ROZDZIAŁ

Mapowanie genomów
technikami genetycznymi

Spis treści
2.1 Mapy genetyczne i fizyczne 15
2.2 Markery dla map genetycznych 15
2.2.1 Geny były pierwszymi stosowanymi markerami 15
2.2.2 Markery DNA do mapowania genetycznego 18
2.3 Sposoby podejścia do mapowania genetycznego 22
2.3.1 Analiza sprzężeń jest podstawą mapowania
genetycznego 22
2.3.2 Przeprowadzanie analizy sprzężeń u różnych
typów organizmów 28
 14 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

Fakty i założenia
Mapowanie genetyczne do tworzenia map genomów wykorzystuje takie techniki
genetyczne jak krzyżowanie organizmów i analiza rodowodów.
Pierwotnie jako markerów używano genów, lecz obecnie uzupełniono je o markery
DNA takie jak RFLP, SSLP i SNP.
Podstawą mapowania genetycznego jest obliczenie częstości rekombinacji poprzez analizę
sprzężeń.
Jeśli możliwe są eksperymenty hodowlane, to przeprowadza się dwu- lub wielopunktowe
krzyżówki testowe.
Trudności w mapowaniu genów u człowieka wynikają z ograniczeń analizy rodowodów.
Analiza genetyczna bakterii wymaga przeniesienia genów z jednej komórki do drugiej.

Następne trzy rozdziały opisują techniki i strategie Samo podejście „shotgun" jest więc nieodpowiednie
stosowane do otrzymania sekwencji genomu. Techniki dla większych, bardziej złożonych genomów. Zamiast
te obejmują znacznie więcej niż tylko same m e t o d y tego, wpierw należy stworzyć mapę genomu. Mapa
sekwencjonowania DNA, które oczywiście mają fun­ genomu stanowi przewodnik do prac nad sekwen-
damentalne znaczenie. Mają także j e d n o p o d s t a w o w e cjonowaniem, pokazując pozycje genów i innych
ograniczenie: nawet stosując najbardziej rozwinięte charakterystycznych rodzajów sekwencji.
technologie, rzadko m o ż n a w j e d n y m eksperymencie Gdy dostępna jest mapa, fazę sekwencjonowania
otrzymać sekwencję dłuższą niż 750 bp, co oznacza, że można przeprowadzić na jeden z dwóch sposobów
sekwencję długiej cząsteczki DNA trzeba składać z serii (rys. 2.3):
krótszych sekwencji. Jednym z podejść jest podzielenie
cząsteczki na fragmenty, ustalenie sekwencji każdego
z nich i użycie komputera do znalezienia zachodzących DNA
na siebie fragmentów, a następnie złożenie oryginalnej
sekwencji (rys. 2.1). Opisana strategia typu „shotgun"
stanowi standardowe podejście do sekwencjonowania
małych g e n o m ó w prokariotycznych, ale ze wzrostem
fragmenty
liczbv fragmentów, niezbędna analiza danych staje się
niewspółmiernie bardziej złożona (dla n fragmentów
liczbę możliwych zakładek opisuje 2n2-2n). Drugim
problemem w metodzie „shotgun" jest możliwość sekwencje
powstawania błędów podczas analizy repetycyjnych
regionów genomu. Jeśli sekwencję zawierającą po­
wtórzenia podzieli się na fragmenty, w wielu otrzy­
Rysunek 2.1 Podejście „shotgun" do składania sekwencji
manych kawałkach będą takie same lub bardzo podob­
ne motywy sekwencyjne. Łatwo m o ż n a złożyć te Cząsteczkę D N A dzieli się na mate fragmenty, z których każdy
sekwencje tak, że część regionów powtarzających się jest sekwencjonowany. Oryginalną sekwencję składa się przez
zostanie usunięta, a n a w e t tak, że dwa fragmenty tego poszukiwanie zachodzących na siebie kawałków sekwencji
samego lub różnych chromosomów zostaną ze sobą pochodzących z poszczególnych fragmentów. W praktyce, by
ustalić, że dwie sekwencje należy ze sobą połączyć, potrzeba
błędnie połączone (rys. 2.2).
zakładki o długości kilkudziesięciu par zasad

powtarzający się DNA
DNA
500 bp
fragmenty
sekwencje
nieprawidłowa
zakładka
Rysunek 2.2 Problemy spotykane przy podejściu „shotgun"
W przedstawionym przykładzie cząsteczka D N A zawiera dwa
segmenty powtarzającego się D N A , z których każdy składa się
z wielu kopii m o t y w u GATTA. Podczas badania sekwencji okazuje
się, że d w a fragmenty z różnych części D N A zachodzą na siebie.
Może to prowadzić do błędnej interpretacji, w której centralny
segment cząsteczki D N A zostanie pominięty, a jeśli dwa
powtarzalne segmenty D N A pochodziły z różnych
c h r o m o s o m ó w , sekwencje tych c h r o m o s o m ó w mogą zostać
błędnie złożone
• Przez zastosowanie kontigów klonów (sekcja 4.2.2).
Genom dzieli się na nadające się do obróbki seg­
menty, każdy o długości kilkuset kb lub kilku Mb,
sekwencjonowane następnie indywidualnie, prze­
ważnie metodą „shotgun". Po ukończeniu sekwen-
cjonowania segmentu można go umieścić w prawi­
dłowym miejscu na mapie.
• Poprzez ukierunkowaną strategię „shotgun" (sek­
cja 4.2.3). Strategia ta wykorzystuje określone pun­
kty na mapie genomu jako znaczniki do pomocy
w składaniu głównej sekwencji z wielkiej liczby
krótkich sekwencji otrzymanych przez podejście
„shotgun". Mapy używa się także do sprawdzenia,
czy nie popełniono błędów w składaniu sekwencji
regionów powtarzalnych. Teoretycznie w ten spo­
sób można zsekwencjonować cały genom człowieka
(Venter i wsp., 1998).
W obu podejściach mapa stanowi szkic do kolejnej
fazy projektu, czyli sekwencjonowania. Pewne typy
map wskazują także pozycje genów, umożliwiając
skierowanie początkowej fazy projektu sekwencjono­
wania na interesujące regiony genomu tak, aby sek­
wencje istotnych genów otrzymać tak szybko, jak to
jest możliwe. Z tych powodów pierwsze 6 lat Projektu
Poznania Genomu Człowieka poświęcono prawie cał­
kowicie na mapowanie genomu człowieka, a nie na
jego sekwencjonowanie.
2.1 MAPY GENETYCZNE I FIZYCZNE
Tradycyjnie metody mapowania genomu dzieli się na
dwie kategorie
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 15
Mapowanie genetyczne opiera się na stosowaniu
technik genetycznych do konstruowania map po­
kazujących pozycje genów i innych charakterys­
tycznych rodzajów sekwencji w genomie. Techniki
genetyczne obejmują krzyżowanie organizmów lub,
w przypadku ludzi, badanie historii rodzin (rodo­
wodów). Mapowanie genetyczne opisano w tym
rozdziale.
Mapowanie fizyczne wykorzystuje techniki biologii
molekularnej do badania cząsteczek DNA bezpo
średnio w celu skonstruowania map pokazujących
pozycje różnych typów sekwencji z genami włącz
nie. Mapowanie fizyczne opisano w następnym
rozdziale.
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH
Jak każdy rodzaj mapy, mapa genetyczna musi poka­
zywać pozycje poszczególnych genów w stosunku do
określonych wyznaczników, czyli markerów. Na ma­
pach geograficznych takimi markerami są rozpozna­
walne składniki krajobrazu, jak rzeki, drogi i budynki.
A jakich markerów możemy użyć w krajobrazie gene­
tycznym?
2.2.1 Geny byty pierwszymi stosowanymi
markerami
W pierwszych mapach genetycznych, konstruowanych
na początku XX wieku dla organizmów takich jak
muszka owocowa, jako markerów używano genów.
Było to wiele lat przed tym, nim zrozumiano, że geny
są segmentami cząsteczek DNA. Geny traktowano
wówczas jako abstrakcyjne jednostki odpowiedzialne
za przekazywanie cech dziedzicznych z rodziców na
potomstwo. By być użyteczną w analizie genetycznej,
cecha dziedziczna musi występować w dwóch alter­
natywnych formach lub fenotypach, czego przykładem
jest występowanie długich i krótkich łodyg u roślin
groszku badanego przez Mendla. Każdy fenotyp jest
określany przez inny allel odpowiadającego mu genu.
Na początku jedynymi genami nadającymi się do
badania były takie, które odpowiadały fenotypom
rozróżnialnym wzrokowo. Tak więc na przykład pierw­
sze mapy genomu muszki owocowej pokazywały
pozycje genów odpowiedzialnych za barwę ciała, kolor
oczu, kształt skrzydeł i podobnych. Wszystkie wymie­
nione fenotypy można obserwować po prostu patrząc
na muchy przez lupę o niewielkim powiększeniu lub
okiem nieuzbrojonym. We wczesnych latach genetyki
takie podejście było odpowiednie, ale genetycy szybko
zdali sobie sprawę, że w ten sposób można badać
dziedziczenie zaledwie ograniczonej liczby fenotypów
nadających się do obserwacji wzrokowej, a w wielu
przypadkach analiza jest trudniejsza, ponieważ na
pojedynczą cechę fizyczną wpływa więcej niż jeden
16 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

500 kb markery
Analiza kontigów Analiza typu
klonów „shotgun"

mapa genomowa
mapowany
segment DNA

sekwencjonowanie
metodą „shotgun"
catego genomu

sekwencjonowanie
„shotgun"
zmapowanego
segmentu

złożone
sekwencje
złożona
sekwencja

markery używane do
pozycja zakotwiczenia złożonych
sekwencji jest sekwencji na mapie
już znana

Rysunek 2.3 Alternatywne podejścia do sekwencjonowania genomu

Zmapowano genom, składający się z liniowej cząsteczki D N A długości 2,5 Mb i poznano pozycje ośmiu markerów (A-H). Z lewej
- analiza kontigów klonów rozpoczyna się od segmentu D N A , którego pozycję na mapie genomu zidentyfikowano, ponieważ zawiera)
markery A i B. Segment sekwencjonuje się metodą „shotgun" i otrzymaną sekwencję umieszcza się w znanej pozycji na mapie. Z prawej
- ukierunkowana strategia „shotgun" obejmuje losowe sekwencjonowanie całego genomu. Uzyskuje się kawałki nieprzerwanych
sekwencji, prawdopodobnie o długości setek kb. Jeśli nieprzerwana sekwencja zawiera marker, to można ją umieścić w odpowiednim
miejscu na mapie. Zauważ, że w obu metodach im więcej markerów znajduje się na mapie genomu, tym lepiej. Więcej szczegółów
dotyczących tych strategii sekwencjonowania - patrz podrozdział 4.2.

gen. Na przykład do roku 1922 zmapowano ponad 50
genów na czterech chromosomach muszki owocowej,
lecz dziewięć z nich stanowiły geny koloru oczu
i każdy nowicjusz, mający nadzieję na wniesienie
czegoś nowego do tej dziedziny, wpierw musiał
nauczyć się rozróżniać kolory oczu muchy: czerwony,
jasnoczerwony i inne odcienie czerwieni, takie jak:
cynober (cinnabar, vermilion), kolor granatu (garnet),
cielisty (carnation), sepia, szkarłat (scarlet), różowy
(pink), purpura (cardinal) lub bordo (claret). Aby
stworzyć bardziej ogólne mapy genów, konieczne
stało się znalezienie cech bardziej policzalnych, dają­
cych się lepiej rozróżniać i mniej złożonych niż nada­
jące się do obserwacji wzrokowej.
Odpowiedzią było wykorzystanie biochemii do roz­
różniania fenotypów, szczególnie ważne u dwóch ty­
pów organizmów - mikroorganizmów i ludzi. Mikro­
organizmy, jak na przykład bakterie i drożdże, mają
niewiele cech, które można obserwować wzrokowo,
więc mapowanie genów tych organizmów musi opierać
się na fenotypach biochemicznych, takich jak wymie­
nione w tabeli 2.1. Ludzie także mają cechy obserwowal-
ne wzrokowo, ale już od lat dwudziestych badano
fenotypy biochemiczne uzyskiwane przez typowanie
krwi, i były to nie tylko standardowe grupy krwi jak
ABO (Yamamoto i wsp., 1990), lecz także warianty
alleliczne białek osocza krwi i białka immunologiczne,
jak antygeny leukocytów człowieka (system HLA - ang.
human leukocyte antigens). Dużą przewagą takich
markerów nad fenotypami widzialnymi jest występowa­
nie alleli wielokrotnych w wielu istotnych genach
(Mori i wsp., 1997). Na przykład gen nazywany HLA-
-DRB1 posiada przynajmniej 59 alleli, a HLA-B przynaj­
mniej 60. Ma to znaczenie ze względu na sposób, w jaki
 2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 17

R a m k a 2 . 1 : K r ó t k i p r z e w o d n i k p o genetyce
mendlowskiej krzyżówka jednopunktowa

Mapowanie genetyczne opiera się na zasadach dziedziczenia rodzice

po raz pierwszy opisanych przez Grzegorza Mendla w roku
genotypy F1
1865 (Orel, 1995). Z wyników krzyżowania roślin grochu
Mendel wyciągnął wniosek, że każda roślina grochu ma dwa
allele każdego genu, ale tylko jeden fenotyp. Łatwo to
zrozumieć, gdy roślina należy do czystej linii lub jest homo- fenotypy F1
zygotą pod względem konkretnej cechy, gdyż wtedy ma dwa
identyczne allele i odpowiedni fenotyp. Jednakże Mendel
krzyżówka dwupunktowa
wykazał, że jeśli skrzyżuje się dwie czyste linie o różnych
fenotypach, całe potomstwo (pokolenie F1) ma ten sam
rodzice wysoki okrągłe TtRr x TtRr wysoki okrągłe
fenotyp. Członkowie pokolenia F1 muszą być heterozygota-
mi pod względem badanego fenotypu, gdyż dziedziczą po genotypy F1 TR Tr tR tr
jednym allelu od każdego z rodziców. Fenotyp rośliny F1 jest TR TTRR TTRr TtRR TtRr
więc dominujący nad drugim, recesywnym fenotypem. Tr TTRr TTrr TtRr Ttrr
tR TtRR TtRr ttRR ttRr
tr TtRr Ttrr ttRr ttrr

fenotypy F1 9 wysokich, okrągłe : 3 wysokie, pomarszczone :

Gen Allele
3 niskie, okrągłe: 1 niski, pomarszczone
wysokość wysoki T niski t
nasiona grochu okrągłe R pomarszczone t

dalnej i że sposób, w jaki allele są przenoszone z rodziców na

rodzice wysoki TTxtt niski okrągłe RR x rr pomarszczone
potomstwo, zgodnie z tym co wydedukował Mendel, od­
rośiiny F1 dziedziczą po jednym allelu od każdego z rodziców
powiada wydarzeniom zachodzącym podczas wytwarzania
genotypy F1 wszystkie Tt wszystkie Rr
haploidalnych gamet podczas mejozy (patrz rys. 2.10). Za­
Fenotypy F1 wszystkie wysokie wszystkie okrągłe
uważamy również, że prosta reguła dominacji-recesywności
wniosek wysoki jest dominujący okrągłe jest dominujące
zaproponowana przez Mendla może się skomplikować w sy­
tuacjach, których nie spotkał u swoich roślin grochu. Jedną
z nich jest niepełna dominacja, gdy fenotyp heterozygoty
Mendel przeprowadził dodatkowe krzyżówki, które umoż­ jest pośredni między dwiema formami homozygotycznymi.
liwiły mu sformułowanie dwóch praw genetyki. Pierwsze Na przykład jeśli czerwone goździki krzyżuje się z białymi, to
prawo mówi, że allele segregują przypadkowo. Innymi w F1 heterozygoty są różowe. Inną komplikacją jest kodo-
słowy, jeśli rodzic ma allele A i a, to osobnik z pokolenia F1 ma minacja, gdy oba allele można wykryć u heterozygoty.
taką samą szansę odziedziczenia A jak a. Drugie prawo mówi, Kodominacja jest sytuacją typową dla markerów DNA, któ­
że pory alleli segregują niezależnie, czyli dziedziczenie alleli rych allele można wykryć bezpośrednio metodami badania
genu A jest niezależne od dziedziczenia alleli genu B. Dzięki DNA (sekcja 2.2.2). Mendel popełnił tylko jeden poważny
tym prawom wyniki krzyżówek genetycznych są przewidywal­ błąd: jego drugie prawo nie zakłada istnienia sprzężeń, czyli
ne, jak to pokazują przykłady u góry następnej kolumny. możliwości, żeby allele dwóch genów dziedziczyły się wspól­
Wielkim wkładem Mendla do współczesnej genetyki było, nie, ponieważ znajdują się na jednym chromosomie. Jak
że niemal bezbłędnie określił sposób dziedziczenia genów. zobaczymy w sekcji 2.3.1, odkrycie sprzężeń przez następców
Teraz wiemy, że dwa allele genu są niesione przez dwa Mendla doprowadziło do metod stosowanych w mapowaniu
chromosomy homologiczne (patrz s. 25) w komórce diploi- genetycznym.

Tabela 2.1 Typowe markery biochemiczne używane w analizie genetycznej Saccharomyces cerevisiae

Marker Fenotyp Metoda identyfikacji komórek niosących marker

ADE2 wymaga adeniny rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecna adenina
CANI oporny na kanawaninę rośnie w obecności kanawaniny
CUPI oporny na miedź rośnie w obecności miedzi
CYHI oporny na cykloheksimid rośnie w obecności cykloheksimidu
LEU2 wymaga leucyny rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecna leucyna
SUC2 zdolny do fermentacji sacharozy rośnie, gdy sacharoza jest jedynym węglowodanem w pożywce
URA3 wymaga uracylu rośnie tylko wtedy, gdy w pożywce jest obecny uracyl
18 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
przeprowadza się mapowanie genów człowieka (sekcja
2.3.2). Zamiast przeprowadzić wiele eksperymentów
krzyżówkowych, co jest procedurą stosowaną do or­
ganizmów eksperymentalnych, takich jak muszki owo­
cowe czy myszy, dane o dziedziczeniu genów ludzkich
trzeba zbierać przez badanie fenotypów członków
jednej rodziny. Jeśli członkowie rodziny są homo-
zygotami pod względem badanego genu, nie uzyskuje
się żadnej użytecznej informacji. Może się to często
zdarzać, jeśli gen ma zaledwie dwa allele, ponieważ
przypadkowo małżeństwo zawarły osoby homozygo-
tyczne względem tego samego allelu. Jest to mniej
prawdopodobne, jeśli badany gen ma 60 alleli, a nie dwa.
2.2.2 Markery DNA do mapowania
genetycznego
Geny są bardzo użytecznymi, jednak nie idealnymi,
markerami. Jeden problem, szczególnie w badaniu
większych genomów - kręgowców i roślin kwiato­
wych, stanowi to, że mapa oparta całkowicie na genach
nie jest zbyt szczegółowa. Byłoby to prawdą, nawet
jeśli można by zmapować każdy gen, ponieważ jak
zobaczyliśmy w rozdziale 1, w genomach tych or­
ganizmów geny są poprzedzielane dużymi przerwami
(patrz rys. 1.7, s. 10). Problem jest tym trudniejszy, że
zaledwie część pełnej liczby genów występuje w for­
mach allelicznych łatwych do odróżnienia. Mapy
genów nie są więc zbyt dokładne. Potrzebujemy
innych typów markerów.
Mapowane cechy nie będące genami nazywa się
markerami DNA. Tak jak markery genowe, aby były
użyteczne, markery DNA muszą występować w przy­
najmniej dwóch formach allelicznych. Trzy typy cech
sekwencji DNA odpowiadają temu wymogowi.
Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
(RFLP)
RFLP (ang. restriction fragment length polymorphism)
były pierwszymi badanymi typami markerów DNA.
Fragmenty restrykcyjne powstają, gdy na cząsteczkę
DNA działa się endonukleazą restrykcyjną, będącą
typem enzymu tnącego cząsteczki DNA w określonych
sekwencjach (patrz Metody badań 3.1, s. 40). Na przy­
kład endonukleazą restrykcyjna EcoRI tnie dwuniciowy
DNA jedynie w obrębie sekwencji:
5' - GAATTC - 3'
3' - CTTAAG - 5'
Taka specyficzność sekwencyjna oznacza, że trawienie
określonej cząsteczki DNA danym enzymem restryk­
cyjnym powinno zawsze dawać ten sam zestaw frag­
mentów. Nie zawsze jest to prawdą w przypadku
cząsteczek genomowego DNA, ponieważ niektóre
miejsca restrykcyjne są polimorficzne, występują jako
dwa allele: jeden allel mający prawidłową sekwencję
dla miejsca restrykcyjnego, i w związku z tym cięty
podczas trawienia DNA enzymem, oraz drugi allel
polimorfczne miejsce restrykcyjne
dodanie nukleazy
restrykcyjnej
4 fragmenty 3 fragmenty
Rysunek 2.4 Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych
(RFLP)
Cząsteczka D N A z lewej strony ma polimorficzne miejsce
restrykcyjne (oznaczone gwiazdką) nieobecne w cząsteczce po
stronie prawej. RFLP ujawnia się po działaniu enzymem
restrykcyjnym, ponieważ jedna cząsteczka jest cięta na cztery
fragmenty, podczas gdy druga jest cięta na trzy fragmenty
- z taką zmianą, że miejsce restrykcyjne nie jest
rozpoznawane. W drugim przypadku dwa graniczące
fragmenty restrykcyjne po traktowaniu enzymem
pozostają ze sobą złączone, co prowadzi do poli­
morfizmu długości (rys. 2.4). To jest RFLP, a jego
pozycję na mapie można odnaleźć przez prześle­
dzenie dziedziczenia jego form allelicznych, tak jak
wtedy, gdy stosowanymi markerami są geny. Uważa
się, że w genomie człowieka jest około 105 RFLP,
ale oczywiście dla każdego RFLP występować mogą
tylko dwa allele (z miejscem restrykcyjnym i bez).
Wartość RFLP w mapowaniu genów człowieka jest
więc ograniczana przez duże prawdopodobieństwo,
że rodzina będzie całkowicie homozygotyczna pod
względem danego RFLP.
W celu oznaczenia RFLP niezbędne jest określenie
wielkości tylko jednego lub dwóch pojedynczych
fragmentów restrykcyjnych na tle wielu nieistotnych
fragmentów. Nie jest to łatwy problem: enzym EcoRI,
rozpoznający sekwencję o długości 6 bp, może ciąć
DNA raz na 46 (czyli raz na 4096 bp), (sekcja 3.1.2).
Jeśli przecinamy ludzki DNA, to otrzymamy prawie
750000 fragmentów. Na szczęście istnieją techniki
umożliwiające wykrycie pojedynczych fragmentów:
• Hybrydyzacja metodą Southerna (patrz Metody
badań 2.1) była pierwszą techniką stosowaną do
oznaczania RFLP. Fragmenty DNA otrzymane po
trawieniu rozdziela się przez elektroforezę w żelu
agarozowym, a poszukiwane wykrywa się dzięki
hybrydyzacji z sondą.
• Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR - ang.
polymerase chain reaction), (patrz Metody badań
2.2) jest obecnie stosowana powszechniej, ponieważ
jest szybsza niż analiza Southerna. W reakcji PCR
region DNA zawierający RFLP namnaża się do
wielu kopii przed pocięciem DNA enzymem re­
strykcyjnym. Wówczas RFLP można uwidocznić
przez barwienie fragmentów restrykcyjnych brom­
kiem etydyny w żelu agarozowym, co jest metodą

Hybrydyzacja m e t o d ą Southerna
Wykrywanie określonych fragmentów restrykcyjnych na tle wielu innych fragmentów
restrykcyjnych
W hybrydyzacji metodą Southerna zestaw fragmentów re­
strykcyjnych przenosi się z żelu agarozowego na błonę
nylonową i specyficzny, badany fragment wykrywa się przez
hybrydyzację z sondą. Technika ta, oprócz zastosowania do
mapowania RFLP (sekcja 2.2.2), jest także używana w innych
procedurach wymagających identyfikacji szczególnych frag­
mentów restrykcyjnych, na przykład do sprawdzenia klono­
wanego fragmentu (Metody badań 3.4, s. 52)
Elektroforeza w żelu agarozowym (Metody badań 3.2, s. 43)
służy do rozdzielania liniowych cząsteczek DNA, takich jak
fragmenty restrykcyjne, zależnie od ich wielkości. Jeśli trawie­
nie dało tylko kilka fragmentów, to każdy tworzy oddzielny
prążek, który można zobaczyć po wybarwieniu żelu brom­
kiem etydyny. Jeżeli jest więcej niż około 50 fragmentów,
prążki łączą się ze sobą tworząc smugę i nie można zobaczyć
pojedynczych fragmentów. Wówczas fragmenty przenosi się
na błonę nylonową po prostu kładąc ją na żelu. Bufor
przesiąkając przenosi DNA z żelu na błonę, do której DNA
się przyłącza (rysunek u góry). Do przenoszenia można kupić
drogą maszynę, lecz prościej użyć pliku papierowych ręcz­
ników.
Sondą do hybrydyzacji jest wyznakowana cząsteczka DNA
o sekwencji komplementarnej do docelowego DNA, który
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 19
chcemy wykryć. Ponieważ sonda i docelowy DNA są kom­
plementarne, mogą tworzyć pary czyli hybrydyzować. Po­
zycję docelowego fragmentu restrykcyjnego na filtrze iden­
tyfikuje się przez wykrycie sygnału znacznika dołączonego
do sondy. Sondą może być syntetyczny nukleotyd (patrz
rys. 2.7) lub sklonowany fragment DNA (Metody badań
3.4, s. 52). W wykrywaniu RFLP sondą jest przeważnie
sklonowany fragment obejmujący polimorficzne miejsce re­
strykcyjne.
Aby przeprowadzić hybrydyzację, błonę umieszcza się
w szklanej butelce z wyznakowaną sondą oraz buforem
i delikatnie obraca przez kilka godzin, aby sonda miała
możliwość hybrydyzowania z docelowym DNA. Następnie
błonę płucze się w celu usunięcia sondy, która nie zhyb-
rydyzowała, i wykrywa się sygnał znacznika. Szczegóły zna­
kowania i detekcji prezentują Metody badań 3.3, s. 46;
w poniższym przykładzie sondę wyznakowano radioaktywnie,
a sygnał wykrywa się stosując autoradiografię. Na auto-
radiogramie widoczne są prążki komplementarne z sondą.
Widzimy, że w ścieżce 2 jest tylko jeden hybrydyzujący
prążek, a w ścieżce 3 dwa prążki. DNA w ścieżce 3 został
przecięty w polimorficznym miejscu restrykcyjnym, natomiast
w ścieżce 2 - nie.
20 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

Reakcja łańcuchowa polimerazy

Wykładnicze namnażanie wybranego regionu cząsteczki D N A

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR - ang. polymerase Ponieważ polimeraza Taq jest termostabilna, mieszaninę
chain reaction) prowadzi do powielenia wybranego fragmentu reakcyjną można podgrzać do 90°C bez niszczenia aktywności
cząsteczki DNA. Bez trudu można namnażać odcinki długości enzymu. W tej temperaturze nowe nici oddzielają się od
nawet ponad 5 kb, a po zmodyfikowaniu standardowej matrycowego DNA. Po ochłodzeniu mieszaniny do mat­
techniki możliwe są dłuższe amplifikacje - aż do 40 kb. rycowego DNA, a także do nowych nici, przyłącza się więcej
Technika PCR ma wiele zastosowań w biologii molekularnej, starterów. Wtedy polimeraza Taq przeprowadza drugi cykl
na przykład w mapowaniu DNA (patrz sekcja 2.2.2), sekwen- syntezy DNA.
cjonowaniu DNA (patrz sekcje 4.1.1 i 4.2.1) i filogenetyce
molekularnej (rozdział 15). Zmodyfikowaną wersję reakcji
PCR można stosować do namnażania cząsteczek RNA w po­
staci DNA (Metody badań 5.1, s. 91). Technika PCR jest także
szeroko używana w wyspecjalizowanych dziedzinach, takich
jak medycyna sądowa i diagnostyka kliniczna, gdzie szczególnie
użyteczna jest możliwość pracy z niewielką wyjściową liczbą
cząsteczek.
Reakcję przeprowadza się przez zmieszanie ze sobą cząs­
teczki DNA stanowiącej matrycę, która może być obecna
w bardzo niewielkich ilościach, oraz nukleotydów, dwóch
syntetycznych oligonukleotydowych starterów i termostabil-
nej polimerazy DNA (patrz Metody badań 4.2, s. 64), odpornej
na denaturację pod wpływem wysokiej temperatury. Zwykle
używa się polimerazy Taq z bakterii Thermus aquaticus żyjącej
w gorących źródłach. Dwa startery muszą się przyłączyć do
matrycy na obu końcach namnażanego regionu, co oznacza,
że aby przygotować odpowiednie oligonukleotydy, musimy PCR można kontynuować przez 30-40 cykli, nim enzym
znać skrajne sekwencje. Oligonukleotydy zapoczątkowują ulegnie ostatecznej inaktywacji albo startery lub nukleotydy
syntezę nowego, komplementarnego polinukleotydu tworzo­ zostaną zużyte. Pojedynczą cząsteczkę wyjściową można
nego - jak we wszystkich enzymatycznych syntezach DNA namnożyć do dziesiątek milionów identycznych fragmentów,
- w kierunku od 5' do 3' przez kopiowanie matrycowego co stanowi kilka mikrogramów DNA. Obecność polimorficz-
DNA w kierunku od 3' do 5' (patrz rys. /./, s. 3 i sekcja nego miejsca restrykcyjnego w namnożonym regionie można
12.3.2). sprawdzić przez trawienie produktu reakcji PCR enzymem
restrykcyjnym i sprawdzenie próbki w żelu agarozowym.

mniej czułą niż hybrydyzacja z sondą. Tło niena-
mnożonego DNA nie pokazuje się, jedynymi wi­
docznymi fragmentami są te, które pochodzą z na­
mnożonego DNA.
Zauważmy, że techniki te bezpośrednio wykrywają
oba allele RFLP: oznacza to, że (jak przy innych
markerach DNA) allele są kodominujące.
Polimorfizm długości prostych sekwencji (SSLP)
SSLP (ang. - simple sequence length polymorphism)
są szeregami powtórzeń sekwencji, przejawiającymi
różnice długości, a wiec różnymi allelami zawierający­
mi różną liczbę jednostek powtarzalnych (rys. 1.5A).
W odróżnieniu od RFLP, SSLP może być wieloallelowe,
bo każdy SSLP może mieć wiele różnych wariantów
długości. Istnieją dwa typy SSLP:
• Minisatelity, z n a n e także jako zmienna liczba
powtórzeń tandemowych (VNTR - ang. variable
number of t a n d e m repeats), w których jednostka
powtarzalna ma kilkadziesiąt nukleotydów dłu­
gości.
(A) Dwa warianty SSLP
allel I
allel 2
(B) Typowanie SSLP za pomocą reakcji PCR
elektroforeza
w żelu
agarozowym
ŚCIEŻKA A: test
ŚCIEŻKA B: markery alleli
WNIOSEK: badany DNA zawiera allel 2
Rysunek 2.5 SSLP i ich oznaczanie
(A) D w a allele mikrosatelitarnego SSLP. W allelu I m o t y w „ G A "
jest powtórzony trzy razy, a w allelu 2 - pięć razy. (B) Sposób
oznaczania SSLP w reakcji PCR. Region otaczający SSLP
amplifikuje się, a badany produkt identyfikuje się przez
elektroforezę w żelu agarozowym. Produkty PCR dają prążek
odpowiadający dłuższej z sekwencji dwóch alleli wykazując, że
testowany D N A zawierał allel 2. Opis elektroforezy w żelu
znajduje się w Metodach badań 3.2, s. 43
2.2 MARKERY DLA MAP GENETYCZNYCH 21
allel 1
allel 2
Rysunek 2.6 Polimorfizm punktowy
• Mikrosatelity lub proste powtórzenia tandemowe
(STR - ang. simple t a n d e m repeats), w których
powtórzeniami są znacznie krótsze jednostki, prze­
ważnie dwu-, trzy- lub czteronukleotydowe. Dwa
mikrosatelity spotkaliśmy w rozdziale 1, gdy pa­
trzyliśmy na typowy 50-kb fragment g e n o m u czło­
wieka (patrz rys. 1.5, s. 6).
Jako markery DNA mikrosatelity są bardziej popularne
niż minisatelity z dwóch p o w o d ó w . Po pierwsze,
minisatelity nie są r ó w n o rozprzestrzenione w geno­
mie, lecz częściej znajduje się je bliżej końców chromo­
somów. Stosując porównanie geograficzne, równo­
ważne jest to z próbą użycia m a p y latarni morskich,
by znaleźć drogę wokół wyspy. Mikrosatelity są dogod­
niej rozmieszczone w genomie. Po drugie, najszybszym
sposobem oznaczania polimorfizmów długości jest
reakcja PCR (rys. 2.5B), a za jej pomocą znacznie
szybciej i dokładniej oznacza się sekwencje krótsze niż
300 bp. Większość alleli minisatelitarnych jest dłuższa,
ponieważ jednostki powtarzalne są stosunkowo długie
i często jest ich wiele w j e d n y m ciągu. Typowy
mikrosatelita zawiera 10-30 kopii powtarzalnej sek­
wencji nie dłuższej niż cztery bp, i dlatego lepiej
nadaje się do oznaczenia w reakcji PCR. Dotychczas
w genomie człowieka znaleziono około 104 mikro-
satelitów, ale p r a w d o p o d o b n i e jest ich znacznie więcej
(sekcja 6.3.1).
Polimorfizmy punktowe (SNP)
SNP (ang. single nucleotide polymorphism) stanowią
bardzo licznie występujące w genomie pojedyncze
mutacje punktowe (rys. 2.6). Niektóre równocześnie
prowadzą do RFLP, choć nie większość, ponieważ
sekwencji, w obrębie których leżą SNP, nie rozpoznaje
żaden enzym restrykcyjny. Uważa się, że w genomie
człowieka jest p o n a d 200 000 SNP położonych w ge­
nach i prawdopodobnie dziesięć razy tyle, a może
i więcej w DNA pozagenowym (Collins i wsp., 1997).
Każdy SNP ma tylko dwa allele *, więc z p u n k t u
widzenia mapowania g e n ó w człowieka ma te same
wady co RFLP; istnieje d u ż e prawdopodobieństwo, że
wszyscy członkowie rodziny będą homozygotyczni
pod względem pojedynczego SNP. Zaletą SNP jest ich
* Polimorfizm punktowy może mieć cztery allele odpowia­
dające wystąpieniu jednego z czterech możliwych nukleotydów:
A, C, T, G (przyp. tłum.).
22 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Rysunek 2.7 Hybrydyzacja z oligonukleotydami jest bardzo
specyficzna
W bardzo dokładnie określonych warunkach hybrydyzacji stabilna
cząsteczka hybrydowa powstaje tylko wtedy, gdy oligonukleotyd
może utworzyć z docelowym D N A strukturę, w której wszystkie
nukleotydy tworzą pary. Pojedyncze miejsce, w k t ó r y m zasady
nie tworzą pary, uniemożliwia tworzenie hybrydy. Aby osiągnąć
taki poziom precyzji w a r u n k ó w , temperatura inkubacji musi być
tuż poniżej t e m p e r a t u r y topnienia (T ) oligonukleotydu.
W temperaturze powyżej 7 nawet cząsteczka, w której
wszystkie zasady tworzą pary, jest niestabilna. Jeśli temperatura
jest niższa od T o więcej niż 5°C, to hybrydy, w których nie
wszystkie zasady tworzą pary, mogą być stabilne.
T oligonukleotydu pokazanego na rysunku wynosi o k o ł o 58°C.
Obliczono to ze w z o r u T m = (4 x liczba nukleotydów G i C)
+ (2 x liczba nukleotydów A i T) °C
olbrzymia liczba i możliwość oznaczania metodami
nie wymagającymi elektroforezy w żelu. Jest to istotne
dlatego, że elektroforeza w żelu jest trudna do
zautomatyzowania, więc każda metoda detekcji na
niej oparta będzie stosunkowo powolna i pracochłon­
na. Wykrywanie SNP jest szybkie, ponieważ opiera się
na analizie hybrydyzacji z oligonukleotydami. Oligo­
nukleotyd to krótka, syntetyzowana chemicznie, jed-
noniciowa cząsteczka DNA, zwykle krótsza niż 50
nukleotydów. Jeśli warunki są odpowiednie, oligo­
nukleotyd będzie hybrydyzował z inną cząsteczką
DNA tylko wtedy, gdy na całej swojej długości
utworzy z nią pary nukleotydów. Jeśli pojawi się
jednonukleotydowa różnica, jedna pozycja oligonuk­
leotydu nie tworzy pary i hybrydyzacja nie zachodzi
(rys. 2.7). Hybrydyzacja z oligonukleotydami pozwala
rozróżnić dwa allele SNP. Strategia przeszukiwania
obejmuje:
• Technologię „chip" DNA (patrz Metody badań 2.3).
„Chip" DNA jest silikonową płytką, o powierzchni
2 cm 2 lub mniejszej, niosącą wiele różnych gęsto
poukładanych oligonukleotydów. Testowany DNA
znakuje się znacznikiem fluorescencyjnym i pipe-
tuje na powierzchnię płytki. Hybrydyzację wy­
krywa się oglądając „chip" pod mikroskopem fluo­
rescencyjnym. Pozycje emitujące sygnał fluores­
cencyjny pokazują, który oligonukleotyd zhybry-
dyzował z b a d a n y m DNA. W ten sposób w jednym
eksperymencie można oznaczyć wiele SNP (Wang
i wsp., 1998).
• Dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla allelu
(DASH - ang. dynamic allele-specific hybridization;
Pennisi, 1998). W tej technice hybrydyzacja zachodzi
w roztworze, na przykład w jednej ze studzienek
96-studzienkowej płytki mikrotitracyjnej i wykry­
wana jest dzięki znacznikowi fluorescencyjnemu
wiążącemu się jedynie z dwuniciowym DNA. Syg­
nał emitowany jest wyłącznie wtedy, gdy zachodzi
hybrydyzacja. Początkowo hybrydyzacja zachodzi
w warunkach umożliwiających istnienie pojedyn­
czych miejsc, gdzie zasady nie tworzą par. Na tym
etapie eksperymentu oligonukleotydy i badany
DNA hybrydyzują niezależnie od tego, jaki allel
SNP występuje w DNA. Rozróżnienie między al-
lelami osiąga się podnosząc temperaturę, ponieważ
hybrydy, w których nie wszystkie zasady tworzą
pary, są mniej stabilne niż pełne hybrydy i roz­
padają się w niższej temperaturze. Obserwując,
w jakiej temperaturze zanika sygnał fluorescencyjny
zależny od hybrydyzacji, można określić, który
allel znajduje się w b a d a n y m DNA.
2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA
D O M A P O W A N I A GENETYCZNEGO
2.3.1 Analiza sprzężeń jest podstawą
mapowania genetycznego
Teraz, kiedy zebraliśmy zestaw markerów, dzięki
którym możemy skonstruować mapę, przyjrzyjmy się
samym technikom mapowania. Wszystkie opierają się
na sprzężeniu genetycznym, odkrytym przez Bate-
sona, Saundersa i P u n n e t t a w 1905 r., lecz zrozumia­
n y m dopiero gdy Tomasz H u n t Morgan rozpoczął
swoje przełomowe badania na muszkach owocowych
w latach 1910-1911. Pierwsi genetycy XX wieku roz­
poznali, że geny leżą na chromosomach, a każdy
chromosom dziedziczy się jako niepodzielna jednostka.
Innymi słowy, jeśli dwa geny leżą na tym samym
chromosomie, to są ze sobą fizycznie sprzężone
i w związku z tym p o w i n n y dziedziczyć się wspólnie.
Wyglądało to na bezpieczną hipotezę, jednak gdy
pierwsi genetycy przeprowadzili krzyżówki genetycz­
ne p o d o b n e do opublikowanych przez Mendla 40 lat
wcześniej, stwierdzili, że niewiele genów wykazuje
pełne sprzężenie. Pary genów dziedziczyły się albo
niezależnie, jak geny z różnych chromosomów, albo
jeśli wykazywały sprzężenie, było to jedynie sprzęże­
nie częściowe: czasem dziedziczyły się razem, a cza­
sem nie (rys. 2.8). Rozwiązanie tej sprzeczności między
teorią a doświadczeniem było milowym krokiem w roz­
woju technik mapowania genetycznego.
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 23

„Chip" DNA

G ę s t o u ł o ż o n e c z ą s t e c z k i D N A d o r ó w n o l e g ł y c h analiz h y b r y d y z a c y j n y c h

„ C h i p " D N A zaprojektowano, by umożliwić przeprowadzanie

jednocześnie wielu eksperymentów hybrydyzacyjnych. Jego zwykta synteza
g ł ó w n y m zastosowaniem jest poszukiwanie p o l i m o r f i z m ó w ,
takich jak SNP (sekcja 2.2.2), i porównywanie populacji RNA
z różnych k o m ó r e k (sekcja 5.4.1). Może być także stosowany
w nowych metodach sekwencjonowania D N A (sekcja 4.1.2).
„ C h i p " D N A niesie dużą liczbę sond D N A , każdą o innej
sekwencji i umieszczoną w określonym miejscu na powierz­
chni płytki. Sondy mogą być syntetycznymi oligonukleotydami
lub innymi k r ó t k i m i cząsteczkami D N A , takimi jak k o m ­
p l e m e n t a r n y D N A ( c D N A - ang. complementary D N A ; dodawanie do
patrz rys. 3.11, s. 50). W najwcześniejszych metodach oligo­ wszystkich
nukleotydy lub c D N A nanoszono na szkiełka mikroskopowe oligonukleotydów
lub błonę nylonową, by utworzyć m i k r o p a n e l e . W ten
synteza aktywowana światłem
sposób można było osiągnąć stosunkowo małą gęstość,
przeważnie 6400 kropek na powierzchni 18 mm na 18 mm
ustawionych 80 x 80. A b y stworzyć panele o dużym zagęsz­
czeniu, potrzebna była bardziej rozwinięta technologia. Roz­
wiązaniem okazała się synteza oligonukleotydów in situ na
powierzchni płytki, co wymagało rozszerzenia metodologii
stosowanej w syntezie oligonukleotydów, jak pokazano na
rysunku obok. Z w y k ł a metoda obejmuje dodawanie nukleo-
t y d ó w jeden po drugim do rosnącego końca; sekwencja
zależała od tego, k t ó r y z substratów d N T P dodano do dodawanie tylko do
mieszaniny reakcyjnej. Taka metoda zastosowana do paneli zaktywowanych
oligonukleotydów
D N A zaowocowałaby wszystkimi oligonukleotydami o takiej
samej sekwencji. Zamiast tego używa się substratów d N T P
zmodyfikowanych tak, że przed przyłączeniem do końca „chip" inkubuje się z wyznakowanym docelowym D N A .
rosnącego oligonukleotydu wymagają aktywacji świetlnej. Przez skanowanie powierzchni płytki i zapisanie pozycji,
d N T P dodaje się jeden po drugim do powierzchni płytki, a do w których w y k r y t o emisję sygnału wysyłanego przez znacznik,
skierowania pulsów światła na konkretne pozycje, czyli okreś­ określa się, k t ó r e oligonukleotydy zhybrydyzowały z D N A .
lenia, który z rosnących oligonukleotydów zostanie wydłużony Do mikropaneli o małej gęstości można stosować znaczniki
o dany d N T P , używa się fotolitografii. izotopowe, wykrywane elektronicznie za pomocą urządzenia
W ten sposób można osiągnąć gęstość do jednego miliona o nazwie p h o s p h o r i m a g e r . Metoda ta nie zapewnia jednak
oligonukleotydów na c m 2 (Ramsay, 1998), co przy poszuki­ rozdzielczości odpowiedniej dla paneli o dużej gęstości, do
waniu SNP pozwala typować pół miliona p o l i m o r f i z m ó w nich niezbędne jest więc użycie znacznika fluorescencyjnego
w jednym eksperymencie, zakładając, że są oligonukleotydy (Metody badań 3.3, s. 46). Sygnał fluorescencyjny w y k r y w a się
dla obu alleli SNP. „ C h i p " D N A nie jest trudny w użyciu przez skanowanie laserem czy bardziej r u t y n o w o - fluores­
(patrz rysunek poniżej). Aby umożliwić zajście hybrydyzacji, cencyjnym mikroskopem konfokalnym.

DNA wyznakowany sygnały

fluorescencyjnie hybrydyzacji

hybrydyzacja mikroskopia
konfokalna
„chip" DNA
24 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

Rysunek 2.8 Częściowe sprzężenie

Częściowe sprzężenie o d k r y t o na początku XX wieku. Pokazaną tutaj krzyżówkę przeprowadzili Bateson, Saunders i Punnett w roku
190S na grochu c u k r o w y m . Krzyżówka rodzicielska daje wynik t y p o w y dla krzyżówek d w u p u n k t o w y c h (patrz ramka 2. /, s. I 7), gdzie
wszystkie rośliny F 1 mają taki sam fenotyp, wskazując, że za fioletowe kwiaty i podłużne ziarna pyłku odpowiadają allele dominujące.
Nieoczekiwanie p o t o m s t w o krzyżówki F ( nie wykazywało stosunku fenotypów 9:3:3:1 (oczekiwanego dla genów na różnych
chromosomach) ani 3:1 (oczekiwanego przy całkowitym sprzężeniu). Ten niezwykły stosunek jest t y p o w y dla częściowego sprzężenia

Zachowanie się chromosomów w czasie mejozy
wyjaśnia, dlaczego geny wykazują sprzężenie
częściowe, a nie całkowite
Przełomowego odkrycia dokonał Tomasz H u n t Mor­
gan wyjaśniając zależność między sprzężeniem częś­
ciowym a z a c h o w a n i e m c h r o m o s o m ó w w czasie
podziału jądra komórkowego. Cytolodzy w końcu
XIX wieku rozróżniali d w a typy podziału jądra:
mitozę i mejozę. Powszechniejszy z nich - mitoza
to proces, w którym diploidalne jądro komórki so­
matycznej dzieli się na dwa p o t o m n e , wciąż di­
ploidalne jądra (rys. 2.9). Aby stworzyć wszystkie
komórki niezbędne w ciągu całego ludzkiego życia,
17
potrzeba około 10 mitoz. Zanim rozpocznie się
mitoza, każdy chromosom w jądrze replikuje się,
ale kopie nie od razu oddzielają się od siebie. Na
początku pozostają połączone w swoich centrome-
rach i nie rozłączają się do m o m e n t u , gdy chro­
mosomy są rozdzielane między dwa n o w e jądra
w czasie mitozy. Szczególnie istotne jest, że każde
p o t o m n e jądro otrzymuje pełen zestaw chromoso­
mów, a większość zdarzeń, które składają się na
proces mitozy, służy osiągnięciu tego celu.
Proces mitozy nie ma bezpośredniego związku
z m a p o w a n i e m genetycznym. Z m a p o w a n i e m zwią­
zany jest inny proces podziałowy - mejoza. Mejoza
zachodzi tylko w komórkach rozrodczych. W jej
wyniku z komórki diploidalnej powstają cztery hap-
loidalne gamety, z których każda może połączyć się
z gametą płci przeciwnej w czasie rozmnażania płcio­
wego. Łatwo wyjaśnić to, że po mejozie powstają
cztery komórki haploidalne. Mitoza p r o w a d z i do
powstania dwóch komórek diploidalnych: w mejozie
zachodzą, jeden po drugim, dwa podziały jądra.
Podstawowa różnica między mitozą i mejoza jest
subtelniejsza. Przypomnijmy, że w komórce diploidal-
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 25

interfaza

btona jądrowa

telofaza

późna profaza

centromer

mikrotubule

anafaza metafaza

Rysunek 2.9 Mitoza

W interfazie, czyli okresie między podziałami jąder, chromosomy znajdują się w formie rozciągniętej (sekcja 6.1.1). Na początku mitozy
chromosomy kondensują i do późnej profazy formują struktury widoczne w mikroskopie świetlnym. Każdy chromosom właśnie
przeszedł replikację D N A , ale dwa p o t o m n e chromosomy są połączone centromerami. W czasie metafazy pęka błona jądrowa (u
większości eukariotów) i chromosomy ustawiają się w jednej płaszczyźnie na środku k o m ó r k i . Teraz mikrotubule odciągają siostrzane
chromosomy w stronę przeciwnych k o ń c ó w k o m ó r k i . W telofazie w o k ó ł każdego zbioru potomnych c h r o m o s o m ó w odtwarzają się
błony jądrowe. Wynikiem jest powstanie z jednego jądra rodzicielskiego d w ó c h identycznych jąder potomnych. Dla ułatwienia pokazano
tylko jedną parę c h r o m o s o m ó w homologicznych; jeden w parze jest czerwony, a drugi - niebieski

nej są dwie oddzielne kopie każdego chromosomu
(sekcja 1.1.1), n a z y w a n e chromosomami homologicz­
nymi. W czasie mitozy chromosomy homologiczne
pozostają oddzielone od siebie. Każdy z pary replikuje
się i jest przenoszony do jądra p o t o m n e g o niezależnie
od swojego homologa. Natomiast w czasie mejozy
chromosomy homologiczne nie zachowują się nieza­
leżnie. W pierwszym podziale mejotycznym każdy
chromosom łączy się z homologiem tworząc biwalent
(rys. 2.10). Zachodzi to po replikacji każdego chromo­
somu, ale przed rozdzieleniem zreplikowanych struk­
tur. Biwalent w rzeczywistości zawiera cztery kopie
chromosomów, a przeznaczeniem każdej z nich jest
odnalezienie drogi do jednej z czterech gamet wy­
tworzonych na końcu mejozy. Wewnątrz biwalentu
ramiona c h r o m o s o m ó w (chromatydy) przechodzą
fizyczne przerwanie i w y m i a n ę segmentów DNA.
Proces ten nazywa się crossing-over lub rekombina­
cją i został odkryty przez belgijskiego cytologa Jans-
sensa w 1909 r., zaledwie na dwa lata przed tym, nim
Morgan zaczął zastanawiać się n a d częściowym sprzę­
żeniem.
W jaki sposób odkrycie crossing-over pomogło Mor­
ganowi wyjaśnić częściowe sprzężenie? Aby to zro­
zumieć, musimy pomyśleć o wpływie jaki crossing-
-over może mieć na dziedziczenie genów. Rozważmy
dwa geny, oba o dwóch allelach. Gen pierwszy na­
zwijmy A, a jego allele A i a, zaś drugi gen B o allelach
B i b. Wyobraźmy sobie teraz, że te dwa geny leżą na
chromosomie 2 Drosophila melanogaster, gatunku mu­
szki owocowej badanego przez Morgana. Prześledzimy
teraz przebieg mejozy diploidalnego jądra, w którym
jedna kopia chromosomu 2 ma allele A i B, zaś druga
ma a i b. Sytuację tę ilustruje rysunek 2.11. Rozważmy
d w a alternatywne scenariusze:
1) Crossing-over nie zachodzi między genami A i B.
W tym przypadku dwie powstające gamety będą
zawierały kopie chromosomów z allelami A i B,
a pozostałe dwie będą zawierać a i b. Innymi słowy,
dwie gamety mają genotyp AB, a dwie genotyp ab.
2) Crossing-over zachodzi między genami A i B. Do­
prowadzi to do wymiany segmentów DNA zawie­
rających gen B między chromosomami homologicz­
nymi. W końcu otrzymuje się cztery gamety o róż­
nych genotypach: AB, aB, Ab, ab.
Pomyślmy teraz, co się zdarzy jeśli spojrzymy na
wyniki mejozy w 100 identycznych komórkach. Jeśli
nigdy nie zachodzi rekombinacja, uzyskamy gamety
26 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

Pokazano zdarzenia obejmujące jedną parę c h r o m o s o m ó w homologicznych; jeden z c h r o m o s o m ó w tworzących parę jest czerwony,
drugi niebieski. Na początku mejozy chromosomy kondensują i każda para c h r o m o s o m ó w homologicznych ustawia się, by utworzyć
biwalent. W biwalencie może zajść crossing-over, obejmujący przerwanie ramion c h r o m o s o m ó w i wymianę D N A . Później w mejozie
następują dwa podziały jądra; wynikiem pierwszego są dwa jądra, oba z dwiema kopiami każdego chromosomu. W końcu powstają
cztery jądra, każde zawierające pojedynczą kopię każdego chromosomu. Końcowe produkty mejozy - gamety są więc haploidalne.
Molekularne podstawy rekombinacji opisano w podrozdziale I 3.2

o następujących genotypach: Od częściowego sprzężenia do mapowania

genetycznego
200 AB
200 ab
Kiedy Morgan zrozumiał, jak można wytłumaczyć
częściowe sprzężenie przez crossing-over zachodzący
Oznacza to całkowite sprzężenie: geny A i B w cza­ w czasie mejozy, wymyślił sposób mapowania względ­
sie mejozy zachowują się jak pojedyncza jednostka. nych pozycji genów na chromosomie. W rzeczywistości
Ale jeśli (a jest to bardziej prawdopodobne) w nie­ kluczowego odkrycia nie dokonał sam Morgan, ale
których jądrach zajdzie rekombinacja między A i B, student pracujący w jego laboratorium, Artur Stur-
pary alleli nie będą dziedziczone jak pojedyncze tevant (Sturtevant, 1913). Stwierdził on, że crossing-
jednostki. Załóżmy, że rekombinacja zachodzi w cza­ -over jest zjawiskiem losowym, z czego wynika, że
sie 40 ze 100 mejoz. Wśród powstałych gamet prawdopodobieństwo jego zajścia w każdej pozycji
będzie: wzdłuż pary równolegle ułożonych chromatyd jest
160 AB jednakowe. Jeśli to założenie jest prawdziwe, to dwa
160 ab blisko siebie położone geny będą rozdzielane przez
40 Ab rekombinację rzadziej niż dwa geny bardziej od siebie
40 oB oddalone. Idąc dalej - częstość, z którą geny będą
To sprzężenie nie jest całkowite, jest tylko częściowe. rozprzęgane przez crossing-over, będzie wprost pro­
Oprócz dwóch genotypów rodzicielskich (AB, ab) porcjonalna do ich odległości na chromosomie. Częs­
widzimy gamety o genotypach zrekombinowanych tość rekombinacji jest więc miarą odległości między
(Ab, aB). dwoma genami. Jeśli uda się określić częstość rekom-
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 27

Rysunek 2.1 I W p ł y w crossing-over na sprzężone geny

Rysunek pokazuje parę c h r o m o s o m ó w homologicznych jeden czerwony, a drugi niebieski. A i B są sprzężonymi genami o allelach A, a,
8 i fa. Z lewej strony pokazano mejozę, w której między A i B nie zaszedł crossing-over. D w i e otrzymane gamety mają genotyp AB,
a pozostałe dwie ab. Z prawej strony między A i B zaszedł crossing-over: cztery gamety wykazują wszystkie możliwe genotypy: AB, aB,
Ab i ab

binacji dla różnych par genów, można skonstruować
mapę ich względnych pozycji na chromosomie (rys.
211):
Okazało się, że założenie Sturtevanta o losowości
crossing-over nie było do końca uzasadnione. Porów­
nania między mapami genetycznymi a rzeczywistymi
pozycjami genów w cząsteczkach DNA określonymi
przez mapowanie fizyczne i sekwencjonowanie DNA
wykazały, że w niektórych obszarach chromosomów,
nazywanych gorącymi punktami rekombinacji, cros­
sing-over zachodzi częściej niż w innych. Oznacza to,
że odległość na mapie genetycznej niekoniecznie
odzwierciedla fizyczną odległość między dwoma mar­
kerami. Teraz zdajemy sobie także sprawę z tego, że
pojedyncza chromatyda może brać udział w więcej
niż jednym akcie rekombinacji jednocześnie, ale też że
odległość, w której te dwie rekombinacje mogą zajść,
jest ograniczona. Prowadzi to do dalszych niedokład-
28 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Rysunek 2.12 Tworzenie mapy genetycznej na podstawie częstości rekombinacji
Przykład zaczerpnięto z oryginalnych eksperymentów z muszką o w o c o w ą przeprowadzonych przez A r t u r a Sturtevanta. Wszystkie
cztery geny są potożone na chromosomie X muszki o w o c o w e j . Pokazano częstości rekombinacji między genami wraz z wydedukowanymi
na ich podstawie pozycjami genów na mapie
ności w procedurze mapowania. Niezależnie od tych
zastrzeżeń analiza sprzężeń zwykle prowadzi do
prawidłowych wniosków o porządku genów, a oszaco­
wania odległości są wystarczająco dokładne do stworze­
nia m a p genetycznych nadających się do zastosowania
jako szkic w projektach sekwencjonowania genomów.
2.3.2 Przeprowadzanie analizy sprzężeń
u różnych typów organizmów
Aby zobaczyć, jak rzeczywiście przeprowadza się anali­
zę sprzężeń, powinniśmy rozważyć trzy różne sytuacje:
• Analiza sprzężeń u organizmów takich jak muszka
owocowa i mysz, które można p o d d a w a ć planowa­
nym eksperymentom hodowlanym.
• Analiza sprzężeń u ludzi, na których nie można
przeprowadzać planowanych eksperymentów,
można jednak wykorzystać r o d o w o d y rodzin.
• Analiza sprzężeń u bakterii, które nie przechodzą
mejozy.
Analiza sprzężeń, gdy możliwe sq planowane
eksperymenty hodowlane
Pierwszym typem analizy sprzężeń jest nowoczesne
uzupełnienie metody wynalezionej przez Morgana
i jego współpracowników. Metoda opiera się na ana­
lizie potomstwa z eksperymentalnych krzyżówek mię­
dzy rodzicami o znanych genotypach i można ją
stosować, przynajmniej w teorii, u wszystkich euka-
riotów. Względy etyczne wykluczają jej zastosowanie
u ludzi, a problemy praktyczne, takie jak długość
ciąży czy czas potrzebny potomstwu do osiągnięcia
dojrzałości (a więc uczestniczenia w następnych krzy­
żówkach) ograniczają efektywność metody w stosunku
do niektórych zwierząt i roślin.
Jeśli wrócimy do rysunku 2.11, zobaczymy, że kluczem
do mapowania genetycznego jest możliwość ustalenia
genotypów gamet powstałych po mejozie. W kilku
przypadkach jest to możliwe przez bezpośrednie
badanie gamet. Na przykład gamety wytwarzane przez
niektóre mikroorganizmy eukariotyczne, z Saccharomy-
ces cerevisiae włącznie, można hodować jako kolonie
komórek haploidalnych i określać ich genotyp stosując
testy biochemiczne. Bezpośrednie genotypowanie ga­
met jest także możliwe u wyższych Eukaryota z użyciem
markerów DNA. DNA z pojedynczego plemnika może
służyć do przeprowadzenia reakcji PCR, umożliwiając
oznaczenie RFLP, SSLP i SNP. Niestety analizy DNA
z plemników są dość pracochłonne. Rutynowej analizy
sprzężeń u wyższych Eukaryota nie przeprowadza się
więc bezpośrednio badając gamety, lecz ustalając
genotypy diploidalnego potomstwa powstałego z fuzji
dwóch gamet, po jednej od każdego z rodziców. Innymi
słowy przeprowadza się krzyżówkę genetyczną.
Komplikacją krzyżówki genetycznej jest to, że uzys­
kane potomstwo nie jest wynikiem jednej, lecz dwóch
mejoz (jednej u każdego z rodziców), a u większości
organizmów przypadki rekombinacji są równie praw­
d o p o d o b n e w czasie tworzenia gamet z a r ó w n o męs­
kich, jak i żeńskich. Musimy w jakiś sposób móc
wyłonić z genotypów diploidalnego potomstwa przy­
padki rekombinacji, które zaszły w obu tych mejozach.
Oznacza to, że krzyżówkę należy przeprowadzać
bardzo starannie. Standardowo wykorzystuje się krzy-
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 29

żówkę testową. Ilustruje ją rysunek 2.13, scenariusz 1,
gdzie przeprowadziliśmy krzyżówkę testową, by zma-
pować dwa spotkane wcześniej geny A (allele A i a)
i B (allele B i b), oba z chromosomu 2 muszki owocowej.
Istotną cechą testu jest genotyp każdego z rodziców:
• Jeden z rodziców jest podwójną heterozygotą.
Oznacza to, że u tego rodzica obecne są wszystkie
cztery allele: jego genotyp to AB/ab. Podwójne
heterozygoty otrzymuje się przez skrzyżowanie
dwóch linii czystych, na przykład AB/ABxab/ab
(patrz ramka 2.1, s. 17).
• Drugi z rodziców jest pochodzącą z linii czystej
podwójną homozygotą. Obie kopie homologicz­
nych chromosomów 2 u tego rodzica są takie same:
w przykładzie p r z e d s t a w i o n y m w scenariuszu
1 obie mają allele a i b, więc genotyp ab/ab.
Podwójne heterozygoty mają genotyp taki sam jak
komórka, której mejozę prześledziliśmy na rysunku
2.11. Naszym celem jest wywnioskowanie, jakie były
genotypy gamet wytworzonych przez tego rodzica
i obliczenie frakcji rekombinantów. Zauważ, że gamety
p r o d u k o w a n e przez drugiego z rodziców, będącego
podwójną homozygotą, będą mieć genotyp ab niezależ­
nie, czy będą gametami rodzicielskimi, czy po rekom­
binacji. W rezultacie mejoza u tego rodzica w czasie
badania genotypów potomstwa jest „niewidoczna" co
oznacza, że jak pokazuje scenariusz 1 na rys. 2.13,
genotypy diploidalnego potomstwa można jednoznacz­
nie przyporządkować genotypom gamet od rodzica
będącego podwójną heterozygotą. Krzyżówka testowa
umożliwia bezpośrednie przebadanie pojedynczej me-
jozy, a zatem obliczenie częstości rekombinacji i zma-
powanie odległości dwóch genów.
Należy rozważyć jeszcze jeden punkt. Jeśli, jak na
rysunku 2.13 w scenariuszu 1, stosuje się markery
genowe wyrażające dominację lub recesywność, rodzic
będący podwójną homozygotą musi mieć oba allele
warunkujące fenotyp recesywny. Jeżeli jednak stosuje
się kodominujące markery DNA, rodzic będący po­
dwójną homozygotą może mieć jakąkolwiek kombina­
cję alieli homozygotycznych (tzn. AB/AB, Ab/Ab, aB/aB,
ab/ab). P o w o d y ku temu pokazuje scenariusz 2 na
rysunku 2.13.

Scenariusz I Scenariusz 2
A i B są markerami genetycznymi A i B są markerami genetycznymi
A i 6 są dominujące względem o i b A i 8 są kodominujące względem o i b

RODZICE RODZICE
1 x 2 krzyżówka testowa 1 x 2
AB/ab ab/ab AB/ab Ab/Ab

AB ab AB Ab
Ab ab Ab Ab
aB ab gamety aB Ab
ab ab ab Ab

GENOTYPY F1 FENOTYPY GENOTYPY F1 WYKRYTE ALLELE

ABab AB ABAb A+B+b
Abab Ab AbAb A+b
aBab aB aBAb A+a+B+b
abab ab abAb A+a + b

Każdy fenotyp jest taki sam jak Genotyp gamet rodzica I identyfikuje
gemeta rodzica I się na podstawie wykrytych alieli:
Jeśli wykryto tylko A, gameta rodzica I
byłaA.
Jeśli wykryto A+a, to gameta rodzica I
była a itd.

Rysunek 2.13 D w a przykłady krzyżówki testowej

W scenariuszu I - A i B są markerami genetycznymi o allelach A, o, B i b. Uzyskane p o t o m s t w o liczy się badając jego fenotypy. Ponieważ
rodzic będący podwójną homozygotą (rodzic 2) ma dwa allele recesywne, o i b, nic nie wnosi do fenotypów potomstwa. Fenotyp
każdego osobnika z pokolenia F 1 jest więc taki sam jak gamety od rodzica I, z której powstał dany osobnik. W scenariuszu 2 - A i B są
markerami D N A , których pary alieli są kodominujące. W t y m konkretnym przypadku rodzic będący podwójną homozygotą ma genotyp
Ab/Ab. Allele obecne u każdego osobnika z pokolenia F 1 w y k r y w a się bezpośrednio, na przykład techniką PCR. Kombinacje alieli
pozwalają wydedukować genotypy gamet rodzica I, z których powstał każdy osobnik
30 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI
Ramka 2.2: Krzyżówki wielopunktowe
Dokładność analizy sprzężeń jest większa, jeśli w jednej
krzyżówce śledzi się więcej niż dwa markery. Nie tylko
pozwala to szybciej uzyskać częstość rekombinacji, ale także,
przez prostą analizę danych, umożliwia ustalenie względnego
porządku markerów na chromosomie. Dzieje się tak dlatego,
że aby w zestawie trzech markerów środkowy oddzielić od
dwóch markerów zewnętrznych, potrzeba dwóch zdarzeń
rekombinacyjnych. A dwa zewnętrzne markery można roz­
dzielić przez tylko jedną rekombinację.
pojedynczy crossing-over
D £ F d E F
podwójny crossing-over
Mapowanie genów przez analizę rodowodów
u człowieka
Oczywiście u ludzi niemożliwy jest dobór genotypów
rodziców i przeprowadzenie krzyżówki zaprojektowa­
nej specjalnie tak, aby była użyteczna w m a p o w a n i u .
Zamiast tego, dane do obliczenia częstości rekombinacji
trzeba uzyskać przez badanie genotypów kolejnych
pokoleń istniejących rodzin. Wynika z tego, że dostęp­
ne d a n e są ograniczone, a ich interpretacja trudna.
Ludzkie małżeństwa rzadko stanowią odpowiednią
krzyżówkę testową, a genotypów jednego lub większej
liczby członków rodziny często nie m o ż n a zbadać
z p o w o d u ich śmierci lub niechęci do współpracy.
Problem obrazuje rysunek 2.74. W tym przykładzie
badamy chorobę dziedziczną obecną w rodzinie zło­
żonej z dwojga rodziców i sześciorga dzieci. Choroby
genetyczne są często stosowanymi markerami gene­
tycznymi u ludzi. Stan choroby jest j e d n y m allelem,
a zdrowia drugim. R o d o w ó d na rysunku 2.14A poka­
zuje, że matka jest chora tak jak i czworo jej dzieci.
Wiemy z wywiadu rodzinnego, że babka ze strony
matki również cierpiała na tę chorobę, ale z a r ó w n o
ona, jak i jej mąż - dziadek ze strony matki nie żyją.
Możemy włączyć ich do r o d o w o d u zaznaczając, że nie
Ponieważ podwójna rekombinacja jest mniej prawdopodobna
niż pojedyncza, oddzielenie środkowego markera od pozo­
stałych będzie zachodzić stosunkowo rzadko. Przykład danych
otrzymanych z krzyżówki trzypunktowej pokazano w tabelce.
Krzyżówkę przeprowadzono między potrójną heterozygotą
(ABC/abc) i potrójną homozygotą (abcłabc). Najliczniejszą
klasę stanowi p o t o m s t w o mające jeden z d w ó c h genotypów
rodzicielskich pochodzące ż przypadków braku rekombinacji
w obszarze zawierającym markery A, B i C. D w i e następne
klasy potomstwa są stosunkowo częste (51 i 63 osobniki
w niniejszym przykładzie). Każda z nich powstała z pojedyn­
czej rekombinacji. Analiza ich genotypów wskazuje, że w pier­
wszej z tych d w ó c h klas marker A został rozprzęgnięty od
m a r k e r ó w B i C, a w klasie drugiej marker B został rozprzęg­
nięty od A i C. Wnioskiem jest, że A i B są markerami
zewnętrznymi. Potwierdza to liczba potomstwa, u którego
marker C został rozprzęgnięty od A i B. Jest ich tylko dwoje,
co wskazuje, że do powstania tego genotypu potrzebna jest
podwójna rekombinacja. Marker C znajduje się więc między
AiB.
Genotypy Liczba Wywnioskowane przypadki
potomstwa potomstwa rekombinacji
ABC/abc 987 brak (genotypy rodzicielskie)
abc/abc
aBC/abc 51 jeden, między A i B, C
Abc/abc
AbC/abc 63 jeden, między B i A,C
abc/abc
ABc/obc 2 dwa: jeden między C i A oraz
abC/abc jeden między C i B.
żyją, przez przekreślenie symbolu, j e d n a k nie uzys­
kamy żadnych dalszych wiadomości o ich genotypach.
Naszym celem jest z m a p o w a n i e pozycji genu od­
powiedzialnego za chorobę genetyczną i w tym celu
prześledzimy jej sprzężenie z mikrosatelitarnym mar­
kerem M, którego cztery allele - M1 M2, M3 i M4 są
obecne u żyjących członków rodziny. Pytanie brzmi:
jak wiele dzieci jest rekombinantami?
Jeśli spojrzymy na genotypy sześciorga dzieci, zoba­
czymy, że 1, 3 i 4 mają allele odpowiedzialne za
chorobę i mikrosatelitarne allele M 1 . Natomiast 2 i 5 ma­
ją allel odpowiadający z d r o w i u i M?. M o ż e m y więc
postawić dwie alternatywne hipotezy. Pierwsza: dwie
kopie c h r o m o s o m ó w homologicznych matki mają
genotyp choroba-M 1 i zdrowie-M 2 , w wyniku czego
dzieci 1, 2, 3, 4 i 5 mają genotypy rodzicielskie, a szóste
dziecko jest jedynym rekombinantem (rys. 2.14B).
Sugerowałoby to, że gen warunkujący chorobę i mik-
rosatelita są względnie blisko sprzężone i rekombinacja
między nimi zachodzi rzadko. W hipotezie alternatyw­
nej zakłada się, że chromosomy matczyne mają geno­
typy zdrowie-M, i choroba-M 2 , dzieci 1-5 są rekom­
binantami, a n u m e r sześć t y p e m rodzicielskim, co by
oznaczało, że g e n y są położone na chromosomie
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 3 I

(A) Rodowód

(B) Możliwe interpretacje rodowodu

CHROMOSOMY MATKI

hipoteza I hipoteza 2
choroba M1 zdrowie M1

zdrowie M2 choroba M2

DZIECKO I choroba M1 rodzicielski zrekombinowany

DZIECKO 2 zdrowie M2 rodzicielski zrekombinowany
DZIECKO 3 choroba M1 rodzicielski zrekombinowany
DZIECKO 4 choroba M1 rodzicielski zrekombinowany
DZIECKO 5 zdrowie M2 rodzicielski zrekombinowany
DZIECKO 6 choroba M2 zrekombinowany rodzicielski

częstość
1/6 = 6,7% 5/6 = 83,3%
rekombinacji

(C) „Wskrzeszenie" babki ze strony matki

allel choroby musi być sprzężony z M1

HIPOTEZA I JEST PRAWDZIWA

LEGENDA
zdrowa kobieta chora kobieta zdrowy mężczyzna chory mężczyzna zmarły

Rysunek 2.14 Przykład analizy r o d o w o d ó w u człowieka

(A) Rodowód przedstawia dziedziczenie choroby genetycznej w rodzinie: dwojga żyjących rodziców i sześciorga dzieci oraz według
informacji o babce ze strony matki - z wywiadu rodzinnego. Allel warunkujący chorobę (pełne symbole) dominuje nad allelem
p r a w i d ł o w y m (puste symbole). Naszym zadaniem jest ustalenie stopnia sprzężenia między genem warunkującym chorobę
a mikrosatelitą M przez typowanie alleli tego mikrosatelity ( M ( , M2, itd.) u żyjących członków rodziny. (B) Rodowód można
zinterpretować na dwa różne sposoby. Hipoteza I zakłada małą częstość rekombinacji i wskazuje, że gen odpowiedzialny za chorobę
jest blisko sprzężony z mikrosatelitą M. Hipoteza 2 sugeruje, że gen i mikrosatelita są znacznie słabiej sprzężone. W (C) problem zostaje
rozwiązany przez ponowne pojawienie się babki ze strony matki; genotyp mikrosatelity babki jest zgodny wyłącznie z hipotezą I. Więcej
szczegółów w tekście
32 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE GENOMÓW TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

względnie daleko od siebie. Nie m o ż e m y ustalić, która ogólnemu zaskoczeniu pojawia się p o n o w n i e w chwili
z hipotez jest prawidłowa: d a n e są frustrująco niejed­ odpowiedniej, by uratować wciąż malejącą oglądal­
noznaczne. ność. Okazuje się, że jej genotyp pod względem
Najbardziej satysfakcjonującym rozwiązaniem prob­ mikrosatelity M to M 1 M 5 (rys. 2.14C). To oznacza, że
lemu postawionego przez r o d o w ó d na rysunku 2.14 allel odpowiedzialny za chorobę i M 1 znajdują się
byłaby znajomość genotypu babki. Załóżmy na chwilę, blisko siebie, na tym samym chromosomie. Teraz
że jesteśmy w serialu telewizyjnym w rodzaju „Dynas­ z pewnością m o ż e m y stwierdzić, że prawidłowa jest
tii" i babka w rzeczywistości nie umarła, natomiast ku hipoteza 1 i tylko dziecko 6 jest rekombinantem.
Zmartwychwstanie kluczowych osobników zwykle
nie jest opcją dostępną dla prawdziwego genetyka,
(A) Koniugacja chociaż DNA m o ż n a uzyskać nawet ze zwłok lub kości
ludzi nieżyjących. Niepełne r o d o w o d y analizuje się
statystycznie stosując miarę zwaną lod score (Morton,
1995). Nazwa pochodzi od logarytmu prawdopodobień­
stwa (ang. logarithm of the odds), że geny są sprzężone.
Miary tej używa się na początku do ustalenia, czy
badane markery leżą na j e d n y m chromosomie, innymi
słowy - czy geny są sprzężone, czy nie. Jeśli analiza lod
nukleoid
score ustali sprzężenie, m o ż n a następnie określić miarę
najbardziej p r a w d o p o d o b n e j częstości rekombinacji.
W sytuacji idealnej d a n e będą pochodzić z więcej niż
jednego r o d o w o d u , podnosząc wiarygodność wyniku.
Analiza jest mniej niejednoznaczna dla rodzin z większą
liczbą dzieci i, jak widzieliśmy na rysunku 2.14, istotna
plazmidy jest możliwość genotypowania przynajmniej trzech
pokoleń. Z tego p o w o d u stworzono kolekcje rodzin,
dawca biorca takie jak zebrana przez Centre d'Etudes du Polymorphi-
sme H u m a i n e (CEPH) w Paryżu (Dausset i wsp., 1990).
(B) Transdukcja Kolekcja CEPH zawiera h o d o w l a n e linie komórkowe
z rodzin, w których można przebadać wszystkich
DNA bakterii bakteriofag
czworo dziadków, jak też co najmniej ośmioro dzieci
z drugiego pokolenia. Kolekcja jest dostępna do mapo­
wania markerów DNA dla każdego badacza, który
zgadza się dostarczyć uzyskane dane do centralnej bazy
danych CEPH (patrz Badania i odkrycia 2.1).

Mapowanie genetyczne u bakterii

Ostatnim typem m a p o w a n i a genetycznego, którym
się zajmiemy, jest podejście stosowane u bakterii.
Główną trudnością, z którą spotykają się genetycy
próbujący rozwinąć techniki mapowania dla bakterii,
jest brak mejozy u tych haploidalnych organizmów.
Trzeba było wymyślić inny sposób wprowadzenia
rekombinacji między homologiczne segmenty bak­
(C) Transformacja
teryjnego DNA. Rozwiązaniem stało się wykorzystanie

Rysunek 2.1 5 Trzy sposoby uzyskania transferu D N A między

bakteriami

(A) Koniugacja może spowodować transfer chromosomowego

lub plazmidowego D N A z bakterii będącej dawcą do biorcy.
Koniugacja obejmuje fizyczny kontakt między dwiema bakteriami
i przeniesienie zachodzące przez wąską rurkę zwaną pila.
(B) Transdukcja to przeniesienie małego segmentu D N A
z k o m ó r k i dawcy za pośrednictwem bakteriofaga.
(C) Transformacja jest podobna do transdukcji, ale przenoszony
D N A jest „nagi". Zdarzenia przedstawione w (B) i (C) często
wiążą się ze śmiercią komórki dawcy. W (B) śmierć następuje,
gdy bakteriofag opuszcza k o m ó r k ę dawcy; w (C) usunięcie D N A
z komórki dawcy jest przeważnie konsekwencją naturalnej śmierci
komórki
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 33

Mapa genetyczna człowieka

Jednym z pierwszych celów Projektu Poznania Genomu Człowieka była mapa genetyczna
o gęstości przynajmniej jednego markera na każde I Mb genomu. Cel ten osiągnięto
w 1994 r. Opisana tu publikacja, wydana d w a lata później, prezentuje mapę genetyczną
o gęstości m a r k e r ó w wynoszącej średnio jeden na 0,6 M b .

Mapę oparto na 5264 mikrosatelitach (sekcja 2.2.2) typu obejmują pozycje 7000 mikrosatelitów obecnych na mapie
AC/TG: genetycznej, umożliwiając integrację obu typów map w jedną
obszerną mapę genomu człowieka.
5' - ACACACACACAC - 3'
3' - TGTGTGTGTGTG - 5'
Były dwie przyczyny, dla których wybrano mikrosatelity
o tej konkretnej sekwencji. Po pierwsze są one częste
w genomie, po kilka na każdy Mb DNA, co zapewnia
stopień pokrycia odpowiedni do mapowania o dużej gęstości.
Po drugie, ten typ mikrosatelity jest bardzo zmienny, wy­
stępuje po kilka alleli każdego z nich w całej populacji.
W praktyce oznacza to, że wykazują dużą heterozygo-
tyczność, czyli wysokie prawdopodobieństwo, że przypad­
kowo wybrana z populacji osoba będzie heterozygotą pod
względem tego konkretnego mikrosatelity. Średnia hete-
rozygotyczność wszystkich markerów użytych do badania
wynosiła 0,7 (prawdopodobieństwo 7 na 10, że osobnik
będzie heterozygotą), a tylko 7% markerów miało hete-
rozygotyczność mniejszą niż 0,5.
Do wykonania większości mapowania użyto materiału
pochodzącego od ośmiu rodzin z kolekcji CEPH. Rodziny te
obejmowały 134 osoby i pozwalały na prześledzenie 186
mejoz. Uzyskane dane wykorzystano do stworzenia map
chromosomów od I do 22. Aby zmapować chromosom X,
włączono jeszcze 12 rodzin (170 osób, o 105 mejoz więcej).
Dodatkowe dane były potrzebne, ponieważ przypadki rekom­
binacji pomiędzy markerami sprzężonymi z X są w rodowo­
dach rzadsze, gdyż mężczyźni mają tylko jeden chromosom X.

Mapa
Analiza sprzężeń pozwoliła przypisać 5264 markery do 2335
pozycji chromosomowych. Liczba pozycji jest mniejsza niż
liczba markerów, ponieważ niektóre mikrosatelity leżą zbyt
blisko siebie, by je rozdzielić; dlatego zostały zmapowane
w tej samej pozycji. Średnia gęstość dla całej mapy wyniosła
jeden marker na 599 kb, sięgając od jednego na 495 kb dla
chromosomu 17 do jednego markera na 767 kb dla chromo­
somu 9. Tylko w trzech miejscach w genomie najbliższe
siebie markery wydawały się odległe o więcej niż 4 Mb DNA.
Mapa mikrosatelitów w genomie człowieka
Podejrzewa się, że te przerwy w rzeczywistości nie są tak
wielkie, jak się wydają, prawdopodobnie w związku z gorą­ Każda czerwona kreska oznacza jedną z 2335 pozycji, w których
cymi punktami rekombinacji (patrz s. 27). Dwa markery po zostaty zmapowane markery mikrosatelitarne. Przedrukowano za zgodą
z: Dib C et al., Nature, 380, 152-154. Copyright 1996 Macmillan
przeciwnych stronach takiego miejsca będą wydawać się Magazines Limited
bardziej oddalone, niż są w rzeczywistości, z powodu dużej
częstości rekombinacji zachodzącej między nimi. Literatura cytowana
Krótko po publikacji mapy genetycznej ukończono mapę
Dib C, Fuare S, Fizames C, et al. (1996) A comprehensive genetic
fizyczną o gęstości markerów sięgającej jeden na 100 kb. map of the human genome based on 5,264 microsatellites. Nature 380,
(Patrz Badania i odkrycia 3.1, s. 56). Ta i inne mapy fizyczne 152-154.
34 ROZDZIAŁ 2 • MAPOWANIE G E N O M Ó W TECHNIKAMI GENETYCZNYMI

dawca biorca

(A) Transfer kolejnych (B) Jednoczesny transfer blisko sprzężonych markerów

markerów w czasie koniugacji w czasie transdukcji lub transformacji

Rysunek 2.16 Podstawy mapowania genów u bakterii

Powyższy rysunek pokazuje transfer funkcjonalnego genu odpowiedzialnego za syntezę tryptofanu z dzikiej bakterii (o genotypie
opisywanym jako trp+) do biorcy, któremu brakuje działającej kopii tego genu (trp~). Biorcę nazywa się auksotrofem tryptofanowym
(słowo używane do opisania zmutowanej bakterii, która może przeżyć tylko wówczas, gdy dostarczy się jej odpowiedniego składnika
odżywczego - w t y m przypadku tryptofanu, który nie jest konieczny dla typu dzikiego, patrz sekcja 13.1.2). Po transferze potrzebna jest
podwójna rekombinacja, by przeniesiony gen włączył się do chromosomu k o m ó r k i biorcy, zmieniając fenotyp biorcy z trp- na trp+.
(A) W czasie koniugacji D N A przenoszony jest z dawcy do biorcy w taki sposób, jak przeciąga się strunę przez rurkę. Względne pozycje
markerów w cząsteczce D N A można zmapować ustalając czas, po którym markery pojawiają się w komórce biorcy. W pokazanym
przykładzie markery A, B i C są przenoszone odpowiednio po 8, 20 i 30 minutach od rozpoczęcia koniugacji. Przeniesienie całego
genomu £. coli zajmuje około 100 minut. (B) Aby zostać wspólnie przeniesione w czasie transdukcji lub transformacji, dwa markery (lub
więcej) muszą być ściśle sprzężone, ponieważ zwykle procesy te umożliwiają przeniesienie z dawcy do biorcy mniej niż 50 kb D N A .
Mapowanie z użyciem transdukcji i transformacji stosuje się do ustalenia względnych pozycji m a r k e r ó w położonych zbyt blisko siebie,
aby zmapować je precyzyjnie stosując koniugację. Dalsze szczegóły - patrz Freifelder (1987)
 2.3 SPOSOBY PODEJŚCIA DO MAPOWANIA GENETYCZNEGO 35

jednej z trzech istniejących metod przenoszenia frag­
m e n t ó w DNA z jednej bakterii do drugiej (rys. 2.15):
1) Koniugacja, w czasie której dwie bakterie zbliżają
się fizycznie i jedna z nich (dawca) przekazuje
DNA drugiej bakterii (biorcy). Przeniesiony DNA
może być kopią części lub, jeśli to możliwe, całości
chromosomu komórki dawcy, albo też segmentem
chromosomowego DNA długości do 1 Mb, włączo­
nym do plazmidu (sekcja 1.2.2). Ten drugi przypa­
dek nazywa się transferem episomu.
2) Transdukcja, która obejmuje przeniesienie małych
(do ok. 50 kb) segmentów DNA z dawcy do biorcy
za pośrednictwem bakteriofaga.
3) Transformacja, gdy komórka biorcy pobiera ze
środowiska fragmenty DNA pochodzące z komórki
dawcy, rzadko dłuższe niż 50 kb.
Po przeniesieniu musi zajść podwójna rekombinacja,
tak aby DNA z bakterii dawcy włączył się do chromo­
somu komórki biorcy (rys. 2.16A). Jeśli to się nie
zdarzy, przeniesiony DNA jest gubiony w czasie
podziału komórki biorcy. Jedynym wyjątkiem jest
transfer episomu, gdyż plazmidy mogą się namnażać
niezależnie od chromosomu gospodarza.
Tutaj też używa się markerów biochemicznych,
fenotypem dominującym lub typu dzikiego jest p e w n a
cecha biochemiczna (np. zdolność syntezy tryptofanu;
wrażliwość na antybiotyk *), a fenotypem recesywnym
- cecha przeciwna (np. brak zdolności syntezy tryptofa­
nu, oporność na antybiotyk). Transfer genu przeważnie
przeprowadza się między dawcą mającym allele dzikie
a biorcą o allelach recesywnych. Przeniesienie do
szczepu biorcy śledzi się poszukując pojawienia się
u biorcy funkcji biochemicznych określanych przez
badane geny (rys. 2.16B). Szczegóły procedury mapo­
wania zależą od używanego typu transferu genów.
W m a p o w a n i u koniugacyjnym DNA dawcy jest prze­
noszony do biorcy jako ciągła nitka, a pozycje genów
mapuje się przez oznaczenie czasu wejścia alleli dzikich
do biorcy. Mapowanie z zastosowaniem transdukcji
i transformacji umożliwia z m a p o w a n i e genów położo­
nych stosunkowo blisko siebie, ponieważ przenoszony
segment DNA jest krótki (50 kb), a prawdopodobieńst­
wo, że dwa geny zostaną przeniesione wspólnie, zależy
od ich bliskości na chromosomie bakteryjnym.
* Wrażliwość na antybiotyki jest cechą dziką, na ogól
recesywną (przyj), tłum.)

LITERATURA CYTOWANA
Collins FS, Guyer MS and C h a k r a v a r t i A (1997) Variations on a theme: cataloging human D N A sequence variation. Science, 2 7 8 ,
1580-1581.
Dausset J, Cann H, C o h e n D, et al. (1990) Program description: Centre d'Etude du Polymorphisme Humain - collaborative genetic
mapping of the human genome. Genomics, 6, 575-577.
Freifelder D (1987) Microbiol Genetics. Jones & Bartlett, Boston.
Mori M, B e a t t y PG, Graves M, Boucher KM and Milford EL (1997) HLA gene and haplotype frequencies in the N o r t h American
population. Transplantation, 65, U I.
M o r t o n NE (1955) Sequential tests for the detection of linkage. Am. J. Hum. Genet., 7, 277-3 18.
O r e l V (1995) Gregor Mendel: The First Geneticist. O x f o r d University Press, O x f o r d .
Pennisi E (1998) Sifting through and making sense of genome sequences. Science, 280, 1692-1693.
Ramsay G (1998) D N A chips: state of the art. Nature Biotechnol, 16, 4 0 - 4 4 .
S t u r t e v a n t AH (1913) The linear arrangement of six sex-linked factors in Drosophila as shown by mode of association. J. Exp. Zoo/.,
14, 39-45.
V e n t e r JC, A d a m s M D , Sutton G G , Kerlavage AR, Smith HO and Hunkapiller M (1998) Shotgun sequencing of the human
genome. Science, 2 8 0 , 1540-1542.
W a n g D G , Fan J-B, Siao C-J, et al. (1998) Large-scale identification, mapping, and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in
the human genome. Science, 280, 1077-1082.
Y a m a m o t o F, Clausen H, W h i t e T, M a r k e n J and H a k a m o r i S (1990) Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system.
Nature, 3 4 5 , 229-233.

LITERATURA UZUPEŁNIAJĄCA
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and W a t s o n JD (1994) Molecular Biology of the Cell. 3rd edition. Garland Publishing,
NewYork. - Zawiera wszystkie szczegóły mitozy i mejozy.
Fincham JRS, D a y PR and Radford A ( 1979) Fungal Genetics, 4th edition. Blackwell, London. - „Biblia" mapowania genów
mikroorganizmów eukariotycznych.
Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki D T , Lewontin RC and G e l b a r t WM (1996) An Introduction to Genetic Analysis, 6th edition. W. H.
Freeman, NewYork. - Rozdziały 5 i 6 szczególnie dobrze opisują mapowanie genów za pomocą krzyżówek eksperymentalnych.
Rozdział 10 dotyczy mapowania u bakterii.
Strachan T and Read AP (1996) Human Molecular Genetics. BIOS Scientific Publishers, O x f o r d . - Rozdział 12 obejmuje mapowanie
genetyczne człowieka.
S t u r t e v a n t AH (1965) A History of Genetics. Harper and Row, N e w York. - Opisuje wczesne prace nad mapowaniem genów
przeprowadzone przez Morgana i jego współpracowników.