Tema 8

8 LA BIOTECNOLOGA EN LA BIOTECNOLOGA EN LA AGRICULTURA: T URA: LA AGRICULTU PLANTAS GM PLANTAS GM

Prof. Gloria Morcillo Ortega

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Introduccin 8.1 Importancia de las plantas para la alimentacin 8.2 Unas bases de Botnica 8.3 La modificacin gentica de las plantas 8.4 Un poco de Historia 8.5 Estrategias para la modificacin gentica de plantas 8.5.1 Cultivos de clulas vegetales 8.5.2 Transformacin de las clulas vegetales 8.5.3 Diseo de la construcciones gnicas 8.6 Transferencia de genes con vectores especficos de plantas 8.6.1 El plsmido Ti 8.6.2 El plsmido Ri 8.6.3 Vectores vricos 8.7 Trasferencia directa de genes 8.8 Expresin de genes exgenos en clulas vegetales 8.8.1 Regiones reguladoras 8.8.2 Genes marcadores 8.9 Algunas aplicaciones de la ingeniera gentica en plantas 8.10 Mejora de las propiedades de los cultivos 8.10.1 Aumento de la eficiencia del metabolismo 8.10.2 Aumento del valor nutritivo 8.10.3 Maduracin controlada de frutos y flores 8.10.4 Resistencia a condiciones ambientales extremas

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8.11 Mejora del rendimiento.Cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas 8.11.1 Resistencia a plagas de insectos 8.11.2 Resistencia a enfermedades vricas 8.11.3 Resistencia a hongos y bacterias 8.11.4 Resistencia a herbicidas 8.12 Las plantas como factoras 8.12.1 Produccin de frmacos 8.12.2 Produccin de plsticos biodegradables 8.13 Descontaminacin ambiental Bibliografa Direcciones en Internet ANEXO I y II

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Los

vegetales

constituyen

el

componente

nutricional

ms

importante para la humanidad y son la fuente de multitud de materias primas. Por este motivo la investigacin en el campo de la ingeniera gentica de plantas recibe una gran atencin en los organismos pblicos, pero tambin, debido a su enorme inters comercial, ha recibido un fuerte impulso por parte de las grandes multinacionales del sector agroalimentario. Esto, unido a la menor dificultad que presenta la modificacin gentica de las plantas con respecto a los animales, ha hecho que en tan solo dos dcadas se haya avanzado de una forma espectacular en este campo. Hoy da, se cultivan una gran variedad de especies vegetales de inters agrcola y comercial modificadas genticamente (plantas GM llamadas tambin plantas transgnicas) y la extensin de estos cultivos en el mundo crece de forma exponencial. Actualmente se encuentran en el mercado una gran variedad de productos alimentarios procedentes de estos cultivos. En este tema se analizan las estrategias y las tcnicas que se utilizan, as como los problemas especficos que se plantean a la hora de lograr la modificacin gentica de plantas. Se presentan, someramente, las diversas aplicaciones que las plantas GM pueden proporcionar, y se analizan con algo ms de detalle algunos ejemplos de plantas modificadas genticamente relacionadas con el campo de la alimentacin.

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8.1. Importancia de las plantas para la alimentacin

Las plantas han estado muy vinculadas con el desarrollo de la civilizacin humana. Desde tiempos prehistricos, los seres humanos consumieron frutos y semillas como alimento, y pronto comenzaron a cultivar y recolectar aquellas que tenian mayor inters. Las semillas desde el punto de vista nutritivo son un almacen muy concentrado de protenas, aceites, carbohidratos y vitaminas, ya que estos compuestos son necesarios para la germinacin y el desarrollo de la planta. Asimismo, tienen una gran ventaja sobre otro tipo de alimentos que, generalmente, resultan muy perecederos, sin embargo, las semillas son fciles de almacenar y, adems, pueden conservarse durante largos periodos de tiempo si se las mantiene secas, de tal modo que son de los pocos alimentos que pueden ser guardados en tiempos de abundancia para aprovecharlos en pocas de escasez. Pocos alimentos tienen esta doble ventaja. Pero tampoco en esto los seres humanos hemos sido muy originales. Todos los seres vivos del planeta dependen para su alimentacin de las plantas. Las nicas formas de vida en la Tierra que no dependen de las plantas para su existencia son algunas pocas especies de procariotas y protistas auttrofos. Para el resto de los seres vivos las plantas son indispensables ya que la energa de la luz solar entra a la biosfera a travs de los cloroplastos de las plantas, y el carbono y otros elementos fundamentales para la vida como el nitrgeno y el azufre se incorporan a los ecosistemas como molculas orgnicas gracias a que son asimilados por las plantas. Los seres vivos que no comen plantas se alimentan de otros que si las comieron. Las plantas estn en la base de las cadenas alimentarias.

Tema 8 La domesticacin de algunas plantas para su uso como

alimento, que puede considerarse la biotecnologa ms antigua, constituye un largo y paciente proceso, que se inici hace miles de aos y contina en la actualidad. Durante este largo periodo siempre se ha buscado lo mismo: mejorar, desde el punto de vista humano, las propiedades de estas plantas; lograr que tengan buenas y agradables condiciones nutritivas, que tengan un mayor rendimiento, y que tengan caractersticas que favorezcan su cultivo y faciliten su recoleccin. El resultado de este proceso de domesticacin, con profundas consecuencias evolutivas, es la creacin de diversas variedades cuyo nico objetivo es servir a las necesidades humanas, y cuya supervivencia est prcticamente limitada a su cultivo y su mantenimiento seria imposible sin los cuidados del hombre. No obstante, las cosechas a su vez han dependido de multitud de factores externos a las propias plantas domesticadas cuyas condiciones la humanidad no ha podido controlar, como la climatologa y las plagas que han arruinado, y siguen hacindolo todava en porcentajes muy importantes, los rendimientos de los cultivos. Se estima que alrededor de una 80000 especies de plantas son comestibles, de las cuales los humanos nicamente cultivamos 300, aunque slo 12 de ellas podemos considerar que son esenciales para la alimentacin de la humanidad, y tan slo 3, arroz, maz y trigo, pueden ser consideradas como la base de la alimentacin mundial. Adems de su importancia alimenticia, las plantas han

representado para la humanidad una fuente fundamental para la obtencin de muchos otros compuestos: fibras vegetales para el vestido y la construccin, compuestos para la salud, tintes, cosmticos, etc.

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8.2 Unas bases de Botnica

La mayor parte de las plantas que el ser humano cultiva y explota, as como las semillas y frutos que consume proceden de las plantas que los botnicos denominan ANGIOSPERMAS, que son las plantas con flores, aunque tambin son comestibles las semillas de algunas GIMNOSPERMAS o plantas sin flores, como es el caso de los piones del pino. Las plantas con flores son fundamentales para nuestra supervivencia como especie. Todos los cultivos importantes que nos proporcionan alimento como los cereales: trigo, arroz, maz y cebada; las plantas leosas, de las cuales obtenemos madera, como el roble, castao, cerezo; las que nos proporcionan fibras como el algodn y el lino; y otros muchos productos como el caucho, el tabaco, el caf, el chocolate, los aceites aromticos para los perfumes, y los miles de medicamentos como el digital y la codena, por poner solamente algunos ejemplos, son obtenidos de plantas que pertenecen al grupo de las Angiospermas. Las Angiospermas son actualmente las plantas con ms xito y sus ms de 235.000 especies dominan el planeta, aunque no siempre en la historia de la Tierra fue as ya que su aparicin es muy reciente, unos 180 millones de aos segn el registro paleontolgico. Comenzaron a ser muy abundantes hace unos 120 millones de aos, coincidiendo con el declive de los dinosaurios. Se han adaptado a todos los ambientes y presentan una amplia variedad de formas y tamaos, desde las pequeas plantas herbaceas de los pastos y praderas con diminutas flores, a las plantas con grandes y llamativas flores hasta bosques. los gigantescos rboles de los

Tema 8 Las Angiospermas son plantas vasculares que se reproducen de manera sexual, mediante un proceso de doble fecundacin nico entre los seres vivos, formando flores y frutos que las distinguen de todas las otras plantas. El fruto protege la semilla en desarrollo y a menudo ayuda a su dispersin. La flor y el fruto representan mecanismos por los cuales los animales son atrados para participar en la estrategia reproductora de este tipo de plantas, y probablemente evolucionaron como un pago a los animales por los servicios prestados en el transporte de las semillas. Dentro de las Angiospermas se distinguen dos clases: las monocotiledneas, que son generalmente plantas herbaceas con hojas largas y estrechas, con nerviaciones paralelas, entre las que se incluyen los pastos, los lirios, la cebolla, las palmeras, y los cereales cuyas semillas son fundamentales para el alimento de la humanidad como son el trigo, arroz y maz; y las dicotiledneas que son ms diversas e incluyen muchas ms especies (al menos 180.000), entre las que podemos citar, por ejemplo, el roble, los girasoles, los cactus, los arndanos, el tomate.

8.3. La modificacin gentica de las plantas

La manipulacin gentica de las plantas no es, estrictamente hablando, una novedad. El hombre ha modificado durante miles y miles de aos el contenido gentico de multitud de plantas de inters agrcola, en un proceso de domesticacin largo y acumulativo, basado en cruces, incluso entre especies diferentes, y en la seleccin posterior de semillas, con unas prcticas que con el tiempo se fueron haciendo cada vez ms sofisticadas. A pesar de que estos mtodos eran lentos e inciertos,

Tema 8 jugando el azar un papel bastante importante, se han logrado obtener especies vegetales que en poco se parecen a las originarias silvestres de las cuales derivaron tras siglos de paciente labor agrcola. Las nuevas tecnologas de ingeniera gentica no han hecho sino acelerar la velocidad de este proceso y , sobre todo, afinar en la seleccin de caracteres, ya que permiten elegir genes en vez de mezclar genomas completos, pero tienen esencialmente el mismo fundamento y objetivo. Sin embargo, una diferencia sustancial es que los mtodos de mejora clsica de plantas estaban limitados por la variabilidad gentica, que poda ser suministrada nicamente por especies que se cruzaran entre s, es decir, por especies prximas. El gran potencial, y a la vez el riesgo, de la ingeniera gentica reside en que se han roto estos lmites, desapareciendo las barreras para elegir y transferir genes entre especies e incluso entre taxones, lo que proporciona un amplio rango de posibilidades para suministrar el fenotipo deseado a un organismo. La ingeniera gentica de plantas tienen un enorme potencial de aplicaciones y, al menos, tres factores importantes confluyen para explicar los impresionantes avances alcanzados en este campo: Enormes intereses econmicos y, por tanto, produccin de frutos y semillas una elevada

financiacin destinada a la investigacin para la mejora en la de inters para la alimentacin humana y ganadera, con mejores cualidades y mayor rendimiento. Adems del inters que tiene la obtencin de nuevas variedades destinadas a condiciones ambientales adversas (salinidad, temperaturas elevadas) o para su cultivo en terrenos hasta ahora considerados no frtiles.

Tema 8 Por otra parte, la creacin de nuevas variedades de flores y plantas de inters ornamental es tambin un campo de enorme futuro comercial. A nivel industrial, las plantas son tambin una importante fuente de materias primas. Productos como el almidn y el azcar tienen gran importancia para las industrias relacionadas con la alimentacin, pero tambin con la energa. El etanol, obtenido por fermentacin de la caa de azcar se utiliza en mezcla con petroleo como combustible en los coches en Brasil. Productos como el algodn, el lino, etc., son la base de la industria textil. As mismo, las plantas son la fuente de multitud de compuestos qumicos para la industria farmacutica, cosmtica, de aditivos alimentarios, etc. Menor dificultad para obtener plantas transgnicas. La produccin de plantas transgnicas es, al menos en teora, mucho ms sencilla que la de animales transgnicos. Las plantas tienen una gran capacidad regenerativa. En muchos casos, una sola clula manipulada genticamente puede dar origen a la produccin de una nueva variedad. Muchas clulas vegetales son totipotentes, esto es, capaces de multiplicarse, diferenciarse y acabar formando plantas completas y frtiles. Esto representa una gran ventaja con respecto a la obtencin de animales transgnicos, ya que se pueden obtener plantas genotpicamente alteradas a partir de una nica clula transformada. Adems, la larga historia de la agricultura ha proporcionado un profundo conocimiento de la gentica de las plantas cultivadas y se dispone de una enorme variedad de lneas portadoras de mutaciones que hoy pueden progenie ser explotadas que a nivel ms molecular. fcil La capacidad mutaciones de y autofecundacin de muchas plantas y la produccin de una numerosa hace sea encontrar recombinaciones poco frecuentes y obtener homocigotos.

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Tema 8 Menor rechazo social que la manipulacin gentica en animales. Los experimentos de manipulacin gentica en plantas despiertan, en general, un menor rechazo y tienen una mayor flexibilidad legislativa que los realizados en animales en todos los paises del mundo. Sin embargo, hay que resaltar el importante rechazo social que se ha generado en los pases de la Comunidad Europea a los cultivos agrcolas con semillas modificadas genticamente. En la UE inicialmente se aprobaron 18 OGM, la mayora de los cuales correspondian a cultivos de plantas relacionadas con la alimentacin, pero desde 1998 existe una moratoria para los mismos en todos los pases de Europa, aunque con la nueva normativa probablemente pronto se comercialicen 13 nuevos productos pendientes de aprobacin que ya han recibido el informe positivo de la Comisin Cientfica. En contrapartida a estas ventajas, algunos sistemas

vegetales presentan tambin una serie de inconvenientes que estn frenando el desarrollo de su manipulacin gentica: Muchas plantas presentan un genoma muy grande, con frecuencia debido a su poliploida, lo que dificulta mucho la experimentacin gentica A pesar de que muchas plantas se pueden regenerar a partir de una nica clula manipulada genticamente y se espera que sean un clon de esta clula, sin embargo, a menudo se producen clulas heterogeneas debido a una variacin somatoclonal, frecuente en plantas, lo que crea graves problemas para esta experimentacin. Finalmente, hay que decir que las plantas monocotiledones, precisamente las que tienen un mayor inters desde el punto de vista de la alimentacin, resultan muy difciles de transformar, aunque el desarrollo 11

Tema 8 de los mtodos de biobalstica para introducir los genes exgenos est consiguiendo bastantes xitos.

8.4 Un poco de historia

El asentamiento de los pueblos nmadas permiti que los primeros labradores de la tierra comenzaran a elegir y cultivar ciertas plantas para alimentarse y supuso el inicio de la civilizacin humana. Desde entonces los agricultores han sido profundos conocedores de la gentica emprica y acumulando conocimientos prcticos que han transmitido durante generaciones han sido capaces de crear multitud de especies nuevas para uso y consumo de la humanidad. A lo largo del siglo XX se produjo un cambio drstico en la agricultura pasando de la artesana gentica, practicado durante milenios, a la ingeniera gentica. Algunas fechas importantes que marcan hitos importantes en este siglo revolucionario tambin para la agricultura son las siguientes: 1910 Los botnicos europeos comienzan a aplicar las leyes de Mendel para la mejora de plantas agrcolas; es el comienzo de la seleccin y mejora clsicas con base cientfica. 1950 Se obtiene la primera generacin de plantas procedentes de un cultivo in vitro 1968 Se inicia la Revolucin Verde, se introducen las semillas hbridas en los pases del Tercer Mundo. Comienza la comercializacin de las semillas, y la introduccin de productos industriales en la agricultura: herbicidas, pesticidas, abonos qumicos . En pocos aos se logra un incremento 12

Tema 8 drstico en la produccin agrcola y en el rendimiento de las cosechas, imprescindible para alimentar a la creciente poblacin humana. 1973 Primer OGM. Los investigadores logran aislar genes e introducirlos en un genoma ajeno, se obtiene la primera bacteria Escherichia coli transgnica que representa el inicio de la Ingeniera Gentica. 1983 Primera planta GM. Se obtiene la primera planta transgnica, una planta de tabaco con el gen de la resistencia al antibitico kanamicina, lograda por un equipo de cientficos de la multinacional agroalimentaria Monsanto. 1986 Primer OGM en el campo. Se emplea Frostban un spray que contena bacterias modificadas genticamente, a las que se les haba introducido un gen que produce resistencia a las heladas. Se pulverizan sobre cultivos de fresas para protegerlos del dao provocado por las heladas en los campos de Brentwood (California). 1994 Primer OGM en el mercado. Se pone a la venta en USA el tomate FLAVR SAVR, modificado genticamente de forma que tiene una maduracin retardada, producido por la empresa Calgene.

8.5 Estrategias para la modificacin gentica de plantas

En trminos generales, la modificacin del genoma de una planta se puede plantear desde dos estrategias alternativas: Adiccin gnica. Cuando se pretende que la planta adquiera una nueva caracterstica o propiedad para lo cual hay que aadir nuevos 13

Tema 8 genes. Puede tratarse de aadir un gen, o ms de uno, y puede proceder de otra variedad de la misma planta cultivada, de otra especie de planta silvestre o cultivada que tenga la caracterstica que se quiere incorporar, o incluso el gen puede proceder de especies muy alejadas filogenticamente como bacterias , levaduras o animales. Supresin gnica. Se trata de eliminar alguna caracterstica o propiedad no deseada, para lo cual hay que eliminar la accin del gen o los genes de la propia planta responsables de la misma. En este caso no se trata de quitar fsicamente el gen del genoma de la planta, ya que esto no es factible actualmente, sino que la modificacin gentica persigue inactivar el producto del gen para impedir, retardar o ralentizar su accin. Aunque hay distintas estrategias la que ha dado mejores resultados es la de introducir en el genoma de la planta un gen que sea el inverso complementario, lo que se ha demominado un gen antisentido, de tal forma que cuando se transcriben sus RNAs al tener la misma secuencia pero ser complementarias hibridarian y se inactivan. De hecho esta tecnologa se emple en el tomate de maduracin retardada, el primer alimento GM que fue aprobado para su comercializacin. Aunque las dos estrategias estan siendo utilizadas, est claro que la segunda tiene unas apliacciones ms limitadas, las caractersticas no deseables que se tratan de eliminar son siempre limitadas, mientras que las nuevas caracteristicas que se pueden incorporar a una planta solo tienen el lmite terico de los genes disponibles para ellas. Las clulas vegetales son totipotentes esto significa que, si se proporcionan las condiciones fsicas y nutricionales adecuadas, cualquier clula vegetal puede regenerar el fenotipo del organismo completo y diferenciado del cul deriv originariamente. Por este motivo, y a diferencia de lo que ocurre con los animales, resulta relativamente sencillo 14

Tema 8 modificar las clulas vegetales aisladas introduciendo el gen o los genes de inters que van a conferir la nueva caracterstica o eliminar la no deseable, y luego a partir de estas clulas se puede regenerar la planta GM completa. En cualquiera de las dos estrategias comentadas, los pasos fundamentales que hay que tener en cuenta a la hora de plantear la modificacin gentica de una determinada especie vegetal son: Disponer de clulas en cultivo de la especie para transformar Disear y obtener la construccin gnica que se va a utilizar Disponer de un mtodo adecuado para transferir la construccin gnica al interior del ncleo de la clula, una vez all es necesario que se integre y que se exprese, de forma que que sea estable Cultivar posteriormente las clulas transformadas y lograr regenerar la planta completa.

8.5.1. Cultivos de clulas vegetales Para obtener buenos cultivos de clulas vegetales se debe partir de pequeas piezas de tejido denominados explantes capaces de una rpida proliferacin, como por ejemplo del pice de raz, de yemas o bien de semillas en germinacin, todas estas regiones contienen clulas que se encuentran continuamente en ciclo de divisin . El explante se lava con un desinfectante, agua oxigenada o hipoclorito, para eliminar microorganismos, y se deja crecer en un medio nutritivo, donde dependiendo de la especie puede llegar a formar una masa indifrenciada 15

Tema 8 de clulas denominada callo, que puede propagarse indefinidamente por divisiones en un medio nutricional adecuado suplementado con fitohormonas. El medio de cultivo suele contener sacarosa como fuente de carbo; una fuente de nitrgeno orgnico, por ejemplo aminocidos, o inorgnico, como nitratos; reguladoras del crecimiento. Si una pieza de callo joven se transfiere a un medio de cultivo lquido y se agita, la masa celular se disgrega y se produce una suspensin de clulas que puede cultivarse indefinidamente, o bin puede sembrarse en un medio slido en el que las clulas crecen se dividen y forman callos de forma anloga a las colonias de bacterias. Esta forma de cultivo in vitro de tejidos es muy frecuente para conservar ciertas variedades de vegetales en los llamados bancos de germoplasma. En un momento dado, el estado de indiferenciacin de estas clulas en cultivo puede alterarse, modificando el tipo y la concentracin de fitohormonas en el medio, e inducir la diferenciacin de races , tallos, etc., que permitirn regenerar una planta completa. Este proceso se denomina organognesis y requiere unas condiciones especficas para cada especie. La capacidad con que una especie superara este proceso es clave par el desarrollo de plantas GM, y es una etapa bastante complicada experimentalmente en el casos de los cereales, a excepcin del arroz y de algunas variedades de maz. 8.5.2. Transformacin de las clulas vegetales Las clulas vegetales tienen por fuera de la membrana plasmtica una fuerte pared de celulosa, que supone un verdadero obstculo fsico para la entrada de genes. Para salvar este problema se pueden seguir dos estrategias, o bien liberar a la clula de esta barrera fsica, o bien 16 sales inorgnicas, metales (Cu, Zn, Co y otros), vitaminas y hormonas vegetales (auxinas, giberelinas, citoqinas)

Tema 8 disear sistemas que dirijan el DNA al interior de la clula incluso en presencia de la pared. Estos ltimos son los mtodos denominados de biobalstica, que se comentaran en el apartado 8.7. Para la transformacin se suelen utilizar protoplastos, que son clulas vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular por medio de tratamiento enzimtico con celulasa y pectinasa. Se suelen emplear clulas de hoja, que son fciles de dispersar y regeneran muy bien la planta completa. Tambin son muy utilizados los protoplastos haploides de polen, ya que pueden regenerar plantas haploides que resultan de gran utilidad para analizar mutantes. La facilidad y las condiciones con que los protoplastos regeneran la planta completa es muy variable y depende de las especies. Los protoplastos al estar desprovistos de la pared externa facilitan la penetracin de molculas de DNA y por tanto son clulas ms fciles de transformar. Posteriormente, el protoplasto puede regenerara la pared celular en un medio slido con los nutrientes y seales adecuadas, en un proceso que dura entre cinco y diez dias, tras lo cual la clual comienza a dividirse y puede formar callos e incluso regenerar la planta completa. Otro sistema alternativo muy utilizado es la transformacin de discos de hoja. Se recortan pequeos discos, de algunos milmeros de diametro, de una hoja. Las clulas de su borde pueden ser facilmente transfectadas por el plsmido de la bacteria Agrobacterium que hace de vector de genes, como veremos ms adelante, y adems, estas clulas tienen una gran capacidad regenerativa, si se trasnfieren a medios que estimulan la capaciadd la diferenciacin celular, son capaces de regenerar la planta completa, en un proceso que dura en total de 4 7 semanas. Resulta ms rpida que la regenaracin a partir de protoplastos y es un sistema muy utilizado actualmente especialmente con las dicotiledoneas. 17

Tema 8

8.5.3. Diseo de las construcciones gnicas En cualquier caso, bien se trabaje con clulas en cultivo o con protoplastos, para modificar genticamente una planta se requiere introducir genes exgenos en el interior del ncleo de una clula vegetal y para ello hay que recurrir a vectores que transporten el gen o los genes, o bien utilizar tcnicas que permitan la introduccin directa del transgen. Y, previamente, es necesario disear la construccin de DNA adecuada que contenga el gen o genes de inters, pero tambin algunos elementos necesarios para asegurar su correcta expresin. Estos son las regiones reguladoras y el promotor del gen que permitirn que el gen sea activo y que lo sea en el momento y en el lugar correcto, es decir, que la protena o protenas se sinteticen en las clulas del tejido donde debe hacerlo. Adems, suele ser muy til introducir en la construccin otros genes que llamaremos marcadores de seleccin, que tambin se suelen denominar reporteros, que permitiran confirmar que se ha producido la integracin. Generalmente se trata de algn gen de resistencia a antibiticos, que permitir seleccionar fcilmente las clulas transformadas por su supervivencia en un medio de cultivo que contenga el antibitico. La presencia de genes de resistencia a antibiticos en las plantas transgnicas representa uno de los puntos ms criticados por los detractores de los cultivos con semillas transgnicas. Actualmente se investiga con gran inters en este campo y hay importantes avances que permiten trabajar con otro tipo de marcadores e incluso se disean construcciones con marcadores que tras una primera etapa que permiten la deteccin y seleccin son posteriormente eliminados. Estas cuestiones se taratran con alho ms de detalle en el apartado 8.8.2.

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Tema 8

8.6 Transferencia de genes con vectores especficos de plantas

8.6.1 El plsmido Ti Uno de los mtodos ms utilizados para transformar clulas de plantas consiste en utilizar como vector para los genes foraneos el plsmido Ti (tumor-inducing) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens. sta es una bacteria gram negativa del suelo, muy abundante y que es capaz de infectar de forma natural a una gran variedad de especies diferentes del grupo de las dicotiledneas, provocando la aparicin de tumores llamados de agalla en corona. La bacteria penetra, a travs de cualquier herida reciente en la epidermis de la planta, y se adhiere a la pared externa de una clula. Desde aqu, es capaz de transferir fragmentos del plsmido Ti, que se encuentra normalmente en el interior de estas bacterias, hasta el ncleo de la clula vegetal. La clula vegetal que ha adquirido el plsmido se convierte en una clula tumoral, creciendo de manera independiente y no regulada, y se dedica a sintetizar unos amonicidos especiales, las opinas, y otros compuestos nica y exclusivamente para alimentar a la bacteria. El plsmido Ti tiene un tamao muy grande, es un DNA circular de unas 200Kb. Sin embargo, al interior de la clula vegetal solo penetra un fragmento de este plsmido, llamado T-DNA (DNA transferido), que tiene un tamao de entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa bacteriana. Esta regin tiene una serie de caractersticas muy interesantes: - Una vez en el interior de la clula, el T-DNA no permanece como un plsmido independiente sino que se integra en uno de los cromosomas de la planta. sta es una caracterstica muy interesante ya que gracias a ello todas las clulas descendientes, formadas por divisin 19

Tema 8 de sa clula, portarn el plsmido debido a que se transmite con los propios cromosomas, produciendose una transformacin estable e irreversible de las clulas de la planta afectada. - Este T-DNA resulta por tanto un vector natural idneo ya que en l se pueden introducir genes forneos de inters y utilizar este sistema para la manipulacin gentica de las plantas dicotiledneas, que son las que de forma natural son infectadas por la bacteria. - El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de los cuales codifican para enzimas que intervienen en la sntesis de opinas. stas son unas molculas derivadas de aminocidos, que son sintetizadas por accin de las enzimas que la bacteria introduce en la planta utilizando los propios aminocidos y otras molculas de la planta, y que, sin embargo, son utilizados como nutrientes por la bacteria. Es decir, la infeccin de las clulas con el plsmido de la bacteria hace que estas clulas se pongan a trabajar para la bacteria de forma que suministran nutrientes para las propias bacterias. Conviene reconocer que la humilde bacteria del suelo Agrobacterium ha logrado desarrollar todo un sistema de ingeniera gentica de plantas para ponerlas a producir sustancias en su propio beneficio, algunos millones de aos antes que el Homo sapiens fuera capaz de hacerlo. Adems, como hemos dicho la infeccin provoca una proliferacin desordenada de las clulas de la planta, debido a que el T-DNA lleva tambin un grupo de genes que codifican enzimas para la sntesis de hormonas vegetales, cuya superproduccin induce una proliferacin desordenada producindose un tumor, conocido como agalla de la corona. 20

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Hoy da se explota este sistema para introducir genes nuevos en plantas, pero para ello previamente es necesario realizar una serie de manipulaciones para modificar el propio plsmido Ti y hacerlo ms adecuado. En la versin comercial que se utiliza se han eliminado los genes oncognicos responsables del crecimiento tumoral de las clulas de la planta, y tambin se han eliminado los genes responsables de la produccin de opinas. Sin embargo, se suele dejar la regin del promotor de estos genes de opinas junto a la cul se aade el gen de inters, de este modo se asegura la expresin del gen forneo introducido a la planta. Tambin es necesario incorporar genes marcadores para identificar y seleccionar las clulas vegetales transformadas. El promotor de las opinas es til para expresar genes de forma constitutiva, es decir, genes que van a estar permanentemente activos produciendo su producto. Sin embargo, en la prctica a veces se requiere que los genes que se introducen se expresen nicamente en determinadas clulas de la planta, por ejemplo en semillas, o en determinados momentos del desarrollo. Esto complica bastante las cosas y hace necesario el uso de promotores especficos de la planta o al menos promotores que se puedan controlar por factores especficos y as lograr regular la expresin del gen.

8.6.2. El plsmido Ri Otro vector especfico es el plsmido Ri (root inducing) de la bacteria Agrobacterium ryzobium, cuya utilizacin sigue bsicamente el mismo proceso que acabamos de comentar para el Ti. Este plsmido cuando infecta una planta produce raz de cabello, o aparicin de

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Tema 8 mltiples races por una proliferacin desordenada de las clulas de la raz. 8.6.3 Vectores vricos Tambin algunos virus de plantas pueden ser utilizados como vectores de genes forneos. Si son adecuadamente manipulados son capaces de transportar un DNA como pasagero al interior de la clula vegetal. Los mayorse avances se han logrado con geminivirus y caulimoviruse, dentro de estos ltimos, especialmente utilizado ha sido el virus del mosaico de la coliflor. Tambin los virus con genoma de RNA que son muy abundantes en el mundo vegetal estn siendo utilizados como vectorers de genes, los ms frecuentes son los del mosaico de la cebada y el virus del mosaico del tabaco.

8.7 Transferencia directa de genes

Debido a que el sistema de Agrobacterium no es eficaz en la plantas monocotiledones, precisamente las de mayor inters agrcola como los cereales, se han tratado de desarrollar alternativas para introducir DNA en las clulas vegetales basadas en mtodos fsicos. Algunas clulas vegetales pueden ser transformadas directamente, por transfeccin de fragmentos de DNA aadidos al medio de cultivo, aunque, en general, la eficiencia de la transformacin directa es bastante baja. Hoy da se trata de mejorarla utilizando diversas tcnicas que favorecen la penetracin del DNA forneo. Algunas de estas tcnicas son:

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Permeabilizacin de membranas - La electroporacin, que consiste en la apertura de poros en la membrana por tratamiento con impulsos elctricos controlados. Utilizando campos de entre 200 y 600 V/cm se consigue transferir DNA extrao a clulas de arroz y de maz con rendimientos bastante buenos. - La permeabilizacin qumica , por ejemplo con etilen glicol. - La permeabilizacin con ultrasonidos. - Tambin se utilizan liposomas para transportar DNA al interior de las clulas. Biobalstica Otras tcnicas ms sofisticadas son las conocidas como biobalstica que incluyen el uso de pistolas gnicas. Estas tcnicas se basan en la utilizacin de microesferas de metales, como oro o tungsteno, de 0,4 a 4 m de diametro, recubiertas del DNA que se desea introducir que es precipitado sobre ellas con cloruro clcico, y que se disparan sobre las clulas, o bien el uso de microproyectiles que llevan dentro gotitas del DNA a transfectar en solucin. El mecanismo de disparo se basa en una pistola especial que lanza las partculas a ms de 400m/s sobre las clulas de forma que penetran sin destruir la membrana, todo el sisitema funciona en un vaco moderado para evitar el rozamiento con el aire, condiciones que las clulas vegetales soportan durante uno o dos minutos. Tras el bombardeo, las clulas son colocadas en condiciones adecuadas para crecer y regenerar la planta.

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8.8 Expresin de genes exgenos en celulas vegetales

8.8.1 Regiones reguladoras Las cosas no son generalmente tan sencillas y, con frecuencia, los genes introducidos en las plantas, sea cual sea el procedimiento que empleemos para ello, plantean problemas de expresin y de mantenimiento en las clulas, resultando que su presencia y actividad es slo transitoria. Otras dificultades adicionales surgen cuando el producto del gen forneo introducido, es decir la protena, es rpidamente degradada por los sistemas enzimticos de la planta, o bien, por el contrario, cuando el compuesto que interesa no puede ser correctamente producido al faltar enzimas o protenas adecuadas para su procesamiento, empaquetamiento final, etc. Est claro que los problemas de la ingeniera gentica para obtener plantas modificadas genticamente no finalizan al encontrar un vector o un sistema adecuado para introducir un gen forneo ms bien, por el contrario, se puede decir que es cuando verdaderamente comienzan. En este punto los avances en el conocimiento de la gentica molecular bsica de las plantas, la regulacin de la expresin de los genes y el desarrollo, son los cimientos sobre los que crece y puede progresar la ingeniera gentica aplicada de plantas. La expresin constitutiva o continuada de los genes

incorporados a plantas se consigue cuando se colocan en los vectores 24

Tema 8 junto a regiones reguladoras como por ejemplo los promotores de opinas, de los que hablamos anteriormente. Pero muchas veces pede resultar ms interesante que el gen o los genes exgenos insertados no se expresen hasta que sean activados especficamente, para lo cual se colocan frente a promotores regulables no constitutivos, que por ejemplo se activen nicamente en determinado momento del desarrollo o nicamente en cierto tejido. Para ello se utilizan promotores como por ejemplo el de la subunidad pequea de la enzima rubisco (del ciclo de Calvin) que se activa solamente en los tejidos fotosintticos, como las hojas; o bien promotores que se activan nicamente en las flores o en la raz. Tambin son muy interesantes los promotores que se activan en determinadas situaciones de estrs, como los de las protenas HS o los de las protenas PR. El uso de estas seales permite controlar con mayor o menor precisin la expresin de los genes forneos incorporados. La bsqueda de promotores especficos de tejidos tiene una enorme importancia para el desarrollo de plantas transgnicas ms especficas y seguras. Por ejemplo, plantas que expresen solo un insecticida que lleven incorporado en aquellos tejidos de la planta que son atacados por el insecto o el patgeno, permaneciendo sin expresarse en aquellos que son comercializados como alimento, por ejemplo frutos y semillas. Muchas veces el gen o los genes incorporados no son activos a pesar de haber diseado una construccin con los reguladores adecuados. Y es que las plantas disponen de mecanismos protectores contra la invasin de DNA ajeno. Uno de estos es la metilacin del DNA extrao integrado en el cromosoma, lo cual impide su transcripcin y por tanto su expresin. Otras veces, se produce una inactivacin de toda la cromatina alrededor de la regin donde se encuentra el gen intruso lo que provoca el mismo resultado. Algunas plantas disponen de un mecanismo ms sofisticado conocido como cosupresin, que consisite en que se

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Tema 8 bloquean secuencias que sean de algn modo semejantes o otras endgenas. Todo esto hace que lograr el xito en este tipo de experimentacin sea bastante ms difcil y complejo de lo que a primera vista podra parecer. El estudio y el conocimiento bsico de la gentica de plantas es fundamental para avanzar con nuevas estrategias.

8.8.2 Genes marcadores La identificacin de las clulas vegetales que han incorporado un determinado gen exgeno, es decir que han sido efectivamente transformadas, es factible mediante el uso simultneo de algn otro gen que codifique para alguna actividad facilmente detectable y que se inserta junto con el de inters actuando de testigo por lo que se suele llamar gen marcador o reportero. Uno de los ms empleados en vegetales es el gen GUS, procedente de la bacteria E. Coli que codifica para la glucuronidasa. Esta actividad enzimtica sobre un compuesto coloreado se puede valorar histoqumicamente. Otro gen marcador muy utilizado es el de la luciferasa una enzima que en presencia de ATP degrada la luciferina emitiendo luz y que por tanto puede valorarse con ayuda de un luminmetro o de una placa o pelcula fotogrfica sensible a la luz. Quiz los marcadores ms ampliamente utilizados son los genes de resistencia a antibioticos procedentes de bacterias, que permiten no solo identificar a las clulas transformadas sino tambien seleccionarlas separandolos del resto de clulas que no han incorporado DNA exgeno en un medio con el antibiotico, ya que solo estas sobreviviran. La mayoria de los vectores que se utilizan llevan una copia del gen bacteriano de resistencia a la kanamicina, denominado kanR o nptII.

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Tema 8 A pesar de que, hasta el momento, ninguna de las protenas de los genes utilizados como marcadores ha demostrado ser nociva para la salud humana o animal, los genes marcadores han sido el blanco de muchas de las crticas a las plantas transgnicas Se argumenta que podran tener efectos txicos, alerggenos, o provocar un aumento de la resistencia a antibioticos o transferir esta resistencia a otras especies. Actualmente se emplean distintos mtodos para obtener plantas transgnicas libres de genes marcadores. La idea es utilizar el marcador solamente en las primeras etapas para identificar y seleccionar las clulas transformadas, y posteriormente eliminarlo antes de obtener la planta transgnica. Para ello la estrategia es que el gen que se desea clonar en la planta y el gen marcador se localicen en sitios diferentes del genoma de la planta receptora, en cromosomas distintos, para que tras unos cuantos cruces iniciales dirigidos se pueda perder el marcador por segregacin cromosmia. Otra estrategia es que el marcador vaya incluido en el interior de una secuencia transponible mvil, que favorece su eliminacin posterior. En esta lnea se est utilizando el gen cre procedente del bacteriofago P1, que codifica para una enzima que cataliza la excisin de fragmentos de DNA flanqueados por una secuencia de reconocimiento de 35bp. La estrategia consiste en utilizar el gen marcador de resistenca flanqueado por estas secuencias de reconocimiento de 35bp, e incluir tambin el gen cre. Una vez en el interior de la clula vegetal transformada, el producto del gen cre cataliza la excisin del gen de resistencia a antibitico. Tambin se puede lograr la eliminacin posterior del propio gen cre, si se ha clonado en un vector distinto y por tanto se ha intengrado en otro cromosoma distinto del gen de inters, por cruzamientos dirigidos . En definitiva, hoy da existen estrategias cada vez ms sofisticadas que permiten evitar la presencia de secuencias distintas a la del gen de inters que se desea clonar en la planta. 27

Tema 8 Aunque en las plantas transgnicas de primera generacin que fueron comercializadas se utilizaron marcadores de resistencia a antibiticos, actualmente se dispone de protocolos muy adecuados de forma que es posible evitar la presencia de genes marcadores no deseables en las plantas transgnicas, eliminando de este modo uno de los argumentos importantes en contra de las mismas. Como Anexo I se incluye un documento ms extenso sobre este tema.

8.9 Algunas aplicaciones de la ingeniera gentica en plantas

El principal objetivo de la modificacin gentica de las plantas comestibles es el de lograr un material biolgico capaz de dar respuesta a los problemas tradicionales de la agricultura, como la prdida de cosechas por agentes patgenos, plagas y malas hierbas al dotar a las propias plantas cultivadas con genes de defensa frente a estos enemigos naturales que actualmente son combatidos por el agricultor con armas qumicas. Pero tambin es interesante destacar que por medio de la ingeniera gentica se pueden abordar aspectos totalmente nuevos, como la mejora de las propiedades nutritivas y se pueden plantear utilidades no ensayadas hasta ahora en la explotacin por el hombre de las plantas cultivadas. As, junto a la mejora de las resistencias, la calidad del producto y de sus caractersticas agronmicas, aspectos que se venan aplicando por los mtodos tradicionales, aparecen nuevas posibilidades de difcil o imposible abordaje por las tcnicas de mejora convencional o incluso totalmente inditas, como la produccin de vacunas, anticuerpos y otros frmacos en las frutas y semillas comestibles, la obtencin de 28

Tema 8 productos de inters industrial, como por ejemplo plsticos, y la recuperacin por las plantas de cultivo de suelos contaminados.

8.10 Mejora de las propiedades de los cultivos

8.10.1 Aumento de la eficiencia del metabolismo de las plantas La fotosntesis es uno de los procesos realizados por las plantas de mayor transcendencia para el conjunto de la vida en el planeta. Es el paso fundamental para la obtencin de materia orgnica a partir del CO2 atmosfrico y de produccin de O2 , de los cuales depende el resto de los seres vivos del planeta. Uno de los objetivos primordiales es, por tanto, conseguir por ingeniera gentica plantas an ms eficientes en la realizacin de este proceso. La fijacin del nitrgeno es otro proceso crucial para el metabolismo de las planats. La mayora de las plantas cultivadas requieren grandes cantidades de nitrgeno para su crecimiento, que es aportado por los fertilizantes qumicos que se aaden al terreno. Solamente algunas plantas de la familia de las leguminosas son capaces de convertir el nitrgeno atmosfrico en compuestos nitrogenados. En este proceso interviene la bacteria Rhizobium, que infecta las races, formando ndulos donde se aloja, y gracias a un complejo proceso en el cual intervienen al menos 17 genes de la bacteria (genes nif ) se produce la fijacin del nitrgeno. Uno de los objetivos prioritarios en este campo es convertir por ingeniera gentica plantas no leguminosas en fijadoras de nitrgeno.

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Tema 8 8.10.2 Aumento del valor nutritivo Otro de los objetivos que se persigue en la actualidad es elevar el valor nutritivo, o bien modificar el contenido en determinados elementos, como por ejemplo aminocidos esenciales o bien de vitaminas, alimentacin humana o animal. Las protenas que se almacenan en las semillas con frecuencia tienen un valor nutritivo deficiente debido a la carencia de alguno de los aminocidos esenciales para el organismo humano. Una importante mejora es la incorporacin de algunos de estos aminocidos esenciales en la protena, y as se ha ensayado con el gen de la faseolina, la protena que se acumula en las habas. La modificacin de la secuencia codificadora de esta protena ha permitido la sntesis de nuevas variedades a las que se la ha incorporado algunos aminoacidos esenciales en la regin C-terminal, sin que afecte a la localizacin y a la funcionalifdad de esta protena. Otra alternativa es aumentar el contenido de aminocidos esenciales en forma libre en la semilla. Se ha conseguido en semillas de soja a las que se les ha modificado una enzima de la ruta biosinttica del aminocido lisina. Esta enzima es regulada negativamente por el producto final, pero ha sido sustituida por el gen que codifica la misma enzima en la bacteria E. Coli, de tal forma que esta enzima bacteriana escapa a la regulacin y sigue funcionando a pesar de que se se acumule la lisina, lograndose una produccin de este aminocido 100 superior a la normal en las semillas de colza transgnica. La colza se usa para harinas de alimentacional animal a las que tradicionalmente se les suplementa con lisina y otros nutrientes. en algunas plantas cuyas semillas, frutos o races son utilizadas para la

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Tema 8 Los cidos grasos son el componente mayoritario de los aceites vegetales, aproximadamente un 75% procede de las semillas de soja, palma, colza y girasol, y la gran mayora se dedican al consumo humano. Uno de los objetivos es modificar el grado de insaturacin de estos aceites para hacerlos mas saludables. En el caso de la colza se dispone actualmente de distintas variedades modificadas genticamente, productoras de semillas con diferente composicin de cidos grasos, que ya estan siendo cultivadas en el campo. Las vitaminas representan una de las carencias nutricionales ms graves en los paises subdesarrollados. Un ejemplo muy reciente, y muy aireado en los medios de comunicacin, ha sido la obtencin del arroz dorado (golden rice) que expresa caroteno, un precursor de la vitamina A que se acumula en el endospermo del grano. Esta variedad transgnica puede contribur a paliar de forma notable las enfermedades relacionadas con la carencia de vitamina A en los pases donde este problema es endmico debido a la dieta pobre y poco variada.

8.10.3 Maduracin controlada de frutos y flores La maduracin del fruto es un proceso natural que froma parte del envejecimiento del vegetal, pero supone un problema bastante grave desde el punto de vista comercial ya que el proceso de maduracin puede ser bastante rpido comparado con los largos plazos de la comercializacin agrcola actual y adems el fruto maduro sufre

importanes deterioros en su manipulacin, lo que acarrea importantes prdidas y hace que actualmente se recolecte mucho antes de los que seria el punto ptimo para su consumo, pero esto provoca que no desarrollen todo su sabor y aroma. 31

Tema 8 Durante la maduracin se activan ciertos genes como los que codifican a las enzimas celulasa y poligalacturonasa, que degradan las paredes de las clulas y provocan el ablandamiento del fruto. La inhibicin de estos genes puede producir un retraso en la maduracin. Esta fue la estrategia que se sigui para la obtencin de la primera planta GM que se comercializ. La compaa Calgene, utiliz la tecnologa denominada antisentido, que ya hemos comentado para inactivar el gen de la poligalacturonasa lo que resultaba en una reduccin del 90% en la actividad de esta enzima y un retraso considerable en la maduracin, que permite recolectar la fruta de la planta con todo su aroma, color y sabor, y es posible todavia su comercializacin sin que se estropee es este periodo. Se han aislado otros genes que relacionados con el proceso de maduracin, que se activan por un aumento de la produccin de etileno, verdadera hormona de la maduracin, y de la actividad respiratoria de las clulas. Uno de estos genes es la enzima ACCS (aminociclopropano,1carboxi sintetasa) fundamental en la sntesis de etileno. Una de las estrategias que se han utilizado ha sido clonar un gen bacteriano que produce una enzima que degrada la ACCS. Este procedimiento se ha utilizado para la obtencin de tomates transgnicos que tienen una inhibicin del 90% en la produccin de etileno y cuya maduracin se retrasa hasta tres meses. De este modo los tomates se recogen de la planta y se maduran por tratamiento externo con etileno, conservando el mismo color, textura, aroma y sabor que los madurados en la propia mata. Del mismo modo, hoy da se trata de obtener flores ornamentales que tarden en marchitarse. Se ha ensayado con claveles modificados genticamente, portadores de un gen antisentido para bloquear la sntesis de etileno.

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Tema 8 8.10.4 Tolerancia a condiciones ambientales extremas Las plantas estn sometidas a cambios drsticos de temperatura, de niveles de agua y de salinidad en el suelo. Debido a su inmovilidad las plantas no pueden escapar de estas situaciones de estrs que provocan la prdida de importantes cosechas. Para resistir a estas condiciones extremas, determinadas plantas han desarrollado diferentes mecanismos que pueden ser aprovechados para la mejora de plantas agrcolas. Hoy da, se han caracterizado algunos genes implicados en la tolerancia de determinadas plantas a situaciones extremas de temperatura, aridez, salinidad etc., y se pretende su utilizacin para modificar cultivos de inters agrcola. La salinizacin de los suelos es uno de los principales factores limitantes de la produccin agrcola a nivel mundial, y es un problema derivado fundamentalmente de la prctica del regadio. Se calcula que una superficie de ms de 80 millones de hectreas est afectada por severos problemas de salinidad, y que cada ao se aaden 5 millones de hectreas ms. Algunas de estas tierras han quedado fuera del uso agrcola o solo pueden utilizarse para el cultivo de especies tolerantes. Algunas plantas viven en ambientes sometidos a periodos de largas sequias y alta salinidad. Para sobrevivir estas plantas sintetizan unas molculas denominadas genricamente osmoprotectores, que facilitan la retencin de agua macromolculas celulares frente a y protegen y estabilizan a las concentraciones inicas elevadas.

Estos osmoprotectores son pequeas molculas de determinados azcares, alcohles, y sales de amonio cuaternario como la betana. La betana es sintetizada por las plantas y tambien por algunas bacterias. El gen betA de Escherichia coli ha sido utilizado para obtener plantas

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Tema 8 transgnicas de tabaco que resultan ser hasta un 80% ms resistentes a altas concentraciones salinas que la planta no transgnica. En la misma lnea, el grupo dirigido por el Prof. Blumwald de la Universidad de Toronto con la empresa Seaphire, ha conseguido plantas transgnicas de tomate y de colza que producen cosechas normales en condiciones de riego con agua con una salinidad del 33%, mientras que la mayora de las especies agrcolas no soportan riegos por encima del 8% de salinidad. La tecnologa est basada en la insercin de un gen que codifica para una protena llamada antiportadora de sodio, que es capaz de transportar y almacenar la sal en las vacuolas de las clulas, mientras que los frutos y las semillas no contienen vacuolas salinas. Adems de algunos genes osmoprotectores que producen resistencia a salinidad y a la deshidratacin del suelo, tambin se han caracterizado genes de enzimas que producen dobles enlaces en cidos grasos de la membrana de las clulas lo que conduce a una mayor resistencia a las heladas por parte de la planta. Sin embargo, el mayor problema reside en lograr una adecuada regulacin de estos genes una vez introducidos en la planta ya que se requiere su expresin limitada a situaciones de emergencia, debido a que su expresin constitutiva, esto es continuada, conllevara efectos secundarios no deseados.

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Tema 8

8.11 Mejora del rendimiento. Cultivos resistentes a plagas, enfermedades y herbicidas.

8.11.1 Resistencia a plagas de insectos La resistencia de los cultivos agrcolas a insectos dainos es una caracterstica de enorme importancia econmica, debido al elevado coste en productos y mano de obra que supone la administracin peridica de insecticidas. Pero tambin hay que tener en cuenta que estos procesos tienen una gran trascendencia ecolgica debido a la contaminacin ambiental que se produce con el uso masivo de insecticidas qumicos. Los insecticidas qumicos que se utilizan masivamente en toda la agricultura mundial no son selectivos, esto quiere decir que eliminan no slo los insectos dainos sino multitud de otros insectos beneficiosos. Adems, los insecticidas qumicos se acumulan en los ecosistemas, en los distintos escalones de las cadenas alimentarias, provocando a largo plazo importantes efectos nocivos en la fauna. Todos los vegetales poseen, en mayor o menor medida, sistemas que les confieren cierta resistencia a insectos, mediada por metabolitos secundarios nocivos para estos ltimos. Hoy da, sin embargo, se han caracterizado numerosos genes bacterianos cuyo producto proteico confiere resistencia frente a determinadas plagas especficas de insectos. Esta caracterstica se ha explotado a nivel comercial y algunos de estos genes bacterianos se han introducido en plantas de inters agrcola y algunas de estas plantas transgnicas se encuentran actualmente en el mercado.

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Tema 8 Este es el caso de la toxina Bt de la bacteria Bacillus

thuringiensis. Hoy da se han logrado numerosas plantas transgnicas Bt que expresan el gen de la toxina, una protena llamada Bt, que les confiere una eficaz resistencia frente a determinadas plagas de insectos. Estas bacterias, cuando son ingeridas por el insecto producen una protena Bt que causa la muerte de ste. El proceso forma parte del ciclo vital natural de la bacteria. Distintas cepas de estas bacterias producen variantes de la protena que afectan de manera muy especfica a distintos insectos. Hoy da se conocen ms de 50 protenas insecticidas Bt, cuyos genes estn identificados y secuenciados, y se estan utilizando como medio bastante especfico para el escarabajo de la patata, etc. Las patatas resistentes a plagas fueron el primer cultivo genticamente modificado con el gen Bt que recibi, en 1995, la aprobacin en Estados Unidos para su comercializacin. Hoy da, hay comercializadas variedades de tomates, tabaco, maz, algodn y patatas que llevan insertado el gen Bt para producir resistencia a diversas plagas de insectos. Aunque ste mtodo parece ms eficaz y seguro, para las personas y los animales, que la utilizacin masiva de plaguicidas qumicos, una de las objeciones ms slidas que se plantean a estas biotecnologas es que el uso extensivo de Bt no har sino acelerar el desarrollo de resistencias por parte de los insectos. Hay datos que apuntan en sta lnea, debido a que diversas especies de insectos han desarrollado ya resistencia al Bt. La realidad es que este insecticida biolgico lleva ya muchos aos, carca de 40, mucho antes de que se desarrollaran las variedades de plantas transgnicas, utilizandose de forma externa en fumigaciones masivas sobre los campos de cultivo. 36 control de plagas de procesionaria, oruga de la mariposa del tabaco, del algodn, del

Tema 8 En la actualidad se est trabajando en la bsqueda de promotores especficos que permitan regular la expresin de estos transgenes Bt, de manera que se expresen nicamente en aquellos tejidos, por ejemplo hojas, que son devorados por los insectos, evitando su expresin masiva en toda la planta y de esta forma se lograra un control ms preciso de las plagas especficas de la planta evitando la exterminacin de otros insectos. En cualquier caso es importante resaltar el alto grado de especificidad de las toxinas producidas por las diferentes estirpes de Bacillus thurigiensis sobre diferentes especies de insectos, que no tiene comparacin con ninguno de los insecticidas qumicos tradicionalmente utilizados en la agricultura moderna intensiva. Y, en segundo lugar, hay que resaltar la ausencia de toxicidad de estas protenas endotoxinas para los mamferos. 8.11.2 Resistencia a infecciones vricas Las mayores prdidas econmicas en las cosechas de grano se deben a las infecciones por virus. Hoy da se trabaja intensamente en este campo y se siguen distintas estrategias para lograr este objetivo. Una de las de mayor xito es la produccin de plantas transgnicas que expresen una protena de la cubierta vrica. Se trata de una inmunizacin de la planta. Aunque no se conocen bien los mecanismos moleculares de esta resistencia, se sabe que la super produccin, de forma constitutiva, de esta protena de la cpsida reduce significativamente la infeccin posterior por virus. Hoy da se dispone ya de plantas de cultivo extensivo resistentes a ms de un virus por este procedimiento, ya que la expresin de la protena de la cubierta de un virus protege a la planta contra la infeccin de un amplio espectro de virus no relacionados.

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Tema 8 Tambin se est intentando el uso de sustancias antivirales producidas por alguna planta. Se han aislado algunos de estos genes y se han trasferido a otra planta de cultivo, estos primeros resultados parecen prometedores. 8.11.3 Resistencia a hongos y bacterias Las infecciones por hongos son muy frecuentes en las plantas y provocan grandes prdidas de las cosechas en todo el mundo. Tan solo un hongo que ataca al arroz en la zona del sudeste asitico se estima que causa prdidas de ms de 5000 millones de dlares al ao. Para luchar contra estos hongos fitopatgenos se emplean productos qumicos peligrosos para la salud humana y animal y debido a que se acumulan son muy dainos para el medio ambiente. Algunas plantas disponen de defensas contra estos agentes patgenos mediante la produccin de unas protenas conocidas genricamente como protenas relacionadas con patognesis (PR), que son enzimas del tipo de glucanasas, quitinasas e inhibidores de proteasas. Por ingeniera gentica se han logrado introducir los genes y expresar algunas de estas protenas en arroz y tabaco transgnicos, consiguiendo cultivos resistentes. Las infecciones por bacterias son tambin muy dainas para los cultivos, y la situacin es ms problemtica ya que no se han identificado genes de resistencia a bacterias que puedan ser incorporados a los cultivos. Solo la bacteria del suelo Erwinia carotovora que es patgena para la patata provoca prdidas anuales de ms de 100 millones de dlares. Se han logrado algunos resultados prometedores con la patata trasgnica que incorpora el gen de la lisozima del virus bacterifago T4, puesto que la lisozima puede actuar tanto en bacterias gram positivas como gram negativas se intenta extrapolas esta estrategia a otros casos.

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Tema 8 8.11.4 Resistencia a herbicidas Otro de las campos que tiene una gran importancia econmica, por los elevados costes de material y mano de obra que representa en la agricultura es el empleo de herbicidas, que a su vez tienen tambin un grave impacto ambiental. Alrededor de un 10% de la produccin agrcola mundial se pierde a causa de las malas hierbas, a pesar del uso extensivo de nuevos y cada vez ms potentes herbicidas; hoy se emplean ms de 100 diferentes, generalmente dainos para el medio ambiente. La utilizacin de herbicidas, tan extendida en la actualidad, tiene adems el grave inconveniente de que no son selectivos, por lo que su accin es generalizada eliminando malas hierbas pero afectando tambin al rendimiento de los cultivos. Los herbicidas ms utilizados son de amplio espectro, como el glifosato ( de nombre comercial Round up) y el fosfinotricn ( de nombre comercial Basta). La produccin de plantas transgnicas resistentes a herbicidas es relativamente sencilla debido a que se conocen las dianas de accin de los herbicidas y, generalmente, corresponden a una nica enzima, con lo cul un nico gen es responsable de conferir resistencia. En esta lnea se estn utilizando bsicamente tres estrategias diferentes: 1- Sobreproducir la enzima afectada por el herbicida. Se tarta de lograr plantas que tengan una amplificacin del gen de la enzima diana del herbicida, esto es plantas con varias copias del gen, lo cual conlleva a una superexpresin de la enzima y confiere una mayor resistencia de la planta al herbicida en cuestion.

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Tema 8 2- Obtener plantas a las que se le ha introducido un gen mutante para la enzima diana del herbicida que producirn una protena que es herbicida resistente y por tanto sern resistentes al herbicida en cuestion. Se ha empleado en el caso del glifosato; este herbicida inhibe una enzima de la ruta de sntesis de aminocidos aromticos. Esta enzima se encuentra en plantas y tambin en bacterias. A partir de una cepa de E. Coli que resultaba ser resistente a este compuesto se aisl el gen que codifica esta enzima, y se ha introducido en genomas de plantas logrando que estas expresaran la enzima resistente de E.coli en sufuciente cantidad como para reemplazar a la enzima vegetal inhibida. As se han logrado plantas transgnicas de patata, tabaco, tomate, petunia y algodn resistentes a los efectos del glifosato. 3- Disear plantas transgnicas a las que se les ha incorporado un gen para una protena que a su vez sea capaz de degradar o inactivar el herbicida en cuestion. La inactivacin del herbicida se ha logrado en varios casos. Por ejemplo, con el herbicida glufosinato (fosfinotricina) que inhibe la sntesis del aminocido glutamina, pero cuya accin es anulada por la enzima fosfinotricina acetil-transferasa codificada por el gen bar de la bacteria Streptomyces hygroscopicus. Se han logrado plantas transgnicas a las que se les ha aadido este gen de Streptomyces que las hace resistentes a este herbicida en ms de 20 especies diferentes de plantas. Todas estas opciones se han desarrollado con xito y se dispone de numerosas variedades con resistencias a los herbicidas ms importantes. En la actualidad se comercializan varios productos como la soja, el tabaco, la colza, y el algodn que son resistentes a herbicidas.

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Tema 8

8.12 Las plantas como factoras

A pesar de que hoy por hoy siguen siendo las clulas de los

microorganismos como las bacterias y las levaduras las principales factoras utilizadas por la bioingeniera para la produccin compuestos (alimentarios, farmacuticos, cosmticos, etc.) cada vez adquiere mayor relevancia la posibilidad de utilizar las plantas transgnicas como alternativa a los grandes bioreactores que se emplean para la produccin de protenas sintetizadas por bacterias recombinantes. La idea de disear plantas transgnicas capaces de producir protenas y otros compuestos de alto valor comercial para sustituir a los tanques de bacterias en las empresas es muy atractiva. Las plantas son fciles y baratas de cultivar, producen una gran biomasa, son relativamente sencillas de manipular genticamente y una vez transformadas son bastante ms estables que los microorganismos con plsmidos recombinantes que con frecuencia se pierden durante una fermentacin prolongada. Adems, tienen importantes ventajas, debido a que son clulas eucariotas, a la hora del procesamiento y modificacin de protenas, muchas veces irrealizable en las clulas bacterianas. El grave inconveniente radica en la mayor dificultad que presenta el proceso de extraccin y purificacin del producto sintetizado. Dedicaremos solamente unas lneas a dos aspectos como son la produccin de frmacos y la obtencin de polmeros biodegradables, que aunque no estn directamente relacionados con la alimentacin humana, s pueden tener una incidencia importante como veremos (frutas-vacuna, alimentos-medicina, aditivos, conservantes, envases, etc.) en el mundo de la industria alimentaria.

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Tema 8 8.12.1 Produccin de frmacos Las plantas constituyen una fuente abundante de medicamentos naturales. Queda todava un enorme campo por explorar ya que ha sido analizado nicamente el potencial farmacutico de aproximadamente el 10% de las especies del planeta. Un ejemplo reciente y muy importante de frmaco derivado de una planta es el taxol, utilizado para el tratamiento de diversos tipos de tumores. Se obtiene de la corteza del tejo del Pacfico, un rbol escaso y de lento crecimiento, por lo que el proceso de extraccin es caro, lento y muy laborioso. Aunque se puede obtener por sntesis qumica , el proceso no es comercialmente viable. El mtodo ms eficiente en este caso y en general para producir grandes cantidades de frmacos de plantas es a travs de la manipulacin gentica de las mismas. Uno de los campos donde se est trabajando con bastante inters es el de la obtencin de plantas transgnicas que produzcan anticuerpos. Se han obtenido ya plantas de tabaco que sintetizan complejos anticuerpos monoclonales funcionalmente activos. Pero an mayores expectativas despierta la posibilidad de lograr la inmunizacin activa a travs de la ingesta de plantas transgnicas que produzcan vacunas, es decir, plantas que produzcan alguna protena de bacterias o de virus que sea capaz de desatar una respuesta inmunolgica por parte del organismo que la ingiera y de esta forma provocar la inmunidad frente al patgeno. Esto permitira en un futuro que el simple hecho de administrar una fruta modificada genticamente proporcionara inmunidad frente a un virus, equivalente a la que se obtiene a travs de costosas y no siempre factibles campaas de

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Tema 8 vacunacin, especialmente difciles de llevar a cabo en los pases menos desarrollados. Las plantas transgnicas puede que devuelvan el protagonismo que siempre tuvieron las plantas para la humanidad en este campo de la salud y que, solo recientemente, haba qumica de medicamentos. 8.12.2 Produccin de plsticos biodegradables Otro ejemplo de enorme inters potencial es el uso de las plantas para producir plsticos biodegradables y, en general, para producir biopolmeros de inters industrial. Las plantas producen diversos tipos de polmeros, siendo los ms abundantes la celulosa, que es biodegradable pero no digerible por el hombre, y el almidn, que es la principal fuente de caloras de la dieta humana. La bacteria Alcaligenes eutrophus produce como polmero de reserva polihidroxibutirato (PHB) y otros polihidroxicidos (PHA) que prima para la fabricacin de estan siendo utilizados como materia sido sustituido por la sntesis

envases y utensilios de plstico biodegradable. La produccin de plantas transgnicas de Arabidopsis, como especie modelo experimental, que incorporan los genes bacterianos para la sntesis de PHAs, confiere a estas plantas no solo la capacidad para sintetizar estos productos sino de acumularlos en los tejidos de reserva. Esto parece que no tiene efectos perjudiciales para la planta y adems hace que la recoleccin sea ms fcil. La soja, la colza y el girasol seran especies agrcolas de gran inters en esta campo ya que sus semillas tienen gran cantidad de aceites, que estando en las mismas rutas metablicas podran bloquearse hacia la sntesis de estos polmeros.

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Tema 8 En la planta de algodn, se ha logrado incorporar los PHAs a las propias fibras celulsicas, lo que permitir obtener un material textil con nuevas propiedades.

8.13 Descontaminacin ambiental

Ciertas plantas pueden ser utilizadas para regenerar suelos contaminados, proceso que es conocido como fitorremediacin. El uso de plantas transgnicas para este fin, aunque muy incipiente, tiene algunos resultados espectaculares. Se han producido ciertas plantas transgnicas que contienen el gen que codifica una enzima que transforma el in mercrico y que tendrn una enorme utilidad en la recuperacin de suelos contaminados por mercurio. Tambin se han obtenido plantas transgnicas que expresan enzimas capaces de degradar compuestos orgnicos nitrogenados y clorados (por ejemplo: nitroglicerina, cloroformo). Todas estas plantas aunque todava estn a nivel experimental, son una esperanza para la regeneracin de terrenos contaminados por vertidos industriales.

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Bibliografa
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Contemporanea. 2001. Eat your genes. S. Nottingham. Zed Books, 1998. Dinner at the new Gene Caf. Bill Lambrecht. Thomas Dunne Books, New York, 2002 45

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Los genes que comemos. Daniel Ramn. Editorial Algar. Valencia, 1999. Cultivos y alimentos transgnicos. Una gua crtica. Jorge Riechmann. Los libros de la Catarata. Fundacin 1 de Mayo. Madrid, 2000. Plantas transgnicas. M.F. Nieto, A. Guevara-Garca, L. Herrera-Estrella. Investigacin y Ciencia. Enero, 1999. Plantas resistentes a insectos. J.J. Estruch. Investigacin y Ciencia. Febrero, 1998. Los riesgos en la alimentacin. Monografa. Mundo Cientfico. N 222, 2001. Nuevos alimentos. Dossier. Mundo Cientfico. N 235, 2002.

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Direcciones de Internet
European Initiative for Biotechnology Education. Tiene un tema, el 9,dedicado a plantas transgnicas que es accesible en espaol. http://www.eibe.org European Food Information Council . EUFIC es una organizacin independiente que ofrece informacin sobre calidad y seguridad Alimentaria, sus pginas contienen bastantes articulos sobre plantas modificadas genticamente y alimentos biotecnolgicos. Accesible en espaol. http://www.eufic.org/sp/tech/food.htm International Food Information Council Foundation. IFIC ofrece

informacion sobre biotecnologia de plantas y alimentaria, sobre todo articulos relacionados con la seguridad y la legislacin. Algunos en espaol. http://www.ific.org/food/biotechnology.vtml Comida transgnica. Paginas donde se debaten los beneficios y posibles riesgos de estas tecnologas aplicadas a los productos de alimentacin,con una tendencia crtica sobre los mismos. http://www.safe-food.org Monsanto. Pagnas en espaol de una de las grandes multinacionales agrcolas implicadas en la investigacin y comercializacin de semillas transgnicas. Contiene informacin actualizada sobre nuevos productos, legislacin y debates e informaciones relacionadas con el tema de plantas transgnicas agrcolas. Http://www.monsanto.com

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FAO. Foro electrnico para Biotecnologa auspiciado por la Food and Agriculture Organization de las Naciones Unidas. Conferencias, noticias y glosario sobre Biotecnologa e Ingeniera Gentica. Http://fao.org/biotech/forum.htm NAL. Biotechnology. An Information Resource. Pginas de la National Agriculture Library (US Department of Agriculture). Noticias, foros y excelentes enlaces. Http://nal.usda.gov/bic/ Transgenic plants and world agriculture. Documento sobre aplicaciones, beneficios y riesgos de la agricultura transgnica elaborado conjuntamente por las siguientes sociedades cientficas: Royal Society of London, U.S.A. National Academic of Sciences, Brazilian Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, Indian Academy of Sciences, Mexican Acedemy of Sciences y la Third World Academy of Sciences. Http://www.nap.edu/catalog/9889.html Genetically modified foods. Foro de discusin sobre riesgos y beneficios de los alimentos transgnicos en el que participaron diferentes cientficos. Http://news.bmn.com/hmsbeagle/78/viewpts/overview

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ANEXO I La seguridad de los marcadores de resistencia a antibioticos. E. Montesinos y E. Badasa Revista Agricultura de la Fundacin Antama. N 836, febrero 2002. ANEXO II Entrevista al Prof. Alonso Rodrguez Navarro Esc. Tec. Superior de Ingenieros Agrnomos. Universidad Politcnica de Madrid Linea de investigacin: Arroz GM para tolerancia salina

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