
RWPE-1 para comparar los efectos de los cannabinoides en otras clulas de prstata.
13


Introduccin

14

2.- MECANISMOS MOLECULARES Y CELULARES
IMPLICADOS EN EL CNCER DE PRSTATA.
POSIBLES DIANAS TERAPUTICAS.

Como ya se ha visto, los tratamientos para el cncer de prstata en su fase independiente de
andrgenos son muy limitados y, adems de su elevada toxicidad suelen ser ineficaces, recurriendo en el
95 % de los casos el proceso tumoral. En este sentido, continuamente se estn buscando dianas
teraputicas alternativas que estn involucradas en los distintos procesos biolgicos del cncer de
prstata, centrndose la investigacin en factores de supervivencia, apoptosis, resistencia a drogas,
angiognesis, regulacin epigentica, evasin y potenciacin de la respuesta inmune. En muchos de
estos procesos la modificacin aberrante de la sealizacin celular tiene un papel clave. Por todo ello, los
avances en el conocimiento de las rutas de sealizacin implicadas en la carcinognesis de prstata
permiten abrir una nueva va en la investigacin para el desarrollo de nuevos frmacos selectivos,
capaces de afectar nicamente a una de estas vas de sealizacin sin interferir inespecficamente en el
resto (Ramsay et al., 2009).

2.1.- Sealizacin celular

2.1.1 Vas de sealizacin que conducen a apoptosis

La apoptosis, o muerte celular programada, es un tipo de muerte celular inducida genticamente a
travs de un programa de suicidio celular. Juega un papel crucial durante el desarrollo, pero tambin en
la carcinognesis, ya que al funcionar como un mecanismo de proteccin contra la formacin y el
desarrollo del tumor su desregulacin puede propiciar el proceso tumoral (Russo et al., 2010).
Teraputicamente puede inducirse por mltiples tratamientos, entre ellos radiacin, quimioterapia y
drogas inductoras de seales apoptticas (Mahmood et al., 2010).

Existen dos vas apoptticas, la intrnseca o mitocondrial y la extrnseca. Ambas se llevan a cabo
principalmente a travs de la activacin de una cascada de reacciones proteolticas mediadas por
distintos miembros de la familia cisteinil-aspartato proteasas, tambin conocidas como caspasas. Estas
protenas se sintetizan como pro-enzimas que se activan por protelisis en respuesta a estmulos

Introduccin

15

externos (va extrnseca) tales como ligandos de los receptores de muerte celular, o internos (va
intrnseca), incluyendo dao en el DNA, privacin de citoquinas y factores de crecimiento, que provocan
daos en distintos componentes celulares. Se organizan dentro de una cascada compuesta de caspasas
iniciadoras, caspasa 8 en la va extrnseca o caspasa 9 en la intrnseca, que al ser activadas provocan la
ruptura de las caspasas efectoras, principalmente la caspasa 3. stas ltimas llevan a cabo la ruptura de
muchas protenas celulares y subsecuentemente, alteraciones morfolgicas y cambios en el metabolismo
que culminan con la muerte controlada de la clula (Kumar, 2009; Duncan et al., 2010; Lamkanfi et al.,
2010)

La va extrnseca se produce a travs de la sealizacin transducida por receptores de muerte
celular. Estos receptores pertenecen a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR) que
poseen una regin de unos 80 aminocidos llamada dominio de muerte (DD), que juega un papel
principal en la transmisin de la seal apopttica. Sus ligandos son miembros de la familia del factor de
necrosis tumoral (TNF), que incluyen a FASL, TNF- y ligandos inductores de apoptosis relacionados con
TNF- (TRAIL). La unin ligando-receptor desencadena un agrupamiento de los receptores,
generalmente mediado por la ceramida localizada en la membrana celular, que permite la formacin del
complejo de sealizacin de muerte celular (DISC). Este complejo est formado por una protena
adaptadora con un dominio de muerte asociado a Fas (FADD), procaspasa-8 y el inhibidor apopttico c-
FLIP. Cuando FADD se une al receptor por medio de su dominio de muerte (DD) y a la procaspasa 8 por
su dominio efector de muerte (DED), se produce la activacin de la procaspasa 8, desencadenando la
cascada de activacin de caspasas, en este caso de las caspasas 3 y 7, induciendo en ltimo trmino la
muerte celular (Schwarze et al., 2008; Mahmood et al., 2010) (figura 6).

La va intrnseca requiere la disrupcin de la membrana mitocondrial por protenas de la familia
Bcl-2, formndose un poro en la membrana mitocondrial y liberndose protenas mitocondriales como el
citocromo c. La familia Bcl-2 se caracteriza por poseer regiones especficas de homologa a Bcl-2 (BH1,
BH2, BH3 y BH4). Puede dividirse en protenas pro-apoptticas y anti-apoptticas. Las protenas pro-
apoptticas incluyen protenas tales como Bax, Bcl-Xs, Bak, Bok/Mtd, que contienen 2 3 dominios de
homologa a Bcl-2 (BH), y otras como Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim/Bod y Blk, con slo un dominio 3
de homologa a Bcl-2 (BH3). Las anti-apoptticas incluyen protenas como Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, A1/Bfl-1,
Mcl-1 y Boo/Diva, que contienen 3 4 regiones de homologa con Bcl-2. La sobre-expresin de protenas
anti-apoptticas inhibe la liberacin del citocromo c de la mitocondria, mientras que la sobre-expresin de

Introduccin

protenas pro-apoptticas induce su liberacin. Al liberarse el citocromo c del espacio intermembrana de
la mitocondria pasa al citoplasma dnde, junto a otros factores citoslicos, como factor 1 activador de
proteasas apoptticas (Apaf-1) y procaspasa 9, promueve la formacin del complejo activador de
caspasas, el apoptosoma, desencadenando la activacin de caspasa 9, que a su vez activa a sus
caspasas efectoras, caspasa 3, 6 y 7, iniciando as la cascada apopttica (Liao et al., 2007; Russo et al.,
2010).
16

Figura 6. Esquema de las principales rutas apoptticas. La va extrnseca se induce por factores externos capaces de
unirse a los receptores de muerte celular, formndose el complejo de muerte celular y activndose la caspasa 8. La va
intrnseca se activa en presencia de estmulos apoptticos internos, como dao en el DNA, permeabilizndose la
membrana mitocondrial y producindose la liberacin al citoplasma del citocromo c, que activa el apoptosoma y a la
caspasa 9.

Papel del estrs de retculo en la apoptosis


El retculo endoplasmtico (ER) es el sitio de sntesis y plegamiento de un tercio de las protenas
celulares, principalmente protenas secretoras y de unin a membrana. Es tambin un elemento clave en
el trfico de vesculas, adems de participar en la sntesis de lpidos y de esteroides, biognesis de
membrana y almacenamiento del calcio intracelular. Adems de este amplio nmero de funciones
biolgicas, se comporta como un sensor de daos celulares, a los que responde mediante una respuesta
llamada estrs de retculo (Schwarze et al., 2008). El estrs de retculo se produce por alteraciones de
la homeostasis celular que causan deplecin de Ca
2+
o de molculas donadoras de energa, as como por
infecciones virales, bloquendose la sntesis de protenas. Se produce de esta forma una acumulacin de
protenas mal plegadas que inducen un mecanismo conocido como respuesta a protenas mal plegadas
DD
Receptor de
muerte
Factores de
crecimiento
procaspasa 9
procaspasa 8
FADD
c-FLIP
Caspasa
3,6,7
Bcl-2
Caspasa 8
Caspasa 9
Apaf
Citocromo c
Va extrnseca
Va intrnseca
DIS
DED DED
C
DD

Introduccin

(UPR). Esta UPR se inicia por mediacin de una chaperona de 78 kDa regulada por glucosa (GRP78),
que en condiciones normales est unida a tres protenas transmembrana que actan como sensores de
estrs, la quinasa del retculo endoplasmtico pancretico (PERK), el factor de transcripcin activador 6
(ATF6) y la enzima dependiente de inositol (IRE1), mantenindolas en un estado inactivo. Al aumentar las
protenas con un mal plegamiento compiten con los sensores de estrs por su unin a GRP78,
liberndose stos y activndose de forma secuencial. PERK activo fosforila al factor iniciador de la
sntesis de protenas en eucariotas, eIF2, inactivndolo, inhibiendo as la transcripcin dependiente de
Cap, pero permitiendo la IRES dependiente y activando adems al factor de transcripcin ATF4, que se
transloca al ncleo y regula la expresin de genes implicados en la homeostasis del ER. ATF6 se
proteoliza y se activa en el aparato de Glogi, translocndose al ncleo, dnde induce la expresin de
genes con elementos de respuesta al estrs de retculo (ERSA), entre otros CHOP y la protena 1 de
unin a X-box (XBP1). XBP1 ha de sufrir un procesamiento post-transcripcional llevado a cabo por IRE1,
lo cual permite su translocacin al ncleo y la activacin de genes inducibles por estrs responsables de
la degradacin de las protenas mal plegadas (Szegezdi et al., 2006; Healy et al., 2009) (figura 7).
Reaccin redox
Transporte y sntesis
de aa
Respuesta a estrs
CHOP
XBP1
Chaperonas
CHOP
Chaperonas
Genes de
degradacin de
protenas
Figura 7. Esquema de las principales rutas implicadas en la respuesta UPR. Bajo agregacin de protenas mal
plegadas, GRP78 se disocia de los tres sensores de estrs de retculo, PERK, ATF6 e IRE1, permitiendo su activacin.
La activacin de estas protenas ocurre de manera secuencial de la siguiente manera: PERK, ATF6 e IRE1. La
activacin de PERK bloquea eIF2, lo que permite la translocacin de ATF4 al ncleo, activndose la transcripcin
independiente de eIF2. ATF6 se activa por protelisis, translocndose al ncleo y regulando la expresin de
chaperonas del ER, as como de XBP1. XBP1 es un factor transcripcional cuyo mRNA ha de modificarse por splicing,
siendo el encargado de esta modificacin IRE1. XBP1 una vez modificado se transloca al ncleo, activando la expresin
de chaperonas y de genes involucrados en degradacin de protenas (Modificado de Szegezdi et al, .2006).

17


Introduccin

18


Aunque la respuesta UPR es principalmente una respuesta pro-supervivencia, en situaciones de
estrs prolongadas que no logran resolverse, puede inducir apoptosis, considerndose incluso el estrs
de retculo una nueva va de induccin de apoptosis (Heath-Engel et al., 2008; Repicky et al., 2008). Si
bien los mecanismos biolgicos por los que ocurre est relacin no estn claros, se sabe que distintos
miembros de la familia Bcl-2 pueden regular la homeostasis del calcio intracelular, afectando as el
intercambio de calcio entre el retculo y la mitocondria, pudiendo traducirse estos cambios en la activacin
de la va intrnseca apopttica (Schwarze et al., 2008).

Papel de la ceramida en la apoptosis


Los esfingolpidos complejos son los principales constituyentes de la membrana celular. Adems
de este papel estructural, algunos de ellos tambin poseen importantes propiedades bioactivas. Estn
formados por esfingosina unida a un cido graso de longitud variable (entre 14 y 16 carbonos), que forma
la molcula de ceramida, al que se une un grupo polar. La ceramida, adems de formar parte de los
esfingolpidos, acta como segundo mensajero regulando vas de sealizacin celular implicadas en
procesos biolgicos como diferenciacin, trfico celular, parada del ciclo celular, proliferacin y apoptosis
(Mao et al., 2008; Arana et al., 2010; Gangoiti et al., 2010).

La ceramida puede generarse a travs de dos rutas: por sntesis de novo y por degradacin de
esfingolmielina (SM) de la membrana plasmtica por esfingomielinasas (SMasas). La primera va, la de
sntesis de novo, es una ruta anablica que comienza con la condensacin de serina y palmitoil coenzima
A por la enzima serina palmitoil transferasa (SPT) rindiendo 3-cetoesfinganina. Posteriormente se reduce
la 3-cetoesfinganina a esfinganina, e inmediatamente se acila por la dihidroceramida sintasa, tambin
denominada ceramida sintasa (CerS), rindiendo dihidroceramida. Existen seis CerS conocidas, que
muestran diferente preferencia por distintos sustratos acil-coenzima A, generando distintas especies de
ceramidas. Por ltimo, acontece la desaturacin de dihidroceramida, originando ceramida. Ceramida
tambin puede formarse directamente a partir de esfingosina por accin de la ceramida sintasa. La
segunda va de generacin de ceramida es una va catablica. La ceramida se origina directamente a
partir de la hidrlisis de esfingomielina por un grupo de enzimas llamadas esfingomielinasas, rindiendo
tambin una molcula de fosforilcolina (Gangoiti et al., 2010) (figura 8).


Introduccin

Ceramida acta como precursor de distintos esfingolpidos complejos. Cerebrsidos y ganglisidos
se sintetizan mediante distintas enzimas biosintticas que aaden sustituyentes especficos en la posicin
C1. SM se genera a travs de la unin de un grupo de fosforilcolina proveniente de la fosfatidil colina (PC)
por la SM sintasa. Adems, ceramida puede fosforilarse por la enzima ceramida quinasa (CerK),
formando ceramida-1-P (C1P), regulador clave de la homeostasis celular, implicado tambin en procesos
de inflamacin (Saddoughi et al., 2008; Arana et al., 2010; Gangoiti et al., 2010).
serina + palmitoil-CoA
19

Figura 8. Vas de sntesis de ceramida. Existen dos rutas que llevan a la generacin de ceramida: la sntesis de novo a
partir de la condensacin de esfingolpidos del retculo endoplasmtico y el aparato de Golgi, y la hidrlisis de
esfingomielina de la membrana plasmtica por esfingomielinasas.
El papel principal de ceramida como segundo mensajero consiste en mediar en respuestas que
conducen a apoptosis y parada de ciclo celular, aunque tambin est implicada en la sealizacin celular
que regula otras respuestas muy diversas, como adhesin, angiognesis, trfico celular e inflamacin.
Ceramida puede interaccionar con fosfatasas y quinasas que regulan importantes vas implicadas en
crecimiento celular y la apoptosis, como protena quinasa C (PKC), MAP quinasas y protena fosfatasas 1
y 2 (PP1 y PP2A) (Saddoughi et al., 2008). Por otro lado, C1P posee funciones antagnicas a las de
ceramida. Presenta un papel mitognico, promoviendo respuestas de supervivencia y crecimiento celular
a travs de la regulacin de diferentes vas de sealizacin, como la protena quinasa quinasa activada
por mitgenos (MEK), PI3K/Akt y c-Jun terminal quinasa (JNK). Adems de esta funcin mitognica, C1P
est fuertemente implicada en respuestas inflamatorias y en regulacin de fagocitosis (Saddoughi et al.,
2008; Arana et al., 2010; Levi et al., 2010).

ceramida
esfingomielina
Esfingomielinasas
dihidroceramida
esfinganina
3-cetoesfinganina
ceramida
sintasa
SNTESIS DE NOVO
HIDRLISIS DE
ESFINGOMIELINA

Introduccin

20

2.1.2 Vas de sealizacin implicadas en proliferacin y supervivencia
celular

Durante la gnesis y el desarrollo del cncer, adems de alterarse los mecanismos anti-
apoptticos, frecuentemente se modifican los mecanismos de supervivencia celular, siendo el balance
entre ambos procesos clave en el control y tratamiento de la enfermedad. Entre los mecanismos que
regulan la supervivencia celular y que habitualmente estn implicados en el cncer, destacan la va
PI3K/Akt/mTOR y las cascadas de MAPKs.

Va PI3K/Akt/mTOR


En el 50-80% de los casos de cncer de prstata avanzado y aproximadamente en el 20% de las
lesiones localizadas se pierde el gen supresor de tumores PTEN (Lee et al., 2008; Antonarakis et al.,
2010a). Este gen es un regulador negativo de la ruta de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K),
encontrndose as esta va sobre-activada frecuentemente en el cncer de prstata. Esta va regula
mltiples procesos celulares, principalmente supervivencia, progresin del ciclo celular y transformacin
neoplsica (Antonarakis et al., 2010a; Mahajan et al., 2010).

PI3K es una protena con un dominio cataltico capaz de convertir fosfatidil inositol 4,5 bisfosfato
(PIP
2
) en fosfatidil inositol trisfosfato (PIP
3
), fosfolpido que acta como segundo mensajero, activando
indirectamente a la protena quinasa B (PKB)/Akt. Una vez activada, Akt puede fosforilar entre otros
sustratos a la protena diana de rapamicina en los mamferos (mTOR). mTOR es una serina/treonina
quinasa que regula la expresin de genes implicados en crecimiento, como c-Myc, ciclina D1 y el factor
de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (Lee et al., 2008; Ramsay et al., 2009; Antonarakis et al.,
2010a). Adicionalmente Akt tambin es capaz de translocarse al ncleo, donde afecta directa o
indirectamente a la actividad de mltiples reguladores de la transcripcin, como CREB (protena de unin
a elementos de respuesta a AMP cclico), el factor nuclear kappa B (NFB) y el factor de transcripcin
forkhead, que regulan la proliferacin y crecimiento celular. Akt tambin puede inactivar por fosforilacin
varios factores apoptticos, como procaspasa 9 y el miembro pro-apopttico de la familia Bcl-2, Bad
(Kitagawa et al., 2002; Fresno Vara et al., 2004; Lee et al., 2008; Qiao et al., 2008) (figura 9).

Introduccin

Factores de
crecimiento
PTEN
21

Figura 9. Va PI3K/PTEN/Akt/mTOR. Distintos factores de crecimiento pueden activar a PI3K, fosforilando PIP2 a PIP3,
segundo mensajero que activa a su vez a Akt. Akt posee un amplio espectro de dianas reguladoras del crecimiento y
apoptosis.

Protenas quinasas activadas por mitgenos


Las protenas quinasas activadas por mitgenos (MAPKs) son una familia de serina/treonina
quinasas que median la sealizacin intracelular implicada en una amplia variedad de procesos tales
como proliferacin celular, diferenciacin, supervivencia, muerte celular y transformacin. La familia de
MAPKs est compuesta por varias protenas, entre las que destacan la quinasa regulada por seales
extracelulares (ERK), p38, y c-Jun NH
2
-terminal quinasa (JNK). Cada una de estas MAPK son el ltimo
elemento de una cascada de sealizacin en la que participan al menos tres quinasas que se activan en
tndem, una MAPK quinasa quinasa (MAP3K), una MAPK quinasa (MAP2K) y la propia MAPK. La
sealizacin culmina con la unin de las MAPKs a factores de transcripcin, activndolos y modulando de
esta forma la expresin de genes a travs de fosforilacin de residuos serina/treonina. Tambin pueden
fosforilar protenas citoplasmticas, principalmente protenas implicadas en procesos apoptticos, como
algunos miembros de la familia Bcl-2 y protenas del citoesqueleto (Junttila et al., 2008; Lee et al., 2008;
Huang et al., 2009) (figura 10).

PI3K
CREB
Caspasa 9
Akt
PIP2
p
p
PIP3
p
p
p
NFkB
mTOR
Bad

Introduccin

MAP4K/GTPasa Ras
MAP3k Raf ASK1,MEKK1,ML3
MAP2K MEK M2K3/M2K6 M2K4/M2K7
MAPK ERK p38 JNK
Respuestas celulares Proliferacin celular
Migracin
Diferenciacin
Proliferacin celular
Diferenciacin y apoptosis
Respuestas inflamatorias
22


Figura 10. Ruta de sealizacin celular de las vas MAPKs. La ruta de las MAPK est compuesta por una serie de
activaciones secuenciales de MAPK: primero MAP3K, segundo MAP2K y por ltimo MAPK. En ocasiones existen
adicionalmente otras quinasas que activan a MAP3K, las MAP4K. Los efectores ltimos de esta ruta, las MAPK, son
ERK, p38 y JNK. MAPK activan un amplio rango de sustratos implicados en diversas funciones celulares, entre ellas
supervivencia celular, apoptosis e inflamacin.
La sealizacin regulada por MAPK ha sido implicada en la patognesis de varias enfermedades,
incluido el cncer (Kim et al., 2010). Aunque en el cncer de prstata no ha sido una ruta muy estudiada,
en los trabajos realizados sobre el tema existe divergencia, relacionndola unos con el desarrollo del
cncer, y otros con su regresin, siendo necesarios ms estudios para aclarar su papel en el cncer de
prstata (Lee et al., 2008).

Va de ERK

Esta va se considera una va promotora de supervivencia. Se activa por una gran variedad de
mitgenos y de steres de forbol. La seal se inicia por Ras, una GTPasa que se activa por receptores
tirosin-quinasa (RTK), seguida de activacin de Raf. Raf tambin puede activarse, as como inhibirse, por
varias quinasas, como PKC, protena quinasa A (PKA) y protena quinasa activada por p21 (PAK). Una
vez activada, Raf se une y fosforila a sus sustratos diana, MEK1 y MEK2, con mediacin de la quinasa
supresora de Ras (KSR). MEK1/2 activa directamente a las quinasas ERK1 y ERK2, que regulan la
actividad de mltiples dianas, entre ellas diferente miembros pro-apoptticos de la familia Bcl-2 y factores
de transcripcin como FOXO3A, CREB, NFB y c-Fos (Lee et al., 2008; Kim et al., 2010).



Introduccin

23

Va de JNK

La va de JNK puede participar en procesos de apoptosis, supervivencia o proliferacin
dependiendo de los distintos estmulos. Se activa en respuesta a estrs y citoquinas. Existen numerosas
MAP3Ks capaces de activar esta va, entre ellas ASK1, HPK1, MLK-3, M3K14, TAK-1 y TPL-2. Estas
activan dos MAP2K, M2K4 o M2K7, ambas necesarias para activar JNK. El principal sustrato de JNK es
c-Jun, pero tambin puede activar otros factores de transcripcin tales como ATF-2, Elk-1, MEF-2c, p53 y
c-Myc. Adems, JNK puede activar protenas anti-apoptticas, entre ellas Bcl-2 y Bcl-x (Junttila et al.,
2008; Kim et al., 2010).

Va de p38

Esta va est implicada en un amplio rango de funciones celulares, incluyendo apoptosis,
regulacin del ciclo celular, induccin de la expresin de citoquinas y diferenciacin. Se activa
principalmente en respuesta a estrs y por molculas proinflamatorias, como TNF e interleuquina 1 (IL-
1) (Feng et al., 2009). Estos estmulos activan las mismas MAP3K que actan en la va de JNK, como
ASK1 y TAKI, que a su vez activan las MAP2K, M2K3 y M2K6, que por ltimo activan a p38 (Junttila et
al., 2008; Feng et al., 2009).


2.2.- Sistema inmune: Inmunoterapia

En los ltimos aos la implicacin del sistema inmune en el tratamiento del cncer est tomando
una gran relevancia. Es ampliamente conocido que los pacientes inmunosuprimidos poseen mayor
susceptibilidad a generar distintos tipos de cncer (Arnon et al., 2008). En este sentido el sistema inmune
puede generar respuestas antitumorales que eviten el desarrollo del tumor, siendo la supresin de estas
respuestas uno de los factores clave para la supervivencia tumoral y la invasin. Por tanto, entrenar al
sistema inmune para inducir una respuesta contra el tumor es el principal objetivo en todas las
aproximaciones inmunoteraputicas (Arnon et al., 2008; Shields et al., 2010).

En el caso del cncer de prstata el xito de la inmunoterapia es ms conflictivo debido al papel ya
mencionado de la inflamacin en el origen y progresin de esta enfermedad. Este hecho induce a pensar
que el cncer de prstata no es un tipo de cncer susceptible al uso de inmunoterapia. No obstante,

Introduccin

24

evidencias recientes sugieren que el cncer de prstata es ms inmunognico de lo que se pensaba,
habiendo pacientes que generan autoanticuerpos espontneamente. Adems, al ser una enfermedad de
lenta progresin permite que la estimulacin del sistema inmune genere con el tiempo una respuesta anti-
tumoral eficaz. As, aunque el uso de inmunoterapia en el cncer de prstata ha de hacerse de manera
altamente controlada, no slo estimulando, si no tambin modulando el sistema inmune, actualmente
existen varias terapias inmunolgicas en fase clnica de desarrollo, entre ellas dos vacunas y un inhibidor
de un factor regulador negativo de la activacin de los linfocitos (Harzstark et al., 2009; Antonarakis et al.,
2010a).

2.2.1 Papel de las clulas T

El uso de una estimulacin global del sistema inmune podra aumentar las reacciones inmunes
inespecficas en el cncer de prstata y aumentar la respuesta inflamatoria. Los principales mediadores y
efectores inespecficos del sistema inmune son las citoquinas, el sistema del complemento y las protenas
de fase aguda, adems de algunos componentes celulares como los neutrfilos, macrfagos y clulas
natural killer. En contraste, la inmunidad adaptativa puede usarse como especfica en inmunoterapia, ya
que este componente del sistema inmune puede ser amplificado y dirigido propiamente contra las clulas
tumorales. Las clulas que median principalmente en las respuestas antitumorales son los linfocitos T
(Carlsson et al., 2007). As, la generacin de reacciones tumor-especficas ejecutadas por los linfocitos T,
ya sea a travs de una vacuna o por el uso de anticuerpos, es una de las aproximaciones ms
prometedoras en inmunoterapia dirigida (Kubler et al., 2008; Reiter et al., 2009). En el caso del cncer de
prstata, concurren varios factores que potencian el uso de las clulas T como posibles antitumorales;
existe un gran nmero de protenas con expresin especfica o preferencial en la prstata que pueden ser
usadas como antgenos asociados al tumor contra los que lanzar la respuesta inmune y, al mismo tiempo,
la prstata es un rgano prescindible no vital, lo cual permite una inmunoterapia dirigida (Carlsson et al.,
2007).

Los linfocitos T se originan en el timo, como clulas T nativas o nave, que circulan por el torrente
sanguneo y migran a los rganos linfoides perifricos, desde dnde vuelven a la sangre, recirculando
entre ambas localizaciones hasta que encuentran al antgeno. Estas clulas participan en la respuesta
inmunitaria adaptativa, pero para ello han de proliferar y diferenciarse a clulas T efectoras, capaces de
destruir los agentes patgenos. Existen dos clases de clulas T efectoras, que se diferencian por la

Introduccin

25

expresin en membrana de dos molculas de superficie diferentes que van a determinar sus funciones
efectoras (figura 11).
Clulas T citotxicas (CTL) son clulas CD8+. Reconocen y lisan las clulas que
presentan antgenos anormales en su membrana, ya sean clulas anormales del organismo, como
clulas neoplsicas, o clulas infectadas por microorganismos intracelulares.
Clulas T colaboradoras o helper (Th) son clulas CD4+. Activan, por medio de la
secrecin de citoquinas, a las clulas B y macrfagos que han capturado el antgeno, ayudndolos a
destruir los microorganismos extracelulares o que viven en vesculas fagocticas. Tras la activacin,
pueden diferenciarse a su vez en tres subtipos. Las clulas Th1 conducen la respuesta inmune mediada
por clulas implicada en dao tisular e infeccin contra parsitos intracelulares. Las clulas Th2 median
la produccin de IgE, estando particularmente involucradas en la respuesta de los eosinfilos, alergia e
infecciones por helmintos y otros parsitos extracelulares. El tercer subtipo de Th son las clulas Th17,
definidas por la produccin de IL-17 y estn relacionadas con inflamacin autoinmune e inmunidad
antimicrobiana (Harrington et al., 2006; Stockinger et al., 2007; Awasthi et al., 2008).
En todas las poblaciones de linfocitos, B, T o natural killer, existen clulas reguladoras
especializadas en suprimir la respuesta inmune contra antgenos propios especficos. Los linfocitos T que
forman parte de stas clulas moduladoras se incluiran en otro subtipo de clulas T distintas de las
clulas efectoras, las clulas T reguladoras (Treg). stas expresan en su membrana la molcula de
superficie CD25 (Amarnath et al., 2007; Li et al., 2010) y son las responsables de desencadenar la
respuesta especializada en mantener la tolerancia a lo propio. Adems se ha visto que pueden participar
como supresores de la respuesta antitumoral (Sfanos et al., 2008).
Se cree que los linfocitos Treg y Th17 tienen un origen comn y son mutuamente excluyentes. Su
activacin es dependiente del cctel de citoquinas presente, en el que juega un papel relevante la
interleuquina-6 (IL-6), que dirime la diferenciacin hacia Th17 (Bettelli et al., 2006; O'Garra et al., 2008;
Volpe et al., 2008; Basso et al., 2009).

Introduccin

26

A pesar de que las clulas del sistema inmune con mayor relevancia en la lucha contra el tumor
son los linfocitos T citotxicos, cada vez existen ms evidencias de la implicacin de los linfocitos Th17 en
esta respuesta antitumoral. Recientemente se ha demostrado esta capacidad antitumoral tanto en
experimentos in vitro, dnde las clulas Th17 son capaces de inducir regresin tumoral, como en un
modelo in vivo, en el que ratones deficientes en IL-17 presentan un crecimiento tumoral mayor (Kryczek
et al., 2009b). Adems, los linfocitos Th17 podran contribuir tambin a la accin antitumoral de los
linfocitos T citotxicos (Martin-Orozco et al., 2009).

2.2.2 Papel de Interleuquina-6

El papel de las citoquinas como principales moduladoras del sistema inmune hace de stas un
factor crucial en la inmunoterapia, siendo el uso de frmacos que regulan sus niveles, junto con el de las
vacunas, una de las estrategias ms empleadas en las aproximaciones inmunoteraputicas dirigidas al
tratamiento del cncer. En el cncer de prstata el uso de vacunas para generar efectos antitumorales
parece ser insuficiente (Slovin, 2008). Esto sugiere que es necesario el uso de una terapia combinada
con citoquinas o inhibidores especficos para aumentar significativamente su eficacia, adems de para
validar el papel de las clulas inmunes en la respuesta antitumoral (Kubler et al., 2008; Antonarakis et al.,
2010b). Por otro lado, las clulas de prstata pueden secretar citoquinas proinflamatorias que participan
Figura 11. Diferenciacin de linfocitos T inducida por citoquinas. Las clulas T nativas pueden activarse por las
clulas dendrticas y formar distintas poblaciones de clulas T efectoras segn el cctel de citoquinas presente, originando
as clulas Th1, Th2, Th17 y Treg (Modificado de OGarra et al., 2008).
Th17
Treg
TGF
TGF
IL-6
Th2
Th1
IFN
IL-4
Cl ul a T
nati va
Cl ul a
dendrti ca

Introduccin

27

activamente en el reclutamiento y activacin de clulas del sistema inmune (Wong et al., 2009), factor
clave en el desarrollo de respuestas antitumorales inducidas por la inmunidad adaptativa (Evans et al.,
2008; Reiter et al., 2009).

La IL-6 es una citoquina pleiotrpica que participa en distintos aspectos biolgicos del cncer. En
prstata es una de las citoquinas con mayor relevancia, ya que no slo regula respuestas inflamatorias,
sino tambin crecimiento celular y resistencia a drogas (Pu et al., 2004; Culig, 2005). Est considerada
una citoquina proinflamatoria, lo cual, junto con el hecho de que se sobre-exprese en el cncer de
prstata ha hecho que se la relacione con su patognesis (Nakashima et al., 2000; Cabrespine et al.,
2007; Bouraoui et al., 2008). Sin embargo, estudios recientes refutan esta hiptesis, al no encontrar
relacin entre el incremento en los niveles de IL-6 circulante y el riesgo en el cncer de prstata, as como
tampoco un incremento de la proliferacin in vitro de clulas de cncer prstata en respuesta a la IL-6
(Xing et al., 2001; Pierce et al., 2009). Es ms, el papel proinflamatorio de esta citoquina podra resultar
beneficioso, ya que las respuestas inflamatorias pueden tener un papel adaptativo si estn circunscritas
en el tiempo. As, en pacientes sometidos a radioterapia ocurre un aumento de los niveles de citoquinas
proinflamatorias como parte de una respuesta coordinada diseada para controlar los daos inducidos
por la radiacin, promoviendo la reparacin tisular (Hagemann et al., 2007; Sepah et al., 2009).

Sealizacin celular inducida por IL-6

IL-6 ejerce sus efectos celulares a travs de la formacin de un complejo receptor localizado en la
membrana, compuesto por el receptor de IL-6 alfa (IL-6R), protena transmembrana glicosilada
perteneciente a la superfamilia clsica de los receptores de citoquinas tipo 1, y por la glicoprotena 130
(gp130), un receptor de citoquinas transmembrana. IL-6 se une a IL-6R y la formacin de este complejo
atrae a gp130, que dimeriza permitiendo la transmisin de la seal intracelular. Ni IL-6 ni IL-6R por s
solos son capaces de unirse y activar gp130 (Bouraoui et al., 2008). Principalmente la seal se transduce
a travs de tirosinas quinasas de la familia Janus, tambin conocidas como Janus quinasa (Jak1, Jak2,
Jak3 y Tyck2) y factores de transcripcin de la familia STAT (transductores de la seal y activadores de
transcripcin). Otras vas alternativas de transduccin son la va de PI3K/Akt y MAPK (Yang et al., 2003;
Hodge et al., 2005; Cabrespine et al., 2007; Santer et al., 2010).


Introduccin

Existe una forma soluble del IL-6R (sIL-6R), generada por splicing alternativo o por ruptura del IL-
6R unido a la membrana, capaz de unirse a la citoquina. El complejo IL-6/sIL-6R puede activar gp130
en ausencia de IL-6R. Esta sealizacin alternativa se conoce como trans-sealizacin de IL-6. En
contraste con otros receptores de citoquinas solubles sIL-6R facilita la actividad de la IL-6, pudiendo tanto
amplificar la seal producida por IL-6R como activarla en clulas que no presentan este receptor.
Tambin existe una forma soluble de la protena gp130 (sgp130), pero sta slo inhibe la activacin del
complejo IL-6/sIL-6R, sin interferir en la actividad del complejo IL-6/ IL-6R (Santer et al., 2010).
IL-6
28


STAT3

Gp130 est asociada a distintas Jak (Jak1, Jak2 y Tyk2), que se activan cuando esta dimeriza,
fosforilando a la propia gp130 en su extremo citoplasmtico. Esta fosforilacin, que ocurre en varios
residuos, es reconocida por los miembros de la familia STAT, que se unen a gp130. Entonces Jak
fosforila a los distintos STAT, activndolos y permitiendo la formacin de dmeros. Estos dmeros se
translocan al ncleo, dnde regulan la transcripcin de mltiples genes. Posteriormente son inactivados
por desfosforilacin, volviendo al citoplasma (Bromberg, 2002; Hodge et al., 2005).

Figura 12. Sealizacin celular de IL-6 va STAT3. La unin de IL-6 al receptor IL-6R produce la dimerizacin de gp130,
y activacin de Jak. Jak activado fosforila a gp130, que es reconocido por STAT3, que se fosforila por Jak, permitiendo la
formacin de dmeros activados, que se translocan al ncleo para regular la transcripcin.
Jak
p
Jak
p
STAT3 STAT3
STAT3
p
S T A T 3
p
STAT3
p
S T A T 3
p
I
L
-
6
R

g
p
1
3
0
g
p
1
3
0
p p

Introduccin

29

Las protenas STAT son una familia de factores de transcripcin formada por siete miembros:
STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b y STAT6, estando algunos de ellos asociados con
diversos tipos de cncer. STAT1 y STAT5 se encuentran constitutivamente activados en algunas
leucemias, aunque es STAT3 el que con ms frecuencia se altera en varios tipos de cncer, entre ellos el
cncer de prstata (Horvath, 2000; Turkson et al., 2000; Barton et al., 2001; Hodge et al., 2005), por lo
que incluso es considerado un oncogn (Levy et al., 2006). Ms an, STAT3 modula la transcripcin de
diversos genes que promueven supervivencia y proliferacin, entre ellos protenas anti-apoptticas como
Bcl-x y Bcl-2 y genes implicados en la progresin del ciclo celular, como la ciclina D1 (Bowman et al.,
2001; Garcia et al., 2001). Adems, la inhibicin de STAT3 est implicada en el mecanismo de accin de
diversas drogas antitumorales (Bispo de Jesus et al., 2008; Chesnokov et al., 2009; Hahm et al., 2010).

2.2.2.1 Papel del factor nuclear kappa B

NFB es un factor de transcripcin pleiotrpico que desempea una funcin central en la respuesta
inmune innata y en la adquirida, induciendo la expresin de genes que codifican citoquinas
proinflamatorias, quimioquinas y molculas de adhesin. Pero tambin participa en otras funciones
biolgicas, entre ellas proliferacin celular y apoptosis. Su papel en estos fenmenos celulares es
controvertido y, aunque normalmente participa en procesos anti-apoptticos, en ciertas ocasiones posee
una funcin antitumoral (Perkins et al., 2006; Chen et al., 2008b). Este factor y muchas de sus mltiples
protenas reguladoras, ente ellas miembros de la familia Bcl-3, estn fuertemente implicados en varios
tipos de tumores slidos y hematolgicos (Sun et al., 2007). Todo esto hace de NFB un posible eslabn
de unin entre inflamacin y progresin del cncer (Kim et al., 2006).

En mamferos existen cinco genes NFB relacionados por un dominio N-terminal de
aproximadamente 300 aminocidos llamado dominio homlogo a Rel (RHD) en el que se localizan
secuencias tanto de unin a DNA y a inhibidores, como de dimerizacin. Estos cinco genes (tabla 2) dan
lugar a siete protenas diferentes, que se dividen en dos clases segn su dominio RHD, que forman
distintas subunidades de NFB:

Clase I: incluye NFB1 (p50 y su precursor p105) y NFB2 (p52 y su precursor p100)
Clase II: RelA (p65), RelB y c-Rel


Introduccin

Las subunidades de clase I, p50 y p52, se sintetizan como precursores, p105 y p100
respectivamente, que son procesados por el proteosoma, donde se elimina su extremo carboxilo-terminal
dando lugar a las formas activas p50 y p52. Las subunidades de clase II poseen un dominio de
transactivacin en su extremo C-terminal, que es el responsable de la activacin gnica.
Clase Protena Otros nombres Gen
I
NF-B1 p105 p50 NFKB1
NF-B2 p100 p52 NFKB2
II
RelA p65 RELA
RelB RELB
c-Rel REL

Tabla 2. Protenas de la familia NFB.
Estas subunidades forman varios homodmeros y heterodmeros, siendo el ms comn el formado
por las subunidades p50/p65. Al ser el dmero ms comn, el trmino NFB generalmente se usa para
referirse a este heterodmero p50/p65, aunque este nombre puede aplicarse tambin a otros dmeros
compuestos por diferentes subunidades de NFB. En ausencia de activacin, los dmeros permanecen
secuestrados en el citoplasma por protenas inhibidoras llamadas IBs. Cuando existe un estmulo
activador estas protenas inhibidoras son fosforiladas por la familia de las quinasas de los inhibidores de
NFB (IKKs), activndose su degradacin. La familia IKK est constituida por IKK, IKK e
IKK, tambin llamada modulador esencial de NFB (NEMO). Cuando se degrada el inhibidor IB se
produce la liberacin de NFB, permitiendo as su activacin y translocacin al ncleo, donde regula la
transcripcin de distintos genes (Hayden et al., 2008; Mohamed et al., 2009).

NFB se activa por varios estmulos como lipopolisacridos bacterianos, steres de forbol, virus,
estrs oxidativo, luz ultravioleta, radiacin ionizante y drogas genotxicas. Su activacin se produce por
las vas de sealizacin del receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1), el receptor 1 de
interleuquina 1 (IL-1R1), el receptor similar a Toll (TLR), el receptor de clulas B (BCR), el receptor de
clulas T (TCR), receptor de linfotoxina b (LTbR), el factor activador de clulas B (BAFFR) y el cluster de
diferenciacin 40 (CD40) (Gloire et al., 2006).

30


Introduccin

Existen dos vas principales de activacin de NFB (figura 13):

La va clsica o cannica, en la que participa el heterodmero p50/p65, que permanece
secuestrado en el citosol por el inhibidor IB. El complejo IKK/ fosforila al inhibidor de NFB, IB,
liberando as al heterodmero p50/p65, que se transloca al ncleo. En esta ruta tambin interviene NEMO,
el cual es requerido para la interaccin del complejo IKK/ con protenas anteriores en la cascada de
transduccin de la seal.

La va no cannica es independiente de IKK y en ella participa el dmero p52/RelB y la quinasa
inductora de NF-B (NIK). NIK fosforila al homodmero IKK desencadenando su activacin y la
fosforilacin de p100 por IKK, lo que conduce a la proteolizacin de esta subunidad a p52 y la
translocacin al ncleo del dmero p52/RelB (Perkins et al., 2006; Mohamed et al., 2009).

31



IKK
NEMO
IKK
NEMO
p50
p65
p
p105
p65
IB
p100
RelB
NIK
p52
RelB
p
p IB
p p
p
Va cannica
Va no cannica
p
Figura 13. Vas principales de activacin de NFB. En la va clsica o cannica, IKK activa al inhibidor de NFB,
IB, liberando as al heterodmero p50/RelA, que se transloca al ncleo, regulando la transduccin de distintos genes.
La va no cannica es independiente de IKK, activndose p100 por IKK, lo que conduce a la proteolizacin de esta
subunidad a p52, y la translocacin al ncleo del dmero p52/RelB.

Introduccin

32

3.- CANNABINOIDES Y SISTEMA ENDOCANNABINOIDE

3.1.- Resea histrica

La marihuana y el hachs, componentes de distintas partes de la planta Cannabis sativa,
constituyen una de las drogas ms antiguas usadas por el hombre y una de las ms empleadas en los
pases occidentales. La popularidad de la marihuana como droga de recreo se debe a su capacidad para
alterar la percepcin sensorial provocando euforia y jbilo. Adems de este uso ldico, los constituyentes
de la planta tambin han sido usados durante dcadas como drogas medicinales, debido a sus
propiedades sobre procesos neuroconductales tales como la memoria, el humor y el apetito (Pacher et
al., 2006; Greineisen et al., 2010). Sin embargo en 1937, debido a los peligros derivados del uso de esta
droga, se prohibi en los Estados Unidos. El aislamiento en 1964 del mayor componente psicotrpico de
la planta el delta-9-tetrahidrocannabinol (THC), estimul durante la dcada de los setenta la generacin
de un amplio rango de anlogos sintticos con propiedades similares a las del componente de la planta.
Ms de dos dcadas despus del descubrimiento del THC se identific el primer receptor de
cannabinoides en el organismo llamado CB1

(Devane et al., 1988) Por su homologa se identific un
segundo receptor de cannabinoides llamado CB2

(Munro et al., 1993). El descubrimiento de receptores
especficos de cannabinoides implicaba que deban de existir ligandos endgenos capaces de unirse a
estos receptores. El primer cannabinoide endgeno descubierto fue la anandamida y su hallazgo permiti
observar que otro metabolito previamente conocido era capaz de unirse con gran afinidad a CB1 y CB2,
el 2 araquidonilglicerol (2AG). Los endocannabinoides pueden reproducir la mayora de los efectos
descritos para fitocannabinoides, mostrando una actividad cannabinoimimtica (Di Marzo, 2009).

Tanto el descubrimiento de la estructura del THC, como el hallazgo de los componentes
endgenos capaces de unirse o actuar como los cannabinoides de la planta, despert de nuevo el inters
sobre el uso teraputico de los cannabinoides, existiendo en la actualidad en uso mdico dos agonistas
de los receptores cannabinoides (el dronabinol y la nabilona), un extracto de cannabis (el Sativex)
(Gerra et al., 2010).






Introduccin

3.2.- Tipos de cannabinoides

Los cannabinoides se pueden dividir por su origen en tres clases: los provenientes de la planta o
fitocannabinoides, los endgenos o endocannabinoides y los cannabinoides sintticos, sustancias
sintetizadas en el laboratorio capaces de unirse a los receptores de cannabinoides. Estos ltimos se
dividen a su vez en dos clases en base a su estructura: cannabinoides clsicos, que poseen una
estructura parecida a la de los fitocannabinoides y cannabinoides no clsicos, con una estructura qumica
que difiere altamente de la del THC (tabla 3).
Naturales Endgenos Sintticos
Clsicos
No cl si cos
THC
AEA
HU-210
Cannabivariol
2-AG
Nabilona
Virodamina
(-)-Cannabidiol
(CBD)
WIN 55,212-2
NADA CP55940
cido ajulmico
Figura 14. Distintos tipos de cannabinoides
33


Introduccin

34

3.2.1 Compuestos bioactivos de Cannabis sativa

De los aproximadamente 500 compuestos presentes en la planta Cannabis sativa, slo unos 70
son considerados cannabinoides. Poseen una estructura tricclica con hidrocarburos oxigenados de 21C
formados generalmente por tres anillos, ciclohexeno, tetrahidropirano y benceno. De todos ellos, el
principal componente activo es el THC. Presenta propiedades hidrofbicas al poseer una estructura
comn tricclica con un anillo fenlico, un anillo de pirano central y un anillo ciclohexilo monoinsaturado
(Nahas, 2002), lo que le proporciona una particular farmacocintica en el organismo. Otros cannabinoides
presentes en la planta, en menor medida que el THC, son el cannabigerol (CBG), el cannabicromeno
(CBC), el cannabidiol (CBD) y el cannabinol (CBN). La concentracin de cannabinoides vara segn la
variedad del cannabis y por lo general se encuentran en una planta solamente tres o cuatro
cannabinoides en concentraciones superiores al 0.1%. Aunque el THC es el mayor responsable de los
efectos farmacolgicos del cannabis, incluyendo sus consecuencias psicoactivas, otros compuestos de la
planta tambin poseen efecto biolgico, especialmente el CBD, un fitocannabinoide no psicoactivo que
tiene propiedades antiinflamatorias, analgsicas y ansiolticas (Nahas et al., 2002; De Backer et al.,
2009).

3.2.2 Ligandos endgenos

Los endocannabinoides encontrados hasta la fecha pertenecen a la familia de los eicosanoides
que presentan afinidad por los receptores de cannabinoides. Son derivados de cidos grasos
poliinsaturados de cadena larga unidos a un grupo ms polar mediante enlace amida, ster o ter.
Incluyen la anandamida (N-araquidonoil etanolamina, AEA), 2-araquidonoil glicerol (2-AG), 2-araquidonoil
gliceril eter (noladina, 2-AGE), O-araquidonoil etanolamina (virodamina) y N-araquidonoil dopamina
(NADA) (De Petrocellis, 2004; Singh and Budhiraja, 2006). Existen otros dos metabolitos estructuralmente
relacionados con los anteriores, la N-oleoiletanolamina (OEA) y la N-palmitoiletanolamina (PEA), que se
distribuyen en bajas concentraciones por el sistema nervioso central, pero su clasificacin dentro de los
endocannabinoides est sujeta a debate, ya que no tienen afinidad ni por CB1 ni por CB2 (Burstein et al.,
2009; Sagar et al., 2009; De Petrocellis et al., 2010).



Introduccin

35

Los endocannabinoides se consideran una nueva clase de reguladores lipdicos. No se almacenan
en vesculas, como los neurotransmisores clsicos, sino que se sintetizan rpidamente a partir de un
precursor lipdico, siendo inmediatamente liberados al espacio extracelular o actuando directamente en la
misma membrana celular (Sagar et al., 2009). AEA, OEA y PEA se sintetizan a partir de su
correspondiente precursor, N-araquidonoil fosfatidil etanolamina (NAPE), N-oleoil fosfatidil etanolamina o
N-palmitoil fosfatidil etanolamina respectivamente. El precursor es hidrolizado por una fosfodiestarasa
especfica, muy similar a la fosfolipasa D (PLD) denominada NAPE-PLD, que ha sido clonada y
caracterizada (Okamoto et al., 2004). Existen tambin dos vas alternativas en las que participan la
fosfolipasa C (PLC) y la hidrolasa (H4)-GDE (Sagar et al., 2009).

El precursor inmediato de 2-AG es el diacilglicerol (DAG). El DAG se produce por hidrlisis de los
fosfoinostidos de membrana (PI) o del cido fosfatdico (PA) dependiendo del tipo celular. Existen dos
diacilglicerol lipasas (DAGL) especficas, DAGL y DAGL, que catalizan la hidrlisis del DAG a 2AG,
liberando el AG de la posicin 1. Tambin se ha propuesto que la sntesis de 2-AG pueda darse por la
fosfolipasa A1 (PLA1) y fosfolipasa C (PLC) (Sagar et al., 2009).

La finalizacin de la seal de anandamida se realiza mediante transporte de AEA al interior
celular y posterior hidrlisis por una amidohidrolasa de cidos grasos (FAAH) que rinde cido
araquidnico (AA) y etanolamina, mientras que el 2-AG se hidrolizara fundamentalmente por una
monoacilglicerol lipasa. AEA y 2-AG pueden tambin ser sustratos de las cicloxigenasas tipo-2 (cox-2),
lipoxigensas (LOX) y citocromo P-450s (CYP450s) (McFarland et al., 2004; Burstein et al., 2009; Sagar et
al., 2009).

3.2.3 Ligandos sintticos

Se ha desarrollado un amplio espectro de cannabinoides sintticos con diferentes actividades y
afinidades por los receptores, lo que supone una herramienta muy til para el estudio de las posibilidades
teraputicas de los cannabinoides. Dentro de stos compuestos se encuentran tanto agonistas como
antagonistas de los dos receptores de cannabinoides, o selectivamente de uno de los dos tipos de
receptores (Kogan et al., 2006; Petrosino et al., 2009). Los dos cannabinoides empleados en esta Tesis
doctoral se engloban dentro de este tipo de sustancias sintticas. El primero de ellos es el anlogo
modificado del endocannabinoide anandamida, (R)-(+)-araquidonoil-1-hidroxi-2-propilamida o (R)-(+)-

Introduccin

metanandamida (MET). La introduccin de los grupos metilo en el carbono dos de la anandamida
produce un aumento de su estabilidad metablica y una mayor afinidad por los receptores de
cannabinoides. Posee afinidad por ambos receptores aunque se une con mayor afinidad a CB1 (Abadji et
al., 1994; Lin et al., 1998; Goutopoulos et al., 2001; Goutopoulos et al., 2002). El segundo es JWH015,
agonista selectivo del receptor CB2 (Showalter et al., 1996; Griffin et al., 1997; Huffman, 2000; Petrosino
et al., 2009).

JWH015 Metanandamida
36

3.3.- Receptores de cannabinoides

Figura 15: Estructura qumica de MET y JWH015
La fuerte hidrofobicidad del THC hizo pensar inicialmente que los efectos de los cannabinoides
podran estar causados por perturbaciones en la membrana o por interacciones con sitios de unin
inespecficos. Sin embargo, el descubrimiento de los receptores CB1 y CB2 demostr que esto no era
as, aunque no se descarta un mecanismo adicional por insercin en la membrana plasmtica. Adems,
cada vez son ms abundantes los datos que sugieren la existencia de otros receptores de cannabinoides
entre los receptores hurfanos GPCRs (Petrosino et al., 2009).

Todos estos receptores, juntos con los endocannabinoides y las enzimas encargadas de su
sntesis y metabolismo constituyen el llamado sistema endocannabinoide (figura 16) (Pacher et al., 2006;
Pertwee, 2009; Pisanti et al., 2009a).




Introduccin

CB
2
GPR55
CB
1
TRPV1
37


3.3.1 CB1 y CB2

Las principales dianas moleculares de los endocannabinoides son los receptores de
cannabinoides tipo 1 (CB1) y tipo 2 (CB2). Ambos estn formados por un nico polipptido con siete
pasos transmembrana -hlice, un extremo N-terminal glicosilado y un extremo C-terminal intracelular.
Son receptores acoplados a protenas G, fundamentalmente a Gi/o. CB1 est principalmente expresado
en clulas neuronales del sistema nervioso central, donde media la liberacin y recaptacin de varios
neurotransmisores. CB2 presenta una expresin ms perifrica, localizndose especialmente en clulas
del sistema inmune, afectando a la liberacin de mensajeros qumicos, como las citoquinas, pudiendo
tambin regular el trfico intracelular. A pesar de estas dos localizaciones preferenciales, ambos
receptores se encuentran tambin expresados en distintos tejidos perifricos (Kogan et al., 2006;
Pertwee, 2009; Greineisen et al., 2010).

3.3.2 GPR-55

Recientemente se ha sugerido la existencia de un posible tercer receptor de cannabinoides, el
receptor hurfano GPR-55, que reconoce varios cannabinoides y fitocannabinoides, aunque la
farmacologa de este receptor no permite incluirlo dentro de los receptores de cannabinoides. GPR-55
parece ser un receptor de lisofosfatilinositol que puede responder tambin a anandamida. Este receptor
Figura 16: Sistema endocannabinoide

GDP
GTP
G
i/o

GDP
GTP
G
i/o

GDP
GTP
G
i/o
MGL
Ca
2+
FAAH
AA AA
AEA
Etanol ami da
+ +
2-AG
Gl i cerol

Introduccin

38

activa a G12 y G13. Por hibridacin in situ su trnscrito ha sido detectado en el ncleo caudado y
putamen, pero no en el hipocampo, tlamo, cerebelo, puente ni cortex frontal (Brown et al., 2009;
Godlewski et al., 2009; Ross, 2009).

Tambin existe otro receptor hurfano identificado mediante aproximaciones informticas, el GPR-
119, que une OEA. Su mRNA ha sido localizado en tejido pancretico e intestinal (Godlewski et al., 2009;
De Petrocellis et al., 2010).

3.3.3 TRPV1

Algunos de los endocannabinoides pueden unirse, adems, al receptor de vanilloides TRPV1 que
constituye un canal catinico no selectivo de cationes divalentes. Por ello se ha considerado a CB1 y CB2
como receptores metabotrpicos de cannabinoides, mientras que TRPV1 sera el receptor ionotrpico.
Este receptor pertenece a la familia de los canales activados por potenciales transitorios (TRP), que se
dividen en las siguientes subfamilias: TRPC (cannica), TRPA (tipo ankirina), TRPM (tipo melastatina),
TRPP (tipo policistina), TRPML (tipo mucolipina) y TRPV (tipo vanilloide). Los canales TRP poseen seis
dominios transmembrana con una puerta de entrada para varios tipos de cationes, incluyendo Ca
2+
. Son
estimulados por agentes fsicos, como la temperatura, la luz y presin mecnica, o qumicos, como
cidos, lcalis y xenobiticos. Estn formados en su forma activa por tetrmeros, dependiendo su
actividad de fosforilaciones ejercidas por quinasas que regulan su funcin, como PKC, PKA y calcio-
calmodulina quinasa (Sagar et al., 2009; De Petrocellis et al., 2010).

Existen seis tipos de receptores TRPV, numerados del 1 al 6. Todos ellos canales de Ca
2+
o
cationes, aunque nicamente TRPV1 puede ser activado por AEA. Entre los ligandos exgenos capaces
de activar TRPV1 destaca la capsaicina, el componente picante de los pimientos, que al unirse a TRPV1
lo activa, produciendo la sensacin de calor caracterstica (De Petrocellis et al., 2010). Existen varios
antagonistas de TRPV1, siendo la capsazepina (CPZ) uno de los ms utilizados.






Introduccin

39

3.4.- Mecanismos de transduccin a travs de CB1 y CB2

Como ya se ha comentado los receptores de cannabinoides son miembros de la superfamilia de los
GPCRs. Inicialmente se describi que ejercan sus efectos biolgicos acoplados principalmente a
protenas G
i/o
, pudiendo tambin activar G
s
y G
q/11
. Este acoplamiento genera un intercambio guanosina
trisfosfato (GTP) / guanosina difosfato (GDP) y subsecuentemente la liberacin de las subunidades y
, que pueden regular la actividad de mltiples efectores entre los que destaca la adenililciclasa. El
receptor CB1 tambin puede inhibir varios canales inicos, entre ellos de calcio, potasio y sodio, a travs
de la subunidad . Los distintos miembros de la familia MAPK tambin pueden ser activados por los dos
receptores de cannabinoides por medio de tres posibles mecanismos: transactivacin de receptores
tirosina quinasa (RTKs), activacin de la ruta de la PI3K/Akt y activacin de la quinasa de adhesin focal
(FAK), regulando as el crecimiento celular (Cabral et al., 2009; Turu et al., 2010).

Adems tambin pueden regular los niveles de calcio intracelular mediante la activacin de PLC,
metabolismo del cido araquidnico, sntesis de ceramida y produccin de xido ntrico. Asimismo
pueden regular la transcripcin por medio de distintos factores de transcripcin, entre ellos c-Fos, Kros-24
y NFB (Diaz-Laviada et al., 2005; Pacher et al., 2006; Dalton et al., 2009).

Los dos receptores de cannabinoides poseen una sealizacin extremadamente compleja. Ambos
estn acoplados a protenas G sensibles a toxina pertusis, pero no participan en idnticas seales de
transduccin. Por ejemplo, mientras que el receptor CB1 puede activar distintos tipos de canales inicos,
el receptor CB2 es incapaz de activarlos, o lo hace dbilmente. Esta divergencia en la sealizacin puede
estar debida a que cada receptor puede acoplarse a un subtipo distinto de protenas G. Otros niveles de
complejidad en la sealizacin derivan de la posible interaccin con lipid rafts capaces de controlar el
trfico y la sealizacin de los receptores, de la existencia de una gran variedad de mecanismos de
desensibilizacin que limitan la duracin y amplitud de la seal y, por ltimo, de la capacidad de los
GPCRs de organizarse dentro de una nueva unidad de sealizacin (McAllister et al., 2002; Bosier et al.,
2010).

Aunque ejercen sus efectos principalmente a travs de protenas G, en ciertas ocasiones pueden
actuar de forma independiente a estas protenas. As, los cannabinoides pueden inducir hidrlisis de
esfingomielina a travs de la interaccin con la protena adaptadora FAN, sin mediacin de protenas G.

Introduccin

40

La sealizacin a travs de arrestinas tambin podra estar ser regulada por los cannabinoides de forma
independiente de protenas G (Diaz-Laviada et al., 2005).

3.5.-Cannabinoides y cncer

El hecho de que el sistema endocannabinoide est altamente conservado entre especies as
como la ubicua expresin de los endocannabnoides y su papel como moduladores de protenas y factores
nucleares que regulan la supervivencia, proliferacin y la diferenciacin celular, sugiere que los
endocannabinoides pueden estar involucrados en el control de procesos fundamentales tales como la
homeostasis celular y posiblemente tambin en transformacin neoplsica (Pisanti et al., 2009a).

Los efectos paliativos de los cannabinoides en enfermedades de cncer estn bien
caracterizados; entre ellos destacan la inhibicin de nuseas y emesis, estimulacin del apetito y alivio
del dolor. Tres de los medicamentos derivados del cannabis, Marinol, Cesament y Sativex, estn
indicados en el tratamiento de estas alteraciones. Su aplicacin como agentes anticancergenos se
encuentra an en fase de investigacin preclnica, pero numerosos estudios sugieren que los
cannabinoides tambin pueden inhibir el crecimiento tumoral. Los mecanismos por los que los
cannabinoides ejercen este efecto antitumoral son variados e incluyen la induccin de apoptosis en
clulas tumorales, efectos antiproliferativos y antimetastsicos a travs de la inhibicin de angiognesis y
migracin celular, y efectos citotxicos y citoestticos (Pacher et al., 2006; Vidinsky et al., 2006; Pisanti et
al., 2009a; Pisanti et al., 2009b).

La plasticidad del sistema endocannabinoide bajo determinadas alteraciones puede ser una
reaccin adaptativa con el fin de restaurar la homeostasis perturbada por estas alteraciones. En este
sentido, se han detectado niveles elevados de cannabinoides en varios tipos de tumores comparando con
tejidos sanos como por ejemplo en glioblastoma, menangioma, adenoma pituitario, adenoma de prstata,
adenoma de colon y sarcoma endometrial. Tambin se ha descrito en algunos casos un incremento en
los niveles de las enzimas encargadas del metabolismo de los endocannabinoides, existiendo una
correlacin entre los niveles de estas enzimas y la progresin del cncer como ocurre en adenocarcinoma
prosttico y adenocarcinoma pancretico. En lo que respecta a los receptores de cannabinoides existen
varias evidencias que sugieren que alteraciones en su nivel de expresin juegan un papel importante en
tumores hematolgicos y en varios tumores slidos. Esto ocurre entre otros en el cncer de prstata y en

Introduccin

41

tumores hepticos, donde los dos receptores de cannabinoides se sobre-expresan respecto del tejido
normal. En los tumores hematolgicos existen datos contradictorios, encontrando clulas de leucemia que
expresan CB2 pero no CB1, y en algunos casos expresin de CB1

en linfomas, pero no en clulas B
normales (McKallip et al., 2002; Sarfaraz et al., 2005; Gustafsson et al., 2006; Xu et al., 2006). La
expresin diferencial de estos receptores entre el tejido normal y el tumoral puede ser de especial inters
para entender mejor el papel del sistema endocannabinoide en la generacin y el mantenimiento de las
neoplasias, pudiendo tambin resultar ventajosa en la terapia farmacolgica. Todas estas alteraciones en
los distintos miembros del sistema endocannabinoide podran sugerir un posible papel antitumoral de los
endocannabinoides en los primeros estados del desarrollo del cncer (Pisanti et al., 2009a). En este
sentido los cannabinoides inhiben el crecimiento de diversas lneas tumorales a travs de distintos
mecanismos de sealizacin celular, entre los que se incluye inhibicin de rutas que regulan el
crecimiento celular, especialmente las MAPKs, parada del ciclo celular por inhibicin de distintos
oncogenes como K-ras, induccin de apoptosis a travs de un incremento en los niveles de ceramida y
alteracin de protenas de estrs (Vidinsky et al., 2006; Sarfaraz et al., 2008; Pisanti et al., 2009a). Slo
existe un estudio publicado en el que los cannabinoides presentaran un efecto protumoral en distintas
lneas cancergenas usando dosis bajas de stos, del orden nanomolar (Hart et al., 2004), pero son
mucho ms numerosos los estudios que demuestran los efectos pro-apoptticos y antiproliferativos. En
este mismo estudio el empleo de dosis ms elevadas los cannabinoides produjo muerte celular y
apoptosis (Melck et al., 2000).

A pesar de las mltiples evidencias preclnicas existentes sobre el uso teraputico de los
cannabinoides como drogas antitumorales, hasta la fecha slo existe un ensayo en fase clnica I
aprobado por el Ministerio Espaol de Sanidad en 2002 (Guzman et al., 2006). El objetivo de este estudio
era evaluar la administracin intratumoral de THC en pacientes de glioblastoma multiforme recurrente, un
tumor primario muy agresivo de pobre prognosis. Se encontr que la administracin intracraneal de THC
era segura y no presentaba efectos psicoactivos, disminuy la proliferacin celular del tumor e indujo
apoptosis, pero tuvo un tenue impacto sobre la media de supervivencia de estos pacientes (Alexander et
al., 2009; Pisanti et al., 2009a).




Introduccin

42

3.5.1 Cannabinoides y cncer de prstata

En las clulas tumorales de prstata existe expresin tanto de CB1 como de CB2 (Ruiz-Llorente et
al., 2003; Sanchez et al., 2003b), y adems sus niveles se incrementan con respecto a la prstata normal
(Sarfaraz et al., 2005). El efecto de los cannabinoides en el cncer de prstata es bimodal dependo de la
dosis empleada; dosis del orden nanomolar producen un efecto mitognico (Sanchez et al., 2003b) y a
dosis ms elevadas, en el rango micromolar, se ha observado una induccin de apoptosis (Ruiz et al.,
1999; Mimeault et al., 2003b) o una parada del ciclo celular (Sarfaraz et al., 2006). El efecto mitognico
de los cannabinoides parece ocurrir a travs de la sealizacin dependiente de cAMP y por modulacin
de la expresin del AR (Sanchez et al., 2003b; Sanchez et al., 2004; Sarfaraz et al., 2005; Sarfaraz et al.,
2006), mientras que la inhibicin de la proliferacin puede acontecer adems de por una inhibicin en la
expresin del AR (Sarfaraz et al., 2005), por modulacin de la sealizacin provocada por diversos
factores de crecimiento, como EGF y NGF (De Petrocellis et al., 1998; Melck et al., 2000; Mimeault et al.,
2003a; Mimeault et al., 2003b) y por un incremento en los niveles de ceramida (Gewies et al., 2000). La
invasin tumoral tambin puede ser inhibida por los cannabinoides a travs de CB1 (Nithipatikom et al.,
2004).

3.5.2 Cannabinoides y sistema inmune

La relevancia del sistema endocannabinoide sobre el sistema inmune se pone de manifiesto no
slo por la presencia de los receptores de cannabinoides en las clulas inmunes, principalmente del
receptor CB2, si no por otras evidencias como el aumento en los niveles de endocannabinoides y el
aumento en la expresin de CB2 que se produce durante la inflamacin y al ser estimuladas las clulas
inmunes por bacterias (Pacher et al., 2006; Cabral et al., 2009). Por otra parte los cannabinoides inducen
la secrecin de diferentes citoquinas, promoviendo tanto efectos pro-inflamatorios como anti-inflamatorios
que modulan la hematopoyesis y el crecimiento tumoral (Pacher et al., 2006; Jean-Gilles et al., 2010).

El papel del sistema inmune en el control del desarrollo del cncer tambin es clave, como
demuestra el hecho de que los individuos inmunodeprimidos tengan mayor riesgo de desarrollar cncer
(Oruc et al., 2004). En este sentido, los cannabinoides pueden ser especialmente importantes, ya que se
conocen bien sus efectos inmunorreguladores, modulando distintos componentes del sistema inmune
(Klein, 2005; Tanasescu et al., 2010). Una de las respuestas que stos inducen sobre el sistema inmune

Introduccin

43

es la inmunosupresin, lo que podra provocar una tolerancia al tumor, que implicara un riesgo derivado
del uso teraputico de los cannabinoides (Klein, 2005). A pesar de esto, existen pocas evidencias que
relacionen los cannabinoides con una respuesta protumoral, y se cree que la capacidad intrnseca del
tumor de responder a los cannabinoides es crtica para resolver el balance entre tolerancia al tumor y
respuesta antitumoral y, en consecuencia, entre progresin y regresin del cncer. Cuando el tumor es
capaz de responder a los cannabinoides, tanto el tumor como las clulas inmunes son dianas de los
cannabinoides, producindose una regresin tumoral. Cuando el tumor no responde a los cannabinoides,
podra prevalecer el efecto inmunosupresor, desarrollndose una tolerancia al tumor que permite el
crecimiento tumoral o neoplasia (Flygare et al., 2005; Bifulco et al., 2008; Pisanti et al., 2009a). An as,
son muchos ms los estudios que revelan un claro papel antitumoral de los cannabinoides, no slo a
travs de la induccin de apoptosis y parada de ciclo celular, si no regulando otros muchos procesos
involucrados en el desarrollo y progresin del cncer, como inhibicin de angiognesis e invasin tumoral
(Ramer et al., 2008). La capacidad de los cannabinoides de modular el sistema inmune tambin podra
estar relacionada con este papel antitumoral, ya que los cannabinoides son capaces de inducir migracin y
diferenciacin celular, especialmente en los linfocitos T (Pisanti et al., 2009b) y modular la secrecin de
citoquinas (Klein, 2005). Todas estas reacciones seran susceptibles de ser empleadas para lanzar
respuestas celulares contra el tumor (Ribeiro et al., 2010). Es ms, se ha demostrado que los
cannabinoides influyen en la diferenciacin de los linfocitos T a travs del receptor CB2 (Yuan et al., 2002;
Klein et al., 2004), y estos linfocitos son principales responsables de las respuestas antitumorales del
sistema inmune (Shafer-Weaver et al., 2007). Por tanto, los cannabinoides podran regular la homeostasis
del sistema inmune fundamentalmente a travs del receptor CB2, modulando la secrecin de citoquinas e
influyendo en la diferenciacin, migracin y proliferacin de las clulas inmunes y al mismo tiempo
resultaran antitumorales efectivos, pudiendo el receptor CB2 servir de unin entre el sistema inmune y la
respuesta antitumoral (Cabral et al., 2009; Tanasescu et al., 2010).




Hiptesis y Objetivos

























HIPTESIS Y OBJETIVOS






Hiptesis y Objetivos

47



El cncer de prstata es uno de los tumores malignos con mayor incidencia y el ms
frecuentemente diagnosticado. Aunque en su fase andrgeno dependiente responde exitosamente al
tratamiento por privacin andrognica, la enfermedad suele recurrir desarrollando una resistencia a esta
ablacin hormonal. Mientras el tumor est localizado, puede tratarse por extirpacin de la prstata
(prostatectoma) o radioterapia, pero cuando la neoplasia est ms avanzada y es capaz de metastatizar
no existe ningn tratamiento eficaz y la media de supervivencia de estos pacientes es muy reducida. El
tratamiento actual para estos pacientes es la quimioterapia con agentes citotxicos. Pero hasta ahora
slo se logra aumentar su supervivencia unos meses, siendo de hecho la metstasis de prstata la
segunda causa de muerte en el varn. Por todo ello, continuamente se est investigando en el desarrollo
de nuevos medicamentos capaces de frenar el desarrollo tumoral, siendo necesario el uso de nuevas
aproximaciones y/o nuevos medicamentos eficaces en el tratamiento del cncer de prstata.

En este sentido se ha mostrado en numerosos tipos de cncer que los cannabinoides afectan a
muchos de los procesos celulares implicados en el desarrollo del tumor, presentando una gran variedad
de efectos anticancergenos. Adems, en el cncer de prstata se expresan varios componentes del
sistema endocannabinoide, entre ellos los receptores de cannabinoides (Ruiz-Llorente et al., 2003), el
receptor TRPV1 (Sanchez et al., 2005), as como la enzima FAAH (Ruiz-Llorente et al., 2004) lo que le
hace susceptible al tratamiento con frmacos que afecten a alguno de estos componentes.

Por todo ello nos propusimos estudiar el efecto de los cannabinoides en las clulas tumorales de
cncer de prstata PC-3, analizando su mecanismo de accin. Con este fin se propusieron los siguientes
objetivos:


1. - Determinar el efecto de los cannabinoides sobre el crecimiento y muerte de las clulas
PC-3.
2. - Estudiar el papel de los receptores de cannabinoides en el efecto sobre el crecimiento y
muerte celular.


Hiptesis y Objetivos

48

3. - Analizar los mecanismos de accin de los cannabinoides, profundizando en el papel de la
sntesis de ceramida y en las rutas de sealizacin celular implicadas.
4. - Comprobar el efecto in vivo de los cannabinoides sobre el crecimiento tumoral.
5. - Valorar la accin de los cannabinoides sobre la secrecin de IL-6, as como las rutas de
sealizacin implicadas.
6. - Estudiar el posible papel de IL-6 sobre el crecimiento y muerte celular.
7. - Establecer el efecto de IL-6 sobre la diferenciacin de los linfocitos Th17.



Materiales y Mtodos































MATERIALES Y MTODOS






Materiales y Mtodos

51

1.- MATERIALES

1.1.- Materiales empleados en los cultivos celulares

Para la realizacin de los cultivos celulares fueron empleados los siguientes materiales:

Placas, frascos de cultivo y pipetas de dos casas comerciales: Falcon Becton Dickinson
Labware (New Jersey, USA) y Nunc
TM
Brand Products (Roskilde, Dinamarca).
Medio RPMI 1640 con L-glutamina estril de la casa comercial Gibco BRL (Escocia, Reino
Unido), suplementado con suero fetal bovino tambin de Gibco BRL o con ITS (5 ng/ml de insulina, 5
mg/ml de transferrina y 5 ng/ml de selenio) de Sigma (St. Louis, USA).
Medio Keratinocyte-SFM suplementado con extracto de pituitaria bovina (0.05 mg/ml) y factor de
crecimiento epidrmico recombinante (5 ng/ml), ambos de Gibco BRL.
Solucin de antibitico (penicilina G 100 UI/ml, sulfato de estreptomicina 100 g/ml y
anfotericina B 0.25 g/ml) de Invitrogen (Paisley, UK).
Solucin de tripsina de la marca comercial Gibco BRL (Escocia, Reino Unido).

1.2.- Reactivos empleados en la elaboracin de tampones

Para la elaboracin de los diferentes tampones fueron empleados lo siguientes reactivos:

cido actico, acetato potsico, acetona, etanol, metanol, NaCl, NaOH, sulfato amnico, cido
tricloroactico (TCA) y 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) se obtuvieron de Panreac
(Barcelona, Espaa).
Albmina srica bovina (BSA) de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, USA).
Aprotinina, leupeptina, inhibidor de tripsina de soja (STI), azida sdica, azul de bromofenol,
bromuro de etidio, dimetil sulfxido (DMSO), gelatina, glicina, trietanolamina (TEA), leupeptina, -
mercaptoetanol, fenil metilsulfonilfluoruro (PMSF) y tween-20, de Sigma (St. Louis, MO, USA).
Sacarosa, glicerol, CaCl
2
, MgCl
2
, KCl, DTT, EDTA, EGTA, KCl, DTT, K
2
HPO
4
, KH
2
PO
4
y SDS
de Merck (Darmstadt, Alemania).

Materiales y Mtodos

52

Cloroformo, acetona, cido perclrico y cido actico de Sigma (St. Louis, MO, USA), metanol
de Panreac (Barcelona, Espaa).
Dioleil-fosfatidilglicerol (DOPG) de Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA) y el cido
dietilenotriaminopentactico (DETAPAC) de Calbiochem (La Jolla, USA).

1.3.- Agonistas, antagonistas e inhibidores

Los cannabinoides R-(+)-metanandamida (MET) y JWH015 proceden de Sigma (St. Louis, MO,
USA). Capsacepina procede de Tocris (Bristol, UK). Los antagonistas de los receptores de cannabinoides
CB1 y CB2, SR 141716 (SR1) y SR 144528 (SR2) respectivamente, provienen de Sanofi Recherche
(Montpelier, France).
El inhibidor de ceramida sintasa, fumonisina B1, procede de Sigma (St. Louis, MO, USA) y el de
esfingomielinasa, D609, de Calbiochem (La Jolla, USA). El inhibidor LY294002 procede de Alexis
Bichemicals (Lausen, Switzerland).

1.4.- Lneas celulares

Se utilizaron tres lneas celulares tumorales epiteliales de prstata humana, LNCaP, PC-3 y DU
145 y una lnea celular de prstata no tumoral, RWPE-1, que fueron obtenidas de ATCC (American Type
Culture Collection, Rockville, MD, USA): PC-3 (ATTC N CRL-1435), LNCaP clon FGR (ATCC N CRL-
1740), DU 145 (HTB-81) y RWPE-1 (ATCC N CRL-11609). La lnea LNCaP, proviene de una metstasis
a un ganglio linftico de un carcinoma prosttico, responde a andrgenos, y por tanto representa el
estadio 1 de la enfermedad. La lnea PC-3 deriva de una metstasis sea de un adenocarcinoma de
prstata de grado IV. Es insensible a andrgenos, por lo que se usa como modelo de la fase dos de la
enfermedad. La lnea DU 145 proviene de una metstasis cerebral de un carcinoma prosttico. Al igual
que la lnea PC-3 no presenta sensibilidad a andrgenos. Y la lnea RWPE-1 se utiliza como control no
tumoral.

Las lneas celulares PC-3 y LNCaP se descongelaron en pases bajos, se sembraron a una
densidad de 15x10
3
-22 x10
3
clulas/cm
2
y se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con 10%
de suero fetal bovino (FBS) en presencia de 1% de solucin de antibitico, a 37 C en un ambiente
hmedo y con un 5 % de CO
2
. Los medios se cambiaban cada dos das y cuando las clulas llegaban a

Materiales y Mtodos

53

un 70-90% de confluencia se les aada tripsina/EDTA para levantarlas, se recogan con medio RPMI
1640, se centrifugaban a 400 g y se volvan a sembrar. Para realizar los distintos ensayos, antes de
alcanzar la confluencia, se retiraba el medio con suero y se incubaban las clulas en medio definido
(RPMI 1640 suplementado con ITS al 5% en el caso de PC-3 y RPMI 1640 sin suplementar en el caso de
LNCaP) durante 24 h y a continuacin se administraban los tratamientos necesarios para la realizacin de
los diversos experimentos.

Las clulas RWPE-1 se sembraban a densidades de 3 x10
4
clulas/cm
2
y se mantenan en medio
Keratinocyte-SFM suplementado con extracto de pituitaria bovina (0.05 mg/ml), factor de crecimiento
epidrmico recombinante (5 ng/ml) en presencia de 1% de solucin de antibitico, a 37 C y con un 5 %
de CO
2
.

Se us tambin la lnea HepG2 (ATCC N HB-8565
TM
), procedente de un carcinoma hepatocelular,
como control para algunos ensayos. Estas clulas se sembraron a una densidad 5000 clulas/cm
2
y se
mantuvieron en medio DMEN suplementado con 10 % de FBS en presencia de 1 % de solucin de
antibitico, a 37 C en un ambiente hmedo y con un 5 % de CO
2
.

2.- MTODOS

2.1.- Medida de la viabilidad celular mediante MTT

Tras tratar a las clulas con diferentes agonistas y antagonistas, se incubaron con 0.5 mg/ml de
MTT (Bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazol) durante 1-2 h a 37C en oscuridad,
apareciendo un precipitado de color azulado que corresponda a la formacin de cristales de formazn.
Posteriormente, este precipitado se solubiliz con isopropanol cido, se agitaron suavemente las placas
para obtener una coloracin homognea y se valoraron las absorbancias a 570 nm y a 630 nm con un
espectrofotmetro de placas (ELX 800 Bio-Tek Intruments, INC). La diferencia de ambas absorbancias
obtenida en las clulas control se consider el 100% de viabilidad, y la viabilidad de las clulas tratadas
se determin por comparacin con respecto a este dato.


Materiales y Mtodos

54

2.2.- Medida de la divisin celular mediante incorporacin de
[
3
H]-timidina

Las clulas se trataron con diferentes compuestos, mantenindolas a 37C durante dos das. 16 h
antes de finalizar el ensayo, se aadi [
3
H]-timidina (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) (1
Ci/pocillo). Posteriormente, despus de lavar las placas cuidadosamente con PBS, se precipitaron las
protenas con cido tricloroactico (TCA) al 10% durante 15 min a 4C y pasado este tiempo, se
levantaron y neutralizaron con NaOH 1 N durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se
recogi el medio de incubacin, se adicion 2 ml de lquido de centelleo (Optiphase Hisafe 3 de Wallac
(Turku, Finlandia)) y se valor la cantidad de [
3
H] presente en cada vial con un contador de centelleo
lquido (Wallac Guardian 1414 Liquid Scintilliation Counter). Los datos obtenidos se expresan como
desintegraciones por minuto (dpm).

2.3.- Tincin de clulas con Ioduro de Propidio para anlisis del ciclo
celular por citometra de flujo

Se sembraron las clulas a una densidad de 2 x10
5
clulas por pocillo. Una vez realizados los
tratamientos se tripsinizaron y centrifugaron a 2000 g durante 5 min. A continuacin se resuspendieron en
una solucin de Nonidet P-40 (Roche Diagnostic Corporation, Indianapolis, USA) al 0.1% y 0.5 mg/ml
RNAsa (Rochester, NY, USA) durante 30 min en completa oscuridad, y transcurrido ese tiempo se
incubaron durante 5 min con 0.05 mg/ml de ioduro de propidio (IP) (Calbiochem USA). Posteriormente se
realizaron las medidas de fluorescencia mediante citometra de flujo (FACSCalibur de Becton Dickinson).
Los porcentajes de las clulas en diferentes fases del ciclo celular, as como las clulas hipodiploides
(sub G1), que corresponden a clulas muertas, se calcularon a partir de los histogramas de contenido de
DNA, utilizando el programa WinMDI 2.8.

2.4.- Unin de Ioduro de Propidio y Anexina V-FITC

Se emple el kit comercial Annexin V-FITC apoptosis detection kit (BD, Nueva Jersey). Se
sembraron las clulas en placas de seis pocillos con una densidad de 2 x10
5
clulas por pocillo. Una vez
realizados los tratamientos, se tripsinizaron las clulas y se centrifugaron a 400 g durante 5 min y se
resuspendieron con 0.5 ml de tampn de unin fro 1X (Hepes 0.1 M /NaOH, pH 7.4, NaCl 1.4 M, CaCl
2

Materiales y Mtodos

55

25 mM). Posteriormente se aadi a cada muestra 5 l de Anexina V conjugada con isotiocianato de
fluorescena (FITC) y 5 l de IP, incubndose 15 min a temperatura ambiente en oscuridad.
Posteriormente se aadieron 400 l de tampn de unin fro y seguidamente se analizaron las muestras
mediante citmetro (FACSCalibur de Becton Dickinson).

2.5.- Tincin de ncleos con DAPI

Las clulas PC-3 se sembraron en cubreobjetos de cristal (12 mm de dimetro) dentro de placas de
6 pocillos a una densidad de 1x10
5
clulas por pocillo. Tras el tratamiento, los cubreobjetos se lavaron 3
veces en PBS y se fijaron las clulas con paraformaldehdo 3.7% en PBS, durante 5 min a temperatura
ambiente. Se realizaron otros dos lavados en PBS y se permeabilizaron con Tritn X-100 ( Sigma, St.
Louis, MO, USA) al 0.05% en PBS durante 5 min. Posteriormente se lavaron las clulas de nuevo con
PBS y se realiz la incubacin con 1 g/ml del fluorocromo DAPI (4, 6-diamidino-2-fenilindol)
(Calbiochem, La Jolla, USA) en PBS durante 20 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Por ltimo,
se lavaron los cubreobjetos con PBS, se realiz el montaje de la preparacin con la solucin
Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y se observ mediante microscopio de
fluorescencia.

2.6.- Medida de niveles de ceramida

2.6.1 Extraccin de lpidos

Las clulas se sembraron en placas P-100 con una densidad de 1x10
6
clulas/placa. Al finalizar los
tratamientos, las clulas se rasparon con PBS se centrifugaron a 400 g durante 5 min. Se retir el PBS y
se congel el sedimento a 80 C. Posteriormente se aadi un volumen de 600 l de agua destilada a
cada muestra, se resuspendi el sedimento y se sonicaron las muestras durante 10 s a temperatura
ambiente.

La extraccin se realiz en un volumen de 500 l, dejando el resto para la valoracin de la
concentracin de protenas totales. Se aadieron 2.5 ml de una mezcla de cloroformo:metanol (2:1, v:v) a
cada muestra y posteriormente se agitaron los tubos durante 5-10 s hasta que la mezcla qued
emulsionada. Se centrifugaron los tubos a 1000 g durante 10 min.

Materiales y Mtodos

56

Se recogi la fase inferior (donde se encuentran los lpidos celulares) y posteriormente estas
muestras fueron evaporadas con nitrgeno gaseoso para evitar la oxidacin lipdica. Las muestras se
guardaron a -20 C hasta su valoracin.

2.6.2 Cuantificacin de ceramida

La cuantificacin de los niveles de ceramida se llev a cabo segn el mtodo de DAG quinasa (Van
Veldhoven et al., 1992), basado en la deteccin de la fosforilacin de las ceramida por la enzima DAG
quinasa que convierte a las ceramida presentes en ceramida-1-fosfato utilizando [
32
P]ATP como
sustrato.

Los extractos lipdicos se resuspendieron en 40 l de una solucin detergente (di-oloil-fosfatidil-
glicerol/octal-beta-glucsido), se agitaron y se sonicaron en un bao durante 10 min. Posteriormente se
aadi la enzima DAG quinasa de E.coli (Calbiochem, La Jolla, USA) a una concentracin de 0.1 mg/ml,
en presencia de 0.4 Ci de [
32
P]ATP (Perkin Elmer, Massachussets, USA) y se incubaron las muestras a
temperatura ambiente durante 30 min. Para parar la reaccin, se aadi a cada muestra 250 l de cido
perclrico 1 %, 400 l de cloroformo y 400 l de metanol, se agitaron las muestras y posteriormente se
centrifugaron a 594 g durante 10 min. Se recogi la fase inferior a la que se aadi 400 l de cido
perclrico/metanol (7:1 v:v) y se volvi a centrifugar durante 10 min a 594 g, recogiendo la fase inferior
donde se encuentran los lpidos fosforilados. Esta fase se evapor mediante nitrgeno gaseoso y
posteriormente se resuspendi en 30 l de cloroformo/metanol (2:1 v:v). Las muestras se separaron por
cromatografa en capa fina (TLC). Para ello, se aplicaron en una placa de silicagel TLC (Whatman, New
Jersey, USA) efectundose la migracin en el sistema cloroformo/acetona/metanol/cido actico/agua
(50:20:15:10:5, v:v:v:v:v). Al finalizar la TLC, los lpidos se localizaron por exposicin a una pelcula
radiogrfica, durante toda la noche. Despus de revelar la pelcula, las bandas correspondientes a la
ceramida-1-fosfato fueron raspadas y se valor la cantidad de [
32
P]ATP incorporado mediante la adicin
de 2.5 ml de lquido de centelleo (Optiphase Hisafe 3 de Wallac (Turku, Finlandia)) utilizando un
contador de centelleo lquido (Wallac Guardian 1414 Liquid Scintilliation Counter).

La cantidad de ceramida se calcul en picomoles (pmol) refiriendo las cpm a un control interno. Los
datos se expresan como porcentaje de pmol de ceramida por mg de protena de la muestra.

Materiales y Mtodos

57

2.7.- Determinacin de niveles de IL-6

La cuantificacin de los niveles de IL-6 fue realizada en los sobrenadantes de las clulas en cultivo
por ensayo ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima) tipo sandwich, siguiendo las instrucciones
del fabricante (Diaclon Reserche, Besaon, Francie). Se sembraron las clulas en placas de 24 pocillos a
una densidad de 1x10
4
clulas por pocillo. Tras los diferentes tratamientos, los sobrenadantes celulares
fueron recogidos y diluidos en PBS.

Se incubaron los sobrenadantes celulares durante una hora en una placa de 96 pocillos
MaxiSorp (Nunc
TM
, Roskilde, Dinamarca), previamente cubierta con anticuerpo anti-IL-6 humana. Tras
lavar la placa con PBS conteniendo 0.05 % de Tween 20, sta fue incubada con anti-IL-6 biotinilado
durante una hora a temperatura ambiente. Se lav la placa con PBS-Tween y se incub con la enzima
peroxidasa de rbano (HRP) conjugada con estreptavidina durante 20 min a temperatura ambiente.
Posteriormente se lavaron las placas y se incubaron con el sustrato de HRP, TMB (3,3,5,5-
tetrametilbenzidina), durante 10 min. La reaccin se detuvo al aadir 1M H
2
SO
4,
y se midi la absorbancia
a 450 nm en un espectrofotmetro de placas (ELX 800 Bio-Tek Intruments, INC).

En algunos de los ensayos se emple IL-6 recombinante de humano procedente de Prepotech
(Paris, France).

2.8.-Determinacin de niveles de IL-17

2.8.1 Aislamiento de clulas mononucleares

Para la obtencin de clulas mononucleares se extrajo sangre perifrica de voluntarios sanos, y se
realiz una separacin en gradiente de densidad con ficoll. La muestra de sangre se diluy 1:1 con suero
fisiolgico y se pipete cuidadosamente medio volumen de Lymphoprep
TM
(compuesto por ficoll y metrizoato
sdico) en la base de esta dilucin, de forma que se gener un lecho de Lymphoprep sobre el que
descansaba la sangre diluida. Se centrifug sin freno a 4 C durante 5 min a 49 g incrementando
posteriormente la aceleracin de forma secuencial, primero a 194 g 10 min, y por ltimo a 292 g 30 min. Se
obtuvo de esta forma un gradiente de ficoll en el que se distribuyeron las clulas sanguneas atendiendo a su
diferente densidad. Se recogi la fraccin mononuclear y se lavaron dos veces las clulas con suero

Materiales y Mtodos

58

fisiolgico, centrifugando 10 min a 304 g cada vez. El sedimento de clulas se resuspendi en medio RPMI
con 10 % de suero y se sembraron las clulas en una placa de 24 pocillos a una densidad de 5 x10
5
clulas
por pocillo

2.8.2 ELISA de IL-17

La cuantificacin de los niveles de IL-17 fue realizada en los sobrenadantes de las clulas
mononucleares mediante ensayo ELISA, siguiendo las instrucciones del fabricante (Diaclon Reserche,
Besaon, France). Las clulas mononucleares fueron sometidas a distintos tratamientos, tras lo cual los
sobrenadantes celulares fueron recogidos y congelados.

Se incubaron los sobrenadantes celulares durante dos horas en una placa de 96 pocillos
MaxiSorp (Nunc
TM
, Roskilde, Dinamarca), previamente cubierta con anticuerpo anti-IL-17 humana. Tras
lavar la placa con PBS conteniendo 0.05 % de Tween 20, sta fue incubada con anti-IL-6 biotinilado
durante una hora a temperatura ambiente. Se lav la placa con PBS-Tween y se incub con la enzima
HRP conjugada con estreptavidina durante 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron las
placas y se incubaron con el sustrato de HRP, TMB, durante 10 min. La reaccin se detuvo al aadir
H
2
SO
4
1M y se midi la absorbancia a 450 nm en un espectrofotmetro de placas (ELX 800 Bio-Tek
Intruments, INC).

2.9.- Separacin de las fracciones particulada y soluble de las clulas

Para la obtencin de las fracciones particulada y soluble de las clulas PC-3 en cultivo, se
levantaron stas de la placa con tampn de homogeneizacin A (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, 2-
mercaptoetanol 10 mM, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, STI 10 g/ml, leupeptina 5 g/ml y
aprotinina 5 g/ml) mediante raspado en hielo. Posteriormente se procedi a la ruptura de la membrana
celular por sonicacin en un sonicador de punta de BRANSON Sonic power company (Rochester, NY,
USA). Inmediatamente despus las muestras fueron centrifugadas a 49000 g durante 1 h y 30 min a 4 C
y posteriormente se recogi, por una parte el sobrenadante (que corresponde a la fraccin soluble) y por
otra el sedimento (que corresponde a la fraccin particulada). El sedimento se resuspendi en tampn de
homogeneizacin A y se homogeneiz por pipeteo o sonicacin. Ambas fracciones se almacenaron a 80
C hasta su utilizacin.

Materiales y Mtodos

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2.10.- Separacin ncleo / citosol

Las clulas se sembraron en placas petri y, tras los diferentes estmulos, se tripsinizaron con 2 ml
de tripsina y se centrifugaron a 329 g. Se lavaron con 5 ml de PBS fro, se resuspendieron en 1 ml de
tampn A (Hepes 10mM pH7.9, MgCl
2
1.5 mM,

KCl 10 mM, DTT 1mM, PMSF 0.5 mM, NaF 5 mM,
leupeptina 2 g/ml, aprotinina 10 g/ml, PMSF 0.1 mM) y se lavaron tres veces con este tampn,
centrifugando cada vez 2 min a 329 g a 4 C. El precipitado se lis con 100 l de tampn de lisis A con
NP-40 0.5% durante 30 min en hielo. Las muestras se centrifugaron a 16060 g durante 10 min a 4 C. Se
recogi en este punto el sobrenadante como extracto citoslico, se lavaron las muertas con 1 ml de
tampn A y se centrifugaron a 16060 g durante 5 min a 4 C. El sedimento se resuspendi en 40 l de
tampn C (Hepes 20mM, NaCl 420mM, MgCl
2
1.5 mM
,
DTT 1mM, glicerol 25% (v/v), NaF 5 mM,
leupeptina 2 g/ml, aprotinina 10 g/ml, PMSF 0.1 mM) y se congel a -20 C. Las muestras se
descongelaron a 4 C y se centrifugaron a 16060 g 15 min a 4 C. El sobrenadante se recolect como
extracto nuclear.

2.11.-Cuantificacin de protenas

Para la obtencin de protenas totales de las clulas PC-3 en cultivo, se levantaron las clulas de la
placa con tampn de homogeneizacin B (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, Tritn X-100 20%, Na
3
V0
4
1 mM, -
glicerofosfato 10 mM, NaF 5 mM, leupeptina 2 g/ml, aprotinina 10 g/ml, PMSF 0.1 mM) mediante el
raspado en hielo. Posteriormente, las muestras recogidas se dejaron a 4 C durante al menos 30 min.
Inmediatamente despus se centrifugaron a 16600 g durante 15 min a 4C, recogiendo el sobrenadante,
donde se encuentran las protenas del lisado celular.
La cuantificacin de protenas se realiz en estos extractos mediante el mtodo de Bradford
(Bradford, 1976) utilizando un reactivo comercial de BioRad (Richmond, CA, USA) y una curva estndar
de 1-20 g/l de BSA.







Materiales y Mtodos

60

2.12.- Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS e inmunodeteccin
de protenas

Se pipetearon 10-30 g de protena de las diferentes fracciones y se sometieron las muestras a
desnaturalizacin por calor a 95 C durante 5 min en un tampn de carga, SBL [(Sample Buffer Laemmli)
(Tris 0.06 M, pH 6.8, SDS 2 %, glicerol 10 %, -mercaptoetanol 5 %, azul de bromofenol 0.001 %)]. Las
muestras se cargaron en geles al 10 % 12 % de acrilamida/bisacrilamida, dependiendo de la protena a
detectar, en condiciones desnaturalizantes (PAGE-SDS) y fueron sometidas a electroforesis de tipo
vertical en un sistema de BioRad (Richmond, CA, USA) a 100 V y temperatura ambiente. El tampn de
electroforesis que se utiliz estaba compuesto por Tris 25 mM, pH 8.3, Glicina 0.2 M y SDS 0.1%. Se
utilizaron marcadores de bajo peso molecular de BioRad Laboratories (Richmond, CA, USA).

Tras la separacin electrofortica de las protenas, se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa de BioRad (Richmond, CA, USA), mediante la aplicacin de un campo elctrico de 100 V
durante 2 h en tampn de transferencia (Tris 25 mM, Glicina 192 mM y Metanol 20 %) a 4 C. Finalizada
la transferencia, para bloquear los sitios de unin inespecficos a la membrana, sta se incub durante 1
h y 30 min a temperatura ambiente con tampn PBS-Tween al 0.01% que contena leche desnatada en
polvo al 5 %. Posteriormente, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario especfico de la
protena a estudiar, diluido con el mismo tampn, durante toda la noche a 4 C. Se realizaron dos lavados
rpidos de las membranas y se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con
peroxidasa durante 1 h a temperatura ambiente. Por ltimo, se realizaron cinco lavados de 5 min y se
procedi al revelado de la seal utilizando sustrato quimioluminiscente ECL
TM
(Millipore, Billerica,
Massachusetts). Tras un breve tiempo de exposicin, se revelaron las autoluminografas. Las placas
fotogrficas utilizadas fueron Hyperfilm
TM
ECL de Amersham Biosciences (Buckinghamshire, Reino
Unido). El anlisis densitomtrico de las bandas obtenidas se realiz con el programa Scion Image (Scion
Corporation, Maryland, USA). Los datos se refieren a la cantidad de tubulina, utilizada como control de
carga de cada pocillo.






Materiales y Mtodos

61

Los distintos anticuerpos utilizados, se detallan a continuacin:

ANTICUERPO Naturaleza Casa comercial
Actina monoclonal Oncogene
p-AKT(Trh308) policlonal Cell signaling
p-AKT(Ser 473) policlonal Cell signaling
p- eIF2 policlonal ABCAM
eIF2 monoclonal ABCAM
p-ERK monoclonal Santa Cruz
ERK2 policlonal Cell Signaling
p-JNK monoclonal Cell Signaling
JNK policlonal Cell Signaling
Caspasa 8 monoclonal Cell Signaling
Caspasa 9 monoclonal Santa Cruz
Citocromo c monoclonal BD Laboratories
p-P38 monoclonal Cell signaling
P38 policlonal Cell signaling
P65 policlonal Santa Cruz
pIB monoclonal Cell signaling
IB policlonal Santa Cruz
pIKK / policlonal Cell signaling
IKK policlonal Santa Cruz
Nucleoporina monoclonal BD Laboratories
p-STAT3 monoclonal Santa Cruz
STAT3 monoclonal Santa Cruz
-Tubulina monoclonal SIGMA
Tubulina monoclonal SIGMA

Como anticuerpos secundarios se utilizaron los siguientes anticuerpos conjugados con peroxidasa:
IgG anti-mouse de Sigma (St. Louis, USA), IgG anti-rabbit (Calbiochem, USA) e IgG anti-goat de Santa
Cruz Biotecnology ( Santa Cruz, CA, USA).


Materiales y Mtodos

62

2.13.- Silenciamiento con RNA de interferencia

La tecnologa del silenciamiento con RNA de interferencia (siRNA) permite inhibir especficamente
la expresin de protenas al transfectar las clulas con oligonucletidos de un nmero bajo pares de
bases que se unen al RNA mensajero (mRNA) especfico y producen su degradacin (Fire et al., 1998).

Para la realizacin de estos experimentos, se sembraron 2x10
5
clulas/pocillo en placas P-6. Al da
siguiente se procedi a realizar la transfeccin con los siRNAs correspondientes, que fueron sintetizados
in vitro empleando el sistema de construccin Ambion Silencer
TM
(Ambion, Austin, USA). Se comprob en
la base de datos del genoma humano mediante el programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov), que los
oligonucletidos prediseados no presentaban semejanza con otros genes del genoma. En la tabla se
recogen las secuencias de oligonucleticos diseados contra CB
2
, ceramida quinasa e IKK:

Protena Sentido 5-3 Antisentido 5-3
CB2 GGCCUCUUCCCAAUUUAAAtt UUUAAAUUGGGAAGAGGCCtc.
Ceramida quinasa UGCCUGCUCUGUGCCUGUAdTdT UACAGGCACAGAGCAGGCAdTdT
IKK GACUGGAGCUGGUUACAGAtt UCUGUAACCAGCUCCAGUCta

Como control de las transfecciones se usaron siRNAs con la misma secuencia del siRNA pero con
las bases desordenadas (scrambled). En este caso tambin se comprob mediante el programa BLAST
que no afectaban a ningn gen del genoma humano.

Primero se diluyeron los oligonucletidos del gen especfico en medio Optimen (Invitrogen, Paisley,
UK) al que posteriormente se aadi una solucin de Optimen ms lipofectamina 2000 (Invitrogen,
Paisley, UK) y la mezcla se incub durante 20 min a temperatura ambiente. Despus de lavar las clulas
dos veces con PBS se aadi la mezcla de transfeccin con una concentracin final de siRNAs de 100
nM.

Se incubaron las clulas toda la noche en estufa a 37 C y 5 % CO
2
y al da siguiente se retir el
medio de transfeccin, se lavaron las clulas con PBS y se aadi 1 ml de medio RPMI con 10 % de
FBS. Despus de la transfeccin, las clulas se dejaron crecer en condiciones normales durante 48 72

Materiales y Mtodos

63

h segn el experimento, para permitir la inhibicin de la expresin de la protena. Posteriormente se
realizaron los tratamientos correspondientes.

2.14.- Aislamiento de RNA

La extraccin de RNA de las clulas en cultivo se realiz con el kit comercial TriReagent
TM
(Sigma,
St. Louis, MO, USA). Tras los distintos tiempos de tratamiento de las clulas, se retir el medio y se
aadi 1ml de TriReagent
TM
por cada placa P-100. El lisado resultante se pas a un tubo de 1.5 ml al que
se aadi 0.2 ml de cloroformo. Tras agitar durante 15 s se dej a temperatura ambiente durante 10 min.
La mezcla se centrifug a 12000 g durante 15 min a 4 C. Se recogi cuidadosamente la fase acuosa y
se aadi 0.5 ml de isopropanol, se dej durante 5-10 min a temperatura ambiente y posteriormente se
centrfugo a 12000 g durante 10 min a 4 C. El precipitado se lav con 1 ml de etanol al 75 % y se volvi a
centrifugar a 10000 g durante 5 min a 4 C. Finalmente el precipitado se sec y se resuspendi en agua
libre de RNAsas.
A continuacin se determin la cantidad y la calidad del RNA midiendo la absorbancia de la
muestra a 260 nm y 280 nm. Para el clculo de la concentracin de RNA se consider que una unidad de
absorbancia a 260 nm corresponde a 44 g/ml de RNA. El grado de pureza del RNA extrado se estim
calculando la relacin 260/280; esta relacin debe ser superior a 1,8 para trabajar con muestras puras.
Adems se analiz su integridad mediante electroforesis en gel de agarosa.

2.15.- Retrotranscripcin (RT)

Se realiz la retrotrascripcin con 50 ng de mRNA, al que se aadi 1 l de Random Hexamers
(Promega, Madison, USA) llevndose la mezcla a un volumen final de 15 l. Se incubaron las muestras a
70C durante 5 min y luego se enfriaron a 4 C, para eliminar posibles estructuras secundarias negativas
para la reaccin. Posteriormente se aadi la mezcla de retrotranscripcin formada por:
Tampn de reaccin (M-MLV buffer 5x) (Promega, Wisconsin, USA): 5 l.
DNTPs (AB gene, Surrey, UK): 1,25 l de un stock de 20mM.
Inhibidor de RNAasa (Promega, Wisconsin, USA): 0,75 l de un stock de 40 U/l.
Agua DEPC: 2.5 l
M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus Retrotranscriptase) (Promega, Wisconsin-USA): 0,5 l
de un stock de 200 U/l.

Materiales y Mtodos

64

El volumen final de la reaccin fue de 25 l.
Posteriormente la reaccin se incub en un termociclador (AB 7500 Fast), programado a 37 C
durante una hora dejndose durante 3 min a 90 C para que se inactivara la enzima. Por ltimo se
cuantific la cantidad de DNA sintetizado en el fotmetro Nanodrop (Wilmington, USA).

2.16.-PCR a tiempo real (RT-PCR qPCR)

La PCR cuantitativa a tiempo real se realiz siguiendo el mtodo de SYBR Green (Applied
Biosystems, Foster City, USA). Se utiliz 5 l de una dilucin 1/100 del producto de reaccin de la
retrotranscripcin, aadindose la siguiente mezcla de reaccin:

2X SYBR

Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems, Foster City, USA): 10 l
Primers (forward/reverse 10 M): 1.4 l
MgCl2 (50 mM): 0.4 l
Agua DEPC: 1.8 - 4.8 l

Las secuencias de los oligonucletidos que fueron elegidas como cebadores para la amplificacin
del gen de IL-6 fueron las siguientes:

Protena Sentido 5-3 Antisentido 5-3
IL-6 CACTGGCAGAAAACAACC AACTCCAAAAGACCAGTGAT

Para amplificar los genes, se introdujeron las muestras en el termociclador (AB 7500 Fast, Applied
Biosciences) con las siguientes condiciones:
95 C durante 10 s
40 ciclos de 94 C 3 s, 60 C 40 s
95 C durante 15 s
60 C durante 1 min
95 C durante 15 s


Materiales y Mtodos

65

Para visualizar y comprobar el tamao de los productos de la PCR, se realiz una electroforesis del
producto de la reaccin en gel de agarosa al 1 %. Las bandas se observaron por la exposicin a la luz
U.V. del gel previamente teido con bromuro de etidio.
La cuantificacin relativa de los genes de inters se calcul usando el mtodo de comparacin de
los valores Ct (ciclo umbral), dnde Ct se define como el nmero de ciclo a partir del cual el producto es
detectado por fluorescencia o el ciclo a partir del cual comienza la amplificacin de manera exponencial.
Para ello se us la siguiente frmula:
2
-Ct


Siendo Ct igual a Ct muestra problema menos Ct muestra control y Ct, la diferencia entre
Ct obtenido en la amplificacin del gen objeto de estudio en la muestra y un gen constitutivo de la misma
muestra frente al cual se normaliza la cuantificacin, en este caso el gen de la actina.

2.17.- Ensayo de inmunoprecipitacin de la cromatina (CHIP)

La inmunoprecipitacin de la cromatina es una tcnica que permite analizar si una protena
concreta se une a una secuencia especfica del DNA. Consta de cuatro pasos diferentes que se
desglosan a continuacin.

2.17.1 Fijacin de la unin DNA-protena y fragmentacin del DNA

Las clulas se sembraron en un frasco de cultivo de 75 mm
2
y se incubaron con los diferentes
tratamientos. Cuando alcanzaron el 70-80 % de confluencia se fij la unin del DNA a las protenas
asociadas aadiendo paraformaldehdo al 1% durante 10 min a temperatura ambiente. Se lavaron dos
veces las clulas con PBS y se rasparon en tampn de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 8.1, SDS 1%, EDTA 10
mM, PMSF 1 mM, leupeptina 1 g/ml, aprotinina 1 g/ml). Tras 10 min de incubacin a 4 C, se
sonicaron las muestras 10 veces durante 30 min, a intervalos de al menos 40 min. Se centrifugaron a
13684 g a 4 C. Se recogi el sobrenadante y se diluy cinco veces en tampn de dilucin (Tris-HCl 20
mM, pH 8.1, Tritn X-100 1%, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM).




Materiales y Mtodos

66

2.17.2 Inmunoprecipitacin

Se aadieron 2 g de DNA de esperma de salmn (Sigma, St. Louis, USA) y 25 l de bolitas de
sefarosa diluidas al 50% y se prelavaron las muestras 2 h a 4 C. Se centrifugaron las muestras a 1520 g
durante 5 min a 4 C. Se tomaron 500 l de sobrenadante que se incub con 1 g de anticuerpo anti
NFB p65 durante toda la noche a 4 C. 20 l fueron reservados como control. Los complejos inmunes
fueron capturados por incubacin durante 1 h a 4C con 2 g de DNA de esperma de salmn y 25 l de
bolitas de sefarosa diluidas al 50%. Se centrifugaron las muestras a 1520 g 5 a 4 C, se lav el
precipitado y se centrifug a 1520 g cada vez, durante 5 min secuencialmente con los siguientes
tampones: TSE 1 (Tris-HCl 20 mM, pH 8.1, SDS 0.1%,Triton X-100 1%, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM), TSE
2 (Tris-HCl 20 mM, pH 8.1,SDS 0.1%, Tritn X-100 1%, EDTA 2 mM, NaCl 500 mM), tampn 3 (Tris-HCl
10 mM, pH 8.1, LiCl 0.25 M, Nonidet P-40 1%, desoxicolato 1%, EDTA 1 mM,) y tampn TE (Tris-HCl
10mM, EDTA 1mM). Finalmente se eluyeron los complejos inmunes con 500 l de tampn de elucin
(SDS 1%, NaHCO
3
0.1 M) durante 30 min a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 1520
g 5 min a temperatura ambiente y se recuper el sobrenadante. La unin protena-DNA se revirti
incubando los sobrenadantes a 65 C toda la noche. En este punto tambin se incub el control.

2.17.3 Aislamiento del DNA

El DNA se aisl por extraccin en fenol-cloroformo-isoamlico del siguiente modo:
Se aadi 1 l de glicgeno y un volumen de fenol-cloroformo-isoamlico (1:1:0.02), agitndose
durante 30 seg. Las muestras se centrifugaron a 16060 g durante 5 min a 4 C. Se recogi la fase acuosa
y se precipit aadiendo 0.1 volmenes de AcNa 3M pH 5.2 y 2 volmenes de EtOH 100% e incubando al
menos 2 h a -20 C. Las muertas se centrifugaron a 16060 g durante 15 min a 4 C y se lav el sedimento
con EtOH 70%. Se centrifug a 16060 g durante 15 min y el sedimento fue disuelto en 20-50 l de agua.

2.17.4 Cuantificacin de las muestras

Se emplearon 5 l del DNA aislado de las muestras inmunuprecipitadas y 2 l del control como
molde en una reaccin de qPCR realizada tal y como se describe en el apartado 2.16. Se utilizaron
oligonucletidos correspondientes a una secuencia de unin a NFB del promotor de IL-6, previamente
descrita (Shimizu et al., 1990; Gruss et al., 1992). Se comprob mediante el uso de bases de datos de

Materiales y Mtodos

secuencias de DNA (http://www.genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl) que esta secuencia
era un sitio de unin NFB. Las secuencias de los oligonucletidos que fueron elegidas como cebadores
fueron las siguientes:


Protena Sentido 5-3 Antisentido 5-3
IL-6 CCCCACCCTCACCCTCCAACAA TGAGCCTCAGACATCTCCAGTCCT

2.18.-Experimentacin animal

2.18.1 Animales

Se utilizaron ratones macho atmicos nu/nu (BALB/cOlaHsd-Foxn1
nu
) de seis semanas de edad
(Harlan Ibrica, Barcelona, Espaa). Al no poseer timo o ser este rudimentario, estos animales tienen una
deficiencia de clulas T (Pantelouris, 1968) presentando una falta de respuesta inmune dependiente del
timo, lo que permite que puedan ser receptores de tumores humanos.
Estos animales fueron mantenidos en una zona de cuarentena en el Centro de Experimentacin
Animal de la Universidad de Alcal, con ciclos constantes de luz/oscuridad de 12 h.
Los estudios fueron realizados en concordancia con la regulacin espaola para el uso y cuidados
de los animales de experimentacin y segn las directrices de la Unin Europea relacionadas con la
investigacin animal (Real Decreto 223/1988 del 14 de Marzo).

2.18.2 Induccin de tumores

A los ratones se les inyect subcutneamente en el flanco derecho, 0,2 ml de medio completo con
2 x 10
6
clulas PC-3. Aproximadamente a las 4 semanas el tumor alcanz un tamao de 70 mm
3
. Los
ratones fueron divididos en 3 grupos experimentales con 8 animales cada uno, los cuales recibieron los
siguientes tratamientos diariamente con inyecciones subcutneas: grupo A, salino (control); grupo B, 1.5
mg/kg b.w (peso corporal) de JWH015; grupo C, 1.5 mg/kg b.w de JWH015 y 1.5 mg/kg b.w de SR2. Para
preparar la solucin de inyeccin, los compuestos fueron inicialmente disueltos en etanol a una
concentracin de 25 mM de JWH015 y 17.2 mM de SR2, y posteriormente disueltos en suero salino hasta
la concentracin deseada. La concentracin final de etanol inyectada a los animales fue del 5%. Los
67


Materiales y Mtodos

68

controles fueron tratados con suero salino al 5% de etanol. La inyeccin fue repetida diariamente en un
tratamiento continuado durante 15 das y el peso de los ratones fue medido cada da. El volumen del
tumor se midi con un calibrador y fue calculado con la formula
4n
3
[
w
2
2
(
L
2
2
) , siendo W el ancho
del tumor y L la longitud del mismo.

2.18.3 Tratamiento de las muestras

Al final de los diferentes tratamientos, los animales fueron sacrificados, se extrajeron los tumores y
se obtuvo el suero.

2.19.-Anlisis estadstico

El anlisis estadstico de todos los datos se realiz con el programa informtico GraphPad Prism de
GraphPad Software Inc. Los valores estn indicados como la media error estandar. El anlisis
estadstico se realiz mediante la t de Student, al comparar dos valores entre los que slo vara un
parmetro y el resultado se consider significativo cuando p< 0.05 p< 0.01 dependiendo de los
ensayos.


Resultados

































RESULTADOS








Resultados

1.- EFECTO DE MET Y JWH015 SOBRE EL CRECIMIENTO
Y MUERTE CELULAR


Para conocer el efecto in vitro de los cannabinoides sobre las clulas tumorales de prstata, se
analiz el efecto de MET, un anlogo de AEA y agonista tanto del receptor de cannabinoides CB1
como del receptor CB2 y de JWH015, un agonista selectivo de CB2, sobre el crecimiento de la lnea
PC-3. En primer lugar se determin el posible efecto de MET y JWH015 sobre la viabilidad celular. Para
ello se trataron las clulas PC-3 durante distintos tiempos con ambos cannabinoides a concentracin
10 M y se valor la viabilidad celular por ensayo MTT. El MTT es un ensayo colorimtrico que
determina la actividad metablica de las clulas valorando su capacidad para reducir la sal de tetrazolio
MTT a un compuesto de color azul oscuro denominado formazn, por las deshidrogenasas
mitocondriales en las clulas vivas (Slater et al., 1963). As pues, este ensayo permite valorar la
viabilidad celular. En la figura 17 vemos la cintica del tratamiento, que muestra una disminucin de la
viabilidad celular a partir de las 12 h, aunque el efecto mximo se da a las 48-72 h. MET induce una
disminucin acusada de la viabilidad celular, llegando a disminuir hasta un 20% a la dosis y el tiempo
ms elevado. JWH015 no sobrepas el 50% de inhibicin de la viabilidad al mximo tiempo de estudio.
A la vista de estos datos se continu el estudio usando 48 h como tiempo ptimo de tratamiento.
71

Figura 17. Efecto de MET y JWH sobre la viabilidad celular en el tiempo. A) Las clulas PC-3 fueron incubadas con 10
M MET a diferentes tiempos, y la viabilidad celular fue medida por MTT tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B)
Las clulas PC-3 fueron incubadas con 10 M JWH015 a diferentes tiempos, y la viabilidad celular fue medida por MTT. Los
resultados se expresan como porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de tres
ensayos diferentes realizados por triplicado, ** p< 0.01 comparando frente al control mediante la t de Student.


Horas
0 20 40 60
%

V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r
0
40
60
80
100
JWH015
** **
Horas
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60
%

V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r
MET
**
**
A) B)
JWH015

Resultados

Una vez establecido el tiempo al cul los cannabinoides inhiban la viabilidad celular, se pas a
estudiar el efecto de la dosis. Para ello se trat a las clulas con dosis crecientes de MET o JWH015
durante 48h y se midi la viabilidad celular por ensayo MTT. Como se observa en la figura 18, existe
una respuesta dependiente de la dosis de cannabinoides, disminuyendo la viabilidad celular de forma
significativa a dosis del orden micromolar, de nuevo de forma ms acusada con la MET. En el caso del
72

Figura 18. Efecto dosis-dependiente de MET y JWH015 sobre la v
incubadas con distintas concentraciones de MET durante 48 h y la viabilidad ce
iabilidad celular. A) Las clulas PC-3 fueron
lular fue medida por MTT tal y como se
describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH015
dur
que
ante 48 h, y la viabilidad celular fue medida por MTT. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control,
se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizados por triplicado, * p< 0.05
y ** p< 0.01 comparando frente al control con la t de Student.
JWH015 el efecto mximo no sobrepas el 50 % de inhibicin.
na
efe
ba
tena un efecto citoesttico sobre las clulas de prstata.
0
20
40
60
80
100
120

Para determinar si tambin se produca un efecto sobre la proliferacin celular, se valor la
incorporacin al DNA de [
3
H]-timidina. Para ello se incubaron las clulas durante 48 h con MET 10 M
JWH015 10 M y 16 h antes de parar el ensayo (tiempo suficiente para que se d una replicacin
celular) se aadi 1Ci/pocillo de [
3
H]-timidina. Una vez finalizado el ensayo se procedi a medir la
cantidad de tritio incorporado en las clulas. En la figura 19 vemos que los cannabinoides inducen un
efecto sobre la proliferacin celular dependiente de la dosis, aumentando sta a dosis del orden
bien documentado (Pacher et al., 2006; Pisanti et al., 2009b). A partir de la dosis 10 M, sin embargo,
se observ una inhibicin total del crecimiento. El hecho de que JWH015 slo inhibiera el 50% de la
viabilidad celular, mientras que bloqueaba totalmente la sntesis de DNA, haca suponer que JWH015
nomolar y ocurriendo una fuerte disminucin con dosis ms elevadas, del rango micromolar. Este
cto bifsico sobre el crecimiento celular segn la dosis empleada, induciendo crecimiento celular a
jas dosis e inhibindolo a dosis ms elevadas, es un comportamiento tpico de los cannabinoides
JWH-015, M
0 5 10 15 20 25
%

V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r
0
40
60
80
100
120
*
**
**
MET, M
%

V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r
**
**
**
A) B)
0 5 10 15 20 25

Resultados

0
100x10
3
200x10
3
300x10
3
400x10
3
500x10
3
600x10
3
73

Figura 19. Efecto dosis-dependiente de MET y JWH sobre la divisin celular. A) Las clulas PC-3 fueron
incubadas con distintas concentraciones de MET durante 48 h y la viabilidad celular fue medida por incorporacin de
[
3
H]-timidina al DNA, tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas PC-3 fueron incubadas con
distintas concentraciones de JWH015 durante 48 h y la viabilidad celular fue medida por incorporacin de [
3
H]-timidina.
Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizados por triplicado, ** p< 0.01 comparando frente al
control con la t de Student.


Para caracterizar este efecto citosttico de los cannabinoides se ti el DNA de las clulas
jo. Este estudio permite valorar los cambios
ocurridos en la distribucin de las clulas en las distintas fases del ciclo celular: G
0/
G
1
, en la cual las
clula
ems una induccin simultnea de apoptosis. Ambos mecanismos
estaran participando en la inhibicin del crecimiento celular inducida por los cannabinoides en las
clula

con IP y se estudi el ciclo celular por citometra de flu
s presentan dos copias de DNA, S, en la cual las clulas estn amplificando su DNA y G
2/M
, en
la que la clulas han replicado su contenido en DNA y presentan cuatro copias del mismo.
Simultneamente tambin permite cuantificar las clulas no viables, que habrn sufrido daos en
su DNA y tendrn un contenido de DNA hipodiploide (sub G
o
/G
1
). Para llevar a cabo este anlisis,
las clulas se incubaron con dosis crecientes de MET o JWH015 durante 48 h y posteriormente se
analiz el ciclo celular por citometra de flujo. De este modo se observ que ambos cannabinoides
producan un pequeo pero significativo aumento de clulas en sub G
0/1
a partir de la dosis de 10
M, as como una disminucin de clulas en fase G1, un aumento en fase de sntesis y un
incremento de G
2/
M (figura 20).

Estos datos confirmaban el efecto citoesttico de los cannabinoides, dndose una parada de
ciclo en fase G
2/
M y revelaban ad
s PC-3.

MET, M
0 5 10 15 20
I
n
c
o
r
p
o
r
a
c
i

n

d
e

3
H
-
T
i
m
i
d
i
n
a
,

d
p
m
**
**
**
**
**
JWH015, M
0
100x10
3
200x10
3
300x10
3
400x10
3
500x10
3
600x10
3
I
n
c
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r
p
o
r
a
c
i

n

d
e

3
H
-
T
i
m
i
d
i
n
a
,

d
p
m
**
**
**
**
A) B)
0 5 10 15 20

Resultados

Control MET 1 M MET 5 M MET 10 M MET 20M
A)
Apoptosis
1.080.43 1.361.03 6.213.52 14.264.51* 22.7820.50
G0/G1
78.724.31 79.181.14 70.422.89 59.494.52* 63.130.82*
S
3.111.73 3.631.70 5.9731.03 6.790.52* 7.990.66
G2/M
15.010.08 16.740.03 17.418.46 21.274.26 26.4519*
N

m
e
r
o
d
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l
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l
a
s
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r
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d
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l
u
l
a
s
N

m
e
r
o
d
e

l
u
l
a
s
IP IP IP IP IP
Control JWH015 1 M JWH015 5 M JWH015 10 M JWH015 20 M
Apoptosis
1.680.58 2.540.68 6.461.66* 9.631.00** 11.664.18**
G0/G1
79.6643.66 76.381.44 71.821.79 64.941.44** 59.852.43**
S
2.480.57 3.090.40 4.200.87 6.010.25** 6.410.22**
G2/M
14.870.71 17.090.37 17.362.01 21.291.11** 23.052.69*
N

m
e
r
o
d
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l
u
l
a
s
N

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d
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N

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e

l
u
l
a
s
N

m
e
r
o
d
e

l
u
l
a
s
IP IP IP IP IP
B)
74


uni
tem os en la distribucin lipdica de
las clulas, aumentando la fosfatidilserina en la cara externa de la membrana plasmtica. La anexina-
V-FITC
Figura 20. Efecto de MET y JWH sobre el ciclo celular. A) Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas
concentraciones de MET durante 48 h y se analiz el ciclo celular por citometra de flujo tal y como se describe en
Materiales y Mtodos. B) Las clulas PC-3 fueron incubadas con distintas concentraciones de JWH015 durante 48 h y
se analiz el ciclo celular por citometra de flujo. Los datos son medias + E.S de tres ensayos diferentes realizados por
duplicado, * p< 0.05 y * p< 0.01 comparando frente al control con la t de Student.
Con el fin de confirmar la induccin de apoptosis por MET y JWH015, se realiz un anlisis de
n a anexina-V-FITC. La prdida de la asimetra de la membrana plasmtica es uno de los eventos
pranos del proceso apopttico. Cuando ocurre, se producen cambi
es una protena marcada con un fluorforo, que presenta afinidad por la fosfatidil serina,
permitiendo la cuantificacin de clulas apoptticas. Las clulas que han perdido la integridad de
membrana tambin se tien con IP, pudiendo discriminar as entre clulas en proceso de apoptosis
temprana, cuando nicamente unen anexina y clulas en apoptosis tarda, cuando unen tanto anexina
como IP. Tras incubar las clulas con distintas dosis de MET o JWH015, se procedi al anlisis de la
apoptosis. En la figura 21 observamos que slo se obtuvieron cambios significativos en la apoptosis
tarda (cuadrante superior derecho), a partir de la dosis 10 M.

Resultados

Control MET1M MET5M
MET10M MET20
Control JWH015 1M JWH015 5M
JWH 015 10M JWH 015 20
5.170.4 4.650.8 6.871.5 8.870.4** 14.852.9**
5.600.3 10.300.9 14.152.0 12.901.7* 13.800.7**
I
P
I
P
Anexina V-FITC
Anexina V-FITC
A)
B)
75


Para corroborar la induccin de apoptosis, se realiz una tincin de las clulas con DAPI,
sonda fluorescente que se intercala en el DNA y permite observar los cambios morfolgicos que se
producen en la cromatina. Cuando las clulas entran en apoptosis suele ocurrir una condensacin
del DNA y posteriormente ste se fragmenta de forma controlada formando los llamados cuerpos
apoptticos (Robertson et al., 2000). Como vemos en la figura 22, al tratar las clulas con MET 10
M o JWH015 10 M se observaron cambios en la morfologa y tamao nuclear, existiendo mayor
condensacin de la cromatina, as como ncleos de mayor tamao que en las clulas no tratadas
con cannabinoides, pero no se lleg a detectar la presencia de cuerpos apoptticos, ni a las 48h ni a
las 72 h de tratamiento.

Figura 21. Estudio de la apoptosis por tincin con anexina-V-FITC/IP. A) Las clulas PC-3 fueron incubadas con
distintas concentraciones de MET (panel A) o de JWH015 (panel B) durante 48 h analizndose la apoptosis por unin
anexina-V-FITC y IP mediante citometra de flujo, tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los datos son medias
+ E.S. de tres ensayos diferentes realizados por duplicado, * p< 0.05 y * p< 0.01 comparando frente al control con la t de
Student.

Resultados

76


a vez conocido el efecto de MET y JWH015 sobre las clulas PC-3, nos planteamos si ste
sera generalizado sobre otras clulas tumorales de prstata. Se usaron otras dos lneas de cncer de
prstata, la lnea celular andrgeno independiente DU 145 y la andrgeno dependiente LNCaP. Las
clulas fueron incubadas con distintas dosis de JWH015 o MET durante 48 h y la viabilidad celular se
midi por MTT. En la figura 23 vemos que ambos cannabinoides inhiben el crecimiento de todas las
lneas, pero el efecto es menos pronunciado en la lnea LNCaP, que representa un cncer de prstata
menos agresivo. Con ambos cannabinoides la disminucin de la viabilidad es ms acusada en las dos
lneas ms agresivas, PC-3 y DU-145.




Control JWH015 MET
48h
72h


Un
Figura 22. Efecto de MET y JWH015 sobre la morfologa nuclear en clulas PC-3. Las clulas fueron incubadas con 10
M de MET o JWH015 durante 48 h (panel superior) o 72 h (panel inferior), y transcurrido estos tiempos se tieron con
DAPI tal y como se describe en Material y Mtodos y se observaron por microscopio de fluorescencia. La imagen es
representativa de dos experimentos independientes realizados por triplicado.

Resultados

77

2.- PAPEL DEL RECEPTOR CB2 EN EL EFECTO
ANTIPROLIFERATIVO DE LOS CANNABINOIDES


Una vez definido el efecto antiproliferativo de los cannabinoides en la lnea PC-3, nos
planteamos estudiar la implicacin de diversos receptores del sistema endocannabinoide en este
efecto. La MET puede unirse a tres de los receptores del sistema endocannabinoide: a los dos
receptores de cannabinoides, CB1

y CB2
,
y al receptor de vanilloides TRPV1. Para estudiar si alguno
e ellos estaba implicado en la disminucin de la viabilidad celular producida por MET, se seleccion la
dosis 10 M de MET, y se pretrataron las clulas con los antagonistas de estos tres receptores: SR1
d
(antagonista de CB1), SR2 (antagonista de CB2) y CPZ (antagonista de TRPV1). Como se observa en
la figura 24, slo se obtuvo una inhibicin parcial de la disminucin de la viabilidad celular al pretratar
las clulas con SR2.




Figura 23. Efecto antiproliferativo de MET y JWH en distintas lneas de prstata. A) Las culas PC-3 fueron incubadas
con 10 M MET (panel A) o JWH015 (panel B) durante 48 h y transcurrido este tiempo la viabilidad celular fue medida por
MTT tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control, que se
consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizados por triplicado, * p< 0.05 y ** p< 0.01
comparando frente al control con la t de Student.
JWH015 (M)
0 5 10 15 20 25
V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
PC-3
DU-145
LNCap
*
**
*
** **
**
*
**
**
MET
0
20
80
00
20
40
(M)
0 5 10
40
60
1
1
1
PC-3
DU-145
LNCap
**
**
**
*
*
**
V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r

(
%
)
15 20 25

Resultados

78


Posteriormente evaluamos la implicacin del receptor CB2 en el efecto sobre la viabilidad
celular producido por JWH015. Al ser este cannabinoide agonista selectivo del receptor de
cannabinoides CB2, estudiamos nicamente la posible implicacin de este receptor. Para ello se
seleccion la dosis 10 M de JWH015 durante 48 h y se pretrataron las clulas con el antagonista
Figura 24. Papel de los receptores de cannabinoides y del receptor TRPV1 en la muerte celular producida por
MET. Las clulas se preincubaron 30 min con los antagonistas SR1 1 M , SR2 2 M y capsazepina (CPZ) 1 M, y 48
horas con MET 10M. Transcurrido este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT tal y como se describe en Materiales
y Mtodos. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos son
medias +
SR2. SR2 inhibi de forma significativa la disminucin de la viabilidad celular producida por JWH015
(figura 25).
E.S. de dos ensayos realizados por triplicado, * p < 0.01 respecto al control y # p < de 0.01 respecto a MET con
la t de Student.
Figura 25. Implicacin del receptor de
cannabinoides CB2 en la muerte celular
lar
en
Materiales y Mtodos. Los resultados se
expresan como porcentaje frente al control,
que se consider el 100 %. Los datos son
medias +
producida por JWH015. Las clulas se
preincubaron 30 min con el antagonista
SR2 2 M, y 48 horas con JWH015 10M.
Transcurrido este tiempo la viabilidad celu
se midi por MTT tal y como se describe
E.S. de dos ensayos realizados
por triplicado, * p < 0.01 respecto al control y
# p < de 0.05 respecto a JWH015 con la t de
Student.
0
20
40
60
80
C MET MET +
CPZ
CPZ
V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
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l
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r

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%
)
*
0
20
40
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C MET MET +
SR2
SR2
V
i
a
b
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i
*
80
100
120
d
a
d

c
e
l
u
l
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(
%
)
*#
0
20
40
C MET MET +
SR1
SR1
V
i
a
b
i
l
i
d
60
80
100
120
a
d

c
e
l
u
l
a
r

(
%
)
*
*
20
40
120
140
V
i
a
b
i
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)
#
60
80
100
a
d

c
e
l
u
l
a
r

(
%
*
0
C JWH
015
JWH
015 +
SR2
SR2

Resultados

79

ra 26 se obtuvo una reversin de la apoptosis producida por los cannabinoides
nicamente con el antagonista del receptor CB2.
Para confirmar el papel de los receptores de cannabinoides se llev a cabo un anlisis por
citometra de flujo de la apoptosis y del ciclo celular en las clulas pretratadas con los antagonistas. La
apoptosis se analiz mediante tincin con anexina-V-FITC/IP y el ciclo celular por tincin con IP. Como
se observa en la figu
Figura 26. Inhibicin por SR2 de la apoptosis inducida por cannabinoides. A) Las clulas se preincubaron 30 min con
los antagonistas SR1 1 M, SR2 2 M y 48 h con MET 10M y se analiz la apoptosis por unin anexina-V-FITC e IP y el
ciclo celular mediante citometra de flujo tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas se preincubaron 30
min con el antagonista SR2 2 M y 48 h con JWH015 10M y se analiz la apoptosis por unin anexina-V-FITC e IP y el
ciclo celular mediante citometra de flujo. Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizados por duplicado, *
p< 0.05 y ** p< 0.01 comparando frente al control y # p< 0.05 y ## p< 0.05 comparado frente al tratamiento con la t de
Student.

4.77 0.5 9.21 0.1* 14.04 2.3 6.55 0.1##

I
P
Control MET MET+SR1 MET+SR2
Control JWH015 JWH+SR2
A
B
Anexina V-FITC
Anexina V-FITC
Control MET10 MET10+SR1 MET10+SR2
N

m
e
r
o
d
e

c

l
u
l
a
s
IP IP IP IP
Apoptosis
1.470.19 9.780.64** 13.090.12 1.750.25#
G0/G1
78.720.52 59.494.79* 52.286.89 59.6110.74
S
3.111.22 6.790.52* 6.082.45 5.4350.95
G2/M
17.032.01 20.833.85 27.885.87 33.945.91
6.280.1 12.021.5** 6.41.2#
I
P
Control JWH015 JWH015+SR2
Apoptosis
0.460.21 8.840.07** 6.460.45
G0/G1
91.3652.79 69.724.03* 70.9913.18
S
1.210.60 5.600.63* 3.821.67
G2/M
7.232.61 22.493.10 18.9314.35
IP IP
IP
N

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c

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N

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l
u
l
a
s

c

l
u
l
s

Resultados

80

P
M durante 48 h, y se valor el efecto sobre la apoptosis y el ciclo celular mediante
citometra de flujo. Como se puede observar en la figura 24, al silenciar CB2 se consigui revertir la
apoptosis inducida por el tratamiento con JWH015, lo que confirmaba el que el efecto antiproliferativo
de JWH015 se produca a travs de CB2.

ara corroborar el papel del recetor CB2 en el efecto inducido por los cannabinoides, se silenci
su expresin en las clulas PC-3. Para ello se transfectaron las clulas con un siRNA selectivo del
receptor de cannabinoides CB2 o con una secuencia de RNA con pares de bases desordenada que no
hibrida con ninguna secuencia del genoma (scrambled), durante 72 h, consiguiendo inhibir
notablemente la expresin del receptor CB2

(figura 27). Posteriormente las clulas fueron tratadas con
JWH015 10
scrambled siRNA
CB2
CB2
Tubulina
scrambled
Control JWH015
siRNACB2
Control JWH015
I
P
Anexina V-FITC
5.99 0.7 10.91 1.8 5.262 1.0 5.464 2.7
scrambled siRNA CB2
Control JWH015 Control JWH015
Figura 27. Relevancia del receptor de cannabinoides CB2 en el efecto producido por los cannabinoides en
clulas PC-3. Las clulas PC-3 fueron transfectadas con un siRNA especfico del receptor de cannabinoides CB2 o con
una secuencia scrambled y transcurridas 72 h fueron tratadas con JWH 10 M durante 48 h. La apoptosis se analiz por
unin anexina-V-FITC e IP, as como el ciclo celular mediante citometra de flujo tal y como se describe en Materiales y
Mtodos. Los datos son medias + E.S.de tres ensayos diferentes realizados por duplicado, * p< 0.01 comparando frente
al control y # p< 0.01 comparado frente al tratamiento con JWH015 con la t de Student.

Apoptosis
2.360.76 8.931.59* 1.280.045 4.241.03
G0/G1
66.825.99 67.186.07 70.664.14 69.563.76
S
7.212.35 5.561.83 6.881.57 5.080.83
G2/M
20.642.18 19.521.62 20.392.20 22.352.58
C
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l
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a
s

Resultados

81

3.-
tivo de los cannabinoides sobre las clulas PC-3 se
pas a analizar los mecanismos de sealizacin implicados en este efecto, centrndonos en la
produccin de ceramida y en las cascadas intracelulares de fosforilacin.

3.1.-Sntesis de ceramida


La ceramida es un lpido que puede participar en la sealizacin celular, regulando distintos
procesos, entre ellos la induccin de apoptosis. Con el fin de estudiar si este segundo mensajero
estaba implicado en el efecto antiproliferativo de los cannabinoides, en primer lugar se trataron las
clulas durante 48 h con distintas dosis de MET o JWH015 y se cuantificaron los niveles de ceramida
intracelular. Para ello se emple un ensayo enzimtico en el cul la DAG quinasa fosforila la ceramida
empleando ATP radiactivo como sustrato (Van Veldhoven et al., 1992). El tratamiento con MET y
JWH015 produjo un incremento significativo de los niveles de ceramidas intracelulares (figura 28).

ESTUDIO DE LA SEALIZACIN CELULAR ACTIVADA
POR CANNABINOIDES

Una vez comprobado el efecto antiprolifera
MET, M
0 2 4 6 8 10
0
100
200
300
400
0
200
400
600
800
1000
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/
m
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n
a

(
%
)
**
*
JWH015, M
p
m
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/
m
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t
e

n
a

(
%
) *
**
A) B)
0 2 4 6 8 10
Figura 28. Efecto de MET y JWH015 sobre la sntesis de ceramida. A) Las clulas PC-3 fueron incubadas con MET 10 M
a diferentes tiempos, y los niveles de ceramida fueron medidos por el mtodo de DAG quinasa tal y como se describe en
Materiales y Mtodos. B) Las clulas PC-3 fueron incubadas con JWH015 10 M a diferentes tiempo y los niveles de ceramida
fueron medidos por el mtodo de DAG quinasa tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los resultados se expresan
como porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S de tres ensayos diferente
realizados por triplicado, ** p< 0.05 y * p< 0.01 comparando frente al control con la t de Student.
s

Resultados

82


as se incubaron con MET 10 M o JWH015 10 M durante
48 h, y posteriormente se valoraron los niveles de ceramidas intracelulares. Slo la fumonisina B1 fue
capaz de revertir totalmente el aumento de ceramida provocado tanto por MET como por JWH015. Con
D609 se obtuvo una ligera reversin, pero no fue estadsticamente significativa (figura 29). Por lo tanto,
el aumento de ceramida se produca fundamentalmente por sntesis de novo, aunque la degradacin
de esfingomielina de la membrana plasmtica tambin podra participar en este aumento.

La ceramida puede generarse a travs de dos rutas: por sntesis de novo a partir de la
condensacin de palmitoil coenzima A y serina del retculo endoplasmtico, formando esfinganina, que
es convertida en ceramida por la enzima ceramida sintasa, o bien por degradacin de esfingolmielina
de la membrana plasmtica por diferentes esfingomielinasas (Malagarie-Cazenave et al., 2002). Para
estudiar cul de las dos rutas estaba implicada en el aumento de ceramidas inducido por los
cannabinoides, se pretrataron las clulas con dos inhibidores de ambas rutas: D609, que inhibe la
degradacin de esfingomielina y fumonisina B1 (Fumo), que inhibe la ceramida sintasa. Tras el
pretratamiento con los inhibidores, las clul
0
100
200
300
400
500
600
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n
a

(
%
)
*
#
A) B)
Figura 29. La sntesis de ceramidas se produce a travs de la ruta de novo. A) Las clulas se preincubaron 30 min
con los inhibidores Fumo 50M y D609 5 M, y 48 h con MET 10 M. Transcurrido este tiempo se midieron los niveles de
ceramidas intracelulares por el mtodo de DAG quinasa tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas se
preincubaron 30 min con los inhibidores Fumo 50M y D609 5 M, y 48 h con JWH015 10 M. Transcurrido este tiempo
o se midieron los niveles de ceramidas intracelulares por el mtodo de DAG quinasa. Los resultados se expresan com
porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizad
por triplicado, * p< 0.01 comparando frente al control y # p < de 0.05 respecto al tratamiento con el cannabinoide median
la t de Student.
os
te

Resultados

83

los antagonistas SR1, SR2 y CPZ en el caso de MET,
omo se observa en la figura 27 el aumento de la
produccin de ceramida fue inhibido en ambos casos al incubar las clulas con SR2, lo que indica
qu
anilloides TRPV1, pero esta
inhibicin no lleg a ser significativa (figura 30).
Hasta ahora habamos observado que los cannabinoides inducan un efecto antiproliferativo y
pro-apopttico en las clulas PC-3 y que tambin eran capaces de provocar un aumento en la
sntesis de novo de ceramida. Con el fin de investigar si la ceramida estaba involucrada en el efecto
omo por JWH015. Por
lo tanto, la sntesis de ceramida estaba implicada en la disminucin de la viabilidad inducida por los
cannabinoides.
Para estudiar la implicacin de los receptores de cannabinoides en la sntesis de ceramida,
medimos los niveles de sta en presencia de
o slo con SR2 en el caso de JWH015. C
e le receptor CB2 era el responsable del aumento de ceramida producido por los cannabinoides.
Con MET tambin se obtuvo una disminucin de los niveles de ceramida al preincubar con los
antagonistas del receptor de cannabinoides CB1 y del receptor de v
antiproliferativo y pro-apopttico de los cannabinoides, se llev a cabo un estudio de la viabilidad
celular pretratando a las clulas con fumonisina B1. En la figura 31 se puede observar que el
pretratamiento con fumonisina B1, inhibidor de la sntesis de novo de ceramida, bloque
parcialmente la disminucin de la viabilidad celular producida tanto por MET c
0
100
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300
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(
%
)
#
*
B)
A)
Figura 30. Implicacin del receptor CB2 en la sntesis de ceramida. A) Las clulas se preincubaron 30 min con los
antagonistas SR1, SR2 y CPZ y 48 h con MET 10M. Transcurrido este tiempo se midieron los niveles de ceramida
por el mtodo de DAG quinasa tal y como de describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas se preincubaron 30
min con el antagonista SR2 y 48 h con JWH015 10M. Transcurrido este tiempo se midieron los niveles de ceramida
por el mtodo de DAG quinasa. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control, que se consider el 100
%. Los datos son medias + E.S. de tres ensayos diferentes realizados por triplicado, * p< 0.01 y # p< 0.01
comparando frente al tratamiento con el cannabinoide con la t de Student.


Resultados

84

Se continu estudiando el efecto de la ceramida sobre los cambios producidos por los
cannabinoides en el ciclo celular. Para ello se preincubaron las clulas con fumonisina B1 durante 30
min y posteriormente con JWH015 10 M durante 48 h. En la figura 32 vemos que la fumonisina B1
revierte el aumento de clulas apoptticas producido por JWH015 sin afectar a las distintas fases del
ciclo celular, por tanto la ceramida participaba en el efecto pro-apopttico de los cannabinoides en las
clulas PC-3.
Figura 31. Papel de la sntesis de ceramida sobre el efecto antiproliferativo producido por los cannabinoides. A)
Las clulas se preincubaron 30 min con el inhibidor de la sntesis de novo de ceramida, Fumo 50 M y 48 h con MET
10M. Transcurrido este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B)
Las clulas se preincubaron 30 min con el inhibidor de la sntesis de novo de ceramida, Fumo 50 M y 48 h con JWH015
10M. Transcurrido este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT. Los resultados se expresan como porcentaje frente
al control, que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de dos ensayos realizados por triplicado, * p < 0.01
respecto el control y # p < de 0.01 respecto del tratamiento con la t de Student.


Figura 32. Papel de la sntesis de ceramidas en la apoptosis producida por JWH015 en las clulas PC-3. Las clulas se
pretrataron con Fumo 50 M durante 30 min y posteriormente con 10 M de JWH durante 48 h. El ciclo celular se analiz
mediante citometra de flujo tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los datos son medias + E.S. tres ensayos
diferentes realizados por duplicado, * p< 0.05 y ** p< 0.01 comparando frente al control y # p < de 0.01 respecto JWH015 con
la t de Student.
0
20
40
60
80
100
120
V
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%
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d

c
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r

(
%
)
*
*
#
B)
) A
Control JWH JWH+Fumo
Apoptosis
1.741.4 9.271.88** 3.850.09#
G0/G1
63.9711.06 57.2714.63 62.908.67
S
4.830.95 5.30.94 3.9650.64
G2/M
27.8413.45 28.86512.33 23.9214.08
N

m
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N

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N

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c
IP IP
IP
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l
u
l
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s
r
o
d
e

l
u
l
a
s

Resultados

85

3.2.- C
tra
ella
pro
de
se in de dos de las MAPKs implicadas en la muerte
celular, p38 y JNK. As se vio que el tratamiento con JWH015 produca una disminucin tanto en la
fosforilacin de p38 como en los niveles totales de p38 (figura 33). Por otro lado, JWH015 indujo
activacin de JNK tal y como indica el aumento en los niveles de JNK fosforilada que se detecta a partir
de los 30 min de tratamiento (figura 33).

Se ha descubierto recientemente que los cannabinoides pueden inducir muerte por autofagia en
las clulas de glioma (Salazar et al., 2009). Adems, datos an no publicados de nuestro laboratorio
indican que JWH015 puede inducir autofagia en clulas de carcinoma hepatocelular. Entre las vas de
sealizacin que regulan el proceso de de autofagia destaca la inhibicin de la protena mTOR,
sustrato de la va PI3K/Akt. Esta va se activa en respuesta a multitud de factores de crecimiento. La
activacin de PI3K c
mTO
su c
dete
trata s e inhibicin a partir de las 24 h
(figura 3
res
cel
tra
act
Co
la fosforilacin de eIF2, indicativa de su inhibicin, observndose un aumento a partir de las 6 h de
tratamiento (figura 33).
ascadas de sealizacin intracelulares

Los cannabinoides pueden regular el crecimiento y la muerte celular a travs de una
nsduccin de seales que implica rutas de sealizacin muy diversas y conectadas entre s. Entre
s se encuentra la va de las MAPKs. Esta tiene una gran relevancia en la regulacin de distintos
cesos relacionados con el crecimiento tumoral y est implicada en la tumorognesis de varios tipos
cncer, entre ellos el cncer de prstata (Grant, 2008; Kinkade et al., 2008). Por ello, en primer lugar
midieron por Western blot los niveles de activac
onduce a activacin de Akt por fosforilacin, que a su vez induce la activacin de
R. En las clulas PC-3, esta va est constitutivamente activada, pudiendo estar relacionada con
recimiento incontrolado. Con el fin de analizar si JWH015 regulaba esta va en las clulas PC-3, se
rmin la fosforilacin de Akt en su residuo ser473, indicativa de la activacin total de la enzima. El
miento con JWH015 indujo activacin de Akt a tiempos corto
3).

Por otro lado, cuando la clula se somete a condiciones adversas, se desencadena una
puesta de estrs en el retculo endoplasmtico que en algunos casos puede inducir la muerte
ular. Entre las protenas que se inhiben en esta respuesta se encuentra el factor de iniciacin de la
nscripcin eIF2, que inicia la sntesis de protenas clsica, dependiente de CAP. En su lugar se
iva la transcripcin dependiente de IRES, encargada de intentar contrarrestar la situacin de estrs.
n el fin de confirmar si los cannabinoides inducan esta respuesta de estrs de retculo, se determin

Resultados

86

Estos resultados indicaban que JWH015 induca estrs de retculo en las clulas PC-3
probablemente con la mediacin de la ruta de JNK. Actualmente en nuestro grupo de investigacin se
est profundizando en el mecanismo de estrs de retculo inducido por los cannabinoides, siendo
objeto de investigacin de otra Tesis doctoral, por lo que en este trabajo no se sigui investigando en
este efecto.

Para determinar la va de apoptosis activada en las clulas PC-3 se analizaron los niveles de
procaspasa 8, partcipe de la va extrnseca, y de procaspasa 9, implicada en la ruta intrnseca. El
tratamiento con JWH015 produjo activacin de caspasa 9 sin inducir cambios en la caspasa 8, por
tanto JWH015 induca apoptosis a travs de la va intrnseca. Para confirmar la activacin la ruta
intrnseca, se midieron los niveles citoslicos de citocromo c, protena mitocondrial que es liberada al
citosol cuando existe un estimulo apopttico y activacin de caspasa 9. Se observ un aumento de
estos niveles, confirmando as la activacin de la ruta intrnseca (figura 33).

p-
-

P38
P38
p JNK
Figura 33. Mecanismos de
sealizacin celular
activados por JWH015 en
clulas PC-3. A) Las culas
PC-3 fueron incubadas con


JWH015 10 M durante
distintos tiempos y los niveles
de fosforilacin de p38, JNK,
Akt y eIF2 fueron medidos
por Western blot, tal y como
se describe en Materiales y
Mtodos. B) Las clulas PC-3
fueron incubadas con
JWH015 10 M durante
distintos tiempos, y los
niveles de procaspasa 8, 9 y
citocromo c citoslico fueron
medidos por Western blot, tal
y como se describe en
Materiales y Mtodos. La
imagen es representativa de
tres experimentos
independientes. Los niveles
de tubulina fueron medidos
como control.
p-eIF2
Caspasa 8
Caspasa 9
Citocromo c
Tubulina
Tubulina
JNK
C 10 30 1h 6h 24h 48h
B
p-Akt
C 10 30 6h 24h 48h
A

Resultados

87

CTO ANTITUMORAL IN VIVO DE JWH015
na vez establecido el efecto de los cannabinoides sobre las clulas PC-3 y su mecanismo de
accin
15 das, registrando cada da el tamao del tumor y el peso
del ratn. Al final del tratamiento, los tumores fueron extirpados y se midi el peso de los mismos.
tanto, JWH015 pareca no tener efectos txicos en este modelo.

4.- EFE

U
, pasamos a estudiar su posible efecto antitumoral en un modelo in vivo. Para ello se escogieron
ratones atmicos desnudos (nu/nu) a los que se les inyect subcutneamente 2x10
6
de clulas PC-3.
Tras aproximadamente tres semanas, cuando el tumor alcanz un tamao de 80 mm
2
, los ratones se
dividieron en tres grupos y se comenzaron los siguientes tratamientos:

- grupo A, suero salino (control)
- grupo B, 1.5 mg/kg b.w (peso corporal) de JWH015
- grupo C, 1.5 mg/kg b.w de JWH015 y 1.5 mg/kg b.w de SR2

El tratamiento se prolong durante

Como se muestra en las curvas del crecimiento tumoral en la figura 34, en el grupo control se
produjo un crecimiento descontrolado del tamao tumoral, mientras que el tratamiento con JWH015
caus una reduccin significativa del tamao del tumor. El tratamiento combinado de JWH015 + SR2
origin una curva de crecimiento tumoral similar a la del grupo control. El peso del tumor al finalizar el
tratamiento tambin fue significativamente menor en el grupo tratado con JWH015, no existiendo
diferencias entre el control y el grupo tratado con JWH015+SR2 (tabla 3). Adems, se valor por
observacin macroscpica la presencia de metstasis en el pulmn, no existiendo ninguna alteracin.
Tambin se midi el peso corporal de los ratones cada da, no observando ninguna reduccin de peso
que podra estar relacionada con un efecto txico generalizado de los cannabinoides en ninguno de los
grupos. Por
Estos datos confirmaban el efecto antitumoral de JWH015 en un modelo in vivo. El hecho de que
el tratamiento combinado con JWH015 ms el antagonista SR2 revirtiera el efecto antitumoral del
JWH015, demostraba adems que el receptor CB2 estaba participando en este efecto antitumoral.



Resultados

CONTROL JW 015 JWH015+SR2 H
0
200
400
600
800
1000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
V
o
l
u
m
e
n
t
u
m
o
r

(
%
)
Tiempo (das)
C
JWH015
JWH015+SR2
**
*
* *
#
#
#
#
Figura 34. Efecto antitumoral del cannabinoide JWH015. Se inyectaron ratones atmicos nu/nu subcutneamente con
2x10
6
de

clulas PC-3 y cuatro semanas ms tarde se iniciaron los tratamientos con vehculo (control), 1.5 mg/kg de
JWH-015 1.5 mg/kg de JWH-015 ms 1.5 mg/kg de SR2. Los tratamientos se administraron por inyeccin peritumoral
cada da y se prolongaron durante 15 das. Se registr diariamente el volumen del tumor. A) Foto representativa del
tamao tumoral en un ratn de cada grupo tratado, as como del tumor disecado al finalizar los tratamientos. B) Curva del
crecimiento tumoral tras el inicio del tratamiento con vehculo, JWH015 o JWH015+SR2. Los resultados se expresan
como porcentaje tamao tumoral inicial, que se consider el 100 %. Los resultados son medias E.S. del volumen
tumoral de cada ratn en dos experimentos independientes. * p< 0.01 frente al control y # p<0.01 frente a JWH-015,
comparado mediante t de student.
88



Resultados

Volumentumor
inicial(mm
3
)
Volumen
tumorfinal(mm
3
)
%Crecimiento
tumoral
Pesodeltumor
(g)
CONTROL
81.6212.90 447.75 45.65 663.2768.09 263.7720.68
JWH015
84.1511.049 344.76 37.741 426.4040.65 203.7221.90
JWH015+SR2
78.887.31 428.07 50.19 623.3872.11 283.7828.32
89


Tabla 3. Efecto antitumoral del cannabinoide JWH015.

5.- ESTUDIO DE LA SECRECCIN DE IL-6

Adems de sus efectos sobre el crecimiento y la muerte celular, el pap
sobre el sistema inmune cada vez cobra ms relevancia. Ambos efectos pue
siendo la secrecin de citoquinas uno de los posibles reguladores, ya que
respuestas inflamatorias, sino que tambin pueden regular el crecimiento
diferenciacin. En prstata una de las citoquinas con mayor relevancia es IL-
crecimiento celular y la resistencia a drogas (Culig et al., 2005; Pu et al., 200
estudiar la secrecin de esta citoquina por las clulas de prstata en presen
Para ello, primero valoramos la secrecin de IL-6 en las clulas PC-3 y en las clulas no tumorales,
RWPE-1, mediante ensayo ELISA tras tratar a las clulas con dosis crecientes de cannabinoides. En la
gura 35 se observa que ambos cannabinoides produjeron un aumento dosis dependiente de la
iaciones en la
secrecin de IL-6 a ninguna de las dosis estudiadas, lo que implicaba una regulacin diferencial de la
secrecin de IL-6 en clulas tumorales y clulas no tumorales.
el de los cannabinoides
den estar relacionados,
stas no slo modulan
, la supervivencia y la
6, por su efecto sobre el
4). As pues, decidimos
cia de MET y JWH015.
fi
secrecin de IL-6 en las clulas PC-3. En la lnea RWPE-1 no se observaron var
Figura 35. MET y JWH015 producen
un incremento en la secrecin de IL-
6 en clulas PC-3. Las clulas PC-3 y
RWPE-1 fueron incubadas con distintas
dosis de MET o JWH015 durante 48 h,
y los
ensa
niveles de IL-6 fueron medidos por
yo ELISA tal y como se describe
en Materiales y Mtodos. Los
resultados se expresan como
porcentaje frente al control, que se
consider el 100 %.Los datos son
medias + E. S. de tres ensayos
realizados por duplicado, *p<
< 0.01 comparando frente al
control con la t de Student.

diferentes
0.05 y ** p 0
100
200
300
2 4 6 8 10
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(

%
)
Canabinoide (M)
400
500
600
700
JWH015 en PC-3
MET en PC-3
JWH015 en RWPE1
MET en RWPE1
**
*
**
**
*
*
0

Resultados

90

s lo
niveles de IL-6. Como se observa en la figura 36, MET aument la sntesis a partir de las 6 h y JWH015
lo hizo
oligonucletidos especficos del RNA de esta citoquina y valoramos su expresin a distintos tiempos de
incubacin con JWH015 10 M. As observamos que a tiempos cortos haba una disminucin en los
niveles de RNA mensajero, pero a partir de las 6h prcticamente se duplicaba su expresin (figura 37).



Posteriormente nos propusimos estudiar la secrecin de IL-6 a lo largo del tiempo. Para ello
incubamos las clulas PC-3 con MET 10 M o JWH015 10 M durante distintos tiempos y medimo
a partir de las 48 h (figura 36).


Tambin quisimos comprobar si el aumento en la secrecin de IL-6 era debido a un aumento
en la expresin a nivel de mRNA. Para ello llevamos a cabo una PCR a tiempo real (qPCR) con
Figura 36. Respuesta en el tiempo de
la secrecin de IL-6 a los
cannabinoides. Las clulas PC-3
fueron incubadas con MET 10 M o
JWH015 10 M durante distintos
tiempos, y los niveles de IL-6 fueron
medidos en los sobrenadantes
celulares por ensayo ELISA tal y como
se describe en Materiales y Mtodos.
Los resultados se expresan como
porcentaje frente al control, que se
consider el 100
medias +
0
100
200
300
400
500
600
700
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
C 10' 30' 1h 6h 24h 48h
Tiempo
MET
JWH015
%. Los datos son
E. S. de tres ensayos
diferentes realizados por duplicado, *p<
0.05 y ** p< 0.01 comparando frente al
control con la t de Student.
Figura 37. Respuesta en el tiempo de
la expresin de mRNA de IL-6 al
JWH015. Las clulas PC-3 fueron
incubadas con JWH015 10 M durante
distintos tiempos, y los niveles de IL-6
fueron medidos mediante qPCR tal y
como se describe en Materiales y
Mtodos. Los resultados se expresan
referidos al control, que se consider 1.
Los datos son medias +
0
0.5
1
1.5
2
2.5
C 10' 30' 1h 6h 24h 48h
N
i
v
e
l
e
s

r
e
l
a
t
i
v
o
s

d
e

m
R
N
A
Tiempo
*
**
**
E. S. de dos
ensayos diferentes realizados por
duplicado, *p< 0.01 comparando frente
al control con la t de Student.


Resultados

91


5.1.- Papel del receptor CB2


Para estudiar la posible participacin de los diferentes receptores en la secrecin de IL-6
mediada por los cannabinoides se pretrataron las clulas con los antagonistas SR1, SR2 y CPZ, y
posteriormente se incubaron en presencia de MET 10 M. Tras 48 h se midieron los niveles de IL-6
mediante ELISA. Slo se obtuvo un bloqueo parcial de la secrecin de IL-6 al pretratar las clulas con
SR2 (figura 38), por tanto el receptor CB2 pareca estar implicado en la induccin de la secrecin de IL-
6.

Con el fin de corroborar la implicacin de CB2 se pas a valorar el efecto del antagonista de este
receptor en la secrecin de IL-6 inducida por JWH015. De este modo se observ que SR2 inhiba
totalmente el aumento de la secrecin de IL-6 provocada por JWH015 (figura 39), indicando una vez
ms que la induccin de la secrecin de IL-6 se realizaba a travs de CB2.




0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
C MET MET +
SR1
SR1
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
C MET MET +
CPZ
CPZ
P
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
*
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
C MET MET +
SR2
SR2
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
*
#
A)
B) C)
Figura 38. Papel de los receptores de cannabinoides y del receptor TRPV1 en la secrecin de IL-6 inducida por MET.
Las clulas se preincubaron 30 min con los antagonistas SR1, SR2 y CPZ, y 48 horas con MET 10M. Transcurrido este
tiempo se midieron los niveles de IL-6 por ELISA tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los resultados se
expresan como porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de dos ensayos
realizados por triplicado, * p < 0.01 respecto el control y # p < de 0.01 respecto MET con la t de Student.

Resultados

92



Para confirmar el papel del recetor CB2 en el efecto inducido por los cannabinoides, se silenci
su expresin en las clulas PC-3. Para ello se transfectaron las clulas con un siRNA selectivo del
receptor de cannabinoides CB2 o con una secuencia de RNA con pares de bases desordenada que no
hibrida con ninguna secuencia del genoma (scrambled), durante 72 h. Posteriormente las clulas
fueron tratadas con JWH015 10 M durante 48 h y se midieron los niveles de IL-6. Como se puede
observar en la figura 40, al silenciar CB2 se consigui revertir totalmente el aumento de secrecin de
IL-6 inducida por el tratamiento con JWH015, lo que ratificaba la implicacin del receptor CB2

en este
efecto.


0
20
40
60
80
100
120
140
Scrambled siRNA CB2
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
160
180
Control
JWH015
Figura 39. Inhibicin de la secrecin de IL-
6 inducida por JWH015 por el antagonista
del receptor de cannabinoides CB2. Las
clulas se preincubaron 30 min con el
antagonista SR2 0.5 M, y 48 h con JWH015
10M. Transcurrido este tiempo los niveles
de IL-6 fueron medidos por ELISA tal y como
se describe en Materiales y Mtodos. Los
resultados se expresan como porcentaje
frente al control, que se consider el 100 %.
Los datos son medias + E.S. de dos ensayos
realizados por triplicado, * p < 0.01 respecto
el control y # p < de 0.01 respecto JWH015
con la t de Student.
Figura 40. Papel del receptor de
cannabinoides CB2 sobre la secrecin de
IL-6. Las
con siR
cannabin
scramble
con 10
niveles d
resultado
al contro
datos so
culas PC-3 fueron transfectadas
NA especfico del receptor de
oides CB2 o con una secuencia
d y transcurridas 72 h fueron tratadas
M de JWH015 durante 48 h. Los
e IL-6 se valoraron por ELISA. Los
s se expresan como porcentaje frente
l, que se consider el 100 %. Los
n medias + E.S. de tres ensayos
s realizados por triplicado. diferente
.

0
C JWH015 JWH015 SR2
20
40
80
100
120
140
160
180
200
+ SR2
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
#
*
#
60
p

Resultados

93

5.2.-
umentaban la sntesis de ceramida a travs del receptor CB2 y
ya que este receptor tambin participaba en la secrecin de IL-6, quisimos investigar si el aumento en
la produccin de ceramida estaba implicado en la secrecin de IL-6 n
de esta interleuquina en presencia de MET 10 M o JWH015 10
con el inhibidor de la sntesis de novo de ceramida, fumonisina B1. C
se produjo ninguna variacin al pretratar las clulas con fumonisina
no estaba implicada en la secrecin de IL-6.

Puesto que la sntesis de novo de ceramida pareca no esta
nos preguntamos si algn metabolito derivado de la ceramida pod en
la introduccin, ceramida es el precursor de la sntesis de muchos esfingolpidos complejos, entre ellos
C1P. La ceramida puede fosforilarse por medio de la enzima abolito que
participa en la regulacin del crecimiento celular.
Papel de la sntesis de ceramida en la secrecin de IL-6


Puesto que los cannabinoides a
. Se valor con este fin la secreci
M, previo tratamiento de las clulas
omo se observa en la figura 41, no
B1, lo que sugera que la ceramida
r involucrada en la secrecin de IL-6,
ra regularla. Tal y como se seala
CERK dando C1P, met
0
50
100
150
C MET MET +
Fumo
Fumo
200
250
300
350
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
*
0
50
100
150
C JWH015 JWH015 +
Fumo
Fumo
* *
200
250
300
350
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
A) B)
Figura 41. La sntesis de ceramida intracelular no est involucrada en la secrecin de IL-6. A) Las clulas se
preincubaron 30 min con el inhibidor de la sntesis de novo de ceramidas, Fumo 50 M y 48 h con MET 10M. Transcurrido
este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT tal y como se describe en Materiales y Mtodos. B) Las clulas se
preincubaron 30 min con el inhibidor de la sntesis de novo de ceramidas, Fumo 50 M y 48 h con JWH015 10M.
Transcurrido este tiempo la viabilidad celular se midi por MTT. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control,
que se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de dos ensayos realiza ente
al control mediante la t de Student.

dos por triplicado, * p < 0.01 comparado fr

Resultados

94

Con el fin de estudiar la participacin de C1P en la regulacin de la secrecin de IL-6 por
CERK mediante un siRNA selectivo. Una vez silenciada
ERK, las clulas fueron tratadas con MET 10M durante 48 h, y se midieron los niveles de IL-6 por
nsayo ELISA. Como se observa en la figura 42, aunque el silenciamiento de CERK no fue completo,
se con

5.3.- Sealizacin celular implicada en la secrecin de IL-6

5.3.1 Ruta de sealizacin de NFB
FB es un factor de transcripcin pleiotrpico que desempea una funcin central en la
respue
onal (Shimizu et al., 1990;
Gruss t al., 1992; Matsusaka et al., 1993). Para dilucidar si este factor de transcripcin participaba en
la induccin de la secrecin de IL-6 por cannabinoides se pretrataron las clulas con el inhibidor
BAY1 M, inhibidor de IKK, una de las quinasas implicadas en la activacin de NFB.
Posteriormente se incubaron con MET 10M y JWH015 10M y se midieron los niveles de IL-6. Como
se observa en la figura 43, la sntesis de IL-6 inducida por los cannabinoides fue inhibida parcialmente
cannabinoides, se silenci la expresin de
C
e
sigui revertir totalmente el aumento de secrecin de IL-6 inducida por el tratamiento con MET.

N
sta inmune innata y adquirida, induciendo la expresin de genes implicados en la respuesta
inmune y el crecimiento celular, algunos de ellos codificantes para citoquinas proinflamatorias. Adems,
NFB es uno de los factores de transcripcin que regulan comnmente la expresin de IL-6, existiendo
en el promotor de esta citoquina un sitio de unin a este factor transcripci
e
1-7082 2.5
en el caso de MET y totalmente en el caso de JWH015 al preincubar las clulas con BAY11-7082.
CERK
Tubulina
Figura 42. CERK est involucrada en la
secrecin de IL-6. Las culas PC-3
fueron transfectadas con un siRNA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Scrambled siRNA CERK
p
g
/
m
l

I
L
-
6
(
%
)
Control
especfico de CERK o con una secuencia
scrambled, y transcurridas 72 h fueron
tratadas con JWH015 10 M durante 48 h.
Los niveles de IL-6 se valoraron por
ELISA. Los resultados se expresan como
porcentaje frente al control, que se
consider el 100 %. Los datos son medias
+
MET
*
#
E.S. de tres ensayos diferentes
realizados por triplicado., * p < 0.01
respecto el control y # p < de 0.01
respecto MET con la t de Student


Resultados

95

consigui revertir totalmente el aumento de secrecin de IL-6 inducida por el tratamiento con
JWH015, existiendo tambin una disminucin de los niveles basales de IL-6.
Figura 43. Inhibicin de la secrecin de IL-6 por BAY. Las clulas fueron incubadas con BAY11-7082 2.5 M durante
30 min, y posteriormente se trataron con MET 10 M o JWH015 10 M durante 48 h. Los niveles de IL-6 fueron medidos
por ensayo ELISA. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control, que se consider el 100 %. Los datos
son medias +
Con el fin de confirmar la implicacin del NFB en la secrecin de IL-6, se silenci la expresin
de IKK en las clulas PC-3. Para ello se transfectaron las clulas durante 72 h con un siRNA selectivo
de IKK o con una secuencia de RNA con pares de bases desordenada que no hibrida con ninguna
secuencia del genoma (scrambled). Posteriormente las clulas fueron tratadas con JWH015 10M
durante 48 h, y se midieron los niveles de IL-6. Como se puede observar en la figura 44, al silenciar
IKK se


E.S. de dos experimentos realizados por triplicado. *p<0.01 respecto del control, y #p<0.01 respecto del
tratamiento con cannabinoide comparando con la t de Student.

Figu
sec
fuer
esp
scra
trata
48 h
ELIS
porc
con
+
ra 44. Papel del IKK sobre la
recin de IL-6. Las clulas PC-3
on transfectadas con un siRNA
ecfico de IKK o con una secuencia
mbled, y transcurridas 72 h fueron
das con 10 M de JWH015 durante
. Los niveles de IL-6 se valoraron por
A. Los resultados se expresan como
entaje frente al control, que se
sider el 100 %. Los datos son medias

reali
.

E.S. de tres ensayos diferentes
zados por triplicado.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
C MET MET+BAY BAY
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
*
#
0
25
50
75
100
125
150
175
200
C JWH015 JWH015+BAY BAY
*
#
225
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Scrambled siRNA IKKb
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)
Control
JWH015
*
#
*

Resultados

96

lizamos la
participacin de diferentes componentes de la va clsica y no clsica de su activacin. Las clulas PC-
3 fueron tratadas con JWH015 10 M a diferentes tiempos, valorndose la fosforilacin de las quinasas
e inhib
(figura 45), lo que indicaba que NFB p65 se estaba
activando y translocndose al ncleo para ejercer su papel en la regulacin transcripcional.
.
Para estudiar los mecanismos que podran regular la activacin de NFB ana
idores que participan en la va de regulacin de NFB. Comprobamos de esta forma que exista
activacin de las quinasas IKK e IKK, as como del inhibidor de NFB, IB (figura 45).
Posteriormente valoramos directamente la activacin de NFB, estudiando su translocacin al
ncleo, que se da cuando este factor de transcripcin se activa. Para ello llevamos a cabo una
extraccin ncleo/citosol y medimos los niveles de la subunidad de NFB p65 en ambos
compartimentos celulares. Observamos una disminucin de los niveles citoslicos de p65
paralelamente a un incremento en el ncleo
Figura
1 2.60.4** 4.30.0** 3.72.1 3.82.6 1.90.7 0.60.0
1 1.20.3** 4.42.6 12.91.3** 2.60.4** 1.60.4** 1.10.5
1 10.05 0.90.04* 0.70.03** 0.90.02* 0.70.1* 0.40.1**
C 10 30 1h 6h 24h 48h
p65
Nucleo Nucleoporina
A)
B)
pIKK/
IKK
pIB
IB
1 1.70.3 2.20.7* 2.10.8 1.50.2* 1.80.3* 0.40.1*
p65
Citoplasma
Tubulina
Nucleoporina
Tubulina
45. Activacin de la va clsica de NFB por JWH015. A) Las clulas fueron incubadas con JWH015 10 M
durante distintos tiempos y se valor la activacin de IKK/ y de IB mediante Western blot. B) Las clulas fueron
incubadas con JWH015 10 M durante distintos tiempos, se llev a cabo una separacin ncleo/citosol y se valoraron los
niveles de p65 en ambos compartimentos celulares mediante Western blot. La figura es representativa de tres ensayos
independientes. Se detect nucleoporina como marcador de extracto nuclear y tubulina como marcador de citosol. La
cuantificacin de las bandas correspondiente a la protena fosforilada respecto de la protena total o a p65 respecto del
correspondiente marcador se muestra debajo del carril.

Resultados

97

5.3.2 Ruta de sealizacin PI3K/Akt

Datos previos de nuestro laboratorio indicaban la va
PI3K/Akt (Sanchez et al., 2003a), y esta va haba sido re cin
constitutiva de NFB en las clulas PC-3 (Dan et al., 2008). As pues, nos propusimos descubrir si la
ruta PI3K/Akt estaba implicada en el aumento de la secrecin de IL-6 inducido por los cannabinoides.
Para ello se incubaron las clulas PC-3 con LY294002 1 M, un inhibidor especfico de la
e observa en
figura 47.
Estudiamos tambin los niveles de otra de las subunidades que pueden formar el complejo
NFB, la subunidad p52, as como de su precursor p100. Esta subunidad est implicada en la va no
clsica del NFB. Como se puede observar en la figura 46 no se detectaron cambios en los niveles de
ninguna de estas protenas, lo que indica que NFB no se activaba por esta va.
protena PI3K. Posteriormente se trataron con MET 10 M o JWH015 10 M y transcurridas 48 h se
Figura 46. Western blot de
p100/p52 Las clulas fueron
incubadas con JWH015 10
M durante distintos tiempos
y se valor los cambios en la
y


e

p52
p100
Actina
C 10 30 1h 6h 16h 24h 48h
activacin de p100/p52
mediante Western blot tal
como se describe en
Materiales y Mtodos. La
figura es representativa d
tres ensayos independientes.
que los cannabinoides activaban
cientemente relacionada con la activa
midieron los niveles de IL-6 por ensayo ELISA. Al pretratar las clulas con el inhibidor de PI3K se
observ una reversin del aumento de secrecin producido por los cannabinoides, como s
la
0
100
200
300
400
500
600
C MET MET+LY LY
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)



#
*
700
0
50
100
150
200
250
300
350
C JWH015+LY
p
g
/
m
l

I
L
-
6

(
%
)



#
400
*
A) B)
Figura 47. Inhibicin de la secrecin de IL-6 por LY. Las clulas fueron incubadas con LY294002 1 M durante 30 min,
y posteriormente se trataron con MET 10 M o JWH015 10 M durante 48 h. Los niveles de IL-6 fueron medidos por
ELISA tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control, que
se consider el 100 %. Los datos son medias + E.S. de dos experimentos por triplicado. *p<0.05 y **p<0.01 respecto del
control, y #p<0.01 respecto del tratamiento con cannabinoide comparando mediante la t de Student.

Resultados

Con el fin de seguir profundizando en la ruta de sealizacin de PI3K/Akt, se llev a cabo
98

con mayor profundidad el estudio de la fosforilacin de Akt, determinando la fosforilacin mediante
Western blot en el residuo thr308, indicativa de una activacin parcial de la encima. La activacin de
PI3K conduce a la activacin de Akt, que a su vez est implicada en multitud de repuestas celulares. Al
incubar las clulas durante distintos tiempos con MET 10 M o JWH015 10 M se observ un
incremento en la fosforilacin a tiempos cortos de Akt, indicativa de la activacin de esta quinasa as
como una disminucin a partir de las 48h, lo que concordaba con la inhibicin de la fosforilacin en el
residuo ser473 observada al estudiar la apoptosis (figura 48A).

Posteriormente se valor la participacin de la protena PI3K y del receptor de cannabinoides
CB2 en la activacin de Akt. Para ello se pretrataron las clulas con LY294002 y con SR2 y
p
c
i

Una vez caracterizadas tanto la va de activaci terminada
la participacin de ambas en la secrecin de IL-6, pas tre ambas
vas, as como la contribucin del receptor de cannabinoides CB2. Para ello incubamos las clulas con
el antagonista SR2 o con el inhibidor LY294002 y poste os la activacin de NFB.
En la figura 49 se muestra que tanto SR2 como LY294002 fueron capaces de inhibir la activacin de
osteriormente se trataron con JWH015 10 M. Como se observa en la figura 48B, la preincubacin
on SR2 bloque parcialmente la activacin de Akt, mientras que el pretratamiento con LY294002
nhibi totalmente su activacin, como era de esperar.
n de NFB como la de PI3K/Akt y de
amos a estudiar la posible relacin en
riormente determinam
Figura 48. Activacin de Akt por MET y JWH015. A) Las clulas fueron incubadas con MET 10 M o JWH015 10 M
durante distintos tiempo y se valor la activacin de Akt mediante as con SR2
o LY294002 durante 30 min y posteriormente fueron incubadas c activacin
de Akt mediante Western blot. La figura es representativa de dos e
MET
A)
C 10 30 1h 6h 24h 48h
pAkt
Tubulina
C 10 30 1h 6h 24h 48h
pAkt
Tubulina
JWH015
C JWH015 +SR2 +LY
pAkt
Tubulina
B)
Western blot. B) Las clulas fueron pretratad
on JWH015 10 M durante 24 h. Se valor la
nsayos diferentes realizados por duplicado.

Resultados

99

p65 inducida por JWH015, lo que sugera que la activacin de NFB por parte de los cannabinoides se
llevab

5.4.- NFB controla la expresin de IL-6

Una vez comprobada la activacin por parte de los cannabinoides del factor de transcripcin
NFB, con mediacin de la va PI3K/Akt, nos propusimos comprobar si efectivamente NFB se una al
promotor de IL-6 en respuesta al tratamiento con cannabinoides. Previamente se haba descrito que en
el promotor de IL-6 exista un sitio de unin a este factor transcripcional (Shimizu et al., 1990; Gruss et
al., 1992), y se comprob mediante el uso de bases de datos de secuencias de DNA
(http://www.genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl
a a cabo a travs de CB2, con mediacin de la va PI3K/Akt.
1 1.60.5* 1.00.1# 0.90.1# 1.00.3 1.10.4
Nucleo

) que esta secuencia era un posible sitio
de unin NFB. As pues, empleamos esta secuencia para comprobar la unin de NFB al promotor de
IL-6. Para ello se llev a cabo un ensayo de coinmunoprecipitacin de la cromatina (ChIP). Se trataron
las clulas con MET 10 M o JWH015 10 M, pretratndolas previamente con el antagonista del
receptor CB2, SR2, y con el inhibidor de PI3K, LY294002. Posteriormente se inmunoprecipit la
subunidad p65 de NFB y se valor la unin de NFB al promotor de IL-6 mediante qPCR usando
o
l
I
n
ligonucletidos especficos de la secuencia de unin a NFB. De este modo se observ que al tratar
as clulas con los cannabinoides exista un aumento significativo en la unin de NFB al promotor de
L-6. El pretratamiento con SR2 y LY294002 disminuy la unin de NFB al promotor de IL-6, aunque
o de forma significativa (figura 50).
Figura 49. Papel de CB2 y PI3K en la activacin de p65 Las clulas fueron incubadas con JWH015 10 M 24 h,
pretratndolas con el antagonista de CB2, SR2, y con el inhibidor de PI3K, LY294002. Se llev a cabo posteriormente una
separacin ncleo/citosol y se valoraron los cambios en la los niveles de p65 en ambos compartimentos celulares mediante
Western blot tal y como se describe en Materiales y Mtodos. La figura es representativa de tres ensayos independientes.
1 0.70.1** 1.70.4# 1.30.1# 0.90.3 0.50.1*
p65
Nucleoporina
C JWH JWH J WH SR2 LY
+SR2 +LY
p65
Tubulina
Citoplasma

Resultados

0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
v
o
s

d
e

m
R
N
A
* *
C MET MET+SR2 MET+LY JWH JWH+S
N
i
v
e
l
e
s

r
e
l
a
t
i
R2 JWH+LY

100


C
Algunos autores han descrito que IL-6 es una citoquina implicada en el crecimiento celular en el
cncer de prstata (Steiner et al., 2003). Tal y como se describe en esta Tesis doctoral, los
cannabinoides ejercen un claro efecto antiproliferativo en las clulas PC-3, a la par que inducen un
aumento de la secrecin de IL-6. Esta aparente disyuntiva nos llev a cuestionarnos el papel biolgico
de la citoquina secretada por las clulas PC-3, por lo que decidimos estudiar su funcionalidad.

Uno de los principales efectores de IL-6 es el factor transcripcional STAT3, que se activa por
medio de tirosina quinasas de la familia Jak cuando IL-6 se une a su receptor, por lo que decidimos
estudiar su activacin. Para ello llevamos a cabo un ensayo en el cul, tras tratar las clulas PC-3 con



6.- PAPEL DE IL-6 EN EL CRECIMIENTO Y MUERTE
Figura 50. Los cannabinoides activan la expresin de IL-6 por medio de la uni . Las
ormente con MET 10 M o JWH015 10 M durante 24h. La
tal y como se describe en Materiales y Mtodos. Los resultados
se expresan referidos al control, que se consider 1. Los datos son medias +
n de NFB a su promotor
clulas fueron incubadas con SR2 y LY294002 y posteri
activacin de la expresin de IL-6 se valor mediante ChIP
ELULAR

6.1.- Funcionalidad de la IL-6 secretada por las clulas PC-3

MET10 M, cannabinoide que produca el mayor aumento en la secrecin de IL-6, se transfirieron los
sobrenadantes celulares a clulas HepG2 y LNCaP, lneas donde est descrito que STAT3 se activa en
presencia de IL-6. Paralelamente se incubaron las clulas HepG2 y LNCaP con IL-6 exgena, usndola
E.S. de dos experimentos realizados por
duplicado

. *p<0.01 respecto del control comparando mediante la t de Student.

Resultados

101

Se estudi por Western blot la activacin de STAT3. La
figura es representativa de dos ensayos independientes.
Figura 52. Especificidad de la activacin de STAT3 en presencia de IL-6. Las clulas PC-3 fueron incubadas durante
48 h con MET 10 M y los sobrenadantes celulares fueron transferidos a clulas LNCaP. Estas clulas se incubaron
durante 30 min con los sobrenadantes o con IL-6 recombinante 100 ng/ml en presencia y ausencia de un anticuerpo
especfico contra IL-6 a 5 mM. La activacin de STAT3 se midi por Western blot. La figura es representativa de dos
ensayos independientes.

como contro

Para confirmar que la fosforilacin de STAT3 se deba nicamente a la IL-6 secretada por las
clulas PC-3 y no a otros posibles elementos presentes en el sobrenadante celular, se llev a cabo el
mismo ensayo de activacin de STAT3 en la lnea LNCaP, pero esta vez en presencia de un anticuerpo
especfico contra IL-6. Como vemos en la figura 52, la activacin de STAT3, tanto en el caso de IL-6
exgena como en el de IL-6 secretada por la clulas PC-3, fue revertida al incubar los sobrenadantes
con el anticuerpo anti-IL-6.
l positivo. Se analiz la fosforilacin de STAT3 por Western blot en ambas lneas celulares.
De este modo se observ que STAT3 se activaba tanto al incubar las clulas con IL-6 exgena como
con el sobrenadante de las clulas PC-3 tratadas con cannabinoides, que debera contener la IL-6
secretada por estas clulas (figura 51).
HepG2 LNCap
Figura 51. Funcionalidad de IL-6 secretada por las clulas PC-3. Las clulas PC-3 fueron incubadas durante 48 h con
MET 10 M y se transfirieron los sobrenadantes a clulas HepG2 y LNCaP. Ambas lneas celulares se incubaron durante
30 min con los sobrenadantes o con IL-6 recombinante 100 ng/ml.
pSTAT3
STAT3
pSTAT3
STAT3
IL6recombinant IL6PC3

Resultados

102


E

Posteriormente nos propusimos determinar de forma directa el efecto de IL-6 sobre la viabilidad
celular de la lnea PC-3. Con este fin se incubaron las clulas con dosis crecientes de IL-6 exgena
6.3.- Expresin
stos resultados indican que la activacin de STAT3 se debe a la IL-6 secretada por las clulas
PC-3 y por tanto la IL-6 secretada por las clulas PC-3 en presencia de cannabinoides era
funcionalmente activa.


6.2.- Efecto de IL-6 sobre la viabilidad celular.
durante 24 h y se valor la viabilidad celular por MTT. No se obtuvieron cambios a ninguna de las dosis
de IL-6 estudiadas (figura 53), lo que indicaba que IL-6 no posea ningn efecto sobre la viabilidad en
las clulas PC-3.

y actividad de STAT3

Pese a la demostracin de la falta de efecto de la IL-6 sobre la viabilidad celular en la lnea
PC-3, esta citoquina podra regular alguna otra funcin biolgica mediante un bucle autocrino en estas
clulas. Para comprobar esta hiptesis, analizamos la activacin de STAT3 en las clulas PC-3, ya que
esta activacin se induce por la unin de IL-6 a su receptor, usando como control positivo clulas de
hepatoma HepG2. Como se observa en la figura 51, en las clulas HepG2 se detect tanto la forma
total como la forma fosforilada de STAT3. Como era de esperar, cuando se trataron estas clulas con
IL-6, la forma fosforilada aument notablemente. Sin embargo, en clulas PC-3 no se apreci seal de
Figura 53. Efecto de IL-6 sobre
viabilidad celular. Las clulas se
incubaron con diferentes dosis de IL-6
recombinante durante 24 h, y la viabilidad
ce
de
lular se valor por MTT tal y como se
scribe en Materiales y Mtodos. Los
datos son medias + E.S. de dos
experimentos por triplicado.con la t de
Student.

0
20
0 1 2.5 5 10 25 50 100
V
i
a
b
i
l
i
d
a
d

c
e
l
u
l
a
r
(

%
)
60
80
100
120
40
IL-6 recombinante (ng/ml)

Resultados

103

F
n
M mRNA de las clulas PC-3 y LNCaP, y se
llev a cabo una RT-PCR con oligonucletidos especficos de STAT3. La figura es representativa de tres ensayos.

mediante RT-PCR. A nivel transcripcional tampoco detectamos
expresin del mRNA de STAT3 en las clulas PC-3, aunque s se detect en la lnea LNCaP, como se
observa en la figura 54B.
ado que la IL-6 secretada por las clulas PC-3 no tena ningn efecto sobre el crecimiento
ulas PC-3,
ino sobre alguno de los componentes de Sistema Inmune. En este sentido, se ha descrito que IL-6
puede
adantes
celulares de las clulas PC-3 tratadas fueron transferidos a los linfocitos aislados de sangre perifrica
cultivndose durante 72 h. Tambin se cultivaron estos linfocitos con IL-6 recombinante y con un
la forma fosforilada de STAT3, as como tampoco de la forma inactiva, ni en estado basal ni en
presencia de IL-6 (figura 54A).
Estos resultados indicaban que STAT3 no se expresaba en las clulas PC-3, y esto podra
explicar la falta de efecto de IL-6 en estas clulas. Para corroborar la ausencia de expresin de STAT3,
se analiz la presencia de mRNA
igura 54. Expresin de STAT3 en clulas PC-3. A) Las clulas PC-3 y HepG2 se incubaron con IL-6 recombinante 100
g/ml durante 30 min y se valor la activacin y presencia de STAT3 mediante Western blot tal y como se describe en
ateriales y Mtodos. La figura es representativa de tres ensayos. B) Se aisl el

7.- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA Th17

D
celular, nos planteamos si esta citoquina podra estar ejerciendo su efecto no sobre las cl
s
regular, junto a otras citoquinas, la diferenciacin de linfocitos T nativos a linfocitos Th17 y en los
ltimos tiempos se ha descubierto que estos linfocitos pueden ejercer respuestas antitumorales. Por
todo ello, nos propusimos estudiar la respuesta Th17 en nuestro modelo. Para ello se extrajeron clulas
de sangre perifrica de individuos sanos y se aisl la lnea blanca. Paralelamente se trataron clulas
PC-3 con MET 10 M y JWH 10 M durante 48 h, preincubando o no con SR2. Los sobren
pSTAT3
STAT3
PC-3 HepG2
500 pb
100 pb
LNCap PC-3
A) B)
STAT3

Resultados

1
tratam
como control y la IL-6 exgena.
ciacin hacia Th17, induciendo la secrecin de IL-17, lo
que podra tener un efecto antitumoral in vivo.


iento combinado de Ionomicina 1 g/ml ms forbol miristato acetato (PMA) 50 ng/ml como
control de activacin linfocitaria (Maek et al., 2007). Transcurridas 72 h se valor la produccin de IL-
17. Como vemos en la figura 55 el tratamiento de las clulas PC-3 con JWH015 produjo un aumento
significativo de los niveles de IL-17 secretada, as como el tratamiento de PMA ms Ionomicina usado

04



Estos datos sugieren que la IL-6 secretada por las clulas PC-3 tratadas con cannabinoides
podra producir activacin de linfocitos y diferen
C JWH JWH+SR2 MET MET+SR2 SR2 Iono+PMA IL-6
p
g
/
m
l

I
L
-
1
7

(
%
)
0
200
1400
1600
*
**
Figura 55. Secrecin de IL-17. Se aislaron linfocitos de sangre perifrica que fueron incubados con IL-6 recombinante o
con los sobrenadantes provenientes de clulas PC-3 tratadas con MET 10 M o JWH015 10 M durante 48 h, en presencia
y ausencia de SR2. Se us el tratamiento combinado de Ionomicina 1 g/ml ms PMA 50 ng/ml como control. Transcurridas
72 h, los niveles de IL-6 fueron medidos por ensayo ELISA. Los resultados se expresan como porcentaje frente al control,
que se consider el 100 %. Los datos son medias + ES de dos experimentos realizados por triplicado. *p<0.05 y **p<0.01
respecto del control comparando con la t de Student.


Discusin

































DISCUSIN







Discusin

107


c
se
inv
el tratamiento con diferentes agentes farmacolgicos. En este sentido, los cannabinoides son capaces de
producir muerte celular en diversos tipos celulares as como regresin tumoral en modelos in vivo,
incluyendo clulas de cncer de prstata. Con estos antecedentes nos propusimos estudiar el efecto de
los cannabinoides en las clulas tumorales de prstata PC-3, que representan la fase ms avanzada del
cncer de prstata.

1.- EFECTO ANTIPROLIFERATIVO DE LOS
CANNABINOIDES

En trabajos anteriores de nuestro laboratorio se haba demostrado que tanto el receptor CB1 (Ruiz
et al., 1999), como el CB2 (Sanchez et al., 2003a) y el TRPV1 (Sanchez et al., 2005) se expresaban en la
lnea celular PC-3. Para estudiar el efecto de los cannabinoides sobre las clulas PC-3, se escogieron dos
cannabinoides sintticos, MET y JWH015. MET fue seleccionada por ser anlogo de uno de los
endocannabinoides ms importantes en el organismo, la AEA, adems de por su afinidad tanto a los
receptores de cannabinoides como al receptor de vanilloides TRPV1, lo que nos permita un estudio de
efe
ba
lab
ind 9), lo que nos indujo a analizar el papel del receptor CB2
como responsable de los efectos apoptticos de los cannabinoides en estas clulas.

Al
s
que JWH015, produciendo una disminucin mayor de la viabilidad. Sin embargo, el efecto sobre la
inhibicin de la proliferacin fue de la misma magnitud con ambos cannabinoides y mucho ms acusado
que el efecto sobre la viabilidad, llegndose a bloquear totalmente la proliferacin. Por tanto, los
En la actualidad no existe tratamiento para la fase avanzada del cncer de prstata, en la que las
lulas se vuelven insensibles a la terapia antiandrognica y parecen perder la capacidad de responder a
ales de inhibicin del crecimiento e induccin de muerte celular. Una de las posibles vas de
estigacin en el tratamiento del cncer es el estudio de mecanismos antitumorales inducidos mediante
l
cto de los cannabinoides sobre varios receptores al mismo tiempo. La seleccin de JWH015 fue en
se a su propiedad de unirse especficamente al receptor CB2, ya que datos previos de nuestro
oratorio demostraban que el efecto apopttico del THC sobre las clulas de cncer de prstata era
ependiente del receptor CB1 (Ruiz et al., 199
estudiar el efecto de los cannabinoides sobre la viabilidad observamos una fuerte reduccin de
ta ya a las 12 h de tratamiento, aunque el efecto mximo se produca a las 48 h. MET result ms eficaz

Discusin

108

cannabinoides tenan un efecto principalmente citosttico, aunque simultneamente tambin presentaban
cierto efecto citotxico.

En las clulas PC-3 otros autores (Mimeault et al., 2003b) haban descrito que AEA inhiba la
proliferacin celular inducida por EGF a travs del receptor CB1. Al prolongar este tratamiento en el tiempo
(5-6 das) se lleg a producir muerte celular, estando esta vez implicados los dos receptores de
cannabinoides. As pues, dado que MET es un anlogo ms estable de AEA, puede que el hecho de que
en este trabajo se observe muerte a partir de las 24 h se deba a una mayor disponibilidad de MET. Las
diferencias observadas con el grupo de Mimeault respecto a la participacin de CB1 pueden deberse a la
interaccin de CB1 con receptores tirosina quinasa, ya que este grupo analiza el efecto de AEA en
respuesta a EGF. Tambin se ha observado que los cannabinoides inhiben el crecimiento inducido por
factores de crecimiento, en la lnea DU 145, en la que la AEA y 2-AG inhiben la proliferacin inducida por
prolactina a travs del receptor CB1 (Melck et al., 2000). Adems, paralelamente a nuestros estudios
Sarfaraz y colaboradores han descrito que WIN-55,212-2, agonista sinttico de CB1 y CB2, induce
apoptosis en la lnea dependiente de andrgenos LNCaP, mediante parada de ciclo celular (Sarfaraz et al.,
2006). Otro efecto antitumoral de los cannabinoides observado en clulas de cncer de prstata, es la
inhibicin de la capacidad invasiva. Nithipatikom y colaboradores describieron este efecto al tratar las
clulas PC-3 y DU 145 con 2-AG (Nithipatikom et al., 2004). As pues, nuestros datos estn en
concordancia con los efectos antitumorales producidos por los cannabinoides en las clulas tumorales de
prstata observados por otros autores.

Al profundizar en el efecto antiproliferativo producido por MET y JWH015 mediante el estudio del
ciclo celular, se observ un aumento discreto pero significativo de la poblacin de clulas apoptticas a
partir de la dosis de 10 M (fase subG
0/1
) y un incremento en la poblacin celular tanto en fase S como en
fase G
2/
as se confirm por ensayo de unin a anexina, obtenindose
valores similares a los del estudio del ciclo celular. Sin embargo, al analizar la morfologa nuclear no se
identific la presencia de cuerpos apoptticos, aunque s se observ hipercromasia y aumento del tamao
nuclear. Esto apoya la idea del efecto citosttico de los cannabinoides, que podran inhibir la proliferacin
celular a travs de dos mecanismos: induccin de apoptosis y parada de ciclo celular en fase G
2/M
. La
r el aumento de tamao nuclear, pero no otros cambios relacionados con
aopotosis. Por otra parte, en algunos casos se ha descrito la ausencia de fragmentacin de la cromatina
durante el proceso apopttico (Zierler et al., 2006), lo que podra estar ocurriendo en nuestro caso.
M
. El aumento de clulas apopttic
tincin con DAPI permiti aprecia

Discusin

109

Adems, el hecho de que en los estudios de ciclo celular se aprecie cierto aumento en la poblacin S,
te bloqueada, puede deberse a que en ste
3
H-timidina en las ltimas 16 h, cuando
probablemente ya se haya producido la parada de ciclo celular.

El efecto de MET y JWH015 sobre la viabilidad celular tambin se observ en la lnea celular
andrgeno dependiente LNCaP y la andrgeno independiente DU 145, representativa de los distintos
estados del cncer de prstata. En todas estas lneas los cannabinoides indujeron una disminucin de la
viabilidad celular. Por tanto, el efecto de los cannabinoides no se limitaba slo a las clulas PC-3, si no que
se produca en todas las lneas tumorales de prstata estudiadas. Esto implicara que el tratamiento con
cannabinoides podra ser efectivo no slo en la fase ms avanzada del cncer, controlando su desarrollo,
sino tambin en sus inicios, frenando la patognesis.

En cuanto el estudio del papel de los distintos receptores, tan slo el antagonista de CB2, SR2, fue
capaz de bloquear parcialmente el efecto producido por MET sobre la viabilidad celular. Sin embargo, con
JWH015 se observ una clara inhibicin de la disminucin de la viabilidad, lo que reforzaba la implicacin
de CB2 en este efecto. En el estudio de la apoptosis tambin se observ una reversin significativa del
aumento de las clulas apoptticas inducido por los cannabinoides al pretratar las clulas con SR2. Todo
ello apuntaba a que la disminucin de la viabilidad producida por los cannabinoides se llevaba a cabo por
mediacin de CB2. Para confirmarlo, ya que el uso de antagonistas puede producir otros efectos no
especficos, se llev a cabo el silenciamiento del receptor CB2 en las clulas PC-3, volvindose a repetir la
inhibicin de la apoptosis obtenida con el antagonista CB2, lo que confirmaba claramente la implicacin de
CB2 en la induccin de apoptosis.

El efecto antiproliferativo y pro-apopttico de los cannabinoides en las clulas PC-3 alentaba a
estudiar su posible papel antitumoral en otros modelos ms prximos a la enfermedad. Con este fin, se
investig el efecto de JWH015 en un modelo in vivo. Se generaron para ello tumores subcutneos en
ratones atmicos mediante inyeccin de clulas PC-3 y posteriormente se trat a los ratones con tres
tratamientos: JWH015, JWH015 ms el antagonista de CB2, SR2, y suero salino como control. El
tratamiento con JWH015 logr reducir significativamente tanto el tamao tumoral como el peso del tumor,
mientras que en los ratones tratados con JWH015 ms SR2 y en los controles, el crecimiento tumoral
ocurri de forma descontrolada y de igual modo en ambos grupos. Estos datos confirmaban que JWH015
mientras que la incorporacin de
3
H-timidina se vea totalmen
ltimo ensayo se mide nicamente la incorporacin de

Discusin

110

resentaba, adems de un efecto antiproliferativo in vitro en las clulas PC-3, un efecto antitumoral en un
mode
estos modelos aislados muchas veces no se reproduzcan al pasar a un modelo in
vivo. En las pautas generales para la metodologa de investigacin y evaluacin de la medicina tradicional
de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) (http://apps.who.int/medicinedocs/en/d/Js4930s/
p
lo in vivo, mediado a travs del receptor CB2. Adems, no se observ ninguna reduccin del peso
corporal en los ratones, que podra estar relacionada con un efecto txico generalizado (Faure et al., 2010)
de los cannabinoides. Por tanto, JWH015, adems de tener un efecto antitumoral, pareca no tener efectos
txicos en este modelo, siendo as un tratamiento seguro.

El uso de los modelos in vivo es clave para trasladar los efectos obtenidos en ensayos in vitro a un
posible uso teraputico en el estudio de un agente farmacolgico de estructura qumica conocida. La
idiosincrasia de los estudios in vitro, mucho menos compleja que la de un organismo vivo, hace que los
efectos obtenidos en
) se recoge
mar los datos obtenidos en ensayos in vivo, que pueden tomarse
como marcadores de inocuidad y desvelan de forma ms confidente la eficacia teraputica. An as las
difere


que, aunque los ensayos in vitro sirven para desvelar los mecanismos de accin del frmaco y son
indicadores de toxicidad, se deben confir
ncias existentes entre especies, as como las limitaciones en el diseo de modelos capaces de
reproducir la enfermedad, hacen que los ensayos in vivo no tengan los mismos resultados en el siguiente
paso hacia la aprobacin del agente farmacolgico, el estudio clnico, pero representan un paso ms en la
concrecin del uso teraputico del frmaco sometido a estudio, adems de ser la aproximacin ms
cercana. Por todo ello, el hecho de que JWH015 fuera capaz de controlar el crecimiento tumoral no slo en
las clulas PC-3, sino tambin en este modelo in vivo, tiene una gran relevancia en el posible uso de los
cannabinoides como agentes antitumorales en el tratamiento del cncer de prstata.






Discusin

111


mida podra estar relacionado con el efecto antiproliferativo de los
cannabinoides. De hecho, en las clulas PC-3 se haba descrito anteriormente por otros autores as como
por nu
ejerce un papel clave en la resistencia a drogas y a radiacin (Pchejetski et al., 2008; Mahdy et al., 2009).
2.- MECANISMO DE ACCIN DE LOS CANNABINOIDES
SOBRE LAS CLULAS PC-3
El estudio del mecanismo de accin de los cannabinoides sobre las clulas PC-3 se centr en el
anlisis de la produccin de ceramida y activacin de diferentes cascadas intracelulares de sealizacin.

Tanto MET como JWH015 indujeron un aumento en la sntesis de ceramida, que se deba a la
sntesis de novo, ya que el inhibidor de la ceramida sintasa inhiba totalmente el incremento de ceramida
provocado por los cannabinoides. La degradacin de esfingomielina de la membrana plasmtica tambin
podra participar dbilmente en este aumento, puesto que cuando se usaba el inhibidor de
esfingomielinasa se obtena una pequea disminucin del incremento de ceramida inducido por los
cannabinoides, pero no lleg a ser significativo.

La funcin biolgica de la ceramida est relacionada con el origen de la misma, de manera que un
aumento discreto de sus niveles, como el que se da a travs de la hidrlisis de esfingomielina, suele
regular procesos metablicos. Cuando el incremento de ceramida se produce de forma sostenida, a travs
de la sntesis de novo o por regulacin de distintas enzimas implicadas en su metabolismo, sta suele
participar en procesos de muerte celular (Velasco et al., 2005). Por tanto, en nuestro sistema al producirse
por sntesis de novo, el aumento de cera
estro grupo de investigacin, que la administracin exgena de ceramida produca muerte celular
(Ruiz et al., 1999; Gewies et al., 2000). Esta relacin se confirm al usar el inhibidor de la sntesis de novo
para valorar tanto la disminucin de la viabilidad celular, como la induccin de apoptosis, demostrndose
as que el incremento en la sntesis de ceramida participaba en la disminucin del crecimiento celular y en
la apoptosis inducidas por los cannabinoides en las clulas PC-3.

La implicacin de ceramida en el efecto antitumoral de los cannabinoides se ha descrito tambin en
otras lneas tumorales, entre ellas glioma (Carracedo et al., 2006b), linfoma (Gustafsson et al., 2009) y
cncer de colon (Cianchi et al., 2008). Adems, en las clulas tumorales de prstata este esfingolpido
est implicado en la induccin de apoptosis por varios agentes antitumorales (Mimeault et al., 2007;
Sanchez et al., 2007). Por otra parte, la alteracin del metabolismo de ceramida en el cncer de prstata

Discusin

112

abinoides en el aumento de ceramida
encontramos que slo el antagonista de CB2 era capaz de bloquear significativamente el incremento en
los n
st implicado el receptor CB2, aunque quedara por
estudiar si otros receptores diferentes a CB1 y TRPV1, podran participar tambin en el incremento de
ceram
ems, en otras lneas de cncer de prstata se ha descrito que p38
posee un papel proliferativo, e incluso se encuentra sobre-expresada (Godoy-Tundidor et al., 2005). La
implic
Por tanto, los datos obtenidos en este trabajo estn de acuerdo tanto con el papel de ceramida como
regulador de apoptosis, como con el efecto de los cannabinoides en otras lneas celulares.

Al estudiar la participacin de los receptores de cann
iveles de ceramida producidos por los cannabinoides. Recientemente se ha descrito que los
cannabinoides pueden incrementar los niveles de ceramida en varios tipos celulares a travs de otros
receptores como CB1 o el receptor activado por proliferadores de peroxisomas tipo gamma (PPAR)
(Eichele et al., 2009; Gustafsson et al., 2009). Sin embargo, cada vez son ms las evidencias que
demuestran una mayor eficiencia de CB2 en la regulacin de la sntesis de ceramida inducida por los
cannabinoides (Carracedo et al., 2006a; Blazquez et al., 2008a; Blazquez et al., 2008b; Cianchi et al.,
2008). En nuestro modelo experimental nicamente e
ida.

Posteriormente estudiamos dos de las vas MAPKs, p38 y JNK, que responden a estmulos que
generan estrs celular inhibiendo generalmente seales promotoras del crecimiento celular, como las
activadas por ERK (Junttila et al., 2008). El tratamiento con JWH015 produjo una disminucin tanto en la
fosforilacin como en los niveles totales de p38 y al mismo tiempo una activacin de JNK a tiempos cortos.
Este efecto contrario en la activacin de ambas MAPKs resulta un tanto sorprendente, puesto que pueden
ser activadas por las mismas MAP3K (Kim et al., 2010) y suelen tener efectos sinrgicos. An as, tambin
hay datos de antagonismo entre ambas MAPKs (Perdiguero et al., 2007), pudiendo incluso inhibirse entre
s (Heinrichsdorff et al., 2008). Ad
acin de JNK en la induccin de apoptosis se ha demostrado en lneas celulares derivadas de
distintos tipos de cncer, como pulmn, colon, mama, ovario, rin e hgado (Zou et al., 2008; Wei et al.,
2010). Por otra parte, en la lnea de prstata DU 145 se haba descrito que la activacin de JNK produca
muerte celular a travs del bloqueo del ciclo celular en la fase G
2/M,
sin mediacin de otras MAPKs como
p38 y ERK (Cho et al., 2005). As pues nuestros datos, aunque implican una regulacin no convencional
de las MAPKs JNK/p38, concuerdan con el papel antiproliferativo de los cannabinoides en las clulas PC-
3, donde adems de inducirse la apoptosis, tambin se observaba un bloqueo del ciclo celular en G
2/M
.


Discusin

113

cin celular activando entre otros sustratos a
mTOR, serina/treonina quinasa que regula la expresin de genes implicados en crecimiento, y a protenas
pro-ap
nnabinoides pueden
roducir muerte celular por autofagia a travs de la respuesta de estrs de retculo (Salazar et al., 2009).
or ello, nos planteamos si esto tambin ocurra en las clulas PC-3. Para descubrirlo analizamos la
sforilacin de una de las protenas implicadas en esta respuesta, el factor de iniciacin de la
anscripcin eIF2. Cuando se activa la respuesta a estrs de retculo, este factor se fosforila e inactiva
or una de las protenas del retculo endoplasmtico que funcionan como sensores de estrs, la quinasa
ERK, bloquendose la transcripcin CAP-dependiente (Healy et al., 2009). Cuando tratamos a las clulas
C-3 con JWH015, se observ un aumento en la fosforilacin de eIF2, sugiriendo este dato que la
respuesta a estrs de retculo podra estar participando en el efecto sobre la muerte celular llevado a cabo
por los cannabinoides.

Siguiendo con el estudio de los mecanismos de sealizacin, pasamos a analizar otras vas
relacionadas con el estrs y el crecimiento celular. La va PI3K/Akt es una de las ms importantes en la
regulacin del crecimiento celular. Adems esta cascada est constitutivamente activada en las clulas
PC-3 (Nakatani et al., 1999), al perder el gen supresor de tumores PTEN, fosfatasa que desfosforila a PIP
3

(Davies et al., 1999). Esta va puede promover la prolifera
optticas como Bad (Lee et al., 2008). Por otra parte, la va de PI3K/Akt puede cooperar con
distintas MAPKs en la induccin de la proliferacin. En nuestro grupo de investigacin se ha descrito
recientemente que Akt puede disminuir los niveles de ceramida en las clulas LNCaP, induciendo as
crecimiento de estas clulas (Malagarie-Cazenave et al., 2009). Por todo ello, analizamos la fosforilacin
de Akt, indicativa de su activacin. Vimos que JWH015 produca una estimulacin a tiempos cortos y una
inhibicin a tiempos ms largos, bloquendola totalmente a las 48 h de tratamiento.

Estos datos estn en concordancia con los obtenidos por otros autores en la lnea celular de
prstata 22RV1, extrada de un tumor xengrafo de clulas CWR22, que mostraban un sinergismo entre
Akt y p38 (Godoy-Tundidor et al., 2005). Esto podra indicar que en las clulas de prstata p38 tendra un
papel de supervivencia, actuando de forma sinrgica con Akt, lo cual explicara nuestros resultados sobre
la inhibicin de p38 y Akt inducida por JWH015 a largo plazo. El papel de p38 en la supervivencia de
clulas de prstata se ha descrito tambin en respuesta a otros inductores como TNFR (Royuela et al.,
2008) o a PDK (Chen et al., 2008a).

Recientemente se ha descrito en clulas tumorales de glioma que los ca
p
P
fo
tr
p
P
P

Discusin

114

las distintas vas de apoptosis en presencia de
acin de caspasa 9 sin producir cambios en la
aspasa 8. La activacin de la ruta intrnseca produce alteraciones en la mitocondria que se pueden
detec
e
midieron los niveles citoslicos de citocromo c, que adems participa en la formacin del apoptosoma. Se
obser
as de respuesta a estrs que se han estudiado en este
trabajo con la va intrnseca de la apoptosis, observando esta conexin tambin en varias lneas tumorales
de pr
or lo tanto, relacionando todo este acervo de datos, se podra concluir que los cannabinoides
induci
Por ltimo, puesto que se haba demostrado en este trabajo que los cannabinoides producan
apoptosis, se pas a estudiar la posible activacin de
JWH015. El tratamiento con JWH015 indujo una activ
c
tar por un aumento citoslico de protenas mitocondriales liberadas al daarse la membrana
mitocondrial, como el citocromo c (Russo et al., 2010). Para confirmar la activacin de la va intrnseca, s
v un incremento en los niveles de esta protena en el citosol, confirmndose por tanto que la ruta
que conduca a la apoptosis inducida por JWH015 era la va intrnseca.

Sera necesario un estudio ms amplio para demostrar la conexin de todas estas complejas vas de
sealizacin en el efecto producido por los cannabinoides. Sin embargo, en la literatura existen multitud de
datos sobre la interconexin de diversas proten
stata al usar distintos agentes con propiedades antitumorales. As, se ha descrito que el tocoferol
provoca apoptosis a travs de la va intrnseca por medio de la activacin de JNK en clulas PC-3 (Zu et
al., 2005), el cido urlico por activacin de JNK e inhibicin de Akt en las mismas clulas (Zhang et al.) y
el -tocoferol por aumento de la sntesis de novo de ceramida en la lnea LNCaP (Jiang et al., 2004). De
igual modo se ha demostrado que la administracin de ceramida exgena induce muerte celular en PC-3 y
DU 145 (Ruiz et al., 1999; Gewies et al., 2000) y que anlogos de ceramida promueven apoptosis a travs
de la inhibicin de Akt en PC-3 (Oh et al., 2006). Por otro lado, los cannabinoides pueden tambin inducir
apoptosis en distintos modelos celulares como en clulas de hepatoma mediante la activacin de JNK,
(Giuliano et al., 2009), en clulas de leucemia por inhibicin de p38 (McKallip et al., 2006), en glioma y en
clulas tumorales de pncreas mediante estrs de retculo (Herrera et al., 2006; Salazar et al., 2009) y en
clulas de glioma por aumento de ceramida (Blazquez et al., 2008b).

P
ran una respuesta a estrs de retculo y un aumento en la sntesis de novo de ceramida en las
clulas PC-3, al activar JNK e inhibir tanto p38 como Akt, lo que conducira en ltimo trmino a la
induccin de apoptosis a travs de la va intrnseca (figura 53).



Discusin

115

, puesto que ya se ha comentado el papel que esta citoquina cumple en la regulacin de
mltiples procesos en el cncer de prstata. As pues, al estar regulada de distinto modo por los
canna
por
cannabinoides, aunque no se puede descartar una posible colaboracin de otros mecanismos
independientes de receptor en este efecto, ya que la incubacin con el antagonista del receptor CB2 no
3.- SECRECIN DE IL-6 INDUCIDA POR LOS
DES CANNABINOI

Adems del indudable papel de IL-6 como una de las principales citoquinas moduladoras del
sistema inmune, esta citoquina es capaz de regular diversas funciones biolgicas en el cncer de prstata,
entre ellas la expresin del AR (Culig et al., 2002; Neuwirt et al., 2007), la neurodiferenciacin (Wang et al.,
2004a; Wang et al., 2004b) y la resistencia a drogas (Pu et al., 2004). A la vista de este preeminente papel,
nos propusimos estudiar su secrecin en las clulas PC-3 y RWPE-1 en respuesta a los cannabinoides.
MET y JWH015 producan un sorpresivo incremento en los niveles de secrecin de IL-6 en las clulas PC-
3, mayor en el caso de MET, siendo esta secrecin dependiente de la dosis. Sin embargo en las clulas
RWPE-1, aunque stas secretaban IL-6 de forma basal al igual que las PC-3, la incubacin con los
cannabinoides no produjo ninguna variacin. Esta respuesta diferente en ambas clulas es muy
interesante
binoides en clulas tumorales PC-3 y en clulas no tumorales RWPE-1, esta citoquina podra estar
cumpliendo un papel fisiolgico diferente, de tal manera que en clulas neoplsicas el aumento de IL-6
podra suponer un intento de evasin de la induccin de muerte celular producida por los cannabinoides,
que no se dara en las clulas normales al ser stas menos agresivas y por tanto carecer de mecanismos
antiapoptticos de rescate. Al estudiar la secrecin de IL-6 a lo largo del tiempo, observamos que MET era
capaz de incrementar la secrecin ya a las 6 h, pero en el caso de JWH015 no se produca hasta las 48 h.
Estas diferencias temporales se suman al efecto superior de MET sobre la secrecin. Estos datos hacen
pensar en una regulacin diferencial de la secrecin de IL-6 por parte de los dos cannabinoides,
probablemente debida a un distinto mecanismo de accin. Para analizar esto, pasamos a estudiar el papel
de los diferentes receptores en este efecto. Al emplear los antagonistas de los receptores de
cannabinoides y del receptor TRPV1 en presencia de MET, slo se obtuvo una leve aunque significativa
reversin del incremento en la secrecin de IL-6 inducido por MET con el antagonista de CB2. En el caso
de JWH015, el uso del antagonista de CB2 bloque totalmente el aumento en la secrecin producido por
JWH015. Para confirmar el papel de CB2, se silenci su expresin y se valoraron los niveles de IL-6 en
presencia de JWH015, inhibindose de esta forma totalmente la secrecin inducida por JWH015. Por
tanto, podemos afirmar que el receptor CB2 est regulando la secrecin de IL-6 inducida

Discusin

116

bloqu

ulacin del crecimiento celular, presentando efectos contrapuestos a
sta (Gomez-Munoz, 2006). Adems C1P puede modular tambin respuestas del sistema inmune, como la
fagoc
eaba totalmente la secrecin inducida por MET. Esto concuerda con los datos obtenidos sobre la
proliferacin celular. Aunque el efecto de MET era de mayor magnitud, slo fue parcialmente revertido por
SR2 o por el silenciamiento de CB2. Esto indica que MET est actuando a travs de varios mecanismos,
unos dependientes de CB2 y otros independientes, probablemente a travs de interacciones inespecficas
en la membrana plasmtica o a travs de otros receptores an por identificar o no estudiados en este
trabajo. Sin embargo, el efecto del JWH105 era de menor magnitud, tanto en la inhibicin del crecimiento
como en la induccin de secrecin de IL-6, pero con este cannabinoide ambos efectos fueron totalmente
revertidos tanto por el antagonista como por el silenciamiento de CB2. Esto indica que JWH015 acta
nicamente a travs de CB2, lo que le convierte en un mejor candidato para su aplicacin teraputica, ya
que al ser su efecto ms especfico probablemente genere menos efectos secundarios no deseados.
Efectivamente esto se comprueba en los estudios in vivo, en los que JWH015 fren el crecimiento del
tumor sin efectos secundarios aparentes y de forma totalmente dependiente de CB2.

Posteriormente nos planteamos si exista alguna relacin entre el incremento de los niveles de
ceramida y la secrecin de IL-6 en las clulas PC-3, ya que los cannabinoides inducan ambas respuestas.
Para ello usamos el inhibidor de la sntesis de novo de ceramida, encontrando que esta inhibicin no
modificaba el efecto en la secrecin de IL-6 producida por los cannabinoides. Por tanto la ceramida no
pareca estar implicada la regulacin de la secrecin de IL-6. Sin embargo, ceramida es el precursor de la
sntesis de muchos esfingolpidos complejos, entre ellos C1P (Saddoughi et al., 2008). C1P comparte
protagonismo con ceramida en la reg
itosis (Hinkovska-Galcheva et al., 2005; Kihara et al., 2007) y respuestas inflamatorias (Arana et al.,
2010). De hecho, C1P es el mayor regulador de la sntesis de eicosanoides, mediadores clave de
respuesta inflamatorias (Lamour et al., 2007). Estudiamos por todo ello su implicacin en la secrecin de
IL-6. Con este fin silenciamos la enzima encargada de fosforilar la ceramida, CERK y medimos los niveles
de IL-6 en presencia de MET. Al silenciar esta enzima se bloque totalmente el aumento en la secrecin
de IL-6. Estos datos sugieren que los cannabinoides incrementaran la produccin de IL-6 a travs de
CERK y de forma independiente de la sntesis de novo. Pudiera ser que la ceramida que participa en la
regulacin de la sntesis de IL-6 procediera de la hidrlisis de SM de la membrana plasmtica, pero seran
necesarios ms estudios para comprobar esta hiptesis.


Discusin

117

se observaron cambios en la
subunidad p52, implicada en la va no cannica. Al estudiar la va clsica, vimos que la incubacin con
JWH0
cin de NFB llevada a cabo por el
tratamiento con los cannabinoides, lo que era indicativo de que la va de PI3K/Akt poda estar implicada en
la act
icativa de la participacin de CB2 en este
proceso. Al valorar la activacin de Akt en presencia del inhibidor de PI3K, pudimos observar una
inhibicin de la fosforilacin de Akt inducida por JWH015, por lo que podemos confirmar que la activacin
Posteriormente quisimos valorar los mecanismos de sealizacin celular que podran regular la
secrecin de IL-6. El factor de transcripcin NFB regula comnmente la expresin de genes implicados
en diversas respuestas del sistema inmune, entre los que se encuentran muchas citoquinas. De hecho, en
el promotor de la IL-6 existe al menos un sitio de unin para este factor transcripcional (Shimizu et al.,
1990; Gruss et al., 1992; Matsusaka et al., 1993). Se haba descrito que en las clulas PC-3 la deplecin
de Zinc poda inducir secrecin de IL-6 a travs de la activacin del NFB (Golovine et al., 2008). As
pues, decidimos investigar si este factor de transcripcin estaba implicado en la secrecin de IL-6 inducida
por los cannabinoides. Para ello analizamos la activacin de distintos componentes de la va clsica de
activacin de NFB, centrndonos en la subunidad p65, ya que no
15 activaba distintos componentes de la misma, entre ellos IKK, quinasa del inhibidor de NFB
IB, que se fosforilaba a tiempos muy tempranos de incubacin (10-30 min). Tambin observamos
fosforilacin del propio inhibidor IB, as como disminucin de sus niveles totales, indicativos ambos
efectos de su activacin y degradacin, respectivamente. Esta degradacin es necesaria para la liberacin
y activacin del NFB, permitiendo su translocacin del citosol al ncleo, donde ejerce su funcin. Por ello,
analizamos la translocacin del NFB, viendo que exista un aumento de los niveles nucleares, a la par de
una disminucin en los niveles citoslicos. As pues, NFB se activaba al incubar las clulas PC-3 con
cannabinoides a travs de la va clsica o cannica. El pretratamiento con SR2 inhiba la activacin de
NFB, lo que indicaba la participacin del receptor CB2. Al mismo tiempo quisimos valorar si la va de
PI3K/Akt estaba implicada en la regulacin del NFB por los cannabinoides. Tanto la va de NFB
(Lindholm et al., 2000) como la de PI3K/Akt (Nakatani et al., 1999) estn constitutivamente activadas en
las clulas PC-3 y datos previos de nuestro laboratorio indicaban que los cannabinoides activaban la ruta
de PI3K/Akt (Sanchez et al., 2003a). Por todo ello, estudiamos la activacin de NFB en presencia del
inhibidor de PI3K, LY294002. Este inhibidor consigui revertir la activa
ivacin de NFB. Para confirmar la activacin Akt por los cannabinoides, valoramos su fosforilacin
en presencia de MET y JWH015, observando un aumento de la fosforilacin a tiempos cortos. Para ver la
posible implicacin del receptor CB2 en esta activacin, usamos el antagonista SR2 en presencia de
JWH015, obteniendo una inhibicin de la activacin de Akt ind

Discusin

118

escriben que Akt participa en la activacin constitutiva de NFB
cual se lleva a cabo incluye activacin de la subunidad p65, al igual
que ocurre en nuestro modelo experimental.
de Akt se estaba llevando a cabo por PI3K. Estos resultados concuerdan con datos publicados
recientemente por otros autores que d
(Dan et al., 2008). El mecanismo por el

Una vez definida la va de activacin de NFB y la implicacin de PI3K/Akt en la misma, pasamos a
estudiar la posible contribucin de ambas en la secrecin de IL-6. Para ello se us por un lado el inhibidor
de PI3K y por otro el de IKK en presencia de MET y JWH015 y se midieron as los niveles de IL-6. Los
dos inhibidores consiguieron revertir la induccin de la secrecin provocada por los cannabinoides. Con el
fin de confirmar la importancia de NFB en la secrecin de IL-6, tambin se llev a cabo el silenciamiento
de IKK y se analiz la secrecin de IL-6, obteniendo una inhibicin de la misma. Por ltimo se estudi
directamente la unin de la subunidad p65 al promotor de la IL-6 mediante ensayo de inmunoprecipitacin
de la cromatina, observando un aumento en la unin de este factor transcripcional al promotor de IL-6 al
tratar las clulas con JWH015. Este dato demostraba que los cannabinoides inducan la secrecin de IL-6
al aumentar la expresin de esta citoquina por mediacin de la subunidad p65 de NFB. Por tanto, los
cannabinoides aumentaran la secrecin de IL-6 a travs de CB2, activando PI3K, que a su vez activara
Akt, lo que inducira activacin de NFB y su desplazamiento al ncleo para regular la transcripcin de IL-
6 (figura 56).

4.- PAPEL DE IL-6 SOBRE EL CRECIMIENTO Y MUERTE
CELULAR

Visto el papel antiproliferativo y pro-apopttico de los cannabinoides y a su vez su implicacin en la
secrecin de IL-6 en las clulas PC-3, quedaba por resolver si los dos efectos estaban relacionados o si
eran activados de forma independiente. El efecto de IL-6 sobre el crecimiento y muerte celular en las
clulas tumorales de prstata no ha sido hasta ahora esclarecido, existiendo gran controversia en los
trabajos publicados. Algunos autores apuntan que IL-6 puede tener efecto anti-apopttico en las clulas
PC-3 (Pu et al., 2004) y en otras lneas de cncer de prstata (Steiner et al., 2003; Cavarretta et al., 2008).
Sin embargo, existen otros datos que indican que IL-6 no posee ningn efecto en el crecimiento de las
clulas de cncer de prstata (Xing et al., 2001; Pierce et al., 2009), o incluso inhibe la proliferacin de
clulas LNCaP (Wang et al., 2004a). Tambin se ha demostrado la implicacin de IL-6 en la reduccin de

Discusin

119

oral podra sugerir o
bien que la secrecin de IL-6 tena algn efecto sobre la muerte celular o bien que se produca en
respu
lular empleada como control positivo. Tambin se
analiz la expresin del mRNA de STAT3, encontrando que a nivel transcripcional tampoco haba
expresin de STAT3. Estos resultados indican que STAT3 no se expresaba en las clulas PC-3, como
tumores xengrafos (Wang et al., 2004b). Esto nos llev a cuestionarnos el efecto de la IL-6 secretada por
las clulas PC-3. La incubacin de las clulas LNCaP y HepG2 con los sobrenadantes de las clulas PC-3
tratadas con cannabinoides produca activacin de STAT3. Con el fin de comprobar si esta activacin era
debida a la IL-6 secretada por las clulas PC-3, se repiti el experimento tratando a los sobrenadantes con
un anticuerpo anti-IL-6. De este modo pudimos ver que al incubar los sobrenadantes con el anticuerpo
anti-IL-6, los niveles de activacin de STAT3 disminuan. Por lo tanto, podramos decir que la IL-6
secretada por las clulas PC- 3 era capaz de activar STAT3, y esto indicaba que esta IL-6 era
funcionalmente activa.

En este punto hemos de recordar que al estudiar la secrecin de IL-6 a lo largo del tiempo en
respuesta a los cannabinoides, observbamos que esta secrecin coincida temporalmente con los efectos
antiproliferativos de los cannabinoides en las clulas PC-3. Esta concurrencia temp
esta a la misma. Sin embargo, al incubar las clulas PC-3 con la IL-6 recombinante no se obtuvo
ningn cambio en la viabilidad celular, lo que indicaba por tanto que IL-6 no tena ningn efecto sobre la
muerte celular en la lnea PC-3. As pues, pudiera ser que la IL-6 secretada por las clulas PC-3 en
presencia de los cannabinoides se produjera como respuesta a la muerte celular provocada por stos. Si
esto fuera as, la IL-6 podra estar regulando alguna otra funcin biolgica mediante un bucle autocrino en
las clulas PC-3. Para comprobar esta hiptesis, nos centramos en el estudio de la activacin de STAT3
en las clulas PC-3, puesto que este factor de transcripcin es uno de los principales efectores de la IL-6 y
adems existan datos sorprendentemente contradictorios sobre su expresin y actividad en las clulas
PC-3; algunos autores relacionaban una activacin constitutiva del mismo como responsable de la
resistencia a drogas y los efectos antiapoptticos en esta lnea celular (Ni et al., 2000; Mora et al., 2002) y
otros sin embargo demostraban la ausencia de expresin de STAT3 en estas clulas (Spiotto et al., 2000;
Clark et al., 2003; Nadiminty et al., 2006). Esta controversia puede estar debida a la conocida inestabilidad
gentica que caracteriza a las clulas tumorales, que tambin se da en las clulas de cncer de prstata,
siendo mayor cuanto ms agresivas son stas (Duesberg et al., 1998; Beheshti et al., 2000). Al valorar la
activacin de STAT3 por los cannabinoides no se detect ni la forma fosforilada de esta protena ni la
forma total en las clulas PC-3, lo que sugera que estas clulas no expresaban STAT3, ya que en el
mismo ensayo se comprob la activacin en otra lnea ce

Discusin

120

algun
debido probablemente a la falta de expresin de STAT3.
os autores haban descrito previamente. Este dato podra explicar la falta de efecto de IL-6 sobre el
crecimiento y muerte celular en la lnea PC-3, ya que STAT3 modula la transcripcin de diversos genes
que promueven supervivencia y proliferacin celular (Bowman et al., 2001; Garcia et al., 2001).

En lo relativo al efecto de la IL-6 en la muerte y el crecimiento celular existen hoy en da demasiadas
incgnitas. As, aunque esta citoquina se ha visto correlacionada con la progresin del cncer de prstata
(Bouraoui et al., 2008), hasta ahora su papel en la patognesis de ste cncer no ha sido definido. Es
ms, a pesar de que algunos estudios in vitro e in vivo parecan apoyar el papel de IL-6 en la patognesis
del cncer de prstata, otros muchos estudios in vitro y preclnicos han revelado resultados contradictorias
con el uso de anticuerpos anti-IL6 o con la propia IL-6 (Santer et al., 2010). Estudios epidemiolgicos
recientes desmienten tambin la influencia de esta citoquina como factor de riesgo del cncer de prstata
(Pierce et al., 2009). Adems, existen otros estudios que demuestran que IL-6 participa en el efecto
antiproliferativo de otras citoquinas al regular la interaccin entre fibroblastos y LNCaP in vitro (Kawada et
al., 1999). As pues, la IL-6 secretada por las clulas PC-3 podra quiz ejercer su accin de forma
paracrina, regulando interacciones clula-clula, sin tener ningn efecto autocrino sobre las propias PC-3,
















Discusin

121

ccin de los linfocitos T citotxicos contra el tumor (Martin-
Orozc et al., 2009) y son capaces de inducir regresin tumoral in vivo e in vitro (Kryczek et al., 2009b). La
IL-6 e
sentido sobre estudios in vivo de tumorognesis que indican que tan slo los tumores con
una alta expresin de receptores de cannabinoides son susceptibles de ser tratados con cannabinoides,
lanzando la hiptesis de que cuando el tumor es capaz de responder a los cannabinoides, tanto el tumor
o et al., 2008; Pisanti et al., 2009a). As, la capacidad intrnseca del tumor de
responder a los cannabinoides resultara crtica para resolver el balance entre tolerancia al tumor y
respu
5.- ACTIVACIN DE LA RESPUESTA TH17

Recientemente se ha descubierto un tipo de linfocitos T que median en la respuesta antitumoral.
Son los linfocitos Th17, que promueven la a
o
s una de las citoquinas implicadas en la diferenciacin de los linfocitos Th17 (O'Garra et al., 2008;
Awasthi et al., 2009). En prstata se ha demostrado que IL-6 media en la autoinmunidad de los linfocitos
Th17 contra la prstata (Kottke et al., 2007). Nuestros datos mostraban que el tratamiento con JWH015
produca un aumento discreto pero significativo de los niveles de IL-17 secretados por linfocitos humanos,
as como el tratamiento con PMA ms Ionomicina y con IL-6 exgena, usados como controles positivos. El
antagonista de CB2 consegua revertir parcialmente el efecto de JWH015, pero no de forma significativa.
Estos datos apuntan a que la IL-6 secretada por las clulas PC-3 podra inducir la diferenciacin de los
linfocitos Th17, generando tal vez una posible respuesta antitumoral.

Aunque estos datos son preliminares y se debera estudiar ms a fondo el papel de los Th17 en las
respuestas antitumorales generadas por los cannabinoides, son muy prometedores y podran implicar una
ventaja adicional a una posible aproximacin teraputica basada en el uso de los cannabinoides. Existen
datos en este
como las clulas inmunes son dianas de los cannabinoides, producindose una regresin tumoral.
(Flygare et al., 2005; Bifulc
esta antitumoral y, en consecuencia, entre progresin y regresin del cncer. De este modo, podra
darse un sinergismo entre el efecto de los cannabinoides sobre el tumor, y el efecto de los cannabinoides
sobre el sistema inmune, resultando por tanto el uso de los cannabinoides como antitumorales una terapia
de efecto combinado, dirigida contra el propio tumor, pero potenciando al mismo tiempo el efecto
antitumoral del sistema inmune.





Discusin

122

de atravesar la barrera hematoenceflica, al mismo tiempo que se persigue
favorecer la selectividad hacia CB2 a fin de evitar los efectos secundarios adversos mediados por CB1
(Worm
pero no de CB1 (Sanchez et al., 2001), y tambin un aumento en la expresin de CB2 en glioblastoma
6.- PAPEL DEL RECEPTOR CB2

Adems de ser eficaz, un frmaco ha de ser seguro, disminuyendo al mximo los efectos adversos
derivados de su uso teraputico. Uno de los principales problemas que limitan el uso de cannabinoides
son los efectos psicotrpicos que stos presentan. Estos efectos estn mediados a travs del receptor
CB1, distribuido ampliamente por el sistema nervioso central (Anand et al., 2009; Worm et al., 2009; Patel
et al., 2010). En este sentido, se intenta limitar la accesibilidad al sistema nervioso central desarrollando
compuesto incapaces
et al., 2009). De hecho, las compaas farmacuticas estn dirigiendo sus esfuerzos hacia el
desarrollo de nuevos agonistas selectivos de CB2. As pues, el hecho de que el efecto antitumoral de los
cannabinoides estudiado en esta Tesis doctoral se ejerza a travs del receptor CB2, presenta una gran
ventaja, reduciendo los posibles efectos secundarios. Adems en el estudio in vivo no se apreciaron
alteraciones asociadas a un efecto txico relacionado con el uso de los cannabinoides, manteniendo los
ratones su peso corporal a lo largo de los tratamientos sin presentar daos conspicuos en la fisionoma
interna o externa de los animales. Por lo tanto, el uso de agonistas de CB2 como antitumorales en el
cncer de prstata parece un tratamiento seguro y eficaz.

Por otro lado existen varios datos que apuntan a la existencia de alteraciones del sistema
endocannabinoide en el cncer de prstata. Sarfaraz y colaboradores observaron una mayor expresin de
los dos receptores de cannabinoides en las clulas tumorales de prstata, comparando con clulas
epiteliales no tumorales (Sarfaraz et al., 2005), y Endsley y colaboradores una sobre-expresin en los
niveles de FAAH comparndola con tejido normal (Endsley et al., 2008). Esta expresin diferencial podra
suponer una ventaja para el tratamiento del cncer de prstata con cannabinoides, ya que respondera de
forma ms eficaz a los cannabinoides por poseer mayor nmero de receptores. As, un aumento en la
expresin de los receptores podra incrementar la sealizacin a travs de vas de transduccin
relacionadas con apoptosis o inhibir las de crecimiento celular, influyendo de esta forma en la regresin
tumoral. Todo ello hace pensar que los cannabinoides podran ser empleados para controlar el crecimiento
tumoral en ste tipo de cncer.

El papel del receptor CB2 en el efecto antitumoral de los cannabinoides est cobrando una gran
relevancia en los ltimos aos. As, se ha descrito inhibicin in vivo de gliomas con la participacin de CB2

Discusin

123

ucindose
una marcada supresin de CB1.

or otra parte tambin se ha demostrado en este trabajo que los cannabinoides son capaces de
incrementar la secrecin de IL-6 por las clulas PC-3 y la liberacin de IL-17 por clulas mononucleares,
todo ello con la participacin de CB2. Adems, este receptor se expresa altamente en las clulas del
sistema inmune, habindose demostrado que regula su migracin e influye as en el reclutamiento de
estas clulas (Miller et al., 2008), lo que hace que haya sido considerado un elemento de unin clave en la
respuesta inmune al tumor (Cabral et al., 2009; Tanasescu et al., 2010). As, los efectos de los
cannabinoides podran tener una especial relevancia sobre la respuesta del sistema inmune al tumor, ya
que la secrecin de citoquinas es el principal elemento regulador de las respuestas celulares del sistema
inmune y la quimioatraccin de las clulas del sistema inmune hacia el tumor es una de las principales
estrategias perseguidas en inmunoterapia. La implicacin del receptor CB2 en todos estos efectos subraya
la utilidad de los agonistas de este receptor. Este posible papel del receptor CB2 sobre el sistema inmune,
unido a los efectos anti-proliferativos y pro-apoptticos de MET y JWH015 sobre las clulas PC-3 y a la
accin antitumoral de JWH015 en tumores xengrafos descritos en esta Tesis, proporciona las bases para
el estudio clnico de agonistas de CB2 en el tratamiento del cncer de prstata, ya que estos compuestos
podran actuar mediante un mecanismo dual sobre el tumor y sobre el sistema inmune con un efecto
multiforme y astrocitoma (De Jesus et al., 2010). En carcinoma endometrial tambin se produce aumento
de la expresin de CB2 y del endocannabinoide 2-AG (Guida et al., 2010). En cncer de mama se ha
descrito una expresin diferencial de los receptores de cannabinoides, aumentando CB2 y prod

En muchos casos el efecto antitumoral de los cannabinoides est mediado a travs del receptor
CB2. Por ejemplo, los cannabinoides pueden inducir apoptosis a travs de CB2 en sebocitos por
activacin de JNK y en clulas de leucemia a travs de un aumento en los niveles de ceramida (Herrera et
al., 2006). Tambin la capacidad invasiva de las clulas tumorales se ha visto inhibida a travs de CB2. En
glioma y en adenocarcinoma cervicouterino MET y THC inducen la expresin de metaloproteasas y
amento de su inhibidor TIMP a travs de CB2, afectando as a la capacidad invasiva de las clulas
malignas (Blazquez et al., 2008a; Ramer et al., 2010). Todos estos datos estn de acuerdo con el papel
antitumoral de los cannabinoides estudiado en esta Tesis, demostrando que los cannabinoides ejercen un
efecto antitumoral tanto in vitro como in vivo en clulas tumorales de prstata PC-3, por mediacin del
receptor CB2, incrementando los niveles de ceramida y activando varias cascadas de sealizacin
intracelular.
P

Discusin

124

rse en un potente sinergismo
ltamente eficaz en la lucha contra el cncer de prstata.








comn antitumoral. La combinacin de ambas respuestas podra concreta
a


Los datos presentados en esta Tesis doctoral apuntan a nuevas evidencias sobre el papel del
receptor CB2 en la accin antitumoral de los cannabinoides y proporcionan una base razonable para la
aplicacin teraputica de agonistas de CB2 en el tratamiento del cncer de prstata.

























Discusin




Figura 56. Posible mecanismo de accin de los cannabinoides en las clulas PC-3
125







Conclusiones





























CONCLUSIONES










Conclusiones

129




1 - MET y JWH015 inhiben el crecimiento de las clulas PC-3 e inducen muerte celular.
Estos efectos estn mediados a travs del receptor CB2, ya que la inhibicin farmacolgica de ste
receptor, as como su silenciamiento gnico, lo revierten. La muerte celular se produce por un
mecanismo de apoptosis que se activa a travs de la va intrnseca, ya que aumenta la liberacin de
citocromo c al citosol y la protelisis de la caspasa 9.

2 - MET y JWH015 provocan un aumento de la sntesis de novo de ceramida a travs del
receptor CB2. Este incremento est involucrado en la disminucin de la viabilidad celular provocada por
MET y JWH015, ya que al bloquear la sntesis de ceramida se inhibe este efecto.

3 - En las clulas de prstata PC-3, JWH015 activa Akt y JNK e inhibe p38 y eIF2.

4 - JWH015 frena el crecimiento de tumores xengrafos en ratones atmicos nu/nu y
produce una disminucin en el peso tumoral al final del tratamiento. En este efecto est implicado el
receptor de cannabinoides CB2, ya que el tratamiento con JWH015+SR2 resulta en un crecimiento
descontrolado del tumor, similar al grupo control, lo que implica que le receptor CB2 es el responsable
de la regresin tumoral inducida por JWH015.

5 - MET y JWH015 inducen un aumento en la sntesis y secrecin de IL-6 por las clulas
PC-3, sin ejercer ningn efecto sobre la secrecin de IL-6 por las clulas no tumorales RWPE-1. El
aumento en la secrecin de IL-6 en las clulas PC-3 es llevado a cabo a travs del receptor CB2, como
prueba la reversin del mismo tanto en presencia de su antagonista como con el silenciamiento del
receptor. Aunque la sntesis de ceramida no est implicada en el aumento de la secrecin de IL-6
inducida por los cannabinoides, el silenciamiento gnico de CERK lo bloquea totalmente, lo que indica
la mediacin de C1P.









Conclusiones

130


6 - La activacin del factor de transcripcin NFB est implicada en la sntesis de IL-6
inducida por JWH015, ya que el inhibidor de la quinasa IKK bloquea el aumento en la secrecin de
IL-6. Esta activacin se lleva a cabo por la va clsica, ya que JWH015 provoca una activacin de la
quinasa IKK, una inhibicin del inhibidor IB y un aumento de los niveles nucleares de la subunidad
p65 de NFB. La incubacin con JWH015 sin embargo no afecta a los niveles de la subunidad p52,
implicada en la va no clsica de activacin de NFB. La activacin de NFB hace que ste se una al
promotor de IL-6, aumentando as la expresin de esta citoquina

7 - La va de PI3K/Akt se activa en presencia de cannabinoides y adems est implicada
en la activacin de NFB por JWH015, como demuestra la reversin de la activacin de NFB al
emplear el inhibidor de PI3K. Por tanto, en las clulas PC-3 los cannabinoides MET y JWH015
aumentan la secrecin de IL-6 travs de un mecanismo que implica la activacin secuencial de CB2,
va PI3K/Akt, y NFB, que al unirse al promotor de IL-6, inducira su expresin.

8 - El tratamiento de las clulas PC-3 con JWH015, as como la incubacin con IL-6
exgena, inducen un incremento en los niveles de IL-17 secretados por clulas humanas
mononucleares, que es atenuado por el pretratamiento con el antagonista del receptor CB2.



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Summary



















ANEXO I: SUMMARY




















Summary

151

1.- IN

TRODUCTION
Prostate cancer is the most common malignancy in males and the most frequently diagnoses
ca lops to ncer in Western countries. Although it initially response to androgen ablation therapy it often deve
an hormon d, it can e-refractory state in which androgen deprivation is ineffective. While the tumor is locate
be is more treated by surgical removal of the prostate or by radiation therapy, but when the tumor
advanced l is very and it is capable of metastasis there is no effective treatment and the patients surviva
re ncrease duced. Current treatment for these patients is chemotherapy with cytotoxic agents, but this just i
its surviva eath in l a few months, being in fact prostate cancer metastasis the second leading cause of d
men. The onducted to develop new drugs able to stop tumor refore, continuous research is being c
de ssary. It velopment and hence the use of new approaches in the treatment of prostate cancer is nece
has recen ects many cellular processes involved in tumor tly being shown that cannabinoids aff
de system,
including c ., 2005)
velopment. In addition, prostate cancer express several components of the endocannabinoid
annabinoid receptors (Ruiz-Llorente et al., 2003), the TRPV1 receptor (Sanchez et al
an ugs that d the enzyme FAAH ( Ruiz-Llorente et al., 2004) making it susceptible to the treatment with dr
affect som analyze the effect of e of these components. Therefore, the aim of this study was to
ca

2.- EX
To a of [
3
H]-
th ell cycle
were perfo eramide
lev ells and
by the stud
The mice, which were
injected subcutaneously with 2 x 10
6
PC-3 cells. Two weeks after transplantation, tumors were grown to an
average volume of 80 mm
3
. Mice were then divided into three experimental groups which received the
following treatments as s.c. injections: group A, saline (control); group B, 0.15 mg/kg b.w. JWH015; group
C, 0.15 mg/kg b.w. JWH015 plus 0.15 mg/kg b.w SR2. The injection was repeated every day and
nnabinoids on prostate cancer cells proliferation and to study the mechanism involved.
PERIMENTAL PROCEDURES

nalyze the effect of cannabinoids in prostate cancer cells MTT assay, measurement
ymidine incorporation into DNA, flow cytometry to detect apoptotic cells and the distribution of c
rmed. The mechanisms involved in this effect were analyzed by measurement of c
els with the method described by Bielawska et al., 2001 for ceramide quantification in cultured c
y of the activation of different proteins involved in the stress response.
in vivo antitumor activity of JWH015 was studied in athymic nude (nu/nu)

Summary

152

treatment was continued for 14 days. Tumor volumes were monitored every day using calliper
measurements and were calculated by the formula: (4/3) x (w/2)
2
x (l/2), where w = width and l = length.
The body weight of the animals was recorded daily.
The effect of cannabinoid on IL-6 secretion was measured by ELISA assay, and the activity of this
cytokine was corroborated by Western blot. Also, the effect of IL-6 on the PC-3 cell line viability was
analyzed by MTT assay, and the expression of STAT3 was studied by RT-PCR and Western blot. Finally,
Chromatin Immunoprecipitation assay was realized to study the binding of p65 subunit of NFB to IL-6
promoter.
The levels of IL-17 secreted by human mononuclear cells when these were incubated with the
supernatant of PC-3 treated with cannabinoid were measured by ELISA assay.
The statistical analysis was performed by comparisons among groups with a Students t test and the
differences were considered to be statistically significant when the P value was < 0.05. Data are
presented as the mean .S. E of the number of experiments indicated.

3.- RESULTS AND CONCLUSION

The cannabinoids MET and JWH015 inhibited the growth of PC-3 cells and induced cell death
through apoptosis. These effects were mediated by the CB2 receptor.
The molecular mechanism involved in cannabinoid-induced cell death included an increase de novo
synthesis of ceramide and the regulation of different stress-related cellular signaling cascades.
Cannabinoids MET and JWH015 induced JNK activation and p38 inhibition. Moreover, they also regulated
the activity of Akt, a ser/thr protein which has been involved in the inhibition of autophagy, which was
activated at short incubation times but was totally inhibited at longer times. Cannabinoid treatment also
inhibited the translator factor eIF2, which is related to the reticulum stress response. Finally,
cannabinoids activated the mitochondrial pathway of apoptosis, enhancing the release of cytochrome c
into the cytosol and the proteolysis of caspase 9.
The in vivo effect of cannabinoids was analyzed by the induction of PC-3 tumor xenografts in nude
mice. JWH015 treatment resulted in a tumor growth curve significantly lower than that of the control group
and a decrease in the tumor weight at the endpoint. The treatment with JWH015 + SR2, a CB2 antagonist,
produced an uncontrolled tumor growth, similar to that of the control group. These results indicated that
CB2 receptor is responsible for the tumor regression induced by JWH015.

Summary

153

Moreover, MET and JWH015 induced an increase in the IL-6 secretion by PC-3 cells, but they did
not exert any effect on the secretion of IL-6 by the non-tumor RWPE-1 cells. This increase was mediated
by the CB2 receptor, as evidenced its reversion in the presence of the CB2 receptor antagonist, or by
receptor gene silencing. The increase on IL-6 secretion was mediated by CERK, which phospohorilated
ceramide to C1P, as CERK gene silencing completely blocked the increase of the IL-6 secretion.
The pathways which participate in the IL-6 secretion include PI3K/Akt pathway and the classic
pathway of NFB. This transcription factor was activated downstream of PI3K/Akt, and regulated the
transcription of IL-6 by binding to its promoter, as determinate by ChIP assay. Pharmacological inhibition
of CB2 prevented the JWH015-induced Akt phosphorylation and the NFB activation.
Although the IL-6 secreted by cells PC-3 was functionally active, as evidenced by the fact that it was
capable of activating STAT3 in other cells, it did not cause any effect on PC-3 cell line viability, probably
because PC-3 cell line does not express STAT3.
Incubation of human mononuclear cells with cannabinoid-treated PC-3 supernatants induced an
increase in the secretion of IL-17 by mononuclear cells. This finding indicates that the IL-6 secreted by
JWH015-treated PC-3 cells could induce lymphocyte differentiation into the Th17 cells. Therefore, results
showed in this study are very promising since they indicate that cannabinoids inhibit PC-3 tumor cells in
vitro and in vivo and induce lymphocyte differentiation which could be use in the therapeutic treatment for
prostate cancer.





Publicaciones












































ANEXO II: PUBLICACIONES