DIFERENCIACIN DE CRECIMIENTO BACTERIANO POR SIEMBRA EN ESTRA, ESTRA EN COLCHN Y AGOTAMIENTO

Andrs Felipe Ros Diego David Mora Estudiantes Biologa Universidad del Quindo RESUMEN Dependiendo del mtodo de siembra bacteriano se pueden obtener diversas formas de colonia, variando la forma, tasa de crecimiento entre otros. La bacteria usada en la prctica fue E. coli DH5 , los mtodos consistieron en la forma de distribuir las bacterias en el medio de cultivo, siendo usados el mtodo por estra, colchn y estra por agotamiento con el objetivo de identificar en cul de los tres casos se vea mayor crecimiento y que otras variaciones en el cultivo se presentaban. Se obtuvo como resultado un cultivo mas disperso en el mtodo por estra, donde las colonias estaban mas dispersas entre ellas, concluyendo as que los mtodos de cultivo son eficaces cuando se desea obtener un tipo especial de crecimiento y depende de lo que queramos estudiar con el cultivo. Palabras clave: bacterias, E. coli, placas de cultivo, mtodos de siembra, cultivo directo.

INTRODUCCION En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros. Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene un slo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola clula; el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de una poblacin microbiana mixta, se utilizan las denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX.

En un principio, Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. (Romero, 2002). Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y 1

es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios. Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales; por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio (Roger y et al. 1192). Slo los cultivos puros permiten realizar estudios sobre las propiedades bioqumicas (pruebas de identificacin o tipificacin) y la sensibilidad a los antimicrobianos selectivos (antibiograma). Existen varias tcnicas de aislamiento, las ms utilizadas siempre se basan en el empleo de un medio de cultivo slido, en el cual los microorganismos dan origen a colonias separadas. Como cada colonia procede de una sola clula, se habla de unidades formadoras de colonias (UFC). El mtodo de aislamiento ms frecuente es la siembra por agotamiento por estras, se trata de un mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inculos sobre un medio slido contenido e una caja de Petri. A medida que se realizan estras las bacterias pasan del asa al medio en un nmero cada vez menor, de manera que las estras iniciales proporcionan un crecimiento confluyente, mientras que, a lo largo de las ltimas estras se desarrollan colonias bien aisladas (Negroni, 2005). MATERIALES Y MTODOS 3 hisopos de algodn 3 mecheros 3 cajas de petri 4,5 g de medio de cultivo Mc Conkey Cultivo de E.coli (DH5) Estufa Autoclave Cinta de enmascarar Incubadora Alcohol 70%

Agua destilada

PROCEDIMIENTO El medio donde se realiz la siembra fue esterilizado. Posteriormente se prepar la mezcla de medio de cultivo Mc Conkey siguiendo las instrucciones de preparacin; se esteriliz en la autoclave a 15 PSI por 10 minutos junto a las tres cajas de Petri y los hisopos. Luego se prepar el medio de cultivo en las cajas de Petri y se procedi a la siembra de E. coli DH5 , siguiendo los estndares para los tres tipos de siembra distintos. Las cajas fueron llevadas a la incubadora y fueron colocadas en forma invertida. Se les realiz un seguimiento durante tres das estudiando los aspectos morfolgicos ms comunes en colonias microbianas. 1) Siembra por estra. El inoculo de E. coli se pas por el medio de la caja de Petri como dividindola en dos partes iguales y desde la parte inicial de la lnea perpendicular se hicieron lneas en zigzag que cubriera todo el ancho de la caja. Posteriormente la caja se sell y fue llevada a incubar a 37C. 2) Estriado en ngulos rectos (colchn). Se realiz el mismo procedimiento anterior y adems se hicieron las lneas en zigzag de manera semiparalela a la lnea inicial de tal forma que el producto final de la siembra es una especie de cuadricula, luego se sell y dejo incubar a 37C. 3) Siembra por agotamiento. El inoculo de E. coli se pas por la parte superior del medio de cultivo formando un zigzag horizontalmente que cubra de la caja de Petri lo mas ancho posible pero sin llegar a la mitad de la caja, luego del extremo final se realiz el mismo procedimiento de la misma forma pero esta vez de arriba abajo, el procedimiento se realiz de la misma forma dos veces mas formando una especie de cuadrado 2

empezando cada zigzag desde el ultimo extremo del anterior. El ltimo zigzag provino del cuarto y se realizo en la parte central de la caja de Petri. Se sell y dejo incubar a 37C.

RESULTADOS El inoculo correspondiente a la bacteria E. coli present una forma circular, con un borde ondulado, se pudo notar una elevacin acuminada y una superficie rugosa. El crecimiento bacteriano en cada medio de cultivo aument con el transcurso del tiempo mostrando las colonias un patrn de esparcimiento justo por las lneas donde se realizo la siembra con el hisopo y no fueron muy invasivas hacia las zonas donde no hubo contacto directo del medio de cultivo con el hisopo de siembra (Figuras 1 a 9).

Figura 2. Cultivo en colchn.

Primera observacin (3 das despus de la siembra)

Figura 3. Siembra en agotamiento.

Figura 1. Siembra en estra.

Segunda observacin (4 das despus de la siembra)

Figura 4. Siembra en estra. Figura 6. Siembra por agotamiento.

Tercera observacion (5 dias despues de la siembra)

Figura 5. Sembrado en colchn. Figura 7. Cultivo en estra.

diferenciar una de la otra, sobre todo al inicio de la siembra y en los lugares donde se cruzan, mostrando un cultivo ms uniforme en estos dos ltimos tipos de siembra.

ANLISIS DE RESULTADOS Segn Prats en el 2006, al sembrar una muestra en un medio de cultivo, las bacterias existentes en la muestra empiezan a multiplicarse. Como la mayora de las bacterias se duplican cada 20 -30 minutos, entre las 18 y 24 horas se habrn desarrollado abundantemente, ello permitir su deteccin aunque su nmero inicial en la muestra fuera muy bajo. Adems el aislamiento por cultivo permite su posterior identificacin y el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos. Los datos obtenidos en el laboratorio corresponden a la anterior afirmacin, se pudo notar que el primer da despus de haber realizado la siembra, las bacterias haban crecido en una manera exponencial, multiplicaron su nmero en gran manera, lo mismo sucedi con los dos das siguientes donde cada ves se encontraba un mayor nmero de microorganismos; puesto que la bacteria que se utiliz en la prctica, E. coli DH5 , provena de un cultivo axnico, fue mucho ms fcil poder identificar su estructura morfolgica, ya que slo exista una sola especie de microorganismo, lo cual facilita en gran manera su estudio, puesto que ser mucho ms fcil poder realizar todo tipo de pruebas, bioqumicas, fisiolgicas, fsicas, adems de permitir el recuento de microorganismos viables para poder comprender su funcionamiento y as poder crear los antibiticos correspondientes que puedan detener la proliferacin y resistencia de estos microorganismos; por otra parte se pudo comprobar que la siembra en estra es la ms efectiva para lograr poblaciones axnicas, puesto que, conforme se van haciendo estras en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos, hasta que se pueda obtener una colonia con un nmero 5

Figura 8. Siembra en colchn.

Figura 9. Crecimiento por agotamiento.

En las imgenes pertenecientes a la siembra por estra se puede notar una mayor diferenciacin de las colonias, en comparacin con la siembra por agotamiento y colchn, donde las colonias quedan tan cerca entre s que es casi imposible

mnimo de bacterias, para as poder estudiar la de inters. CONCLUSIONES Con la tcnica de siembra en placa por estra se logr la separacin de microorganismos, que si bien provenan de un cultivo homogneo, existan un gran nmero de individuos. Se descubri que el mejor tipo de siembra es el de placa por estra, puesto que a partir de ste, se pueden separar cultivos de microorganismos puros a partir de muestras mixtas. Es importante comprender la forma de crecimiento de las bacterias, ya que es vital a la hora de entender los microorganismos y los usos que el hombre le pueda dar; o por el contrario entes patgenos, cmo se comportan y los daos que puedan llegar a causar en los organismos infectados.

Por que de acuerdo al tipo de siembra las condiciones de crecimiento varan, por lo cual van a crecer de distintas maneras, adems de que en microbiologa es indispensable conocer el crecimiento de los microorganismos para as entender sus comportamientos.

3. A que hace referencia siembra por agotamiento y para que se hace? La siembra por agotamiento hace referencia al estilo que se usa para distribuir los microorganismos de manera que el primer zigzag creado es el que contiene la mayor cantidad de bacterias y con cada estra siguiente al tomarse de la anterior, el numero de microorganismos va a disminuir haciendo del cultivo un medio de distribucin que disminuye la cantidad de microorganismos con cada estra. 4. Existe un mtodo para disminuir la cantidad de microorganismos antes de realizar la siembra en el agar. Cul es? Para disminuir la cantidad de organismos es esencial esterilizar todo el material que se valla a usar en la siembra con el fin de evitar la contaminacin de agentes indeseados en nuestro cultivo. 5. En que casos se har el tipo de siembra en agar inclinado? Cuando se desea obtener poca cantidad de colonias, esto debido a la poca superficie del medio de cultivo lo que evita la proliferacin de microorganismos en exceso. 6 Con sus propias palabras explique Cules son las principales condiciones que se deben tener en cuenta para el desarrollo de microorganismos?

ANEXOS Cuestionario 1. Porque dejar las cajas invertidas en la incubadora?

Porque al condensarse el vapor de agua producto del metabolismo de los microorganismos, el agua cae sobre la tapa evitando que el agua entre en contacto con el cultivo y este se dae.

2. Porque evitar poner el asa caliente en la muestra? Por que el exceso de calor mata los microorganismos que vamos a sembrar o en su defecto causa daos a sus paredes celulares, membranas, enzimas etc. 3 Para que necesita describir la colonia que escogi?

De acuerdo al tipo de microorganismo las condiciones varan, ya que si son agentes patgenos de animales como el ser humano deben cumplir ciertas condiciones especiales 6

tales como el medio de proliferacin debe tener los nutrientes necesarios para que se puedan desarrollar, una temperatura adecuada y un tiempo determinado que permita la correcta proliferacin de los microorganismos. LITERATURA CITADA Romero, Cabello R. 2002. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases Etiolgicas de las Enfermedades Infecciosas. Stanier, R. Ingraham, J. Wheelis, M. Painter, Microbiologia. P. 2a Edicin, 1192. Editorial Revert. Pg. 18-23. Negroni, N. 2005. Microbiologa estomatolgica. 2a edicin, 2005. Editorial Panamericana. Pg. 555-557. Prats, G. Microbiologa clnica. Editorial Panamericana. Pg. 23- 26.