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oPaS/aNVISa/SVS
Controle Interno da Qualidade
para Testes de Sensibilidade
a antimicrobianos
Tecnologia em servios de sade
Projeto de Monitoramento e Preveno da Resistncia
Microbiana em Servios de Sade
Coordenao do Projeto
Flvia Freitas de Paula Lopes GGTES/ANVISA/MS
Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Maria Cndida de Souza Dantas CGLAB/SVS/MS
Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS
Elaborao
Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS
Colaboradores
Adlia Aparecida Maral dos Santos GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Antonia Maria Machado - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP
Eliete Frigatto - Laboratrio Central do Hospital So Paulo - UNIFESP
Heiko Thereza Santana - GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Janana Sallas Coordenao Geral Laboratrios de Sade Pblica DEVEP/CGLAB/SVS/MS
Mrcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz / So Paulo SP
Maria Rita Elmor Laboratrio de Microbiologia do Hospital Srio Libans / So Paulo SP
Marins Dalla Valle Martino Hospital Israelita Albert Einstein / So Paulo SP
Sociedade Brasileira de Anlises Clnicas
Reviso tcnica
Heiko Thereza Santana GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Janana Sallas DEVEP/CGLAB/SVS/MS
Slvia Figueiredo Costa Hospital das Clnicas FM/USP
Suzie Marie Gomes GIPEA/GGTES/ANVISA/MS
Valeska de Andrade Stempliuk OPAS/OMS
Reviso de texto
Ana Beatriz de Noronha
Esta publicao est sendo realizada no marco do Termo de Cooperao 37 (TC 37) entre a Agncia
Nacional de Vigilncia Sanitria / Ministrio de Sade e a Organizao Pan-Americana da Sade/Or-
ganizao Mundial da Sade - Representao do Brasil.
Organizao Pan-Americana da Sade/Organizao Mundial da Sade
Setor de Embaixadas Norte, Lote 19, 70800-400 Braslia-DF
Postmaster@bra.ops-oms.org
www.opas.org.br
Impresso no Brasil
M2 - 5 Tecnologia em Servios de Sade
Lista de Figuras
Figura 1
Propagao da cultura de Bactrias
Figura 2
Fluxograma para manuseio e estocagem da Cepa de Referncia
Figura 3
Fluxograma para manuseio da Cepa de Referncia no controle da qualidade
M2 - I - 4
M2 - C1 - 2
M2 - C1 - 3
M2 - 6 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
Lista de Siglas e abreviaturas
Anvisa Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria
ATCC American Type Culture Collection
BaSO4 Sulfato de Brio
CCIH Comisso de Controle de Infeco Hospitalar
CGLAB Coordenao Geral de Laboratrios de Sade Pblica
CIM Concentrao Inibitria Mnima
CIQ Controle Interno da Qualidade
CLSI Clinical Laboratory Standard Institute
CO
2
Dixido de Carbono
CQ Controle da Qualidade
CQIL Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais
DEVEP Departamento de Vigilncia Epidemiolgica
EPC Equipamentos de Proteo Coletiva
EPI Equipamentos de Proteo Individual
ESBL Beta-lactamase de Espectro Estendido
FM/USP Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
GGTES Gerncia-Geral de Tecnologia em Servios de Sade
GIPEA Gerncia de Investigao e Preveno das Infeces e dos Eventos Adversos
IEC International Electrotechnical Commission
ISO Internacional Standards Organization
MH Mueller-Hinton
MS Ministrio da Sade
OMS Organizao Mundial da Sade
OPAS Organizao Pan-Americana da Sade
PCIQ Programa de Controle Interno da Qualidade
pH Potencial Hidrogeninico
POP Procedimento Operacional Padro
SNVS Sistema Nacional de Vigilncia Sanitria
SPVA Sucrose Fosfato Glutamato
SVS Secretria de Vigilncia em Sade
TSB Caldo de Soja Trptica
UNIFESP Universidade Federal Escola Paulista
M2 - 7 Tecnologia em Servios de Sade
Introduo
1. Parmetros para um Programa de Controle da Qualidade
I - Fase pr-analtica
II - Fase analtica
III - Fase ps-analtica
2. Cepas de referncia
2.1. Defnies
2.2. Tabela 1. Indicao de uso das cepas de referncia
Captulo 1
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Bacteriologia
1. Cepas de referncia
1.1. Manuseio e estocagem
2. Controle de Turbidez para a Preparo do Inculo
3. Mtodo de Disco-Difuso
3.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade
3.2. Teste de controle da qualidade dos meios de cultura
3.3.Testesdecontroledaqualidadedaprovaedoperfldesensibilidade
4. Mtodo de Diluio em Caldo ou gar (CIM)
4.1. Freqncia dos testes de controle da qualidade
4.2. Freqncia dos testes de controle da qualidade para testes de triagem
4.3. Testes de controle da qualidade do meio de cultura
4.4. Mtodo de diluio em gar
4.5. Mtodo de diluio em caldo (microdiluio e macrodiluio)
4.6.Testesdecontroledaqualidadedaprovaedoperfldesensibilidade
Captulo 2
Controle da qualidade em testes de sensibilidade para Leveduras
1. Cepas de Referncia
1.1. Cepas recomendadas para testes de CIM de 48 horas por diluio
em caldo
1.2. Cepas recomendadas para testes de CIM de 24 e 48 horas por
microdiluio em caldo
1.3. Cepas recomendadas para disco-difuso
2. Manuseio e estocagem das cepas de referncia
2.1. Preparo das cepas de referncia para armazenamento
2.2. Armazenamento das cepas de referncia
2.3. Manuseio das cepas de referncia nos testes de rotina
Sumrio
M2 - I - 1
M2 - I - 1
M2 - I - 1
M2 - I - 2
M2 - I - 4
M2 - I - 4
M2 - I - 4
M2 - I - 5
M2 - C1 - 1
M2 - C1 - 1
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M2 - C1 - 4
M2 - C1 - 4
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M2 - C1 - 5
M2 - C1 - 6
M2 - C1 - 8
M2 - C1 - 9
M2 - C1 - 9
M2 - C1 - 9
M2 - C1 - 9
M2 - C1 - 10
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M2 - C2 - 2
M2 - 8 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
3. Freqncia dos Testes de Controle da Qualidade
3.1. Intervalos de CIM
3.2. Testes de sensibilidade a antifngicos
4. Testes de controle da qualidade do Meio de Cultura e Artigos de Plstico
5. Outros Testes de Controle utilizados na macrodiluio e microdiluio
5.1. Controle do crescimento
5.2. Controle de pureza
5.3.Controledaleituradospontosfnaisdareao
6. Testedequalidadedaprovaedoperfldesensibilidade
Captulo 3
Controle da qualidade em testes de sensibilidade realizado por
Mtodos Automatizados
1. Elementos essenciais do sistema de gesto da qualidade
1.1 Fase pr-analtica
1.2. Controle interno do laboratrio
1.3. Controle da qualidade dos processos automatizados
1.4. Validao
Referncias Bibliogrfcas
Anexos
Anexo I: Procedimentos utilizados para manuteno e estocagem de
microrganismos
Anexo II: Planilhas para controle interno da qualidade
Anexo III: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da
Qualidade - Hospital
Anexo IV: Relatrios de Registro da Realizao do Controle Interno da
Qualidade - LACEN
M2 - C2 - 3
M2 - C2 - 3
M2 - C2 - 3
M2 - C2 - 4
M2 - C2 - 5
M2 - C2 - 5
M2 - C2 - 5
M2 - C2 - 5
M2 - C2 - 5
M2 - C3 - 1
M2 - C3 - 1
M2 - C3 - 1
M2 - C3 - 1
M2 - C3 - 1
M2 - C3 - 2
M2 - A - 1
M2 - A - 1
M2 - A - 3
M2 - A - 15
M2 - A - 19
M2 - RB - 1
M2 - - 1 Tecnologia em Servios de Sade
O programa de controle interno da qualidade um conjunto de aes que visam garantir a
qualidade e reprodutibilidade dos processos e dos resultados produzidos por meio da verifcao
continua dos fatores que interferem nessa. Deve ser visto como uma oportunidade de aprimoramento
das atividades desenvolvidas no laboratrio. Segundo a Organizao Mundial de Sade (OMS)
1
a
implantao de um programa da qualidade necessria para:
melhorar a qualidade dos servios de sade;
gerarresultadosconfveisereproduzveis;
propiciar que resultados interlaboratoriais sejam comparveis;
aumentar a credibilidade do laboratrio entre os mdicos e seus clientes;
motivar os funcionrios a melhorar o desempenho; e
prevenir de complicaes legais que podem seguir a liberao de exames de baixa qualidade.
Muitos fatores interferem na qualidade dos resultados liberados pelo laboratrio de microbiolo-
gia, como por exemplo: (a) a seleo, coleta, transporte e acondicionamento apropriados do espcime
biolgico; (b) o treinamento, comprometimento e motivao do pessoal de laboratrio; (c) fatores
ambientais,comoluminosidadedefcienteouexcessiva,ventilaoecondiesdolocaldetrabalho;
(d) fatores analticos, como baixa qualidade dos reagentes, vidraria, corantes, meios de cultura e falta
de equipamentos precisos; e (e) erros de transcrio de resultados, resultados liberados incompletos
e interpretao errada das provas bioqumicas ou antibiograma
1
.
Este guia um instrumento que tem como objetivo oferecer subsdios aos laboratrios de micro-
biologia na elaborao do manual de procedimentos operacionais padro (POP) que deve ser construdo
pelo laboratrio. Ele faz parte do Manual de Microbiologia Clnica para o controle de infeco em servios
de sade elaborado e disponvel na pgina eletrnica da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (An-
visa)
2
. Este deve ser utilizado em consonncia com a Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI),
Boas Prticas de Laboratrios, Norma Brasileira Reguladora - NBR ISO/ IEC 17025 por microbiolgicos
e biolgicos e Resoluo Diretoria Colegiada - RDC 302, de 13 de outubro de 2005.
Os documentos aqui apresentados contm informaes bsicas acerca da realizao, da freqn-
cia e das indicaes dos testes de controle interno da qualidade (CIQ) dos laboratrios de microbiologia
clnica, na fase analtica.
1. ParMeTroS Para uM PrograMa de CoNTroLe da QuaLIdade
2,3
I - FaSe Pr-aNaLTICa
a) garantia da qualidade das amostras clnicas
O laboratrio de Microbiologia deve elaborar um manual de instrues, contemplando os
seguintes itens:
coleta,identifcaoeconservaodaamostra;
transporte da amostra, estabelecendo meio recomendado, prazo, condies de temperatura
e padro tcnico para garantir a sua integridade e estabilidade;
Introduo
M2 - - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
critrios para o preparo do cliente com instrues claras e escritas em linguagem acessvel, sendo
que somente as instrues simples e de fcil compreenso podem ser dadas verbalmente;
critrios para a aceitao ou rejeio das amostras; e
documentao das informaes relacionadas s amostras coletadas, como data, horrio e
responsvel pela coleta e eventuais intercorrncias, garantindo sua rastreabilidade durante
todo o processo.
II - FaSe aNaLTICa
a) Manual de Procedimentos operacionais Padro (PoP)
O laboratrio de Microbiologia deve elaborar os documentos internos de procedimentos,
seguindo as indicaes de GP2-A4 do CLSI (Clinical Laboratory Technical Procedure Manuals; Ap-
proved Guideline - Fourth Edition (2002) e deste documento.
Os POPs devero conter, no mnimo: tcnica, limites de tolerncia, aceitao e rejeio da amostra,
preparo de reagentes, controle de qualidade (CQ), clculos, critrios de liberao de resultados.
Revisar os documentos, anualmente, ou sempre que ocorrer mudanas nos processos descritos.
Disponibilizar as informaes escritas no ambiente de trabalho.
B) garantia da qualidade tcnica dos colaboradores
Oferecer e documentar capacitao tcnica para as atividades desempenhadas na rotina do
laboratrio de microbiologia.
Manter programa de capacitao para o uso apropriado de equipamentos.
Utilizar equipamentos de proteo individual (EPI) e equipamentos de proteo coletiva
(EPC) e cumprir as normas de biossegurana.
Participar ativamente junto Comisso de Controle de Infeco Hospitalar (CCIH), forne-
cendo dados epidemiolgicos de diferentes agentes etiolgicos de infeco hospitalar e seus
perfsdesensibilidade.
Armazenar cepas de interesse para estudos.
Os resultados dos procedimentos e testes devem ser conferidos quanto exatido, reprodu-
tibilidade e concordncia com os padres de CQ pelo responsvel designado.
C) desempenho dos equipamentos e instrumentos
Elaborar e manter um programa de manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos.
Manter registro dirio de temperaturas dos equipamentos de banho-maria, estufa, freezer,
geladeira e meio ambiente.
Fazercontroledaefcciadoprocessodeesterilizaodasautoclaves(Bacillus stearother-
mophilus).
Dispor de manual de funcionamento do equipamento em portugus.
Estabelecer cronograma de manuteno preventiva.
Registrar a manuteno preventiva e corretiva dos equipamentos em uso.
Documentar o estado de calibrao dos equipamentos e instrumentos usados nos processos
analticos, como pipetas automticas e pipetadores, termmetros, centrfugas, microscpios,
espectrofotmetros, turbidmetro, balanas analticas, pHmetro, equipamentos analticos, etc.
Documentaraverifcaodofuncionamentodoequipamento.
Documentar a realizao da limpeza dos equipamentos.
Manter e documentar a higienizao peridica de fuxos, cabines de segurana, capelas,
geladeiras, freezer, banho-maria, centrfugas, estufas, etc.
M2 - - 3 Tecnologia em Servios de Sade
DocumentarautilizaodecepasderefernciaparaoCIQdeacordocomasespecifcaes
do equipamento.
Documentar alertas emitidos pelo equipamento.
Atualizar softwareacadamudana,documentandoasmodifcaes.
Defniroslimitesdeaceitabilidadeparaasinexatidesencontradasnascalibraes,verif-
caes e comparaes entre equipamentos, e garantir a implementao de aes corretivas
para os eventuais desvios.
d) Controle da Qualidade dos Insumos Laboratoriais (CQIL)
D1. Corantes e reagentes
Respeitar as orientaes escritas dos fabricantes para o uso dos reagentes.
Solicitar cpia dos laudos qualitativos junto ao fabricante para cada lote recebido.
Rotular cada produto com: nome, nmero do lote, concentrao, condies de estocagem,
data do preparo, recebimento, quando foi colocado em uso e prazo de validade.
Testar com controles positivos e negativos antes do uso, conforme o tipo de teste.
SeosresultadosnoforemsatisfatriosnotifcarofornecedoreoSNVS.
Descartar o produto se o controle no estiver apropriado.
Defniredocumentarograudepurezadaguareagenteutilizadanasanlises,assimcomo
a forma de obteno e controle dessa gua.
D2. Meios de cultura
Documentar a quantidade de meio preparado no laboratrio, nmero do lote, mtodo de
esterilizao, data do preparo, pH, validade e tcnico responsvel pela preparao.
Realizar e documentar teste de esterilidade e desempenho dos meios preparados no labo-
ratrio, utilizando cepas de referncia, tipo ATCC.
Observar o meio quanto a cor, consistncia, profundidade e/ou superfcie, hemlise, presena
de bolhas e contaminao.
Documentar o nmero do lote e a data de recebimento dos meios comerciais. Solicitar ao for-
necedorocertifcadodecontroledequalidade,conformerecomendaesdoCLSI.
Documentar os meios que no estejam de acordo com os padres, as aes corretivas tomadas
e informar ao fornecedor e ao SNVS.
D3. Discos e ftas E-test
Testar os discos ou ftas E-test de antimicrobianos, cartes ou painis com antibiticos,
diariamente, por 20 dias consecutivos, a fm de validar a metodologia. Utilizar cepas de
referncia, tipo ATCC.
Seguir, rigorosamente, as recomendaes do fabricante quanto ao armazenamento dos
discos antimicrobianos.
Documentar os discos de antimicrobianos que no estejam de acordo com os padres CLSI,
as aes corretivas tomadas e informar ao fornecedor e SNVS.
D4. Kits comerciais e anti-soros
Verifcarsehregistrodokit junto ao ministrio da sade www.anvisa.gov.br
Testar os kits e anti-soros de um novo lote em paralelo com o lote anterior ou com cepas de
referncia, antes de coloc-los em uso. Utilizar controles positivos e negativos, juntamente
com cepas de referncia recomendadas. Documentar os resultados desses testes.
M2 - - 4 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
Seguir as recomendaes do fabricante para o teste do controle da qualidade.
Registrar as informaes contidas no rtulo do Kit para rastreabilidade do processo.
NotifcaraofornecedoreSNVSosdesviosdequalidadeencontrados.
III - FaSe PS-aNaLTICa
Documentar a liberao de resultados, emisso e entrega de laudos.
Garantiraconfdencialidadedosresultadosdoslaudos.
Fornecer aos colaboradores uma avaliao peridica de desempenho do laboratrio no
controleinterno,verifcandoaabrangnciaeadequaodessescontroles.
2. CePaS de reFerNCIa
6,7
2.1. deFINIeS
6
As cepas de refernciadestinam-severifcaodosresultadosobtidos,poissuascaractersticas
fenotpicasjsoconhecidas,ouseja,suaidentifcaoeseuperfldesensibilidadejforamdeterminados.
Ascepasderefernciadevempossuirumaorigemconfvel,vindodeumlaboratriodereferncia
querealizatestesfenotpicosemolecularesparaconfrmarsuaidentifcaoeperfldesensibilidade.
Defne-secomocultura de estoque o subcultivo das cepas de referncia. Essa cultura ar-
mazenada no laboratrio de microbiologia (a -20
o
C ou menos) e descongelada anualmente.
A cultura de trabalho o subcultivo semanal ou mensal da cultura de estoque e ser mantida
no laboratrio (4
o
C a 8
o
C) para realizao dos testes dirios ou semanais de CIQ.
Uma passagem a transferncia do organismo de uma cultura vivel para um novo meio
de cultura com crescimento de microrganismos. A hidratao (ou decongelamento) de uma cepa de
referncia no considerada uma passagem ou repique. A primeira passagem ser o subcultivo da
cepa de referncia para a cultura de estoque. A transferncia do microrganismo da cultura de estoque
para a cultura de trabalho ser a segunda passagem (Figura 1).
Cepa de referncia Cultura de estoque
1 passagem
Cultura de trabalho
2 passagem
Figura 1. ProPagao da CuLTura de BaCTrIaS
4
M2 - - 5 Tecnologia em Servios de Sade
Microrganismos
Gram-negativos
2.2. Tabela 1: INdICao de uSo daS CePaS de reFerNCIa
4,5
Teste indicado
E. coli ATCC 25922
- Cepa no produtora de -lactamase.
E. coli ATCC 35218
- Cepa produtora de -lactamase
Deve ser mantida a -60
o
C para prevenir perda
do plasmdeo
E. coli ATCC 51446
K. pneumoniae ATCC 13883
K. pneumoniae ATCC 700603
- Cepa produtora de -lactamase de
espectro ampliado
Deve ser mantida a -60
o
C para prevenir perda
do plasmdeo
P. aeruginosa ATCC 27853
Sensvel aos agentes anti-pseudomas
P. mirabilis ATCC 7002
Qualidade da prova de DD e CIM de
enterobactrias
Qualidade da prova de DD e CIM de
Pseudomonas, Acinetobacter, S. maltophilia e
Burkholderia
Qualidade da prova de DD e CIM de Vibrio colerae
TestesdetriagemeconfrmatriodeESBL
Qualidade da prova em testes automatizados de
susceptibilidade em painis de gram negativos
Qualidade da prova de DD e CIM para de
-lactmicos e inibidores de -lactamase
Qualidade da prova de DD e CIM para Amoxacilina
- Ac. clavulnico de Haemophilus spp
VITEK GNS MIC painel QC set
Testes automatizados para inibidores de
-lactamase em painis de gram-negativos
Testes automatizados de para ESBL
Qualidade da prova em testes automatizados de
identifcaodebacilosgram-negativos
TestesdetriagemetesteconfrmatriodeESBL
Qualidade da prova em testes de diluio em
caldo e diluio em gar de P. aeruginosa e
outros no-enterobacteriaceas
Testesautomatizadosparaverifcaoda
concentrao de ction e pH com aminoglicosdeos
em painis de gram-negativos
Qualidade da prova em testes automatizados de
identifcaodebacilosgram-negativos
M2 - - 6 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
Microrganismos
Gram-positivos
2.2. Tabela 1: INdICao de uSo daS CePaS de reFerNCIa
4,5
Teste indicado
Adequao do meio para testes de sulfonamidas e
trimetropim, DD e CIM
Qualidade da prova de CIM para Enterococcus spp
Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos
aminoglicosdeos e vancomicina
Qualidade da prova em testes automatizados de
identifcaoesusceptibilidadedegram-positivos
Teste de triagem de alto nvel de resistncia aos
aminoglicosdeos e vancomicina
Testes automatizados de susceptibilidade a
vancomicina para gram-positivos
Qualidade da prova em testes de DD para
Staphylococcus spp, Enterococcus spp
Qualidade da prova em testes de CIM para
Staphylococcus spp
TesteconfrmatriodesusceptibilidadeaOxacilina
Qualidade da prova em testes automatizados de
identifcaoesusceptibilidadedegram-positivos
TesteconfrmatriodesusceptibilidadeaOxacilina
Qualidade da prova de DD da susceptibilidade de S.
pneumoniae ou Streptococcus spp
E. faecalis ATCC 29212
- Sensvel a vancomicina,
ampicilina e altos nveis de
aminoglicosdeos
E. faecalis ATCC 51299
- Resistente a vancomicina e altos
nveis de aminoglicosdeos
S. aureus ATCC 25923
- Cepa no produtora de -lactamase
S. aureus ATCC 29213
- Cepa produtora de -lactamase
S. aureus ATCC 43300
- Resistente a oxacilina
S. pneumoniae ATCC 49619
- Intermedirio para penicilina
Leveduras
Qualidade da prova em testes automatizados de
identifcaodeleveduras
Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
CIMeDDdefuconazol
Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
CIM de leveduras
Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
DDdefuconazol
Qualidade da prova em testes de susceptibilidade por
DDdefuconazol
C. albicans ATCC 14053
C. parapsilosis ATCC 22019
C. kruzei ATCC 6258
C. albicans ATCC
90028
C. tropicalis ATCC
750
M2 - C1 - 1 Tecnologia em Servios de Sade
1. CePaS de reFerNCIa
1.1. MaNuSeIo e eSToCageM
As cepas de referncia tm um nmero mximo de geraes a qual podem ser submetida, so
cinco passagens a partir da cepa de referncia original
6
.Onmeroindefnidodepassagenspodecom-
prometer principalmente a pureza da cultura e as caractersticas fenotpicas de algumas bactrias.
Seguindo os procedimentos descritos neste documento e em condies ideais de armazenagem,
a passagem para a produo das culturas de estoque pode ser anual e a passagem das culturas de
trabalho pode ser realizada a cada trs semanas.
Algumas cepas devem ser mantidas em condies especiais devido a suas caractersticas in-
trnsecas (ex. cepas exigentes).
As cepas de controle da qualidade devem ser testadas usando os mesmos materiais e mtodos
empregados para testes de isolados clnicos.
No caso de armazenamento prolongado, as culturas de referncia devem ser mantidas a tem-
peratura de -20
o
C, ou menos, (de preferncia a -60
o
C ou menos, ou em nitrognio lquido)
em meio estabilizador recomendado.
Meios utilizados para a manuteno das cepas de referncia (Figura 2):
Skin milk a 20% (p/v) de leite desnatado em p dissolvido em gua destilada, autoclavar
a 121
o
C por 20 minutos.
Caldo de soja trptica a 10 - 20% de glicerol (v/v), autoclavar 121
o
C por 20 minutos.
Sanguedecoelhodesfbrinado.
OBS: Os criotubos com selo de proteo interna so os mais utilizados para o processo de arma-
zenamento dessas amostras. Os criotubos so preparados com antecedncia, em volumes que
em geral esto em torno de 0,5mL por tubo, e previamente testados quanto esterilidade.
A) Partindodacepaoriginallioflizada:
Ressuspenderacepalioflizada,conformeasrecomendaesdofabricante.
Homogenizar o frasco.
Semearemmeiodeculturaespecfco(garSangue,MacConkeyougarChocolate).
Fazer dois repiques.
IdentifcaratravsdeprovasbioqumicasmanuaisouautomatizadasecoloraodeGram.
Realizar testes de sensibilidade antimicrobianos.
Depoisdecertifcaraidentifcaoeostestesdesensibilidade,armazenaracepa.
Transferir as colnias recentes de 18 a 24 horas, em 15 frascos estreis (criotubos), para cada
cepa de referncia a ser utilizada no controle.
Etiquetar os frascos com o nome do microrganismo, nmero da cepa de referncia, a data
do armazenamento e o ms a ser utilizado (janeiro a dezembro). Nos outros trs frascos,
colocar a data dos trs anos seguintes para realizar o mesmo procedimento.
Armazenar em freezer 20
o
C ou 60
o
C (Figura 2).
Captulo 1
Controle da qualidade em testes
de sensibilidade para Bacteriologia
M2 - C1 - 2 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
Figura 2. FLuxograMa Para MaNuSeIo e eSToCageM da CePa de reFerNCIa
gar de acordo com
o microrganismo
especfco
2 placas de gar
especfco+1
gar Seletivo
Armazenar todas
Freezer - 20C ou - 60C
Identifcaoeconfrmao
Provas Bioqumicas e
Colorao de Gram
Testedeperflde
sensibilidade
(Antibiograma)
Jan. Fev. Mar. Abr. Mai. Jun. Jul. Ago. Set. Out. Nov. Dez.
ATCC lioflozada
Hidratar
1 Repique
Verifcaraviabilidade,
pureza das colnias
2 Repique
Validao
Fazer o banco
2006
2007
2008
M2 - C1 - 3 Tecnologia em Servios de Sade
B) Partindodacepacongelada:
Retirar o criotubo com a cepa (ex.: janeiro) do freezer e com o auxlio de uma ala bacterio-
lgica,semearaamostraaindacongeladaemmeioespecfco.
Incubar a placa por 18 a 24 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
Fazer um segundo repique utilizando duas placas.
Numa das placas, fazer os testes de sensibilidade a antimicrobianos (para a 1 semana).
Na outra placa, semear a cepa em trs tubos de gar Meller Hinton inclinado.
Incubar por 18 a 20 horas em temperatura e atmosfera recomendadas.
Colocar esses tubos na geladeira ( 2 a 8
o
C) para serem utilizados nos testes de sensibilidade
aos antimicrobianos para a 2
a
, 3
a
e 4
a
semanas do ms, repicar apenas uma vez.
Esse procedimento deve ser realizado para todas as cepas envolvidas no CIQ (Figura 3).
OBS: As culturas congeladas ou lioflizadas devem ser cultivadas duas vezes antes de se
realizar os testes de sensibilidade.
Ateno especial manuteno do organismo (subcultivo mnimo) e seu armazenamento
(ex.- 60
o
C ou menos) so particularmente importantes para as cepas CIQ E. coli ATCC 35218
e K. pneumoniae ATCC 700603, visto que tem sido documentada a perda espontnea do
plasmdeoquecodifcaa-lactamase.
Deve-se preparar um novo lote de cultivos se forem obtidos resultados aberrantes.
Figura 3. FLuxograMa Para MaNuSeIo da CePa de reFerNCIa No CoNTroLe da QuaLIdade
gar MH inclinado
Janeiro
1 Repique
2 Repique
Geladeira
O 2 repique para
o uso na 1 semana
2 semana 3 semana 4 semana
M2 - C1 - 4 Implantao da Rede Nacional de Monitoramento da Resistncia Microbiana em Servios de Sade
2. CoNTroLe de TurBIdez Para a PreParo do INCuLo
7
Para padronizar a densidade do inculo para um teste de sensibilidade, deve-se usar um con-
trole de turbidez de BaSO
4
, equivalente a uma soluo padro 0,5 de McFarland ou seu equivalente
ptico (ex., suspenso de partculas de ltex). A soluo padro 0,5 de McFarland de BaSO4 pode ser
preparada da seguinte maneira.
Acrescenta-se uma alquota de 0,5mL de BaCl
2
0.048 mol/L (1,175% v/v BaCl
2
2H
2
O)
a 99,5mL de H
2
SO
4
0,18mol/L (1% v/v), homogeneizando constantemente para manter
a suspenso.
Adensidadecorretadocontroledeturbidezdeveserverifcadausandoumespectrofotmetro
com fonte de luz de 1-cm e cubeta apropriada para determinar a absorbncia. A absorbncia
da soluo padro 0,5 de McFarland dever variar de 0,08 a 0,10 utilizando um comprimento
de onda de 625 nm.
A suspenso de sulfato de brio deve ser transferida, em alquotas de 4 a 6 mL, para tubos
com tampas de rosca do mesmo tamanho usados para cultivar e diluir o inculo bacteriano.
Esses tubos devem ser selados hermeticamente e armazenados em local escuro, tempera-
tura ambiente.
O controle de turbidez de sulfato de brio deve ser agitado vigorosamente num misturador
mecnicotipovrtexantesdecadauso,verifcandoseestuniformementetrbido.Nocaso
de precipitao visvel, o controle deve ser substitudo. As suspenses de partculas de ltex
devem ser misturadas invertendo-as suavemente, e no num misturador tipo vrtex.
Oscontrolesdesulfatodebriodevemsersubstitudos,ousuasdensidadesverifcadas,
todo ms.
3. MTodo de dISCo-dIFuSo
O mtodo de Kirby-Bauer ou disco-difuso recomendado para algumas combinaes micror-
ganismo/ antimicrobiano e muito utilizado em nosso meio. Sua praticidade, baixo custo e facilidade
operacional facilitam a implantao deste mtodo nos laboratrios de microbiologia clnica.
Alguns fatores relacionados ao preparo do meio de cultura e sua composio podem interferir
noresultadofnalliberadopelolaboratrio.Aconfrmaodaqualidade,esterilidadeecomposio
do meio de cultura devem ser avaliadas atravs dos testes de CIQ.
3.1. FreQNCIa doS TeSTeS de CoNTroLe da QuaLIdade
A freqncia dos testes de CIQ deve ser no mnimo mensal. Entretanto, as recomendaes
nacionais e internacionais
2,6
preconizam testes semanais. Essas recomendaes devem ser seguidas
se a estrutura ou a capacidade do laboratrio permitir.
A introduo do programa de CIQ inicia-se com a realizao de testes dirios, passando, em
fase posterior, para a realizao mensal dos testes.
Teste dirio - Testar todas as cepas de controle pertinentes durante cinco dias consecutivos
e documentar os resultados.
Para passar a realizao dos testes de diria para mensal nenhuma das cinco leituras de halos,
para cada combinao de agente/antimicrobiano, pode estar fora dos limites aceitveis.
M2 - C1 - 5 Tecnologia em Servios de Sade
Teste mensal - Testar todas as cepas de CIQ no mnimo mensalmente e sempre que qual-
quer novo reagente do teste for utilizado (ex.: um novo lote de gar ou meio, um novo lote
de discos ou outro fabricante de insumos).
Documentar a realizao dos testes de controle da qualidade, anotando os nmeros dos lotes,
meios de cultura, reagentes, discos de antibiticos testados nas respectivas datas e ms.
Sempre que algum resultado dos testes mensal de controle da qualidade estiver fora da faixa
aceitvel, faz-se necessrio implantar ao corretiva
6
.
Sempre que um novo agente antimicrobiano for acrescentado ou houver mudanas impor-
tantes no mtodo de leitura dos resultados dos testes, estes devem ser realizados por cinco
dias consecutivos e documentados, antes de se passar para uma freqncia mensal.
3.2. TeSTe de CoNTroLe da QuaLIdade doS MeIoS de CuLTura
6
a) Meio de cultura
O meio indicado para os testes de disco-difuso em organismos no fastidiosos o gar Meller-
Hinton (MH).
B) espessura
A espessura do meio deve ser de 4 mm uniformemente distribuda. Volumes mdios utilizados:
60 a 70 mL / placa de 150 mm e 25 mL / placa de 90 mm.
C) esterilidade
Apspreparodasplacas,examinarumaamostrasignifcativa(10%)ealeatriadecadalote
dasplacasparaconfrmarsuaesterilidade,mediantesuaincubaoa30C-35Cpor,pelo
menos, 24 horas.
As placas devem ser usadas at sete dias aps o preparo, a no ser que sejam tomadas precaues
adequadas, como embrulh-las em saco plstico, para minimizar o ressecamento do gar.
d) pH
OpHdecadalotedegarMeller-Hintondeveserverifcadoquandoogarpreparado.
OmeiogardeverterpHentre7,2e7,4atemperaturaambienteapssolidifcao.
A medida do pH deve ser feita preferencialmente atravs de pHmetro apropriado, submerso
emporodemeiosolidifcadotemperaturaambiente.Casoestejaforadasespecifcaes,
deve-se checar a procedncia do meio, a qualidade da gua e, eventualmente, preparar novo
lote seguindo estritamente as recomendaes do fabricante
6
.
MtodosdeverifcaodepH(verCLSINormaM2-A9
6
ou norma substituta):
Macerarumaquantidadesufcientedegarparasubmergirapontadeumeletrododo
pHmetro calibrado.
Oupermitirqueumapequenaquantidadedegarsolidifque-seemtornodapontade
um eletrodo do pHmetro calibrado.
Ou em um bquer contendo o gar usar um eletrodo de superfcie devidamente calibrado.
e) efeitos da timidina ou timina
Excesso dessas substncias pode levar a falsas resistncias para sulfa-trimetoprim. Portanto,
deve-se usar meio gar Meller-Hinton com o menor teor possvel de timina ou timidina